title: Examining the role of the presynaptic cytomatrix protein bassoon in cone photoreceptor degeneration in bassoon-deficient mouse lines
title: Untersuchung der Rolle des präsynaptischen Zytomatrixproteins Bassoon bei der Zapfenphotorezeptordegeneration in Bassoon-defizienten Mauslinien
Creators: name: Ryl, Miriam
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: Neurobiologie
subject: Retina
subject: Bandsynapse
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften::50 Naturwissenschaften::500 Naturwissenschaften und Mathematik

description: The mammalian retina is a complex neuronal network specialized in processing and transmitting visual information. A malfunction or even degeneration of the sensitive photoreceptor cells can lead to blindness, as it is e.g. the case in the retinal diseases retinitis pigmentosa and achromatopsia. One cause of neurodegeneration can be pathological changes at the synapses, known as synaptopathies. One protein that plays a crucial role in the structural and functional integrity of both conventional chemical synapses and the sensory ribbon synapses of photoreceptors is the presynaptic scaffold protein bassoon (BSN). At ribbon synapses, BSN is postulated to be essential for anchoring the synaptic ribbon, a protein-rich structure at the active zone that enables rapid and tonic transmitter release. The characterization of the first BSN-deficient mouse line, BsnΔEx4/5, showed free-floating synaptic ribbons, reduced transmission between photoreceptors and bipolar cells, remodeling of the retinal network, and cone photoreceptor degeneration. Deciphering the mechanisms and molecular processes underlying the selective degeneration of cone photoreceptors in BSN-deficient mice may help to understand how structural and functional changes in photoreceptor ribbon synapses may affect sensory cell survival. In the first part of my dissertation, I analyzed the three BSN-deficient mouse lines BsnΔEx4/5, Bsngt, and Bsnko functionally by electrophysiology and structurally by high-resolution microscopy. Surprisingly, I found different phenotypes in the outer retina of these three mouse lines. While the synaptic function of photoreceptors was similarly impaired in all three mouse lines, the synaptic structure was more severely affected in BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 and Bsngt/gt than in Bsnko/ko photoreceptors. The synaptic defects in the BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 and Bsngt/gt retinae were accompanied by the sprouting of bipolar and horizontal cells, the formation of ectopic synapses, and the death of cone photoreceptors; processes that did not occur in Bsnko/ko retinae. Analysis of Bsngt/ko hybrid mice revealed an attenuated version of the Bsngt/gt phenotype. In the second part of my dissertation, I searched for factors responsible for the phenotypic differences between Bsngt and Bsnko mice. Since it has been shown previously that loss of BSN in brain neurons of Bsngt/gt mice leads to increased presynaptic autophagy and proteasomal activity and thus to decreased levels of important presynaptic proteins, I investigated these degradation pathways in Bsngt and Bsnko retinae. I was able to show that increased proteasomal activity occurred in the retinae of both the degenerating Bsngt and the non-degenerating Bsnko mouse line. Thus, my results are consistent with other studies regarding the role of BSN as a regulator of proteasomal activity at chemical synapses. However, the disruption of these functions cannot be the (only) trigger for the degeneration of the cone photoreceptors in the Bsngt/gt mice. Therefore, I further investigated whether the expression of residual BSN proteins in the different BSN-deficient mice could be a possible trigger of degeneration. In BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 mice, the expression of a 180kDa BSN residual protein was already known. Furthermore, the Bsngt/ko crossbreeding experiment showed that the presence and amount of altered gt- and ko-Bsn genes have an effect on the severity of the retinal phenotype, possibly also indicating the presence of residual BSN proteins in these mouse lines. Interestingly, overexpression of a possible N-terminal BSN fragment of Bsngt mice in HEK293T cells showed an increase in proteasomal activity, as was also observed in Bsngt/gt mice. At the same time, I found high levels of Bsn mRNA in Bsnko/ko retinae and immunostaining with specific BSN antibodies revealed BSN signals in retinal and brain tissue of these mice. Interestingly, the target sequences of the BSN antibodies that generated BSN signals in Bsnko/ko tissue indicate the expression of a truncated BSN lacking the N-terminus. Based on these observations, I hypothesized that the expression of different BSN fragments is crucial for the divergent retinal phenotypes in the three BSN-deficient mouse lines BsnΔEx4/5, Bsngt, and Bsnko. Future work is needed to clarify whether the N-terminal BSN fragments have a degenerative effect in BsnΔEx4/5 and Bsngt retinae and/or whether the expression of a large BSN fragment leads to a partial compensation of BSN functions in Bsnko mice, which mitigates the severity of the degenerative retinal phenotype. In summary, in my thesis I was able to show using three BSN-deficient mouse lines that BSN is essential for the anchoring of the synaptic ribbon and correct synaptic transmission at the photoreceptor ribbon synapses. Furthermore, I could show for the first time that BSN is involved as a negative regulator in proteasomal processes in the retina. Finally, I hypothesized that the expression of BSN fragments might play a role in the different retinal phenotypes of the three BSN-deficient mouse lines BsnΔEx4/5, Bsngt, and Bsnko. Future studies on the occurrence and mode of action of these BSN fragments could help to decipher the underlying mechanisms of cone photoreceptor degeneration in BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 and Bsngt/gt retinae.
description: Die Säugetiernetzhaut ist ein komplexes neuronales Netzwerk, das auf die Verarbeitung und Weiterleitung visueller Informationen spezialisiert ist. Eine Fehlfunktion oder gar Degeneration der empfindlichen Photorezeptorzellen kann zur Erblindung führen, wie dies beispielsweise bei den Netzhauterkrankungen Retinitis pigmentosa und Achromatopsia der Fall ist. Zu den Ursachen für die Degeneration von Nervenzellen gehören unter anderem pathologische Veränderungen an den Synapsen, so genannte Synaptopathien. Ein Protein, welches für die synaptische Struktur und Funktion sowohl konventioneller chemischer Synapsen als auch der sensorischen Bandsynapsen von Photorezeptoren wichtig ist, ist das präsynaptische Gerüstprotein Bassoon (BSN). An den Bandsynapsen steht BSN im Verdacht, wichtig für die Verankerung des synaptischen Bandes zu sein, einer proteinreichen Struktur an der aktiven Zone, welche eine schnelle und tonische Transmitterausschüttung ermöglicht. Die Charakterisierung der ersten BSN-defizienten Mauslinie, BsnΔEx4/5 zeigte freischwimmende synaptische Bänder, eine verringerte Transmission zwischen Photorezeptoren und Bipolarzellen, eine Umstrukturierung des retinalen Netzwerks und den Tod von Zapfenphotorezeptoren. Die Erforschung der Mechanismen und molekularen Prozesse, die der selektiven Degeneration der Zapfenphotorezeptoren in BSN-defizienten Mäusen zugrunde liegen, könnte helfen zu verstehen, wie strukturelle und funktionelle Veränderungen der Photorezeptor-Bandsynapsen das Überleben der Sinneszelle beeinflussen können. Im ersten Teil meiner Dissertation untersuchte ich funktionell mittels Elektrophysiologie und strukturell mittels hochauflösender Mikroskopie drei BSN-defiziente Mauslinien: BsnΔEx4/5, Bsngt und Bsnko. Überraschenderweise fand ich in der äußeren Netzhaut der drei Mauslinien unterschiedliche Phänotypen. Während die synaptische Funktion der Zapfen- und Stäbchenphotorezeptoren in allen drei Mauslinien in ähnlicher Weise beeinträchtigt war, war die Synapsenstruktur in BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 und Bsngt/gt stärker betroffen als in Bsnko/ko Photorezeptoren. Die synaptischen Defekte in den BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 und Bsngt/gt Retinae gingen mit dem Aussprossen von Bipolar- und Horizontalzellen, der Bildung von ektopischen Synapsen und dem Absterben von Zapfenphotorezeptoren einher; Prozesse, die in Bsnko/ko Retinae nicht auftraten. Die Analyse von Bsngt/ko Hybridmäusen ergab eine abgeschwächte Version des Bsngt/gt Phänotyps. Im zweiten Teil meiner Dissertation suchte ich nach Faktoren, die für die phänotypischen Unterschiede zwischen Bsngt und Bsnko Mäusen verantwortlich sind. Da in der Vergangenheit bereits gezeigt wurde, dass der Verlust von BSN in Gehirnneuronen von Bsngt/gt Mäusen zu erhöhter präsynaptischer Autophagie und proteasomaler Aktivität und damit zu verringerten Mengen wichtiger präsynaptischer Proteine führt, untersuchte ich diese Abbauwege in Bsngt und Bsnko Retinae. Ich konnte zeigen, dass erhöhte proteasomale Aktivität sowohl in den Retinae der degenerierenden Bsngt als auch der nicht-degenerierenden Bsnko Mauslinie auftrat. Damit decken sich meine Ergebnisse mit anderen Studien bezüglich der Rolle von BSN als Regulator proteasomaler Aktivität an chemischen Synapsen. Die Störung dieser Funktionen kann allerdings nicht der (einzige) Auslöser für die Degeneration der Zapfenphotorezeptoren in den Bsngt/gt Mäusen zu sein. Deswegen untersuchte ich weiterführend, ob die Expression von BSN Restproteinen in den verschiedenen BSN-defizienten Mäusen ein möglicher Auslöser der Degeneration sein könnte. In BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 Mäusen war die Expression eines 180kDa großen BSN Restproteins bereits bekannt. Außerdem zeigte das Bsngt/ko Kreuzungsexperiment, dass die Anwesenheit und Menge der veränderten gt- und ko-Bsn Gene einen Effekt auf die Schwere des retinalen Phänotyps haben, was möglicherweise auch auf die Anwesenheit von BSN-Restproteinen in diesen Mauslinien hindeuten könnte. Interessanterweise zeigte die Überexpression eines möglichen N-terminalen BSN Fragments der Bsngt Mäuse in HEK293T Zellen eine Erhöhung der proteasomalen Aktivität, wie es eben auch in Bsngt/gt Mäusen zu beobachten war. Gleichzeitig konnte ich in Bsnko/ko Retinae hohe Bsn mRNA Mengen finden und die Immunfärbung mit bestimmten BSN-Antikörpern zeigte BSN Signale in Retina- und Gehirngewebe dieser Mäuse. Die Zielsequenzen der BSN Antikörper, die in Bsnko/ko Gewebe BSN Signale erzeugten, deuten interessanterweise auf die Expression eines verkürzten BSNs ohne N-Terminus hin. Aufgrund dieser Beobachtungen stellte ich die Hypothese auf, dass die Expression verschiedener BSN-Fragmente entscheidend für die unterschiedlichen retinalen Phänotypen in den drei BSN-defizienten Mauslinien BsnΔEx4/5, Bsngt und Bsnko ist. Hierbei gilt es in Zukunft zu klären, ob die N-terminalen BSN-Fragmente einen degenerativen Effekt in BsnΔEx4/5 und Bsngt Retinae haben und/oder ob die Expression eines großen BSN-Fragments zu einer teilweisen Kompensation von BSN Funktionen in Bsnko Mäusen führt, was die Schwere des degenerativen retinalen Phänotyps mildert. Zusammenfassend konnte ich in meiner Arbeit anhand von drei verschiedenen BSN-defizienten Mauslinien zeigen, dass BSN essentiell für die Verankerung des synaptischen Bandes und die korrekte synaptische Übertragung an den Photorezeptor-Bandsynapsen ist. Außerdem konnte ich erstmals zeigen, dass BSN als negativer Regulator an proteasomalen Prozessen in der Retina beteiligt ist. Schließlich stellte ich die Hypothese auf, dass die Expression von BSN-Fragmenten eine Rolle bei den unterschiedlichen retinalen Phänotypen der drei BSN-defizienten Mauslinien BsnΔEx4/5, Bsngt und Bsnko spielen könnte. Zukünftige Untersuchungen zum Vorkommen und zur Wirkungsweise dieser BSN-Fragmente könnten dazu beitragen, die zugrundeliegenden Mechanismen der Zapfenphotorezeptor-Degeneration in BsnΔEx4/5/ΔEx4/5 und Bsngt/gt Retinae zu entschlüsseln.