Einfluss von biomechanischem Stress auf Binde- und Hornhautepithelzellen
Creators: name: Burgemeister, Fabian
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: 1. ZUSAMMENFASSUNG 1.1 Hintergrund und Ziele In der vorliegenden Arbeit wird ein in vitro Zellkultur-Flusssystem etabliert, um eine humane telomerase-immortalisierte Hornhautepithel-Zelllinie (hTCEpi Zellen) unter verschiedenen Scherbeanspruchungen zu analysieren. Dies soll die physiologischen Bewegungen des Tränenfilms auf der Augenoberfläche nachahmen um so Veränderungen der hTCEpi Zellen auf wechselnde Scherkräfte aufzuzeigen und diese miteinander zu vergleichen. Die hTCEpi Zellen werden mittels eines Pumpsystems der Firma ibidi einer diskontinuierlich- oszillierenden und einer kontinuierlich-unidirektionalen Scherbeanspruchung ausgesetzt. Zum Vergleich werden hTCEpi Zellen untersucht, die ohne Scherbeanspruchung bebrütet werden. 1.2 Methoden Die hTCEpi Zellen werden durch Verwendung eines Zellkultur-Flusssystems der Firma ibidi für drei Tage in einem Brutschrank bei 37° Celsius und 5% CO2 bebrütet. Es werden drei verschiedene Versuchsbedingungen miteinander verglichen. Es erfolgt der Einsatz einer Standkultur, sowie das Nachahmen vom physiologischem Blinzel des Augenlids und die damit verbundene Bewegung vom Tränenfilm über der Hornhaut. Dies kann mit dem ibidi Pumpsystem simuliert werden. Die hTCEpi Zellen werden einem diskontinuierlich- oszillierenden Mediumfluss (66mbar, Mediumfluss 2250ms in die eine Richtung; 2250ms in die andere Richtung; 3 Sekunden Pause; 3 Tage) und einem kontinuierlich-unidirektionalen Mediumfluss (15 mbar in eine Richtung; 3 Tage) ausgesetzt. Nachdem die hTCEpi Zellen jeweils für drei Tage kultiviert worden sind, werden die Expressionsprofile ausgewählter Proteine, die für die Zellkontakte und Verbindungen der Zellen untereinander verantwortlich sind, sowie die Zellmorphologie der hTCEpi Zellen näher betrachtet. Die Zelloberfläche und die Zytoskelettarchitektur werden mittels Rasterelektronenmikroskopie und Immunfluoreszenz untersucht. Dazu wird die Proteinexpression von Desmoplakin, dem Tight Junction-Protein 1B (TJP1B), sowie Occludin mittels Western Blot analysiert und ihre Lokalisierung mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen. Zur Beurteilung der Bildung membrangebundener Muzine (MUC), die von den hTCEpi Zellen gebildet werden, werden Muzine durch histologischer Färbung und mittels Immunfluoreszenz gegen MUC1, -4 und -16 analysiert. 1.3 Ergebnisse In Abhängigkeit der Scherbeanspruchung zeigen die durchgeführten Untersuchungen einen Einfluss auf die Expression von Proteinen der Zellkontakte (z.B. Desmoplakin, Occludin und TJP1B). Es können zusätzlich signifikante morphologische Veränderung der hTCEpi Zellen aufgezeigt werden. Unter einer diskontinuierlich-oszillierenden Scherbeanspruchung zeigen die hTCEpi Zellen eine typische abgeflachte, polygonale Zellform der oberflächlichen Schicht des mehrschichtig, unverhornten Plattenepithels. Die Zellen der Standkulturen erscheinen kleiner und runder. Unter zunehmender Scherbeanspruchung legen sich die Zellen näher aneinander und es zeigen sich weniger extrazelluläre Freiräume zwischen benachbarten Zellen. Hierbei weisen die Zellen unter diskontinuierlich-oszillierender Scherspannung die geringsten extrazellulären Freiräume auf. Ein Rückschluss auf die Ausrichtung der Zellen und deren Vernetzungen im Hinblick auf die Strömungsrichtung kann nicht dargestellt werden. Durch die Bengal Rosa Färbung können in allen drei Zellkulturen Muzinschichtdefekte nachgewiesen werden. Bei der kontinuierlich- unidirektionaler Scherbeanspruchung liegen die Bengal Rosa positiven Zellen vermehrt in Zellgruppen zusammen. Bei der Betrachtung der Zellen kann das Zytoskelettfilament F-Aktin in allen drei Versuchsreihen als ein großer Bestandteil der Zellmembranen aufgezeigt werden. Eine Ausrichtung der F-Aktin Filamente in Strömungsrichtung kann hierbei nicht nachgewiesen werden. Durch den Western Blot wird die Einwirkung der Scherkräfte auf die Expression von TJP1B, Occludin und Desmoplakin nachgewiesen. Diese Proteine sind Bestandteile der Aufrechterhaltung von Zellkontakten. Die Expression von TJP1B, Occludin und Desmoplakin steigt mit zunehmender Stärke der Scherkräfte an. Bei Desmoplakin ergibt sich der deutlichste Anstieg der Expression in den Flusskulturen. Unter einer diskontinuierlich-oszillierender Scherbeanspruchung kann eine siebenfache höhere Expression im Vergleich zur Standkultur nachgewiesen werden. In der Immunfluoreszenz sind alle drei Muzine MUC1, MUC4 und MUC16 unabhängig von der Scherbeanspruchung nachweisbar. Die Muzine MUC1, -4 und -16 zeigen in der Immunfluoreszenz subjektiv die stärkste Immunreaktion unter kontinuierlich-unidirektionalen Bedingungen. Bei der Standkultur ist auffällig, dass sich MUC1 an den Zellgrenzen lokalisiert. Im Hinblick auf den Nachweis von MUC4 und MUC16 ist die Verteilung der Muzine bei Standkulturen und bei Kulturen mit Scherbeanspruchung unregelmäßig im Zellinneren verteilt. 1.4 Schlussfolgerung Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass eine Scherbeanspruchung, wie sie an der Augenoberfläche durch den Lidschlag auftritt, eine nachweisbare Auswirkung auf die Hornhautepithelzellen hat. Es kommt zu Veränderungen vom Zytoskelett und beeinflusst die Expression vom verschiedenen Zellproteinen die für die Aufrechterhaltung der Zellbarrieren und den Zellkontakten zwischen den Zellen verantwortlich sind. Die Befunde untermauern damit die physiologisch- mechanische Bedeutung der Tränenflüssigkeitsbewegung auf dem Hornhautepithel. Damit zeigt das hier etablierte Modell, dass es für in vitro Untersuchungen von Augenoberflächenepithelien nützlich sein kann, da es eine wesentlich physiologischere Reproduktion der in vivo Situation darstellt als die üblicherweise angewandten statischen Kulturbedingungen.