title: Characterization immuninhibitory properties of SIGIRR and the production of monoclonal antibodies against human SIGIRR
title: Charakterisierung immuninhibitorischer Eigenschaften von SIGIRR und die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR
Creators: name: Kumler, Jasmin Ute
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Immunologie
Toll-like-Rezeptoren
Monoklonaler Antikörper
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
SIGIRR
IL-1R8 , TIR8

description: The first part of this thesis
      focuses on the immuninhitory properties of SIGIRR in the
      stimulation of primary murine cells. The second part
      describes the production of monoclonal antibodies against
      human SIGIRR. The central question of this theses was to
      distinguish the role of SIGIRR regarding the immunregulation
      of murine spleen cells, B-cells and myeloid Dendritic Cells
      via toll-like receptors and the circumstances under which
      those would come to pass. Monoclonal antibodies against human
      SIGIRR were to be raised, characterised and used in
      immunfluorescence-aided expression studies on SIGIRR. For
      this purpose, for one, different stimuli were used on
      wildtype versus SIGIRR-knockout mouce cells comparing the
      resulting IL-6 reaction. Secondly, SIGIRR-knockout mice were
      inoculated with SIGIRR and hybridoma cells producing
      SIGIRR-specific antibodies were generated. Antibodies were
      then tested for usage in ELISA, Western Blot and FACS. In
      violation of the original hypotheses, the stimulation
      experiments with different TLG-ligands showed not differences
      in the IL-6 production between wildtype or SIGIRR-knockout in
      spleen cells, B-cells or myeloid Dendritic Cells. Hence no
      immunregulative influence of SIGIRR on TLRsignaling was
      evident in this experimental environment, though most current
      studies would suggest otherwise. Solely preliminary tests
      with MACS-separated CD11c+ mDCs were in favour of the stated
      theses. The raising of antibodies resulted in SIGIRR-specific
      antibodies with good binding-properties in ELISA and Western
      blot. FACS results showed SIGIRR on the surface of HEK cells
      transfected with SIGIRR and signalpeptide. The results
      obtained in the stimulation experiments deviated remarkably
      from the stated thesis and current publications. Therefore
      the reflection of probable causes as discussed here might be
      essential for future endeavour. Though some results could be
      achieved from SIGIRR-specific antibodies, raising
      SIGIRR-specific antibodies was limited by the ability of
      hybridoma cells to produce antibodies in continous culture
      and stable hybridoma cell clones could not be obtained. In
      future stimulation experiments with SIGIRR-knockout mice the
      use of MACS-separated CD11c positive myeloid Dendritic Cells
      seems to be most promising. The raising of SIGIRRspecific
      antibodies in the laboratory is a time-consuming but
      promising method, if early subcloning is respected, but
      purchasing antibodies on the market should also be taken in
      consideration. SIGIRR-specific antibodies could be used e.g.
      via fluorescence-marking in studies on the expressionpattern
      of SIGIRR in different cell lines.
description: Im ersten Teil der vorliegenden
      Arbeit wurden immuninhibitorische Eigenschaften SIGIRRs in
      der Stimulation primärer muriner Zellen untersucht. Der
      zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der
      Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes SIGIRR.
      Fragestellung der Arbeit war es, eine Beteiligung SIGIRRs an
      der Immunregulation muriner Milzzellen, B-Zellen und
      myeloiden dendritischen Zellen in Bezug auf unterschiedliche
      Tolllike Rezeptoren aufzuzeigen und zu charakterisieren, wann
      und ggf. durch welche Mechanismen eine solche zustande kommt.
      Hergestellte und auf ihre Eigenschaften hin untersuchte
      monoklonale Antikörper gegen humanes SIGIRR sollten genutzt
      werden um die Expression SIGIRRs mithilfe Immunfluoreszenz zu
      untersuchen. Dazu wurden zum Einen aus der Maus isolierte
      Zellen von Wildtypmäusen im Vergleich zu
      SIGIRR-Knockoutmäusen stimuliert und in ihrem Reaktionsmuster
      verglichen. Zum Anderen wurden, nach Immunisierung von
      SIGIRR-Knockoutmäusen mit SIGIRR, Hybridoma-Zellen generiert.
      Diese wurden auf die Produktion brauchbarer Antikörper
      getestet und die resultierenden Antikörper auf ihre
      Anwendbarkeit in ELISA, Westernblot und FACS untersucht. In
      den Stimulationsexperimenten zeigt sich entgegen der
      Hypothese keine Unterschiede zwischen WT-Mäusen und
      SIGIRRKnockoutmäusen bei der Stimulation mit
      unterschiedlichen LPS Liganden für Milzzellen, B-Zellen und
      myeloide dendritische Zellen. Eine Einfluss SIGIRRs auf die
      Immunregulation dieser Zellen konnte damit, entgegen der
      Aussage einschlägiger Literatur, unter den hier angewandten
      Bedingungen nicht nachgewiesen werden. Lediglich
      Vorexperimente mit MACS separierten CD11c+ konnten Hinweise
      auf einen solchen Sachverhalt liefern. Die
      Antikörperherstellung lieferte spezifische Antikörper gegen
      humanes SIGIRR mit guten Bindungseigenschaften in ELISA und
      Westernblot. Im FACS konnte in der Oberflächenfärbung SIGIRR
      an der Oberfläche von mit SIGIRR und Signalpeptid
      transfizierten HEK-Zellen nachgewiesen werden. Damit ist in
      den Stimulationsexperimenten insbesondere die Abweichung von
      der gestellten Hypothese und den meisten bisherigen
      Publikationen bemerkenswert, wodurch die Diskussion möglicher
      Ursachen, wie sie in der vorliegenden Arbeit unternommen
      wird, entscheidend für mögliche zukünftige Ansätze ist.
      Problematisch in der Antikörperherstellung zeigte sich die in
      fortlaufender Kultur beständig nachlassende
      Antikörperproduktion, bzw. eine verminderte Spezifität der
      produzierten Antikörper. Es konnten mit den bereits
      gewonnenen Antikörpern jedoch einige Aufschlüsse zu SIGIRR
      erzielt werden. In zukünftigen Experimenten bietet sich die
      Verwendung von MACS separierten CD11c positiver dendritischer
      Zellen in Stimulationsexperimenten mit SIGIRR-Knockoutmäusen
      an. Die laborinterne Herstellung SIGIRR-spezifischer
      Antikörper ist eine zeitintensive aber erfolgversprechende
      Methode, wenn ausreichend früh Subklonierungen durchgeführt
      werden, muss aber gegen die Möglichkeit eines käuflichen
      Erwerbs abgewogen werden. Mit SIGIRR-spezifischen Antikörpern
      könnte insbesondere, z.B. mit fluroeszenzmarkierten
      Antikörpern, das Expressionsmuster von SIGIRR in Zellen
      untersucht werden.