Κλωνοποίηση του γονιδίου DJ-1 και έκφραση της αντίστοιχης πρωτεϊνης σε ευκαρυωτικά κύτταρα
Creators: name: Μαραμή, Θωμαή Κοσμά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Κλωνοποίηση γονιδίου
Έκφραση πρωτείνης
Ευκαρυωτικά κύτταρα καρκίνου μήτρας
Gene cloning
DJ-1
Gene expression

description: Σκοπός της μεταπτυχιακής αυτής διπλωματικής εργασίας ήταν η κλωνοποίηση της πρωτεΐνης DJ-1 στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-N1, προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης σε HeLa καρκινικά κύτταρα καθώς και η βιωσιμότητα των κυττάρων αυτών παρουσία της υπερεκφρασμένης πρωτεΐνης DJ1 .Η πρωτείνη DJ-1 που μελετήσαμε εκφράζεται ευρέως στα θηλαστικά και εμφανίζεται ως ομοδιμερές. Η σύνδεση των δύο μονομερών σχηματίζει την ενεργή θέση η οποία περιέχει αμινοξικά κατάλοιπα κυστεΐνης που είναι σημαντικά για τη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. Σε παθογόνες καταστάσεις, μεταλλάξεις σε ένα αμινοξύ (M26I, D149A και L166P) και χημική τροποποίηση της κυστεΐνης διαταράσσουν την τεταρτοταγή δομή της πρωτεΐνης, μεταβάλλουν τη λειτουργικότητά της και τις σηματοδοτικές οδούς που συμμετέχει. Η DJ-1 έχει προταθεί οτι σχετίζεται με νευροεκφυλιστικές διαταραχές και κυρίως τη νόσο Parkinson. Στη δεκαετία αυτή, πολλές αναφορές έχουν υποδείξει τη DJ-1 ως θεραπευτικό στόχο, ενώ έχει προταθεί και η χρήση ενός σημαντικού αριθμού μορίων/ενώσεων στόχευσης της DJ-1 για τη θεραπεία διαφόρων νευροεκφυλιστικών διαταραχών.Αρχικά, λοιπόν για την μελέτη της συγκεκριμένης πρωτεΐνης κλωνοποιήσαμε τo cDNA τo οποίo κωδικοποιεί την πρωτεΐνη DJ1 . Αυτή κλωνοποίηση του cDNA της DJ-1 πραγματοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-N1. Στη συνέχεια αφού επιβεβαιώθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης σε HeLa κύτταρα ακολουθώντας τις κατάλληλες διαδικασίες που περιγράφονται αναλυτικά στο κείμενο, προχωρήσαμε στον έλεγχο της υποκυτταρικής της εντόπισης που αποτελούσε και ένα από τα ζητούμενα. Για να μπορέσουμε να μελετήσουμε την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης σύντηξης DJ-1-GFP, αρχικά προχωρήσαμε σε παροδική επιμόλυνση κυττάρων HeLa με τους ανασυνδυασμένους πλασμιδιακούς φορείς. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε δοκιμασία έμμεσου φθορισμού και ανίχνευση της υπερκεφρασμένης πρωτείνης με τη χρήση της φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP,η οποία δίνει πράσινο φθορισμό και συνδέεται με την πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος μας. Η πρωτεΐνη σύντηξης λοιπόν ,DJ-1-GFP εντοπίζεται κυρίως στην περιφέρεια των κυττάρων. ‘Ένα μικρό ποσοστό μόνο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ το μεγαλύτερο κλάσμα βρίσκεται στον εξωκυττάριο χώρο ανάμεσα στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες γειτονικών κυττάρων. Στο συγκεκριμένο πείραμα, ακόμα ,θελήσαμε να διερευνήσουμε την επίπτωση της υπερέκφρασης της DJ-1 στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων HeLa για αυτό και εφαρμόσαμε την μέθοδο MTT . Από την διαδικασία αυτή παρατηρήσαμε ότι η υπερέκφραση της DJ-1, δεν επιφέρει σημαντικές αλλαγές στη βιωσιμότητα των HeLa κυττάρων
description: The aim of this master thesis was to clone and study the expression of DJ-1 protein in HeLa cells. The DJ-1 protein that we studied is widely expressed in mammals and appears as homodimer. The binding of the two monomers forms the active site which contains amino acid cysteine residues that are important for the normal function of the protein. In pathogenic conditions, mutations in an amino acid (M26I, D149A and L166P) and chemical modification of the cysteine disrupt the quaternary structure of the protein, altering its functionality and the signaling pathways that are involved. DJ-1 has been suggested to be associated with many neurodegenerative disorders and especially Parkinson's disease. In this decade, many reports have suggested that DJ-1 could be used as a therapeutic target, and the use of a significant number of DJ-1 targeting molecules / compounds for the treatment of various neurodegenerative disorders has been also suggested. Initially, in order to study this protein, we cloned the cDNA that encodes the DJ1 protein. DJ-1 cDNA cloning was performed on the plasmid vector pEGFP-N1. After confirming the expression of DJ-1 in HeLa cells, following the appropriate procedures described in the text, we studied the subcellular localization. In order to study the subcellular localization of the DJ-1-GFP fusion protein, firstly we infected HeLa cells with the recombinant plasmid vectors. An indirect fluorescence test was then performed and the overexpressed protein was detected using the fluorescent GFP protein, which gives green fluorescence and binds to the protein of interest. The fusion protein, DJ-1-GFP, is located mainly in the periphery of cells. ‘Only a small percentage is to be found in the cytoplasm, while the largest fraction is in the extracellular space between the cytoplasmic membranes of neighboring cells. In this particular experiment, we also wanted to investigate the effect of DJ-1 overexpression on the viability of HeLa cancer cells, that is why the MTT method was applied. From this procedure we observed that overexpression of DJ-1 does not bring about significant changes in the viability of HeLa cancer cells