Αξιολόγηση ανασυνδυασμένων στελεχών της ελαιογόνου ζύμης Yarrowia lipolytica για την παραγωγή βιοντίζελ σε εργαστηριακή κλίμακα
Creators: name: Ορφανίδου, Μαρία Χριστοφόρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Yarrowia lipolytica
Κύτταρα-βιοκαταλύτες
Βιοκαταλυτική παραγωγή βιοντίζελ
Whole-cell biocatalysts
Biocatalytic synthesis of biodiesel

description: Η Yarrowia lipolytica είναι ένας ευκαρυωτικός μικροοργανισμός. Πρόκειται για μία ελαιογόνο ζύμη με πολλές βιοτεχνολογικές εφαρμογές, μία εκ των οποίων είναι και η παραγωγή λιπασών. Οι λιπάσες είναι υδρολυτικά ένζυμα που καταλύουν και την αντίδραση μετεστεροποίησης, η οποία βρίσκει εφαρμογή μεταξύ άλλων και στη βιοκαταλυτική παραγωγή βιοντίζελ. Η παραγωγή βιοντίζελ μπορεί να γίνει με ποικίλες χημικές μεθόδους οι οποίες όμως κατά κανόνα κάνουν χρήση ισχυρών βάσεων ή οξέων, βλαβερών δηλαδή ενώσεων όταν αποβάλλονται εν συνεχεία στο περιβάλλον. Μία εναλλακτική, περιβαλλοντικά φιλική προσέγγιση, είναι η ενζυμική μετεστεροποίηση φυτικών και ζωικών ελαίων ή λιπών, με χρήση είτε ελεύθερων είτε ακινητοποιημένων. Εκτός από την ακινητοποίηση σε διάφορα υλικά, η ακινητοποίηση των λιπασών μπορεί επίσης να επιτευχθεί με την αγκίστρωσή τους στην επιφάνεια κυττάρων ζύμης μέσω της τεχνικής “yeast cell surface display”. Μέσω αυτής της τεχνολογίας, τα ένζυμα σταθεροποιούνται στην κυτταρική επιφάνεια, ενώ τα ίδια τα κύτταρα μπορούν να αποτελέσουν κύτταρα-βιοκαταλύτες ως ολότητες (whole-cell biocatalysts), παρακάμπτοντας τις επίπονες και δαπανηρές διαδικασίες ανάκτησης και καθαρισμού του ενζύμου. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, χρησιμοποιήθηκαν επίλεκτα ανασυνδυασμένα στελέχη της Y. lipolytica ικανά να εκκρίνουν σημαντικές ποσότητες της λιπάσης Lip2 αλλά και στελέχη τα οποία φέρουν τη λιπάση αγκιστρωμένη στην επιφάνειά τους και λειτουργούν ως κύτταρα-βιοκαταλύτες. Μελετήθηκε η ανάπτυξη των ανασυνδυασμένων στελεχών σε θρεπτικά μέσα με βάση τη γλυκερόλη και η βιοκαταλυτική τους ενεργότητα σε αντιδράσεις υδρόλυσης και μετεστεροποίησης αντίστοιχα, με στόχο την εύρεση των στελεχών με τη βέλτιστη απόδοση. Παρατηρήθηκε μειωμένη σταθερότητα του ενζύμου Lip2 σε διαλυτή κατάσταση που είχε ως επακόλουθο τη δυσκολία στο χειρισμό του. Εξ’ αιτίας αυτού αποφασίστηκε να δοθεί περισσότερη προσοχή στα στελέχη που έφεραν αγκιστρωμένη τη λιπάση τα οποία έδιναν περισσότερο επαναλήψιμα αποτελέσματα. Στη συνέχεια, επιλέχθηκε το στέλεχος στο οποίο η έκφραση του γονιδίου PIR1-LIP2 ήταν υπό τον έλεγχο του ισχυρού υβριδικού υποκινητή UAS1B8-TMAL(250)p και καλλιεργήθηκε σε βιοαντιδραστήρα για αριστοποίηση κρίσιμων παραμέτρων με στόχο την αύξηση τόσο της παραγωγής βιομάζας αλλά και της βιοκαταλυτικής δράσης. Η παραγόμενη βιομάζα χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή βιοντίζελ σε εργαστηριακό επίπεδο (αλκοόλυση ελαιολάδου απουσία διαλύτη), όπου μελετήθηκαν κρίσιμες παράμετροι που επηρεάζουν την απόδοση μετατροπής (τύπος αλκοόλης, αναλογία ελαιολάδου/μεθανόλης, περιεκτικότητα νερού, ποσότητα βιοκαταλύτη, προσθήκη μεθανόλης άπαξ ή σε στάδια, προσθήκη silica gel). Τέλος, εξετάστηκε η επίδραση της πηγής άνθρακα (θρεπτικά μέσα καλλιέργειας εμπλουτισμένα με ελαιόλαδο και μελάσα) στην ανάπτυξη του ίδιου στελέχους, καθώς και στην έκφραση της λιπάσης. Αποδείχθηκε ότι το ανασυνδυασμένο στέλεχος που επιλέχθηκε ως καλύτερο είναι ικανό να δώσει σημαντικά ποσοστά μετατροπής τριγλυκεριδίων σε μεθυλεστέρες και επιπλέον η χρήση απόβλητου λαδιού ή μελάσας ως πηγή άνθρακα βελτιώνει σημαντικά την απόδοση του βιοκαταλύτη.
description: Yarrowia lipolytica belongs to eukaryotic microorganisms. It is an oleaginous yeast with many biotechnological applications, one of which is the production of lipases. Lipases are hydrolytic enzymes that catalyze the transesterification reaction, which finds application among others in the biocatalytic production of biodiesel. The production of biodiesel can be realized using a variety of chemical methods, which generally, make use of strong bases or acids, i.e. harmful substances when released into the environment. An alternative approach that could be considered environmentally friendly is through enzymatic transesterification of vegetable or animal oils or fats using either free or immobilized lipases. One innovative approach to immobilize lipases is their anchoring onto the surface of yeast cells through the “yeast cell surface display” engineering technology. Through this process, the enzymes are stabilized, while the cells act as whole cell biocatalysts, bypassing the expensive processes of enzyme recovery and purification. In this thesis, recombinant strains of Y. lipolytica previously constructed in the laboratory were used, some of which secrete significant amounts of the lipase Lip2, while others anchor it on the surface and act as whole-cell biocatalysts. Their growth on glycerol-based culture media and their catalytic activity in hydrolysis and transesterification reactions were studied to select strains with superior performance. Due to reduced stability of the Lip2 enzyme in the soluble state resulting in difficulty in its manipulation, more attention was subsequently paid to whole-cell biocatalyst strains that yielded more reproducible results. The strain with the best performance, i.e., expressing the PIR1-LIP2 gene under the control of a hybrid promoter UAS1B8-TMAL(250)p was selected and cultivated in a bench-top bioreactor to identify and optimize critical parameters and increase both biomass production and biocatalytic activity. The resulting biomass was used to produce biodiesel at laboratory level (alcoholysis of olive oil in the absence of solvent) where key variables affecting the conversion to alkylesters were studied (alcohol type, oil/methanol ratio, water content, biocatalyst loading, addition of methanol once or stepwise, addition of silica gel). Finally, the effect of the carbon source (culture media enriched with waste olive oil or molasse) on the growth profile of the same strain as well as lipase expression were examined. It was shown that this recombinant strain can give significant conversion rates of triglycerides to methyl esters and furthermore the use of olive oil and molasses significantly improves the performance of the biocatalyst.