Επιγενετική ανάλυση της κυτταρικής σειράς ορθοκολικού καρκίνου RKO και μελέτη των επιγενετικών τροποποιήσεων μετά από αναστολή της B-RAF μετάλλαξης
Creators: name: Τσομίδης, Ιωάννης Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: αναστολή BRAF γονιδίου
πιγενετική
μεθυλίωση
πρότυπο μεθυλίωσης
ορθοκολικός καρκίνος
αναστολέας BRAF
BRAF inhibition
epigenetic
methylation
methylation phenotype
colorectal cancer
BRAF inhibitor

description: Ο ορθοκολικός καρκίνος κατατάσσεται στις συχνότερες αιτίες θανάτου από καρκίνο στις αναπτυγμένες χώρες και η αντιμετώπισή του αποτελεί πρόκληση καθώς παρουσιάζει σημαντική μοριακή ετερογένεια λόγω γενετικών μεταλλάξεων αλλά και επιγενετικών φαινομένων όπως είναι η υπερμεθυλίωση του γονιδιώματος. Η μεθυλίωση των υποκινητών γονιδίων εμφανίζει μοτίβα, που χαρακτηρίζουν την μοριακή παθογένεια και την πρόγνωση του καρκίνου, και η αναστροφή της μεθυλίωσης συνιστά πιθανό θεραπευτικό στόχο του καρκίνου. Η συνύπαρξη της B-RAF V600E μετάλλαξης με υπερμεθυλίωση υποκινητών συγκεκριμένων γονιδίων και χρωμοσωμική αστάθεια συνιστά το οδοντωτό μονοπάτι καρκινογένεσης στον ορθοκολικό καρκίνο με δυσμενή πρόγνωση. Σκοπός της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η αναστολή της BRAF V600E μεταλλαγμένης πρωτεΐνης με τον αναστολέα κινασών νταμπραφενίμπη ώστε να ελέγξουμε εάν η αναστολή της BRAF V600E μετάλλαξης μπορεί να αναστρέψει τον φαινότυπο μεθυλίωσης, ο οποίος καθορίζεται από τα γονίδια CACNA1G, NEUROG1, RUNX3, IGF2 και SOCS1. Καρκινικά κύτταρα της σειράς RKO καλλιεργήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικές συνθήκες: α) θεραπεία με DMSO, 1 μΜ και 10 μΜ νταμπραφενίμπης για τρεις ημέρες, β) θεραπεία με DMSO, 1 μΜ και 10 μΜ νταμπραφενίμπης για επτά ημέρες, χωρίς αλλαγή θρεπτικού υλικού, γ) θεραπεία με DMSO, 1 μΜ και 10 μΜ νταμπραφενίμπης, με ανακαλλιέργεια την τρίτη ημέρα, για επτά ημέρες, δ) θεραπεία με DMSO, 1 μΜ και 10 μΜ νταμπραφενίμπης για επτά ημέρες. Κύτταρα από κάθε συνθήκη καταμετρήθηκαν και απομονώθηκε DNA για τροποποίηση και χαρακτηρισμό του φαινοτύπου μεθυλίωσης. Διαπιστώθηκε περίπου 50% αναστολή του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τη χορήγηση νταμπραφενίμπης συγκριτικά με το DMSO, χωρίς να παρατηρηθεί διαφορά μεταξύ των δύο συγκεντρώσεων νταμπραφενίμπης. Επίσης, σε καμία συνθήκη δεν παρατηρήθηκε αναστροφή του φαινοτύπου μεθυλίωσης. Επομένως, ο αναστολέας νταμπραφενίμπη της B-RAF δεν αναστρέφει τον φαινότυπο μεθυλίωσης στην κυτταρική σειρά RKO
description: Colorectal cancer is considered as one of the most common death causes among cancer types in the developed countries. Treatment of colorectal cancer is a challenge due to its molecular heterogeneity originating from genetic mutations and epigenetic events such as hypermethylation of human genome. Methylation in the promoter of genes shows patterns, which define the molecular pathogenesis and prognosis of cancer. Reversal of DNA methylation constitutes a potential therapeutic target of cancer. Coexistence of B-RAF V600E mutation with hypermethylation in the promoter of specific genes and chromosomal instability characterize the serrated pathway of carcinogenesis in colorectal cancer and has been associated with poor prognosis. The purpose of this experiment was the inhibition of BRAF V600E mutant protein using the B-RAF inhibitor dabrafenib in order to investigate if the inhibition of BRAF V600E mutation is able to reverse the methylation phenotype, defined by following genes: CACNA1G, NEUROG1, RUNX3, IGF2 and SOCS1. Cancer cells from RKO cell line were cultured under four different conditions: a) treatment with DMSO, 1 μΜ and 10 μΜ dabrafenib for three days, b) treatment with DMSO, 1 μΜ and 10 μΜ dabrafenib for seven days, without refreshing culture medium, c) treatment with DMSO, 1 μΜ and 10 μΜ dabrafenib, with cell passage on the third day, for seven days, d) treatment with DMSO, 1 μΜ and 10 μΜ dabrafenib for seven days. Cells from every condition were counted and DNA was extracted for the bisulfite conversion and the characterization of the methylation phenotype. A 50% inhibition of cell growth rate by dabrafenib was noted, albeit without difference between the two concentrations. Additionally, a reversal of the methylation phenotype was not noted under any condition. Consequently, the B-RAF inhibitor dabrafenib is not able to reverse the methylation phenotype in RKO cell line.