Διερεύνηση της δράσης του ενζύμου της χιτινάσης, σε ιχθείς μετά από χορήγηση τροφής με μερική υποκατάσταση ιχθυαλεύρου από εντομοάλευρο
Creators: name: Μηνά, Αμαλία Νικολάου-Πέτρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: ενζυμική δραστικότητα χιτινάσης
χιτίνη
υποκατάσταση ιχθυαλεύρου από εντομοάλευρο
chitinase enzyme activity
chitin
substitution of fish meal by insect meal

description: Σήμερα οι ιχθυοκαλλιέργειες αντιμετωπίζουν προβλήματα κυρίως εξαιτίας της αύξησης του κόστους των ιχθυαλεύρων. Η ανάγκη εύρεσης εναλλακτικών πηγών πρωτεΐνης γίνεται πιο επιτακτική. Η χρήση των εντομοάλευρων αποτελεί εναλλακτική λύση που παρέχει υψηλής ποιότητας πρωτεΐνη. Σχετικές μελέτες δείχνουν ότι τα περισσότερα είδη εντόμων έχουν υψηλή ποιότητα και ποσότητα πρωτεΐνης, ανταγωνιζόμενα αυτά των ιχθυάλευρων και των σογιάλευρων. Σε πειράματα που διενεργήθηκαν σε συνεργασία του εργαστηρίου μας με άλλα εργαστήρια, διαπιστώθηκαν προβλήματα στην αύξηση των εκτρεφόμενων ιχθύων εξαιτίας της μερικής υποκατάστασης του ιχθυάλευρου από εντομοάλευρο. Επειδή ανάμεσα στις πιθανές αιτίες για τα προβλήματα αυτά θεωρήθηκε η αδυναμία πλήρους πέψης της χιτίνης των εντόμων, προχωρήσαμε στη μελέτη του ενζύμου της χιτινάσης στο πεπτικό σύστημα των εκτρεφόμενων ιχθύων. Συγκεκριμένα ιστούς τσιπούρας (Sparus aurata), και ιριδίζουσας πέστροφας (Oncorhynchus mykiss), ύστερα από μερική υποκατάσταση ιχθυάλευρων από άλευρα που προήλθαν από το έντομο Tenebrio molitor. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας προσδιορίστηκε ως βέλτιστο pH για τον πεπτικό σωλήνα η τιμή 5,4 με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου 0,2Μ. Ο χρόνος επώασης για τον προσδιορισμό της δραστικότητας του ενζύμου περιορίστηκε στα 60 min, από τα 120. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας η ενζυμική δράση που ανιχνεύτηκε οφείλεται στον ιστό του πεπτικού σωλήνα και όχι σε παράσιτα της χλωρίδας του εντέρου. Διαπιστώθηκε επαγωγή της δραστικότητας του ενζύμου στον πεπτικό σωλήνα τσιπούρας μετά από υποκατάσταση ιχθυάλευρου 50%, ενώ στην πέστροφα δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μετά την υποκατάσταση 60%. Κατά τον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων του ενζύμου στους ιστούς που μελετήθηκαν, διαπιστώθηκε ότι η τιμή της Km δεν μειώθηκε στατιστικά σημαντικά μετά την υποκατάσταση του ιχθυαλεύρου κατά 50% από εντομοάλευρο (0% υποκατάσταση 0.34 ± 0.09 mg/ml, 25% υποκατάσταση 0.45 ± 0.08 mg/ml και 50% υποκατάσταση 0.27 ± 0.02 mg/ml), ενώ η Vmax αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά (Ρ&lt;0,01) (1,1 ± 0.08 Units/mg/hr, 1,4 ± 0.09 Units/mg/hr, 3,1 ± 0.3 Units/mg/hr για υποκατάσταση 0%, 25% και 50% αντίστοιχα). Στην περίπτωση της πέστροφας, η Km παρέμεινε ανεπηρέαστη (0.25 ± 0.03 mg/ml και 0.30 ± 0.04 mg/ml για 0% και 60% υποκατάσταση), όπως και η Vmax (1,55 ± 0.2 και 1,47± 0.2 Units/mg/hr για 0% και 60% υποκατάσταση αντίστοιχα). Υπάρχουν διαφορές στη δομή των χιτινών που διακρίνονται στους τύπους α, β ή γ. Για να διαπιστώσουμε εάν υπάρχουν διαφορές στη χιτίνη προνύμφης του εντόμου, διερευνήσαμε την επίπτωση των χιτινών διαφορετικής προέλευσης, προερχόμενες από οργανισμούς που μπορεί να αποτελούν φυσική τροφή ιχθύων, πάνω στη δράση του ενζύμου. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, στην περίπτωση της τσιπούρας παρατηρήθηκε σημαντική μείωση 44% στην τιμή της δραστικότητας του ενζύμου σε παρουσία χιτίνης κελύφους σουπιάς και εξώδερμα προνύμφης εντόμου όταν υπήρξε υποκατάσταση 50% του ιχθυάλευρου από εντομοάλευρο. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή παρουσία χιτίνης γαρίδας και ενήλικου ατόμου εντόμου στις τρείς συνθήκες διατροφής που μελετήθηκαν. Σε αντίστοιχα πειράματα πεπτικού σωλήνα πέστροφας, παρατηρήθηκε πολύ σημαντική αναστολή του ενζύμου, παρουσία χιτίνης σουπιάς, που έφτασε στην πλήρη αναστολή του ενζύμου μετά τη χορήγηση τροφής με υποκατάσταση 60% ιχθυάλευρου από εντομάλευρο. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης, δεν φαίνεται να ευθύνεται η παρουσία της χιτίνης στο εντομοάλευρο για την παρατηρούμενη καθυστέρηση στην ανάπτυξη των εκτρεφόμενων ειδών.
description: Nowadays aquaculture is facing problems, mainly due to the increased cost of fishmeal. The need to find alternative sources of protein becomes demanding. The use of insect meal is new alternative solution which includes high quality protein. Studies show that most insects have high quality and quantity of protein competing those of fishmeal and soya meal. Some experiments have shown problems in growth rate of farmed fish due to the substitution of fishmeal by insect meal. In the present study we determined as best pH for the digestive tube pH 5.4 with potassium phosphate buffer solution 0.2Μ. The incubation time to determine the activity of the enzyme was limited to 60 min from 120. According to our results the measured enzyme activity is due to the tissue of the digestive tube and not to any parasites of digestive tube micro flora. Substitution of fishmeal by insect meal (by 50%), caused induction on the enzyme activity in the digestive tube of gilthead seabream while no any difference was observed in the same tissue of trout after substitution of fishmeal by insect meal (by 60%). Not statistically significant changes were found in Km of the enzyme on the tissues of the fish that were studied after partial substitution of fishmeal by insect meal (0% substitution 0.34 ± 0.09 mg/ml, 25% substitution 0.45 ± 0.08 mg/ml and 50% substitution 0.27 ± 0.02 mg/ml). However Vmax was increased in a statistical significant manner (Ρ&lt;0,01) after 50% substitution of fishmeal by insect meal (1,1 ± 0.08 Units/mg/hr, 1,4 ± 0.09 Units/mg/hr, 3,1 ± 0.3 Units/mg/hr for substitution 0%, 25% and 50%). In the case of the rainbow trout both kinetic parameters (Km and Vmax), remained unchanged (0.25 ± 0.003 mg/ml and 0.30 ± 0.004 mg/ml for 0% and 60% for Km and 1,55 ± 0.2 and 1,47± 0.2 Units/mg/hr for 0% and 60% substitution for Vmax). It is known that there are differences in the structure of chitin that are discriminated in three types α, β, γ. In order to check if there are important structural differences between chitin from larva of Tenebrio molitor, and other organisms that may constitute natural food of fish, we studied the effects of different origin chitin (cuttlebone, shrimps and larval or adult insects). According to our results in the case of the digestive tube gilthead seabream was noted an important decrease on the enzyme activity at the level of 44%, with chitin of cuttlebone and larva T. molitor, only when 50% of fishmeal was substituted with insect meal. Not any important changes were noticed when chitin from shrimps or adult insects was studied. In the case of the trout digestive tube, we found a very important inhibition of the enzyme’s activity due to chitin of cuttlefish that reached almost 100% when feeding with substitution fishmeal by 60% insect meal. According to the results of this study, the presence of chitin in insect meal doesn't seem to be responsible for the noted delay in the growth of the farmed species.