Διερεύνηση των επιγενετικών μεταβολών του DNA μετά τη χορήγηση ηρωίνης ή κοκαΐνης: μελέτη σε πειραματόζωα
Creators: name: Φράγκου, Δομνίκη Β.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Επιγενετική
Μεθυλίωση του DNA
Κοκαΐνη
Ηρωίνη
Epigenetics
DNA methylation
Cocaine
Heroin

description: Σκοπός της διατριβής αυτής ήταν η μελέτη της καθολικής μεθυλίωσης του DNA στον εγκέφαλο και στο ήπαρ επίμυων μετά από χορήγηση κοκαΐνης ή ηρωίνης. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης με υπεριώδη ανίχνευση. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η σταθερότητα των δειγμάτων κάτω από διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης και χειρισμούς και τελικά, η μέθοδος που αναπτύχθηκε εφαρμόστηκε στην ανάλυση των δειγμάτων. Αφορμή για την πραγματοποίηση της εν λόγω διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διαπίστωση ότι οι επιγενετικές δράσεις της κοκαΐνης και της ηρωίνης δεν έχουν μελετηθεί, παρ’ όλο που ο επιστημονικός κλάδος της επιγενετικής γνωρίζει συνεχώς αυξανόμενο επιστημονικό ενδιαφέρον. Για το σκοπό της διατριβής, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες των εννέα επίμυων, από τις οποίες οι δύο έλαβαν κοκαΐνη ή ηρωίνη βάσει πρωτοκόλλων που μιμούνται τον εθισμό στους ανθρώπους και οι άλλες δύο χρησιμοποιήθηκαν ως οι αντίστοιχοι μάρτυρες. Μία ώρα μετά την τελευταία χορήγηση τα ζώα θανατώθηκαν και αφαιρέθηκαν τα όργανά τους, τα οποία κατόπιν εμβάπτισης σε υγρό άζωτο αποθηκεύτηκαν στους -80°C. Με κατάλληλα πρωτόκολλα απομόνωσης του DNA ελήφθη υψηλής καθαρότητας γενετικό υλικό, το οποίο στη συνέχεια υδρολύθηκε ενζυματικά για να διασπαστεί στα επιμέρους νουκλεοτίδια. 10 μg υδρολυμένου DNA αναλύθηκαν με HPLC-UV. Η συγκεκριμένη μέθοδος αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για τον ποιοτικό προσδιορισμό των τεσσάρων βάσεων του DNA και της πέμπτης βάσης, της 5-mdC και για την ποσοτικοποίηση δύο εξ αυτών, της 5-mdC και της dC. Η μέθοδος παρουσίασε γραμμικότητα, πολύ καλό διαχωρισμό και υψηλή επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ποσοστό της 5-mdC έναντι της συνολικής κυτοσίνης. Μετά από επεξεργασία και ανάλυση 72 δειγμάτων ιστών, συγκρίθηκε η καθολική μεθυλίωση στο ήπαρ και στον εγκέφαλο μεταξύ των πειραματοζώων που έλαβαν ηρωίνη ή κοκαΐνη και των αντίστοιχων υγιών μαρτύρων. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στην καθολική μεθυλίωση μεταξύ πειραματοζώων και μαρτύρων και για τους δύο ιστούς που μελετήθηκαν. Επιπρόσθετα, η % 5-mdC βρέθηκε πάντα να είναι στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη στον εγκέφαλο από ότι στο ήπαρ και στις τέσσερις ομάδες επίμυων. Η απουσία μεταβολών στην καθολική μεθυλίωση του DNA μετά τη χορήγηση ηρωίνης και κοκαΐνης ενδεχομένως οφείλεται σε αντισταθμιζόμενες επιδράσεις αυτών των ουσιών σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος. Είναι πιθανό κάποιες περιοχές του DNA να υπο-μεθυλιώνονται, ενώ κάποιες άλλες να υπερ-μεθυλιώνονται διατηρώντας έτσι τα συνολικά επίπεδα μεθυλίωσης αμετάβλητα. Εκτός αυτού, είναι εξίσου πιθανό να υπάρχουν διαφορετικές επιγενετικές επιδράσεις σε διαφορετικές ανατομικές περιοχές του ήπατος και του εγκεφάλου. Τέλος, μία άλλη αιτία μπορεί να είναι η ενεργοποίηση των φυσικών προστατευτικών μηχανισμών του γονιδιώματος, όπως είναι η de novo μεθυλίωση (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπομεθυλίωση) ή η απομεθυλίωση του DNA, με πρώτο στάδιο το σχηματισμό της 5-hmdC (στην περίπτωση που η επίδραση της ουσίας προκαλεί υπερμεθυλίωση). Περαιτέρω διερεύνηση σε διαφορετικές περιοχές του γονιδιώματος, στις διάφορες ανατομικές περιοχές των οργάνων, καθώς και σε άλλους παράγοντες, όπως η 5-hmdC και οι DNMTs, θα μπορέσουν να απαντήσουν στα παραπάνω ερωτήματα.
description: The aim of the present thesis was to study the global methylation of DNA in the brain and liver following heroin or cocaine administration in mice. The DNA extracts were analyzed by high performance liquid chromatography coupled with ultraviolet detection and the results were statistically analyzed for the comparison between the two tissues and between different groups of animals (dosed vs non-dosed). For the purposes of the study, four groups (n=9) of animals were used. Two of the groups received either heroin or cocaine, according to protocols that mimic addiction, whilst the other two groups served as controls. One hour after the last drug administration, the animals were sacrificed, their organs were removed, frozen with liquid nitrogen and stored at -80°C. Appropriate isolation protocols were used to extract genetic material of high purity which was enzymatically hydrolyzed into bases. 10 μg of hydrolyzed DNA were analyzed by HPLC-UV, by using a method developed and validated in our laboratory. The method used, showed good linearity, excellent separation and was highly reproducible and accurate, whilst the total analysis time reached 50 min. The results were expressed as the percentage of 5-mdC over the overall cytosine content. Following the extraction, hydrolysis and chromatographic analysis of 72 samples, the global methylation status of brain and liver DNA was compared between the animals that had been dosed with cocaine or heroin and the corresponding control animals. The results of the present study revealed that there is no significant difference in the global methylation status between the dosed and the control animals in both tissues. In addition, the % 5-mdC was always found to be higher in the brain compared to the liver. The fact that no significant alterations were found in the global DNA methylation status following cocaine or heroin administration could be possibly attributed to the fact that some DNA regions may be hypomethylated, while others are hypermethylated, therefore cancelling each other out. In addition, different effects (hypomethylation and hypermethylation) may cancel each other out in anatomically different parts of the same tissue. Our findings could also be supported by the theory that following drug administration and subsequent changes in methylation, the protective mechanisms of the organism may start repairing the epigenome either by triggering de novo methylation or by initiating demethylation, a process that involves the formation of 5-hmdC from 5-mdC. A future inquiry into the DNA methylation changes in different genomic regions or in anatomically different parts of the tissue, as well as in various other factors such as 5-hmdC or DNMTs could shed a light into the exact epigenetic mechanisms triggered by drugs of abuse.