Untersuchungen zum Einfluss der GPI-Verankerung auf das Faltungsverhalten des Prion Proteins
Creators: name: Schumacher, Miria C.
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2011
Subjects: subject: Prion Protein
subject: GPI-Anker
subject: Posttranslationale Modifikation
subject: Expressed Protein Ligation
subject: Membranprotein
subject: 570

description: Viele eukaryontische Oberflächenproteine sind mit einem GPI-Anker modifiziert. Inzwischen sind mehr als 200 dieser posttranslational veränderten Proteine bekannt. Ein wichtiges Beispiel ist das Prion Protein, dem Auslöser der Prion-Erkrankung. Die Missfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese von BSE oder Creutzfeld-Jakob. Die Verankerung des Proteins auf der Außenseite der Zelle mittels GPI-Anker stellt eine wichtige Komponente für die Infektiösität der Erkrankung dar. Da die Isolation von homogen GPI-verankerten Prion Protein bis jetzt nicht möglich ist, wurden die meisten Transmissionsexperimente mit rekombinant hergestellten Prion Proteinen ohne GPI-Verankerung oder heterogenen Proteinpräparationen aus mammalischen Zelllinien durchgeführt. Um einen Zugang zu homogen GPI-verankertem, rekombinant hergestelltem Prion Protein zu erhalten, wurde in der vorliegenden Arbeit Saccharomyces cerevisiae als Modellsystem benutzt. Durch die Verwendung hefespezifischer Signalsequenzen für den ER-Import und die GPI-Verankerung, erhält man posttranslational modifiziertes Protein (GFP-GPI und PrP-GPI). Daraus ließ sich eine allgemeine Methode zur Isolation eines GPI-verankerten Peptids mit N-terminalem Cystein etablieren. Dieser Baustein wurde für die GPI-Verankerung eines in E. coli exprimierten Prion Proteins (recPrP) unter Verwendung der Expressed Protein Ligation (EPL) genutzt. Die in Hefe exprimierten Proteine (GFP-GPI bzw. PrP-GPI) wurden mit TEV-Protease gespalten und das entstandene GPI-Peptid mittels Covalent Capture Beads aufgereinigt. Durch MALDI-MS wurde die Struktur des GPI-Ankers bestimmt. Das erhaltene GPI-Synthon konnte anschließend erfolgreich an ein Testpeptid ligiert werden. Die Modifikation eines rekombinant in E. coli exprimierten Prion Proteins war durch EPL nicht möglich. Mit Hilfe des Prozesses des Protein Trans-Spleißens wurde das recPrP jedoch in vivo mit einem GPI-Anker modifiziert und stabil auf die Plasmamembran von Hefezellen, sowie murinen Neuroblastomazellen übertragen. Der anschließende Nachweis mit Immunofluoreszenz zeigte dabei die Lokalisation des Proteins auf der Außenseite der Zellen und entsprach somit dem Lokalisationsmuster des PrPC. Der Einfluss der GPI-Verankerung, sowie des N Terminus auf das Aggregationsverhalten des Prion Proteins (PrP-GPI) wurde untersucht. Hierbei konnte ebenfalls die Verankerung des Proteins auf der Außenseite der Plasmamembran mittels Immunofluoreszenz, sowohl in Hefezellen als auch in N2a Zellen, nachgewiesen werden. Um zu verifizieren, dass es sich um eine Verankerung des Proteins auf der Zellaußenseite mittels GPI-Anker handelt, wurden N2a-Zellen mit phosphatidyl-inositolspezifischer Phospholipase C inkubiert. Dies führte zu einer Freisetzung der Proteine von der Zelloberfläche in das Medium und lieferte den Beweis für die Membranverankerung durch den GPI-Anker. Durch die Bodipy®-Markierung am freien Cystein des PrP-GPI war es ebenfalls möglich, die Internalisierung des Proteins in N2a-Zellen nachzuweisen. Hierbei zeigte sich bereits nach fünf Minuten eine Aufnahme des GPI-verankerten Proteins von der Außenseite der Zelle ins Zellinnere. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit der biophysikalischen Charakterisierung der Umfaltung des PrP-GPI. Unter Verwendung von DLS, GFC und ThT-Test konnte gezeigt werden, dass der pH-Wert des eingesetzten Puffers die Bildung von Oligomeren und Fibrillen beeinflusst. So war die Oligomerisierung des PrP-GPI bei einem pH-Wert des Puffers = 5 gegenüber der Fibrillenbildung begünstigt. Hierbei konnte kein Einfluss des GPI-Ankers auf den Aggregationsprozess festgestellt werden. Allerdings zeigte das PrP-GPI (23-231) im Gegensatz zu PrP ohne N-Terminus (90-231) die Ausbildung mehrerer oligomerer Spezies. Die semisynthetische Darstellung des Prion Proteins mit einem nativen GPI-Anker, sowie die Expression von hmPrP in S. cerevisiae mit den bekannten posttranslationalen Modifikationen (N-Glykane und GPI-Verankerungen) bieten die Möglichkeit, die PrPC-PrPSc-Konversion in neuronalen Maus-Zellen (N2a-Zellen) genauer zu charakterisieren. So kann unter anderem der Einfluss der GPI-Verankerung auf die Umfaltungsreaktion durch die Verwendung der semisynthetischen Methoden, unabhängig von der Seitenketten-Glykosylierung untersucht werden. Ferner können die so dargestellten Proteine chemisch modifiziert werden, um die Internalisierung des PrP-GPI und die Umfaltungsreaktion von endogenem PrPC in vivo zu analysieren.