Υπερέκφραση του γονιδίου KLF5 με την τεχνολογία CRISPRa σε ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα
Creators: name: Σιώκατας, Γεώργιος Ευαγγέλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα
KLF5
Σύστημα CRISPRa
Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)
CRISPRa system

description: Οι καρδιαγγειακές παθήσεις, σε όλες τους τις μορφές, ευθύνονται για τον μεγαλύτερο αριθμό θανάτων παγκοσμίως ενώ οι στρατηγικές αντιμετώπισής τους περιορίζονται σε φαρμακευτικές αγωγές και χειρουργικές επεμβάσεις. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε, σε βάθος, τις μοριακές διεργασίες που προκαλούν καρδιακές παθήσεις για να αναπτύξουμε αποτελεσματικότερες στρατηγικές για τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών και τη μείωση της συχνότητας εμφάνισής τους. Επιπλέον, η δημιουργία νέων μοντέλων για την έρευνα των μηχανισμών αυτών κρίνεται εξίσου απαραίτητη. Ο KLF5 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που παίζουν ρόλο στον μεταβολισμό των λιπαρών οξέων. Έχει συσχετιστεί με διάφορες καρδιακές παθήσεις όπως η καρδιακή ανεπάρκεια, η ισχαιμική καρδιομυοπάθεια, και η διαβητική καρδιομυοπάθεια. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι ο KLF5 ρυθμίζει τη μεταγραφή του πυρηνικού υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων (Pparα), της οξειδάσης 4 του NADPH (Nox4) καθώς και των βασικών υπομονάδων, 1 και 2, της μακροαλυσίδας της παλμιτοϊλοτρανσφεράσης σερίνης (Serine Palmitoyltransferase long chain base subunit 1,2 (Sptlc)1 και Sptlc2).Τα ανθρώπινα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (hiPSC) είναι κύτταρα τα οποία προέρχονται από τον επαναπρογραμματισμό ενήλικων σωματικών κυττάρων και διαθέτουν όλες τις ιδιότητες των πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων όπως η αυτοανανέωση, ο πολλαπλασιασμός αλλά και η δυνατότητα διαφοροποίησης σε οποιονδήποτε τύπο σωματικού κυττάρου. Η δυνατότητα διαφοροποίησης τους σε καρδιομυοκύτταρα μας προσφέρει ένα νέο κυτταρικό μοντέλο διερεύνησης των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε καρδιακές παθήσεις. Επιπλέον, η τεχνολογία CRISPR/Cas9 μας επιτρέπει να εισάγουμε στοχευμένα γενετικές αλλαγές σε μοναδικές κυτταρικές σειρές hiPSC για την περαιτέρω μελέτη των μηχανισμών αυτών. Στην παρούσα διπλωματική χρησιμοποιήθηκε το σύστημα CRISPRa για τη δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών hiPSC που υπερεκφράζουν τον KLF5. Αρχικά, έγινε μελέτη της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα KLF5 κατά τα διάφορα στάδια της διαφοροποίησης των hiPSCs σε καδιομυοκύτταρα από την οποία φάνηκε ότι ο KLF5 ενεργοποιείται κατά την διαφοροποίηση με την έκφραση του να κορυφώνεται στις ημέρες 10 ( 4.2 φορές, p&gt; 0.05 ) και 14 (21.71 φορές, p &lt; 0.0001 ) οπότε τα κύτταρα αρχίζουν να πάλλονται. Στη συνέχεια, σχεδιάστηκαν 3 RNA οδηγοί (gRNA) που στοχεύουν τον υποκινητή του γονιδίου Klf5 και εκφράστηκαν μέσω λεντοϊών σε κύτταρα hiPSC που εκφράζουν την πρωτεΐνη DCAS-VP64, πριν και μετά την τελική διαφοροποίηση τους σε καρδιομυοκύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι, πριν τη διαφοροποίηση των hiPSCs, η έκφραση του mRNA του KLF5 ενισχύθηκε κατά 4.2 φορές (p &lt;0.0001) και 7.1 φορές (p = 0.0009) από τα gRNA 1 και gRNA 4, αντίστοιχα. Ενώ, μετά τη διαφοροποίηση η ενίσχυση του KLF5 από τα gRNA 1 και gRNA 4 περιορίστηκε στις 2.9- (p = 0.0301) και 2.8-φορές (p = 0.0361), αντίστοιχα. Τα παραπάνω προκαταρκτικά δεδομένα της διπλωματικής εργασίας μου υποστηρίζουν την επαγωγή της έκφρασης του KLF5 κατά την ανάπτυξη του μυοκαρδίου στον άνθρωπο, ενώ η χρήση του συστήματος CRISPRa για τη δημιουργία σταθερών σειρών hiPSC και με υπερέκφραση του KLF5, πριν και μετά τη διαφοροποίηση τους σε καρδιομυοκύτταρα, αναμένεται να αποτελέσει νέο πειραματικό εργαλείο για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του KLF5, στον άνθρωπο.
description: The overwhelming majority of deaths globally are caused by cardiovascular diseases, and their treatment is currently limited to pharmacological treatments and surgical interventions. To better develop methods for enhancing patients’ quality of life and preventing cardiac disorders, it is crucial to get a greater understanding of the molecular mechanisms causing cardiac diseases. Additionally, the development of new experimental models to research these mechanisms is also crucial. KLF5 is an important transcription factor that regulates the expression of genes related to fatty acid metabolism. KLF5 has been linked to several cardiac diseases, including ischemic cardiomyopathy, diabetic cardiomyopathy, and heart failure. Additionally, KLF5 has been found to interact and activate peroxisome proliferator-activated receptor alpha (Pparα), NADPH oxidase 4 (Nox4), as well as the Sptlc1 and Sptlc2 genes. Human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are cells that are reprogrammed from adult somatic cells and exhibit all the characteristics of embryonic stem cells, including self-renewal, proliferation, and the ability to differentiate into any somatic cell type. Their ability to differentiate into cardiomyocytes provides a novel model for investigating the molecular pathways involved in heart disorders. The CRISPR/Cas9 technique also makes it possible to create distinct hiPS cell lines with precise genetic modifications for further studying these mechanisms. In the present master’s thesis, we used the CRISPRa system to create stable hiPS cell lines that overexpress KLF5. Initially, the expression of the transcription factor KLF5 was examined at different stages of hiPSC differentiation into cardiomyocytes. This revealed that KLF5 was activated during differentiation with peak expression observed day 10 (4.2 fold change, p&gt; 0.05) and day 14 (21.71 fold change, p &lt; 0.0001), coinciding with the appearance of beating cells. Subsequently, 3 gRNAs targeting the promoter of the Klf5 gene were constructed and introduced into plasmids to generate lentiviruses that were then utilized to transduce hiPSCs that were stably expressing DCAS. We observed a 4.2-fold increase (p &lt;0.0001) in the expression of KLF5 mRNA with the gRNA 1, and a 7.1-fold increase (p = 0.0009) with the gRNA 4. Additionally, we differentiated hiPSCs expressing DCAS into cardiomyocytes and infected them with the gRNA lentiviruses. We observed a 2.9-fold increase (p = 0.0301) in KLF5 mRNA expression with the gRNA 1 and a 2.8-fold increase (p = 0.0361) with the gRNA 4. The data collected during this master’s thesis are all preliminary. The hiPS cell line overexpressing KLF5 exhibits significant potential for further investigation of the molecular pathways underlying KLF5-related cardiac dysfunction.