title: The role of p53 signaling in CD4+ T cells
title: Die Rolle des p53-Signalwegs in CD4+ T-Zellen
Creators: name: Schürer, Hendrik
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: p53
subject: p21
subject: CDK4
subject: CDK6
subject: CD4+
subject: T-Zelle
subject: TH1-Differenzierung
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: Background and aims For decades, the tumour suppressor Tp53 has been investigated in the context of cancer cell development. However, Tp53 contributes to several other processes in the organism as well, such as to an appropriate immune response. For this immune response, CD4+ T cells are one central cell population, as they regulate many other immune cells via cytokines. Other researchers found that Tp53 becomes upregulated after T cell activation and that Tp53-deficiency shifts the TH17/Treg balance towards TH17 cells. In contrast, very little is known about the role of Tp53 for TH1 differentiation. For this reason, and because of the great relevance of TH1 cells for both the anti-tumour response and viral defence, our aim was to investigate this relationship. Methods For our experiments, we used healthy, eight to twelve weeks old C57BL/6 mice carrying a conditional Tp53 deletion in T cells. First, we analysed whether a Tp53ΔCD4 deletion affects the distribution of various immune cell populations in vivo. For that purpose, we isolated cells from blood, mesenteric lymph nodes, spleen and thymus and measured them via flow cytometry. Furthermore, we performed H&amp;E stainings of several organs to identify potential differences in tissue morphology. The T cell population was characterised in more detail, namely in respect to changes in differentiation, effector-memory function, proliferation, apoptosis and the expression of the co-stimulatory molecules CD27/CD28. In a next step, these functions were also investigated in the context of in vitro TH1 differentiation, with a focus on alterations in TH1 differentiation. Here, we measured the expression of TH1-associated genes over time via flow cytometry, quantitative PCR and Western Blot. After we found that Tp53 influences TH1 differentiation, we searched for the underlying mechanism. The cell cycle regulation seemed to be a promising candidate, so its role was further analysed through DAPI staining and the use of the CDK4/6 inhibitor Palbociclib. Results The phenotyping of young, healthy C57BL/6 mice with a conditional Tp53ΔCD4 deletion did not show any relevant changes compared to control mice, neither in the distribution of immune cell types nor in T cell functions. In contrast, in vitro T cell differentiation experiments revealed that Tp53 expression rises under TH1-stimulating conditions and that Tp53ΔCD4 deletion compromises TH1 differentiation from day three onwards. This was accompanied by an increased proportion of central-memory T cells and a reduction of CD28 expression. Neither changes in apoptosis, proliferation, DNA repair nor the IL2-receptor pathway could explain the impaired TH1 differentiation of Tp53-deficient T cells. Instead, we identified the p21-CDK4/6 pathway as one major factor: Tp53-deficient T cells expressed less p21 and exhibited an accelerated G1/S transition. The addition of Palbociclib, which acts as a CDK4/6 inhibitor similarly to p21, reduced this effect on the cell cycle and increased the amount of TH1 cells as well. Conclusion In the past, Tp53 has often been associated to immune suppression, for instance by the inhibition of so-called “bystander” T cells or by shifting the TH17/Treg balance towards Treg cells. We now present a mechanism by which Tp53 facilitates the immune response by supporting the TH1 differentiation in vitro. Furthermore, we were able to identify the p21-CDK4/6 pathway as one central mechanism. In summary, our work helped to better understand the complex regulation of T cell differentiation and provides incentives to investigate the functional role of Tp53 in T cells in vivo as well.
description: Hintergrund und Ziele Der Tumorsuppressor Tp53 wurde in den letzten Jahrzehnten vor allem im Kontext der Krebszellentstehung erforscht. Daneben existieren jedoch weitere Prozesse im Organismus wie die Immunabwehr, an denen Tp53 beteiligt ist. Eine zentrale Zellpopulation des Immunsystems sind die CD4+ T-Zellen, da sie über Zytokine die Funktion zahlreicher weiterer Immunzellen regulieren. Andere Forschergruppen zeigten, dass Tp53 im Rahmen der T-Zell-Aktivierung verstärkt exprimiert wird und dass eine Tp53-Defizienz das Gleichgewicht zwischen TH17- und Treg-Zellen in Richtung TH17-Zellen verschiebt. Über die Bedeutung von Tp53 für die TH1-Differenzierung ist hingegen sehr wenig bekannt. Aus diesem Grund und wegen der großen Relevanz von TH1-Zellen bei der Anti-Tumor-Antwort und der viralen Abwehr war das Ziel dieser Arbeit, jenen Zusammenhang näher zu beleuchten. Methoden Für unsere Versuche verwendeten wir gesunde, acht bis zwölf Wochen alte C57BL/6-Mäuse mit einer konditionalen Tp53-Deletion in T-Zellen. Zunächst wurde analysiert, ob eine Tp53ΔCD4-Deletion die Verteilung verschiedener Immunzellentypen in vivo ändert. Dazu wurden die Zellen aus Blut, Knochenmark, mesenterischen Lymphknoten, Milz und Thymus isoliert und durchflusszytometrisch gemessen. Außerdem wurden von einigen Organen H&amp;E-Präparate angefertigt, um mögliche Effekte auf die Gewebsmorphologie zu identifizieren. Die T-Zell-Population wurde mittels Durchflusszytometrie ausführlicher charakterisiert, und zwar im Hinblick auf die Differenzierung, Effektor-Gedächtnis-Funktion, Proliferation, Apoptose und Expression der Co-Stimulatoren CD27/CD28. Die gleichen Funktionen wurden auch im Rahmen der in vitro TH1-Differenzierung untersucht, wobei der Fokus auf den Veränderungen der TH1-Differenzierung lag. Hierfür wurden TH1-assoziierte Gene im zeitlichen Verlauf via Durchflusszytometrie, quantitativer PCR und Western Blot gemessen. Nachdem wir einen Einfluss von Tp53 auf die TH1-Differenzierung beobachten konnten, suchten wir den zugrundeliegenden Mechanismus. Der Zellzyklus schien hierbei eine Rolle zu spielen, sodass dieser mittels DAPI-Färbung und der Verwendung des CDK4/6-Inhibitors Palbociclib weitergehend analysiert wurde. Ergebnisse Bei der Phänotypisierung junger, gesunder C57BL/6-Mäuse führte eine Tp53ΔCD4-Deletion zu keinen nennenswerten Änderungen, weder bei der Verteilung der Immunzelltypen noch den T-Zell-Funktionen. Im Gegensatz dazu zeigte sich in der in vitro T-Zell-Differenzierung, dass Tp53 unter TH1-stimulierenden Bedingungen verstärkt exprimiert wird und dass eine Tp53ΔCD4-Deletion ab dem dritten Tag zu einer gestörten TH1-Differenzierung führt. Zusätzlich war durch die Deletion der Anteil der zentralen Gedächtnis-T-Zellen erhöht und die CD28-Expression erniedrigt. Als Hauptursache für die beeinträchtigte TH1-Differenzierung konnten Veränderungen der Apoptose, Proliferation, DNA-Reparatur und des IL2-Rezeptor-Signalwegs ausgeschlossen werden. Stattdessen identifizierten wir den p21-CDK4/6-Signalweg als einen bedeutenden Faktor: Tp53-defiziente Zellen exprimierten weniger p21 und wiesen eine beschleunigte G1/S-Transition auf. Durch Zugabe von Palbociclib, das ähnlich wie p21 CDK4/6 hemmt, reduzierte sich dieser Effekt auf den Zellzyklus und führte gleichzeitig zu einer Zunahme der TH1-Zellen. Schlussfolgerung In der Vergangenheit wurde Tp53 häufig eine immunsupprimierende Rolle zugeschrieben, sei es durch die Inhibition sogenannter „bystander“ T-Zellen oder die Verlagerung des TH17/Treg-Gleichgewichts hin zu Treg-Zellen. Nun präsentieren wir einen Mechanismus, über den Tp53 die Immunantwort fördert, indem es die TH1-Differenzierung in vitro unterstützt. Zusätzlich konnten wir hierbei eine zentrale Beteiligung des p21-CDK4/6-Signalwegs nachweisen. Diese Arbeit half dabei, die komplexe Regulation der T-Zell-Differenzierung besser zu verstehen und soll weitere Anreize schaffen, die funktionelle Bedeutung von Tp53 in T-Zellen auch in vivo besser zu erforschen.