Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων που κωδικοποιούν μόρια κυτταρικής προσκόλλησης στο καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου(ακανθοκυτταρικό) του στόματος:
Creators: name: Κυροδήμου, Μαριάνθη Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Κυτταρική συγκόλληση
Καρκίνος στόματος
γονιδιακή έκφραση
Cell adhesion
Oval cancer
Gene expression

description: Τα μόρια κυτταρικής προσκόλλησης συμμετέχουν σε διακυτταρικές και εξωκυττάριες συνδέσεις, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη δημιουργία ιστών και οργάνων κατά την εμβρυογένεση, στην παροχή μηχανικής σταθερότητας στους ιστούς, στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της απόπτωσης, της διαφοροποίησης και της μετανάστευσης των κυττάρων. Διαταραχές στη δομή και τη λειτουργίας τους, μπορεί να οδηγήσουν σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις, όπως η λευκοπλακία και το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος. Τα πειραματικά αποτελέσματα της συγκεκριμένης πειραματικής διπλωματικής εργασίας, δείχνουν ότι όταν τα καρκινικά HSC-3 (Human Squamous Carcinoma cells) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τριβλία επιστρωμένα με την υδρογέλη poly-HEMA (poly 2-hydroxyethyl methacrylate), δεν προσκολλήθηκαν στο υπόστρωμα, αλλά παρέμειναν στρογγυλά και δημιούργησαν κυτταρικά συσσωματώματα (MCAs). Μάλιστα, η συγκεκριμένη μορφή καλλιέργειας επέτρεψε στα κύτταρα να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν, αλλά με ρυθμό χαμηλότερο σε σχέση με τα HSC-3 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν φυσιολογικά ως μονοστιβάδες (MLs). Επίσης, διερεύνηση της απόκρισης των HSC-3 κυττάρων (MLs και MCAs) στον κυτταροτοξικό αντικαρκινικό παράγοντα ετοποσίδη, επιβεβαιώνει την κυτταροτοξικότητα του συγκεκριμένου φαρμάκου στα HSC-3 κύτταρα, αλλά με διαφορετική ευαισθησία ανάμεσα στις MLs και MCAs καλλιέργειες. Ακόμα, ανάλυση με RT-PCR της γονιδιακής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση (desmogleins-1/2/3, catenins-β/γ, E-cadherin), τη διαφοροποίηση (involucrin) ή/και γονίδια αναφοράς (β-actin) κατά την ανάπτυξη των HSC-3 κυττάρων στην καλλιέργεια, έδειξε: α) μείωση του επιπέδου των RNA μεταγράφων για το γονίδιο της DSG3, καθώς τα κύτταρα περνούν από τη λογαριθμική στην πλατώ φάση ανάπτυξης, β) αύξηση των επιπέδων για τα γονίδια DSG2, της γ-CAT και της INV, ενώ γ) για τα γονίδια E-CAD, β-CAT και β-ACT δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές στην έκφρασή τους. Επιπρόσθετα, η αντίστοιχη ανάλυση με RT-PCR για την πρωτείνη dsg1, έδειξε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Περαιτέρω ανάλυση των πρωτεϊνικών επιπέδων για τις desmogleins-2/3, catenins-β/γ, E-cadherin, κατά την ανάπτυξη των HSC-3 κυττάρων σε καλλιέργεια ως MLs ή/και ως MCAs, έδειξε αύξηση των ολικών (ελεύθερης και δεσμευμένης) πρωτεϊνικών επιπέδων της dsg2 στο κύτταρο και αντίστοιχη μείωση της dsg3, της β-cat, της γ-cat και της E-cad κατά τη μετάβαση των HSC-3 κυττάρων από τη λογαριθμική στην πλατώ φάση ανάπτυξης. Επίσης, με ανοσοκυτταροχημεία μελετήθηκε η κυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών dsgs-2/3, catenins-β/γ, E-cadherin, involucrin σε HSC-3 κύτταρα καλλιεργούμενα ως MLs, όπου παρατηρήθηκε ότι: 1) η dsg2 και η inv εμφανίζουν διάχυτη κυτταροπλασματική και περιπυρηνική εντόπιση, 2) η E-cad παρουσιάζει διαμεμβρανική εντόπιση, και 3) η dsg3, η β-cat και η γ-cat εντοπίζονται κυτταροπλασματικά και περιπυρηνικά στις 24 ώρες ανάπτυξης, ενώ στις 96 ώρες μόνο μεμβρανικά. Ένα ενδιαφέρον στοιχείο της ανάλυσης, αφορά τη μελέτη της κυτταρικής εντόπισης των πρωτεϊνών dsg3, β-cat, γ-cat και E-cad, σε ιστούς προκαρκινικής (λευκοπλακία) και καρκινικής φάσης (καρκίνωμα πλακώδους επιθηλίου του στόματος). Σε αυτήν την περίπτωση, και καθώς το στάδιο της νεοπλασματικής εξαλλαγής των κυττάρων οδηγείται προς την καρκινική κατάσταση, παρατηρήθηκε μια γενικότερη μείωση της μεμβρανικής εντόπισης αυτών των πρωτεϊνών, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις μία αύξηση της κυτταροπλασματικής (dsg3 και γ-cat), της περιπυρηνικής (dsg3 και γ-cat) και της πυρηνικής (γ-cat) εντόπισης των μελετούμενων πρωτεϊνών. Συμπερασματικά, η ανάλυση των μορίων προσκόλλησης στο καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου του στόματος, δείχνει ότι μπορεί να αποτελέσει στοιχείο επιστημονικής ανάλυσης με ενδιαφέρουσες κλινικές προεκτάσεις.
description: Cell Adhesion Molecules (CAMs) participate in cell-cell and cell-matrix adhesion and are critical components during embryogenesis by maintaining the mechanical stability at tissues and contributing to cell decision related to proliferation, apoptosis, differentiation and migration. As a consequence, dysfunction of CAMs affecting their structure and function can lead to pathophysiological conditions, such as Oral Leukoplakia (OL) and Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC). The aim of this work is to assess gene expression of specific CAMs upon OSCC development by using HSC-3 cells (Human Squamous Carcinoma) grown in culture either as Monolayers (MLs) or Multicellular Aggregates (MCAs). Furthermore, the analysis of samples from patients suffering either from OL or OSCC of various stage is also included. The data obtained, provide evidence that when HSC-3 cells are cultured in plates coated with the hydrogel poly-HEMA, they form MCAs, since cell-matrix adhesion is abrogated. MCAs provide cells an environment to survive and proliferate, but in a lower growth rate as compared to MLs. The pharmacological relevance of growing HSC-3 cells in MLs or MCAs was further assessed by treating cells with the anticancer drug etoposide. Indeed, when HSC-3 cells cultured in the presence of etoposide, although its cytotoxic effect was confirmed, a different sensitivity was seen on MLs and MCAs. The IC50 for etoposide was 1x10-6M in MLs and 1x10-5M in MCAs. Furthermore, RT-PCR assessment of the steady state level of RNA transcripts encoded by genes related with cell adhesion (desmogleins-1/2/3, catenins-β/γ, E-cadherin), cell differentiation (involucrin) and housekeeping genes (β-actin), from cells growing from the exponential to the plateau phase of growth, indicated the following: a) reduction of the steady state mRNA level encoded dsg3, b) increase of that for dsg2, γ-cat and inv, c) no significant alteration for E-cad, β-cat, β-act, d) undetectable gene expression levels for dsg1. Further assessment of the protein levels for dsgs-2/3, catenins-β/γ, E-cadherin, in HSC-3 cells cultured as MLs and/or as MCAs growing from the exponential to the plateau phase, has shown increased protein levels for dsg2 with parallel decrease of that for dsg3, β-cat, γ-cat and E-cad. Additionaly, by performing immunocytochemistry on HSC-3 cells growing either as MLs and/or as MCAs, our results have indicated that: 1) dsg2 and inv exhibited diffuse cytoplasmic and perinuclear localization, 2) E-cad shown membrane staining and 3) dsg3, β-cat and γ-cat possessed both cytoplasmic and perinuclear localization at 24hr (exponential phase) and only membrane staining at 96hr (plateau phase). Based on immunohistochemistry of tissue samples derived from patients with OL and/or OSCC, we observed decrease in membrane localization of dsg3, β-cat, γ-cat and E-cad, in parallel with the increase of the grade of malignancy. In some cases, an increased cytoplasmic (dsg3 and γ-cat), perinuclear (dsg3 and γ-cat) and nuclear (γ-cat) protein expression was observed. Overall, such data suggest that the analysis of CAMs in OSCC exhibit different gene expression profiles and further work is needed, in order to delineate the underlying molecular mechanisms, in a way to better understand OSCC behavior and allow improvement of clinical practice and treatment opportunities.