ChIP-on-chip

InbiochimicaLaChIP-on-chip(anche dettaChIP-chip) è una tecnica che combina l'immunoprecipitazione della cromatina("ChIP") con la tecnologia deimicroarray("chip"). Come la classicaChIP, la ChIP-on-chip è usata per ricercare interazioni traproteineeDNAin vivo. In particolare, permette l'identificazione dei cistroni, insiemi di siti di legame per proteine leganti il DNA.
Le analisi sull'intero genoma possono essere effettuate per determinare la localizzazione dei siti di legame di quasi ogni proteina d'interesse.Come suggerisce il nome della tecnica, queste proteine sono di solito quelle operanti nel contesto dellacromatina. I maggiori rappresentanti di questa classe sono ifattori di trascrizione, le proteine correlate allareplicazione del DNA, come laORC, gliistoni, le loro varianti, e le modifiche istoniche.
L'obiettivo della ChIP-on-chip è quello di identificare i siti di legame delle proteine che possano aiutare ad identificare elementi funzionali nelgenoma. Per esempio, nel caso di un fattore di trascrizione come proteina d'interesse, si possono determinare i siti di legame del fattore di trascrizione in tutto il genoma. Altre proteine permettono l'identificazione di regionipromotore,enhancers, repressori e silencers, insulators, e sequenze che regolano la replicazione del DNA.Se gli istoni sono l'oggetto dello studio, si crede che la distribuzione e la localizzazione delle modificazioni possano offrire nuove intuizioni sul meccanismo dellaregolazione genica.
Uno degli obiettivi a lungo termine per cui la ChIP-on-chip fu progettata è di creare una serie di organismi (selezionati) che raccolgano tutte leinterazioni DNA-proteinein varie condizioni fisiologiche. Questa conoscenza potrebbe in ultimo luogo aiutare a comprendere il meccanismo dietro la regolazione genica, la replicazione cellulare, e la progressione dei malanni. Quindi, la ChIP-on-chip offre non solo un enorme potenziale per allargare le nostre conoscenze riguardo all'organizzazione del genoma a livello nucleotidico, ma anche a livelli più alti di informazione e regolazione, insieme con la ricercaepigenetica.
I supporti tecnologici per condurre esperimenti ChIP-on-chip sonomicroarray, o"chips". Questi possono essere distinti in base a varie caratteristiche:
Oltre ai microarray in sé, per effettuare esperimenti ChIP-on-chip è necessario anche ulteriore equipaggiamento hardware e software. Di solito succede che i microarray di una ditta non possano essere analizzati dagli hardware di un'altra compagnia. Quindi, comprare un array richiede anche l'acquisto di tutto la strumentazione associata. Gli elementi più importanti sono, tra gli altri, forni di ibridazione, chip scanners, e pacchetti software per la successiva analisi numerica dei dati grezzi.
Partendo da un problema biologico, un esperimento ChIP-on-chip può essere suddiviso in tre grandi fasi: la prima è la progettazione e l'allestimento dell'esperimento selezionando l'array e la sonda appropriati. Nella seconda fase, l'esperimento vero e proprio viene svolto nel laboratorio. Infine, durante la fase informatica, i dati raccolti vengono analizzati sia per trovare una risposta al problema iniziale che per arrivare allo studio di nuovi problemi, in modo che il ciclo possa ricominciare.
Usando i tiled arrays, la ChIP-on-chip permette mappe dell'intero genoma ad alta risoluzione. Queste mappe possono determinare i siti di legame di molte proteine, come i fattori di trascrizione, e anche modificazioni della cromatina.
Nonostante la ChIP-on-chip sia una tecnica potente nel campo della genomica, è molto costosa. Gli studi maggiormente pubblicati che hanno usato la tecnologia ChIP-on-chip ripetono i loro esperimenti almeno tre volte per assicurare che le mappe ottenute abbiano un reale significato biologico. Il costo dei microarray di DNA rappresenta spesso un fattore limitante nella scelta di un approccio ChIP-on-chip. Un'altra limitazione è costituita dalla dimensione dei frammenti di DNA che si possono ottenere. Molti protocolli di ChIP-on-chip sfruttano la sonicazione come metodo di rottura del DNA in piccoli frammenti. Comunque, la sonicazione è limitata da una dimensione minima dei frammenti di 200 pb. Per mappe a maggiore risoluzione, questa limitazione andrebbe superata per poter ottenere frammenti di dimensioni minori, preferibilmente alla risoluzione di singolinucleosomi. Come accennato precedentemente, l'analisi statistica dell'enorme mole di dati generati dall'array rappresenta una vera sfida, e le procedure di normalizzazione dovrebbero mirare a minimizzare gli artefatti e determinare cosa sia davvero biologicamente significativo. Finora, l'applicazione al genoma di mammiferi è stata molto limitata, ad esempio a causa della significativa percentuale di genoma occupata da ripetizioni. Comunque, con l'avanzare della tecnologia ChIP-on-chip, dovrebbe essere possibile ottenere mappe ad alta risoluzione dell'intero genoma dei mammiferi.
Gli anticorpi usati per la ChIP-on-chip possono rappresentare un importante fattore limitante. La ChIP-on-chip richiede anticorpi altamente specifici, che riconoscano il loroepitopoin soluzione e anche in condizioni fisse. Per superare il problema della specificità, la proteina di interesse può essere fusa ad un marcatore come FLAG o emoagglutinina che vengano riconosciuti dagli anticorpi. Un'alternativa alla ChIP-on-chip che non richiede l'uso di anticorpi è la DamID.
Un primo esperimento ChIP-on-chip fu effettuato nel 1999 per analizzare la distribuzione della coesina lungo il cromosoma 3 di lievito.Nonostante il genoma non fosse completamente rappresentato, il protocollo usato in questo studio rimane identico a quelli usati negli studi seguenti. La tecnica ChIP-on-chip che usasse tutte le ORF del genoma (che comunque rimane incompleto, mancando le regioni intergeniche) è stata applicata con successo in tre articoli pubblicati nel 2000 e nel 2001.Gli autori hanno identificato i siti di legame di fattori di trascrizione nel lievitoSaccharomyces cerevisiae. Nel 2002, il gruppo di Richard Youngha determinato le posizioni nell'intero genoma di lievito di 106 fattori di trascrizione usando un sistema di marcatura c-Myc. Altre applicazioni per la ChIP-on-chip includono la replicazione del DNA, la ricombinazione genetica, e la struttura della cromatina. Da allora, la ChIP-on-chip è diventata un potente strumento nella costruzione di mappe dell'intero genoma di modificazioni degli istoni e molti altri fattori di trascrizione. L'uso della ChIP-on-chip nei mammiferi è stato difficile a causa del vasto genoma e della quantità di ripetizioni presenti. Quindi, molti studi sulle cellule di mammiferi si sono occupati di regioni promotrici che si è ipotizzato legassero fattori di trascrizione, e non hanno analizzato l'intero genoma. Comunque, array dell'intero genoma dei mammiferi sono stati recentemente resi disponibili in commercio da compagnie come Nimblegen. In futuro, con l'avanzare della tecnologia ChIP-on-chip, mappe dell'intero genoma di mammifero di proteine leganti il DNA e componenti della cromatina saranno analizzate più in dettaglio.
[1]CoCAS: un software gratuito per analisi di esperimenti ChIP-on-Chip Agilent.
[2]rMAT: implementazione R dal programma MAT per normalizzare e analizzare tiling arrays e dati ChIP-on-chip.
Copia archiviata, subioinformatics.oxfordjournals.org.URL consultato il 29 marzo 2009(archiviato dall'url originaleil 1º aprile 2009).Touati Benoukraf , Pierre Cauchy , Romain Fenouil , Adrien Jeanniard , Frederic Koch , Sébastien Jaeger , Denis Thieffry , Jean Imbert , Jean-Christophe Andrau , Salvatore Spicuglia , and Pierre Ferrier , CoCAS: a ChIP-on-chip analysis suite, Bioinformatics Advance Access published on April 1, 2009, DOI 10.1093/bioinformatics/btp075, Bioinformatics 25: 954-955.
[3]W. Evan Johnson, Wei Li, Clifford A. Meyer, Raphael Gottardo, Jason S. Carroll, Myles Brown, and X. Shirley Liu. Model-based analysis of tiling-arrays for ChIP-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Aug 15;103(33):12457-62. Epub 2006 Aug 8.
La Chip-Sequencing è una tecnologia di recente sviluppo che utilizza l'immunoprecipitazione della cromatina come nella ChIP-on-chip, ma invece di usare i microarray, sfrutta la tecnica del sequenziamento per identificare i punti di interazione tra DNA e proteine.
Il DamID è un metodo alternativo che non richiede l'uso di anticorpi.