Die Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Hdp2 und dessen Rolle in der biotrophen Phase von $\textit{Ustilago maydis}$
Creators: name: Jurca, Matteo
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2022
Subjects: Ustilago maydis
Hdp2
Genregulation
ChIP-Seq

description: Ustilago maydis ist ein phytopathogener Basidiomyzet, dessen dimorpher Lebenszyklus die sexuelle und pathogenen Entwicklung miteinander verknüpft und in Abhängigkeit des Wirts Zea mays abläuft. Die Transition von saprophytischer zu biotropher Phase erfordert hierbei eine streng regulierte und komplexe Integration verschiedenster Signalwege, die über ein hierarchisches Transkriptionsfaktornetzwerk realisiert wird. Nach erfolgter Zellfusion zweier kompatibler Sporidien, die über ein Pheromon-/Rezeptorsystem vermittelt wird, bildet sich ein dikaryotisches Filament, welches die biotrophe Phase einleitet. Die hierbei eingesetzte Regulationskaskade unterliegt der Kontrolle der vom b-Locus kodierten, heterodimeren Transkriptionsfaktoren bE und bW, die neben dem filamentösen Wachstum und einem G2-Zellzyklusarrest die Induktion weiterer Transkriptionsfaktoren auslösen. Der bW/bE-abhängig exprimierte Zinkfingertranskriptionsfaktor Rbf1 steuert dabei als zentraler Regulator 90 % der b-regulierten Gene. Rbf1 ist, unabhängig von b, sowohl notwendig als auch ausreichend für die Initiation der pathogenen Entwicklung; für den weiteren Infektionsverlauf ist b notwendig. Die Expression von rbf1 während der Infektion unterliegt einer strengen Kontrolle; während es auf der Blattoberfläche zur Induktion kommt, reprimiert die Interaktion zwischen bW/bE und Clp1, einem weiteren direkt b-induzierten Faktor, die rbf1 Expression. Zwei Tage nach der Infektion ist keine rbf1 Expression mehr nachweisbar. Mikroskopische und qRT-PCR Analysen in dieser Arbeit konnten zeigen, dass rbf1 lediglich für den Übergang zur biotrophen Phase benötigt wird, da eine prolongierte Expression zu einer aberranten Zellkernverteilung und zum Verlust der Virulenz führt. Während rbf1 selbst jedoch unmittelbar nach der Penetration nicht mehr aktiv ist, werden ungefähr die Hälfte der rbf1-regulierten Gene auch im weiteren Infektionsverlauf in planta exprimiert. Diese Weiterführung der Regulation wird durch die rbf1-abhängigen Transkriptionsfaktoren Hdp2 und Biz1 realisiert. Neben Aufrechterhaltung der Expression rbf1-vermittelter Gene, treibt vor allem Hdp2 die biotrophe Phase von U. maydis voran. ChIP-Seq Analysen konnten die Bindung von Hdp2 an zahlreiche Promotoren von pathogenitätsrelevanten Genen in planta zeigen und deuten nicht nur auf eine Regulation von charakterisierten Effektoren, sondern auch auf eine Weiterführung der Signalkaskade durch die Kontrolle weiterer Transkriptionsfaktoren hin. hdp2 selbst unterliegt einer komplexen Kontrolle, die ein Zusammenspiel aus verschiedenen Transkriptionsfaktoren und zwei alternativen Promotoren erfordert. Auf der Blattoberfläche wird hdp2 von Rbf1 induziert, das nach der Penetration der Pflanze von Biz1 abgelöst wird. Die Übernahme der Regulation durch Biz1 erfolgt, nachdem ein gewisser Schwellenwert von Biz1 erreicht ist und ist gleichzeitig mit einem Wechsel der Promotoren verbunden. Während Rbf1 vor einem 5‘-Exon von hdp2 bindet, findet die Bindung von Biz1 innerhalb des Introns statt, wodurch ein Transkript entsteht, das ein alternatives Startcodon bei der Translation verwendet und Hdp2 um 55 Aminosäuren verlängert. Die beiden Hdp2 Isoformen, Hdp2S und Hdp2L, weisen keine signifikanten Unterschiede bezüglich konservierter Domänen auf und zeigen keine Unterschiede hinsichtlich der Induktion von Zielgenen oder der pathogenen Entwicklung. Die Proteinvarianten sind damit als Nebenprodukte der Verwendung von zwei unterschiedlichen entwicklungsabhängigen Promotoren zu interpretieren. Die Verwendung alternativer Promotoren wurde genomweit analysiert und konnte bei weiteren pathogenitätsrelevanten Genen identifiziert werden. Dies liefert Hinweise auf eine stadienspezifische Regulation dieser Gene während der Transition von saprophytischer zu biotropher Phase von U. maydis und wird von den Hauptregulatoren Rbf1, Hdp2 und Biz1 maßgeblich kontrolliert. Die entwicklungsspezifische Regulation besitzt dabei eine Ähnlichkeit mit der in höheren Eukaryoten und ist ein Novum in Pilzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen wesentlich dazu bei, das Verständnis für den regulatorischen Aspekt der frühen biotrophen Phase und deren beteiligte Faktoren näher zu erweitern, wodurch neue Anhaltspunkte für anschließende Untersuchungen der pathogenen Entwicklung von U. maydis erlangt werden konnten.