Visualisierung und Charakterisierung der S-Protein vermittelten Fusion von Coronaviren
Creators: name: Eifart, Patricia
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Year: 2008
Subjects: subject: Fusion
subject: Coronavirus
subject: MHV-A59
subject: Zelleintritt
subject: SARS-CoV
subject: Fusionsprotein
subject: 3D-Struktur
subject: Spikeprotein
subject: Fluoreszenzmikroskopie
subject: Konformationsumwandlung
subject: Endozytose
subject: Cell Entry
subject: fusion protein
subject: 3D structure
subject: S protein
subject: Fluorescence Microscopy
subject: Conformation
subject: Endocytosis
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie
subject: 32 Biologie
subject: WD 2200

description: Die Fusionsreaktion des Coronavirus MHV wird vom S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen untersucht. Die Infektivität kann durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose gehemmt werden. Der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen erfolgt über die Clathrin-abhängige Endozytose und setzt die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran bei niedrigem pH-Wert voraus. Fluoreszenzmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen bestätigen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes kommt es zur Färbung der Plasmamembran. Die Erniedrigung des pH-Wertes in Abwesenheit des Rezeptors führt zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die die Inaktivierung der Fusionsaktivität und den Verlust der Infektivität zur Folge hat. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin. Ein niedriger pH-Wert eines zellulären endosomalen Kompartiments induziert vermutlich die Konformationsänderung im S-Protein und löst die Fusionsreaktion aus. Ein vorläufiges 3D-Modell des S-Proteins von MHV-A59 konnte erstellt werden. Darüber hinaus wurde die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Ein Zell-Zell-Fusionsassay konnte nachweisen, dass die Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf Basis theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der "Heptad-Repeat" (HR) Domäne HR1.
description: Fusion of the Coronavirus MHV-A59 is mediated by the viral S-protein. The entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied in this work. Infection was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances interfering with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic compartments. Fluorescence microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. When the virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. These alterations are likely to be irreversible because low pH-treatment of viruses caused an irreversible loss of fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore the conformation of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 was characterized by cryoelectron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure could be accomplished. Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The cell-based fusion assay revealed that fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit. Additionally fusion could be significantly increased by lowering of the pH. The theoretical part of the thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed main characteristics of internal fusion peptides. It allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion.