title: Molecular determinants of dephosphorylation and gene activation of the signal transducer and activator of transcription 1
title: Molekulare Determinanten der Dephosphorylierung und Genaktivierung des Signaltransduktors und Aktivators der Transkription 1
Creators: name: Staab, Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: dephosphorylation
gene activation
Signaltransduktion
Linker-Domäne
Chemie
STAT1
Dephosphorylierung
signaltransductor
Genaktivierung
linker domain

description: STAT proteins are members of an
      evolutionary highly conserved protein family. They consist of
      a modular domain structure with six well-characterized
      functional domains. The linker domain, which connects the
      amino-terminal DNA-binding domain with the carboxy-terminal
      SH2-domain, is known to be engaged in DNA binding and
      transcriptional activation. However, the molecular mechanisms
      regulating transcriptional modulation by the linker domain
      are largely unknown. To gain a deeper insight into the role
      of this domain in DNA-binding and transcriptional activation,
      point mutants in the linker domain of STAT1 were generated
      and functionally characterized. The substitution of a
      conserved glutamate residue in position 500 resulted in
      enhanced transcriptional activation of IFN-sensitive genes,
      whereas tyrosine phosphorylation and nuclear accumulation
      were both similar to the wild-type protein. In contrast,
      target gene activation after stimulation with IFN was
      significantly reduced. This observation shows that the linker
      domain is responsible for ligand-dependent differential gene
      activation. Furthermore, it was demonstrated that the linker
      domain contributes to the inactivation of
      tyrosine-phosphorylated STAT1. Mutation of a highly conserved
      lysine residue in position 525 led to the disruption of a
      salt bridge with a glutamate residue in the SH2 domain of the
      same monomer. This salt bridge appears to be essential for
      the stabilization of parallel STAT1 dimers. Loss of this
      stabilization leads to a shift of STAT1 dimers to the
      antiparallel conformation. As compared to the wild-type
      protein, destabilizing this interaction resulted in a mutant
      with diminished nuclear accumulation, reduced tyrosine
      phosphorylation and target gene activation upon stimulation
      of cells with IFN. Further experiments including in vitro
      assays demonstrated that the inactivating T-cell phosphatase
      preferentially dephosphorylates STAT1-K525A as compared to
      the wild-type protein. To get further insight of the
      DNA-binding of STAT1 a point mutant of the DNA-binding domain
      was characterized. In contrast to other DNA-binding mutants
      this mutant has no direct contacts to DNA, but nevertheless
      showed a reduced affinity to DNA. This mutant shows that the
      architecture of the whole domain is required for functional
      DNA-binding.
description: Bei den STAT-Proteinen handelt es
      sich um eine evolutionär hochkonservierte Proteinfamilie, die
      aus sechs funktionellen Domänen aufgebaut ist. Obgleich die
      Linker-Domäne, die zwischen der aminoterminal davon gelegenen
      DNA-Binde- und der carboxyterminal positionierten SH2-Domäne
      lokalisiert ist, einen zentralen Bereich in der modularen
      Molekülorganisation beansprucht, ist über deren
      physiologische Bedeutung bislang vergleichsweise wenig
      bekannt. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die
      Linker-Domäne von STAT1 einen Einfluss auf DNA-Bindung und
      transkriptionelle Aktivität besitzt; jedoch konnte der
      molekulare Mechanismus dafür nicht identifiziert werden. Um
      einen besseren Einblick in die Rolle der Linker-Domäne im
      Zusammenhang von DNA-Bindung und Zielgenerkennung zu
      gewinnen, wurden Punktmutanten einzelner konservierter
      Aminosäurereste des STAT1-Moleküls generiert und diese
      funktionell charakterisiert. Die Substitutionsmutation eines
      konservierten Glutamatrests in Position 500 führte zu einer
      verbesserten transkriptionellen Aktivität nach
      IFN-Stimulation, während sich Phosphorylierungs- und
      Kernakkumulationskinetik sowie DNA-Bindeaffinität nicht vom
      Wildtyp-Molekül unterschieden. Die IFN-abhängige
      Zielgenaktivierung war im Gegensatz zur IFN-vermittelten
      Signalantwort jedoch supprimiert. Dieses zeigt, dass die
      Linker-Domäne ursächlich an einer differentiellen,
      ligandenabhängigen Gen-aktivierung beteiligt ist. Des
      Weiteren konnte eine Beteiligung der Linker-Domäne an der
      Dephosphorylierung von STAT1 nachgewiesen werden. Die
      Mutation eines hochkonservierten Lysinrests in Position 525
      führte zum Verlust einer für die Stabilisierung der
      parallelen Dimerkonformation essentiellen Salzbrücke mit
      einem kritischen Glutamatrest der SH2-Domäne des gleichen
      Monomers. Dieser Stabilitätsverlust scheint das Gleichgewicht
      der Konformere im STAT1-Dimer zugunsten der antiparallelen
      Dimerkonformation zu verschieben, wobei die anti-parallele
      Konformation von der STAT1-inaktivierenden Phosphatase
      bevorzugt wird. Durch Dephosphorylierungsassays konnte
      gezeigt werden, dass die K525A-Mutante gegenüber dem
      Wildtyp-Protein ein bevorzugtes Substrat der nukleären
      T-Zell-Phosphatase ist. Dies resultiert nach Stimulation mit
      IFN in einer erhöhten In-vivo- und
      In-vitro-Dephosphorylierungsrate, verminderten
      Tyrosin-Phosphorylierung, reduzierten Kernakkumulation und
      einer konsekutiv verminderten Genaktivierung in vivo. Um
      einen besseren Einblick in die DNA-Bindung von STAT1 zu
      gewinnen, wurde zusätzlich eine weitere Mutante der
      DNA-Bindedomäne charakterisiert, die im Gegensatz zu anderen
      DNA-Bindemutanten nicht in direktem Kontakt mit der DNA-Helix
      steht, aber in ihrer Affinität zur DNA inhibiert ist. Wie mit
      Hilfe dieser Struktur-mutante gezeigt werden konnte, haben
      nicht nur Aminosäuren, die in direktem Kontakt mit der DNA
      stehen einen Einfluss auf die DNA-Bindung, sondern auch
      solche, die an der Bildung der dreidimensionalen
      Domänenstruktur beteiligt sind.