title: Biochemische Charakterisierung der Relaxase TraI, des Kopplungsproteins TraD und des hypotetischen Proteins Yaf des neuartigen Typ IV Sekretionssystems des human-pathogenen Bakteriums Neisseria gonorrhoeae
title: Biochemical characterization of the relaxase TraI, the coupling protein TraD and the hypothetical protein Yaf of the novel Type IV Secretion System from the human pathogen Neisseria gonorrhoeae
Creators: name: Heller, Eva-Maria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Biowissenschaften, Biologie
relaxase
coupling protein
DNA processing
Kopplungsprotein
Sekretion
Relaxase
Secretion System
Neisseria gonorrhoeae
DNA Prozessierung

description: Typ IV Sekretionssysteme (T4SSs)
      transportieren DNA und verschiedenen Effektorproteine über
      die innere und äußere Zellmembran von Prokarioten. Sie
      bestehen aus einem Transportkomplex, dem sogenannten
      MPF-Komplex („mating pair formation“), der einen Kanal durch
      die innere und äußere Membran bildet und aus DNA
      Prozessierungs- und Transferproteine (Dtr Proteine). Ein
      neues und bisher einzigartiges T4SS ist innerhalb des
      „gonococcal genomic island“ lokalisiert, welchen in den
      meisten Neisseria gonorrhoeae Stämmen vorkommt. Dieses T4SS
      ist das erste T4SS, das einzelsträngige DNA in allen
      Wachstumsphasen direkt in seine Umgebung sekretiert. Diese
      Eigenschaft macht das T4SS von N. gonorrhoeae zu einen
      vielversprechendem Forschungsobjekt für Studien über den
      Transportmechanismus von T4SSs. Das GGI-T4SS besteht aus
      einem MPF-Komplex, der große Ähnlichkeit mit dem MPF-Komplex
      des F-Plasmides von E. coli hat (die sogenannte MPFF
      Familie), und aus Dtr Proteinen die zu der MOBH Familie der
      Prozessierungs- und Lokalisationsfaktoren gehören. Um die
      Verteilung und Konservierung GGI ähnlicher T4SSs zu
      untersuchen wurden mittels bioinformatischer Analysen
      ähnliche T4SSs aus allen derzeitig sequenzierten Genomen und
      Plasmiden identifiert. Neben dem T4SS aus N. gonorrhoeae
      wurde weitere ähnlich konservierte T4SSs in anderen Bakterien
      identifiziert. Diese T4SSs sind entweder genomisch oder
      befinden sich auf Plasmiden. Die meisten der GGI Gene
      innerhalb der Region zwischen ltgX und exp1 kodieren für MPFF
      Proteine und sind hoch konserviert in allen identifizierten
      T4SSs, auch wenn einige dieser Gene nicht in den Transfer von
      Einzelstrand-DNA involviert sind. Bemerkenswerterweise
      enthalten alle identifizierten genomischen T4SSs mpf Gene der
      MPFF Familie und dtr Gene der MOBH Familie; die
      Plasmid-kodierten T4SSs hingegen enthalten mpf Gene der MPFF
      Familie und dtr Gene der MOBF Familie. Die zeigt, dass
      Relaxasen der MOBH Familie hauptsächlich in genomischen T4SSs
      vorhanden sind. Um den Mechanismus der DNA Prozessierung des
      einzigartigen T4SSs aus N. gonorrhoeae zu studieren wurden in
      dieser Arbeit die Schlüsselenzyme TraD (das
      Kopplungsprotein), TraI (die Relaxase) und das hypothetische
      Protein Yaf aus N. gonorrhoeae biochemisch charakterisiert.
      Die Überexpression und die Aufreinigung von
      Kopplungsproteinen und Relaxasen von T4SSs ist eine
      schwierige Herausforderung und obwohl viele verschiedene
      Versuche unternommen wurden um TraD rekombinant in E. coli zu
      überexprimieren, war es nicht möglich lösliches Protein zu
      isolieren. Stattdessen wurden große Mengen von
      Einschlusskörperchen gebildet. Kleine Mengen von TraD wurden
      in isolierten inneren Zellmembranen von E. coli detektiert,
      allerdings konnte dieses Protein nicht aus den Membranen
      herausgelöst werden. Schließlich wurde TraD unter
      dentaurierenden Bedingungen aus Einschlusskörperchen isoliert
      und aufgereinigt, allerdings schlugen alle weiteren
      Neufaltungsversuche fehl und führten entweder zum Verlust des
      Proteins oder zu Aggregation. Deshalb war es nicht möglich
      die enzymatische Aktivität des neisserialen Kopplunsproteins
      zu charakterisieren. Das hypothetische Protein Yaf konnte
      erfolgreich in großen Mengen isoliert werden und bildet in
      Lösung ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen oligomeren
      Stadien. Hauptsächlich werden jedoch Dimere gebildet. Das
      Gleichgewicht zwischen den verschiedenen Oligomeren wird
      deutlich von der Proteinkonzentration und den jeweiligen
      Pufferbedingungen beeinflusst. Die Umwandlung der einzelnen
      Oligomerstadien ist ein langsam verlaufender Prozess. Die
      Anwesenheit eines N terminalen His-tags hat einen
      stabilisierenden Effekt auf die tetramere Form. Limitierte
      Proteolyse mit Trypsin zeigte eine hohe Resistenz von Yaf
      gegenüber Trypsin, was auf eine hohe strukturelle Stabilität
      von Yaf hindeutet. Tetramere zeigten hierbei eine größere
      Resistenz gegenüber der proteolytischen Aktivität von Trypsin
      als Dimere. Erstaunlicherweise führten Punktmutationen
      innerhalb der Sequenze von Yaf zu einer Destabilisierung des
      Proteins und die Mengen an löslichem Protein waren stark
      reduziert. Mit Hilfer verschiedener Aktivitätsmessungen wurde
      die Funktion von Yaf untersucht. DNA-Bindungsversuche haben
      gezeigt, dass dimeres und tetrameres Yaf doppelsträngige DNA
      Substrate mit geringer Affinität (&gt;5 µM) bindet.
      Desweiteren wurde in Elutionsfraktionen mit dimeren und
      tetrameren Yaf eine Metall-abhängige und Sequenz unabhängige
      Nukleaseaktivität beobachtet. Diese Nukleaseaktivität war
      spezifisch für doppelsträngige DNA Fragmente und für
      Oligonukleotide mit Sekundärstrukturen. In der Anwesenheit
      von verschiedenen divalenten Metallionen konnte innerhalb der
      Elutionsfraktionen mit dimerem und tetramerem Yaf eine
      Relaxierungsaktivität auf superspiralisierte Plasmide
      beobachtet werden. Diese Reaktion war besonders verstärkt in
      Anwesenheit von Mn2+ und Co2+, konnte aber auch in
      Anwesenheit von Mg2+ beobachtet werden. Um Informationen über
      den strukturellen Aufbau und über die Funktion von Yaf zu
      erhalten, wurde die Kristallisation von Yaf in Zusammenarbeit
      mit Dr. S. Smits aus der Forschungsgruppe von Prof. L.
      Schmitt (Heinrich Heine Universität in Düsseldorf) begonnen.
      Kristalle, die aus Yaf mit einem N-terminalen His-tag
      bestehen, streuen zurzeit bis zu einer Auflösung von 3 Å.
      Zudem konnte kürzlich erstes Wachstum von Protein-Kristallen
      mit inkorporiertem Selenomethionin beobachtet werden. Natives
      Yaf kristallisiert jedoch nicht unter den gleichen
      Bedingungen wie Yaf mit einem N-terminalen His-tag. Um die
      MOBH Relaxase TraI funktionell zu charakterisieren wurden
      viele verschiedene Überexpressionsmethoden und
      Reinigungsprotokolle getestet. Schließlich konnten eine
      Überexpressionsmethode und ein Reinigungsprotokoll etabliert
      werden, mit denen erfolgreich lösliches TraI isoliert werden
      konnte. TraI bildet in Lösung stabile Dimere und limitierte
      Proteolyse zeigte, dass TraI aus mindestens drei
      unterschiedlichen Trypsin-resistenten Domänen besteht. DNA
      Bindgungsversuche haben gezeit, dass TraI doppelsträngige und
      einzeilsträngige DNA mit hoher Affinität in einer
      Sequenz-unabhängigen Reaktion bindet. Die minimale
      Bindungslänge von einzelsträngigen DNA Substraten, die für
      eine Bindung mit TraI nötig ist wurde auf 9 Nukeotide
      bestimmt. Desweiteren wurde für TraI eine Metall-abhängige
      und Sequenz-unabhängige Relaxierungsaktivität auf
      superspiralisierte Plasmide beobachtet. In Anwesenheit von
      Mn2+ ist diese Aktivität deutlich gesteigert. Die
      Relaxierungsaktivität von TraI ist ähnlich zu der
      enzymatischen Aktivität von Topoisomerase I aus E. coli,
      unterscheidet sich aber von dieser bezüglich des bevorzugten
      Metall-Cofaktors und durch die tatsache, dass bei der
      Reaktion von TraI keine detektierbaren Topoisomerasen
      I-typischen Intermediate während der Reaktion beobachtet
      wurden. Experimente zur DNA-Strangspaltungsaktivität von TraI
      wurden mit unterschiedlichen einzel-strängigen DNA Substraten
      durchgeführt. Dabei wurde ein TraI induzierte
      Strang-spezifische Spaltung bei zwei Oligonukleotiden
      beobachtet, die abhängig ist von Mn2+. TraI spaltet
      einzelsträngige DNA Substrate, die entweder die Sequenze der
      oriT Region des GGI enthalten oder die Sequenz der oriT
      Region des F-Plasmides aus E. coli. Dazu komplementäre
      Stränge und ein polyT Oligonukleotid wurden nicht von TraI
      gespalten. Ein Vergleich der beiden postulierten Spaltstellen
      in den Oligonukleotiden ergab keine Ähnlichkeiten zwischen
      den beiden Sequenzen. Um strukturelle Informationen über TraI
      zu erhalten, wurden die Kristallisation von TraI in
      Zusammenarbeit mit Dr. S. Smits aus der Forschungsgruppe von
      Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine Universität in Düsseldorf)
      initialisiert. Neben der Charakterisierung der enzymatischen
      Aktivität von TraI und Yaf wurde mit „pull-down“ Versuchen
      untersucht, ob beide Proteine miteinander oder ob sie mit mit
      der neisseriellen T4SS ATPase TraC interagieren. Die
      Ergebnisse zeigten jedoch keine Interaktion zwischen diesen
      drei Proteinen. Die Ergebnisse dieser Studie führen dazu, ein
      besseres Verständnis bezüglich des DNA
      Prozessierungsmechanismus des einzigartigen T4SS von N.
      gonorrhoeae zu erhalten. Bedeutende Fortschritte wurden bei
      der funktionellen Überexpression und der Aufreinigung von
      TraI und Yaf erzielt. Die, in dieser Studie erzielten
      Ergebnisse der biochemischen Charakterisierung von TraI
      repräsentieren die ersten verfügbaren biochemischen Daten
      über diese neue Relaxase-Familie. Desweitern ermöglicht diese
      Studie erstmals Einblicke in die enzymatische Aktivität des
      nicht charakterisierten hypothetischen Proteins Yaf, obwohl
      die eigentliche Funktion dieses Proteins noch immer unbekannt
      ist.
description: Type IV secretion systems (T4SSs)
      are able to transport DNA and effector proteins across the
      inner and outer membranes of prokaryotes. T4SSs consist of a
      transport complex which forms the channel across the inner
      and outer membrane, the so called mating pair formation
      complex (MPF), and DNA processing and transfer proteins (Dtr
      proteins). A unique T4SS is encoded in the gonococcal genomic
      island which is found in most Neisseria gonorrhoeae strains.
      Remarkably, this secretion system is the first T4SSs that was
      shown to secrete ssDNA during all phases of growth directly
      into the environment. This property might facilitate
      functional studies on the transport mechanisms used by T4SSs.
      Remarkably, the T4SS encoded within the GGI consists of a MPF
      complex that is homolgous to the MPF complex of the E. coli
      F-plasmid (MPFF family) and Dtr proteins that belong to the
      MOBH family of targeting factors. Although many different
      members of the MOBH family have already been identified,
      almost no information is currently available on this novel
      group of targeting factors. To study the conservation of
      GGI-like T4SSs, similar T4SS were identified in a
      computational analysis of all currently completely sequenced
      chromosomes and plasmids. Next to N. gonorrhoeae very similar
      conserved T4SSs have been found in several other bacteria.
      These T4SSs are either encoded within the chromosome or on
      plasmids. Most of the genes encoded in the GGI between the
      ltgX and exp1 genes, the region which encodes mainly the MPFF
      proteins, were highly conserved in allmost all of the
      identified systems, even though, several of theses genes have
      been shown previously not to be important for ssDNA
      transport. Remarkably, all identified chromosomal GGI-like
      T4SSs encode mpf genes of the MPFF family and dtr genes of
      the MOBH family; whereas, the plasmid encoded GGI-like T4SSs
      always contain dtr genes of the MOBF family and mpf genes of
      the MPFF family. This suggests that relaxases of the MOBH
      family are preferentially found in chromosomally encoded
      T4SSs. To elucidate the functional mechanism of the DNA
      processing reaction of this unique DNA secretion system a
      biochemical approach was set up to functionally characterize
      the coupling protein TraD, the relaxase TraI and the
      hypothetical protein Yaf which are different key enzymes of
      the Dtr proteins of N. gonorrhoeae. The overexpression and
      purification of coupling proteins and relaxases of other
      T4SSs has previously been shown to be inherently difficult.
      Although many different approaches using E. coli as host for
      a recombinant overexpression have been tested, it was not
      possible to obtain soluble TraD and large amounts of
      inclusion bodies were produced. Small amounts of TraD have
      been detected in isolated inner membranes of E. coli, but all
      performed solubilization attempts failed. Finally, TraD was
      isolated and purified from inclusion bodies under denaturing
      conditions, but all further refolding approaches with the
      purified protein resulted either in the loss or the
      aggregation of TraD. Therefore, it was not possible to
      characterize the enzymatic activity of the neisserial
      coupling protein TraD. The hypothetical protein Yaf, which is
      encoded in same operon with traI and traD was sucessfully
      overexpressed and purified. Interestingly, Yaf forms
      different oligomeric states in solution. The most abundant
      oligomer of native Yaf was the dimeric state. The dynamic
      equilibrium of the different oligomeric states was strongly
      dependent on the concentration of the protein and the buffer
      conditions. The interconversion between the different
      oligomeric states is a slow process. The presence of an
      N-terminal His-tag strongly stabilized the tetrameric form.
      Limited proteolysis experiments showed that Yaf is highly
      resistant against trypsin and most likely has a very compact
      and stable structure. Tetrameric Yaf showed a higher
      resistance against proteolytic digestion than dimeric Yaf.
      Remarkably, the introduction of different point mutations
      into the sequence of Yaf resulted in a destabilization of the
      protein and a strong decrease in the amount of soluble
      protein. Different activity assays have been performed with
      the purified protein to study the function of Yaf. DNA
      binding assays showed binding of dimeric and tetrameric Yaf
      to dsDNA with low affinity (&gt;5 μM). Furthermore, a metal
      dependent sequence unspecific nuclease activity was observed
      associated with elution fractions containing dimeric and
      tetrameric Yaf. This nuclease activity was specific for dsDNA
      fragments and oligonucleotides that contained secondary
      structures. In the presence of different divalent metals, a
      relaxation activity on supercoiled plasmid DNA has been
      observed for fractions containing dimeric and tetrameric Yaf,
      and was strongly enhanced in the presence of Mn2+ and Co2+,
      but was also observed in the presence of Mg2+. To obtain
      further information on the structure and function of Yaf,
      crystallization attempts have been started in close
      collaboration with Dr. S. Smits in the group of Prof. Dr. L.
      Schmitt (Heinrich Heine University in Düsseldorf). Small
      crystals of N-terminally His-tagged Yaf diffracted up to 3 Å.
      Remarkably, no crystals have been obtained for native Yaf in
      any of the tested conditions. Recentyl, crystals of
      N-terminal His-tagged Yaf with incorporated selenomethionine
      have been obtained. To characterize the MOBH relaxase TraI,
      many different overexpression and purification approaches
      have been tested. Finally, an overexpression and purification
      method could be established to purify soluble TraI. Isolated
      TraI formed stable dimers in solution, and limited
      proteolysis revealed the presence of at least three trypsin
      resistant domains in TraI. DNA binding assays showed that
      TraI binds to ssDNA and dsDNA with high affinity in a
      sequence unspecific manner. The minimal binding frame of TraI
      for ssDNA substrates has been determined with 9 nucleotides.
      Furthermore, a metal dependent sequence unspecific relaxation
      activity of TraI on supercoiled plasmids has been observed,
      with Mn2+ as preferred metal cofactor. The relaxation
      activity of TraI is similar to the activity of E. coli
      Topoisomerase I, but differs within the preferred metal
      cofactor and the lack of detectable intermediates during the
      relaxation reaction of TraI. DNA cleavage assays performed
      with different ssDNA substrates demonstrated that TraI
      cleaves oligonucleotides containing the putative oritT
      sequence of the GGI or the oriT region of the E. coli F
      plasmid strand specific in a Mn2+ dependent manner. The
      complementary strands and a polyT oligonucleotide were not
      cleaved by TraI. Analysis of the putative cleavage sites did
      not show any sequence similarity between both cleaved
      oligonucleotides. To obtain structural information about
      TraI, crystallization attempts in close collaboration with
      Dr. S. Smits in the group of Prof. L. Schmitt (Heinrich Heine
      University in Düsseldorf) were started. Besides the
      characterization of the enzymatic activity of TraI and Yaf,
      pull down assays were performed to test whether these
      proteins interact with each other or with the T4SS ATPase
      TraC. Unfortunately, no protein-protein interactions were
      detected between these three proteins. The experimental
      results from the current study help to understand the DNA
      processing mechanism of the unique T4SS of N. gonorrhoeae.
      Important steps have been made in the functional
      overexpression and the purification of Yaf and TraI. The
      hereby obtained results from the biochemical characterization
      of TraI represent the first reported biochemical data which
      is available on the novel MOBH relaxase family. Furthermore,
      this study revealed first insights into a possible enzymatic
      activity of the previously uncharacterized hypothetical
      protein Yaf, even though the function of this protein still
      remains unknown.