DOI: 10.14457/tu.the.2015.501
title: การผลิตและการศึกษาสมบัติทนอุณหภูมิของซี-ไฟโคไซยานินจากไซยาโนแบคทีเรียที่แยกจากบ่อน้ำพุร้อน

description: ซี-ไฟโคไซยานินเป็นสารสีธรรมชาติในกลุ่มโปรตีนที่มีการประยุกต์อย่างกว้างขวางในทางเทคโนโลยีชีวภาพ เช่น อุตสาหกรรมอาหาร และอุตสาหกรรมเครื่องสำอาง อย่างไรก็ตาม ซี-ไฟโคไซ-ยานินมีข้อจำกัดในการนำไปใช้ในกระบวนการที่ใช้อุณหภูมิต่ำเท่านั้น เนื่องจากซี-ไฟโคไซยานินมีความเสถียรต่ำที่อุณหภูมิสูง ดังนั้น การค้นหาซี-ไฟโคไซยานินที่คงตัวที่อุณหภูมิสูงจึงจำเป็นต่อการเพิ่มโอกาสในการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมที่หลากหลายขึ้น งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดแยกและเพาะเลี้ยงไซยาโนแบคทีเรียที่เจริญได้ดีที่อุณหภูมิสูง และใช้เป็นแหล่งของซี-ไฟโคไซยานินที่ทนอุณหภูมิสูงได้ โดยแผ่นไซยาโนแบคทีเรียที่ใช้ในการศึกษาได้จากการสุ่มเก็บตัวอย่างจากแหล่งน้ำพุร้อน 4 ที่ในจังหวัดสุราษฎร์ธานี โดยเลี้ยงในอาหารสูตร BG-11 ที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ให้แสงต่อเนื่องเป็นเวลา 1 สัปดาห์ จากนั้นจึงนำตัวอย่างแผ่นสาหร่ายมาบดและเกลี่ยบนอาหารแข็งสูตร BG-11 บ่มที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส โดยให้แสงต่อเนื่อง จากการศึกษาพบไซยาโนแบคทีเรียที่มีสัณฐานแตกต่างกัน 5 สายพันธุ์ โดย Thermosynechococcus sp. TUBT-T01 เป็นสายพันธุ์ที่เจริญเติบโตได้ดี จึงนำไปศึกษารูปแบบการเจริญเติบโตในอาหารสูตร BG-11 ที่เติม NaNO3 ปริมาณ 3 กรัมต่อลิตร บ่มที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส เขย่า 100 รอบต่อนาที โดยให้แสงต่อเนื่อง เก็บตัวอย่างทุก 2 วัน เป็นเวลา 44 วัน แล้วนำไปวัดการเติบโตในรูปของค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 730 นาโนเมตร และพบความหนาแน่นของเซลล์สูงสุดเท่ากับ 6.98 ในวันที่ 36 ของการเพาะเลี้ยง และมีอัตราการเจริญเติบโตจำเพาะเท่ากับ 0.155 ต่อวัน จากผลการทดลองที่ได้แสดงให้เห็นว่า TUBT-T01 เป็นตัวเลือกที่สำคัญสำหรับการพัฒนากระบวนการผลิตไฟโคไซยานินทนร้อนต่อไปเพื่อเปรียบเทียบซี-ไฟโคไซยานินที่ได้จาก TUBT-T01 ซึ่งคัดแยกได้จากน้ำพุร้อน และไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์ที่มีลักษณะสัณฐานทางวิทยาใกล้เคียงกันได้แก่ S. cedrorum TISTR 8589 จึงทำการขยายขนาดการเพาะเลี้ยง ในขวดปริมาตร 2 ลิตร เพื่อเก็บเกี่ยวเซลล์สำหรับสกัดซี-ไฟโคไซยานินสำหรับใช้ทดสอบสมบัติทนร้อนของซี-ไฟโคไซยานินจากไซยาโนแบคทีเรียทั้งสองสายพันธุ์ พบว่า สายพันธุ์ TUBT-T01 มีปริมาณของเซลล์เปียกและเซลล์แห้งเท่ากับ 0.89 และ 0.25 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ ซึ่งเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ TISTR 8589 ที่สามารถเก็บเกี่ยวของเซลล์เปียกและเซลล์แห้งเท่ากับ 6.67 และ 1.00 กรัมต่อลิตรส่วนของการเตรียมซี-ไฟโคไซยานินสกัดหยาบ เริ่มจากการทดสอบสารละลายที่ใช้ในการสกัดซี-ไฟโคไซยานิน โดยเมื่อเปรียบเทียบสารละลายที่ใช้ในการสกัดซี-ไฟโคไซยานิน ซึ่งได้แก่ น้ำกลั่น โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ที่มีความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ (แปรผันค่าพีเอชที่พีเอช 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, และ 8.0) และโซเดียมคลอไรด์ (แปรผันความเข้มข้นที่ความเข้มข้น 50, 100, 150, 200, และ 250 มิลลิโมลาร์) พบว่าสารละลายที่เหมาะสมสำหรับใช้ในการสกัดซี-ไฟโคไซยานินจาก TUBT-T01 คือการใช้น้ำกลั่นสกัดที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นระยะเวลา 48 ชั่วโมง ให้สารสกัดหยาบที่มีปริมาณซี-ไฟโคไซยานินเท่ากับ 41.0 มิลลิกรัมต่อกรัมเซลล์แห้ง และในส่วนของสายพันธุ์ TISTR 8589 พบว่าสารละลายที่เหมาะสมสำหรับการสกัดคือฟอสเฟสบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 50 mM ที่พีเอช 7.0 สกัดเป็นระยะเวลา 8 ชั่วโมง ซึ่งให้สารสกัดหยาบของซี-ไฟโคไซยานินเท่ากับ 26.4 มิลลิกรัมต่อกรัมเซลล์แห้ง เมื่อทำการขยายขนาดการสกัดเพื่อเตรียมซี-ไฟโคไซยานินสกัดหยาบใช้ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ความเข้มข้น 50 มิลลิโมลาร์ พีเอช 7.0 ในอัตราส่วน 1: 50 ในการสกัดผลการสกัดซี-ไฟโคไซยานินจาก TUBT-T01 และ TISTR 8589 มีความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินเท่ากับ 30.28 และ 15.88 มิลลิกรัมต่อกรัมเซลล์ตามลำดับ และมีค่าความบริสุทธิ์เท่ากับ 0.88 และ 0.47 ตามลำดับ ส่วนของการเก็บเกี่ยวและทำให้ซี-ไฟโคไซยานินเข้มข้นด้วยเทคนิคดูดซับ ขั้นต้นหาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการดูดซับซี-ไฟโคไซยานินของตัวแลกเปลี่ยนประจุ โดยใช้ตัวกลางแลกเปลี่ยนประจุ Streamline Direct HST1 ต่อสารสกัดหยาบซี-ไฟโคไซยานินในอัตราส่วน 1 ต่อ 10 ศึกษาที่พีเอช 4.0 ถึง 7.0 เมื่อทำการศึกษาซี-ไฟโคไซยานินที่ได้จาก TUBT-T01 (TC-PC) พบว่าสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการดูดซับซี-ไฟโคไซยานิน คือ พีเอช 5.0 ดูดซับซี-ไฟโคไซยานินได้ถึง 90.58 เปอร์เซ็นต์ และเมื่อทำการขยายขนาดการดูดซับจาก 5 มิลลิลิตร เป็น 250 มิลลิลิตร พบว่า มีปริมาณซี-ไฟโคไซยานินที่ถูกดูดซับร้อยละ 83.19 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งสามารถเพิ่มความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินได้ถึง 3.71 เท่า มีผลได้จากการชะเท่ากับ 74.1 เปอร์เซ็นต์ และมีความบริสุทธิ์สูงสุดเท่ากับ 1.96 และเมื่อทำการศึกษาซี-ไฟโคไซยานินที่ได้จาก TISTR 8589 (SC-PC) พบว่า สภาวะที่เหมาะสมสำหรับการดูดซับซี-ไฟโคไซยานินคือ ที่พีเอช 4.5 สามารถดูดซับซี-ไฟโคไซยานินได้ 49.48 เปอร์เซ็นต์ และเมื่อทำการขยายขนาดการดูดซับจาก 5 มิลลิลิตร เป็น 250 มิลลิลิตร พบว่า มีปริมาณซี-ไฟโคไซยานินที่ถูกดูดซับ ร้อยละ 74.87 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งคิดเป็นความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินที่ถูกดูดซับ 4.07 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรของตัวดูดซับ เพิ่มความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินได้ 2.50 เท่า และให้ค่าผลได้เท่ากับ 50 เปอร์เซ็นต์ และมีบริสุทธิ์สูงสุดเท่ากับ 2.15และส่วนสุดท้ายการศึกษาผลของพีเอชและอุณหภูมิต่อเสถียรภาพของซี-ไฟไคไซยานิน พบว่า อุณหภูมิและพีเอชมีบทบาทสำคัญต่อเสถียรภาพของซี-ไฟโคไซยานิน โดยส่งผลให้ซี-ไฟโคไซยานินมีค่าคงที่อัตราการสลายตัวเพิ่มขึ้นและค่าครึ่งชีวิตลดลง พีเอชทำให้ซี-ไฟโคไซยานินมีความเสถียรสูงสุด คือ พีเอช 5.0 ซึ่งทำให้ความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินคงเหลือสูงถึง 97.45 เปอร์เซ็นต์ เมื่อบ่มที่ 50 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 4 ชั่วโมง ซึ่งมีเสถียรภาพมากกว่า SC-PC ที่มีความเสถียรสูงสุดที่พีเอช 7.0 และมีความเข้มข้นของซี-ไฟโคไซยานินคงเหลือ 74.54 เปอร์เซ็นต์