РНК-интерференция

РНК-интерференция(англ.RNA interference,RNAi) — процесс подавленияэкспрессии генана стадиитранскрипции,трансляции, деаденилирования или деградациимРНКпри помощи малых молекул РНК.
Процессы РНК-интерференции обнаружены вклеткахмногихэукариот: уживотных,растенийигрибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защитеклетокотвирусов, паразитирующихгенов(транспозонов), а также в регуляцииразвития,дифференцировкии экспрессии геноворганизма.
Процесс РНК-интерференции начинается с действияферментаDicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21—25нуклеотидов, называемыеsiRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплексаRISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется скомплементарнойпоследовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНКбелкомArgonauteлибоингибированиетрансляциии/или деаденилирование мРНК. Эти события приводятк подавлению экспрессии(сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК — siRNA имикроРНК.
Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает RNAi полезным инструментом для исследований с использованиемкультур клетоки живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызываютсупрессиюспецифических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в областимолекулярной биологии,биохимии,биотехнологииимедицины. Так, например, РНК-интерференцию используют для систематического «выключения» генов в клетках и установления функций генов при изученииделения клетки.
Исторически РНК-интерференция была известна под названием посттранскрипционногосайленсинга генов. Только после того, как эти предположительно несвязанные процессы были исследованы, стало ясно, что все они описывали проявления RNAi. В2006 годуамериканскиеучёныеЭндрю ФайериКрейг МеллополучилиНобелевскую премию в области физиологии и медициныза работы по изучению РНК-интерференции унематодыCaenorhabditis elegans, опубликованные в1998 году.
До открытия РНК-интерференции у растений были описаны факты ингибированиятранскрипцииантисмысловыми РНК. В1990 годудля того, чтобы изменить окраску цветковпетунии(Petunia hybrida), в растения были введены дополнительные копии гена халконсинтазы — фермента, необходимого для синтеза розового и фиолетового пигментов. Однако повышение экспрессии гена синтазы не привело к проявлению более тёмной окраскиоколоцветника, напротив, цветки стали более светлыми и даже частично белыми. Полученные результаты свидетельствовали о том, что активностьферментане растёт, а снижается. Гены халконсинтазы экспрессировались на более низком уровне, чем до введениятрансгена.Через некоторое время «подавление гена» было описано у грибаNeurospora crassa, однако данный процесс не был соотнесён с процессами, описанными для растений. Дальнейшие исследования показали, что у растений деградация мРНК приводит к снижению активности гена по механизму посттранскрипционного ингибирования. Данное явление получило название «косупрессии экспрессии гена», однако механизм данного процесса не был известен.
Подобный неожиданный эффект был описан при попытке повышения устойчивости растений квирусам. Было известно, что растения, экспрессирующие вирусные белки, имеют повышенную устойчивость к вирусной инфекции, однако дальнейшие исследования показали, что устойчивость к инфицированию другими вирусами обеспечивается лишь короткими участками некодирующих вирусных РНК. Исследователи также полагали, что трансгенные вирусные РНК могут также ингибировать репликацию вирусов. Обратный эксперимент, в ходе которого короткие последовательности генов растений были введены вгеномвируса, показал, что происходит супрессия генов-мишеней в заражённых растениях. Данный феномен был назван «сайленсингом генов, вызванным вирусами» (англ.virus-induced gene silencing, VIGS), а совокупность подобных явлений была названа посттранскрипционным сайленсингом генов (англ.post transcriptional gene silencing).
После наблюдений, сделанных на растениях, многие лаборатории по всему миру пытались обнаружить подобное явление в других организмах.Крейг МеллоиЭндрю Файерв статье в журналеNatureв1998 годуописали эффект сайленсинга генов после введения двуцепочечной РНК в организм круглого червяCaenorhabditis elegans. В исследованиях по регуляции синтеза мышечных белков Мелло и Файера показали, что введение мРНК или антисмысловых РНК не влияло насинтез белка, в то время как введение двуцепочечных РНК успешно снижало экспрессию гена-мишени. Результатом этих работ стало появление терминаРНК-интерференция. Исследования Файера и Мелло примечательны тем, что в ходе их работы было выявлено действующее начало системы посттранскрипционного сайленсинга генов. В2006 годуза исследования в области РНК-интерференции Файер и Мелло получилиНобелевскую премию в области физиологии и медицины.
Рибонуклеиновыйкомпонент системы РНК-интерференции может быть представлен эндогенными и экзогенными короткими двуцепочечными олигонуклеотидами двух типов —микроРНКималыми интерферирующими РНК(англ.small interfering RNA, siRNA).
Малые интерферирующие РНК представляют собой двуцепочечные РНК длиной 21—25 нуклеотидов с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах. Каждая цепочка нуклеотидов имеет фосфатную группу на 5'-конце игидроксильнуюгруппу на 3'-конце. Такая структура siRNA образуется в результате активности ферментаDicer,субстратомкоторого являются длинные двуцепочечные РНК иликороткие РНК, содержащие шпильки. Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее вкаталитическийкомплексRISC, где при участии белка Argonaute происходит расплетение дуплекса и образование комплементарного комплекса короткой антисмысловой РНК со специфической последовательностью в кодирующей области мРНК, что приводит к дальнейшей деградации последней. В отличие от микроРНК, малые интерферирующие РНК, как правило,точноспариваются с мишенью и приводят к эндонуклеолитическому расщеплению единственной специфической мРНК
МикроРНК(англ.MicroRNA, miRNA) представляют собойнекодирующие РНКдлиной 21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляцииэкспрессии генов. МикроРНК связываются со специфическими последовательностямимРНКв 3'-нетранслируемой области и вызывают ингибированиетрансляциилибо удалениеполи(А)-хвоста. Молекулы микроРНКэкспрессируютсяв виде первичныхтранскриптовдлинныхгенов, кодирующих предшественники микроРНК (англ.pri-miRNA, primordial miRNA), и послепроцессингавядреклетки представляют собой pre-miRNA — структуры вида стебелёк-петля длиной около 70нуклеотидов. Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит фермент с активностьюРНКазы III, называемыйDrosha, и белок, связывающий двуцепочечную РНК, —Pasha. Двуцепочечная часть pre-miRNA связывается и разрезается белком Dicer (уDrosophila melanogasterмикроРНК и малые интерферирующие РНК процессируются разными изоформами ферментаDicer); при этом образуется зрелая молекула микроРНК, которая может далее поступать вRISC. Известен также путь образования микроРНК, независимый от Dicer. Процессинг предшественника микроРНК в данном случае осуществляется белком Argonaute 2.
У животных микроРНК обычно имеют неполное спаривание с мРНК-мишенью и могут ингибировать трансляцию многих мРНК со сходными последовательностями. У растений спаривание во многих случаях может быть полным.
Каталитической частьюRISC(комплекс сайленсинга, индуцированный РНКангл.RNA-induced silencing complex) являются белки-эндонуклеазысемействаArgonaute, которые разрезаютмРНК, комплементарные связанноймалой интерферирующей РНК. Так как фрагменты, которые образуются после разрезания белкомDicerявляются двуцепочечными, потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК (англ.siRNA). Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой (англ.guide strand) связывается с белком Argonaute иподавляет экспрессию гена. Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей (англ.passenger strand, anti-guide strand) подвергается деградации во время активации RISC. Хотя ранее считалось, что цепочки разделяетАТФ-зависимаягеликаза, в настоящее время показано, что данный процесс является АТФ-независимым и осуществляется непосредственно белками, входящими в состав RISC. Выбор направляющей цепочки не зависит от направления, в которомDicerразрезает двуцепочечную РНК до поступления в RISC. Белок R2D2 может являться фактором, различающим при связывании более стабильный 5'-конец цепочки-спутницы.
При помощирентгеноструктурного анализаизучено связывание молекул РНК с РНК-связывающим доменом белка семейства Argonaute. При этом фосфорилированный 5'-конец одноцепочечной РНК попадает в консервативный карман белка, где 5'-концевой фосфат удерживается координационными связями при участииионаMg, а адениновый остаток вступает в стекинг-взаимодействия с консервативным остаткомтирозина. Данный участок белка, по-видимому, стимулирует связывание малых интерферирующих РНК с мишенью мРНК.
К настоящему времени механизм, по которому RISC находит комплементарную мРНК внутри клетки, изучен недостаточно. Показано, что для успешной деградации мРНК комплексом siRISC трансляция не требуется. Более того, показано, что путь РНК-интерференции может быть более эффективным против мРНК-мишеней, трансляция которых не осуществляется в текущий момент времени. Белки семейства Argonaute являются каталитическим компонентом RISC, и находятся в специфических районахцитоплазмы, известных как Р-тельца (англ.P-bodies); показано, что активность малых интерферирующих РНК и деградация мРНК максимальны именно в Р-тельцах. Р-тельца являются важной частью системы РНК-интерференции. Их разрушение приводит к снижению эффективности данного процесса..
РНК-интерференция является РНК-зависимым процессомсайленсингагенов, который контролируется RISC. RISC активируется вцитоплазмеклетки, где короткие двуцепочечные молекулы РНК взаимодействуют с каталитическим компонентом RISC — белкомArgonaute. В случае, когда двуцепочечная РНК является экзогенной (появляется в результате лабораторных манипуляций или инфицирования РНК-содержащим вирусом), РНК оказывается непосредственно в цитоплазме, где разрезается на короткие фрагменты (siRNA) белкомDicer, и образующийся siRNA-содержащий функциональный комплекс называется siRISC. В случае пре-микроРНК,экспрессирующихсяс геновнекодирующих РНК, RNAi запускается эндогенной двуцепочечной РНК. Первичныетранскриптытаких генов сначалапроцессируютсявядрес образованием пре-микроРНК, содержащих специфические структуры «стебель-петля». Пре-микроРНКзатем экспортируются в цитоплазму и разрезаются белком Dicer с образованием микроРНК, которые включаются в состав микроРНК-содержащего комплекса, называемого miRISC. Таким образом,RISCявляется местом, где пересекаются два пути РНК-интерференции, индуцированные экзогенными и эндогенными двуцепочечными РНК.
Экзогенная двуцепочечная РНК запускает систему РНК-интерференции, активируяфермент-рибонуклеазуDicer, который связывает и разрезает РНК-дуплексы, при этом образуются siRNA-двуцепочечные фрагменты длиной 21—25 пар нуклеотидов, с несколькими неспаренными основаниями на каждом конце.Биоинформационныйанализ геномов многих организмов предполагает, что такая длина siRNA увеличивает их специфичность к гену-мишени и снижает вероятность неспецифического связывания. Далее siRNA разделяются на отдельные цепочки и вовлекаются вRISC(siRISC). После интеграции в RISC, siRNAкомплементарносоединяются с мРНК-мишенью и вызывают разрезаниемРНК, таким образом предотвращая еётрансляцию.
Экзогенная двуцепочечная РНК узнаётся и связывается специальными эффекторными белками (например, RDE-4 уCaenorhabditis elegansи R2D2 уDrosophila), усиливающими активность белка Dicer. Эти эффекторные белки связываются лишь с длинными двуцепочечными РНК, однако механизм сродства к таким субстратам неизвестен. Такие РНК-связывающие белки облегчают перенос разрезанныхsiRNAк комплексуRISC.
УCaenorhabditis elegansпуть инициации РНК-интерференции в клетке может быть усилен в результате синтеза «вторичных»siRNAна матрице «первичных» малых интерферирующих РНК. «Вторичные» siRNA отличаются по структуре от образовавшихся в результате активности белка Dicer, и, по-видимому, синтезируются РНК-зависимой РНК-полимеразой (англ.RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP).
Многиеэукариотыиспользуют систему РНК-интерференции для поддержания структурыгенома. Химическая модификациягистонови переход соответствующих участковхромосомв состояниегетерохроматинаприводит к снижению транскрипции соответствующих генов; данный процесс относится ксайленсингу транскрипции, индуцированному РНК(англ.RNA-induced transcriptional silencing, RITS), и осуществляется сложным комплексом белков. В делящихсядрожжахданный комплекс содержитArgonaute, белок с хромодоменом Chp1, и белок, называемый Tas3 с неизвестной функцией. Как следствие, индукция и расширениегетерохроматиновыхучастков требует наличия белков Argonaute иРНК-зависимой РНК-полимеразы. В действительности,делецииданных генов в делящихся дрожжахSchizosaccharomyces pombeнарушаетметилированиегистонов и образованиецентромер, вызывает замедление или остановкуанафазыв процесседеления клетки. В некоторых случаях подобные процессы связаны с модификацией гистонов и для них показан эффект повышения транскрипции соответствующих генов.
Механизм, по которому комплекс RITS вызывает образованиегетерохроматина, изучен не полностью. Значительная часть исследований направлена на изучение участка геномадрожжей, регулирующего тип спаривания (англ.mating-type region), однако данный участок может быть нерепрезентативным в случае геномов других организмов. Для сохранения существующих районов гетерохроматина RITS образует комплексы с малыми интерферирующими РНК, комплементарными соответствующим генам и прочно связывается с метилированными гистонами. Далее RITS действует в момент транскрипции, деградируя любые пре-мРНК, синтезируемые РНК-полимеразой. Для образования подобных участков гетерохроматина требуется фермент Dicer, который синтезирует первичные комплементарные siRNA, участвующие в деградации транскриптов. Поддержание участков хромосом в состоянии гетерохроматина, по-видимому, является примеромположительной обратной связи, так как малые интерферирующие РНК, входящие в состав RITS, образуются из случайных транскриптов, синтезированных РНК-зависимой РНК-полимеразой. Данные, полученные при исследовании центромерных районов хромосом дрожжей, вероятно, не могут быть распространены намлекопитающих, так как у последних поддержание гетерохроматиновых участков не всегда зависит от системы РНК-интерференции.
Наиболее распространённой формойредактирования РНКу высших эукариот является превращениеаденозинавинозинв двуцепочечныхРНК, которое осуществляетсяферментомаденозиндеаминазой. В2000 годубыло предположено что путь РНК-интерференции и путь редактирования РНК A→I могут конкурировать за общий субстрат двуцепочечной РНК. Действительно, некоторые предшественники малых интерферирующих РНК могут подвергаться редактированию A→I, причём данный механизм может регулировать процессинг и экспрессию зрелых молекул малых интерферирующих РНКУ млекопитающих описан как минимум один фермент, выводящий молекулы малых интерферирующих РНК из системы РНК-интерференции.. Исследования линий круглого червяCaenorhabditis elegans, не имеющих фермента редактирования РНК A→I, показали, что редактирование РНК может препятствовать сайленсингу эндогенных генов и трансгенов по пути РНК-интерференции.
Организмы отличаются по способности воспринимать чужеродные двуцепочечные РНК и использовать их в процессе РНК-интерференции. Эффекты РНК-интерференции у растений иCaenorhabditis elegans(но не удрозофилыимлекопитающих) могут наследоваться, а могут быть системными. У растений система РНК-интерференции может распространять малые интерферирующие РНК поплазмодесмам(каналам вклеточных стенках, осуществляющих коммуникацию и транспорт). Наследование обеспечиваетсяметилированиемпромоторов, изменённый паттерн метилирования передаётся в результате деления дочерним клеткам. Значительные отличия в мишенях малых интерферирующих РНК междурастениямииживотнымиобусловлены тем, что у растениймикроРНКвысоко комплементарны рибонуклеиновым мишеням и вызывают деградацию мРНК в составе RISC, а у животных малые интерферирующие РНК сильно отличаются по последовательностинуклеотидови вызываютрепрессиютрансляции. МикроРНК могут оказывать влияние на инициациютрансляциипутём взаимодействия с факторами инициации трансляции и споли(А)-трактом мРНК.
Некоторые простейшие, например,Leishmania majorиTrypanosoma cruzi, не имеют никаких компонентов пути РНК-интерференции. Большая часть компонентов системы РНК-интерференции также отсутствует у некоторых грибов, например, умодельного организмаSaccharomyces cerevisiae. Показано наличие компонентов системы РНК-интерференции в других делящихся дрожжах, например,Saccharomyces castelliiиCandida albicans. Индукция двух белков системы РНК-интерференции изSaccharomyces castelliiоблегчает данный процесс уSaccharomyces cerevisiae. Тот факт, что некоторыеаскомицетыибазидиомицетыне имеют пути РНК-интерференции, указывает на то, что гены, кодирующие белки, необходимые для данного процесса, были утеряны независимо во многих родословных грибов, вероятно, по причине появления в ходеэволюциинового пути со сходными функциями, или ввиду утериадаптивногопреимущества в данныхэкологических нишах.
Экспрессия геновупрокариотрегулируется системой, основанной на РНК, сходной по некоторым параметрам с системой РНК-интерференции. У прокариот описаны гены, кодирующие специальные РНК, которые контролируют распространение итрансляциюмРНК, путём спаривания с комплементарными последовательностями. Однако, данные регуляторные РНК не являются полными аналогамималым интерферирующим РНК, так как в данный процесс не вовлекается ферментDicer. Показано, что у прокариот система коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) является аналогичной системе РНК-интерференции у эукариот, хотя ни для одного из компонентов прокариотической системы не известныгомологичныеэукариотические белки.
Система РНК-интерференции является важной частьюиммунного ответаквирусами к другому чужеродномугенетическомуматериалу. У растений система РНК-интерференции предотвращает распространениетранспозонов. Растения имеют несколькогомологовбелкаDicer, которые направлены против различных типов вирусов. Показано, что индуцированныйсайленсинг генову растений может передаваться от подвоя кпрививаемому растению. Эта особенность адаптивной иммунной системы растений позволяет после первоначального локального проникновения вируса отвечать на повторные проникновения вируса всему организму. В ответ многие вирусы в ходе эволюции приобрели механизмы, подавляющие систему РНК-интерференции в клетках растений. Описаны вирусные белки, связывающие короткие двуцепочечные фрагменты РНК с одноцепочечными выступами, образующиеся в результате активности белка Dicer. Некоторые растения экспрессируют эндогенныемалые интерферирующие РНКв ответ на заражение некоторымибактериями. Эти эффекты могут быть частью общего ответа напатогены, в результате которого в организме хозяина снижаются многиеметаболическиепроцессы в ответ на инфекцию.
Хотя в клетках животных, как правило,экспрессируетсяменьшее количество вариантов ферментаDicer, чем у растений, система РНК-интерференции у животных в некоторых случаях участвует в антивирусном ответе. РНК-интерференция уювенильныхи взрослых особейDrosophilaиграет важную роль во врождённом противовирусномиммунитетеи принимает участие в защите против таких патогенов, какX-вирус Дрозофилы. Сходную роль в иммунитете играет система РНК-интерференции уCaenorhabditis elegans: экспрессия белковArgonauteповышается при вирусной инфекции, при этом черви, в организме которых повышаетсяэкспрессия геновпути РНК-интерференции, приобретают устойчивость к вирусной инфекции.
Роль системы РНК-интерференции воврождённом иммунитетемлекопитающихизучена не полностью. Однако тот факт, что некоторые вирусы содержат гены, снижающие ответ системы РНК-интерференции в клетках млекопитающих, свидетельствуют о наличиииммунного ответа, вызванного системой РНК-интерференции. Однако, гипотеза иммунитета, опосредованного системой РНК-интерференции у млекопитающих, является недостаточно обоснованной. Хотя недавно Майяр и соавт.и Ли и соавт.представили новые свидетельства  существования в клетках млекопитающих функционального противовирусного пути РНК-интерференции.Малые интерферирующие РНК,экспрессируемыевирусом герпеса, могут вызывать образованиегетерохроматинаи приводить к переходу вируса влатентное состояние.
Показано, что удаление одной копии гена Dicer1 умышейприводило к появлению большего количествоопухолей, чем в контрольной группе, также понижались уровни микроРНК и выживаемость. Полное удаление гена Dicer1 блокировало образование опухолей, вероятно, также и потому, что некоторый уровень экспрессии продукта гена Dicer1 требуется для роста клеток.
В работах2013 годапоказано, что в клетках млекопитающих имеется система РНК-интерференции, проявляющая противовирусную активность.Другие функции системы РНК-интерференции вирусов млекопитающих представлены микроРНК вируса простого герпеса, которые действуют как организаторыгетерохроматинаи приводят клатентностивируса.
При репрессиитрансляции, на некоторых этапахразвитияживых организмов, особенно на стадииморфогенезаи поддержания клеток в недифференцированном состоянии (например, в случаестволовых клеток), важное значение имеют эндогенно экспрессируемыемикроРНК, которые являются продуктамиинтронныхи межгенныхучастков. Роль таких эндогенно экспрессируемых микроРНК в подавленииэкспрессии геновбыла впервые описана унематодыCaenorhabditis elegansв1993 году. У растений такая функциямикроРНКбыла впервые описана намодельном объектеArabidopsis thaliana, для которого было показано влияние "JAW микроРНК" на регуляцию нескольких генов, контролирующих внешний вид. У растений гены, регулируемые микроРНК, как правило, являютсяфакторами транскрипции, поэтому микроРНК регулируют целыегенные сети, изменяя экспрессию ключевых генов (в том числе, факторов транскрипции ибелков F-box) в ходеэмбрионального развития. У многих организмов, в том числе и у человека, микроРНК принимают участие в образовании опухолей и нарушении регуляцииклеточного цикла. В данном случае микроРНК могут являться каконкогенами, так исупрессорами опухолей.
Последовательности малых интерферирующих РНК и микроРНК комплементарны последовательностям нуклеотидов промоторных участков. Связывание siRNA и микроРНК с этими участками может приводить к повышению транскрипции генов иактивации РНК. Увеличение экспрессии данных генов происходит при участии белковDicerиArgonaute, также происходит деметилирование гистонов.
Методы вычислительногофилогенетическогоанализа свидетельствуют о том, что наиболее поздний общий предок всех эукариот имел РНК-интерференцию, отсутствие же системы РНК-интерференции у некоторых эукариот является приобретённым признаком. Эволюционно древний путь РНК-интерференции, по-видимому, содержал ферменты, аналогичныеDicer,Argonaute,PIWI, а также РНК-зависимую РНК-полимеразу. Вероятно, наряду с РНК-интерференцией, эти ферменты играли в клетке и другие роли. Масштабные исследования в области сравнительнойгеномикисвидетельствуют о том, что малая группа, ставшая родоначальником всех эукариот также имела компоненты, тесно связанные с системами деградации ДНК, например, сходные сэкзосомными комплексами. Семейство белков Argonaute, общее для многих эукариот, а такжеархейи некоторых бактерий (например,Aquifex aeolicus), гомологично и эволюционно происходит от компонентов системы инициациитрансляции.
Наиболее древней функцией системы РНК-интерференции, как правило, называют защиту от экзогенных генетических элементов — геномов вирусов итранспозонов. Некоторые связанные функции, например, модификациягистонов, могли быть представлены у предков современных эукариот, в то время как другие — например, регуляция развития при помощи микроРНК, по-видимому, появились позже.
Гены системы РНК-интерференции у многих эукариот являются компонентами врождённой иммунной системы, противостоящей вирусам. Некоторые вирусы растений приобрели механизмы подавления ответа системы РНК-интерференции клетки хозяина. Скорость изменения генов пути РНК-интерференции уDrosophilaнаправляетсяположительным отбором. Гены системы РНК-интерференции эволюционируют с очень высокой скоростью в сравнении с другими генами генома дрозофилы.
Система РНК-интерференции часто используется в экспериментальной биологии для изучения функции генов в культурах клеток и в модельных организмахin vivo. Синтетическую двуцепочечную РНК, комплементарную заданному гену, вводят в клетку или организм, где чужеродная молекула РНК запускает систему РНК-интерференции. Этот метод позволяет исследователям значительно снижать уровень экспрессии соответствующего гена. Изучение последствий снижения экспрессии интересующего гена позволяет выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Так как система РНК-интерференции не может полностью выключить экспрессию гена, данный метод называется «нокдауном гена» — в отличие от полного удаления гена, «нокаута гена».
Значительные достижения в областивычислительной биологиипозволяют разрабатывать двуцепочечные РНК, которые обеспечивают максимальное снижение экспрессии гена-мишени и обладают минимальными побочными эффектами. Побочные эффекты могут возникать в случае, когда вводимая молекула РНК имеет последовательность, комплементарную нескольким генам одновременно, что приводит к снижению экспрессии нескольких генов на недостаточную величину. Подобные трудности возникают часто в случае, когда двуцепочечная РНК содержит повторяющиеся последовательности. Изучение геномовHomo sapiens,Caenorhabditis elegans, иSchizosaccharomyces pombeпоказало, что около 10 % молекул малых интерферирующих РНК будут приводить к значительным побочным эффектамРазработано значительное количество компьютерных программ для подбора последовательностей малых интерферирующих РНК, в том числе, специфичных для млекопитающихи вирусов. Предлагаемые последовательности siRNA автоматически проверяются на перекрёстную активность.
В зависимости от организма и экспериментальной системы, экзогенные РНК могут быть сконструированы длинными и являться мишенью белка Dicer, либо короткими и являться субстратами малых интерферирующих РНК. Для большинства клеток млекопитающих предпочтительнее использовать более короткие РНК, так как длинные двуцепочечные РНК у млекопитающих вызываютинтерфероновыйответ, формуврождённого иммунитета, неспецифической реакции на чужеродный генетический материал. Дляооцитовмыши, а также для клеток эмбрионов мыши на ранних стадиях развития интерфероновый ответ на экзогенные двуцепочечные РНК не характерен, поэтому эти клетки являются удобной системой изучения нокдауна генов у млекопитающих. Для использования системы РНК-интерференции в лабораторных условиях были разработаны специальные методы, не требующие прямого введения малых интерферирующих РНК в клетку, например, системытрансфекцииплазмидой, кодирующие транскрибируемые последовательности siRNA,лентивирусныевекторы, позволяющие индуцировать или инактивировать транскрипцию, называемые такжеангл.conditional RNAi.
Стратегию искусственной регуляции генов альтернативную РНК-интерференции обеспечивает методCRISPRiдействующий на уровне включения/выключения транскрипции
Методыфункциональной геномики, использующие систему РНК-интерференции применяют обычно наCaenorhabditis elegansиDrosophila melanogaster, так как данные животные являются наиболее часто используемыми моделями и система RNAi в этих организмах работает наиболее эффективно.Caenorhabditis elegansявляется удобным объектом для исследований при помощи РНК-интерференции по двум причинам — во-первых, эффекты сайленсинга генов у нематоды наследуются, и, во-вторых, потому что доставка двуцепочечной ДНК в нематоду чрезвычайно проста. Нематодам можно скармливать клетки бактерий, например,Escherichia coli, содержащие требуемые двуцепочечные РНК, которые при этом усваиваются через кишечник. Данный способ доставки РНК с пищей является эффективным с точки зрения эффективности сайленсинга генов и одновременно намного более дешёвым, простым и быстрым, чем обмакивание червей в раствор, содержащий двуцепочечные РНК или введение двуцепочечных РНК вгонады. У большинства других организмов доставка двуцепочечных РНК представляется намного более трудоёмкой, однако принимаются попытки крупномасштабного исследования геномов в культурах клеток млекопитающих.
Подходы к созданию библиотек РНК-интерференции для полных геномов намного сложнее, чем в случае определённого набора малых интерферирующих РНК для заданного эксперимента. Для создания библиотек siRNA, а также прогнозирования их эффективности длянокдауна генов, часто применяютискусственные нейронные сети. Массовыескринингигеномов являются многообещающими методиками для аннотации геномов, что привело к развитию методов высокопроизводительного скринирования на основе технологииДНК-микрочипов. Под вопросом остаётся возможность использования данных методик для исследования других организмов, — например, паразитических круглых червей.
Исследования в области функциональной геномики с использованием методов РНК-интерференции, являются привлекательными для картирования геномов и аннотации генов у растений, так как многие растения являютсяполиплоидами, что затрудняет исследования при помощи традиционных методовгенетической инженерии. Например, РНК-интерференция успешно используется в функциональной геномике для изученияTriticum aestivum(гексаплоид), а также и в случае других модельных растений —Arabidopsis thalianaикукурузы.
Возможно применение методов РНК-интерференции втерапии, в частности вРНК-терапии. Хотя введение длинных двуцепочечных РНК в клетки млекопитающих затруднено из-за интерферонового ответа, успешно используются молекулы, подобные малым интерферирующим РНК. Были произведеныклинические испытаниятерапиидеградации сетчаткии леченияреспираторного синцитиального вирусапри помощи РНК-интерференции, также была показана эффективность системы RNAi для терапии повреждений печени на лабораторных мышах.
Другим возможным клиническим применением РНК-интерференции является лечение вируса простогогерпесатипа 2 (например, вHarvard University Medical School) и ингибирование экспрессии генов вирусов в опухолевых клетках, нокдаун рецепторов хозяина кВИЧи корецепторов, сайленсинг геновгепатита Aигепатита B, сайленсинг генов вирусагриппа, ингибирование репликации вирусакори. Также возможно лечение нейродегенеративных заболеваний, например,болезни Хантингтона. РНК-интерференцию также часто считают многообещающим способом лечения опухолей путём выключения генов, повышенно экспрессирующихся в клетках опухолей, либо генов, принимающих участие в делении клетки. Важной областью исследований в области РНК-интерференции для клинического применения является разработка методов безопасной доставки малых РНК, например, подбор векторных систем, длятерапии генами.
Несмотря на то, что появляются новые исследования на культурах клеток, подтверждающие потенциальную возможность терапии лекарствами на основе компонентов системы РНК-интерференции, остаются нерешёнными вопросы относительно безопасности таких методов лечения, в том числе, неочевидны последствия от побочных эффектов репрессии генов со сходными нуклеотидным последовательностями. Методы вычислительной геномики показывают, что подобные побочные эффекты ошибочного связывания составляют до 10%. Одно из крупных исследований заболеваний печени на мышах, показало более высокий уровень смертности среди экспериментальных животных, что было объяснено исследователями «перегрузкой» двуцепочечными РНК (miRNA,shRNA), так как малые РНК, содержащие шпильку процессируются в ядре и экспортируются в цитоплазму по механизмуактивного транспорта. Все рассмотренные факты исследуются и в настоящее время, что ограничивает потенциальные приложения методов РНК-интерференции для терапии.
Кроме того существенным препятствием в развитии методов терапии с помощью РНК-интерференции является то, что доставка малых интерферирующих (миРНК) пока крайне неэффективна, и чрезвычайно высокие дозы препарата необходимы для достижения даже минимально значимого нокдауна гена-мишени. Однако разработанные в последнее время технологии позволяют надеяться, что в скором времени этот способ терапии все же войдёт и в клиническую практику. Так, например, обнаружено, что одновременная инъекция миРНК связанной с  холестерином (chol-siRNA) и, обладающего эндосомолитическими свойствами, полимера  ARC-520 позволила добиться более чем более 500-кратного повышения эффективности и достигнуть 90% снижения экспрессии гена-мишени у мышей in vivo..
Разрабатываются способы использования РНК-интерференции для лечения персистирующей ВИЧ-инфекции первого типа. Вирусы, подобные ВИЧ-1 представляют собой сложную мишень для системы RNAi, так как требуют сочетания нескольких путей РНК-интерференции. Возможные способы антивирусной терапии при помощи системы РНК-интерференции представляются многообещающими, но крайне важным представляется также постановка многих контрольных экспериментов вдоклинических испытанияхдля того, чтобы однозначно показать сиквенс-специфичное действие системы RNAi.
РНК-интерференция используется вбиотехнологии, в частности для создания растений, синтезирующих натуральныетоксичные веществав более низких количествах. Разработаны методы создания растений, стабильно экспрессирующих компоненты системы РНК-интерференции, например, семенахлопкав норме богаты белком, пригодным для употребления в пищу, но содержат токсичныйтерпеноидгоссипол(англ.gossypol). Методы, использующие явление РНК-интерференции, позволяют создавать линии хлопка с пониженным уровнем ключевого для синтеза госсипола фермента — (+)-δ-кадинен-синтазы. При этом, другие части растенияэкспрессируютданный фермент на обычном уровне, так как госсипол является важным соединением, защищающим растения от вредителей. Сходные попытки принимаются для снижения уровняцианидовв натуральном продуктелинамарине, получаемого изманиока(Manihot esculenta).
Разработаны способы снижения уровнейаллергеновв растенияхтоматаи способы снижения предшественниковканцерогеновв растенияхтабака. Другими примерами генно-инженерных изменений растений, является созданиеопийного макасо сниженным уровнемнаркотическихвеществ, повышение устойчивости растений к вирусам, а также добавление в плоды томатовантиоксидантов. Более ранние коммерческие генно-инженерные растения —томатипапайя, были разработаны с использованием антисмысловых РНК, по-видимому, работающих по механизму РНК-интерференции. С помощью РНК-интерференции учёными Узбекистана была подавлена функция гена фитохрома А хлопчатника. В результате были получены линии хлопчатника у которых одновременно улучшены несколько важных признаков: длина и качество волокна,урожайность, время созревания, устойчивость к водному дефициту и солевому стрессу. На основе полученных линий хлопчатника были созданы новые высококачественные сорта хлопчатника серии Порлок, которые в настоящее время высеваются на полях Узбекистана. Волокно данных сортов реализуются по цене выше чем у обычного хлопчатника, так как по качественным характеристикам они превосходят волокна обычного хлопчатника.