Ο ρόλος των ριβοενζύμων στην αποδόμηση του παθολογικού mRNA κολλαγόνου τύπου Ι στην ατελή οστεογένεση: πειραματική μελέτη
Creators: name: Λαδά, Ζωή Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: COL1A1
COL1A2

description: Ο σκοπός της εργασίας μας ήταν να μελετηθούν τα χαρακτηριστικά της δράσης των ριβοενζύμων in vitro και in cellulo και να δημιουργηθεί ριβοένζυμο, που είναι πιο σταθερό ενδοκυττάρια και επομένως πιο αποτελεσματικό. Το μοντέλο της εργασίας ήταν η ατελής οστεογένεση, η οποία είναι μονογονιδιακή, συστηματική νόσος του συνδετικού ιστού και αφορά το κολλαγόνο τύπου Ι. Τα COL1A1 και COL1A2 είναι τα δύο γονίδια που κωδικοποιούν το κολλαγόνο τύπου Ι και η πλειοψηφία των ασθενών με ατελή οστεογένεση έχει μεταλλάξεις στα δύο αυτά γονίδια. Δημιουργήθηκε στόχος με βάση το COL1A1 και τρεις σημειακές μεταλλάξεις στο στόχο αυτό με σκοπό να πλησιάσουμε τις μεταλλάξεις που υπάρχουν πραγματικά στην ατελή οστεογένεση. Στη συνέχεια δημιουργήθηκαν τα ριβοένζυμα που στοχεύουν τις τρεις μεταλλάξεις. Δημιουργήθηκαν επίσης πολυμερή ριβοενζύμων, που έχουν τη δυνατότητα να αυτοκαταλύονται σε μονομερή και να καταλύουν το στόχο. Πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμασίες in vitro σε διαφορετικές θερμοκρασίες και μοριακές αναλογίες. Έπειτα δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές που περιέχουν το στόχο και κάποιο από τα ριβοένζυμα. Δημιουργήθηκε ακόμη ένα τροποποιημένο πολυμερές το οποίο καταλύει το στόχο, χωρίς να αυτοκαταλύεται σε μονομερή. Επομένως διατηρεί το μεγάλο του μέγεθος και ενδεχομένως να είναι πιο σταθερό όσο αφορά την καταστροφή του από ριβονουκλεάσες του κυττάρου και πιο αποτελεσματικό στην αποδόμηση του στόχου. Έγιναν δοκιμασίες για τη μελέτη του χρόνου ημίσειας ζωής των ριβοενζύμων και δοκιμασίες υπολογισμού της αποδόμησης του στόχου ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα in vitro πειράματά μας έδειξαν ότι τα ριβοένζυμα επιτυγχάνουν απολύτως εξειδικευμένη αποδόμηση του στόχου τους, ο οποίος διαφέρει από το φυσιολογικό κατά μία μόνο βάση. Τα ομοπολυμερή (πολυμερή ενός ριβοενζύμου) και τα ετεροπολυμερή (πολυμερή διαφορετικών ριβοενζύμων) διατηρούν την εξειδίκευση της κατάλυσης, όπως ακριβώς τα μονο-ριβοένζυμα, ενώ συγχρόνως εμφανίζουν αυξημένη καταλυτική δράση. Στις in vitro δοκιμασίες φάνηκε πράγματι ότι το ετεροπολυμερές ήταν πιο αποτελεσματικό από τα ομοπολυμερή και από τα αντίστοιχα μονο-ριβοένζυμα στην κατάλυση του στόχου με τις τρεις μεταλλάξεις. Τα δεδομένα αυτά είναι ενθαρρυντικά για τη χρησιμοποίηση ετεροπολυμερών σε συστήματα με πολλαπλούς στόχους, όπως ο ΗΙV ή άλλοι ιοί. Οποιαδήποτε αντι-ιική στρατηγική που θα βασιζόταν σε ένα μόνο ριβοένζυμο, θα ήταν από την αρχή καταδικασμένη σε αποτυχία, αφού είναι γνωστό πως οι ιοί μεταλλάσσονται συνεχώς. Τα ετεροπολυμερή θα εξασφάλιζαν πιο παρατεταμένη αποτελεσματικότητα. Επίσης σε μονογονιδιακές νόσους όπως η ατελής οστεογένεση, κάποιες μεταλλάξεις είναι πιο συχνές. Θα μπορούσαν λοιπόν ετεροπολυμερή που στοχεύουν αυτές τις συχνές μεταλλάξεις, να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικοί παράγοντες σε μεγάλο αριθμό ασθενών. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια να σχεδιασθούν ριβοένζυμα με μεγαλύτερη ενδοκυττάρια σταθερότητα και αποτελεσματικότητα. Έχουν τροποποιηθεί χημικά και έχουν μελετηθεί διαφορετικές δομές τους, ώστε να επιτευχθεί μεγαλύτερη αντοχή στην καταστροφή από νουκλεάσες και βελτίωση της καταλυτικής δράσης τους. Έτσι στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε όπως αναφέρθηκε, η κατασκευή ενός πολυμερούς που διατηρεί μεγαλύτερο μέγεθος. Στις in vivo δοκιμασίες έγινε φανερό ότι το τροποποιημένο πολυμερές μπορούσε να δρα ενδοκυττάρια με την ίδια εξειδίκευση όπως και το μονομερές. Επίσης το τροποποιημένο πολυμερές είχε μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής από το αντίστοιχο πολυμερές που καταλυόταν σε μονομερή και ήταν έντεκα φορές πιο αποτελεσματικό. Ο περαιτέρω σχεδιασμός πιο σταθερών και δραστικών ριβοενζύμων λοιπόν θα μπορούσε να βασιστεί στην ιδέα που εφαρμόστηκε στην εργασία μας. Συμπερασματικά θα λέγαμε πως είναι σημαντικό να συνεχιστεί η προσπάθεια κατανόησης και βελτίωσης των ριβοενζύμων, ώστε να σκιαγραφηθεί ο ρόλος που μπορεί να έχουν στη βιολογία και στην ιατρική
description: The aim of this thesis was to study the characteristics of the action of ribozymes in vitro and in cellulo and to produce a ribozyme that has greater intracellular stability and is therefore more effective. Osteogenesis imperfecta is a single gene systemic disease of the connective tissue and it involves type I collagen. The genes COL1A1 and COL1A2 are the two genes that code for type I collagen. And the majority of patients with osteogenesis imperfecta carry mutations in these two genes. We created a target based on the structure of COL1A1 and three point mutations were incorporated in this target to simulate the mutations that actually exist in osteogenesis imperfecta. Subsequently, ribozymes which target these three mutations were created. Multimers of these ribozymes were created that had the inherent ability to self-catalyse into monomers and to catalyse the target. Multiple trials of these ribozymes were carried out at different temperatures and molecular rates in vitro. Following that, cell lines that contained the target and one of the multimers were created. We also created a modified multimer that would catalyse the target without being self-catalysed into monomers. This modified multimer therefore sustains its large size and could potentially be more stable, not allowing cellular ribonucleases to degrade it and would therefore potentially be more effective in ablating the target. We performed trials to ascertain the half life of ribozymes and calculated the percent of the target ablated. RESULTS In vitro experiments have shown that ribozymes achieve specific ablation of their target even if it differs from the normal at just one base. The homo-multimers and hetero-multimers of ribozymes retain their specificity of action just like monomers, while they also show increased catalytic action. In vitro trials showed that the hetero-multimers were indeed more effective than the homo-multimers as well as more than the prospective monoribozymes in the ablation of a target containing 3 mutations. These findings are encouraging as they mean that hetero-multimers can be used in systems with multiple tagets, such as HIV or other viruses. An antivirus strategy that would utilize just one ribozyme would be destined to fail, as it is widely known that virus mutation rates are very high. The hetero-multimers would achieve long term effectiveness. In addition, in single gene disorders such as osteogenesis imperfecta some mutations are more frequent than others. Hetero-multimers targeting the most frequent mutations could be used as therapeutic agents in a great number of patients. In recent years a great effort has ensued in the designing of ribozymes with greater intracellular stability and potency. Ribozymes have been modified chemically and their molecular properties have been studied, in order to achieve a greater resilience against destruction from nucleases and an improvement of their catalytic activity. Thus, in this thesis as was mentioned before we constructed a modified multimer that could retain its large size. In the in vivo trials it was evident that this multimer could act intracellularly with the same specificity as the monomer. Additionally, it had a greater half life from the respective multimer which can catalyse itself into monomers and was eleven times more effective. The design of more stable and potent ribozymes could be based on the approach which was used in this thesis. In conclusion it could be said that it is of great importance that research in the field of ribozymes continues, in order to further understand the underlying mechanisms and improve the function of ribozymes which will inadvertedly show their important role in biology and medicine alike