Erkennung von Regulationssequenzen für die Transkription in heterologen Systemen
Creators: name: Jacob, Daniela
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Year: 2003
Subjects: subject: Promotor
subject: Genexpression
subject: Transkription
subject: Gentechnologie
subject: promoter
subject: gene expression
subject: transcription
subject: gene technology
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie
subject: 32 Biologie
subject: WG 1800
subject: WG 1900

description: Während der Evolution entwickelten sich Promotorelemente von Prokaryonten, Eukaryonten und Plastiden in Sequenz und Struktur unterschiedlich. Ein Transfer von Promotorsequenzen zwischen Prokaryonten, Eukaryonten und Plastiden sollte daher zu keiner effizienten Genexpression führen. Mit dieser Arbeit sollte die Spezifität von Promotoren analysiert und ihre Funktionalität über `kingdom´-Grenzen hinaus untersucht werden. Hierfür wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren, welche in der Gentechnik zur Herstellung von transgenen Pflanzen eingesetzt werden, auf Genexpression in fünf Bakterienarten untersucht. Weiterhin wurden drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren auf Genexpression in Nicotiana tabacum untersucht. Die Frequenz, mit der die pflanzenspezifischen Promotoren (P) in den untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führten, lag bei 50 % der getesteten Kombinationen. Für den P ST-LS1 aus Solanum tuberosum wurde eine Expression in den fünf untersuchten Bakterienarten nachgewiesen. Zwei der getesteten pflanzenspezifischen Promotoren, P RolC aus Agrobacterium rhizogenes und P 247 aus N. tabacum zeigten keine Expression in den untersuchten Bakterienarten. Die Charakterisierung der mRNA-Transkripte ausgewählter Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit den Reportergenen zeigten eindeutig, dass für die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNA-Polymerase Sequenzelemente der pflanzenspezifischen Promotoren genutzt wurden. Mit einer ortsspezifischen Mutagenese des P ST-LS1 konnte die von der bakteriellen RNA-Polymerase genutzte -10-Region in Escherichia coli und Acinetobacter sp. ermittelt werden. Die `down-Mutanten´ führten in E. coli und Acinetobacter sp. zu einer Reduktion der Expression, wohingegen sie nach stabiler Integration in das Pflanzengenom von N. tabacum eine unverminderte Expression in bezug auf den Wildtyp-Promotor zeigten. Die Untersuchung der bakteriellen und Plastiden Promotoren ergab nur in einem einzigen Fall von neun getesteten Promotoren eine sehr geringe transiente Expression.
description: During evolution the promoter elements from prokaryotes, eukaryotes and plastids have developed differently with regard to their sequence and structure, implying that in general a transfer of promoter sequences between prokaryotes, eukaryotes and plastids will not cause an efficient gene expression. The aim of this study was to investigate the specificity of promoter sequences and their functionality in different kingdoms. Therefore 12 different plant-specific promoters, all used for the construction of genetically modified plants, were tested for their capability to direct a gene expression in various bacteria. Furthermore three bacterial and six plastid promoters were tested with respect to their ability to direct a gene expression in Nicotiana tabacum. The frequency of plant-specific promoters (P) directing gene expression in bacteria was 50 % of the combinations analysed. The promoter P ST-LS1 of Solanum tuberosum was functional in all bacteria tested. Two of the plant-specific promoters, P RolC of Agrobacterium rhizogenes and P 247 of N. tabacum, caused no gene expression in the bacteria tested. The characterisation of mRNA-transcripts of fusions between the plant-specific promoter sequences and the reporter genes proved that sequence elements of the plant-specific promoters themselves were used for transcription initiation by the bacterial RNA polymerase. By site-directed mutagenesis of the P ST-LS1 the -10 region used by the bacterial RNA polymerase of E. coli and Acinetobacter sp. was identified. The generated `down-mutants´ of the P ST-LS1 promoter showed a reduction of expression in E. coli and Acinetobacter sp. while these mutants were still fully active after stable integration in the genome of N. tabacum compared to the wildtype promoter. The investigation of the bacterial and the plastid promoters showed a very low transient expression of one out of nine promoters tested.