title: Ribosome-Independent Biosynthesis of Peptide Natural Products: Nonribosomal Peptide Synthetases and Cyclodipeptide Synthases
title: Ribosom-unabhängige Biosynthese von peptidischen Naturstoffen: Nichtribosomale Peptidsynthetasen und Cyclodipeptidsynthasen
Creators: name: Gießen, Tobias
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: cyclodipeptide synthases
Cyclodipeptide
Nonribosomal peptides
nonribosomal peptide synthetases
Peptide , Antibiotikum
Nichtribosomale Peptide
Ribosom-unabhängige Peptidsynthese, Diketopiperazine
diketopiperazines
Molekularbiologie
Naturstoffchemie , Synthetische Biologie
Chemie
Biochemie

description: Bioaktive Peptid-Naturstoffe
      spielen weiterhin eine wichtige Rolle in der modernen
      Medizin, wo sie oftmals als letzte Option bei schweren,
      lebensbedrohlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Ein großer
      Teil dieser Peptide wird in der Natur, unabhängig vom
      Ribosom, durch Templat-abhängige und Templat-unabhängige
      sekundäre Stoffwechselwege synthetisiert. Oftmals sind diese
      strukturell komplexen Peptid-Naturstoffe nicht durch rein
      synthetische Ansätze zugänglich. Deshalb wurde damit begonnen
      neue Ansätze für in vivo Fermentationsprozesse, sowie
      chemoenzymatische Strategien zur Synthese und Diversifikation
      von Peptid-Naturstoffen zu entwickeln. Diese Ansätze fußen
      auf einem vertieften Verständnis der zugrundeliegenden
      biosynthetischen Stoffwechselwege. In dieser Arbeit wurden
      aus diesem Grund jeweils zwei Templat-abhängige und
      Templat-unabhängige Biosyntheserouten eingehend untersucht.
      Hierbei standen sowohl die Mechanismen, welche zur Synthese
      eines bestimmten Peptidgerüsts führen, sowie die zugehörigen
      Modifizierungsstrategien, die das assemblierte Peptid weiter
      dekorieren, im Fokus. Bei den beiden untersuchten
      Templat-abhängigen NRPS-Biosynthesewegen handelt es sich um
      die Assemblierungsrouten des Antitumor-Antibiotikums
      Sibiromycin und des neu identifizierten Siderophors
      Mirubactin. Es wurde durch detaillierte in vitro Studien
      gezeigt, dass die ungewöhnlich substituierte
      Anthranilsäure-Gruppe des Sibiromycins durch vier
      biosynthetische Schritte generiert wird. Ausgehend von
      3-Hydroxykynurenin wird durch die SAM-abhängige
      Methyltransferase SibL eine Methylierung an der 4-Position
      eingeführt. Die PLP-abhängige Kynureninase SibQ erzeugt
      anschließend 3-Hydroxy-4-methylanthranilsäure (3H4MAA) durch
      Hydrolyse. Dieses Intermediat dient nun als Substrate für die
      NRPS SibE, welche es aktiviert und kovalent an seine
      Thiolierungsdomäne bindet. Abschließend wird die vollständig
      modifizierte Anthranilsäure-Gruppe durch
      online-Hydroxylierung, katalysiert durch die
      FAD/NADH-abhängige Hydroxylase SibG, gebildet. Das vormals
      unbekannte Siderophor Mirubactin konnte aus Actinosynnema
      mirum durch Kultivierung unter Eisen-limitierten Bedingungen,
      gefolgt von Aktivitäts-geleiteter Aufreinigung, isoliert
      werden. Durch eine Kombination an spektroskopischen,
      massenspektrometrischen und Derivatisierungs-Methoden, konnte
      die Struktur von Mirubactin aufgeklärt werden. Durch
      bioinformatische Analysen und in vitro Untersuchungen der
      biosynthetischen Maschinerie konnte der Mirubactin Gencluster
      identifiziert werden. Es konnte eine Biosyntheseroute
      postuliert werden, welche die iterative Verwendung eines an
      eine Thiolierungsdomäne gebundenen Substrats (MrbD), sowie
      die Bildung eines ungewöhnlichen O-Acylhydroxamsäureesters
      durch eine C-terminale Kondensationsdomäne (MrbJ), enthält.
      Zusätzlich wurden zwei Templat-unabhnägige
      CDPS-Biosynthesewege untersucht, die für die Synthese der
      Nocazine und die Generierung von modifizierten
      Ditryptophan-Diketopiperazinen (DKPs) zuständig sind. Mittels
      bioinformatischer Analysen konnte der erste
      Nocazine-Gencluster identifiziert werden. Durch in vivo und
      in vitro Studien konnte die gesamte Biosyntheseroute von
      Nocazine E und XR334 aufgeklärt werden. Die DKP-Bildung wird
      durch die CDPS Ndas_1148 katalysiert, welche ein neues
      Produktprofil aufweist bei dem cyclo(L-Phe-L-Tyr) und
      cyclo(L-Phe-L-Phe) die beiden Hauptprodukte darstellen.
      Weitere Modifikation des DKP-Gerüsts wird anschließend durch
      kombinatorischen Gebrauch einer Cyclodipeptidoxidase
      (Ndas_1146/1147) sowie zweier SAM-abhängiger
      O-/N-Methyltransferasen (Ndas_1145 und Ndas_1149) erreicht.
      Ein CDPS-Gencluster, zuständig für die Biosynthese von
      methylierten Ditryptophan-DKPs, konnte durch Genomanalyse von
      A. mirum identifiziert werden. Der Biosyntheseweg wurde durch
      in vivo und in vitro Untersuchungen aufgeklärt. Zu Beginn
      katalysiert die hoch spezifische CDPS Amir_4627 die Bildung
      des vormals unbekannten CDPS-Produkts cyclo(L-Trp-L-Trp). Nun
      methyliert die SAM-abhängige N-Methyltransferase Amir_4628
      entweder einen oder beide Ring-Stickstoffe des DKP-Gerüsts
      und bildet somit die einfach- oder doppelt-methylierten
      Ditryptophan-DKP Produkte.
description: Bioactive peptide natural products
      continue to play an important role in modern medicine since
      many of them represent last-resort treatments for a variety
      of life threatening diseases. A large fraction of those
      peptides are generated via ribosome-independent templated and
      non-templated biosynthetic pathways. Oftentimes the
      structural complexity of those peptides has prevented their
      synthesis and diversification through purely synthetic means.
      New approaches build on detailed knowledge about the
      respective biosynthetic pathways have been envisaged where
      fermentative in vivo or chemoenzymatic strategies are used to
      generate highly modified peptide natural products. To work
      towards this vision two templated and two non-templated
      biosynthetic pathways have been investigated. Both their
      abilities to generate particular peptide scaffolds and to
      subsequently decorate a given peptide backbone through the
      action of dedicated modification enzymes have been explored.
      The two templated NRPS-dependent pathways studied are the
      biosynthetic systems of the antitumor-antibiotic sibiromycin
      and the newly discovered siderophore mirubactin. The origin
      of the highly substituted anthranilate moiety found in
      sibiromycin was investigated. The pathway was shown to
      consist of four steps starting from the known metabolite
      3-hydroxykynurenine using detailed in vitro analyses.
      Initially, the SAM-dependent methyltransferase SibL converts
      its substrate to the 4-methyl derivative, followed by
      hydrolysis through the PLP-dependent kynureninase SibQ
      leading to 3-hydroxy-4-methylanthranilic acid (3H4MAA)
      formation. Then the NRPS didomain SibE activates 3H4MAA and
      tethers it to its thiolation domain, where it then serves as
      the hydroxylation substrate for the FAD/NADH-dependent
      hydroxylase SibG, yielding the fully substituted anthranilate
      moiety found in sibiromycin. The siderophore mirubactin was
      discovered and purified from Actinosynnema mirum through
      cultivation under iron-limited conditions followed by
      activity-guided isolation. Structure elucidation was
      accomplished through a combination of spectroscopic, mass
      spectrometric and derivatization methods. Bioinformatic
      analyses coupled with in vitro characterization of its
      biosynthetic machinery, was used to identify the mirubactin
      gene cluster. A biosynthetic assembly route could be proposed
      comprising the iterative use of a stand-alone
      carrier-protein-bound substrate (MrbD) and the formation of
      an unusual O-acyl hydroxamic acid ester bond through a
      C-terminal condensation domain (MrbJ). In addition, two
      non-templated CDPS-dependent pathways responsible for
      nocazine biosynthesis and the generation of singly and doubly
      methylated ditryptophan diketopiperazines (DKPs) have been
      investigated. The first nocazine gene cluster could be
      identified through bioinformatic analyses and the
      biosynthetic pathway leading to the two nocazine family
      members nocazine E and XR334 could be elucidated through in
      vivo and in vitro studies. DKP-formation is carried out by a
      CDPS (Ndas_1148) that shows an unknown product profile
      forming cyclo(L-Phe-L-Tyr) and cyclo(L-Phe-L-Phe) as its main
      products. Tailoring of the DKP-scaffold is achieved through
      the combined and combinatorial action of a cyclic dipeptide
      oxidase (Ndas_1146/1147) and two distinct SAM-dependent
      O-/N-methyltransferases (Ndas_1145 and Ndas_1149). A CDPS
      gene cluster responsible for the formation of methylated
      ditryptophan DKPs was identified in A. mirum through
      bioinformatic genome analysis. The assembly pathway was
      investigated through in vivo and in vitro studies. Initially,
      the highly specific CDPS Amir_4627 catalyzes the formation of
      a formerly unknown CDPS product, namely cyclo(L-Trp-L-Trp)
      followed by the methylation of one or both DKP-ring nitrogens
      through the action of the SAM-dependent N-methyltransferase
      Amir_4628 generating singly and doubly methylated
      ditryptophan DKPs.