Ανάπτυξη νέων σύνθετων υλικών βιοπολυμερούς-βιοκεραμικού για εφαρμογές ιστομηχανικής
Creators: name: Τσιόπτσιας, Κωνσταντίνος Ν.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Ιστομηχανική
Βιοπολυμερές
Πορώδη υλικά
Ικριώματα
Υπερκρίσιμο CO2
θερμιδομετρία υψηλής πίεσης
Tissue engineering
Biopolymer
Porous materials
Scaffolds
Supercritical CO2
High pressure calorimetry

description: Το κύριο αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων υλικών κατάλληλων για εφαρμογές ιστομηχανικής. Τα βασικά επιθυμητά γνωρίσματα ενός ικριώματος ιστομηχανικής είναι η βιοαποικοδομησιμότητα, η βιοσυμβατότητα, και η ύπαρξη πορώδους δομής. Τα δύο πρώτα γνωρίσματα μπορούν να εξασφαλιστούν εύκολα επιλέγοντας την κατάλληλη πρώτη ύλη για την κατασκευή του ικριώματος (π.χ. ένα φυσικό πολυμερές), οπότε το αντικείμενο της διατριβής επικεντρώνεται στην παραγωγή πορωδών δομών σε βιοαποικοδομήσιμα-βιοσυμβατά πολυμερή. Αρχικά παρήχθησαν επιτυχώς ινώδεις δομές πολυ(υδροξυ-βουτυρικού εστέρα) (ΡΗΒ) και οξικής κυτταρίνης με την τεχνική της ηλεκτροστατικής ινοποίησης (electrospinning). Οι δομές που προέκυψαν είχαν μέση διάμετρο ινών μεταξύ 0,6 και 3 μm. Στα ινώδη ικριώματα ΡΗΒ έγινε εγκλεισμός πυροξικάμης ενώ στις ίνες οξικής κυτταρίνης έγινε εγκλεισμός αμοξικιλλίνης. Και στις δύο περιπτώσεις το ποσοστό εγκλεισμού ήταν μικρό. Βρέθηκε ότι αύξηση της συγκέντρωσης φαρμάκου στο αρχικό διάλυμα δεν οδηγεί απαραίτητα σε αύξηση του ποσοστού εγκλεισμού. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της απομάκρυνσης σωματιδίων για την παραγωγή πορωδών δομών χιτίνης. Αρχικά τα σωματίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υδατοδιαλυτά σύμφωνα με όσα αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Βρέθηκε ότι η μέθοδος αυτή δεν μπορεί να εφαρμοστεί με μεγάλη επιτυχία σε υδρόφιλα πολυμερή (και σε σύνθετα υλικά αυτών) όπως η χιτίνη, εξαιτίας της ταυτόχρονης απομάκρυνσης του διαλύτη του πολυμερούς και του μέσου πορογένεσης. Για αυτό έγινε χρήση μη υδατοδιαλυτών σωματιδίων. Η παραλλαγή αυτή της μεθόδου εφαρμόστηκε με επιτυχία στη χιτίνη, την κυτταρίνη, τη χιτοζάνη και σε σύνθετα υλικά χιτίνης-υδροξυαπατίτη, κυτταρίνης-υδροξυαπατίτη και χιτοζάνης-ζελατίνης. Οι δομές παρουσίαζαν μεγάλη ομοιομορφία, υψηλό πορώδες και αρκετά υψηλό βαθμό διασύνδεσης. Η χρήση ιοντικών υγρών ως διαλυτών, στην περίπτωση της κυτταρίνης διευκολύνει την όλη διεργασία και την παραγωγή σύνθετων υλικών. Με την εφαρμογή της μεθόδου απομάκρυνσης μη υδατοδιαλυτών σωματιδίων in situ πάνω σε κεραμικά δοκίμια επιτεύχθηκε σύνδεση ικριωμάτων χιτίνης, χιτοζάνης και χιτοζάνης-ζελατίνης με τα εν λόγω δοκίμια. Με φασματοσκοπία υπερύθρου μελετήθηκε η σύνδεση και βρέθηκε ότι οφείλεται στην αλληλεπίδραση με δυνάμεις διασποράς ομάδων των πολυμερών με το κεραμικό δοκίμιο. Το κεραμικό υλικό συνδεδεμένο με το ικρίωμα αποτελεί ένα σύνθετο βιοϋλικό. Άλλα σύνθετα βιοϋλικά που αποτελούνται από δύο ή τρία ικριώματα παρήχθησαν με συνδυασμό διαφόρων τεχνικών. Η σύνδεση μεταξύ των ικριωμάτων επιτεύχθηκε είτε λόγω δυνάμεων διασποράς είτε λόγω δεσμών υδρογόνου. Ένα τέτοιο υλικό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για ανάπλαση πολλαπλών ιστών ή διεπιφάνειας ιστών. Με χρήση υπερκρίσιμου CO2 και με τη μέθοδο αφρισμού πολυμερών με ανύψωση της θερμοκρασίας έγινε παραγωγή πορωδών δομών πολυ(μεθακρυλικού μεθυλεστέρα). Εξετάστηκε η επίδραση του πάχους δοκιμίων στο μέγεθος πόρων. Σε όλες τις περιπτώσεις η μέση διάμετρος πόρων ήταν κάτω του 1 μm και βρέθηκε ότι με αύξηση του πάχους του δοκιμίου προκαλείται αύξηση της μέσης διαμέτρου και αύξηση της διασποράς. Τα αποτελέσματα εξηγήθηκαν ποιοτικά με τον θεωρητικό προσδιορισμό της ενέργειας ενεργοποίησης ομογενούς εμπυρήνωσης, λαμβάνοντας υπόψη την κινητική της μεταφοράς μάζας και θερμότητας στα δοκίμια αυτά. Για την παραγωγή πορωδών δομών σε κρυσταλλικά πολυμερή όπως η χιτίνη και η κυτταρίνη, με υπερκρίσιμο CO2, χρησιμοποιήθηκε μια νέα μέθοδος που αναπτύχθηκε στα πλαίσια της διατριβής, ο αφρισμός υδροπηκτών. Παρήχθησαν πορώδεις δομές χιτίνης, κυτταρίνης και σύνθετων υλικών κυτταρίνης-υδροξυαπατίτη και κυτταρίνης-οξειδίου του πυριτίου με μέση διάμετρο πόρων μεταξύ 30 και 150 μm. Βρέθηκε ότι η αύξηση της πίεσης και η ελάττωση της θερμοκρασίας οδηγεί σε μείωση της μέσης διαμέτρου. Η ατελής εκρόφηση του CO2 από την υδροπηκτή σε μερικές περιπτώσεις (που προκαλείται από τη ψύξη λόγω του φαινομένου Joule-Thomson) οδηγεί σε αυξημένη διασύνδεση μεταξύ των πόρων. Αν αντί για υδροπηκτές χρησιμοποιηθούν αλκοολο-πηκτές βρέθηκε ότι με την τεχνική ξήρανσης κρίσιμου σημείου (με χρήση υπερκρίσιμου CO2) μπορούν να παραχθούν νανοπορώδεις αεροπηκτές χιτίνης και κυτταρίνης. Εξετάστηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων στα χαρακτηριστικά των υλικών. Επίσης έγινε παραγωγή αεροπηκτής άνθρακα με πυρόλυση σε αδρανή ατμόσφαιρα αζώτου αεροπηκτής χιτίνης. Ο αφρισμός αλκοολο-πηκτών (σε αντιστοιχία με τον αφρισμό υδροπηκτών) βρέθηκε να είναι προβληματικός. Αυτό συνδέθηκε με την κρυσταλλικότητα των πηκτών. Οι υδροπηκτές μπορούν να παρομοιαστούν με ένα άμορφο πολυμερές σε ελαστομερή κατάσταση (ευκίνητες αλυσίδες), όπου η εκρόφηση του CO2 προκαλεί τη δημιουργία πορώδους δομής. Αντίθετα στις αλκοολο-πηκτές η δημιουργία ή όχι πορώδους δομής εξαρτάται αποκλειστικά από τις αλληλεπιδράσεις του CO2 με τον διαλύτη της πηκτής. Μετρήθηκε η ρόφηση CO2 από υδροπηκτές κυτταρίνης και χιτίνης με μια τροποποιημένη μέθοδο απώλειας μάζας. Επίσης σχεδιάστηκε και κατασκευάστηκε διάταξη που συνδυάζει την ογκομετρική μέθοδο με θερμιδομετρία Calvet. Η διάταξη αυτή επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό της ρόφησης και ενθαλπίας ρόφησης του CO2 από πολυμερή καθώς και της συγκέντρωσης αερίου που προκαλεί πλαστικοποίηση. Το πολυμερές που χρησιμοποιήθηκε ήταν το ΡΜΜΑ. Οι μετρήσεις έγιναν σε θερμοκρασία 54,3 οC και σε εύρος πιέσεων από 20 ως 50 bar. Τα αποτελέσματα ρόφησης και ενθαλπίας ρόφησης (ισορροπία στερεού-αερίου) περιγράφηκαν θεωρητικά με το μοντέλο διπλής ρόφησης (Dual Sorption Model) και το μοντέλο πλεγματικού ρευστού μη τυχαίας διευθέτησης (Non Random Hydrogen Bonding, NRHB). Η NRHB χρησιμοποιήθηκε για την περιγραφή της ισορροπίας φάσεων στερεού-υγρού και συγκεκριμένα για την πρόβλεψη της διαλυτότητας της χιτίνης και της κυτταρίνης σε ιοντικά υγρά. Η πρόβλεψη αυτή ήταν μόνο ποιοτική λόγω έλλειψης επαρκών και αξιόπιστων δεδομένων τόσο για τις καθαρές ουσίες όσο και για τα δυαδικά μίγματα. Αρκετά καλύτερα ήταν τα αποτελέσματα στην περιγραφή ισορροπίας υγρού-υγρού και υγρού-αερίου συστημάτων ιοντικών υγρών με διάφορους διαλύτες. Γενικά, η NRHB περιγράφει και προβλέπει αρκετά ικανοποιητικά τέτοια συστήματα με ελάχιστο αριθμό βελτιστοποιούμενων παραμέτρων. Τέλος, πολλά από τα παραγόμενα υλικά (ινώδη ικριώματα οξικής κυτταρίνης, πορώδη ικριώματα χιτίνης και πορώδη ικριώματα χιτίνης, χιτοζάνης και χιτοζάνης-ζελατίνης συνδεδεμένα πάνω σε κεραμικά δοκίμια) παραχωρήθηκαν σε διάφορα εργαστήρια του ΑΠΘ όπου έγινε βιολογική-βιοϊατρική χρήση και αξιολόγηση των υλικών. Οι καλλιέργειες έγιναν με διαφόρων τύπων ινοβλάστες. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα υλικά είναι κατάλληλα για εφαρμογές ιστομηχανικής και ευνοούν την προσκόλληση και ανάπτυξη των ινοβλαστών
description: The main objective of the thesis is the development of novel materials for fabrication of tissue engineering scaffolds. The desirable characteristics of a tissue engineering scaffold are biodegradation, biocompatibility and the existence of porous structure. The first two characteristics can be rather easily satisfied by choosing an appropriate starting material for the fabrication of the scaffold (e.g. a natural polymer), so the main subject of the present thesis is focused on the production of porous structures out of biodegradable-biocompatible polymers. Initially, fibrous cellulose acetate and poly(hydroxyl butyrate) (PHB) structures were successfully prepared via the electrospinning technique. The structures exhibited an average diameter size between 0.6 and 3 μm. In the fibrous scaffolds of PHB piroxicam was encapsulated while amoxicillin was loaded in the cellulose acetate scaffolds. In both cases the loading percentage was low. It was found that increase of the drug concentration in the initial solution does not lead to an increase in the loading percentage. Next, the particulate leaching method was used in order to produce porous chitin and chitin-hydroxyapatite structures. According to the literature, salt (water soluble) particles were used. It was found that this method cannot be applied successfully in hydrophilic polymers like chitin due to the simultaneous removal of the polymer solvent and the porogen particles. Thus, next water insoluble particulates were used. This approach was successfully applied to chitin, cellulose, chitosan and composite materials of chitin-hydroxyapatite, cellulose-hydroxyapatite and chitosan-gelatin. The produced structures exhibited great uniformity, high and open porosity. The use of ionic liquids as solvents, in the case of cellulose, enables the process and the production of composite materials. By the in situ fabrication of scaffolds with the above mentioned method in porcelain samples, connection of chitin, chitosan and chitosan-gelatin scaffolds with porcelain was achieved. The connection was by infrared spectroscopy and it was found that mainly responsible for this, is the interaction via dispersion forces between groups of the polymers and the porcelain sample. The ceramic connected with polymer scaffolds is a composite biomaterial. Other composite biomaterials that consist of two or three scaffolds were fabricated by combining different techniques. The connection between the scaffolds was achieved due to dispersion forces or hydrogen bonds. Such a material could possibly find application in multiple tissue or tissue interface regeneration. By using supercritical CO2 porous poly(methyl methacrylate) structures were produced via the polymer foaming (temperature induced) method. The influence of the polymer thickness was examined. In all cases sub-micron porous were obtained and it was found that by increasing thickness the average pore diameter and the dispersion increase. For qualitative theoretical explanation of the results the activation energy of homogeneous nucleation was determined by taking into account the kinetics of heat and mass transfer in these samples. For the production of porous structures, by using CO2, in crystalline polymers such as chitin and cellulose a novel method, that was developed during the thesis, was applied: the hydrogel foaming. Porous chitin, cellulose, cellulose-hydroxyapatite and cellulose-silicon oxide structures were produced with an average diameter between 30 and 150 μm. It was found that by increasing pressure or decreasing temperature, average pore diameter decreases. The incomplete desorption of CO2 from the hydrogel in some cases (that arises from cooling due to the Joule-Thomson effect) leads to an increased pore interconnection. If instead of hydrogels alco-gels are used it was found that via the critical point drying technique (and by using supercritical CO2) nanoporous chitin and cellulose aerogels can be prepared. The influence of different parameters on the characteristics of the final material was examined. Also the feasibility of producing carbon aerogel with chitin aerogel as precursor was examined. The foaming of alco-gels was found to be defective. This was attributed to the crystallinity of the gels. Hydrogels can be considered as amorphous polymer in the rubbery state (flexible chains), where the CO2 desorption leads to pore formation. In contrast, in the case of alco-gels the production of porous structure depends exclusively on the interaction of CO2 with the solvent of the gel. The sorpion of CO2 by chitin and cellulose hydrogels was measured by a modified mass loss analysis. Also an apparatus was designed and constructed that combines volumetric method and Calvet calorimetry. The apparatus allows for the simultaneous measurement of sorption and heat of sorption of CO2 by polymers, and also for the determination of gas concentration that causes plasticization of the polymer. PMMA was used. Measurements were carried out at the temperature of 54,3 oC and in a pressure range from 20 to 50 bar. Results of sorption and heat of sorption (solid-vapor equilibira) were described by the dual sorption model and the non random hydrogen bonding model (NRHB). NRHB was used for the prediction of the solubility of chitin and cellulose in ionic liquids (solid-liquid equlibria). The prediction was only in qualitative agreement with the experimental data, due to the lack of sufficient and reliable experimental data for both pure substances and binary systems. Much better were the results in the case of description of vapor-liquid and liquid-liquid equilibria of binary systems containing ionic liquids. In general NRHB describes and predicts very well such systems with a minimum number of optimized parameters. Finally many of the fabricated materials (cellulose acetate fibrous scaffolds, chitin porous scaffolds, and chitin, chitosan and chitosan-gelatin porous scaffolds connected to porcelain ssamples) were given in 3 different medical laboratories, and biomedical-biological evaluation of the scaffolds was carried out. Cell culturing was carried out with different types of fibroblasts. The results showed that the fabricated materials support fibroblast attachment and spreading