title: Development and characterization of a 3D printed multi-layer composite implant to improve bone regeneration in critical size defects
title: Entwicklung und Untersuchung eines 3D gedruckten Vielschicht-Komposit-Implantates zur verbesserten Knochenregeneration von Defekten kritischer Größe
Creators: name: Bednarzig, Vera
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 62 Ingenieurwissenschaften :: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten

description: Further development of skull implants for critical size defects is crucial to improve the patient’s quality of life by enhancing the chance of complete healing. Essential factors for an “ideal” implant are a close simulation of the natural bone tissue and its properties. Further, fast and cost-efficient production is mandatory. Another essential point is the need to achieve easy adaptability of the implant to the defect, in terms of dimension and curvature, during surgery under sterile conditions using surgical instruments. The 3-dimensional (3D) printing method allows combining various materials at defined positions in one printing process without post-processing. In this way, it is possible to generate a multi-layer implant adaptable in composition and 3D structure to the required individual properties. Five different layers of three materials are used in the implant: a barrier layer of pre-crosslinked alginate, a layer suitable to induce for bone regeneration using the fillers hydroxyapatite or bioactive glass, and a titanium mesh already in medical use. In the present work, alginate, a natural hydrogel, is used as a base for the various printed layers. Hydrogels have the property of swelling in aqueous solutions, allowing a direct and tight connection between the implant and natural bone. This should prevent the formation of connective tissue. To adapt the composition of the alginate base to the individual layers’ mechanical and biological requirements, pretreatment and the addition of fillers were carried out. The generated structures were crosslinked after the printing process by divalent cations, calcium (Ca2+) and barium (Ba2+), to improve the stability of the hydrogels and their composites. Ba2+ ions obtained, in all studies, higher strength and degradation resistance due to the higher affinity to alginate chains’ crosslinking. In addition, the use of Ba2+ ions resulted in barium-salt formation due to the interaction with ions in the used deposition medium on the surface of all printed materials. To function as a barrier layer for defined bone regeneration and the prevention of fibroblast ingrowth into the implant, the bioinert alginate was successfully pre-crosslinked by calcium carbonate (CaCO3) and glucono-delta-lactone (GDL). This process significantly improved the printability of the material and the dimensional stability of the printed structure after post-crosslinking with divalent ions. The densely printed membranes were investigated chemically, physically and biologically. Regardless of the post-crosslinking ions, membranes were easy to handle, stable and adaptable in their geometric dimensions. The inert character of the material and its biocompatibility could be confirmed in direct and indirect cell studies with pre-osteoblasts, a crucial factor for the application as a boundary layer. In the bone regeneration layer, angular bioactive glass particles (13-93, BG composition [wt%]: 53 % SiO2, 6 % Na2O, 12 % K2O, 5 % MgO, 20 % CaO, 4 % P2O5) (particle size: 40-71 µm) and round hydroxyapatite particles (particle size: 49 ± 12 µm) were added to the alginate matrix as filler. Bioactive glasses and hydroxyapatite proved an outstanding success in numerous studies for application in bone regeneration. For the formation of new bone tissue, the 3D printed scaffolds must offer, among other features, an interconnected pore structure suitable for cell adhesion, proliferation and vascularization of the implant. Precisely printable composites could be generated with both fillers, allowing printing of scaffolds with suitable pore size, connectivity and stability. An angle change of 60° between each printed layer ensured a strong bond and suitable porosity (hydroxyapatite composite: ~48 %, bioactive glass composite: 52-54 %). Mechanical tests confirmed sufficient stiffness and flexibility of the structures after crosslinking with Ca2+ and Ba2+ ions. The hydroxyapatite-based systems were also combined with gelatin (type A), crosslinked with microbial transglutaminase (mTG). This further improved the printability, stiffness, and the adhesion and proliferation of MC3T3-E1 cells by introducing the RGD sequence. Nevertheless, the bioactive glass-based scaffolds showed superior properties in stiffness, degradation resistance, cell adhesion, and proliferation compared to hydroxyapatite composites. Acellular in vitro bioactivity studies proved for both fillers the formation of hydroxyapatite on the surface of the printed structures and thus their bioactive potential. However, this was only detectable for Ca2+ crosslinking. Ba2+ ions seemed to cause a limitation of the materials’ bioactivity. The obtained results in terms of fabrication, scaffold properties and biological suitability provide promising results for both composite systems. To fabricate an implant prototype from the combination of all individual layers, the printing parameters were optimized using an extrusion-based printing system with mechanical feed. This system enabled the generation of an implant with an area of 90x90 mm2 in a single process step. The finished implant comprises four printed layers (two material compositions) in combination with a titanium mesh already in medical use. The mesh should improve the implant’s stability and enable the implant’s attachment to healthy bone. The combination of pre-crosslinked alginate (barrier) and the hydroxyapatite composite (bone regeneration) showed promising results after crosslinking with Ca2+ ions. Initial compression tests revealed a Young’s modulus of 83 ± 4 kPa, excellent layer connection during tensile tests (52 ± 7 kPa stress at break) and high flexibility of the printed structure. Preliminary direct cell studies further indicated good cell adhesion on the bone regeneration layer without impact on the inert character of the barrier material. No negative interaction could be found between the different materials in the investigated period. Further, the combination with the titanium-mesh to a multi-layer implant prototype proved sufficient stability of all material compositions already during the printing process, preventing the sinking of subsequent printed layers into the previous ones. The prototype further demonstrated easy manageability and adaptability to curvatures and size without delamination, closure of pores or breakage after crosslinking, fulfilling the necessary requirements. Therefore, the generated prototype for the regeneration of critical size skull defects should be further investigated also concerning the application of the bioactive glass-based composite as a layer for bone regeneration. In conclusion, combining different biomaterial layers is a promising method to generate improved implants that can be applied in the field of critical-size bone defects. In this research, for the first time, the used combination of materials and layers forming a 3D printed implant was realized to extend and improve existing implants in the market. Furthermore, the layers can also be applied individually, especially in non-load bearing areas. The approach followed in this project was thus successful to obtain layered composite scaffolds for skull defect treatment.
description: Die Weiterentwicklung von Schädelimplantaten für die Anwendung im Bereich von Defekten kritischer Größe ist ausschlaggebend, um die Lebensqualität des Patienten und die Chance auf vollständige Heilung weiter zu verbessern. Wichtige Faktoren für ein solch „ideales“ Implantat sind eine möglichst authentische Nachahmung des natürlichen Knochengewebes und dessen Eigenschaften, sowie eine schnelle und kosteneffiziente Herstellung. Hierbei ist es zudem maßgeblich, das Implantat während der Operation unter sterilen Bedingungen einfach und schnell an den Defekt, in seiner Abmessung und Krümmung, mit Hilfe von Operationsbesteck anpassen zu können. Das Verfahren des 3-dimensionalen (3D) Druckens ermöglicht es verschiedenste Materialien an definierten Positionen miteinander in einem Druckprozess, ohne Nachbearbeitung, zu kombinieren. Auf diese Weise ist es möglich ein mehr-lagiges Implantat zu generieren, welches in Zusammensetzung und 3D Struktur an die benötigten individuellen Eigenschaften und Anforderungen angepasst werden kann. Anwendung im Implantat finden fünf Lagen aus drei verschiedene Materialien, eine Grenzschicht aus vor-vernetztem Alginat, einer geeigneten Schicht zur Knochenregeneration durch die Füllstoffe Hydroxylapatit und bioaktivem Glas, sowie einem bereits in medizinischer Anwendung befindlichem Titan-Mesh. In der vorliegenden Arbeit wird Alginat, ein natürliches Hydrogel, als Basis für die verschiedenen gedruckten Schichten verwendet. Hydrogele besitzen die Eigenschaft in wässrigen Lösungen zu quellen, wodurch eine direkte und dichte Verbindung zwischen Implantat und natürlichem Knochen geschaffen werden kann, was wiederum die Bildung von Bindegewebe verhindern soll. Um die Zusammensetzung des Grundmaterials an die mechanischen und biologischen Anforderungen der einzelnen Schichten anzupassen, wurde das verwendete Alginat vorbehandelt oder durch Füllstoffe individualisiert. Zur Verbesserung der Stabilität der Hydrogele und deren Komposite wurden die generierten Strukturen nach dem Druckvorgang durch die bivalenten Kationen, Kalzium (Ca2+) und Barium (Ba2+) quervernetzt. Während aller durchgeführten Studien konnte mit Ba2+ Ionen eine höhere Festigkeit und Degradationsbeständigkeit durch dessen höhere Affinität, zur Vernetzung der Alginat-Ketten erzielt werden. Zudem führte die Verwendung von Ba2+ Ionen zur Bildung von Barium-Salzen durch die Wechselwirkung mit Ionen in den verwendeten Auslagerungsmedien an der Oberfläche aller gedruckten Materialien. Für die Funktion als Grenzschicht zur definierten Knochenregenation und zur Vermeidung des Einwachsens von Fibroblasten in das Implantat, wurde das bioinerte Alginat durch Kalzium-Carbonate (CaCO3) and Glucono-delta-Lacton (GDL) erfolgreich vorvernetzt. Hierdurch konnte die Druckbarkeit des Materials, sowie die Formstabilität der gedruckten Struktur nach der Vernetzung mit bivalenten Ionen signifikant verbessert werden. Die so hergestellten, dicht gedruckten Membranen wurden sowohl chemisch als auch physikalisch und biologisch untersucht. Unabhängig von den verwendeten Ionen zur Nachvernetzung, waren die Membranen einfach zu handhaben, stabil und anpassbar in ihren geometrischen Abmessungen. Der inerte Charakter des Materials sowie dessen Biokompatibilität konnte in direkten und indirekten Zellstudien mit Pre-Osteoblasten bestätigt werden, wie es für die Anwendung als Grenzschicht ausschlaggebend ist. In der Knochenregenerations-Schicht wurde der Alginat-Matrix zum einem kantige bioaktives Glas-Partikel (13-93, BG Zusammensetzung [wt%]: 53 % SiO2, 6 % Na2O, 12 % K2O, 5 % MgO, 20 % CaO, 4 % P2O5) (Partikelgröße: 40-71 µm), zum anderen runde Hydroxylapatit-Partikel (Partikelgröße: 49 ± 12 µm) als Füllstoff hinzugefügt. Bioaktive Gläser sowie Hydroxylapatit zeigten in zahlreichen Studien herausragende Erfolge für die Anwendung im Bereich der Knochenregenration. Zur erfolgreichen Neubildung von Knochengewebe müssen die 3D gedruckten Scaffolds unter anderem eine interkonnektierende Porenstruktur aufweisen, die sowohl für Zelladhäsion und Proliferation als auch für die Vaskularisation des Implantates geeignet ist. Es konnten mit beiden Füllstoffen präzise druckbare Komposite generiert werden, wodurch 3D Scaffolds mit geeigneter Porengröße, Konnektivität und Stabilität gedruckt werden konnten. Ein Druckwinkel von 60° zwischen den einzelnen gedruckten Lagen sorgte für eine feste Verbindung, sowie für geeignete Porosität (Hydroxylapatit-Komposit: ~48 %, Bioaktives Glas-Komposit: 52-54 %). Mechanische Untersuchungen zeigten zudem ausreichende Steifigkeit und Flexibilität der Strukturen nach der Vernetzung mit Ca2+ und Ba2+ Ionen. Die auf Hydroxylapatit basierten Systeme wurden zudem mit Gelatine (Typ A) kombiniert und diese mit mikrobieller Transglutaminase (mTG) vernetzt. Hierdurch konnte die Druckbarkeit und Steifigkeit sowie, die Zelladhäsion und Proliferation der MC3T3-E1 Zellen durch das Einbringen der RGD-Sequenz, weiter verbessert werden. Dennoch zeigten die auf bioaktivem Glas basierenden Scaffolds im Bereich der Steifigkeit, Degradationsbeständigkeit, Zelladhäsion und Proliferation überlegene Eigenschaften im Vergleich zu Hydroxylapatit-Kompositen. Azelluläre in vitro Bioaktivitätsstudien bewiesen für beide Füllstoffe die Bildung von Hydroxylapatit an der Oberfläche der gedruckten Strukturen und damit deren bioaktives Potential. Dies war jedoch nur bei Vernetzung mit Ca2+ Ionen nachweisbar, wobei Ba2+ Ionen eine Einschränkung der Bioaktivität zu bewirken schienen. Die erzielten Ergebnisse im Bereich der Fabrikation, Scaffold Eigenschaften und biologischer Eignung liefern vielversprechende Ergebnisse für beide Komposit-Systeme. Zur Fertigung eines Implantat-Prototypen aus der Kombination aller einzelnen Schichten, wurden die Druckparameter auf ein extrusionsbasiertes Drucksystem mit mechanischem Vorschub optimiert. Durch dieses System war er möglich, Implantate mit einer Fläche von 90x90 mm2 in einem einzelnen Prozessschritt zu verwirklichen. Das fertige Implantat setzt sich aus insgesamt vier gedruckten Schichten (zwei Materialzusammensetzungen) in Kombination mit einem bereits in medizinischer Anwendung befindlichen Titan-Mesh zur Verbesserung der Stabilität und zur Befestigung des gesamten Implantates am gesunden Knochen zusammen. Die Kombination aus vorvernetztem Alginat (Grenzschicht) und dem Hydroxylapatit-Komposit (Knochenregeneration) zeigte nach der Vernetzung mit Ca2+-Ionen vielversprechende Ergebnisse. Erste mechanische Untersuchungen ergaben einen E-Modul von 83 ± 4 kPa, einen hervorragenden Schichtverbund bei Zugversuchen (52 ± 7 kPa Bruchspannung) und eine hohe Flexibilität der gedruckten Struktur. Vorläufige direkte Zellstudien deuteten außerdem auf eine gute Zelladhäsion auf der Knochenregenerationsschicht hin, ohne dass der inerte Charakter des Barrierematerials beeinträchtigt wurde. Während des Untersuchungszeitraums konnten keine negativen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Materialien festgestellt werden. Die Kombination mit dem Titan-Mesh zu einem mehrschichtigen Implantat-Prototypen bewies zudem eine ausreichende Stabilität aller Materialzusammensetzungen bereits während des Druckprozesses, da ein Einsinken nachfolgender gedruckter Schichten in die vorherige Lage verhindert wurde. Der Prototyp erwies sich zudem als leicht handhabbar und anpassungsfähig in Krümmungen und Größe, ohne dass es zu Delaminationen, Porenverschluss oder Brüchen nach der Vernetzung kam. Der generierte Prototyp erfüllte somit die notwendigen Voraussetzungen. Daher sollte der erstellte Prototyp für die Regeneration von Schädeldefekten kritischer Größe auch hinsichtlich der Anwendung des bioaktiven Glas basierten Komposits als Schicht für die Knochenregeneration weiter untersucht werden. Zusammenfassend ist die Kombination verschiedener Lagen von Biomaterialien eine vielversprechende Methode verbesserte Implantate zu generieren, welche im Bereich von Knochendefekten kritischer Größe Anwendung finden können. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die verwendete Kombination aus Materialien und Lagen zu einem 3D gedruckten Implantat verwirklicht, um die auf dem Markt bereits existierenden Implantate zu erweitern und zu verbessern. Des Weiteren können die Schichten auch einzeln Anwendung finden, besonders in nicht-lastragenden Bereichen. Der in diesem Projekt verfolgte Ansatz mehrschichtige Komposit-Implantate für die Behandlung von Schädeldefekten zu generieren war somit erfolgreich.