Progettazione, sintesi e caratterizzazione farmacologica di derivati peptidici e pseudopeptidici attivi sui recettori PAR (PAR1-4)
Creators: name: Cirillo, Donatella
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: In questi  ultimi anni è stato messo in evidenza che determinate proteasi, tradizionalmente considerate come enzimi capaci di degradare proteine extracellulari, svolgono un’azione anche come molecole di segnale attivando una particolare categoria di recettori presenti sulla membrana plasmatica e regolando, quindi, una molteplicità di funzioni cellulari.  
Un’importante famiglia di recettori attivati dalle proteasi è quella dei PARs. Allo stato attuale i PARs possono essere suddivisi in quattro gruppi recettoriali: PAR-1, PAR-2, PAR-3 e PAR-4. 
I recettori attivati da proteasi (PARs, protease activated receptors) sono accoppiati a proteine G e presentano un particolare meccanismo di autoattivazione che coinvolge la porzione amminoterminale extracellulare. Le proteasi, infatti, tagliano il recettore e determinano l’esposizione di un nuovo terminale amminico che agisce come un tethered ligand; quest’ultimo, ripiegandosi sulla molecola recettoriale tagliata, ne determina l’attivazione. La porzione minima di tethered ligand attivante il recettore è costituita da 5 o 6 amminoacidi.
Il recettore PAR-4 umano, una proteina costituita da 385 aminoacidi, viene attivato quando la trombina o la tripsina effettuano il taglio a livello della Arg47-Gly48 esponendo il nuovo terminale amminico GYPGQV (GYPGKF nei topi).
Il gruppo di ricerca presso il quale ho svolto il mio lavoro di dottorato è già da tempo impegnato nello sviluppo di agonisti ed antagonisti dei recettori PAR-1 e PAR-2. Sulla base delle acquisizioni recentemente ottenute e dei dati già presenti in letteratura, per i recettori PAR-1 e PAR-2, si è pensato, parallelamente, di rivolgere l’attenzione anche al recettore PAR-4 al fine di sintetizzare agonisti ed  antagonisti, peptidici e non, con l’obbiettivo di ottenere, anche per essi, delle relazioni struttura-attività che consentissero di definire quelle caratteristiche strutturali necessarie ai fini di un’interazione selettiva.
Partendo da queste recenti acquisizioni, inizialmente il mio lavoro è stato rivolto all’individuazione di PAR-4 APs dotati di maggiore selettività e potenza d’azione. Il mio progetto ha previsto come prima tappa l’individuazione della minima sequenza peptidica responsabile dell’interazione con il recettore. 
A tal fine è stato eseguito un Alascan del peptide nativo. Tale tecnica ha consentito di sintetizzare  una serie di peptidi analoghi della sequenza GYPGKF in cui di volta in volta ciascun residuo amminoacidico è stato sostituito con un residuo di Alanina che rappresenta il più piccolo amminoacido chirale.
Tale strategia ha permesso contestualmente di individuare la minima sequenza responsabile dell’interazione con il recettore PAR-4 e di valutare l’importanza dei singoli residui aminoacidici nell’interazione con il suddetto recettore. L’Ala-Scan ha mostrato infatti che, mentre la sostituzione della Gly in posizione 1 porta ad un aumento dell’attivazione del recettore PAR-4, la sostituzione della Tyr in posizione 2 con un residuo di Ala determina una perdita dell’attività agonista. Da ciò si è evince che, come nel PAR-1 AP SFLLRN, il residuo aromatico in posizione 2 è fondamentale per l’interazione con il recettore.
Sulla base di queste acquisizioni, mi sono occupata della progettazione, della sintesi e della valutazione biologica di una serie di pseudopeptidi in cui è stata effettuata la sostituzione della Tyr in posizione 2 con derivati della glicina N-alchilati.  
Lo spostamento della catena laterale dell’aminoacido dal carbonio- all’atomo di azoto costituisce un approccio molto diffuso per sviluppare composti peptidomimetici che presentino proprietà farmacologiche più favorevoli in termini di specificità d’azione, resistenza alla degradazione e biodisponibilità.
I derivati N-alchilati della Gly sono stati ottenuti mediante alchilazione riduttiva parallela della N-glicina metilestere in presenza di dieci differenti aldeidi aromatiche disponibili commercialmente e di NaBH3CN. Le aldeidi scelte hanno fornito aminoacidi modificati che possono mimare residui aromatici convenzionali  e residui non naturali. 
La sintesi è stata condotta impiegando un forno a microonde  specificamente progettato per la sintesi organica (ETHOS 1600, Milestone). 
Gli aminoacidi non convenzionali così ottenuti sono stati poi introdotti nella sequenza del PAR 4-AP ottenendo così una serie di composti peptidomimetici caratterizzati dalla sequenza G-X-P-G-K-F, dove X è rappresentato di volta in volta da uno degli aminoacidi non naturali da me sintetizzati. 
Tutti i prodotti sono stati purificati mediante HPLC preparativo a fasi inverse. L’omogeneità e la purezza dei composti finali è stata valutata mediante HPLC analitico a fasi inverse e la caratterizzazione è stata effettuata mediante ESI-MS ed 1H NMR. 
Contestualmente mi sono occupata anche della progettazione e della sintesi di derivati pseudopeptidici in cui erano presenti dei surrogati del legame peptidico (legame metilen-aminico) e dei residui non naturali da me sintetizzati (5-GTIC, 6-GTIC, 7-GTIC, 8-GTIC).
I dipeptidi contenenti il legame metilen-aminico sono stati sintetizzati mediante la tecnica di irraggiamento a micronde e successivamente sono stati inseriti nella sequenza del PAR-4-AP. Tutti gli intermedi ed i prodotti finali sono stati purificati mediante cromatografia liquida su colonna e caratterizzati mediante spettrometria di massa.
I residui non naturali 5-GTIC, 6-GTIC, 7-GTIC, 8-GTIC sono stati sintetizzati mediante una metodica classica in soluzione e sono successivamente stati inseriti nella sequenza del PAR-4-AP. Tutti gli intermedi sono stati purificati mediante cromatografia liquida su colonna e caratterizzati mediante spettrometria di massa. I prodotti finali sono stati purificati mediante HPLC preparativo a fasi inverse. L’omogeneità e la purezza di tali composti è stata valutata mediante HPLC analitico a fasi inverse e la caratterizzazione è stata effettuata mediante ESI-MS.
I prodotti così ottenuti sono stati sottoposti a sperimentazione farmacologica presso il dipartimento di Fisiologia dell’Università degli Studi di Siena e hanno permesso di valutare la capacità dei composti sintetizzati di ripristinare la produzione di IFN-. Alcuni dei composti pseudopeptidici appartenenti a questa serie hanno mostrato risultati incoraggianti 
Contestualmente, durante il mio dottorato di ricerca l’attenzione è stata rivolta alla sintesi di antagonisti non peptidici del recettore PAR-4 .  Recentemente, infatti, è stato riportato in letteratura il composto YD-3 1-benzyl-3-(ethoxycarbonyl-phenyl)-indazole che è in grado di inibire, nell’uomo, l’aggregazione piastrinica indotta dal PAR-4AP,  ma ha uno scarsissimo effetto quando l’aggregazione è indotta dalla trombina o dal PAR-1AP.
Partendo dalla struttura del composto YD3 e dai recenti dati presenti  in letteratura, sono state progettate strutture analoghe in cui il nucleo indazolico è stato sostituito con strutture eterocicliche bioisostere, già precedentemente impiegate nella sintesi di altre strutture farmacologicamente attive. E’ stata, quindi, analizzata una libreria di 50 prodotti sintetizzati in precedenza dal gruppo di ricerca presso il quale lavoro e caratterizzati da molecole contenenti almeno un elemento strutturale comune con il composto di riferimento YD-3. Lo screening ha consentito di valutare la capacità di tali composti di indurre la mobilizzazione del Ca+2 intracellulare in maniera analoga a quanto era stato fatto per l’antagonista di riferimento. Dall’analisi della suddetta libreria di composti è emerso che taluni derivati a nucleo benzotriazolico e benzotriazinonico riuscivano in una certa misura a mimare l’effetto dell’antagonista YD-3.
Da tale screening tre composti hanno evidenziato una certa significatività riguardo l’attività biologica valutata. 
I tre composti presentano alcune analogie con il riferimento YD-3. Infatti, di volta in volta si ripropone almeno uno degli elementi strutturali caratterizzanti il composto YD3. 
Tali composti hanno quindi rappresentato il punto di partenza per lo sviluppo di una nuova libreria di composti che presentano il nucleo benzotriazolico e il sostituente benzilamminico variamente sostituito con gruppi elettron-donatori o elettron-attrattori.
Lo scopo di tali sostituzioni è stato quello di cercare di comprendere come l’interazione con la controparte recettoriale potesse venire influenzata dalla presenza di tali sostituenti. 
La sintesi dei prodotti è stata effettuata mediante una metodica classica in soluzione, tutti gli intermedi ed i prodotti finali sono stati purificati mediante cromatografia liquida su colonna e caratterizzati mediante spettrometria di massa e 1H e 13C NMR. 
La sperimentazione farmacologica è stata condotta presso il Dipartimento di Farmacologia Sperimentale di questa Facoltà dal gruppo del Prof. Giuseppe Cirino, in collaborazione con il Dipartimento di Fisiologia dell’Università di Siena.
I saggi biologici hanno permesso di valutare la capacità dei composti sintetizzati di ripristinare la produzione di IFN- . In maniera sorprendente si può notare che taluni composti non sono solo in grado di ripristinare la produzione di IFN-, ma addirittura ne determinano un aumento.