title: Screening for novel targets of the MAPK Hog1 using quantitative proteomics
Creators: name: Romanov, Natalie
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Alle Zellen überwachen (und reagieren entsprechend) auf Veränderungen in den extrazellulären Parametern, wie Osmolarität, Temperatur, pH-Wert aber auch auf Schwankungen in der Nährstoffsituation. Eine solche Veränderung verursacht häufig die Aktivierung spezialisierter Signaltransduktionskaskaden. Eukaryoten wie z.B. die Hefe Saccharomyces cerevisiae haben eine breite Palette an Sensoren und Signalproteinen, die Prozesse initiieren um das zelluläre Gleichgewicht in Stresssituation wieder in Ordnung zu bringen. Diese Sensoren und Signalproteine sind in typischen Signalkaskaden in einer hierarchischen Ordnung gegliedert. Sobald eine Signalkaskade aktiviert wird, führt dies zu weiteren zellulären Ereignissen, wie Transkription und post-translationale Proteinmodifizierung zur Steuerung von Proteinaktivität. Mitspieler der Kaskade sind über Feedback-Loops miteinander verflochten. Obzwar die Veränderung der Genexpression eine wesentliche und vor allem dauerhafte Rolle in der zellulären Reaktion auf hyperosmotischen Stress spielt, könnte die Transkription per se wenig Einfluss auf das unmittelbare Überleben der Zelle unter gestressten Bedingungen haben. Vielmehr ist es die Modulierung der Proteinaktivität durch post-translationale Modifikationen (PTMs), die die unmittelbare Reaktion auf Stress ermöglicht. Eine besonders verbreitetete Modifizierung, die über Proteinkinasen und Phosphatasen gesteuert wird, ist die Phosphorylierung. Die Identifizierung der post-translationalen Modifikationsstellen an möglichen Zielproteinen und auch die Erfassung der Modifikationskinetik stellt oft eine besondere Herausforderung dar. Erst die jüngsten Entwicklungen in der quantitativen Massenspektrometrie (MS)-Analytik ermöglichen es tausende von Phosphorylierungen und eventuelle Site-Abhängigkeiten von modifizierenden Enzymen festzustellen. In dieser Arbeit präsentiere ich eine Vorgehensweise Proteinregulation in de Bäckerhefe auf Reaktion von extrazellulären hyperosmotischen Stress über post-translationale Modifikationen (PTM) zu erfassen. Es ging vor allem darum Targetproteine zu identifizieren, die über die mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Hog1 gesteuert werden. Um diese zu spezifizieren, integrierten wir zwei MS-Datensätze: Während ein Datensatz im Allgemeinen Veränderungen im Phosphorylierungsmuster in hyperosmotischen Stress aufzeigt, beinhaltet der andere Datensatz jene Veränderungen im Phosphorylierungsmuster, die duch Inhibition der MAPK Hog1 hervorgerufen werden. Für ein sicheres Proteintarget von Hog1 erwarten wir uns ein charakteristisches Verhalten des betroffenen Phosphorylierungsmusters in beiden Datensätzen. Weiters testen wir die extrahierten Proteintargets auf Interaktion mit der MAPK über ein Protein-Protein Interaktionsassay. Um eine möglichst vollständige Sequenzabdeckung zu erreichen und alle regulierten Modifikationsstellen eines Proteins abzudecken, werden interessante Kandidaten im Zuge einer „Targeted Proteomics“- Strategie analysiert. So präsentiere ich in dieser Arbeit Tsl1, die große Untereinheit der Trehalose Synthase in der Hefe: Das Protein weist drei Hog1-Motive auf, die unter hyperosmotischen Bedingungen stark phosphoryliert werden, was eventuell auf eine Rolle in der Hog1-gesteuerten zellulären Stressreaktion hinweist.
description: The environment of a living cell is defined by a set of physico-chemical and biological parameters, such as temperature, pH, oxygen exposure, nutrient availability and quality, etc. Since these parameters can significantly fluctuate, cells have evolved specialized signaling pathways to respond appropriately to any occurring changes in the environmental conditions. Simple eukaryotes such as the yeast Saccharomyces cerevisiae have a wide range of sensors and signaling proteins which initiate processes that re-establish cellular homeostasis in unfavorable or stressful environmental situations. Sensors and signaling proteins are commonly organized in a distinct hierarchy in various signaling cascades. Often an intracellular signaling pathway becomes activated upon external stimuli resulting in adjustments of cellular processes at different levels, ranging from transcriptional regulation of particular genes to post-translational fine-tuning of protein activity. The timing of these particular responses is additionally controlled by feedback loops. While alterations of the global gene expression profile usually provide the protein set necessary to conquer environmental insults in the long run, transcription per se might have fewer implications for the immediate cell survival under stress conditions. It is rather the modulation of activity through post-translational modifications (PTMs) of pre-existing protein factors that gives rise to immediate cellular responses. One particularly wide-spread and important modification is the addition of a phosphate moiety to a particular amino acid residue, termed phosphorylation. This PTM is involved in a number of signaling pathways in bacteria, as well as in eukaryotes. Although detection of post-translational changes is crucial for the understanding of many cellular responses, a large-scale description of these regulatory events remains challenging. Only recent advances in quantitative mass spectrometry (MS) allow monitoring thousands of modified sites at the same time and to assess whether specific modifying enzymes target certain sites. In this work we present an approach to study protein regulation at the level of post-translational modifications (PTMs) in yeast in response to hyperosmotic shock. In particular, we tried to identify targets of the main regulatory kinase of the hyperosmotic-stress-response, namely the mitogen-activated protein kinase (MAPK) Hog1. To specify the targets we integrate two MS shotgun datasets: one showing changes in the phosphorylation pattern that occur upon hyperosmotic stress and a second one showing the effect on these phosphorylation patterns if the MAPK Hog1 is specifically inhibited. We expect possible Hog1 targets to produce a characteristic behavior in their phosphorylation pattern within the two MS datasets. In a second line of evidence, a direct interaction of the MAPK Hog1 with some of these potential substrates was confirmed using a protein-protein interaction assay. Interesting candidates were further analyzed via an MS target validation approach to increase sequence coverage and complete the phosphorylation map. As an example I present results obtained from the analysis of the large subunit of the trehalose synthase complex (Tsl1): The protein contains three Hog1 motifs that get phosphorylated upon osmotic disbalance, suggesting that the disaccharide trehalose might play a role in the first seconds of the osmotic stress response in yeast.