title: Regulation of Rho-activating proteins by heterotrimeric G proteins: Sensitivity of Gα RhoGEF interaction is determined by dissociation kinetics
title: Regulation of Rho-activating proteins by heterotrimeric G proteins: Sensitivity of Gα RhoGEF interaction is determined by dissociation kinetics
title: Die Regulation Rho-aktivierender Proteine durch heterotrimere G-Proteine: Die Sensitivität der Gα-RhoGEF-Interaktion wird durch die Dissoziationskinetik reguliert
Creators: name: Bodmann, Eva-Lisa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Förster resonance energy transfer
Leukämie assoziiertes RhoGEF
leukemia-associated RhoGEF
Biowissenschaften, Biologie
Gαq
Gα13
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
p63RhoGEF
Regulator of G protein signaling 2
G-Protein gekoppelte Rezeptoren

description: Die Aktivierung der RhoGTPasen
      durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren ist wichtig für viele
      physiologische Funktionen wie etwa die Blutdruckregulation.
      Am besten sind die Unterfamilien Rho, Rac und Cdc42 der
      RhoGTPasen verstanden. In der vorliegenden Arbeit liegt der
      Fokus auf Signaltransduktions-Mechanismen, welche RhoA
      aktivieren. Aktives RhoA reguliert zum Beispiel das
      Zytoskelett durch seinen Einfluss auf die Aktin-Dynamik und
      reguliert die Rho-Kinase ROCK, welche die
      Myosin-Leichtketten-Phosphatase durch Phosphorylierung
      inaktiviert. RhoA induziert weiterhin mittels des Serum
      responsiven Faktors Gentranskription. Die meisten RhoGTPasen
      wechseln zwischen einem GDP-gebunden inaktiven und einem
      GTP-gebunden aktiven Zustand hin und her. Der Austausch von
      GDP durch GTP und somit die Aktivierung wird durch Rho Guanin
      Austausch Faktoren (RhoGEFs) vermittelt. Die größte Familie
      der RhoA-aktivierenden RhoGEFs ist funktionell und
      strukturell durch eine DH Domäne und eine direkt
      anschließenden PH Domäne charakterisiert. Die DH Domäne
      stellt die GEF Aktivität bereit, die PH Domäne hat vor allem
      regulatorische Funktionen. Manche dieser RhoGEFs werden durch
      Gαq/11 und/oder Gα12/13 aktiviert. Die vorliegende Arbeit
      beschäftigt sich mit der Regulation dieser RhoGEFs. Unterhalb
      von Gα13 werden RH RhoGEFs aktiviert. Alle RH-RhoGEFs
      besitzen eine Regulator of G protein signaling (RGS) homologe
      (RH) Domäne zusätzlich zur DH-PH Domäne, welche auch das
      Gαq-aktivierte p63RhoGEF besitzt. Nach genetischer Depletion
      des RH-RhoGEFs LARG sind Mäuse gegen Salz-induzierten
      Bluthochdruck geschützt und die akute Reaktion auf Behandlung
      mit Angiotensin II fehlt den p63RhoGEF defizienten Mäusen.
      Trotzdem war bisher unklar, warum RhoGEFs durch zwei
      Gα-Unterfamilien aktiviert werden. Auch über die zeitliche
      und räumliche Dynamik der Rezeptor-vermittelten Aktivierung
      war wenig bekannt. Deshalb entwickelten wir FRET-basierte
      Messmethoden, welche es ermöglichen, die RhoGEF Aktivierung
      zum ersten Mal in lebenden Zellen zu beobachten. FRET findet
      zwischen zwei Fluorophoren statt - in dieser Studie sind die
      Fluorophore an interessierende Proteine fusioniert –, welche
      einen Abstand von höchsten 10nm besitzen. Daher reflektiert
      ein Anstieg im FRET nach Stimulation mit dem Agonisten die
      Annäherung der interessierenden Proteine. In einzelnen,
      lebenden Zellen wurden Änderungen in FRET mit einer
      Hochgeschwindigkeitskamera detektiert. Die Interaktion
      zwischen LARG und Gα13 wurde in Zellen beobachtet, welche mit
      Gα13-mTur2 und YFP-LARG transfiziert waren. Die Stimulation
      des Thromboxan A2 Rezeptors führte zu einem robusten Anstieg
      des FRET Signals. Wie sich in der langsamen Abnahme des FRET
      Signals zwischen LARG und Gα13 zeigte, dissoziierten LARG und
      Gα13 deutlich langsamer (t1/2&gt;5min) als Gα13 inaktivierte
      (t1/2=17,50s). Dies konnte auch in der Kinetik der LARG
      Translokation zur Plasmamembrane beobachtet werden. Somit
      verursacht die Aktivierung des Gα13, dessen schnelle
      Interaktion mit LARG. Bemerkenswerterweise inhibiert LARG
      entweder die Gα13´s Inaktivierung oder es bindet an Gα13 nach
      dessen Inaktivierung. Wir gehen davon aus, dass die
      verlängerte Interaktion die Ursache für die fast 100fach
      erhöhte Sensitivität der LARG-Gα13-Interaktion für die
      Stimulation mit einem Thromboxan Agonisten im Vergleich zur
      Gα13-Aktivierung ist. Die Aktivierung von p63RhoGEF wurde
      durch Beobachtung der Interaktion von Gαq-CFP und
      Venus-p63RhoGEF untersucht. Ein robuster Anstieg im FRET
      wurde nach Stimulation von Gαq-gekoppelten Rezeptoren
      detektiert. Im Gegensatz zur LARG-Gα13-Interaktion
      reflektiert die p63RhoGEF-Gαq-Interaktion zeitlich sehr genau
      sowohl die Gαq-Aktivierung als auch seine Inaktivierung.
      Außerdem zeigen die p63RhoGEF-Gαq-Interaktion und die
      Gαq-Aktivierung eine ähnliche Sensitivität (EC50 von 500nM
      Histamin). Beide Beobachtungen wurden auch in einem trimären
      Komplex aus p63RhoGEF, Gαq und RGS2 bestätigt. In der
      Vergangenheit wurde eine beschleunigte Gαq-Inaktivierung
      durch RGS2 in vitro beschrieben und auch wir beobachteten
      eine beschleunigte Dissoziation von p63RhoGEF und Gαq in
      Anwesenheit von RGS2. Zusätzlich konnten wir einen Anstieg im
      FRET zwischen p63RhoGEF und RGS2 beobachten. Diese
      Beobachtung war der erste Beweis für diesen trimären Komplex
      in lebenden Zellen und unterstützt das Konzept eines
      funktionalen, aktivierungsabhängigen
      p63RhoGEFGαq-RGS2-Komplexes. In diesem Komplex inhibiert RGS2
      die nachgeordnete Signalweiterleitung. Zusammenfassend werden
      sowohl LARG als auch p63RhoGEF durch die Stimulation der
      G-Protein gekoppelter Rezeptoren aktiviert. Trotzdem ist
      LARGs Sensitivität für die Rezeptoraktivierung deutlich höher
      und die Dauer der Signalweiterleitung länger als es für
      p63RhoGEF gezeigt wurde. Die Inaktivierung von p63RhoGEF wird
      zudem durch RGS2 weiter beschleunigt. Dies hat eine Abnahme
      der nachgeordneten Signalweiterleitung zur Folge.
description: Activation of RhoGTPases downstream
      of G protein coupled receptors is important for many
      physiological functions, such as blood pressure regulation.
      The subfamilies Rho, Rac and Cdc42 are the best understood
      RhoGTPases and the present study focused on signaling towards
      the Rho subfamily member RhoA. In its active state RhoA
      regulates the cytoskeleton by its influence on actin
      dynamics, activates important signal transducers such as
      Rho-associated coiled-coil kinase, which phosphorylates and
      thereby inactivates myosin light chain phosphatase and
      induces gene transcription via serum response factor. Most
      RhoGTPases cycle between a GDP-bound inactive and a GTP-bound
      active state. The exchange of GTP for GDP and therefore
      activation is mediated through Rho guanine nucleotide
      exchange factors (RhoGEFs). In the case of RhoA the largest
      family of RhoGEFs is functionally and structurally
      characterized by a DH domain adjunct to a PH domain. The DH
      domain holds GEF activity and the PH domain has mainly
      regulatory functions. Some of these RhoGEFs can be activated
      by Gαq/11 and/or Gα12/13 and the present work focused on
      their regulation: Downstream of Gα13 RH-RhoGEFs are
      activated. This group of RhoGEFs shares a regulator of G
      protein signaling homology domain (RH) in addition to the
      DH-PH domain, which is also present in the Gαq-activated
      p63RhoGEF. Knock-out of the RH-RhoGEF leukemia-associated
      RhoGEF (LARG) protects against salt-induced hypertension in
      mice and the acute response of vascular smooth muscle cells
      to angiotensin II treatment is mediated mainly by p63RhoGEF.
      For both proteins several other physiological functions have
      been described. Nevertheless, little had been known about why
      RhoGEFs are activated downstream of two Gα subfamilies and
      the temporal as well as spatial dynamics of their
      receptor-mediated activation. Therefore we developed
      FRET-based assays monitoring RhoGEF activation in living
      cells for the first time. The Förster resonance energy
      transfer (FRET) occurs between two fluorophores - in the
      present study fused to the proteins of interest - with a
      distance of less than 10nm. Thus an increase in FRET upon
      stimulation with the agonist reflects convergence of the
      proteins of interest. Changes in FRET were recorded in
      single, living cells with a high-speed CCD-camera. The
      interaction between LARG and Gα13 was monitored in cells
      transfected with Gα13-mTur2 and YFP-LARG. The stimulation of
      thromboxane A2 receptor induced a robust increase in FRET.
      Surprisingly, as shown by the slow decrease in FRET between
      LARG and Gα13, the interaction of LARG and Gα13 dissociated
      very slowly (estimated t1/2&gt;5min) compared to the Gα13
      inactivation (t1/2=17.50s). This observation was also
      reflected in the kinetics of LARG translocation to the plasma
      membrane. Thus LARG and Gα13 interact rapidly upon activation
      of Gα13, but either LARG inhibits Gα13 inactivation or stays
      in a complex with Gα13 after inactivation of the same. In our
      opinion the prolonged interaction is most likely the reason
      for the almost 100-fold higher sensitivity towards
      stimulation with a thromboxane agonist of the Gα13 LARG
      interaction compared with the Gα13 activation. The p63RhoGEF
      activation was studied by monitoring the interaction of
      Gαq-CFP and Venus-p63RhoGEF. A robust increase in FRET was
      observed upon stimulation of Gαq coupled receptors. In
      contrast to the LARG Gα13 interaction, the p63RhoGEF Gαq
      interaction mirrored closely the Gαq activation as well as
      inactivation. In addition also the sensitivity of p63RhoGEF
      Gαq interaction and Gαq activation was in the same range
      (EC50 of 500nM histamine). Both observations were also true
      in a trimeric complex of p63RhoGEF and Gαq with the regulator
      of G protein signaling RGS2. RGS2 was previously shown to
      accelerate Gαq inactivation in vitro and consequently we
      observed an accelerated dissociation of p63RhoGEF and Gαq in
      the presence of RGS2. Additionally, we could monitor an
      increase in FRET between p63RhoGEF and RGS2, which is the
      first evidence for such a trimeric complex in living cells.
      Thus our data strongly support the concept of a functional
      activation-dependent p63RhoGEF Gαq RGS2 complex. In this
      complex RGS2 inhibits downstream signaling. This could be an
      explanation for severe hypertension, which has been observed
      in RGS2 knock-out mice (Tang et al., 2003). In summary, LARG
      as well as p63RhoGEF are both activated upon stimulation of G
      protein coupled receptors. Nevertheless LARG´s sensitivity
      towards receptor activation and duration of signaling seems
      to be remarkably higher and longer than p63RhoGEF´s. The
      inactivation of p63RhoGEF is further accelerated by RGS2,
      which also decreases downstream signaling.