Ανάπτυξη μεθόδων μεταβολομικής ανάλυσης για την εύρεση βιοδεικτών δυναμικού ανθρώπινης αναπαραγωγής
Creators: name: Βιργιλίου, Χριστίνα Ε.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Μεταβολομική
Υγρή χρωματογραφία υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων
Εξωσωματική γονιμοποίηση
Προωρότητα τοκετού
Metabolomics
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
In Vitro Fertilisation
Premature Delivery

description: Σκοπός αυτής της Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθόδων ολιστικής και στοχευμένης μεταβολομικής ανάλυσης και η εφαρμογή τους στην ανάλυση βιολογικών δειγμάτων διαφορετικού υποστρώματος καθώς και σε κυτταρικές καλλιέργειες εμβρύων για την εύρεση βιοδεικτών ανθρώπινης αναπαραγωγής. Συγκεκριμένα δείγματα αμνιακού υγρού, ορού αίματος εγκύων γυναικών καθώς και δείγματα εξωκυττάριου θρεπτικού υλικού του κύκλου IVF αναλύθηκαν με τις πιο διαδεδομένες τεχνικές μεταβολομικής ανάλυσης συμπεριλαμβανομένου των LC-MS/MS, GC-MS, NMR, FTICR-MS και UPLC-TOF/MS. Για τις ανάγκες τις παρούσας διατριβής αναπτύχθηκε μια μέθοδος στοχευμένης μεταβολομικής ανάλυσης με την τεχνική (HILIC) UPLC-MS/MS ικανή για την ανίχνευση και σχετική ποσοτικοποίηση περισσότερων από 100 ενδογενών και μη μεταβολιτών. Η ικανότητα ακριβούς ποσοτικοποίησης δεκάδων αναλυτών με μια μόνο έγχυση δείγματος και ανάλυση προσφέρει απαράμιλλα χαρακτηριστικά στη μέθοδο, δεδομένου ότι μπορεί να βελτιώσει το πεδίο εφαρμογής, την τεκμηρίωση και την εναρμόνιση των αποτελεσμάτων. Η τεχνική GC-MS είναι μεταξύ των πιο διαδεδομένων λόγω της ικανότητάς της για υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια στην ανάλυση, και της επαναληψημότητας στο προφίλ θραυσματοποίησης των μορίων. Η βελτιστοποίηση της μεθόδου καθιστά την τεχνική GC-MS ένα πολύτιμο εργαλείο στη μεταβολομική ανάλυση. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής παρέχουν σαφείς ενδείξεις ότι η μεταβολομική προσέγγιση μπορεί να προσφέρει πλεονεκτήματα στην έρευνα της αιτιολογίας του πρόωρου τοκετού. Τα έμβρυα που αναπτύσσονται in vitro και έχουν υψηλό δυναμικό ανάπτυξης μεταβάλλουν το περιβάλλον τους με διαφορετικό τρόπο συγκριτικά με τα έμβρυα που δεν αναπτύσσονται και δεν εμφυτεύονται επιτυχώς. Η στοχευμένη ανάλυση αποκάλυψε διαφορές στο μεταβολικό προφίλ του εξωκυττάριου περιεχομένου από έμβρυα με διαφορετικά ποσοστά εμφύτευσης. Η χαρτογράφηση του μεταβολικού περιεχομένου των δειγμάτων εξωεμβρυϊκής κοιλότητας αυξάνουν τη σχετική βιοχημική / κλινική εικόνα και θα μπορούσαν να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την σχετική έρευνα, με δυνατότητες ανακάλυψης βιοδεικτών που θα μπορούσαν να σχετίζονται με την ανάπτυξη του εμβρύου, την εξέλιξη της εγκυμοσύνης, και την τελική έκβαση.
description: The aim of the present PhD study is the development of metabolomics based methods for both holistic and targeted analysis and their application to different biofluids and extracellular culture medium for biomarker discovery corresponding to human reproduction. Specifically amniotic fluid and serum samples of women from 2nd trimester of their pregnancy and extracellular culture media from IVF procedure were analysed using cutting edge technologies for metabolomics studies including LC-MS/MS, GC-MS, NMR, FTICR-MS and UPLC-TOF/MS instrumentation. For the needs of the present PhD study a targeted metabolomics based method able to detect and quantify more than 100 primary polar metabolites was developed using (HILIC)UPLC-MS/MS technique. The capability to accurately quantify tens of difficult- to- analyse polar metabolites in one LC injection offers unparalleled method characteristics as it can improve method applicability, documentation and harmonization. GC-MS is among the most widely applied because of its ability to show high sensitivity and resolution, and a reproducible fragmentation pattern of molecules. Improvements on GC-MS methods render GC-MS an important tool for metabolomic applications. The present study provides new knowledge on the correlation of serum and amniotic fluid metabolic profiles to fetal growth and premature delivery. Metabolic content changes could be detected in maternal serum and amniotic fluid at the 2nd trimester of pregnancy in women who later deliver preterm in comparison to paired samples of women who deliver at term. The data summarized from this PhD study strongly suggest that in vitro cultured embryos that have a high developmental potential alter their environment differently compared to embryos that for various reasons do not develop further or failed to implant. Targeted and holistic profiling analysis revealed differences in metabolic profile of extracellular media content from embryos with different implantation rates. The metabolic mapping of both Coelomic Fluid and Coelomic Fluid Cells increases the relevant biochemical/clinical insight and could provide useful information for related research, with potential further use for the discovery of biomarkers that could be related to fetal growth, pregnancy development, and outcome.