Φυτοχημική ανάλυση του Tephrosia humilis της οικ. Fabaceae, με έλεγχο αντιοξειδωτικής δράσης in vitro και αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης:
Creators: name: Πλιούκας, Μιχαήλ Η.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Tephrosia humilis
Φυτοχημική ανάλυση
LC-DAD-MS (ESI+)
Αντιοξειδωτική ικανότητα
Αναστολή αναγωγάσης αλδόζης
Phytochemical analysis
Antioxidant capacity
Aldose reductase inhibition

description: Το γένος Tephrosia (Fabaceae) περιλαμβάνει περί τα 400 είδη θάμνων, που ενδημούν σε τροπικές και υποτροπικές περιοχές. Από τη χρήση του φυτού στη λαϊκή θεραπευτική από τοπικούς πληθυσμούς, τα περισσότερα είδη του γένους Tephrosia φαίνεται να διαθέτουν υπογλυκαιμικές, εντομοκτόνες, ιχθυοκτόνες, αντιελκωτικές, ηπατοπροστατευτικές και αντικαρκινικές ιδιότητες με την ξηρά δρόγη να είναι αποτελεσματική ως καθαρτικό, ανθελμινθικό και διουρητικό. Από τη φυτοχημική ανάλυση του φυτού προέκυψε η ύπαρξη χαλκονών, φλαβανονών, φλαβονών, ισοφλαβονών, κουμεστονών, πτεροκαρπανίων και ροτενοϊδών ως δευτερογενών μεταβολιτών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου του υπέργειου τμήματος του φυτού Tephrosia humilis (Fabaceae), έλεγχος διαφόρων εκχυλισμάτων σχετικά με την αντιοξειδωτική ικανότητα (δοκιμή ρίζας DPPH•, χημειοφωταύγεια της λουμινόλης και αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης), καθώς και έλεγχος αναστολής του ενζύμου αναγωγάση της αλδόζης σε σύγκριση με την αναστολή του ενζύμου αναγωγάση της αλδεΰδης. Το ένζυμο αναγωγάση της αλδόζης είναι υπεύθυνο για την εκδήλωση των δευτερογενών επιπλοκών σε διαβητικούς τύπου ΙΙ, όπου συγχρόνως έχουμε και γένεση ελευθέρων ριζών (κυτταρικό οξειδωτικό στρες). Το φυτικό υλικό εκχυλίστηκε εξαντλητικά με πετρελαϊκό αιθέρα, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη, διαδοχικά. Το ξηρό υπόλειμμα του μεθανολικού εκχυλίσματος διαλύθηκε σε ζέον ύδωρ, διηθηθήκε και ακολούθησε κατανομή με τους ακόλουθους διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας: διαιθυλαιθέρα, οξικό αιθυλεστέρα και βουτανόλη. Η εναπομείνασα υδατική φάση συλλέχθηκε και αυτή. Η φυτοχημική ανάλυση των αρχικών εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε σύστημα LC-DAD-MS (ESI+). Παράλληλα πραγματοποιήθηκε, σε παρασκευαστικό επίπεδο, προσπάθεια απομόνωσης των κυρίων συστατικών με διάφορες τεχνικές [υγρή χρωματογραφία στήλης (CC), υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC), χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC)]. Από την φυτοχημική ανάλυση ανιχνεύθηκαν συνολικά 95 ενώσεις εκ των οποίων 65 απομονώθηκαν με χρωματογραφικές τεχνικές και 30 αναλύθηκαν με την τεχνική του LC-DAD-MS. 13 από τις συνολικά 65, ταυτοποιήθηκαν με όλα τα φασματοσκοπικά τους στοιχεία, 38 με τα φάσματα UV-Vis κατά Mabry (1970) ενώ δεν κατέστη δυνατή η διευκρίνιση σε 14 ενώσεις. Εκτιμήθηκε η δομή σε 29 ενώσεις από τις 30 με την τεχνική του LC-DAD-MS, ενώ δεν κατέστη δυνατή η διευκρίνιση σε μία εξ αυτών. Από τον αντιοξειδωτικό έλεγχο με όλες τις τεχνικές αξιολόγησης, προέκυψε η ισχυρή αντιοξειδωτική ικανότητα της κατανομής του οξικού αιθυλεστέρα, συγκριτικά με τις ουσίες αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν. Σύμφωνα με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης όλα τα κλάσματα, πλην οξικού αιθυλεστέρα, εμφάνισαν χαμηλή ικανότητα σάρωσης ελευθέρων ριζών, ενώ με τα αποτελέσματα της μεθόδου με τη χρήση DPPH, απεδείχθη ότι οι κατανομές του οξικού αιθυλεστέρα, της βουτανόλης και του υπολείμματος του οξικού αιθυλεστέρα αποτελούν ισχυρούς σαρωτές ελευθέρων ριζών. Σχετικά με την αναστολή της λιποξυγονάσης, οι κατανομές του οξικού αιθυλεστέρα και του υπολείμματος του οξικού αιθυλεστέρα, αποδείχθηκαν οι πιο ισχυροί αναστολείς του ενζύμου. Όσον αφορά την αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης, όλες οι κατανομές, πλην της υδατικής, ήταν ισχυροί αναστολείς του ενζύμου, με τα κλάσματα της βουτανόλης και του οξικού αιθυλεστέρα να υπερβαίνουν το 75%. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη φυτοχημική μελέτη του φαινολικού περιεχομένου του υπέργειου τμήματος του φυτού Tephrosia humilis, καθώς και η πρώτη in vitro ένδειξη καλής αντιοξειδωτικής ικανότητας και με παράλληλη αναστολή της αναγωγάσης της αλδόζης.
description: Tephrosia ssp. (Fabaceae) genus contains about 400 species of shrubs indigenous in tropical and sub-tropical regions. Because of the use of the plant in tradional remedies by the natives in these areas, most Tephrosia species seem to possess hypoglycemic, insecticidal, fish-poisoning, antiulcer, hepatoprotective and anticancer properties and the dried herb is effective as a laxative, anthelminthic and diuretic [3]. The phytochemical investigation of this plant provided chalcones, flavanones, flavones, isoflavones, coumestones, pterocarpanes and rotenoids as secondary metabolites. In the present research work the aerial parts of Tephrosia humilis (Fabaceae) were tested about their phenolic content, the antioxidant potential (DPPH•, luminol chemiluminescence and LOX tests) and their ability to inhibit the aldose reductase enzyme (ALR2) in comparison with the inhibition of the aldehyde reductase enzyme (ALR1). The ALR2 enzyme is postulated to be associated with the development of the long term (type II) diabetic complications, where also cellular oxidative stress is implied. The plant material was exhaustively extracted with petroleum ether, dichloromethane and methanol consecutively. The dry remaining of the methanolic extract (44,68g) was dissolved in hot water, filtrated and partitioned with the following solvents of increasing polarity: diethyl ether, ethyl acetate and butanol. Finally the remaining aqueous extract was collected. The phytochemical analysis of the initial extracts was realized at an LC-DAD-MS (ESI+) system. Furthermore, there has been an effort for the isolation and clarification of the major compounds with preparative techniques [Column Chromatography (CC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), Thin Layer Chromatography (TLC)]. Phytochemical analysis resulted to the detection of 95 compounds, 65 of which have been isolated with chromatographic techniques and 30 have been analyzed by the LC-DAD-MS analysis. The structure of the 13, out of the first 65, have been fully elucidated, 38 were estimated by means of their UV-Vis spectra (Mabry et al., 1970), and the rest 14 could not be elucidated. 29 of the next 30 were estimated from the LC-DAD-MS analysis and only one of them could not be elucidated. Antioxidant results according to all tests proved the strong antioxidant capacity of the ethyl acetate fraction in comparison to the standards used. According to the CL test, all fractions, except for the ethyl acetate fraction, showed low hydroxyl radical scavenging ability, and the DPPH∙ test results proved that the ethyl acetate, the n-butanolic and the ethyl acetate residue fractions are effective radical scavengers. As for the inhibition of the lipoxygenase, the fractions of the ethyl acetate and its residue, proved to be the strongest inhibitors of the enzyme. As about the ALR2 inhibition, all fractions, except the aqueous, were strong inhibitors of the enzyme, with the n-butanolic and the ethyl acetate fractions to inhibit the enzyme above 75%. This research work is the first phytochemical study of the phenolic content of the aerial parts of Tephrosia humilis, as well as the first scientific establishment of the good in vitro antioxidant capacity of Tephrosia humilis extracts, and specifically of the ethyl acetate fraction, and its strong inhibitory activity against ALR2 enzyme. All this information may be useful for the promotion of use of Tephrosia humilis as a natural antioxidant in food and medicinal products and can be an answer to the continual demand for new natural antioxidants. Moreover, the inhibition of ALR2 of the aerial parts of Tephrosia humilis, validated the use of the plant for medicinal purposes, especially its potential against the long term diabetic complications.