Κλωνοποίηση και υπερέκφραση των γονιδίων TTHA0144, TTHA0145, TTHA0740 και TTHA0815 των συστημάτων δυο-συστατικών του θερμόφιλου βακτηρίου Thermus thermophilus HB8:
Creators: name: Ζήση, Μαρία Φωτίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Συστήματα μετάδοσης δυο-συστατικών
Κινάσες ιστιδίνης
Ρυθμιστές απόκρισης
Two-component systems (TCSs)
Histidine Kinases
Response Regulators

description: Ένα συνεχώς μεταβαλλόμενο, και πολλές φορές εχθρικό, περιβάλλον αποτελεί το χώρο δράσης των περισσότερων ζωντανών οργανισμών. Η ικανότητα των βακτηρίων να αποκρίνονται στις διάφορες περιβαλλοντικές αλλαγές είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την επιβίωση τους. Τα συστήματα μετάδοσης δυο-συστατικών αποτελούν το βασικό μηχανισμό σύζευξης ερεθίσματος απόκρισης, σε αυτές τις μεταβαλλόμενες συνθήκες. Η παρούσα εργασία αποτελεί συνέχεια της προσπάθειας της ολιστικής κατανόησης του τρόπου με τον οποίο αντιλαμβάνεται και αποκρίνεται το βακτηριακό στέλεχος Thermus Thermophilus HB8 το εξωτερικό του περιβάλλον. Πιο συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση της ολικής αλληλουχίας κωδικοποίησης του ρυθμιστή απόκρισης TTHA0145 και της κινάσης ιστιδίνης TTHA0144, καθώς και οι αλληλουχίες κωδικοποίησης των κινασών ιστιδίνης TTHA0740 και TTHA0815 από τις οποίες είχαν αφαιρεθεί οι διαμεμβρανικές τους περιοχές. Την κλωνοποίηση ακολούθησε επαγωγή πρωτεϊνικής έκφρασης, με σκοπό την απομόνωση των αντίστοιχων πρωτεϊνών και την κατόπιν μελέτη των δικτύων αλληλεπιδράσεων τους. Η κινάση ιστιδίνης TTHA0740 απομονώθηκε σε μεγάλη ποσότητα και καθαρίστηκε επαρκώς, ενώ οι υπόλοιπες δυο κινάσες ιστιδίνης, TTHA0144 και TTHA0815 δεν παρουσίασαν καθόλου έκφραση με βάση τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν. Όσον αφορά στο ρυθμιστή απόκρισης TTHA0145 παρουσιάστηκε πρότυπο πρωτεϊνικής έκφρασης μετά από επαγωγή, αλλά δεν πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καθαρισμός του, καθώς η ύπαρξη της πρωτεΐνης δεν επιβεβαιώθηκε με το πείραμα της ανοσοαποτύπωσης. Τελικά, η παρούσα εργασία αποτελεί ένα βήμα προς την πλήρη κατανόηση του τρόπου επικοινωνίας του συγκεκριμένου στελέχους, ώστε στη συνέχεια, να αποτελέσει ένα εξειδικευμένο στέλεχος για βιοτεχνολογικές εφαρμογές.
description: A constantly changing environment, and very often a cruel environment, is the scene of action for the majority of living organisms. The ability of bacteria to respond to the different environmental changes is a necessary prerequisite for their survival. The two-component systems are the major sensing mechanisms of external stimuli comprise. This work is continue of an effort for the holistic comprehension of the way the bacterial strain T. thermophilus HB8 perceives and responds to the external environment. More specifically, we cloned the full-length coding sequences of the response regulator TTHA0145 and the histidine kinase TTHA0144, as well the truncated sequences (the coding sequence without transmembrane regions) of the histidine kinases TTHA0740 and TTHA0815. Thereafter, induction of protein expression was performed for isolation of the corresponding proteins, to study the potential involvement networks of multiple interactions. The histidine kinase TTHA0740 was isolated in large quantity and was sufficiently purified, whereas, the histidine kinases TTHA0144 and TTHA0815 displayed no expression under the conditions used. On the other hand, the response regulator TTHA0145 expressed well under the conditions of our experimentations. Eventually, this work is another step for the thorough knowledge of how the specific strain responds to external stimuli and it may result in its further improvement as model organism for biotechnological purposes.