title: Adeno-associated virus 8 virus-like particle analysis employing chip capillary electrophoresis combined with molecular beacons
Creators: name: Pichler, Jessica
Publisher: name: TU Wien
Year: 2020
Subjects: subject: Virus-like partikles
subject: Chipelektrophorese
subject: Molecular beacons
subject: Virus-like particles
subject: Chip electrophoresis
subject: Molecular beacons

description: Das Adeno-assoziierte Virus Serotyp 8 (AAV8) ist ein Virus ohne zusätzlicher Lipidhülle und gehört der Gruppe der Dependoparvoviren an, die von einem Helfervirus abhängig und somit alleine nicht replikationsfähig sind. Es ist ein wichtiges Werkzeug in der Pharmazie, wo es als Transportmittel für verkapseltes Material, z.B. genomischer Information, fungieren kann, wenn es als virus-ähnlicher Partikel (virus-like particle, VLP) eingesetzt wird. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie AAV8 als VLP mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer System durch Chip-basierte Kapillarelektrophorese charakterisiert werden kann. Geladene Partikel werden dabei anhand ihrer elektrophoretischen Mobilität (EM) getrennt und können anschließend durch fluoreszenzbasierte Detektion erfasst werden. Aufgrund des Interesses an der nukleinsäurebasierten verkapselten Fracht, können verschiedene sogenannte Molecular Beacons dazu dienen, das untersuchte Genom zu identifizieren, indem diese an unterschiedliche Stellen der untersuchten DNA binden. Die verkapselte DNA kann durch drei verschiedene Vorbehandlungsmethoden freigesetzt werden: 1. durch Zerstörung der viralen Kapsel durch Hitzeeintrag; 2. durch pH-Änderung in den sauren Bereich; 3. durch Verdau der viralen Kapsel mit dem Enzym Proteinase K. Ein Vergleich der Ergebnisse mit internen Standards ermöglicht eine Bestimmung der Menge an verkapselter Fracht. Die Freisetzung der DNA wird zudem durch nES GEMMA (nano electrospray gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis) überprüft, bei welcher einfach-geladene Partikel durch eine nano-Elektrospray-Einheit (nano-ES), ausgestattet mit einer radioaktiven Ladungsreduktionseinheit (210Po), erzeugt werden. In weiterer Folge erfolgt eine Trennung der Partikel anhand ihres elektrophoretischen Mobilitätsdurchmessers (EMD). Durch Behandlung mit Proteinase K und nES GEMMA Analysen wird festgestellt, ob der enzymatische Verdau der proteinösen VLP-Kapsel erfolgreich abgelaufen ist und daher auch, ob die erhaltenen Fluoreszenzsignale tatsächlich von der Bindung der Molecular Beacons an die freigesetzte DNA stammen.
description: Adeno-associated virus serotype 8 (AAV8) is a helper dependent (replication-defective) and non-enveloped virus belonging to the genus Dependoparvovirus. It is an important tool in pharmaceutics enabling transport of encapsulated material, e.g. genomic information, when employed as virus-like particle (VLP). In this work, it is presented how AAV8 VLPs can be characterized by the Agilent 2100 Bioanalyzer system with chip-based capillary electrophoresis, where charged particles are separated according to their electrophoretic mobility (EM) and detected via their fluorescence. Taking interest in nucleic acid-based encapsulated cargo, so-called molecular beacons can be used for DNA identification, due to their specific targeting mechanism. Release of genomic material from VLPs can be obtained by three different treatments: (i) capsid disassembly induced by heat; (ii) capsids protein uncoating by change of pH to acidic range; (iii) capsid degradation by enzymatic digestion with proteinase K. Comparison of results with calibration standards enables the estimation of the amount of encapsulated cargo. The release of DNA from the capsid is further confirmed with nES GEMMA (nano electrospray gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis), where single-charged particles are produced by means of a nano electrospray (nano-ES) source, equipped with a radioactive charge equilibration unit (210Po-based). These particles are later on separated according to their electrophoretic mobility diameter (EMD). Proteinase K treatment and nES GEMMA analyses reveal, if the enzymatic digestion of the proteinaceous VLP capsid was successful, and if the obtained fluorescent signals indeed result from molecular beacons targeting the released DNA.