title: Rekombinante Produktionssysteme in der Enzym-Prodrug-Therapie
Creators: name: Übelhör, Katharina
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Diese Arbeit befasst sich mit der Kultivierung von Pichia pastoris (in weiterer Folge P. pastoris genannt), Hefezellen, die mittels rekombinanter DNA das Protein Hydrophobin produzieren und sekretieren, dem darauffolgenden Aufschluss der Hefezellen, dem Aufreinigungsprozess und der anschließenden Testung des reinen Hydrophobins auf den Zelllinien Caco-2 (Colon-Karzinom-Zellen) und SvHuc (mit Simian-Virus infizierte humane Uroepithelzellen). P. pastoris stellt einen attraktiven biotechnologischen Wirtsorganismus dar, da der Hefestamm sehr robust gegenüber äußerer Stressfaktoren, wie pH-Wert- oder Druck-Veränderungen, und schnell und einfach zu kultivieren ist. Außerdem weist P. pastoris, im Gegensatz zum häufig eingesetzten Bakterienstamm Escherichia coli (in Folge E. coli genannt), die vorteilhafte Eigenschaft auf, dass bei der Protein-Produktion die korrekten, für ein funktionierendes Protein notwendigen, post-translationalen Modifikationen ausgeführt werden können. Über einen Vektor wurde die DNA der Hefe so verändert, dass das Protein Hydrophobin, fusioniert mit einem roten oder grünen Fluoreszenz-Marker, produziert und sekretiert wird. Auf die Kultivierung folgt ein Zellaufschluss, um die gesamte Ausbeute an produziertem, aber teilweise nicht sekretiertem Hydrophobin zu gewinnen. Diese Versuchsreihe stellt den Hauptfokus dieser Arbeit dar, da der Aufschluss der Hefe aufgrund deren Robustheit und die speziellen tensidartigen Eigenschaften des produzierten Fusionsproteins den Down-Stream-Prozess erschweren. Der Aufschluss der Hefezellen wurde mit verschiedenen Verfahren getestet, unter anderem enzymatisch durch Zusatz von Lyticase, mechanisch, mittels Einsatzes einer Kugelmühle und zwei verschiedener Sonotroden. Nach dem Aufschluss waren mehrere Aufreinigungsschritte notwendig, um Verunreinigungen und in der Suspension verbliebene Hefezell-Bestandteile abzutrennen, wofür Methoden wie Ultrafiltration, Zentrifugation, ein Zwei-Phasen-Trenn-System (ATPS) und Säulenchromatografie zur Anwendung kamen. Filtration und Zentrifugation dienten der Abtrennung größerer Suspensionspartikel, zur Trennung des Hydrophobins von anderen, durch die Hefezelle produzierten, Proteinen kam die Säulenchromatografie zur Anwendung. Die aufgereinigten Proben konnten danach für Bindungs- und Internalisierungsversuche an den oben genannten Zelllinien eingesetzt werden. Die Bindungsversuche wurden an Einzelzellsuspensionen durchgeführt und mittels Flow Cytometer (FCM) vermessen, die Internalisation wurde an Zell-Monolayern getestet und die Fluoreszenz des Fusionsproteins via Spektrophotometrie gemessen. Weiters wurden einige Probe-Chargen von Mikro- und Nanopartikeln aus biodegradablem Polylactid-co-Glycolid (PLGA) hergestellt, wie sie im zielgerichteten Wirkstoff-Transport Anwendung finden. Rekombinantes Hydrophobin könnte hier möglicherweise eine Alternative bieten zu bisher eingesetzten Stabilisatoren bei der Herstellung der Partikel , könnte als Überzugsmittel zur Erhöhung der Hydrophilie fungieren, oder gemeinsam mit einem bioadäsiven Liganden (als Fusions-Protein) für zielgerichtetes Drug-Targeting eingesetzt werden.
description: This thesis deals with the cultivation of the yeast Pichia pastoris (subsequently written as P. pastoris) that produces and secretes the amphiphile protein Hydrophobin, the breakdown of the yeast cells, the purification process of the fusion protein and the testing of its interaction with Caco-2 cells (colon carcinoma cells) and SvHuc cells (simian virus-transformed human uroepithelial cells). P. pastoris poses as an attractive host organism system for biotechnological processes as its cultivation is relatively easy and cost efficient. The yeast also holds an advantage to commonly used bacterial host Escherichia coli (E. coli) as P. pastoris produces proteins with the correct post-translational modifications. A DNA-vector-system was used to provide a genetically modified yeast that produces and secretes an organism foreign protein fused with red or green fluorescent markers. Different methods were used to break down the host cell walls after the purification process to get a hold of un-secreted fusion protein. These experiments represent the focus of this thesis as P. pastoris is a very robust type of yeast that withstands different external influences. After breaking down the cell walls, several purification steps were needed to separate the Hydrophobin from the rest of the harvest biomass. Methods like ultrafiltration, centrifugation, an aqueous two-phase system (ATPS) and size exclusion chromatography were tested as purification methods. The last step was to test the ability of the purified protein to bind onto or internalize into mammal cell-lines like Caco-2 or SvHuc. Single-cell suspensions and cell monolayers were used for these experiments. Another aspect of this thesis was the production of micro- and nanoparticles made from biodegradable polylactic-co-glycolic acid (PLGA) and the possibility of using Hydrophobin as a stabilizing agent in the process or coating the particles with the protein to enhance the hydrophilicity of the particles so that they may enhance targeted drug-delivery.