title: Optimised micropatterning workflows for positioning of migratory cell lines on EM substrates
Creators: name: Schuster, Maximilian
Publisher: name: :none
Year: 2023

description: Kryo-Elektronentomographie (ET) ermöglicht die Visualisierung von 3D-Strukturen von Objekten im nativen, hydrierten Zustand. Zur Durchführung von kryo-ET an Säugetierzellen werden diese auf Elektronenmikroskopie (EM)-Gittern angezüchtet, überzogen mit einer Kohlenstoffschicht. Allerdings neigen die Zellen dazu, sich zufällig zu verteilen und sich in der Nähe oder auf dem Gitternetzwerk anzuhaften, da durch dieses eine höhere Stabilität des Substrats gegeben ist. Für die ET-Aufnahme ist es jedoch unerlässlich, dass sich die Zellen im Zentrum eines einzelnen Gitterquadrats in unmittelbarer Nähe zum Zentrum des Gitters befinden. Maskenloses Photodrucken ist eine Technik zur Kontrolle der Zellausrichtung durch Mikromuster von extrazellulären Matrixproteinen auf empfindlichen EM-Gittern. In dieser Studie wurde ein Protokoll zur effizienten Mikromusterung mit dem PRIMO-Gerät entwickelt, wobei darauf geachtet wurde, die benötigte Vorbereitungszeit, teure Reagenzien und das Bewegen der Gitter mit Pinzetten zu minimieren. Verschiedene Säugetierzelltypen wurden getestet und der Erfolgsgrad der mikromusterten Gitter wurde bewertet. Die Ergebnisse zeigten eine 3-5-fache Steigerung der korrekt positionierten Zellen für nachfolgende kryo-ET-Arbeitsabläufe. Die Technik zum Säen der Zellen wurden an die spezifischen Anforderungen der verschiedenen Zelltypen angepasst. Die Verwendung von 3D-gedruckten EM-Gitterhaltern für den Musterdruckprozess wurde ebenfalls bewertet, erwies sich jedoch in deren aktueller Qualität als ungeeignet. Das Verhalten verschiedener Zelltypen auf verschiedenen Musterformen wurde bewertet, was das Potenzial mikrogemusterter Gitter zur Kontrolle der morphologischen Eigenschaften von Säugetierzellen verdeutlichte. Insgesamt präsentiert diese Arbeit ein optimiertes Mikromusterungsprotokoll mit signifikanten Verbesserungen bei der Zellpositionierung für kryo-ET-Studien.
description: Cryo-electron tomography (ET) enables the visualization of 3D structures of objects in their native hydrated state. To perform cryo-ET on mammalian cells, they are seeded on carbon-coated electron microscopy (EM) grids. However, the cells tend to spread randomly and adhere near or on the mesh of the grid, as higher stability of the substrate is given. For ET acquisition, it is essential that the cells are located in the centre of an individual grid square, in close proximity to the centre of the grid. Maskless photopatterning is a technique used to control cell orientation by micropatterning extracellular matrix proteins on delicate EM grids. This study aimed to develop a protocol for efficient micropatterning with the PRIMO device, minimizing the required preparation time, expensive reagents, and grid handling. Various mammalian cell types were tested, and the success rate of micropatterned grids was evaluated. The results showed a 3-5x increase in properly positioned cells for subsequent cryo-ET workflows. Seeding procedures were adapted to meet the specific requirements of different cell types. The use of 3D printed EM grid holders for the patterning workflow was also assessed but found unsuitable in their current quality. The behaviour of different cell types on various pattern shapes was evaluated, demonstrating the potential of micropatterned grids to control mammalian cell morphology. Overall, this work presents a streamlined micropatterning protocol with significant improvements in cell positioning for cryo-ET studies.