Ανίχνευση βακτηριακής μόλυνσης σε φυτά με τη χρήση μαγνητικών xMAP μικροσφαιριδιών
Creators: name: Τσιάνιου, Αθανασία Θεοφάνη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: DNA υβριδισμός
Βακτηριακά φυτοπαθογόνα
xMAP μικροσφαιρίδια
DNA hybridization
Bacterial phytopathogens
xMAP microspheres

description: Η βακτηριακή μόλυνση φυτών οδηγεί σε απώλεια μεγάλου μέρους της γεωργικής παραγωγής παγκοσμίως. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την όλο και αυξανόμενη απαίτηση για τρόφιμα αναδεικνύει την ανάγκη για τον περιορισμό των καταστροφικών συνεπειών που προκαλούν τα βακτηριακά φυτικά παθογόνα στις καλλιέργειες. Ένα πρώτο βήμα για την αντιμετώπιση αυτού του αρνητικού αντικτύπου αποτελεί η έγκαιρη ανίχνευση των φυτοπαθογόνων αλλά και η αξιόπιστη ταυτοποίηση τους, έτσι ώστε να είναι δυνατή η διαχείριση των μολύνσεων στα φυτά με στοχευμένη θεραπεία. Η παρούσα εργασία αποτελεί μέρος της μελέτης αλληλεπιδράσεων φυτών με παθογόνα βακτήρια που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας ΑΠΘ με επιβλέπουσα την Επίκουρη Καθηγήτρια Παπή Ρηγίνη, στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος ‘Πρωτεομική και μεταβολομική μελέτη των αλληλεπιδράσεων των φυτών με επιβλαβείς οργανισμούς’ - Υποέργο 16 της Πράξης "Αναβάθμιση του φυτικού πλούτου (PlantUp)" . Ο στόχος μας ήταν η ανίχνευση βακτηριακής μόλυνσης σε φύλλα φυτού Arabidopsis thaliana με τον αναλυτή MAGPIX®. Συγκεκριμένα, ακολουθήθηκε η μεθοδολογία ανάλυσης άμεσου DNA υβριδισμού με χρήση μαγνητικών xMAP μικροσφαιριδίων κατάλληλων για σύζευξη με αμινοτροποποιημένα ολιγονουκλεοτίδια ιχνηθέτες. Πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός ιχνηθετών έτσι ώστε να είναι κατάλληλοι για τον εντοπισμό αλληλουχιών στις 16S και 23S rrl περιοχές του βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. maculicola. Επίσης, σχεδιάστηκαν ιχνηθέτες κατάλληλοι για τον εντοπισμό αλληλουχιών στις 16S και 23S περιοχές rrl των βακτηρίων Escherichia coli, Pseudomonas syringae και Xanthomonas campestris pv. campestris. Ακόμα, πραγματοποιήθηκαν PCR αντιδράσεις με καθαρό gDNA των βακτηρίων με τη χρήση εκκινητών κατάλληλα σχεδιασμένων για την ενίσχυση περιοχών στις οποίες εντοπίζεται η αλληλουχία του ιχνηθέτη. Αυτά τα PCR προϊόντα υβριδίστηκαν με τα συζευγμένα μαγνητικά xMAP μικροσφαιρίδια-ιχνηθέτες και ο αναλυτής MAGPIX® αντιστοίχησε το σήμα φθορισμού του μορίου αναφοράς με τα μικροσφαιρίδια που αυτό αλληλοεπιδρά και ποσοτικοποίησε την ένταση του σήματος φθορισμού. Οι εντάσεις σήματος φθορισμού σε συνδυασμό με την ηλεκτροφορητική εικόνα των PCR προϊόντων οδήγησαν στην επιλογή του Uni1 ιχνηθέτη και του ζεύγους εκκινητών UN_F1, UN_R1 ως κατάλληλων για την ανίχνευση βακτηριακού DNA. Τέλος, η μέθοδος ανίχνευσης με τον αναλυτή MAGPIX® εφαρμόστηκε σε επιμολυσμένα φύλλα φυτού A. thaliana. Τα PCR προϊόντα από το απομονωμένο gDNA φύλλων του φυτού υβριδίστηκαν με τα συζευγμένα μικροσφαιρίδια-ιχνηθέτες, Uni1-C35. Τα πειραματικά μας αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τη δυνατότητα ανίχνευσης της μόλυνσης στα επιμολυσμένα από τα βακτήρια φύλλα τόσο με τις εντάσεις του σήματος φθορισμού, όσο και με την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης.
description: Plant diseases due to bacterial pathogens cause major losses in global crop yields. Also, the rising demand in food supplies because of the growth in human population points out the need for reduction of outbreaks due to bacterial pathogens in crops. The first step for handling these negative effects is the rapid detection and identification of plant pathogens to manage plant diseases with targeted approaches. This study is part of research project entitled “Proteomic and metabolomic study of plant-pathogens interactions’’ – Upgrading the Plant Resources (“PlantUp”). The aim of this study was the detection of bacterial infection in plant leaves of Arabidopsis thaliana using the MAGPIX® analyzer. Specifically, direct DNA hybridization method was used with probe-coupled xMAP microspheres. Amino-modified oligonucleotide capture probes were designed corresponding to unique sequences in 16S and 23S ribosomal RNA for Pseudomonas syringae and, also, to conserved sequences in 16S and 23S rRNA for the bacteria Escherichia coli, Pseudomonas syringae and Xanthomonas campestris. For PCR amplification, various sets of primers were designed. PCR amplicons were hybridized to the probe-coupled xMAP microspheres and the MAGPIX® analyzer detected and quantified the fluorescent signal of the target molecule. Fluorescent signals and the visualization of PCR amplicons led to the selection of Uni1 probe and UN_F1, UN_R1 primers as suitable for bacterial DNA detection. Finally, the xMAP method was used to detect the infection in Arabidopsis thaliana leaves. PCR amplicons from leaves’ gDNA were hybridized to probe-coupled microspheres Uni1, resulting in the confirmation of bacterial disease of plant leaves. Our experimental data confirmed the bacterial detection in Arabidopsis thaliana leaves both measuring the fluorescence intensity and PCR products visualization.