title: Microscopy based methods for studying tumor-microbe interaction in murine colon cancer allograft tissue and spheroids
Creators: name: Raheb, Hanan
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Diese Arbeit basiert auf dem Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie (FLM) zur Untersuchung der Verteilung fluoreszenzmarkierter Mikroben in Darmkrebsmodellen auf der Basis der murinen Tumorzelllinie CT26. Das erste Projekt untersucht die Bioverteilung von leeren Bakterienhüllen (Bacterial Ghosts, BGs) in CT26-tumortragenden Mäusen, während das zweite Projekt die Infiltration von Archaeen in aus CT26 Zellen gebildeten mehrzelligen Tumorsphäroiden (MCTS) untersucht. Sowohl von den Organen der CT26-tumortragenden Mäuse als auch von den CT26-Sphäroiden wurden Gefrierschnitte angefertigt und die entsprechenden Fluoreszenzsignale abgebildet. Der erste Teil dieser Arbeit stellt das Projekt der BGs vor, bei dem diese mit dem Nahe-infrarot Fluoreszenzfarbstoff AF750 kovalent markiert sind und durch Fluoreszenzemission im nahen Infrarotbereich sowie durch Immunfärbung gegen das Eisnukleationsprotein (INP) nachgewiesen wurden. Von den Organen, die den CT26-tumortragenden Mäusen (2 Stunden nach Injektion von AF750-BGs) entnommen wurden, wurde der Pankreas und im CT26 Tumorlesionen im Pankreas ausgewählt und davon Gefrierschnitte angefertigt. Diese wurden dann einer FLM unterzogen, um a) die BGs über die AF750-Emission (Cy7-Kanal) und über das INP (FITC-Kanal, nach Immunfluoreszenzfärbung mit den Fluoreszenzfarbstoff AF488) nachzuweisen und b) die Tumorzellen über DAPI-Emission nachzuweisen. Die Assoziation der BGs mit den Tumorzellen wurde anhand von drei Bildgebungszielen untersucht und dargestellt: 1. Überlappung der AF750- und AF488-Emission bei unterschiedlichen Vergrößerungen, 2. Möglichkeit der Betrachtung der AF750-BGs durch den Cy7-Filter bei 10- facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit zwischen 1,5 und 2 Sekunden und 3. Abbildung der intakten BGs bei 60-facher Vergrößerung. Im zweiten Teil der Arbeit wurden auf ähnliche Weise fluoreszenzmikroskopische Techniken eingesetzt, um die Infiltration von Archaeen in 3D-MCTS auf CT26-Basis zu beobachten. Diese Sphäroide wurden mit nicht pathogenen, streng anaeroben Archaea des Stammes Methanococcus maripaludis S0001 beimpft. Die Lokalisation der Archaea wurde zu drei Zeitpunkten (24, 120 und 168 Stunden) verfolgt, um zu beobachten, ob die Archaea in die Tumorsphäroide eindringen können. Die Fluoreszenzbilder der DAPI-gefärbten Gefrierschnitte der Sphäroide veranschaulichen die Lokalisierung der AF488-markierten Archaeen auf der Oberfläche von Sphäroiden, die 24 Stunden lang mit Archaeen kultiviert wurden, und die Tendenz dieser Mikrobe, sich nach 120-stündiger Kultivierung in Richtung Zentrum des Sphäroids zu bewegen. Schließlich erbrachten die überlagerten Messkanäle DAPI und FITC der Gefrierschnitte der Sphäroide, die 168 Stunden lang mit AF488-markierten Archaeen kultiviert worden waren, den Nachweis für die Lokalisierung anaerober Archaeen nahe und innerhalb der hypoxischen Bereiche dieser Sphäroide, was wiederum die Selektivität dieser Mikroorganismen voraussagt auch in vivo auf die hypoxischen Zentren von Krebsgewebe abzuzielen.
description: This work is based on employing fluorescence microscopy (FLM) for studying the distribution of fluorescently labeled microbes within colorectal cancer models based on the murine cell line CT26.The first project investigates the biodistribution of bacterial ghosts (BGs) in CT26 tumor bearing mice, while the second one studies the infiltration of archaea within CT26 derived multicellular tumor spheroids (MCTS). Both, organs from CT26 tumor bearing mice and spheroids derived from CT26 cells, were cryo-sectioned and imaged for the desired fluorescence. The first part of this thesis presents bacterial ghosts’ project, where BGs were labeled with AF750 dye and detected by near infrared fluorescence emission and also by immunostaining for ice nucleation protein (INP). Out of the organs harvested from CT26 tumor bearing mice (2 hours after injecting AF750-BGs), pancreas and pancreatic tumor nodules were selected and cryo-sectioned, and were then subjected to FLM for detecting a) BGs via direct AF750 emission (Cy7 channel) and via the presence of INP (FITC channel) and b) tumor cells via DAPI emission. The association of BGs with tumor cells had been imaged and investigated through three imaging aims: 1. Overlap between AF750 and INP emission at different magnifications; 2. ability to observe the AF750-BGs through Cy7 filter at 10X magnification and exposure time between 1.5-2 s; 3. imaging the intact BGs at 60X magnification. Similarly, the second part of thesis employed fluorescence microscopy techniques to observe archaea infiltration in CT26-based 3D MCTS. These spheroids were inoculated with the nonpathogenic, strictly anaerobic archaea, Methanococcus maripaludis S0001, and the localization of archaea was tracked at three timepoints after inoculation, i.e.; 24, 120 and 168 hours, in order to observe if they are able to infiltrate into the tumor spheroids. Fluorescent imaging for the DAPI stained spheroids’ cryosections illustrated the localization of archaea labeled with the dye AF488 (emission in the FITC channel) on the surface of spheroids inoculated with archaea for 24h, and the tendency of this microbe to move toward the center after 120 hours of inoculating the spheroids. Finally, DAPI and FITC merged channels for the cryosections of spheroids inoculated with “AF488 labeled” archaea for 168 hours could proof the localization of anaerobic archaea near and within the hypoxic areas of these spheroids, which could predict in turn the selectivity of these microorganisms for in vivo targeting the hypoxic centers of cancerous tissues.