title: Molecular characterization of immunologic cell death in 3D cultures
Creators: name: Wernitznig, Debora
Publisher: name: :none
Year: 2021

description: Zweifellos hat zielgerichtete Therapie die Landschaft der Krebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten verändert. Im Speziellen hat die Erkenntnis, dass Tumore von spezifischen, mutierten Treibern abhängig sind und die Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen zu einer Verbesserung der Krebstherapie geführt. Trotzdem haben zielgerichtete Therapien ihre Grenzen. Eine davon ist die Resistenz, die von hauptsächlich zwei molekularen Ereignissen abhängt: I) Das Ziel selbst verändert sich durch Mutation, so dass die zielgerichtete Therapie das Ziel nicht mehr beeinflusst (z.B. Ausweichmutationen von EGFR) und/oder ii) der Tumor findet einen neuen Weg um Tumorwachstum zu erreichen, der nicht vom ursprünglichen Ziel abhängt (z.B. der Wechsel von RAS-ERK zum PI3K-AKT Signalweg). Die Kombination von zielgerichteten Therapien, könnte die Phase der Resistenz bis zu einem gewissen Grad überwinden. Zusätzlich zu größerer Toxizität der Kombinationstherapie sind auch Resistenzen beobachtet worden. Den Austausch zwischen Tumormikroumgebung und neoplastischen Zellen, ermöglichte es nicht nur die Krankheit besser zu charakterisieren und zu verstehen, sondern auch neue Zielproteine in nicht-krebskranken Zellen wie Endothelzellen oder Fibroblasten zu identifizieren und vorzuschlagen. Sogar mit diesen neuartigen Behandlungsarten, die das Tumorstroma angreifen, sind viele Krebsarten immer noch therapieresistent und einige sind immer noch nicht behandelbar oder heilbar. Neue Erkenntnisse weisen auf die entscheidende Rolle des Immunsystems, nicht nur bei der Tumorentstehung, sondern auch im Ergebnis der Behandlung, hin. Eine Fülle von Studien beschreibt die Rolle der dynamischen Interaktion zwischen Krebszellen, der Tumormikroumgebung und verschiedenen Subgruppen von Immunzellen. Immunonkologieforschung hebt viele wichtige Aspekte hervor, die bei der Krebsbehandlung beachtet werden sollten und, besonders wichtig, wie Krebszellen in der Lage sind, Immunzellen zu „lehren“, das Tumorwachstum zu unterstützen und Mechanismen abzustellen, die fähig wären die Krebsentwicklung und dessen Fortschritt zu stoppen oder in Balance zu halten. Außer dem Konzept der Immun-Checkpoint-Hemmer, ist die vielversprechendste Entdeckung in der Immunonkologie sicher das Konzept des immunogenen Zelltods (immunogenic cell death (ICD)). ICD basiert auf einer Abgabe von räumlich-zeitlich definierten Signalen von sterbenden (Krebs-)Zellen, die sich dem Immunsystem ‚sichtbar‘ machen. Am wichtigsten ist es, dass ICD von bestimmten Anti-Krebs-Modalitäten ausgelöst werden kann und in der Lage ist, das beeinträchtigte Immunsystem in Richtung lang anhaltender Anti-Tumor-Antwort zurückzustellen. Das Auslösen von ICD ist für eine Kaskade von Ereignissen verantwortlich, die letztlich zur T-Zell Vorbereitung und zur Entwicklung einer langfristigen Immunantwort gegen den Tumor in immun-kompetenten Wirten führt. Mehrere Versuche starteten, um herauszufinden welche Wirkstoffe/Ansätze ICD auslösen können: In der Zwischenzeit ist es bekannt, dass bestimmte Chemotherapeutika, wie Oxaliplatin in der Lage sind, ICD auszulösen, wenn auch manchmal in niedrigeren Konzentrationen, als sie in Standard-Therapien verwendet werden. Diese Ergebnisse beleben eine Diskussion über die Wirksamkeit und den Wert von „alten“ chemotherapeutischen Wirkstoffen in der Klinik und verstärken das Forschungsinteresse für potentielle Kombinationen mit zielgerichteter Therapie und/oder anderer Chemotherapie, die dabei helfen könnte, Krebsresistenz zu umgehen. Um spezifische Wirkstoffe/Behandlungen als ICD-Auslöser zu klassifizieren, sind zur Zeit nur ein paar komplexe und zeitraubende in-vivo Modelle verfügbar, die Impfungsuntersuchungen in immun-kompetenten syngenen Mäusen erfordern. Außer dem sehr großen Aufwand, haben diese Modelle auch den Nachteil, dass sie die Eigenschaften des menschlichen Immunsystems nicht vollständig nachstellen können. Daher sind relevante Modelle für die bessere Charakterisierung dringend erforderlich, um Plattformen für die Vorauswahl von potentiellen ICD Auslösern in-vivo zu etablieren. Während meiner Doktorarbeit, konzentrierte ich mich auch die Charakterisierung und die Anwendung von in-vivo Ansätzen, die 3-dimensionale Zellkulturen verwenden, um die molekularen Signaturen von ICD nach der Behandlung mit metall-basierenden Medikamenten zu studieren. 3D-Zellkulturen können bekanntermaßen die Tumormikroumgebung besser imitieren, als Zellen die in einer Einzelschicht wachsen. Das gilt besonders für Eigenschaften wie Tumor-Architektur, die Gradienten von Sauerstoff und Nährstoffen, sowie molekulare Signale und Zelltransport-Ereignisse. Wir zeigen erstmals, dass zusätzlich zum Krebsmedikament KP1339 auch Plecstatin-1 in der Lage ist, ICD-Signaturen in zellulären Darmkrebs-3D-Kulturen zu erzeugen. Diese Arbeit hebt die Anwendung und Eignung von 3D-Kulturen als in-vitro Auswahlmethode für das Studium von ICD-Auslösern hervor und ebnet den Weg für seine weitere Entwicklung in Richtung einer komplexeren Plattform für die Abschätzung der immunogenen Fähigkeiten von Anti-Krebs-Medikamenten. Außerdem streicht unsere Arbeit die aufkommende Rolle von metall-basierenden Medikamenten und ihrem Potential als Auslöser einer Immunantwort, sei es allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen, als effektive Anti-Krebs-Behandlung hervor.
description: Unequivocally, targeted therapy has changed the landscape of cancer treatment in the past decades. In particular, the identification of tumors being addicted to specific mutational drivers and the knowledge and investigations of the underlying mechanisms clearly led to an improve-ment in cancer therapy. However, targeted therapies do have some limitations. Resistance is one of the major reasons following mainly two molecular events: i) the target itself changes through mutation so that the targeted therapy does not affect the target anymore (e.g. escape mutations in EGFR) and/or ii) the tumor finds a new pathway to achieve tumor growth that does not depend on the original target (e.g. shift from Ras-ERK to PI3K-Akt signaling). Combination of targeted therapies may overcome to a certain extend the phase of resistance. However, in addi-tion to increasing toxicity, for combination therapy resistance has been observed as well. Under-standing the crosstalk of tumor microenvironment and neoplastic cells, enabled not only to better understand and characterize the disease but also to identify and suggest novel targets in non-cancerous cells such as endothelial or fibroblast cells. However, even with an increase in novel treatment regimens targeting tumor stroma, many cancers are still resistant to therapies and some are still not treatable or curable at all. Recent discoveries point out the crucial role played by the immune system not only in tumorigenesis but also in the outcome of treatments. A pletho-ra of studies focused on the role played by the dynamic interaction among cancer cells, tumor microenvironment and different subsets of immune cells. Immuno-oncology research unveiled many important aspects to be considered while treating cancers and - most importantly - how cancer cells are able to ‘educate’ immune cells to support tumor growth and to deactivate mech-anisms that usually would be able to remove or keep in balance cancer´s develop-ment/progression. Apart from the concept of immune checkpoint inhibitors, the most promising discovery in cancer immunology is certainly the concept of immunogenic cell death (ICD). ICD relies on the emission of a spatiotemporally defined combination of signals by dying (cancer) cells that render them ‘visible’ to the immune system. Most importantly, ICD can be triggered by certain anticancer modalities and is able to reset the impaired immune system towards the acti-vation of a long-lasting protective anti-tumor response. Induction of ICD is responsible for a cas-cade of events that will finally lead to T-cell priming and to the development of a long-term im-mune response against the tumor in immune competent hosts. Several trials started to determine which agents/approaches could induce ICD. Meanwhile, it is known that certain chemotherapeu-tic agents, such as oxaliplatin are able to induce ICD albeit sometimes at lower concentrations than those used for standard of care therapies. These findings revive a discussion about the efficacy and the value of ‘old’ chemotherapeutic agents in clinics and increases the research interest in studying potential combination therapies with targeted and/or other chemotherapeutic agents, which might help to circumvent and overcome cancer resistance. In order to classify a specific agent/treatment as an ICD inducer, only a few complex and time-consuming in vivo models are currently available involving vaccination assays in immunocompetent, syngeneic mice. Apart from the huge effort, these models have the disadvantage of not fully mimicking the properties of the human immune system. Therefore, relevant models are urgently needed to bet-ter characterize and establish pre-screen platforms that facilitate a pre-selection of potential ICD inducers in vitro. In the course of my PhD Thesis, I concentrated on the characterization and the application of an in vitro approach that uses 3-dimensional cultures to study the molecular signa-ture of ICD upon treatment with metal-based drugs. 3D cultures are known to better mimic the tumor microenvironment in comparison to cells growing as monolayers. This particularly holds true for properties such as tumor architecture, oxygen and nutrient gradient levels as well as molecular signaling and cellular transport events. Here we show for the first time that in addition to KP1339, also plecstatin-1 is able to induce an ICD signature in cellular colon cancer 3D-culture models in vitro. This work highlights the application and suitability of 3D cultures as an in vitro screen approach for studying ICD inducers and paves the way for its further development toward a more complex platform for evaluating the immunogenic capacity of anticancer agents. Furthermore, our work highlights the emerging role of metal-based drugs and their potential to be explored as inducers of immune responses, alone or in combination with other treatments as effective anticancer regimens.