title: Functional analysis of Ustilago maydis effector protein Tin3 in gene cluster 19A
title: Funktionelle Analyse des Ustilago maydis Effektorproteins Tin3 im Gencluster 19A
Creators: name: Neidig, Nina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Effektor, Autophagie
Ustilago zeae
effector, autophagy
Mais , Proteaseinhibitor
plant pathogen
Biowissenschaften, Biologie
Pflanzenpathogen

description: U. maydis ist ein pilzliches
      Pflanzenpathogen, das in Mais den sogenannten Maisbeulenbrand
      auslöst. Die pathogene Entwicklung aller Brandpilze ist an
      die sexuelle Entwicklung gekoppelt, die durch die Fusion
      zweier haploider Zellen mit unterschiedlichen Paarungstypen
      initiiert wird (Bölker et al., 1992). Dies führt zur Bildung
      eines dikaryotischen Filaments, welches in der Lage ist,
      Pflanzenzellen mittels spezieller Infektionsstrukturen, den
      Appressorien, zu penetrieren (Feldbrügge et al., 2004).
      Während dieses Prozesses wird die Plasmamembran des Wirtes
      eingestülpt und umhüllt die Pilzhyphen. Dies erzeugt eine
      spezielle Interaktionszone zwischen Pflanze und Pilz.
      Biotrophe Pathogene wie U. maydis sind vom Überleben der
      Wirtspflanze abhängig. Aus diesem Grund ist es essenziell für
      das Pathogen Erkennung durch das Pflanzenimmunsystem zu
      vermeiden oder zu unterdrücken, um eine kompatible
      Interaktion zu etablieren (Doehlemann et al., 2008b). Um
      diese biotrophe Interaktion mit seiner Wirtspflanze
      aufzubauen ist U. maydis auf eine Vielzahl von sekretierten
      Proteinen angewiesen. In dieser Arbeit wurde der U. maydis
      Effektor Tin3 charakterisiert, der signifikant an der
      Tumorbildung beteiligt ist und der in Hefe
      Zwei-Hybrid-Analysen mit einer pflanzlichen Cysteinprotease
      und dem pflanzlichen Autophagieprotein Beclin1 interagiert
      (T. Brefort, pers. Mitteilung). Expressionsstudien zeigten,
      dass tin3 stark und spezifisch während der biotrophen Phase
      hochreguliert wird. Funktionelle Studien offenbarten eine
      duale Funktion von Tin3, die über die Interaktion mit zwei
      Maisproteinen vollzogen wird. Nach der Sekretion in die
      apoplastische Interaktionszone inhibiert Tin3 sekretierte
      Mais Cysteinproteasen. In vitro Protease-Aktivitätstests in
      Kombination mit in vivo Studien zeigen, dass Tin3 in der Lage
      ist die Cysteinprotease Mir3 und nahe verwandte Proteasen
      durch Bindung im aktiven Zentrum zu inhibieren. Die
      biologische Relevanz der roteaseinhibition durch Tin3 zeigte
      sich in Versuchen, in denen es gelang den Virulenzphänotyp
      der tin3 Mutante partiell durch Proteaseinhibitoren zu
      erreichen. Des Weiteren konnte eine zweite Funktion von Tin3
      als Autophagie-Repressor postuliert werden, die durch
      Hefe-Assays und in planta Autophagosomen-Färbungen entdeckt
      wurde. Die Expression von vier pflanzlichen Autophagiegenen
      war nach Deletion von tin3 induziert, ein Befund der die
      Inhibition der Autophagie durch Tin3 unterstützte. H2O2
      Akkumulationen in Infektionen mit der tin3 Deletionsmutante
      deuten an, dass der Tin3 Effektor pflanzliche
      Abwehrreaktionen durch seine duale Funktion aktiv unterdrückt
      und deshalb für die Etablierung der Biotrophie benötigt
      wird.
description: Ustilago maydis is a fungal plant
      pathogen, which causes smut disease in maize. The pathogenic
      development of all smut fungi is coupled to sexual
      development, which is initiated by the fusion of two
      compatible haploid cells with different mating types (Bölker
      et al., 1992). This leads to the formation of a dicaryotic
      filament that is able to penetrate plant cells with a special
      infection structure called appressorium (Feldbrügge et al.,
      2004). During this process the host plasma membrane
      invaginates and encases the fungal hyphae. A special
      interacting zone between plant and fungus is created.
      Biotrophic pathogens like U. maydis are dependent on the
      survival of their host plants. Therefore, it is essential for
      the pathogen to avoid or suppress recognition by the plant
      immune system in order to establish a compatible interaction
      (Doehlemann et al., 2008b). To accomplish this interaction
      with its host plant U. maydis depends on a variety of novel
      secreted proteins. In this study the U. maydis effector Tin3
      was characterised that contributes significantly to tumor
      formation and interacts with a plant cysteine protease and
      the plant autophagy protein Beclin1 in yeast
      two-hybrid-assays. Expression studies showed that tin3 is
      highly and specificly upregulated during the biotrophic
      phase. Functional studies revealed a dual function of Tin3
      via interaction with two maize proteins. After secretion of
      Tin3 into the apoplastic interaction zone it inhibits defense
      related secreted maize cysteine proteases. In vitro protease
      activity assays combined with in vivo studies showed that
      Tin3 is able to inhibit cysteine protease Mir3 and closely
      related proteases via binding to the active site. The
      biological relevance of this function was shown in
      experiments that were able to partially complement the
      virulence phenotype of the tin3 mutant by protease
      inhibitors. Furthermore, a second function of Tin3 as
      autophagy repressor could be postulated, which was revealed
      by a yeast assay and in planta stainings of autophagosomes.
      Expression of four plant autophagy genes was induced after
      deletion of tin3, a finding that supports inhibition of
      autophagy by Tin3. H2O2 accumulations in infections with the
      tin3 deletion mutant indicated that the Tin3 effector
      actively participates in suppression of plant defense
      responses via its dual function and is therefore needed
      during the establishment of biotrophy.