Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικών μεθόδων για προσδιορισμό φαρμάκων και βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα
Creators: name: Μπέγου, Όλγα – Αγγελική I.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Μεταβολομική
Φασματομετρία μάζας
Βιοδείκτες
Ανάπτυξη μεθόδου
Metabolomics
Mass spectrometry
Biomarkers
Method development

description: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικών μεθόδων για την εύρεση φαρμάκων και βιοδεικτών σε βιολογικά δείγματα, μέσω της μεταβολομικής ανάλυσης. Η μεταβολομική αποτελεί ένα διεπιστημονικό πεδίο έρευνας που συνδυάζει σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές, όπως φασματομετρία μάζας, φασματοσκοπία NMR, με προηγμένα στατιστικά μοντέλα, με στόχο την ολιστική περιγραφή των ενδογενών ενώσεων που εμπεριέχονται στα διάφορα βιολογικά υποστρώματα (βιολογικά υγρά, ιστοί, τρόφιμα, κ.α.). Βρίσκει εφαρμογή σε πληθώρα επιστημών, όπως οι επιστήμες ζωής, η βιολογία, η χημεία, κ.α., ενώ παράλληλα απαιτεί τη χρήση της βιοπληροφορικής προκειμένου να αναλυθεί ο μεγάλος όγκος δεδομένων που προκύπτει. Στις επιστήμες ζωής, η μεταβολομική χρησιμοποιείται ως πολυδύναμο εργαλείο για τη διερεύνηση του μεταβολικού προφίλ στην έγκαιρη διάγνωση νόσων, στην εξατομικευμένη θεραπεία, καθώς και στην αποτελεσματικότητα φαρμάκων ή στην τοξικότητα αυτών. Οι νέοι, εξαγόμενοι βιοδείκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως περισσότερο αποτελεσματικό και λιγότερο επεμβατικό μέσο για τον σκοπό αυτό. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί, που δυσχεραίνουν την εφαρμογή της μεταβολομικής σε μεγάλης κλίμακας αναλύσεις σημαντικού αριθμού δειγμάτων. Για παράδειγμα, υπάρχοντες βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται μέχρι στιγμής για ορισμένες ασθένειες διάγνωσης και παρακολούθησης, όπως π.χ. διαταραχές του θυρεοειδούς αδένα (συγγενής υποθυρεοειδισμός), νεφρική δυσλειτουργία σε βρέφη και νεογνά με συγγενή στένωση της πυελοουρητηρικής συμβολής (ΣΠΟΥΣ) και των καρδιαγγειακών παθήσεων (CAD) χαρακτηρίζονται από χαμηλή ειδικότητα. Επίσης, πολλοί από τους μεταβολίτες και τα ένζυμα κατανέμονται ευρέως στα νεογνά, ειδικά σε εκείνα που γεννιούνται πρόωρα, δίνοντας ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Άλλοι περιορισμοί έγκεινται στη χαμηλή αναπαραγωγιμότητα της μέτρησης ή στη δυσκολία ανάλυσης συγκεκριμένων κατηγοριών ενώσεων, όπως πολύ πολικών ενώσεων ή μη πολικών (π.χ. λιπίδια). Επιπροσθέτως, σε ορισμένες περιπτώσεις η ανάλυση ενδογενών ενώσεων είναι δύσκολη λόγω της απουσίας “λευκών” υποστρωμάτων ή κάποιου Πιστοποιημένου Υλικού Αναφοράς (Certified Reference Material, CRM), ενώ πολλές φορές σημαντικό πρόβλημα αποτελεί και η μόλυνση του αναλυτικού συστήματος από τα διάφορα βιολογικά υποστρώματα, ιδίως στην περίπτωση της υγρής χρωματογραφίας, οδηγώντας έτσι σε μειωμένη αποτελεσματικότητα της μέτρησης. Επομένως, η αποτελεσματική αντιμετώπιση των παραπάνω περιορισμών, έχει μεγάλη σημασία για την εφαρμογή της μεταβολομικής στην πράξη. Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας, επικεντρώνεται στην ανάπτυξη επικυρωμένων μεθόδων μεταβολομικής, καθώς και στην καθιέρωση βιβλιοθηκών δεικτών συγκράτησης στην υγρή χρωματογραφία, με στόχο την γρήγορη, αποτελεσματική και έγκυρη ταυτοποίηση άγνωστων ενώσεων σε μη στοχευμένες αναλύσεις μεταβολομικής. Η δημιουργία τέτοιων βιβλιοθηκών θα βοηθήσει στην αντιμετώπιση των προβλημάτων που προκύπτουν από την δυσκολία εύρεσης ή ακόμα και απουσίας αναλυτικών προτύπων, επισημασμένων προτύπων, καθώς και Πιστοποιημένων Υλικών Αναφοράς. Από την άλλη πλευρά, οι επιστήμες ζωής επικεντρώνονται στην ανάπτυξη ευαίσθητων διαγνωστικών εργαλείων για την έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία διαφόρων ασθενειών με στόχο τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Για τους παραπάνω λόγους, επιστρατεύτηκαν τόσο στοχευμένες όσο και μη στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής για τον προσδιορισμό ενδογενών ενώσεων και ενός φαρμάκου σε διάφορα βιολογικά υποστρώματα. Όλα τα συλλεχθέντα βιολογικά δείγματα αναλύθηκαν με προηγμένες, “state-of-the-art” αναλυτικές πλατφόρμες, όπως είναι η αέρια και υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (GC-MS, UPLC-MS/MS, UHPLC-HRMS). Ακόμα, έγινε προσπάθεια εύρεσης του δείκτη συγκράτησης μιας πληθώρας ενδογενών ενώσεων, με σκοπό τη δημιουργία βιβλιοθήκης δεικτών συγκράτησης, η οποία θα μπορούσε να εφαρμοστεί καθολικά. Ο ακριβής προσδιορισμός του χρόνου συγκράτησης είναι πολύ σημαντικός στην επιβεβαίωση μιας άγνωστης ένωσης, ιδίως σε πολύπλοκα υποστρώματα. Συνήθως, η ταυτοποίηση μιας ένωσης βασίζεται στην απόλυτη αντιστοίχιση του χρόνου συγκράτησης και του φάσματος μαζών της άγνωστης ένωσης με μια αντίστοιχη πρότυπη ένωση. Ωστόσο, στην υγρή χρωματογραφία η διακύμανση του χρόνου συγκράτησης είναι συχνό φαινόμενο μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, οργάνων, αναλυτικών συστημάτων, κτλ., ενώ η χρήση πρότυπων ενώσεων αναφοράς δεν είναι πάντα εφικτή. Για αυτούς τους λόγους, μια πρόταση για την αντιμετώπιση του συγκεκριμένου προβλήματος, αποτελεί η δημιουργία – καθιέρωση βιβλιοθηκών δεικτών συγκράτησης καθολικού χαρακτήρα. Για το σκοπό αυτό, 95 ενδογενείς μεταβολές, συμπεριλαμβανομένων αμινοξέων, οργανικών οξέων, καρνιτινών, κ.α., καθώς και ένα υλικό αναφοράς αποτελούμενο από 20 ενώσεις μιας ομόλογης σειράς, αναλύθηκαν με μέθοδο υγρής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (RPLC-MS/MS). Ακολούθησε καταγραφή των χρόνων συγκράτησης για όλες τις ενώσεις, ενώ οι αντίστοιχοι δείκτες συγκράτησης υπολογίστηκαν με βάση την εξίσωση RI = RI0 + (RI1 - RI0) x [(RT-RT0)/(RT1-RT0)]. Παρόμοια πειραματική διαδικασία επιστρατεύτηκε και από άλλα 4 συνεργαζόμενα εργαστήρια, χρησιμοποιώντας διαφορετικές αναλυτικές πλατφόρμες, αλλά ακριβώς ίδιο αναλυτικό πρωτόκολλο, αναφορικά με την αναλυτική στήλη, την κινητή φάση, τη θερμοκρασία στήλης, τη ροή και τις πρότυπες ενώσεις. Τα δεδομένα που προέκυψαν, υπέδειξαν μια ικανοποιητική γραμμική συσχέτιση (R2&gt; 0,8899) μεταξύ όλων των εργαστηρίων, αποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο την αναπαραγωγιμότητα, την ευρωστία των αποτελεσμάτων, αλλά και την εφαρμοσιμότητα μιας καθολικής βιβλιοθήκης μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων με διαφορετική οργανολογία. Οι επόμενες δυο μελέτες αφορούσαν την ανάπτυξη μεθόδων και επικύρωση αυτών για την ανάλυση ενός φαρμάκου στα ανθρώπινα ούρα και την ανάλυση τεσσάρων κηραμιδίων στον ανθρώπινο ορό, αντίστοιχα. Αρχικά, αναπτύχθηκε μέθοδος αέριας χρωματογραφίας – φασματομετρία μάζας (NICI-GC-MS) για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ακεταζολαμίδης και άλλων σουλφοναμιδίων στα ανθρώπινα ούρα. Για πρώτη φορά γίνεται χρήση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης PFB-Br σε ήπιες συνθήκες για τον προσδιορισμό σουλφοναμιδίων. Η μέθοδος περιελάβανε μια έυκολη και γρήγορη προκατεργασία μικρού όγκου δείγματος ανθρώπινων ούρων (50 μL), παραγωγοποίηση των ενώσεων ενδιαφέροντος με 30% PFB-Br σε ACN (60 min, 30 °C), εξάτμιση μέχρι ξηρού και ανασύσταση με τολουόλιο. Ο προσδιορισμός της ακεταζολαμίδης και του αντίστοιχου εσωτερικού της προτύπου πραγματοποιήθηκε βάσει των παραγώγων R-SO2-N(PFB)2 με m/z 581 και m/z 584, αντίστοιχα. Η ακρίβεια και επαναληψιμότητα της μεθόδου κυμάνθηκε μεταξύ 95,3% - 109% και 0,3% - 4,2%, αντίστοιχα, ενώ το LOD και το LOQ ήταν 300 fmol και 1 μM, αντίστοιχα. Με την προτεινόμενη μέθοδο συν προσδιορίστηκαν τα σουλφοναμίδια μεθαζολαμίδη και δορζολαμίδη, υποδηλώνοντας ότι η χρήση του PFB-Br περιορίζεται στο μέγεθος της αλυσίδας της συγκεκριμένης κατηγορίας ενώσεων. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα ούρων ενήλικα εθελοντή, όπου πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της ακεταζολαμίδης σε διάφορα χρονικά σημεία πριν και μετά την κατανάλωση του φαρμακευτικού σκευάσματος Acemit. Η δεύτερη μέθοδος αφορούσε τον ποσοτικό προσδιορισμό τεσσάρων κηραμιδίων και συγκεκριμένα των Cer d18:1/16:0, Cer d18:1/18:0, Cer d18:1/24:0 και Cer d18:1/24:1, σε ανθρώπινο ορό με την τεχνική RPLC-MS/MS. Τα συγκεκριμένα κηραμίδια βρέθηκε ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως ο διαβήτης, οι καρδιαγγειακές παθήσεις, ο καρκίνος κ.α.. Διάφορα πρωτόκολλα προκατεργασίας δείγματος δοκιμάστηκαν για την ικανοποιητική εκχύλιση των κηραμιδίων από τον ανθρώπινο ορό, με την εκχύλιση υγρού-υγρού με διχλωρομεθάνιο:μεθανόλη, 2:1 v/v να παρουσιάζει τα βέλτιστα αποτελέσματα. Ωσττόσο, και η SLE παρουσίασε ικανοποιητικά αποτελέσματα, αναφορικά με την ακρίβεια, την επαναληψιμότητα, την ανάκτηση εκχύλισης και την επίδραση του υποστρώματος. Το τελικό πρωτόκολλο προκατεργασίας δείγματος περιελάβανε εκχύλιση των ενώσεων ενδιαφέροντος από το υπόστρωμα, εξάτμιση της οργανικής φάσης μέχρι ξηρού και την ανασύσταση στην κινητή φάση. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κηραμιδιων εξετάστηκε επίσης η χρήση υποκατάστατου υποστρώματος (surrogate matrix). Για το λόγο αυτό, 5% αλβουμίνη βόειου ορού συγκρίθηκε τόσο με μία εξωτερική καμπύλη, όσο και με αντίστοιχη καμπύλη σταθερής προσθήκης, δίνοντας ικανοποιητικά αποτελέσματα. Η μέθοδος παρουσίασε καλή γραμμικότητα για όλες τις ενώσεις (R2&gt;0,99), καθώς και ικανοποιητική ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Η ανάκτηση της εκχύλισης κυμάνθηκε από 82,2% έως 120,2% για όλα τα κηραμίδια. Και σε αυτή τη περίπτωση, η μέθοδος εφαρμόστηκε σε πραγματικά δείγματα ασθενών με κάποια καρδιαγγειακή πάθηση προκειμένου να επιβεβαιωθεί η καταλληλότητα της μεθόδου σε αναλύσεις ρουτίνας. Τα επόμενα κεφάλαια παρουσιάζουν εφαρμογές της μεταβολομικής για την εύρεση βιοδεικτών σε δύο κλινικές μελέτες που αφορούν την πληθυσμιακή ομάδα των παιδιών και νεογνών και μία διατροφική παρέμβαση σε επίμυες. Η πρώτη μελέτη επικεντρώθηκε στο μεταβολικό προφίλ αποξηραμένων κηλίδων αίματος (dried blood spots, DBS) παιδιών με συγγενή υποθυρεοειδισμό (ΣΥ). Συνολικά, 36 δείγματα παιδιών με ΣΥ και 24 δείγματα υγιών μαρτύρων, αναλύθηκαν τόσο με στοχευμένη μέθοδο υγρής χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας όσο και με μη στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση αέριας χρωματογραφίας – φασματομετρίας μάζας. Από την στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση, μόνο 14 μεταβολίτες ανιχνεύτηκαν στο συγκεκριμένο υπόστρωμα συμπεριλαμβανομένων της κρεατινίνης, του βενζοϊκού οξέος, του νικοτιναμιδίου και άλλων, πιθανώς λόγω χαμηλής ευαισθησίας. Η στατιστική ανάλυση απέτυχε να αναδείξει οποιαδήποτε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων. Από την μη στοχευμένη ανάλυση που ακολούθησε, 347 μεταβλητές εξήχθησαν με τη χρήση των λογισμικών AMDIS και GaVIn, με τις 96 από αυτές να πληρούν όλα τα αναλυτικά κριτήρια. Από τη στατιστική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, τέσσερα αμινοξέα ξεχώρισαν και συγκεκριμένα το γλουταμινικό οξύ, η γλουταμίνη, η λυσίνη και η μεθειονίνη, με τα επίπεδά τους να είναι σημαντικά χαμηλότερα στην ομάδα του ΣΥ. Τα εξαγόμενα αποτελέσματα, έρχονται σε συμφωνία με τη διεθνή βιβλιογραφία, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι τα αμινοξέα είναι βασικές ενώσεις που σχετίζονται άμεσα με την κατάσταση του θυρεοειδούς αδένα. Η επόμενη μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάλυση συγκεκριμένου πάνελ μεταβολιτών, προκειμένου να βρεθούν τυχόν διαφορές μεταξύ του μεταβολικού προφίλ ορού και ούρων παιδιών και βρεφών με σοβαρή ή ήπια στένωση της πυελοουρητηρικής συμβολής (ΣΠΟΥΣ) συγκριτικά με υγιείς μάρτυρες. Δύο στοχευμένες μελέτες μεταβολομικής και συγκεκριμένα μία HILIC-MS/MS για τον προσδιορισμό 100 πολικών ενδογενών ενώσεων και μία GC-MS για την ανάλυση αμινοξέων και παραγώγων, καθώς και για τον προσδιορισμό του νιτρώδους, του νιτρικού και της μαλονδιαλδεΰδης, επιστρατεύτηκαν. Τόσο η μονοπαραμετρική όσο και η πολυπαραμετρική στατιστική ανάλυση ξεχώρισε ένα πλήθος σημαντικών μεταβολιτών που διαφοροποιήθηκαν σημαντικά μεταξύ των δυο ομάδων. Μεταξύ των μεταβολιτών αυτών είναι η ομοκυστεΐνη, η χολίνη, η ισολευκίνη, η ομοαργινίνη, η μαλονδιαλδεΰδη και η ασύμμετρη διμεθυλαργινίνη στον ορό και το γλουταμινικό οξύ, ξανθίνη και η υποξανθίνη στα ούρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ένα πάνελ συγκεκριμένων μεταβολιτών μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην καθημερινή κλινική πράξη για την έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση και πρόγνωση της νόσου. Στο τελευταίο κεφάλαιο, αξιολογήθηκε η επίδραση του χαρουπιού στην καθημερινή δίαιτα επίμυων. Το χαρούπι θεωρείται υψηλής θρεπτικής αξίας τρόφιμο, καθώς είναι πλούσιο σε βιταμίνες, τανίνες και θρεπτικά συστατικά. Οι ευεργετικές επιδράσεις του χαρουπιού κατά του καρκίνου, του μεταβολικού συνδρόμου, του διαβήτη, της διάρροιας, της υπερλιπιδαιμίας και της γαστροοισοφαγικής παλινδρόμησης είναι μόνο μερικές από τις θεραπευτικές του δράσεις. Για το σκοπό αυτό, 8 αρσενικοί επίμυες τύπου Wistar τράφηκαν με σκόνη χαρουπιού για 15 συνεχόμενες ημέρες και συγκρίθηκαν με αντίστοιχη ομάδα επίμυων που δεν τράφηκε με χαρουπί. Δείγματα κοπράνων και ούρων συλλέχθηκαν σε 5 χρονικά σημεία (0, 1, 5, 10 και 15 ημέρες) και αναλύθηκαν τόσο με τη μέθοδο HILIC-MS/MS όσο και με τη μέθοδο RPLC-HRMS. Βάσει της στοχευμένης μεταβολομικής μελέτης, παρατηρήθηκε σαφής διαχωρισμός μεταξύ των δύο ομάδων την πρώτη και δέκατη πέμπτη ημέρα στα κόπρανα, ενώ ήπιες διαφορές παρατηρήθηκαν την πρώτη ημέρα στο υπόστρωμα των ούρων. Είκοσι ένας μεταβολίτες διαφοροποιήθηκαν στο υπόστρωμα των κοπράνων, συμπεριλαμβανομένων των αμινοξέων και των παραγώγων τους, των βιταμινών και των οργανικών οξέων, ενώ 7 μεταβολίτες βρέθηκαν να μεταβάλλονται σημαντικά στα δείγματα των ούρων. Από τη μη στοχευμένη προσέγγιση, σαφής διαχωρισμός μεταξύ των εξεταζόμενων ομάδων, παρατηρήθηκε στα κόπρανα τη 15η ημέρα. Είκοσι ένα μεταβλητές ξεχώρισαν στον θετικό ιονισμό, από τις οποίες ταυτοποιήθηκαν η φαινυλαλανίνη και το δωδεκανοδιοϊκό οξύ. Μεταβολές στο μεταβολικό ποφίλ των κοπράνων θα μπορούσαν ίσως να αποδοθούν σε βιοχημικές προσαρμογές που αντανακλούν τη διατροφική παρέμβαση.
description: The objective of this thesis is the development and validation of analytical methods for the identification of biomarkers and drugs in biological samples through metabolomics-based approaches. Metabolomics constitutes an interdisciplinary field that combines modern instrumental analytical techniques (mass spectrometry, NMR spectroscopy) with advanced statistical modeling, aiming in the holistic profiling of metabolites that are present in a biological system. Metabolomics-based studies are applied in various scientific fields, such as life sciences, biology, chemistry, requiring the use of bioinformatics in order to statistically analyze large amounts of analytical data. In life sciences metabolomics is used as a useful tool for the investigation of the potential of metabolomic profiling in early disease diagnosis, personalized therapy or drugs efficacy and toxicity. Metabolomics may provide new biomarkers at molecular level that can be used as a more efficient, less invasive means for these purposes. However, despite the great applicability of such studies, significant limitations still occur, not allowing the implementation on large-scale analysis of large number of samples. For example, existing biomarkers used so far for some diseases for diagnosis and monitoring, such as e.g. disorders of neonatal thyroid gland (Congenital Hypothyroidism), renal impairment in infants and neonates with congenital narrowing of the pyelonephritis contribution (UPJO) and cardiovascular disease (CAD) are characterized by low specificity. Also, many of the metabolites and enzymes are widely distributed in neonates, especially in those born prematurely, giving false-negative results. Other limitations are focused on low analytical reproducibility of measurement or in the difficulty of analyzing specific categories of compounds, such as highly polar compounds or non-polar ones (e.g. lipids). Moreover, in some cases analysis of endogenous compounds is difficult due to the absence of analyte-free matrices, or of Certified Reference Material (CRM). Another problem is system contamination of biological matrices, especially in liquid chromatography that results in reduced efficiency of analysis. Therefore, the revocation of the above restrictions is of great importance in order to use metabolomics into final practices. Nowadays, scientific interest focuses in the establishment of validated metabolomics – based studies, as well as in the establishment of retention index libraries in LC, that will allow the rapid, effective and valid identification of unknown compounds in untargeted analyses. Retention index libraries will help overcoming the problems occurring from analytical standards, isotope-labeled standards or CRM absence. On the other hand, life sciences focus in the development of sensitive diagnostic tools for early diagnosis and treatment of various diseases, improving patients’ life. Thus, both targeted and untargeted approaches were conscripted for the determination of endogenous compounds and a drug in biological matrices. The collected biological samples were analyzed with state-of-the-art analytical techniques, as gas and liquid chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS, UPLC-MS/MS, UHPLC-HRMS). Also, an attempt was made to calculate the retention index of a large number of endogenous compounds, in order to establish a universally applicable retention index library. Accurate determination of retention time is very important in confirming the detection of analytes, especially in complex matrices. Usually, the identification of a compound is based on the absolute match of the retention time and spectrum of the unknown compound to a standard reference. In liquid chromatography, variation in retention time is very common between different laboratories, instrumentation, chromatographic systems, etc., and the solution of using reference standards is not always feasible. Thus, an idea of overcoming this problem, is the establishment of universal retention index libraries. For this purpose, 95 endogenous metabolites, including amino acids, organic acids, carnitines, etc., and a reference material containing 20 homologous compounds (1-alkylpyrinium-3-sulfonate, APS) were analyzed using a RPLC-MS/MS method. Retention times for all analytes were recorded, and their respective retention indices were calculated based on the equation RI=RI0 + (RI1 – RI0) x [(RT-RT0)/ (RT1-RT0)]. A similar experimental procedure took place in 4 collaborating laboratories, using different instrumentation but exactly the same protocol of analysis regarding analytical column, mobile phases, column temperature and standards. Obtained data showed a linear correlation of R2&gt; 0.8899 for all laboratories, proving results’ reproducibility and robustness despite different instrumentation but also demonstrating the applicability of a universal library among different laboratories. The next two studies were related to method development and validation of the analysis of drug in human urine and the analysis of four ceramides in human serum, respectively. Firstly, a NICI-GC-MS method was developed for the absolute quantification of acetazolamide and other sulfonamides in human urine. It was the first study, where sulfonamides derivatization with PFB-Br in mild conditions was reported. The method was based on an easy and quick sample preparation procedure including the evaporation of a small urine volume (50 μL), derivatization of sulfonamides and internal standard with 30% PFB-Br in ACN (60 min, 30 °C), evaporation and reconstitution with toluene. Quantification of acetazolamide and its respective internal standard was performed using the R-SO2-N (PFB)2 derivatives with m/z 581 and m/z 584, respectively. Method accuracy and precision were between 95.3% - 109% and 0.3% - 4.2%, respectively, while LOD and LOQ were 300 fmol and 1 μM, respectively. Regarding the other sulfonamides tested, only metazolamide and dorozolamide gave similar derivatives using PFB-Br, suggesting that the use of PFB-Br is limited to the size of the chain of this particular compound class. The developed and validated method was applied to real urine samples of an adult volunteer for the quantification of acetazolamide at different time points, after drug Acemit consumption. The second method was on the quantification of four specific ceramides, namely Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), Cer(d18:1/24:0), and Cer(d18:1/24:1), in human serum with a RPLC-MS/MS method. These specific ceramides were found to play an important key-role to various disease states, such as diabetes, cardiovascular diseases, cancer, etc. Different sample preparation methodologies were tested for accurate and efficient extraction of ceramides from human plasma, with liquid-liquid extraction using dichloromethane: methanol, 2:1 v/v being selected. Supported liquid extraction also presented satisfactory results, regarding accuracy, precision, extraction recovery and matrix effect. Final sample preparation protocol included extraction of the compounds of interest into organic phase, evaporation to dryness and reconstitution in the mobile phase. For the quantification of the endogenous compounds the use of surrogate matrix was also tested. As such five % of bovine serum albumin was compared to both an external and a standard addition curves, providing satisfactory results. The proposed method showed good linearity for all compounds (R2&gt;0.99), as well as satisfactory accuracy and precision. Extraction recovery ranged between 82.2% to 120.2% for all ceramides. The developed method was then applied to real serum samples of CAD patients, in order to confirm method’s suitability into clinical practice. The followed three chapters were related to the application of metabolomics-based studies for biomarkers discovery into two clinical studies in human cohorts and one nutritional intervention in animals. The first study focused in the metabolic profiling of dried blood spots (DBS) of infants with congenital hypothyroidism. In total, 36 sampled of infants with CH and 24 samples of healthy matched controls, were analysed with both an untargeted gas chromatography-mass spectrometry method and a targeted liquid chromatography tandem mass spectrometry method. From the target analysis only 14 metabolites were detected in DBS, including creatinine, benzoic acid, nicotinamide and others, probably due to low sensitivity. Statistical analysis failed to highlight any statistically significant difference between the tested cohorts. Thus, untargeted GC-MS analysis was performed. Three hundred and forty-seven features were detected and identified using AMDIS and GaVIn software, with 96 of them passing all analytical criteria set. Univariate statistical analysis performed highlighted four amino acids, namely glutamate, glutamine, lysine and methionine to significant up-regulated or down-regulated in hypothyroidism group. The results are in agreement with the literature, confirming the fact that amino acids are key-compounds directly related to the thyroid gland state. The next study targeted in the analysis of a specific class of compounds, in order to distinguish the metabolic profile of serum and urine of infants with severe or mild ureteropelvic junction obstruction (UPJO) compared to healthy matched controls. Two targeted methodologies were applied using HILIC-MS/MS for the determination of 100 polar endogenous compounds and GC-MS for the analysis of amino acids and derivatives, as well as for nitrite, nitrate and malondialdehyde. Both univariate and multivariate statistical analyses highlighted a panel of metabolites significantly altered between the groups tested. From the differentiated metabolites great importance is given in homocysteine, choline, isoleucine, homoarginine, malondialdehyde and asymmetric dimethylarginine in serum and in glutamic acid, xanthine and hypoxanthine in urine. The results indicate that a panel of validated metabolites can be used in clinical practice for early and accurate diagnosis and prognosis of the disease. In the final chapter two metabolomics-based methodologies were applied for the evaluation of the nutritional effects of carob in everyday diet. Carob is considered to be of highly nutritional value, as it is rich in vitamins, tannins and nutrients. The beneficial effects of carob against cancer, metabolic syndrome, diabetes, diarrhea, hyperlipidemia and gastro esophageal reflux disease are only a few of its therapeutic actions. For this reason, 8 male Wistar rats were treated with carob powder for a 15-day period and compared to 8 non-treated rats. Fecal and urine samples were collected at 5 time points (0, 1, 5, 10 and 15 days) and were analysed with both HILIC-MS/MS method and RP LC-HRMS method. Based on the targeted approach a clear group separation was observed after day one and day fifteen on fecal metabolome, while a mild one was observed on day one on urine metabolome. Twenty-one fecal metabolites were differentiated, including amino acids and their derivatives, vitamins and organic acids, and 7 metabolites were found to be altered in rat urine samples. On the other hand, untargeted approach was able to separate the two groups based on fecal metabolome at day fifteen. Twenty-one features were altered in positive ionization mode, among which phenylalanine and dodecanedioic acid were identified. Metabolic alterations in fecal samples could be attributed to physiological and biochemical adaptations derived from the nutritional intervention. Fecal targeted metabolomics were proven to be suitable for highlighting such alterations.