Characterising protein-protein interactions of the high osmolarity glycerol pathway in Saccharomyces cerevisiae
Creators: name: Augustine-Rubak, Jillian
Publisher: name: (:none)
Year: 2018

description: The ability of organisms to sense and respond to changes in their environment is one of the key characteristics of life. This is possible due to cell signalling; the inter- and intracellular transmission of messages throughout an organism. In eukaryotic organisms, cells can respond to a range of stimuli such as UV light, heat and hyperosmotic stress through the activation of signalling responses involving the mitogen-activated protein kinase (MAPK) p38 also referred to as a stress-activated protein kinase (SAPK) (Cuadrado &amp; Nebreda 2010; Wagner &amp; Nebreda 2009; Zarubin &amp; Han 2005). In the yeast Saccharomyces cerevisiae, as part of the High Osmolarity Glycerol (HOG) response, a MAPK cascade is activated the upon exposure to hyperosmotic conditions which leads to activation of the MAPK and p38 homologue, Hog1. Although many proteins required for Hog1 activation have been identified, conflicting results regarding the roles of these proteins mean that the exact mechanism of pathway activation is not clearly understood. In this work, I used the M-Track assay, a protein-proximity assay specially designed to detect short lived protein-protein interactions in S. cerevisiae, to study the interactions of kinases of the MAPK cascade and their associated proteins. I found that, in contrast to current models of pathway activation, the MAPKKK Ste11 and its adaptor protein Ste50 only localise to the plasma membrane upon hyperosmotic stress and are not “primed” at the membrane as was previously thought. Moreover, although Ste11/50 membrane localisation is enhanced by the presence of transmembrane proteins Msb2, Hkr1 and Sho1, it can still localise independently of these factors. In addition, Ste11 is recruited to the membrane independently of its activation state. Through further experiments I could exclude the possibility that activation of Calcineurin signalling or inactivation of Tor1-Ypk1/2 signalling (both HOG pathway-independent hyperosmotic stress responses) were major regulation events in the process of Ste11 membrane localisation. In addition, I found that MAPKK Pbs2 interacts with Sho1 in the absence of osmotic stress, but this interaction is strongly enhanced during osmotic stress. Finally, the question of how the transmembrane proteins interact with each other was addressed. I found that Opy2 and Sho1, the membrane anchors for Ste11 and Pbs2 respectively, come into closer proximity to each other during osmotic stress and this increase in proximity depends on the osmosensors Msb2 and Hkr1. Taken together, these results suggest that although Ste11 and Pbs2 are recruited to the plasma membrane independently of each other, stress-induced clustering of proteins around the osmosensors Msb2 and Hkr1 ensures efficient MAPK cascade activation during hyperosmotic stress.
description: In den Zellen höherer Eukaryoten führen die meisten physikochemischen Stressbedingungen zur Aktivierung der sogenannten mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) p38, welche auch als stress-aktivierte Proteinkinase (SAPK) bezeichnet wird (Cuadrado &amp; Rebreda 2010; Wagner &amp; Nebreda 2009; Zarubin &amp; Han 2005). In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wird bei erhöhter extrazellulärer Osmolarität die p38-homologe MAPK Hog1 aktiviert. Obwohl bereits viele der Proteine, welche für die Regulation von Hog1 benötigt werden, identifiziert wurden ist der Mechanismus der Aktivierung dieser Signaltransduktionskaskade noch nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit konzentriere ich mich auf das Interaktions- und Lokalisationsverhalten unterschiedlicher "upstream" Faktoren dieser Kaskade. Hierzu verwendete ich einen Interaktions Assay (M-Track (Zuzuarregui, 2015)), der speziell zum Nachweis kurzlebiger Protein-Protein-Wechselwirkungen in S. cerevisiae entwickelt wurde. Ich konnte zeigen, dass die MAPKK Kinase Ste11 und ihr Adapterprotein Ste50 nur unter hyperosmotischen Stressbedingungen an die Plasmamembran rekrutiert werden und dass diese nicht, wie bisher angenommen, permanent membran-assoziiert sind. Obwohl die Membranlokalisierung von Ste11 und Ste50 durch die Transmembranproteine Msb2, Hkr1 und Sho1 unterstützt wird, kann sie auch unabhängig von diesen stattfinden. Außerdem wird Ste11 unabhängig von ihrem Aktivierungszustand an die Plasmamembran rekruitiert. Darüber hinaus findet die Membranrekrutierung von Ste11 unabhängig von Calcineurin- oder Tor1 Ypk1/2-Signalen (beide sind Schlüsselfaktoren in HOG-unabhängigen Stressantworten der Bäckerhefe) statt. Zusätzlich fand ich heraus, dass die MAPK Kinase Pbs2 bereits in Abwesenheit von osmotischem Stress mit dem membran-assoziierten Osmosensor Sho1 interagiert, diese Wechselwirkung unter osmotischen Stress aber wesentlich verstärkt wird. Schließlich konnte ich zeigen, dass die Membrananker für Ste11 und Pbs2, Opy2 und Sho1, bei osmotischem Stress abhängig von den Osmosensoren Msb2 und Hkr1 verstärkt miteinander interagieren. Zusammengefasst legen meine Resultate folgende zwei Punkte nahe: 1) Ste11 und Pbs2 werden unabhängig voneinander zur Plasmamembran rekrutiert. 2) Die stressinduzierte Clusterbildung um die Osmosensoren Msb2 und Hkr1 sorgt für eine effiziente Aktivierung der Signaltransduktionskaskade während des hyperosmotischen Stresses.