title: Selektion Internalin-bindender Peptide – Neue Wege zur Verhinderung der Infektiosität und des Wachstums von Listeria monocytogenes
Creators: name: Kenzel, Julia
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2020
Subjects: subject: Listeria monocytogenes
subject: Phagen-Display
subject: Internaline
subject: Peptide
subject: Detektion
subject: Therapie
subject: 570

description: Die Nachfrage der Konsumenten nach frischen und natürlich behandelten Lebensmitteln sowie die hohen Anforderungen in der Lebensmittelsicherheit fordern neue und innovative Strategien zur Detektion und Eliminierung von Lebensmittelpathogenen. Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) zählt zu den häufigsten und gefährlichsten durch Lebensmittel übertragenen Pathogenen und ist der Verursacher von Listeriose, die trotz Antibiotika-behandlung eine Mortalitätsrate von bis zu 30 % aufweist. Derzeit verfügbare Methoden zur Listeria-Detektion sind kostspielig und zeitintensiv. Ziel dieser Arbeit war es, innovative Ansätze zu entwickeln, die zur Detektion des Bakteriums und zur Prävention der Listeria-Infektion beitragen sollen. Frühere Studien mit Antikörpern gegen L. monocytogenes lieferten eine unzureichende Selektivität und Spezifität. Die Verwendung spezifischer Peptide bietet hierbei eine Alternative und eignet sich besonders durch die hohe Stabilität und die kostengünstige standardisierte Produktion der Peptide. Hierfür wurde die Selektion L. monocytogenes-bindender Peptide erstmals mit einem Protein-basierten Phagen-Display durchgeführt. Bisher publizierte Peptide wurden unter Verwendung ganzer Zellen selektioniert, wodurch das Target der resultierenden Peptide unbekannt ist. In dieser Arbeit wurden Peptide aus 12 Aminosäuren identifiziert, die an L. monocytogenes-spezifische Oberflächenproteine Internalin A und Internalin B binden. Internalin A und Internalin B induzieren durch ihre Interaktion mit humanen Rezeptoren, E-Cadherin bzw. c-Met, die Invasion des Bakteriums in humane Wirtszellen und sind für den Infektionszyklus essenziell. Für die Selektion wurden zunächst rekombinante Proteine Internalin A(36-496) und Internalin B(36-321) gereinigt und ihre Bindung an den jeweiligen humanen Rezeptor verifiziert. Anschließend konnten in dieser Arbeit Internalin A-bindende Peptide mit den Aminosäuresequenzen GLHTSATNLYLH (JB1) und DSQFNKYSIATV (JB2) selektioniert werden. Ihre Bindung an sowohl rekombinantes Internalin A als auch an ganze Zellen L. monocytogenes wurde erfolgreich untersucht. Zudem konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von JB1 und JB2 an Internalin A die Interaktion zwischen Internalin A und E-Cadherin verhindert wird, wodurch die Internalisierung in epitheliale Wirtszellen verhindern werden könnte. Außerdem konnte erstmals gezeigt werden, dass Internalin A und Internalin B neben E-Cadherin bzw. c-Met mit dem humanen hepatischen Rezeptor IGF2R (insuline like growth factor 2 receptor) interagieren. Die Bindung des Bakteriums mit IGF2R ermöglicht die Invasion in Hepatozyten, der listeriale Interaktionspartner war bislang jedoch nicht bekannt. In einem weiteren Phagen-Display wurden die Peptide YSLRLTSVTAPT (JB6) und LTPHKHHKHLHA (JB8) gegen Internalin B selektioniert. Die Interaktion beider Peptide mit rekombinantem Internalin B und L. monocytogenes konnte erfolgreich gezeigt werden. JB8 wurde anschließend für die synthetische Kopplung an eine antimikrobiell wirkende Hopfenkomponente verwendet. Hopfenkomponenten aus der weiblichen Hopfenpflanze Humulus lupulus sind für ihre antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien bekannt. Sie wirken als Ionophore und schädigen die bakterielle Zellmembran oder den Transmembran-Protonengradienten. Hopfenextrakte werden bereits in der Konservierung von Lebensmitteln eingesetzt, um das Wachstum von L. monocytogenes zu verhindern. Konzentrationsbedingte negative Geschmacksveränderungen sollen durch eine Verringerung der Dosierung vermieden werden. Durch die Verknüpfung der Hopfenkomponente mit einem Internalin B-bindenden Peptid sollte die Substanz gezielt an die Bakterienmembran lokalisiert und damit die anti-listeriale Wirkung verstärkt werden. Die Auswahl einer für die Verknüpfung geeigneten Hopfenkomponente sowie die Bestimmung optimaler Versuchsbedingungen erfolgten durch Messungen der minimalen Hemmkonzentration (MHK) dreier Substanzen: Hulupinsäure, Xanthohumol und Lupulon. Dabei wurde für Xanthohumol eine MHK von 2,5 µg/ml bei pH 6,0 und 30 °C ermittelt und diese Hopfenkomponente mit Peptid JB8 verknüpft. Xanthohumol und Lupulon erwiesen sich als weniger geeignet. Eine antimikrobielle Aktivität des Konjugats Xanthohumol-JB8 konnte zwar gezeigt werden, die postulierte Verringerung der MHK im Vergleich zu Xanthohumol konnte allerdings zunächst nicht erzielt werden. Allerdings sind hierbei viele Parameter, wie die Art der Verknüpfung, entscheidend und können weiterführend optimiert werden. Die erstmals gegen Oberflächenproteine von L. monocytogenes selektionierten Internalin A- und Internalin B-bindenden Peptide JB1, JB2, JB6 und JB8 liefern jedoch einen entscheidenden Beitrag für die Entwicklung neuer Detektionsmethoden von L. monocytogenes sowie zur Verhinderung des pathogenen Mechanismus. Markierungen der spezifischen Peptide mit beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffen könnten eine schnelle Detektion des Bakteriums in humanen Zellen oder Lebensmittelproben ermöglichen. Zusätzlich könnten diese spezifischen Peptide zur Inhibition der Interaktion zwischen den Internalinen und den humanen Rezeptoren verwendet werden, um den Eintritt des Pathogens in Wirtszellen zu verhindern.