title: 6S RNAs in Bacillus subtilis. Investigation of biological function and molecular mechanism
Creators: name: Ganapathy, Sweetha
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: 6S RNA
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik
RNAP
B. subtilis
non-coding RNA
pRNA transcription

description: 6S-1 RNA (bsrA) is a 190 nucleotides small non-coding RNA found in Bacillus subtilis, which binds to the housekeeping sigma A (σA) RNA polymerase holoenzyme (RNAP). 6S-1 RNA levels peak in stationary phase where the RNA supports adaptation to nutrient scarcity (or other stresses) and prepares cells for an instant outgrowth from stationary phase upon nutrient re-supply. In addition to inhibiting cellular transcription by binding to σA-RNAP, 6S-1 RNA also serves as a template for this enzyme to direct the synthesis of small product RNAs (pRNAs) in an RNA-dependent RNA polymerization reaction. These pRNAs, if long enough (~ 14-mer), are able to rearrange the structure of 6S-1 RNA such that the polymerase is released from the 6S-1 RNA and transcription of DNA promoters can be resumed. The kinetics of the process and key nucleotides involved in release and rearrangement of 6S-1 are unknown. Towards a deeper understanding of this process, we introduce substitutions/deletions along the secondary structure of 6S-1 RNA and analyse the impact thereof on the kinetics of 6S-1 rearrangement. In our study, we found that mutations C44/45 in the 5’-Central Bulge (CB) weaken 6S-1 RNA:σA-RNAP ground state binding two- to threefold while stabilizing the Central Bulge Collapse Helix (CBC) and shifting the pRNA length pattern to shorter pRNAs. A 6S-1 RNA variant with a weakened helix P2 and CBC stabilized by the the C44/45 mutation was more effectively rearranged and released from the enzyme. Our mutational analysis also revealed that formation of a second short hairpin in 3’-CB is detrimental to 6S-1 RNA release. From our results we infer that formation of the CBC subtly supports pRNA-induced 6S-1 RNA rearrangement and release. Additionally, truncated variants of 6S-1 RNA, solely consisting of the CB flanked by two short helical arms, can still traverse the functional 6S RNA cycle in vitro, despite decreased σA-RNAP affinity. This indicates that the ‘- 35-like’ region is not strictly essential for 6S-1 RNA function, at least in B. subtilis. We also showed that pRNA-isosequential locked nucleic acids (pLNAs) as short as 6 nt were able to induce 6S-1 RNA rearrangement and disrupt/prevent complex formation with σA-RNAP. Additionally, we analyzed the spatial dimensions of free 6S-1 RNA versus 6S-1:pLNA complexes by atomic force microscopy, revealing that 6S-1:pRNA hybrid structures, on average, adopt a more bent/constrained structure than 6S-1 RNA alone. The pLNA studies help us interpret the 6S-1 rearrangement to be a progressive process with intermediate states, ultimately leading to a maximally constrained and bent structure. Finally, we observed that the pRNA-mediated rearrangement of 6S-1 RNA and its release from σA-RNAP largely accelerates at NTP concentrations &gt; 40 μM, which supports the role of 6S-1 RNA during nutrient re-supply. In gel assays, the regulatory 6S-1 and 6S-2 RNAs of Bacillus subtilis bind to the housekeeping RNA polymerase holoenzyme (σA-RNAP) with submicromolar affinity. We observed copurification of endogenous 6S RNAs from a published B. subtilis strain expressing a His-tagged RNAP. Such 6S RNA contaminations in σA-RNAP preparations reduce the fraction of enzymes that are accessible for binding to DNA promoters. In addition, this leads to background RNA synthesis by σA-RNAP utilizing copurified 6S RNA as template for the synthesis of short abortive transcripts termed product RNAs (pRNAs). To avoid this problem, we constructed a B. subtilis strain expressing His-tagged RNAP but carrying deletions of the two 6S RNA genes. The His-tagged, 6S RNA-free σA-RNAP holoenzyme can be prepared with sufficient purity and activity by a single affinity step. We also reported expression and separate purification of B. subtilis σA that can be added to the His-tagged RNAP to maximize the amount of holoenzyme and, by inference, in vitro transcription activity. In order to test our hypothesis that the regulatory role of 6S RNAs may be particularly important under natural, constantly changing environmental conditions, we constructed 6S RNA deletion mutants of the undomesticated B. subtilis wild-type strain NCIB 3610. We observed a strong phenotype under stress conditions in which the Δ6S-2 RNA strain exhibited retarded swarming activity and earlier spore formation. In contrast, the Δ6S-1&amp;2 double knockout strain exhibited lesser spore formation than the wild-type. Additionally, we could show that 6S mutants grown under nutrient rich conditions revealed no strong phenotype. Our data suggests that both 6S RNAs contributes to the fitness of B. subtilis under the unsteady and temporarily harsh conditions encountered in natural habitats.
description: 6S-1 RNA (bsrA) ist eine 190 Nukleotid lange, nicht-kodierende RNA, die in Bacillus subtilis vorkommt und an das Housekeeping-Sigma-A (σA) RNA-Polymerase-Holoenzym (RNAP) bindet. Die 6S-1 RNA Konzentration erreicht ihren Höhepunkt in der stationären Phase, in der die RNA die Anpassung an Nährstoffknappheit (oder andere Stressfaktoren) unterstützt und die Zellen darauf vorbereitet, bei erneuter Nährstoffzufuhr sofort aus der stationären Phase herauszuwachsen. Neben der Hemmung der zellulären Transkription durch Bindung an σA-RNAP dient die 6S-1 RNA auch als Vorlage für dieses Enzym, um die Synthese von kleinen Produkt-RNAs (pRNAs) in einer RNA-abhängigen RNA-Polymerisationsreaktion zu steuern. Diese pRNAs sind, wenn sie lang genug sind (~ 14-mer), in der Lage, die Struktur der 6S-1 RNA so umzugestalten, dass die Polymerase von der 6S-1 RNA freigesetzt wird und die Transkription der DNA-Promotoren wieder aufgenommen werden kann. Die Kinetik des Prozesses und die Schlüsselnukleotide, die an der Freisetzung und Umstrukturierung von 6S-1 beteiligt sind, sind unbekannt. Um diesen Prozess besser zu verstehen, führen wir Substitutionen/Deletionen entlang der Sekundärstruktur der 6S-1 RNA ein und analysieren deren Auswirkungen auf die Kinetik der 6S-1 Umstrukturierung. In unserer Studie fanden wir heraus, dass die Mutationen C44/45 in der 5'-Central Bulge (CB) die 6S-1 RNA:σA-RNAP Grundzustandsbindung um das Zwei- bis Dreifache schwächen, während sie die Central Bulge Collapse Helix (CBC) stabilisieren und das pRNA-Längenmuster zu kürzeren pRNAs verschieben. Eine 6S-1 RNA Variante mit einer geschwächten Helix P2 und einer durch die C44/45 Mutation stabilisierten CBC wurde effektiver umstrukturiert und vom Enzym freigesetzt. Unsere Mutationsanalyse ergab außerdem, dass die Bildung einer zweiten kurzen Haarnadel in 3'-CB die Freisetzung von 6S-1 RNA beeinträchtigt. Aus unseren Ergebnissen schließen wir, dass die Bildung der CBC die pRNA-induzierte Umstrukturierung und Freisetzung von 6S-1 RNA auf subtile Weise unterstützt. Darüber hinaus können verkürzte Varianten der 6S-1 RNA, die nur aus der CB bestehen, das von zwei kurzen helikalen Armen flankiert wird, den funktionalen 6S RNA Zyklus in vitro trotz verminderter σA-RNAP Affinität durchlaufen. Dies deutet darauf hin, dass die "-35-ähnliche" Region für die Funktion der 6S-1 RNA zumindest in B. subtilis nicht unbedingt erforderlich ist. Wir haben auch gezeigt, dass pRNA-isosequentiell verschlossene Nukleinsäuren (pLNAs) mit einer Länge von nur 6 nt in der Lage sind, eine Umstrukturierung der 6S-1 RNA zu bewirken und die Komplexbildung mit σA-RNAP zu unterbrechen/verhindern. Darüber hinaus analysierten wir die räumlichen Dimensionen von freier 6S-1 RNA im Vergleich zu 6S-1:pLNA-Komplexen mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie und stellten fest, dass 6S-1:pRNA-Hybridstrukturen im Durchschnitt eine stärker gebogene/begrenzte Struktur aufweisen als 6S-1 RNA allein. Die pLNA-Untersuchungen helfen uns, die 6S-1 Umstrukturierung als einen fortschreitenden Prozess mit Zwischenzuständen zu interpretieren, der schließlich zu einer maximal eingeschränkten und gebogenen Struktur führt. Schließlich beobachteten wir, dass die pRNA-vermittelte Umstrukturierung der 6S-1 RNA und ihre Freisetzung aus σA-RNAP bei NTP-Konzentrationen &gt; 40 μM stark beschleunigt wird, was die Rolle der 6S-1 RNA während der Nährstoffversorgung unterstützt. In Gel-Assays binden die regulatorischen 6S-1 und 6S-2 RNAs von Bacillus subtilis mit submikromolarer Affinität an das Holoenzym der Housekeeping-RNA-Polymerase (σA-RNAP). Wir haben eine Co-Aufreinigung endogener 6S RNAs aus einem aus der Literatur bekannten B. subtilis Stamm beobachtet, der eine His-markierte RNAP exprimiert. Solche 6S RNA Kontaminationen in σA-RNAP Präparaten reduzieren den Anteil der Enzyme, die für die Bindung an DNA-Promotoren zugänglich sind. Darüber hinaus führt dies zu einer Hintergrund-RNA-Synthese durch σA-RNAP, die die co-aufgereinigte 6S RNA als Vorlage für die Synthese kurzer, fehlgeschlagener Transkripte, so genannter Produkt-RNAs (pRNAs), verwendet. Um dieses Problem zu vermeiden, haben wir einen B. subtilis Stamm konstruiert, der His-markierte RNAP exprimiert, aber Deletionen der beiden 6S RNA Gene trägt. Das His-markierte, 6S RNA-freie σA-RNAP Holoenzym kann mit ausreichender Reinheit und Aktivität in einem einzigen Affinitätsschritt hergestellt werden. Wir berichteten auch über die Expression und separate Reinigung von B. subtilis σA, dass der His-markierten RNAP hinzugefügt werden kann, um die Menge des Holoenzyms und damit die in vitro Transkriptionsaktivität zu maximieren. Um unsere Hypothese zu testen, dass die regulatorische Rolle der 6S RNAs unter natürlichen, sich ständig ändernden Umweltbedingungen besonders wichtig sein könnte, konstruierten wir 6S RNA Deletionsmutanten des undomestizierten B. subtilis Wildtyp Stammes NCIB 3610. Wir beobachteten einen starken Phänotyp unter Stressbedingungen, bei dem der Δ6S-2 RNA Stamm eine verzögerte Schwarmaktivität und eine frühere Sporenbildung aufwies. Im Gegensatz dazu wies der Δ6S-1&amp;2 Doppelknockout Stamm eine geringere Sporenbildung auf als der Wildtyp. Außerdem konnten wir zeigen, dass 6S Mutanten, die unter nährstoffreichen Bedingungen wuchsen, keinen starken Phänotyp aufwiesen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass beide 6S RNAs zur Fitness von B. subtilis unter den unbeständigen und zeitweise rauen Bedingungen in natürlichen Lebensräumen beitragen.