Nasumično_sekvenciranje
Hijerarhijsko nasumično sekvenciranje
Iako se nasumično sekvencioniranje u teoriji može primijeniti na genom bilo koje veličine, njegova direktna primjena na sekvenciranje velikih genoma (naprimjer, ljudski genom) bila je ograničena do kasnih 1990-ih, kada je tehnološki napredak učinio praktičnim rukovanje od ogromne količine složenih podataka uključenih u proces. Historijski gledano, vjerovalo se da je ovakvo sekvenciranje punih genoma ograničeno i samom veličinom velikih genoma i složenošću koju dodaje visoki postotak repetitivne DNK (veći od 50% za ljudski genom) prisutan u velikim genomima. Nije bilo široko prihvaćeno da će sekvenca velikog genoma sačmaricama punog genoma pružiti pouzdane podatke. Iz ovih razloga, morale su se koristiti druge strategije koje su smanjile računarsko opterećenje sklopa sekvenci prije nego što se izvrši sačmarično sekvenciranje. U hijerarhijskom sekvenciranju, poznatom i kao sekvenciranje odozgo prema dolje, genoma niske rezolucije fizička mapa se pravi prije stvarnog sekvenciranja. Iz ove mape se odabire minimalni broj fragmenata koji pokrivaju cijeli hromosom za sekvenciranje. Na ovaj način je potrebna minimalna količina sekvenciranja i sklapanja visoke propusnosti. Amplificirani genom se prvo siječe na veće komade (50–200 kb) i klonira u bakterijskog domaćina koristeći BAC ili P1-izvedeni vještački hromosom (PAC). Budući da je više kopija genoma nasumično izrezano, fragmenti sadržani u ovim klonovima imaju različite krajeve i sa dovoljno pokrivenosti (vidi odjeljak iznad) pronalaženje skele BAC kontiga koji pokriva cijeli genom je teorijski moguće. Ova skela zove se popločavanje putanje. Jednom kada je putanja popločavanja napravljena, pronađeni BAC-ovi koji formiraju ovu putanju se nasumično dijele na manje fragmente i mogu se sekvencirati korištenjem metoda sačmarice na manjem obimu. Iako pune sekvence BAC kontiga nisu poznate, poznate su njihove orijentacije jedna u odnosu na drugu. Postoji nekoliko metoda za određivanje ovog redoslijeda i odabir BAC-ova koji čine putanju popločavanja. Opća strategija uključuje identifikaciju položaja klonova u odnosu jedan prema drugom, a zatim izbor najmanjeg broja klonova potrebnih za formiranje susjedne skele koja pokriva cijelo područje od interesa. Redoslijed klonova utvrđuje se određivanjem načina na koji se oni preklapaju. Klonovi koji se preklapaju mogu se identificirati na nekoliko načina. Mala radioaktivno ili hemijski označena sonda koja sadrži mjesto označeno sekvencom (STS) može se hibridizirati na mikromrežu na kojem se klonovi štampaju. Na ovaj način, svi klonovi koji sadrže određenu sekvencu u genomu su identificirani. Kraj jednog od ovih klonova se zatim može sekvencirati kako bi se dobila nova sonda i proces se ponovio metodom koji se zove hodanje po hromosomima. Alternativno, BAC biblioteka može biti restrikcijski sažetak. Zaključuje se da se dva klona koji imaju nekoliko zajedničkih veličina fragmenata preklapaju jer sadrže više zajedničkih restrikcijskih mjesta na sličan način. Ovaj metod genomskog mapiranja naziva se restrikcijskim otiskom prsta jer identificira skup ograničenja mjesta sadržana u svakom klonu. Nakon što je pronađeno preklapanje između klonova i njihov redoslijed u odnosu na genom poznat, skela minimalnog podskupa ovih kontiga koja pokriva cijeli genom se sekvencira. Budući da prvo uključuje kreiranje mape genoma niske rezolucije, hijerarhijsko sekvenciranje sačmaricama je sporije od sekvenciranja sačmaricama cijelog genoma, ali se manje oslanja na kompjuterske algoritme nego sekvenciranje sačmaricama cijelog genoma. Međutim, proces obimnog kreiranja BAC biblioteke i odabira putanje popločavanja čini hijerarhijsko sekvenciranje sačmarica sporim i radno intenzivnim. Sada kada je tehnologija dostupna i pouzdanost podataka demonstrirana, brzina i isplativost nasiumičnog sekvenciranja u cijelom genomu učinili su ga primarnim metodom za sekvenciranje genoma.