title: Nipahvirus-induzierte Zytokinantwort in porcinen und humanen respiratorischen Epithelzellen
Creators: name: Elvert, Mareike
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Medical sciences Medicine
Medizin
primäre humane respiratorische Epithelzellen
Nipahvirus
Porcine ex vivo Lungenschnitte
primäre porcine respiratorische Epithelzellen

description: Das hochpathogene Nipahvirus (NiV), das zu dem Genus Henipavirus in der Familie Paramyxoviridae gehört, führt seit 1998 zu Ausbrüchen in Südostasien. Dabei verursacht das Virus schwere Erkrankungen in verschiedenen Spezies und hohe Letalitätsraten beim Menschen, wogegen es keine Behandlungsmöglichkeit oder Impfung gibt. Aus diesen Gründen ist das NiV in die höchste biologische Sicherheitsstufe 4 (BSL-4) eingestuft. Aufgrund der Schwere der Krankheitsverläufe befinden sich Nipahviren auf der R&amp;D Blueprint list of priority diseases der World Health Organization (WHO), die die Erforschung dieser Viren als Priorität eingestuft hat. Beim ersten bekannten Ausbruch 1998/1999 in Malaysia und Singapur wurde das NiV von Flughunden, dem Virusreservoir, auf Schweine übertragen. Diese entwickelten eine starke symptomatische Entzündung der Lunge und konnten das Virus über Sekrete auch auf Menschen übertragen. Infizierte Menschen entwickelten eine schwere Enzephalitis, zeigten aber im Vergleich zu Schweinen nur selten respiratorische Symptome oder eine Virusausscheidung in Atemwegssekreten. Da sich die Genomsequenzen der Virusisolate aus Schweinen und Menschen nicht unterscheiden, deutet die unterschiedlich starke Beteiligung der Atemwege während der NiV-Infektion auf Wirtsspezies-spezifische Unterschiede hin. Unsere Arbeitsgruppe hat bereits gezeigt, dass der Eintrittsrezeptor für NiV (Ephrin-B2) in humanen und porcinen Atemwegsepithelzellen unterschiedlich stark exprimiert wird, was auch einen gewissen Einfluss auf die Infektionseffizienz hatte. In dieser Arbeit sollten nun weitere Wirtsfaktoren identifiziert werden, die einen Einfluss auf die NiVMalaysia-Infektion in den Atemwegsepithelien haben könnten. Zu diesem Zweck wurden Infektionsstudien in primären humanen und porcinen respiratorischen Epithelzellen durchgeführt. Dabei wurde die NiV-Replikation, die Freisetzung infektiöser Viruspartikel und die angeborene Immunantwort in infizierten Zellen, genauer die Induktion von Interferonen (IFN), Interferon-stimulierten Genen (ISGs) und proinflammatorischen Zytokinen untersucht. Die Infektion von Epithelzellen aus verschiedenen humanen und porcinen Lungenabschnitten (Trachea, Bronchien, Small-Airways) ergab, dass alle Atemwegskulturen mit einer deutlichen Hochregulierung von Typ-III IFN, vor allem von IFN-λ2,3 (human) bzw. IFN-λ3 (porcin), reagierten. Dabei zeigten humane und porcine Bronchial-Epithelzellen eine deutlich stärkere IFN-Antwort als NiV-infizierte Epithelzellen aus der Trachea oder den Small-Airways. Neben den quantitativen Unterschieden in der IFN-Antwort der Zellen aus den verschiedenen Lungenabschnitten konnten in dieser Arbeit eindeutige Spezies-spezifische Unterschiede in der Zytokin-Induktion nachgewiesen werden. Direkte Vergleichsstudien von NiV-infizierten humanen und porcinen Bronchial-Epithelzellen (HBEpC und PBEpC) ergaben, dass bei gleich effizienter Virusreplikation (gemessen über die intrazellulären Virus-RNA-Mengen) die Typ-III IFN- und ISG-Antwort in den PBEpC im Vergleich zu den HBEpC deutlich vermindert war. Die Virusfreisetzung, das heißt die Virustiter im Zellüberstand, waren in PBEpC erhöht. Dies spricht dafür, dass das NiV in porcinen Bronchial-Epithelzellen eine relativ geringe antivirale Antwort induziert und sich produktiv vermehrt. Die Infektionsstudien haben weiterhin gezeigt, dass die NiV-Infektion in den porcinen Bronchial-Epithelzellkulturen trotz der schwachen IFN- und ISG-Antwort eine eindeutige Expression von proinflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8) induziert. Insgesamt geben die vergleichenden Infektionsstudien klare Hinweise darauf, dass Unterschiede in der Zytokinantwort wichtige Wirtsspezies-spezifische Faktoren darstellen, die die NiV-Infektion in der menschlichen und porcinen Lunge beeinflussen könnten. Auf Basis der Ergebnisse könnte man die in vivo beobachteten Unterschiede in der respiratorischen Symptomatik und der Virusausscheidung in Atemwegssekreten wie folgt erklären: Eine NiV-Infektion der Lunge führt beim Menschen zu einer moderaten proinflammatorischen Antwort, induziert aber eine effiziente IFN-abhängige antivirale Immunantwort, die letztendlich die Virusproduktion limitiert. Im Gegensatz dazu kommt es in Schweinen bei einer NiV-Infektion der Lunge zu einer ausgeprägten inflammatorischen Antwort, aber einer geringen IFN-abhängigen Hemmung der Virusvermehrung, was die ausgeprägte respiratorische Symptomatik bei Schweinen und die produktive Virusausscheidung über Atemwegssekrete erklären könnte. Da die bisherigen Untersuchungen stark darauf hinweisen, dass IFN-λ eine wichtige Rolle bei der antiviralen Immunantwort in Bronchial-Epithelzellen spielt, wurde in nachfolgenden Infektionsstudien die Wirkung von Cyclosporin A (CSA) untersucht. Für CSA wurde kürzlich ein IFN-λ abhängiger inhibitorischer Effekt auf MERS-Coronaviren beobachtet. Tatsächlich führte eine CSA-Behandlung der primären humanen und porcinen Bronchial-Epithelzellen zu einer Typ-III IFN-Hochregulierung und zu einer eindeutigen Hemmung der NiV-Infektion. Ob CSA ein möglicher Behandlungsansatz ist, um die NiV-Infektion in der Lunge zu hemmen, soll in Zukunft in komplexeren primären Zellkulturmodellen getestet werden, die größere intakte Epithelverbände mit verschiedenen epithelialen und submukosalen Zelltypen enthalten. Deshalb wurde im letzten Teil der Arbeit eine Methode zur Herstellung von Lungenschnitten, sogenannte porcine ex vivo lung slices cultures etabliert. Die aus frischen Schweinelungen gewonnenen Lungenschnitte waren über mehrere Tage vital und die Infektion mit einem rekombinanten NiVeGFP konnte über den Nachweis autofluoreszierender NiV-positiver Zellen am Bronchuslumen und im Lungengewebe erfolgreich nachgewiesen werden. Somit steht nun ein System zur Verfügung, mit dem in Zukunft NiV-Inhibitorstudien in einem komplexen ex vivo Zellmodell durchführt werden können.
description: The highly pathogenic Nipah virus (NiV), which belongs to the genus Henipavirus in the family Paramyxoviridae causes outbreaks of infection in Southeast Asia since 1998. NiV induces severe diseases in various species and high mortality rates in humans, while no treatment or vaccination is available. For these reasons, NiV is classified as a biological safety level 4 (BSL-4) pathogen. Due to severe course of disease, NiV is listed on the R&amp;D Blueprint list of priority diseases of the World Health Organization (WHO). This list contains viruses prioritized for further research. During the first outbreak in Malaysia and Singapore in 1998/1999, NiV was transmitted from the virus reservoir, fruit bats, to pigs. Infected pigs showed a severe symptomatic inflammation of the lung and transmitted the virus also to humans via secretions. Infected humans developed severe encephalitis but rarely showed respiratory symptoms or virus shedding in airway secretions. Because the genome sequences of NiV isolates from pigs and humans do not differ, the variations in the respiratory involvement indicate host species-specific differences. Our research group already revealed that the entry receptor for NiV (Ephrin-B2) is differently expressed in human and porcine respiratory epithelial cells, which also influenced the infection efficiency. The aim of this work was to identify further host factors that influence NiVMalaysia infection in airway epithelia. Therefore, infection studies in primary human and porcine respiratory epithelial cells were performed. NiV replication, the release of infectious virus particles and innate immune responses, namely the induction of interferons (IFNs), interferon-stimulated genes (ISGs) and proinflammatory cytokines, were investigated. NiV infection of human and porcine epithelial cells from different parts of the lung (trachea, bronchia, small airways) showed that all epithelial cells reacted with an upregulation of type III IFN, especially IFN-λ2,3 (human) or IFN-λ3 (porcine). Both, human and porcine bronchial epithelial cells showed higher IFN responses to NiV compared to epithelial cells from the trachea or small airways. In addition to quantitative differences in the IFN response in cells from different parts of the lung, this work revealed clear species-specific differences in cytokine induction. Direct comparative studies of NiV-infected human and porcine bronchial epithelial cells (HBEpC and PBEpC) showed that, despite similar replication rates (measured via the intracellular viral RNA content), the type III IFN and ISG responses in PBEpC were significantly reduced compared to HBEpC. The release of infectious virus particles (virus titres in the cell supernatant) was increased in PBEpC. This suggests that NiV induces a relatively low antiviral response in porcine bronchial epithelial cells and replicates productively. The infection studies of this work have further shown that, despite the limited IFN and ISG response, NiV infection induced a prominent expression of proinflammatory cytokines (IL-6, IL-8) in porcine bronchial epithelial cell cultures. Altogether, the comparative infection studies in this work provide the first clear evidence that differences in cytokine response are important host species-specific factors that could influence NiV infection in the human and porcine lung. Based on these results, the differences observed in vivo in respiratory symptoms and virus shedding in respiratory secretions might be explained as follows: In humans, NiV infection in the lung triggers a moderate proinflammatory response and induces an efficient IFN-dependent antiviral immune response, which in turn limits virus production. In contrast, NiV infection in pigs causes a pronounced inflammatory response in the lung. The IFN-dependent inhibition of virus replication is limited, which may explain the prominent respiratory symptoms in pigs and the productive virus shedding via airway secretions. Since IFN-λ appears to play an important role in the antiviral immune response in bronchial epithelia, the effects of cyclosporine A (CSA) were analyzed, which was recently found to cause an IFN-λ dependent inhibitory effect on MERS coronaviruses. In fact, CSA treatment of primary human and porcine bronchial epithelial cells resulted in type III IFN upregulation and a strong inhibition of NiV infection. Wheter CSA is a possible therapeutic approach to inhibit NiV infection in the lung, should be tested in the future in a more complex primary cell culture models containing larger intact epithelial layers with diverse epithelial and submucosal cell types. Therefore, in the last part of this work, a method to generate lung slices, so-called porcine ex vivo lung slices cultures, was established. The lung slices prepared from fresh pig lungs were vital for several days and infection with recombinant NiVeGFP could be successfully detected by autofluorescent NiV-positive cells in the bronchial lumen and the lung tissue. Thus, a system is available for future NiV inhibitor studies in a complex ex vivo cell model.