title: HPLC-Analysen zur Bedeutung genetischer Varianten organischer Kationentransporter für hydrophile kationische Medikamente
title: HPLC analysis for the importance of genetic variants of organic cation transporter for cationic hydrophilic drugs
Creators: name: Tadjerpisheh, Sina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Proguanil,Cycloguanil,Amisulprid, Debrisoquin
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
organsiche hydrophile Medikamente
HPLC
amisulpride
hplc analysis, proguanil
debrisoquine
cycloguanil

description: The importance of genomic
      variation in the biotransformation of drugs is well known.
      Only in the last two decades, the big importance of drug
      membrane transporters and of genomic variation in their genes
      became apparent. For this reason and because of the
      importance in drug-drug interactions, the identification of
      the relevant membrane transporters has meanwhile become an
      essential part of pre-clinical and early clinical drug
      development. Particularly for hydrophobic drugs the ATP
      consuming efflux transporters like the multidrug resistance
      transporter 1 (MDR1) are highly important. In addition to the
      efflux transporters, there are influx transport proteins
      which accelerate the uptake of hydrophilic cationic molecules
      into the cell. One group of these influx transporters are the
      organic cation transporters (OCTs). In order to measure
      substrate concentrations in transport experiments within the
      cell, the analytical method of the high pressure liquid
      chromatography (HPLC) is the most commonly used procedure
      alongside to the still widespread use of radioactive labels.
      However, not every previously published method can be easily
      transfered to the existing conditions. The specific
      challenges of this present work resulted from the small
      volumes and low concentrations to be analyzed in the
      transport experiments. The thesis had the following
      objectives: Firstly, the HPLC methods for quantitative
      analysis of drugs such as proguanil, cycloguanil, amisulpride
      and debrisoquine for membrane transport experiments should be
      optimized and validated. The cellular uptake of proguanil and
      cycloguanil should be measured in HEK293 cells which
      overexpress the organic cation transporters OCT1, -2, and -3
      and OCTN1 and -N2. The data should be further validated by
      inhibition of the transport using typical inhibitors of OCTs
      and drugs relevant as comedication. In addition, the impact
      on the relevant inherited variants of organic cation
      transporters should be analyzed. Finally, the transport of
      proguanil into non-infected erythrocytes should be
      characterized. This should include inhibition experients with
      prototypical inhibitors of organic cation transporters and
      with substances relevant as co-medication. 1. Einleitung 36
      Based on validation and optimization of HPLC methods, the
      concentration of the drugs proguanil, cycloguanil,
      amisulpride and debrisoquine could be determined
      quantitatively. The drugs were measured and detected in the
      low nanogram/ml concentration range. In-vitro experiments
      showed that the antimalarial drug proguanil and its active
      metabolite cycloguanil can be transported with different
      maximum transport velocities and affinities by the
      electrogenic organic cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3.
      In contrast to them, the organic cation transporter OCTN1 and
      OCTN2 overexpressed in HEK cells didn´t show any increase in
      the cellular uptake of proguanil and cycloguanil. Selected
      inherited variants of OCT1 existing in Caucasian populations
      with a relatively high frequency and differing in their
      transport functions with many other drug also showed altered
      uptake of the drug proguanil and its active metabolite
      cycloguanil here. Coincubation with other drugs or model
      substrates in different concentrations showed significant
      reductions in the transport of proguanil and cycloguanil by
      OCT1. In particular, transport activity was reduced by
      quinine, mefloquine and omeprazole. A carrier-mediated
      transport of the antimalarial drug proguanil through the
      erythrocyte membrane could also be shown. This process could
      be inhibited and followed a Michaelis-Menten kinetics.
      Interestingly, the erythrocyte uptake could be inhibited by
      the OCTN substrate carnitine, a finding which requires
      further studies considering that overexpression of OCTN1 and
      OCTN2 in HEK cells did not increase proguanil or cycloguanil
      uptake. In conclusion, the results showed that the organic
      cation transporters OCT1, OCT2 and OCT3 may play a role in
      the absorption and secretion of proguanil and cycloguanil
      within the human organism.
description: Die Bedeutung genetischer Variation
      bei der Biotransformation von Arzneimitteln ist gut bekannt.
      Es hat sich in den letzten zwei Dekaden gezeigt, dass in den
      Genen einiger Arzneimittel-Membrantransporter eine erhebliche
      erbliche Variation besteht. Aus diesem Grunde und wegen der
      Bedeutung bei Arzneimittel-Interaktionen ist die Erforschung
      der relevanten Membrantransporter inzwischen zu einem
      wichtigen Bestandteil der präklinischen und frühen klinischen
      Arzneimittelentwicklung geworden. Für hydrophobe Arzneistoffe
      sind Efflux-Transporter wie der Multidrug-Resistance-Proteine
      1 (MDR1) von großer Bedeutung. Hinzu kommen für die
      hydrophilen Arzneistoffe viele Influx-Transporterproteine wie
      beispielsweise die organischen Kationentransporter (OCTs),
      die die Aufnahme von organischen kationischen Molekülen in
      die Zelle beschleunigen. Um bei Transportmessungen
      Konzentration innerhalb der Zelle zu messen, ist heute neben
      der immer noch weit verbreiteten Anwendung der radioaktiven
      Markierungen die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
      das am häufigsten verwendete analytische Verfahren. Jedoch
      lässt sich nicht jede bereits publizierte Methode problemlos
      auf die vorhandenen Gegebenheiten und Anforderungen bezüglich
      der Empfindlichkeit übertragen. Daraus ergaben sich die
      speziellen Herausforderungen der vorliegenden Arbeit. Im
      Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden folgende Ziele
      verfolgt: Für Untersuchungen zur Bedeutung organischer
      Kationentransporter sollte zunächst die Optimierung und
      Validierung von HPLC-Methoden zur quantitativen Bestimmung
      der Arzneistoffe Proguanil, Cycloguanil, Amisulprid,
      Debrisoquin und 4-Hydroxydebrisoquin erfolgen. Die Biochemie
      der zellulären Aufnahme von Proguanil sowie Cycloguanil
      sollte geklärt werden. Dies sollte erfolgen anhand von
      HEK293-Zellen, welche die vermutlich hier relevanten
      organische Kationentransporter OCT1-3 sowie OCTN1 und OCTN2
      exprimierten. Zur weiteren Klärung und Bestätigung sollten
      auch Experimente mit Inhibition des Transports an den oben
      erwähnten OCTs durchgeführt werden. Ferner sollten zu
      Proguanil und Cycloguanil die Auswirkungen der bei Europäern
      relevanten und natürlicherweise auftretenden Genvarianten und
      Interaktionen mit weiteren Arzneistoffen auf den 1.
      Einleitung 34 Membrantransport analysiert werden. Schließlich
      sollte der Transport von Proguanil durch
      Erythrozytenmembranen mit anschließender Inhibition des
      vermeintlichen Transports und der Interaktion mit weiteren
      Arzneistoffen analysiert werden. Durch die Validierung und
      Optimierung der HPLC-Methoden konnten die Konzentrationen der
      Arzneistoffe Proguanil, Cycloguanil, Amisulprid sowie
      Debrisoquin quantitativ bestimmt werden. Die obigen
      Arzneistoffe konnten mit der erforderlichen Empfindlichkeit
      und Präzision gemessen werden Die In-Vitro-Versuche zeigten,
      dass das Antimalariamittel Proguanil und sein aktiver
      Metabolit Cycloguanil über die elektrogenen organischen
      Kationentransporter OCT1, OCT2 und OCT3 mit unterschiedlicher
      Vmax und KM transportiert werden können. Die organischen
      Kationentransporter OCTN1 und OCTN2 zeigten hingegen keine
      Beschleunigung der zellulären Aufnahme der beiden Substanzen.
      Ausgewählte Polymorphismen des OCT1, die mit einer erhöhten
      Häufigkeit bei Kaukasiern auftreten und Auswirkungen auf die
      Aufnahme von anderen Arzneistoffen zeigten, zeigten auch bei
      Proguanil und Cycloguanil einen veränderten und in der Regel
      reduzierten Membrantransport. Die gleichzeitige Gabe weiterer
      Pharmaka (insbesondere Mefloquin, Chinin oder Omeprazolmit
      unterschiedlichen Konzentrationen führten zu einer Reduktion
      des Membrantransports von Proguanil und Cycloguanil an OCT1.
      Der erythrozytäre Transport des Antimalariamittels Proguanil
      durch die Erythrozytenmembran konnte ebenfalls analysiert
      werden. Dieser war unter anderem mit L-Carnitin hemmbar und
      folgt einer Michaelis-Menten-Kinetik. Die Ergebnisse zeigen,
      dass die organischen Kationentransporter eine bedeutende
      Rolle bei der Aufnahme und Ausscheidung von Proguanil und
      Cycloguanil im menschlichen Organismus spielen
      können.