Progettazione di inibitori dell’integrasi dell’HIV-1 dotati di elevata potenza e selettività da impiegare per il trattamento dell’AIDS.
Creators: name: Di Giovanni, Carmen
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2008

description: L’AIDS (sindrome da immunodeficienza acquisita) è una patologia che colpisce il sistema immunitario determinata dal retrovirus dell’HIV-1. I retrovirus codificano i loro tre enzimi (proteasi, trascrittasi inversa ed integrasi) all’interno del gene POL, che è traslato come poliproteina Pol. L’integrasi dell’HIV è una proteina del peso di 32 kDa ed ha il ruolo di favorire l’integrazione del DNA virale nella cellula ospite attraverso due step caratterizzati dalla rottura del DNA virale (3’-processing) e dalla sua integrazione nella cellula ospite (strand-transfer). L’integrasi presenta tre domini strutturali: un dominio amino-terminale (NTD), un core catalitico (CCD) ed un dominio carbossi terminale (CTD). La struttura molecolare di questi tre domini è stata determinata attraverso studi di diffrazione a raggi X e di risonanza magnetica nucleare. Il CCD, che comprende i residui 50-212 organizzati in cinque β-sheet intrecciati a regioni di α-eliche, forma un dimero in tutte le strutture esaminate, ed è strutturalmente simile a quello delle altre integrasi retrovirali (Murine Leukemia Virus (MLV) e Avian Sarcoma Virus (ASV). Questa famiglia di enzimi che processano il DNA contiene una tripletta di amminoacidi conservati. Nell’integrasi dell’HIV, la triade aminoacidica in questione è  formata dai residui D64 (aspartato 64), D116 (aspartato 116) ed E152 (glutammato 152). La mutazione di uno solo di questi tre amminoacidi annulla l’attività enzimatica e la replicazione virale. In letteratura è riportato che i due residui D64 e D116 formano un complesso di coordinazione con uno ione bivalente (Mn2+ o Mg2+). Contrariamente a quanto osservato, nella struttura cristallina dell’integrasi di ASV è presente un ulteriore atomo di metallo bivalente,  motivo per cui, si è ipotizzato che anche i residui D116 e E152 coordinino un secondo metallo (Mn2+ o Mg2+), quando l’integrasi lega il suo DNA substrato. È quindi probabile che i metalli coordinino sia il core domain dell’integrasi che lo scheletro fosfodiestereo del DNA substrato durante il 3’-processing e lo strand transfer. In più strutture, il CCD contiene un piccolo loop flessibile (residui 141-150), che sembra avere un ruolo importante nella ricognizione del substrato. Pertanto inibitori di tale enzima rappresentano un valido target per lo sviluppo di farmaci contro l’HIV. Farmaci che inibiscono selettivamente questo enzima in associazione agli inibitori della trascrittasi inversa e della proteasi sono efficaci nel reprimere la replicazione virale. Tra gli inibitori dell’integrasi, gli α-dichetoacidi rappresentano i composti lead più interessanti. Pertanto, da queste osservazioni si è ritenuto opportuno costruire un modello d’interazione integrasi/DNA/farmaco allo scopo di razionalizzare le relazioni struttura-attività (SAR) di una serie di nuovi derivati dichetoacidi bi-fuzionali e proporre un plausibile meccanismo d’azione dei composti in esame, facendo uso di metodiche computazionali. La struttura del dominio catalitico (CCD) dell’integrasi di HIV-1 è stata ricavata dalla Protein Data Bank (PDB), ref. code 1BIS. Per i nostri studi è stata presa in considerazione la catena B di tale struttura a raggi X. Per avere un’idea dello spazio conformazionale dell’enzima integrasi, è stata realizzata una simulazione MD a 1 ns. I docking dei composti nel CCD sono stati effettuati usando il programma AutoDock (versione 3.0.5). I composti hanno rivelato un set di modalità di binding ricorrenti. I risultati del docking sono apparsi ben clasterizzati. Per tale studio sono stati realizzati 50 run indipendenti su differenti snapshots della dinamica dell’enzima che convergono ad piccolo numero di differenti posizioni ( “clusters” di risultati che differiscono meno di 1.5 Å). Generalmente i clusters più popolati sono stati anche quelli con la più favorevole energia libera di legame. I migliori risultati in termini di energia libera, inoltre si sono disposti tutti  in una comparabile posizione nel sito catalitico.
Una successiva modifica e perfezionamento del modello è stata effettuata per l’analisi di una seconda serie di composti in cui la porzione dichetoacidica in posizione 6 è stata sostituita con gruppi più piccoli che hanno conferito alla classe maggiore potenza e selettività nei confronti dello step strand transfer. In tale modello è stato aggiunto un secondo metallo bivalente, così come presente nella maggior parte delle proteine appartenenti alla stessa superfamglia ed il DNA, anche per tentare di razionalizzare la selettività nei confronti dello step strand trasfer. I risultati delle simulazioni in silico per entrambe le serie, hanno evidenziato alcuni aspetti cruciali, utili nel fornire una plausibile spiegazione dell’inibizione della catalisi dell’enziam. In particolare essi hanno riguardato:

•	l’orientamento del  gruppo carbossilico della catena dichetoacidica del ligando che è apparso chelare lo ione Mg2+
•	la formazione di legami ad idrogeno con i  residui Lys156 e Lys159, residui chiave per l’attività dell’enzima, come confermato da esperimenti di mutagenesi. 
•	Il posizionamento del gruppo aromatico che in entrambe le serie  si posiziona in una tasca idrofobica formata dai residui del loop catalitico Tyr143, Pro142, Ile141, Gly140 e dai residui Ile60, Gln62, Val77, Val79, His114, Gly149, Val150, Ile151, Glu152, Ser153, Met154.

 Allo stato attuale tale progetto si è concluso con successo, in quanto ha messo in risalto nuovi lead compound che potranno essere utilizzati come scaffold per la progettazione di potenti e selettivi inibitori dell’integrasi. Pur tuttavia  la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), causata dal virus HIV-1, rimane ancora un problema irrisolto, anche se in anni di intenso lavoro, sono stati scoperti ed introdotti nella pratica clinica numerosi inibitori della trascrittasi inversa e della proteasi. Tuttavia la resistenza sviluppata dal virus HIV-1, hanno fatto sì che tutte le terapie farmacologiche intraprese per inibire l’uno e l’altro enzima, si siano rivelate sfortunatamente inefficaci nei trattamenti a lungo termine. Per questo motivo si è pensato di combinare, in una unica combinazione farmacologica, sia gli inibitori della proteasi che quelli della trascrittasi inversa allo scopo di inibire il ciclo di replicazione virale bloccando due diverse tappe del processo. Sicuramente gli inibitori dell’integrasi si aggiungono proficuamente a questo già valido armamentario terapeutico nella battaglia contro l’AIDS.