Ενίσχυση και βιοπληροφορική ανάλυση του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4
Creators: name: Τσεκούρα, Χριστίνα Κοσμά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2007
Subjects: Πυρηνικός υποδοχέας
Μεταγραφικός παράγοντας
Ηπατοειδικός Πύρηνικός παράγοντας
Υποξία
Nuclear receptor
Transcription factor
Hepatocyte Nuclear Factor
Hypoxia

description: Οι πυρηνικοί υποδοχείς είναι επαγώγιμοι μεταγραφικοί παράγοντες, η δράση των οποίων εξαρτάται από κάποιο μόριο-συνδέτη. Ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται σε σημαντικές λειτουργίες των οργανισμών, όπως είναι η ομοιόσταση, η ανάπτυξη, η διαφοροποίηση, η αναπαραγωγή και ο μεταβολισμός. Στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων ανήκει ο Ηπατοειδικός Πυρηνικός Παράγοντας-4 (Hepatocyte Nuclear Factor-4, ΗΝF-4), ένας πυρηνικός υποδοχέας για τον οποίο αναγνωρίστηκαν ως συνδέτες ενδογενή λιπαρά οξέα. Ο ΗΝF-4 συνδέεται στο DΝΑ των γονιδίων-στόχων μόνο ως ομοδιμερές και εντοπίζεται αποκλειστικά μέσα στον πυρήνα. Αποτελείται από 5 διακριτές περιοχές με συγκεκριμένο λειτουργικό ρόλο, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως Α/Β, C, D, E και F. Η περιοχή C αποτελεί την περιοχή σύνδεσης στο DNA των γονιδίων-στόχων, ενώ η περιοχή Ε αντιπροσωπεύει την περιοχή πρόσδεσης του συνδέτη. Ανάμεσα στις περιοχές C και Ε βρίσκεται η περιοχή D που αποτελεί έναν ευέλικτο σύνδεσμο. Στις περιοχές Α/Β και Ε εντοπίζονται δύο περιοχές ενεργοποίησης, οι ΑF-1 και ΑF-2, οι οποίες ευθύνονται για την ενεργοποίηση της μεταγραφής στα κύτταρα απουσία ή παρουσία συνδέτη, αντίστοιχα. Όσον αφορά την περιοχή F, αυτή δρα κατασταλτικά στην ενεργοποίηση του HNF-4 που προκύπτει από την AF-2 περιοχή. Οι πιο συντηρημένες περιοχές μεταξύ των διαφορετικών οργανισμών είναι οι περιοχές C και D, ακολουθεί η περιοχή Ε, ενώ οι περιοχές Α/Β και F εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία.Ο HNF-4 παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυονικά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Ρυθμίζει την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια, όπως γονίδια των οποίων τα προϊόντα παίρνουν μέρος στο μεταβολισμό των αμινοξέων, των λιπιδίων και της γλυκόζης. Παράλληλα, επάγει την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν τη μεταγραφή των ηπατοειδικών γονιδίων. Έτσι, κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων, ενώ ταυτόχρονα ευθύνεται για τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο ήπαρ και για τη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου.Κρίσιμος είναι ο ρόλος του και στη γαστριδιοποίηση, δεδομένου ότι σε ποντίκια στα οποία τα αλληλόμορφα του γονιδίου του HNF-4 δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα η γαστριδιοποίηση αρχίζει, αλλά αποτυγχάνει να συνεχίσει περαιτέρω, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξής τους. Στη συγκεκριμένη εργασία, έγινε μελέτη του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4 στο είδος Mytilus galloprovincialis. Πρόκειται για ένα είδος μυδιού που εμφανίζει μεγάλη αναπαραγωγικότητα, μεγάλη αντίσταση στα παράσιτα και αυξημένους ρυθμούς ανάπτυξης σε νερά με υψηλές θερμοκρασίες και υψηλή αλατότητα. Μάλιστα, δεδομένου ότι έχει την ικανότητα να διηθεί τεράστιες ποσότητες νερού, είναι πολύ ευαίσθητο στη ρύπανση που προκαλείται από χημικές ενώσεις ή από μικροοργανισμούς και για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται ως βιομάρτυρας της ποιότητας των υδάτων. Συχνά, εκτίθεται σε συνθήκες υποξίας, στις οποίες έχει την ικανότητα να αποκρίνεται ο HNF-4 και να επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της ερυθροποιητίνης.Προκειμένου να ενισχυθεί το γονίδιο του HNF-4 από το M. galloprovincialis, σχεδιάστηκαν 11 εκκινητές. Με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης ενισχύθηκαν επικαλυπτόμενες ακολουθίες που αντιπροσωπεύουν τμήμα του γονιδίου του πυρηνικού υποδοχέα HNF-4, το οποίο κωδικοποιεί την αμινοξική ακολουθία που εκτείνεται από την αρχή της περιοχής σύνδεσης στο DNA ως το τέλος της περιοχής πρόσδεσης του συνδέτη. Οι ακολουθίες αυτές συγκροτούν μια νουκλεοτιδική ακολουθία μεγέθους 3136 ζευγών βάσεων, η οποία περιλαμβάνει 5 εξόνια και 4 ιντρόνια. Η κωδικοποιούσα περιοχή αντιπροσωπεύεται από 936 ζεύγη βάσεων, από τη μετάφραση των οποίων προκύπτουν 312 αμινοξέα. Τόσο η νουκλεοτιδική όσο και η αμινοξική ακολουθία κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων EMBL. Πρόκειται για την πρώτη γονιδιωματική ακολουθία του HNF-4 που έχει απομονωθεί όχι μόνο από το M. galloprovincialis, αλλά και γενικότερα από όλα τα μαλάκια.
description: Hepatocyte Nuclear Factor-4 (HNF-4), a member of the nuclear receptor superfamily, is constitutively active without the addition of exogenously added ligand. HNF_4 regulates the transcriptions of a large number of genes involved in diverse metabolic pathways and developmental processes, such as embryo gastrulation and determintation of hepatic phonotype. Like other nuclear receptors HNF-4, exhibits a modular structure with 5 distinct region (AVB, C, D, E and F), which correspond to functional domains. In the present study we have amplified a fragment of the HNF-4 gene from Mytilus galloprovincialis, the most common mussel species in the Mediterranean Sea. Exposure to intermittent severe hypoxia, in which HNF-4 becomes active and regulates the transcription of erythropoietis gene, can be frequent occurence for M. galloprovincialis. The fragment amplified consists of 3136 base pairs and contains 5 exons (with a total length of 936 base pairs) interrupted by 4 introns (2200 base pairs in total). The predided aminoacid sequence encoded by this fragment consists of 312 aminoacids that correspond to regions C, D, and E of HNF-4. The nucleotide and aminoacid sequences were submitted to the EMBL database. This is the first HNF-4 genomic sequence characterized not only in M. galloprovincialis but also in the molluscophylum