title: Konditionale Degrons zur Untersuchung von Genfunktionen während der Gametogenese und Proliferation von Saccharomyces cerevisiae
title: Conditional Degrons to Study Gene Functions During Saccharomyces cerevisiae Gametogenesis and Proliferation
Creators: name: Renicke, Christian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Mitotic Exit Network
Saccharomyces cerevisiae
Meiose
Sporenbildung , Signaltransduktion
Spindle Polarity
Biowissenschaften , Synthetische Biologie
TEV Protease
LOV2
Cytologie , Proteolyse
Genetik
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Conditional Degrons

description: Diploide Saccharomyces cerevisiae
      Zellen können Sporen bilden, um Mangelbedingungen zu
      überdauern. Sporulation bezeichnet eine Zelldifferenzierung,
      bei der Meiose und Sporenbildung verknüpft sind. Eingeleitet
      wird die Sporenbildung beim Übergang in Meiose II an den
      Spindelpolkörpern, den Zentrosomenäquivalenten der Hefe.
      Eingebettet in die Kernmembran werden diese während der
      Meiose zweimal durch einen vorwiegend konservativen
      Mechanismus verdoppelt. Daraus resultieren drei Generationen
      von Spindelpolkörpern in Meiose II: Der erste stammt aus dem
      vorangegangenen Zellzyklus, der zweite wird während der
      meiotischen Prophase gebildet und die dritte Generation
      entsteht vor Eintritt in die zweite meiotische Teilung. Zu
      Beginn der Meiose II formen sich an den zytoplasmatischen
      Plaques der Spindelpolkörper die sogenannten meiotischen
      Platten. Diese ermöglichen die Bildung der
      Prosporenmembranen, welche um die Ausstülpungen des Kerns
      herum wachsen und sich nach Zusammenbruch der Meiose
      II-Spindeln schließen. Die Sporenwand wird anschließend im
      Lumen der entstandenen Doppelmembran aufgebaut. Zuletzt
      kollabiert die Mutterzelle um die Sporen und formt den Ascus.
      Hefezellen sind in der Lage entsprechend der
      Nahrungsbedingungen Asci mit weniger als vier Sporen zu
      bilden indem sie weniger Proteine der meiotischen Platten
      produzieren. Ermöglicht wird diese Regulation durch die
      Polarität der Meiose II-Spindeln, durch welche meiotische
      Platten bevorzugt an den jüngeren Spindelpolkörpern geformt
      werden. Dieser Prozess stellt sicher, dass Asci mit nur zwei
      Sporen keine Schwesterchromatiden enthalten und trägt damit
      entscheidend zur Aufrechterhaltung der genetischen Vielfalt
      und Überlebensfähigkeit einer Population bei. Dennoch ist
      wenig über den zugrundeliegenden Mechanismus bekannt. In
      dieser Arbeit habe ich verschiedene synthetische Methoden
      entwickelt, um den Einfluss des „Mitotic Exit Networks“ (MEN)
      auf meiotische Spindelpolarität und Sporenzahlkontrolle zu
      erforschen. Das MEN ist ein konservierter
      Signaltransduktionsweg, der essentielle Funktionen während
      des vegetativen Wachstums erfüllt indem er die Aufteilung des
      Genoms mit der Zytokinese koordiniert. Außerdem kontrolliert
      er die Ausbildung der mitotischen Spindelpolarität während
      der Metaphase. Die Funktionen des MEN in der Meiose sind
      weitgehend unbekannt, da es an verlässlichen Methoden zur
      Herstellung von sporulationsspezifischen Mutanten mangelte,
      die nötig gewesen wären, um die für den Zellzyklus
      essentiellen Komponenten des MEN zu untersuchen. Zur Lösung
      dieses Problems habe ich zwei verschiedene Ansätze zur
      Kontrolle der Proteinmengen durch konditionale
      Degradationssequenzen (Degrons) gewählt. Erstens wurde ein
      photosensitives Degron etabliert, welches auf der Fusion
      eines synthetischen C-terminalen Degrons an die LOV2
      Photosensor-Domäne des Phototropin 1 aus Arabidopsis thaliana
      basiert. Im Dunkeln ist das Degron maskiert während
      konformationelle Änderungen der LOV2-Domäne unter Blaulicht
      zur Aktivierung des Degrons und Abbau des markierten
      Zielproteins führen. Zweitens wurde ein bestehendes System
      zur Protein-Destabilisierung weiterentwickelt, welches die
      Tabak-Ätz-Virus-Protease verwendet, um ein geschütztes Degron
      zu aktivieren. In vorangegangenen Arbeiten ermöglichte die
      Regulation der Biosynthese dieser Protease durch einen
      meiosespezifischen Promotor die Aufklärung von
      Proteinfunktionen während der Sporulation. Zur Entwicklung
      eines effizienteren Systems habe ich zwei parallele
      Strategien verfolgt: Durch gerichtete Evolution wurde eine
      Variante der Protease erzeugt, welche durch eine verringerte
      Substratspezifität die Verwendung potenterer Degrons zulässt.
      Davon unabhängig habe ich eine meiosespezifische
      Deaktivierung der Zielgenexpression kombiniert mit einer
      Steigerung der Proteaseproduktion während der Sporulation.
      Dieser Ansatz konnte erfolgreich genutzt werden, um
      meiosespezifische Mutanten aller wesentlichen Komponenten des
      MEN zu erzeugen. So konnte gezeigt werden, dass dieser
      Signalweg die altersabhängige Entscheidung beeinflusst, an
      welchen Spindelpolkörpern meiotische Platten gebildet werden.
      Außerdem fand ich eine funktionelle Diversifizierung der MEN
      Komponenten während der Sporulation. Die vorgelagerte Kinase
      Cdc15 trägt zur Regulation der Anzahl von meiotischen Platten
      und der Schließung der Prosporenmembranen bei. Für die
      Spindelpolkörper-Auswahl zu Beginn der Meiose II sind sowohl
      Cdc15 als auch die nachgelagerten Komplexe aus Dbf2 bzw.
      Dbf20 und Mob1 notwendig. Nach den meiotischen Teilungen
      werden diese Komplexe für den Aufbau der Sporenwände und
      damit eine zuverlässige Weitergabe der haploiden Genome
      benötigt. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse eine
      entwicklungsspezifische Plastizität des MEN: Das
      Signalnetzwerk wird nicht für das Durchlaufen der meiotischen
      Teilungen benötigt, verschiedene Komponenten wirken aber
      während bestimmter Schritte in der Sporenbildung und sichern
      so die erfolgreiche Weitergabe des Erbguts.
description: Diploid cells of Saccharomyces
      cerevisiae can form stable spores to ensure survival under
      poor nutritional conditions. Sporulation is a coupled
      developmental program of meiotic divisions and spore
      formation. The latter process is initiated at onset of
      meiosis II at the spindle pole bodies (SPBs), the yeast
      centrosome equivalents. The SPBs are embedded in the nuclear
      envelope and duplicate twice during meiosis in a mostly
      conservative fashion. Thus, three generations of SPBs are
      present in meiosis II. The first SPB inherited from mitosis,
      the second formed in meiotic pro-phase and the two youngest
      SPBs generated prior to meiosis II. At the onset of meiosis
      II the cytoplasmic faces of the SPBs are modified by meiotic
      plaques. They serve as nucleation platform for the prospore
      membranes, which grow around the nuclear lobes and close
      after meiosis II spindle breakdown. The spore wall is then
      formed in the lumen of the double-layered prospore membrane.
      Finally, the former mother cell collapses and forms the
      spore-containing ascus. Cells are able to adjust the spore
      numbers according to the available nutrients by reducing
      meiotic plaque protein levels to generate asci with less than
      four spores. This regulation is facilitated by meiosis II
      spindle polarity, which directs meiotic plaque formation
      towards the younger SPBs. Yet, the underlying mechanisms are
      poorly understood, although this process significantly
      contributes to preservation of genetic variability and
      population fitness by ensuring encapsulation of non-sister
      chromosomes in asci with only two spores. Here, I developed
      different synthetic tools to study the role of the mitotic
      exit network (MEN) in meiotic spindle polarity and spore
      number control of S. cerevisiae. The MEN is a conserved
      signaling cascade essential for vegetative growth. It
      coordinates mitotic exit with genome segregation and
      cytokinesis and establishes mitotic spindly polarity in
      metaphase. However, the meiotic functions of this network are
      mainly unknown due to the lack of reliable methods for
      creation of meiosis-specific mutants of the mainly essential
      proteins of the MEN. To overcome this obstacle, I pursued two
      different approaches to control the abundance of a protein
      with sequences inducing conditional degradation (degrons). 1.
      I established a photo-sensitive degron module which combines
      the LOV2 photoreceptor domain of Arabidopsis thaliana
      phototropin 1 attached to a synthetic C-terminal degron. In
      the dark, this degron is sterically inaccessible. Upon
      blue-light illumination, structural rearrangements of the
      LOV2 domain lead to activation of the degron and degradation
      of the target protein it is fused to. 2. I improved an
      established system for protein destabilization, which employs
      tobacco etch virus (TEV) protease to activate a cryptic
      degron. Control of protease production by a meiosis-specific
      promoter has been used previously to study protein functions
      during sporulation. To develop a more efficient system, I
      followed two strategies in parallel: by directed evolution, I
      created a TEV protease variant with a higher substrate
      tolerance, allowing usage of stronger degrons. Independently,
      I combined transcriptional shut-off of the target gene upon
      initiation of meiosis with elevated protease levels during
      sporulation. The latter approach was used successfully to
      create meiosis-specific mutants of all core MEN components. I
      could demonstrate a role of the MEN in age-based selection of
      SPBs for meiotic plaque modification. Moreover, I found
      functional diversification of MEN components during
      sporulation. The upstream kinase Cdc15 is involved in
      regulation of meiotic plaque numbers and prospore membrane
      closure, while Cdc15 and the downstream kinase complexes
      consisting of Dbf2/20-Mob1 are all necessary for SPB
      selection at the onset of meiosis II. After the meiotic
      divisions, efficient genome inheritance requires Dbf2/20-Mob1
      during subsequent spore wall formation. Together, these data
      reveal a developmental-specific plasticity of the signaling
      network. In contrast to mitosis, execution of meiosis does
      not require the MEN but faithful genome inheritance requires
      concerted action of different MEN components at distinct
      steps of spore formation.