title: Entwicklung und Charakterisierung von nanoskaligen, liposomalen Ultraschallkontrastmitteln zum Plaque-Targeting sowie Aufbau eines in vitro-Plaque-Modells
title: Development and characterization of nanoscaled,liposomal ultrasound contrast agents for plaque targeting und development of an in vitro plaque model
Creators: name: Marxer, Elena Eva Julianne
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Ultrasound , Liposome
Medizin, Gesundheit
Ultraschall
Liposom , Arteriosklerose
Atherosclerosis

description: In dieser Arbeit wurden neue,
      lipidbasierte, nanoskalige Formulierungen zur Anwendung als
      Ultraschallkontrastmittel und zum Targeting von
      arteriosklerotischen Plaques entwickelt und charakterisiert.
      Ziel war eine sehr gute Kontrastverstärkung bei Verwendung
      von diagnostischem, nicht-invasivem Ultraschall bei
      Frequenzen zwischen 1 und 3 MHz. Es konnte eine Methode zur
      Bestimmung elastischer Eigenschaften nanoskaliger Systeme
      mittels AFM entwickelt und am Beispiel von PLGA-Nanopartikeln
      getestet werden. Und schließlich wurde ein in vitro
      Plaque-Modell aufgebaut und das erfolgreiche Plaque-Targeting
      gezeigt. Die Grundlagen zu Ultraschall und die Anwendung von
      Ultraschall in Diagnose und Therapie sowie besonders die
      Anwendung von ultraschallkontrastverstärkenden Mitteln wurden
      in der Einleitung (Kapitel 1) dargestellt. Ein kurzer
      Überblick zur Gefäßkrankheit Arteriosklerose, die
      Visualisierung dieser Erkrankung und in vivo
      Charakterisierungsmöglichkeiten wurde gegeben. Die
      verwendeten Methoden, zur Herstellung der
      Ultraschallkontrastmittel bzw. PLGA-Nanopartikel
      (Filmmethode, Salting-out), deren physiko-chemische und
      morphologische Charakterisierung (PCS, LDA, Cryo-TEM,
      31P-NMR, AFM), die Messung der
      ultraschallkontrastverstärkenden Eigenschaften (Flussmodell)
      und der Nachweis des Fibrin-Targetings (in
      vitro-Plaque-Modell) wurden in Kapitel 2 erläutert. Kapitel 3
      befasste sich mit den Ergebnissen der physiko-chemischen und
      morphologischen Charakterisierung der hergestellten
      liposomalen Formulierungen sowie von Polymer-Nanopartikeln.
      Es konnte sowohl mit PCS-Messungen, also auch mit AFM und
      Cryo-TEM gezeigt werden, dass bei der Herstellung der
      liposomalen Ultraschallkontrastmittel zwei Größenfraktionen
      auftraten und mithilfe des 31P-NMR wurde deutlich, dass
      Mizellen und Liposomen nebeneinander vorlagen. Die
      Herstellung von anderen Lipidmischungen führte zu ähnlichen
      Ergebnissen, was anhand von PCS-Messungen gezeigt wurde. Die
      erfolgreiche Kopplung von Antikörpern an die liposomalen
      Formulierungen und die Antigen-Antikörper-Wechselwirkung,
      konnten mit dem AFM nachgewiesen werden. Ebenfalls mittels
      PCS, wurde die erfolgreiche Steuerung der Größen der
      PLGA-Nanopartikel durch unterschiedliche
      Rührgeschwindigkeiten, des bei der Herstellung verwendeten
      Ultra-Turrax®, gezeigt. Kapitel 4 stellte die Ergebnisse der
      Ultraschallkontrastmessungen dar. Durch die Verwendung eines
      Flussmodells konnten die Kontraststärken und auch die
      Lagerungsstabilität der Ultraschallkontrastmittel schnell und
      effektiv gemessen und mittels der ImageJ-Software als
      mittlere Grauwerte ausgewertet werden. Dabei wurden alle
      Kontrastmittel mit SonoVue®, einem käuflichen
      Ultraschallkontrastmittel mit Bläschengrößen zwischen 2 und 8
      µm, verglichen. Kapitel 5 befasste sich mit den Ergebnissen
      der Verbesserung der Kontrastintensität durch Variation der
      Herstellungsmethode, der Lipidzusammensetzung, sowie dem
      Gefriertrocknen. Die verschiedenen Mischungen wurden wieder
      im Flussmodell untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass
      die Herstellungsmethode teilweise starken Einfluss auf die
      Kontraststärke hatte. Durch die Verwendung des
      Ultraschallstabes, statt des Ultraschallbades, bei der
      Herstellung, konnten deutlich bessere Ergebnisse erzielt
      werden. Auch die Zusammensetzung der liposomalen
      Formulierungen war entscheidend für die Kontrastintensität.
      Das Gefriertrocken hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf
      die Kontraststärke und führte beinahe immer zu einer
      Kontrastverbesserung. Selbst wenn die Herstellung der
      liposomalen Formulierungen mit dem Ultraschallbad geschah und
      diese dadurch einen schwächeren Ultraschallkontrast
      aufwiesen, wurde dieser nach dem Gefriertrocknen enorm
      verbessert. In Kapitel 6 wurden, mit Hilfe des
      Rasterkraftmikroskops, elastische Eigenschaften am Beispiel
      von Polymer-Nanopartikeln bestimmt. Da die elastischen
      Eigenschaften der liposomalen Ultraschallkontrastmittel einen
      Einfluss auf die Ultraschallkontrastintensität hätten haben
      können, wurde zunächst ein Modellsystem zur Messung von
      Elastizitäten entwickelt. Hierzu wurden Polymer-Nanopartikel
      unterschiedlicher Größen hergestellt und vermessen. Dabei
      zeigten sich auch die an der Partikeloberflächliche
      stattfindenden Abbauphänomene der PLGA-Nanopartikel. Kapitel
      7 stellte ein selbst entwickeltes in vitro Plaque-Modell zur
      Untersuchung der spezifischen Targeting-Eigenschaften vor. Es
      konnte das erfolgreiche Fibrin-Targeting an künstlichen
      Plaques, bestehend aus Fibrin-Pulver, und an menschlichen, in
      kleine Stücke geschnittenen Plaques, gezeigt werden. Die mit
      Antikörpern gekoppelten liposomalen Formulierungen blieben
      auch unter Strömung an den künstlichen und menschlichen
      Plaques haften und die Plaques waren als helle Flecken im
      Ultraschallbild sehr gut zu erkennen.
description: In this work, new, lipid-based
      formulations for use as nanoscaled ultrasound contrast agents
      and for targeting of atherosclerotic plaques were developed
      and characterized. The aim was a very good contrast
      enhancement in the use of diagnostic, non-invasive ultrasound
      at frequencies between 1 and 3 MHz. A method to determine
      elastic properties of nanoscale systems using AFM was
      developed and tested with PLGA nanoparticles. And finally an
      in vitro model has been established and the successful plaque
      targeting was shown. The basics of ultrasound and the use of
      ultrasound in diagnosis and therapy, and particularly the use
      of ultrasound contrast-enhancing agents have been shown in
      the introduction (Chapter 1). A brief overview of the
      vascular disease atherosclerosis, the visualization of the
      disease and in vivo characterization of the lesions were
      given. The methods used for the preparation of the ultrasound
      contrast agents and PLGA nanoparticles (film method,
      salting-out method), the physico-chemical and morphological
      characterization (PCS, LDA, cryo-TEM, 31P NMR, AFM),
      measurement of the ultrasound contrast-enhancing properties
      (flow model) and the results of fibrin targeting (in vitro
      plaque model) were explained in chapter 2. Chapter 3 dealt
      with the results of physico-chemical and morphological
      characterization of the liposomal formulations as well as of
      the polymer nanoparticles. It has been shown with PCS
      measurements and also with AFM and cryo-TEM that two size
      fractions occurred in the preparation of the liposomal
      ultrasound contrast agents. And with using the 31P-NMR it
      could be shown that micelles and liposomes were present
      together. The preparation of other lipid mixtures revealed
      similar results by PCS measurements. The successful coupling
      of antibodies to the liposomal formulations and the
      antigen-antibody interaction could be detected with the AFM.
      The successful control of the size of the PLGA nanoparticles
      with different stirring speeds during preparation with the
      Ultra-Turrax ®, was shown by PCS. Chapter 4 presented the
      results of the ultrasonic contrast measurements. With the use
      of a flow model, the contrast intensities could be determined
      and evaluated as mean gray values using the ImageJ software.
      All contrast agents were compared to SonoVue ®, a
      commercially available ultrasound contrast agent with bubbles
      sizes between 2 and 8 microns. Chapter 5 dealt with the
      results of the improvement of the contrast intensity by
      variation of the preparation method, the lipid composition,
      as well as freeze-drying. The various mixtures were again
      examined in the flow model. It turned out that the method of
      preparation had strong influence on the contrast. By the use
      of the ultrasonic tip, instead of the ultrasonic bath for
      preparation, significantly better results were achieved. The
      composition of the liposomal formulations was crucial for the
      contrast intensity. Lyophilization had also a large influence
      on the contrast enhancement and almost always led to an
      improvement in contrast. Even if the preparation of liposomal
      formulations was done with the ultrasonic bath and the
      formulations had a weaker ultrasonic contrast, this was after
      freeze-drying greatly improved. In chapter 6 elastic
      properties of polymer nanoparticles were measured with the
      atomic force microscope. Since the elastic properties of the
      liposomal ultrasound contrast agents could have an effect on
      the intensity of ultrasound contrast, this model system for
      the measurement of elasticity was developed. The polymer
      nanoparticles were prepared with different sizes, and
      measured. The experiments also revealed degradation phenomena
      of PLGA nanoparticles. Chapter 7 introduced a self-made in
      vitro plaque model to study the specific targeting
      properties. The successful targeting of artificial fibrin
      plaques, consisting of fibrin powder, and of human plaques,
      cut into small pieces, was shown. The liposomal formulations
      with coupled antibodies adhered even under flow on the
      artificial and human plaques and the plaques could be seen as
      bright spots in the ultrasound image.