title: From Active-Site Mapping to Lead Discovery using Fragment-based Approaches on the Aspartic protease Endothiapepsin
title: From Active-Site Mapping to Lead Discovery using Fragment-based Approaches on the Aspartic protease Endothiapepsin
title: Von Active-Site Mapping zu Lead Identifizierung mit Fragment-basierten Ansätzen am Beispiel der Aspartylprotease Endothiapepsin
Creators: name: Radeva, Nedyalka
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Fragment
Dynamische kombinatorische Chemie
Screening
Dynamic combinatorial chemistry, Screening
no entry
keine Angabe
X-Ray crystallography
Röntgenkristallographie

description: The work focuses on the evaluation
      and comparison of different fragment-based approaches, for
      which purpose the model system Endothiapepsin (EP) has been
      used. The enzyme belongs to the family of aspartic proteases.
      We used the 361-entry in-house fragment library compiled with
      physico-chemical properties similar to the rule-of-three. We
      applied six different techniques to screen the fragment
      library: saturation-transfer difference NMR (STD-NMR),
      thermal shift assay (TSA), reporter-displacement assay (RDA),
      microscale thermophoresis (MST), fluorescence-based
      biochemical assay (HCS), and native mass spectrometry (MS).
      Alarmingly, the overlap between the hits produced by all six
      methods was very low. While only 41 out of all 361 fragment
      library entries could be identified by at least two methods,
      only 3 were identified by five methods, and no single
      fragment was identified as hit by all six methods taken
      together (chapter 2). We thus performed X-ray crystallography
      with individual fragments soaked to beforehand prepared apo
      EP crystals. For this purpose very high fragment
      concentrations of 90 mM were used. Intriguingly, we were able
      to identify 71 fragment hits as bound to EP, corresponding to
      20% hit rate. Worryingly, only 30% of the 71 hits were
      predicted by only one of the beforehand applied screening
      techniques, clearly emphasizing that any screening strategy
      comprising at least two prescreening methods would have been
      able to identify only 19 (27%) of the 71 crystallographic
      hits. We divided the hits into two main groups: catalytic
      dyad binders and remote binders. Chapter 3 deals with the
      catalytic dyad binders. Therein we describe a variety of
      warheads which address the catalytic aspartates either
      directly or via the catalytic water molecule W501, while
      occupying the S1 and S1’ binding pockets. Furthermore, we
      found fragments, which occupied both pockets simultaneously,
      offering an optimal platform for further optimization
      strategies into both directions. The very useful information
      regarding preferred spots of binding remote from the
      catalytic dyad is described in detail in chapter 4. The so
      called hot spots represent key pocket residues, which have to
      be addressed in an optimization procedure in order to achieve
      optimal ligand binding. The high-throughput potential of
      X-ray crystallography (chapters 3 and 4) compared to the
      other six prescreening techniques presented in chapter 2 is
      still very low. Because of this, a lot of effort has been
      invested in academia and industry to extend the method’s
      applicability as a primary screening technique. Whenever used
      as such, practitioners exposed protein crystals to a mixture
      of compounds to accelerate the hit identification. However,
      we cannot recommend the use of cocktail experiments with
      clear conscience as we believe that parameters such as
      compound solubility, chemical reactivity, and crystal damage,
      often resulting in reduced ligand occupancy, diffuse electron
      density, or deviating fragment binding poses are provoked by
      the presence of multiple compounds in a mixture. These issues
      are exemplified in chapter 5 where we directly compared the
      difference electron density in the binding pocket of EP
      between singly soaked fragments and cocktails prepared those.
      For example, many of the fragments used in a mixture of two
      failed to be identified as hits, whereas clear density around
      those fragments could be observed in the single soaking
      experiments. Moreover, the clear assignment of a fragment to
      diffuse electron density usually requires additional
      experiments, which confirm the binding site. When considering
      this, even more time has to be spent, which extremely slows
      down the hit identification procedure. The only plausible
      reason to use several compounds in a mixture is when the
      reaction between those is aimed. This is an approach named
      dynamic combinatorial chemistry (DCC) and described in
      chapter 6. The compounds, hydrazides and aldehydes, chosen
      for the mixtures react with one another with dehydration to
      larger acylhydrazones. The formation of the strongest binders
      among others, acylhydrazones (S)-H4-A4 and (R)-H3-A5, was
      induced by the natural selection by the target protein EP.
      Moreover, in a follow-up optimization project, which started
      based on the binding modes of the two acylhydrazones, the
      combination of a bis-aldehyde with hydrazides resulted in the
      natural selection of a bis-acylhydrazone by EP, with an
      240-fold improved potency compared to the initial
      acylhydrazones.
description: Die Arbeit beruht auf der
      Auswertung und dem Vergleich verschiedener, fragmentbasierter
      Verfahren, für welche Zwecke das Modelprotein Endothiapepsin
      (EP) verwendet wurde. Das Enzym gehört zu der Familie der
      Aspartylproteasen, deren Vertreter in die Pathogenese
      schwerer Krankheiten wie Malaria, Alzheimer, AIDS,
      Bluthochdruck, und Pilzinfektionen involviert sind. Eine
      interne Fragmentbibliothek wurde verwendet, die 361 Fragmente
      enthält und die auf der Grundlage von physikalisch-chemischen
      Eigenschaften ähnlich der Astex rule-of-three basiert. Um
      diese zu durchmustern, wurden sechs verschiedene
      Screeningmethoden angewendet: Sättigungstransferdifferenz mit
      Kernspinresonanz (STD-NMR), thermal shift Assay (TSA),
      Reporterverdrängungsassay (RDA), Thermophorese (MST), ein
      fluoreszenzbasierter biochemischer Assay (HCS), und
      Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen haben die RDA und
      HCS Assays eine vergleichbare Anzahl an Hits gezeigt (50
      (RDA) gegenüber 56 (HCS)). Jedoch ist die Anzahl der Hits für
      die TSA und MS Assays drastisch geringer (25 (TSA) gegenüber
      8 (MS)), obwohl die Gesamtzahl der verwendeten Fragmente in
      allen vier Assays sehr ähnlich war (325 (RDA), 358 (HCS), 330
      (TSA), und 342 (MS)). Auffällig ist allerdings die geringe
      Überlappung der Hits, die von jeder der sechs Methoden
      detektiert wurden. Während nur 41 von 361 Fragmenten in der
      Bibliothekdatenbank von mindestens zwei Methoden detektiert
      werden konnten, waren es nur drei, die von fünf Methoden und
      kein einziges Fragment, welches von allen Methoden
      gleichzeitig detektiert wurde (Kapitel 2, Abb. 2.1). Aus
      diesem Grund wurde jedes der 361 Fragmente einzeln in apo
      EP-Kristalle diffundiert um mit den hieraus erhaltenen Daten
      eine Röntgenstrukturanalyse durchzuführen. Hierfür wurde eine
      sehr hohe Fragmentkonzentration von 90 mM verwendet.
      Interessanterweise konnten 71 gebundene Fragmente detektiert
      werden, was einer Hitrate von 20% entspricht. Auffallend war
      allerdings die Tatsache, dass nur 30% der 71 Hits von maximal
      einer der sechs zuvor durchgeführten Screeningmethoden
      detektiert werden konnten. Dies stellt deutlich heraus, dass
      jede Screeningkaskade, bestehend aus mindestens zwei
      Methoden, nur 19 (27%) der 71 kristallographischen Hits
      detektiert hätte. Dies hätte zur Folge gehabt, dass 73% der
      71 kristallographischen Hits nicht als solche erkannt worden
      wären. Die Treffer wurden in zwei Hauptkategorien aufgeteilt:
      direkt- und fernbindende Fragmente. In Kapitel 3 wurden die
      Direktbinder behandelt. Dort wurde eine Vielzahl von
      Kopfgruppen beschrieben, die die katalytische Dyade entweder
      direkt oder über das katalytische Wasser W501 adressieren,
      während sie die S1 und S1‘ Bindetaschen besetzen. Darüber
      hinaus wurden Fragmente gefunden, die beide Bindetaschen
      gleichzeitig besetzen, was eine optimale Grundlage für
      Optimierungsstrategien in die benachbarten Taschen auf jeder
      Seite der katalytischen Aspartate bietet. Bindestellen
      abseits der katalytischen Dyade wurden in Kapitel 4
      beschrieben. Die so genannten „hot-spots“ stellen wichtige
      Aminosäuren dar, die in einem Optimierungsprozess adressiert
      werden sollen, um optimale Ligandbindung zu erzielen. Das
      Durchsatzpotenzial der Röntgenstrukturkristallographie
      (Kapitel 3 und 4) verglichen mit den anderen sechs in Kapitel
      2 beschriebenen Screeningverfahren, ist noch sehr gering. Es
      wird oft eine Mischung aus Verbindungen in Proteinkristalle
      diffundiert um die Hitidentifizierung zu beschleunigen.
      Dieses Verfahren können wir jedoch nicht empfehlen, da wir
      glauben, dass Parameter wie Löslichkeit, Reaktivität zwischen
      den Verbindungen, kompetitive Bindungsposen, und
      Kristallschäden durch die Mehrzahl an Verbindungen in einer
      Mischung stark beeinflusst werden. Probleme solcher Art sind
      in Kapitel 5 dokumentiert, in dem die
      Differenzelektronendichte zwischen einzeln gesoakten
      Fragmenten und Cocktails aus diesen direkt miteinander
      verglichen werden. Der einzig plausible Grund für die
      Verwendung mehrerer Verbindungen in einem Cocktail ist eine
      beabsichtigte Reaktion zwischen einzelnen Komponenten. Dieses
      Verfahren wird dynamische kombinatorische Chemie (DCC)
      genannt und in Kapitel 6 beschrieben. Als Verbindungen für
      die Mischung wurden Hydrazide und Aldehyde gewählt, die in
      einer Kondensationsreaktion zu Acylhydrazonen reagieren. Die
      Bildung der stärksten Liganden, die Acylhydrazone (S)-H4-A4
      und (R)-H3-A5, wurde durch natürliche Selektion veranlasst,
      da das Zielprotein EP solche potenten Binder aus dem
      Mischungsgleichgewicht zieht. In einer Folgestudie erfolgte
      basierend auf den Bindungsmodi der zwei Acylhydrazone die
      Kombination von einem bis-Aldehyd mit Hydraziden und hieraus
      die natürliche Selektion eines bis-Acylhydrazones durch EP.
      Das auf diese Weise identifizierte bis-Acylhydrazon wies eine
      240-fach höhere Affinität im Vergleich zu den ursprünglichen
      Acylhydrazonen auf, resultierend in einem zweistellig
      nanomolaren Binder.