Λυτικές τρανσγλυκοσυλάσες στον μικροοργανισμό Thermus thermophilus HB8.Εντοπισμός και ρόλος τους στους κόκκους πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHAs).:
Creators: name: Σίμου, Ολγα Μάριου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Thermus thermophilus HB8
Λυτικές τρανσγλυκοσυλάσες
κόκκοι πολυυδροξυαλκανοϊκών οξέων
Lytic transglycosylases (LTs)
PHAs granules

description: Ο μικροοργανισμός Thermus thermophilus HB8, ένα Gram (-) βακτήριο, συσσωρεύει πολυυδροξυαλκανοïκά οξέα-πολυεστέρες των υδροξυαλκανοïκών οξέων-υπό μορφή αδιάλυτων κόκκων μέσα στο κύτταρο ως ενδοκυττάριες αποθηκεύσιμες πηγές άνθρακα και ενέργειας όταν τα θρεπτικά συστατικά ελαττώνονται. Η παρούσα εργασία, είχε ως αντικείμενο μελέτης την ανίχνευση (και καθαρισμό) ενδοκυττάριας λυσοζύμης με μοριακή μάζα 14 kDa καθώς και ενδοκυττάριων εξειδικευμένων λυτικών τρασγλυκοσυλασών οι οποίες είναι μουραμιδάσες ικανές να αποικοδομήσουν τοπικά το στρώμα πεπτιδογλυκάνης (PG) των Gram (-) βακτηρίων, υδρολύοντας τους β-1,4-γλυκοσιδικούς δεσμούς μεταξύ του Ν-ακετυλομουραμικού οξέος και της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης. Τα ένζυμα αυτά ανιχνεύθηκαν στις μεμβράνες των κυττάρων και στην επιφάνεια των κόκκων PHAs ως ένζυμα συνδεδεμένα με αυτούς (GAPs: granules associated proteins), όπου μέχρι στιγμής η ύπαρξή τους ήταν άγνωστη. Οι PHAs τρανσγλυκοσυλάσες έχουν μοριακή μάζα 130 kDa, 90 kDa, 75 kDa, 35 kDa. Οι μεμβρανικές τρανσγλυκοσυλάσες έχουν μοριακή μάζα 90 kDa, 70 kDa, 10 kDa. Παράλληλα, ανιχνεύθηκαν δύο εξωκυττάριες τρανσγλυκοσυλάσες με μοριακή μάζα 17 kDa και 10 kDa. Η δράση της λυτικής τρανσγλυκοσυλάσης, ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το συνθετικό υπόστρωμα 4-Νιτροφαινυλ-β-D-Ν-ακετυλγλυκοσαμινίδιο καθώς και ζυμόγραμμα χρησιμοποιώντας τον μικροοργανισμό Micrococcus lysodeikticus. Παλαιότερες αναφορές έχουν προτείνει ότι οι κόκκοι σχηματίζονται είτε από την εσωτερική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης ως προεκβολές (θυλάκια) της, είτε από μια αρχική δομή μικκυλίου στον κυτταροπλασματικό χώρο. Προτείνουμε λοιπόν ότι η κοινή τρανσγλυκοσυλάση, με μοριακή μάζα 90 kDa, που εντοπίζεται στου κόκκους PHAs και στις μεμβράνες, είναι το ένζυμο εκείνο που εμπλέκεται στο σχηματισμό και στην απελευθέρωση των κόκκων. Η εύρεση ενζύμων αυτής της κατηγορίας στους κόκκους αποσαφηνίζει την βιολογία του σχηματισμού, της ανάπτυξης και του εντοπισμού των κόκκων στα κύτταρα.
description: Thermus thermophilus HB8, a Gram negative bacterium, accumulates polyhydroxyalkanoates (PHA)-polyesters of hydroxyalkanoates- as insoluble granules inside the cell as intracellular carbon and energy source/storage compounds when nutrients are limited. In this paper, we report the determination and purification of an intracellular lysozyme with molecular mass 14 kDa, and specialized lytic transglycosylases which are muramidases capable of locally degrading the peptidoglycan (PG) layer of Gram negative bacteria, cleaving the β-1,4-glycosidic linkages between the N-acetylmuramoyl (MurNAc) and N-acetylglucosamilyl (GlcNAc) residues of PG. These enzymes were determined to be localized in the cell membranes, and on the surface of PHA granules as granules associated proteins (GAPs), which until nowadays were unclear. The PHAs transglycosylases have molecular mass of 130 kDa, 90 kDa, 75 kDa, 35 kDa. The membrane transglycosylases have molecular mass 90 kDa, 70 kDa, 10 kDa. Also two extracellular LTs were determined which have molecular mass 17 kDa and 10 kDa. The LT activity was determined using the synthetic substrate N-acetyl-β-D-glucosaminide and zymogram analysis using Micrococcus lysodeikticus. Previous studies have suggested that PHA granules are formed either in the inner membrane on a central scaffold or in the cytoplasm. We suggested that the common lytic transglycosylase on the surface of PHA granules and in the cell membranes -90 kDa- it is the enzyme that involves in the formation and release of PHA granules. Consequently, these results might support both models of PHAs formation, by micelle model or by budding model since the involvement of lytic transglycosylases might be necessary for formation and localization of PHA granules in the cytoplasm. The presence of this class of enzymes onto the PHAs granules make clear the understanding of the cell biology of PHAs granule formation, their growth and their localization into the cell.