Γενοτυπική παραλλακτικότητα πληθυσμών του μύκητα Botrytis cinerea και η σχέση της με την ανθεκτικότητα σε μυκητοκτόνα.:
Creators: name: Σαμουήλ, Στυλιανός Αναστασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Τεφρά σήψη
Φράουλα
Παρεμπόδιση συμπλόκου ΙΙΙ της αναπνοής
Gray mold
Strawberry
QoI Fungicides

description: Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια της μεταπτυχιακής μου διατριβής και είχε ως αντικείμενο μελέτης τη γενοτυπική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του μύκητα Botrytis cinerea και τη συσχέτισή της με την ανθεκτικότητα σε μυκητοκτόνα. Η εργασία διαχωρίζεται σε 2 ξεχωριστές ενότητες: η πρώτη αφορά στη μελέτη της γενετικής δομής πληθυσμών του μύκητα Botrytis cinerea από διάφορους ξενιστές στην Ελλάδα και η δεύτερη στη μελέτη της ανθεκτικότητας πληθυσμών του μύκητα σε μυκητοκτόνα με έμφαση τους παρεμποδιστές του συμπλόκου ΙΙΙ της αναπνοής. Η εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ., ενώ μέρος αυτής εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Ινστιτούτου Γεωργικών Ερευνών Κύπρου. Στα πλαίσια της εργασίας αυτής, μελετήθηκε ένα δείγμα 299 απομονώσεων του παθογόνου οι οποίες συλλέχθηκαν από διάφορους καλλιεργούμενους ξενιστές του στην Ελλάδα. Κατά τη πρώτη σειρά πειραμάτων, ο πληθυσμός διαχωρίστηκε με βάση τη παρουσία ή όχι των δύο μεταθετών στοιχείων (Boty ή/και Flipper) στο γονιδίωμα του μύκητα, σε δύο υποπληθυσμούς, transposa ή vacuma αντίστοιχα. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι και οι τέσσερις πιθανοί γενότυποι συνυπήρχαν γεωγραφικά στους πληθυσμούς από όλους τους ξενιστές του δείγματος. Επίσης παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη συχνότητα των γενοτύπων μεταξύ των πληθυσμών. Επιπλέον, με βάση το πολυμορφισμό του γονιδίου Bc-hch έγινε διαχωρισμός των απομονώσεων του μύκητα στις ομάδες Ι και ΙΙ απ’ όπου προέκυψε ότι το σύνολο των απομονώσεων που μελετήθηκαν ανήκαν στην Ομάδα ΙΙ του B. cinerea. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση θερμοκρασίας στο ρυθμό μυκηλιακής ανάπτυξης των transposa και vacuma απομονώσεων καθώς και η παθογόνος δύναμή τους σε καρπούς ακτινιδίου. Με βάση τα αποτελέσματα προέκυψε ότι οι ρυθμοί μυκηλιακής ανάπτυξης των transposa και vacuma απομονώσεων δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε καμία από τις τρεις θερμοκρασίες επώασης. Αντίθετα τα αποτελέσματα από τα πειράματα μολυσματικότητας έδειξαν ότι υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ένταση προσβολής μεταξύ transposa και vacuma απομονώσεων όταν οι καρποί επωάστηκαν στους 0 oC. Σε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων, έγινε προσδιορισμός της συχνότητας ανθεκτικότητας σε έξι μυκητοκτόνα (cyprodinil, fludioxonil, iprodione, carbendazim, fenhexamid και pyraclostrobin) τα οποία χρησιμοποιούνται στην Ελλάδα για την αντιμετώπιση του B. cinerea. Ο προσδιορισμός των συχνοτήτων ανθεκτικότητας, χρησιμοποιώντας τις διακριτές δόσεις των μυκητοκτόνων αυτών, αποκάλυψε διαδεδομένη ύπαρξη ανθεκτικότητας στα βενζιμιδαζολικά, δικαρβοξαμιδικά και ανίλινοπυριμηδινικά μυκητοκτόνα. Επίσης, διαπιστώθηκε η ύπαρξη φαινοτύπων ανθεκτικών στις στρομπιλουρίνες μόνο στο πληθυσμό του μύκητα από καρπούς φράουλας. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι, σε όλους τους ξενιστές του δείγματος, οι συχνότητες ανθεκτικότητας ήταν σημαντικά ψηλότερες στον transosa υποπληθυσμό σε σύγκριση με το vacuma. Επιπλέων, προσδιορίστηκαν οι ακριβείς τιμές ευαισθησίας (τιμές EC50) των απομονώσεων του μύκητα από φράουλα στο pyraclostrobin απ’ όπου προέκυψαν δύο τύποι ευαισθησίας. Η ανθεκτικότητα του B. cinerea στα μυκητοκτόνα της ομάδας των στρομπιλουρινών αποδόθηκε πρόσφατα στη μεταλλαγή G143A, ενώ σε διάφορες απομονώσεις του παθογόνου ανιχνεύθηκε ένα επιπλέον εσόνιο στο κωδικόνιο 143 του γονιδίου του κυτοχρώματος b. Για την ανίχνευση της παρουσίας του QoI-ευαίσθητου (G143) ή του QoI-ανθεκτικού (A143) αλληλομόρφου αναπτύχθηκε μια πολλαπλή TaqMan PCR ενώ για την ανίχνευση της παρουσίας του επιπλέον εσονίου μεταξύ των κωδικονίων 143 και 144 του γονιδίου του κυτοχρώματος b (Bcbi 143/144 intron) αναπτύχθηκε μια δεύτερη TaqMan PCR.Από τα αποτελέσματα προέκυψε ότι απομονώσεις με φαινοτυπική ανθεκτικότητα στις στρομπιλουρίνες έφεραν τη G143A μεταλλαγή. Επίσης, το επιπλέον εσόνιο ανιχνεύθηκε μόνο σε απομονώσεις που δεν έφεραν την G143A μεταλλαγή. Με βάση τα αποτελέσματα, φαίνεται ότι η διαδεδομένη παρουσίας του επιπλέον εσονίου στους πληθυσμούς του μύκητα ενδεχομένως σχετίζεται με την καθυστέρηση εμφάνισης ανθεκτικότητας στις στρομπιλουρίνες σε καλλιέργειες που δέχονται αυξημένο αριθμό εφαρμογών όπως είναι για παράδειγμα η θερμοκηπιακή καλλιέργεια τομάτας.
description: The current study was conducted aimed primary at investigating the presence and frequency distribution of the transposable elements Boty and Flipper in populations of the necrotroph plant pathogen Botrytis cinerea in Greece. In total, 299 isolates were collected during 2008 and 2009 from grapes, strawberries, tomatoes, cucumbers, kiwifruit and apple fruit. The presence of the two transposable elements was determined by PCR detection.Results showed that, in all of the sampled hosts, the 4 possible different genotypes, isolates of transposa type carrying both transposable elements, Boty–type isolates, Flipper-type isolates and vacuma type isolates carrying neither transposable element, occurred in sympatry. Marked differences in genotype frequencies among populations were observed. In tomatoes, cucumbers, grapes and strawberries transposa isolates carrying both elements were predominant in the populations, while in kiwifruit and apple fruit populations the vacuma isolates were prevailing.Furthermore, a PCR-RFLP approach on a 1171 bp fragment of Bc-hch gene was used to divide B. cinerea population into two groups: Group I and Group II. The results showed that all isolates were Group II and none of them were Group I.In an attempt to explain the observed predominance of vacuma isolates in kiwi and apple fruit populations, mycelial growth rate of a set of vacuma isolates was compared to the mycelial growth rate of a set of transposa isolates at 3 different temperatures (0, 10 and 20 oC). In addition, the same set of vacuma and transposa isolates were used to compare the virulence of isolates on wound-inoculated kiwifruits incubated at 2 different temperatures (0 and 20 oC), in terms of disease incidence and disease severity. The results showed that vacuma and transposa isolates had similar mycelial growth rates both at the limiting temperatures of 0 and 10 0C, and at the optimum temperature of 20oC. On the other hand, the results of the virulence test showed that there was a significant difference in disease severity on kiwifruit between transposa and vacuma isolates when incubated at 0 oC.Furthermore, fungicide resistance frequencies in the sampled population were determined. Measurements of the fungicide sensitivity profile of the isolates, using a single discriminatory concentration, revealed the widespread existence of resistance to benzimidazole, dicarboximide and anilinopyrimdine fungicides. Also, QoI-resistant phenotypes existed only within the population collected from strawberry fruit. None of the isolates was resistant either to phenylpyrroles or hydroxyanilides. Interestingly, resistance frequencies were significantly higher in the transposa subpopulation compared to the vacuma subpopulation in all the sampled hosts. Resistance of Botrytis cinerea to the quinone outside inhibiting (QoI) fungicides has been recently attributed to the G143A mutation, while in several pathogen isolates an intron has been detected at the 143 codon of the cytochrome b (cytb) gene. Measurements of EC50 values to pyraclostrobin, in the strawberry population, showed a bimodal sensitivity distribution. A real-time TaqMan® PCR assay was developed and applied to the detection of the G143A mutation and the presence of the cytb intron. Results showed that isolates which were phenotypically resistant to pyraclostrobin possessed the G143A mutation. Moreover, differences were observed among the sampled populations originating from different hosts in the genotypic structure of cytb.Individuals carrying the intron were present at high incidence in apple fruit and greenhouse grown tomato and cucumber populations, whereas in strawberry population the intron frequency was lower. The intron presence was only identified in isolates that did not carry the G143A mutation, while none of the isolates carrying the mutation possessed the intron. The results of the study suggest that a high risk for selection of QoI highly-resistant strains exists in crops extensively treated with QoIs. However, the widespread presence of fungal strains carrying the cytb intron may explain the delay in the appearance of QoIs-resistance in crops heavily treated with QoIs such as greenhouse grown tomatoes.