title: Gene therapy for muscular dystrophy using secondary modifiers of the dystrophic phenotype
Creators: name: Abmayr, Simone
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2005
Subjects: subject: Gentherapie , Muskeldystrophie , Duchenne-Syndrom , , Gene therapy , Duchenne muscular dystrophy
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: The absence of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy causes sarcolemmal instability and renders muscle fibers susceptible to contraction-induced injury. Muscle repair mechanisms cannot compensate for progressive muscle degeneration, leading to a gradual replacement of muscle with adipose and connective tissue. Viral vectors have been successfully used to deliver dystrophin cDNA to dystrophin-deficient mdx mice, leading to a partial functional and morphological recovery of dystrophic muscle. However, a complete rescue of the dystrophic phenotype may require the co-delivery of additional factors to treat secondary pathological changes of dystrophic muscle. Since several malfunctions such as mechanical, signaling and regeneration may contribute to muscular dystrophy, we sought to study a number of treatments and their relative and combined potential for reversing the dystrophic pathology of the mdx mouse. The first part of the work centers around the characterization of ARC, apoptosis repressor interacting with caspase-recruitment domain, in normal and dystrophic mdx muscle and its potential to ameliorate muscular dystrophy. ARC was shown previously to interact selectively with caspases and to prevent hypoxia-induced release of cytochrome c from mitochondria, both features that may play a role in dystrophic pathology. We examined ARC protein expression in striated muscles and found that ARC displayed fiber-type restricted expression patterns and co-localized with the mitochondrial marker cytochrome oxidase. ARC expression in normal muscle showed a distinct regular pattern of ARC positive and negative fibers, while ARC expression in dystrophic mdx muscle appeared as a less distinct, irregular pattern. To gain further insights in the role of ARC in dystrophic mdx muscle, we generated transgenic mdx mice that over-expressed ARC under a tissue-specific promoter. These mice demonstrated high expression levels of transgenic ARC in all, oxidative and glycolytic, muscle fibers. Despite the over-expression of ARC in mdx skeletal muscle, these mice developed a dystrophic phenotype. We evaluated muscle morphology in ARC transgenic/mdx in comparison with mdx animals and did not observe an amelioration of the dystrophic pathology in ARC transgenic/mdx mice in various muscles at different ages. In summary, these studies suggested that the apoptotic pathways regulated by ARC do not significantly contribute to myofiber death in muscular dystrophy. The second part of this work focuses on the delivery of insulin-like growth factor (Igf-I) to mdx muscle without and in conjunction with gene replacement therapy. We wanted to assess if the beneficial effect of Igf-I is synergistic with the protective effect of dystrophin in restoring muscle strength and function in muscular dystrophy. In contrast to ARC, the effects of Igf-I have been widely studied in various cell types and tissues. In particular, overexpression of Igf-I in transgenic mdx muscles has been shown to protect the animals from the loss of muscle mass and function and to enhance muscle repair mechanisms. We have cloned and characterized the isoforms of Igf-I that are expressed in normal and dystrophic mouse muscle. Based on this information, we have tested virally mediated overexpression of Igf-I in vitro and in vivo in dystrophic muscle and established quantitative PCR and morphological and functional assays to assess expression and effects of Igf-I. Then we delivered dystrophin (AAV-mdys) and the muscle-specific Igf-I isoform (AAV-Igf-I) to dystrophic mdx muscles via recombinant adeno-associated viruses and analyzed their relative and combined potential in ameliorating the dystrophic phenotype. Functional measurements demonstrated that AAV-mdys injected animals were partially protected from contraction-induced injury, whereas animals injected with AAV-Igf-I alone were as susceptible as mdx animals to muscle damage. AAV-Igf-I treated animals, on the other hand, showed an increase in muscle mass, which was not seen after AAV-mdys only treatment. In contrast, co-injection of AAV-Igf-I and AAV-mdys resulted in increased muscle mass and muscle strength, and in protection from contraction-induced injury. These results suggest that the combination of AAV-Igf-I and AAV-mdys acted synergistically in ameliorating the dystrophic phenotype.
description: Das Fehlen von Dystrophin in Muskeldystrophie Duchenne führt zur Instabilität von Muskelmembranen, die somit leicht durch Muskelkontraktionen beschädigt werden können. Zusätzlich führen eine Beeinträchtigung wesentlicher Mechanismen der Signaltransduktion, sowie unzureichende Muskelregeneration, zu einem fortschreitenden Verlust des Muskelgewebes, das dadurch nach und nach von Binde-und Fettgewebe ersetzt wird. Mit Hilfe von viralen Vektoren kann Dystrophin erfolgreich im dystrophischen Muskel exprimiert werden und das pathologische Krankheitsbild verbessern. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass eine vollständige Heilung die zusätzliche Behandlung von sekundären pathologischen Symptomen, wie z.B. den Verlust der Muskelmasse, erfordert. In dieser Arbeit versuchen wir ein genaueres Verständnis für die Struktur- und Signalfunktion von Dystrophin zu gewinnen. Darüber hinaus testen wir die kombinierte Gentherapie, bei der Dystrophin im dystrophischen mdx Muskel ersetzt wird und zusätzlich sekundäre pathologische Symptome behandelt werden. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit dem anti-apoptotischen Protein ARC (apoptosis repressor interacting with caspase recruitment domain). Neue Studien haben gezeigt, dass das Protein ARC in hohen Mengen im humanen Skelett- und Herzmuskel vorkommt, und dass die Überexpression von ARC in Herzmuskelzellen vor Hypoxie und oxidativem Stress induziertem Zelltod schützen kann. Dieser Schutz könnte im dystrophischen Gewebe beeinträchtigt sein, da dessen Sensitivität gegenüber diesen sekundären Reizen erhöht ist. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ARC eine Rolle in der Pathologie der Dystrophie spielt und ob es vor Zerstörung von Muskelfasern schützen kann. Daher wurde murines ARC kloniert und seine Expression im gesunden und dystrophischen mdx Muskel charakterisiert. Immunohistologische Untersuchungen ergaben, dass ARC faserspezifisch im quergestreiften Muskel exprimiert ist, wo es hauptsächlich in oxidativen Muskelfasern vorkommt und mit dem mitochondrien-spezifischen Marker Cytochromoxidase kolokalisiert. ARC im gesunden Gewebe zeigte ein regelmäßiges Expressionsmuster von ARC positiven und negativen Muskelfasern, während dieses Muster im dystrophischen mdx Gewebe stark unregelmäßig und weniger deutlich ausgeprägt war. Um weitere Einsichten über die Rolle von ARC im dystrophischen Muskel zu gewinnen, wurden transgene mdx Mäuse generiert, die ARC unter einem gewebespezifischen Promoter überexprimieren. Diese Mäuse wiesen eine hohe Expression von transgenem ARC in oxidativen und glykolytischen Muskelfasern auf, und entwickelten trotz ARC Überexpression einen dystrophischen Krankheitsverlauf. Es wurde daraus geschlossen, dass apoptotische Regulationsmechanismen, die durch ARC kontrolliert werden, nicht signifikant zur Muskelpathologie in dystrophischem Gewebe beitragen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden adulte mdx Muskeln gentherapeutisch mit insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I (Insulin-like growth factor-I, Igf-I) alleine und in Kombination mit Dystrophin behandelt. Damit sollte untersucht werden, ob Igf-I synergistisch mit Dystrophin wirkt und das Krankheitsbild von Muskeldystrophie verbessern kann. Im Gegensatz zu ARC ist die Rolle von Igf-I in verschiedenen Zell- und Gewebetypen in früheren Studien ausgiebig charakterisiert worden. Die Überexpression von Igf-I im mdx Skelettmuskel mildert den dystrophischen Phänotyp, indem es die Muskelmasse vergrößert und Reparaturmechanismen des Muskels fördert. Es wurden die cDNAs für zwei muskelspezifische Isoformen des Igf-I kloniert und die Expression in normalem und dystrophischem mdx Muskelgewebe charakterisiert. Weiter wurden rekombinante adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren generiert, die unter einem muskelspezifischen Promotor entweder Igf-I (AAV-Igf-I) oder eine funktionelle Mikroversion von Dystrophin (AAV-mdys) exprimierten. Funktionelle Studien zeigten, dass die mit AAV-mdys behandelten Muskeln vor Verletzungen durch Muskelkontraktionen geschützt waren, jedoch keine größere Muskelmasse und Muskelkraft aufwiesen. AAV-Igf-I behandelte Muskeln hingegen waren nicht vor Verletzungen durch Muskelkontraktionen geschützt, wiesen aber eine größere Muskelmasse auf. Im Gegensatz dazu zeigte die Kombinationsbehandlung sowohl einen Schutz vor Verletzungen durch Muskelkontraktionen, als auch eine erhöhte Muskelmasse und Muskelkraft. Aus diesem Ergebnis konnte geschlussfolgert werden, dass Dystrophin und Igf-I synergistisch wirkten und die Kombinationsbehandlung den Krankheitsverlauf stärker abschwächte als die jeweiligen Einzelbehandlungen.