In culture μελέτη της ενδοκυττάριας μεταγωγής των βιοτεχνολογικά παραγόμενων TAT-L-Sco2-HA και TAT-β-σφαιρίνης-HA πρωτεϊνών:
Creators: name: Ingendoh, Alexandra Thomas (Ίνγκεντοχ, Αλεξάνδρα Θωμά)
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Μεταγωγή πρωτεϊνών
Μιτοχονδριακές ασθένειες
Βήτα θαλασσαιμία
Protein transduction
Mitochondrial disorders
Beta thalassemia

description: Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της ενδοκυττάριας μεταφοράς δύο ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, Sco2 και β-σφαιρίνη, από τις οποίες η κάθε μία συνδέεται σε μία μεταβολική ασθένεια. Η πρώτη είναι μία μιτοχονδριακή ασθένεια με μειωμένη δραστικότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c, που οφείλεται σε μεταλλάξεις στο SCO2 γονίδιο και η δεύτερη η βήτα θαλασσαιμία, με μειωμένη ή μηδενική παραγωγή βήτα σφαιρίνης, λόγω μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο. Ένας άλλος στόχος ήταν η διερεύνηση, αν η τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών Sco2 και βήτα σφαιρίνη επηρεάζεται κατά τη σύντηξή τους με πεπτίδια μεταγωγής (CPPs, Cell Penetrating Peptides), για την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ΤΑΤ-L-Sco2-HA και ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ. Για την προσέγγιση των παραπάνω προβλημάτων χρησημοποιήθηκαν κυτταροκαλλιέργειες, στις οποίες κάθε φορά μεταφέρθηκε μία από τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (ΤΑΤ-L-Sco2-HA ή ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ). Κύτταρα που επωάστηκαν με κάθε μία από τις πρωτεΐνες μελετήθηκαν με διάφορες τεχνικές: απομόνωση μιτοχονδρίων, μέτρηση της δραστικότητας της οξειδάσης του κυτοχρώματος c, ανοσοαποτύπωση κατά Western για τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό των πρωτεϊνών και ανοσοκατακρήμνιση για τον εντοπισμό πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων στα κύτταρα. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν προβλέψεις της τρισδιάστατης δομής των πρωτεϊνών και συστοιχίσεις με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής. Τα αποτελέσματα έδειξαν μεταγωγή της ΤΑΤ-L-Sco2-HA σε κύτταρα και μιτοχόνδρια κυττάρων ινοβλαστών ασθενών με μεταλλάξεις στο SCO2 γονίδιο, με παράλληλη αύξηση της δραστικότητας της οξειδάσης του κυτοχρώματος c. Στη συνέχεια, η ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ μεταφέρθηκε σε Κ562 κύτταρα, όπου φαίνεται να αλληλεπιδρά με την άλφα σφαιρίνη. Η βιοπληροφορική ανάλυση δεν ανέδειξε σημαντικές διαφορές στην τρισδιάστατη δομή των παραγόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Τα παραπάνω δεδομένα αποτελούν ένδειξη ότι οι μεταγόμενες μέσω του πεπτιδίου μεταγωγής ΤΑΤ σε κύτταρα στόχους ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Sco2 και βήτα σφαιρίνη, θα μπορούσαν να δράσουν θεραπευτικά στην περίπτωση μεταβολικών ασθενειών. Το ερώτημα αν η βιολογική δράση των δύο πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες παραμένει να διερευνηθεί.
description: The scope of the present study was to investigate the intracellular delivery of two recombinant proteins, Sco2 and β-globin, involved in two metabolic disorders: one was a mitochondrial disorder with reduced cytochrome c oxidase activity caused by a mutation in the SCO2 gene and the second was beta thalassemia, with null beta globin production caused by mutations on this gene. Another aim was to determine whether the three-dimensional structure of the proteins Sco2 and β-globin is affected by fusion with Cell Penetrating Peptides (CPPs) for the production of the recombinant proteins TAT-L-Sco2-HA and TAT-β-globin-HA. These questions were addressed using cultured cell lines in which either recombinant protein (TAT-L-Sco2-HA or TAT-β-globin-HA) was transported. Cells loaded with either protein were assessed using several techniques: mitochondria extraction, cytochrome c oxidase activity measurement, western blotting for intracellular protein detection and co-immunopercipitation to detect protein interactions in cells. Moreover, the three-dimensional protein structure predictions and superimpositions were also carried out using bioinformatics tools. The results show that TAT-L-Sco2-HA was transduced in SCO2 deficient patient’s fibroblast cells and imported into mitochondria, while increasing cytochrome c oxidase activity. Furthermore, TAT-β-globin-HA was transduced in human K562 cells whereas interacts with endogenous alpha globin. Bioinformatics analysis has shown no significant changes in the three-dimensional structure of the produced recombinant proteins. These data indicate that recombinant proteins Sco2 and β-globin delivered in target cells with the use of protein transduction domain TAT could act therapeutically in metabolic disorders. Whether the biological effect of both proteins is carried out via interaction with other proteins remains to be demonstrated.