title: Mechanistische und strukturelle Untersuchungen verschiedener nicht kodierender RNAs in Bakterien
title: Mechanistic and structural analyses of different non-coding RNAs in bacteria
title: Mechanistic and structural analyses of different non-coding RNAs in bacteria
Creators: name: Köhler, Karen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Aquifex aeolicus
RNase P
6S RNA
nicht kodierende RNAs
Chemie
non-coding RNA

description: RNase P RNA and 6S RNA are two non
      coding RNAs found in essentially all (RNase P RNA) or most
      (6S RNA) known bacteria. The tRNA maturation function of
      RNase P is highly essential but until now the catalytic
      mechanism is not fully understood. We started to investigate
      the two metal-ion-based mechanism via dynamical NMR
      measurements. For this purpose, we used a shortened variant
      of the Escherichia coli (E. coli) RNase P RNA (~370 nt) which
      lacks most of the specificity domain (E. coli RNase P RNA
      catalytic domain termed Ecat) to minimize the amount of NMR
      signals. Furthermore, we designed several hairpin-like
      minimal substrates containing a 5’ leader to determine
      nucleotides (substrate and Ecat) that are involved in the
      catalytically process. Due to the fact, that Ecat lost the
      function to cleave a substrate alone, the E. coli RNase P
      protein (C5 protein) was essential for the reaction. Here i)
      the homogeneity of the Ecat variant ii) the stability of
      C5-protein at room temperature and iii) the cleavability of
      the minimal substrates was tested. Further investigations on
      the usability of the minimal substrates for NMR measurements
      were performed. 6S RNA is a bacterial small non-coding RNA
      with a length of approximately 200 nt. First described in E.
      coli it was later detected in all branches of the bacterial
      kingdom [Barrick et al., 2005]. Among them the well-known
      model organisms E. coli and B. subtilis (Bacillus subtilis),
      but also extremophilic organisms such as the Aquificales
      bacteria were predicted to harbor a 6S RNA. The function of
      6S RNA remained elusive for decades. Nowadays it is known
      that 6S RNA is a transcriptional regulator, binding RNA
      polymerases (RNAP) containing the housekeeping sigma factor
      to inhibit gene expression upon transition into stationary
      growth phase [Wassarman and Storz, 2000; Beckmann, Hoch et
      al., 2012]. Although 6S RNA is thought to compete with 70
      (E. coli) or A (B. subtilis)- dependent promoters for
      binding to A/70 RNAP by mimicking an open DNA promoter
      structure also promoters regulated by other sigma factors
      were found to be affected by a 6S RNA knockout [Wassarman,
      2007]. When bound to RNAP 6S RNA is used as a template for
      the synthesis of short 'product' RNAs (pRNAs). While shorter
      pRNAs (~ 8-mers) dissociate from the complex, transcription
      of pRNAs exceeding a certain minimal length leads to a
      persistent rearrangement of the 6S RNA structure which
      results in the dissociation of 6S RNA:RNAP complexes
      [Beckmann and Hoch et al., 2012; Steuten et al., 2014]. A 6S
      RNA homolog was also identified in an experimental RNomics
      study based on a cDNA library derived from small RNAs
      expressed in the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus
      [Willkomm et al., 2005]. A. aeolicus 6S RNA is predicted to
      form a canonical rod-shaped secondary structure with a
      central bulge region. The central bulge is flanked by two
      stem structures: i) the terminal or closing stem formed by
      the bases located at the 5’ and 3’ end of 6S RNA and ii) the
      internal stem arranged in a hairpin like structure.
      Comprising only 163 nt and a G/C- ratio of ~ 61% this 6S RNA
      exhibits the most stable structure among all known 6S RNAs.
      In this work the secondary structure of A. aeolicus 6S RNA
      and its structural change after pRNA transcription were
      investigated by NMR. NMR studies were performed on free 6S
      RNA as well as 6S RNA:pRNA hybrids, using a putative pRNA 15
      mer previously found by deep sequencing analysis. Due to the
      fact that an maximal RNA size for NMR measurements is approx.
      80 nt, the A. aeolicus 6S RNA was shortened either at the
      terminal stem (132-nt 6S RNA variant) or at both (terminal
      and internal) stem regions (85-nt 6S RNA variant). By
      analyzing these two shortened 6S RNA variants via NMR, we
      were able to verify formation of several predicted structural
      stem elements within the terminal and the internal stem, as
      well as predicted structural transitions upon pRNA binding.
      Additionally, the secondary structure of A. aeolicus 6S RNA
      was investigated by enzymatic and chemical structure probing
      to complement the NMR data in order to obtain a more
      fine-grained model of the RNA’s solution structure. We could
      finally clarify that the free 6S RNA is formed as expected,
      whereas the solved structure of the 6S RNA:pRNA hybrid shows
      intense divergence to the prediction. First of all, we could
      show that the terminal stem remains solidly paired even after
      the pRNA induced rearrangement of the 6S RNA structure.
      Moreover, hairpin formation in the 3´ central bulge (CB),
      which is known e.g. from B. subtilis 6S RNA, could not be
      detected. In line with the prediction we were able to prove
      the pRNA mediated formation of the CB collapse helix. Besides
      the structural investigation of 6S RNA we were interested in
      mechanistic aspects. To determine if A. aeolicus 6S RNA
      shares hallmark features with canonical 6S RNAs we employed
      the RNAP from B. subtilis which is well investigated in terms
      of 6S RNA binding and pRNA transcription [Beckmann et al.,
      2011; Beckmann, Hoch et al., 2012; Burenina et al., 2014].
      Using B. subtilis RNAP for in vitro transcription, the 6S RNA
      of A. aeolicus was demonstrated to serve as a template for
      pRNA transcription and to undergo the structural
      rearrangement upon pRNA hybridization comparable to already
      known 6S RNAs of E. coli and B. subtilis. However, inhibiting
      formation of the central bulge collapse helix leads to
      inefficient 6S RNA:pRNA release from the RNAP complex, in A.
      aeolicus as well as in B. subtilis. This observation suggests
      that an efficient release of 6S RNA:pRNA hybrids from the
      complex with RNAP can only be induced by pRNAs whose
      transcription is initiated at their canonical position in 5’
      CB.
description: RNase P RNA und 6S RNA sind zwei
      nicht codierende RNAs die im Grunde in allen (RNase P RNA)
      oder in den meisten (6S RNA) bekannten Bakterien gefunden
      wurden. Die Funktion der tRNA Maturation von RNase P ist
      äußerst wichtig, aber bis jetzt noch nicht vollständig
      verstanden. Wir begannen den Zwei Metall Ionen Mechanismus
      mittels NMR Messungen zu untersuchen. Zu diesem Zweck
      verwendeten wir eine verkürzte Variante der Escherischia coli
      (E. coli) RNase P RNA (~370 nt) welcher der größte Teil der
      Spezifitäts-Domaine fehlt (E. coli RNase P RNA katalytische
      Domain genannt Ecat), um die Menge an NMR-Signalen zu
      minimieren. Weiterhin haben wir einige Haarnadel ähnliche
      Minimalsubstrate entworfen, die eine einzelsträngige 5‘
      Leitsequence beinhaltet, um die Nukleotide (Substrate und
      Ecat), die an dem katalytischen Prozess beteiligt sind, zu
      ermitteln. Da Ecat die Funktion ein Substrat ohne die Hilfe
      zu binden und somit zu spalten verloren hat, musste das E.
      coli RNase P Protein (C5-Protein) zur Reaktion zugesetzt
      werden. Wir testeten i) die Homogenität der Struktur der Ecat
      Variante, ii) die Stabilität des C5-Proteins bei längerer
      Aufbewahrung bei Raumtemperatur und iii) die Effektivität der
      Spaltung der verschiedenen Minimalsubstrate. Weiter wurde
      auch die Verwendbarkeit der Minimalsubstrate für folgende NMR
      Messungen getestet. 6S RNA ist eine bakterielle kleine,
      nicht-codierende RNA mit einer Länge von ca. 200 nt. Zum
      ersten Mal beschrieben in E. coli wurde 6S RNA später in
      allen Bereichen der Bakterienwelt gefunden [Barrick et al.,
      2005]. Unter ihnen befinden sich die Modellorganismen E. coli
      und B. subtilis, aber ebenso extremophile Organismen wie
      Aquificales Bakterien wurde der Besitz einer 6S RNA
      vorausgesagt. Die Funktion der 6S RNA blieb jahrzehntelang
      unbekannt. Heutzutage ist bekannt, dass 6S RNA die
      Transkription reguliert, indem sie mit der RNA-Polymerase
      (RNAP) interagieren, die die Enzym-eigene Sigma Untereinheit
      enthält. Diese ist für die Genexpression beim Übergang in die
      stationären Phase zuständig, welche durch die Bindung an die
      6S RNA inhibiert wird [Wassarman und Storz, 2000; Beckmann
      und Hoch et al., 2012]. Obwohl angenommen wird, dass 6S RNA
      mit 70 (E. coli) oder A (B. subtilis) abhängige
      DNA-Promotoren um die Bindung an die A/70-RNAP konkurriert,
      indem sie eine offene DNA Promotor Struktur imitiert, wurden
      auch Promotoren, die von anderen Sigma-Faktoren reguliert
      werden, gefunden, die durch 6S RNA Deletion beeinflusst
      werden [Wassarman, 2007]. Wenn 6S RNA an die RNAP gebunden
      ist, wird sie als Matrize zur Transkription kurzer ´Produkt‘
      RNAs (pRNAs) verwendet. Während kürzere pRNAs (~ 8 mere) vom
      Komplex dissoziieren, erreicht die pRNA während der
      Transkription durch Zugabe frischem Mediums (erneute
      exponentielle Phase) eine minimale Länge, die zu einer
      Umlagerung der 6S RNA Struktur führt. Diese wiederum
      initiiert die Ablösung der 6S RNA:pRNA Hybridstruktur aus dem
      6S RNA:RNAP Komplexes [Beckmann und Hoch et al., 2012;
      Steuten et al., 2014]. Ein 6S RNA Homolog wurde in einer in
      einer cDNA Bibliothek kleiner RNAs basierend auf einer
      experimentellen RNomics Studie in dem hyperthermophilien
      Bakterium Aquifex aeolicus identifiziert [Willkomm et al.,
      2005]. Diese 6S RNA weist Berechnungen zur Folge die
      kanonische stäbchenartige Sekundärstruktur mit dem zentralen
      Bauch Bereich auf. Der zentrale Bauch Bereich ist von zwei
      Stammstrukturen flankiert: i) der terminale oder
      Schluss-Stamm, der durch Basen des 5‘- und 3‘-Endes der 6S
      RNA geformt wird und ii) der interne Stamm mit einer
      Haarnadel ähnlichen Struktur. Mit nur 163 nt und einem G/C
      Gehalt von ~ 61% dieser 6S RNA, weist die stabilste Struktur
      aller bekannten 6S RNAs auf. Diese Arbeit wurde durchgeführt
      um die Sekundärstruktur der freien A. aeolicus 6S RNA als
      auch die umgelagerte Struktur nach der 6S RNA:pRNA
      Hybridisierung mittels NMR zu bestimmen. Es wurden NMR
      Messungen an der freien 6S RNA als auch an der 6S RNA:pRNA
      hybridisierten Struktur durchgeführt. Dafür haben wir eine
      15-nt pRNA gewählt, deren Sequenz wir in einer mittels Deep
      Sequencing identifiziert haben. Um eine möglichst kleine RNA
      (~80 nt; Größenlimit für NMR Messungen) vermessen zu können,
      wurden zwei durch Mutation verkürzte Varianten der A.
      aeolicus 6S RNA verwendet (132-nt Variante: Verkürzt durch
      Mutation des terminalen Stamms; 85 nt Variante: Verkürzt
      durch Mutation des terminalen und des internen Stammes). Wir
      konnten durch Vermessung dieser 6S RNA Varianten verschiedene
      vorhergesagte Stammregionen im terminalen und internen
      Stammbereich verifizieren und ebenso strukturelle Übergänge
      durch die pRNA Bindung. Zusätzlich haben wir zur
      Sekundärstrukturaufklärung enzymatischen und chemischen
      Sonden Experimenten durchgeführt, zum komplettieren der NMR
      Daten um ein fein strukturiertes Model zu erhalten.
      Abschließend konnten wir klären, dass die freie 6S RNA
      Struktur geformt ist, wie zuvor in silico berechnet. Einige
      Ergebnisse wichen jedoch immens von den berechneten
      Vorhersagen ab, wie die Struktur des terminalen Stamms, der
      nach der pRNA-induzierten Umlagerung weiterhin geschlossen
      vorliegt. Außerdem konnte keine Ausbildung einer
      Haarnadelstruktur am 3‘ zentralen Bauch (CB) in der
      Hybridstruktur, bekannt von z.B. B. subtilis 6S RNA,
      aufgedeckt werden. In Einklang mit der Berechnung konnten wir
      den pRNA vermittelten Kollaps des zentralen Bauch Bereiches
      (CBC) mit einhergehender Bildung der CBC Helix bestätigen.
      Neben der Strukturaufklärung waren wir ebenfalls an der
      Funktion dieser 6S RNA interessiert. Um herauszufinden, ob
      die A. aeolicus 6S RNA die typischen Funktionen einer
      kanonischen 6S RNA aufweist, verwendeten wir die in Hinsicht
      auf 6S RNA Bindung und pRNA Transkription gut untersuchte B.
      subtilis RNAP [Beckmann et al., 2011; Beckmann, Hoch et al.,
      2012; Burenina et al., 2014]. Durch Verwendung der B.
      subtilis RNAP konnte gezeigt werden, dass A. aeolicus 6S RNA
      (132 nt) als Matrize zu pRNA Transkription dient und eine
      strukturelle Umlagerung vergleichbar zu bekannten 6S RNAs von
      E. coli und B. subtilis induziert wird. Indes führt die
      Inhibition der CBC Helix-Bildung sowohl in A. aeolicus als
      auch in B. subtilis zu einer ineffizienten Ablösung des 6S
      RNA:pRNA Hybrids von der RNAP. Diese Beobachtung suggeriert,
      dass eine effektive Ablösung des 6S RNA:pRNA Hybrids aus dem
      Komplex mit RNAP nur durch pRNAs induziert werden kann, deren
      Transkription an der kanonischen Position des 5‘ CB gestartet
      wird.