title: Strahlensensitivierung von Kopf-Hals-Tumorzellen durch den dualen PI3K/mTOR-Inhibitor NVP-BEZ235
Creators: name: Balzer, Viola
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: SUMMARY For years, squamous cell carcinoma of the head and neck region (HNSCC) have been among the six most frequent malignant diseases worldwide. Besides alcohol and nicotine consumption, local infection with human papilloma viruses (mainly HPV-16 and HPV-18) contributes to oncogenesis. They establish their own molecular tumor entity with rising incidence. Radiation therapy is, along with surgical resection, one of the most important therapeutic options in the multimodal treatment of these tumors and represents an effective way to treat the tumor in a way that preserves the integrity of the organs. As these tumors are often detected very late and treated at an advanced stage, and have a relatively high rate of recurrences and secondary tumors, the disease is usually associated with a poor prognosis. Only for HPV-associated carcinomas a significantly better survival is observed, which is mainly due to an enhanced radiation sensitivity. However, despite much progress, intensive therapy is associated with high normal tissue toxicity. For this reason, efforts have been underway for years to improve the therapy in order to achieve better cure rates while reducing normal tissue toxicity. The scientific focus is primarily on molecular approaches that specifically intervene in specific tumor processes. One of the most promising target structures in HNSCC tumors is the PI3K/mTOR/Akt signaling pathway, as it is misregulated in a large number of these tumors mostly resulting in an over-activation. This pathway influences proliferation, metabolism and DNA repair via a large number of effectors. Therefore, it was expected, that the inhibition of this signaling pathway may lead to a targeted radiation sensitization. Within the scope of this work, HPV-positive as well as HPV-negative HNSCC cell lines were examined for the first time to determine whether treatment with BEZ235 effectively suppresses the repair of radiation-induced DNA double-strand breaks (DSB) and thereby achieves a significant radiation sensitivity. Four HPV-negative HNSCC cell lines (UM-SCC-3, UM-SCC-6, UM-SCC-11b, UM-SCC-33) and four HPV-positive lines (UM-SCC-104, UD-SCC-2, UM-SCC-47, 93VU-147T) were used. The effect on cell survival was determined using the colony formation assay. The detection of DSB was performed with the very sensitive gH2AX foci technique. The proportion of cells with ≥5 gH2AX-Foci was determined. To distinguish between G1- and G2-phase cells, the cell cycle-dependent expression of the centromere specific protein F (CenpF) was used. Overall, the following observations were made: 1. Treatment with 50 nM BEZ235 alone has little or no effect on cell survival. 2. In combination with irradiation, BEZ235 causes a significant radiation sensitization, whereby this effect is independent of the HPV-status of the HNSCC cells. 3. In untreated HPV-negative as well as -positive HNSCC cell lines, the proportion of cells with ≥5 gH2AX foci is very low, averaging only 1-2%. 4. When irradiated with 2 Gy, the proportion of cells with ≥5 gH2AX foci is significantly higher in the HPV-positive cells when compared to HPV-negative cells, which - in accordance with previous data - indicates a defective DSB repair in HPV-positive cells. 5. In both HPV-negative and HPV-positive HNSCC cells, BEZ235 inhibits DSB repair, resulting in a significant increase in the proportion of cells with ≥5 gH2AX foci. 6. This increase is only seen in G1-phase cells and not in G2-phase cells This indicates that BEZ235 primarily suppresses non-homologous end joining (NHEJ), which is the most important repair process in G1-phase. 7. When BEZ235 is combined with irradiation, the proportion of cells with ≥5 gH2AX foci as measured in G1-phase cells correlates very well with the corresponding decrease in survival rate. This finding indicates that the radiation sensitization by BEZ235 primarily results from an inhibition of DSB repair. Overall, this work demonstrates for the first time that a strong radiation sensitization can be achieved in all HPV-negative and HPV-positive HNSCC cell lines by effective suppression of the PI3k/mTOR/Akt signaling pathway using the dual inhibitor BEZ235. In the long term, this result offers the possibility to increase the overall survival of HNSCC by a combined treatment with a targeted radiation sensitization while reducing normal tissue toxicity. The data of this work were published together with other results in the journal Cancers: Schötz U, Balzer V, Brandt FW, Ziemann F, Subtil FSB, Rieckmann T, Köcher S, Engenhart-Cabillic R, Dikomey E, Wittig A, Arenz A. Dual PI3K/mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 Enhances Radiosensitivity of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) Cell Lines Due to Suppressed Double-Strand Break (DSB) Repair by Non-Homologous End Joining. Cancers (Basel). 2020 Feb 18;12(2).
description: ZUSAMMENFASSUNG Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region (HNSCC) zählen seit Jahren zu den sechs häufigsten bösartigen Neuerkrankungen weltweit. Neben Alkohol- und Nikotinkonsum trägt die lokale Infektion mit Humanen Papillomaviren (vornehmlich HPV-16 und HPV-18) zur Onkogenese bei. Damit begründen sie eine eigene molekulare Tumorentität mit steigender Inzidenz. Die Strahlentherapie ist neben der chirurgischen Resektion eine der wichtigsten Therapieoptionen bei der multimodalen Behandlung dieser Tumore und stellt eine effektive Möglichkeit dar, den Tumor organ- und funktionserhaltend zu behandeln. Da diese Tumore oft sehr spät erkannt und in einem fortgeschrittenen Stadium behandelt werden, sowie eine relativ hohe Rate an Rezidiven und Zweittumoren aufweisen, geht die Erkrankung meist mit einer schlechten Prognose einher. Lediglich für HPV-assoziierte Karzinome wird ein deutlich besseres Überleben beobachtet, was vor allem auf eine hohe Strahlenempfindlichkeit zurückgeführt werden kann. Die intensive Therapie ist allerdings trotz vieler Fortschritte mit einer hohen Normalgewebetoxizität verbunden. Deshalb gibt es seit Jahren Bestrebungen eine Verbesserung der Therapie zu erreichen, die es ermöglicht, höhere Heilungsraten bei gleichzeitiger Reduzierung der Normalgewebetoxizität zu erzielen. Im wissenschaftlichen Fokus stehen hierbei vor allem molekulare Ansätze, die gezielt in spezifische Abläufe der Tumoren eingreifen. Zu den vielversprechenden Zielstrukturen gehört bei HNSCC-Tumoren insbesondere der PI3K/mTOR/Akt-Signalweg, da er in einer Vielzahl dieser Tumore im Sinne einer Überaktivierung fehlreguliert ist. Der Signalweg nimmt über eine Vielzahl von Effektoren Einfluss auf Proliferation, Metabolismus sowie die DNA-Reparatur. Die Hoffnung ist daher, durch Inhibition dieses Signalweges eine gezielte Strahlensensibilisierung zu erreichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig an HPV-pos. sowie HPV-neg. HNSCC-Zelllinien untersucht, ob durch die Behandlung mit BEZ235 die Reparatur der strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) effektiv unterdrückt und dadurch eine deutliche Strahlensensitivierung erreicht werden kann. Verwendet wurden hierfür die vier HPV-negativen HNSCC-Zelllinien (UM-SCC-3, UM-SCC-6, UM-SCC-11b, UM-SCC-33) sowie die vier HPV-positiven Linien (UM-SCC-104, UD-SCC-2, UM-SCC-47, 93VU-147T). Die Wirkung auf das Zellüberleben wurde mittels des Koloniebildungstests bestimmt. Der Nachweis der DSB erfolgte mit der sehr sensitiven gH2AX-Foci-Technik. Bestimmt wurde jeweils der Anteil der Zellen mit ≥5 gH2AX-Foci. Um bei dieser Analyse zwischen G1- und G2-Phase-Zellen zu unterscheiden, wurde die Zellzyklus-abhängige Expression des Zentromer-spezifischen Proteins F (CenpF) genutzt. Insgesamt konnten folgende Beobachtungen gemacht werden: 1. Die Behandlung mit 50 nM BEZ235 allein hat keinen oder nur sehr geringen Einfluss auf das Zellüberleben. 2. In Kombination mit Bestrahlung bewirkt BEZ235 eine deutliche Strahlensensibilisierung, wobei dieser Effekt unabhängig vom HPV-Status der HNSCC-Zellen ist. 3. In unbehandelten HPV-negativen wie -positiven HNSCC-Zelllinien ist der Anteil an Zellen mit ≥5 gH2AX Foci sehr gering mit im Mittel nur 1-2%. Zusammenfassung 41 4. Bei einer Bestrahlung mit 2 Gy ist der Anteil der Zellen mit ≥5 gH2AX Foci in den HPV-positiven Zellen deutlich höher als in den HPV-negativen Zellen, was – in Übereinstimmung mit früheren Daten - auf einen Defekt der DSB-Reparatur in den HPV-positiven Zellen hinweist. 5. Sowohl in HPV-negativen als auch in HPV-positiven HNSCC-Zellen wird durch BEZ235 die DSB Reparatur inhibiert, was zu einer deutlichen Zunahme des Anteils an Zellen mit ≥5 Foci führt. 6. Diese Zunahme zeigt sich nur in G1-Phase-Zellen und nicht in G2-Phase-Zellen. Dies deutet daraufhin, dass BEZ235 primär die Nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) unterdrückt, welche in der G1-Phase der wichtigste Reparaturprozess ist. 7. Bei der Kombination von BEZ235 mit Bestrahlung korreliert der Anteil der Zellen mit ≥5 Foci, wie er in den G1-Phase-Zellen gemessen wird, sehr gut mit der entsprechenden Abnahme in der Überlebensrate. Dies bedeutet, dass die Strahlensensibilisierung durch BEZ235 primär auf eine Hemmung der DSB-Reparatur zurückgeführt werden kann. Insgesamt kann mit dieser Arbeit erstmalig dargestellt werden, dass durch eine effektive Unterdrückung des PI3k/mTOR/Akt-Signalweges mittels des dualen Inhibitors BEZ235 in allen HPV-negativen bzw. HPV-positiven HNSCC-Zelllinien eine starke Strahlensensibilisierung erreicht werden kann. Dieses Ergebnis bietet langfristig die Möglichkeit, durch eine gezielte Strahlensensibilisierung der Tumore die Heilungsrate von HNSCC durch eine kombinierte Behandlung zu steigern bei gleichzeitiger Reduktion der Normalgewebetoxizität. Die Daten dieser Arbeit wurden zusammen mit anderen Ergebnissen in der Zeitschrift Cancers veröffentlicht: Schötz U, Balzer V, Brandt FW, Ziemann F, Subtil FSB, Rieckmann T, Köcher S, Engenhart-Cabillic R, Dikomey E, Wittig A, Arenz A. Dual PI3K/mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 Enhances Radiosensitivity of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) Cell Lines Due to Suppressed Double-Strand Break (DSB) Repair by Non-Homologous End Joining. Cancers (Basel). 2020 Feb 18;12(2).