Μελέτη της αναγεννητικής ικανότητας και δημιουργία διαγονιδιακών φυτών τομάτας που εκφράζουν το γονίδιο gmgstu4 (μεταφοράση της γλουταθειόνης) από τη σόγια.:
Creators: name: Κατίδου, Χριστίνα Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Τομάτα
Ιστοκαλλιέργεια Γενετική τροποποίηση(Μεταφοράσες της γλουταθειόνης, Αγροβακτήριο) Tomato
Tissue culture Agrobacterium transformation
(Glutathione transferases)

description: Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αναγεννητική ικανότητα τριών υβριδίων τομάτας (CLX3711, CLX3731 και Don Jose) και η γενετική τροποποίηση των υβριδίων CLX3711 και CLX3731 μέσω της μεθόδου του Agrobacterium tumefaciens. Για την αναγέννηση, κοτυληδόνες 12 ημερών τοποθετήθηκαν σε 10 διαφορετικούς συνδυασμούς των ρυθμιστών αύξησης ζεατίνη (Z, zeatin) και ινδολ-3-ακετικό οξύ (IAA, indol-3-acetic acid). Βέλτιστο υπόστρωμα για το CLX3711 ήταν το MSR συμπληρωμένο με 1.0 mg/l Z και 0.1 mg/l ΙΑΑ, ενώ για τα CLX3731 και Don Jose, το MSR συμπληρωμένο με 0.5 mg/l Z και 0.1 mg/l ΙΑΑ. Τα τρία υβρίδια δεν διέφεραν ως προς τον αριθμό εκφύτων που σχημάτισαν βλαστούς (9.33-11.33), τον αριθμό βλαστών ανά έκφυτο (2.89-3.03), το δείκτη σχηματισμού πολλαπλών μικροβλαστών (4.59-4.67) και την in vitro επιβίωση των παραγόμενων ριζοβολημένων φυταρίων (31.00-36.67), ενώ το υβρίδιο CLX3711 ήταν το καλύτερο ως προς το συνολικό αριθμό βλαστών ανά έκφυτο και την in vivo σκληραγώγηση των παραγόμενων έρριζων φυταρίων, με μέσους όρους 34.33 και 10.00 αντίστοιχα, διαφέροντας σημαντικά από τα άλλα δύο υβρίδια. Η γενετική τροποποίηση κοτυληδόνων των CLX3711 και CLX3731, πραγματοποιήθηκε με χρήση του δυαδικού φορέα pART27, που έφερε το διαγονίδιο gmgstu4, υπό τον έλεγχο του υποκινητή 35S-CaMV. Προκειμένου να δημιουργηθεί ένα αποτελεσματικό πρωτόκολλο γενετικής τροποποίησης μελετήθηκαν οι παράγοντες ηλικία των κοτυληδόνων, προκαλλιέργεια, διάρκεια συγκαλλιέργειας, συγκέντρωση της ακετοσυριγκόνης (As, acetosyringone) στο διάλυμα συγκαλλιέργειας και συγκέντρωση της θειαμίνης (T, thiamine) στο υπόστρωμα επιλογής. Με χρήση κοτυληδόνων 15 ημερών που προκαλλιεργήθηκαν 1 ημέρα, συγκαλλιέργηθηκαν με το A.tumefaciens-gmgstu4 επί 2 ημέρες σε διάλυμα συμπληρωμένο με 200 μM As και κατόπιν τοποθετήθηκαν σε υπόστρωμα επιλογής MSR συμπληρωμένο με 0.4 mg/l T, σημειώθηκε ποσοστό επιτυχούς γενετικής τροποποίησης 37.04%. Η ύπαρξη του διαγονιδίου 35S-gmgstu4 στα πιθανά γενετικά τροποποιημένα φυτά ελέγχθηκε μέσω της τεχνικής PCR και η ποσοτική του έκφραση στα διαγενετικά φυτά, μέσω της Real Time Q-PCR. Οι κλώνοι Α0 κι Α4 του υβριδίου CLX3711 παρουσίασαν τα υψηλότερα ποσοστά της σχετικής ποσοτικής έκφρασης του διαγονιδίου gmgstu4, με μέσους όρους 23.7 και 26.0 αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα (ακτίνη).
description: An efficient regeneration protocol for three tomato hybrids (CLX3711, CLX3731 and Don Jose) and an Agrobacterium-mediated transformation protocol for hybrids CLX3711 and CLX3731 are developed. Shoot organogenesis of 12-days old cotyledons was tested by treating them with 10 different combinations of plant growth combinations zeatin (Z) (0.0-2.0 mg/l) and indol-3-acetic acid (IAA) (0.0-0.1 mg/l). Hybrid CLX3711 showed the highest percentage of shoot formation, number of shoots per explant and total number of shoots on MS supplemented with 1.0 mg/l Z and 0.1 mg/l IAA whilst the optimal results for CLX371 and Don Jose were obtained on MS supplemented with 0.5 mg/l Z and 0.1 mg/l IAA. There was no significant difference between the 3 hybrids concerning the number of regenerated explants (9.33-11.33), the number of shoots per explant (2.89-3.03), the multiplication rate (4.59-4.67) and the in vitro survival of the generated rooted plantlets (31.00-36.67), however the hybrid CLX3711 led to the highest total number of shoots and in vivo survival rate, with averages of 34.33 and 10.00 respectively, differing significantly by the other two hubrids. The cotyledons of hybrids CLX3711 and CLX3731 were transformed via the pART27 binary vector that was harboring the transgene gmgstu4 under the control of CaMV-35S promoter. For optimizing the transformation procedure, the effects of explant age, days of preculture, days of cocultivation, concentration of acetoryringone (As) on the cocultivation media and of vitamin thiamine (T) on the selection media were tested. Cotyledons of 15 days, after one day of preculture, 2 days on coculture media supplemented with 200 μM As and followed by a transfer on MS medium supplemented with 1.0 mg/l Z, 0.1 mg/l IAA, 0.4 mg/l T, resulted in 37.04% transformation efficiency. The presence of the transgene in the T0 plants was verified with PCR and its expression by Real Time Q-PCR. The clones A0 and A4 of hybrid CLX3711 exhibited the highest percentages of relative quantitive expression of the transgene gmgstu4, with averages of 23.7 and 26.0 respectively, in relation to the gene of control (actin).