Mechanizmy patogenetyczne i cele terapeutyczne w chłoniaku rozlanym z dużych komórek B zależne od konstytutywnej aktywności tonicznej receptora B-komórkowego i programu transkrypcyjnego BCL6: od mikromacierzy DNA do racjonalnego leczenia

Wielkokomorkowe chloniaki rozlane B-komorkowe (DLBCL, diffuse large B-cell lymphoma) są najczestszymi nowotworami ukladu chlonnego u ludzi doroslych, a zarazem niezwykle heterogenną grupą chorob. Ich molekularną substrukture odzwierciedlają w znacznym stopniu biologiczne uwarunkowania, scharakteryzowane uprzednio na podstawie globalnego profilu ekspresji genow i algorytmu consensus clustering w dwoch niezaleznych grupach chorych. Badania te wykazaly, ze w obrebie chloniakow DLBCL mozna wyroznic trzy podtypy o odmiennej genetycznej charakterystyce. Profil ekspresji najliczniejszej ze zidentyfikowanych grup, nazwanej „BCR” (B-cell receptor signaling), charakteryzowala nadekspresja genow kodujących bialka receptora B-komorkowego i kaskady transdukcji sygnalu z tego receptora, w tym SYK (Spleen Tyrosine Kinase) oraz niektore B-komorkowe czyniki transkrypcyjne, w tym BCL6. W grupie “BCR” obserwowano rowniez czestsze niz w innych podtypach translokacje regionu 3q obejmujące locus BCL6. Obserwacje te sugerowaly, ze wzrost i proliferacja komorek tego molekularnego podtypu DLBCL moze zalezec od ściezek sygnalowych zaleznych od receptora BCR i/lub od programu transkrypcyjnego BCL6. W celu zbadania tej hipotezy, przeprowadzono badania oceniające role tonicznego sygnalu zaleznego od kinazy SYK i konsekwencji inhibicji transdukcji tego sygnalu in vitro, mechanizmy kontrolujące aktywnośc kinazy SYK, mechanizmy transkrypcyjne czynnika transkrypcyjnego BCL6 i konsekwencje wylączenia funkcji BCL6 in vitro oraz interakcje pomiedzy funkcją czynnika transkrypcyjnego BCL6 i aktywnością receptora BCR w chloniakach o molekularnej charakterystyce „BCR”. W przeprowadzonych badaniach wykazano, ze zarowno linie komorkowe o charakterystyce molekularnej odpowiadającej chloniakom typu „BCR”, jak i pierwotne izolowane komorki nowotworowe pobrane od cześci chorych, wykazują konstytutywną toniczną aktywnośc kinazy SYK i jej bezpośredniego substratu, bialka adaptorowego BLNK (B-cell linker protein). Zastosowanie wysokospecyficznego, ATP-kompetycyjnego inhibitora R406 in vitro prowadzilo do zahamowania tonicznej i aktywowanej ligandem aktywności receptora BCR (mierzonej jako fosforylacja BLNK84) i prowadzilo do apoptozy badanych komorek. Badania te wskazują, ze SYK-zalezny toniczny sygnal receptora BCR jest waznym czynnikiem warunkującym proliferacje komorek chloniakowych o molekularnej charakterystyce „BCR” i moze byc terapeutycznym celem dla malocząsteczkowego inhibitora SYK. Wykazano ponadto, ze komorki wrazliwe na dzialanie tego inhibitora mozna zidentyfikowac na podstawie ich globalnego profilu ekspresji genow. Kluczowa rola SYK w transdukcji i amplifikacji sygnalu z receptora BCR sugerowala, ze aktywnośc tej kinazy pozostaje pod ścislą fizjologiczną kontrolą. W drugiej cześci badan wykazano, ze kinaza ta jest substratem dla tkankowo-swoistej izoformy fosfatazy PTPROt ( Protein Tyrosine Phosphatase, Receptor–type O, truncated ). Wymuszona ekspresja PTPROt prowadzila do zahamowania fosforylacji SYK indukowanej ligandem i dystalnej blokady w transdukcji sygnalu do kinaz ERK1/2. Nadekspresja PTPROt prowadzila rowniez do zahamowania proliferacji komorek, a w konsekwencji do ich apoptozy. Apoptotyczną śmierc komorek wskutek nadekspresji PTPROt obserwowano rowniez przy braku aktywacji receptora BCR, co sugeruje, ze fosfataza ta reguluje takze toniczną aktywnośc SYK. Drugą podstawową charakterystyką chloniakow DLBCL typu „BCR” jest nadekspresja czynnika transkrypcyjnego BCL6 i czestsze translokacje dotyczące tego onkogenu. Obserwacje te sugerowaly, ze ekspresja BCL6 moze byc dodatkowym czynnikiem warunkującym wzrost w tym podtypie molekularnym DLBCL. Chloniaki DLBCL zalezne od szlakow molekularnych regulowanych przez BCL6 powinny wykazywac skoordynowany profil ekspresji genow kontrolowanych przez BCL6, odrebny od profilu chloniakow niezaleznych od BCL6. W celu zbadania tej hipotezy, przeprowadzono genomową analize regionow promotorowych regulowanych przez BCL6. Wykazano, ze geny kontrolowane przez BCL6 byly istotnie cześciej reprezentowane w grupie „BCR”. W badaniach przeprowadzonych na liniach komorkowych, proapoptotyczny efekt inhibicji funkcji BCL6 peptydem BPI (BCL6-peptide inhibitor) obserwowano wylącznie w liniach typu „BCR”. Unikalna wrazliwośc linii komorkowych typu „BCR” na inhibicje BCL6 sugerowala istnienie nieznanego dotychczas związku miedzy dzialaniem tego czynnika transkrypcyjnego a sygnalem zaleznym od receptora BCR. Celem zbadania postulowanego związku, przeanalizowano wplyw czynnika transkrypcyjnego BCL6 na poziom transkrypcji genow kodujących bialka biorące udzial w proksymalnych etapach transdukcji sygnalu z BCR. W izolowanych, wysoko oczyszczonych frakcjach prawidlowych limfocytow, w tym naiwnych, germinalnych i komorkach pamieci oraz w dwoch grupach pacjentow z DLBCL, ekspresja transkryptu BCL6 pozostawala w odwrotnej korelacji z ekspresją transkryptu PTPROt. W dalszych badaniach funkcjonalnych wykazano, ze BCL6 jest represorem transkrypcji genu PTPROt i bezpośrednio wiąze sie z jego regionem promotorowym. Wylączenie funkcji BCL6 poprzez mechanizm interferencji RNA powodowalo nadekspresje PTPROt, defosforylacje SYK oraz zahamowanie transdukcji sygnalu z receptora BCR tylko w liniach komorkowych typu „BCR”. BCL6 kontrolowal promotor PTPROt rowniez w prawidlowych izolowanych germinalnych limfocytach B, wskazując, ze BCL6 jest fizjologicznym regulatorem przekazywania sygnalu z BCR. Przeprowadzone badania identyfikują dotychczas nieznaną funkcje BCL6 w regulacji aktywności kompleksu receptora BCR oraz wskazują na istotny mechanizm wrazliwości na inhibicje BCL6, zalezny od zahamowania aktywności kinazy SYK. Badania te sugerują rowniez, ze skojarzone zahamowanie szlakow sygnalowych zaleznych od BCL6 i receptora B-komorkowego moze miec charakter synergistyczny u chorych z chloniakami DLBCL o charakterystyce molekularnej “BCR”.