title: Assessing protein-metal-binding using "accurate constant via transient incomplete separation" (ACTIS)
Creators: name: Eric, Zorica
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die Bewertung von biomolekularen Interaktionen ist einer der wichtigsten Aspekte der Bioanalytik. Alle etablierten Methoden zur Beurteilung der Bindungsstärke zwischen Protein und einer bindenden Komponente (PC) weisen inhärente Fehlerquellen auf. Dies führ dazu, dass die resultierenden Dissoziationskonstanten (Kd) für dasselbe Modellsystem mehrere Größenordnungen voneinander abweichen. Accurate Constant via Transient Incomplete Separation (ACTIS) ist eine neue Methode zur genauen Bestimmung von Kd, die theoretisch frei von inhärenten Fehlerquellen ist. Diese Methode basiert auf einem deterministischen Prozess der Transient Incomplete Separation (TIS). Die Differenz in der transversalen Diffusion von freiem C und PC ist die Grundlage für das Auftreten von TIS. Bisher wurde ACTIS nur zur Bewertung von Protein-Kleinmolekül-Modellen verwendet. Diese Arbeit stellt den ersten Versuch einer Analyse von Protein-Metall-Bindungen mithilfe von ACTIS dar. Zur Validierung unseres Setups wurde die Bindung von Humanem Serumalbumin (HSA) an Fluorescein (FLC) mithilfe von ACTIS gekoppelt an einem Fluoreszenzdetektor untersucht. Darüber hinaus wurde die Kompatibilität von ACTIS mit verschiedenen Detektionsmethoden demonstriert. Unsere Experimente umfassten die Kopplung des ACTIS-Setups mit vier verschiedenen Detektionsmethoden: Fluoreszenzdetektion (FLD), Flugzeit - Massenspektrometrie (TOF-MS), induktiv gekoppelte Plasma - Massenspektrometrie (ICP-MS) und Atomemissionsspektroskopie (ICP-AES). Die Bindung von Quercetin-Eisen (FeQ2)-Komplex an β-Lactoglobulin (BLG) wurde mithilfe von ACTIS-TOF-MS untersucht. Neben der Kd - Bestimmung wurden auch Experimente zur Verbesserung der Fe - Detektion mit ICP-Techniken durchgeführt. Abschließend wurde der Einfluss der Detektor-Konfiguration, insbesondere des inneren Radius der Transferkapillare, in silico mit Hilfe von Computersimulationen untersucht.
description: The assessment of biomolecular interactions is one of the main aspects of bioanalytics. All established methods for assessment of protein-compound (PC) binding have inherent sources of inaccuracy. This results in multiple values for the dissociation constant (Kd) differing in few orders of magnitude determined for same model system. Accurate constant via transient incomplete separation (ACTIS) is a recently introduced method, theoretically free from inherent sources of inaccuracy. This method is based on a deterministic process of transient incomplete separation (TIS). The difference in transverse diffusion of free C and PC is the basic for the TIS occurrence. So far ACTIS was only used for assessment of small molecule-protein models. This would be the first protein-metal-binding assessment utilizing ACTIS. To proof our setup, the Humane Serum Albumin (HSA) binding to Fluorescein (FLC) was assessed using ACTIS coupled to fluorescence detector. Furthermore, the compatibility of ACTIS with different detection methods was demonstrated. Our experiments included coupling of ACTIS setup to four different detection methods: fluorescence detection (FLD), time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS), inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) and atomic emission spectroscopy (ICP-AES). The binding constant of β-lactoglobulin (BLG) to quercetin-iron (FeQ2) complex was assessed using ACTIS-TOF-MS. Beside the assessing of Kd, the experiments aiming the improvement of the transient Fe detection with ICP techniques were also conducted. Finally, the impact of the detector configuration, specifically the inner radius of the transfer capillary, was examined in silico by employing computer simulations.