title: Entwicklung, Synthese und Charakterisierung niedermolekularer Liganden G-Protein gekoppelter Rezeptoren
title: Development, synthesis and characterization of small-molecule ligands of G protein-coupled receptors
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Neumann, Sebastian (M. Sc.)
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
chemistry
Organische Chemie
medicinal chemistry, organic chemistry
Synthese
Medizinische Chemie
GPCR
Pharmazie
Arzneistoffentwicklung

description: Als eine der größten Proteinsuperfamilien ist die Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bekannt, die als Target für etwa 30 % der zugelassenen Arzneistoffe gilt. GPCRs können durch eine Vielzahl extrazellulärer Stimuli aktiviert werden. Aufgrund ihrer vielfältigen Signaltransduktion werden sie mit vielen Krankheiten wie Krebs, Entzündungen, Immunerkrankungen und dem metabolischen Syndrom in Verbindung gebracht. Sie bestehen aus einer Sieben-Transmembrandomäne mit einer orthosterischen Bindungstasche im extrazellulären Bereich und einer intrazellulären G-Protein-Bindungstasche. Der Aufbau der orthosterischen Bindetasche ist häufig über verschiedene Rezeptorsubtypen konserviert, daher ist die Entwicklung selektiver Wirkstoffe oftmals herausfordernd. Eine mögliche Strategie zur Entwicklung von Wirkstoffen mit erhöhter Rezeptorselektivität und somit geringerem Nebenwirkungspotenzial ist die Identifizierung und Adressierung alternativer Bindestellen. Im Rahmen des GLUE-Projekts (G-protein-coupled receptor ligands of underexplored epitopes) wurde diese Strategie in der vorliegenden Arbeit verfolgt, wobei die pharmakologisch relevanten Rezeptorfamilien der Endothelin-Rezeptoren (ETRs) und der freien Fettsäure-Rezeptoren (FFARs) sowie der Orphan-Rezeptor GPRC5b als Targets dienten.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der peptidische ETBR-Ligand 4Ala-ET-1 mittels automatisierter Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Anschließend wurde der N-Terminus des resultierenden Peptids über einen Linker an Biotin gekoppelt, um einen geeigneten Liganden für die Proteinaufreinigung des ETBR durch Affinitätschromatographie zu erhalten. Außerdem wurden ein fluoreszenzmarkiertes und drei verkürzte 4Ala ET 1-Derivate synthetisiert. Nach Abschluss der Synthese wurden die erhaltenen Verbindungen an die kooperierenden Arbeitsgruppen des GLUE-Projekts für weitere Untersuchungen übergeben. 
Darüber hinaus wurde ein fluoreszenzmarkierter FFAR2-Ligand, der als tool-compound für einen BRET-Bindungsassay dienen soll, nach einer leicht modifizierten 11-stufigen Literaturvorschrift synthetisiert. Außerdem wurde die Grundstruktur des FFAR2-Liganden über einen Ethylenglykol-Linker mit Biotin verknüpft, um ein analoges biotinyliertes Derivat für diesen Zielrezeptor zu erhalten.
Im dritten Teil der Arbeit wurden mögliche allosterische Liganden auf der Grundlage von Docking-Studien von der Arbeitsgruppe von Prof. Kolb bewertet. Die vielversprechendsten Liganden wurden für die Synthese ausgewählt, die dann geplant und durchgeführt wurde. Alle synthetisierten Verbindungen wurden analytisch charakterisiert. Demnach wurden Liganden aus drei ETBR-Docking-Studien hergestellt, wobei zwei Kampagnen die intrazelluläre G-Protein-Bindungstasche und eine die known site 5 adressierten. Diese Docking-Studien dienten zur Auswahl von sieben Zielverbindungen, auf deren Grundlage insgesamt 41 Derivate synthetisiert wurden. Darüber hinaus wurden zwei bekannte allosterische GPCR-Modulatoren und sechs Derivate davon synthetisiert. Anschließend wurden alle Verbindungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Bünemann auf deren biologische Aktivität in einem FRET-basierten G-Protein-Bindungs- und Rezeptorsensor-Assay am ETBR in einer Konzentration von 100 µM getestet. Darüber hinaus wurden ausgewählte Verbindungen an dem strukturell verwandten GLUE-Target FFAR3 mit analogen Assays untersucht. Bei dieser in-vitro-Charakterisierung konnte für keine der synthetisierten Zielverbindungen eine biologische Aktivität festgestellt werden, weder am ETBR noch am FFAR3.
In einer weiteren Docking-Studie wurde die extrazelluläre Bindungstasche des Orphan-Rezeptors GPRC5b untersucht. Auf der Grundlage der Docking-Ergebnisse wurden zwei Zielverbindungen und 42 Derivate synthetisiert und analytisch charakterisiert. Anschließend sollten diese Zielverbindungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Bünemann in vitro auf ihre biologische Aktivität am GPRC5b untersucht werden. Dies ist jedoch aufgrund des Fehlens eines etablierten Testsystems noch nicht möglich. Daher steht die biologische Charakterisierung noch aus.