Βελτιστοποίηση προκατεργασίας αποβλήτων κατανάλωσης καφέ με στόχο την βιοτεχνολογική αξιοποίηση τους
Creators: name: Βουλγαρίδης, Χαρίλαος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: απόβλητο κατανάλωσης καφέ
όξινη προκατεργασία
βελτιστοποίηση
spent coffee grounds
acid pre-treatment
optimisation

description: Η κυτταρίνη είναι το πιο άφθονο βιοπολυμερές στη γη. Αποτελεί το κύριο συστατικό της φυτικής βιομάζας ενώ μπορεί να παραχθεί και μέσω μικροβιακής ζύμωσης ως εξωκυτταρικό πολυμερές. Η υψηλή καθαρότητα και τα ειδικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της βακτηριακής κυτταρίνης (BC) έχουν σαν αποτέλεσμα να βρίσκει εφαρμογή σε τομείς όπως είναι η ιατρική, η βιομηχανία τροφίμων, τα καλλυντικά αλλά και άλλα βιομηχανικά προϊόντα. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή αξιολογήθηκε η δυνατότητα παραγωγής ΒC από το βακτηριακό στέλεχος Komogateibacter sucrofermentans αξιοποιώντας απόβλητα κατανάλωσης καφέ (Spent Coffee Grounds-SCG), τα οποία είχαν υποστεί διάφορες προκατεργασίες. Στόχος της διαδικασίας προκατεργασίας είναι αφενός η απομάκρυνση της λιγνίνης, που αποτελεί αναχαιτιστικό παράγοντα για την ανάπτυξη μικροοργανισμών και τη ζύμωση της βιομάζας, και αφετέρου η υδρόλυση των ημμικυτταρινών με σκοπό τη βελτίωση της απόδοσης της διαδικασίας υδρόλυσης της κυτταρίνης για την μετέπειτα αξιοποίηση της. Η διάσπαση της λιγνοκυτταρινούχας βιομάζας βελτιώνει την υδρόλυση των ημικυτταρινών και της κυτταρίνης σε βιομηχανικά σημαντικούς μονοσακχαρίτες. Τα προϊόντα που προκύπτουν μετά την υδρόλυση αποτελούν εναλλακτική πηγή άνθρακα για την παραγωγή BC. Αρχικά, δείγματα SCG, του είδους Coffea arabica, συλλέχθηκαν και πραγματοποιήθηκε ο χαρακτηρισμός τους. Πιο συγκεκριμένα, έγινε ο προσδιορισμός των ολικών στερεών, της υγρασίας, της τέφρας, του λίπους, της πρωτεΐνης, των δομικών υδατανθράκων, της καφεΐνης και της κατανομής μεγέθους των σωματιδίων. Ακολούθησε η χρήση φασματοσκοπίας υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier (FT-IR) καθώς και ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) για τον πιο αναλυτικό χαρακτηρισμό του αποβλήτου. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες όξινης υδρόλυσης για την ανάκτηση των ζυμώσιμων σακχάρων από SCG με σκοπό την μετέπειτα βιοτεχνολογική αξιοποίηση τους. Μελετήθηκε η όξινη υδρόλυση του SCG με την χρήση H2SO4 (≤4% v/v) υπό ήπιες συνθήκες (θερμοκρασία ≤100°C, ατμοσφαιρική πίεση) προκειμένου να αποτραπεί η αποσύνθεση των μονομερών σακχάρων, η οποία ενισχύεται σε θερμικές διεργασίες παρουσία οξέος. Για την βελτιστοποίηση των συνθηκών όξινης υδρόλυσης, χρησιμοποιήθηκε η Μεθοδολογία της Επιφανειακής Απόκρισης (Response Surface Methodology, RSM) με βάση τον Σύνθετο Κεντρικό Σχεδιασμό (Central Composite Design, CCD). Σκοπός της βελτιστοποίησης, είναι να συσχετιστεί η συγκέντρωση των παραγόμενων σακχάρων από την υδρόλυση, με τα επίπεδα ενός αριθμού μεταβλητών, που την επηρεάζουν, σε μια συγκεκριμένη περιοχή ενδιαφέροντος. Οι μεταβλητές που μελετήθηκαν ήταν ο χρόνος αντίδρασης (η διάρκεια δηλαδή της υδρόλυσης), η αναλογία οξέος/SCG, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση του H2SO4. Στόχος ήταν ο προσδιορισμός των σημαντικών μεταβλητών της υδρόλυσης καθώς και ο βέλτιστος δυνατός συνδυασμός των επιπέδων τους, με σκοπό τη μεγιστοποίηση της απόδοσης της υδρόλυσης. Στη συνέχεια, οι βέλτιστες τιμές των παραγόντων που μελετήθηκαν στην όξινη υδρόλυση χρησιμοποιήθηκαν σε SCG που είχαν υποστεί επεξεργασίες όπως η αφαίρεση λίπους και η αφαίρεση φαινολικών. Τα υδρολύματα που προέκυψαν από την υδρόλυση αξιοποιήθηκαν ως πηγές άνθρακα για την παραγωγή BC από το βακτηριακό στέλεχος Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973. Οι ζυμώσεις για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης έγιναν σε συνθετικά υποστρώματα με διάφορες πηγές άνθρακα (υδρολύματα SCG). Τα υποστρώματα ανάπτυξης του Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 που μελετήθηκαν για την παραγωγή BC ήταν τα ακόλουθα: υδρόλυμα SCG, υδρόλυμα SCG μετά επεξεργασία ενεργού άνθρακα, υδρόλυμα SCG το οποίο είχε υποστεί αφαίρεση φαινολικών, υδρόλυμα SCG το οποίο είχε υποστεί αφαίρεση λίπους και υδρόλυμα SCG έπειτα από υδροθερμική επεξεργασία. Όλες οι ζυμώσεις πραγματοποιήθηκαν υπό στατικές συνθήκες. Τέλος, μετά την παραλαβή και τον καθαρισμό των BC, ακολούθησε ο προσδιορισμός της ικανότητας συγκράτησης νερού, η μέτρηση του πάχους και των διαστάσεων των μεμβρανών, και ο χαρακτηρισμός τους με FT-IR και SEM. Τα αποτελέσματα της βελτιστοποίησης την όξινης υδρόλυσης έδειξαν ότι, η μεγιστοποίηση της απόδοσης σακχάρου μπορεί να επιτευχθεί σε 149,73 (~150) min, αναλογία L/S 10,25 mL/gSCG, 90°C και 3% H2SO4. Υπό αυτές τις συνθήκες, η αποτελεσματικότητα της υδρόλυσης έφτασε το 73,88% εκφρασμένη σε ισοδύναμα γλυκόζης, που αντιστοιχεί σε μια μέση απόδοση 0,1876 ggluc.eq/gscg. Αναφορικά με τους παράγοντες που μελετήθηκαν τα αποτελέσματα της βελτιστοποίησης έδειξαν ότι η αύξηση της θερμοκρασίας, του χρόνου και της συγκέντρωσης οξέος οδήγησαν σε αύξηση της απόδοσης υδρόλυσης. Αντίθετα, η αύξηση της αναλογίας στερεού προς υγρό δεν είχε επίδραση στο τελικό αποτέλεσμα Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των πειραμάτων παραγωγής BC, η υψηλότερη παραγωγή BC σημειώθηκε στο συνθετικό υπόστρωμα ΗS (1,25 ± 0,063 g/L), και ακολουθούσε η παραγωγή στο υδρόλυμα της όξινης υδρόλυσης του SCG που υπέστη επεξεργασία με ενεργό άνθρακα και σε αυτό χωρίς την επεξεργασία με αποδόσεις που άγγιζαν τα 1,17 ± 0,14 g/L και 1,00 ± 0,13 g/L αντίστοιχα. Χαμηλότερες τιμές παρουσίασαν τα υποστρώματα που παρασκευάστηκαν με υδρόλυμα SCG το οποίο είχε υποστεί προεπεξεργασία, είτε για την εκχύλιση των φαινολικών είτε για την αφαίρεση λίπους. Τα φάσματα FTIR επιβεβαίωσαν ότι η κυτταρίνη που παρήχθη από βακτήρια είχε παρόμοια δομή σε σχέση με την εμπορική κυτταρίνη φυτικής προέλευσης, ενώ η ανάλυση SEM κατέδειξε ότι οι BC που παρήχθησαν με χρήση υδρολύματος SCG είχαν νανοινώδη μορφή όπως και οι BC του συνθετικού υποστρώματος. Τέλος, την μεγαλύτερη ΙΣΝ παρουσίασε η BC από το συνθετικό υπόστρωμα (ΗS), ενώ ακολούθησαν τα δυο δείγματα των όξινων υδρολυμάτων SCG και SCG-C. Συμπερασματικά λοιπόν, το απόβλητο SCG δύναται να αξιοποιηθεί μέσω της προτεινόμενης βιοδιεργασίας για τη δημιουργία ενός μικροβιακού προϊόντος υψηλής αξίας με ποικίλες εφαρμογές
description: Cellulose is the most abundant biopolymer on earth. It is the main component of plant biomass and can also be produced through microbial fermentation as an extracellular polymer. High purity and specific physicochemical characteristics of bacterial cellulose (BC) have resulted in its application in areas such as medicine, food industry, cosmetics and other industrial products. In the present thesis, the potential production of BC from the bacterial strain Komogateibacter sucrofermentans by utilizing Spent Coffee Grounds (SCG) waste, which had undergone various pretreatments, was evaluated. The aim of the pre-treatment processes is to remove lignin, which is an inhibiting factor for the growth of microorganisms and the fermentation of biomass, and to hydrolyse the hemicelluloses in order to improve the efficiency of the cellulose hydrolysis process for its subsequent utilisation. The degradation of lignocellulosic biomass improves the hydrolysis of hemicelluloses and cellulose to monosaccharides that could be valorized in the industry. The sugars obtained after hydrolysis are an alternative carbon source for BC production. Initially, samples of SCG, of the Coffea arabica species, were collected and characterized. More specifically, total solids, moisture, ash, oil/fat content, proteins, structural carbohydrates, caffeine and particle size distribution were determined. Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) and scanning electron microscopy (SEM) were also applied for more detailed characterization of the waste. Subsequently, the optimal acid hydrolysis conditions for the recovery of fermentable sugars from SCG were determined. Acid hydrolysis of SCG using H2SO4 (≤4% v/v) under mild conditions (temperature ≤100°C, atmospheric pressure) was studied in order to prevent the decomposition of monomeric sugars, which is enhanced in thermal processes in the presence of acid. The Response Surface Methodology (RSM) based on the Central Composite Design (CCD) was used to optimize acid hydrolysis conditions. The aim of the optimization is to correlate the concentration of sugars produced by hydrolysis with the levels of a number of variables affecting it in a specific region of interest. The studied variables were reaction time (i.e. the duration of the hydrolysis), acid/SCG ratio, temperature and H2SO4 concentration. The aim was to identify the important variables of the hydrolysis and the optimal combination of their levels in order to maximize the hydrolysis efficiency. In addition, the optimal values of the studied factors were applied in SCG that had undergone various pre-treatments such as fat or phenolic components removal. The hydrolysates obtained from the hydrolysis were utilized as carbon sources for the production of BC by the bacterial strain Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973. The fermentations for bacterial cellulose production were performed on synthetic substrates with different carbon sources (SCG hydrolysates). The growth substrates of Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 studied for BC production were the following: SCG hydrolysate, SCG hydrolysate after activated carbon treatment, SCG hydrolysate which had undergone phenolic removal, SCG hydrolysate which had undergone fat removal and SCG hydrolysate after hydrothermal treatment. All fermentations were carried out under static conditions. Finally, after BC collection and purification, the water retention capacity was determined, the thickness and dimensions of the membranes were measured, and they were characterized by FT-IR and SEM. The results of the acid hydrolysis optimization showed that, the maximization of sugar yield can be achieved in 149.73 (~150) min, L/S ratio of 10.25 mL/gSCG, 90°C and 3% H2SO4. Under these conditions, the hydrolysis efficiency reached 73.88% expressed in glucose equivalents, corresponding to an average yield of 0.1876 ggluc.eq/gscg. Regarding the studied factors, the optimization results showed that increasing temperature, time and acid concentration led to an increase in hydrolysis efficiency. In contrast, increasing the solid to liquid ratio had no effect on the final result According to the results of the BC production experiments, the highest BC production was obtained in the synthetic substrate HS (1.25 ± 0.063 g/L), followed by the production in the SCG acid hydrolysate with (SCG-C) and without (SCG) treatment with activated carbon with yields approaching 1.17 ± 0.14 g/L and 1.00 ± 0.13 g/L, respectively. Lower values were obtained for substrates prepared with the hydrolysates of SCG that had been pretreated, either for phenolic extraction or for fat removal. FTIR spectra confirmed that the bacteria-derived cellulose had a similar structure to commercial plant-derived cellulose, while SEM analysis showed that the BCs produced using SCG hydrolysate had a nanofibrous structure like the BCs of the synthetic substrate. Finally, the BC from the synthetic substrate (HS) showed the highest WHC, followed by the two samples of acidic hydrolysates SCG and SCG-C. In conclusion, SCG can be utilized through the proposed bioprocess to produce an added value microbial product with diverse applications