title: Biochemische Untersuchungen an bakteriellen und pilzlichen Prenyltransferasen
title: Biochemical investigations on bacterial and fungal prenyltransferases
Creators: name: Fan, Aili
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
Biocatalyst
Tyrosine, Dipeptide
Dimethylallyltransferase
Tryptophan
Dimethylallyl-Transferase
Dipeptide
Biokatalysator , Tryptophan
Tyrosin

description: Prenylated natural products are
      widely distributed in nature and demonstratean amazing
      varietyof structures and promising biological activities,
      which are usually distinct from their non-prenylated
      precursors. Therefore, they are intensively studied by
      researchers from different disciplines. These
      includeinvestigationson their biosynthesis as well as on the
      involved key enzymes such as prenyltransferases, which
      contribute significantly to the structural diversity and
      biological activity. Prenyltransferases catalyze the transfer
      reactionsof prenyl moietiesfrom different prenyl donors to
      various aliphatic or aromatic acceptors.This thesis focuses
      on the prenyltransferases from the dimethylallyltryptophan
      synthase (DMATS) superfamily. A new member of this
      superfamily TyrPT was characterized biochemically in vitro.
      The responsible geneAn13g01840had been identified in the
      genome sequence ofA.niger and cloned into pET28a. In this
      thesis, TyrPT was found to catalyze theO-prenylation of
      tyrosine as well as C7-prenylation of tryptophan. It was
      further compared with the known tyrosine O-prenyltransferase
      SirD and tryptophan C7-prenyltransferase 7 DMATS toward a
      series of tyrosine and tryptophan derivatives. TyrPT
      exhibited a broader substrate spectrum and significantly
      higher catalytic activity for several substrates than the
      other two enzymes.Kinetic parameters of TyrPT reactions
      withten substrateswere determined.This studynot only
      providesanew enzyme,but also enhances the
      relationshipsbetween tyrosine O- andtryptophan
      C-prenyltransferases. Further studiesdemonstrated that
      tryptophan prenyltransferases FgaPT2 and 7-DMATS also
      accepted tyrosine and its derivatives as substrates and
      catalyzed a unique C3- and O-prenylation, respectively. A
      mechanism ofthe FgaPT2 reaction with tyrosine was proposed
      based on the molecular modeling results with the available
      crystal structure of FgaPT2.Based on this hypothesis, sixteen
      mutated FgaPT2 derivatives were tested with tryptophan and
      tyrosine as substrates. The mutant K174F demonstrated much
      higher catalytic ability toward tyrosine than FgaPT2 and
      showed almost no activity toward tryptophan. Therefore,
      tryptophan C4-prenyltransferase was switched to a specific
      tyrosine C3-prenyltransferase by site-directed mutagenesis.
      This strategy was also used for enhancing thecatalytic
      activity of FgaPT2as a C4-prenylating enzyme of cyclic
      dipeptides. Thirteen mutated FgaPT2 with much higher
      catalytic activities and different substrate preferences
      toward cyclic dipeptides were obtained as new biocatalysts.
      Inspired by the results above, the L-tyrosineanalogs,L-o-
      andL-m-tyrosine, were tested with the tryptophan
      prenyltransferases FgaPT2, 5-DMATS, 6-DMATSSv and 7 DMATS as
      well as the tyrosine prenyltransferases SirD and TyrPT.
      Surprisingly,SirD hardly accepted thesetyrosine analogs. In
      contrast,tryptophan prenyltransferases generally demonstrated
      higher catalytic activities toward these two substrates.
      Product isolation and structure elucidation proved
      C5-prenylated o-tyrosine as unique product of these enzymes,
      and both C4- andC6-prenylated derivativeswere identified as
      the products of the FgaPT2 reaction with L-m-tyrosine.These
      results revealed that chemical category of the aromatic
      nucleus was not the essential featureforthe acceptance of a
      substrate by tryptophan or tyrosine prenyltransferases. It
      strongly depends on thesubstitution positions of the
      functional groups on the aromatic nucleus, which directly
      interact with the enzyme active sites. Aforementioned results
      exhibitfairly the broad substrate spectra of DMATS enzymes.
      However, the tryptophan prenyltransferases usually accepted
      cyclic dipeptides only at high protein
      concentrations.Consequently, tryptophan was a verypoor
      substrate for cyclic dipeptide prenyltransferases. In this
      thesis, the substrate promiscuity of indole
      prenyltransferases including tryptophan and
      tryptophan-containing cyclic dipeptide prenyltransferases was
      further expanded by their acceptance of the synthesized
      unnatural cyclo-L-homotryptophan-D-valine with one additional
      C-atom between the indole and the diketopiperazine rings.This
      compound was well accepted by all the tested
      prenyltransferases including three tryptophan and five cyclic
      dipeptide prenyltransferases. Seven prenylated products with
      one prenyl moiety at each position of the indole nucleus were
      isolated from the enzyme assays.This was the firstreport on
      the production of seven monoprenylated productsfrom one
      substrate by one-step reactions. The results presented in
      this thesis demonstrate that prenyltransferases of theDMATS
      superfamily are a rich source of biocatalysts, which could
      play an important role forproduction of prenylated
      compounds.
description: Prenylierte Substanzen sind in der
      Natur weitverbreitet und weiseneine erstaunliche strukturelle
      Diversitätauf. Sie besitzen häufigeine vielversprechende
      biologische Aktivität, was sie von ihren unprenylierten
      Vorstufenunterscheidet. Daher werden sie von Wissenschaftlern
      aus verschiedenen Disziplinen umfangreich untersucht.Die
      Forschung beinhaltet deren Biosynthese unddie daran
      beteiligten Schlüsselenzyme, wie z. B. Prenyltransferasen,
      die maßgeblich an der strukturellen Vielfalt und biologischen
      Aktivität beteiligt sind. Prenyltransferasen katalysieren die
      Übertragung einer Prenyleinheit von unterschiedlichen
      Prenyldonoren auf verschiedene aliphatische oder aromatische
      Akzeptoren. Diese Dissertation beschäftigt sich mit den
      Prenyltransferasen der Dimethylallyltryptophansynthase
      (DMATS) Superfamilie. Die Prenyltransferase TyrPT, ein neues
      Mitglied dieser Superfamilie, wurde biochemisch in vitro
      charakterisiert. Das verantwortliche GenAn13g01840 wurde
      zuvor in der Genomsequenz von A. niger identifiziert und in
      pET28a kloniert. In der vorliegenden Arbeit wurde
      festgestellt, dass TyrPT sowohl die O-Prenylierung von
      Tyrosin als auch die C7-Prenylierung von Tryptophan
      katalysiert. Weiterhin wurde dieses Enzym mit der bekannten
      Tyrosin-O-Prenyltransferase SirD und der Tryptophan-C7
      Prenyltransferase 7-DMATS gegenüber einer Reihe von Tyrosin-
      und Tryptophan-Derivate als Substrate verglichen. TyrPT wies
      ein breiteres Substratspektrum sowieeine deutlich höhere
      katalytische Aktivität für verschiedeneSubstrate auf, als die
      zwei anderen Enzyme. Ebenso wurden die kinetischen Parameter
      der TyrPT-Reaktionen mitzehn Substraten bestimmt. Diese
      Arbeitliefert nicht nur ein neues Enzym, sondern vergröβert
      auch unser Wissen über dieBeziehungenderTyrosin-O- und
      Tryptophan-C-Prenyltransferasen. Weitere Untersuchungen
      ergaben, dass die Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2 und
      7-DMATS auch Tyrosin und dessen Derivate als Substrate
      akzeptieren und jeweils eine C3- und O-Prenylierung
      katalysieren. Ein Mechanismus der FgaPT2-Reaktion mit Tyrosin
      wurde durchmolekulares modellieren („molecularmodeling“)
      basierend auf der verfügbaren Kristallstruktur postuliert.
      Ausgehendvon dieser Hypothese wurden 16 FgaPT2-Mutanten mit
      Tryptophan und Tyrosine als Substrate getestet. Die Mutante
      K174F zeigte eine viel höhere katalytische Aktivität
      gegenüber Tyrosin als FgaPT2, jedoch kaum Aktivität mit
      Tryptophan. Somit wurde die Tryptophan-C4-Prenyltransferase
      durch zielgerichtete Mutagenese zu einer spezifische
      Tyrosin-C3-Prenyltransferase umgewandelt. Diese Strategie
      wurde auch eingesetzt um diekatalytische Aktivität von FgaPT2
      als C4-prenylierendes Enzym von zyklischen Dipeptidenzu
      erhöhen. 13 FgaPT2-Mutanten mit deutlichhöherer katalytischer
      Aktivität und unterschiedlichen Substratspräferenzengegenüber
      Dipeptidenkonntenals neue Biokatalysatoren erhalten werden.
      Motiviert durch die zuvorgenannten Ergebnisse wurden zwei
      Analoga von L-Tyrosin, L o- und L-m-Tyrosin, mit den
      Tryptophan-Prenyltransferasen FgaPT2, 5-DMATS, 6-DMATSSv und
      7-DMATS sowie den Tyrosin-Prenyltransferases SirD und TyrPT
      getestet. Interessanterweise akzeptierte SirDdie zwei Tyrosin
      Analoga nur gering. Im Gegensatz dazu, wiesen die
      Tryptophan-Prenyltransferasen eine höhere katalytische
      Aktivität gegenüber diesen Substraten auf. Durch
      Produkt-Isolierung und Strukturaufklärung konnte bezüglich
      TyrPT und den Tryptophan-PrenyltransferasenC5-prenyliertes
      o-Tyrosin als einzigesProdukt nachgewiesen werden. Für die
      FgaPT2-Reaktion wurden C4- und C6-prenyliertes m-Tyrosin
      identifiziert. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass die
      Grund Strukturder Substrate keine essentielle Rolle für die
      Akzeptanz von Tryptophan- oder Tyrosin-Prenyltransferasen
      spielt, sondern von der Substitutionsposition der
      funktionellen Gruppe am aromatischen Kern abhängt, welche in
      direkte Wechselwirkung mit dem aktiven Zentrum des Enzyms
      tritt. Die zuvor beschriebenen Ergebnisse verdeutlichen die
      breite Substratspezifität der DMATS-Enzyme. Die
      Tryptophan-Prenyltransferasen akzeptieren jedoch die
      zyklischenDipeptide nur bei hohen Proteinkonzentrationen. Im
      Gegenzug stellt Tryptophan ein sehr schlechtes Substrat für
      zyklische Dipeptid-Prenyltransferasen dar. Die
      Substratpromiskuität der Indol-Prenyltransferasen,
      einschließlich der Tryptophan- und
      tryptophanhaltigenzyklischenDipeptid-Prenyltransferasen wurde
      durch das unnatürliche Substrat
      cyclo-L-homotryptophan-D-valin, welches ein zusätzliches
      C-Atom zwischen denIndol- und Diketopiperazinringen besitzt,
      erweitert. Alle drei getestetenTryptophan-Prenyltransferasen
      sowie die fünf zyklischenDipeptid-Prenyltransferasen
      akzeptierten das Substrat sehr gut. Sieben prenylierte
      Produkte mitjeweils einer Prenylgruppe an jeder Position des
      Indolkerns wurden aus den Enzymreaktionen isoliert. Damit
      wurden erstmals sieben monoprenylierte Produkte aus einem
      Substrat in einstufigen Reaktionenproduziert. Die aus dieser
      Dissertation hervorgegangenen Ergebnisse demonstrieren, dass
      die Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie eine wertvolle
      Quelle für Biokatalysatoren darstellen unddamit eine wichtige
      Rolle in der Produktionprenylierter Verbindungen spielen
      könnten.