title: Single Cell Analysis of Oncogenic Signalling in Intestinal Organoids
Creators: name: Sell, Thomas Sebastian
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: Darmkrebs
subject: Zelluläre Signalübertragung
subject: Massenzytometrie
subject: Organoide
subject: System- und rechnergestützte Biologie
subject: Colorectal Cancer
subject: Cell Signalling
subject: Mass Cytometry
subject: Organoids
subject: Systems and Computational Biology
subject: 570 Biologie

description: Darmkrebs ist ein weit verbreitetes Leiden, das durch erworbene, überwiegend sequenzielle Mutationen in einer kleinen Zahl Onkogene verursacht wird. Diese beeinflussen die zelluläre Signalübertragung. Um Auftreten und Progression kolorektaler Karzinome zu verstehen, müssen daher Transkriptome, Phosphoproteome und phänotypische Proteinmarker individueller Zellen berücksichtigt werden. Die Einzelzell-RNS-Sequenzierung bietet die erste dieser Fähigkeiten, während Techniken zur Messung von Proteinen auf Einzelzellebene noch wenig verbreitet sind. Hauptziel meiner Forschung war es, Massenzytometrie für Darmkrebsmodelle anzupassen und so Studien intrazellulärer Signalnetzwerke zu ermöglichen. Auf Basis etablierter Protokolle habe ich eine Methodologie entwickelt, mit der sich epitheliale Zellkulturen untersuchen lassen. Außerdem habe ich Best Practices für die Analyse von Massenzytometriedaten aufgestellt. So konnte ich zeigen, dass die Aktivierung des ERK-Signalwegs in KRAS-aktivierten Dünndarmorganoiden transgener Mäuse graduell unterschiedlich ist. Bei Aktivierung von BRAF, dem direkten Aktivierungsziel von KRAS, geht diese Eigenschaft verloren. Ich habe Statistik angewendet, um Zelltypeigenschaften aus dem Massenzytometrie-Datensatz zu extrahieren. So konnte ich zeigen, dass onkogenes KRAS zwar nicht den ERK-Signalweg signifikant aktiviert, aber die gesamte Zellpopulation in Richtung eines Stammzellphänotyps verschiebt. Mithilfe einer Serie von sequenziell CRISPR-mutierten humanen Kolonorganoiden untersuchte ich anschließend, wie sich Signalaktivität und Zellphänotypen in Abhängigkeit einzelner Onkogene der Darmkrebsentwicklung verändern. Auf Basis des intestinalen Kryptenmarkers EphB2 definierte ich dafür eine Pseudo-Differenzierungsachse. Meine Ergebnisse zeigen, dass sich die gesamte Zellpopulation während der Darmkrebsentstehung zwar in Richtung Stammzelligkeit verschiebt, diese Progression jedoch nicht durch jedes Onkogen gleichermaßen vorangetrieben wird.
description: Colorectal cancer (CRC) is a widespread disease caused by acquired, predominantly sequential, mutations in a limited set of oncogenes. They in turn influence cellular signalling and enable clonal advantages of tumour cells over their surrounding stroma. To understand the emergence and progression of CRC it is therefore crucial to assess transcriptomes, phospho-proteomes, and phenotype protein markers of individual cells. Single-cell RNA sequencing already enables the foremost of these capabilities while single-cell (phospho)-proteomic techniques are not yet widely established. Primary goal of my research was adapting mass cytometry (MC) for 2D and 3D CRC model systems and characterising cell signalling as well as phenotype changes in intestinal 3D organoids during CRC progression. Based on established MC protocols I devised a methodology suited for measuring epithelial cell cultures and also best practices for data analysis. With this set of tools I could show that ERK signalling is graded in KRAS-activated mouse small intestinal organoids, but not when KRAS downstream target BRAF is mutated active. I used principal component analysis (PCA) and k-means clustering to extract cell-type information from the MC dataset and could show that while oncogenic KRAS does not significantly change downstream ERK signalling, it globally shifts cells towards a crypt-like phenotype. Using a series of sequentially CRISPR-mutated human colon organoids I then investigated how signalling and cell phenotypes change in response to each newly acquired oncogene of the canonical CRC progression. Based on intestinal crypt-to-villus marker EphB2, I defined a pseudo-differentiation axis. My findings showed that, although cells generally shift towards a stem-like cell phenotype during CRC progression, this shift is not continuous.