رقاقة التسلسل

رقاقة التسلسل، تسمى أيضاChIP-seq، هي طريقة مستخدمة لتحليل تفاعلاتالبروتينمعالحمض النووي. يجمع ChIP-seq بينالمناعة المناعية للكروماتين(ChIP)وتسلسل الحمض النوويالمتوازي بشكل كبير لتحديدمواقع الربطللبروتينات المرتبطة بالحمض النووي. يمكن استخدامه لتعيين مواقع الربط بشكل عمومي بالتحديد لأي بروتين مهم. في السابق، كانChip-on-chipهو الأسلوب الأكثر شيوعًا المستخدم لدراسة علاقة الحمض النووي بالبروتين .
يستخدم ChIP-seq بشكل أساسي لتحديد كيفية تأثيرعوامل النسخوالبروتينات الأخرى المرتبطة بالكروماتين على آليات التي تؤثر علىالنمط الظاهري. يعد تحديد كيفية تفاعل البروتينات مع الحمض النووي لتنظيمالتعبير الجينيأمرًا ضروريًا لفهم العديد من العمليات البيولوجية وحالات الأمراض. هذه المعلوماتالجينيةمكملةللنمط الجينيوتحليل التعبير. ينظر إلى تقنية ChIP-seq حاليًا كبديللشريحة Chipالتي تتطلبمصفوفة بروتين دقيقة. يقدم هذا بالضرورة بعض التحيز، حيث يقتصر المصفوفة على عدد محدد من التحقيقات. بالمقابل، يُعتقد أن التسلسل أقل تحيزًا، على الرغم من أن التحيز التسلسلي لتقنيات التسلسل المختلفة لم يتم فهمه بشكل كامل حتى الآن.
مواقع الحمض النووي المحددة في التفاعل الجسدية المباشر مع عوامل النسخ والبروتينات الأخرى يمكن عزلها عن طريقالترسيب المناعي الكروماتين. تنتج ChIP مكتبة مواقع الحمض النووي المستهدفة المرتبطة ببروتين مهمفي الجسم الحي. تُستخدم تحليلات التسلسل المتوازي بشكل كبير بالاقتران مع قواعد بيانات تسلسل الجينوم الكامل لتحليل نمط تفاعل أي بروتين مع الحمض النووي،أو نمط أي تعديلاتكروماتينيةجينية. يمكن تطبيق ذلك على مجموعة البروتينات والتعديلات القادرة للحصول على chip ، مثل عوامل النسخوالبوليمراتوالآلات النسخيةوالبروتينات الهيكليةوتعديلات البروتين وتعديلاتالحمض النووي.وكبديل للاعتماد على أجسام مضادة محددة، وتم تطوير طرق مختلفة للعثور على مجموعة شاملة لجميع المناطق التنظيمية النشطة في جسيم نووي المستنفدة للنيوكليوم أو النيوكليوسوم في الجينوم مثلDNaseوFAIRE seq.
ChIPهي وسيلة قوية لإثراء انتقائي لتسلسل الحمض النووي المرتبطة ببروتين معين فيالخلاياالحية. ومع ذلك، فإن الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة كان محدودا بسبب عدم وجود طريقة قوية بما فيه الكفاية لتحديد جميع تسلسل الحمض النووي المحسن تعمل عملية ChIP على إثراء مجموعات معينة من بروتين الحمض النووي المتشابك باستخدامجسم مضادضد البروتين المستهدف للحصول على وصف جيد لبروتوكول مختبر الرطب من chip، انظرChIP-on-chip. ثم تضاف محولاتأوليغنيكليوتيدإلى الامتدادات الصغيرة من الحمض النووي التي كانت مرتبطة بالبروتين المستهدف لتمكين التسلسل المتوازي على نطاق واسع.
بعد اختيار الحجم، يتم تسلسل جميع شظايا ChIP-DNA الناتجة في وقت واحد باستخدام منظم الجينوم. يمكن لمسار تسلسلي واحد أن يبحث عن الارتباطات على نطاق الجينوم بدقة عالية، مما يعني أنه يمكن تحديد الميزات بدقة على الكروموسومات. على النقيض من ذلك، تتطلب رقاقة Chips مجموعات كبيرة منصفائف التجانبلخفض الدقة.
هناك العديد منطرق التسلسل الجديدةالمستخدمة في هذه الخطوة التسلسل. يمكن لبعض التقنيات التي تقوم بتحليل التسلسلات استخدامالتضخيم العنقوديلشظايا ChIP DNA ذات محول في الركيزة الصلبةلخلية التدفقلإنشاء مجموعات من حوالي 1000 نسخة نسيلية لكل منها. يتم ترتيب مجموعة الكثافة العالية الناتجة من مجموعات القوالب على سطح خلية التدفق بواسطة برنامج تحليل الجينوم. يخضع كل قالب مجموعةالتسلسل تلوالتوازي في موازاة استخدام نيوكليوتيدات فاصل عكسي المسمى fluorescently. يتم تسلسل القوالب كل قاعدة على حدة أثناء كل قراءة. بعد ذلك، يقوم برنامج جمع وتحليل البيانات بمحاذاة تسلسل العينات مع تسلسل جينومي معروف لتحديد شظايا ChIP-DNA المطلوبة .
تعتمد حساسية هذه التقنية على عمق المدى التسلسلي (أي عدد علامات التسلسل المعين) وحجم الجينوم وتوزيع العامل المستهدف. يرتبط عمق التسلسل مباشرة بالتكلفة. إذا كان من الضروري تعيين روابط وفيرة في جينومات كبيرة بحساسية عالية، فستكون التكاليف مرتفعة حيث ستكون هناك حاجة إلى عدد كبير للغاية من علامات التسلسل. وهذا يتناقض مع رقاقة Chip حيث لا ترتبط التكاليف بالحساسية.
وعلى عكس طرق ChIP المستندة إلىمصفوفة البروتين الدقيقة، فان دقة اختبار ChIP-seq لا تقتصر على تباعد التحقيقات المحددة مسبقًا. من خلال دمج عدد كبير من القراءات القصيرة، يتم الحصول على توطين موقع الربط الدقيق للغاية. مقارنةً برقاقة ChIP ، يمكن استخدام بيانات ChIP-seq لتحديد موقع الربط ضمن عشرات قليلة من الأزواج الأساسية لموقع ربط البروتين الفعلي. تعد كثافات العلامات في مواقع الربط هي مؤشرًا جيدًا على تقارب ارتباط البروتين بالحمض النووي،مما يجعل من السهل تحديد ومقارنة الارتباطات المرتبطة للبروتين بمواقع الحمض النووي المختلفة.
رابطة الحمض النووي (الحالة 1): تم استخدام ChIP-seq لدراسة أهداف STAT1 في خلايا HLA S3. ثم تمت مقارنة أداء ChIP-seq بطرق تفاعل البروتين والحمض النووي البديلة في ChIP-PCR و ChIP-chip.
بنية نووية للمروجين: باستخدام ChIP-seq ، تم تحديد أن جينات الخميرة يبدو أنها تحتوي على أقل منطقة محفِّزة خالية من النيوكليوسوم تبلغ 150 نقطة أساس والتي يمكن أن يبدأ فيها بوليميريز الحمض النووي الريبي النسخ.
الحفاظ على عامل النسخ: تم استخدام ChIP-seq لمقارنة حفظ الـ TFs في الدماغ الأمامي وأنسجة القلب في الفئران الجنينية. حدد المؤلفون والتحقق من صحة وظائف القلب من معززات النسخ، وقرروا أن معززات النسخ للقلب هي أقل تحفظا من تلك الموجودة في الدماغ الأمامي خلال نفس المرحلة التنموية.
ChIP-seq على نطاق الجينوم: اكتمل تسلسل ChIP على الدودة (C. elegans)لاستكشاف مواقع الربط على نطاق الجينوم التي تضم 22 عاملاً من النسخ. تم تعيين ما يصل إلى 20 ٪ من الجينات المرشحة المشروحة لعوامل النسخ. تم تعيين العديد من عوامل النسخ لمناطق الحمض النووي الريبي غير المشفرة وقد تخضع لمتغيرات تطورية أو بيئية. كما تم تحديد وظائف بعض عوامل النسخ. بعض عوامل النسخ تنظم الجينات التي تتحكم في عوامل النسخ الأخرى. لا يتم تنظيم هذه الجينات من قبل عوامل أخرى. تعمل معظم عوامل النسخ كأهداف ومنظمين لعوامل أخرى، مما يدل على وجود شبكة من التنظيم .
الاستدلال على الشبكة التنظيمية: تم عرض إشارة Chip-seq لتعديل هيستون على أنها أكثر ارتباطًا بزخارف عامل النسخ عند المروجين مقارنة بمستوى الحمض النووي الريبي.ومن هنا اقترح المؤلف أن استخدام تعديل هيستون يوفر ChIP-seq استدلالًا أكثر موثوقية للشبكات التنظيمية الجينية مقارنةً بالطرق الأخرى القائمة على التعبير.
يقدم ChIP-seq بديلاً Chip-chip : تتمتع بيانات STAT1 التجريبية بدرجة عالية من التشابه مع النتائج التي تم الحصول عليها بواسطة Chip-chip لنفس النوع من التجربة، مع أكثر من 64٪ من القمم في المناطق الجينية المشتركة. نظرًا لأن البيانات عبارة عن قراءة تسلسلية، تقدم ChIP-seq خطًا للتحليل السريع (طالما يتوفر تسلسل جينوم عالي الجودة لرسم الخرائط للقراءة، ولا يحتوي الجينوم على محتوى متكرر يربك عملية التعيين) القدرة على اكتشاف الطفرات في تسلسل مواقع الربط، والتي قد تدعم مباشرة أي تغييرات ملحوظة في ربط البروتين وتنظيم الجينات.
كما هو الحال مع العديد من أساليب التسلسل عالية الإنتاجية، تقوم ChIP-seq بإنشاء مجموعات بيانات كبيرة للغاية، والتي تتطلب طرق التحليل الحسابية المناسبة. للتنبؤ بمواقع ارتباط الحمض النووي من بيانات ChIP-seq ، تم تطوير طرق الاتصال القصوى . الطريقة الأكثر شعبية هو MACS الذي يصمم تجريبياً حجم التحول لعلامات ChIP-Seq ويستخدمه لتحسين الدقة المكانية لمواقع الربط المتوقعة.
هناك مشكلة حسابية أخرى ذات صلة وهي النداء الذروي التفاضلي، الذي يحدد اختلافات كبيرة في إشارات تشيب-ساق من ظروف بيولوجية متميزة. الجزء المتصل بالذروة التفاضلية يشتمل على اثنين من إشارات ChIP-seq ويحدد الذروة التفاضلية باستخدامنماذج Hidden Markov. أمثلة للمتصلين الذروة التفاضلية على مرحلتين هي ChIPDiffو ODIN.