Formulation, characterization and processing of protein-based hydrogels
Creators: name: Haas, Sandra Katrin
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2023
Subjects: protein-based hydrogels
3D printing
magnetic resonance imaging

description: In den letzten Jahren ist der Bedarf an Materialien aus erneuerbaren Ressourcen gestiegen, was zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der proteinbasierten Materialien geführt hat. Derzeit konzentriert sich die Forschung in diesem Feld dabei insbesondere auf Anwendungen im medizinischen Bereich, da Proteine und Peptide in der Regel biokompatibel und biologisch abbaubar sind und über spezifische, auf Stimuli reagierende Materialeigenschaften verfügen. Fortschritte in der Rekombinationstechnologie für Desoxyribonukleinsäure (DNA) ermöglichten die Entwicklung von Polymeren auf Peptidbasis, die auf natürlichen Vorbildern basieren. Ein Beispielmolekül, das in dieser Dissertation verwendet wird, sind elastinähnliche Proteine (ELPs), die das Tropoelastin von Säugetieren nachahmen. Obwohl sie für das Design neuer proteinbasierter Materialien mit gewünschten Eigenschaften von entscheidender Bedeutung sind, sind die Einflussparameter während der Formulierung und Lagerung, die die mechanischen Eigenschaften der gebildeten Hydrogele bestimmen, sowie die der Bildung von Proteinnetzwerken zugrunde liegende Physik nach wie vor kaum verstanden. Das Ziel dieser Arbeit ist es, das Verständnis von proteinbasierten Hydrogelen während ihrer Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung zu verbessern. Neben der Entwicklung von dityrosinvernetzten proteinbasierten Hydrogelformulierungen für Homo- und Copolymere aus natürlich vorkommenden Proteinen und eines künstlich hergestellten ELPs, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch verschiedene weitere Herausforderungen im Zusammenhang mit proteinbasierten Hydrogelen behandelt. Damit proteinbasierte Hydrogele aus rekombinant exprimierten ELP gebildet werden können, wurde zunächst deren Herstellung untersucht, indem drei Aufreinigungsprozesse für ein hydrophobes ELP-Konstrukt mit niedrigem Temperaturübergang durchgeführt und bewertet wurden. Im Formulierung- und Prozessierungsteil dieser Arbeit wurde eine neuartige Tinte für den Extrusionsdruck von unmodifiziertem Kasein entwickelt, um die prinzipielle Anwendbarkeit der additiven Fertigung zur Funktionalisierung und Verarbeitung des Hydrogelmaterials zu demonstrieren. Zur Charakterisierung der entwickelten Materialien wurden herkömmliche makroskopische Methoden wie Rheometrie, Kompression und gewichtsbasiertes Quellverhalten angewandt. Mit der Magnetresonanztomographie wurde eine zerstörungsfreie Analysestrategie mit hoher räumlicher Auflösung etabliert, um das Quellverhalten von Hydrogelen zu überwachen. Mit diesem Ansatz konnte die Flüssigkeitsaufnahme und das Quellverhalten von Hydrogelen, die in Flüssigkeiten mit komplexer Zusammensetzung hergestellt und gequollen wurden, sowie das Verhalten komplexer Hydrogelgeometrien beschrieben werden, was besonders für die Charakterisierung funktionalisierter Hydrogelmaterialien nützlich ist. Die drei Themen Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung wurden in insgesamt fünf Studien mit dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis aus unterschiedlichen Perspektiven behandelt. In einer ersten Studie wurden drei verschiedene Aufreinigungsprozesse für ein neuartiges, künstlich entwickeltes hydrophobes ELP-Konstrukt, das in Einschlusskörpern in Escherichia coli exprimiert wurde, untersucht. Neben dem Ziel einer hohen Zielausbeute und Reinheit, sowie eines wirtschaftlichen und skalierbaren Prozessdesigns wurden zusätzlich der Salzgehalt der Formulierung und der Nukleinsäuregehalt betrachtet. Die Aufreinigung des mit Hexahistidin markierten ELP-Konstrukts mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) unterhalb der Raumtemperatur in Wasser wurde durch Homogenisierung und Auflösung der Einschlusskörper begonnen, entweder gefolgt von einer Hochsalzfällung, einer Kombination aus Hochsalzfällung und einem Zyklus des inverse transition cycling (ITC) oder einer immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) in Kombination mit einer Größenausschlusschromatographie. Die Methode der Hochsalzfällung hatte die höchste Ausbeute an Zielmolekülen, aber eine geringe Reinheit (60 %) und eine höhere Nukleinsäurekontamination und höheren Salzgehalt in der Endformulierung. Die ITC-Methode erhöhte die Reinheit und die Nukleinsäureentfernung, verringerte aber auch die Gesamtausbeute um 17 bis 34 % während des Niedrigtemperaturzentrifugationsschritts in Abhängigkeit von der angewandten Zentrifugationszeit aufgrund der niedrigen LCST-Temperatur des verwendeten ELP-Konstrukts. IMAC hatte eine vergleichbare Reinheit und eine etwas geringere Ausbeute, aber auch eine höhere Nukleinsäureentfernung. Unter Berücksichtigung der skalenabhängigen Kosten und dem Ziel, Material für biomedizinische Anwendungen zu erzeugen, sollte ITC (hohe Prozessierungskosten aufgrund der temperaturabhängigen Zentrifugationsschritte) gegen IMAC (hohe Investitionskosten) abgewogen werden, während die salzinduzierte Fällung aufgrund ihrer hohen Ausbeute und Einfachheit eine Option für Massenanwendungen sein könnte. Vor der Polymerisation von proteinbasierten Hydrogelen aus diesem ELP-Konstrukt, wurde eine Studie mit einem allgemeineren Ansatz durchgeführt. Ziel der Studie war es, zu verstehen, wie die Art und die Eigenschaften des Proteins in Kombination mit den Formulierungsbedingungen die mechanischen Eigenschaften der dityrosinvernetzten Hydrogele beeinflussen. Die unmodifizierten, handelsüblichen Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Kasein wurden unter verschiedenen Bedingungen vernetzt, wobei das photoinitiierende System konstant gehalten wurde. Die resultierenden Hydrogelnetzwerke wurden in Puffersystemen mit oder ohne externe Stimuli gelagert und die Hydrogele auf ihre mechanischen Eigenschaften hin untersucht. Die Proteinfaltung und damit die dreidimensionale (3D) Anordnung und die Oberflächenverfügbarkeit der Aminosäurereste wurden durch Zugabe verschiedener Harnstoffkonzentrationen zum Formulierungspuffer variiert und der Speichermodul sowie der Verlustfaktor mit oszillierender Rheometrie gemessen. Höhere Harnstoffkonzentrationen verstärkten die strukturelle Festigkeit und Elastizität des Hydrogels, wobei die genauen zugrunde liegenden Mechanismen, die für diesen Effekt verantwortlich sind, unklar bleiben. Der Speichermodul, die Bruchdehnung und die Druckfestigkeit nahmen mit der Proteinkonzentration zu, während die Elastizität ein konzentrationsabhängiges Maximum bei 60 mg/ml BSA aufwies und die Bruchdehnung oberhalb von 80 mg/ml BSA nicht weiter anstieg. In der letzten Teilstudie wurden das rheologische Verhalten und das gewichtsbezogene Quellungsverhältnis von Hydrogelen, die entweder 100 mg/ml Casein oder BSA enthielten, in Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration und der Nettoladung des BSA-Proteins bei verschiedenen pH-Werten der Formulierung untersucht. Die sich daraus ergebenden Hydrogeleigenschaften waren vom Protein und vom Lagermedium abhängig, was die Bedeutung der Formulierungskomponenten für die Entwicklung der gewünschten mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis hervorhebt. Um die große Vielfalt der potenziell vernetzbaren Proteine zu demonstrieren, wurden diese Methoden im weiteren Verlauf auf insgesamt vier Proteine angewandt, die vom intrinsisch ungeordneten ELP-Konstrukt bis zu BSA mit einer geordneten Tertiärstruktur reichen. Diese Proteine wurden verwendet, um entweder dityrosinvernetzte Homo- oder Copolymerhydrogele herzustellen, wobei die Proteine in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt wurden. Die rheologischen Eigenschaften der resultierenden homopolymeren Hydrogelnetzwerke unterschieden sich je nach Proteincharakteristik, während die Eigenschaften durch Kompressionsversuche für alle Proteinkonstrukte vergleichbar waren. Das zweite Ziel dieser Studie war es, eine Möglichkeit zu finden, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen zu modifizieren, ohne den spezifischen Einfluss bestimmter Proteineigenschaften auf das resultierende Hydrogelnetzwerk zu bestimmen, da dies aufgrund der vielen Faktoren, die zwischen den chemisch komplexen Proteinmolekülen variieren, schwierig ist. Zu diesem Zweck wurden Copolymerhydrogele polymerisiert, indem je zwei der vier Proteine vor der Vernetzung in zwei verschiedenen Pufferbedingungen gemischt wurden, wobei die Gesamtsumme der Aminosäuren durch Verwendung gewichtsabhängiger Konzentrationen konstant gehalten wurde. Die rheologischen Eigenschaften dieser copolymeren Hydrogele waren von den gemischten Proteintypen und -konzentrationen abhängig, wobei die Druckfestigkeit und die Zähigkeit des Hydrogels bei kaseinhaltigen Mischungen im Vergleich zu den entsprechenden Homopolymeren am höchsten waren. Insgesamt konnte innerhalb der Grenzen der Studie gezeigt werden, dass es möglich ist, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis zu verändern, indem copolymere Hydrogele aus verschiedenen Proteinen mit bekannten Eigenschaften ihrer homopolymeren Hydrogele hergestellt werden. Damit steht mit dieser Methodik ein einfaches Werkzeug für das gezielte Design mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen auf Proteinbasis für spezifische Anwendungen zur Verfügung. Für die Verarbeitung biobasierter Materialien ist eine mögliche Option die additive Fertigung, eine Methode zur schichtweisen Herstellung von 3D-Objekten mit komplexen Geometrien. Die meisten Tintenformulierungen für biobasierte Materialien beruhen auf modifizierten chemischen Substanzen. Ein Vorteil der photoinduzierten Dityrosinvernetzung ist, dass dadurch unter anderem der extrusionsbasierte Druck von unmodifizierten Proteinen möglich sein kann. In einer weiteren Studie wurde eine photopolymerisierbare Tintenformulierung auf der Grundlage des natürlich vorkommenden Proteins Kasein für den Extrusionsdruck entwickelt. Diese Tinte wird durch Mischen des Proteins, des Photoinitiatorsystems, eines Puffers und eines Verdickungsmittels zur Erhöhung der Extrudierbarkeit der Tintenlösung hergestellt. Die Studie zeigte, dass die Herstellbarkeit einer solchen Tinte stark von dem verwendeten Verdickungsmittel und dem verwendeten Mischverfahren abhängt. Insgesamt wurden acht verschiedene Verdickungsmittel getestet, um das am besten geeignete zu finden, das die Viskosität der gemischten Tinte erhöht, ohne dass es zu einer irreversiblen Schaumbildung oder einer Hemmung der Polymerisation formstabiler Hydrogele kommt. Für die entwickelte Tintenformulierung erwies sich Natriumalginat als das wirksamste Verdickungsmittel und wurde für den Druck funktionalisierter Hydrogelstrukturen mit bis zu 30 Schichten verwendet. Neben der Verarbeitung zu funktionalisierten Hydrogelstrukturen ist das Verständnis und die Charakterisierung der zeitabhängigen stimulusabhängigen Verhaltens solcher Hydrogele wichtig in der Entwicklung für ihre potenziellen Anwendungen. Hydrogele können aus mehreren Komponenten bestehen, wobei Salze und Puffersubstanzen mehr als die Hälfte des Trockengewichts des Hydrogels im Ausgangszustand ausmachen können. Diese Eigenschaften können eine aussagekräftige Interpretation gängiger Analysemethoden, wie z. B. gewichtsbasierter Quellungsquotienten, erschweren. Die Magnetresonanztomographie (MRI) ist eine zerstörungsfreie Technik, die eine räumlich aufgelöste 3D-Untersuchung von weichen Materialien ermöglicht. Die zuvor entwickelte Tintenformulierung wurde als eine auxetische Struktur gedruckt, getrocknet, um vergleichbare Probenbedingungen zu schaffen, und ihr Flüssigkeitsaufnahme- und Quellverhalten in verschiedenen Flüssigkeiten mittels MRI untersucht. Es zeigte sich, dass das Verhalten des Hydrogels je nach Flüssigkeit, in die es eingetaucht war, unterschiedlich war. Diese Studie zeigte das Potenzial des Einsatzes von MRI zur Untersuchung komplexer struktureller Veränderungen von Hydrogelen, zur Überwachung der Aufnahme von Flüssigkeit in das Hydrogel und der stimulusabhängigen Hydrogelreaktion. Diese Arbeit hat durch ein tieferes Verständnis der Faktoren, die die Hydrogelformulierung unter Verwendung der durch sichtbares Licht induzierten Dityrosinvernetzung beeinflussen, den Grundstein für die gezielte Entwicklung von Hydrogelen auf Proteinbasis gelegt. Darüber hinaus wurde ein tiefes Verständnis des Produktionsprozesses eines hydrophoben elastinähnlichen Proteins gewonnen, was dazu beitragen wird, die Produktion dieser Proteinklasse effizienter und kostengünstiger zu gestalten. Die maßgeschneiderte Verarbeitung der entwickelten Materialien durch Extrusionsdruck ermöglicht die Herstellung funktionalisierter Hydrogele mit maßgeschneiderten mechanischen Eigenschaften. Um komplexe Prozesse in diesen funktionalisierten Hydrogelen zu untersuchen, kann MRI eingesetzt werden. Ihr Potenzial wurde durch die Überwachung des zeitabhängigen Flüssigkeitsaufnahme und Quellverhaltens von auxetischen Hydrogelstrukturen gezeigt.