title: Inhibitors of p53 and HIF-prolyl-4-hydroxylases provide mitochondrial protection in a model of oxytosis
title: Inhibitoren für p53 und HIF-prolyl-4-hydroxylasen schützen Mitochondrien in einem Modelsystem der Oxytose
Creators: name: Neitemeier, Sandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: oxytosis, mitochondria
neuronal cell death
p53
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
HIF-prolyl-4-hydroxylase
Mitochondrium
Oxidativer Stress , Protein p53
Zelltod

description: Mitochondrial dysfunction and
      demise are hallmarks of many neurological disorders and
      neurodegenerative diseases. Since mitochondria are the key
      organelles providing energy, they are regarded as the power
      house of the cell. Under conditions of stress, mitochondria
      regulate the ‘point of no return’ in intrinsic cell death
      pathways, which marks the decision point between life and
      death. Once the mitochondria are irretrievably damaged, they
      drive the cell into death. Mitochondrial protection displays
      a promising strategy to protect neurons from death.
      Previously, the two proteins p53 and PHD1 have been
      associated with neurodegeneration. Hence, the aim of this
      study was to investigate the role of those two proteins in
      neuronal cell death and to evaluate the neuroprotective
      potential of their particular inhibitors PFTα and DFO, DHB,
      CPO and oxyquinoline, respectively. Additionally, underlying
      mechanisms should be elucidated by which these inhibitors
      mediate their neuroprotective effects. In this study,
      immortalised mouse hippocampal HT-22 cells were used since
      they represent an established model of caspase-independent
      cell death induced by glutamate, termed oxytosis. Moreover,
      erastin was applied in the same cell line to induce a mode of
      cell death called ferroptosis. The first part of this study
      revealed that siRNA-mediated knockdown of p53 delayed
      glutamate-induced cell death in HT-22 cells for about 2 h,
      but failed to prevent lipid peroxidation or mitochondrial
      damage depicted as enhanced mitochondrial fragmentation,
      depolarisation of the mitochondrial membrane, increased
      mitochondrial ROS formation and a loss of ATP levels. Both
      p53 and phospho-p53 did not translocate to the mitochondria
      upon glutamate challenge indicating that oxytosis was not
      attributed to a direct action of p53 at the level of
      mitochondria. The inhibition of p53 transcriptional activity
      by knockdown of p53, which was determined by a reporter assay
      established in this work, could serve as a possible
      explanation for the observed delay of cell death. In
      contrast, the pharmacological p53-inhibitor PFTα prevented
      glutamate-induced cell death of HT-22 cells more efficiently
      and was still able to rescue these cells when applied up to 4
      h after the onset of glutamate treatment. Furthermore, PFTα
      abolished lipid peroxidation and subsequently preserved
      mitochondrial integrity which was indicated by reduced
      mitochondrial fission, attenuated formation of mitochondrial
      ROS and restored mitochondrial membrane potential and ATP
      levels. Notably, PFTα rescued HT-22 cells depleted of p53
      from glutamate-induced cell death. These results exposed a
      pronounced neuroprotective potential of PFTα which occurred
      at the level of mitochondria and independently of p53. The
      second part of this thesis demonstrated the neuroprotective
      potential of PHD inhibition by the use of structural diverse
      PHD-inhibitors and siRNAs selectively targeting PHD1. Both
      concepts of PHD inhibition reduced generation of lipid
      peroxides and preserved mitochondrial morphology and function
      indicated by restored mitochondrial respiration and membrane
      potential and abolished mitochondrial ROS formation,
      revealing that PHD inhibition acts upstream of mitochondrial
      demise. Remarkably, the effects by siRNA-mediated PHD1
      silencing were less pronounced than those achieved by
      pharmacological inhibitors. These differences in efficacy
      were likely attributed to the insufficient knockdown by the
      siRNA approach. Nevertheless, these findings exposed the
      selective inhibition of PHD1 and the broad pharmacological
      inhibition of the PHD enzyme family as promising strategies
      to achieve mitochondrial rescue and subsequent
      neuroprotection. Previously, PHDs have been shown to interact
      with the transcription factor ATF4. The present study
      revealed that oxyquinoline was able to prevent the
      glutamate-induced down regulation of ATF4. However,
      oxyquinoline was still able to prevent oxytosis in cells
      depleted of ATF4. Therefore, the observed regulation of ATF4
      protein levels after oxyquinoline application emerged as
      dispensable for oxyquinoline mediated protection in oxytosis,
      although previous studies in vivo suggested a modification of
      ATF4 transcriptional activity as mode of action for
      oxyquinoline. Overall, the exact mechanism by which PHD
      inhibition and, in particular oxyquinoline induced
      neuroprotection in the paradigm of oxytosis remains elusive
      so far. Finally, PHD inhibition was also shown to protect
      HT-22 cells against erastin-induced ferroptosis further
      supporting the pivotal role of PHDs in neuronal demise and
      the potential of PHD inhibition as a promising therapeutic
      strategy in the treatment of neurodegenerative diseases,
      where oxidative stress contributes to progressive
      mitochondrial dysfunction and neuronal death.
description: Eine der wichtigsten Aufgaben von
      Mitochondrien ist die Bereitstellung von Energie in Form von
      ATP. Daher werden sie oft auch als Kraftwerke der Zelle
      bezeichnet. Darüber hinaus erfüllen Mitochondrien zentrale
      Funktionen im Zellstoffwechsel. Da neuronale Zellen einen
      sehr hohen Energiebedarf aufweisen, sind sie in besonderem
      Maße auf die physiologischen Funktionen der Mitochondrien
      angewiesen. Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle in der
      neuronalen Apoptose. Deshalb wird der Schutz von
      Mitochondrien zunehmend als eine Strategie zur wirkungsvollen
      Bekämpfung und Behandlung dieser Erkrankungen verfolgt. Zwei
      Proteine, die möglicherweise in der Entstehung und
      Progression neurodegenerativer Erkrankungen eine Rolle
      spielen, sind p53 und die Isoform 1 der
      HIF-prolyl-4-hydroxylasen (PHD). Das Ziel der vorliegenden
      Arbeit war daher, die Funktion dieser beiden Proteine im
      neuronalen Zelltod näher zu untersuchen. Zu diesem Zweck
      wurde die murine, hippocampale Zelllinie HT-22 verwendet, die
      ein etabliertes Modellsystem zur Erforschung des
      Caspase-unabhängigen intrinsischen Zelltods darstellt, der in
      diesem Modell durch die extrazelluläre Zugabe von Glutamat
      hervorgerufen wird. Diese Art des Zelltods wird auch als
      Oxytose bezeichnet. Des Weiteren wurde die Substanz Erastin
      eingesetzt, um den Tod der HT-22 Zellen nach dem Muster der
      Ferroptose herbeizuführen. Im ersten Teil der Arbeit wurden
      die Effekte einer verminderten Expression von p53, die durch
      den Einsatz einer p53 siRNA erreicht wurde, auf den
      neuronalen Zelltod untersucht. Eine Reduktion der p53-Spiegel
      konnte den durch Glutamat provozierten Tod der HT-22 Zellen
      um circa zwei Stunden verzögern. Dagegen war die Reduktion
      der p53 Proteinmenge nicht in der Lage, die Schädigung der
      Mitochondrien zu verhindern. Diese zeigte sich in einem
      erhöhten Fragmentierungsgrad der Mitochondrien und einer
      Depolarisation der mitochondrialen Membran. Die
      Beeinträchtigung der Mitochondrienfunktion wurde jedoch nicht
      durch einen direkten Einfluss von p53 auf die Mitochondrien
      ausgelöst, da weder für p53 noch für phosphoryliertes p53
      eine Translokation zu den Mitochondrien nach
      Glutamatbehandlung gezeigt werden konnte. Die Durchführung
      eines Reporter-Assays offenbarte weiterhin eine Reduktion der
      transkriptionellen Aktivität von p53 in Zellen, die zuvor mit
      p53 siRNA behandelt worden waren. Im Gegensatz dazu zeigte
      der p53-Inhibitor PFTα eine ausgeprägte Protektion der HT-22
      Zellen gegenüber Glutamat und war auch in der Lage, die
      Struktur und Funktion der Mitochondrien zu erhalten, was sich
      in einem tubulären Erscheinungsbild der Mitochondrien, einer
      verminderten Produktion von ROS, einem intakten
      Membranpotenzial und physiologischen ATP-Spiegeln zeigte.
      Außerdem verhinderte PFTα den Tod der HT-22 Zellen, wenn es
      bis zu vier Stunden nach dem Beginn der Glutamatbehandlung
      appliziert wurde. Darüber hinaus war PFTα sogar im Stande,
      HT-22 Zellen mit reduzierten p53-Spiegeln vor der
      Glutamatschädigung zu schützen. Diese Ergebnisse bestätigen
      das große neuroprotektive Potenzial von PFTα und deuten
      darauf hin, dass der Effekt von PFTα vor oder zum Zeitpunkt
      der Mitochondrienschädigung zum Tragen kommt. Weiterhin
      scheinen andere durch PFTα hervorgerufene Effekte unabhängig
      von der p53-Blockade zum Schutz der Neurone beizutragen. Im
      zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss von PHDs auf den
      neuronalen Zelltod untersucht. Dafür wurden die verschiedenen
      PHD-Inhibitoren DFO, DHB, CPO und Oxyquinoline sowie zwei
      siRNA Sequenzen zur Verminderung der Expression von PHD1
      verwendet. Sowohl die pharmakologischen Inhibitoren als auch
      die gentechnische Reduktion der PHD1-Spiegel schützten die
      HT-22 Zellen vor dem Zelltod durch Glutamatschädigung sowie
      der daraus folgenden Lipidperoxidation und Schädigung der
      Mitochondrien. Die Funktionalität der Mitochondrien wurde
      durch Untersuchungen der mitochondrialen Atmung sowie des
      Membranpotenzials und der ATP-Spiegel nachgewiesen. Außerdem
      führten beide Ansätze zur Hemmung der PHDs zu einer
      verminderten Produktion von ROS in den Mitochondrien und
      verhinderten die durch oxidativen Stress hervorgerufene
      Fragmentierung der Mitochondrien. Auch wenn die Effekte der
      PHD1 siRNA signifikant geringer waren als die der
      pharmakologischen Inhibitoren, deuten diese Ergebnisse
      insgesamt darauf hin, dass sowohl die selektive Hemmung der
      PHD1 Expression als auch die pharmakologische Inhibition
      aller PHD Isoformen zu einem Schutz der Mitochondrien und
      damit zur Neuroprotektion beitragen. In einem letzten Schritt
      wurde gezeigt, dass sowohl die pharmakologischen
      PHD-Inhibitoren als auch die verminderte Expression von PHD1
      zu einer Protektion der HT-22 Zellen im Model der Ferroptose
      führen, was die Bedeutung der PHDs für den neuronalen Zelltod
      unterstreicht und sie als vielversprechende Zielstruktur in
      der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen
      hervorhebt.