Κλωνοποίηση, έκφραση και χαρακτηριστμός γλυκοπρωτεϊνών του ιού Hepatitis (HCV) με τη χρήση ανασυνδυασμένων ιϊκών φορέων βασισμένων στον ιό Hespes simplex 1 (HSV-1)
Creators: name: Κουβάτσης, Βλάσιος Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Ιός Ηπατίτιδας C (HCV)
Γλυκοπρωτείνης ιικού φακέλου
Χιμαιρικές πρωτεϊνες
Ανασυνδυασμένοι ερπητοϊοί
Hepatitis C virus (HCV)
Viral envelope glycoproteins
Chimeric proteins
Recombinant herpesviruses

description: Ο ιός της Ηπατίτιδας C (HCV) είναι ο κύριος αιτιολογικός παράγοντας ασθενειών του ήπατος, συμπεριλαμβανομένης της χρόνιας ηπατίτιδας, της κίρρωσης και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας Flaviviridae και πρόκειται για ένα μικρού μεγέθους ιό με φάκελο. Το γονιδίωμα είναι ένα θετικής πολικότητας μονόκλωνο μόριο RNA που κωδικοποιεί μια πρόδρομη πολυπρωτεΐνη μήκους ~ 3100 αμινοξέων, η οποία ωριμάζει συν- ή μετα-μεταφραστικά από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες σε τουλάχιστον 10 ώριμες πρωτεΐνες. Οι δύο γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου, Ε1 και Ε2, είναι τύπου Ι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με μεγάλου μήκους Ν-τελική εξωπεριοχή που φέρει πολλάπλες θέσεις Ν-γλυκοσυλίωσης και μια C-τελική περιοχή που περιέχει σινιάλα κατακράτησης στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ). Οι περισσότερες θέσεις γλυκοσυλιώσεις (5 και 11 για την Ε1 και Ε2, αντίστοιχα) είναι καλά συντηρημένες και παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών του φακέλου, οι οποίες εξετάζονται αναφορικά με το ρόλο τους στην είσοδο του ιού στα κύτταρα ξενιστές. Μετά τη σύνθεσή τους, οι γλυκοπρωτεΐνες συγκροτούν μη ομοιοπολικά δομόμουμενα ετεροδιμερή μέσω των διαμεμβρανικών τους περιοχών. Τα ετεροδιμερή Ε1/Ε2 εντοπίζονται κυρίως στο ΕΔ, το προτεινόμενο κυτταρικό διαμέρισμα για τη συγκρότηση του ιικού σωματίου. Η απουσία μέχρι πρόσφατα κατάλληλου συστήματος κυτταροκαλλιέργειας του ιού, οδήγησαν στην ανάπτυξη ετερόλογων συστημάτων για τη μελέτη των γλυκοπρωτεΐνων, όπως ψευδoτυπικών σωματίων με βάση των ιό VSV ή ρετροϊούς που ενσωματώνουν χιμαιρικές ή φυσικές μορφές των ιικών γλυκοπρωτεϊνών κα. Η χρήση τέτοιων συστημάτων οδήγησε στην αναγνώριση αρκετών υποδοχέων του ιού, όπως της τετρασπανίνης hCD81 και του υποδοχέα λιποπρωτεΐνών SRBI. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, επιτεύχθηκε η κατασκευή δύο ανασυνδυασμένων HSV-1 ιών που κωδικοποιούν χιμαιρικές μορφές της γλυκοπρωτεΐνης Ε2, αποτελούμενες από διαφορετικά τμήματα της εξωπεριοχής (αμινοξέα 384 - 611 και 384 – 711 αντίστοιχα) και ενός ανασυνδυασμένου ιού που κωδικοποιεί μια χιμαιρική μορφή της γλυκοπρωτεΐνης Ε1 (αμινοξέα 193 – 336) συνδεόμενα με διαφορετικού μήκους τμήματα της διαμεμβρανικής και κυτταροπλασματικής περιοχής της γλυκοπρωτεΐνης gC του HSV-1.Για την κατασκευή των ανασυνδυασμένων ιών με τη τεχνική του ομόλογου ανασυνδυασμού, χρησιμοποιήθηκε ως πατρικός ιός, το στέλεχος KgBpK-gC-, που εμφανίζει μειώμενη ικανότητα πρόσδεσης (~ 80%) σε θειϊκή ηπαράνη (HS) σε σχέση με το στελεχος άγριου τύπου (KOS). Δείξαμε ότι όλες οι χιμαιρικές πρωτεΐνες εκφράζονται αποτελεσματικά από τους ανασυνδυασμένους ιούς και μεταφέρονται στην κυτταρική επιφάνεια του μολυσμένου κυττάρου. Επίσης, όλες ενσωματώνονται στο ιικό σωμάτιο των αντίστοιχων ανασυνδυασμένων ιών ενώ η παρουσία των χιμαιρικών μορίων gC:E2 στον ιικό φάκελο αποκαθιστά μερικώς (~ 20%) την ικανότητα πρόσδεσης σε ΗS. Επιπλέον, δείξαμε ότι η χιμαιρική γλυκοπρωτεΐνη gC:E2ScaI αναγνωρίζει και προσδένεται σ’ έναν καλά χαρακτηρισμένο υποδοχέα, την τετρασπανίνη CD81, του HCV ενώ η χιμαιρική γλυκοπρωτεΐνη gC:E1 έχει την ικανότητα να αλληλεπιδρά σε ενδοκυτταρικό επίπεδο με απολιποπρωτεΐνες και υποδοχείς λιποπρωτεϊνών. Τέλος, δείξαμε ότι κανένας από τους ανασυνδυασμένους ιούς δεν έχει την ικανότητα μόλυνσης μη δεκτικών κυτταρικών σειρών για τον ιό HSV-1 τροποποιημένων να εκφράζουν καλά χαρακτηρισμένους υποδοχείς του ιού HCV.
description: Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver diseases, including chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is a small enveloped virus that belongs to the Hepacivirus genus within the Flaviviridae family. The positive single stranded RNA genome encodes a single polyprotein precursor of ~3,010 amino acid (aa) residues, which is cleaved co- and post-translationally by cellular and viral proteases to yield at least 10 mature products The two envelope glycoproteins (gp’s), E1 and E2, are type I trans-membrane proteins with large N-terminal ectodomains carrying multiple N-linked glycosylation sites and C-terminal hydrophobic regions containing ER retention signals. Most of the glycosylation sites (5 and 11 potential glycosylation sites for E1 and E2, respectively) are well conserved and play an essential role in the functional properties of HCV envelope gp’s, which are currently being investigated for their role in mediating HCV entry into host cells. After their synthesis, E1 and E2 assemble into non-covalent heterodimers through their trans-membrane domains (TMDs). The E1/E2 complexes are mainly retained in the ER, a proposed site for HCV assembly and budding. Because suitable cell culture systems for in vitro virus propagation and efficient production of infectious particles have been limited until recently, a number of surrogate systems have been employed to study the functional properties of HCV glycoproteins including E1/E2 liposomes, vesicular stomatitis virus (VSV)-HCV pseudotypes, virus-like particles (VLPs) expressed in insect cell systems and retro- or lentiviral pseudotypes harbouring HCV envelope gp’s . These surrogate assays have led to the identification of several candidate receptors for HCV, including human CD81 (hCD81) and Scavenger Receptor class B type I (SR-BI). We report the construction of two HSV-1 recombinants encoding chimeric forms of the E2 glycoprotein of HCV-1a composed of the ectodomain of E2 (aa384 to 611 or 384 to 711) and one recombinant virus encoding a chimeric form of E1 (aa 193 to 336) fused to different parts of the transmembrane and cytoplasmic domain of the HSV-1 gC glycoprotein (gC). The parental HSV-1, known as KgBpK-gC-, is deleted for gC and the main heparan sulfate (HS) binding domain of gB, and it exhibits impaired binding (ca. 80%) to HS compared to the wild type virus KOS. We showed that all chimeric proteins are efficiently expressed and transported to the cell surface. We also demonstrate that HSV-1 can incorporate all chimeric proteins into particles and show that incorporation of chimeric gC:E2 molecules in the viral envelope partially restored binding (ca. 20%) of the HSV-1 recombinants to HS. Moreover, we showed that the gC:E2ScaI chimeric glycoprotein was able to bind a recombinant form of hCD81 and virion-expressed gC:E2ScaI permitted the binding of the HSV-1 recombinant virus to the hCD81 molecule while gC:E1 molecule has the ability to interact intracellularly with lipoprotein receptors and apolipoprotein molecules. Finally, we showed that none of the recombinant herpesviruses has the ability to infect non permissive cell lines for HSV-1 modified to express well characterized receptors of HCV.