Etablierung eines quantitativen transienten Expressionssystems zur funktionellen Charakterisierung von RNA-Bindeproteinen in der posttranskriptionellen Genregulation
Creators: name: Elgner, Mareike
Publisher: name: Universität Bielefeld
Year: 2023
Subjects: subject: 570

description: RNA-Bindeproteine (RBPs) regulieren eine Vielzahl von zellulären Anpassungsprozessen. Da sie stark durch exogene Faktoren beeinflusst werden, binden sie häufig unterschiedliche Zieltranskripte. Zur Identifizierung der Zieltranskripte in vivo wurde individual nucleotide crosslinking and immunoprecipition (iCLIP) entwickelt. Diese Technik erlaubt es, die Zieltranskripte von RBPs zu identifizieren und auch die für eine Bindung verantwortlichen RNA-Sequenzen zu bestimmen. Das glycinreiche RBP AtGRP7 war das erste RBP in Arabidopsis thaliana (A. thaliana) für das transkriptomweit die Zieltranskripte durch iCLIP identifiziert wurden. AtGRP7 wird mit der Regulation vieler pflanzlicher Anpassungsprozesse wie der Blühinduktion, der Kälte- und Frosttoleranz und der Pathogenabwehr in Verbindung gebracht. Posttranskriptionell reguliert AtGRP7 seine Zieltranskripte über alternatives Spleißen. Auch andere Mechanismen wie die Beeinflussung der Transkriptstabilität, die subzelluläre Lokalisierung oder die translationale Kontrolle können Wirkungsweisen einer Bindung durch AtGRP7 sein.
Um aufzuklären welche Auswirkungen eine Bindung von AtGRP7 an seine Zieltranskripte hat, wurde ein quantitatives transientes Genexpressionssystem in Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) etabliert. Mit Reportergenkonstrukten wurde die in vivo Funktionalität der Bindung von AtGRP7 an CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEIN 2 (CAB2) charakterisiert. CAB2 ist ein nicht alternativ gespleißtes, stark rhythmisch reguliertes Gen, das von AtGRP7 in den 5´ und 3´ untranslatierten Regionen (UTRs) gebunden wird.<br><br>
Die Reportergene umfassten den CAB2 Promotor sowie die endogene 5´UTR und 3´UTR. Die codierende Region wurde durch GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) als Reporter ersetzt, welches zur Detektion des Transkriptlevels diente. AtGRP7 regulierte durch Bindung cis-regulatorischer Sequenzen in den UTRs diesen CAB2 Wildtyp-Reporter signifikant herab. Damit spiegelte sich im transienten System die in A. thaliana beobachtete Regulation wider. Reporter mit Mutationen in der CAB2 5´UTR sowie mit Mutationen in vier Bindestellen innerhalb der CAB2 3´UTR wurden ebenfalls signifikant reguliert. Die Mutagenese von 5 Bindestellen innerhalb der 3´UTR reduzierte den Effekt der Regulation durch AtGRP7. Es wurde eine doppelt so hohe AtGRP7-Dosis benötigt, um den Reporter signifikant zu regulieren. AtGRP7 bindet CAB2 daher an mehreren Bereichen in der 3´UTR. Außerdem zeigten Reporterkonstrukte mit heterologen UTRs oder heterologem Promotor, dass eine Regulation nur stattfand, wenn das Konstrukt durch den CAB2 Promotor exprimiert wurde. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass der Promotor und die UTRs nur in Kombination funktional wirken.<br><br>
Zudem konnte eine Bindung von AtGRP7 an unterschiedliche Sequenzmotive von CAB2 in vitro durch electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) nachgewiesen werden. 5´biotinylierte Oligoribonkleotide (ORN) enthielten die durch iCLIP identifizierten Bindemotive und wurden von GST-AtGRP7 gebunden. Zwei starke Bindungen wurden für Sequenzmotive beobachtet, die innerhalb der CAB2 3´UTR vorkommen. Die Spezifität der Bindungen wurde durch Kompetition mit mutierten ORNs bestätigt. In den in vitro Analysen wurde das Motiv GUUUG bevorzugt gebunden.<br><br>
Für die Aufklärung des Einflusses von AtGRP7 auf weitere Zieltranskripte wurden Transkriptanalysen in einer AtGRP7 loss of function Mutante und einer AtGRP7 Überexpressionslinie vergleichend mit dem Wildtyp durchgeführt. Gegensätzliche Effekte auf die Transkriptanbundanz konnten vornehmlich für die Uhr-Komponente LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) festgestellt werden. Ein Effekt auf LHY durch das dem zentralen Oszillator nachgeschaltete AtGRP7 lässt Rückschlüsse darauf zu, dass AtGRP7 auf die innere Uhr zurückwirken könnte. Dies unterstreicht die wichtige Rolle von RBPs in der Regulierung verschiedener Signalwege, die im Zusammenhang mit der inneren Uhr stehen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass sich durch das quantitative transiente Expressionssystem die Funktionalität der Bindung von AtGRP7 an die durch iCLIP identifizierten Bindestellen innerhalb der CAB2 UTRs experimentell überprüfen lässt. Dieses System wird sich zukünftig für die Untersuchungen weiterer Interaktionen zwischen RBPs und deren Zieltranskripten anwenden lassen.