title: Label-free detection of nanoparticles secreted from living cells and cellular ensembles via interferometric scattering microscopy (iSCAT)
title: Markerfreie Detektion von Nanopartikeln sekretiert durch lebende Zellen und Zell-Ensembles mittels interferometrischer Streumikroskopie (iSCAT)
Creators: name: Gemeinhardt, André
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: iSCAT
subject: Secretion
subject: Proteins
subject: Microscopy
subject: Label-free Detection
subject: interferometric
subject: Sekretion
subject: Mikroskopie
subject: Markerfreie Detektion
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 50 Naturwissenschaften :: 502 Verschiedenes
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 53 Physik :: 530 Physik
subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 62 Ingenieurwissenschaften :: 621 Angewandte Physik

description: Cellular processes are regulated by the interaction of proteins. The connection between a protein's structure and its function forms the basis for understanding its fundamental properties and roles within biological systems. Therefore, the fields of proteomics and secretomics intensively study the entirety of proteins in a system or focus on proteins that are released by cells into the extracellular space. This interaction with the environment is key for processes such as immune response or cell-cell communication. A plethora of tools is used to study proteins, including electrophoresis, Western blotting, mass spectrometry, electron microscopy, immuno assays, fluorescence microscopy, and flow cytometry. These methods typically require labeling and complex instrumentation. Furthermore, they cannot offer high sensitivity, high spatiotemporal resolution, or access to dynamic studies in real time simultaneously. In this work, we establish interferometric detection of scattered light (iSCAT) to study secretion from single cells and cellular ensembles. iSCAT works by collecting the light scattered by a protein and interfering it with a reference wave such as the light reflected by the microscope cover glass. This approach enhances the signal and offers excellent sensitivity, fundamentally limited only by the shot noise of the system. Furthermore, the signal in iSCAT can be directly related to the particle's volume and used to extract the molecular weight of a protein. The high spatiotemporal resolution enables real time dynamic studies. The method works label-free and does not require complex instrumentation, which allows for simple combination with other existing techniques. First, we use iSCAT to detect single proteins secreted by individual living cells. Dynamic studies are performed to determine secretion rates and observe cellular response to stress. Additionally, the use of surface functionalization allows specific detection of IgG antibodies. To advance from single cell studies, a device is designed and realized which we term the secretoscope. It allows the detection of particles secreted by an ensemble of cells via iSCAT's single protein sensitivity. We use the secretoscope to study various systems such as suspension cells (Laz388, tor70), adherent cells (A549), or parasites (Leishmania). The cells are separated from the sensor unit by a filter structure and are imaged in additional bright-field and fluorescence channels to monitor their viability. The device maintains physiological conditions for the cells and enables long term measurements in an automated fashion, demonstrated for up to 24~hrs. iSCAT and the secretoscope prove to be promising additions to existing methods for studying proteomics and secretomics. The real time detection of single proteins over long periods paves the way for extensive investigation of biological systems. Our method can be complemented by other techniques to add specificity and extend its capabilities. In the future, iSCAT could be used to answer substantial questions in medical and biological fields, such as the cellular life cycle, immune response, or infection by viruses or parasites.
description: Zelluläre Prozesse werden durch das Zusammenspiel von Proteinen gesteuert. Der Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion eines Proteins bildet die Grundlage, seine wesentlichen Eigenschaften und Rolle innerhalb biologischer Systeme zu verstehen. Die Bereiche der Proteomik und Sekretomik befassen sich intensiv mit der Untersuchung der Gesamtheit aller Proteine eines Systems oder konzentrieren sich auf Proteine die von Zellen in den Extrazellularraum freigesetzt werden. Diese Interaktion mit der Umgebung ist von zentraler Bedeutung für Prozesse wie die Immunreaktion oder interzelluläre Kommunikation. Eine Fülle an Werkzeugen wird verwendet um Proteine zu untersuchen, einschließlich Elektrophorese, Western Blotting, Massenspektrometrie, Elektronenmikroskopie, Immunassays, Fluoreszenz-Mikroskopie oder Durchflusszytometrie. Diese Methoden benötigen typischerweise eine Markierung der Probe oder eine komplexe Messausrüstung. Außerdem bieten sie nicht gleichzeitig eine hohe Empfindlichkeit, hohe Orts- und Zeitauflösung sowie Zugang zu dynamischen Studien in Echtzeit. In der vorliegenden Arbeit etablieren wir die interferometrische Detektion von Streulicht (iSCAT) für die Untersuchung der Sekretion von einzelnen Zellen und zellulären Ensembles. iSCAT wird ermöglicht durch die Interferenz des von einem Protein gestreuten Lichts mit einer Referenz-Welle, wie dem durch das Mikroskop-Deckglas reflektierten Licht. Durch diesen Ansatz wird das Signal verstärkt und eine hervorragende Empfindlichkeit erreicht, grundsätzlich nur limitiert durch das Schrotrauschen des Systems. Außerdem kann das Signal in iSCAT direkt mit dem Volumen des Teilchens in Verbindung gebracht, und zur Bestimmung der Molekülmasse eines Proteins genutzt werden. Die Methode funktioniert markerfrei und benötigt keinen komplexen Aufbau, wodurch eine unkomplizierte Kombination mit anderen existierenden Verfahren möglich wird. Zunächst nutzen wir iSCAT um einzelne Proteine sichtbar zu machen die von individuellen lebenden Zellen sezerniert werden. Dynamische Studien werden durchgeführt um Sekretionsraten zu bestimmen und die Reaktion der Zellen auf Stress zu beobachten. Des Weiteren erlaubt der Einsatz von Oberflächen-Funktionalisierung den spezifischen Nachweis von IgG Antikörpern. Aufbauend auf die Einzelzell-Studien wurde ein Instrument konzipiert und realisiert, das wir als Sekretoskop bezeichnen. Es erlaubt die Detektion von Teilchen sezerniert durch ein Zellensemble dank der Einzelprotein-Empfindlichkeit von iSCAT. Wir nutzen das Sekretoskop für die Untersuchung verschiedener Systeme wie beispielsweise Suspensionszellen (Laz388, tor70), adhärente Zellen (A549) oder Parasiten (Leishmania). Die Zellen werden durch eine Filter-Struktur von der Sensor-Einheit getrennt und durch zusätzliche Hellfeld- und Fluoreszenz-Kanäle beobachtet, um deren Lebensfähigkeit zu überwachen. Das Instrument stellt physiologische Bedingungen für die Zellen sicher und ermöglicht Langzeit-Messungen in einem automatisierten Verfahren, demonstriert für bis zu 24~Stunden. iSCAT und das Sekretoskop erweisen sich als vielversprechende Ergänzungen zu existierenden Methoden für Untersuchungen in Proteomik und Sekretomik. Der Nachweis von einzelnen Proteinen in Echtzeit über lange Zeiträume ebnet den Weg für umfangreiche Studien von biologischen Systemen. Unsere Methode kann mit anderen Techniken kombiniert werden um Zugang zu Spezifität zu erlangen und Anwendungsmöglichkeiten zu erweitern. In der Zukunft kann iSCAT verwendet werden um Antworten zu wesentlichen Fragen in Medizin und Biologie zu geben, wie beispielsweise in Bezug auf Zellzyklus, Immunantwort oder Infektion durch Viren oder Parasiten.