title: New optical biosensors for uric acid and glucose
Creators: name: Schrenkhammer, Petra
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Enzym-Biosensor , Sauerstoff , Optischer Sensor , Wasserstoffionenkonzentration , Harnsäure , Glucose-Sensor , Lanthanoide , Verzögerte Fluoreszenz , Europium-Tetracycline-Komplex , europium-tetracycline complex , time-resolved luminescence measurement
subject: 540 Chemie

description: This thesis describes the development of a microtiter plate assay for determination of uric acid. It also depicts the development, characterization and application of luminescence based optical biosensors for determination of uric acid and glucose. Chapter 1 gives an introduction on the importance of the determination of uric acid and glucose. Furthermore, an overview on the state of the art of optical sensing of oxygen and pH is given, along with a comparison of optical sensor versus electrochemical sensor technology. In this thesis a microtiter plate assay for uric acid determination is described applying an europium complex as fluorescent probe. Hence, the luminescence emission mechanism of lanthanide complexes is explained in detail. Chapter 2 describes a microtiter plate assay for uric acid. The hydrogen peroxide sensitive probe europium(III)-tetracycline (Eu3TC) was applied for sensing hydrogen peroxide that is released by the enzyme uricase during the oxidation of uric acid. Hydrogen peroxide coordinates to Eu3Tc and enhances its luminescence intensity. The assay is carried out in the time-gated mode. Uric acid can be detected in the concentration range up to 60 µM with a limit of detection of 9.9 µM. The assay cannot be applied to the determination of uric acid in urine unfortunately. Urine a complex matrix contains phosphate which quenches the luminescence intensity of the complex Eu3TC-HP strongly. In chapter 3, a biosensor membrane is presented for detection of uric acid. The biosensor membrane consists of a single layer which contains an oxygen probe and the enzyme uricase. The detection of uric acid is based on the measurement of oxygen that is consumed during the oxidation catalyzed by uricase. A ruthenium- or an iridium complex incorporated in organically modified sol-gel is applied as oxygen sensitive probe, whose luminescence intensity is dynamically quenched in presence of oxygen. Uric acid can be detected in the concentration range up to 0.8 mM with a limit of detection of 0.05 mM using the ruthenium complex as oxygen sensitive probe. Applying the iridium complex as oxygen sensitive probe uric acid is detected in the concentration range from 0.02 to 0.6 mM. The optical biosensor using the ruthenium complex as oxygen sensitive probe is successfully applied to the determination of uric acid in blood serum. In chapter 4, a biosensor membrane is prepared for determination of glucose. The fundamental idea of this chapter is the simultaneous detection of glucose via (a) oxygen and (b) pH transduction. The first part of this chapter describes a strategy to embed an oxygen sensitive probe and the enzyme glucose oxidase in a hydrogel matrix and apply it to glucose sensing. The detection scheme is based on the principle described in chapter 3. The enzyme glucose oxidase catalyzes the oxidation of glucose under oxygen consumption which is detected using a ruthenium complex as the oxygen sensitive probe. Its luminescence intensity is enhanced in absence of oxygen. Glucose can be detected in the concentration range from 0.2 to 1.0 mM. In the second part glucose is determined via a pH transducer. During the oxidation of glucose one of the end products is gluconic acid which dissociates in gluconate and protons. Hence, the pH of the microenvironment decreases which can be detected in luminescence changes of a pH sensitive probe. Two pH indicators, HPTS and CF, are applied but without the desirable success. The application of CF as pH indicator is disadvantageous due to strong photobleaching. However, the determination of glucose using HPTS as pH transducer is feasible only in the molar concentration range and the reproducibility of the results is very low. Hence, the simultaneous determination of glucose via oxygen and pH transduction is not possible. In chapter 5, a triple sensor is presented for simultaneous monitoring of glucose via an oxygen and pH transducer along with monitoring the temperature. The oxygen-, pH- and temperature transducers are embedded in a hydrogel matrix along with the enzyme glucose oxidase. The triple sensor is illuminated by one single LED and the resulting emissions of the indicators are imaged by a CCD camera and spectrally separated by using suitable filters. This set up allows the simultaneous monitoring of glucose via oxygen and pH transduction and the temperature. This temperature determination is important because the activity of the enzyme GOx and the luminescence of the oxygen transducer PtTFPL are temperature dependent. Simultaneous sensing of glucose via pH and oxygen transduction along with temperature is successful in the case of monitoring glucose via oxygen transduction along with the temperature. The detection of glucose via pH transduction lacks the desirable success because the response times are very long and the reproducibility of the results is very low.
description: Diese Arbeit beschreibt zum einen die Entwicklung eines Mikrotiterplattentests zur Bestimmung von Harnsäure, zum anderen die Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von optischen Biosensoren zur Bestimmung von Harnsäure und Glucose. Im ersten Kapitel wird auf die Notwendigkeit der Bestimmung von Harnsäure und Glucose eingegangen. Harnsäure und Glucose können über den Sauerstoffverbrauch bestimmt werden, der aus einer durch die Enzyme Uricase oder Glucose Oxidase verursachten Oxidation resultiert. Beide Enzyme produzieren während der Oxidation Wasserstoffperoxid, welches als indirekter Nachweis für Harnsäure oder Glucose genutzt werden kann. Glucose kann zudem auch über eine Änderung des pH-Wertes während der Oxidation nachgewiesen werden, da das Oxidationsprodukt Gluconsäure in Gluconat und Protonen dissoziiert, die den pH-Wert absinken lassen. Aus diesem Grund wird in diesem Kapitel außerdem ein allgemeiner Überblick über Nachweismöglichkeiten für Sauerstoff, Wasserstoffperoxid und pH gegeben. Für die Bestimmung von Harnsäure und Glucose werden in dieser Arbeit optische Sensoren eingesetzt, welche sowohl Vorteile als auch Nachteile gegenüber elektrochemischen Sensoren aufweisen. Diese Vor- und Nachteile werden genau aufgezeigt und erläutert. Für die Bestimmung von Harnsäure mit Hilfe eines Mikrotiterplattentests wird ein Europiumkomplex als fluoreszierende Sonde verwendet. Der Mechanismus der Fluoreszenzanregung und Emission von diesem Europiumkomplex wird im Detail beschrieben. Kapitel zwei beschreibt ausführlich einen Mikrotiterplattentest zur Bestimmung von Harnsäure. In Gegenwart des Enzyms Uricase wird Harnsäure zu Allantoin unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid oxidiert, das mit einem Europium-Tetracyclin Komplex (Eu3TC) im molaren Verhältnis 3:1 nachgewiesen werden kann. In Gegenwart von Wasserstoffperoxid nimmt die Fluoreszenzintensität von Eu3TC zu. Aufgrund seiner langen Fluoreszenzabklingzeit ist die Anwendung von zeitverzögerter Fluoreszenzspektroskopie möglich. Dieser Test ist einfach durchzuführen und Harnsäure kann in einem Konzentrationsbereich von 9,9 bis 60 µM nachgewiesen werden. Die Anwendung dieses Tests zur Bestimmung von Harnsäure in Urin führte zu keinem Erfolg. Urin beinhaltet neben vielen anderen Komponenten auch Phosphat, welches die Fluoreszenzintensität von Eu3Tc mit koordiniertem Wasserstoffperoxid stark quencht, was die Detektion von Harnsäure in Urin unmöglich macht. Kapitel drei beschreibt die Entwicklung eines optischen Biosensors zum Nachweis von Harnsäure. Hier wird Harnsäure über den Sauerstoffverbrauch während der Oxidation detektiert. Für den Nachweis von Sauerstoff werden Sauerstoff-sensitive Farbstoffe wie ein Ruthenium- oder ein Iridiumfarbstoff verwendet, deren Fluoreszenz dynamisch durch Sauerstoff gequencht wird. In dieser Arbeit werden die Sauerstoff-sensitiven Farbstoffe in organisch modifizierten Sol-Gel-Partikeln immobilisiert und zusammen mit dem quervernetzten Enzym Uricase in eine Hydrogelschicht eingebettet. Harnsäure kann in einem Konzentrationsbereich von 0,05 bis 0,8 mM für den Sauerstoff sensitiven Rutheniumkomplex und von 0,02 bis 0,6 mM für den Sauerstoff sensitiven Iridiumkomplex nachgewiesen werden. Die Bestimmung von Harnsäure in Blutserum unter Verwendung des Rutheniumkomplexes ist gut durchführbar. Kapitel vier beschreibt die Entwicklung von optischen Biosensoren zur Bestimmung von Glucose. Die Grundidee dieses Kapitels ist die Entwicklung eines Dualsensors zur gleichzeitigen Bestimmung von Glucose mittels eines Sauerstoff- und eines pH- Transducers. Im ersten Teil dieses Kapitels erfolgt die Bestimmung von Glucose über die Detektion des Sauerstoffverbrauchs. Hier wird ebenfalls ein Rutheniumkomplex als Sauerstoffindikator verwendet, welcher in Sol-Gel-Partikeln immobilisiert ist und dessen Fluoreszenz in Gegenwart von Sauerstoff gequencht wird. Die Indikatorpartikel und das Enzym Glucose Oxidase werden in einer Hydrogelschicht eingebettet. Glucose kann mit diesem System in einem Bereich von 0,2 bis 1,0 mM nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieses Kapitels wird Glucose nachgewiesen indem man die pH-Wert Änderung mit einem pH sensitiven Farbstoff wie HPTS oder CF detektiert. Die erhaltenen Ergebnisse mit zwei verschiedenen pH-Indikatoren zeigen nicht den gewünschten Erfolg. Die Anwendung von CF als pH-Indikator ist aufgrund der sehr schlechten Photostabilität nicht möglich. HPTS hingegen zeigt zufriedenstellendere Ergebnisse, wobei der Glucosenachweis aber nur im molaren Konzentrationsbereich möglich und die Reproduzierbarkeit dieser Methode sehr niedrig ist. Im fünften Kapitel wird Glucose mit Hilfe eines Tripelsensors, welcher Sauerstoff-, pH- und Temperatur- sensitive Partikel, sowie Glucose Oxidase in einer Hydrogelschicht enthält, bestimmt. Die Grundidee in diesem Kapitel ist Glucose gleichzeitig über die Messung des Sauerstoffverbrauchs und die pH-Wert Änderung zu detektieren. Während der enzymatischen Oxidation ist es auch wichtig die Temperatur zu verfolgen, da die Aktivität von Glucose Oxidase und die Fluoreszenz des Sauerstoffindikators stark temperaturabhängig sind. Alle verwendeten Indikatoren werden mit einer LED angeregt und die daraus resultierenden Emissionen mit Hilfe einer CCD-Kamera spektral mit geeigneten Filtern voneinander getrennt. Wie schon erwähnt kann Glucose auf drei verschiedene Arten bestimmt werden. Die Temperaturmessung während der Oxidation und die gleichzeitige Glucosedetektion über den Sauerstoffverbrauch und die pH-Änderung liefern keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Mit diesem optischen Biosensor ist die Bestimmung der Temperatur und der Glucosenachweis über den Sauerstoffverbrauch möglich. Die Glucosebestimmung über die pH-Wert Änderung ist nicht sehr vielversprechend aufgrund der langen Ansprechzeiten und der geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.