Αλληλούχηση του ALS γονιδίου και δράση του ALS ενζύμου από ανθεκτικούς πληθυσμούς ήρας (Lolium rigidum) σε ζιζανιοκτόνα:
Creators: name: Τσιώνη, Βασιλική Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: ALS ένζυμο
Ήρα
Ανθεκτικότητα
ALS enzyme
Lolium rigidum
Resistance

description: Σε πειράματα εργαστηρίου διερευνήθηκε ο μηχανισμός ανθεκτικότητας και η δράση του ενζύμου ALS από επτά (7) ανθεκτικούς πληθυσμούς και από ένα (1) ευαίσθητο πληθυσμό του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron. Ειδικότερα, έγινε αλληλούχηση του ALS γονιδίου από τους προαναφερθέντες πληθυσμούς για την παρουσία ή μη σημειακών μεταλλάξεων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα και τη δράση του ενζύμου ALS. Η καταλυτική δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS επτά ανθεκτικών πληθυσμών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας αξιολογήθηκε παρουσία έξι (6) συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron και imazamox. Για το σκοπό αυτό, εκχυλίστηκαν οι πρωτεΐνες από φυτά των προαναφερθέντων πληθυσμών και ακολούθως έγινε ποσοτικός προσδιορισμός φασµατοφωτοµετρικά µε μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 520 nm (A520nm). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με σκοπό την εξεύρεση της εξίσωσης που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου και της δράσης του ενζύμου ALS, ενώ στη συνέχεια υπολογίστηκε για κάθε πληθυσμό η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου που προκαλεί μείωση της δράσης του ενζύμου ALS κατά 50% (τιμή I50). Ακολούθως, υπολογίστηκε η ένταση ανθεκτικότητας (R/S) ως το κλάσμα της I50 τιμής των ανθεκτικών πληθυσμών ως προς την αντίστοιχη I50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από Ala, Leu, Gln ή His είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS (σταυρανθεκτικότητα) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron, tribenuron και mesosulfuron, ενώ οι ίδιες αντικαταστάσεις δεν επηρέασαν την ευαισθησία του ALS ενζύμου στο ζιζανιοκτόνο imazamox. Αυτό σημαίνει ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία των πληθυσμών της ήρας στις σουλφονυλουρίες αλλά όχι στις ιμιδαζολινόνες. Αντιθέτως, η παρόμοια ευαισθησία του ALS ενζύμου των τριών ανθεκτικών πληθυσμών χωρίς σημειακή μετάλλαξη σε σύγκριση με εκείνη του ευαίσθητου πληθυσμού ήταν αναμενόμενη λόγω της απουσίας μετάλλαξης. Ο μηχανισμός ανθεκτικότητας των προαναφερθέντων ανθεκτικών βιοτύπων χωρίς σημειακή μετάλλαξη μελετήθηκε μέσω βιοδοκιμής σπόρων σε τριβλία Petri όπου αξιολογήθηκαν τρεις πληθυσμοί ήρας για πιθανότητα ύπαρξης μηχανισμού ανθεκτικότητας λόγω καταλυτικής δράσης των CytΡ450 μονοξυγονασών. Ειδικότερα, σπόροι των τριών πληθυσμών τοποθετηθήκαν σε αιωρήματα των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron ή tribenuron με ή χωρίς malathion και ακολούθως μετρήθηκε το μήκος των ριζών των σποροφύτων σε κάθε τριβλίο και, πριν την ανάλυση των δεδομένων, αυτό εκφράστηκε ως % του μάρτυρα. Ακολούθως υπολογίστηκε για κάθε πληθυσμό η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου, παρουσία ή απουσία του malathion, που προκαλεί μείωση του μήκους της ρίζας του ζιζανίου κατά 50% (τιμή I50). Οι τιμές αυτές στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της έντασης ανθεκτικότητας κάθε πληθυσμού (R/S1 = I50 τιμή του ανθεκτικού πληθυσμού προς την αντίστοιχη I50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού και R/S2 = I50 τιμή του πληθυσμού απουσία malathion ως προς την αντίστοιχη τιμή I50 παρουσία malathion). Η παρουσία του malathion μείωσε σημαντικά τις τιμές I50 των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron και tribenuron για τον ευαίσθητο και τον ανθεκτικό πληθυσμό χωρίς σημειακή μετάλλαξη. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η ανθεκτικότητα του πληθυσμού χωρίς σημειακή μετάλλαξη οφείλεται στην παρουσία μηχανισμού μεταβολισμού του συγκεκριμένου ζιζανιοκτόνου από ένζυμα CytP450 μονοξυγονάσες. Επίσης, τα δεδομένα δείχνουν ότι η προσθήκη του εντομοκτόνου malathion κατά την εφαρμογή των δύο ζιζανιοκτόνων αυξάνει την αποτελεσματικότητά τους εναντίον των ευαίσθητων πληθυσμών της ήρας.
description: Laboratory experiments were conducted to study one susceptible (S) and seven resistant (R) rigid ryegrass populations for possible existence of point mutations in their ALS gene (DNA sequencing), which are responsible for ALS resistance to herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron. The ALS sequencing showed mutations only in four R populations and particularly in the codon (CCG) 197 (Pro197). ALS in vitro experiments were also conducted to study the activity of the ALS enzyme extracted from one S and seven R rigid ryegrass populations in the presence of six concentrations of chlorsulfuron, mesosulfuron, tribenuron or imazamox. The data obtained from the conducted tests were expressed as percentage (%) of the absorption recorded for the control samples. Then, the obtained data were used for regression analysis and the concentration of each herbicide that causes 50% reduction of the ALS activity (I50 value) was estimated for each population. The estimated I50 values were used to calculate the resistance factor (R/S) as the ratio of the I50 value of the R population divided by the respective I50 value of the S population. The highest resistance factor was estimated for the herbicide chlorsulfuron (R/S = 51-&gt;320) and tribenuron (R/S = 3-&gt;110), the moderate for mesosulfuron (R/S = 6-9) and the lowest was estimated for imazamox (R/S = 0,7-2). These data indicated that the Pro197 substitution by Ala, Leu, Gln, Arg or His resulted in reduced ALS sensitivity to the herbicides chlorsulfuron, tribenuron and mesosulfuron, but it did not affect the ALS sensitivity to herbicide imazamox. Therefore, these results clearly suggest that the detected in four populations amino acid substitution at the codon 197 (Pro197) was related with high ALS resistance to sulfonylurea but not to imidazolinone herbicides. However, the similar ALS sensitivity recorded in three R populations as compared with that of the S population could be attributed to the confirmed absence of ALS mutation. Petri dishes bioassay tests including one R rigid ryegrass population with Pro197-Ala substitution, one partially R population and one S population were conducted to investigate the possible existence of the CytP450-based metabolism herbicide resistance. Seeds were placed in suspensions of chlorsulfuron or tribenuron in the absence and presence of the insecticide malathion. The root length of the seedlings was measured and the data obtained were used for regression analysis. Then, the concentration of each herbicide that causes 50% reduction of root length for each population was estimated, and these I50 values were used to calculate the resistance factor in the presence or absence of malathion. The results indicated that the presence of malathion in the partially R population resulted in 11.8 and 6.7 times lower resistant factor (R/S) for chlorsulfuron and tribenuron than their respective values in the absence of malathion. These findings suggest that the resistance of this population is due to herbicide metabolism by the CytP450 monooxygenases.