title: Analyse des Proteoms der Sepsispatienten mittels Immunodepletion, Zweidimensionaler HPLC und nanoLC-MS/MS
title: Sepsis Proteome Analysis by the Combination of Immunodepletion, Two-dimensional HPLC and nanoLC-MS/MS
Creators: name: Zhang, Wei
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Sepsis
HPLC
Tandem-Massenspektrometrie
Biowissenschaften, Biologie
Biomarker
Proteomanalyse
immunodepletion

description: Sepsis ist eine
      infektionsinduzierte Inflammationsreaktion des Körpers, wobei
      die Intensität des infektiösen Triggers nicht mit der
      Intensität der Antwortreaktion des Wirtsorganismus kongruent
      sein muss. Während eine kontrollierte lokal be-schränkte
      inflammatorische Reaktion der Elimination der Infektion
      dient, kann sie unkontrolliert systemisch zu einer Vielzahl
      von Ereignissen führen, die letztendlich im
      Multiorganversagen enden kann. Pathogenetisch bedeutsam ist
      hierbei die aus der Dysfunktion des unspezifischen
      Immunsystems resultierende Gerinnungsaktivierung und
      endotheliale Dysfunktion. Die frühe Erkennung der Sepsis und
      die Vorhersage der Mortalität sind zwingend notwendig für
      eine weitere Senkung der immer noch hohen Sepsissterblichkeit
      weltweit. Die bisherigen Sepsismarker sind für diese Aufgabe
      nur unzureichend geeignet. In der vorliegenden Arbeit sollte
      mit Hilfe eines neuen Flüssigkeitschromatografie- basierten
      Verfahrens zur differenziellen Proteomanalyse versucht
      werden, Biomarkerkandidaten aus Plasmaproben von
      Sepsispatienten zu identifizieren. Dabei wurde das
      Proteinreinigungssystem ProteomeLab IgY-12 zur Abtrennung der
      12 High-Abundance-Plasmaproteine eingesetzt. Anschließend
      erfolgte mit dem Proteinseparationssystem Proteome Lab PF2D
      eine zweidimensionale Auftrennung der Proteine nach
      isoelektrischem Punkt und Hydrophobizität. Die integrierte
      DeltaVue Software zeigt die Unterschiede zwischen normalen
      und septischen Proteomen an. Die differenziell dargestellten
      Peaks wurden, fraktioniert gesammelt, zur weiteren
      Identifizierung potentieller Biomarker anhand von nano
      LC-MS/MS analysiert. Nach verschiedenen Optimierungsschritten
      zeigte sich die angewandte „IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS“ –
      Strategie als effektive und effiziente Methode zur
      differentiellen Proteomanalyse humaner Plasmaproben. In der
      vorliegenden Studie wurden Plasmaproben von gesunden
      Probanden und Patienten mit Sepsis untersucht. Von den 124
      Patienten mit Sepsis, schwerer Sepsis und septischen Schock
      wurden Plasmaproben von 5 männlichen Patien¬ten mit ähnlicher
      Krankengeschichte und Sepsisursache für die differenzielle
      Proteomanalyse verwendet. Als Referenzproteom wurden
      Plasmaproben von 5 gesunden männlichen Probanden
      (altersgematcht) herangezogen. Insgesamt wurden 1800
      Fraktionen analysiert und 233 einzelne Proteine
      identifiziert. 17 Proteine, die nur in den Patientenproben
      mit Sepsis vorkamen, wurden als Biomarkerkandidaten
      postuliert. Neben bekannten Akute – Phase – Proteinen wurden
      auch einige neue Proteine wie z. B. Lumican, Urinary Protease
      Inhibitor und Cationic trypsinogen als putative Sepsismarker
      identifiziert, deren Rolle in der Sepsispathogenese noch zu
      klären sind. Alle 17 Biomarkerkandidaten sollten nun in
      weiteren gezielten Studien hinsichtlich ihres diagnostischen
      und prognostischen Wertes überprüft werden.
description: Sepsis, defined as the systemic
      host response to infection, is not a single disease but a
      complex and heterogenous process. Effective therapies and
      their evaluation have been hampered by insufficient
      characterization of the underlying pathogenesis and in
      consequence limited ability to stratify patients into more
      homogenous subgroups. As no single or any combination of
      biomarkers at present can reliable be used for prediction
      there is an immense and vast growing interest in protein
      profiling. The proteomic analysis of plasma samples
      represents a challenge due to the presence of a few highly
      abundant proteins such as albumin and immunoglobulins in
      addition to the desired biomarkers of interest that are
      typically low in abundance. The detection of possible
      biomarkers therefore requires a specific depletion of these
      high abundance proteins and/or optimized multidimensional
      protein fractionation methods based on charge, size,
      hydrophobicity or any combination therefore. The
      IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS strategy applied in this study combines
      immunoaffinity subtraction chromatography (IgY-12) for the
      removal of high abundance plasma proteins with
      two-dimensional protein fractionation (PF2D) for separation
      and nano LC-MS/MS for identification of proteins. In this
      study, plasma samples from patients with sepsis and healthy
      controls were examined. More than 120 adult patients with
      manifest sepsis, severe sepsis and septic shock were
      included. Citrated plasma samples from five male patients
      with a clinically similar cause of sepsis and underlying
      disease were used for this part of the study. The plasma
      samples were taken from three survivors and two non-survivors
      at the first (diagnosis of sepsis) and last day (relocation
      or death) of their stay in the intensive care unit (ICU)
      respectively. Citrated plasma samples from three age matched
      healthy male individuals were used as reference. A total of
      1,800 fractions were analyzed and 233 distinct proteins were
      identified with. 132 proteins from healthy male individuals,
      identified by double and/or triple determination with high
      reliability, were regarded as the reference protein pool.
      Only significantly up-regulated peaks present in all of the
      sepsis samples were selected for MS analysis, resulting in
      the identification of 17 distinct proteins present only in
      septic patients. Whereas most of these proteins are known to
      be involved in inflammatory response, some are considerably
      novel and exploring their roles in association with the
      pathophysiology of sepsis may lead to the identification of
      new biomarkers for sepsis.