title: Funktionalisierung von PLLA-Nanofasern mittels integrinbindender RGD-Sequenzen im Rahmen des Tissue Engineering
title: Funktionalisierung von PLLA-Nanofasern mittels integrinbindender RGD-Sequenzen im Rahmen des Tissue Engineering
title: RGD-functionalisation of PLLA-Nanofibers for Tissue Engineering
Creators: name: Bockelmann, Sarah Kristin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Tissue Engineering
PLLA Tissue Engineering
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
Regenerative Medizin

description: In clinical practice the adressing
      of bone defects with less availability of the autologous
      material are major challenges. The Tissue Engineering offers
      a sufficient method in order to produce bone substitutes. In
      this case autologous material from the patient is removed,
      cultured in laboratory conditions (in vitro) and replanted to
      the human organism. In previous studies biocompatible
      scaffolds made of collagen fibre during electrospinning
      processes were developed and enabled a good approach and
      differentiation of human mesenchymale stem cells (hMSC). The
      disadvantage of those Collagen-Scaffolds is a lesser
      mechanical stability. The results of current research showed
      that the osteoinductive effect of collagen is due to an amino
      acid sequence Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD). The aim of
      this study was to relate the osteoinductive effect of the
      collagen with the influence of RGD-sequences on mechanical
      more stable Poly(lactid)Nanofibres (PLLA). For this, the cell
      culturing of hMSCs was carried out over a period of 22 days
      under osteoinductive terms and growth conditions. In this
      study quantitative determinations of hMSC differentiation
      markers such as osteocalcin, collagen and alkaline
      phosphatase over real time PCR and fluorescence microscopy
      were performed. We compared a linear and cyclic RGD-sequence
      with each other and investigated various methods of
      introducing sequences into the fiber. The RGD sequences were
      introduced by suspension and emulsion into the fiber as well
      as after plasma treatment of the PLLA scaffolds and linking
      of EDC (1-ethyl-3 (3dimethylaminopropyl) carbodiimide) and
      NHS (Nhydroxysulfosuccinimide) to the surface of the fiber.
      The structural changes within the fiber characteristics of
      different procedures were evaluated by electron microscopy
      (assessment of the fiber diameter and contact angle) and by a
      tensile testing machine (assessing the tear strength). In our
      study we were able to display that the cyclically arranged
      RGD sequence has significant higher cell differentiation (p
      &lt;0.016) compared with the linear variation yet same cell
      number. The sequences which were introduced by emulsion
      offered no significant advantage towards the fibers
      introduced by suspension (p&gt; 0.05). The coupling method
      using plasma treatment resulted in increased osteoinductivity
      (increase of gene products from the real time PCR of alkaline
      phosphatase, osteocalcin and collagen) compared to the PLLA
      fiber. Moreover, there were no significant changes within the
      fiber characteristics by different incorporation and coupling
      methods. Taking all aspects into consideration we could show
      in this study that all performed methods are suitable for the
      incorporation of osteoinductive RGD sequences. The cyclic
      variation of RGD is more inductive than the linear one and
      increases cell differentiation in particular as a surface
      contact by plasma treatment of the fiber. However, it is
      necessary to find a verification procedure which is able to
      measure the quantity of the RGD sequences in the fiber
      surface. So the osteoinductive effect will be optimized and
      the scaffolds will be a possible medium for tissue
      engineering.
description: Im klinischen Alltag stellt die
      Versorgung von Knochendefekten bei nur geringer Verfügbarkeit
      des körpereigenen Materials eine große Herausforderung dar.
      Das Tissue Engineering bietet eine geeignete Methode zur
      Produktion von Knochenersatzmaterial. Hierbei wird
      körpereigenenes Material unter Laborbedingungen (in vitro)
      gezüchtet und dem Organismus replantiert. Vorausgehende
      Arbeiten konnten in Elektrospinnprozessen biokompatible
      Scaffolds aus Kollagenfasern herstellen, welche ein gutes
      Angehen und Differenzieren von humanen mesenchymalen
      Stammzellen (hMSC) ermöglichten. Der Nachteil dieser
      Kollagen-Scaffolds lag jedoch in der geringen mechanischen
      Stabilität. In den Forschungsergebnissen zeigte sich, dass
      die osteoinduktive Wirkung von Kollagen auf eine
      Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparaginacid (RGD)
      zurückzuführen ist. Ziel dieser Arbeit war es die
      osteoinduktive Wirkung des Kollagens mit Hilfe von
      RGD-Sequenzen mit den mechanisch stabileren
      Poly(L-lactid)Nanofasern (PLLA) zu verbinden. Hierzu erfolgte
      die Zellkultivierung von hMSC über 22 Tage unter
      osteoinduktiven Bedingungen und Wachstumsbedingungen auf
      PLLANanofaserscaffolds. Es wurden quantitative Bestimmungen
      der hMSCDifferenzierungsmarker Osteocalcin, Kollagen und
      Alkalischer Phosphatase über RealtimePCR und
      Fluoreszensmikroskopie durchgeführt. Es wurden eine lineare
      und eine zyklische RGD-Sequenz miteinander verglichen sowie
      unterschiedliche Einbringungsverfahren der Sequenzen in die
      Faser untersucht. Die RGD-Sequenzen wurden mittels Suspension
      und mittels Emulsion in die Faser eingebracht sowie nach
      Plasmabehandlung des PLLAScaffolds und Kopplungen von EDC
      (1-Ethyl-3(3dimethylaminopropyl) carbodiimid) und NHS
      (N-Hydroxysulfosuccinimid) an die Oberfläche der Faser
      gekoppelt. Die strukturellen Veränderungen auf die
      Fasereigenschaften der unterschiedlichen Behandlungsmethoden
      wurden mittels Elektronenmikroskopie (Beurteilung
      Faserdurchmesser und Kontaktwinkel) und Zugdehnungsmessgerät
      (Beurteilung der Reißfestigkeit) beurteilt. Die vorliegende
      Arbeit zeigt, dass die zyklisch angeordnete RGD-Sequenz eine
      signifikant höhere Zelldifferenzierung (p&lt;0,016) gegenüber
      der linearen Variante bei jedoch gleicher Zellzahl aufweist.
      Die mittels Emulsion eingebrachten Sequenzen boten keinen
      signifikanten Vorteil gegenüber der mittels Suspension
      eingebrachten Fasern (p&gt;0,05). Das Kopplungsverfahren
      mittels Plasmabehandlung erbrachte eine Tendenz zur
      vermehrten Osteoinduktivität (Steigerung der Genprodukte aus
      der RealtimePCR der Alkalischen Phosphatase, Osteocalcin und
      Kollagen) gegenüber der unbehandelten PLLA-Faser. Die
      Fasereigenschaften änderten sich durch die vorgenommenen
      Einbringungs- oder Kopplungsverfahren nicht signifikant.
      Diese Arbeit konnte zeigen, dass alle aufgeführten Verfahren
      für die Einbringung der osteoinduktiven RGD-Sequenzen
      geeignet sind. Die zyklische RGD Variante zeigt sich
      induktiver als die lineare und steigert die
      Zelldifferenzierung insbesondere als Oberflächenkontakt nach
      Plasmabehandlung der Faser. Ein Nachweisverfahren welches die
      Quantität der RGD-Sequenzen an der Faseroberfläche darstellen
      kann, um die osteoinduktive Wirkung zu optimieren und es zu
      einem möglichen Träger für das Tissue Engineering zu machen,
      sollte entwickelt werden.