Κλωνοποίηση, έκφραση και χαρακτηρισμός του γονιαδιακού προϊόντος του ανοιχτού αναγνωστικού πλαισίου U90/89 του ανθρώπινου ερπητοιού τύπου 6Α(Human herpesvirus SA, HHV-6A)
Creators: name: Νικολάου, Κωνσταντίνα Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2004
Subjects: Ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο U90/89 του HHV6
Αμεσα πρώιμη περιοχή A του HHV6
Open reading frame U90/89 of HHV6
Major immediate early region a of HHV6

description: Ο ανθρώπινος ερπητοϊός 6(Human Herpes Virus 6, HHV6) ανήκει στη οικογένεια των β-ερπητοϊών. Τα πρώτα γονίδια που εκφράζονται μετά την είσοδο του ιού στο κύτταρο είναι τα α-γονίδια(immediate early, IE). Στα α-γονίδια του HHV6 συμπεριλαμβάνεται το ΙΕ1 το οποίο προκύπτει μετά από διασύνδεση των ανοιχτών αναγνωστικών πλαισίων U90/89. Υποπεριοχές του U90/89 κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς και οι ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες απομονώθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή πολυκλωνικών μονοειδικών αντιορών που χρησίμευσαν στην ανίχνευση της αυθεντικής πρωτεϊνης σε κύτταρα CBL μολυσμένα με τους ιούς HHV6A, HHV6B ή HHV7 με ανοσοανίχνευση τύπου Western blot και σε πειράματα εντοπισμού της πρωτεϊνης ΙΕ1 στα μολυσμένα κύτταρα με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Οι ανασυνδυασμένες πρωτεϊνες χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε υβριδισμούς τύπου Southwestern blot στους οποίους ως ανιχνευτής χρησιμοποιήθηκε τμήμα DNA της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου ΙΕ1 καθώς και σε πειράματα συν-διαμόλυνσης με το πλασμίδιο που παρείχε τη ρυθμιστική περιοχή ΙΕ1 πριν από το γονίδιο CAT(Chloramphenicol Acetyl Transferase, CAT). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η πρωτεϊνη ΙΕ1 που ανιχνεύτηκε σε CBLs μολυσμένα με το στέλεχος U1102 της ομάδας Α, παρουσιάζει μοριακό βάρος μεγαλύτερο από το αναμενόμενο, γεγονός που υποδηλώνει την πραγματοποίηση μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων και παρουσιάζει σε σημαντικό βαθμό πυρηνικό εντοπισμό. Τα αντιγονικά επιτόπια που διαθέτει είναι συνεχή(δομικά) και παρόλο που η κωδικοποιούσα περιοχή της παρουσιάζει μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των στελεχών των ομάδων Α και Β, η αντιγονική τους συγγένεια είναι εξαιρετικά υψηλή. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν διασταυρούμενες αντιδράσεις με την πρωτεϊνη ΙΕ1 του πιο στενά συγγενικού ιού, του HHV7. Η ΙΕ1 έχει την ικανότητα σύνδεσης στο DNA η οποία οριοθετήθηκε σε μια περιοχή 48 αμινοξέων του καρβοξυτελικού άκρου πλούσια σε λυσίνες, που μπορεί να συμβάλλουν λόγω του αρνητικού φορτίου τους στη σύνδεση με το DNA και έχει την ικανότητα να ενισχύει την μεταγραφική δραστηριότητα του προαγωγέα ΙΕ1
description: Human herpesvirus 6(HHV6) belongs to the Herpesviridae subfamily and the two major virus subgroups are designed A and B. Primary virus infection causes exanthema subitum,a mild childhood diseave. HHV6 shows tropism for CD4+ T lymphocytes and like other herpesviruses can establish latent or productive infection. The gene product of HHV6 ORF U90/89 has been designed as IE1(immediate early 1, IE1) gene, because it is expressed like other a-genes immediately after virus entry into the host cell. Various subregions of ORF U90/89 were cloned in proper plasmid vectors and the recombinant proteins they expressed in bacteria were isolated by affinity chromatography method. The bacterially expressed proteins were used to raise monospecific polyclonal anti-serum in order to detect the authentic IE1 protein in HHV6A/B or HHV7 infected CBL(cord blood cells, CBL) by Western blot or indirect fluorescence immunoassay, and in Southwestern blot hybridization where they probed by a 140bp radiolabeled DNA region derived from IE1 promoter. An IE1 cDNA construct was used in co-transfection experiments with a plasmid construct containing a prompter region cloned before CAT gene in order to evaluate IE1 influence on its promoter transcription activity. The results show that IE1 protein which has been detected in HHV6A infected CBL possess an apparent molecular mass greater than the calculated, an indication of post-translational modifications and exhibits nuclear and cytoplasmic localization. There is high antigenic relationship of IE1 epitopes between subgroups A and B, even though IE1 genes' sequence is characterized by the greatest polymorphism. On the contrary no cross-reaction was observed with HHV7. IE1 possess DNA binding activity delineated in a 48 a region of the carboxy-terminal region which is rich in lysines negative charged amino acids that may facilitate DNA binding. IE1 positively regulates transcription activity of IE1 promoter region