title: Targeted meiotic recombination in Arabidopsis thaliana
Creators: name: Janisiw, Michael
Publisher: name: :none
Year: 2009

description: Die sexuelle Reproduktion diploider Organismen benötigt Mechanismen zur korrekten Verteilung der paternalen und maternalen Chromosomen in den zu bildenden Keimzellen. Dieser Prozess findet im Rahmen der Meiose statt. Nach Replikation der Chromosomen führen zwei Schritte von Chromosmensegregationen zur Bildung von vier haploiden Gametenvorläufer-Zellen. Durch Rekombination von paternalen und maternalen Chromosomen wird während der Meiose die genetische Diversität erhöht. Dieser Prozess führt auch zur Ausbildung von Chiasmata, welche aus reziproken Rekombinationsereignissen hervorgehen, und ist essentiell für die korrekte Chromosomensegregation während der ersten meiotischen Teilung. Das Schlüsselereignis dieses Prozesses, die kontrollierte Ausbildung von DNA Doppelstrangbrüchen, ist eine Voraussetzung für die nachfolgend stattfindende homologe Rekombination. Die Verteilung der DNA Doppelstrangbrüche ist nicht zufällig, da diese an diskreten Loci im Genom konzentriert sind – den ‚Hotspots’ der meiotischen Rekombination. Das zentrale Protein im Rahmen der Induktion von Doppelstrangbrüchen ist das konservierte Enzym SPO11. In Arabidopsis thaliana wurden drei SPO11 Gene identifiziert, von welchen AtSPO11-1 und AtSPO11-2 für die gezielte Einführung von DNA Doppelstrangbrüchen verantwortlich sind. Das Hauptziel dieser Studie war, die Rekombinationsmaschinerie zu spezifischen Loci im Arabidopsis Genom zu dirigieren. Die dabei gewählte Strategie beinhaltet die Erzeugung verschiedener Fusionsproteine, in welchen AtSPO11 N-terminal an Zink-Finger (ZF) DNA-Bindungsdomänen fusioniert wurde. Dadurch ist zu erwarten, dass induzierte DNA Doppelstrangbrüche verstärkt in der Region der spezifischen Zink-Finger DNA-Bindungsstelle erfolgen. Weiters auch, dass die nachfolgende DNA Reparatur zum Austausch von paternaler und maternaler genetischer Infomation an dem gewählten Locus führt Es wurden verschiedene Zink-Finger Konstrukte hergestellt, welche an einen bestimmten endogenen Locus im Arabidopsis Genom binden. Die Einführung eines zusätzlichen c-Myc Epitops in die Konstrukte erlaubt dadurch eine biochemische Manipulation der Fusionsproteine. Die AtSPO11-1-ZF Fusionsproteine wurden durch Komplementationsanalyse auf ihre Funktionalität getestet, und konnten die Funktion des endogenen AtSPO11-1 Proteins übernehmen. In zukünftigen Experimenten ist weiters die Herstellung von AtSPO11-2-ZF Fusionsproteinen geplant. Unterschiedliche Tester-Linien welche AtSPO11-ZF Konstrukte und gleichzeitig verschiedende Marker beinhalten, um die erwartete erhöhte Rekombinationsrate quantitativ zu bestimmen, wurden miteinander gekreuzt. Die Kreuzungsprodukte dienen der Detektion von induzierten Rekombinationsereignissen an dem ausgewählten Locus, einhergehend mit einem trans zu cis Austausch der Markerkonfiguration.
description: Sexually reproducing eukaryotes need to maintain their chromosome number across generations. During meiosis two rounds of chromosome segregation that finally lead to the formation of four haploid gamete precursors follow one round of DNA replication. During this process genetic diversity is increased by recombination of paternal and maternal homologous chromosomes. Moreover, chiasmata form as a consequence of the reciprocal recombination events and are essential for regular chromosome segregation during the first meiotic division. The key event of this process is controlled DNA double strand break (DSB) formation, which is a prerequisite for subsequent homologous recombination (HR). Sites of DSB induction are not randomly distributed, but preferentially formed at discrete loci within certain genomic regions, the hotspots of meiotic recombination. The central protein of meiotic DNA DSB formation is the conserved enzyme SPO11. In Arabidopsis thaliana three different SPO11 genes exist, of which AtSPO11-1 and AtSPO11-2 are involved in meiotic DSB induction. The major aim of this study was to target the meiotic recombination machinery to specific loci within the Arabidopsis genome. My strategy involved the creation of a series of fusion proteins, with AtSPO11 fused to different C-terminal zinc-finger (ZF) DNA binding proteins. As a consequence, introduced DSBs are anticipated to be generated at the target site of the respective ZF protein. Repair by the HR pathway will lead to exchange of paternal and maternal genetic information at a chosen locus. Different zinc-finger constructs were designed to target an endogenous Arabidopsis locus. Introduction of a c-Myc epitope enabled biochemical manipulation of transgenic fusion proteins. Successful complementation analysis confirmed that the assessed fusion proteins are functional in-planta. Future work will include the generation of AtSPO11-2-ZF fusion proteins as well. The CSR1 locus as a target for the ZF fusion proteins was carefully chosen because of its unique characteristics. Two mutant alleles crs1-1 and csr1-2 are available, flanking the ZF target sites, respectively, and conferring resistance to two different classes of herbicides. The naturally given very low intragenic recombination rate between csr1-1 and csr1-2 will allow to detect low-level induction of recombination due to SPO11-ZF induced DSB formation. Furthermore, the different tester lines harboring SPO11-ZF constructs, and visual markers for screening recombination at the ZF target locus have been combined by crossings. Induction of locus-specific meiotic recombination will result in a trans to cis exchange of marker configuration, which will be scored by fluorescent pollen signal exchange or by occurence of double herbicide resistance in subsequent generations. Apart from stimulating the mere exchange of genetic markers, introduction of locus-specific DSBs might allow for the integration of ectopic homologous DNA sequences, possibly opening new roads in the generation of transgenic organisms.