Modeling of cancer immune phenotype by new epigenetic drugs: a strategy to improve efficacy of immunotherapy
Creators: name: CANNITO, SARA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Siena
Year: 2020

description: Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) � un tumore molto aggressivo e rapidamente progressivo che si sviluppa a livello del mesotelio che compone la pleura; questa neoplasia pu� assumere diversi sottotipi istologici (epitelioide, bifasico e sarcomatoide), i quali sono strettamente correlati alla prognosi. Le modificazioni epigenetiche che avvengono nelle fasi di iniziazione e progressione del MPM possono svolgere un ruolo fondamentale nel regolare negativamente il crosstalk tra tumore e sistema immunitario, contribuendo a mantenere un microambiente tumorale immunosoppressivo. Conoscere pi� dettagliatamente il panorama epigenetico del MPM pu� contribuire a definire il razionale per nuove terapie antitumorali e porre le basi per studi di combinazione che prevedano l?utilizzo di farmaci epigenetici con farmaci immunoterapeutici.
Con il presente studio abbiamo voluto valutare, in un primo momento, le modificazioni nel profilo di espressione genica di 10 linee di MPM, di diverso istotipo, trattate con la guadecitabina, un agente demetilante il DNA di seconda generazione, tramite la piattaforma nCounter di Nanostring. I risultati ottenuti tramite Ingenuity Pathway Analysis (IPA) hanno mostrato che la guadecitabina era in grado di indurre l?attivazione dei geni coinvolti nel crosstalk tra cellule dendritiche e natural killer nel 50% delle linee cellulari di MPM indagate, accompagnata dall?attivazione di altre componenti coinvolte nella risposta immunitaria a infezioni e infiammazioni. I fattori trascrizionali ?upstream? pi� frequentemente attivati appartenevano al pathway di segnalazione dell?interferon (IFN)-?. Inoltre, � stata riscontrata l?up-regolazione (fold change medio (mFC) ? 1.5) di molecole immuno-relate, come NY-ESO-1 (mFC=13.16), MAGE-B2 (mFC=13.09), CD70 (mFC=5.27) e CTLA-4 (mFC=4.81).
Abbiamo inoltre effettuato analisi istotipo-specifiche per esplorare le modificazioni molecolari indotte dalla guadecitabina nei 3 sottotipi di MPM. La guadecitabina ha indotto l?up-regolazione dell?espressione di marcatori del fenotipo epiteliale (es. CDH1, EPCAM e PECAM1), osservata ad alti livelli nelle linee cellulari sarcomatoidi; ci� � stato associato alla down-regolazione di molecole di origine mesenchimale (es. CDH2 e NCAM) e induttori della cascata metastatica (es. CDH11).
Successivamente abbiamo comparato gli effetti immunomodulatori della guadecitabina con quelli di altri farmaci epigenetici (gli inibitori delle iston acetiltransferasi (HDAC) VPA e SAHA o l?inibitore di EZH2 EPZ-6438) da soli o in combinazione con la guadecitabina in 5 linee cellulari di MPM (2 sarcomatoidi, 1 bifasica e 2 epitelioidi). Analisi citofluorimetriche e molecolari hanno rivelato che la guadecitabina up-regolava l?espressione delle molecole immuno-relate, quali HLA di classe I (mFC=1.59), ICAM-1 (mFC=3.27), PD-L1 (mFC=2.13), e NKG2DL (MICA mFC=1.88, MICB mFC=2.42, ULBP2 mFC=3.16), inducendo/up-regolando l?espressione dei Cancer Testit Antigens (CTA) NY-ESO-1, MAGE-A1 e MAGE-A3; il VPA up-regolava l?espressione degli antigeni di HLA di classe I (mFC=1.50), PD-L1 (mFC=2.76), NKG2DL (MICA mFC=1.69, MICB mFC=2.67, ULBP2 mFC=3.26) e quella dei CTA MAGE-A1 e MAGE-A3, rispettivamente in 2/5 e 3/5 linee cellulari di MPM; il SAHA up-regolava l?espressione di MICA (mFC=1.57), MICB (mFC=4.05) e MAGE-A1 e MAGE-A3, rispettivamente in 2/5 e 4/5 linee cellulari; per contro, l?EPZ-6438 ha mostrato minime capacit� immunomodulanti, inducendo solamente NY-ESO-1 e up-regolando l?espressione di PD-L1, MICB e ULBP2 in 1 linea cellulare ciascuno. Contrariamente ai risultati eterogenei ottenuti dai singoli farmaci, l?associazione di VPA, SAHA o EPZ-6438 alla guadecitabine ha rafforzato le capacit� immunomodulanti di quest?ultima, influenzando l?espressione di tutte le molecole indagate. Specificatamente, le combinazioni di guadecitabine con VPA, SAHA o EPZ-6438 up-regolavano l?espressione degli antigeni HLA di classe I (mFC=2.21, 2.03, o 2.29 rispettivamente), di ICAM-1 (mFC=4.09, 4.63, o 5.33), di PD-L1 (mFC=6.95, 2.42, o 2.50), di MIC-A (mFC=3.48, 2.00, o 2.23), di MIC-B (mFC=6.80, 2.48, o 2.81) e di ULBP2 (mFC=13.45, 3.40, o 4.11). Infine, livelli di up- regolazione/induzione maggiori sono stati osservati per i CTA a seguito di tutti e 3 i trattamenti combinati rispetto alla guadecitabina in singolo. La modulazione delle caderine � stata influenzata dal sottotipo istologico di MPM: l?espressione di CDH1 � stata indotta dalla guadecitabina in singolo e dalla sua combinazione con VPA, SAHA e EPZ-6438 nelle 2 linee cellulari sarcomatoidi, costitutivamente negative per l?espressione del gene; l?espressione di CDH2 � stata up-regolata dal VPA e dal SAHA singoli in 1/5 linee cellulari e dalle combinazioni di guadecitabina con VPA o SAHA, rispettivamente in 3/5 o 1/5 linee cellulari di MPM; ciononostante, non � stata osservata alcuna up-regolazione del gene nelle 2 linee cellulari epiteliodi, costitutivamente negative per l?espressione di CDH2.
In conclusione, dalle analisi approfondite del pannello di espressione genica abbiamo confermato che la guadecitabina � in grado di up-regolare/indurre l?espressione di molecole immunitarie e immuno- relate cruciali per il crosstalk tra il tumore e il sistema immunitario; inoltre, abbiamo dimostrato che essa induce l?attivazione di geni correlati all?IFN, soprattutto nel fenotipo sarcomatoide, supportando l?ipotesi che i demetilanti possano aumentare la risposta immunitaria contro il MPM, potenzialmente anche del tipo istologico pi� aggressivo; la modulazione delle molecole di adesione tendente verso il fenotipo epitelioide suggerisce la possibilit� di revertire la transizione epitelio-mesenchima, cruciale nel processo di metastatizzazione. Infine, combinando la guadecitabina con farmaci inibitori delle HDAC/EZH2 ha rafforzato la sua attivit� immunomodulante, fornendo il razionale per studi di associazione di farmaci epigenetici e agenti immunoterapici in modo da aumentare l?efficacia di questi ultimi nel trattamento del mesotelioma.