Characterization of an in vitro model of Spinal Muscular Atrophy (SMA)
Creators: name: Μπισχινιώτη, Ιωάννα Θεοδώρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Νωτιαία Μυϊκή Ατροφία (ΝΜΑ)
Νευρικά βλαστοκύτταρα
Αποσιώπηση γονιδίου
Spinal Muscular Atrophy (SMA)
CRISPR interference
Motor neurons

description: Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic autosomal recessive neurodegenerative disease that is the number one cause of genetic infant mortality worldwide. SMN (Survival Motor Neuron) protein depletion is responsible for the SMA phenotype. SMN is encoded in humans by the SMN1, and its paralog SMN2, although the latter only transcribes a small amount of FL-SMN (Full Length SMN) protein. Homologous deletion of the SMN1 gene in humans is responsible for 95% of all SMA cases. However, disease severity among SMA types is determined by the copy number of SMN2 gene an individual carries and is thus dubbed as disease modifier. In this study we aimed to target the promoter of the SMN1 and SMN2 genes in smNPCs (small neural precursor cells) which had previously been successfully infected with a Tet-On dCas9-KRAB transgene. We used lentiviruses to infect the dCas9-KRAB smNPCs with four different sgRNAs designed complementary to the SMN locus promoter and measured the levels of SMN depletion by RT-qPCR and Western Blot. After establishing a robust 30% depletion in FL-SMN mRNA levels as well as a reduction in protein production, we went on to test the differentiation efficacy of our system. More specifically, we differentiated our smNPCs to neuroepithelial cells and to Motor Neurons (MNs), the main target of SMA pathology. smNPCs were able to differentiate to neuronal cells in both conditions despite the reduction in SMN protein levels. However, compared to the controls, the differentiation potential of cells producing lower levels of SMN was markedly reduced. These results indicate that SMN plays a crucial role in differentiation and neurodevelopment. Lastly, our engineered cell model offers a relatively cost-effective way to study disease pathology and identify therapeutic targets for SMA.
description: Η νωτιαία μυϊκή ατροφία (SMA) είναι μία γενετική νευροεκφυλιστική νόσος, που προσβάλει τους α-κινητικούς νευρώνες του πρόσθιου κέρατος του νωτιαίου μυελού, οδηγώντας σε μυϊκή αδυναμία και προοδευτική εκφύλιση των κινητικών μυών. Πρόκειται για το πιο συχνό γενετικό αίτιο βρεφικής θνησιμότητας, ενώ κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο πρότυπο κληρονομικότητας. . Ο φαινότυπος αυτός της SMA οφείλεται σε ελαττωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης SMN (Survival Motor Neuron). Η πρωτεΐνη SMN κωδικοποιείται στον άνθρωπο από το γονίδιο SMN1 και κατά ένα πολύ μικρότερο ποσοστό από το παράλογό του, SMN2. Οι ασθενείς με SMA στερούνται του SMN1 γονιδίου ενώ η βαρύτητα των συμπτωμάτων της νόσου (τύποι I-IV), εξαρτάται από το πλήθος των SMN2 αντιγράφων στο γονιδίωμα του ασθενούς. Στη παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πρόδρομα νευρικά κύτταρα (smNPCs), που είχαν ήδη μολυνθεί με ιούς ούτως ώστε να εκφράζουν την πρωτεΐνη dCas9-KRAB, στα οποία επιδιώξαμε την γονιδιακή αποσιώπηση των SMN1 και SMN2 με την τεχνολογία CRISPRi (CRISPR interference). Αυτό επετεύχθη μετά από μόλυνση των κυττάρων με 4 διαφορετικά sgRNAs (single guide RNAs), σχεδιασμένα συμπληρωματικά για την αλληλουχία του υποκινητή των γονιδίων αυτών. Με την χρήση της τεχνολογίας αυτής, κατέστη δυνατή η μείωση της έκφρασης της FL-SMN (Full-Length SMN) ,σε επίπεδο της τάξης του 30%, με τη χρήση ενός εκ των τεσσάρων sgRNA. Στη συνέχεια, δείξαμε πως τα τροποιημένα αυτά κύτταρα είναι ικανά να διαφοροποιηθούν, τόσο σε αυθορμήτως διαφοροποιημένα νευροεπιθηλιακά κύτταρα, αλλά και, δοθέντων των κατάλληλων μορίων σηματοδότησης, σε κινητικούς νευρώνες. Τελικά, επετεύχθη η μείωση στο επίπεδο της μεταγραφής του SMN1 γονιδίου, τόσο σε πρόδρομα νευρικά κύτταρα όσο και σε διαφοροποιημένα. Επιπλέον, μελέτες στα επίπεδα των δεικτών νευρωνικής διαφοροποίησης έδειξαν σημαντική υστέρηση στην διαφοροποίηση των κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, η έκφραση της SMN ήταν ελαττωμένη, τόσο σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα όσο και σε κινητικούς νευρώνες, υποδεικνύοντας πως η SMN πρωτεΐνη έχει κρίσιμο ρόλο κατά τη νευρωνική διαφοροποίηση. Εν κατακλείδι, το μοντέλο αυτό έχει σημαντικές δυνατότητες αξιοποίησης στην μελέτη του ρόλου της SMN πρωτεΐνης σε νευρώνες και νευρογλοιακά κύτταρα, λόγω της ευκολίας και οικονομίας του πρωτοκόλλου διαφοροποίησης σε σχέση με άλλα υπάρχοντα κυτταρικά συστήματα, ενώ μπορεί ακόμη να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων για την SMA.