title: Comet Assay: Ermittlung von personenbezogenen Quantifizierungsunterschieden und Vergleich verschiedener Zelltypen
Creators: name: Sauermoser, Verena
Publisher: name: :none
Year: 2017

description: Der Comet Assay ist eine schnelle molekularbiologische Methode um DNA-Strangbrüche, oxidative DNA-Schäden und H2O2-induzierte DNA-Strangbrüche zu ermitteln. Aufgrund seiner einfachen und kosteneffizienten Durchführung wird er in vielen verschiedenen wissenschaftlichen Sparten verwendet. Heutzutage stellen die vier großen Hauptbereiche Genotoxizitätstests, humane Biomonitoring-Studien, ökotoxikologische Tests und Tests rund um den Mechanismus der DNA-Schäden bzw. der DNA-Reparatur dar. Allerdings ist der Vergleich der ausgewerteten Daten nach wie vor sehr schwierig, da oft unterschiedliche Protokolle verwendet werden und die Auswertung von verschiedenen Personen erfolgt. In der vorliegenden Studie wurden personenbezogene Quantifizierungsunterschiede bei der Auswertung von Vollblutzellen, PBMC’s und oralen Leukozyten von Diabetes Typ 2 Patientinnen mittels Comet Assay ermittelt. Hierfür wurden die Reserve-Objektträger (Backup Slides) der Querschnittsstudie „MIKRODIAB“ verwendet und quantifiziert. Es zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen der Gruppe „Neu“ (Quantifizierung durch eine Person) und der Gruppe „Alt“ (Quantifizierung durch mehrere Personen). Zudem wurden die DNA-Schäden (% DNA im Schweif) aller drei Zelltypen miteinander verglichen und auf Korrelation untersucht. Alle 3 Zelltypen (PBMC, VB, OL) wiesen signifikant unterschiedliche Ergebnisse auf, sowohl in der Gruppe „Alt“ als auch in der Gruppe „Neu“. Zusätzlich wurde keine positive Korrelation zwischen den Zelltypen beobachtet. Der Vergleich der Comet Assay Daten erweist sich dadurch als sehr schwierig, da die DNA-Schäden der einzelnen Zellen aufgrund ihrer Lebensdauer und Sensitivität möglicherweise nicht zu vergleichen sind. Zudem scheint es von großer Bedeutung zu sein, von wie vielen Personen die verschiedenen Zellen ausgezählt werden. Des Weiteren wurden Vollblutzellen ein Jahr bei -80°C aufbewahrt und der Comet Assay erst anschließend durchgeführt. Diese Zellen wurden mit den Vollblutzellen der Gruppe „Neu“ verglichen. Es konnten signifikante Unterschiede der Mittelwerte bei den lysierten Zellen festgestellt werden (0,62±0,29; 1,19±0,55*). Die Enzym-behandelten Zellen wiesen keinen signifikanten Unterschied auf. Vollblutzellen können somit für ein Jahr bei -80°C gut aufbewahrt werden. Zum Vergleich der DNA-Schäden der Diabetikergruppe wurde eine gesunde Referenzgruppe (n=24) herangezogen. Es konnten in beiden Zelltypen (PBMC und VB) signifikante Unterschiede festgestellt werden, wobei die Diabetikergruppe sowohl im Vollblut (6,64±0,69) als auch in den PBMC‘s (5,71±0,72) erhöhte oxidative DNA-Schäden bei den FPG-behandelten Zellen aufwies (p&lt;0,05). Auch in der gesunden Referenzgruppe wurde keinerlei signifikante Korrelation zwischen den Zelltypen beobachtet. Es kann somit die Hypothese bestätigt werden, dass Diabetiker aufgrund verschiedener metabolischer Einflüsse erhöhte DNA-Schäden in den Enzym-behandelten Zellen aufweisen. Wir kommen daher zu dem Schluss, dass der Comet Assay eine einfache und schnelle Methode darstellt, um DNA-Schäden und Strangbrüche zu messen. Allerdings stellt der Vergleich der Daten aufgrund des individuellen Auszählens von verschiedenen Personen und der unterschiedlichen technischen Durchführungsprotokolle ein großes Problem dar. Zudem gibt es noch sehr wenig Literatur über den Zusammenhang der verschiedenen Zelltypen bzw. der Korrelationen zwischen den einzelnen Zellmatrices.
description: The Comet Assay (SCGE) has become one of the best known methods to detect oxidative DNA damage (FPG), DNA strand breaks (lysis) or H2O2 induced strand breaks. Due to the rapid, simple, sensitive and cost-effective way of the assay, it can be used in many different areas and represents a commonly used method. The four main sectors are genotoxicity tests, human biomonitoring studies, ecotoxicological tests and the research of mechanisms around DNA damage and repair. However, the variety of the results is one of most critical factors of the comet assay as the evaluation of the comet data is sometimes done by different investigators and by various of technical protocols. In the present master thesis the comet assay was used for whole blood cells, PBMC’S and oral leucocytes from female diabetes-type-2 patients. Therefore the backup slides from the cross-sectional study “MIKRODIAB” were re-evaluated and quantified and DNA strand breaks, FPG-sensitive sites and H2O2 induced strand breaks were analysed. There are four main hypotheses that we aimed to verify. First, are there differences in the results if different persons count the cells, compared to one counter? Second, is there a positive correlation between the different cell types? The third hypothesis proves, if slides with whole blood cells could be stored at -80 °C for one year and fourth, are there differences in DNA damage between diabetes patients and a healthy reference group. To verify the first hypothesis we compared the results gathered from group “Neu” (only one person counted the cells) with the group “Alt” (more people has been counting the cells). Significant differences emerged between the two groups in all three cell types. Concerning the second hypothesis, the % DNA in tail was compared to all three cell types (VB, PBMC, and OL) and the correlation between all types was evaluated. No significant positive correlation was found. Generally, it seems to be relevant whether one person is counting and quantifying the cells, or more investigators are involved, especially for the comparison of the data. However, there is no positive correlation, neither in group “Neu”, nor in the group “Alt” between the cell types. The reason might be that the different properties of cell types make any comparison between them not feasible. Furthermore, whole blood cells, which have been stored for one year at a temperature of -80°C, were compared to whole blood cells from group “Neu”. The only significant difference found throughout this comparison was in the cells from lysis (0.62±0.29; 1.19±0.55*). Cells which were treated with FPG showed no significant difference. This proves that whole blood cells can be stored at -80 degrees up to one year without increased DNA damage. For comparison of the oxidative DNA damage of the diabetes patients, a healthy reference group was consulted. A significant difference was observed in both cell types (PBMC and VB) with the enzyme-modified comet assay. Through the present study, we conclude that Diabetes-Type-2 patients show higher oxidative DNA damage compared to healthy subjects. Finally we can say, that the Comet Assay is a simple and rapid method for measuring DNA-strand breaks and DNA-damage. However, one of the major problems of the assay is the comparison of the evaluated data, especially if more investigators are involved. Furthermore, comparatively few literature is available on the correlation between the different cell types.