title: Contribution of activin signals to progression of malignant pleural mesothelioma and evaluation of therapeutic implications
Creators: name: Münzker, Julia
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Hintergrund: Das maligne Pleuramesotheliom (MPM) ist ein Asbest-bedingter bösartiger Tumor mit häufig auftretender Resistenz gegen Chemo- und Strahlentherapie. Wachstumsfaktoren aus der Aktivin Superfamilie spielen beim malignen Wachstum von verschiedenen Tumorerkrankungen, einschließlich dem Nicht-Kleinzelligen Bronchialkarzinom und Ösophaguskarzinom eine wichtige Rolle. Das Ziel dieser Studie war es zu untersuchten, welche Rolle Activin Signale in MPM Zellmodellen spielen und inwieweit diese zu Wachstum und Migration beitragen. Methoden: Die Expression von Activin βA, βB, βC und βE (kodiert durch die Gene INHBA, INHBB, INHBC and INHBE), Aktivin-Rezeptoren (ACVR2, ACVR2B, ALK4 und ALK7) und Aktivin-Antagonisten wurde in 9 MPM Zelllinien und in nicht-malignen Mesothelzellen mittels RT- und qRT-PCR untersucht. Die Aktivin A Expression wurde weiters mittels Immunhistochemie in Paraffin-eingebetteten MPM-Gewebeproben untersucht. Zur funktionellen Analyse von Aktivin Signalen wurden MPM Zelllinien exogen mit Aktivin A, Aktivin-Rezeptor-Inhibitoren und INHBA-regulierenden siRNAs behandelt. Die Ermittlung der Zellproliferation erfolgte durch MTT und Clonogenic Assays und Zellmigration wurde durch Scratch und Transwell Assays ermittelt. Die Phosphorylierung von SMAD2 wurde mittels Western Blot untersucht als Nachweis für die Aktivierung des kanonischen Aktivin/TGF-β Signalweges. Ergebnisse: Die mit PCR durchgeführten Expressionsanalysen zeigten eine hohe Expression von Aktivin A und Aktivin-Rezeptoren in den meisten Zelllinien im Vergleich zu nicht malignen Mesothelzellen. Immunhistochemisch konnte in Gewebeproben von MPM Patienten eine intensive zytoplasmatische Färbung der Tumorzellen gezeigt werden. Die Behandlung mit exogenem Aktivin A führte zu einer Phosphorylierung von SMAD2 in allen Zelllinien, was auf die Funktionalität der Aktivin-Signalachse in MPM Zelllinien schließen lässt. Im Gegensatz zur humanen Leberkrebszelllinie HepG2, die durch eine Behandlung mit Aktivin A inhibiert wird, konnte die Proliferation von Mesotheliom-Zelllinien durch Behandlung mit Aktivin A stimuliert werden, wie MTT Assays und Clonogenic Assays zeigten. Eine Behandlung mit zwei verschiedenen Kinase-Inhibitoren für Aktivin-Rezeptoren (SB-431542, A8301) führte hingegen zu einer klaren Inhibierung der Proliferation, Klonogenität und Migration von Mesotheliom-Zellen. Da diese Kinase-Inhibitoren jedoch nicht spezifisch für Aktivin-Rezeptoren sind und zusätzlich auch auf TGF-β Rezeptoren wirken, wurde die Expression von INHBA zusätzlich durch siRNA-Oligonukleotide reduziert. Wie erwartet wurde durch die Transfektion mit siRNA spezifisch für Aktivin A, jedoch nicht durch Scrambled Kontroll-siRNA die Aktivin A Expression reduziert und die Zellproliferation geschwächt. Abschließend wurde der Einfluß von Trichostatin A und 5-Azacytidine als Einzelsubstanzen und als Kombination auf die Genexpression von INHBA getestet, allerdings konnte kein klarer Trend bezüglich einer Erhöhung oder Reduktion der Expression festgestellt werden. Schlussfolgerung: Diese Daten zeigen, dass deregulierte Aktivin A Expression zum malignen Phänotyp von Mesotheliom-Zellen beiträgt und dass Aktivin-Signale als neues therapeutisches Target weiter untersucht werden sollten.
description: Background: Malignant pleural mesothelioma (MPM) is an asbestos-related malignancy characterized by frequent resistance to chemo- and radiotherapy. Growth factors of the activin family are involved in malignant growth in several tumor types including non-small cell lung cancer (NSCLC) and esophageal cancer. The aim of the present study was to investigate activin signals in MPM cell models and their contribution to malignant growth and spreading. Methods: The expression of the activin βA, βB, βC and βE subunits (encoded by the genes INHBA, INHBB, INHBC, INHBE), activin receptors (ACVR2, ACVR2B, ALK4 and ALK7) and activin antagonizing factors was analyzed in a panel of 9 MPM cell lines and in non-malignant mesothelial cells by RT- and qRT-PCR. Activin A expression was also analyzed by immunohistochemistry in paraffin embedded tissues. For functional analysis of activin signals, MPM cell lines were treated with exogenous activin A, activin receptor inhibitors or INHBA-targeting siRNA. Cell growth was assessed by MTT and clonogenic growth assays and cell migration by scratch and transwell assays. Phosphorylation of SMAD2 was analyzed by Western blotting as readout for activation of the canonical activin/TGF-β signaling pathway. Results: Expression data in mesothelioma cell models obtained by real-time PCR revealed high expression of activin-βA and activin receptors in most cell lines compared to non-malignant mesothelial cells. Likewise, immunohistochemistry in paraffin embedded tissue sections of MPM patients showed intense cytoplasmic staining for activin A in the tumor cells of a subset of the cases analyzed. Treatment with exogenous activin A induced SMAD2 phosphorylation in all cell lines tested, thus demonstrating functionality of the activin signaling axis in mesothelioma cell models. In contrast to the human hepatocarcinoma cell line HepG2, which in agreement with previous reports was inhibited, proliferation of mesothelioma cell models was stimulated by activin A as observed by MTT assays and clonogenic assays. Treatment with two different kinase inhibitors of activin receptors (SB-431542, A8301) in contrast, clearly inhibited mesothelioma cell proliferation and clonogenicity as well as migration. As kinase inhibitors are not absolutely specific for activin receptors and also co-target TGF-β receptors, INHBA was also silenced with siRNA oligonucleotides. As expected, transfection with INHBA-targeting siRNA but not scrambled control siRNA decreased activin-βA expression level and impaired cell proliferation. Finally, the influence of Trichostatin A and 5-azacytidine on the expression of INHBA was tested as single agents, as well as in combination, but no clear trend towards up- or down-regulation could be observed. Conclusions: The data generated during this investigation clearly suggest that deregulated activin A signaling contributes to the malignant phenotype of mesothelioma cells and might therefore represent a valuable candidate for therapeutic interference.