title: Molecular biological and biochemical investigations of prenyltransferases from different Aspergillus species
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen aus verschiedenen Aspergillus Arten
Creators: name: Pockrandt, Daniel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Prenyltransferases ; Aspergillus
Biowissenschaften, Biologie
Aspergillus
Prenyltransferasen

description: Prenylated aromatic compounds are
      widely distributed in nature and many of these compounds
      display interesting biological and pharmaceutical activities.
      The transfer of prenyl moieties to aromatic substrates is
      catalysed by aromatic prenyltransferases, and the multitude
      of possibilities for attachment of these moieties gives rise
      to a large structural diversity. Investigation of the
      functions of aromatic prenyltransferases would therefore help
      to elucidate the biosynthetic pathways of those natural
      compounds in the producing organism, as well as the
      applicability of these enzymes for chemoenzymatic synthesis
      of biologically active compounds for pharmaceutical purposes.
      Four putative prenyltransferase genes of the
      dimethylallyltryptophan synthase (DMATS) superfamily from
      Aspergillus nidulans (A. nidulans) were investigated as one
      part of this thesis. The genes xptA, xptB, ANID_10289 and
      ANID_11080 were cloned, and the two putative xanthone
      prenyltransferase genes xptA and xptB were overexpressed in
      Escherichia coli (E. coli). Both recombinant
      prenyltransferases were purified to near homogeneity using
      affinity chromatography with Ni-NTA and investigated
      biochemically. In this thesis, the enzyme XptB was confirmed
      to function as a xanthone prenyltransferase, catalysing a
      regiospecific Oprenylation of several xanthones. The enzyme
      products were isolated on high performance liquid
      chromatography (HPLC) and analysed by nuclear magnetic
      resonance spectroscopy (NMR) and mass spectrometry (MS).
      Another previously postulated substrate, the benzophenone
      arugosin H, was not accepted by XptB under the tested
      conditions. No enzyme activity was detected for the second
      enzyme XptA with postulated or potential substrates. Reports
      of the enzyme VrtC from Penicillium aethiopicum (P.
      aethiopicum) implicated that some members of the DMATS
      superfamily might not be restricted to the usual prenyl donor
      dimethylallyl diphosphate (DMAPP, C5-unit). VrtC was shown as
      the first known member of the DMATS prenyltransferases, which
      accepts geranyl diphosphate (GPP, C10-unit), but not DMAPP,
      for prenylation of a naphthacenedione substrate. Therefore,
      the acceptance of prenyl donors, such as GPP and farnesyl
      diphosphate (FPP, C15-unit), was investigated in this thesis
      with the prenyltransferases 7-DMATS and CdpNPT, both from
      Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), as well as CdpC3PT and
      AnaPT, both from Neosartorya fischeri (N. fischeri). It was
      found that AnaPT accepted, in addition to DMAPP, also GPP as
      prenyl donor. Furthermore, a shift of the prenylation
      position was observed. Instead of a reverse C3α-prenylation
      with DMAPP, C6- and C7-geranylations of tryptophan-containing
      cyclic dipeptides with GPP were demonstrated in this thesis.
      This was the first report of the acceptance of both DMAPP and
      GPP by a member of the DMATS superfamily. The observed shift
      of the prenylation position by changing the prenyl donor
      expands the applicability of AnaPT for the production of
      prenylated compounds. As last part of this thesis, the
      putative prenyltransferase genes AO090102000322,
      AO090701000600 and AO090020000527 from Aspergillus oryzae (A.
      oryzae) were cloned. The recombinant protein BAE61387,
      encoded by AO090102000322, was successfully overproduced and
      purified from E. coli. Analysis of neighbouring genes in the
      genome of A. oryzae revealed no backbone genes for the
      biosynthesis of a possible natural substrate of BAE61387. The
      enzyme BAE61387 was therefore incubated with a large number
      of compounds that are known substrates of enzymes from the
      DMATS superfamily. Activity was clearly observed in
      incubation mixtures with hydroxynaphthalenes. Interestingly,
      these unnatural substrates, which are accepted by several
      members of this enzyme class, were accepted by BAE61387 in
      the presence of all three prenyl donors DMAPP, GPP and FPP.
      The acceptance of all these prenyl donors for regiospecific
      C-prenylations of hydroxynaphthalenes has never been shown
      for a member of this enzyme superfamily prior to this
      work.
description: Prenylierte aromatische
      Verbindungen sind in der Natur weit verbreitet und viele
      dieser Stoffe besitzten interessante biologische und
      pharmazeutische Aktivitäten. Die Übertragung der Prenylreste
      auf aromatische Substrate wird durch aromatische
      Prenyltransferasen katalysiert und die Vielzahl der
      Verknüpfungsmöglichkeiten der Prenylreste ermöglicht eine
      hohe strukturelle Diversität prenylierter Naturstoffe.
      Untersuchungen zur Funktion von aromatischen
      Prenyltransferasen geben einen Einblick in die
      Biosynthesewege dieser Naturstoffe und bieten diese Enzyme
      als Werkzeuge in der chemoenzymatischen Herstellung von
      biologisch aktiven Substanzen für pharmazeutische Anwendungen
      an. Vier putative Prenyltransferasegene der
      Dimethylallyltryptophan Synthase (DMATS) Superfamilie aus
      Aspergillus nidulans (A. nidulans) wurden als ein Teil der
      vorliegenden Arbeit untersucht. Die Gene xptA, xptB,
      ANID_10289 und ANID_11080 wurden kloniert, und die beiden
      putativen Xanthon-Prenyltransferasegene xptA und xptB wurden
      in Escherichia coli (E. coli) überexprimiert. Die
      rekombinanten Enzyme wurden mittels Affinitätschromatographie
      mit Ni-NTA aufgereinigt und biochemisch im Hinblick auf ihre
      Enzymaktivität und Substratspezifität untersucht. In der
      vorliegenden Arbeit konnte das Enzym XptB als Xanthon-
      Prenyltransferase bestätigt werden, welche die
      regiospezifische O-Prenylierung von einigen Xanthonen
      katalysiert. Die enzymatischen Produkte wurden mittels high
      performance liquid chromatography (HPLC) isoliert und
      mithilfe von Kernresonanzspektroskopie (NMR) und
      Massenspektrometrie (MS) untersucht. Ein weiteres in der
      Literatur postuliertes Substrat von XptB, das Benzophenon
      Arugosin H, wurde unter den getesteten Bedingungen nicht
      umgesetzt. Für das zweite aufgereinigte Enzym XptA konnte
      allerdings keine enzymatische Aktivität, weder in
      Inkubationsansätzen mit dem postulierten Substrat
      Variecoxanthon A, noch mit anderen potenziellen Substraten
      nachgewiesen werden. Mit dem Enzym VrtC aus Penicillium
      aethiopicum (P. aethiopicum) wurde erstmals die Umsetzung
      einer Naphthacendion-Verbindung mit Geranyldiphosphat (GPP,
      C10-Einheit) durch eine DMATS-Prenyltransferase beschrieben.
      Diese Entdeckung führte zu der Annahme, dass nicht alle
      DMATS-Prenyltransferasen auf den sonst üblichen Prenyldonor
      Dimethylallyldiphosphat (DMAPP, C5-Einheit) beschränkt sein
      müssen. In der vorliegenden Arbeit wurden dazu die bekannten
      Prenyltransferasen 7-DMATS und CdpNPT, beide aus Aspergillus
      fumigatus (A. fumigatus), sowie CdpC3PT und AnaPT, beide aus
      Neosartorya fischeri (N. fischeri), auf die Akzeptanz von GPP
      und Farnesyldiphosphat (FPP, C15-Einheit) untersucht. Von den
      untersuchten Enzymen konnte für AnaPT, zusätzlich zu DMAPP,
      eine Umsetzung von Tryptophan-enthaltenden zyklischen
      Dipeptiden mit GPP nachgewiesen werden. Für sechs zyklische
      Dipeptide, für welche mit DMAPP zuvor eine reverse C3α-
      Prenylierung beobachtet wurde, konnte durch die Verwendung
      von GPP in der vorliegenden Arbeit die Geranylierung durch
      AnaPT an den Positionen C-6 und C-7 des Indols nachgewiesen
      werden. Eine Akzeptanz von sowohl DMAPP als auch GPP durch
      eine DMATSPrenyltransferase wurde somit erstmals
      demonstriert. Die Akzeptanz von DMAPP und GPP, sowie die
      beobachtete Verschiebung der Prenylierungsposition durch den
      Einsatz von Prenyldonoren unterschiedlicher Länge, erhöhen
      die Nützlichkeit dieses Enzyms zur chemoenzymatischen
      Synthese prenylierter Verbindungen. Als letzter Teil dieser
      Arbeit wurden die drei putativen Prenyltransferasegene
      AO090102000322, AO090701000600 und AO090020000527 aus
      Aspergillus oryzae (A. oryzae) kloniert. Das putative Produkt
      BAE61387 von AO090102000322 wurde in E. coli überproduziert
      und das rekombinante Enzym erfolgreich aufgereinigt. Durch
      Sequenzanalysen konnten im Genom von A. oryzae in der
      Nachbarschaft zu AO090102000322 keine Gene identifiziert
      werden, welche Aufschluss über ein mögliches natürliches
      Substrat von BAE61387 geben könnten. Das erhaltene Protein
      wurde daher mit zahlreichen Substraten von bekannten Enzymen
      der DMATS-Superfamilie inkubiert. Eine enzymatische Aktivität
      konnte in Inkubationsansätzen mit einigen
      Hydroxynaphthalin-Derivaten beobachtet werden. Allerdings
      wurden diese unnatürlichen Substrate, welche von einigen
      Mitgliedern der DMATSPrenyltransferasen akzeptiert werden, in
      Gegenwart von DMAPP, GPP und FPP umgesetzt. Die Akzeptanz der
      drei Prenyldonoren DMAPP, GPP und FPP zur regiospezifischen
      CPrenylierung von Hydroxynaphthalin-Derivaten durch eine
      DMATS-Prenyltransferase wurde zuvor noch nicht
      demonstriert.