Divalent cations stimulate DNA repair activities of bacterial (6-4) photolyases
Creators: name: Ma, Hongju
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2018
Subjects: DNA repair
photolyase
photoreduction
pyrimidine dimer

description: Die (6-4) Photolyasen der bakteriellen Cryptochrom/Photolyase (BCP) -Gruppe gehören zu einer Familie von Flavoproteinen, die als Reparaturenzyme für UV-B-induzierte DNA-Läsionen (Photolyasen) oder als Blaulicht-Photorezeptoren (Cryptochrome) fungieren. Die (6-4) BCP-Proteine kommen ausschließlich in Prokaryoten vor.
 In dieser Arbeit wurden 3 Mitglieder der (6-4) BCP-Gruppe, PhrB von Agrobacterium fabrum, CryB von Rhodobacter sphaeroides und Proma-PL von Prochlorococcus marinus mit einer eukaryotischen (6-4) Photolyase von Ostreococcus tauri OtCPF1 und einem Mitglied der Klasse III CPD Photolyasen PhrA von Agrobacterium fabrum verglichen. Es zeigte sich, dass die DNA-Reparatur-Effizienz von (6-4) BCP-Proteinen durch Mg2+ oder andere zweiwertige Kationen stimuliert wird, während bei OtCPF1 und PhrA keine Wirkung von zweiwertigen Kationen beobachtet wurde.
 Der Einfluss zweiwertiger Kationen auf die Photoreduktion bei verschiedenen Photolyasen wurde ebenfalls untersucht. Die Photoreduktion von PhrB wurde durch Mg2+ negativ beeinflusst, während bei PhrA Mg2+ einen stimulierenden Effekt hatte. Es stellte sich klar heraus, dass die Abhängigkeit von Mg2+ bei der DNA-Reparatur der (6-4) BCP und nicht bei der Photoreduktion zu suchen ist. Die veranlasste uns zu der Annahme, dass Mg2+ die DNA-Bindung und -Reparatur in (6-4) BCP-Proteinen beeinflusst. Zusammen mit den Strukturdaten und der Sequenzanalyse fanden wir eine vorgeschlagene Mg2+ Bindungsposition neben der DNA-Läsion und modifizierten die beiden betreffenden Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese. Der Effekt von Mg2+ ging für beide Mutanten verloren, während die Basisreparaturaktivität ohne Mg2+ von der Mutation nicht beeinflusst wurde. Vermutlich fördert Mg2+ die Bindung der (6-4) Läsion und erhöht die Elektronen-Affinität des Substrats. Außerdem wird die Barriere für Elektronentransfer verringert, wodurch und die Reaktion reibungsloser verläuft. Ich untersuchte auch die Reparatureffizienz für verschiedene Längen einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA. Je länger die DNA war, desto schneller war die Reparatur. Bei einer Länge der DNA von 12 nt oder mehr änderte sich allerdings mit Zunahme der Länge die Geschwindigkeit der Reparatur nicht mehr.  
In dieser Arbeit werden auch die Mutanten PhrB-Y424F und PhrB-I51W vorgestellt. Tyr424 von PhrB ist Teil der DNA-Bindungsstelle und könnte eine Elektronenverbindung zum Fe-S-Cluster bilden. Die PhrB-Y424F-Mutante zeigte eine starke Verringerung der Bindung von Läsions-DNA und DNA-Reparatur. Die Mutante PhrB-I51W ist durch den Verlust des DMRL-Chromophors, reduzierte Photoreduktion und reduzierte DNA-Reparaturkapazität gekennzeichnet. Die Kristallstrukturen zeigen eine hohe Übereinstimmung mit der Wildtyp-Struktur, somit beeinflussen Mutationen nur lokale Proteinumgebungen.  
Die Photoreduktion von PhrB sich unterscheidet von dem typischen Muster, da die dem FAD benachbarte Aminosäure der Elektronenkaskade ein Tyrosin (Tyr391) ist, während Photolyasen und Cryptochrome anderer Gruppen ein Tryptophan als direkten Elektronendonor von FAD besitzen. In einer Mutante, in der Tyr391 durch Tryptophan ersetzt wurde, ging der Cofaktor-FAD verloren und die PhrB-Struktur war instabil. Trp342 und Trp390 sind für den Ladungstransfer essentiell sind. Trp342 befindet sich an der Peripherie von PhrB. Die Rolle von Tyr391, die zwischen Trp390 und FAD liegt, war jedoch unklar, da der Ersatz durch Phenylalanin die Photoreduktion nicht blockierte. Bei der Substitution von Tyr391 durch Ala wurde die Photoreduktion blockiert, was darauf hindeutet, dass Tyr391 ein Teil der Elektronentransferkette ist und zeigt, dass der Ladungstransfer über die Triade 342-391-390 erfolgt. Diese Ergebnisse deuten auf ein tunneling (Elektronentransfer ohne Ladungsänderung) zwischen Trp390 und FAD hin.