title: Aldehyde-oxidizing enzymes in the anaerobic phenylalanine metabolism of Aromatoleum aromaticum
title: Aldehyd-oxidierende Enzyme im anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel von Aromatoleum aromaticum
Creators: name: Debnar-Daumler, Lisa Lena Carlotta
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: phenylalanine
Phenylalanin
Phenylacetaldehyd
Aldehyde
anaerob
Biowissenschaften, Biologie
Molybdän
Wolfram
Aromatoleum
anaerobe
tungsten
Dehydrogenase
aldehyde
Moco

description: Der anaerobe Abbau von Phenylalanin
      führt über das Zwischenprodukt Phenylacetat zu Benzoyl-CoA,
      dem häufigsten Intermediat im anaeroben Abbau von
      aromatischen Verbindungen. Das Zwischenprodukt Phenylacetat
      entsteht durch die Oxidation von Phenylacetaldehyd. Vor
      Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass Aromatoleum aromaticum
      sowohl eine Aldehyd:Ferredoxin-Oxidoreduktase (AOR) besitzt,
      die den Schritt katalysieren könnte, als auch ein oder
      mehrere Enzyme, die diese Oxidation mit NAD und NADP als
      Elektronenakzeptoren durchführen könnten. Folglich stellte
      sich die Frage, welches dieser Enzyme das Schlüsselenzym für
      den anaeroben Phenylalanin-Stoffwechsel darstellt. Außerdem
      ist die Entdeckung einer AOR in einem fakultativ anaeroben
      Bakterium ungewöhnlich, da AORs bisher ausschließlich aus
      obligat anaeroben, häufig hyperthermophilen Prokaryonten
      bekannt sind. A. aromaticum braucht ein Molybdän-Enzym zum
      denitrifizierenden Wachstum, nämlich die Nitrat-Reduktase.
      Alle bisher beschriebenen AORs enthalten das dem Molybdän
      sehr ähnliche Metall Wolfram. Vor diesem Hintergrund sollte
      untersucht werden, welches Metall die AOR aus A. aromaticum
      enthält. Für beide Fragestellungen war es wichtig, die
      Phenylacetaldehyd-oxidierenden Enzyme aus A.
      aromaticum-Zellen anzureichern und im Idealfall
      aufzureinigen. Durch vielfältige chromatographische Verfahren
      gelang es, alle Enzymaktivitäten in einem für die Bearbeitung
      der Fragestellungen ausreichenden Maße anzureichern.
      Metallanalysen der angereicherten AOR-Fraktionen und
      begleitende Wachstumsversuche mit verschiedenen Molybdat- und
      Wolframat-Konzentrationen zeigten, dass die AOR tatsächlich
      einen Wolfram-Cofaktor enthält und dieser nicht wirksam durch
      einen Molybdän-Cofaktor ersetzt werden kann. Folglich muss A.
      aromaticum zur selben Zeit spezifisch mindestens ein Mo-
      (Nitrat-Reduktase) und ein W-Enzym (AOR) herstellen können.
      Während die meisten Enzyme aus dem
      Molybdän-Cofaktor-Biosyntheseweg auch zur Biosynthese des
      Wolfram-Cofaktors dienen können, wurden in dieser Arbeit
      durch bioinformatische Analysen mehrere Enzyme gefunden, die
      eine Metall-Spezifität unterstützen könnten. Dazu gehören
      Molybdat- und Wolframat-spezifische Transporter und Enzyme,
      die das Metall auf den Cofaktor übertragen. Außerdem wurden
      Proteine aus dem Cofaktor-Biosyntheseweg gefunden, die in
      enger Assoziation mit AORs codiert werden und möglicherweise
      auch bei der Bereitstellung des richtigen Cofaktors eine
      Rolle spielen. Durch Anreicherung der NAD(P)-abhängigen
      Phenylacetaldehyd-oxidierenden Aktivitäten konnte das
      zugehörige Enzym, eine Aldehyd-Dehydrogenase, die durch das
      Gen ebA4954 codiert wird, identifiziert werden. Die
      Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PDH) wurde heterolog
      produziert, mithilfe eines C-terminalen Strep-Tags
      aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Es handelt sich
      um ein Homotetramer, das sehr spezifisch für
      Phenylacetaldehyd ist, eine kooperative Kinetik zu diesem
      Substrat zeigt, stark durch steigende
      Phenylacetaldehyd-Konzentrationen inhibiert wird und sowohl
      NAD als auch NADP reduzieren kann. Die Ergebnisse dieser
      Arbeit führen zu der neuen Hypothese, dass die PDH das
      Schlüsselenzym für den Phenylalanin-Stoffwechsel ist. Es
      wurde gezeigt, dass die AOR nicht essentiell für das
      denitrifizierende Wachstum auf Phenylalanin ist, aber
      verschiedenste Aldehyde mit ähnlichen
      Reaktionsgeschwindigkeiten oxidieren kann. Deshalb ist es
      vorstellbar, dass der AOR eine Funktion zur Detoxifizierung
      reaktiver Aldehyde zukommt, wenn der Stoffwechsel aus dem
      Gleichgewicht gerät. Die Erkenntnis, dass A. aromaticum
      gleichzeitig Molybdän- und Wolfram-Enzyme produzieren kann,
      eröffnet viele neue Fragestellungen und
      Forschungsansätze.
description: Anaerobic degradation of
      phenylalanine proceeds via the intermediate phenylacetate to
      benzoyl-CoA which is the common intermediate in anaerobic
      degradation of aromatic compounds. Phenylacetate is formed by
      the oxidation of phenylacetaldehyde. At the beginning of this
      project it was known that Aromatoleum aromaticum contains on
      the one hand an aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) that
      could catalyze this step and on the other hand one or more
      enzymes that could oxidize phenylacetaldehyde with NAD and
      NADP as electron acceptors. Consequently, the question arose,
      which of these enzymes was the key enzyme in anaerobic
      phenylalanine metabolism. Moreover, AOR is an unusual enzyme
      especially for a facultative anaerobic bacterium since
      AOR-type enzymes are exclusively known from obligatory
      anaerobic, often hyperthermophilic prokaryotes so far. A.
      aromaticum needs one molybdenum enzyme for denitrifying
      growth, the nitrate reductase. All AORs known to date contain
      tungsten which is a metal very similar to molybdenum. This
      leads to the question which metal the AOR from A. aromaticum
      contains. For both questions it was important to enrich and,
      ideally, purify the phenylacetaldehyde-oxidizing enzymes from
      cells of A. aromaticum. Sufficient enrichment of all enzyme
      activities to advance the given tasks was achieved by using a
      multitude of different chromatographic techniques. Metal
      analyses of the enriched AOR fractions and accompanying
      growth experiments with varying molybdate and tungstate
      concentrations showed that AOR actually contains a tungsten
      cofactor which could not be replaced by a molybdenum cofactor
      to form active enzyme. Consequently, A. aromaticum needs to
      be able to simultaneously produce at least one Mo-enzyme
      (nitrate reductase) and one W-enzyme (AOR). Most of the
      enzymes needed for the biosynthesis of the molybdenum
      cofactor can be shared for biosynthesis of the tungsten
      cofactor. Within the project at hand several enzymes were
      identified by bioinformatics analyses that may promote metal
      specificity of the biosynthesis machinery. These include
      molybdate- and tungstate-specific transporters and enzymes
      that transfer the metal to the cofactor. Moreover, another
      protein from the biosynthetic pathway was found to be encoded
      in close association to aor genes and may therefore play a
      role in providing the right cofactor. The enrichment of the
      NAD(P)-dependent phenylacetaldehyde-oxidizing activities
      enabled the identification of the corresponding enzyme, an
      aldehyde dehydrogenase encoded by gene ebA4954. This enzyme
      (PDH) was heterologously produced, purified with the help of
      a C-terminal Strep-tag, and biochemically characterized. It
      is a homotetramer that is very specific for
      phenylacetaldehyde, shows cooperative substrate-kinetics, is
      strongly inhibited by phenylacetaldehyde, and reduces both
      NAD and NADP. The results summarized in the thesis at hand
      lead to the new hypothesis that PDH is the key enzyme for
      phenylalanine metabolism. It was shown that AOR is not
      essential for denitrifying growth on phenylalanine but
      oxidizes various aldehydes with similar reaction rates.
      Therefore it is imaginable that AOR serves as a detoxifying
      enzyme that oxidizes reactive aldehydes when the metabolism
      becomes unbalanced. The finding that A. aromaticum
      simultaneously produces molybdenum and tungsten enzymes leads
      to many new questions and research approaches.