Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des Na + -Phosphat-Kotransporters Typ II
Creators: name: Dehmelt, Leif
Publisher: name: Universität Dortmund
Year: 2000
Subjects: subject: FB 03
subject: NaPi-IIa
subject: Adapterprotein
subject: PDZ
subject: Shank
subject: Niere
subject: Kotransport
subject: Microvilli
subject: Dendritische Zellen
subject: Lymphocyten
subject: 540

description: Der Na+/Phosphat Kotransporter NaPi-IIa spielt eine wichtige Rolle in der Phosphathomöostase von Vertebraten. Insbesondere die stark polarisierte Sortierung des Proteins zur luminalen Membran, als auch die Regulation des Proteins durch verschiedene Stimuli erfordert spezifische Interaktionen mit Adapterproteinen. Ziel der Arbeit war die Identifizierung und molekulare Charakterisierung eines Bindungspartners von NaPi-IIa. Mit Hilfe eines Two-Hybrid Screens gelang es, die PDZ-Domäne des Proteins C160 aufgrund einer Wechselwirkung mit dem C-Terminus des Na+/Phosphat Kotransportsystems NaPi-IIa der Maus zu identifizieren. PDZ-Domänen erkennen unter anderem ein C-terminales Motiv mit der allgemeinen Konsensussequenz S/T-X-V/L/I-COOH. Dieses Motiv ist auch in den C-terminalen Aminosäuren des Na+/Phosphat Kotransporters vorhanden (T-R-L-COOH). Die Interaktion dieser Domäne mit dem NaPi-IIa C-Terminus wurde in vitro durch einen "Blot-Overlay" mit aufgereinigten Fusionsproteinen bestätigt. Um weitere Untersuchungen durchführen zu können, wurde der komplette Klon isoliert. Dieser umfaßt 4.3 kb und kodiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 77 kD. Zur immunhistochemischen Lokalisation von C160 wurden Nierenzellkulturen (OK-Zellen) untersucht, welche C160 und NaPi-IIa überexprimieren. Mit Hilfe von zwei unterschiedlichen fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern konnten beide Proteine in der Bürstensaummembran dieser Zellen kolokalisiert werden. C160 gehört zu der Adapter-Proteinfamile Shank. Zwei Isoformen dieser Proteinfamilie wurden untersucht: Shank 2 und das im Lauf der Arbeit klonierte und in Shank3b umbenannte C160. Im intakten Organ ist eine Wechselwirkung von Shank3b/C160 mit NaPi-IIa unwahrscheinlich. Shank3b/C160 ist nach immunhistochemischen Untersuchungen an Mäusenierenschnitten in einem anderen Zelltyp als NaPi-IIa exprimiert. Shank3b/C160 wurde ausschließlich in dendritischen Zellen und Lymphocyten detektiert, auch in Rattenniere, Rattenleber und Rattenthymus. Da die Isoform Shank2 ein vielversprechender Kandidat für eine physiologisch relevante Interaktion mit NaPi-IIa ist, wurde dieses Protein immunhistochemisch in der Mäuseniere lokalisiert. Hierdurch konnte klar gezeigt werden, daß Shank2 und NaPi-IIa in der Bürstensaummembran von proximalen Tubuluszellen der Niere kolokalisiert sind. Durch Western-Blots mit der Bürstensaummembranfraktion der Mäuseniere wurde dieser Befund bestätigt. Für eine funktionelle Einordnung von Shank2 in das komplexe Netzwerk von Interaktionen in der Regulation von NaPi-IIa sind jedoch zu wenig Informationen vorhanden. Eine Interaktion der beiden Proteine ist sehr wahrscheinlich, obwohl sie in vivo noch nicht auf molekularer Ebene bewiesen wurde. Beide Proteine werden jedoch zur luminalen Membran von proximalen Tubuluszellen sortiert. Zur Beschreibung der dynamischen Vorgänge in der spezifischen Regulation von NaPi-IIa sind jedoch sicherlich weitere Interaktionspartner nötig, welche noch identifiziert werden müssen.