Απομόνωση και χαρακτηρισμός προβιοτικών μικροοργανισμών από το εντερικό σωλήνα του σαλιγκαριού Cornu aspersum maxima από σαλιγκαροτροφείο της Νότιας Ελλάδας
Creators: name: Βασιλακοπούλου Δήμητρα Στυλιανού
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Προβιοτικά
Έμφυτη άμυνα
Probiotics
Cornu aspersum
Innate immunity

description: Τα τελευταία χρόνια έχει αποδειχθεί η ύψιστη σημασία της εντερικής μικροχλωρίδας στη διατήρηση της ομοιόστασης και της υγείας των ζώων και του ανθρώπου και η στοχευμένη τροποποίηση της μικροχλωρίδας, μέσω της χορήγησης προβιοτικών μικροοργανισμών, έχει τεθεί ως θεραπευτικός στόχος. Ωστόσο, η βιβλιογραφία που αφορά τις λειτουργικές ιδιότητες της μικροχλωρίδας των χερσαίων γαστερόποδων και, ειδικότερα, του εδώδιμου σαλιγκαριού Cornu aspersum είναι περιορισμένη. Στην παρούσα εργασία, απομονώθηκαν μικροοργανισμοί από το έντερο σαλιγκαριών του είδους Cornu aspersum maxima και χαρακτηρίστηκαν ως προς τις in vitro και in vivo προβιοτικές τους ιδιότητες. Στο σύνολο απομονώθηκαν 67 πιθανοί προβιοτικοί μικροοργανισμοί (βακτήρια και ζύμες) εκ των οποίων 35 βακτηριακά στελέχη εξετάστηκαν ως προς τις in vitro προβιοτικές τους ιδιότητες. Όσον αφορά στις in vitro προβιοτικές ιδιότητες, εξετάστηκε η ικανότητα των βακτηριακών στελεχών να επιβιώνουν κατά τη διέλευση από τον πρώτο αμυντικό μηχανισμό των χερσαίων γαστερόποδων, δηλαδή την εξωτερική βλέννα και τους φυσικούς φραγμούς του πεπτικού σωλήνα, όπως τα πεπτικά ένζυμα των γαστρικών εκκρίσεων, την αντιμικροβιακή δράση της γαστρικής βλέννας και τις χαμηλές τιμές pH κατά μήκος του πεπτικού σωλήνα. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκαν χαρακτηριστικά που έχουν συσχετιστεί θετικά με την ικανότητα επιβίωσης και αποικισμού στον εντερικό βλεννογόνο, όπως η ικανότητα σχηματισμού βιοϋμένα, το ποσοστό αυτοσυσσωμάτωσης και το ποσοστό υδροφοβίας της εξωτερικής κυτταρικής επιφάνειας. Μετά το πέρας του προσδιορισμού των in vitro προβιοτικών ιδιοτήτων, ένα υποσύνολο βακτηρίων, που επιλέχθηκαν με βάση την απόδοσή τους στις τις in vitro προβιοτικές τους ιδιότητες, εξετάστηκαν για την αντιμικροβιακή τους δράση ενάντια σε δύο υπερλοιμογόνα στελέχη Listeria monocytogenes SN3 και KED3, που είχαν προηγουμένως απομονωθεί από το ίδιο είδος σαλιγκαριού. Τρία από αυτά εμφάνισαν αντιμικροβιακή δράση έναντι και των δύο παθογόνων στελεχών Listeria monocytogenes. Συνολικά επιλέχθηκαν 8 βακτηριακά στελέχη, τα οποία ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους, με 7 από αυτά να ανήκουν στο είδος Enterococcus malodoratus και 1 στέλεχος στο είδος Leuconostoc mesenteroides. Τέλος, 4 από αυτά, 3 στελέχη Enterococcus malodoratus και 1 στέλεχος Leuconostoc mesenteroides, διερευνήθηκαν για τις in vivo ανοσοτροποποιητικές τους επιδράσεις στους έμφυτους μηχανισμούς κυτταρικής και χυμικής άμυνας. Αναλυτικότερα, τα 4 επιλεγμένα βακτηριακά στελέχη είχαν την ικανότητα να διεγείρουν τη χημειόταξη των αμοιβαδοκυττάρων της αιμολέμφου χωρίς να αυξήσουν τον αριθμό υαλινοκυττάρων ή νεκρών κυττάρων και, ταυτοχρόνως, κατάφεραν να ενισχύσουν τη φαγοκυτταρική δράση των αμοιβαδοκυττάρων. Παράλληλα, χορήγηση των παραπάνω στελεχών δεν επηρέασε την παραγωγή παραγόντων χυμικής άμυνας, όπως τα νιτρικά ιόντα, οι δραστικές μορφές οξυγόνου και το αντιμικροβιακό ένζυμο φαινολοξειδάση, ενώ ένα από αυτά (στέλεχος 41) παρουσίασε στατιστικά σημαντικά μικρότερη παραγωγή κυτταροτοξικών μορίων όπως νιτρικά ιόντα και δραστικές μορφες οξυγόνου
description: In the last few years, research has highlighted the importance of the gut microflora in maintaining homeostasis and health both in animals and humans. However, the bibliography regarding gut microflora in terrestrial molluscs and, moreover, for the garden snail Cornu aspersum is limited. The purpose of this thesis was to isolate microorganisms from the gut of the garden snail Cornu aspersum and study their in vitro and in vivo probiotic properties. In total, 67 microorganisms were isolated (including bacteria and yeast), from which, 35 were investigated for their in vitro probiotic properties. Regarding the in vitro probiotic properties, the ability of the bacterial strains to survive against the first external defense line of terrestrial molluscs, the pedal mucus was tested. We also examined their ability to survive the defense mechanisms of the digestive tract, such as digestive enzymes in the gastric juices, the antimicrobial action of the gastric mucus and the low pH values along the digestive tract. Furthermore, cell surface traits that have been positively correlated with the ability to survive and adhere to the intestinal epithelial cells, such as the biofilm-forming ability, the autoaggregation and hydrophobicity rates were investigated. After determining the in vitro probiotic properties, a few selected isolates, that scored highest in the in vitro probiotic properties, were tested for their antimicrobial properties against two hypervirulent strains of Listeria monocytogenes SN3 and KED3, previously isolated from the same garden snail species, Cornu aspersum. A total of 8 bacterial strains were selected, identified to species level (7 strains identified as Enterococcus malodoratus and one Leuconostoc mesenteroides strain) and, 4 of them (3 Enterococcus malodoratus strains and the Leuconostoc mesenteroides strain), were evaluated on their in vivo immunomodulatory effect on innate cellular and humoral defense mechanisms. In more detail, the 4 selected bacterial strains stimulated chemotaxis of amoebocytes without elevating the number of hyalinocytes and dead cells and simultaneously increased the phagocytic capacity of amoebocytes. Meanwhile, the production of humoral defense factors, such as nitrite ions, reactive oxygen species and the antimicrobial enzyme phenoloxidase didn’t change significantly after the administration of the 3 out of the 4 strains. Lastly, it is worth mentioning that Enterococcus malodoratus strain 41 was able to decrease the production of cytotoxic molecules such as nitrite ions and reactive oxygen species