title: Characterization studies on the biological and neurotrophic effects of cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF)
title: Charakterisierungsstudien der biologischen und neurotrophen Eigenschaften des cerebral dopamine neurotrophic factor (CDNF)
Creators: name: Barkholz, Michael
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Mesc cells
6-Hydroxydopamin
Herstellung rekombinanter Proteine
LUHMES-Zellen
Mesc-Zellen
LUHMES cells
Medizin, Gesundheit
Production of recombinant proteins
Ciliary neurotrophic factor
HT-22 Zellen
HT-22 cells
Cerebral dopamine neurotrphic factor
Brain-derived neurotrophic factor
ER-Retention
6-hydroxydopamine

description: Neurotrophe Faktoren ermöglichen
      das Überleben von Neuronen auch unter pathologischen
      Stressbedingungen sowie eine erneute Proliferation neuronaler
      Zellstrukturen nach Beschädigung. Neurotrophe Faktoren sind
      definiert als sekretierte Proteine. Sie werden nach
      Strukturhomologien, Rezeptoren und Signaltransduktionswegen
      in verschiedene Familien unterteilt. Die Bezeichnung
      „neurotropher Faktor“ umfasst Proteine mit
      unterschiedlichsten Funktionen. Die neurotrophen
      Eigenschaften von CDNF, das zur CDNF/MANF Proteinfamilie
      gehört, wurden durch intrastriatale Injektion und darauf
      folgende Protektion und Proliferation von Neuronen in einem
      in vivo Schädigungsmodell nachgewiesen. Diese Proteinfamilie
      könnte somit einen neuen Ansatz zu einer Therapiemöglichkeit
      von neurodegenerativen Krankheiten bieten. CDNF und MANF
      haben ein Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa. Der
      Aminoterminus enthält eine globuläre Saposin-ähnliche
      (saposin like protein SAPLIP)-Domäne, und der Carboxyterminus
      ist verwandt mit der Sequenz von scaffold attachment factors
      (SAFs) und enthält analog zu SAFs eine redoxaktive
      Cysteinbrücke eingebettet in ein CXXC-Motiv. Die biologische
      Funktion, Rezeptoren und Wirkmechanismus der Neuroprotektion
      der CDNF/MANF Proteinfamilie sind bisher unbekannt. In dieser
      Arbeit wurden unterschiedliche Versuche zur Charakterisierung
      der Eigenschaften von CDNF und dessen SAPLIP-Domäne
      unternommen. Für alle Versuche waren umfangreiche
      biotechnologische Vorarbeiten notwendig, die in der
      Forschungsabteilung von CSL Behring, Marburg vorgenommen
      wurden. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der
      Überprüfung der These, dass CDNF, ausgehend von seiner
      SAPLIP-Domäne, transduktorische Eigenschaften besitzen
      könnte: Makromoleküle in Zellen zu schleusen, ist durch die
      selektiv durchlässige Zellmembran nur sehr beschränkt
      möglich. Diese Restriktionen erlauben nur einem sehr kleinen
      Teil möglicher therapeutischer Substanzen den Zugang ins
      Zellinnere. Die natürliche Struktur von beispielsweise
      Proteinen verhindert das passive Eindringen dieser Stoffe in
      die Zelle. In den 1980er Jahren wurden jedoch Peptidsequenzen
      entdeckt, die als Molekültransporter Makromoleküle in das
      Zellinnere schleusen können. Die N-terminalen Domäne von CDNF
      besitzt nicht die klassische Struktur proteinogener
      Molekültransporter, sie ist jedoch verwandt mit Saposinen.
      Saposine und Saposin-ähnliche Domänen weiterer Proteine
      können Lipide binden oder Zellmembranen permeabilisieren.
      Diese Eigenschaften führten zu der These, dass auch die
      SAPLIP-Domäne von CDNF potentielle transduktorische
      Funktionen ausüben könnte. Zur Überprüfung der These wurden
      CDNF-Fusionsproteine biotechnologisch produziert und auf ihre
      transduktorischen Eigenschaften untersucht. Es konnte aber
      keine Transduktion von CDNF oder Assoziation mit der
      Zellmembran detektiert werden. Der zweite Teil der Arbeit
      zeigt die zelluläre Lokalisation von nativem CDNF. CDNF wird
      als sekretierter neurotropher Faktor beschrieben. Die
      C-terminale KTEL-Sequenz von CDNF weist jedoch eine große
      Ähnlichkeit zum allgemeinen ER-Retentionssignal KDEL auf. Wir
      zeigen in dieser Arbeit mit unterschiedlichen Methoden zum
      ersten Mal, dass CDNF tatsächlich im ER retardiert wird. Es
      wurden weiterhin CDNF-Mutanten mit verändertem CTerminus
      produziert. Die CDNF-Mutante mit C-terminaler KDEL-Sequenz
      und natives CDNF konnten nicht im Überstand von
      transfizierten Säugetier-Zellkulturen detektiert werden. Im
      Gegensatz zu CDNF-Mutanten mit deletiertem, maskiertem oder
      anderweitig verändertem C-Terminus, die im Kulturüberstand
      nachweisbar waren. Dieser Vergleich mit unterschiedlichen
      CDNF-Mutanten zeigt die wichtige Funktion einer freien
      C-terminalen KTEL-Sequenz bei der zellulären Lokalisation von
      CDNF. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den
      neurotrophen Eigenschaften von CDNF in vitro. Nach
      erfolgreicher Protektion sollte durch molekulare und
      biochemische Methoden der unbekannte Mechanismus der
      neuroprotektiven Wirkung von CDNF näher untersucht werden.
      Verschiedene neuronale Zellkulturen wurden dafür mit
      6-Hydroxydopamin oder Glutamat geschädigt. Rekombinant
      hergestelltes CDNF oder dessen SAPLIP-Domäne wurden extern
      zugeführt und der Einfluss der zugesetzten Proteine
      analysiert. Im Gegensatz zu den vorherigen Ergebnissen in
      vivo, konnte in keinem der verwendeten in vitro Systeme eine
      signifikante Protektion oder Proliferation durch CDNF
      beobachtet werden.
description: Neurotophic factors enable the
      survival of neurons under pathological conditions and mediate
      novel proliferation of damaged neuronal cell structures.
      Neurotrophic factors are defined as secretory proteins. They
      are clustered into families according to structural
      similarities, receptors and signal transduction pathways.
      These neurotrophic protein families contain proteins of
      diverse functions. The neurotrophic abilities of CDNF - a
      member of the CDNF/MANF family - first have been discovered
      in vivo. Protection and proliferation of neurons were
      observed after intrastriatal application of CDNF in a rat
      model of neuronal degeneration. This protein family could
      therefore lead to a new concept in the therapy of
      neurodegenerative diseases. CDNF and MANF have a molecular
      weight of around 21 kDa. The amino terminus is formed by a
      globular saposin-like protein (SAPLIP) domain, whereas the
      carboxy terminus is related to scaffold attachment factors
      (SAF) and also contains a redox-active cysteine bridge
      presented in a CXXC motif. The biological function, receptors
      and molecular mechanisms involved in the neurotrophic effect
      are hence unknown. This work presents a set of experiments to
      characterize the properties of CDNF and its SAPLIP domain.
      The extensive biotechnological work of the performed
      experiments was conducted at CSL Behring, Marburg. The first
      part of this thesis investigates a proposed theory that the
      SAPLIP domain of CDNF could initiate a transduction effect.
      Due to their size and natural structure macromolecules are
      not able to pass cell membranes passively. Therefore only a
      few therapeutical substances have easy access to the interior
      of cells. In the 1980’s a special class of transporter
      peptides was discovered that can pass the cell membrane
      together with attached macromolecules. The Nterminal domain
      of CDNF does not contain the typical structure of these cell
      membranepenetrating peptides but it is related to saposins.
      Saposins and saposin-like domains of other proteins can bind
      lipids (e.g. for degradation in lysosomes) or even
      permeabilize cell membranes. These abilities lead to the
      proposal of the potential transduction effect of the SAPLIP
      domain of CDNF. CDNF fusion proteins were designed and
      produced biotechnologically to investigate the transduction
      effect of the SAPLIP domain. However, no transduction effect
      or association of CDNF with cell membranes could be detected.
      The second part shows the cellular localization of native
      CDNF which has been described as a secretory neurotrophic
      factor. Interestingly, the C-terminal KTEL sequence of CDNF
      is similar to the general ER retention sequence KDEL. We
      could show for the first time with different experimental
      methods that CDNF is retarded in the ER. Different CDNF
      mutants were designed to proof the importance of the KTEL
      retention signal. The CDNF mutant with the general ER
      retention sequence KDEL and native CDNF could not be detected
      in the supernatant of confluent cell cultures. In contrast,
      CDNF mutants with deleted, masked or otherwise altered
      C-terminus could be discovered in the medium as secreted
      proteins. This shows the importance of a free C-terminal KTEL
      sequence to investigate native CDNF localization and
      trafficking. The third part of the thesis was designed to
      endeavour the neurotrophic mechanisms of CDNF in vitro.
      Putative neuroprotective effects should be further
      investigated by molecular and biochemical methods. Different
      neuronal cell cultures were damaged by 4-hydroxydopamin or
      glutamate. Recombinant CDNF or the isolated SAPLIP domain
      were externally administered to investigate the protective
      effect of these proteins. In contrast to the formerly
      discovered protective effect in vivo no protective or
      proliferative effects of CDNF were observed in vitro.