Διερεύνηση του ρόλου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης Rpl35a στη διαφοροποίηση και απόπτωση των κυττάρων Mel:
Creators: name: Αμανατιάδου, Ελισάβετ Παύλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Ριβοσωμικές πρωτεΙνες
Ψευδογονίδιο
Απόπτωση
Διαφοροποίηση
Rpl35a
Sirna
Ribosomal proteins
Pseudogene
Apoptosis
Differntiation

description: Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αποτελούν συστατικά της βασικής κυτταρικής μηχανής που είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση όλων των πρωτεϊνών του κυττάρου. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων χρόνων, έχει βρεθεί ότι ριβοσωμικές πρωτεΐνες από όλα τα είδη οργανισμών παίζουν ρόλο σε διαδικασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η μεταμόρφωση και ο θάνατος, ένα γεγονός που εδραιώνει τον πολυλειτουργικό τους ρόλο. Προηγούμενη δουλειά στο εργαστήριό μας έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων των ριβοσωμικών πρωτεϊνών RPS5 και RPL35a, μειώνονται σταδιακά κατά την επαγόμενη διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL. Επιπρόσθετα, η εκτοπική υπερέκφραση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPS5 στα κύτταρα MEL, οδήγησε σε καθυστέρηση στην έναρξη του προγράμματος διαφοροποίησης, παρεμποδίζοντας την είσοδο των κυττάρων στην φάση κυτταρικού κύκλου G1/G0 και τροποποιώντας τα επίπεδα των CDKs (CDK2, CDK4, CDK6). Κατά συνέπεια, κεντρικό στόχο της παρούσας μεταπτυχιακής πειραματικής εργασίας αποτέλεσε η διερεύνηση του πιθανού ρόλου της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPL35a στην διαφοροποίηση και απόπτωση των κυττάρων MEL. Eπιπλέον, η παρούσα πειραματική εργασία είχε σαν στόχο τη συνέχεια και ολοκλήρωση της προηγούμενης δουλειάς στο εργαστήριο, που αφορά τη ριβοσωμική πρωτεΐνη RPS5, η οποία αντίθετα με την RPL35a ανήκει στη μικρή υπομονάδα του ριβοσώματος. Για να διερευνηθεί ο ρόλος της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPL35a στην διαφοροποίηση των κυττάρων MEL, χρησιμοποιήθηκαν εξειδικευμένα siRNAs για την αποσιώπηση του γονιδίου της RPL35a. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας καθορίστηκαν οι πειραματικές συνθήκες, στις οποίες αναστέλλεται η έκφραση του γονιδίου της RPL35a με τη χρήση εξειδικευμένων siRNAs, ένα γεγονός που μπορεί να συμβάλει στην αποσαφήνιση του πιθανού ρόλου της πρωτεΐνης στο πρόγραμμα διαφοροποίησης των κυττάρων MEL. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος της πρωτεΐνης RPL35a στην απόπτωση. Καλλιέργειες MEL κυττάρων επωάστηκαν με τον αποπτωτικό παράγοντα ετοποσίδη, και το αποτέλεσμα παρατηρήθηκε σε διάφορα 93 χρονικά σημεία ως και 96 ώρες μετα την προσθήκη του ετοποσίδη στην καλλιέργεια. Διαπιστώθηκε η υπερέκφραση του γονιδίου της RPL35a, 48 ώρες μετά την προσθήκη του ετοποσίδη σε συγκέντρωση 0.3μM. Η παρατήρησή μας στηρίζει προηγούμενες αναφορές που συσχετίζουν τον ρόλο της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPL35a με την κυτταρική απόκριση σε κυτταροτοξικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, έχει αποδειχτεί ότι κύτταρα στα οποία υπερεκφράστηκε η RPL35a εμφάνισαν αυξημένη αντίσταση σε διαφόρων ειδών ερεθίσματα που προάγουν τον κυτταρικό θάνατο, ενώ από την άλλη πλευρά, κύτταρα στα οποία μειώθηκαν τα επίπεδα τη RPL35a παρουσιάζουν μειωμένο αναπαραγωγικό δυναμικό, εν μέρει λόγω της απόπτωσης που παρατηρείται. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας πειραματικής εργασίας έγινε μια συστηματική βιοπληροφορική ανάλυση της πρωτεΐνης RPL35a. Αντικείμενο ενδιαφέροντος ήταν α) η πιθανή φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης και εντοπισμός πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης στο μόριό της, β) η ύπαρξη χαρακτηριστικών μοτίβων στο μόριό της που απαντώνται στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες γενικά, γ) η πιθανή ύπαρξη ομόλογων πρωτεϊνών με διαφορετικό λειτουργικό ρόλο. Σε αυτή την προσπάθεια, διαπιστώθηκε η ύπαρξη ενός χιμαιρικού μορίου mRNA το οποίο αποτελείται από το mRNA της πρωτεΐνης Ino80, ενωμένο στην 3’‐μη μεταφραζόμενη περιοχή με το mRNA της RPL35a. Η πρωτεΐνη Ino80 εμπλέκεται στην διαδικασία της επιδιόρθωσης του DNA και η ιστική προέλευση του χιμαρικού mRNA είναι ένα καρκίνωμα μαστού ποντικού, γεγονός που οδήγησε στην πειραματική προσπάθεια εντοπισμού του χιμαιρικού mRNA στα κύτταρα MEL. Αν και η προσπάθεια αυτή δεν ήταν επιτυχής, η βιοπληροφορική ανάλυση επέτρεψε την θεωρητική ερμηνεία του σχηματισμού του χιμαιρικού mRNA σε μεταγραφικό επίπεδο, με βάση την ύπαρξη ψευδογονιδίων της RPL35a στο γονιδίωμα του ποντικού. Φαίνεται πως στο σχηματισμό του χιμαιρικού mRNA συμμετέχει το γονίδιο της πρωτεΐνης Ino80 το οποίο μεταγράφεται μαζί με ένα ψευδογονίδιο της RPL35a που εδράζεται στο ίδιο χρωμόσωμα. Αυτό το στοιχείο έχει ιδιάζουσα σημασία, άσχετα από την πιθανή ιστική εξειδίκευση που μπορεί να χαρακτηρίζει την ύπαρξη του χιμαιρικού mRNA. Η άποψη αυτή αντιτίθεται ακόμη και στην βασική αντίληψη ότι τα ψευδογονίδια των ριβοσωμικών πρωτεϊνών δεν μεταγράφονται.
description: Ribosomal proteins are integral components of the basal cellular machinery involved in protein synthesis. During the last two decades, various ribosomal proteins from all species have been found to play roles in regulating cell growth, differentiation, transformation and death establishing their identification as multifunctional proteins. Previous work in our laboratory has shown that ribosomal protein RPS5 and RPL35a gene expression is down regulated upon differentiation of murine erythroleukemia (MEL) cells in vitro. Furthermore, over expression of mouse RPS5 cDNA in MEL cells caused a delay in the initiation of differentiation program by abrogating the accumulation of cells into G1/G0 phase and modulating the level of CDKs (CDK2, CDK4, CDK6). Thus, the main objective of this master thesis was to investigate the potential role of ribosomal protein RPL35a in differentiation and apoptosis of MEL cells. In addition, this master thesis aimed at completing the previous work in our laboratory concerning ribosomal protein RPS5 which, in contrary to RPL35a, belongs to the small subunit of the ribosome and has been found to follow a similar expression pattern under the same experimental conditions. In order to investigate the potential role of RPL35a in the induced differentiation of MEL cells, specific siRNAs were used to silence the RPL35a gene. To this end, the experimental conditions where the RPL35a gene can be silenced by using specific siRNAs have been established, a fact that could finally lead to the exploration of the role of RPL35a in MEL cell differentiation program. In addition, the potential role of ribosomal protein RPL35a in apoptosis was also explored. MEL cells were treated with the apoptosis‐ inducing agent etoposide and its effect was investigated at various time intervals up to 96 hr. RPL35a was found to be overexpressed 48 hr after the addition of etoposide in the culture at a concentration of 0.3μM. Our observation further supports previous reports on the implication of RPL35a in the cellurar response upon cytotoxic damage conditions. In particular, it has been shown that cells that ectopically express RPL35a exhibited increased resistance to various death‐inducing stimuli, while, on the other hand, 96 cells depleted of RPL35a have exhibited decreased proliferation potential partly due to the increased apoptosis observed in culture. Finally, a comprehensive bioinformatics analysis was performed during the course of this master thesis concerning RPL35a. Of great interest were the findings that show: a) its potential phosphorylation by identifying specific phosphorylation sites; b) the presence of distinct motifs in its molecule which are also present in other ribosomal proteins in general; c) the potential existence of homologous proteins possessing different functions. In this effort, a chimeric mRNA was identified in DNA databases which is comprised of the Ino80 mRNA fused at its 3΄‐ UTR to RPL35a mRNA. Ino80 protein is implicated in the DNA repair process and the origin of the identified chimeric mRNA is a mouse mammary tumor, a fact that prompted us to further investigate its presence in MEL cells. Although the chimeric mRNA was not detected in MEL cells, however the bioinformatics analysis enabled us to suggest its potential transcription origin based on the presence of RPL35a pseudogenes in the mouse genome. To this end, Ino80 gene seems to be co‐transcribed with a pseudogene of RPL35a lining at the same chromosome with Ino80 gene that leads to the formation of the chimeric mRNA. This result constitutes a new interesting element in transcription regardless of the potential tissue specificity. It even opposes to the basic notion that mammalian ribosomal pseudogenes are not transcribed. The fundamental role of ribosomal protein RPL35a in differentiation and particularly erythropoiesis was proven by its recent implication in the pathophysiology of Diamond‐Blackfan anemia. Diamond‐Blackfan anaimia (DBA) is an inherited bone marrow failure syndrome characterized by a reduction of erythroid precursors and defective erythropoiesis. Haploinsufficiency of RPL35a, as well as of other ribosomal proteins, has recently been recognized as a molecular feature in DBA patients supporting the main assumption that led to our work in the laboratory. In conclusion, the potential role of ribosomal protein RPL35a, apart from its constitutional role in the translational apparatus, was investigated and important new features were attributed to RPL35a. Further experiments are needed to clarify the exact implication of RPL35a in erythroid lineage differentiation by exploiting potential extra‐ribosomal functions of this protein in vital cellular processes.