title: Studies to optimize the genetic constellation of influenza vaccine seed viruses using an attenuated mutant of the virus isolate A/FPV/Rostock/1934 (H7N1)
title: Untersuchungen zur Optimierung der genetischen Konstellation von Influenzaimpfstoff-Saatviren unter Verwendung einer attenuierten Mutante des Virusisolats A/FPV/Rostock/1934 (H7N1)
Creators: name: Alex, Nina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Antigen
vaccine-seed
Influenza-A-Viren
Reassortanten
reassortants
Impfstoffsaatviren
Influenza-A-virus
antigen
Biowissenschaften, Biologie

description: Influenza-A-viruses cause highly
      contagious respiratory infections in different species
      against which vaccination provides the most effective
      protection. Presently the majority of influenza vaccines are
      still produced in embryonated chicken eggs but the
      development of cell culture-based systems is increasing (e.g.
      MDCK- and Vero-cells). The producible antigen yield that is
      highly dependent on the seed virus growth capacities is the
      major limiting factor for sufficient vaccine supply. In
      particular for emerging pandemic viruses the recoverable
      amounts of antigen are often very low (such as those of the
      H1N1 pandemic of 2009 and potentially pandemic H5N1
      isolates). The focus of this work was to generate higher
      antigen yields by using an alternative acceptor strain for
      the generation of the reassortant seed viruses to be used for
      vaccine production. Usually the human H1N1-subtype isolate
      A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) is the recommended high-yield
      acceptor strain for the integration of the surface antigen
      proteins of circulating viruses. In this study the
      suitability of the non-pathogenic, attenuated variant FPVmut
      of the avian influenza strain A/chicken/Rostock/1934 (H7N1)
      to serve as an alternative background strain was explored.
      For this purpose recombinant reassortant viruses were
      generated in both acceptor strain backgrounds that contained
      the antigenic surface proteins hemagglutinin and
      neuraminidase (HA and NA) of selected seasonal and
      (potentially) pandemic donor viruses (subtypes H1N1, H1N1pdm,
      H3N2, H5N1, H9N2). Further, due to its established function
      in promoting viral particle formation the potential influence
      of the incorporation of the HA- and NA-homologous M1 protein
      was analyzed. Both acceptor strains, FPVmut and PR8, produced
      almost identical viral yields when propagated in embryonated
      chicken eggs, MDCK- and Vero-cells. However, we found that
      the onset of virus production and growth to high titers in
      MDCK cells was faster for FPVmut than for PR8. Both acceptor
      strains were equally suitable for the generation of
      recombinant reassortant viruses applying a “reverse genetics”
      approach. For reassortants carrying HA and NA from an avian
      donor strain a more rapid and pronounced cell-to-cell spread
      was detectable in the FPVmut acceptor background. No
      significant differences were observed in the NA yields or the
      virus morphology depending on the background strain or the
      genetic composition. When using a potentially pandemic avian
      H5N1 strain as HA and NA donor a significant increase in the
      antigen yield was obtained in chicken eggs with
      FPVmut-reassortants. Both, higher average and maximum
      HA-titers and higher absolute amounts of HA-antigen were
      reached in the allantoic fluid of infected eggs in the
      FPVmut-background. This finding was even more pronounced in
      the Vero cell production system where the HA-antigen yields
      achievable with the FPVmut-reassortants were threefold higher
      than those of the PR8-reassortants. For the H9N2 isolate the
      incorporation of the surface proteins homologous M gene
      segment within the FPVmut genetic background resulted in an
      1,5-fold increase in antigen yield. Similarly, for the
      H1N1pdm09 donor virus the highest individual values of the HA
      yields were measured in the PR8 background with the
      homologous M gene segment. Taken together, these data show
      that depending on the donor virus the use of the alternative
      acceptor strain FPVmut and/or the integration of the
      homologous M1 protein are effective approaches to optimize
      the composition of influenza vaccine seed viruses to achieve
      higher HA antigen yields. Therefore, both approaches could be
      of good value for the production of future seasonal and
      pandemic vaccines.
description: Influenza-A-Viren lösen beim
      Menschen hochansteckende Infektionen der Atemwege aus, die in
      Abhängigkeit des Immunstatus der Person und der Pathogenität
      des Virus unterschiedlich schwere Krankheitsverläufe nehmen
      können. Eine Impfung bietet hierbei den effektivsten Schutz
      vor einer Infektion und den damit einhergehenden
      gesundheitlichen Komplikationen. Zum jetzigen Zeitpunkt
      erfolgt die Herstellung der Impfstoffe überwiegend in
      embryonierten Hühnereiern, jedoch zunehmend auch in
      zellkulturbasierten Vermehrungssystemen (MDCK- und
      Vero-Zellen). Einer der wichtigsten limitierenden Faktoren
      für die ausreichende Impfstoffversorgung der Bevölkerung
      stellt dabei die erzeugbare Antigenausbeute dar, die abhängig
      von dem eingesetzten Saatvirus stark variabel sein kann.
      Insbesondere bei neu auftretenden pandemischen Viren, wie
      z.B. denen der H1N1-Pandemie 2009 sowie den H5N1-Isolaten,
      sind die erzielbaren Antigenmengen häufig sehr niedrig. In
      dieser Arbeit wurde mit dem Fokus höhere Antigenausbeuten zu
      erzielen, die Eignung der apathogenen, attenuierten Variante
      FPVmut des hochpathogenen aviären Influenzastammes
      A/Huhn/Rostock/1934 (H7N1) als neuer, alternativer
      Akzeptorstamm für die Generierung der Impfstoffsaatviren im
      Vergleich zu dem gegenwärtig durch die WHO empfohlenen
      humanen H1N1-Stamm A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) analysiert.
      Zusätzlich wurde der Einfluss der Inkorporation des zu den
      Oberflächenantigenen Hämagglutinin und Neuraminidase (HA und
      NA) homologen M-Gens in die Saatviren untersucht. Hierzu
      wurden mittels des Reversen-Genetik-Systems
      Doppel-Reassortanten (HA+NA) sowie Triple-Reassortanten
      (HA+NA+M) in den beiden zu vergleichenden Akzeptorstämmen
      hergestellt. Bei dieser Reassortierungsmethode kann die
      genetische Zusammensetzung der zu erzeugenden rekombinanten
      Viren vorab gezielt festgelegt werden, da die
      Virusgenerierung ausschließlich ausgehend von klonierter cDNA
      erfolgt. Hierzu werden acht für die Gensegmente kodierenden
      Plasmide in Zellen transfiziert. Als Donorviren wurden sowohl
      saisonale Viren der Subtypen H1N1 und H3N2 als auch
      (potenziell) pandemische Isolate der Subtypen H1N1pdm09, H5N1
      und H9N2 eingesetzt. FPVmut zeichnet sich bei Vermehrung in
      embryonierten Hühnereiern sowie MDCK- und Vero-Zellen durch
      identische Ausbeuten im Vergleich mit dem aufgrund seiner
      guten Wachstumseigenschaften für die Erzeugung von
      Influenzasaatviren standardmäßig eingesetzten PR8-Isolat aus.
      Zusätzlich erwiesen sich beide Hintergrundstämme
      grundsätzlich als gleichermaßen geeignet für die Erzeugung
      rekombinanter Viren, da mit ihnen im selben Zeitrahmen ein
      identischer Satz an Reassortanten erzeugt werden konnte. Bei
      der Untersuchung der Replikationseigenschaften zeigte sich,
      dass bei den Viren mit dem FPVmut-Hintergrund eine produktive
      MDCK-Zellinfektion zu früheren Zeitpunkten einsetzte und
      ergänzend bei den aviären Donor-Isolaten eine gesteigerte
      Infektionsausbreitung beobachtet werden konnte. Kein
      wesentlicher Unterschied war in der NA-Ausbeute oder der
      Virusmorphologie in Abhängigkeit von dem Hintergrundstamm
      oder der genetischen Zusammensetzung festzustellen. Bei
      Verwendung des aviären H5N1 konnte eine deutliche Steigerung
      der Antigenausbeute im Hühnerei- und noch signifikanter im
      Vero-Anzuchtsystem erzielt werden, wodurch sich für dieses
      potenziell pandemische Isolat das FPVmut als ein
      leistungsfähigerer Akzeptorstamm im Vergleich zu dem
      PR8-Standardsystem herausstellte. Hierbei wurden sowohl
      höhere gemittelte als auch maximal erreichbare HA-Titer sowie
      höhere absolute HA-Antigenmengen in der Allantoisflüssigkeit
      infizierter Hühnereier gemessen. Bei der Vermehrung in
      Vero-Zellen wurden in den Doppel-Reassortanten nach einer
      72-stündigen Inkubation 3fach höhere HA-Antigenmengen im
      FPVmut Akzeptorstamm erhalten. Im Falle des H9N2-Isolates
      bewirkte die Inkorporation des homologen M-Gensegmentes im
      FPVmut-Hintergrund eine Steigerung der Antigenausbeute um den
      Faktor 1,5. Auch bei dem H1N1pdm09-Isolat wurden die höchsten
      Einzelwerte der HA-Ausbeuten nach Inkorporation des
      M-Gensegmentes im PR8-Hintergrund gemessen. Somit konnte
      gezeigt werden, dass sich isolatabhängig Triple-Reassortanten
      als sinnvolle Variation der genetischen Zusammensetzung der
      Saatviren eignen können und die Verwendung eines aviären
      Akzeptorstammes zu einer deutlichen Steigerung der
      erzielbaren HA-Antigenausbeute in unterschiedlichen
      Vermehrungssystemen führen kann.