title: Mechanismen der C-Domänen-vermittelten Lipoinitiation in der nichtribosomalen Peptidsynthese
title: Mechanisms of the C Domain Mediated Lipoinitiation during Nonribosomal Peptide Synthesis
Creators: name: Kraas, Femke
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Chemie
Lipidation
Condensation domain
Peptidsynthese
Lipidierung
Lipopeptides
Kondensationsdomäne
Biochemistry
Lipopeptide
Biochemie
nichtribosomal
Nonribosomal peptide synthesis

description: Nonribosomally synthesized
      lipopeptides of microbial origin contain a fatty acyl moiety
      and exhibit diverse biological activities including
      antibiotic, anticancer or biosurfactant properties. Thus,
      these natural products are subject of intense research and
      present a potent class of new agents for pharmaceutical and
      biotechnological applications. The biosynthesis of
      lipopeptides usually starts by N-acylation of the peptide
      backbone and is referred to as lipoinitiation. This study
      adresses the exploration and characterization of different
      mechanisms of lipoinitiation consisting of activation and
      transfer of the lipid moiety. These reactions were elucidated
      during the biosynthesis of the lipoheptapeptide surfactin
      from Bacillus subtilis and of the acidic lipodepsipeptide CDA
      (calcium-dependent antibiotic) from Streptomyces coelicolor
      A3(2) displaying two novel strategies for the incorporation
      of a fatty acid into a peptidic natural product. The involved
      domains were dissected from their nonribosomal peptide
      synthetases (NRPSs) by genetic techniques and were
      heterologously produced as singular proteins. Commercially
      not available substrates were chemically synthesized.
      Biochemical studies revealed in both systems that the starter
      C domains from the initiation modules of the corresponding
      NRPSs are essential for the transfer of the fatty acid acting
      as acyltransferases. The catalytic motif HHxxxDG identified
      in other C domains was shown to be indispensable in this
      reaction which was investigated by mutational studies
      pointing towards a common mechanism of C domain catalyzed
      reactions. The investigated lipoinitiation reactions during
      surfactin and CDA biosynthesis differred in the mode of fatty
      acid activation. For surfactin production, enzymes from the
      primary metabolic pathways activate the fatty acid by
      coupling it to coenzyme A resulting in a reactive thioester
      that directly serves as a substrate for the N-acylation of
      the peptidyl-carrier protein(PCP)-bound amino acid. However,
      the starter C domain from the CDA synthetase needs an
      acyl-carrier protein(ACP)-bound fatty acid for the transfer
      reaction. Both starter C domains exhibit high selectivities
      for their substrates except for the PCP domain, which could
      be arbitrarily substituted with other PCP domains. The second
      part of the thesis aimed at the characterization of a
      cyclization domain of the bacitracin synthetase BacA-Cy2
      which is closely related to C domains. It catalyzes the
      formation of a thiazoline in the antibiotic bacitracin from
      Bacillus licheniformis and was dissected from the native
      synthetase resulting in a singular protein to allow detailed
      characterization and the determination of substrate
      specificity.
description: Nichtribosomal synthetisierte
      Lipopeptide aus mikrobiellen Organismen weisen ein breites
      Spektrum an biologischen Aktivitäten auf, zu denen
      beispielsweise antibiotische, antitumorale aber auch
      biotensidische Eigenschaften zählen. Daher sind diese
      Naturstoffe von pharmazeutischem sowie biotechnologischem
      Interesse und stellen einen Gegenstand intensiver
      gegenwärtiger Forschung dar. Die Biosynthese dieser
      Lipopeptide beginnt in der Regel mit der Inkorporation des
      Fettsäurerestes, die durch eine N-Acylierung des
      Peptidrückgrats stattfindet und als Lipoinitiation bezeichnet
      wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung
      verschiedener Lipoinitiationsmechanismen, zu denen die
      Aktivierung und die Übertragung des Fettsäurerests gehört. In
      den Biosynthesewegen des Lipoheptapeptids Surfactin aus
      Bacillus subtilis und des sauren Lipodepsipeptids CDA (engl.:
      calcium-dependent antibiotic) aus Streptomyces coelicolor
      A3(2) konnten diese Reaktionen biochemisch charakterisiert
      werden. Diese stellen zwei neue Strategien der Lipoinitiation
      dar. Dazu wurden die beteiligten Domänen der nichtribosomalen
      Peptidsynthetasen (NRPS) heterolog als singuläre Proteine
      produziert und die Substrate, sofern nötig, chemisch
      synthetisiert. In den biochemischen Untersuchungen zeigte
      sich, dass in beiden Reaktionen die Kondensations(C)-Domäne
      des Initiationsmoduls der jeweiligen Peptidsynthetase als
      Acyltransferase wirkt und für den Transfer der Fettsäure
      essentiell ist. Die Notwendigkeit des aus anderen C-Domänen
      bekannten katalytisch aktiven Motivs HHxxxDG konnte durch
      Mutationsstudien in den hier untersuchten
      Initiations-C‑Domänen bestätigt werden und deutet auf einen
      universellen Katalysemechanismus der Familie der C‑Domänen
      hin. Die beiden untersuchten Systeme der Lipoinitiation der
      Surfactin- und CDA-Biosynthese zeigten jedoch auch
      Unterschiede. Während in der Surfactinsynthese eine durch
      Enzyme aus dem Primärmetabolismus CoA-aktivierte Fettsäure
      mit der Peptidyl-Carrier-Protein(PCP)-gebundenen Aminosäure
      kondensiert wird, wird die Fettsäure in der CDA-Biosynthese
      von einem Acyl-Carrier-Protein ausgehend übertragen. In
      beiden Reaktionen zeigten sich ausgeprägte Spezifitäten mit
      Ausnahme der Selektivität für die PCP‑Domäne, die in beiden
      Systemen durch fremde PCP-Domänen substituiert werden konnte.
      Der zweite Teil der Arbeit bestand aus der Charakterisierung
      der eng mit C-Domänen verwandten Zyklisierungs-Domäne aus der
      Bacitracin-Synthetase BacA-Cy2. Diese katalysiert die Bildung
      des Thiazolinrings in dem Antibiotikum Bacitracin aus
      Bacillus licheniformis und wurde in dieser Arbeit ebenfalls
      als freistehendes Protein heterolog produziert, wodurch eine
      genaue Charakterisierung und Bestimmung der ausgeprägten
      Substratspezifität ermöglicht wurde.