title: Speziesdifferenzierung in Milch- und Sojamilchprodukten mittels Real-time PCR und PCR
Creators: name: Kern, Carola Christina
Publisher: name: :none
Year: 2010

description: Die Authentizitätsbestimmung von Lebensmitteln ist in den letzten Jahren zu einer treibenden Kraft für die Entwicklung DNA-basierter Methoden zur Aufdeckung von Verfälschungen und fehlerhaften Deklarationen auf Lebensmitteln ebenso wie zum Schutz des Konsumenten vor potentiellen Gesundheitsrisiken wie Allergenen gewachsen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei verschiedene spezies-spezifische PCR Systeme eingesetzt um Kuhmilchanteile in Schafkäsen und Sojamilchprodukten nachweisen zu können. Die verwendeten Primer zielten dabei auf das mitochondriale 12S rRNA Gen bzw. das mitochondriale Cytochromoxidase II Gen der Rinder ab. Beide Systeme erlaubten den qualitativen Nachweis einer minimalen Konzentration von 0,1% Kuhmilchanteil in Standardmischungskäsen aus Schaf- und Kuhmilch ebenso wie in einer Standardmischungsreihe aus Kuh- und Sojamilch. Dieselben PCR Systeme konnten auch zum qualitativen Nachweis von Kuhmilchanteilen in zwölf verschiedenen im Handel erhältlichen Sojamilchprodukten angewendet werden. Um auch quantitative Aussagen über den enthaltenen Kuhmilchanteil in Schafkäsen und Sojamilchprodukten zu ermöglichen, wurde außerdem Real-time PCR eingesetzt. Dabei wurde SYBR Green als Fluoreszenzfarbstoff verwendet und mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse die Spezifität der amplifizierten Produkte überprüft. Für den quantitativen Nachweis von Kuhmilchanteilen in Schafkäse wurde ein rinderspezifisches Primerpaar verwendet, das auf das mitochondriale 12S rRNA Gen des Rindes abzielt und ein 256 bp Amplikon liefert. In Kombination mit dem speziesspezifischen Primerpaar wurde auch ein Universalprimerpaar eingesetzt. Das daraus resultierende Amplikon war eine 464 bp lange Sequenz des mitochondrialen Cytochrom b Gens. Die unter Verwendung des Universalprimerpaares erzielten Ergebnisse wurden eingesetzt um die Resultate des speziesspezifischen Primerpaares zu normalisieren. Das Universalprimerpaar fungierte also als endogene Kontrolle, die den gesamten Gehalt an amplifizierbarer DNA in der Probe anzeigen sollte. Zur Quantifizierung wurden aus Schaf- und Kuhmilch hergestellte Käse einer Mischungsreihe als Standards herangezogen, deren Kuhmilchanteil bekannt war. Für die Quantifizierung des Kuhmilchanteils in Sojamilchprodukten wurde dieselbe rinderspezifische 256 bp lange Gensequenz als Zielregion verwendet. Der Universalprimer war auf das nukleäre 18S rRNA Gen eukaryontischer DNA gerichtet und ergab ein 137 bp Amplikon. Eine Mischungsreihe aus Kuh- und Sojamilch mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen Komponente wurde als Standard eingesetzt. Das System lieferte verlässliche Ergebnisse und konnte so auch zur Quantifizierung des Kuhmilchanteils in den im Handel erhältlichen Sojamilchprodukten verwendet werden. Dabei wurden jene vier Proben untersucht, die bereits mittels speziesspezifischer PCR positive oder fragwürdige Resultate erzielten. Die eben beschriebene Real-time PCR Methode erlaubte die Quantifizierung des Kuhmilchanteils in allen vier Proben. Es hat sich gezeigt, dass die Real-time PCR eine schnelle, verlässliche und empfindliche Technik zum Nachweis von Kuhmilchanteilen in Schafkäsen oder Sojamilch ist. Dabei können minimale Konzentrationen von 0,1% nachgewiesen werden. Unter Verwendung zweier verschiedener Standardreihen hat sich gezeigt, dass es zu Problemen bei der Quantifizierung kommt. Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung von adäquaten Standards, die derselben Behandlung unterzogen worden sein sollen, wie die Proben, die schließlich analysiert werden.
description: Authenticity assessment of dairy products has been a driving force in the development of DNA-based analytical techniques to detect commercial frauds and inaccurate food labelling and protect consumers from potential health risks such as allergens. In this work two different species-specific PCR systems were applied to detect cow’s milk in ewe’s cheeses and soy milk products targeting the bovine mitochondrial 12S rRNA gene and the bovine mitochondrial Cytochrome oxidase II gene. Both systems allowed the qualitative detection of cow’s milk concentrations as low as 0.1% in standard mixtures of ripened cow’s and ewe’s cheese as well as in standard mixtures of cow’s milk and soy milk. The same PCR systems were used for the qualitative detection of cow’s milk in 12 retail soy milk products. In order to obtain quantitative results a Real-time PCR technique using a SYBR Green detection system and melting curve analysis to confirm specificity of the amplified products was applied for the detection of cow’s milk in ewe’s cheeses or soy milk products. For the quantitative detection of cow’s milk in ewe’s cheeses, bovine specific primers targeting the mitochondrial 12S rRNA gene, yielding a 256 bp amplicon, and a universal primer targeting the mitochondrial Cytochrome b gene, resulting in a 464 bp amplicon, were applied. The results of the universal primer were used to normalize the results of the species specific primer, serving as an endogenous control for the total amount of amplifiable DNA in the samples. Quantification was carried out using the standard mixtures of cow’s and ewe’s cheese as calibrator samples of known cow’s milk concentration. For the quantification of cow’s milk in soy milk products the same bovine specific 256 bp gene region was used as target sequence. The universal primer was targeting a nuclear 18S rRNA gene sequence from eukaryotic DNA, resulting in a 137 bp amplicon. Standard mixtures of cow’s milk in soy milk were used as calibrator samples of known cow’s milk content. The system delivered accurate results for the quantification of cow’s milk in soy milk and was consequently applied to four retail soy milk products that proved or were suspected to be positive for bovine DNA using species specific PCR. Real-time PCR allowed quantification of the cow’s milk concentration of all four samples.