Μεταμεταγραφική_ρύθμιση
Γονιδιακή αποσιώπηση με miRNA και siRNA
Σημαντικό βήμα για την επιστήμη θεωρείται η ανακάλυψη μικρών (20-30 nt), μη κωδικών RNA, τα οποία ρυθμίζουν γονίδια και γονιδιώματα, σε επίπεδο μεταγραφικό και μεταμεταγραφικό. Η δράση των μικρών RNA είναι γενικότερα ανασταλτική, και δρουν ως εξειδικευμένοι παράγοντες που καθοδηγούν προσδεμένες πρωτεΐνες, μέσω αλληλεπιδράσεων σύζευξης βάσεων. Ρυθμιστικά μονοπάτια που ελέγχονται από αυτά τα μικρά RNAs ονομάζονται γενικά RNA interference (RNAi), ή RNA silencing. Το RNA interference (RNAi) είναι μια τεχνική κατά την οποία εξωγενές δίκλωνο RNA (dsRNAs), το οποίο είναι συμπληρωματικό σε γνωστό mRNA, εισάγεται σε ένα κύτταρο για να καταστρέψει το συγκεκριμένο mRNA, με συνέπεια την ελάττωση ή την πλήρη κατάργηση της γονιδιακής έκφρασης. Υπάρχουν τρεις βασικές κατηγορίες μικρών μη κωδικών RNA: τα short interfering RNA (siRNA), τα microRNA (miRNA) και τα piwi interacting RNA (piRNA). Όλα χαρακτηρίζονται από τη δίκλωνη φύση των προδρόμων τους. Τα siRNA και τα miRNA προσδένονται σε πρωτεΐνες μέλη του κλάδου Ago της οικογένειας Argonaute, ενώ τα piRNA σε μέλη του κλάδου Piwi. Τα miRNA δρουν ως ρυθμιστές ενδογενών γονιδίων, ενώ τα siRNA ως υπερασπιστές της ακεραιότητας του γονιδιώματος, εναντίον ξένων νουκλεϊκών οξέων-εισβολέων. Τα μονόκλωνα miRNA και siRNA σχετίζονται με το Επαγόμενο από RNA Σύμπλοκο Αποσιώπησης, (RNA Induced Silencing Complex, RISC). Σε όλες τις περιπτώσεις, η ταυτότητα του γονιδίου που πρόκειται να σιγηθεί καθορίζεται από το μέρος του μικρού RNA που αναγνωρίζει το στόχο μέσω Watson-Crick base pairing. Έτσι, η σίγηση με miRNA και siRNA μπορεί εύκολα να επαναπρογραμματιστεί. Τα miRNA αποτελούνται από έως και 25 αλληλουχίες RNA, μερικώς συμπληρωματικές των 3’ UTR του mRNA- στόχου. Τα primary miRNA (pri-miRNA) μετάγραφά τους διασπώνται αρχικά στον πυρήνα από την Drosha, ένα ένζυμο RNaseIII. Αργότερα μεταφέρονται στο κυτταρόπλασμα, με τη βοήθεια του μορίου exportin-5 και εκεί μετατρέπονται σε δίκλωνες αλυσίδες miRNA/miRNA, με την καταλυτική δράση του RNaseIII ενζύμου Dicer, το οποίο αφαιρεί τη θηλιά της δίκλωνης αλυσίδας. Η αλυσίδα miRNA, μαζί με την ενδονουκλεάση AGO2 και άλλες πρωτεϊνες, σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα ενζύμων, το RNA-induced silencing complex (RISC). Τα miRNA καθοδηγούν το RISC στο mRNA- στόχο, μέσω μερικώς συμπληρωματικών αλληλουχιών, για την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης. Τα miRNA έχουν βρεθεί σε ευκαρυωτικούς φυτικούς και ζωικούς οργανισμούς και κωδικοποιούνται από πλήθος γονιδίων. μικρογραφία|Η Drosha (dsRNA-specific ribonuclease) κόβει το pri-miRNA ώστε να απελευθερωθεί η δομή φουρκέτας (precursor miRNA /pre-miRNA) Τα siRNA είναι δίκλωνα μόρια RNA, μήκους έως και 21 nt, επεξεργάζονται με τον ίδιο τρόπο από το Dicer, το οποίο οδηγεί στη δημιουργία δύο εξέχοντων νουκλεοτιδίων στα 3’ άκρα. Αυτά τα dsRNA εμπλέκονται στο RNAi μονοπάτι, σχηματίζοντας RISC με AGO2 και άλλες πρωτεϊνες και οδηγώντας το στην αλληλουχία mRNA-στόχο, αναστέλλοντας τη μετάφρασή της. Η λειτουργική εξειδίκευση μεταξύ miRNA και siRNA σίγησης είναι ξεκάθαρη στα φυτά, στις μύγες, στα σκουλήκια, ακόμη και μεταξύ μελών του ίδιου κλάδου. Η κινητήρια δύναμη του RNAi είναι ένα μεγάλο γραμμικό και απόλυτα συζευγμένο δίκλωνο μόριο RNA, προερχόμενο από το περιβάλλον ή κατευθείαν από τον πυρήνα. Τα dsRNA μόρια αυτά επεξεργάζονται από την Dicer μέσα στα siRNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή σίγηση. Τα siRNA δρουν για την άμυνα του γονιδιώματος και δεν είναι μόνο προϊόντα από ξένα νουκλεικά οξέα, αλλά προκύπτουν και από ενδογενείς γονιδιωματικούς τόπους. Διαφέρουν από τα ενδογενή siRNA στο ότι αυτά ή οι πρόδρομοί τους περνάνε υποχρεωτικά από μια πυρηνική φάση. Η κυριότερη διαφορά των miRNA και siRNA εντοπίζεται στην ακρίβεια των άκρων τους. Τα microRNA συμπεριφέρονται ως παραδοσιακά πολυμερή προϊόντα της λειτουργίας των γονιδίων και συνεπώς τα περισσότερα είδη έχουν πολύ συγκεκριμένα άκρα με ελάχιστη διαφοροποίηση. Αντιθέτως τα siRNA είναι περισσότερο ετερογενή όσον αφορά τη σύσταση των άκρων τους. Επίσης, τα miRNA είναι κατάλοιπα RNA μήκους 21 nt, που προέρχονται από μεγαλύτερα RNA που περιέχουν ατελώς συζευγμένα τμήματα μεγέθους 70 nt με δομή φουρκέτας και αποτελούν τον πρόδρομο του ώριμου miRNA. Τα siRNA από την άλλη, ενώ έχουν παρόμοιο μήκος, προέρχονται από μεγαλύτερα τέλεια συζευγμένα δίκλωνα μόρια RNA ενδογενούς ή εξωγενούς προέλευσης. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η διάκριση των miRNA και siRNA βασίζεται αποκλειστικά στη διαφορετική τους προέλευση και βιογένεση και είναι ανεξάρτητη του βαθμού συμπληρωματικότητας του στόχου και της ικανότητας του 21 nt RNA να προωθήσει το ενδονουκλεολυτικό σχίσιμο του mRNA στόχου.