Protein-Semisynthese und mechanistische Studien zum Proteinspleißen mit Hilfe eines gespaltenen Inteins
Creators: name: Ludwig, Christina
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2008
Subjects: subject: Protein-Semisynthese
subject: Inteine
subject: Proteinspleißen
subject: Fluoreszenz-Anisotropie
subject: 570
subject: 540

description: The term intein is used for an internal protein domain, that catalyses its own excision out of a precursor protein and the concomitant linkage of the two flanking sequences, the Nand C-extein, with a native peptide bond. In split inteins, the intein domain is divided into two parts that undergo fragment association followed by protein splicing in trans. The specificity and sequence promiscuity of split inteins make them a generally useful biochemical tool, for example for the preparation of proteins out of two fragments. If the intein is used to ligate a synthetic and a recombinant fragment the splice product represents a semi-synthetic protein. The new approach outlined in this work is based on the artificially split Ssp DnaB mini-intein. The splitting was performed at a variable loop position close to the N-terminus leading to a synthetically accessible N-terminal intein fragment (Int^N) and a recombinantly expressible C-terminal part (Int^C), which are 11 and 143 amino acids in length, respectively. This intein enables the chemo-enzymatic synthesis of N-terminally modified semi-synthetic proteins. The feasibility of the new approach was shown experimentally using two model systems, wherein a synthetic N-extein peptide pentamer, including a 5,6-Carboxyfluorescein moiety, was ligated to the N-terminus of the 12 kD protein thioredoxin and the 31 kD protein ß-lactamase. After 24 h of incubation at 25°C, under native conditions and using a peptide and protein concentration in the micromolar range, the desired splice product could be formed with a maximal yield of approximately 70%. Furthermore, the reaction also proceeded selectively in an E. coli cell lysate. The applicability in such complex mixtures together with the fact, that this intein enables the generation of N-terminally modified semi-synthetic proteins without a necessary incorporation of thioester groups and amino terminal cysteins, are the main advantages compared to Expressed Protein Ligation. For a detailed characterisation of the semi-synthetic intein the minimal sequence requirements of Int^N were evaluated. Measurements of changes in fluorescence anisotropy were carried out to investigate the inherent affinity of both intein fragments. For that purpose an Int^C mutant blocked in protein splicing was used, leading to a dissociation constant of 1.1 µM and a rate constant of complex formation of 16.8 M^-1s^-1. Furthermore, based on an alanine scanning analysis of the Int^N(1-11) sequence, three for the complex association essential hydrophobic residues could be identified (Ile2, Ile8 and Leu10), whereas substitutions at other positions were tolerated. Additionally, the semi-synthetic intein was well suited for further mechanistic studies of the protein splicing mechanism. Intriguingly, a Gly[-1]Ala-substitution of the first amino acid within the N-extein, was revealed to result in thiazoline ring formation involving the catalytic Cys1, likely by aberrant dehydration of an oxythiazolidine-anion intermediate. This finding provides the first experimental evidence for this postulated intermediate during the initial N,S ?? acyl shift. A second interesting side reaction within the splicing mechanism, the formation of a caprolactone, could be induced using an N-methylated amino acid at position [-1] and a serin residue at position [-2]. Further unnatural amino acids were successfully introduced at delicate positions within the synthetic Int^N-fragment as well as the N-extein sequence, and their impact on the spatially and temporally coordinated steps of the splicing mechanism was evaluated.
description: 1 Als Intein wird eine interne Proteindomäne bezeichnet, die sich autoakatalytisch aus einem Vorläuferprotein herausschneiden kann und dabei die beiden flankierenden Domänen, das Nund C-Extein, mittels einer nativen Peptidbindung verknüpft. In einem gespaltenen Intein liegt die Inteindomäne in zwei Fragmente geteilt vor, welche zunächst assoziieren und rekonstituieren müssen, bevor das sogenannte trans-Proteinspleißen katalysiert wird. Aufgrund ihrer Spezifität und ihrer Toleranz gegenüber heterologen Exteinsequenzen stellen gespaltene Intein ein wichtiges biochemisches Werkzeug dar, mit dem z.B. Zielproteine aus zwei Polypeptidsequenzen aufgebaut werden können. Wird das Intein zur Ligation einer synthetischen und einer rekombinanten Polypeptidsequenz verwendet, dann entspricht das Spleißprodukt einem semisynthetischen Protein. Der in dieser Arbeit etablierte neue Ansatz zur Protein-Semisynthese basiert auf dem künstlich gespaltenen Ssp DnaB-Mini-Intein. Die Spaltung wurde in diesem Fall innerhalb einer variablen Schleifenregion nahe am N-Terminus vollzogen, wodurch ein synthetisch zugängliches N-terminales Inteinfragment (Int^N) und ein rekombinant exprimierbares Cterminales Segment (Int^C) entstanden, welche eine Größe von 11 und 143 Aminosäuren umfassen. Dieses neuartig gespaltene Intein ermöglicht die chemoenzymatische Synthese von N-terminal modifizierten semisynthetischen Proteinen. Die Umsetzbarkeit der neuen Methode wurde anhand von zwei Modellproteinen getestet, wobei ein synthetisches Pentapeptid, inklusive einer 5,6-Carboxyfluoresceingruppe, mit dem N-Terminus des 12 kDa großen Proteins Thioredoxin und des 31 kDa großen Proteins ß-Lactamase verknüpft wurde. Nach 24 h Inkubation bei 25°C, unter nativen Bedingungen und in einem mikromolaren Konzentrationsbereich beider Reaktanten, konnte eine maximale Spleißproduktausbeute von ca. 70% erreicht werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Reaktion auch in einem E. coli Zelllysat selektiv ablief. Diese generelle Anwendbarkeit der Methode in komplexen Umgebung stellt zusammen mit der Tatsache, dass beim semisynthetischen trans-Proteinspleißen die Einführung von C-terminalen Thioestergruppen und N-terminalen Cysteinen nicht notwendig ist, den wichtigsten Vorteil im Vergleich zur Expressed Protein Ligation dar. Für eine detaillierte Charakterisierung des semisynthetischen Inteins wurde die minimale Int^N-Sequenzlänge ermittelt. Messungen zur Inteinfragment-Affinität wurden durch die Bestimmung der Fluoreszenz-Anisotropie mit Hilfe einer Int^C-Mutante durchgeführt, deren Fähigkeit zur Spleißproduktbildung durch drei eingeführte Punktmutationen blockiert war. Die ermittelte Dissoziationskonstante betrug 1,1 µM, und die Geschwindigkeitskonstante der Inteinfragment-Assoziation entsprach einem Wert von 16,8 µM^-1s^-1. Mit Hilfe eines systematischen Alanin-Scans der Int^N-Sequenz konnten drei für eine Assoziation essentielle hydrophobe Aminosäuren identifiziert werden (Ile2, Ile8 und Leu10), während Substitutionen an anderen Positionen toleriert wurden. Schließlich konnten mit dem semisynthetischen Intein verschiedene mechanistische Studien durchgeführt werden. So offenbarte die Reaktion eines Gly[-1]Ala-substituierten Peptids die Bildung eines Thiazolinrings, ausgelöst durch eine anormale Dehydrierung des Oxythiazolidin-Anion-Intermediats. Diese Beobachtung stellt den ersten experimentellen Beweis für dieses bislang lediglich postulierte Intermediat des N??S-Acyltransfers dar. Eine zweite interessante Nebenreaktion des Spleißmechanismus, die Bildung eines Caprolactons, konnte mittels einer N-methylierten Aminosäure an Position [-1] und eines Serins an Position [-2] induziert werden. Auch weitere unnatürliche Aminosäurebausteine wurden an interessanten Positionen innerhalb der Int^N- und der N-Exteinsequenz eingeführt und erlaubten eine Analyse der strukturellen Anforderungen der räumlich und zeitlich hoch koordiniert ablaufenden Reaktionsschritte des Proteinspleißens.