Σολβοθερμική σύνθεση ZnO νανοσωματιδίων παρουσία αλειφατικών αμινών, χαρακτηρισμός, και in vitro μελέτη της δράσης τους στην αμυλοείδωση της ινσουλίνης
Creators: name: Καραγεώργου, Μαρία-Ελένη Απόστολου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Νανοσωματίδια οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO NPs)
Πρωτεϊνική αμυλοείδωση
Ινσουλίνη
Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs)
Protein amyloidosis
Insulin

description: Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε η σύνθεση νανοσωματιδίων οξειδίου του ψευδαργύρου (ZnO NPs) με διαφορετικά χαρακτηριστικά ως προς τη μορφολογία, το μέγεθος, το σχήμα, και τις επιφανειακές ιδιότητες. Οι συνθέσεις πραγματοποιήθηκαν μέσω της σολβοθερμικής μεθόδου σε αυτόκλειστο σύστημα, υπό την επίδραση των αλειφατικών αμινών οκταδεκυλαμίνης (ODA) και ολεϋλαμίνης (OAm) και με τη χρήση του ακετυλακετονικού συμπλόκου του ψευδαργύρου, Zn(acac)2∙xH2O, ως πρόδρομη ένωση. Συνολικά παρασκευάστηκαν 8 νανοκρυσταλλικά συστήματα ZnO NPs, δομής βουρτσίτη, και ακολούθησε ο πλήρης φυσικοχημικός χαρακτηρισμός τους με μεθόδους όπως, η περίθλαση ακτίνων-Χ (XRD), η ηλεκτρονική μικροσκοπία διερχόμενης δέσμης (ΤΕΜ, HRTEM), η περίθλαση ηλεκτρονίων (SAED), η φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR), η θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA) και η φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατής ακτινοβολίας (UV-Vis). Οι αλειφατικές αμίνες εξετάστηκαν για τη δράση τους, α) σε τριπλό ρόλο (διαλύτης, αναγωγικό μέσο, επικαλυπτικός παράγοντας), δίνοντας επαρκώς επικαλυμμένα εξαγωνικά ZnO@ODA (~135 nm) και σφαιρικά ZnO@OAm (48 nm) NPs, β) παρουσία μη πολικού διαλύτη (διφαινυλαιθέρα, DPE), οδηγώντας σε λιγότερο επικαλυμμένα ZnO@ODA και ZnO@OAm (33-35 nm, μέγεθος XRD) και γ) παρουσία πολικού διαλύτη-πολυόλης (προπυλενογλυκόλη, PG), από όπου προέκυψαν μικρότερα, τραπεζοειδούς σχήματος, ZnO@OAm NPs (32 nm), με σημαντικά χαμηλότερο ποσοστό επικάλυψης. Τέλος, από σολβοθερμική σύνθεση απουσία αμίνης, όπου η πολυόλη PG έδρασε σε τριπλό ρόλο, απομονώθηκαν «γυμνά» ZnO NPs με ατελές εξαγωνικό σχήμα και μέγεθος 44 nm. Σε συνέχεια του συνθετικού μέρους, τρία δείγματα ZnO νανοσωματιδίων (ZnO, ZnO@OAm και ZnO@ODA NPs) εξετάστηκαν περαιτέρω in vitro, τόσο για την ανασταλτική τους δράση στην πρωτεϊνική αμυλοείδωση της ινσουλίνης, η οποία χρησιμοποιείται ως πρωτεΐνη-μοντέλο (ThT assay), όσο και για την αντιοξειδωτική τους δράση (DPPH assay). Τα ZnO νανοσωματίδια προκάλεσαν αναστολή της πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης της ινσουλίνης κατά την συν-επώαση, ενώ επίσης παρουσίασαν ήπια αντιοξειδωτική ικανότητα (IC50 = 200-250 μg/mL). Τα ZnO, ZnO@OAm και ZnO@ODA NPs υπέστησαν επακόλουθα διαφορετική χημική επιφανειακή τροποποίηση με βιοδραστικές ουσίες και φάρμακα, με σκοπό τη δημιουργία «έξυπνων» νανοσυστημάτων, υποψήφιων, τόσο για τη θεραπεία όσο και τη διάγνωση ασθενειών που σχετίζονται άμεσα με την πρωτεϊνική αμυλοείδωση. Πιο συγκεκριμένα, τα ZnO@ODA και ZnO@OAm NPs τροποποιήθηκαν με ενώσεις-παράγωγα του αδαμαντανίου (αδαμαντάν-καρβοξυλικό οξύ, ADA, και μεμαντίνη, Mem) που βρίσκουν φαρμακευτική εφαρμογή για νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ενώ τα «γυμνά» ZnO NPs λειτουργικοποιήθηκαν με τη φυσική ανθρακινόνη, αλιζαρίνη. Η παρουσία της αδαμάντυλ-ομάδας στο νανοσύστημα ZnO@ODA@ADA, το οποίο προέκυψε μέσω ομοιοπολικής σύζευξης (EDC-NHS assay), οδήγησε σε διαφορετικό κινητικό προφίλ στην πρωτεϊνική συσσωμάτωση της ινσουλίνης, προκαλώντας περαιτέρω αύξηση της λανθάνουσας φάσης (από 22 σε 51 h). Από την άλλη, το νανογαλάκτωμα ZnO NPs@SDS@Mem-Flu, το οποίο προέκυψε από τον εγκλεισμό των ZnO@OAm NPs και του τροποποιημένου με φλουορεσκεΐνη φαρμάκου μεμαντίνης (Mem-Flu) σε SDS, εμφάνισε ελεγχόμενη απελευθέρωση του φαρμάκου (85.9% σε 24h). Τέλος, η αλιζαρίνη ενίσχυσε την αντι-αμυλοειδογόνο και την αντιοξειδωτική δράση των ZnO NPs, ενώ ταυτόχρονα προσέδωσε σε αυτά χαρακτηριστικά απεικονιστικού παράγοντα. Τα ZnO@Alzn NPs εμφάνισαν δοσοεξαρτώμενη αναστολή της πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης της ινσουλίνης, μειωμένες τιμές IC50 (166.71 μg/mL έναντι 221.45 μg/mL) και ικανότητα χρώσης των αμυλοειδών πλακών με κόκκινο-μωβ χρώμα.
description: In the present thesis, the synthesis of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) with different characteristics in terms of morphology, size, shape, and surface properties was performed. The synthetic procedures were conducted by solvothermal method in autoclaves, under the influence of the aliphatic amines octadecylamine (ODA) and oleylamine (OAm), using acetyl-acetonate complex of zinc, Zn(acac)2∙xH2O, as a precursor. In total, 8 nanocrystalline systems of ZnO NPs with a wurtzite structure were isolated and subsequently fully physico-chemically characterized, by methods such as X-ray powder Diffraction (XRD), Transmission Electron Microscopy (TEM, HRTEM), Selected Area Electron Diffraction (SAED), Infrared spectroscopy (FT-IR), Thermogravimetric Analysis (TGA) and Ultraviolet-Visible spectroscopy (UV-Vis). The aliphatic amines were tested for their effect, a) in triple role (solvent, reducing agent, coating), resulting in sufficiently coated hexagonal ZnO@ODA (~135 nm) and spherical ZnO@OAm (48 nm) NPs, b) in the presence of a non-polar solvent (diphenyl ether, DPE), giving less coated ZnO@ODA and ZnO@OAm NPs (33-35 nm, size by XRD), and c) in the presence of a polar solvent - polyol (propylene glycol, PG), leading to smaller, trapezoidal-shaped ZnO@OAm NPs (32 nm) with significantly lower coating rates. Lastly, from a synthesis in the sole presence of propylene glycol in triple role and in the absence of amines were isolated truncated and “naked” ZnO NPs of 44 nm size. Afterwards, three samples of ZnO nanoparticles (ZnO, ZnO@OAm and ZnO@ODA NPs) were further tested in vitro, both for their inhibitory effect on protein amyloidosis of insulin, which is used as a model-protein (ThT assay), as well as for their antioxidant activity (DPPH assay). ZnO nanoparticles seemed to inhibit insulin’s aggregation during the co-incubation, while they all also showed mild antioxidant activity (IC50 = 200-250 μg/mL). ZnO, ZnO@OAm and ZnO@ODA NPs, were subsequently underwent different chemical surface modification with bioactive molecules and drugs, in order to prepare "smart" nanosystems, which may act as theranostic candidates for protein amyloidosis-related diseases. More specifically, ZnO@ODA and ZnO@OAm NPs were modified with adamantane derivatives (adamantane-carboxylic acid, ADA and memantine, Mem) that find pharmaceutical applications for neurodegenerative diseases, while the “naked” ZnO NPs were functionalized with the natural anthraquinone alizarin. The presence of adamantyl- group in the ZnO@ODA@ADA nanosystem, which resulted from direct covalent coupling (EDC-NHS assay), led to a different kinetic profile in insulin protein aggregation, causing further prolongation of nucleation phase (from 22 to 51 h). Additionally, ZnO NPs@SDS@Mem-Flu nanoemulsion, which resulted from the inclusion of ZnO@OAm NPs and fluorescein-modified memantine (Mem-Flu) drug in SDS, showed controlled drug release profile (85.9% in 24h). Last but not least, alizarin enhanced the anti-amyloidogenic and antioxidant activity of ZnO NPs, and at the same time provided to them characteristics of an imaging agent. ZnO@Alzn NPs exhibited dose-dependent inhibition of insulin aggregation, reduced IC50 values (166.71 μg/mL vs. 221.45 μg/mL) and red-purple staining of amyloid plaques.