title: DNA translocases and origin region segregation in B. subtilis
title: DNA Translokalisation und Segregation von Ursprungsregionen in B. subtilis
Creators: name: El Najjar, Nina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: B. subtilis
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Translocases
Segregation , Bacillus subtilis
Translokalisation
Translokasen

description: Die Segregation von Chromosomen
      wird durch spezielle Mechanismen sicher gestellt, welche die
      Position des Septums sowie die korrekte Trennung von
      chromosomalen Dimeren gewährleisten und somit an der
      Aufrechterhaltung der Integrität der chromosomalen DNA
      während des gesamten Zellzyklus beteiligt sind. Anhand des
      Gram-positiven Modellorganismus Bacillus subtilis wurden im
      ersten Teil dieser Arbeit DNA-Translokasen untersucht, welche
      über einen direkten Transport die Chromosomen von der
      zellulären Teilungsebene weg bewegen. Bei SpoIIIE handelt es
      sich um eine Membranintegrierte Translokase, die während der
      Sporulation aktiv ist. Es wurde bereits gezeigt, dass SftA
      hingegen in vitro löslich ist und über einen bisher
      unbekannten Mechanismus mit dem Divisionsseptum assoziiert.
      Die Löslichkeit von SftA in vivo wurde über
      Zell-FraktionierungsExperimente nachgewiesen. Der Teil des
      Proteins, welcher zur Bindung an das Septum führt, wurde über
      die Lokalisation von unterschiedlichen, trunkierten und
      fluoreszenzmarkierten SftA Derivaten identifiziert, wodurch
      die für die Bindung an das Septum verantwortlichen
      Aminosäuren eingegrenzt werden konnten (siehe Manuskript,
      4A). Über die Expression in einem eukaryotischen, heterologen
      System konnte eine Interaktion von SftA mit FtsA, jedoch
      nicht mit FtsZ nachgewiesen werden. Ein weiterer Nachweis
      hierfür wurde über Experimente durch single molecule tracking
      erbracht, wobei die lösliche Fraktion der SftA-Moleküle bei
      geringer Expression von FtsA im Vergleich zu dem Wildtyp
      zunimmt. Untersuchungen auf Einzelmolekül-Level von SpoIIIE,
      einer Membran-assoziierten DNATranslokase in B. subtilis und
      PfkA, einer löslichen Phosphofructokinase, ließen auf ein
      unterschiedliches Verhalten der beiden Translokasen (SftA und
      SpoIIIE) schließen: SftA besitzt eine am Septum gebundene
      Fraktion und eine kleine, sich schnell bewegende, lösliche
      Fraktion, welche mit der ausschließlich löslichen
      PfkA-Fraktion vergleichbar ist. SpoIIIE ist im Vergleich
      weniger dynamisch, wobei sogar die dynamische Fraktion viel
      langsamer ist als die statische SftA Fraktion. Scheinbar
      bewegt sich SpoIIIE langsam entlang der Membran, ohne sich am
      Septum anzureichern; selbst nach der Zugabe von Mitomycin C
      (MMC, siehe Manuskript 4B). Der zweite Teil dieser Arbeit
      befasste sich mit der Anzahl von Nukleoiden, Origin- und
      Termini unter schnellen und langsamen Wachstumsbedingungen,
      mit oder ohne Induktion von Doppelstrangbrüchen durch MMC. B.
      subtilis scheint vornehmlich diploid zu sein, mit polyploiden
      und monoploiden Zellfraktionen, welche sich abhängig von den
      gewählten Wachstumsbedinungen verändern. Die Replikation von
      benachbarten Regionen der Replikationsursprünge nahm nach der
      Induktion von DNA-Schäden zu, wie schon durch die Zunahme der
      Anzahl von Origins während der DNA-Reparatur gezeigt wurde,
      während die Anzahl der Terminatorsequenzen konstant blieb.
      Time lapse Experimente der Segregation von markierten
      Replikationsursprüngen zeigte, dass sich die Bewegung der
      Moleküle am besten durch gezielte Diffusion beschreiben
      lässt, welche sich durch die Zugabe von MMC oder
      Ciprofloxacin, welches die Topoisomerase IV inhibiert, zwar
      verlangsamt, sich jedoch als robust und kontinuierlich
      beschreiben lässt
description: Specialized mechanisms involved in
      chromosome segregation, septum placement, and chromosome
      dimer resolution contribute to the maintenance of chromosome
      integrity throughout the cell cycle. The first part of this
      work focuses on the investigation of DNA translocases in the
      Gram positive model organism Bacillus subtilis, which move
      the chromosomes away from the division plane by directed DNA
      transport. SpoIIIE is a membrane-integral translocase that
      also acts during sporulation, while SftA is associated with
      the division septum by an unknown mechanism and was reported
      to be a soluble protein in vitro. The solubility of SftA in
      vivo was proven with cell fractionation experiments, and the
      part of the protein that serves for septal targeting was
      determined through the localization of different truncations
      of fluorescently labeled SftA, which helped narrow down the
      stretch of amino acids responsible for targeting the protein
      to the septum. Expression in a Eukaryotic heterologous system
      revealed an interaction between SftA and FtsA, but not FtsZ.
      Further evidence was provided by single molecule tracking
      experiments whereby the fraction of soluble SftA molecules
      increased in an FtsA depletion background as compared to a
      wild type background. Concomitant investigation on the single
      molecule level of SpoIIIE, a membrane associated DNA
      translocase in B. subtilis, and PfkA, a soluble
      phosphofructokinase, revealed a different behavior of the two
      translocases (SftA and SpoIIIE): SftA has a septal bound
      fraction, and a small soluble fast moving fraction,comparable
      in diffusion coefficient to the exclusively soluble PfkA
      tracked under the same conditions. SpoIIIE is much slower in
      comparison, and even its “fast” moving fraction is much
      slower than that of SftA. It seems to move slowly along the
      membrane with no specific enrichment at the septum, even
      after Mitomycin C (MMC) treatment. The second part of this
      work focused on the count of nucleoids, origin, and terminus
      of replication regions under conditions of fast and slow
      growth, with or without the induction of double strand breaks
      with MMC. B. subtilis seemed to be predominantly diploid,
      with a fraction of polyploid and monoploid cells which
      changed depending on the growth conditions. Replication of
      the origin proximal regions increased after DNA damage
      induction, as was shown by the increase in the number of
      origins during the time of DNA repair, while the number of
      termini remained constant. Time lapse experiments of the
      segregation of the tagged origin regions revealed that the
      movement is best described as directed diffusion, but seems
      to be quite robust and continues, though slower, after MMC
      treatment or treatment with Ciprofloxacin which blocks the
      topoisomerase IV