title: Anaerober Abbau von Alkanen und Alkenen durch Sulfatreduzierer
title: Anaerobic degradation of alkanes and alkenes by sulfate reducing bacteria
Creators: name: Sünwoldt, Katharina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: hexadecane, alkanes
Alkene
degradation, hydroxylation,
Sulfatreduzierer , Alkane
Abbau
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
alkenes
Desulfococcus oleovorans
Hexadecan
Desulfatibacillum alkenivorans
Hydroxylierung
sulfate reducing bacteria

description: Alkanes and alkenes are components
      of crude oil. Consequently, they are unfortunately part of
      the environment. The degradation of these components is very
      important, because of the increasing global pollution caused
      by crude oil and other fuels. These hydrocarbons are degraded
      anaerobically by mono- and dioxygenases. The most known
      anaerobic bacteria degrade alkanes via fumarate addition.
      However, there are some other anaerobic microorganisms that
      also degrade alkanes in a different way, but the exact
      mechanisms of action are still unknown. Former findings of
      alkene degradation show that a hydration of the double bound
      of the alkene could be the initial reaction. Desulfococcus
      oleovorans strain Hxd3 and Desulfatibacillum alkenivorans
      strain AK-01 are well-known sulfate-reducing bacteria, which
      degrade alkanes and alkenes anaerobically. D. alkenivorans
      degrades alkanes via fumarate addition. In contrast, D.
      oleovorans uses a different, not fully characterized
      metabolic pathway. Nevertheless, it is still known that the
      strain contains genes, which encode for an enzyme, which has
      a high sequence similarity to the ethylbenzenedehydrogenase
      (EBDH) of Aromatoleum aromaticum. The main aim of this work
      was to characterize the alkane and alkene degradation by
      sulfate-reducing bacteria under anaerobic conditions and to
      analyse the possible involvement of the EBDH-like enzyme of
      D. oleovorans on the anaerobic alkane and alkene metabolism.
      We detected induced proteins in cells of D. oleovorans, which
      were grown on hexadecane. Using MALDI-TOF analyses, these
      proteins were identified as subunits of the EBDH-like enzyme.
      The enzyme was called alkanehydroxylase in this thesis,
      because of its supposed ability to catalyse the hydroxylation
      of the alkane to the corresponding iso-alcohol. We could also
      detect small amounts of the corresponding intermediate
      2-hexadecanol in an extract of a hexadecane-degrading culture
      of D. oleovorans by GC/MS analyses. The theory that a
      hydration reaction is the initial step of the alkene
      degradation to the corresponding 1-alcohol by
      sulfate-reducing bacteria forms the basis for our analyses.
      The evaluation of the fatty acid pattern of different
      substrates showed that D. oleovorans prefers alkenes and
      iso-alcohols instead of alkanes. One explanation for this
      observation could be that the bacteria need more energy to
      activate alkanes. The genes of the three subunits of the
      active alkane hydroxylase lie together with other genes on an
      apparent operon. All these proteins together may form a
      membrane-bound complex. In this complex electrons of the
      hydroxylation reaction, which takes place on the periplasm
      side, were may transferred to menaquinone, which is located
      in the membrane. The endergonic electron transfer is probably
      linked to energy consumption. D. alkenivorans discriminates
      between alkanes and alkenes but not as much as D. oleovorans.
      In hexadecane-degrading cultures of D. alkenivorans only the
      alkylsuccinate synthase was detected as induced protein. This
      enzyme catalysis the addition of fumarate to the methyl group
      of the alkane. Using the fatty acid pattern, we were able to
      show that D. oleovorans has a different degradation pathway
      than D. alkenivorans, which degrades alkanes by fumarate
      addition. Products of the degradation of an odd-chain
      iso-alcohol were mostly even-chain fatty acids in D.
      alkenivorans. In contrast, odd-chain alkanes were degraded to
      odd-chain fatty acids. Nevertheless, D. oleovorans mainly
      produced even-chain fatty acids independent of the substrate
      (odd-chain iso-alcohols or odd-chain alkanes). The results
      could indicate that the 2-iso-alcohol is a metabolite of the
      anaerobic alkane metabolism of D. oleovorans. We could not
      detect any specific induced proteins in both strains, when
      alkenes were used as substrates. However, we found that the
      initial enzyme of the alkene degradation in both strains is
      not dependent on tungsten such as the acetylene hydratase of
      Pelobacter acetylenicus, which catalyses the addition of
      water to the triple bound of acetylene. Genes of D.
      oleovorans which could encode for an acetylenehydratase-like
      enzyme, which is necessary for the alkene degradation, were
      transferred into an isolated strain of Pseudomonas stutzeri,
      which is able to grow on 1-hexadecanol but not on hexadecene.
      It was possible to detect growth of hexadecene-growing
      cultures under aerobic conditions with two of the potential
      alkene degrading enzymes of D. oleovorans.
description: Alkane und Alkene kommen als
      Bestandteile von Erdöl häufig in der Natur vor. Aufgrund der
      globalen Verschmutzung durch Erdöl bzw. daraus resultierenden
      Kraftstoffen, spielt der Abbau dieser Verbindungen eine große
      Rolle. Diese Kohlenwasserstoffe können aerob mit Hilfe
      bakterieller Mono- oder Dioxygenasen abgebaut werden. Bei den
      meisten bekannten anaeroben Bakterien, die Alkane abbauen
      können, erfolgt der Angriff über eine Fumarat-Addition. Es
      gibt einige Mikroorganismen, die Alkene anaerob über einen
      alternativen Mechanismus abbauen, zu dem bisher keine
      genaueren Details bekannt sind. Im Fall der Alkene sprechen
      die bisherigen Erkenntnisse für eine Hydratisierung der
      Doppelbindung als mögliche initiale Reaktion. Zu den am
      besten untersuchten anaeroben Bakterien, die sowohl Alkane
      als auch Alkene abbauen können, zählen die Sulfatreduzierer
      Desulfococcus oleovorans Stamm Hxd3 und Desulfatibacillum
      alkenivorans Stamm AK-01. D. alkenivorans Stamm AK-01 baut
      Alkane über Fumarat-Addition ab, während D. oleovorans einen
      unbekannten alternativen Mechanismus für den Alkanabbau
      benutzt, allerdings auch Gene für ein Enzym enthält, das hohe
      Ähnlichkeit zur Ethylbenzoldehydrogenase (EBDH) aus
      Aromatoleum aromaticum aufweist. Das Ziel dieser Arbeit war
      es, den anaeroben Abbau von Alkanen und Alkenen durch diese
      Sulfatreduzierer näher zu charakterisieren und die mögliche
      Beteiligung des in D. oleovorans gefundenen EBDH-ähnlichen
      Enzyms am anaeroben Alkan- oder Alkenbbau zu untersuchen. In
      D. oleovorans Zellen, die mit Hexadecan als Substrat wuchsen,
      wurden induzierte Proteine gefunden, die durch eine MALDI-TOF
      Analyse als Untereinheiten des EBDH-ähnlichen Enzyms
      identifiziert werden konnten. Dieses Enzym wurde in der
      vorliegenden Arbeit als Alkanhydroxylase bezeichnet, da es
      vermutlich für die Hydroxylierung des Alkans zum
      korrespondierenden iso-Alkohol verantwortlich ist. Das
      entsprechende Intermediat 2-Hexadecanol konnte tatsächlich
      auch in kleinen Mengen durch eine GC/MS Analyse nachgewiesen
      werden. Der Untersuchung des anaeroben Alkenabbaus durch
      Sulfatreduzierer wurde die Theorie zu Grunde gelegt, dass es
      sich bei der initialen Reaktion um eine Hydratisierung
      handeln könnte, wobei der korrespondierende 1-Alkohol
      entsteht. Durch die Analyse der Fettsäuremuster auf
      verschiedenen Substraten konnte festgestellt werden, dass
      besonders Alkene, aber auch iso-Alkohole im Gegensatz zu
      Alkanen von D. oleovorans bevorzugt werden. Das lässt
      vermuten, dass der Abbau von Alkanen für die Bakterienzellen
      mit einem höheren Energieverbrauch verbunden sein könnte. Die
      Gene der drei Untereinheiten der aktiven Alkanhydroxylase
      liegen mit weiteren Genen, die auf einen bc1-ähnlichen
      Komplex hindeuten, auf einem gemeinsamen apparenten Operon.
      Dies deutet daraufhin, dass diese Proteine einen gemeinsamen
      membranständigen Komplex bilden. Innerhalb des Komplexes
      werden dann wahrscheinlich die Elektronen aus der
      Hydroxylierung der Alkane, die im Periplasma stattfindet, auf
      Menachinon in der Membran übertragen. Es handelt sich dabei
      um einen endergonen Elektronentransfer, der wahrscheinlich
      mit einer Investition von Energie verbunden ist. Gegenüber D.
      oleovorans unterscheidet D. alkenivorans zwar auch zwischen
      Alkanen und Alkenen, aber nicht im gleichen Maße. Als
      induziertes Enzym in Hexadecan-Kulturen konnte einzig die
      Alkylsuccinatsynthase detektiert werden, welche die Addition
      von Fumarat an die Methylgruppe des Alkans katalysiert.
      Anhand der Fettsäuremuster konnte bestätigt werden, dass D.
      oleovorans im Gegensatz zu D. alkenivorans, welches Alkane
      durch Fumarat-Addition abbaut, einen anderen Abbaumechanismus
      haben muss. Beim Abbau eines ungeradkettigen 2-Alkohols
      wurden bei D. alkenivorans hauptsächlich geradkettige
      Fettsäuren detektiert. Wurde dahingegen ein ungeradkettiges
      Alkan abgebaut, entstanden hauptsächlich ungeradkettige
      Fettsäuren. Bei D. oleovorans wurden dahingegen sowohl beim
      Abbau eines ungeradkettigen Alkans, als auch eines
      ungeradkettigen 2-Alkohols geradkettige Fettsäuren
      detektiert. Das lieferte einen weiteren Hinweis darauf, dass
      der 2-Alkohol ein Abbauprodukt des Alkanmetabolismus in D.
      oleovorans ist. In Alken-abbauenden Kulturen beider Stämme
      konnten keine spezifisch induzierten Enzyme detektiert
      werden. Es wurde aber gezeigt, dass das jeweils initiale
      Enzym des Alkenabbaus in D. oleovorans und D. alkenivorans
      nicht Wolfram abhängig ist, wie die Acetylenhydratase aus
      Pelobacter acetylenicus, welche die Addition von Wasser an
      die Dreifachbindung von Acetylen katalysiert. Potentielle
      Gene aus D. oleovorans, die für ein
      Acetylenhydratase-ähnliches Enzym zum Abbau von Alkenen
      kodieren, wurden in einen selbst isolierten Pseudomonas
      stutzeri Stamm eingebracht, der 1-Hexadecanol, aber kein
      Hexadecen, abbauen kann. Es wurde gezeigt, dass Wachstum auf
      Hexadecen unter aeroben Bedingungen mit zwei der potentiellen
      Gene, die für das mögliche Enzym des initialen Schritts des
      Alkenabbaus codieren, wahrscheinlich möglich war.