title: Towards a time- and cost-effective protocol for the systematic analysis of cellular gene expression kinetics in scale
Creators: name: Slama, Lisa
Publisher: name: :none
Year: 2022

description: Die Genexpression ist ein wesentlicher und stark regulierter Prozess, der die Produktion, Verarbeitung und den Zerfall von RNA umfasst. Die derzeit verfügbaren RNA-Sequenzierungsprotokolle bieten schnelle Einblicke in die qualitativen und quantitativen Veränderungen des Transkriptoms im Steady-State, erlauben aber keine Einsicht in die relativen zellulären Kinetiken der RNA-Biogenese, -Verarbeitung und -Umsetzung. Dies hat sich mit der Entwicklung von zeitaufgelösten RNA-Sequenzierungsverfahren wie SLAMseq geändert. SLAMseq nutzt die 4-Thiouridin (s4U)-basierte metabolische RNA-Markierung in kultivierten Zellen, gefolgt von Thiol-verknüpfter Alkylierung, was zu spezifischen T-zu-C-Umwandlungen an der Stelle des s4U-Einbaus bei der cDNA-Konvertierung und Sequenzierung führt. Während dieser Ansatz Zugang zur zellulären Rate der RNA-Biogenese und des RNA-Umsatzes bietet, ist seine Anwendung bei massiven parallelen Screening-Ansätzen durch die hohen Sequenzierungskosten im Zusammenhang mit der herkömmlichen globalen RNA-Sequenzierung begrenzt. In dieser Arbeit entwickelte ich einen gezielten Multiplex-SLAMseq-Ansatz, der die systematische Untersuchung der Genexpressionskinetik ermöglicht. Zu diesem Zweck habe ich SLAMseq mit der gezielten 3'-mRNA-Sequenzierung von Kandidaten-Transkripten kombiniert und die Parameter und Reagenzien für das Protokoll zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek systematisch optimiert. Als Ergebnis konnte ich robuste kinetische Parameter für bis zu 30 verschiedene Transkripte mit konsistenter Darstellung erhalten. Eine weitere Erhöhung der Transkript Anzahl ist möglich und kann durch den Einsatz eines verschachtelten Amplifikationsansatzes erreicht werden. Schließlich schlage ich einen minimalisierten Arbeitsablauf für die künftige halbautomatische cDNA Bibliotheksbereitung vor, der die reverse Transkription und das Barcoding im Lysat umfasst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ich robuste, skalierbare, und kosteneffiziente Protokolle für die systematische Erstellung von Profilen der Genexpressionskinetik entwickelt habe, die für die künftige massive parallele Untersuchung von Genregulationswegen nützlich sein werden.
description: Gene expression is an essential and highly regulated process, which involves the production, processing, and decay of RNA. Currently available RNA sequencing protocols provide rapid insights into qualitative and quantitative changes of the transcriptome at steady-state but are blind to the relative kinetics of RNA biogenesis, processing and turnover. This has changed with the recent development of time-resolved RNA sequencing approaches, such as SLAMseq. SLAMseq uses 4-thiouridine (s4U)-based metabolic RNA labeling in cultured cells followed by thiol-linked alkylation, resulting in specific T-to-C conversions at the site of s4U-incorporation upon cDNA conversion and sequencing. While this approach provides access to the cellular rate of RNA biogenesis and turnover in the context of steady-state gene expression profiles, its application to massive parallel screening approaches is limited by high sequencing costs associated with conventional global RNA sequencing. Here, I developed a multiplexed targeted SLAMseq approach to overcome the current limitations in the systematic inspection of gene expression kinetics in scale. To this end, I combined SLAMseq with targeted 3' mRNA sequencing of candidate transcripts and systematically optimized the parameters and reagents for cDNA library preparation. As a result, I was able to obtain robust kinetic parameters for up to 30 different transcripts with consistent representation despite vastly diverging steady-state expression levels. A further increase in transcript numbers is possible and could be achieved by employing a semi-nested amplification approach. Finally, I propose an advanced workflow for future semi-automated library preparation, which involves in-lysate reverse transcription and barcoding. In summary, I developed robust, scalable, and cost-effective protocols for the systematic profiling of gene expression kinetics that will be useful for the future massive parallel dissection of gene regulatory pathways.