Die Entwicklung eines Targeting-Moduls zur HIV-Therapie
Creators: name: Jäger, Christiane
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2005
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 612.01

description: Das Oberflächenprotein CD4 wird auf T-Lymphozyten exprimiert und spielt eine entscheidende Rolle im Immunsystem. CD4 ist als primärer Rezeptor des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) ebenfalls ein wichtiges Protein im Laufe einer HIV-Infektion. Konservierte Bereiche in der Struktur des Oberflächenglykoproteins gp120 des HIV ermöglichen dessen Bindung an CD4. Somit wird eine gezielte Aufnahme des Virus in die Zellen vermittelt. Für die Wechselwirkung mit gp120 ist nur die erste extrazelluläre Domäne (D1) des CD4 relevant. Diese Domäne kann in Therapieansätzen als Fusionshemmer fungieren und die Bindung des HI-Virus an die Zielzellen durch Kompetetion der Bindungsstellen auf dem Virus inhibieren. D1 konnte im Rahmen der Arbeit in Escherichia coli exprimiert und durch Entwicklung eines Renaturierungs- und Reinigungsprotokolls in hoher Quantität und Qualität hergestellt werden. Die Analyse der Sekundärstruktur und Wechselwirkung zum Oberflächenglykoprotein gp120 bestätigten die Darstellung des nativen Proteins. Das Oberflächenglykoprotein gp120 des HIV wird auf der Oberfläche der HIV-infizierten Zellen exponiert. Derivate des CD4 sind geeignet, zytotoxische Reagenzien zelltypspezifisch auf HIV-infizierte Zellen zu dirigieren. Das zu entwickelnde Targeting-Modul zur HIV-Therapie war eine CD4-Variante, welche über ein C-terminales Dimerisierungsmotiv an therapeutisch relevante Moleküle assoziiert werden kann. Grundlage dieses Dimerisierungsmotivs sind kurze polyionische Fusionspeptide, bestehend aus einer Abfolge von acht entweder positiv oder negativ geladenen Aminosäureresten und einem zusätzlichen Cystein-Rest. Durch Modifizierung von Proteinen mit diesen Peptiden kann, vermittelt durch ionische Wechselwirkung mit anschließender Disulfidverbrückung, die kovalente Konjugation von zwei Proteinen erreicht werden. Für die Darstellung des Targeting-Moduls wurde die N-terminale extrazelluläre Domäne des CD4 (D1) mit einem Okta-Argininpeptid und einem Cystein N-terminal verlängert (D1R8C). Zur Eliminierung gp120-positver Zellen erfolgte die Assoziation des CD4-Konstrukts D1R8C an ein Derivat des Pseudomonas Exotoxin E8C-PE38. Die zelltypspezifische und zytotoxische Wirksamkeit des hergestellten rezeptor-spezifischen Zytotoxins konnte in Zellkulturexperimenten nachgewiesen werden.
description: The cell surface protein CD4 is expressed on most T-lymphocytes and plays an important role in the cellular immune response. It has also a major relevance in the course of HIV infection as the primary receptor for the envelope glycoprotein gp120 of the human immunodeficiency virus. Binding of the viral glycoprotein, gp120, to CD4 is the initial step in viral entry, leading to fusion of viral and cell membranes. The first extracellular domain of the CD4 (D1) is necessary for the interaction with gp120. Blocking viral attachment by inhibiting gp120-CD4 binding is a potentially valuable antiviral strategy in AIDS therapy. Based on the recombinant expression of D1 in Escherichia coli, a protocol to produce the first extracellular domain of CD4 in large quantities and high quality was developed in the present study. Analyses of secondary structure and the binding affinity to the envelope glycoprotein gp120 of HIV confirmed the production of native protein. The gp120 envelope glycoprotein of the human immunodeficiency virus (HIV) is expressed on the surface of HIV-infected cells. Derivates of recombinant CD4 that bind gp120 with high affinity are attractive vehicles for targeting a cytotoxic reagent to HIV-infected cells. In this study a variant of the domain D1 of CD4 containing an octa-arginine tag (D1R8C) was generated. The described construct of the D1 domain of CD4 was engineered to bind via electrostatic interaction to a mutant of the Pseudomonas exotoxin PE38 possessing a negatively charged octa-glutamate tag. This association was stabilized by an engineered disulfide bridge. The resulting receptor specific cytotoxin killed gp120 presenting cells.