Μελέτη της επίδρασης συνθηκών τροποποιημένης βαρύτητας στο οστεογενετικό δυναμικό και τον κιρκαδικό ρυθμό αρχέγονων βλαστικών κυττάρων
Creators: name: Τόσκα Μελανία Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Υπερβαρύτητα
Βλαστικά κύτταρα περιακρορριζικής θηλής
Κιρκαδικός ρυθμός
Οστεο/οδοντογενή διαφοροποίηση
Hypergravity
Stem cells from apical papilla
SCAP
Circadian rhythm
Osteo/odontogenic differentiation

description: Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της υπερβαρύτητας στις βιολογικές λειτουργίες των βλαστικών κυττάρων προερχόμενων από την περιακρορριζική θηλή (Stem cells from apical papilla – SCAP), συγκεκριμένα στον πολλαπλασιασμό, την οστεο/οδοντογενή διαφοροποίηση και τον κιρκαδικό ρυθμό τους. Κύτταρα SCAP απομονώθηκαν από τρίτους γομφίους στο στάδιο διάπλασης της ρίζας, από νέους υγιείς δότες και χαρακτηρίστηκαν με ειδικούς δείκτες βλαστικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Οι καλλιέργειες των SCAP εκτέθηκαν σε συνθήκες υπερβαρύτητας 5g, 10g και 20g με τη χρήση φυγόκεντρου(Centrifuge 5804 R, Eppendorf) για 30 και 45 λεπτά. Η ζωτικότητα/πολλαπλασιασμός αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ για όλες τις πειραματικές ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (1g). Η αξιολόγηση της έκφρασης των οστεο/οδοντογενών δεικτών (ALP, BMP-2, DSPP, RUNX2) πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία Real time PCR. Η έκφραση των γονιδίων του κιρκαδικού ρυθμού (Clock, Bmal1, Per1, Per2, Cry1) αξιολογήθηκε επίσης με τη δοκιμασία Real time PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα 5g εμφανίζουν στατιστικά σημαντική υψηλότερη τιμή στη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (1g), μετά από φυγοκέντρηση 30 λεπτών. Η φυγοκέντρηση στα 45 λεπτά για τα 5g και 10g στις 72 ώρες εμφάνισε στατιστικά σημαντική αύξηση στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Τα μοτίβα έκφρασης γονιδίων έδειξαν έντονη οστεο/οδοντογενετική αλλαγή των SCAP, που αποδεικνύεται από την ανοδική ρύθμιση των DSPP, BMP-2, ALP και του μεταγραφικού παράγοντα RUNX2, ιδιαίτερα στα 5g. Η έκφραση όλων των γονιδίων του κιρκαδικού ρυθμού τροποποιήθηκε κατά τη διαδικασία διαφοροποίησης. Τα επίπεδα πρωτεΐνης των Clock, Bmal1 και Per2 επηρεάστηκαν σημαντικά από την υπερβαρύτητα σε σύγκριση με το 1g. Τέλος, η έκφραση των Per1 και Cry1 ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένη σε όλες τις ομάδες σε σύγκριση με την ημέρα 0 (βασική έκφραση). Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που τεκμηριώνει τη χρήση υπερβαρύτητας με σκοπό να προάγει τον πολλαπλασιασμό, την οστεο/οδοντογενή διαφοροποίηση και τον κιρκαδικό ρυθμό των SCAP. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας πιστοποιούν ότι η υπερβαρύτητα μπορεί να θεωρηθεί μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη μηχανική ενασβεστιωμένων οδοντικών ιστών
description: Aim of this study was to investigate the effect of hypergravity on the normal processes of stem cells from the apical papilla (SCAP), in particular on their proliferation, their osteo/odontogenic differentiation and their circadian rhythms. SCAP cultures were established from third molars at the stage of root development of young healthy donors and characterized for stem cell-SC markers with flow cytometry. SCAPs were exposed to hypergravity conditions of 5g, 10g and 20g by utilizing centrifuge (Centrifuge 5804 R, Eppendorf ) for 30 and 45 minutes. Viability/proliferation was evaluated by MTT assay for all experiment groups compared with control (1g). Real time PCR was used to evaluate osteo/odontogenic markers' expression (DSPP, RUNX2, BMP-2, ALP). The expression of circadian core clock genes (Clock, Bmal1, Per1, Per2, Cry1) was assessed also with real-time PCR. The results showed that 5g had a statistically significant higher value on cell metabolic activity compared with the control (1g), at 30 minutes centrifugation. For the 45 minutes centrifuge, 5g and 10g at 72h exhibited a statistically significant increase in cell viability. Gene expression patterns indicated pronounced osteo/odontogenic shift of SCAPs, evidenced by upregulation of DSPP, BMP-2, ALP, and the transcription factor RUNX2, particularly at 5g. The expression of all circadian core clock genes changed during differentiation process. The protein level of Clock, Bmal1 and Per2 was significantly changed by hypergravity compared to 1g. The expression of Per1 and Cry1 was statistically significant decreased in all groups in comparison with day 0 (basic expression). This is the first study validating the potential of hypergravity to promote proliferation, osteo/odontogenic differentiation and circadian rhythmicity of SCAP. These results, reveal that hypergravity can be considered a promising strategy towards tissue engineering of mineralized dental tissues