title: Chemische, molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mykotoxinen aus Ascomyceten
title: Chemical, molecular biological and biochemical Investigations on biosynthetic enzymes of mycotoxins from Ascomycetes
Creators: name: Wollinsky, Beate
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Biowissenschaften, Biologie
Magnetische Kernresonanz
Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie
Heterologe Genexpression
Kultivierung
Schlauchpilze
ascomycetes
Naturstoffforschung
HPLC

description: To understand the biological
      diversity of natural products produced by different
      microorganism, it is very important to elucidate the
      biosynthesis of these products. In most cases, the
      biosynthetic genes are located as a cluster on the genome and
      can be identified by bioinformatic approaches. Based on the
      structure feature of natural products, it is possible to find
      the biosynthetic gene cluster in the genome sequence. After
      successful identification of a cluster in the genome
      sequence, it is possible to modify the original biosynthesis
      by chemoenzymatic synthesis or by genetic manipulations. For
      that purpose, FtmPT1 in the biosynthesis of verruculogen was
      overproduced in E. coli M15 cells and purified with
      Ni-NTA-Agarose. In addition, the four stereoisomers of
      cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala were synthesised by chemical
      synthesis. These and further six cyclic dipeptides were
      subsequently incubated with the overproduced
      prenyltransferase FtmPT1, resulting in the formation of
      regularly C2-prenylated derivatives. These chemoenzymatically
      produced diketopierazines were tested in cooperation with
      Prof. Kassack from Düsseldorf for their biological activities
      with their non-prenylated precursors as controls. The results
      showed that the cytotoxic effects of the prenylated
      diketopierazines were significant higher than those of the
      non-prenylated precursors. This seems that the prenyl moiety,
      rather than the prolin moiety is essential for the biological
      activity. In addition, all tested stereoisomers of
      cyclo-Trp-Pro and cyclo-Trp-Ala showed comparable cytotoxic
      activities towards the tested cell lines. So the
      stereochemistry at C-11 and C-14 and the corresponding
      substituents have no significant influence on the
      cytotoxicity. During the isolation of the C2-prenylated
      diketopiperazines, detailed analysis of the incubation
      mixtures of FtmPT1 revealed the presence of additional
      product peaks in the HPLC chromatograms. Seven regularly
      C3-prenylated hexahydropyrrolo[2,3-β] indoles and two
      regularly N1-prenylated diketopiperazines were isolated and
      identified by HR-ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC
      and NOESY experiments. L-tryptophan-containing cyclic
      dipeptides were converted to C3β-prenylated diketopiperazines
      and D-tryptophan containing cyclic dipeptides to
      C3α-prenylated diketopiperazines, so that in both cases a
      syn-cis configuration was generated. Based on the given
      crystal structure of FtmPT1, a putative reaction mechanism
      was proposed. The independent product formation was confirmed
      by time dependency assays and elucidation of KM-values. In
      addition to the chemoenzymatic production of tryprostatin B
      analoga the natural compound fumigaclavin A was isolated from
      Penicillium commune NRRL2033. The structure and
      stereochemistry of (8R,9S)-fumigaclavin A was confirmed by
      ESI-MS and NMR analysis including HMBC, HSQC and NOESY
      experiments. Isolation of fumitremorgin A from N. fischeri
      NRRL181 provided the evidence for its role as end product of
      the biosynthesis of fumitremorgins in this fungus.
      Furthermore nine natural products could be isolated from N.
      fischeri NRRL181 and identified via HR-ESI-MS and NMR
      analysis. First of all, the known products aszonalenin,
      acetylaszonalenin and the precursors of fumitremorgin A:
      12,13-dihydroxyfumitremrogin C, fumitremorgin B and
      verruculogen. Four additional substances of the
      fumitremorgin-type with unknown biosynthetic pathways could
      be isolated from N. fischeri NRRL181. Via HR-ES-MS and NMR
      analysis, these compounds could be identified as verruculogen
      TR-2, spirotryprostatin A, 6-methoxyspirotryprostain B and
      compound 15. Spirotryprostatin A and
      6-methoxyspirotryprostain B were first isolated from N.
      fischeri NRRL181 in this study and compound 15 has not been
      reported previously. The prenyltransferase gene ftmPT3 is not
      located in the known verruculogen-cluster at chromosome 8,
      but at a different chromosome. It was therefore speculated
      that the genes around ftmPT3 could be responsible for the
      biosynthesis of verruculogen TR-2, spirotryprostatin A,
      6-methoxyspirotryprostain B or compound 15. Three genes were
      therefore amplified by PCR from gDNA or cDNA and were cloned
      into expression vectors (pQE60, pQE70, pHis8, pYES2/NT C).
      After heterologous gene expression in E. coli or S.
      cerevisiae and purification of the recombinant proteins,
      enzyme assays with different substrates and cofactors were
      carried out; unfortunately, no additional product peak could
      be detected in the HPLC chromatograms of the enzyme assays.
      Transformation of the prenyltransferase gene brePT into A.
      nidulans TN02A7 containing the NRPS gene ftmPS, was used as a
      strategy for in vivo production of deoxybrevianamid E.
      Unfortunately, no expected product could be detected with
      HPLC.
description: Zum besseren Verständnis der
      biologischen Diversität von Naturstoffen aus verschiedenen
      Mikroorganismen ist es wichtig, deren Biosynthese
      aufzuklären. Durch bioinformatische Analysen weiß man, dass
      in den meisten Fällen die Biosynthesegene aus Mikroorganismen
      in einem Cluster im Genom liegen. Aufgrund der Strukturen der
      Naturstoffe ist es demnach möglich, deren Biosynthesegene
      aufzudecken und zu identifizieren. Nach gelungener
      Identifikation der Cluster ist es nun möglich die Biosynthese
      gezielt zu modifizieren und somit neue Substanzen mit vorher
      festgelegter Struktur mittels chemoenzymatischer Synthese mit
      rekombinanten Enzymen oder aber auch durch genetische
      Manipulation in Modelorgansimen zu erhalten. Im Zuge dieser
      Arbeit wurde hierfür zunächst das rekombinante Protein FtmPT1
      aus der bekannten Biosynthese von Verruculogen in E.
      coli-M15-Zelle überproduziert und mittels Ni-NTA-Agarose
      aufgereinigt. Zusätzlich wurden die vier Stereoisomere von
      cyclo Trp-Pro und cyclo Trp Ala synthetisiert, um sie später
      zusammen mit sechs weiteren zyklischen Dipeptiden mittels
      chemoenzymatischer Synthese mit FtmPT1 und DMAPP an Position
      C-2 zu prenylieren. In Kooperation mit Prof. Kassack aus
      Düsseldorf wurden die 14 chemoenzymatisch hergestellten
      Tryprostatin B-Analoga auf ihre Zytotoxizität gegenüber
      verschiedenen Zelllinien untersucht. Dabei ließ sich
      feststellen, dass die prenylierten Substanzen, bis auf ein
      paar Ausnahmen, eine ähnliche zytotoxische Aktivität
      gegenüber einer Zelllinie aufwiesen, wobei alle prenylierten
      Diketopiperazine eine deutlich höhere zytotoxische Aktivität
      als ihre unprenylierten Substrate aufwiesen. Dies deutet
      darauf hin, dass die Prenyl-Einheit essentiell für die
      biologische Aktivität ist, die Prolin-Einheit in Tryprostatin
      B dagegen nicht. Des Weiteren wiesen in den von Prof. Kassack
      durchgeführten Assays alle vier getesteten Stereoisomere von
      cyclo-Trp-Pro und cyclo-Trp-Ala ähnliche IC50-Werte gegenüber
      den getesteten Zelllinien auf. Dies spricht nun dafür, dass
      die Stereochemie an C-11 und C-14 der Diketopiperazine sowie
      deren Substituenten ebenfalls keinen großen Einfluss auf die
      Zytotoxizität nehmen. Im Zuge der Isolierung der
      C2-prenylierten Diketopiperazine wurden in den
      HPLC-Chromatogrammen zusätzliche Produktpeaks entdeckt,
      welche ebenfalls mittels semipräperativer HPLC isoliert
      wurden. Die Strukturen wurden anschließend mittels ESI-MS-
      und NMR-Spektroskopie als reguläre C3- und reguläre
      N1-prenylierte Produkte identifiziert, wobei L
      tryptophanhaltige zyklische Dipeptide mit FtmPT1 zu
      C3β-prenylierten Diketopiperazinen umgesetzt wurden und
      D-tryptophanhaltige zyklische Dipeptide zu C3α-prenylierten
      Diketopiperazinen, so dass in beiden Fällen eine syn-cis
      Konfiguration vorlag. Basierend auf der bekannten FtmPT1
      Struktur wurden daraufhin Reaktionsmechanismen postuliert und
      mittels Zeitabhängigkeitsassays sowie durch Bestimmung von
      KM-Werten eine voneinander unabhängige Produktbildung
      bestätigt. Neben der chemoenzymatischen Produktion der
      Tryprostatin B-Analoga wurde, ebenfalls mittels
      semipräperativer HPLC, Fumigaclavin A aus P. commune NRRL2033
      isoliert. Durch Aufklärung der Stereochemie mittels
      NOESY-Spektroskopie als (8R,9S)-Fumigaclavin A konnte
      Pyroclavin, ebenfalls mit 8R-Konfiguration, als Vorstufe der
      Biosynthese von Fumigaclavin A identifiziert werden. Durch
      die Isolierung von Fumitremorgin A aus N. fischeri NRRL181
      konnte der letzte Schritt in der Biosynthese von
      Fumitremorgin A in N. fischeri NRRL181 identifiziert werden.
      Zusätzlich zu Fumitremorgin A konnten neun weitere
      Naturstoffe aus N. fischeri NRRL181 isoliert und deren
      Struktur mittels ESI-MS-und NMR-Spektroskopie aufgeklärt
      werden. Hierbei handelt es sich unter anderem um Aszonalenin
      und Acetylaszonalenin, welche von einem bekannten Cluster aus
      N. fischeri NRRL181 synthetisiert werden. Die Vorstufen 12,13
      Dihydroxyfumitremogin C, Fumitremorgin B und Verruculogen in
      der Biosynthese von Fumitremorgin A wurden ebenfalls
      isoliert. Neben diesen sechs Indolalkaloiden mit bekannter
      Biosynthese wurden vier weitere Alkaloide des
      Fumitremorgin-Typs aus N. fischeri NRRL181 isoliert, deren
      Biosynthese zu Beginn dieser Arbeit noch nicht aufgeklärt
      werden konnte. Hierbei handelt es sich um Verruculogen TR-2,
      Spirotryprostatin A, 6 Methoxyspirotryprostain B und Substanz
      15, wobei Spirotryprostatin A und 6 Methoxyspirotryprostain B
      zum ersten Mal aus N. fischeri NRRL181 isoliert werden
      konnten und es sich bei Substanz 15 um einen neuen Naturstoff
      handelt. Da die Prenyltransferase FtmPT3, anders als
      erwartet, nicht im Biosynthesecluster von Verruculogen
      identifiziert wurde, sondern auf einem anderen Chromosom,
      wurde vermutet, dass die benachbarten Gene von FtmPT3 für die
      Biosynthese der im Rahmen dieser Arbeit isolierten
      Verbindungen aus N. fischeri NRRL181 verantwortlich sein
      könnten. Deswegen wurden drei Gene ausgesucht, welche mittels
      PCR aus gDNA bzw. cDNA amplifiziert und anschließend in
      verschiedene Expressionsvektoren (pQE60, pQE70, pHis8,
      pYES2/NT C) kloniert wurden. Durch heterologe Genexpression
      in E. coli- bzw. S. cerevisiae-Zellen und Aufreinigung der
      überproduzierten Proteine konnten verschiedene Enzymassays
      mit unterschiedlichen Cofaktoren und Substraten durchgeführt
      werden. Jedoch konnte in keinem der getesteten Assays ein
      Produktpeak mittels analytischer HPLC detektiert werden.
      Zusätzlich sollte durch Transformation des
      Prenyltransferasegenes brePT in den Modelorganismus A.
      nidulans CaW03, in welchen bereits die NRPS FtmPS ektopisch
      integriert wurde, eine in vivo Produktion von
      Deoxybrevianamid E mittels HPLC detektiert werden. Dieser
      letzte Schritt der biologischen in vivo Synthese von
      Deoxybrevianamid E konnte jedoch nicht erfolgreich
      durchgeführt werden.