Επίδραση της πρωτεΐνης TAF15 στην έκφραση και τη δραστικότητα της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1
Creators: name: Νίκα, Μαρία Ελένη Μιχαήλ
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: SRPK1
TAF15
SR πρωτεΐνες
SR proteins

description: Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της πρωτεΐνης TAF15 στην έκφραση και τη δραστικότητα της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1. Η συμβολή της TAF15 σε βασικές λειτουργίες του οργανισμού αποδεικνύεται από την καθολική της έκφραση σε ανθρώπινους εμβρυικούς ιστούς και ιστούς ενηλίκων. Έχει βρεθεί πως συμμετέχει σε σημαντικές διαδικασίες όπως η μεταγραφή, η επιδιόρθωση του DNA, το μάτισμα και η μεταφορά του mRNA μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Στις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στις οποίες υπόκειται η πρωτεΐνη αυτή περιλαμβάνεται και η φωσφορυλίωση. Η SRPK1 είναι μέλος μίας οικογένειας πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν τα υποστρώματά τους σε κατάλοιπα σερίνης τα οποία αποτελούν κατά κανόνα μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων σερίνης/αργινίνης. Έναυσμα για τη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των δύο μορίων αποτέλεσε το γεγονός ότι η ομόλογη της TAF15 στη ζύμη S. cerevisiae, Npl3, φωσφορυλιώνεται από την ομόλογη της SRPK1, Sky1, σε ένα κατάλοιπο σερίνης. Επιπρόσθετα, η TAF15 περιλαμβάνει διάσπαρτα διπεπτίδια σερίνης, που θα μπορούσαν να αποτελούν στόχους της SRPK1. Χρησιμοποιώντας δοκιμασία δράσης RS κινάσης, διαπιστώθηκε ότι η TAF15 δεν είναι υπόστρωμα της SRPK1 in vitro αλλά οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ισχυρά, όπως προκύπτει από δοκιμασίες συγκατακρήμνισης. Επιπλέον, παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης TAF15 in vitro προκαλείται σταδιακή μείωση της δραστικότητας της SRPK1. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση της GFP-TAF15 σε HeLa κύτταρα και RT-PCR με το ολικό RNA των κυττάρων, απ’ όπου προέκυψε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης της SRPK1, σε επίπεδο RNA. Αναφορικά με τη δραστικότητα της SRPK1 στα HeLa, η υπερέκφραση της GFP-TAF15 βρέθηκε πως οδηγεί σε μείωση των επιπέδων φωσφορυλίωσης γνωστών υποστρωμάτων τις SRPK1, όπως οι SR πρωτεΐνες και ο υποδοχέας της λαμίνης Β.
description: The aim of this master thesis is the investigation of the impact of the protein TAF15 on the expression and activity of the protein kinase SRPK1. The contribution of TAF15 in basic functions of the human organism is proved by its ubiquitous expression in fetal as well as adult tissues. This protein has been implicated in important processes such as transcription, DNA repair, splicing and mRNA transportation between the nucleus and the cytoplasm. Among the post-translational alterations that TAF15 is undergoing phosphorylation is included. SRPK1 is a member of the serine/arginine subfamily of serine/threonine kinases, that specifically phosphorylate serine residues. These residues are part of a repeated sequence of arginine/serine dipeptides. The fact that TAF15’s homolog protein in S. cerevisiae, Npl3, is phosphorylated by the SRPK1’s homolog, Sky1, in a serine residue, was the starting point for the investigation of the interaction between the two proteins. Moreover, the sequence of TAF15 includes scattered dipeptides of serine/arginine, which could be potential targets of SRPK1. Using a RS kinase activity assay, it was found that TAF15 is not a substrate of SRPK1 in vitro, but the two proteins strongly interact, a result confirmed by pull-down assays. Moreover, in presence of an increased concentration of TAF15 in vitro, the enzymatic activity of SRPK1 gradually declines. In addition, the overexpression of the fusion protein GFP-TAF15 in HeLa cells had no effect on the expression of SRPK1. Regarding the activity of SRPK1 in HeLa cells, the overexpression of GFP-TAF15 had a negative effect on the phosphorylation process of known substrates of SRPK1, such as the SR proteins and the Lamin B Receptor.