DOI: 10.14457/tu.the.2018.21
title: การคัดเลือกกลิมเอสไรโบสวิตช์ประสิทธิภาพสูงในระบบเซลล์ Escherichia coli เพื่อใช้เป็นเครื่องมือทางรีเวิร์สเจเนติกส์ สำหรับเชื้อมาลาเรีย

description: โรคมาลาเรียเป็นปัญหาทางสาธารณะสุขที่สำคัญของโลก ปัจจุบันพบปัญหาการดื้อยาต้านมาลาเรียซึ่งส่งผลต่อการรักษาและการควบคุมโรค จึงมีความจำเป็นในการพัฒนายาต้านมาลาเรีย รวมทั้งการค้นหาเป้าหมายของยาต้านมาลาเรียใหม่ วิทยานิพนธ์นี้ทำการศึกษาหน้าที่และความสำคัญของยีนดีออกซีไฮพิวซีนซินเทสในเชื้อมาลาเรีย Plasmodium falciparum เพื่อพิสูจน์การเป็นเป้าหมายของยา ดีออกซีไฮพิวซีนซินเทสมีความสำคัญในสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตทำหน้าที่ในกระบวนการเติมกรดอะมิโนไฮพิวซีนให้กับโปรตีน eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) ซึ่งเป็นโปรตีนที่มีความสำคัญในการแปลรหัสโปรตีน ผู้วิจัยได้ศึกษาเชื้อมาลาเรียปรับแต่งพันธุกรรมที่ถูกลดการแสดงออกของยีนดีออกซีไฮพิวซีนซินเทสโดยใช้เครื่องมือทางรีเวิร์สเจเนติกส์   กลิมเอสไรโบสวิตช์ในสภาวะที่มีน้ำตาลกลูโคซามีน เพื่อเหนี่ยวนำการตัดตัวเองของกลิมเอสไรโบสวิตช์ออกจากสายอาร์เอ็นเอ จากการตรวจสอบการสังเคราะห์โปรตีนที่ถูกสร้างใหม่ด้วยการติดฉลากโปรตีนด้วยพิวโรมัยซิน พบว่าการลดการแสดงออกของยีนดีออกซีไฮพิวซีนซินเทสที่ระดับ 90 เปอร์เซ็นต์ใน P. falciparum  ไม่ส่งผลต่อการสังเคราะห์โปรตีนทั้งหมดในเชื้อ แต่พบการเติบโตของเชื้อที่ช้าลงเมื่อเปรียบเทียบกับเชื้อปรับแต่งพันธุกรรมที่ถูกเลี้ยงในสภาวะปกติ แสดงให้เห็นว่ายีน     ดีออกซีไฮพิวซีนซินเทสอาจเป็นยีนสำคัญของเชื้อ อย่างไรก็ตามระบบกลิมเอสไรโบสวิตช์ยังมีข้อจำกัดในเรื่องระดับการลดการแสดงออกของยีนได้เพียง 70-90 เปอร์เซ็นต์ ซึ่งส่งผลต่อการศึกษาหน้าที่ของยีนในเชื้อมาลาเรียที่มีระดับการแสดงออกที่แตกต่างกัน อีกทั้งในการใช้น้ำตาลกลูโคซามีน ซึ่งเป็นสารเหนี่ยวนำให้เกิดการทำงานของกลิมเอสไรโบสวิตช์     ไม่สามารถใช้ในปริมาณที่สูงเนื่องจากมีความเป็นพิษต่อเชื้อมาลาเรีย จึงมีความจำเป็นในการคัดเลือกระบบกลิมเอสไรโบสวิตช์ที่มีประสิทธิภาพดีขึ้น อย่างไรก็ตาม การทดสอบและคัดเลือกกลิมเอสไรโบสวิตช์ในเชื้อมาลาเรียโดยตรง ต้องอาศัยขั้นตอนการสร้างเชื้อมาลาเรียปรับแต่งพันธุกรรมซึ่งใช้เวลานานและมีประสิทธิภาพต่ำ ดังนั้นผู้วิจัยจึงมีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างระบบเซลล์แบคทีเรียสำหรับศึกษาการทำงานของกลิมเอสไรโบสวิตช์และคัดเลือกกลิมเอสไรโบสวิตช์ที่มีประสิทธิภาพสูงในระดับเซลล์ ผู้วิจัยได้สร้าง Escherichia coli ที่มี พลาสมิดรายงานผลและพลาสมิดสำหรับแสดงออกเอนไซม์ RNaseJ1 (RJ1) ซึ่งมีความสำคัญในการสลายอาร์เอ็นเอ ที่เกิดจากการทำงานของกลิมเอสไรโบสวิตช์   ในวิทยานิพนธ์นี้มีการใช้พลาสมิดรายงานผลเพื่อแสดงออกโปรตีนรายงานผลสามชนิด ได้แก่     พลาสมิดสำหรับผลิตโปรตีน E ซึ่งเป็นโปรตีนที่ทำให้เซลล์ของ E. coli เจ้าบ้านถูกย่อยและแตกออก พลาสมิดสำหรับผลิตโปรตีนเรืองแสงสีเขียว หรือ green fluorescent protein (GFP)  และพลาสมิดสำหรับผลิตโปรตีนคู่ EGFP-hDHFR ซึ่งประกอบด้วยโปรตีนเรืองแสงสีเขียวแบบเข้ม หรือ enhanced GFP (EGFP) และโปรตีน human dihydrofolate reductase (hDHFR)   พลาสมิดรายงานผลจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์ของกลิมเอสไรโบสวิตช์จาก Bacillus subtillis และ M9 ซึ่งเป็นไรโบสวิตช์ที่ขาดความสามารถในการตัดตัวเองอยู่ที่หน้าลำดับนิวคลีโอไทด์ ที่เป็นตำแหน่งจับของไรโบโซมของยีนรายงานผล  ผู้วิจัยได้พิสูจน์การแสดงออกของโปรตีนรายงานผลและเอนไซม์ RNaseJ1 ใน E. coli  ที่มีพลาสมิดรายงานผลและ พลาสมิด RJ1 พบว่าโปรตีนรายงานผลและเอนไซม์ RNaseJ1 สามารถแสดงออกได้  โดยได้มีการปรับสภาวะการเพาะเลี้ยงเพื่อให้เชื้อมีการเติบโตที่คงที่และลดผลกระทบจากสารทดลองต่อการเติบโตของเชื้อ จากการทดลองพบว่าความยาวของลำดับนิวคลีโอไทด์ระหว่างไรโบสวิตช์และลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เป็นตำแหน่งจับของไรโบโซมมีความสำคัญต่อการแสดงออกของโปรตีนรายงานผล   และเมื่อศึกษาการทำงานของกลิมเอสไรโบสวิตช์ใน E. coli ที่มีพลาสมิดรายงานผลและพลาสมิด RJ1 โดยการเหนี่ยวนำด้วยน้ำตาลกลูโคซามีนและตรวจสอบระดับการแสดงออกของโปรตีนรายงานผล   พบว่าโปรตีนรายงานผลมีการแสดงออกลดลงใน E. coli ที่มีพลาสมิดรายงานผลที่แสดงออกโปรตีน E ที่มี กลิมเอสไรโบสวิตช์ความยาว 168 คู่เบส และพบว่าโปรตีนรายงานผลใน E. coli ที่มีพลาสมิดรายงานผลที่แสดงออกโปรตีน EGFP_hDHFR ที่มีกลิมเอสไรโบสวิตช์มีการแสดงออกได้น้อยกว่า M9 แสดงให้เห็นว่ากลิมเอสไรโบสวิตช์อาจมีการทำงานในระบบเซลล์ที่สร้างขึ้น ระบบเซลล์แบคทีเรียดังกล่าวนี้จะสามารถนำมาใช้ในการทดสอบและคัดเลือกกลิมเอสไรโบสวิตช์ที่มีประสิทธิภาพได้