title: Stabile kovalente Konjugate von designed Ankyrin Repeat Proteinen (DARPins) mit therapeutischen Oligonukleotiden
Creators: name: Tot, Emilia
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: RNA-Interferenz ist ein natürlicher Mechanismus des Organismus zur posttranslationalen Genexpressionsregulierung, kann aber auch therapeutisch genutzt werden. SiRNA-basierte Therapeutika sind vor allem in der Behandlung von Krebs, viralen und genetischen Erkrankungen vielversprechende Entwicklungen, die neue Gen-Angriffspunkte bieten. Einige Vertreter befinden sich bereits in klinischer Testung. Allerdings ist die Anwendungsmöglichkeit siRNA-basierter Therapie beschränkt. Es gibt einige Hürden, die es zu überwinden gilt. Dazu gehören unter anderem die kurze Halbwertszeit, Abbau durch Enzyme, hohe renale Clearence und off-target Effekte. Eines der größten Probleme ist die geringe Zellaufnahme. In dieser Diplomarbeit wurden Konjugate von Designed Ankyrin Repeat Proteinen (DARPins) mit siRNA hergestellt. DARPins sind Proteine, die spezifisch Antigene binden können und Antikörpern in vielen Faktoren überlegen sind. Das EpCAM-spezifische DARPin Ec4-C wurde verwendet. Es bindet selektiv an sein Target EpCAM, ein Membranprotein, das in einigen Krebsformen überexprimiert wird. Ein Schwerpunkt der Diplomarbeit lag bei der Herstellung dieser Konjugate. Dabei wurden die Reaktionsverläufe und Aufreinigungsschritte mittels HPLC und Gelelektrophorese kontrolliert und optimiert. Eine oligonukleotidbasierte Affinitätschromatographie wurde entwickelt um ein reines Produkt zu erhalten. Dann erfolgten die Analyse der Duplexbildung und einige Zellkulturversuche. Mittels Luciferase-Test wurden die Fähigkeit des Konjugats zum Gen-Silencing und mit der Durchflusszytometrie die Bindung des Targets EpCAM untersucht. Der Luciferase-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen der Herunterregulierung des Zielgens durch nackte siRNA oder Konjugat. Allerdings war eindeutig eine Konzentrationsabhängigkeit zu erkennen. Die Bindung des intakten Konjugats an EpCAM-exprimierende Zellen durch den fluoreszenzmarkierten Gegenstrang konnte mittels Durchflusszytometrie nicht eindeutig bewiesen werden, wobei die der DARPin-Komponente durch einen entsprechenden sekundären Antikörper festgestellt werden konnte.
description: RNA interference is a natural mechanism of an organism for posttranslational regulation of gene expression. It also can be used therapeutically. SiRNA based therapeutics could offer new opportunities for the treatment of various diseases like cancer, viral infections and genetic disorders. Some representatives are already in clinical testing. But their application is limited because of some hurdles. Short half life, degradation through enzymes, high renal clearence and off-target effects are examples for restricting factors. One of the biggest problems is poor cellular uptake. Therefore several chemical modifications, conjugates and nanoparticles are in development. Conjugates of siRNA with Designed Ankyrin Repeat Proteins (DARPins) were produced during this diploma thesis. DARPins are proteins, which can bind antigens specifically, and have important advantages over antibodies. The EpCAM-specific DARPin Ec4-C was used. EpCAM is a transmembrane protein, which is upregulated in diverse forms of cancer. The preparation of these conjugates was a point of main effort. The reactions and purification steps were controlled with HPLC and gel electrophoresis. Subsequently the processes were optimized. An oligonucleotide based affinity chromatography was developed to gain a pure product. Then analysis of duplex formation and cell culture tests followed. Gene silencing was probed with a Luciferase Reporter Assay. Binding of the target EpCAM was examined with flow cytometry. Luciferase Reporter Assay showed no significant differences between gene silencing through naked siRNA or conjugate. But it was recognized that the effect was dependent on the used concentration. The attachment to EpCAM could not be proven for the conjugate but for the protein itself by use of flow cytometry. These results indicate that conjugates of DARPins with siRNA could offer new strategies for target specific RNAi based therapy.