title: Investigations on a methyltransferase and different prenyltransferases from the secondary metabolism of various Aspergillus species
title: Untersuchungen zu einer Methyltransferase und verschiedenen Prenyltransferasen aus dem Sekundärstoffwechsel von Aspergillus-Arten
Creators: name: Rigbers, Ole Jörgen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Aspergillus
Indole alkaloids
Ergot alkaloids
SAM-dependent N-methyltransferase
Dimethylallyl-trans-Transferase
Ergotalkaloide
SAM-abhängige N-Methyltransferase
Medizin, Gesundheit
Indolalkaloide
Dimethylallyl-Transferase
Secondary metabolism
Sekundärstoffwechsel

description: In der vorliegenden Dissertation
      wurden Arbeiten zur biochemischen Charakterisierung der
      SAM-abhängigen N-Methyltransferase FgaMT aus A. fumigatus
      sowie verschiedener putativer Prenyltransferasen
      unterschiedlicher Aspergillen durchgeführt. Das putative Gen
      fgaMT, bestehend aus zwei Exons von 272 bp und 748 bp,
      getrennt durch ein Intron von 72 bp, wurde in dem
      Biosynthese-Gencluster von Fumigaclavin C in A. fumigatus
      identifiziert. Das abgeleitete Protein FgaMT besteht aus
      insgesamt 339 Aminosäuren und weist eine molekulare Masse von
      38.1 kDa auf. Der codierende Abschnitt dieses Gens konnte per
      PCR erfolgreich aus cDNA amplifiziert werden. Nach Klonierung
      in den Expressionsvektor pQE60 wurde das entstandene
      Expressionskonstrukt pOR15 mit dem Stamm E. coli XL1 Blue
      MRF´ transformiert. Die Überexpression des fgaMT-Gens
      erfolgte bei 37 oC, 200 rpm und 1 mM IPTG Endkonzentration im
      Medium. Das lösliche FgaMT-His6 wurde bis zur Homogenität
      aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Mit Hilfe von
      Enzymassays wurde bewiesen, dass FgaMT in Anwesenheit von
      S-Adenosylmethionin (SAM) als Co-Substrat die Methylierung
      von 4-Dimethylallyltryptophan (4-DMAT) an der NH2-Gruppe
      katalysiert. Das Produkt dieser Reaktion wurde durch Analyse
      per NMR und Massenspektroskopie eindeutig als
      4-Dimethylallylabrin nachgewiesen. Da FgaMT 4-DMAT, nicht
      aber L-Tryptophan als Substrat akzeptierte, konnte
      nachgewiesen werden, dass FgaMT den zweiten Schritt in der
      Biosynthese von Ergotalkaloiden katalysiert. Das Enzym
      benötigt keine Metall-ionen für seine enzymatische Aktivität
      und weist eine relativ hohe Substratspezifität gegenüber
      einem Prenylrest an Position C-4 des Indolringes auf.
      Derivate von 4-DMAT mit Modifikationen am Indolring wurden
      ebenfalls von FgaMT als Substrate akzeptiert. Sogar
      4-Methyl-L-tryptophan wurde von FgaMT umgesetzt. Die KM-Werte
      wurden mit 0,12 mM für 4-DMAT und 2,4 mM für SAM bestimmt.
      Die Umsatzrate betrug 2,0 s-1. Durch eine Analyse über FPLC
      konnte gezeigt werden, dass FgaMT als Homodimer wirkt. Das
      putative Prenyltransferasegen NFIA_112230 konnte von dem von
      mir betreuten Bachelor-Studenten Andreas Schweitzer aus
      genomischer DNA von N. fischeri NRRL181 amplifiziert und mit
      dem Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. In Fortführung
      dieses Projektes wurde das Gen von mir in dem Stamm E. coli
      XL1 Blue MRF´ erfolgreich überexprimiert und das abgeleitete,
      rekombinante Enzym EAW20699-His6 isoliert. Das Protein konnte
      mit einer molekularen Masse von ca. 50 kDa fast bis zur
      Homogenität aufgereinigt werden. Um das natürliche Substrat
      von EAW20699 zu identifizieren, wurde eine Vielzahl von
      Enzymassays mit unterschiedlichen Substraten durchgeführt und
      über HPLC analysiert. Bisher konnte jedoch noch keine
      Prenylierungsaktivität nachgewiesen werden. Die beiden
      putativen Prenyltransferasegene AN9229-PT1 und AN9229-PT2 aus
      A. nidulans sowie das Gen ATEG_03092.1 aus A. terreus,
      ebenfalls für eine Prenyltransferase kodierend, wurden
      erfolgreich durch Fusions-PCR aus Fosmiden bzw. gDNA der
      entsprechenden Aspergillus-Stämme amplifiziert und in die
      beiden E. coli Expressionsvektoren pQE60 und pHis8, sowie im
      Falle von AN9229-PT2, auch in den Hefevektor pYES2/NT C
      kloniert und mit den entsprechenden Wirtsstämmen
      transformiert. Die erfolgreiche Klonierung konnte durch die
      Sequenzierung der Expressionskonstrukte bei allen drei
      Prenyltransferasegenen verifiziert werden. Die Überexpression
      der Gene war in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten
      optimierten Wirtsstamm E. coli M15 [pREP4] ebenfalls
      erfolgreich, wobei die überproduzierten Proteine jedoch
      anscheinend zu “inclusion bodies“ aggregierten, ausfielen und
      nicht mehr ohne Weiteres isoliert und gereinigt werden
      konnten. Im Falle der Überexpression von AN9229-PT2 konnte
      aber durch Kultivierung unter sehr milden Bedingungen
      (niedrige Kultivierungstemperatur und Dauer, Induktion durch
      geringe IPTG-Konzentration) bzw. durch Aufreinigung mit
      Laurylsarcosin, das Protein in geringer Menge isoliert
      werden. Die Enzymassays mit den so gewonnenen Proteinen, wie
      auch durchgeführte Assays mit dem Rohextrakt, zeigten bisher
      aber noch keine Prenyltransferaseaktivität. Auch Enzymassays
      mit Rohextrakten der beiden anderen Prenyltransferasen
      AN9229-PT1 und EAU36366 wiesen auf keine enzymatische
      Aktivität hin.
description: The main topics of the present
      dissertation are the biochemical characterisation of a
      SAM-dependent N-methyltransferase from A. fumigatus and
      different putative Prenyltransferases from various
      Aspergillus species. The putative gene fgaMT, consisting of
      two exons with a size of 272 bp and 748 bp and an intron
      sequence with a size of 72 bp, was identified in a
      biosynthetic gene cluster of fumigaclavines in A. fumigatus.
      Its deduced protein FgaMT comprises 339 amino acids with a
      molecular mass of 38.1 kDa. The coding region of the gene was
      successfully amplified from a cDNA library by PCR. After
      cloning of fgaMT into the expression vector pQE60 the created
      expression construct pOR15 was transformed into E. coli
      strain XL1 Blue MRF´. Overexpression of fgaMT was carried out
      by cultivation at 37 oC, 200 rpm and 1 mM IPTG induction.
      Soluble FgaMT-His6 was purified to near homogeneity and
      characterised biochemically. By performing enzyme assays we
      could prove that FgaMT catalyzes the methylation of
      4-dimethylallytryptophan (4-DMAT) in the presence of
      S-adenosylmethionine (SAM) at the NH2-group. The product of
      this reaction was identified as 4-dimethylallyl-L-abrine by
      NMR and mass spectrometry analysis. FgaMT only accepts 4-DMAT
      but not L-Trp as substrate, which proves that FgaMT is
      responsible for the second step in the biosynthesis of ergot
      alkaloids. This enzyme does not require metal ions for its
      enzymatic activity and shows relatively high substrate
      specificity towards tryptophan derivatives with a prenyl
      moiety at position C-4 of the indole ring. 4-DMAT derivatives
      with modifications at the indole ring were also accepted as
      substrates. Even 4-methyl-L-tryptophan was accepted by FgaMT.
      KM values were determined at 0.12 mM for 4-DMAT and 2.4 mM
      for SAM. The turnover number was 2.0 s-1. FPLC analysis
      showed that FgaMT acts as a homodimer. The putative
      prenyltransferase gene NFIA_112230 from Neosartorya fischeri
      NRRL 181 was successfully amplified by PCR and cloned into
      expression vector pQE60. This work was started by bachelor
      student Andreas Schweitzer under my supervision. The
      expression construct pAS6os was transformed with E. coli XL1
      Blue MRF´, the gene was successfully overexpressed and the
      derived, recombinant protein EAW20699-His6 was isolated. The
      protein with a molecular mass of about 50 kDa was purified to
      near homogeneity. To identify its natural substrate a series
      of enzyme assays with various different substances were
      carried out and analyzed by HPLC. Until now no prenylation
      activity could be detected for the recombinant enzyme. Two
      putative prenyltransferase genes from A. nidulans FGSC A4,
      named AN9229-PT1 and AN9229-PT2, and the putative
      prenyltransferase gene ATEG_03092.1 from A. terreus DSM1958
      were successfully amplified by Fusion-PCR from Fosmids or
      gDNA of the appropriate Aspergillus strains, respectively.
      The amplified genes were cloned into the expression vectors
      pQE60 and pHis8, and in case of AN9229-PT2, also into
      pYES2NT/C. The gene sequences were verified by sequencing of
      the expression constructs. Expression of the genes was
      successful in the optimized overexpression E. coli strain M15
      [pREP4], but the overproduced proteins aggregated to so
      called inclusion bodies and could not be used for further
      experiments. In case of AN9229-PT2, it was possible to
      isolate little amounts of soluble protein by cultivation
      under mild conditions (low temperature, short cultivation
      duration and low IPTG concentration) and purification with
      N-laurylsarcosin, alternatively. Enzyme assays carried out
      with purified protein as well as with crude extracts in the
      presence of different possible substrates showed no enzymatic
      activity until now. Similarily, enzyme assays carried out
      with crude extracts of AN9229-PT1 and EAU36366 showed the
      same result.