IN VITRO FERROPORTIN EXPRESSION IN NON-TRANSFUSION DEPENDENT THALASSEMIA DURING ERYTHROID DIFFERENTIATION
Creators: name: SONZOGNI, LAURA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2015

description: INTRODUZIONE 
Le ?-talassemie sono una delle malattie genetiche pi� frequenti in tutto il mondo con 270 milioni di portatori e 350.000 nuovi nati affetti all?anno. 
Questa malattia � geneticamente caratterizzata dalla perdita di produzione della catena ? globinica dell'emoglobina adulta, dovuta a diverse mutazioni nel gene della ?-globina. Poich� il gene beta � espresso su entrambi i cromosomi 11, possiamo avere due differenti tipi (e con differente gravit�) di beta talassemia a seconda dell?assenza di entrambi o di un solo gene della beta globina: nel primo caso si ha la ? talassemia MAJOR o trasfusione dipendente, nel secondo caso si ha la ? talassemia MINOR o INTERMEDIA trasfusione indipendente. I nostri studi si concentrano su quest?ultima. 
L'assenza della catena ? globina comporta diverse conseguenze per l'organismo come: 
- Eritropoiesi inefficace 
- Il sovraccarico di ferro 
- Il danno ossidativo 
Finora sono stati condotti molti studi in diversi campi (genomico, proteomico e nel metabolismo ferro) per garantire una maggiore comprensione di questa malattia. Recentemente si � scoperta una nuova proteina che potrebbe essere un eventuale regolatore o responsabile del sovraccarico di ferro nella ? - talassemia; questa molecola � la ferroportina. 
La Ferroportina (FPN) � l'unico esportatore di ferro finora conosciuto. Essa � espressa in diversi tipi di cellule, tra cui gli enterociti duodenali, gli epatociti, i macrofagi e gli eritroblasti. 
Pochi anni fa, � stata segnalata l'esistenza di due trascritti alternativi della FPN con o senza le Iron Responsive Elements (IRE) sul loro promotore (FPN1A e FPN1B rispettivamente). L'espressione delle diverse isoforme della ferroportina nonch� i meccanismi che la regolano nelle cellule eritroidi della ? talassemia non-trasfusione dipendente (NTDT) non sono ancora noti. 

SCOPO 
Studiare il profilo di espressione delle due isoforme della ferroportina durante il differenziamento eritroide in colture controllo e di NTDT e chiarire i meccanismi che regolano la loro espressione. 

MATERIALI E METODI
Per questi studi � stato usato un modello di eritropoiesi in vitro derivato da cellule CD34+ provenienti da sangue periferico di volontari sani (controllo) e pazienti NTDT. Il profilo dell'espressione genica delle due isoforme (FPN1A e FPN1B) � stato valutato allo stadio basale (giorno 0) e al giorno 7 e 14 della cultura (stadio di pro eritroblasti e di eritrociti ortocromatici rispettivamente) mediante la tecnica di real-time PCR (2-dCt). La percentuale relativa di ogni isoforma � stata calcolata sulla base dell?espressione della ferroportina totale (FPN1A + FPN1B). La concentrazione di ferro intra and extracellulare � stata analizzata utilizzando un kit di Ferro Assay (Biovision). In esperimenti indipendenti, colture di controllo e NTDT sono state trattate con: ferro (Ferro Ammonio Citrato [FAC] 100?M), Desferal (DFO, 4?M), protoporfirina (SNPP IX 50-20?M), eme (Emina 20-10?M) o perossido di idrogeno (H2O2 0,1mM) per indagare su un possibile ruolo di questi composti nella regolazione della ferroportina. L?espressione della FPN � stata valutata al 14esimo giorno in condizioni standard e nei trattati mediante la tecnica di real-time PCR (2-ddCt; cellule non trattate utilizzate come calibratore). 

RISULTATI 
L'espressione ferroportina aumenta durante il differenziamento eritroide, raggiungendo il livello massimo di espressione allo stadio di eritroblasti (giorno 14 di coltura) sia nel controllo sia negli NTDT. La FPN1A � l'isoforma pi� espressa in entrambe le condizioni. La sua espressione � pi� elevata negli stadi iniziali e finali dell?eritropoiesi (giorno 0 e 14), mentre l'espressione della FPN1B � maggiore nella fase intermedia di differenziamento eritroide (giorno 7). Degno di nota, l'espressione della FPN1B, anche se inferiore rispetto alla 1A, � significativamente maggiore nelle culture NTDT rispetto ai controlli, in particolare al giorno 14. La concentrazione di ferro intracellulare � diminuita in modo significativo durante il differenziamento eritroide (dal giorno 7 al giorno 14), sia nei controlli sia negli NTDT, tuttavia, al giorno 7 (stadio di eritroblasti) i livelli di ferro nelle culture NTDT sono notevolmente inferiori rispetto ai controlli. L'aggiunta di FAC, DFO, SnPP IX ed Emina nei controlli e nelle colture di NTDT non ha modificato l'espressione della ferroportina rispetto ai non trattati. L?H2O2 aggiunto ai controlli aumenta l'espressione di entrambe le isoforme della ferroportina (FPN1A: cellule non trattate: 1; H2O2: 1.33 FPN1B: cellule non trattate: 1; H2O2: 2.04). I livelli di ferro intra ed extracellulari riflettono i risultati genetici: c'� stato un aumento di ferro extracellulare causa di un aumento di espressione FPN. 

CONCLUSIONI 
L'espressione della ferroportina aumenta durante il differenziamento eritroide sia nei controlli sia nelle culture NTDT, suggerendo il suo ruolo nell?esportare il ferro intracellulare in eccesso. In entrambe le condizioni, la FPN1A � l'isoforma pi� espressa. Tuttavia, l'espressione dell?isoforma 1B non responsiva al ferro, anche se minore rispetto a FPN1A, � significativamente maggiore nei NTDT rispetto ai CTRL. In colture di controllo, l?espressione della FPN, ed in particolare dell?isoforma 1B, sembra essere regolata dall?aggiunta di H2O2. Questi dati suggeriscono che lo stress ossidativo, particolarmente elevato nelle NTDT, potrebbe essere uno dei principali regolatori dell?espressione dell?isoforma 1B, generando cos� un?importante esportazione di ferro dalle cellule NTDT.