title: (R)-Indolelactyl-CoA dehydratas, das Schlüsselenzym in der Tryptophan Reduktion in Clostridium sporogenes
title: (R)-Indolelactyl-CoA dehydratase, the key enzyme of tryptophan reduction to indolepropionate in Clostridium sporogenes
Creators: name: Li, Huan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: tryptophan
dehydratase
Fermentation
Proteine
reduction
modification
Biowissenschaften, Biologie
Tryptophan
Enzym

description: In dieser Arbeit wurde der Weg der
      Fermentation von Tryptophan zu Indolpropionat in Clostridium
      sporogenes sowie das Schlüsselenzym Indollactat-Dehydratase
      untersucht. Die Zwischenprodukte und Endprodukte der
      Fermentation wurden mittels Massenspektrometrie nachgewiesen.
      Tryptophan disproportioniert oxidativ über 3-Indolpyruvat zu
      3-Indolacetat und reduktiv über (R)-3-Indollactat und
      (E)-3-Indolacrylat zu 3-Indolpropionat (IPA). IPA, das im
      menschlichen Darm gebildet wird, gelangt über das Blut ins
      Gehirn, wo es Sauerstoffradikale (ROS) abfängt und dadurch
      vor der Alzheimer Krankheit schützen kann. Die Aktivitäten
      der Enzyme der Tryptophan-Reduktion (Tryptophan Transaminase,
      Indollactat Dehydrogenase, Indollactat Dehydratase und
      Indolacrylat Reduktase) wurden in im Rohextrakt von
      Tryptophan-Kulturen nachgewiesen. In ganz analoger Weise wird
      Phenylalanin von C. sporogenes über (R)-Phenyllactat und
      (E)-Zimtat zu Phenylpropionat reduziert. Die Arbeit hat sich
      besonders auf das Schlüsselenzym Indollactyl-CoA Dehyratase
      mit einem ungewöhnlichen radikalischen Umpolungs-Mechanismus
      fokussiert. Die Dehydratase katalysiert die radikalische
      syn-Eliminierung eines nicht aktivierten Protons in der
      β-Position und einer OH-Gruppe in der α-Position des
      Thioestercarbonyls. Erstaunlicherweise zeigt die Dehydratase
      aus der Tryptophan Kultur eine höhere spezifische Aktivität
      mit Indollactyl-CoA als mit Phenyllactyl-CoA, während mit der
      Dehydratase aus der Phenylalanin Kultur das umgekehrte der
      Fall ist. Beide Enzyme bestehen aus einem Komplex mit je drei
      Untereinheiten. Mittels Peptide MALDI-TOF Fingerprinting und
      Nano LC-MS wurden die Untereinheiten als eine CoA-Transferase
      (FldA) und eine heterodimere Dehydratase (FldBC)
      identifiziert. Die Peptid Sequenzen der drei Untereinheiten
      aus Tryptophan sowie Phenylalanin Kulturen sind identisch und
      werden von denselben Genen fldABC kodiert. Die rekombinante
      FldBC aus E. coli zeigt sogar eine noch höhere Aktivität als
      die native Dehydratase FldABC. Die Untereinheit FldB der
      nativen Dehydratasen hat eine um 2 kDa kleinere molekulare
      Masse als vom Gen fldB vorausgesagt, wobei die N- und
      C-Termini erhalten sind, während ein internes 4,3 kDa Peptid
      beim Peptide-Fingerprinting nicht nachgewiesen werden konnte.
      Modellierungsversuche von FldBC mit der bekannten Struktur
      der 2-Hydroxyisocaproyl-CoA-Dehydratase zeigen, dass die 2.
      Hälfte des 4,3 kDa Peptids eine Schleife bildet, die durch
      posttranslationales Spleißen herausgeschnitten werden könnte.
      Zudem induzieren Phenylalanin und Tryptophan möglicherweise
      unterschiedliche Schnittstellen, mit denen man die ober
      erwähnten verschiedenen spezifischen Aktivitäten erklären
      könnte.
description: In this thesis the pathway of the
      fermentation from tryptophan to indolepropionate in
      Clostridium sporogenes and the key enzyme indolelactyl-CoA
      dehydratase were investigated. The intermediates and the end
      product were detected via mass spectrometry. Tryptophan
      disproportionates oxidatively via 3-indolepyruvate to
      3-indoleacetate and reductively via (R)-3-indolelactate and
      (E)-3-indoleacrylate to 3-indolepropionate (IPA). IPA, which
      is formed in the human intestine, is transferred via the
      blood to the brain. In the human brain IPA scavenges reactive
      oxygen species (ROS) and thus protects from Alzheimer’s
      disease. The activities of the enzymes from the reductive
      branch of tryptophan fermentation (tryptophan transaminase,
      indolelactate dehydrogenase, indolelactate dehydratase and
      indoleacrylate reductase) were determined in the cell-free
      extract. Similarly, phenylalaine is reduced by C. sprogenes
      via (R)-phenyllactate and (E)-cinnamate to
      3-phenylpropionate. Further this thesis focused on the key
      enzyme indolelactyl-CoA dehydratase, which catalyzes a very
      unusual syn-elimination of a non-activated proton at the
      β-position and an OH-group at the α-position of the thioester
      carbonyl by employing radical intermediates. Surprisingly the
      dehydratase purified from cultures growing on tryptophan
      shows a higher specific activity with indolelactyl-CoA than
      with phenyllactyl-CoA. The reverse was the case with the
      dehydratase purified from cultures growing on phenylalanine.
      Both native dehydratases consist of three subunits, which
      were identified via peptide MALDI-TOF fingerprinting and Nano
      LC-MS as the CoA-transferase (FldA) and the heterodimeric
      dehdratase (FldBC). The peptide sequences of the three
      subunits from the culture growing on tryptophan as well as
      that on phenylalanine are identical and derived from the same
      genes fldABC. The recombinant FldBC produced in E. coli shows
      even a higher specific activity than the native dehydratase
      FldABC. It has been observed that the molecular mass of the
      subunit FldB of the native dehydratase is around 2 kDa
      smaller than that calculated from the gene. Peptide
      fingerprinting showed that the N- and C-termini remained, but
      one internal 4.3 kDa peptide could not be detected. The
      predicted model of FldBC based on the structure of
      2-hydroxyisocaproyl-CoA dehydratase shows that the C-terminal
      half of this peptide could have been cut off by
      posttranslational splicing. Probably tryptophan and
      phenylalanine induce slightly different splicing positions,
      which result in different specific activities of the
      dehydratase.