Kompartimentierte Mikroreaktoren für die Oligosaccharidsynthese mittels magnetischer Enzymimmobilisate
Creators: name: Greifenstein, Raphael
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2020
Subjects: Mikroreaktoren
Fluidische Reaktoren
Immobilisierte Enzymreaktoren
Immobilisierte Enzyme
Glykane

description: Immobilisierte mikrofluidische Enzymreaktoren (IMER) haben einen großen Anwendungsbereich, zu dem die Biomedizin und Pharmazie zählen. In diesen Bereichen ist die Synthese von Glykanen und Glykokonjugaten von besonderem Interesse. Dabei ist die chemische Synthese der Glykokonjugate aufgrund ihrer strukturellen Diversität schwierig. Der Einsatz von Enzymen bietet dagegen attraktive Vorteile wie Regio- und Stereoselektivität. Entsprechende Enzymkaskaden haben bisher jedoch wenig Flexibilität zugelassen und deren Entwicklung und Optimierung war mit einem hohen Zeitaufwand verbunden. Daher ist die Nachfrage nach Reaktionssystemen hoch, in denen Enzymkaskadenreaktionen automatisiert ablaufen können. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, ein automatisiertes, kompartimentiertes Mikroreaktorsystem (KMS) zu entwickeln, in welchem immobilisierte Enzyme in Reaktionskaskaden die Synthese von Nukleotidzuckern und Glykanen durchführen können. Das KMS wurde aus einem bereits bestehenden Mikroreaktorsystem entwickelt und für die Anwendungen angepasst und erweitert. Die sechs verwendeten rekombinanten Enzyme mit His6-Tag wurden von Projektpartnern bereitgestellt. Sie wurden mittels Komplexbildung auf magnetischen Trägerpartikeln immobilisiert. Die durch die immobilisierten Enzyme katalysierten Reaktionen sollten charakterisiert und optimiert werden. Das KMS ist aus modularen, kommerziellen Ventil-, Spritzenpumpen- und I/O-Modulen aufgebaut und wird mit der dazugehörigen Software gesteuert. Ein Helmholtz-Spulenpaar und ein Permanentmagnetarray, eingebaut in 3D-gedruckte Komponenten, bilden das Herz des Systems. Als Reaktionskammer werden wässrige Kompartimente in einem Fluorpolymer-Schlauch gebildet, der zwischen den Helmholtz-Spulen durchgeführt wird. Um Synthesen im präparativen Maßstab zu ermöglichen, wurden im fluidischen Peripheriesystem des KMS entsprechende Ventile und Schläuche verbaut, sodass wässrige Kompartimente mit bis zu 3 mL generiert werden können. Für enzymatische Reaktionen unter optimalen Bedingungen wurde ein Temperaturkontrollmodul (TKM) in das KMS implementiert. Dieses besteht aus einer mit Wasser gefüllten zylindrischen Polymerkammer, die zwei parallel verlaufende Schläuche ummantelt und mit einem Thermostat verbunden ist. Das reproduzierbare Erstellen von stabilen Kompartimenten wurde eingehend untersucht. Dafür wurden verschiedene Separationsfluide für unterschiedliche Schlauchgrößen getestet. Zudem wurde die Verteilung von Magnetpartikeln in diesen Kompartimenten durch verschiedene, zeitlich veränderliche, elektromagnetische Felder erprobt. Die Verbindung des KMS mit einem analytischen Massenspektrometrie-System ermöglichten es, die Produkte der Enzymsynthesen online zu analysieren. Für jedes immobilisierte Enzym wurde die Beladungsausbeute ermittelt, um die optimalen Bedingungen für die Immobilisierung zu bestimmen. Auf diese Weise konnten bis zu 96% der eingesetzten Enzyme gebunden werden. Ausgehend von Angaben der Literatur wurde für alle immobilisierten Enzyme Aktivitätsassays und Analysemethoden entwickelt. Um die optimalen Reaktionsbedingungen jedes immobilisierten Enzyms zu bestimmen, wurden die Einflüsse der Parameter Enzymbeladung, pH-Wert, Temperatur und Substratkonzentration auf die spezifische Enzymaktivität halb automatisiert im KMS untersucht. So konnte mit den immobilisierten Enzymen teilweise die spezifische Aktivität freier Enzyme übertroffen werden. Dieses Phänomen trat bei Tests mit Temperaturen auf, welche deutlich über denen lagen, die für freie Enzyme als optimal angegeben wurden. Mit der, durch die Immobilisierung erhaltenen, erhöhten Stabilität gegenüber Reaktionseinflüssen konnten optimierte Reaktionsbedingungen ermittelt und genutzt werden. Durch wiederholten Einsatz der gleichen magnetischen Enzymimmobilisate (MEI) in Aktivitätsassays, konnte die Wiederverwendbarkeit der immobilisierten Enzyme untersucht werden. Dabei erreichten die meisten immobilisierten Enzyme in 6 Zyklen eine durchschnittliche Restaktivität von mehr als 50%. Durch die Wiederverwendbarkeit konnten die immobilisierten Enzyme mehr Produkt umsetzen als die gleiche Menge an freien Enzymen. Mit den optimierten Reaktionsbedingungen konnten Synthesereaktionen für 5 – 6 h im KMS automatisiert durchgeführt werden. Dazu wurden die enzymatisch katalysierten Reaktionen in einer komplexen Reaktionskaskade verknüpft. Die Nukleotidzucker-Substrate wurden durch parallelisierte Enzymreaktionen umgewandelt und die Zwischenprodukte zur Umwandlung durch nachfolgende immobilisierte Enzyme weiter transportiert. Die MEI wurden dabei durch das Magnetfeld des Permanentmagnetarrays abgetrennt und mittels eines alternierenden, elektromagnetischen Feldes der Helmholtz-Spulen resuspendiert. Da der Substratumsatz in den räumlich getrennten Enzymreaktionen optimiert wurde, verkürzte sich die Prozesszeit und die Raum-Zeit-Ausbeute wurde erhöht. Das schrittweise Anpassen der Reaktionsbedingungen und MEI-Verhältnisse ermöglichte eine Steigerung der, Gesamtausbeute des nicht-sulfatierten Human Natural Killer-1 (HNK-1) Glykan Epitops mit der Enzymkaskade auf 96%. Die Produkte konnten mit dem integrierten MS-System nachgewiesen werden. Eine Simulation der Enzymkaskade konnte das Ergebnis der Gesamtausbeute bestätigen. Wurde die Reaktionskaskade mit freien Enzymen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, belief sich die Ausbeute nur auf 44%. Durch den Vergleich konnten somit die Vorteile eines Prozesses mit den MEI in dem KMS demonstriert werden.