Cariotipo

Concariotiposi indica, incitogenetica, la costituzione del patrimoniocromosomicodi una specie dal punto di vista numerico emorfologico.
Con ilmicroscopio otticosi valutano la lunghezza, la posizione dei centromeri, il pattern di bandeggio, eventuali differenze tra i cromosomi sessuali, ed eventuali altre caratteristiche fisiche.L'analisi del cariotipo permette di costruire una rappresentazione grafica ordinata del corredo cromosomico di un individuo, dettacariogramma.
Lo studio del cariotipo è reso possibile mediante colorazione. Solitamente il colorante più adatto che si utilizza è il Giemsa, una preparazione che include vari coloranti: blu di metilene, eosina Y e Azure-A,B,C. Giemsa viene applicato dopo che le cellule sono state arrestate da una soluzione di colchicina, generalmente in metafase o prometafase mitotica, quando i cromosomi sono più condensati. Affinché il colorante aderisca correttamente, tutte le proteine cromosomiche devono essere digerite e rimosse. Per gli esseri umani vengono utilizzati più di frequente i globuli bianchi, perché sono facilmente indotti a dividersi e a crescere in coltura.A volte le osservazioni possono essere fatte sulle cellule non di divisione (interfase), infatti il sesso di un feto può essere determinato attraverso l'osservazione di cellule in interfase.
I vari passi dello studio del cariotipo umano sono:
I vari cromosomi vengono poi ritagliati e ordinati mediante programmi informatici (icromosomi omologhivengono appaiati: i cromosomi appartenenti alla stessa coppia hanno gli stessi bandeggi e il loro centromero è nella stessa posizione).
I cromosomi hanno una zona più ristretta dove c'è un granulo dettocentromeroe 2 braccia uguali o diverse. In base al posizionamento del centromero nel cromosoma si possono dividere in:
Nell'uomo e nella maggior parte degli animali il corredo cromosomico èdiploidenelle cellule somatiche (cioè "del corpo"), ed èaploidenelle cellule germinali (cioè deigameti: spermatozoi ed ovocellule).
Solitamente si osservano e confrontano sei diverse caratteristiche del cariotipo.
Un resoconto completo di un cariotipo può quindi includere il numero, il tipo, la forma e le bande dei cromosomi, così come altre informazioni citogenetiche.
Le variazioni si trovano spesso:
Utilizzando tecniche di colturain vitro, fu stabilito nel 1956 daJoe Hin TjioeAlbert Levanche il numero cromosomico dell'uomo è di 46, cioè 23 coppie, di cui 22 coppie sono detteautosomie la ventitreesima coppia è quella dei cosiddettieterosomio cromosomi sessuali. Nei precedenti trenta anni, in seguito alle indagini di Theophilus Painter del 1923, era prevalente l'ipotesi che il numero cromosomico umano fosse 48.
La prima definizione del cariotipo fu formulata alla Conferenza diDenvernel 1960, ed è basata su criteri di lunghezza del cromosoma e posizione delcentromero. Le coppie quindi sono numerate in ordine decrescente di grandezza e gli eterosomi sono indicati come X e Y.In seguito, nella Conferenza diChicagodel1966è stata messa a punto una nomenclatura più dettagliata, nella quale i cromosomi sono raggruppati in sette gruppi, nominati con le lettere maiuscole daAaG.
L'analisi del cariotipo può essere richiesta per diversi motivi:
Il numero dei cromosomi presenti nel nucleo delle cellule eucariotiche prende il nome di ploidia, con distinzione tra:
Per cui nell'uomo ogni gamete presenta 23 cromosomi, cioè 22 autosomi + 1 cromosoma sessuale o eterosoma: nell'ovocita il cromosoma sessuale è sempre X, mentre negli spermatozoi può essere X o Y. Dopo la fecondazione della cellula uovo da parte dello spermatozoo si forma lo zigote, cioè una cellula diploide (2N) formata da 46 cromosomi, cioè 22 coppie di autosomi + 2 cromosomi sessuali, per cui si ha un corredo cromosomico o cariotipo costituito da 46,XX nella femmina e 46,XY nel maschio. In pratica 22 autosomi e 1 cromosoma X sono ereditati al momento del concepimento con la cellula uovo, mentre gli altri 23 cromosomi sono trasmessi dallo spermatozoo che può portare un cromosoma sessuale X o Y. La probabilità di fecondazione è analoga per gli spermatozoi che portano il cromosoma X o Y, per cui il numero dei concepiti con sesso cromosomico maschile o femminile è sovrapponibile.
In genere, il bandeggio cromosomico avviene con lacolorazione di Giemsa, per cui si parla anche di bandeggio G, in cui il vetrino viene prima trattato con una soluzione salina o enzimatica, poi viene colorato con soluzione di Giemsa, determinando lungo l'asse principale dei cromosomi una sequenza di regioni a diversa intensità di colorazione, dette bande cromosomiche, caratteristiche di ogni cromosoma consentendo la loro classificazione secondo uno schema standardizzato in modo da definire il cariotipo di un individuo (ideogramma o cariotipo normale). In genere, si usano 3-5 cellule per l'analisi dei cromosomi almicroscopio otticoe su fotografie: le bande riflettono il diverso grado di condensazione della cromatina.
Per cui il bandeggio cromosomico avviene in due fasi:
Nel bandeggio G i cromosomi sono sottoposti a digestione enzimatica con tripsina che elimina le proteine cromosomiche e, quindi, colorati con Giemsa che ha affinità per le regioni ricche in basi AT. Queste sono facili da denaturare e digerire enzimaticamente perché le coppie AT sono unite solo da 2legami idrogeno. Le bande più scure sono costituite da cromatina molto condensata o eterocromatina; vi sono presenti pochi geni che si replicano nella fase S tardiva del ciclo cellulare, cioè successivamente alle zone eucromatiniche, e inoltre poco attive dal punto di vista trascrizionale. Dunque, dopo colorazione Giemsa, si osserva al microscopio un'alternanza tra le bande G-positive, scure, e le bande G-negative, chiare.
Nel bandeggio Q i cromosomi sono sottoposti a digestione enzimatica e colorati con un colorante fluorescente, cioè la Quinacrina che ha affinità per le regioni ricche in basi AT ma mette in evidenza bande fluorescenti dette bande Q, corrispondenti a quelle G, e spesso consente di valutare la presenza di polimorfismo cioè una variazione di grandezza del braccio lungo del cromosoma Y, che si trasmette da padre a figlio, anche se non rappresenta una condizione patologica.
Nel bandeggio R i cromosomi sono denaturati ad alte temperature (60 °C) in una soluzione salina tamponata e colorati con Giemsa mettendo in evidenza regioni ricche in basi AT che sono complementari, opposte a quelle delle bande G e Q, infatti, la lettera "R" sta per "reverse", osservando al microscopio le bande R, chiare, dette G-negative, opposte alle bande scure G.Invece, per mettere in evidenza le regioni cromosomiche ricche in basi GC si usa un colorante specifico, cioè la cromomiocina, mettendo in evidenza le bande R opposte alle bande Q, dette Q-negative. Le regioni ricche in GC sono più difficili da denaturare poiché le coppie di basi sono unite da 3 legami H, sono costituite da cromatina meno condensata o eucromatina, ricca di geni che si replicano nella fase S precoce del ciclo cellulare, cioè prima della fase S, molto attivi dal punto di vista trascrizionale, dettigeni housekeepingimportanti per tutte le funzioni e la vita della cellula.Le bande T corrispondono alle regioni telomeriche localizzate alle estremità dei cromosomi, corrispondono a gruppi di bande R che si colorano più intensamente, trattando i cromosomi ad alte temperature e colorando con Giemsa o fluorocromi.
Le bande C si ottengono denaturando i cromosomi insoluzione saturadiidrossido di barioe colorando con Giemsa, in modo da colorare selettivamente l'eterocromatina che si presenta monocromatica in tutti i cromosomi e in qualsiasi fase del ciclo cellulare, localizzata nelle regioni attorno al centromero o pericentromeriche e sul braccio lungo del cromosoma Y, ad alto grado di condensazione, costituite da sequenze di DNA altamente ripetute, ricche in basi AT, costituita da pochissimi geni codificanti che si replicano in fase S tardiva, mentre l'attività trascrizionale è assente. Le bande C corrispondono a eteromorfismi cromosomici.
Il numero dellebande cromosomichedipende dal grado di condensazione dei cromosomi e quindi dalla fase del ciclo cellulare, infatti, durante la metafase si osservano ~ 320 bande formate da 6.000-8.000 kb (chilobasi o migliaia di basi), mentre in profase e prometafase (inizio della metafase) il numero delle bande può triplicarsi sui cromosomi meno condensati, ottenendo dei preparati cromosomici ad alta risoluzione utili per evidenziare anomalie di struttura molto fini, non riconoscibili con le tecniche tradizionali, osservando bande piuttosto corte, pari a 800-1.000 kb, ottenute bloccando la divisione cellulare con metotrexate o timidina, introducendo successivamente nella coltura acido folico o deossicitidina che sbloccano le cellule in sincronia, procedendo nella mitosi.
Giunti in prometafase si aggiunge la colchicina ad intervalli di tempo specifici, perché i cromosomi non sono completamente contratti e sono in grado di fornire un bandeggiamento più fine.
In condizioni patologiche bisogna specificare la presenza di un difetto di numero dei cromosomi e la presenza di anomalie strutturali a carico delle braccia, regioni o bande.
Ad es. in una donna consindrome di Downo Trisomia 21 si scrive 47,XX,+21 che indica la presenza di un cromosoma 21 in soprannumero, mentre la sigla 46,XY,del(1)(p32.2) indica una delezione o perdita (del) di una parte del braccio corto (p) del cromosoma 1 a livello della regione 3, nella banda 2, nella sottobanda 2, in un maschio (XY) a 46 cromosomi.