title: Kinetic and thermodynamic analysis of the bI5 intron bound to its protein cofactors
Creators: name: Mühlhölzl, Lukas
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Zu den meist analysierten und studierten nicht codierenden RNAs gehört die Gruppe der selbst spleißenden Gruppe I Introns. Um deren autokatalytische Funktion zu verstehen, müssen deren Struktur und der dazugehörende Faltungsprozess analysiert werden. bI5, das fünfte und terminale Intron der Cytochrom b pre-mRNA von Saccharomyces cerevisiae, gehört zu den Gruppe I Introns. In vivo benötigt bI5 zwei Hilfsproteine um seine native Konformation zu erreichen. Der Kofaktor Cbp2 unterstützt die Faltung von bI5, indem es mit Intermediat-Konformationen interagiert und den Faltungsprozess finalisiert. Die DEAD-box Helikase Mss116p bindet und hydrolisiert ATP um stabile, aber kinetisch gefangene Konformationen aufzulösen. Der genaue Interaktionsmechanismus von Mss116p ist noch unklar. In vitro kann die native Konformation von bI5 ohne Mss116p, aber mit Cbp2 und einer Mg2+ Konzentration von ~7mM erreicht werden. Um das Zusammenspiel von bI5, Cbp2 und Mss116p in vivo verstehen zu können, muss die Rollenverteilung der beiden Proteine während des Faltungs- und Splicing Prozesses evaluiert werden. Hierfür haben wir die Transformationsrate der pre-mRNA zu dessen Splicing-Produkten, anhand von Splicing Experimenten in vitro ermittelt. Bei einem äquimolaren Verhältnis Cbp2/Mss116p und bei einem 2 fachen Überschuss an Mss116p, stieg die Transformationsrate, verglichen mit Cbp2 ohne Mss116p Unterstützung, lediglich 1.5-fach an. Bei einem 4 fachen Überschuss an Mss116p stieg die Transformationsrate auf das 2.5-3 fache. Diese Ergebnisse waren sowohl bei gleichzeitiger Zugabe der Proteine zu denaturiertem bI5, bei Zugabe von Mss116p zu vorgeformten Cbp2 – bI5 Komplex und bei der Zugabe von Cbp2 zu vorgeformtem Mss116p-bI5 Komplex zu beobachten. Das lässt vermuten, dass es keine hierarchische Ordnung der beiden Proteine gibt. Außerdem scheint es kein Konkurrieren der beiden Proteine um Bindungsstellen zu geben. Da der Anstieg der Transformationsrate in Anwesenheit von Mss116p nur gering ist, scheint nur eine Sub-Population Mss116p für den Faltungsprozess zu benötigen. Im Gegensatz dazu benötigt die gesamte Population von bI5 den Kofaktor Cbp2. Diese Beobachtung geht Konform mit dem Fakt, dass Splicing von bI5 in vivo um 50% reduziert ist, wenn MSS116 abgeschaltet ist. Im Gegensatz dazu findet bei einem Cbp2 knock-out kein Splicing von bI5 mehr statt (Sachsenmaier 2014). Für weitere Charakterisierung der Protein-RNA Interaktionen haben wir die Bindungsaffinitäten von Cbp2 und Mss116p ermittelt. Cbp2 weist eine Dissoziationskonstante von 3.03 ± 0.3nM, Mss116p eine von 24.5 ± 5.1nM auf. Hohe Affinität von Cbp2 zu bI5 ist mit der sehr spezifischen Bindung zu erklären. Mss116p assistiert beim Splicing-Prozess von Gruppe I und Gruppe II Introns und muss daher weniger Spezifität in der Bindung vorweisen. Dies erklärt die verhältnismäßig niedrige Bindungsaffinität von Mss116p zu bI5.
description: One of the most studied non-coding RNAs are the self-splicing group I introns. To understand their autocatalytic function, their structure and corresponding folding process need to be analysed. bI5, the fifth and terminal intron of the cytochrome b pre-mRNA of Saccharomyces cerevisiae, belongs to the class of group I introns. For proper folding in vivo, bI5 requires two assisting proteins. In vitro, the cofactor Cbp2 was shown to facilitate folding of bI5 by capturing the near-native conformation, reached under near-physiological Mg2+ conditions, and finalizes the folding process. While the DEAD-box helicase Mss116p is known to use ATP binding and hydrolysis to unwind RNA duplexes in vitro, the role of Mss116p is not fully understood. To understand the in vivo interplay of proteins and pre-mRNA, it is necessary to define the roles of both proteins during the splicing and folding process. Therefore, we determined the observed rate constant (kobs), derived from the pre-mRNA decay, by performing splicing assays under various in vitro conditions. Using equimolar ratios of Cbp2 and Mss116p in the splicing process of bI5 or a 2-fold molar excess of Mss116p over Cbp2 results in a ~1.5-fold increase in kobs, compared to Cbp2-assisted bI5 splicing. Increasing the Mss116p to Cbp2 molar ratio to 4-fold further enhances the observed rate constant of bI5 splicing (~2.5 - 3-fold). Importantly, these observed effects were virtually identical whether both proteins were added concomitantly to the denatured bI5 intron or if the 2nd protein was added to either pre-formed protein-bI5 complex. This suggest that the order of events, in which the two proteins encounter and act on the RNA, is not a critical determinant for promoting efficient bI5 splicing. Also, our data implies that the two proteins do not appear to compete for a binding site. Since the increase in kobs in the presence of Mss116p in addition to Cbp2 is only small, this could indicate that only a sub-population of bI5 pre-mRNAs depends on Mss116p for proper folding, while the entire bI5 population requires Cbp2 for reaching the native conformation. This is also in line with the fact that in vivo bI5 splicing is reduced to 50% in the mss116 knock-out strain, while it is abolished in the cbp2 knock-out strain. For characterization of protein-RNA interactions we determined the affinity of Cbp2 and Mss116p to bI5. Cbp2 showed a dissociation constant of 3.03 ± 0.3nM, while that of Mss116p is 24.5 ± 5.1nM. Cbp2 binding is very specific, which could explain the higher affinity compared to Mss116p. Mss116p, on the other hand, needs to bind to two structurally distinct RNA classes, group I and group II introns respectively, and therefore might be less specific and have a lower affinity.