BACTERIAL ENZYMATIC ACTIVITIES AS POTENTIAL MARKERS FOR ASSESSING THE TECHNOLOGICAL PROPERTIES OF (UN)PROCESSED MILK
Creators: name: DECIMO, MARILU'
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2014

description: RIASSUNTO

I batteri psicrotrofi sono i principali responsabili del deterioramento del latte crudo o termotrattato poich� sono in grado di sintetizzare proteasi e lipasi extracellulari termostabili, causa di formazione di odori e sapori sgradevoli, fenomeni di gelificazione, riduzione delle propriet� schiumogene del latte, perdita di qualit� sensoriale e riduzione della shelf-life. Ad oggi, non esiste ancora una sufficiente conoscenza degli specifici pathways proteolitici e lipolitici di questi enzimi termostabili.

Inizialmente questo lavoro ha riguardato la caratterizzazione dell?attivit� enzimatica di 80 ceppi di psicrotrofi isolati da latte crudo. I batteri appartenenti al genere Pseudomonas sono stati i pi� isolati (78.75%) e Pseudomonas fluorescens � risultata la specie predominante (30.16%); tra le Enterobacteriaceae (21.25%), Serratia marcescens � stata la specie pi� frequentemente isolata (52.94%). Quarantuno ceppi di psicrotrofi mostravano tutte le attivit� enzimatiche. Il pi� alto numero di ceppi positivi a tutte le temperature di incubazione � stato osservato per l?attivit� lipolitica (59) e, a seguire, proteolitica (31) e lecitinasica; i tratti enzimatici variavano tra i ceppi di Pseudomonas e Enterobacteriaceae ed erano marcatamente influenzati dalla temperature di incubazione, essendo 30 �C quella ottimale. Il gene aprX � stato ritrovato in 19 ceppi di Pseudomonas ed � risultato esser diffuso tra i ceppi di P. fluorescens (15 su18).

La seconda parte della ricerca � stata focalizzata sulla valutazione della produzione di composti organici volatili (VOCs) e del rilascio di acidi grassi liberi (FFAs) da ceppi di batteri psicrotrofi.
Diverse specie del genere Pseudomonas e il ceppo Serratia marcescens hanno mostrato profili di VOCs complessi e dipendenti dal ceppo batterico inoculato in campioni di latte UHT, durante le differenti condizioni di incubazione. In particolare, sono stati identificati 56 VOCs appartenenti a aldeidi, chetoni, acidi grassi, alcoli, composti solforati e idrocarburi. Generalmente, il numero di VOCs tendeva ad incrementare con il progredire del tempo di incubazione, sia nel latte controllo non inoculato sia nei campioni di latte contaminati. Tra i VOCs rilevati, alcune molecole sono state individuate solo quando il latte era contaminato da uno specifico ceppo microbico. Nel dettaglio, 3-metilbutan-2-olo, 3-metilesan-2-olo, pentan-1-olo e 3,3-dimetilesano sono stati rilevati solo a seguito dello sviluppo di P. fragi. P. rhodesiae � stata l?unica specie a produrre pentano-2,3-dione, eptano e 3-metilesano, mentre l?esano � stato rilasciato solo in campioni di latte contaminati con P. fluorescens. La maggior produzione di composti solforati e alcoli � stata individuata nello spazio di testa del latte contaminato con P. mosselii e P. fragi, rispettivamente. Lo sviluppo e l?attivit� di P. rhodesiae e S. marcescens sono risultati associati ad un pi� alto numero di acidi grassi e chetoni mentre P. fluorescens ha mostrato la pi� scarsa produzione di composti volatili. Alcuni VOCs come 3-metilbutan-1-olo, 2-metilpropan-1-olo, 3-idrossibutan-2-one, butano-2,3-dione, acido butanoico ed acido esanoico potrebbero perci� rappresentare potenziali marker per il riconoscimento dell?attivit� enzimatica di batteri psicrotrofi e per la precoce individuazione del deterioramento del prodotto.
Per quanto riguarda il rilascio di FFAs, diverse quantit� di questi composti sono state rilasciate dai batteri psicrotrofi appartenenti a specie diverse e alla stessa specie conseguentemente alla diversa capacit� di produrre lipasi. Gli acidi palmitico (16:0), oleico (18:1) e linoleico (18:2) sono risultati i pi� presenti tra gli acidi grassi saturi, monoinsaturi e polinsaturi. P. fluorescens PS73 e P. fluorescens PS81 sono state le specie che hanno prodotto la maggior quantit� di FFAs, a 24 h e 4 giorni di incubazione, rispettivamente. Al contrario, H. alvei PS57 e P. fragi PS55 hanno rilasciato la minor quantit� di FFAs ad entrambi i tempi di incubazione.
Le lipasi dei ceppi di psicrotrofi hanno mostrato una specificit� variabile nei riguardi degli esteri degli acidi grassi con diversa lunghezza della catena carboniosa. P. fragi PS55, P. putida PS17, P. fluorescens PS14 and P. fulva PS10 sono risultate le specie pi� attive nell?idrolisi dei trigliceridi. La lipasi del ceppo di P. rhodesiae PS62 ha mostrato la pi� scarsa capacit� idrolitica verso tutti i trigliceridi testati.

Infine, � stata effettuata la caratterizzazione proteomica di proteasi extracellulari di ceppi di P. fluorescens. Una proteasi termostabile di circa 45 kDa � stata individuata su casein zymogram gel in ciascun surnatante dei ceppi batterici selezionati. L?estratto enzimatico del ceppo P. fluorescens PS19, concentrato per ultrafiltrazione (10 kDa), ha mostrato un?elevata attivit� proteolitica e due ulteriori bande proteolitiche di circa 15 e 25 kDa. I risultati delle analisi nLC/MS/MS dopo digestione sia in gel che in solution hanno evidenziato che la proteasi di 45 kDa corrisponde ad una AprX metalloproteasi di P. fluorescens (acc. no. C9WKP6, UniProt). La proteasi di 15 kDa � stata riconosciuta come un frammento della stessa AprX metalloproteasi, mentre la proteasi di 25 kDa non ha mostrato nessuna omologia con alcuna delle proteine note di Pseudomonas.
La caratterizzazione tramite LC/MS del profilo peptidico generato dall?azione delle proteasi termostabili dello stesso ceppo sulle frazioni caseiniche del latte � in corso di studio.
In generale, questo studio fornisce ulteriori conoscenze per la lo studio delle attivit� enzimatiche di batteri psicrotrofi nel latte.