DEREGULATION OF UV-ACTIVATED INFLAMMASOME BY HPV 38 IN HUMAN KERATINOCYTES
Creators: name: CERAOLO, MARIA GRAZIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: I carcinomi spinocellulari (o a cellule squamose) sono le malattie umane pi� comuni che si verificano negli adulti di carnagione chiara e rappresentano circa il 30% dei tumori totali nel mondo. L'eziologia di questo tipo di cancro � multifattoriale, dal momento che fattori genotipici, fenotipici e/ o ambientali possono essere coinvolti nel suo sviluppo. Diversi studi hanno messo in evidenza che l'esposizione ai raggi ultravioletti (UVB) rappresenta un fattore di rischio chiave nello sviluppo del cancro della pelle. Inoltre, gli agenti infettivi potrebbero costituire un ulteriore fattore di rischio, ipotesi sostenuta dal fatto che i pazienti immunocompromessi, quali ad esempio i soggetti che hanno subito un trapianto di organo (OTR), mostrano un rischio pi� elevato di sviluppare carcinomi spinocellulari rispetto agli individui immunocompetenti. Molti agenti infettivi sono in grado di colonizzare la pelle e in particolare un sottogruppo di beta papillomavirus umani a tropismo cutaneo (?-HPV) � considerato il fattore eziologico pi� probabile nello sviluppo del carcinoma a cellule squamose. In particolare, la presenza di ?-HPV � stata riportata nei pazienti affetti da un raro difetto dell?immunit� cellulo-mediata, chiamato epidermodisplasia verruciformis (EV), che causa un?elevata suscettibilit� allo sviluppo del carcinoma a cellule squamose della pelle (SCC). Questo costituisce la prova iniziale secondo la quale gli agenti infettivi, come ?-HPV, rappresenterebbero un potenziale fattore di rischio supplementare nello sviluppo dei tumori spinocellulari. Diversi studi hanno dimostrato le propriet� trasformanti delle oncoproteine virali, E6 e E7, sia in modelli sperimentali in vitro che in vivo. Entrambe le proteine, alterando le funzioni di proteine cellulari, quali p53 e pRb, sono in grado di deregolare diversi eventi cellulari chiave, come il ciclo cellulare, la riparazione del danno del DNA, l'apoptosi e la senescenza. Sulla base di questi risultati in vitro, il nostro gruppo ha generato un modello animale di topi transgenici (Tg) che esprimono le proteine virali E6 e E7 di HPV38 nello strato basale della pelle e nella mucosa epiteliale. Questi topi hanno mostrato un?elevata suscettibilit� alla radiazione UV; infatti, la loro esposizione ai raggi UVB causa lo sviluppo di lesioni attiniche simili alla cheratosi che sono considerati come precursori del carcinoma a cellule squamose della pelle nell'uomo, e alcune settimane dopo hanno sviluppato il carcinoma conclamato. Al contrario, i topi wild-type non hanno sviluppato alcun tipo di lesioni cutanee quando sono stati esposti alla stessa dose di radiazioni UV. Tuttavia, il meccanismo della cooperazione tra UV e HPV38 non � stato ancora chiarito e l?obiettivo di questo lavoro di tesi � stato quello di esaminare i meccanismi molecolari di tale sinergismo. A tale scopo, abbiamo valutato se l'espressione degli oncogeni virali negli animali transgenici potesse alterare l'espressione genica indotta dalle radiazioni UV. L'analisi dell'intero trascrittoma ha rilevato che pi� di 300 geni sono deregolati nei topi transgenici dopo l'esposizione ai raggi UVB, rispetto agli animali wild-type. In particolare, le oncoproteine E6 e E7 sono in grado di deregolare l'espressione di proteine coinvolte nella formazione dei complessi dell?inflammosoma o dei loro effettori a valle, come IL-18. � interessante notare che molti studi condotti su linee cellulari di cheratinociti hanno dimostrato che le radiazioni UV attivano l?inflammosoma, portando alla secrezione di specifiche citochine pro-infiammatorie, come IL-1? e IL-18. I risultati ottenuti tramite RT-qPCR hanno confermato i dati dell?analisi del trascrittoma, mostrando che l'espressione dell?IL-18 � regolata nei topi wild-type dopo l'esposizione a UV, mentre � fortemente inibita nei topi transgenici. Successivamente, utilizzando i cheratinociti umani primari (HPKs) come modello sperimentale, abbiamo analizzato i meccanismi coinvolti nell'espressione dell?IL-18 indotta dai raggi UV, nonch� il ruolo di HPV38 nella deregolazione di questi eventi. I cheratinociti primari umani in seguito all?irradiazione con raggi UV mostravano un aumento dei livelli di espressione di mRNA dell?IL-18 e di altri componenti chiave dei complessi dell?inflammosoma, quali AIM2 e ASC; al contrario, la presenza delle proteine virali E6 e E7 riduceva fortemente l?espressione dell?IL-18 sia a livello di espressione di mRNA che di secrezione. L?utilizzo di cheratinociti esprimenti il gene della telomerasi umano (hTERT), al fine di prolungare il ciclo vitale delle cellule, quale modello sperimentale in vitro alternativo, ha messo in evidenza un elevalto livello basale di mRNA di IL-18 rispetto ai cheratinociti primari; inoltre, la presenza di E6 e E7 svolge un ruolo inibitorio su tale espressione. L?espressione transiente di un vettore contenente il promotore isolato dell?IL-18 clonato davanti al gene reporter della luciferasi, in cheratinociti esprimenti il gene hTERT, ha confermato la capacit� di E6 e E7 di HPV38 di reprimere l'attivit� del promotore dell?Interleuchina 18. Inoltre, l'analisi del promotore dell? IL-18, mediante l?utilizzo del programma bioinformatico TFBIND, ha rivelato la presenza di 15 putativi siti di legame per p53, classicamente attivato dalle radiazioni UV. Eseguendo test di immunoprecipitazione della cromatina (CHIP), abbiamo dimostrato che p53 viene reclutato in due distinte regioni del promotore dell?IL-18, che comprendono quattro elementi responsivi per p53. Le proteine E6 e E7 di HPV38 impediscono in modo efficace il reclutamento di p53 su queste regioni del promotore dell?IL-18. Questi risultati corroborano la nostra ipotesi circa la possibilit� che ?-HPV38 svolga un ruolo importante nell'inibizione della risposta dell?inflammosoma indotta dai raggi UV; in particolare, il virus potrebbe alterare l'espressione genica e la produzione di proteine coinvolte nella formazione del complesso dell?inflammosoma cos� come di citochine specifiche (quali ad esempio IL-18). Altres�, la riduzione della regolazione dell?IL-18 potrebbe compromettere la capacit� dei cheratinociti di reclutare le cellule del sistema immunitario nell'area esposta ai raggi UV, causando un difetto nell'eliminazione delle cellule che hanno subito un danno al DNA. In conclusione, tutte queste alterazioni potrebbero determinare l'accumulo di danni al DNA indotti dall?esposizione ai raggi UV e allo sviluppo del cancro a cellule squamose della pelle.