title: Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und HAT
title: Synthesis and characterization of the haemagglutinin-cleaving proteases furin and HAT
Creators: name: Sielaff, Frank
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Enzyminhibitor
influenza
Inhibitor
Influenza-A-Virus
Furin
Vogelgrippe
flu
Naturwissenschaften
Grippe
Serinprotease
inhibitor
HAT
furin

description: Inhibitors of the haemagglutinin
      cleaving proteases furin and HAT were synthesized and
      characterized in this thesis. While the proproteinconvertase
      furin is activating the haemagglutinin (HA) of highly
      pathogenic influenza viruses of the subtype H5 and H7, the
      trypsin-like serine protease HAT activates the HA of seasonal
      influenzaviruses of the subtypes H1, H2 and H3. Therefore,
      the described inhibitors may be useful tools for the
      development of new antiviral drugs for the treatment of the
      flu. In a first screening a bis-amidinohydrazone-derivate was
      identified as a lead structure for new low molecular weight
      furin inhibitors, which was modified in four subsequent
      synthesis cycles. Commercially available carbonyl compounds
      were used in a first series. The most potent derivative was
      derived from terephthalaldehyde and possesses an inhibitory
      constant of 1,5 µM. Inhibitors with three or four basic
      residues were obtained from second and third series. The
      coupling of 4-guanidionbutyric acid to the lead structure in
      the second series and the dimerization of the initial
      screening hit with chloroaceticacidchloride led to compounds
      with a inhibitory potency of 0,5 to 0,6 µM. A known
      salicylaldehyde benzylether-derived compound was used as a
      lead structure of the fourth series. However, all inhibitors
      from this attempt were less potent than the lead structure.
      With one exception all amidinohydrazone derived inhibitors
      from this thesis feature a high selectivity against the
      related trypsin-like serineproteases thrombin, factor Xa and
      plasmin (Ki &gt; 30 µM). Until now only few inhibitors for
      the trypsin-like serinportease HAT were described. Thus, the
      first attempt in this field was the screening of available
      compounds for HAT inhibition. Besides, substrate analogue
      compounds with a 4-amidinobenyzlamide moiety on the
      C-terminal part and inhibitors with a 3-amidinophenylalanine
      of the TAPAP-type were identified as possible starting points
      for the development of HAT inhibitors. For all substrate
      analogue inhibitors a P4-benzylsulfonyl residue and a
      P1-Amidinobenzylamidine residue were used. In a first series
      with a proline in P2-position, several d-configurated
      aminoacids were well-accepted in P3-position. Especially
      d-Arg and d-homo-Arg were favored as a P3-residue.
      Nevertheless, hydrophobic derivatives, like a tert.-butyl
      protected d-Asp or d-Glu, were also well-suited for
      incorporation. Due to the preference of HAT for basic or
      hydrophobic amino acids in P3, cyclized amines were coupled
      to the side chains of d-Asp or d-Glu in a second series. Most
      potent compound from this attempt was obtained via coupling
      of 1-(2-pyrimidyl)piperazin to the free side chain of d-Glu
      (Ki = 17 nM). Substrate analogue inhibitors with a P2-Proline
      are common inhibitors of several trypsine-like proteases.
      Hence, the influence of other amino acid residues replacing
      the proline was examined keeping d-Arg in P3-position. Small
      hydrophobic residues like 2-aminobutyric acid (Abu),
      norvaline (Nva), Ala or Val are a good replacement for
      proline and the compounds inhibit HAT with Ki-values below 30
      nM. An advantage of these inhibitors is their enhanced
      selectivity against the other tested proteases thrombin,
      factor Xa and plasmin. Selected compounds were also tested in
      cell based assays to examine their ability to suppress viral
      replication. In these experiments the inhibitors with an Abu
      or Nva residue in P2-position effectively inhibit the
      replication of influenza viruses of the subtypes H1 and H3.
      It should be noted that this effect is not associated with
      any toxic effects to the cells. Several substrate analogue
      compounds which inhibit HAT with inhibition constants &lt; 30
      nM are presented in this thesis. Contrary to until now known
      antiviral drugs, the synthesized compounds are targeting host
      cell proteases. Therefore, there will be no rising of
      resistances against these drugs.
description: In der vorliegenden Arbeit wurden
      Inhibitoren der hämagglutininspaltenden Proteasen Furin und
      HAT synthetisiert und charakterisiert. Während die
      Proproteinkonvertase Furin das Hämagglutinin (HA)
      hochpathogener Influenzaviren vom Subtyp H5 und H7 aktiviert,
      bewirkt die trypsinartige Serinprotease HAT die Spaltung des
      HA saisonaler Influenzaviren der Subtypen H1, H2 und H3. Die
      entwickelten Hemmstoffe dieser Proteasen können somit als
      Ausgangsstoffe für die Entwicklung neuer antiviraler
      Wirkstoffe zur Therapie der Influenza dienen. Ein
      Bis-Amidinohydrazonderivat wurde in einem screening als
      Startpunkt für die Entwicklung neuer niedermolekularer
      Furininhibitoren identifiziert. In vier Syntheseserien wurden
      Furininhibitoren dieses Typs dargestellt. In der ersten Serie
      wurden kommerziell erhältliche Carbonylverbindungen als
      Ausgangsmaterial verwendet. Die wirksamste Verbindung dieser
      Serie mit einem Ki-Wert von 1,5 µM ist der vom
      Terephthalaldehyd abgeleitete Inhibitor. In zwei weiteren
      Serien wurden Derivate mit drei oder vier basischen
      Funktionen synthetisiert. Die Kopplung von 4
      Guanidinobuttersäure an die Leitstruktur MI-0007 in der
      zweiten Serie und die Darstellung tetrabasischer Verbindungen
      unter Verwendung von in der dritten Serie führten zu
      Inhibitoren mit Hemmkonstanten von 0,5 - 0,6 µM. Ein aus der
      Literatur bekanntes, vom Salicylaldehydbenzylether
      abgeleitetes, monovalentes Amidinohydrazon mit einem Ki-Wert
      von 11,8 µM wurde als Leitstruktur einer vierten Serie von
      Furininhibitoren genutzt. Jedoch waren die Verbindungen
      dieser Serie weniger wirksam als die entsprechende aus der
      Literatur bekannte Ausgangsverbindung. Mit Ausnahme einer
      Verbindung, weisen alle im Rahmen dieser Arbeit
      synthetisierten Amidinohydrazonderivate eine hohe
      Selektivität gegenüber den untersuchten trypsinartigen
      Serinproteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin auf (Ki-Werte
      &gt; 30 µM). Für die trypsinartige Serinprotease HAT wurden
      bisher nur wenige Inhibitoren in der Literatur beschrieben.
      Deshalb begannen die Arbeiten zur Entwicklung der
      HAT-Inhibitoren mit einer Testung von im Arbeitskreis
      verfügbaren Verbindungen. Neben substratanalogen Inhibitoren
      mit einem C terminalen 4-Amidinobenzylamid konnten
      Verbindungen mit einem zentralen 3-Amidinophenylalanin des
      3-TAPAP-Typs als Startpunkte für die Entwicklung von
      HAT-Hemmstoffen identifiziert werden. In sämtliche
      substratanaloge Inhibitoren wurde in P4- ein
      Benzylsulfonylrest und in P1-Position ein 4-Amidinobenzylamid
      eingebaut. In einer ersten Serie mit einem Prolin als P2-Rest
      wurden in P3 Position verschiedene D-Aminosäurereste
      akzeptiert, besonders jedoch das basische D-Arginin oder
      D-homo-Arginin. Akzeptiert werden auch hydrophobe
      Aminosäurederivate, wie ein tert.-butyl-geschütztes D-Asp
      oder D-Glu (Ki &lt; 40 nM). Aufgrund der Präferenz für
      basische und hydrophobe Aminosäurereste in P3-Position,
      wurden in einer zweiten Serie die Seitenketten von D-Asp und
      D-Glu mit verschiedenen zyklischen Aminen modifiziert. Die
      wirksamste Verbindung wurde durch Kopplung von
      1-(2-Pyrimidyl)piperazin an die Seitenkette von D-Glu
      erhalten und hemmt HAT mit einem Ki-Wert von 17 nM. Da
      substratanaloge Inhibitoren mit einem P2-Prolin häufig auch
      andere trypsinartige Serinproteasen hemmen, wurde der
      Einfluss anderer Aminosäuren in P2-Position in Kombination
      mit D-Arginin als P3-Rest untersucht. Die stärkste
      Hemmwirkung innerhalb dieser Serie mit Ki Werten &lt; 30 nM
      wurde für kleine hydrophobe Aminosäurereste, wie
      2-Aminobuttersäure (Abu), Norvalin (Nva), Valin oder Alanin
      gefunden. Ein Vorteil der Derivate mit Abu oder Nva in
      P2-Position ist deren verbesserte Selektivität gegenüber den
      Proteasen Thrombin, Faktor Xa und Plasmin. Die Verbindung
      Bzls-D-Arg-Nva-4-Amidinobenzylamid ist mit einer
      Hemmkonstante von 15 nM der erste Inhibitor, der die anderen
      getesteten Proteasen schwächer hemmt und somit die höchste
      Selektivität für HAT aufweist. Ausgewählte substratanaloge
      Inhibitoren wurden in Zellkulturversuchen eingesetzt, um die
      Hemmung der Vermehrung von Influenzaviren zu untersuchen.
      Eine besonders starke Hemmwirkung auf Influenzaviren der
      Subtypen H1 und H3 wurde durch Inhibitoren mit Norvalin oder
      2-Aminobuttersäure in P2-Position bestimmt. Die Inhibitoren
      weisen darüber hinaus keine signifikante Zytotoxizität auf,
      so dass die reduzierte Virusausbreitung auf die HAT-Hemmung
      zurückzuführen ist. In der vorliegenden Arbeit wurden
      zahlreiche substratanaloge Inhibitoren identifiziert, die HAT
      mit Ki-Werten &lt; 30 nM hemmen. Im Gegensatz zu den bereits
      etablierten antiviralen Wirkstoffen hemmen alle im Rahmen
      dieser Arbeit entwickelten Furin- und HAT-Inhibitoren
      Zielstrukturen des Wirts. Deshalb sollten auch bei längerer
      Verwendung dieser Verbindungen keine Resistenzen
      auftreten.