Белки

Белки́(протеи́ны,полипепти́ды) —высокомолекулярныеорганические вещества, состоящие изаминокислот, соединённых в цепочкупептидной связью. В живых организмах аминокислотный состав белков определяетсягенетическим кодом, при синтезе в большинстве случаев используется 20стандартных аминокислот. Множество их комбинаций определяет большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того, аминокислотные остатки в составе белка часто подвергаютсяпосттрансляционным модификациям(добавление полиА-хвоста и КЭПа), которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять свою функцию, и во время его «работы» в клетке. Часто в живых организмах несколько молекул разных белков образуют сложные комплексы, например,фотосинтетический комплекси другие комплексы.
Функции белков вклеткахживых организмов более разнообразны, чем функции другихбиополимеров—полисахаридовиДНК. Так, белки играют ключевую роль прииммунном ответе, они могут выполнять транспортную функцию (например,гемоглобин, переносящий газы вкрови, иальбумины, транспортирующиежиры), запасающую (например,казеинмолока), каталитическую (пищеварительные ферменты,ДНК-полимеразаиРНК-полимеразаучаствуют в матричных реакциях), структурную (как примеры, из белкакератинасостоят волосы и ногти,коллагениэластинявляются важными компонентамисоединительной ткани,тубулинобразуетмикротрубочки),рецепторнуюфункцию всигнальных системах клеток(одним из примеров является белокродопсин, необходимый для работы зрительных рецепторов и обеспечивающий формированиенервного импульсав ответ на действиефотоновсвета). Можно также выделить несколько не столь значительных функций, например, энергетическую (приистощении) и функцию ядов (белки-яды).
Белки — важная часть питанияживотныхичеловека(основные источники: мясо, птица, рыба, молоко, орехи, бобовые, зерновые, овощи, фрукты, ягоды и грибы.)
В процессепищеваренияферменты разрушают потреблённые белки до аминокислот, которые используются длябиосинтезасобственных белков организма или подвергаются дальнейшему распаду для полученияэнергии.
За впервые проведённое определение аминокислотной последовательности белка —инсулина— методомсеквенированияФредерику Сенгерубыла присвоенаНобелевская премия по химиив 1958 году.
Первые трёхмерные структуры белковгемоглобинаимиоглобинабыли установлены методомдифракции рентгеновских лучей, соответственно,Максом ПеруцемиДжоном Кендрюв конце 1950-х годов, за что в 1962 году они получилиНобелевскую премиюпо химии.
Впервые белок был получен (в видеклейковины) в 1728 г. итальянцемЯкопо Бартоломео Беккарииз пшеничной муки. Белки были выделены в отдельный класс биологическихмолекулвXVIII векев результате работ французского химикаАнтуана де Фуркруаи других учёных, в которых было отмечено свойство белковкоагулировать(денатурировать) под воздействием нагревания иликислот. В то время были исследованы такие белки, какальбумин(«яичный белок»),фибрин(белок изкрови) иглютениз зернапшеницы.
В начале XIX века уже были получены некоторые сведения об элементарном составе белков, было известно, что при гидролизе белков образуютсяаминокислоты. Некоторые из этих аминокислот (напримерглицинилейцин) уже были охарактеризованы. Голландский химикГеррит Мульдерна основе анализа химического состава белков выдвинул гипотезу, что практически все белки имеют сходнуюэмпирическую формулу. В 1836 году Мульдер предложил первую модель химического строения белков. Основываясь на теориирадикалов, он после нескольких уточнений пришёл к выводу, что минимальная структурная единица белка обладает следующим составом: C40H62N10O12. Эту единицу он назвал «протеином» (Pr) (отдр.-греч.протос — первый, первичный), а теорию — «теорией протеина». Сам термин «протеин» был предложен ещё шведским химикомЯкобом Берцелиусом. Согласно представлениям Мульдера, каждый белок состоит из нескольких протеинных единиц,серыифосфора. Например, он предложил записывать формулу фибрина как 10PrSP. Мульдер также исследовал продукты разрушения белков — аминокислоты и для одной из них (лейцина) с малой долей погрешности определил молекулярную массу — 131дальтон. По мере накопления новых данных о белках теория протеина стала подвергаться критике, но, несмотря на это, до конца 1850-х всё ещё считалась общепризнанной.
К концу XIX века было исследовано большинство аминокислот, которые входят в состав белков. В конце 1880-х гг. русский учёныйА. Я. Данилевскийотметил существование пептидных групп (CO—NH) в молекуле белка. В 1894 году немецкий физиологАльбрехт Коссельвыдвинул теорию, согласно которой именно аминокислоты являются основными структурными элементами белков. В начале XX века немецкий химикЭмиль Фишерэкспериментально доказал, что белки состоят из аминокислотных остатков, соединённыхпептидными связями. Он же осуществил первый анализ аминокислотной последовательности белка и объяснил явлениепротеолиза.
Однако центральная роль белков в организмах не была признана до 1926 года, когда американский химикДжеймс Самнер(впоследствии — лауреат Нобелевской премии по химии) показал, что ферментуреазаявляется белком.
Сложность выделения чистых белков затрудняла их изучение. Поэтому первые исследования проводились с использованием тех полипептидов, которые легко могли быть очищены в большом количестве, то есть белков крови, куриных яиц, различныхтоксинов, а также пищеварительных/метаболических ферментов, выделяемых после забоя скота. В конце 1950-х годов компанияArmour Hot Dog Co.смогла очистить килограмм бычьейпанкреатическойрибонуклеазы А, которая стала экспериментальным объектом для многих исследований.
Идея о том, чтовторичная структурабелков — результат образованияводородных связеймежду аминокислотными остатками, была высказанаУильямом Астберив1933 году, ноЛайнус Полингсчитается первым учёным, который смог успешно предсказать вторичную структуру белков. Позднее Уолтер Каузман, опираясь на работыКая Линнерстрём-Ланга, внёс весомый вклад в понимание законов образованиятретичной структурыбелков и роли в этом процессегидрофобных взаимодействий. В конце 1940-х — начале 1950-х годовФредерик Сенгерразработал методсеквенирования белков, с помощью которого он к 1955 году определил аминокислотную последовательность двух цепейинсулина, продемонстрировав, что белки — это линейные полимеры аминокислот, а не разветвлённые (как у некоторыхсахаров) цепи,коллоидыилициклолы. Первым белком, аминокислотную последовательность которого установили советские/российские учёные, стала в 1972 годуаспартатаминотрансфераза.
Первые пространственные структуры белков, полученные методомдифракции рентгеновских лучей(рентгеноструктурного анализа) стали известны в конце 1950-х — начале 1960-х годов, а структуры, открытые с помощьюядерного магнитного резонанса— в 1980-х годах. В 2012 году Банк данных о белках (Protein Data Bank) содержал около 87 000 структур белков.
В XXI веке исследование белков перешло на качественно новый уровень, когда исследуются не только индивидуальные очищенные белки, но и одновременное изменение количества ипосттрансляционных модификацийбольшого числа белков отдельныхклеток,тканейили целых организмов. Эта область биохимии называетсяпротеомикой. С помощью методовбиоинформатикистало возможно не только обработать данныерентгеноструктурного анализа, но и предсказать структуру белка, основываясь на его аминокислотной последовательности. В настоящее времякриоэлектронная микроскопиякрупных белковых комплексов и предсказание пространственных структурбелковых доменовс помощью компьютерных программ приближаются к атомарной точности.
Размер белка может измеряться в числе аминокислотных остатков или вдальтонах(молекулярная масса), но из-за относительно большой величины молекулы масса белка выражается в производных единицах — килодальтонах (кДа). Белкидрожжей, в среднем, состоят из 466 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу 53 кДа. Самый большой из известных в настоящее время белков —титин— является компонентомсаркомеровмускулов; молекулярная масса его различных вариантов (изоформ) варьирует в интервале от 3000 до 3700 кДа. Титинкамбаловидной мышцы(лат.soleus) человека состоит из 38 138 аминокислот.
Для определения молекулярной массы белков применяют такие методы, какгель-фильтрация,электрофорез в полиакриламидном геле,масс-спектрометрический анализ,седиментационный анализи другие.
Белки обладают свойством амфотерности, то есть в зависимости от условий проявляют каккислотные, так иосно́вныесвойства. В белках присутствуют несколько типов химических группировок, способных кионизациив водном растворе:карбоксильные остаткибоковых цепей кислых аминокислот (аспарагиноваяиглутаминоваякислоты) и азотсодержащие группы боковых цепей основных аминокислот (в первую очередь, ε-аминогруппализинаиамидиновыйостаток CNH(NH2)аргинина, в несколько меньшей степени —имидазольныйостатокгистидина). Каждый белок характеризуетсяизоэлектрической точкой(pI) — кислотностью среды (pH), при которой суммарныйэлектрический зарядмолекул данного белка равен нулю и, соответственно, они не перемещаются вэлектрическом поле(например приэлектрофорезе). В изоэлектрической точке гидратация и растворимость белка минимальны. Величина pI зависит от соотношения кислых и основных аминокислотных остатков в белке: у белков, содержащих много кислых аминокислотных остатков, изоэлектрические точки лежат в кислой области (такие белки называют кислыми), а у белков, содержащих больше основных остатков, — в щелочной (основные белки). Значение pI данного белка также может меняться в зависимости отионной силыи типабуферного раствора, в котором он находится, так как нейтральные соли влияют на степень ионизации химических группировок белка. pI белка можно определить, например изкривой титрованияили с помощью изоэлектрофокусирования.
В целом, pI белка зависит от выполняемой им функции: изоэлектрическая точка большинства белков тканей позвоночных лежит в пределах от 5,5 до 7,0, однако в некоторых случаях значения лежат в экстремальных областях: так, например, дляпепсина— протеолитического фермента сильнокислого желудочного сока pI ~ 1, а для сальмина — белка-протаминамолоклосося, особенностью которого является высокое содержание аргинина, — pI ~ 12. Белки, связывающиеся снуклеиновыми кислотамиза счётэлектростатического взаимодействиясфосфатными группами, часто являются основными белками. Примером таких белков служатгистоныи протамины.
Белки различаются по степенирастворимостив воде. Водорастворимые белки называютсяальбуминами, к ним относятся белки крови и молока. К нерастворимым, илисклеропротеинам, относятся, например,кератин(белок, из которого состоят волосы, шерсть млекопитающих, перья птиц и т. п.) ифиброин, входящий в составшёлкаипаутины. Растворимость белка определяется не только его структурой, но внешними факторами, такими как природа растворителя, ионная сила и pH раствора.
Белки также делятся нагидрофильныеигидрофобные. К гидрофильным относится большинство белковцитоплазмы,ядраимежклеточного вещества, в том числе нерастворимыекератинифиброин. К гидрофобным относится большинство белков, входящих в составбиологических мембран, — интегральных мембранных белков, которые взаимодействуют с гидрофобнымилипидамимембраны(у этих белков, как правило, есть и гидрофильные участки).
Денатурацией белка называют любые изменения в его биологической активности и/или физико-химических свойствах, связанные с потерейчетвертичной,третичнойиливторичной структуры(см. раздел «Структура белка»). Как правило, белки достаточно стабильны в тех условиях (температура, pH, давление, инфракрасное излучение и др.), в которых они в норме функционируют в организме. Резкое изменение этих условий приводит к денатурации белка. В зависимости от природы денатурирующего агента выделяют механическую (сильное перемешивание или встряхивание), физическую (нагревание, охлаждение, облучение, обработкаультразвуком) и химическую (кислотыищёлочи,поверхностно-активные вещества,мочевина) денатурацию.
Денатурация белка может быть полной или частичной, обратимой или необратимой. Самый известный случай необратимой денатурации белка в быту — это приготовление куриного яйца, когда под воздействием высокой температуры растворимый в воде прозрачный белоковальбуминстановится плотным, нерастворимым и непрозрачным. Денатурация в некоторых случаях обратима, как в случае осаждения водорастворимых белков с помощью солейаммония(метод высаливания), и этот метод используется как способ их очистки.
Молекулы белков представляют собой линейныеполимеры, состоящие из остатков α-L-аминокислот (которые являютсямономерами), также в состав белков могут входить модифицированные аминокислотные остатки и компоненты неаминокислотной природы. Для обозначения аминокислот в научной литературе используются одно- или трёхбуквенные сокращения налатинице, например, длявалина: Val, V. Хотя на первый взгляд может показаться, что использование в большинстве белков «всего» 20 аминокислотограничивает разнообразие белковых структур, на самом деле, количество их вариантов очень велико: для цепочки из 5 аминокислотных остатков оно составляет уже более 3 миллионов, а цепочка из 100 аминокислотных остатков (небольшой белок) может быть представлена более чем в 10вариантах. Цепочки длиной от 2 до нескольких десятков аминокислотных остатков часто называютпептидами, при большей степени полимеризации —белками, хотя это деление весьма условно.
При образовании белка в результате взаимодействия α-карбоксильной группы (-COOH) одной аминокислоты с α-аминогруппой (-NH2) другой аминокислоты образуютсяпептидные связи. Концы белка называют N- и C-концом, в зависимости от того, какая из групп концевого аминокислотного остатка свободна: -NH2или -COOH, соответственно. При синтезе белка на рибосоме первым (N-концевым) аминокислотным остатком обычно является остатокметионина, а последующие остатки присоединяются к C-концу предыдущего.
К. Линдстрём-Ланг предложил выделять 4 уровня структурной организации белков:первичную,вторичную,третичнуюичетвертичнуюструктуры. Хотя такое деление несколько устарело, им продолжают пользоваться. Первичная структура (последовательность аминокислотных остатков) полипептида определяется структурой егогенаигенетическим кодом, а структуры более высоких порядков формируются в процессесворачивания белка. Хотя пространственная структура белка в целом определяется его аминокислотной последовательностью, она является довольно лабильной и может зависеть от внешних условий, поэтому более правильно говорить о предпочтительной или наиболее энергетически выгодной конформации белка.
Первичная структура — последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Первичную структуру белка, как правило, описывают, используя однобуквенные или трёхбуквенные обозначения для аминокислотных остатков.
Важными особенностями первичной структуры являютсяконсервативные мотивы— устойчивые сочетания аминокислотных остатков, выполняющие определённую функцию и встречающиеся во многих белках. Консервативные мотивы сохраняются в процессеэволюциивидов, по ним часто удаётся предсказать функцию неизвестного белка. По степени гомологии (сходства) аминокислотных последовательностей белков разных организмов можно оценивать эволюционное расстояние междутаксонами, к которым принадлежат эти организмы.
Первичную структуру белка можно определить методами секвенирования белков или по первичной структуре егомРНК, используя таблицу генетического кода.
Вторичная структура — локальное упорядочивание фрагмента полипептидной цепи, стабилизированноеводородными связями. Ниже приведены самые распространённые типы вторичной структуры белков:
Третичная структура — пространственное строение полипептидной цепи. Структурно состоит из элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами взаимодействий, в которыхгидрофобные взаимодействияиграют важнейшую роль. В стабилизации третичной структуры принимают участие:
Исследования принципов укладки белков показали, что между уровнем вторичной структуры и атомарной пространственной структурой удобно выделять ещё один уровень — мотив укладки (архитектура, структурный мотив). Мотив укладки определяется взаимным расположением элементов вторичной структуры (α-спиралей и β-тяжей) в пределахбелкового домена— компактной глобулы, которая может существовать или сама по себе или входить в состав более крупного белка наряду с другими доменами. Рассмотрим для примера один из характерных мотивов строения белков. Изображённый на рисунке справа глобулярный белок, триозофосфатизомераза, имеет мотив укладки, который называется α/β-цилиндр: 8 параллельных β-тяжей формируют β-цилиндр внутри ещё одного цилиндра, сложенного из 8 α-спиралей. Такой мотив обнаруживается примерно в 10 % белков.
Известно, что мотивы укладки являются довольно консервативными и встречаются в белках, которые не имеют ни функциональных, ни эволюционных связей. Определение мотивов укладки лежит в основе физической, или рациональной классификации белков (такой как CATH или SCOP).
Для определения пространственной структуры белка применяют методы рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса и некоторые виды микроскопии.
Четвертичная структура (или субъединичная,доменная) — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в составе единого белкового комплекса. Белковые молекулы, входящие в состав белка с четвертичной структурой, образуются на рибосомах по отдельности и лишь после окончания синтеза образуют общую надмолекулярную структуру. В состав белка с четвертичной структурой могут входить как идентичные, так и различающиеся полипептидные цепочки. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной. Надмолекулярные белковые комплексы могут состоять из десятков молекул.
По общему типу строения белки можно разбить на три группы:
Помимо пептидных цепей, в состав многих белков входят и неаминокислотные группы, и по этому критерию белки делят на две большие группы — простые и сложные белки (протеиды). Простые белки состоят только из полипептидных цепей, сложные белки содержат также неаминокислотные, илипростетические, группы. В зависимости от химической природы простетических групп среди сложных белков выделяют следующие классы:
Физические свойства белка в клетке с учётомводной оболочкиикраудинга макромолекулочень сложны. В пользу гипотезы о белке, как о упорядоченной «кристаллоподобной системе» — «апериодическом кристалле»— свидетельствуют данные рентгеноструктурного анализа (вплоть до разрешения в 1ангстрем), высокая плотность упаковки, кооперативность процесса денатурациии другие факты.
В пользу другой гипотезы, о жидкообразных свойствах белков в процессах внутриглобулярных движений (модель ограниченной прыжковой илинепрерывной диффузии), свидетельствуют эксперименты по рассеянию нейтронов,мёссбауэровской спектроскопии.
Белки синтезируются живыми организмами из аминокислот на основе информации, закодированной вгенах. Каждый белок состоит из уникальной последовательности аминокислотных остатков, которая определяется нуклеотидной последовательностью гена, кодирующего данный белок.Генетический кодпредставляет собой способ перевода нуклеотидной последовательности ДНК (через РНК) в аминокислотную последовательность полипептидной цепи. Этот код определяет соответствие трёхнуклеотидных участков РНК, называемыхкодонами, и определённых аминокислот, которые включаются в состав белка: последовательность нуклеотидов АУГ, например, соответствуетметионину. Поскольку ДНК состоит из четырёх типовнуклеотидов, то общее число возможных кодонов равно 64; а так как в белках используется 20 аминокислот, то многие аминокислоты определяются более чем одним кодоном. Три кодона являются незначащими: они служат сигналами остановки синтеза полипептидной цепи и называютсятерминаторными кодонами, или стоп-кодонами.
Гены, кодирующие белки, сначалатранскрибируютсяв последовательность нуклеотидов матричной РНК (мРНК) ферментамиРНК-полимеразами. В подавляющем большинстве случаев белки живых организмов синтезируются нарибосомах— многокомпонентных молекулярных машинах, присутствующих в цитоплазме клеток. Процесс синтеза полипептидной цепи рибосомой на матрице мРНК называетсятрансляцией.
Рибосомный синтез белков принципиально одинаков упрокариотиэукариот, но различается в некоторых деталях. Так, мРНК прокариот может считываться рибосомами в аминокислотную последовательность белков сразу после транскрипции или даже до её завершения. У эукариот же первичныйтранскриптсначала должен пройтисерию модификацийи переместиться в цитоплазму (к месту локализации рибосом), прежде чем может начаться трансляция. Скорость синтеза белков выше у прокариот и может достигать 20 аминокислот в секунду.
Ещё до начала трансляции ферментыаминоацил-тРНК-синтетазыспецифично присоединяют аминокислоты к соответствующим имтранспортным РНК(тРНК). Участок тРНК, который называется антикодоном, может комплементарно спариваться с кодоном мРНК, обеспечивая тем самым включение присоединённого к тРНК аминокислотного остатка в полипептидную цепь в соответствии с генетическим кодом.
Во время начальной стадии трансляции, инициации, инициаторный (обычно метиониновый) кодон узнаётся малой субъединицей рибосомы, к которой при помощи белковыхфакторов инициацииприсоединена аминоацилированная метиониновая тРНК. После узнавания стартового кодона к малой субъединице рибосомы присоединяется большая субъединица, и начинается вторая стадия трансляции — элонгация. При каждом шаге рибосомы от 5'- к 3'-концу мРНК считывается один кодон путём образования водородных связей между ним и комплементарным ему антикодоном транспортной РНК, к которой присоединён соответствующийаминокислотный остаток. Образованиепептидной связимежду последним аминокислотным остатком растущего пептида и аминокислотным остатком, присоединённым к тРНК, катализируется рибосомальной РНК (рРНК), образующей пептидилтрансферазный центр рибосомы. Этот центр позиционирует атомыазотаиуглеродав положении, благоприятном для прохождения реакции. Третья и последняя стадия трансляции, терминация, происходит при достижении рибосомой стоп-кодона, после чего белковыефакторы терминациигидролизуютсвязь между последней тРНК и полипептидной цепью, прекращая её синтез. В рибосомах белки всегда синтезируются от N- к C-концу.
У низшихгрибови некоторых бактерий известен дополнительный (нерибосомный, или мультиферментный) способ биосинтеза пептидов, как правило, небольших и необычной структуры. Синтез этих пептидов, обычновторичных метаболитов, осуществляется высокомолекулярным белковым комплексом, NRS-синтазой, без непосредственного участия рибосом. NRS-синтаза обычно состоит из нескольких доменов или отдельных белков, осуществляющих селекцию аминокислот, образование пептидной связи и высвобождение синтезированного пептида. Вместе эти домены составляют модуль. Каждый модуль обеспечивает включение одной аминокислоты в синтезируемый пептид. NRS-синтазы, таким образом, могут состоять из одного или более модулей. Иногда в состав этих комплексов входит домен, способный изомеризовать L-аминокислоты (нормальная форма) в D-форму.
Короткие белки могут быть синтезированы химическим путём с использованием методоворганического синтеза, например,химического лигирования. Чаще всего химический синтез пептида происходит в направлении от C-конца к N-концу, в противоположность биосинтезу на рибосомах. Методом химического синтеза получают короткиеиммуногенныепептиды (эпитопы), которые затем инъецируют животным с целью получения специфичныхантителилигибридо́м. Кроме того, этот способ также используется для получения ингибиторов некоторых ферментов. Химический синтез позволяет вводить в состав белков аминокислотные остатки, не встречающиеся в обычных белках, например такие, к боковым цепям которых присоединеныфлюоресцентные метки. Химические методы синтеза белков имеют ряд ограничений: они неэффективны при длине белка более 300 аминокислотных остатков, искусственно синтезированные белки могут иметь неправильную третичную структуру и у них отсутствую характерныепосттрансляционные модификации(см. ниже).
После завершения трансляции большинство белков подвергается дальнейшим химическим модификациям, которые называются посттрансляционными модификациями. Известно более двухсот вариантов посттрансляционных модификаций белков.
Посттрансляционные модификации могут регулировать продолжительность существования белков в клетке, их ферментативную активность и взаимодействия с другими белками. В ряде случаев посттрансляционные модификации являются обязательным этапом созревания белка, в противном случае он оказывается функционально неактивным. Например при созревании инсулина и некоторых других гормонов необходимограниченный протеолизполипептидной цепи, а при созревании белков плазматической мембраны —гликозилирование.
Посттрансляционные модификации могут быть как широко распространёнными, так и редкими, вплоть до уникальных. Примером универсальной модификации служитубиквитинирование(присоединение к белку цепи из нескольких молекул короткого белка убиквитина), которое служит сигналом к расщеплению этого белкапротеасомой. Другой распространённой модификацией является гликозилирование — считается, что около половины белков человека гликозилировано. К редким модификациям относят тирозинирование/детирозинирование и полиглицилированиетубулина.
Один и тот же белок может подвергаться многочисленным модификациям. Так,гистоны(белки, входящие в составхроматинау эукариот) в разных условиях могут подвергаться более чем 150 различным модификациям.
Посттрансляционные модификации делят на:
Синтезируемые в цитоплазме эукариотической клетки белки должны транспортироваться в разныеорганеллыклетки:ядро,митохондрии,эндоплазматический ретикулум(ЭПР),аппарат Гольджи,лизосомыи др., а некоторые белки должны попасть во внеклеточную среду. Для попадания в определённый отдел клетки белок должен обладать специфической меткой. В большинстве случаев такой меткой является часть аминокислотной последовательности самого белка (лидерный пептид, илисигнальная последовательность белка), но в некоторых случаях меткой служат посттрансляционно присоединённые к белкуолигосахариды.
Транспорт белков в ЭПР осуществляется по мере их синтеза, так как рибосомы, синтезирующие белки с сигнальной последовательностью для ЭПР, «садятся» на специальные белки на его внешней мембране. Из ЭПР в аппарат Гольджи, а оттуда в лизосомы и на внешнюю мембрану или во внеклеточную среду белки попадают путём везикулярного транспорта. В ядро белки, обладающиесигналом ядерной локализации, попадают черезядерные поры. В митохондрии и хлоропласты белки, обладающие соответствующими сигнальными последовательностями, попадают через специфические белковые поры-транслокаторы при участиишаперонов.
Поддержание правильной пространственной структуры белков принципиально для их нормального функционирования. Неправильное сворачивание белков, приводящее к их агрегации, может быть вызвано мутациями,окислением, стрессовыми условиями или глобальными изменениями в физиологии клетки. Агрегация белков является характерным признакомстаренияорганизма. Считается, что неправильное сворачивание белков является причиной или усугубляет такие заболевания, какмуковисцидоз,лизосомная болезнь накопления, а также нейродегенеративные расстройства (болезниАльцгеймера,ХантингтонаиПаркинсона).
В процессе эволюции клетками было выработано четыре основных механизма для противодействия агрегации белков. Первые два — повторное сворачивание (переукладка) с помощью шаперонов и расщеплениепротеазами— встречаются как у бактерий, так и у высших организмов.Аутофагияи накопление неправильно свёрнутых белков в особых немембранных органеллах характерны для эукариотов.
Способность белков восстанавливать правильную трёхмерную структуру после денатурации позволила выдвинуть гипотезу о том, что вся информация о конечной структуре белка содержится в его аминокислотной последовательности. В настоящее время общепризнана теория о том, что стабильная конформация белка обладает минимальнойсвободной энергиейпо сравнению с другими возможными конформациями этого полипептида.
В клетках существует группа белков, функция которых — обеспечение правильного сворачивания других белков после их синтеза на рибосоме, восстановление структуры белков после их повреждения, а также создание и диссоциация белковых комплексов. Эти белки называютсяшаперонами. Концентрация многих шаперонов в клетке возрастает при резком повышении температуры окружающей среды, поэтому они относятся к группе Hsp (англ.heat shock proteins— белки теплового шока). Важность нормальной работы шаперонов для функционирования организма может быть проиллюстрирована на примере шаперона α-кристаллина, входящего в составхрусталикаглаза человека. Мутации в этом белке приводят к помутнению хрусталика из-за агрегирования белков и, как результат, ккатаракте.
Если третичная структура белков не может быть восстановлена, они разрушаются клеткой. Ферменты, осуществляющие деградацию белков, называются протеазами. По месту атаки молекулы субстрата протеолитические ферменты делятся на эндопептидазы и экзопептидазы:
По механизму катализа Международный союз по биохимии и молекулярной биологии выделяет несколько классов протеаз, среди нихсериновые протеазы, аспарагиновые протеазы,цистеиновые протеазыи металлопротеазы.
Особый тип протеазы —протеасома, крупная мультисубъединичная протеаза, присутствующая в ядре и в цитоплазмеэукариот,архейи некоторыхбактерий.
Для того, чтобы белок-мишень расщепился протеасомой, он должен быть помечен путём присоединения к нему маленького белкаубиквитина. Реакция присоединения убиквитина катализируется ферментамиубиквитинлигазами. Присоединение первой молекулы убиквитина к белку служит для лигаз сигналом для дальнейшего присоединения молекул убиквитина. В результате к белку оказывается присоединена полиубиквитиновая цепь, которая связывается с протеасомой и обеспечивает расщепление белка-мишени. В целом, эта система получила название убиквитин-зависимой деградации белка. Деградация 80—90 % внутриклеточных белков происходит при участии протеасомы.
Деградация белка впероксисомахважна для протекания многих клеточных процессов, включаяклеточный цикл, регуляциюэкспрессии генови ответ наокислительный стресс.
Аутофагия — это процесс деградации долгоживущих биомолекул, в частности, белков, а также органелл влизосомах(у млекопитающих) или вакуолях (у дрожжей). Аутофагия сопровождает жизнедеятельность любой нормальной клетки, но стимулами к усилению процессов аутофагии в клетках могут служить нехватка питательных веществ, наличие в цитоплазме повреждённых органелл и, наконец, наличие в цитоплазме частично денатурированных белков и их агрегатов.
Различают три типа аутофагии: микроаутофагию, макроаутофагию и шаперон-зависимую аутофагию.
При микроаутофагии макромолекулы и обломки клеточных мембран захватываются лизосомой. Таким путём клетка может переваривать белки при нехватке энергии или строительного материала (например при голодании). Но процессы микроаутофагии происходят и при нормальных условиях и в целом неизбирательны. Иногда в ходе микроаутофагии перевариваются и органеллы; так, у дрожжей описана микроаутофагия пероксисом и частичная микроаутофагия ядер, при которой клетка сохраняет жизнеспособность.
При макроаутофагии участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо органеллы) окружается мембранным компартментом, похожим на цистерну эндоплазматического ретикулума. В результате этот участок отделяется от остальной цитоплазмы двумя мембранами. Такие двухмембранные органеллы называются аутофагосомами. Аутофагосомы сливаются с лизосомами, образуя аутофаголизосомы, в которых органеллы и остальное содержимое аутофагосом перевариваются. Видимо, макроаутофагия также неизбирательна, хотя часто подчёркивается, что с помощью неё клетка может избавляться от «отслуживших свой срок» органелл (митохондрий, рибосом и др.).
Третий тип аутофагии — шаперон-зависимая. При этом способе происходит направленный транспорт частично денатурированных белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в её полость, где они перевариваются. Этот тип аутофагии, описанный только у млекопитающих, индуцируется стрессом.
В условиях стресса, когда эукариотическая клетка не может справиться с накоплением большого числа денатурированных белков, они могут направляться в один из двух типов временных органелл —JUNQ и IPOD.
JUNQ (англ.JUxta Nuclear Quality control compartment— околоядерный компартмент контроля качества белков) ассоциирован со внешней стороной ядерной мембраны и содержит убиквитинированные белки, которые могут быстро переходить в цитоплазму, а также шапероны и протеасомы. Предполагаемая функция JUNQ состоит в переукладке и/или деградации белков.
IPOD (англ.Insoluble Protein Deposit— место отложения нерастворимых белков) расположен около центральной вакуоли и содержит неподвижные агрегаты формирующихамилоидыбелков. Накопление этих белков в IPOD может предотвращать их взаимодействие с нормальными клеточными структурами, поэтому предполагают, что это включение имеет защитную функцию.
Также как и другие биологические макромолекулы (полисахариды, липиды и нуклеиновые кислоты), белки являются необходимыми компонентами всех живых организмов и играют важную роль в жизнедеятельности клетки. Белки осуществляют процессыобмена веществ. Они входят в состав внутриклеточных структур —органеллицитоскелета, секретируются во внеклеточное пространство, где могут выступать в качествесигнала, передаваемого между клетками, участвовать вгидролизепищи и образованиимежклеточного вещества.
Классификация белков по их функциям является достаточно условной, так как один и тот же белок может выполнять несколько функций. Хорошо изученным примером такой многофункциональности служит лизил-тРНК-синтетаза — фермент из классааминоацил-тРНК-синтетаз, которая не только присоединяет остатоклизинактРНК, но и регулируеттранскрипциюнескольких генов.
Многие функции белки выполняют благодаря своейферментативнойактивности. Так, ферментами являются двигательный белокмиозин, регуляторные белкипротеинкиназы, транспортный белокнатрий-калиевая аденозинтрифосфатазаи др.
Наиболее хорошо известная функция белков в организме —катализразличных химических реакций. Ферменты — это белки, обладающие специфическими каталитическими свойствами, то есть каждый фермент катализирует одну или несколько сходных реакций. Ферменты катализируют реакции расщепления сложных молекул (катаболизм) и их синтеза (анаболизм), в том числерепликациюирепарациюДНК и матричный синтез РНК. К 2013 году было описано более 5000 ферментов. Ускорение реакции в результате ферментативного катализа может быть огромным: реакция, катализируемая ферментом оротидин-5'-фосфатдекарбоксилазой, например, протекает в 10¹⁷ раз быстрее некатализируемой (периодполуреакциидекарбоксилированияоротовой кислотысоставляет 78 миллионов лет без фермента и 18 миллисекунд с участием фермента). Молекулы, которые присоединяются к ферменту и изменяются в результате реакции, называютсясубстратами.
Хотя ферменты обычно состоят из сотен аминокислотных остатков, только небольшая часть из них взаимодействует с субстратом, и ещё меньшее количество — в среднем 3—4 аминокислотных остатка, часто расположенные далеко друг от друга в первичной структуре — напрямую участвуют в катализе. Часть молекулы фермента, которая обеспечивает связывание субстрата и катализ, называетсяактивным центром.
Международный союз биохимии и молекулярной биологии в 1992 году предложил окончательный вариант иерархической номенклатуры ферментов, основанной на типе катализируемых ими реакций. Согласно этой номенклатуре названия ферментов всегда должны иметь окончание -азаи образовываться от названий катализируемых реакций и их субстратов. Каждому ферменту приписывается индивидуальныйкод, по которому легко определить его положение в иерархии ферментов. По типу катализируемых реакций все ферменты делят на 6 классов:
Структурные белки цитоскелета, как своего рода арматура, придают форму клеткам и многим органеллам и участвуют в изменении формы клеток. Большинство структурных белков являются филаментозными: мономерыактинаитубулинаэто, например, глобулярные, растворимые белки, но после полимеризации они формируют длинные нити, из которых состоит цитоскелет, позволяющий клетке поддерживать форму.Коллагениэластин— основные компоненты межклеточного веществасоединительной ткани(например,хряща), а из другого структурного белкакератинасостоятволосы,ногти,перьяптиц и некоторыераковины.
Существует несколько видов защитных функций белков:
Многие процессы внутри клеток регулируются белковыми молекулами, которые не служат ни источником энергии, ни строительным материалом для клетки. Эти белки регулируют продвижение клетки поклеточному циклу,транскрипцию,трансляцию,сплайсинг, активность других белков и многие другие процессы. Регуляторную функцию белки осуществляют либо за счёт ферментативной активности (например,протеинкиназы), либо за счёт специфичного связывания с другими молекулами. Так,факторы транскрипции,белки-активаторыи белки-репрессоры, могут регулировать интенсивность транскрипции генов, связываясь с их регуляторными последовательностями. На уровне трансляции считывание многих мРНК также регулируется присоединением белковых факторов.
Важнейшую роль в регуляции внутриклеточных процессов играют протеинкиназы ипротеинфосфатазы— ферменты, которые активируют или подавляют активность других белков путём присоединения к ним или отщепления фосфатных групп.
Сигнальная функция белков— способность белков служить сигнальными веществами, передавая сигналы между клетками, тканями, о́рганами и организмами. Часто сигнальную функцию объединяют с регуляторной, так как многие внутриклеточные регуляторные белки тоже осуществляют передачу сигналов.
Сигнальную функцию выполняют белки-гормоны,цитокины,факторы ростаи др.
Гормоны переносятся кровью. Большинство гормонов животных — это белки или пептиды. Связывание гормона с его рецептором является сигналом, запускающим ответную реакцию клетки. Гормоны регулируют концентрации веществ в крови и клетках, рост, размножение и другие процессы. Примером таких белков служитинсулин, который регулирует концентрациюглюкозыв крови.
Клетки взаимодействуют друг с другом с помощью сигнальных белков, передаваемых через межклеточное вещество. К таким белкам относятся, например, цитокины и факторы роста.
Цитокины — пептидные сигнальные молекулы. Они регулируют взаимодействия между клетками, определяют их выживаемость, стимулируют или подавляют рост,дифференцировку, функциональную активность иапоптоз, обеспечивают согласованность действий иммунной, эндокринной и нервной систем. Примером цитокинов может служитьфактор некроза опухоли, который передаёт сигналы воспаления между клетками организма.
Растворимые белки, участвующие в транспорте малых молекул, должны иметь высокое сродство (аффинность) к субстрату, когда он присутствует в высокой концентрации, и легко его высвобождать в местах низкой концентрации субстрата. Примером транспортных белков можно назватьгемоглобин, который переноситкислородиз лёгких к остальным тканям иуглекислый газот тканей к лёгким, а такжегомологичныеему белки, найденные во всех царствах живых организмов.
Некоторыемембранные белкиучаствуют в транспорте малых молекул через мембрану клетки, изменяя её проницаемость.Липидныйкомпонент мембраны водонепроницаем (гидрофобен), что предотвращаетдиффузиюполярных или заряженных (ионы) молекул. Мембранные транспортные белки принято подразделять на белки-каналы и белки-переносчики. Белки-каналы содержат внутренние заполненные водой поры, которые позволяют ионам (через ионные каналы) или молекулам воды (через белки-аквапорины) перемещаться через мембрану. Многиеионные каналыспециализируются на транспорте только одного иона; так,калиевыеинатриевые каналычасто различают эти сходные ионы и пропускают только один из них. Белки-переносчики связывают, подобно ферментам, каждую переносимую молекулу или ион и, в отличие от каналов, могут осуществлять активный транспорт с использованием энергии АТФ. «Электростанция клетки» —АТФ-синтаза, которая осуществляет синтез АТФ за счётпротонного градиента, также может быть отнесена к мембранным транспортным белкам.
К таким белкам относятся так называемые резервные белки, которые запасаются в качестве источника энергии и вещества в семенах растений (например, глобулины 7S и 11S) и яйцеклетках животных. Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессыметаболизма.
Белковые рецепторы могут находиться как в цитоплазме, так и встраиваться вклеточную мембрану. Одна часть молекулы рецептора воспринимаетсигнал, которым чаще всего служит химическое вещество, а в некоторых случаях — свет, механическое воздействие (например, растяжение) и другие стимулы. При воздействии сигнала на определённый участок молекулы — белок-рецептор — происходят еёконформационные изменения. В результате меняется конформация другой части молекулы, осуществляющей передачу сигнала на другие клеточные компоненты. Существует несколько механизмов передачи сигнала. Некоторые рецепторыкатализируютопределённую химическую реакцию; другие служат ионными каналами, которые при действии сигнала открываются или закрываются; третьи специфически связывают внутриклеточные молекулы-посредники. У мембранных рецепторов часть молекулы, связывающаяся с сигнальной молекулой, находится на поверхности клетки, а домен, передающий сигнал, — внутри.
Целый классмоторных белковобеспечивает движения организма, например, сокращение мышц, в том числелокомоцию(миозин), перемещение клеток внутри организма (например, амёбоидное движениелейкоцитов), движениересничекижгутиков, а также активный и направленный внутриклеточный транспорт (кинезин,динеин). Динеины и кинезины проводят транспортировку молекул вдольмикротрубочекс использованиемгидролизаАТФв качестве источника энергии. Динеины переносят молекулы и органоиды из периферических частей клетки по направлению кцентросоме, кинезины — в противоположном направлении. Динеины также отвечают за движение ресничек ижгутиковэукариот. Цитоплазматические варианты миозина могут принимать участие в транспорте молекул и органоидов по микрофиламентам.
Большинствомикроорганизмови растений могут синтезировать 20 стандартныхаминокислот, а также дополнительные (нестандартные) аминокислоты, например,цитруллин. Но если аминокислоты есть в окружающей среде, даже микроорганизмы сохраняют энергию путём транспорта аминокислот внутрь клеток и выключения их биосинтетических путей.
Аминокислоты, которые не могут быть синтезированы животными, называютсянезаменимыми. Основные ферменты вбиосинтетическихпутях, например, аспартаткиназа, которая катализирует первый этап в образованиилизина,метионинаитреонинаизаспартата, отсутствуют у животных.
Животные, в основном, получают аминокислоты из белков, содержащихся в пище. Белки разрушаются в процессепищеварения, который обычно начинается с денатурации белка путём помещения его вкислотную средуигидролизас помощью ферментов, называемыхпротеазами. Некоторые аминокислоты, полученные в результате пищеварения, используются для синтеза белков организма, а остальные превращаются вглюкозув процессеглюконеогенезаили используются вцикле Кребса. Использование белка в качестве источника энергии особенно важно в условиях голодания, когда собственные белки организма, в особенности мускулов, служат источником энергии. Аминокислоты также являются важным источникомазотав питании организма.
Единых норм потребления белков человеком нет.Микрофлоратолстого кишечника синтезирует аминокислоты, которые не учитываются при составлении белковых норм.
Группа природных растительных белков, обладающих сладким вкусом. Выделяются преимущественно из семян и плодов тропических растений, произрастающих в Африке и Азии.
Сладкие белки в 100-3000 раз слаще обычного сахара (сахароза) в пересчете на массу, при этом отличаются небольшой калорийностью. На текущий момент идентифицированы семь белков сладкого вкуса, включаятауматинI и II (Ivengar, 1979),браззеин(Ming, D., Hellekant, G., 1994), мабинлин (Hu, Z., Min, H., 1983), монеллин (Inglett, G. E., May, J. F., 1969), куркулин (Yamashita H., 1990), пентадин (Morris JA, 1972), лизоцим (Maehashi, K., Udaka, S., 1998) и один белок, модифицирующий сладкий вкус —миракулин(Theerasilp S, Kurihara, 1988). За исключением лизоцима, который получают из яичного белка, остальные белки выделяют из тропических растений.
Сладкие белки используются в пищевой индустрии как безопасная альтернативасахаруисинтетическим подсластителям. Они многократно (в несколько тысяч раз) слаще сахарозы, при этом отличаются низкой калорийностью (то есть, не провоцируют ожирение) и не влияют на выработку инсулина. Кроме того, в отличие от сахара, сладкие белки не оказывают вредного воздействия на зубы и ротовую полость.
Подсластители на белковой основе используются для изготовления диетических продуктов, показанных при диабете и ожирении.
В качестве подсластителей и корректоров вкуса сладкие белки одобрены к применению в США, странах Евросоюза, Японии, России. Они применяются как самостоятельно, так и в сочетании с другими натуральными и синтетическими сахарозаменителями.
Структуру и функции белков изучают как на очищенных препаратахin vitro, так и в их естественном окружении в живом организме,in vivo. Исследования чистых белков в контролируемых условиях полезны для определения их функций:кинетических особенностейкаталитическойактивности ферментов, относительного сродства к различным субстратам и т. п. Исследования белковin vivoв клетках или в целых организмах предоставляют дополнительную информацию о том, где они функционируют и как регулируется их активность.
Методымолекулярной и клеточной биологииобычно применяются для изучения синтеза и локализации белков в клетке. Широко применяется метод изучения локализации, основанный на синтезе в клеткехимерного белка, состоящего из исследуемого белка, соединённого с «репортёром», например,зелёным флуоресцентным белком(GFP). Расположение такого белка в клетке можно увидеть с помощьюфлуоресцентного микроскопа. Кроме того, белки можно визуализировать с помощью распознающих их антител, которые в свою очередь несут флуоресцентную метку. Часто одновременно с изучаемым белком визуализируют известные белки таких органелл, как эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы и вакуоли, что позволяет более точно определить локализацию изучаемого белка.
Иммуногистохимические методыобычно используют антитела, которые конъюгированы с ферментами, катализирующими реакцию образования люминесцирующего или окрашенного продукта, что позволяет сравнить локализацию и количество изучаемого белка в образцах. Более редкой методикой определения расположения белков является равновесноеультрацентрифугированиеклеточных фракций в градиенте сахарозы илихлорида цезия.
Наконец, один из классических методов — этоиммуноэлектронная микроскопия, которая принципиально похожа наиммунофлуоресцентную микроскопиюс тем отличием, что используется электронный микроскоп. Образец подготавливается для электронной микроскопии, а затем обрабатывается антителами к белку, которые соединены с электронно-плотным материалом, как правило, золотом.
С помощьюсайт-направленного мутагенезаисследователи могут изменять аминокислотную последовательность белка и, следовательно, его пространственную структуру, расположение в клетке и регуляцию его активности. С помощью этого метода, используя модифицированные тРНК, можно также ввести в белок искусственные аминокислоты, и сконструировать белки с новыми свойствами.
Для выполнения анализаin vitroбелок должен быть очищен от других клеточных компонентов. Этот процесс обычно начинается с разрушения клеток и получения так называемогоклеточного экстракта. Далее методамицентрифугированияи ультрацентрифугирования этот экстракт может быть разделён на: фракцию, содержащую растворимые белки; фракцию, содержащую мембранные липиды и белки; и фракцию, содержащую клеточные органеллы и нуклеиновые кислоты.
Осаждение белков методом высаливания применяется для разделения белковых смесей, а также позволяетсконцентрироватьбелки.Седиментационный анализ(центрифугирование) позволяет фракционировать белковые смеси по значениюконстанты седиментацииотдельных белков, измеряемой всведбергах(S). Чтобы выделить необходимый белок или белки на основе таких свойств, какмолекулярная масса, заряд и аффинность, затем используются различные видыхроматографии. Кроме того, белки могут быть выделены в соответствии с их зарядом с использованиемэлектрофокусирования.
Чтобы упростить процесс очистки белков, часто используетсягенетическая инженерия, которая позволяет создать производные белков, удобные для очистки, не затрагивая их структуры или активности. «Метки», представляющие собой небольшие аминокислотные последовательности, например, цепочку из 6 и более остатковгистидина, и прикрепляются к одному из концов белка. Когда экстракт клеток, синтезировавших «меченый» белок, пропускается через хроматографическую колонку, содержащую ионы никеля, гистидин связывается никелем и остаётся на колонке, в то время как остальные компоненты лизата беспрепятственно проходят сквозь колонку (никель-хелатная хроматография). Множество других меток было разработано, чтобы помочь исследователям выделить специфические белки из сложных смесей чаще всего методомаффинной хроматографии.
Степень очистки белка можно определить, если известны его молекулярная масса иизоэлектрическая точка— с помощью различных видов гель-электрофореза— или измерения ферментативной активности, если белок является ферментом.Масс-спектрометрияпозволяет идентифицировать выделенный белок по его молекулярной массе и массе его фрагментов.
Для определения количества белка в образце используют ряд методов:биуретовый метод,микробиуретовый метод,метод Бредфорда,метод Лоури,спектрофотометрический метод.
Совокупность белков клетки называетсяпротеомом, его изучение —протеомикой, названной по аналогии сгеномикой. Основные экспериментальные методы протеомики включают:
Совокупность всех биологически значимых взаимодействий белков в клетке называетсяинтерактомом. Систематическое исследование структуры белков, представляющих все возможные типытретичных структур, называетсяструктурной геномикой.
Предсказание пространственной структуры с помощью компьютерных программ (in silico) позволяется строить модели белков, структура которых ещё не определена экспериментально. Самый успешный тип предсказания структур, известный как гомологическое моделирование, опирается на существующую «шаблонную» структуру, сходную по аминокислотной последовательности с моделируемым белком. Методы предсказания пространственной структуры белков используются в развивающейся областигенетической инженерии белков, с помощью которой уже получены новые третичные структуры белков. Более сложной вычислительной задачей является прогнозирование межмолекулярных взаимодействий, таких какмолекулярная стыковкаи предсказание белок-белковых взаимодействий.
Укладка и межмолекулярные взаимодействия белков могут быть смоделированы с использованиеммолекулярной механики, в частности,молекулярной динамикииметода Монте-Карло, которые всё чаще используют преимуществапараллельныхираспределённых вычислений(например, проектFolding@home). Укладка небольших α-спиральных белковых доменов, например, белкавиллинаили одного из белковВИЧ, были успешно смоделированыin silico. С помощью гибридных методов, сочетающих стандартную молекулярную динамику с квантовой механикой, были исследованы электронные состояния зрительногопигментародопсина.