Διερεύνηση της παρουσίας δυνητικά τοξικών κυανοβακτηρίων και της βιοτοξίνης "μυκροκυστίνη LR" σε θαλάσσια ύδατα και σε μύδια εντατικών καλλιεργειών του Θερμαϊκού κόλπου
Creators: name: Καλαϊτζίδου, Μαρία Π.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Κυανοβακτήρια
Μικροκυστίνες
Θερμαϊκός κόλπος
Μύδια
Cyanobacteria
Microcystins
Thermaikos gulf
Mussels

description: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της παρουσίας τοξικών κυανοβακτηρίων στα θαλάσσια ύδατα του καλλιεργητικού πάρκου του Θερμαϊκού κόλπου και σε παρακείμενα υφάλμυρα ύδατα, η διερεύνηση της παρουσίας τοξικών κυανοβακτηρίων σε μύδια από μυδοκαλλιέργειες του καλλιεργητικού πάρκου του Θερμαϊκού κόλπου, η ανίχνευση των συχνότερων μικροκυστινών -LR, -RR και -YR από μύδια μυδοκαλλιεργειών, η διενέργεια πειραματικής μόλυνσης μυδιών με καθορισμένους πληθυσμούς θαλάσσιου στελέχους του Θερμαϊκού κόλπου και η ανίχνευση σε αυτά μικροκυστινών. Η απομόνωση των κυανοβακτηρίων επιτεύχθηκε με τη χρήση του υποστρώματος Marine agar, στο οποίο προστέθηκαν τα αντιβιοτικά ιμιπενέμη και καναμυκίνη και το αντιμηκυτιακό νυστατίνη στην τελική συγκέντρωση των 50 mg/L. Για την ανίχνευση των μικροκυστινών στο νερό και στα μύδια χρησιμοποιήθηκε ως εκχυλιστικό μέσο υδατικό διάλυμα μεθανόλης 75%, έγινε καθαρισμός (clean up) των δειγμάτων των μυδιών με εκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Extraction, SPE) και ο πρώτος ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των μικροκυστινών των δειγμάτων νερού και μυδιών (screening) γινόταν με ενζυμικό ανοσοπροσροφητικό προσδιορισμό με κατάλληλο kit ELISA για μικροκυστίνες [(ADDA)-DM (direct monoclonal)]). Στα δείγματα των μυδιών στα οποία η συγκέντρωση ήταν άνω του 1 ppb, έγινε επιβεβαίωση με την αναλυτική τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υπερυψηλής απόδοσης συζευγμένης με φασματομετρία μάζας υψηλής διαχωριστικής ικανότητας (LC-Orbitrap). Για την πειραματική μόλυνση μυδιών του είδους Mytilus galloprovincialis χρησιμοποιήθηκε το δυνητικά τοξικό θαλάσσιο στέλεχος του νανοπλαγκτονικού κυανοβακτηρίου Synechocystis sp., που απομονώθηκε από τα θαλάσσια ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου, σε πληθυσμούς 104 και 105 κύτταρα/mL τεχνητού θαλασσινού νερού. Μετά την μόλυνση λαμβάνονταν δείγματα μυδιών στις 24, 48 και 72 ώρες και ακολουθούσε η ανίχνευση μικροκυστινών. Από τα θαλάσσια και υφάλμυρα ύδατα του Θερμαϊκού κόλπου απομονώθηκαν τα δυνητικά τοξικά στελέχη Synechocystis sp., Synechococcus sp., Anabaena sp and Anabaena flos-aque. Η δε ανίχνευσή τους παρουσίασε χωρική και χρονική κατανομή, κυρίως την άνοιξη και το φθινόπωρο. Στα μύδια Mytilus galloprovincialis ανιχνεύτηκαν οι μικροκυστίνες -RR και -LR και παρατηρήθηκε βιοσυσσώρευση αυτών στο ηπατοπάγκρεας.. Κατά την πειραματική μόλυνση παρατηρήθηκε παραγωγή των μικροκυστινών -RR και σε ίχνη -LR από πληθυσμό 105 κύτταρα/mL τεχνητού θαλασσινού νερού και βιοσυσσώρευση αυτών στα μύδια του είδους Mytilus galloprovincialis μετά από 72 ώρες έκθεσης. Κατά τη σύγκριση των μεθόδων ELISA και LC-Orbitrap, διαπιστώθηκε υπερεκτίμηση των συγκεντρώσεων των μικροκυστινών, κατά την ανάλυση με τη μέθοδο ELISA
description: The objectives of the thesis were the detection of potentially toxic species of cyanobacteria in marine waters, brackish waters and farmed mussels of Thermaikos gulf, the detection of microcystins -RR, -LR and -YR, the experimental contamination of farmed mussels, with a potential toxic specie, isolated from Thermaikos gulf and the detection of microcystins production related to the abundance. The isolation of cyanobacteria was obtained in Marine agar medium, supplemented with the broad spectrum antibiotics, imipenem and kanamycin and an antifungal, nystatin, at the final concentration of 50 mg/L. The water samples and the mussels were extracted with aquatic methanol solution 75%, for microcystin detection. The clean- up of the mussels’ samples was obtained by Solid Phase Extraction (SPE), and the screening was performed by using a commercial ELISA kit [(ADDA)-DM (direct monoclonal)]. Mussel samples with concentration above 1ppb, were confirmed by Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled with a high- resolution mass spectrometer (HRMS) (Orbitrap analyzer). The experimental contamination of the farmed mussels Mytilus galloprovincialis, was performed by feeding them with two different populations (104 cells/mL and 105 cells/mL) of the nanoplanktonic potential toxic cyanobacterium, Synechocystis sp.. Samples were taken in 24, 48 and 72 hours after contamination for the detection of microcystins. During the epidemiological survey the potentially toxic species Synechocystis sp., Synechococcus sp., Anabaena sp and Anabaena flos-aque were isolated from marine, and brackish waters. Spatial and temporal distribution during Spring and Autumn was observed. Microcystin -RR and microcystin -LR were detected in mussels and bioaccumulation in digestive gland was observed. Regarding the experimental contamination, it was found that microcystins were produced after 72 hours of exposure at the abundance of 105 cells/mL of the cyanobacterium Synechocystis sp.. Microcystin -RR and traces of microcystin -LR were detected. An overestimation was observed during the analysis by ELISA, in relation with LC-Orbitrap HRMS.