title: Physiologische Charakterisierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteter Kardiomyozyten
Creators: name: Schwarz, Dennis
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2022
Subjects: subject: 610 Medicine and health

description: In dieser Arbeit wurde das Calcium-handling wildtypischer iPS-Kardiomyozyten (iPS-CM) der SFS.1-Linie fluoreszenzmikroskopisch mittels Calciumtransientenmessung untersucht. Zur Beurteilung der Maturierung wurden Calciumtransienten von iPS-CM unterschiedlicher Altersgruppen (zwei, drei und fünf Wochen) und von wildtypischen adulten murinen ventrikulären Kardiomyozyten (mvCM) gemessen. Die Calciumtransientenmessung erfolgte sowohl unter Basalbedingung als auch unter beta-adrenerger Stimulation. Es zeigte sich, dass die Calciumtransientenkinetik der iPS-CM mit zunehmendem Alter jener der mvCM stärker ähnelt. Darüber hinaus wiesen die iPS-CM mit steigendem Alter eine stärkere und den mvCM ähnlichere Reaktion auf die beta-adrenerge Stimulation auf. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine höhere Zellkonzentration der iPS-CM während der Kultivierung zu einer Beeinträchtigung ihrer Reifung hinsichtlich der Calciumtransientenkinetik führt.
description: 1. EINLEITUNG ..... 1 1.1. Kardiovaskuläre Erkrankungen – Herzinsuffizienz ..... 1 1.1.1. Etablierte Therapieoptionen der Herzinsuffizienz ..... 2 1.1.2. Stammzelltherapie kardialer Erkrankungen ..... 2 1.2. iPS-Kardiomyozyten als Modell für die Grundlagenforschung zu kardialen Erkrankungen ..... 3 1.2.1. Gewinnung und Reprogrammierung der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZellen) ..... 3 1.2.2. Differenzierung der iPS-Zellen zu Kardiomyozyten ..... 4 1.3. Calcium-handling der iPS-Kardiomyozyten ..... 7 1.3.1. Vom Aktionspotential zur Kontraktion - die elektromechanische Kopplung ..... 7 1.3.2. Regulation des Calcium-handlings durch β-adrenerge Stimulation ..... 11 1.4. Reifung der iPS-Kardiomyozyten ..... 12 1.4.1. Strukturelle Reifung ..... 13 1.4.2. Transkriptionelle Reifung ..... 13 1.4.3. Funktionelle Reifung ..... 14 2. ZENTRALE FRAGESTELLUNGEN ..... 16 3. MATERIAL &amp; METHODEN ..... 17 3.1. Materialien ..... 17 3.1.1. Feinchemikalien ..... 17 3.1.2. Verwendete Zell- und Tierlinien ..... 17 3.1.2.1. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) der Zelllinie SFS.1 ..... 17 3.1.2.2. Isolierte murine ventrikuläre Kardiomyozyten ..... 18 3.2. Kultivierung von iPS-Zellen ..... 18 3.2.1. Allgemeine Zellkultur ..... 18 3.2.2. Kryokonservierung und Auftauen der iPS-Zellen ..... 21 3.3. Kardiale Differenzierung der iPS-Zellen und Kultivierung der iPS-Kardiomyozyten ..... 22 3.3.1. Ablauf der kardialen Differenzierung ..... 22 3.3.2. Passagierung der iPS-Kardiomyozyten ..... 24 3.3.2.1. Passagierung der iPS-Kardiomyozyten auf Deckgläschen ..... 26 3.3.3. Kryokonservierung und Auftauen der iPS-Kardiomyozyten für die Calciumtransientenmessung fünf Wochen nach dem Differenzierungsstart ..... 27 3.4. Calciumtransientenmessung der iPS-Kardiomyozyten ..... 28 3.4.1. Versuchsaufbau und Ablauf der Calciumtransientenmessung der iPS-Kardiomyozyten unter Basalbedingung ..... 28 3.4.2. Ablauf der Calciumtransientenmessung der iPS-Kardiomyozyten unter β-adrenerger Stimulation ..... 31 3.5. Calciumtransientenmessung muriner ventrikulärer Kardiomyozyten ..... 32 3.6. Auswertung ..... 33 3.6.1. Analyse der Calciumtransienten mittels IonWizard ..... 33 3.6.2. Statistische Analyse ..... 35 4. ERGEBNISSE ..... 36 4.1. Charakterisierung der Calciumtransienten von iPS-Kardiomyozyten zwei Wochen nach dem Differenzierungsstart ..... 36 4.2. Charakterisierung der Calciumtransienten von iPS-Kardiomyozyten drei Wochen nach dem Differenzierungsstart ..... 37 4.2.1. Einfluss der Zellkonzentration der iPS-Kardiomyozyten auf die Calciumtransientenkinetik 40 4.3. Charakterisierung der Calciumtransienten von iPS-Kardiomyozyten fünf Wochen nach dem Differenzierungsstart ..... 43 4.4. Vergleich elektrisch stimulierter Calciumtransienten von iPS-Kardiomyozyten und adulten murinen ventrikulären Kardiomyozyten ..... 46 4.4.1. Vergleich hinsichtlich der diastolischen intrazellulären Calciumkonzentration ..... 46 4.4.2. Vergleich hinsichtlich der intrazellulären Calciumtransientenamplitude ..... 47 4.4.3. Vergleich hinsichtlich der maximalen Geschwindigkeit des Anstiegs und des Abfalls des intrazellulären Calciumtransienten ..... 47 4.4.4. Zusammenfassender Vergleich ..... 48 5. DISKUSSION ..... 52 5.1. Ausgeprägte elektrophysiologische Reifung der iPS-Kardiomyozyten von Woche zwei zu Woche drei nach dem Differenzierungsstart ..... 53 5.2. Vergleich der iPS-Kardiomyozyten drei und fünf Wochen nach dem Differenzierungsstart mit murinen ventrikulären Kardiomyozyten insbesondere hinsichtlich ihrer Reaktion auf β-adrenerge Stimulation ..... 56 5.2.1. iPS-Kardiomyozyten an Tag 21 reagieren auf β-adrenerge Stimulation ..... 56 5.2.2. Die Zellkonzentration der iPS-Kardiomyozyten bei der ersten Passagierung hat einen Einfluss auf ihre Calciumtransientenkinetik und ihre β-adrenerge Reaktion ..... 58 5.2.3. iPS-Kardiomyozyten zeigen von der dritten zur fünften Woche eine Reifung insbesondere hinsichtlich ihrer Reaktion auf β-adrenerge Stimulation, erreichen jedoch nicht die Maturität adulter muriner ventrikulärer Kardiomyozyten ..... 59 5.3. Ausblick ..... 63 5.3.1. Limitationen der iPS-Kardiomyozyten ..... 63 5.3.2. Potential der iPS-Kardiomyozyten ..... 64 6. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..... 66 7. LITERATURVERZEICHNIS ..... 67 8. DANKSAGUNG ..... 77 9. LEBENSLAUF ..... 78