: Ανίχνευση και χαρακτηρισμός ιών του γένους Ophiovirus που προσβάλλουν την πιπεριά
Creators: name: Βασιλείου, Νεφέλη Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2025
Subjects: Διάγνωση
Γονιδίωμα
Olpidium virulentus
Detection
Genome

description: Η πιπεριά (Capsicum annuum) αποτελεί μια οικονομικώς σημαντική καλλιέργεια της χώρας μας, η οποία ωστόσο προσβάλλεται από πλήθος ιικών παθογόνων. Το 2021, παρατηρήθηκαν σε καλλιέργειες πιπεριάς στο Μανδρικό της Ρόδου συμπτώματα ίκτερου, παραμόρφωσης των φύλλων και των νεύρων, ελαφρύ μωσαϊκό, ευθρυπτότητα φυλλώματος και ελαφριά συστροφή. Η εφαρμογή της αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High throughput sequencing, HTS), σε δύο δείγματα φυτών πιπεριάς με αυτά τα συμπτώματα (PeRo 2 και 50), ανέδειξε για πρώτη φορά στη χώρα μας την παρουσία δύο ιών του γένους Ophiovirus (οικογένεια Aspiviridae). Πρόκειται για τον ιό της λευκής ποικιλοχλώρωσης του Ranunculus (ranunculus white mottle virus, RWMV) και τον ιό της δακτυλιοειδούς νέκρωσης του μαρουλιού (lettuce ring necrosis virus, LRNV). Οι ιοί αυτοί διαθέτουν διηρημένο (τετραμερές), αρνητικής πολικότητας RNA γονιδίωμα. Η μετάδοσή τους πραγματοποιείται με ζωοσπόρια μυκήτων του γένους Olpidium. Η παρουσία τους σε φυτά πιπεριάς έχει καταγραφεί και σε άλλες χώρες ενώ έχει βρεθεί πως αποτελεί ξενιστή τους και η τομάτα, μια εξίσου σημαντική καλλιέργεια. Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να χαρακτηριστούν περαιτέρω αυτά τα δυο νέα ιικά παθογόνα, να αναπτυχθούν νέες αξιόπιστες μέθοδοι για την ανίχνευσή τους και να διερευνηθεί η μετάδοσή τους με μύκητες του γένους Olpidium. Η HTS ανάλυση έδωσε τη δυνατότητα ανάκτησης των αλληλουχιών ελληνικών απομονώσεων (PeRo 2 και 50) των δυο ιών. Στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης, επιβεβαιώθηκε με αλληλούχηση κατά Sanger η πλήρους μήκους αλληλουχία του γονιδιώματος (RNA 1-4) της απομόνωσης PeRo 2 του RWMV και των RNA 1, 3 και 4 της απομόνωσης PeRo 50 του LRNV και μερικώς το RNA 2. Επιπλέον, από την φυλογενετική ανάλυση των αλληλουχιών αναδείχθηκε ότι ο RWMV έχει μεγαλύτερη ενδοειδική παραλλακτικότητα σε σχέση με τον LRNV. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν αξιόπιστες διαγνωστικές μέθοδοι RT-PCR με σκοπό να ανιχνεύουν αποτελεσματικά το σύνολο των γνωστών απομονώσεων των δύο ιών. Οι μέθοδοι αυτές εφαρμόστηκαν για τον έλεγχο του συνόλου του φυτικού υλικού που συλλέχθηκε κατά τα έτη 2021, 2022 και 2023 από τη Ρόδο. Σε δύο από τα τέσσερα θερμοκήπια από τα οποία συλλέχθηκαν δείγματα το 2021 ανιχνεύτηκαν ο RWMV και ο LRNV και το 2023 εντοπίστηκε μόνο ο RWMV σε ένα από αυτά. Ταυτοποιήθηκε επίσης ο μύκητας Olpidium virulentus στο έδαφος των θερμοκηπίων στα οποία εντοπίστηκαν οι ophio-ιοί τόσο μικροσκοπικά, όσο και μοριακά με PCR και αλληλούχηση κατά Sanger. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα μετάδοσης των RWMV και LRNV σε υγιή φυτά πιπεριάς και τομάτας, με έδαφος προερχόμενο από θερμοκήπια στα οποία βρέθηκαν οι παραπάνω ιοί και ο μύκητας O. virulentus. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων βρέθηκε πως και ο δύο ιοί μεταδίδονται αποτελεσματικά σε εργαστηριακές συνθήκες σε φυτά πιπεριάς και τομάτας, χωρίς ωστόσο να είναι εφικτή η παρατήρηση συμπτωμάτων. Μάλιστα παρατηρήθηκε ότι τα ποσοστά ανίχνευσης των ιών ήταν μεγαλύτερα στους τρείς μήνες μετά τη μόλυνση έναντι των δύο μηνών και επιπλέον ήταν υψηλότερα στο ριζικό σύστημα έναντι του φυλλώματος.
description: Pepper (Capsicum annuum) is an economically important crop of our country, which, however, is affected by a number of viruses. In 2021, symptoms of interveinal yellowing, leaf and vein deformation, mild yellow mosaic, upward leafroll and brittle leaves were observed in pepper plants in Mandriko, Rhodes. The application of High throughput sequencing (HTS) to two samples of pepper plants with this symptomatology (PeRo 2 and 50), revealed for the first time in our country the presence of two viruses of the genus Ophiovirus (family Aspiviridae). These are ranunculus white mottle ophiovirus (RWMV) and lettuce ring necrosis ophiovirus (LRNV). These viruses have a divided (tetrameric), negative polarity RNA genome. Their transmission is carried out by zoospores of fungi of the genus Olpidium. Their presence in pepper plants has been recorded in other countries and tomato, an equally important crop, has been found to be their host. The aim of the present study was to further characterize these two new viruses, develop new reliable methods for their detection and investigate their transmission through Olpidium. The HTS analysis made possible to retrieve the sequences of the Greek isolates (PeRo 2 and 50) of the two viruses. In the context of this study, the complete genome sequence (RNA 1-4) of the isolate PeRo 2 of RWMV and the RNAs 1, 3, 4 of LRNV of the isolate PeRo 50, were confirmed by Sanger sequencing. Also, RNA 2 of LRNV of the isolate PeRo 50 was partially confirmes. In addition, phylogenetic analysis of the sequences showed that RWMV has greater intraspecific variation than LRNV. Subsequently, reliable RT-PCR diagnostic methods were developed in order to detect all known isolates effectively. These methods were applied to control all plant material collected during 2021, 2022 and 2023 from Rhodes. RWMV and LRNV were detected in two out of four greenhouses from which samples were collected in 2021, and in 2023 only RWMV was detected in one of them. Olpidium virulentus was also identified both microscopically and molecularly through PCR, in the soil of the greenhouses, where ophioviruses had also been detected. Finally, transmission of RWMV and LRNV to healthy pepper and tomato plants with greenhouse-derived soil in which the above viruses and the fungus O. virulentus were present. The results of the experiments highlighted that both viruses can be effectively transmitted under laboratory conditions to pepper and tomato plants, but it was not possible to reproduce and observe the symptoms they create. In fact, it was observed that virus detection rates were higher three months after infection, compared to two months and were also higher in root than in the foliage.