Μελέτη της βιολογικής συμπεριφοράς βιοκεραμικών ικριωμάτων ενισχυμένων με μαγνήσιο σε βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού με στόχο την αναγέννηση οδοντίνης
Creators: name: Μπουσνάκη, Μαρία Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Ιστοτεχνολογία
Βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού
Βιοκεραμικά ικριώματα ενισχυμένα με μαγνήσιο
Οδοντινογένεση
Αυξητικοί παράγοντες
Tissue Engineering
Dental Pulp Stem Cells-DPSCs
Mg-doped bioceramic scaffolds
Dentin regeneration
Growth factors

description: Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της βιολογικής συμπεριφοράς βιοκεραμικών ικριωμάτων ενισχυμένων με μαγνήσιο σε βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού με στόχο την αναγέννηση οδοντίνης, καθώς και η μελέτη της επίδρασης εξωτερικής τοποθέτησης αυξητικών παραγόντων, ανθρώπινης ανασυνδυασμένης φωσφωρυλιωμένης πρωτεΐνης της οδοντίνης (human recombinant Dentin Matrix Protein: hr-DMP-1) ή ανθρώπινης ανασυνδυασμένης οστικής μορφογενετικής πρωτεΐνης (human recombinant Bone Morphogenetic Protein: hr-BMP-2), στο μοντέλο που αναφέρθηκε. Μέθοδος: Αρχικά πραγματοποιήθηκε απομόνωση βλαστικών κυττάρων από τους πολφούς τρίτων γομφίων μετά την εξαγωγή τους από νεαρούς υγιείς δότες και χαρακτηρισμός τους για δείκτες βλαστικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Βιοκεραμικά ικριώματα με βάση το πυρίτιο και ενισχυμένα με μαγνήσιο με την ακόλουθη σύνθεση: SiO2 = 60, MgO = 7,5, CaO = 30, ΖηΟ = 2,5 σε % κ.β, κατασκευάστηκαν με την τεχνική αναπαραγωγής σπογγώδους μήτρας (foam replica) (στο Τμήμα του Φυσικού του Α.Π.Θ.) και χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα. Στα ικριώματα τοποθετήθηκαν 2x106 βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού (Dental Pulp Stem Cells-DPSCs) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο καλλιεργειών με ή χωρίς επιπρόσθετη εφάπαξ έκθεση σε 100ng/ml hr-DMP-1 ή hr-BMP-2 για χρονικό διάστημα 3-21 ημερών ανάλογα με τη μελετώμενη βιολογική διαδικασία. Πραγματοποιήθηκε φασματομετρία ατομικής εκπομπής σε επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission spectrometry-ICP/AES) για τον έλεγχο των απελευθερούμενων ιόντων από τα ικριώματα. Στη συνέχεια, ακολούθησαν οι δοκιμασίες έλεγχου κυτταροτοξικότητας, όπως η δοκιμασία αναγωγής άλατος τετραζολίου (δοκιμασία ΜΤΤ), ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) και η σήμανση ζωντανών/ νεκρών κυττάρων με τις φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη ΑΜ (calcein AM) και αιθιδίο ομοδιμερές (ethidium homodimer (EthD-1)) και ποσοτική ανάλυση με συνεστιακή μικροσκοπία (confocal microscopy). Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμασίες ελέγχου οδοντογενούς διαφοροποίησης των DPSCs, που περιλάμβαναν τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων σχετιζόμενων με την οδοντογενή διαφοροποίηση, τη δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης και τη μελέτη της βιοεναλάτωσης εντός των ικριωμάτων. Αποτελέσματα: Τα DPSCs παρουσίασαν αυξημένη έκφραση για τους δείκτες βλαστικών κυττάρων (όπως CD90, CD73, CD 29, και CD166), καθώς και περιαγγειακούς και εμβρυϊκούς δείκτες, πιστοποιώντας τον υψηλό βαθμό εμπλουτισμού των καλλιεργειών που χρησιμοποιήθηκαν σε DPSCs. Τα βιοκεραμικά ικριώματα παρουσίασαν μια ελαφρώς μεταβαλλόμενη αλλά γενικά σταθερή απελευθέρωση ιόντων μαγνησίου (13-17 mg/L), πυριτίου(68-74 mg/L), ασβεστίου (117-154 mg/L), και ψευδαργυρου (7.7-8.9 mg/L). Τα DPSCs φαίνεται να έχουν πολύ καλή προσκόλληση και επιβίωση εντός των ικριωμάτων, με τα αποτελέσματα της χρώσης ζωντανών/νεκρών κυττάρων να δείχνουν ότι παραμένουν ζωντανά (96.6±1.1%) μέχρι και τη 14η μέρα, με πολύ χαμηλό αριθμό νεκρών κυττάρων (3.4±1.1%). Αυτό επιβεβαιώνεται και από τη δοκιμασία ΜΤΤ, όπου παρουσιάζεται αύξηση της μεταβολικής δραστηριότητας από την 3η μέχρι και τη 12η μέρα. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε ότι η παρουσία του βιοκεραμικού ικριώματος ήταν ευνοϊκή για την οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs, γεγονός το οποίο ήταν εμφανές από την χρόνο-εξαρτώμενη (p&lt;0.05) αύξηση που πραγματοποιήθηκε στους δείκτες όπως η DSPP (11,2 φορές), η BMP-2 (9,2 φορές), η BGLAP (3 φορές) και ο OSTERIX (1,8 φορές). Η εξωγενής χορήγηση των των hr-DMP-1 και hr-ΒΜΡ-2 ενίσχυσε την οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs με περαιτέρω αύξηση των εν λόγω δεικτών (DSPP 14 φορές, BMP-2 15,2 φορές, BGLAP 3,2 φορές, OSTERIX). Συμπεράσματα: Τα βιοκεραμικά ικριώματα ενισχυμένα με μαγνήσιο αποτέλεσαν ένα φιλικό και ευνοϊκό περιβάλλον για την προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό των DPSCs, ενώ τα απελευθερούμενα ιόντα οδήγησαν σε οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs, όπως υποδηλώνεται από την αύξηση ειδικών δεικτών, όπως η DSPP. Η εξωγενής χορήγηση των hr-DMP-1 και hr-ΒΜΡ-2 ενίσχυσε την οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs ακόμη περισσότερο, ενεργοποιώντας μονοπάτια που οδηγούν στην αύξηση της έκφρασης της DSPP
description: Aim of this study was to investigate the biological effect of Mg-doped bioceramic scaffolds combined with Dental Pulp Stem Cells-DPSCs on dentin-like tissue regeneration, as well as the effect of the external application of growth factors (human recombinant Dentin Matrix Protein: hr-DMP-1 or human recombinant Bone Morphogenetic Protein: hr-BMP-2) on the above mentioned experimental model. Materials &amp; Method: DPSC cultures were established from third molars of young healthy donors and characterized for stem cell markers with flow cytometry. Magnesium-dopped bioceramic scaffolds with the following formulation (SiO2=60, MgO=7.5, CaO=30, ZnO=2.5 in wt %) were prepared (in the Department of Physics, A.P.Th.) by the foam replica technique and sintered at 870-1060oC (10oC/min) with an annealing time of 2h and were used for the experimental procedures. Cells were spotted at 2×106 cells/scaffold and cultured with complete culture medium with or without the exposure to either 100 ng/ml hr-DMP-1 or hr-BMP-2 for 24h. Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry-ICP/AES was used for scaffold elemental release analysis. Scanning Electron Microscopy-SEM, live/dead fluorescence staining and MTT assay were used to evaluate cell attachment and viability, Real Time PCR for expression of odontogenic differentiation markers, and SEM-energy dispersive X-ray spectroscopy-EDS for chemical analysis of the regenerated tissue. Results: DPSC cultures were positive for several stem cell markers (such as CD90, CD73, CD 29, CD166) and embryonic markers. Bioceramic scaffolds constantly released low concentrations of Mg2+(13-17 mg/L), Ca2+(117-154 mg/L), Zn2+(68-74 mg/L), ad Si4+(7.7-8.9 mg/L). SEM microphotographs showed that scaffolds could support cell viability, while live/dead staining confirmed that the majority of the cells remained viable through the culture period (96.6±1.1% of DPSCs were alive at 14 d), results that were further supported by the MTT assay. A significant up-regulation of several odontogenesis-related markers was observed for DPSCs grown inside the scaffolds (up to 10-fold for BMP-2, 11-fold for DSPP, 3-fold for BGLAP and 1,8 fold for Osterix after 14 d). Exposure of DPSCs to either hr-BMP-2 or hr-DMP-1 for 24h was associated with a statistically significant increase of all odontogenesis genes' expression (p&lt;0.05)(up to 15-fold for BMP-2, 14-fold for DSPP, 3-fold for BGLAP after 14 d). Conclusions: Mg-dopped bioceramic scaffolds supported viability and odontogenic differentiation of DPSCs. hr-DMP-1 and hr-BMP-2 were proved beneficial to the odontoblastic differentiation of DPSCs inside the scaffolds, which makes them potential candidates for biofunctionalization on scaffold surfaces in future application for dental tissue engineering