title: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der humanen Proteine DBC1, PARP1 und Sirt1 sowie ihrer Interaktionen
Creators: name: Pfahler, Julian
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2021
Subjects: subject: DBC1
subject: PARP1
subject: Sirt1
subject: Protein-Protein-Interaktion
subject: Regulation
subject: Proteinkomplex
subject: Biochemie
subject: 500
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description: Die kontinuierlich steigende menschliche Lebenserwartung steht im direkten Zusammenhang mit der zunehmenden Zahl an Krebserkrankungen, denen beispielsweise DNA-Mutationen und Telomer-Verkürzungen zugrunde liegen. Durch Steuerung entsprechender Mechanismen kann die menschliche Lebenserwartung weiter erhöht werden. Das Protein DBC1 (deleted in breast cancer 1) nimmt eine zentrale Rolle in der Regulation posttranslationaler Modifikationen mit Auswirkung auf die DNA-Reparatur und die Apoptose ein. Es wurde als Regulator der Deacetylase Sirt1 (silent information regulator two, Isoform 1) und der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1) identifiziert. PARP1 ist maßgeblich an der Initiierung zellulärer DNA-Reparaturprozesse beteiligt, weshalb sowohl die Inhibition durch DBC1 als auch die pharmakologische Inhibition in bestimmten Tumorzellen zu Synthetischer Lethalität führen kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Regulationsmechanismen zur Erhaltung der Gesundheit menschlicher Zellen untersucht. Dabei erfolgte beispielsweise die kristallographische Strukturaufklärung der katalytischen PARP1 Domäne im Komplex mit einem NAD+ kompetitiven Inhibitor. Durch Analyse des Bindungsschemas wurden Möglichkeiten zur Selektivitätssteigerung gegenüber weiteren PARPs eruiert, da ein selektiverer PARP1 Inhibitor zur Minimierung der Nebenwirkungen einer Krebstherapie führen kann. Als zentraler Teil dieser Arbeit wurde der DBC1-PARP1 Komplex untersucht. Dafür wurden die interagierenden Domänen zunächst separat voneinander strukturell bestimmt und biochemisch charakterisiert. Dabei konnte eine stabile aber bislang nicht beschriebene offene Konformation der PARP1 BRCT Domäne identifiziert werden. Diese geöffnete Konformation zeichnet sich durch einen strukturell definierten C-terminalen Bereich aus, der durch Konformationsänderung am BRCT Kernbereich bindet (geschlossene Konformation). Der Einfluss dieser konformellen Flexibilität auf die PARP1 Aktivität wird Gegenstand zukünftiger Forschung sein. Die mit PARP1 interagierende Domäne in DBC1 wurde bisher aufgrund von Sequenzhomologien den NUDIX Domänen (nucleotide diphosphate linked to moiety X) zugeordnet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Struktur dieses DBC1 Bereichs gelöst und eine starke strukturelle Variation zu den NUDIX Domänen festgestellt werden. Aufgrund von zwei NUDIX-untypischen Loops und der hier nachgewiesenen Interaktion des N-terminalen Bereichs mit Sirt1 wurde diese Domäne in NUDIL (NUDIX domain with N-terminal interaction site and extended loops) umbenannt. Die vorhergesagte katalytische Inaktivität wurde bestätigt. Der Komplex von DBC1 und PARP1 wurde mittels einer Reihe von biochemisch und biophysikalisch unterschiedlichen Methoden charakterisiert und ein Komplexmodell durch Docking der Einzelstrukturen unter Einbezug aller experimentellen Daten vorgeschlagen. Trotz nachgewiesener NAD+ Bindung von DBC1 konnte die postulierte starke NAD+ Abhängigkeit des DBC1-PARP1 Komplexes weder experimentell noch anhand des Komplexmodells eindeutig bestätigt werden. Möglicherweise ist die NAD+ Abhängigkeit durch die Beteiligung weiterer, hier nicht untersuchter Domänen in den nativen Proteinen reguliert. Darüber hinaus interagiert DBC1 auch mit dem Enzym Sirtuin 1, das an der Regulierung der DNA-Reparatur, an gene silencing sowie an der Unterdrückung von Apoptose und Entzündungen beteiligt ist. Im Gegensatz zur DBC1-PARP1 Interaktion existieren bereits verschiedene Forschungsarbeiten zur DBC1-Sirt1 Interaktion, diese widersprechen sich jedoch bezüglich der an der Interaktion beteiligten Domänen. Mit Fokus auf die Sirt1 Regulation durch DBC1 wurden Aktivitäts- und Bindungsstudien sowie Kristallisationsexperimente mit verschiedenen Deletionsmutanten und synthetischen Peptiden beider Komplexpartner durchgeführt. Daraus wurde ein Modell zur Regulation der Sirt1 Aktivität entwickelt, das eine bilaterale Kompetition des N-terminalen Bereichs der DBC1 NUDIL Domäne mit dem intrinsisch aktivierenden Sirt1 ESA Motiv (essential for sirtuin activity) und der Bindestelle des acetylierten Sirt1-Substrats beschreibt.