title: Biorekognitive Nanopartikel als neue Delivery-Strategie in der intravesikalen Therapie
Creators: name: Mesaric, Sandra
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Im Zuge der vorliegenden Diplomarbeit wurden Polylactid-co-Glycolid (PLGA)-Nanopartikel (NP) mit Wheat Germ Agglutinin (WGA), einem aus Weizen isolierten Lektin, modifiziert und deren Adhäsionsverhalten an verschiedene Blasenzelllinien untersucht, mit dem Ziel, eine neue Delivery-Strategie für lokal am Urothel applizierte Wirkstoffe zu entwickeln. Nicht-muskelinvasiver Blasenkrebs gehört zu den häufigsten Krebserkrankungen und ist vorwiegend gekennzeichnet durch ein hohes Risiko für frühe Rezidive, welches durch intravesikale Therapie mit chemotherapeutischen oder immunmodulatorischen Substanzen in gewissem Maße gesenkt werden kann. Um die hohe Rezidivrate noch effizienter senken zu können, wäre ein neues Drug-Targeting- bzw. Delivery-System, wie z. B. Lektin-modifizierte Nanopartikel, wünschenswert. Um die Partikel-Zell-Interaktion genau zu charakterisieren, wurden Versuche mit gesunden Urothelzellen (SV HUC) und zwei unterschiedlichen Urothel-Krebszelllinien – eine mit höherer Malignität (HT 1376) und eine mit niedrigerer Malignität (5637) – durchgeführt. Die Zellen wurden entweder in Form einer Einzelzellsuspension verwendet und flowcytometrisch analysiert, oder aber bis zur Konfluenz gezüchtet und im Monolayer mit einem „Microplate Reader“ analysiert. Zur näheren Untersuchung und Absicherung wurden die quantitativen Analysen durch fluoreszenzmikroskopische Färbungen ergänzt. NP, die mit WGA modifiziert wurden (WGA-NP), hatten sowohl an Einzelzellen als auch am Monolayer gesunder und malign veränderter Zellen eine höhere Adhäsion als nicht modifizierte NP (nmNP). Einzelzellen niedrigerer Malignität wiesen die höchste WGA-NP-Bindung, die beiden anderen Zelllinien zeigten ein gleiches, aber signifikant niedrigeres Bindungsniveau. Am Monolayer war die WGA-NP-Adhäsion bei allen drei Zelllinien ähnlich stark. Die WGA-NP-Bindung war zudem konzentrations- und zeitabhängig, wobei sich das Sättigungsgleichgewicht bei Einzelzellsuspensionen viel schneller einstellte als am Zell-Monolayer. Mit Hilfe von N,N`,N``-Triacetylchitotriose konnte bei Einzelzellsuspensionen die spezifische WGA-NP-Adhäsion kompetitiv unterbunden werden, während das am Zell-Monolayer nur bei gesunden Blasenzellen der Fall war. Pulse-Chase-Untersuchungen wurden auf Zell-Monolayern durchgeführt, um festzustellen, ob die initiale, WGA-vermittelte Oberflächenbindung in einer dauerhaften Zytoadhäsion und möglicherweise einer Internalisation der Partikel resultiert. Es stellte sich heraus, dass bei Ausschaltung dynamischer metabolischer Prozesse (Chase bei 4°C), das Fluoreszenzsignal der mit WGA-NP inkubierten Zellen annähernd gleich blieb. Wurde aber die Chase-Phase bei physiologischen Temperaturen (37°C) durchgeführt, so sank die Fluoreszenz innerhalb von zwei Stunden und fünf Waschvorgängen rapide auf 10% - 20% des ursprünglichen Wertes ab. Eine fluoreszenzmikroskopische Analyse nach Beendigung der Chase-Phase zeigte zwar ebenfalls weniger WGA-NP als davor, dennoch konnte auch hier eine deutliche Anzahl von stabil an den Zell-Monolayer gebundenen WGA-NP beobachtet werden. Eine Anwendung von WGA-NP zur zielgerichteten installativen Chemotherapie des nicht-muskelinvasiven Blasenkarzinoms erscheint aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse vor allem hinsichtlich des geringen Affinitätsunterschiedes zwischen gesunden und malign veränderten Zell-Monolayern derzeit zwar eher unwahrscheinlich. Ein Einsatz zur Verlängerung der Verweildauer von Arzneistoffen in Form einer Retardarzneiform z.B. zur lokalen Therapie bei Blasenentzündung ist aber durchaus vorstellbar.
description: Adjuvant intravesical therapy has proven effective in prolonging the recurrence-free interval after resection of non-muscle-invasive cancer, which today represents the most critical challenge in the management of urothelial carcinoma from both, a clinical and economic point of view. There is, however, controversial debate on whether the still limited overall effect warrants the substantial effort associated with repeated instillations, and various device-assisted or pharmacokinetic concepts are thus under evaluation with aim of improving treatment impact by enhancing the urothelial bioavailability. Surprisingly, the potential benefit of in-situ targeted colloidal drug carriers in the micro- or nanometer regime has so far hardly been addressed as compared to other fields of oncology, and especially the use of biorecognitive principles for cytoadhesion (second-generation bioadhesive delivery systems) to improve uptake in superficial cells has not been investigated. We hypothesized that the carbohydrate-specific binding- and uptake-mechanism utilized by uropathogenic Escherichia coli to invade the bladder wall can be mimicked with lectin-decorated, biodegradable nanoparticles in order to take advantage of a more intensive particle-cell contact. For this, PLGA nanoparticles containing Bodipy® as a fluorescent label were surface-modified with wheat germ agglutinin (WGA) and characterized via flow cytometry and fluorescence readout in regard to their interaction potential with urothelial cell lines of healthy and malignant origin. The beneficial impact of WGA-coating could be clearly demonstrated and allowed for enhanced, receptor-mediated binding on both, single cells and monolayers. Experiments were followed microscopically to confirm stable surface adhesion. While rate and extent of potential WGA-triggered cell internalization still require further investigation, the strong tissue binding gained by this novel strategy presents a promising approach towards improving residence time and bioavailability of intravesically applied agents in the treatment of bladder cancer.