Hyaluronic acid as potential macromolecular crowding agent in equine stem cell culture
Creators: name: Garnica Gálvez, Sergio S.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Υαλουρονικό οξύ
Παράγοντας μακρομοριακού συνωστισμού
Βλαστοκυττάρων αλόγου
Εξωκυτταρική μήτρα
Hyaluronic acid
Macromolecular crowding
Equine stem cells
Extracellular matrix
Ácido hialurónico
Células madre equinas
Matriz extracelular

description: Οι μυοσκελετικοί τραυματισμοί είναι ένα ανεκπλήρωτο κλινικό αποτέλεσμα με αρνητικό αντίκτυπο στο σύστημα υγειονομικής περίθαλψης του ανθρώπου και στη βιομηχανία αλόγων, ιδιαίτερα στα άλογα ιπποδρομιών. Τα ισοδύναμα αυτοσυναρμολογούμενων ιστών χωρίς ικρίωμα μπορούν να ξεπεράσουν τα προβλήματα που προκύπτουν από τη χρήση βιοϋλικών στην αναγεννητική ιατρική, εκμεταλλευόμενοι την ικανότητα των εγγενών κυττάρων να συνθέτουν μια φυσική εξωκυτταρική μήτρα (ECM) με κατάλληλη στοιχειομετρία. Ωστόσο, η καθυστερημένη εναπόθεση ECM in vitro λόγω των τρεχουσών υποτυπωδών συνθηκών αραιωμένης καλλιέργειας αποτελεί μειονέκτημα για την κατασκευή υποκατάστατων ιστών. Επιπλέον, η ex vivo καλλιέργεια ενηλίκων κυττάρων, μακριά από το φυσιολογικό μικροπεριβάλλον των ιστών, οδηγεί σε φαινοτυπική μετατόπιση και γήρανση. Ο μακρομοριακός συνωστισμός (MMC), ένα βιοφυσικό φαινόμενο που βασίζεται στην αρχή της επίδρασης αποκλεισμένου όγκου, θα μπορούσε να είναι ένα πιθανό εργαλείο για την επιτάχυνση της εναπόθεσης ECM σε συνδυασμό με μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα (MSCs), τα οποία μπορεί να λύσουν τα προβλήματα που σχετίζονται με τα ενήλικα κύτταρα λόγω τους υψηλότερους ρυθμούς πολλαπλασιασμού, τις αποδόσεις εκχύλισης και τη δυνατότητα διαφοροποίησης. Επιπρόσθετα, τα άλογα θεωρούνται τα καταλληλότερα μεγάλα μοντέλα ζώων λόγω των αναλογιών που βρίσκονται σε μυοσκελετικές κακώσεις και επίσης, οι ασθενείς των ιπποειδών, καθώς και των ανθρώπων, χρειάζονται περιόδους αποκατάστασης. Σε αυτήν την πειραματική μελέτη, διερευνήσαμε τη δυνατότητα του υαλουρονικού οξέος (ΗΑ), ενός υδροσκοπικού φυσικού πολυμερούς, ως νέου παράγοντα μακρομοριακού συνωστισμού (MMC) σε καλλιέργειες MSC ιπποειδών, σε σύγκριση με άλλους δύο συνήθως χρησιμοποιούμενους crowders: carrageenan και Ficoll®. Αναπτύχθηκε ένας πρώτος έλεγχος σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που προέρχονται από λιπώδη ιστό (eADSCs) υπό συνθήκες MMC με διαφορετικά μοριακά βάρη (MWs) και συγκεντρώσεις ΗΑ. Ωστόσο, παρόλο που το ΗΑ έδειξε δυναμικό ως παράγοντας MMC, καμία από τις δοκιμασμένες συνθήκες δεν είχε καλύτερη απόδοση του Ficoll® ούτε της καρραγενάνης στην εναπόθεση κολλαγόνων I, III και IV. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ένας δεύτερος έλεγχος με τα ίδια διαλύματα HA σε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα που προέρχονται από μυελό των οστών (eBM-MSCs) με βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα σε eADSC, αλλά λήφθηκαν παρόμοια αποτελέσματα. Προηγούμενες μελέτες, υποστηριζόμενες από βιοφυσικές αναλύσεις, έχουν αποκαλύψει ότι οι επιδράσεις του MMC στην ενίσχυση της εναπόθεσης ECM συσχετίζονται με υψηλή πολυδιασπορά και αρνητικό φορτίο. Ως εκ τούτου, διαφορετικοί συνδυασμοί HA MWs κατασκευάστηκαν και δοκιμάστηκαν σε eBM-MSCs, που οδήγησαν σε υψηλότερη εναπόθεση κολλαγόνων III, IV, VI και λαμινίνης σε σύγκριση με τα απλά διαλύματα HA, ειδικά με τον συνδυασμό 10 mg/ml 60 kDa HA + 10 mg/ ml 100 KDa ΗΑ. Τέλος, η επίδραση του MMC στη διαφοροποίηση eBM-MSC αποκάλυψε ότι το ΗΑ ήταν ο πιο αποτελεσματικός ενισχυτής για την οστεογένεση, η καραγενάνη για τη χονδρογένεση και το Ficoll® για τη λιπογένεση όταν προστέθηκε στα μέσα επαγωγής. Συλλογικά, τα δεδομένα που ελήφθησαν υπογραμμίζουν τη σημασία της κατανόησης των ειδικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ των στρωμάτων συνωστισμού και των στρωμάτων τύπου κυττάρου προκειμένου να επιλεχθούν και να βελτιστοποιηθούν οι συνθήκες MMC για τη μηχανική ιστών.
description: Musculoskeletal injuries are an unmet clinical outcome with a negative impact in human healthcare system and in horse industry, especially racehorses. Scaffold-free self-assembled tissues equivalents may overcome the problems derived from the use of biomaterials in regenerative medicine by taking advantage of the intrinsic cells’ ability to synthesize a native extracellular matrix (ECM) with a proper stoichiometry. However, the delayed ECM deposition in vitro due to the current rudimentary diluted culture conditions is a handicap for tissue surrogates’ fabrication. Furthermore, ex vivo culture of adult cells, far from tissue physiological microenvironment, leads to phenotypic drift and senescence. Macromolecular crowding (MMC), a biophysical phenomenon based on the principle of the volume-excluded effect, could be a potential tool to accelerate ECM deposition in combination with mesenchymal stem cells (MSCs), which may solve the issues related to adult cells due to their higher proliferation rates, extraction yields and differentiation potential. Additionally, horses are considered the most appropriate large animal models due to the analogies found in musculoskeletal injuries and also, equine, as well as human, patients require rehabilitation periods. In this experimental study, we investigated the potential of hyaluronic acid (HA), a hydroscopic natural polymer, as a novel macromolecular crowding (MMC) agent in equine MSC cultures, compared to other two customarily used crowders: carrageenan and Ficoll®. A first screening was developed in equine adipose-derived mesenchymal stem cells (eADSCs) under MMC conditions with different molecular weights (MWs) and concentrations of HA. However, although HA showed potential as an MMC agent, none of the tested conditions outperformed Ficoll® neither carrageenan effects on collagens I, III and IV deposition. Subsequently, a second screening with the same HA solutions was performed in equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (eBM-MSCs) based on the previous results in eADSCs, but similar outcomes were obtained. Previous studies, supported by biophysical analyses, have revealed that the effects of MMC on enhancing ECM deposition are correlated with high polydispersity and negative charge. Therefore, different HA MWs combination were fabricated and tested in eBM-MSCs, which resulted in higher collagens III, IV, VI and laminin deposition compared to HA single solutions, especially with the combination of 10 mg/ml 60 kDa HA + 10 mg/ml 100 KDa HA. Finally, the influence of MMC in eBM-MSC differentiation revealed that HA was the most efficient enhancer for osteogenesis, carrageenan for chondrogenesis and Ficoll® for adipogenesis when added to the induction media. Collectively, the data obtained highlights the importance of understanding the specific interactions between crowders and cell-type layers in order to choose and to optimize MMC conditions for tissue engineering.