title: Die Funktion der Coiled-Coil-Domäne im Nukleoprotein des Ebolavirus
title: Function of the coiled coil domain of the Ebolavirus nucleoprotein
Creators: name: Behrendt, Katja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Nucleocapsid
Ebola-Virus
Nukleoprotein
Self assembly
Coiled coil
Medizin, Gesundheit
Nucleoprotein

description: Ebola virus and Marburg virus make
      up the family Filoviridae. Due to their singlestranded RNA
      genome in negative orientation, they belong to the order
      Mononegavirales. Filoviruses cause a severe hemorragic fever
      in humans and non-human primates with fatality rates up to
      90%. Because of the severe illness, and the fact that there
      is no specific treatment or vaccination, they are classified
      as BSL-4 pathogen. The Nucleocapsid is built by the
      non-segmented RNA-genome, the nucleoprotein NP, the viral
      polymerase L, the polymerase-cofactor VP35 and VP30. Subject
      of this study is a coiled coil domain within NP and its
      influence on various functions of NP. First the role of the
      coiled coil domain in the interaction of NP with VP30 and
      VP35 was investigated by immunofluorescence analysis.
      NP-mutants without coiled coil 3D-structure or without coiled
      coil domain were still able to interact with VP35, but not
      with VP30. This could be due to two binding domains on NP for
      VP35. Binding of VP30 to NP is either mediated directly by
      the coiled coil or requires a 3D confirmation determined by
      the NP coiled coil. Furthermore, this study is focussing on
      the influence of the coiled coil domain on NPNP interaction
      and self assembly of NP. By immunofluorescence analysis it
      could be proofed that the formation of NP inclusion bodies
      (inclusions) depends on a functional coiled coil. Knock-out
      mutants could still be recruited to inclusions build by NPwt,
      suggesting that the loss of the coiled coil domain only
      causes a partly loss of the ability for self-interaction.
      With an complementation assay it could be shown that the
      coiled coil domain is sufficient to mediate NP-NP
      interactions. NP forms helices that are supposed to be the
      framework of the nucleocapsids. Analysis of NP-helices by
      electron microscopy suggested that the ability to form
      helices also depends on an intact coiled coil domain or the
      presence of NPwt. NP mutants alone were not able to assemble
      to helices. Oligomerization mediated by the coiled coil
      domain or an interaction with RNA influenced by this domain
      could be reasons for these findings. The last part of the
      study is dedicated to the influence of the NP coiled coil
      domain on viral transcription. In an iVLP assay a dominant
      negative effect of NP with deleted or mutated coiled coil
      domain could be observed. This in probably due to a defect of
      NP with deleted or mutated coiled coil in encapsidation the
      virus sepecific minigenome that serves as template for the
      viral polymerase complex which is also indicated by the
      altered NP helices formation.
description: Das Ebolavirus (EBOV) bildet mit
      dem Marburgvirus die Familie der Filoviren, die aufgrund
      ihres einzelsträngigen, negativ orientierten RNA-Genoms der
      Ordnung der Mononegavirales zugeteilt werden. Filoviren
      verursachen beim Menschen und bei nicht-menschlichen Primaten
      ein schweres hämorrhagisches Fieber mit einer Mortalitätsrate
      bis zu 90%. Deshalb und weil es bisher keine spezifische
      Therapie und keine Impfung gibt, werden Filoviren als
      Pathogene der Sicherheitsstufe 4 eingestuft. Der
      Nukleokapsidkomplex des EBOV besteht aus dem
      nicht-segmentierten RNAGenom sowie dem Nukleokapsidprotein
      NP, der viralen Polymerase L, dem Polymerase-Ko-Faktor VP35
      sowie VP30 besteht. Gegenstand dieser Arbeit ist eine
      Coiled-Coil-Domäne innerhalb des NP, deren Einfluss auf
      verschiedene Funktionen des NP untersucht werden sollte.
      Hierfür wurde die Rolle der Coiled-Coil bei der Interaktion
      mit VP30 und VP35 analysiert. NPMutanten, die entweder keine
      Coiled-Coil-3D-Struktur oder gar keine Coiled-Coil mehr
      aufwiesen, konnten hier zwar noch mit VP35, aber nicht mehr
      mit VP30 interagieren. Die Gründe hierfür sind vermutlich,
      dass VP35 mehrere Bindungsstellen besitzt und VP30 entweder
      im Bereich der Coiled-Coilbindet oder die durch die
      Coiled-Coil vermittelte Konformation des NP benötigt.
      Weiterhin befasst sich diese Arbeit mit der Rolle der
      Coiled-Coil-Domäne bei der NPNP- Interaktion und dem self
      assembly. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass die Bildung
      von NP-Einschlusskörpern, so genannter inclusions, von der
      Coiled-Coil- Domäne abhängt. Coiled-Coil-defiziente Mutanten
      können aber noch durch NPwt in inclusions rekrutiert werden,
      die Fähigkeit zur Selbstinteraktion ist also nur
      eingeschränkt. Mittels eines Complementation Assays konnte
      gezeigt werden, dass die Coiled-Coil-Domäne allein
      ausreichend für eine NP-NP Bindung sein kann.
      Immunelektronenmikroskopischen Analysen konnten zudem zeigen,
      dass die Bildung von NP-Helices, welche das Gerüst der
      Nukleokapside darstellen, ebenfalls nur bei intakter
      Coiled-Coil-Domäne oder in Gegenwart von NPwt möglich ist.
      Eine Rolle könnte hierbei entweder eine durch die
      Coiled-Coil-Domäne vermittelte Oligomerisierung des NP oder
      RNA-Interaktion spielen, welche zur Bildung von Helices
      wichtig ist. Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluss
      Coiled-Coil-Domäne auf die virale Transkription untersucht.
      Hierbei zeigte sich im iVLP-Assay, dass eine nicht intakte
      Coiled-Coil einen dominant negativen Effekt auf die
      Transkription hat. Dies ist vermutlich dadurch bedingt, dass
      ohne intakte Coiled-Coil keine NP-Helices gebildet werden
      können und so auch keine regulären Nukleokapside, welche für
      die Polymerase als Matrize zur Transkription und Replikation
      dienen.