title: Functional characterization of ATP-dependent chromatin remodelers of the CHD family of Drosophila
title: Funktionelle Charakterisierung der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler der CHD Familie von Drosophila
Creators: name: Murawska, Magdalena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Biowissenschaften, Biologie
Drosophila
Transkription
Transcription
Chromatin

description: Members of the CHD family
      (Chromodomain-Helicase-DNA binding) of ATP-dependent
      chromatin remodelers play key roles at different steps of the
      transcription cycle. They are essential in regulation of
      developmental and differentiation programs in multicellular
      organisms. However, the complexity of these remodelers makes
      it difficult to study them in higher eukaryotes. In this
      study, advantage was taken of Drosophila melanogaster as a
      model organism, which possesses only four CHD family members.
      In the first part of this study, a novel chromatin remodeler,
      dCHD3, has been characterized biochemically and functionally.
      dCHD3 is highly similar to dMi-2 and consequently it
      possesses similar enzymatic activities in vitro. dCHD3 is a
      highly active, nucleosome stimulated ATP-dependent chromatin
      remodeler which slides mononucleosomes in vitro. The
      chromodomains of dCHD3 seem to be important for substrate
      recognition and for the remodeling activity of this enzyme.
      Despite the similarities, dCHD3 and dMi-2 differ
      significantly in other aspects. In contrast to dMi-2, dCHD3
      exists as a monomer in vivo and it is not associated with
      deacetylase activity. Moreover, dCHD3 expression is
      restricted to early developmental stages and certain tissues.
      Finally, dCHD3 cannot compensate for the loss of dMi-2 which
      suggests that they are not functionally redundant. In the
      second part of this work, a role of dMi-2 in active
      transcription has been studied. dMi-2 has been implicated in
      transcriptional repression as a part of dNuRD or dMec
      complexes. This study shows that dMi-2 colocalizes with
      active regions on polytene chromosomes and it is recruited to
      heat shock genes. Both, reduction of dMi-2 expression in
      flies or ectopic expression of a catalytically inactive
      mutant, impair heat shock gene response. Interestingly, 3’
      end processing and splicing of some of these genes is
      affected. In agreement with this, dMi-2 binds to nascent hsp
      gene transcripts upon heat shock induction. Consequently,
      these results suggest a role of dMi-2 catalytic activity in
      co-transcriptional RNA processing. Study of the recruitment
      mechanism of dMi-2 to heat shock genes suggests that it
      occurs in a poly(ADP-ribose) dependent manner. Several
      results support this hypothesis. First, dMi-2 recruitment to
      hsp70 gene is reduced upon PARP inhibition. Second, dMi-2
      binds PAR polymers directly in vitro and several dMi-2
      regions, which bind PAR independently in vitro, have been
      identified. Third, a dMi-2 mutant unable to bind PAR does not
      localise to active heat shock loci in vivo. Moreover, RNA and
      PAR compete for dMi-2 binding in vitro suggesting a two-step
      process for dMi-2 association with active heat shock genes.
      First, dMi-2 is recruited to the locus via PAR binding
      followed by association with nascent RNA transcripts.
      Collectively, these studies suggest, that stress-induced
      chromatin modification by PARP serves as a scaffold for rapid
      recruitment of factors that are required for quick and
      efficient transcriptional response.
description: Mitglieder der CHD Familie
      (Chromodomain-Helicase-DNA binding) chromatin-modifizierender
      Proteine spielen eine zentrale Rolle in unterschiedlichen
      Schritten des Transkriptionszyklus. Sie sind für die
      Regulation von Entwicklungs- und Differenzierungsprogrammen
      in mehrzelligen Organismen essentiell. Die Komplexität dieser
      Proteine erschwert allerdings ihre genauere Untersuchung in
      höheren Eukaryoten. In der vorliegenden Arbeit wurde daher
      auf den Modellorganismus Drosophila melanogaster
      zurückgegriffen, der lediglich über vier Mitglieder der CHD
      Familie verfügt. Im ersten Teil der Arbeit wurde dCHD3, ein
      neuentdecktes Mitglied der CHD Familie, biochemisch und
      funktionell charakterisiert. dCHD3 ist dMi-2, einem anderen
      CHD Familienmitglied, sehr ähnlich und besitzt folglich
      ähnliche enzymatische Aktivitäten in vitro. dCHD3 ist ein
      hochgradig aktives, durch Nukleosomen stimuliertes
      ATP-abhängiges Chromatin-modifizeirendes Enzym, das
      Mononukleosomen in vitro verschiebt. Die Chromo-Domänen von
      dCHD3 scheinen für Substraterkennung und die Aktivität dieses
      Enzyms wichtig zu sein. Trotz der Ähnlichkeiten in diesen
      Belangen, unterscheiden sich dCHD3 und dMi-2 in anderer
      Hinsicht deutlich. Im Gegensatz zu dMi-2 liegt dCHD3 in vivo
      als Monomer vor und ist mit keiner Deazetylierungsaktivität
      assoziiert. Darüberhinaus ist die Expression von dCHD3 auf
      frühe Entwicklungsstadien und bestimmte Gewebe beschränkt.
      dCHD3 ist zudem nicht in der Lage, einen Verlust von dMi-2 zu
      kompensieren, was dafür spricht, dass beide Proteine
      funktionell nicht redundant sind. Im zweiten Teil dieser
      Arbeit wurde die Beteiligung von dMi-2 in aktiver
      Transkription untersucht. dMi-2 spielt als Bestandteil der
      dNuRD und dMec-Komplexe bekanntermaßen bei der
      transkriptionellen Repression von Genen eine Rolle. Diese
      Arbeit zeigt hingegen, dass dMi-2 mit
      transkriptionell-aktiven Bereichen auf Polytänchromosomen
      kolokalisiert und zu Hitzeschock-Genen rekrutiert wird.
      Sowohl die Verringerung der Expression von dMi-2 als auch
      Überexpression einer katalytisch-inaktiven Mutante verringern
      die Hitzeschockantwort in Fliegen. Interessanterweise ist bei
      einigen dieser Gene die 3‘-Prozessierung und das Spleissen
      beeinträchtigt. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen
      bindet dMi-2 im Verlauf der Hitzeschockinduktion an hsp
      Transkripte, die im Entstehen begriffen sind. Insgesamt
      deuten diese Resultate auf eine Funktion von dMi-2 bei der
      kotranskriptionellen RNA-Prozessierung hin. Die Untersuchung
      der Rekrutierung von dMi-2 zu Hitzeschock-Genen deutet darauf
      hin, dass sie in einer Poly-(ADP-Ribose)-abhängigen Weise
      stattfindet. Mehrere Ergebnisse unterstützen diese Hypothese.
      Erstens ist die Rekrutierung von dMi-2 zum hsp70 Gen
      verringert, wenn PARP inhibiert wird. Zweitens bindet dMi-2
      PAR Polymere in vitro und mehrere Regionen, die PAR in vitro
      unabhängig binden, wurden identifiziert. Drittens ist eine
      dMi-2 Mutante, deren PAR-Binderegionen entfernt wurden, nicht
      in der Lage, in vivo zu aktiven Hitzeschockloci zu
      lokalisieren. Weiterhin konkurrieren RNA und PAR um Bindung
      an dMi-2. Insgesamt deuten die Ergebnisse auf einen
      zweischrittigen Mechanismus hin, der zur Assoziierung von
      dMi-2 mit aktiven Hitzeschock-Genen führt. Zuerst wird dMi-2
      mittels Bindung an PAR zum Locus rekrutiert, bindet daraufhin
      aber an neuentstandene Transkripte. Insgesamt deuten die
      vorliegenden Ergebnisse daraufhin, dass die stress-induzierte
      Modifikation von Chromatin durch PARP als Gerüst für die
      Rekrutierung von Faktoren dient, die ihrerseits für eine
      schnelle und effiziente transkriptionelle Antwort notwendig
      sind.