Μεθοδολογία προσδιορισμού υπολειμμάτων γεωργικών φαρμάκων και βιοδραστικών ουσιών στο σουσάμι και βιοδιαθεσιμότητα συστατικών αυτού
Creators: name: Παπαδάκης, Εμμανουήλ-Νικόλαος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2007
Subjects: Οργανοχλωριωμένα εντομοκτόνα
Εκχύλιση με μικροκύματα
Λιγνάνια
Βιοδιαθεσιμότητα
Περισπέρμιο
Organochlorine pesticides
Microwave-Assisted extraction
Lignans
Bioavailability
Perisperm

description: Το σουσάμι αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους ελαιούχους σπόρους. Ο σουσαμόσπορος και τα παράγωγά του θεωρούνται προϊόντα υψηλής διατροφικής αξίας, τόσο για το υψηλής ποιότητας έλαιό του όσο και για την υψηλής βιολογικής αξίας πρωτεΐνη του. Επίσης, τα λιγνάνια του σουσαμόσπορου έχουν συσχετισθεί με ευεργετικές επιδράσεις στην υγεία. Η γνώση της συμπεριφοράς των ενώσεων αυτών όταν εισέρχονται στον οργανισμό είναι θεμελιώδους σημασίας για την αξιολόγηση της βιοδιαθεσιμότητάς τους. Στην Ελλάδα, το μεγαλύτερο ποσοστό του σουσαμόσπορου εισάγεται από το Σουδάν, την Αιθιοπία και την Ινδία. Στις χώρες αυτές η χρήση των οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων ήταν εκτεταμένη μέχρι και το πρόσφατο παρελθόν λόγω του μικρού τους κόστους. Καθίσταται συνεπώς επιτακτική η ανάγκη εξεύρεσης μεθόδων για την παρακολούθηση της πιθανής παρουσίας υπολειμμάτων οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων στο σουσαμόσπορο που εισάγεται στην χώρα μας. Το πρώτο μέρος της διατριβής αναφέρεται στην ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης εννέα οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων (aldrin, dieldrin, DDT, lindane, heptachlor, endosulfan I και II, endrin, methoxychlor), τριών προϊόντων αποικοδόμησής τους (DDE, endosulfan sulfate, heptachlor epoxide) και τεσσάρων παραπροϊόντων σύνθεσής τους (DDD, α-, β- και δ-HCH) στο σουσαμόσπορο. Η μέθοδος στηρίζεται στην τεχνική της Υποβοηθούμενης Εκχύλισης με Μικροκύματα. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με την χρήση διαλύματος ακετονιτριλίου:νερού σε αναλογία 95:5. Με τη χρήση αυτού του εκχυλιστικού μέσου επιτεύχθηκαν καλές ανακτήσεις και πολύ μικρή παραλαβή λιπαρών ουσιών από το υπόστρωμα. Η διερεύνηση για την εξεύρεση της βέλτιστης θερμοκρασίας έδειξε ότι η εκχύλιση ήταν πιο αποδοτική σε θερμοκρασία 100 oC. Ο ελάχιστος όγκος του εκχυλιστικού μέσου ο οποίος είναι απαραίτητος για υψηλές ανακτήσεις ήταν 40 mL. Ο βέλτιστος χρόνος εκχύλισης ήταν 10 λεπτά. Η απομάκρυνση των συνεκχυλιζόμενων ουσιών του εκχυλίσματος πραγματοποιήθηκε με την χρήση φυσιγγίων τα οποία περιείχαν προσροφητικό υλικό florisil. Η έκλουση των 16 ουσιών που μελετήθηκαν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση μίγματος διαλυτών που αποτελούνταν από εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα σε αναλογία 80:20. Η ανίχνευση των 16 ενώσεων στο εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της αέριας χρωματογραφίας-φασματοσκοπίας μάζας σε συνθήκες επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (SIM). Η απόδοση της μεθόδου αξιολογήθηκε με την ανάλυση δειγμάτων ανάκτησης σε τρία επίπεδα συγκέντρωσης (10, 50 και 500 μg/kg). Οι ανακτήσεις ήταν σε όλες τις περιπτώσεις μεγαλύτερες από 80%, ενώ η επαναληψημότητα της μεθόδου ήταν μικρότερη από 15%. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δειγμάτων σουσαμόσπορου τα οποία εισήχθησαν στην Ελλάδα. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πέντε κυριότερων λιγνανίων του σουσαμόσπορου (σεσαμίνη, σεσαμολίνη, σεσαμινόλη, λαρισιρεσινόλη, πινορεσινόλη) και δύο μεταβολιτών τους (εντεροδιόλη, εντερολακτόνη), καθώς και η πραγματοποίηση πειραμάτων χορήγησης διαφόρων τροφών με βάση τον σουσαμόσπορο και προϊόντων του σε πειραματόζωα, ώστε να διαπιστώσουμε εάν η απορρόφηση των λιγνανίων επηρεάζεται από την μορφή χορήγησης. Η μέθοδος ανάλυσης συνίσταται στα παρακάτω στάδια: α) Υδρόλυση των δειγμάτων αίματος με τη χρήση β-γλυκουρονιδάσης ώστε να απελευθερωθούν οι αγλυκόνες των λιγνανίων. β) Απομόνωση των λιγνανίων από το δείγμα με την χρήση φυσιγγίων με το προσροφητικό υλικό Lichrolut ΕΝ και παραλαβή τους με έκλουση με διάλυμα διχλωρομεθανίου:διαιθυλεθέρα:μεθανόλης (45:45:10). γ) Καθαρισμός του εκχυλίσματος με τη χρήση φυσιγγίων με προσροφητικό υλικό το οποίο έφερε αμινοπρόπυλο-ομάδες. δ) Χρωματογραφικός προσδιορισμός των λιγνανίων με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης με στήλη τύπου C18 και ανιχνευτή παράταξης διόδων (DAD). Η μέθοδος αξιολογήθηκε όσον αφορά την ακρίβεια και την επαναληψημότητά της με δείγματα ανάκτησης σε τρία επίπεδα (50, 200 και 1000 ng/mL) και με πραγματικά δείγματα αίματος με χαμηλή και υψηλή περιεκτικότητα σε λιγνάνια. Ο μέσος όρος των ανακτήσεων της κάθε ουσίας κυμάνθηκε από 74 έως 98% με σχετική τυπική απόκλιση μικρότερη από 11%. Η μελέτη της απορρόφησης των λιγνανίων από τον οργανισμό πραγματοποιήθηκε σε πρώτο στάδιο με τη χορήγηση μίας δόσης τροφής βασισμένης σε σουσαμόσπορο ή ταχίνι σε πειραματόζωα και προσδιορισμό της συγκέντρωσης των λιγνανίων στο αίμα σε διάστημα 24 ωρών από το πέρας της χορήγησης. Παρατηρήθηκε ότι τα λιγνάνια του σουσαμόσπορου παρουσίασαν την μέγιστη συγκέντρωσή τους σε διάστημα 4 έως 8 ωρών από τη χορήγηση. Στα πειραματόζωα που χορηγήθηκε ταχίνι οι συγκεντρώσεις που ανιχνεύτηκαν ήταν υψηλότερες εκτός από την σεσαμολίνη. Στις 24 ώρες, η συγκέντρωση των λιγνανίων του σουσαμόσπορου ήταν μικρή ενώ αυτή των μεταβολιτών τους πολύ υψηλή. Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις για τους δύο μεταβολίτες ανιχνεύτηκαν στα πειραματόζωα που χορηγήθηκε ταχίνι. Σε δεύτερο στάδιο, χορηγήθηκαν τροφές με βάση το σουσαμόσπορο, το ταχίνι, το σουσαμέλαιο, το περισπέρμιο του σπόρου και ένα πολυφαινολικό εκχύλισμα από το περισπέρμιο για χρονικό διάστημα 15 ημερών. Στην συνέχεια προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση των λιγνανίων στο αίμα των πειραματόζωων. Παρατηρήθηκε ότι στα πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκε τροφή βασισμένη στο περισπέρμιο η συγκέντρωση της εντεροδιόλης και της εντερολακτόνης ήταν πολύ υψηλότερη απ' ό,τι θα αναμενόταν με βάση τη συγκέντρωση των πρόδρομων ουσιών
description: Sesame is one of the most important oilseeds. The food products that are based on sesame seeds are considered to be of high nutritional value due to the high quality oil and protein that they contain. Furthermore, sesame lignans have been shown to have beneficial effects on human health. Knowledge of the fate of those compounds when they enter the organism is important for the assessment of their bioavailability. The majority of the sesame seeds imported in Greece come from Sudan, Ethiopia and India. In those countries, the use of organochlorine pesticides was extensive due to their low cost. Thus, there is a need for the development of analytical methods used in the monitoring of organochlorine pesticides in the sesame seeds imported in Greece. In the first section of the present thesis, a method for the multiresidue analysis of 16 organochlorine insecticides in sesame seeds has been developed. The method is based on the Microwave-Assisted Extraction (MAE) of the sesame seeds by the use of a water-acetonitrile mixture followed by florisil clean-up of the extracts and subsequent analysis by GC/MS in the SIM mode. MAE operational parameters (extraction solvent, temperature and time, extractant volume) have been optimized with respect to extraction efficiency of the target compounds from sesame seeds with 46% oil content. Recoveries &gt;80% with %RSD &lt;12% have been obtained for all compounds under the selected parameters. The florisil clean-up step has proved sufficient for the removal of co-extracted substances so that no adverse effect on the chromatographic system was observed. LOQ values are in the range of 5-10 μg/kg. The proposed method has been applied in the analysis of sesame seed samples imported to Greece. In the second section of the thesis, a method has been developed for the determination of the sesame lignans sesamin, sesamolin, sesamolinol, lariciresinol, pinoresinol and their microbial derivatives enterodiol and enterolactone (enterolignans), in rat plasma. Furthermore, feeding experiments have been conducted by the administration of various experimental diets based on sesame seeds and products to elucidate whether lignan absorption is influenced by the form of the experimental diet. The method is based on the Solid-Phase Extraction of the plasma samples after their initial hydrolysis by β-glucuronidase, and subsequent cleanup by aminopropyl cartridges for the removal of interfering substances. The final determination is carried out by HPLC-DAD on a C18 column. Recoveries of the target analytes are above 70% and the intra- and inter-assay precision is lower than 15% in both low- and high-lignan concentration plasma samples. The effect of different forms of sesame-based diets on the concentrations of plasma lignans was assayed by estimating the levels of sesame lignans and enterolignans in the plasma of experimental animals. In a series of experiments, male Wistar rats were fed with either a raw sesame-enriched diet or a tehineh-enriched diet. The plasma concentrations of sesame lignans and enterolignans were determined at various time intervals over a 24-hour period after a single administration. Enterodiol and enterolactone concentrations in the tehineh-treated group were significantly higher than in the raw sesame-treated group. In another series of experiments, male Wistar rats were fed, for 15 days, with diets enriched in raw hulled sesame, sesame perisperm, sesame oil, tehineh and a polyphenol-rich fraction derived from the seed perisperm. Enterodiol and enterolactone plasma concentrations were high in the case of the sesame perisperm in spite of its low concentration in the assessed sesame lignans. Overall, the levels of the sesame and mammalian lignans present in plasma seem to be influenced not only by the lignan intake but also by other factors such as the form of the sesamebased diet