Strumenti di genomica per lo studio di geni coinvolti nella
resistenza a patogeni in Solanum tuberosum e Vicia faba
Creators: name: Vitale, Stefania
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2011

description: L’obiettivo principale del presente lavoro di tesi è stato lo studio dell’interazione pianta-patogeno nei sistemi biologici Ralstonia solanacearum–patata ed Ascochyta fabae-fava mediante l’utilizzo di differenti approcci di genomica. 
R. solanacearum è l’agente causale dell’avvizzimento batterico e costituisce un serio ostacolo alle coltivazioni di molte Solanacee. In particolare la razza 3 rappresenta un reale pericolo per le coltivazioni europee di patata. Ad oggi, sono ancora scarse le conoscenze sulla base genetica e molecolare dell’interazione incompatibile che si instaura tra la pianta e il batterio. In questo caso l’obiettivo del presente studio è consistito nell’identificazione di geni putativamente coinvolti nella risposta al batterio fitopatogeno in un genotipo resistente (S. commersonii) ed in uno suscettibile (S. tuberosum cv Blondy). Mediante l’utilizzo di due chip microarray (uno contenente sequenze EST di pomodoro e l’altro di patata) sintetizzati con tecnologia CombiMatrix, è stato analizzato il trascrittoma di diversi tessuti della specie di patata resistente S. commersonii e di quella suscettibile S. tuberosum cv Blondy, a vari tempi dall’inoculo con il batterio R. solanacearum. Sono stati inizialmente confrontati i pattern di espressione genica globale delle piante di S. tuberosum cv Blondy inoculate con quelli delle piante asintomatiche di S. commersonii utilizzando il chip di pomodoro. 39 geni, corrispondenti al 5,9% delle sonde sintetizzate sul chip, sono risultati differenzialmente espressi nel confronto tra piante di S. commersonii inoculate con le piante non inoculate a72 ore dall’inoculazione mentre negli stadi sucessivi  solo 4 geni (corrispondenti allo 0,6% delle sonde sintetizzate sul chip). Un numero maggiore di geni (94, 14% delle sonde sintetizzate sul chip) è invece risultato differenzialmente espresso quando si confrontavano le piante di S. tuberosum inoculate con quelle controllo, 72 ore dopo l’inoculazione. Gran parte dei geni differenzialmente espressi è risultato coinvolto nella risposta a vari tipi di stress (17%).
Per meglio indagare l’interazione patata/ralstonia e ovviare ai problemi potenzialmente legati alla bassa omologia di sequenza esistente tra le due specie è stato disegnato ed utilizzato un chip di patata. Quest’ultimo è stato ibridato con RNA estratto da S. commersonii (foglie/fusti e radici) infettato e non a sei giorni dall’inoculo. In questo caso il numero di geni differenzialmente espressi tra le due condizioni analizzate è risultato maggiore (256 geni). La gran parte dei geni differenzialmente espressi sono risultati coinvolti nella risposta della pianta all’acido abscissico e a vari tipi di stress. In particolare, tra i geni diferenzialmente espressi è stata identificata una chinasi associata al recettore interleuchina 1, per la quale recentemente è stato descritto un ruolo nella percezione delle MAMPs. Il suo profilo di espressione è risultato opposto nelle radici del genotipo suscettibile rispetto a quello resistente a 72 ore dall’inoculazione. In S. commersonii in generale è stato osservato che alcuni dei trascritti differenzialmente espressi putativamente coinvolti nelle risposta di resistenza/suscettibilità al patogeno, studiati nel dettaglio mediante analisi RT-qPCR, presentano un trend simile. L’espressione di questi geni a tre giorni dall’inoculazione (differentemente da quanto accade in S. tuberosum ) è più simile a quella osservata in entrambe i genotipi negli stadi più avanzati dell’infezione. Ciò lascia ipotizzare che la resistenza orizzontale mostrata dal genotipo resistente S. commersonii possa essere legata ad una percezione più rapida del patogeno rispetto a quella del genotipo suscettibile S. tuberosum, come già riportato in letteratura  per altri patosistemi. 
Ascochyta fabae, agente causale dell’antracnosi della fava, è il responsabile di una delle malattie fungine più frequenti nelle zone di produzione della fava. In questo caso l’obiettivo è stato quello di trasferire una serie di marcatori (SSR e marcatori derivati da EST) precedentemente identificati nella specie modello M. truncatula ed in altre leguminose (P. sativum, L. albus, G. max ) in tre differenti popolazioni RIL F6 di V. faba (Vf6 x Vf136, Vf29H x Vf136 e Vf6 x Vf27) i cui parentali mostravano un differente livello di resistenza nei confronti del patogeno A. fabae. Tra i marcatori polimorfici trasferiti nelle tre popolazioni RIL utilizzate, i marcatori derivati da EST hanno mostrato un tasso di trasferibilità più alto (82%) rispetto a quelli di tipo SSR (18%). In totale sono stati trasferiti 40 marcatori polimorfici tra SSR (precedentemente sviluppati nella specie modello P. sativum ed in altre cultivar di V. faba), e marcatori derivati da EST (di M. truncatula ed altre specie di leguminose). Di questi, 18 (tutti derivati da EST) sono stati genotipizzati nella popolazione Vf6 x Vf136, 18 (15 derivati da EST e 3 SSR) nella popolazione Vf29H x Vf136 e 4 (tutti SSR) nella popolazione Vf6 x Vf27. L’inclusione dei marcatori molecolari identificati in questo lavoro nelle mappe genetiche preesistenti ha permesso di incrementare il grado di saturazione delle mappe genetiche delle popolazioni Vf6 x Vf136, Vf29H x Vf136 e Vf6 x Vf27 di V. faba. Uno dei vantaggi associati alla saturazione di una mappa genetica consiste nell’aumento della precisione con la quale si possono localizzare i QTL all’interno di un cromosoma.
Nel nostro lavoro, grazie all’aggiunta di un cospicuo numero di marcatori, è stato possibile saturare ulteriormente le regioni cromosomiche relative ai QTL Af1 e Af2 nella mappa della popolazione Vf6 x Vf136. Sono infatti stati inseriti marcatori più strettamente associati a tali regioni permettendo da un lato di confermare la localizzazione cromosomica dei QTL di resistenza ad A. fabae e dall’altro di ridurre l’ampiezza della regione cromosomica all’interno della quale si localizzano gli stessi QTL. Otto dei marcatori che hanno contribuito al processo di saturazione dei cromosomi II.a e III.a sono marcatori EST sviluppati in questo lavoro di dottorato. In particolare LG54, Lup66 e SAT sono localizzati nelle vicinanze del QTL Af1. Tale lavoro risulterà utile per l’identificazione di potenziali geni candidati e per sviluppare marcatori molecolari utili in programmi di miglioramento genetico assistito (MAS). 
In conclusione questo lavoro ha permesso di approfondire le nostre conoscenze sulle basi genetiche e i meccanismi molecolari associati con la resistenza di V. faba e S. commersonii ai fitopatogeni A. fabae e R. solanacearum.