title: Characterization of potential cancer initiating cells in breast cancer cell lines
Creators: name: Hagen, Timo
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Krebsstammzellen (CSCs) stellen eine wichtige Subklasse von neoplastischen Zellen dar und sind von hoher Bedeutung für die Klinik. In dieser Masterarbeit etablierten wir Methoden für die zeitsparende, reproduzierbare Analyse von CSC Eigenschaften, nämlich eine zelloberflächenmarker-basierte, durchflusszytometrische Identifikationsmethode und den Soft-Agar-Koloniebildungs-Test. Es wurden die Oberflächenmarker CD24, CD44 und CD49f ausgewählt und die beiden basalen/mesenchymalen humanen Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-436 sowie die luminale Brustkrebszelllinie MCF7 verwendet. Mittels der optimierten Bestimmungsmethode wurden die Brustkrebszelllinien bezüglich ihres CD24/CD44/CD49f antigenen Phänotyps charakterisiert. Die Charakterisierung ergab, dass die zwei basal/mesenchymalen Zelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-436 vorwiegend den CD24-/CD44+/CD49f+ antigenen Phänotyp aufwiesen. Die luminale Zelllinie MCF7 wies jedoch den CD24+/CD44+/CD49f+ antigenen Phänotyp am häufigsten auf. In einem nächsten Schritt wurde der vielversprechende, auf CSC abzielende Wirkstoff Salinomycin verwendet. Die Zytotoxizität von Salinomycin sowie dem Chemotherapeutika Daunorubicin auf die drei Brustkrebszelllinien wurde getestet. Durch eine durchflusszytometrische lebend-tot-Bestimmung wurde gezeigt, dass die Zelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-436 konzentrationsabhängig von Salinomycin getötet wurden. Diese Tendenz konnte aber bei der Zelllinie MCF7 nicht festgestellt werden, wenngleich ein höherer Prozentsatz an toten Zellen als in den anderen Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurde der Einfluss von Salinomycin auf die mit CSC verbundenen Eigenschaften des Oberflächenmarkerprofils und des nicht-adhärenz basierten Wachstums der Zelllinien MDA-MB-231 und MCF7 untersucht. Der dominante CD24/CD44/CD49f antigene Phänotyp wurde durch die Behandlung mit Salinomycin in keiner der beiden getesteten Zelllinien beeinflusst. Darüber hinaus konnte kein Zusammenhang zwischen der Fähigkeit der Spheroidbildung (Anzahl, Größe) und den verschiedenen Konditionen festgestellt werden. In einem weiteren Schritt wurde der Soft-Agar-Test optimiert. Als Letztes wurde der alternativ einsetzbare Methylcellulose-Test durchgeführt, welcher eine schnellere Methode zur Generierung von multizellulären Aggregaten darstellt. Dieser Test öffnet die Türen zu Kryoschnitten und Histologie von isolierten multizellulären Aggregaten.
description: Cancer stem cells (CSCs) represent an important subclass of neoplastic cells with high clinical relevance. In this work we established methods for time-efficient and reproducible analysis of CSC properties, namely a cell surface marker based flow-cytometry based identification method and a soft agar colony formation assay. The three surface marker CD24, CD44 and CD49f were selected. We focused on the basal/mesenchymal human breast cancer cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-436, as well as the luminal-like human breast cancer cell line MCF7. Using the optimized evaluation method, the cell lines were characterized for their CD24/CD44/CD49f antigenic surface profile. The characterization revealed that the two basal/mesenchymal-like cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-436 predominantly exhibited CD24-/CD44+/CD49f+ antigenic phenotype, whereas the luminal-like cell line MCF7 exhibited the CD24+/CD44+/CD49f+ antigenic phenotype most frequently. In a next step, we utilized the promising CSC targeting drug salinomycin. We tested the cytotoxic effects of salinomycin and the chemotherapeutic daunorubicin on the three cell lines. Using a live-dead staining based approach coupled with flow cytometry we found that salinomycin eliminated the cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-436 in a dose-dependent manner. For the cell line MCF7 this tendency was not observed. Furthermore we examined the effects of salinomycin to the CSC-associated properties of surface marker identity and non-adherent growth of the cell lines MDA-MB-231 and MCF7. The CD24/CD44/CD49f antigenic phenotype was not affected by drug treatment in any of the two cell lines tested. Moreover the spheroid formation in non-adherent environment did not result in treatment-dependent effects on spheroid size or spheroid number. In an additional step, we optimized the soft agar colony formation assay. Finally we successfully tested the methyl cellulose assay, which represents a faster method to produce multicellular aggregates ideal for testing of further downstream spheroid analysis methods.