title: Investigating the substrate specificity of enteroviral 2A proteases - an attempt to solve high resolution structures of enzyme-substrate complexes
Creators: name: Neubauer, David
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Die Familie der Picornaviren enthält wichtige humane Pathogene wie Poliovirus (PV), humanes Rhinovirus (HRV) und Coxsackievirus (CV). Sie alle gehören der Gattung der Enteroviren an. Diese simplen Viren bestehen aus einer nackten Proteinhülle mit ikosaedrischer Symmetrie, die ein RNA Genom positiver Polarität beinhaltet. Das Genom besitzt lediglich einen einzigen offenen Leserahmen der ein Polyprotein codiert. Zwei virale Proteasen, 2Apro und 3Cpro, sorgen für die Spaltung des Polyproteins in die eigentlichen, einzelnen Proteine. 2Apro initiiert dabei die Reihe der Spaltungen durch die Hydrolyse der Peptidbindung zwischen dem C-Terminus des vorhergehenden Proteins VP1 und dem eigenen N-Terminus. Diese Reaktion erfolgt intramolekular (cis). 3Cpro ist für die Summe der restlichen Spaltungen am Polyprotein, mit Ausnahme der Spaltung von VP0, verantwortlich. Außerdem wurde eine Vielzahl von zellulären Substraten für 2Apro identifiziert. Die molekulare Struktur von HRV2 2Apro wurde mithilfe von Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 1.95Å gelöst. Sie zeigt eine dem Chymotrypsin ähnliche Faltung. Die N-terminale Domäne ist jedoch zu einem beta-Faltblatt reduziert. Ferner bedient sich 2Apro eines Cystein Restes als Nucleophil im aktiven Zentrum und bindet ein Zn2+ Ion in seiner C-terminalen Domäne. Die Substratspezifität von 2Apro weist außerdem Unterschiede zur Spezifität vergleichbarer zellulärer Proteasen auf. Diese Differenzen machen 2Apro zu einem potenten Ziel für die Entwicklung anti-viraler Substanzen. Dieser Ansatz wird durch die kürzlich entdeckten dominant negativen Effekte von inaktivierten 2Apro Mutanten auf das Wachstum von wt Virus untermauert. Eine wissensbasierte Entwicklung von Wirkstoffen wird jedoch durch unser schlechtes Verständnis der genauen Spezifität als auch des exakten Mechanismus der intramolekularen Reaktion weitgehend behindert. Als Grund für diese Wissenslücken kann das Nichtvorhandensein der Molekül Strukturen von 2Apro- Substrat Komplexen genannt werden. Deshalb beschreibt diese Arbeit eine Vielzahl an Experimenten mit dem Ziel, solche Strukturen zur Verfügung zu stellen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt inaktive 2Apro Konstrukte mit N-terminalen Verlängerungen. Diese sollten das Beobachten von Substrat in gebundener Form durch Röntgenstrukturanalyse ermöglichen um ein besseres Verständnis für die Erkennung des Substrates bei der intramolekularen Reaktion zu fördern. Um die Wahrscheinlichkeit für die Kristallisation zu verbessern wurden 2A Proteasen von PV, CV und HRV mit unterschiedlich langen N-terminalen Extensionen verwendet. Trotz intensiver Bemühungen konnten jedoch keine qualitativ hochwertigen Kristalle erzeugt werden. Ein weiterer Aspekt der Arbeit befasst sich deshalb mit Komplexen aus aktiver 2Apro mit den kanonischen Inhibitoren Chymostatin und Elastatinal. Dazu wurde HRV2 2Apro kristallisiert und die Kristalle in Lösungen der Inhibitoren getränkt. Datensätze zur Röntgenstrukturanalyse wurden an einem Synchrotron aufgenommen und das Phasenproblem über Molecular Replacement gelöst. Die resultierenden Elektronendichten wiesen positive Peaks im Bereich des aktiven Zentrums auf, was auf die Anwesenheit der Inhibitor Moleküle schließen lassen könnte. Die Qualität der Elektronendichteverteilung war jedoch zu gering um das Platzieren der Wirkstoff Moleküle zu ermöglichen. Ein sinnvolles Modell konnte aus diesem Grund nicht erstellt werden.
description: The family of picornaviruses contains several important human pathogens such as poliovirus (PV), human rhinovirus (HRV) and coxsackievirus (CV) within its genus of enteroviruses. These simple viruses are composed of a naked protein shell with icosahedral symmetry that encapsidates an RNA genome of positive sense. The genome contains only one open reading frame (ORF) from which a single polyprotein is produced. The pathogens use two virally encoded proteases, namely 2Apro and 3Cpro, to process the polyprotein in order to yield mature proteins. 2Apro initiates the processing cascade by cleaving between the C-terminus of the preceding protein VP1 and its own N-terminus in an intramolecular (cis) reaction. 3Cpro cleaves all other protein junctions on the polyprotein with the exception of the maturation cleavage within VP0. Once freed from the polyprotein, 2Apro has been shown to target several cellular substrates. The molecular structure of HRV2 2Apro has been refined to a resolution of 1.95Å. The coordinates reveal a chymotrypsin like fold. However, the N-terminal beta-barrel is severely truncated (compared to chymotrypsin). Furthermore, 2Apro uses a cysteine residue and not a serine residue at the active site as its nucleophile and tightly binds a Zn2+ ion within its C-terminal domain. These findings and the fact that 2Apro shows substrate specificity patterns that are distinct from comparable cellular proteases account for the qualification of 2Apro as a potent drug target. Moreover, inactive PV 2Apro mutants were shown to exhibit a dominant negative effect on the growth of wt PV. However, our lack in understanding the exact mechanism of self-processing as well as substrate specificity hampers the knowledge driven design of new antiviral compounds. One reason for this gap in our knowledge is the lack of 2Apro structures bound to substrate. For this reason, this thesis covers a number of experiments aiming to provide such structures. In the first set of experiments, we used inactive 2Apro constructs with N-terminal extensions. These recombinant proteins were designed with the purpose of trapping the substrate within the substrate binding cleft. Hence, X-ray crystallography should be used to solve the molecular structures of such conformations in order to provide information of the exact mode of substrate binding during self-processing. In order to raise the likelihood of crystallization, we used 2Apro from HRV, CV and PV and different lengths of N-terminal extensions. However, despite our intense efforts we were not able to obtain diffraction quality crystals. In a different approach, we aimed to solve the high resolution structure of 2Apro bound to one or both of the two canonical inhibitors chymostatin or elastatinal. To this end, we were able to reproduce crystals of active HRV2 2Apro as described in the literature. Crystals were soaked in inhibitor solutions and X-ray datasets were collected on a synchrotron beam-line. Initial phases were solved by molecular replacement using the apo HRV2 2Apro coordinates. Additional electron density could be traced within the substrate binding cleft suggesting the presence of the inhibitor. However, the quality of the maps did not allow the placing of the inhibitor molecules, thereby preventing a refinement of the structure.