Διερεύνηση της έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας p53, Hsp90 και Hsp70 στη νεοπλασία των κυττάρων της αιμολέμφου στο μεσογειακό μύδι Mytilus galloprovincialis
Creators: name: Μαρμελούδη, Νανά Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: αιμική νεοπλασία
p53-πρωτεΐνη
Mytilus galloprovincialis
haemic neoplasia
p53-protein

description: Το μεσογειακό μύδι Mytilus galloprovincialis αναπτύσσει μία αιμική νεοπλασματική ασθένεια που χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό μη φυσιολογικών αιμοκυττάρων, τα οποία φέρουν χαρακτηριστικούς διογκωμένους πυρήνες και λιγότερο κυτταρόπλασμα. Η αιμική νεοπλασία του Mytilus sp. θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο για ανθρώπινους καρκίνους καθώς έχουν εντοπιστεί ομοιότητες στους μοριακούς μηχανισμούς. Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 δρα ως μεταγραφικός παράγοντας, επιδρά στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου και στην απόπτωση. Στα μαλάκια η οικογένεια p53 αποτελείται από τρία μέλη, την 53, την ΔNp63/73 και την TAp63/73, τα οποία προκύπτουν από το ίδιο γονίδιο με εναλλακτικό μάτισμα. In silico ανάλυση των αλληλουχιών των hsp90 γονιδίων αποκάλυψε μια υποθετική θέση πρόσδεσης της p53 στην περιοχή του υποκινητή τους, οδηγώντας στην υπόθεση για πιθανή μεταγραφική ρύθμιση τους από την p53 και για συμμετοχή της Hsp90 στη λευχαιμία των μαλακίων. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι οι ισομορφές της οικογένειας p53 καθώς και της οικογένειας θερμικού πλήγματος συμμετέχουν στην παθογένεια της ασθένειας. Προηγούμενες μελέτες στο είδος Μ.trossulus έδειξαν ότι τα επίπεδα mRNA των p53 και ΔNp63/73 αυξάνουν στα δείγματα με αιμική νεοπλασία. Σε προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου, τα αποτελέσματα διαφέρουν μεταξύ των ιστών. Συγκεκριμένα, σε άτομα του είδους M.galloprovincialis, τα επίπεδα mRNA των p53 και ΔNp63/73 ισομορφών αυξάνονται από τον φυσιολογικό στον λευχαιμικό φαινότυπο στους ιστούς της αιμόλεμφου, στα βράγχια και στον μανδύα, ενώ η ΤΑp63/73 ισομορφή αυξάνεται στον μανδύα και μειώνεται στην αιμόλεμφο και στα βράγχια. Η παρούσα εργασία έχει ως σκοπό την διερεύνηση του ρόλου τον ισομορφών της p53 στην ρύθμιση της μεταγραφής των πρωτεϊνών θερμικού πλήγματος, στον λευχαιμικό φαινότυπο. Άτομα του είδους M.galloprovincialis συλλέχτηκαν από τον κόλπο του Θερμαϊκού, ελέχθησαν για νεοπλασία, και αναλύθηκαν ως προς τους ιστούς της αιμόλεμφου, του μανδύα και του μυ. Στη συνέχεια ακολούθησε σύνθεση του cDNA και ημι-ποσοτική PCR για τον προσδιορισμό των επιπέδων mRNA των p53, ΔNp63/73, TΑp63/73, hsp70 και hsp90,με σκοπό την ποσοτικοποίηση της έκφρασης τους. Οι προσπάθειες για την πρωτεϊνική μελέτη των ισομορφών της p53, της Ηsp90 και της Ηsp70, δεν έδωσαν αποτέλεσμα ικανοποιητικό προς μελέτη. Συμπερασματικά, βάσει της εικόνας των αιμοκυττάρων των μυδιών, υπολογίστηκε ότι το 4,8% των ατόμων, που εξετάστηκαν, παρουσίαζαν λευχαιμία. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από την ποσοτικοποίηση της έκφρασης σε μεταγραφικό επίπεδο, αποκάλυψαν αυξημένη έκφραση των p53, ΔΝp63/73 και TΑp63/73 στα λευχαιμικά δείγματα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά. Ομοίως, οι μέσοι όροι σχετικής έκφρασης των hsp90 και hsp70 φαίνονται να αυξάνονται στα λευχαιμικά μύδια. Η πρωτεϊνική μελέτη θέλει παραπάνω διερεύνηση για να καταλήξει σε κάποιο συμπέρασμα. Στο σύνολο της η εργασία υποδεικνύει ότι οι ισομορφές της p53 συμμετέχουν στην αιμική νεοπλασία του M.galloprovincialis.
description: The commercially important marine bivalve Mytilus galloprovincialis (Mediterranean mussel) can develop a leukaemia-like disease, haemic neoplasia, which can be induced, in part, by environmental stressors. Haemic neoplasia is characterized by continuously dividing haemocytes, which display enlarged nuclei. Leukemia in Mytilus sp. could be used as model for human cancers as the implicated molecular mechanisms share similarity. Tumor suppressor protein p53 is related to the cell cycle control, transcriptional regulation and apoptosis. It has been previously shown to be involved in haemic neoplasia at the gene and protein level. The p53 family in mollusks consists of three members namely p53, ΔNp63/73 and TAp63/73, which are likely splice variants of a single gene. Previous results of our laboratory revealed a putative p53 binding site in the promoter region of the M. galloprovincialis hsp90 gene. Heat shock proteins (HSPs) are synthesized by cells in response to various stress conditions and they serve as molecular chaperones in protein transport and folding. Several references report the major role of heat shock proteins in cancer, in a variety of species. Two genes of the HSP90 family, coding for the same protein and six genes of the HSP70 family have been isolated from M.galloprovincialis individuals. mRNA levels of p53, ΔNp63/73 isoforms were previously shown to be increased in M. trossulus with haemic neoplasia. In previous studies of our laboratory, the results differ among the tissues. Especially, mRNA levels were decreased in haemolymph and gills and they were increased in mantle, among normal and neoplastic individuals of M.galloprovincialis. The purpose of this study was the quantification of p53-like isoforms, stress induced Hsp70 members and Hsp90 at the mRNA level, in mussels with haemic neoplasia compared to normal controls. M. galloprovincialis specimens were collected from Thermaikos gulf. Total RNA was extracted from mantle and muscle of normal, intermediate and neoplastic samples. After cDNA synthesis, semi-quantitive PCR was performed to determine the transcription level of hsp90, hsp70, p53, DNp63/73 and TAp63/73. Our results showed that mRNA levels of all genes tested increased in the leukemic phenotype in both tissues. In conclusion, the transcription of hsp90, hsp70 and p53 like isoforms is up-regulated at neoplastic versus normal individuals in both mantle and muscle. Τhe results of protein levels are not suitable for a conclusion. The study of protein levels needs more research to reach a conclusion. In total, the work suggests that p53 family is involved in haemic neoplasia of M.galloprovincialis.