Untersuchungen zum Glukosemetabolismus und der Toxizität von TCDD während der Differenzierung von embryonalen Stamm- und Karzinomzellen der Maus
Creators: name: Tonack, Sarah
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2005
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 618.2

description: Embryonale Stammzelllinien bieten die Möglichkeit, embryonale Zelleigenschaften wie Pluri- und Totipotenz und deren molekulare oder zelluläre Determinanten in vitro zu untersuchen. Embryonale Stammzellen durchlaufen bei der Bildung der embryoid bodies (EB) verschiedene Differenzierungsstadien. Der EB ist ein komplexes dreidimensionales Aggregat mit Zellkommunikation der einzelnen Zellen untereinander und ähnelt insofern einem Präimplantationsembryo. Zur Charakterisierung ihrer Entwicklung und Differenzierung wurde die Expression der Glukosetransporterisoformen (GLUT) in der embryonalen Stammzelllinie D3 und die zelluläre Reaktion auf 2,3,7,8 Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in der embryonalen Karzinomzelllinie (ECC) P19 untersucht. Zur Beantwortung der Frage, ob GLUT potentielle Differenzierungsmarker sind, wurde die Expression von GLUT-Isoformen in embryonalen Stammzellen (ES) und EBs mittels RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz untersucht. Die Isoformen 1, 3 und 8 kommen in allen Stadien der EB-Differenzierung vor. GLUT4 wird ab 2d EB und GLUT2 erst ab 15d EB in differenzierten stage specific embryonic antigen-1 (SSEA-1)-negativen Zellen nachweisbar. GLUT sind in ES- und EB-Zellen, wie in der frühen Embryogenese, differentiell exprimiert und haben eine stadienspezifische zelluläre Anordnung. Zur Beantwortung der Frage, ob TCDD die Differenzierung beeinflusst, wurden die P19-ECC in Herzmuskelzellen differenziert und mittels Real-time PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz charakterisiert. Es kommt durch TCDD zu einer signifikanten Erhöhung der Expression des herzmuskelspezifischen Aktins (α-MHC) bis 5+5d und einer Verringerung des für neuronale Zellen essentiellen Transkriptionsfaktors Mash-1. TCDD beeinflusst demnach die kardiomyogene und neuronale Differenzierung der P19-ECC. Die mRNA-Expression von GLUT wurde nicht verändert, während es zu einer drastischen Abnahme der GLUT1 und 3 Proteinmenge während der P19 Differenzierung kam. Die Lokalisation von GLUT1 in undifferenzierten Zellen änderte sich nach TCDD Zugabe von der Plasmamembran in das Zytoplasma. Die Glukoseaufnahme in 5d EBs wurde durch TCDD signifikant verringert. Dies zeigt, dass TCDD den Glukosemetabolismus und die Differenzierung embryonaler Zellen durch eine Störung der GLUT-Expression und Lokalisation beeinflusst.
description: Embryonic stem cells are a useful model to study embryonic cell attributes like pluripotency and totipotency and their molecular and cellular determinants in vitro. Embryonic stem cells can be cultivated as spontaneously differentiation embryoid bodies (EB). EBs are spherical three dimensional cell aggregates and many aspects of the lineage-specific differentiation programs observed within EBs reflect those found in the early preimplantation embryo. In order to characterise the development and differentiation (i) the GLUT isoform expression was investigated in the embryonic stem cell line D3 (ii) the influence of 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) was studied in the embryonic carcinoma cell line (ECC) P19. Whereas the GLUT expression as a cell specific marker is well characterised in adult tissues, the expression during cell differentiation processes is still not clear. The GLUT-expression was investigated in mouse embryonic stem cell line D3 (ESC) and during spontaneous, neuronal and myogenic differentiation of EBs using RT-PCR, Western blotting and immunofluorescence. Both ESC and EBs expressed GLUT1, 3 and 8. GLUT2 and 4 were detectable in EBs starting at 15 and 2 days of culture, respectively. GLUT4 is expressed in most of differentiated stage specific embryonic antigen-1 (SSEA-1) negative cells. These data suggest, that during EB differentiation the cell-type specific GLUT expression is similar to the expression pattern in the early embryo. For determination of the TCDD influence, the cardiac muscle differentiation of P19-ECC was investigated by real time PCR, Western blotting and immunofluorescence. During differentiation alpha cardiac actin (α-MHC) mRNA was increased until day 5+5, whereas the mRNA of an important neuronal transcription factor Mash-1 was decreased by TCDD, indicating that TCDD influences the cardiomyogenic and neuronal differentiation. The amount of GLUT1, 3, 4 and 8 transcripts showed no significant TCDD effect, indicating that TCDD acts mainly on GLUT protein level and localisation. The protein amount of GLUT1 and 3 was significantly decreased during myogenic differentiation. In undifferentiated TCDD treated P19-ECC GLUT1 localisation changed from plasma membrane into cytoplasm. The glucose uptake in 5d EBs was significantly decreased. These data suggest, that TCDD influences glucose metabolism in undifferentiated and differentiating embryonic cells by affecting expression and localisation of GLUT isoforms.