Διερεύνηση συμπλόκου βαναδίου-κουρκουμίνης ως πιθανός αναστολέας φωσφατασών
Creators: name: Τσαλουχίδου, Βικτώρια Παντελεήμονος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Αλκαλική φωσφατάση
Αναστολή
Βιομεμβράνη
Alkaline phosphatase
Inhibition
Biofilm

description: Το 65% των βακτηριακών και το 80% των χρόνιων λοιμώξεων σχετίζεται με την ανάπτυξη βιομεμβρανών. Η αδυναμία αποτελεσματικής αντιμετώπισής τους λόγω της αντοχής που εμφανίζουν στους μηχανισμούς άμυνας του οργανισμού και στη δράση των αντιμικροβιακών ουσιών έχει οδηγήσει στην αναζήτηση νέων στρατηγικών για την αντιμετώπισή τους. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε συμπλόκου βαναδίου (IV) με βάση το φυσικό προϊόν κουρκουμίνη (V-Cur), ως αναστολέας αλκαλικής φωσφατάσης (ALP). Η μελέτη πραγματοποιήθηκε παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του V-Cur με δύο διαφορετικά υποστρώματα: το αδενοσινο-τριφωσφορικό οξύ (ATP) και το παρα-νιτροφαινυλο-φωσφορικό (pNPP) και αξιολογήθηκε η ανασταλτική του δράση με κινητικές μελέτες. Επιπλέον, διερευνήθηκε ξεχωριστά η επίδραση της κουρκουμίνης, του θειικού βαναδυλίου (VOSO4) και της 2,2´-διπυριδίνης στη δραστικότητα της ALP. Το V-Cur αναστέλλει δοσο-εξαρτώμενα το ένζυμο (IC50= 26.91 ± 1.61 μM με υπόστρωμα το ATP, IC50= 2.42 ±0.12 μM με υπόστρωμα το pNPP) και αποτελεσματικότερα σε σχέση με το VOSO4 (IC50= 68.24 ± 8.27 μΜ με υπόστρωμα το ATP, IC50= 8.24 ± 0.14 μΜ με υπόστρωμα το pNPP). Το V-Cur φαίνεται να εμφανίζει μεικτό τύπο αναστολής και με τα δύο υποστρώματα. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδραση του V-Cur στον σχηματισμό βιομεμβρανών και στη δραστικότητα της ALP του Gram (+) βακτηρίου Staphylococcus aureus και του Gram (-) Escherichia coli. Για τον έλεγχο της επίδρασης του V-Cur στο σχηματισμό βιομεμβράνης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του σωλήνα, η μέθοδος πλάκας καλλιέργειας ιστών καθώς και παρατήρηση της μορφολογίας των βιομεμβρανών μικροσκοπικά, παρουσία και απουσία του V-Cur. Η ανασταλτική δράση του V-Cur στην ανάπτυξη βιομεμβράνης από τα βακτήρια επιβεβαιώθηκε από όλες τις μεθόδους που εφαρμόστηκαν (IC50= 37.86 ± 2.01 μΜ για τη βιομεβράνη S.aureus, IC50= 38.41 ± 1.91 μΜ για τη βιομεμβράνη E.coli). Στο αιώρημα κυττάρων των S. aureus και E. coli παρατηρήθηκε αναστολή της δραστικότητας ALP παρουσία του V-Cur. Ακόμη, εκτιμήθηκε η αντιβακτηριδιακή δράση του V-Cur στα παραπάνω βακτήρια. Έως και την ανώτερη ποσότητα των 200 μg V-Cur που δοκιμάστηκε δεν παρατηρήθηκε αντιβακτηριακή δράση. Από τα αποτελέσματα επιβεβαιώνεται η σημασία της ALP στο σχηματισμό βιομεμβράνης από τα βακτήρια και η πιθανή χρήση του V-Cur ως παράγοντα αναστολής τους, στο πλαίσιο ανεύρεσης καινοτόμων στρατηγικών για την αντιμετώπιση λοιμώξεων που σχετίζονται με βιομεμβράνες
description: Bacterial biofilms are a major health concern, associated with the 80% of medical device related infections and the 65% of all microbial infections. Since bacterial biofilms exhibit unique resistance against human immune system and antibiotics, new molecular targets for anti-biofilm therapeutics are being explored. At the present study, a newly-synthesized Vanadium (IV) – Curcumin complex (V-Cur) has been studied, as a possible inhibitor of alkaline phosphatase (ALP). Two different substrates were employed: adenosine-triphosphate (ATP) and para-nitrophenylphosphate (pNPP) in order to evaluate the inhibitory effect of V-Cur and/or its constituents: curcumin, VOSO4 and 2,2´-bipyridine. V-Cur has been found to inhibit ALP dose-dependently (IC50= 26.91 ± 1.61 μM for ATP, IC50=2.42 ± 0.12 for pNPP). Moreover, V-Cur was more effective inhibitor of ALP activity compared to VOSO4 alone (IC50= 68.24 ± 8.27 μM for ATP, IC50=8.24 ± 0.14 for pNPP). It was also proved that V-Cur exhibits a mixed-type inhibitory behavior at both substrates tested. V-Cur effect on biofilm formation and bacterial ALP activity have also been assayed, for Gram (+) bacteria Staphylococcus aureus and Gram (-) Escherichia coli. For evaluating the ability of biofilm formation at the presence or absence of V-Cur, Tube and Tissue Culture Plate methods were performed, as well as microscopy visualization. The inhibitory efficacy of V-Cur on biofilm formation was verified by all these methods (IC50= 37.86 ± 2.01 μΜ for S.aureus biofilm, IC50= 38.41 ± 1.91 μΜ for E.coli biofilm). As far as the effect of V-Cur’s constituents, uncomplexed curcumin was found to be a potent inhibitor of biofilm formation as well (IC50= 96.79 ± 14.26 μΜ for S.aureus biofilm, IC50= 15.06 ± 1.83 μΜ for E.coli biofilm). At the cell suspension of both bacteria ALP activity was inhibited in the presence of V-Cur. In addition, the antimicrobial effect of V-Cur was investigated using agar well diffusion method, at the aforementioned bacteria. No antibacterial effect was detected up to the highest 200 μg V-Cur tested. Τhe results of this study suggest a specific anti-biofilm activity of V-Cur. Considering that the anti-biofilm effect of the studied compound is not due to inhibition of bacterial growth, and that V-Cur is a potent inhibitor of ALP activity, the involvement of ALP on biofilm formation is indicated. Thus, V-Cur could constitute a potential, innovative agent for treating biofilm-associated infections