title: „Glioblastoma in a dish“ – The Establishment of a secondary glioblastoma mouse model.
title: „Glioblastoma in a dish“ – Die Etablierung eines Mausmodells für das sekundäre Glioblastom
Creators: name: Radke, Josefine
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Akt
Myc
p53
Glioblastom
Astrozytom
Medizin, Gesundheit
Stereotaxie
stereotaxis
Protein p53
astrocytoma
glioblastoma

description: The Glioblastoma multiforme is not
      only the most common but also the most aggressive brain
      tumor. The treatment of this desease involves chemotherapy,
      radiation, radiosurgery, corticosteroids, antiangiogenic
      therapy, and surgery. Nevertheless the patients´ prognosis is
      very poor. Although there are some new therapeutic approaches
      median survival is only about 14 month. Scientifically there
      are two different entities – the primary and secondary
      glioblastoma multiforme, which cannot be distinguished
      histologically. The tumor shows a rapid diffuse infiltrative
      growth, polymorphic nuclei, necrosis and angiogenesis. The
      primary glioblastoma develops de novo. Common mutations seen
      in primary glioblastomas are loss of heterozygosity of 10q,
      EGFR-ampilfication and deletion of p16INK4a. There is no
      evidence of a low-grade neoplasia in diagnostic imaging or
      histology. In contrast to that the secondary glioblastoma
      progresses from low-grade or anaplastic astrocytomas into a
      high-grade lesion. The mutation of the tumor suppressor p53
      is often seen in those low-grade lesions. As already
      mentioned the glioblastoma multiforme is a very aggressive
      type of cancer which affects middle-aged people. In order to
      understand the cancers origin, its metastasis, infiltration
      and migration good tumor models are needed. Furthermore
      understanding the tumor biology is also necessary to develop
      new therapeutic strategies. There have been various
      approaches in the past to develop a mouse model for the
      glioblastoma mutiforme. Unfortunately they all were not able
      to show infiltrative growth in the brain, which is a strong
      characteristic of that lesion. Besides that there is a deep
      disagreement in the scientific community whether the
      glioblastoma multiforme originates from differentiated
      astrocytes or neural progenitors. Holland EC et al. were able
      to create a promising glioblastoma model through gene
      transfer resulting in an overexpression of K-Ras and Akt in
      neural progenitors. Furthermore Lassman et al. published a
      similar tumor model with differentiated astrocytes that
      showed an undifferentiated phenotype through overexpression
      of c-Myc. Following these tumor models this work wanted to
      create a glioblastoma model from differentiated astrocytes
      without the overexpression of K-Ras since the mutation of
      K-Ras is not a common mutation seen in glioblastoma
      multiforme. P53 knockout astrocytes from newborn p53 knockout
      mice were cultured. The cultured astrocytes were infected
      with a supernatant from cultured Phoenix cells. After
      transfection with certain plasmids this cell line is capable
      of producing a retrovirus that is able to infect murine
      cells. As a result this work was able to create 3 different
      cell lines: Astrocytes that over expressed Akt, c-Myc or Akt
      and c-Myc. Through the overexpression of Akt cells were
      immortalized. In contrast to that c-Myc seemed to be
      responsible for a rapid growth and an undifferentiated
      phenotype of the cultures astrocytes. The cultures astrocytes
      were stained against Ki67, GFAP and against neural progenitor
      marker like Olig2, Nestin, Musashi-1, CD133 showing a loss of
      GFAP and a positive immunostaining for the progenitor marker
      in late cell passages. Using RNA Protection Assay this work
      was able to proof that our cultures astrocytes did not
      overexpress neuronal markers like for example neurofilament,
      synptophysin or calbindin. Furthermore stereotactic injection
      was used to place p53 knockout astrocytes that overexpressed
      Akt and c-Myc in the striatum of Bl6- and RAG2-/- mice. After
      21 days animals were sacrificed, cryosections of the brains
      were made and the resulting tumor was stained with
      hematoxylin and eosin. To finish tumor sections were stained
      against CD4, CD8 and Mac-1 showing no infiltration of the
      immune system in the animals´ brains.
description: Bei dem Glioblastoma multiforme
      handelt es sich um den häufigsten primären Hirntumor. Es
      handelt sich um einen sehr malignen Tumor, der Menschen in
      mittlerem Alter betrifft und sich durch eine infauste
      Prognose auszeichnet. Trotz einer Kombination aus Operation,
      Radiatio und verschiedenen Ansätzen der Chemotherapie,
      versterben die meisten Pateinten bereits im ersten Jahr nach
      Diagnosestellung. Es wird zwischen primären und sekundären
      Glioblastomen unterschieden. Das primäre Glioblastom
      entwickelt sich völlig neu (de novo). Es gibt weder
      radiologische, noch histologische Hinweise auf einen
      vorausgegangenen weniger malignen Tumor. Häufige Mutationen
      sind EGFR-Amplifikation, Deletion des p16INK4a und LOH (loss
      of heterozygosity) von 10q. Im Gegensatz dazu, entwickelt
      sich das sekundäre Gliobastom durch Progression eines
      niedriggradigen oder anaplastischen Astrozytoms. Bereits in
      den niedrigmalignen Vorläuferläsionen kommt es häufig zu
      einem Verlust des Tumorsuppressors p53. Das mittlere
      Erkrankungsalter liegt bei 45 Jahren. Das Glioblastom ist
      bevorzugt in den Großhirnhemisphären, insbesondere
      frontotemporal, lokalisiert. Makroskopisch zeichnen sich
      diese Tumoren durch eine bunte Schnittfläche aus.
      Charakteristisch sind gelbliche Nekrosen, Blutungen,
      grau-weiß aussehendes Tumorgewebe und diffuses
      infiltrierendes Wachstum. Rein histologisch können beide
      Tumorentitäten nicht voneinander unterschieden werden. Um den
      Ursprung des Tumors und dessen Tumorbiologie sowie
      Infiltration und Migration besser verstehen zu können und um
      neue therapeutische Strategien zu entwickeln, werden gute
      Mausmodelle benötigt. In der Vergangenheit gab es einige gute
      Ansätze zur Entwicklung eines solchen Modells. Leider gelang
      es keinem Modell das infitrative Wachstum im Gehirn
      nachzuempfinden, welches für die Läsion so charakterisch ist.
      Desweiteren gibt es Unstimmigkeiten in der wissenschaftlichen
      Gemeinschaft bezüglich der Ursprungszellen des Glioblastoms.
      Es konnte bisher nicht herausgefunden werden, ob es sich bei
      diesen Zellen um differenzierte Astroyzten oder aber neurale
      Progenitoren handelt. Holland et al. entwickelten ein
      vielversprechendes Glioblastom-Modell durch Gentransfer und
      eine daraus resultierende Überexpression von K-Ras uns Akt in
      neuralen Progenitoren. Des Weiteren publizierten Lassman et
      al. ein Modell mit differenzierten Astroyzten, die durch eine
      Überexpression von c-Myc einen undifferenzierten Phänotyp
      zeigten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung
      eines Glioblastom-Modells mit differenzierten Astrozyten
      jedoch ohne eine Überexpression von K-Ras, da dieses eine für
      das Glioblastoma multiforme eher untypische Mutation
      darstellt. Diese Arbeit konzentrierte sich somit auf die
      Verwendung von p53-knockout Astrozyten. Diese wurden aus
      neugebornenen p53-knockout Mäusen gewonnen und kultiviert.
      Die kultivierten Astrozyten wurden mit einem Überstand von
      kultivierten und vorher transfizierten Phoenix-Zellen
      infiziert. Bei den Phoenix-Zellen handelt es sich um eine
      Zelllinie, die nach einer Transfektion mit bestimmten
      Plasmiden fähig ist, einen Retrovirus zu produzieren, der
      widerum für die Infektion anderer muriner Zellen zur
      Verfügung steht. Somit konnten in dieser Arbeit 3
      verschiedene Zelllinien generiert werden: p53-knockout
      Astrozyten, die Akt, Myc oder Akt und Myc überexprimierten.
      Durch die Überexpression von Akt konnten die Zellen
      immortalisiert werden. Myc-überexprimierende Astrozyten
      zeigten ein rapides Zellwachstum und einen undifferenzierten
      Phänotyp. Verschiedene Passagen der Kulturen wurden
      immunhistochemisch gegen Ki67, GFAP und neurale Marker für
      Progenitoren wie Olig2, Nestin, Musashi-1 und CD133 gefärbt.
      Es kam zu einem Verlust des GFAP und einer positiven
      Immunhistochemie für die neuralen Marker der Progenitoren in
      späten Passagen. Mit Hilfe eines RNA Protection Assay (RPA)
      konnte auf RNA-Ebene bewiesen werden, dass es sich bei den
      Kulturen um reine Astrozytenkulturen handelt, die auch im
      Verlauf späterer Passagen keine neuronalen Marker, wie
      Synaptophysin, Calbindin oder Neurofilament exprimierten. Im
      Verlauf der Arbeit injizierten wir stereotaktisch Myc und Akt
      überxprimierende p53 knockout-Astrozyten (p53MA) in das
      rechte Striatum von Bl6- und RAG2-/- Mäusen. Nach 21 Tagen
      wurden die Hirne der Tiere entnommen und Kryostatschnitte
      angefertigt. Durch eine HE-Färbung konnte das Tumorwachstum
      nachgewiesen werden. Zusätzlich wurden die Schnitte
      immunhistochemisch gegen CD4, CD8 und Mac-1 gefärbt. Es
      konnte keine Infiltration von Zellen des Immunsystems
      nachgewiesen werden.