title: Effect of fluid shear stress on the membrane integrity of endothelial cells
Creators: name: Starke, Ann Marleen
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2024
Subjects: subject: 572 Biochemistry

description: Endothelzellen sind einer konstanten mechanischen Belastung durch den Blutfluss ausgesetzt, wodurch ein Plasmamembranschäden (PMS) entstehen kann. Um den Zellttod zu verhindern, haben diese Zellen Mechanismen entwickelt, um PMS innerhalb von Sekunden zu reparieren und Zelltod zu verhindern. In dieser Arbeit wurde ein Lebendzellmikroskopie-Versuch entwickelt und die Auswirkungen von Scherstress (SStr) auf die Integrität der Plasmamembran untersucht. Human umbilical vein endothelial cells wurden zunächst einem SStr von 3 dyn/cm² ausgesetzt, der auf 11, 12,5 oder 14,1 dyn/cm² erhöht wurde. Eine Erhöhung von 3 auf 14,1 dyn/cm² führte zu PMS bei 4,46 % der Zellen, während Erhöhungen unter 8 dyn/cm² keinen relevanten PMS verursachten. Größere SStr-Differenzen führten zu mehr PMS. Wir zeigten, dass Endothelzellen durch SStr verursachten PMS calciumabhängig reparieren können. Unsere Ergebnisse weisen auf eine VAMP2-vermittelte Beteiligung von frühen Endosomen an der Reparatur hin.
description: Abstract ..... - 1 -
1 Introduction ..... - 2 -
1.1 Endothelial cell function ..... - 2 -
1.2 Shear Stress ..... - 2 -
1.3 Shear stress in pathology ..... - 4 -
1.4 Plasma membrane wounds – A daily challenge for mammalian cells ..... - 6 -
1.5 Plasma membrane repair mechanism ..... - 7 -
1.6 Assays established to study membrane wounding and resealing ..... - 13 -
2 Aim of the thesis ..... - 17 -
3 Materials ..... - 18 -
3.1 Chemicals, reagents ..... - 18 -
3.2 Fluorescent dyes ..... - 18 -
3.3 Devices ..... - 19 -
3.4 Plasmids ..... - 19 -
4 Methods ..... - 21 -
4.1 HUVEC culturing and passaging ..... - 21 -
4.2 HUVEC transfection ..... - 21 -
4.3 Generation of fluid shear stress ..... - 22 -
4.4 Preparation of the pump flow system ..... - 22 -
4.5 Wounding assay ..... - 24 -
4.5.1 Culturing in channel slides ..... - 24 -
4.5.2 Fluorescence staining ..... - 24 -
4.5.3 Live cell confocal microscopy ..... - 25 -
4.5.4 Quantitative analysis of wounded and resealed cells ..... - 26 -
4.6 Transfection assay ..... - 27 -
4.7 Statistical analysis ..... - 28 -
5 Results ..... - 29 -
5.1 A live cell microscopic assay suitable for the study of plasma membrane damage due to fluid shear stress ..... - 29 -
5.2 Low-to-high fluid shear stress induces damages in the plasma membrane of HUVEC ..... - 32 -
5.3 HUVEC can reseal shear stress induced plasma membrane damage ..... - 37 -
5.4 Endosomal involvement in membrane repair of shear stress induced plasma membrane damage in HUVEC ..... - 38 -
5.5 TfR-SEP marked endosomes undergo exocytosis upon shear stress induced plasma membrane damage ..... - 43 -
5.6 VAMP2 in HUVEC repair of shear stress induced plasma membrane damage ..... - 46 -
6 Discussion ..... - 49 -
6.1 A new live cell microscopic assay to study the membrane damaging effect of shear stress ..... - 49 -
6.2 Shear stress alteration induces plasma membrane damage ..... - 50 -
6.2.1 HUVEC are able to repair shear stress induced plasma membrane damage ..... - 51 -
6.3 Early endosomes are involved in HUVEC plasma membrane repair ..... - 51 -
6.4 Clinical relevance ..... - 54 -
7 References ..... - 56 -
8 Supplement ..... I
8.1 Table of figures ..... I
8.2 List of Tables ..... VI
8.3 List of Abbreviation ..... VII
8.4 Macros ..... VIII
8.4.1 Total cell count ..... VIII
8.4.2 Wounded cell count ..... IX
8.4.3 PI positive cell count ..... X
8.4.4 Counting GFP-2xFYVE / TfR-SEP / VAMP2 puncta ..... XI