title: Heme oxygenase 2 interacts with the potassium channel TREK-1 and modulates its open probability by producing carbon monoxide
title: Hämoxygenase-2 reguliert die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kaliumkanals TREK-1durch die Produktion von Kohlenstoffmonoxid
Creators: name: Koschinksky, Kristin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: K2P-Kanäle , Protein- Protein Interaktion
nitric oxide (NO)
CO-freisetzende Moleküle (CORMs)
Stickstoffmonoxid (NO)
K2P-channel, TREK-1
Hämoxygenase-2 , Kohlenstoffmonoxid
heme oxygenase 2 (HO-2)
TREK-1
protein-protein interaction, carbon monoxide (CO)
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
CO-releasing molecules (CORMs)

description: The mechanosensitive K2P-channel
      TREK-1 is regulated by various physical and chemical stimuli,
      as well as interaction partners. The aim of this study was to
      characterize the interaction between TREK-1 and the enzyme
      HO-2, which catalyzes the breakdown of heme into biliverdin,
      Fe2+ and CO, and to clarify the functional consequences.
      Furthermore, the influence of CO on the TREK-1 channel was
      examined. The interaction between TREK-1 and HO-2 was
      confirmed by coimmunoprecipitation in HeLa cell lysates. In
      addition, yeast-two-hybrid experiments with HO-2 deletion
      mutants showed that the distal carboxyterminus of HO-2 is
      crucial for the interaction with the TREK-1 channel. The
      functional consequences of this interaction were examined by
      using two-electrodevoltage- clamp (TEVC) measurements in
      Xenopus oocytes. Coexpression of human HO-2 and TREK-1 led to
      a significant increase of TREK-1 current amplitude, whereas
      coexpression of the catalytically inactive enzyme HO-2H45N,
      which still interacts with TREK-1, evoked no significant
      change in the TREK-1 current amplitude. The catalytic
      activity of HO-2 in Xenopus oocytes was modulated by
      application of HO-2 activators and inhibitors. Xenopus
      oocytes constitutively express HO-2. Application of Hemin, a
      HO-2 activator, led to a significant increase in TREK-1
      currents. Additional coexpression of human HO-2 led to a
      significantly higher activation of TREK-1 currents.
      Application of zinc protoporphyrin, an HO-2 inhibitor, led to
      significant reduction of TREK-1 currents, which was higher
      after additional coexpression of human HO-2. Application of
      carbon monoxide (CO) via CO-releasing molecule CORM-2
      produced a significant increase of TREK-1 currents in Xenopus
      oocytes and in HEK293 cells. Further studies with the
      PhotoCORM-S1 and CO gas also increased TREK-1 currents
      significantly. Furthermore, the related mechanosensitive
      K2P-channels TREK-2 and TRAAK could also be activated by CO
      by a comparable degree as TREK-1. CO is an important cellular
      signaling molecule which interacts with various proteins and
      modulates a number of signaling pathways. Investigations of a
      possible CO-dependent signaling pathway showed that the
      different phosphorylation sites S362 (PKG-phosphorylation
      site) and S344 (PKAphosphorylation site) in the
      carboxyterminus of the channel were not involved in
      CO-mediated activation of the channel. Furthermore, deletion
      of the TREK-1 amino- or carboxyterminus showed that the
      shortened channels could still be activated by CO. Activation
      of TREK-1 currents by the gaseous signaling molecule NO was
      abolished in measurements with the carboxyterminal deletion
      mutant. Thus, the gaseous signaling molecules CO and NO
      appear to influence the open probability of TREK-1 via
      different signaling pathways. A direct COeffect on TREK-1
      channels was proven by using inside-out measurements
      (giant-patches) in Xenopus oocytes. My results support the
      hypothesis that HO-2 binds to TREK-1 channels and regulates
      the open probability of the channel via local production of
      CO.
description: Der mechanosensitive K2P-Kanal
      TREK-1 wird durch eine Vielzahl von physikalischen und
      chemischen Stimuli, sowie durch eine Reihe von
      Interaktionspartnern reguliert. Das Ziel dieser Arbeit
      bestand darin, die Interaktion des TREK-1 Kanals mit dem
      Enzym Hämoxygenase 2 (HO-2), welches den stereospezifischen
      Abbau von Häm zu Biliverdin, Fe2+ und CO katalysiert, zu
      charakterisieren und die funktionellen Auswirkungen
      aufzuklären. Die Interaktion zwischen dem Enzym HO-2 und
      TREK-1 konnte durch Koimmunopräzipitation bestätigt werden.
      Untersuchungen im Hefe-Zwei-Hybrid System mit HO-2
      Verkürzungsmutanten zeigten, dass der distale Carboxyterminus
      der HO-2 eine wichtige Rolle bei der Interaktion mit dem
      TREK-1 Kanal spielt. Die funktionellen Auswirkungen der
      Interaktion wurden mittels Strommessungen in Xenopus Oozyten
      untersucht. Eine Koexpression von humaner HO-2 und TREK-1
      führte zu einer signifikanten Erhöhung der Stromamplitude von
      TREK-1, während die Koexpression der katalytisch inaktiven
      Form des Enzyms HO-2H45N, die ebenfalls mit TREK-1
      interagierte, keine signifikante Änderung der Stromamplitude
      im Kanal hervorrief. Die funktionelle Relevanz der
      katalytischen Aktivität der HO-2 wurde mit Hilfe von
      Aktivatoren und Inhibitoren untersucht. Zugabe von Hämin,
      einem Aktivator der HO-2, führte in Oozyten, die HO-2
      konstitutiv exprimieren, zu einem signifikanten Anstieg des
      TREK-1 Stromes. Zusätzliche Koexpression der humanen HO-2
      führte zu einer signifikant stärkeren Zunahme des TREK-1
      Stromes. Applikation von Zinkprotoporphyrin (ZnPP), einem
      HO-2 Inhibitor, führte hingegen zu einer signifikanten
      Reduktion der TREK-1 Stromamplitude. Applikation von CO mit
      Hilfe des CO-freisetzenden Moleküls CORM-2 führte zu einer
      Aktivierung des TREK-1 Kanals in Xenopus Oozyten und HEK293
      Zellen. Messungen mit PhotoCORM-S1 und CO-Gas zeigten
      ebenfalls eine signifikante Aktivierung des TREK-1 Kanals.
      Auch die mechanosensitiven K2P-Kanäle TREK-2 und TRAAK
      konnten in ähnlichem Ausmaß wie TREK-1 durch CO aktiviert
      werden. CO ist ein wichtiges zelluläres Signalmolekül,
      interagiert mit einer Vielzahl von Proteinen und kann eine
      Reihe von Signalwegen modulieren. Meine Untersuchungen zu
      möglichen CO-abhängigen Signalwegen zeigten, dass die
      verschiedenen Phosphorylierungsstellen S362 (PKG-abhängige
      Phosphorylierungsstelle) und S344 (PKA-abhängige
      Phosphorylierungsstelle) im Carboxyterminus des TREK-1 Kanals
      nicht an der CO-vermittelten Aktivierung beteiligt sind. Eine
      Deletion des zytosolisch lokalisierten TREK-1 Aminoterminus
      bzw. Carboxyterminus zeigte darüber hinaus, dass die
      verkürzten Kanalvarianten weiterhin durch CO aktiviert werden
      konnten. Die Aktivierung des TREK-1 Stromes durch das
      gasförmige Signalmolekül NO war bei der carboxyterminalen
      Verkürzungsvariante allerdings nicht mehr möglich. Diese
      Ergebnisse lassen vermuten, dass die gasförmigen
      Signalmoleküle CO und NO die Öffnungswahrscheinlichkeit von
      TREK-1 durch unterschiedliche Mechanismen beeinflussen. Eine
      direkte Wirkung von CO auf TREK-1 konnte durch inside-out
      Messungen in Giant-Patches von Xenopus Oozyten nachgewiesen
      werden. Meine Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass
      HO-2 an TREK-1 Kanäle bindet und durch lokale Produktion von
      CO die Öffungswahrscheinlichkeit des Kanals
      reguliert.