Διερεύνηση στρατηγικών προαγωγής της εμφύτευσης των γενετικά-τροποποιημένων αιμοποιητικών κυττάρων με λεντι-ιικό φορέα αναφοράς.:
Creators: name: Χρυσικοπούλου, Ελένη-Λευκοθέα Θεόδωρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Λεντι-ιικός φορέας
Αιμοποιητικά Στελεχιαία κύτταρα
Εμφύτευση
Lentiviral
Hematopoietic stem cells
Engraftment

description: Τα τελευταία χρόνια, τα αποτελέσματα από κλινικές μελέτες γονιδιακής θεραπείας είναι ενθαρρυντικά, με τη γονιδιακή θεραπεία να θεωρείταιως μια πιθανή θεραπευτική επιλογή σε ανίατες και θανατηφόρες γενετικές ασθένειες, παρ’όλα αυτά υπάρχουν ακόμη εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν για επίτευξη επιτυχούς γονιδιακής θεραπείας. Σημαντικά προβλήματα προς επίλυση αποτελούν η ένταση του προπαρασκευαστικού σχήματος που αποσκοπεί στη δημιουργία ‘χώρου’ στο μυελό των οστών που θα επιτρέψει στα γενετικά διορθωμένα κύτταρα να εμφυτευθούν και η ενίσχυση της σχετικά χαμηλής εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων μετά από μεταμόσχευση. Πρωταρχικό στόχο της παρούσας εργασίας, αποτέλεσε το βάθος της μυελοκαταστολής που επιτυγχάνει υψηλά ποσοστά εμφύτευσης με αποδεκτή τοξικότητα. Προκλινική μελέτη διεξήχθει με χορήγηση δύο χημειοθεραπευτικών φαρμάκων του Busulfan και Melphalan, με δύο μη πλήρως μυελοκατασταλτικές δόσεις και μία πλήρως μυελοκατασταλτική δόση από το καθένα. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως το Busulfan στη δόση των 100 mg/kg υπερέχει τόσο στην επιβίωση όσο και στην εμφύτευση από όλες τις άλλες συγκρινόμενες δόσεις μόνο όταν χορηγήθηκε σε μικρές δόσεις κάτω από 50 mg/kg, ενώ δεν παρουσίασε πλεονέκτημα επιβίωσης των δεκτών όταν χορηγήθηκε σε μεγαλύτερες δόσεις. Απαραίτητη προϋπόθεση της γενετικής τροποποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με λεντι-ιικούς φορείς είναι η ex vivo ενεργοποίησή τους σε καλλιέργεια παρουσία διαφόρων κυτοκινών. Η ενεργοποίηση αυτή επιφέρει αλλοιώσεις σε διάφορα μόρια προσκολλήσεως (CAMs), θέτει τα κύτταρα σε κυτταρικό κύκλο και αυξάνει την τάση των κυττάρων για απόπτωση, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης και κατ’επέκτασην εμφύτευσης στο δέκτη, έπειτα από μεταμόσχευση. Απώτερο στόχο της μελέτης, αποτέλεσε η διερεύνηση στρατηγικών που αποσκοπούν στη βελτίωση της έκβασης της γονιδιακής θεραπείας όπως η βελτίωση της γονιδιακής μεταφοράς στα HSCs και η προαγωγή της εμφύτευσης των γενετικά διορθωμένων κυττάρων στον μυελό των οστών. Διερευνήθηκαν τρεις διαφορετικοί παράγοντες Bortezomib, AMD 3100 και η Προσταγλανδίνη dmPGE2, ως προς την ικανότητά τους να προάγουν την εμφύτευση των γενετικά τροποιημένων αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων. Στα πειράματά μας επιβεβαιώσαμε τη σημαντική αύξηση της γονιδιακής μεταφοράς με την προσθήκη Bortezomib κατά τη διαμόλυνση των HSCs, ωστόσο παρατηρήθηκε ισχυρή και άμεση τοξικότητα του Bortezomib στα HSC, ακομη και όταν χρησιμοποιήθηκε σε χαμηλή συγκέντρωση και η έκθεση των κυττάρων ήταν μικρής διάρκειας. Αν και θεωρητικά, ένα μη πλήρως μυελοκατασταλτικό προπαρασκευαστικό σχήμα, θα έδινε τη δυνατότητα στο AMD3100 να δημιουργήσει περισσότερο «χώρο» για τα εγχυόμενα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα και να ενισχύσει την εμφύτευση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, δεν διαπιστώσαμε διαφορές στην εμφύτευση μεταξύ των ομάδων. Γεγονός που έρχεται σε αντίθεση με τις υπάρχουσες αναφορές σε μη γενετικά επεξεργασμένα κύτταρα που υποστηρίζουν επιλεκτική ενίσχυση της εμφύτευσης των χορηγούμενων κυττάρων του δότη. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα in vitro και από τα in vivo πειράματα με προσταγλανδίνη κατέδειξαν αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης προς τον SDF-1 και σημαντική αύξηση της εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων και καλλιεργημένων κυττάρων του μυελού έναντι των γενετικά τροποποιημένων με συμβατικό τρόπο κυττάρων. Επιπλέον, έκθεση σε dmPGE2 φάνηκε να επιφέρει σημαντική αύξηση της γονιδιακής μεταφοράς. Περαιτέρω έρευνες που θα περιλαμβάνουν και δευτερογενείς μεταμοσχεύσεις, θα χρειαστούν για να επιβεβαιώσουν τα παραπάνω συμπεράσματα.
description: In recent years, the results of clinical trials of gene therapy are encouraging, with latest to be considered as a possible treatment option in incurable and fatal genetic disease, nevertheless there are still obstacles to be overcome to achieve successful gene therapy. Major problems that demands solution are the intensity of the conditioning designed to create 'space' in the bone marrow that would allow genetically corrected cells to engraft and enhance the relatively low implantation of genetically modified cells after transplantation.The primary objective of this study was the depth of myeloabletion achieves high implantation rates with acceptable toxicity. Preclinical study was performed by administering two antineoplastic drugs, Busulfan and Melphalan, with two non-fully myelosuppressive doses and a fully myelosuppressive dose of each. Results showed that the dose of Busulfan in 100 mg / kg excels both in survival and engraftment of all other doses compared only when administered in doses below 50 mg / kg. Necessary requirement for genetical modification of hematopoietic stem cells with lentiviral viral vectors is the ex vivo activation in culture in the presence of various cytokines. This activation results in alterations of various adhesion molecules (CAMs), sets the cells in cell cycle and increases the tendency of cells for apoptosis, leading to reduced capacity of homing and implantation in the recipient, after transplantation. Additional aim of the study was to explore strategies to improve the outcome of gene therapy such as improved gene transfer to hematopoietic stem cells (HSCs) and promotion of implantation of genetically corrected cells in the bone marrow. We explored three different factors Bortezomib, AMD 3100 and Prostaglandin dmPGE2, as to their ability to promote the engraftment of the of genetically modified hematopoietic stem cells. In our experiments we confirmed the significant increase in gene transfer with the addition of Bortezomib during the transfection of HSCs, however, we observed a strong and instant toxicity of Bortezomib to HSCs, even when used in low concentration and short duration of exposure. Although theoretically, a nonmyeloablative conditioning would enable AMD3100 to create more "space" for genetically modified cells injected and enhance engraftment compared with the control group, we found differences in implantation between groups. Which contrasts with the existing references to non-genetically engineered cell supporting selective enhancing of engraftment of the administered donor cells. The results of the in vitro and the in vivo experiments with prostaglandin demonstrated enhanced ability of migration to SDF-1 and a significant increase in the engraftment of genetically modified cultured bone marrow cells against genetically modified cells in a conventional manner. Furthermore, exposure to dmPGE2 seemed to lead to a significant increase of gene transfer. Further research that will include secondary transplants will be needed to confirm these findings.