title: Mutational analysis of ligand - LDL-receptor interactions
Creators: name: Schlager, Stefanie
Publisher: name: :none
Year: 2009

description: Lipoproteinrezeptoren sind Plasmamembranproteine, welche für die spezifische Bindung und Aufnahme der im Blutkreislauf zirkulierenden Lipoproteine in hepatische und extrahepatische Gewebe verantwortlich sind. Dieser physiologische Vorgang wird als rezeptorvermittelte Endozytose bezeichnet und basiert auf der Interaktion zwischen Mitgliedern der sogenannten Low Density Lipoprotein (LDL) Rezeptor Familie und Lipoproteinen im Plasma. Der als erster entdeckte und am besten charakterisierte Lipoproteinrezeptor ist der LDL Rezeptor (LDLR). Dieser Rezeptor spielt eine wichtige Rolle in der Regulation der Cholesterinspiegel durch die Bindung und Internalisierung von Lipoproteinen, welche Apolipoprotein- B (apoB) und /oder -E (apoE) als Proteinkomponente besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurde das legende Huhn, ein gut etablierter Modellorganismus zur Erforschung des Lipidstoffwechsels, herangezogen um die Interaktion des LDL Rezeptors mit Apolipoprotein B- und -E hältigen Lipoproteinen näher zu charakterisieren. Früheren Studien zufolge gibt es zahlreiche Oberflächenrezeptoren im Huhn, die eine deutliche Homologie zur Familie der LDL Rezeptorproteine von Säugern aufweisen. Der zum menschlichen LDL Rezeptor homologe Rezeptor im Huhn wurde erstmals im Jahr 2003 beschrieben und weist die klassischen Strukturmerkmale der Säuger-LDL Rezeptoren auf, was auf eine hohe evolutionäre Konservierung deutet. Alle Mitglieder der LDL Rezeptorfamilie besitzen einen charakteristischen modularen Aufbau aus vier bis fünf unterschiedlichen Domänen. Die amino-terminale Region enthält die Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors und besteht aus mehreren cysteinreichen Abschnitten, den sogenannten LA-repeats, welche die Interaktion mit verschiedenen Proteinen, wie Apolipoprotein, Proteasen und Signalproteinen vermitteln. Mutationsanalysen zeigen, dass die einzelnen Repeats unterschiedliche funktionelle Bedeutungen bei der Ligandenbindung besitzen. Bindungsstudien im Hühnersystem ergaben, dass einige Rezeptoren der LDLR Familie Apolipoprotein E binden, ein in Säugern, jedoch nicht im Huhn produziertes Protein. Andere Rezeptoren wiederum besitzen diese Bindungseigenschaft nicht. Dieses unterschiedliche Verhalten weist darauf hin, dass bestimmte Variationen in der ligandenbindenden Domäne des Rezeptors einen entscheidenden Einfluss auf die Ligandenbindung besitzen. In der vorliegenden Arbeit habe ich mich damit beschäftigt, die strukturellen Unterschiede zwischen ApoE-bindenden Rezeptoren und Rezeptoren, welche die Fähigkeit ApoE zu binden nicht besitzen, zu ermitteln. Gemäß den Ergebnissen aus früheren Mutationsanalysen wurde die Ligandenbindungsdomäne des Hühner- LDLR an vermeintlich wichtigen Bindungsregionen mutiert. Die bakteriell exprimierten mutanten Rezeptorproteine wurden durch Affninitätschromatographie gereinigt und, um die physiologische Funktionsweise zu erlangen, einem Faltungsprozess unterzogen, welcher durch das molekulare Chaperon RAP (Receptor-associated Protein) unterstützt wurde. Schließlich wurden die Rezeptormutanten hinsichtlich der Ligandenbindung von Apolipoprotein B- und -E -hältigen Lipoproteinen untersucht. Diese Bindungsanalysen ergaben, dass das erste cysteinreiche LA Repeat (LA1) nicht an der Binding von Apolipoprotein B beteiligt scheint. Indessen führten Mutationen in den Repeats 4 und 5 (LA4, LA5), sowie in der Linker-Region zwischen diesen Repeats zu erheblichen Einschränkung bezüglich der Bindung von ApoB-hältigen Lipoproteinen. Bindungsanalysen zur Erforschung der Interaktion zwischen ApoE und den Rezeptormutanten lieferten bisher keine reproduzierbaren Ergebnisse, und erfordern daher weitere Untersuchungen. Die Daten, die im Zuge dieser Arbeit durch Experimente im Huhn ermittelt wurden, tragen zum Verständnis des molekularen Mechanismus der LDL Rezeptor-Ligand Interaktion bei und stehen im Einklang mit Untersuchungsergebnissen am menschlichen LDL Rezeptor, welche eine große Bedeutung des fünften LA Repeats (LA5) für die Ligandenbindung beschreiben.
description: Lipoprotein receptors are cell surface-exposed receptors that are specific for the binding and uptake of lipoproteins from the circulation into hepatic and extrahepatic tissues. This process is termed receptor-mediated endocytosis and is largely dependent upon the interaction between members of the so-called Low Density Lipoprotein (LDL) receptor family and plasma lipoproteins. The best characterized receptor of this family is the LDL receptor (LDLR). It plays a major role in the regulation of plasma cholesterol levels by mediating the binding and uptake of apolipoprotein B- (apoB) and -E (apoE) -containing plasma lipoprotein particles. To gain further insight into the molecular mechanism of LDL receptor- ligand interactions, I performed the present study in the domesticated chicken (Gallus gallus), which serves as an excellent model organism for research on lipid metabolism. Various surface receptors homologous to members of the mammalian LDLR family have been discovered in this species, and are recognized as important in the maintenance of systemic lipid homeostasis and embryongenesis including follicle development and oocyte growth. In 2003, the first avian LDL receptor ortholog was characterized and revealed a high degree of conservation during evolution, since the LDLR’s hallmark properties are already present in the chicken protein. The numerous avian and mammalian relatives of the receptor family share characteristic similarities, both in structural and functional terms. Via highly conserved cysteine-rich repeat elements in the extracellular ligand-binding domain the receptors are able to bind many unrelated proteins, such as apolipoproteins, proteases, signaling molecules, and several other groups of proteins. Acting as cargo transporters, members of this receptor family are not only capable of transporting macromolecules, but also of signal transduction. According to previous studies, certain chicken receptors belonging to the LDLR family are able to bind apolipoprotein E, a protein of mammalian origin, which is not produced in the avian species, while other receptors like the chicken LDLR do not have binding affinity for apoE. In agreement with previous investigations, this observation indicates that certain variations in the ligand-binding domain of the receptor contribute to the recognition of a variety of heterogeneous ligands. In the present study I focused on the investigation of structural differences between apoE-binding competent and apoE-binding incompetent receptors that are pivotal for ligand-binding. To address these issues I generated receptor fragments of the chicken LDLR consisting of the ligand-binding region. Based on previous findings derived from extensive studies of the human LDLR, mutations in putatively important receptor domains that were characterized as critical for apoE binding were introduced. Following bacterial expression, the receptor mutants were purified using affinity chromatography. Since the functionality of the LDLR depends on the correct folding including disulfide bond formation, the main challenge was to re-fold the recombinant receptor fragments into a binding-active conformation. This was achieved by the assistance of the receptor-associated protein (RAP), a molecular chaperone especially acting on LDLR family members. The refolding procedure was performed in the presence of RAP in an environment that allows disulfide bond formation and Ca2+ incorporation. Finally, the mutated receptors were characterized with regards to the ligand-binding properties towards apolipoprotein B and -E containing lipid particles. The data obtained from solid phase binding assays revealed that the first LA repeat is not required to bind apoB- containing lipoproteins. However, mutations in the linker region separating repeat 4 and 5 as well as mutations in LA repeat 5 dramatically impaired the binding of apoB-containing lipoproteins. Initial investigations examining the binding activity of the mutant receptors towards apoE-containing particles did not lead to reproducible results and thus require further investigations. These data obtained in an oviparous species contribute to the understanding of LDLR-ligand interactions and are in agreement with previous investigations, in which the importance of LA5 for ligand recognition of the human LDLR was established.