title: Thrombinaktivität basierter Test zur intrinsischen Gerinnung
title: Thrombin activity based test for intrinsic coagulation
Creators: name: Otto, Stefanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: intinsisch
Fotometrie
intrinsic
Thrombin , Gerinnung
chromogenic
Koagulation
Thrombin , Prothrombin
coagulation , thrombin
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: The Intrinsic Coagulation Activity
      Assay (INCA) is a new general chromogenic hemostasis test for
      the intrinsic pathway of blood coagulation. At the present
      time, the most common assay to measure intrinsic coagulation
      is the Activated Partial Thromboplastin Time (aPTT).
      Meanwhile it is generally recognized that the aPTT is not
      capable of reflecting the full spectrum of coagulation
      activation in terms of giving clear account of a normal
      coagulatory response or detecting prothrombotic and
      anticoagulatory stages. While being able to monitor
      unfractionated heparin therapy, the aPTT is unsuitable for
      monitoring therapy with many other anticoagulants. New
      thrombin generation assays, chromogenic and fluorogenic ones,
      have been introduced, but are hampered by the problem of
      fibrin formation, interference of contact activation, or the
      need for special calculation software and fluorescence
      readers, respectively. Furthermore, these assays have all
      been developed with focus on reflecting the extrinsic
      pathway. At the same time, the need for a sensitive assay for
      the intrinsic pathway is emphasized by the rising evidence of
      the part played by the intrinsic coagulation factors in
      pathologic thrombus formation and prothrombotic diseases.
      INCA is designed for measuring thrombin activity in
      International Units (IU) using a chromogenic peptide
      substrate and a photometer. INCA involves two reactions which
      take place separately from each other: First the coagulation
      reaction is carried out by incubating 50 μl citrated plasma
      with 5 μl SiO2 (Pathromtin® SL) and 250 mmol/l CaCl2 in
      polystyrene flat-bottom wells at 37°C in a digitally
      controlled water bath. To obtain the most important part of a
      thrombin generation curve, after four or five minutes
      coagulation reaction time (CRT) the reaction is stopped by
      adding 100 μl of 2.5 mol/l arginine, pH 8.6, to inhibit
      hemostasis and depolymerize fibrin. After an incubation time
      of 20 minutes at room temperature, 50 μl of 1 mmol/l
      chromogenic peptide substrate CHG-Ala-Arg-pNA in 1.25 mol/l
      arginine, pH 8.7, is added (final concentration 0.24 mmol/l),
      starting the detection reaction. The chromogenic substrate is
      cleaved by thrombin releasing free pNA. In a microtiter plate
      photometer the change in absorbance (ΔA) is detected at 405
      nm. For calibration, a standard containing 1 IU/ml thrombin
      is used. INCA measured at four and five minutes CRT (INCA-4
      and INCA-5) yields all necessary information for evaluating a
      plasma sample if INCA-5/INCA-4 ratio is greater than one,
      indicating that thrombin is measured in the ascending part of
      the curve, that is, in the phase of increasing thrombin
      activity. This work shows that the normal thrombin activity
      of INCA-4 (main value) is about 0.5 IU/ml (= 100% of normal)
      and of INCA-5 (control value) is about 1.9 IU/ml (= 100% of
      normal), the normal range being 100% ± 30% (mean value ±
      standard deviation), determined by measuring 39 plasmas of
      healthy adults. A 10-fold measurement of pooled fresh normal
      plasma demonstrated that the intra-assay or interassay
      coefficients of variation are &lt; 10% and &lt; 15%,
      respectively. The analysis of 173 patient plasmas revealed
      that the mean value for INCA-4 in patients with prolonged
      aPTT or increased International Normalized Ratio (INR)
      respectively was about 10% of the INCA-4 activity of patients
      without anticoagulation. The difference of the INCA-4 mean
      values of the groups „prolonged aPTT“ or „elevated INR“,
      respectively, compared to those patients without
      anticoagulation was statistically significant, which suggests
      that INCA reflects the therapeutic effect of heparins and
      coumarins. Correlations of INCA values with aPTT or INR
      values show a weak to moderate negative correlation. None of
      the correlations yield a value of |r| &gt; 0.6, emphasizing
      that INCA provides unique information – beyond what can be
      assessed by the routine assays. INCA is very sensitive to
      changes in the plasma matrix as dilution of the activator
      increases INCA values artificially. Also, pre-analytic
      freezing/thawing of plasma enhances the INCA-4 value. As a
      result of three special features of the INCA, namely the use
      of arginine for hemostasis stabilization and fibrin
      depolymerization, the low concentration of the INCA activator
      (less than 5% of the contact activator amount of the aPTT),
      and the fast reacting chromogenic substrate, the INCA is
      extremely sensitive. Further research is needed to evaluate
      whether INCA can be used as a screening test for a
      dysfunctional intrinsic hemostasis system and whether INCA is
      helpful for more precisely monitoring anticoagulant therapies
      of various types. If so, INCA may become a valuable
      diagnostic instrument in the hemostasis laboratory, possibly
      capable of filling the gap in hemostasis analysis of the
      intrinsic pathway.
description: Der Intrinsic Coagulation Activity
      Assay (INCA) ist ein neuer chromogener Globaltest für die
      intrinsische Blutgerinnung. Bisher ist die aktivierte
      partielle Thromboplastinzeit (aPTT) der am weitesten
      verbreitete Test zur Messung der intrinsischen Gerinnung,
      obgleich bekannt ist, dass die aPTT nicht in der Lage ist,
      das volle Spektrum der Gerinnungsaktivierung wiederzugeben,
      d. h. eine ausgeglichene Gerinnungsaktivität einerseits und
      prothrombotische oder antikoagulatorische Zustände
      andererseits klar als solche zu erkennen. Die aPTT eignet
      sich dazu, die Therapie mit unfraktioniertem Heparin zu
      überwachen, während sie für die Therapieüberwachung vieler
      anderer Antikoagulanzien nicht geeignet ist. Neue chromogene
      und fluorogene Thrombingenerierungsteste wurden entwickelt,
      konnten gewisse Probleme jedoch nicht überzeugend lösen: das
      Problem der Fibrinbildung, die Interferenz der
      Kontaktaktivierung und den Bedarf an spezieller
      Computersoftware und Fluorometer im Falle der fluorogenen
      Methoden. Darüber hinaus wurden alle diese Teste zur Messung
      der extrinsischen Gerinnung entwickelt. Die zunehmende
      Evidenz für die Bedeutung der Kontaktfaktoren für die
      pathologische Thrombusbildung und für prothrombotische
      Krankheitsbilder unterstreicht unterdessen den Bedarf an
      einem neuen sensitiven Test zur intrinsischen Gerinnung. Der
      INCA misst die Thrombinaktivität in internationalen Einheiten
      (IU) unter Verwendung eines chromogenen Peptidsubstrats und
      eines Photometers. INCA beinhaltet zwei Reaktionen, welche
      getrennt voneinander ablaufen: Zuerst startet die
      Gerinnungsreaktion durch Inkubation von 50 μl Zitratplasma
      mit 5 μl SiO2 (Pathromtin® SL) und 250 mmol/l CaCl2 in
      Polystyrol-F-wells bei 37 °C in einem digital kontrollierten
      Wasserbad. Um den wichtigsten Teil einer
      Thrombingenerierungskurve zu erstellen, wird die Reaktion
      sodann nach vier bzw. fünf Minuten Gerinnungsreaktionszeit
      (GRZ) durch Zugabe von 100 μl 2.5 mol/l Arginin, pH 8.6,
      welches die Gerinnung inhibiert und Fibrin depolymerisiert,
      gestoppt. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei
      Raumtemperatur werden 50 μl 1 mmol/l chromogenes
      Peptidsubstrat CHG-Ala-Arg-pNA in 1.25 mol/l Arginin, pH 8.7,
      zugefügt (finale Konzentration 0.24 mmol/l), um die
      Nachweisreaktion zu starten. Das chromogene Substrat wird von
      Thrombin gespalten und setzt pNA frei. In einem
      Mikrotiterplattenphotometer wird der Absorptionsunterschied
      (ΔA) bei 405 nm registriert. Zur Kalibrierung dient ein
      Standard, welcher 1 IU/ml Thrombin enthält. INCA gemessen
      nach vier und fünf Minuten GRZ (INCA-4 und INCA-5) liefert
      die zur Beurteilung einer Plasmaprobe nötige Information,
      vorausgesetzt, dass der Quotient INCA-5/INCA-4 größer als
      eins ist. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die normale
      Thrombinaktivität von INCA-4 (Hauptwert) ca. 0.5 IU/ml (=
      100% der Norm) und von INCA-5 (Kontrollwert) ca. 1.9 IU/ml (=
      100% der Norm) beträgt. Wie durch die Messung von 39 Plasmen
      gesunder erwachsener Spender ermittelt wurde, ist der
      Normbereich 100% ± 30% (Durchschnitt ± Standardabweichung).
      Die 10-fach-Bestimmung eines frischen Normalplasmapools ergab
      einen intra-assay bzw. inter-assay Variationskoeffizienten
      von &lt; 10% bzw. &lt; 15%. Die Analyse von 173
      Patientenplasmen zeigte, dass der Durchschnittswert für
      INCA-4 bei Patienten mit verlängerter aPTT oder erhöhter
      International Normalized Ratio (INR) ca. 10% der
      INCA-4-Aktivität von nicht antikoagulierten Patienten
      beträgt. Der Unterschied in den INCA-4-Mittelwerten der
      Gruppen „verlängerte aPTT“ und „erhöhte INR“ jeweils im
      Vergleich zu den Nicht-Antikoagulierten war statistisch
      signifikant, was darauf hindeutet, dass der Effekt von
      Heparin und Cumarinderivaten von INCA erfasst wird. Die
      Korrelation von INCA-Aktivitäten mit der aPTT oder der INR
      zeigen einen schwachen bis mäßigen negativen Zusammenhang.
      INCA ist sehr empfindlich in Bezug auf Veränderungen der
      Plasmamatrix, so dass eine Verdünnung des Aktivators zu
      falsch-hohen INCA-Werten führt. Auch das präanalytische
      Einfrieren und Auftauen von Plasma erhöht den INCA-4-Wert.
      Aufgrund von drei Eigenheiten des INCA, nämlich dem Einsatz
      von Arginin zur Hämostasestabilisierung und
      Fibrindepolymerisierung, der geringen Aktivatorkonzentration
      (weniger als 5% der Kontaktaktivatormenge der aPTT) und dem
      schnell reagierenden chromogenen Substrat, ist der INCA sehr
      empfindlich. Durch zukünftige Forschung ist zu klären, ob der
      INCA als Screeningtest für Funktionsstörungen im
      intrinsischen Gerinnungssystem geeignet ist und ob er dazu
      beitragen kann, die Therapieüberwachung von
      verschiedenartigen Antikoagulanzien zu verbessern. Wenn sich
      dies bestätigt, könnte INCA ein wertvolles diagnostisches
      Instrument in den Gerinnungslaboren werden, welches
      möglicherweise in der Lage wäre, die Lücke in der
      Gerinnungsanalyse des intrinsischen Systems zu
      schließen.