title: Characterization of a minimal Type I CRISPR-Cas system found in Shewanella putrefaciens CN-32
title: Charakterisierung eines minimalen Typ I CRISPR-Cas Systems aus Shewanella putrefaciens CN-32
Creators: name: Dwarakanath, Srivatsa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: RNS , Mikrobiologie
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
CRISPR-Cas
Immunsystem
Shewanella putrefaciens CN-32
Bakterien

description: CRISPR (Clustered Regularly
      Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas
      (CRISPR-assoziiert) ist ein adaptives Immunsystem in
      Prokaryoten, das fremde DNA oder RNA mit Hilfe von kleinen
      CRISPR-RNAs (crRNAs) erkennt und diese anschließend
      degradiert. Das CRISPR-Cas System besteht dabei aus einem
      CRISPR-Lokus und einer Gruppe von cas Genen. Individuelle
      crRNA Moleküle werden aus einem langen Transkript des
      CRISPR-Lokus generiert und im Anschluss in
      CRISPR-Ribonukleoproteinkomplexen inkorporiert. Diese
      bestehen aus verschiedenen Cas-Proteinuntereinheiten bestehen
      und übernehmen die Funktion der zellulären Kontrolle der
      Immunantwort. Die Typ I CRISPR-Cas Systeme sind
      gekennzeichnet durch die Anwesenheit des Signatur-Proteins
      Cas3 und des CRISPR- Ribonukleoproteinkomplexes mit der
      Bezeichnung Cascade. Dabei variieren die Cas-Proteine in den
      jeweiligen Cascade-Komplexen der unterschiedlichen Subtypen
      von Typ I CRISPR-Cas Systemen. Eine minimale Variante eines
      Typ I-F Systems konnte in Shewanella putrefaciens CN-32
      identifiziert werden. Das Genom von S. putrefaciens CN-32
      enthält dabei nur fünf Cas Proteine (Cas1, Cas3, Cas6f,
      Cas1821 und Cas1822) und einen einzelnen CRISPR-Lokus mit 81
      Spacer-Sequenzen. Dieses System beinhaltet Cas1, eine
      Integrase welche die Integration neuer Spacer vermittelt,
      Cas3, eine Nuklease welche die Ziel-DNA degradiert und Cas6f,
      eine Endonuklease die reife crRNAs generiert. Die zwei
      weiteren Proteine, Cas1821 und Cas1822, zeigen keine
      Sequenzähnlichkeit zu allen bisher bekannten Cas-Protein
      Familien. Die große Untereinheit des Cascade-Komplexes, die
      in anderen Subtypen verantwortlich für die Identifizierung
      der Ziel-DNA ist, fehlt. RNA-Seq Analysen wiesen die
      Transkription des CRISPR-Lokus und die Herstellung der reifen
      crRNAs nach. Interferenz-Aktivität für dieses minimale System
      konnte in vivo mit Hilfe eines Plasmid Konjugations-Assays
      gezeigt werden. Die Interferenz-Aktivität war dabei abhängig
      von der Erkennung des Dinukleotids „GG“ in unmittelbarer Nähe
      zur Ziel-Sequenz. Dieses Motiv wird PAM (Protospacer Adjacent
      Motif) genannt. Die Deletion von cas1821 und cas1822 in S.
      putrefaciens CN-32 führte zur Aufhebung der in vivo
      Interferenz Aktivität und resultierte gleichzeitig in dem
      Verlust einer stabilen crRNA-Population in der Zelle. Ein
      minimaler Cascade Komplex konnte isoliert werden, der aus
      Cas1822, Cas6f, mehreren Kopien von Cas1821 und reifer crRNA
      besteht. Rekombinant hergestelltes Cas1821 bildete durch
      Bindung von RNA lange helikale Filamente aus und die Analyse
      von Stämmen mit Cas1822 Mutationen demonstrierte die
      Abhängigkeit der DNA Interferenz-Aktivität von konservierten
      Arginin-Resten in Cas1822. Es wird diskutiert, ob Cas1822
      oder Cas3, welches einen konservierten Cas2-ähnlichen Bereich
      am N-terminalen Ende enthält, die Funktion der kleinen und
      großen Untereinheiten ersetzen zu können. Diese Ergebnisse
      geben Einblicke in die Evolution von reduzierten CRISPR-Cas
      Systemen und demonstrieren Cascade-Funktionalität ohne die
      Anwesenheit einer großen und kleinen Untereinheit.
description: CRISPR (Clustered Regularly
      Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas
      (CRISPR-associated) is an adaptive immune system in
      prokaryotes that uses small CRISPR RNA (crRNA) to detect and
      degrade foreign DNA or RNA. CRISPR-Cas systems consist of a
      CRISPR array and a set of cas genes. Individual crRNAs are
      generated from CRISPR array transcripts and are incorporated
      into CRISPR ribonucleoprotein (crRNP) surveillance complexes
      that include different Cas proteins. The Type I CRISPR-Cas
      systems are identified by the presence of the signature
      protein Cas3 and utilize a crRNP surveillance complex termed
      Cascade. The Cas protein content of Cascade differs between
      the CRISPR-Cas subtypes. A minimal variant of the Type I-F
      subtype was identified in Shewanella putrefaciens CN-32. The
      genome of S. putrefaciens CN-32 contains only five Cas
      proteins (Cas1, Cas3, Cas6f, Cas1821 and Cas1822) and a
      single CRISPR array with 81 spacers. This system contains
      Cas1, an integrase that mediates spacer acquisition, Cas3,
      the target DNA nuclease and Cas6f, the endonuclease that
      generates mature crRNAs. Two additional proteins, Cas1821 and
      Cas1822, show no apparent sequence similarity to any known
      Cas protein families. A large subunit protein responsible for
      target recognition in other subtypes is absent. RNA-Seq
      analyses showed that the CRISPR array is transcribed and that
      mature crRNAs are generated. In vivo interference activity
      was demonstrated for this minimal system using a plasmid
      conjugation assay. The interference activity was dependent on
      the recognition of a dinucleotide GG sequence, termed
      Protospacer Adjacent Motif (PAM). The deletion of cas1821 and
      cas1822 in S. putrefaciens CN-32 abolished the in vivo
      interference activity and resulted in the loss of a stable
      crRNA pool. A minimal Cascade complex was isolated which
      contained multiple Cas1821 copies, Cas1822, Cas6f and mature
      crRNAs. Recombinant Cas1821 formed helical filaments upon RNA
      binding and the analysis of mutant strains demonstrated that
      DNA interference depended on conserved arginine residues of
      Cas1822. Cas1822 and Cas3, which contains a conserved
      Cas2-like N-terminus, are discussed to compensate for the
      absence of the large and small subunits present in other
      Cascade assemblies. These results provide insights into the
      evolution of reduced CRISPR-Cas systems and demonstrate
      Cascade functionality without a large subunit.