title: Fragmentscreening an der CDPME-Synthetase (IspD): Neue Leitstrukturen für ein Enzym in der Malaria und Tuberkulose-Therapie
title: Fragment Screening at the CDPME-Synthetase (IspD) : New Lead Structures for an Enzyme in the Malaria and Tuberculosis-Therapy
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Fu, Kan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: protein crystallization
IspD
fragment-based screening
Tuberculosis
no entry
keine Angabe
Kristallisation
Malaria
Tuberkulose
Wirkstoff
Röntgenkristallographie

description: Summary Background In the last two decades the approach of fragment-based drug design (FBDD) has evolved as an important tool for the generation of lead compounds. This assessment is confirmed by the approval of the first drug discovered by this approach, Vemurafenib, in 2011 by the FDA. This success motivates to face the newly posed challenges of FBDD in the context of fragment hit detection. These challenges mainly involve the problem that conventional bioassay-based screening methods are often inappropriate to detect weakly binding fragment. Therefore, to obtain optimal results from fragment screening the optimal choice of the best method and the selection of a suited strategy is essential for the success. Goals In this thesis strategies for the rapid and cost effective identification of high-quality fragment hits have been developed. The first strategy is a fragment screening cascade. It coprises a screening-, a validation- and a characterization phase to facilitate fast and effective X-ray independent screenings. This is especially suited for protein targets for which no crystallization conditions have been found. The second strategy is based entirely on crystallography to render hit identification more effective. To advance in this field, the work flow of crystallization has been optimized and innovative methods for co-crystallization and crystal soaking have been developed. Results 1. Fragment Screening Cascade: A screening cascade was developed that, at the first stage, aims at the identification of primary hits using TSA and enzyme assays. As model protein IspD was used. The second phase consists of a ligand-based NMR (WATERLOGSY) discrimination of specific or unspecific fragment-protein-binding modes in order to exclude or validate primary hits respectively. In the third phase a protein-based NMR (TROSY) is carried out for the characterization of binding modes by means of reference spectrum comparison. In the first phase, 27 primary hits could be identified successfully and in the second phase this amount could be reduced to two hits. Fragment 134 was excluded owing to its non-competitive binding. In the third phase even the binding of fragment 005 could not be confirmed using TROSY-NMR. These experiments show that the cascade is an effective, less expensive and time-saving strategy for hit identification. Nevertheless, the cascade must be tested with more model proteins. The rather disappointing results of the TROSY-NMR are most likely due to the fact that the IspD-binding pocket is polar and charged. In contrast, the fragments of the applied library were less polar and only weakly charged. 2. Sole crystallographic fragment screening: A systematic approach to crystallography has been developed using microseeding and detailed adjustment by means of DVR/DV. This enables a fast improvement of crystallization conditions and the optimization of working conditions for other temperatures. The obtained IspD-crystals showed very good diffraction power and reproducibility. Furthermore, the “Baking-Method” has been developed, which enables, for the first time, efficient screening by means of co-crystallization. This is achieved because the conditions for co-crystallization must not be optimized individually for every fragment separately. Beyond this, the method enables the immobilization of complete fragment libraries in microtiter plates. In order to improve the process of soaking, the ISOSOAK-method has been developed. It offers the possibility to screen for optimal soaking conditions and facilitates soaking at very high concentrations of fragments. Furthermore, the UNISOAK-method has been developed which allows soaking under standard conditions or soaking of many different crystals simultaneously (tested for seven crystal at the same time). The diffraction power of soaked crystals in comparison to the uncomplexed proteins turned out to be at least of equal quality. Studies of the AG Klebe showed that different methods used for screening yield only sparse amounts of overlapping results. This calls for a sole crystallographic approach, since this facilitates the detailed characterization of binding modes. The methods developed here offer the required tools to implement a very effective, time-saving and cost-effective work flow. Particularly, in the field of soaking considerable progress has been made. Furthermore, cocktail screenings, which are problematic regarding data interpretation and reliability, become obsolete, since fragment soaking can now be carried out fast and individually. Due to these improvement fragment screenings come into reach also of small and medium-sized companies.
description: Zusammenfassung Hintergrund In den letzten 20 Jahren wurde der Ansatz des Fragment-Based Drug Design (FBDD) derart weiterentwickelt, dass er heute eine wichtige Rolle in der Suche nach neuen Lead-Verbindungen spielt, was sich in der Zulassung des Arzneimittel Vemurafenib durch die FDA äußerte (2011), das über einen Fragment-basierten Ansatz entdeckt wurde. Dieser Erfolg motiviert, die Herausforderungen des FBDD zur Detektion von Fragmenthits anzunehmen. Diese bestehen darin, dass konventionelle Bioassay-basierte Methoden für ein Screening mit in der Regel eher schwach bindenden Fragmenten oft ungeeignet sind. Um mit dem Fragmentscreening zu optimalen Ergebnissen zu gelangen ist jedoch nicht nur die Wahl der Methoden wichtig, sondern auch die Strategie ihrer Anwendung. Ziele In dieser Arbeit wurden Strategien zur schnellen und kostengünstigen Identifizierung von Fragmenthits hoher Qualität entwickelt. Die erste Strategie ist eine Fragment-Screening Kaskade, welche ein Screening-, eine Validierungs- und eine Charakterisierungsstufe umfasst, um schnelles, effizientes, X-Ray-unabhängiges Screening zu ermöglichen (besonders für Zielproteine geeignet, die sich nicht kristallisieren lassen). Die zweite Strategie basiert rein auf Kristallographie, um die Hitidentifizierung effizienter zu gestalten. In diesem Rahmen wurden die Arbeitsprozesse der Kristallisation optimiert und neue Methoden zur Kokristallisation und zum Kristallsoaking entwickelt. Ergebnisse 1. Fragment-Screening-Kaskade: Es wurde eine Screening-Kaskade entwickelt, die in der ersten Stufe mittels TSA und Enzym-Assays der Identifizierung von Primärhits für das Protein IspD dient. Die zweite Stufe umfasst eine Liganden-basierte NMR-Suche (WATERLOGSY) zur Reduktion der Primärhits und deren Validierung durch Unterscheidung von spezifischen und unspezifischen Bindern durch Verdrängungsexperimente. In der dritten Stufe erfolgt die proteinbasierte NMR-Suche (TROSY) zur Charakterisierung der Bindungsmodi durch Vergleich mit Referenzspektren. In der ersten Kaskadenstufe konnten 27 Primärhits erfolgreich identifiziert und in der zweiten Stufe auf zwei Hits reduziert werden, wobei sich für Fragment 134 eine nichtkompetitive Bindung feststellen lies. In der dritten Stufe konnte mittels TROSY-NMR die Bindung des Fragments 005 leider nicht bestätigt werden. Die Experimente zur Screening-Kaskade zeigen, dass sie eine zeitsparende, weniger kostenaufwendige und effizientere Hitidentifizierung ermöglicht. Allerdings muss die Kaskade mit weiteren Modellproteinen getestet werden. Das wenig erfolgreiche Ergebnis der TROSY-NMR ist darauf zurückzuführen, dass die IspD-Bindetasche polar und geladen ist und die Fragmente in der verwendeten Bibliothek nur wenig polar sind und keine hohen Ladungen aufweisen. 2. Fragment Screening ausschließlich mit Kristallographie: Es wurde eine systematische Herangehensweise an die Kristallisation entwickelt, bei der Mikroseeding und Feinjustierung mittels DVR/DV zum Einsatz kommen, um Kristallisationsbedingungen sehr schnell zu optimieren und die Bedingungen für das Arbeiten unter anderen Temperaturen anzupassen. Die so erzeugten IspD-Kristalle waren von sehr hoher Diffraktionsfähigkeit bei guter Reproduzierbarkeit. Außerdem wurde die Baking-Methode entwickelt, welche erstmals ein effizientes Screening mittels Kokristallisation möglich macht, da die Kokristallisationsbedingungen nicht für jedes Fragment individuell optimiert werden müssen. Auch ermöglicht sie die Immobilisierung vollständiger Fragmentbibliotheken in Mikrotiterplatten. Für die Verbesserung des Soakingprozesses wurde zum einen die Isosoak-Methode entwickelt, die ein schnelles Auffinden von Soakingbedingungen erlaubt und auch das Soaking bei sehr hohen Fragmentkonzentrationen ermöglicht. Zum anderen wurde die Unisoak-Methode entwickelt, die Kristallsoaking unter Standardbedingungen bzw. ein Soaking von vielen Kristallen gleichzeitig, möglich macht (erfolgreich getestet an sieben kristallinen Proteinen gleichzeitig). Die Diffraktionsfähigkeit der gesoakten Kristalle gegenüber den Kristallen der Apoproteine ist von mindestens gleicher Qualität. Studien der AG Klebe zeigen, dass verschiedene Screeningmethoden nur wenige sich überlappende Ergebnisse liefern, was einen rein kristallographischen Ansatz wünschenswert macht, der direkt die exakten Bindungsmodi liefert. Die hier entwickelten Methoden geben die dazu nötigen Werkzeuge an die Hand, um ein sehr effektives, zeit- und kostensparendes Arbeiten zu ermöglichen. Besonders im Feld des Soakings sind entscheidende Fortschritte gemacht worden. Auf die für die Dateninterpretation problematischen Coktailscreenings kann nun verzichtet werden, da Fragmente nun schnell individuell gesoakt werden können. Durch die Verbesserungen des Soakingprozesses rückt das Fragmentscreening auch für kleine bis mittelgroße Unternehmen in den Bereich des Möglichen.