REGULATING HYDROLASES OF THE ENDOCANNABINOID SYSTEM: NOVEL PHOTOMETRIC ASSAYS FOR DRUG DISCOVERY
Creators: name: MICELI, MATTEO
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: Le ricerche oggetto della tesi hanno riguardato le possibilit� di sviluppare nuovi saggi enzimatici di screening ad alto rendimento (HTS) dedicati alle idrolasi regolatrici del sistema endocannabinoide (ES). Il ruoli dell?ES � quello di mantenere il bilanciamento omeostatico dell?organismo, cui giunge regolando e modulando un ampio spettro di risposte fisiologiche, dando come risultato ultimo uno stato di benessere generale. L?ES � costituito dai recettori cannabinoidi (CB), dagli endocannabinoidi (EC) e dagli enzimi regolatori di questi ultimi. Una disregolazione dell?ES � stata messa in relazione a condizioni patologiche, quali dolore cronico, stati infiammatori, ansia e vari altri disordini. Gli enzimi regolatori includono l?amidasi FAAH e le esterasi MAGL, ABHD6 ed ABHD12. L?inibizione farmacologica di questi enzimi � emersa quale strategia promettente per aumentare il signaling da EC e mantenere gli effetti benefici dell?attivazione dei CB, evitando gli effetti indesiderati dovuti all?attivazione recettoriale farmacologica diretta. Inoltre, l?inibizione di questi enzimi porta alla morte cellulare di diversi tipi di cancro che li sovraesprimono. I saggi convenzionali per l?attivit� delle idrolasi e lo screening dei loro inibitori utilizzano substrati marcati con radionuclidi (costosi e di difficile impiego), di esteri alchilici dei p-nitrofenili che liberano il substrato cromogenico p-nitrofenolo o, pi� recentemente, di substrati che rilasciano molecole fluorescenti dopo essere stati idrolizzati. Queste molecole fluorescenti aumentano di molto le rese dei metodi che le utilizzano, specialmente sotto il profilo della sensibilit�. Uno di questi metodi, basato sul substrato fluorigenico per MAGL 7-idrossiresorufinil arachidonato, � stato recentemente pubblicato dal nostro gruppo. Su un altro fronte, lo studio delle propriet� delle esterasi transmembrana ABHD6 ed ABHD12 si trova ai primi stadi, perch� non si ha ancora la disponibilit� dei due enzimi in forma attiva ed isolata, che permetterebbe una precisa caratterizzazione delle loro propriet� biochimiche; inoltre, il solo saggio disponibile per lo studio della loro attivit� si basa su una reazione enzimatica costituita da quattro passaggi, che include un analita aspecifico come il glicerolo ed utilizza lisati cellulari interi come fonte degli enzimi. Approcci sperimentali Nella prima parte del lavoro di tesi abbiamo sintetizzato dieci derivati della resorufina caratterizzati da catene laterali sature, insature, ramificare, aromatiche ed abbiamo studiato un loro possibile impiego come substrati migliori per MAGL studiandone le loro costanti cinetiche. La pi� promettente di queste molecole, il 7-Idrossiresorufinil ottanoato, � stata validata tramite degli inibitori noti dell?enzima e proposta come il miglior substrato in generale per saggi HTS su MAGL. Questa molecola risulta essere pi� facilmente sintetizzabile e pi� stabile di quelle fino ad ora utilizzate, oltre a possedere migliori propriet� cinetiche. Sfruttando i dati sperimentali derivanti da questo studio, abbiamo poi condotto dei test computazionali di docking per trovare delle spiegazioni ai diversi comportamenti idrolitici osservati basate sulle interazioni strutturali fra i vari substrati e l?enzima. Un nuovo approccio alla quantificazione dell?attivit� di MAGL che abbiamo sperimentato � l?uso della bioluminescenza, una tecnica che offre una sensibilit� da dieci a mille volte superiore a quella dei saggi in fluorescenza. Abbiamo studiato la possibilit� che una nuova luciferasi chimerica possa essere attiva nelle condizioni del saggio, poich� concentrazioni significative di DMSO, indispensabile per la solubilizzazione del substrato, inibiscono completamente le luciferasi di lucciola wild-type. Questo problema � stato risolto impiegando la luciferasi PLG2, un enzima chimerico ottenuto presso i laboratori del prof. Bruce Branchini del Connecticut College (New London, CT, USA), presso cui il candidato ha trascorso un periodo di studio e ricerca. Il plasmide col cDNA della proteina � stato quindi espresso anche presso i laboratori di Milano. Il saggio � stato completamente sviluppato e validato ed il suo potenziale come metodo HTS � stato discusso. Infine, abbiamo ottenuto dati preliminari per giungere ad un protocollo di espressione ricombinante delle idrolasi transmembrana ABHD6 ed ABHD12 in forma attiva, utilizzando un ceppo di Escherichia coli come ospite. L?espressione ricombinante di proteine nelle colture batteriche ha il vantaggio di fornire quantit� relativamente abbondanti di proteina pura, ma gli enzimi transmembrana dei mammiferi vengono spesso immagazzinati dai batteri all?interno di corpi di inclusione, perdendo quindi del tutto o quasi la propria attivit�. Ci� nonostante, il nostro protocollo di espressione, bench� si trovi ancora ad uno stadio non ottimizzato, ha mostrato la capacit� di produrre entrambe queste proteine, conservando almeno in parte la loro attivit�. Questo approccio necessita di ulteriore lavoro per essere completato, ma i dati raccolti durante il progetto mostrano che si tratta di un modo interessante per ottenere quantitativi considerevoli delle idrolasi ABHD facenti parte dell?ES. La disponibilit� delle proteine, attive ed in forma pura, in quantitativi sufficienti, consentirebbe la caratterizzazione completa degli enzimi da un punto di vista biochimico, farmacologico e strutturale.