Υπερέκφραση του γονιδίου της φραταξίνης (fxn) με το σύστημα CRISPR/dcas σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου
Creators: name: Σώση, Άννα Μαρία Γρηγορίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Φραταξίνη
CRISPR
Αταξία Φρίντριχ
Frataxin
Friedreich’s Ataxia

description: Το γονίδιο της φραταξίνης (FXN) κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη με πολλαπλές ισομορφές, που εντοπίζονται κυρίως στη μιτοχονδριακή μήτρα αλλά και στο κυτταρόπλασμα. Αν και ο ακριβής ρόλος της πρωτεΐνης δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως, η κύρια λειτουργία της φαίνεται να είναι η ρύθμιση της βιοσύνθεσης συμπλόκων σιδήρου-θείου (2Fe-2S), όπου επιταχύνει την αποσουλφουρυλίωση και μεταφορά της δραστικής υδροθειομάδας της κυστεϊνης, μέσω της αποσουλφουράσης NSF1, στην Fe2+- φέρουσα, πρωτεϊνη-ικρίωμα ISCU. Η αφθονία της πρωτεΐνης στους ιστούς φαίνεται να σχετίζεται με τις ανάγκες του ιστού σε ενέργεια. Μεταλλάξεις στο γονίδιο FXN οδηγούν σε μία νευροεκφυλιστική και καρδιακή διαταραχή, την Αταξία Φρίντριχ. Τα συμπτώματα ξεκινάνε συνήθως στην εφηβεία με αστάθεια στο βάδισμα. Το 96% περίπου των ασθενών, είναι ομόζυγοι για τρινουκλεοτιδικές επαναλήψεις GAA στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου της FXN. Στο υπόλοιπο 4% των ασθενών, τα προσβεβλημένα άτομα είναι ετερόζυγα και φέρουν επαναλήψεις GAA στο ένα αλληλόμορφο και σημειακές μεταλλάξεις στο άλλο αλληλόμορφο. Στους ασθενείς παρατηρείται μείωση της έκφρασης των επιπέδων της πρωτεΐνης, η οποία μειώνεται στο 5% έως 35% των επιπέδων υγιών ατόμων. Η ασθένεια οδηγεί σε πρόωρο θάνατο και η θνησιμότητα αποδίδεται κυρίως σε καρδιακή ανεπάρκεια.Στην παρούσα διπλωματική εργασία στόχος είναι η λειτουργική ενεργοποίηση του FXN σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs), ως ένα νέο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της αταξίας Φρίντριχ. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas. Σχεδιάστηκαν 5 RNA οδηγοί (single guide RNAs, sgRNAs) που οδηγούν την ενδονουκλεάση dCas9 κοντά στον υποκινητή του γονιδίου FXN και ρυθμίζοντας την έκφραση ενδογενών γονιδίων οδηγούν σε μεταγραφική ενεργοποίηση. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι ο sgRNA2,8 και 12 οδηγούν σε υπερέκφραση του FXN. Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης, στην παρούσα εργασία οδήγησε σε διαφοροποίηση των hiPSCs καθιστώντας συνεπώς αδύνατη τη δημιουργία σταθερών FXN-activation hiPSC κυτταρικών σειρών. Τα αποτελέσματα αναμένεται να συνεισφέρουν σημαντικά στο ερευνητικό πεδίο της Αταξίας Φρίντριχ, καθώς προσεγγίσεις που θα καταφέρουν να ενισχύσουν την έκφραση της φραταξίνης θα αποτελέσουν δυνητικές νέες θεραπείες για την καταπολέμηση της ασθένειας.
description: Frataxin (FXN) gene encodes a protein located in the mitochondrial matrix. Although the exact role of the protein is not fully understood, recent studies indicate that it is primarily involved in iron-sulfur cluster biogenesis (2Fe-2S), by accelerating the NFS1-mediated transfer of sulfur from a cysteine-bound persulfide to a Fe2+-containing scaffold protein ISCU. Mutations in the FXN gene lead to Friedreich’s Ataxia, a neurodegenerative and cardiac disorder. Symptoms usually begin in adolescence with gait instability. Approximately 96% of patients are homozygous for GAA trinucleotide repeats in the first intron of the FXN gene. In the remaining 4% of patients, the affected individuals are heterozygous and have GAA repeats in one allele and point mutations in the other allele. In both patients the expression of protein levels is reduced to 5% up to 35% of the levels of healthy individuals. The disease leads to premature death and mortality is mainly attributed to heart failure.The aim of this thesis was the activation of endogenous FXN transcription in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), as a new experimental model for studying Friedrich's ataxia. For this purpose, the CRISPR/dCas genome editing system was used. Five single- guide RNAs (sgRNAs) were designed to direct endonuclease dCas9 near the promoter of the FXN gene and by regulating the expression of endogenous genes lead to transcriptional activation. The results support that sgRNA2,8 and 12 lead to overexpression of FXN. Moreover, in the preset work, overexpression of the gene led to differentiation of hiPSCs thus making it impossible to generate stable FXN-activation hiPSC cell lines. The results could significantly contribute to the research field of Friedreich's Ataxia, as approaches that succeed in enhancing the expression of frataxin will be potential new treatments to fight the disease.