Μελέτες πρωτεϊνικής σύνθεσης με χρήση οπτικών λαβίδων και μονομοριακού FRET:
Creators: name: Κατρανίδης, Αλέξανδρος Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Οπτικές λαβίδες
Μεταφορά ενέργειας λόγω συντονισμού κατά Foerster
Μελέτη μεμονωμένων μορίων
Συμμεταφραστικλη αναδίπλωση
Πρωτεϊνική σύνθεση ελεύθερη κυττάρων
Πράσινη φθορίζουσα πρωτεϊνη
In vino βιοτινυλίωση ριβοσωμάτων
Optical tweezers
Foerster resonance energy transfer
Single molecule studies
Contranslational folding
Cell free protein synthesis
Green fluorescent protein (GFP)
In vivo biotinylation of ribosomes

description: Η διατριβή είχε ως σκοπό να εξετάσει θεμελιώδη ερωτήματα βιοσύνθεσης πρωτεϊνών, υπό το πρίσμα ενός καινούριου πεδίου της έρευνας, που αφορά τη μελέτη μεμονωμένων μορίων. Ένας από τους στόχους ήταν να μετρηθούν οι δυνάμεις που ασκούνται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης από το ριβόσωμα με τη χρήση οπτικών λαβίδων. Αρχικά δημιουργήθηκε ένα κατάλληλο βιοχημικό σύστημα, το οποίο επέτρεπε την ελεγχόμενη βιοσύνθεση in vitro. Ριβοσώματα συνδεδεμένα σε χάντρες συνέθεταν μέχρι το επιθυμητό σημείο τις πρωτεϊνες GFPem και ουβικιτίνη. Το αμινοτελικό άκρο των πρωτεϊνών, που είχε βιοτινυλιωθεί κατά τη βιοσύνθεση, είχε τη δυνατότητα να συνδεθεί σε δεύτερη χάντρα, η οποία ήταν παγιδευμένη στις οπτικές λαβίδες. Κατέστη δυνατό να μετρηθούν δυνάμεις στην κλίμακα των pN. Αποδείχτηκε ότι απαιτείται δύναμη μικρότερη των 10pN, για να διατηρηθεί ανέπαφη η σύνδεση του συστήματος. Ο δεύτερος στόχος ήταν να μελετηθεί η συμμεταφραστική αναδίπλωση μεμονωμένων πρωτεϊνών από ριβοσώματα, με τη χρήση του φαινομένου FRET. Ριβοσώματα μη ειδικά σημασμένα με φθορισμοφόρο και συνδεδεμένα σε επιφάνειες, ήταν ικανά να συνθέσουν πλήρως λειτουργικές πρωτεϊνες GFPem, οι οποίες φθόριζαν. Αποδείχτηκε ότι η σύνθεση και αναδίπλωση της GFPem είναι γρήγορες διαδικασίες, με σημαντικά ωφέλη για το κύτταρο. Επίσης, ριβοσώματα ειδικά σημασμένα με φθορισμοφόρο-δέκτη και συνδεδεμένα σε επιφάνειες, συνέθεταν πρωτεϊνες, στις οποίες ενσωματώνονταν το φθορισμοφόρο-δότης κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. Τα δύο φθορισμοφόρα έδιναν FRET όταν πλησίαζαν μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της σύνθεσης
description: The purpose of the thesis was to study fundamental questions of protein synthesis in single molecule level. One goal was to measure the forces applied on the nascent peptide chain during synthesis by the ribosome, using optical tweezers. Initially an appropriate biochemical system was created, in order to allow controlled in vitro biosynthesis. Ribosomes tethered on beads were producing up to a desired length the proteins GFPem and ubiquitin. The N-terminus of the proteins, was biotinylated during synthesis and had the possibility to be attached to another bead, which was trapped with the optical tweezers. It was possible to measure forces in the pN scale. It was proven that a force lower than 10pN was needed in order to detain the binding from rupture. The second goal was to study the cotranslational folding of single proteins, using FRET. Ribosomes, non-specifically labeled with a dye, were tethered on a surface and they were able to synthesize fully active GFPem, that were able to fluoresce. It was proven that synthesis and folding of GFPem, were very fast processes, with important implications for the cell. Additionally, ribosomes specifically labeled with an acceptor-dye and tethered on a surface, were able to synthesize proteins, to which a donor-dye was incorporated during synthesis. The two dyes gave a FRET signal when they came close to each other during synthesis