Κλωνοποίηση και υπερέκφραση των γονιδίων TTHA1003 και ΤΤΗΑ1592 των συστημάτων δύο συστατικών του θερμόφιλου βακτηρίου Τhermus thermophilus HB8
Creators: name: Τσαχίδου, Μπέλλα Ισαάκ
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Συστήματα δύο συστατικών
Κινάση ιστιδίνης
Μεταγωγή σήματος
Two-component systems
Histidine kinase
Signal transduction

description: H αντίληψη των περιβαλλοντικών μεταβολών και η μεταγωγή σήματος είναι απαραίτητα για την ανταπόκριση και συνεπώς την επιβίωση των βακτηρίων. Προκειμένου να αποκριθούν αποτελεσματικά στα ποικίλα ερεθίσματα που δέχονται, επιστρατεύουν τα συστήματα δύο συστατικών (TCSs) και τα συστήματα φωσφομεταβίβασης, τα οποία δομούνται κυρίως από αισθητήριες κινάσες ιστιδίνης και από ρυθμιστές απόκρισης. Η παρούσα εργασία αποτελεί μέρος μιας προσπάθειας ολιστικής κατανόησης του τρόπου με τον οποίο αντιλαμβάνεται και αποκρίνεται το βακτηριακό στέλεχος T. thermophilus HB8 σε μεταβολές στο εξωτερικό του περιβάλλον. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση των αλληλουχιών κωδικοποίησης των κινασών ιστιδίνης TTHA1003 και TTHA1592 από τις οποίες αφαιρέθηκε το τμήμα της αλληλουχίας που οδηγεί στη σύνθεση της αμινοτελικής διαμεμβρανικής τους περιοχής, έτσι ώστε να είναι δυνατή η εύκολη ανάκτηση των πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, την κλωνοποίηση διαδέχτηκε η επαγωγή πρωτεϊνικής έκφρασης με σκοπό την απομόνωση των αντίστοιχων πρωτεϊνών και την μετέπειτα μελέτη των δικτύων της μεταξύ τους αλληλεπίδρασης. Μια ιδιομορφία που χαρακτηρίζει την συγκεκριμένη μελέτη είναι η εισαγωγή δύο τριπλετών αδενίνης μετά το κωδικόνιο έναρξης ATG (θέσεις +1 και +2), κάτι που πιστεύεται ότι ενισχύει την γονιδιακή έκφραση. Η κινάση ιστιδίνης ΤΤΗΑ1003 εκφράστηκε σε ικανοποιητικό βαθμό και ο καθαρισμός της με χρωματογραφία αγχιστείας ήταν επιτυχής. Η υπερέκφραση της κινάση ιστιδίνης ΤΤΗΑ1592 απέδωσε προϊόν με μικρότερη μοριακή μάζα από την αναμενόμενη, καθώς μεταλλάξεις που εισάχθηκαν είχαν ως αποτέλεσμα την παρεμβολή κωδικονίων τερματισμού στο εσωτερικό της αμινοξικής αλληλουχίας. Ο καθαρισμός της ΤΤΗΑ1592 με χρωματογραφία αγχιστείας ήτανε ανεπιτυχής, καθώς η ετικέτα ιστιδινών απουσιάζει από την πρωτεΐνη λόγω πρόωρου τερματισμού της μετάφρασης. Ωστόσο, η περικομμένη κινάση ιστιδίνης ΤΤΗΑ1592 μειωμένης μοριακής μάζας, εντοπίζεται στα έγκλειστα σωματίδια κατά την χρώση με νιτρικό άργυρο. Τελικά, η πλήρης κατανόηση του τρόπου απόκρισης του συγκεκριμένου στελέχους στα εξωτερικά ερεθίσματα είναι ιδιαίτερης σημασίας, καθώς τα μεταβολικά του χαρακτηριστικά και τα προϊόντα του παρουσιάζουν μεγάλο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον, λόγω της πιθανής τους εφαρμογής στις βιομηχανίες τροφίμων, φαρμάκων και χημικών.
description: Perception of environmental changes and signal transduction is indispensable for the response and therefore the survival of the bacteria. In order to effectively respond to various stimuli that they receive, bacteria employ two-component systems (TCSs) and phosphorelay systems that are composed primarily of a sensory histidine kinase and a response regulator. This study constitutes part of an effort for the holistic understanding of how bacterial strain T. thermophilus HB8 perceives and responds to changes in the external environment. More specifically, we cloned the coding sequences of the truncated (the coding sequence without the sequence that results in the synthesis of N-terminal transmembrane region, in order to obtain easy retrieval of the proteins) histidine kinase TTHA1003 and TTHA1592. Thereafter, induction of protein expression was performed, in order to isolate the corresponding proteins and further study the networks developed by their interactions. A unique feature of this study is the insertion of two adenine codons after the ATG initiation codon (+1 and +2 codons), which is believed to enhance gene exprssion. The histidine kinase TTΗA1003 was expressed adequately and its purification by affinity chromatography was successful. The overexpresion of histidine kinase TTHA1592 yielded a product with a smaller molecular mass than the expected one, as mutations were introduced during the polymerase chain reaction resulted in the insertion of stop codons within the amino acid sequence. Purification of TTHA1592 by affinity chromatography was unsuccessful, as the polyhistidine tag is absent from the protein due to premature termination of translation. However, the truncated histidine kinase TTHA1592 of reduced molecular mass was detected in inclusion bodies when stained with silver nitrate. Eventually, thorough understanding of the way this strain responds to external stimuli is of particular importance as, it's metabolic characteristics and products are of great biotechnological interest because of their potential application in food, pharmaceutical and chemical industries.