Φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος στελεχών Pasteurella multocida και Mannheimia haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών (προβάτων, αιγών, βοοειδών) και χοίρων:
Creators: name: Βουγίδου, Χριστίνα Π.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Pasteurella multocida
Mannheimia haemolytica
Μηρυκαστικά
Χοίροι
Ruminants
Pigs

description: Σκοπός της διατριβής ήταν ο φαινοτυπικός και γονοτυπικός έλεγχος στελεχών της P. multocida και της M. haemolytica που απομονώθηκαν από πνεύμονες μηρυκαστικών και χοίρων. Η ταυτοποίηση των στελεχών έγινε με βασικές βιοχημικές δοκιμές, καθώς και με τη μέθοδο της PCR. Η μέθοδος της PCR χρησιμοποιήθηκε και για τη διάκριση των τύπων (A, B, D, E και F) των στελεχών της P. multocida, ενώ η οροτυποποίηση των στελεχών της M. haemolytica έγινε με τη δοκιμή της έμμεσης αιμοσυγκόλλησης. Επιπλέον, τα στελέχη εξετάσθηκαν για την παρουσία γονιδίων λοιμοτοξικότητας. Συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκαν με PCR τα γονίδια toxA και ompA της P. multocida και τα γονίδια lktA και ompA της M. haemolytica. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου ompA της P. multocida με τη μέθοδο PCR-RFLP και την ανάλυση της αλληλουχίας του DNA του γονιδίου. Στα στελέχη της M. haemolytica, έγινε ανάλυση της αλληλουχίας του DNA των γονιδίων lktA και ompA, ενώ για τη μελέτη των πολυμορφισμών στο γονίδιο ompA χρησιμοποιήθηκε και η μέθοδος DGGE. Πνεύμονες με μακροσκοπικές αλλοιώσεις πνευμονίας συλλέχθηκαν από 21 συνολικά σφαγεία όλης της χώρας. Εξετάσθηκαν συνολικά 491 δείγματα, ενώ παράλληλα εξετάσθηκαν και οκτώ δείγματα πνευμονικού ιστού ζώων από εκτροφές, τα οποία παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα πνευμονίας. Απομονώθηκαν 144 στελέχη P. multocida και 103 στελέχη M. haemolytica. Ο επιπολασμός των δύο βακτηριακών ειδών βρέθηκε να διαφέρει ανάμεσα στα είδη των ζώων που μελετήθηκαν. Μεταξύ των στελεχών της P. multocida, βρέθηκαν οι τύποι Α (86,1%), D (13,2%) και F (0,7%). Το γονίδιο toxA ανιχνεύθηκε σε ποσοστό 43% στο σύνολο των στελεχών της P. multocida. Στους χοίρους και στα βοοειδή, το ποσοστό ήταν χαμηλό (2,3% και 5,3% αντίστοιχα). Αντίθετα, στα στελέχη των μικρών μηρυκαστικών, το ποσοστό ανίχνευσης του γονιδίου ήταν απρόσμενα υψηλό (85,7% στις αίγες και 93,2% στα πρόβατα), γεγονός που εγείρει ερωτήματα σχετικά με τη σημασία της τοξίνης στην παθογένεια και επιδημιολογία των πνευμονικών λοιμώξεων από P. multocida στα συγκεκριμένα είδη ζώων. Η ανάλυση του γονιδίου ompA της P. multocida έδειξε πολύ μεγάλη ετερογένεια των στελεχών, ωστόσο ήταν δυνατή η διάκριση των στελεχών των μηρυκαστικών από τα στελέχη των χοίρων. Μεταξύ των στελεχών της M. haemolytica, ο επικρατέστερος ορότυπος ήταν ο Α2 (47,8% στο σύνολο των στελεχών). Στα πρόβατα, σε ποσοστό 11,8% βρέθηκαν ορότυποι που δεν περιλαμβάνονται στα εμβόλια του εμπορίου. Με τη μελέτη του γονιδίου ompA ήταν δυνατή η διάκριση της πλειονότητας των στελεχών των αιγών από αυτά των προβάτων. Η παρουσία πολλών πολυμορφισμών σε συντηρημένες, υδρόφοβες περιοχές του γονιδίου lktA και η μεγαλύτερη πιθανότητα ορισμένες από τις αλληλουχίες των ελληνικών στελεχών να έχουν το ρόλο MTS (mitochondrial targeting signal) αποτελούν σημαντικά ευρήματα της παρούσας έρευνας που χρήζουν μελλοντικής διερεύνησης. Η μελέτη του γονιδίου ompA έδειξε ότι συγκεκριμένα αλληλόμορφα φαίνεται να εμφανίζουν ειδικότητα ξενιστή και, επομένως, το γονίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη πρωτοκόλλου ταυτοποίησης στελεχών των δύο ειδών βακτηρίων. Τα ευρήματα της παρούσας έρευνας αποτελούν την πρώτη αναφορά μέχρι σήμερα στη γενετική ποικιλότητα του γονιδίου ompA της P. multocida.
description: The aim of this study was to phenotypically and genotypically characterize P. multocida and M. haemolytica strains isolated from pneumonic lungs of ruminants and pigs. Bacterial identification was performed using biochemical testing and PCR assays. A multiplex PCR assay was used for the capsular typing (types A, B, D, E and F) of P. multocida isolates, while an indirect haemagglutination test was used for serotyping M. haemolytica isolates. Furthermore, isolates were investigated for the presence of certain virulence genes. PCR assays were used to detect the presence of the toxA gene and the ompA gene in P. multocida isolates and the presence of the lktA gene and the ompA gene in M. haemolytica isolates. Moreover, a PCR-RFLP method and DNA sequence analysis were used to study the polymorphisms of the ompA nucleotide sequences obtained from P. multocida isolates. Among M. haemolytica isolates, the lktA and the ompA nucleotide sequences were analysed by DNA sequencing, while the polymorphisms of the ompA nucleotide sequences were also studied using DGGE. Pneumonic lung tissue samples were collected from 21 slaughterhouses throughout Greece. Four-hundred and ninety-one tissue samples were examined. In addition, eight lung tissue samples that originated from animals with clinical signs of pneumonia were included in the study. In total, 144 P. multocida strains and 103 M. haemolytica strains were isolated. However, the isolation rate varied among the different species. Among the P. multocida isolates, capsular types A (86.1%), D (13.2%) and F (0.7%) were found. The toxA gene was detected in 43% of the P. multocida isolates. The detection rate was quite low among the porcine and the bovine isolates (2.3% and 5.3% respectively). In contrast, the toxA gene was detected at an unexpectedly high rate in small ruminants (85.7% among caprine isolates and 93.2% among ovine isolates), suggesting a more important epidemiological role of toxA-positive strains for these animal species. Analysis of the ompA sequences revealed a great heterogeneity among the P. multocida isolates. However, the ruminant strains could be differentiated from the porcine strains by both methods. Among the M. haemolytica isolates, serotype A2 was the most prevalent (47.8%). It is interesting that 11.8% of the serotypes recovered from sheep are not represented in commercial vaccines. Analysis of the ompA sequences could differentiate the majority of the caprine strains from the ovine ones. The significant number of polymorphisms found in conserved, hydrophobic domains of the lktA gene and the increased probability of certain lktA sequences to act as a mitochondrial targeting signal (MTS) are two important findings that warrant future investigation. Analysis of the ompA sequences showed that certain alleles were associated with a single animal species, potentially revealing host specificity. Therefore, the ompA gene could serve as a target for the development of a molecular typing method of P. multocida and M. haemolytica isolates. To our knowledge, the results of the present study concerning the genetic diversity of the ompA gene among P. multocida isolates are the only, so far, available data on this subject.