title: Entwicklung von Photosensitizer-Konjugaten und Evaluierung im Caco-2 Modell
Creators: name: Kaniak, Ingrid Marlis
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Die Photosensitizer-gestützte photodynamische Therapie stellt auf Grund ihrer hohen Selektivität eine vielversprechende Behandlungsmethode in der Tumortherapie dar. Durch die gezielte Verabreichung von photosensibilisierenden Substanzen und deren anschließender Aktivierung durch Bestrahlung mit Licht kann direkt an Tumorzellen ein zytotoxischer Effekt hervorgerufen werden. Jedoch ist der Erfolg der photodynamische Therapie durch ungünstige chemische, physikalische und pharmakologische Eigenschaften der meist lipophilen PS begrenzt. Um einige dieser limitierenden Faktoren zu überwinden, könnten Photosensitizer mit wasserlöslichen Polymeren oder cytoadhäsiven Proteinen modifiziert werden, um Hydrophilie bzw. Zellinteraktion und damit die Effizienz zu erhöhen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Photosensitizer aus der Gruppe der Porphyrine mit Polystyrolsulfat-Natrium (PSS-Na) oder Weizenlektin (WGA) modifiziert und die Interaktion dieser Konjugate mit Caco-2 Monolayern im Vergleich zur jeweiligen Ausgangsverbindung untersucht. WGA ist ein wasserlösliches Lektin, das durch seine spezifische Interaktion mit Zuckerstrukturen der Zellmembran die Bindung und auch Aufnahme von konjugierten Wirkstoffen in die Zelle verbessern kann. mTHPP wurde mit 13 Molekülen PSS-Na komplexiert (mTHPP-PSSNa), TPP wurde mittels mixed-anhydride-Methode und TCPP mittels Carbodiimid kovalent an WGA konjugiert. Die Modifikation von mTHPP mit PSS-Na bewirkte nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C eine signifikant erhöhte Bindung des Photosensitizers an die Zelloberfläche, die quantitativ durch eine 30-fach höhere RFI bestätigt wurde. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich bei 37°C nach 30 minütiger Inkubation mit einer bis zu 4-fach höheren Zell-assoziierten relativen Fluoreszenzintensität (RFI) im Vergleich zu mTHPP belegt werden. Eine Verlängerung der Inkubationsdauer bei 4°C und bei 37°C führte bei beiden Verbindungen zu einem deutlichen Anstieg der RFI. Dabei zeigten sowohl mTHPP als auch mTHPP-PSSNa bei 37°C eine höhere zellassoziierte Fluoreszenzintensität als bei 4°C, was auch auf eine Aufnahme der Photosensitizer in die Zellen hinweist. Diese quantitativen Ergebnisse konnten auch qualitativ durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt werden. Darüber hinaus führte die Weißlicht-Bestrahlung der mit PS beladenen Monolayer zu punktuellen Fluoreszenzverteilungen von mTHPP-PSSNa in den Zellen, welche aber nachweislich, gestützt auf Kolokalisationsstudien mit Fluorescein-markiertem WGA, nicht durch Aufnahme in die Lysosomen zustande kommt. Des Weiteren konnte auch durch Visualisierung der Zellgrenzen mittels Färbung des tight junction Proteins ZO-1 weder für mTHPP noch für mTHPP-PSSNa eine eindeutige Aussage über eine Aufnahme in die Zelle getroffen werden. Um die Wirkstoff – Zellinteraktion zu verbessern wurde TPP mittels mixed anhydride-Methode an WGA gekoppelt. Die anschließende Zell-Bindungsstudien der Konjugate bei 4°C ergaben keine Verbesserung der Bindungsrate durch die WGA-Modifikation. Aus diesem Grund wurden keine weiteren Versuche mit TPP durchgeführt. TCPP, das im Gegensatz zu TPP vier Carboxylgruppen besitzt, wurde durch die Carbodiimid-Methode in zwei unterschiedlich molaren Verhältnissen (1:10 und 1:50, WGA:TCPP) an WGA gekoppelt. Die fluorimetrisch ausgewerteten Bindungsstudien bei 4°C erlaubten keine Aussage über eine verbesserte Interaktion mit dem Zellmonolayer für ein bestimmtes molares Ansatzverhältnis. Als zusätzliche Kontrollen wurde einerseits eine Lösung von TCPP in Puffer, andererseits ein möglicher ionischer Komplex mit Rinderserumalbumin eingesetzt, um die Zell-Bindungskapazitäten der beiden Konjugate näher charakterisieren zu können. Die geringfügig höheren RFI-Werte der TCPP-WGA Konjugate im Vergleich zu TCCP-BSA weisen auf eine WGA-vermittelte Bindung an die Zelloberfläche hin, darüber hinaus bewies die 1,5-fach höhere zellgebundene Fluoreszenzintensität eine verbesserte Zell-Bindungskapazität von TCPP-WGA-Konjugaten im Vergleich zum lipophilen TCPP. Durch Visualisierung der Zellbindung der TCPP-Konjugate durch Mikroskopie ergab, dass nur TCPP-WGA-3 an den Zellgrenzen angereichert wird, während weder TCPP, TCPP-WGA-1 noch TCPP-BSA eine sichtbare Anlagerung zeigten. Nachdem eine Dunkeltoxizität für alle eingesetzten Probelösungen ausgeschlossen werden konnte, wurden die mit Photosensitizer behandelten Monolayer mit Weißlicht bestrahlt und bei 37°C inkubiert. Nach 60 Minuten konnte durch mikroskopische Analyse für TCPP-WGA-3 und nach 90 Minuten auch für TCPP-WGA-1 ein zytotoxischer Effekt durch Abrundung und Ablösen der adhärenten Caco-2 Zellen beobachtet werden, der zusätzlich durch Färben der Zellkerne toter Zellen bestätigt werden konnte. Insgesamt konnte in dieser Diplomarbeit gezeigt werden, dass die Effizienz von Photosensitizern durch zwei Parameter, einerseits eine gewisse minimale Hydrophilie zum Erreichen der Zellmembran in gelöster Form, und andererseits eine gewisse minimale Lipophilie zur Anlagerung bzw. Aufnahme in die Zelle, bestimmt wird. Um dies zu erreichen, konnte die Komplexbildung mit einem hochmolekularen hydrophilen Molekül wie Polystyrolsulfat ausgenützt werden. Um nicht nur die Hydrophilie, sondern auch die Anlagerung und Aufnahme des Photosensitizers in die Zelle zu erhöhen, wurde dieser mit hochmolekularen, cytoinvasiven Lektinen modifiziert. Beide Konzepte konnten erstmals in Ihrer Funktionalität bestätigt werden, jedoch sind noch viele und eingehendere Studien notwendig, bevor diese Photosensitizerkonjugate in der Therapie angewandt werden können.