title: Development of biomaterial-based technologies for the biomedical application of essential oils: Wound healing and bone regeneration
title: Entwicklung von Biomaterial-basierenden Technologien für die biomedizinische Anwendung von ätherischen Ölen: Wundheilung und Knochenregeneration
Creators: name: Unalan, Irem
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 62 Ingenieurwissenschaften :: 629 Andere Fachrichtungen der Ingenieurwissenschaften

description: Microbial infection and oxidative stress are major issues, particularly during wound healing and bone regeneration. Microorganisms can quickly cause infections at damaged skin or deformed bones and impede recovery. Meanwhile, immune cells need oxidation-reduction reactions to produce energy and survive during the inflammatory phase of the healing process. However, a lack of controlling oxidation may lead to oxidative stresses caused by the excessive amount of reactive oxygen species (ROS) formation, which retards bone regeneration and wound healing. Therefore, preventing bacterial infection and oxidative stress is crucial during wound healing and bone regeneration. In order to counteract the abovementioned problems, essential oils (EOs) combination with engineered biomaterials could provide a potential solution to enhance antibacterial, antioxidant and anti-inflammatory, and biological activity. At the same time, combination of EOs with engineered biomaterials may overcome the volatility, instability, and sensitivity issues of EOs. In the present study, EOs-incorporated engineered biomaterials were developed in various structural and morphological forms, including electrospun nanofibers, hybrid scaffolds, three-dimensional (3D)-printed hydrogels, and bioactive glass (BG)-based scaffolds. In the first part of this investigation, polycaprolactone (PCL)- gelatin (GEL) electrospun nanofibers containing three different peppermint (PEP) or clove (CLV) concentrations were developed based on the green-electrospinning principle for wound healing applications. Uniform, bead-free, and homogenous electrospun nanofibers were achieved, which were characterized by scanning electron microscopy (SEM). The presence of PEP or CLV into PCL-GEL electrospun nanofibers was confirmed using attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and Ultraviolet-Visible (UV-Vis) spectroscopy by analysis of functional groups, the actual amount, and total phenolic content of EOs, respectively. Interestingly, PEP or CLV incorporated PCL-GEL electrospun nanofibers showed different releasing patterns. CLV incorporated PCL-GEL electrospun nanofibers showed a long-term sustained release profile, whereas PEP ones indicated continued release for up to 3 days and then reached a plateau. The antioxidant activity was analyzed using 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) free radical test, and both PEP and CLV improved the antioxidant property of PCL-GEL electrospun nanofiber. Additionally, the antibacterial activity of the electrospun nanofibers was tested with Staphylococcus aureus (gram-positive) and Escherichia coli (gram-negative) bacteria and revealed promising results concerning PCL-GEL electrospun nanofibers containing PEP or CLV. Furthermore, in vitro biological activity assays based on cell proliferation, and cell morphology assays performed on human keratinocyte (HaCaT) and normal human dermal fibroblast (NHDF) cells demonstrated that PEP or CLV incorporation into the PCL-GEL electrospun nanofibers has no cytotoxic effect and promoted both cell lines adhesion and proliferation. Moreover, the in vitro anti-inflammatory activity was investigated using Raw 264.7 macrophage-like cells by the Nitrite/Nitrate colorimetric kit. The results confirmed that incorporation of PEP or CLV improved anti-inflammatory activity. In the second part of this study, phytotherapeutic hybrid scaffolds composed of 3D-printed PCL struts and PEP or CLV incorporated PCL-GEL electrospun nanofibers layers were fabricated via a combination of 3D printing and electrospinning methods to develop alternative wound dressings. Herein, the alkaline surface modification was applied to improve the adhesion of electrospun nanofibers. The pull-off assay results indicated that the delamination issue between the layers was eliminated by surface modification. Additionally, the electrospun nanofiber layer containing PEP or CLV enhanced the hybrid scaffolds' antibacterial, antioxidant and anti-inflammatory activity. Furthermore, biocompatibility, in vitro cell proliferation, and cell-morphology assays performed using NHDF cells showed that phytotherapeutic hybrid scaffolds had good biocompatibility, cell adhesion, and proliferation, demonstrating a potential candidate biomaterial for wound healing applications. In the third part of this study, an extrusion-based 3D printing method was used to fabricate CLV-incorporated sodium alginate (ALG)-xanthan gum (XAN) 3D-printed hydrogel for wound healing applications. The challenge of ALG's printability and shape fidelity was overcome by blending XAN, which was confirmed by rheological analysis, filament fusion, and filament collapse assays. Releasing results showed that CLV exhibited sustainable release up to 28 days. Additionally, incorporation of CLV increased the DPPH free radical scavenging while reducing the S. aureus and E. coli relative bacterial viability; thereby, the CLV incorporation enhanced the ALG-XAN 3D-printed hydrogels antioxidant and antibacterial activity. Furthermore, in vitro cytotoxicity results showed that the incorporation of CLV has no toxic effect on NHDF cells, whereas the proliferation of NHDF cells exhibited a dose-dependent manner in relation to CLV content. In the final part of this study, 45S5 bioactive glass (BG)-based scaffolds were fabricated via foam replica technique using polyurethane foams as sacrificial template. Then, the produced scaffolds were coated with soy protein (SP) or cinnamon (CO)-incorporated SP solution for bone regeneration applications. Results indicated that the coating enhanced the compression strength and reduced the jagged stress-strain curve of the scaffolds under compressive loads. Additionally, incorporating CO improved the scaffold's antioxidant activity, indicating that the scaffold can reduce oxidative stress development in bone regeneration. Furthermore, antibacterial activity analysis investigated by colony counting and agar diffusion methods confirmed that CO coating enhanced the antibacterial activity of 45S5 BG-based scaffolds against S. aureus and E. coli. Meanwhile, the biocompatibility of the coated and uncoated scaffolds was investigated using MG-63 osteoblast-like and MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells. The results showed that the cytotoxicity in CO-contained scaffolds is dependent on the CO content, and consequently, the antibacterial activity and cell-material interaction are related to the presence of the EO. In summary, the research presented in this thesis demonstrated the versatility and efficacy of EOs-incorporated engineered biomaterials to produce multifunctional biomaterials with improved antioxidant, antibacterial and anti-inflammatory properties for wound healing and bone regeneration applications. Future research in this area should pursue the development and improvement of smart composite systems allowing the application of EOs as natural plant-based phytotherapeutic agents in wound healing and bone regeneration approaches. Comprehensive in vitro and in vivo investigations are reinforced for supporting the transformation of EO containing biomaterials for clinical use, especially long-term assessments.
description: Mikrobielle Infektionen und oxidativer Stress stellen ein großes Problem insbesondere während der Wundheilung und Knochenregeneration dar. An Hautwunden oder gebrochenen Knochen können Mikroorganismen schnell Infektionen verursachen und die Genesung verzögert sich dadurch. Während der Heilungsprozesses benötigen Immmunzellen in der Entzündungsphase Energie, die sie durch Redoxreaktionen gewinnen. Jedoch wird die Wundheilung und Knochenregeneration verlangsamt wenn es zu einem Mangel an kontrollierter Oxidation kommt. Dies geschieht durch übermäßige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezien (ROS), Daher ist es in dieser Phase entscheidend, bakterielle Infektionen und oxidativen Stress zu verhindern. Um diesen Problemen entgegenzuwirken, könnte die Integration von ätherischen Ölen (EOs) in Biomaterialien eine potenzielle Lösung zur Verbesserung der antibakteriellen, antioxidativen, entzündungshemmenden und biologischen Aktivität darstellen. Gleichzeitig kann diese Integration die Volatilitäts-, Instabilitäts- und Empfindlichkeitsprobleme von EOs lösen. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Studie Biomaterialien, in denen EOs eingebunden wurden, in verschiedenen strukturellen und morphologischen Formen hergestellt, darunter elektrogesponnene Nanofasern, Hybridgerüste, 3-dimensional (3D) gedruckte Hydrogele und BG-basierte Gerüste. Im ersten Teil dieser Forschungsarbeit wurden elektrogesponnene Polycaprolacton (PCL) Gelatine (GEL) Nanofasern mit drei verschiedenen Pfefferminz (PEP)- oder Nelken (CLV)-Konzentrationen auf der Grundlage des „grünen Elektrospinningprinzips“ für Wundheilungsanwendungen entwickelt. Es wurden gleichmäßige, partikelfreie und homogene elektrogesponnene Nanofasern generiert, die durch Rasterelektronenmikroskop (REM) Analysen morphologisch evaluiert wurden. Die Anwesenheit von PEP oder CLV in elektrogesponnenen PCL-GEL-Nanofasern wurde mittels abgeschächter Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und UV-Vis-Spektroskopie durch Analyse der funktionellen Gruppen, der tatsächlichen Menge bzw. des Gesamtphenolgehalts von EOs nachgewiesen. Dabei zeigten elektrogesponnene PCL-GEL-Nanofasern mit eingebautem PEP oder CLV ein anderes Freisetzungsmuster. Elektrogesponnene PCL-GEL-Nanofasern mit eingebautem CLV zeigten ein langanhaltendes Freisetzungsprofil, während PEP-Nanofasern eine fortgesetzte Freisetzung für bis zu 3 Tage aufwiesen und dann ein gewisses Konzentrationsplateau erreichten. Die antioxidative Aktivität wurde mittels frei werdender Radikale durch 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl PEP als auch CLV die antioxidative Eigenschaft der elektrogesponnenen PCL-GEL-Nanofaser verbessert. Zusätzlich wurde die antibakterielle Aktivität der elektrogesponnenen Nanofasern mit S. aureus (grampositiven) und E. coli (gramnegativen) Bakterien getestet und vielversprechende Ergebnisse bezüglich der elektrogesponnenen PCL-GEL-Nanofasern mit PEP oder CLV erzielt. Darüber hinaus zeigten an menschlichen Karanozyten (HaCaT) und menschlichen dermale Fibroblasten (NHDF) durchgeführte in vitro Studien, dass der Einbau von PEP oder CLV in die elektrogesponnenen PCL-GEL-Nanofasern keine zytotoxische Wirkung hat und sowohl Zelladhäsions als auch Proliferation fördert. Außerdem wurde die entzündungshemmende Wirkung in vitro unter Verwendung von RAW 264.7-Makrophagen-ähnlichen Zellen mit dem kolorimetrischen Nitrit/Nitrat-Kit untersucht. Die Ergebnisse bestätigten, dass der Einbau von PEP oder CLV die entzündungshemmende Wirkung verbesserte. Im dritten Teil dieser Studie wurde ein extrusionsbasiertes Verfahren verwendet, um CLV-beinhaltendes Natriumalginat (ALG)-Xanthangummi (XAN) ein 3D-gedrucktes Hydrogel für Wundheilungsanwendungen herzustellen. Das Problem der Druckbarkeit und der Stabilität des gedruckten ALG-basierten Konstrukts wurde durch die Zugabe von XAN gelöst, welches durch rheologische Analyse, Filamentfusions- und Filamentkollapsprüfung bewiesen wurde. Die Freisetzungsergebnisse zeigten, dass CLV eine nachhaltige Freisetzung von bis zu 28 Tagen aufweist. Zusätzlich erhöhte der Einbau von CLV das Abfangen freier Radikale von DPPH, während die relative bakterielle Lebensfähigkeit von S. aureus und E. coli verringert wurde. Dadurch verstärkte das CLV-beinhaltende Polymer die antioxidative und antibakterielle Aktivität der ALG-XAN-3D-gedruckten Hydrogele. Weiterhin zeigten die Ergebnisse der In vitro Zytotoxizität, dass der Einbau von CLV keine toxische Wirkung auf NHDF-Zellen hat, während die Proliferation von NHDF-Zellen dosisabhängig war. Im letzten Teil der vorliegenden Studie wurden 45S5-Gerüste auf Basis von bioaktivem Glas (BG) mittels Schaumrepliktechnik unter Verwendung von Polyurethan (PU) als Opfervorlage hergestellt. Daraufhin wurden die hergestellten Gerüste mit einem Sojaprotein (SP) oder einer Zimt (CO)-enthaltende SP-Lösung für die Anwendung im Bereich der Knochenregeneration beschichtet. Die mechanischen Ergebnisse zeigten, dass die beschichteten Gerüste die Druckspannung verstärkten und den „gezackte“ Bereich der Spannungs-Dehnungs-Kurve reduzierten. Darüber hinaus verbesserte die Aufnahme von CO die antioxidative Aktivität des Gerüsts. Die Ergebnisse bestätigen, dass diese Materialkombination für die Behandlung von oxidativem Stress bei der Knochenregeneration genutzt werden kann. Darüber hinaus zeigte die Analyse der antibakteriellen Aktivität, die durch Koloniezählung und Agardiffusionsmethoden untersucht wurde, dass die CO-Beschichtung die antibakterielle Aktivität von 45S5 BG-basierten Gerüsten gegen S. aureus und E. coli verstärkte. Außerdem wurde die Biokompatibilität der beschichteten und unbeschichteten Gerüste unter Verwendung von humanen Osteoblasten-ähnlichen Zellen (MG-63) sowie mit Maus präosteoblastischen Zellen (MC3T3-E1) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zytotoxizität in CO-haltigen Stützgerüste abhängig von der CO-Dosis sind und folglich die antibakterielle Aktivität sowie die Zell-Material Wechselwirkung mit dieser zusammenhängt. Zusammenfassend zeigte diese Forschung die vielseitige Wirksamkeit von EOs-enthaltenden Biomaterialien zur Herstellung multifunktionaler Biomaterialien mit verbesserter antioxidativer, antibakterieller, entzündungshemmender Aktivität und vielversprechender Biokompatibilität, die für die Anwendung im Bereich der Wundheilung und der Knochenregenaration genutzt werden kann. Zukünftige Forschungen auf diesem Gebiet könnten die Entwicklung und Verbesserung intelligenter Materialien fördern, die die Anwendung von EOs als natürliches Phytotherapeutikum auf Pflanzenbasis in Wund- und Knochenheilungsansätzen ermöglichen und weitere in vitro und in vivo Untersuchungen unterstützen.