Η φωσφορυλίωση της θρεονίνης-14 εμπλέκεται στην κυτταρική διαμετακίνηση της ανθρώπινης ριβοσωμικής πρωτεΐνης rpS5
Creators: name: Πίτου, Μαρία Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Ριβόσωμα
Ριβοσωμικές πρωτεΐνες
Ριβοσωμική πρωτεΐνη S5
Ψευδοφωσφορυλίωση
Ribosome
Ribosomal proteins
rpS5
Pseudophoshorylation

description: Το ευκαρυωτικό ριβόσωμα αποτελεί ένα από τα πιο πολύπλοκα και σημαντικά οργανίδια του κυττάρου. Δομικά συγκροτείται από δυο υπομονάδες, την μικρή και την μεγάλη. Αποτελείται από RNA και πρωτεΐνες, μια από τις οποίες είναι και η rpS5. Η rpS5 εντοπίζεται στην κεφαλή της μικρής υπομονάδας και εκτός από την βιογένεση του ριβοσώματος εμπλέκεται και σε άλλες διεργασίες, όπως η έναρξη της διαφοροποίησης. Γενικά, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες αποτελούν στόχους φωσφορυλίωσης, η οποία επηρεάζει και την κυτταρική διαμετακίνηση των πρωτεϊνών. Σε φωσφορυλίωση υπόκειται και η rpS5, όταν βρίσκεται στην ελεύθερη μορφή της. Με εργαλεία βιοπληροφορικής βρέθηκαν τα αμινοξέα που αποτελούν στόχους φωσφορυλίωσης. Πιο συγκεκριμένα, η rpS5 φωσφορυλιώνεται στην θρεονίνη 133 και στη συνέχεια στη σερίνη 24 ώστε να μετακινηθεί από τον πυρήνα στους πυρηνίσκους, όπου και ξεκινά η βιογένεση. Η μετακίνηση από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα πραγματοποιείται μέσω του συμπλέγματος του πυρηνικού πόρου λόγω της αλληλεπίδρασης με την ευέλικτη περιοχή 38-Tyr Tyr-50 aa. Στην αμινοτελική περιοχή η rpS5 φωσφορυλιώνεται in vivo και στην θρεονίνη 14. Για να μελετηθεί η in vivo φωσφορυλίωση χρησιμοποιήθηκε η ψευδοφωσφορυλίωση, δηλαδή η μετάλλαξη του αμινοξέος στη θέση 14 σε ασπαραγινικό οξύ. Η μεταλλαγμένη rpS5 κλωνοποιήθηκε και εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, ώστε έπειτα από παροδική διαμόλυνση κυττάρων HeLa, να παρατηρηθούν σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Από τα πειράματα μικροσκοπίας συνεστίασης αποδείχθηκε ότι η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 14 είναι απαραίτητη ώστε η rpS5 να παραμείνει στον πυρήνα και τους πυρηνίσκους και να αρχίσει περαιτέρω η βιογένεση του ριβοσώματος.
description: The eukaryotic ribosome is one of the most complex and important organelles of the cell. Structurally it is composed of two subunits, the small and the large. It consists of RNA and proteins, one of which is the rpS5. The rpS5 is localized in the head of the small subunit and except of the ribosome biogenesis is implicated in other extraribosomal processes, such as the initiation of differentiation. Generally, ribosomal proteins are targets for phosphorylation. Phosphorylation mainly affects the cellular translocation of proteins. When rpS5 is in free form, is also subjected in phosphorylation. With the use of bioinformatics tools the amino acids that are targets of phosphorylation were found. More particularly, the rpS5 is phosphorylated at threonine 133 and then at serine 24 to move from the nucleus to the nucleoli, where biogenesis begins. Movement from the cytoplasm to the nucleus is performed via the nuclear pore complex because of the interaction with the flexible region 38- -50 aa. In the N-terminal region rpS5 is also phosphorylated in vivo in threonine 14. In order to study the in vivo phosphorylation pseudophosphorylation was used, i.e. the mutation of the amino acid at position 14 to aspartic acid. The mutant rpS5 was cloned and expressed as fusion protein with green fluorescent protein. After transient transfection of HeLa cells, the fused protein was observed in confocal microscopy. The confocal microscopy experiments demonstrated that phosphorylation in threonine 14 is necessary so that rpS5 remains in the nucleus and nucleoli and further starts ribosome biogenesis