Synthese und Evaluierung stabilisierter Bindungsepitope zur Adressierung kleiner GTPasen
Creators: name: Spiegel, Jochen
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2016
Subjects: subject: Kleine GTPhasen
subject: Protein-Protein-Interaktion
subject: Stapled peptides
subject: 570
subject: 540

description: Kleine GTPasen dienen als molekulare Schalter bei der Kontrolle zahlreicher wichtiger zellulärer Prozesse. Die fehlerhafte Funktion kleiner GTPasen steht daher in Verbindung mit der Entstehung und Entwicklung diverser Erkrankungen. Allerdings konnte diese Proteinklasse mit konventionellen Methoden nur äußerst schwer direkt adressiert werden, da ihre Regulierung und biologische Signalwirkung über ausgedehnte und flache Protein‒Protein-Interaktionen (PPIs) vermittelt werden. Um Verbindungen zu generieren, die an kleine GTPasen binden und potentiell ihre Signalwirkung modulieren können, wurden deshalb im Rahmen dieser Arbeit Bindungsepitope natürlicher Interaktionspartner konformativ stabilisiert. Auf Basis struktureller Daten von GTPase‒Protein-Komplexen wurden dazu geeignete Peptidsequenzen identifiziert und chemisch modifiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurden Ras-Proteine, die prominenteste Unterfamilie kleiner GTPasen, adressiert. Basierend auf einem α-helikalen Bindungsmotiv des Nukleotidaustauschfaktors SOS wurden Peptide mit α-methylierter Kohlenwasserstoffverbrückung (hydrocarbon stapled peptides) entwickelt, während eine vom Effektor c-Raf abgeleitete β-Haarnadel mittels unterschiedlicher Verbrückungsstrategien stabilisiert wurde. Aufgrund der sehr geringen Affinität der Ausgangssequenzen wurden jedoch keine Derivate erhalten, die für eine Anwendung als PPI-Inhibitoren geeignet wären. Im zweiten Teil der Arbeit wurde in einer breit angelegten Machbarkeitsstudie eine analoge Strategie für die größte Unterfamilie kleiner GTPasen, sog. Rab-Proteine, verfolgt. Ausgehend von diversen α-helikalen Bindungsmotiven wurde eine Bibliothek von stapled peptides generiert, die sich im Vergleich zu den Ausgangssequenzen durch deutlich gesteigerte Affinitäten auszeichneten. Obgleich die Peptide keinen Einfluss auf die GEF-vermittelte Nukleotidaustauschrate von Rab-GTPasen zeigten, konnte ein Peptid identifiziert werden, das selektiv an die aktivierte Form von Rab8a bindet und in der Lage ist, eine Rab‒Effektor-Wechselwirkung in vitro zu inhibieren. Abschließend konnte durch Variation der Verbrückungsarchitektur die Affinität dieses Peptids weiter gesteigert werden.
description: Small GTPases work as molecular switches inside cells and play a key role in the control of numerous crucial cellular processes. The aberrant function of small GTPases has therefore been associated with a variety of different diseases. However, the direct targeting of small GTPases by means of conventional small molecular approaches has turned out to be extremely challenging as GTPase regulation and signaling is mediated by shallow and extended protein‒protein-interaction surfaces. In this thesis stabilized peptide binding epitopes derived from protein interaction sites of natural interaction partners were explored as modulators of GTPase signaling. Based on structural data of GTPase‒protein complexes suitable peptide sequences were selected and chemically modified. The first part of this thesis explored this strategy for Ras proteins, the most prominent subfamily of small GTPases. Based on an α-helix of the nucleotide exchange factor SOS a small library of hydrocarbon stapled peptides was generated, while a c-Raf derived β-hairpin was stabilized using different types of cross-links. However, none of the peptide derivative showed sufficient target affinity, probably due to very poor affinities of the corresponding wild type sequences. In the second part of the thesis the same approach was applied to Rab proteins, the largest subfamily of small GTPases. A library of hydrocarbon stapled peptides was designed based on a variety α-helical binding epitopes from different Rab interaction partners. These peptides showed significantly increased affinities. Though no influence on the GEF-catalyzed nucleotide exchange was observed, one of the stapled peptides binds selectively to activated Rab8a and inhibits a Rab8a‒effector-interaction in vitro. Target affinity was further improved by variation of the stapling architecture.