title: Impact of Low-Dose Radiotherapy on expression and secretion of inflammatory and anti-inflammatory cytokines of macrophages under different basal inflammatory conditions
title: Einfluss niedrig dosierter Röntgenstrahlung auf die Expression und Sekretion von inflammatorischen und anti-inflammatorischen Zytokinen von Makrophagen unter verschiedenen basalen Entzündungsbedingungen
Creators: name: Wolff, Teresa
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::61 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit
subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften::57 Biologie

description: Hintergrund und Ziele Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich hauptsächlich in einer chronischen Gelenkentzündung manifestiert. Aktivierte Immunzellen, wie Makrophagen und Fibroblasten-ähnliche Synoviozyten (fibroblast like synoviocytes, FLS), infiltrieren dabei die Gelenklinie und führen zu einer Entzündungsreaktion, die zunehmend Knochen und Knorpel zerstört. Wird die Krankheit nicht adäquat behandelt, führt dies zu einer Zerstörung des Gelenks. Es hat sich gezeigt, dass eine Behandlung mit einer niedrig dosier-ten Strahlentherapie (low dose-radiotherapy, LD-RT) zu einer Schmerzreduktion und sogar zu einer Erhöhung der Beweglichkeit führen kann. Eine Strahlendosis von 0,5 Gray (Gy) hat sich als besonders wirksam erwiesen, um die bestehende Entzündung zu vermindern und den Knochenstoffwechsel zu ver-bessern. LD-RT beeinflusst die in den entzündeten Gelenken vorhandenen Immunzellen, wie zum Beispiel Makrophagen. Diese Zellen des angeborenen Immunsystems differenzieren sich bei Kontakt mit Gewebe aus Vorläuferzellen, den Monozyten des Knochenmarks. Ihre Hauptfunktion ist die Phagozytose von Mikroorganismen und absterbenden Zellen. Sie spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Entstehung als auch bei der Auflösung von Entzündun-gen. Aufgrund von unterschiedlicher Stimulation können zwei Haupt-Makrophagen-Phänotypen definiert werden: M1-Makrophagen werden durch Lipopolysaccharide (LPS) und pro-inflammatorische Zytokine stimuliert. Sie produzieren das Enzym induzierbare NO-Synthase (iNOS) sowie pro-inflammatorische Zytokine, wie Interleukin-6 (IL-6) und den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α); diese Zytokine sind auch an der Pathogenese von RA beteiligt. M2-Makrophagen werden durch anti-inflammatorische Zytokine induziert; dieser Phänotyp wird durch die Freisetzung von anti-inflammatorischen Zytokinen gekennzeichnet. Es konnte bereits gezeigt werden, dass LD-RT eine Zunahme von Arginase-1 (Arg1), IL-10 und TGF-β (transforming growth factor-β) in Makrophagen induziert, was ein Hinweis darauf ist, dass ionisierende Strahlung, die bei LD-RT eingesetzt wird, eine Entzündung durch Beeinflussung des Makrophagen-Phänotyps lindert. Bislang ist jedoch nicht bekannt, wie der basale Entzündungsstatus die Modulation des Makrophagen-Phänotyps durch LD-RT beeinflusst. Methoden In dieser Arbeit wurde insbesondere die Freisetzung pro-inflammatorischer und anti-inflammatorischer Zytokine durch entzündliche und nicht-entzündliche Makrophagen in Abhängigkeit vom Geschlecht untersucht. Es wurde ein Vergleich des Einflusses von LD-RT auf Makrophagen von humanen Tumornekrosefaktor-α-transgenen (hTNF-α tg) Mäusen mit gesunden C57BI/6-Wurfgeschwistern angestellt. Zusätzlich wurde eine Gegenüberstellung von Makrophagen aus männlichen und weiblichen Mäusen vorgenommen. Die gewonnenen Serumproben wurden mittels enzymatischem Immunadsorptionsverfahren (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) analysiert. Veränderungen auf RNA-Ebene der Zytokine wurden mithilfe von quantitativer Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion (quantitative real-time poly-merase chain reaction, qRT-PCR) untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen Bei Untersuchungen im Grundstatus, ohne Bestrahlung, war kein signifikanter Unterschied der Zytokinsekretion inflammatorischer und anti-inflammatorischer Zytokine bei Makrophagen aus erkrankten und gesunden Tieren zu erkennen. Die Zytokinsekretion unterschied sich vor allem zwischen den verschiedenen Makrophagen-Phänotypen. Die Konzentration von anti-inflammatorischen Zy-tokinen war bei Makrophagen der männlichen Tiere bei allen Phänotypen durchschnittlich etwas höher als bei Makrophagen der weiblichen Tiere. Auch zeigten M1-Makrophagen eine höhere Zytokinkonsekretion als M0- und M2-Makrophagen. Besonders deutlich zeigte sich dies bei den inflammatorischen Zytokinen IL-6, mTNF-α und hTNF-α. Bei den anti-inflammatorischen Zytokinen zeigte sich ebenfalls eine leicht gesteigerte Zytokinsekretion des M1-Phänotyps gegenüber den M0-und M2-Phänotypen. Zudem ließen sich anti-inflammatorische Effekte von M1-Makrophagen nachweisen, was die Plastizität der verschiedenen Phänotypen unterstrich. Schlussfolgerungen und Diskussion Um den Einfluss unterschiedlicher Bestrahlungsdosen auf die Zytokinsekretion von Makrophagen zu untersuchen, wurden Strahlendosen von 0,1 Gy, 0,5 Gy, 1 Gy und 2 Gy angewandt. Von Interesse war, ob sich bei einer bestimmten Strahlendosis ein besonders entzündungsfördernder oder -hemmender Effekt erkennen lässt. Der Einfluss von LD-RT auf die Sekretion von inflammatorischen Zytokinen ließ sich im Rahmen der hier durchgeführten Versuche nicht belegen. Die Bestrahlung zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Zytokinsekretion von Makrophagen. Unabhängig von der Strahlendosis war bei M1-Phänotypen eine deutlich höhere Konzentration inflammatori-scher und anti-inflammatorischer Zytokine gegenüber den M0-und M2-Phänotypen vorhanden. Alleinig resultierte bei M1-Makrophagen eine Bestrahlung mit 0,5 oder 1,0 Gy in reduzierter Sekretion von mTNF-α bei weiblichen Tieren. MMP 9 war hingegen nach 0,5 Gy bei M1-Makrophagen aus männlichen Tieren erhöht. IL-10 wurde verstärkt von M1-Makrophagen aus männlichen Mäusen nach LD-RT sezerniert. Um zusätzliche Hinweise auf ei-ner Veränderung der Makrophagen auf genomischer Ebene durch niedrig dosierte Bestrahlung zu erhalten, wurden zusätzlich qRT-PCR Versuche durchgeführt. Es sollte ermittelt werden, ob bereits auf genomischer Ebene Veränderungen durch eine Bestrahlung erkennbar sind und ob sich bei einer bestimmten Strahlendosis einen Effekt auf inflammatorische, beziehungweise anti-inflammatorische Gene erkennen lässt. Trotz mehrerer Ansätze ließ sich aus den vorhandenen Zellen nur eine sehr kleine Menge an RNA isolieren und es konnten nur lückenhafte Ergebnisse erzielt werden, welche in dieser Arbeit exemplarisch dargestellt werden. Von Makrophagen männlicher hTNF-α tg Mäuse ließ sich die größte Menge an RNA isolieren. Von Makrophagen männlicher C57BI/6 Mäuse sowie von weiblichen Tieren ließ sich dagegen keine ausreichende Menge für eine statistische Auswertung generieren. An dieser Stelle kann in folgenden Forschungsarbeiten angesetzt werden, um durch eine höhere Anzahl an Proben interpretierbare Ergebnisse auf genomischer Ebene zu erhalten.
description: Background and objectives Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease that mainly manifests in a chronic inflammation of the joints. Activated immune cells, such as macro-phages and fibroblast-like synoviocytes (FLS) hereby infiltrate the joint line and lead to an inflammatory reaction that increasingly destroys bone and cartilage. If the disease is not adequately treated, this leads to destruction of the joint. It has been shown that treatment with low dose-radiotherapy (LD-RT) can lead to a reduction in pain and even an increase in mobility. A radiation dose of 0.5 Gray (Gy) was shown to be particularly effective in reducing existing inflammation and improving bone metabolism. LD-RT also influences the immune cells present in the inflamed joints, such as macrophages. These cells of the innate immune system differentiate from precursor cells, the monocytes of the bone marrow, upon contact with tissue. Their main function is phagocytosis of microorganisms and dying cells. They play an important role in both, the development and resolution of inflammation. Due to different stimulation, two main macrophage phenotypes can be defined: M1-macrophages are stimulated by lipopolysaccharides (LPS) and pro-inflammatory cytokines. They produce the enzyme inducible nitric oxide synthase (iNOS) as well as pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-6 (IL-6) and tumor-necrosis-factor-α (TNF-α); these cytokines are also involved in the pathogenesis of RA. M2-macrophages are induced by anti-inflammatory cytokines; this phenotype is characterised by the release of anti-inflammatory cytokines. It has previously been shown that LD-RT induces an increase of Arginase 1 (Arg1), IL-10 and TGF-β (transforming growth factor-β) in macrophages, which provides an indication that ionising radiation used in LD-RT ameliorates inflammation by affecting the macrophage phenotype. However, it is not known by now how the basal inflammation status affects the modulation of the macrophage pheno-type by LD-RT. Methods In particular, this work investigated the release of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines by inflammatory and non-inflammatory macrophages in a sex-dependent manner. A comparison of the effect of LD-RT on macrophages from human tumor necrosis factor-α transgenic (hTNF-α tg) mice with healthy C57BI/6 littermates was performed. In addition, a comparison of mac-rophages from male and female mice was carried out. Serum samples ob-tained were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Changes at the RNA level of cytokines were analyzed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Results and observations In baseline studies, without irradiation, there was no significant difference in cytokine secretion of inflammatory and anti-inflammatory cytokines in macro-phages from diseased and healthy animals. Cytokine secretion differed mainly between the different macrophage phenotypes. The concentration of anti-inflammatory cytokines was, on average, quite a bit higher in macrophages from male animals than in macrophages from female animals for all phenotypes. In addition, M1-macrophages showed a higher cytokine secretion than M0- and M2-macrophages. This was particularly evident for the inflammatory cytokines IL 6, mTNF-α, and hTNF-α. The anti-inflammatory cytokines also showed a slightly increased cytokine secretion of the M1-phenotype compared with the M0- and M2-phenotypes. In addition, anti-inflammatory effects of M1-macrophages could be detected, which underlined the plasticity of the different phenotypes. Conclusions and discussion To investigate the influence of different irradiation doses on cytokine secretion by macrophages, radiation doses of 0.1 Gy, 0.5 Gy, 1 Gy, and 2 Gy were applied. Of interest was whether a particular pro-inflammatory or anti-inflammatory effect could be detected at a given radiation dose. The influence of LD-RT on the secretion of inflammatory cytokines could not be proven in the experiments performed here. Irradiation showed no clear effect on cytokine secretion from macrophages. Irrespective of the radiation dose, a significantly higher concentration of inflammatory and anti-inflammatory cytokines was present in M1-phenotypes compared to M0- and M2-phenotypes. In M1-macrophages alone, irradiation with 0.5 or 1.0 Gy resulted in reduced secretion of mTNF-α in female animals. In contrast, MMP 9 was increased after 0.5 Gy in M1-macrophages from male animals. IL-10 was increasingly secreted by M1-macrophages from male mice after LD-RT. In order to obtain additional evidence of macrophage alteration at the genomic level by low dose irradiation, further qRT-PCR experiments were performed. The aim was to determine whether changes due to irradiation are already detectable at the genomic level and whether an effect on inflammatory or anti-inflammatory genes can be detected at a certain radiation dose. Despite several approaches, only a very small amount of RNA could be isolated from the available cells and only incomplete results could be obtained, which are exemplified in this work. The largest amount of RNA could be isolated from macrophages of male hTNF-α tg mice. From macrophages of male C57BI/6 mice as well as from female animals, however, no sufficient amount could be generated for a statistical evaluation. This is where subsequent research can start to obtain interpretable results at the genomic level by increasing the number of samples.