Πειραματική μόλυνση του κουνελιού με στελέχη της Escherichia coli και εκτίμηση των αλλοιώσεων σε σχέση με τη χορήγηση ή μη αντιοξειδωτικών παραγόντων
Creators: name: Τσαλή, Ελευθερία Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: Βακτηριακή λοίμωξη
Bacterial infection

description: Tα εντεροπαθογόνα (EPEC) στελέχη της E. coli είναι εξωκυτταρικά βακτήρια τα οποία προκαλούν διάρροια εξαιτίας της προσκόλλησης τους στην κυτταρική μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου. Η διαδικασία αυτή είναι πολύπλοκη και έχει ως αποτέλεσμα την προσκόλληση (του βακτηρίου) και την εξάλειψη (attachment and effacement) των μικρολαχνών των κυττάρων και εμφάνιση κυτταρικών προσεκβολών με τη μορφή βάθρων προσκόλλησης στα οποία είναι σταθερά προσκολλημένα τα βακτήρια. Αναφορικά με τη χορήγηση βιταμίνης Ε ως συμπλήρωμα διατροφής πιστεύεται ότι αυτή είναι ευεργετική και βελτιώνει την κατάσταση του οργανισμού σε νευρολογικά νοσήματα, σε καρδιαγγειακές διαταραχές, σε νεοπλασματικές νόσους και χρόνιες φλεγμονές. Ο ευρύτερα αποδεκτός, προστατευτικός, ρόλος της βιταμίνης Ε σχετίζεται με τη λειτουργία της ως μόριο το οποίο διακόπτει την παραγωγή ελεύθερων ριζών και προστατεύει τις κυτταρικές μεμβράνες και τις λιποπρωτεΐνες από την οξειδωτική βλάβη. Αρκετές ευρενητικές εργασίες δηλώνουν ότι η βιταμίνη Ε βελτιώνει τη φλεγμονώδη αντίδραση των ζώων σε περιπτώσεις λοιμώξεων, συμπεριλαμβανομένης και της μόλυνσης από E. coli. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν να εξετασθεί εάν η βιταμίνη Ε, ως πρόσθετο διατροφής, είχε κάποια επίδραση στις αλλοιώσεις που δημιουργούνταν από το EPEC Ε22 στον εντερικό βλεννογόνο. Χρησιμοποιήθηκαν 105 θηλυκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Ο απογαλακτισμός των κουνελιών έγινε σε ηλικία 26 ημερών και ο ενοφθαλμισμός τους με βακτήρια έγινε σε ηλικία 30 ημερών. Από τα 105 κουνέλια που χρησιμοποιήθηκαν: σε 45 κουνέλια χορηγήθηκε με οισοφαγικό καθετήρα βιταμίνη Ε (Tad-Vet, Veterin) σε ημερήσια δόση 60mg/kg σ.β. ξεκινώντας 10 ημέρες πριν από την πειραματική μόλυνση και σε όλη τη διάρκεια του πειραματισμού; σε 60 κουνέλια (30 από αυτά ελάμβαναν βιταμίνη Ε) χορηγήθηκαν με οισοφαγικό καθετήρα 2 ml εναιωρήματος του παθογόνου στελέχους E.coli Ε22 (2 x 106 CFU/ml); σε 30 κουνέλια μάρτυρες (από τα οποία 15 είχαν λάβει βιταμίνη Ε) χορηγήθηκαν με οισοφαγικό καθετήρα 2 ml εναιωρήματος του απαθογόνου στελέχους E.coli ΒΜ21 (109 CFU/ml); και σε 15 κουνέλια μάρτυρες χορηγήθηκαν 2 ml αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού. Τελικά τα 105 πειραματόζωα χωρίσθηκαν στις ακόλουθες πέντε ομάδες (ο): «οΕ22» (n=30) στην οποία χορηγήθηκε το παθογόνο στέλεχος της E.coli Ε22, «οΕ22+VE» (n=30) στην οποία χορηγήθηκε βιταμίνη Ε και το παθογόνο στέλεχος της E.coli Ε22, «οΒΜ21» (n=15) στην οποία χορηγήθηκε το απαθογόνο στέλεχος της E.coli ΒΜ21, «οΒΜ21+ VE» (n=15) στην οποία χορηγήθηκε βιταμίνη Ε και το απαθογόνο στέλεχος της E.coli ΒΜ21 και «οS» (n=15) στην οποία χορηγήθηκε μόνο αποστειρωμένος φυσιολογικός ορός. Ευθανασία των πειραματόζωων πραγματοποιήθηκε από την 1 έως 7 ημέρα μετά τη μόλυνση (ημμ), και κάθε ημέρα επιλέγονταν για ευθανασία τα ζώα που είχαν τα εντονότερα κλινικά συμπτώματα ή ήταν ετοιμοθάνατα. Πολλαπλά ιστοτεμάχια από το sacculus rotundus, το τυφλό έντερο, τα τελευταία 10 cm του ειλεού και τα πρώτα 10 cm του κόλου συλλέχθηκαν για το οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Η αρχιτεκτονική δομή του εντερικού βλεννογόνου και η φλεγμονώδης αντίδραση εκτιμήθηκαν με τη χρήση ηλεκτρονικού προγράμματος ανάλυσης και βελτίωσης φωτογραφιών (Image-pro Plus 4.1). Οι μορφομετρικές αναλύσεις που έγιναν ήταν: ολικό πάχος βλεννογόνου, ύψος λάχνης, βάθος κρύπτης, αναλογία ύψους λάχνης/βάθος κρύπτης, αριθμός μονοπύρηνων και πολυμορφοπύρηνων ουδετερόφιλων κυττάρων στον υποβλεννογόνιο χιτώνα, στη βάση της κρύπτης και στην κορυφή της λάχνης. Ο βαθμός πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων και ο αποικισμός τους από το εντεροπαθογόνο στέλεχος της E. coli E22 προσδιορίσθηκαν με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι του PCNA και ειδικού αντιορού προβάτου έναντι του εντεροπαθογόνου στελέχους της E. coli E22. Ο βαθμός απόπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων εκτιμήθηκε με τη μέθοδο TUNEL. Ο πληθυσμός της E. coli στα κόπρανα όλων των πειραματόζωων προσδιορίζονταν καθημερινά καθ' όλη τη διάρκεια του πειράματος. Είκοσι έξι (26) πειραματόζωα από την κάθε ομάδα, που μολύνθηκαν με το εντεροπαθογόνο στέλεχος της E. coli E22, παρουσίασαν μαλακά κόπρανα από την 1 ημμ, και προοδευτικά διάρροια από τη 2 ημμ. Από την 4 ημμ και μετέπειτα παρατηρήθηκαν στις ομάδες οΕ22 και oE22+VE έντονη υδαρής διάρροια, ανορεξία και αφυδάτωση. Οι πληθυσμοί της E. coli E22 που αποβάλλονταν με τα κόπρανα δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τω ομάδων οΕ22 και oE22+VE. Για να μελετηθεί το αποτέλεσμα της επίδρασης της περίσσειας βιταμίνης Ε στον βακτηριακό αποικισμό προσδιορίσθηκαν ποσοτικά τα επιθηλιακά κύτταρα του ειλεού και του sacculus rotundus που έφεραν ανοσοϊστοχημική σήμανση της E. coli E22. Αν και στην ομάδα oE22+VE ο αριθμός των αποικισμένων επιθηλιακών κυττάρων ήταν σταθερά μικρότερος σε σύγκριση με την ομάδα oE22, στατιστικώς σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε στον ειλεό μόνον την 4 και 7 ημμ. Παρά ταύτα το γενικό αποτέλεσμα έδειξε ότι η βιταμίνη Ε δεν επηρέασε σημαντικά τον αποικισμό του ειλεού και του sacculus rotundus από το EPEC Ε22. Κατά τη νεκροτομική εξέταση των πειραματόζωων, παρατηρήθηκαν μακροσκοπικές αλλοιώσεις ήπιου έως έντονου βαθμού σε ίδιο αριθμό ζώων των ομάδων οΕ22 και oE22+VE. Τα πλείστα των ζώων παρουσίαζαν ειλεΐτιδα και τυφλίτιδα. Παρατηρήθηκε ήπιου έως έντονου βαθμού υπεραιμία, υποβλεννογόνιο οίδημα, διόγκωση των πλακών του Peyer και των μεσεντέριων λεμφογαγγλίων, και αιμορραγίες στον ορογόνο του τυφλού εντέρου. Από την 4 ημμ και τις μετέπειτα ημέρες, το περιεχόμενο του ειλεού ήταν υποκίτρινου χρώματος και το περιεχόμενο του τυφλού εντέρου ήταν επίσης υδαρές, αφρώδες, δύσοσμο και καστανοπράσινου χρώματος. Στις ομάδες oE22 και oE22+VE, από την 1η ημμ παρατηρήθηκαν στα επιθηλιακά κύτταρα του ειλεού και του sacculus rotundus εστίες βακτηρίων E. coli Ε22 και διάχυτος αποικισμός από τη 2η ημμ. Τη 2η ημμ παρατηρήθηκε αποικισμός βακτηρίων και στο επιθήλιο που κάλυπτε το λεμφικό ιστό στις πλάκες του Peyer. Εστίες αποικισμού βακτηρίων παρατηρήθηκαν στο τυφλό έντερο και στο κόλο από την 4 ημμ. Το αποικισμένο εντερικό επιθήλιο παρουσίασε καθίζηση, ατροφία και συγχώνευση των εντερικών λαχνών, εκφύλιση, νέκρωση και αποφολίδωση των επιθηλιακών κυττάρων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία συχνά μικροδιαβρώσεων. Μέσου έως έντονου βαθμού φλεγμονή, οίδημα, συμφόρηση αγγείων και εστιακές αιμορραγίες παρατηρήθηκαν στο βλεννογόνο και στον υποβλεννογόνιο χιτώνα. Η στατιστική ανάλυση του ολικού πάχους βλεννογόνου, του ύψους λάχνης, του βάθους κρύπτης και της αναλογίας ύψους λάχνης/βάθος κρύπτης, έδειξε ότι η αρχιτεκτονική δομή του εντερικού βλεννογόνου στις ομάδες που μολύνθηκαν με το εντεροπαθογόνο στέλεχος της E. coli E22 μεταβλήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τους μάρτυρες του πειραματισμού. Επιπρόσθετα, η ομάδα oE22+VE είχε σημαντικά υψηλότερες τιμές ολικού πάχους βλεννογόνου, ύψους λάχνης, αναλογία ύψους λάχνης/βάθος κρύπτης, και μικρότερες τιμές βάθους κρύπτης σε σχέση με την ομάδα οΕ22. Στo ηλεκτρονικό μικροσκόπιο παρατηρήθηκαν επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία έφεραν πολυάριθμα βακτήρια προσκολλημένα στην επιφάνεια τους, εκφύλιση και αποκόλληση των επιθηλιακών κυττάρων, έντονο μεσοκυττάριο οίδημα και διηθήσεις φλεγμονικών κυττάρων. Οι στεγανές συνδέσεις των επιθηλιακών κυττάρων δεν παρουσίαζαν αλλοιώσεις, ακόμα και αν η βακτηριακή προσκόλληση ήταν ακριβώς πάνω από τη συγκεκριμένη σύνδεση. Επίσης, παρατηρήθηκαν βάθρα προσκόλλησης (pedestals) αλλά και επίπεδες θέσεις προσκόλλησης των βακτηρίων. Η στατιστική ανάλυση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων, που ανεβρέθηκαν με τη μέθοδο TUNEL, κατέδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων oE22 και oE22+VE, αν και ο βαθμός απόπτωσης στις δύο αυτές ομάδες ήταν αυξημένος σε σχέση με τους μάρτυρες του πειραματισμού (oBM21, oBM21+VE, oS). Σε κάθε μια από τις ομάδες oE22 και oE22+VE, η σύγκριση του αριθμού των αποπτωτικών κυττάρων που αποικίζονταν από το βακτήριο Ε22 και αυτών που δεν αποικίζονταν, έδειξε ότι ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων που αποικίζονταν από το βακτήριο Ε22 ήταν στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερος. Ο βαθμός πολλαπλασιασμού των επιθηλιακών κυττάρων στις ομάδες oE22 και oE22+VE ήταν στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερος σε σύγκριση με τις ομάδες μαρτύρων του πειραματισμού. Ο αριθμός των επιθηλιακών κυττάρων που ανευρέθηκαν θετικά στο μονοκλωνικό αντίσωμα PCNA, ήταν μεγαλύτερος στην ομάδα oE22+VE σε σχέση με την ομάδα oE22, και στατιστικώς σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε την 1, 4, 5, 6 και 7 ημμ.
description: Enteropathogenic E. coli (EPEC) is an extracellular bacterium that causes diarrhea by binding to the surface of enterocytes in a multi-step process that results in a characteristic ultrastructural apical membrane lesion ("attachment and effacement") of the microvilli, followed by the appearance of an adherence pedestal upon which the EPEC cell is intimately attached. Vitamin E nutritional supplementation is believed to be beneficial in ameliorating the effects of diseases such as neurological and cardiovascular disorders, cancer and chronic inflammation. The most widely accepted protective role o vitamin E is related to its function as a radical chain-breaking molecule that protects cell membranes and lipoproteins from oxidative damage. Several lines of evidence indicate that vitamin E improves the inflammatory response of animals against various infections, including E. coli-induced disease. The purpose of this study was to examine whether vitamin E nutritional supplementation had an effect in bowel changes induced by EPEC. Female New Zealand white rabbits (n=105) were used. Rabbits were weaned at the age of 26 days and inoculated with bacteria at the age of 30 days. Of the 105 rabbits, 45 were treated daily throughout the experiment with an oral dose of vitamin E (60 mg/kg) commencing 10 days before the time of infection; 60 (30 of which were vitamin E treated) were infected orally with 2 ml of PBS suspension of the E22 strain (2X106 CFU/ml); 30 controls (of which 15 were vitamin E-treated) were inoculated rally with 2 ml of a suspension of the BM21 stain (109 CFU/ml); and 15 controls received orally 2 ml of sterile PBS. These treatments enabled the following five five groups (o) to be established: oE22 (n=30) received a single dose of strain E22, oE22+VE (n=30) received vitamin E and a single dose of strain E22; oBM21 (n=15) received a single dose of strain BM21; oBM21+VE (n=15) received vitamin E treatment and a single dose of strain BM21; and oS (n=15) received only PBS. From 1 to 7 days post inoculation (dpi) rabbits were humanely killed. Priority was given to morbid and severely affected rabbits at each timepoint. Multiple specimens from the sacculus rotundus, the caecum, the last 10cm of distal ileum and the first 10 cm of proximal colon were collected for electron and light microscopy. Quantitative morphometric analysis of ileal mucosal architecture and inflammation was performed with computerized image analysis (Image-pro Plus 4.1) and the measurements carried out were: Total mucosal thickness, villous height, crypt depth, villous height/crypt depth ratio, mononuclear and polymorphonuclear cells at the submucosa, base of the crypts and tip of the villi. Epithelial cell proliferation and E22 colonization were determined with mouse monoclonal antibodies against proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and a sheep anti-E22 specific serum. Apoptosis was visualized with TUNEL method. Faecal shedding of E. coli from all animals was determined daily throughout the experiment. Twenty-six rabbits from each of the E22-infected groups showed soft faecal pellets at 1 dpi, progressing to diarrhoea from 2 dpi. Severe watery diarrhea, anorexia and dehydration were seen in animals from both the oE22 and oE22+VE groups from 4dpi onwards. Daily monitoring of E22 faecal shedding revealed no statistically significant differences between the oE22 and oE22+VE groups. To investigate the effect of vitamin E nutritional supplementation on bacterial colonization, epithelial cells bearin immunohistochemically labeled E22 in tissue samples from the ileum and sacculus rotundus were quantified. Although the oE22+VE group constantly showed lower numbers of colonized epithelial cells than did the oE22 group, statistically significant differences were evident only in ileal sections at 4 and 7 dpi. However the overall effect of vitamin E on EPEC colonization of ileum and sacculus rotundus was not significant. At necropsy, moderate to severe gross lesions were found in the same propotion of rabbits (26/30) in both the E22-infected groups. Most animals showed terminal ileitis and typhlitis. Consistently, there was moderate to severe hyperaemia, submucosal oedema, enlargement of Peyer's patches and mesenteric lymph nodes, and haemorrhages in the caecal serosa. From 4 dpi onwards, the small intestinal contents were liquid and yellowish and the caecal contents were also liquid, foamy, greenish-brown and foul-smelling. Animals from both the oE22 and oE22+VE groups showed focal E. coli epithelial colonization of the ileum and sacculus rotundus at the 1dpi and diffuse colonization from 2 dpi onwards. In Peyer's patches the follicle associated epithelium was found at 2dpi to be colonized. Foci of bacterial colonization were also first seen in the caecum and proximal ascending colon at 4 dpi. Colonized epithelia showed blunting, atrophy and fusion of intestinal villi, with degeneration, necrosis and sloughing of epithelial cells, which often resulted in microerosions. Moderate to severe inflammation, oedema, congestion and focal haemorrhages occured in the mucosa and submucosa. Statistical analysis of total mucosal thickness, villous height, crypt depth, villous height/crypt depth ratio, showed that the mucosal architecture was significantly altered in both EPEC-infected groups by comparison with control groups. However, the oE22+VE group differed from the oE22 group in having significantly higher values for total mucosal thickness, villous height, villous height/crypt depth ratio, and lower values for crypt depth. By electron microscopy epithelial cells with numerous bacteria attached to their surface, degeneration and shedding of epithelial cells, severe intercellular oedema, and infiltration of inflammatory cells were observed. The tight junctions of epithelial cells showed no lesions, even when the bacterial attachment was just on top of tight junction. Additionally, cup-shaped pedestals and flat bacteria attachment sites were also showed. Statistical analysis of apoptotic cell counts in TUNEL-stained ileal sections demonstrated no significant differences between the oE22+VE and oE22 groups, although apoptosis of both groups was increased as compared with controls (oBM21, oBM21+VE, oS). Intra-group comparisons of apoptosis between E22-colonized and non-colonized epithelial cells demonstrated a significantly higher apoptotic index for the colonized epithelium. Epithelial cell proliferation of both E22-infected groups was significantly increased by comparison with the control groups. The PCNA-positive ileal epithelial cells found in the oE22+VE group were more numerous than those of their oE22 group counterparts throughout the experiment, statistical significance being shown at 1, 4, 5, 6 and 7 dpi