title: Molecular biological and biochemical investigations on the biosynthesis of ergot alkaloids in fungi of the families Trichocomaceae and Arthrodermataceae
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Ergotalkaloiden in Pilzen der Familien Trichocomaceae und Arthrodermataceae
Creators: name: Wallwey, Christiane
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Aspergillus fumigatus
Gencluster
Ergotalkaloide
Dissertation
Arthroderma benhamiae
Arthrodermataceae
Biosynthese
Naturwissenschaften
Schlauchpilze

description: Ergotalkaloide (EA) sind eine
      komplexe Familie von Indolderivaten mit einem tetrazyklischen
      Ergolinringsystem, die von Pilzen aus zwei unterschiedlichen
      Familien produziert werden. Dies sind z.B. Aspergillus
      fumigatus (A. fumigatus) aus der Familie Trichocomaceae oder
      Claviceps purpurea (C. purpurea) aus der Familie
      Clavicipitaceae. EA besitzen unterschiedliche Strukturen und
      dadurch auch unterschiedliche biologische Aktivitäten.
      Aufgrund ihrer Strukturen können EA in drei Gruppen
      eingeteilt werden: Alkaloide vom Clavin-Typ, Ergoamide und
      Ergopeptine. Ergoamide sind Amid-Derivate der D-Lysergsäure,
      während Ergopeptine Peptid-Derivate der D-Lysergsäure
      darstellen. Alkaloide vom Clavin-Typ enthalten zwar das
      tetrazyklische Ergolinringsystem, sind jedoch keine Derivate
      der D-Lysergsäure. Ein Beispiel für diese Gruppe ist
      Fumigaclavin C, das Endprodukt der Ergotalkaloidbiosynthese
      in A. fumigatus. Die Pilze der Familie Trichocomaceae
      produzieren nur Alkaloide vom Clavin-Typ, während Pilze der
      Familie Clavicipitaceae hauptsächlich Ergoamide und
      Ergopeptine bilden. Durch den Vergleich der Gencluster für
      die Biosynthese von EA verschiedener Produzenten konnten
      sieben homologe Gene identifiziert werden. Es wurde die
      Hypothese aufgestellt, dass diese Gene in die Bildung des
      tetrazyklischen Ergolinringsystems involviert sein müssen. In
      früheren Studien konnten zwei der sieben homologen Gene,
      fgaPT2 und fgaMT aus A. fumigatus, den entsprechenden
      Schritten in der Biosynthese des Ergolinrings zugeordnet
      werden. Die Prenyltransferase FgaPT2 katalysiert den ersten
      Schritt, die Prenylierung von L-Tryptophan. Das Produkt
      4-Dimethylallyltryptophan wird im nächsten Schritt durch die
      N-Methyltransferase FgaMT zu
      N-Methyl-4-Dimethylallyltryptophan umgesetzt. Im Rahmen der
      vorliegenden Dissertation konnten die Funktionen von drei
      weiteren der sieben homologen Gene aus A. fumigatus, fgaDH,
      fgaOx3 und fgaFS, in der Biosynthese von Fumigaclavin C
      aufgeklärt werden. FgaDH besitzt die konservierten Motive von
      klassischen Short-Chain Dehydrogenasen/Reduktasen (SDRs),
      weist aber ansonsten keine Sequenzähnlichkeiten zu SDRs oder
      anderen bekannten Proteinen auf. Es konnte gezeigt werden,
      dass FgaDH die Oxidation von Chanoclavin-I zu
      Chanoclavin-I-Aldehyd katalysiert, wobei NAD+ als Kofaktor
      benötigt wird. Die Struktur von Chanoclavin-I-Aldehyd konnte
      eindeutig durch NMR- und MS-Analysen nachgewiesen werden. Die
      KM-Werte für Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,27 bzw. 1,1
      mM. Eine Wechselzahl von 0,38 s-1 wurde aus den kinetischen
      Parametern berechnet. Das Protein FgaOx3 enthält eine old
      yellow enzyme-like FMN binding domain, während FgaFS keine
      konservierten Bereiche oder sonstige Ähnlichkeiten zu
      bekannten Proteinen aufweist. Die beiden Proteine FgaOx3 und
      FgaFS sind zusammen für die Umsetzung von
      Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin verantwortlich. In
      Abwesenheit von FgaFS kommt es durch FgaOx3 unter Einbau von
      Sauerstoff zur Bildung eines Produktgemischs, das aus zwei
      Stereoisomeren besteht und durch FgaFS nicht weiter umgesetzt
      wird. Die Strukturen von Festuclavin und den zwei
      Stereoisomeren konnten durch detailierte NMR- und MS-Analysen
      aufgeklärt werden. Anhand der gesammelten Daten wurde ein
      Reaktionsmechanismus ausgehend von Chanoclavin-I-Aldehyd
      postuliert. Desweiteren konnte in dieser Dissertation durch
      eine Analyse der Genomsequenzen verschiedener Pilze ein
      putatives Ergotalkaloidgencluster in den Pilzen der Familie
      Arthrodermataceae identifiziert werden. Das Cluster besteht
      aus fünf Genen, deren Homologe in A. fumigatus und C.
      purpurea in die Bildung von Chanoclavin-I-Aldehyd aus
      L-Tryptophan involviert sind. Es konnten keine homologen Gene
      zu denen gefunden werden, die für die weitere Umsetzung von
      Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin bzw. Agroclavin oder für
      die späteren Schritte im Biosyntheseweg von A. fumigatus bzw.
      C. purpurea verantwortlich sind. Aus dem putativen Gencluster
      von Arthroderma benhamiae (A. benhamiae) wurde das Gen
      ARB_04646, welches das Homolog zu fgaDH ist, mit korrigierter
      Intron/Exon-Struktur amplifiziert, kloniert und erfolgreich
      exprimiert. Das Enzym bekam die Bezeichnung ChaDH. ChaDH
      katalysiert wie sein Homolog FgaDH in Anwesenheit von NAD+
      die Oxidation von Chanoclavin-I. Das enzymatische Produkt
      konnte durch NMR- und MS-Analysen eindeutig als
      Chanoclavin-I-Aldehyd identifiziert werden. Die KM-Werte für
      Chanoclavin-I und NAD+ betrugen 0,09 bzw. 0,36 mM. Aus den
      kinetischen Parametern wurde eine Wechselzahl von 0,76 s-1
      berechnet. In den Kulturüberständen von A. benhamiae konnten
      keine EA nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse der Gene
      zeigte, dass unter den gewählten Laborbedingungen keine
      detektierbare Expression stattfand. In dieser Arbeit konnte
      somit eine dritte pilzliche Familie identifiziert werden, die
      zumindest die genetischen Informationen für die Biosynthese
      von EA bzw. Chanoclavin-I-Aldehyd enthält.
description: Ergot alkaloids are a complex
      family of indol derivatives with the typical tetracyclic
      ergoline ringsystem, which are produced by fungi of two
      different families, e.g. Aspergillus fumigatus (A.
      fumigatus), from the family Trichocomaceae, and Claviceps
      purpurea (C. purpurea), from the family Clavicipitaceae.
      Ergot alkaloids exhibit different structures and therefore
      diverse biological activities. Based on the structures ergot
      alkaloids can be divided into three groups: clavine-type
      alkaloids, ergoamides and ergopeptines. Ergoamides and
      ergopeptines are amide and peptide derivatives of D-lysergic
      acid, respectively. Clavin-Type alkaloids consist merely of
      the ergoline ringsystem and are no D-lysergic acid
      derivatives. An example for a clavine-type alkaloid is
      fumigaclavine C, the end product of the ergot alkaloid
      biosynthetic pathway in A. fumigatus. Fungi of the family
      Trichocomaceae are producers of clavine-type alkaloids,
      whereas some members of the family Clavicipitaceae produce
      mainly ergoamides and ergopeptines. The comparison of the
      biosynthetic gene clusters of different ergot alkaloid
      producers led to identification of seven homologous genes. It
      was speculated that these genes are involved in the formation
      of the tetracyclic ergoline ring system. In previous studies,
      two of the seven homologous genes, fgaPT2 and fgaMT of A.
      fumigatus, were assigned to the corresponding step in the
      biosynthesis of the ergoline ring. The gene fgaPT2 encodes a
      prenyltransferase, which catalyzes the first step in the
      biosynthesis, i.e. prenylation of L-tryptophan. The product
      4-dimethylallyltryptophan (4-DMAT) of this reaction is then
      methylated by N-methyltransferase FgaMT, resulting in the
      formation of N-methyl-4-dimethylallyltryptophan
      (4-DMA-L-abrine). In this thesis, functions of three
      additional genes, fgaDH, fgaOx3 and fgaFS of A. fumigatus,
      were proven biochemically. FgaDH contains the conserved
      motifs of classical short-chain dehydrogenases (SDRs), but
      shows otherwise no significant sequence similarity to SDRs or
      other known proteins. It was shown that FgaDH catalyses the
      oxidation of chanoclavine-I to chanoclavine-I aldehyde in the
      presence of NAD+. The structure of chanoclavine-I aldehyde
      was unequivocally elucidated by NMR and MS analysis. The KM
      value was determined as 0.27 mM for chanoclavine-I and 1.1 mM
      for NAD+, respectively The turnover number was determined as
      0.38 s-1. The protein FgaOx3 contains an old yellow
      enzyme-like FMN binding domain, whereas FgaFS has no
      conserved regions or similarity to known proteins. FgaOx3 and
      FgaFS together are responsible for the formation of
      festuclavine from chanoclavine-I aldehyde. In the abscence of
      FgaFS a mixture of two stereoisomers is generated by FgaOx3
      under consumption of oxygen. The isomers could not be further
      converted by FgaFS. The structures of these two stereoisomers
      as well as that of festuclavine were unequivocally elucidated
      by 1D- and 2D-NMR and MS analysis. On the basis of the
      obtained data, a reaction mechanism with chanoclavine-I
      aldehyde as substrate was postulated. Furthermore, a putative
      ergot alkaloid gene cluster was identified in fungi of the
      family Arthrodermataceae by analysis of genome sequences. The
      cluster contains five genes whose enzymes have homology to
      the enzymes, which are involved in the formation of
      chanoclavine-I aldehyde from L-tryptophan in A. fumigatus und
      C. purpurea. Homologues neither to the genes responsible for
      the conversion of chanoclavine-I aldehyde to festuclavine or
      agroclavine nor to the genes involved in the later steps of
      ergot alkaloid biosyntheses in A. fumigatus and C. purpurea
      exist in the genomes of these fungi. The fgaDH homologue from
      the putative ergot alkaloid cluster, ARB_04646, was amplified
      from gDNA of Arthroderma benhamiae (A. benhamiae), cloned and
      expressed in E. coli. The enzyme named ChaDH catalyses also
      the oxidation of chanoclavine-I in presence of NAD+. The
      enzymatic product was identified as chanoclavine-I aldehyde
      by NMR and MS analysis. The KM values were determined as 0.09
      mM for chanoclavine-I and 0.36 mM for NAD+, respectively. The
      turnover number was found to be 0.76 s-1. Thus a third fungal
      family was identified in this thesis, which has at least the
      genetic information for the biosyntheses of ergot alkaloids
      or their precursors, i.e. chanoclavine-I aldehyde. But no
      ergot alkaloids were detectable in the supernatant of A.
      benhamiae cultures and the analysis of the expression of the
      five cluster genes by Northern blot showed no detectable
      expression under the used conditions.