Sangerovsko_sekvenciranje
Metod
Klasični metod završetka lanca zahtijeva jednolančani DNK šablon, DNK prajmer, DNK-polimerazaDNK-polierfazu, normalne dezoksinukleotidne trifosfate (dNTP-e) i modificirane didezoksinukleotidne trifosfate (ddNTPs), od kojih potonji završavaju produžavanje lanca DNK. Ovim nukleotidima koji završavaju lanac nedostaje 3'-OH grupa potrebna za formiranje fosfodiesteske veze između dva nukleotida, što uzrokuje da DNK-polimeraza prestane sa produžavanjem DNK kada se ugradi modificirani ddNTP. ddNTP-ovi mogu biti radioaktivno ili fluorescentno označeni za detekciju u automatizovanim mašinama za sekvenciranje. Uzorak DNK je podijeljen u četiri odvojene reakcije sekvenciranja, koje sadrže sva četiri standardna dezoksinukleotida (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) i DNK-polimerazu. Svakoj reakciji se dodaje samo jedan od četiri didezoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP ili ddTTP), dok su ostali dodati nukleotidi obični. Koncentracija dezoksinukleotida bi trebala biti približno 100 puta veća od one odgovarajućeg didezoksinukleotida (npr. 0,5 mM dTTP : 0,005 mM ddTTP), kako bi se omogućilo da se proizvede dovoljno fragmenata, dok se još uvijek prepisuje kompletna sekvenca (ali koncentracija ddNTP također ovisi o željenom dužina sekvence). Stavljajući to u razumniji red, četiri odvojene reakcije su potrebne u ovom procesu za testiranje sva četiri ddNTP. Nakon ciklusa produžetka DNK šablona iz vezanog prajmera, rezultujući fragmenti DNK se zagrijavaju denaturiraju i razdvajaju po veličini pomoću gel elektroforeza. U originalnoj publikaciji iz 1977. godine, formiranje petlji uparenih bazama ssDNK bilo je uzrok ozbiljnih poteškoća u rješavanju pojaseva na nekim lokacijama. Ovo se često izvodi pomoću denaturirajućeg poliakrilamidnog-ureja gela pri čemu se svaka od četiri reakcije odvija u jednoj od četiri pojedinačne trake (trake A, T, G, C). DNK trake se tada mogu vizualizirati autoradiografijom ili UV svjetlom, a DNK sekvenca se može direktno očitati sa X-zrakama filma ili slike gela. Na slici desno, rendgenski film je bio izložen gelu, a tamne trake odgovaraju fragmentima DNK različite dužine. Tamna traka u traci ukazuje na fragment DNK koji je rezultat prekida lanca nakon ugradnje didezoksinukleotida (ddATP, ddGTP, ddCTP ili ddTTP). Relativni položaji različitih traka između četiri trake, odozdo prema gore, zatim se koriste za čitanje DNK sekvence. Tehničke varijacije sekvenciranja završetka lanca uključuju označavanje nukleotidima koji sadrže radioaktivni fosfor za radioobilježavanje, ili korištenje prajmera označenog na 5' kraju fluorescentnom bojom. Sekvenciranje prajmera boje olakšava čitanje u optičkom sistemu za bržu i ekonomičniju analizu i automatizaciju. Kasniji razvoj od strane Leroya Hooda i saradnika fluorescentno obilježenih ddNTP i prajmera postavili su scenu za automatizovano, visoko propusno sekvenciranje DNK. Metodi prekida lanca uveliko su pojednostavile sekvenciranje DNK. Naprimjer, komercijalno su dostupni kompleti zasnovani na prekidu lanca koji sadrže reagense potrebne za sekvenciranje, prethodno raspoređene u alikvote i spremne za upotrebu. Ograničenja uključuju nespecifično vezivanje prajmera za DNK, što utiče na precizno očitavanje sekvence DNK i sekundarne strukture DNK koje utiču na vijernost sekvence.