Γονιδιακή μελέτη του ρόλου των ανθρώπειων β-ντιφενσινών στην παθογένεια της λοίμωξης από Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού:
Creators: name: Καζάκος, Ευάγγελος Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού
β - ντιφενσίνες
Mικροσυστοιχίες DNA
Παθογένεια
Helicobacter pylori
β-defensins
DNA microarrays
Pathogenesis

description: Η έκκριση των ανθρώπειων β-ντιφενσινών (hβDs) από τα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα συμβάλλει στην αποτελεσματική επιτήρηση των μικροβιακών πληθυσμών εγγύς του γαστρικού βλενογόνου. Ωστόσο, η παραμονή του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού (Hp) στο γαστρικό βλεννογόνο παραμένει μία αινιγματική πτυχή της αλληλεπίδραση ξενιστή - παθογόνου που οδηγεί στην υπόθεση ότι η διαφυγή ή την καταστολή μηχανισμών της φυσικής ανοσίας συμβάλλει στην επιτυχή επιβίωση του στο γαστρικό περιβάλλον. Επιπλέον, η παρουσία των κοκκοειδών, εμμένοντων κυττάρων (VBNCs) εντός σχηματιζόμενων Ηp-βιομεμβρανών πιθανόν να συνεισφέρει περαιτέρω στην παθογένεση της χρόνιας λοίμωξης. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν: 1. η διερεύνηση των πρώιμων μεταγραφικών αλλαγών στο γονιδίωμα του Hp ως αποτέλεσμα έκθεσής του σε χαμηλές συγκεντρώσεις hβDs, οι οποίες υφίστανται στο γαστρικό επιθήλιο, και 2. η επίδραση των hβDs στη δημιουργία Η.pylori-βιομεμβρανών in vitro ως - πιθανού - προσαρμοστικού μηχανισμού αντοχής του Η. pylori στις εκκρινόμενες από τα επιθηλιακά κύτταρα του στομάχου, hβDs. Για το σκοπό αυτό, η έρευνά μας επικεντρώθηκε στα ακόλουθα: α. Αποτύπωση της γενετικής ποικιλομορφίας των εργαστηριακών Η. pylori στελεχών 60190 και SS1, β. Έλεγχος της βακτηριοκτόνου ικανότητας διαβαθμισμένων συγκεντρώσεων hβDs έναντί του Hp, προκαταρκτική διερεύνηση πιθανώς διαφορετικών μηχανισμών βακτηριοκτόνου δράσης των επιμέρους hβDs, καθώς και μελέτη της επίδρασης καθορισμένων συγκεντρώσεων hβDs στην ανάπτυξη Hp-βιομεμβρανών in vitro γ. Εφαρμογή μεθόδων ηλεκτρονικής μικροσκοπίας για την εκτίμηση πιθανών μορφολογικών αλλοιώσεων στα εκτιθέμενα Ηp κύτταρα, ώστε να αποσαφηνισθεί περαιτέρω ο τρόπος δράσης των hβDs και να διαπιστωθεί η παρουσία πιθανών διαφορών (strain-to-strain variation) σχετικών με την ικανότητα διαφορετικών Hp στελεχών να σχηματίζουν βιομεμβράνες δ. Ανάλυση του μεταγραφώματος Hp κυττάρων, που εκτίθενται σε μη βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις hβDs ώστε να ταυτοποιηθούν πιθανοί μηχανισμοί προσαρμογής, και ανοσιακής διαφυγής του Hp, in vivo Η ανάλυση των πειραματικών δεδομένων έδειξε: α. Παρουσία σημαντικού βαθμού ετερογένειας του γενετικού περιεχομένου των Hp SS1 και 60190 β. Ισχυρή βακτηριοκτόνο δράση των hβD1 - 4 έναντι του Hp, με τη διαμεσολάβηση διαφορετικών μηχανισμών δράσης γ. Διαφορετικού βαθμού ικανότητα σχηματισμού βιομεμβρανών μεταξύ των εξετασθέντων Hp στελεχών δ. Σημαντική, παρόμοιου βαθμού, καταστολή δημουργίας Hp-βιομεμβρανών από τα εξεταζόμενα στελέχη ως αποτέλεσμα έκθεσής τους σε υψηλές βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις hβDs σε αντίθεση με τη σημαντική επαγωγή της ικανότητας παραγωγής τους λόγω της επίδρασης ενδιάμεσων δόσεων επιμέρους hβDs ε. Σημαντικές αλλαγές του μεταγραφικού προφίλ του Hp όπως αποδεικνύεται από την επαγωγή ή καταστολή γονιδίων-συστατικών διακριτών μηχανισμών μολυσματικότητας και οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται σε απόκρισεις έναντι στρεσογόνων παραγόντων. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε την πολυεπίπεδη επίδραση των hβDs στην παθογένεια του Hp, καθώς φαίνεται ότι η έκλυσή τους από τα επιθηλιακά κύτταρα του γαστρικού βλενογόνου πιθανώς να αποτελεί καθοριστικό στοιχείο επιλογής των θέσεων προσκόλλησης του Hp και να επάγει τον αποικισμό του γαστρικού ιστού μέσω του σχηματισμού βιομεμβρανών - οι οποίες πιθανώς να ευθύνονται, εν μέρει, για τα ποσοστά αποτυχίας των θεραπευτικών σχημάτων εκρίζωσης και την εγκατάσταση της χρόνιας φλεγμονής.
description: Secretion of human β-defensins (hβDs) by gastric epithelial cells contributes to effective surveillance of microbial populations in proximity to the gastric mucus. However, persistence of H. pylori (Hp) in the gastric mucosa remains a puzzling aspect of the host - microbe interaction leading us to hypothesize that escape or suppression of innate immunity mechanisms counts towards its enhanced survival in the gastric environment. Furthermore, the presence of Variable-But-not-Culturable persister cells (VBNCs) inside Hp-biofilms may further contribute to the pathogenesis of chronic infection. This thesis aimed to: 1. investigate early transcriptional changes that occur in H. pylori upon challenge to low concentrations of hβDs, similar to those present in the gastric epithelium; and 2. provide preliminary data regarding the formation of H. pylori biofilms in vitro as a putative, resistance mechanism that favors gastric colonization and survival. For this purpose, our research has focused on the following: a. Demonstrate the genetic diversity of widely used laboratory strains H. pylori 60190 and SS1 in comparison to the sequenced strains H. pylori 26695 and J99, as a prerequisite to adequate evaluation of hβDs influence at genome level b. Assess the bactericidal capacity of hβDs against H. pylori at defined concentrations, initiate a preliminary investigation regarding the existence of divergent modes of action between them, as well as investigate the effect of defined hβD concentrations in H. pylori biofilm development in vitro c. Demonstrate by electron microscopy methods, morphological defects in hβD- exposed bacterial cells so as to further clarify their mode of action and possible strain- to-strain variations in biofilm formation d. Perform a transcriptome analysis of H. pylori-exposed to subinhibitory concentrations hβDs that may aid the identification of possible mechanisms of H. pylori adaptation and immune escape in vivo Analysis of our experimental data showed: a. Existence of variable degree of heterogeneity of H. pylori 60190 and SS1 b. Profound bactericidal activity of all 4 hβDs against Hp, mediated through different modes of action c. Strain-to-strain variation in forming distinct type biofilms d. Significant of similar magnitude, suppression in H. pylori-biofilm activity as a result of exposure to high bactericidal concentrations of hβDs as opposed to the profound induction in H. pylori biofilm formation due to intermediate doses of certain hβDs, e. Significant changes in H. pylori transcriptome as demonstrated by the induction or suppression of multiple gene components of distinct virulence mechanisms and signaling pathways implicated in stress responses. In conclusion, this study demonstrated the multifaceted impact of hβDs in the pathogenesis of H. pylori, as it appears that hβD release from gastric epithelial cells dictates site selection and adhesion properties of H. pylori, induces H. pylori colonization of the gastric mucosa through biofilm formation, which, in turn, partly accounts for the observed failure of eradication regimens and the establishment of chronic inflammation.