title: Influence of Int1 and the repeat clusters on the inversion of the central region of PhiCh1
Creators: name: Beer, Clara
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Der gemäßigte Kopf-Schwanz-Virus PhiCh1 beherbergt sich wiederholende Cluster (ORF34, ORF36) und eine Invertase (int1) in der zentralen Region seines Genoms. Die Inversion der 3'-Enden von ORF34 und ORF36 führt zur Expression eines rekombinanten Proteins gp3452, das wiederum an der Infektion von N. magadii beteiligt ist, seinem einzig bekannten Wirt. Zur weiteren Untersuchung dieser Inversion wurden zwei verschiedene Plasmide in N. magadii L13 geklont, einen von dem Virus geheilten Stamm, die entweder ORF34, int1 und ORF36 oder nur ORF34 und ORF36 enthielten. Die Proben der Wachstumskurven wurden mittels PCR analysiert. Da Polymerasen bei der Amplifikation von repetitiven Sequenzen bekanntermaßen unzuverlässig sind und die Ergebnisse stark von früheren Ergebnissen abwichen, die mit einer inzwischen nicht mehr verfügbaren Polymerase erzielt wurden, konnte keine konkrete Schlussfolgerung gezogen werden. Zusätzlich wurden int1-Deletionsmutanten durch Deletionsplasmide hergestellt. Die Deletion wurde mittels PCR und Southern Blot bestätigt, gefolgt von Plaque-Assays und Western Blots. Die beiden untersuchten Mutanten wiesen unterschiedliche Infektiositäten auf, da ein Klon vermutlich ORF34 in seiner nicht rekombinierten Form und der andere in seiner rekombinierten Form trägt. Aufgrund von PCR-Ungenauigkeiten war es nicht möglich, die Klone zweifelsfrei zu klassifizieren. Die Western Blots der beiden zeigten ein Signal für das rekombinante gp3452, aber der verwendete Antikörper konnte bisher nicht zwischen gp34 und gp36 unterscheiden. Daher sind weitere Untersuchungen notwendig. Außerdem wurde ein Deletionsplasmid von ORF36 in umgekehrter Orientierung konstruiert, um eine ORF36 Mutante zu erzeugen. Bislang konnte aber noch kein positiver Klon identifiziert werden.
description: The temperate head-tail virus PhiCh1 harbors repeat clusters (ORF34, ORF36) and an invertase (int1) in the central region of its genome. The inversion of the 3’ ends of ORF34 and ORF36 leads to the expression of a recombined protein gp3452 which in turn is involved in the infection of N. magadii, its only known host. To further investigate this inversion reaction, two different plasmids were cloned into N. magadii L13, a strain cured of the virus, containing either ORF34, int1 and ORF36 or only ORF34 and ORF36. Growth curve samples were analyzed via PCR. As polymerases are known to be unreliable when amplifying repetitive sequences and the results differed greatly from previous ones achieved with a now unavailable polymerase, no concrete conclusions could be drawn. Furthermore, int1 deletion mutants were produced through deletion plasmids. The deletion was confirmed via PCR and Southern Blot followed by plaque assays and Western Blots. The two investigated mutants showed different infectivities as one clone presumably carries ORF34 in its unrecombined form and the other in its recombined form. Due to PCR inaccuracies, it was not possible to classify the clones without doubt. The Western Blot of both showed a signal for the recombined gp3452 but the used antibody could previously not distinguish between gp34 and gp36. Therefore, further investigations are needed. Moreover, a deletion plasmid of ORF36 in its reverse orientation was constructed to produce a ORF36 mutant. So far no positive clones were obtained.