title: Cryo-electron microscopy and crystal structure of F420-reducing [NiFe]-hydrogenase (FrhABG) from Methanothermobacter marburgensis
title: Cryo-Elektronenmikroskopie- und Kristallstruktur der F420-reduzierenden [NiFe]-Hydrogenase (FrhABG) aus Methanothermobacter marburgensis
Creators: name: Vitt, Stella
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Oxidoreductasen
heterologous production
Biowissenschaften, Biologie
Zwillingsbildung
Methanogenese
F420-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase
heterolgoe Produktion
Methanothermobacter marburgensis
methanogenesis
Coenzym-F
Kubisches Gitter
F420-reducing [NiFe]-hydrogenase
Elektronenmikroskopie
FrhB
Einzelmolekülmikroskopie
Kristallstruktur
Dissertation

description: Die Methanbildung aus H2 und CO2
      ist die einzige Energie-liefernde Reaktion in vielen
      methanogenen Archaeen. Pro Mol gebildetem Methan werden vier
      Mol H2 verbraucht. Der Wasserstoff wird dabei durch
      Hydrogenasen aktiviert, wovon es in den meisten
      hydrogenotrophen Methanbildnern drei unterschiedliche
      [NiFe]-Hydrogenasen und eine [Fe]-Hydrogenase gibt. Von den
      vier Hydrogenasen ist die F420-reduzierende
      [NiFe]-Hydrogenase die quantitativ wichtigste, da sie über
      reduziertes F420H2 vier der acht zur CO2 Reduktion benötigten
      Reduktionsäquivalente bereitstellt. F420 ist ein 5
      ́-Deazaflavinderivat, das zwar strukturell einem Flavin
      ähnelt, sich aber funktionell wie ein Pyridinnukleotid
      verhält, in dem es ein Hydrid und nicht einzelne Elektronen
      übertragen kann. Das Redoxpotential Eo ́ von F420 ist mit
      -360 mV aber um 40-mV negativer als das von NAD und NADP. Die
      Reduktion von F420 mit H2 (Eo ́= -414 mV) erfolgt daher auch
      nahe am thermodynamischen Gleichgewicht, insbesondere unter
      physiologischen Bedingungen, unter denen der H2-Partialdruck
      in Kulturen von methanogenen Archaeen sehr viel niedriger als
      ein Bar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Struktur
      von FrhABG aufzuklären, wofür es eine Reihe unterschiedlicher
      Motive gab. Zum einen ist es die funktionelle Reversibilität,
      die dieses Enzym von allen bisher strukturell untersuchten
      Hydrogenasen unterscheidet. Zum anderen gehört FrhABG zur
      phylogenetischen Gruppe 3 [NiFe]-Hydrogenasen, von denen es
      noch keine Strukturen gibt; alle bisher strukturell
      aufgeklärten NiFe-Hydrogenasen gehören der Gruppe 1 an. Und
      letztlich, weil der FrhABG Komplex die Untereinheit B
      enthält, die phylogenetisch verwandt ist mit Untereinheiten,
      die in anderen F420-abhängigen Enzymen vorkommen wie in den
      F420- abhängigen Formiat Dehydrogenase, F420-abhängigen
      Glutamat-Synthase, F420-abhängigen Sulfit- Reduktase, den
      F420H2:Quinon-Oxidoreduktase und
      F420H2:Phenazin-Oxidoreduktase Komplexen, von denen es
      ebenfalls noch keine Strukturen gibt. Der F420-reduzierende
      FrhABG Komplex wurde aus Methanothermobacter marburgensis
      gereinigt. Nach 100-facher Anreicherung wurde eine homogene
      Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 280 U/mg und
      einem apparenten Km für F420 von 40 μM erhalten. Die
      Präparation mit einer apparenten Molmasse von über 1000 kDa
      enthielt die drei Untereinheiten A, B und G im Verhältnis 1
      zu 1 zu 1. Die makromolekulare Struktur von FrhABG legte es
      nahe, den multimeren Komplex zunächst
      Cryo-elektronenmikroskopisch (Cryo-EM) zu charakterisieren,
      was mit einer einmaligen Auflösung bis ~4 Å gelang. Auf Grund
      der hohen Auflösung war es möglich, das Kohlenstoffrückrad in
      die Elektronendichte zu modellieren. Das Heterotrimer bildet
      einen (FrhABG)12 Komplex mit einer molekularen Masse von etwa
      1215 kDa. Dabei werden die Trimerisierung und die
      Multimerisierung hauptsächlich über Salzbrücken stabilisiert.
      Parallel zu den Cryo-EM Untersuchungen wurden
      Kristallisationsversuche von FrhABG durchgeführt. Die
      Kristallstruktur konnte bis zu einer Auflösung von 1.8 Å
      verfeinert werden, was eine exakte Analyse insbesondere der
      Metallzentren erlaubte. In der Kristallstruktur ist das
      [NiFe]-Zentrum in der FrhA Untereinheit viel deutlicher zu
      erkennen, als in der Cryo-EM Struktur. Das Nickelatom wird
      durch vier Cystein-Thiolate koordiniert, wobei zwei dieser
      Thiolate zusätzlich eine Brücke zu dem Eisenatom bilden.
      Weiter ist zu erkennen, dass das Eisen drei diatomische
      Liganden trägt, sehr wahrscheinlich ein CO und zwei CN-.
      Trotz des hohen Konservierungsgrads des aktiven
      [NiFe]-Zentrums, gibt es in seiner Umgebung ein paar markante
      Aminosäureaustausche, die unsere Vorstellung über
      Hydrogenasen erweitern. In der FrhG Untereinheit mit drei
      [4Fe4S]-Clustern weist das proximale [4Fe4S]-Cluster eine
      ungewöhnliche, in anderen [NiFe]-Hydrogenasen noch nicht
      beschriebene Koordinierung mit einem Aspartat anstelle eines
      Cysteins auf. Ebenfalls ungewöhnlich ist, dass der mediale
      Cluster ein [4Fe4S]- und nicht ein [3Fe4S]-Cluster ist und
      dass der mediale und distale [4Fe4S]-Cluster in eine
      Ferredoxin- ähnliche Struktur eingebettet sind. In der FrhB
      Untereinheit sind das [4Fe4S]-Cluster und das FAD, welches
      eine ungewöhnlich gestauchte Konformation aufweist, gut
      aufgelöst. Die Distanz zwischen dem [4Fe4S]-Cluster und dem
      FAD liegt bei 7,5 Å. FAD ist so angeordnet, dass es in
      van-der-Waals-Kontakt zu F420 kommt und ein Hydrid von F420H2
      von der pro-S-Position akzeptieren kann, was aus
      Modellierungen hervorgeht. Um zu zeigen, dass FrhB
      tatsächlich die Untereinheit ist, an der F420 reduziert wird,
      wurde das Gen frhB aus Methanocaldococcus jannaschii in
      Escherichia coli überproduziert, gereinigt und
      charakterisiert. Die heterolog produzierte Untereinheit hatte
      eine molekulare Masse von etwa 31 kDa und enthielt sowohl FAD
      und als auch ein Eisen-Schwefel-Cluster. Das rekombinante
      Enzym katalysierte die Oxidation von F420H2 mit
      Benzylviologen als Elektronenakzeptor mit einer spezifischen
      Aktivität von 15 U/mg Protein, verlor aber seine Aktivität
      schnell, insbesondere beim Einfrieren. Diese und vorläufige
      Elektronenspinresonanzspektroskopische (ESR) Untersuchungen
      zum Redoxpotential der einzelnen [4Fe4S]-Cluster werden in
      Kapitel 3 der vorliegenden Arbeit beschrieben.
description: The methane formation from H2 and
      CO2 is the only energy providing reaction in many
      methanogenic archaea. Per mol produced methane four mol H2
      are consumed. Therefore hydrogen is activated by hydrogenase
      activity. Most hydrogenotrophic methanogens harbor three
      different [NiFe]-hydrogenases and one [Fe]-hydrogenase. From
      these four hydrogenases the F420-reducing [NiFe]-hydrogenase
      (FrhABG) is the quantitative most important one, because it
      provides via reduced F420H2 four of the eight reducing
      equivalents that are necessary for CO2 reduction. F420 is a
      5´-deazaflavinderivate that resembles structurally a flavin
      but behaves more like a pyridinnucleotide by transferring a
      hydride rather then single electrons. The redox potential Eo´
      of F420 is -360 mV and with this -40 mV lower than that from
      NAD and NADP, respectively. The reduction of F420 with H2 (Eo
      ́= -414 mV) takes place near the thermodynamical equilibrium,
      particular under physiological conditions. Here the H2
      partial pressure from cultures of methanogenic archaea is
      much lower then one bar. The goal of the present work was
      solving the structure of FrhABG, wherefore different motives
      were present. On the one hand the functional reversibility
      distinguish this enzyme from the structural known
      hydrogenases. On the other hand FrhABG belongs to the
      physiological group 3 of [NiFe]-hydrogenases, from this group
      no structure is available so far. All structural analyzed
      [NiFe]-hydrogenases belong to group 1. And finally, because
      FrhABG contains the subunit B which is phylogenetically
      related with subunits of other F420-dependent enzymes like
      F420-dependent formate dehydrogenase, F420-dependent
      glutamate synthase, F420- dependent sulfite reductase,
      F420H2:quinone oxidoreductase and F420H2:phenazine
      oxidoreductase complex, respectively. From all of these
      enzymes no structure has been solved. The F420 reducing
      FrhABG complex was purified from Methanothermobacer
      marburgensis. Homogeneous preparation with a specific
      activity of 280 U/mg and an apparent KM for F420 of 40 μM was
      reached after a purification fold of 100. The preparation
      with an apparent molecular mass of &gt;1000 kDa contains the
      three subunits A, B, and G in a ratio 1 to 1 to 1. The
      macromolecular structure of FrhABG gave the ability to
      characterize this multimeric complex firstly with
      Cryo-electron microscopy (Cryo-EM). The structure was solved
      with a unique resolution of ~4 Å. Because of this high
      resolution, it was possible to model the carbon backbone into
      the electron density. It turned out that the heterotrimer
      builds up a complex of (FrhABG)12 with a molecular mass of
      1215 kDa. The trimeric and multmerization is stabilized
      mainly by salt bridges. Parallel to analysis by Cryo-EM
      crystallization experiments from FrhABG were performed. The
      X-ray crystal structure was solved with a resolution of 1.8
      Å. With this received structure detailed analysis of the
      containing metal centers were possible. The [NiFe]-center of
      the FrhA subunit is in detail more visible in the crystal
      structure than in the Cryo-EM structure. The nickel atom is
      coordinated by four cysteine thiolates, thereby two of this
      cysteines forming an additional bridge to the iron atom.
      Furthermore, the iron is coordinated additionally by three
      diatomic ligands; one CO and two CN-. Interestingly, despite
      the fact that the [NiFe]-center is highly conserved, the
      surrounding revealed some interesting amino acid exchanges
      which enlarge our view on hydrogenases. FrhG contains three
      [4Fe4S]-clusters. The proximal [4Fe4S]-cluster has a unique
      coordination with one aspartate instead of a cystein; this
      aspartate is not described in any [NiFe]-hydrogenase
      structure so far. Moreover, the medial cluster is a [4Fe4S]-
      and not a [3Fe4S]-cluster and together with the distal
      [4Fe4S]-cluster bound in a ferredoxin-like domain. In the
      FrhB subunit the [4Fe4S]-cluster and the FAD, that shows a
      unique compressed confirmation, are clearly visible. The
      distance between them is 7.5 Å. FAD is arranged in
      van-der-Waals contact to F420. So FAD could accept a hydride
      from F420H2 from the pro-S side; this information arises from
      post modeling of F420. To show that FrhB is indeed the F420
      reducing subunit, the gen frhB from Methanocaldococcus
      jannaschii was over produced in Escherichia coli, purified
      and characterized. The heterologous produced subunit has a
      molecular mass of 31 kDa and contains FAD and an iron-sulfur
      cluster, respectively. The recombinant enzyme catalyzes the
      oxidation of F420H2 and simultaneously the reduction of
      benzyl viologen with a specific activity of 15 U/mg. The
      protein loses the activity fast, especially after freezing.
      This and preliminary electron paramagnetic resonance (EPR)
      analysis of the redox potential of the single [4Fe4S]-cluster
      from FrhABG are presented in this work.