Investigation of Acyl Protein Thioesterase activity at the membrane
Creators: name: Estel, Kathrin
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2018
Subjects: subject: Acyl protein thioesterase
subject: APT
subject: Ras
subject: Depalmitoylierung
subject: Fluoreszenzmikroskopie
subject: PC 12 Assay
subject: Stopped-Flow
subject: Mitose
subject: 570
subject: 540
subject: Ras
subject: Protein
subject: Fluoreszenzmikroskopie

description: Die Enzyme Acyl Protein Thioesterase 1 und 2 (APT1 und APT2) spielen eine wichtige Rolle bei der Depalmitoylierung verschiedener Protein in der Zelle, unter anderem deacylieren sie das Protoonkogen Ras. Damit verhindern sie die fehlerhafte Lokalisierung von Ras an internen Membranen, was die Signalweiterleitung von extraellulären Botenstoffen durch das Ras Protein an der Plasmamembran ermöglicht. Die Repalmitoylierung von Ras erfolgt am Golgi-Apparat. Die Inhibierung von APT kann diesen Zyklus unterbrechen, so dass das von Ras vermittelte Proliferationssignal, z.B. in Krebszellen, unterbrochen werden kann. Somit ist APT ein potentielles Ziel von Anti-Tumor-Medikamenten. APT selbst kann reversibel an einem N-terminalen Cystein palmitoyliert sein, was eine erhöhte Membranaffinität zur Folge hat. Bis heute ist der Effekt verschiedener Membrantypen auf APT und dessen Substrate sowie der Einfluss der physiologischen Membranumgebung auf die APTAktivität unbekannt. Weiterhin ist unklar, ob APT die Substrate aktiv aus der Membran extrahieren kann bzw. direkten Zugriff auf membrangebundene Substrate hat, und/oder ob die Palmitoylierung am N-terminalen Cystein einen Einfluss auf die Effizienz der Substratextraktion oder –depalmitoylierung hat. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, herauszufinden, ob APT ein membrangebundenes Substrat depalmitoylieren kann und wo dieser Prozess stattfindet (an der Membran oder im Cytosol). Dazu wurde ein FRET-System mit Fluoreszenz-Markern an palmitoylierten Peptiden sowie an Vesikeln am Plattenleser und an der Stopped-Flow etabliert. Als Peptide wurden ein Nonapeptid entsprechend dem N-Terminus von hAPT1 sowie ein längers Pepdit entsprechend dem CTerminus von H-Ras gewählt. Es wurde gezeigt, dass sowohl hAPT1 als auch hAPT2 beide Vesikel-gebundenen Peptide hydrolysieren können, wobei hAPT2 etwas effizienter als hAPT1 war, und das H-Ras-Peptid etwa schneller gespalten wurde als das hAPT1-Peptid.
description: The enzymes Acyl Protein Thioesterase 1 and 2 (APT1 and APT2) were described to depalmitoylate the proto-oncogen Ras. This depalmitoylation is assumed to prevent mislocalization of Ras on internal membranes, thus ensuring its predominant localization at the plasma membrane, where Ras can translate extracellular signals into cellular responses. Repalmitoylation takes place at the Golgi. Inhibition of APT can disturb the acylation cycle, leading to a weaker Ras mediated proliferation signal in cancer cells, making APT a potential anti-cancer target. APT itself undergoes a dynamic palmitoylation at an N-terminal cysteine to achieve a steady state membrane localization. To date, the effect of different membrane types on APT and its target proteins as well as the mechanism by which the physiological membrane environment influences APT activity still remains unclear. Furthermore, it also remains unknown if APT can extract and depalmitoylate its palmitoylated target proteins by itself and/ or if APT1/2 palmitoylation at Cys2 has an effect on substrate extraction/depalmitoylation. One aim of this thesis was the investigation of APT’s activity on membrane bound substrates and where this process takes place (at the membrane or in cytosol). Therefore, a FRET approach (in a plate reader and a stopped-flow machine) was used with fluorescently labeled vesicles and fluorescently labeled palmitoylated peptides. It was shown that APT can depalmitoylate vesiclebound peptides (both a peptide with the sequence of APT’s N-terminus and a peptide with the C-terminal sequence of H-Ras), but APT can not actively extract the peptide from the membrane. The kinetic constants of the association and dissociation reaction of the peptides were measured, and apparent kcat values showed that hAPT2 seems to be slightly more active on those substrates compared to hAPT1. Moreover, the membrane affinity of APT was analyzed in vitro via fluorescence confocal microscopy localization studies on giant unilamellar vesicles, and in vivo via localization studies of transfected and electroporated APT constructs. It was shown in the literature that APT is recruited to membranes if it is palmitoylated at Cys2, but APT also features prominent hydrophobic patches, that were predicted to confer to membrane affinity. This work revealed that a membrane anchor (palmitoylation at Cys2) is essential for APT to bind to membranes and that the hydrophobic patches are not sufficient for a membrane localization. For those studies giant unilamellar vesicles were prepared with the method of electroformation. In the cell studies it was demonstrated that APT is located with the palmitoylated Cys2 to the Golgi membranes and the cells are able to palmitoylate a recombinant electroporated APT protein.