Δημιουργία in vitro κυτταρικών μοντέλων για την μελέτη της επίδρασης της καταστολής του ενζύμου APOBEC1 στις νόσους Prion
Creators: name: Κυρίτσης, Κωνσταντίνος Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: RNA στοιχειοθεσία
Νόσοι Prion
Ένζυμο APOBEC1
RNA editing
Prion diseases
APOBEC1 enzyme

description: Οι νόσοι prion, αποτελούν σπάνιες θανατηφόρες νευροεκφυλιστικές νόσους, τα πλήρη αίτια εμφάνισης των οποίων παραμένουν άγνωστα, κυρίως όσον αφορά τις σποραδικές μορφές τους, ενώ δεν έχουν βρεθεί ακόμα ούτε μέθοδοι έγκαιρης διάγνωσης ούτε αποτελεσματικές θεραπευτικές προσεγγίσεις. Κοινά γνωρίσματα των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων αποτελούν η μη φυσιολογική συμπεριφορά και αναδίπλωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών, που οδηγεί στην εμφάνιση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Το 10 με 15 % των περιστατικών της νόσου έχει να κάνει με γενετική προδιάθεση για την ανάπτυξη της νόσου. Η εμφάνιση λαθών σε επίπεδο RNA έχει προταθεί ως πιθανός μηχανισμός για την παραγωγή και συσσώρευση λανθασμένα αναδιπλωμένων πρωτεϊνών που μπορούν να εξηγήσουν την εμφάνιση της νόσου στο υπόλοιπο 85 % των σποραδικών μορφών της νόσου. Η RNA στοιχειοθεσία αποτελεί έναν σχετικά καινούργιο μοριακό μηχανισμό μετα-μεταγραφικής τροποποίησης της αλληλουχίας του RNA και στα θηλαστικά εμφανίζεται ως απαμίνωση μεμονομένων βάσεων αδενίνης και κυτοσίνης προς ινοσίνη και ουρακίλη από μέλη των οικογενειών των απαμινασών ADARs και AID/APOBEC αντίστοιχα. Ήδη έχουν γίνει μελέτες που συσχετίζουν η A-to-I RNA στοιχειοθεσία των ενζύμων ADARs με νευροεκφυλιστικά νοσήματα, όπως η αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση. Αντίθετα ο χαρακτηριστικός αντιπρόσωπος της οικογένειας AID/APOBEC, το ένζυμο APOBEC1, που αποτελεί την πρώτη απαμινάση που χαρακτηρίστηκε για τη C-to-U RNA στοιχειοθεσία που επιτελεί στο mRNA της απολιποπρωτεΐνης Β, δεν έχει μελετηθεί καθόλου ως προς τη συμμετοχή του στα νευροεκφυλιστικά νοσήματα. Πρόσφατες μελέτες, επιστρατεύοντας τεχνολογία αλληλούχισης νέας γενιάς του RNA (RNA sequencing), έδειξαν ότι το APOBEC1 αναγνωρίζει και καταλύει το C-to-U RNA editing σε ποικίλα μετάγραφα σε ιστούς μυών in vivo, μεταξύ των οποίων και το mRNA του γονιδίου APP, που κωδικοποιεί για την πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς και σχετίζεται άμεσα με την νόσο Alzheimer. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε καταστολή της έκφρασής του ενζύμου APOBEC1 σε κυτταρικές σειρές του κεντρικού νευρικού συστήματος του μυός, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία RNAi. Για τον σκοπό αυτό, ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος του μυός, μολυσμένες (scN2a) και μη (N2a) με την παθολογική πρωτεΐνη PrPSc της νόσου scrapie, με μονοκλωνική προέλευση και μόνιμη καταστολή του APOBEC1, δημιουργήθηκαν με την μέθοδο της σταθερής διαμόλυνσης με πλασμιδιακό φορέα έκφρασης shRNA. Επιπλέον, με την μέθοδο παροδικής διαμόλυνσης με siRNA, επετεύχθη η παροδική καταστολή της έκφρασης του APOBEC1 στην κυτταρική σειρά μικρογλοίας του μυός, BV2. Οι προσεγγίσεις αυτές οδήγησαν στην δημιουργία in vitro μοντέλων για την μελέτη της δράσης του APOBEC1 στις νευροεκφυλιστικές νόσους και στους πληθυσμούς του κεντρικού νευρικού συστήματος του μυός γενικότερα. Τέλος πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση ενός εκτεταμένου τμήματος του 3’ UTR του APP mRNA, από φυσιολογικές κυτταρικές σειρές N2a, scN2a και BV2, σε πλασμιδιακό φορέα και συλλέχθηκαν ανεξάρτητες βακτηριακές αποικίες – κλώνοι, που η κάθε μία έφερε ένα μοναδικό μόριο του κλωνοποιημένου τμήματος του 3’ UTR. Εφαρμογή της μεθόδου Sanger sequencing έδειξε απουσία γεγονότων C-to-U RNA editing από το 3’ UTR του APP mRNA σε N2a και scN2a, ενώ αντίθετα πληθώρα θέσεων βρέθηκε για τα κύτταρα BV2. Εφαρμογή της μεθόδου ξανά, αυτή τη φορά σε εκτεταμένη περιοχή του 3’ UTR του PrP mRNA της κυτταρικής σειράς BV2, φανέρωσε 2 θέσεις με C-to-T αλλαγές. Ωστόσο η χαμηλή συχνότητα των αλλαγών αυτών επιβάλλει την πραγματοποίηση περαιτέρω πειραμάτων είτε για την επιβεβαίωση των αλλαγών ως χαμηλής συχνότητας C-to-U RNA editing είτε για την απόρριψή τους ως λάθη κατά την ανάστροφη μεταγραφή ή την ενίσχυση με PCR.
description: Prion diseases are rare and fatal neurodegenerative diseases, the full causes of which remain unknown, especially concerning the sporadic forms, while methods of early diagnosis or effective treatment of the disease are still to be found. Common features of all the neurodegenerative diseases is the abnormal processing and folding of certain proteins, that leads to the appearance of misfolded protein aggregates in the nervous system. 10 to 15% percent of the disease’s incidents are connected with genetic predisposition for the appearance of the disease. The appearance of mistakes at the RNA level is suggested as probable mechanism for the production and the aggregation of misfolded proteins, that can explain the emergence of the disease for the remaining 85% of its sporadic forms. RNA editing constitutes a relatively new mechanism of post-transcriptional modification of the RNA sequence and in mammals it is represented by the deamination of particular adenine and cytosine bases towards inosine and uracil by members of the ADARs and AID/APOBEC enzyme families, respectively. Already there are studies that correlate A-to-I RNA editing, catalyzed by the ADARs, with neurodegenerative diseases, like Amyotrophic Lateral Sclerosis. In contrast, the main representative of the AID/APOBEC family, the enzyme APOBEC1, that constitutes the first deaminase discovered for the C-to-U RNA editing that performs on the mRNA of apolipoprotein B, has not been studied at all as to its participation in neurodegenerative diseases. Recent studies, by using next generation sequencing of RNA (RNA sequencing), showed that APOBEC1 recognizes and catalyzes C-to-U RNA editing for a variety of transcripts, expressed in mouse tissues in vivo, amongst which is the mRNA of the APP gene, that codes for the amyloid precursor protein and is directly correlated with Alzheimer’s disease. In the present study, repression of the expression of the APOBEC1 enzyme was performed in mouse cell lines of the central nervous system, using RNAi technology. For this purpose, independent mouse neuroblastoma cell lines, infected (scN2a) and not (N2a) by the pathological protein PrPSc from scrapie disease, with monoclonal origin and permanent repression on APOBEC1, were created by using the method of stable transfection with a plasmid vector expressing shRNA. Furthermore, by using the method of transient transfection with siRNA, transient repression was achieved for the expression of APOBEC1 in the mouse microglia cell line, BV2. These courses of action led to the creation of in vitro models for the study of APOBEC1 in neurodegenerative diseases and in mouse cellular populations of the central nervous system in general. Finally an extended part of the 3’ UTR of APP mRNA, coming from normal cell lines N2a, scN2a and BV2, were cloned in a plasmid vector, which was used to raise and collect independent bacterial colonies – clones, each representing a unique molecule of the cloned 3’ UTR part. Applying the method of Sanger sequencing showed the absence of C-to-U RNA editing events from the 3’ UTR of APP mRNA in N2a and scN2a, while in contrast multiple positions were found in BV2 cells. Applying the method again, this time for a part of the 3’ UTR of PrP mRNA from the BV2 cell line, revealed two positions with C-to-T changes. However the low frequency of these changes demands more experiments for either the confirmation of these changes as low frequency C-to-U RNA editing events or their dismissal as mistakes that happened during the reverse transcription or the amplification with PCR. The repression of APOBEC1 expression from N2a, scN2a and BV2 cell lines as well as the appliance of Sanger sequencing in independent clones of parts coming from the 3’ UTR of different mRNAs, enables to one study the effects of the absence of APOBEC1 in vitro and provides with a method to check candidate transcripts – targets for C-to-U RNA editing events respectively.