Υπερέκφραση της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1a σε κύτταρα πολύμορφου γλοιοβλαστώματος:
Creators: name: Στόγιος, Γρηγόριος Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Πολύμορφο γλοιοβλάστωμα
Κινάση πρωτεϊνών SRPK1a
Υπερέκφραση
Glioblastoma multiforme (GBM)
Protein kinase SRPK1a
overexpression

description: Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα αποτελεί μια μορφή νεοπλασίας του κεντρικού νευρικού συστήματος και είναι μια ιδιαίτερα ετερογενής μορφή καρκίνου. Αποτελεί ένα γρήγορα αναπτυσσόμενο γλοίωμα που προκύπτει στον εγκέφαλο από τα νευρογλοιακά κύτταρα τα οποία στηρίζουν τα νευρικά κύτταρα. Ταξινομείται ως ένα αστροκύττωμα βαθμού κακοήθειας IV με βάση τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας. Είναι η πιο κακοήθης μορφή αστροκυτταρικού όγκου και αποτελείται από χαμηλής διαφοροποίησης νεοπλασματικά κύτταρα, κυρίως αστροκύτταρα. Με βάση κλινικές και γενετικές μελέτες κατηγοριοποιείται σε πρωτογενές και δευτερογενές.Το πρωτογενές πολύμορφο γλοιοβλάστωμα φαίνεται να εκδηλώνεται ως υψηλού βαθμού βλάβη εξ' αρχής και συναντάται στο 90-95% των περιπτώσεων. Αντίθετα το δευτερογενές εξελίσσεται αργά από ένα ήδη υπάρχον αστροκύττωμα βαθμού II ή III. Το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα εισβάλλει στον εγκέφαλο με εξαιρετικά επιθετικό και διηθητικό τρόπο και συνήθως αναπτύσσεται στους λοβούς των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Αξίζει όμως να σημειωθεί ότι είναι μια μορφή νεοπλασίας που δε μπορεί να κάνει μεταστάσεις σε άλλα όργανα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήσαμε την πρωτεϊνική κινάση SRPK1a. Η SRPK1a ανήκει στην οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών σερίνης-αργινίνης, οι οποίες τροποποιούν τα υποστρώματά τους φωσφορυλιώνοντας σερίνες που αποτελούν μέρος μιας επαναλαμβανόμενης ακολουθίας διπεπτιδίων από αργινίνες και σερίνες. Αποτελέσματα προηγούμενων πειραματικών ερευνών απέδειξαν ότι η κινάση SRPK1a δεν εκφράζεται καθόλου ή εκφράζεται ελάχιστα στις περισσότερες κυτταρικές σειρές πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Στη συγκεκριμένη εργασία στόχος μας ήταν να γίνει υπερέκφραση της κινάσης SRPK1a στις κυτταρικές σειρές T98, U251 και MO59K πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Μέσα στα κύτταρα η SRPK1a υφίσταται μια διαδικασία ματίσματος και ένα ποσοστό της μετατρέπεται στην ισομορφή SRPK1. Για να γίνει επιτυχής υπερέκφραση της SPRK1a έπρεπε να αποφευχθεί αυτή η περαιτέρω διαδικασία ματίσματος. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε το 5' splice μετάλλαγμα της κινάσης SRPK1a, το οποίο δημιουργήθηκε με τροποποίηση της αλληλουχίας στο 5' άκρο της SRPK1a όπου βρίσκεται η 5' θέση αποκοπής του ιντρονίου κατά τη διαδικασία ματίσματος. Με την τροποποίηση αυτή δε μπορεί να προσδεθεί το σωματίδιο ματίσματος στην 5' θέση αποκοπής με συνέπεια να μη γίνεται καθόλου μάτισμα της SRPK1a προς SRPK1. Το γονίδιο της 5' splice SRPK1a κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-N1, ώστε η πρωτεϊνη να εκφραστεί ως πρωτεϊνη σύντηξης με τη GFP φθορίζουσα πρωτεϊνη στο C-τελικό της άκρο. Δεδομένου ότι η επιμόλυνση κυττάρων Τ98 με τον ανασυνδυασμένο φορέα pEGFP-N1/5' splice SRPK1a δεν οδήγησε σε έκφραση της 5' splice SRPK1a ακολούθησε προσπάθεια επιμόλυνσης των κυττάρων Τ98, U251, MO59K με τον πλασμιδιακό φορέα pFLAG-CMV2 όπου είχαν κλωνοποιηθεί τα γονίδια των κινασών SRPK1, SRPK1a, 5' splice SRPK1a (ώστε να εκφραστούν ως πρωτεϊνες σύντηξης με το FLAG επίτοπο στο Ν-τελικό τους άκρο). Με παρατήρηση στο μικροσκόπιο και δοκιμή με MTT συμπεράναμε ότι η υπερέκφραση της εξωγενούς πρωτεϊνης 5' splice SRPK1a οδηγεί τα Τ98 κύτταρα σε απόπτωση, ενώ δεν παρατηρήσαμε ανάλογα αποτελέσματα για τις υπόλοιπες κυτταρικές δοκιμές. Με τη χρήση RT-PCR διαπιστώθηκε ότι το γεγονός αυτό δεν οφείλεται σε διαφορετική έκφραση των κινασών SRPK1, SRPK1a και 5' splice SRPK1a, αλλά πιθανότατα σε κάποια εξειδικευμένη δραστικότητα της 5' splice SRPK1a.
description: The glioblastoma multiforme is a type of tumor of the central nervous system and is a highly heterogeneous cancer. It is comprised of a rapidly growing glioma resulting in the brain from the neuroglial cells which support the nerve cells. It is classified as an astrocytoma grade IV malignacy according to the World Health Organization. It is the most malignant form of astrocyte tumor and it is comprised of poorly differentiated tumor cells, particularly astrocytes. Based on clinical and genetic studies it is categorized into primary and secondary. The primary glioblastoma multiforme seems to manifest as a high degree failure from the outset and it is found in 90-95% of cases. Unlike the secondary, it evolves slowly from an already existing astrocytoma grade II or III. The glioblastoma multiforme invades the brain with an extremely aggressive and invasive manner and it usually develops in the lobes of the cerebral hemispheres. It is worth noting that this is a form of tumor that cannot metastasize to other organs. In this thesis we studied the protein kinase SRPK1a. The SRPK1a belongs to the family of protein kinases serine-arginine, which modify their substrates by phosphorylating serines forming part of a repeated sequence of dipeptides from arginines and serines. Results of previous experimental research have shown that the kinase SRPK1a is not expressed at all or it is expressed minimally in most cell lines of glioblastoma multiforme. In this specific paper our aim was for an overexpression of kinase SRPK1a in cell lines T98, U251 and MO59K glioblastoma multiforme.