title: Effect of micro biocides on Listeria monocytogenes
Creators: name: Szendy, Maik
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2021
Subjects: subject: Listeria monocytogenes
subject: Nisin, Mikrobiozide
subject: Neusilin UFL2
subject: Lebensmittelsicherheit
subject: Glutamatdecarboxylase
subject: Sauermilchkäse
subject: 500
subject: 570

description: Listeria monocytogenes ist ein bedeutendes, durch Lebensmittel übertragenes pathogenes Bakterium, welches Listeriosen verursachen kann und daher weltweit zu gesundheitlichen Problemen und wirtschaftlichen Verlusten führt. Der Verzehr von Lebensmitteln, die kontaminiert mit L. monocytogenes sind, führt zur Übertragung der Krankheit auf den Menschen, zum Beispiel durch Milchprodukte. Lebensmittelsicherheitsmanagementsysteme geben Leitlinien zur Kontrolle von Krankheitserregern, die durch Lebensmittel übertragenen werden, vor. Dies kann durch ein strenges Reinigungs- und Desinfektionsregiment erreicht werden. Mikrobiozide werden daher in Molkereiproduktionsanlagen eingesetzt, um das Wachstum von L. monocytogenes zu inhibieren. Das Ziel der ersten Studie war es, die Wirksamkeit von Mikrobioziden zu bewerten und die Empfindlichkeit von L. monocytogenes Feldisolate gegenüber Mikrobioziden zu bestimmen. In der zweiten Studie wurde ebenfalls die Zellantwort der L. monocytogenes Feldisolate auf das antimikrobiell wirkende Konservierungsmittel Nisin untersucht. Häufig wird Weichkäse mit freiem Nisin versetzt, um L. monocytogenes wirksam zu hemmen. Diese erhobenen Daten lieferten die Grundlage für die letzte Studie, um die Nisinformulierungen in vitro und in Sauermilchkäse (SMK) zu erproben. Zwei Panel mit jeweils 251 und 282 L. monocytogenes Feldisolaten aus deutschen Rohprodukten, verzehrfertigen Lebensmitteln, Patientenproben und aus lebensmittelverarbeitenden Umgebungen sowie Listeria spp. Referenzstämme wurden in der ersten Studie analysiert. In der ersten und letzten Studie wurde die Mikrodilution in Bouillon als Test für die Wirksamkeits- und Toleranzstests verwendet. Daher wurden vier Desinfektionsmittel (H2O2, NaOCl, Benzalkoniumchlorid und Cetalkoniumchlorid), zwei seit langem verwendete antimikrobielle Konservierungsmittel (freies Nisin und NaNO2) und ein Aromastoff (Citral), welcher ein potentiell neues antimikrobielles Konservierungsmittel darstellt, gegen L. monocytogenes Feldisolate getestet. Vorab wurde ein experimentelles Design entwickelt, welches eine hohe Vergleichbarkeit in Bouillon, die organische Rückstände simulierte, zwischen allen Mikrobioziden ermöglichte. Die Wirksamkeit der Mikrobioziden war in Gegenwart von organischen Verbindungen außer beim Desinfektionsmittel NaOCl unverändert. Darüber hinaus korrelierten hohe minimale Hemmkonzentrationen (MHKs) von NaOCl und Citral mit MHKs von zwei therapeutisch relevanten Antibiotika, während für freies Nisin keine Korrelation gefunden wurde. Die Mehrheit der nisintoleranten L. monocytogenes Feldisolate (NNS) war vom Serotyp IIa und wurde in Milchprodukten gefunden. Diese Beobachtung führte zu der Frage, warum NNS-Feldisolate des Serotyps IIa in dieser Umgebung häufig vertreten waren, während ihr Vorkommen in anderen Lebensmittelumgebungen geringer war. Um diese Frage in der zweiten Studie zu beantworten, wurden vier Nisin empfindliche (NS) und zwei NNS L. monocytogenes Feldisolate des Serotyps IIa einer vollständigen Genomsequenzierung unterzogen. Die nachfolgende Analyse von Genen, die mutmaßlich mit Nisintoleranz und deren Regulation assoziiert sind, fand DNA Sequenzvarianten (DSVs) im gadD2-Gen, welches für die Glutamatdecarboxylase kodiert. Dort unterschieden sich die NNS von NS Feldisolate von einander. Die gleichen spezifischen DSVs in gadD2 wurden ebenfalls in sieben weiteren NNS Feldisolaten gefunden. In Gegenwart von freiem Nisin und bei einem pH-Wert von 7,0 hatten NNS Feldisolate im Vergleich zu NS Feldisolate eine wesentlich kürzere Verzögerungsphase in der Wachstumskurve. Modellierung des GadD2 zeigte, dass durch ein Aminosäureaustausch an Position 453, Asparaginsäure zu Asparagin, das aktive Zentrum bei pH 7,0 nicht blockiert wurde. Dies führte vermutlich zu einer weniger pH-abhängigen enzymatischen Aktivität. Der SMK wurde als wichtige Matrix identifiziert, die die antimikrobielle Aktivität von freiem Nisin reduzierte. Daher wurde im Rahmen der letzten Studie eine neue Nisinformulierung, Neusilin UFL2-N (UFL2-N), entwickelt. Diese ermöglichte die Freisetzung von adsorbierten Nisin aus Neusilin UFL2 in einer Umgebung, die dem pH des Sauerquarks ähnelte. In BHI-Bouillon und über einen weiten pH-Bereich war UFL2-N in der Lage, mit freiem Nisin zu konkurrieren. Die resultierenden MICs beider Nisinformulierungen waren vergleichbar. Wenn die Nisinformulierungen auf kontaminierten SMK Oberflächen aufgetragen wurden, zeigten bei der höchsten getesteten Konzentration sowohl UFL2-N als auch freies Nisin antilisteriale Aktivität und L. monocytogenes blieb unterhalb der Quantifizierungsgrenze der qPCR. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass die Wirksamkeit der Mikrobiozide gegen L. monocytogenes durch organische Rückstände beeinträchtigt wurde, während die MHKs von Nisin nicht erhöht waren. Weiterhin bestätigten die Resultate die laufende Diskussion, ob DSVs in gadD2 die Nisintoleranz unterstützen. UFL2-N ermöglichte eine langsame Freisetzung und antilisteriale Aktivität in vitro sowie auf der SMK Oberfläche.