Glukosemetabolismus im malignen Melanom
Creators: name: Herr, Felix
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: 2.1 Hintergrund und Ziele Der Energiemetabolismus von Tumorzellen ist dysreguliert und gewinnt in der onkologischen Forschung zunehmend an Relevanz. Aufgrund der „Warburg-Hypothese“, die eine verstärkte aerobe Glykolyse für Tumorzellen beschreibt, lässt sich schlussfolgern, dass sowohl der Glukose- als auch der Glykogenmetabolismus in diesen Zellen fehlreguliert ist. Der veränderte Energiemetabolismus könnte insbesondere dann relevant sein, wenn Melanomzellen nicht auf überlebenswichtige Nährstoffe zurückgreifen können (starvation) und sollte daher im Fokus zukünftiger Studien stehen. Des Weiteren zeigten frühere Untersuchungen die Aktivierung des Transkriptionsfaktors HIF-1 alpha (Hypoxie induzierter Faktor) in Melanomzellen bereits unter Normoxie sowie eine transkriptionelle Regulation von Genen des Glukose- und Glykogenmetabolismus durch HIF-1 alpha. Seit einiger Zeit wird die Existenz einer kleinen therapieresistenten Subpopulation von Tumorzellen, den Tumorstammzellen, diskutiert, bei denen der Energiemetabolismus ebenfalls fehlreguliert ist. Diese Tumorstammzellen ähneln in ihren Charakteristika den dormant Zellen, die sich in einem „Schlafzustand“ befinden und eine klinische Inapparenz vortäuschen können. Ziel dieser Arbeit ist es, im malignen Melanom die Dysregulation des Glykogen- und Glukosemetabolismus und eine mögliche Verbindung zu HIF-1 alpha und Tumorstammzellen zu analysieren. 2.2 Methoden Mit Hilfe der beiden Reportersysteme pAAV-CAG-iGlucoSnFR-TS und pcDNA3.1 FLII12Pglu 700uDelta6 wurde die Glukosekonzentration im intrazellulären Raum von Melanomzellen unter physiologischen Kultivierungsbedingungen und unter starvation (nährstoffarme Kultivierung) über mehrere Tage analysiert. Mittels Phasenkontrastmikroskopie wurde die Morphologie und mittels XTT-Assay die Proliferation der Tumorzellen unter starvation untersucht. Um den Glukoseverbrauch von Melanomzellen beurteilen zu können, wurde die Glukosekonzentration im extrazellulären Raum gemessen. Außerdem wurde das Verteilungsmuster von Glykogen im intrazellulären Raum unter physiologischen Bedingungen mittels PAS-Färbung (engl. für Periodsäure-Schiff-Reaktion) in vitro und in vivo (murines und humanes Melanomgewebe) analysiert. Die Veränderungen der Glykogenspeicher unter starvation wurden neben der PAS-Färbung mit dem Glycogen Assay Kit (Colorimetric) quantifiziert. Mit Hilfe von in silico (cDNA-Microarray) und in vitro (qRT-PCR) Analysen von Genen, die im Glukose- und Glykogenmetabolismus relevant sind, sollte eine potenzielle Fehlregulation im malignen Melanom verglichen mit Melanozyten ermittelt werden. Anschließend wurde eine funktionelle Analyse durchgeführt, bei der nach knockdown von Schlüsselgenen des Glykogenmetabolismus mit einem XTT-Assay die Proliferation und Viabilität (Zelllebensfähigkeit) unter starvation näher betrachtet wurde. Zusätzlich wurden dormant Tumorzellen (CIB-3D) hinsichtlich ihres Glykogen- und Glukosemetabolismus untersucht. Dafür wurden die Zellen PAS gefärbt und eine RNA-Seq durchgeführt. Außerdem wurde eine Ko-Färbung von PAS und HIF-1 alpha von humanem Melanomgewebe und Proteinfärbungen des Human Protein Atlas von HIF-1 alpha und Schlüsselgenen des Glykogenmetabolismus in Bezug auf das Verteilungs- und Intensitätsmuster verglichen. 2.3 Ergebnisse und Beobachtungen Hinsichtlich des Glukosemetabolismus in Melanomzellen konnte gezeigt werden, dass bei Kultivierung unter physiologischen Bedingungen die Glukosekonzentration im extrazellulären Raum abnahm, während sie im intrazellulären Raum konstant blieb. Auch unter starvation blieb die Glukosekonzentration im intrazellulären Raum stabil. Interessanterweise konnte jedoch ein heterogenes Verteilungsmuster der Glukosekonzentration zwischen den einzelnen Melanomzellen beobachtet werden. Starvation führte zu einer Abnahme der Proliferation und Zellzahl sowie einer veränderten Morphologie der Zellen. Unter starvation wurde Glukose nach Zugabe zu Melanomzellen direkt verstoffwechselt. Weitere in vitro und in vivo Untersuchungen demonstrierten, dass Glukose in Form von Glykogen in Melanomzellen gespeichert wird, zwischen einzelnen Melanomzellen heterogen verteilt ist und unter starvation verbraucht wird. In silico (cDNA-Microarrays) und in vitro (qRT-PCR) Analysen ergaben, dass wichtige Gene des Glukose- und Glykogenmetabolismus wie Glykogenphosphorylase B, Glycogenin 1 and 2, Glycogensynthase 1 and solute carrier family 2 member 1 (= GLUT1) in Primärtumor und Melanommetastasen im Vergleich zu Melanozyten hochreguliert sind. Bei einer funktionellen Analyse mittels in vitro knockdown der fehlregulierten Gene des Glykogenmetabolismus konnte keine verminderte Proliferation der Melanomzellen unter starvation festgestellt werden. In dormancy Melanomzellen wurde beobachtet, dass Gene des Glykogen- und Glukosemetabolismus hochreguliert sind und Glykogen in großen Mengen gespeichert wird. In vivo Untersuchungen von humanem Melanomgewebe zeigten ein ähnliches Verteilungsmuster von PAS-Signalen (Glykogen), Proteinfärbungen von Genen des Glykogenmetabolismus und HIF-1 alpha innerhalb der Tumorzellen. 2.4 Schlussfolgerungen und Diskussion Die vorliegenden Analysen legen dar, dass der Glukose- und Glykogenmetabolismus in Melanomzellen fehlreguliert ist und eine Rolle in der Tumorprogression und im Überleben der Tumorzellen spielt. Glukose- und Glykogenspiegel sind in Melanomzellen unterschiedlich hoch (Heterogenität), was den Rückschluss erlauben könnte, dass Melanomzellen mit hoher Glukose- und Glykogenkonzentration als „Versorgerzellen“ die Zellen mit niedriger unterstützen. Auch der Nachweis von Glykogen und die Hochregulation von Genen des Glykogenmetabolismus in dormant Zellen stärkt diese Hypothese. Die Glykogenanreicherung könnte in Zusammenhang mit der in früheren Studien dokumentierten Expression von HIF (Hypoxie-induzierter Faktor) in Melanomzellen unter Normoxie stehen. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass das Proteinfärbemuster von HIF in Melanomzellen ähnlich zu den von Glykogen und Glykogen- und Glukosemetabolismus relevanten Genen ist. Es konnte gezeigt werden, dass Melanomzellen unter starvation trotz eingeschränkter Proliferation ihre Glukoselevel im intrazellulären Raum stabil halten können. Das Proliferationsverhalten der Melanomzellen unter starvation scheint jedoch unabhängig von Genen des Glykogenmetabolismus zu sein, da sich die Proliferation unter knockdown nicht veränderte. Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit daraufhin, dass innerhalb der Melanomzellen eine Subpopulation von „Versorgerzellen“ mit hohen Glukose- und Glykogenkonzentrationen im Sinne eines Cancer-Stem-Cell-Phänotypen existiert