Севера_Ачоа
Прамежкавы метабалізм
Два гады Ачоа працаваў на медыцынскім факультэце Нью-Ёркскага ўніверсітэта, пасля чаго перайшоў на факультэт біяхіміі ў стары будынак праз дарогу, дзе заняў пасаду памочніка прафесара біяхіміі. Праз два гады ён стаў фармаколагам. Факультэт фармакалогіі таксама грунтаваўся ў старым будынку і меў новыя лабараторыі, так што Севера Ачоа набыў больш прасторы і пашырыў сваю дзейнасць, прымаючы на працу студэнтаў і работнікаў са ступенню. Яго першае даследаванне ў Нью-Ёркскім універсітэце было звязана з акісляльным фасфараляваннем. Раней, у Оксфардзе, Севера Ачоа паказаў, што акісленне суправаджае фасфараляванне AMP ў ATP, прытрымліваючыся за пераносам фосфару ад ATP да цукру. Абавязковае суіснаванне фасфаралявання і акіслення пірувата, таксама даказанае Белітцэрам ў СССР і Калкарам ў Даніі, з’яўляецца значным адкрыццём. Выкарыстоўваючы сардэчны гомагенат, ён вызначыў атамныя суадносіны эстэрыфікаванага фосфару да выдаткаванага кіслароду (дачыненне P/O). Параўнанне фасфаралявання, прычынай якога з’яўляецца акісленне піравінаграднай кіслаты з тым, прычынай якога з’яўляецца дысмутацыя піравінаграднай кіслаты і фосфагліцэрынавай кіслаты ў сардэчным экстракце дала P/O=3 для першай рэакцыі. Раней яно раўнялася 2; прыніжаным значэнне P/O было з прычыны страт, выкліканых гідразізам ATP ATP-азой. Значэнне 3 было ў далейшым пацверджана Альбертам Ленінджэрам з выкарыстаннем мітахондрый. Пасля завяршэння гэтай працы, Севера Ачоа палічыў, што механізм акісляльнага фасфаралявання, не можа быць зразуметы без дадатковых ведаў аб ферментатыўных рэакцыях, якія праходзяць пры акісленні, асабліва пра тыя, якія спадарожнічаюць фасфараляванню. Як было вядома дзякуючы Крэбсу, цыкл трыкарбонавых кіслот з’яўляецца галоўным акісленнем ежы ў клетцы, а Кілін і Варбург ў сваёй працы паказалі, што ў гэты працэс ўцягнутыя пірыдынавыя нуклеатыды, флавапротэіны і цытахромы. Ачоа абраў для вывучэння ізалімонную дэгідрагеназу. Было вядома, што ізацытрат утвараецца з цытрата з дапамогай цыс-аканітата, але рэакцыя, якая вядзе да α-кетаглютарату, не была даказаная, толькі прадказаная, і Ачоа вырашыў прыгатаваць меркаваны інтэрмедыят «оксаласукцынавую кіслату», чаго ён і дасягнуў пасля некалькіх няўдалых спробаў. Пачаўшы з оксаласукцынавай кіслаты, ён назіраў утварэнне α-кетаглютарата і зрабіў заключэнне аб тым, што оксаласукцынавая кіслата сапраўды з’яўляецца інтэрмедыятам дадзенай рэакцыі. Тым часам, біяхімікі былі ўражаны з’явай фіксацыі CO2, якая мае месца ў гетэратрофнай бактэрыі, прадэманстраванай Вудам і Веркманам. Ачоа прыйшла думка, што рэакцыя ізалімоннай дэгідрагеназы зварачальная і абумоўлівае механізм працэсу фіксацыі CO2 у клетках жывёл. Лабараторыя Севера Ачоа не была абсталявана прыборамі, якія выкарыстоўваюць ізатопы; ён вырашыў, што можа вывучыць рэакцыю, якая павінна прывесці да акіслення NADPH спектрафотаметрычным шляхам, калі ізацытрат утвараецца шляхам фіксацыі CO2 на α-кетаглютараце. Аднак, як ён піша ў «Штогадовым аглядзе» (Annual Reviews), ён не верыў, што гэта спрацуе і адцягваў эксперымент да таго часу, пакуль не быў падбадзёраны Эфраімам Ракерам. Апошні працаваў на факультэце мікрабіялогіі паверхам ніжэй, і паміж імі было шмат дыскусій. Калі, нарэшце, Ачоа правёў эксперымент і ўбачыў, як стрэлка спектрафатометра прыйшла ў рух, паказваючы акісленне NADPH, ён настолькі ашалеў ад шчасця, што выбег і закрычаў: «ідзіце і паглядзіце, як рухаецца стрэлка спектрафатометра!». Але, улічваючы, што было ўжо 9 вечара, вакол нікога не аказалася. Спектрафатометр, на якім быў выраблены эксперымент, быў перададзены ў дар амерыканскаму Філасофскаму таварыству і павінен быў быць вернуты праз год, але поспех эксперыментаў і неабходнасць у спектрометры для далейшай працы прымусіла таварыства дазволіць Ачоа захаваць прыбор у сябе. Пасля гэтага ён становіцца віртуозам спектрафотаметрычнага даследавання акісляльных ферментаў; часта доследная рэакцыя магла злучацца з трыма ці чатырма іншымі ферментатыўнымі рэакцыямі да таго часу, пакуль ланцуг не завершыцца, і NAD- або NADP- залежныя рэакцыі, у якіх акісляліся або аднаўляліся пірыдзінавыя нуклеатыды, маглі забяспечыць аснову для бесперапыннага спектраметрычнага даследавання актыўнасці ферментаў. Доўгі час гэты спектрафатометр быў адзіным на ўсім факультэце — паспяховыя Амерыканскія лабараторыі не былі гэтак забяспечаны, як гэта часам здавалася.