Solutions to common issues in widefield microscopy: vignetting, mosaicing and depth of focus
Creators: name: Piccinini, Filippo <1985>
Publisher: name: Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
Year: 2013
Subjects: ING-INF/06 Bioingegneria elettronica e informatica

description: In this thesis we have developed solutions to common issues regarding widefield microscopes, facing the problem of the intensity inhomogeneity of an image and dealing with two strong limitations: the impossibility of acquiring either high detailed images representative of whole samples or deep 3D objects. First, we cope with the problem of the non-uniform distribution of the light signal inside a single image, named vignetting. In particular we proposed, for both light and fluorescent microscopy, non-parametric multi-image based methods, where the vignetting function is estimated directly from the sample without requiring any prior information. After getting flat-field corrected images, we studied how to fix the problem related to the limitation of the field of view of the camera, so to be able to acquire large areas at high magnification. To this purpose, we developed mosaicing techniques capable to work on-line. Starting from a set of overlapping images manually acquired, we validated a fast registration approach to accurately stitch together the images. Finally, we worked to virtually extend the field of view of the camera in the third dimension, with the purpose of reconstructing a single image completely in focus, stemming from objects having a relevant depth or being displaced in different focus planes. After studying the existing approaches for extending the depth of focus of the microscope, we proposed a general method that does not require any prior information. In order to compare the outcome of existing methods, different standard metrics are commonly used in literature. However, no metric is available to compare different methods in real cases. First, we validated a metric able to rank the methods as the Universal Quality Index does, but without needing any reference ground truth. Second, we proved that the approach we developed performs better in both synthetic and real cases.
description: In questa tesi abbiamo sviluppato soluzioni a questioni comuni in materia di microscopia a campo largo. Abbiamo affrontato il problema della non omogeneità dell'intensità delle immagini acquisite e due forti limitazioni: l'impossibilità di acquisire immagini ad alto dettaglio rappresentative o dell'intero campione o di oggetti 3D con spessore non trascurabile. Per prima cosa abbiamo studiato le caratteristiche del problema denominato vignettatura, relativo alla distribuzione non uniforme del segnale di luce all'interno di ogni singola immagine. In particolare abbiamo proposto metodi dove la funzione di vignettatura è stimata utilizzando un insieme di immagini acquisite direttamente dal campione. In seguito, abbiamo studiato come risolvere il problema legato alla limitata dimensione del campo di vista della telecamera, al fine di essere in grado di acquisire una singola immagine ad alto ingrandimento rappresentativa dell'intera area del campione osservato. A questo scopo abbiamo sviluppato tecniche di mosaicatura in grado di operare on-line con l'acquisizione delle immagini. Partendo da una serie di immagini acquisite manualmente, abbiamo validato un approccio di registrazione in grado di creare velocemente un mosaico allineando accuratamente le singole immagini acquisite. Infine, abbiamo studiato come estendere virtualmente il campo di vista della telecamera lungo la terza dimensione, con lo scopo di poter ottenere singole immagini completamente a fuoco di oggetti 3D. Abbiamo proposto un metodo generale che non richiede alcuna informazione a priori. Per confrontare i risultati dei diversi metodi, in letteratura sono tipicamente usate diverse metriche comuni. Tuttavia nessuna metrica è in grado di confrontare diversi metodi usando immagini reali. In primo luogo abbiamo validato una metrica in grado di classificare i diversi metodi in accordo all'indice di qualità universale, ma senza bisogno di alcuna verità di riferimento. Poi abbiamo dimostrato che il metodo che abbiamo sviluppato risulta essere il migliore tra tutti quelli testati per estendere la profondità di fuoco.