জৈৱ_প্ৰযুক্তি
জৈৱ প্ৰযুক্তিবিজ্ঞানৰ মূলনীতি
তিনিটা স্তৰত ৰিকম্‌বিনেণ্ট DNA প্ৰস্তুত কৰা হয় যেনে, আকাংক্ষিত জিন প্ৰস্তুতকৰণ, প্লাজমিডক পৃথককৰণ আৰু আকাংক্ষিত জিন প্লাজমিডৰ লগত সংযুক্তকৰণ। A. আকাংক্ষিত জিন প্ৰস্তুতকৰণ (Preparation of Desired gene): প্ৰাকৃতিক উৎস আৰু mRNA ৰ পৰা আকাংক্ষিত জিন আহৰণ কৰা হয়। 1. প্ৰাকৃতিক উৎসৰ পৰা (From Natural Source): উদাহৰণ স্বৰূপে মানুহৰ অগ্নাশয়ৰ কোষবোৰত থকা ইনচুলিন জিন তলত উল্লেখ কৰা স্তৰসমূহত পৰ্যায়ক্ৰমে পৃথক্কৰণ কৰা হয়। (i) কোষবোৰ প্ৰথমতে চডিয়াম ক্ল’ৰাইড দ্ৰবৰে ধৌতকৰণ কৰা হয়। (ii) সমজাতীয়কৰণ (Homogenization) প্ৰক্ৰিয়াৰে কোষবেৰবোৰ বিদীৰ্ণ কৰি লোৱা হয়। (iii) সমজাতীয়কৰণ কৰাৰ পাছত SDS (Sodium dodecyle sulphate) ডিটাৰজেণ্ট ব্যৱহাৰ কৰি ঘূৰ্ণন প্ৰক্ৰিয়াৰে (Centrifugation) অলাগতিয়াল দ্ৰব্যসমূহ আতৰোৱা হয়। (iv) বাকী থকা পৃষ্ঠপ্লৱখিনিত (Supernatant) প্ৰটিন, DNA আৰু RNA থাকে। (v) প্ৰটিনখিনি প্ৰটিয়েজ (Protease) উৎসেচকৰ সহায়ত অধক্ষেপিত কৰি ঘূৰ্ণন প্ৰক্ৰিয়াৰে পৃথক কৰা হয়। (vi) RNAখিনি আতৰ কৰিবলৈ ৰিব’নিউক্লিয়েজ (Ribonuclease) উৎসেচক ব্যৱহাৰ কৰি পুনৰায় ঘূৰ্ণন প্ৰক্ৰিয়াৰে (vii) এতিয়া পৃষ্ঠপ্লৱখিনিত ইথানল মিহলাই এডাল গ্লাছৰ দণ্ডৰে লৰাই থাকিলে গ্লাছ দণ্ডডালৰ চাৰিওফালে বগা আহঁযুক্ত অধক্ষেপ পৰিব। (viii) অধক্ষেপখিনি ইথানল চডিয়াম ক্লৰাইড দ্ৰবৰ দ্বাৰা দ্ৰৱীভূত কৰি আতৰোৱা পাছত ইয়াত DNAখিনি ৰৈ যায়। 2. mRMA ৰ পৰা (From mRNA): অগ্নাশয়ৰ কোষবোৰত mRNA ৰ পৰা ইনচুলিনৰ সংশ্লেষণ হয়। ওপৰত উল্লিখিত পদ্ধতিৰ দ্বাৰা প্ৰস্তুত কৰা পৃষ্ঠপ্লৱৰ পৰা mRNA পৃথক কৰি লোৱা হয়। এই mRNA দ্ৰৱৰ লগত ৰিভাৰ্জ ট্ৰেনচ্‌ক্ৰিপ্‌টেজ (Reverse transcriptase) উৎসেচক আৰু নিউক্লিঅ’টাইড মিহলোৱা হয়। ৰিভাৰ্জ ট্ৰেনচ্‌ক্ৰিপ্‌তেজ উৎসেচকে mRNAৰ দণ্ডডালক সাচ (template) হিচাপে লৈ একদণ্ডীয় পৰিপূৰক DNAৰ (Complementory DNA/cDNA) সৃষ্টি কৰে। এতিয়া দ্ৰবখিনিত পুনৰায় DNA পলিমেৰেজ (DNA Polymerase) আৰু নিউক্লিয়’টাইড মিহলোৱা হয়। DNA পলিমেৰেজ উৎসেচকে একদণ্ডীয় cDNA দণ্ডডালক সাচ হিচাপে ব্যৱহাৰ কৰি নিউক্লিয়’টাইড সংযোগকৰণেৰে দ্বিদণ্ডীয় DNA লৈ (ইনচুলিন জিন) ৰূপান্তৰ কৰে। B. প্লাজমিডৰ পৃথক্কৰণ (Separation of Plasmid): প্লাজমিড হ’ল বেক্টেৰিয়াত থকা অতিৰিক্ত দুডাল দণ্ডযুক্ত DNA অণু। বেক্টেৰিয়াৰ পৰা প্লাজমিড পৃথক কৰিবলৈ প্ৰথমতে লাইচ’জাইম (Lysozyme) আৰু EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) ব্যৱহাৰ কৰি বেক্টেৰিয়াৱ কোষবেৰ বিদীৰ্ণ কৰি লোৱা হয়। পাছত SLS (Sodium lauryl sarcinate) ব্যৱহাৰ কৰি কোষাবৰণখনৰ অপঘটন (Lysis) কৰা হয়। শেষত ঘূৰ্ণন প্ৰক্ৰিয়াৰে প্লাজমিড DNAখিনি আঁতৰোৱা হয়। C. আকাংক্ষিত জিন প্লাজমিড অন্তভূৰ্ক্তকৰণ (Insertion of Desired Gene into Plasmid): আকাংক্ষিত জিন প্লাজমিডৰ DNA ৰ লগত সংযুক্ত কৰিবলৈ প্ৰথমতে বৃত্তাকাৰ প্লাজমিড DNA ডাল ৰেষ্ট্ৰিক্‌চন উৎসেচকৰ (Restriction enzyme) দ্বাৰা কাটি লোৱা হয়। ৰেষ্ট্ৰিক্‌চন উৎসেচকবোৰ প্ৰথমতে মেচেল্‌চন (Meslson) আৰু লোডাৰবাৰ্গে (Lederberg) 1964 চনত আৱিষ্কাৰ কৰিছিল। এইবোৰক ৰেষ্ট্ৰিক্‌চন এণ্ড’নিউক্লিয়েজ (Endonuclease) বুলিও কোৱা হয়। ৰেষ্ট্ৰিক্‌চন এণ্ডনিউক্লিয়েজে DNA ৰ পেলিনড্ৰমিক (Palindromic) ক্ৰমক চিনাক্ত কৰি সেই ঠাইতে DNA নিউক্লিয়’টাইডৰ আধাৰ ক্ৰমক বিচ্ছিন্ন কৰে। DNA তন্তুৰ পেলিনড্ৰমিক ক্ৰমত দুয়োটা দিশৰ পৰা অৰ্থাৎ 5´→3´ ফালৰ পৰা আৰু 3´→5´ ফালৰ পৰা পঢ়ি গল অনুক্ৰম বোৰ একে হয়। যেনে - 5´→ GAATTC´→3´ 3´→ CTTAAG →5´ ইয়াৰে 3´ দিশৰ কটা অংশটোত মুক্ত –OH মূলকটো থাকে, আনহাতে মুক্ত 5´ দিশটোত ফছ্‌ফেট গ্ৰুপটো থাকে। দণ্ডদুডাল কটাৰ পিছত দুয়োডাল দণ্ডৰ প্ৰত্যেকৰে কিছু অংশ ওলমি থাকে। ওলমি থকা অংশখিনিক ষ্টিকি এণ্ড (Sticky end) বোলা হয়। কিছুমান ৰেষ্ট্ৰিক্‌চন উৎসেচকে (Eg. Ball, Brevibacterium albidum) আকৌ DNA ৰ দণ্ড দুডালক পথালিকৈ ঠিক মাজেদি কাটি দিয়ে। এই ক্ষেত্ৰত মূৰ দুটাক ভোটা (Blunt) মূৰ বুলি কোৱা হয়। এতিয়া খণ্ডিতকৰন কৰি লোৱা প্লাজমিড আৰু আকাংক্ষিত জিনক একেলগ কৰা হয় আৰু DNA লাইগেজ (DNA Ligase) উৎসেচকৰ দ্বাৰা ইহঁতক (Sticky end) সংযোজন কৰা হয়। ভোটা মূৰ (Blunt end) লগ লগাবলৈ T4DNA ligase উৎসেচক ব্যৱহাৰ কৰা হয়। আকাংক্ষিত জিন প্লাজমিডত সংযুক্ত হোৱাৰ পাছত ইয়াক ৰিকম্‌বিনেণ্ট DNA (rDNA) বোলা হয়।