Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche
Creators: name: Naldi, Marina <1977>
Publisher: name: Alma Mater Studiorum - Università di Bologna
Year: 2008
Subjects: BIO/10 Biochimica

description: Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3
e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il
nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina.
A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali
quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste
modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici
coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio
della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene
a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di
acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone
acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia
possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la
localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione.
Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi;
per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di
composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti
provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca
farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi
di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore
chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC
deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più
controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella
capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di
indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta
immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi.
Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla
loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC
appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una
specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente
inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei
processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore.
Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine
istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare.
Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che
comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi
più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante
spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise
informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti
coinvolti nelle modifiche post-traduzionali.
Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla
caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla
spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo
cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base,
delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione
HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di
massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente
electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che
differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa
estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme
non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto
accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del
ciclo e alla morte cellulare.
Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la
stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente
ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione.
Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse
modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva
analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di
identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di
acetilazione delle lisine stesse.
Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a
carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e
selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato
all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e
butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati
testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti.
Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa
potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA
e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di
evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre
messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi
di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275
selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande.
E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza
dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle
modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che
per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle
diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di
ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone
meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata
inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti
studi di tempo-dipendenza.
I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie
classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle
cellule.
In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno
causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per
HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4.
Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a
livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi
di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi,
somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla
stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti
significatici sul ciclo cellulare.
Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche
permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle
HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che
l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare.
Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare
l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli
inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il
meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari
tumorali.