DOI: 10.5283/epub.54004
title: Data archive of "Photo-Controlling Substrate Stereoselectivity of Phosphotriesterase via the Incorporation of a Light Responsive Non Canonical Amino Acid"
title: Kontrolle der Enantioselektivität der Phosphotriesterase durch den Einbau einer lichtabhängigen unnatürlichen Aminosäure

description: Organophosphates are a class of organophosphorus compounds that are used for a large variety of many different applications ranging from their use as insecticides, herbicides, or warfare agents to prodrugs used in pharmacology. First isolated from Pseudomonas diminuta and Flavobacterium sp. phosphotriesterase (PTE) has been shown to be capable of degrading various organophosphate compounds with the insecticide paraoxon as outstanding substrate where the rate of hydrolysis comes close to the rate limited by diffusion only. PTE features three distinct subsites for substrate binding, the small, the large and the leaving group subsite. Due to thedifferent sizes of these sites, PTE exhibits an enantioselectivity for the different stereoisomers (SP/RP) of chiral substrates. By altering the sizes of the subsites, stereoselectivity can be increased, relaxed, or inversed. Since the distinct enantiomers of a substrate may reveal significantly different biochemical properties, fine-tuning of enantioselectivity is highly desired to selectively degrade or isolate one single enantiomer. An interesting but hitherto unexplored way to tailor stereoselectivity is its light-control by photo-sensitive non-canonical amino acids (ncAAs). Based on this idea, in this work genetic code expansion was employed to create a photo-responsive PTE variant that exhibits an inversion of stereoselectivity upon light-exposure. More specifically, the photocaged ncAA o-nitrobenzyl-L-tyrosine (ONBY) was incorporated at two distinct positions the large subsite of PTE and further residue exchanges in both the small and the large subsite were selected based on rational design. In total, nine PTE variants containing ONBY were heterologously expressed and purified in sufficient amount and purity for further characterization. The enzymatic efficiencies and enantioselectivities of all variants for a defined substrate scope were determined by steady-state enzyme kinetics using a spectrophotometric assay. The preferentially hydrolyzed enantiomer by each variant was identified with a complementary assay employing the highly SP-enantiomer favoring PTE_G60A mutant and 31P NMR spectroscopy. The majority of the PTE variants did not display any significant effects indicative of an inversion of enantioselectivity upon irradiation for the racemic substrates tested. However, a slightly reversed stereoselectivity was observed for the hydrolysis of the cyclohexane-substituted substrates IV and V catalyzed by the variant PTE_I106A_F132A_H254G_H257ONBY, as well as for the hydrolysis of the phenyl-substituted substrate II catalyzed by PTE_H254G_L303T_H257ONBY. Strikingly, two other variants unambiguously exhibited a reversal of stereoselectivity upon irradiation. PTE_I106A_H257ONBY favored the SP enantiomer of substrate II by 3.5-fold before ONBY decaging while afterwards, the R¬P enantiomer was preferentially hydrolyzed by 36-fold. The photo-induced inversion of stereoselectivity was similar for PTE_I106A_F132A_S308A_H257ONBY where the preference of the SP enantiomer of substrate IV by 9-fold switched to a preference of the RP enantiomer by 18-fold. The design of a PTE variant whose stereoselectivity is inverted upon irradiation for the first time provides a fundamental starting point with regard to further investigations towards the photo-control of stereoselective enzymes and furthermore, offers advanced opportunities in various biochemical applications.
description: Organophosphate finden vielerlei Anwendung, beispielsweise als Insektizide, Herbizide, chemische Kampfstoffe oder in der Pharmakologie. Das Enzym Phosphotriesterase (PTE) kann verschiedene Organophosphate abbauen und wurde erstmals aus Pseudomonas diminuta und Flavobacterium sp. isoliert. Die höchste Aktivität zeigt PTE für das Insektizid Paraoxon, dessen Hydrolyse fast nur durch das Diffusionslimit begrenzt ist. Die PTE besitzt eine Bindetasche welche weiter unterteilt werden kann in die sogenannte kleine Bindestelle, die große Bindestelle und die Bindestelle der Abgangsgruppe. Durch den Unterschied in der Größe dieser Bindestellen weist die PTE eine Enantioselektivität gegenüber verschiedenen Stereoisomeren (SP/RP) chiraler Substrate auf. Veränderungen der Größe der unterschiedlichen Bindungsstellen der Bindetasche kann die Stereoselektivität verstärken, abschwächen oder sogar invertieren. Die Enantiomere unterschiedlicher Substrate besitzen verschiedene biochemische Eigenschaften, weshalb es allgemein vorteilhaft ist, eines der beiden bevorzugt abbauen oder isolieren zu können. Ein interessanter, aber bisher noch unerforschter Ansatz, die Stereoselektivität zu regulieren wäret die Kontrolle mittels Licht durch photosensitive unnatürliche Aminosäuren. Um diese Idee zu verwirklichen, wurde in dieser Arbeit eine lichtabhängige PTE-Variante hergestellt, deren Stereoselektivität nach Belichtung invertiert wird. Dafür wurde die Methode der Erweiterung des genetischen Codes genutzt. Genauer gesagt wurde die unnatürliche Aminosäure o-Nitrobenzyl-L-Tyrosin (ONBY) an zwei Positionen in der großen Bindestelle in PTE eingebaut und es wurden zusätzliche Aminosäuren sowohl in der großen als auch in der kleinen Bindestelle durch rationales Design ausgetauscht. Insgesamt wurden neun PTE-Varianten, die ONBY beinhalten, in ausreichender Menge und Reinheit exprimiert. Die katalytische Effizienz und Enantioselektivität aller Varianten wurde für eine Auswahl an Substrate über Steady-State-Enzymkinetiken spektrophotometrisch bestimmt. Das Enantiomer, das von jeder Variante bevorzugt hydrolysiert wurde, wurde sowohl mithilfe eines Komplementationsassays mit der höchst SP-selektiven Variante PTE_G60A als auch durch 31P NMR-Spektroskopie identifiziert. Die meisten PTE-Varianten zeigten nach Belichtung keine signifikanten Effekte, die eine Inversion der Stereoselektivität für die untersuchten razemischen Substrate zeigten. Dennoch wurde eine geringfügige Inversion der Enantioselektivität für die Hydrolyse des cyclohexan-substituierten Substrats IV, katalysiert durch die Variante PTE_I106A_F132A_H254G_H257ONBY, und für die Hydrolyse des phenyl-substituierten Substrats II, katalysiert durch PTE_H254G_L303T_H257ONBY, beobachtet. Bemerkenswerterweise zeigten zwei andere Varianten eine eindeutige Inversion der Stereoselektivität nach Belichtung. PTE_I106A_H257ONBY bevorzugte das SP Enantiomer von Substrat II um 3.5-fache vor Belichtung, wohingegen das RP Enantiomer 36-fach nach Belichtung favorisiert wurde. Diese lichtinduzierte Inversion der Stereoselektivität war ähnlich bei PTE_I106A_F132A_S308A_H257ONBY, dessen 9-fache Präferenz für das SP Enantiomer von Substrat IV sich zu einer 18-fachen Präferenz für das RP Enantiomer nach Belichtung umkehrte. Die erstmalige Entwicklung einer PTE-Variante, deren Enantioselektivität durch Belichtung invertiert wird, stellt eine wichtige Grundlage für zukünftige Untersuchungen der Lichtkontrolle von stereoselektiven Enzymen dar und bietet zudem fortgeschrittene Möglichkeiten für verschiedene biochemischen Anwendungen.
description: Courses of measurements for substrate hydrolysis used for obtaining catalytic efficiencies and stereoselectivities of different PTE variants.