title: Spannungsempfindliche Phosphatasen: Verstehen ihrer Funktion und Ausweiten ihrer potenziellen Nutzung
title: Voltage sensitive phosphatases: understanding their function and expanding their potential use
Creators: name: Mavrantoni, Angeliki
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: PTEN, phosphoinositides
VSP
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Voltage sensitive phosphatases
      (VSPs) are proteins consisting of two distinct domains: a
      transmembrane voltage sensor domain (VSD) and a cytosolic
      phosphatase domain highly similar to the human tumor
      suppressor protein PTEN (phosphatase and tensin homologue
      deleted from chromosome 10). The first characterized VSP was
      isolated from the sea squirt Ciona Intestinalis, named
      Ci-VSP, one decade ago. Upon membrane depolarization, Ci-VSP
      has phosphatase activity against phosphoinositide (PI)
      substrates and acts predominantly as a 5-phosphatase of
      PI(4,5)P2 and PI(3,4,5)P3. VSPs exist in several species,
      including human, and although their function and
      physiological role are not completely understood, they have
      been proven excellent tools to rapidly and reversibly alter
      the phosphoinositide content of the plasma membrane in living
      cells. The first part of this work focuses on further
      characterizing and understanding the function of VSPs by
      using well established techniques. We used whole-cell patch
      clamping to control VSPs and total internal reflection
      fluorescent (TIRF) microscopy to record their activity. We
      first investigated the human VSP isoform 1 (hVSP1). hVSP1
      lacks plasma membrane localization and has not been
      characterized in depth. Here we attempted to target hVSP1 to
      the plasma membrane and examine its enzymatic activity. We
      found that complete replacement of the VSD of hVSP1 with that
      of Ci-VSP resulted in a membrane targeted, voltage activated
      5-phosphatase of PI(4,5)P2. Given the similarity of VSPs with
      PTEN, the chimeric protein PTENCiV had been created
      previously by fusing the VSD of Ci-VSP with PTEN. PTENCiV
      fully represents the enzymatic activity of PTEN
      (3-phosphatase of PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3) and by being
      voltage regulated it comprises a powerful tool for studying
      this tumor suppressor. Specifically, we characterized the
      enzymatic activity of a novel PTEN mutation, A126G,
      identified from a prostate cancer patient. This mutation was
      found to convert the substrate specificity of PTEN from a 3-
      to a 5-phosphatase. VSPs are suggested to be involved in
      processes where pH and redox state changes are known to
      occur. Therefore we next investigated the effect of
      intracellular pH and redox state on VSPs activity. We saw
      that acidic pH increases the PI(4,5)P2 depletion by VSPs,
      while oxidation inhibits the enzymatic activity. Thus, it
      seems possible that pH and oxidation can, in addition to
      voltage, contribute to a fine modulation of VSPs. In the
      second part, we developed an easily applicable method to use
      VSPs for manipulation of PI levels without the use of patch
      clamping. We used different cation channels that upon
      activation led to membrane depolarization and consequently
      VSP activation. We then characterized methods to monitor PIs
      levels, using fluorescence microscopy or photometry. At last,
      we demonstrated the application of these techniques by
      employing PTENCiV to characterize the effect of known PTEN
      mutations and analyze the effect of PTEN inhibitors. In
      conclusion, in this work we increased our understanding
      regarding several aspects of VSPs activity, including hVSP1
      and PTEN substrate specificity as well as the regulation of
      VSPs by intracellular pH and redox state. Lastly, we
      established an approach that allows for rapid manipulation
      and monitoring of PI levels in a population of cells and
      facilitates the study of PTEN mutations and pharmacological
      targeting.
description: Spannungsempfindliche Phosphatasen
      (englisch: Voltage Sensitive Phosphatases, VSPs) sind
      Proteine, die aus zwei unterschiedlichen Teilen bestehen:
      einer transmembranen Spannungssensor-Domäne (VSD) und einer
      zytosolischen Phosphatase-Domäne. Die Spannungssensor-Domäne
      steuert die katalytische Aktivität einer Phosphatase, sehr
      ähnlich wie bei dem menschlichen Tumorsuppressorprotein PTEN
      (Phosphatase- und Tensin-Homolog gelöscht von Chromosom 10).
      Die erste charakterisierte VSP, Ci-VSP, wurde vor einem
      Jahrzehnt, von der Seescheide Ciona Intestinalis isoliert.
      Ci-VSP hat bei Membrandepolarisation eine
      Phosphatase-Aktivität gegenüber Phosphoinositid (PI)
      Substraten und sie wirkt vor allem als 5-Phosphatase von
      PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3. VSPs wurden in verschiedenen
      Spezies gefunden, einschließlich dem Menschen. Trotz des
      fehlenden vollständigen Verständnisses, sind VSPs
      ausgezeichnete Werkzeuge, um den Phosphoinositid-Gehalt der
      Plasmamembran in lebenden Zellen schnell und reversibel zu
      ändern. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf
      die weitere Charakterisierung und das Verständnis der
      Funktion der VSPs mit Hilfe gut etablierter Techniken. Wir
      verwendeten die Whole-Cell-Patch-Clamp-Technik, um die VSPs
      zu kontrollieren und Interne
      Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (englisch: Total
      Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF) um ihre
      Aktivität aufzunehmen. Zuerst untersuchten wir die
      menschliche VSP-Isoform 1 (hVSP1). hVSP1 zeigt keine
      Plasmamembran-Lokalisation und deshalb ist es nicht
      tiefergehend charakterisiert worden. Hier haben wir versucht,
      hVSP1 an die Plasmamembran zu bringen und ihre enzymatische
      Aktivität zu untersuchen. Wir stellten fest, dass eine
      vollständige Ersetzung der Spannungssensor-Domäne von hVSP1
      durch die von Ci-VSP eine membranständige,
      spannungsaktivierte 5-Phosphatase von PI(4,5)P2 ergibt.
      Angesichts der Ähnlichkeit der VSPs mit PTEN wurde durch
      Verbindung der VSD von Ci-VSP mit PTEN das chimärische
      Protein PTENCiV erstellt. PTENCiV, behält die vollständige
      enzymatische Aktivität von PTEN (PTEN wirkt als 3-Phosphatase
      von PI(3,4)P2 und PI(3,4,5)P3). Die zusätzliche
      Regulierbarkeit durch Spannung macht PTENCiV zu einem
      leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung dieses
      Tumorsuppressors. Insbesondere haben wir die enzymatische
      Aktivität der neuen Prostatakrebs-PTEN-Mutation A126G
      charakterisiert. Wir fanden heraus, dass die A126G-Mutante
      die Substratspezifität von PTEN von einer 3-zu einer
      5-Phosphatase konvertiert. Es wird vermutet, dass VSPs in
      Prozessen, in denen pH- und Redox-Zustandsänderungen
      auftreten, beteiligt sind. Deshalb untersuchten wir als
      Nächstes die Wirkung von intrazellulärem pH-Wert und von
      Redox-Zustand auf VSPs. Wir sahen, dass ein saurer pH-Wert
      den PI(4,5)P2 Abbau in allen getesteten VSPs erhöht, und dass
      Oxidation die enzymatische Aktivität von Ci-VSP hemmt. Es
      scheint daher möglich, dass zusätzlich zur Spannung auch
      pH-Wert und Oxidation zu einer feinen Modulation von VSPs
      beitragen. Im zweiten Teil entwickelten wir eine
      leichtanwendbare Methode zur Manipulation von PI-Pegeln
      -unter Verwendung von VSPs aber ohne die Notwendigkeit der
      Patch-Clamp-Technik. Wir setzten verschiedene Kationenkanälen
      ein, die bei Aktivierung zu Membrandepolarisation führten und
      sequenziell zur VSP-Aktivierung. Als Nächstes
      charakterisierten wir Methoden um PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3
      unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie oder Photometrie
      zu kontrollieren. Außerdem haben wir die Anwendbarkeit dieser
      Techniken gezeigt, um die Wirkung von bekannten
      PTEN-Mutationen und PTEN-Inhibitoren durch Verwendung der
      PTENCiV Chimäre zu untersuchen. Als Ergebnis dieser Arbeit
      erhöhen wir das Verständnis über verschiedene Aspekte der
      VSP-Aktivität, einschließlich der Substrat Spezifität von
      hVSP1 und PTEN, sowie der Regulierung der VSP durch
      intrazellulären pH-Wert und Redox-Zustand. Außerdem haben wir
      einen Ansatz etabliert, der nicht nur zügige Manipulation und
      Kontrolle des PI-Gehalts in einer Population von Zellen
      zulässt, sondern der auch die Untersuchung von PTEN-Mutanten
      und Pharmakologie erleichtert.