Διερεύνηση του δυναμικού παραγωγής φυτοενίου από τον μύκητα Blakeslea trispora: Αξιολόγηση καταλληλότητας χημικών ρυθμιστών της βιοσύνθεσης β-καροτενίου και εργοστερόλης
Creators: name: Σφαιροπούλου, Ελπίς Βασιλείου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Φυτοένιο
Blakeslea trispora
Τερβιναφίνη
Phytoene
Terbinafine

description: Το φυτοένιο συντίθεται από όλους τους οργανισμούς με ικανότητα βιοσύνθεσης καροτενοειδών, παρουσιάζει υψηλή βιοδιαθεσιμότητα και η μελέτη του έχει παραβλεφθεί σε μεγάλο βαθμό κατά τα προηγούμενα έτη. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η διερεύνηση του δυναμικού παραγωγής φυτοενίου από τη συζευγμένη καλλιέργεια (+) και (-) στελεχών του μύκητα Blakeslea trispora. Για την ικανοποίηση του παραπάνω στόχου επιλέχθηκε να διερευνηθεί η επίδραση τριών χημικών ενώσεων -της διφαινυλαμίνης, του 2-μεθυλο ιμιδαζολίου και της υδροχλωρικής τερβιναφίνης- στο προφίλ των καροτενοειδών που συσσωρεύονται στα κύτταρα της συζευγμένης καλλιέργειας του μύκητα B. trispora. Οι ενώσεις αυτές δρουν ως χημικοί ρυθμιστές των βιοσυνθετικών οδών των καροτενοειδών και της εργοστερόλης, οι οποίες μοιράζονται κοινές πρόδρομες ενώσεις, μέσω της αναστολής της δράσης των ενζύμων αφυδρογονάση φυτοενίου, β-κυκλάση λυκοπενίου και εποξειδάση σκουαλενίου, αντιστοίχως. Για τον πειραματικό σχεδιασμό και την αξιολόγηση των πειραματικών δεδομένων αξιοποιήθηκε η μεθοδολογία επιφανειών απόκρισης. Ως ανεξάρτητες μεταβλητές ορίστηκαν το επίπεδο προσθήκης των τριών χημικών αναστολέων, ο χρόνος προσθήκης τους, ο χρόνος ζύμωσης και η αναλογία σπορίων (+)/(-) στελεχών. Η απόδοση σε ξηρή βιομάζα και η περιεκτικότητα της βιομάζας σε 15-cis-φυτοένιο και all-trans-λυκοπένιο χρησίμευσαν ως εξαρτημένες μεταβλητές (αποκρίσεις), με απώτερο σκοπό τη βελτιστοποίηση της διεργασίας ως προς την παραγωγή φυτοενίου. Ο υγροχρωματογραφικός διαχωρισμός των καροτενοειδών πραγματοποιήθηκε σε χρωματογραφική στήλη αντίστροφης φάσης C18, κάτω από ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης. Ο σχηματισμός βιομάζας δεν φάνηκε να επηρεάζεται σημαντικά από την παρουσία των τριών χημικών αναστολέων στο μέσο καλλιέργειας. Σημαντική επίδραση στην τιμή του εμφάνισαν η χρονική διάρκεια της διεργασίας και ο χρόνος προσθήκης των παραπάνω αναστολέων. Αντίθετα, η παρουσία των αναστολέων επηρέασε ποιοτικά και ποσοτικά το προφίλ των καροτενοειδών. Τα εκχυλίσματα των πειραματικών δοκιμών εμφάνισαν ένα πλούσιο προφίλ καροτενοειδών, αποτελούμενο από μια πληθώρα ενδιάμεσων μορίων της βιοσυνθετικής πορείας του β-καροτενίου στα κύτταρα του μύκητα B. trispora. Μεταξύ αυτών, το λυκοπένιο μαζί με το φυτοένιο αποτέλεσαν τα κύρια καροτενοειδή που εντοπίστηκαν στα εκχυλίσματα των δοκιμών παρουσία 2-μεθυλο ιμιδαζολίου. Η περιεκτικότητα σε φυτόενιο παρουσίασε διακυμάνσεις, αλλά σε όλες τις περιπτώσεις τα επίπεδα του ήταν υψηλότερα από αυτά των προϊόντων ντομάτας που αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία ως πλούσια διαιτητική πηγή φυτοενίου. Η μέγιστη τιμή της περιεκτικότητας σε φυτοένιο (5,02 mg/g ξηρής βιομάζας) επιτεύχθηκε απουσία διφαινυλαμίνης και 2-μεθυλο ιμιδαζολίου, με την προσθήκη 91,54 mg τερβιναφίνης/L θρεπτικού μέσου στις 67,57 h ζύμωσης, αναλογία σπορίων (+)/(-) ίση με 1/10 και διάρκεια ζύμωσης 125 h. Η τιμή αυτή είναι τουλάχιστον είκοσι φορές υψηλότερη από την αντίστοιχη που έχει αναφερθεί για τρόφιμα φυτικής προέλευσης που θεωρούνται καλές πηγές φυτοενίου (0,005-0,24 mg/g ξηρού βάρους). Παράλληλα, αποτελεί την υψηλότερη τιμή που έχει καταγραφεί για βιομάζα συζευγμένης καλλιέργειας άγριων στελεχών του B. trispora, ενώ είναι συγκρίσιμη με τα επίπεδα τιμών που έχουν αναφερθεί σε ορισμένες μελέτες, που εξετάζουν τη βιοτεχνολογική παραγωγή φυτοενίου με την αξιοποίηση γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών.
description: Phytoene is synthesized by all carotenogenic organisms, exhibits high bioavailability, and its study has been largely neglected in previous years. This study was aimed to explore the potential of phytoene production from the mated culture of (+) and (-) strains of the fungus Blakeslea trispora. To satisfy the above objective, the effect of three chemical compounds - diphenylamine, 2-methyl imidazole and terbinafine hydrochloride- on the profile of carotenoids accumulated in the cells of the mated culture of the fungus B. trispora, was investigated. These compounds act as chemical regulators of the carotenoid and ergosterol biosynthetic pathways, which share common precursor molecules, by inhibiting the action of the enzymes phytoene dehydrogenase, lycopene β-cyclase and squalene epoxidase, respectively. Response surface methodology was used to design the experiment and evaluate the experimental data. The level of addition of the three inhibitors, their addition time, fermentation time and the strain ratio (+)/(-) were defined as independent variables. Biomass dry weight and 15-cis-phytoene and all-trans-lycopene yield served as dependent variables (responses), with the ultimate goal of optimizing the process for phytoene production. The liquid chromatographic separation of carotenoids was performed on a C18 reverse phase chromatographic column, under isocratic elution conditions. Biomass formation did not appear to be significantly affected by the presence of the three chemical inhibitors in the culture medium. The fermentation time and the time of addition of the above inhibitors showed a significant effect on its value. On the contrary, the presence of the inhibitors qualitatively and quantitatively affected the carotenoid profile. The extracts of the experimental runs showed a rich carotenoid profile, consisting of a multitude of intermediate molecules of the biosynthetic pathway of β-carotene in the cells of the fungus B. trispora. Among them, lycopene together with phytoene were the main carotenoids identified in the extracts of the runs in the presence of 2-methyl imidazole. The content of phytoene varied, but in all cases its levels were higher than in tomato products, which are reported in the international literature as a rich dietary source of phytoene. The maximum value of phytoene yield (5.02 mg/g of biomass dry weight) was achieved in the absence of diphenylamine and 2-methyl imidazole, with the addition of 91.54 mg terbinafine/L of culture medium at 67.57 h of fermentation, strain ratio (+) /(-) equal to 1/10 and fermentation time 125 h. This value is at least twenty times higher than that reported for plant-based foods that are considered good sources of phytoene (0,005-0,24 mg/g dry weight). At the same time, it is the highest value recorded for the biomass of mated cultures of wild-type B. trispora strains, while it is competitive with the value levels reported in some studies, which examine the biotechnological production of phytoene using genetically modified microorganisms.