title: Charakterisierung eines ABC-Transporters für kompatible Solute in dem hyperthermophilen Archaeon Archaeoglobus fulgidus und Untersuchungen zur thermoprotektiven Wirkung kompatibler Solute in Bacillus subtilis
Creators: name: Holtmann, Gudrun
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2002
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Bacillus subtilis
Archaeoglobus fulgidus

description: Kompatible Solute wurden erstmals in Zusammenhang mit der Osmostressantwort verschiedener Organismen identifiziert und seitdem auch als Osmoprotektiva bezeichnet. In den letzten Jahren wurde jedoch deutlich, dass ihnen auch bei der Anpassung an andere widrige Bedingungen (Kälte, Hitze, Trockenheit) eine bedeutende Rolle zukommt und sie daher eher als generelle Stressprotektiva zu sehen sind. Im Reich der Bacteria sind Aufnahmesysteme für diese Verbindungen sehr gut charakterisiert, in Archaea wurde aber bislang nur ein Transporter für Glycin Betain auf molekularer Ebene identifiziert und näher untersucht. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die biochemische und physiologische Analyse eines putativen Transporters (ProU) aus dem hyperthermophilen Archaeon Archaeoglobus fulgidus, der auf Proteinebene signifikante Sequenzidentitäten zu bereits charakterisierten Aufnahmesystemen für kompatible Solute aufweist und zur Familie der ABC-Transporter zählt. Zur näheren Analyse der Substratspezifität und der kinetischen Parameter des extrazellulären Substratbindeproteins ProX, gelang es im Rahmen dieser Arbeit, das Protein funktionell in Escherichia coli überzuproduzieren und zu reinigen. ProX hat Glycin Betain und Prolin Betain als Substrat und weist für beide Verbindungen Affinitätskonstanten im unteren nanomolaren Bereich auf. Darüber hinaus zeigt es ein interessantes Temperaturverhalten, da es bereits bei 25C seine Substrate bindet und selbst bei 100C nicht thermisch inaktiviert wird. Um Aufschluss über die Struktur des Proteins und die Art der Substratbindung zu erhalten, wurden Kristallisationsexperimente mit dem heterolog exprimierten ProX durchgefhrt. Die Struktur von ProX wurde von André Schiefner (AG Welte, Universitt Konstanz) gelöst. Die Eigenschaften des Bindeproteins lassen darauf schließen, dass A. fulgidus mit dem ProUTransporter ein hochaffines Aufnahmesystem für kompatible Solute zur Verfügung steht und damit konnte ProU als erster ABC-Transporter für diese Verbindungen in einem hyperthermophilen Archaeon identifiziert werden. Eine Analyse hinsichtlich der physiologischen Bedeutung von Glycin Betain in A. fulgidus führte zu dem unerwarteten Ergebnis, dass Glycin Betain diesem Organismus nicht zu osmoprotektiven Zwecken dient, sondern Glycin Betain die Hitzetoleranz von A. fulgidus steigert. Westernblot Analysen mit einem ProX spezifischen Antikörper zeigten, dass die Menge von ProX in A. fulgidus Zellextrakten abhängig von Hitzestress, aber nicht osmotisch reguliert wird. Obwohl es nicht möglich ist, in A. fulgidus Deletionsmutanten zu generieren, lässt sich die Glycin Betain Aufnahme unter diesen Bedingungen vermutlich allein auf ProU zurckführen, da dem Organismus basierend auf Datenbankanalysen keine weiteren Aufnahmesysteme für diese Verbindung zur Verfügung stehen. Um nähere Einblicke in die Rolle kompatibler Solute als Thermoprotektiva zu erhalten, wurde die Nutzung kompatibler Solute in dem mesophilen Bodenbakterium Bacillus subtilis zur Thermoprotektion näher untersucht. Die meisten kompatiblen Solute, die von B. subtilis als Osmoprotektiva genutzt werden, wirken in diesem Organismus auch thermoprotektiv. Eine nähere Analyse der involvierten Aufnahmesysteme zeigte, dass B. subtilis für die Aufnahme kompatibler Solute bei Hitzestress dieselben Transporter nutzt wie unter osmotischem Stress. Mittels Northernblot-Analysen konnte eine durch Hitzestress induzierte Transkription der für die involvierten Transporter codierenden Gene nachgewiesen werden. Ein Vergleich des Glycin Betain-Pools ungestresster B. subtilis-Zellen und B. subtilis-Kulturen, die bei 52C kultiviert wurden lieferte Erkenntnisse darüber, welche Konzentrationen kompatibler Solute unter Hitzestress intrazellulär akkumuliert werden. In B. subtilis ist der Glycin Betain-Pool sowohl bei 37C als auch bei 52C nahezu identisch. Kompatible Solute müssen demnach bei supraoptimalen Temperaturen nicht, wie bei osmotischem Stress, bis zu molaren Konzentrationen angehäuft werden, sondern es reichen offenbar deutlich geringere Mengen aus, um eine effektive Thermoprotektion zu gewhärleisten. Einige Organismen synthetisieren unter Hitzestress dieselben kompatiblen Solute de novo wie unter hyperosmotischen Bedingungen. Da B. subtilis unter hyperosmotischen Bedingungen Prolin mittels de novo Synthese akkumuliert, wurde der osmotisch kontrollierte Prolinsyntheseweg (ProHJ) in B. subtilis im Zusammenhang mit Hitzestress näher beleuchtet. In Northernblot Analysen zeigte sich, dass die Gene für die Enzyme der osmotisch kontrollierten Synthese von Prolin auch unter Hitzestress deutlich induziert sind und Primerextension Analysen zeigten, dass die Transkription unter diesen Bedingungen unter der Kontrolle desselben A-abhängigen Promotors erfolgte wie bei hoher Salinitt. Eine ProHJ-Mutante wies aber bei 52C keinerlei Wachstumsnachteil im Vergleich zum Wildtyp auf und HPLC-Analysen von B. subtilis Zellextrakten belegten eine fehlende Prolin-Akkumulation bei 52C. B. subtilis nutzt bei Hitzestress also exogen vorhandene kompatible Solute und akkumuliert diese durch die bereits aus der Osmostressantwort bekannten Opu-Transporter. Eine Anhäufung kompatibler Solute durch de novo Synthese findet bei 52C jedoch nicht statt. Neben der allgemein bekannten Synthese sogenannter Hitzeschockproteine als Antwort auf Hitzestress kommt offenbar auch der Akkumulation kompatibler Solute aus der Umwelt als Anpassungsstrategie an supraoptimale Temperaturen eine fundamentale Bedeutung zu.
description: Compatible solutes were discovered for the first time in connection with the osmostress response of different organisms and called osmoprotectants since that time. However, recently it became evident that compatible solutes protect organisms also against other harsh growth conditions (cold, heat, dessication) and compatible solutes play thus a more general role as stress protectants. In the domain of Bacteria uptake systems for these compounds are well characterized, whereas in Archaea there is only one transporter for glycine betaine identified on molecular level. Topic of the present work was the biochemical and physiological analysis of a putative transporter (ProU) from the hyperthermophilic Archaeon Archaeoglobus fulgidus, which shows significant sequence-identity to already characterized uptake systems for compatible solutes and belongs to the family of ABC-transporters. To investigate the substrate specificity and the kinetic parameters of the extracellular substrate binding protein ProX it was possible to express the protein heterologously in Escherichia coli and to purify it to homogeneity. Substrates of ProX are glycine betaine and proline betaine and the protein displays an affinity in the low nanomolar range for both compounds. Above this it shows an interesting temperature dependence, since it binds its substrates already at 25C and is not inactivated by incubation at 100C. To get an insight into the structure and the mode of substrate binding, crystallization experiments were performed with the heterologously expressed ProX. The structure of ProX was solved by Andr Schiefner (AG Welte, university of Konstanz). The properties of the binding protein imply that ProU serves as a high-affinity uptake system for compatible solutes in A. fulgidus and thus ProU was the first uptake system for compatible solutes characterized in a hyperthermophilic Archaeon. Investigations concerning the physiological role of glycine betaine in A. fulgidus lead to the unexpected result that glycine betaine does not serve for osmoprotective purposes in this organism but increases the heat tolerance of A. fulgidus. Western blot analyses with a ProX specific antibody revealed, that the amount of ProX depends on heat stress but is not influenced by osmolarity. Although it is not possible to generate deletion mutants in A. fulgidus, the uptake of glycine betaine goes presumably solely back to the ProU system, because database analyses revealed that the organism does not possess any additional uptake systems for the uptake of these compounds. To get a closer look on the role of compatible solutes as thermoprotectants, the role of compatible solutes as heat protectants was analyzed in the mesophilic soil bacterium Bacillus subtilis. Most compatible solutes which are used by B. subtilis as osmoprotectans also mediate heat protection. An analysis of the involved uptake system showed that B. subtilis recruits the same uptake systems under heat stress as under osmotic stress. By means of northern blot analyses it could be shown that the transcription of the genes of the involved transporters is increased upon heat stress. A comparison of the glycine betaine pool of unstressed B. subtilis cells with B. subtilis grown at 52C revealed to what extend glycine betaine is accumulated in response to heat stress. The glycine betaine pool of B. subtilis is identical at 37C as well as at 52C. Thus compatible solutes are not necessarily accumulated to molar concentrations under supraoptimal temperatures as under osmotic stress but lower amounts are apparently sufficient to mediate effective thermoprotection. Some organisms synthesize upon heat stress the same compatible solutes de novo like in response to hyperosmotic growth conditions. Since B. subtilis accumulates proline under hyperosmotic conditions, the osmotically controlled proline biosynthetic pathway (ProHJ) was analyzed in connection with heat stress. Northern blot analyses revealed that the genes for the enzymes of the osmotically controlled synthesis of proline are also significant induced under heat stress and primer-extension analyses showed that transcription is mediated by the same A-dependent promoter as upon high salinity. A ProHJ mutant strain however did not show a growth defect at 52C in comparison with the wild type and HPLC-analyses of cell extracts verified a missing proline accumulation at 52C. B. subtilis uses exogenic compatible solutes under heat stress and accumulates these through the Opu-transporters, but an accumulation of compatible solutes through de novo synthesis is absent at 52C. Besides the well known synthesis of so-called heat-shock proteins as response to heat stress, the accumulation of compatible solutes plays a fundamental role as adaptation strategy to supraoptimal growth temperatures.