title: Charakterisierung der Repressorfunktion von PRMT6 und deren Rolle bei der Differenzierung, Proliferation und Seneszenz
title: Characterization of the repressive function of PRMT6 and its role in differentiation, proliferation and senescence
Creators: name: Stein, Claudia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Transkription
Arginine methylation
Gene regulation
Genregulation
PRMT6
Biowissenschaften, Biologie
Argininmethylierung
Transcription

description: PRMT6 belongs to the enzyme family
      of protein arginine methyltransferases and was identified in
      2002 by sequence homology search in the human genome using
      the conserved catalytic domain. The enzyme is predominantly
      localized in the nucleus. Although some PRMT6 substrates have
      been described, the precise function of this enzyme still
      remains elusive. The aim of this work was the identification
      and characterization of novel chromatin functions of PRMT6.
      At first the in vivo existence and relevance of the H3R2
      dimethylation catalyzed by PRMT6 was verified. It was shown
      that the PRMT6-mediated H3R2 dimethylation counteracts the
      active histone modification H3K4me3 and thereby represses the
      expression of a subset of HOXA genes and c-Myc target genes.
      In the following the underlying mechanism of this antagonism
      between H3R2me2 and H3K4me3 was uncovered at the HOXA2 gene.
      PRMT6-mediated H3R2 dimethylation inhibits H3K4
      trimethylation by preventing the chromatin recruitment of the
      components MLL1 and WDR5 of the H3K4 methyltransferase
      complex. This repressive function of PRMT6 was also found to
      be relevant for HOXA2 gene expression during neuronal
      differentiation in the NT2/D1 cell model. In the further
      course of this work a potential positive cross-talk between
      PRMT6 and polycomb group proteins was studied. PRMT6 was
      shown to interact with a subset of PcG proteins and similar
      to PcGs to be involved in the maintenance of the specific
      expression pattern of the entire HOXA gene locus during
      neuronal differentiation. Similar to the depletion of PcG
      proteins, depletion of PRMT6 was accompanied by
      hyperactivation of the anterior-localized HOXA genes and
      derepression of the posterior-localized HOXA genes following
      ATRA-induced differentiation of NT2/D1 cells. This
      deregulation of the HOXA genes upon loss of PRMT6 coincided
      with enhanced enrichment of the active histone modification
      H3K4me3 and decreased amounts of the repressive histone
      modification H3K27me3. In summary, these findings identify
      PRMT6 as a novel transcriptional repressor depending on its
      H3R2 methyltransferase activity and reveal as molecular
      mechanism of this repression a cross-talk between histone
      arginine methylation and lysine methylation. Since PcG
      proteins have been linked to the regulation of proliferation
      and senescence by repressing the INK4B-ARF-INK4A locus, it
      was investigated next whether PRMT6 would similarly control
      the INK4B-ARF-INK4A expression. The loss of PRMT6 in human
      embryonic fibroblasts resulted in a proliferation block,
      which was characterized by an accumulation of G1-phase cells.
      Moreover, depletion of PRMT6 caused cellular senescence
      indicated by beta-galactosidase positive cells and led to the
      upregulation of the CDK-inhibitors p16/INK4A as well as
      CDKN1A (p21/CIP1). In agreement with these results, the
      clonogenic growth potential of tumor cells was reduced in
      PRMT6-depleted cells. In conclusion, these data suggest that
      PRMT6 is necessary for the proliferation of both human
      diploid fibroblasts and tumor cells and inhibits cellular
      senescence as indicated here by controlling the expression of
      important cell cycle regulators. Finally, an unbiased screen
      for novel interaction partners of PRMT6 was established using
      overexpression of TAP (tandem affinity purification)-tagged
      PRMT6. Subsequent to affinity purification of exogenous
      PRMT6, co-purifying proteins were identified by mass
      spectrometry and analyzed by the database STRING and
      literature search to uncover published connections between
      the putative interactors, arginine methylation and PRMT6.
      These results will serve as a starting point for future
      research extending our knowledge on further nuclear functions
      of PRMT6.
description: PRMT6 gehört zur Familie der
      Protein-Arginin-Methyltransferasen und wurde 2002 durch
      genomweite Suche nach neuen PRMT Mitgliedern anhand der
      konservierten katalytischen Domäne gefunden und als nukleär
      lokalisiertes Enzym identifiziert. Obwohl bereits einige
      Substrate von PRMT6 beschrieben wurden, ist über die genaue
      Funktion des Enzyms wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit
      hatte zum Ziel neue Chromatinfunktionen von PRMT6 aufzudecken
      und zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurden
      zunächst das Vorkommen und die Relevanz der
      PRMT6-vermittelten H3R2 Dimethylierung in vivo nachgewiesen.
      Es wurde gezeigt, dass die H3R2 Dimethylierung durch PRMT6
      die aktive Histonmodifikation H3K4me3 antagonisiert und
      darüber die Repression einiger HOXA Gene und c-Myc-Zielgene
      erreicht wird. In nachfolgenden Untersuchungen wurde der
      Antagonismus zwischen H3R2me2 und H3K4me3 am HOXA2 Gen
      mechanistisch aufgeklärt. Die PRMT6-vermittelte H3R2
      Dimethylierung inhibiert die H3K4 Trimethylierung, indem die
      Chromatinrekrutierung der Untereinheiten des
      H3K4-Methyltransferase Komplexes MLL1 und WDR5 verhindert
      wird. Es wurde gezeigt, dass die transkriptionelle Repression
      von HOXA2 durch PRMT6 auch bei der neuronalen Differenzierung
      von NT2/D1 Zellen von Bedeutung ist. Weitere Untersuchungen
      im Rahmen dieser Arbeit beschäftigten sich mit der Aufklärung
      einer potentiellen positiven Wechselwirkung zwischen PRMT6
      und PcG Proteinen. Dabei wurde gefunden, dass PRMT6 mit PcG
      Proteinen interagiert und ähnlich wie die PcG Proteine zum
      Erhalt des spezifischen Expressionsmusters der HOXA Gene
      während der neuronalen Differenzierung beiträgt. Ähnlich wie
      die Depletion von PcG Proteinen führte die Depletion von
      PRMT6 zur Hyperaktivierung der anterior lokalisierten HOXA
      Gene und zur Derepression der posterior lokalisierten HOXA
      Gene nach Induktion der Differenzierung in NT2/D1 Zellen mit
      ATRA. Diese Fehlregulation der HOXA Gene als Folge der PRMT6
      Depletion ging mit einem veränderten
      Histonmodifikationsmuster einher. PRMT6-defiziente Zellen
      wiesen eine Zunahme der aktiven Histonmodifikation H3K4me3
      und einen Verlust der repressiven Histonmodifikation H3K27me3
      auf. Zusammenfassend identifizieren diese Daten PRMT6 als
      transkriptionellen Repressor durch die Katalyse der H3R2
      Dimethylierung. Diesem Repressionsmechanismus liegt die
      Wechselwirkung zwischen Histon-Argininmethylierung und
      Histon-Lysinmethylierung zugrunde. Aufgrund der Tatsache,
      dass PcG Proteine durch direkte Regulation des
      INK4B-ARF-INK4A Lokus mit der Regulation von Proliferation
      und Seneszenz in Verbindung gebracht werden, wurde im
      Folgenden untersucht, ob PRMT6 den INK4B-ARF-INK4A Lokus
      ebenfalls reguliert. Der Verlust von PRMT6 in humanen
      diploiden Fibroblasten (TIG3-T) führte zu einem
      Proliferationsarrest, der durch eine Akkumulation von
      G1-Phase Zellen gekennzeichnet war. Darüber hinaus
      resultierte die Depletion von PRMT6 in zellulärer Seneszenz,
      die durch die Aktivität von Seneszenz-assoziierter
      beta-Galaktosidase nachgewiesen wurde, und in einer
      Hochregulation der CDK-Inhibitoren p16/INK4A und CDKN1A
      (p21/CIP1). In Übereinstimmung damit führte eine Depletion
      von PRMT6 in Tumorzellen zur Reduktion des klonogenen
      Potentials. Zusammenfassend weisen diese Daten darauf hin,
      dass PRMT6 für die Proliferation von humanen diploiden
      Fibroblasten und Tumorzellen benötigt wird und durch
      transkriptionelle Regulation wichtiger Zellzyklusregulatoren
      Seneszenz inhibiert. Abschließend wurde ein
      unvoreingenommener Ansatz zur Aufreinigung neuer
      Interaktionspartner von PRMT6 unter Verwendung von TAP
      (Tandem Affinity Purification)-markiertem PRMT6 etabliert.
      Die coaufgereinigten Interaktionspartner wurden mittels
      massenspektrometrischer Analyse identifiziert und mit Hilfe
      der Datenbank STRING sowie Literaturrecherche auf publizierte
      Zusammenhänge zwischen den möglichen Interaktionspartnern,
      Argininmethylierung und PRMT6 analysiert. Diese Ergebnisse
      können als Ausgangspunkt für die zukünftige Erforschung von
      PRMT6 dienen und zur Erweiterung des Verständnisses weiterer
      nukleärer Funktionen von PRMT6 beitragen.