title: Aufreinigung und Charakterisierung der RNase P in Aquifex aeolicus
title: Purification and characterization of the RNase P in Aquifex aeolicus
Creators: name: Nickel, Astrid Ingeborg
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Ribonucleoproteines
RNase P
Biowissenschaften, Biologie
Ribonucleoproteine
Endoribonuklease P
Aquifex aeolicus

description: Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit
      bestand darin, die Ribonuklease P (RNase P) in dem
      hyperthermophilen Bakterium Aquifex aeolicus mittels eines
      biochemischen Ansatzes zu identifizieren und zu
      charakterisieren. Die phylogenetische Einordnung der Gattung
      Aquifex ist bis heute nicht eindeutig geklärt und
      bioinformatische Analysen des A. aeolicus-Genoms führten
      nicht zur Identifizierung von Genen für RNase P-Komponenten.
      Folglich gestaltete sich die Etablierung einer
      Aufreinigungs-Methode schwierig, da über die Biochemie der A.
      aeolicus RNase P nichts bekannt war. Trotz der schwierigen
      Ausgangssituation ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen,
      eine semi-präparative native Aufreinigungsmethode zu
      etablieren, die wie angestrebt sowohl effizient als auch
      reproduzierbar ist. Die Methode besteht aus drei sukzessiven
      Aufreinigungsschritten, in denen nach Ladung, Hydrophobizität
      und Größe getrennt wird. Dadurch konnte die RNase P-Aktivität
      stark angereichert und ein Großteil der Zellkomponenten
      abgetrennt werden. Anschließend wurde ein Protokoll
      entwickelt, mit dem aus den hochaufgereinigten RNase
      P-aktiven Proben eine separate Extraktion funktioneller
      Gesamt-RNA und Gesamt-Protein gelang. Aus diesen RNA- und
      Protein-Präparationen konnten erstmals RNase P-aktive
      Holoenzyme von A. aeolicus in vitro rekonstituiert werden.
      Die Rekonstitutionsexperimente belegen eindeutig, dass sowohl
      eine RNA- als auch eine Protein-Komponente für die RNase
      P-Aktivität in A. aeolicus essenziell ist. Zu Beginn der
      Arbeit, als die Holoenzymrekonstitution noch nicht entwickelt
      war, wurde eine vermeintliche P RNA, die von einer
      bioinformatischen Expertengruppe (Prof. I. Hofacker,
      Universität Wien) als A. aeolicus P RNA vorhergesagt wurde,
      getestet und auf experimenteller Basis als RNase P-Komponente
      ausgeschlossen. Ausführliche kinetische Untersuchungen
      ergaben keine Hinweise auf eine Beteiligung der
      vorgeschlagenen RNAVariante an der 5´-Prozessierung von
      Prä-tRNAs. Zudem war die RNA in RNA-Seq- Bibliotheken
      praktisch nicht repräsentiert, was gegen ihre Expression
      spricht. Zur Ordnung der Aquificales gehören drei Familien:
      die Desulfurobacteriaceae, die Hydrogenothermaceae und die
      Aquificaceae. Bislang wurden RNase P-Enzyme nur in den
      sequenzierten Spezies der Desulfurobacteriaceae und der
      Hydrogenothermaceae gefunden, nicht aber in der Familie der
      Aquificaceae, zu denen auch A. aeolicus gehört. Da der
      Nachweis von RNase P-Aktivität in Zellfraktionen von A.
      aeolicus gelang, bioinformatisch jedoch weder ein
      bakterientypisches Gen für die RNA- noch für die
      Protein-Untereinheit der RNase P gefunden werden konnte,
      handelt es sich bei dem Enzym in diesem Bakterium mit hoher
      Wahrscheinlichkeit um eine unkonventionelle Form der RNase P.
      Folglich wurde in den RNase P-angereicherten Fraktionen
      besonders nach Komponenten gesucht, die ausschließlich in
      Aquificaceae, nicht aber in den beiden anderen Familien der
      Aquificales vorkommen. Bei der RNA-Seq-Analyse von
      RNA-Extrakten, die auf RNase P-Aktivität angereichert worden
      waren, konnten zwei RNA-Transkripte identifiziert werden, die
      diesem Kriterium entsprechen. Die bioinformatische Analyse
      ergab, dass diese RNA-Varianten nur in - wenn auch nicht in
      allen - Aquificaceae-Spezies vorkommen, nicht aber in anderen
      Aquificales. Faltungsvorhersagen dieser RNAs ließen jedoch
      keine markanten strukturellen Ähnlichkeiten zu klassischen
      bakteriellen RNase P RNAs erkennen. Die RNA-Seq-Analyse
      zeigte zudem, dass parallel zur RNase P-Aktivität eine
      Anreicherung der 6S RNA und der 16S rRNA stattfindet. Die
      Anreicherung der 16S rRNA deutet auf eine Assoziation der
      RNase P mit der kleinen ribosomalen Untereinheit hin. Bei der
      Suche nach den Proteinkomponenten der A. aeolicus RNase P
      wurde mittels massenspektrometrischer Analyse sowohl die
      Identität als auch die Quantität der Proteine in den
      hochaufgereinigten Fraktionen mit maximaler RNase P-Aktivität
      bestimmt. Das Ergebnis wurde dann mit der Analyse von
      Fraktionen verglichen, die ansteigende oder abnehmende
      Enzymaktivität aufwiesen. Parallel dazu wurden auch RNase
      P-aktive Fraktionen entsprechend ihrer Elution beim 3.
      Aufreinigungsschritt auf einem SDS-Gradientengel aufgetrennt.
      Einzelne Proteinbanden, die gut mit der RNase P-Aktivität
      korrelieren, wurden daraufhin ausgeschnitten und ebenfalls
      einer massenspektrometrischen Analyse unterworfen. Durch
      einen Vergleich der Ergebnisse aller Analysen konnte ein 22,5
      kDa Protein identifiziert werden (aq_880), das signifikant in
      hochaufgereinigten Proben mit maximaler RNase P-Aktivität
      vorhanden war. Bioinformatische Struktur- und
      Domänenvorhersagen ergaben, dass dieses Protein viele
      gestellte Suchkriterien erfüllt. So weist das Protein eine
      RNA-bindene Domäne auf, die zur Bindung des
      Prä-tRNA-Substrats bzw. einer RNA-Komponente erforderlich
      ist. Weiter wird dem Protein aufgrund einer vorhergesagten
      PIN-Domäne eine Endonuklease-Aktivität zugeschrieben. Solch
      eine Proteinfunktion wäre mit den Anforderungen an eine nicht
      kanonische bakterielle RNase P durchaus vereinbar. Die
      PIN-Domäne ist bei den erst kürzlich identifizierten
      PRORPEnzymen, also den eukaryontischen Protein-basierten
      RNase P-Enzymen, nachweislich die katalytische
      Metallonuklease-Domäne. Zudem handelt es sich bei dem
      identifizierten aq_880-Protein um ein hypothetisches Protein
      unbekannter Funktion, das ausschließlich in den Aquificaceae
      vorkommt, nicht aber in den Desulfurobacteriaceae und
      Hydrogenothermaceae. Neben dem aq_880-Protein wurden in
      Fraktionen mit hoch aufgereinigter RNase P-Aktivität fünf
      weitere Proteine mit einer deutlichen, aber im Vergleich zu
      aq_880 geringeren Signifikanz angereichert. Dabei handelt es
      sich um das hypothetische Protein aq_707, das
      Strukturvorhersagen zufolge partiell mit dem bifunktionellen
      tRNAModifikations- Enzym MnmC aus E. coli übereinstimmt und
      demzufolge an der Synthese von
      5-Methylaminomethyl-2-thiouridin beteiligt sein könnte, die
      Polyribonukleotid Nukleotidyltransferase (PNPase), das
      Transkriptions-Antiterminationsprotein NusB, das ribosomale
      Proteine S2 und die Glutamin-Synthetase. Die Auswertung der
      Gelchromatogramme der Größenausschlusschromatographie ergab,
      dass das Elutionsvolumen der Fraktionen mit der maximalen
      RNase P-Aktivität einer Masse von 300 - 400 kDa entspricht.
      Demnach ist denkbar, dass die RNase P in A. aeolicus als
      Bestandteil eines größeren Komplexes vorliegt. Hier könnten
      mehrere Enzyme des RNA-Metabolismus funktionell miteinander
      gekoppelt sein. Eine gleichzeitige Anreicherung des
      ribosomalen Proteins S2 und der 16S rRNA mit RNase P-aktiven
      Fraktionen könnte auch auf eine Assoziation der RNase P mit
      der kleinen ribosomalen Untereinheit hindeuten. Desweiteren
      konnten im Rahmen dieser Arbeit die Transkripte sowohl
      bekannter als auch neu identifizierter nicht-kodierender RNAs
      aus A. aeolicus mittels Northern Blot-Analyse nachgewiesen
      werden. Auch die bei Transkriptomanalysen von A. aeolicus
      gefundene starke Transkription von antisense RNAs auf dem
      Gegenstrang nicht-kodierender RNA-Gene konnte experimentell
      mittels Northern Blot verifiziert werden ((Lechner, Nickel,
      Wehner et al., im Druck), siehe Anhang 7.4).
description: 5‘ end maturation of precursor
      tRNAs is catalyzed by the enzyme Ribonuclease P (RNase P) in
      all kingdoms of life. RNase P enzymes characterized in
      bacteria, archaea, yeast nuclei / mitochondria and animal
      cell nuclei are ribozymes composed of one catalytic RNA
      subunit and one to ten protein subunits. Recently, human
      mitochondrial RNase P was identified to be composed of three
      polypeptides but to lack any RNA subunit. Thereupon, the
      RNase P in land plants and kinetoplastids was found to
      consist of only one single polypeptide and was hence named
      “PRORP” (proteinaceous RNase P). In the hyperthermophilic
      bacterium Aquifex aeolicus, neither a gene for the RNA nor
      the protein component of bacterial RNase P has been
      identified in its sequenced genome. However, RNase P activity
      can be detected in A. aeolicus cell lysates. This PhD thesis
      aimed at developing a robust and reproducible method for the
      purification and enrichment of A. aeolicus RNase P activity.
      Mass spectrometry analysis identified one A. aeolicus protein
      in highly purified fractions. According to homology structure
      modeling, this protein might well be involved in A. aeolicus
      RNase P activity. Furthermore and for the first time, a
      protocol for successful in vitro reconstitution of RNase P
      activity from RNA and protein preparations from A. aeolicus
      fractions was established. The reconstitution experiments
      provide evidence that RNA as well as protein components are
      involved in A. aeolicus RNase P activity. Protein and RNA
      analysis also suggest an association of A. aeolicus RNase P
      with ribosomes. Additionally, roughly 100 noncoding RNA
      (ncRNA) candidates, many represented by sense and antisense
      transcripts, were identified bioinformatically and by deep
      sequencing (RNAseq); selected ncRNA candidates were verified
      via Northern blot detection in total RNA of A.
      aeolicus.