Μελέτη των πυρηνικών υποδοχέων που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπερξειδιοσωμάτων(Peroxisome Proliferator-Activated Receptors-PPARs) σε καλλιεργούμενα είδη ιχθύων
Creators: name: Μπουκουβάλα, Ευρυδίκη Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: PPARs
Τσιπούρα/Λαβράκι
Sea bream/Sea boss

description: Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια ευρωπαϊκού προγράμματος με στόχο τη μελέτη του μεταγραφικού ελέγχου του μεταβολισμού των λιπιδίων σε καλλιεργούμενα είδη ψαριών, όπως στην τσιπούρα (Sparus aurata), στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax), στο σολομό (Salmo salar) και στο φασί του Ατλαντικού (Pleuronectes platessa). Για το σκοπό πραγματοποιήθηκε αρχικά κλωνοποίηση και ανάλυση των PPARs που αποτελούν μεταγραφικούς παράγοντες της υπεροικογένειας των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων και ενεργοποιούνται από λιπαρά οξέα και φαρμακευτικές ουσίες με υπολιπιδαιμική δράση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη του προτύπου έκφρασης και μελέτη των ιδιοτήτων των δυο βασικότερων περιοχών, DBD (DNA binding domain) και LBD (Ligand binding domain) των υποδοχέων. Αρχικά, επιτεύχθηκε η κλωνοποίηση τμημάτων των γονιδίων των τριών τύπων PPAR α, β και γ, από την τσιπούρα και το λαβράκι, καθώς και τμήμα του γονιδίου της δεύτερης ισομορφής του PPARα από την τσιπούρα. Διαπιστώθηκε σημαντική ομοιότητα της αλληλουχίας και της οργάνωσης των γονιδίων των PPARs των ψαριών με τα ομόλογα γονίδια των θηλαστικών και των αμφιβίων. Στη συνέχεια, προχωρήσαμε σε κλωνοποίηση και των cDNAs των PPARs από τα συγκεκριμένα είδη, ώστε να διαπιστωθεί εάν οι συγκεκριμένες γενωμικές ακολουθίες αποτελούν λειτουργικά γονίδια των ψαριών. Με RT-PCR ενισχύθηκαν οι κωδικοποιούμενες περιοχές και τμήματα των 3' και 5' αμετάφραστων άκρων των PPARs από την τσιπούρα και το λαβράκι. Και στην περίπτωση αυτή διαπιστώθηκαν πολύ υψηλά ποσοστά ομοιότητας μεταξύ των αμινοξικών αλληλουχιών των PPARs των ψαριών με τους ομόλογους τύπους των θηλαστικών και των αμφιβίων. Η μελέτη του προτύπου της ιστοειδικής έκφρασης των PPARs στην τσιπούρα και στο λαβράκι, με τη μέθοδο RNase protection, έδειξε ότι η έκφρασή τους παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες αλλά και σημαντικές διαφορές με αυτή των θηλαστικών, υποδηλώνοντας διαφοροποιήσεις στη φυσιολογία τους. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των συμπλόκων DNA-πρωτεϊνών (EMSA-Electrophoretic Mobility Shift Assay) μελετήθηκε η ικανότητα των PPARs από την τσιπούρα, το λαβράκι, το φασί του Ατλαντικού και το σολομό, να προσδένονται ως ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR σε ακολουθίες που αποτελούν γνωστά ή υποτιθέμενα αποκρινόμενα στοιχεία των PPARs. Οι υποδοχείς και από τα τέσσερα είδη ψαριών σχημάτισαν ετεροδιμερή με τους υποδοχείς RXR και αναγνώρισαν τις ακολουθίες των αποκρινόμενων στοιχείων του τύπου DR-1 που εξετάστηκαν, αποδεικνύοντας τη συντήρηση των ιδιοτήτων τόσο της DBD περιοχής όσο και της LBD περιοχής και σε κατώτερα εξελικτικά σπονδυλωτά. Με τη μέθοδο CARLA (CoActivator-Dependent Receptor Ligand Assay) τέλος εντοπίστηκαν ουσίες που μπορούν να αποτελέσουν προσδέτες των PPARs των ψαριών. Διαπιστώθηκε ότι οι LBD περιοχές των PPAR α και β των ψαριών εκτός του σολομού, παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με αυτές των θηλαστικών, αναγνωρίζοντας αρκετές από τις ουσίες που εξετάστηκαν, ενώ η αντίστοιχη περιοχή του PPARγ παρουσιάζει χαμηλή ή και καθόλου συγγένεια για τις συγκεκριμένες ουσίες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, οι PPARs των ψαριών είναι δομικά ομόλογοι με τους PPARs των θηλαστικών και πιθανότατα συμμετέχουν σε ανάλογες λειτουργίες ρυθμίζοντας την έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων
description: My thesis was part of a European research project which intention was the study of transcription control of lipid metabolism in farmed fish and especially in sea bream (Sparus aurata), sea bass (Dicentrarchus labrax), salmon (Salmo salar) and plaice (Pleuronectes platessa). For this purpose we initially performed the cloning and analysis of PPARs in these species. PPARs are ligand-inducible transcription factors belonging to the nuclear hormone superfamily. We also studied PPARs' tissue expression profile and the properties of their two basic domains DBD and LBD. At the beginning, we isolated and cloned parts of the three PPAR isotypes genes, α, β and γ from both species and part of the second isoform of sea bream PPARα gene. Sequence analysis of these genomic fragments revealed significant homology with the mammalian PPAR genes. To confirm that these isolated genomic fragments constitute parts of functional genes we also isolated and cloned the cDNAs of sea bream and sea bass PPARs. We amplified with RT-PCR their coding regions as well as parts of the 3' and 5' untranslated regions. The amino acid sequences of fish PPARs also revealed high homology with mammalian and amphibian homologs. The expression profile of PPARs was determined by the RNase protection assay. The results demonstrate that sea bream and sea bass PPARs present similarities and differences with the mammalian PPARs pattern. This maybe indicates the physiological variations between fish and mammals.Using the Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) we studied the abilities of sea bream, sea bass, plaice and salmon PPARs to form heterodimers with RXR and recognize and bind to well-characterized or potential PPAR response elements. The fish PPARs were able to form heterodimers with RXR and bind to DR-1 response elements we tested. Thus, the properties of PPARs' DBD and LBD domains are conserved in lower evolutionally vertebrates. Finally, through CoActivator-Dependent Receptor Ligand Assay (CARLA) we identified compounds that can act as ligands of fish PPARs. The results suggest that fish, except salmon, PPAR α and β demonstrate similar properties with the mammalian counterparts, sharing common ligands. In contrast, the fish PPARγ exhibit low or no affinity for any of the compounds tested. According to the results presented here, the fish PPARs are structurally homologs with their mammalian counterparts and possibly they are involved in similar functions controlling the expression of relevant genes