Αποσιώπηση της έκφρασης του γονίδιου της φραταξίνης (fxn) με το σύστημα CRISPR/CAS9 σε επαγώμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου
Creators: name: Παπακυπριανού, Μαργαρίτα Άννα Θωμά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Αταξία Φριντριχ
Αποσιώπηση έκφρασής της Φραταξίνης
Σύστημα συσταδοποιημένων, βραχείων, παλινδρομικών επαναλήψεων που διατάσσονται σε κανονικά διαστήματα
Friedriech’s Ataxia
Knock out of Frataxin gene
Crispr/ Cas9 system

description: Το γονίδιο της φραταξίνης (FXN) κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη με πολλαπλές ισομορφές, που εντοπίζονται κυρίως στη μιτοχονδριακή μήτρα αλλά και στο κυτταρόπλασμα. Αν και ο ακριβής ρόλος της πρωτεΐνης δεν έχει προσδιοριστεί πλήρως, η κύρια λειτουργία της φαίνεται να είναι η ρύθμιση της βιοσύνθεσης συμπλόκων σιδήρου-θείου (2Fe-2S), όπου επιταχύνει τη δημιουργία δισουφλιδικού δεσμού μεταξύ των καταλυτικών υπομονάδων κυστείνης της αποσουλφουράσης της κυστεϊνης NSF1 και της πρωτεϊνης-ικρίωμα ISCU. Η αφθονία της πρωτεΐνης στους ιστούς φαίνεται να σχετίζεται με τις ανάγκες του ιστού σε ενέργεια. Μεταλλάξεις στο γονίδιο FXN οδηγούν σε μία νευροεκφυλιστική και καρδιακή διαταραχή, την Αταξία Φρίντριχ. Τα συμπτώματα ξεκινάνε συνήθως στην εφηβεία με αστάθεια στο βάδισμα. Το 96% περίπου των ασθενών, είναι ομόζυγοι για τρινουκλεοτιδικές επαναλήψεις GAA στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου της FXN. Στο υπόλοιπο 4% των ασθενών, τα προσβεβλημένα άτομα είναι ετερόζυγα και φέρουν επαναλήψεις GAA στο ένα αλληλόμορφο και σημειακές μεταλλάξεις στο άλλο αλληλόμορφο. Στους ασθενείς παρατηρείται μείωση της έκφρασης των επιπέδων της πρωτεΐνης, η οποία μειώνεται στο 5% έως 35% των επιπέδων υγιών ατόμων. Η ασθένεια οδηγεί σε πρόωρο θάνατο και η θνησιμότητα αποδίδεται κυρίως σε καρδιακή ανεπάρκεια. Στην παρούσα διπλωματική εργασία στόχος ήταν η λειτουργική απενεργοποίηση του FXN σε επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs), ως ένα νέο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της αταξίας Φρίντριχ. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα επεξεργασίας γονιδιώματος CRISPR/Cas. Σχεδιάστηκαν 3 RNA οδηγοί (single guide RNAs, sgRNAs) που οδηγούν την ενδονουκλεάση Cas9 να προκαλέσει στοχευμένες μεταλλάξεις στο γονίδιο FXN. Τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι ο sgRNA3 οδηγεί σε λειτουργική απενεργοποίηση του FXN. Επιπλέον, η λειτουργική απενεργοποίηση του FXN ανέστειλε πλήρως την in vitro ανάπτυξη των hiPSCs και οδήγησε σταδιακά σε κυτταρικό θάνατο, καθιστώντας συνεπώς αδύνατη τη δημιουργία σταθερών FXN-knockout hiPSC κυτταρικών σειρών. Συμπερασματικά, τα δεδομένα που προέκυψαν υποστηρίζουν ότι η πλήρης απενεργοποίηση του FXN πιθανώς καθιστά αδύνατη τη διατήρηση των hiPSCs σε καλλιέργεια. Τα αποτελέσματα αναμένεται να συνεισφέρουν σημαντικά στο ερευνητικό πεδίο της Αταξίας Φρίντριχ, καθώς φαρμακογονιδιωματικές προσεγγίσεις που θα καταφέρουν να αναστρέψουν τον «θανατηφόρο» φαινότυπο των FXN-knockout hiPSCs, θα αποτελέσουν δυνητικές νέες θεραπείες για την καταπολέμηση της ασθένειας. 8
description: Frataxin (FXN) gene encodes a protein located in the mitochondrial matrix. Although the exact role of the protein is not fully understood, recent studies indicate that it is primarily involved in iron-sulfur cluster biogenesis (2Fe-2S), by directly interacting with and accelerating the donation of a cysteine-bound persulfide from the cysteine desulfurase NFS1 to the scaffold protein ISCU. Mutations in the FXN gene lead to Friedriech’s Ataxia, a neurodegenerative and cardiac disorder. Symptoms usually begin in adolescence with gait instability. Approximately 96% of patients are homozygous for GAA trinucleotide repeats in the first intron of the FXN gene. In the remaining 4% of patients, the affected individuals are heterozygous and have GAA repeats in one allele and point mutations in the other allele. In both patients the expression of protein levels is reduced to 5% up to 35% of the levels of healthy individuals. The disease leads to premature death and mortality is mainly attributed to heart failure. The aim of this thesis was the functional inactivation of FXN in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), as a new experimental model for studying Friedrich's ataxia. For this purpose the CRISPR / Cas genome editing system was used. Three single- guide RNAs (sgRNAs) were designed to direct Cas9 endonuclease to introduce short frameshift targeted insertion-deletions (indels) to disrupt the FXN gene. The results suggest that sgRNA3 leads to functional inactivation of FXN. In addition, functional inactivation of FXN completely inhibited the in vitro growth of hiPSCs and led to gradual cell death, thus making it impossible to establish stable FXN-knockout hiPSC cell lines. In conclusion, our studies suggest that the complete inactivation of FXN makes it, probably, impossible to maintain hiPSCs in culture. The results are expected to contribute significantly to the research field of Friedriech’s Ataxia, as pharmacogenomic approaches that will reverse the "lethal" phenotype of FXN-knockout hiPSCs, will be potential new therapies to treat the disease.