From acetate to value-added products: L-malic acid production with Aspergillus oryzae
Creators: name: Kövilein, Aline
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2023

description: Angesichts der zunehmenden Verknappung fossiler Ressourcen und der Herausforderungen im Zusammenhang mit Treibhausgasemissionen gewinnt die Umstellung unserer hauptsächlich auf Erdöl, Kohle und Erdgas basierenden Wirtschaft auf eine Bioökonomie zunehmend an Bedeutung. Im Zuge dessen müssen herkömmliche Syntheseverfahren durch biobasierte Prozesse ersetzt werden. Die Forschung zur Herstellung verschiedenster Produkte aus erneuerbaren Rohstoffen hat sich bisher hauptsächlich auf Saccharide wie Glukose als Kohlenstoffquelle konzentriert und steht damit in Konkurrenz zur Lebens- und Futtermittelproduktion. Die Nutzung der Kohlenstoffquelle Acetat stellt dazu eine vielversprechende Alternative dar. Aus Biomasse gewonnene Substrate enthalten häufig Essigsäure, die durch Abspaltung von Acetylgruppen aus der Hemicellulose entsteht. Dazu gehören beispielsweise Lignocellulosehydrolysate und Pyrolyseprodukte, in denen Acetat ein Haupt¬bestandteil sein kann. Außerdem kann Essigsäure durch Synthesegasfermentation mittels acetogenen Bakterien gewonnen werden. Daher sind acetathaltige, aus Biomasse gewonnene Substrate eine vielversprechende Kohlenstoffquelle im Kontext der Bioökonomie. Äpfelsäure gehört zu den Chemikalien, die derzeit aus fossilen Rohstoffen synthetisiert werden. Die Dicarbonsäure wird hauptsächlich als Säuerungsmittel und Geschmacksverstärker in der Lebensmittelindustrie verwendet, kann aber auch als Bestandteil von Kosmetikartikeln, Reinigungsprodukten, Arzneimitteln oder zur Synthese von Polymeren genutzt werden. Als Zwischenprodukt des Tricarbon¬säurezyklus hat Äpfelsäure ein großes Potenzial, mikrobiell hergestellt zu werden. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Produktionsorganismen ist die fermentative Äpfelsäuresynthese im Vergleich zur chemischen Herstellung jedoch noch nicht wirtschaftlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die mikrobielle L-Äpfelsäureproduktion aus Acetat als Möglichkeit einer biobasierten Synthese der organischen Säure untersucht. Aspergillus oryzae DSM 1863 wurde dafür als Produktionsstamm gewählt, da dieser filamentöse Pilz ein potenter natürlicher Malatproduzent und ein robuster Mikroorganismus gegenüber Inhibitoren ist, die in aus Biomasse gewonnenen Substraten enthalten sein können. Zunächst wurden Experimente im Schüttelkolbenmaßstab durchgeführt, um verschiedene grund-legende Aspekte der Äpfelsäureproduktion aus Acetat zu untersuchen. Dazu gehörten die Bestimmung der optimalen Substratkonzentration im Batch-Verfahren, sowie der Einfluss der Kultivierungstemperatur und der Art der Stickstoffquelle. Es wurde festgestellt, dass die initiale Acetat¬konzentration die Morphologie und das Spektrum der von A. oryzae produzierten organischen Säuren beeinflusst. In Medien mit Substratkonzentrationen bis zu 30 g/L wurden Biomasse¬pellets gebildet, wohingegen eine filamentöse Morphologie ab 40 g/L Essigsäure beobachtet wurde. Für die Malatproduktion im Batch-Prozess erwies sich eine Substratkonzentration von 45 g/L Essig¬säure als am besten geeignet, womit eine maximale Äpfelsäurekonzentration von 8,44 ± 0,42 g/L, eine Produktionsrate von 0,044 ± 0,002 g/L/h, sowie eine Ausbeute von 0,19 ± 0,01 g/g erreicht wurden. Bei einer höheren Konzentration von 55 g/L Essigsäure war die maximale Produktionsrate verringert, was auf eine Substrathemmung hindeutet. Die Analyse der Nebenprodukte zeigte einen Einfluss der initialen Substratkonzentration auf das Säurespektrum. Niedrige Acetatkonzentrationen führten beispielsweise zu einem höheren Anteil an Oxalsäure. Im Vergleich zur Kultivierung mit Glukose erhöhte sich bei der Verwendung von 45 g/L Essigsäure der Anteil des Nebenprodukts Succinat, das etwa 35-40% der Gesamtsäurekonzentration ausmachte, während der Anteil der Äpfel¬säure etwa 55% betrug. Es wurde außerdem festgestellt, dass auch die Kultivierungstemperatur während der Malatproduktion das Spektrum der Nebenprodukte beeinflusst. Obwohl sich die Produktbildung mit steigender Temperatur beschleunigte, nahm dabei der Anteil von Malat zugunsten von Succinat ab, weshalb eine Kultivierungstemperatur von 32 °C als optimal bewertet wurde. Die Untersuchung des Einflusses verschiedener Stickstoffquellen auf das Wachstum von A. oryzae zeigte einen früheren Beginn der Konidienkeimung und einen um bis zu 3,9-fach höheren Biomassetiter bei Verwendung von komplexen Stickstoffquellen im Vergleich zu Kulturen mit Ammoniumsulfat. Während der Säureproduktionsphase beschleunigte insbesondere die Verwendung von Hefe¬extrakt die Malatsynthese. Weiterhin wurde die Äpfelsäureproduktion auch durch Supplementierung des Acetatmediums mit niedrigen Glukosekonzentrationen im Bereich von 5 15 g/L beschleunigt. Dabei wurde festgestellt, dass A. oryzae beide Kohlenstoffquellen gleichzeitig verstoff¬wechselte, was eine interessante Beobachtung für die künftige Nutzung von biomassebasierten Substraten ist. Während mit einer Acetatkonzentration von 45 g/L die höchsten Äpfelsäure- und Biomassetiter erzielt wurden, führte die Verwendung dieser Substratkonzentration zu einer hauptsächlich filamentösen Morphologie. Diese Beobachtung ist wahrscheinlich auf eine hohe Ionenkonzentration in acetatreichen Medien zurückzuführen. Eine pelletartige Morphologie wird jedoch häufig bevorzugt, da diese zu einer geringeren Viskosität des Fermentationsmediums führt, wodurch ein besserer Wärme-, Sauerstoff- und Nährstofftransport gewährleistet werden kann. Daher wurde die Möglichkeit der Immobilisierung von A. oryzae durch Einschluss in natürliche Polymere als Werkzeug zur morphologischen Kontrolle während der Äpfelsäureproduktion mit A. oryzae untersucht. Da dies in der Literatur zuvor nicht beschrieben war, wurden Versuche zum Vergleich sowohl in Medien mit Acetat als auch mit Glukose durchgeführt. Dazu wurden Konidien in verschiedenen Konzentrationen von Alginat, Agar und κ-Carrageen eingeschlossen. Eine Malatbildung wurde unter allen Bedingungen nachgewiesen, es ließen sich jedoch Unterschiede zwischen den beiden Kohlenstoffquellen hinsichtlich der Produktionsrate, des maximalen Produkttiters und der Matrixstabilität feststellen. In glukosehaltigem Medium waren alle Polymere stabil, und mit immobilisiertem A. oryzae wurden ähnliche Produktkonzentrationen erzielt wie mit natürlich gebildeten Biomassepellets. Bei Verwendung eines acetathaltigen Mediums hingegen war die Produktion in Schüttelkolbenkulturen geringer als mit freiem Myzel und die Inkubation der Polymerstrukturen in diesem Medium hatte nach längerer Zeit eine negative Wirkung auf deren Stabilität. In späteren Stadien der Fermentation tendierten die Alginatstrukturen dazu, sich aufzulösen und es wurde eine Ablösung der Biomasse von den Agar- und κ-Carrageen-Strukturen beobachtet. Trotz dieser Herausforderungen erwies sich der Polymereinschluss von A. oryzae in 2,5 L-Bioreaktorkulturen mit acetathaltigem Medium als vorteilhaft, da eine Ablagerung der Biomasse an Reaktoreinbauten verhindert wurde, was zu einer verbesserten Produktion führte. Aufgrund der festgestellten Substrathemmung mit Acetat als Kohlenstoffquelle im Batch Prozess ist die maximale Malatkonzentration auf Werte von weniger als 10 g/L begrenzt. Um diese Hemmung durch eine initial hohe Substratkonzentration zu umgehen, ist ein Fed-Batch- oder Repeated-Batch-Verfahren geeignet. Diese Möglichkeiten wurden zunächst in Schüttelkolben-kulturen mit Ammoniumsulfat oder Hefeextrakt als Stickstoffquelle untersucht. Im Repeated-Batch-Verfahren konnte die Produktionsrate über eine Kultivierungszeit von 240 Stunden, was drei Medienwechseln entsprach, erfolgreich auf einem hohen Niveau gehalten werden. Dabei wurde die höchste absolute Malatmenge verglichen mit den zwei anderen Prozessstrategien quantifiziert. Eine Prozessoptimierung ist jedoch erforderlich, um die Produktivität auch über eine höhere Anzahl von Zyklen aufrechtzuerhalten. Auch das Fed-Batch Verfahren zeigte Vorteile gegenüber dem Batch-Verfahren, da der Produktionszeitraum verlängert und höhere maximale Produkt¬konzentrationen (11,49 ± 1,84 g/L mit (NH4)2SO4 und 12,08 ± 1,25 g/L mit Hefeextrakt) erzielt wurden. Die Produktionsraten sanken jedoch im Verlauf der Kultivierung, was höchstwahrscheinlich auf ein wiederholtes Absinken des pH-Werts auf Werte zwischen 5,5 und 6,0 infolge der manuellen Zugabe von Essigsäure zurückzuführen ist. Daher wurde die Möglichkeit der Verwendung einer pH-gekoppelten Zufuhr von Essigsäure in 2,5-L-Bioreaktor-Fermentationen untersucht. Ein Vorteil von acetatbasierten Prozessen ist, dass der aufgrund des Substratverbrauchs verursachte Anstieg des pH-Werts durch die Verwendung von Essigsäure zur pH-Kontrolle bei gleichzeitiger Zugabe von zusätzlichem Kohlenstoff ausgeglichen werden kann. Mit einer pH gekoppelten Zufuhr von 10 M Essigsäure wurde nach 264 h ein maximaler Äpfelsäuretiter von 29,53 ± 1,82 g/L erreicht, was einer 5,3-fachen Steigerung gegenüber dem Batch-Prozess ohne pH Kontrolle entspricht. Außerdem wurde die Ausbeute auf 0,29 ± 0,01 g/g erhöht und die bisher höchste Gesamtproduktionsrate von 0,112 ± 0,007 g/L/h erreicht. Da die Malatproduktion gegen Ende der Fermentation trotz Kohlenstoffverfügbarkeit stoppte, wurde außerdem eine mögliche Produkt-hemmung untersucht. Versuche mit Zugabe von bis zu 50 g/L Äpfel- und Bernsteinsäure zeigten, dass A. oryzae trotz Produktkonzentrationen in diesem Bereich in der Lage ist, weiter organische Säuren zu produzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen breiten Überblick über verschiedene Aspekte der L-Äpfelsäureproduktion aus Acetat mit dem Wildtyp A. oryzae DSM 1863 bietet. Während der Nutzung von Acetat als Kohlenstoffquelle wurden einige Herausforderungen identifiziert wie beispielsweise eine vom pH-Wert beeinflusste Substrathemmung, ein Einfluss von acetathaltigen Medien auf die Morphologie, und ein höherer Anteil an Nebenprodukten verglichen mit glucosebasierten Kultivierungen. Daher wurden Strategien untersucht und entwickelt, um eine effiziente Malatproduktion trotz dieser Anforderungen zu ermöglichen, und Optionen für eine weitere Optimierung aufgezeigt. Insbesondere die Entwicklung geeigneter Prozessführungsstrategien wie die Nutzung von Essigsäure zur pH-Kontrolle und als gleichzeitige Substratzufuhr sind für eine Steigerung der Malatproduktion mit Acetat als Kohlenstoffquelle von Bedeutung.