title: Stem cell-based adipose tissue engineering
Creators: name: Neubauer, Markus
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2005
Subjects: subject: Adulte Stammzellen , Fibroblastenwachstumsfaktor , Tissue Engineering , Fettgewebe , Biomimetische Polymere , mesenchymal stem cells , basic fibroblast growth factor , tissue engineering , adipose tissue , biomimetic polymers
subject: 540 Chemie

description: In reconstructive and plastic surgery, there exists a continuously increasing demand for adipose tissue surrogates to replace fat tissue following tumor resections, complex trauma and congenital abnormalities as well as to augment tissues for cosmetic purposes. However, the optimal approach to adipose tissue replacement and reconstruction still remains elusive after more than a decade of research. The fast growing field of tissue engineering may provide alternative strategies that improve upon the conventional surgical options. Recently, promising new therapy strategies based on tissue engineering techniques that combine de novo adipogenesis and cell-based therapeutic approaches using adipocytes and preadipocytes have been developed. Stem cells derived from adult bone marrow, also referred to as mesenchymal stem cells (MSCs), represent a promising alternative cell source for soft tissue engineering. However, no study on tissue engineered fat exists using MSCs. In this thesis, the potential of MSCs for adipose tissue engineering applications was investigated. Thereby, the growth factor basic fibroblast growth factor (bFGF) was found to strongly enhance the hormonal cocktail-induced adipogenesis of MSCs in 2-D cell culture. This was determined on the histological and molecular level employing Oil Red O staining, FACS analysis, glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity measurement, and RT-PCR of the genes glucose transporter 4 (GLUT4) and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR gamma). This adipogenic culture protocol could be successfully transferred to a 3-D culture system using poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) scaffolds as a cell carrier. In presence of bFGF, the constructs partially resembled characteristics of native fat such as unilocular adipocytes as determined by osmium tetroxide histology and scanning electron microscopy and the expression of adipocyte-specific genes and proteins including GLUT4, PPAR gamma, and GPDH. In addition, biomimetic polymers were utilized for the generation of vascularized constructs by a novel principle based on the instant surface modification of polymeric scaffolds with the growth factor bFGF. Recently, a new generation of polymers, also termed biomimetic polymers, has been designed in order to control the cellular behavior on the molecular level. In our laboratory, poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid) (PEG-PLA) polymers have been synthesized to which peptides and proteins can be covalently bound by an instant surface modification. Furthermore, a technique has been recently developed to process these polymers into 3-D scaffolds. As a first step towards the proof of the feasibility of the tethering of bFGF to scaffolds made from a PEG-PLA derivative, the interactions of bFGF with PEG-PLA (adsorption, desorption) derivatives were investigated. In the next study, the tethering of bFGF to the scaffolds was characterized in detail. The maximum amount of bFGF which could be covalently immobilized to the scaffolds under appropriate conditions was determined. The stability of the linkage of bFGF to the scaffolds was determined in an in vivo experiment. Radiolabeled bFGF could be anchored for at least three weeks within the scaffolds. And last but not least, the bioactivity and the angiogenic effect of tethered bFGF was assessed in a further in vivo study. Remarkably, only tethered bFGF strongly induced angiogenesis within the scaffolds, whereas adsorbed bFGF remained ineffective. In conclusion, this thesis shows the potential of MSCs for adipose tissue engineering applications for the first time. Basic FGF was found to be a suitable growth factor for the enhancement of the adipogenesis of MSCs in 2-D and 3-D cell culture and to strongly improve the generation of engineered adipose tissue-like constructs. In addition, the delivery of bFGF by tethering to 3-D scaffolds allows for the vascularization of tissue constructs in vivo. This system represents a novel �off-the-shelf� product for tissue engineering applications. In future studies, a combination of these two strategies may lead to mature vascularized engineered adipose tissue.
description: In der rekonstruktiven und plastischen Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an Fettgewebe für dessen Ersatz nach Tumorektomien, komplexen Traumata und angeborenen Missbildungen sowie zur kosmetischen Vergrößerung von Geweben. Allerdings gibt es auch nach jahrelanger Forschung nach wie vor keinen optimalen Ansatz zum Ersatz und zur Rekonstruktion von Fettgewebe. Das sich schnell entwickelnde Feld des Tissue Engineerings zeigt neue und alternative Strategien auf, die den herkömmlichen chirurgischen Optionen überlegen sein könnten. Bisher wurden vielversprechende neue Therapiestrategien entwickelt, die auf Tissue-Engineering-Techniken basieren: De-novo-Adipogenese-Ansätze und zellbasierte Ansätze mit Adipozyten und Präadipozyten. Adulte Knochenmarksstammzellen, auch mesenchymale Stammzellen (MSCs) genannt, stellen eine vielversprechende alternative Zellart für das Tissue Engineering von Weichgeweben dar. Allerdings gibt es bisher keine Studien über gezüchtetes Fettgewebe, das mittels MSCs generiert wurde. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Erforschung des Potentials von MSCs für das Tissue Engineering von Fettgewebe. Dabei wurde herausgefunden, dass der Wachstumsfaktor Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) die durch einen Hormoncocktail induzierte Adipogenese der MSCs in der 2D-Zellkultur stark steigert. Dies wurde auf histologischer und molekularer Ebene durch Anwendung von Ölrot-Färbungen, FACS-Analytik, Glycerol-3-phosphatdehydrogenase-Aktivitätsbestimmungen und der RT-PCR der Gene Glukosetransporter 4 (GLUT4) und Peroxisome Proliferator-activated Receptor Gamma (PPAR gamma) ermittelt. Die etablierte Fettzellkultur konnte erfolgreich auf ein 3D-Kultursystem übertragen werden, wobei Polymilchsäure-co-glykolsäure (PLGA) als Material für die Zellträger verwendet wurde. Durch Zusatz von bFGF wurden Konstrukte erhalten, die teilweise Charakteristika von nativem Fettgewebe wie unilokuläre Fettzellen, analysiert mittels Osmiumtetroxid-Histologie und Rasterelektronenmikroskopie, und die Expression von adipozytenspezifischen Genen und Proteinen wie z.B. GLUT4, PPAR gamma und GPDH widerspiegeln. Außerdem wurden biomimetische Polymere für die Generierung von vaskularisierten Konstrukten verwendet, wobei durch ein neuartiges Prinzip die Oberfläche von Polymerscaffolds mit dem Wachstumsfaktor bFGF in einem Instantverfahren modifiziert wurden. In letzter Zeit wurde eine neue Generation von Polymeren konzipiert, die auch als biomimetische Polymere bezeichnet werden, um die Entwicklung von Zellen auf molekularer Ebene zu steuern. An unserem Lehrstuhl wurden Polyethylenglykol-polymilchsäure (PEG-PLA)-Polymere synthetisiert, an die Peptide und Proteine durch ein Instantverfahren zur Oberflächenmodifikation kovalent gebunden werden können. Zudem wurde eine Technik entwickelt, um diese Polymere zu 3D-Scaffolds prozessieren zu können. Als erster Schritt in Richtung des Nachweises der Durchführbarkeit der Anbindung von bFGF an PEG-PLA-Scaffolds wurden die Interaktionen von bFGF mit PEG-PLA-Derivaten (Adsorption, Desorption) untersucht. Die Anbindung von bFGF an die Scaffolds wurde in der nächsten Studie detailliert charakterisiert. Es wurde die maximale Menge an bFGF bestimmt, die an die Scaffolds unter geeigneten Bedingungen kovalent gebunden werden kann. Die Stabilität der Bindung zwischen bFGF und den Scaffolds wurde in einem In-vivo-Versuch ermittelt. Radioaktiv markiertes bFGF wurde für mindestens drei Wochen in den Scaffolds immobilisiert. Schließlich wurde die Bioaktivität und die angiogene Wirkung von immbolisiertem bFGF in einem weiteren In-vivo-Versuch untersucht. Bemerkenswerterweise induzierte nur angebundenes bFGF verstärkt Angiogenese in den Scaffolds, wogegen adsorbierter bFGF sich als unwirksam erwies. Als Fazit bleibt festzuhalten, dass diese Dissertation das Potential von MSCs für das Tissue Engineering von Fettgewebe zum ersten Mal zeigt. Basic FGF erwies sich als geeigneter Wachstumsfaktor für die Steigerung der Adipogenese von MSCs in 2D- und 3D-Zellkultur sowie für einen deutlichen Fortschritt bei der Generierung von gezüchteten fettähnlichen Konstrukten. Darüber hinaus ermöglicht die Anbindung von bFGF an 3D-Scaffolds die Vaskularisierung von Gewebekonstrukten in vivo. Dieses System stellt ein neuartiges Tissue-Engineering-Produkt �von der Stange� dar. In zukünftigen Sudien könnte eine Kombination dieser beiden Strategien zu künstlich hergestelltem, vollentwickeltem und vaskularisiertem Fettgewebe führen.