title: Crosstalk between gut microbiota, intestinal epithelial cells, and T cells in inflammatory bowel disease
Creators: name: Shah, Aayushi
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik::500 Naturwissenschaften::500 Naturwissenschaften und Mathematik
subject: inflammatory bowel disease
subject: microbiota-host interaction
subject: epithelial-immune crosstalk
subject: T cell differentiation
subject: Th1/17 cells
subject: chronisch-entzündliche Darmerkrankungen

description: Inflammatory bowel disease (IBD) is a multifactorial condition characterised by variable patient responses to therapy, which likely arise from the interplay of diverse immune pathways and microbial environments. Despite advances in immunotherapy, the variable efficacy of current treatments highlights a critical gap in our understanding of the molecular and cellular mechanisms that drive diverse inflammatory circuits and patient-specific responses. In particular, the heterogeneity of T-cell differentiation pathways and their crosstalk with intestinal epithelial cells (IECs) suggest that multiple intertwined pathways contribute to disease severity and therapeutic outcomes. To address this gap, we developed an integrative experimental framework using a T cell transfer model in recombination activating gene 1 (Rag1) deficient mice colonised with distinct microbial communities. We manipulated the genetic background of transferred T cells: wild-type (WT), T-box transcription factor 21 (T bet) deficient, retinoic acid receptor related orphan receptor gamma t (RORγt) deficient, and double deficient cells to examine how alterations in key transcription factors influence mucosal inflammation. This approach was combined with high-resolution single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) of IECs and immune cells, mass cytometry, T cell receptor (TCR) repertoire analysis, and IEC-T cell interaction analysis using NicheNet to decipher intercellular signalling dynamics. Our findings revealed that even before T cell transfer, the gut microbiota establishes a proinflammatory metabolic milieu. Notably, the expansion of pathobionts such as Mucispirillum, Helicobacter, and Bacteroides vulgatus drives shifts in microbial metabolism, leading to altered short-chain fatty acid profiles, further reinforcing inflammatory loops involving T helper 17 (Th17) and hybrid Th1/Th17 cell subsets. IECs responded distinctly to microbial signals, especially microbiota-B, showing pronounced interferon (IFN)-stimulated gene (ISG) responses. These epithelial changes, marked by increased antigen presentation (e.g. major histocompatibility complex (MHC) class II), likely intensified immune activation. In contrast, microbiota-A promotes epithelial stability via metabolic and xenobiotic-processing pathways. Regional analysis revealed segment-specific epithelial responses transitioning from proximal immune surveillance (high ISG expression) to distal antigen presentation (robust MHC class II expression). Such gradients mirror the lesion localisation and inflammatory patterns in human IBD. Myeloid cells are critically influenced by microbiota-B, which reduces eosinophil populations and increases inflammatory monocytes/macrophages. This shift could lead to pro-inflammatory cytokine production (interleukin-1 beta (IL-1β), IL-23), reinforcing pathogenic T cell differentiation, and sustained inflammation. Upon T-cell infiltration, the preconditioned epithelium guides divergent T cell differentiation trajectories. In wild-type settings, heightened IFN-driven signals and enhanced antigen presentation favour classical Th1 responses characterised by strong interferon gamma (IFNγ) and tumour necrosis factor (TNF) production, and sustained signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) activation. In contrast, T bet deficient T cells are rerouted into the hybrid Th1\Th17 phenotype. These cells co-express IFNγ and IL-17 in response to persistent signals from elevated IL-23 and IL-1β levels, a profile that mirrors the pathogenic T cell populations observed in human IBD. Moreover, RORγt deficient T cells adopt a cytotoxic, IFNγ-rich phenotype, marked by the upregulation of granzyme B and perforin, whereas the absence of both transcription factors (double knockout) leads to a distinct molecular environment with high cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) expression and alternative activation markers. Our integrative analysis identified critical ligand-receptor interactions that mediate epithelial–immune crosstalk. WT T cells employed regulatory pathways (cluster of differentiation 28 (CD28), programmed cell death protein 1 (PD1)), Tbet-deficient T cells leveraged proliferative and gut-homing interactions (semaphorin 6D (SEMA6D), CC motif chemokine receptor type 9 (CCR9)), while RORγt deficient T cells relied on CXCR3-mediated infiltration. Double knockout cells adopted alternative innate-like cytotoxic interactions, demonstrating functional adaptability despite significant transcriptional constraints. Importantly, paired scRNA-seq and TCR-seq datasets revealed pronounced oligoclonal expansion of certain TCR clonotypes, reflecting the selective expansion of pathologically relevant clones responding to microbial antigens and epithelial signals at the peak of inflammation. This oligoclonal dominance suggests that targeted modulation of specific T cell subsets or antigens could be an effective therapeutic strategy, particularly given the distinct transcriptional programs linked to specific clonotypes. Collectively, our multi-omics approach delineated a complex genotype-dependent network of cellular interactions at the mucosal interface. These data highlight that microbial metabolites, epithelial reprogramming, and T-cell plasticity converge to generate diverse inflammatory circuits. These findings help explain why single-target therapies often fail in IBD, highlighting the necessity for combinatorial strategies that simultaneously address microbial dysbiosis, epithelial barrier integrity, and immune cell differentiation.
description: Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen (CED) sind multifaktorielle Erkrankungen, die durch unterschiedliche Therapieansprechen gekennzeichnet sind und wahrscheinlich aus komplexen Wechselwirkungen zwischen immunologischen Signalwegen und der mikrobiellen Umgebung resultieren. Trotz Fortschritten in der gezielten Therapien verdeutlicht die variable Wirksamkeit aktueller Behandlungsstrategien eine kritische Wissenslücke bezüglich der molekularen und zellulären Mechanismen, welche die Entzündungskaskaden und patientenspezifische Reaktionen bestimmen. Insbesondere weist die Heterogenität der T-Zell-Differenzierungswege und deren Kommunikation mit intestinalen Epithelzellen (IECs) darauf hin, dass multiple, ineinandergreifende Signalwege zu Krankheitsverlauf und Therapieerfolg beitragen. Um diese Wissenslücke zu schließen, entwickelten wir ein integratives experimentelles Framework basierend auf einem T-Zell-Transfer-Modell in recombination activating gene 1 (Rag1)-defiziente Mäusen, die mit unterschiedlichen mikrobiellen Gemeinschaften kolonisiert wurden. Wir manipulierten den genetischen Hintergrund der transferierten T-Zellen, indem wir Wildtyp (WT)-, T-Box Transcription Factor 21 (T bet)-defiziente, retinoic acid receptor related orphan receptor gamma t (RORγt)-defiziente sowie doppelt knockout Zellen verglichen, um zu untersuchen, wie Veränderungen in zentralen Transkriptionsfaktoren die mukosale Entzündung beeinflussen. Dieser Ansatz wurde mit hochauflösender Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) von IECs und Immunzellen, Massenzytometrie (CyTOF), T-Zell-Rezeptor (TCR)-Repertoire-Analysen sowie IEC-T-Zell-Interaktionsanalysen mittels NicheNet kombiniert, um die interzellulären Signaldynamiken zu entschlüsseln. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Darmmikrobiota bereits vor dem T-Zell-Transfer ein proinflammatorisches metabolisches Milieu etabliert. Besonders die Expansion pathogener Mikroben wie Mucispirillum, Helicobacter und Bacteroides vulgatus induziert Veränderungen im mikrobiellen Metabolismus, die erhöhte Succinatspiegel und veränderte Profile kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) bewirken und somit entzündliche Schleifen mit T Helfer Zell 17 (Th17)- und hybriden Th1/Th17-Zellpopulationen verstärken. Die intestinalen Epithelzellen reagierten unterschiedlich auf mikrobielle Signale; insbesondere unter Mikrobiota-B zeigten IECs eine ausgeprägte Aktivierung interferon-stimulierter Gene (ISGs). Diese epithelialen Veränderungen, gekennzeichnet durch erhöhte Antigenpräsentation (z.B. Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II), intensivierten wahrscheinlich die Immunaktivierung. Dagegen förderte Mikrobiota-A die epitheliale Stabilität über metabolische und xenobiotische Prozesse. Eine regionale Analyse enthüllte segment-spezifische epitheliale Antworten, die von proximaler Immunüberwachung (hohe ISG-Expression) bis zu distaler Antigenpräsentation (starke MHC-II-Expression) reichten, was die Läsionslokalisation und Entzündungsmuster bei menschlichen CED widerspiegelt. Myeloide Zellen wurden durch Mikrobiota-B wesentlich beeinflusst; hier zeigte sich eine Reduktion der eosinophilen Populationen und eine Zunahme inflammatorischer Monozyten/Makrophagen. Dies führte zu einer erhöhten Produktion proinflammatorischer Zytokine (Interleukin-1 beta (IL-1β), IL-23), welche die pathogene T-Zell-Differenzierung und anhaltende Entzündung förderten. Nach T-Zell-Infiltration lenkte das vorgeprägte Epithel die T-Zell-Differenzierung. Im Wildtyp-Kontext förderten verstärkte IFN-getriebene Signale und erhöhte Antigenpräsentation klassische Th1-Antworten (starke Interferon gamma (IFNγ)- und Tumour necrosis factor (TNF)-Produktion sowie anhaltende signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1)-Aktivierung). Im Gegensatz dazu wurden T-bet-defiziente T-Zellen in hybride Th1/Th17-Phänotypen umgeleitet, welche IFNγ und IL-17 co-exprimierten, was den pathogenen Zellpopulationen bei menschlichen CED ähnelt. RORγt-defiziente T-Zellen entwickelten einen zytotoxischen, IFNγ-reichen Phänotyp mit erhöhter Granzyme-B- und Perforin-Expression, während der Verlust beider Transkriptionsfaktoren zu einer einzigartigen molekularen Umgebung mit hoher cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4)-Expression und alternativen Aktivierungsmarkern führte. Unsere integrative Analyse identifizierte wesentliche Liganden-Rezeptor-Interaktionen, welche die epithelial-immunologische Kommunikation vermitteln. WT T-Zellen nutzten regulatorische Signalwege (Cluster of differentiation 28 (CD28), Programmed cell death protein 1 (PD1)), Tbet-defiziente T-Zellen proliferative und Darm-orientierte Interaktionen (semaphorin 6D (SEMA6D), CC motif chemokine receptor type 9 (CCR9)), während RORγt-defiziente Zellen die CXC motif chemokine receptor 3 (CXCR3)-vermittelte Infiltration bevorzugten. Doppelt knockout Zellen zeigten alternative, innate-ähnliche zytotoxische Interaktionen und bewiesen funktionelle Anpassungsfähigkeit trotz erheblicher transkriptioneller Einschränkungen. Die Kombination aus scRNA-seq- und TCR-seq-Datensätzen offenbarte eine deutliche oligoklonale Expansion bestimmter TCR-Klonotypen, was auf eine selektive Expansion pathologisch relevanter Klone hinweist, die auf mikrobielle Antigene und epitheliale Signale während der Entzündung reagieren. Diese oligoklonale Dominanz legt nahe, dass eine gezielte Modulation spezifischer T-Zell-Subtypen oder Antigene effektive Therapieansätze darstellen könnte. Zusammenfassend beschreibt unser multi-omischer Ansatz ein komplexes, genotypabhängiges Netzwerk zellulärer Interaktionen an der mukosalen Grenzfläche. Die Ergebnisse unterstreichen, dass mikrobielle Metabolite, epitheliale Reprogrammierung und T-Zell-Plastizität zusammenwirken, um vielfältige Entzündungsschaltkreise zu generieren. Diese Erkenntnisse erklären das häufige Versagen von Monotherapien bei CED und verdeutlichen die Notwendigkeit kombinierter Behandlungsstrategien, die mikrobielle Dysbiose, epitheliale Barriereintegrität und Immunzelldifferenzierung gleichzeitig adressieren.