title: Entwicklung einer Real-Time PCR zum Nachweis von Streptococcus agalactiae auf Basis der 16S rRNA unter Verwendung der Reverse-Transkriptase Reaktion
Creators: name: Stier, Anja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: S. agalactiae
RT-PCR
neonatale Sepsis
Medical sciences Medicine
Medizin

description: Als Ergänzung zur klassischen mikrobiologischen Diagnostik wurden in den letzten Jahrzehnten vermehrt molekularbiologische Methoden etabliert, die den Nachweis von Nukleinsäuren direkt aus dem Patientenmaterial innerhalb kurzer Zeit ermöglichen. Die DNA-basierte PCR-Analytik ist die am meisten verbreitete Methode.
Bei Proben mit geringer Erregerdichte und einem daraus resultierenden hohen Risiko für falsch-negative Ergebnisse bietet die Verwendung der zahlenmäßig weit überlegenen ribosomalen RNA als Zielmolekül einen vielversprechenden Ansatz. Abhängig vom Bakterium liegt die Anzahl der Ribosomen pro Zelle zwischen 100 und 10.000. Bisher jedoch fand dieses Konzept keine breite Anwendung. Bis heute existiert kein kommerzieller Test zur Identifizierung von Pathogenen, der auf spezies-spezifischer 16S rRNA basiert. Das steht im Widerspruch zu Erfahrungen auf dem benachbarten Gebiet der medizinischen Virologie, wo virale RNA im gleichen Maße wie DNA als Zielmolekül dient.
Diese Arbeit untersuchte das Potenzial der 16S rRNA als neuen molekularen Marker für den PCR-basierten Nachweis am Beispiel des Erregers Streptococcus agalactiae. Ein zentraler Fokus lag auf der Entwicklung und Optimierung einer 16S rRNA-basierten Reverse-Transkriptase-qPCR und der Darstellung der Sensitivitätssteigerung gegenüber der Standard-qPCR.
Ribosomale RNA-Moleküle weisen strukturelle Besonderheiten auf, wie chemische Modifikationen und komplexe Faltungen, die die Reaktionsdynamik beeinflussen können und daher berücksichtigt werden müssen.
Eine softwaregestützte Analyse auf DNA- und RNA-Ebene wurde benutzt, um den potenziellen Einfluss der räumlichen Anordnungen der 16S-Sequenz auf einzelne Schritte der RT-qPCR-Reaktion zu untersuchen. Mithilfe von In-silico-Simulationen wurde eine Auswahl an Primern für das Screening getroffen und vorläufige Reaktionsparameter für die RT-qPCR ermittelt.
Die Etablierung einer robusten Real-Time-PCR (qPCR) war ein essenzieller Zwischenschritt in dieser Arbeit. Diese Standard-qPCR sollte im späteren Verlauf als Referenzmethode dienen und einen direkten Vergleich mit der Reverse-Transkriptase-qPCR ermöglichen. Darüber hinaus sollte sie als Werkzeug zur Quantifizierung von Einflussfaktoren und zur Optimierung der Variablen in der reversen Transkription fungieren. Anschließend erfolgte die Etablierung und Charakterisierung der reversen Transkription.
Durch experimentelle Primer-Selektion in Kombination mit der Auswahl an Enzymen und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnte eine Real-Time PCR etabliert werden, die zum Nachweis der bakteriellen genomischen DNA sowie der von rRNA abgeleiteten cDNA diente und eine Sensitivität von bis zu 50 Genomäquivalenten erreichte. Die der qPCR vorgeschaltete reverse Transkription führte zu einer Steigerung der Gesamtmenge an DNA-Matrizen um Faktor 100 bis 1000 und bestätigte die Ergebnisse einer japanischen Arbeitsgruppe, die eine ähnliche Erhöhung der diagnostischen Sensitivität bei Einsatz von rRNA anstelle von DNA am Beispiel von S. aureus und P. aeruginosa gezeigt hatten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die angestrebte Steigerung der Sensitivität im RT-qPCR-Verfahren im Vergleich zur herkömmlichen qPCR-Methode entscheidend von der Menge der cDNA-Moleküle und somit von der Effizienz der reversen Transkription abhängt. Diese Arbeit unterstützt weiterhin die Hypothese, dass 16S rRNA als Target für diagnostische Anwendungen dienen kann. Der potenzielle Nutzen liegt darin, dass die vorgeschaltete reverse Transkription die Nachweisgrenze der qPCR erweitern und die Häufigkeit falsch-negativer Ergebnisse, insbesondere bei Proben mit geringen Mengen an genomischer DNA, reduzieren kann.
Weitere Studien sind notwendig, um die Methode für den klinischen Alltag weiter zu optimieren und zu evaluieren.