title: Developement and characterisation of nanoscaled lipid formulations as ultrasound contrast agents for sonothrombolytic therapy
title: Entwicklung und Charakterisierung nanoskaliger Lipidformulierungen als Ultraschallkontrastmittel zur sonothrombolytischen Therapie
Creators: name: Brüßler, Jana
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: sonothrombolysis
micelle
Micelle
diagnostics
Sonothrombolyse
Liposom
Biowissenschaften, Biologie
liposom
Diagnose
Ultraschall
ultrasound

description: In dieser Arbeit wurden
      Entwicklung, Charakterisierung und erste in vitro Versuche
      eines neuen, nanoskaligen Ultraschallkontrastmittels (NUSCA)
      vorgestellt. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines
      NUSCA zur Verbesserung der Behandlung thromboembolischer
      Erkrankungen. Kapitel 1 enthält eine allgemeine Einführung in
      das Thema der Arbeit, während in Kapitel 2 die verwendeten
      Methoden zusammengefasst werden. Kapitel 3 gibt verschiedene
      Herstellungsmethoden und Lipidmischungen und ihren Einfluss
      auf physikochemische Eigenschaften der NUSCA wieder. Die
      Auswirkungen von Extrusion, Lyophilisation, DPPG-Zusatz und
      Veränderungen der PEG40S-Konzentration bei zusätzlicher
      Beschallung mit einem Ultraschallhomogenisator auf Größe,
      Zetapotential und Struktur der NUSCA wurden getestet. Dabei
      konnten liposomale Strukturen bei DPPC/CH-Formulierungen und
      Mischungen aus Liposomen und Mizellen für PEG40S-haltige
      Formulierungen gefunden werden. Die Extrusion führte zu einer
      deutlichen Verringerung der hydrodynamischen Durchmesser
      aller Formulierungen. Lyophilisation, als Möglichkeit die
      Lagerstabilität zu verbessern, führte zu einer deutlichen
      Vergrößerung der Formulierungen. Das negative Lipid DPPG,
      zugesetzt um eine Aggregation der Partikel zu verhindern,
      veränderte Größe und PDIs der Formulierungen nicht, senkte
      aber ab einer Konzentration von 1 mol% das Zetapotential
      deutlich auf Werte kleiner -20 mV ab. Die zusätzliche
      Beschallung der PEG40S-haltigen NUSCA am
      Ultraschallhomogenisator führte zu einer deutlichen
      Verminderung der Größen. Ein Einfluss der
      PEG40S-Konzentration konnte dabei sowohl auf die Struktur als
      auch auf die Größe festgestellt werden. Die
      Ultraschallkontrastverstärkung der einzelnen NUSCA wurde in
      Kapitel 4 in einem speziellen Durchflussmodell getestet. Der
      Einfluss der verschiedenen Herstellungsmethoden auf die
      Echogenizität war in den meisten Fällen negativ. Nach der
      Extrusion verschwand der Kontrast der DPPC/CH-Liposomen
      vollständig und der Kontrast der PEG40S-haltigen NUSCA wurde
      deutlich schwächer. Die Lyophilisation, die eigentlich dafür
      bekannt ist die Echogenizität zu verbessern, schwächte den
      Kontrast, außer bei Zusatz von PEG4000 zu den
      DPPC/CH-Liposomen, ab. Eine Konzentrationsabhängigkeit der
      Echogenizität war für den DPPG-Zusatz zu beobachten, aber
      auch hier blieb der Kontrast hinter den Werten der
      Formulierungen ohne DPPG zurück. Die zusätzliche Beschallung
      konnte die Echogenizität verbessern, wobei eine Abhängigkeit
      von der PEG40S-Konzentration deutlich wurde. Das Verhältnis
      der Liposomen und Mizellen zueinander schien einen Einfluss
      auf die Echogenizität zu haben, allerdings waren zwischen den
      DPPC- und DSPC-Formulierungen Unterschiede sichtbar.
      Untersuchungen zur Mischbarkeit von DPPC und DSPC mit PEG40S
      wurden daher in Kapitel 5, zur weiteren Erklärung der
      Kontrastverstärkungen, durchgeführt. Mit Hilfe von П/A -
      Isothermen wurde eine Mischbarkeit für DPPC und PEG40S in der
      flüssig-expandierten Phase festgestellt. DSPC und PEG40S
      dagegen waren nicht miteinander mischbar.
      Epifluoreszenzmessungen nach Beimischung eines
      fluoreszenzmarkierten Lipids konnten diese Ergebnisse
      bestärken. Die Konformation der PEG-Ketten in den
      Formulierungen wurde als weitere Erklärung für die
      konzentrations-abhängige Echogenizität aus diesen Ergebnissen
      abgeleitet. Bei den DPPC/PEG40S-NUSCA war das PEG40S
      gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt und lag daher länger
      in der geknäulten mushroom- Konformation vor. Höhere
      Konzentrationen an PEG40S führten zu einer stärkeren
      Interaktion der PEG-Ketten und einer Veränderung der
      Anordnung dieser in die gestreckte brush- Konformation. Bei
      Formulierungen aus den nicht mischbaren DSPC und PEG40S
      bildeten sich PEG40S-Domänen, in denen die Ketten sehr früh
      stark interagierten und daher in der brush- Konformation
      vorlagen. Die weiter in das Medium herausstehenden Ketten
      dieser Anordnung konnten stärker mit dem Ultraschall (US)
      interagieren und sorgten so für eine bessere Echogenizität.
      Eine in vitro Studie zur Bestimmung des sonothrombolytischen
      Potentials des NUSCA mit den besten Eigenschaften wurde in
      Kapitel 6 beschrieben. Thromben aus menschlichem Vollblut
      wurden dabei einer Behandlung mit diagnostischem US und
      verschiedenen Kombinationen der thrombolytischer Arzneistoffe
      und des NUSCA ausgesetzt. Die ermittelten Gewichtsverluste
      waren deutlich höher als in vergleichbaren in vitro Studien
      und Effekte des NUSCA auf das Fibrinnetz konnten gezeigt
      werden. NUSCA und US alleine führten zu einer deutlichen
      Zunahme der Porengröße im Fibrinnetz. Nach der Kombination
      von US, NUSCA und Arzneistoff konnte kein Fibrinnetz mehr auf
      der Oberfläche der Thromben nachgewiesen werden. Diese
      Ergebnisse machen unser NUSCA zu einem vielversprechenden
      neuen Ansatz in der sonothrombolytischen Therapie.
description: In this work development,
      characterisation and first in vitro experiments with a new,
      nanoscaled ultrasound contrast agent (NUSCA) are presented.
      The aim of this work was improving the therapy of
      thromboembolic diseases with the use of a NUSCA. Chapter 1
      gives an introduction into the topic of this thesis and
      chapter 2 summarises the methods used. In chapter 3 the
      influence of different preparation methods und lipid mixtures
      on the physicochemical properties of the NUSCA’s are shown.
      Effects of extrusion, lyophilisation, DPPG addition and
      changes of PEG40S concentration in combination with
      additional sonication with an US-tip on size, Zetapotential
      and structure of the NUSCA were examined. Liposomal structure
      was visible for DPPC/CH formulations while PEG40S containing
      formulations form a mixture of liposomes and micelles.
      Extrusion led to a reduction of hydrodynamic diameter of all
      the formulations while lyophilisation, as a possibility to
      increase storage stability, increases particle size. Addition
      of the negative charged lipid DPPG to prevent particle
      aggregation didn’t change particle size and structure but the
      Zetapotential decreases to less than -20 mV. Additional
      sonication with an ultrasound-tip decreases the size of the
      formulation. An influence of PEG40S concentration on the
      structure as well as the hydrodynamic diameter could be
      shown. The echogenicity of the NUSCA was tested in a custom
      build flow-model and the results are summarised in chapter 4.
      Variations of the preparation method had mostly negative
      effect on the echogenicity. After extrusion no contrast
      enhancement was measurable for DPPC/CH liposomes and the
      echogenicity of PEG40S containing formulations was weakened.
      Lyophilisation, normally known to increase echogenicity, also
      reduces the contrast enhancement of our formulation, beside
      an addition of PEG4000 to the DPPC/CH liposomes. Depending on
      the concentration of DPPG the echogenicity increases, but
      never exceed echogenicity of formulation without DPPG.
      Additional sonication increased the contrast enhancement
      dependent on the PEG40S concentration. The ratio of liposomes
      to micelles seems to influence the echogenicity, however a
      difference between DPPC and DSPC formulations was found. The
      miscibility of the compound was therefore investigated in
      chapter 5. Langmuir monolayer studies revealed miscibility in
      fluid-expanded phase for DPPC and PEG40S while DSPC and
      PEG40S were not miscible. Epifluorescence measurements after
      adding a fluorescent labelled lipid ensure these results.
      Based on these results the regime of PEG-chains was derived
      as a further explanation for PEG40S concentration dependent
      echogenicity of the formulations. For the DPPC/PEG40S
      formulations the PEG chains exist longer in the supercoiled
      mushroom regime due to the equal distribution of the PEG40S
      on the surface. Increase of the PEG40S concentration leads to
      interaction of the PEG chains and thus a change of the
      conformation to brush regime. For the immiscible DSPC and
      PEG40S a formation of PEG40S domains was visible. A strong
      interaction of the PEG chains in this domains cause stronger
      PEG chain interaction at lower concentration and thus an
      early change of the regime. PEG chains in the brush regime
      extend further into the surrounding medium leading to
      stronger interaction with ultrasound (US) and thus higher
      echogenicity. Chapter 6 summarises the results of an in vitro
      sonothrombolysis study using the best NUSCA. Blood clots of
      human whole blood were exposed to diagnostic US and different
      combination of thrombolytic drugs and NUSCA. The clot mass
      loss was higher than in comparable in vitro studies.
      Furthermore an effect of the NUSCA on the fibrin network
      could be proven. NUSCA and US lead to a clearly visible
      increase in pore size of the fibrin network. After treatment
      with US, NUSCA and thrombolytic agent no fibrin could be
      detected at the thrombus surface. These results make our
      NUSCA a promising new approach for sonothrombolytic
      therapy.