Μελέτη της επίδρασης του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) στο προφίλ έκφρασης μικρογλοιακών κυττάρων BV2 – Συσχέτιση με ADAR-διαμεσολαβημένη RNA στοιχειοθεσία
Creators: name: Μαρούδας, Αλέξανδρος Σταμάτιου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: ADAR1 - διαμεσολαβημένη RNA στοιχειοθεσία
Γονιδιακό προφίλ κυττάρων μικρογλοίας
Λιποπολυσακχαρίτης
ADAR1 – mediated RNA Editing
Gene Expression profile in Microglia
LPS

description: Η ενεργοποίηση της μικρογλοίας αποτελεί χαρακτηριστικό του νευροεκφυλισμού και εμφανίζεται στο μεγαλύτερο ποσοστό των νευροεκφυλιστικών νόσων. Η βακτηριακή ενδοτοξίνη ή λιποπολυσακχαρίτης (LPS) έχει την ιδιότητα πρόκλησης ραγδαίας απόκρισης της φυσικής ανοσίας, ενώ θεωρείται ικανός παράγοντας στην ενεργοποίηση της μικρογλοίας και απόκτηση προφλεγμονώδους φαινοτύπου (Μ1 φαινότυπος). Επιπλέον, τα γεγονότα RNA στοιχειοθεσίας που καταλύονται από τις πρωτεΐνες της οικογένειας ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) αποτελούν μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις (Α-σε-Ι τροποποιήσεις) που εμφανίζονται σε αφθονία στον εγκέφαλο, ενώ αλλαγές στα επίπεδα τους έχουν παρατηρηθεί σε πολλές νευροπαθολογικές καταστάσεις. Για τη βαθύτερη κατανόηση της επίδρασης της έκθεσης κυττάρων μικρογλοίας στον LPS πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση διαφορικής γονιδιακής έκφρασης ανάμεσα σε κύτταρα μικρογλοίας σε κατάσταση ηρεμίας και κύτταρα μικρογλοίας εκτεθειμένα για 24 ώρες στον LPS, ενώ τα διαφορετικά έκφραζόμενα γονίδια που προέκυψαν εμφάνισαν ισχυρή σύνδεση με μηχανισμούς της ανοσίας. Επιπλέον, η διέγερση με LPS κυττάρων μικρογλοίας με καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης ADAR1 είχε παρόμοια αποτελέσματα με κύριο μονοπάτι εμπλοκής των γονιδίων το μονοπάτι NF-kappa Β σηματοδότησης, που αποτελεί σημαντικό μονοπάτι προώθησης προφλεγμονωδών αντιδράσεων. Επιπλέον, η αναζήτηση διαφορετικά εκφραζόμενων γονιδίων που σχετίζονται με τη κυτταρική αντίδραση στον LPS είχε ως αποτέλεσμα την ανίχνευση 5 γονιδίων, των οποίων η έκφραση θα μπορούσε να επιβεβαιωθεί εργαστηριακά. Σημαντική ήταν και η παρατήρηση ότι το πλήθος των Α-σε-Ι τροποποιήσεων που οφείλονται στις πρωτεΐνες ADAR παρουσίασε αύξηση μετά την έκθεση στον LPS τόσο σε φυσιολογικά κύτταρα μικρογλοίας όσο και κύτταρα μικρογλοίας με έλλειψη της πρωτεΐνης ADAR1, ενισχύοντας την υπόθεση της αύξησης της ενεργότητας του ενζύμου ADAR2 από τον LPS. Η έλλειψη της ADAR1 πρωτεΐνης είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση των Α-σε-Ι τροποποιήσεων σε κύτταρα μικρογλοίας υπό φυσιολογικές συνθήκες και συσχέτιση τους με διαδικασίες της φυσικής ανοσίας, ενώ υπό συνθήκες φλεγμονής (μετά από χορήγηση LPS) η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε εξαιρετικά μεγάλη μεταβολή της έκφρασης και συσχέτιση των διαφορετικά εκφραζόμενων γονιδίων με ζωτικής σημασίας λειτουργίες, όπως η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, η επιδιόρθωση του DNA και η αντίδραση του ανοσοποιητικού συστήματος, αποδεικνύοντας τον νευροπροστατευτικό ρόλο που μπορεί να διαδραματίζει το ένζυμο σε συνθήκες νευροφλεγμονής. Η αναζήτηση γονιδίων που σχετίζονται με διαδικασίες του ανοσοποιητικού συστήματος μετά την καταστολή της ADAR1 οδήγησε στην ανίχνευση 8 γονιδίων που η έκφραση μεταβάλλεται σημαντικά στη μικρογλοία και η εργαστηριακή τους δοκιμή μελλοντικά θα επιβεβαίωνε τα αποτελέσματα. Τέλος, η διερεύνηση των Α-σε-Ι θέσεων τροποποίησης πάνω στο RNA κυττάρων μικρογλοίας στις υπό μελέτη συνθήκες έδειξε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό τους εντοπίζεται σε αλληλουχίες καθοδικά των γονιδίων, ενώ μεγάλα ποσοστά εντοπισμού εμφάνισαν οι ανοδικές περιοχές και οι 3’ αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων
description: Microglial activation is is a feature of neurodegeneration and occurs in the largest percentage of neurodegenerative diseases. Bacterial endotoxin or lipopolysaccharide (LPS) is capable of inducing a rapid innate immune response and it is considered to have the ability to activate microglia in order to switch from resting to proinflammatory state (M1 phentotype). Furthermore, RNA editing events being catalyzed by ADAR protein family (adenosine deaminase acting on RNA) are post-transcriptional modifications (A-to-I modifications), which occur in abundance in the brain and changes in their levels have been reported in many neuropathological conditions. To better understand the effect of microglial cell exposure on LPS, bioinformatic analysis of differential gene expression was performed between resting microglial cells and microglial cells exposed to LPS for 24 hours. The resulting significantly differentially expressed genes showed a strong association with immune system process. Similar results were observed after LPS stimulation of ADAR1 Knockout microglial cells, while pathway analysis showed that differentially expressed genes were strongly associated with NF-kappa B signaling pathway, which is a key mediator of pro-inflammatory gene induction. In addition, the investigation of differentially expressed genes associated with the cellular response to LPS resulted in the detection of 5 genes, whose expression could be confirmed in vitro. It is also important to note that the number of A-to-I modifications increased after exposure to LPS in both normal microglial cells and microglial cells lacking ADAR1 protein, reinforcing the hypothesis that LPS may induce increased activity of ADAR2 enzyme. Suppression of ADAR1 protein expression resulted in the reduction of A-to-I modifications in microglia cells under normal conditions (untreated microglia) and gene expression alterations were strongly associated with immune system response, while under inflammatory conditions (after LPS administration), gene expression analysis showed extremely large changes in expression and correlation of differently expressed genes with vital cellular functions such as cell cycle regulation, DNA repair and immune system response, indicating the possible neuroprotective role ADAR1 may play under neuroinflammatory conditions. The investogation of genes related to immune system processes after ADAR1 suppression led to the detection of 8 genes, whose expression was significantly altered in microglia and experimental procedures would confirm the results in the future. Finally, analysis of A-to-I RNA Editing Sites (RESs) among the different conditions showed that the largest proportion of RESs were located in Downstream regions of genes, while also high percentages of RESs were detected in Upstream and 3 'Untranslated Regions of genes (3’UTR region)