title: Expanding the toolbox
Creators: name: Haslhofer, Felix
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die zellspezifische Expression von Entwicklungsgenen wird meist von mehreren regulatorischen Sequenzen, sogenannten Enhancern, reguliert. Obwohl Enhancer Gene aus großer Distanz regulieren können, nimmt die Genexpression in minimaler regulatorischer Umgebung drastisch ab, wenn die Enhancer-Promoter Distanz erhöht wird. Die systematische Analyse von Genloci zeigt, dass Enhancer in komplexen Abhängigkeiten und Hierarchien mit anderen regulatorischen Elementen stehen. Mit aktuellen Plasmid-basierten Hochdurchsatzmethoden lassen sich diese Wechselwirkungen nur bedingt zeigen. Daher wurde von uns kürzlich ein synthetischer Genlocus konstruiert, der die komplexen Interaktionsmuster von endogenen Loci zeigen kann. Hier soll gezeigt werden, dass starke Enhancer oft mit schwächeren Enhancern synergistisch zusammenarbeiten: Ein starker Enhancer, der 75 kb entfernt von einem Promoter positioniert wird, zeigt Superadditivität mit 3 von 4 schwachen Enhancern, die sich bei 25 kb Distanz befinden. Je stärker ein Enhancer, desto besser kann er die genomische Distanz überwinden und desto weniger profitiert er von der Präsenz eines Enhancers in 75 kb Distanz. Durch die Optimierung mehrerer SOX2- und OCT4-Motive lässt sich zeigen, dass die Fähigkeit, genomische Distanz zu überwinden, eng mit der Stärke eines Enhancers zusammenhängt. Zuletzt wurde basierend auf einem Kassettenaustauschverfahren (RMCE) ein optimierter synthetischer Locus konstruiert, der eine Hochdurchsatz-Anwendung erlaubt. Damit lassen sich zukünftig tausende von regulatorischen Elementen testen, die Aufschluss darüber geben sollen, wie die Fähigkeit, Distanzen zu überwinden und mit anderen Elementen in Wechselwirkung zu stehen, in der DNA-Sequenz verankert ist.
description: Expression of cell-type specific developmental genes is typically regulated by multiple enhancers, often located at large genomic distances from their target genes. Increasing enhancer-promoter distance at an ectopic location leads to a sharp drop of gene expression. However, the same elements often work from significantly larger distances in their endogenous context. Genetic dissections of individual loci showed that enhancers are not independent units but display intricate hierarchies and interdependencies. Current plasmid-based high-throughput analyses of enhancer-enhancer combinations do not display the diversity of interdependencies seen in genetic dissections. To address these drawbacks, we have previously built a synthetic locus that allows the bottom-up construction of regulatory landscapes. Here I show that synergy between strong and weak enhancers could be a wide-spread phenomenon: When fixing a strong enhancer at 75 kb from a minimal promoter, 3 of 4 weak enhancers at 25 kb show synergy. Additionally, there is a trend for enhancers with increased strength to act over larger distances and display less synergy if placed at 25 kb. Furthermore, by optimizing individual SOX2/OCT4 motifs I could show that enhancer strength and distance dependency are interconnected. Finally, I developed a more efficient synthetic locus (2.0), based on the large-serine recombinase Bxb1 and a cassette-exchange approach (RMCE). To optimize our enhancer integration system, I constructed an inducible Bxb1-expressing cell line containing an RMCE-based landing pad at 1.5 kb, suitable for high-throughput integrations. By integrating thousands of elements, we hope to understand the rules governing distance dependency and synergy.