STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF COMPLEMENT FACTOR H: A CRUCIAL PROTEIN IN SEVERAL DISORDERS
Creators: name: BERRA, SILVIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2015

description: Il Fattore H del complemento (FH) � un importante regolatore della via alternativa del complemento: protegge infatti le cellule dell?ospite dall?attacco del sistema del complemento e carenze di FH sia qualitative e quantitative dovute a mutazioni nel gene CFH sono spesso associate ad una serie di malattie umane, come la glomerulonefrite membranoproliferativa (MPGN), la sindrome emolitico-uremica atipica (aHUS) e la degenerazione maculare della retina legata all?et� (AMD). Mentre esiste una caratterizzazione genetica per tutte queste malattie, i dati funzionali a livello di proteine sono spesso carenti. Inoltre, il FH gioca un ruolo significativo nelle malattie infettive: molti agenti patogeni sono infatti in grado di reclutare il FH sulla loro superficie sfruttandolo per proteggersi dagli attacchi del complemento. Mentre per alcuni agenti patogeni l'interazione con il FH � stata ben descritta, per gli altri gli "interattori" diretti sono ancora sconosciuti. Tuttavia, lo studio del FH � complicato dalla presenza di proteine FH-related (FHRs) che posseggono un elevato grado di somiglianza con il FH e ne rendono quindi difficile la purificazione e la analisi diretta. Il primo obiettivo di questo progetto � stato lo sviluppo di saggi quantitativi e funzionali FH-specifici, utilizzando un anticorpo monoclonale (Mab 5H5) prodotto nel nostro laboratorio, che si � dimostrato essere specifico per FH. Il secondo era la produzione del FH intero e di tre frammenti, contenenti diverse porzioni della proteina, sia in un sistema di espressione eucariotico che procariotico. L?anticorpo 5H5 � stato prodotto in grandi quantit� utilizzando un mini-fermentatore ed � stato utilizzato per purificare il FH mediante cromatografia di affinit�. La purezza e l?attivit� funzionale del FH purificato sono state valutate e confrontate con gli altri metodi di purificazione (ad es. affinit� su Eparina, HPLC, HIC). � stato inoltre sviluppato un test ELISA per la corretta quantificazione del FH da fluidi biologici, utilizzando il 5H5 insieme ad un anticorpo policlonale anti-FH, anch?esso prodotto nel nostro laboratorio, e al FH purificato per affinit�. Questo test di quantificazione � risultato affidabile ed � stato utilizzato per valutare diversi campioni di pazienti aHUS e AMD. Inoltre, sono stati sviluppati anche due micro-metodi di purificazione del FH. Questi metodi consentono di purificare una buona quantit� di FH altamente purificato partendo da una piccola quantit� di campione e sono quindi uno strumento utile per studiare il FH specialmente in quelle patologie, quali aHUS, che colpiscono soprattutto i bambini. Infine, sono stati sviluppati due saggi funzionali per valutare sia l'attivit� cofattoriale N-terminale che l?attivit� protettiva C-terminale del FH. Il FH � una grossa glicoproteina solubile che possiede funzioni diverse in differenti parti della molecola. Quindi diversi test sono necessari per valutare la completa funzionalit� del FH. Il primo test, il "cofactor assay", basato sul fatto che il FH possiede attivit� cofattoriale per il taglio del C3b mediato dal FI, � completamente funzionante ed � gi� stato utilizzato per lo screening di diversi campioni. Il secondo, il test di emolisi, si basa sul fatto che il FH � in grado di proteggere gli eritrociti di pecora dalla emolisi mediata dal complemento. In questo test il FH purificato dai pazienti verr� utilizzato insieme ad un siero di controllo depleto di FH, al fine di avere un saggio in cui l'unica variabile sia il FH. Questo test � stato gi� messo a punto utilizzando un siero di controllo al fine di verificare tutte le condizioni, ed � ora nella fase finale di sviluppo, dopo di che sar� utilizzabile su materiale dei pazienti. I quattro cloni contenenti la sequenza completa del FH e i frammenti parziali (SCRs 1-7, SCRs 8-14, SCRs 15-20) sono stati prodotti e saranno utilizzati per esprimere FH sia in forma glicosilata che non glicosilata. Sar� quindi analizzata la capacit� di queste proteine ricombinanti di interagire con le proteine dei patogeni o di ripristinare la funzione di un FH difettoso.