title: Single cell measurements of microbial stoichiometry and phylogeny
Creators: name: Birtel, Julia
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Die ökologische Stöchiometrie beschäftigt sich mit den Verhältnissen von Elementen in einzelnen Organismen und Ökosystemen sowie dem Gleichgewicht zwischen den Elementen in ökologischen Prozessen und Interaktionen. In der vorliegenden Arbeit habe ich Unterschiede zwischen verschiedenen Methoden untersucht, die häufig für die Messung der Stöchiometrie (C:N:P) von Bakterien verwendet werden (1. Kapitel). Des Weiteren habe ich versucht, stöchiometrische Messungen einzelner Bakterien mit phylogenetischen Bestimmungen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) zu verbinden (2. Kapitel). Für die Untersuchungen wurden die beiden Bakterienarten Pectobacterium carotovorum und Verrucomicrobium spinosum verwendet. Diese wurden vorab in mehreren Ansätzen bei unterschiedlichen Nährstoffverhältnissen angezogen und sowohl in der stationären als auch in der logarithmischen Wachstumsphase für weitere Analysen fixiert wurden. Mittels energiedispersiver Röntgenmikroanalyse (EDX) wurden die C:N:P Verhältnisse von einzelnen Bakterien gemessen. Die Stöchiometrie vieler Bakterien zusammen („Bulk“) wurde mit Hilfe eines CHN Analysators (C, N) und Phosphoraufschluss (P) bestimmt. Ich habe ferner versucht mit Elektronenenergieverlustsspektroskopie (EELS) die Stöchiometrie einzelner Bakterien zu messen, jedoch waren diese Messungen aufgrund der Dicke der Bakterien nicht erfolgreich. Im Mittel wurde ein C:N:P Verhältnis von 365:67:1 für EDX Ergebnisse ohne Standardkorrektur durch Koenzym A, 228:33:1 für standardkorrigierte EDX Ergebnisse (EDX_S) und 148:24:1 für Bulk bestimmt. Fast 80 % der EDX_S Ergebnisse, sowie 36 % der nicht standardkorrigierten EDX Ergebnisse, waren statistisch nicht signifikant unterschiedlich von den Bulk Ergebnissen (p &lt; 0.05). Diese Resultate haben gezeigt, dass sowohl EDX als auch Bulk Analysen ähnliche Ergebnisse erzielen, sofern für die EDX Auswertung ein Standard verwendet wird. Welche Methode für die verbleibenden Unterschiede verantwortlich ist, ist dabei noch ungeklärt. Signifikante Unterschiede wurden darüber hinaus zwischen den Elementverhältnissen der verschiedenen Wachstumsphasen sowie den beiden untersuchten Arten gefunden, was darauf hindeutet, wie wichtig diese beiden Faktoren bei stöchiometrischen Analysen sind. Die Varianz zwischen EDX_S Ergebnissen einzelner Zellen war signifikant höher für C:P und N:P als bei nicht standardisierten EDX Ergebnissen. EDX_S Ergebnisse haben, verglichen mit den Bulk Ergebnissen, eine signifikant höhere Varianz gezeigt. Dies könnte durch die deutlich kleinere Probenanzahl bei Bulk Messungen (3 – 4 Proben pro Ansatz) im Vergleich zu den EDX Messungen (10 – 37 Zellen pro Ansatz) bedingt sein. Im zweiten Teil der Arbeit habe ich versucht Messungen der Stöchiometrie einzelner Bakterien mit deren phylogenetischer Bestimmung zu verbinden und habe dafür brommarkierte FISH Sonden sowie CARD-FISH mit brom- oder fluormarkierten Tyramiden verwendet. Brom ließ sich mit EDX nicht in den Zellen nachweisen und die gemessene Menge an Fluor war in den fluormarkierten Zellen nicht signifikant höher als in den brommarkierten Zellen. Etliche Möglichkeiten sind denkbar um diese Methode zu verbessern, so zum Beispiel eine Markierung der Zellen mit Immunogold, Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie (FACS), ein verändertes FISH-Protokoll, bei dem die Zellen direkt auf dem TEM Grid markiert werden, sowie Schnitte von eingebetteten Bakterien um dann mittels EELS eine genau Messung von F durchzuführen. Weitere Analysen müssen ferner durchgeführt werden um die Veränderung der Stöchiometrie, welche bei FISH-markierten Zellen gemessen wurde, zu minimieren.
description: Ecological stoichiometry is the study of the relative proportions of elements in organisms and ecosystems and the relationship of balance between elements in ecological processes and interactions. In this study, I investigated how different methods to measure the stoichiometry (C:N:P) of bacteria compare, and if it is possible to combine measurements of single cell stoichiometry to species identification with Fluorescent in situ hybridization (FISH). I used two bacterial species, Pectobacterium carotovorum and Verrucomicrobium spinosum, grown in several treatments at different resource ratios and harvested each in stationary and logarithmic growth phase. Single cell measurements were conducted with Energy Dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and bulk cell analyses were performed with a CHN analyzer and phosphorus digestion. In addition, I tried to measure single cell stoichiometry with Electron Energy Loss Spectroscopy, but due to the thickness of the cells, these measurements were not successful. The average C:N:P was 365:67:1 for unstandardized EDX results, 228:33:1 for standardized EDX (EDX_S), and 148:24:1 for bulk measurements. EDX results were compared to bulk results and only 22 % of the EDX results, when standardized with Coenzyme A, were significantly different from the bulk cell analyses (p &lt; 0.05). When unstandardized EDX results were compared to bulk results, 64 % of the elemental ratios differed significantly between the two methods. These results indicate that, if EDX results are standardized, both methods may be used for microbial elemental analysis and it is currently unclear which of the two methods drives the 22 % of significant differences. Significant differences were also found between the elemental ratios of cells harvested at different growth phases and between two species, pointing out the importance of these variables when microbial stoichiometry is studied. Standardized EDX results furthermore had significantly lower variance in C:P and N:P as compared to unstandardized EDX results. In addition, the variance of the bulk results differed significantly from the EDX results, which might be an effect of low sample number for the bulk analyses (3 – 4) compared to single cell measurements (10 – 37). In the second part of the study I aimed to combine measurements of single cell stoichiometry to phylogenetic identification and used FISH with bromine (Br) labeled probes and CARD-FISH with Br or fluorine (F) containing tyramides in order to identify these rare elements in labeled cells with EDX. Unfortunately, the Br label was not detectable with EDX, and no significantly higher amount of F could be measured for F labeled cells. However, there are various possibilities to improve the method, such as immunogold labeling, cell sorting by Flow Cytometry, performing FISH labeling directly on TEM grids, or the slices of resin-embedded cells for EELS measurements of F. Future research also has to address the significant change of single cell stoichiometry found after cell labeling when the elemental ratios of FISH and CARD-FISH labeled cells were compared to ratios of unlabeled cells.