THE IMPACT OF LOW DOSE RADIOTHERAPY ON CARTILAGE FORMATION AND GENE EXPRESSION OF PRIMARY C57BL/6 CHONDROCYTES: ESTABLISHMENT OF A PROTOCOL FOR STUDIES ON RHEUMATOID ARTHRITIS
Creators: name: Urban, Alexander
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023

description: 2.1 Background and Aims In the last past decades, an anti-inflammatory effect of low dose-radiotherapy (LD-RT) on rheumatoid arthritis (RA) has been identified. RA is a common autoimmune disease primarily affecting the joints and is further associated with progressive disability, systemic complications, and early death. It is characterized by the transition of the synovial membrane into an inflammatory tissue invading cartilage and bone and, as the disease progresses, leading to cartilage degradation and bone erosion. On a cellular level, RA affects various cell types such as osteoclasts, osteoblasts, fibroblast-like synoviocytes (FLS), and chondrocytes. While the impact of LD-RT on osteoclasts, osteoblasts, and FLS had been studied by others and by us, the impact of clinically relevant doses on chondrocytes is scarcely examined. This thesis aimed to establish a murine chondrocyte cell culture to investigate the impact of LD-RT on chondrocytes in more detail. After successful establishment, the impact was determined using gene expression analysis and cartilage matrix measurement. Additionally, the influence of the pro-inflammatory cytokine TNFα was investigated by supplementing it to the cultivation media after radiation. 2.2 Methods Several experiments were performed to determine the ideal parameters for a standardized experiment protocol. After running a protocol prototype in a first trial run, the impact of duration of cultivation, differentiation media, and seeded cell numbers on gene expression and absorbance values were analyzed. The established protocol was used in later main experiments. In these, chondrocytes were isolated from 0 - 3 days old C57BL/6 mice. Based on previous publications, ribs were used as sources for chondrocytes, using trypsin and Collagenase-P for digestion and DMEM + 10% FCS as medium for proliferation. To stimulate the generation of cartilage matrix, after proliferation for three days in 24- and 48- well plates the medium was switched to Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (Promocell™). After 21 days of cultivation, the generated cartilage matrix was examined by Alcian blue staining, and gene expression was investigated using qPCR. Chondrocytes were exposed to the clinically relevant intermediated dose per fraction of 0.5 Gray (Gy) of X-rays as well as to lower and higher single doses per fraction. To analyze the impact of the pro-inflammatory cytokine TNFα, some chondrocytes were stimulated with TNFα after irradiation. 2.3 Results and Observations The establishment of a protocol was successful. Isolated chondrocytes cultivated in a differentiation medium formed cartilage layers that kept adhesion to the well surfaces of 24- and 48- well plates. On a microscopic level, formed cartilage was comparable to articular cartilage in terms of structure, the shape of chondrocytes as well as the arrangement of cells in matrix cavities. Measurement of absorbance values of formed cartilage layers, as well as qPCR analysis of chondrocyte specific target genes, provided evaluable and replicable results. After successful establishment, main experiments were performed. Irradiation did not seem to alter cartilage structure and chondrocyte morphology on a microscopic level. For both TNFα-stimulated and non-stimulated chondrocytes, no significant influence of irradiation on the absorbance of Alcian blue-stained cartilage layers as well as the expression of the target genes was detected. However, expression of Sox9, Pthlh, and Col2a1 was slightly elevated in non-stimulated chondrocytes after irradiation with a clinically relevant dose of 0.5 Gy. Cartilage layers stimulated with TNFα lost adhesion to well surfaces and shrank to small spheres. On a microscopic level, the number of chondrocytes seemed to decrease, and size as well as form of cells appeared more heterogeneous. In comparison to non-stimulated cartilage layers, absorbance and gene expression were decreased. 2.4 Conclusions and Discussion The protocol can be used in future studies. Necessary cultivation time, a suitable differentiation medium as well as the optimal seeded cell count per well was examined in preliminary tests. The results regarding the impact of LD-RT on gene expression and cartilage formation of murine chondrocytes were promising and are compatible with the few existing studies focusing on this topic. Although LD-RT showed no significant impact on formation of extracellular matrix, slightly increased expression of chondrogenic transcripts Sox9, Pthlh and Col2a1 might indicate a beneficial impact of the clinically relevant dose per fraction 0.5 Gy on differentiation and repair mechanisms of articular cartilage. The direct stimulation of cartilage layers with TNFα proved to be an unsuitable model to simulate cartilage affected by RA. However, the direct impact of the pro-inflammatory cytokine on murine chondrocytes was observed. The usage of more complex models such as the isolation of chondrocytes from hTNFα transgene mice as well as the interaction with further RA-affected cell types might be a better approach to study the impact of LD-RT on RA affected cartilage.
description: 1.1 Hintergrund und Ziele In den letzten Jahrzehnten wurde ein antiinflammatorischer Effekt von niedrig dosierter Strahlentherapie (low-dose radiotherapy, LD-RT) bei rheumatoider Arthritis (RA) nachgewiesen. RA ist eine häufige Autoimmunerkrankung, die primär die Gelenke betrifft und mit fortschreitender Behinderung, systemischen Komplikationen und frühem Tod assoziiert wird. Charakteristisch ist die Umwandlung der Synovialmembran in ein entzündliches Gewebe, das in Knorpelgewebe und Knochen eindringt und zu deren Abbau und Zerstörung führt. Auf zellulärer Ebene beeinflusst RA verschiedene Zelltypen wie Osteoblasten, Osteoklasten, Fibroblasten-ähnliche Synoviozyten (fibroblast-like synoviocytes, FLS) und Chondrozyten. Während der Einfluss von LD-RT auf Osteoklasten, Osteoblasten und FLS schon genauer untersucht wurde, ist die Wirkung klinisch relevanter Einzeldosen auf Knorpelgewebe bisher kaum erforscht. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer murinen Chondrozyten-Primärkultur, um den Einfluss von LD-RT auf Chondrozyten genauer untersuchen zu können. Nach erfolgreicher Etablierung sollte dieser mithilfe von Genexpressionsanalysen und Knorpelmatrixbestimmung ermittelt werden. Zusätzlich sollte der Einfluss des pro-inflammatorischen Zytokins Tumornekrosefaktor α (TNFα) auf die Chondrozyten untersucht werden. 1.2 Methoden Um die optimalen Parameter für ein standardisiertes Versuchsprotokoll zu bestimmen, wurden mehrere Vorversuche durchgeführt. Nachdem in einem ersten Versuch das Protokoll einer anderen Arbeitsgruppe getestet wurde, dienten weitere Durchläufe zur Ermittlung der idealen Kultivierungsdauer und Zellzahl sowie zum Vergleich verschiedener Differenzierungsmedien. Das etablierte Versuchsprotokoll wurde in den späteren Hauptversuchen genutzt. In diesen wurden Chondrozyten aus den Rippenkörben von 0-3 Tage alten C57BL/6- Mäusen isoliert. Freigelegte Rippen wurden durch Trypsin und Collagenase-P zersetzt. Zur Kultivierung wurde DMEM/HAM F12 + 10% FCS verwendet. Um die Bildung von Knorpelmatrix zu stimulieren, wurde das Medium nach drei Tagen auf das Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Medium (Promocell™) umgestellt. Nach 21 Tagen der Kultivierung wurde die entstandene Knorpelmatrix mithilfe einer Alcianblau-Färbung gemessen und die Genexpression mittels qPCR untersucht. Die Chondrozyten wurden mit klinisch relevanten Einzeldosen von 0,5 Gray (Gy) sowie niedrigeren und höheren Einzeldosen bestrahlt. Um den Einfluss des pro-inflammatorischen Zytokins TNFα zu untersuchen, wurde ein Teil der Chondrozyten nach Bestrahlung mit TNFα stimuliert. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Die Etablierung des Protokolls war erfolgreich. Isolierte Chondrozyten, die in Differenzierungsmedium kultiviert wurden, formten am Boden von 24- und 48- Well Platten anheftende Knorpelschichten. In Bezug auf Aufbau des Knorpels sowie Form und Anordnung der Chondrozyten war der gebildete Knorpel auf mikroskopischer Ebene vergleichbar mit Gelenkknorpel. Die Messung der Extinktion der mithilfe von Alcianblau angefärbten Knorpelschichten sowie die qPCR-Analyse der Chondrozyten-spezifischen Gene lieferte auswertbare und replizierbare Ergebnisse. Nach erfolgreicher Etablierung wurden die Hauptversuche durchgeführt. Auf mikroskopischer Ebene konnte keine durch Bestrahlung verursachte Veränderung der Knorpelstruktur und Chondrozytenmorphologie beobachtet werden. Sowohl bei TNFα-stimulierten als auch bei nicht stimulierten Chondrozyten wurde kein signifikanter Einfluss von Bestrahlung auf die Extinktion Alcianblau-angefärbter Knorpelschichten sowie die Expression der Zielgene ermittelt. Jedoch war bei Letzteren die Expression von Sox9, Pthlh und Col2a1 nach Bestrahlung mit klinisch relevanten Dosen von 0,5 Gy leicht erhöht. Knorpelschichten, die zuvor mit TNFα stimuliert worden waren, verloren die Haftung zum Plattenboden und schrumpften zu kleinen Kugeln. Die Zahl der Chondrozyten schien reduziert und Größe sowie Form dieser uneinheitlicher. Extinktion und Genexpression waren insgesamt geringer als bei nicht stimulierten Knorpelschichten. 1.4 Schlussfolgerungen und Diskussion Das Versuchsprotokoll kann in kommenden Studien angewendet werden. Durch Vorversuche konnten die notwendige Kultivierungsdauer, ein geeignetes Differenzierungsmedium sowie die optimale Zellzahl pro Well ermittelt werden. Die Versuchsergebnisse zum Einfluss von LD-RT auf Genexpression und Knorpelbildung waren vielversprechend und lassen sich mit den wenigen bisherigen Studien vereinen. Obwohl LD-RT keinen signifikanten Einfluss auf die Bildung extrazellulärer Matrix zeigte, könnte die leicht erhöhte Genexpression der Chondrozytenmarker Sox9, Pthlh und Col2a1 ein Indiz für einen vorteilhaften Einfluss der klinisch relevanten Einzeldosis 0.5 Gy auf die Differenzierung und den Reparaturmechanismus von Gelenkknorpel sein. Die direkte Stimulierung der Knorpelschichten mit TNFα erwies sich als ungeeignetes Modell, um von RA betroffenen Knorpel zu simulieren. Jedoch konnte der direkte Einfluss des Zytokins auf die Chondrozyten gut beobachtet werden. Die Verwendung von komplexeren Modellen wie die Isolierung der Chondrozyten aus hTNFα transgenen Mäusen und das Zusammenspiel mit weiteren aus Gelenken dieser isolierten Zelltypen könnte ein besserer Ansatz für die Untersuchung des Einflusses von LD-RT auf von RA befallenem Knorpel sein.