title: Identifizierung während der Apoptose transkriptionell hochregulierter Gene mittels einer viralen Genfalle und Charakterisierung eines dieser Gene: Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase Ibeta
Creators: name: Schneider, Stephanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2005
Subjects: Phosphatidylinositol
Genfallen
Signal transduction
Apoptosis
Apoptose
Signaltransduktion
Gene trap
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Zusammenfassung Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist sowohl für die Erklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen als auch für zukünftige rationale Therapieansätze von Bedeutung. Besonders bei der Entwicklung neuer pharmakologischer Substanzen, die gegen Krebs oder neurodegenerative Krankheiten eingesetzt werden können, ist die Entdeckung neuer apoptoserelevanter Gene von ausschlaggebender Relevanz. Das Ziel dieser Arbeit war daher, neue Gene zu finden, deren Expression während der Apoptose induziert wird, und eines dieser Gene funktionell zu charakterisieren. Als Studiensystem wurden IL-3-abhängige Zellen (FDC P1) benutzt, da die Existenz eines schnell aktivierbaren Apoptose-Signalwegs in verschiedensten Zellen zu dem Schluss geführt hatte, dass Überlebensfaktoren diesen Signalweg reprimieren. IL-3 abhängige Zelllinien hören nicht auf zu proliferieren, wenn ihnen IL-3 entzogen wird, vielmehr durchlaufen sie Apoptose. IL-3 sichert also das Überleben der Zellen dadurch, dass apoptoseaktivierende Signal-Kaskaden reprimiert werden. Um neue Komponenten solcher regulatorischer Kaskaden ausfindig zu machen, war es nötig eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Zellen trotz eines Apoptosestimulus am Leben zu erhalten. Eine entsprechende Strategie zur Identifizierung eben solcher Gene, die schon erfolgreich bei eine Reihe anderer Fragestellungen eingesetzt worden war, beruht auf dem Einsatz von Genfallen. Aus der Kombination von Genfalleninsertion und dem Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte letztendlich eine Methode entwickelt werden, die die Apoptoseinduktion durch IL-3 Entzug einer strikt IL-3 abhängigen Zelllinie erlaubte. Dabei wird, nach gezielter Rekombination, das Gen für den Überlebensfaktor IL-3 exprimiert. Dadurch werden die Zellen unabhängig von exogen zugeführtem Cytokin. Anders als konventionelle Genfallen-Strategien sollte der Cre/loxP-Ansatz nicht nur eine Anreicherung von Genen erlauben, die durch spezifische biologische Stimuli induziert werden, sondern auch die Identifizierung von nur transient exprimierten Genen ermöglichen. Mit Hilfe eines solchen Ansatzes konnte aus der FDC P1-Zelllinie das Gen Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase isoliert werden. Zur Validierung der transkriptionellen Induktion der identifizierten Gene wurden Northern-Blot Experimente durchgeführt, die zeigten, dass die Transkriptmenge nur in einem eng begrenzten Zeitfenster ansteigt und danach wieder auf das Ausgangsniveau absinkt. Somit erfüllt das gewählte Genfallensystem auch die Forderung nach der Detektion von nur vorübergehend transkriptionell aktivierten Genen. Die Ergebnisse aus den Proliferationsexperimenten mit FDC P1-Zellen zeigten, dass PIP5K in den Zellzyklus eingreift. PIP5K überexperimierende Zellen haben neben einer erhöhten Proliferationsrate (ca. 3-fach höhere Zellzahlen) auch eine verringerte Spontanapoptose (ca. 70% weniger apoptotische Zellen). In Weichagarexperimenten konnte auch eine erhöhte Stressresistenz der Zellen beobachtet werden (ca. 8-fach unter normalen Il-3 Bedingungen). Nachdem in FDC P1-Zellen nur eine moderate Expression von exogener PIP5K erzielt werden konnte, wurden stabile PIP5K-überexprimierende HeLa-Zellpopulationen isoliert. In einer systematischen, biochemischen Analyse von Zellzyklusregulatoren wurden darüber hinaus PIP5K regulierte Zellzyklusproteine identifiziert. So führte die PIP5K Überexpression zu einer Induktion von PCNA, hsMAD2 und DNA-Polymerase , und zu einer Repression von p21/Cip1/Waf1. Schließlich wurde die Rolle von PIP5K während der, durch alternative Stimuli induzierten Apoptose in HeLa-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass PIP5K die zytostatika- und strahleninduzierte Apoptose akzeleriert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass PIP5K den Apoptoseprozess, je nach Stimulus, sowohl verzögern als auch beschleunigen kann. Während PIP5K bei IL-3 Entzug anti-apoptotisch wirkt, geschieht genau das Gegenteil nach zytostatischer Behandlung. Insgesamt spiegelt dies eine subtil aufeinander abgestimmte Regulation von Zellzyklus und Apoptose wieder.
description: Summary Apoptosis is of basic importance for tissue homoeostasis of every organism. Dysregulation of programmed cell death can lead either to degenerative deseases or neoplasias. The fundamental molecular mechanisms are of major importance for the understanding of the pathogenesis of disorders and are essential for further therapy attempts. The discovery of new apoptotic genes is of decisive importance in particular for the development of new pharmacological agents in the treatment of cancer and neurodegenerative diseases. The aim of this thesis was to find novel genes whose expression is induced during apoptosis, and to characterize one of these genes functionally. The IL-3-dependent cell line FDC P1 was used as a study system. The existence of a constitutively expressed apoptosis cascade has led to the notion that survival factors repress this machinery and, if such factors are unavailable, cells die by default. IL-3 dependent cell lines do not stop proliferation if IL-3 is deprived, on the contrary they undergo apoptosis. In order to identify genes that are transcriptionally regulated in cells undergoing apoptosis by survival factor deprivation, a gene trap approach was used. For the identification of genes that are expressed only transiently during a biological process a strategy which makes use of the site-specific Cre/loxP recombination system was developed. By the combination of gene trap mutagenesis with site-specific recombination it is possible to select for integrations into transiently expressed genes. Using this strategy the gene Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase I (PIP5K) could be isolated from the FDC P1 cell line. To demonstrate the transcriptional induction of the identified genes Northern Blot experiments were carried out. These experiments showed the increase of the transcript only in a closely limited time window that afterwards decrease again to the output level. In proliferation experiments it could be shown that overexpression of PIP5K has an influence on the cell cycle. Such cells besides of an increased proliferation (approx. triple higher cell numbers) also showed a reduced spontaneous apoptosis ratio (approx. 70% less apoptotic cells). In soft agar experiments also an increased stress resistance of the cells could be observed (approx. eightfold under normal IL-3 conditions). For further experiments stable PIP5K-expressing HeLa cell populations were isolated. In a systematic biochemical analysis of cell cycle modulators, PIP5K regulated cell cycle proteins were identified. The increased expression of PIP5K led to an induction of PCNA, hsMAD2 and DNA polymerase , and, furthermore, to a repression of p21/Cip1/Waf1. Finally, the role of PIP5K was examined in HeLa cells through alternative stimuli induced apoptosis. It was shown that apoptosis accelerates in cells which where treated with cytostatic drugs or radiation. PIP5K can both increase and decrease apoptosis, depending upon the stimulus. While PIP5K showed an antiapoptotic effect during IL-3 withdrawal, after cytostatic treatment it acted proapoptotic. Finally, these results reflect again a subtle coordinated regulation of cell cycle and apoptosis.