title: The Insect-Metalloproteinase-Inhibitor IMPI for the treatment of wound infections - Preclinical investigations and formulation design
title: Der Insekten-Metalloprotease-Inhibitor IMPI zur Therapie von Wundinfektionen - Präklinische Untersuchungen und Formulierungsdesign
Creators: name: Eisenhardt, Michaela
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: hydrogel
Metalloprotease, Pseudomonas Elastase
Wundinfektion
Sciences
Naturwissenschaften
Pseudomonas aeruginosa
Hydrogel
Metallproteinases , Pseudolysin
Wound infections , Pseudomonas aeruginosa

description: Chronische Wundinfektionen stellen
      ein weltweites medizinisches Problem mit hoher Prävalenz,
      gravierenden Folgen für die Patienten und hohen Kosten für
      das Gesundheitssystem dar. Aufgrund von Resistenzen der
      verursachenden Keime, fehlen derzeit die therapeutischen
      Alternativen und nicht selten resultiert eine Sepsis mit
      hoher Amputations- und Mortalitätsrate. Pseudomonas
      aeruginosa ist dabei eines der häufigsten und bedeutendsten
      Bakterien mit hoher Antibiotikaresistenz. Sein
      Schlüsselvirulenzfaktor, die M4-Metalloprotease (MP)
      Pseudolysin (PE), ist an der Intoxikation, der Invasion und
      der Verteilung im Wirt beteiligt. Die Hemmung von
      Virulenzfaktoren ist ein neuer, vielversprechender
      Behandlungsansatz. Allerdings wirken MP-Inhibitoren meist
      unspezifisch und sind für die Therapie weniger geeignet. Der
      Insekten-Metalloprotease-Inhibitor (IMPI) hingegen zeigte in
      proteolytischen Aktivitätstests eine effiziente, spezifische
      Wirkung gegen bakterielle M4-MP, wie z.B. PE. Die Ziele
      dieser Arbeit waren die pharmakologische Charakterisierung
      von IMPI und die Entwicklung einer geeigneten Formulierung.
      Das therapeutische Potenzial von IMPI bei P. aeruginosa
      Infektionen wurde erstmals auf molekularer, zellulärer und
      histologischer Ebene bestimmt. Die inhibitorische Kapazität
      von IMPI-GST gegen PE und das Sekretom, eines aus der Wunde
      isolierten P. aeruginosa Stammes, wurde in Protease-Tests
      ermittelt. Im Vergleich zum Referenz-Inhibitor Phosphoramidon
      (PA) zeigte IMPI-GST eine effizientere Wirkung und einen
      schnelleren Wirkeintritt. In der vorliegenden Arbeit wurde
      zum ersten Mal das P. aeruginosa Sekretom auf Hautzellen
      untersucht. Mit steigender Sekretom-Konzentration reduzierte
      sich die Viabilität der Keratinozyten und nach Applikation
      von 10% Sekretom wurde ein komplettes Zellsterben
      festgestellt. Dabei erwies sich die Zellablösung als
      Hauptursache und damit das Auftreten einer Anoikis. In
      immunhistologischen Färbungen wurden morphologische
      Veränderungen des Zytoskeletts bei mit Sekretom behandelten
      Keratinozyten festgestellt. Aus diesen Ergebnissen und unter
      Berücksichtigung der Literatur wurde angenommen, dass die
      Zerstörung von Zellkontakten, die Degradierung von Proteinen
      der Extrazellulären Matrix sowie der Einfluss auf den
      MAPK-Signalweg ursächlich für die Anoikis sind. Obwohl die
      zellbasierten Untersuchungen auf eine multifaktorielle
      Virulenz des Sekretoms hinweisen, scheint PE dafür
      hauptverantwortlich zu sein. Die potenzielle Wirkung von
      IMPI-GST wurde zunächst in vitro und ex vivo ermittelt.
      IMPI-GST zeigte selbst keinen zytotoxischen Einfluss,
      verhinderte die Sekretom bedingten Zellablösungen und führte
      zu einer signifikanten Steigerung der Viabilität um mehr als
      60%. Die Migration von Keratinozyten ist ein essentieller
      Vorgang der Wundheilung und wurde in vitro unter Einfluss des
      Sekretoms ermittelt. Mit steigender Sekretom-Konzentration
      verminderte sich die Zellmigration. IMPI-GST führte bei
      gleichzeitiger Applikation zu einer signifikanten Erhöhung
      der Migration und verhinderte die Auswirkungen des Sekretoms
      vollständig. Die Ergebnisse der in vitro Untersuchungen
      wurden ex vivo in einem Schweinehaut-Wundmodell überprüft.
      Hierbei bestätigten sich der nekrotische, zellschädigende und
      heilungsvermindernde Einfluss des Sekretoms sowie die Wirkung
      von IMPI-GST. Bei gleichzeitiger Applikation von IMPI-GST
      wurde der vom Sekretom induzierte Gewebeabbau zum Großteil
      verhindert und eine deutlich verbesserte Wundheilung
      beobachtet. Der Fokus des zweiten Teils dieser Arbeit lag auf
      der Entwicklung einer Formulierung zur Anwendung von IMPI bei
      Wundinfektionen. Dazu wurde ein thermosensitives Hydrogel mit
      dem Hauptgelbildner Poloxamer 407 designt. Die geeigneten
      Poloxamere und Additive wurden in Bezug auf ihre Rheologie in
      oszillatorischen Messungen untersucht. Daraus ergab sich eine
      Gelzusammensetzung aus 16% P407 mit 15% P188 und 3% Glycerin.
      Keimbelastungstests beweisen den Einsatz von 0,2%
      Kaliumsorbat mit 0,1% Zitronensäure als geeignete
      Konservierungsmittel. Abschließende Aktivitätstests mit der
      Galenik zeigten keine Beeinträchtigung der
      Wirkstoff-Aktivität. In einem Franz-Zell-Diffusionsversuch
      zeigte IMPI-GST eine kontinuierliche Freisetzung über einen
      Zeitraum von 10 h und IMPI-GST beeinflusste die Rheologie des
      Gels nicht signifikant. Die vorliegende Arbeit bestätigt das
      Wirkpotential von IMPI-GST zur Therapie von Infektionen mit
      P. aeruginosa auf molekularer, zellulärer und histologischer
      Ebene. Es wurde erstmals der schädigende Einfluss des
      pathogenen P. aeruginosa Sekretoms auf humanen Keratinozyten
      und einem Schweinehaut-Wundmodell identifiziert. Die
      Behandlung mit IMPI-GST verbesserte systematisch in allen in
      vitro und ex vivo Experimenten deutlich die Viabilität, die
      Morphologie und die Migrationsfähigkeit sowie insgesamt die
      Wundheilung. Für die Applikation von IMPI-GST erwies sich das
      entwickelte thermosensitive Hydrogel als geeignet.
description: Chronic wound infections are a
      worldwide occurring health care problem with massive
      consequences for the patient and high costs for the health
      care system. Due to the frequent antibiotic resistance of
      pathogenic bacteria the therapeutic options are limited. The
      Pseudomonas aeruginosa is one of the commonest and most
      important germs in wounds with high antibiotic resistance.
      Its key virulence factor, the M4-Metalloproteinase (MP)
      Pseudolysin (PE), takes part in the intoxication, the
      invasion and the distribution of the pathogen. The inhibition
      of virulence factors is a novel promising therapeutic
      approach, but most of the MP-inhibitors are unspecific and
      thus unsuitable for the pharmaceutical use. The
      Insect-Metalloproteinase-Inhibitor (IMPI), however, was
      proved to be an efficient and highly specific inhibitor
      against bacterial M4-MP, like PE. The focuses of this thesis
      research were the pharmacological verification of IMPI and on
      the development of a suitable formulation for its application
      in wound infections. For the first time the therapeutic
      potential of IMPI against infections with P. aeruginosa was
      investigated on molecular, cellular and histological level.
      The inhibitory capacity of IMPI-GST was initially tested
      against pure PE and the secretome of wound isolated P.
      aeruginosa in proteolytic activity assays. In comparison to
      the reference inhibitor Phosphoramidon (PA), IMPI-GST was
      more efficient and showed a narrower active window. In this
      thesis the P. aeruginosa secretome was studied on skin cells
      for the first time. A strong decrease in the cell viability
      was measured due to an increasing secretome concentration and
      treatment with 10% secretome resulted in complete cell death.
      This was mainly caused by the detachment of cells from the
      surface and thus the occurrence of Anoikis.
      Immunohistochemical stainings of secretome-treated cells
      showed retraction of F Aktin and morphological changes in the
      cytoskeleton. Therefore, it was hypothesized that the main
      reasons are the destruction of cell contacts, like Tight
      Junctions, Adherence Junctions and Focal Adhesions, the
      degradation of proteins of the extracellular matrix as well
      as the influence in the MAPK pathway. Although the cell based
      examinations suggested a multifactorial virulence of the
      secretome PE seems to be mainly responsible. Subsequently,
      the potential pharmaceutic effect of IMPI-GST was examined in
      vitro and ex vivo. IMPI-GST showed no cytotoxic impact and
      prevented the secretome-related cell detachment, which
      resulted in a significant increase in viability of more than
      60%. The migration of keratinocytes is an essential process
      in wound healing. The in vitro cell migration was strongly
      reduced in accordance to an increased applied secretome
      concentration. IMPI-GST enhanced the migration and completely
      prevented the secretome-induced impact on the keratinocytes.
      Finally, the observed in vitro results were tested in an ex
      vivo porcine skin wound healing model. Therein the healing
      diminishing, necrotic and cell destructing effects of the
      secretome were confirmed. Also, the positive results of the
      IMPI-GST treatment were proved. The tissue destruction,
      induced by the secretome, was prevented due to a simultaneous
      application of IMPI-GST and a clear improvement in wound
      healing was observed based on a formed wound tongue. The
      second part of the thesis focused on the formulation
      development for the application of IMPI-GST in chronic wound
      infections. Therefore, a thermosensitive hydrogel with the
      gelling agent Poloxamer 407 was designed. The suitable
      Poloxamers and additives as well as their appropriate
      concentrations were investigated in relation to their
      rheological parameters, elastic and viscous modulus, in
      oscillatory measurements. This led to a final gel composition
      of 16% P407, 15% P188 and 3% Glycerin.
      Germ-contamination-tests approved the use of the preservative
      combination of 0.2% potassium sorbate with 0.1% citric acid.
      Final activity assays demonstrated no interference in the
      inhibitory activity of IMPI-GST with the formulation. In
      Franz cell diffusion assays IMPI-GST was continuously
      released out of the hydrogel over a period of 10 h.
      Furthermore, neither the influence of IMPI-GST on the
      rheological characteristic of the hydrogel nor any other
      interaction between the formulation and the active
      pharmaceutical ingredient was recognized. In conclusion, this
      study confirms the presumed therapeutic activity of IMPI
      against infections with P. aeruginosa on molecular, cellular
      and histological level. The influence of the pathogenic P.
      aeruginosa secretome on human keratinocytes and a porcine
      wound model was identified for the first time. An improvement
      in viability, morphology and migration capacity of the
      secretome-treated cells as well as wound healing in all in
      vitro and ex vivo experiments occurred by the application of
      IMPI-GST. For the use of this active peptide IMPI a
      thermosensitive hydrogel was developed.