title: Λειτουργία βιοαντιδραστήρα για την παραγωγή βιοτασιενεργών ουσιών με χρήση βαρέων κλασμάτων αργού πετρελαίου ως πηγή άνθρακα και αξιολόγηση αυτών για ενίσχυση της βιοαποικοδόμησης αργού πετρελαίου
title: Biosurfactant production in bioreactors by using heavy crude oil fractions as substrate and evaluation of the ability of biosurfacatns to enhance crude oil biodegradation
Creators: name: Μανδαλενακη Αθηνα
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2019

description: Οι βιοτασιενεργές ουσίες (Biosurfactants, BS) είναι αμφίφυλες βιολογικές ενώσεις που παράγονται εξωκυτταρικά ή ως τμήμα της κυτταρικής μεμβράνης, από ποικιλία ζυμών, βακτηρίων και μυκήτων και χρησιμοποιούνται σε γκάμα εφαρμογών, μία εκ των οποίων είναι η βιοεξυγίανση. Κατά την βιοεξυγίανση θαλάσσιας ρύπανση από πετρελαιοειδή, οι BS χρησιμοποιούνται ώστε να αυξηθεί η βιοδιαθεσιμότητα του ρύπου και έτσι να αυξηθεί ο ρυθμός αποικοδόμησής του από τους γηγενείς μικροοργανισμούς.  
Η επίδραση της πηγής άνθρακα στην ποιότητα και ποσότητα των BS μιας καλλιέργειας είναι πολύ μεγάλη. Η πηγή άνθρακα συχνά διαλυτοποιείται στην καλλιέργεια και το βιοτασιενεργό προϊόν έχει προσμίξεις από αυτήν. Το γεγονός αυτό δυσκολεύει την διαδικασία απομόνωσης των BS και αυξάνει το κόστος παραγωγής.  Στο συγκεκριμένο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν βαρέα κλάσματα αργού πετρελαίου ως πηγή άνθρακα στις καλλιέργειες. Στόχος ήταν οι BS να απομονώνονται με απλή εκχύλιση, δίχως προσμίξεις της πηγής άνθρακα.
Ο μικροοργανισμός που χρησιμοποιήθηκε σε αυτό το πείραμα ήταν το βακτήριο Alcanivorax borkumensis SK2 το οποίο είχε απομονωθεί σε προγενέστερη έρευνα του εργαστηρίου, από το θαλάσσιο περιβάλλον της Ελευσίνας. Πρόκειται για ένα βακτήριο γνωστό για την παραγωγή γλυκολιπιδίων και ενεργό στην βιοαποικοδόμηση υδρογονανθράκων. Βακτήριο το οποίο συναντάται σε θαλάσσιες περιοχές ρυπασμένες με πετρελαιοειδή.
Για την παραγωγή BS χρησιμοποιήθηκε βιοαντιδραστήρας της Bioengineering ώστε οι συνθήκες να είναι ελεγχόμενες και σταθερές, και ούτος ώστε το πείραμα να διεξαχθεί σε μεγαλύτερη κλίμακα. Η μέγιστη συγκέντρωση BS στην καλλιέργεια του βιοαντιδραστήρα ήταν της τάξεως των 20 mg/L. Πρόκειται για μία μικρή συγκέντρωση σε σύγκριση με την βιβλιογραφία, όμως προτέρημα της συγκεκριμένης μεθοδολογίας ήταν η μη ύπαρξη προσμίξεων από την πηγή άνθρακα στο τελικό προϊόν.
Για τον χαρακτηρισμό των BS που παράχθηκαν εργαστηριακά, χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία λεπτής στιβάδας και το δείγμα μας συγκρίθηκε με πρότυπο δείγμα ραμνολιπιδίων (R-95 RL95% της Aldrich Chemistry). Από το πείραμα αυτό διαπιστώθηκε ότι το δείγμα μας περιείχε μόνο- και δι- ραμνολιπίδια καθώς και δύο ακόμη μη ταυτοποιημένα λιπίδια.
Επίσης, πραγματοποιήθηκε πείραμα για την εκτίμηση της διασποράς του πετρελαίου στην υδάτινη φάση με χρήση BS. Σε αυτό το πείραμα εφαρμόστηκε το Baffled Flask Test (BFT) του πρωτοκόλλου της EPA. Συγκρίθηκε η διασπορά του πετρελαίου με και χωρίς την χρήση BS. Ως διαλύτης για τις BS χρησιμοποιήθηκε σογιέλαιο και οι διάφορες συγκεντρώσεις BS που εξετάστηκαν ήταν 0%, 5%, 7,5% και 15% w/v.  Η ποσοστιαία αύξηση της διασποράς του πετρελαίου σε κάθε περίπτωση ήταν 0%, 25,85%, 74,85% και 77,76% αντίστοιχα.
Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν BS ως βελτιωτικός παράγοντας για την βιοαποικοδόμηση αργού πετρελαίου. Ως διαλύτες για τις BS χρησιμοποιήθηκαν απιονισμένο νερό και σογιέλαιο. H εκτίμηση της ποσότητας των πετρελαιοειδών που είχε αποικοδομηθεί έπειτα από συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, έγινε με χρήση GC-MS. Ενδεικτικά, ο μέσος όρος μείωσης της μάζας των κορεσμένων υδρογονανθράκων σε 28 ημέρες, με διαλύτη το νερό (~ 2 mg δραστική ουσία / 10 ml seawater) και το σογιέλαιο (~ 5 mg δραστική ουσία / 10 ml seawater) ήταν 52,18% και 29,45% αντίστοιχα. 
description: Biosurfactants (BS) are amphiphilic biological molecules produced extracellularly or as a part of the cell membrane, from a variety of yeasts, bacteria and fungi. They are used in a range of applications one of which is bioremediation. During bioremediation of crude oil in sea, BS increase the bioavailability of the pollutant and thus, the rate of degradation by the native microorganisms.
Biosurfactant production is highly dependent on the carbon source used in the culture. Most commonly, the carbon source is soluble and the biosurfactant product has substrate impurities. This fact makes the production of purified BS more difficult and expensive. During this experiment, heavy oil fractions (HOF) were used as carbon source. The aim of this investigation was to extract purified BS with a simple solvent extraction from the culture.
The microorganism used was Alcanivorax borkumensis SK2. This bacterium was isolated from Elefsina bay during previous investigation of our lab. This microorganism is known for its glycolipid production and its oil degradation ability. Furthermore, it is commonly found in oil polluted marine environments.
For the biosurfactant production, a Bioengineering bioreactor was used, as to have stable and controlled conditions in the culture but also a bigger scale. The maximum BS production in the bioreactor was 20 mg/L. According to other investigations and the bibliography, this concentration is quite low, but the main asset of the mythology used, is the fact that purified BS were isolated by a simple solvent extraction.
Thin layer chromatography was carried out to compare the BS produced in the lab with a pure rhamnolipid sample (R-95 RL95% της Aldrich Chemistry). The BS produced by A. borkumensis SK2 contains mono- and di- rhamnolipids, and two other non-detected biosurfactants.
Furthermore, the baffled flask test (BFT) protocol (according to the EPA) was implemented as to detect the dispersion of crude oil in water, by using BS. BS were previously diluted in soybean oil and the different BS concentrations tested were 0%, 5%, 7,5% and 15% w/v. The percent increase of oil dispersion in each case was 0%, 25.85%, 74.85% and 77.76% respectively.
Last but not least, a bioremediation test was carried out as to test the effect of BS in the biodegradation of crude oil. BS were diluted in water and crude oil. GC-MS was used as to estimate the degradation of crude oil after specific time frames. Indicatively, the average mass reduction of saturated hydrocarbons, after 28 days of experiment, was 52,18% for BS diluted in water (2 mg active agent / 10 ml seawater) and 29,45% for BS diluted in soybean oil (5 mg active agent / 10 ml seawater).