Fungi for Future : Biotechnological application of anaerobic fungi
Creators: name: Stabel, Marcus
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2022
Subjects: anaerobic fungi
Neocallimastigomycota
hydrogen
lignocellulose
biomass degradation
anaerobic fermentation
dark fermentation
bioeconomy
biofuel
biomass usage
xylan
xylan degradation
xylanase

description: Der Verwendung Lignocellulose-haltiger Rohstoffe wird eine essentielle Rolle beim Übergang von einer auf fossilen Rohstoffen basierenden zu einer biobasierten Ökonomie beigemessen. Die für die biotechnologische und chemische Nutzbarmachung von Lignocellulose als Ausgangssubstrat nötige Vorbehandlung ist jedoch energieintensiv und/oder produziert toxische Abfälle und Nebenprodukte. Wasserstoff ist ein vielversprechender Energieträger für eine zukünftige Bioökonomie, der jedoch zurzeit hauptsächlich aus fossilen Rohstoffen gewonnen wird. Eine Alternative bietet die biologische Wasserstoffproduktion auf Basis von Lignocellulose, die jedoch zurzeit durch den hohen Energiebedarf der Lignocellulose-Vorbehandlung sowie niedriger Ausbeuten bisher eher unbedeutend ist. Anaerobe Pilze des Phylums Neocallimastigomycota können durch die Sekretion einer Vielzahl von Lignocellulose abbauenden Enzymen auf unvorbehandelter Biomasse wachsen und produzieren hierbei Wasserstoff und andere Plattformchemikalien wie Acetat, Formiat, Lactat, Ethanol und Succinat als metabolische Endprodukte. Trotz des hohen biotechnologischen Potenzials sind diese Organismen und ihre Enzyme weitgehend unerforscht. So sind grundlegende Wachstumsvoraussetzungen nahezu unbekannt und Kenntnisse über ihre Stoffwechselwege und deren Regulierung sind noch begrenzt. Durch Untersuchung dieser Aspekte soll diese Arbeit den Grundstein für eine biotechnologische Anwendung von anaeroben Pilzen legen. Die Nichtverfügbarkeit anaerober Pilz-Stämme in Stammsammlungen stellt eine der Herausforderungen bei der Arbeit mit diesen Organismen da. Der erste Schritt war daher eine Isolation aus dem Kot unterschiedlicher Zootiere, was zum Erhalt von sechs verschiedenen Isolaten führte. Ein aus Alpakakot isolierter Stamm stellte sich als eine neue Pilzgattung und -art heraus, die zuvor nur als SK4-Klade von sequenzierten Umweltproben bekannt war. Interessanterweise wurde der gleiche Stamm gleichzeitig aus dem Pansen eines Mähnenspringers in Texas, USA isoliert. Die Kooperation unserer Forschergruppen mündete in einer gemeinsamen Publikation, welche Kapitel 3 bildet. Isolate von beiden Orten waren nahezu identisch. Sie bildeten mittelgroße (2-5 mm) Kolonien mit einem weißen Zentrum aus Sporangien auf Agar und einen Biofilm aus Myzel in flüssigem Medium. Mikroskopisch waren monozentrische Thalli und sphärische poly-flagellierte Zoosporen mit 7-20 Flagellen zu erkennen. Sowohl die Öffnung einer apikalen Pore des Sporangiums wie auch das Aufbrechen der sporangialen Zellwand führten zur Freisetzung der Zoosporen. Dieser duale Mechanismus ist bisher einzigartig unter allen derzeit beschriebenen anaeroben Pilz-Stämmen. Ein phylogenetischer Vergleich anhand der Sequenzen der D1-D2 28S Untereinheit des rRNA Gens (LSU) und des internal transcribed spacer 1 (ITS1) wies hohe Identitätsübereinstimmungen zwischen allen Isolaten (geringste Identität jeweils 99,07 % und 96,96 %) aber geringe Übereinstimmung zu den nächsten Verwandten auf (jeweils 92,4 % und 86.7 %). Anhand der LSU konstruierte phylogenetische Bäume ordneten die Isolate als neue monophyletische Gruppe in der Orpinomyces-Neocallimastix-Pecoramyces-Feramyces-Ghazallamyces Klade ein. Sowohl die LSU wie auch die ITS1 Sequenzen der Isolate wiesen eine hohe Sequenzidentität zu Umweltproben aus Schafen und verschiedenen anderen Herbivoren auf. Interessanterweise wurden diese Proben der SK4-Klade hauptsächlich bei Tieren gefunden, die auf Sommerweiden grasten, woraus sich die Benennung der neuen Gattung, Aestipascuomyces (abgeleitet vom lateinischen Wort für „Sommerweide“), und der Spezies, A. dubliciliberans, ableitete. Die übrigen fünf Isolate konnten, wie in Kapitel 4 beschrieben, den bereits bekannten Neocallimastigomycota Gattungen und Spezies Neocallimastix cameroonii, Caecomyces spec., Orpinomyces joyonii, Pecoramyces ruminantium, und Khoyollomyces ramosus zugeordnet werden. Während der phylogenetischen Analyse wurde eine hohe Ähnlichkeit zwischen Spezies der Gattung Neocallimastix bemerkt, was zur Neuzuweisung von Neocallimastix californiae und Neocallimastix lanati zu Neocallimastix cameroonii führte. Die Daten befürworteten ebenfalls eine Neuzuweisung der Gattung Cyllamyces als Spezies der Gattung Caecomyces. Kapitel 4 beschreibt ebenfalls die biochemische Charakterisierung aller Isolate inklusive des in Kapitel 3 beschriebenen. Die Pilze wurden auf verschiedenen Kohlenstoffquellen kultiviert und die Produktion der Metabolite Wasserstoff, Acetat, Formiat, Lactat, Ethanol und Succinat, analysiert. Unter den getesteten Bedingungen produzierte Orpinomyces joyonii kein Succinat und Khoyollomyces ramosus kein Lactat. Die Ergebnisse wiesen des Weiteren auf eine sequenzielle Produktion der Metabolite unter Bevorzugung von Wasserstoff, Acetat und Formiat hin. Beim Vergleich der Metabolitproduktion während des Wachstum auf Monosacchariden und auf Stroh fiel eine höhere Wasserstoffproduktion bei letzterem auf. Dies könnte auf eine Reaktion des Metabolismus auf erhöhte Zuckerkonzentrationen hindeuten. Für das robusteste Isolat, Neocallimastix cameroonii G341, wurde ein Dunkelfermentationsprozess im Rührkessel-Bioreaktor entwickelt, was in Kapitel 5 beschrieben ist. Dazu wurden im Vorfeld weitere Optimierungen bezüglich Medienzusammensetzung und Kultivierungsbedingungen vorgenommen. Beim Testen verschiedener Stickstoffquellen führten nur Glutamin und Ammonium zum Wachstum des Isolates. Der Pilz wuchs optimal in einem Temperaturbereich von 38,5 °C bis 41,5 °C und präferierte initiale pH-Werte zwischen 6,6 und 6,8. Die höchste Wasserstoffproduktion fand jedoch bei einem initialen pH-Wert von 6,4 bis 6,6 statt. Zugabe von Wasserstoff zu Beginn des Experiments verringerte die Wasserstoffproduktion. Im Gegensatz dazu konnte durch Erhöhung des Kopfraumvolumens oder durch Agitation die Wasserstoffproduktion erhöht werden, was mit einem Abfall der gebildeten Lactat- und Ethanol-Konzentrationen einherging. Durch Kombination beider Parameter sanken Lactat- und Ethanolproduktion soweit, dass Wasserstoff, Acetat und Formiat nahezu die einzigen Produkte waren. Succinat konnte, wenn überhaupt, nur in Spuren nachgewiesen werden. Nach Etablierung des Prozesses im Rührkesselreaktor konnten die Ergebnisse aus dem Flaschenversuch bestätigt werden. Die Wasserstoffproduktion stieg mit steigender Rührgeschwindigkeit an. Während der Anstieg von 0 rpm auf 250 rpm mit einem Anstieg der Geschwindigkeit der Wasserstoffproduktion einherging, verlangsamte eine weitere Steigerung auf 600 rpm dessen Produktion. Ein ähnlicher Effekt trat beim Vergleich von Fermentationsprozessen mit und ohne pH Regulation auf. Wurde der pH-Wert konstant bei 6,8 gehalten, verdoppelte sich im direkten Vergleich zu nicht-pH regulierten Prozessen die Produktion aller Metabolite mit Ausnahme von Lactat. Diese Ergebnisse führten zu dem Schluss, dass Wasserstoff der präferierte Elektronenendakzeptor von Neocallimastix cameroonii sein könnte. In diesem Fall würden Lactat und Ethanol nur produziert, falls eine thermodynamische Beeinträchtigung der Wasserstoffbildung vorliegt. Die höchste Wasserstoffausbeute (2,406 mmol/g = 58,84 ml/g) resultierte aus Flaschenversuchen mit 5 g/l Stroh als einziger Kohlenstoffquelle mit erhöhtem Kopfraumvolumen und Agitation. Im Literaturvergleich entspricht dies ungefähr 33-50 % der für die Dunkelfermentation angegebenen Wasserstoffausbeuten auf Basis von Stroh. Allerdings wurden bei diesen Studien diese Ausbeuten nur nach einer intensiven Vorbehandlung des Strohs erzielt. Weiterhin ist der hier beschriebene Prozess mit anaeroben Pilzen noch nicht optimiert. Auch wenn das Potential anaerober Pilze, lignocellulose-haltige Biomasse effizient zu hydrolysieren, weithin bekannt ist, und eine Vielzahl ihrer Enzyme bereits heterolog exprimiert wurden, sind die wenigsten biochemisch charakterisiert. Dies betrifft besonders hemicellulolytische Enzyme, welche verglichen mit cellulolytischen Enzymen weit weniger erforscht sind. Kapitel 6 behandelt daher die Expression von Neocallimastigomycota Hemicellulasen und deren biochemische Charakterisierung. Nach ihrer Identifikation im Pilzproteom von Neocallimastix californiae konnten die GH43 Xylosidase Xyl43Nc und die GH11 Endoxylanase X11Nc in Escherichia coli exprimiert werden. Xyl43Nc wies eine hohe Aktivität gegen 4-Nitrophenol-Xylopyranosid (Km = 0,72 mM und kcat = 29,28 s-1) bei einem Temperaturoptimum von 32 °C und einem pH Optimum von 6 auf. Bei gemeinsamer Verwendung von Xyl43Nc und X11Nc konnte Xylose aus Buchenholzxylan und Weizen-Arabinoxylan freigesetzt werden. Phylogenetische Analysen von Xyl43Nc zeigten einen gemeinsamen Ursprung mit Enzymen aus Spirochaeten. Das Enzym bildete eine monophyletische Gruppe abseits der Sequenzen von Ascomyceten im phylogenetischen Baum. Hieraus ließ sich ein Ursprung des Enzyms aus horizontalem Gentransfer ableiten. Zusammengefasst legt diese Arbeit den Grundstein für eine zukünftige biotechnologische Anwendung anaerober Pilze und deren Enzyme.