Perturbation Analysis of Colorectal Cancer Cell Plasticity and Therapy Resistance at Single Cell Resolution
Creators: name: Lüthen, Mareen
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2023
Subjects: subject: Darmkrebs
subject: MAPK
subject: Organoide
subject: Signaltransduktionskaskade
subject: Inhibitorkombinationen
subject: Einzelzellanalyse
subject: Zellheterogenität
subject: Differenzierungsgradient
subject: Colorectal cancer
subject: organoids
subject: signal transduction cascades
subject: inhibitor combinations
subject: single cell analyses
subject: cellular heterogeneity
subject: differentiation gradient
subject: 610 Medizin und Gesundheit

description: Das normale Kolonepithel weist eine strenge Zellhierarchie auf, die aus bekannten Zelltypen besteht. Bei Darmkrebs (CRC) ist die Struktur weniger konserviert und nicht gut verstanden. Krebsauslösende Mutationen können die Prävalenz von Zelltypen verändern, und Zellen können sich auch dedifferenzieren, um einer gezielten Krebstherapie zu entgehen. Mein Ziel ist es, die Existenz heterogener Zelltypen in Organoiden zu bestätigen und Signalnetzwerke in CRC zu untersuchen, indem ich mit pharmakologischen Eingriffen spezifische Signalwege inhibiere, die Zellhierarchien im normalen Darm kontrollieren. Strategisch ausgewählte Medikamente wurden eingesetzt, um Knotenpunkte in verschiedenen Signalwegen zu hemmen, die für das Fortschreiten von Darmkrebs relevant sind. Ich untersuchte, ob die Inhibition von Signalwegen die Zusammensetzung der Zelltypen und den Differenzierungszustand verändert oder welche Kombinationen von Inhibitoren Plastizität oder Apoptose auslösen könnten. Von Patienten stammende Organoide mit verschiedenen onkogenen Treibermutationen wurden kultiviert und 48 Stunden lang mit einer Reihe von Inhibitoren und Inhibitorkombinationen behandelt. Diese Organoide wurden hauptsächlich auf zwei Ebenen untersucht: durch scRNA seq zur Ermittlung ihres Transkriptoms und durch CyTOF, das die Proteinhäufigkeit pro Zelle misst, um die Aktivität von Signaltransduktionskaskaden zu beurteilen. Beide Methoden wurden eingesetzt, um die Heterogenität des CRC zu quantifizieren. Ich konnte feststellen, dass sich Organoide mit denselben Treibermutationen ähnlicher verhalten und dass die molekularen Grundlagen der verschiedenen Linien Unterschiede im Therapieerfolg bedingen. Heterogene Transkriptome und Proteinexpression wurden durch einen Differenzierungsgradienten beeinflusst und konnten durch die Zugabe von Inhibitoren verändert werden. Die MAPK-Aktivität folgt diesem Differenzierungsgradienten und eine MAPK-Inhibition verringerte die Zellheterogenität und führte zu Plastizität. Darüber hinaus stellte ich fest, dass ein Teil der Zellen in Apoptose geht und die verbleibenden Zellen einen nicht-proliferativen Stammzellzustand annehmen, der es den Zellen ermöglicht, sich nach Aussetzung der Behandlung zu erholen. Es wurden in silico und in vitro Analysen durchgeführt, um neuartige Inhibitorkombinationen zur Maximierung der Apoptose in CRC-Organoiden zu finden, um die Entstehung therapieresistenter Subpopulationen weiter zu reduzieren. Wirksame Behandlungskombinationen bleiben jedoch zelllinienabhängig. Durch die getrennte Analyse des Zelldifferenzierungszustands und des Zellsignalisierungszustands habe ich dazu beigetragen zu verstehen, wie Tumorzellen einer gezielten Therapie durch nicht-genetische Resistenzmechanismen entgehen können. Die MAPK-Inhibition zur Verringerung der Zellheterogenität in Kombination mit anderen Inhibitoren könnte in Zukunft zur Optimierung des Therapieerfolgs eingesetzt werden.
description: Normal colon epithelium has a strict cell hierarchy consisting of well-known cell types. In colorectal cancer (CRC) the structure is less conserved and poorly understood. Cancer driver mutations may modulate the prevalence of cell types, and cells may also dedifferentiate to overcome targeted cancer therapy. My aim is to confirm the existence of heterogeneous cell types in organoids and investigate signaling networks in CRC by targeting specific signaling pathways with pharmacological intervention, which control cell hierarchies in the normal intestine. Strategically selected drugs were used to inhibit nodes in different signaling pathways relevant to the progression of CRC. I explored whether signaling inhibition changes cell type composition and differentiation state, or which inhibitor combinations might induce plasticity or apoptosis. Patient-derived organoids with different oncogenic diver mutations were cultured and treated with a panel of inhibitors and inhibitor combinations for 48 hours. These organoids were mainly examined on two levels: by scRNA seq to assess their transcriptome and by CyTOF, which measures protein abundance to assess the activity of pathways. Both methods were used to quantify CRC heterogeneity. I was able to see that organoids with the same driver mutations behave more similarly and that the molecular underpinnings of the different lines drive differences in therapy response. Heterogeneous transcriptomes and protein expression were affected by a differentiation gradient and could be altered by inhibitor addition. MAPK activity was graded along this differentiation gradient, and MAPK inhibition reduced cell heterogeneity and induced plasticity. Additionally, I found that a fraction of cells undergo apoptosis, and the remaining cells adopt a non-proliferative stem cell state, which allows cells to recover after suspension of treatment. \textit{In silico} and \textit{in vitro} analyses were performed to find novel inhibitor combinations to maximize apoptosis in CRC organoids to further reduce the emergence of therapy-resistant subpopulations. However, effective treatment combinations remain cell-line dependent. By separately analyzing cell differentiation state and cell signaling state I contributed to our understanding of how tumor cells can evade targeted therapy by non-genetic resistance mechanisms. Using MAPK inhibition to reduce cell heterogeneity in combination with other inhibitors may be used in the future to optimize therapy success.