Aspetti molecolari, funzionali ed evolutivi dei recettori nucleari nel controllo endocrino della spermatogenesi.
Creators: name: Letizia, Francesca
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2011

description: Negli organismi pluricellulari, la capacità di regolare funzioni vitali come la riproduzione, lo sviluppo e il metabolismo, ha coinciso con l’evoluzione di una delle classi più importanti di fattori di trascrizione, la superfamiglia dei recettori nucleari (NR, Nuclear Receptor) (Bookout et al., 2006). Ad oggi, la superfamiglia dei recettori nucleari nella specie umana è composta da una cinquantina di geni e più di 75 proteine, in Drosophila melanogaster i recettori nucleari sono circa 21 e ben 270 in Caenorhabditis elegans (Maglich et al., 2001; Robinson-Rechavi et al., 2001; Mangelsdorf et al., 1995). L’elevata conservazione e la distribuzione ubiquitaria lungo il genoma di numerose specie evidenzia l’importanza biologica di tali proteine: non a caso, diversi recettori nucleari sono implicati nella regolazione del ciclo cellulare, nel controllo dei processi apoptotici, nell’infertiltà e, non ultimo, nel cancro (Clarke et al. 2004; Shulman and Mangelsdorf, 2005). 
I PPAR sono recettori ormonali nucleari che mediano gli effetti degli acidi grassi e dei loro derivati, intervenendo in numerose funzioni come il metabolismo dei glucidi, dei lipidi, la proliferazione cellulare e il differenziamento (Desvergne and Wahli, 1999). Nell’uomo sono stati identificati tre geni PPAR: il gene PPARA, codificante il recettore hPPAR (NR1C1), localizzato nella regione 22q12, sul cromosoma 22, il gene PPARB, codificante il recettore hPPAR/ (NR1C2), localizzato sul cromosoma 6, in posizione 6p21 ed infine il gene PPARG, codificante il recettore hPPAR (NR1C3) localizzato sul cromosoma 3, nella regione 3p25 (Sher et al., 1993; Issemann et al., 1990; Costa et al., 2010). Il recettore PPARγ è quello più intensamente studiato poiché partecipa a numerosi processi biologici come il differenziamento, lo sviluppo, la riproduzione e il controllo del ciclo cellulare. Inoltre, numerosi dati di letteratura, evidenziano come l’iper-espressione del gene PPARG sia in grado di provocare l’arresto del ciclo cellulare, differenziamento e apoptosi, mentre la sua perdita sia associata all’induzione nello sviluppo del tumore (Grommes et al. 2004; Han and Roman, 2007). 
L’ormone steroideo 17β‐estradiolo è un regolatore chiave per la crescita, il differenziamento e lo sviluppo sessuale (Hall et al., 2001). L’attività degli estrogeni è mediata da due recettori che appartengono alla famiglia dei recettori nucleari per gli ormoni steroidei (Laudet et al., 1992). Nei vertebrati sono state identificate due isoforme proteiche principali, derivanti da due geni distinti: ESR1 (Estrogen Receptor 1), che codifica l’isoforma ERα (NR3A1) ed ESR2 (Estrogen Receptor 2), che codifica per la proteina ERβ (NR3A2) (Gosden et al., 1986; Ponglikitmongkol et al., 1988; Mosselman et al., 1996; Enmark et al., 1997). Gli estrogeni sono importanti fattori di rischio per l’iniziazione di diversi tumori endocrino-correlati (Russo and Russo 1998; Deroo and Korach, 2006). Generalmente, il recettore ERα è in grado di promuovere le vie di segnale proliferative e l’entrata nel ciclo cellulare (Hall and McDonnell, 1999), mentre, in presenza del recettore ERβ, l’ormone E2 induce la morte cellulare (Acconcia et al., 2005; Marino and Ascenzi, 2008; Acconcia and Marino, 2011). Il gene ESR2 inoltre risulta la forma predominante nel tratto riproduttivo maschile e quella maggiormente espressa nelle cellule germinali primordiali (Saunders et al., 1998; Pelletier et al. 2000; Sharpe 1998; Hess et al, 2001; Hess, 2003). 
L’uso degli spermatogoni come modello per studiare la proliferazione cellulare diventa sempre più consistente, date le numerose evidenze di un’origine embrionale delle neoplasie testicolari, dovuta alla presenza di gonociti maligni che progrediscono dalla fase di cellule germinali primordiali sino allo stadio di cellule trasformate (Jørgensen et al., 1993; Giwercman et al., 1993; Dohle, 2010). I proto-oncogeni sono attivati ormonalmente durante la spermatogenesi e sono coinvolti negli eventi trascrizionali e nel controllo della proliferazione e differenziazione delle cellule germinali durante specifiche fasi del ciclo dell’epitelio seminifero (Schultz et al., 1995; Iawaoki et al., 1993). Partendo da queste considerazioni e dai dati presenti nella letteratura, il progetto di Dottorato di Ricerca si è incentrato sull’analisi del possibile ruolo dei geni PPARG ed ESR2 come fattori pro-apoptotici nella proliferazione cellulare. Nel lavoro di Dottorato è stato utilizzato come modello sperimentale il rettile Podarcis sicula, un vertebrato non mammifero a riproduzione stagionale, la cui fisiologia riproduttiva è ben nota, così come il profilo annuale degli ormoni sessuali steroidei. La spermatogenesi discontinua del rettile sessualmente maturo Podarcis sicula, si è rivelata una fortunata strategia di indagine per l’osservazione della crescita cellulare e di fenomeni difficilmente esaminabili in organismi più complessi come l’uomo, dove gli spermatogoni non proliferano finchè non sopraggiunge la pubertà (Hadziselimovic et al, 1987; Huff et al., 1989, 1991; Dunkel et al., 1997). Nel testicolo di Podarcis sicula, infatti, la massima attività proliferativa delle cellule germinali avviene solitamente in primavera, si blocca completamente nella fase refrattaria (estate) ed è successivamente rallentata in autunno-inverno. Inoltre, in Podarcis sicula, risulta particolarmente interessante poter osservare l’espressione dei geni pro-apoptotici PPARG ed ESR2, nell’organismo immaturo (fase refrattaria) dove, durante le mitosi spermatogoniali, si verifica un progressivo aumento dei livelli degli estrogeni. Questi dati risultano estremamente rilevanti, considerando l’ipotesi della “base fetale delle malattie dell’adulto” che precede l’insorgenza di diverse patologie, come i tumori invasivi del testicolo ed il sistematico ritrovamento dei livelli degli estrogeni stabilmente elevati nelle lesioni neoplastiche testicolari (Skakkebaek 1982). È infatti noto che l’esposizione in utero al momento della differenziazione testicolare è un fattore di rischio per lo sviluppo di queste neoplasie e, sperimentalmente, la somministrazione pre-natale e post-natale agli estrogeni provoca regolarmente lo sviluppo di tumori testicolari in alcuni ceppi di roditori (Atanassova et al., 1999; Fielden et al., 2002; Newbold et al., 2000; Bosland, 1996).
Al fine di esaminare il ruolo dei geni PPARG ed ESR2 nella spermatogenesi di Podarcis sicula, è stato indispensabile conoscere la loro sequenza nel modello animale utilizzato in questo studio. Data la mancanza (o la scarsissima presenza) delle sequenze genomiche relative ai due recettori in Podarcis sicula, il punto di partenza di questo lavoro di tesi é stato il clonaggio ed il sequenziamento completo di entrambi i geni codificanti i suddetti recettori. L’analisi comparativa delle sequenze nucleotidiche presenti nelle banche dati genomiche per i geni PPARG ed ESR2 in diverse classi di vertebrati ha rivelato un’elevata identità nucleotidica, in particolare, nonostante la distanza evolutiva dei primati con i rettili, l’allineamento con i rispettivi geni umani ha rivelato una significativa conservazione nucleotidica, pari all’83% per il recettore PPARγ e al 73% per il recettore ERβ. Le sequenze nucleotidiche ottenute, sono state depositate nella banca dati NCBI. Il gene PPARG (Provisional Accession No.1481500) si estende per 1383 bp e comprende l’ATG d'inizio traduzione, mentre per il gene ESR2 (Provisional Accession No. 1482266) è stato identificato un trascritto di 1522 bp.
Dopo aver identificato i geni PPARG ed ESR2, è stata analizzata, nel testicolo e nell’encefalo, di Podarcis sicula sessualmente matura, l’espressione relativa durante peculiari fasi del ciclo riproduttivo dell’animale, mediante esperimenti di Real-Time PCR (qRT-PCR). 
In entrambi i tessuti analizzati, l’espressione dell’mRNA del gene PPARG in Podarcis sicula risulta significativamente ridotta nei mesi corrispondenti al periodo di stasi invernale, con un progressivo aumento della sua espressione nei mesi relativi alla fase riproduttiva, fino a più elevati livelli d’espressione genica nella fase refrattaria. La marcata sovra-espressione del gene PPARG durante la fase refrattaria suggerisce fortemente, anche in Podarcis sicula, un ruolo anti-proliferativo (e pro-apoptotico) di tale recettore, con conseguente blocco della proliferazione cellulare ed estesa degenerazione delle cellule seminali, che si osservano in questa fase del ciclo riproduttivo.
I risultati dell’analisi per qRT-PCR, ottenuti per il gene ESR2 nell’encefalo di Podarcis sicula, hanno evidenziato un andamento decrescente dell’espressione del gene, da valori elevati nel periodo di stasi riproduttiva fino ad un blocco completo della sua espressione nel periodo refrattario (il rapporto dell’espressione relativa del gene è 2:1:0, stasi, riproduttivo, refrattario, rispettivamente). Nel testicolo, sede della spermatogenesi, i livelli di espressione relativa del gene ESR2 di Podarcis sicula, mostrano invece un andamento a campana: il gene è infatti espresso ad elevati livelli durante l’attiva spermatogenesi, perfettamente in linea con la principale funzione riproduttiva svolta dall’ormone E2, mentre nel periodo di stasi e in quello refrattario, l’espressione del gene tende a diminuire in maniera sensibile. I dati di Real Time mettono in evidenza una marcata down-regolazione del recettore ERβ ad alte dosi di ligando durante la fase refrattaria, quando nel testicolo di Podarcis sicula si registra un forte rallentamento sino al blocco totale dell’attività proliferativa delle cellule germinali, in concomitanza con gli elevati livelli dell’ormone 17β-estradiolo sia plasmatici che tissutale. 
L’analisi del profilo d’espressione dei geni PPARG e ESR2 in Podarcis sicula, ha evidenziato, in tutti gli esperimenti condotti, una correlazione negativa tra i livelli di espressione del recettore PPARγ e quelli del recettore ERβ, confermando i dati presenti in letteratura sull’effetto reciprocamente inibitorio sul processo maturativo della gonade maschile e, più in generale, sul pathway di sopravvivenza cellulare. Recentemente, è stata attribuita una crescente importanza fisiologica al cross-talk osservato tra i diversi recettori nucleari, dimostrando, in particolare, l’esistenza di un’interazione negativa tra i segnali proliferativi attivati dal recettore estrogenico e quelli dipendenti dai ligandi di PPARγ (Keller et al., 1995; Qin et al., 2003; Gunin et al., 2004; Bonofiglio et al., 2005; Foryst-Ludwig et al., 2008). Sebbene l’attivazione di entrambi i recettori PPARγ e ERβ sia implicata nei meccanismi anti-proliferativi, pro-apoptotici e di differenziamento cellulare, sembra evidente, una associazione negativa tra le due proteine, che interferiscono, sia in condizioni fisiologiche che patologiche, in maniera mutuamente esclusiva. Lo studio dell’interazione tra i recettori nucleari ed altri fattori di trascrizione è importante per la comprensione dei meccanismi delle risposte ormonali e per la modulazione dell’espressione genica. Ulteriori studi sembrano quindi necessari per chiarire queste interazioni, dirette ed indirette, tra il gene PPARG ed ESR2 nella proliferazione cellulare. 
Contemporaneamente agli studi molecolari effettuati sulla spermatogenesi dell’organismo modello Podarcis sicula, è stata eseguita un’estesa analisi bioinformatica nel genoma umano per verificare la presenza di eventuali trascritti alternativi nelle regioni genomiche corrispondenti ai geni PPARG e ESR2. In particolare, partendo da un’analisi in silico delle librerie EST (Expressed Sequence Tag) nelle regioni genomiche in cui sono mappati i due geni PPARG ed ESR2, è stato possibile identificare dei nuovi trascritti. Relativamente al gene ESR2, l’analisi è ancora in corso, mentre per il gene PPARG, è stata identificata una nuova isoforma con una delezione completa dell’esone 5, la cui espressione risulta particolarmente elevata nel tessuto tumorale.In conclusione, i risultati ottenuti durante il Progetto di Dottorato di Ricerca rappresentano un buon punto di partenza per una migliore comprensione del ruolo pro-differenziativo e pro-apoptotico dei recettori PPARγ ed ERβ nella proliferazione cellulare.