Costruzione di un BCG ricombinante che esprime antigeni di MTB e valutazione della sua immunogenicità in vivo
Creators: name: SPERANZA, VIVIANA
Publisher: name: Università degli Studi di Roma "Tor Vergata"
Year: 2008
Subjects: subject: tubercolosi; TB; Mycobacterium bovis-Bacillus Calmette-Guerin; BCG;
subject: tubercolosi
subject: TB
subject: Mycobacterium bovis-Bacillus Calmette-Guerin
subject: BCG

description: 20. ciclo
description: 1. Introduzione - 1.1 La Tubercolosi nel mondo - 1.2 Mycobacterium tuberculosis - 1.3 La risposta immunitaria verso MTB - 1.3.1 Risposta immunitaria innata - 1.3.2 Risposta immunitaria acquisita - 1.4 Immunopatogenesi della Tubercolosi (TB) - 1.5 La vaccinazione per la prevenzione della TB il Bacillo di Calmette-Guerin (BCG) - 1.5.1 La storia del BCG - 1.5.1a I problemi legati alla vaccinazione con BCG - 1.5.1b I vantaggi della vaccinazione con BCG - 1.5.1c I vaccini non-vivi - 1.5.1d I vaccini vivi - 1.6 Regolazione dell’espressione genica di MTB durante l’interazione ospite-patogeno - 2. Scopo della Tesi - 3. Materiali e metodi 43 3.1 Animali e immunizzazioni - 3.2 Ceppi batterici e condizioni di crescita - 3.3 Amplificazione dei geni selezionati - 3.4 Clonaggio nei vettori di espressione - 3.5 Trasformazione del BCG - 3.6 Estrazione DNA plasmidico da rBCG - 3.7 Estrazione dell’RNA dal BCG - 3.8 Digestione con DNasi I e RT-PCR - 3.9 Espressione delle proteine di fusione nel ceppo E.coli BL21 - 3.10 Purificazione delle proteine di fusione - 3.11 Estrazione e purificazione delle proteine da rBCG - 3.12 Immunoblotting delle proteine di fusione estratte - 3.13 Determinazione dell’ IFN-γ prodotto dagli splenociti dei topi immunizzati con gli rBCG ELISA - 3.14 Determinazione del numero delle CFU negli organi - 3.15 Inclusione in paraffina - 3.16 Immunoistochimica su organi su sezioni in paraffina - 3.17 Immunofluorescenza su sezioni in paraffina - 3.18 Infezione di macrofagi umani con gli rBCG e il BCG Aventis - 3.19 Immunocitochimica su macrofagi 56 3.20 Immunofluorescenza su macrofagi infettati - 3.21 Digestione con DNAsi I e sintesi di un 33P-cDNA con primers MTB-specifici - 3.21.1 Esperimenti con i Macroarrays - 3.22 Sequenziamento del DNA - 4. Risultati - 4.1 Selezione degli antigeni da inserire in BCG - 4.2 Modulazione del gene Rv1767 in BCG Aventis - 4.3 Costruzione dei BCG ricombinanti - 4.3.1 Clonaggio dei geni selezionati in un vettore per E.coli - 4.3.2 Sub-clonaggio nei vettori di espressione - 4.4 Espressione dei geni clonati negli rBCG - 4.5 Espressione e purificazione delle proteine di fusione in E.coli - 4.6 Produzione di sieri policlonali contro le proteine Rv3425, Rv1767 e Rv1255 e studio preliminare dell’immunogenicità delle proteine di fusione - 4.7 Identificazione delle proteine di fusione prodotte dagli rBCG - 4.8 Stabilità dei tre rBCG in vivo - 4.9 Analisi in vivo dell’espressione proteica degli rBCG - 4.10 Studio della risposta cellulare e umorale indotta in topi Balb/C contro le proteine Rv1255, R3425 e Rv1767 dai rispettivi rBCG - 4.11 Immunistochimica sulle sezioni di derma in prossimità del sito di inoculo del BCG - 4.12 Infezione di macrofagi con gli rBCG - 4.13 Caratterizzazione del profilo di espressione genica di BCG Aventis e rBCG-Rv1255c tramite Macroarray - 5. Discussione - 6. Ringraziamenti - 7. Bibliografia