Ελεγχος του γονιδίου της φωσφατάσης ομόλογης της τενσίνης με δείκτες μικροδορυφορικού DNA και μελέτη της έκφρασής της σε δείγματα αίματος ασθενών με καρκίνο του μαστού:
Creators: name: Παπαδημητρίου, Ελλη Ελευθερίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Φωσφατάσης ομόλογη της τενσίνης
ΡΙ3Κ/ΑΚΤ
Ελλειψη ετεροζυγωτίας
Καρκίνος του μαστού
PTEN
Phosphatase
PI3k/akt
Loss of heterozigosity
Breast cancer

description: Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοχημείας του τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στα πλαίσια του διατμηματικού –διεπιστημονικού μεταπτυχιακού προγράμματος «Νανοεπιστήμες και Νανοτεχνολογίες» με επιβλέπων καθηγητή τον κ. Δημήτριο Κυριακίδη.Αντικείμενο της διατριβής αποτελεί η μελέτη ετεροζυγωτίας του ογκοκαταστολέα pten και έκφρασης της πρωτεΐνης που κωδικοποιεί σε δείγματα αίματος ασθενών σε διάφορα στάδια καρκίνου του μαστού. Για τη μελέτη ετεροζυγωτίας έγινε απομόνωση DNA με χρήση του kit της εταιρίας Qiagen από το σύνολο των δειγμάτων και ακολούθησε PCR για πολλαπλασιασμό των περιοχών μικροδορυφορικού DNA σε τρείς περιοχές, με χρήση των εκκινητων D10S549 D10S571 και D10S215. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τον αναλυτή Licor, εισήχθησαν στο πρόγραμμα FSTAT όπου και επεξεργάστηκαν στατιστικά. Όπως προέκυψε η παρατηρούμενη ετεροζυγωτία ήταν πολύ μεγαλύτερη από την αναμενόμενη γεγονός που επιβεβαίωσε την έλλειψη ετεροζυγωτίας στο σύνολο των δειγμάτων, όπως άλλωστε αναμενόταν και από τη βιβλιογραφία. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης, μιας φωσφατάσης η οποία δρα στα φωσφολιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών και συμμετέχει με τον τρόπο αυτό σε ένα ιδιαίτερο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που προάγει την ογκοκαταστολή. Συγκεκριμένα η ΡΤΕΝ δρα ανταγωνιστικά στο μονοπάτι ΡΙ3Κ/ΑΚΤ το οποίο στέλνει σήματα αύξησης επιβίωσης και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Όσον αφορά τη μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης της ΡΤΕΝ (φωσφατάση ομόλογη της τενσίνης) οι πρωτεΐνες απομονώθηκαν από τη buffy coat στοιβάδα αίματος με χρήση του αντιδραστηρίου TRI που πειρέχει φαινόλη. Στη συνέχεια ακολούθησε ηλεκτροφόρηρηση των πρωτεϊνών, χρώση με νιτρικό άργυρο, ηλεκτρομεταφορά τους σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ανοσοαποτύπωσή τους με εξειδκευμένα αντισώματα έναντι της ΡΤΕΝ αλλά και της φωσφορυλιωμένης μορφής της. Από τα αποτελέσματα αποδείχθηκε μεγαλύτερη έκφραση της ΡΤΕΝ στους ασθενείς, από ότι στους υγιείς. Συγκεκριμένα τα άτομα που εμφάνιζαν αρχικά στάδια της νόσου (υπερπλασία και λοβιακή νεοπλασία) παρουσίαζαν τη μεγαλύτερη έκφραση της ενεργής μη φωσφορυλιωμένης ΡΤΕΝ. Ελαφρώς μικρότερα εμφανίζονταν τα ποσοστά έκφρασής της στα άτομα με λοβιακό και πορογενές καρκίνωμα in situ, πιθανά λόγω καταστολής εσωτερικών μηχανισμών των κυττάρων, ενώ η αντίστοιχη έκφραση της στα καρκινικά κύτταρα διηθητικού καρκίνου του μαστού αυξανόταν σε μεγάλο βαθμό. Επίσης από τα αποτελέσματα προέκυψε πως τα κύτταρα περιέχουν και τη φωσφορυλιωμένη μη ενεργή μορφή της ΡΤΕΝ την οποία μετατρέπουν σε ενεργή μη φωσφορυλιωμένη ανάλογα με τις ανάγκες τους για ογκοκαταστολή. Σε πολλές περιπτώσεις υπήρχε έκφραση μόνο της μίας ή μόνο της άλλης μορφής της πρωτεΐνης υποδηλώνοντας τον παραπάνω μηχανισμό. Τέλος λόγω της πολυπλοκότητας της νόσου προκειμένου να εξαχθούν ακριβέστερα συμπεράσματα απαιτείται η μελέτη περισσότερων δειγμάτων αλλά και ταυτόχρονης έκφρασης περισσότερων μορίων που συμμετέχουν στο μονοπάτι δράσης της ΡΤΕΝ στην ογκοκαταστολή.
description: In the current thesis we studied the pten onco- suppressor for loss of heterozygosity in patients with different stages of breast cancer. For this purpose we isolated DNA from human blood and studied heterozygosity by using the primers D10S215, D10S549 and D10S571. The results that came from the Licor analyzer elaborated with the FSTAT program and confirmed a big loss of heterozygosity in the total amount of the samples. Beyond the pten gene, we studied the expression of the PTEN protein as well as the phosphorelated type P-PTEN. PTEN is a phοsphatase with both lipid and protein action. ΡΤΕΝ acts on the phospholipids PIP3 of the membranes and transforms them into PIP2. Thus PTEN acts as an antagonist in the PI3K/AKT signaling pathway. For this purpose we isolated proteins from human blood using the TRI reagent. We made Western blotting with the PTEN and P-PTEN antibodies and we studied the difference in the expression. The levels of the expressed active PTEN were very low in healthy people, comparing with the patients with breast cancer. We found that the PTEN active type of the protein was expressed in bigger amounts in the patients with hyperplasia and lobular neoplasia, indicating the need for onco-suppression. We also found that the cells were expressing the active PTEN, were not expressing the non active P-PTEN type. We confirmed the existence of an on-off switch mechanism that transforms the protein, from the active to the non active type according to the needs of the cells. Due to the complexity of the disease we need to study simultaneously the action of other molecules of the pathway.