title: Neue Einblicke in den Reaktionsmechanismus der Benzylsuccinat-Synthase
title: New insights into the reaction mechanism of the benzylsuccinate synthase
Creators: name: Seyhan, Deniz
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: initiation
BSS
Benzylsuccinat-Synthase
Elektronenspinresonanzspektroskopie
Anaerober Stoffwechsel , Toluol
Abbau
benzylsuccinate synthase
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
toluene degradation
Biochemie
Thauera aromatica
reaction mechanism

description: The enzymes pyruvate formate
      lyase, anaerobic ribonucleotide reductase, the coenzyme B12
      independent diol dehydratase, the choline trimethylamine
      lyase, and the 4-hydroxyphenylacetate decarboxylase are
      members of the glycyl radical enzyme family. The
      (R)-benzylsuccinate synthase (BSS) catalyzes the initiation
      of the anaerobic toluene degradation, adding the methyl group
      of toluene to the double bond of fumarate forming
      (R)-benzylsuccinate as product of the reaction. The
      holoenzyme consists of three subunits α, β, and γ with
      molecular masses of 98, 8.5, and 6.5 kDa, respectively,
      composing a heterohexamer (α2β2γ2) with a total molecular
      mass of 220 kDa. The two α subunits each contain an essential
      glycine and cysteine residue, which are conserved in all
      glycyl radical enzymes. The catalytic center of the enzyme is
      located in the α subunit, whereas the two smaller subunits
      both contain one Fe4S4 cluster with unknown function. Due to
      its position in a recently solved crystal structure of the
      enzyme in Thauera aromatica T1, the β subunit could regulate
      the substrate access to the catalytic center of the α
      subunit. The BSS is post-translationally activated by a
      SAM-dependent activating enzyme BssD, inserting a free
      radical into the conserved glycine residue in the C-terminal
      domain of the alpha subunit forming the glycyl radical. The
      structural genes bssC, A, and B and the gene bssD are
      organized in a toluene-inducible operon together with further
      genes of unknown function. Besides toluene other methylated
      carbohydrates, e.g. n-alkanes, cycloalkanes, p-cresol,
      2-methylnaphthaline, p-cymene (in Thauera sp. pCyN2), and
      ethylbenzene, are activated for the subsequent degradation to
      acyl CoA thioesters through the addition of fumarate. The
      catalyzing enzymes are consolidated as fumarate-adding
      enzymes (FAEs). For the catalytic mechanism of the BSS the
      formation of an enzyme bound substrate radical was proposed,
      which reacts with fumarate to a product radical.
      Subsequently, the product radical abstracts a hydrogen atom
      from the catalytic cysteine residue Cys493, generating
      benzylsuccinate as the final product of the reaction. In this
      project further information about the reaction mechanism of
      the BSS should be gained via biochemical and spectroscopic
      analyses. Prior to this study, organic radicals could be
      identified as reaction intermediates by EPR analyses,
      resulting from different substrate analogs. In this work EPR
      analyses with the potent BSS inhibitor benzyl alcohol started
      by Markus Hilberg were continued, giving answers to questions
      that could not been answered in the thesis of Hilberg (2013).
      Yet the unambiguous identification of the new organic radical
      species, that will provide information about the reaction
      mechanism is still pending. Moreover, it has succeeded in
      overproducing in vivo activated BSS heterologously under
      benzoate degrading conditions and in detecting activity in
      the crude extract. Putatively important amino acids in the
      catalytic center of BSS might have a crucial function in
      substrate specificity, enantiomeric specificity and the
      general reaction mechanism. For this purpose, several amino
      acids in close proximity to the putative catalytic center of
      the α subunit of BSS have been mutated to overproduce the
      respective enzymes in Aromatoleum aromaticum EbN1 SR7. The
      obtained enzyme activity in the crude extracts and different
      substrate usage should be analyzed in comparison to the wild
      type. To completely exclude activity from the wild type gene
      products and to clarify the unknown roles of bssEFGH, the bss
      operon was successfully deleted entirely (ΔbssDCABEFGH) and
      partially (ΔbssEFGH). Using chiral radiolabeled (R)-und
      (S)-toluene with one of the three hydrogen isotopes at the
      methyl group the ‘cryptic stereospecificity’ of the
      benzylsuccinate synthases could be solved as both of the two
      enantiomers react with fumarate in an inversion of
      configuration at the methyl group of toluene.
description: Zusammen mit der
      Pyruvat-Formiat-Lyase, der anaeroben Ribonukleotid-Reduktase,
      der Co-Enzym B12-unabhängigen Diol-Dehydratase, der
      Cholintrimethylamin-Lyase und der
      4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase gehört die
      (R)-Benzylsuccinat-Synthase zur Familie der
      Glycylradikalenzyme. Die (R)-Benzylsuccinat-Synthase (BSS)
      katalysiert die Initiierung des anaeroben Abbaus von Toluol
      mit einer Addition der Methylgruppe des Toluols an die
      Doppelbindung von Fumarat unter Bildung von
      (R)-Benzylsuccinat als Produkt der Reaktion. Sie besteht aus
      drei Untereinheiten mit 98, 8,5 und 6,5 kDa, die ein
      Heterohexamer α2β2γ2 mit einer Gesamtmasse von 220 kDa
      bilden. Die großen α-Untereinheiten enthalten jeweils einen
      essentiellen Glycin- und Cysteinrest, die in allen
      Glycylradikal-Enzymen konserviert sind. Das aktive Zentrum
      des Enzyms befindet sich in der großen α-Untereinheit, wobei
      die beiden kleinen Untereinheiten jeweils ein Fe4S4-Cluster
      unbekannter Funktion beinhalten. Die β-Untereinheit könnte
      aufgrund ihrer Lage in der kürzlich aufgeklärten Struktur den
      Zugang des Substrats an das katalytische Zentrum der
      α-Untereinheit regulieren. An ihrem konservierten Glycinrest
      am C-Terminus der großen Untereinheit wird sie
      posttranslational durch das SAM-abhängige aktivierende Enzym
      BssD aktiviert, wobei ein freies Radikal an einem
      konservierten Glycin-Rest eingeführt wird und ein
      Glycylradikal entsteht. Die Strukturgene bssC, A und B sind
      mit dem Gen für das aktivierende Enzym bssD und weiteren
      Genen unbekannter Funktion in einem Toluol-induzierbaren
      Operon organisiert. Neben Toluol werden andere methylierte
      Kohlenwasserstoffe wie n-Alkane, Cycloalkane, p-Cresol,
      2-Methylnaphthalin, p-Cymol (in Thauera sp. pCyN2) und
      Ethylbenzol durch die Anlagerung von Fumarat für den weiteren
      Abbauweg zu Acyl-CoA-Thioestern aktiviert. Die
      katalysierenden Enzyme werden als Fumarat-addierende Enzyme
      (FAEs) zusammengefasst. Als katalytischer Mechanismus der
      Benzylsuccinat-Synthase-Reaktion wurde die Bildung eines
      enzymgebundenen Substratradikals aus Toluol vorgeschlagen,
      das anschließend mit Fumarat zu einem Produktradikal
      reagiert. Durch die Re-Abstrahierung eines Wasserstoffatoms
      vom katalytischen Cysteinrest Cys493 entsteht im nächsten
      Schritt das Produktradikal. In diesem Projekt sollten weitere
      Informationen über den Reaktionsmechanismus der BSS mittels
      biochemischer und spektroskopischer Analysen erhalten werden.
      Bereits in der Vergangenheit wurden durch EPR-Analysen
      organische Radikale als Reaktionsintermediate identifiziert,
      die aus verschiedenen Substratanaloga hervorgegangen sind. In
      dieser Arbeit wurden die EPR-spektroskopischen Analysen mit
      Benzylalkohol als potenten Inhibitor der BSS, die von Markus
      Hilberg begonnen wurden, fortgesetzt. Dabei wurden Fragen,
      die in der Abhandlung von Hilberg (2013) noch offen geblieben
      sind, beantwortet. Die eindeutige Identifizierung der neuen
      organischen Radikalspezies, die für die Aufklärung des
      Mechanismus der BSS dienlich ist, steht noch aus. Weiterhin
      ist es zum ersten Mal gelungen, in vivo aktivierte BSS
      heterolog bei Inkubation mit Benzoat als Substrat
      überzuproduzieren und BSS-Aktivität im Rohextrakt
      nachzuweisen. Es sollte die Rolle wichtiger Aminosäuren, die
      das katalytische Zentrum der BSS bilden, in Bezug auf die
      Substratspezifität, die Enantiospezifität und den generellen
      Katalysemechanismus des Enzyms aufgeklärt werden. Es wurden
      mehrere Aminosäuren in der Nähe des katalytischen Zentrums
      der α-Untereinheit der BSS mutiert, um das entsprechende
      Enzym in Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 SR7
      überzuproduzieren. Mit den erhaltenen Enzymaktivitäten der
      Extrakte sollten die Enzymaktivitäten und die Nutzung
      verschiedener Substrate jeweils im Vergleich zum
      Wildtyp-Enzym analysiert werden. Um gänzlich auszuschließen,
      dass eine gemessene Aktivität auf das Wildtypenzym
      zurückzuführen ist und um die Rolle der unbekannten Gene
      bssEFGH aufzuklären, wurde das bss-Operon vollständig
      (bssDCABEFGH) und partiell (bssEFGH) erfolgreich deletiert.
      Durch Verwendung von chiralem radioaktiv markiertem (R)-und
      (S)-Toluol mit je einem der drei verschiedenen
      Wasserstoffisotope an der Methylgruppe ist es in dieser
      Arbeit gelungen, die Stereospezifität der
      Benzylsuccinat-Synthase aufzuklären. Bei einer Reaktion
      dieser Substrate mit Fumarat kommt es an der Methylgruppe des
      Toluols zu einer Inversion der Konfiguration.