Μοριακή μελέτη για το χαρακτηρισμό των ελληνικών στελεχών των ιών της προϊούσας πνευμονίας/εγκεφαλίτιδας του προβάτου και της αρθρίτιδας της αίγας
Creators: name: Ali, Yassir
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006

description: Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν να αναπτυχθεί μια μοριακή δοκιμή ανίχνευσης (ημι-ένθετη PCR) γενικής ειδικότητας και μεγάλης ευαισθησίας για τα διαφορετικά στελέχη των lenti-ιών των μικρών μηρυκαστικών. Η δοκιμή PCR και οι διάφορες μέθοδοι προετοιμασίας του εκμαγείου, που αναπτύχθηκαν, αξιολογήθηκαν ως προς το εύρος, την ειδικότητα και την ευαισθησία ανίχνευσης χρησιμοποιώντας μεγάλο αριθμό στελεχών και απομονώσεων από το εξωτερικό και την Ελλάδα, καθώς και την ορολογική μέθοδο AGID, ως μέτρο σύγκρισης. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η φυλογενετική σχέση ελληνικών απομονώσεων των SRLVs, με βάση το προϊόν (404 ζβ) της ημι-ένθετης PCR, που αφορούσε τμήμα του γονιδίου pol το οποίο κωδικοποιεί μέρος των πρωτεϊνών dUTPάση και ενσωματάση. Για τους σκοπούς αυτούς χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 220 αιγοπρόβατα (132 πρόβατα και 88 αίγες), που χωρίστηκαν σε 2 ομάδες. Τα πειραματόζωα της ομάδας Ι, χρησιμοποιήθηκαν για την συλλογή απομονώσεων lenti-ιών των μικρών μηρυκαστικών, ενώ της ομάδας ΙΙ, χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της διαγνωστικής ικανότητας της νέας PCR. Σχετικά με το εύρος ανίχνευσης της ημι-ένθετης PCR, διαπιστώθηκε ότι ήταν ικανή να ανιχνεύσει το σύνολο των διεθνών και ελληνικών SRLV στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν Η φυλογενετική ανάλυση των ελληνικών απομονώσεων, έδειξε ότι η μικρή αυτή περιοχή του γενώματος δίνει σημαντικές πληροφορίες για τις γενετικές σχέσεις των ελληνικών απομονώσεων που στην στην πλειοψηφία τους προσδιορίστηκαν κυρίως ως MVV. Παράλληλα, φάνηκε πως υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των ελληνικών MVV απομονώσεων και την κατά τόπους προέλευσή τους μέσα στον ελλαδικό χώρο. Διαπιστώθηκαν, επίσης, δύο πιθανές περιπτώσεις εισαγωγής SRLVs από το εξωτερικό, που αφορούσαν μία MVV, καθώς και CAEV απομονώσεις. Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν τη δυνατότητα μετάδοσης των στελεχών CAEV και στα δύο είδη ζώων μικτών ποιμνίων. Διεθνή πρωτοτυπία της παρούσας διατριβής αποτελεί η συγκεκριμένη μεθοδολογία για την ανίχνευση και το χαρακτηρισμό των SRLVs, η οποία περιλαμβάνει των ημι-ένθετη PCR με εκφυλισμένους εκκινητές γενικής ειδικότητας και τη φυλογενετική ανάλυση της αλληλουχίας του προϊόντος χρησιμοποιώντας αλγόριθμο «Μέγιστης Πιθανοφάνειας»
description: The objective of this work was to develop a molecular technique (semi-nested PCR) assay which is polyvalent and highly sensitive for reliable detection of Small Ruminant Lentiviruses (SRLVs) proviral DNA. Its results were then compared with those of agar gel immunodiffusion (AGID) test and evaluated using different virus isolates and template preparation methods. In addition phylogenetic analysis of Greek SRLVs was performed. It was based on 404 base pair of selected sequences in the dUTPase-integrase encoding region of the pol gene. A total of 220 sheep and goats were used (132 sheep and 88 goats) divided into two groups. Animals of group I were used for obtaining SRLV isolates for evaluating the polyvalency of the semi-nested PCR protocol, while group II animals were used for the evaluation of the developed PCR. The semi-nested PCR proved to be much more sensitive, specific and capable of detecting many SRLV variants in infected or suspected animals. Phylogenetic analysis showed that most of the Greek isolates constituted a new monophyletic clade that belongs to MVV group. Some Greek isolates clustered with CAEV group. There was correlation between Greek isolates and their geographical distribution inside Greece. Two events of introduction of MVV and CAEV from outside Greece were reported. CAEV was shown to be transmitted between sheep and goats. The nobility of this work was the development of a semi-nested PCR using degenerated primers to detect and characterize SRLVs and the phylogenetic analysis of sequences of PCR products with Maximum likelihood