Development of a three-dimensional tissue engineering-based dental tissue analogue, as a novel biocompatibility evaluation tool of dental resinous cements
Creators: name: Χατζηχρίστου, Χριστίνα Ν.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Ιστοτεχνολογικό ανάλογο οδοντίνης/πολφού
Έλεγχος κυτταροτοξικότητας
Συνκαλλιέργεια ενδοθηλιακών/μεσεγχυματικών κυττάρων (scap/huvec)
Υδρογέλη κολλαγόνου/ινικής
Ιστοτεχνολογία
Dentin/pulp tissue analogue
Cytotoxicity assessment
SCAP/HUVEC Co-culture
Collagen/fibrin hydrogel
Tissue engineering

description: Aim of the study: Two-dimensional (2D) in vitro models are extensively utilized for cytotoxicity assessment of dental materials, but with limitations of in-vitro-in vivo extrapolation. A three-dimensional (3D) dentin/pulp tissue analogue, resembling the human natural tissue has been engineered in an in vitro setup, aiming to assess the cytocompatibility of resin-based dental restorative cements, resinous monomers and bacterial endotoxins. Materials and Methods: The analogue comprised two compartments: the upper, representing the dentin component, with a layer of odontoblast-like cells expanded on the microporous membrane of a cell culture insert and covered by a treated dentin matrix; and the lower, representing a pulp analogue, incorporating HUVEC/SCAP co-cultures into collagen-I/fibrin (Col-I/Fib) hydrogels. Representative resinous monomers (HEMA: 1–8 mM;TEGDMA: 0.5–5 mM), specimens of two resin-based cements (BreezeTM, Pentron: Cement-1/C1; SpeedCEMplusTM, Ivoclar-Vivadent: Cement-2/C2) and bacterial components (LPS: 1 μg/ml) were applied into the construct. Cytotoxicity was assessed by MTT-, LDH- assays and live/dead staining. Realtime PCR was performed for odontogenesis- and angiogenesis- related markers. Shear modulus of the hydrogels at 3.5 and 5 mg/ml was evaluatedby dynamic mechanical analysis. Results: The dentin/pulp tissue analogue, supported cell viability and promoted capillary-like network formation inside the pulp analogue. LPS induced expression of odontogenesis-related markers (RUNX2, ALP, DSPP) without compromising viability of the odontoblast-like cells, while cotreatment with LPS and resin monomers induced cytotoxic effects (live/dead staining, MTT and LDH assays) in cells of both upper and lower compartments and reduced expression angiogenesis-related markers (VEGF, VEGFR2, ANGPT1, TIE2, PECAM-1) in a concentration-and time- dependent manner. LPS treatment aggravated TEGDMA-induced and -in certain concentrations (2–4 mM)- HEMA-induced cytotoxicity. On the contrary, both cements caused no significant toxicity to the dentin/pulp tissue analogue. C1 induced stimulation (p&lt;0.01) of cell viability (158.0 3%, 72 h), while pre-stimulation with LPS attenuated this effect. C2 (± LPS) caused minor reduction of viability (15-20%, 24 h) that recovered at 72 h for the LPS+ group. Both cements caused upregulation of VEGF, ANGPT1, and downregulation of the respective receptors VEGFR2 and TIE1. Conclusions: The dentin/pulp tissue analogue represents a promising tissue engineering- based cytotoxicity assessment tool, providing more insight into the mechanistic aspects of interactions of dental materials to the dentin/pulp tissue.
description: Αντικείμενο της εργασίας: Τα δισδιάστατα (2D) in vitro μοντέλα έχουν χρησιμοποιηθεί για την μελέτη της κυτταροτοξικότητας των οδοντιατρικών υλικών αλλά παρουσιάζουν περιορισμούς ως προς την αναγωγή συμπερασμάτων από in vitro σε in vivo συνθήκες. Στην παρούσα μελέτη δημιουργήθηκε σε ένα in vitro εργαστηριακό περιβάλλον, ένα τρισδιάστατο (3D) ιστοτεχνολογικό σύμπλεγμα ως ανάλογο οδοντίνης/πολφού με χαρακτηριστικά που προσομοιάζουν με τον φυσικό ιστό με σκοπό την πιο αξιόπιστη μελέτη της κυτταροτοξικότητας ρητινωδών κονιών συγκόλλησης,ρητινωδών μονομερών και βακτηριακών ενδοτοξινών. Μέθοδος: Το ιστοτεχνολογικό σύμπλεγμα αποτελείται από δυο τμήματα. Το άνω τμήμα που αναπαριστά τον ιστό της οδοντίνης και αποτελείται από μια στιβάδα κυττάρων που προσομοιάζουν οδοντινοβλάστες και καλλιεργούνται πάνω σε μια μεμβράνη με μικροπόρους, εντός ενθεμάτων κυτταροκαλλιέργειας. Αυτή η στιβάδα κυττάρων καλύπτεται από επεξεργασμένη φυσική οδοντίνη σε σχήμα κυλινδρικού δοκιμίου. Το κάτω τμήμα αναπαριστά τον ιστό του πολφού, ενσωματώνοντας μια συγκαλλιέργεια ενδοθηλιακών/μεσεγχυματικών κυττάρων (HUVEC/SCAP) μέσα σε υδρογέλη κολλαγόνου-Ι/ινικής. Στο ιστοτεχνολογικό ανάλογο ελέγχθηκαν ως προς την κυτταροτοξικότητας= τους δυο αντιπροσωπευτικά μονομερή σε διάφορες συγκεντρώσεις (HEMA: 1–8 mM; TEGDMA: 0.5–5 mM), εκχυλίσματα από δυο ρητινώδεις κονίες συγκόλλησης (BreezeTM, Pentron: Cement-1/C1; SpeedCEMplusTM, Ivoclar-Vivadent: Cement-2/C2) και μια βακτηριακή ενδοτοξίνη Gram αρνητικών βακτηρίων (LPS: 1 μg/ml). Έγινε έλεγχος της κυτταροτοξικότητας με δοκιμασίες MTT και LDH και χρώση ζωντανών/νεκρών κυττάρων. Πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για γονίδια σχετικά με την οδοντινογένεση και την αγγειογένεση. Έγινε εκτίμηση του μέτρου διάτμησης (shear modulus) του πολφικού αναλόγου με συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης στην υδρογέλη 3.5 ή 5 mg/ml, μέσω δυναμικής μηχανικής ανάλυσης. Αποτελέσματα: Στο ανάλογο οδοντίνης/πολφού διατηρήθηκε η ζωτικότητα των κυττάρων και ευνοήθηκε η δημιουργία δικτύου τριχοειδών εντός του πολφικού αναλόγου. Η εισαγωγή του LPS οδήγησε στην έκφραση δεικτών σχετικών με την οδοντογένεση (RUNX2, ALP, DSPP), χωρίς να επηρεάζει την ζωτικότητα των οδοντινοβλαστικών κυττάρων. Η ταυτόχρονη χορήγηση LPS και μονομερών προκάλεσε κυτταροτοξικότητα, όπως έδειξαν οι δοκιμασίες MTT και LDH και η χρώση ζωντανών/νεκρών κυττάρων τόσο στο άνω αλλά και στο κάτω τμήμα του αναλόγου οδοντίνης/πολφού, αλλά και μείωση στην έκφραση των δεικτών αγγειογενούς διαφοροποίησης (VEGF, VEGFR2, ANGPT1, TIE2, PECAM-1) η οποία ήταν δόσο- αλλά και χρόνο- εξαρτώμενη. Η χορήγηση LPS επιδείνωσε την κυτταροτοξικότητα που προκλήθηκε από το μονομερές TEGDMA, αλλά και από το HEMA (για τις συγκεντρώσεις 2–4 mM). Αντιθέτως, τα σκευάσματα ρητινωδών κονιών συγκόλλησης δεν προκάλεσαν σημαντική κυτταροτοξικότητα στο ανάλογο οδοντίνης/πολφού. Μετά την χορήγηση της κονίας C1 προκλήθηκε διέγερση (p&lt;0.01) της ζωτικότητας των κυττάρων (158.0 3%, 72 h), κάτι που όμως αναχαιτίστηκε στην περίπτωση της χορήγησης LPS πριν την τοποθέτηση της κονίας. Η κονία C2 (±LPS) προκάλεσε μείωση της ζωτικότητας (15-20%, 24 h) η οποία ανέκαμψε στις 72 h στην περίπτωση της χορήγησης LPS. Και οι δυο κονίες (C1, C2) προκάλεσαν αύξηση στην έκφραση των γονιδίων VEGF, ANGPT1, και μείωση των αντίστοιχων υποδοχέων VEGFR2 και TIE1. Συμπεράσματα: Το ανάλογο οδοντίνης/πολφού που αναπτύχθηκε αποτελεί ένα υποσχόμενο ιστοτεχνολογικό εργαλείο για τον έλεγχο της κυτταροτοξικότητας, που μπορεί να δώσει πληροφορίες σε μηχανιστικές πτυχές των αλληλεπιδράσεων των οδοντιατρικών υλικών και του συμπλέγματος οδοντίνης/πολφού.