La glucosio-6-fosfato deidrogenasi in orzo (Hordeum vulgare): aspetti biochimici in risposta alla nutrizione azotata ed allo stress salino e confronto con  l’enzima dall’alga verde unicellulare Chlorella sorokiniana
Creators: name: Guerriero, Gea
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: [ITALIANO] La via del pentoso fosfato (OPPP) genera il potere riducente necessario per la riduzione del nitrito e per l’organicazione dell’ammonio. La reazione catalizzata dalla GOGAT nei tessuti non fotosintetici necessita dello shunt del pentoso fosfato come fonte di potere riducente. Il principale enzima della OPPP è la glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH). In tutte le piante finora studiate sono state trovate diverse isoforme della G6PDH: una citosolica (Cy-G6PDH) e due compartimentate: cloroplastica (P1-G6PDH) e plastidiale (P2-G6PDH). L’attività della G6PDH, in particolare nell’isoforma cloroplastica, è regolata da vari fattori, tra cui la luce, i composti riducenti, il rapporto NADPH/NADP+. L'enzima citosolico è scarsamente sensibile ai cambiamenti del potere riducente e collegato al metabolismo basale della cellula. 
L’attività G6PDH aumenta nelle radici di piante d’orzo cresciute su azoto, mentre nelle foglie l’attività non subisce variazioni nelle diverse condizioni di nutrizione azotata. L’aumento osservato nelle radici dopo l’aggiunta di azoto è in parte dovuto alla comparsa dell’isoforma P2-G6PDH, come confermato dai Western blots.
Le piante necessitano di nutrienti minerali per crescere e svilupparsi. Tuttavia, un eccesso di sali solubili nel terreno provoca danni consistenti: un suolo che accumula una quantità eccessiva di sali minerali altera il potenziale idrico del suolo e causa degli inconvenienti di natura osmotica alle radici. Una delle risposte più immediate della pianta allo stress salino è la sintesi di osmoliti, composti caratterizzati da particolari proprietà la cui sintesi richiede potere riducente (NADPH). Ciò suggerisce quindi una correlazione tra la via del pentoso fosfato e la sintesi di osmoliti.    
L’aggiunta di cloruro di sodio al terreno di coltura provoca un raddoppio dell’attività della G6PDH nelle radici di piante di orzo, indipendentemente dall’aggiunta di nitrato. 
Nelle radici di orzo cresciute in assenza di azoto è presente una sola isoforma della G6PDH; questa proteina reagisce specificamente contro gli anticorpi monoclonali della isoforma citosolica ed i parametri cinetici sono simili a quelli misurati per la Cy-G6PDH in altre piante. Nelle piante nutrite con azoto è possibile purificare una seconda isoforma della G6PDH che reagisce contro gli anticorpi per l’isoforma plastidiale. L’isoforma plastidiale è caratterizzata da una minore affinità per il G6P e soprattutto da una tolleranza agli alti livelli di NADPH. 
Nelle radici di piante di orzo lo stress provoca nelle due isoforme presenti, la Cy-G6PDH e la P2-G6PDH, effetti molto simili, quali l’aumento di affinità per il G6P e l’aumento della KiNADPH, e quindi della tolleranza agli alti livelli di riducenti presenti in condizioni di stress. 
L’attività della G6PDH nell’alga verde Chlorella sorokiniana non varia apprezzabilmente sia in assenza che in presenza di azoto ed è possibile purificare una singola isoforma della G6PDH, che presenta delle caratteristiche cinetiche variabili con le condizioni di nutrizione azotata. La G6PDH parzialmente purificata da Chlorella mostra parametri cinetici simili a quelli della isoforma P2-G6PDH delle piante superiori. L’isolamento della frazione cloroplastica e la purificazione della G6PDH dagli organelli isolati, gli zimogrammi per l’attività G6PDH e l’analisi Western dimostrano la localizzazione unicamente cloroplastica della G6PDH di Chlorella (che riconosce solo gli anticorpi per la P2-G6PDH). Inoltre una bassa KmG6P e una differente sensibilità al NADPH suggeriscono una differente struttura biochimica. La principale caratteristica è rappresentata dalla bassa sensibilità all’inibizione da NADPH (KiNADPH = 103 µM) simile a quello osservato per la P2-G6PDH. Inoltre l’enzima risulta avere una bassa sensibilità verso la luce e gli agenti riducenti, tipica delle isoforme citosoliche delle piante, ma non di quelle cloroplastiche, presentando quindi caratteristiche ibride rispetto a quelle delle isoforme compartimentate delle piante superiori. La G6PDH purificata da Chlorella possiede inoltre 9 cisteine per subunità rispetto alle 6 note nelle piante superiori. 
Quindi, la G6PDH algale presenta caratteristiche che potrebbero far supporre che tale enzima rappresenti un antenato delle isoforme compartimentate delle piante superiori, che si sono successivamente specializzate e differenziate. / [INGLESE] The oxidative pentose phosphate pathway (OPPP) generates the reducing power for nitrite reduction and ammonia assimilation. The reaction catalysed by GOGAT in non-photosynthetic tissues needs the OPPP as a source for reducing equivalents. The main regulatory enzyme of the OPPP is glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Different G6PDH isoforms have been described  in all the plants studied so far: a cytosolic (Cy-G6PDH), a chloroplastic (P1-G6PDH) and a plastidial enzyme (P2-G6PDH). G6PDH activity, particularly the chloroplastic one, is regulated by different factors, among which it is worth remembering the light, the reducing agents, the NADPH/NADP+ ratio. The cytosolic isoform is scarcely responsive to changes in the redox poise and it seems linked to the basal metabolism of the cell. 
G6PDH activity increases in the roots of barley plants grown in the presence of nitrogen, while in the leaves no major changes in the activity are observed in the different nitrogen feeding regimes. The increase observed in the roots after nitrogen supply is partly due to the appearance of P2-G6PDH, as confirmed by the Western blots.  
Plants need mineral elements in order to grow and develop. Nevertheless, an excess of salts in the soil triggers serious consequences: it negatively affects the water potential of plant cells, leading to osmotic damages in the roots.
One of the promptest response of the plant to salt stress is the synthesis of osmolytes, a class of compounds with peculiar features and whose biosynthesis requires reducing power (NADPH). Thus a close relationship exists between the OPPP and the synthesis of osmolytes. 
The addition of NaCl to the media causes an increase in G6PDH activity which doubles in barley roots, regardless of nitrate supply. In nitrogen-deprived barley roots only one G6PDH isoform is present; this enzyme specifically reacts against cytosolic monoclonal antibodies and its kinetic parameters are similar to those measured for Cy-G6PDH in other plants. In nitrogen-fed barley roots it is possible to purify a second G6PDH isoform which specifically reacts against plastidial monoclonal antibodies. The plastidial isoform is characterized by a lower affinity to G6P, but, above all, by its tolerance to high NADPH levels.       
In barley roots salt stress causes similar effects on Cy- and P2-G6PDH, like the increase in G6P affinity and the increase of the KiNADPH (and thus the increase of the tolerance to high reducing equivalents, as a consequence of the abiotic stress).
G6PDH activity in Chlorella sorokiniana remains substantially unchanged when expressed on a packed cell volume basis, under different nitrogen nutrition regimes.
A single isoform is purified from Chlorella in all the nitrogen-feeding regimes studied and its kinetic characterization highlights a strong biochemical similarity with  P2-G6PDH. The isolation of the chloroplasts and the purification of the isoform from the organelles, the zymograms for G6PDH activity and the Western blotting analysis confirm the chloroplastic localization of G6PDH from Chlorella (which reacts against P2-G6PDH antibodies from potato). Moreover, both a low KmG6P and a different sensitivity to NADPH suggest a different biochemical structure. The main feature is represented by the low sensitivity to NADPH inhibition (KiNADPH= 103 µM), a value which is similar to that observed for P2-G6PDH. 
The purified algal G6PDH shows a scarce sensitivity to the light and the reducing agents: this behaviour is typical of the cytosolic isoform, but not of the chloroplastic one. The purified algal enzyme shows 9 cysteines per subunit, while it is well known that in higher plants only 6 cysteines are present. 
G6PDH from Chlorella thus shows peculiar features: these findings support the hypotesis according to which the algal enzyme would represent the ancestor of the plastidial enzymes from higher plants, which lately specialized and evolved.