title: Signalwege und zelluläre Mechanismen beim spontanen und durch Phorbolester induzierten Verlust des transversalen tubulären Systems in Kardiomyozyten der Ratte
Creators: name: Wessolowski, Jonas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Hintergrund und Ziele Die chronische Herzinsuffizienz beschreibt ein komplexes Syndrom, das durch eine Abnahme des Herzzeitvolumens gekennzeichnet ist, entweder aufgrund einer unzureichenden Füllung der Ventrikel oder aufgrund einer eingeschränkten Blutauswurfleistung. Die Ursache der kontraktilen Dysfunktion der Herzinsuffizienz liegt häufig im maladaptiven Remodeling, bei welchem es unter anderem zum Verlust des transversalen tubulären Systems (T-System) kommt. Das T-System ist ein dichtes Netzwerk tubulärer Membranstrukturen, das für die elektromechanische Kopplung in Kardiomyozyten entscheidend ist. Welche zellulären Mechanismen den T-System-Verlust bzw. dessen Umbauprozesse bedingen, ist bisher kaum geklärt. Ziel der Arbeit war es, unter Verwendung eines in-vitro-Modells die Signalwege und zellulären Mechanismen, die am Verlust des T-Systems beteiligt sind, besser zu verstehen. Methoden Alle in den Experimenten verwendeten Kardiomyozyten wurden aus dem linken Ventrikel adulter weiblicher Wistar-Ratten isoliert. Zur Visualisierung des T-Systems und Untersuchung der beteiligten Signalwege wurden Myozyten mit pharmakologischen Aktivatoren bzw. Inhibitoren verschiedener Signalwege für 3-24 h in Zellkulturmedium kultiviert und die Zellmembran mit Di8-ANEPPs gefärbt. Um eine Beteiligung der Endozytose als zellulären Mechanismus zu untersuchen, wurden kultivierte Myozyten mit fluoreszierendem Dextran (10 kDA, Alexa Fluor 488) inkubiert, anschließend mit dem Fluoreszenzfarbstoff AM4-66 gefärbt und dann fixiert. Die dreidimensionale Darstellung des T-Systems erfolgte mittels konfokaler Mikroskopie. Die Dichte der T-Tubuli bzw. die Anzahl der intrazellulären Einschlüsse wurde mittels automatisierter Bildanalyse quantifiziert. Weitere Myozyten wurden nach Isolierung und Kultivierung immunologisch analysiert (Western Blot). Ergebnisse Die Inkubation von Myozyten mit PMA führte zu einer hochsignifikanten Abnahme der T- System-Dichte und gleichzeitig zu einer hochsignifikanten Zunahme intrazellulärer Einschlüsse. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass diese intrazellulären Einschlüsse morphologisch den T-Tubuli entsprechen und ausschließlich in Bereichen vorkommen, in denen keine Membranfärbung durch AM4-66 vorhanden ist, die eingeschlossenen T-Tubuli also keinen Kontakt mehr zur äußeren Membran hatten. Der Proteinkinase D-Inhibitor CRT0066101 sowie der PI3K-Inhibitor PI-103 verhinderten den PMA-induzierten Tubulusverlust nach 24-stündiger Inkubation. Die Inkubation von PMA mit den NFkB-Inhibitoren TPCA1 und NIK-SMI1 zeigte nach 24h einen vergleichbar signifikanten Effekt wie CRT0066101 bezüglich der T-System-Erhaltung, der Effekt eines singulären NFkB-Inhibitors mit PMA war deutlich geringer und unterschied sich signifikant zur Dichte der Kontrollgruppe. Im Vergleich zum spontanen nativen T-System-Verlust nach drei Tagen war die Tubulusdichte in der TPCA1- und PI-103-Gruppe signifikant erhöht, NIK- SMI1 und CRT0066101 hatten keinen Einfluss auf den Tubulus-Erhalt nach drei Tagen. Eine Inhibition der Akt-Proteinkinase mittels AKTI12 zeigte ebenfalls nur geringe Effekte. Die PMA-induzierte Hochregulation der intrazellulären Einschlüsse wurde durch PI-103 signifikant supprimiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass vor allem die Endozytose- Inhibitoren Pitstop-2 und Amilorid die Hochregulation tubulärer Einschlüsse trotz kombinierter Inkubation mit PMA hochsignifikant verhindern konnten, während der Effekt des Inhibitors Dynasore diesbezüglich nur schwach ausgeprägt war. Die Western-Blot-Analyse zeigte eine PMA-bedingte Aktivierung der Proteinkinase D nach bereits einstündiger Inkubation und eine Aktivierung der Akt-Kinase nach 24 h Inkubation. Während CRT0066101 signifikant die Aktivierung der PKD hemmte, hatten TPCA1 und PI- 103 keinen Einfluss auf die PKD-Aktivierung. PI-103 hemmte signifikant die Akt-Aktivierung und TPCA1 die NFkB-Aktivierung. Schlussfolgerungen Es konnte gezeigt werden, dass der PKD-NFkB-Signalweg eine entscheidende Rolle im PMA- induzierten Tubulusverlust spielt, da CRT0066101 bei kombinierter Inkubation mit PMA die Aktivierung der PKD hemmt und zugleich einen Erhalt der transversalen Tubuli induziert. Zudem supprimierte TPCA1 die PMA-bedingte NFkB-Aktivierung und konnte mit NIK-SMI1 den PMA-bedingten T-System-Verlust verhindern. Darüber hinaus scheint die PI3K eine wichtige Rolle beim PMA-induzierten T-System-Verlust einzunehmen, da PMA zur gesteigerten Phosphorylierung der Akt an der PI3K-spezifischen Stelle Threonin 308 führt und PI-103 diese Phosphorylierung sowie den Tubulusverlust durch PMA hochsignifikant verhinderte. Als zellulären Mechanismus des PMA-induzierten T-System-Verlustes identifizierten wir die Endo-/ Makropinozytose als möglicherweise entscheidenden Prozess. Da insbesondere die Endozytose-Inhibitoren Pitstop-2 und Amilorid hochsignifikante Effekte zeigten, gehen wir von einem Clathrin-unabhängigen Prozess aus
description: Objectives Chronic heart failure describes a complex syndrome characterised by a decrease in cardiac output, either due to inadequate filling of the ventricles or due to impaired blood ejection. The cause of the contractile dysfunction of heart failure is often maladaptive remodeling involving loss of the transverse tubular system (T-system). The T-system is a dense network of tubular membrane structures that is critical for excitation-contraction coupling in cardiomyocytes. The cellular mechanisms that cause T-system loss and its remodeling processes, however, are still poorly understood. The aim of this work was to better understand the signalling pathways and cellular mechanisms involved in T-system loss using an in vitro model. Methods All cardiomyocytes used in the experiments were isolated from the left ventricle of adult female Wistar rats. To visualise the T system and investigate the signalling pathways involved, myocytes were cultured with pharmacological activators or inhibitors of different signalling pathways for 3-24 h in cell culture medium and the cell membrane was stained with Di8- ANEPPs. To investigate the involvement of endocytosis as a cellular mechanism, cultured myocytes were incubated with fluorescent dextran (10 kDA, Alexa Fluor 488), then stained with the fluorescent dye AM4-66 and then fixed. Three-dimensional imaging of the T-system was performed using confocal microscopy. The density of the T-tubules or the number of intracellular inclusions was quantified using automated image analysis. Further myocytes were analysed immunologically (Western blot) after isolation and cultivation. Results Incubation of myocytes with PMA led to a highly significant decrease in T-system density and simultaneously to a highly significant increase in intracellular inclusions. By means of confocal microscopy, it could be shown that these intracellular inclusions correspond morphologically to T-tubules and occur exclusively in areas without membrane staining by AM4-66, i.e. the included T-tubules no longer had contact with the surface membrane. The protein kinase D inhibitor CRT0066101 as well as the PI3K inhibitor PI-103 prevented PMA-induced tubule loss after 24 h incubation. Incubation of PMA with the NFkB inhibitors TPCA1 and NIK-SMI1 showed a comparable significant effect as CRT0066101 with respect to T-system maintenance after 24 h. The effect of a singular NFkB inhibitor with PMA was significantly smaller and differed significantly from the density of the control group. Compared to spontaneous native T-system loss at 3 days, tubule density was significantly increased in the TPCA1 and PI-103 groups, NIK-SMI1 and CRT0066101 had no effect on tubule maintenance at 3 days. Inhibition of Akt protein kinase using AKTI12 also showed only minor effects. The PMA-induced upregulation of intracellular inclusions was significantly suppressed by PI- 103. In addition, it could be shown that especially the endocytosis inhibitors Pitstop-2 and amiloride could prevent the upregulation of tubular inclusions despite combined incubation with PMA, while the effect of the inhibitor Dynasore was only weak. Western blot analysis showed PMA-induced activation of protein kinase D after as little as one hour of incubation and activation of Akt kinase after 24 h of incubation. While CRT0066101 significantly inhibited PKD activation, TPCA1 and PI-103 had no effect on PKD activation. PI-103 significantly inhibited Akt activation and TPCA1 inhibited NFkB activation. Conclusions The PKD-NFkB pathway was shown to play a crucial role in PMA-induced tubule loss, as CRT0066101, when incubated with PMA, inhibited PKD activation while inducing transverse tubule maintenance. Moreover, TPCA1 suppressed PMA-induced NFkB activation and was able to prevent PMA-induced T-system loss with NIK-SMI1. In addition, PI3K appears to play an important role in PMA-induced T-system loss, as PMA leads to increased phosphorylation of Akt at the PI3K-specific site threonine 308 and PI-103 highly significantly prevented this phosphorylation as well as tubule loss by PMA. We identified endo- /macropinocytosis as the cellular mechanism of PMA-induced T-system loss as a potentially crucial process. Since the endocytosis inhibitors Pitstop-2 and amiloride showed particulary significant effects, we suggest a clathrin-independent process.