Transglutaminase, nutrition and human health
Creators: name: GIORDANO, DEBORAH
Publisher: name: Universit� degli Studi di Foggia
Year: 2019

description: Conoscenze preesistenti: Le transglutaminasi (TGase) sono una classe di enzimi ampiamente diffusa tra gli organismi procarioti ed eucarioti. Gli enzimi di questa famiglia catalizzano modifiche post-traduzionali in molte proteine attraverso reazioni di trasferimento dell?acile, reazioni di deaminazione e di crosslinking (polimerizzazione) tra residui peptidici di lisina (accettore di acile) e glutammina (donatore di acile) intra- o inter-catena proteica. A causa della sua facilit� di espressione e di purificazione, l?unica TGase ampiamente usata per le applicazioni industriali � la TGase microbica estratta da Streptomyces mobaraensis (MTGase). Oggigiorno la MTGase � disponibile in commercio ed � ampiamente usata nell?industria dei biopolimeri, in cosmetica, per applicazioni cliniche, nell?industria tessile della lana e soprattutto nell?industria alimentare. La sua abilit� di catalizzare legami crociati in molti substrati proteici differenti � sempre pi� usata non solo per la produzione di salsicce, prosciutti e formaggi ma, molto recentemente, anche per la detossificazione della farina, come possibile terapia alternativa alla dieta senza glutine. Ne consegue che oggigiorno le applicazioni industriali della MTGase stiano aumentando, coinvolgendo sempre pi� settori e producendo una ricerca scientifica su questo argomento sempre pi� fervente, allo scopo di tentare di rispondere a specifiche esigenze industriali, come l?implementazione di sistemi di purificazione della MTGase pi� efficienti, la ricerca di fonti alternative di transglutaminasi microbica, e di fonti sicure di enzimi ricombinanti. Scopo del progetto di dottorato: lo scopo principale del progetto � l?identificazione di nuove forme di transglutaminasi microbica che possano diventare un?alternativa a quella attualmente in uso. � stata eseguita un?analisi approfondita delle sequenze note allo scopo di ottenere una classificazione delle TGase microbiche attraverso la loro similarit� a forme note. Per selezionare le migliori candidate che possano essere forme attive in appropriate condizioni, le sequenze selezionate sono state soggette di modellamento molecolare e simulazioni molecolari. Per testare l?attivit� enzimatica, sono stati effettuati dei saggi sperimentali su una nuova forma trovata ed un?ulteriore nuova forma � stata espressa. Risultati: il presente lavoro propone in primo luogo un?analisi, ad oggi assente, dell?ampio panorama delle transglutaminasi microbiche, sviluppando la prima classificazione delle TGase microbiche basata sulle loro caratteristiche di sequenza e sulle loro specifiche strutture secondarie predette. Al fine di classificare ed analizzare le caratteristiche strutturali di tutte le sequenze annotate come aventi un TGase core, sono state utilizzate tecniche computazionali che coinvolgono analisi di sequenza, studi comparativi, costruzione di alberi filogenetici, modellamento per omologia e simulazioni di dinamica molecolare. Tramite questo approccio, � stata effettuata una classificazione preliminare di queste sequenze dividendole in cinque gruppi principali. Ogni gruppo � stato studiato dal punto di vista delle sequenze per analizzare la presenza di motifs specifici. Per tre di questi cinque gruppi, sono state studiate anche le strutture secondarie e, da questa analisi, sono state rilevate caratteristiche specifiche per ogni gruppo. Inoltre, due nuove forme di TGase microbica (mTGase) sono state studiate in dettaglio: K. albida mTGase e l?ipotetica mTGase da SaNDy (organismo non rivelato per possibilit� di brevetto). Per la prima, in comparazione con la MTGase, sono state effettuate analisi della tasca relativa al sito attivo e simulazioni di dinamica molecolare. Per la seconda, invece, sono state utilizzate tecniche sperimentali per purificare l?ipotetico enzima al fine di testarne l?attivit� su substrati alimentari. Saggi sperimentali su entrambe le proteine sono ancora in corso, al fine di trovare le migliori condizioni di attivit� enzimatica e i migliori substrati di reazione. Le simulazioni di dinamica molecolare eseguite sulla mTGase di K. albida hanno suggerito alcune spiegazioni alla maggiore specificit� di questo enzima rispetto alla MTGase, dimostrata sperimentalmente da Steffan e colleghi, ed alcune indicazioni per variare le condizioni di attivit� usate per testarla. Inoltre, l?analisi dei substrati ha permesso di trovare nuovi possibili substrati, sui quali l?enzima potrebbe essere impiegato ai fini della riduzione delle allergenicit�. D?altro canto, l?enzima estratto da SaNDy, mostrando una pi� alta somiglianza con la MTGase, potrebbe essere meno selettivo della mTGase da K. albida nei confronti di specifici substrati, pertanto potrebbe essere possibile una sua applicazione anche su substrati gliadinici, tuttavia, per provare ci�, sono necessari ulteriori esperimenti. Note: il presente lavoro di dottorato � stato principalmente svolto presso il Laboratorio di Bioinformatica del CNR di Avellino sotto la supervisione del Dr. Facchiano, tuttavia, tutte le simulazioni di dinamica molecolare sono state eseguite presso il Dipartimento di Biochimica dell?Universit� di Zurigo, nel laboratorio di biologia strutturale e computazionale sotto la supervisione del Prof. A. Caflisch e del suo gruppo di ricerca (periodo di formazione all?estero obbligatorio). I saggi di attivit� sperimentale sul substrato gliadinico sono stati effettuati dal laboratorio di spettrometria di massa CeSMA-ProBio presso il CNR di Avellino; e l?ipotetica mTGase da SaNDy � stata invece clonata, espressa e purificata durante la collaborazione con il laboratorio di Molecular Sensing presso il CNR of Avellino.