title: Gentherapeutische Vektoren für die Tumortherapie
title: Gene therapy vectors for tumor therapy
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Hubing, Sascha
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik

description: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich generell mit der Entwicklung von Gentherapeutischen Transfektionssystemen mit dem vorrangigen Ziel die Behandlungsmöglichkeiten bei Tumorerkrankungen zu optimieren und auszubauen. Durch die Weiterentwicklung und Verknüpfung etablierter Systeme sollen neue Möglichkeiten geschaffen werden, um die Therapie onkologischer Erkrankungen zielgerichteter und effizienter zu gestalten. Die drei nachfolgend beschriebenen Projekte adressieren dieses Ziel durch unterschiedliche Ansätze. Im 1. Projekt in Kapitel 4 beschreiben wir Polyethylenimin-Silica-Nanopartikel als effiziente Gentherapeutische Vektoren. Durch die Kombination von zwei etablierten Vertretern aus der Gruppe der nicht-viralen Vektoren konnten wir eine deutliche Verbesserung bezüglich wichtiger Eigenschaften erreichen. Mit verschiedenen Toxizitätsstudien in der Zellkultur konnten wir belegen, dass die zytotoxischen Nebenwirkungen im Vergleich zu den einzelnen Komponenten wesentlich geringer ausgeprägt ist. Für die spätere Verwendung in der Praxis ist diese Optimierung von besonderer Relevanz, weil gerade die Toxizität einen wesentlichen limitierenden Faktor für den Einsatz nicht-viraler Gentherapeutika darstellt. Folglich ist bei einer zukünftigen Anwendung mit reduzierten Nebenwirkungen und einer verbesserten Compliance zu rechnen. Weiterhin ist es uns gelungen eine um rund 40 % gesteigerte Transfektionseffizienz im Vergleich zu Polyplexen nachgewiesen. Besonders diese herausragende Perfomance macht unseren Vektor zu einem attraktiven Kandidaten für den gentherapeutischen Einsatz. Durch eine mehrtägig angelegte Messreihe zur Überprüfung der Resilienz gegenüber Agglomerationsvorgängen haben wir die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität unseres Vektors über mehrere Tage nachgewiesen. Die bei Silica-NP besonders ausgeprägte Neigung zur Bildung von Agglomeraten konnte somit verhindert werden. Hinsichtlich der späteren Handhabbarkeit und Lagerung ist diese Wandlung ein enormer Zugewinn. Das 2. Projekt in Kapitel 5 befasst sich mit der Tauglichkeit von Biolumineszenz zur selbstinduzierten Photodynamischen Therapie. Hierfür haben wir Zellen mit pCMV-luc beladen Lipopolyplexen transfiziert um sie zur Biolumineszenz zu befähigen. Die durch die BL emittierten Lichtstrahlen sollen den in der Hülle des Transportsystems eingebetteten Photosensetizer Hypericin aktivieren und folglich durch dessen toxische Reaktion zur Apoptose des angrenzenden Gewebes führen. Durch die Untersuchung der wechselseitigen Beeinflussung von unterschiedlichen Mengen an Hypericin und D-Luciferin auf die Lichtemission einer Luciferase exprimierenden Ziellinie konnten wir Rückschlüsse auf die Aktivierung von Hypericin durch die Biolumineszenz der Zelllinie gewinnen. Bei dem Vergleich der emittierten Lichtstrahlen in Abwesenheit und Anwesenheit von unterschiedlichen Hypericin-Darreichungen konnten wir die Absorption einer Teilmenge des emittierten Lichts beobachten. Die Lichtabsorption wurde durch die Erhöhung der Hypericinkonzentration jedoch nicht beeinflusst. Als Folge der Lichtabsorption durch Hypericin konnten wir jedoch keine toxischen Effekte auf die verwendete Zelllinie feststellen. Signifikante Unterschiede, die wir bei MTT-Versuchen beobachten konnten, waren lediglich auf die eingesetzte Menge an D-Luciferin zurückzuführen. Trotz nachgewiesener Absorption durch den Photosensitizer kommt es zu keinen messbaren toxischen Effekten. Das bei der Biolumineszenz-Reaktion freigesetzte Licht reicht folglich nicht aus, um eine effiziente Aktivierung des Photosensetizers Hypericin zu erreichen. In dem 3. Projekt in Kapitel 6 beschreiben wir Lipopolyplexe als effektive Vektoren für den MDR1-Knockdown durch RNA-Interferenz, in dessen Folge durch die Überexpression von P-Glykoprotein vermittelte Zytostatikaresistenzen wieder zurückgebildet werden. Mittels RT-qPCR konnten wir eine Reduzierung der MDR1-mRNA um ca. 60 % nachweisen. Polyplexe haben mit gleicher siMDR1-Konzentration nur eine halb so große Reduktion erzielt. Besonders für niedrige DOX-Konzentrationen konnten wir in Folge des MDR1-Knockdowns eine ausgeprägte Rückgewinnung der Sensitivität zeigen. Von keiner toxischen Wirkung bei einer Konzentration von 125 µg DOX / ml zu einer Zellüberlebensrate von knapp 50 % bei vorangegangenem MDR1-Knockdown mit Lipopolyplexen. Gerade für die Klinische Praxis ist die Wirksamkeit in niedrigen Konzentrationen wichtig, da Dosissteigerungen durch ausgeprägte Nebenwirkungen oftmals nicht möglich sind. Da in engem Zusammenhang mit der Konzentration an MDR1 auch eine Reihe weiterer Faktoren diskutiert werden, die den Verlauf und die Letalität einer Tumorerkrankung maßgeblich beeinflussen, haben wir die Auswirkung des MDR1-Knockdowns auf diese Charakteristika, zu denen Zellmigration, -invasion, -proliferation und -kolonisation gehören, untersucht. Für alle Faktoren konnten wir durch verschiedene in-vitro Versuche eine deutliche Reduktion der jeweiligen Tendenz feststellen, die mit dem Ausmaß der MDR1-Reduzierung korreliert. Diese Erkenntnisse sprechen im Allgemeinen für den Ansatz der MDR1-Knockdown Therapie, da neben der verbesserten Wirksamkeit der Zytostatikatherapie die Ausbreitung der Tumorzellen beeinträchtigt wird.