Die zelluläre Kontrolle der PLA2-Aktivität - ein Element des Signaltransfers zur Auslösung der Alkaloid-Biosynthese in Eschscholzia californica
Creators: name: Schwartze, Wieland
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2007
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 572.549452335
subject: 571.742335

description: In Suspensionskulturen von Zellen des Kalifornischen Mohns (Eschscholzia californica Cham., Papaveraceae) wird durch Kontakt mit niedrigen Konzentrationen (1 μg/ml) eines Hefe-Elicitors ein Signaltransduktionsprozess ausgelöst, der in die Biosynthese von Benzophenanthridin-Alkaloiden mündet. Diese zelluläre Reaktion dient der Abwehr von Pathogenen, da es sich bei den gebildeten Alkaloiden um wirksame Phytoalexine handelt. Die vorliegende Arbeit ist auf eine frühe Etappe des Signalwegs fokussiert, welche durch eine G-Protein-kontrollierte Phospholipase A2 (PLA2) dominiert wird. Schwerpunkt war die Charakterisierung zweier Ebenen der Kontrolle der PLA2: der Regulation ihrer Aktivität über ein heterotrimeres G-Protein und der Metabolisierung des durch diese Aktivität freigesetzten "second messenger" Lysophosphatidylcholin (LPC). Um eine möglichst selektive Inaktivierung von Gα an der Plasmamembran zu erreichen, wurde ein single-chain-Antikörper (scFv) im Zytosol von Eschscholzia californica exprimiert. Die transformierten Zelllinien zeigten eine über mehrere Monate stabile Antikörper-Expression. Sie reagierten mit einer deutlich verminderten Alkaloid-Biosynthese bei Behandlung mit niedrigen Elicitorkonzentrationen. Zugleich war die Aktivierung der PLA2 durch diese Elicitorkonzentrationen vermindert. Bei der essentiellen Bedeutung von Lysophosphatidylcholin (LPC), des Produktes der PLA2, als Signalmolekül sprechen diese Daten für eine Kontrolle des gesamten Signalwegs durch Gα. Transformierte, Antikörper produzierende Zelllinien exprimierten signifikant mehr Gα-Protein als Zelllinien des Wildtyps. Dieses Phänomen belegt eine spezifische Reaktion der Zellen auf die Expression eines Gα-bindenden Proteins. Zur Gewinnung des vollständigen Gα-Proteins wurde eine cDNA-Bank von Eschscholzia californica hergestellt, das vollständige Gen isoliert, sequenziert und das Protein mit His-tag heterolog exprimiert. Bindungsstudien mit dem rekombinanten Protein sprechen für eine physikalische Interaktion mit solubilisierter PLA2 aus der Plasmamembran. Der Zusatz von LPC zu Zellsuspensionen führt zu einer raschen Reacylierung dieser Verbindungen, wobei bevorzugt Linolsäure als Acylierungspartner verwendet wird. Die Reacylierung hat damit die gleiche Präferenz für die verwendete C2-Fettsäure wie die Phosphatidylcholin-Biosynthese. Die Kapazität der Reacylierung in der Plasmamembran überschreitet bei Weitem die Aktivität der dort lokalisierten PLA2. So ist sichergestellt, dass der für den weiteren Signalweg entscheidende Peak der LPC-Konzentration transient im Zytoplasma bzw. am Tonoplasten entsteht.
description: Low concentrations of yeast-elicitor (1 μg/ml) trigger an increased production of benzophenanthridine alkaloids in cell suspensions of Californian poppy (Eschscholzia californica Cham., Papaveraceae). These cellular reaction causes resistence to pathogens because the alkaloids are potent phytoalexins The dissertation focuses on an early step of the signal pathway, which is dominated by an G-protein- controlled phospholipase A2 (PLA2). The main focus was the characterization of PLA2-control on two levels: regulation of activity via a heterotrimeric G-protein and the metabolism of the PLA2-released second messenger lysophosphatidylcholine (LPC). To inactivate Gα at the plasma membrane selectively, a single-chain-antibody (scFv) was expressed in the cytosol of Eschscholzia californica. A stable expression of scFv was found in the transformed celllines over a few months. Treatment with low concentrations of yeast-elicitor triggered significantly diminished alkaloid-biosynthesis. The activation of PLA2 was reduced likewise. These results suggest the control of the entire signal-pathway by the Gα-Protein, considering the essential role of LPC, produkt of PLA2, as a signal molecule. Transformed, scFv-antibody producing celllines expressed significantly more Gα-protein than wildtype cells. This phenomenon proves a specific cellular reaction to the expression of a Gα-binding protein. For getting the Gα-Protein of Eschscholzia californica, a cDNA-library was constructed, the Gα-gene isolated, sequenced and expressed heterologous with a his-tag. First investigations with the recombinant protein suggest a physical interaction with solubilized plasma membrane PLA2. Supplementary added LPC undergoes a rapid reacylation in cell suspensions. Prefered compound for that acylation is linoleic acid. So both the reacylation and the biosynthesis of phosphatidylcholine show the same preference for the used C2-fatty acid. The capacity of reacylation at the plasma membrane is many times higher than the activity of the plasmamembrane-bound PLA2. So it is guaranteed that the peak of LPC-concentration, which is essential for downstream-steps of the signal-pathway, is a transient one at the tonoplast and in the cytosol.