فلوسیتومتر
تهیه سلول برای فلوسایتومتری
برای انجام هر نوع فلوسایتومتری ابتدا باید سلول‌ها را آماده کرد به‌طوری‌که سلول‌ها به صورت تکی درآمده و در محیط مناسبی معلق شده باشند. روش‌های مختلفی برای تهیه سلول وجود دارند و روش انتخاب شده به نوع سلول مورد ارزیابی بستگی دارد. پس از تهیه سوسپانسیون مناسب، سلول‌ها باید با مواد فلورسانس رنگ شوند یا با آنتی بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم نشاندار شوند. روش نشاندار کردن تحت تأثیر فاکتورهای زیادی قرار می‌گیرد از جمله میزان اختصاصی بودن آنتی بادی و غلظت آنتی ‍ژن در سطح یا داخل سلول، مناسب بودن غلظت آنتی بادی مورد استفاده و به کار بردن کنترل‌های مثبت و منفی مناسب در آنالیز سلول‌ها. فلوسایتومترها باید بتوانند نور لیزر پراکنده شده یا فلورسانس نشر شده از یک سلول منفرد را در میان انواع سلول‌ها با حساسیت بالایی ردیابی کنند و بدین منظور سلول‌ها باید در محیط مایع به صورت سوسپانسیون یکنواختی درآیند. محیط اطراف سلول‌ها معمولاً به صورت ایزوتونیک با pH برابر ۳/۷ و غلظت سلولی بین ۱۰۵ تا ۱۰۶سلول در هر میلی لیتر تهیه می‌شود و تحت چنین شرایطی سلول‌ها به صورت یک به یک از مقابل محور تابش نور لیزر عبور خواهند کرد. معمولاً حجم کمی از نمونه (۲/۰ تا ۱ میلی لیتر) برای آنالیز لازم است ولی «حداقل حجم مورد نیاز از نمونه» به کثرت سلول‌های مورد نظر در میان انواع سلول‌های موجود در نمونه نیز بستگی دارد و اگر درصد سلول‌های تحت بررسی، نسبت به سایر سلول‌های موجود پایین باشد لازم است ابتدا برای حذف بخشی از سلول‌های ناخواسته اقدام شود. قطر سلول‌های ارزیابی شده باید در محدوده ۱ تا۳۰ میکرون باشد و فلوسایتومترهای معمولی برای ارزیابی ذرات کوچکتر از۱میکرون حساسیت لازم را ندارند، از طرفی وجود ذرات درشت از ۳۰ میکرون موجب انسداد جریان مایع در دستگاه خواهد شد. فلوسایتومترهای معمولی برای استفاده و آنالیز سلول‌های خونی طراحی شده‌اند زیرا پلاکت‌های خون حدود ۱میکرون قطر دارند و قطر سلول‌های خونی نیز ۶ تا ۱۲میکرون می‌باشند. با این حال سلول‌هایی از منشا بافت‌های دیگر (مثل بافت‌های لنفوئیدی و سلول‌های کشت شده) را نیز می‌توان با فلوسایتومترهای معمولی آنالیز کرد. با این شرط که آن‌ها باید از همدیگر و از بسترشان جدا شوند و به صورت سوسپانسیون سلول‌های منفرد در آیند و هر گونه توده سلولی باید قبل از آنالیز حذف شود. عاملی که فلوسایتومتری را به عنوان یک تکنیک فوق‌العاده در مطالعات کلینیکی در می‌آورد این است که سرعت جریان نمونه (۵ تا ۵۰ متر در ثانیه) امکان جمع‌آوری اطلاعات مربوط به ۵۰۰۰ تا۵۰۰۰۰ سلول را در هر ثانیه فراهم می‌نماید و حجم مورد نیاز از نمونه خون معمولاً حدود ۱۰۰میکرولیتر یا کمتر می‌باشد. قدم اول برای تهیه نمونه، گرفتن یا ساختن سوسپانسیون سلولی مناسب می‌باشد. نمونه خون در حالت معمول حاوی سلول‌های منفرد است که در پلاسمای خون به صورت معلق هستند. نمونه‌های بدست آمده از مغز استخوان را می‌توان با پی پت کردن مکرر به صورت سوسپانسیون سلول‌های منفرد در آورد. در نمونه‌های تهیه شده از بافت‌های جامد و لنفوئیدی، اتصالات سلول به سلول یا سلول به بستر باید شکسته شود و سلول‌ها کاملاً آزاد شوند. قدم دوم این است که تا زمان آنالیز نمونه، خصوصیات و عملکرد سلول‌های تحت بررسی باید در حالت طبیعی و دست نخورده حفظ شوند. برای برخی از انواع سلول‌ها (مثلاً آنتی ژن‌های اختصاصی رده سلولی در لنفوسیت‌های در حال استراحت) این کار نسبتا ساده است و استفاده از روش‌های مختلف معمولاً در این مورد نتایج یکنواختی به بار می‌آورد. اما برای برخی سلول‌های دیگر مثل آنتی ژن‌های CD62p در پلاکت‌ها و CD11b در نوتروفیل‌ها که سریعا تغییر می‌یابند نگهداری سلول‌ها مشکل آفرین خواهد بود و روش‌های مختلف تهیه و نگهداری سلول در این موارد ممکن است به نتایج متفاوتی ختم شود.