Ανάλυση μοριακών μηχανισμών και φαινοτύπων σε βιομιμητικό περιβάλλον για αξιοποίηση στη συστημική φαρμακολογία και μεταφραστική ιατρική
Creators: name: Θεοδωρούλα, Νικολέτα Φ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Πεπτιδικές υδροπηκτές αυτοσυναρμογής
Χορήγηση θεραπευτικών
Ικρίωμα
Μηχανική των ιστών
Self-assembled peptide hydrogels
Drug-delivery
Scaffold
Tissue engineering

description: Μια αναδυόμενη τάση στην έρευνα για τον καρκίνο περιλαμβάνει τη δημιουργία τρισδιάστατων (3D) μοντέλων όγκων, αξιοποιώντας υδροπηκτές αυτοσυναρμογής ικανών να αναπαράγουν το φυσικό εξωκυττάριο (ECM) μικροπεριβάλλον του όγκου. Η χρήση βιοϋλικών που επιτρέπουν την ανάπτυξη κυττάρων σε 3D δομές αποτελεί αναμφίβολα μια ελπιδοφόρα πειραματική μεθοδολογία, αφού μπορούν να αναπαριστούν το φυσικό μικροπεριβάλλον και να παρέχουν έτσι μια βιομιμητική 3D πλατφόρμα υποστήριξης των αποφάσεων του κυτταρικού πληθυσμού σε ελεγχόμενες συνθήκες για πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση ή/και απόπτωση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, τόσο για την ανάπτυξη φορέων χορήγησης θεραπευτικών όσο και ικριωμάτων για 3D κυτταροκαλλιέργειες, παρουσιάζει η αξιοποίηση φυσικών συστατικών έτσι ώστε να επιτυγχάνεται η αιτούμενη βιοσυμβατότητα και βιοαποικοδόμηση. Ως αποτέλεσμα, η χρήση των πεπτιδικών υδροπηκτών αυτοσυναρμογής, μικρών πεπτιδίων φυσικής προέλευσης, έχει αποκτήσει έντονο ενδιαφέρον για την εφαρμογή τους στη μηχανική κυττάρων και ιστών και την ανάπτυξη καινοτόμων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Στο πλαίσιο αυτό, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αξιοποίηση διεπιστημονικών πειραματικών μεθοδολογιών για τη δημιουργία και φαρμακολογική αξιολόγηση ενός περιβάλλοντος αυτοσυναρμολογούμενης υδροπηκτής βιοπολυμερών, που μιμείται το φυσικό μικροπεριβάλλον του όγκου και προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα για την αξιολόγηση: α) σε μοριακό επίπεδο των αλληλεπιδράσεων των καρκινικών κυττάρων με βιοϋλικά, β) καινοτόμων αντικαρκινικών φαρμάκων και φορέων μεταφοράς θεραπευτικών, γ) συστημάτων υδροπηκτής ως συστήματα παρατεταμένης απελευθέρωσης φαρμάκων στον οργανισμό. H διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε: στην αξιοποίηση του μικρού μήκους, φυσικής προέλευσης, πεπτιδίου NGIWY-amide που απομονώθηκε από το θαλάσσιο αγγούρι Stichopus japonicus για τη δημιουργία ενός περιβάλλοντος υδροπηκτής αυτοσυναρμογής. Ακολούθησαν ρεολογικές και φυσικοχημικές μελέτες της υδροπηκτής αυτής, με στόχο την αξιολόγηση πιθανούς αξιοποίησής της ως σύστημα στοχευμένης μεταφοράς θεραπευτικών. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε in vitro φαρμακολογική αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της υδροπηκτής ως προς τη δημιουργία ικριώματος για την τρισδιάστατη καλλιέργεια κυττάρων. Τέλος, πραγματοποιήθηκε συγκριτική αξιολόγηση της in vitro επίδρασης τριών διαφορετικών υδροπηκτών: του πεπτιδίου NGIWY- amide, του Matrigel και του RADA16 σε 3D καλλιέργειες φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων και ανάλυση μοριακών μηχανισμών και φαινοτύπων φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων σε βιομιμητικό περιβάλλον Matrigel για πιθανή κλινική αξιοποίηση. Με βάση τα ληφθέντα αποτελέσματα, στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιβεβαιώθηκε η υπόθεση ότι το πεπτίδιο NGIWY-amide σχηματίζει σταθερή υδροπηκτή αυτοσυναρμογής και τα συνολικά δεδομένα καταδεικνύουν: 1) Τη θεραπευτική χρησιμότητα της πεπτιδικής υδροπηκτής ως βιοσυμβατό σύστημα χορήγησης φαρμάκων, καθώς η πεπτιδική υδροπηκτή επέδειξε: (i) απλή σύνθεση χαμηλού κόστους, (ii) ευκολία δημιουργίας υδροπηκτής υπό φυσιολογικές συνθήκες, (iii) σχηματισμό σταθερής υδροπηκτής, (iv) μια απλή διαδικασία εγκλωβισμού φαρμάκων και (v) απελευθέρωση τόσο υδρόφοβων όσο και υδρόφιλων μορίων φαρμάκων αλλά και μακρομορίων με ελεγχόμενο τρόπο. 2) Τη δυνατότητα αξιοποίησης της υδροπηκτής ως μια απλή, οικονομικά αποδοτική και ευέλικτη λύση για την υποστήριξη τρισδιάστατης καλλιέργειας τόσο φυσιολογικών όσο και καρκινικών κυττάρων. 3) Τα κύτταρα παρουσιάζουν διαφορετικούς φαινότυπους στις διαφορετικές υδροπηκτές ως απόκριση στα μοριακά ερεθίσματα της κάθε πηκτής, επιβεβαιώνοντας ότι το μικροπεριβάλλον διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στον φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων και, ως εκ τούτου, προσφέρει έναν νέο στόχο για θεραπεία. 4) Τα μοριακά ερεθίσματα της κάθε πηκτής διαφοροποιούν άμεσα την κυτταρική συμπεριφορά. Χαρακτηριστική είναι η διαφοροποίηση των ανθρώπινων πνευμονικών ινοβλαστών προς κύτταρα που σχηματίζουν σωληνοειδείς δομές παρόμοιες του ενδοθηλίου όταν ως ικρίωμα χρησιμοποιείται η υδροπηκτή matrigel.
description: An emerging trend in cancer research involves the creation of three-dimensional (3D) tumor models that use self-assembling hydrogels capable of replicating the natural extracellular (ECM) microenvironment of the tumor. The use of biomaterials that allow the growth of cells in 3D structures is undoubtedly a promising experimental methodology since they can replicate the natural microenvironment and thus provide a biomimetic 3D platform to support cell population decisions under controlled conditions for proliferation, differentiation and/or apoptosis. To this end, the use of self-assembling hydrogels formed by ultra-short peptides of natural origin, has gained intense interest for their application in cell and tissue engineering and the development of innovative therapeutic approaches. In this context, the aim of this PhD thesis was to explore interdisciplinary experimental methodologies for the generation and pharmacological evaluation of a self assembling biopolymer hydrogel environment that mimics the natural tumor microenvironment and offers significant advantages for evaluation: (a) At the molecular level of cancer cell interactions with biomaterials; (b) Innovative anti-cancer drugs and therapeutic delivery vehicles; (c) Hydrogel systems as sustained-release drug delivery systems in the body. The PhD thesis is focused on the utilization of the ultra-short, naturally occurring, peptide NGIWY-amide isolated from the sea cucumber Stichopus japonicus to create a self assembly hydrogel environment. Rheological and physicochemical studies of this hydrogel followed to evaluate its ability to be used as a targeted therapeutic delivery system. In addition, an in vitro pharmacological evaluation of the efficacy of the hydrogel in terms of scaffold generation for 3D cell culture was performed. Finally, a comparative evaluation of the in vitro effect of three different hydrogels: the NGIWY- amide peptide, Matrigel and RADA16 on 3D cultures of normal and cancer cells and analysis of molecular mechanisms and phenotypes of normal and cancer cells in Matrigel biomimetic medium for potential clinical use was performed. The hypothesis behind the execution of The PhD thesis is that the peptide NGIWY amide forms a stable self-assembly hydrogel was confirmed. Overall, the results obtained indicate: 1) Τhe therapeutic utility of peptide hydrogel as a biocompatible drug delivery system, as peptide hydrogel demonstrated: (i) simple low-cost synthesis, (ii) ease of gelation under physiological conditions, (iii) formation of a stable hydrogel, (iv) a simple drug encapsulation process, and (v) release of both hydrophobic and hydrophilic drug molecules and macromolecules in a controlled manner. 2) The potential to exploit the hydrogel as a simple, cost-effective and flexible solution to support the 3D culture of both normal and cancer cells. 3) Cells exhibit different phenotypes in different hydrogels in response to the molecular stimuli of each gel, confirming that the microenvironment plays a crucial role in the phenotype of cancer cells and therefore offers a new target for therapy. 4) The molecular cues of each gel directly modulate cell behaviour. Characteristic is the differentiation of human lung fibroblasts into forming tubular structures resembling that of endothelial cells when matrigel hydrogel is used as a scaffold.