Ταυτοποίηση συγγενικών ειδών ιχθύων με μοριακές τεχνικές:
Creators: name: Γεωργιάδης, Ανδρέας Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού
Ταυτοποίηση ειδών
Μέθοδος επέκτασης επικτητών
Single nucleotide polymorphisms(SNPs)
Species identification
Primer extension method

description: Η εύρεση αξιόπιστων μεθόδων διάκρισης – ταυτοποίησης συγγενικών ειδών ιχθύων είναι απαραίτητη για τη διεξαγωγή ελέγχων που στοχεύουν στην αποτροπή της εμπορικής νοθείας, για την εποπτεία των κανόνων εκμετάλλευσης των φυσικών αποθεμάτων, για την αύξηση της ακρίβειας των ιχθυοπλαγκτονικών ερευνών και τη διασφάλιση της υγείας των καταναλωτών. Η σημασία των μεθόδων διάκρισης – ταυτοποίησης ειδών γίνεται έκδηλη σε περιπτώσεις που εξετάζονται νεαρά άτομα που ανήκουν σε είδη του ίδιου γένους, ή σε ελέγχους επεξεργασμένων προϊόντων όπως φιλέτων ή κονσερβών, όπου η διάκριση που βασίζεται στα μορφολογικά χαρακτηριστικά είναι δύσκολη έως αδύνατη. Έτσι, με σκοπό την αντιμετώπιση αυτών των προβλημάτων, τις τελευταίες δύο δεκαετίες πολλές μοριακές μέθοδοι προσαρμόστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τη διάκριση – ταυτοποίηση ειδών. Στην εργασία αυτή αναπτύχθηκε μια τεχνική διάκρισης – ταυτοποίησης ειδών που περιλαμβάνει τη χρήση ‘ειδο-ειδικών’ εκκινητών. Ο σχεδιασμός των εκκινητών αυτών, κατά τον οποίο αξιοποιήθηκαν μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί του μιτοχονδριακού γονιδιώματος, τους επιτρέπει να εμφανίζονται λειτουργικοί μόνο στο είδος για το οποίο σχεδιάστηκαν. Η τεχνική αυτή εφαρμόστηκε σε δύο διαφορετικά πειράματα διάκρισης – ταυτοποίησης συγγενικών ειδών ιχθύων, από τα οποία το πρώτο αφορούσε τη διάκριση ανάμεσα σε τρία είδη του γένους Trachurus και το δεύτερο τη διάκριση ανάμεσα σε δύο είδη του γένους Mullus. Στο καθένα από τα δύο πειράματα, όλοι οι εκκινητές συνδυάστηκαν σε μια ‘multiplex PCR’. Αποτέλεσμα των δύο αυτών αντιδράσεων ήταν ο πολλαπλασιασμός μικρών ‘ειδο-ειδικών’ τμημάτων διαφορετικού μήκους, τα οποία μπορούσαν να διακριθούν μεταξύ τους με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Το γεγονός αυτό επιτρέπει την εύκολη και αξιόπιστη διάκριση των ειδών που περιλαμβάνονται σε κάθε εφαρμογή, σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα. Γενικά, κάθε μέθοδος που προτείνεται για τη διάκριση – ταυτοποίηση ειδών θα πρέπει να χαρακτηρίζεται από ταχύτητα και ευκολία εφαρμογής, να είναι αξιόπιστη και να έχει χαμηλό κόστος. Από τα αποτελέσματα και τα τελικά πρωτόκολλα της τεχνικής που παρουσιάζεται στην παρούσα εργασία, φαίνεται πως αυτή καλύπτει όλα τα παραπάνω κριτήρια, γεγονός που της επιτρέπει να εφαρμοστεί με επιτυχία σε ελέγχους μεγάλης κλίμακας, για την αποτροπή της εμπορικής νοθείας. Συμπερασματικά, πιστεύουμε πως η τεχνική αυτή θα αποτελέσει στο μέλλον ένα πολύτιμο εργαλείο για τη διάκριση – ταυτοποίηση συγγενικών ειδών ιχθύων.
description: Methods for reliable fish species identification are required for the detection and elimination of commercial fraud, the implementation of proper legislations regulating fisheries and production, the proper implementation of conservation strategies and ecological studies, and the assurance of the consumers’ health. Although the observation of morphological features provides a good means for adult species identification, in many cases it might be inadequate. Especially when dealing with congeneric juveniles, or when processed products are examined, such as fish fillets or canned products, in which the morphological characteristics are removed at the processing stage. As a consequence, in the last two decades many DNA-based methods have been adjusted and employed in species discrimination – identification assays. In this study we developed a species discrimination – identification technique which utilizes species-specific forward primers and a common reverse primer. Forward primers were designed to have high specificity to their respective species by utilizing mitochondrial single nucleotide polymorphisms (mtSNPs). The technique was applied in two different assays, one for the discrimination – identification of three species of the genus Trachurus and one for the discrimination – identification of two species of the genus Mullus. In the two assays, all primers were combined in a single reaction to develop two ‘multiplex PCR’ systems, which produced small-sized species-specific amplicons of different length. This enabled easy discrimination of the species, by simple agarose gel electrophoresis without the need of further laboratory analysis. Hence, this technique differentiated congeneric species unambiguously within a short time span. It has been stated that the analytical methods employed in species identification should be reliable, rapid and easy to perform, without being cost prohibitive. As the protocols presented here fulfill all these criteria, we recommend the use of ‘multiplex PCR’ with ‘species-specific primers’ for the molecular identification of congeneric species and the detection of mislabeling or fraudulent substitutions. Conclusively, this technique represents a valuable addition to the range of methods currently available for species identification.