title: The role of Ca2+ activated potassium channels KCa3.1 and KCa2.3 in retinal angiogenesis
title: Die Rolle der Ca2+-aktivierten K+-Kanäle KCa3.1 und KCa2.3 bei retinalen Angiogeneseprozessen
Creators: name: Rappert, Denis
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: K+-Kanal
Angiogenesis
Netzhaut
Retina
Medizin, Gesundheit
Angiogenese
Potassium-channels

description: Angiogenesis plays an important
      role in many physiological and pathological processes. It is
      well known that the stimulation for vessel growth is
      controlled by ion channels in the endothelial cell membrane.
      Recent results suggest that the two calcium dependant
      potassium channels KCa3.1 and KCa2.3 are also important for
      angiogenesis. In this dissertation I investigated whether a
      change of expression in terms of knockout or upregulation
      affect the morphological and quantitative vascularisation of
      the retina. Analysis took place in young, 5- and 7-days old
      mice and in adult, 30-days old mice in different types of
      transgenic animals. It was possible to either specifically
      knockout one of the two channels, overexpress KCa2.3 or to
      combine knockout and overexpression. For the evaluation it
      was necessary to use and refine existing and to develop new
      methods for the preparation and visualisation of the retinal
      vessels. A very reliable and homogeneous immuno-histochemical
      staining of the vessels was reached by combining two
      antibodies. The first one was a type IV Kollagen antibody and
      the second one, coupled with alexa fluor, was specific to the
      first one. The preparation was then used to produce a graph
      of the main retinal vessel plexus of the retina and to obtain
      a picture of the complete retina via technical-optical
      methods. The so obtained picture was analysed using different
      methods to qualitatively and quantitatively determine the
      morphological changes of the vessels. A grey scale analysis
      was used to determine which percentage of the total area was
      covered with vessels. Additionally, the branching of the
      vessels in certain areas was evaluated to obtain the density
      of the capillary plexus. Finally, the diameter of both small
      as well as large vessels was measured to examine whether
      there are differences between the animal models. It was
      possible to show that the knockout of the KCa3.1 channel
      coincides with a increase of vessels in the retina, and
      specifically with a significant increase of the vascular
      branching. Similarly, the knockout of the KCa2.3 channel
      effects proangiotic changes in the retina, also causing an
      increase in the branching. Furthermore, the knockout of both
      channels increases the vascular branching as compared to the
      knockout of only one channel. However, the diameter of the
      capillars is not changed in any group of animal models. For
      the very young, five and seven day old, animals the results
      are less obvious and there are no clear differences between
      the different animal models, even though tendencies similar
      to the adult mice are discernible. Additionally, the used
      animal models allowed for investigation of the effects of
      overexpression of the KCa2.3 channel on the vascularisation
      of the retina. KCa2.3T/T transgenic animals and double
      transgenic animals KCa3.1-/-/ KCa2.3T/T with an
      overexpression of KCa2.3 showed a vessel density compared to
      the Wildtypes. The dependence of the KCa3.1 and KCa2.3
      channels for angiogenetic effects have been shown in this
      dissertation. It is possible that these channels could be a
      useful target for pharmacological manipulation of
      neovascularisation and vessel growth.
description: Angiogeneseprozesse spielen in
      vielen physiologischen und pathologischen Prozessen eine
      wichtige Rolle. Neuere Forschungen legen nahe, dass auch
      endotheliale Ca2+-abhängige K+-Kanäle KCa3.1 und KCa2.3
      wichtig für Angiogeneseprozesse sein könn-ten. In dieser
      Arbeit wurde untersucht, ob ein Verlust oder eine
      Überstimulation oben genannter Kanäle – durch genetischen
      Knockout oder Induktion – einen Einfluss auf die
      morphologische und quantitative Vaskularisierung der Retina
      von juvenilen, 5- und 7-Tage alten, sowie von adulten,
      30-Tage alten transgenen Tieren hat. Es wurden ver-schiedene
      bestehende Tiermodelle herangezogen, es waren der spezifische
      Knockout eines oder beider Kanäle, die Überexpression von
      KCa2.3 sowie eine Kombination von Knockout und Überexpression
      möglich. Es konnten bestehende und neue Methoden zur
      Retina-Präparation und Visualisierung der Netzhaut-Gefäße
      herangezogen und partiell entwickelt werden. Durch die
      Kombination eines ersten Typ IV Kollagen Antikörpers und
      eines zweiten, mit Alexa Fluor gekoppelten Antikörpers gegen
      den Ersten wurde eine sehr zuverlässige und homogene
      immunhistochemische Anfärbung der Gefäße erreicht. In einem
      weiteren Schritt wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop
      durch technisch-optische Hilfsmittel der Hauptgefäßplexus der
      Retina isoliert dargestellt und aus Einzelbildern ein
      digitales Bild der gesamten Retina erstellt. Auf dieses
      Abbild des Gefäßnetzes wurden verschiedene Arten der
      Auswertung angewandt, um die morpholo-gischen
      Gefäßveränderungen quantitativ und qualitativ beurteilen zu
      können. Bei der Flächenanalyse wurde mittels einer
      Grauwert-Analyse ausgewertet, wie viel der Ge-samtfläche
      eines Präparates mit Gefäßen bedeckt ist. Bei einer anderen
      Analyse wurden die Verzweigungen der Gefäße in definierten
      Arealen bestimmt um auf die Dichte des Kapillarnetzes
      Rückschlüsse zu ziehen. Als letztes wurden ebenfalls in
      definierten Arealen die Durchmesser sowohl kleiner als auch
      großer Gefäße bestimmt, um zu se-hen, ob bei den
      verschiedenen Tiermodellen Unterschiede in der Größe der
      Gefäße be-stehen. Es konnte hier gezeigt werden, dass der
      Knockout des KCa3.1-Kanals mit einer Zunahme der Anzahl der
      Gefäße in der Retina einhergeht, speziell die Anzahl der
      Verzweigungen der Gefäße sind signifikant höher. Auch der
      Knockout des KCa2.3-Kanals hat proangiotische Auswirkungen
      auf die Retina, was sich ebenfalls in einer Erhöhung der
      Verzweigungen äußert. Ausgeprägter war diese Beobachtung bei
      einem Knockout beider Kanäle. Der Durchmesser der Arteriolen
      und Kapillaren ist in allen Gruppen unverändert. Bei sehr
      jungen, 5- und 7-Tage alten Tieren zeichnen sich in der
      Tendenz gleichgerichtete Veränderungen ab, wie sie in adulten
      Tieren beobachtet werden. Die Eigenschaften der verwendeten
      Tiermodelle erlaubten Untersuchungen, in denen der
      KCa2.3-Kanal überexprimiert wird. Hier zeigte sich sowohl bei
      KCa2.3T/T transgenen Tieren als auch bei KCa3.1-/-/ KCa2.3T/T
      doppeltransgenen Tieren eine den Wildtypen vergleichbare
      Gefäßdichte bei Überexpression von KCa2.3. In Bezug auf die
      Rolle der Kanäle KCa3.1 und KCa2.3 wurde in der vorliegenden
      Arbeit die These der Einflussnahme auf Angiogeneseprozesse
      beider Kanäle dargelegt. Es ist denkbar, dass sich diese
      Kanäle in Zukunft als ein lohnendes Ziel für pharmakologische
      Beeinflussung von Gefäßwachstum und Neoangiogenese
      herausstellen.