Χαρακτηρισμός και γονιδιακή εκφραση τεσσάρων συνθετασών των σεσκιτερπενίων από το Cistis Cretius ssp. creticus
Creators: name: Γιουψάνη, Αναστασία Τραϊανού
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: Cistus creticus ssp. creticus
Σεσκιτερπένια
Συνθετάσες τερπενίων
Ανάλυση κατά northern
Απομόνωση RNA
Γονιδιακή έκφραση
Sesquiterqenes
Terpene synthases
Northern hybridization
RNA extraction
Gene expression

description: Το αρωματικό φαρμακευτικό φυτό Cistus creticus ssp. creticus (L.) της οικογένειας Cistaceae αναπτύσσεται στην ευρύτερη περιοχή της Μεσογείου και ειδικότερα στην Κρήτη. Το φυτό αυτό έχει προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον, διότι η ρητίνη 'λάδανο' που παράγει αποτελεί πηγή λαβδανικών διτερπενίων για τα οποία έχουν αποδειχθεί αντιμικροβιακές και κυτταροτοξικές ιδιότητες. Επομένως, κρίνεται συνολικά αξιόλογη η προσπάθεια απομόνωσης και χαρακτηρισμού γονιδίων που υπεισέρχονται στη βιοσύνθεση των τερπενίων του Cistus creticus ssp. creticus (L.). Σε αυτά τα γονίδια περιλαμβάνονται και οι συνθετάσες των σεσκιτερπενίων.Από την Ομάδα Βιοτεχνολογίας Φαρμακευτικών Φυτών του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Α.Π.Θ κατασκευάστηκε μία cDNA βιβλιοθήκη από τρίχες που απομονώθηκαν από τρία διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια φύλλων του Cistus creticus ssp. creticus (L.). Αλληλούχιση και βιοπληροφορική ανάλυση 2000 τυχαίων cDNA κλώνων έδειξε ότι τέσσερις από αυτούς παρουσιάζουν υψηλή ομολογία με γονίδια που κωδικοποιούν συνθετάσες σεσκιτερπενίων από άλλα φυτά και περισσότερο με τη συνθετάση του γερμακρενίου D από το Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoeides. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία έχει ως στόχο το χαρακτηρισμό και τη γονιδιακή έκφραση των τεσσάρων πιθανών συνθετασών των σεσκιτερπενίων από το Cistus creticus ssp. creticus (L.)Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, οι τέσσερις κλώνοι πιθανών συνθετασών σεσκιτερπενίων από το Cistus creticus ssp. creticus (L.) αλληλουχήθηκαν εκ νέου με την κατά Sanger μέθοδο της αυτοματοποιημένης DNA αλληλούχισης σε κύκλους. Ο ένας από τους κλώνους (αρ. 2532, CcSTPS2) μήκους 2053 ζευγών βάσεων (bp) αποτελεί πλήρους μήκους συμπληρωματικό DNA (cDNA) αναγνωστικού πλαισίου 1656 bp που κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη 551 αμινοξέων (aa) με χαρακτηριστικά συνθετάσης σεσκιτερπενίων. Οι υπόλοιποι κλώνοι έχουν μήκος 661 bp (κλώνος αρ. 23, CcSTPS1), 856 bp (κλώνος αρ. 3037, CcSTPS4) και 1114 bp (κλώνος αρ. 2832, CcSTPS3). Στη συνέχεια, απομονώθηκε ολικό RNA από φυτά Cistus creticus ssp. creticus (L.) και πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά northern, με σκοπό τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης των τεσσάρων πιθανών συνθετασών σεσκιτερπενίων σε διάφορους φυτικούς ιστούς και σε φυτά που υπέστησαν καταπόνηση με μηχανικό τραυματισμό, καταπόνηση λόγω ξηρασίας και καταπόνηση λόγω επεξεργασίας με φυτικές ορμόνες (μεθυλιωμένο ιασμονικό οξύ, αιθυλένιο) και σαλικυλικό οξύ και συνδυασμούς αυτών. Επίσης, απομονώθηκε γενωμικό DNA από φυτά Cistus creticus ssp. creticus (L.) και πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Southern, με σκοπό την εύρεση του αριθμού των αντιγράφων των συνθετασών σεσκιτερπενίων και την αποκάλυψη πιθανής πολυγονιδιακής οικογένειας αυτών των ενζύμων στο γονιδίωμα του Cistus creticus ssp. creticus (L.)
description: The mediterranean medicinal aromatic plant Cistus creticus ssp. creticus (L) of Cistaceae family has been of particular research interest, since it secretes a characteristic resin called ladano which is a source of labdane-type diterpenes displaying antibacterial and cytotoxic activities. Trying to isolate and characterize genes encoding enzymes that participate in the biosynthesis of terpenes in Cistus creticus ssp. creticus, the Group of Biotechnology of Pharmaceutical Plants of the Laboratory of Pharmacognosy in the School of Pharmacy of Aristotelian University of Thessaloniki has constructed a cDNA library from trichromes isolated form three different developmental stages of leaves of the plant. Sequencing and bioinformatic analysis of random cDNA clones revealed that four of them present high homology with genes encoding sesquiterpene synthases from other plants and mainly with and mainly with germacrene D synthase from Populus balsamifera supsp. trichocarpa x Populus deltoeides. In the frame of this postgraduate dissertation, the four sesquiterpene synthases cDNA cones from Cistus creticus ssp. creticus were fully sequenced by the Sanger method. In addition total RNA was isolated from Cistus cretiucs ssp. creticus plants and northern analysis was conducted in order to study gene expression of the four sesquiterpene synthases in different plant tissues and in leaves from plants that had previously been subjected to stress conditions such as mechanical wounding, drought and treatment with plant hormones (methyljasmonate, ethylene) and salicylic acid and combinations of them. This is the first attempt ti cgaracteruze sesqyuterpene synthases and study their expression in the level of transcription in Cistus creticus ssp. creticus. The fact that gene expression of the four sesquiterpene synthases was found to be induced under stress conditions supports the involvement of the produced sesquiterpenes in the defense synstem of Cistus creticus ssp. creticus