SPHINGOLIPID SIGNALING AS A TARGET IN PHOTORECEPTOR DEGENERATION: AN IN VITRO MODEL FOR THERAPEUTIC STRATEGIES IN RETINITIS PIGMENTOSA
Creators: name: FABIANI, CARLOTTA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2014

description: Introduzione: gli Sfingolipidi sono una vasta famiglia di molecole con il duplice ruolo di componenti strutturali di membrane e mediatori intra ed extra cellulari. Sono implicati nel controllo di proliferazione, differenziazione e sopravvivenza cellulare ma anche di fenomeni legati alla morte, tra cui l?apoptosi. Ceramide (Cer), alla base degli sfingolipidi complessi, pu� andare incontro a deacilazione generando sfingosina e sfingosina-1-fosfato (S1P). Quest?ultimo � considerato un mediatore di sopravvivenza e proliferazione cellulare, in opposizione a Cer, che promuove arresto del ciclo ed apoptosi. La degenerazione retinica ed, in particolare la Retinite Pigmentosa (RP) sono associate all?accumulo di Cer ed all?induzione di morte cellulare. L?inibizione della sintesi e dell?accumulo di Cer, inattivando la serina palmitoiltransferasi (SPT) attraverso l?utilizzo di Miriocina, � stata dimostrata essere coinvolta nel recupero morfologico e funzionale dei fotorecettori retinici, in particolare dei coni, in un modello murino di RP (mutante rd10).
Scopo: Il nostro scopo � di intervenire sul metabolismo degli sfingolipidi per ridurre il danno di fotorecettori retinici, attarveso l?utilizzo di una linea cellulare di fotorecettori coni. In particolare, promuovendo l?aumento di S1P intracellulare, tramite l?inibizione dell?enzima S1P liasi, e la riduzione di Cer attraverso l?inattivazione di SPT.
Metodi: le cellule murine 661W, una linea di fotorecettori (coni), sono state trattate con 2-acetil-4(5)-(1(R),2(S),3(R),4-tetraidrobutil)-imidazolo (THI) 75�M, un inibitore dell?enzima S1Pliasi, per 2 ore; quindi, le cellule sono state sottoposte a deprivazione di siero e trattate con H2O2 1mM per differenti lassi di tempo. La curva di crescita di queste cellule � stata determinata attraverso il saggio MTT e la vitalit� con Typan blue. Il saggio TUNEL e il FRAP test sono stati impiegati per verificare, rispettivamente, il grado di apoptosi e il potere antiossidante intrinseco dei fotorecettori. I contenuti intracellulari di sfingolipidi sono stati misurati attraverso l?analisi LC-MS. La tecnica del Western blotting, attraverso l?impiego di anticorpi specifici, � stata utilizzata per valutare la fosforilazione di ERK1/2 e Akt/PKB, il rapporto tra Bcl-2/Bax e l?espressione proteica di Nrf2. Attraverso Real time-PCR, le modulazioni nell?espressione dei trascritti di HO-1 e dei recettori di S1P sono stati valutati in seguito a stress ossidativo e trattamento con THI. S1P esogeno (100nM) e Miriocina (10�M) sono stati impiegati, rispettivamente 1 ora e 5 ore prima H2O2, per antagonizzare l?effetto dello stimolo ossidativo sui fotorecettori. In fine, abbiamo esaminato 30 composti di nuova sintesi per determinare la loro capacit� inibitoria su SPT, attraverso un saggio di attivit� enzimatica.
Risultati: i nostri risultati mostrano che l?aumentata stabilit� di S1P, ottenuta tramite l?utilizzo di THI, � in grado di ridurre l?effetto inibitorio sulla proliferazione e la vitalit� cellulare, dato dalla deprivazione di siero e dal trattamento con H2O2. Il pretrattamento con THI, infatti, antagonizza la de-fosforilazione di ERK1/2 e la fosforilazione di Akt su Ser473, indotte dagli stimoli di morte utilizzati. Abbiamo, quindi, focalizzato la nostra ricerca sugli effetti dello stress ossidativo, evidenziando che THI si contrappone all?induzione dell?apopstosi tramite l?aumento del rapporto Bcl-2/Bax e influenza il potere antiossidante intrinseco dei fotorecettori modulando la via di segnale di Nrf2 e HO-1. Inoltre, THI aumenta l?espressione dei recettori di S1P, mostrando un effetto maggiore sui recettori S1P4 e S1P5. Inoltre, abbiamo osservato che basse concentrazioni di S1P migliorano la proliferazione, la vitalit� e la risposta antiossidante di cellule 661W, mentre alte concentrazioni portano alla saturazione dei recettori.Il pretrattamento con miriocina, sia da solo che in combinazione con THI, protegge i fororecettori dallo stress ossidativo e riduce drasticamente i livelli intracellulari di tutte le specie di Cer. Parallelamente, abbiamo selezionato tre composti con attivit� inbitoria su SPT, determinando i rispettivi valori di IC50 che sono risultati essere compresi tra 17,71�M e 40,41�M.
Conclusioni: possiamo quindi concludere che la stabilizzazione di S1P e, pi� in generale, l?azione sul metabolismo degli sfingolipidi � da considerarsi un target terapeutico per promuovere la sopravvivenza fotorecettoriale in differenti condizioni di stress, tra cui lo stress ossidativo.