title: Wirkung und qPCR-basierte Quantifizierung von miRNAs in Tumorzellen
Creators: name: Bauer, Victoria
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: RNA Interferenz ist ein natürlicher biologischer Prozess, der besonders in den letzten beiden Dekaden in das Zentrum der Forschung vieler Wissenschaftler gerückt ist. MIRNAs und siRNAs, kurze RNA Sequenzen mit einer ungefähren Länge von 21 Basenpaaren, interferieren mit komplementärer mRNA und schalten so bestimmte Gene ab. Diese Methode gilt als besonders zukunftsversprechend im Bezug auf Krebstherapie, Autoimmunerkrankungen, und dergleichen mehr. In dieser Diplomarbeit wurde der Blick auf das Ausmaß der miRNA Wirkung in Tumorzellen gelegt. Je nach Tumorart werden miRNAs in Tumorzellen hinauf- oder hinunterreguliert. Eine komplementäre Bindung einer anti-Tumor miRNA an die gewünschte mRNA kann schließlich Apoptose oder ein Anhalten des Zellzyklus bewirken. Für eine aussagekräftige Bestimmung des miRNA Potentials, ist es notwendig Referenzgene zu finden, welche durch miRNA und siRNA Transfektionen nicht bzw. nur sehr wenig beeinflusst werden und eine möglichst geringe Schwankungsbreite aufweisen. Aus diesem Grund wurde eine Analyse mittels RT-qPCR mit unterschiedlichen Referenzgenen in drei verschiedenen Zelllinien durchgeführt und ihre Stabilität anhand der RefFinder-Software, ausgewertet. Dabei erwiesen sich NFATC3 (HeLa, MCF-7 und KBC-1), ZNF48 (MCF-7, KBC-1) und GOLGA1 (HeLa, KBC-1)als geeignetste Referenzgene. Nach Synthese und Aufreinigung wurden miRNA-125b, 218, 29b-1, 29b-2 und 4731 auf ihre Effektivität in HeLa Zellen getestet. Die Expressionsrate wurde mit RT-qPCR gemessen und so die erfolgreiche Transfektion bestätigt.Die Proliferationshemmung durch die miRNA Transfektion anhand eines Formazan-basierenden Assays untersucht. Die Hemmung der Expression durch die ausgewählten anti-Tumor-miRNAs betrug maximal 7,8 % nach Behandlung mit miR-15a. Des Weiteren wurde miRNA-4731 für die Ko-Transfektion mit verschiedenen potenten siRNAs ausgewählt. Im Fall der Hemmung von PLCB-1, HSP 90 und MCL-1 konnte eine Verstärkung des Effekts durch miRNA-4731 festgestellt werden. Mit Hilfe einer Durchflusszytometrie-Auswertung wurde die Beeinflussung des Zellzyklus von HeLa Zellen nach der Transfektion mit miRNAs getestet. Keine der miRNAs führte zu einem signifikanten Zellzyklus-Arrest. Diese Ergebnisse unterstreichen den regulatorischen Einfluss tumorrelevanter miRNAs mit deren geringen direkten Einfluss auf den Zell-Phänotyp.
description: RNA interference is a natural biological process, which became the focus of attention for many scientists in the last two decades. MiRNAs and siRNAs, short sequences with a length of about 21 base pairs, interfere with complementary mRNA and silence specific genes. This method seems very promising concerning cancer therapy, autoimmune diseases and the like. In this thesis the effects of specific miRNAs on tumor cells were investigated. Compared to healthy tissue, miRNAs are often up or down regulated in tumors. A complementary binding between an anti-tumor miRNA and its target mRNA can ultimately cause apoptosis or a cell cycle arrest. For a significant determination of the miRNA potential, it is necessary to find reference genes with a small range of variation, which are not or just little affected by miRNA and siRNA transfections. Therefore an analysis with the RT-qPCR was performed in three cell lines and the stability was evaluated with the RefFinder software. These experiments revealed NFATC3 (HeLa, MCF-7, and KBC-1), ZNF48 (MCF-7, and KBC-1) und GOLGA1 (HeLa, and KBC-1) as most suited reference genes. After the synthesis and purification, the efficacy of miRNA-125b, 218, 29b-1, 29b-2, and 4731 in HeLa cells was tested. The expression levels were measured with RT-qPCR and proved successful transfection of the synthetic miRNAs. The proliferation repression, caused by the miRNA transfection, was investigated with a formazan-based assay. The reduction of proliferation reached a maximum of 7.8 % after treatment with miR-15a MiRNA-4731 was chosen for co-transfections with different potent siRNAs. In the case of PLCB-1, HSP 90 and MCL-1 an increase of inhibition with miR-4731 was observed. By means of flow cytometry analysis, effects of the miRNA transfections on the cell cycle of HeLa cells were tested. None of the miRNAs attained a significant cell-cycle arrest. These outcomes emphasize the regulatory role of tumor-relevant miRNAs with their small direct influence on the cell-phenotype.