NADPH-induced chemiluminescence and lipid peroxidation in kidney microsomes.

NADPH-induced chemiluminescence and lipid peroxidation in kidney microsomes. Lipid peroxidation and reactive oxygen species have been shown to affect diverse biological processes potentially important in renal disease. We therefore examined NADPH-induced chemiluminescence (CL) and lipid peroxidation (LP) by renal cortical and, in some experiments, medullary microsomes. We further examined the role of reactive oxygen species in these processes by the use of enzymatic and chemical scavengers. Cortical microsomes gave a marked NADPH-induced CL accompanied by LP. The time course of LP closely paralleled the CL response. Cortical microsomal CL and LP increased with increasing concentrations of protein (0.3 to 1.8 mg) and NADPH (0.1 to 3.0mM); NADH could not substitute for NADPH. Using similar amounts of protein and NADPH concentrations, cortical CL was significantly higher than medullary CL at all time points examined (peak cortical CL: 490 ± 25 × 10 3 cpm/mg protein, N=4; peak medullary CL: 226 ± 61 × 10 3 cpm/mg protein, N=4). Cortical LP was similarly higher at all time points, values corresponding to peak CL being 44.7 ± 3 nmoles/mg protein for cortex and 29.9 ± 0.8 nmoles/mg protein for medulla. Para-chloromercuribenzoate (PCMB), an inhibitor of NADPH-cytochrome P450 reductase, caused a marked inhibition of the microsomal CL and LP whereas SKF 525A, an inhibitor of cytochrome P450, had a relatively minor effect. Marked inhibition of NADPH induced CL and LP was observed with chelators EDTA and 1,10-phenanthroline. The addition of NADPH to microsomes prepared with sucrose-EDTA and washed in a Chelex-treated buffer gave a negligible CL and LP response; the responses were restored by the addition of iron. Scavengers of superoxide anion (superoxide dismutase), hydrogen peroxide (catalase), and the hydroxyl radical (sodium benzoate, tryptophan) had a relatively minor effect on CL and LP. Singlet oxygen quenchers sodium azide and 1,4-diazabicyclo (2.2.2) octane (DABCO) caused an incomplete inhibition of CL and LP responses and then only after the first 30min. Taken together, these data suggest that other free radical mechanisms are likely to be important in the CL and LP responses. These results which demonstrate the production of excited states and LP by renal microsomes suggest that their role in renal disease deserves further study. Chemiluminescence induite par le NADPH et peroxydation des lipides dans les microsomes de rein. Il a ete montre que la peroxydation des lipides et le type d'oxygene reactif modifient diversement les processus biologiques potentiellement importants dans les maladies renales. C'est pourquoi nous avons examine la chemiluminescence (CL) induite par le NADPH, et la peroxydation (LP) des lipides par des microsomes corticaux et dans quelques experiences, medullaires renaux. Nous avons ensuite examine le role du type d'oxygene reactif dans ces processus en utilisant des agents metabolisants enzymatiques et chimiques. Les microsomes corticaux donnaient une CL marquee induite par le NADPH accompagnee par une LP. Dans le temps, la LP etait etroitement parallele a la reponse CL. La CL et la LP microsomiales corticales s'elevaient avec l'accroissement des concentrations de proteines (0, 1 a 1,8 mg) et de NADPH (0,1 a 3,0mM); le NADH ne pouvait so substituer au NADPH. En utilisant des quantites identiques de proteines et de NADPH, la CL corticale etait significativement plus elevee que la CL medullaire a tous les temps examines (pic de CL corticale: 490 ± 25 × 10 3 cpm/mg proteine, N=4, pic de CL medullaire: 226 ± 61 × 10 3 cpm/mg proteine, N=4). De meme la LP corticale etait plus elevee a tous les temps, les valeurs correspondant au pic de CL etant de 44,7 ± 3 nmoles/mg proteine pour le cortex et de 29,9 ± 0,8 nmoles/mg proteine pour la medullaire. Le parachloromercuribenzoate (PCMB), un inhibiteur de la reductase NADPH-cytochrome P450a entraine une inhibition marquee de la CL et de la LP microsomiales tandis que le SKF 525 A, un inhibiteur du cytochrome P450, avait un effet relativement minime. Une inhibition marquee de la CL induite par le NADPH et de la LP a ete observee avec des chelateurs tels l'EDTA et le 1,10-phenanthroline. L'addition de NADPH a des microsomes prepares dans du sucrose-EDTA et laves dans un tampon traite au Chelex entrainait une reponse CL et LP negligeable; les reponses etaient restaurees par l'addition de fer. Les agents metabolisants l'anion superoxide (dismutase superoxide), le peroxide d'hydrogene (catalase), et le radical hydroxyle (benzoate de sodium, tryptophane) avaient un effet relativement minime sur CL et LP. Les capteurs d'oxygene singulet comme l'azide de sodium et le 1,4-diazabicyclo (2.2.2) octane (DABCO) entrainaient une inhibition incomplete des reponses CL et LP et cela seulement apres les 30 premieres min. Prises dans leur ensemble, ces donnees suggerent que d'autres mecanismes par radicaux libres sont probablement importants dans les reponses CL et LP. Ces resultats, qui demontrent la production d'etats excites et de LP par des microsomes renaux, suggerent que leur role dans les maladies renales necessite d'autres etudes.