CAPTURE-BASED NEXT GENERATION SEQUENCING IMPROVES THE IMMUNOGLOBULIN/T-CELL RECEPTOR CLONAL MARKERS IDENTIFICATION IN ADULT ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA PATIENTS LACKING MOLECULAR PROBES
Creators: name: CAVAGNA, ROBERTA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2019

description: La valutazione della presenza di cellule leucemiche residue durante e dopo il trattamento (malattia residua minima o Minimal Residual Disease, MRD) � il principale fattore prognostico nella Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL). Il gold standard per il monitoraggio della MRD � rappresentato dalla PCR quantitativa con oligonucleotidi allele-specifici (ASO), che richiede l?identificazione alla diagnosi dei riarrangiamenti di Immunoglobuline/T-Cell Receptor (Ig/TCR) quali marcatori di clonalit�. I primers ASO sono disegnati sulla base delle sequenze delle regioni giunzionali V-D-J identificate, peculiari per ogni riarrangiamento linfocitario, e utilizzati per la valutazione della MRD. La procedura convenzionale permette l?individuazione accurata e sensibile di cellule leucemiche a bassa frequenza (10-5, i.e. 1 cellula leucemica in un contesto di 100000 linfociti normali), tuttavia tale approccio � laborioso e dispendioso in termini di tempo, poich� richiede la messa a punto di condizioni sperimentali paziente-specifiche. Inoltre, in circa il 5-10% dei casi (definiti come MRD-unknown), questo metodo fallisce nell?identificazione di adeguati marcatori per la valutazione della MRD. Recentemente sono state descritte tecniche alternative di sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS) ad ampliconi per la valutazione della clonalit� e il monitoraggio della MRD nelle neoplasie linfoidi. Sebbene altamente sensibili, questi approcci sono anch?essi basati sull?amplificazione tramite PCR di riarrangiamenti selezionati, pertanto sono soggetti ad alcuni limiti della metodica convenzionale. Al fine di sviluppare un metodo semplificato e possibilmente pi� efficiente, abbiamo disegnato un pannello NGS diretto sulle regioni codificanti dei geni V, D e J nei loci di Ig/TCR, che permette la selezione anche dei riarrangiamenti rari e la possibilit� di combinare l?individuazione dei riarrangiamenti di Ig/TCR con l?analisi di rilevanti alterazioni geniche LAL- correlate. Il pannello � stato validato utilizzando 10 campioni prelevati alla diagnosi da pazienti arruolati nel protocollo clinico NILG-ALL 09/00, precedentemente analizzati per la clonalit�. Mediante l?approccio NGS, non solo abbiamo identificato correttamente tutti i 51 riarrangiamenti Ig/TCR noti, ma abbiamo anche individuato 24 ulteriori clonalit�, successivamente confermate, compresi riarrangiamenti rari, oligoclonali e cloni minoritari. Dopo la validazione sui campioni precedentemente studiati, abbiamo applicato l?approccio NGS per l?identificazione retrospettiva di marcatori clonali Ig/TCR alla diagnosi nella coorte di pazienti MRD-unknown, all?interno del protocollo NILG-ALL 09/00, in cui la metodica convenzionale aveva fallito. Nel complesso abbiamo identificato 92 riarrangiamenti clonali, individuando almeno un riarrangiamento Ig/TCR in 20/23 pazienti (87%). Per tre pazienti MRD-unknown, tutti di lineage T, non sono stati identificati riarrangiamenti Ig/TCR. Inoltre, abbiamo confermato il 77% dei riarrangiamenti definiti tramite NGS ad un livello ?5%, utilizzando metodiche di PCR standard implementate o oligonucleotidi specifici disegnati sulla base delle sequenze derivanti da NGS. Per i restanti riarrangiamenti, la validazione � fallita in quanto la metodica NGS ha individuato cloni minoritari o oligocloni, che non possono essere discriminati tramite procedura convenzionale che utilizza primers consensus famiglia-specifici. Nella maggior parte dei casi, i saggi di ASO-qPCR disegnati sulla base delle sequenze derivanti da NGS hanno raggiunto la sensibilit� richiesta per la valutazione di MRD ed hanno permesso di seguire l?andamento dei cloni leucemici, anticipando la recidiva ematologica. La maggior parte dei pazienti risultati mutati per TP53 in un precedente studio, apparteneva alla nostra coorte di pazienti MRD-unknown, in quanto non erano stati individuati riarrangiamenti Ig/TCR informativi e utili per il disegno di sonde molecolari paziente-specifiche. Per questi pazienti, non solo abbiamo identificato mediante NGS almeno un riarrangiamento Ig/TCR, ma abbiamo anche messo in luce la prevalenza di riarrangiamenti IGH incompleti. La presenza di riarrangiamenti IGH incompleti � stata inoltre analizzata in ulteriori 25 pazienti affetti da LAL non mutati per TP53, per i quali questo tipo di riarrangiamenti clonali non era stato testato alla diagnosi, dimostrando la maggior prevalenza di riarrangiamenti IGH incompleti nei pazienti affetti da LAL-B mutati in TP53, rispetto alla controparte non mutata. Infine, grazie all?applicazione prospettiva dell?approccio di NGS a cattura, abbiamo identificato almeno un riarrangiamento in 10/12 (83%) nuove diagnosi di pazienti MRD-unknown affetti da LAL, identificando nel complesso 40 riarrangiamenti clonali. Per due pazienti T-lineage non sono stati individuati marcatori clonali Ig/TCR. Sulla base delle sequenze ottenute tramite NGS, abbiamo disegnato saggi ASO-qPCR per la valutazione di MRD per quei casi in cui era stato identificato almeno un marcatore clonale Ig/TCR, ottenendo almeno una sonda paziente-specifica altamente sensibile nel 50% dei casi. Per due pazienti per cui erano disponibili campioni relativi al follow-up abbiamo utilizzato le sonde disegnate per procedere con la valutazione di MRD, assicurando l?allocazione dei pazienti nella categoria di rischio pi� adeguata. Il pannello di NGS a cattura che includeva sia i loci Ig/TCR sia i geni correlati a LAL � stato validato utilizzando materiale diagnostico derivante da 7 pazienti adulti affetti da LAL precedentemente studiati per i riarrangiamenti Ig/TCR ed � stato testato in prospettico sui 12 pazienti affetti da LAL MRD-unknown di nuova diagnosi. Globalmente abbiamo identificato 51 varianti geniche in 18/19 (94.7%) pazienti analizzati. In tutti i pazienti affetti da LAL-B abbiamo identificato singole varianti su un unico gene (CREBBP, FLT3, JAK2, PAX5 e TP53), mentre il solo paziente affetto da LAL-T con un solo gene mutato (PTEN) � risultato avere due mutazioni concomitanti. Infatti, nei restanti casi di LAL-T abbiamo identificato la presenza di varianti geniche a carico di almeno due geni e abbiamo osservato una correlazione statisticamente significativa tra il lineage T e l?aumento del numero di mutazioni per paziente (p=0.0282). Degna di nota � l?identificazione di varianti geniche (da 2 a 5) in tre pazienti in cui non erano stati identificati riarrangiamenti Ig/TCR, pertanto la categoria di rischio dei pazienti non era stata determinata molecolarmente. Dal momento che i riarrangiamenti Ig/TCR rappresentano un surrogato di marcatori clonali leucemici stabili e facilmente identificabili, le alterazioni dei geni mutati potrebbero rappresentare, in questi casi, la signature molecolare per l?analisi di MRD con metodi alternativi o per la terapia mirata. In conclusione, il saggio di NGS a cattura sviluppato ha permesso l?identificazione di riarrangiamenti clonali nella maggior parte dei casi in cui l?approccio standard aveva fallito, individuando anche riarrangiamenti rari, oligoclonali e poco rappresentati, non isolati mediante metodiche convenzionali. Quindi l?NGS pu� essere di grande valore nei pazienti con riarrangiamenti rari, adeguati per la valutazione della MRD e il trattamento da essa indirizzato. Inoltre la tecnologia NGS � risultata utile nell?identificazione di cloni leucemici minoritari alla diagnosi, anticipando una possibile recidiva inattesa in pazienti negativi per i cloni maggioritari. In sintesi, i nostri risultati suggeriscono che l?applicazione prospettica di questa tecnologia potrebbe semplificare la valutazione della clonalit� e migliorare lo sviluppo di saggi standard per il monitoraggio della leucemia, fornendo inoltre informazioni circa lo stato mutazionale di geni correlati a LAL.