Ο ρόλος του UBE2T στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα
Creators: name: Λάμπρου, Κωνσταντίνος Αριστείδης Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα
βιοδείκτες
UBE2T(Ubiquitin-conjugating enzyme E2 T)
hepatocellular carcinoma
biomarkers

description: Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η τρίτη πιο συχνή αιτία θανάτου από κακοήθειες, με συνολικά 600.000 θανάτους ετησίως. Οι κύριοι περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη, τη συντήρηση και την ανάπτυξη HCC είναι ιογενείς παράγοντες όπως ο ιός της ηπατίτιδας Β και C, ο χρόνιος αλκοολισμός, οι αυτοάνοσες ασθένειες, το κάπνισμα, η παχυσαρκία, το μεταβολικό σύνδρομο, η μη αλκοολική στεατοπαπατίτιδα (NASH) και η μόλυνση από αφλατοξίνη. Η συνήθης πορεία του HCC είναι η εξής: χρόνια φλεγμονή, σχηματισμός ινώδους ιστού, κίρρωση και HCC. Το UBE2T είναι ένα γονίδιο που υπερεκφράζεται έως και σήμερα που υποβάλλονται σε καρκινικούς τύπους και οδηγεί σε μετασχηματισμό και ανάπτυξη κυττάρων. Επειδή το UBE2T είναι ένα από τα ένζυμα Ε2 που εκφράζονται υπό έλεγχο κυττάρου, οποιαδήποτε ανίχνευση έκφρασης προς τα πάνω μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικός δείκτης. Επειδή, μεταξύ των διαφορετικών καρκίνων, το UBE2T φαίνεται να επηρεάζεται από το ιστολογικό μικροπεριβάλλον, χρησιμοποιώντας διαφορετικούς στόχους κάθε φορά (ποικιλομορφία στα υποστρώματα που επηρεάζει) και διαφορετικές οδούς για τη διευκόλυνση της ανάπτυξης του όγκου. Σε αυτήν τη μελέτη, για να διερευνήσουμε τις αλληλεπιδράσεις του UBE2T με άλλα γονίδια, δημιουργήσαμε κυτταρικά μοντέλα των κυττάρων HepG2 και Huh7 που είχαν παροδική υπερέκφραση του γονιδίου UBE2T ή παροδική πτώση του ίδιου γονιδίου. Στη συνέχεια λήφθηκε RNA για κάθε κυτταρικό μοντέλο και πραγματοποιήσαμε σχετική μελέτη έκφρασης των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν (NEK2, NUF2, EZH2) για να δούμε αν η υπερέκφραση ή η καταστολή του γονιδίου UBE2T επηρεάζει την έκφραση αυτών των γονιδίων. Δεν ελήφθησαν σημαντικά αποτελέσματα. Η δεύτερη προσέγγιση ήταν με τη δημιουργία σταθερών μονοκλωνικών κυττάρων HepG2 και Huh7 που υπερεκφράζουν το γονίδιο UBE2T. Στη συνέχεια, το RNA εκχυλίστηκε και πραγματοποιήθηκε για άλλη μια φορά σχετική μελέτη έκφρασης για τα ίδια γονίδια ενδιαφέροντος (NEK2, NUF2, EZH2) συν τρία ακόμη γονίδια που είναι δεύτεροι αγγελιοφόροι στις οδούς UBE2T (CDC20, MAD2L1, CCNB1). Για τα πρώτα τρία γονίδια η έκφραση ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στις παροδικές κυτταρικές σειρές. Για τους δεύτερους αγγελιοφόρους δεν υπήρξε σημαντική αλλαγή στην έκφραση. Η επόμενη προσέγγιση ήταν με τη δημιουργία σταθερών μονοκλωνικών κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν το UBE2T που προέρχεται από φυσιολογικά αθανατοποιημένα ηπατοκύτταρα (IHH). Μετά τον προσδιορισμό των κλώνων πραγματοποιήσαμε δύο δοκιμασίες σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων και το δυναμικό ανάπτυξης σε συνθήκες ανεξάρτητες από την προσκόλληση σε ένα υπόστρωμα (δοκιμασία μηδέν και δοκιμασία μαλακού άγαρ). Η μετανάστευση των κυττάρων, δηλαδή η μετακίνηση των κυττάρων από τη μία περιοχή στην άλλη, συνήθως λόγω ενός συγκεκριμένου μηνύματος διέγερσης, είναι ένα καθιερωμένο γεγονός σε πολλές διαδικασίες, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, η εμβρυογένεση και η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Η δοκιμασία γρατσουνιών, διαφορετικά μια δοκιμασία επούλωσης πληγών, είναι μια πολύ καλή μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της μετανάστευσης των κυττάρων. Στην ανάλυση μαλακού άγαρ τα κύτταρα αναπτύσσονται σε περιβάλλον 3D (πήκτωμα άγαρ) και για αυτό το λόγο αυτή η πειραματική προσέγγιση είναι ουσιαστικά μια προσομοίωση της ανάπτυξης ενός όγκου όπως γίνεται in vivo. Για άλλη μια φορά δεν ελήφθησαν στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα συγκρίνοντας τους σταθερούς κλώνους με τους φυσιολογικούς μάρτυρες.
description: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third most common cause of death from malignancies, with a total of 600,000 deaths per year. The main environmental risk factors for the development, maintenance and development of HCC are viral factors such as hepatitis B and C virus, chronic alcoholism, autoimmune diseases, smoking, obesity, metabolic syndrome, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and aflatoxin infection. The usual course of HCC is as follows: chronic inflammation, fibrous tissue formation, cirrhosis and HCC. UBE2T is a gene that is overexpressed in up to currently undergoing cancerous types and leading to transformation and cell growth. Because UBE2T is one of the E2 enzymes which are expressed under cell control, any detection of expression upwards can be used as a diagnostic marker. Since, among the different cancers, UBE2T appears to be influenced by the histological microenvironment, using different targets each time (diversity in the substrates it affects) and different pathways to facilitate tumor growth. In this study, in order to investigate UBE2T’s interactions with other genes, we created cell models of the HepG2 and Huh7 cell lines that had transient overexpression of the UBE2T gene or transient knock down of the same gene. Then RNA was obtained of each cell model and we performed relative expression study of the genes of interest ( NEK2, NUF2 , EZH2) to see whether the overexpression or suppression of UBE2T gene affects the expression of these genes. No significant results were obtained. The second approach was with creating stable monoclonal HepG2 and Huh7 cell lines that overexpress UBE2T gene. Then RNA was extracted and once again relative expression study was performed for the same genes of interest(NEK2, NUF2, EZH2) plus three more genes that are second messengers in the UBE2T pathways ( CDC20, MAD2L1, CCNB1). For the first three genes expression was similar to the one observed in the transient cell lines. For the second messengers there was no significant change in expression. The next approach was with creating stable monoclonal cell lines that overexpress UBE2T deriving from normal immortalized hepatocytes (IHH). After establishing the clones we performed two assays concerning cell migration and growth potential in conditions independent of adherence to a substrate (scratch assay and soft agar assay). Cell migration, that is, the movement of cells from one region to another, usually due to a certain stimulus message, is an established event in many processes, such as cell differentiation, embryogenesis and cancer cell metastasis. The scratch assay, otherwise a wound healing test, is a very good method of quantifying cell migration. In the soft agar assay the cells grow in 3D environment (agar gel) and for this reason this experimental approach is essentially a simulation of the growth of a tumor as it is done in vivo. Once again no statistically significant results were obtained comparing the stable clones to normal controls.