FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL GENETIC VARIANT PREDISPOSING TO ADVANCED FIBROSIS AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA DEVELOPMENT IN NONALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE
Creators: name: BASELLI, GUIDO ALESSANDRO
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2020

description: Functional characterization of a novel genetic variant predisposing to advanced fibrosis and hepatocellular carcinoma development in nonalcoholic fatty liver disease Introduzione La steatosi epatica non alcoolica (NAFLD) rappresenta la pi� comune tra le malattie epatiche croniche nei paesi occidentali e rappresenta una causa emergente di cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare (HCC). Numerosi studi hanno sottolineato l'importanza di vari tratti ereditari nel modificare la suscettibilit� e il decorso di questa malattia. Tuttavia, la componente ereditabile di NAFLD resta in larga misura sconosciuta. Scopo dello studio Nell?ipotesi che una componente dell?ereditariet� della NFLD sia rappresentata da varianti genetiche rare con un forte impatto sull?attivit� proteica, il primo obiettivo di questo studio � stato quello di identificare, mediante Whole Exome Sequencing (WES), nuove varianti genetiche rare che determinassero un'alterazione dell'attivit� proteica e si associassero agli stadi avanzati della NAFLD. Abbiamo rilevato un'associazione tra una variante nel gene interferon regulatory factor 3 (IRF3) e lo sviluppo di carcinoma epatocellulare (HCC) correlato alla NAFLD. Abbiamo successivamente esaminato la regolazione specifica delle isoforme di IRF3 nei pazienti a rischio di NAFLD in relazione al danno epatico, abbiamo cercato di comprendere il ruolo di IRF3 nella biologia dell?epatocita e, infine, di mimare l'impatto della perdita di funzione dei trascritti alternativi di IRF3 sfruttando l'approccio di CRISPR/Cas9 genome editing in modelli in vitro. Infine, abbiamo testato l'impatto dell'inibizione della via di IRF3 sul tasso di proliferazione di cellule epatiche (HepG2) da parte dell'amlexanox. Quest?ultimo � un inibitore dell'asse TBK1-IRF3 in studio per il trattamento delle complicanze legate all'obesit�. ? Metodi e Pazienti ? Abbiamo effettuato il sequenziamento dell'intero esoma (WES) di 72 pazienti NAFLD-HCC italiani e 50 individui sani. I pazienti HCC sono stati confrontati con la popolazione europea (Europei non finlandesi inclusi nell? Exome Aggregation Consortium, N = 33,370). ? Le associazioni sono state validate in un altro gruppo di pazienti con HCC correlato a NAFLD (N = 105), in 211 pazienti con fibrosi avanzata (N = 211) e altri 270 individui Italiani sani. Inoltre, � stato utilizzato un database pi� ampio per valutare la popolazione europea (genome aggreagation consortium, N = 64.603). ? Sono state eseguite analisi trascrittomiche su 125 soggetti gravemente obesi (coorte trascrittomica) sottoposti a biopsia epatica percutanea eseguita durante un intervento chirurgico bariatrico. L'RNA-Seq � stato eseguito su RNA estratto da biopsie epatiche congelate rapidamente. ? Per valutare l'effetto di IRF3-CL � stata introdotta una variante somatica nell'accettore di splicing dell?esone 7 specifico di IRF3-CL. In breve, abbiamo generato una linea di cellule HepG2 esprimente Cas9 sotto il controllo di un promotore inducibile da dxiciclina usando vettori lentivirali (Dharmacon, Lafayette, U.S.A.). L?RNA guida specifico � stato disegnato utilizzando il CRISPR design tool (http://crispr.mit.edu/) e clonato in un vettore di espressione (Addgene # 51133). Infine, le cellule trattate con doxiciclina sono state trasfettate con il vettore di espressione. Popolazioni clonali derivate da singole cellule sono state ottenute con il metodo della diluizione limite. In seguito, la presenza di mutazioni nel locus specificato � stata studiata mediante test nucleasi T7 (New England Biolabs, Ipswich, USA) e ulteriormente confermata con sequenziamento diretto (metodo di Sanger). ? Risultati La variante IRF3 rs141490768 � risultata pi� frequente nel gruppo di pazienti con HCC rispetto alla popolazione europea (OR = 37,1, p = 4,5 * 10-7) e, allo stesso modo, era pi� frequente nei pazienti con fibrosi avanzata (N = 211, p = 0,049; OR = 5,8; IC al 95% = 0,7-21). Considerando tutti i pazienti con epatopatia avanzata (N = 388), l'associazione � rimasta fortemente significativa (OR = 11; IC 95% = 4-24; p = 6,16 * 10-6). rs141490768 codifica una variante loss-of-function (A418T) nell'isoforma regolatoria IRF3-CL, suggerendo che una maggiore attivit� dell'IRF3 pu� predisporre al NAFLD-HCC. Inoltre, anche due trascritti non codificanti a funzione sconosciuta (rispettivamente IRF3-NC1 e IRF3-NC2) si sovrappongono al locus rs141490768. Mediante Burden test abbiamo riscontrato che vi era un arricchimento in varianti rare che alterano specificamente IRF3-CL sia nei pazienti con HCC (p = 5,69 * 10-7; OR = 35,5; IC al 95% = 11-90) che in quelli con fibrosi avanzata (OR = 6,4; IC al 95% = 0,8-24; p = 0,04). Le analisi di trascrittomica hanno rivelato livelli elevati di espressione di IRF3, IRF3-CL e IRF3-NC1. Inoltre, i livelli di mRNA di IRF3-CL erano direttamente correlati con lo stadio della malattia, mentre quelli di IRF3-NC1 erano inversamente correlati (? = 1,3 e -0,77, rispettivamente; p &lt;0,05, entrambi). Mediante analisi immunoistochimica abbiamo evidenziato un?overespressione e iperattivazione di IRF3 in base alla severit� del danno epatico. Inoltre, IRF3 � risultato overespresso nel tessuto tumorale rispetto al tessuto sano in una coorte di 20 pazienti del database TCGA e in campioni istologici. Sfruttando modelli in vitro abbiamo visto come l'esposizione ad acidi grassi liberi riesca attivare IRF3 in cellule HepG2, supportando il suo coinvolgimento nella patogenesi NAFLD. Allo stesso modo, anche stimoli proliferativi erano in grado di attivare questo fattore trascrizionale. Per mimare l'impatto della perdita di funzione di IRF3-CL e valutarne l?effetto sulla biologia degli epatociti, abbiamo sviluppato una linea di HepG2 parzialmente difettiva per IRF3-CL. Come previsto, le cellule IRF3-CL +/- presentavano un?attivazione di IRF3 pi� sostenuta in risposta al siero. Inoltre l'esposizione delle HepG2 all'amlexanox, da solo in combinazione con sorafenib, risultava in grado di ridurre il tasso di crescita cellulare. Questo effetto risultava pi� evidente nelle cellule IRF3-CL+/-. ? Conclusioni In conclusione, la variante IRF3 rs141490768 � associata ad un aumentato rischio di sviluppare stadi avanzati di NAFLD. Inoltre, l'overespressione di IRF3 � stata associata alla gravit� della malattia epatica, in parallelo con l'induzione della risposta infiammatoria, l?alterazione del metabolismo lipidico e la proliferazione cellulare. Anche se saranno necessari ulteriori studi meccanicistici per chiarire la complessa rete di interazioni tra le varie isoforme di IRF3, i nostri esperimenti in vitro confermano che IRF3-CL esercita un effetto inibitorio sull'attivazione dell'isoforma principale, che induce la proliferazione cellulare. Complessivamente, i dati suggeriscono che il meccanismo alla base dell'associazione della variante rs141490768 con la progressione NAFLD a fibrosi grave e HCC � correlato a un?attivazione aberrante della via di IRF3. Infine, i risultati supportano la necessit� di ulteriori studi per esaminare il possibile ruolo dell'amlexanox (o altri inibitori Ikk-epsilon) nel trattamento della NAFLD e indicano questa classe di farmaci come buoni candidati da valutare ulteriormente per il trattamento di NAFLD HCC in combinazione con sorafenib.