Il complesso orexinergico nell'apparato genitale maschile di alcuni mammiferi. Aspetti morfo-funzionali e patologici
Creators: name: Liguori, Giovanna
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2015

description: Le orexine A (OxA) e B (OxB) sono due peptidi ipotalamici scoperti nel 1998 da due gruppi di ricerca diretti da Sakurai T. e de Lecea L. nel 1998 che lavorarono indipendemente l'uno dall'altro. Tali peptidi derivano dal taglio proteolitico della molecola precursore nota come prepro-orexina. Le orexine esplicano la loro azione biologica attraverso il legame con due recettori definiti recettore 1 e 2 per le orexine (OX1R ed OX2R) e sono localizzate nel sistema nervoso centrale ed in organi periferici quali le ghiandole surrenali, i reni, e vari segmenti degli apparati digerente e genitale. Le orexine influenzano numerose funzioni organiche tra le quali l'assunzione degli alimenti, il comportamento sessuale, il ritmo circadiano, le funzioni cardiache e le relazioni neuroendocrine. Scopo del presente lavoro è di indagare la presenza della prepro-orexina, dell'OxA, dell'OxB, dell'OX1R e dell'OX2R in alcuni organi dell'apparato genitale maschile di diverse specie animali e dell'uomo in condizioni fisiologiche e patologiche utilizzando metodiche di immunoistochimica (IHC), western blotting (WB), reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) e colture in vitro di sezioni tissutali e linee cellulari. 
Gli organi presi in considerazione per la ricerca sono stati il testicolo del ratto e dell'alpaca, l'epididimo dell'alpaca e la prostata umana normale, iperplastica e neoplastica. Frammenti tissutali sono stati fissati in liquido di Bouin per 24-48 ore, inclusi in Paraplast e tagliati microtomicamente in sezioni di vario spessore le quali sono state colorate con la metodica dell'IHC all'avidina-biotina. Un'altra quota di frammenti tissutali è stata crioconservata a -80°C e quindi sottoposta alle tecniche del WB e dell'RT-PCR. Sezioni di tessuto spesse 1-2 mm sono state prelevate dal testicolo del ratto e dell'alpaca e sottoposte ad analisi in vitro per la valutazione dell'effetto delle orexine sulla steroidogenesi tissutale. Infine linee cellulari prostatiche normali e patologiche sono state coltivate in vitro per studiare alcuni aspetti metabolici in esse indotte dalla presenza di orexine. 
L'OxA, l'OxB ed i relativi recettori 1 e 2 risultano presenti in diversi citotipi testicolari nel ratto e nell'alpaca. Nel testicolo del ratto immunoreattività all'OxB è stata descritta negli spermatociti nello stadio di pachitene, e negli spermatidi durante le diverse fasi evolutive del loro sviluppo, da cellule rotonde ad allungate. In particolare, i citotipi positivi all'OxB sono stati evidenziati durante la seconda parte del ciclo evolutivo dell'epitelio germinale cioè dal VII al XIV stadio. Inoltre, immunoreattività all'OX1R è stata descritta negli spermatociti in zigotene e pachitene e negli spermatidi rotondi. Sempre nel testicolo di ratto l'OX2R è presente negli spermatociti in pachitene e di seconda generazione e negli spermatidi nelle varie fasi evolutive. A differenza di quanto rilevato per l'OxB, i citotipi immunopositivi all'OX2R sono stati rinvenuti lungo l'intero ciclo evolutivo dell'epitelio germinale. L'analisi dell'RT-PCR ha evidenziato l'espressione degli mRNA codificanti per i recettori OX1R ed OX2R e la presenza dei due recettori è stata garantita dalla tecnica del WB. Gli esperimenti condotti per testare la capacità steroidogenica delle orexine rivelano che l'OxA stimola effettivamente la secrezione di testosterone e la sua azione si esplica probabilmente antagonizzando quella del Müllerian Inhibiting substance, (MIS), un noto agente steroidolitico secreto dalle cellule del Sertoli. Al contrario l'OxB non sembra avere effetto sulla steroidogenesi ma rivela azione de-fosforilante sulla coppia di enzimi ERK1/2. 
Per quanto concerne il testicolo dell'alpaca, immunoreattività all'OxA è stata riscontrata nelle cellule del Leydig e del Sertoli e negli spermatogoni, spermatociti in fase di preleptotene e spermatidi nelle varie fasi maturative. L'OxB è stato riscontrato negli spermatogoni, spermatociti in fase di preleptotene, zigotene e pachitene e spermatidi rotondi ed allungati. Immunoreattività all'OX1R ed all'OX2R è stata evidenziata nelle cellule del Leydig e negli spermatidi. L'espressione della prepro-orexina, dell'OX1R e dell'OX2R è stata confermata mediante la tecnica del WB. Come nel ratto nell'alpaca espleta un effetto steroidogenico probabilemente antagonizzando quello steroidolitico del MIS. 
Nell'epididimo dell'alpaca, immunoreattività all'OxA ed all'OX1R è stata riscontrata nel citoplasma delle cellule principali della testa dell'organo. La tecnica del WB ha consentito di confermare i dati immunoistochimici in quanto ha evidenziato l'espressione dei peptidi prepro-orexina ed OX1R negli omogenati tissutali. È ipotizzato che l'OxA contenuta nelle cellule principali possa regolare gli scambi ionici intercorrenti tra tali cellule ed il lume dell'organo notoriamente indispensabili per l'idratazione di quest'ultimo e quindi per la vita degli spermatozoi.
Nella prostata umana normale, iperplastica e neoplastica, l'OxA e l'OX1R sono stati rinvenuti nel citoplasma delle cellule epiteliali follicolari esocrine. L'espressione degli mRNA codificanti per la prepro-orexina e l'OX1R nonché la presenza delle relative proteine negli estratti tissutali sono state dimostrate mediante le tecniche dell'RT-PCR e del WB, rispettivamente. Allo scopo di conseguire nuove conoscenze relative al ruolo funzionale dell'OxA nella prostata, la linea cellulare PNT1A, esprimente OX1R, è stata trattata con differenti concentrazioni di OxA allo scopo di valutare la proliferazione cellulare e le eventuali variazioni di cAMP e di Ca++ intracitoplasmatico. La proliferazione della linea cellulare non risulta variata ma sono stati registrati incrementi di cAMP e del rilascio di Ca++ intracitoplasmatico. Gli stessi esperimenti condotti sulla linea cellulare carcinomatosa LNCaP, esprimente anch'essa OX1R, hanno evidenziato diminuzione della proliferazione cellulare ed aumento del cAMP e del Ca++ citoplasmatico. Degno di nota è il risultato che l'OxA induce significativa riduzione dell'uptake intranucleare dei recettori del testosterone. I risultati ottenuti nel corso del lavoro di tesi apportano un contributo alla conoscenza della presenza del complesso orexinergico nell'apparato genitale maschile. In particolare i risultati ottenuti studiando gli effetti dell'OxA in cellule neoplastiche sembrano costituire una base di partenza per l'impiego del peptide nella terapia del cancro prostatico.