title: Токсин токсического шока стафилококков цитотоксичен для ткани эпителия молочной железы коров
Creators: name: ., М.П. Щанникова – мл. науч. сотрудник, лаборатория иммунохимии, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН(ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: mshannikova@mail.ru Е.К. Томгорова – к.б.н., профессор РАН, ст. науч. сотрудник, лаборатория клеточной инженерии, ФГБНУ Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. акад. Л.К. Эрнста» (п. Дубровицы, Моск. обл.) E-mail: tomgorova@rambler.ru  И.В. Шульчева – мл. науч. сотрудник, лаборатория иммунохимии, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: loskutova-i@mail.ru Б.С. Мельник – д.ф-м.н., руководитель группы спектроскопии белка, Институт белка РАН (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: bmelnik@phys.protres.ru К.К. Фурсова – к.б.н, ст.науч. сотрудник, лаборатория иммунохимии, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: phursova_k@rambler.ru С.Г. Семушина – науч. сотрудник, лаборатория биологических испытаний, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: emushina@bibch.ru А.Н. Носков – д.б.н., зав. лабораторией клостридиозов, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ (Москва) E-mail: a_n_noskov@mail.ru В.А. Казаков – д.м.н., ст.науч. сотрудник, лаборатория биологических испытаний, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: vitalij.tomsk@list.ru Я.В. Харитонова – магистр, Пущинский государственный естественно-научный институт E-mail: kharitonova-yv@mail.ru Н.А. Волкова – д.б.н., профессор РАН, вед. науч. сотрудник, рук. лаборатории клеточной инженерии, ФГБНУ Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. акад. Л.К. Эрнста» (п. Дубровицы, Моск. обл.)  E-mail: natavolkova@inbox.ru О.А. Артемьева – к.б.н, зав. Лабораторией микробиологии, ФГБНУ Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. акад. Л.К. Эрнста» (п. Дубровицы, Моск. обл.)  E-mail: vijmikrob@mail.ru Д.А. Никанова – науч. сотрудник, лаборатория микробиологии ФГБНУ Федеральный научный центр «Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. акад. Л.К. Эрнста» (п. Дубровицы, Моск. обл.)  E-mail: dap2189@gmail.com Н.А. Зиновьева – академик РАН, д.б.н., профессор, директор ФГБНУ Федеральный научный центр Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. акад. Л.К. Эрнста» (п. Дубровицы, Моск. обл.)  E-mail: n_zinovieva@mail.ru Ф.А. Бровко – д.б.н, зав. лабораторией иммунохимии, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ФИБХ РАН) (г. Пущино, Моск. обл.) E-mail: brovko@bibch.ru
Publisher: name: Издательство Радиотехника
Year: 2019

description: Экспрессия рекомбинантных белков в молоко животных часто связана с риском возникновения мастита. Важную роль в развитии заболевания играют стафилококки и секретируемые ими экзотоксины, при этом часто встречающимся является токсин токсического шока (TSST-1). Токсины способны оказывать отрицательное воздействие на иммунную систему как самого животного, так и потребителя молока – человека и требуется более тщательная очистка экспрессируемых белков. Зараженные сегменты молочной железы становятся малопродуктивными, что может приводить к дегенерации тканей и к уменьшению выхода рекомбинантных белков.
Исследовать влияние рекомбинантного TSST-1 на клетки эпителия молочной железы. Для сравнения использовали охарактеризованный ранее энтероткосин Н стафилококков (SEH).
Стафилококки, носители гена TSST-1, выделены ранее от животных больных маститом. Аминокислотная последовательность rTSST соответствовала последовательности GenBank: SBF10293.1. Ген tsst1 клонировали и экспрессировали в клетках E. coli BL21 (DE3) с индукцией IPTG. rTSST-1 и rSEH выделяли аффинной металлхелатной хроматографией на Ni-NTA-агарозе. Мономерные формы энтеротоксинов выделяли гель фильтрацией на Sephacryl S100 High Resolution. Эндотоксин E. coli удаляли на polymyxin B. Препарат имел чистоту не менее 95% по данным электрофореза в ДСН-ПААГ, соответствие вторичной структуры подтверждали методом кругового дихроизма. Уровень продукции составил 3 мг на 1 л культуры для rTSST-1 и 12,5 мг на 1 л для rSEH.
Цитотоксическое действие rTSST-1 и rSEH на первичную культуру эпителия молочной железы (bMECs) определяли по их жизнеспособности двумя методами.
Методом световой микроскопии показан цитотоксический эффект для rTSST-1 и rSEH. Уровень токсичности и их концентрационный эффект различались. Незначительное токсическое действие на клетки молочной железы было установлено при использовании rSEH, по сравнению с более сильным эффектом rTSST-1. При введении rSEH в среду культивирования в концентрациях 10, 50, 100 и 250 мкг/мл наблюдалось снижение доли жизнеспособных клеток на 7, 8, 12 и 13%, соответственно. Эти результаты находятся в соответствии с данными, полученными Yongxia et al., 2014. При введении в среду культивирования rTSST-1 в концентрации 10 мкг/мл доля живых клеток не превышала 33%. При увеличении содержания токсина в среде культивирования до 50, 100 и 250 мкг/мл, уровень токсичности возрастал более чем в 2 раза.
В МТТ-анализе оценивалось действие каждого из токсинов при внесении в среду в концентрации 100 мкг/мл. Было показано, что рассмотренные рекомбинантные токсины вызывали снижение количества жизнеспособных клеток, при этом токсический эффект различался примерно в три раза. В МТТ – тесте для rSEH показано снижение доли живых клеток bMECs на 18%, для rTSST-1 на 60%.
В проведенном исследовании разработан метод экспрессии и выделения токсина тканевого шока. rTSST-1 был очищен от эндотоксина E. coli, выделен в мономерной форме гельфильтрацией. Нативность белка подтверждена анализом спектра КД. Аналогичная процедура была использована для выделения ранее охарактеризованного белка сравнения rSEH.
Впервые установлено, что rTSST-1 оказывает токсическое действие на эпителий молочной железы in vitro. Это показывает возможную роль токсина в мастите, ассоциированном со стафилококками.