title: Bindungsstudien zur Selektivitätsbestimmung von Adenosin-Rezeptor-Liganden
Creators: name: Balber, Theresa
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Adenosin spielt eine zentrale Rolle in der Energiehomöostase des menschlichen Körpers. Physiologisch wirkt es über vier verschiedene Rezeptoren, die als Adenosin-A1-Rezeptor (A1R), Adenosin-A2A-Rezeptor (A2AR), Adenosin-A2B-Rezeptor (A2BR) und Adenosin-A3-Rezeptor (A3R) bezeichnet werden. Da der A3R von primären (humanes Melanom, Dickdarm-, Brust-, Kleinzelliges Lungen- und Pankreaskarzinom) und metastasierenden Tumoren (Lymphknotenmetastasen) vermehrt exprimiert wird, im Vergleich zu gesundem, nicht neoplastischem Gewebe, stellt der A3R ein potentielles Target für die Bildgebung von Tumorerkrankungen dar. Ziel dieser Diplomarbeit war die in-vitro Evaluierung neuer FE@SUPPY-Derivate (FE2@SUPPY, Me2@SUPPY, FEMe@SUPPY:2 und FE@SUPPY:11) hinsichtlich deren Affinität zu den Adenosin-Rezeptor-Subtypen A1R, A2AR und A3R. In weiterer Folge wurde deren Selektivität hinsichtlich des A3R bestimmt, um potentielle hoch affine und selektive A3R Antagonisten, als zukünftige A3R PET-Tracer, zu identifizieren. Des Weiteren wurden strukturell ähnliche (FE@CAPPY, Me2@CAPPY) wie auch strukturell andersartige Verbindungen (BD1, BD3) evaluiert. Zudem wurden die Bindungsprofile der entsprechenden Metaboliten der beiden PET-Tracer, [18F]FE@SUPPY und [18F]FE@SUPPY:2, DFE@SUPPY und DFE@SUPPY:2, untersucht. Darüber hinaus wurde die Selektivität der A3R Antagonisten FE@SUPPY und FE@SUPPY:2 bestimmt und verifiziert. Deren Bindungsprofile wurden anschließend (1) mit den neuen Liganden und (2) mit den A3R Antagonisten MRS1523 und MRS1191 verglichen. Die Radioliganden-Bindungs-Experimente wurden mit Hilfe eines Brandel® Cell Harvesters durchgeführt. Die Verdrängungsexperimente erfolgten mittels Membranen, die den gewünschten Rezeptor (hA1R, hA2AR und hA3R) exprimieren, und mittels [3H]DPCPX, [3H]CGS21680 oder [125I]AB-MECA als entsprechende Radioliganden. Abhängig von dem verwendeten Rezeptor unterschieden sich die Versuchsbedingungen in der Inkubationszeit, dem verwendeten Puffer und Pufferzusätzen (ADA, BSA). Die Radioaktivität wurde mittels Flüssigszintillation beziehungsweise Messung der Gammastrahlung bestimmt. Die Datenauswertung (Generierung der kompetitiven Verdrängungskurven und Ermittlung der IC50 -Werte) erfolgte mit Hilfe der GraphPad Prism® Software (San Diego, Version 5). Die Ki-Werte wurden mittels der Gleichung nach Cheng und Prusoff berechnet. BD1, BD3, FE@SUPPY:11, DFE@SUPPY und DFE@SUPPY:2 zeigten Ki-Werte für den humanen A3R im µM-Bereich. FE@CAPPY, Me2@CAPPY, Me2@SUPPY und FEMe@SUPPY:2 zeigten mittlere bis niedrige Affinität für den humanen A3R. Diese Komponenten sind daher nicht geeignet als zukünftige PET-Tracer. FE2@SUPPY stellt einen potentiellen neuen A3R PET- Tracer Kandidaten dar, da es hohe Affinität zu dem hA3R wie auch gute Selektivität gegenüber den anderen Subtypen aufweist. FE@SUPPY zeigt das beste Bindungsprofil unter all den getesteten Komponenten, da es durch eine hohe Affinität für den hA3R (Ki=6.02nM±0.4) als auch durch eine hohe Selektivität gegenüber den anderen Subtypen mit Verhältnissen von 1/669 (hA1R/hA3R) und 1/286 (hA2AR/hA3R) ausgezeichnet ist. Eine positive Erkenntnis dieser Studie betreffend der Pharmakokinetik der PET-Tracer [18F]FE@SUPPY und [18F]FE@SUPPY:2 war, dass die entsprechenden Metaboliten DFE@SUPPY und DFE@SUPPY:2 keine Affinität am hA3R zeigten. Diese Diplomarbeit bestätigt ein weiteres Mal das Potential von FE@SUPPY als A3R PET-Tracer zu dienen, da es ein sehr gutes Bindungsprofil aufweist.
description: Adenosine is an important modulator in the energy homeostasis of the human body and acts through four different adenosine receptor subtypes, denoted as A1, A2A, A2B and A3 receptors. Since the adenosine A3 receptor (A3R) is highly expressed in primary and metastatic tumors (human melanoma, colon, breast, small-cell lung cancer, pancreatic carcinoma tissues and lymph node metastasis) versus non-neoplastic tissue it is a potent target for molecular imaging of tumor-related pathologies. Aim of this thesis was the in-vitro evaluation of several new FE@SUPPY-derivatives (FE2@SUPPY, Me2@SUPPY, FEMe@SUPPY:2 and FE@SUPPY:11) regarding their respective affinities for different adenosine receptor subtypes (hA1R, hA2AR, hA3R). Hence selectivity for the A3R subtype was calculated to identify highly selective A3R antagonists with the potential to serve as future PET-tracers. Apart from that, structurally related ligands (FE@CAPPY and Me2@CAPPY) as well as structurally different compounds (BD1 and BD3) were investigated. Furthermore, binding profiles of the respective metabolites of the PET-tracers [18F]FE@SUPPY and [18F]FE@SUPPY:2, DFE@SUPPY and DFE@SUPPY:2, were evaluated. Moreover, selectivity of the lead compounds, the A3R antagonists FE@SUPPY and FE@SUPPY:2, was determined and verified. Their binding profiles were compared with (1) the new ligands and (2) the A3R antagonists MRS1191 and MRS1523. Radioligand binding assays were performed using a Brandel® cell harvester. Competition experiments were conducted using membranes expressing hA1R, hA2AR and hA3R and [3H]DPCPX, [3H]CGS21680 or [125I]AB-MECA as radioligands, respectively. Depending on the receptor assay conditions varied in incubation time, composition of buffer and additives (BSA, ADA). Radioactivity was detected by liquid scintillation counting or gamma-counting. Data were evaluated (competitive binding curves were generated for determination of IC50 values) using the GraphPad Prism® Software (San Diego, version 5). Ki values were calculated via the Cheng and Prusoff equation. BD1, BD3, FE@SUPPY:11, DFE@SUPPY and DFE@SUPPY:2 showed human A3R Ki values in a µM range; FE@CAPPY, Me2@CAPPY, Me2@SUPPY and FEMe@SUPPY:2 showed intermediate to low affinity for the hA3R. These compounds are therefore not suitable as potential PET-tracers. FE2@SUPPY turned out as a potential candidate, since it shows high affinity for the hA3R and good selectivity towards the other adenosine subtypes. However, FE@SUPPY shows the best binding profile among all tested compounds, displaying high affinity for the hA3R (Ki=6.02nM±0.4) and good selectivity towards the other subtypes with ratios of 1/669 (hA1R/hA3R) and 1/286 (hA2AR/hA3R). A positive finding regarding the pharmacokinetics of [18F]FE@SUPPY and [18F]FE@SUPPY:2 is that the respective metabolites DFE@SUPPY and DFE@SUPPY:2 do not show any affinity for the hA3R. This thesis confirmed once more the potential of FE@SUPPY to serve as a future PET-tracer, as it displays an outstanding binding profile among a pool of new derivatives.