Dynamic chromatin association of RCC1 during the cell cycle
Creators: name: Bierbaum, Martin
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2011
Subjects: subject: cell biology
subject: Chromatine
subject: fluorescence correlation spectroscopy
subject: fluorescence microscopy
subject: Guanine nucleotide exchange factor
subject: small G-proteins
subject: 570

description: Ein räumlicher Aktivitätsgradient des kleinen G-Proteins Ran ist ein bedeutender Kontrollmechanismus von grundlegenden zellulären Prozessen wie dem Transport zwischen Kern und Cytoplasma, dem Aufbau des mitotischen Spindelapparats und der Bildung der Kernhülle. Die Entstehung dieses Gradienten verlangt eine räumliche Trennung der entgegenwirkenden enzymatischen Aktiviäten des Ran-spezifischen Guaninnukleotid- Austauschfaktors RCC1 und des Ran-spezifischen GTPase aktivierenden Proteins Ran- GAP. Die Interaktion von RCC1 mit Chromatin ist eine Vorraussetzung hierfür, indem sie RCC1 von dem sich im Cytoplasma befindlichen RanGAP trennt. Darüber hinaus beein usst die Chromatininteraktion möglicherweise die enzymatische Aktivität von RCC1 und bewirkt eine räumliche Kopplung der Reaktion zwischen Ran und RCC1 an Chromatin. Die Regulation der Chromatininteraktion von RCC1 ist deswegen ein potentieller Mechanismus, die Aktivierung von Ran in Abhängigkeit des Zellzyklus zu regulieren. Um diese Hypothese zu überprüfen, wird in der vorliegenden Arbeit eine Untersuchung der kinetischen Eigenschaften der Chromatininteraktion von RCC1 durchgeführt. Die Messung der Mobilität von RCC1 auf molekularer Ebene durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) erlaubt Rückschlüsse auf den Mechanismus der Chromatininteraktion. Ein Vergleich der Verteilung von RCC1 zwischen Chromatin und Zytoplasma und der durch FCS gemessen Mobilität zeigt, dass an Chromatin gebundenes RCC1 zwei verschiedene Mobilitätszustände einnehmen kann. Es kann unterschieden werden zwischen RCC1, das in einem eindimensionalen Prozess entlang der Chromatinfaser diffundiert, und RCC1, das für einen kurzen Zeitraum an spezifischen Stellen gebunden ist. Die quantitative Analyse der FCS-Messungen ermöglicht eine Bestimmung der Di usionkonstante des mobilen Zustands sowie der Dissoziationsrate des gebundenen Zustands. Durch Messung der Mobilität von Ran wird gezeigt, dass die Interaktionskinetik zwischen Ran und Chromatin mit der Reaktionskinetik zwischen Ran und RCC1 korreliert. Weiterhin stärken Messungen der Interaktion von Ran und RCC1 mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) die Hypothese, dass die Reaktion zwischen beiden Proteinen an Chromatin gekoppelt ist. Insbesondere weisen die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass der binäre Komplex zwischen Ran und RCC1, ein wichtiges enzymatisches Intermediat, an Chromatin gebunden ist. Der Vergleich zwischen Mobilitätsmessungen während der Interphase und während der Zellteilung demonstriert eine zellzyklusabhängige Regulation der Chromatininteraktion von RCC1. Diese äu ert sich in einer verringerten Dissoziationsrate des fest gebundenden Zustands von RCC1. Des Weiteren kann während der Zellteilung eine verringerte Interaktion zwischen RCC1 und Ran gemessen werden. Hieraus wird abschlie end die Hypothese abgeleitet, dass durch eine Regulation der Bindungseigenschaften des fest gebundenen Zustands von RCC1 eine Verringerung der Reaktionsrate zwischen Ran und RCC1 erreicht wird.