title: Functional analysis of the plasma membrane Alr1 and Alr2 proteins in Yeast Saccharomyces cerevisiae
Creators: name: Wachek, Marcin
Publisher: name: :none
Year: 2009

description: Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae besitzt ein sehr raffiniertes System für den Magnesiumtransport in die Zelle, kodiert durch die Gene ALR1 und ALR2. In der vorliegenden Arbeit bestätigt eine Reihe von biochemischen und genetischen Analysen eine funktionelle und strukturelle Homologie von Alr1p und seinem nahen Homolog Alr2p mit der CorA-Mrs2-Alr1 Familie. Während Alr1p als der primäre Mg2+ -Transporter fungiert, trägt das Alr2-Protein unter Standardbedingungen nur wenig zur Mg2+-Aufnahme bei. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass der Alr2p vermittelte Mg2+-influx durch die Substitution einer einzelnen Aminosäure von Argxy zu Gluxy in der „loop-Region“ zwischen beiden Transmembranhelices signifikant gesteigert werden konnte. Mittels chemischer „cross-link Studien“ und in vivo „mating-based split-ubuquitin Studien“ konnte sowohl die Ausbildung von Homo- als auch Heterooligomere zwischen Alr1p und Alr2p beobachtet werden. Um die Funktion unterschiedlicher Proteinabschnitte zu analysieren wurden sequenzielle Deletionen sowohl am C- als auch am N-terminus des Proteins durchgeführt und die Funktion bzw. deren Ausfall untersucht. Veränderungen am C-terminalen Ende, nahe der 2. Transmembrandomäne hatten meist einen Funktionsverlust des Proteins zur Folge. Konsekutive Verkürzungen am N-terminus bis zu einem Ausmaß von ca. 270 Aminosäuren hatten keinen Einfluss auf die Funktion des Proteins. Allerdings zeigten sich signifikante Abweichungen in der Proteinstabilität und Lokalisation dieser Isomere. Deletionen von mehr als 270 aa führten zu einem totalen Funktionsverlust. Proteine mit einer Deletion im Abschnitt zwischen E271 und Q318 wurden nicht mehr zur Plasmamembran transloziert und wiesen eine sehr geringe, von Magnesium unabhängige, Stabilität auf. Mit größter Wahrscheinlichkeit werden diese defekten Proteine durch „Sorting Prozesse“ des Endoplasmatischen Reticulums bzw. des Golgiapparates erkannt und dem proteosomalen Abbau zugeführt.
description: Proteins Alr1 and Alr2 of Saccharomyces cerevisiae encode a very sophisticated system to take up magnesium, one of the most abundant cations, into the cell. In this thesis a series of biochemical and genetic analyses support the functional and structural homology of Alr1p and its close homolog protein Alr2 to the CorA-Mrs2-Alr1 family. Whereas Alr1p acts as the main Mg2+-transporter, Alr2p contributes poorly to Mg2+-uptake. Substitution of a single arginine with a glutamic acid residue in the loop between the two TM domains greatly improves its activity. Both, Alr1 and Alr2 proteins are shown to form homo- and hetero-oligomers. Furthermore, this assay also showed that the orientation of Alr proteins is consistent with CorA, where both N-terminal and C-terminal ends are exposed to the cell interior. Successive truncations were constructed from N- and C-terminal tails of Alr1p to dissect the role in protein function. The analysis of carboxyl truncations affirmed the importance of this region for Alr1p Mg2+ transport activity and its critical impact on channel formation. In contrast, consecutive shortening of N-terminal domain of Alr1p accounted for striking abnormalities concerning protein stability and subcellular localization. Further analysis using short amino acid intragenic deletions led to the identification of a sequence element of about 50 amino acids in the amino terminal tail essential for protein translocation and stability. Proteins missing this region were blocked in translocation to the plasma membrane and undergo Mg2+ independent degradation, most likely via sorting mechanisms of the ER and subsequential proteasomal decay.