title: Identifizierung neuer Interaktionspartner des Pals1-Associated Tight Junction Protein (PATJ) mithilfe des mating-based-Split-Ubiquitin Systems (mbSUS)
Creators: name: Abunasa, Doaa
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2023
Subjects: subject: 610 Medicine and health
subject: 570 Biology

description: Der Crumbs-Komplex, bestehend aus den Proteinen Crb, Pals1 und PATJ, ist ein essenzieller Bestandteil für die Aufrechterhaltung der Zellpolarität und reguliert verschiedene zelluläre Prozesse. Obwohl bereits verschiedene Interaktionspartner der PDZ-Domänen von PATJ bekannt sind, sind für viele PDZ-Domänen noch keine Bindungsproteine identifiziert. Ziel meiner Arbeit ist; mittels des mbSUS-Systems neue Interaktionspartner für PATJ zu identifizieren. Durch einen Interaktionsscreen wurden folgende Bindungspartner identifiziert: LAMTOR2, JWA, INF2, ID2 und Thioredoxin-1. Studien haben bereits gezeigt, dass diese Proteine an der Zellproliferation, Tumorprogression und der Regulation von Signalwegen wie dem PI3/AKT/mTOR- und dem RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg, beteiligt sind.
description: Abbildungsverzeichnis ..... VII
Tabellenverzeichnis ..... VIII
Abkürzungsverzeichnis ..... IX
1. Einleitung ..... 1
1.1 Aufbau und Funktion von Tight junction (TJ) ..... 1
1.1.1 Polaritätskomplexe ..... 2
1.1.2 Der Crumbs-Komplex ..... 4
1.2 Rolle von Crumbs-Komplex in Hippo- und mTOR-Signalweg ..... 7
1.2.1 Der Hippo-Signalweg ..... 7
1.2.2 Einfluss des Crumbs-Komplexes auf den Hippo-Signalweg ..... 9
1.2.3 Pl3K-Akt-mTOR-Signalweg ..... 11
1.2.4 PATJ-Einfluss auf Pl3K-Akt-mTOR-Signalweg ..... 11
1.3 Grundlagen zum mating-based-Split-Ubiquitin System (mbSUS) ..... 12
1.4 Zielsetzung der Arbeit ..... 14
2. Materialien ..... 15
2.1 Geräte ..... 15
2.2 Laborbedarf ..... 16
2.3 Chemikalien ..... 17
2.4 Puffer und Lösungen ..... 18
2.5 Enzyme ..... 20
2.6 Plasmide ..... 20
2.7 Sequenzierungsprimer ..... 21
2.8 PCR-Primer ..... 21
2.9 Primer für Mutagenese-PCR ..... 22
2.10 Verwendete Organismen ..... 22
2.11 Kommerzielle Kits ..... 23
2.12 Nährmedien für Bakterien ..... 23
2.13 Nährmedien für Hefe ..... 24
3. Methoden ..... 26
3.1 Arbeiten mit DNA ..... 26
3.1.1 Verdau mit Restriktionsendonukleasen ..... 26
3.1.2 Agarose-Gelelektrophorese ..... 26
3.1.3 DNA-Extraktion aus dem Agarose-Gel ..... 26
3.1.4 Phosphorylierung der Oligonukleotide ..... 27
3.1.5 Annealing ..... 28
3.1.6 Ligation ..... 28
3.1.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ..... 28
3.1.8 DNA-Mutagenese (site-directed mutagenesis) ..... 29
3.2 Arbeiten mit Bakterien ..... 30
3.2.1 Bakterientransformation ..... 30
3.2.2 Plasmid lsolierung aus Bakterien ..... 31
3.2.3 Mini/ Midi-Präparation ..... 31
3.3 Arbeiten mit Hefe ..... 32
3.3.1 Aufbau der Konstrukte für mbSUS-System ..... 33
3.3.2 ln vivo Cloning ..... 34
3.3.3 Herstellung einer Hefevorkultur ..... 36
3.3.4 Herstellung und Transformation von kompetenten Hefezellen ..... 36
3.3.5 Plasmid-DNA-lsolation aus S. cerevisiae ..... 37
3.3.6 Überprüfen der in vivo Cloning ..... 37
3.3.7 Mating ..... 38
3.3.8 Selektion der diploiden Hefezellen ..... 38
3.3.9 lnteraktions-Test ..... 38
3.3.10 Transformation der Human Kidney NubG-X cDNA Library und lnteraktionsscreen ..... 39
3.3.11 Detektieren der positiven Kolonien ..... 41
3.3.12 Proteinextraktion aus Hefe nach Kushnirov (2000) ..... 41
3.4 Arbeiten mit Proteinen ..... 42
3.4.1 SDS-PAGE ..... 42
3.4.2 Western Blot ..... 43
4. Ergebnisse ..... 44
4.1 Ergebnisse des mbSUS-System ..... 44
4.2 Protein Expression in THY.AP4-Hefezellen und Nachweis im Western Blot ..... 57
4.3 lnteraktionsscreen ..... 57
4.4 Auswahl der zu validierenden lnteraktionspartner ..... 60
4.5 Validierung der lnteraktionspartner ..... 60
5. Diskussion ..... 64
5.1 Überblick über Funktion der ausgewählten Proteine ..... 66
5.1.1 Rolle von LAMTOR2 in RAS-RAF-MEK-ERK-Signalweg ..... 66
5.1.2 Der regulatorische Effekt von JWA (ARL6lP5) auf die Zellmigration, Zellproliferation und Apoptose ..... 67
5.1.3 lD-2 ..... 69
5.1.4 Thioredoxin-1 ..... 70
5.2 Die Rolle von PATJ und seiner lnteraktionspartner als Tumorsuppressor ..... 70
5.3 Ausblick ..... 71
Literaturverzeichnis ..... 72
Danksagung ..... 72
Lebenslauf ..... 83