Die präklinische Charakterisierung der Thiopurinanaloga G-04 und G-05
Creators: name: Holle, Johannes C.
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023

description: Bei den chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) handelt es sich um eine in Schüben verlaufende entzündliche Störung des Intestinaltraktes, welcher eine multifaktorielle Pathogenese zugrunde liegt. Dabei spielen sowohl genetische Disposition, Umwelteinflüsse, Mikroorganismen im Darm und ein fehlreguliertes Immunsystem eine Rolle. Die Klinik der akuten Schübe der CED ist in der Regel von starken abdominellen Schmerzen und rezidivierenden, blutig-schleimigen Durchfällen gekennzeichnet. Hinsichtlich der CED-Pathogenese herrscht Konsens darüber, dass eine verminderte Integrität der Darmbarriere, zusammen mit einer Fehlregulation des mukosalen Immunsystems eine zentrale Rolle spielt. So weisen z.B. CD4+ T-Lymphozyten in der Darmmukosa von CED-Patienten eine erhöhte Apoptoseresistenz auf und das klinische Ansprechen auf viele etablierte CED-Therapien korreliert mit einer vermehrten Apoptose von aktivierten CD4+ T-Lymphozyten in der Darmmukosa der Patienten. In der medikamentösen Therapie der CED hat das klassische und bereits seit den 1960er-Jahren bekannte Immunsuppressivum Azathioprin noch immer einen hohen Stellenwert im Rahmen der Remissionserhaltung. Eine im Jahr 2003 von Tiede et al. veröffentlichten Studie trug entscheidend zu einem detaillierten Verständnis der molekularen Wirkweise von Azathioprin in der CED-Therapie bei. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Azathioprin durch eine Bindung seines aktiven Metaboliten 6-Thio-GTP an die kleine GTPase Rac1 eine Apoptose-induzierende Wirkung auf CD28 co-stimulierte T-Lymphozyten hat. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde, mit dem Ziel, die Therapie der CED zu optimieren, eine erste Generation von gezielt modifizierten Thiopurinen entwickelt. Neben einer potenziell gesteigerten therapeutischen Wirksamkeit erhoffte man sich von dieser Strategie insbesondere, den verzögerten Wirkeintritt sowie das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen als die zwei größten Limitationen der klassischen Thiopurine überwinden zu können. Erste in vitro Zellkulturexperimente mit den neu entwickelten Thiopurinanaloga zeigten in der Tat vielversprechende Ergebnisse. Vermutlich aufgrund einer eingeschränkten Bioverfügbarkeit oder Stabilität der getesteten Substanzen gelang es im Anschluss aber leider nicht, das immunsuppressive Potenzial der neuen Thiopurinanaloga unter experimentellen in vivo Bedingungen zu bestätigen. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist die präklinische in vitro Charakterisierung einer neuen Generation von Thiopurinanaloga, G-04 und G-05, hinsichtlich ihres immunsuppressiven Profils. Hier für wurde deren in vitro Wirkung auf humane CD4+ T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut gesunder Spender im Vergleich zur Vorläufersubstanz B-0N untersucht. Im Mittelpunkt stand dabei die Fähigkeit von G-04 und G-05, Apoptose in T-Lymphozyten zu induzieren. Weiterhin wurde die hemmende Wirkung der beiden Thiopurinanaloga auf die kleine GTPase Rac1 untersucht, da Rac1 eine wichtige pharmakologische Zielstruktur der klassischen Thiopurine in T-Lymphozyten von CED-Patienten darstellt. Schlussendlich untersuchte der Autor den Einfluss von G-04 und G-05 auf die Sekretion der Zytokine Interferon-γ (INF-γ) und IL-4 durch stimulierte T-Zellen, welche eine wichtige Rolle in der Pathogenese der CED spielen. Zu diesem Zweck wurden CD4+ T-Lymphozyten aus dem Blut von gesunden Spendern mittels Dichtegradientenzentrifugation und MACS® MicroBead Technologie separiert. Anschließend wurden die gewonnenen T-Lymphozyten in Gegenwart der Thiopurinanaloga G-04, G-05 sowie B-0N stimuliert und kultiviert.  Alternativ wurde der Effekte von G-04 und G-05 in vitro in einer gemischten Lymphozytenreaktion analysiert. Dabei wurden mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs: engl.: Peripheral Blood Mononuclear Cells) von zwei verschiedenen allogenen Spendern gemeinsam kultiviert. Die apoptotischen Zellen wurden mithilfe einer Annexin V / Propidiumiodid Färbung durchflusszytometrisch quantifiziert. Die Bestimmung der Zytokinkonzentrationen in den Zellkulturüberständen erfolgte mittels ELISA. Ein G-LISA-Aktivierungs-Assay (Cytoskelett) ermöglichte den Vergleich des Niveaus der Rac1-Aktivität in T-Zellen, die in An- oder Abwesenheit der Thiopurinanaloga kultiviert wurden. Die therapeutische Wirkung von Azathioprin bei CED-Patienten lässt sich auf die Fähigkeit zur Induktion von Apoptose in CD4+ T-Lymphozyten in der Lamina propria des Darms der Patienten zurückführen. Zur Untersuchung des immunsuppressiven Potenzials von G-04 und G-05 wurde der Einfluss der neuen Thiopurinanaloga auf das Apoptoseverhalten von CD4+ T-Lymphozyten untersucht. Hierbei resultierte die in vitro Behandlung mit G-04 und G-05 in einem signifikanten Anstieg der Rate an spätapoptotischen / nekrotischen CD4+ T-Lymphozyten an Tag 3. Hinsichtlich dieses beobachteten Effekts konnte allerdings kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden neu entwickelten Thiopurinanaloga G-04 und G-05 und ihrer Vorläufersubstanz B-0N dargestellt werden.  Um das immunsuppressive Potenzial von G-04 und G-05 weiter abschätzen zu können, wurde außerdem ihr Einfluss auf die Sekretion des in der Pathogenese der CED wichtigen Zytokins INF-γ gemessen. Wurden stimulierte humane CD4+ T-Lymphozyten in Anwesenheit von G-04 oder G-05 kultiviert, bewirkte dies eine starke und hochsignifikante Inhibition der INF-γ Produktion an Tag 3 der in vitro Da die kleine GTPase Rac1 eine wichtige Zielstruktur der klassischen Thiopurine darstellt und für B-0N ebenfalls als Zielmolekül bestätigt werden konnte, wurde die Hemmung der kleinen GTPase Rac1 durch G-04 und G-05 untersucht. Hierbei resultierte die in vitro Behandlung mit G-04 nach zwei oder drei Tagen in einer signifikanten Reduktion der Rac1-Aktivität in stimulierten CD4+ T-Lymphozyten. Auch eine dreitägige in vitro Behandlung mit G-05 schien in den durchgeführten Experimenten eine Hemmung der Rac1-Aktivität in CD4+ T-Lymphozyten zu bewirken, allerdings erreichte der G-05 vermittelte Effekt keine statistische Signifikanz. Da eine hohe Stabilität der neu entwickelten Thiopurinanaloga G-04 und G-05 eine wichtige Voraussetzung für die angestrebte in vivo Einsetzbarkeit und Funktion darstellt, erfolgten auch erste in vitro Stabilitätstestungen. Hierbei konnte anhand einer gemischten Lymphozytenreaktion bestätigt werden, dass G-04 und G-05 über drei Tage ihre immunsuppressive in vitro Funktion stabil beibehielten. Durch die präklinische in vitro Untersuchung der neuen Thiopurinanaloga G-04 und G-05 wurde ihr immunsuppressives Potenzial bestätigt und es konnte gezeigt werden, dass sie die Apoptose von co-stimulierten CD4+ T-Lymphozyten signifikant stärker und früher auslösen als das klassische Thiopurin Azathioprin. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass G-04 und G-05 die Aktivität der kleinen GTPase Rac1 in stimulierten CD4+ T-Lymphozyten hemmen, welche eine wichtige Rolle im CD28-vermittelten antiapoptotischen Signalweg spielt. Es wurde auch festgestellt, dass die immunsuppressive Wirkung von G-04 und G-05 unter in vivo-ähnlichen Bedingungen über einen Zeitraum von drei Tagen stabil bleibt. Es konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass G-04 und G-05 eine Überlegenheit gegenüber der Vorläufersubstanz B-0N aufweisen. Aufgrund dieser Ergebnisse sind weitere Untersuchungen erforderlich, einschließlich in vitro Bioverfügbarkeits- und Toxizitätstestungen sowie in vivo Testungen in Colitis-Tiermodellen, um eine abschließende Einschätzung des klinischen Potentials von G-04 und G-05 zu ermöglichen.