Western blot

Ilwestern blotoimmunoblotè una tecnicabiochimicache permette di identificare una determinataproteinain una miscela di proteine, mediante il riconoscimento da parte dianticorpispecifici;in generale, per facilitare il riconoscimento, la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro dimensioni (opeso molecolare) utilizzando un gel dipoliacrilammide(ma esistono variazioni quali ildot bloto slot blot, in cui la miscela proteica non viene separata in base alle dimensioni, ma ci si affida alla selettività antigene/anticorpo); successivamente le proteine vengono trasferite su un supporto, che comunemente è una membrana dinitrocellulosa, e quindi si procede al riconoscimento vero e proprio della proteina mediante l'utilizzo di un anticorpo specifico.
Recentemente sono state messe a punto tecniche che permettono il riconoscimento antigene/anticorpo direttamente nella matrice del gel, evitando quindi il trasferimento su membrana. Questa tecnica si usa quando il campione è composto da una miscela di moltissime proteine tali che con una colorazione standard (blu di Coomassieonitrato di argento) non si riuscirebbe a distinguerle l'una dall'altra, oppure quando, pur avendo bande ben distinte (discrete), la proteina di interesse è in quantità troppo basse per essere visualizzata con altre tecniche. Infatti il western possiede tre passaggi in cui avviene l'amplificazione del segnale, ciò rende visibili anche decimi di picomole (10mol) di proteina.
Il metodo è stato ideato daGeorge StarkallaStanford University. Il nomeWestern blotfu dato dalla tecnica diW. Neal Burnette,è un gioco sul nomeSouthern blot, tecnica per il rilevamento diDNAsviluppato precedentemente daEdwin Southern. Il rilevamento diRNAè chiamatoNorthern blot.Ci sono molte aziende di reagenti specifici per anticorpi (monoclonaliepoliclonali) contro decine di migliaia di proteine differenti.Gli anticorpi commerciali possono essere costosi, quelli non legati possono essere riutilizzati. Questo metodo è usato inbiologia molecolare,biochimica,immunogeneticae altre discipline.
Campioni possono essere presi da tessuti interi o da colture cellulari. Tessuti solidi sono prima meccanicamente frantumati confrullatori(larghi volumi) o usandoomogeneizzatori(volumi piccoli), o consonicazione. Anche le cellule possono essere aperte con tali metodi. Virus o campioni prelevati da ambienti possono essere fonti di proteine e conseguentemente il western blot non è usato solo negli studi cellulari. Detergenti, sali, e soluzioni tampone possono essere impiegate per aumentare lalisidi cellule e solubilizzare proteine. Inibitori diproteasiefosfatasisono spesso aggiunte per prevenire ladigestionedei campioni da parte dei loro stessienzimi. La preparazione dei tessuti è spesso fatta a temperature basse per evitarne la degradazione. Una combinazione di tecniche biochimiche e meccaniche – comprese vari tipi difiltrazioniecentrifugazioni– possono essere usate per separare differenti cellule eorganuli.
Le proteine del campione sono separate usando l'elettroforesi in gel. La separazione di proteine può avvenire perpunto isoelettrico(pI),peso molecolare, carica elettrica, o una combinazione di questi fattori. La natura della separazione dipende dal trattamento del campione e dalla natura del gel. Questo modo è il più usato per identificare una proteina. Il tipo più comune di elettroforesi in gel impiegagel di poliacrilammide(Elettroforesi su gel di poliacrilammide) e tamponi caricati conlaurilsolfato di sodio(SDS). LaSDS-PAGE(SDS polyacrylamide gel electrophoresis) mantiene polipeptidi in uno stato denaturato una volta trattato con agenti riducenti forti per rimuovere strutture secondarie e terziarie (esempio disolfuro [S-S] e gruppimercaptani[SH e SH]) e permettere la separazione di proteine in base al loropeso molecolare. Le proteine campionate legano il SDS che conferisce loro carica negativa e si muovono in questo modo verso l'elettrodo positivo attraverso le rete di pori del gel. Le proteine più piccole migrano più velocemente attraverso questa rete e le proteine vengono separate in base alla dimensione (misurata inkiloDalton, kDa). La concentrazione di acrilammide determina la risoluzione del gel - maggiore la concentrazione, migliore la risoluzione di proteine a basso peso molecolare. Le proteine viaggiano solo in una dimensione lungo il gel per diversi blot. I campioni sono caricati in pozzetti nel gel. Una striscia è usualmente riservata per unmarcatoreoscala, una miscela commerciale di proteine con peso molecolare definito, tipicamente colorate così da formare bande colorate visibili. Quando latensione elettricaè applicata lungo il gel, le proteine migrano attraverso esso a velocità differenti, in funzione della loro dimensione. Queste differenti velocità di avanzamento (mobilità elettroforetica) permettono la separazione inbandedentro ciascunacorsia.
È inoltre possibile usare l'elettroforesi bidimensionale.
Per rendere accessibili le proteine alla rilevazione dell'anticorpo esse vengono trasferite dal gel ad una membrana diNitrocellulosaoPolivinilidenfluoruro(PVDF). Il metodo principale per il trasferimento è chiamato "electroblotting" e usacorrente elettricaper trasferire le proteine dal gel alla membrana. Le proteine si muovono dal gel alla membrana mentre mantengono l'organizzazione presente nel gel. Un metodo più vecchio di trasferimento consiste nel mettere una membrana sul gel e strati di carta filtrante al di sopra di essa. Il tutto è posto in una soluzione tampone che si muove verso l'alto del filtro percapillarità, portando le proteine con sé. Quest'ultimo metodo non è usato perché richiede troppo tempo. L'electroblottingè preferito. Come risultato di entrambi i processi di "blotting", le proteine sono esposte su una superficie sottile per la rilevazione (vedi sotto). Membrane diverse sono scelte per le loro proprietà non-specifica di legame con proteine diverse. Il legame alla proteina è basato sulle interazioniidrofobiche, così come le interazioni tra la membrana e la proteina. Le membrane dinitrocellulosasono più economiche di quelle inPVDF, ma molto più fragili e non facilmente riutilizzabili.
L'uniformità e l'effettivo trasferimento di proteina dal gel alla membrana può essere controllata colorando la membrana conBlu di Coomassieo conPonceau Sè il più comune dei due, data l'alta sensibilità e solubilità in acqua, più facilmente decolorabile per analizzare la membrana, come descritto sotto.
Dopo aver scelto la membrana per la capacità di legare la proteina, è necessario prevenire le interazioni tra la membrana e l'anticorpo usato per rilevare la proteina bersaglio. Il bloccaggio di legami non specifici è raggiunto ponendo la membrana in una soluzione diluita di proteina - tipicamente 3-5%albumina sierica bovina(BSA) olatte in polvereintampone Tris salino(TBS), con una piccola percentuale di detergente comeTween 20oTriton X-100. La proteina nella soluzione diluita attecchisce alla membrana in tutti i punti dove le proteine bersaglio non hanno attecchito. Questo permette, quando l'anticorpo è aggiunto, che esso non si leghi a siti aspecifici in quanto già occupati dalla proteina precedentemente citata. Questo riduce il "rumore" nel prodotto finale, portando risultati più puliti, e eliminando falsi positivi.
Durante il processo di rilevamento la membrana diventa il provino per la proteina d'interesse con un anticorpo modificato che è collegato a unenzimamessaggero; quando esposto ad un appropriato substrato questo enzima crea una reazione colorimetrica e produce uncolore. Per una serie di ragioni questo processo si svolge, tradizionalmente, in due fasi, anche se esistono metodi per processi a singola fase per determinate applicazioni.
Gli anticorpi primari sono generati quando la specie ospite o le colture dicelluleimmunitarie sono esposti allaproteinadi interesse (o parte ad essa vicina). Normalmente questo è parte della risposta immunitaria, dove essi sono coltivati e usati come dispositivi specifici di rilevamento che legano la proteina direttamente. Dopo il bloccaggio, una soluzione diluita di anticorpo primario (generalmente tra 0,5 e 5 µg/ml) è incubato con la membrana agitandolo delicatamente. Tipicamente, la soluzione è composta da una soluzione tampone con una piccola percentuale di detergente, e qualche volta conlatte in polvereoBSA. La soluzione anticorpo e la membrana possono essere sigillate e incubate assieme per 30 minuti o una notte intera. Può inoltre essere incubata a differenti temperature (a temperature più calde si associano legami più forti) sia sulla specificaproteina(target, il "segnale") e non-specifica ("rumore").
Dopo il risciacquo della membrana per rimuovere l'anticorpo primario non legato, alla membrana è associato un altro anticorpo, diretto a una specifica specie di anticorpo primario. Anticorpi provengono da animali (o colture ibride di provenienza animale,ibridomi), un anticorpo secondario del topo si legherà a qualsiasi anticorpo primario di topo, permettendo risparmi sui costi, consentendo a un intero laboratorio di condividere un'unica fonte di anticorpo prodotto, e fornisce risultati migliori. Questo è conosciuto come anticorpo secondario, e data le sue proprietà bersaglio, ci si riferisce a "anti-topo," "anti-capra," ecc. L'anticorpo secondario è legato solitamente allabiotinao all'enzimamessaggero comefosfatasi alcalinaoperossidasi Armoracia rusticana. Questo significa che diversi anticorpi secondari si legheranno a un anticorpo primario, aumentando il segnale. Comunemente, un legame-perossidasi Armoracia rusticanasecondario è usato per dividere un agentechemiluminescente, e la reazione prodotta emetteluminescenzaproporzionale all'ammontare di proteina. Unapellicola fotograficaè posta contro la membrana; esposta alla luce della reazione crea un'immagine di anticorpi legato al blot. Un sistema più economico utilizza un colorante 4-cloronaftolo all'1% diperossido di idrogeno; la reazione di radicali perossido con il 4-cloronaftolo produce colore porpora scuro, permettendo lafotografiasenza l'utilizzo dipellicolespecifiche.
Come con l'ELISPOTe l'ELISA, l'enzima può essere dato da un substrato di molecole che può essere convertito dall'enzima in un prodotto di reazione colorata visibile sulla membrana (vedi le bande blu nella figura sotto). Un altro metodo con anticorpo secondario rilevatore utilizza un anticorpo fluoro-legato al vicino-infrarosso(NIR). La luce prodotta dall'eccitazione del colorante fluorescente è statica, permettendo un rilevamento accurato delle differenze di segnale prodotte da anticorpi etichetta legati a proteine sul western blot. Le proteine possono essere quantificate perché il segnale generato dalla differenza di quantità di proteine sulle membrane è misurata in modo statico, comparato allachemiluminescenza, ove la luce è misurata in stato dinamico.Una terza alternativa è usare etichette radioattive piuttosto che un enzima accoppiato all'anticorpo secondario, così come etichettare una proteina anticorpo non-legante come la proteina A diStaphylococcusoStreptavidinacon unisotopo radioattivodiIodio. Dato che altri metodi sono più sicuri, veloci, economici, questo è ora il meno usato; il vantaggio di questo metodo è la sensibilità radiografica che permette quantificazioni di proteina molto accurate, quando associato a software specifici (esempio l'Optiquant).
Storicamente il processo di campionamento fu fatto in due passi data la relativa semplicità di produrre anticorpi primari e secondari in processi separati. Questo dà ai ricercatori molti vantaggi in termini di flessibilità, e aggiunge una amplificazione nel rilevamento. Dato l'avvento di analisi proteiche ad alta efficienza e limiti più bassi di rilevamento, c'è stato interesse a sviluppare sistemi a singola fase che permettono maggior velocità di esecuzione e meno consumabili. Questo richiede un provino anticorpo che rileva la proteina d'interesse e che contenga un'etichetta rilevabile, provini che spesso sono disponibili perproteina bersaglio. Il provino primario è incubato con la membrana in un modo simile a quello dell'anticorpo primario in un processo a due fasi, e così è pronto per il rilevamento diretto dopo una serie di lavaggi.
Dopo che i provini non legati sono lavati via, il western blot è pronto per la rilevazione di provini che sono etichettati e legati allaproteinadi interesse. Non tutti i western blot rivelano proteine solo in una banda della membrana. Dimensioni approssimate sono prese dalla comparazione delle bande colorate rispetto al marcatore o scala caricata durante l'elettroforesi. Il processo è ripetuto per una proteina strutturale, comeactinaotubulina, che non cambia tra i campioni. L'ammontare di proteina bersaglio ènormalizzataalla proteina strutturale da controllare nei gruppi. Questa pratica assicura correzioni per l'ammontare della proteina totale sulla membrana, in caso di errori o trasferimenti incompleti.
La rilevazione colorimetrica dipende dall'incubazione del western blot con un substrato che reagisce con l'enzimaconvertitore (comeperossidasi) legato all'anticorpo secondario. Questo converte il colorante solubile in forma insolubile di differenti che precipitano in prossimità dell'enzima e conseguentemente colora la membrana. Lo sviluppo delblotè fermato dal lavaggio dei coloranti. I livelli di proteina sono valutati condensitometria(maggiore ove più colorato) ospettrofotometria.
I metodi con rilevazionechemiluminescentedipendono dall'incubazione del western blot con un substrato che emette luce quando esposto al convertitore dell'anticorpo secondario. La luce è rilevata da pellicola fotografica, e più recentemente dasensori CCDche catturano un'immagine digitale del western blot. L'immagine analizzata condensitometriarileva l'ammontare di proteina colorante e quantifica i risultati in termini di densità ottica. Nuovi software permettono ulteriori analisi come ilpeso molecolare.
I marcatori radioattivi non richiedono substrati enzimatici, permettendo il posizionamento di pellicole araggi Xdirettamente contro il western blot che sviluppa, con l'esposizione, zone scure corrispondenti alla proteina d'interesse. È una tecnica dispendiosa e pericolosa, meglio preferire l'alternativa ECL (enhanced chemiluminescence).
Il provinofluorescenteè eccitato dallalucee l'emissione dell'eccitazione è rilevata dafotosensoricomeCCDequipaggiati di opportuni filtri che catturano un'immagine digitale del western blot; ciò permette ulteriori analisi comepeso molecolaree un'analisi quantitativa del western blot. La rilevazione fluorescente è considerata uno dei migliori metodi per quantificare, anche se meno sensibile dellachemiluminescenza.
La maggior differenza tra membrane dinitrocellulosaePVDFè la capacità di supportare l'eliminazione di anticorpi per il riutilizzo della membrana con provini successivi. Mentre ci sono protocolli ben definiti per membrane in nitrocellulosa, quelle in PVDF permettono riutilizzi numerosi prima di perdere sensibilità. Un'altra differenza è che, diversamente dalla nitrocellulosa, PVDF deve essere tenuto in soluzione al 95% dietanolo,isopropanoloometanolo, prima dell'uso. Membrane PVDF tendono ad essere più sottili e robuste nell'uso.
L'elettroforesi bidimensionaleo elettroforesi 2D è un tipo di tecnicaelettroforeticautilizzata nel campo dellaproteomicaper separare miscele proteiche complesse (formate cioè da più specie proteiche differenti), come ad esempio una miscela diproteineestratta da unacellulain un dato momento delciclo cellulare. La tecnica, come anticipa il nome, consta di due dimensioni ortogonali lungo le quali sono separate le diverse proteine. In proteomica, il termineortogonaleindica in genere due dimensioni lungo le quali la separazione avviene sfruttando principi fisici differenti, che non sono influenzati l'uno dall'altro. Nel caso dell'elettroforesi bidimensionale, i principi più utilizzati sono ilpunto isoelettricoe ilpeso molecolare.