Μελέτη της ενδοκυττάριας μεταγωγής της βιοτεχνολογικά παραγόμενης ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ πρωτεΐνης σε ερυθροκύτταρα
Creators: name: Τζίκαλου, Λαμπρινή Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Μεταγωγή πρωτεϊνών
Βήτα θαλασσαιμία
Ερυθροκύτταρα
Protein transduction
Beta-thalassemia
Erythrocytes

description: Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της ενδοκυττάριας μεταγωγής της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ σε ερυθροκύτταρα ασθενών με β-θαλασσαιμία. Η ασθένεια αυτή, είναι μια από τις σημαντικότερες μονογονιδιακές διαταραχές και προκύπτει από μειωμένη ή καθόλου έκφραση της β-σφαιρίνης, λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο. Η Μεσογειακή αναιμία ή β-θαλασσαιμία αντιμετωπίζεται σήμερα με μεταγγίσεις αίματος, ενώ προσπάθειες γίνονται για ριζική θεραπεία μέσω μεταμόσχευσης μυελού των οστών, γονιδιακής θεραπείας ή κυτταρικών θεραπειών. Ως εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση, προτείνεται η Πρωτεϊνική Θεραπεία μέσω της τεχνολογίας των πεπτιδίων μεταγωγής [CPPs (Cell Penetrating Peptides)]. Για το σκοπό αυτό έχει ήδη παραχθεί στα εργαστήριο Φαρμακολογίας η ανασυνδυασμένη ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ πρωτείνη, με δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταγωγής. Δείγματα ερυθροκυττάρων ασθενών που πάσχουν από αιμοσφαιρινοπάθειες, συμπεριλαμβανομένου και Μεσογειακής αναιμίας (7 ασθενείς), επωάστηκαν με την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ. Στη συνέχεια ακολούθησε: α) λύση των ερυθροκυττάρων και ανάλυση του πρωτεινικού εκχυλίσματος για να επιβεβαιωθεί η μεταγωγή της εξωγενούς ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ με ανοσοαποτύπωση κατά Western˙ και β) HPLC χρωματογραφική ανάλυση των αιμοσφαιρινών, η οποία αποδίδει διάφορες κορυφές απορρόφησης στα 415 nm που αντιστοιχούν σε διαφορετικές αιμοσφαιρίνες (φυσιολογικές και παθολογικές), για την ανίχνευση πιθανής νέας κορυφής που να αντιστοιχεί σε πιθανό ενδοκυτταρικό σχηματισμό τετραμερούς συμπλόκου σφαιρινών, τύπου [α2(ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ)2]. Με βάση τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής: α) επιβεβαιώθηκε η ενδοκυττάρια μεταγωγή της βιοτεχνολογικά παραγόμενης ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ πρωτεΐνης στα ερυθροκύτταρα των ασθενών˙ και β) δεν εντοπίστηκε με την HPLC ανάλυση κάποια σημαντική διαφορά στο προφίλ των αιμοσφαιρινών από τις καλλιέργειες των ερυθροκυττάρων ασθενών που επωάστηκαν με την ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ πρωτεΐνη. Παράγοντες που φαίνεται να παιζουν ρόλο είναι: i) η συγκέντρωση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης για την επώαση των ερυθροκυττάρων˙ ii) ο χρόνος επώασης και τέλος, iii) η θερμοκρασία. Επιπλέον μελέτες είναι απαραίτητες για να διαπιστωθεί αν πράγματι η προτεινόμενη ενδοκυττάρια μεταγωγή της ανασυνδυασμένης β-σφαιρίνης θα μπορούσε να αποτελέσει εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση για τους ασθενείς με β-θαλασσαιμία. Παράλληλα επιχειρήθηκε η κλωνοποίηση του cDNA που κωδικοποιεί την παραγωγή της ανασυνδυασμένης ΤΑΤ-β-σφαιρίνη πρωτεΐνης στα βακτήρια. Η πρωτείνη αυτή δεν περιέχει το επιτόπιο ΗΑ στο καρβοξυτελικό άκρο και μοιάζει ακόμη περισσότερο με τη φυσιολογική ενδογενή β-σφαιρίνη από δομικής άποψης. Ενδεχομένως να μπορεί να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματικό σχηματισμό του επιθυμητού συμπλόκου α2(ΤΑΤ-β-σφαιρίνη)2.
description: The scope of the present study was to investigate the intracellular transduction of the recombinant protein TAT-b-globin-HA in erythrocytes of patients with beta-thalassemia. β-thalassemias are severe congenital hemoglobinopathies, attributed to more than 200 mutations of beta (β) globin gene. This results in imbalance between alpha and βeta globin chains of adult hemoglobin HbA and precipitation of unpaired alpha globin chains in the erythroid precursor cells in bone marrow as well as mature erythrocytes (RBCs) in peripheral blood. Current treatments of β-thalassemias include repeated RBCs transfusions with parallel administration of chelating agents to remove excess of iron as well as allogeneic bone marrow transplantation, while efforts are being made for radical therapy through gene or cell therapy. As an alternative therapeutic approach we propose Protein Therapy using the Protein Transduction Domain (PTD) Technology. For this purpose the recombinant protein TAT-b-globin-HA in the laboratory of Pharmacology has already been produced. Erythrocytes derived from patients with hemoglobinopathies were incubated with TAT-b-globin-HA protein and then analyzed with Western blot and HPLC analysis. Western blot was used to confirm the transduction of the recombinant protein to erythrocytes. HPLC chromatographic analysis of RBCs’ extracted hemoglobins yielded different absorption peaks at 415 nm corresponding to different hemoglobins (normal and abnormal). This work confirmed the intracellular transduction of TAT-b-globin-HA protein in erythrocytes, while HPLC analysis did not detect a different profile of hemoglobins in cultures of erythrocytes of patients, incubated with the TAT-b-globin-HA protein. Factors that seem to play an important role include: i) the concentration of the recombinant protein, ii) the time and iii) the temperature of RBCs’ incubation with protein. Additional studies are required to determine if the proposed intracellular transduction of recombinant beta-globin could be an alternative treatment approach for patients with beta-thalassemia. In a complementary study, we cloned the cDNA and produced recombinant TAT-b-globin protein that lacks the HA epitope at the C-terminus. Possibly, this protein may lead to the desired formation of the hemoglobin complex α2(TAT-β-globin)2.