title: Zytokinartige Wirkungen von Laktoferrin in verschiedenen Differenzierungsstadien von Caco-2 und THP-1 Zellen
Creators: name: Badrnya, Sigrun
Publisher: name: :none
Year: 2009

description: Laktoferrin ist physiologisch nicht nur als eisenbindendes Glykoprotein von Bedeutung, sondern erfüllt ebenso wie TGF-β1 auf zellulärer Ebene zahlreiche regulatorische und immunmodulatorische Funktionen. Seit einigen Jahren steht Laktoferrin auch in unserer Arbeitsgruppe im Fokus der Forschung. Aufbauend auf Ergebnissen zuvor durchgeführter Studien wurden in dieser Arbeit mögliche Unterschiede in der Regulation der Signaltransduktion in Abhängigkeit des Differenzierungsgrades, sowie in Antwort auf bovines Laktoferrin im Vergleich zu TGF-β1 in enterozytären Caco-2 Zellen und humanen monozytären THP-1 Zellen analysiert. Der Einfluss von Laktoferrin auf diese beiden Zelllinien ist auch physiologisch relevant, da Laktoferrin nicht nur als zweithäufigstes Milchprotein mit der Dünndarmmukosa in Kontakt tritt, sondern auch als wesentliche Komponente der unspezifischen Abwehr vielfältige Wirkungen auf Immunzellen ausübt. Analysen der Grundlevel spezifischer Proteine und Gene undifferenzierter und differenzierter Caco-2 und THP-1 Zellen zeigten eine modulierte Regulation in Abhängigkeit des Zelltyps und des Differenzierungsgrades. Als typisches Markerenzym differenzierter Caco-2 Zellen konnte ein Expressionsanstieg der Sucrase-Isomaltase festgestellt werden. Bei PAI-1 und c-Myc wurde dagegen ebenso wie bei p-Dab2 und den MAPKinasen p-p38 und pERK1/2 eine Abnahme der Signalstärke festgestellt. Auf der Ebene der Rezeptorexpression war nur bei β-Glycan, LRP-1 und Dab1 ein signifikanter Anstieg erkennbar. In Übereinstimmung mit der Literatur zeigten die Ergebnisse von Kurzzeit-inkubationen eine beeinträchtigte bzw. keine Antwortfähigkeit postkonfluenter Caco-2 Zellen gegenüber TGF-β1 und Laktoferrin, bestätigt durch den Verlust der Fähigkeit, spezifische nachgeschaltete Effektoren zu aktivieren. Dagegen wurden die untersuchten Mediatoren im subkonfluentem Stadium durch TGF-β1 zeit- sowie durch Laktoferrin auch dosisabhängig stimuliert. Während das Niveau der Smad2-Aktivierung mit Erhöhung der Laktoferrinkonzentration auf bis zu 500 µg/ml gesteigert wurde, erreichte der Aktivierungszustand von p38, ERK1/2 oder Dab2 bei Laktoferrindosen von 0,5 bzw. 5 µg/ml den Maximalwert. Monozytäre THP-1 Zellen differenzieren in vitro durch Zusatz des Phorbolesters PMA innerhalb von drei Tagen zu makrophagenähnlichen Zellen aus. 24 Stunden nach PMA-induzierter Differenzierung konnte mittels PCR-Analysen eine verstärkte Expression der Differenzierungsmarker CD-36, LRP-1, Endoglin und MMP-9 festgestellt werden. Ebenso war ein Anstieg der MMP-2- und MMP-9-Expressionslevel im Verlauf der THP-1 Differenzierung nachweisbar. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression von PAI-1 oder FN-1 auf transkriptioneller Ebene sowie die Aktivierung von Smad2 oder β-Catenin auf Proteinebene erst mit zunehmendem Anteil adhärenter Zellen induziert wird. Die Signalstärke von LRP-5 und p-p38 wurde im Vergleich zu THP-1 Monozyten über den Zeitraum der Differenzierung dramatisch reduziert. Als besonderes Charakteristikum der THP-1 Zelldifferenzierung konnte nicht nur ein Anstieg der pERK1/2-Level, sondern auch eine Umkehrung des Verhältnisses von pERK1 und pERK2 beobachtet werden. Western Blot-Ergebnissen ein- und vierstündiger Inkubationen zufolge sind differenzierte THP-1 Zellen TGF-β1- und Laktoferrin-responsive, entwickeln jedoch wie postkonfluente Caco-2 Zellen im Zuge der Differenzierung eine gewisse Resistenz. Dies bestätigten die Ergebnisse von PCR-Analysen, die in THP-1 Makrophagen keinen Einfluss von TGF-β1 und Lakroferrin auf die untersuchten Gene zeigen konnten. In monozytären THP-1 Zellen war auf Proteinebene kein p-Smad2-Signal detektierbar, hingegen auf RNA-Ebene eine Stimulierung von PAI-1 durch TGF-β1 und Laktoferrin nachweisbar. Da eine TGF-β1- und Laktoferrin-abhängige Aktivierung der MAPKinasen festgestellt wurde, könnte PAI-1 möglicherweise Smad-unabhängig über den MAPK-Pathway stimuliert werden. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass bovines Laktoferrin ebenso wie TGF-β1 in der Lage ist, zentrale Mediatoren des Smad-, MAPK- oder Wnt-/β-Catenin-Pathway zu stimulieren. Der Zelltyp und Differenzierungsgrad erwiesen sich ebenso wie die eingesetzte Dosis und Inkubationszeit als bestimmende Faktoren für die vermittelten Effekte. Die durchgeführten Analysen liefern mögliche Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchungen, die zur Aufklärung der zugrundeliegenden Mechanismen Laktoferrin-mediierter Effekte beitragen.
description: Lactoferrin is a glycoprotein which is, not only due to its iron-binding properties, physiologically important. At cellular levels, Lactoferrin as well as TGF-β1 fulfils diverse regulatory and immunmodulatory functions. In recent years Lactoferrin has been the focus of intense research in our working group. Based on earlier analyses the purpose of this study was to investigate potential differences in the regulation of signal transduction depending on the state of differentiation as well as in response to Lactoferrin compared to TGF-β1 in human enterocytic Caco-2 and monocytic THP-1 cells. The impact of Lactoferrin on these cell lines is physiologically relevant as Lactoferrin not only interacts with the intestinal mucosa as the second most abundant protein in milk but also exerts various effects on immune cells as an essential component of the innate immune system. Analyses of protein and gene expression levels in undifferentiated and differentiated Caco-2 cells showed an increase in the expression of the differentiation marker sucrase-isomaltase. In contrast PAI-1, c-Myc as well as p-Dab2 and the MAP kinases p-p38 and pERK1/2 were downregulated. On the level of receptor expression β-Glycan, LRP-1 and Dab1 were significantly upregulated. In accordance with literature, the results of short-term incubations revealed an attenuated or no reaction of postconfluent Caco-2 cells towards TGF-β1 and Lactoferrin. This has been confirmed by the loss of the ability to stimulate specific downstream effectors. However, in Caco-2 cells at subconfluency the examined mediators were stimulated by TGF-β1 in a time- as well as by Lactoferrin in a dose- and time-dependent manner. While concentrations of lactoferrin up to 500 µg/ml led to enhanced activation of Smad2, the activation level of p38, ERK1/2 or Dab2 reached the maximum value at anoptimal effective dose of 0,5 - 5 µg/ml. In vitro monocytic THP-1 cells differentiate after treatment with the phorbolester PMA within three days into mature macrophages. 24 hours after PMA-induced differentiation an enhanced expression of the differentiation markers CD-36, LRP-1, Endoglin and MMP-9 was found by PCR analyses. Besides, expression levels of MMP-2 and MMP-1 were elevated during the time course of differentiation. With an increasing number of adherent cells, Smad2 and β-catenin were elevated just as PAI-1 and FN-1 were expressed at transcriptional level. Compared to THP-1 monocytes the expression levels of LRP-5 and p-p38 were considerably reduced in THP-1 macrophages. Moreover differentiation experiments of THP-1 cells revealed not only an upregulation of pERK1/2 activation level but also a dramatic inversion in the pERK1/2 ratio. According to Western Blot analyses after 1 and 4 hours of incubation differentiated THP-1 cells have been proven to be TGF-β1- and Lactoferrin-responsive. On the other hand THP-1 macrophages developed a partial resistance towards TGF-β1 and Lactoferrin comparable to postconfluent Caco-2 cells and confirmed by PCR-analyses. In contrast no p-Smad2 signal could be detected in THP-1 monocytes, although PAI-1 has been stimulated by TGF-β1 and Lactoferrin at transcriptional level. However, TGF-β1 and Lactoferrin induced the activation of p38 and ERK1/2 which indicates that the MAPK-Pathway might be involved in the stimulation of PAI-1. To sum up, results provide further evidence that just as TGF-β1, bovine Lactoferrin is able to stimulate key mediators of the Smad-, MAPK- or Wnt-/β-catenin-Pathway. The cell type, state of differentiation, period of incubation and dose could be identified as determining factors for the mediated effects. The findings provide new approaches to further elucidate underlying mechanisms of Lactoferrin-mediated effects.