Εργαστηριακή μελέτη λοιμώξεων από το Mυκόπλασμα της πνευμονίας στα παιδιά
Creators: name: Almasri, Motasem Y.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: PCR
ELISA-IgM-Captur

description: Το Μυκόπλασμα της πνευμονίας είναι μια συνήθης αιτία λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος στα παιδιά σχολικής ηλικίας και στους νεαρούς ενήλικες. Προκαλεί φαρυγγίτιδα, ρινίτιδα, τραχειοβρογχίτιδα, οξεία μέση ωτίτιδα και ευθύνεται για ποσοστό 10-20% των νοσηλευομένων παιδιών με πνευμονία και για 20-40% των περιπατητικών παιδιών με πνευμονία. Προκαλεί μεμονωμένα κρούσματα ή επιδημίες σε κλειστές κοινότητες. Η λοίμωξη από το Μ. της πνευμονίας είναι ενδημική στις περισσότερες περιοχές του κόσμου και ιδιαίτερα σε χώρες με εύκρατο κλίμα. Η κλινική εικόνα των ασθενών με λοιμώξεις από το Μ. της πνευμονίας δεν διαφέρει από αυτήν των ασθενών με λοιμώξεις οφειλόμενες σε άλλους ιούς ή βακτήρια, με αποτέλεσμα η διάγνωση της λοίμωξης από το Μ. της πνευμονίας να βασίζεται σε ειδικές εργαστηριακές μεθόδους. Η έλλειψη διαγνωστικής εργαστηριακής μεθόδου ικανής να ανιχνεύει άμεσα το M. της πνευμονίας ή να προσδιορίζει με ακρίβεια την ορολογική απάντηση έχει ως αποτέλεσμα η επιδημιολογία και η κλινική σημασία του μικροοργανισμού να μην έχει διευκρινιστεί πλήρως. Η άμεση διάγνωση είναι σημαντική διότι η θεραπεία της λοίμωξης από το Μ. της πνευμονίας με β-λακταμικά αντιβιοτικά που συνήθως χρησιμοποιούνται για παρόμοιες λοιμώξεις δεν είναι αποτελεσματική, ενώ αντίθετα η θεραπεία με αντιβιοτικά όπως οι μακρολίδες είναι δυνατόν να μειώσει σημαντικά τη διάρκεια της νόσου. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν α) να καθορισθεί η συχνότητα των λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος που οφείλονται στο M. της πνευμονίας σε παιδιά που νοσηλεύθηκαν λόγω οξείας λοίμωξης του αναπνευστικού συστήματος β) να διερευνηθεί η πιθανότητα συσχέτισης της λοίμωξης από το Μ. της πνευμονίας με άλλες παραμέτρους όπως η ηλικία και η κλινική διάγνωση, γ) να γίνει σύγκριση των κλασικών με τις μοριακές μεθόδους εργαστηριακής διάγνωσης του M. της πνευμονίας και να καταγραφούν τα πλεονεκτήματα και οι τυχόν δυσκολίες εκάστης εξ αυτών, ώστε να καθοριστεί ο κατάλληλος αλγόριθμος μεθόδων που θα πρέπει να εφαρμόζεται σε κάθε περίπτωση πιθανής λοίμωξης από το Μ. της πνευμονίας και δ) να τυποποιηθούν τα στελέχη του Μ. της πνευμονίας της παρούσας μελέτης με βάση την αλληλουχία νουκλεοτιδίων του γονιδίου προσκόλλησης Ρ1. Η πρωτοτυπία αυτής της μελέτης ήταν αφενός μεν ο καθορισμός της συχνότητας των λοιμώξεων από το Μ. της πνευμονίας χρησιμοποιώντας συνδυασμό μοριακών και κλασσικών μεθόδων, αφετέρου δε ο προσδιορισμός των τύπων του Μ. της πνευμονίας που προκάλεσαν λοιμώξεις κατά το χρονικό διάστημα της μελέτης συμβάλλοντας στην επιδημιολογική μελέτη του μικροοργανισμού. Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 225 παιδιά ηλικίας 2 μηνών-14 ετών (μέση ηλικία 4,41 έτη) τα οποία νοσηλεύθηκαν κατά τη διάρκεια 13 μηνών (1/5/2003-1/6/2004) για τουλάχιστον δύο ημέρες στις Β΄ και Δ΄ Πανεπιστημιακές Παιδιατρικές Κλινικές του Νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ Θεσσαλονίκης με συμπτώματα οξείας λοίμωξης του αναπνευστικού συστήματος. Η Δ΄ Παιδιατρική Κλινική τους τελευταίους 4,5 μήνες της μελέτης μεταφέρθηκε στο Νοσοκομείο «Παπαγεωργίου». Από κάθε ασθενή λήφθηκε φαρυγγικό επίχρισμα και ένα πρώτο δείγμα ορού αίματος κατά την ημέρα εισαγωγής του στο Νοσοκομείο, ενώ ένα δεύτερο δείγμα ορού αίματος λήφθηκε από 75 ασθενείς μετά από 5-63 ημέρες (μέση διάρκεια 13,8 ημέρες). Στα φαρυγγικά επιχρίσματα αναζητήθηκε το Μ. της πνευμονίας 1) με την καλλιέργεια σε διφασικό θρεπτικό υλικό με κυανό του μεθυλενίου και γλυκόζη 2) με την άμεση ανίχνευση αντιγόνου (EIA) σε 206 φαρυγγικά επιχρίσματα και 3) με την PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς για το γονίδιο P1. Και στα δύο δείγματα ορού αίματος των ασθενών προσδιορίσθηκαν ειδικά αντισώματα με τη δοκιμασία συνδέσεως συμπλήρωματος (CFT), με τη δοκιμασία του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) για IgM και IgG αντισώματα και την ανοσοενζυμική δοκιμασία (ELISA) για IgM και IgG. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε ELISA- IgA για 68 δείγματα ορού αίματος, ενώ ορισμένα δείγματα εξετάστηκαν με την ανοσοαποτύπωση (western-blot) για την ανίχνευση και την επιβεβαίωση IgM (34 δείγματα) και IgA (3 δείγματα) αντισωμάτων. Η τυποποίηση του Μ. της πνευμονίας έγινε σε αντιπροσωπευτικά δείγματα. Για την τυποποίηση πολλαπλασιάστηκε περιοχή του γονιδίου μεγέθους 1110 bp και ακολούθησε στοίχιση και σύγκριση των αλληλουχιών με αντίστοιχες του γονιδίου Ρ1 από διάφορα στελέχη αναφοράς που πάρθηκαν από την Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών (GenBank). Σύμφωνα με τα κριτήρια που τέθηκαν 23 από τα 225 παιδιά (10,2%) είχαν βέβαιη πρόσφατη λοίμωξη, 12 από τα 225 (5,3%) είχαν προφανή και 16 από τα 225 (7,1%) είχαν ενδεχόμενη πρόσφατη λοίμωξη. Από τα 23 παιδιά με βέβαιη πρόσφατη λοίμωξη τα 16 (69,6%) είχαν πνευμονία, τα 6 (26,1%) οξεία φαρυγγίτιδα και το 1 (4,4%) είχε τραχειοβρογχίτιδα. Παρατηρήθηκε ότι η συχνότητα των λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος από το Μ. της πνευμονίας αυξανόταν με την ηλικία και ότι οι περισσότερες περιπτώσεις σημειώθηκαν το καλοκαίρι και το φθινόπωρο ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ αρρένων και θηλέων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς τις κλινικές εκδηλώσεις και τα συνήθη εργαστηριακά ευρήματα μεταξύ των παιδιών με λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος με Μ. της πνευμονίας και των παιδιών με λοίμωξη που οφείλεται σε άλλα βακτηριακά ή ιογενή αίτια. Γι' αυτό υπογραμμίζεται η ανάγκη αιτιολογικής εργαστηριακής διάγνωσης της νόσου ώστε να χορηγείται η κατάλληλη αντιβιοτική θεραπεία. Από τα 23 παιδιά με βέβαιη πρόσφατη λοίμωξη η καλλιέργεια, η άμεση ανίχνευση αντιγόνου και η PCR ήταν θετικές στα 4 (ευαισθησία 17,4%), 1(4,4%) και 17 (73,9%) παιδιά αντίστοιχα. Εξετάζοντας τα πρώτα δείγματα ορού αίματος κατά την οξεία φάση της νόσου η CFT, η IgM-IFA, η IgM-ELISA και η IgA-ELISA ήταν θετικές στα 7 (ευαισθησία 30,4%), 11 (47,8%), 16 (69,6%) και 2 (8,7%) παιδιά αντίστοιχα. Όταν συμπεριλήφθηκαν και τα δεύτερα δείγματα ορού αίματος αυτές οι δοκιμασίες έγιναν θετικές στα 11 (ευαισθησία 47,8%), 15 (65,2%), 20 (87%) και 5 (21,7%) παιδιά αντίστοιχα. Θεωρώντας ότι μόνο τα 23 παιδιά είχαν βέβαιη πρόσφατη λοίμωξη η ειδικότητα αυτών των δοκιμασιών διαμορφώθηκε ως εξής: καλλιέργεια 100%, ανίχνευση αντιγόνου 100%, PCR 96,5% και για τις ορολογικές δοκιμασίες όταν συμπεριλήφθηκαν και τα δύο δείγματα ορού αίματος: CFT 97,5%, IgM-IFA 91,6% και IgM-ELISA 98%. Μετά την τυποποίηση του Μ. της πνευμονίας βρέθηκε ότι έξι στελέχη ανήκαν στον τύπο Ι και ένα στέλεχος στον τύπο ΙΙ, ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά όσον αφορά την κλινική εκδήλωση της νόσου μεταξύ των δύο τύπων. Η καλλιέργεια και η άμεση ανίχνευση αντιγόνου έχουν χαμηλή ευαισθησία αλλά άριστη ειδικότητα. Η PCR είναι πιο ευαίσθητη από τις ορολογικές δοκιμασίες όταν υπάρχει ένα δείγμα ορού αίματος κατά την οξεία φάση της νόσου και η ειδικότητα της είναι ικανοποιητική (96,5%). Από τις ορολογικές δοκιμασίες όταν αυτές γίνουν σ' ένα δείγμα ορού αίματος κατά την οξεία φάση της νόσου καλύτερη ευαισθησία έχει η IgM-ELISA (69,6%) με υψηλότερη ειδικότητα (98%) σε σχέση με τον IgM-IFA (92,6%). Καλύτερα αποτελέσματα επιτυγχάνονται όταν εξετάζονται δύο δείγματα ορού αίματος, όπου πάλι η IgM-ELISA έχει μεγαλύτερη ευαισθησία (87%) και μεγαλύτερη ειδικότητα (98%) σε σχέση με τις υπόλοιπες ορολογικές δοκιμασίες. Η IgA-ELISA βρέθηκε να έχει πολύ χαμηλή ευαισθησία (8,7%) και δεν θεωρείται κατάλληλη για τη διάγνωση της λοίμωξης από το Μ. της πνευμονίας. Τέλος η ανοσοαποτύπωση IgM βρέθηκε να είναι πολύ ευαίσθητη για την ανίχνευση των IgM αντισωμάτων κατά την οξεία φάση της νόσου, πριν την ανίχνευση των IgM με άλλες ορολογικές μεθόδους. Επιπλέον, η ανοσοαποτύπωση IgM και IgA είναι χρήσιμες για την επιβεβαίωση IgM και IgA αντισωμάτων όταν υπάρχει διαφωνία μεταξύ IFA και ELISA. Συμπεραίνεται, ότι το Μ. της πνευμονίας ευθύνεται για το 10,2% των λοιμώξεων του αναπνευστικού συστήματος σε παιδιά που νοσηλεύονται, ότι κυκλοφορούν και οι δύο τύποι αυτού στην Ελλάδα και ότι για την ορθή εργαστηριακή διάγνωση της λοίμωξης με το Μ. πνευμονίας πρέπει να ακολουθείται ορισμένος αλγόριθμος που περιλαμβάνει την PCR και την ELISA-IgM κατά την οξεία φάση της νόσου, ώστε να αρχίζει έγκαιρα η κατάλληλη θεραπευτική αγωγή με αποτέλεσμα τη μείωση της διάρκειας της νόσου και την αποφυγή εμφάνισης τυχόν επιπλοκών
description: Mycoplasma pneumoniae is a common cause of respiratory tract infections in school-aged children and young adults. It causes pharyngitis, rhinitis, tracheobronchitis and acute otitis media. M. pneumoniae also causes infection in 10- 20% of paediatric patients hospitalised due to pneumonia and infection in 20 to 40% of ambulatory paediatric patients with pneumonia. It causes individual infection cases and epidemics, which usually take place in close communities. Infection due to M. pneumoniae is endemic in most areas of the world, although it is more common in temperate zones. The clinical presentation of patients with M. pneumoniae infection is not significantly different from that of patients with infections caused by other bacteria or viruses, so diagnosis of infection relies primarily on special laboratory testing. The lack of rapid, accurate diagnostic laboratory tests to detect M. pneumoniae directly or the serologic response it elicits has hampered understanding of the epidemiology as well as contributed to unawareness of the potential clinical significance of this common pathogen in daily practices. However, a specific diagnosis is important, because b-lactam antibiotics' treatment of infection due to M. pneumoniae is ineffective, whereas the use antibiotics such as macrolides can markedly reduce the duration of the illness. The aims of this study were a) to determine the frequency of M. pneumoniae infection among children hospitalised due to acute respiratory tract infections, b) to investigate the relationship of M. pneumoniae infection to other parameters like age and clinical diagnosis, c) to compare classical and molecular laboratory methods used for the diagnosis of M. pneumoniae infection and to investigate the advantages and the difficulties that may be faced in each of these methods, so that we determine the most suitable approach that we must apply in each possible case of M. pneumoniae infection, and d) to discriminate the types of M. pneumoniae strains of this study on the base of P1 gene diversity. The study was conducted during a 13-month period (May 2003 to June 2004). Two hundreds and twenty-five children, mean age 4,41 years (range 2 months to 14 years) from the area of Thessaloniki, with signs and symptoms of community-acquired respiratory tract infection were hospitalised for at least two days in the B΄ or D΄ Clinic of Paediatrics, AHEPA Hospital, Aristotle University of Thessaloniki. The D Clinic of Paediatrics during the last 4.5 months was transferred to Papageorgiou Hospital. From each patient a throat swab specimen and first serum specimen were obtained on his/her admission to the hospital. Whereas, second serum specimens were obtained from 75 patients 5 to 63 days (mean 13.8 days) later. Throat swab specimens from these children were examined for the detection of M. pneumoniae by: 1) Methylene blue-glucose diphasic medium 2) EIA-antigen detection (for 206 specimens) and 3) PCR with primers (P1-1 and P1-3) that were specific for the P1 gene (209 b.p). Both of the first and second serum specimens from these patients were examined for the presence of antibodies against M. pneumoniae by complement fixation test (CFT), Indirect Immunofluorescence assay-IFA (IgM and IgG) and Enzyme Linked Immunoassay-ELISA (IgM and IgG). In addition, 68 specimens were examined using ELISA-IgA, while western-blot technique was used for detection and confirmation of IgM (34 specimens) and IgA (3 specimens) antibodies. M. pneumoniae strains were typed in representative cases. For typing a 1110 bp region of the P1 gene was amplified by PCR, which was subsequently sequenced. The resulting sequences were compared to P1 gene sequences of reference strains obtained from the Gene Bank to determine the type of the representative strains in the present study. According to the applied diagnostic criteria 23/225 (10.2%) had confirmed recent M. pneumoniae infection, 12/225 (5.3%) had probable recent infection and 16/225 (7.1%) had possible recent infection. Sixteen of the 23 children (69.6%) with confirmed recent M. pneumoniae infection had defined pneumonia, 6 (26.1%) acute pharyngitis and 1 (4.4%) had tracheobronchitis. The frequency of respiratory tract infection caused by M. pneumoniae was increased by age and most cases were reported during summer and autumn. With respect to clinical manifestations and laboratory parameters statistical differences were not found between patients with M. pneumoniae infection and patients with other infections. Therefore, confirming the need for laboratory diagnosis of the disease so that the suitable antibiotic treatment can be applied. Of the 23 children with confirmed diagnosis of recent M. pneumoniae infection, culture, antigen detection test and PCR were positive in 4 cases (sensitivity 17.4%), 1 (4.4%) and 17 (73.9%) respectively. In the acute phase first serum specimens CFT, IgM-IFA, IgM-ELISA and IgA-ELISA were positive in 7 (sensitivity 30.4%), 11 (47.8%), 16 (69.6%) and 2 (8.7%) respectively. When the second serum specimens were included, these assays became positive in 11 (47.8%), 15 (65.2%), 20 (87%) and 5 (21,7%), respectively. When it was considered that only these 23 children had confirmed recent M. pneumoniae infection the specificities of these methods were found as follows: culture 100%, antigen detection test 100%, PCR 96.5% and for serologic methods when the second serum specimens were included: CFT 97.5%, IgM-IFA 91.6% and IgM-ELISA 98%. After typing PCR, six strains of M. pneumoniae were found to be of type I and one strain was found to be of type II. Both types were found to be associated with respiratory tract disease in children. Culture and indirect antigen detection test for M. pneumoniae had low sensitivity but high specificity. PCR was found to be more sensitive than the serologic methods when there was a single serum specimen in the acute phase of the disease and its specificity (96.5%) was satisfactory. When the serological assays were used to examine the first serum specimens during the acute phase of the disease, IgM-ELISA had better sensitivity (69.6%) and higher specificity (89%) than IgM-IFA. Better results were achieved when two serum specimens were examined and again IgM-ELISA had higher sensitivity (87%) and higher specificity (98%) in comparison to the other serological methods. IgA-ELISA was found to have very low sensitivity (8.7%), and its use alone was not suitable for the diagnosis of M. pneumoniae infection in children at the acute phase of infection. Finally, western blot IgM was found to be very sensitive for the detection of IgM antibodies at the early stage of infection before IgM antibodies could be detected by other traditional serologic methods. In addition, western blot IgM and IgA were helpful for confirmation of the results of IgM and IgA antibodies when there is disagreement between IFA and ELISA. In conclusion, an algorithm combining traditional and molecular methods has to be followed in order to achieve a rapid and accurate laboratory diagnosis of M. pneumoniae infection so that an appropriate antibiotic therapy to be applied in order to decrease the duration of illness and to avoid the occurrence of possible complications