Η πρωτεΐνη MreB ως νέος αντιβιοτικός στόχος: in vitro χαρακτηρισμός της αντιμικροβιακής και κυτταροτοξικής δράσης του MreB-αναστολέα Α22 σε συνδυασμό με συμβατικά αντιβιοτικά έναντι Gram-negative κλινικών στελεχών
Creators: name: Κοτζιαλάμπου, Αναστασία Σπ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Αντιμικροβιακή ανοχή
Νέα αντιβιοτικά
Πρωτεΐνη MreB
Συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις αντιβιοτικών
Antimicrobial resistance
Novel antibiotics
MreB protein
Synergistic antibiotic interactions

description: Διανύοντας την εποχή της αντιμικροβιακής ανοχής, η προκαρυωτική πρωτεΐνη κυτταροσκελετού MreB παρουσιάζεται ως ιδανικός αντιβιοτικός στόχος στο σχεδιασμό νέων αντιβιοτικών. Παράλληλα, η συνδυαστική θεραπεία μεταξύ MreB αναστολέων και συμβατικών αντιβιοτικών μπορεί να αποτελέσει μια αποτελεσματική προσέγγιση για την αντιμετώπιση του φαινομένου της αντιβιοανοχής. Σκοπό της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η αξιολόγηση της πιθανής συνεργιστικής αλληλεπίδρασης του MreB- αναστολέα Α22 με κλινικά αντιβιοτικά έναντι πλαγκτονικών κυττάρων και βιομεμβρανών σε κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa και Escherichia coli, λαμβάνοντας υπόψη πιθανές κυτταροτοξικές και αιμολυτικές συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις, καθώς επίσης και την ανάπτυξη ταχείας βακτηριακής ανοχής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της διατριβής, τα κλινικά στελέχη εμφάνισαν στη συντριπτική πλειοψηφία τους ένα πολύ-ανθεκτικό προφίλ με τα ποσοστά ανθεκτικότητας να ποικίλουν μεταξύ των διαφορετικών αντιβιοτικών κλάσεων. Το Α22 παρουσίασε δόσο-εξαρτωμένη ανασταλτική δράση με συγκεντρώσεις MIC που κυμαινόταν μεταξύ 2 και 64 μg/ml. Το Α22 σε χαμηλές και μη βακτηριοκτόνες συγκεντρώσεις, οδήγησε στη μετατροπή των ραβδόμορφων κυττάρων σε σφαιρικά με επακόλουθη διαταραχή στη διαπερατότητα και ακεραιότητα της μεμβράνης. Από τα πειράματα αξιολόγησης της συνδυαστικής δράσης διαφάνηκε ότι το Α22 παρουσίασε συνεργιστικές και προσθετικές αλληλεπιδράσεις με όλα τα συμβατικά αντιβιοτικά που εξετάστηκαν, ενώ ανταγωνισμός δεν προσδιορίστηκε σε κανέναν συνδυασμό. Η εκδήλωση συνεργιστικής ή προσθετικής δράσης ήταν κυρίως είδο-ειδική και τα μεγαλύτερα ποσοστά συνέργειας προσδιορίστηκαν στους συνδυασμούς του Α22 με κεφταζιδίμη, μεροπενέμη, γενταμυκίνη, σιπροφλοξασίνη στα στελέχη Pseudomonas aeruginosa και στους συνδυασμούς του A22 με κεφοξιτίνη, αζιθρομυκίνη, κεφταζιδίμη στα στελέχη Escherichia coli. Οι συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις που προσδιορίστηκαν επέδειξαν και ισχυρή βακτηριοκτόνο δράση στις 24 ώρες συνδυαστικής θεραπείας προκαλώντας παράλληλα μεγαλύτερης χρονικής διάρκειας μετά-αντιβιοτική δράση. Το Α22 παρουσίασε ιδανικό αντί-QS προφίλ καθώς οδήγησε σε αναστολή σχηματισμού βιοφίλμ και αποκόλληση της πολυμερικής μήτρας, επιβράδυνε τη βακτηριακή κινητικότητα και κατέστειλε την παραγωγή μολυσματικών παραγόντων. Τα αποτελέσματα της μεθόδου ΜΤΤ και της συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης φανέρωσαν ότι οι συνεργιστικές βακτηριοκτόνες αλληλεπιδράσεις που προσδιορίστηκαν έναντι των πλαγκτονικών κυττάρων παρουσίασαν ταυτόχρονα ισχυρή ανασταλτική δράση στο σχηματισμό βιοφίλμ και στην αποδόμηση ώριμων βιομεμβρανών. Παράλληλα, επέδειξαν ανασταλτική δράση στην επιφανειακή κινητικότητα και στην παραγωγή και έκκριση μολυσματικών παραγόντων (πρωτεάσες, ελαστάση, πυοκυανίνη, ραμνολιπίδια) στα κλινικά στελέχη Pseudomonas aeruginosa. Τα πειράματα αξιολόγησης της βιοσυμβατότητας έδειξαν ότι η μονοθεραπεία Α22 χαρακτηρίζεται από ικανοποιητικό προφίλ βιοσυμβατότητας έναντι αιμοποιητικών και καρκινικών κυττάρων ανθρώπου, και ότι η συνδυαστική θεραπεία σε συγκεντρώσεις πολύ υψηλότερες από τις αντίστοιχες συνεργιστικές που προσδιορίστηκαν έναντι των βακτηριακών κυττάρων, δε χαρακτηρίζεται από κύτταρο- και αίμο- τοξικότητα και δεν αυξάνει την ολική τοξικότητα. Τέλος, η μονοθεραπεία Α22 χαρακτηρίζεται από μικρή έως ελάχιστη πιθανότητα ανάπτυξης ταχείας ανοχής in vitro, η οποία μειώνεται περισσότερο και εξαλείφεται στην παρουσία συμβατικών αντιβιοτικών, οδηγώντας σε χαμηλές συγκεντρώσεις MPC και περιορίζοντας το παράθυρο επιλογής μεταλλαγμάτων. Η παρούσα διατριβή υποστηρίζει και ενισχύει προγενέστερα ερευνητικά δεδομένα που παρουσιάζουν την MreB ως εν δυνάμει αντιβιοτικό στόχο, υπογραμμίζοντας ότι η MreB μπορεί να αξιοποιηθεί πέρα από το πλαίσιο της μονοθεραπείας και ως στόχος για συνδυασμένη αντιμικροβιακή χημειοθεραπεία, και προτείνει το Α22 ως ιδανικό παράγοντα για τη μελέτη συνεργιστικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ MreB-αναστολέων και αντιβιοτικών στο μέλλον.
description: In the era of antibiotic resistance, the bacterial cytoskeletal protein MreB is presented as a potential target for the development of novel antimicrobials. Combined treatments of conventional antibiotics with MreB inhibitors may be promising candidates in combating the resistance crisis, but also in preserving the potency of many clinical drugs. This study was dedicated to examining potential synergism between the MreB inhibitor A22 and clinical used antibiotics against both planktonic and biofilm forms of multidrug resistant Gram negative bacteria, considering their hemolytic and cytotoxic activity, as well as the emergence of bacterial resistance. According to our results, Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli isolates were resistant to conventional antibiotics to varying degrees. A22 inhibited the bacterial growth in a dose dependent manner with MIC values ranging between 2 and 64 μg/ml. Treatment with A22 at sub-MIC and non bactericidal concentrations leads to the formation of spherical cells with damaged membranes. We found that A22 exhibited great synergistic growth inhibitory effects with various antibiotics and no antagonism was observed with any of the combinations. In combination studies, the synergistic effects were strain-dependent and synergism occurred most frequently when A22 was combined with ceftazidime, meropenem, gentamicin and ciprofloxacin against Pseudomonas aeruginosa, and with azithromycin, ceftazidime and cefoxitin against Escherichia coli. The results of the combinational time-kill assays showed great synergistic bactericidal interactions with all expected combinations at 24 h of combined treatment, inducing a long post-antibiotic effect. MTT and confocal laser scanning microscopy studies show that synergistic combinations even at the lowest tested concentrations were able to inhibit biofilm formation and eradicate mature biofilms in both strains. A22 combined treatment inhibited the production of quorum-sensing related extracellular virulence factors (protease, elastase, pyocyanin and ramnolipid) of clinical P. aeruginosa isolates, as well as their swarming and swimming motility. A22 either as a single agent or in combination showed a minimal cytotoxic activity against human cancer cell lines and human PBMC and PMN cells, as well as, selective hemolytic properties toward human erythrocytes. In addition, relative to A22 alone, the combination of A22 with antibiotics significantly reduces or eliminates the detectable emergence of resistance. Combined treatment of A22 resulted in MPC reductions with a narrow mutant selection window. The findings of the present study support previous research regarding the use of MreB as a novel antibiotic target and provide new evidence that MreB may take a place as a target not only for single but also for combined antimicrobial therapy, suggesting that A22 can serve as a leading compound for studying potential synergism between MreB inhibitors and antibiotics in the future.