Cultural and PCR‐based detection of Septoria musiva in inoculated hybrid poplar stems

Summary The fungal pathogen Septoria musiva can be difficult to isolate from cankers that result from its colonization of poplar stems, and its persistence in these cankers has not been well studied. In order to compare cultural and polymerase chain reaction (PCR)-based assays for detection of S. musiva in cankers, stems of susceptible hybrid poplar clone NC11505 were wounded and inoculated in August 2003. At 8, 16, 24 and 32 weeks after inoculation (October and December 2003, February and April 2004, respectively), 110 inoculated stems (plus controls) were harvested and a semiselective culture medium was used in attempts to detect the pathogen in bark and wood. Six chips of bark and six chips of underlying wood from one half of each canker were incubated on the semiselective medium for 2 weeks until pycnidia and conidia of S. musiva could be identified. The number of positive cankers and positive chips (out of six attempts per tissue per canker) was recorded. The remaining halves of cankers from subsets of 70 inoculated stems (plus controls) of those harvested in October 2003 and April 2004 were tested using a PCR-based assay. Three chips of bark and three chips of underlying wood were ground, and DNA was extracted and then amplified using S. musiva-specific primers designed from the internal transcribed spacer (ITS) region of nuclear rDNA repeats. The number of positive cankers and positive chips (out of three attempts per tissue per canker) was recorded. For both assays, the number of positive cankers and the number of positive chips per canker decreased with time. Using either assay, however, the pathogen was still detected from at least 49% of cankers at 32 weeks after inoculation. Resume Le champignon pathogene Septoria musiva est parfois difficile a isoler des chancres resultant de sa colonisation de tiges de peupliers, et sa persistance dans les chancres n'a pas eteetudiee en detail. Afin de comparer des methodes culturales et par PCR pour la detection de S. musiva dans les chancres, des tiges d'un clone sensible de peuplier hybride, NC11505, ont ete inoculees apres blessure en Aout 2003. A 8, 16, 24 et 32 semaines apres inoculation (Octobre et Decembre 2003, Fevrier et Avril 2004 respectivement), 110 tiges inoculees (et des temoins) ont ete prelevees et un milieu de culture semi selectif a ete utilise pour detecter le pathogene dans le bois et l’ecorce. Six morceaux d’ecorce et six morceaux de bois sous-jacent preleves sur la moitie de chaque chancre ont ete incubes sur le milieu semi selectif pendant deux semaines, jusqu’a ce que les pycnides et conidies de S. musiva puissent etre identifiees. Le nombre de chancres positifs et de morceaux positifs (sur six isolements par tissu) ont ete notes. La deuxieme moitie des chancres d'un echantillon de 70 tiges inoculees (et des temoins) parmi celles prelevees en Octobre et Avril 2004 ont ete testes par PCR. A partir de trois morceaux d’ecorce et trois morceaux du bois sous jacent qui ont ete broyes, l'ADN a ete extrait puis amplifie en utilisant des amorces specifiques de S. musiva, dans la region de l'ITS de l'ADN nucleaire ribosomal. Le nombre de chancres et de morceaux positifs ont ete notes. Quelle que soit la methode de detection, une decroissance du nombre de chancres positifs et du nombre de morceaux positifs par chancre a ete observee avec le temps. Toutefois, le pathogene est encore detecte dans au moins 49% des chancres 32 semaines apres inoculation, avec les deux methodes. Zusammenfassung Der Pilz Septoria musiva ist aus den Rindennekrosen, die er an Pappelstammen verursacht, zum Teil schwer isolierbar und seine Persistenz in diesen Nekrosen wurde nur unzureichend untersucht. Zum Vergleich von zwei Nachweismethoden (Isolierungen und PCR) von S. musiva in Nekrosen wurden Stamme des anfalligen Hybridpappelklons NC11505 im August 2003 verletzt und inokuliert. Nach 8, 16, 24 und 32 Wochen (Oktober und Dezember 2003 sowie Februar und April 2004) wurden 110 inokulierte Stamme und zusatzliche Kontrollbaume entnommen und es wurde versucht, das Pathogen aus der Rinde und dem Holz mit einem semiselektiven Medium zu isolieren. Je 6 Probestucke aus der Rinde und dem darunter liegenden Holz aus einer Halfte jeder Nekrose wurden fur zwei Wochen auf dem Selektivmedium inkubiert bis Pyknidien und Konidien von S. musiva identifiziert werden konnten. Die Anzahl der positiven Nekrosen und der positiven Gewebeproben (bei 6 Isolierungen pro Nekrose) wurde registriert. Bei 70 Nekrosen an Stammen, die im Oktober 2003 und April 2004 beprobt worden waren, wurde die zweite Halfte der Nekrose mit einem PCR-Nachweis getestet. Zusatzlich wurden Kontrollbaume untersucht. Hierzu wurden je drei Stucke aus der Rinde und dem darunter liegenden Holz zerkleinert, die DNA extrahiert und anschliessend mit fur S. musiva spezifischen Primern aus der ITS-Region der nuklearen rDNA amplifiziert. Auch hier wurde die Anzahl positiver Nekrosen und positiver Proben (bei jeweils drei Proben pro Gewebetyp) fur jede Nekrose registriert. Bei beiden Nachweismethoden nahm die Anzahl positiver Nekrosen und positiver Proben pro Nekrose mit der Zeit ab. Das Pathogen konnte aber mit beiden Methoden 32 Wochen nach der Inokulation noch bei mindestens 49% der Nekrosen nachgewiesen werden.