Gel electrophoresis and isoelectric focusing of mitochondrial and viral-induced thymidine kinases.

Subcellular fractionation studies have shown that the thymidine (dT) kinases induced by vaccinia and herpes simplex type 1 (HSV-1) viruses are localized principally in the cytosol fraction. Isoelectric focusing, disc polyacrylamide gel electrophoresis (disc PAGE), and glycerol gradient centrifugation experiments were carried out in order to compare the viral-induced enzymes with cellular dT kinases from the following sources: (1) cytosol fractions of dT kinase-positive human (HeLa S3) and mouse (LM) cells; and (2) mitochondrial extracts of HeLa S3 and of bromodeoxyuridine-resistant, dT kinase-deficient HeLa (BU25) and LM (TK−) cells. These analyses revealed that the sedimentation coefficients of the vaccinia and HSV-1 induced dT kinases were similar to those of the HeLa S3 and LM cytosol enzymes, but the viral-induced dT kinases exhibited greater disc PAGE mobilities (Rm values) and lower pI values than the HeLa S3 and LM cytosol dT kinases. The vaccinia and HSV-1 induced dT kinases were distinctly different. Both viral-induced enzymes also differed from LM (TK−) mitochondrial dT kinase in sedimentation coefficient, Rm and pI. Small differences were found between the HSV-1 induced dT kinase and a human mitochondrial-specific isozyme. However, the HSV-1 induced dT kinase resembled the mitochondrial-specific human and mouse dT kinases in ability to substitute GTP, UTP and CTP for ATP as phosphate donors in the dT kinase reaction. In contrast, the LM and HeLa S3 cytosol dT kinases and the vaccinia-induced dT kinase efficiently utilized only ATP as a phosphate donor. Recovery of LM and HeLa S3 cytosol dT kinase activities from gels was very poor when ribonucleoside 5'-triphosphates were omitted from the upper buffer solution during disc PAGE. Also, in the absence of ATP, enzyme recoveries of mitochondrial and viral-induced dT kinases were reduced and Rm values were decreased. Electrophorese et Point Isoelectrique des Thymidine Kinases Mitochondriales ou Viro-Induites Des etudes de fractionnement subcellulaire ont montre que les thymidine ( d T ) kinases induites par les virus de la vaccine et de I'herpes simplex type 1 (HSV-1) sont surtout Iocalisees dans la fraction cytosol. La recherche du point isoelectrique, l'electrophorese en gel de polyacrylamide (disc PAGE) et la centrifugation en gradient de glycerol ont ete effectuees en vue de comparer les enzymes viro-induits et les dT kinases cellulaires provenant: 1) de fractions cytosol de cellules murines (LM) ou humaines (HeLa S3) dT kinase-positives, et 2) d'extraits mitochondriaux de cellules HeLa S3 et de cellules HeLa (BU25) et LM (TK-) resistantes a la bromodesoxyuridine et deficientes en dT kinase. Ces analyses revelent que les coefficients de sedimentation des dT kinases induites par le virus de la vaccine ou le HSV-1 sont analogues a ceux des enzymes du cytosol des HeLa S3 et des LM, mais que les premieres ont des mobilites (valeurs Rm) plus fortes lors de l'electrophorese et des valeurs pl plus faibles que les secondes. Les dT kinases induites par le virus de la vaccine et le HSV-1 sont nettement differentes. Les deux enzymes viro-induits different egalement de la dT kinase mitochondriale des LM (TK-) par leur coefficient de sedimentation, leur Rm et leur PI. De faibles diffeences ont ete observees entre la dT kinase induite par le HSV-1 et un isozyme humain specifique des mitochondries. Toutefois, cette dT kinase ressemble aux dT kinases des mitochondries humaines et murines par son aptitude a remplacer l'ATP par la GTP, I'UTP et la CTP. Par contre, les dT kinases du cytosol des LM et des HeLa S3 ainsi que la dT kinase induite par le virus de la vaccine n'utilisent efficacement que I'ATP comme donneur de phosphate. L'activite de la dT kinase du cytosol des LM et des HeLa S3 Ptait tres faible s'il n'y avait pas de ribonucleosides 5′-triphosphates dans la solution du tampon superieur lors de l'electrophorese. De meme, en l'absence d'ATP, l'activite enzymatique des dT kinases mitochondriales ou viro-induites etait moins importante et les valeurs Rm diminuaient.