Ανάπτυξη μεθόδου για τον προσδιορισμό στεροειδών σε ορό αίματος
Creators: name: Ριζοπούλου, Ιφιγένεια Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2025
Subjects: Στεροειδή
Ορός
Υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μαζών σε σειρά
Steroids
Serum
LC-MS/MS

description: Τα στεροειδή διαδραματίζουν καίριο ρόλο στη ρύθμιση πολυάριθμων φυσιολογικών διεργασιών. Δρουν ως ορμόνες, επιτρέποντας την επικοινωνία μεταξύ κυττάρων και ιστών και συμμετέχουν σε μηχανισμούς που επηρεάζουν την ανάπτυξη, τον μεταβολισμό και τη διατήρηση της ομοιόστασης του οργανισμού. Η διατάραξη των επιπέδων των στεροειδών μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές παθολογικές καταστάσεις. Μεταβολές στη σύνθεση ή στον μεταβολισμό τους σχετίζονται με ενδοκρινικές διαταραχές, όπως το σύνδρομο Cushing, το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών και η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων. Η ανίχνευση και η ποσοτικοποίησή τους είναι επομένως ζωτικής σημασίας για τη διάγνωση και την παρακολούθηση αυτών των καταστάσεων. Οι ως τώρα μέθοδοι ανάλυσης, όπως οι ανοσοδοκιμασίες, συχνά στερούνται επαρκούς εξειδίκευσης και ευαισθησίας. Στον αντίποδα, η υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας σε σειρά (LC-MS/MS) έχει αναδειχθεί ως η πλέον αξιόπιστη τεχνική, προσφέροντας υψηλή εκλεκτικότητα και δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών στεροειδών σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Ωστόσο, ο ποσοτικός προσδιορισμός των στεροειδών παρουσιάζει προκλήσεις. Οι χαμηλές τους συγκεντρώσεις στον ορό αίματος (από pg/mL έως ng/mL), οι διαφορές στα φυσιολογικά επίπεδα ανάλογα με το φύλο και την ηλικία, καθώς και η παρουσία τους σε ελεύθερη ή συζευγμένη μορφή απαιτούν ιδιαίτερα ευαίσθητες μεθόδους ανάλυσης. Στο πλαίσιο των δοκιμών, εξετάστηκαν διαφορετικές τεχνικές προκατεργασίας των δειγμάτων, όπως η κατακρήμνιση πρωτεϊνών (PPT), η υγρή-υγρή εκχύλιση (LLE), η εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) και η υποστηριζόμενη υγρή εκχύλιση (SLE), προκειμένου να επιλεγεί η πλέον αποδοτική προσέγγιση. Επιπλέον, εξετάστηκαν διάφορες χρωματογραφικές στήλες και διαφορετικές χρωματογραφικές συνθήκες για τη βελτιστοποίηση του διαχωρισμού των ενώσεων. Στην παρούσα μελέτη, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μια μέθοδος UPLC-MS/MS, η οποία επιτρέπει τον ταυτόχρονο και αξιόπιστο προσδιορισμό πολλαπλών στεροειδών στον ορό αίματος. Η απλή και αποδοτική διαδικασία προκατεργασίας, που περιλαμβάνει εκχύλιση υγρού-υγρού μετά από κατακρήμνιση πρωτεϊνών, επέτρεψε την απομάκρυνση παρεμποδίσεων και την προσυγκέντρωση των προσδιοριζόμενων ενώσεων, βελτιώνοντας σημαντικά την ευαισθησία της ανάλυσης. Η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα, την επαναληψιμότητα, την ακρίβεια και την ανάκτηση εκχύλισης. Συγκεκριμένα, η επαναληψιμότητα, η οποία ήταν εντός αποδεκτών ορίων, επιβεβαίωσε τη συνέπεια των μετρήσεων, ενώ οι μετρήσεις ακρίβειας απέδειξαν ότι τα αποτελέσματα παραμένουν σταθερά εντός των καθορισμένων ορίων. Επιπρόσθετα, η ανάκτηση εκχύλισης ήταν ικανοποιητική τόσο σε χαμηλές όσο και σε υψηλές συγκεντρώσεις, διασφαλίζοντας ότι οι ενώσεις μεταφέρονται χωρίς απώλειες από το ένα στάδιο στο επόμενο καθ’ όλη τη διάρκεια της προκατεργασίας. Τέλος, τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ) κυμάνθηκαν μεταξύ των τάξεων ppt και ppb, επιβεβαιώνοντας την υψηλή ευαισθησία της μεθόδου. Η συμμόρφωση με τις παραμέτρους επικύρωσης αποδεικνύει την αξιοπιστία της μεθόδου για τον προσδιορισμό στεροειδών στον ορό αίματος, καθιστώντας την ένα σημαντικό εργαλείο στη διαγνωστική και βιοαναλυτική έρευνα.
description: Steroids play a crucial role in regulating numerous physiological processes. They act as hormones, facilitating communication between cells and tissues, and are involved in mechanisms affecting growth, metabolism, and homeostasis. Imbalance in steroid levels can lead to severe pathological conditions. Alterations in their synthesis or metabolism are associated with endocrine disorders such as Cushing's syndrome, polycystic ovary syndrome, and congenital adrenal hyperplasia. Detecting and quantifying steroids is therefore essential for diagnosing and monitoring these conditions. Traditional analytical methods, such as immunoassays, often lack sufficient specificity and sensitivity. In contrast, liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) has emerged as the most reliable technique, offering high selectivity and the ability to simultaneously quantify multiple steroids at low concentrations. However, the quantitative determination of steroids presents challenges. Their low concentrations in blood serum (ranging from pg/mL to ng/mL), variations in normal levels based on sex and age, and their presence in free or conjugated forms necessitate highly sensitive analytical methods. In this study, different sample pretreatment techniques, including protein precipitation (PPT), liquid-liquid extraction (LLE), solid-phase extraction (SPE), and supported liquid extraction (SLE), were evaluated to determine the most efficient approach. Additionally, various chromatographic columns and conditions were examined to optimize compound separation. A validated UPLC-MS/MS method was developed for the simultaneous and reliable determination of multiple steroids in blood serum. The simple and efficient pretreatment process, involving liquid-liquid extraction following protein precipitation, enabled the removal of interferences and pre-concentration of the analytes, significantly improving analytical sensitivity. The method was validated for linearity, repeatability, accuracy, and extraction recovery. Specifically, repeatability was within acceptable limits, ensuring measurement consistency, while accuracy tests demonstrated that results remained stable within the defined criteria. Furthermore, extraction recovery was satisfactory at both low and high concentrations, ensuring efficient analyte transfer throughout the pretreatment process. Finally, detection (LOD) and quantification (LOQ) limits ranged from ppt to ppb levels, confirming the high sensitivity of the method.Compliance with validation parameters confirms the method’s reliability for steroid determination in blood serum, establishing it as an important tool in diagnostic and bioanalytical research.