title: Influence of PCNA on the expression of genes encoded by the ɸCh1 virus infecting the archaeon N. magadii
Creators: name: Jerliu, Ermirë
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Das ORF59 des фCh1-Virus, das das halophile Archaeon N. magadii infiziert, kodiert ein putatives proliferierendes Zellkernantigen (PCNA), das eine hohe Sequenzähnlichkeit zum vom Wirt kodierten PCNA aufweist, was auf einen kürzlichen horizontalen Gentransfer hindeutet. PCNA, ein Prozessivitätsfaktor in der DNA-Replikation, ist selten in dsDNA Viren, insbesondere in Archaea, was das фCh1-PCNA zu einem einzigartigen Untersuchungsziel macht. Frühere Forschungen zeigten, dass virales PCNA für die фCh1-Replikation entscheidend ist, wobei seine Deletion die Virusnachkommen, die Proteinsynthese und die Zelllyse stark beeinträchtigt. Seine spezifische Wirkung auf wichtige virale und Wirtsproteine blieb jedoch in einem virusbefreiten Stamm unerforscht. Diese Studie zielte darauf ab zu bestimmen, ob PCNA die Expression von Methyltransferase und gp34-Proteinen, die von фCh1 in N. magadii-Stamm L13 kodiert werden, direkt oder indirekt beeinflusst. Drei PCNA-Varianten, darunter: (1) Wildtyp-PCNA des Virus mit dem GTG-Codon, (2) eine Variante, bei der das GTG-Codon in ATG geändert wurde, und (3) eine verkürzte Version, die mit ATG beginnt und der Größe des vom Wirt kodierten PCNA entspricht, wurden in N. magadii L13 kloniert und in zwei Systemen analysiert: in cis, wo PCNA und das Zielgen (gp34) auf demselben Plasmid waren, und in trans, wo PCNA und ORF94 (Methyltransferase) auf separaten Plasmiden waren. Basierend auf Wachstumskinetik- und Western-Blot-Analysen zeigen die verschiedenen PCNA-Varianten unterschiedliche Auswirkungen auf die Produktion von Methyltransferase und gp34. Obwohl PCNA eine direkte Rolle bei der Steigerung der Expression beider Proteine spielt, ist es für ihre Synthese nicht unbedingt erforderlich. Neben dem Wildtyp-ORF94 wurde eine zweite Konstruktion, die eine mutierte regulatorische Region stromaufwärts von ORF94 (ORF94-M M1_2) enthält, entwickelt, um zu untersuchen, ob Veränderungen in der regulatorischen Region die Bindung und die nachfolgende Expression der Methyltransferase beeinflussen. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Mutation die Expression der Methyltransferase tatsächlich beeinflusst, was darauf hindeutet, dass Änderungen in der regulatorischen Region die ordnungsgemäße Regulation und Bindung stören und letztlich die Proteinproduktion beeinträchtigen.
description: The ORF59 of фCh1 virus, infecting the halophilic archaeon N. magadii, encodes a putative proliferating cell nuclear antigen (PCNA) with high sequence similarity to the host-encoded PCNA, suggesting recent horizontal gene transfer. PCNA, a processivity factor in DNA replication, is rare in dsDNA viruses, especially in Archaea. Previous research showed that viral PCNA is crucial for фCh1 replication, with its deletion severely impacting viral progeny, protein synthesis, and cell lysis. However, its specific effect on key viral and host proteins, remained unstudied in a virus-cured strain, making фCh1 PCNA a unique target for study. This study aimed to determine whether PCNA directly or indirectly affects the expression of methyltransferase and gp34 proteins encoded by фCh1 in N. magadii strain L13. Three PCNA variants, namely wild-type, mutated (GTG  ATG) and a truncated version with ATG as start codon were cloned into N. magadii L13 and analysed both in cis, where PCNA and the target gene (gp34) were on the same plasmid, and trans with PCNA and ORF94 (methyltransferase) located on separate plasmids. Based on growth kinetics and Western blot analyses, the different PCNA variants demonstrate distinct effects on methyltransferase and gp34 production. Although PCNA plays a direct role in enhancing the expression of both proteins, it is not strictly essential for their synthesis. In addition to the wild-type ORF94, a construct containing a mutated upstream region of ORF94 was designed to investigate whether alterations in the upstream regulatory region affect the binding and subsequent expression of the methyltransferase. The results suggest that this mutation does indeed impact methyltransferase expression, indicating that changes in the upstream regulatory region interfere with proper regulation and binding, ultimately affecting protein production.