title: Structural and functional studies of mucin-interacting adhesion domains from Candida glabrata and Helicobacter pylori
title: Strukturaelle und funktionaelle Untersuchungen an Mucin-interagierenden Adhesions-Domaenen aus Candida glabrata und Helicobacter pylori
Creators: name: Maestre-Reyna, Manuel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: adhesin
Structural biology
Chemie
Infektionsbiologie
infection
Biochemie
Helicobacter pylori
recombinant protein
Chemische Struktur
Biochemistry
Protein cristallography
Proteinkristallographie
Rekombinantes Protein
Candida glabrata
Torulopsis glabrata

description: Epithelial adhesins from Candida
      glabrata Epithelial adhesins (Epa) are crucial proteins in
      the colonization, pathogenesis and virulence of Candida
      glabrata. These adhesins have a similar modular structure to
      Saccharomyces cerevisiae flocculins, with an N-terminal
      adhesive A domain, a central neck-like B domain, and an
      anchorage C-terminal C domain. A hallmark of many fungal
      adhesins is the presence of a calcium binding PA14 domain
      within the A domain. The PA14 domain is responsible for
      carbohydrate binding in a calcium dependent manner, which
      allows for the classification of these proteins as C-type
      lectins[1]. In this study, it was possible to elucidate the
      crystal structures of Epa1A and three variants at resolutions
      from 1.4 to 2.0 Å. The latter were meant to emulate the
      specificities of Epa2, Epa3 and Epa6 adhesive domains. The
      results yielded a profound knowledge of the binding pocket of
      Epa1A and the mechanisms through which specificity is
      controlled in the Epa A domain. Especially surprising was the
      fact that, even though the proteins were crystallized in the
      presence of lactose, the protein co-crystals never showed the
      aforementioned sugar. Instead, a galactoseβ1-3glucose
      disaccharide unit could be modeled into the electron density.
      The disaccharide is commonly found on cell surfaces and milk
      derivates, from which the employed lactose was obtained[2].
      Epa1A , Epa1→2A, Epa1→3A and Epa1→6A were also functionally
      characterized by semi- quantitative, high-throughput
      methodologies. In collaboration with the consortium for
      functional glycomics, fluorescently labeled proteins were set
      in contact with large-scale glycan arrays. The results showed
      a marked preference for galactoseβ1-3 terminal
      oligosaccharides in the case of Epa1A. For the other
      proteins, varying degrees of promiscuity were noted. Epa1→6A
      presented a very similar binding profile to the one presented
      by Zupancic et. al. in 2008 for Epa6A, demonstrating the
      validity of the method. Epa1→2A and Epa1→3A were much less
      active, and presented a preference for sulfated glycans,
      along with terminal galactose. Fluorescence titrations showed
      for Epa1A a ~20 time stronger affinity for the T antigen
      (galactoseβ1-3N-acetyl- galactosamine) than for the
      milk-derived lactose, showing how marked the adhesin
      preference for β1-3 linkages is, as compared to β1-4
      glycosidic bonds. Adhesins of Helicobacter pylori The
      adhesins of H. pylori have been shown to be critical for the
      colonization and immune recognition of the bacterium during
      gastric invasion and disease development[3]. BabA and SabA
      figure prominently, as the former is the primary adhesin
      during early stage colonization, while the latter binds
      strongly to inflamed tissue[4]. Both of them are
      autotransporters, with a C-terminal, membrane bound
      translocation unit and an N-terminal passenger domain which
      contains the adhesive portion of the protein[5]. Pure,
      soluble passenger domains of BabA and SabA were successfully
      overproduced by recombinant expression in Escherichia coli.
      BabA could be functionally characterized by the same method
      as the Epa proteins. The results showed that BabA activity
      was strongly pH dependent, with a ~100 times stronger
      activity at pH 5.8 than at pH 2.5. This behavior could be
      further characterized through circular dichroism spectroscopy
      and size exclusion chromatography, which showed that BabA is
      in a reversible molten globule-like, aggregation-prone and
      relaxed conformation at pH 2.5. At pH 5.8, on the other hand,
      the protein is in a much more compact, defined conformation
      with a strong tendency to precipitate. H. pylori has been
      shown to present many pH dependent virulence factors, like
      the urea transporter, but up to now no direct biochemical
      data had been presented supporting pH dependent
      conformational changes in its adhesins.
description: Epitheladhäsine von C. glabrata
      Die Epitheladhäsine (Epa) sind zentrale Proteine in der
      Kolonisierung, Pathogenese und Virulenz von C. glabrata.
      Diese Adhäsine haben einen ähnlichen modularen Aufbau wie S.
      cerevisiae Flokuline, mit einer N-terminalen adhäsiven
      A-Domäne, einer halsartigen B-Domäne und einer C-terminalen
      C-Domäne, die als Verankerung an der Zellwand dient.
      Flokulin-artige Adhäsine können in vielen Fällen eine
      Calcium-bindende PA14 Domäne innerhalb der A-Domäne
      beinhalten. Diese Proteinen wurden als C-Typ Lektine
      eingestuft, da die PA14 Domäne für eine Calcium abhängige
      Glycan-Bindung verantwortlich ist[1]. In der folgenden Arbeit
      war es möglich, die Kristallstrukturen von Epa1A und drei
      Varianten mit Auflösungen von 1,4 bis 2,0 Å zu lösen. Die
      Varianten sollten die Spezifitäten der Epa2-, Epa3- und Epa6-
      adhäsiven A-Domänen emulieren. Diese Erkenntnisse erlaubten
      eine detaillierte Beschreibung der Bindungstasche von Epa1A
      und die Mechanismen, durch die die Spezifität in der Epa A-
      Domäne bestimmt werden. Besonders überraschend war die
      Tatsache, dass, obwohl die Proteine in Gegenwart von Laktose
      kristallisiert wurden, die Co-Kristalle keine Laktose
      zeigten. Stattdessen konnte nur ein Galaktoseβ1-3glukose
      Disaccharid in die Elektronendichte modelliert werden. Dieses
      Disaccharid findet sich für gewöhnlich auf Zelloberflächen
      und in Milchderivaten[2], aus denen die verwendete Laktose
      stammte. Die funktionelle Charakterisierung von Epa1A ,
      Epa1→2A, Epa1→3A und Epa1→6A verlief über semiquantitative,
      Hochurchsatz Analysen in Zusammenarbeit mit dem Consortium
      for Functional Glycomics (CFG). Mit Fluoroforen markierte
      Proteine wurden mit Glykan Arrays in Kontakt gesetzt. Die
      Ergebnisse zeigten eine deutliche Präferenz im Falle von
      Epa1A für Oligosaccharide mit einer terminalen Galaktoseβ1-3
      Verknüpfung. Für die anderen Proteinen konnte gezeigt werden,
      dass die Spezifität in unterschiedlichen Massen verringert
      war. Das Epa1→6A Bindungsprofil konnte mit der von Zupancic
      et. al. 2008 publizierten Daten für Epa6A verglichen werden
      und zeigte große Ähnlichkeit. Epa1→2A und 3A waren deutlich
      weniger aktiv, zeigten aber eine Präferenz für sulfatierte
      Glykane sowie für terminale Galaktosen. Quantitative
      Fluoreszenztitrationen ergaben ungefähr zwanzigfach höhere
      Affinitäten für das T-Antigen als für die aus Milch gewonnene
      Laktose, wodurch die Präferenz für β1-3 über β1-4
      Verbindungen weiter bestätigt werden konnte. 1.4 Adhäsine von
      Helicobacter pylori Die Adhäsine von H. pylori zeigten sich
      als kritisch bei der Kolonisierung und Immunerkennung des
      Bakteriums während des Eindringens in den Magen und der
      Entstehung und Entwicklung der Krankheit[3]. BabA und SabA
      sind zwei besonders wichtige Adhäsine, da ersteres bei einer
      frühen Kolonisierung als Primäradhäsin wirkt, während SabA
      stark an entzündetes Gewebe bindet[4]. Es handelt sich bei
      beiden um Autotransporter, die mit einer C-terminalen,
      membrangebundenen Translokationseinheit und einer
      N-terminalen, adhäsiven transportierte Domäne versetzt sind.
      Reine, lösliche transportierte Domänen von BabA und SabA
      wurden in großen Mengen in Escherichia coli rekombinant
      überproduziert. BabA konnte, wie die Epa Proteine, mit Hilfe
      von Glykan Arrays funktionell charakterisiert werden.
      BabA-Aktivität erwies sich als stark pH-abhängig, da sich bei
      pH 5.8 eine etwa hundertfach stärkere Bindung als bei pH 2.5
      zeigte. Dieses Verhalten konnte durch Circular-Dichroismus
      Spektroskopie und chromatographische Analyse weiter
      untersucht werden. Es zeigte sich, dass BabA bei pH 2.5 sich
      in eine relaxierten, molten-globule ähnlichen Konformation
      befand, die leicht aggregierte. Bei pH 5.8 andererseits
      befand sich das Protein in einer viel kompakteren, klarer
      definierten Konformation mit einer starken Tendenz zur
      Präzipitat-Entstehung. Es konnten schon mehrere H. pylori
      Virulenzfaktoren gefunden werden, deren Aktivität pH abhängig
      ist, aber bis jetzt gab es noch keine biochemischen Daten,
      die pH abhängige Konformationsänderungen bei ihren Adhäsinen
      belegten.