Polimerazna_lančana_reakcija
Polimerazna lančana reakcija (eng. polymerase chain reaction: PCR), jeste lančana reakcija umnožavanja polimerazom. Lančana sinteza polimerazom, amplifikacija polimerazom ili polimerazna amplifikacija, uobičajeno PCR, samo su neki od oblika prevoda izvornog naziva tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju u oblasti molekulske  genetike i biologije uopće. Polazna količina DNK, koja je decenijama predstavljala ograničavajući faktor u istraživanjima, svela se na potrebu prisustva samo jedne dobro očuvane molekule a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraživačima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga, gotovo da ne postoji društvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni “krivci” za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U časopisu Science 1985. godine objavili su rad u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog umnožavanja fragmenta DNK in vitro kataliziranog enzimom DNK polimeraza porijeklom iz Escherichia coli. U istom časopisu 1988. godine isti tim naučnika publicira rad u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu I izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unatoč brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. godine i 1988. godine nisu se značajnije izmijenile. mini|Kary Mullis Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su slijedeće. Pošavši od ovih premisa, Mullis je pretpostavio da može postići umnožavanje specifičnog dijela DNK molekule koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata. Selekcija specifičnog dijela DNK molekule postiže se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20–30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’3’–pravcu, tako da se na njihovom 3’–kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH–grupom i obično se obilježavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95 oC pucaju vodikove veze koje održavaju dvolančanu strukturu molekule čiji se dio umnožava (template DNA = matrica) te se ona denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uvjeti za renaturaciju, ali i za formiranje hibridnih molekula matrica–prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i pod odgovarajućim uvjetima katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid–3–fosfata za 3’–OH–grupu dezoksiriboze prajmera prema konstanti komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji može poslužiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Također, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dijela DNK. Teorijski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n–2n (n = broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Također teorijski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, može dobiti 230–2*30 = 1.073.741.764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid–3–fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veličine umnožavanog dijela DNK i željene koncentracije, tipična PCR reakcija se odvija u 30–40 ciklusa. Jedna od prvih DNK molekula koju je Mullis uspio umnožiti na ovaj način je dio gena veličine 110 bp koji kodira sitezu –globina. Ovaj fragment sadrži mjesta tačkastih mutacija u šestom kodonu gena koje dovode do promjene normalnog –globina (A) u S karakterističan za anemiju srpastih ćelija i A u C karakterističan za intracelularnu kristalizaciju hemoglobina i hemolizu. Ova procedura je značajno skratila i pojednostavila identifikaciju dva tipa mutacija koje dovode do ozbiljnih poremećaja hemoglobina. Tako je PCR tehnika već u začetku zauvijek osigurala svoje mjesto u svijetu molekularnogenetičkih istraživanja. Tipična reakcija enzimatske amplifikacije DNK fragmenta odvija se u plastičnim tubicama sa poklopcem volumena 200 l. Plastika je termostabilna a zid tubice dovoljno tanak da omogući brzo i ravnomjerno zagrijavanje smjese. Volumen reakcije se kreće od 25 do 100 l, ovisno o primjeni. Ovdje je naveden jedan primjer smjese i programa PCR reakcije. Tab. 3.6.1: Elementi i uvjeti tipične PCR reakcije