Βιοπληροφορική ανάλυση στελεχών Staphylococcus aureus μικρών μηρυκαστικών: Διερεύνηση ανάπτυξης εμβολίου κατά της μαστίτιδας
Creators: name: Παρασκευά, Αναστασία Αλκιβιάδη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: subject: Μαστίτιδα
subject: Εμβόλιο ανασυνδυασμένης πρωτεϊνικής υπομονάδας
subject: Βιοπληροφορική
subject: Mastitis
subject: Subunit protein vaccine
subject: Bioinformatics
subject: FOS: Computer and information sciences

description: Η μαστίτιδα των γαλακτοπαραγωγικών ζώων πλήττει μεγάλο αριθμό μηρυκαστικών με αποτέλεσμα σημαντικές συνέπειες στην υγεία και την ευζωία των ζώων, αλλά και στην παγκόσμια οικονομία. Διακρίνεται σε κλινική και υποκλινική. Η μαστίτιδα μπορεί να προκληθεί από ποικίλους παράγοντες, αλλά συνήθως οφείλεται στο βακτήριο Staphylococcus aureus. Παρά τη μεγάλη σημασία της νόσου, μέχρι σήμερα οι προσπάθειες για την παραγωγή εμβολίου δεν έχουν στεφθεί με επιτυχία. Αντικείμενο αυτής της έρευνας ήταν ο φαινοτυπικός και γενοτυπικός χαρακτηρισμός στελεχών S. aureus και η χρήση της μεθόδου της αντίστροφης βιοπληροφορικής μηχανικής ανάλυσης, με σκοπό την ετερόλογη έκφραση πρωτεΐνης που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως εμβόλιο ανασυνδυασμένης υπομονάδας κατά του βακτηρίου. Η ικανότητα του παθογόνου ανταπεξέρχεται στους μηχανισμούς δράσης του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή είναι ο βασικός παράγοντας που επιτρέπει την εξέλιξη της νόσου. Για το λόγο αυτό διερευνήθηκε η ικανότητα επιβίωσης των στελεχών στην παρουσία των έμμορφων και άμορφων συστατικών του αίματος μηρυκαστικών. Το σύνολο των στελεχών έδειξε σημαντική μείωση της επιβίωσης. Στα στελέχη που εξετάστηκαν καταγράφηκε χαμηλή ανθεκτικότητα σε αντιμικροβιακούς παράγοντες. Το σύνολο των βακτηρίων είχε τη δυνατότητα παραγωγής βιοϋμενίου, ενώ η ισχυρή παραγωγή σχετίστηκε με τα κλινικά στελέχη. Ταυτόχρονα εντοπίστηκαν πολλοί παράγοντες λοιμογονικότητας που σχετίζονται με την προσκόλληση των βακτηρίων. Η παθογένεια του S. aureus βασίζεται στη πληθώρα των λοιμογονικών παραγόντων που διαθέτει. Στο σύνολο των στελεχών ανιχνεύθηκαν από 26 έως 42 διαφορετικά γονίδια λοιμογονικότητας από τα 49 που εξετάστηκαν. Τα γονίδια hld, tsst-1, lukM, lukF, sec, sel και sdrC σχετίστηκαν με την κλινική μορφή της ασθένειας, ενώ τα fnbA και sdrE με την υποκλινική. Από τη φυλογενετική ανάλυση καταγράφηκε υψηλή γενοτυπική ποικιλομορφία, ενώ ταυτόχρονα φάνηκε ότι υπάρχει συγκεκριμένη κλωνική εξάπλωση σε συγκεκριμένες περιοχές. Τα βακτηριακά στελέχη διαχωρίστηκαν με βάση τα MLST γονίδια, την επιφανειακή πρωτεΐνη spa και τα ρυθμιστικά γονίδια agr. Ο πιο συχνός τύπος ST που καταγράφηκε ήταν ο ST133, ο οποίος εμφανίζεται μόνο στα μικρά μηρυκαστικά. Όσον αφορά τα agr γονίδια, ο πιο συχνά εμφανιζόμενος τύπος ήταν ο agrΙ, ο οποίος συσχετίστηκε με την κλινική μορφή της ασθένειας. Η πλειοψηφία των σταφυλόκοκκων που εξετάστηκαν έφεραν τουλάχιστον ένα πλασμίδιο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον είχε το πλασμίδιο του κλινικού στελέχους ΜΙΝ1, το οποίο διέθετε γονίδια ανθεκτικότητας, λοιμογονικότητας, αντιγραφής και μεταφοράς. Το πλασμίδιο αυτό καταγράφεται όλο και με υψηλότερη συχνότητα τα τελευταία χρόνια και η κύρια πηγή προέλευσης είναι τα τραύματα ανθρώπων. Το γεγονός αυτό είναι ιδιαίτερα ανησυχητικό για τη δημόσια υγεία και ενέχει σημαντικούς κινδύνους. Σύμφωνα με τα δεδομένα της ανάλυσης και της μεθόδου αντίστροφης βιοπληροφορικής μηχανικής ανάλυσης, επιλέχθηκε τμήμα της επιφανειακής πρωτεΐνης sdrM για την κλωνοποίηση σε ετερόλογο σύστημα και την παραγωγή της σε μεγάλη κλίμακα. Για το λόγο αυτό, το γονίδιο sdrM ενσωματώθηκε σε πλασμιδιακό φορέα, αρχικά για κλωνοποίηση και στη συνέχεια σε φορέα έκφρασης για την παραγωγή και απομόνωσή της. Η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε υποδεικνύει από τη μία πλευρά τη σοβαρότητα και την αναγκαιότητα της δημιουργίας ενός αποτελεσματικού μέσου πρόληψης της μαστίτιδας και από την άλλη τη μεγάλη πολυπλοκότητά της. Η ασθένεια είναι πολυπαραγοντική και οι πιθανοί υποψήφιοι επίτοποι, πρωτεΐνες και συνδυασμοί πολλοί.
description: Mastitis, a prevalent mammary gland disorder affecting a wide spectrum of lactating mammals, bears significant implications for animal welfare, health, and the global economy. This ailment manifests as either clinical or subclinical mastitis, varying in intensity and symptomatology. Bacterial infections, chiefly attributable to Staphylococcus aureus, underscore its etiology. The absence of efficacious prevention and treatment methodologies accentuates the urgency of research in this domain. Novel approaches, such as vaccine development, have proven elusive thus far. This study delves into characterizing the phenotypic and genotypic traits of S. aureus strains while exploring reverse vaccinology's potential by expressing a recombinant subunit vaccine candidate. The capacity of S. aureus to thwart the host's immune system significantly influences mastitis development. Hence, we scrutinized the survival mechanisms of these strains in the presence of mammalian blood's cellular and acellular components. Results unveiled a marked reduction in overall strain survival post-exposure, with survival rates peaking at 17% and 30%, respectively. Notably, antimicrobial resistance in the studied strains remained limited, despite harboring several resistance genes, while robust biofilm formation emerged, particularly in clinical strains. This study also revealed a plethora of virulence factors linked to bacterial adhesion, augmenting biofilm production. S. aureus pathogenicity hinges on various virulence factors encompassing toxin genes, superantigen toxins, surface, and adhesion proteins. Our investigation identified 26 to 42 virulence genes per strain out of the 49 probed. Clinical disease correlated with genes like hld, tsst-1, lukM, lukF, sec, sel, and sdrC, while subclinical infection was linked to fnbA and sdrE. Phylogenetic analysis showcased pronounced genotypic diversity, with geographically proximate strains forming distinctive clusters, signifying region-specific dissemination. The strains were differentiated through MLST genes, surface protein spa, and regulatory genes agr. The prevailing sequence type (ST) was ST133, prominent in small ruminants, while agrI was the prevalent agr gene type, predominantly linked to clinical mastitis. Intriguingly, most staphylococci strains harbored at least one plasmid. Noteworthy was the plasmid in clinical strain MIΝ1, harboring genes associated with resistance, virulence, replication, and transfer. Alarmingly, this plasmid, primarily sourced from human wounds, has recently proliferated, sparking public health apprehensions.Leveraging our analysis and reverse vaccinology, a segment of surface protein sdrM was chosen for cloning into a heterologous system for upscale production. In silico evaluations exhibited encouraging outcomes, hinting at its potential to evoke an immune response and confer protection against S. aureus infection. Consequently, the protein was incorporated into a plasmid vector for cloning and later into an expression vector for production and isolation.In summation, this study provides a comprehensive comprehension of the attributes and virulence factors characterizing S. aureus strains implicated in lactating animal mastitis. These insights illuminate disease pathogenesis, setting the stage for preventive and therapeutic strategies, notably the development of a recombinant subunit vaccine. This research serves as a cornerstone for addressing mastitis-related challenges and advancing animal welfare and productivity.