title: Photodynamics of phototropin and cryptochrome blue-light photoreceptors
Creators: name: Song, Sang-Hun
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Phototropin , Chlamydomonas reinhardii , Cryptochrom , Photorezeptor , Emissionsspektroskopie , Absorptionsspektroskopie , Flavine , Blaulicht , , cryptochrome , LOV-Domain , absorption spectroscopy , emission spectroscopy , energy transfer
subject: 540 Chemie

description: The plant responding on blue light was reported as early as 1881 by Darwin. Since then different photoreceptors have been studied. Light signals regulate plant growth and development through the action of specialized photoreceptors, working alone or in combination. The photoreceptors convert their signals into photobiological response and they have their own distinct photo-dynamic cycles. Flavin based blue light photoreceptors are LOV domains (LOV=Light, Oxygen, Voltage) with FMN (flavin mononucleotide) cofactors, cryptochromes with FAD cofactor (FAD: flavin adenine dinucleotide) and BLUF domain (BLUF: blue light sensor using FAD). In this dissertation the absorption and emission spectroscopic characterisations of LOV1 � LOV2 domain (LOV1/2) from Chlamydomonas reinhardtii and cryptochrome 3 (cry3) from Arabidopsis thaliana are studied. A LOV1/2-MBP fusion protein (MBP = maltose binding protein) and LOV1/2 with a His-tag at the C-terminus (LOV1/2-His) expressed in an Escherichia coli strain are investigated. Blue-light photo-excitation generates a non-fluorescent intermediate photoproduct (flavin-C(4a)-cysteinyl adduct with absorption peak at 390 nm). The photo-cycle dynamics is studied by dark-state absorption and fluorescence measurement, by following the temporal absorption and emission changes under blue and violet light exposure, and by measuring the temporal absorption and fluorescence recovery after light exposure. A bi-exponential absorption recovery after light exposure with a fast (in the several ten seconds range) and a slow component (in the near ten minute range) are resolved. The quantum yield of photo-adduct formation is extracted from excitation intensity dependent absorption measurements. It decreases somewhat with rising excitation intensity. The behaviour of the combined wildtype LOV1 � LOV2 double domains is compared with the behaviour of the separate LOV1 and LOV2 domains. The blue light photoreceptor cryptochrome 3 (cry3) from Arabidopsis thaliana was characterized at room temperature in vitro in aqueous solution by optical absorption and emission spectroscopic studies. The protein non-covalently binds the chromophores flavin adenine dinucleotide (FAD) and N5,N10-methenyl-5,6,7,8-tetrahydrofolate (MTHF). In the dark-adapted state of cry3, the bound FAD is present in the oxidized form (FAD-ox, ca. 38.5 %), in the semiquinone form (FADH°, ca. 5 %), and in the fully reduced neutral form (FADH2) or fully reduced anionic form (FADH-, ca 55 %). Some amount of FAD (ca. 1.5 %) in the oxidized state remains unbound probably caused by protein aggregation and/or denaturation. Förster-type energy transfer from MTHF to FAD-ox is observed. Photo-excitation reversibly modifies the protein conformation causing a slight rise of the MTHF absorption strength and an increase of the MTHF fluorescence efficiency (efficient protein conformation photo-cycle). Additionally there occurs reversible reduction of bound FAD-ox to FADH2 (or FADH°, FAD-ox photo-cycle of moderate efficiency), reversible reduction of FADH° to FADH2, and modification of re-oxidable FADH2 to permanent FADH2 with low quantum efficiency. Photo-excitation of MTHF causes the reversible formation of a MTHF species (MTHF�, MTHF photo-cycle, moderate quantum efficiency) with slow recovery to the initial dark state, and also the formation of an irreversible photoproduct (MTHF��).
description: Über die Reaktion von Pflanzen auf blaues Licht berichtete bereits Darwin im Jahre 1881. Seitdem wurden veschiedene Photorezeptoren untersucht. Lichtsignale regulieren das Pflanzenwachstum und die Pflanzenentwicklung, durch spezielle Photorezeptoren, die alleine oder in Kombination agieren. Die Photorezeptoren wandeln ihre Signale in photobiologische Antworten und haben ihre eigenen photodynamischen Zyklen Blaulichtphotorezeptor mit Flavin-Cofaktoren sind die LOV-Domänen (LOV=Light, Oxygen, Voltage) und FMN (Favin Mononucleotide) als Chromophor, die Cryptochrome und FAD (Flavin Adenine Dinucleotide) als Chromophore und die BLUF-Domänen (blue light sensor using FAD). In dieser Dissertation wurden absorptions- und emissionsspektroskopische Studien an der Doppeldomäne LOV1-LOV2 der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii (LOV=Light, Oxygen, Voltage) und an Cryptochrome 3 der Pflanze Arabidopsis thaliana durchgeführt. LOV1/2-MBP (MBP=Maltose Bindung Protein) und LOV1/2 mit einem His-Tag wurden untersucht. Blaulicht Photoanregung erzueugt eine nicht-fluoreszentes Zwischenprodukt (Flavin-C(4a)-cysteinyl Addukt mit Absorptionmaximum bei 390 nm). Die Dynamik des Photozykluses wurde studiert durch Untersuchung der Absorption und Fluoreszenz des Dunkelzustandes, durch Untersuchung des zeitlichen Verhaltens der Absorption und Fluoreszenz während der Bestrahlung mit violettem und blauem Licht, und durch Untersuchung der Wiederherstellung der Absorption und Fluoreszenz nach Bestrahlung mit Licht. Eine biexponentielle Absorptionserholung nach Lichtabschaltung mit einer schnellen und einer langsamen Komponente wurde gefunden. Die Quantunausbeute der Photoadduktbildung wurde durch intensitätsabhängige Absorptionsmessungen ermittelt. Sie nimmt mit steigender Anregungsenergiedichte leicht ab. Das Verhalten der kombinierten LOV1-LOV2-Doppel-Domäne wurde mit dem Verhalten der getrennten LOV1 und LOV2 Einzeldomänen verglichen. Der Cryptochrom Blaulichtphotorezeptor Cry3 von Arabidopsis thaliana wurde bei Raumtemperatur in vitro durch optische absorptions- und emissionsspektrospische Untersuchungen in wässriger Lösung studiert. Das Protein bindet die Chromphore FAD (Flavin Adenine Dinucleotide) und MTHF (methenyltetrahydrofolate) nicht-kovalent. Im Dunkelzustand existiert FAD in oxidierter Form (FAD-ox), in seimiquinone Form (FADH°) und in reduzierter neutraler Form oder in der reduzierter anionischer Form. Ein kleines Anteil von FAD in oxiderter Form bleibt ungebunden, wahrscheinlich aufgrund von Proteinaggregation und Denaturierung. Förster-Energietransfer von MTHF nach FAD-ox wurde beobachtet und analysiert. Photoanregung modifiziert die Proteinkonformation und verursacht einen leichten Anstieg der MTHF Absorption und einer Anstieg der MTHF Fluoreszenz. Zusätzlich findet reversible Reduktion von gebundenem FAD-ox zu FADH2 (oder FADH-, FAD-ox Photozyklus mit kleiner Effizienz), reversible Reduktion von FADH° zu FADH2, und Modifikation von reoxidierbarem FADH2 zu permanentem FADH2 mit geringer Quanteneffizienz statt. Photoanregung von MTHF verursacht die reversible Bildung einer MTHF Spezies (MTHF�, MTHF Photozyklus, mäßige Quanteneffizienz) mit langsamer Rückbildung zum ursprünglichen MTHF im Dunkeln, und auch die Bildung eines irreversiblen Photoprodukt (MTHF��).