DISSECTING ERAP2 ROLE IN HIV-1 INFECTION
Creators: name: LORI, ELISA MARIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2019

description: Introduzione: La risposta immunitaria contro HIV � composita e complessa: entrano in gioco molti fattori appartenenti sia al virus che all?ospite e le variabili interindividuali non sono trascurabili e agiscono su vari livelli. Molti studi sono stati condotti per valutare l?influenza che questi diversi fattori possono esercitare sull?infezione da HIV-1 e sulla progressione della malattia e particolare interesse � stato rivolto all?identificazione di fattori genetici in grado di modulare la suscettibilit� all?infezione da HIV. Questo orientamento ha portato alla elaborazione del concetto di ?vantaggio immunologico? che sembra contraddistinguere la naturale resistenza ad HIV riscontrata in individui HIV-esposti sieronegativi (HESN). In particolare, in questi soggetti tale resistenza � stata correlata a diversi polimorfismi genetici (SNPs) in geni che esercitano un ruolo nell?organizzazione e funzionamento del sistema immunitario (es. ERAP2, APOBEC3H, MX2 e TLR3). Tuttavia, l?eventuale coinvolgimento di questi SNP in pazienti sieropositivi sottoposti ad una terapia antiretrovirale combinata (cART) non � mai stato investigato. Tra i geni ?protettivi? menzionati sopra, Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 2 (ERAP2) � un enzima coinvolto nel processo di presentazione antigenica, infatti, taglia le estremit� amino terminali di precursori peptidici adattandoli alla corretta lunghezza per il legame con la tasca delle molecole HLA di classe I. Splicing alternativi aplotipo-specifici sul gene di ERAP2 originano sia un trascritto alternativo (Hap B) sia un trascritto definito full-lenght (Hap A). E? Interessante osservare che la frequenza di quest?ultimo risulta maggiore in individui HESN e, inoltre, la presenza dell?aplotipo A � stata correlata alla naturale resistenza all? infezione da HIV in vitro. Infine, recentemente, � stata discussa la possibilit� dell?esistenza di una localizzazione di ERAP2 alternativa da quella consueta a livello del reticolo endoplasmatico. Alla luce di queste osservazioni il progetto di ricerca si propone di: 1) approfondire la correlazione tra aplotipi di ERAP2 e la suscettibilit� in vitro al virus dell?HIV-1; 2) investigare il ruolo di varianti genetiche associate ad ERAP2 in rapporto alla progressione dell?infezione virale in pazienti sieropositivi riceventi terapia cART; ed 3) esaminare il meccanismo molecolare attraverso il quale Hap A e Hap B mediano la produzione di peptidi destinati alla presentazione antigenica e, di conseguenza, la risultante risposta immunitaria mediata da linfociti T CD8+. Metodi: Per investigare il ruolo svolto da SNP definiti ?protettivi? in risposta alla cART sono stati arruolati 300 pazienti provenienti dalla corte italiana ICONA, riceventi per la prima volta la terapia HAART, sui quali sono state condotte analisi per genotipizzare le varianti resistenti sui geni codificanti ERAP2, TLR3, APOBEC3H e MX2. Periodicamente (basale, 6 mesi ed 1 anno dall?inizio della terapia cART) sono stati raccolti i parametri clinici dei pazienti (genere, conta cellulare CD4/CD8, carica virale (VL), terapia, anno di infezione, evoluzione clinica) e, successivamente, analizzati per identificare una possibile correlazione con le varianti genetiche citate in precedenza. In parallelo, per approfondire il ruolo rivestito da ERAP2 nella suscettibilit� in vitro a HIV-1, PBMCs, isolate da 30 donatori sani (HC) suddivisi in funzione del loro genotipo per ERAP2, sono state infettate in vitro con HIV-1Ba-L in presenza/assenza di ERAP2 ricombinante (rh) (100ng/mL) o in presenza/assenza di DG013A (100 nM/mL), un inibitore di ERAP2. In seguito le culture cellulari sono state analizzate per valutare: 1) la suscettibilit� all? infezione da HIV-1 (saggio ELISA); 2) l?espressione dei livelli dei trascritti (mRNA) di geni coinvolti nei meccanismi di presentazione antigenica; 3) l?espressione di molecole MHC di classe I e la valutazione della risposta citotossica attraverso misurazione dei livelli di perforina/granzimi su cellule CD8+. Inoltre, l?abilit� di taglio e la modulazione della risposta cellulare CD8-mediata di Hap A e Hap B � stata valutata attraverso saggi di trasfezione con costrutti modello su cellule ERAP2 deficienti, esprimenti precursori peptidici e valutati attraverso saggio CPRG e risposta B3Z. Risultati: I risultati ottenuti da pazienti HIV-1 infetti sottoposti a terapia cART non hanno mostrato nessuna correlazione significativa tra i genotipi di TLR3, APOBEC3G and MX2 (singoli o combinati) e la progressione dell?infezione da HIV-1. L?unica eccezione � rappresentata dal gene ERAP2, dove pazienti HIV-1 infetti di origine caucasica con condizione di omozigosi GG per rs2549782 SNP (Hap A) hanno mostrato una significativa riduzione (p=0.042) in carica virale e ripristino dei valori cellulari di linfociti CD4+, comparati ai pazienti eterozigoti o TT omozigoti (Hap B). I dati ottenuti da Hap A HC hanno mostrato una minor suscettibilit� ad un?infezione in vitro rispetto a Hap B. L?inibizione dell?attivit� di ERAP2, ad opera del peptide DG013A, ha portato ad un aumento dell?infezione da HIV-1 in tutte le PBMCs, indipendentemente dal relativo aplotipo. Il ruolo mediato da ERAP2 nel processamento antigenico correlato alla suscettibilit� verso HIV-1 � stato confermato da un aumento dell?espressione di trascritti (mRNA) di altre aminopeptidasi e trasportatori specifici, come ad esempio ERAP1 e TAP1 (P&lt;0.05; P&lt;0.01;P&lt;0.005), in condizioni nelle quali ERAP2 era inibito. In linea con questi dati, esperimenti di trasfezione hanno mostrato che i modelli per ERAP2 Hap A presentano un?attivit� di processamento peptidico pi� efficiente, mentre costrutti modello per ERAP2 Hap B hanno mostrato una ridotta attivit� di taglio risultante in una diminuzione della risposta cellulare CD8-mediata (P&lt;0.05, P&lt;0.005, P&lt;0.001). L?aggiunta in vitro di rhERAP2 in cellule infettate con HIV ha portato ad una riduzione della replicazione virale in entrambi gli aplotipi di ERAP2 (p&lt;0.01), senza influenzare per� la vitalit� cellulare. Questo effetto protettivo � stato raggiunto indipendente dall?aumento dell?espressione di molecole HLA-ABC e/o innalzamento dei livelli di perforina e granzimi sui linfociti CD8+. Conclusioni: L?aplotipo A di ERAP2 � associato sia ad una riduzione della suscettibilit� a HIV-1 in vitro sia ad una progressione pi� lenta della malattia in pazienti HIV-1 infetti sottoposti a trattamento cART. L?effetto pu� essere giustificato da un miglior controllo del meccanismo di presentazione antigenica in soggetti Hap A, definita in termini di attivit� di processamento peptidico e conseguente modulazione della risposta immune T CD8 mediata. Il ruolo extracellulare di ERAP2 � ancora in discussione e richiede ulteriori indagini. Nonostante ci�, i dati ottenuti suggeriscono un ruolo protettivo mediato da ERAP2 nell?infezione da HIV-1, probabilmente esercitato attraverso meccanismi non convenzionali, indipendenti dalla modulazione del sistema immunitario.