Analyse ligandeninduzierter Konformationsänderungen von Proteinen
Creators: name: Mayer-Wrangowski, Svenja
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2015
Subjects: subject: Estrogenrezeptor beta
subject: Direkter Bindungsassay
subject: p38 alpha
subject: 570
subject: 540

description: Der Estrogenrezeptor gehört zur Proteinfamilie der Kernrezeptoren. Diese ligandenkontrollierten Transkriptionsfaktoren regulieren spezifisch die Transkription ihrer Zielgene. Die Aktivität der Kernrezeptoren wird durch die Bindung kleiner lipophiler Liganden, wie Steroidhormone oder therapeutische Wirkstoffe, reguliert, welche an die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors binden und Konformationsänderungen induzieren. Dadurch wird die Interaktion des Rezeptors mit einer Vielzahl an Koregulatorproteinen sowie der DNA kontrolliert. Kernrezeptoren spielen bei der Vermittlung einer Vielzahl physiologischer Prozesse, aber auch bei der Entstehung von Erkrankungen, wie Diabetes, Krebs, Asthma oder Hormonresistenz, eine entscheidende Rolle und stellen daher interessante Zielstrukturen für die moderne Wirkstoff-Forschung dar. In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung des fluoreszenzbasierten direkten Bindungsassays FLiN (Fluorescent Labels in Nuclear receptors) beschrieben, der in der Lage ist, spezifische Konformationsänderungen in der Ligandenbindungsdomäne des humanen Estrogenrezeptors beta zu detektieren. Der FLiN-Assay basiert auf der Einführung eines Cystein-Rests innerhalb der flexiblen Helix 12 in der Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors und anschließender Modifikation mit einem Thiol-reaktiven solvatochromen Fluorophor. Durch die Bindung agonistischer oder antagonistischer Liganden werden unterschiedliche Konformationen der Helix 12 stabilisiert, wodurch es zu Veränderungen in der Polarität der Mikroumgebung des Fluorophors kommt. Diese Veränderungen verursachen unterschiedliche Verschiebungen des Emissionsspektrums des Fluorophors, anhand derer die verschiedenen Konformationen unterschieden werden können und sich Bindungsaffinitäten der Liganden ermitteln lassen. Zur Etablierung des FLiN-Assays wurden in einem strukturbasierten Ansatz verschiedene Proteinkonstrukte der Ligandenbindungsdomäne entworfen, heterolog exprimiert, aufgereinigt, mit einem Fluorophor modifiziert und ihre Eignung als Sensoren für die unterschiedlichen Konformationsänderungen des ER analysiert. Nach einer Optimierung des Assays, bei der unterschiedliche Fluorophore und Puffersysteme getestet wurden, wurden die Ergebnisse des FLiN-Assays mit Hilfe eines orthogonalen Assay-Systems validiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass der FLiN-Assay für den Einsatz im Hochdurchsatzformat geeignet ist und, im Gegensatz zu anderen hochdurchsatzfähigen in vitro Testsystemen, zur gezielten Suche nach neuen Liganden die eine aktive oder inaktive Konformation des Rezeptors stabilisieren, eingesetzt werden kann. Zusätzlich wurden zeitaufgelöste FLiN-Messungen zur Analyse der Kinetik der Ligandenbindung an den Estrogenrezeptor durchgeführt. Im Rahmen eines Kooperationsprojektes wurde die Bindung verschiedener Inhibitoren an die p38α MAP-Kinase mit Hilfe des direkten Bindungsassays FLiK sowie strukturbiologischer Studien analysiert. Dabei wurden Komplexkristallstrukturen der Kinase mit einem Benzosuberon-Inhibitor (1) sowie zwei Dibenzoxepinon-Verbindungen (2 und 3) generiert. Die Inhibitoren induzierten einen, für diese Verbindungsklasse charakteristischen, Glycin-flip innerhalb der Scharnierregion. Sowohl die strukturbiologischen Untersuchungen als auch die Analyse mittels FLiK zeigten, dass die untersuchten Inhibitoren jedoch nicht in der Lage waren, einen reinen Typ-II Bindungsmodus zu induzieren.
description: The estrogen receptor belongs to the nuclear receptors, a protein family of ligand-dependent multidomain transcription factors that specifically regulate the expression of their target genes. The activity of NRs is under control of lipophilic small-molecule ligands, like hormones and drugs, that bind to the ligand-binding domain of the receptor, where they account for conformational changes and interactions with a variety of transcriptional co-regulator proteins and DNA. Nuclear receptors play a fundamental role in the control of physiological functions. Moreover, they are involved in pathological processes, such as diabetes, cancer, asthma, and hormone resistance syndromes. Therefore, they are important targets for current drug discovery efforts. This thesis describes the development of FLiN (Fluorescent Labels in Nuclear receptors), a fluorescence-based direct binding assay that can monitor conformational changes within the ligand-binding domain of the human estrogen receptor β. The assay technology is based on the introduction of a cysteine residue within the flexible helix 12 in the ligand-binding domain of the receptor and subsequent labeling with a thiol-reactive solvatochromic fluorophore. Binding of agonistic or antagonistic ligands stabilizes distinct conformations of helix 12 and leads to changes in the polarity of the microenvironment of the fluorophore. These changes translate into alterations of the emission spectrum that can be used to distinguish different conformations and to determine binding affinities of the ligands. In order to establish the FLiN-assay, a series of protein constructs of the receptors’ ligand-binding domain was designed in a structure-guided approach. The protein constructs were produced by heterologous expression, purified, labelled with a solvatochromic fluorophore and their suitability to report on conformational changes was assessed. After optimization of buffer-conditions and testing of different fluorophores, the results of FLiN were validated with an orthogonal assay system. The FLiN assay produces robust data, suitable for high-throughput screening, and allows for screening for new scaffolds that are able to stabilize active or inactive conformations of the receptor, which is not possible with conventional competition assay systems. Furthermore, time-resolved FLiNmeasurements were used to monitor the kinetics of ligand-binding to the receptor. Within the framework of a cooperation project, the binding of different inhibitors to p38α MAP kinase was analyzed using the FLiK-direct binding assay and structural biology studies. Three crystal structures of the kinase in complex with a benzosuberone (1) and two dibenzoxepinone inhibitors (2 and 3) were solved, revealing a characteristic binding mode with an induction of the so-called glycine-flip within the hinge region that provides selectivity over other protein kinases. Structural biology studies and FLiK-measurements both showed that the compounds were not able to stabilize a complete type II binding mode.