Pewarnaan H&E

Pewarnaan hematoksilin dan eosin (selalunya disingkatkan jadi pewarnaan H&E atau pewarnaan HE) merupakan salah satu daripada kaedah pewarnaan tisu utama yang digunakan dalam bidang histologi. Ia merupakan kaedah pewarnaan yang paling banyak digunakan dalam diagnosis perubatan dan selalunya merupakan piawaian emas. Contohnya, apabila seorang ahli patologi melihat biopsi kanser yang disyaki, keratan histologi mungkin diwarnai dengan H&E.
Kaedah H&E menggunakan gabungan dua pewarna histologi: hematoksilin dan eosin. Hematoksilin mewarnakan nukleus sel dengan warna biru keunguan, dan eosin mewarnakan matriks ekstrasel dan sitoplasma dengan warna merah jambu, manakala struktur lain pula diwarnakan dengan bayangan, rona dan warna hasil gabungan hematoksilin dan eosin pada tahap yang berbeza-beza. Disebabkan itulah ahli patologi dapat dengan mudah membezakan antara bahagian nukleus dengan sitoplasma dalam sebuah sel, tambahan pula corak keseluruhan pewarnaan tersebut menunjukkan susun atur sel dan taburan sel secara umum, sehingga dapat memberikan gambaran umum struktur sampel tisu. Oleh itu, pengecaman corak, baik melalui kepakaran manusia sendiri mahupun melalui perisian yang membantu pakar tersebut (dalam bidang patologi digital) dapat menyediakan maklumat histologi.
Kombinasi dua pewarna ini diperkenalkan pada tahun 1877 oleh ahli kimia Nicolaus Wissozky di Universiti Diraja Kasan di Rusia.
Prosedur pewarnaan H&E merupakan pewarnaan tunjang dalam bidang histologi kerana ia boleh dilakukan dengan cepat, tidak mahal, dan mewarnakan tisu dalam cara yang boleh mendedahkan sejumlah besar anatomi mikroskopik, dan boleh digunakan untuk mendiagnosis pelbagai keadaan histopatologi. Hasil daripada pewarnaan H&E tidak terlalu bergantung pada bahan kimia yang digunakan untuk menetap tisu mahupun sedikit ketidakkonsistenan dalam protokol makmal, dan faktor-faktor ini menyumbang kepada penggunaan rutinnya dalam histologi.
Pewarnaan H&E tidak selalunya memberikan kontras yang mencukupi untuk membezakan semua tisu, struktur sel, mahupun corak taburan bahan kimia. Jika butiran yang lebih lanjut diperlukan, maka pewarnaan dan kaedah yang lebih khusus perlu digunakan.
Terdapat banyak cara untuk menyediakan larutan hematoksilin (formulasi) yang digunakan dalam prosedur H&E, tambahan pula terdapat banyak protokol makmal untuk menghasilkan slaid berwarna H&E, dengan sesetengah daripada cara-cara atau protokol-protokol tersebut mungkin khusus hanya untuk sesebuah makmal tertentu. Walaupun tiada prosedur piawai, hasil pewarnaan kebiasaannya bersifat konsisten kerana nukleus sel diwarnakan biru dan sitoplasma dan matriks ekstrasel diwarnakan merah jambu. Makmal histologi juga boleh melaraskan kandungan atau jenis pewarnaan khusus untuk pakar patologi tertentu.
Selepas tisu telah dikumpul (selalunya sebagai biopsi) dan difiksasi, ia lazimnya dinyahairkan dan ditanam dalam lilin parafin cair, selepas itu blok yang terhasil dipasang pada mikrotom dan dihiris menjadi helaian parafin yang nipis. Helaian tersebut dilekatkan pada slaid mikroskop dengan seterusnya lilin dikeluarkan oleh pelarut dan hirisan tisu yang melekat pada slaid dihidrasi semula dan sedia untuk pewarnaan. Alternatifnya, pewarnaan H&E ialah noda yang paling banyak digunakan dalam pembedahan Mohs melalui penggunaan tisu yang biasanya dibekukan, dipotong pada kriostat (mikrotom yang memotong tisu beku), difiksasi dalam alkohol dan kemudian diwarnakan.
Kaedah pewarnaan H&E melibatkan penggunaan pewarna hematoksilin yang bercampur dengan garam logam (atau mordan) selalunya diikuti dengan bilasan dalam larutan asid lemah untuk menghilangkan pewarnaan berlebihan (pembezaan), diikuti dengan pembiruan dalam larutan beralkali sederhana. Selepas penggunaan hematoksilin, tisu diwarna balas dengan eosin (kebiasaannya eosin Y).
Hematoksilin pada dasarnya mewarnakan nukleus sel dengan warna biru atau ungu tua, bersama-sama dengan beberapa tisu lain, seperti butiran keratohialin dan bahan terkalsifikasi . Eosin pula mewarnakan sitoplasma dan beberapa struktur lain termasuk matriks ekstrasel seperti kolagen sehingga lima jenis warna merah jambu. Struktur eosinofil (bahan yang diwarnai oleh eosin) biasanya terdiri daripada protein intrasel atau ekstrasel. Jasad Lewy dan jasad Mallory merupakan contoh struktur eosinofil. Kebanyakan sitoplasma adalah eosinofil dan menjadi merah jambu. Sel darah merah pula diwarnakan dengan merah berkepekatan tinggi.
Walaupun hematein (yakni bentuk teroksida hematoksilin) merupakan pewarna aktif (apabila digabungkan dengan mordan), pewarna tersebut masih dirujuk sebagai hematoksilin. Hematoksilin apabila digabungkan dengan mordan (kebiasaannya tawas aluminium) sering dianggap sebagai "menyerupai" pewarna bes, bercas positif, atau kation. Eosin merupakan pewarna anion (bercas negatif) dan berasid. Pewarnaan nukleus oleh hemalum (gabungan ion aluminium dan hematein) biasanya disebabkan oleh pengikatan kompleks pewarna-logam terhadap DNA, tetapi pewarnaan nukleus boleh diperolehi selepas pengekstrakan DNA daripada bahagian tisu tersebut. Mekanismenya adalah berbeza daripada pewarnaan nukleus oleh pewarna asas (kation) seperti tionin atau biru toluidin. Pewarnaan oleh pewarna bes hanya berlaku pada larutan yang kurang berasid daripada hemalum, dan ia dihalang oleh pengekstrakan asid nukleik secara kimia atau berenzim sebelumnya. Terdapat bukti untuk menunjukkan bahawa ikatan koordinat, sama seperti yang mengikat aluminium dan hematein, mengikat kompleks hemalum kepada DNA dan kepada kumpulan karboksi protein dalam kromatin nukleus.
Sesuatu struktur sel tidak perlu bersifat asid atau bes untuk dipanggil basofil dan eosinofil; terminologi tersebut adalah berdasarkan pertalian komponen sel terhadap pewarna. Warna lain, contohnya kuning dan coklat, boleh didapati dalam sampel; ia disebabkan oleh pigmen intrinsik seperti melanin. Lamina dasar perlu diwarnai oleh pewarna PAS atau beberapa pewarna perak, jika ia perlu kelihatan dengan baik. Gentian retikular juga memerlukan pewarnaan perak. Struktur hidrofobik juga cenderung untuk kekal jelas; dan struktur tersebut biasanya kaya dengan lemak, contohnya adiposit, mielin di sekeliling akson neuron, dan membran jasad Golgi.