title: Cis-regulation of Segmentation Genes in Insects
title: Cis-Regulierung von Segmentierungsgenen in Insekten
Creators: name: Mau, Christine
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: Enhancer
subject: ATAC-seq
subject: Computational Modeling
subject: Tribolium
subject: Drosophila
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 576 Genetik und Evolution

description: The analysis of cis-regulatory elements, specifically of enhancers, is of major importance to get a deeper understanding of gene regulation in developmental processes. In this work, I focused on the characterization of gene regulation during development. To that end, I used gap gene and pair-rule gene regulation during anterior-posterior (AP) patterning of the red flour beetle Tribolium castaneum (Tribolium) and the fruit fly Drosophila melanogaster (Drosophila) as model systems for developmental gene regulation. I aimed to answer the following three questions: (1) How could the same genes be used in mediating different modes of embryonic patterning? Drosophila possesses a highly derived mode of AP patterning, where expression domains of patterning genes arise more-or-less simultaneously at their final positions within the AP axis of the embryo. In contrast, other insects like Tribolium employ a more ancestral mode of AP patterning using sequential waves of gene expression. Although Drosophila and Tribolium exhibit different modes of AP patterning (simultaneous patterning vs sequential patterning), they use a similar set of segmentation genes. I applied a computational modeling approach to understand how the same genes can be used in different patterning modes without changing the underlying gene regulatory network. I could show that differential initialization of the gap gene cascade explains the evolution of sequential (Tribolium-like) to simultaneous (Drosophila-like) patterning. In the case of Drosophila and Tribolium, an anterior-to-posterior protein gradient of Hunchback (Hb) differentially initializes the gap gene cascade (steep initial Hb gradient in Drosophila vs shallow initial Hb gradient in Tribolium). The results of this study are already published (Rudolf H*, Zellner C*, El-Sherif E. “Speeding up anterior-posterior patterning of insects by differential initialization of the gap gene cascade.” Dev Biol. 2020 Apr 1;460(1):20-31. doi: 10.1016/j.ydbio.2019.04.015. Epub 2019 May 7. *Equal contribution). (2) How are genes regulated at the molecular level to induce waves of gene expression? Patterning by waves of gene expression seems to be a widespread mechanism in development. Such gene expression waves are initiated as a broad expression domain, that propagate, shrink while propagating, and then stabilize as defined expression domains. Therefore, gene regulation switches from a dynamic behavior (initialization of gene expression) to a static behavior (stabilization of gene expression). In a recent study (Zhu et al., 2017; El-Sherif lab), this behavior was explained by an ´Enhancer Switching Model´ implementing a set of dynamic enhancers that initialize gene expression and static enhancers that stabilize gene expression. In this work, I identify such enhancers using computational predictions and genomics data in Tribolium. Activity dynamics of putative enhancer regions were examined using reporter assays (in situ and in live Tribolium embryos using the MS2-MCP system) and time- and tissue-specific ATAC-seq data. The obtained results are in line with the ´enhancer switching´ model. (3) What is the function of eRNA transcription? Studies using genomics approaches revealed that transcription takes place not only at gene bodies, but also at enhancer regions, giving rise to non-coding transcripts termed enhancer RNAs (eRNAs). The results of cell culture studies indicated a role of eRNA transcription in transcriptional gene regulation. However, genomic approaches are bulk assays that average the behavior of thousands or millions of cells and cell culture studies might give a rather artificial picture of the function of eRNA transcription (especially during development). Here I analyzed eRNA transcription using an imaging-based approach in whole Drosophila embryos. I could demonstrate that eRNAs originate from promoter-like structures (I term ´e-promoters´). Using transgenic assay approaches in which e-promoters are blocked using insulators, elucidated a role of eRNA transcription in driving robust mRNA transcription. Based on these results, I argue that eRNA transcription creates a stock of RNA polymerase II (RNA pol II) molecules around the gene locus. This RNA pol II stock seems to be used by the gene promoter to support robust mRNA transcription. In consequence, the act of eRNA transcription rather than, or in addition to, eRNA transcripts themselves might be functionally important in transcriptional regulation of segmentation genes in the early Drosophila embryo.
description: Die Analyse von cis-regulatorischen Elementen insbesondere von Enhancern ist von großer Bedeutung, um ein tieferes Verständnis von Genregulation in Entwicklungsprozessen zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich mich auf die Charakterisierung von Genregulierung während der Entwicklung fokussiert. Zu diesem Zweck habe ich Lücken- und Paarregelgenregulierung beteiligt an der anterior-posterioren (AP) Musterbildung in dem roten Mehlkäfer Tribolium castaneum (Tribolium) und der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (Drosophila) als Modellsystem für Genregulierung während der Entwicklung verwendet. In diesem Zusammenhang zielte ich darauf ab, die folgenden drei Fragen zu beantwortet: (1) Wie können die gleichen Gene verschiedene Arten der embryonalen Musterbildung vermitteln? Drosophila weist einen höchst abgeleiteten Mechanismus der AP Musterbildung auf, bei dem Genexpressionsdomänen mehr oder weniger simultan an ihrer finalen Position innerhalb der AP Achse im Embryo entstehen. Im Gegensatz dazu nutzen andere Insekten wie Tribolium eine evolutionär ältere Weise der AP Musterbildung mittels sequenziellen Genexpressionswellen. Trotz der Tatsache einer scheinbar unterschiedlichen Musterbildungsweise zwischen Drosophila und Tribolium (simultane Musterbildung vs. sequenzielle Musterbildung) verwenden sie einen ähnlichen Satz an Segmentierungsgenen. Ich habe einen computer-gestützten Modellierungsansatz angewandt, um zu verstehen, wie die gleichen Gene in unterschiedlichen Musterbildungsarten verwendet werden können, ohne das zugrundeliegende genregulatorische Netzwerk zu verändern. Ich konnte zeigen, dass die differenzielle Initialisierung der Lückengenkaskade die Evolution von sequenzieller (Tribolium-artig) zu simultaner Musterbildung (Drosophila-artig) erklärt. Im Fall von Drosophila und Tribolium wird die Lückengenkaskade differentiell von einem anterior-posterioren Hunchback (Hb) Proteingradienten initialisiert (steiler initialer Hb Gradient in Drosophila vs. flacher initialer Hb Gradient in Tribolium). Die Ergebnisse dieser Untersuchung wurden bereits publiziert (Rudolf H*, Zellner C*, El-Sherif E. “Speeding up anterior-posterior patterning of insects by differential initialization of the gap gene cascade.” Dev Biol. 2020 Apr 1;460(1):20-31. doi: 10.1016/j.ydbio.2019.04.015. Epub 2019 May 7. *Gleicher Beitrag). (2) Wie sind Gene auf der molekularen Ebene reguliert, um Genexpressionswellen zu induzieren? Musterbildung mittels Genexpressionswellen scheint ein genereller Mechanismus in der Entwicklung zu sein. Diese Genexpressionswellen werden als breite Expressionsdomänen initialisiert, welche propagieren, sich dabei verschmälern und als definierte Expressionsdomänen stabilisieren. Daher wechselt die Genregulierung von einem dynamischen Verhalten (Initialisierung von Genexpression) zu einem statischen Verhalten (Stabilisierung von Genexpression). In einer kürzlich veröffentlichten Studie (Zhu et al., 2017; El-Sherif lab) wurde dieses Verhalten mittels eines Enhancer Switching Modells erklärt unter Implementierung eines Satzes von dynamischen Enhancern, welche Genexpression initialisieren, und statischen Enhancern, welche Genexpression stabilisieren. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich solche Enhancer unter zu Hilfenahme von computer-gestützten Vorhersagemethoden und genomischen Daten in Tribolium identifiziert. Aktivitätsdynamiken der putative Enhancerregionen wurden mittels Reporterassays (in situ und in lebenden Tribolium Embryonen mittels des MS2-MCP Systems) und zeit- und gewebespezifischen ATAC-seq Daten analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse stimmen mit der Idee des „Enhancer Switching“ Modells überein. (3) Was ist die Funktion von eRNA Transkription? Studien mit genomischen Untersuchungsansätzen konnten zeigen, dass Transkription nicht nur auf den Genkörper beschränkt ist, sondern dass Enhancerregionen nicht-kodierende Transkripte hervorbringen, welche Enhancer RNAs (eRNAs) genannt werden. Ergebnisse aus Zellkulturstudien wiesen darauf hin, dass eRNA Transkription eine Rolle bei der transkriptionellen Genregulierung spielen könnte. Jedoch sind genomische Untersuchungsansätze Bulk-Assays, welcher das Verhalten von tausenden oder Millionen von Zellen mitteln und Zellkulturstudien könnten lediglich ein artifizielles Bild der Funktion der Enhancertranskription liefern (vor allem während der Entwicklung). Hier habe ich eRNA Transkription unter Verwendung eines Mikroskopie-basierten Verfahrens in ganzen Drosophila Embryonen untersucht. Ich konnte zeigen, dass eRNAs an Promotor-artigen Strukturen (welche ich als „e-Promotoren“ bezeichne) entstehen. Transgene Assaytechniken, bei denen e-Promotoren mittels Insulatoren geblockt wurden, zeigten, dass eRNA Transkription bei der Regulierung robuster mRNA Transkription beteiligt ist. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen argumentiere ich, dass eRNA Transkription einen Pool an RNA Polymerase II (RNA pol II) Molekülen am Genlokus generiert. Dieser RNA pol II Pool scheint vom Genpromoter genutzt zu werden, um robuste mRNA Transkription zu unterstützen. Daraus resultiert, dass der Vorgang der eRNA Transkription eher als oder zusätzlich zu den eRNA Transkripten selbst funktional von Bedeutung sein könnte bei der transkriptionellen Regulierung von Segmentierungsgenen im frühen Drosophila Embryo.