Identifikation und Charakterisierung von rlcA, einer neuen Komponente des Lichtsignalweges in Aspergillus nidulans
Creators: name: Hübner, Jennifer
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2019
Subjects: Aspergillus nidulans
Licht
FphA

description: Licht ist eines der wichtigsten Signale, um physiologische und morphologische Prozesse in vielen Organismen zu regulieren. Es hilft dabei, sich an verschiedene Umgebungsbedingungen anzupassen. Der filamentöse Ascomyzet Aspergillus nidulans ist in der Lage sowohl rotes als auch blaues Licht wahrzunehmen. Das pilzliche Phytochrom FphA (fungal phytochrome A) ist der Hauptlichtrezeptor in A. nidulans. Neben FphA gibt es die beiden Blaulichtrezeptoren LreA und LreB sowie das Cryptochrom CryA. Der FphA-abhängige Signalweg ist in A. nidulans gut untersucht jedoch besteht großes Interesse alle Komponenten zu identifizieren. Ziel dieser Arbeit war es neue Komponenten oder Signalwege finden.
Daher wurde eine UV-Mutagenese mit einem Auxotrophie-Reportersystem durchgeführt. Das Auxotrophiemarker-Gen pyr4 aus Neurospora crassa wurde unter der Kontrolle des lichtregulierten conJ Promotors exprimiert. Es wurden 100 konstitutive Mutanten isoliert, die trotz Abwesenheit des Auxotrophiemarkers im Medium ein verstärktes Wachstum in der Dunkelheit zeigten. Nach dem Rückkreuzen, um Hintergrundmutationen zu reduzieren, wurde das Genom einer Mutante vollständig sequenziert, um die verantwortliche Mutation zu identifizieren. Das Gen AN1777 wies zwei Basensubstitutionen auf, die zu einem vorzeitigen Stop-Codon führten. Es wurde aufgrund seiner Funktion rlcA (regulator of light responsive genes and chromatin remodelling A) genannt. RlcA kodiert für ein Protein, das eine Nterminale PHD-Fingerdomäne, eine TFSIIM-Domäne und eine C-terminale SPOC-Domäne enthält. Von der Literatur ist bekannt, dass PHD-Fingerdomänen am Chromatin-Remodelling beteiligt und SPOC-Domänen an transkriptionellen Repressor-Komplexen beteiligt sind. Der mutierten Version des Proteins von RlcA (RlcA1-381) fehlt diese SPOC-Domäne.
Überexpressionsexperimente führten durch bereits publizierte Ergebnisse zu der Annahme, dass dieses Protein den Acetylierungszustand des lichtregulierten Gens ccgA moduliert. Dies konnte durch ChIP-Experimente bestätigt werden. Die durch Split YFP bestätigte Interaktion von RlcA und FphA führte zu der Vermutung, dass es eine Aktivierung von RlcA durch FphA geben könnte. Weiterhin wurde die Interaktion von RlcA und der Acetyltransferase GcnE, einer Komponente des SAGA-Komplexes, durch Split-YFP bestätigt und die Interaktionsdomäne konnte identifiziert werden. Eine andere Wechselwirkung von RlcA mit SsnF, einem Protein eines Korepressor-Komplexes, konnte nur mit beiden Proteinen voller Länge gezeigt werden. Es gab keine Wechselwirkung der mutierten Version von RlcA und SsnF. In dieser Doktorarbeit konnte so ein neuer regulatorischer Komplex gefunden werden, der an der Regulierung lichtinduzierbarer Gene und der Modifizierung von Chromatin beteiligt ist.
Die Fähigkeit, Licht wahrzunehmen, bietet die Möglichkeit einer besseren Vorbereitung von Stoffwechselprozessen, um sie an den täglichen Rhythmus anzupassen. In N. crassa steuert eine zirkadiane Uhr, die aus einer autoregulatorischen negativen Rückkopplungsschleife besteht, die Expression von Genen auf regulatorische Weise. Bislang war eine solche Uhr in A. nidulans nicht zu finden. Einige Komponenten der inneren Uhr von N. crassa sind in A. nidulans enthalten, die WC-Homologen LreA und LreB, wichtige Komponenten wie FRQ oder VVD sind jedoch nicht zu finden.
Im bd-Stamm von N. crassa, der eine Mutation im ras-1 Gen aufweist, ist eine deutliche circadiane Sporulation zu erkennen. Durch Einbringen dieser Mutation in das rasAGen hätte eine circadiane Sporulation von A. nidulans visualisiert werden sollen. Durch das Einführen von Temperaturzyklen zeigten A. nidulans Stämme, die die Mutation in rasA enthielten, eine Ringbildung. Unter Verwendung eines Luciferase-Reporter-Systems konnte eine zirkadiane Expression der Luciferase unter dem ccgA-Promotor in Temperaturzyklen beobachtet werden. Bei freien Läufen bei konstanter Temperatur und dauerhaftem Licht konnte eine rhythmische Expression von ccgA, conJ und gpdA bei rotem Licht beobachtet werden.