title: Einfluss von PACAP (Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide) bzw. des PACAP Rezeptors PAC1 auf Metabolismus, Morphologie und Expression proinflammatorischer / oxidativen Stress -relevanter Proteine/Zytokine in der Leber bei 20 Wochen Cholesteringefütterten ApoE-/- Mäusen
Creators: name: Puffert, Resa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: PACAP liver immunohistochemical cholesterol triglycerides amino acids
PACAP Leber Immunhistochemie Cholesterin Triglyzeride Aminosäuren
PACAP Leber
Medical sciences Medicine
Medizin

description: Die koronare Herzkrankheit ist seit vielen Jahren eine der Haupttodesursachen in den Industrienationen. Die Ursache für Ischämien und Infarkte stellen hierbei Gefäßveränderungen durch Atherosklerose dar. Die therapeutische Behandlung sowie Prävention stellen die Wissenschaft weiterhin vor Herausforderungen, da immer noch nicht alle pathophysiologischen Mechanismen bekannt sind. Eine entscheidende Rolle bei der Atheroskleroseentstehung spielen jedoch der Lipidstoffwechsel, sowie PACAP und ApoE. Da die Leber eine zentrale Funktion im Fettstoffwechsel einnimmt, sowie systemische Entzündungsreaktionen und die Entstehung der Atherosklerose beeinflusst, sollte zum Verständnis des Krankheitsbildes ebenfalls der Einfluss von PACAP, dem PACAP-Rezeptor PAC1 und ApoE auf den Leberstoffwechsel untersucht werden. PACAP ist ein autonomer Neurotransmitter, der zur Familie des Glukagons, Sekretins, VIP sowie des GHRH gehört und über die PAC1-, VPAC1- und VPAC2-Rezeptoren sowohl immunmodulatorisch und antiapoptotisch als auch modulatorisch auf Kreislauf und Metabolismus wirkt. Die vorliegende Dissertation soll dieses bisher wenig erforschte Thema näher untersuchen und ein besseres Verständnis für den Einfluss von PACAP und PAC1 auf den Leberstoffwechsel vermitteln. Hierfür wurden vier verschiedene Genotypen verwendet: Wildtyp-, ApoE-/--, PACAP-/-/ApoE-/-- und PAC1-/-/ApoE-/--Mäuse. Diese wurden für 20 Wochen mit cholesterinreichem Futter versorgt. Die Lebern der Mäuse wurden durch immunhistochemische Färbungen im Hinblick auf proinflammatorische und metabolische Marker untersucht. Biochemische Untersuchungen konnten zusätzlich einen Überblick über den metabolischen Status der Leber geben. Die Arbeit zeigte bei ApoE-/--Mäusen 8,9-fach höhere Plasmacholesterinspiegel als bei Wildtyp-Mäusen und bei PACAP-/-/ApoE-/--Mäusen 1,5-fach höhere Plasmatriglyzeridspiegel als bei ApoE-/--Mäusen. Gleichzeitig war die hepatische Cholesterinkonzentration bei ApoE-/--Mäusen 2,6-fach höher als bei Wildtyp-Mäusen, aber bei PACAP-/-/ApoE-/--, sowie PAC1-/-/ApoE-/--Mäusen 54,6 % bzw. 56,9 % geringer als bei ApoE-/--Mäusen. Die hepatische Triglyzeridkonzentration war bei PACAP-/-/ApoE-/--Mäusen um 73,4 % höher als bei ApoE-/--Mäusen. Die Konzentration an proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren im Lebergewebe von ApoE-/--Mäusen war um 84,5 % bzw. 83,8 % geringer als bei Wildtyp-Mäusen. Das Lebergewebe der PAC1-/-/ApoE-/--Mäuse zeigte um 21,3 % geringere Konzentrationen an nicht-proteinogenen Aminosäuren als bei ApoE-/--Mäusen. Bei ApoE-/--Mäusen zeigten sich im Lebergewebe Hydroxyprolinkonzentrationen, während die Konzentrationen bei Wildtyp-Mäusen unter der Nachweisgrenze lagen. PACAP-/-/ApoE-/--Mäuse hatten um 24,4 % geringere hepatische Asparaginsäurekonzentrationen als ApoE-/--Mäuse und um 37,5 % höhere hepatische Tyrosinkonzentrationen als ApoE-/--Mäuse. Die PAC1-/-/ApoE-/--Mäuse zeigten um 25,8 % geringere Ureakonzentrationen, um 26,3 % niedrigere Threoninkonzentrationen, um 23,8 % niedrigere Asparaginkonzentrationen und um 15,1 % niedrigere Ornithinkonzentrationen im Lebergewebe als ApoE-/--Mäuse. Die GSH- und rGSH-Konzentrationen im Lebergewebe der ApoE-/--Mäuse waren um 30,5 % bzw. 32,8 % höher als bei Wildtyp-Mäusen, während auch der rGSH2/GSSG-Quotient um 95,4 % höher war als bei Wildtyp-Mäusen. PAC1-/-/ApoE-/--Mäuse hatten um 18,6 % niedrigere GSH- und um 19,0 % niedrigere rGSH-Konzentrationen im Lebergewebe als ApoE-/-- Mäuse. Die immunhistochemischen Analysen zeigten eine 2,1-fach höhere Dichte an CD68-positiven Makrophagen um die hepatischen Glisson Trias von ApoE-/--Mäusen als bei Wildtyp-Mäusen, wobei auch die Dichte der MOMA-2-positiven Makrophagen um die Glisson Trias 3,5-fach höher war als bei Wildtyp-Mäusen. Auch die Dichte an COX-2-positiven Zellen war bei ApoE-/--Mäusen um die Glisson Trias 1,5-fach höher als bei Wildtyp-Mäusen. PACAP-/-/ApoE-/--Mäuse zeigten im Bereich der Glisson Trias eine nicht signifikant 1,7-fach höhere Dichte an IL-1β-positiven Zellen als ApoE-/--Mäuse. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass eine PACAP-Defizienz eine Hypertriglyzeridämie sowie erhöhte hepatische Triglyzeridkonzentrationen bewirken könnte. Ob PACAP unter physiologischen Bedingungen die plasmatische und hepatische Triglyzeridkonzentration senken könnte bleibt noch unklar. Diese Feststellung eröffnet neue Möglichkeiten, um therapeutische Ansätze für Hypertriglyzeridämie-Erkrankungen zu entwickeln, die bei bestimmten ApoE-Subtypen auftreten können. Gleichzeitig geben unsere Daten starke Hinweise darauf, dass PACAP und sein Rezeptor an der Cholesterinaufnahme in die Leber beteiligt sind. Aus therapeutischer Sicht könnte durch PACAP- oder PAC1-Antagonisten die Entstehung einer cholesterinbedingten Leberverfettung reduziert werden. Mögliche Nebenwirkungen könnten dann jedoch erhöhte plasmatische und hepatische Triglyzeridkonzentrationen sein. Außerdem lassen unsere Ergebnisse vermuten, dass ApoE-Defizienz einen Mangel an proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren im Lebergewebe bewirkt, der mit einem fibrotischen Umbau des Lebergewebes einhergehen könnte. Der fehlende PAC1-Rezeptor in ApoE-/--Mäusen scheint zusätzlich einen Anstieg von Substraten und eine gleichzeitige Verminderung von Produkten des Harnstoffzyklus und eine verminderteKonzentration an den hepatoprotektiv wirkenden Aminosäuren Asparagin und Ornithin zu bewirken. Auch als proinflammatorisch geltende Aminosäuren wie Tyrosin scheinen vermehrt unter PACAP-Defizienz anzufallen. Des Weiteren scheint ein ApoE-/--Mangel mit erhöhten hepatischen GSH- und rGSHKonzentrationen sowie einem erhöhten hepatischen GSH2/GSSG-Quotienten vergesellschaftet zu sein. Im Gegensatz dazu scheint eine PAC1-Defizienz verminderte hepatische GSH- und rGSH-Konzentrationen zu bewirken und dadurch eine niedrigere Toleranz der Leberzellen gegenüber oxidativem Stress zu begünstigen. Diese Beobachtungen sind mit früheren Studien über PACAP und dessen zytoprotektiven Einfluss bei Ischämie-induzierter Leberschädigung vergleichbar. Die immunhistochemischen Analysen deuten darauf hin, dass eine ApoE-Defizienz eine vermehrte Makrophageninfiltration des Lebergewebes und eine höhere Dichte an COX-2-positiven Zellen bewirkt, während eine PACAP-Defizienz in ApoE-/--Mäusen möglicherweise zu einer höheren Dichte an IL-1β-positiven Zellen führen könnte. Diese Ergebnisse unterstützen die antiinflammatorischen Eigenschaften sowohl von ApoE als auch von PACAP, wie sie bereits in anderen Studien gezeigt wurden. Zumal Autoimmunerkrankungen einen großen Anteil der Morbidität besonders der jüngeren Gesellschaft ausmachen, eröffnen unsere Ergebnisse an dieser Stelle weitere PACAP basierte Therapiemöglichkeiten und mögliche Alternativen für IL-1β-Inhibitoren. Unsere Daten unterstützen die Ergebnisse bisheriger Studien zu PACAP und PAC1, insbesondere bezüglich der antiinflammatorischen Wirkung. Zudem zeigen sich neue Erkenntnisse über hepatische Stoffwechselvorgänge, die durch PACAP bzw. PAC1 beeinflusst werden. Für mögliche therapeutische Ansätze mit PACAP-/PAC1-Agonisten oder -Antagonisten sind allerdings weitere Studien mit größeren Fallzahlen vonnöten.
description: Coronary heart disease is a major cause of death in industrialized countries. Vascular alteration and atherosclerosis are the main reasons for cardiac ischemia and heart damage. As the pathomechanism is still not fully understood, strategies for therapies and prevention remain a difficult subject for medical researchers. The lipid metabolism, PACAP and ApoE seem to play an important role for the development of atherosclerosis. The liver is a central organ for lipid metabolism and systemic inflammatory response so that it can be related to the formation of atherosclerotic plaques. Referring to this, it is unavoidable to consider the influence of PACAP, the PACAP-receptor PAC1 and ApoE on the liver metabolism. PACAP is an autonomic neurotransmitter and belongs to the glucagon, secretin, VIP and GHRH family. The immunomodulative, anti-apoptotic, circulatory, and metabolic effects of PACAP are mediated threw its receptors called PAC1-, VPAC1- und VPAC2-receptor. The present dissertation is an investigation on this unexplored field and creates a better understanding for the influence of PACAP and PAC1 on the liver metabolism. Therefore, we used four different genotypes: Wildtype-, ApoE-/--, PACAP-/-/ApoE-/-- and PAC1-/-/ApoE-/--mice. These were fed with a cholesterol-enriched diet for 20 weeks. With the help of applied immunohistochemical staining it was possible to quantify proinflammatory and metabolic tissue markers in the liver. Different biochemical procedures gave an overview of the metabolic status of the liver. Our results showed an 8,9 times higher plasma cholesterol level in ApoE-/--mice than in wildtype-mice and an 1,5 times higher plasma triglyceride level in PACAP-/-/ApoE-/--mice than in ApoE-/--mice. The concentration of hepatic cholesterol was 2,6 times higher in ApoE-/--mice than in wildtype-mice while PACAP-/-/ApoE-/-- and PAC1-/-/ApoE-/--mice had 54,6 % and 56,9 % lower hepatic cholesterol concentrations than ApoE-/--mice. PACAP-/-/ApoE-/--mice showed 73,4 % higher hepatic triglyceride concentrations than ApoE-/--mice. The concentration of proteinogenic and non-proteinogenic amino acids in the liver of ApoE-/--mice was 84,5 % and 83,8 % lower than in wildtype-mice. PAC1-/-/ApoE-/--mice had a 21,3 % lower hepatic concentration of non-proteinogenic amino acids than ApoE-/--mice. In the liver of ApoE-/--mice we found a significant concentration of hydroxyproline while there was no detectable hepatic hydroxyproline concentration in wildtype-mice. PACAP-/-/ApoE-/--mice had a 24,4 % lower hepatic concentration of aspartic acid than ApoE-/--mice and a 37,5 % higher hepatic concentration of tyrosine than ApoE-/--mice. PAC1-/-/ApoE-/--mice showed a 25,8 % lower hepatic urea concentration, a 26,3 % lower threonine concentration, a 23,8 % lower asparagine concentration and a 15,1 % lower ornithine concentration than ApoE-/--mice. The hepatic concentrations of GSH and rGSH were 30,5 % and 32,8 % higher in ApoE-/--mice than in wildtype-mice while the rGSH2/GSSG-ratio was 95,4 % higher than in wildtype-mice. PAC1-/-/ApoE-/--mice showed an 18,6 % lower hepatic GSH concentration and a 19,0 % lower hepatic rGSH concentration than ApoE-/--mice. Immunohistochemical staining showed a 2,1 times higher density of CD68-positive macrophages around the hepatic glisson trias of ApoE-/--mice than in wildtype mice. The density of MOMA-2-macrophages around the glisson trias of ApoE-/--mice was 3,5 times higher than in wildtype-mice. In ApoE-/--mice we found a 1,5 times higher concentration of COX-2-positive cells around the hepatic glisson trias than in wildtype-mice. PACAP-/-/ApoE-/--mice had a non-significant 1,7 times higher density of IL-1β-positive cells around the glisson trias than ApoE-/--mice. The results suggest that PACAP-deficiency might cause hypertriglyceridemia and elevated hepatic triglyceride levels. Whether PACAP could possibly decrease the plasmatic and hepatic triglyceride concentration remains unclear. These observations reveal new possibilities for pharmacological targets for hypertriglyceridemia, a disease that is found in patients with specific ApoE-subtypes. Considering the results, there is strong evidence that PACAP and its receptor PAC1 mediate the uptake of cholesterol in the liver. Regarding the pharmacological aspect, it would be possible to study PACAP- or PAC1-antagonists as a treatment for fatty liver disease caused by cholesterol. Possible side effects of this treatment could be elevated plasmatic and hepatic triglyceride concentrations. The present results show a decreased concentration of proteinogenic and nonproteinogenic amino acids in the liver of ApoE-/--mice that is probably associated with a fibrotic change in the liver tissue. The additional absence of PAC1 in ApoE-deficient mice causes increased levels of substrates and decreased levels of products of the urea metabolism as well as decreased levels of the hepatoprotective amino acids aspartate and ornithine. PACAP-deficiency seems to lead to higher concentrations of inflammatory amino acids like tyrosine. It can be suspected that ApoE-deficiency is associated with elevated levels of GSH, rGSH and a higher GSH2/GSSG-ratio in liver tissue. In contrast, PAC1-deficiency seems to provide decreased levels of total and reduced glutathione and by that cause a decreased tolerance to hepatic cells against oxidative stress. These observations are comparable to earlier studies concerning PACAP and its cytoprotective effects on ischemic induced liver injury. According to the immunohistochemical analyses, ApoE-deficiency seems to cause an increased influx of macrophages and a higher density of COX-2-positive cells in the liver, while PACAP-deficiency could lead to a higher density of IL-1β-positive cells. These results confirm the anti-inflammatory properties of ApoE and PACAP that have been explored in various studies. As autoimmune diseases make up a big part of morbidity of the younger generation, our results give a new perspective for PACAP based pharmacological treatments and possible alternatives to IL-1β-inhibitors. Our findings are in accordance with a big part of previous studies on PACAP and PAC1, especially considering its effect on inflammatory processes in the body. Apart from that, there are some new findings about the influence of PACAP and PAC1 on the hepatic metabolism. To achieve therapeutic approaches with PACAP-/PAC1-agonists or -antagonists, it is necessary to start further investigations with a larger number of cases.