Einfluß niedermolekularer Medienzusätze und sezernierter, ATP-unabhängiger Chaperone auf die Ausbeute therapeutischer Poteine im Periplasma von Escherichia coli
Creators: name: Schäffner, Jörg
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2000
Subjects: Hochschulschrift

description: Die Bildung der nativen Disulfidbrückenkonfiguration rekombinant hergestellter Proteine stellt eine große Herausforderung der biotechnologischen Forschung dar. In dieser Arbeit sollten anhand von Modellproteinen Möglichkeiten zur Verbesserung der Ausbeute von nativen therapeutisch relevanten Proteinen, die ins Periplasma von E. coli sezerniert wurden, untersucht werden. Aufgrund der Durchlässigkeit der äußeren bakteriellen Membran für Stoffe bis 600 Da können niedermolekulare Zusätze im Kulturmedium die Faltung von ins Periplasma sezernierten Proteinen beeinflussen. Dabei erwies sich insbesondere L-Arginin, das die Aggregation bei der in vitro-Proteinfaltung inhibiert, als effektiver Zusatz zur Steigerung der Ausbeute von nativem Plasminogenaktivator und einem scFv gegen Thyrotropin. Es konnten Steigerungen um das 10- bis 40-fache durch Zugabe von 0,4 M L-Arginin zum Medium erzielt werden. L-Arginin wird im Verlauf der Fermentation nicht nennenswert von E. coli metabolisiert. Reduziertes Glutathion kann eingesetzt werden, um als artifizielles Disulfid-Austauschsystem zu fungieren, da es im Laufe der Fermentation teilweise in die oxidierte Form überführt wird. Jedoch war der ausbeutesteigernde Effekt von reduziertem Gluathion nicht so groß wie der von L-Arginin. Die Ausbeute von nativem Proinsulin konnte nicht durch L-Arginin- oder GSH-Zusatz erhöht werden. Durch Co-Sekretion der ATP-unabhängigen Chaperone DnaJ und Hsp25 sowie dem N-terminalen Fragment von DnaJ, der J-Domäne, wurde die Ausbeute von funktionellem Plasminogenaktivator um das bis zu 5-fache gesteigert. Die Menge von nativem Proinsulin wurde durch Co-Sekretion von DnaJ oder der J-Domäne um einen Faktor von 35 bzw. 50 verbessert. Dagegen hatte die Co-Sekretion dieser molekularen Chaperone keinen positiven Einfluß auf die Ausbeute von scFv-Thyrotropin. Der beobachtete ausbeutesteigernde Effekt ist höchstwahrscheinlich auf die Chaperonfunktion von DnaJ und Hsp25 zurückzuführen, da (I) nachgewiesen werden konnte, daß DnaJ im Periplasma zur nativen Konformation faltet, (II) ein als Kontrolle co-sezerniertes "Nicht-Chaperon" zu keiner Ausbeuteverbesserung führte und (III) ein spezifischer Chaperonbedarf für die genutzten Modellproteine festgestellt werden konnte. Allerdings konnte aus den vorhandenen Literaturdaten keine Erklärung für den Effekt der J-Domäne abgeleitet werden. Ein Zusammenhang zwischen der Anordnung der Disulfidbrücken im Protein und dem Chaperonbedarf wird vermutet.
description: The formation of native disulfide bridged recombinant proteins is a great challenge in biotechnology. This work dealt with possible means to increase the yield of model proteins which were secreted to the periplasmic space of E. coli and are of therapeutic interest. The outer periplasmic membrane is no diffusion barrier for compounds with a molecular weight below 600 Da. This raises the opportunity to influence the folding of secreted proteins in that compartment by addition of low molecular weight additives to the cultivation medium. Especially L-arginine, a compound that reduces aggregation in in vitro protein folding, was sufficient to improve the yield of native plasminogen activator or scFV-TSH (TSH, thyroid stimulating hormone) up to 10 - 40-fold. Neither L-arginine nor glutathione are metabolized significantly by E. coli but it could be shown that reduced glutathione was partly oxidized during cultivation in a way that the addition of reduced glutathione to the medium established an artificial disulfide-shuffling system. However, the yield of proinsulin was not improved by addition of L-arginine or glutathione. Co-secretion of the ATP-independent molecular chaperones DnaJ and Hsp25 as well as an N-terminal fragment of DnaJ, the J-domain, increased the yield of functional plasminogen activator up to 5-fold. The amount of native proinsulin was improved by co-secretion of DnaJ or the J-domain up to a factor of 35 or 50, respectively. However, co-secretion of molecular chaperones had no positive effect on the yield of scFv-TSH. The determined increase of yield by co-secretion of these chaperones is very probably due to the chaperone function of DnaJ or Hsp25, because (I) it was shown that DnaJ folds to its native conformation in the periplasm, (II) co-secretion of a "non-chaperon" was not sufficient to improve the yield significantly and (III) a specific demand for chaperones of the used model proteins was found. The effect of the J-domain was surprising because the literature data cannot explain this result. A connection between the disulfide configuration of the model proteins and the demand for chaperones was assumed.