Προσδιορισμός της Κολιστίνης σε δείγματα ούρων με χρωματογραφία υγρού σε συνδυασμό με εν ροή παραγωγοποίηση μετά τη στήλη
Creators: name: Παπαβασιλείου, Καλλιόπη Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Κολιστίνη
Χρωματογραφία Υγρού
Παραγωγοποίηση
Colistin
Liquid Chromatography
Derivatization

description: Η κολιστίνη είναι ένα πολυπεπτίδιο με αντιβιοτικές ιδιότητες, που συντίθεται μη ριβοσωμικά από το Bacillus polymyxa υποείδος colistinus. Είναι ένα πολύπλοκο μείγμα που αποτελείται από δομικά συγγενείς ενώσεις, με τις δύο κύριες να είναι η Κολιστίνη Α (πολυμυξίνη Ε1) και η Κολιστίνη Β (πολυμυξίνη Ε2). Ο μηχανισμός δράσης του κατά των Gram-αρνητικών βακτηρίων βασίζεται σε ηλεκτροστατικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με μόρια λιποπολυσακχαριτών, προκαλώντας μετατόπιση ιόντων ασβεστίου και μαγνησίου και αποσταθεροποίηση της εξωτερικής μεμβράνης οργανισμών που είναι απαραίτητοι στην αντιμικροβιακή δράση. Φαρμακολογικά, η κολιστίνη διατίθεται σε δύο εμπορικές μορφές: τη θειϊκή κολιστίνη που χρησιμοποιείται από το στόμα και τοπικά, ενώ το λιγότερο τοξικό προφάρμακο νατριούχο κολιστιμεθάτη (CMS) που είναι κατάλληλη για παρεντερική χορήγηση και εισπνοή. Σε αυτή τη μελέτη, παρουσιάζεται η ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή μιας νέας μεθόδου υγρής χρωματογραφίας με παραγωγοποίηση μετά τη στήλη για τον προσδιορισμό της κολιστίνης σε δείγματα ανθρώπινων ούρων. Ο διαχωρισμός της κολιστίνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια αναλυτική στήλη C18 συμπαγούς πυρήνα σε αλκαλικό μέσο προκειμένου i) να είναι συμβατή με την αντίδραση παραγωγοποίησης μετά τη στήλη με βάση την ο-φθαλαδιαλδεΰδη (ΟΡΑ) και (ii) να επιτευχθεί καλύτερη συγκράτηση της προσδιοριζόμενης ουσίας. Το παράγωγο της κολιστίνης ανιχνεύθηκε φασματοφθορομετρικά (λext/λem = 340/460 nm) μετά από παραγωγοποίηση μετά τη στήλη με o-φθαλαδιαλδεΰδη και Ν-ακετυλο κυστεΐνη. Οι παράμετροι παραγωγοποίησης βελτιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον πειραματικό σχεδιασμό Box-Behnken και η μέθοδος επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας την έννοια του συνολικού σφάλματος. Τα διαστήματα ανοχής β δεν υπερέβαιναν τα κριτήρια αποδοχής ±15%, πράγμα που σημαίνει ότι το 95% των μελλοντικών αποτελεσμάτων θα περιλαμβανόταν στα καθορισμένα όρια σφάλματος. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν επαρκές που αντιστοιχούσε σε 100 nmol· L−1 . Το μέσο αναλυτικό σφάλμα (εκφρασμένο ως σχετικό σφάλμα) στα επίπεδα επιμόλυνσης ήταν κατάλληλο, καθώς κυμαινόταν από -2,8 έως +2,5% και για τις δύο ενώσεις με την ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση να είναι χαμηλότερη από 3,4% σε όλες τις περιπτώσεις. Η προτεινόμενη αναλυτική μέθοδος εφαρμόστηκε ικανοποιητικά στην ανάλυση του φαρμάκου σε δείγματα ανθρώπινων ούρων.
description: Colistin is a polypeptide with antibiotic properties, being synthesized non-ribosomally by Bacillus polymyxa subspecies colistinus. It is a rather complex mixture consisting of structurally related compounds, with the two major ones being Colistin A (polymyxin E1) and Colistin B (polymyxin E2). Its mechanism of action against Gram-negative bacteria is based on electrostatic and hydrophobic interactions with lipopolysaccharide molecules, causing displacement of calcium and magnesium ions and destabilization of the outer membrane of organisms that are essential in antimicrobial activity. Pharmacologically, Colistin is available in two commercial forms: Colistin sulfate is used orally and topically, while the less toxic prodrug Colistin methanesulfonate (CMS) is suitable for parenteral administration and inhalation. In this study, the development, validation, and application of a new liquid chromatography post-column derivatization method for the determination of Colistin in human urine samples is demonstrated. Separation of Colistin was performed using a core–shell C18 analytical column in an alkaline medium in order (i) to be compatible with the o-phthalaldehyde-based post-column derivatization reaction and (ii) to obtain better retention of the analyte. The Colistin derivative was detected spectrofluorometrically (λex/λem = 340/460 nm) after post-column derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl cysteine. The post-column derivatization parameters were optimized using the Box–Behnken experimental design, and the method was validated using the total error concept. The β-expectation tolerance intervals did not exceed the acceptance criteria of ±15%, meaning that 95% of future results would be included in the defined bias limits. The limit of detection of the method was adequate corresponding to 100 nmol·L−1. The mean analytical bias (expressed as relative error) in the spiking levels was suitable, being in the range of −2.8 to +2.5% for both compounds with the percentage relative standard deviation lower than 3.4% in all cases. The proposed analytical method was satisfactorily applied to the analysis of the drug in human urine samples.