Investigation of the aggregation mechanism of pathological ataxin-1 protein and potential pharmacological inhibitory approaches
Creators: name: Γκέκας, Ιωάννης Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Νωτιαίο-παρεγκεφαλιδική αταξία τύπου 1
Πολυγλουταμίνη
Συσσωματώματα
Εικονική σάρωση
Spinocerebellar ataxia type 1
Polyglutamine
Intranuclear inclusion bodies
Virtual screening

description: Οι ασθένειες πολυγλουταμίνης (polyQ diseases) αποτελούν μια ομάδα νευροεκφυλιστικών διαταραχών που προκαλούνται από επαναλήψεις τρινουκλεοτιδίων CAG στην κωδική περιοχή γονιδίων. Μία από αυτές τις ασθένειες είναι η νωτιαίο-παρεγκεφαλιδική αταξία τύπου 1. Για να διερευνήσουμε τον ρόλο των αδιάλυτων ενδοπυρηνικών εγκλείστων ΑΤΧΝ1 στην παθογένεια της νωτιαίου-παρεγκεφαλιδικής αταξίας τύπου 1, κατασκευάσαμε ένα νέο μοντέλο πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης με επαγώγιμη υπερέκφραση της μεταλλαγμένης ισομορφής του γονιδίου ATXN1(Q82) σε ανθρώπινα κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y. Στη συνέχεια, αναπτύξαμε ένα πρωτόκολλο για την απομόνωση των αδιάλυτων εγκλείστων ATXN1. Βιοφυσικές μελέτες έδειξαν ότι αυτά τα έγκλειστα περιέχουν μόρια RNA, τα οποία αναλύθηκαν μέσω αλληλούχισης νέας γενιάς. Η ανάλυση δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η δέσμευση κρίσιμων μεταγράφων RNA από τα έγκλειστα ATXN1(Q82) διαταράσσει τη λειτουργία των ριβοσωμάτων, προκαλώντας σφάλματα στη σύνθεση πρωτεϊνών και επηρεάζοντας τη συνολική σταθερότητα του πρωτεώματος. Η παθολογική δράση της ataxin-1 τροποποιείται από πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν μαζί της. Μια από αυτές, η MED15, ενισχύει την τοξικότητα και τη συσσωμάτωση της, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ ataxin-1 και MED15 επηρεάζει την εξέλιξη της νόσου. Για να αξιολογήσουμε την επίδραση της MED15 στη συσσωμάτωση της παθολογικής πρωτεΐνης ataxin-1, κατασκευάσαμε ένα κυτταρικό μοντέλο σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που χαρακτηρίζεται από σταθερή έκφραση του διαγονιδίου mCherry-MED15 και επαγώγιμη έκφραση του διαγονιδίου YFP-ATXN1(Q82). Στη συνέχεια, προβλέψαμε τις δομές των πρωτεϊνών ATXN1 και MED15 και προσομοιώσαμε την αλληλεπίδρασή τους. Χρησιμοποιώντας τη βιοδοκιμασία LuTHy, η οποία διακρίνεται για την ικανότητά της να ανιχνεύει και να ποσοτικοποιεί πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις με εξαιρετική ακρίβεια, επιβεβαιώθηκε in vitro η αμινοξική περιοχή 99-163 της ataxin-1 και 548-665 της MED15 ως τόπος αλληλεπίδρασης μεταξύ των δυο πρωτεϊνών. Έπειτα, διεξήχθη μια εικονική (in silico) σάρωση χημικής βιβλιοθήκης και εντοπίσαμε 24 μόρια που συνδέονται στη θέση αλληλεπίδρασης στην πρωτεΐνη ataxin-1. Οι ουσίες που αναγνωρίστηκαν αξιολογήθηκαν μέσω βιοδοκιμασιών LuTHy. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι η αμινοξική περιοχή 99-163 της πρωτεΐνης ataxin-1 είναι κρίσιμη για τον διμερισμό της, τονίζοντας περαιτέρω τη σημασία της στη συσσωμάτωση της. Επιπλέον, εστιάσαμε στην περιοχή AXH της ataxin-1, η οποία είναι εξίσου σημαντική για την παθογένεια της νόσου καθώς επάγει σε μεγάλο βαθμό τον διμερισμό/ολιγομερισμό της πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε μια δεύτερη εικονική σάρωση χημικής βιβλιοθήκης για μόρια που συνδέονται στη περιοχή ΑΧΗ. Εντοπίστηκαν 42 μόρια που συνδέονται σε αυτήν την περιοχή. Παράλληλα εγκαθιδρύθηκε μια in vitro βιοδοκιμασία LuTHy για την ποσοτικoποίηση του διμερισμού της περιοχής ΑΧΗ της ataxin-1. Οι ουσίες που προέκυψαν από την εικονική σάρωση προστέθηκαν σε βιοδοκιμασίες LuTHy όπου ποσοτικοποιήθηκε η επίδρασή τους στο διμερισμό της περιοχής ΑΧΗ. Στη συνέχεια, οι ουσίες που βρέθηκαν ότι αναστέλλουν την αλληλεπίδραση ΑΤΧΝ1-ΜΕD15 και τον διμερισμό της περιοχής AXH αξιολογήθηκαν περαιτέρω ως προς την ικανότητα τους να αναστέλλουν το διμερισμό της πλήρους-μήκους πρωτεΐνης ataxin-1. Τέλος, μόρια εγνωσμένης νευροπροστατευτικής δράσης, εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να μειώνουν τη συσσωμάτωσή της παθολογικής πρωτεΐνης ataxin-1 σε πρωτογενή ανθρώπινα κύτταρα με την μέθοδο dot-blot. Διαπιστώθηκε ότι η ουσία G4-Mal μπορεί να μειώσει την ποσότητα των αδιάλυτων συσσωματωμάτων της πρωτεΐνης ataxin-1. Ωστόσο, το καφεϊκό οξύ, το γαλλικό οξύ και τα παράγωγα τους δεν έδειξαν τέτοια αποτελέσματα.
description: Polyglutamine diseases (polyQ) comprise a group of neurodegenerative disorders associated with a trinucleotide (CAG) repeat expansion within the coding region of diverse genes. In the case of spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1), CAG expansions in ATXN1 gene results in longer polyglutamine chains in the produced protein. A striking feature of the polyQ ataxin-1 protein is its ability to form toxic species and misfold into oligomers that slowly aggregate into larger insoluble inclusions in the nucleus. To investigate the role of polyQ IIBs in SCA1 pathogenesis, we generated a novel protein aggregation model by inducible overexpression of the mutant ATXN1(Q82) isoform in human neuroblastoma SH-SY5Y cells and developed a reproducible protocol for isolating ATXN1 insoluble inclusions. Biophysical studies showed that polyQ IIBs are enriched in RNA molecules, which were further analyzed by next generation sequencing. Protein interaction networks analysis suggested that sequestration of essential RNA transcripts within ATXN1(Q82) inclusions disrupts ribosomal function, leading to errors in protein synthesis and overall proteome instability. These findings shed new light on the molecular pathogenesis of SCA1, highlighting the critical impact of polyQ IIBs on critical cellular processes. Additionally, we explored the interaction between ATXN1 and MED15, a protein that significantly enhances ATXN1 aggregation and toxicity. To explore the effect of MED15 on polyQ-expanded ATXN1 aggregation, we generated an overexpression cell model in MSCs, characterized by stable expression of mCherry-MED15 and inducible expression of YFP-ATXN1(Q82) transgenes. Next, we predicted ATXN1 and MED15 protein structures and simulated their interaction. Predicted interaction sites between ATXN1 and MED15 were validated using LuTHy, a mammalian cell-based assay which enables the detection and quantification of PPIs. The validated interaction site encompasses amino acids 99-163 of ATXN1 and 548-665 of MED15. A targeted in-silico screen for inhibitors of this PPI within the ATXN1 region 99-163 identified 24 compounds with their effects further tested in high-throughput LuTHy assays. Further analysis also revealed that the ATXN1 interaction site modulates its dimerization, emphasizing its significance in polyQ aggregation. Moreover, focusing on the AXH domain of ataxin-1, which is critical for the dimerization of the mutant polyQ protein, we performed an in silico screening and identified 42 compounds that bind to the AXH domain of ATXN1. In parallel, we set up a LuTHy assay for the quantification of its dimerization. Selected compounds were tested to determine if they could inhibit the dimerization of the AXH domain in high-throughput LuTHy assays. Hit compounds for ATXN1-MED15 interaction and AXH dimerization were further evaluated for their ability to inhibit the dimerization of full-length ATXN1 protein in LuTHy assays. Finally, compounds with known neuroprotective and anti-aggregation properties were tested for their ability to inhibit ATXN1(Q82) aggregation in primary human cells, using a filter retardation assay and and G4-Mal was found to reduce the quantity of insoluble polyQ IIBs. However, Caffeic acid, Gallic acid, and their derivatives did not show such effects.