title: Dynamics of DNA repair enzymes and competence proteins in Bacillus subtilis
title: Dynamik von DNA-Reparaturenzymen und Kompetenzproteinen in Bacillus subtilis
Creators: name: Altenburger, Stephan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Chemistry and allied sciences
Chemie
Fluorescence Micorscopy
Bakterien , Fluoreszenzmikroskopie
DNA repair , Bacteria
DNA Reparatur

description: DNA Doppelstrangbrüche (DSBs) sind
      eine schwere Bedrohung der Integrität des Genoms, deshalb
      gibt es seine Vielzahl von Proteinen, die solche Schäden
      reparieren. Der in Bakterien wichtigste Signalweg ist die
      homologe Rekombination (HR), mit der ATPase RecA als
      zentrales Enzym. RecA bildet dabei Filamente, die die Distanz
      zwischen den beiden Schwesterchromatiden überbrückt. Aber
      bereits vor RecA gibt es eine Vielzahl von Proteinen
      (RecNJORFX), die aktiv bei HR werden. In Bacillus subtilis
      startet dieser Prozess damit, dass RecN Fokusse bildet, 15
      Minuten nachdem DSBs induziert werden. Beendet wird der
      Vorgang 3 Stunden später durch den Abbau der RecA-Filamente
      und der Wiederaufnahme des Wachstums. Ich wollte einen
      detailreicheren Einblick in die Dynamik der beteiligten
      Proteine haben und habe deshalb die Methode der
      Einzelmolekülmikroskopie (single molecule microscopy) in
      lebenden Zellen angewandt. Dabei habe ich Videos mit 40 ms
      Belichtungszeit erstellt, die Bewegung der Rec-Proteine
      gemessen und die resultierenden Trajektorien mathematisch
      analysiert. In exponentiell wachenden Zellen konnte ich
      beobachten, dass RecN, RecO und viele RecJ-Moleküle
      kontinuierlich das Chromosom abrastern, was ein Model für die
      Einzelmoleküle der distributiven Suche unterstützt. Im
      Gegensatz zu RecN und RecO verbleibt ein Anteil der
      RecJ-Moleküle an der Replikationmaschine. Sobald DSBs
      induziert werden, verharren RecNOJ an mehreren Stellen auf
      dem Nukleoid. RecN bildet keine statischen Reparaturzentren,
      wie man in Eukaryoten beobachten konnte, sondern kurzlebige
      (~2,5 s) Cluster die als Rekrutierungsplattform für
      Reparaturenzym dienen. So wird die lokale Konzentration von
      Rec-Proteinen erhöht und das Einfangen von
      Interaktionspartnern aus einem diffusen Reservoir ermöglicht.
      Der Großteil der RecNJO-Moleküle sucht, selbst in Gegenwart
      von DSBs, weiterhin das Chromosom nach Schäden bzw.
      Interaktionspartnern ab. In toto zeigt meine Arbeit, dass die
      initiale Detektion von DSBs, das Prozessieren der freien
      DNA-Enden und das Beladen der hergestellten ssDNA mit RecA in
      sehr kurzen Zeiträumen abläuft und nur von einer Minderheit
      der Proteinpopulation bewerkstelligt wird.
description: DNA double strand breaks (DSBs) are
      a severe threat to genome integrity and thus a variety of
      proteins are dedicated to repair such threats. The major
      repair route in bacteria is that of homologous recombination
      (HR), with the ATPase RecA as a key player. In HR, a broken
      DNA strand is repaired using a second intact DNA copy present
      on a homologous chromosome. This process involves the
      exchange of DNA strands, mediated by RecA, which forms
      filamentous polymers on ssDNA and initiates strand exchange.
      Prior to RecA, a plethora of Rec-proteins (Rec NJORFX) act to
      initiate HR. In Bacillus subtilis this process starts with
      RecN forming foci 15 minutes after DSB induction and is
      finished when RecA filaments disassemble and cell growth
      resumes after three hours. I wished to obtain a more detailed
      view on the dynamics of these proteins, and therefore
      employed single molecule fluorescence microscopy in live
      cells. Using 40 ms stream acquisition, I detected the
      movement of single Rec proteins and analyzed these
      trajectories mathematically. In exponentially growing cells I
      observed that RecN, RecO and, partially, RecJ continuously
      scan the nucleoid, supporting a distributive search model of
      individual molecules. In contrast to RecN and RecO, a
      fraction of the exonuclease RecJ is retained at the
      replication machinery. Upon induction of DSBs, RecNJO arrest
      at several sites on the nucleoid. RecN does not form static
      repair centers as proposed for eukaryotes, but short-lived
      (~2.5 s) clusters that act as repair enzyme recruitment
      platforms. Thus the local concentration of Rec-proteins
      increases to trap interaction partners out of a pool of
      diffusive enzymes. A majority of the RecNJO molecules keep on
      scanning for lesions or interaction partners, even in the
      presence of DSBs. In toto, my work indicates that the initial
      detection of a DSB, processing of free DNA ends, and loading
      of RecA on the generated ssDNA site takes place in a very
      short time frame, performed by a minority of the protein
      population.