Proteine chiave dei processi metabolici indotti dall’acido indolo-3-acetico (IAA) in Rizobio
Creators: name: Imperlini, Esther
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: I batteri del suolo gram-negativi dei generi Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Mesorhizobium e Sinorhizobium, collettivamente chiamati rizobi, sono microrganismi azotofissatori simbionti delle radici delle Leguminose. Nel processo di simbiosi i rizobi inducono la divisione cellulare delle cellule corticali della radice con la formazione dei cosiddetti noduli radicali, all’interno dei quali i batteroidi, ossia i batteri differenziati, riducono l’azoto atmosferico ad ammonio (P. van Rhijn et al., 1995). La formazione di un nodulo radicale azotofissatore è un processo complesso che richiede una serie di interazioni tra il batterio e la pianta. I processi che danno origine allo sviluppo del nodulo sono oggetto di studio da molti anni ed è stato dimostrato che i fitormoni quali auxine, citochinine e giberelline influenzano la nodulazione (A.M. Hirsch et al.,1997). L’auxina meglio nota e caratterizzata è l’acido indolo-3-acetico (IAA), che influenza, in pianta, mediante una serie di cambiamenti biochimici, l’elongazione, la divisione e il differenziamento cellulare (H. Kende et al., 1997). I microrganismi del suolo capaci di associazioni simbiotiche (Rhizobium e Azospirillum) o patogene con le piante (Agrobacterium e Pseudomonas) producono IAA. Inoltre, tale molecola sembra svolgere un ruolo importante nella simbiosi rizobi-leguminose e, in particolare, nell’organogenesi del nodulo radicale, all’interno del quale l’IAA è presente in concentrazioni più elevate rispetto al resto della radice. Non è, però, ancora chiaro quale partner simbiotico produca l’IAA presente nel nodulo e in che modo tale molecola possa favorire il meccanismo di formazione e sviluppo del nodulo. Tuttavia, l’utilizzo, nel processo simbiotico, di ceppi di Rhizobium (R. leguminosarum viciae e R. etli), opportunamente ingegnerizzati, nel laboratorio dove si è svolto tale progetto, allo scopo di aumentare la biosintesi batterica di IAA, influenza positivamente lo sviluppo e la funzionalità del nodulo radicale. L’iperproduzione batterica di IAA, in particolare, comporta una fissazione biologica dell’azoto più efficiente mediante un aumento della dimensione dei noduli, una diversa morfologia dei batteroidi, un’aumento dell’attività nitrogenasica, della biomassa vegetale e del peso secco dei semi. Gli effetti dell’aumentata produzione batterica di IAA sulla simbiosi, sulla organogenesi del nodulo e sul differenziamento dei rizobi, evidenziano un potenziale ruolo di tale molecola in complessi circuiti regolativi e in importanti processi metabolici. In tale contesto si è inserito questo progetto di dottorato il cui obiettivo principale è stato lo studio degli effetti indotti dalla somministrazione endogena ed esogena di IAA sul metabolismo cellulare e sui profili di espressione proteica di Rizobio, per una migliore comprensione del processo di simbiosi in cui si utilizzano ceppi iperproduttori di IAA. La maggior parte delle analisi, infatti, sono state condotte su Sinorhizobium meliloti selvatico trattato in modo esogeno con IAA 0,5 mM e sul ceppo selvatico trasformato con un opportuno plasmide, contenente i geni di un secondo pathway di biosintesi di IAA, che, per semplicità, è stato denominato ceppo iperproduttore di IAA.  S. meliloti è il rizobio più conosciuto e studiato perchè il suo genoma è stato sequenziato nel 2001 e, per tale motivo, è particolarmente adatto per l’analisi proteomica realizzata in tale lavoro.  Uno dei principali obiettivi è stato quello di verificare che il secondo pathway di biosintesi di IAA, introdotto in S. meliloti, sia biochimicamente attivo, determinando, mediante GC/MS, la quantità relativa di IAA in colture batteriche. Da tale analisi è risultato che il ceppo iperproduttore produce e rilascia nel sovranatante una quantità di IAA 80 volte maggiore di quella determinata in colture wild-type. 
L’analisi metabolica, ossia degli effetti di IAA sull’attività dei principali enzimi coinvolti nel metabolismo energetico, è stata realizzata mediante approcci biochimici (saggi enzimatici). A tale proposito, sono state saggiate le attività degli enzimi chiave coinvolti nel catabolismo dei carboidrati (glicolisi o via EMP di Embden-Meyerhof-Parnas, via ED di Entner-Doudoroff  e via PP del pentosio fosfato), di tutti gli enzimi della via del gliossilato e del ciclo di Krebs o ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA). Tale analisi è stata effettuata in estratti proteici totali provenienti da cellule di due ceppi di S. meliloti selvatico: uno trattato in modo esogeno con IAA e l’altro iperproduttore di IAA, in fase esponenziale e stazionaria di crescita. I risultati, paragonati con quelli ottenuti per il ceppo selvatico, hanno evidenziato che le cellule sottoposte al trattamento con IAA e quelle iperproduttrici di IAA presentano un ciclo di Krebs attivo e metabolizzano il mannitolo principalmente attraverso la glicolisi o via EMP e non attraverso la via ED, la principale via degradativa in S. meliloti (A. Arias et al.,1978; C. Cervenansky et al., 1984). Dai dati metabolici ottenuti, è risultato che l’IAA induce un significativo aumento del flusso di carbonio attraverso la via gilicolitica e il ciclo di Krebs: le attività, infatti, degli enzimi chiave (fosforuttochinasi, citrato sintasi e α-chetoglutarato deidrogenasi) di queste vie metaboliche risultano indotte in seguito al trattamento esogeno con IAA e all’iperproduzione batterica di IAA. Gli effetti di IAA sulla velocità del flusso di carbonio sono maggiormente evidenti in fase stazionaria di crescita rispetto a quella esponenziale e per il ceppo iperproduttore di IAA rispetto al ceppo selvatico trattato con IAA. Dal momento che la fosfofruttochinasi rappresenta il principale punto di controllo della glicolisi e gli enzimi citrato sintasi e α-chetoglutarato deidrogenasi controllano la velocità dell’intero ciclo di Krebs, è stata rivolta particolare attenzione a tali enzimi, analizzando gli effetti della somministrazione esogena ed endogena di IAA sulle loro attività in diverse condizioni di crescita (diversa natura delle sorgenti di carbonio, in condizioni limitanti di carbonio e di ossigeno). 
Inoltre, per una migliore comprensione degli effetti di IAA sul metabolismo energetico di S. meliloti, sono stati determinati, mediante saggio di bioluminescenza con luciferasi, i livelli intracellulari di ATP, per valutare lo stato energetico generale della cellula (N. Hattore et al., 2003) e, mediante saggio spettrofotometrico, i livelli endogeni di NADH, rappresentante lo stato redox cellulare. Il confronto dei livelli di ATP e di NADH nel ceppo iperproduttore di IAA con quelli presenti nel ceppo selvatico ha permesso di rilevare una riduzione della quantità di ATP e di NADH (del rapporto NADH/NAD) nel ceppo iperproduttore. La riduzione dei livelli di ATP, per effetto di IAA, evidenzia una condizione di basso stato energetico delle cellule, che spiegherebbe l’attivazione del flusso metabolico attraverso la glicolisi e il ciclo di Krebs (P.R. Jensen et al., 1992). Il risultato relativo ai livelli intracellulari di NADH è anch’esso in accordo con i dati metabolici precedenti, in quanto è noto che gli enzimi chiave del ciclo di Krebs (citrato sintasi, isocitrato deidrogenasi -chetoglutarato deidrogenasi) sono inibiti in vitro da alti valori del rapporto NADH/NAD (Salminen et al., 1990) e che la riduzione di tale rapporto NADH/NAD attiva il flusso di substrati attraverso il ciclo di Krebs. Approci biochimici, quindi, sono stati utilizzati, in seguito, per la determinazione degli effetti di IAA sul controllo coordinato di questi processi ed, in particolare, sui livelli intracellulari di importanti intermedi metabolici e sull’attività di altri enzimi direttamente coinvolti. Infatti, tra i metaboliti analizzati, l’acetil-CoA, prodotto del metabolismo degradativo, comune ai carboidrati, agli acidi grassi e agli amminoacidi, si è rivelato un intermedio chiave nello studio degli effetti di IAA sul metabolismo energetico. Per il ceppo iperproduttore di IAA i livelli intracellulare di acetil-CoA sono significativamente aumentati rispetto al ceppo wild-type. Tale intermedio è il prodotto delle reazioni catalizzate dagli enzimi piruvato deidrogenasi e ATP-citrato liasi, le cui attività, determinate mediante saggi enzimatici, sono aumentate in estratti proteici provenienti da cellule trattate con IAA e iperproduttrici di IAA. Tuttavia, l’acetil-CoA è anche il substrato delle reazioni catalizzate dal primo enzima del ciclo di Krebs, citrato sintasi, e dalla β-chetotiolasi, primo enzima del pathway biosintetico dei poli-β-idrossibutirrati (PHB). Tali composti sono accumulati dai rizobi, nello stato simbiotico e non-simbiotico, come materiale di riserva di carbonio e di energia. Dall’analisi degli effetti di IAA sul metabolismo dei PHB, è risultato un aumento delle attività degli enzimi (β-chetotiolasi e acetoacetil-CoA redattasi) della biosintesi di tali composti e un accumulo maggiore di PHB, estratti con cloroformio da cellule trattate con IAA e in quelle iperproduttrici di IAA e convertiti in acido crotonico per una determinazione spettrofotometrica accurata.
Per quanto riguarda l’analisi proteomica, la combinazione dell’eletroforesi bidimensionale (2DE), della bioinformatica e della spettrometria di massa (MS) ha permesso di analizzare gli effetti di IAA sui profili di espressione proteica. Dall’analisi dei gel 2-DE ottenuti, tale sistema si è rivelato efficiente per la separazione non solo delle proteine citoplasmatiche, che costituiscono la frazione dominante di un estratto proteico totale, ma anche delle proteine di membrana. Questa tecnica ha permesso di effettuare delle separazione preparative, rivelando le proteine separate mediante colorazione con Blue di Coomassie. Da un’analisi preliminare delle immagini relative alla scansione dei gel 2D, ottenuti caricando uguali quantità di proteine estratte da cellule di S. meliloti selvatiche, trattate in modo esogeno con IAA e iperproduttrici di IAA endogeno, è stato individuato un certo numero di proteine (sia citoplasmatiche sia di membrana) differenzialmente espresse nei tre campioni. Un’analisi accurata dei pattern 2D, altamente complessi e derivanti da 5 esperimenti indipendenti, è stata realizzata con un adatto software che ha consentito, sulla base delle intensità relative delle proteine, di quantificare i livelli di espressione proteica. Le proteine, differenzialmente espresse nei ceppi di S. meliloti iperproduttore di IAA e trattato in modo esogeno con IAA, sono state definite indotte se i loro livelli di espressione sono almeno 2 volte maggiori del controllo e represse se presentano una diminuzione di almeno il 50% rispetto ai livelli di espressione riscontrati nel ceppo selvatico. Alcune delle proteine citoplasmatiche differenzialmente espresse sono state digerite in situ con opportuni enzimi proteolitici, estratte dal gel 2DE e poi identificate mediante procedure di spettrometria di massa. Tra le proteine citoplasmatiche, finora identificate mediante MS, sono risultate di particolare interesse la proteina heat shock 70 HSP70 (dnaK o SMc02857) e la proteina SSB (Single-Strand Binding o SMc01233). I livelli di espressione di entrambe le proteine sono significativamente indotti in S. meliloti iperproduttore di IAA, sia in fase esponenziale sia stazionaria di crescita. DnaK è una proteina con attività ATPasica che risponde attivamente agli shock iperosmotici, a stress di carenza nutrizionale e che agisce come chaperones molecolare per il folding di proteine citoplasmatiche, di quelle danneggiate termicamente e nei processi di riconoscimento e di riparo di DNA danneggiato (Zou et al., 1998).  La proteina SSB, invece, interviene, in processi, che richiedono ATP, di replicazione cromosomale, di ricombinazione e di riparo della doppia elica del DNA (ssDNA). E’, quindi, ipotizzabile che l’aumento intracellulare, per effetto di IAA, di DnaK e SSB, da un lato, permetterebbe la protezione dei costituenti cellulari da stress cellulari e da cambiamenti ambientali e dall’altro favorirebbe la ricombinazione cellulare, realizzando maggiori interventi di riparo e aumentando, in questo modo, la sopravvivenza cellulare. A conferma di tale ipotesi, nel primo anno di dottorato, è stato osservato, mediante test di viabilità su piastre, che il trattamento esogeno di IAA e la iperproduzione batterica di IAA consentono una maggiore sopravvivenza cellulare in fase stazionaria di crescita.
Infine, l’identificazione e la caratterizzazione delle altre proteine citoplasmatiche e di membrana, la cui espressione è influenzata da IAA, completerà l’analisi proteomica, presentata in questo lavoro e permetterà di individuare altri possibili ruoli di IAA.
Parallelamente all’analisi proteomica, è stata condotta l’analisi delle proprietà simbiotiche del ceppo di S. meliloti iperproduttore di IAA e confrontate con quelle del ceppo wild-type, che nodula in maniera specifica piante di Medicago Truncatula. In particolare, è stato verificato che il ceppo di S. meliloti  iperproduttore di IAA presentasse quelle caratteristiche simbiotiche tipiche degli altri ceppi di rizobio iperproduttori di IAA, realizzati e analizzati nel laboratorio dove si è svolto tale progetto di tesi di dottorato. L’aumentata produzione batterica di IAA comporta un aumento dell’attività nitrogenasica, determinata mediante saggio di riduzione dell’acetilene, in noduli contenente i batteroidi del ceppo di S. meliloti iperproduttore di IAA. Infine, l’analisi al microscopio ottico di sezioni sottili di nodulo ha evidenziato una maggiore attività meristematica per i noduli derivanti dal ceppo iperproduttore di IAA rispetto a quelli derivanti dal ceppo selvatico. La zona meristematica del nodulo ha un ruolo importante nello sviluppo di tale organo azotofissatore, in quanto è la parte priva di batteri, dalla quale si sviluppano i tessuti centrali del nodulo. La valutazione di questi dati permette di affermare che anche l’utilizzo del ceppo di S. meliloti iperproduttore di IAA, nel processo di simbiosi, consente una fissazione biologica dell’azoto più efficiente rispetto al ceppo wild-type. Tale osservazione è correlabile all’ipotesi di una diversa fase di sviluppo dei noduli generati dal ceppo iperproduttore di IAA e, in particolare, di un’accelerazione della formazione di strati cellulari, legata alla maggiore attività meristematica osservata in nodulo. Tale ipotesi sarebbe valida anche per lo sviluppo del batterio nella forma libera, in quanto l’analisi microscopica, realizzata nel primo anno di lavoro, ha evidenziato una morfologia del batterio iperproduttore di IAA in fase esponenziale diversa da quella del batterio wild-type nella stessa condizione di crescita, ma molto simile a quella del batterio wild-type in fase stazionaria. L’iperproduzione di IAA, quindi, e una concentrazione maggiore di tale molecola determinerebbe un’accelerazioni delle fasi di sviluppo del batterio con importanti conseguenze sul suo metabolismo, come è stato precedentemente descritto. Infine, l’insieme dei dati metabolici e proteomici, finora ottenuti in questo lavoro di tesi di dottorato, e la correlazione tra caratteristiche simbiotiche con le proprietà metaboliche indotte in S. meliloti per effetto di IAA hanno permesso una comprensione più approfondita della relazione esistente tra IAA e il processo di simbiosi e di formulare valide ipotesi sul suo ruolo nei processi di nodulazione e di differenziamento dei rizobi.