Παρακολούθηση των επιπέδων σκουαλενίου και εργοστερόλης στο λιπιδικό κλάσμα του μύκητα Blakeslea trispora σε συνθήκες που ευνοούν το σχηματισμό φυτοενίου
Creators: name: Θάνου, Παναγιώτα Ευαγγέλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Φυτοένιο
Εργοστερόλη
Blakeslea trispora
Υγρή χρωματογραφίας Αντίστροφης φάσης
Αντιοξειδωτική δράση
DPPH•
Phytoene
Ergosterol
Reverse phase liquid Chromatography
Antioxidant activity

description: Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν η παρακολούθηση και αξιολόγηση των επιπέδων σκουαλενίου και εργοστερόλης στο ασαπωνοποίητο ενδοκυτταρικό κλάσμα της συζευγμένης καλλιέργειας του (+) και (-) στελέχους του ζυγομύκητα B. trispora σε συνθήκες που ευνοούν το σχηματισμό και τη βιοσύνθεση του φυτοενίου. Λαμβάνοντας υπόψιν ότι η οδός βιοσύνθεσης της εργοστερόλης και του β-καροτενίου μοιράζονται κοινές πρόδρομες ενώσεις, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της επίδρασης της βιοσυνθετικής πορείας της εργοστερόλης που φαίνεται να δρα ανταγωνιστικά ως προς το μονοπάτι βιοσύνθεσης των καροτενοειδών παρουσία των αναστολέων διφαινυλαμίνη, 2-μεθυλο-ιμιδαζόλιο και τερβιναφίνη. Οι χημικές αυτές ενώσεις δρουν αναστέλλοντας τη δράση κρίσιμων ενζύμων των δύο μεταβολικών μονοπατιών, της αφυδρογονάσης φυτοενίου, της β-κυκλάσης του λυκοπενίου και της εποξειδάσης του σκουαλενίου, αντίστοιχα. Η διερεύνηση της επίδρασης των κρίσιμων παραμέτρων της βιοδιεργασίας παραγωγής σκουαλενίου και στερολών πραγματοποιήθηκε μέσω του κεντρικού σύνθετου σχεδιασμού και της μεθοδολογίας επιφάνειας απόκρισης. Ως ανεξάρτητες μεταβλητές ορίστηκαν το επίπεδο προσθήκης των τριών χημικών αναστολέων, ο χρόνος προσθήκης τους, ο χρόνος ζύμωσης και η αναλογία σπορίων των (+)/(-) στελεχών, με στόχο τη διερεύνηση των επιδράσεων τους στην περιεκτικότητα της ξηρής βιομάζας σε εργοστερόλη (mg/g ξηρής βιομάζας) και σκουαλένιο (mg/g ξηρής βιομάζας) (εξαρτημένες μεταβλητές). Ο υγροχρωματογραφικός διαχωρισμός του σκουαλενίου και των στερολών πραγματοποιήθηκε σε χρωματογραφική στήλη αντίστροφης φάσης κάτω από ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης. Στις διαφορετικές πειραματικές δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν και περιλάμβαναν την ταυτόχρονη προσθήκη χημικών αναστολέων κρίσιμων ενζύμων των μεταβολικών οδών της εργοστερόλης και των καροτενοειδών, τα επίπεδα προσθήκης των αναστολέων φάνηκε να μην επηρεάζουν σε μεγάλο βαθμό την περιεκτικότητα της ξηρής βιομάζας σε εργοστερόλη. Σημαντική επίδραση εμφάνισαν ο χρόνος ζύμωσης και ο χρόνος προσθήκης των αναστολέων. Στον αντίποδα, αναφορικά με την περιεκτικότητα της ξηρής βιομάζας σε σκουαλένιο σημαντική επίδραση, πέραν των προαναφερθέντων παραγόντων, εμφάνισε το επίπεδο προσθήκης του αναστολέα, τερβιναφίνη. Κατά τον προσδιορισμό σκουαλενίου, εργοστερόλης και επιμέρους στερολών σε συνθήκες ανάπτυξης που ευνοούν τη συσσώρευση φυτοενίου παρουσία του χημικού αναστολέα τερβιναφίνη παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην περιεκτικότητα του ασαπωνοποίητου κλάσματος του ενδοκυτταρικού λίπους σε επιμέρους στερόλες. Η αρνητική ρύθμιση της βιοσυνθετικής οδού της εργοστερόλης παρουσία τερβιναφίνης συσχετίστηκε με την παρατηρούμενη αύξηση της παραγωγής του φυτοενίου. Το γεγονός αυτό αποδόθηκε είτε στην αυξημένη δραστικότητα της αναγωγάσης του υδροξυ-3-µεθυλο-γλουταρυλο-συνενζύμου Α (HMG-CoA), βασικό σημείο ελέγχου της βιοσυνθετικής οδού των τερπενοειδών, είτε στην εμπλοκή της τερβιναφίνης στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των καροτενοειδών παρουσιάζοντας δράση παρόμοια με τη διφαινυλαμίνη. Λόγω της έλλειψης δεδομένων σχετικά με την αντιοξειδωτική δράση εκχυλισμάτων καροτενοειδών εμπλουτισμένα σε φυτοένιο, πραγματοποιήθηκε προκαταρκτική διερεύνηση της αντιοξειδωτικής δράσης εκχυλίσματος που παρήχθη από το μύκητα B. trispora από τη βιοδιεργασία σε συνθήκες μέγιστης ως προς τη συσσώρευση φυτοενίου. In vitro εκτίμηση της αντιοξειδωτικής δράσης του εν λόγω εκχυλίσματος έγινε μέσω της δοκιμής DPPH•. Η υψηλότερη δραστικότητά του συγκριτικά με συνθετικό μίγμα ίδιας σύστασης σε φυτοένιο και β-καροτένιο πιθανόν οφείλεται στη συνεργιστική δράση βιοδραστικών ενώσεων, όπως καροτενοειδών, στερολών ή και άλλων ενώσεων που περιέχονται στα λιποσφαιρίδια του συγκεκριμένου μύκητα. Το εκχύλισμα, λόγω της υψηλής αντιοξειδωτικής του ικανότητας και της ενισχυμένης σύστασής του σε φυτοένιο, θα μπορούσε να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση και την ανάπτυξη νέων λειτουργικών τροφίμων, φαρμακευτικών σκευασμάτων και προϊόντων κοσμετολογίας .
description: This study was aimed to monitor and evaluate squalene and ergosterol levels in the unsaponified intracellular fraction of the mated culture of (+) and (-) strains of the fungus B. trispora under conditions favouring the formation and biosynthesis of phytoene. Considering that the biosynthetic pathway of ergosterol and β-carotene share common precursor compounds, an investigation was conducted on the effect of the biosynthetic pathway of ergosterol, which appears to act competitively with the β-carotene pathway in the presence of inhibitors diphenylamine, 2-methylimidazole and terbinafine. These chemicals act by inhibiting the action of crucial enzymes of the two metabolic pathways, phytoene dehydrogenase, lycopene β-cyclase and squalene epoxidase, respectively. Central composite design and response surface methodology was used to investigate the influence of the crucial parameters of the bioprocess for the production of squalene and sterols. The level of addition of the three chemical inhibitors, their addition time, fermentation time and strain ratio of (+)/(-) were defined as independent variables, in order to investigate their effects on ergosterol (mg/g dry biomass) and squalene (mg/g dry biomass) yield (dependent variables). The liquid chromatographic separation of squalene and sterols was performed on a reverse phase chromatographic column under isocratic elution conditions. In the different experimental trials that were conducted involving the simultaneous addition of chemical inhibitors of crucial enzymes in the metabolic pathways of ergosterol and carotenoids, it appeared that they did not significantly affect the ergosterol content. The fermentation time and the addition time of inhibitors showed significant effects. In contrast, regarding the content of squalene, in addition to the aforementioned factors, the level of addition of terbinafine, also appeared a significant impact. During the determination of squalene, ergosterol and intermediate sterols under growth conditions favouring phytoene accumulation in the presence of inhibitor terbinafine, a significant reduction in the content of the unsaponified intracellular fraction of intermediate sterols was observed. The negative regulation of the ergosterol biosynthetic pathway in the presence of terbinafine was associated with the observed increase in phytoene production. This was attributed either to the increased activity of hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMG-CoA), a key point in the terpenoid biosynthetic pathway, or to the involvement of terbinafine in the carotenoid biosynthetic pathway, exhibiting a similar action to diphenylamine. Due to the lack of data regarding the antioxidant activity of carotenoid-enriched extracts, a preliminary investigation of the antioxidant activity of an extract derived from the fungus B. trispora through a bioconversion process under conditions favouring the accumulation of phytoene was conducted. In vitro assessment of the extract's antioxidant activity was performed using the DPPH• assay. Its higher activity compared to a synthetic mixture of the same composition in phytoene and β-carotene is likely attributed to the synergistic effect of bioactive compounds such as carotenoids, sterols, and other compounds present in the liposomes of this specific fungus. Due to its high antioxidant capacity and enhanced composition of phytoene, the examined extract could be utilized and play a significant role in the development and formulation of new functional foods, nutraceuticals, and nutricosmetics.