Επίδραση του εξασθενούς χρωμίου σε αναπτυσσόμενα ακρορρίζια του φυτού Arabidopsis thaliana
Creators: name: Φάτσιου, Μαρία Βλασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: εξασθενές χρώμιο
προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος
ακρορρίζια
hexavalent chromium
programmed cell death
root apex

description: Το χρώμιο (Cr) είναι το έβδομο πιο άφθονο μεταλλικό στοιχείο στο φλοιό της γης και είναι τοξικό για τους ζώντες οργανισμούς. Συναντάται στη φύση κυρίως με την τρισθενή [Cr(III)] και εξασθενή [Cr(VI)] μορφή του, οι οποίες έχουν εντελώς διαφορετικές ιδιότητες καθώς το Cr(ΙΙΙ) είναι δυσκίνητο και λιγότερο τοξικό επειδή οι ενώσεις του είναι γενικά αδιάλυτες στο νερό, ενώ το Cr(VI) είναι ευδιάλυτο στο νερό, ευκίνητο και πολύ τοξικό. Η τοξικότητά του έχει μελετηθεί εκτεταμένα στα θηλαστικά, ενώ περιορισμένες είναι οι έρευνες για την επίδρασή του σε φυτικούς οργανισμούς. Με τη μορφή διχρωμικού καλίου (K2Cr2O7) μελετήσαμε την επίδραση του Cr(VI) σε αναπτυσσόμενα ακρορρίζια του φυτού Arabidopsis thaliana. Σε προκαταρκτικά πειράματα μετρήθηκε ο ρυθμός μεταβολής του μήκους ρίζας παρουσία διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων Cr(VI) με σκοπό την ανεύρεση της κρίσιμης συγκέντρωσης για τα κύρια πειράματα. Στη συνέχεια, προφυτρωμένα αρτίβλαστα του φυτού εκτέθηκαν σε 50, 100 και 250 μΜ Cr(VI) για 24 ώρες για να μελετηθεί αρχικά η επίδραση του χρωμίου στη διάταξη των μικροσωληνίσκων με συνεστιακή μικροσκοπία μετά από έμμεση ανοσοσήμανσή τους. Κρίσιμη αποδείχθηκε η συγκέντρωση των 100 μΜ Cr(VI), στην οποία πραγματοποιήθηκαν όλα τα επόμενα πειράματα για τη σύγκριση στη μορφολογία των μικροσωληνίσκων , τη ζωτικότητα των κυττάρων και την επίδραση του χρωμίου στην υπέρλεπτη δομή σε διαφορετικούς χρόνους επίδρασης. Σε ακρορρίζια μάρτυρα και παρουσία 100 μΜ Cr(VI) για 16, 24 και 48 ώρες έγινε μελέτη της ζωτικότητας κυττάρων, έλεγχος αποκόλλησης της πλασματικής τους μεμβράνης, εντοπισμός της παραγωγής ενεργών μορφών οξυγόνου (ROS), υπεροξειδασών και αυτοφαγοσωμάτων με κατάλληλες τεχνικές. Διαπιστώθηκε ότι ο μεγαλύτερος αριθμός νεκρών κυττάρων εντοπίζεται στη μεταβατική περιοχή της ρίζας, με έντονο το φαινόμενο αποκολλήσεων πλασματικών μεμβρανών, ενώ ταυτόχρονα παρατηρήθηκε μια βαθμιαία χρονοεξαρτώμενη αύξηση στα επίπεδα παραγωγής ROS και υπεροξειδασών κατά μήκος της ρίζας. Η παρουσία αυτοφαγοσωμάτων ήταν έντονη στο μέγιστο υπό μελέτη χρόνο επίδρασης. Με ηλεκτρονική μικροσκοπία πραγματοποιήθηκε μελέτη της υπέρλεπτης δομής και εντοπίσθηκαν υποκυτταρικές αλλοιώσεις σε διάφορα οργανίδια και δομές, καθώς και επιπλέον σχηματιζόμενες δομές οι οποίες οφείλονται στην επίδραση χρωμίου. Στο κυτταρικό τοίχωμα εντοπίζονται πολυάριθμες άμορφες αποθέσεις, οι οποίες πιθανόν αντιστοιχούν σε συγκεντρώσεις διχρωμικού καλίου στο πλαίσιο άμυνας του κυττάρου και περιορισμού της εισόδου του στο ζωντανό κυτόπλασμα. Η πλασματική μεμβράνη αποκολλάται από το κυτταρικό τοίχωμα, τα μιτοχόνδρια και πλαστίδια διογκώνονται και αποκτούν ηλεκτρονικά διαυγές στρώμα, το σύμπλεγμα Golgi δημιουργεί μικρές συστοιχίες σακιδίων και διάσπαρτα κυστίδια με ποικίλη ηλεκτρονική πυκνότητα, το ΕΔ δημιουργεί μεγάλες αθροίσεις συγκεντρικών σακιδίων, ενώ στον πυρήνα εγκλείονται δομές που μορφολογικά μοιάζουν με μικροσωληνίσκους. Μέσα στο κυτόπλασμα των κυττάρων επίδρασης εμφανίζονται σφαιρικά, ηλεκτρονικά πυκνά και άμορφα σωματίδια, πιθανόν λιπιδικής φύσης, ενώ αυξάνεται η συχνότητα εμφάνισης πολυμεμβρανικών δομών. Όλα τα παραπάνω είναι συμβατά με μια σοβαρή τοξικότητα του Cr(VI) στα αναπτυσσόμενα ακρορρίζια του φυτού Arabidopsis thaliana, ενδεχόμενα με την παραγωγή ROS και την επαγωγή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου.
description: Chromium (Cr) is the seventh most abundant metallic element in the earth's crust and is toxic to living organisms. Cr exists in nature mainly in the trivalent [Cr(III)] and hexavalent [Cr(VI)] states, which exhibit very different properties since Cr(III) is less mobile and less toxic as its compounds are generally insoluble in water, while Cr(VI) is readily soluble in water, highly mobile and highly toxic. Cr toxicity has been extensively studied in mammals but limited research has been conducted in plants. In the present study the effects of Cr(VI) provided as potassium dichromate (K2Cr2O7) in developing root tips of the plant Arabidopsis thaliana were investigated. In preliminary experiments the rate of root length change in the presence of graded concentrations of Cr was measured in order to determine the critical Cr concentration for the main experiments. Pre-germinated seedlings were exposed to 50, 100 and 250 μM Cr(VI) for 24 hours and the Cr(VI) effects on microtubules were investigated by confocal laser scanning microscopy after their indirect immunolabelling. The critical concentration of 100 μM Cr(VI) was used to compare the microtubule morphology, cell viability and the effects of chromium on cell ultrastructure at different exposure times of Cr effect. In the root apex of control and 100 μM Cr(VI)-treated seedlings for 16, 24 and 48 hours cell viability, detachment of plasma membrane, production of reactive oxygen species (ROS), peroxidases and autophagosomes were studied by appropriate techniques. It was found that the greatest number of dead cells seemed to be encountered in the transition zone of the root, with a simultaneously strong detachment of plasma membrane in these cells, while there was a gradual time-dependent increase in the production of ROS and peroxidases along the root. The presence of autophagosomes was maximum when roots developed under the longest exposure time to Cr(VI). The subcellular alterations of various organelles and structures, as well as of some additional structures observed after chromium treatment were studied by electron microscopy. In the cell wall numerous amorphous deposits were identified, which probably represent local accumulations of potassium dichromate in the frame of a cell defense mechanism and prevention of its entry into the cytoplasm. The plasma membrane detached from the cell wall, mitochondria and plastids appeared swollen and with an electronic translucent matrix, the Golgi apparatus formed small stacks of cisternae and scattered vesicles with varying electron density, the ER created large concentric aggregations, while in the nucleus some structures morphologically resembling to microtubules were entrapped. Spherical, electronically dense and amorphous particles, probably of lipid nature, appeared in the cytoplasm of Cr(VI)-treated cells, while the frequency of multi-membrane structures increased too. All the above hallmarks are compatible with a severe toxicity of Cr(VI) in the root apex of developing Arabidopsis thaliana seedlings, possibly through the production of ROS and the induction of programmed cell death.