Επίδραση των CD34+ΜPs από ομφαλοπλακουντικά μοσχεύματα στην γονιδιακή και πρωτεινική ανάλυση αποπτωτικών παραγόντων στις λευχαιμικές σειρές HL60 και MOTL4
Creators: name: Κατανά, Ζωή Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Oμφαλιοπλακουντικό αίμα
Μικροσωμάτια
Απόπτωση
ΗL60
ΜΟLT4
Umbilical Cord Blood
Microparticles
Apoptosis

description: Το ομφαλιοπλακουντικό αίμα (UCB) αποτελεί πηγή βλαστικών και προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και χρησιμοποιείται ως μια εναλλακτική πηγή μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων. Από την κυτταροπλασματική μεμβράνη των κυττάρων εκβλαστάνουν μικρά κυστίδια που ονομάζονται μικροσωμάτια (MPs), που μπορεί να φέρουν αντιγόνο επιφάνειας. Προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι UCB περιέχουν MPs που φέρουν το αντιγόνο των προγονικών βλαστοκυττάρων CD34. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της δράσης των CD34+MPs στην βιωσιμότητα των κυττάρων και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση στις λευχαιμικές κυτταρικές σειρές HL60,MOLT4 και σε μονοπύρηνα ομφαλιοπλακουντικού αίματος. Για τον σκοπό αυτό, κύτταρα HL60 ή MOLT4 καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία (oμάδα ελέγχου) CD34+ MPs. Μετά την επώαση μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων, απομονώθηκε το RNA, μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA και πραγματοποιήθηκε PCR για τα γονίδια BCL-2, FAS, CASPASE-3, BAX και GAPDH. Ο αριθμός των κυττάρων HL60 μετά την επώαση με CD34+MPs μειώθηκε σημαντικά μετά από 24 ώρες. Μελέτη της έκφρασης των γονιδίων BCL-2,FAS,CASPASE-3,BAX έδειξε μείωση του αντιαποπτωτικού BCL2, σταθερά επίπεδα του γονιδίου BAX ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των αποπτωτικών FAS και caspase 3. Αντίθετα στην κυτταρική σειρά MOLT4 η έκφραση του γονιδίου caspase 3 δεν επηρεάστηκε από την παρουσία των CD34+MPs. Πρωτεωμική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με την χρήση του Proteome ProfilerTM Array Human Apoptosis Array Kit και έδειξε ότι η προσθήκη CD34+MPs για 1 ημέρα επάγει την έκφραση των πρωτεϊνών που προαναφέρθηκαν. Μετά από 3 ημέρες επώασης εκφράζονται οι προκασπάση 3 και η καταλάση στα HL60 ενώ στα ΜΝC εκφράζεται μόνο η καταλάση. Συμπερασματικά, τα CD34+MPs παρουσιάζουν διακριτή έκφραση των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην απόπτωση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και παίζουν τόσο αποπτωτικό όσο και αντιαποπτωτικό ρόλο συμμετέχοντας είτε μέσω του ενδογενούς ή μέσω του εξωγενούς μονοπατιού απόπτωσης
description: Umbilical Cord Blood (UCB) is a source of hematopoietic stem and progenitor cells and it can be used as an alternative source for hematopoietic cell transplantation. Small vesicles called microparticles (MPs) are shed from the cytoplasmic membrane of these cells. Previous studies have shown that UCB contains ΜPs that express the surface marker CD34, which is characteristic for progenitor cells. The aim of this study is to investigate the role of CD34+ MPs on cell viability and the expression of genes related to apoptosis in the leukemic cell lines HL60 and MOLT4 and in mononuclear cells of UCB. For this purpose, MOLT-4 and HL-60 cells were co-cultured with CD34+ MPs from umbilical cord blood units, control cultures were used as well. After incubation, number of cells was accessed, RNA was isolated and reverse transcribed into cDNA and PCR was performed for the BCL-2, FAS, CASPASE-3, BAX and GAPDH genes. The number of HL60 cells was decreased significantly after co-culture with CD34+ MPs for 24 h. The study of the expression of BCL-2, FAS, CASPASE-3, BAX genes showed a decrease in the anti-apoptotic BCL2, stable levels of the BAX gene and an increase in the expression of the apoptotic genes FAS and caspase 3. In contrast, in MOLT4 cell line the levels of caspase 3 were not affected by the presence of CD34+ MPs. Protein analysis was performed using Proteome ProfilerTM Array Human Apoptosis Array Kit and revealed that co-culture with CD34+ MPs induced the expression of the genes discussed above. After 3 days procaspase 3 and catalase were expressed in HL60 cells while in ΜΝCs only catalase was expressed. In conclusion, CD34+ MPs caused a distinct expression of proteins involved in apoptosis in different cell types and play both an apoptotic and anti-apoptotic roles through the expression of proteins involved in extrinsic and extrinsic apoptotic pathway