title: Investigation of the function of gp44 as well as the construciton of ɸCh1::PCNA and its effect on the development of virus ɸCh1
Creators: name: Tschurtschenthaler, Michael
Publisher: name: :none
Year: 2017

description: Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Konstruktion einer phiCh1::PCNA Mutante und deren Auswirkung auf die Entwicklung des Viruses phiCh1. Das proliferating cell nuclear antigen (PCNA) ist ein Prozessivitätsfaktor der Pol sigma welche ein Homolog der beta Untereinheit von dem DNA Polymerase III Holoenzym von E. coli ist. PCNA ist sowohl auf der Virus DNA von phiCh1 als auch auf der DNA von seinem einzig bekanntem Wirt N. magadii kodiert. Beide Proteine zeigen eine Sequenzidentität von 65% auf über 247 AA auf, welche mittels BLAST analysiert wurde. Die Tatsache, dass das Virus kodierte PCNA Protein um 21 AA länger ist als das bei N. magadii, macht eine Unterscheidung der zwei Varianten möglich. Aber warum der Virus sein eigenes PCNA Protein exprimmiert und nicht die Wirtseigene ist bis jetzt noch nicht bekannt. Der Grund könnte eine erhöhte Affinität der Virus kodierten Variante zu seinen möglichen Ziel- Sequenzen sein. In dieser Masterarbeit konnte gezeigt warden, dass die Deletion von ORF59 eine frühere Lyse des Wirtes N. magadii L11-deltaPCNA zur folge hatte. Desweiteren konnte eine verringerte Produktion des Hauptcapsidproteins E festgestellt werden, was zu einer geringeren Freisetzung von Virusnachkommen zur Folge hatte. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass der ORF59 nicht essenziell für den Virus ist, jedoch unterstzützt er die Produktion von Viruspartikeln. Die frühere Lyse des Mutantenstammes kann auf einen Einfluss auf die Regulation des Lebenszyklus von phiCh1 deutet. Im zweiten Teil dieser Arbeit, geht es um die Konstruktion eines Mutanten mit einer ORF44 Deletion, sowie die Funktion dessen Genprodukts gp44. Es wird vermutet, dass gp44 ein Teil eines Toxin-Antitoxin Systems ist, welches von ORF43 und ORF44 kodiert wird. Letzterer representiert das Toxin. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass ORF44 Homologien zu einer VapC PIN nuclease Domäne aufweist. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass gp44 vermutlich spezifisch die mRNA von ORF3452 schneidet, welches ein verkleinertes Protein ergibt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Deletionsmutante hergestellt werden, welche als Basis für zukünftige Studien dient.
description: The first part of this thesis focuses on the construction of a phiCh1::PCNA mutant and its effects on the development of the virus phiCh1. The proliferating cell nuclear antigen (PCNA) is a processivity factor for Pol sigma which is a homologue of the beta subunit of the E. coli DNA polymerase III holoenzyme. PCNA is encoded by the virus phiCh1 and also by its only known host N. magadii. Both proteins showed to have a sequence identity of 65% over 247 AA, which was determined by BLAST analysis. The fact, that the virus encoded PCNA is 21 AA larger than the one of N. magadii makes it possible to distinguish between these two proteins. Why the virus phiCh1 is not using the PCNA of the host and instead encoding for its own copy is not known yet. It might be possible, that the virus encoded form has a greater affinity to its target. The effects on the virus development upon deleting the phiCh1 PCNA gene were investigated. In this master thesis it could be demonstrated, that the deletion of ORF59 resulted in an earlier onset of lysis of N. magadii L11-deltaPCNA and a reduced production of the major capsid protein E, resulting in a reduction of progeny viruses release. Therefore, ORF59 is not essential, however it support the production of virus particles. In addition lysis of the mutated strain occurred earlier, which could indicate to a general influence on the regulation of the life cycle of virus phiCh1. The second part focuses on the construction of a mutant with an ORF44 deletion and the function of its gene product gp44. Gp44 is part of a putative toxin-antitoxin system that is encoded by the ORFs 43 and 44, whereas the latter one represents the toxin. Sequence analysis showed, that ORF44 has homology to a VapC PIN nuclease domain. Previous studies demonstrated, that gp44 probably specifically cleaves mRNA of ORF3452 which results in a shorter but precise protein. In course of this study, the construction of these deletion mutants could be obtained, which serve as a basis for future studies.