Nucleotide sequence identification of Cryphonectria hypovirus 1 infecting Cryphonectria parasitica on grafted American chestnut trees 12–18 years after inoculation with a hypovirulent strain mixture

Summary Natural blight cankers on grafted American chestnut Castanea dentata trees were inoculated with one French-derived hypovirulent Cryphonectria parasitica strain, with a predominantly orange-pigmented colony phenotype and three Italian hypovirulent C. parasitica strains, with a predominantly white colony phenotype, in 1982 and 1983. Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) dsRNA was extracted from the four inoculated strains and from 11 predominantly white or orange pigmented C. parasitica isolates recovered from blight-controlled cankers on the grafted trees during 1994–2000; cDNAs were made by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for two hypovirus regions: (i) an 844-bp region in the helicase domain of open reading frame B (ORF B), designated OB and (ii) an 894-bp region that included part of the 5′ non-coding region and part (p29) of ORF A (5′OA). Nucleotide sequence analysis indicated that hypovirus isolates from the grafted trees and Italian inoculated strains had high homologies (identities) to each other and high homologies for OB (98.7–99.9%) and 5′OA (99.2–99.6%) to reference hypovirus, CHV1-Euro7; homologies to reference hypovirus, CHV1-EP713, were low (≤89.8%). In contrast, the hypovirus from the predominantly pigmented, French-derived inoculated strain had high homologies for OB (99.1%) and 5′OA (99.7%) to reference CHV1-EP713, and low homologies (87.7–89.7%) to the predominantly pigmented grafted-tree isolates. These results provide strong evidence that hypoviruses present in the two predominantly pigmented isolates and nine predominantly white isolates of C. parasitica from the grafted trees were of Italian inoculated hypovirulent strain origin. For the Phe(25) through Gln(73) phenotype-determinant region in p29 of 5′OA, hypovirus isolate amino acid sequences were dependent on whether they were CHV1-Euro7 or CHV1-EP713 hypoviruses, but predominantly white and predominantly pigmented phenotypes within CHV1-Euro7 or within CHV1-EP713 had identical amino acid sequences. Grafted-tree hypovirus isolates infecting the predominantly pigmented C. parasitica isolates may originate from chance transmission and replication of a CHV1-Euro7 hypovirus variant or variant mixture, possibly present in one or more of the Italian inoculated hypovirulent strains, such as Ep 49. Resume Des chancres naturels sur châtaigniers americains (Castanea dentata) greffes ont ete inocules avec 4 souches hypovirulentes de Cryphonectria parasitica, une derivee d'une souche francaise a phenotype majoritairement colore (pigmentation orange) et 3 italiennes a phenotype blanc, en 1982 et 1983. Une extraction de l'ARNdb du Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) a ete realisee a partir des 4 souches et de 11 isolats obtenus a partir des chancres traites, pigmentes (2) ou blancs (9) selon les cas, pendant la periode 1994-2000. Les ADNc ont ete obtenus par reaction reverse-transcriptase-polymerase en chaine (RT-PCR) pour 2 regions de l'hypovirus : (1) une region de 844pb dans le domaine helicase de l'ORF B (OB) et (2) une region de 894pb incluant une partie non codante de l'extremite 5’ et une partie (p29) de l'ORF A (5’OA). L'analyse de sequence a montre que les isolats obtenus presentent de fortes homologies (identite) entre eux et avec les souches italiennes inoculees, ainsi qu'avec l'hypovirus de reference CHV1-Euro7, pour OB (98.7–99.9%) et 5’OA (99.2–99.6%) ; l'homologie avec l'autre reference CHV1-EP713 est faible (≤89.8%). Par contre, l'hypovirus issu de la souche pigmentee d'origine francaise presente une forte homologie avec CHV1-EP713 pour OB (99.1%) et 5’OA (99.7%), et une faible homologie (87.7 a 89.7%) avec les virus obtenus a partir des isolats pigmentes. Il est donc probable que les virus obtenus a partir des isolats preleves sur les arbres ont pour origine les souches hypovirulentes italiennes inoculees. La sequence d'acides amines de Phe (25) a Gln(73), determinant le phenotype et correspondant a la region p29 de 5’OA, est differente entre les hypovirus CHV1-Euro7 et CHV1-EP713 mais aucune difference entre isolats, de phenotype blanc ou pigmente, a l'interieur des groupes CHV1-Euro7 et CHV1-EP713 n’ a ete obtenue. Les isolats d'hypovirus provenant d'isolats pigmentes de Cryphonectria parasitica pourraient provenir de la transmission et de la replication d'un variant ou d'un melange de variants de CHV1-Euro7, qui auraient pu etre presents dans une ou plusieurs des souches italiennes inoculees, comme Ep 49. Zusammenfassung Naturliche Cryphonectria -Krebse auf veredelten Amerikanischen Kastanien (Castanea dentata) wurden 1982 und 1983 mit einem aus Frankreich stammenden hypovirulenten Cryphonectria parasitica– Stamm mit hauptsachlich orange gefarbtem Phanotyp und mit drei hypovirulenten C. parasitica– Stammen mit uberwiegend weissem Phanotyp aus Italien inokuliert. Die dsRNA des Cryphonectria – Hypovirus 1 (CHV1) wurde sowohl aus den vier ursprunglich inokulierten C. parasitica– Isolaten als auch aus elf weiss oder orange pigmentierten Pilzstammen extrahiert, die aus hypovirulenten Krebsen auf den veredelten Baumen in den Jahren 1994–2000 reisoliert worden waren. Mit Hilfe der Reverse Transcriptase (RT)-PCR wurden cDNAs fur zwei Hypovirus-Regionen hergestellt: (i) eine 844 bp Sequenz in der Helicase Domain von ORF B (OB) und (ii) eine 894 bp Sequenz, die einen Teil der 5′- nicht kodierenden Region und einen Teil (p29) der Region ORF A einschliesst (5′OA). Die Sequenzanalyse ergab, dass die Hypovirus-Isolate von veredelten Baumen und die inokulierten Stamme aus Italien grosse Homologien untereinander aufweisen und dass auch eine grosse Ubereinstimmung mit dem Referenz-Hypovirus CHV1-Euro 7 bei OB (98,7–99,9%) und 5′OA (99,2–99,6%) vorhanden ist. Die Homologie zum Referenz-Hypovirus CHV1-EP713 war gering (≤89,8%). Im Gegensatz dazu war das Hypovirus des pigmentierten inokulierten Stammes aus Frankreich bei OB (99,1%) und 5 OA (99,7%) weitgehend homolog zum Referenzvirus CHV1-EP713 und wenig homolog (87,7–89,7%) zu den pigmentierten Isolaten von den veredelten Baumen. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Hypoviren aus den beiden uberwiegend pigmentierten und den neun vorwiegend weissen Isolaten von C. parasitica von den veredelten Baumen ihren Ursprung in den inokulierten hypovirulenten Stammen aus Italien hatten. Fur die Region Phe(25), die innerhalb von p29 bei 5′OA durch Gln(73) den Phanotyp determiniert, waren die Aminosauresequenzen der Hypovirus-Isolate davon abhangig, ob diese CHV1-Euro 7 oder CHV1-EP713 Hypoviren waren. Sowohl vorwiegend weisse als auch vorwiegend pigmentierte Phanotypen innerhalb der CHV1-Euro 7 oder innerhalb der CHV1-EP713 Hypoviren kodierten jedoch identische Aminosauresequenzen. Hypovirus-Isolate aus den veredelten Baumen, welche die hauptsachlich pigmentierten C. parasitica -Isolate infizierten, konnen aus zufalliger Transmission und Replikation einer CHV1-Euro 7–Hypovirus-Variante oder –Variantenmischung stammen, die moglicherweise in einem oder mehreren der inokulierten hypovirulenten Stamme aus Italien, z.B. Ep49, vorhanden waren.