title: Control of epithelial Na+ channels by CFTR, receptors and kinases
Creators: name: Bachhuber, Tanja
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Natriumkanal , Chloridkanal , Purinozeptor , Mukoviszidose , Regulation , Proteinkinase CK2 , ENaC , CFTR , Protein-Kinase CK2 , Regulation von ENaC , ENaC , CFTR , protein kinase CK2 , regulation of ENaC
subject: 610 Medizin

description: The epithelial Na+ channel (ENaC) is located in the apical membrane of salt (re-) absorbing epithelia in kidney, colon, airways and glandular excretory ducts. In this thesis it is demonstrated that both stimulation of purinergic receptors and activation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and other Cl- channels lead to inhibition of epithelial Na+ channels, resulting in reduced Na+ absorption. Activation of purinergic receptors is the starting point for a signalling cascade, leading to inhibition of ENaC via hydrolysis of the phospholipid PIP2. The Na+ channel is also inhibited by stimulation of CFTR- or other Cl- channels, which change the intracellular Cl- concentration upon activation in co-expression experiments. A correlation was found between the degree of ENaC inhibition and the increase in intracellular Cl- concentration. While binding of ENaC to PIP2 keeps the channel in an active state, interference of ENaC with intracelluar Cl- seems inhibitory on ENaC function. To carry out CFTR studies under conditions like in native tissue, two new cell lines were created from MDCK type II cells, which stably express wt-CFTR or its mutant counterpart F508del-CFTR. The cell lines grow as tight monolayers and are therefore suitable for Ussing chamber experiments. CK2 is a constitutively active protein kinase that influences the activity of the channel through its binding and phosphorylation of both beta- and gamma subunits of ENaC. Lack of these phosphorylation sites or dephosphorylation of one of these sites results in a significant attenuation of the activity of the epithelial Na+ channel. It suggests that phosphorylation of both beta- and gammaENaC by CK2 prevents binding of the ubiquitin ligase Nedd4-2 to ENaC. Lack of binding of Nedd4-2 to ENaC may result in both reduced endocytosis and accumulation of ENaC in the cell membrane as well as increase in ENaC activity.
description: Der epitheliale Na+-Kanal (ENaC) wird in der apikalen Membran von Kochsalz-(re-) absorbierenden Epithelien in Niere, Kolon, Luftwegen und exkretorischen Drüsen exprimiert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass sowohl die Stimulation purinerger Rezeptoren als auch die Aktivierung des cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) und anderer Cl--Kanäle die Hemmung epithelialer Na+-Kanäle bewirkt. Dies führt zu einer Verminderung der Na+-Absorption. Die Aktivierung purinerger Rezeptoren markiert den Anfangspunkt einer Signalkaskade, die über Hydrolyse des Phospholipids PIP2 zur Inhibition von ENaC führt. In Coexpressionsexperimenten hat die Stimulation von CFTR-Cl--Kanälen oder anderer Cl--Kanäle, die nach ihrer Aktivierung die intrazelluläre Cl--Konzentration verändern, ebenfalls die Hemmung des epithelialen Na+-Kanals zur Folge. Es ließ sich ein Zusammenhang herstellen zwischen dem Ausmaß der ENaC-Hemmung und dem Anstieg der intrazellulären Cl--Konzentration. Während die Bindung von ENaC an PIP2 den Kanal in einem aktiven Zustand hält, scheint sich das Interferieren von ENaC mit intrazellulärem Cl- hemmend auf seine Funktion auszuwirken. Um CFTR-Studien unter Bedingungen durchführen zu können, die denen im nativen Gewebe entsprechen, wurden aus MDCK Typ II-Zellen zwei neue Zelllinien geschaffen, die wt-CFTR oder dessen mutiertes Gegenstück F508del-CFTR stabil exprimieren. Die Zelllinien wachsen als dichte Ein-Zell-Schichten und eignen sich daher für Ussing Kammer-Experimente. CK2 ist eine konstitutiv aktive Protein-Kinase, die Einfluss auf die Aktivität des Kanals nimmt, indem sie an die beta- und gamma Untereinheit von ENaC bindet und diese phosphoryliert. Das Fehlen dieser Phosphorylierungsstellen oder die Dephosphorylierung einer dieser Stellen führt zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität des epithelialen Na+-Kanals. Es deutet darauf hin, dass die Phosphorylierung von beta- und gammaENaC durch CK2 die Bindung der Ubiquitin-Ligase Nedd4-2 an ENaC verhindert. Die fehlende Bindung von Nedd4-2 an ENaC dürfte sowohl zu einer verringerten Endozytose und zur Anhäufung von ENaC in der Zellmembran als auch zu einer Zunahme der Aktivität von ENaC führen.