DOI: 10.5281/zenodo.18338865
title: Archivio_longshot_genoma

description: # README per studenti

## Analisi di varianti sul genoma completo del cane (ROS_Cfam_1.0)

Questo documento spiega **in modo completo e guidato** il significato e l’uso dei file:

* `*.fasta`* `*.fasta.fai`* `*.bam`* `*.bam.bai`

utilizzati per il **variant calling con Longshot** sul **genoma completo del cane** (*Canis lupus familiaris*).

**Leggere tutto prima di lanciare comandi**: molti errori nascono da reference e coordinate sbagliate.

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## 1. Il file FASTA del genoma (`combined_refs.fasta`)

### Cos’è

Il file `combined_refs.fasta` contiene le **sequenze di riferimento del genoma completo del cane**, una per ogni cromosoma.

Esempio di intestazioni:

```text>1 dna:primary_assembly primary_assembly:ROS_Cfam_1.0:1:1:123313939:1 REF>2 dna:primary_assembly primary_assembly:ROS_Cfam_1.0:2:1:86187811:1 REF...```

### Come leggerle

Ogni riga `>` descrive:

* **nome del cromosoma** (`1`, `2`, `3`, …)* **assembly**: ROS_Cfam_1.0* **coordinate**: da `1` a `LN` (lunghezza cromosoma)

Questo FASTA rappresenta **l’intero genoma**, non una porzione.

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## 2. Il file FASTA index (`combined_refs.fasta.fai`)

### Cos’è

È l’**indice del FASTA**, creato con:

```bashsamtools faidx combined_refs.fasta```

### A cosa serve

* Permette accesso rapido a singole regioni del genoma* È **obbligatorio** per:

  * samtools  * bcftools  * Longshot

Senza `.fai`, i comandi con `chr:start-end` non funzionano correttamente.

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## 3. Il file BAM (`*.bam`)

### Cos’è

Il file `.bam` contiene le **read di sequenziamento allineate** contro il reference FASTA.

Caratteristiche importanti:

* È un file binario (non leggibile a occhio)* Contiene:

  * cromosoma  * posizione  * qualità  * allineamento

### Controllo fondamentale (da fare SEMPRE)

Prima di ogni analisi, verificare il reference usato:

```bashsamtools view -H file.bam | grep '^@SQ' | head```

Esempio corretto:

```text@SQ SN:1 LN:123313939@SQ SN:2 LN:86187811```

I nomi (`SN`) e le lunghezze (`LN`) **devono combaciare** con il FASTA.

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## 4. Il file BAM index (`*.bam.bai`)

### Cos’è

È l’**indice del BAM**, creato con:

```bashsamtools index file.bam```

### A cosa serve

* Accesso rapido a regioni specifiche del BAM* Necessario per:

  * `samtools view chr:start-end`  * `samtools depth`  * Longshot con `--region`

Se il BAM cambia, l’indice va rigenerato.

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## 5. Coordinate genomiche: concetto chiave

Nel **genoma completo**:

* le coordinate partono da **1*** arrivano fino alla lunghezza del cromosoma

Esempio valido:

```text1:49662496-49740525```

Queste coordinate hanno senso **solo se**:

* il BAM è allineato contro **lo stesso FASTA*** i contig hanno lo stesso nome (`1`, non `CM025100.1`)

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## 6. Verifica della copertura (passaggio OBBLIGATORIO)

Prima di lanciare Longshot:

```bashsamtools depth -r 1:49662496-49740525 file.bam | head```

### Interpretazione

* **Output presente** → la regione è coperta → analisi sensata* **Nessun output** → nessuna read → Longshot non troverà varianti

Questo controllo evita **minuti o ore di calcolo inutili**.

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## 7. Uso corretto di Longshot (genoma completo)

Esempio standard:

```bashlongshot \  --bam file_genoma.sorted.bam \  --ref combined_refs.fasta \  --out varianti_chr1.vcf \  --region 1:49662496-49740525```

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## 8. Errore molto comune (da evitare assolutamente)

Usare coordinate genomiche su BAM di **adaptive sampling**Usare BAM e FASTA non coerentiNon controllare header e coverage

In caso di **adaptive sampling**, le coordinate sono **locali** (es. 1–800 kb) e **NON genomiche**.

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## 9. Regola d’oro da ricordare

> **Le coordinate esistono solo rispetto al reference usato per l’allineamento.**> BAM, FASTA e indici sono un unico sistema.

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## 10. Checklist rapida per studenti (prima di iniziare)

☑ Ho controllato il FASTA☑ Ho controllato l’header del BAM☑ I nomi dei cromosomi coincidono☑ Ho il file `.bai`☑ Ho verificato la coverage con `samtools depth`

Se tutte sono ✔️ → puoi lanciare Longshot con sicurezza.