title: Untersuchungen zur Struktur und Stabilität neuer, durch Genome Mining identifizierter Lassopeptide
title: Structure and stability investigations of novel lasso peptides identified by genome mining
Creators: name: Zimmermann, Marcel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Chemie
Stabilität
Massenspektrometrie
Mutation , Naturstoff
Biosynthese
Struktur , Magnetische Kernresonanz
stability
genome mining, ribosomal peptide
Peptide
structure
nuclear magnetic resonance
genome mining

description: The increasing occurrence of
      multi-resistant bacteria makes it more necessary than ever to
      search for new antibacterial compounds. For this, natural
      products are a rich source, since they feature structural and
      chemical diversity, which is only hardly or not at all
      accessible by synthetic chemistry. An interesting method for
      the identification of new natural products is genome mining,
      which gains more and more importance as the number of
      sequenced genomes has risen enormously in the past few years
      due to the strong reduction in sequencing costs. The lasso
      peptides are a special family of ribosomally assembled and
      post-translationally modified peptides (RiPPs), which owe
      their name to their unique three-dimensional fold. This fold
      is responsible for their chemical, thermal and proteolytic
      stability and in some instances for their bioactivities
      despite the relatively low degree of chemical modification.
      In this work nearly 100 potential lasso peptide biosynthetic
      gene clusters could be identified through genome mining. To
      validate the suitability of this approach, one cluster was
      selected and different truncated variants of the heat labile
      lasso peptide astexin-1 were isolated. They were analyzed for
      thermal and proteolytic stability and the 3D-structure of
      astexin-1(19) was elucidated via NMR spectroscopy. An
      extensive mutagenesis study was performed to investigate the
      specificity of the biosynthetic machinery and to identify
      important residues for the lasso fold. Through the rational
      incorporation of specific mutations, it was possible to
      transform the native heat labile natural product into a
      heat-stable lasso peptide. In the second part of this work
      two biosynthetic gene clusters from Caulobacter sp. K31,
      which were identified by genome mining, were selected and it
      was possible to isolate four new lasso peptides, caulonodins
      IV - VII. These four caulonodins feature serine or alanine at
      position 1 of the lasso peptide sequence and therefore
      redefine class II of the lasso peptides, since all formerly
      identified peptides of this class feature glycine at this
      position. The caulonodins were investigated for thermal and
      proteolytic stability revealing them to be heat labile lasso
      peptides. The subsequent mutagenesis study showed the altered
      specificity of the biosynthetic machinery for position 1 and
      made it possible to predict the plug amino acids for all four
      caulonodins. This prediction was confirmed through
      elucidation of the 3D-structure of caulonodin V through NMR
      techniques. A mutagenesis study of the leader peptide could
      confirm that there are more residues involved in the
      maturation by the biosynthetic machinery than just
      Thr-2.
description: Das zunehmende Auftreten
      multiresistenter Bakterien macht die Suche nach neuen
      antibakteriellen Wirkstoffen notwendiger denn je. Naturstoffe
      stellen dabei eine sehr reichhaltige Quelle dar, da sie über
      strukturelle und chemische Diversität verfügen, die teilweise
      nicht oder nur unter großem Aufwand synthetisch zugänglich
      ist. Für die Identifikation neuer Naturstoffe kann dabei
      besonders die Methode des Genome Minings genutzt werden, da
      durch die stark gesunkenen Kosten von Sequenzierungen immer
      mehr Komplettgenome in den Datenbanken zur Verfügung stehen.
      Eine spezielle Familie der ribosomal synthetisierten und
      post-translational modifizierten Peptide (RiPPs) sind die
      Lassopeptide, die ihren Namen ihrer besonderen
      dreidimensionalen Faltung verdanken. Diese zeigen trotz
      geringer chemischer Modifikation thermische und
      proteolytische Stabilität und teilweise interessante
      Bioaktivitäten. In dieser Arbeit konnten mit dem Genome
      Mining Ansatz fast 100 potentielle
      Lassopeptidbiosynthesegencluster identifiziert werden. Als
      Beweis der Funktionalität des Genome Minings wurde ein
      Cluster ausgewählt und das hitzelabile Lassopeptid Astexin-1
      in verschiedenen Verkürzungsvarianten isoliert, auf
      thermische und proteolytische Stabilität hin untersucht und
      seine 3D-Struktur mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Eine
      extensive Mutagenesestudie wurde zur Untersuchung der
      Spezifität der Biosynthesemaschinerie, sowie zur
      Identifikation wichtiger Reste für die Stabilität der
      Lassofaltung durchgeführt. Dabei konnte durch rationale
      Inkorporation einer Mutation der nativ hitzelabile Naturstoff
      in ein hitzestabiles Lassopeptid transformiert werden. Im
      zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Biosynthesegencluster aus
      Caulobacter sp. K31, die durch Genome Mining identifiziert
      worden sind, ausgewählt und es konnten vier neue
      Lassopeptide, die Caulonodine IV – VII, isoliert werden.
      Diese vier Caulonodine tragen Serin bzw. Alanin an Position 1
      der Lassopeptidsequenz und definieren damit die Klasse II der
      Lassopeptide neu, da vorher nur Peptide mit Glycin an dieser
      Position bekannt waren. Die Caulonodine wurden auf ihre
      thermische und proteolytische Stabilität hin untersucht und
      offenbarten sich als hitzelabile Lassopeptide. Die
      anschließende Mutagenesestudie zeigte die veränderte
      Spezifität der Biosynthesemaschinerie für Position 1 und
      ermöglichte die Postulierung der Stöpselaminosäuren für alle
      vier Caulonodine. Diese Vorhersage wurde für Caulonodin V
      durch Aufklärung der 3D Struktur mittels NMR-Spektroskopie
      bestätigt. Eine Mutagenesestudie des Leaderpeptids konnte
      bestätigen, dass im Leaderpeptid weitere Reste neben Thr-2
      für die Prozessierung durch die Biosynthesemaschinerie
      wichtig sind.