title: Charakterisierung und Anwendung von PAL, eines blaulichtabhängig RNA-bindenden Proteins
Creators: name: Kaiser, Jennifer
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2023
Subjects: subject: Photoreceptor
subject: LOV-domain
subject: ANTAR-domain
subject: RNA-binding
subject: blue light dependent
subject: liquid liquid phase separation
subject: LOV-photochemistry
subject: 540
subject: 570

description: Die Anwendung von Photorezeptoren, also durch Licht verschiedener Wellenlängen regulierbare Proteine, für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Proteinaktivität -Lokalisierung und -Stabilität hat zu vielseitigen Fortschritten in der Grundlagenforschung und den angewandten Wissenschaften geführt. Das aus Nakamurella multipartita isolierte, neuartige, lichtabhängig RNA-bindende Protein PAL erlaubt nun auch die direkte Kontrolle zellulärer RNA-Spezies durch Beleuchtung mit blauem Licht. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von PAL mit zwei durch ein SELEX-Verfahren identifizierte Aptamer-Zielsequenzen in vitro durch Fluoreszenzanisotropie Messungen evaluiert und es wurden hohe Affinitäten mit KD-Werten von 12 nM und 17 nM im Licht im Vergleich zu einer ungefähr 100-fach geringeren Affinität im Dunkeln festgestellt. Eine Untersuchung der Interaktionskinetiken zeigte den Einfluss der Selektionskriterien des SELEX-Prozess auf die Eigenschaften der Aptamere auf. Es wurden durch Variation der Selektionsbedingungen Aptamere mit unterschiedlichen Dissoziationsraten erhalten Das PAL-Protein wurde in einem E. coli basierten Reportersystem eingesetzt, das im Verlauf dieser Arbeit entwickelt wurde und das eine 10-fache Repression eines Reportergens durch blaulichtabhängige RNA-Bindung ermöglicht. Dieses System stellt den ersten rekombinanten Einsatz des PAL-Proteins für eine optogenetische Anwendung dar und wurde verwendet, um eine umfangreiche Struktur-Funktionsanalyse durchzuführen. Zu diesem Zweck wurden sowohl Domänen- und Subdomänendeletionen als auch Punktmutationen in das Protein eingebracht. Die resultierende Proteinaktivität wurde anhand der Fluoreszenz des Reporterproteins ausgewertet. An einer Mutante, die ohne ein konserviertes Cystein im lichtadaptierten Zustand ein stabiles Radikal bildet, wurden EPR-Experimente zur Einschätzung der Dynamik des Proteins bei der Lichtantwort durchgeführt. Die Ergebnisse der Mutationsstudie im Zusammenhang mit den EPR-Messungen erlaubten einen ersten Entwurf des Mechanismus der RNA-Bindung und Signalweiterleitung von PAL. Eine Punktmutante von PAL, die ohne ein konserviertes Glutamin wildtyptische Aktivität aufwies, wurde identifiziert. Die Variante zeigte vorhandene Signaltransduktion und RNA-Bindung, wenn auch mit geringerer Affinität. Diese Feststellung führte zu weiteren Untersuchungen des Mechanismus der Lichtrezeption in LOV-artigen Photorezeptoren. Die Optimierung des entwickelten Reportersystems erlaubte das effiziente Screening von neuen Aptamer-Varianten, um nach Bindesequenzen für zwei im Verlauf der Arbeit identifizierte PAL-Homologe aus einem verwandten Nakamurella-Stamm zu suchen. Diese PAL-Varianten zeigten in in-vitro Untersuchungen ebenfalls typische LOV-Photochemie, interagierten jedoch nicht mit den zuvor identifizierten Aptameren. Zur Untersuchung von lichtaktivierter flüssig-flüssig-Phasenseparation wurde ein in-vitro-System basierend auf einem EYFP PAL-Fusionsprotein in Kombination mit einem EYFP-nanobody und polyvalenten RNA-Aptameren entworfen und charakterisiert. In ersten Experimenten konnte mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie die lichtabhängige Bildung von Nukleationskeimen, nicht aber die makroskopische Phasenseparation des Systems beobachtet werden.