title: Bacterial Danger Sensing Protects Against Bacteriophage Predation
Creators: name: Vaidya, Sanika
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: phage
Stressreaktion
Bakteriophagen
biofilm
Vibriophage
vibrio cholerae
Phagen
bacterial sensing
bacteriophages
c-di-GMP
Peptidoglykan
stress response
Biakterielle Erkennung
Biofilm
peptidoglycan
Vibrio cholerae
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Die Anpassungsfähigkeit von Bakterien an ungünstige Bedingungen, in der Umwelt oder in ihren eukaryotischen Wirten, ist für das Überleben und die Vermehrung von Bakterien essentiell. Bakterien sind häufig Bakteriophagen (einfach als Phagen bezeichnet) ausgesetzt, die eine ernsthafte Bedrohung für das bakterielle Überleben darstellen. Phagen sind natürliche Predatoren von Bakterien, da sie Bakterienzellen als Wirt für die Replikation nutzen und anschließend ihre Nachkommenschaft durch Lyse der Wirtszelle freisetzen. Bakterien zeigen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber sich ändernden Umweltbedingungen, wenn sie als zelluläre Gemeinschaft, eingebettet in selbst produzierter Matrix, leben. Solche bakteriellen Gemeinschaften werden auch als Biofilme bezeichnet. Die Matrix besteht aus sekretierten Polysacchariden und Proteinen, welche die Bakterienzellen umhüllen und sie im Vergleich zu planktonischen Zellen schützen, Phagenangriffe zu überleben. Obwohl sich die Biofilmbildung als Vorteil für das Überleben von Bakterien gegen Phagenbefall erwiesen hat, ist der Mechanismus, wie Bakterien die Anwesenheit von biotischen Stressfaktoren wie Phagen wahrnehmen und wie sie die Biofilmbildung als Reaktion darauf initiieren, unbekannt. Um die Interaktionen zwischen Phagen und Bakterien zu untersuchen, wurde der Modellorganismus Vibrio cholerae verwendet. V. cholerae ist ein humaner Krankheitserreger und verursacht die Krankheit Cholera. V. cholerae-Zellen bilden Biofilme, um sowohl in ihrer aquatischen Umgebung als auch im menschlichen Wirt zu überleben. Darüber hinaus treffen V. cholerae-Zellen in diesen beiden Habitaten auf Phagen, die nachweislich das Wachstum von V. cholerae-Gemeinschaften einschränken und deren Evolution beeinflussen. Einer der lytischen Phagen, der mit V. cholerae co-isoliert wurde und für die Infektion einer Reihe von V. cholerae-Stämmen verantwortlich ist, genannt Vibriophage N4, wurde in dieser Studie als virales Agens verwendet. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass V. cholerae aktiv Biofilme als Reaktion auf die Exposition mit Vibriophage N4 bildet. Diese bakterielle Reaktion wurde weder durch die Selektion von phagen-resistenten Mutanten, noch durch Hypermatrix-produzierende Mutanten verursacht. Ein kombinierter Ansatz von Proteomik und Transkriptomik deckte auf, dass die Zellen die Produktion von Biofilm-Matrix-Komponenten nach Phagen-Exposition initiierten. Die Biofilm-Matrix-Produktion wurde auch mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. V. cholerae-Zellen waren vor Phagen geschützt, solange sie in die Biofilm-Matrix eingebettet waren. Infektion durch Phagen war jedoch möglich solange noch keine Biofilme gebildet wurden, und kontraintuitiv ging der Biofilmbildung immer eine initiale Zelllyse voraus. Dies führte zu der Hypothese, dass die Phagen-induzierte Zelllyse für die Bakterien notwendig ist, um eine Biofilm-Antwort hervorzurufen. Indem V. cholerae-Zellen Bakterienlysaten ausgesetzt wurden, konnte bestätigt werden, dass die Biofilmbildung in V. cholerae nicht durch die Phagen selbst, sondern durch eine Komponente lysierter Bakterienzellen ausgelöst wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass dieser Biofilm-induzierende Faktor allgemein für Lysate aus verschiedenen gramnegativen und -positiven Bakterien gilt. Durch die Identifizierung der zellulären Fraktion, aus der der Biofilm-induzierende Faktor stammte, wurde Peptidoglykan als das Signal zur Induktion der Biofilmbildung entdeckt. Das Erkennen von Peptidoglykanfragmenten aus lysierten Zellen diente als indirektes Signal für die Anwesenheit von lyse-induzierenden Entitäten (wie z. B. Phagen), weshalb es sich bei diesem Phänotyp um eine bakterielle Erkennung von Gefahr handelt. Mit Hilfe der Transkriptomik wurde die bakterielle Reaktion auf Peptidoglykan charakterisiert, und es wurde festgestellt, dass Gene, die mit der Produktion eines intrazellulären sekundären Botenmoleküls, c-di-GMP, zusammenhängen, hochreguliert sind. Zusätzlich wurden auch Gene, die für Komponenten der Biofilm-Matrix kodieren, hochreguliert, ähnlich dem Proteom- und Transkriptom-Profil von Zellen, die eine Phagen-Infektion überlebt haben. Die Produktion von c-di-GMP und Biofilm-Matrix in V. cholerae-Zellen während der Peptidoglykan-Exposition wurde mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Da bekannt ist, dass c-di-GMP eine entscheidende Rolle bei der Induktion der bakteriellen Biofilmbildung spielt, war es wahrscheinlich, dass die Peptidoglykan-Exposition die Biofilmbildung in V. cholerae über c-di-GMP reguliert. Peptidoglykan erwies sich auch als relevantes Signal für die Induktion der Biofilmbildung in Pseudomonas aeruginosa, was darauf hindeutet, dass die Erkennung von Gefahren in Bakterien konserviert sein könnte. Diese Ergebnisse zeigen, wie Gefahren-Signale die bakterielle Biofilmbildung induziert, um eine schnelle und allgemeine Reaktion zum Schutz der Zellen gegen Phagen und möglicherweise andere lytische Belastungen zu ermöglichen.
description: Bacterial adaptability to unfavourable conditions, in the environment or in their eukaryotic hosts, is essential for survival and proliferation. Bacteria also have to frequently contend with bacteriophages (simply termed phages) that pose a serious threat to bacterial survival. Phages are natural predators of bacteria and utilise bacterial cells as a host for replication and subsequently, release their progeny by lysing bacterial cells. Bacteria show augmented resilience against changing environmental conditions when they exist as matrix-embedded communities, termed biofilms. This matrix comprises of secreted polysaccharides and proteins that encase bacterial cells, making them more adept at surviving phage attack as compared to their planktonic counterparts. Although biofilm formation has been shown to be an advantage in bacterial survival against phage predation, the mechanism of how bacteria sense the presence of biotic stresses, such as phages, and how they initiate biofilm formation as a response is unknown. To investigate phage-bacteria interactions, the model organism Vibrio cholerae was used. V. cholerae is a human pathogen, responsible for causing the disease cholera. V. cholerae cells form biofilms to survive in their aquatic environment, as well as in the human host. Furthermore, in both of these environments, V. cholerae cells encounter phages that have been shown to constrict the growth of V. cholerae communities and contribute to their evolution. One of the lytic phages that was co-isolated with V. cholerae, responsible for infecting a range of V. cholerae strains, called Vibriophage N4, was used as the viral agent in this study. The results described in this thesis show that V. cholerae actively forms biofilms in response to the exposure of Vibriophage N4. This bacterial response was neither caused by the selection of phage resistant mutants, nor by hyper matrix-producing mutants. A combined approach of proteomics and transcriptomics uncovered that cells initiated the production of biofilm matrix components upon phage exposure. Biofilm matrix production was also confirmed using fluorescence confocal microscopy. When embedded in the biofilm matrix, V. cholerae cells were protected from phage predation. However, phage infection was successful at early time points prior to biofilm formation, and counterintuitively, biofilm formation was always preceded by initial cell lysis. This led to the hypothesis that phage-induced cell lysis was necessary for bacteria to elicit a biofilm response. By exposing V. cholerae cells to sonicated bacterial lysates, it was confirmed that biofilm formation in V. cholerae was triggered not by the phages themselves, but by a component of lysed bacterial cells. Moreover, this biofilm-inducing factor was found to be general to lysates obtained from various Gram-negative and -positive bacteria. By identifying the cellular fraction from which the biofilm-inducing factor originated, the signal for inducing biofilm formation was determined to be peptidoglycan. The detection of peptidoglycan fragments from lysed cells served as an indirect signal for the presence of lysis-inducing entities (such as phages), and therefore, this signalling was referred to as bacterial danger sensing. Transcriptomics was used to characterise the bacterial response to peptidoglycan and consequently, genes related to the production of an intracellular secondary messenger molecule, c-di-GMP, were found to be upregulated. Additionally, genes encoding biofilm matrix components were also upregulated, similar to the proteome and transcriptome profile of cells that survived phage infection. The production of c-di-GMP and biofilm matrix in V. cholerae cells during peptidoglycan exposure was visualised by fluorescence confocal microscopy. As c-di-GMP has been known to play a crucial role in inducing bacterial biofilm formation, it was likely that peptidoglycan exposure induced biofilm formation in V. cholerae via c-di-GMP. Peptidoglycan was also found to be a relevant signal for inducing biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa, suggesting that danger sensing could be conserved in bacteria. These results demonstrate how danger sensing induces bacterial biofilm formation to facilitate a rapid and general response to protect cells against phages, and potentially, other lytic stresses.