title: Die zentrale Vakuole von Phaeodactylum tricornutum:Charakterisierung und Untersuchung des Proteintransports
Creators: name: Schreiber, Viktoria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2018
Subjects: Phaeodactylum tricornutum
zentrale Vakuole
vacuole
P. tricornutum
protein transport
Vakuole
Proteintransport
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Der Proteintransport zum Lysosomen bzw. der Vakuole erfolgt über das Endomembransystem (EMS), das sich in seiner einfachsten Form aus endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat, und Endosomen zusammensetzt. Die Membranen des EMS stehen über Vesikel, die durch Abschnüren und der Fusion mit der Zielmembran in Verbindung stehen. Damit ein Protein zu seinem Zielkompartiment gelangt, werden spezifische Targetingsignale benötigt, die entweder N-terminal, C-terminal oder innerhalb der Aminosäuresequenz des zu transportierenden Proteins lokalisiert sind. Diese Targetingsequenzen werden entweder von spezifischen Rezeptoren oder von Adapterprotein-Komplexen erkannt, die im späten sekretorischen Weg den Transport über Clathrin-umhüllte Vesikel vermittelt. Über den Proteintransport in die zentrale Vakuole der Diatomee Phaeodactylum tricornutum war bisher nichts bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinzusammensetzung der zentralen Vakuole über in silico und in vivo-Ansätze untersucht. Potentielle Vakuolenproteine wurden über bioinformatischen Analysen hinsichtlich N-terminaler Zielsteuerungssequenzen, Transmembrandomänen, konservierten Proteindomänen und potentiellen Targetingsignalen untersucht und anschließend mithilfe von exprimierten eGFP-Fusionenproteinen auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Dabei konnten neben den bereits bekannten vakuolären Membranproteinen neun weitere Vakuolenproteine identifiziert werden, die unter anderem auf einen Im-oder Export von Sekundärmetaboliten, Kationen und Polysacchariden hindeutet. Diese Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die zentrale Vakuole neben der Speicherung von Chrysolaminarin auch lytische Funktionen hinsichtlich der Proteindegradation und bei der Detoxifizierung von Xenobiotika übernimmt. Ein weiterer Teil beschäftigte sich mit der Untersuchung des Proteintransports in die zentrale Vakuole sowie der Identifizierung von Targetingsignalen. Durch die Generierung von Aminosäureaustausch-Mutanten und Chimären gelang es mehrere Targetingsingale zu identifizieren und zu verifizieren. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Tyrosin- oder Dileucinmotive für den vakuolären Proteintransport relevant sind. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Proteintransport zur zentralen Vakuole von P. tricornutum ähnlich wie in Pflanzen- oder Säugerzellen ablaufen könnte.
description: Protein transport to vacuoles or lysosomes takes place via the endomembrane system (EMS). The EMS is composed of the endoplasmic reticulum (ER), the Golgi apparatus and endosomes in its simplest constellation. The compartments of the EMS are connected by vesicles. These vesicles bud off the EMS and allow to transfer cargo proteins among the EMS. To find their final destination proteins need specific targeting signals located at the N-terminus, C-terminus or within the protein sequence. Those targeting signals can be recognized either by receptors or adaptor protein complexes, which mediates the transport of cargo proteins via clathrin coated vesicles in the late secretory pathway. However, Targeting of proteins to the central vacuole of the diatom Phaeodactylum tricornutum is poorly investigated. As part of this study the protein composition of the central vacuole was analyzed by using in silico and in vivo approaches. Putative vacuolar proteins were investigated by bioinformatic analyses regarding to N-terminal targeting sequences, trans-membrane domains, conserved protein domains and putative targeting signals. Subsequently, the candidates were expressed as eGFP fusion proteins for investigating their subcellular localization. Beside the already known vacuolar membrane proteins in P. tricornutum, this screen resulted in the identification of nine proteins in total new vacuolar membrane proteins, which might be involved in import or export of secondary metabolites, cations and carbohydrates. Apart from storing chrysolaminarin, the results of this work indicate that the central vacuole is a lyctic compartment in respect to protein degradation and detoxification of xenobiotics. A further part of this study dealt with the investigation of protein targeting to the central vacuole as well as the identification of targeting motifs. By generating mutated versions of the vacuolar membrane located proteins, the results indicate that tyrosine and dileucine motifs are relevant for vacuolar transport. Furthermore, the results suggest that the protein transport to the central vacuole of P. tricornutum are comparable to those in plants or mammals.