Μελέτη κολιμυκίνης σε βρέφη και παιδιά με λοιμώξεις από πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτήρια
Creators: name: Γελαδάρη, Αναστασία Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Κολιμυκίνη
Gram-αρνητικά βακτήρια
Βιοϋμένια
Φαρμακοκινητική
Colistin
Gram-negative bacteria
Biofilms
Pharmacokinetics

description: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της φαρμακοδυναμικής και ανοσοτροποποιητικής δράσης της κολιμυκίνης έναντι βιοϋμενίων πολυανθεκτικής Klebsiella pneumoniae σε in vitro επίπεδο, καθώς και της φαρμακοκινητικής της σε παιδιατρικούς ασθενείς, σε δόσεις υψηλότερες από τις έως τώρα συνιστώμενες. Μελετήθηκε η βακτηριοκτόνος δράση της κολιμυκίνης, της ριφαμπικίνης, της μεροπενέμης, της γενταμυκίνης και της τιγεκυκλίνης, και της κολιμυκίνης σε συνδυασμό με εν λόγω αντιβιοτικά έναντι ώριμων βιοϋμενίων ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae. Απομονώθηκαν 20 στελέχη από το αίμα ενηλίκων ασθενών με βακτηριαιμία και εκτιμήθηκε η ικανότητα τους να δημιουργούν βιοϋμένιο, με τη μέθοδο του κρυσταλλικού ιώδους. Η καταστροφή του βιοϋμενίου από τα αντιμικροβιακά φάρμακα μετρήθηκε ως η ποσοστιαία μείωση της μεταβολικής του δραστηριότητας, μέσω της μεθόδου XTT. Η MIC50 για τα βιοϋμένια ορίστηκε ως η ελάχιστη συγκέντρωση φαρμάκου που μπορούσε να προκαλέσει ≥50% βακτηριακή καταστροφή συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Οι αλληλεπιδράσεις των φαρμάκων αναλύθηκαν με το μαθηματικό μοντέλο Bliss. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι επιδράσεις υπο-ανασταλτικών για το βιοϋμένιο συγκεντρώσεων της κολιμυκίνης (i) στην καταστροφή που προκαλείται στα βιοϋμένια K. pneumoniae από τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, με τη μέθοδο XTT, και (ii) στην παραγωγή κυτταροκινών και υποδοχέων από τα μονοκύτταρα που εκτέθηκαν στα βιοϋμένια, με τη μέθοδο ELISA και με ανάλυση RT-PCR, αντίστοιχα. Τέσσερα από τα 20 στελέχη K. pneumoniae είχαν την ικανότητα να παράγουν βιοϋμένιο. Η MIC50 της κολιμυκίνης, της ριφαμπικίνης, της μεροπενέμης, της γενταμυκίνης, και της τιγεκυκλίνης για τα βιοϋμένια των στελεχών αυτών ήταν 64, 8, &gt; 256, 128, και 8 μg/mL, αντίστοιχα. Συνεργική αλληλεπίδραση διαπιστώθηκε σε συγκεντρώσεις κολιμυκίνης 32-64 μg/mL συνδυασμένης με 0,25-4 μg/mL ριφαμπικίνης, στα 32 μg/mL κολιμυκίνης συνδυασμένης με 0,007-0,25 μg/mL μεροπενέμης, και στα 16-32 μg/mL κολιμυκίνης σε συνδυασμό με 16-64 μg/mL τιγεκυκλίνης. Η συνέργεια ήταν μεγαλύτερη για το συνδυασμό της κολιμυκίνης με τη ριφαμπικίνη, με το μέσο ΔE ± τυπικό σφάλμα (SE) ίσο με 49,87% ± 9,22%, συγκριτικά με το συνδυασμό της κολιμυκίνης με τη μεροπενέμη και της κολιμυκίνης με την τιγεκυκλίνη, που τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν ίσα με 29,52% ± 4,97% (p &lt;0,001) και 32,44% ± 6,49% (p &lt;0,001). Η αλληλεπίδραση της κολιμυκίνης με τη γενταμυκίνη είχε αδιάφορα αποτελέσματα, ενώ κανένας συνδυασμός δεν ήταν ανταγωνιστικός. Η προ-επώαση της ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae με υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις κολιμυκίνης οδήγησε σε επακόλουθη αυξημένη καταστροφή του βιοϋμενίου από τα ουδετερόφιλα (συνδυασμός με προσθετική δράση). Τα μονοκύτταρα ανταποκρίθηκαν στα βιοϋμένια της ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae, μέσω αυξημένης ρύθμισης της έκφρασης του TLR2 και με ενεργοποίηση του NLRP3 φλεγμονοσώματος. Τα ανθεκτικά στις καρβαπενέμες βιοϋμένια K. pneumoniae οδήγησαν σε αυξημένη παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β, TNF-α, IL-8 και IL-6. Κατά τον συνδυασμό με 0,5 μg/mL κολιμυκίνης μειώθηκαν τα επίπεδα της IL-1β, του TNF-α, και της IL-8, ενώ σε συγκεντρώσεις 2 και 8 μg/mL αυξήθηκαν τα επίπεδα της αντιφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10 (p &lt;0,05). Στα πλαίσια της διερεύνησης της φαρμακοκινητικής της κολιμυκίνης στα παιδιά, πραγματοποιήθηκε μια πληθυσμιακή φαρμακοκινητική μελέτη σε 17 βαρέως πάσχοντες ασθενείς ηλικίας 3 μηνών έως 13,75 ετών, που έλαβαν άλας νατρίου μεθανοσουλφονικής κολιμυκίνης (colistimethate sodium, CMS) για λοιμώξεις που οφείλονταν σε ανθεκτικά στις καρβαπενέμες Gram-αρνητικά βακτήρια. Οι δοσολογίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 200.000 IU/kg/ημέρα σε 6 ασθενείς, 300.000 IU/kg/ημέρα σε 10 ασθενείς, και 350.000 IU/kg/ημέρα σε έναν ασθενή. Οι συγκεντρώσεις της κολιμυκίνης στο πλάσμα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης συνδυασμένης με φασματομετρία μάζας σε σειρά και ιοντισμό ηλεκτροψεκασμού. Η πληθυσμιακή ανάλυση έγινε με μη γραμμική μικτών επιδράσεων μοντελοποίηση. Διάφορες παράμετροι των ασθενών που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στη φαρμακοκινητική της κολιμυκίνης καταγράφονταν, καθώς επίσης δεδομένα σχετιζόμενα με τις λοιμώξεις και την αντιμετώπιση τους, και πιθανές ανεπιθύμητες ενέργειες. Η φαρμακοκινητική της κολιμυκίνης περιγράφηκε με μονο-διαμερισματικό μοντέλο κατανομής, που περιελάμβανε σαν μεταβλητές την κάθαρση της κρεατινίνης, το σωματικό βάρος, και την παρουσία συνδρόμου συστηματικής φλεγμονώδους απόκρισης (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) (p &lt;0,05). Η μέση συγκέντρωση σταθερής κατάστασης της κολιμυκίνης στο πλάσμα (Css,avg) κυμάνθηκε από 1,11 έως 8,47 μg/mL (διάμεση τιμή 2,92 μg/mL). Η παρουσία SIRS σχετίζονταν με μειωμένη φαινομενική κάθαρση της κολιμυκίνης (47,8% εκείνης χωρίς SIRS). Η σχέση ανάμεσα στον αριθμό των mg CBA/ημέρα που απαιτούνται για να επιτευχθεί κάθε 1 μg/mL της Css,avg της κολιμυκίνης στο πλάσμα και της κάθαρσης της κρεατινίνης (σε mL/min) περιγράφηκε με γραμμική παλινδρόμηση με διαφορετικές κλίσεις για ασθενείς με και χωρίς SIRS. Νεφροτοξικότητα, πιθανά μη σχετιζόμενη με την κολιμυκίνη, παρατηρήθηκε σε έναν ασθενή. Συμπερασματικά, η κολιμυκίνη, σε υψηλές συγκεντρώσεις, παρουσίασε σημαντική δραστικότητα έναντι των βιοϋμένιων K. pneumoniae, και αξιοσημείωτη συνεργική δράση με τη ριφαμπικίνη, τη μεροπενέμη και την τιγεκυκλίνη. Σε υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις αύξησε την ικανότητα θανάτωσης των ουδετεροφίλων και ανέστειλε την υπερβολική παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών από τα μονοκύτταρα που εκτέθηκαν στα βιοϋμένια της K. pneumoniae, υπογραμμίζοντας την ευεργετική της δράση για τα κύτταρα του ανοσιακού μας συστήματος. Οι υψηλότερες δόσεις του CMS που χορηγήθηκαν ήταν καλά ανεκτές και οδήγησαν σε βελτιωμένη έκθεση. Η πληθυσμιακή φαρμακοκινητική ανάλυση επισήμανε την κάθαρση της κρεατινίνης και την παρουσία SIRS ως κύριους παράγοντες που επηρεάζουν τη φαινομενική κάθαρση της κολιμυκίνης και επομένως τα επίπεδα της στο πλάσμα. Η ανάπτυξη ενός δοσολογικού αλγορίθμου δεν ήταν εφικτή καθώς διαπιστώθηκε ευρεία μεταβλητότητα όταν συμπεριλήφθηκαν και ασθενείς προηγούμενων μελετών.
description: The aim of this study was to investigate the pharmacodynamic and immunomodulatory effects of colistin against biofilms of multidrug resistant Klebsiella pneumoniae in vitro, and the pharmacokinetics of this drug in pediatric patients, at dosages higher than currently recommended. We investigated the bactericidal activities of colistin, rifampin, meropenem, gentamicin, and tigecycline alone, and that of colistin in combination with rifampin, meropenem, gentamicin, or tigecycline against carbapenem-resistant K. pneumoniae mature biofilms. Twenty carbapenem-resistant K. pneumoniae blood isolates were derived from an equal number of bloodstream infections in adult patients. Biofilm formation was assessed by crystal violet method. Biofilm damage was measured as the percent reduction of metabolic activity by XTT assay. The MIC50 for biofilms was determined as the minimum concentration that caused ≥ 50% bacterial damage compared to that for untreated controls. Antibacterial drug interactions were analyzed using the Bliss independence model. Furthemore, the interactions between colistin and innate immune cells against carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms were investigated, by studying the effect of biofilm sub-MICs of colistin on (i) damage induced by human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) on carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms by XTT reduction assay and (ii) the immunomodulatory potential of human mononuclear cells (MNCs) exposed to carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms by RT-PCR and multiplex ELISA. Four of the 20 carbapenem-resistant K. pneumoniae isolates were biofilm producers. Biofilm MIC50s of colistin, rifampin, meropenem, gentamicin, and tigecycline for these isolates were 64, 8, &gt; 256, 128, and 8 μg/mL, respectively. Synergistic interactions were observed at 32- 64 μg/mL of colistin combined with 0.25- 4 μg/mL of rifampin, at 32 μg/mL of colistin combined with 0.007- 0.25 μg/mL of meropenem, and at 16- 32 μg/mL of colistin combined with 16- 64 μg/mL of tigecycline. The synergy was highest for colistin plus rifampin, with a mean ΔE ± standard error (SE) of 49.87% ± 9.22%, compared to 29.52% ± 4.97% for colistin plus meropenem (p &lt;0.001) and 32.44% ± 6.49% for colistin plus tigecyline (p &lt;0.001). Indifferent interactions were demonstrated for colistin plus gentamicin. None of the combinations exhibited antagonism. Colistin biofilm sub-MICs led to subsequent increased PMN-mediated biofilm damage (additive effect). MNCs responded to carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms through TLR2 upregulation and NLRP3 inflammasome activation. Carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms stimulated increased production of inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α, IL-8 and IL-6. In the combination treatment, 0.5 μg/mL of colistin reduced IL-1β, TNF-α and IL-8 levels, whereas at 2 μg/mL and 8 μg/mL it increased the anti-inflammatory cytokine IL-10 (p &lt;0.05). To evaluate pharmacokinetics (PK) of colistin in children, we conducted a population PK study in 17 critically ill patients 3 months to 13.75 years old who received CMS for infections caused by carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. CMS was dosed at 200,000 IU/kg/day (6 patients), 300,000 IU/kg/day (10 patients), and 350,000 IU/kg/day (1 patient). Plasma colistin concentrations were determined using ultra performance liquid chromatography (UPLC) combined with electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Population PK modeling of colistin in plasma was conducted using the first-order conditional estimation algorithm. Various parameters were recorded that could possibly be implicated in colistin PK, as well as infection- or treatment-related data. Patients were clinically and laboratory monitored for adverse events. Colistin PK was described by a one-compartment disposition model, including creatinine clearance, body weight, and the presence or absence of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) as covariates (p &lt;0.05). The average colistin plasma steady-state concentration (Css,avg) ranged from 1.11 to 8.47 μg/mL (median, 2.92 μg/mL). Ten patients had Css,avg of ≥ 2 μg/mL. The presence of SIRS was associated with decreased apparent clearance of colistin (47.8% of that without SIRS). The relationship between the number of milligrams of CBA per day needed to achieve each 1 μg/mL of plasma colistin Css,avg and creatinine clearance (in mL/min) was described by linear regression with different slopes for patients with and without SIRS. Nephrotoxicity, probably unrelated to colistin, was observed in one patient. In conclusion, colistin, in high doses, exhibited significant activity against carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms, and a remarkable synergistic effect with rifampicin, meropenem, and tigecycline. Biofilm sub-MICs of the drug improved PMNs’ killing capacity, and inhibited the excessive production of inflammatory cytokines by MNCs exposed to K. pneumoniae biofilms, emphasizing its beneficial effect on human immune cells. Administration of CMS at the above, higher than recommended, doses improved exposure and was well tolerated. Population PK analysis identified creatinine clearance and the presence or absence of SIRS as important covariates for the apparent clearance of colistin. The development of a generalizable dosing algorithm for pediatric patients however was not feasible, as significant interpatient variability was observed when patients from previous studies were included in the analysis.