«Геном прокариот» (проект)/Отчет №1

Файл:Human-dialog-info.svg |
|




## Введение

### Исторический обзор

При определении эволюционной связи основная проблема это выбор — на основании каких признаков делать выводы о эволюционной связи. Существуют разные подходы, например, девятое издание определителя бактерий Берги [1], основываются на совокупности различных признаков:

- морфологических (форма тела; наличие или отсутствие жгутиков; капсулы; способность к спорообразованию; особенности внутриклеточного строения; окрашивание по Граму)
- культуральных (признаки, выявляемые при культивировании в лаборатории чистой культуры),
- физиолого-биохимических (способы получения энергии; потребности в питательных веществах; отношение к факторам внешней среды; нуклеотидный состав и последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК; наличие и характер минорных оснований в ДНК; нуклеотидный состав рибосомальной РНК; последовательность аминокислот в ферментных белках с аналогичными функциями).

А виды бактерий разделены на основании фенотипических признаков на группы, например: грамотрицательные аэробные палочки и кокки (группа 4), анаэробные грамотрицательные кокки (группа 8), грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры (группа 13), скользящие бактерии, образующие плодовые тела (группа 24).

В 60-х гг. было установлено, что все свойства организма определяются ДНК и бактерии могут быть классифицированы путем сравнения их геномов. Поэтому современные исследования основываются на сходстве геномных последовательностей. А именно — фенотипичные критерии заменяются молекулярными критериями, молекулярные последовательности могут показать эволюционные отношения более точно, чем классические фенотипичные критерии, и даже молекулярные функции [2].

Первоначально для таксономических целей сравнивали молярное содержание суммы гуанина и цитозина (ГЦ) в процентах от общего количества оснований ДНК у разных объектов. Этот показатель у прокариот колеблется от 25 до 75%. Однако ГЦ-показатель дает возможность только для грубого сравнения геномов. Поэтому если организмы имеют одинаковый нуклеотидный состав ДНК, возможно и сходство и различие между ними, поскольку генетическое кодирование основано не только на определенном содержании оснований в единице кодирования (триплете), но и на их взаимном расположении. Кроме анализа молекул ДНК для установления степени родства между прокариотными организмами сравниваются продукты отдельных генов, выполняющие в клетке одинаковые функции. Это могут быть белки (ферредоксины, цитохромы и др.) или рРНК. [3]

Выбор рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) для решения проблем эволюционной систематики прокариот оказался удачным по ряду причин: эти молекулы обнаружены у всех клеточных форм жизни, их функции связаны с важнейшим для организма процессом трансляции, первичная структура в целом характеризуется высокой консервативностью.

Считается, что особенностью рРНК является нахождение вне сферы действия отбора, поэтому данные молекулы эволюционируют в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью, и накопление таких мутаций зависит только от времени. Таким образом, мерой эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК. [3]

Известно, что в рибосомах прокариот и эукариот присутствуют 3 типа рРНК, различающихся молекулярной массой и коэффициентом седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины: 16S (~1600 нуклеотидов). Систематика основывается на расчете коэффициентов сходства сравниваемых организмов. Именно на основании анализа рРНК современная систематика выделяет три домена бактерии, археи и эукариоты [2], а так же на этом основывается систематика, бактерий и архей X издания Берги [4].

### Возможность другой основы для систематики

Консервативность рРНК тем не менее не достаточно велика, консервативны лишь некоторые её части. А так как есть достаточно вариабельные части у рРНК, то приходится делать допущения и предполагать, где были разрывы и вставки отдельных фрагментов при мутации. С такими допущениями результат сравнения будет недостаточно точен и возможны статистические погрешности аналогичные, тому если основываться на ГЦ-показателе, но только в меньшей степени.

Поэтому в основу подхода описанного здесь положен следующий тезис:

Файл:Logo arte.jpg | При сравнении геномных последовательностей сравниваются такие участки, которые вообще не подвергались мутациям, и абсолютно идентичны в разных организмах. |


В этом случае мы также свободны от гипотезы, что особенностью рРНК является нахождение вне сферы действия отбора. Таким образом, мы согласно бритве Оккама используем существенно меньше допущений.

Но могут возникнуть опасения, что таких геномных последовательностей, кодирующих белки или РНК практически нету для хоть сколь нибудь разных видов. Но это не так. Целый ряд белков (их ДНК код) абсолютно одинаковы для многих видов, отнесенных к одному роду, или даже семейству. Но еще большей консервативностью обладают транспортные РНК (тРНК). В хромосоме бактерии, как правило, существуют все 20 видов тРНК, каждая из которых ответственна за транспортировку определенной аминокислоты к месту синтеза белка. И вот на основании их можно проследить эволюционную связь не только отдельных семейств, но и целых классов и даже типов.

В данной работе мы основывались только на одной тРНК, транспортирующую аланин (Ala tRNA). Поэтому выводы о эволюционной связи не претендуют на окончательный результат. Для этого нужно сопоставить результаты в отношении других тРНК. Но тем не менее, проделанное исследование позволяет наметить ряд положений о близости некоторых родов бактерий. Затем будет показано, что о близких эволюционных связях нельзя говорить в терминах филогенетического дерева. Это вызвано тем фактом, что существует горизонтальный перенос и конъюгация у бактерий, и тут требуются другие подходы.

## Анализ геномов

В центре нашего внимания будет род Yersinia, но в результате исследования были рассмотрены и другие такие как Shewanella, Pseudomonas, Vibrio, Erythrobacter, Pseudoalteromonas, Photobacterium и ряд других (список анализируемых штаммов см. здесь, здесь и здесь, всего 109 локусов)

тРНК у бактерий, как правило, имеет константную длину 76 нуклеотидов, при этом антикодон располагается в позициях 34,35,36. Аланин в ДНК кодируется четырьмя кодонами: GCT, GCC, GCA, GCG. Поэтому потенциально возможны 4 вида Ala tRNA, с антикодонами AGC, GGC, TGC, CGC.

Но у подавляющего большинства рассматриваемых бактерий в геноме есть только по 2 вида Ala tRNAGCA и Ala tRNAGCС. Иногда, например в локусе NC_007484 имеется еще Ala tRNAGCG. Во второй хромосоме (у тех видов, где она есть), отсутствует Ala tRNAGCС.

Для анализа были использованы секвенированные геномы ДНК, которые имеются в базе NCBI. Все идентичные немутировавшие тРНК были помечены уникальным идентификатором (Id). С помощь написанной для анализа компьютерной программы, в полуавтоматическом режиме с ручной верификацией, был составлен список разнообразных видов Ala tRNA (см. Ala tRNA ID ), и их расположение в том или ином секвенированном локусе.

## Результаты

У всех рассматриваемых штаммов рода *Yersinia* (9 шт.), имеется в геноме одинаковые Ala tRNAGCA с Id=00046 и Ala tRNAGCС с Id=00043. На основании этого факта, можно сделать вывод, что действительно эти штаммы имеют сильную эволюционную связь, и поэтому их всех относят к роду *Yersinia*.

Сейчас род *Yersinia* относят к семейству *Enterobacteriaceae*. Но на основании проделанного анализа, в рамках сходства по Ala tRNA, эта связь малообоснованна.

Если посмотреть на классических представителей семейства *Enterobacteriaceae*, таких как *Escherichia*, *Salmonella*, *Shigella*, *Citrobacter*, *Cronobacter*, *Klebsiella*, *Pectobacterium*, то у всех них совершенно другие Ala tRNA. А именно у них Ala tRNAGCA с Id=00011 и Ala tRNAGCС с Id=00012 (см. Ala tRNA Enterobacteriaceae Summary). На этом основании мы и можем считать перечисленные роды семейства Enterobacteriaceae классическими представителями.

И только с родом *Photorhabdus*, по одному линии Ala tRNAGCA с Id=00046, *Yersinia* имеет связь. Поэтому род *Yersinia* имеет черты от разных семейств. Такой род мы назовем *переходным* родом между различными семействами.

Итак, если с семейством *Enterobacteriaceae* род *Yersinia* связывает только одна конфигурация не мутировавшей Ala tRNAGCA с Id=00046 (и то частично), то встает вопрос с каким семейством род *Yersinia* связан по другой конфигурации не мутировавшей Ala tRNAGCС с Id=00043 ?

Оказывается наиболее прямой связью по этой линии является род *Shewanella* (семейство: *Shewanellaceae*, порядок: *Alteromonadales*, класс: гамма-протеобактерии). При этом объединяющая их линия Ala tRNAGCС с Id=00043, является ключевой в эволюционном плане, так как присутствует так же еще у родов *Pseudomonas* и *Vibrio*. Все эти связи более близкие, чем следует из современной классификации, где эти роды объединены лишь на уровне класса.

В свою очередь некоторые представители рода *Shewanella* имеют одинаковые Ala tRNAGCA с Id=00047 и Ala tRNAGCС с Id=00043. Уже выяснив, что *Yersinia* и *Shewanella* имеют связь по одной линии (Id=00043), интересно с кем связан род *Shewanella* по другой линии (Id=00047). Оказывается, что эта линия также является достаточно ключевой в эволюционном плане. Она разветвляет происхождение далее и Ala tRNAGCA с Id=00047 обладают так же представители родов *Vibrio*, *Thiomicrospira*, *Saccharophagus*.

Мы можем также проследить эти связи и далее (см. Ala tRNA Yersinia Link Image ). Но уже сейчас понятно, чтобы систематизировать эти эволюционные связи, нужно несколько изменить подход к их описанию.

## Выводы

Файл:Question book-3.png | Этот раздел содержит гипотетические предположения, которые имеют лишь косвенные подтверждения, и научное сообщество не располагает прямыми доказательствами. |


Следует еще раз подчеркнуть, что **все выводы сделанные в работе, базируются на анализе только tRNA Ala, и конечно для признания результатов нужна проверка по другим видам тРНК**. Но тем ни менее уже сейчас мы можем сделать некоторые выводы и описать каким образом нужно изменить подходы к систематике таксонов.

Достаточную сложность вызывает определение какой из видов более эволюционно древний, а какой более молодой. Но если исходить из гипотезы, что биологический мир развивался от простого к сложному, то у нас есть по крайней мере один неоспоримый факт. Если бактерия имеет две хромосомы, то кажется очевидным, что она эволюционно более молода, чем имеющая одну.

Поэтому в рамках нашего исследования можно с уверенностью сказать, что род *Vibrio* более молодой, чем *Shewanella* или *Yersinia*. И тогда, раз *Vibrio* и *Shewanella* объединены идентичными Ala tRNAGCA с Id=00047, то с большой вероятностью, род *Vibrio* произошел от *Shewanella* и так произошла одна хромосома. После чего другие представители рода *Vibrio* произошли от рода *Colwellia* и так произошла вторая хромосома. В результате объединения этих хромосом в одном организме мы и можем говорить о роде *Vibrio*, который по одной линии произошел от *Shewanella*, а по другой от *Colwellia*.

**Таким образом, мы должны говорить не о происхождении от одного предка, а о как минимум двух, а то и больше.**

С однохромосомными бактериями сложнее определить направление эволюции (кто более молодой, а кто более древний). Но основываясь на двуххромосомные виды, можно сказать, так как существует вид *Vibrio* с Ala tRNAGCA с Id=00049 и Ala tRNAGCС с Id=00043; а также существуют виды *Vibrio* с Ala tRNAGCA с Id=00047, то первоночально существовали именно Ala tRNAGCA с Id=00047 и Ala tRNAGCС с Id=00043. А они содержались в *Shewanella*, и поэтому его нужно признать наиболее древним организмом, и положить в основу систематики рассмотренных здесь организмов.

Тогда можно сделать вывод, что от *Shewanella* по одной линии произошли *Yersinia*. От *Yersinia* в свою очередь *Photorhabdus*, от которого и произошло все семейство *Enterobacteriaceae*. Но это только по одной линии. По другой же мы уже упоминали какие роды произошли от *Shewanella*.

Многовидовое происхождение сильно запутывает эволюционную картину, но с этим ничего не поделаешь — такова сложность видообразования, и нам нужно лишь их наиболее точно отразить в условиях, когда не все виды известны.

## Приложения

Shewanella |
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


Shewanella amazonensis |
| ||||||||||||


Colwellia |
| ||||||||||||||||||


## Примечания

- ↑
*Holt JG (editor)*Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th ed.. — Williams & Wilkins. — 1994. — ISBN ISBN 0-683-00603-7 - ↑
2,02,1*Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L.*Towards a Natural System of Organisms: Proposal for the Domains Archaea, Bacteria, and Eucarya //*Proc. Natl. Acad. Sci. USA*. — 1990. — Т. 87. — С. 4576—4579. - ↑
3,03,1Микробиология Гусев М. В., Минеева Л. А. - ↑ Bergey's Manual of Systematic Bacteriology