DOI: 10.14457/tu.the.2015.4
title: การพัฒนากระบวนการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนโดยยีสต์สายพันธุ์ทนร้อน Ogataea thermomethanolica ภายใต้การควบคุมการแสดงออกตลอดเวลาด้วยโปรโมเตอร์ OthGAP

description: การพัฒนากระบวนการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนโดยยีสต์สายพันธุ์ทนร้อน Ogataea thermomethanolica ภายใต้การควบคุมการแสดงออกตลอดเวลาด้วยโปรโมเตอร์ OthGAP ใน งานวิจัยนี้ได้แบ่งการทดลองออกเป็น 5 ส่วน คือ 1. การศึกษารูปแบบการเติบโตของรีคอมบิแนนท์ยีสต์ O. thermomethanolica ในฟลาสก์เขย่าสำหรับเตรียมกล้าเชื้อเพื่อเพาะเลี้ยงในถังปฏิกรณ์ชีวภาพ 2. การศึกษาอิทธิพลของพีเอชและอุณหภูมิต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตสในถังปฏิกรณ์ชีวภาพโดยใช้กระบวนการเพาะเลี้ยงแบบแบทช์ 3. การศึกษารูปแบบการเติมสับสเทรตในระยะการเพาะเลี้ยงแบบเฟด-แบทช์ 4. การศึกษาความเป็นไปได้ในการใช้น้ำตาลซูโครสเป็นแหล่งคาร์บอน และ 5. การศึกษาอิทธิพลของการเพิ่มอุณหภูมิในระยะเฟด-แบทช์ต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตส การศึกษารูปแบบการเติบโตของรีคอมบิแนนท์ยีสต์ O. thermomethanolica ในฟลาสก์เขย่าได้ทำการศึกษาอิทธิพลของอุณหภูมิ (แปรผันอุณหภูมิเท่ากับ 30, 35 และ 40 องศาเซลเซียส)และระยะเวลาที่เหมาะสมในการเตรียมกล้าเชื้อขั้นที่ 1 และกล้าเชื้อขั้นที่ 2 สำหรับการเพาะเลี้ยงในถังปฏิกรณ์ชีวภาพ จากผลจากการทดลองพบว่า การเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส ส่งผลให้ความเข้มข้นของเซลล์และอัตราการเติบโตจำเพาะมีค่าสูงสุดเท่ากับ 12.00±0.24 กรัมต่อลิตร และ 0.26 ต่อชั่วโมง นอกจากนี้ ระยะเวลาที่เหมาะสมในการเตรียมกล้าเชื้อขั้นที่ 1 ในอาหารเหลว YPD และระยะเวลาที่เหมาะสมในการเตรียมกล้าเชื้อขั้นที่ 2 ในอาหารสังเคราะห์สูตร Syn6 ที่อุณหภูมิ 35 องศาเซลเซียส คือ 16 ชั่วโมง และ 24 ชั่วโมง ตามลำดับ การศึกษาอิทธิพลของพีเอชและอุณหภูมิต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตสในกระบวนการเพาะเลี้ยงแบบแบทช์ โดยแปรผันค่าพีเอชเท่ากับ 4.0, 5.0, 6.0, 6.5 และ 7.0 และควบคุมสภาวะอื่นให้คงที่ (อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 1000 รอบต่อนาที และอัตราการให้อากาศ 1 ลิตรต่อลิตร.นาที) ผลการทดลองพบว่า การเพาะเลี้ยงที่พีเอช 4.0-6.5 เซลล์มีรูปแบบการเติบโตคล้ายกัน  โดยพีเอชที่เหมาะสมที่สุดต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตสคือ พีเอช 6.0 เนื่องจากให้ค่าความเข้มข้นของเซลล์และค่ากิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตสสูงสุดเท่ากับ 14.00±0.21 กรัมต่อลิตร และ 7.83±0.04 หน่วยต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ ดังนั้น พีเอชที่เหมาะสมต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตสคือ พีเอช 6.0 ส่วนการศึกษาอิทธิพลของอุณหภูมิทำการแปรผันอุณหภูมิเท่ากับ 30, 34, 38, 40 และ 42 องศาเซลเซียส และควบคุมสภาวะอื่นให้คงที่ (พีเอช 6.0 อัตราการกวน 1000 รอบต่อนาที และอัตราการให้อากาศ 1 ลิตรต่อลิตร.นาที) ผลการทดลองพบว่า เซลล์สามารถเติบโตได้ในช่วงอุณหภูมิระหว่าง 30-40 องศาเซลเซียส โดยการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิสูงกว่า 34 องศาเซลเซียส ส่งผลให้ความเข้มข้นของเซลล์ อัตราการเติบโตจำเพาะ และกิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตสมีค่าลดลง อย่างไรก็ตาม การเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 และ 34 องศาเซลเซียส ให้ผลการเติบโตและการผลิตไม่ต่างกันมากนัก ดังนั้นผู้วิจัยจึงเลือกอุณหภูมิ 34 องศาเซลเซียส เป็นอุณหภูมิควบคุมเพื่อลดต้นทุนในการผลิตการศึกษารูปแบบการเติมสับสเทรตในการเพาะเลี้ยงแบบเฟด-แบทช์เพื่อเพิ่มความหนาแน่นของเซลล์ และการผลิตเอนไซม์ไฟเตส โดยหลีกเลี่ยงการสร้างผลพลอยได้ในรูปเอทานอลและกรดอะ-ซิติก ในงานวิจัยนี้ได้ทำการศึกษารวมทั้งสิ้น 4 รูปแบบ ได้แก่ การเติมแบบเอกซ์โพเนนเชียล การเติมแบบคงที่ การเติมแบบครั้งคราว และการเติมโดยอาศัยค่าออกซิเจนละลายเป็นตัวควบคุม (DO stat) ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า การเติมแบบเอกซ์โพเนนเชียลส่งผลให้เซลล์เติบโตได้อย่างรวดเร็วในระยะแรกของการเติมสับสเทรต จากนั้นเซลล์มีการสร้างผลิตภัณฑ์รองในรูปเอทานอลและกรดอะซิ-  ติกอย่างต่อเนื่องซึ่งมีค่าเท่ากับ 48.70±3.55 และ 12.79±0.21 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ การเติมแบบคงที่และการเติมแบบครั้งคราวส่งผลให้ความเข้มข้นของเซลล์ และผลได้ของเซลล์จากสับสเทรตมีค่าใกล้เคียงกัน แต่เมื่อพิจารณาค่ากิจกรรมเอนไซม์ของไฟเตสพบว่า การเติมแบบครั้งคราวให้ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตส (166.58±2.26 หน่วยต่อมิลลิลิตร) สูงกว่าการเติมแบบคงที่ (66.41±0.50 หน่วยต่อมิลลิลิตร) อย่างไรก็ตาม การเติมสับสเทรตแบบครั้งคราวอาจเกิดความยุ่งยากในทางปฏิบัติ เนื่องจากผู้ปฏิบัติงานต้องคอยติดตามค่าออกซิเจนละลายของระบบอย่างใกล้ชิดเพื่อเติมสับสเทรตในครั้งถัดไป ดังนั้นผู้วิจัยศึกษาการเติมสับสเทรตโดยใช้ค่าออกซิเจนละลายเป็นตัวควบคุมการเติมสับ สเทรต ผลการศึกษาพบว่า เซลล์สามารถเติบโตและผลิตเอนไซม์ไฟเตสได้อย่างต่อเนื่องและตรวจไม่พบผลิตภัณฑ์รองในระบบการเพาะเลี้ยง ดังนั้นการเพาะเลี้ยงแบบเฟด-แบทช์ที่มีการควบคุมการเติมสับสเทรตโดยใช้ค่าออกซิเจนละลายจึงมีความเหมาะสมที่สุดสำหรับการผลิตเอนไซม์ไฟเตสจากรีคอมบิแนนท์ยีสต์ O. thermomethanolicaจากการศึกษาความเป็นไปได้ในการใช้น้ำตาลซูโครสเป็นแหล่งคาร์บอนในการเพาะเลี้ยง     รีคอมบิแนนท์ยีสต์ O. thermomethanolica เพื่อผลิตเอนไซม์ไฟเตส จากผลการศึกษาพบว่า การเพาะเลี้ยงแบบแบทช์เซลล์มีรูปแบบการเติบโตและให้ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตสใกล้เคียงกับการใช้กลูโคสเป็นแหล่งคาร์บอน ส่วนการเพาะเลี้ยงแบบเฟด-แบทช์โดยอาศัยค่าออกซิเจนละลายเป็นตัวควบคุมการเติมสับสเทรตพบว่า ค่าความเข้มข้นของเซลล์ กิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตส และพารามิเตอร์อื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเติบโตและการสร้างผลิตภัณฑ์มีค่าใกล้เคียงกับการใช้กลูโคสเป็นแหล่งคาร์บอน จากผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าน้ำตาลซูโครสสามารถนำมาใช้ในการเพาะเลี้ยงรีคอม-บิแนนท์ยีสต์ O. thermomethanolica เพื่อผลิตเอนไซม์ไฟเตสภายใต้การควบคุมการแสดงออกของโปรโมเตอร์ OthGAP ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การศึกษาอิทธิพลของการเพิ่มอุณหภูมิในระยะเฟด-แบทช์ต่อการเติบโตและการผลิตเอนไซม์ไฟเตส ซึ่งการเพาะเลี้ยงในระยะแบทช์ทำการควบคุมอุณหภูมิเท่ากับ 34 องศาเซลเซียส เมื่อเข้าสู่ระยะเฟด-แบทช์ทำการเติมสับสเทรตโดยอาศัยค่าออกซิเจนละลายเป็นตัวควบคุม และทำการเพิ่มอุณหภูมิเป็น 38, 40 และ 42 องศาเซลเซียส ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า การเพิ่มอุณหภูมิเป็น 38 และ 40 องศาเซลเซียส เซลล์สามารถเติบโตและผลิตเอนไซม์ไฟเตสได้อย่างต่อเนื่อง ส่วนการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส ไม่สามารถควบคุมการเติมสับสเทรตโดยใช้ค่าออกซิเจนละลาย ทั้งนี้การเพิ่มอุณหภูมิส่งผลให้ความเข้มข้นของเซลล์ ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตส และพารามิเตอร์อื่นๆ มีค่าลดลง โดยการเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 38 องศาเซลเซียส ให้ค่ากิจกรรมของเอนไซม์ไฟเตสสูงกว่าอุณหภูมิ 40 และ 42 องศาเซลเซียส ประมาณ 3.1 และ 5.7 เท่า ตามลำดับ