title: An extracellular drug binding site of potassium channels THIK-1 and THIK-2
title: Eine extrazelluläre Bindungsstelle am THIK-1 und THIK-2
Creators: name: Zou, Xinle
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: IBMX
Kanal
THIK
Medical sciences, Medicine
channel
potassium
Kalium

description: Background: THIK-1, THIK-2 and
      TREK-1 and all belong to family of two-pore-domain potassium
      channel (K2P channels). THIK-2 was until recently regarded as
      ‘silent’ potassium channels. 3-isobutyl-1-methylxanthine
      (IBMX) is normally used as inhibitor of phosphodiesterase,
      resulting in an increase of cAMP levels in the cytosol. Aims:
      Identification of an extracellular drug binding site on
      THIK-1 and THIK-2. Methods: Whole cell recording patch clamp
      measurements in mammalian cells was used to analyze K2P
      channels mentioned above. Chemicals such as IBMX, forskolin
      and cAMP were used intracellularly (via the pipette solution)
      and/or extracellularly (via the bath solution). To identify
      the binding site of IBMX on THIK-1 we mutated all amino acids
      of the helical cap one by one and screened for changes in
      IBMX sensitivity of the channels. To analyze the surface
      expression of the channel we used HA-tagged THIK-2 and thus
      quantified the copy number of the channels at the cell
      membrane using an antibody-based assay. Results: We found
      that IBMX can rapidly inhibit both the inward and outward
      currents carried by THIK-1 channels; the IC50 of this effect
      was about 120 μM. The application of H89 (PKA inhibitor) and
      forskolin (PKA activator) did not modify the effects of IBMX
      on the channel. Application of 100 μM intracellular cAMP
      almost completely inhibited TREK-1 current but not THIK-1
      current, indicating that the effect of IBMX in THIK-1 is not
      mediated by cAMP. Finally, we found that IBMX blocks THIK-1
      currents only if it is applied extracellularly. By mutating
      all of the helical cap amino acids, we found that the
      arginine to alanine mutant of THIK-1 (THIK-1R92A) had a lower
      sensitivity to IBMX. Mutation of the arginine at position 92
      to glutamate or glutamine reduced the sensitivity to IBMX
      even further. R92 is localized to the linker region between
      cap helix 2 (C2) and the pore helix (P1). Part of the linker
      region is not visible in the crystal structures. R92 is at
      the end of the unstructured region.Compared to THIK-1, the
      'silent' channel THIK-2 has an additional domain at its
      N-terminus (residues 6-24) which contains a putative
      retention signal (RRR). Removal of this additional domain
      (mutant THIK-2Δ6-24) or mutation of the RRR motif to AAA
      (THIK-2AAA mutant) gave rise to a measurable potassium
      current. Furthermore, the surface expression of the reporter
      protein CD74 containing the AAA mutated N-terminus of THIK-2
      was more than threefold larger than the analogous reporter
      protein containing the wild type N-terminus of THIK-2 (RRR).
      These data indicate that the ER retention/retrieval signal
      RRR can prevent the THIK-2 export to the cell membrane,
      leading to the silence of the channel. In addition, we found
      that THIK-2 currents can also be blocked by application of
      IBMX from the extracellular side. Conclusions: IMBX can block
      TREK-1 channels though the PKA pathway, it also can bind to
      the extracellular side of THIK-1 or THIK-2, leading to a
      direct block of the channels. This describes a novel effect
      of IBXM on K2P channels. The IC50 of the direct effect of
      IBMX on THIK-1 channels was about 120 μM. Our results suggest
      that arginine 92 of THIK-1 and the C2-P1 linker region of K2P
      channels play an important role in the binding of IBMX, and
      perhaps other more potent drugs, to the channel.
description: Hintergrund: THIK-1, THIK-2 und
      TREK-1 gehören zur Familie der Zwei-poren-domänen
      Kaliumkanäle (K2P Kanäle). THIK-2 wurde bis vor kurzem als
      inaktiver Kaliumkanal angesehen. 3-isobutyl-1-methylxanthin
      (IBMX) wird normalerweise als Phosphordiesterasehemmer
      verwendet, der die intrazelluläre c-AMP Konzentration erhöht.
      Ziel der Arbeit: Identifizierung einer extrazellulären
      Bindungsstelle am THIK-1 und THIK-2. Methoden:
      Ganzzellstrommessungen an Säugetierzellen wurden durchgeführt
      um die obigen K2P Kanäle zu untersuchen. Chemikalien wie
      IBMX, Forskolin und c-AMP wurden intrazellulär über die
      Pipette und/oder extrazellulär über die Badlösung zugegeben.
      Um die IBMX Bindungsstelle am THIK-1 zu finden wurden alle
      Aminosäuren der äußeren Helices einzeln ausgetauscht und die
      Stärke des IBMX Blocks ermittelt. Um die
      Oberflächenexpression des Kanals zu bestimmen, wurde ein
      HA-markierter THIK-2 Kanal verwendet und mittels eines
      antikörperbasierten Verfahrens dessen Oberfächenkonzentration
      quantifiziert. Ergebnisse: Wir haben gemessen, dass 1 mM IBMX
      die Einwärts- und Auswärtsströme von THIK-1 sehr schnell
      blockiert. Die Zugabe von H89, einem PKA-Inhibitor, und von
      Forskolin, einem PKA-Aktivator veränderte den Effekt von IBMX
      auf den Kanal nicht. Die intrazelluläre Zugabe von 100 μM
      c-AMP blockierte den TREK-1 Strom fast vollständig,
      beeinflusste jedoch nicht den THIK-1 Strom, woraus man
      schließen kann, dass IBMX nicht über eine Erhöhung der c-AMP
      Konzentration auf den THIK-1 wirkt. Außerdem beobachteten
      wir, dass IBMX die THIK-1 Ströme nur blockiert, wenn es von
      der extrazellulären Seite zugegeben wird. Eine Mutationen in
      der extrazellulären Region von THIK-1 and Position 92
      (THIK-1R92A) bewirkte eine Abnahme der Affinität der Binding
      von IBMX an den Kanal. Eine Mutation dieser Aminosäure (R92)
      zu Glutamin oder Glutaminsäure verringerte die Affinität noch
      stärker. R92 liegt in der Verbindungsschleife zwischen der
      Helix 2 und der Porenhelix des Kanals. IV Diese Region ist
      teilweise nicht in der Kristallstruktur sichtbar; R92 liegt
      am Ende dieser unstrukturierten Region. Im Vergleich zum
      THIK-1 besitzt der THIK-2 einen zusätzliches Segment am
      N-Terminus (Aminosäure 6 - 24) welches ein potentielles
      Retentionssignal (RRR) enthält. Durch Herausschneiden dieses
      Segments (THIK-2Δ6-24) oder Mutation von RRR nach AAA
      (THIK-2AAA) konnten THIK-2 Mutanten erzeugt werden, die einen
      messbaren Strom zeigten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden
      dass die Oberflächenexpression eines Reporterproteins (CD74),
      das mit dem modifizierten N-Terminus von THIK-2AAA fusioniert
      wurde, mehr als dreimal so hoch war als unter
      Kontrollbedingungen (Fusion mit dem nicht modifizierten
      N-Terminus von THIK-2. Daraus läßt sich schließen, dass das
      ER Retentionssignal RRR den Transport von THIK-2 zur
      Zellmembran verhindert und zu einem elektrisch inaktiven
      Kanal führt. Außerdem fanden wir heraus, dass THIK-2 Ströme
      ebenfalls durch IBMX von der extrazellulären Seite blockiert
      werden können. Schlußfolgerungen: IBMX blockiert TREK-1
      Kanäle über die PKA Phosphorilierung. IBMX bindet auch an der
      extrazellulären Seite von THIK-1 und THIK-2 und führt zu
      einem direkten Block. Das ist eine neue bisher nicht
      beschriebene Wirkung von IBMX auf K2P Kanäle. Die Ergebnisse
      dieser Arbeit deuten darauf hin, daß der C2-P1 Linker und
      insbesondere das Arginin an der Stelle 92 beim THIK-1 an der
      IBMX Bindung beteiligt sind.