title: Development of Pseudomonas exotoxin-based duotoxins for the treatment of CD22 positive hematologic malignancies
title: Generierung von Pseudomonas Exotoxin-basierten Duotoxinen für die Behandlung von CD22 positiven hämatologischen Erkrankungen
Creators: name: Ammon, Anna-Maria
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: During the middle of the 20th century, the first breakthrough in cancer therapy took place when chemotherapy found its way into the clinic. This was the foundation for modern cancer therapy and the mortality rate for many cancer types dropped drastically. Nevertheless, there are still a lot of patients, especially in relapse, which are in need of new therapy options. One option which has become more and more popular over the last few decades is targeted therapy. Drugs developed for this type of treatment can act upon specific cellular pathways needed for the proliferation of the cancerous cell, recruit immune cells, or eliminate cancerous cells by targeting them directly. Antibody-drug conjugates (ADC) and immunotoxins are two types of drugs which rose from the concept of targeted cell death. Both drugs contain an antibody fragment and a drug or toxin, which induces cell death. While the ADC is conjugated to a drug, the immunotoxin is fused to a toxin fragment. Another option for new therapies is the combination of already existing drugs to overcome resistances as well as to aim for synergistic cell death. Unfortunately, the evaluation of combination therapy in clinical trials is onerous, since a lot of patients are needed for dose escalation as well as to analyse whether there is a beneficial effect of the combination treatment over the single drug treatment. A combination of different drugs on one molecule could overcome these disadvantages and therefore this thesis aims to develop a proof of concept for the generation of a novel duotoxin, consisting of an immunotoxin conjugated to a drug. An anti-CD22 immunotoxin was conjugated to a drug by amine conjugation, thiol conjugation, and sortase mediated antibody conjugation (SMAC). Conjugation by amine conjugation as well as thiol conjugation, independent of site-specific or inter-chain, led to an inadequate conjugation efficiency, while SMAC resulted in a well conjugated duotoxin. Although SMAC led to the highest drug-antibody ratio (DAR) no improve in activity could be detected in vitro or in vivo, most likely due to the fact that a cleavable linker is needed for drug release for this target. Conjugation of DM1 to the lysines or to the inter-chain cysteines both increased in vivo activity but the best result was achieved for site-specific thiol conjugation to LC-V205C with SGD-1910, a drug-linker conjugate with a pyrrolobenzodiazepine. The SGD-1910 duotoxin had similar pharmacokinetics to the unconjugated immunotoxin and a good in vitro activity. Furthermore, it was highly active in three different in vivo xenograft models, making it a promising drug for further investigations. Overall, different conjugation methods for the generation of a novel duotoxin were established and resulted in different duotoxins with improved activity. Although conjugation efficiency was an issue, even with a low DAR activity could be improved significantly for duotoxins generated by site-specific thiol conjugation. By enhancing the conjugation efficiency it can be assumed that the activity of the duotoxin can be improved even further. Additionally, combining the site-specific thiol conjugation and SMAC has the potential to result in a triple-toxin to overcome drug resistances.
description: Zum ersten Durchbruch in der Krebstherapie kam es Mitte des 20. Jahrhunderts, als die Chemotherapie ihren Weg in die Kliniken fand. Dadurch wurde der Grundbaustein für die moderne Krebstherapie gelegt und die Mortalitätsrate sank drastisch. Trotzdem gibt es immer noch viele Patient*innen die neue Therapieoptionen benötigen, vor allem Patient*innen welche einen Rückfall hatten. Eine Möglichkeit, welche in den letzten Jahrzenten an Popularität gewonnen hat, ist die zielgerichtete Therapie. Therapeutika, welche auf diesem Prinzip beruhen, können spezifisch in zelluläre Signalwege der Proliferation eingreifen, Immunzellen rekrutieren oder maligne Zellen zielgerichtet eliminieren. Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) und Immunotoxine sind zwei Arten von Therapeutika, die aus dem Konzept der zielgerichteten Abtötung von Zellen entstanden sind. Bei ADCs wird ein Wirkstoff konjugiert, wohingegen Immunotoxine mit einem Toxin fusioniert sind. Eine weitere Möglichkeit neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln ist die Kombination aus bereits zugelassenen Therapeutika, um zum einen Resistenzen zu umgehen und zum anderen um einen synergistischen Zelltod herbeizuführen. Leider ist die Evaluierung von Kombinationstherapien in klinischen Studien mühsam, da für die Dosisfindung und für die Analyse, ob die Kombinationstherapie einen Vorteil gegenüber der Einzelgabe hat, viele Patient*innen benötigt werden. Mit der Kombination mehrerer Therapeutika in einem Molekül können diese Nachteile umgangen werden und daher ist es Ziel dieser Arbeit ein Konzept für die Generierung neuartiger Duotoxine zu entwickeln, welche aus einem Immunotoxin bestehen an welches ein Wirkstoff konjugiert ist. Ein anti-CD22 Immunotoxin wurde durch Aminkonjugation, Thiolkonjugation und Sortase-vermittelte Antikörperkonjugation (SMAC) mit einem Wirkstoff konjugiert. Sowohl Konjugation durch Aminkonjugation als auch durch Thiolkonjugation, unabhängig ob diese spezifisch oder unspezifisch erfolgte, führten zu einer inadäquaten Konjugationseffizienz, wohingegen die Sortase-vermittelte Antikörperkonjugation zu einem gut konjugierten Duotoxin führte. Obwohl die Sortase-vermittelte Antikörper Konjugation zum höchsten Antikörper-Wirkstoff Verhältnis führte, konnte weder in vitro noch in vivo eine Steigerung der Aktivität festgestellt werden. Das liegt wahrscheinlich an der Tatsache, dass für die die Wirkstofffreisetzung ein Linker benötigt wird, welcher geschnitten werden kann. Konjugation von DM1 an Lysine oder an die Cysteine innerhalb der Antikörperkette führten zu einer gesteigerten in vivo Aktivität. Das beste Ergebnis konnte allerdings durch die spezifische Thiolkonjugation von SGD-1910, einem Wirkstoff-Linker Konjugat welches ein Pyrrolobenzodiazepin beinhaltet, an LC-V205C erzielt werden. Das SGD-1910 Duotoxin hatte ähnliche pharmakokinetische Eigenschaften wie das unkonjugierte Immunotoxin und eine gute in vitro Aktivität. Außerdem zeigte es stark verbesserte Zytotoxizität in drei verschiedenen in vivo Xenograft-Modellen, womit es einen vielversprechenden Kandidaten für weitere Untersuchungen darstellt. Alles in allem wurden verschiedene Methoden zur Generierung von neuartigen Duotoxinen etabliert und führten zu unterschiedlichen Duotoxinen, welche eine erhöhte Aktivität aufweisen. Trotz der Tatsache, dass die Konjugationseffizienz gering war und zu einem niedrigen Wirkstoff-Antikörper Verhältnis führte, konnte mit der spezifischen Thiolkonjugation eine signifikante Aktivitätssteigerung erzielt werden. Durch die Verbesserung der Konjugationseffizienz kann angenommen werden, dass die Aktivität der Duotoxine noch weiter gesteigert werden kann. Zusätzlich könnte die spezifische Thiolkonjugation und die Sortase-vermittelte Antikörper Konjugation zur Generierung eines Triple-Toxins kombiniert werden, um Resistenzen zu verhindern.