title: RNA/DNA-hybrids in innate immunity and cholesterol-coupled RNA as adjuvant
title: Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in der angeborenen Immunantwort und das Potential von cholesterolkonjugierter RNA als Adjuvans
Creators: name: Obermann, Hannah-Lena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Toll-like Rezeptoren
retrovirale Infektion
Immunologie
adjuvant
cholesterol
Interferon
Adjuvans
RNA/DNA-hybrids
retroviral infection
Cholesterol
Medizin, Gesundheit
TLR9
RNA/DNA-Hybride

description: RNA/DNA-hybrids in innate immunity
      The innate immune system senses viral and bacterial nucleic
      acids in the cytoplasm or in endosomal compartments via
      different pattern recognition receptors (PRR) such as
      Toll-like receptors (TLR). The repertoire of
      pathogen-associated molecular patterns (PAMP) is still not
      exhausted. Since RNA/DNA-hybrids are formed transiently
      during viral infection, cell endogenous processes and may
      lead to autoimmune diseases, the immunstimulatory capacity of
      RNA/DNA-hybrids needs to be further investigated. Analysis of
      HCMV- and HIV-derived synthetic RNA/DNA-hybrids showed an
      efficient induction of IFNα-secretion in human PBMC as well
      as in murine Flt3L-DC. Additionally, murine Flt3L-DC produced
      TNFα, IL-6 and IP-10 upon RNA/DNA-hybrid stimulation.
      Cytokine induction occured in a TLR9-dependent manner since
      TLR9-deficient Flt3L-DC did not respond with cytokine
      production to RNA/DNA-hybrids. Direct interaction of
      RNA/DNA-hybrids with TLR9 was demonstrated by an ELISA-based
      binding assay. Furthermore, intact RNA/DNA-hybrids could be
      detected within transfected Flt3L-DC with the
      RNA/DNA-hybrid-specific antibody S9.6. The influence of
      RNA/DNA-hybrids within viral, bacterial or mitochondrial
      ge-nomes could not be analysed in detail, because their
      immunostimulatory potential was probably masked by high
      amounts of genomic DNA. Infection of Flt3L-DC with Mo-MuLV
      lead to RNA/DNA-hybrid formation and accumulation within the
      cells cytoplasm and in vesicular structures. However, Mo-MuLV
      negatively influenced CpG2216-mediated IFN-signalling
      independent of Siglec-H or DAP12 in Flt3L-DC and therefore
      avoided antiviral immune responses. Cholesterol-coupled
      dsRNA40 serves as a potent adjuvant delivery system
      Vaccination is indispensable to prevent infectious diseases
      and therefore development of safe and potent vaccine
      adjuvants is still highly important. Adjuvants are included
      in vaccines to enhance immune responses to an antigen. In
      general, TLR-ligands possess the potential to be utilized as
      adjuvants. Different TLR are expressed within diverse
      subtypes of immune cells and induce various cytokines. The
      cytokine milieu mainly influences the characteristics of an
      vaccine. RNA40, which is a well established HIV-derived
      TLR7-ligand, has to be complexed to a transfection reagent
      for cellular uptake and for preventing enzymatic degradation.
      In this study a very potent adjuvant delivery system for TLR7
      has been developed. Double-stranded RNA40 was coupled to
      cholesterol to force cellular uptake. Cholesterol occurs
      naturally within cell membranes for which reason undesired
      side-effect should be prevented. Cellular uptake of
      cholesterol coupled dsRNA40 by Flt3L-DC was analyzed by flow
      cytometry and was as effective as uptake of dsRNA40 complexed
      to Dotap. Interestingly, stimulation of Flt3L-DC with dsRNA40
      coupled to cholesterol lead to an increased secretion of
      IFNα, TNFα, IL-6 and IL-10 in comparison to complexation of
      dsRNA40 to Dotap. Immune stimulation by cholesterol itself
      could be excluded. Overall, these in vitro experiments showed
      an effective activation of murine Flt3L-DC by dsRNA40-Chol in
      a TLR7-dependent manner.
description: Die Rolle von RNA/DNA-Hybriden in
      der angeborenen Immunantwort Das angeborene Immunsystem
      detektiert RNA und DNA über verschiedene pattern recognition
      receptors (PRR), zu welchen unter anderem die Toll-like
      Rezeptoren (TLR) gehören. RNA/DNA-Hybride treten im Verlauf
      viraler Infektionen, während endogener Prozesse sowie im
      Zusammenhang mit Autoimmunerkrankungen auf. In dieser
      Dissertation konnte gezeigt werden, dass synthetische
      RNA/DNA-Hybride, welche als Bestandteil der Genome des
      humanen Zytomegalievirus (HCMV) und des humanen
      Immundefizienzvirus (HIV) vorkommen, sowohl in humanen
      peripheral blood mononuclear cells (PBMC) als auch in murinen
      Flt3L-differenzierten dendritischen Zellen (Flt3L-DC) eine
      durch die Sezernierung von IFNα gekennzeichnete Immunantwort
      induzieren. Für das murine System wurde außerdem die
      Sezernierung weiterer Zytokine (TNFα, IL-6, IP-10)
      nachgewiesen. Durch die Verwendung von TLR9-defizienten
      Flt3L-DC wurde TLR9 als Rezeptor für die Detektion von
      RNA/DNA-Hybriden identifiziert. Außerdem wurde die
      spezifische Bindung von RNA/DNA-Hybriden an TLR9 in einer
      Bindungsstudie verifiziert. Dass die Induktion der
      Immunantwort durch RNA/DNA-Hybride erfolgte wurde
      fluoreszenzmikroskopisch unter Verwendung eines
      RNA/DNA-Hybrid-spezifischen Antikörpers bestätigt. Während
      der retroviralen Infektion von Flt3L-DC mit dem Moloney
      murinen Leukämievirus (Mo-MuLV) wurde die intrazelluläre
      Bildung und Akkumulation von RNA/DNA-Hybriden verifiziert.
      Des Weiteren wurde gezeigt, dass Mo-MuLV einen
      inhibitorischen Einfluss auf die CpG2216-vermittelte
      Induktion der IFN-Signalkaskade in Flt3L-DC besitzt, welcher
      weder über den Oberflächenrezeptor Siglec-H noch über das
      Adaptermolekül DAP12 vermittelt wird. Das TLR9-abhängige
      immunstimulatorische Potential synthetischer RNA/DNA-Hybriden
      konnte für virale, bakterielle oder mitochondriale Genome,
      welche natürlicherweise vorkommende RNA/DNA-Hybrid-Strukturen
      beinhalten, nicht abschließend analysiert werden, da der
      wesentlich höhere Gehalt an immunstimulatorischer genomischer
      DNA zu einer Überlagerung des RNA/DNA-Hybrid-induzierten
      Einflusses führte. Das Potential von cholesterolkonjugierter
      RNA40 als Adjuvans Zur Prävention von Infektionskrankheiten
      ist die Entwicklung von Impfstoffen von großer Bedeutung.
      Adjuvantien werden als Bestandteil von Impfstoffen eingesetzt
      und verstärken die durch den Impfstoff induzierte
      Immunantwort. Sowohl natürliche als auch synthetische
      TLR-Liganden besitzen das Potential als Adjuvantien verwendet
      zu werden. Da die unterschiedlichen TLR zelltypspezifisch
      exprimiert und durch ihre Liganden verschiedene
      Zytokinprofile induziert werden, kann eine eingeleitete
      Immunantwort durch TLR-Liganden modelliert werden. Solche
      Adjuvantien dürfen keine unerwünschten Nebenwirkungen
      besitzen. RNA40, eine Sequenz aus dem HIV-Genom, wurde
      bereits als TLR7-Ligand beschrieben. Derzeit müssen jedoch
      Transfektionsreagenzien verwendet werden, um sowohl die
      zelluläre Aufnahme des TLR-Liganden zu forcieren als auch die
      Stabilität der Nukleinsäuren zu gewährleisten. Da
      Transfektionsreagenzien zelltoxische Eigenschaften besitzen,
      sind sie für die Zulassung als Adjuvans von humanen
      Impfstoffen problematisch. In dieser Arbeit konnte gezeigt
      werden, dass cholesterolkonjugierte dsRNA40 (dsRNA40-Chol)
      ohne zusätzliche Komplexierung mit einem synthetischen
      Transfektionsreagenz ein außerordentliches
      immunstimulatorisches Potential besitzt, welches sich in der
      Sezernierung von IFNα, TNFα, IL-6 und IP-10 durch murine
      Flt3L-DC äußerte. Die durch dsRNA40-Chol eingeleitete
      Immunreaktion war im Vergleich zu der durch dotapkomplexierte
      dsRNA40 induzierten deutlich stärker. Die Detektion von
      dsRNA40-Chol erfolgte, wie erwartet, durch TLR7. Die
      zelluläre Aufnahme von dsRNA40-Chol wurde
      durchflusszytometrisch verifiziert und war der Transfektion
      von dsRNA40 im Komplex mit Dotap gleichwertig.