title: Intra- and intercellular trafficking of the prion protein
Creators: name: Schiff, Edwin
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Prionprotein , Nervenzelle , Dendritische Zelle , Lipidmembran , Proteintransport , Zentralnervensystem , PrPC , PrPSc , lipid rafts , PrPC , PrPSc , lipid rafts , tunneling nanotubes , dendritic cell , neuron
subject: 610 Medizin

description: Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) consist of a group of diseases of infectious, sporadic and genetic origin, found in higher organisms and caused by the pathological form of the prion protein (PrPSc). The inheritable subgroup of TSEs are linked to deleterious changes in the prion gene prnp, which favour its misfolding and are passed on to offspring in an autosomal-dominant fashion. The majority of patients from this group of diseases are heterozygous, leading to the co-expression of the wild-type form (PrPC) and the mutant form (PrPmut) in the same cells. In the first part of my thesis I mimicked this situation in vitro by ectopically co-expressing plasmids encoding for wild-type and various PrP-mutants in FRT-cells. Since the proteins were linked to different fluorophores of the GFP-family and also contained protein-tags we could distinguish between wild-type and mutant forms and were interested to find phenotypical changes caused by the interaction of the two proteins by biochemistry and microscopy. The co-expressed proteins occupied the same cellular sites (such as Golgi-apparatus and plasma membrane) and probably interact (as seen by FRET) with no apparent clear change of phenotype when compared with the single-expressing controls. However significant changes were found on a subcellular level. Co-expression lead to an increased segregation of wild-type and mutant forms into detergent resistant membranes (DRMs). This was only seen in the case of co-expressed mutants but not with a control expressing two wild-type proteins. Taken together these results underline once more the importance of DRMs in TSE-pathology and suggest that the described changes in DRM-sequestration could contribute to pathology in heterozygous carriers by a yet to be defined mechanism. In the second part of my thesis I focussed on the question how prions propagate intercellularly and how prions invade the peripheral neuronal system. Specifically the infectious forms are believed to be mainly caused by oral exposure to contaminated foodstuffs. A still enigmatic process is how prions, upon intestinal uptake, transfer from cell to cell and how they invade the peripheral nervous system in order to be retrogradely transported to the central nervous system. Based mainly on microscopic techniques, we could show in fixed and living cell lines of epithelial and neuronal origin that prions exploit for intercellular spread a novel cell-to-cell communication mechanism consisting of fine intercellular membrane tubes, termed tunnelling nanotubes (TNTs). Additionally, utilizing primary cell cultures, we show that bone marrow derived dendritic cells interact with hippocampal neurons via TNTs and that organelles such as lysosomes, as well as Alexa-568nm-labelled purified PrPSc can transfer through these membrane connections intercellularly. The experiments with primary cells substantiate our findings with immortalized cell lines and lead us to hypothesize that this scenario could also occur in vivo when immune cells, infected with prions, interact closely with the peripheral sympathetic nervous system in secondary lymphoid organs (as we could see by immunohistofluorescence of murine spleen). This part of my work provides a new mechanism by which prions could propagate from the peripheral entry site to the central nervous system. Knowledge on ways how to temporarily inhibit formation of TNTs could serve as a powerful means to block the spread of prions upon acute exposure.
description: Transmissible spongiforme enzephalopathien (TSEs) ist eine Gruppe von tierischen Krankheiten mit infektiöser, sporadischer oder genetischer Ätiologie, die durch die pathologisch-missgefaltete Form des PrP-Proteins (Prion oder PrPSc) ausgelöst werden. Mutationen im prnp-Gen, welche die Missfaltung des Proteins begünstigen, bilden die Untergruppe der vererbbaren Erkrankungen. Diese Krankheiten werden an Nachkommen autosomal-dominant weitervererbt, wobei die Mehrheit der Patienten heterozygot sind, d.h. eine gesunde und eine fehlgebildtete Form des Proteins in Zellen exprimieren. Im ersten Teil meiner Dissertation simulierte ich diese Situation in vitro indem ich gesunde (PrPwt) und mutierte (PrPmut) Proteine in FRT-Zellen koexprimierte. Nachdem die Proteine an fluoreszierende Varianten der GFP-Familie gebunden waren, konnte man sie mikroskopisch unterscheiden. Desweiteren enthielten die mutierten Versionen einen sogenannten �tag�, genannt 3F4, um sie auch per antikörper unterscheiden zu können. Mit diesen Mitteln wollte ich untersuchen, ob phenotypische Veränderungen (biochemisch und/oder mikroskopisch) auftreten, die auf die Interaktion der beiden Proteine zurück zu führen sind. Aufgrund von positiven FRET-Ergebnissen, erscheint es wahrscheinlich, daß die koexprimierten Proteine eng miteinander interagieren. Die koexprimierten Proteine kolokalisierten in der Zelle im Golgi-Apparat und auf der Plasmamembran, scheinbar ohne den jeweiligen Phänotypen zu beinflussen. Veränderungen im Phänotyp wurden jedoch auf subzellulärer Ebene gefunden: Die Koexpression von wild-typ und mutierten Proteinen führte zu einer signifikanten Erhöhung der beiden Proteine in sogenannten DRMs (detergent resistant membranes). Dies konnte nur festgestellt wenn wild-typ und Mutante koexprimiert wurden, aber nicht in einer Kontrolle, die zwei unterschiedliche wild-typ Proteine exprimierte. Im Ganzen betrachtet, bestätigen diese Ergebnisse die bereits vorgeschlagene Bedeutung von DRMs in der Pathologie von TSE-Krankheiten, allerdings durch einen neuen und vormals unbekannten Aspekt. Unser Ergebnis lässt uns vermuten, daß die beschriebenen Erhöhungen in DRM-Sequestration zur Pathologie in heterozygoten Patienten beitragen könnte. Im zweiten Teil meiner Dissertation wendete ich mich der Fragestellung zu, wie Prionen von Zelle zu Zelle weiter wandern und wie Prionen dadurch in das periphere Nervensystem (PNS) eindringen können um letztendlich in das zentrale Nervensystem (ZNS) vorzudringen. TNTs (tunneling nanotubes) sind unlängst beschriebene, filigrane, membranäre interzelluläre Zellverbindungen, die vermutlich der Zellkommunikation dienen. Durch mikroskopische Studien an fixierten und lebenden Zellen epithelialer und neuronaler Abstammung, konnte ich zeigen, daß Prionen TNTs für ihre eigene Verbreitung mißbrauchen. Anhand von primären gemischten Zellkulturen konnte ich zeigen, daß dendritische Zellen (DCs) mit hippocampalen Neuronen über TNTs kommunizieren und, daß in diesem Prozess Lysosomen sowie aufgereinigtes, fluoreszentes PrPSc von DCs zu Neuronen per TNTs transferiert. Die erfolgreichen Experimente mit primären Zellen bekräftigte meine vorherigen Untersuchungen an Zelllinien und führt zu meiner Hypothese, daß dieses Szenario ähnlich in vivo ablaufen könnte. Dies wird desweiteren untermauert durch Immunohistofluoreszenz-Experimente an murinem Milzgewebe, wo ich DCs sehr nahe mit Neuronen assoziert fand. Dieser Teil meiner Dissertation liefert einen neuen Mechanismus, wie Prionen aus der Peripherie eines oral infizierten Organismus ins ZNS vordringen können. Informationen zur temporären Blockierung dieser Strukturen könnte sich als eine vielversprechende Möglichkeit zur Inhibierung der Verbreitung von Prionen im Organismus herausstellen.