cyanic-selkie/wikianc huggingface dataset:
Olimpiyat köyü
Olimpiyat köyü, Olimpiyat Oyunları için genellikle bir Olimpiyat Parkı ya da başka bir yerde ev sahipliği yapan bir şehirde kurulmuş bir konaklama merkezidir. Olimpiyat köyleri katılan tüm sporcuların yanı sıra yetkililer ve antrenörleri de barındıracak şekilde inşa edilmiştir. 1972 Yaz Olimpiyatları'ndaki Münih Katliamı'ndan sonra köyler son derece güvenli hale getirildi. Olimpiyat köylerine yalnızca atletler, eğitmenler ve yetkililer ile uygun kontrollerle aile üyeleri ve eski Olimpik sporcuların içeri girilmesine izin verilir. Olimpiyat köylerinde basın ve medya da kısıtlanmıştır.
Zelotes paroculus
Zelotes paroculus, Zelotes cinsine bağlı bir örümcek türüdür.
Konşimento
Konşimento (İtalyanca: conoscimento) ya da taşıma senedi, üzerinde yükleyici, alıcı, ihbar merciiden başlayarak her türlü bilginin yer aldığı kıymetli evraktır. Gemiye yüklenilen bir malın teslim alındığını gösteren, gönderenin ve alıcının adlarının yazılı olduğu hukuki belgedir. Malın alıcısına genellikle önceden gönderilen bu belge, alıcının mal üzerindeki mülkiyet hakkını gösterir. Alıcı, bu belge olmaksızın malları teslim alamaz.
Kara Yolu Taşıma Senedi; Uluslararası nitelikteki CMR (Convention Marchandises Routiers) anlaşmasının hükümlerini kabul eden ülkelerce kullanılan bir karayolu taşıma belgesidir ve taşımanın CMR hükümlerine göre yapıldığını gösterir. Navlun komisyoncusu veya taşımacılık şirketi tarafından alıcının adına düzenlenir. Malların belirtilen şartlarla taşınmak üzere, iyi durumda teslim alındığını ve taşıma sözleşmesinin yapıldığını gösteren hukuki bir delildir. Malların mülkiyetini temsil etmediği için ciro edilemez. Üç orijinal nüsha olarak düzenlenir. Birincisi yükletene verilir, ikincisi mallara eşlik eder, üçüncüsü de taşımacıda kalır. Yükleten, mallar yolda iken taşımacıya talimat vererek taşımayı durdurma, teslim yerini değiştirme veya malların belgede ismi yazılı alıcıdan başka bir şahsa teslimini isteme hakkına sahiptir. Bu hak belgenin ikinci orijinalinin belgede adı yazılı alıcıya verilmesi üzerine hükümden düşer. Anılan, hakkını, kullanmak istediğinde yükleten belgenin birinci orijinalini taşımacıya ibraz etmelidir. Bu durumda yeni talimat belgeye kaydedilir. Yükleten aynı zamanda taşımacıya garanti vermelidir.
Hava Yolu Taşıma Senedi (Airwaybill/AWB), havayolu şirketlerince düzenlenen ve malların taşınmak üzere teslim alındığını gösteren makbuzdur. Mallar üzerinde tasarruf etme yetkisi vermez. Varış havalimanında gümrük işleminin tamamlanmasından sonra mallar belgede ismi yazılı alıcıya teslim edilir. Alıcı yerine alıcının bankası adına da düzenlenebilir. Bu durumda banka varış yerindeki havayolu şirketine vereceği yazılı talimatla malları alıcıya teslim ettirir. Hava yolu taşıma senedi biri alıcıya, biri yükletene, biri de havayolu şirketine ait olmak üzere 3 orijinal ve 9 kopya olarak düzenlenir. Bankalara ibraz edilen nüsha 3 numaralı yükleten nüshasıdır. Belgede yer alan bilgiler: Uçuş sefer sayısı tarihi, malın cinsi ve miktarı, alıcının adı, yükletenin adı, navluna ait kayıt ve havayolu şirketinin kaşe ve imzasıdır.
Deniz Yolu Taşıma Senedi: Bu belge bir gemi şirketinin veya onun yetkili acentesinin veya yükleme limanında acentesi yoksa gemi kaptanının malı yükletene verdiği, emre ve nama düzenlenebilen ve belge konusu malların taşınmak üzere kabul edildiğini gösteren bir makbuz ve aynı zamanda yükleme kaydı konduğunda bir taşıma sözleşmesidir. Belirtilen malın mülkiyetini de temsil eder ve belgenin ciro edilmesiyle mal el değiştirir.
Şahindere, Edremit
Şahindere, Balıkesir ilinin Edremit ilçesine bağlı bir mahalledir.
Dragonfly (uzay aracı)
Dragonfly, 2027 yılında Dünya'dan fırlatılması planlanan uzay aracı ve uzay görevi. Bu araç yaklaşık 9 yıllık bir yolculuktan sonra Satürn'ün büyük uydularından birisi olan Titan'a iniş yapacak. Araç Titan'da defalarca uçarak bu uydu hakkında derinlemesine bilgiler edinecek. Ingenuity gibi bir helikopter şeklinde tasarlanmış bu uzay aracı Ingenuity'den farklı olarak bir rover içinde gelmeyecek. Direkt olarak helikopter şeklinde Titan'a iniş yapacak ve yüksek mobilitesi sayesinde Titan'da deney yapılması ve araştırılması gereken kraterleri bir roverdan daha hızlı bir şekilde araştıracak. Titan'da Güneş enerjisinin etkili bir şekilde kullanılamamasından dolayı aynı Curiosity uzay aracında olduğu gibi bir termoelektrik jeneratör kullanılacak.
Yoyogi Parkı
Yoyogi Parkı ( Yoyogi Kōen), Japonya'nın başkenti Tokyo'nun Shibuya semtinde bulunan bir parktır. Park Harajuku İstasyonu ile Meiji Tapınağı arasında yer almaktadır.
Parkın bulunduğu arazide müttefik işgali sırasında ABD'ye ait askeri kışlalar yer almaktaydı. Arazi daha sonra 1964 Yaz Olimpiyatları'nda atletlerin barındığı yer ve Yoyogi Ulusal Spor Salonu için kullanıldı. 1967'de jimnastik kompleksinin kuzeyi ve Meiji Tapınağı'nın güneyinde kalan alanın büyük çoğunluğu Yoyogi Parkı'na dönüştürüldü.
Park Tokyo'da görülecek önemli bir yerdir. Pazar günleri özellikle Japon rock müziği hayranları, hokkabazlar, komedyenler, dövüş sanatları kulüpleri, cosplayerler ve diğer altkültür ve hobi grupları için bir buluşma yeri olarak kullanılmaktadır. İlkbaharda da binlerce kişi hanami festivali için parkı ziyaret etmektedir.
Leo Howard
Leo Howard (d. 13 Temmuz 1997), Amerikalı oyuncu, model ve dövüş sanatçısıdır.
Dört yaşında dövüş sanatları eğitimine ve yedi yaşındayken oyunculuk kariyerine başladı. Howard film ve televizyon rollerinde karate ve wushu becerilerini gösterdiği rollerde ön plana çıkmıştır. Oynadığı filmler arasında 2009 aksiyon filmi "Genç Snake Eyes", "GI Joe:The Rise of Cobra" 2011 fantastik filmi Barbar Conan'da "Genç Conan" ve Disney XD komedi dizisi, "Kickin 'It"'te Jack rolü sayılabilir. Howard, 2015'te Kickin'it in 4. sezonunun  "Fight at the Museum" bölümüne yönetmenlik yaparak, Guiness Rekorlar Kitabı'na en genç yönetmen olarak girmiştir. Bu yönetmenlik deneyimini 16 yaşında yapmıştır.
Kathleen Barr
Kathleen Barr (d. 6 Nisan 1967; Toronto), Kanadalı seslendirme sanatçısı. Ed, Edd ve Eddyde Kevin ve Marie Kanker, My Little Pony: Arkadaşlık Sihirlidirde ise Trixie ve Kraliçe Chrysalis karakterini canlandırmakla bilinir.
Zelotes parascrutatus
Zelotes parascrutatus, Zelotes cinsine bağlı bir örümcek türüdür.
Paul Arbaud
Erken yaşam
Paul Arbaud, 27 Mart 1832'de Paris'te doğdu.Aslen Manosque'li olan babası Paris'te hakim olarak çalışıyordu.Annesi ise Château de Coulans'ın sahibi Jules Paul Pasquier'in kızı ve Etienne Denis Pasquier'in yeğeniydi.
Koleksiyonu
Arbaud 1883'te Académie d'Aix-en-Provence'e katıldı.1884'te Aix-en-Provence'in Quartier Mazarin'de yerleşen rue du Quatre-Septembre konağına taşındı.Burada koleksiyon için plaka, resim ve eski kitaplar toplamaya başladı.1892'de "L'Historie de s. Louis"in orijinal kopyasını tarihçi Louis Antoine de Ruffi sayesinde elde etti.Koleksiyonunda, yaklaşık 1,600 eski kitap vardı.
10 Ekim 1910'da Arbaud tüm koleksiyonunu Académie d'Aix-en-Provence'a bağışladı.
Özel hayatı, ölümü ve mirası
Arbaud Adrienne de Robineau Valmont ile evliydi.
17 Mart 1911 yılında Aix-en-Provence'de hayata gözlerini kapadı.Konağı, içinde kendi koleksiyonu bulunan  "Arbaud'un müzesi" ismiyle faaliyete başladı.
Vectipelta
Vectipelta (anlamı: "Wight Adası kalkanı"), İngiltere'nin Erken Kretase yaşlı Wessex Formasyonu'ndan çıkarılan soyu tükenmiş bir ankilozor dinozor cinsidir. Cins, birkaç osteoderm içeren parçalı bir iskeletten bilinen tek bir türü, V. barretti, içerir. Tanımından önce tarihsel olarak "Kargı ucu ankylosaur" olarak biliniyordu.
Keşif ve adlandırma
Vectipelta holotip örnekleri, IWCMS 1996.153 ve IWCMS 2021.75, Kasım 1993'te (dokuz omur Gavin Leng tarafından) ve Mart 1994'te (Lin Spearpoint tarafından) İngiltere'nin Wight Adası'ndaki Chilton Chine yakınlarındaki Wessex Formasyonu çökellerinde keşfedildi. Holotip, birçok servikal, dorsal, sakral ve kaudal omurları, parçalı göğüs ve pelvik kuşakları, ön ve arka bacakların elemanlarını ve birkaç osteodermi içeren parçalı bir iskeletten oluşur. İlk başta kalıntılar Polacanthus'a atfedildi.
Fosil materyali ilk olarak Thomas J. Raven tarafından bir doktora tezinde tanımlanmış ve 2019 ve 2021'de yeni bir taksonu temsil ettiği sonucuna varılmıştır Parafiletik bir Nodosauridae öneren Mayıs 2023 tarihli bir çalışma, filogenetik veri kümesine "Kargı ucu ankylosaur"u dahil etti, ancak ek bilgilerde ona "Polywotsit" vekil adı (geçici) verildi.
Haziran 2023'te Pond ve ark. bu fosil kalıntılarına dayanarak Vectipelta barretti'yi yeni bir ankylosaurian cinsi ve türü olarak tanımladı. "Vectipelta" cins adı, Wight Adası'nın Latince adı olan "Vectis"ten türetilmiştir. Tür adı olan "barretti", Doğal Tarih Müzesi'nden paleontolog Paul Barrett'e aittir.
Sınıflandırma
Pond et al. (2023) Vectipelta{'}yı, Dongyangopelta ve Zhejiangosaurus{'}un oluşturduğu klada kardeş takson olarak buldu (bu kladın Ankylosauridae'ye kardeş olması ve geleneksel Nodosauridae'nin parafiletikliğiyle beraber). Bu dinozor, Wealden Group':ta bulunan Polacanthus ve Hylaeosaurus{'}la sadece uzaktan akrabaydı. Onların filogenetik analiz sonuçları aşağıdaki kladogramda gösterilmiştir (Wealden Group ankylosaurları vurgulanmıştır):
Didgori-2
Didgori-II (Gürcüce: დიდგორი-II) STC Delta tarafından üretilen çok amaçlı özel harekât aracıdır. 2009 yılında Didgori-1 ile birlikte bazı ek özellikle geliştirilmiştir. Zırhlı personel taşıyıcı olan Didgori-II'nin, keşif ve konvoy koruması da dahil olmak üzere çeşitli görevlerde özel kuvvetlere ulaşım, gelişmiş görünürlük ve ateş gücü desteği sağladığı düşünülmektedir.
Vectipelta
Ekoloji
Wessex Formasyonu, olasılıkla birkaç milyon yıllık önemli bir süreyi kapsar ve bundan ötürü, oluşumdan bilinen tüm hayvanların çağdaş olması muhtemel değildir. Vectipelta muhtemelen Polacanthus'tan milyonlarca yıl daha yaşlıdır.
Noe Ramişvili
Noe Ramişvili (Gürcüce: ნოე რამიშვილი; translit.: “noe ramişvili”; 5 Nisan 1881, Kvemo Surebi, Guria, Gürcistan – 7 Aralık 1930, Paris), Gürcü siyaset adamıdır. Gürcistan Demokratik Cumhuriyeti'nin ilk hükûmetinin başkanıydı. Rusya Sosyal Demokrat İşçi Partisi'nin Menşevik kanadı liderlerinden biri olarak da tanınır. Noe Ramişvili 1902'de Rusya Sosyal Demokrat İşçi Partisi'ne katılmış ve kısa sürede Menşeviklerin önde gelen sözcüsü olmuştur.
Pallidochromis
Pallidochromis Cichlidae familyasına bağlı bir cinstir.
Sarıkız, Edremit
Sarıkız, Balıkesir ilinin Edremit ilçesine bağlı bir mahalledir.
Ahmed Abdallah Mohamed Sambi
Ahmed Abdallah Mohamed Sambi (d. 5 Haziran 1958), Komorlu siyasetçi. Sambi, Afrika ada ülkesi Komorlar'da 2006 ile 2011 yılları arasında devlet başkanlığı makamında bulunmuştur.
2006 yılında gerçekleştirilen devlet başkanlığı seçimlerine katılarak birinci olan Sambi, bu seçim zaferi ile 1999 yılından bu yana iktidarda bulunan Azali Assoumani'den görevi devralmıştır. 2009 yılında gerçekleştirdiği anayasa referandumu ile ülkenin daha merkezi bir otorite ile yönetilmesini hedeflemiş ve aynı zamanda devlet başkanının iki dönem üst üste seçilebilme olanağını sağlamaya çalışmıştır. Her ne kadar referandum sonucunda çoğunluk değişikliği onaylasa da, Komorlar Anayasa Mahkemesi özellikle iki dönem devlet başkanı seçilebilme imkânını daha sonra iptal ederek Sambi'nin ikinci bir dönem daha seçilmesine onay vermemiştir. Bu gelişmeler neticesinde Kasım 2010 tarihinde gerçekleştirilen seçimlere katılamayan Sambi, seçimlerden zafer ile ayrılan Ikililou Dhoinine'ye görevi Mayıs 2011'de devrederek makamdan ayrılmıştır.
New Port Richey, Florida
New Port Richey ABD'nin Florida eyaletine bağlı Pasco ilçesinde bulunan bir şehirdir. Şehrin nüfusu 2010 sayımına göre 14.911'dir.
Reit im Winkl
Reit im Winkl Traunstein bölgesinde, Almanya'nın Bavyera güneydoğu kesiminde Almanya / Avusturya sınırında bulunan küçük bir köy olup, daha önce bir göç ve gümrük kontrol noktasıdır (Schengen'in oluşumundan önce). Chiemsee'in güneyinde ve Biatlon Dünya Kupasına ev sahipliği yapan Ruhpolding'in güneybatısında, Bavyera Alpleri'nde ve Tyrol'e doğru bakmaktadır. Köy, Avusturya eyaletleri Tyrol ve Salzburg'un yanında yer almaktadır. Tirol'deki Kössen, Tiroler Achen nehrinin birleşmesinden önce, Lofer nehri üzerindeki bir sonraki köydür. Reit im Winkl yaklaşık 2,600 nüfusa sahiptir.
Yaz aylarında, Reit im Winkl, Bavyera'daki en güneşli gün sayısından birine sahiptir ve dağ bisikleti ve kuzey yürüyüş meraklıları tarafından popülerdir. Ziyaretçiler, Seegatterl'ın kuzeydoğusunda yer alan üç dağ gölünün (Weitsee, Mittersee ve Loedensee) veya Lofer nehri'nin tadını çıkarabilir, alabalık göldeki balık avında şanslarını deneyebilir veya ormanlar ve tarlalarda at arabasna binebilirler.
Tarihçe
Reit im Winkl'deki yerleşmenin ilk işaretleri 12. yüzyıldadır. Vakfın tarihi, Otto de Rute'in bir belgesinde ismini verdiği tarih 1160'dur. Belgenin doğruluğu tartışmalıdır ve bazı tarihçiler, yerleşimin başlangıcını 13. yüzyılın ortaları olduğunu söylemektedir. O zamandan beri Bavyera'nın bir parçası olmuştur. Reit im Winkl, kendisini 1275'ten 1804'e kadar Chiemsee piskoposluğunun bir parçası olan Tirol Kirchdorf cemaatinin bir parçasıydı.
Reit im Winkl'in ilk turisti, 1858'de, yerel basında çıkan habere göre, Kral II. Maximilian idi. Üçüncü Reich'teki Kraft durch Freude hareketi ve savaştan sonraki kapalı sınırlar, turizmi bölgedeki ana gelir kaynağı olarak turizme teşvik etti. Bugün, yıllık ziyaretçilerin sayısı 90.000 olan yaklaşık 5000 yatak kapasiteli olan Reit im Winkl için turizme verilen öneminin bir göstergesidir.
Zelotes paranaensis
Zelotes paranaensis, Zelotes cinsine bağlı bir örümcek türüdür.
Spyaxe
Kendisi Spytrooper adlı bir başka internet virüsüyle birlikte hareket ediyor. Aniden bir resme tıklanırsa sahte haber veriyor. Bu haberde, "bilgisayarınıza tehlikeli bir virüs girdi hemen altdaki antivirüs programına basın" deniliyor. Ancak bu yapılırsa Sytrooper adlı bir başka virüs de ekleniyor. Kullanıcıdan bir miktar para isteniyor.
Oligonükleotit
Oligonükleotitler, genetik test, araştırma ve adli tıpta geniş bir uygulama alanına sahip olan kısa DNA veya RNA molekülleri, oligomerleridir. Laboratuvarda katı faz kimyasal sentezi ile yaygın olarak yapılan bu küçük nükleik asit bitleri, herhangi bir kullanıcı tanımlı diziye sahip tek sarmallı moleküller olarak üretilebilir ve bu nedenle yapay gen sentezi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA dizileme moleküler klonlama ve moleküler problar için hayati öneme sahiptir. Doğada oligonükleotitler genellikle gen ekspresyonunun düzenlenmesinde (örneğin mikroRNA) işlev gören küçük RNA molekülleri olarak bulunur veya daha büyük nükleik asit moleküllerinin parçalanmasından türetilen bozunma ara maddeleri olarak bulunur.
Oligonükleotitler, tüm molekülü oluşturan nükleotit artıkları dizisi ile karakterize edilir. Oligonükleotitin uzunluğu genellikle "-mer" ile gösterilir (Yunanca meros'tan "kısım"). Örneğin, altı nükleotitden (nt) oluşan bir oligonükleotit bir heksamer iken 25 nt'den biri genellikle "25-mer" olarak adlandırılır. Oligonükleotitler, daha yüksek sıralı çiftler veya daha az sıklıkla melezler oluşturmak için kendi tamamlayıcı oligonükleotitleri DNA veya RNA'ya sekansa özgü bir şekilde kolayca bağlanır. Bu temel özellik, oligonükleotitlerin spesifik DNA veya RNA sekanslarını tespit etmek için problar olarak kullanılması için bir temel görevi görür. Oligonükleotitleri kullanan prosedürlerin örnekleri arasında DNA mikro dizileri Southern blot ASO analizi floresan in situ hibridizasyon (FISH) PCR ve yapay genlerin sentezi yer alır.
Oligonükleotitler, farklı farmakolojik etkiler elde etmek için omurgada veya 2’ şeker konumunda modifiye edilebilen 2'-deoksiribonükleotitlerden (oligodeoksiribonükleotitler) oluşur. Bu modifikasyonlar, oligonükleotitlere yeni özellikler kazandırır ve onları antisens terapisinde anahtar bir unsur haline getirir.
Sentezi
Oligonükleotitler, doğal veya kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleositlerin yapı blokları korumalı fosforamiditleri veya daha az ölçüde nükleozidik olmayan bileşikler kullanılarak kimyasal olarak sentezlenir. Oligonükleotit zincir düzeneği, "sentetik döngü" olarak adlandırılan rutin bir prosedürü takip ederek 3 'ila 5' yönünde ilerler. Tek bir sentetik döngünün tamamlanması, büyüyen zincire bir nükleotit kalıntısının eklenmesi ile sonuçlanır. Her sentetik aşamadan% 100'den az verim ve yan reaksiyonların meydana gelmesi, işlemin verimliliğinin pratik sınırlarını belirler. Genel olarak oligonükleotit dizileri genellikle kısadır (13-25 nükleotit uzunluğunda). Sentetik oligonükleotitlerin maksimum uzunluğu, 200 nükleotit kalıntısını hemen hemen geçmez. Ürünleri istenen sekansla izole etmek için HPLC ve diğer yöntemler kullanılabilir.
Kimyasal modifikasyonlar
Kimyasal olarak kararlı kısa oligonükleotitlerin oluşturulması, ASO tedavilerinin geliştirilmesindeki en erken zorluktu. Doğal olarak oluşan oligonükleotitler, nükleotitleri parçalayan ve her hücre tipinde bol miktarda bulunan bir enzim olan nükleazlar tarafından kolayca parçalanır. Kısa oligonükleotit sekansları ayrıca, in vivo bozunmalarına katkıda bulunan zayıf iç bağlanma afinitelerine sahiptir.
Omurga modifikasyonları
nükleotitlerin nükleosit organotiofosfat (PS) analogları, oligonükleotitlere bazı yararlı özellikler verir. PS omurgalarının nükleotitlere verdiği temel yararlı özellikler, her nükleotitin diastereomer tanımlanması ve oligonükleotit sentezinde faydalı olan fosforotioat nükleotitleri içeren reaksiyonları kolayca takip etme kabiliyetidir. Oligonükleotitlere yapılan PS omurga modifikasyonları, onları enzimler tarafından istenmeyen bozunmaya karşı korur. nükleotit omurgasının modifiye edilmesi, çoğu nükleotitde görece kolaylık ve doğrulukla elde edilebildiği için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Şeker halkası modifikasyonları
Oligonükleotitlerin tıbbi uygulamaları için yararlı olan başka bir modifikasyon, 2'şeker modifikasyonlarıdır. 2'pozisyonundaki şekerin modifiye edilmesi, oligonükleotitlerin spesifik olarak antisens oligonükleotit terapilerinde hedef bağlanma yeteneklerini geliştirerek oligonükleotitlerin etkinliğini arttırır. Ayrıca spesifik olmayan protein bağlanmasını azaltarak spesifik proteinleri hedeflemenin doğruluğunu artırır. En yaygın kullanılan modifikasyonlardan ikisi 2'-O-metil ve 2'-O-metoksietildir.
Antisens oligonükleotitler
Antisens oligonükleotitler, seçilen bir diziye tamamlayıcı olan tek DNA veya RNA zincirleridir. Antisens RNA durumunda, hibridizasyon adı verilen bir işlemle onlara bağlanarak belirli haberci RNA zincirlerinin protein translasyonunu önlerler. Antisens oligonükleotitler, spesifik bir tamamlayıcı (kodlayan veya kodlamayan) RNA'yı hedeflemek için kullanılabilir. Bağlanma meydana gelirse, bu hibrit, RNaz H enzimi tarafından parçalanabilir. RNaz H, RNA'yı hidrolize eden bir enzimdir ve bir antisens oligonükleotit uygulamasında kullanıldığında, mRNA ifadesinin% 80-95 oranında aşağı regülasyonu ile sonuçlanır.
Morfolino antisens oligonükleotitlerinin, artık gelişimsel biyolojide standart bir teknik olan ve değiştirilmiş gen ekspresyonunu ve gen fonksiyonunu incelemek için kullanılan omurgalılarda gen nakavtları için kullanımı, ilk olarak Janet Heasman tarafından Xenopus kullanılarak geliştirildi. FDA onaylı Morpholino ilaçları arasında eteplirsen ve golodirsen bulunur. Antisens oligonükleotitler, hücre hatlarında influenza virüsü replikasyonunu inhibe etmek için de kullanılmıştır.
Tek bir mutant proteinin sonucu olan nörodejeneratif hastalıklar, yüksek seçicilikle çok spesifik RNA dizilerini hedefleme ve modifiye etme yeteneklerinden dolayı antisens oligonükleotit terapileri için iyi hedeflerdir. Huntington hastalığı, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) dahil olmak üzere birçok genetik hastalık, yanlış RNA dizilerine neden olan ve toksik fizyolojik etkiye sahip yanlış çevrilmiş proteinlerle sonuçlanan DNA değişiklikleriyle ilişkilendirilmiştir.
Kromatografi
Alkilamidler, kromatografik sabit fazlar olarak kullanılabilir. Bu fazlar, oligonükleotitlerin ayrılması için araştırılmıştır.
Kütle spektrometrisi
MALDI kütle spektrometresinde oligonükleotit analizi için bir matris olarak 5-metoksisalisilik asit ve spermin karışımı kullanılabilir.
DNA mikrodizisi
DNA mikro dizileri, oligonükleotitlerin yararlı bir analitik uygulamasıdır. Standart cDNA mikrodizileriyle karşılaştırıldığında, oligonükleotit bazlı mikrodiziler, hibridizasyona göre daha kontrollü özgüllüğe ve alternatif olarak eklenmiş veya poliadenile dizilerin varlığını ve yaygınlığını ölçme kabiliyetine sahiptir. DNA mikrodizilerinin bir alt tipi, oligonükleotitlerin yüksek yoğunlukta bağlandığı substratlar (naylon, cam vb.) Olarak tanımlanabilir. Yaşam bilimleri içinde DNA mikrodizilerinin bir dizi uygulaması vardır.
Parachromis
Parachromis Cichlidae familyasına bağlı bir cinstir.
Peptit sentezi
Organik kimyada peptit sentezi, birden fazla amino asidin peptit bağları olarak da bilinen amid bağları ile bağlandığı peptit bileşiklerinin üretimidir. Peptitler, bir amino asidin karboksil grubunun diğerinin amino grubuna yoğunlaşma reaksiyonu ile kimyasal olarak sentezlenir. Koruma grubu stratejileri genellikle çeşitli amino asit yan zincirleri ile istenmeyen yan reaksiyonları önlemek için gereklidir. Kimyasal peptit sentezi, en yaygın olarak peptitin karboksil ucunda (C-terminali) başlar ve amino terminaline (N-terminali) doğru ilerler. Canlı organizmalardaki protein biyosentezi (uzun peptitler) ters yönde gerçekleşir.
Peptitlerin kimyasal sentezi, klasik çözelti fazı teknikleri kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak bunlar çoğu araştırma ve geliştirme ortamında katı faz yöntemleriyle değiştirilmiştir. Bununla birlikte, çözelti fazı sentezi, endüstriyel amaçlar için büyük ölçekli peptit üretiminde kullanışlılığını korumaktadır.
Kimyasal sentez, bakterilerde eksprese edilmesi zor olan peptitlerin üretimini, doğal olmayan amino asitlerin peptit/protein omurga modifikasyonuna dahil edilmesini ve D-amino asitlerden oluşan D-proteinlerinin sentezini kolaylaştırır.
Beritan Güneş Altın
XXVIII. dönem TBMM'de YSP Mardin milletvekilidir.
Peptit sentezi
Katı faz sentezi
Katı destek, yeni oluşan peptit zincirine bağlanan reaktif gruplar (amin veya hidroksil grupları gibi) ile işlevselleştirilmiş küçük, polimerik reçine boncuklarından oluşur. Peptit, sentez boyunca desteğe kovalent olarak bağlı kaldığından, fazla reaktifler ve yan ürünler, yıkama ve süzme yoluyla çıkarılabilir. Bu yaklaşım, geleneksel çözelti fazı sentezi kullanılırken gerekli olacak olan, her reaksiyon aşamasından sonra ürün peptitinin çözeltiden nispeten zaman alan izolasyonunu ortadan kaldırır.
Beritan Güneş Altın
Yaşamı
Mardin'nin Nusaybin ilçesinde doğdu. İlk, orta ve lise eğitimini Mardin’de tamamladı.Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Psikoloji bölümünden mezun oldu. Çeşitli sivil toplum kuruluşlarında psikolog olarak ve aktivist olarak görevler aldı.
Peptit sentezi
Katı faz sentezi
Peptit zinciri N-terminaline bağlanacak her bir amino asit, yan zincire bağlı olarak Boc (aside dayanıksız) veya Fmoc (baz-kararsız) gibi uygun koruma grupları kullanılarak N-ucunda ve yan zincirinde korunmalıdır ve kullanılan koruma stratejisi.
Beritan Güneş Altın
Siyasi yaşamı
Siyasete HDP çatısı altında devam eden Altın, 2023 Türkiye genel seçimleri'nde YSP'den Mardin'i temsilen Türkiye Büyük Millet Meclisi'ne milletvekili seçildi. Mecliste Milli Eğitim, Kültür, Gençlik ve Spor Komisyonu'nda görev aldı.
Peptit sentezi
Katı faz sentezi
Genel SPPS prosedürü, alternatif N-terminal korumayı kaldırma ve birleştirme reaksiyonlarının tekrarlanan döngülerinden biridir. Reçine, her adım arasında yıkanabilir. Önce reçineye bir amino asit bağlanır. Daha sonra aminin koruması kaldırılır ve ardından ikinci amino asidin serbest asidiyle birleştirilir. Bu döngü, istenen dizi sentezlenene kadar tekrar eder. SPPS döngüleri, reaksiyona girmemiş amino asitlerin uçlarının reaksiyona girmesini bloke eden kapatma aşamalarını da içerebilir. Sentezin sonunda, ham peptit katı destekten ayrılırken aynı anda tüm koruma grupları, trifloroasetik asit veya bir nükleofil gibi bir reaktif güçlü asitler kullanılarak çıkarılır. Ham peptit, organik olarak çözünür yan ürünleri uzaklaştırmak için dietil eter gibi polar olmayan bir çözücüden çökeltilebilir. Ham peptit, ters fazlı HPLC kullanılarak saflaştırılabilir. Özellikle daha uzun peptitlerin saflaştırma işlemi zor olabilir çünkü ürüne çok benzeyen birkaç yan ürünün küçük miktarları uzaklaştırılmalıdır. Bu nedenle, MCSGP gibi sürekli kromatografi işlemleri, saflık seviyelerinden ödün vermeden verimi en üst düzeye çıkarmak için ticari ortamlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır.
SPPS, reaksiyon verimleri ile sınırlıdır ve tipik olarak 70 amino asit aralığındaki peptitler ve proteinler, sentetik erişilebilirliğin sınırlarını zorlamaktadır. Sentetik zorluk ayrıca diziye bağlıdır, tipik olarak amiloidler gibi topaklaşmaya yatkın dizilerin yapılması zordur. Daha kısa uzunluklara, tamamen koruması kaldırılmış iki sentetik peptitin çözelti içinde birleştirilebildiği doğal kimyasal ligasyon gibi ligasyon yaklaşımları kullanılarak daha uzun uzunluklara erişilebilir.
peptit birleştirme reaktifleri
Bir amin ve karboksilik asit arasındaki amid bağı oluşumu yavaştır ve bu nedenle genellikle "birleştirme reaktifleri" veya "etkinleştiriciler" gerektirir. Kısmen belirli birleştirmeler için değişen etkinliklerine bağlı olarak çok çeşitli birleştirme reaktifleri mevcuttur, bu reaktiflerin çoğu ticari olarak temin edilebilir.
Karbodiimidler
Disikloheksilkarbodiimid (DCC) ve diizopropilkarbodiimid (DIC) gibi karbodiimidler, amid bağı oluşumu için sıklıkla kullanılmaktadır. Reaksiyon, oldukça reaktif bir O-asilizoüre oluşumu yoluyla ilerler. Bu reaktif ara ürün, bir peptit bağı oluşturan peptit N-terminal amin tarafından saldırıya uğrar. O-asilizoüre oluşumu, diklorometan gibi polar olmayan çözücüler içinde en hızlı şekilde ilerler.
DIC, bir sıvı olarak kolayca dağıtıldığı ve üre yan ürünü kolayca yıkanıp atılabildiği için özellikle SPPS için kullanışlıdır. Bunun tersine, ilgili karbodiimid 1-Etil-3-(3 dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC), üre yan ürünü sulu çalışma sırasında yıkanarak uzaklaştırılabildiğinden, çözelti fazlı peptit birleştirmeleri için sıklıkla kullanılır. Karbodiimid aktivasyonu, aktive edilmiş amino asidin rasemizasyon olasılığını açar. Rasemizasyon, triazoller 1-hidroksi-benzotriazol (HOBt) ve 1-hidroksi-7-aza-benzotriazol (HOAt) gibi "rasemizasyonu baskılayıcı" katkı maddeleri ile engellenebilir. Bu reaktifler, istenen peptit bağını oluşturmak için daha sonra peptit ile reaksiyona giren aktif bir ester oluşturmak için O-asilizoüre ara ürününe saldırır. Etil siyanohidroksiiminoasetat (Oxyma), karbodiimid bağlanması için bir katkı maddesi, HOAt'a bir alternatif olarak işlev görür.
Aminyum/uronyum ve fosfonyum tuzları
Bu reaktifler, karbodiimid aktivasyon koşulları ile aynı aktif ester türlerini oluşturur, ancak kuplaj reaktifinin karbon iskeletinin doğası tarafından belirlenen ilk aktivasyon aşamasının hızında farklılık gösterir. Ayrıca, aminium / üronyum reaktifleri, aktif olmayan bir guanidino yan ürünü oluşturmak için peptit N-terminali ile reaksiyona girebilirken fosfonyum reaktifleri değildir.
Propanfosfonik asit anhidrit
2000'lerin sonlarından bu yana, "T3P" gibi çeşitli isimler altında ticari olarak satılan propanfosfonik asit anhidrit, ticari uygulamalarda amid bağı oluşumu için yararlı bir reaktif haline gelmiştir. Karboksilik asidin oksijenini, peptit birleştirme yan ürünleri suda çözünür olan ve kolayca yıkanabilen bir ayrılan gruba dönüştürür. Propanfosfonik asit anhidrit ve apeptit olmayan bir ilacın hazırlanması için diğer peptit birleştirme reaktifleri arasındaki performans karşılaştırmasında, bu reaktifin, verim ve düşük epimerizasyon açısından diğer reaktiflerden üstün olduğu bulundu.
Katı destekler
Sıvıların hızlı filtrasyonuna izin vermek için fiziksel olarak stabilite için peptit sentezi için katı destekler seçilir. Uygun destekler SPPS sırasında kullanılan reaktifler ve çözücüler için etkisizdir, ancak reaktiflerin nüfuz etmesine izin vermek ve ilk amino asidin bağlanmasına izin vermek için kullanılan çözücülerde şişmeleri gerekir.
Üç ana tip katı destek şunlardır: jel tipi destekler, yüzey tipi destekler ve kompozitler. peptit sentezi için kullanılan katı desteklerdeki gelişmeler, SPPS'nin korumanın kaldırılması adımı sırasında TFA'nın tekrarlanan kullanımına dayanma yeteneklerini arttırır. Bir C-terminal karboksilik asit veya amidin istenip istenmediğine bağlı olarak iki birincil reçine kullanılır. Wang reçinesi, 1996 itibarıyla C-terminal karboksilik asitlere sahip peptitler için en yaygın olarak kullanılan reçinedir.
Grup şemalarını koruma
Her birinin avantajlarını ve dezavantajlarını içeren her iki yaklaşım da aşağıda daha ayrıntılı olarak özetlenmiştir.
Boc/Bzl SPPS
Peptit sentezi için orijinal yöntem, geçici bir N-terminal a-amino koruma grubu olarak tert-butiloksikarbonile (veya daha basitçe "Boc") dayanıyordu. Boc grubu, trifloroasetik asit (TFA) gibi bir asitle çıkarılır. Bu, aşırı TFA varlığında pozitif yüklü bir amino grubu oluşturur (amino grubunun sağdaki görüntüde protonlanmadığına dikkat edin), bu da nötrleştirilir ve gelen aktive edilmiş amino aside bağlanır. Nötralizasyon, bağlanmadan önce veya temel birleştirme reaksiyonu sırasında yerinde gerçekleşebilir.
Boc / Bzl yaklaşımı, sentez sırasında peptit agregasyonunu azaltmadaki yararlılığını korur. Ek olarak Boc / Bzl SPPS, Fmoc korumasının kaldırılması adımı sırasında bazla muamele gerektiğinden (aşağıya bakınız) baza duyarlı kısımlar (depsipeptitler gibi) içeren peptitleri sentezlerken Fmoc / tBu yaklaşımına göre tercih edilebilir.
Boc / Bzl SPPS sırasında kullanılan kalıcı yan zincir koruma grupları tipik olarak benzil veya benzil bazlı gruplardır. peptitin katı destekten nihai olarak çıkarılması, hidrolitik yarılma yoluyla susuz hidrojen florür kullanılarak yan zincir korumasının kaldırılmasıyla aynı anda gerçekleşir. Nihai ürün, nispeten kolay çözündürülebilen bir florür tuzudur. Reaktif t-bütil katyonlarının istenmeyen ürünler oluşturmasını önlemek için kresol gibi tutucular HF'ye eklenmelidir. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, peptitin hidrojen florür tarafından parçalanma potansiyelidir.
Fmoc/ tBu SPPS
N-terminal Fmoc korumasının kullanılması, Boc / Bzl SPPS için kullanılandan daha hafif bir koruma kaldırma şemasına izin verir ve bu koruma şeması, SPPS koşulları altında gerçekten ortogonaldir.
Fmoc korumanın kaldırılması, DMF içinde tipik olarak %20-50 piperidin kullanır. Açığa çıkan amin bu nedenle nötrdür ve sonuç olarak Boc / Bzl yaklaşımı durumunda olduğu gibi peptit reçinenin nötrleştirilmesi gerekmez. Bununla birlikte, peptit zincirleri arasında elektrostatik itme eksikliği, Fmoc / tBu SPPS ile artan toplanma riskine yol açabilir. Serbest bırakılan florenil grubu bir kromofor olduğundan Fmoc korumasının kaldırılması, reaksiyon karışımının UV emilimi ile izlenebilir, otomatikleştirilmiş peptit sentezleyicilerinde kullanılan bir strateji.
Fmoc grubunun aside karşı stabil iken nispeten hafif bazik koşullar altında bölünebilme yeteneği, (TFA)'deki son bölünme için kullanılanlardan daha hafif asidik son bölünme koşulları Boc/Bzl SPPS (HF)'de çıkarılabilen Boc ve tBu gibi yan zincir koruyucu grupların kullanımına izin verir. Yan zincir korumasının kaldırılması sonucunda açığa çıkan reaktif katyonik türlerle yan reaksiyonları önlemek için son bölünme sırasında su ve triizopropilsilan (TIPS) gibi tutucular eklenir. Elde edilen ham peptit, Boc SPPS'de üretilen florür tuzlarından potansiyel olarak çözünürleştirilmesi daha zor olan bir TFA tuzu olarak elde edilir.
Fmoc / tBu SPPS, florenil grubu Boc grubundan çok daha büyük olduğu için atom açısından daha az ekonomiktir. Buna göre, Fmoc amino asitlerinin fiyatları, ilk sentezlenmiş peptit ilaçlarından biri olan enfuvirtid'in geniş ölçekli pilot uygulaması, piyasa talebinin Fmoc- ve Boc- amino asitlerinin nispi fiyatlarını ayarladığı 1990'larda başlayana kadar yüksekti.
Benziloksi-karbonil
(Z) grubu, oligopeptitlerin sentezinde ilk olarak Max Bergmann tarafından kullanılan bir başka karbamat tipi amin koruma grubudur. Asetik asit içinde HBr kullanılarak sert koşullar altında veya daha hafif katalitik hidrojenasyon koşulları altında uzaklaştırılır. Peptit sentezinde a-amin koruması için periyodik olarak kullanılırken, neredeyse yalnızca yan zincir koruması için kullanılır.
Tahsis ve çeşitli gruplar
Alliloksikarbonil (tahsis) koruma grubu bazen bir ortogonal korumayı kaldırma şeması gerektiğinde bir amino grubunu (veya karboksilik asit veya alkol grubunu) korumak için kullanılır. Aynı zamanda bazen, peptitin reçineye bir yan zincir fonksiyonel grubu ile bağlandığı reçine üzeri döngüsel peptit oluşumu gerçekleştirirken de kullanılır. Alloc grubu, tetrakis (trifenilfosfin) paladyum (0) kullanılarak çıkarılabilir.
Bölgesel seçici disülfür bağ oluşumu
Çoklu doğal disülfitlerin oluşumu, katı faz yöntemleriyle doğal peptit sentezine meydan okur. Rastgele zincir kombinasyonu tipik olarak, doğal olmayan disülfür bağlarına sahip birkaç ürünle sonuçlanır. Aşamalı disülfür bağları oluşumu tipik olarak tercih edilen yöntemdir ve tiyol koruma grupları ile gerçekleştirilir. Farklı tiyol koruma grupları, birden çok boyutta ortogonal koruma sağlar. Bu ortogonal olarak korunan sisteinler, peptitin katı faz sentezi sırasında dahil edilir. Serbest tiyol gruplarının seçici maruziyetine izin vermek için bu grupların art arda çıkarılması, aşamalı bir şekilde disülfid oluşumuna yol açar. Bir seferde yalnızca bir grubun çıkarılması için grupların kaldırılma sırası dikkate alınmalıdır.
Soğanyemez, Edremit
Soğanyemez, Balıkesir ilinin Edremit ilçesine bağlı bir mahalledir.
Peptit sentezi
Bölgesel seçici disülfür bağ oluşumu
Daha sonra bölge seçici disülfür bağı oluşumunu gerektiren peptit sentezinde kullanılan tiyol koruyucu grupların birçok özelliğe sahip olması gerekir. İlk olarak, korumasız yan zincirleri etkilemeyen koşullarla tersine çevrilebilir olmaları gerekir. İkinci olarak koruyucu grup, katı faz sentezi koşullarına dayanabilmelidir. Üçüncüsü, tiyol koruma grubunun çıkarılması, ortogonal koruma isteniyorsa, diğer tiyol koruma gruplarını bozulmadan bırakacak şekilde olmalıdır. Yani PG A'nın kaldırılması PG B'yi etkilememelidir. Yaygın olarak kullanılan tiyol koruma gruplarından bazıları asetamidometil (Acm), tert-butil (But), 3-nitro-2-piridin sülfenil (NPYS), 2-piridin-sülfenil (Pyr) ve tritil (Trt) gruplarını içerir. Daha da önemlisi NPYS grubu, aktive bir tiol elde etmek için Acm PG'nin yerini alabilir.
Paracyprichromis
Paracyprichromis Cichlidae familyasına bağlı bir cinstir.
Peptit sentezi
Bölgesel seçici disülfür bağ oluşumu
Bu yöntemi kullanarak, Kiso ve arkadaşları 1993 yılında ilk toplam insülin sentezini rapor ettiler. Bu çalışmada, insülinin A zinciri, sisteinleri üzerinde aşağıdaki koruyucu gruplar ile hazırlandı: CysA6 (But) CysA7 (Acm) ve CysA11 (But), CysA20'yi korumasız bırakarak.
Mikrodalga destekli peptit sentezi
Mikrodalga destekli peptit sentezi, uzun peptit dizilerini yüksek verim ve düşük rasemizasyon dereceleri ile tamamlamak için kullanılmıştır.
Uzun peptitlerin sentezlenmesi
Amino asitlerin sırayla adım adım bağlandığı aşamalı uzama, 2 ila 100 amino asit kalıntısı içeren küçük peptitler için idealdir. Başka bir yöntem, peptit fragmanlarının bağlandığı fragman yoğunlaştırmadır. İlki, peptit zincirini rasemizasyon olmadan uzatabilse de, yalnızca uzun veya yüksek polariteli peptitlerin oluşturulmasında kullanılması halinde verim düşer. Fragman yoğunlaşması, sofistike uzun peptitlerin sentezlenmesi için aşamalı uzamadan daha iyidir, ancak rasemizasyona karşı koruma sağlamak için kullanımı sınırlandırılmalıdır. Parçanın yoğunlaşması da istenmeyen bir durumdur, çünkü birleştirilmiş parçanın, parçanın uzunluğuna bağlı olarak bir sınırlama olabilen brüt fazlalık olması gerekir.
Daha uzun peptit zincirleri üretmek için yeni bir gelişme, kimyasal ligasyondur: korumasız peptit zincirleri, sulu çözelti içinde kemoseçici olarak reaksiyona girer. Kinetik olarak kontrol edilen bir birinci ürün, amid bağını oluşturmak için yeniden düzenlenir. En yaygın doğal kimyasal ligasyon biçimi, bir terminal sistein kalıntısı ile reaksiyona giren bir peptit tioester kullanır.
Polipeptitlerin sulu çözelti içinde kovalent olarak bağlanması için uygulanabilen diğer yöntemler arasında bölünmüş inteinlerin spontane izopeptit bağı oluşumu ve sortaz ligasyonunun kullanılması yer alır.
Uzun peptitlerin sentezini optimize etmek için, Medicon Valley'de peptit dizilerini dönüştürmek için bir yöntem geliştirildi. Basit ön sıra (ör. Lizin (Lysn); Glutamik Asit (Glun); (LysGlu) n), alfa-sarmal benzeri bir yapı oluşturmak için peptitin C-terminaline dahil edilmiştir. Bu, potansiyel olarak biyolojik yarı ömrü artırabilir, peptit stabilitesini artırabilir ve farmakolojik aktiviteyi veya etki profilini değiştirmeden enzimatik bozunmayı inhibe edebilir.
Reçine siklizasyonunda
Peptitler, katı bir destek üzerinde siklize edilebilir. HBTU / HOBt / DIEA, PyBop / DIEA, PyClock / DIEA gibi çeşitli siklizasyon reaktifleri kullanılabilir. Baştan sona peptitler, katı destek üzerinde yapılabilir. C-terminalinin uygun bir noktada korumasının kaldırılması, koruması kaldırılmış N-terminali ile amid bağı oluşumu yoluyla reçine üzerinde siklizasyona izin verir. Siklizasyon gerçekleştiğinde peptit, asidoliz ile reçineden ayrılır ve saflaştırılır.
Siklik peptitlerin katı faz sentezi için strateji, Asp, Glu veya Lys yan zincirleri yoluyla bağlanmayla sınırlı değildir. Sistein, yan zincirinde çok reaktif bir sülfhidril grubuna sahiptir. Bir Sisteinden gelen bir kükürt atomu, proteinin farklı bir bölümünde ikinci bir sisteinden başka bir kükürt atomu ile tek bir kovalent bağ oluşturduğunda bir disülfür köprüsü oluşturulur. Bu köprüler, özellikle hücrelerden salgılananlar olmak üzere proteinleri stabilize etmeye yardımcı olur. Bazı araştırmacılar, disülfür bağının oluşumunu engellemek, ancak sisteini ve proteinin orijinal birincil yapısını korumak için S-asetomidometil (Acm) kullanarak modifiye sisteinler kullanır.
Reçinesiz siklizasyon
Reçinesiz siklizasyon, anahtar ara maddelerin katı fazlı bir sentezidir, ardından çözelti fazında anahtar siklizasyon, herhangi bir maskelenmiş yan zincirlerin nihai korumasının kaldırılması da çözelti aşamasında gerçekleştirilir. Bunun dezavantajları, katı faz sentezinin verimliliklerinin, yan ürünler reaktiflerinden ve dönüştürülmemiş materyalden saflaştırmanın gerekli olduğu çözelti fazı aşamalarında kaybolması ve makrosikl oluşumu söz konusu olduğunda istenmeyen oligomerlerin oluşabilmesidir.
Pentaflorofenil esterlerin (FDPP, PFPOH ) ve BOP-Cl'nin kullanımı peptitlerin siklize edilmesi için faydalıdır.
Alan hedefli mutajenez
Alan hedefli mutajenez, mutasyonları DNA dizilerine sokarak DNA kitaplıkları oluşturmak için en önemli laboratuvar tekniklerinden biridir. Bölgeye yönelik mutajenez elde etmek için çok sayıda yöntem vardır, ancak oligonükleotit sentezinin maliyetlerinin azalmasıyla, yapay gen sentezi artık bazen bölgeye yönelik mutajenez yerine bir alternatif olarak kullanılmaktadır. 2013 yılından bu yana, prokaryotik bir viral savunma sistemine dayalı CRISPR / Cas9 teknolojisinin geliştirilmesi, genomun düzenlenmesine de izin vermiştir ve mutagenez, nispeten kolaylıkla in vivo gerçekleştirilebilir.
Tarih
Radyasyon veya kimyasal mutajenler kullanılarak mutajenezdeki erken girişimler, bölgeye özgü olmayan rastgele mutasyonlar oluşturdu. Nükleotidlerin analogları ve diğer kimyasallar daha sonra lokalize nokta mutasyonları oluşturmak için kullanıldı, bu tür kimyasalların örnekleri aminopurin, nitrosoguanidin ve bisülfittir. Alan hedefli mutajenez, 1974 yılında Charles Weissmann'ın laboratuvarında GC'nin AT'ye geçişini indükleyen bir nükleotid analoğu N4-hidroksisitidin kullanılarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu mutagenez yöntemleri, elde edebilecekleri mutasyon türüyle sınırlıdır ve daha sonraki alan hedefli mutajenez yöntemleri kadar spesifik değildir.
1971'de Clyde Hutchison ve Marshall Edgell, küçük faj parçaları ϕX174 ve kısıtlama nükleazları ile mutantlar üretmenin mümkün olduğunu gösterdi. Hutchison daha sonra 1978'de iş arkadaşı Michael Smith ile DNA polimeraz ile bir primer uzatma yönteminde oligonükleotidler kullanarak bölgeye yönelik mutajenez için daha esnek bir yaklaşım üretti. Bu sürecin geliştirilmesindeki rolü için Michael Smith, daha sonra Ekim 1993'te, polimeraz zincir reaksiyonunu icat eden Kary B. Mullis ile Nobel Kimya Ödülü'nü paylaştı.
Temel mekanizma
Temel prosedür, kısa bir DNA primerinin sentezini gerektirir. Bu sentetik primer, istenen mutasyonu içerir ve mutasyon sahası etrafındaki şablon DNA'ya tamamlayıcıdır, böylece ilgilenilen gendeki DNA ile hibridize olabilir. Mutasyon, tek bir baz değişikliği (bir nokta mutasyonu) çoklu baz değişikliği silme veya ekleme olabilir. Tek iplikli primer daha sonra genin geri kalanını kopyalayan bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilir. Bu şekilde kopyalanan gen, mutasyona uğramış bölgeyi içerir ve daha sonra bir vektördeki bir konakçı hücreye sokulur ve klonlanır. Son olarak, istenen mutasyonu içerip içermediklerini kontrol etmek için mutantlar DNA dizilemesi ile seçilir.
Yaklaşımlar
Tek primerli uzatma kullanan orijinal yöntem, düşük mutant verimi nedeniyle verimsizdi. Ortaya çıkan bu karışım, hem orijinal mutasyona uğramamış şablonu hem de mutant ve mutant olmayan progenlerin karışık bir popülasyonunu üreten mutant ipliği içerir. Ayrıca, kullanılan şablon, mutant iplik metillenmemişken metillenmiştir ve daha az mutantla sonuçlanan metillenmiş şablon DNA'yı destekleyen yanlış eşleşme onarım sisteminin varlığı nedeniyle mutantlar karşı seçilebilir. O zamandan beri, mutagenezin etkinliğini iyileştirmek için birçok yaklaşım geliştirilmiştir.
Yeni teknikler genlere bölgeye özgü mutasyonu sokmanın daha basit ve daha kolay yollarına izin verdiğinden, çoğu 2000'li yılların başından beri laboratuvarlarda nadiren kullanılmasına rağmen, bölgeye yönelik mutagenezi etkilemek için çok sayıda yöntem mevcuttur.
Kunkel'in yöntemi
1985'te Thomas Kunkel, mutantlar için seçme ihtiyacını azaltan bir teknik geliştirdi. Mutasyona uğratılacak DNA parçası, M13mp18 / 19 gibi bir fajmid içine yerleştirilir ve daha sonra iki enzim dUTPaz (dut) ve urasil deglikosidaz (udg) eksikliği olan bir E. coli suşuna dönüştürülür. Her iki enzim de, bakteri kromozomunu dCTP'nin dUTP'ye spontan deaminasyonu yoluyla mutasyonlardan koruyan bir DNA onarım yolunun parçasıdır. DUTPase eksikliği, hücrede yüksek seviyede dUTP ile sonuçlanan dUTP'nin parçalanmasını önler. Urasil deglikosidaz eksikliği, urasilin yeni sentezlenen DNA'dan uzaklaştırılmasını engeller. Çift mutant E. coli faj DNA'sını kopyaladığından, enzimatik mekanizma dTTP yerine dUTP'yi yanlış birleştirerek bazı urasiller (ssUDNA) içeren tek iplikli DNA ile sonuçlanabilir. SsUDNA, ortama salınan bakteriyofajdan ekstrakte edilir ve daha sonra mutajenez için şablon olarak kullanılır. Primer uzantısı için istenen mutasyonu içeren bir oligonükleotid kullanılır. Oluşan heterodubleks DNA, dUTP içeren bir ebeveyn mutasyona uğramamış zincirden ve dTTP içeren mutasyona uğramış bir zincirden oluşur. DNA daha sonra vahşi tip dut ve udg genlerini taşıyan bir E. coli suşuna dönüştürülür. Burada urasil içeren ebeveyn DNA zinciri bozulur, böylece ortaya çıkan DNA'nın neredeyse tamamı mutasyona uğramış iplikten oluşur.
Kaset mutagenezi
Diğer yöntemlerden farklı olarak, kaset mutagenezinin DNA polimeraz kullanılarak primer uzatma içermesine gerek yoktur. Bu yöntemde, bir DNA parçası sentezlenir ve daha sonra bir plazmite yerleştirilir. plazmitdeki bir bölgedeki bir kısıtlama enzimi tarafından bölünmeyi ve ardından ilgili gendeki mutasyonu içeren bir çift tamamlayıcı oligonükleotidin plazmite bağlanmasını içerir. Genellikle plazmit ve oligonükleotitte kesen sınırlama enzimleri, plazmitin yapışkan uçlarına ve birbirine bağlanmasına izin veren aynıdır. Bu yöntem,% 100'e yakın verimlilikte mutantlar üretebilir, ancak mutasyona uğratılacak siteyi çevreleyen uygun kısıtlama alanlarının mevcudiyeti ile sınırlıdır.
PCR sahasına yönelik mutajenez
Kaset mutagenezinde kısıtlama alanlarının sınırlandırılması, oligonükleotid primerleri ile polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak aşılabilir, böylece iki uygun kısıtlama bölgesini kapsayan daha büyük bir parça üretilebilir. PCR'deki üssel amplifikasyon, daha sonra standart rekombinant moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak orijinal içeriğe eklenebilen jel elektroforezi ile orijinal mutasyona uğramamış plazmitden ayrılacak yeterli miktarda istenen mutasyonu içeren bir fragman üretir. Aynı tekniğin birçok çeşidi vardır. En basit yöntem, mutasyon bölgesini parçanın uçlarından birine doğru yerleştirir, burada parçayı oluşturmak için kullanılan iki oligonükleotitten biri mutasyonu içerir. Bu, tek bir PCR adımını içerir, ancak yine de çok uzun bir primer kullanılmadıkça, mutasyon bölgesinin yakınında uygun bir kısıtlama alanı gerektirme gibi doğal bir soruna sahiptir. Bu nedenle diğer varyasyonlar, üç veya dört oligonükleotit kullanır; bunlardan ikisi, iki uygun kısıtlama bölgesini kapsayan ve sindirilebilen ve bir plazmite bağlanabilen bir fragman oluşturan mutajenik olmayan oligonükleotitler olabilirken, mutajenik oligonükleotit, içindeki bir lokasyona tamamlayıcı olabilir. herhangi bir uygun kısıtlama sitesinden çok uzakta parçalayın. Bu yöntemler, bağlanacak nihai parçanın istenen mutasyonu içerebilmesi için çok sayıda PCR adımını gerektirir. İstenen mutasyona ve ilgili kısıtlama alanlarına sahip bir fragman oluşturmak için tasarım süreci külfetli olabilir. SDM-Assist gibi yazılım araçları süreci basitleştirebilir.
Tam plazmit mutagenezi
plazmit manipülasyonları için, diğer bölgeye yönelik mutagenez tekniklerinin yerini, büyük ölçüde, oldukça verimli, ancak nispeten basit kullanımı kolay ve bir kit olarak ticari olarak temin edilebilen teknikler almıştır. Bu tekniklerin bir örneği, bir çift tamamlayıcı mutajenik primerin, pfu polimeraz gibi yüksek kaliteli bir sarmal yer değiştirmeyen DNA polimeraz kullanılarak bir ısıl döngü reaksiyonunda tüm plazmiti büyütmek için kullanıldığı Quikchange yöntemidir. Reaksiyon, çentikli, dairesel bir DNA oluşturur. Şablon DNA, metillenmiş DNA için spesifik olan DpnI gibi bir kısıtlama enzimi ile enzimatik sindirim yoluyla elimine edilmelidir. Escherichia coli suşlarının çoğundan üretilen tüm DNA'lar metillenecektir, E. coli içinde biyosentezlenen şablon plazmit bu nedenle sindirilecek ve in vitro olarak üretilen ve bu nedenle metillenmemiş olan mutasyona uğramış plazmit sindirilmemiş olarak bırakılacaktır. Bu çift sarmallı plazmit mutajenez yöntemlerinde, ısıl döngü reaksiyonu kullanılabilirken DNA'nın bir PCR'de olduğu gibi üssel olarak çoğaltılmasına gerek olmadığına dikkat edin. Bunun yerine amplifikasyon doğrusaldır ve bu nedenle zincir reaksiyonu olmadığından bunları bir PCR olarak tanımlamak yanlıştır.
Oligo yönelimli hedeflerin (SMOOT) tarama mutagenezi gibi diğer teknikler, plasmid mutagenezinde mutajenik oligonükleotitleri yarı rastgele birleştirebilir. Bu teknik, tek mutasyonlardan bütün bir gen boyunca kapsamlı kodon mutagenezine kadar değişen plazmit mutagenez kitaplıkları oluşturabilir.