title: Structural and functional characterization of components of the eukaryotic iron-sulfur-cluster biogenesis machinery
title: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Komponenten der eukaryotischen Eisen-Schwefel-Cluster-Biogenese-Maschinerie
Creators: name: Webert, Holger
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: cofactor-biogenesis
ISC-Maschinerie
Eisen-Schwefel-Cluster
Iron-sulfur-cluster
Kofaktor-Biogenese
iron-sulfur-protein
ISC-machinery
Biowissenschaften, Biologie
ferredoxin
Biogenese
Ferredoxin
Eisen-Schwefel-Protein

description: Iron-sulfur clusters
      (Fe/S-clusters) are essential and versatile cofactors of
      numerous proteins and are present in virtually all living
      organism. Despite their relatively simple structure, their
      biosynthesis and assembly into apoproteins requires complex
      multi-protein biosynthesis-machineries which are conserved in
      eukaryotes. In the eukaryotic model organism S. cerevisiae
      the biogenesis of mitochondrial Fe/S-proteins depends on the
      mitochondrial ISC assembly system, whereas the synthesis of
      cytosolic and nuclear Fe/S-proteins additionally requires the
      mitochondrial ISC export machinery and the cytosolic CIA
      machinery. The biosynthesis of both mitochondrial and
      cytosolic nuclear Fe/S-proteins occurs in two major steps.
      First, an Fe/S-cluster is synthesized de novo on a scaffold
      protein. Second, the preassembled Fe/S-cluster is transferred
      and inserted in the target apoprotein. Whereas nearly all
      components of the biosynthesis machineries have been
      identified, the molecular mechanisms of Fe/S-cluster
      biosynthesis within the living cell are widely unknown. The
      de novo synthesis of Fe/S-clusters on the scaffold protein
      Isu1 of the mitochondrial ISC-assembly machinery requires an
      electron transfer by the NAD(P)H - ferredoxin reductase -
      ferredoxin chain. In the first part of this study it was
      shown that mitochondrial ferredoxins functionally and
      structurally are comprised of three distinct subclasses.
      Whereas members of the first subclass like human ferredoxin
      Fdx2 are specifically required for Fe/S-cluster biogenesis
      and heme A biosynthesis, ferredoxins of the second subclass
      such as the Fdx2-related human Fdx1 deliver electrons for
      steroid biosynthesis by cytochrome P450 enzymes (CYP). The
      third subclass is formed by the even more versatile
      ferredoxins from fungi including Yah1 from S. cerevisiae,
      which in addition to the functions of Fdx2, also plays an
      important role in the biosynthesis of coenzyme Q6. In this
      work, the three dimensional structure of human ferredoxin
      Fdx2 was determined at 1,7 Å resolution using X ray structure
      analysis. The folding of Fdx2 is virtually identical to that
      of Fdx1, despite the distinct substrate specificities of the
      two proteins. Structural differences were only observed in
      α-helix C and the region right after α-helix C. Genetic and
      biochemical experiments showed that the highly conserved
      C-terminus of Fdx2 is essential for its specific in vivo
      function in the biogenesis of Fe/S-clusters. An Fdx1 protein,
      which functions in Fe/S-cluster biogenesis, was successfully
      generated after exchange of the last 27 amino acids against
      the respective sequence from Fdx2. Further amino acid
      exchanges in the region of α-helix C and the loop covering
      the Fe/S-cluster increased the functionality showing the
      importance of these regions for substrate specificity. Vice
      versa, the generation of electron transfer capacity from Fdx2
      to CYP was successful after introduction of the key mutation
      R73E. In this case, the gain of function was independent of
      the C terminus. The efficiency of specificity transfer was
      not complete; hence the key residue 73 is not solely
      responsible for the functional specificity. In fact, other
      global factors within the structure of the protein contribute
      to the specificity. It appears that the positively charged
      residue R73 in Fdx2 may inhibit transfer of electrons to CYP.
      Theoretical analysis of the dipole moment revealed an almost
      perpendicular orientation within the ferredoxins Fdx1 and
      Fdx2, despite their striking structural similarity. As the
      interaction of the highly charged ferredoxins with protein
      partners is based on charge-charge interactions, the
      difference in dipole moment orientation suggests an
      electrostatically driven steering mechanism during the
      encounter of the ferredoxins with their respective electron
      acceptors as a possible reason for their high degree of
      functional specificity. The steering effect might be a
      general mechanistic principle during the approach of proteins
      in electron transfer reactions. ..
description: Eisen-Schwefel-Cluster
      (Fe/S-Cluster) sind essentielle und vielseitige Kofaktoren
      zahlreicher Proteine und kommen in allen bekannten
      Lebensformen vor. Trotz ihrer vergleichsweise einfachen
      Struktur erfordert ihre Biosynthese und der Einbau in
      Apoproteine komplexe Synthesemaschinerien, die evolutionär
      konserviert sind. Im eukaryotischen Modellorganismus S.
      cerevisiae hängt die Biogenese mitochondrialer Fe/S-Proteine
      von der mitochondrialen ISC-Maschinerie ab, während die
      Synthese zytosolischer und nukleärer Fe/S-Proteine zusätzlich
      noch die mitochondriale ISC-Export- und die zytosolische CIA
      Maschinerie erfordert. Sowohl die Biosynthese mitochondrialer
      Fe/S-Proteine als auch die von zytosolischen oder nukleären
      Fe/S Proteinen kann in zwei biochemische Hauptreaktionen
      eingeteilt werden. Nach der de novo Assemblierung eines Fe/S
      Clusters auf einem Gerüstprotein wird der so vorgefertigte
      Cluster auf das eigentliche Zielprotein übertragen und dort
      inseriert. Während nahezu alle Komponenten der
      Biogenesemaschinerien mittlerweile bekannt sind, ist der
      molekulare Mechanismus der in vivo Fe/S-Cluster Biosynthese
      noch in vielen Punkten ungeklärt. Für die de novo
      Assemblierung von Fe/S-Clustern auf dem Gerüstprotein Isu1
      der mitochondrialen ISC-Maschinerie ist die
      Elektronenübertragung durch ein Ferredoxin essentiell. Im
      ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich
      eukaryotische mitochondriale Ferredoxine funktionell und
      strukturell in drei Untergruppen aufteilen lassen. Während
      die Mitglieder der ersten Untergruppe wie humanes Ferredoxin
      Fdx2 spezifisch an der Fe/S-Cluster Biogenese und der Häm A
      Biosynthese beteiligt sind, liefern die Ferredoxine der
      zweiten Untergruppe wie das Fdx2-verwandte humane Ferredoxin
      Fdx1 Elektronen für die Steroidbiogenese durch Cytochrom P450
      Enzyme (CYP). Die dritte Untergruppe bilden die noch
      vielseitigeren Ferredoxine aus Pilzen wie Yah1 aus S.
      cerevisiae, das neben den Funktionen des Fdx2 auch noch eine
      essentielle Rolle in der Biosynthese von Koenzym Q6 spielt.
      In dieser Arbeit wurde die Struktur des humanen Ferredoxins
      Fdx2 mit einer Auflösung von 1,7 Å durch
      Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Im Vergleich zur schon
      bekannten Struktur von Fdx1 besitzt Fdx2 eine nahezu
      identische Faltung. Strukturelle Unterschiede wurden nur in
      der α-Helix C sowie im Bereich nach α-Helix C gefunden. Dies
      warf die Frage nach der strukturellen Basis für die hohe
      Substratspezifität der beiden humanen Ferredoxine auf. Durch
      genetische und biochemische Experimente konnte gezeigt
      werden, dass der hoch konservierte C Terminus von Fdx2
      essentiell für die in vivo Funktion des Proteins in der
      Biogenese von Fe/S-Clustern ist. Ein in der Fe/S-Cluster
      Biogenese funktionelles Fdx1 konnte durch die Übertragung der
      27 C-terminalen Aminosäuren des Fdx2 an den Fdx1 C-Terminus
      erzeugt werden. Weitere Sequenzaustausche im Bereich der α
      Helix C sowie in der Fe/S-Cluster-bedeckenden Schlaufe
      erhöhten die Funktionsfähigkeit des Fdx1 in der Fe/S
      Proteinbiogenese, was die Rolle dieser Reste bei der
      Erzeugung der Substratspezifität nachweist. Umgekehrt gelang
      es, in Fdx2 eine Elektronenübertragungsfunktion auf CYP
      einzuführen. Die hierfür kritische Mutation wurde als R73E
      identifiziert. Die Umfunktionalisierung des Fdx2 war
      überraschenderweise nicht abhängig von der Sequenz am C
      Terminus. Da die Funktionsübertragung durch die R73E Mutation
      nur partiell erfolgte, scheint diese Schlüsselaminosäure
      nicht allein verantwortlich für die Spezifität von Fdx1 für
      CYP zu sein. Der positiv geladene Rest R73 im Fdx2 könnte
      daher eher verhindern, dass dieses Ferredoxin Elektronen auf
      CYP übertragen kann. Die theoretische Analyse des
      Dipolmomentes der Ferredoxine Fdx1 und Fdx2 ergab, dass die
      Dipolmomentvektoren der beiden Ferredoxine nahezu senkrecht
      zueinander stehen. Da die Interaktion der hochgeladenen
      Ferredoxine mit ihren Proteinpartnern auf
      Ladungswechselwirkungen beruht, deutet dieser Unterschied auf
      einen elektrostatischen Steuerungseffekt bei der Annäherung
      der Ferredoxine an den entsprechenden Elektronenakzeptor als
      mögliche Unterstützung der Funktionsspezifität hin. Ein
      solcher Steuerungseffekt könnte ein allgemeines Prinzip bei
      der Annäherung von Proteinen in transienten
      Elektronentransferkomplexen darstellen. ..