title: Synthesis, Identification, Kinetic, and Structural Characterization of Inhibitors of the Aspartic Proteases HTLV-1 Protease and Endothiapepsin
title: Synthese, Identifizierung, kinetische und strukturelle Charakterisierung von Inhibitoren der Aspartylproteasen HTLV-1-Protease und Endothiapepsin
Creators: name: Kuhnert, Maren Sophia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: drug design
Indinavir
Inhibitor
aspartic proteases
Proteinkristallographie
X-ray crystallography
Medical sciences, Medicine
Aspartylproteasen
enzyme inhibitor
Proteasen
Enzym
HTLV-1-Proteaseinhibitor
Wirkstoffdesign

description: Diese Arbeit umfasst die
      Identifizierung und Synthese sowie enzymkinetische und
      strukturelle Charakterisierung von nicht-peptidischen
      Kleinmolekülen als Inhibitoren der beiden Aspartylproteasen
      HTLV-1-Protease und Endothiapepsin. Die HTLV-1-Protease
      stellt ein vielversprechendes Zielenzym für die Behandlung
      von viralen Infektionen mit dem Humanen T-Zell-Leukämie-Virus
      (HTLV) dar und ist eng verwandt mit der bekannteren
      HIV-1-Protease. Trotz struktureller Ähnlichkeit beider
      Proteasen unterscheiden sich diese jedoch deutlich
      voneinander hinsichtlich ihrer Substrat- und
      Inhibitorspezifität. Jedoch stellen auf Grund der
      Ähnlichkeiten im aktiven Zentrum einige der bereits bekannten
      HIV-1-Protease-Inhibitoren einen geeigneten und
      vielversprechenden Startpunkt für die Identifizierung und
      Optimierung von neuartigen Kleinmolekülen zur Inhibition der
      HTLV-1-Protease dar, über deren Bindungsmodus vor Aufnahme
      dieser Arbeiten allerdings noch nichts bekannt war. Nach
      erfolgreicher in-house-Etablierung der Expression, der
      Proteinreinigung, eines Affinitätsassays sowie geeigneter
      Kristallisationsbedingungen für die HTLV-1-Protease wurde
      zunächst der bekannte HIV-1-Protease-Inhibitor Indinavir, der
      gegenüber der HTLV-1-PR eine Affinität im einstellig
      mikromolaren Bereich aufweist, näher untersucht. Die
      Affinität (Ki: 3,5 µM) gegenüber der HTLV-1-Protease ist im
      Vergleich zur HIV-1-Protease (540 pM) zwar deutlich geringer,
      jedoch weisen andere hoch-affine HIV-1 PR-Inhibitoren
      (Saquinavir, Ritonavir, Nelfinavir und Amprenavir) keine
      nennenswerte Affinität gegenüber der HTLV-1-Protease auf (Ki
      &gt; 20 µM). Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit der
      Kristallstruktur von Indinavir im Komplex mit der
      HTLV-1-Protease die nach unserem Wissen erste
      HTLV-1-Protease-Kristallstruktur mit einem nicht-peptidischen
      Inhibitor beschrieben werden. Die so erhaltenen strukturellen
      Informationen tragen maßgeblich zum Verständnis der moderaten
      Affinität von Indinavir gegenüber der HTLV-1-Protease bei und
      legten darüber hinaus den Grundstein für weitere
      strukturbasierte Optimierungsansätze. In einem zweiten Ansatz
      zur Leitstrukturidentifizierung wurde das Konzept der
      „privilegierten Strukturen“ zur Identifizierung neuartiger
      niedermolekularer Grundgerüste für die HTLV-1 PR-Inhibition
      verfolgt. Durch Screening der Arbeitskreis-internen
      Substanzbibliothek verschiedener Aspartylproteaseinhibitoren
      konnten C2-symmetrische
      3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierte Pyrrolidine sowie
      bizyklische Pyrrolidine als vielversprechende Kandidaten zur
      Inhibition der HTLV-1-Protease identifiziert werden. Beide
      Inhibitorklassen wurden ursprünglich als
      HIV-1-Protease-Inhibitoren entwickelt und im Rahmen dieser
      Arbeit bezüglich ihrer enzymkinetischen und strukturellen
      Eigenschaften gegenüber der HTLV-1-Protease genauer
      untersucht. Aus einer Serie mit zehn C2-symmetrischen
      3,4-bis-N-alkylsulfonamid-substituierten Pyrrolidinen stellt
      die Verbindung AB84 mit einer Affinität von 15 nM nicht nur
      den affinsten Vertreter dieser Serie, sondern, nach bestem
      Wissen, auch den bislang affinsten nicht-peptidischen
      HTLV-1-Protease-Inhibitor dar. Die erfolgreiche Bestimmung
      der Kristallstrukturen von AB84 sowie einem weiteren
      Vertreter dieser Inhibitorklasse, ermöglichte ebenfalls die
      strukturbasierte Interpretation der
      Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR). Die bizyklischen
      Pyrrolidin-basierten Inhibitoren weisen Affinitäten im drei-
      bis einstellig micromolaren Bereich auf, wobei eine mit zwei
      Benzhydrylgruppen substituierte Verbindung den bisher
      aktivsten Vertreter dieser Inhibitorserie (Ki: 1,4 µM)
      darstellt. Eine Kristallstruktur dieser Verbindungsklasse
      wurde mit NK101 erfolgreich bestimmt. Basierend auf den
      erhaltenen, grundlegenden Erkenntnissen über den
      Bindungsmodus sowie der abgeleiteten SAR bieten beide
      Grundgerüste vielversprechende Optionen für die weitere
      strukturbasierte Leitstrukturoptimierung. Der zweite Teil
      dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Aspartylprotease
      Endothiapepsin, einem bekannten Modellenzym für
      Aspartylproteasen. Verschiedene Verbindungen mit einem
      2-Amino-Thiophen Grundgerüst wurden basierend auf der
      Gewald-Reaktion synthetisiert. Überraschenderweise wurden
      innerhalb einer Serie von acht strukturell sehr ähnlichen
      Liganden vier verschiedene Bindungsmodi gefunden, was im
      Nachhinein erklärt, warum die auf den Affinitätsdaten und der
      Kristallstruktur der Leitstruktur basierte SAR nicht
      schlüssig interpretiert werden konnte. Darüber hinaus konnte
      gezeigt werden, dass Unstimmigkeiten bei der Korrelation von
      klassischen Affinitäts- mit TSA-Daten einen Hinweis auf eine
      geänderte Bindungsgeometrie liefern können. Die hier
      präsentierte Fallstudie unterstreicht eindrucksvoll die
      Komplexität des Bindungsgeschehens von Liganden, dessen
      Abhängigkeit von kleinsten chemischen Veränderungen am
      Substitutionsmuster einer Leitstruktur und die Notwendigkeit
      der kontinuierlichen Überwachung der Bindungsmodi während
      einer Leitstrukturoptimierung.
description: This thesis focuses on the
      identification and synthesis as well as kinetic and
      structural characterization of non-peptidic small molecule
      inhibitors of the two aspartic proteases HTLV-1 protease
      (HTLV-1 PR) and endothiapepsin. The HTLV-1 PR, a promising
      target for the treatment of viral infections caused by the
      human T-cell leukemia virus type-1, is related to the
      well-known HIV-1 PR, however, it exhibits a substantially
      different substrate specificity and inhibition profile than
      the latter. However, due to the similarity in the active
      site, HIV-1 PR inhibitors provide a promising starting point
      for the identification and further optimization of novel
      small molecule inhibitors against HTLV-1 PR. First, after
      successful establishment of an in-house HTLV-1 protease
      technology platform, the well-known HIV-1 PR inhibitor
      indinavir, which displays a Ki-value in the one-digit
      micromolar range (3.5 µM) against the HTLV-1 PR, was chosen
      as auspicious starting point although in comparison to the
      HIV-1 PR (540 pM) its affinity is strongly reduced. However,
      other highly potent HIV-1 protease inhibitors (saquinavir,
      ritonavir, nelfinavir, and amprenavir) do not show any
      relevant affinity against HTLV-1 protease (Ki &gt; 20 μM).
      Within this thesis the X-ray structure of indinavir in
      complex with the HTLV-1 PR was determined at 2.40 Å
      resolution, representing, to the best of our knowledge, the
      first HTLV-1 PR crystal structure with a non-peptidic
      inhibitor. This structural information laid the foundation
      for rationalizing the rather moderate affinity of indinavir
      against the HTLV-1 PR and thus provided the basis for further
      structure-guided optimization strategies. As a second
      approach for lead identification, the privileged structure
      concept was exploited as tool to identify novel small
      molecule scaffolds for HTLV-1 PR inhibition. A screening of
      our in-house aspartic protease inhibitor library was
      performed and resulted in the identification of C2-symmetric
      3,4-bis-N-alkylsulfonamido-pyrrolidines and pyrrolidine-based
      bicyclic HIV-1 PR inhibitors as promising candidates for
      HTLV-1 PR inhibition. Both inhibitor classes were
      characterized in more detail regarding their kinetic as well
      as structural properties. Out of a series of ten
      3,4-bis-N-alkylsulfonamido-pyrrolidine inhibitors, AB84
      exhibits an affinity of 15 nM (Ki-value) and represents, to
      the best of our knowledge, the most potent non-peptidic
      inhibitor of HTLV-1 PR described so far. The successfully
      determined crystal structures of AB84 and another
      representative of this inhibitor series, enabled
      structure-guided SAR interpretations thus laying the
      foundation for the deduction of design ideas for further
      optimization of this inhibitor scaffold. The
      pyrrolidine-based bicyclic compounds exhibit affinities from
      the three-digit up to the one-digit micromolar range, the
      most potent inhibitor of this series (Ki-value: 1.4 µM) is
      substituted with two benzhydryl moieties. A crystal structure
      of this inhibitor series was determined with NK101. Based on
      these fundamental insights and the deduced SAR described in
      this thesis, both scaffolds represent promising starting
      points for the further inhibitor optimization utilizing
      structure-based drug design. The second part of this thesis
      deals with the aspartic protease endothiapepsin that serves
      as a model system for aspartic proteases in general. Various
      2-aminothiophene compounds were synthesized as inhibitors of
      endothiapepsin utilizing the Gewald reaction. Surprisingly,
      the binding mode analysis of eight similar 2-aminothiophene
      inhibitors resulted in four completely different binding
      modes, hence, explaining retrospectively, why the initial
      deduction of the SAR based on the obtained affinity data had
      failed. Moreover, we could demonstrate that discrepancies
      between affinity data based on enzyme kinetics and TSA
      results within one inhibitor series may be exploited as a
      hint for putative changes in the adopted binding geometry.
      The presented example highlights the complexity of binding
      events, their strong dependence on seemingly minor effects of
      the scaffold decoration and the necessity to continuously
      monitor binding modes during the hit-to-lead optimization
      process.