title: Ion-Channel Engineering: The monomeric porin OmpG as model
title: Ion-Channel Engineering: Das monomere Porin OmpG als Modell
Creators: name: Große, Wolfgang
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Protein crystallography
Proteine
OmpG
Chemie
Kristallographie
Membrane protein
Protein Kristallographie
Ion channel
Ion-Channel Engineering
Ionenkanal
Membranprotein
Modifizierung

description: Membranproteine wie passive Kanäle
      und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren regulieren den
      essentiellen Fluss von Informationen und Substanzen über
      durch Zellmembranen gebildete Permeabilitäts-Barrieren.
      Aufgrund dieser zentralen Rolle stehen Membranproteine als
      Angriffspunkt für Wirkstoffe im Fokus des Interesses der
      pharmazeutischen Industrie. Die Technik des Ion-Channel
      Engineering (ICE) modifiziert natürliche Kanäle durch
      chemische und biologische Werkzeuge, um Einblick in die
      Funktionsweise von Kanälen und Poren zu erhalten. Die
      erhaltenen Informationen bilden des Weiteren eine Basis für
      die Verwendung von Ionenkanälen als Bausteine für die
      Gestaltung komplexer biologischer Systeme, wie sie durch die
      Synthetische Biologie erforscht werden. In der vorliegenden
      Arbeit wurden die einzigartigen strukturellen Eigenschaften
      des monomeren Porins OmpG für die Nutzung als Modellsystem im
      Feld des ICE untersucht. Das integrale Membranprotein aus der
      äußeren Membran des Gram-negativen Bakteriums Escherichia
      coli bildet ein beta-barrel aus 14 beta-Strängen mit einem
      großen Innendurchmesser von 12 · 15 Å, das als Monomer in
      Membranen aktiv ist. Das Membranprotein wurde sowohl aus der
      Membran extrahiert als auch aus Inclusion Bodies mittels
      rapid dilution rückgefaltet eingesetzt. Zur
      Funktionalisierung von OmpG wurden zwei Ansätze gewählt, die
      Funktionalisierung von Cysteinen im zentralen Ionenleitweg
      des Porins mittels S-Alkylierung und die Funktionalisierung
      der Pore mittels synthetisierter N-Peptide über Native
      Chemische Ligation (NCL). Ein zweiter Schritt zur weiteren
      Modifikation erfolgte durch Cu(I)-katalysierte Click-Chemie.
      Erzeugte Biohybrid-Poren wurden mit einer Kombination aus
      SDS-PAGE, Fluoreszenz-Spektroskopie, Massenspektrometrie,
      Black Lipid Membrane-Messungen (BLM-Messungen) und
      Proteinkristallisation ausführlich charakterisiert. Beide
      Modifikationsrouten führten zu funktionellen Biohybriden und
      die erste Röntgenstruktur eines kovalent funktionalisierten
      OmpG-Membranproteins wurde erhalten. Die Daten zeigten, dass
      eine Optimierung der Eigenschaften der Pore für BLM-Messungen
      und der Aufhängung von Funktionalisierungen im Inneren der
      Pore notwendig waren. Zur Stabilisierung des Offen-Zustands
      der Pore wurden zwei verschiedene Deletionen des flexiblen
      loop6 vorgenommen und charakterisiert. Beide Varianten des
      Membranproteins waren faltungs-kompetent und zeigten
      verbesserte Eigenschaften in den BLM-Messungen. Für die
      Variante des Porins mit der maximalen Verkürzung des loops
      konnte eine Röntgenstruktur in einer neuen, triklinen
      Kristallform erhalten werden. Eine Analyse der
      Kristallpackungen der OmpG-Strukturen ergab zwei hydrophobe
      Interfaces, von denen mindestens eines in allen verfügbaren
      Kristallpackungen des Membranproteins OmpG zu beobachten ist.
      Die Optimierung der Funktionalisierungsaufhängung wurde durch
      das Einführen einer molekularen Strebe quer durch den
      Ionenleitweg des Membranproteins durchgeführt. Hierfür wurden
      zwei Strategien getestet, das direkte Einführen einer Strebe
      mittels bifunktioneller Verbindungen an Cysteinen und die
      Verstrebung von zwei unabhängigen Modifikationen initiiert
      durch Komplexierung eines Metallions. Für den Erfolg
      letzterer Strategie liegen Indizien durch den Nachweis
      gebundenen Kupfers mittels ICP-Massenspektrometrie und
      BLM-Messungen vor. OmpG bietet aufgrund seiner einzigartigen
      Struktur ein vielversprechendes Templat für das ICE. Das
      Membranprotein konnte in dieser Arbeit durch Deletion von
      loop6 für die Anwendung optimiert und verschiedene Strategien
      zur Erzeugung funktionalisierter Poren konnten erfolgreich
      etabliert werden.
description: Membrane proteins like passive
      channels and pores, active transporters and receptors mediate
      the essential flow of information and matter across the
      permeability barrier generated by cell membranes. Due to
      their central role in the cell’s survival, membrane proteins
      form important targets for drug development by the
      pharmaceutical industry. Ion-Channel Engineering (ICE)
      utilizes chemical and biological methodologies to modify
      naturally occurring channels and pores to access and
      elucidate their function. Information derived from these
      membrane proteins can be applied to the design of complex
      systems as performed in bottom-up approaches of synthetic
      biology. This work exploits the potential of the monomeric
      porin OmpG to serve as a model for ICE as OmpG provides
      unique structural features amongst this class of proteins.
      This integral membrane protein from the outer membrane of the
      Gram-negative bacterium Escherichia coli shows a beta-barrel
      fold formed by 14 beta-strands and shows a large inner lumen
      of 12 · 15 Å diameter. The porin functions as a monomer and
      can be either extracted from membrane fractions or refolded
      from inclusion bodies using the rapid dilution technique. Two
      approaches were chosen to functionalize the OmpG porin:
      Functionalization of cysteines in the inner conductive
      pathway by S-alkylation or by the introduction of chemical
      alterations by N-peptides using the native chemical ligation
      (NCL) technique. As second step, copper (I)-catalyzed click
      chemistry was performed for diversification. Obtained hybrids
      were characterized by a combined approach using SDS-PAGE,
      fluorescence spectroscopy, mass spectrometry, black lipid
      membrane measurements (BLM measurements) and protein
      crystallography. All approaches yielded functionalized
      protein hybrids. Additionally, the first X-ray structure of a
      synthetically modified OmpG pore could be presented. The data
      including BLM-measurements mostly raised two challenges:
      reduction of flickering and attachment of the compounds to
      the pore for mobility reduction. To enforce a stable open
      state of the pore two deletion variants of the OmpG pore were
      prepared lacking the flexible loop6. Both variants could be
      refolded and formed functional channels with improved gating
      characteristics as indicated by BLM recordings. X-ray
      crystallographic data could be obtained for the variant
      bearing the larger deletion. The structural data revealed a
      novel, triclinic crystal form for the OmpG pore. Analysis of
      all observed crystal packings identified two hydrophobic
      interfaces, of which at least one is part of every structural
      assembly. Two strategies for the advanced attachment of a
      molecular bar through the middle of the OmpG conductive
      pathway were examined. One strategy focused on the direct
      introduction of the bar using the modification of cysteines
      by bifunctional labeling agents. The other strategy
      established the bar by later complexation of a metal ion
      using two independent, cystein-attached bipyridine ligands.
      The latter method appeared to have succeeded in establishing
      a molecular bar due to incorporated copper found by ICP-mass
      spectrometry and planar lipid bilayer recordings. In general,
      OmpG serves as an ideal template for ICE due to its unique
      structural features. This membrane protein could be optimized
      for sensing applications and functionalized through
      application of diverse methods.