title: Characterization of the ptnaN promoter and its use for homologous gene expression in Natrialba magadii
Creators: name: Schönfelder, Kathrin
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Halophile Proteine und Enzyme sind an die hohe Salzkonzentration ihrer Umgebung angepasst. Die Industrie hat ein sehr großes Interesse daran Anwendungen für diese Proteine und Enzyme zu finden. Doch dafür bedarf es kontrollierter Genexpression um diese Proteine gezielt zu produzieren und auf ihre Funktion hin zu untersuchen. Starke und kontrollierbare Promotoren sind ein zentrales Instrument für die Expression spezifischer Gene. Um ordnungsgemäß gefaltete Protein zu erhalten, ist es von großer Wichtigkeit, Expressionssysteme für halophile Archaeen zu entwickeln. 2011 konnte der mit Tryptophan induzierbare Promoter (ptnaN) für Nab. magadii etabliert werden (68). Dieser Promoter zeigt kaum Hintergrundaktivität und ist durch Zugabe von Tryptophan zum Kulturmedium induzierbar. Der Erste Teil dieser Masterarbeit beschäftigt sich mit der genaueren Untersuchung der Promoter Region. Aufgrund der Tatsache das sich mehrere mögliche Promoter Sequenzen upstream des Tryptophanase Gens (tnaA) befinden, galt es zu bestimmen, ob diese einzelnen Sequenzen nur im Zusammenhang oder auch getrennt voneinander als Promoter funktionieren. Für dieses Experiment wurde der Stamm Nab. magadii L13 mit mehreren verschiedenen Kombinationen an interessanten Bereichen transformiert. Um die Aktivität der einzelnen Sequenzen quantifizieren zu können, wurde die halophile β-Galaktosidase bgaH als Reportergen eingesetzt. Die Aktivität der individuellen Fragmente, wurde in Bezug auf die Wachstumsphasen abhängige Expression des Reportergens in Nab. magadii L13 Zellen bestimmt. Bei der Analyse des BgaH-Assay zeigte keines der einzelnen Sequenzen eine Promoteraktivität. Aus diesem Grund wird vermutet, dass der Tryptophan induzierbare Promoter ptnaN ausschließlich den gesamten upstream Bereich des tnaA Gens benötigt um aktiv sein zu können. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den Versuch den Tryptophan induzierbaren Promoter für die homologe Genexpression in Nab. magadii einzusetzen. Für diesen Versuch wurde ORF34 und ORF36 des Virus фCh1 mit einem His-Tag, unter der Kontrolle des Tryptophan induzierbaren Promoters, im Wildtyp Nab. magadii L13 und in der Deletionsmutante Nab. magadii L13ΔtnaA exprimiert. Leider konnte nur das Protein des ORF36 mittels Western Blot detektiert werden. Zusätzlich war das Western Blot Signal sehr schwach. Eine unzureichende Histidin Konzentration im Kulturmedium könnte der Grund für dieses Problem sein. Um eine gezielte Expression eines Proteins zu erhalten, wachsen alle Stämme im so genannten Mineral Medium NMMb+, welches kein Tryptophan enthält. Aufgrund des Nährstoffmangels im Mineral Medium und der Tatsache das Nab. magadii proteolytisch wächst könnte es sein, dass Histidin für das Wachstum anstatt für die Protein Produktion verwendet wird. Um das Wachstum Nab. magadii zu erleichtern und bessere Ergebnisse bei der Expression zu erzielen, wurde das gesamte Expressionsexperiment mit allen Stämmen wiederholt, unter der Verwendung von NMMb+ mit unterschiedlichen Histidinkonzentrationen. Erneut konnte nur die Expression des ORF36 in Nab. magadii L13 detektiert werden, bei einer Histidinkonzentration von 5mM und 10 mM. Während des gesamten Expressionsprozesses gelang es nicht die Proteine des ORF34 und ORF36 in ausreichender Menge für die anschließende native Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie zu exprimieren. Es wurde vermutet, dass der His-tag einen negativen Einfluss auf die Proteinexpression haben könnte. Aus diesem Grund wurde der ORF34 ohne His-tag, unter der Kontrolle des Ferredoxin Promoters pfdx, des Tryptophan induzierbaren Promoters ptnaN und unter dem eignen Promoter von ORF34, in Nab. magadii L13 exprimiert. Gen-Expression konnte nur mit Hilfe des eignen Promoters erzielt werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollten die Untersuchungen weiter geführt werden um einen passenden Protein-Tag zu finden, der zusammen mit dem Mineralmedium verwendet werden kann. Zusätzlich sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um ein passendes Expressionssystem für Nab. magadii zu finden.
description: Halophilic proteins and enzymes are adapted to the high salt intracellular environment. Industrial applications are of great interest in finding applications of salt-functioning proteins and enzymes. Therefore controlled expression of genes is very important for the overproduction of proteins, which enables a directed investigation of specific proteins and their functions. Strong, inducible and tightly controlled promoters are a central tool to switch on and off genes at any time to achieve controlled gene expression. In order to obtain proper folded proteins, overexpression systems have to be evolved for halophilic Archaea. In 2011, for Nab. magadii the tryptophan inducible promoter of the tryptophanase gene (tnaA) was established, called ptnaN (68). This promoter shows nearly no basal activity and can be simply turned on by adding tryptophan to the culture medium. The first part of this thesis focuses on the analysis of the promoter region. Due to the fact that there are multiple possible promoter sequences upstream of the tnaA gene, it was important to determine, whether they are active in combination or when they are separated. A combination of interesting sites of the upstream region of the tnaA gene was cloned as transcriptional fusions with the bgaH gene and transformed into Nab. magadii L13, in order to analyze the promoter strength of the particular sequences. Therefore the individual fragments were investigated with respect to growth-phase-dependent expression of the bgaH gene in Nab. magadii L13 cells. All truncated fragments showed no promoter activity. It seems that the tryptophanase promoter of Nab. magadii requires the entire upstream region of the tnaA gene for its activity. The second part of this work deals with the attempt to use ptnaN for homologous gene expression in Nab. magadii. Therefore Nab. magadii L13 and the tryptophanase deletion mutant Nab. magadii L13ΔtnaA were transformed with different plasmids harboring His-tagged ORF34 and ORF36 of фCh1. Only expression of ORF36 in Nab. magadii L13 was detectable via western blotting, but the signal was very weak. All other strains showed no western blot signal may be due to an insufficient histidine concentration in the medium. In order to achieve specific gene expression with tryptophan, all strains were grown in mineral medium NMMb+, which is without tryptophan. Due to the fact, that Nab. magadii growth proteolytically, it is possible that histidine is used for growth instead of tagging any protein. To overcome this problem, the whole expression experiment was repeated, by using mineral medium with different histidine concentrations, to facilitate the growth and to obtain better results at the expression level. Again, only expression of ORF36 in Nab. magadii L13 was detectable at a histidine concentration of 5mM and 10 mM. During the whole expression process, it was not possible to express gp34 or gp36 in an adequate quantity for subsequent protein purification. For this reason it was supposed, that the His-tag has a negative influence on the protein expression. Therefore ORF34 was expressed without a His-tag under control of the ferredoxin promoter pfdx, ptnaN and its own promoter. Gene expression was only achieved by using the own promoter of ORF34. Based on these results, investigations should be continued to find a suitable protein tag for subsequent protein purification, which can be used in combination with the mineral medium. And further investigations should be made to find a suitable expression system for Nab. magadii.