Molecular analysis and visualisation of adventitious root formation in rose (Rosa L.)
Creators: name: Wamhoff, David
Publisher: name: Hannover : Institutionelles Repositorium der Leibniz Universität Hannover
Year: 2024
Subjects: subject: adventitious root formation
subject: genome-wide association study
subject: hemicelluloses
subject: imaging
subject: marker-assisted selection
subject: root primordium
subject: Rosa hybrida
subject: Adventivwurzelbildung
subject: Bildgebung
subject: genomweite Assoziationsstudie
subject: Hemicellulosen
subject: markerge-stützte Selektion
subject: Wurzelprimordium
subject: Dewey Decimal Classification::500 | Naturwissenschaften::580 | Pflanzen (Botanik)

description: Roses (Rosa L.) are among the most important ornamental crops and of great importance in the market segments of cut flowers, garden and pot plants. Due to their highly heterozygous nature, roses must be propagated vegeta-tively to achieve true-to-type multiplication. Most cut and garden rose cultivars are still propagated by xenovegeta-tive propagation, which is labour-intensive and costly. Therefore, propagation by cuttings is of increasing interest to rose breeders. However, prerequisite for this is adventitious root (AR) formation, a complex multiphasic process that is under highly quantitative genetic control. In roses, huge genotypic differences between individual cultivars can be observed and some genotypes even do not form roots at all. Factors that limit AR formation are difficult to identify due to the complexity of the overall process, particularly in the early stages. Therefore, a better under-standing of the process of AR formation in roses on the molecular level and knowledge about the anatomical and biochemical characteristics in the different developmental stages is desirable. The aims of this study were to unravel possible constraints of AR formation in different developmental phases and to achieve a better understanding of the genetic control of this quantitative trait in rose. To characterise the genetic regulation of AR formation, existing genome-wide association studies (GWAS) in a population of 96 garden roses were followed up by analysing a larger number of genotypes and of cuttings per genotype to increase the power of the GWAS. Genotypic single nucleotide polymorphism (SNP) information generated with the 68k WagRhSNP Axiom® SNP array was available for the population of the 96 garden roses and a population of 96 cut roses. First, the popu-lations were characterised for their AR formation in vivo. The experiments were performed with stem cuttings in a hydroponic rooting system under greenhouse conditions for 6 weeks. Analyses of rooting percentage after 6 weeks, root number and root fresh mass revealed no significant associations, but several SNPs with strong allele dosage effects for these traits were identified, that were located in distinct peak regions. Of these, ten SNPs were located in the coding region of the putative phosphoinositide phosphatase SUPRESSOR OF ACTIN 9 (SAC9). This is the first di-rect evidence that the phosphoinositide (PI) signalling pathway may also be involved in the regulation of AR for-mation. For one of these SNPs - namely RhK5_69_1627P - an allele-specific PCR marker was derived and verified in an independent group of rose genotypes homozygous for this SNP. Thus, this allele-specific PCR marker can be used in rose breeding programs to improve AR formation by marker-assisted selection. In further GWAS analyses the early events in AR formation in vitro were investigated for 106 rose genotypes. The formation of root primordia (RP), AR formation and anatomical characteristics of the shoot base were correlated. Significant correlations were found for several rooting-associated traits with vasculature dimensions after 1 week of culture. In addition, it was observed that some genotypes showed RP in high numbers after 1 week, but low AR formation percentages after 3 weeks. GWAS analyses for traits at different stages of AR development showed a higher contribution of distinct genomic regions to phenotypic variation for traits at earlier developmental stages and identified nine SNPs to be significantly associated with different traits. The combination of early RP and later AR formation data as an index enabled to identify genomic regions and factors that potentially prevent RP from emer-gence. In addition, two SNPs located in homologues of genes that are involved in the PI signalling pathway showed strong allele dosage effects for RP/AR formation traits. The visualisation of the early stages in AR formation is of particular interest for genotypes with low rooting capacity, but challenging as most methods are destructive and do not allow observations over time. Magnetic resonance imaging was used to non-destructively visualise microstructures in AR formation already 3 days post excision. Both, the difficult-to-root genotype ᶦMariatheresiaᶦ (MT) and the easy-to-root genotype ᶦHerzogin Friederikeᶦ (HF) showed a pronounced formation of RP. Conspicuous differences in the MRI signal in the region of the shoot cortex in front of the RP referred to further investigation of the biochemical composition in this region of the shoot base. Spatially-resolved Fourier-transformed infrared spectroscopy revealed distinct differences in cell wall composition. In particular, absorbance for lignin and hemicelluloses were significantly higher for MT compared to HF. Thus, not the RP development limited the AR formation capacity in MT, but the emergence of RP was hindered by the altered composition and mechanical strength of the cell walls in regions of the cortex. In conclusion, by genetically dissecting AR formation using GWAS, this study contributed to a better understanding and potential improvement of AR formation in rose in breeding programmes and for the first time provided evi-dence of a possible role of the PI signalling pathway in AR formation. The combination of imaging techniques made it possible to identify anatomical and biochemical factors that limit AR formation, particularly in the early events of AR formation.
description: Die Rose (Rosa L.) ist eine der wichtigsten Zierpflanzen und von großer Bedeutung für die Marktsegmente Schnittblumen, Garten- und Topfpflanzen. Aufgrund ausgeprägter Heterozygotie müssen Rosen für eine sortenechte Vermehrung vegetativ vermehrt werden. Die meisten Schnitt- und Gartenrosensorten werden derzeit noch xenove-getativ vermehrt, was sehr zeit- und kostenintensiv ist. Daher ist die Vermehrung durch Stecklinge von zunehmen-dem Interesse. Die dafür erforderliche Bildung von Adventivwurzeln („adventitious roots“ = ARs) ist jedoch ein kom-plexes, mehrphasiges und hochgradig quantitativ vererbtes Merkmal. Rosen weisen große genotypische Unter-schiede für dieses Merkmal auf und einige Genotypen bewurzeln gar nicht. Die Faktoren, die die Bildung von ARs limitieren, sind aufgrund der Komplexität des Prozesses, insbesondere in den frühen Entwicklungsstadien schwer zu identifizieren. Ein besseres Verständnis der Regulation der Bildung von ARs auf molekularer Ebene und Einblicke in die phänotypischen Merkmale in den verschiedenen Entwicklungsstadien sind daher wünschenswert. Ziele dieser Arbeit waren, ein besseres Verständnis der genetischen Kontrolle des quantitativen Merkmals der AR-Bildung bei Rosen zu erlangen und potentielle Limitationen zu identifizieren. Um die genetische Regulation zu charakterisieren, wurden bestehende genomweite Assoziationsstudien (GWAS) zur AR-Bildung in einer Population von 96 Gartenrosen weiterverfolgt. Dabei wurden eine größere Anzahl Genotypen und Stecklinge je Genotyp analy-siert, um die Aussagekraft der GWAS-Ergebnisse zu erhöhen. Genotypische Informationen in Form von Single Nucle-otide Polymorphismen (SNPs), ermittelt mit dem 68k WagRhSNP Axiom® SNP-Array, standen bereits für 96 Garten-rosen und 96 Schnittrosen zur Verfügung. Die Genotypen wurden auf ihre Bewurzelungsfähigkeit in vivo charakteri-siert. Die Versuche wurden 6 Wochen lang mit Stecklingen in einem hydroponischen Bewurzelungssystem unter Gewächshausbedingungen durchgeführt. GWAS zur Bewurzelung nach 6 Wochen, Wurzelanzahl und Wurzelfrisch-masse brachten keine signifikant assoziierten SNPs hervor. Allerdings zeigten mehrere SNPs starke Alleldosiseffekte für diese Merkmale. Von diesen lagen zehn SNPs in der kodierenden Region des Gens SUPRESSOR OF ACTIN 9 (SAC9). Dies ist ein erster direkter Hinweis, dass der Phosphoinositid (PI) Signalweg auch in der Regulation der Aus-bildung von ARs involviert sein kann. Für den SNP RhK5_69_1627P wurden allelspezifische PCR-Primer abgeleitet und in einer unabhängigen Gruppe selektierter, für den SNP homozygoter Genotypen verifiziert. Dieser allelspezifi-sche PCR-Marker kann somit zur Selektion zur Verbesserung der Adventivwurzelbildung in Rosenpopulationen an-gewendet werden. In weiteren GWAS-Analysen wurden frühe Ereignisse der AR-Bildung in vitro für 106 Rosen-Genotypen untersucht. Die Bildung von Wurzelprimordien („root primordia“ = RP), die Bewurzelung und anatomische Merkmale der Sprossbasis wurden korreliert. Signifikante Korrelationen zwischen mehreren Merkmalen der RP- und AR-Bildung mit der räumlichen Ausdehnung der Leitgefäße nach einwöchiger Bewurzelung wurden gefunden. Einige Genotypen bildeten eine hohe Anzahl RP nach einer Woche aus, wiesen jedoch geringe Bewurzelungsprozente nach 3 Wochen auf. GWAS-Analysen für Merkmale verschiedener Entwicklungsstadien zeigten einen höheren Beitrag genomischer Regionen zur phänotypischen Variation für Merkmale früherer Entwicklungsstadien. Insgesamt neun SNPs assoziier-ten signifikant mit verschiedenen, teils mehreren Merkmalen. Die Kombination von Daten zur frühen RP- und späte-ren AR-Bildung in Form eines Index ermöglichte es, genomische Regionen und Faktoren zu identifizieren, die mög-licherweise das Auswachsen von RP verhindern. Darüber hinaus zeigten zwei SNPs, die in Homologen von Genen liegen, welche am PI-Signalweg beteiligt sind, starke Alleldosiseffekte für Merkmale der RP/AR-Bildung. Die Visualisierung früher Stadien der AR-Bildung ist besonders für Genotypen mit geringer Bewurzelungsfähigkeit von Interesse. Aufgrund der Destruktivität der meisten Methoden waren Beobachtungen an identischen Explantaten über die Zeit bisher nicht möglich. Mittels Magnetresonanztomographie konnten mikrostrukturelle Veränderungen während der AR-Bildung bereits nach 3 Tagen an In-vitro-Stecklingen zerstörungsfrei visualisiert werden. Sowohl für den schwer zu bewurzelnden Genotyp ᶦMariatheresiaᶦ (MT) als auch den leicht zu bewurzelnden Genotyp ᶦHerzogin Friederikeᶦ (HF) wurde die Entwicklung zahlreicher RP in der Sprossbasis gezeigt. Auffällige Unterschiede im MRT-Signal im Sprosscortex initiierten weitere Untersuchungen zur biochemischen Zusammensetzung in dieser Region der Sprossbasis. Die ortsaufgelöste Fourier-transformierte Infrarotspektroskopie zeigte Unterschiede in der Zell-wandzusammensetzung. Insbesondere die Absorptionswerte für Lignin und Hemicellulosen waren bei MT im Ver-gleich zu HF deutlich höher. Somit begrenzt nicht die RP-Entwicklung die Bewurzelung bei MT, sondern das Aus-wachsen von RP war wahrscheinlich durch die veränderte Zellwandzusammensetzung in bestimmten Regionen der Sprossbasis behindert. Zusammenfassend trug diese Studie durch die genetische Analyse mittels GWAS zu einem besseren Verständnis und zur Verbesserung der AR-Bildung bei Rosen in Zuchtprogrammen bei und lieferte erstmals Hinweise auf eine mögliche Rolle des PI-Signalweges in der AR-Bildung. Darüber hinaus ermöglichte die Kombination moderner bild-gebender Verfahren die zerstörungsfreie Identifizierung anatomischer und biochemischer Faktoren, die zur Limita-tion der AR-Bildung beitragen können und das insbesondere in den frühen Stadien.