Identification of a teratogenic drug-protein complex in sera of phenytoin-treated monkeys.

Summary: Whole rat embryos were cultured for 48 h on sera drawn from monkeys before and 10 h after phe-nytoin gavage (275 mg/kg body weight). Sera from treated monkeys caused exencephaly, anophthalmia, microcephaly, and incomplete ventral curvature when used as culture media, whereas sera drawn from the same monkeys before treatment supported normal embryonic development. To identify the cause of serum teratogenicity, isolated constituents of teratogenic sera were added to nonteratogenic sera for testing by embryo culture. Serum extracts containing free phenytoin and its free metabolites were not teratogenic. Teratogenicity was found associated with serum proteins. Using polyacryl-amide gel electrophoresis (PAGE) and an antibody that recognized phenytoin and its metabolites, we were able to demonstrate that phenytoin was bound to a protein of 80,000 daltons. Addition of this same antibody to teratogenic sera from dosed monkeys improved the development of cultured embryos and provided additional support for this complex as the proximal teratogen. Use of the antibody to follow the uptake and distribution of phenytoin in cultured embryos suggested that only the phenytoin-protein complex (and not phenytoin itself) was able to pass through the yolk sac and reach the tissues of the embryo proper. These results suggested that a drug-protein complex may serve to transport drugs from their site of activation in the maternal liver to the developing embryo. RESUME Des embryons entiers de rats ont ete cultives pendant 48 heures dans du serum preleve chez des singes avant et 10h apres gavage par la phenytoine (275 mg/kg de poids). Les serums de singes traites ont provoque exencephalie, anophtalmie, microce-phalie et defaut de courbure ventrale, alors que les serums preleves chez les memes singes avant traitement ont permis un developpement normal de l'embryon. Afin d'identifier la cause de la teratogenicite du serum, des constituants isoles de serums tera-togenes ont ete ajoutes a des serums non teratogenes et testes sur des cultures d'embryons. Les extraits seriques contenant la phenytoine libre et ses metabolites libres ne se sont pas reveles teratogenes. La teratogeniciteetait liee aux proteines seriques. L'utilisation de l'electrophorese sur gel de polyacrylamide et d'un anticorps dirige contre la phenytoine et ses metabolites a permis de montrer que la phenytoine se trouvait liee a une proteine de PM 80 000. L'adjonction de ce meme anticorps aux serums teratogenes preleves chez les singes traites a permis d'ameliorer le developpement des embryons cultives, ce qui renforce l'hypothese du role de ce complexe comme teratogene immediat. L'anticorps a ete utilise pour suivre la fixation et la distribution de la phenytoine dans les embryons cultives; il est apparu que seul le complexe proteine-phenytoine (non la pheny-toine seule) est capable de franchir la membrane vitelline pour atteindre les tissus proprement embryonnaires. Ces resultats suggerent qu'un complexe medicament-proteine sert au transport des medicaments de leur site d'activation au niveau du foie maternel vers l'embryon. RESUMEN Durante 48 horas se han cultivado embriones completas de rata en suero extraido de monos antes y 10 horas despues de haber administrado fenitoina por medio de sonda gastrica (275 mg/kg de peso corporal). Los sueros de los monos tratados pro-dujeron exencefalia, anoftalmia, microcefalia y una curvatura ventral incompleta cuando se utilizaron como medios de cultivo, mientras que los sueros extraidos de los mismos monos antes del tratamiento produjeron desarrollo embrionario normal. Para identificar la causa de la teratogenicidad del suero, consti-tuyentes aislados del suero teratogenico fueron anadidos a los sueros no teratogenicos para determinar su actividad en el cultivo del embrion. Los extractos de suero que contenian fenitoina libre y sus metabolitos libres no eran teratogenicos. Sin embargo, la teratogenicidad estaba asociada a las proteinas sericas. Utilizando electroforesis por gel de poliacrilamida y un anti-cuerpo que reconocia la fenitoina y sus metabolitos, ha sido po-sible demostrar que la fenitoina se ligaba a las protei'nas de 80.000 dallons. La incorporacion de este mismo anticuerpo a los sueros teratogenicos de los monos medicados mejoro el desarrollo de los cultivos de embrion y proporciono apoyo adi-cional para considerar este complejo como el teratogeno proximal. La utilizacion del anticuerpo para seguir la captacion y distribucion de la fenitoina en los cultivos de embrion sugiere que solamente el complejo proteina-fenitofna (y no la fenitoina en si misrna) pasa a traves del saco del ovulo y alcanza los te-jidos del embrion propio. Estos resultados sugieren que el complejo droga-proteina puede servir de medio de transporte de drogas desde el lugar de activacion en el higado materno al embrion en vias de desarrollo. ZUSAMMENFASSUNG Ganze Rattenembryos wurden 48 Stunden lang in Serenkultiviert, die von Affen vor und 10 Studen nach einer Phenytoin-Gabe (275 mg/kg Korpergewicht) stammten. Die Seren von behandelten Affen verursachten eine Exenzephalie, Anoph-thalmie, Mikrozephalie und inkomplette Ventralkrummung wahrend die Seren von den gleichen Affen vor Behandlung eine normale embryonale Entwicklung unterstutzten. Um die Ur-sache der Teratogenitat der Seren zu erkennen, wurden isolierte Bestandteile der teratogenen Seren den nicht-teratogenen Seren zum Test in der Embryokultur beigegeben. Serumextrakte, die freies Phenytoin und seine freien Metaboliten enthielten, waren nicht teratogen. Eine Teratogenitat wurde jedoch im Zusammen-hang mit Serumproteinen gefunden. Mit Hilfe der Polyacryla-midgelelektrophorese und einem Antikorper, der Phenytoin und seine Metaboliten erkennt, war es moglich zu zeigen, das das Phenytoin an ein Protein von 80.000 Dalton gebunden ist. Die Zugabe dieses Antikorpers zu teratogenen Seren von behan-delten Affen verbesserte die Entwicklung der kultivierten Embryos und unterstutzte die Annahme, das dieser Komplex das mogliche Teratogen darstellt. Die Anwendung des Antikorpers um Aufnahme und Verteilung des Phenytoin in kultivierten Embryos zu verfolgen, erlaubt den SchluZ, das nur der Phenytoin-proteinkomplex und nicht das Phenytoin selbst fahig ist, den Dottersack zu durchdringen und das Gewebe des Embryo zu er-reichen. Diese Ergebnisse legen nahe, das ein Medikamenten-Proteinkomplex dazu dienen konnte, um Medikamente von der Stelle ihrer Aktivierung in der metterlichen Leber zum sich ent-wickelnden Embryo zu transportieren.