Einzelmolekül-FRET-Analyse der biomolekularen Dynamik des SAM-I-Riboschalters
Creators: name: Manz, Christoph
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2021
Subjects: Riboschalter
Konfokalmikroskopie
RNS-Faltung
HMM-Analyse
FRET
Försterresonanzenergietransfer
Fluoreszenzmikroskopie
SAM-I-Riboschalter
Einzelmolekülspektroskopie
Biophysik

description: Riboschalter (RS) sind in der Natur omnipräsent und regulieren eine Vielzahl von fundamentalen biochemischen Prozessen. Sie stellen eine faszinierende Untergruppe von Ribonukleinsäure-Molekülen dar. Ihre Eigenschaften erlauben eine hohe strukturelle Dynamik. Sie binden spezifische Botenstoffe mit hoher Selektivität und Sensitivität und regulieren die Vervielfältigung von Genen als Antwort auf die Bindung der spezifischen Botenstoffe. Ribonukleinsäuren (RNS) sind Biopolymere, bestehend aus einer langen Sequenz, die aus vier verschiedenen Nukleotiden aufgebaut ist. Bislang waren RNS-Moleküle in Organismen vor allem durch ihre passive Rolle als Blaupause einer Desoxyribonukleinsäure-Sequenz (DNS-Sequenz) in der Synthese von Proteinen bekannt. Innerhalb der letzten Jahrzehnte wurden jedoch RNS-Moleküle entdeckt, die auch aktive Eigenschaften besitzen [1, 2]. Dazu gehört zum Beispiel die Gruppe der enzymalen RNS, sogenannte Ribozyme. Diese katalysieren chemische Reaktionen in Bakterien [3-5]. In ihrer natürlichen Umgebung in Zellen bilden RNS-Moleküle innerhalb einer wässrigen Lösung mit spezifischen Ionenkonzentrationen dreidimensionale Strukturen, welche die Funktion des Moleküls bestimmen. Diese funktionalen Strukturen werden als native Konformation bezeichnet. Den Prozess, bei dem das lineare Biopolymer in seine native Konformation übergeht, nennt man Faltung. Ein Hauptinteresse der heutigen Erforschung von Biopolymeren ist es, zu verstehen, welche Molekülstrukturen welche Funktionalitäten übernehmen können. Aus dem tieferen Verständnis der katalytischen und regulatorischen Fähigkeiten von RNS-Molekülen erhoffen sich Wissenschaftler vielfältige Anwendungspotentiale in der synthetischen Biologie oder der Gentechnik. Riboschalter im Speziellen sind für therapeutische Anwendungen auf dem Gebiet der Krebsforschung [6] oder der Antibiotika-Entwicklung vorstellbar [7-9]. Zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Molekülstruktur und Funktion wurden zusammen mit der Proteinforschung immer leistungsfähigere Methoden entwickelt. Dazu gehört beispielsweise Simulationssoftware, welche die Faltung von Biomolekülen auf immer längeren Zeitskalen berechnen kann. Ebenso wurden die experimentellen Techniken sukzessive verbessert. So konnten die Syntheseverfahren zur Herstellung immer größerer und komplexerer Biomoleküle optimiert werden. Messaufbauten mit leistungsfähigeren Mikroskopen ermöglichen auch Untersuchungen von lichtschwachen Proben auf immer kürzeren Zeitskalen. Dies ebnete den Weg für Untersuchungen einzelner, fluoreszenzmarkierter Biomoleküle, wie sie in dieser Arbeit an Riboschaltern durchgeführt wurden. Solche Einzelmolekülexperimente bieten gegenüber den üblichen Ensemblemessungen an einer Vielzahl von Molekülen, den Vorteil, dass Mittelungen der Messdaten vermieden werden. Durch Zuhilfenahme des Försterresonanzenergietransfers (FRET) können die Struktur und die Dynamik einzelner Moleküle bis in den Nanometerbereich vermessen werden. In Kombination mit einer hohen Zeitauflösung der Messung ist es so möglich, mit Einzelmolekülexperimenten selbst seltene Subpopulationen von Molekülzuständen nachzuweisen. Im Gegensatz zu invasiven Methoden, wie der Einzelmolekülkraftspektroskopie, machen Einzelmolekül-FRET-Experimente auch nicht invasive, In-vivo-Untersuchungen möglich. Biomoleküle wie Riboschalter besitzen eine komplexe Struktur und Faltungsdynamik, sodass einfache Analysemethoden oft nicht ausreichen, genügend Rückschlüsse aus den Messdaten zu ziehen. Um ein detaillierteres Ergebnis zu erhalten, bedarf es einer ausgeklügelten Analysesoftware, zum Beispiel einer Hidden-Markov-Modellanalyse (HMM), wie sie in dieser Arbeit eingesetzt wurde. Durch die Verwertung sowohl spektroskopischer als auch zeitlicher Informationen aus den Messdaten können nämlich Faltungszustände identifiziert werden, welche bei konventionellen Analyseverfahren nicht sichtbar geworden wären. Dadurch kann ein besseres Wissen über die Funktion der Riboschalter erlangt werden. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe von Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie und der Anwendung einer HMM-Analyse der sogenannte SAM-I-Riboschalter untersucht. Er gehört zu einer Gruppe von Riboschaltern, die den Botenstoff S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) binden und damit die Genregulierung auf transkriptioneller Ebene beeinflussen. Sie sind Bestandteil der fundamentalen Biosynthese von Cystein, Methionin und SAM-Metaboliten [10, 11]. Bislang ist wenig über Konformationen und Faltungsdynamik eines vollständigen SAM-I-Riboschalters bekannt, sodass der Schwerpunkt dieser Arbeit in der Erforschung der Energielandschaft des vollständigen SAM-I-Riboschalters (Bacillus subtilis yitJ) gelegt wurde.