Triton X-114 and Amine-Based Wash Strategy Reduces Lipopolysaccharides to FDA Limit and Achieves Purer, More Potent Recombinant Immunotoxin
Triton X-114 und aminbasierte Aufreinigungsmethode reduziert LPS unter FDA- Grenzen und generiert reinere und wirksamere Immuntoxine
Creators: name: George, Rebekka
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::61 Medizin und Gesundheit::616 Krankheiten

description: HINTERGRUND UND ZIELE Rekombinante Immuntoxine (rIT) sind Fusionsproteine, die aus einem zielgerichteten Antikörperfragment und einem Toxin, z.B. einem Teil des Pseudomonas Exotoxin A, bestehen. Indem Exotoxin A den eukaryotischen Elongationsfaktor 2 (eEF2) durch Adenosindiphosphat-(ADP)-Ribosylierung inhibiert, stoppt es die Proteinbiosynthese, was zum Tod der Zelle führt. Aus diesem Grund kommen rIT als Immuntherapien gegen maligne Erkrankungen zum Einsatz. Da sie die eukaryotische Protein- expression zum Erliegen bringen, müssen sie in prokaryotischen Zellen, genauer in Escherichia coli (E. coli), hergestellt werden. Durch die Produktion in E. coli sind rIT unweigerlich mit Endotoxinen kontaminiert, welche als Lipopolysaccharide (LPS) einen Bestandteil der äußeren Zellmembran gramnegativer Bakterien bilden. Es ist bekannt, dass LPS die Proteinfunktion reduziert und über Toll-like Rezeptoren Inflammation induziert, welches die Ergebnisse immunologischer Studien beeinflusst. Folglich haben staatliche Behörden wie die Federal Drug Administration (FDA) strikte LPS-Grenzen für medizinische Produkte und Medikamente eingeführt (0,05 Endotoxin Units (EU)/ml). Ziel des Projekts war die Etablierung einer breit anwendbaren Aufreinigungsmethode, die LPS unter FDA- Grenzen reduziert, ohne Stabilität oder Funktion der Proteine zu verschlechtern. METHODEN Die Produktion der Immuntoxine wurde nach einem etablierten Standardprotokoll durchgeführt. Für die LPS-Reduktion wurde das gegen CD22 gerichtete rIT Moxetumomab hergestellt und zwei Methoden miteinander kombiniert. Das Zielprotein wurde entweder direkt auf einer Chromatographiesäule mit 0,1% Triton X- 114 bei 10 °C gewaschen, in aminbasierten Zentrifugationssäulen gereinigt oder beide Methoden kombiniert. Anschließend wurde der LPS-Gehalt anhand des Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Assay gemessen, während die Proteinqualität mittels SDS-PAGE und durch Überprüfung der Hitze-Stabilität gemessen wurde. Die rIT wurden in ihrer Funktion bezüglich ADP-Ribosylierung, Zytotoxizität, Bindungsaffinität und in vivo Effektivität im Xenograftmodell getestet und verglichen. ERGEBNISSE Das mittels Standardmethode hergestellte Immuntoxin Moxetumomab enthielt 2,7 EU/mg LPS. Durch einen auf einer Chromatographiesäule stattfindenden Triton X- 114 Waschschritt wurde LPS ohne Proteinverlust und nicht signifikant auf 2,41 EU/mg reduziert, während die Aufreinigung mittels aminbasierter, kommerziell erwerbbarer Zentrifugationssäulen eine LPS-Reduktion auf 0,40 EU/mg bei 54% Proteinausbeute erzielte. Die Kombination beider Methoden führte zu einer 120- fachen Verringerung von LPS auf 0,02 EU/mg mit 61% Proteinertrag. Immuntoxine, die auf diese kombinierte Weise gereinigt wurden, waren auch in der SDS-PAGE reiner, während die Proteinstabilität unter Hitzeexposition für beide Versionen erhalten blieb. Ebenso zeigten sich ähnliche enzymatische Aktivitäten im ADP- Ribosylierungstest. Das LPS-reduzierte Moxetumomab erwies sich als 2,4-fach aktiver gegen die akute lymphatische Leukämie Zelllinie KOPN8, sowie 1,5-fach aktiver gegen die Mantelzelllymphom Zelllinie JeKo-1, welches mit einer 2,4-fach gesteigerten Bindungsaffinität zu CD22 auf der Zelloberfläche von KOPN8 korreliert. Die in vivo Aktivitäten beider rIT zeigten keinen signifikanten Unterschied im systemischen Mausmodell der Mantelzelllymphomlinie JeKo-1. Außerdem konnte die Methode erfolgreich auf zwei weitere Antikörper- und Toxin-Varianten angewendet werden. SCHLUSSFOLGERUNGEN UND DISSKUSSION Nur mittels Kombination des Triton-X-114-Säulenwasches und aminbasierten Zentrifugationssäulen konnten FDA-Grenzen, unabhängig von Antikörperformat oder Ziel-Antigen der Immuntoxine, erreicht und sogar unterschritten werden. Unsere Daten suggerieren, dass Triton X-114 die Zugänglichkeit von LPS für die positiv geladenen Seitenketten der Zentrifugationssäulen erleichtert, was dann kombiniert die Aufreinigung verbessert. Der Austausch der Säulen durch Arginin-Waschschritte könnte eine vollautomatisierte, industrielle Hochskalierung ermöglich. Gründe für die verbesserte Zytotoxizität durch gesteigerte Affinität könnten durch LPS-Reduktion verringerte sterische und elektrostatische Hinderungen der rIT-Bindung an die Zelloberfläche sein. Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Beschreibung dieser Methode, welche zu reineren und wirksameren rIT führt und eine Anwendung jener im Labormaßstab hergestellten rIT in immunkompetenten Modellen zulässt.