Endonucleasi

Leendonucleasisonoenzimiidroliticiidentificati neglianni settanta, che scindono illegame fosfodiestericoall'interno di una catena polinucleotidica, dividendola in duepolimeri, a differenza delleesonucleasiche ne distaccano il nucleotide terminale. Endonucleasi sono coinvolte nella riparazione delDNAe nella maturazione dell'RNAdegliEucarioti.
Alcuni enzimi, come le deossiribonucleasi I, tagliano il DNA in maniera relativamente aspecifica (senza considerare la sequenza); mentre altri, come le endonucleasi di restrizione, tagliano il DNA solo in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche.
Sono endonucleasi sequenza-specifiche glienzimi di restrizionebatterici, che tagliano il DNA in regioni particolari definite siti di restrizione. Spesso tale idrolisi avviene insequenze palindromiche(sequenze che lette nella stessa polarità su entrambi I filamenti complementari risultano essere identiche) lunghe circa 4-6 bp e in modo asimmetrico creando delle estremità coesive (ciò permette la generazione di molecole di DNA che si autoassemblano in varie combinazioni), oppure effettuare un taglio centrale creando estremità piatte o "blunt". È un sistema di riconoscimento di DNA estraneo dei batteri, funge da meccanismo di difesa contro agenti estranei come i virus.
Gli enzimi di restrizione sono ampiamente utilizzati nella tecnologia del DNA ricombinante in quanto permettono di ottenere dei frammenti di DNA che digeriti con lo stesso enzima possono essere connessi, una volta appaiati mediante ibridazione, dalla DNA ligasi che catalizza la formazione del legame fosfodiesterico.
Ci sono tre categorie di endonucleasi di restrizione: i tipi I e III formano dei grandi complessi aventi sia attività endonucleasica che metilasica. Entrambi richiedono energia sotto forma di ATP per la loro funzione. Il tipo I taglia il DNA in punti casuali che possono essere distanti anche più di 1000 bp dalla sequenza di riconoscimento a cui si lega. Il tipo III taglia il DNA a circa 25 bp dalla sequenza di riconoscimento. Il tipo II, isolato per la prima volta daHamilton Smithnel 1970, si comporta in modo diverso in quanto non necessita di ATP nei suoi processi di degradazione. Alcuni esempi di enzimi di restrizione di tipo II includono BamHI, EcoRI, EcoRv e HaeIII.
La nomenclatura degli enzimi di restrizione si basa sul genere e sulla specie del batterio dal quale è stato isolato l'enzima di restrizione. Così, per esempio, "EcoRI" significa:
- E: genereEscherichia,
- co: speciecoli,
- R: ceppo RY13,
- I: prima endonucleasi isolata.
Gli enzimi di restrizione in genere riconoscono brevi sequenze bersaglio di circa 4-8 paia di basi, ad esempio l'enzima EcoRI riconosce e taglia la sequenza 5'-GAATTC-3'. Alcune endonucleasi possono tagliare anche DNA a singolo filamento o RNA. Infatti, oltre a DNA a doppio filamento, all'azione di questi enzimi sono sottoposti anche:
-giunzioni di Holliday;
- molecole di DNA a triplo o quadruplo filamento (G-quadruplex);
- molecole ibride a doppio filamento (uno costituito da DNA, l'altro da RNA);
- molecole di DNA sintetiche, che possono contenere basi alternative oltre alle quattro basi azotate presenti nella molecola di DNA naturale.
Inoltre, la ricerca attualmente mira a realizzare endonucleasi di restrizione artificiali o sintetiche, aventi siti di ricognizione unici all'interno del DNA.
Dal taglio mediante endonucleasi di restrizione si possono formare estremità piatte (il taglio dei due filamenti avviene esattamente nello stesso punto) o appiccicose (i punti di taglio sui due filamenti sono sfalsati di alcuni nucleotidi).
La tabella illustra le principali endonucleasi procariotiche ed eucariotiche
Xeroderma pigmentosaè una malattia autosomica recessiva rara, causata da un'endonucleasi UV-specifica difettiva. I pazienti che presentano l'enzima mutato sono incapaci di riparare danni al DNA causati dalle radiazioni solari.
L'anemia falciformeè una patologia causata da una mutazione puntiforme. La sequenza alterata dalla mutazione elimina il sito di riconoscimento dell'endonucleasi di restrizione MstII che riconosce la sequenza nucleotidica.
Mutazioni dell'endonucleasi tRNA-splicing causano l'ipoplasia pontocerebellare. L'ipoplasia pontocerebellare (PCH) rappresenta un gruppo di disordini neurodegenerativi autosomici recessivi che è causato da mutazioni in tre delle quattro subunità del complesso dell'endonucleasi tRNA-splicing.
Le endonucleasi rivestono un ruolo nella riparazione delle basi danneggiate. L'enzima AP-endonucleasi agisce in modo specifico catalizzando l'incisione del DNA esclusivamente nei siti AP, preparando in tal modo il DNA per la successiva escissione dei nucleotidi. Ad esempio, quando si verifica la depurinazione, questa lesione lascia lo zucchero desossiribosio con una base mancante. L'AP endonucleasi riconosce questo zucchero e taglia il DNA in questo sito e quindi permette di riparare il DNA. Le cellule di E. coli contengono due tipi di enzimi AP: endonucleasi IV (endoIV) ed esonucleasi III (exoIII). Mentre negli eucarioti, c'è un solo tipo di endonucleasi AP.