Investigations on the regulation of endothelial nitric oxide formation with emphasis on the interaction of nitric oxide and superoxide
Creators: name: Zöllner, Stefan
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Year: 1998
Subjects: subject: Stickstoffmonoxid
subject: Endothelzellen
subject: Superoxidanion
subject: Proliferation
subject: nitric oxide
subject: endothelial cells
subject: superoxide anion
subject: proliferation
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie
subject: 32 Biologie
subject: WW 7900

description: Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel).
description: abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).