title: Regulation der Sekretion der signalling Protease PopC in Myxococcus xanthus
title: Regulation of secretion of the signalling protease PopC in Myxococcus xanthus
Creators: name: Konovalova, Anna
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Secretion
Naturwissenschaften
Sekretion
Signal
Signaling
Bacteria
Bakterien
Protease
Entwicklung
Development
Myxococcus xanthus

description: In response to starvation
      Myxococcus xanthus initiates a developmental program that
      culminates in fruiting body formation. Completion of this
      developmental program depends on cell-cellcommunication
      involving at least two intercellular signals, the A-signal
      and the C-signal. The contact-dependent intercellular
      C-signal function to induce and coordinate the two
      morphogenetic events in fruiting body formation, aggregation
      and sporulation, temporally and spatially coordinated. The
      intercellular C-signal is a 17 kDa protein (p17), which is
      generated by proteolytic cleavage of the full-length 25 kDa
      csgA protein (p25), and is essential for fruiting body
      formation. p25 and PopC, the protease that cleaves p25,
      accumulate in the outer membrane and cytoplasm, respectively
      in vegetative cells. PopC is specifically secreted during
      starvation. Therefore, restriction of p25 cleavage to
      starving cells depends on a compartmentalization mechanism
      that involves the regulated secretion of PopC in response to
      starvation. In this report, the main focus is on
      understanding the mechanism underlying regulated secretion of
      the PopC protease. We first focused on the identification of
      proteins required for PopC secretion. PopC lacks a signal
      peptide and is secreted in an unprocessed form. We report
      that two incomplete type III secretion systems, a type VI
      secretion system and type I secretion systems are not
      involved in PopC secretion. From a collection of mutants
      generated by random transposon mutagenesis and unable to
      complete fruiting body formation, we identified seven mutants
      unable to secrete PopC. None of the insertions were in genes
      coding for known secretion systems. The mutations were
      divided into three classes based on the insertion sites. The
      class I mutation was in a gene cluster largely encoding
      proteins of unknown function, predicted to localize to the
      cell envelope, and with a narrow phylogenetic distribution
      except for a D,D-carboxypeptidase and two Ser/Thr kinases.
      The class II mutations were in two clusters encoding
      paralogous proteins of unknown function predicted to localize
      to the cytoplasm. Several of the class II genes are
      phylogenetically widely distributed and frequently present in
      gene clusters linked to genes encoding secretion systems. We
      speculate that the class I mutation affect a novel type of
      secretion system involved in PopC secretion and that the
      class II mutations either affect proteins with accessory or
      regulatory functions in PopC secretion. Next, we focused on
      elucidating the molecular mechanism underlying the activation
      of PopC secretion in response to starvation. Our data
      demonstrate that PopC secretion is controlled at the
      post-translational level by a regulatory cascade involving
      the RelA and PopD proteins. Specifically, RelA is required
      for activation of PopC secretion in response to starvation
      and PopD, which is encoded in an operon with PopC, interacts
      directly with PopC and acts as an inhibitor of PopC
      secretion. On the basis of genetic and biochemical data we
      suggest that PopC and PopD form a cytoplasmic complex that
      blocks PopC secretion in the presence of nutrients. In
      response to starvation, RelA is activated resulting in
      induction of the stringent response. Activated RelA by an
      unknown mechanism induces the proteolytic degradation of PopD
      in the PopC/PopD complex in that way releasing PopC for
      secretion. On the basis of these data, we suggest that the
      generation of p17 depends on a two-step proteolytic cascade
      involving degradation of PopD and, subsequently, the specific
      cleavage of p25 by PopC. The current model for intercellular
      A-signaling in M. xanthus proposes that starvation induces
      the release of extracellular A-signal proteases. These
      proteases are thought to cleave surface-exposed proteins and
      extracellular proteins thereby generating the A-signal amino
      acids and peptides, which serve to measure the density of
      starving cells early during development. DNA microarray
      analyses (S. Wegener-Feldbrügge, unpubl.) previously
      suggested that the primary defect in the asgA and asgB
      mutants, which are unable to generate the A-signal, is not a
      reduced capacity in protein secretion but a reduced
      expression of genes encoding secreted proteases including
      popC. Here, genetic analyses demonstrated that restored
      expression of popCD rescues development of asgA and asgB
      mutants without restoring A-signaling. Thus, ectopic
      expression of popCD leads to a bypass of the requirement for
      the A-signal during development. We suggest that the
      inability of asgA and asgB mutants to undergo development is
      the result of at least two defects: (i) reduced expression of
      the genes encoding the A-signal proteases; and, (ii) reduced
      expression of the popC gene.
description: Unter Nährstoffmangel initiiert
      Myxococcus xanthus ein Differenzierungsprogramm, das die
      Bildung von multizellulären Fruchtkörpern ermöglicht. Der
      Ablauf dieses Programms ist abhängig von interzellulären
      Kommunikationsprozessen und involviert mindestens zwei
      interzelluläre Signale, das A-Signal und das C-Signal. Das
      Zellkontakt-abhängige C-Signal induziert und koordiniert die
      für die Fruchtkörperbildung essentiellen morphogenetischen
      Prozesse der Aggregation und Sporulation, sowohl räumlich als
      auch zeitlich. Dieses Signal ist ein 17 kDa Protein (p17),
      das aus der proteolytischen Spaltung des 25 kDa CsgA-Proteins
      (p25) hervorgeht, und ist essentiell für die
      Fruchtkörperbildung. p25 und PopC, die Protease die p25
      spaltet, akkumulieren unter vegetativen Bedingungen in der
      äußeren Membran bzw. im Zytoplasma. Unter
      Nährstoffmangelbedingungen kommt es dann zu einer
      spezifischen Sekretion von PopC. Dieser Mechanismus der
      Kompartimentalisierung garantiert, dass eine Spaltung von p25
      nur in hungernden Zellen erfolgen kann. Der Hauptschwerpunkt
      dieser Arbeit betrifft die Mechanismen, die der regulierten
      Sekretion der Protease PopC zugrunde liegen. Zunächst galt es
      die Proteine zu identifizieren, die für die PopC Sekretion
      benötigt werden. PopC verfügt über kein Signalpeptid und wird
      in einer nicht-prozessierten Form sekretiert. In dieser
      Arbeit wird gezeigt, dass weder zwei unvollständige Typ-III-,
      noch ein Typ-IV noch ein Typ-I Sekretionssystem an der
      Sekretion von PopC beteiligt sind.Aus einer Sammlung von
      Mutanten, die durch zufällige Transposon-Insertionen
      entstanden sind und keine Fruchtkörper mehr bilden können,
      wurden sieben Mutanten identifiziert, in denen keine PopC
      Sekretion mehr stattfand. Keine der dazugehörigen Insertionen
      waren in Genen lokalisiert, die für bekannte
      Sekretionssysteme kodieren. Basierend auf den entsprechenden
      Insertionspositionen wurden drei Klassen definiert:Die
      Mutation der ersten Klasse war in einem Gencluster
      lokalisiert, dass überwiegend Proteine unbekannter Funktion
      kodiert. Diese Proteine lokalisieren vermutlich in der
      Zellhülle und zeigen, mit der Ausnahme von einer
      D,D-Carboxypeptidase und zwei Ser/Thr Kinasen, eine
      eingeschränkte phylogenetische Verbreitung. Die zweite Klasse
      von Mutationen fand sich in zwei Genclustern, die paraloge
      Proteine mit unbekannter Funktion kodieren. Bei diesen
      Proteinen handelt es sich vermutlich um zytoplasmatische
      Proteine. Viele Gene dieser 2. Klasse sind phylogenetisch
      weit verbreitet und finden sich oftmals in Genclustern, die
      sich in Nachbarschaft mit Sekretionssystem-kodierenden Genen
      befinden. Wir nehmen an, dass die Klasse 1 Mutation ein
      neuartiges Sekretionssystem beeinflusst, dass an der PopC
      Sekretion beteiligt ist. Wir vermuten außerdem, dass die
      Klasse 2 Mutationen Proteine beeinflussen, die akzessorische
      oder regulatorische Funktionen bei der PopC Sekretion
      einnehmen. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf dem
      Mechanismus, mit dem die PopC Sekretion unter
      Nährstoffmangelbedingungen aktiviert wird. Die vorliegenden
      Daten demonstrieren, dass die PopC Sekretion auf
      post-translationaler Ebene durch eine regulatorische Kaskade
      kontrolliert wird, an der die Proteine RelA und PopD
      beteiligt sind. Dabei wird RelA für die Aktivierung der PopC
      Sekretion unter Nährstoffmangelbedingungen benötigt, und
      PopD, dessen Gen zusammen mit popC in einem Operon exprimiert
      wird, interagiert direkt mit PopC und fungiert dabei als
      Inhibitor der PopC Sekretion. Auf der Basis genetischer und
      biochemischer Daten vermuten wir, dass in der Anwesenheit von
      Nährstoffen PopC und PopD einen zytoplasmatischen Komplex
      bilden, der eine PopC Sekretion unterbindet. Unter
      Nährstoffmangel kommt es zu einer RelA-abhängigen Induktion
      der stringenten Antwort. Durch diese stringente Antwort wird
      durch einen noch nicht geklärten Mechanismus die
      proteolytische Degradation von PopD innerhalb des PopC/PopD
      Komplexes initiiert, wodurch PopC für eine anschließende
      Sekretion freigesetzt wird. Auf der Basis dieser Daten
      scheint die Bildung von p17 von einer zweischrittigen
      proteolytischen Kaskade abzuhängen; zunächst erfolgt eine
      Degradation von PopD und später die spezifische Spaltung von
      p25 durch PopC. Das gegenwärtige Modell des interzellulären
      A-Signals in M. xanthus basiert auf der Annahme, dass unter
      Nährstoffmangel extrazelluläre A-Signal Proteasen freigesetzt
      werden. Diese Proteasen sollen dann sowohl
      Oberflächenproteine als auch extrazelluläre Proteine spalten
      und dadurch die A-Signal Aminosäuren und Peptide freisetzen,
      die den Zellen als Sensor der Populationsdichte dienen.
      DNA-Mikrochip-Analysen (S. Wegener-Feldbrügge, nicht
      veröffentlicht) ließen vermuten, dass der primäre Defekt von
      asgA- und asgB-Mutanten, die kein A-Signal bilden können,
      nicht in einer reduzierten Protein Sekretion begründet ist,
      sondern auf eine reduzierte Expression von Genen, die
      Proteasen u. a. auch PopD kodieren. In dieser Arbeit konnte
      gezeigt werden, dass nur durch die wiederhergestellte
      Expression von popCD die Differenzierungsdefekte von asgA-
      und asgB-Mutanten aufgehoben werden können, und zwar ohne
      gleichzeitige Bildung des A-Signals. Die ektopische
      Expression von popCD umgeht somit während der
      Differenzierungsphase die A-Signal Abhängigkeit. Wir
      vermuten, dass die Differenzierungsdefekte der asgA- und
      asgB-Mutanten daher zwei Gründe haben: (i) eine reduzierte
      Expression von Genen, die A-Signal Proteasen kodieren, und
      (ii) eine reduzierte Expression des popC Gens.