title: Der Einfluss von N6-Methyladenosin auf die Replikation von Influenzaviren
title: The influence of N6-methyladenosine on the replication of influenza viruses
Creators: name: Laukemper, Viktoria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: RNA-Moleküle verschiedenster
      Organismen enthalten zahlreiche chemisch modifizierte
      Nukleoside, deren Funktionen bisher nur zum Teil verstanden
      sind. In eukaryotischer mRNA ist N6-Methyladenosin (m6A) die
      am häufigsten vorkommende Modifikation und entsteht durch die
      Methylierung der Aminogruppe an Position 6 des Ringsystems.
      Diese wird durch einen Enzymkomplex aus METTL3, METTL14 und
      WTAP innerhalb der Konsensussequenz
      [G/A/T][G&gt;A]m6AC[T&gt;A&gt;C] vermittelt. Die
      Sequenzabfolge GGACT ist dabei das am häufigsten methylierte
      Motiv. Verschiedene Studien deuten darauf hin, dass m6A
      verschiedene Schritte des RNA-Metabolismus beeinflusst und
      damit zahlreiche zelluläre Prozesse regulieren kann. Hierbei
      wird insbesondere ein Einfluss von m6A auf die Translation,
      das Spleißen und die Stabilität von RNA diskutiert. Die
      Effekte von m6A werden in der Zelle durch Bindung
      verschiedener reader-Proteine aus der hnRNP- und
      YTH-Proteinfamilie vermittelt. Interessanterweise enthält
      auch die mRNA verschiedener Viren m6A, aber die Funktion
      dieser Modifikation für die Virusreplikation und Pathogenese
      sind noch zu einem großen Teil unverstanden. Ältere Studien
      deuten darauf hin, dass auch die mRNA von Influenzaviren m6A
      enthält, wobei die genauen Positionen der Methylierungen
      nicht bekannt sind. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von
      m6A auf die Replikation des Influenzastammes A/Puerto
      Rico/8/1934 H1N1 untersucht. Dafür wurden rekombinanten Viren
      hergestellt, die Mutationen in den m6A-Konsensusmotiven GGACT
      der viralen NS-, NA- oder HA-mRNA enthielten, sodass an
      diesen Positionen keine Methylierung mehr stattfinden konnte,
      gleichzeitig jedoch keine Veränderung der Aminosäuresequenz
      induziert wurde. Durch Replikationsversuche und Untersuchung
      der Protein- sowie mRNA-Expression in humanen Zelllinien
      wurden die Viren charakterisiert und mit Wildtyp(wt)-Viren
      verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Viren mit den
      mutierten GGACT-Motiven in der HA-mRNA deutlich schlechter
      replizierten als die wt-Viren und zudem eine reduzierte
      Expression der HA-mRNA- sowie des HA-Proteins zeigten. Die
      Mutationen in den GGACT-Motiven der NS- und NA-mRNA hatten
      hingegen keinen Einfluss auf die Virusreplikation. Um die
      Beobachtungen aus den Replikationsversuchen auf den
      Methylierungsstatus der Viren zurückführen zu können, wurden
      die m6A-Positionen in der mRNA des wt-Virus und des Virus mit
      den Mutationen in der HA-mRNA mithilfe der Methode des
      methylated RNA immunoprecipitation with next generation
      sequencing (MeRIP-Seq) identifiziert. So konnte gezeigt
      werden, dass die GGACT-Motive der NS- und NA-mRNA des
      wt-Virus nicht methyliert vorlagen, was die normale
      Replikationsfähigkeit der entsprechenden Virusmutanten
      erklärte. Von den GGACT-Motiven in der HA-mRNA des wt-Virus
      enthielt nur ein einziges eine m6A-Modifikation. Hierbei
      handelte es sich um das 2. GGACT-Motiv in der HA-mRNA. Diese
      Methylierung konnte in der mRNA des Virus, bei dem die
      GGACT-Motive in der HA-mRNA durch Mutationen verändert
      wurden, nicht mehr identifiziert werden. Replikationsversuche
      mit Viren, bei denen die GGACT-Motive der HA-mRNA nicht
      gleichzeitig, sondern einzeln mutiert vorlagen, konnten
      zeigen, dass die Mutation des 2. GGACT-Motivs zu einer
      reduzierten Replikationsfähigkeit und zu einer verringerten
      Expression der HA-mRNA- sowie des HA-Proteins führte. Die
      reduzierte Replikationsfähigkeit des Virus, welches
      Mutationen an allen GGACT-Motiven in der HA-mRNA aufwies,
      konnte damit allein auf die Mutation des 2. GGACT-Motivs und
      dem damit einhergehenden Verlust der m6A-Modifikation an
      dieser Position zurückgeführt werden. Durch das MeRIP-Seq
      konnten weitere m6A-Modifikationen in den mRNAs des NS-, M-,
      NA-, NP- und HA-Segments nachgewiesen werden, insbesondere in
      den 5‘- und 3‘-Regionen, deren Funktionen in weiteren
      Versuchen untersucht werden muss. Der Nachweis einer
      Influenza-vermittelten Regulation der m6A-assoziierten
      Proteine sollte Hinweise liefern, durch welche Mechanismen
      m6A die virale RNA- und Proteinexpression während einer
      Infektion beeinflusst. Eine Influenza-vermittelte Veränderung
      der mRNA-Expression von Demethylasen, Methyltransferasen und
      reader-Proteinen konnte in den verwendeten Zelllinien jedoch
      nicht gezeigt werden. Aufgrund bisheriger Studien, die auf
      eine YTHDF2-vermittelte Verstärkung der Proteintranslation
      von methylierter mRNA hindeuten, wurde auch die
      Proteinexpression von YTHDF2 in humanen Zellen während einer
      Influenzainfektion untersucht. Auch hier zeigte sich jedoch
      keine Veränderung in der Expression. Weitere Versuche werden
      daher klären müssen, durch welche Mechanismen m6A in der
      Influenza-mRNA die Proteinexpression und Replikation
      beeinflusst. Zusammenfassend konnte damit in dieser Arbeit
      gezeigt werden, dass der Verlust einer m6A-Modifikation in
      der viralen mRNA zu einer reduzierten Replikationsfähigkeit
      der Influenzaviren führte. Diese Daten deuten darauf hin,
      dass die Hemmung der m6A-Modifikation in der Zelle die
      Replikation der Influenzaviren einschränken könnte und damit
      das Potential für einen neuen Therapieansatz gegen die
      Influenzagrippe bietet.
description: RNA from different organisms
      contains more than 100 different chemically modified
      nucleosides, but their functions are largely unknown.
      N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant modification in
      eukaryotic mRNA and is post-transcriptionally installed by a
      methyltransferase complex consisting of METTL3, METTL14 and
      WTAP within the consensus motif
      [G/A/T][G&gt;A]m6AC[T&gt;A&gt;C]. Therefore, the sequence
      motif GGACT is the most common m6A motif. M6A is bound by
      proteins from the YTH and hnRNP protein family, which
      function as reader proteins and regulate cellular processes
      like translation, splicing and RNA decay. Interestingly,
      viral mRNA has also been reported to contain m6A but the role
      for virus replication and pathogenicity still has to be
      elucidated. Studies from the 1970s indicate that influenza
      virus mRNA also contains m6A but the exact positions of m6A
      have not yet been determined. In this thesis, the influence
      of m6A on the replication of the influenza strain A/Puerto
      Rico/8/1934 H1N1 was analyzed. For this purpose, recombinant
      viruses were generated which contain mutations in the m6A
      consensus motifs GGACT of the viral NS, NA or HA mRNAs. These
      mutations will abrogate the N6-methylation at the respective
      position without inducing a change in the amino acid sequence
      of the protein. The viruses were characterized by replication
      experiments and analysis of the viral RNA and protein
      expression, and then compared to the wt virus. It could be
      shown that the virus with the mutated GGACT motifs in the HA
      mRNA (HAmut1-4) replicated less efficient when compared to
      the wt virus and showed a reduced HA mRNA and HA protein
      expression. In contrast, the mutations in the GGACT motifs of
      the NS and NA mRNA did not affect viral replication. To link
      the observations from the replication studies to the
      methylation status of the viruses, the m6A positions in the
      mRNA from the wt virus and from the virus HAmut1-4 were
      determined by the method of methylated RNA
      immunoprecipitation with next generation sequencing
      (MeRIP-Seq). This analysis showed that the GGACT motifs in
      the NS and NA mRNA of the wt virus were not methylated and
      therefore confirmed the results from the replication studies,
      in which the viruses with mutations at these sites replicated
      normally. In the HA mRNA, only one of the four GGACT sites
      was methylated. The mRNA from the wt virus contained a
      methylation at the second GGACT motif, which was abrogated in
      the mRNA from the virus HAmut1-4 with the mutated GGACT
      motifs. In further experiments recombinant influenza viruses
      were generated in which the GGACT motifs in the HA mRNA were
      mutated individually. Replication studies with these viruses
      could show that the mutation of the second GGACT motif lead
      to a reduced replication efficiency and to a decreased
      expression of HA mRNA and HA protein. Therefore, the reduced
      replication efficiency of the virus HAmut1-4 with four
      mutated GGACT motifs in the HA-mRNA could be linked solely to
      the single mutation at the second GGACT motif and to a
      resulting loss of m6A at this position. The MeRIP-Seq could
      determine further m6A modifications in the NA, M, NA, NP and
      HA mRNA, especially in the 5’ and 3’ regions. Further studies
      have to elucidate the functions of these m6A modifications.
      The detection of an influenza-mediated regulation of the
      m6A-associated enzymes should reveal how m6A regulates viral
      mRNA and protein expression during an influenza infection. In
      this thesis, however, an influenza-mediated change in the
      mRNA expression of different methyltransferases, demethylases
      and reader proteins could not be shown. With regard to
      different studies, which indicate a role of YTHDF2 in the
      m6A-mediated increase of protein translation, the YTHDF2
      protein expression was also analyzed during an influenza
      infection in human cell lines. However, the virus infection
      did not induce any visible change in the YTHDF2 protein
      expression. Therefore, further studies have to reveal how m6A
      influences the replication and protein expression of
      influenza viruses. In summary, this thesis could show that
      the loss of an m6A modification in the viral mRNA lead to a
      reduced replication efficiency of influenza virus. These data
      suggest that the inhibition of m6A modifications could have
      the potential to inhibit influenza replication and could
      therefore be used as a therapy against influenza
      infection.