Ρόλος μιτοχονδριακών πρωτεϊνών στην παθοφυσιολογία και θεραπευτική εκφυλιστικών παθήσεων
Creators: name: Φολτοπούλου, Παρθένα Φ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2007
Subjects: Sco2 πρωτεϊνη
Οξείδωση του κυτοχρώματος C
Μεταγωγή πρωτεϊνών
Τεχνολογία των PTDS
Sco2 protein
Cytochrome C oxidase
Protein trnansduction
PTDs technology
Copper binding

description: Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, έγινε η ετερόλογη παραγωγή στην Ε. coli της ώριμης πρωτεϊνης Sco2w/t(42-266aa), καθώς και των δύο μεταλλαγμένων μορφών της Sco2 πρωτεϊνης(Sco2e140k και Sco2s225f), ως χιμαιρικά μόρια με την ιντεϊνη, με τη χρήση του πλασμιδιακού φορέα pTYB11, και κατέστη δυνατός ο καθαρισμός τους μέσω χρωματογραφίας αγχιστείας. Στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των σημειακών μεταλλάξεων (E140K, S225F) στη λειτουργία και φυσιολογική συμπεριφορά της μιτοχονδριακής πρωτεϊνης Sco2 όπως και στην ικανότητα σύνδεσης της με το χαλκό(Foltopoulou et al., 2004). Στην προσπάθεια ενδοκυτταρικής μεταγωγής της ανασυνδυαμένης αγρίου τύπου L-Sco2w/t πρωτεϊνης(πλήρους μεγέθους, 266aa) και ακόλουθης μεταφοράς στα μιτοχόνδρια, χρησιμοποιήθηκε η νέα τεχνολογία μεταγωγής πρωτεϊνών μέσω των PTDs(Protein Transduction Domains). Η αγρίου τύπου πρωτεϊνη L-Sco2w/t(266aa), εκφράστηκε ως χιμαιρικό μόριο είτε με την ιντεϊνη(ιντεϊνη-TAT-L-Sco2-HA)είτε με την αλληλουχία δέκα(10) ιστιδινών(10xHis-XAsite-TAT-L-Sco2-HA) μαζί με τις αλληλουχίες του TAT-PTD και του HA, με τη χρήση των πλασμιδιακών φορέων pTYB11 και pET-16b, αντίστοιχα. Μεταγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεϊνης σε κύτταρα γλοιώματος(κυτταρική σειρά U-87 MG) και μελέτη με πειράματα, τόσο υποκυτταρικής κατανομής όσο και με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, έδωσαν τις πρώτες ενδείξεις για εντόπιση της ανασυνδυασμένης αυτής πρωτεϊνης στα μιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών κυττάρων
description: Within the scope of present thesis, the point mutations(E140K, S225F) of SCO2 gene were studied. Wild type and mutants of SCO2 gene were cloned and expressed as heterologous proteins in E. coli cells, using fusion cloning and expression vector system(IMPACT^tm-CN, pTYB11). Wild type and mutated forms of Sco2 were prepared as recombinant proteins and examined for their physical state, condormation and thei ability to bind cooper. SDS-PAGE electrophoresis analysis revealed that Sco2^e140k και Sco2s225f mutant forms of Sco2 protein are quite different from their wild type counterpart in physical state and copper capacity. Circular dichroism(CD) spectroscopy and thermal denaturation studies confirmed difference, supporting the motion that the two point mutations alter both the physical state and the binding capacity of Sco2 proteins(Foltopoulou et al., 2004). Combinatorial Cloning Technology complemented by the novel Protein Transduction Technology(PTD) was applied in order to attempt targeted intracellular delivery of human recombinant Sco2 protein in eukaryotic cells. Wild type recombinant Sco2 fusion protein, bearing also the TAT domain as PTD, His-tag and HA-tag, produced in genetically modified E. coli cells. This hererologous protein was resolved, refolded and delivered in culture of U-87 MG glioma cells. Preliminary immunofluorescent data, followed by subcellular localization, SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting analysis revealed that recombinant Sco2 protein had been delivered into mitochondria of mammalian cells