title: Untersuchungen zu den Mechanismen der Katalyse der Coenzym-B12 abhängigen Glutamat-Mutase von Clostridium cochlearium
title: Investigations into the mechanism of the coenzyme B12 dependent reaction catalyzed by glutamate mutase from Clostridium cochlearium
Creators: name: Lyatuu, Fredrick Edwin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Methylaspartatmutase , Clostridium cochlearium
Biowissenschaften, Biologie
Coenzym
Coenzyme B12 , Glutamate Mutase
Clostridium cochlearium

description: Aims of this study were the search
      for inhibitors of the coenzyme B12-dependent glutamate mutase
      and for insight into the first step of its catalytic
      mechanism, the homolytic cleavage of the cobalt-carbon bond.
      Glutamate mutase is composed of two separately isolated
      protein components S and E2, which in the presence of
      coenzyme B12 assemble to the active holo-glutamate mutase
      E2S2-B12 that catalyzes the reversible conversion of
      (S)-glutamate to (2S,3S)-3-methylaspartate. This reaction has
      been coupled with methylaspartase, which deaminates
      (2S,3S)-3-methylaspartate to mesaconate absorbing at 240 nm,
      to allow activity assays for glutamate mutase by
      UV-spectrophotometry. As potential inhibitors, compounds with
      sp2-centers and structural analogies to the intermediate
      radicals in the proposed mechanism were selected. Analogues
      to the 4-glutamyl radical were (E)- and (Z)-glutaconates,
      whereas analogues to the (2S,3S)-3-methyleneaspartate radical
      included itaconate, buta-1,3-diene-2,3-dicarboxylate,
      fumarate, maleate and mesaconate. Because all these compounds
      inhibited the auxiliary enzyme methylaspartase, glutamate
      mutase was incubated with these compounds for a certain time,
      followed by gelfitration on Sephadex G25. The residual
      activity of the inactivator-free enzyme was then determined
      by the coupled assay described above, whereby unexpectedly
      fumarate, maleate and mesaconate caused inactivation of the
      mutase. To check whether the other compounds acted as
      reversible inhibitors, a new assay with
      (2S,3S)-3-methylaspartate and pyruvate as substrates
      involving glutamate-pyruvate aminotransferase and the
      NADH-dependent (R)-2-hydroxyglutarate dehydrogenase was
      developed. Application of this assay showed that 2.5 mM
      itaconate and 8 mM (E)-glutaconate inhibited glutamate mutase
      in the presence of 200 mM (2S,3S)-3-methylaspartate by 50%.
      Furthermore, the kinetic constants of
      (2S,3S)-3-methylaspartate in the reaction of glutamate mutase
      were determined as Km= 7 ± 0.07 mM, kcat= 0.54 ± 0.06 s-1and
      kcatKm-1= 77 s-1M-1. Together with the kinetic constants of
      (S)-glutamate determined with the methylaspartase assay (Km =
      2.25 ± 0.03 mM, kcat = 2.85 ± 0.5 s-1 and kcatKm-1 = 1.3 ×
      10-3 s-1M-1), an equilibrium constant of Keq = [glutamate] ×
      [methylaspartate]-1 = 16 was calculated by the Briggs-Haldane
      equation close to that described in the literature (Keq =
      12). ... The mutL gene from Clostridium tetanomorphum is
      located between the structural genes of glutamate mutase. We
      speculate that MutL acts as chaperone, which removes
      cob(II)alamin from inactive glutamate mutase complexes in an
      ATP dependent manner. The liberated components E2 and S
      recombine with coenzyme B12 to form a new active enzyme. To
      check this hypothesis, mutL was successful cloned on
      pASG-IBA3 and pASG-IBA 5 expression vectors via the pre-entry
      vector IBA-20. The MutL chaperone was produced in E. coli
      Rossetta in good yields
description: Ziele dieser Untersuchungen waren
      zum einen die Suche nach neuen Inhibitoren der Coenzym-B12
      abhängigen Glutamat-Mutase und zum anderen der Mechanismus
      des ersten Schritts der Katalyse, die Homolyse der
      Kobalt-Kohlenstoff-Bindung. Das Enzym Glutamat-Mutase aus dem
      Glutamat-fermentierenden Clostridium cochlearium ist aus zwei
      getrennt isolierbaren Untereinheiten, S und E2 aufgebaut, die
      in sich in Gegenwart Coenzym-B12 zu dem enzymatisch aktiven
      Holoenzym E2S2-B12 vereinigen, das die reversible
      Isomerisierung von (S)-Glutamat zu (2S,3S)-3-Methylaspartat
      katalysiert. Diese Reaktion wurde mit der Deaminierung von
      Methylasparat zu dem bei 240 nm absorbierenden Mesaconat
      gekoppelt, um einen UV-spektrophotometrischen Test für die
      Glutamat-Mutase zu erhalten. Als potentielle Inhibitoren
      wurden Verbindungen ausgewählt, die sp2-Zentren und
      strukturelle Ähnlichkeiten zu den im Mechanismus postulierten
      Radikalen aufwiesen. Als Analoga zum 4-Glutamylreadikal
      wurden (E)- und (Z)-Glutaconat verwandt, während als Analoga
      zum 3-Methylenaspartat-Radikal Itaconat,
      Buta-1,3-dien-2,3-dicarboxylat, Mesaconat, Fumarat und Maleat
      eingesetzt wurden. Da alle diese ungesättigten Dicarbonsäuren
      das Hilfsenzym Methylaspartase inhibierten, wurde
      Glutamat-Mutase mit je einem der potentiellen Inaktivatoren
      inkubiert und nach Abtrennung der niedermolekularen
      Verbindungen mittels Gelfiltration, die Restaktivität
      bestimmt. Dabei zeigte sich, dass unerwarteter Weise nur
      Mesaconat, Fumarat und Maleat das Enzym inaktivierten. Um zu
      prüfen, ob die anderen Verbindungen das Enzym reversibel
      inhibierten, wurde ein neuer Test mit
      (2S,3S)-3-Methylaspartat, Pyruvat und NAD+ als Substrate
      ausgearbeitet. Mit Hilfe der Enzyme
      Glutamat-Pyruvat-Aminotransferase und
      (R)-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase konnte die Bildung von
      Glutamat bei 340 nm gemessen werden. Dabei zeigte es sich,
      dass 2.5 mM Itaconat oder 8 mM (E)-Glutaconat die
      Glutamat-Mutase in Gegenwart von 200 mM
      (2S,3S)-3-Methylaspartat zu 50% inhibierten. Zur Überprüfung
      der Zuverlässigkeit des neuen Tests wurden die kinetischen
      Konstanten für (2S,3S)-3-Methylaspartat bestimmt: Km= 7 ±
      0.07 mM, kcat= 0.54 ± 0.6 s-1and kcatKm-1= 77 s-1M-1. Daraus
      berechnet sich mit den bekannten Konstanten für Glutamat und
      der Briggs-Haldane Gleichung die Gleichgewichtskonstante Keq
      = [Glutamat] × [Methylaspartat]-1 = 16, die mit dem
      Literaturwert von 12 gut übereinstimmt. ... Das mutL Gen von
      Clostridium tetanomorphum liegt zwischen den strukturellen
      Genen der Glutamat-Mutase, mutE and mutS. Wir spekulieren,
      dass MutL als ATP-abhängiges Chaperon Co(II)alamin aus
      inaktiven Glutamat-Mutase-Komplexen entfernt. Die dabei
      freigesetzten Komponenten MutE und MutS vereinigen sich mit
      Coenzym B12 wieder zum aktiven Enzym. Um diese Hypothese zu
      überprüfen, wurde mutL in pASG-IBA3 und pASG-IBA5
      Expressionsvektoren über den pre-entry vector IBA-20
      kloniert. Die Expression in E. coli Rossetta führte zu guten
      Ausbeuten.