title: Klonale experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis: Charakterisierung myelinspezifischer Antikörper in einem TH2-induzierten adoptiven Transfermodell
title: Clonal experimental autoimmune encephalomyelitis: characterization of myelinspecific antibodies in a TH2 adoptive transfer model
Creators: name: Sieren, Michael
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: T-Lymphozyt
Antibodies
PLP
Antikörper
Allergische Encephalomyelitis
Medizin, Gesundheit
Adoptives
TH2
EAE
Adoptive
Transfermodell

description: Die Multiple Sklerose ist in Europa
      und Nordamerika die häufigste Entmarkungserkrankung des
      zentralen Nervensystems. Sie ist neben Inflammation und
      Demyelinisierung auch durch neurodegenerative Prozesse
      gekennzeichnet. Hierbei spielen T-Zell-vermittelte
      Mechanismen eine wesentliche Rolle. Aufgrund der
      Heterogenität ihres klinischen Verlaufs sind weder
      individuelle Voraussagen bezüglich der Progression der
      neurologischen Defizite noch bezüglich des therapeutischen
      Ansprechens möglich. Diese klinische Heterogenität spiegelt
      sich in unterschiedlichen histopathologischen sowie
      liquorzytologischen Mustern wieder. Es finden sich Subtypen,
      bei denen humorale Effektormechanismen eine wesentliche Rolle
      zu spielen scheinen. Die experimentelle autoimmune
      Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell der Multiplen
      Sklerose und kann in suszeptiblen Tierstämmen durch aktive
      Immunisierung mit Myelinpeptiden oder durch den adoptiven
      Transfer myelinspezifischer CD4 positiver TH1-Zellen
      induziert werden. Die EAE galt lange als eine im Wesentlichen
      TH1-vermittelte Erkrankung, während TH2-Zellen eher
      protektive Funktionen zugeschrieben wurden. Dieses
      TH1-TH2-Paradigma stellt jedoch eine zu starke Vereinfachung
      der Immunantwort im Rahmen der EAE-Induktion dar. Zum einen
      spielen weitere T-Zell-Subpopulationen eine wesentliche Rolle
      bei der Pathogenese. So gelingt z.B. durch den adoptiven
      Transfer von TH17-Zellen eine sehr effiziente EAE-Induktion
      auch ohne eine vorherige in vitro Stimulation. Zum anderen
      kann in einem neuartigen adoptiven T-Zell-Transfermodell
      durch den Transfer klonaler Proteolipidprotein (PLP) 139-151
      spezifischer CD4+ TH2-Zellen bei immunkompetenten SJL-Mäusen
      eine EAE mit chronifizierendem Verlauf induziert werden,
      deren entzündliche Läsionen in der chronischen Phase durch
      Infiltrate aus Makrophagen, B-Zellen, Plasmazellen sowie
      massiven Antikörperablagerungen gekennzeichnet sind. Im Serum
      der Mäuse ist eine hochtitrige Antikörperantwort gegen
      PLP139-51 nachweisbar. Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine
      nähere Charakterisierung der Antikörperantwort in diesem
      Modell. Nach EAE-Induktion durch adoptiven Transfer von
      Zellen des PLP 139-151 spezifischen TH2-Zell-Klons 3-3 wurden
      in der chronischen Phase der Erkrankung Milzzellen entnommen
      und mit Zellen der Sp2-Maus-Myelom-Zelllinie fusioniert.
      Hierdurch wurden antikörperproduzierende Hybridomzellen
      generiert. Durch Klonierung mittels des
      Limiting-Dilution-Verfahrens und anschließender
      chromatograpischer Aufreinigung wurden monoklonale,
      myelinspezifische Antikörper gewonnen. Deren weitere
      Charakterisierung erfolgte mittels ELISA, Western-Blot, an
      Gewebsschnitten sowie in adoptiven Transferexperimenten. Die
      Besonderheit dieses Modells liegt darin, dass die
      monoklonalen Antikörper ohne vorherige aktive Immunisierung
      generiert wurden. Es handelt sich somit um einen neuen,
      physiologischeren Ansatz zur Charakterisierung der
      T-Zell-B-Zell-Interaktion bzw. der Rolle von Antikörpern in
      einem neuen TH2-induzierten EAE-Modell. Im ersten Teil der
      Arbeit wurden ausgewählte monoklonale PLP139-151 spezifische
      Antikörper der Isotypen IgG1 sowie IgG2b aufgereinigt. Zwar
      konnten diese PLP139-151 in einem ELISA binden. Weder in
      einem Western Blot mit Myelinproteinen noch in Kryo- oder
      Paraffinschnitten von ZNS-Gewebe zeigte sich hingegen eine
      spezifische Bindung an Myelin. Der adoptive Transfer in mit
      Pertussis Toxin vorbehandelte SJL-Mäuse konnte keine
      klinischen Symptome induzieren. Im zweiten Teil der Arbeit
      wurden die Untersuchungen daher auf Antikörper gegen weitere
      Myelinpeptide ausgedehnt. Hierbei konnte der Myelin
      Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG) 35-55 spezifische
      monoklonale IgM Antikörper 4E6-2 identifiziert werden, der
      Myelin in Paraffinschnitten spezifisch färbte. Zudem zeigte
      sich im Western Blot eine Bindung an MOG. Der Antikörper
      wurde in einem Transferversuch an Mäusen getestet, bei denen
      zuvor eine EAE durch adoptiven Transfer eines TH1-Klons
      induziert worden war. Hierbei fand sich kein Hinweis auf eine
      krankheitsmodifizierende Wirkung des Antikörpers. Zur
      weiteren Klärung der Rolle antikörpervermittelter Mechanismen
      im hier beschriebenen Modell ist eine weitere
      Charakterisierung der Antikörper hinsichtlich ihrer
      Effektorfunktionen, wie z.B. ihrer Fähigkeit zur
      Komplementaktivierung, erforderlich.
description: Multiple sclerosis (MS) is a
      chronic inflammatory demyelinating disease of the central
      nervous system. Clinical manifestation and progression of
      neurological deficits are highly heterogeneous and
      unpredictable. Clinical heterogeneity is reflected by four
      distinct histopathological patterns and defined patterns of
      cerebrospinal fluid pathology. T-cell mediated mechanisms
      seem to play a pivotal role in the course of disease.
      Furthermore humoral immunity seems to contribute essentially
      to inflammation in several subtypes of MS. Experimental
      autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of MS.
      It can be either induced by active immunization with myelin
      components or by adoptive transfer of myelin specific CD4+
      TH1-cells. A shift towards a TH2-response however has been
      considered to lead to an amelioration of the clinical course.
      Recent developments revealed that this TH1-TH2-paradigm is an
      oversimplification of the complex immune response during the
      course of EAE. Further T-cell subpopulations seem play a
      pivotal role in the pathogenesis of EAE. Adoptive Transfer of
      TH17-cells e.g. is a very efficient way of EAE-induction
      without prior in-vitro stimulation. In addition adoptive
      transfer of clonal proteolipidprotein (PLP) 139-151 specific
      TH2-cells to immunocompetent non-transgenic SJL-mice in a new
      model leads to induction of an EAE with a chronifying course
      of disease. Demyelinating lesions in the chronic phase of
      disease contain B-cells, plasma cells, macrophages and
      massive deposits of antibodies. Furthermore PLP139-151
      specific antibodies as well as antibodies against other
      myelin components can be detected in the serum of the
      animals. The aim of this study is the further
      characterization of the antibody response in this new
      TH2-induced EAE model. After EAE-induction by adoptive
      transfer of the prior established PLP139-151 specific TH2
      clone 3-3 spleen cells were obtained during the chronic phase
      of disease approximately 90 days after T-cell transfer. By
      fusion of these cells with cells of the Sp2 myeloma cell line
      antibody producing hybridoma cells were created. By cloning
      in limiting dilution technique followed by affinity
      chromatography of cell culture supernatants, monoclonal
      myelin specific antibodies were purified. For further
      characterization the so gained monoclonal antibodies were
      tested in myelin specific ELISAs and Western Blots, in
      immunohistochemistry on central nervous system (CNS) tissue
      samples and in adoptive transfer experiments. A distinctive
      feature of this model is that monoclonal antibodies were
      generated without prior active immunization with myelin
      antigens. This offers a completely new more physiologic
      approach to characterize T-cell-B-cell interactions and the
      role of antibodies in a new TH2-induced EAE-Modell. In the
      first part of the study selected monoclonal PLP139-151
      specific antibodies of isotype IgG1 and IgG2b were purified
      and characterized as described before. PLP139-151 specifity
      could be shown in a peptide coated ELISA. Neither in Western
      Blots nor in immunohistochemistry with CNS tissue samples
      could reactivity against PLP or other myelin components be
      observed. Adoptive transfer of antibodies in SJL-mice
      pre-treated with Pertussis toxin could not induce clinical
      symptoms of EAE. In the second part the study therefore was
      extended to monoclonal antibodies specific for other myelin
      components. The monoclonal myelin oligodendroglia
      glycoprotein (MOG) 35-55 specific antibody 4E6-2 stained MOG
      in a Western Blot as well as myelin on paraffin embedded CNS
      tissue sections. The antibody was tested in adoptive
      co-transfer experiments in SJL-mice after prior EAE-induction
      by adoptive transfer of cells of the myelin specific TH1
      clone cPLP 25. This experiment did not reveal a disease
      modifying effect of 4E6-2. For clarification of the role of
      antibody mediated mechanisms in our new TH2 mediated model of
      EAE in SJL-mice further characterization of these antibodies
      in regard to their effector functions like e.g. their ability
      to fix complement has to be carried out. Nevertheless the
      findings support the concept of pathogenetic heterogeneity of
      EAE and MS and might have an impact on the struggle for new
      therapeutic approaches.