title: Reinigung und funktionelle Charakterisierung von rekombinanter humaner Protease ADAM8
title: Purification and Functional Characterization of Recombinant Human ADAM8 protease
Creators: name: Xiangdi Yu
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: CT1746
Medizin, Gesundheit
BB-94
Fibronectin
ADAM8
CD23

description: From recent studies in different
      tumor entities it became apparent that the membrane-anchored
      metalloprotease-disintegrin ADAM8 plays an active role in
      tumor progression and consequently in patient prognosis. It
      is therefore desirable to understand the functional role of
      ADAM8 in vitro by characterizing the soluble extracellular
      part of ADAM8, which is called the ADAM8 ectodomain. The
      human ectodomain ADAM8 (hEctoA8) protein consists of the
      prodomain, metalloprotease domain (MP), a disintegrin domain
      (DIS), a cysteine-rich domain (Cys) and a EGF-like domain
      (EGF), whilst removal of the prodomain by autocatalysis leads
      to the active form of hEctoA8. Like the full-length ADAM8,
      hEctoA8 contains the catalytic consensus sequence
      HEXXHXXGXXHD in the metalloprotease domain and is therefore
      predicted to be proteolytically active. Up to now, functional
      studies on ADAM8 in vitro were hampered by the lack of
      sufficient quantities of folded, biologically active, and
      purified recombinant forms of hEctoA8. In our study, we
      successfully purified the recombinant hEctoA8 protein from
      supernatants of transfected HEK cells. Purified recombinant
      hEctoA8 containing the catalytic function of ADAM8 can cleave
      CD23 in cells in trans and FN in vitro; CD23 cleavage
      resulted in fragments of 37, 33, 25 and 16 kDa and FN
      cleavage by recombinant hEctoA8 resulted in 9 fragments, one
      fragment of 38 kDa contains a RGD motif essential for cell
      adhesion. Functionally, ADAM8-dependent cell adhesion of
      pancreatic tumor cells Panc1 was affected by FN cleavage and
      resulted in reduced cell adhesion. Concomitantly, a decreased
      expression of integrin α5; was found, whereas cleavage of FN
      by recombinant hEctoA8 had no effect on the expression levels
      of integrin β1, and on the activation of p-ERK1/2 and
      p-Akt.
description: In einer Reihe von klinischen
      Studien wurde nachgewiesen, dass die membranständige
      Metalloprotease ADAM8 eine Rolle bei der Tumorprogression
      spielt und eine erhöhte ADAM8-Expression mit einer
      verschlechterten Patientenprognose einhergeht. Es ist daher
      notwendig, die Rolle der ADAM8-Aktivität in vitro zu
      verstehen. In dieser Arbeit sollte daher die lösliche
      Variante von ADAM8, die Ektodomäne (hEctoA8), aufgereinigt
      und funktionell charakterisiert warden. Diese besteht aus der
      Prodomäne, der Metalloprotease-Domäne (MP), der
      Disintegrin-Domäne (DIS), der Cystein-reichen Domäne (Cys)
      and der EGF-artigen Domäne (EGF). Die autokatalytische
      Entfernung der Prodomäne führt zur aktiven Protease. Wie das
      gesamte ADAM8-Molekül auch, enthält das rekombinanten Protein
      hEctoA8 die für Metzinkine charakteristische
      Konsensus-Sequenz “HEXXHXXGXXHD” in der MP-Domäne und sollte
      daher proteolytische Aktivität besitzen. Bis heute war es nur
      schwer möglich, funktionelle Studien mit ADAM8 in vitro
      durchzuführen, da nicht genügend rekombinantes Protein mit
      biologischer Aktivität zur Verfügung stand. In dieser Arbeit
      wurde das rekombinante humane ADAM8 als hEctoA8 erfolgreich
      aus Überständen von stabil transfizierten und selektionierten
      HEK293 Zellen aufgereinigt. Das so gewonnene Protein hEctoA8
      besitzt eine hohe katalytische Aktivität und kann in einem
      FRET-basierten Assay ein Fluoreszenz-gequenchtes Peptid
      spalten, das der ADAM8-Spaltstelle im niedrig-affinen IgE
      Rezeptor CD23 nachempfunden ist. Interessanterweise wird auch
      intaktes membranständiges CD23 von der Oberfläche stabiler
      CD23-exprimierender Zellen in Fragmente von 37, 33, 25 and 16
      kDa abgespalten, womit erstmalig eine Susbtratspaltung in
      trans nachgewiesen wurde. Weiterhin wurden die
      ADAM8-Spaltstellen für das extrazelluläre Matrixprotein
      Fibronectin (FN) charakterisiert. Es entstanden dabei 9
      FN-Fragmente von unterschiedlichem Molekulargewicht. Ein
      FN-Fragment mit einem Molekulargewicht von 38 kDa war dabei
      besonders interessant, da es so genannte Zellbindungsdomänen
      sowie ein RGD-Motiv enthält. Durch die ADAM8-abhängige
      Spaltung dieses Fragments kann man davon ausgehen, dass eine
      durch FN vermittelte Zelladhäsion verloren gehen sollte.
      Diese Hypothese wurde durch Pankreas-Tumorzellen Panc1
      überprüft, bei denen eine ADAM8-abhängige Zelladhäsion auf FN
      mit und ohne vorherigen Verdau gemessen wurde. Es konnte
      gezeigt werden, dass der Verdau von Fibronektin durch ADAM8
      die Zelladhäsion signifikant reduzierte. Die Expression des
      daran beteiligten Fibronektin-Rezeptors 51 wurde auf
      Proteinebene untersucht und dabei gezeigt, dass spezifisch
      die Integrin 5-Untereinheit vermindert ist, während die
      Integrin 1-Untereinheit nicht verändert ist. Auch die vom
      Fibronektin-Rezeptor abhängige Signalkaskade, an der unter
      anderem die Kinasen p-ERK1/2 und p-Akt beteiligt sind, zeigt
      keine Änderungen im Aktivierungsstatus, sodass man daraus
      schliessen kann, dass die von ADAM8 vermittelte Degradation
      von FN direkt über die Regulation der Integrin
      5-Untereinheit zu einer verminderten Zelladhäsion
      führt.