Cellular heterogeneity in the DNA damage response is determined by cell cycle specific p21 degradation
Creators: name: Sheng, Caibin
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2018
Subjects: subject: Heterogenität
subject: Einzelzellen
subject: p21 Dynamiken
subject: Zellzyklus
subject: heterogeneity
subject: single cell
subject: p21 dynamics
subject: cell cycle
subject: 570 Biowissenschaften; Biologie
subject: WG 3290
subject: WE 2500

description: Die zelluläre Antwort auf einen spezifischen Stimulus wird nicht nur durch den Stimulus selbst, sondern auch von dem Zustand der Zelle bestimmt. Um ein tieferes Verständnis für die Variabilität in einer Zellpopulation zu gewinnen, ist es notwendig, die verschiedenen zellulären Antworten mit definierten zellulären Zuständen zu verbinden. In dieser Arbeit wurde ein System etabliert, welches es ermöglicht, die zelluläre Antwort auf DNA-Schäden und den Einfluss unterschiedlicher zellulärer Zustände zu studieren sowie die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Im Zuge dessen wurde eine auf CRISPR/Cas9 basierende Methode entwickelt, mit der Fluoreszenzreporter für endogene Signalproteine in nicht transformierten Brustepithelzellen (MCF10A) generiert wurden. Anhand dieses Reportersystems konnte durch time-lapse Mikroskopie die Dynamik des Tumorsuppressors p53 und eines seiner Zielgene, des Zellzyklusinhibitors p21, verfolgt werden. Dabei wurde deutlich, dass die p21 Antwort der einzelnen Zellen auf DNA-Schäden sehr heterogen ausfällt. Über eine Form-basierte Gruppierungsmethode wurden vier verschiedene Subpopulationen mit charakteristischen p21 Dynamiken identifiziert. Um den Einfluss der Zellzyklusphase zu untersuchen, wurde die Zellteilung vor Bestrahlung analysiert und so Rückschlüsse auf die initiale Zellzyklusphase gezogen. 24h nach Bestrahlung wurde ein EdU labeling durchgeführt und der Zellzyklus mittels semi-supervised Klassifizierung bestimmt. Durch Einführen einer Mutation in der Bindedomäne von p21 wurde gezeigt, dass proliferating cellular nuclear antigen (PCNA) für die Heterogenität der p21 Antwort verantwortlich ist. Alles in allem bietet mein Projekt eine Pipeline, um auf Einzelzellebene zu erforschen, wie zelluläre Antworten durch den Zellzyklus beeinflusst werden. Dieser Ansatz könnte zukünftig Anwendung in der Erforschung von Medikamentenresistenz finden, zumal zelluläre Heterogenität in der Tumortherapie zu fractional killing führt.
description: The cellular response to a given stimulus is not only governed by the stimulus itself, but also depends on the state of the cells. However, it remains obscure how cellular states influence cell fate decisions. In this thesis, I established a framework to study how the cellular response to DNA damage is affected by varying cell states and to identify the underlying molecular mechanisms. To this end, I generated fluorescent reporters using CRISPR/Cas9 in non-transformed breast epithelial cells (MCF10A) and measured the dynamics of the tumor suppressor p53 and one of its target genes, the cell cycle inhibitor p21 using time-lapse microscopy. I found DNA damage induced highly diverse p21 dynamics in individual cells. A shape-based clustering identified four subpopulations of characteristic p21 dynamics. To examine the source of variability, I analyzed initial cell cycle states by monitoring cell division prior to damage, and determined final cellular state by EdU labelling and a semi-supervised classification 24h post damage. The results suggested that p21 dynamics depend on cell cycle phases and determine cell cycle progression. Furthermore, proliferating cellular nuclear antigen (PCNA)--a cell cycle dependent factor-- was shown to determine p21 heterogeneity using a mutant p21 deficient in interaction with PCNA. Overall, my project provides a pipeline to study at the single cell level how cellular response is affected by cellular states. Considering that cellular heterogeneity leads to fractional killing in tumor therapies, this approach also suggests future application on studying drug-resistance in cancer therapy.