title: Identification of insect species in feed by high resolution melting (HRM) analysis
Creators: name: Yakova, Klementina
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die PCR-HRM-Analyse ist ein leistungsfähiges Verfahren für das Screening von Lebensmittelverfälschungen, da sie DNA-Sequenzvariationen schnell nachweisen kann, ohne dass eine nachfolgende Verarbeitung erforderlich ist. Sie eignet sich daher hervorragend für die Differenzierung von Spezies in komplexen Lebensmittelmatrizes und gewährleistet die Authentizität und Qualität von Lebensmitteln. Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung einer PCR-HRM-Methode zur Unterscheidung von Insektenarten, die in der EU als Futtermittel zugelassen sind: Soldatenfliege, Seidenraupe, Heimchen, Kurzflügelgrille, Krullfliege, Buffalowurm und Mehlwurm. Die DNA von zehn Insektenarten und drei Fleischsorten wurde mit zwei verschiedenen Kits extrahiert, wobei das DNeasy® mericon® Food Kit mehr konsistente Ergebnisse lieferte. Durch Designs von mehreren Primern und Optimierungen wurde ein Set von fünf Primern festgelegt, das eine erfolgreiche Differenzierung der der Schmelzkurven der Insektenarten ermöglichte. Anfangs erschienen die Schmelzkurven in drei Clustern: Soldatenfliege und Seidenraupe; Mehlwurm, Steppengrille und Krullfliege; Kurzflügelgrille und Heimchen. Die größte Herausforderung war die Auflösung von diesen Schmelzkurven-Clustern, insbesondere zwischen Arten mit ähnlichen DNA Sequenzen wie der Soldatenfliege und der Seidenraupe sowie dem Mehlwurm und der Krullfliege. Die Methode wurde weiter validiert, indem Futtermittelproben analysiert wurden, wobei in zwölf Proben erfolgreich Insekten DNA nachgewiesen werden konnte. Insbesondere die Futtermittelprobe mit gemischter Insekten DNA aus Soldatenfliege und Mehlwurm zeigte Schwierigkeiten bei der Identifizierung der enthaltenen Insektenart, was darauf hindeutet, dass die Methode für die Analyse gemischter Proben weiter verfeinert werden muss. Die Anwendbarkeit der PCR-HRM-Methode wurde anhand von DNA-Extrakten demonstriert, die mit einer CTAB-Extraktionsmethode gewonnen wurden, und die Ergebnisse bestätigten, dass dieser Ansatz reproduzierbare und unterscheidbare Schmelzkurven für verschiedene Insektenarten liefern kann. Es sind jedoch weitere Experimente erforderlich, um die Robustheit der Methode in komplexen, stark verarbeiteten Produkten zu verbessern und die Wiederholbarkeit für Spezies wie Heimchen zu verbessern, dessen Schmelzprofile eine größere Variabilität in Lebensmittelproben aufwiesen. Letztendlich zeigt die PCR-HRM-Analyse ein großes Potenzial als schnelles, einfaches und kosteneffizientes Instrument für die Authentizitätsprüfung von Futtermitteln. Bei weiterer Optimierung könnte sie komplexere DNA-basierte Verfahren effektiv ersetzen und einen zuverlässigen Nachweis und eine Differenzierung von zugelassenen Insektenarten in Futtermitteln ermöglichen.
description: PCR-HRM analysis is a powerful tool for food adulteration screening due to its ability to rapidly detect DNA sequence variations without the need for subsequent processing. This makes it highly suitable for differentiating species in complex food matrices, securing food authenticity and quality. In this master´s thesis, the aim was to develop a PCR-HRM method to distinguish between seven insect species legally permitted in EU feed: black soldier fly, silkworm, house cricket, tropical house cricket, housefly, lesser mealworm and mealworm. DNA from ten insect species and three meat species was extracted using two different kits, with the DNeasy® mericon® Food Kit providing superior and more consistent results. After performing multiple primer designs and optimizations, a five-primer set was developed that allowed for the successful differentiation of melt curves for the insect species. Initially, melt curves appeared in three clusters: black soldier fly and silkworm; mealworm, crazy red cricket and housefly; tropical house cricket and house cricket. The key challenge was to resolve these melt curve clusters, particularly between species with similar DNA sequences, such as black soldier fly and silkworm, and mealworm and housefly. The method was further applied by analyzing commercially available feed samples, where insect DNA was successfully detected in twelve samples where the presence of insect content was stated. However, the feed sample with mixed insect DNA from black soldier fly and mealworm displayed challenges in identifying the species present, suggesting that the method requires further refinement for mixed samples analysis. The applicability of the PCR-HRM method was also demonstrated using DNA extracts obtained with a CTAB extraction method, and the results confirmed that this approach could provide reproducible and distinct melt curves for various insect species. Nevertheless, additional work is needed to improve its robustness in complex, highly processed products and to improve the repeatability for species such as house cricket, whose melt profiles exhibited more variability in food samples. To conclude, PCR-HRM analysis shows great potential as a rapid, simple, and cost-effective tool for feed authenticity testing. With further optimization, it could effectively replace more complex DNA-based techniques, providing dependable detection and differentiation of legally permitted insect species in feed products.