title: Investigations on the formation of rosmarinic acid in Anthoceros agrestis and Melissa officinalis.
title: Untersuchungen zur Bildung von Rosmarinsäure in Anthoceros agrestis und Melissa officinalis.
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Ernst, Lucien
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: enzymology
biochemistry
molecular biology
Rosmarinsäure
Biochemie
Phenylpropanoidweg
Pharmaceutical biology
Enzymology
Rosmarinsäure Synthase
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Melissa officinalis
Anthoceros agrestis
BAHD acyltransferases
phenylpropanoid pathway
Molekularbiologie
Kaffesäurederivate
Pharmazeutische Biologie
BAHD-Acyltransferasen

description: Rosmarinsäure (RA) ist ein Naturstoff, der in Anthoceros agrestis vorkommt und im Rahmen
dieser Arbeit untersucht wurde, wobei Mengen von bis zu 4 % des Trockengewichts festgestellt
wurden. Der Biosyntheseweg für RA konnte für Plectranthus scutellarioides vollständig
aufgeklärt werden, wobei L-Tyrosin und L-Phenylalanin als Vorläufer dienen. Ein wesentlicher
Schritt in dieser Biosynthese ist die Esterverknüpfung von 4-Cumaroyl-CoA und 4-
Hydroxyphenylmilchsäure durch die Rosmarinsäure Synthase (RAS) zur Bildung von 4-
Cumaroyl-4‘-Hydroxyphenylmilchsäure, die dann weiter hydroxyliert wird, um RA zu bilden.
Für A. agrestis wurde jedoch kein Ortholog zu RAS gefunden. Da RAS eine Acyltransferase der
BAHD-Familie ist, wurde eine Suche nach Sequenzen durchgeführt, die konservierte Motive
enthalten, die für BAHD-Acyltransferasen charakteristisch sind. Dabei wurden mehrere
Sequenzen gefunden, wobei AaHCT6 am ähnlichsten zu RAS von P. scutellarioides ist.
Untersuchungen an der heterolog exprimierten AaHCT6 zeigten jedoch, dass sie nicht die
Reaktion von 4-Cumaroyl-CoA und 4-Hydroxyphenylmilchsäure oder 3,4-
Dihydroxyphenylmilchsäure katalysiert, wie ursprünglich vorgeschlagen. Ein Katalog von 55
potenziellen Akzeptorsubstraten wurde auf Akzeptanz durch AaHCT6 getestet und ergab
Akzeptanz für Shikimat, 3-Hydroxyanthranilat und 2,3-Dihydroxybenzoat mit Caffeoyl-CoA und
4-Cumaroyl-CoA als Donorsubstraten. Enzymkinetische Messungen ergaben die höchste
Affinität für 4-Cumaroyl-CoA als Donorsubstrat und Shikimat als Akzeptorsubstrat, gefolgt von
3-Hydroxyanthranilat und 2,3-Dihydroxybenzoat. Für 3-Hydroxyanthranilat erfolgt die
Produktbildung über eine Amidbindung, während bei Shikimat und 2,3-Dihydroxybenzoat die
Produktbildung über eine Esterbindung erfolgt.
AaHCT1 wurde erfolgreich aus Gesamt-RNA amplifiziert, in verschiedene Expressionsvektoren
ligiert und in prokaryotische und eukaryotische Organismen zur heterologen Expression
eingeführt. Jedoch war eine Expression des entsprechenden Proteins nicht erfolgreich.
AaHCT2 wurde erfolgreich in E. coli exprimiert, und Untersuchungen zur Substratakzeptanz
ergaben eine Akzeptanz für zwei kleine Alkanole als Akzeptorsubstrate, Methanol und Ethanol,
mit Caffeoyl-CoA als Donorsubstrat. AaHCT5 wurde erfolgreich in E. coli exprimiert, wie durch
Western Blot verifiziert wurde, jedoch wurde kein Substrat akzeptiert, das in dem Katalog von
55 potenziellen Substraten enthalten war. Die Sequenz, die für AaHCT7 kodiert, wurde zwar in
einem späten Stadium dieser Arbeit entdeckt, konnte jedoch erfolgreich aus Gesamt-RNA
amplifiziert werden. Eine Integration in den Vektor pDrive war erfolgreich, wie durch
175
Sequenzierung verifiziert wurde. Eine Integration in den Expressionsvektor pET-15b war jedoch
nicht erfolgreich, da sie in einer umgekehrten Orientierung eingebaut wurde.
Bis heute ist der letzte Schritt des Rosmarinsäure-Biosynthesewegs in A. agrestis noch unklar.
Es besteht die Möglichkeit, dass dieser Schritt von einem Enzym der BAHD-Acyltransferase-
Familie katalysiert wird, wie es für Pflanzen der Lamiaceae-Familie nachgewiesen wurde. Es
kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Schritt von einem Enzym einer völlig
anderen Klasse katalysiert wird. Darüber hinaus ist es möglich, dass dieser Schritt von einem
Enzym katalysiert wird, das Acyltransferase-Aktivität aufweist, aber die für BAHD-
Acyltransferasen typischen konservierten Sequenzen fehlen (oder davon abweichen).
Neben der Aufklärung der Funktion und Rolle von HCTs, die in A. agrestis gefunden wurden,
befasst sich diese Arbeit auch mit der Erforschung von Elektrizität als potenziellem Auslöser
für die Steigerung der Produktion von Rosmarinsäure in Suspensionskulturen von Melissa
officinalis. Erste Experimente mit elektrischen Feldern zeigten unterschiedliche Auswirkungen
auf die Metabolitproduktion, was auf die Notwendigkeit weiterer Optimierung und
Untersuchung der Anwendung von elektrischem Strom als Auslöser hinweist. Die Ergebnisse
zeigten jedoch, dass die Anwendung eines chemischen Elicitors, Methyljasmonat, die
Rosmarinsäureproduktion konsequent besser fördert als die elektrische Stimulation, was die
wirtschaftliche Praktikabilität von Methyljasmonat für die Steigerung der Bildung von
Naturstoffen gegenüber komplexen Aufbauten mit elektrischer Verkabelung hervorhebt.