Characterization and Validation of a Novel GMP-Compliant Magnetic Separator – Process Development and Optimization for Protein Recovery
Creators: name: Ebeler, Moritz
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2019

description: Monoklonale Antikörperpräparate dominieren heutzutage den biopharmazeutischen Markt. Um mit dem stetig wachsenden Bedarf Schritt halten zu können wurden über die Jahre standardisierte Aufreinigungsverfahren entwickelt und verfeinert. Etablierte Konzerne haben durch immense Investitionen große, unflexible Produktionseinrichtungen geschaffen. Das Aufkommen von flexibleren und weniger kostenintensiven Einmalprodukten und Techniken ermöglichte es auch kleineren Unternehmen und einer steigenden Zahl von Auftragsproduzenten in den Markt einzusteigen. Die dadurch steigende Konkurrenz führt zu einem enormen Kostendruck und somit zu einer stetigen Optimierung von Prozesszeiten, Kosten und Ausbeuten. Zusätzlich führt der wachsende Markt für personalisierte Arzneimittel zu einem verstärkten Bedarf an flexiblen und schnellen Aufreinigungstechniken. Ein Ansatz um die Prozesskosten zu senken und die Produktivität zu steigern ist die Kombination bzw. Zusammenfassung einzelner Prozessschritte zu integrierten Prozessen. Den größten Nutzen hat diese Kombination von Prozessschritten zu Beginn des Aufreinigungsprozesses. Aufgrund dessen sind Verfahren von Interesse, welche die Zellernte mit der Isolation beziehungsweise der ersten Aufreinigung des Zielproduktes vereinen. Typische Beispiele für die Kombination von Fest-Flüssigtrennung, eingesetzt zur Zellernte, und der Isolation des Zielproduktes sind wässrige Zwei-Phasen-Systeme (ATPS) oder Expanded-Bed-Adsorption (EBA). Der Nachteil von ATPS-Systemen besteht in der aufwendigen Entwicklung geeigneter Systeme und der Einbringung prozessbedingter Verunreinigungen, die zur Ausbildung der Phasen von Nöten sind und anschließend durch zusätzliche Prozessschritte entfernt werden müssen. EBA hingegen ist anfällig für Alterungsprozesse des Mediums. Außerdem wird der Durchsatz des Prozesses stark durch die maximale Flussrate limitiert um ein Austragen des Mediums zu vermeiden. Als weiterer Vertreter integrierter Aufreinigungsmethoden hat die Magnetseparation das Potential die industrielle Nachfrage nach einem flexiblen, kostensparenden und schnellen Prozess zu befriedigen. Die Kombination aus funktionalisierten Magnetpartikeln mit hoch-gradienten Magnetseparation ermöglicht eine spezifische Aufreinigung des Zielproduktes direkt aus der Fermentationsbrühe. Der nötige Entwicklungsaufwand ist verglichen mit ATPS und EBA gering, da eine Vielzahl an funktionelle Gruppen bzw. Molekülen aus der Säulenchromatographie bekannt und umfassend beschrieben sind. Magnetische Partikel und Prozesse sind zusätzlich als analytische Technik weit verbreitet und somit ist eine große Auswahl von Partikeln kommerziell erhältlich. Die Vorteile der Magnetseparation liegen neben dem geringeren Entwicklungsaufwand in den schnellen Prozesszeiten aufgrund der erwarteten kurzen Bindezeiten. Zusätzlich besteht nahezu keine Limitierung in den Flussraten. Die Auswahl an Magnetpartikeln und funktionellen Gruppen macht dieses Verfahren flexibel einsetzbar und ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Prozessentwicklung. Des Weiteren können während der Produktion Zeit und somit auch Kosten eingespart werden, bei gleichzeitiger Steigerung der Produktivität durch Verringerung der Anzahl von Prozessschritten. Trotz all dieser Vorteile konnte sich die Magnetseparation bisher nicht als Aufreinigungsmethode im industriellen Umfeld durchsetzen. Dies ist vor allem auf das Fehlen geeigneter GMP-konformer Magnetseparatoren zurückzuführen. Herkömmliche Konstruktionen der Trennmatrix sowie unzureichende Dichtungskonzepte entsprachen nicht den strengen Anforderungen der Zulassungsbehörden für die pharmazeutische Arzneimittelherstellung. Wesentlich für die Einführung eines neuen Geräts in einer GMP geregelten Umgebung ist neben der Funktionalität auch der Nachweis der Reinigungsfähigkeit die für Magnetseparatoren meist nicht gegeben war. Der Nachweis der Reinigbarkeit und die Validierung dieses Prozesses ist erforderlich um die Sicherheit und Gesundheit der Patienten zu gewährleisten. Im Rahmen des Kooperationsprojektes der Andritz GmbH und des Karlsruher Instituts für Technologie sollte der Mangel an einem industriell einsetzbaren Magnetseparator behoben werden. Basierend auf einer ‚Rotor-Stator‘ Separationsmatrix, welche von Franzreb et al. bereits vor mehr als zehn Jahren entwickelt und patentiert wurde, konnte der erste GMP-konforme Magnetseparator entwickelt werden, welcher seit Anfang 2017 kommerziell erhältlich ist. Der entwickelte Separator wird in Abschnitt 4.3.1 vorgestellt. Die wichtigste Neuerung ist das komplett überarbeitete Dichtungskonzept, welches eine effektive Reinigung und Sterilisation ohne Zerlegen des Apparates ermöglicht. PEEK-Elemente dienen sowohl als Abdichtung als auch als Abstandhalter zwischen den Matrixelementen und bieten so einen leicht zu reinigenden, geschlossenen Verfahrensraum ohne Toträume. Die Kammer sowie die Ventilblöcke sind so ausgelegt, dass eine Selbstentleerung des Gerätes möglich ist. Darüber hinaus verhindern hohe Oberflächengüten das Anlagern von Verunreinigungen und vereinfachen die Reinigung des Gerätes. Zur Bestimmung der Systemeigenschaften wurden zwei unterschiedliche kommerziell erhältliche Magnetpartikel verwendet. Zum einen Mag Prep Partikel, welche einen mittleren Durchmesser von 100 nm bis 200 nm aufweisen. Zum anderen wurden M-PVA Partikel verwendet. Diese besitzen laut Hersteller einen mittleren Durchmesser von 1 µm bis 3 µm. Es konnten maximale Filterkapazitäten von 270 g Mag Prep Partikeln bis zu einem 1 %igen Durchbruch erreicht werden. Die Filterkapazität für M-PVA Partikel lag mit 430 g pro Liter Kammervolumen sogar deutlich höher. Die Verwendung viskoser Flüssigphasen führte zu etwas geringeren Filterkapazitäten, wobei der Haupt Einflussparameter auf die Separationseffizienz auf die Eigenschaften der Partikel zurückzuführen ist und nicht bei der Flüssigphase liegt. Hohe Partikelrückgewinnungsraten von über 99 % in Kombination mit prozessrelevanten Daten zu den Partikelbindkapazitäten ermöglichte es die Produktivität des Systems rechnerisch zu ermittelt und zu optimieren. Es zeigte sich, dass mehr als 200 L Fermentationsbrühe pro Tag prozessiert und dabei mehr als 1,6 kg Zielprodukt aufgereinigt werden können.
Diese Produktivität sollte durch die Implementierung eines industriell relevanten Proteinreinigungsprozesses validiert werden. Zu diesem Zweck wurde ein Aufreinigungsprozess eines monoklonalen Antikörpers aus einer Zellkultur von Chinesischen Hamster Ovarien für den Magnetseparator entwickelt, um das neue Gerät mit einem Benchmark-Prozess aus der Industrie vergleichen zu können. Es konnten fünf Aufreinigungszyklen mit konstanten Ausbeuten von über 85 %, Reinheiten von über 95 % und einer Reduktion des Wirtszellproteins von mehr als 2,5 log-Stufen hintereinander durchgeführt werden. Die erreichten Prozessausbeuten von über 85 % können mit den intensiv optimierten Plattformprozessen mithalten, während die Reinheiten von 95 % bei säulenbasierten Prozessen etwas höher liegen dürften. Zur Verbesserung der Reinheit kann eine weitere Optimierung des Waschprotokolls und die Wahl optimierter Waschlösungen erwogen werden. Der Hauptvorteil des Magnetseparationsprozesses liegt allerdings in der enormen Zeit- und Materialersparnis durch die Kombination aus Produkternte und chromatographischen Prozessschritten. Durch die Kombination von Zellernte und Reinigung des Zielproduktes können bis zu 25 % der Gesamtprozesskosten eingespart werden, die durch Operationen in der Fest-Flüssig Trennung verursacht werden. Der Vergleich mit säulenbasierten Verfahren ergab zudem eine dreimal höhere Produktivität für den Magnetseparationsprozess. Darüber hinaus kann dieser Prozess aufgrund stabiler Lebendzellzahlen während des gesamten magnetischen Trennprozesses auch als in-situ Trennmethode eingesetzt werden.
Der Hauptnachteil magnetischer Trennverfahren liegt in der Batchcharakteristik des Bindeschrittes des Zielmoleküls an die magnetischen Partikel. Bei diesem Prozess wird nur eine Gleichgewichtseinstellung erreicht, was zu einer geringen Beladung der Partikel mit Zielmolekül, insbesondere bei suboptimaler Bindungsaffinität, führt. Allerdings sind hohe Beladungen erwünscht. Zum einen können große so Volumina verarbeiten werden und zum anderen ist eine wirtschaftliche Nutzung der Partikel nur bei hohen Beladungen gegeben. Auf Grund dessen wurde ein Gegenstrom-Bindeprozess entwickelt, der in Abschnitt 2.6.2 vorgestellt wird. Bei diesem Verfahren werden magnetische Partikel und Fermentationsbrühe in einem zweistufigen Batch-Bindungsprozess im Gegenstrom bewegt. So war es möglich die Ausbeute von 74 % für einen einstufigen Prozess auf fast 100 % für den Gegenstromprozess zu steigern. 
Wie bereits angesprochen ist neben der Prozessentwicklung und Optimierung die Entwicklung von Reinigungsstrategien und dessen Validierung essentiell für eine Produktion unter GMP Richtlinien. Daher wurde für zwei Modellverunreinigungen ein CIP-Verfahren (Cleaning in Place) entwickelt. Für diesen Modellprozess wurden Hämoglobinlösung und Pferdeserum als Kontaminanten verwendet. Als Reiniger kamen COSA CIP 92, ein industrielles Reinigungsmittel auf der Basis von Natriumhydroxid und reine 0,5 M Natronlauge zum Einsatz. Das Reinigungsverfahren lieferte vielversprechende Ergebnisse, da insgesamt weniger als 2 mg Verunreinigungen im gesamten System verblieben. Zur Validierung des Prozesses wurde ein Oberflächenwischtest mit nachgeschalteter Analyse des gesamten organischen Kohlenstoffes (TOC) validiert und verwendet. Die Korrelation zwischen dem TOC-Gehalt und der Konzentration der Kontaminanten zeigte lineare Zusammenhänge über einen weiten Konzentrationsbereich, zudem konnten hohe Rücklöseraten der Kontaminanten aus den verwendeten Tupfern erzielt werden, was die Validierung des Reinigungsprozesses ermöglichte.
Die Kombination aus Charakterisierung, Prozessentwicklung und Optimierung sowie einer erfolgreichen Reinigungsvalidierung des ersten GMP konformen hochgradienten Magnetseparators ist ein umfassender Ansatz zur Charakterisierung und Inbetriebnahme des neuen Systems und legt den Grundstein für eine erfolgreiche Implementierung von Magnetseparationsprozessen in industriellen biopharmazeutischen Proteinaufreinigungsprozessen.