title: “Genetic and biochemical analysis of the regulation of N-Cadherin through the Arf-GEF Schizo and Arp2/3 complex mediated F-actin formation during myoblast fusion in Drosophila melanogaster”
title: „Genetische und biochemische Analysen zur Regulation von N-Cadherin durch den Arf-GEF Schizo und zur Arp2/3-Komplex vermittelten F-Aktin Bildung während der Myoblastenfusion von Drosophila melanogaster“
Creators: name: Groth, Verena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Entwicklungsbiologie
Muskelentwicklung
Developmental biology
Drosophila
Naturwissenschaften
Myogenesis

description: In the development of
      multicellular organisms, cell-cell fusion is a rare,
      nevertheless elementary process. A well-studied example is
      the fusion of founder cells (FCs) with fusion-competent
      myoblasts (FCMs) during the formation of the somatic muscles
      of Drosophila melanogaster. At the beginning of this process,
      myoblasts must specifically recognize and adhere to each
      other. Subsequently, intracellular signaling pathways are
      activated resulting in the merger of the plasma membranes and
      the reorganization of the cytoplasm. All these steps involve
      actin-based processes. Mutants of the gene schizo (also
      called loner) show only unfused myoblasts, suggesting an
      essential function of this gene during fusion (Chen et al.,
      2003). Schizo is a guanine-nucleotide exchange factor (GEF)
      for Arf GTPases that are involved in secretory and endocytic
      vesicle transport, membrane organization and reorganization
      of the actin cytoskeleton. The present work is divided into
      two parts. In the first part analysis of the Schizo
      interaction partners N-Cadherin and CG12006 were performed.
      The second part deals with the reorganization of the actin
      cytoskeleton during myoblast fusion. In an attempt to learn
      more about the function of Schizo during myoblast fusion, we
      performed a yeast 2-hybrid screen that resulted in the
      identification of the Ca2+-dependent adhesion molecule
      N-Cadherin as a Schizo interaction partner (Diplomarbeit V.
      Groth, 2008). The focus of this work lies on the
      characterization of this interaction. CadN localizes to the
      cell membranes of FCs and FCMs in the early fusion-relevant
      stages. Surprisingly, the loss of CadN does not result in
      muscle defects. Interestingly, studies in vertebrate cell
      culture showed that cell adhesion molecules must be removed
      from the fusion site and that the cell fusion takes place in
      protein-free regions of the membrane. Genetic interaction
      studies described in this work suggest that Schizo acts as a
      negative regulator that initiates the internalization of
      CadN. Another hint for this is provided by live-imaging cell
      culture studies in which a co-localization of
      CadNTMintra-eGFP and Schizo-fl-mCherry in small vesicular
      structures can be observed. In this context, various
      endocytic pathways were analyzed. Based on the results of
      this work it is postulated that CadN must be removed from the
      membrane before the actual merger of the cell membranes can
      occur and that this is achieved by Schizo-mediated
      endocytosis of CadN. Another putative Schizo interaction
      partner is the α2-mannosyltransferase CG12006.
      Mannosyltransferases are involved in the biosynthesis of
      glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors needed to anchor
      proteins without transmembrane domain to the cell surface.
      In-situ hybridizations in this study show the
      mesoderm-specific expression of CG12006. Interestingly, the
      RNAi-induced loss of CG12006 results in mild fusion defects,
      suggesting a relevance of the GPI anchor biosynthesis for
      myoblast fusion. Concerning the reorganization of the actin
      cytoskeleton during the fusion process, several actin
      regulators were analyzed in relation to myoblast fusion.
      Interestingly, a genetic interaction between
      Chickadee/Profilin and Wip during myoblast fusion was
      observed. The double mutant was characterized at the cellular
      and ultrastructural level. Furthermore, the
      nucleation-promoting factor Cortactin and Wip seem to
      interact genetically. Therefore, the studied actin regulators
      Chic and Cortactin seem to participate in the complex
      actin-regulatory mechanism during myoblast fusion.
description: In der Entwicklung multizellulärer
      Organismen ist die Zell-Zell Fusion ein seltener, doch
      elementarer Prozess. Ein gut untersuchtes Beispiel hierfür
      ist die Fusion von Founderzellen (FCs) mit fusionskompetenten
      Myoblasten (FCMs) bei der Bildung der somatischen Muskulatur
      von Drosophila melanogaster. Zu Beginn dieses Prozesses
      müssen sich die Myoblasten spezifisch erkennen und aneinander
      adhärieren. Anschließend werden intrazelluläre Signalketten
      aktiviert, welche in die Membranverschmelzung und
      Reorganisation des Zytoplasmas resultieren. All diese
      Schritte beinhalten Aktin-basierte Prozesse. Mutanten für das
      Gen schizo (auch loner genannt) weisen nur unfusionierte
      Myoblasten auf, was auf eine essentielle Funktion dieses Gens
      für den Fusionsprozess hindeutet (Chen et al., 2003). Schizo
      ist ein Guanin-Nukleotidaustauschfaktor (GEF) für
      Arf-GTPasen, die am sekretorischen und endozytotischen
      Vesikeltransport, der Membranorganisation und der
      Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts beteiligt sind. Die
      vorliegende Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Im ersten
      Teil dieser Arbeit wurden Analysen zu den Schizo
      Interaktionspartnern N-Cadherin und CG12006 durchgeführt. Der
      zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der
      Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts während der
      Myoblastenfusion. Interessanterweise wurde in einem Hefe
      Zwei-Hybrid Screen die Interaktion von Schizo mit dem
      Adhäsionsmolekül N-Cadherin (CadN) festgestellt (Diplomarbeit
      V. Groth, 2008). Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der
      Charakterisierung dieser Interaktion. Der Nachweis von CadN
      zeigt die Lokalisation in der Zellmembran der FCs und FCMs in
      frühen fusionsrelevanten Stadien, was eine Beteiligung an der
      Adhäsion der Myoblasten möglich macht. Erstaunlicherweise
      resultiert der Verlust von CadN jedoch nicht in
      Muskeldefekten. Interessanterweise zeigen Studien in
      Vertebraten Zellkultur, dass Zelladhäsionsmoleküle von der
      Fusionsstelle entfernt werden müssen und dass die Zellfusion
      in proteinfreien Regionen der Membran stattfindet. In dieser
      Arbeit durchgeführte genetische Interaktionsstudien deuten
      darauf hin, dass Schizo als negativer Regulator die
      Internalisierung von CadN initiiert. Ein weiteres Indiz
      hierfür liefern Beobachtungen in live-imaging
      Zellkulturstudien, in denen eine Kolokalisation von
      CadNTMintra-eGFP und Schizo-fl-mCherry in kleinen vesikulären
      Strukturen beobachtet werden kann. In diesem Zusammenhang
      werden verschiedene Endozytosemechanismen beleuchtet.
      Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit wird postuliert,
      dass CadN vor der eigentlichen Fusion von der Zellmembran
      entfernt werden muss und dass dies durch Schizo-vermittelte
      Endozytose reguliert wird. Ein weiterer putativer Schizo
      Interaktionspartner ist die α2-Mannosyltransferase CG12006.
      Mannosyltransferasen sind in die Biosynthese von
      Glykosylphosphatidylinositol (GPI) Ankern involviert, über
      die Proteine ohne Transmembran-Domäne an der Zelloberfläche
      verankert werden können. In situ Hybridisierungen in dieser
      Arbeit zeigen die Mesoderm-spezifische Expression von
      CG12006. Interessanterweise resultiert der RNAi-induzierte
      Genverlust von CG12006 zudem in leichten Fusionsdefekten, was
      auf eine Relevanz der GPI-Anker Biosynthese für die
      Myoblastenfusion hinweist. Im Zusammenhang mit der
      Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts während des
      Fusionsprozesses wurden verschiedene Aktinregulatoren im
      Bezug auf die Myoblastenfusion analysiert. Interessanterweise
      wurde in Analogie zum Vertebratensystem in dieser Arbeit eine
      genetische Interaktion zwischen Chickadee/Profilin und Wip
      während der Myoblastenfusion festgestellt. Die Doppelmutante
      wurde auf zellulärer und ultrastruktureller Ebene
      charakterisiert. Des Weiteren scheinen der
      kernbildungsfördernde Faktor Cortactin und Wip genetisch zu
      interagieren. Die in dieser Arbeit untersuchten
      Aktinregulatoren Chic und Cortactin scheinen sich somit in
      den komplexen Aktin-Regulationsmechanismus während der
      Myoblastenfusion einzufügen.