PRECLINICAL AND PROTEOMIC EVALUATION OF A STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS CLINICAL ISOLATE IN ORTHOPEDIC BIOFILM-RELATED INFECTIONS
Creators: name: BOTTAGISIO, MARTA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: Il termine pseudoartrosi � riferito a un tipo di frattura caratterizzata dall?impossibilit� di una fisiologica guarigione. Le pseudoartrosi sono tra le complicazioni ortopediche pi� complesse non solo a livello clinico, ma anche a livello socio-economico incidendo drasticamente sia sulla qualit� di vita dei pazienti colpiti, sia sulle casse dei Sistema Sanitario Nazionale. Si stima che il 5-10% dei casi di frattura vada incontro allo sviluppo di pseudoartrosi e generalmente le ossa maggiormente interessate a questo fenomeno sono le ossa lunghe, tra le quali tibia, femore, omero, radio e ulna. Lo sviluppo di pseudoartrosi pu� conseguire la perdita di sostanza ossea, ad esempio a seguito di traumi o alla resezione di tumori, ma non solo, pu� anche derivare da una frattura che non riesce a consolidarsi. I fattori che possono maggiormente influenzare la corretta guarigione del tessuto osseo sono molteplici e spesso correlati allo stato di salute del paziente: la presenza di malattie metaboliche, l?et�, le abitudini alimentare e il fumo incidono drasticamente sul processo di guarigione della frattura. Un?ulteriore causa dello sviluppo di pseudoartrosi � l?insorgere di infezioni date da contaminazioni che possono susseguire fratture esposte o che possono avere luogo in sede operatoria. In questi casi si parla di pseudoartrosi settiche. � stato stimato che circa i due terzi dei casi clinici di pseudoartrosi settiche sono dovuti alla presenza di stafilococchi e pi� specificatamente alla presenza di Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. In particolare, S. epidermidis � stato recentemente riconosciuto come un importante patogeno opportunista coinvolto nell?aumento di infezioni nosocomiali, essendo comunemente presente sulla cute umana. S. epidermidis � un microrganismo commensale presenta fisiologicamente nella flora di pelle e mucose. A causa della sua presenza ubiquitaria � spesso difficile distinguere se un isolato clinico di S. epidermidis rappresenta l?agente causale di un?infezione o un contaminante non specifico della coltura. A differenza di S. aureus, S. epidermidis non esprime molteplici fattori di virulenza; � contraddistinto come patogeno dalla abilit� di formare biofilm sulla superficie di impianti o device introdotti all?interno del nostro corpo (ad esempio protesi, pacemakers, cateteri ecc.). Il biofilm � una spessa matrice extracellulare secreta da batteri sessili irreversibilmente attaccati ad un substrato. All?interno del biofilm i microrganismi creano comunit� organizzate in cui, a seconda delle influenze ambientali, la comunicazione tra cellula e cellula regola l?espressione di geni coinvolti in meccanismi di sopravvivenza. Pertanto il biofilm costituisce una nicchia protettiva, un luogo in cui proliferare e sfuggire alle difese immunitarie dell?ospite e ai trattamenti antibiotici, portando allo sviluppo di antibiotico resistenze. Un mezzo fondamentale e necessario per lo studio della patogenesi delle pseudoartrosi settiche sono i modelli preclinici, grazie ai quali � possibile indagare come i batteri interagiscano con l?impianto e formino biofilm su di esso. In letteratura, ad oggi, non sono presenti modelli di pseudoartrosi settica causata da S. epidermidis e pertanto nella prima fase del progetto di dottorato � stato quindi generato un modello di pseudoartrosi settica in grado di mimare un?infezione nosocomiale caratterizzata dalla presenza di un impianto metallico, al fine ultimo di indagare nuove strategie preventive e terapeutiche. Con l?obiettivo di identificare la carica batterica minima in grado di portare allo sviluppo di pseudoartrosi settiche, i ratti sono stati sottoposti a una frattura femorale in cui, a seconda del gruppo sperimentale, sono state inoculate diverse concentrazioni di S. epidermidis meticillino-resistente (MRSE). Grazie a questo modello siamo stati in grado di definire tre differenti modelli preclinici. � stato infatti possibile dimostrare come un basso inoculo batterico (10^3 CFU/inoculo) � in grado di determinare un modello subclinico di pseudoartrosi settica, caratterizzata dalla sporadica presenza di pochi segni clinici di infezione. Abbiamo inoltre descritto come un inoculo intermedio (10^5 CFU/inoculo) sia in grado di determinare segni acuti di infezione e come un inoculo alto (10^8 CFU/inoculo) sia capace di portare ad una rapida formazione di biofilm sull?impianto e quindi allo sviluppo di pseudoartrosi in tutti gli animali trattati. I successi ottenuti in questa prima fase del progetto hanno reso possibile la realizzazione della successiva fase sperimentale in cui, grazie al modello di infezione acuta, abbiamo potuto testare l?efficacia di nuove strategie preventive. In letteratura sono descritti diversi approcci terapeutici per il trattamento di pseudoartrosi settiche e tante nuove ricerche stanno cercando di ottimizzare un trattamento che ancora ad oggi non � presente. L?ingegneria tissutale, ad esempio, da anni studia l?utilizzo di scaffold biologici o sintetici con propriet� osteoinduttive e antibatteriche per scagionare l?instaurazione di infezioni favorendo allo stesso momento la rigenerazione del tessuto osseo. Tuttavia la maggior parte delle proposte sviluppate possiede delle limitazioni, legate, ad esempio, alla non biodegradabilit� del materiale che potrebbe in alcuni casi addirittura favorire l?adesione batterica o legate al tipo sostanze antibiotiche caricabili nel materiale. In questo senso gli hydrogel rappresentano un giusto compromesso, poich� in grado di fornire localmente antibiotici, fattori di crescita o cellule, sfavorendo lo sviluppo di infezioni batteriche associate a impianti. � stato recentemente sviluppato un nuovo hydrogel a base di acido ialuronico e polilattico. Test in vitro e in vivo di questo rivestimento riassorbibile hanno dimostrato come esso sia in grado di prevenire la formazione di infezioni quando associato alla presenza di antibatterico. Tuttavia, non sono ancora note le propriet� osteoinduttive/osteoconduttive che si presume abbia questo innovativo hydrogel. Altri importanti traguardi dell?ingegneria tissutale sono stati raggiunti grazie all?utilizzo di terapie cellulari, dove il trapianto di cellule progenitrice ha portato a impressionanti risultati nella rigenerazione di organi e tessuti, nonch� nel trattamento di pseudoartrosi. Questo approccio mira a fornire cellule progenitrici sane in grado di produrre nuova matrice extracellulare all?interno del tessuto danneggiato per ripristinare la perdita di funzione del tessuto danneggiato. Le cellule staminali mesenchimali (mesenchymal stem cells, MSCs) hanno attirato l?attenzione dei ricercatori di questo settore come fonte facilmente accessibile di cellule autologhe in grado di differenziarsi in vitro in diversi tessuti di origine mesenchimale (ad esempio osseo, cartilagineo, adiposo). Inoltre, alcuni studi hanno descritto le propriet� immunomodulatorie e antimicrobiche di queste cellule, dimostrando come le MSCs possano limitare la crescita batterica in vivo e come possano attivamente modulare la risposta infiammatoria nel sito dell?infezione. Tuttavia, il meccanismo d?azione delle MSCs nella modulazione del processo infiammatorio non � ancora chiaro. Un?altra importante caratteristica di queste cellule � la loro mancanza del complesso maggiore di istocompatibilit� II che le rende quindi candidate ideali per il trapianto allogenico. L?obiettivo della seconda fase sperimentale di questo progetto � quello di valutare l?efficacia di un innovativo hydrogel arricchito di vancomicina, nel prevenire lo sviluppo di una pseudoartrosi settica e allo stesso momento favorire la rigenerazione del tessuto osseo. L?utilizzo locale dell?hydrogel � stato comparato all?uso di vancomicina per via sistemica, essendo un trattamento standard in clinica in caso di infezione da batteri meticillino-resistenti. Parallelamente all?interno dello stesso disegno sperimentale, abbiamo valutato l?efficacia dell?utilizzo di BMSCs, cellule mesenchimale da midollo osseo, per il controllo della risposta infiammatoria e della diffusione della crescita batterica in vivo. In particolare, ratti immunocompetenti sono stati sottoposti a una frattura femorale infettata con MRSE e, successivamente, inoculati con BMSCs per via sistemica o locale a seconda del gruppo di appartenenza degli animali. Scopo dello studio non solo � stato quello di analizzare gli effetti immunomodulatori delle BMSCs attraverso la valutazione dei livelli di espressione di citochine infiammatorie, ma anche valutare le propriet� osteoinduttive delle BMSCs in grado di produrre matrice extracellulare nel tessuto danneggiato. Anche in questo caso l?uso sistemico di cellule � stato paragonato a quello locale con il fine di stabilire una via di somministrazione sicura. Per tutta la prima fase del progetto di dottorato si � ricercata una strategia in grado di impedire la colonizzazione batterica dell?impianto. Tuttavia, il nostro modello animale non � stato in grado di fornirci informazioni su come l?infezione sia stata debellata dall?organismo e quali sono stati i meccanismi attivati che hanno permesso l?eradicazione dell?infezione e della guarigione della frattura. Perch� i batteri non sono stati pi� in grado di formare biofilm in presenza dei trattamenti? Pertanto, per rispondere a questa domanda sperimentale, nell?ultima fase del progetto di dottorato l?attenzione si � spostata sull?analisi del proteoma di S. epidermidis per capire i meccanismi molecolari che i batteri attivano quando formano e stabiliscono biofilm in vitro su inserti di titanio. Il percorso che regola la formazione del biofilm in vivo non � ancora completamente noto, ma � stato ampiamente studiato e descritto; diversamente troviamo in letteratura poche informazioni sul biofilm maturo. Pertanto, con lo scopo di individuare la chiave della stabilit� del biofilm maturo, le proteine espresse da due ceppi di S. epidermidis coltivati sia in forma planctonica sia in forma sessile sono state studiate. In particolare, abbiamo concentrato la nostra attenzione sul ceppo clinico GOI1153754-03-14 e comparato la sua espressione di proteine con quelle espresse da S. epidermidis ATCC 35984, considerato il ceppo standard e cui sequenza genomica � gi� stata studiata e depositata in banca dati. Infatti, punto cruciale dell?analisi del proteoma dei batteri � la conoscenza del loro genoma. Perci�, per prima cosa, l?intera genoma di S. epidermidis GOI1153754-03-14 � stato sequenziato e successivamente depositato in banca dati. La presenza dell?intera sequenza genomica di un isolato clinico � cruciale sia per le nostre successive analisi, ma permetter� anche di avere una maggiora conoscenza dei ceppi clinici coinvolti in infezioni ortopediche. A seguito di questa fase preliminare necessaria, S. epidermidis GOI1153754-03-14 e ATCC 35984 sono stati staticamente coltivati in forma planctonica e in biofilm formante per 72 ore. La coltura sessile � stata condotta su dischetti di titanio sabbiato per permettere l?adesione dei batteri e la formazione di biofilm; al contrario la coltura planctonica � stata realizzata in agitazione per prevenire l?aggregazione delle cellule. I batteri poi sono stati prelevati e dopo vari lavaggi, mirati a eliminare i residui del brodo di coltura, sono stati lisati per poter estrarre le proteine. Dopo la quantificazione, le proteine sono state prima divise secondo punto isoelettrico e poi secondo peso molecolare per ottenere mappe bidimensionali contenenti singoli spot associati a una singola proteina. Gli spot statisticamente differenti sono stati poi staccati e le proteine identificate per mezzo di analisi di spettrometria di massa. Le analisi hanno rivelato l?incremento di espressione di geni legati allo stress cellulare in batteri coltivati in forma planctonica. La coltura a 72 ore ha reso possibile la formazione di biofilm sulla superficie del dischetto di titanio, ma allo stesso modo ha pregiudicato la crescita degli stessi in forma planctonica. La scelta del time point sperimentale in questo studio rappresenta la maggiore limitazione, ma allo stesso tempo un punto di partenza per valutare il proteoma di S. epidermidis a diversi tempi per lo studio dell?attivazione/repressione di geni coinvolti nella formazione e maturazione della matrice. Lo scopo principale di quest?ultima fase del progetto di dottorato e di futuri studi � quello di definire potenziali bersagli molecolari di innovative terapie o di definire nuovi biomarcatori diagnostici, tramite l?analisi delle proteine espresse dai batteri in determinate condizioni di crescita.