title: Evaluation of alternative fluorophores for fluorescence in situ hybridization in microbial ecology
Creators: name: Berger, Adrian Christoph
Publisher: name: :none
Year: 2016

description: Fluorescene in situ hybridization (FISH) mittels rRNA- gerichteten Oligonukleotidsonden ist ein sehr mächtiges und vielseitiges Tool für den Nachweis, die Visualisierung und der Quantifizierung von Mikroorganismen in umwelt- und medizinischen Proben. Da diese kultivierungsunabhängige Methode die Möglichkeit einer räumlichen Visualisierung der Anordnung von Mikroorganismen in ihrem Umfeld und zueinander ermöglicht, kann dadurch auf mögliche antagonistischen oder mutualistischen Lebensstile zurückgeschlossen werden. Daher stellt diese Technik eine wichtige Methode dar, die uns dabei hilft mehr Verständnis über die hochkomplexen, mikrobiellen Lebensgemeinschaften zu erfahren. Jedoch waren Wissenschaftler in der Vergangenheit durch intrinsische Limitationen von Mikroskopen (fixierte Anregungswellenlänge, Filter und Detektoren) auf die gleichzeitige Visualisierung von drei unterschiedlichen Taxa beschränkt. Wissenschaftler in der Vergangenheit haben versucht diese Limitation durch binäre Farbstoffkombinationen und der Verwendung von mehreren Sonden pro Zielorganismus zu umgehen, jedoch senken alle diese Methoden die Sensitivität des Protokolls beträchtlich, was schließlich zu falschen Zellzuordnungen führen kann. Daher stellen wir hier eine neue, robuste und leicht anwendbar FISH- Methode vor, bei der wir auf die neueste Technologie des Weißlichtlasers, mit seinen Möglichkeiten der stufenlosen Anregung- und Detektion zurückgreifen und diese mit alternativen Farbstoffen kombinieren. Als Bestätigung unseres Ansatzes haben wir die (Mikro-) Diversität einer nitrifizierenden Bakteriengesellschaft in einer Großkläranlage in Ingolstadt (Deutschland) visualisiert. Damit konnten acht verschiedene mikrobielle Gruppen erfasst werden, wobei es gelungen ist sechs Zielgruppen innerhalb eines Gesichtsfeldes zu visualisieren. Fluoreszenz Intensitätsmessungen haben weiteres ergeben, dass zwei alternative Farbstoffe die Leuchtkraft von Cy3 mit einem Faktor von 1,45 und 1,55 deutlich übersteigen. Daher bietet diese Arbeit nicht nur eine Reihe neuer, attraktiver und gut mit FISH kombinierbaren Farbstoffe an, sondern stellt es auch eine einfache, robuste und leicht anwendbare multicolour FISH Methode mit erhöhter Sensitivität dar, die sich besonders in der weiteren Erforschung von komplexen mikrobiellen Lebensgemeinschaften als dienlich erweisen wird.
description: Fluorescence in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted olignoucleotides is a very powerful and versatile tool for the verification, visualization and enumeration of microorganisms in environmental and medical samples. As this cultivation-independent technique also offers the possibility of visualizing the in situ spatial arrangement of microbes in the environment and to each other, hereby revealing potential antagonistic or mutualistic lifestyles, it represents an essential method that helps to understand complex microbial interactions. However, due to intrinsic limitations of microscopy (fixed excitation wavelengths, fixed filters and detectors) in the past, researchers were constraint to the simultaneous visualization of a few different microbial taxa. Although several attempts to circumvent this limitation have been made by applying probes equipped with binary dye combinations or multiple, mono- labelled probes competing for the same target site, they all suffer from a reduced sensitivity and thus might be prone to wrong cell assignment. We here present a novel, robust, and straight- forward multicolour FISH approach that fully exploits the steplessly tunable white light laser (WLL) technology and the introduction of alternative fluorophores. As a biological proof of principle, this method was used to visualize the (micro)- diversity of the nitrifying community within activated sludge of the full- scale wastewater treatment plant (WWTP) Ingolstadt, Germany. By this, eight different microbial taxa could successfully be visualized, whereat six target groups could be detected simultaneously within one field of view. Fluorescence intensity measurements further revealed that two alternative dyes clearly exceeded the brightness of the carbocyanine dye Cy3 by a factor of 1.45 and 1.55, respectively. Thus this study not only offers a rash of new and attractive alternative dyes that are compatible with FISH, but also depicts an easy and robust multicolour FISH approach with increased sensitivity that will particularly be helpful in the future for the assessment of complex microbial communities.