Παραγωγή δενδριτικών κυττάρων από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα διαφορετικών πηγών προέλευσης για την ανοσοθεραπεία ιογενών λοιμώξεων και κακοηθειών.
Creators: name: Γούναρη, Ελένη Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: δενδριτικά κύτταρα
ανοσοθεραπεία
ομφάλιο αίμα
dendritic cells
immunotherapy
cord blood

description: Παραγωγή δενδριτικών κυττάρων από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα διαφορετικών πηγών προέλευσης για την ανοσοθεραπεία ιογενών λοιμώξεων και κακοηθειών. Η μοναδική ικανότητα των δενδριτικών κυττάρων (ΔΚ) να επάγουν τη δημιουργία ειδικών ανοσοαποκρίσεων από “μη έμπειρα” (naive) Τ-λεμφοκύτταρα εγείρει ερευνητικό ενδιαφέρον ώστε να αξιοποιηθούν στην κυτταρική θεραπεία λοιμώξεων σε ανοσοκατασταλμένους ασθενείς, καθώς και κακοηθειών προχωρημένου σταδίου. Ωστόσο οι εξαιρετικά πολύπλοκες και δαπανηρές μέθοδοι που εφαρμόζονται για την παραγωγή ΔΚ περιορίζουν οποιαδήποτε εφαρμογή τους και καθιστούν αναγκαία την αναζήτηση εναλλακτικών μεθόδων και πηγών. Στην παρούσα μελέτη, αναπτύξαμε μία νέα μέθοδο παραγωγής μυελοειδών-ΔΚ σε μεγάλη κλίμακα από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+) μη μεταμοσχεύσιμων μονάδων ομφαλοπλακουντιακού αίματος (umbilical cord blood units-UCBU), χρησιμοποιώντας βιοαντιδραστήρες-(G-rex) και προσδιορίσαμε τον ελάχιστο όγκο ομφάλιου αίματος που απαιτείται για την παραγωγή επαρκούς αριθμού μυελοειδών-ΔΚ για κλινική εφαρμογή. Παράλληλα τα εκπτυσσόμενα ΔΚ συγκρίθηκαν με ΔΚ προερχόμενα από διαφορετικές πηγές προέλευσης (μυελός των οστών και κινητοποιημένο περιφερικό αίμα). Τα UCB/CD34+κύτταρα μετά από ανοσομαγνητικό διαχωρισμό, καλλιεργήθηκαν παρουσία κυτοκινών (stem-cell-factor, GM-SCF και IL-4) για 10 ημέρες σε συμβατικά τρυβλία και στη συνέχεια εκπτύχθηκαν σε βιοαντιδραστήρες για 25 ημέρες. Οι καλλιέργειες αναφοράς ολοκληρώθηκαν στα τρυβλία. Η ωρίμανση των παραγόμενων ΔΚ πραγματοποιήθηκε με προσδέτες των υποδοχέων τύπου Toll (TLR-Ls) ή με ευρέως χρησιμοποιούμενα χαμηλού κόστους εμβόλια που περιέχουν TLR-Ls. Ο ανοσοφαινότυπος των ΔΚ αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής και οι εκκρινόμενες κυτοκίνες με ELISA. Η ικανότητα φαγοκυττάρωσης προσδιορίστηκε με εγκόλπωση ζυμών. Η διάμεση τιμή των ΔΚ που παρήχθησαν σε βιοαντιδραστήρες ήταν 2x109, αντανακλώντας διάμεση έκπτυξη x20.875 φορές, σε αντίθεση με την x100 φορές έκπτυξη που επιτεύχθηκε στα τρυβλία. Με την ολοκλήρωση της καλλιέργειας τα παραγόμενα ΔΚ στους βιοαντιδραστήρες εμφάνιζαν σαφείς δείκτες μυελοειδών-ΔΚ. Μετά από ωρίμανση είτε με TLR-Ls ή με εμβόλια, τα μυελοειδή-ΔΚ εμφάνιζαν δυνατότητα αυξημένης ενδοφαγοκυττάρωσης, εξέφραζαν ικανοποιητικά ποσοστά των HLA-DR, CD40, CD86, CD83 αντιγόνων και παρήγαγαν εξαιρετικά αυξημένα επίπεδα IL-12p70, TNF-α και IL-6 ενώ τα επίπεδα της IL-10 ήταν σχεδόν μηδενικά, υποδηλώνοντας ισχυρή ικανότητα Th1-απόκρισης. Χρησιμοποιώντας διαφορετικούς όγκους ομφάλιου αίματος, διαπιστώσαμε πως ο ελάχιστος απαιτούμενος όγκος για την παραγωγή μεγάλης κλίμακας μυελοειδών-ΔΚ στο συγκεκριμένο σύστημα καλλιέργειας, είναι 9ml, ποσότητα που αντιστοιχεί στο ~10% μιας μεταμοσχεύσιμης UCBU. Συνολικά, προτείνουμε μία νέα μέθοδο έκπτυξης για παραγωγή κλινικά επαρκούς αριθμού μυελοειδών-ΔΚ, προερχόμενων από UCB/CD34+κύτταρα που φέρουν τις αναγκαίες ιδιότητες για θεραπευτική χρήση ώστε να συμβάλλουν σημαντικά στην κλινική εφαρμογή της κυτταρικής ανοσοθεραπείας κακοηθειών ή/και ιογενών λοιμώξεων.
description: Dendritic cells production from hematopoietic stem cells for the immunotherapy of viral infections and tumor malignancies Dendritic cells (DCs) have received attention as a therapeutic tool for infections and immunotherapy of advanced malignancies, due to their unique ability of antigen-presentation and initiation of the T-cell-dependent immune response. However, broader application of vaccine- or antitumor specific T cell–based immunotherapy is limited by DC’s scarcity in peripheral blood and complex and costly methodology required for their production. To date, peripheral blood monocytes are the most common source for DCs generation and recently hematopoietic stem cell (CD34+)-derived DCs have also been produced. However, the accessibility to stem cell sources is limited and the number of generated DCs are barely enough for wide clinical use. The non-transplantable umbilical cord blood (UCB) units could be a readily available and promising source for large scale DC production, by offering adequate number of CD34+ cells. In the present study, we developed a new culture method for the generation of high numbers of myeloid DCs from non-transplantable UCB units by using new generation bioreactors (G-rex) and estimated the minimum required volume of a UCB unit to produce adequate number of DCs for clinical application. CD34+cells from non-transplantable UCBs were purified by immunomagnetic separation, cultured in the presence of a cytokine cocktail (SCF, GM-SCF and IL-4) for 10 days in tissue culture plates and subsequently expanded in G-rex bioreactors for 25 additional days. DCs were matured either with a combination of Toll-like receptor ligands or with commonly used vaccines containing TLR-Ls. DCs phenotype was analyzed by flow cytometry and the cytokine secretion values were measured by ELISA. The endophagocytic activity of DCs was assessed by a dead yeast engulfment assay. DCs derived from UCB CD34+ cells, were cultured in bioreactors or in conventional plates. DCs cultured in Grexes reached a median fold expansion 20.875 and a median absolute number of 2 billions, in sharp contrast to a median 100-fold increase of conventionally cultured DCs. The expanded DCs had the typical morphology and surface markers of myeloid DCs. To address whether those highly expanded DCs are functional and have the ability, upon maturation, to induce Th1 response, the cells were matured with either a cocktail of TLR-Ls or commonly used vaccines, and tested for the expression of molecules needed for antigen presentation, endophagocytic activity and cytokine production. The expanded and matured with either way DCs, expressed also HLA-DR and co-stimulatory molecules whereas they produced increased levels of IL-12p70, TNF-α and IL-6 but undetectable IL-10, thus suggesting a strong potential for Th1 response. We tested different volumes and UCB units for CD34+cell-derived DCs and showed that the minimum volume of a UCB unit that could be used for large scale DCs generation with our optimized culture system, is 9ml, corresponding to approximately 10% of the volume of a transplantable UCB unit. We established an optimized and simple culture system to expand at clinically relevant numbers, the production of human, myeloid DCs from UCB-derived CD34+ cells. These DCs have the functional properties that are necessary to obtain therapeutic gains against malignancies and viral infections.