Индуцированные стволовые клетки

Индуцированные стволовые клетки(иСК) —стволовые клетки, полученные из каких-либо иных (соматических,репродуктивныхилиплюрипотентных) клеток путёмэпигенетическогоперепрограммирования. В зависимости от степени дедифференцировки клетки при перепрограммировании различают: индуцированныетотипотентные,индуцированные плюрипотентные стволовые клетки(ИПСК) и получаемые так называемымпрямым перепрограммированиемили каким-либо иным способоминдуцированныепрогениторные(мультипотентные илиунипотентные) стволовые клетки, иногда называемые также индуцированными соматическими стволовыми клетками (ИССК).
В настоящее время существует три пути перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки:
Ещё в 1895 годуТомас Морган, удалив один из двухбластомеровлягушки, обнаружил, что оставшаяся частьэмбрионаспособна, тем не менее, воссоздать цельный эмбрион. Это означало, что клетки, при необходимости, способны изменять направление своей специализации и такое изменение скоординировано. Позднее в 1924 году, Шпеманн и Мангольд (Spemann and Mangold) показали, что важнейшую ключевую роль в процессах развития животных играют межклеточные взаимодействия называемые индукцией.Метаплазиейназывают обратимую замену одного дифференцированного типа клеток на другой тип зрелых дифференцированных клеток. Этот переход от одного типа клеток к другому может быть частью нормального процесса созревания или вызван каким-то индуцирующим его стимулом. Примерами этого перехода можно назвать трансформацию клеток радужной оболочки глаза в линзу в процессе созревания и превращение клеток пигментного эпителиясетчаткив нейрональную сетчатку при регенерации глаза у взрослых тритонов. Этот процесс позволяет организму заменить исходные клетки, не подходящие к новым условиям, на новые которые больше подходят к новым условиям.
В опытах на клеткахимагинальныхдисков дрозофилы было обнаружено, что существует ограниченное число стандартных дискретных состояний дифференцировки и клеткам приходится выбирать одно из них. Тот факт, что трансдетерминация (смена пути дифференцировки) часто происходит не в одной, а сразу в группе клеток доказывает, что она вызвана не мутацией, а именно индуцирована.
К настоящему времени удалось выявить минимальные условия и факторы, наличия которых достаточно для индукции каскада молекулярных и клеточных процессов, направляющих дифференцировку и самоорганизацию плюрипотентных клеток вэмбрион. Рольморфогенов, как оказалось, выполняют противоположно направленные градиенты концентрацииморфогенетического белка костной ткани (BMP)и белкаNodal.
В основевегетативного размножениярастенийлежитсоматический эмбриогенез, в ходе которого из соматической клетки путём индукциифитогормонамиобразуются тотипотентные клетки дающие начало образованию нового организма без полового процесса.
Некоторые типы зрелых, специализированных клеток взрослого организмапозвоночных животныхтакже способны естественным путём вернуться к стадии стволовой клетки. Например, дифференцированные клетки желудка, называющиеся аделоморфными или «главными клетками» и синтезирующие маркер стволовых клеток Troy, обычно производят пищеварительные жидкости. Однако, они могут при необходимости превратиться обратно в стволовые клетки для «ремонтных работ» в случае травм желудка, таких как порез или повреждение вызванное инфекцией. Более того, они осуществляют этот переход даже в отсутствие заметных травм и способны восполнить пул всех клеточных линий желудочного эпителия, по существу, выступая в качестве покоящихся «резервных» стволовых клеток. При повреждении трахеи, дифференцированные эпителиальные клетки дыхательных путей могут вернуться к фенотипу стабильных и функциональных стволовых клеток, если, однако, они не имеют непосредственного контакта с базальной стволовой клеткой, которая предотвращает подобную дедифференцировку. Зрелые терминально дифференцированные эпителиальные клетки почки, после травмы, способны дедифференцироваться в свои более ранние версии, а затем снова дифференцироваться в типы клеток нуждавшихся в замене в повреждённой ткани. Макрофаги могут самообновляться путём локальной пролиферации зрелых дифференцированных клеток. Это происходит, когда понижаются концентрации или происходит ингибирование двух факторов транскрипцииMafBиc-Maf, препятствующих активации программы самообновления. Утритоновмышечная ткань восстанавливается из специализированныхмышечных клеток, которые для этого дедифференцируются забыв свою прежнюю специализацию. Эта способность крегенерациитканей не уменьшается с возрастом, что вероятно связано со способностью тритонов при необходимости образовывать из мышечных клеток новые стволовые клетки.
В организме существует небольшой процент стволовых клеток, способных генерировать множество различных типов клеток. Например,мультилинейно-дифференцирующиеся устойчивые к стрессу(англ.muse cell) стволовые клетки взрослого человека обладают способностью к самообновлению и образуют в суспензионной культуре характерные скопления (кластеры) плюрипотентных клеток, которые могут дифференцироваться как in vitro, так и in vivo в энтодермальные, эктодермальные и мезодермальные клетки. Они также легко перепрограммируются в ИПСК.
Подробное описание некоторых других хорошо документированных примеровтрансдифференцировкиin vivo и их роль в развитии ирегенерациирассматриваются в обзоре.
В самом начале XXI века были обнаруженыбелки F-boxодин из которыхFbx15активен в раннем эмбрионе и только в недифференцированных клетках. Позднее он для поддержания жизни уже не нужен. Это позволило использовать его в качестве маркера плюрипотентности и разработать систему отбора факторов плюрипотентности (названных факторами Яманаки).]]
Индуцированные тотипотентные клетки обычно используют дляклонированияи получения генетически модифицированных животных. Эти клетки можно получить с помощью перепрограммирования соматических клеток путёмпереноса ядер соматических клеток(Somatic cell nuclear transfer — SCNT) в ооциты-реципиенты. При этом ооциты не обязательно должны принадлежать тому же виду. Иногда удаётся использовать ооциты других видов, например овецили поросят. И хотя эффективность межвидовой SCNT была примерно в три раза ниже обычной, такие эмбрионы удавалось довести до стадиибластоцисты. Эффективность перепрограммирования можно повысить в два раза, если за сутки до пересадки остановить мейоз ооцитов-реципиентов с помощью бутиролактона1 в комбинации снейротрофическим фактором мозга(BDNF). Кроме того, эффективность клонирования может быть значительно повышена, а процедура SCNT упрощена благодаря использованию ингибиторовгистондеацетилазы, таких как трихостатин Аи ингибиторов полимеризациицитоскелетногоактинатаких как цитохалазин В или латранкулин A (latrunculin A). Для полноценного развития образующихся эмбрионов необходимо также предварительно уменьшить метилирование лизина 4 в молекуле гистона H3 в клетках донорах ядра. Кроме того для полноценного развития эмбриона необходимы такжеэкзосомывыделяемые его клетками.
Повторное клонирование на протяжении 25 поколений жизнеспособных мышей с помощью метода SCNT, основанном на добавлении в среду клеточной культуры ингибиторадеацетилазы гистонов— трихостатина А,показало, что можно достаточно долго (на протяжении 16 лет) неоднократно повторно клонировать животных без видимого накопления нарушений в геноме.
До настоящего времени бытует представление о возможности преждевременного старения клонированных животных, полученных методом SCNT. Показано, чтотеломерыу эмбрионов клонированных свиней, полученных с помощью стандартных методов SCNT хуже восстановлены, по сравнению с эмбрионами образующимися по естественному пути. Обработка же трихостатином А значительно увеличивает длину теломер у клонированных свиней и это может быть одним из механизмов, лежащих в основе улучшенного развития клонированных животных, после обработки трихостатином А.
При использовании технологии SCNT разработанной Миталиповымможно получать ЭСК человека используя ядра из фибробластов кожи даже пожилых людей, что открывает широкие перспективы для технологийрегенеративной медицины
Разработан метод, открывающий новые возможности для создания генетически модифицированных животных с помощьюгаплоидныхэмбриональных стволовых клеток, которые могут быть использованы вместо спермы. Для этого из ооцита удаляют ядро. Затем в него вводят микроинъекцией сперму. Из образующейся в результате этого бластоцисты получают гаплоидные эмбриональные стволовые клетки. Эти клетки, синхронизованные в М фазе, вводят в ооцит вместо спермы, в результате чего развивается жизнеспособное потомство. Эти разработки, вместе с данными о возможности неограниченного получения ооцитов из митотически активных половых стволовых клеток, открывают возможность промышленного производства трансгенных сельскохозяйственных животных. Так, в Китае с помощью упрощённой техники клонирования получены трансгенные овцы, у которых улучшено качество мяса и молока за счёт увеличения в них незаменимых ненасыщенных жирных кислот, которые снижают риск развития ишемической болезни сердца и необходимы для поддержки глаз и головного мозга. Ген, вызывающий синтез ω-3 полиненасыщенных жирных кислот успешно удалось передать трансгенной овце.
Клонирование животных для исследовательских целей в Китае уже приобрело промышленные масштабы. Одних только различных клонов поросят производится порядка 500.
Подобные технологии могут также найти клиническое применения для преодоления цитоплазматических дефектов в ооцитах человека. Например, разработаны технологии, которые могут воспрепятствовать нежелательному наследованию митохондриального заболевания, которое передаётся следующему поколению. Митохондрии, которые часто называют «электростанцией клетки», содержат генетический материал, который передаётся от матери к ребёнку. Мутации митохондриальной ДНК могут вызвать диабет, глухоту, заболевания глаз, желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, деменцию и ряд других неврологических заболеваний. Пересадкой ядра из яйцеклетки одного человека (несущей дефектную митохондриальную ДНК) в другую (здоровую) можно эффективно заменить цитоплазму клетки и вместе с ней митохондрии (и их ДНК). Полученная таким образом яйцеклетка может рассматриваться как имеющая двух матерей. Эмбрион образующийся после оплодотворения такой яйцеклетки будет иметь здоровую митохондриальную ДНК. Однако насколько оправданы подобные манипуляции с клетками человека с точки зрениябиоэтикипока не ясно.
Подробнее о новейших достижениях техники клонирования и получении тотипотентных клеток с помощью SCNT см.:
До недавнего времени получить тотипотентные клетки удавалось лишь с помощью SCNT. Однако появились работы где было продемонстрировано получение иТК с помощью перепрограммирования факторами Яманаки in vivo, а также in vitro с помощью таких эпигенетических факторов ооцита как зародышевая изоформагистонов. Перевестиэмбриональные стволовые клеткив состояние тотипотентности характерное для ранних эмбрионов 2-клеточной стадии можно также путём подавления активностиCAF-1необходимой для сборки хроматина.
От превращения ЭСК и ИПСК в тотипотентные клетки, способные дать начало таким внеэмбриональным тканям какплацентаижелточный мешок, плюрипотентные стволовые клетки, по-видимому, так же удерживаетмикроРНК-34а. Ингибирование её синтеза приводит к активации экспрессии эндогенногоретровирусаMuERV-L и расширяет потенциал плюрипотентных стволовых клеток до способностей клеток стадии двух бластомеров.
Разработан химический коктейль для получения из клеток мочи человека так называемых плюрипотентных стволовых клеток с расширенными возможностями по дифференцировке — они могут дать начало как клеткам эмбриона, так и внеэмбриональным тканям.Такие супертотипотентные клетки (иСТК) могут быть использованы для полученияхимерс цельювыращивания органов в организме животныхВ частности разработана комбинация из трёх малых молекул: производногоретинолатератогенаTTNPB(4-[(1E)-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафталинил)-1-пропен-1-ил]бензойная кислота), высокоселективного ингибитораGSK3B1-Азакенпауллона(1-Azakenpaullone) имитогенаWS6(N-[6-[4-[2-[4-[(4-метилпиперазин-1-ил)метил]-3-(трифторметил)анилино]-2-оксоэтил]фенокси]пиримидин-4-ил]циклопропанкарбоксамид), которая позволила проводить индукцию и длительное поддержание культуры тотипотентных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток мыши.
Используя среды, содержащиеретиноевую кислотуифолликулярную жидкостьсвиньи, можно получить in vitro, дифференцировкой из ИПСК, клетки ранних стадийгаметогенезаподобные репродуктивным клеткам, из которых образуются сперма и ооциты. Для образования примордиальных половых клеток человека требуется активность двух ключевых регуляторов: гена SOX17 направляющего дифференцировку в сторону образования предшественников половых клеток иBlimp1подавляющего энтодермальные и другие соматические гены во время этой специализации.
В статье китайских учёных с первым автором Чжоу (Zhou) описана технология дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток которые претерпевают мейоз in vitro превращаясь в гаплоидные сперматиды, способные к оплодотворению, о чём свидетельствовало получение с их помощью жизнеспособного и фертильного потомства.
Подробный обзор методов искусственного получения мужских половых клеток можно найти в статье Hou с соавторамии Irie, Kim, Surani, а также.
Разработана технология позволяющая получать зрелые ооциты in vitro из эмбриональных стволовых клеток, а также из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из взрослых фибробластов взятых с кончика мышиного хвоста. Более того оплодотворив такие яйцеклетки in vitro и подсадив их в матку мыши удалось с выходом в 1 % получить жизнеспособное потомство.
Эта технология послужит платформой для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе тотипотентности и для разработки методов производства ооцитов из других (в том числе редких) видов млекопитающих в лабораторных условиях.
Впервые ИПСК были получены в виде перевиваемойтератокарциномы, индуцированной трансплантатом, взятым из мышиных эмбрионов. Было доказано, что тератокарциномы образуются из соматических клеток. Тот факт, что из клеток тератокарциномы можно получить нормальную мышь доказывал их плюрипотентность. Оказалось, что клетки тератокарциномы, выделяя в культуральную среду различные факторы, способны поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток эмбриона в недифференцированном состоянии. Таким образом, ещё в 1980-е годы стало ясно, что трансплантация плюрипотентных или эмбриональных стволовых клеток во взрослый организм млекопитающих обычно приводит к образованиютератомы, которая затем может превратиться в злокачественную опухоль — тератокарциному. Если, однако, поместить клетки тератокарциномы в ранний зародыш млекопитающего (на стадии бластоцисты), то они включаются в составклеточной массы бластоцистыи из такого химерного (то есть состоящего из клеток от разных организмов) эмбриона нередко развивается нормальное химерное животное. Почти во всех органах и тканях которого часть дифференцированных клеток происходит из клеток тератокарциномы, которые совместно с клетками нормального происхождения участвуют в построении здорового организма. Это свидетельствовало о том, что причиной образования тератомы является диссонанс в стадии развития донорных клеток и окружающих их клеток реципиента (так называемойниши). Уже тогда, используя ретровирусные векторы, удалось ввести инородные гены в мышиные химеры, полученные с помощью клеток тератокарциномы.
В августе 2006 года японские исследователи сумели превратить клетки мышиной кожи (фибробласты) в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки — ИПСК (induced pluripotent stem cells — iPSC), используя для модификации клетки всего четыре репрограммирующих фактора:Oct4,Klf4,Sox2иc-Myc, доставленных в ядро ретровирусами. Этим они доказали, что гиперэкспрессия небольшого количества факторов иногда может подтолкнуть клетки к переходу в новое стабильное состояние, связанному с изменениями активности тысяч генов. По своим свойствам ИПСК оказались очень похожи на эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Так, сравнение протеома и фосфопротеома ЭСК и ИПСК, проведённое на 4-х линиях человеческих эмбриональных стволовых клеток и 4-х линиях индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, показало, что большинство идентифицированных белков и участков фосфорилирования в белках всех линий совпадают. Хотя были и небольшие, но статистически воспроизводимые различия, свидетельствующие об определённом функциональном различии. Не было отмечено и особых изменений в последовательности ДНК, особенно если ИПСК были получены с помощью неинтегрирующихся в геном плазмид.
Позднее, с развитием технологии перепрограммирования, лучшим доказательством идентичности ИПСК и ЭСК стала возможность получения взрослой мыши полностью из некоторых линий ИПСК. Несмотря на то, что рядом исследований была доказана идентичность ЭСК и ИПСК, получаемые клоны сильно отличаются друг от друга и не для всех из них можно доказать идентичность с ЭСК, далеко не все клоны способны дать жизнь химерным мышам или подвергнуться эффективной дифференциации в те или иные соматические клетки. Одной из причин таких различий является разница между составом транскрипционных факторов при репрограммировании в ИПСК и набором факторов в материнском ооците. К числу таких «упущенных» факторов относится, в частности способствующий процессу репрограммирования особый, характерный для ооцитов линкерный (связующий, компонующий нуклеосомы) гистон H1foo. Замена одного из факторов Яманаки, а именно c-Myc на H1foo, значительно повысили количество и качество получаемых клонов ИПСК — они стали более однородными по свойствам, из них чаще стали получаться мыши-химеры.  В более поздних работах в коктейле факторов Яманаки во избежание онкогенеза MYC был заменен на LMYC и соответственно коктейль стал называться OSKL. Добавление к OSKL гистона H1FOO, модифицированного путем присоединения к нему домена дестабилизации (DD), помогло добиться повышения однородности получаемых клеток и воспроизводимости результатов, кроме того получаемые клетки стали более похожими на эмбриональные стволовые клетки бластоцисты.
Oct4 положительно регулирует гены, связанные с плюрипотентностью и самообновлением, а также подавляет гены, способствующие дифференцировке. Избыточная экспрессия Oct4 во время перепрограммирования ухудшает качество ИПСК — по сравнению с OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc), перепрограммированиеSKM(Sox2, Klf4 и c-Myc) генерирует ИПСК с высоким потенциалом развития (почти в 20 раз выше, чем у OSKM), что доказано по их способности генерировать мышей методомтетраплоидной комплементациииз эмбрионов полностью состоящих из ИПСК. В то же время перепрограммирование SKM видоспецифично, оно может быть достигнуто в клетках мыши, но не в клетках человека
Важным преимуществом ИПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона. Поэтому стало возможным получать ИПСК от взрослых и даже пожилых пациентов. Перепрограммирование соматических клеток в ИПСК приводит к их омоложению о чём свидетельствуют данные исследования теломеров— концевых участков хромосом состоящих из коротких следующих друг за другом повторов эволюционно консервативной последовательности ДНК. Выяснилось, что перепрограммирование приводит к удлинению теломеров и их нормальному укорочению по мере дифференцировки ИПСК обратно в фибробласты. Таким образом, при индуцированной плюрипотенции восстанавливается эмбриональная длина теломеров, а значит, увеличивается потенциальное число делений клетки, ограниченное так называемымлимитом Хайфлика(Hayflick limit). Более того омолаживаются и митохондрии клетки при этом восстанавливается характерный для молодых клеток уровень дыханияПоэтому технология получения ИПСК является способом радикального омоложения.
Из-за диссонанса в стадии развития омоложённых клеток и окружающих их старых клеток реципиента, инъекция пациенту его же собственных ИПСК, обычно приводит к иммунной реакции, что может быть использовано в медицинских целях, или образованию опухолей типа тератомы.
Одной из причин иммуногенности аутологичных ИПСК и ЭСК считается группа из 9 генов (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a,Chi3L4, Olr1, Retn), синтез которых повышен в тератомах, полученных из этих клетокОчевидно, некоторые клетки, дифференцированные из ИПСК и ЭСК, продолжают синтезировать эмбриональные изоформы белкови неадекватно интерпретируют сигналы окружающих их клеток реципиента.
Образование тератомы из плюрипотентных стволовых клеток может быть вызвано низкой активностью ферментаPTEN, способствующей выживанию, в процессе дифференцировки, небольшой популяции (не превышающей 0,1-5 % от общей численности клеток) высоко онкогенных клеток карциномы, инициирующих тератомы. Выживание этих инициирующих тератомы клеток связано с недостаточной репрессиейNanog, а также с повышением метаболизма глюкозы и холестерина.Эти, инициирующие образование тератом, клетки характеризуются также более низким соотношениемp53/p21по сравнению с неонкогенными клетками.
Недавно методом отбора удалось найти небольшие молекулы (цитотоксические селективные ингибиторы плюрипотентных стволовых клеток человека), которые предотвращают образование тератомы у мышей после трансплантации им плюрипотентных стволовых клеток человека. Самое мощное и селективное из этих соединений — PluriSIn #1, вызывало ингибирование стеароил-КоА десатуразы (ключевого фермента в биосинтезеолеиновой кислоты), что в конечном итоге приводило к апоптозу плюрипотентных стволовых клеток. С помощью этой молекулы удаётся выборочно удалить из культуры недифференцированные клетки.. Ещё одной молекулой избирательно удаляющей недифференцированные клетки является STF-31,являющийся ингибиторомGLUT1.Эффективной стратегией избирательного устранения плюрипотентных клеток, которые способны дать начало тератоме является ингибирование характерных для этих клеток антиапоптотических факторов, таких каксурвивинилиBcl10. Обработкой малыми молекулами, которые могут ингибировать эти антиапоптотические факторы, можно добиться селективного удаления подобных клеток вызвав ихапоптоз. В частности, одной обработки смешанной популяции химическими ингибиторами сурвивина (такими как, например,кверцетинили YM155) достаточно чтобы вызвать избирательную и полную гибель недифференцированных клеток, вызванную накоплением р53 в митохондриях. Этого, по мнению авторов исследования, достаточно, чтобы предотвратить образование тератомы после трансплантации клеток полученных из ИПСК.О способе удаления плюрипотентных клеток с помощью красителя  см. ниже.
Тем не менее, маловероятно, что какая либо, пусть даже самая изощрённая, предварительная очистка, способна обезопасить подсадку ИПСК или ЭСК, так как при избирательном удалении плюрипотентных клеток, они вновь довольно быстро возникают путём превращения дифференцированных клеток обратно в стволовые (к обратному переходу может в частности подтолкнуть гипоксия), что приводит к образованию опухоли. Это может быть связано с нарушением регуляции осуществляемой микро РНК let-7 по отношению к её мишени — белку Nr6a1 (известному также как ядерный фактор зародышевых клеток — GCNF), являющемуся эмбриональным репрессором транскрипции генов плюрипотентности, который необходим для правильной дифференцировки индуцированных плюрипотентных клеток.Обнаружена также малая молекула названная Дисплюригеном (Displurigen), которая воздействуя набелок теплового шокаHSPA8(Heat shock 70 kDa protein 8), необходимый для связыванияOCT4с ДНК, способна вывести клетку из состояния плюрипотентности. Ещё один способ предотвратить образование тератомы — это вызвать в пересаживаемой клетке ИПСК гиперэкспрессию генаCREG
Использование ИПСК для клеточной терапии пока ограничено.Тем не менее, они могут быть использованы для целого ряда иных целей — включая моделирование болезней, скрининг (селективный отбор) лекарств, проверку токсичности различных препаратов.
Важными факторами для получения высококачественных ИПСК являются определённые небольшие молекулы, способствующие сохранению геномной целостности, образующихся при перепрограммировании ИПСК, путём ингибирования двухцепочечных разрывов ДНК и активации гена Zscan4, содействующего процессам репарации ДНК. Перепрограммирование вызываетрепликативныйстресс, который можно снизить повысив уровень чекпоинт киназы 1 (CHK1), благодаря чему повышается качество и эффективность образования ИПСК. Кроме того добавление во время перепрограммированиянуклеозидовпозволяет снизить повреждения ДНК и число геномных перестроек в получаемых ИПСК
Ткани, выращенные из ИПСК, помещённых в «химерные» эмбрионы на ранних стадиях развития мыши, практически не вызывают иммунного ответа (после того, как эмбрионы выросли во взрослых мышей) и пригодны дляаутологичной трансплантации,причём даже в том случае когда ИПСК получены от очень старых животных.
В ранних работах полное перепрограммирование взрослых клеток в тканях у мышейin vivoпутём временной активации факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус, приводило к образованию в различных органах множества тератом. Более того, частичное перепрограммирование клеток в ИПСКin vivoпоказало, что неполное перепрограммирование приводит к эпигенетическим изменениям (нарушению репрессииПоликомбцелей и изменениюметилирования ДНК) в клетках, которые ведут к развитию рака
Изменив продолжительность и дозировку удалось провести без последующего канцерогенеза циклическое частичное перепрограммированиеin vivoпутём экспрессии факторов Яманака в течение короткого периода времени (с их экспрессией в течение 2 дней и интервалом без экспрессии в течение 5 дней). Такими, циклически повторяемыми активациями факторов Яманака, удалось частично омолодить, и, таким образом, продлить продолжительность жизни прогероидных мышей.Используя мышиную модель, которая обеспечивает индуцируемую экспрессию 4F - четырёх факторов Яманаки  (Oct-3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc) удалось путём их временной экспрессиейin vivoиндуцировать частичное перепрограммирование взрослых гепатоцитов в состояние предшественников и увеличить пролиферацию клеток, что по мнению авторов статьи может противодействовать печёночной недостаточностиЧастичное эпигенетическое перепрограммирование 4F у старых мышей позволило обратить вспять некоторые маркеры старения печени, но только в сочетании с истощением богатых маркером старения клеток p16, которые ограничивали пластичность клеток.
В опытахin vitro, при использовании несколько более длительных периодов перепрограммирования (чтобы достичь более существенного омоложения) клетки теряли свою клеточную идентичность, но затем восстанавливали свою первоначальную соматическую идентичность, при удалении факторов репрограммирования.
Длительное частичное перепрограммированиеin vivoприводит к омолаживающим эффектам в различных тканях, таких как почки и кожа, а также в целом на уровне организма. Многократность лечения определяла степень положительного эффекта. Омолаживающие эффекты были связаны со снижением возраста по даннымэпигенетических часов, а также по данным метаболических и транскриптомных изменений, включая снижение экспрессии генов, участвующих в путяхвоспаления,клеточного старенияи реакции настресс
Эффективность методов частичного перепрограммирования как in vitro, так и in vivo пока очень низкая, поскольку клетки в процессе частичного перепрограммирования усиливают экспрессию NK-активирующихлигандов, таких какMULT1иICAM-1, в результате чегоNK-клеткираспознают и убивают частично перепрограммированные клетки. Поэтому повысить эффективность частичного перепрограммированияin vivoпомогает истощение пула NK-клеток
Определение уникального набора транскрипционных факторов, которые необходимы для репрограммирования клеток представляет собой длительный и дорогостоящий процесс. Международная группа исследователей разработала алгоритм, называемый Магрифи (Mogrify), который помогает предсказать оптимальный набор клеточных факторов, необходимых для преобразования одного типа клеток человека в другой. Появился также алгоритм, который предсказывает не только транскрипционные факторы необходимые для перепрограммирования, но также и идеальный выбор времени для применения этих факторов.Поскольку выяснилось чтонуклеосомыс меткой нагистонеH3 называемойH3K4me3обычно сидят на последовательностях ДНК предшествующих генам, которые важны для определения судьбы клетки, предопределения её типа, стало возможным с помощью алгоритма эпиМагрифи (EpiMOGRIFY) находить подобные гены чтобы влиять на дифференцировку культивируемых клеток
Спрогнозировать результаты целенаправленных вмешательств и помочь разработке процессов перепрограммирования может программа cSTAR (cell state transition assessment and regulation) классифицирующая состояния клеток на основании данныхпротеогеномики
Факторы транскрипции (TFs) регулируют генные программы, тем самым контролируя различные клеточные процессы и состояния клеток. 
Создан Атлас транскрипционных факторов для направленной дифференцировки и библиотекаMORF(multiplexed overexpression of regulatory factors) мультиплексной гиперэкспрессии регуляторных факторов, которые помогут идентифицировать комбинации факторов транскрипции, которые управляют определенными фенотипами.
Разработаны критерии качества и стратегия производства ИПСК для клинических испытаний, так называемая cGMP (англ.current Good Manufacturing Practice).
Чтобы сделать доступными технологии регенеративной медицине на основе ИПСК большему числу пациентов, необходимо создавать универсальные ИПСК, которые можно трансплантировать независимо отгаплотиповHLA. Текущая стратегия создания универсальных ИПСК преследует две основные цели: удаление экспрессии HLA и предотвращение атак со стороныNK-клеток, которые вызваныделециейHLA. Сообщалось, что делеция геновB2MиCIITAс использованием системыCRISPR/Cas9подавляет экспрессию HLA класса I и класса II соответственно. Для предотвращения атак NK-клеток использоваласьтрансдукциялигандов, ингибирующих NK-клетки, таких какHLA-EиCD47.HLA-Cпри этом оставляют без изменения, поскольку 12 часто встречающихся аллелей HLA-C достаточно для охвата 95 % населения мира.
Чтобы обезопасить применение ИПСК в клинике, было предложено одновременно с перепрограммированием клеток пациента в ИПСК, вводить в эти клетки индуцируемый малой молекулой генкаспазы-9(IC9) для запуска каскадовапоптозадля самоубийства клеток образованных из этих ИПСК. Такой «предохранитель» позволит избавляться от омоложённых клеток после того как они выполнили свою терапевтическую функцию или в случае образования опухоли из этих клеток.
Уголых землекоповуровень заболеваемости раком крайне низок по сравнению с другими млекопитающими. Обнаружено, что у ИПСК этого животного ослаблена способность к образованию тератом при трансплантации, что может быть связано:
Более того, удалось найти сигнальный путь ASIS (англ.ARF suppression-induced senescence), с помощью которого вероятно удастся защитить ИПСК от возникновения из них опухолей.
До настоящего времени недостаточно понятно, почему эффективность перепрограммирования с помощьюфакторов транскрипциизначительно ниже, чем при пересадке ядра в ооцит. Показано, что большинство фибробластов кожи взрослого человека начинают процесс перепрограммирования сразу после обработки трансгенами Яманаки (Oct4,Sox2,Klf4, иc-Myc).
Помимо этих факторов в «коктейль» для репрограммирования можно также добавлять фактор CECR2 необходимый для преодоления эпигенетических барьеров во время репрограммирования.
Тем не менее, только небольшая часть (~ 1 %) из этих «новоиспечённых» ИПСК образуют впоследствии колонии ИПСК. Причиной, понижающего эффективность перепрограммирования, возврата большинства клеток к состоянию дифференцировки может быть:
Найден фактор BRD3 (bromodomain-containing protein 3), который опознаёт «коды»ацетилированных гистоновв хромосоме, а также активирует большой набормитотическихгенов, повышая таким образом митотическую активность клетки. Этот фактор позволил более чем в 20 раз повысить эффективность выхода ИПСК, сократить длительность перепрограммирования до нескольких дней и повысить качество перепрограммирования.
Низкомолекулярный ингибиторPFI-3(CAS No. : 1819363-80-8) специфически воздействует на бромодомены субъединицSMARCA2/4иPBRM1комплексаSWI/SNF, что значительно снижает экспрессию многочисленных генов внеклеточного матрикса (ECM) и  как следствие усиливает эффективность перепрограммирования iPSC.Повысить эффективность перепрограммирования позволяет нокдаунCOL11A1являющегося барьером для перепрограммирования.
Как отмечено выше повысить эффективность репрограммирования позволяет также замена с-Мус на H1foo. В случае когда требуется репрограммировать клетки пожилых пациентов повысить эффективность позволяет ингибирование H3K79 гистон метилтрансферазы называемойDOT1L(Disruptor of telomeric silencing 1-like)
Сконструирован супер-SOX2-17 транскрипционный фактор состоящий из факторовSox2иSox17, который, будучи внесён в состав коктейлей усиливает перепрограммирование в сотни раз и позволяет перепрограммировать в ИПСК клетки пожилых людей, не поддававшиеся перепрограммированию.
Предлагается также для повышения генетической стабильности ИПСК помимо факторов Яманаки во время перепрограммирования клеток использовать также трансфекциюциклином D1с целью повышения процессоврепарации ДНКи уменьшения клеточного стресса.
В первичных после биопсии культурах клеток при перепрограммировании лишь очень немногие клетки способны превратиться в ИПСК, и тех из них, которые такой способностью обладают, называют «элитными» клетками. Учёные нашли способ получения таких элитных клеток из соматических с помощью фактораC/EBPα (CCAAT/enhancer binding protein-α). В первичной культуре мышиных В-клеток непродолжительная экспрессия C/EBPα с последующим перепрограммированием факторами Яманаки позволила добиться 100-кратного увеличения эффективности перепрограммирования в плюрипотентные клетки, причём с участием 95 % клеточной популяции. Такие искусственно созданные элитные клетки очень похожи на белые кровяные прогениторные клетки-предшественникикостного мозга, известные какмиелобласты. К сожалению, сверхэкспрессия C/EBPα может способствовать развитию острого миелоидного лейкоза и острого лимфобластного лейкоза делая клетки устойчивыми к лечению.
Замечено, что успешно репрограммируются те из фибробластов, которые имеют небольшой размер клетки и имеют более высокую способность к пролиферации. Их можно выявить и выделить по содержанию транскрипционного фактораSRF (Serum response factor).
Известно, чтоаскорбиновая кислота (витамин С)усиливает процесс перепрограммированияс помощью нескольких механизмов, в первую очередь из-за ее кофакторной роли в Fe (II) и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназах, включаяДНК-деметилазуTET (Ten Eleven Translocase)идеметилазы гистонов.
Обнаружено, чтовитамин B12является ограничивающим фактором клеточного перепрограммирования какin vitro, так иin vivo.
Тот факт, что ИПСК человека способны к образованию тератом не только в теле человека, но и в организме некоторых животных, в частности в организме мыши или свиньи, позволил разработать метод дифференцировки ИПСК в условиях in vivo. Для этого ИПСК вводят, вместе с клетками индуцирующими направленную дифференцировку,генмодифицированнойсвинье или мыши, у которой подавлена активация иммунной системы на клетки человека, а затем, вырезав образовавшуюся тератому, выделяют из неё необходимые дифференцированные клетки человека,используямоноклональные антителак тканеспецифичным маркерам на поверхности полученных клеток. Этот метод был успешно использован для получения функциональныхмышечных, а такжемиелоидных, лимфоидных и эритроидныхклеток человека пригодных для трансплантации (пока только мышам). Таким образом, доказана возможность производства in vivo из клеток пациента необходимых ему дифференцированных клеток для трансплантации, изготовления антител или скрининга лекарственных средств. Используя перевиваемую генмодифицированную тератому с гиперэкспрессией факторов Gfi1b, c-Fos и Gata2 можно неоднократно трансплантировать мышкам тератому и на протяжении длительного времени стабильно получать полностью функциональные мышиные гематопоэтические стволовые клетки
Используя лектин rBC2LCN избирательно связывающий ИПСК, или же MitoBloCK-6и /или PluriSIn #1 можно очистить полученные прогениторные клетки от плюрипотентных клеток образующих тератому. Тот факт, что дифференцировка проходит в условиях тератомы позволяет надеяться, что полученные клетки достаточно устойчивы к стимулам способным запустить их обратный переход к дедифференцированному (плюрипотентному) состоянию, а значит безопасны.Беспокойство, однако, вызывает тот факт, что «воспитанные» в тератоме у животных человеческие клетки за время своего «воспитания», по всей вероятности, поглощают значительное количествоэкзосомпроизведённых окружающими клетками организма носителя тератомы, а значит, попав в организм человека, могут повести себя неадекватно.
Методика основанная на обнаруженииген-репортёр-GFP-положительных клеток в тератоме, полученной из ИПСК, позволит идентифицировать и вырастить культуры ткани, используя индуцированные взрослые стволовые клетки различных типов, выделение которых ранее было затруднительно.
Весьма перспективной средой для первоначальной дифференцировки ИПСК in vivo могут оказаться куриные эмбрионы. Есть доказательства того, что микросреда этих эмбрионов оказывает антионкогенное действие на человеческие клетки и намного лучше чем условия in vitro
Разработана технология «дозревания», полученных из ИПСК в условияхin vitroчеловеческих прогениторных клеток кардиомиоцитов, путёмксенотрансплантацииих в организм новорождённых крыс, используемых в качествеin vivoбиоинкубатора. Такое «дозревание» занимает ~6 недель
См. также:Robert Lanza, Michael West (2013)Method for facilitating the production of differentiated cell types and tissues from embryonic and adult pluripotent and multipotent cells. Patent US 20130058900 A1
В ближайшее время предполагается приступить к клиническим испытаниям, призванным продемонстрировать безопасность использования ИПСК для клеточной терапии людей скатарактойа также с возрастной дегенерацией жёлтого пятна — заболевания, которое повреждаясетчатку, может привести к слепоте. Описаны методы получения из ИПСК клетокхрусталикаи сетчаткии способы их использования для клеточной терапии, которая по крайней мере на 6 недель улучшала зрение у подопытных животных.
Хронические заболевания лёгких, такие какидиопатический фиброзирующий альвеолит,Силикоз,хроническая обструктивная болезнь лёгкихибронхиальная астмавходят в число основных причин инвалидности и смертности. Поэтому исследователи ищут пути эффективной клеточной терапии и тканевой инженерии лёгких, которые бы позволили бороться с этими заболеваниями.
Были разработаны способы получения различных типов лёгочных клеток из ИПСК, которые могут быть взяты за основу для получения терапевтических клеток из материала, полученного от пациента.
Юань и коллеги сообщили, что нервные стволовые клетки человека, индуцированные из ИПСК с помощью ретиноевой кислоты в бессывороточной среде имеют стабильный нейронный фенотип. После трансплантации крысам со смоделированным ишемическим инсультом, эти клетки не только выжили, но и мигрировали в зону ишемии мозга, где дифференцировались в зрелые нервные клетки, что оказало благотворное влияние на функциональное восстановление утраченных от повреждения в результате инсульта неврологических функций.
Разработана система для быстрого (за 3 дня) и эффективного (70 %-80 % популяции) превращения ИПСК в клоны характерные для клеток почки с помощью ингибитора CHIR99021 и некоторых ростовых факторов. Более того, удалось излечивать в опытах на мышах острые поражения почек, используя стволовые клетки почки, полученные из ИПСК.
Известно чтоаденозини его рецепторы, в частностиA2bRиграют важную роль в регенерациикостныхпереломов. Простое добавление в культуральную среду аденозина позволило превратить человеческие ИПСК в остеобласты. При трансплантации этих остеобластов мышке, с использованием макропористой синтетической матрицы, остеобласты полученные из ИПСК, участвовали в регенерации повреждений кости образуя новые ткани и стимулируя кальцификацию. При этом не наблюдалось образования тератом, что очевидно свидетельствует о 100 % дифференцировке клеток ИПСК в остеобласты.
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки, независимо от того, получены ли они из бластоцисты или являются результатом перепрограммирования соматических клеток, существенно отличаются от классических мышиных эмбриональных стволовых клеток и по мнению ряда исследователей представляют более позднюю стадию развитияэпибласта. Удалось получить нПСК у которых утеряна эпигенетическая «память»метилирования ДНКкакгаметы(ооцита), так и человеческойбластоцисты. Такие клетки в отличие от ИПСК не имеют антиген SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4).
Перевести ЭСК и ИПСК человека в наивное состояние позволяет гиперэкспрессия фактора YAP (Yes-associated protein). Гиперэкспрессию YAP с получением наивного состояния можно также имитировать путём добавления к культуральной среде (лизофосфатидной кислоты(LPA), являющейся активатором YAP.
Репрограммирование человеческих ЭСК и ИПСК с помощью рекомбинантного, усечённого человеческого NME7 (найденного в семенниках фактора, содержащего двадоменануклеозиддифосфат киназы (NDPK) и способного связываться с расщеплённой формой трансмембранного рецептораMUC1, называемой MUC1*) позволило получить стабильно наивные клетки, которые более пригодны для широкомасштабного клонирования и имеют расширенный потенциал дифференциации. На основе таких клеток можно создать «фабрики клеток» для промышленного производства продукции необходимой для нуждклеточной терапии.
Перевести ИПСК в стабильно наивное состояние, подобноевнутренней клеточной массе (ВКМ)человека перед имплантацией, позволяет инкубация в буфере LIF-3i состоящем из коктейля трёх малых молекул:XAV939подавляющейсигнальный путь Wntпутём ингибированиятанкиразы/PARP (поли(АДФ-рибоза)-полимеразы),CHIR99021ингибирующейGSK3βиPD0325901ингибирующейсигнальные пути MAPK/ERK
Ву и его коллеги обнаружили, что комбинация свободной от сыворотки среды,фактора роста фибробластов 2 (FGF2)и ингибиторасигнальных путей Wntпозволяет получить в результате устойчивую линию рсПСК (регион-селективных плюрипотентных стволовых клеток,по англrsPSCs) клеток человека.
Потранскриптомуэти клетки напоминали таковые из задних клеток раннегоэмбрионамыши. Трансплантация этих клеток в 7,5-дневные эмбрионы мыши привела к их эффективному включению в задний, но не в другие части эмбриона. После 36 часов культивирования этиххимерныхэмбрионов, клетки рсПСК проявили способность к пролиферации и способность к дифференцировке в ткани трёхзародышевых листков. Хотя исследователи остановили дальнейшую дифференцировку этих клеток, предполагается, что каждый из образованных этими клетками зародышевых листков способен дать начало определённым тканям и органам.
В отличие от других человеческих стволовых клеток, которые, как правило, не удаётся интегрировать в эмбрион мыши, человеческие rsPSCs способны к такой интеграции и к развитию в ранние стадии тканей человека.
Клетки F класса в отличие от ИПСК не способны включаться в ткани организма и участвовать в построениихимерногоорганизма. Тем не менее они удовлетворяют другому тесту на плюрипотентность — способны образовыватьтератомы. По сравнению с обычными стволовыми клетками подобными эмбриональным и ИПСК,клетки F-типа растут в лаборатории быстрее и их выращивать проще и дешевле — их можно просто поместить в большой сосуд с питательной средой и вырастить за несколько дней или часов, а не за несколько недель как обычные ИПСК.
В связи с тем, что использование ИПСК для клеточной терапии сопряжено с большим риском опухолей и рака, необходима разработка методов получения более безопасных клеточных линий, пригодных для применения в клинике. Альтернативой методам ИПСК стала техника так называемого «прямого репрограммирования», то есть индуцируемой определёнными факторами прямой трансдифференцировки, без предварительного прохождения клеток через стадии плюрипотентного состояния. Основу для такого подхода заложили исследования Тейлор и Джонса (Taylor and Jones), показавших, что воздействие5-азацитидина— реактива, вызывающего деметилирование ДНК — на бессмертную линию клеток мышиных эмбриональных фибробластов способно вызвать образование миогенных, хондрогенных и адипогенных клонови Вейнтрауба с соавторами, обнаруживших, что для репрограммирования достаточно активации всего одного гена, позднее названного MyoD1. По сравнению с ИПСК, для получения которых требуются не менее двух недель, образование индуцированных прогениторных клеток происходит сравнительно быстро — иногда за несколько дней. Эффективность перепрограммирования также обычно во много раз выше. Для этого перепрограммирования не всегда требуется деление клетки. Но главное, это то, что получаемые в результате перепрограммирования мультипотентные соматические стволовые клетки более пригодны для клеточной терапии, так как не образуют тератомы. Это очевидно связано с тем что при прямой трансдифференцировке в получаемых клетках сохраняются признаки старения исходных клеток.См. также обзоры
Разработан метод получения, так называемых, индуцированных мультипотентных стволовых клеток (ИМПСК) путём непродолжительной обработкипостнатальных стволовых клетоккостного мозга и жировых клеток комбинацией фактора роста (тромбоцитарный фактор роста— АВ (PDGF-AB)) и5-азацитидина. Авторы этого исследования утверждают, что: «В отличие от первичных мезенхимальных стволовых клеток, которые хотя и используются в клинической практике для содействия восстановлению тканей, но не способны сами включаться в эту ткань, ИМПСК способны к непосредственному участию процессах регенерации тканей и при этом не образуют опухолей», в связи с чем «могут быть использованы для регенерации различных тканей»
ОсобенностьюнематодыCaenorhabditis elegansявляется настолько жёсткая программа развития, что соматическая клетка, находящаяся в определённом участке организма, как правило, имеет одинаковую родословную у всех особей.При этом зрелые клетки, в отличие от ранних эмбриональных клеток, обычно очень устойчивы к изменению их фенотипа. Тем не менее, обнаружено, что как у интактных личинок, так и у неповреждённых взрослых нематод краткосрочный синтез всего одного фактора транскрипции, а именно фактора ELT-7GATAможет превратить фенотип полностью дифференцированной, высокоспециализированной не-энтодермальной клетки фаринкса (глотки) в фенотип полностью дифференцированной энтодермальной клетки кишечника. Это превращение происходит «в одну стадию» — путём прямой трансдифференцировки, без каких-либо промежуточных стадий дедифференцировки.
Фенотип клетки можно изменять с помощьюредактирования эпигенома. Например, путём активации определённых эндогенных генов, используя для этогоCRISPR— опосредованный активатор. Если соединить домен dCas9(который изменён таким образом, что он больше не режет ДНК, но все ещё может находить и связываться с конкретными последовательностями ДНК) с активатором транскрипции (таким как p65HSF1), то можно с большой точностью изменять эндогенную экспрессию конкретных генов.
Например, активируя только один эндогенный ген Sox2 или Oct4 удалось получить из фибробластов мыши ИПСК с выходом в 0,1 %. Пользуясь подобным методом, Вэй и др. усиливали экспрессию эндогенных геновCdx2иGata6, воздействуя на них с помощью CRISPR-опосредованных активаторов, и таким образом, сумели осуществить прямое репрограммирование мышиных эмбриональных стволовых клеток в две внезародышевые линии, а именно в типичныетрофобластыи клетки внеэмбриональнойэнтодермы. Аналогичным образом активация эндогенных генов Brn2, Ascl1, и Myt1l позволила преобразовать эмбриональные фибробласты в индуцированные нервные клетки.
Ещё один способ перепрограммирования заключается в поэтапном моделировании на скелетной мышце млекопитающих процессов, которые происходят у амфибий при регенерации конечности. Таким образом, с помощью химических веществ: миосеверина (myoseverin), реверсина (2-(4-морфолиноанилино)-6-циклогексиламинопурина) и некоторых других веществ, в условиях культуры мышечных клеток млекопитающих, которые, как известно, не способны регенерировать конечности, удалось индуцировать процессы аналогичные тем которые протекают при регенерации конечностей у амфибий и получить предшественники мышечных, костных, жировых и нервных клеток.
Обнаружены моноклональные антитела, способные преобразовывать стволовые клетки костного мозга непосредственно в прогениторные клетки нейронов головного мозга.
Для этой трансдифференцировки как оказалось достаточно всего одного белка — антитела имитирующего факторGCSF. Для поиска подобных антител используется специальный метод селекции антител.
Идентифицированы антитела, которые могут во время перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши в ИПСК соответственно заменить три из четырёх факторов перепрограммирования Sox2, c-Myc или Oct4. Найти замену четвёртому фактору Klf4 пока не удалось. Более того Sox2-замещающее антитело действуя как антагонист к связанному с мембраной белкуBasp1, тем самым активирует подавленные им ядерные факторыWT1,EsrrbиLin28a(Lin28) независимо от Sox2.
Желудочно-кишечный тракт человека колонизирован обширным сообществом бактерийсимбионтовикомменсалов. Исследователи продемонстрировали феномен перепрограммирования соматических клеток бактериями и выработку мультипотентных клеток из клеток кожи человека, под воздействиеммолочнокислых бактерий. Выяснилось, что подобная клеточная трансдифференцировка вызванарибосомамии «может произойти под воздействием бактерий, которые проглатываются и перевариваются клетками-хозяевами, что приводит к стрессу от попадания чужеродных рибосом и стимулирует клеточную пластичность».
Ричард Шлегель и его исследовательская группа разработали метод, который позволяет размножать in vitro культуру клеток похожих на взрослые стволовые клетки, без каких-либо генетических манипуляций. Они показали, что под воздействием облучённых фибробластов (см. обзорыи) и ингибиторов Rho киназы, таких как:Y-27632илифасудил, первичные эпителиальные клетки млекопитающих переходят к состоянию неограниченной пролиферации(что, по мнению авторов, связано с ростом концентрацииβ-катенинав ядре и снижением Notch сигнализации). Индукция УПК происходит довольно быстро (в течение 2 дней) и является результатом «перепрограммирования» всей клеточной популяции, а не одной из её субпопуляций. При этом в УПК не наблюдалась характерная для ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) активация синтеза Sox2, Oct4, Nanog, и Klf4. Эта индукция УПК обратима — достаточно удалить Y-27632 и облучённые фибробласты, чтобы клетки перешли к обычной дифференцировке.
Обнаружено, что факторы, вызывающие индукцию условно перепрограммированных клеток, переходят из «питающих» клеток подложки в культуральную среду в результате обусловленного радиациейапоптозаэтих клеток.Этот метод может иметь большое будущее врегенеративной медицине, так как эти клетки в отличие от ИПСК не образуют опухоли. Так, например, используя технологию условно-перепрограммированных клеток, исследователи смогли найти эффективную терапию для пациента с редким типом опухоли лёгких.
Иной подход к получению условно перепрограммированных клеток заключается в ингибировании мембранного белкаCD47, являющегося рецепторомтромбоспондина-1. Показано, что потеря CD47 снимает запрет на устойчивую пролиферацию первичных мышиных эндотелиальных клеток, повышая частоту их асимметричного деления, а также позволяет этим клеткам спонтанно перепрограммироваться в мультипотентные клетки формирующиеэмбриональные тела.Нокдаун генаCD47 резко увеличивает в клетках уровни мРНК с-Мус и других факторов перепрограммирования Яманаки как in vitro, так и in vivo. Очевидно, тромбоспондин-1 является ключевым сигналомнишы, который подавляет способность стволовых клеток к самообновлению влияя на них через CD47. Поэтому антагонисты CD47 могут активировать самообновление и перепрограммирование клеток выключая механизмы негативной регуляции с-Мус и других факторов транскрипции стволовых клетокПо мнению авторов исследования, образующиеся при этом мультипотентные клетки не образуют тератом.
In vivo блокада CD47 с помощью антисмысловогоморфолиноповышает выживаемость мышей, тело которых подверглось воздействию летальной дозы облучения. Эта устойчивость к радиации обусловлена увеличением пролиферативной способности клеток крови, образующихся из костного мозга, и активации защитнойаутофагиирадиочувствительных желудочно-кишечных тканей.
Разработан метод при котором соматические клетки переходят в промежуточное пластическое состояние- частично перепрограммированные ИПСК (pre-iPSC), индуцированное кратковременным воздействием перепрограммирующих факторов, а затем дифференцируются с помощью специально разработанной химической среды (искусственной ниши).Предполагается, что этот новый метод может быть более эффективным и безопасным, так как он, по мнению его авторов, не вызывает опухоли или другие нежелательные генетические изменения, и при этом позволяет получать требуемые клетки быстрее и c гораздо большим выходом по сравнению с другими методами. Тем не менее, безопасность этих клеток все же сомнительна — учитывая то, что преобразование из пре-ИПСК опирается на использование условий перепрограммирования в ИПСК, и нельзя исключить что часть клеток может все же приобрести плюрипотентные свойства(если они не прекратят процесса де-дифференцировки in vitro или в связи с дальнейшей де-дифференцировкой in vivo).
Общей особенностью, взятых из разных источников, плюрипотентных стволовых клеток, отличающей их от большинства (исключение составляют лейкоциты) неплюрипотентных клеток, является особый характер гликозилирования белков их наружней мембраны.
Расположенные на поверхности стволовых клетокгликаныбыстро реагируют на изменения в состоянии клетки и поэтому идеально подходят в качестве маркеров для выявления изменений в клеточных популяциях. Многие широко используемыемаркеры стволовых клеток(в том числеSSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, и Тра 1-81.) являются гликанами клеточной поверхности. Так, например, гликопротеин подокаликсин (podocalyxin) расположен исключительно только на недифференцированных клетках человека (ИПСК и ЭСК), но не на поверхности дифференцированных соматических клеток, что позволяет отделить эти клетки с помощью лектина BC2L-C из Burkholderia cenocepacia (rBC2LCN).Suila Хели и соавторыполагают, что у стволовых клеток человека внеклеточные о-GlcNAc и о-LacNAc, выполняют решающую роль в тонкой настройкесигнального пути Notch— высококонсервативной системыклеточной сигнализации, от которой зависят судьбы стволовых клеток, их дифференцировка, лево- и правосторонняя асимметрия, апоптоз, и пролиферация (см. обзоры:)
Очевидно, изменения характерагликозилированиябелков наружней мембраны являются маркерами состояния клетки каким-то образом связанными с плюрипотенцией и дифференцировкой. Причём «сдвиг» в характере гликозилирования, по всей видимости, это не просто результат инициализации экспрессии генов, а механизм играющий роль важного регулятора группы генов, вовлечённых в приобретении и поддержании недифференцированного состояния. Так, показано, что активациягликопротеинаACA, связывающегогликозилфосфатидилинозитолна поверхности прогениторных клеток периферической крови человека, посредством сигнального каскадаPI3K/Akt/mTor/PTENиндуцирует повышение экспрессии геновWnt,Notch1,Bmi-1иHoxB4, а также способствует образованию и самообновлению популяции гемопоэтических стволовых клеток. Более того показано, что индуцируемая посредством ACA-зависимого сигнального пути дедифференцировка прогениторных клеток, приводит к образованию ACA-индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, способных дифференцироваться in vitro в клетки всех трёхзародышевых листков.. Изучение избирательно связывающих гликопротеинылектинов, на предмет их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, привело к открытию лектина эритрина кристагалли (Erythrina Cristagalli — ЕСА) способного служить в качестве простой и высокоэффективной матрицы для культивации человеческих плюрипотентных стволовых клеток
Альтернативной стратегией превращения соматических клеток в плюрипотентные состояния может быть непрерывная стимуляция фибробластов одним изпротеогликановECM, а именнофибромодулином. Такие клетки проявляют способность к регенерации скелетных мышц с заметно меньшим онкогенным риском по сравнению с ИПСК. Пониженная онкогенность таких клеток связана с активациейCDKN2B(ингибиторациклин-зависимой киназы2B) во время процесса перепрограммирования рекомбинантным человеческим фибромодулином.
В 2014 году группа японских исследователей опубликовала в статью в журнале Nature, где было заявлено открытие нового способа быстрого перепрограммирования соматических клеток млекопитающих в плюрипотентные клетки — так называемые клеткиSTAPв ответ на действие сильных внешних раздражителей, таких как временное повышение кислотности окружающей среды. Однако другим исследователям не удалось воспроизвести эти результаты. Впоследствии материал о клетках STAP был отозван журналом Nature как ошибочный, один из соавторов работы покончил жизнь самоубийством, а сами работы по этому направлению были прекращены.
Плюрипотентные клетки содержатE-кадгерин, который при дифференцировке заменяется наN-кадгерин. Уникальной особенностью Е-кадгерина, помимо того, что он ответственен за межклеточную адгезию, является способность регулировать сигнальные пути клетки и заменять фактор Oct4 при индукции плюрипотентности. Фибробласты в которых подавлен синтез E-кадгерина не могут перепрограммироваться. Во время перепрограммирования, N-кадгерин может заменять функции E-кадгерина, что предположительно указывает на необходимость адгезии для перепрограммирования. Однако, согласно Гуаньнань Су с соавт., формирование в культуре клеток 3D сфер, в связи с вынужденным ростом клеток на поверхности с низкой связывающей способностью, иногда приводит к репрограммированию клеток. В качестве примера они показали, что нервные клетки-предшественники могут быть получены непосредственно из фибробластов путём физического воздействия, без введения экзогенных перепрограммирующих факторов.Ранее подобные сферы были получены в опытах с фибробластами мыши с мутацией инактивирующейген-супрессор опухолейретинобластомы — RB1, белка без которого клетки теряют способность к старым контактам и контактному ингибированию пролиферации в результате чего выходят за пределы колонии и образуют сферы где доминируют новые межклеточные контакты, по всей видимости, и вызывающие самопроизвольное перепрограммирование в тератомоподобные стволовые клетки.
Вбиореакторнойкультуре сдвиг жидкости при перемешивании индуцирует повышенную экспрессию генов маркеров плюрипотентности, которую можно подавить ингибируяβ-катениниливинкулин.
Физические сигналы, в виде параллельных микродорожек на поверхности подложки для культивации клеток, могут заменить действие низкомолекулярных эпигенетических модификаторов и значительно повысить эффективность перепрограммирования. Механизм основан на механомодуляции изменяющей морфологию и эпигенетическое состояние клеток. В частности, по мнению авторов исследования: «снижение активности гистоновой дезацетилазы и повышение экспрессии WD повторяющего домена 5 (WDR5)-субъединицы H3 метилтрансферазы вызванное поверхностью с микродорожками приводит к увеличению ацетилирования и метилирования гистона Н3». Аналогичное действие на клетки оказывали нановолоконные подложки с выровненной ориентацией волокон.
Важным биофизическим фактором влияющим на дифференцировку клеток является жёсткость подложки. Например, мягкие субстраты способствуют образованию из ЭСК, поBMP4-зависимому пути, нейроэпителиальных клеток, в то же время предотвращают дифференцировку в клеткинервного гребня. Исследования показали, что в этом механизме задействованы механочувствительноеSmadфосфорилированиеиядерно-цитоплазматическиеперемещения, зависящие от регулируемой жёсткостью подложки активностиHippo/YAP1и сократительной способности комплексаактомиозин-цитоскелет.
Помогает клетке преобразовывать механические раздражители в электрические и биохимические сигналы белок регулирующий открытие ионного канала Са++ названный Пьезо1 (Piezo1), который активируется натяжением мембраны. В зависимости от липидного состава мембран придающего ей жёсткость или мягкость меняется и способность Пьезо реагировать на механические стимулы
Механизмы механомодуляции см. в обзорах:
Разработан метод, который превращает соматические клетки в стволовые клетки «сжимая» их с помощью 3D микроокружения состоящего из специально подобранного геля, что открывает путь для крупномасштабного производства стволовых клеток для медицинских целей.
Как отмечено выше, в процессе перепрограммирования клетки морфологически изменяются, что приводит к изменению их способности к адгезии. Эти характерные различия в адгезии позволили разработать процесс выделения плюрипотентных стволовых клеток с помощьюмикрожидкостныхустройств. Преимуществом этого метода является то что: разделение занимает менее 10 минут, при этом удаётся получить более чем на 95 % чистую культуру ИПСК клеток, причём выживаемость клеток больше 80 % и полученные клетки сохраняют нормальные транскрипционный профиль, потенциал дифференцировки и кариотип.
Центральная нервная система млекопитающих имеет крайне ограниченные возможности для регенерации. Поэтому для лечения многих нервных расстройств (таких как: инсульт, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и т. д.) требуются нервные стволовые клетки, автологичным источником которых могут стать иНСК пациента. В ряде новейших публикаций описано прямое преобразование соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки.
Так, например, предшественники нервных клеток можно получить прямым преобразованием и без введения экзогенных транскрипционных факторов, пользуясь только химическим коктейлем. Эти клетки, называемые ciNPCs (chemical-induced neural progenitor cells) можно к примеру получить из фибробластов кончика хвоста мыши или мочевыводящих соматических клеток человека, используя для этого коктейль состоящий из:
Аналогичным образом без введения экзогенных транскрипционных факторов, пользуясь только химическим коктейлем можно получитьШванновские клетки.
По некоторым данным, в принципе, возможно, преобразовать трансплантированные в мозг мыши фибробласты и астроциты человека, спроектированные методами генной инженерии на выработку факторов (Ascl11, Brn2a и Myt1l) индуцирующих их перепрограммирование в нейроны, активируя после трансплантации соответствующие гены с помощью активатора добавленного к питьевой воде животных.Было также показано, что in situ эндогенныеастроцитымыши могут быть напрямую преобразованы в функциональные нейроны, способные участвовать в формированиинейросетей. В отличие от ИПСК, полученные таким образом клетки не пролиферируют, а значит более безопасны. Наблюдения за подвергшимися этой процедуре мышами в течение года, не выявили у них признаков образования опухоли. Те же исследователи превратили астроциты спинного мозга в прогениторные клетки, называемыенейробластами, которые способны дифференцироваться в нейроны при поврежденнии спинного мозга.
В то время как нейроны взрослого человека обычно не в состоянии регенерировать после травмы спинного мозга, нейроны, полученные из человеческих ИПСК, после трансплантации крысам с травмами спинного мозга продемонстрировали значительный рост по всей длине центральной нервной системы животных. В эксперименте были использованы ИПСК полученные из клеток кожи, взятых от 86-летнего мужчины. Авторы исследования продемонстрировали, что полученные из ИПСК омоложённые нейроны способны прожить в костном мозге крысы не менее трёх месяцев и в течение этого срока не образовывали опухолей. Однако, такаяклеточная терапияне привела к излечению крысы от паралича.
Inoue и его коллеги трансплантировалиглиальные нервные клетки-предшественники, полученные из человеческих иПСК в поясничный отдел спинного мозга мышей с модельюбокового амиотрофического склероза (БАС). Трансплантированные клетки дифференцировались вастроцитыи продлевали жизнь мышей с БАС. Очевидно ИПСК могут стать перспективным ресурсом для трансплантационной терапии БАС.
Разработана технология для прямого преобразование фибробластов в функциональные астроциты с помощью транскрипционных факторовNFIA (Nuclear factor 1 A),NFIB (Nuclear factor 1 B)иSOX9
Как показано в обзоре Бельмонто с соавт. способы прямого преобразования соматических клеток в индуцированные нервные стволовые клетки отличаются по своим методическим подходам. Какой из этих подходов окажется наиболее приемлемым для клиники покажут исследования.
Безмиелиновойоболочки, выполняющей роль изоляции волоконнейронной сети, сигналы посланные по нервам быстро затухают. Поэтому при заболеваниях, связанных с потерей миелиновой оболочки, таких какрассеянный склероз, наблюдается снижениеинтеллекта,парез,атаксиятуловища и конечностей, нарушения зрения, потеря чувствительности и ряд других неврологических симптомов. Перспективным подходом к лечению подобных заболеваний является трансплантация клеток-предшественниковолигодендроцитов(ПКОД), способных заново создать миелиновую оболочку вокруг поражённых нервных клеток. Для такой терапии необходимо иметь доступный источник этих клеток.
Основу для решения этой проблемы заложил метод прямого преобразования фибробластов мышей и крыс в олигодендроглиальные стволовые клетки индуцированного путём принудительной гиперэкспрессии восьмиили всего трёх транскрипционных факторов Sox10, Olig2 и Zfp536.Показано, что аутологичная клеточная терапия с использованием полученныхin vitroиз ИПСК пациента клеток-предшественниц олигодендроцитов приводит к миелинизацииin vivo, что свидетельствует о функциональности этих человеческих клеток в организме мыши и об открывшейся перспективе их использования в клинике.
Одной из наиболее актуальных задач клинической науки нынешнего столетия является развитие терапевтических стратегий, способных обратить вспять прогрессирование сердечной недостаточности — основной причины инвалидности и смертности населения. Большие надежды в этом плане возлагаются на методы клеточной терапии, которые могли бы предотвратить образование соединительной рубцовой ткани (фиброз) вместо мышечной. Простейшим подходом к решению этой задачи могло бы быть перепрограммирование сердечных фибробластов непосредственно в организме путём доставки в сердце факторов транскрипцииили микроРНК. Была предпринята попытка перепрограммировать сердечные фибробласты в кардиомиоцит-подобные клетки in vivo путём гиперэкспрессии в них факторов транскрипции Gata4, Mef2c и Tbx5 (GMT). В случае удачи, такой поход позволил бы превращать рубцовую ткань в мышечную непосредственно в сердце, без необходимости клеточной трансплантации. Эффективность такого перепрограммирования оказалась очень низкой, а фенотип полученных кардиомиоцитов существенно отличался от фенотипа нормальных зрелых кардиомиоцитов. Результатом чего явилась низкая выживаемость перепрограммированных клеток. Позднее в опытах in vitro фенотип удалось несколько исправить (добавлением ESRRG, MESP1, Myocardin, ZFPM2 и TGF-β), но эффективность перепрограммирования осталась низкой. Поднять эффективность перепрограммированияin vivoпозволяют неинтегрирующиеся векторы вируса Сендай, с вектором факторов перепрограммирования Gata4, Mef2c, и Tbx5Более того предпринята успешная попытка леченияинфаркта миокадаin vivoпутём улучшения регенерации сердца и улучшения работы миокарда после инфаркта, опосредованной полицистронным вектором Mef2c/Gata4/Tbx5 (MGT), эффективность которого подняли с помощью деградатораBRD4BETd-246.
Определённые успехи наметились в методах получения и выращивания большого количества кардиомиоцитов in vitro. Так, например, удалось с высокой степенью эффективности получить из ИПСК человека прогениторные сердечные клетки способные, при трансплантации их в сердечную мышцу, снизить её перерождение в рубцовую ткань после инфаркта. С помощью малых молекул и путём активации синтезаβ-катенинаили же ингибирования синтезаWntв ИПСК человека in vitro, удалось повысить эффективность получения кардиомиоцитов до 80 %.
Возможно, что в будущем удастся заменить искусственныеэлектрокардиостимуляторы, необходимые людям с медленным илинерегулярным сердцебиением, на биологический кардиостимулятор (пейсмекер) из индуцированных стволовых клеток. Надежду на это вселяют эксперименты в которых поросятам делали инъекцию индуцированных сердечных клеток, способных синхронизировать ритм сердцебиения. Более того, при ишемической кардиомиопатии, вызванной смоделированным на мышах инфарктом миокарда, трансплантация ИПСК способствовала синхронизации повреждённых желудочков сердца, улучшая их проводимость и сократимость за счёт активации процессов восстановления.
Перепрограммированием соматических клетокin vivoс помощью эмбрионального фактора транскрипцииT-box 18 (TBX18)можно преобразовать кардиомиоциты в клетки пейсмекера. Это открытие открывает возможность легко и быстро вылечить пациентов зависящих от кардиостимулятора. Перенос гена TBX18In situс помощью инъекции его аденовирусного носителя позволяет создать в месте инъекции естественный источник биологического водителя ритма уже через 2-3 дня после введения. При этом пока не наблюдалось возникновения опухолей или каких-либо нарушений в деятельности сердца. Таким образом, минимально инвазивный перенос генов TBX18 может рассматриваться как перспективный метод лечения больных с блокадой сердца, который в будущем, очевидно, заменит лечение искусственными кардиостимуляторами.
Создан коктейль для прямой (без прохождения через плюрипотентное состояние) трансдифференцировки, состоящий из четырёх низкомолекулярных компонентов (SB431542 (ингибитора ALK4/5/7), CHIR99021 (ингибитораGSK3), парната (ингибитора LSD1/KDM1, называемого такжетранилципромином), и форсколина (активаторааденилатциклазы)). Этот коктейль позволил с высокой эффективностью превратить фибробласты мыши в клетки сердечной мышцы с помощью всего одного фактора транскрипции — Oct4. Полученные таким способом индуцированные кардиомиоциты спонтанно сокращались. Методом прямой трансдифференциации без использования генетических векторов, то есть чисто фармакологически, с помощью коктейля из девяти компонентов, удалось получить с выходом 97 % из фибробластов кожи бьющиеся химически индуцированные кардиомиоцит-подобные клетки (ciCMs), которые почти не отличались от человеческих кардиомиоцитов по данным исследования их транскриптома, эпигенетически и по электрофизиологическим параметрам. Более того, при трансплантации в сердце мыши с инфарктом, обработанные этим коктейлем фибробласты превращались в выглядевшие здоровыми клетки сердечной мышцы. Предпринята успешная попытка противостоять постинфарктномуфиброзу(перерождению сердечной мышцы в соединительную ткань с образованиемрубца) с помощью химического перепрограммирования in vivo сердечных фибробластов в кардиомиоциты.
Лу с соавторамисоздали биоинженерную конструкцию сердца путём заселения очищенного от клеток (децеллюларизованного) сердца мыши мультипотентными сердечно-сосудистыми прогениторными клетками, полученными из ИПСК человека. Они обнаружили, что мультипотентные сердечно-сосудистые прогениторные клетки направленно мигрируют в соответствии с архитектурой сердца, а прибыв на место, размножаются и дифференцируются в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальные клетки, как это необходимо для восстановления утраченной структуры сердца. Очевидно, что внеклеточный матрикс сердца мыши (оставшаяся после удаления клеток мыши подложка сердца) может посылать сигналы мультипотентным сердечно-сосудистым прогениторным клеткам человека, необходимые для их навигации и превращения в специализированные клетки, обеспечивающие нормальную работу сердца. Через 20 дней после перфузии сердца средой содержащей факторы роста, оно, после электростимуляции, начинало биться с темпом 40-50 ударов в минуту и реагировало на медикаменты.
Подробнее в обзорах:
Кардиомиоциты получаемые из ИПСК отличаются от взрослых соматических клеток и остаются незрелыми при культивировании в чашках Петри. Японским учёным удалось добиться созревания этих клеток. Для этого они на месяц поместили незрелылые клетки кардиомиоцитов в сердце новорождённой мыши для дозревания.
Пожилые люди нередко страдают от прогрессирующейдистрофиии слабости мышц, что отчасти связано с повышенной активностью сигнальных путейp38α и p38β митоген-активированных протеин киназв стареющих мышечных стволовых клетках. Подвергнув такие стволовые клетки непродолжительному воздействию SB202190 — ингибитора p38α и p38β — в сочетании с культивированием на мягкой подложке изгидрогеля, можно быстро омолодить их и размножить. Более того, после имплантации в организм такие омоложённые клетки способны повысить силу старых мышц.
Восстановить способность сателлитных стволовых клеток к регенерации можно и подавив синтез на генеp16(называемом также Cdkn2a).
Миогенные предшественники, которые могут быть использованы для моделирования болезней или клеточной терапии скелетных мышц, могут быть также получены непосредственно из ИПСК с помощью свободно-плавающей шаровойкультуры(EZ сфер) в культуральной среде, содержащей высокие концентрации (100 нг / мл)фактора роста фибробластов-2 (FGF-2)иэпидермального фактора роста.
Гепатоцитычеловека имеют очень ограниченную способность к восстановлению после повреждений печени. Поэтому трансплантация печени нередко является единственным способом лечения таких болезней как цирроз. Клеточная терапия печени затрудняется тем, что культура гепатоцитов плохо размножается in vitro.Поэтому удобнее размножить клетки в виде ИПСК, и только затем превратить их в гепатоциты.Разработано несколько способов получения гепатоцитов из ИПСКТак, например для очистки и размножения самообновляющихся гепатобласт-подобных клеток из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК/ИПСК), их культивировали на чашках покрытых человеческим ламинином-111 в течение более 3 месяцев, после чего они подобно овальным клеткам печени были способны дифференцироваться в гепатоцит-подобные клетки, а также в клетки жёлчных путей —холангиоцит-подобные клетки. Было показано, что такие гепатобласт-подобные клетки могут интегрироваться в паренхиму печени мыши. Предполагается, что, благодаря подавлению неблагоприятных генных регуляторных сетей при культивировании на поверхности покрытой ламинином, гепатоциты имеют большое сходстве со взрослыми гепатоцитами и могут быть использованы для скрининга лекарственных средств, а также в качестве источника клеток для регенеративной терапии печени.
В 2010 году была продемонстрирована возможность индуцировать полученные из жировой ткани стромальные клетки (ASC) в клетки похожие по ряду функций на гепатоциты человека, способные прижиться в повреждённой токсинами печени мыши. Позднее был разработан быстрый (до десяти дней) и эффективный (с выходом более 50 процентов) способ превращать клетки полученные путём липосакции в клетки печени. Клетки, полученные из собственных клеток человека с помощью этой новой методики, превращаются в клетки печени без промежуточной фазы плюрипотентных клеток и, очевидно, не образуют опухоли. В печени они формируют многоклеточные структуры необходимые для образование жёлчных протоков. Особенностью этой методики является культивирование адипоцитов в жидкой суспензии, в которой они образуют сфероиды
Обнаруженная у совместной культуры гепатоцитов, полученных из ИПСК, с эндотелиальными (для образования сосудов) и мезенхимальными (для образования поддерживающеговнеклеточного матрикса) клетками, способность к самоорганизации (самосборке) в трёхмерные шарообразные структуры, представляющие собой зачаток печенипозволяет надеяться, что в будущем трансплантологам: не надо будет искать и ждать донора, больному будут пересаживать зачаток нужного органа, полученный из его же собственных клеток, и этот зачаток будет уже на месте дорастать до нужных размеров.Эта методика позволяет использовать клетки всего одной мыши для предварительной проверки 1.000 лекарственных препаратов на их пригодность для лечения болезней печени, что открывает новые возможности для медицинских исследований и проверки безопасности лекарств.
Для получениягепатоцитовиз человеческих фибробластов не обязательно вначале получить ИПСК. Используя небольшие молекулы можно добиться прямого перехода фибробластов в индуцированные мультипотентные прогениторные клетки (iMPC) из которых затем образуются сначала прогениторные клетки эндодермы, а затем гепатоциты. После трансплантации мышкам с иммунодефицитом и смоделированным поражением печени, клетки iMPC интенсивно размножаются и приобретают функциональные способности характерные для взрослых гепатоцитов. При этом не наблюдалось образование опухолей, потому что клетки не проходили через стадию плюрипотентного состояния. С помощью инфицированиялентивирусами, вызывающими экспрессию геновFOXA3,HNF1AиHNF4A, удалось осуществить прямое преобразование фибробластов человека во взрослые гепатоцито-подобные клетки, которые могут быть размножены в культуре, а затем использованы для лечения острой печёночной недостаточности и метаболической болезни печени..
Инактивация сигнального пути Hippo in vivo с высокой эффективностью приводит к дедифференцировке взрослых гепатоцитов в клетки, несущие характеристики прогениторных клеток. Эти клетки-предшественники продемонстрировали способность к самообновлению и смогли прижиться в печени. Эти данные продемонстрировали беспрецедентный уровень фенотипической пластичности зрелых гепатоцитов
Коктейль из малых молекул, Y-27632, A-83-01 и CHIR99021, может превратить зрелые гепатоциты крысы и мыши in vitro в пролиферативные бипотентные клетки — CLiPs (chemically induced liver progenitors — химически индуцированные клетки-предшественники печени). CLIPS могут дифференцироваться как в зрелые гепатоциты, так и в эпителиальные клетки жёлчных протоков, которые могут образовывать функциональные структуры протоков. При длительном культивировании CLIPS не теряют свою пролиферативную активность и способность дифференциации в клетки печени, и могут заселять хронически поражённые ткани печени.
Подробнее см. обзор:
.
Осложнениясахарного диабета, такие каксердечно-сосудистые заболевания,ретинопатия,невропатия,нефропатияи заболеванияпериферического кровообращенияобусловленыдисрегуляцией сахара в кровииз-за недостаточной продукцииинсулинапанкреатическимибета-клеткамии при отсутствии адекватного лечения могут привести к летальному исходу. Одним из перспективных подходов к лечению диабета являетсятрансплантация β-клеток, источником которых могли бы стать плюрипотентные стволовые клетки, (в том числе ЭСК и ИПСК). Однако β-клетки, получаемые из плюрипотентных стволовых клеток, имеютфенотипхарактерный для функционально незрелых β-клеток эмбрионального типа и отличаются от взрослых β-клеток повышенным уровнем базальной секреции глюкозы и отсутствием способности реагировать на сигналы стимуляции её синтеза (что подтверждают и результатысеквенирования РНКтранскриптов).
Избыточная экспрессия комбинации трёхтранскрипционных факторов(PDX1,NGN3иMAFA) называемой PNM, способна привести к трансформации некоторых видов клеток в состояние подобное β-клеткам.Оказалось, что наиболее подходящим и доступным источником для перепрограммирования в инсулин-продуцирующие клетки, являетсяэпителийкишечника. Под действием PNM трёхмерная культура зачатков органа (так называемыеорганоиды) стимулирует превращение эпителиальных клеток кишечника в β-подобные клетки, которые можно использовать для трансплантации.
Кровеносные сосуды образуют обширные сети, которые в течение всей жизни обеспечивают клетки организма питательными веществами и кислородом. Когда кровеносные сосуды становятся старше, их структура и функции, нередко, отклоняются от нормы, способствуя тем самым многочисленным возрастным заболеваниям, таким как: инфаркт миокарда, ишемический инсульт и атеросклероз артерий, питающих сердце, мозг и нижние конечности. Поэтому, важной задачей является стимулирование роста сосудов для обеспечения циркуляции, чтобы предотвратить обострение этих заболеваний. Одним из способов стимулирования роста сосудов является имплантация индуцированных прогениторных клетокэндотелия(иПЭк).Так, например, с помощью иПЭк, полученных путём частичного репрограммирования клеток эндотелия, удалось добиться увеличения коронарного кровотока и по данным эхокардиографии улучшить функционирование сердца. Стволовые клетки, извлечённые из жировой ткани послелипосакцииможно превратить в прогениторныегладкие мышечные клетки(иПГМк), участвующие в формировании артерий и вен. Это клетки могут быть использованы для создания кровеносных сосудов, необходимых для замены неисправных артерий сердца.
Так, например, обнаружено, что с помощью культуры ИПСК человека в сочетании с селекцией с помощью трёх маркеров: CD34 (поверхностного гликофосфопротеина ранних эмбриональных фибробластов), NP1 (рецептора — нейрофилин1) и KDR (киназы содержащей домен рецептора), удалось получить эндотелиальные клетки, которые после трансплантации мышам образовали in vivo стабильные функциональные кровеносные сосуды, работавшие на протяжении по меньшей мере 280 дней..
При леченииинфаркта миокардаважно предотвратить образованиефиброзных тканей шрамаи стимулировать регенерацию. Достичь этого in vivo можно применив паракринные факторы способные изменить направление дифференцировки сердечных стволовых клеток предшественников от специализации в фиброзную рубцовую ткань в сторону образования сердечно-сосудистой ткани. Например, на мышиной модели инфаркта миокарда, было показано, что однократная интрамиокардиальная инъекция мРНКфактора роста эндотелия сосудов(VEGF-A modRNA), синтетически модифицированной так чтобы предотвратить её деградацию организмом, приводит к длительному улучшению функциисердца, обусловленному перенаправлением дифференцировки эпикардиальных клеток-предшественников в сердечно-сосудистый тип клеток.
Мервин Иодер с соавт., описали метод для преобразования ИПСК человека в клетки, подобные эндотелиальным колониеобразующим клеткампуповинной крови(CB-ECFCs). Полученные ими CB-ECFC-подобные клетки имели стабильный эндотелиальный фенотип, высокий пролиферативный потенциал и способность, при трансплантации мышкам, образовывать человеческие кровеносные сосуды, а также участвовать в регенерации сетчатки и конечностей мыши после ишемии. Индуцированные CB-ECFC-подобные клетки практически не образуют тератомы.
Взрослые клетки проксимальных канальцевпочкимогут быть непосредственно перепрограммированы в прогениторныенефроныэмбриональной почки, с использованием пула из шести генов кодирующих «инструктирующие» факторы транскрипции (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1(EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) и Snail homolog 2 (SNAI2)).Возможность получения таких клеток позволит в будущем приступить к разработке методов клеточной терапии почечных заболеваний. Первые успехи на этом пути уже есть. Так, недавно было показано, что эмбриональные органоиды почки, сформированные путём самоорганизации из клеточной суспензии, после трансплантации их во взрослую почку крысы могут в ней прижиться.
Одной из самых востребованных целейрегенеративной медициныявляется возможность получения в неограниченном количествегемопоэтических стволовых клеток, пригодных для трансплантации, из более зрелых или дифференцированных клеток крови, для того чтобы покрыть дефициттрансплантатовкостного мозга. Чтобы запустить в фибробластах процессыгемопоэзав условияхin vitroдостаточно всего четырёхтранскрипционных факторов: Gata2, Gfi1b, cFos, и Etv6 . Их воздействие приводит к образованию клеток подобныхэндотелиальным—прогениторным клеткамс последующим возникновением из них кроветворных клеток. Аналогичным образом, используя 6 транскрипционных факторов: Run1t1, Hlf, Lmo2, Prdm5, Pbx1, и Zfp37, а также ещё два фактора Mycn и Meis1 для повышения эффективности перепрограммирования, удалось получитьгемопоэтические стволовые клеткииз зрелых дифференцированных клеток крови.
См. также обзоры:
Переливаниеэритроцитовнеобходимо для многих пациентов с травмами или гематологическими заболеваниями. Однако, на сегодняшний день, поставка эритроцитов зависит от добровольных доноров число которых недостаточно. Кроме того, переливание крови от доноров сопряжено с определённым риском из-за возможности передачи ряда инфекций. Решить эту проблему могло бы производство необходимых количеств эритроцитов вне организма. В принципе уже доказано, что эритроциты, полученные вне организма из мобилизованныхCD34-позитивных клеток (CD это на англ. сокращённокластер дифференцировки), способны выжить при переливанииаутологичномуреципиенту. Эритроциты, получаемые in vitro, как правило, содержат исключительнозародышевый гемоглобин(HbF), который непригоден для нормального функционирования эритроцитов во взрослом организме.Тем не менее, in vivo, после трансфузии полученных из ИПСК эритроидных прогениторных клеток содержащих ядро, наблюдалось переключение на синтезвзрослой изоформы гемоглобина. Однако в этом случае возникает другая проблема: несмотря на то, что эритроциты не имеют ядер, и, следовательно, не могут образовывать опухоли, их непосредственные предшественники эритроидные прогениторные клетки ядром обладают и следовательно потенциально опасны. Созреваниеэритробластов в функционально зрелые эритроцитытребует сложного процесса реорганизации, который заканчивается удалением ядра с образованием безъядерных эритроцитов. Увы, методы перепрограммирования клеток в настоящее время часто приводят к нарушению этих процессов энуклеации и поэтому использование эритроцитов или их непосредственных предшественников эритробластов для переливания ещё недостаточно защищено от возможности образования опухолей. Тем не менее Bouhassira и его коллеги обнаружили, что кратковременное воздействие цитокинов, благоприятствующих дифференцировке стволовых клеток в эритроидные, на CD34 позитивные клетки, до их размножения с последующейпролиферациейполученных предшественников, позволяет получать на порядок больший выход эритроидных клеток, чем наблюдалось ранее. И что самое главное: эти красные кровяные клетки имели те же изоформы глобина что и использованные в качестве источника CD34 позитивные клетки. Значительно повысить выход эритроидных клеток из ИПСК или же эритроцитов из человеческих гемопоэтических стволовых клеток позволяет подавление генаSH2B3или его инактивация генным редактированием с помощьюCRISPR/Cas9
Важную роль в развитии нормальных клеток крови играет сигнальный путь рецептора арил-углеводородов (AhR) (который как было установлено, содействует и образованию раковых клеток). Активация AhR в человеческих гемопоэтических клетках-предшественницах (HPS) приводит к беспрецедентной пролиферации HPS, мегакариоцитов и клеток эритроидных линий..
Подробный обзор методов получения эритроцитов см. в
Тромбоцитыиграют важную роль в предотвращении кровоизлияния у больных с тромбоцитопенией или с тромбоцитемией. Серьёзной проблемой для пациентов после повторных переливаний тромбоцитов является развитие иммунных реакций. Поэтому для клиники большое значение имеет возможность получения тромбоцитов, не содержащихHLA-антигены, вне организма и на средах, не содержащих сыворотки. Некоторых успехов в этом направлении добились Figueiredo с соавторами. ИспользуяРНК-интерференциюдля подавления синтеза β2-микроглобулина вCD34-положительных клетках, они сумели получить тромбоциты, в которых на 85 % было снижено содержание антигенов HLA. Позднее удалось получить неиммуногенные по HLA класса I тромбоциты, которые кроме того не активируютNK-клетки
Разработан метод получения тромбоцитов, который заключается в создании из ИПСК человека устойчивых иммортализованных линий клеток-предшественниковмегакариоцитов(imMKCLs) путёмдоксициклин-зависимой гиперэкспрессииBmi1иBCL-XL.
Полученные imMKCLs можно размножать и культивировать в течение длительного периода (4—5 месяцев), причём даже послекриоконсервации. Прекращение сверхэкспрессии c-MYC, Bmi1 и Bcl-X L (путём удаления доксициклина из среды) заставляло эти клетки производить тромбоцитыCD42b+, которые по большинству параметров не отличались от тромбоцитов крови.
Альтернативный подход получения мегакариоцитов, с высоким выходом (3 единицы (2.4 × 10тромбоцитов на единицу) тромбоцитов для переливания с одного миллиона клеток ИПСК) и с чистотой более 90 %, позволяет культивирование на среде без продуктов животного происхождения (а потому с достаточно определёнными, предсказуемыми условиями, что важно для получения надёжно воспроизводимых результатов). Для перепрограммирования использовалась лентивирусная трансдукция, приводящая к одновременной экзогенной экспрессии трёх факторов транскрипции:GATA1,FLI1иTAL1.
Обзор по проблемам связанным с производством тромбоцитов см.
Вырабатываемый иммунной системой специализированный типбелых кровяных клеток, известный какцитотоксические Т-лимфоциты(CTL), способен распознать специфические маркеры на поверхности различных инфекционных или опухолевых клеток и уничтожить эти вредоносные клетки. Поэтомуиммунотерапияс использованием антиген-специфических Т-клеток в будущем может быть использована для борьбы со многими видами рака и вирусных инфекций. Организм производит очень мало таких клеток и выделить их в количестве необходимом для терапии очень сложно. Потенциально эффективным подходом получения этих клеток для терапии может быть технология заключающаяся в том чтобы превратить зрелые CTL в ИПСК, которые обладают способностью к неограниченной пролиферации in vitro, размножить эти ИПСК до необходимого количества и затем провести их дифференцировку обратно в зрелые CTL.
Ещё большие возможности обещает метод, который сочетает две технологии — 1. получение ИПСК и превращение их в Т-клетки, и 2. последующую их генетическую модификацию, с помощью технологии конструирования химерных рецепторов антигенов (CAR), позволяющую им распознавать раковые клетки-мишени по антигенам, в частности по CD19 — антигену, синтезируемому злокачественными В-клетками. По аналогичной технологии можно было бы создать распознающие белокPBP2AТ-клетки направленные противустойчивых к антибиотикам бактерийтаких какметициллин-резистентный золотистый стафилококк.
Большой клинический потенциал в качествеадъювантадля иммунотерапии рака имеютинвариантныеестественные киллерыT (INKT)— клетки, которые могут служить в качестве моста междуврождённойиприобретённойиммунной системами. Они повышают противоопухолевую активность организма, производя гамма-интерферон(ИФН-γ). Предложен концептуальный метод использования INKT клеток, полученных из ИПСК, для терапии рака, который состоит из четырёх ступеней: (1) выделение минимального количества INKT клеток, (2) перепрограммирования этих INKT клеток в ИПСК, (3) размножение этих ИПСК в культуре и дифференцировка их обратно в INKT клетки и (4) инъекция, полученных INKT клеток, подопытным животным для терапии рака.
Сконструирована клональная линия ИПСК с тремя генами отредактированными так, чтобы они экспрессировали: высокоаффинную, нерасщепляемую версиюFc-рецептораCD16a; белокинтерлейкина (IL)-15связанный с его мембранным рецепторомIL-15Rи при этом у них был бы подавлен нокаутом ферментCD38, который гидролизует НАД+. Природные киллеры (NK), полученные из этих сконструированных ИПСК, называемыхiADAPT, активны в условиях, когда клетки обычных естественных киллеров уже не работают и поэтому могут быть использованы для эффективного лечения пациентов с запущенным раком.
Для терапии могут быть использованы такжедендритные клетки, которые участвуют в контроле Т-клеточного ответа. После инъекции они могут выжить достаточно долго, чтобы стимулировать антиген-специфические CTL, после чего могут быть полностью устранены. Неисчерпаемым источником для терапии вакцинами могут служить антиген-представляющие дендритные клетки, полученные из человеческих ИПСКили прямым перепрограммированием из фибробластов.
В-клеткиспособны к быстрой (за 2-3 дня) трансдифференцировке в макрофаги под воздействием транскрипционного фактораC / EBPα.
Кроме того эффективность перепрограммирования В-клеток в ИПСК с помощью транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и Myc под воздействием C / EBPα возрастает 100-кратно и охватывает порядка 95 % популяции клеток.С помощью C / EBPα можно преобразовать некоторые линии в-клеток лимфомы человека и лейкоза в макрофаг-подобные клетки уже не способные к дальнейшему онкогенезу.
Тимусявляется органом, размеры которого существенно сокращаются с возрастом. Это сокращение является одной из основных причин того, чтоиммунная системас возрастом становится менее эффективной. Одним из центральных звеньев механизма возрастной инволюции тимуса является снижение синтеза транскрипционного фактораFOXN1.
Клэр Блэкберн и её коллеги показали, что даже далеко зашедшая возрастная инволюция тимуса может быть обращена вспять путём принудительного усиления активности в эпителиальных клетках тимуса всего одного фактора транскрипции — FOXN1 с целью содействия омоложению, пролиферации и дифференцировки этих клеток в полностью функциональный эпителий.
Более того они показали, что принудительная экспрессия Foxn1 позволяет перепрограммировать клетки кожи — фибробласты в функциональные эпителиальные клетки тимуса. Эти FOXN1-индуцированные эпителиальные клетки тимуса (iTECs) поддерживали эффективное развитиеin vitroлиний клетокCD4+ иCD8+ тимуса. Но, что самое главное, после трансплантации в почку мыши, iTECs собирались и образовывали полностью организованный и функциональный тимус, который содержал все подтипы эпителиальных клеток тимуса, необходимых для поддержки дифференцировки Т-клеток, в результате чего иммунная система реципиента пополнялась новыми Т-клетками.Это открытие можно считатьпервым примеромвыращивания органовизтрансплантированных индуцированных стволовых клеток. В будущем этот метод может быть широко использован для повышения иммунной функции и борьбы синфлеммеджингому пациентов путём омоложения тимусаin situ.
Благодаря своим способностям вызывать иммуносупрессию и способности к дифференцировке во многие типы мезенхимальных тканей,стволовые/стромальные клеткимезенхимы(МСК) интенсивно исследуются на предмет их применения для лечения сердца, почек, нервной ткани, суставов и регенерации костей, а также терапии воспалительных заболеваний и подавления реакции отторжения при трансплантации. МСК, как правило, получают путём болезненных, инвазивных процедур из взрослого костного мозга или жира, при этом выход очищенных МСК составляет всего лишь 0,001 % — 0,01 % от клеток костного мозга и 0,05 % от аспирата липосакции. На практике удобнее всего получать МСК из аспирата липосакции, при этом удаляют взрослые адипоциты, которые успели потерять способность к пролиферации. Между тем взрослые адипоциты легко можно выделить и подвергнуть дедифференцировке в так называемые дедифференцированные жировые клетки (ДДЖК), которые возвращают способность к пролиферации и мультипотентность. При соответствующих условиях культивирования in vitro или окружения in vivo ДДЖК могут дать начало адипогенным, остеогенным, хондрогенным или миогенным прогениторным клеткам, а также стимулировать неоваскуляризацию то есть проявляют те же свойства, что и МСК костного мозга. У пожилых пациентов, которые больше всего нуждаются в восстановлении тканей путём аутологичной клеточной терапии, с возрастом наблюдается резкое возрастное снижение количества и качества МСК и адипоцитов. Вместе с тем, известно, что ИПСК могут быть получены путём омоложения клеток даже от столетних людей. Поэтому ИПСК, которые можно получить перепрограммированием клеток из тканей пациента и затем практически неограниченно размножать in vitro, может стать удобным источником омоложённых МСК.Как показали опыты на мышах с модельювоспалительных заболеваний кишечникатаких какБолезнь КронаиЯзвенный колит, молоденькие ИМСК могут быть успешно использованы для лечения даже лекарственно-рефрактерных форм подобных воспалительных заболеваний.
Chen с соавт. обнаружили, что воздействуя на ИПСК человека препаратомSB-431542можно достаточно быстро получить однородную культуру клеток ИМСК, которые по свойствам мало чем отличаются от молодых МСК. По мнению авторов статьи такие ИМСК не обладают способностью к образованию тератом и имеют стабильный кариотип, а поэтому могут быть использованы для терапииВ настоящее время пока мало данных об эффективности и долгосрочной безопасности полученных этим методом ИМСК in vivo. Известно только что ИМСК могут быть использованы в клинике для лечениипериодонтитаи разработки методовортопедии
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) присутствуют во всех тканях и, как известно, прямо или косвенно способствуют регенерации тканей. Однако при использовании иМСК для трансплантационной терапии существует риск образования тератом из остаточных недифференцированных иПС-клеток. Удаление таких нежелательных иПС-клеток перед трансплантацией имеет решающее значение для реализации безопасной клеточной терапии на основе иМСК.Обнаружено что обработка культуры иМСК в течение 7 днейБреквинаром (BRQ)мощным ингибиторомдигидрооротатдегидрогеназы (ДГОДГ)избирательно удаляет недифференцированные иПС-клетки человека из иМСК, активируя остановку клеточного цикла и апоптоз, тогда как иМСК сохраняют свои свойства и потенциал дифференцировки.
Важную роль в инициировании и ускорении молекулярной программы, которая приводит к дифференциации ИМСК из ИПСК выполняет белок2MSX2 (muscle segment homeobox 2).
Генетическая делеция MSX2 ухудшает дифференцировку ИМСК из ИПСК. При использовании коктейля растворимых молекул эктопическая экспрессия MSX2 способствует образованию почти однородной популяции полностью функциональных ИМСК.
Разработан химический метод получения ИМСК из первичных фибробластов кожи человека с использованием шести химических ингибиторов (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 и CHIR99021) с добавлением трёх факторов роста: трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора подавления лейкемии (LIF). Этот химический коктейль преобразует человеческие фибробласты в ИМСК всего за 6 дней с эффективностью порядка 30-40 процентов.
Культуры мезенхимальных стволовых клеток человека могут быть использованы in vitro для массового производстваэкзосом, которые, как выяснилось, идеально подходят в качестве средства для доставки лекарстви для доставки в клетку-мишень факторов транскрипции или микроРНК индуцирующих перепрограммирование (дедифференцировку, дифференцировку или трансдифференцировку).
Обнаружены гены позволяющие успешно идентифицировать МСК во всех исследованных тканевых источниках, в связи с чем они могут использоваться наряду с раннее выработанными критериямив качестве маркеров стволовых клеток.Это шесть генов:PSMB5,PSMB1,PSMD14,PSMC4,PSMA1иPSMD8.Все эти гены кодируют белки участвующие в работе комплексапротеасомы— многобелкового комплекса, разрушающего ненужные или дефектные белки при помощи протеолиза.
Хрящ соединительной ткани обеспечивает движение суставов без трения. Его дегенеративное перерождение в конечном счёте, приводит к полной потере функции сустава на поздних стадиях остеоартрита. Единственным типом клеток в хряще являются хондроциты окружённые выделяемым ими внеклеточным матриксом. В настоящее время исследователи используют два способа восстановления хрящевой ткани:
Преимуществом первого метода является быстрое размножение культуры исходных клеток. Преимуществом второго — отсутствие в культуре плюрипотентных клеток, которые могли бы вызвать тератому. Клетки, полученные прямым перепрограммированием, синтезировали коллаген типа II. После имплантации в область поражения они смогли выжить и в течение не менее четырёх недель участвовали в образовании хрящевой ткани у мышей.
Наиболее часто для перепрограммирования используют получаемые биопсией фибробласты кожии клетки крови, однако удобнее получать соматические клетки из мочи. Этот способ не требуетбиопсииили взятия образцов крови и поэтому безвреден для пациента. Стволовые клетки мочи имеют способность к мультипотентной дифференцировке. Они способны дифференцироваться в эндотелиальные, остеогенные, хондрогенные, адипогенные, скелетные миогенные и нейрогенные линии и вместе с тем не образуют тератомы.. Поэтому их эпигенетическая память хорошо подходит для перепрограммирования в ИПСК. Вместе с тем, клеток в моче мало, эффективность их превращения в стволовые клетки низка, тогда как риск бактериального заражения выше, по сравнению с другими источниками клеток.
Ещё одним перспективным источником клеток для перепрограммирования являются мезенхимальные стволовые клетки, полученные из фолликулов человеческого волоса.и кератиноциты
Происхождение соматических клеток используемых для перепрограммирования может оказывать влияние на эффективность перепрограммирования, функциональные свойства получаемых индуцированных стволовых клетоки способность к образованию опухолей.
ИПСК сохраняют эпигенетическую память о тканях из которых они произошли, и это влияет на их способность к направленной дифференцировкеОстаточная эпигенетическая память не обязательно проявляется на стадии плюрипотентности — ИПСК, полученные из разных тканей имеют надлежащую морфологию, в них активны гены характерные для плюрипотентности, и они способны дифференцироваться в ткани трёх эмбриональных слоёв как in vitro, так и in vivo. Однако, эта эпигенетическая память может проявиться позже, во время повторной дифференцировки в специфические типы клеток, которая требует активации локусов, сохранивших элементы остаточной эпигенетической памяти.
Для выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека обычно используются так называемые питающие клетки (feeder cells) и сыворотка из эмбрионов быка (FBS). И то и другое является продуктами животного происхождения и может изменять свойства от партии к партии, что затрудняет стандартизацию условий. Кроме того выращивание стволовых клеток на клетках другого человека или животных создаёт риск загрязнения патогенными микроорганизмами, которые могут стать источником болезни для пациента после клеточной терапии.. Поэтому компоненты животного происхождения требуют дорогостоящего контроля на качество, и их свободу отпатогенов,полиаминоксидазыиантигенов.
Для замены питающих клеток используются различные подложки, такие как: Matrigel, CELLstart, рекомбинантные белки и синтетические полимеры такие как Synthemax (см. обзор к статье.
Известно, что важную роль в адгезии клеток друг к другу и к внеклеточному матриксу играет тримерный белокламинин. Было найдено что ламинин-511, названный так за то, что он содержит α5 , β1 и γ1 цепи, если его нанести на дночашки Петриспособен поддерживать стабильную культуру ЭСК или ИПСК. На основе этого открытия была разработана стандартная методика для длительного культивирования ЭСК и ИПСК человека в чашках покрытых rLN511E8 — рекомбинантным фрагментом ламинина −511 и с безсывороточной средой StemFit™.
Аналогичная методика но с использованием ламинина-521 иE-кадгеринапозволила клонировать in vitro эмбриональные стволовые клетки без необходимости использовать ингибиторыROCK(англ.Rho-associated protein kinase). Интересно было бы применить её и для ИПСК.
В стадии разработки находится также очень дешёвая подложка из углеродных нанотрубок. Она позволит выращивать и проводить дифференцировку стволовых клеток в промышленных масштабах. По заверениям авторов изобретения, изменяя условия изготовления этой подложки, можно так изменить её свойства, что она будет влиять на способность выращиваемых клеток к адгезии, на их пролиферацию и морфологию образуемых клеточных колоний.
Длятрёхмерного культивированияшироко используютгидрогели, такие как, например, гидрогель для получениякардиомиоцитовв одну стадию
Разработана среда-коктейль CEPT, состоящая из четырёх малых молекул: chroman 1 (ингибитор ROCK), emricasan (ингибиторкаспазы), транс-ISRIB.и полиаминов таких какспермин, которая, улучшает жизнеспособность плюрипотентных стволовых клеток человека, защищает клетки во время культивирования икриоконсервации, а также способствует дифференцировкеin vitroи образованиюорганоидов
Способы доставки можно подразделить навирусныеи невирусные, а также на те, что связаны с интеграциейвекторовнесущих репрограммирующие факторы в геном и действующие без интеграции.
(Значками отмечены свойства соответствующего вектора: (+)- Геномная интеграция происходит; (±)- интеграция происходит, но очень редко; (-)- вектор не интегрируется; (тр)- после интеграции векторная конструкция должна быть удалена транспозазой.)
Чаще всего для доставки используются вирусныевекторныесистемы. Вирусы используют свой врождённый механизм заражения клетки, что позволяет использовать их для доставки и внедрения кассеты генов необходимых для экспрессии репрограммирующих факторов
В качестве вирусов для доставки генов обычно используют:
Аденоассоциированный вирусныйвектор (AAV) может быть связан сэкзосомами(exo-AAV), если вектор выделяют из культуральной среды клеток-продуцентов. Такой вектор более устойчив к нейтрализующим антителам по сравнению со стандартным AAV. Он более эффективен для трансфекции in vivo
По сравнению с вирусными векторами, не-вирусные векторы являются потенциально менее иммуногенными и их сравнительно легче использовать в условиях клиники.
Невирусным подходом является прямая доставка в клеткусинтетической мРНК(-) кодирующей четыре канонических фактора Яманаки: KLF4, c-MYC, OCT4, и SOX2. Метод позволяет достичь высокой эффективности перепрограммирования, но технически сложен и сильно зависит от качества реактивов. Недавно он был модифицирован,что позволило сократить продолжительность процесса и число необходимых реагентов. Ещё более экономным в отношении стоимости перепрограммирования является метод получения ИПСК и последующей их дифференцировки с помощью микрожидкостного устройства в объёмах не превышающих микролитра и эффективностью в 50 раз большей чем при традиционном перепрограммировании путём доставки синтетических мРНК, кодирующих факторы транскрипции.
Для перепрограммирования in vivo очевидно подойдёт доставка мРНК с помощью олиго (карбонат-b-α-амино эфиров) под общим названием CARTs (charge-altering releasable transporters), катионов, которые образуя комплекс с мРНК, защищают её и доставив в клетку высвобождают
Перепрограммирование мышечных клеток головастиков Xenopus в недифференцированные клетки может быть достигнуто In vivo с помощьюДНК(±) мыши кодирующей Oct4, Sox2, и Klf4 в условиях способствующих регенерации.
Привлекательным методом невирусной доставки генов, который позволяет эффективно встраивать желаемую ДНК в геном различных клеток является использованиетранспозонов— сложных структур содержащих дискретные куски ДНК, обладающие способностью изменять своё местоположение в геноме посредством механизма транспозиции (инсерции), вынуждающего его включиться или наоборот покинуть определённый участок генома. Транспозон состоит из инсерционных сегментов ДНК, которые могут перемещаться как единое целое, захватывая лежащие между ними гены. Описано несколько транспозонных систем пригодных для транспортировки генов в клетки млекопитающих. Это «Спящая красавица» — Sleeping Beauty (SB), SB100X, и Tol2 и PiggyBac (PB). Разработаны эффективные методики получения ИПСК мыши и человека введением в соматические клетки векторов на основеPiggyBac(тр)В том числе с кассетой из ДНК кодирующей 6 факторов (Oct4, c-Myc, Klf4, Sox2 плюсRarg (retinoic acid receptor gamma — RAR-γ)иLrh-1 (liver receptor homologue 1 известный также как Nr5a2)., что позволило сократить продолжительность перепрограммирования до 4-12 дней и поднять его эффективность до уровня сопоставимого с методами переноса ядер и слияния клеток.
Векторные системы на основеэписомныхплазмид(±). Перепрограммирование основанное на использовании эписомных плазмид считается наиболее эффективным и безопасным так как не требует интеграциитрансгеновв геном. Однако первоначально эффективность перепрограммирования этим методом была крайне низка (менее 0,0002 %.) . Значительно увеличить эффективность индукции ИПСК позволило использование комбинации плазмид, кодирующих OCT3/4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 и малой интерферирующей РНК для ингибирования гена TP53, кодирующего белокp53(супрессор опухолей, ингибирующий перепрограммирование) в сочетании сЭпштейн-Барр ядерным антигеном 1(EBNA1), который является белкомвируса Эпштейна-Барр(ВЭБ), необходимым для амплификации эписомных векторовРазработаны полицистронные свободные от вирусов плазмиды (±), содержащие последовательности самовыщепляющегося 2A пептида (пептида, который взаимодействуя с рибосомой инициирует отделение от растущего полипротеина, вызвав «пропуск» последней пептидной связи на С-конце 2А) и постоянно активный промотор вируса энцефаломиокардита (CMV).
Рекомбинантные белки(-) представляют собой проникающие в ядро белки, полученные путёмрекомбинации(в данном случае, присоединения последовательности, кодирующей поли-аргининовый доментрансдукции, к генам четырёх перепрограммирующих факторов: Oct4, Sox2, Klf4 и C-Myc, на участке соответствующем их С-концевой последовательности, и, кроме того, постоянно активного промотора вируса энцефаломиокардита) с последующим синтезом этих белков в тельцах включения бактерииE.coli. Выделенные из E. coli и очищенные рекомбинантные белки используются для репрограммирования без интеграции. Эффективность репрограммирования с помощью рекомбинантных белков ничтожно мала, но может быть существенно увеличена при воспалении вызываемом поли I:C (синтетическим аналогом двухцепочечной РНК).
Используя для перепрограммирования исключительно малые молекулы, китайские учёные Дэн Хонгкуй с коллегами показали, что для перепрограммирования клеток достаточно эндогенных «мастер генов». Они индуцировали плюрипотентное состояние у взрослых клеток мыши, используя семь низкомолекулярных соединений.
Эффективность метода оказалась достаточно высокой: она была в состоянии преобразовать 0,2 % взрослых клеток ткани в ИПСК, что сопоставимо с результатами получаемыми при использовании экзогенных «мастер генов» доставляемых вирусными векторами.
Авторы отмечают, что полученные от мышей CiPSCs были на «100 % жизнеспособными и здоровы на протяжении, по меньшей мере, 6 месяцев наблюдения».
В число этих семи низкомолекулярных соединений входили:
Методы и составы «коктейлей» из малых молекул для химического воздействия на мышечную ткань с целью активации процессов образования функциональных сердечных, скелетных и гладкомышечных клеток и регенерации повреждённых тканей in situ можно найти в обзоре Джанга и Виллиамса.С механизмами действия малых молекул при перепрограммировании можно ознакомиться в обзорах.
В 2015-м году система химического перепрограммирования была усовершенствована — разбита на три этапа с использованием разных «коктейлей» на разных этапах. Были найдены новые малые молекулы. Это позволило поднять выход перепрограммированных клеток почти в 1000 раз.
Выяснилось, что поскольку начальный этап химического перепрограммирования переводит клетки фибробластов в стабильное XEN (extra-embryonic endoderm)-подобное состояние одинаковое для прямого перепрограммирование фибробластов в различные клетки, эти XEN-подобные клетки (которые можно размножать) могут служить универсальной платформой для создания различных желаемых типов клеток.
Обнаружено что основным барьером для химического перепрограммирования является путьJNK, ингибирование которого необходимо для подавления провоспалительных путей мешающих индукции клеточной пластичности и программы, подобнойрегенерацииконечностейаксолотля. Не случайно поэтому эволюционно консервативный сигнальныйпуть N-концевой киназы c-Jun (JNK)является важным генетическим детерминантом контролядолголетия
Для безопасной терапии индуцированными стволовыми клетками необходимы несложные методы обнаружения и разрушения недифференцированных стволовых клеток. С этой целью широко используются антитела SSEA-4 и SSEA-5, а также антитела на антигены: антитело TRA-1-60на трансмембранный гликопротеин подокаликсин (podocalyxin), Oct3/Oct4 и Nanog. Эти вещества как и большинство белков стоят недёшево и быстро портятся. Гораздо более стабильным и дешёвым реагентом способным отличить плюрипотентные стволовые клетки от дифференцированных клеток оказался флуоресцентный краситель KP-1 (Kyoto probe 1), который избирательно красит в митохондриях альдегиддегидрогеназу 2 (ALDH2). Эта селективность KP-1 зависит от способности митохондрии удалить его с помощью транспортных белков множественной лекарственной устойчивости ABCB1 и ABCG2, экспрессия которых подавляется в плюрипотентных клетках человека и индуцируется после дифференцировки.
Способность плюрипотентных клеток, и в частности ИПСК, избирательно окрашиваться красным красителем CD1 может быть использована для их селективного удаления из инкубационной среды, с помощью фотодинамической обработки светом, оставшихся недифференцированными ИПСК после проведения их дифференцировки в соматические клетки. Эта простая технология предварительной очистки позволяет резко снизить риск образования опухолей типа тератомы при трансплантации клеток полученных из ИПСК.
Разработана также разновидность этой технологии. Для этого флуоресцентную пробу KP-1 (Kyoto probe 1) (которая обычными клетками выводится наружу белками ABCB1 и ABCG2, синтез которых в ИПСК подавлен) соединили с анти раковым препаратом SN38. Полученный препарат, названный «конъюгат 17» за 72 часа полностью удаляет оставшиеся недифференцированными ИПСК
Чтобы избавиться от плюрипотентных клеток, которые могут вызвать образование терратомы, можно использовать синтетические фосфо-D-пептиды, поскольку известно что на поверхности ИПСК сверхэкспрессируются щелочные фосфатазы, которые вызывают дефосфорилирование фосфо-D-пептидов в гидрофобные пептиды, которые агрегируя вызывают гибель клеток.
Можно также удалить плюрипотентные клетки с помощью препарата Брекинар (Brequinar, DuP-785), который действует как мощный и селективный ингибитор ферментадигидрооротатдегидрогеназы. Он блокирует синтез нуклеотидов на основе пиримидина в организме и таким образом подавляет рост клеток. В опытах с плюрипотентными стволовыми клетками мыши выяснилось что брекинар вызывает остановку клеточного цикла, гибель именно стволовых клеток, тогда как в отношении нормальных тканеспецифичных стволовых клеток и дифференцирующихся клеток он менее токсичен.
Описаны также способы устранения ИПСК, смешанных с кардиомиоцитами, нейронами и гепатоцитами, с использованием препарата от ожирения, называемогоорлистатили аторвастатина.
Ещё один способ удаления ИПСК основан на использованиидиаминовсалициловой кислоты.
Описана технология очистки путеммикрофлюидногоразделения на основе размера клеток для сравнительно безопасного производства клеток-предшественников спинного мозга, полученных из ИПСК. По утверждениям авторов технология снижает риск образования опухоли после трансплантации и при этом имеет высокую производительность без ущерба для жизнеспособности и функции клеток.
Ярким свидетельством значения индуцированных стволовых клеток для медицины будущего и всего человечества, стало присуждениеДжону ГордонуиСинъе ЯманакеНобелевской премии 2012 года по медицине. Бо́льшую часть от Нобелевской премии, а также от полученной им в 2013 годуПремии за прорыв в области медициныв 3 млн долларов Синъя Яманака решил потратить на развитие своих исследований.
В настоящее время индуцированные стволовые клетки используются главным образом для моделирования болезней, скрининга (селективного отбора) лекарств, проверки токсичности различных препаратов. Однако в ближайшие годы начнётся их широкомасштабное использование для клеточной терапии ивыращивания органов и их «запчастей»для трансплантации.