Καθαρισμός βιοτεχνολογικά παραγόμενων ΤΑΤ-σφαιρινών και αξιολόγηση της δράσης τους μετά από την ενδοκυττάρια μεταγωγή τους σε ερυθροκύτταρα
Creators: name: Λάσπα, Δήμητρα Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Πεπτίδια Μεταγωγής
ΤΑΤ-α-σφαιρίνη
Θαλασσαιμία
PTDs / CPPs
TAT-α-globin
Thalassemia

description: Η α- και β-θαλασσαιμία αποτελούν δύο από τις πιο συνηθισμένες μονογονιδιακές διαταραχές στον άνθρωπο και προκύπτουν από μειωμένη, μη επαρκή ή καθόλου έκφραση της α- ή της β-σφαιρίνης, αντίστοιχα, με συνέπειανα δημιουργείται μια ανισορροπία τωνα-/β-σφαιρινικών αλυσίδωντης αιμοσφαιρίνης των ενηλίκων (HbA: α2β2). Η κύρια αντιμετώπιση της α- και β-θαλασσαιμίας περιλαμβάνει: α) μεταγγίσεις αίματος σε συνδυασμό με αποσιδήρωση, β) μεταμόσχευση μυελού των οστών, σε συγκεκριμένες περιπτώσεις, ενώ γ) τα τελευταία χρόνια δοκιμάζoνται και νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Μια εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση είναι η πρωτεϊνική θεραπεία μέσω της τεχνολογίας της Πρωτεϊνικής Μεταγωγής (ProteinTransductionDomain, PTDtechnology), με τη χρήση των πεπτιδίων μεταγωγής (CellPenetratingPeptides, CPPs), που έχουν τη δυνατότητα να διαπερνούν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες. Στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΑΠΘπροτείνεται η εισαγωγή της βιοτεχνολογικά παραγόμενης φυσιολογικής ανθρώπινης α- και β- σφαιρίνης σε ερυθροκύτταρα θαλασσαιμικών ατόμων μέσω της σύντηξης με το πεπτίδιο ΤΑΤ, το πρωτότυπο και πιο συχνά χρησιμοποιούμενο CPP. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένηπρωτεΐνη ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ διαπερνά τις μεμβράνες του κυττάρου, εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα των Κ-562 κυττάρων, τα οποία στερούνται της ώριμης β-σφαιρίνης, και σχηματίζει σύμπλοκο με την ενδογενή α-τύπου σφαιρίνη. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία έχει ως σκοπό: α) την παραγωγή και τον εμπλουτισμό-καθαρισμό τριών ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών που είχαν ήδη κλωνοποιηθεί από μέλη του εργαστηρίου Φαρμακολογίας, της ΤΑΤ-β- σφαιρίνης-ΗΑ, της ΤΑΤ-α-σφαιρίνης-ΗΑ και της α-σφαιρίνης-ΗΑ, η οποία στερείται του πεπτιδίου ΤΑΤ, και β) τον έλεγχο της ενδοκυττάριας μεταγωγής τους σε ερυθροκύτταρα. Τα αποτελέσματα από τα πειράματα που διενεργήθηκαν κατά την εκπόνηση της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας υποδεικνύουν : α) τον επιτυχημένο εμπλουτισμό-καθαρισμό των βιοτεχνολογικά παραγόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ, ΤΑΤ-α-σφαιρίνης-ΗΑ και της α-σφαιρίνης-ΗΑ,αλλά με μικρή απόδοση, β) την επιτυχή ενδοκυττάρια μεταφορά των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ και ΤΑΤ-α-σφαιρίνης-ΗΑ σε ερυθροκύτταρα και γ) τη διαπίστωση ότι η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη α-σφαιρίνη-ΗΑ δεν εισέρχεται στα ερυθροκύτταρα, αφού στερείται του πεπτιδίου ΤΑΤ, όπως και αναμενόταν. Απώτερος στόχος της ερευνητικής αυτής προσπάθειας είναι η ανάπτυξη μιας νέας πιθανής θεραπευτικής προσέγγισης ασθενών με α- και β-θαλασσαιμία.
description: α- and β-thalassemia are two of the most common monogenic disorders in man and result from decreased, inadequate or no expression of α- or β-globin, respectively, resulting in imbalanceof α-/β-globin chains of adult hemoglobin (HbA: α2β2). The main treatment of α- and β-thalassemia includes: a) blood transfusions in combination with chelation, b) bone marrow transplantation in specific cases,while c) new therapeutic approaches have been tested in recent years.An alternative therapeutic approach is the protein therapy through Protein Transduction Domain (PTD) technology,usingthe Cell Penetrating Peptides (CPPs), which have the potential to permeate almost all biological membranes. In the Pharmacology Laboratory of the School of Pharmacy (Aristotle University of Thessaloniki) it is proposed the production and transduction of the recombinant human α- and β-globin, fused with the TAT peptide (the prototype and most commonly used CPP), into the erythrocytes of thalassemic individuals. Experiments performed in our laboratory showed that the recombinant TAT-β-globin-HA protein penetrates the membranes of the cell, enters the cytoplasm of the K-562 cells, which lack mature β-globin, and complex with the endogenous native α-like globin. This post-graduate thesis aims at: a) the production and enrichment-purification of three recombinant proteins, already cloned by members of the Pharmacology Laboratory, TAT-β-globin-HA, TAT-α-globin-HA as well as theα-globin-HA, which lacks the TAT peptideand b) the evaluation of their intracellular transduction into erythrocytes. The results from the experiments carried out during the elaboration of this diploma thesis indicate: a) the successful purification of the biotechnologically produced recombinant TAT-β-globin-HA, TAT-α-globin-HA and α-globin-HA proteins, but with limited yield, b) successful intracellular transduction of the recombinant TAT-β-globin-HA and TAT-α-globin-HA proteins into erythrocytes, c) the finding that the recombinant α-globin-HA protein does not enter the erythrocytes, as expected, since it lacks the TAT peptide. The ultimate goal of this research effort is to develop a new possible alternative therapeutic approach for patients with α- and β-thalassemia.