Μελέτη του ρόλου RNA EDITING ενζύμων στην παθογένεση νευροεκφυλιστικών ασθενειών και σε σταθερές μικρογλοιακές κυτταρικές σειρές με ADAR1 καταστολή
Creators: name: Καραγιάννη, Κορίνα Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: RNA στοιχειοθεσία
Νευροεκφυλιστικές ασθένειες
ADAR1 καταστολή
RNA Editing
Neurodegenerative diseases
ADAR1 Knock out

description: Το νευρικό σύστημα αποτελεί ένα από τα πολυπλοκότερα συστήματα του οργανισμού και οι ασθένειες που σχετίζονται με αυτό αντιπροσωπεύουν μια ομάδα νοσημάτων με μεγάλη ετερογένεια και πολυπαραγοντικά αίτια εκδήλωσης, των οποίων οι μοριακοί μηχανισμοί δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως. Σύμφωνα με στατιστικά δεδομένα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας τα νευροεκφυλιστικά νοσήματα αποτελούν από τις κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως τα τελευταία 30 χρόνια, ενώ η αυξημένη ηλικία παίζει καθοριστικό παράγοντα κινδύνου εμφάνισης τέτοιων νοσημάτων. Ως νευροεκφυλισμός ορίζεται οποιαδήποτε παθολογική κατάσταση απώλειας της δομής ή της λειτουργίας των νευρώνων. Οι κυριότερες και πιο συχνές νευροεκφυλιστικές ασθένειες είναι η νόσος Alzheimer (AD), η νόσος Parkinson (PD), η νόσος Huntington (HD), η πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση (ALS), καθώς και κάποιες αυτοάνοσες ασθένειες όπως η πολλαπλή σκλήρυνση (MS). Η RNA στοιχειοθεσία (RNA editing), αποτελεί ένα είδος μετα-μεταγραφικής διαδικασίας που οδηγεί σε τροποποίηση της αλληλουχίας ενός RNA μεταγράφου, έτσι ώστε αυτό να διαφέρει από την αλληλουχία του DNA από την οποία προήλθε. Παίζει σημαντικό ρόλο στη δυνατότητα ενός οργανισμού να επιτύχει γενετική ποικιλομορφία, καθώς επίσης και στην προστασία του γονιδιώματος από βλαβερές μεταλλάξεις. Σήμερα, στα θηλαστικά έχουν ταυτοποιηθεί δύο κύριες κατηγορίες RNA στοιχειοθεσίας: η απαμίνωση της αδενοσίνης (Α) προς ινοσίνη (I) που καταλύεται από την οικογένεια πρωτεϊνών ADAR και η απαμίνωση της κυτιδίνης (C) προς ουριδίνη (U) που καταλύεται από την οικογένεια πρωτεϊνών APOBEC/AID. Δραστηριότητα RNA στοιχειοθεσίας παρατηρείται σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, όμως θεωρείται ιδιαίτερα σημαντική για τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και του ΚΝΣ και για τον λόγο αυτό η απορρύθμιση της RNA στοιχειοθεσίας έχει συσχετιστεί με διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η κατασκευή των απαραίτητων πειραματικών εργαλείων και η βιοπληροφορική αξιολόγηση προηγούμενων δεδομένων για τη μελέτη του ρόλου των RNA editing ενζύμων σε μικρογλοιακά κύτταρα και την σχέση τους με τη νευροφλεγμονή και τον νευροεκφυλισμό. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε εκτενής βιβλιογραφική ανασκόπηση scRNAseq αναλύσεων σε μικρογλοιακά κύτταρα καθώς και βιοπληροφορική μετα-ανάλυση RNA-seq δεδομένων από ιστούς εγκεφάλου ΠΑΕ, ενώ στην συνέχεια ακολούθησε δημιουργία και χαρακτηρισμός σταθερών μικρογλοιακών κυτταρικών σειρών με ADAR1 μόνιμη καταστολή για χρήση σε μελλοντικά πειράματα εύρεσης RNA editing στόχων που σχετίζονται με το νευροεκφυλισμό. Τέλος, για την αξιολόγηση της BV2 κυτταρικής σειράς ως κατάλληλο πειραματικό in vitro μοντέλο πραγματοποιήθηκε απομόνωση μικρογλοιακών κυττάρων από εγκέφαλο ποντικών και δημιουργήθηκε πρωτογενής μικρογλοιακή κυτταρική καλλιέργεια, προκειμένου στη συνέχεια να συγκριθούν τα πρότυπα RNA στοιχειοθεσίας μεταξύ των δύο κυτταρικών τύπων. Τα αποτελέσματα στις BV2 μονοκλωνικές κυτταρικές σειρές μόνιμης καταστολής της πρωτεΐνης ADAR1 έδειξαν σημαντική μείωση των θέσεων που υφίστανται A:I RNA στοιχειοθεσία στα KO κύτταρα σε σχέση με τους Scrambled και WT κλώνους. Τα επίπεδα C:U RNA στοιχειοθεσίας εμφανίζονται πολύ χαμηλά σε όλες τις περιπτώσεις, γεγονός που επιβεβαιώνει την αρχική μας υπόθεση ότι στο νευρικό σύστημα οι πρωτεΐνες ADAR εκφράζονται και δρουν σε μεγαλύτερο ποσοστό από ότι οι πρωτεΐνες APOBEC. Παράλληλα, αξιοσημείωτη μείωση δράσης A:I RNA στοιχειοθεσίας παρατηρήθηκε και ανάμεσα στους Scrambled και WT κλώνους, γεγονός που αντικατοπτρίζει την επίδραση της πειραματικής διαδικασίας στο τελικό αποτέλεσμα και καταδεικνύει την σημασία των scr κλώνων ως επιπλέον controls αξιολόγησης της επίδρασης της πειραματικής διαδικασίας στο αποτέλεσμα.
description: The nervous system is the most complex and sophisticated system that regulates and coordinates body activities. Diseases that affect the nervous system include a broad category of conditions that present high heterogeneity and causes of manifestation. Various treatment strategies have been investigated but the label of low therapeutic success is always associated with them, mostly because their molecular mechanisms has not yet been fully elucidated. Central nervous system (CNS) or neurological disorders are very serious problems and major health concerns all over the world. According to WHO Neurodegenerative Diseases have been one of the leading causes of death worldwide for the last 30 years, and they affect mostly older people. Neurodegeneration is defined as the progressive loss of structure or function of neurons, which may ultimately involve cell death. The most common neurodegenerative diseases are Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and multiple sclerosis (MS). RNA editing is a post-transcriptional process in which nucleotide changes are introduced into an RNA sequence. It plays an important role in the achievement of genetic diversity and it can contribute to proteomic sequence variation. There are two main types of RNA editing in mammals: A:I RNA editing catalyzed by the ADAR family of enzymes and C:U RNA editing catalyzed by the APOBEC1 enzyme complex. RNA editing is considered to be of high importance in the autoimmune system of the CNS and has been associated with various neurodegenerative diseases. The aim of this study was to create the necessary experimental tools for investigating the process of RNA Editing in neurodegenerative diseases and the bioinformatic evaluation of RNA seq data to identify the most important RNA editing sites that play a critical role in neurodegenerative disorders. For this reason, we exploited publicly available RNA seq data from murine microglial cells of two time points of EAE, naïve and acute. Using an in house bioinformatic analysis tools, we generated a list of candidate editing transcripts and compared them with a number of transcripts that were produced by a thorough review of scRNAseq studies in microglial cells. Subsequently, we generated and characterized stable ADAR1 knock out microglial cell lines in order to investigate ADAR1 role in neurodegeneration and neuroinflammation. Finally, we isolated primary microglia from mouse brain tissue in order to compare them with BV2 cells and assess if their transcriptional patterns are similar enough in order to be able to use BV2 cells for our forthcoming experiments. Results showed a significant reduction of the A:I RNA editing sites in ADAR1_KO clones compared to WT and scrambled clones. Furthermore, C:U RNA editing activity was very low and remained unaltered in all cases.