Ανάπτυξη και χαρακτηρισμός εύκαμπτων και εκτυπωμένων ηλεκτροχημικών ανοσοαισθητήρων με σκοπό την ανίχνευση καρδιακής Τροπονίνης T (cTnT)
Creators: name: Γραμματικός, Στυλιανός-Νεκτάριος Αγγελή
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Ηλεκτροχημικός ανοσοαισθητήρας
Εκτυπωμένα ηλεκτρόδια
Καρδιακή Τροπονίνη T
Νανοσωματίδια χρυσού
Electrochemical immunosensor
Screen printed electrodes (SPEs)
Cardiac Troponin T (cTnT)
Gold nanoparticles (AuNPs)

description: Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία πραγματεύεται την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισμό εύκαμπτων και εκτυπωμένων ηλεκτροχημικών ανοσοαισθητήρων, με σκοπό την ανίχνευση καρδιακής τροπονίνης T (cTnT). Αρχικά, πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός ηλεκτροχημικών μορφοτροπέων 3 ηλεκτροδίων, και κατασκευή τους μέσω της τεχνικής εκτύπωσης οθόνης (screen printing). Κατά σειρά, εκτυπώθηκαν οι επαφές Ag των ηλεκτροδίων, το Ag/AgCl ηλεκτρόδιο αναφοράς (RE), το carbon ηλεκτρόδιο εργασίας (WE) και βοηθητικό ηλεκτρόδιο (CE), και τέλος το διηλεκτρικό στρώμα, οριοθετώντας το ηλεκτροχημικό κελί του βιοαισθητήρα και μονώνοντας τμήμα των αγώγιμων μονοπατιών των επαφών. Ολοκλήρωση της κατασκευής του ανοσοαισθητήρα επήλθε με την κατάλληλη βιολειτουργικοποίηση της επιφάνειας του WE. Συγκεκριμένα, εναποτέθηκαν με ρίψη σταγόνας κατά σειρά, κατάλληλες ποσότητες ιοντικού υγρού κρυστάλλου (ILC) Br-Py ως redox probe, βιολειτουργικοποιημένων νανοσωματιδίων χρυσού (AuNPs) με αντισώματα της καρδιακής τροπονίνης T (ab-cTnT) ως πλατφόρμα ακινητοποίησης αντιγόνων cTnT (ag-cTnT), και γλυκίνης, ως στρώμα μπλοκαρίσματος των μη ειδικών σημείων πρόσδεσης στην επιφάνεια του WE. Η ταυτοποίηση της δομής του Br-Py έγινε μέσω 1H-NMR, ενώ η επιβεβαίωση της δράσης του ως redox probe, μέσω μετρήσεων κυκλικής βολταμμετρίας (CV) και βολταμμετρίας τετραγωνικού παλμού (SWV). Τα AuNPs συντέθηκαν μέσω της μεθόδου χημικής αναγωγής. Πιο συγκεκριμένα, συντέθηκαν Turkevich AuNPs με χρήση κιτρικού νατρίου (TCD) ως αναγωγικό παράγοντα, και στη συνέχεια τροποποιήθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις της αμινοθιόλης κυστεαμίνης, προκειμένου να αποκτήσουν αμινομάδες στην επιφάνειά τους. Τα Cys-modified Turkevich AuNPs με τη χαμηλότερη συγκέντρωση κυστεαμίνης (0.5 μM) δεν εμφάνισαν σημαντική συσσωμάτωση, με αποτέλεσμα την επιλογή τους για βιολειτουργικοποίηση στη συνέχεια, με προσθήκη ποσότητας EDC/NHS activated ab-cTnT. Ακόμα, συντέθηκαν Chitosan AuNPs, με χρήση χιτοζάνης ταυτόχρονα ως αναγωγικού και επιφανειοδραστικού παράγοντα, όπου δοκιμάστηκαν τρεις συγκεντρώσεις της (0.1%, 0.25% &amp; 0.4% w/v). Στην περίπτωση αυτή, η βιολειτουργικοποίηση έγινε με απευθείας προσθήκη κατάλληλης ποσότητας ab-cTnT στο διάλυμα 0.25% w/v Chit-AuNPs που επιλέχθηκε. Τα συνθεμένα AuNPs χαρακτηρίστηκαν μέσω μετρήσεων φασματοσκοπίας απορρόφησης (UV-Vis), όπου επιβεβαιώθηκε η πλασμονική τους συμπεριφορά, μέσω δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) για προσδιορισμό υδροδυναμικού μεγέθους (dh), δείκτη πολυδιασποράς (PDI) και z-δυναμικού τους, και μέσω μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων (AFM) για τον προσδιορισμό του μεγέθους και σχήματός τους. Ακολούθως, οι ηλεκτροχημικοί ανοσοαισθητήρες μελετήθηκαν στα διαφορετικά στάδια κατασκευής τους μέσω μετρήσεων CV και SWV, επιβεβαιώνοντας την ορθή λειτουργία των επιμέρους τμημάτων που τους απαρτίζει. Αξιολογήθηκαν, ακόμα, ως προς την αναλυτική απόδοσή τους, με προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης (LoD), του εύρους γραμμικότητας και της ευαισθησίας τους, μετά από επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS (0.01 M, pH=7.4), διαφορετικών συγκεντρώσεων ag-cTnT, για ~15 λεπτά. Η καμπύλη βαθμονόμησης παρουσίασε γραμμικότητα στην περιοχή 0.2 – 1.0 ng/ml, και το LoD υπολογίστηκε στα ~0.19 ng/ml, που είναι χαμηλότερο από το κριτήριο διάγνωσης οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου (AMI) στα ≥ 0.3 ng/ml, συνεπώς το σύστημα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έγκαιρη ανίχνευση της συγκεκριμένης πάθησης. Τέλος, παρουσιάζεται μια πρόταση ενσωμάτωσης των εκτυπωμένων ανοσοαισθητήρων σε έναν φορητό ηλεκτροχημικό αναλυτή, όπου προτείνεται η χρήση ενός smartwatch ως μονάδα επεξεργασίας, με σκοπό τη δημιουργία ενός PoC συστήματος πρόληψης του AMI.
description: The present diploma thesis deals with the development and characterization of flexible and printed electrochemical immunosensors, aiming to detect the cardiac troponin T (cTnT). First, the 3-electrode electrochemical transducers were designed, and fabricated via screen printing process. Initially, the Ag contacts of the electrodes were printed, followed by the Ag/AgCl reference electrode (RE), the carbon working electrode (WE) and counter electrode (CE) and finally the dielectric layer, delimiting the electrochemical cell of the biosensor and insulating part of the conductive paths of the contacts simultaneously. The immunosensor construction was completed with the appropriate functionalization of the WE surface via drop casting. In particular, appropriate quantities of the ionic liquid crystal (ILC) Br-Py used as an electrochemical redox probe were deposited, followed by deposition of gold nanoparticles (AuNPs) biofunctionalized with cardiac troponin T antibodies (ab-cTnT) as cTnT antigen (ag-cTnT) immobilization platform, and finally deposition of glycine, as a blocking layer for non-specific binding sites onto the WE surface. The Br-Py structure was verified by 1H-NMR, while its activity as an electrochemical redox probe was confirmed by cyclic voltammetry (CV) and square-wave voltammetry (SWV) measurements. AuNPs were synthesized using the chemical reduction method. More specifically, Turkevich AuNPs were synthesized using sodium citrate (TCD) as reducing agent, and then modified with different concentrations of the aminothiol cysteamine, in order for the NPs to obtain amino groups onto their surface. Cys-modified Turkevich AuNPs with the lowest cysteamine concentration (0.5 μM) did not show significant aggregation and thus were selected for subsequent biofunctionalization with the addition of EDC/NHS activated ab-cTnT. Furthermore, Chitosan AuNPs were synthesized, with chitosan acting both as a reducing and stabilizing agent, where three concentrations (0.1%, 0.25% and 0.4% w/v) were tested. In this case, the biofunctionalization was performed by directly adding appropriate amount of ab-cTnT solution, to the selected 0.25% Chit-AuNPs selected solution. The synthesized AuNPs were characterized by UV-Vis spectroscopy, where their plasmonic behavior was confirmed, by dynamic light scattering (DLS) in order to determine their hydrodynamic diameter (dh), polydispersity index (PDI) and z-potential, and by atomic force microscopy (AFM), to specify their size and shape. The electrochemical immunosensors were studied in their different construction steps through CV and SWV measurements, verifying the expected properties of the individual components they consist of. They were also evaluated with regard to their analytical performance, by determining their limit of detection (LoD), linear region and sensitivity, after incubation with different concentrations of the ag-cTnT in PBS buffer (0.01 M, pH=7.4) for ~15 mins. The calibration curve showed linearity in the range of 0.2 - 1.0 ng/ml, while the LoD was calculated at ~0.19 ng/ml, which is lower than the criterion for the diagnosis of acute myocardial infarction (AMI) at ≥ 0.3 ng/ml, therefore this system can be used for the early detection of this condition. Finally, a proposal to integrate the printed immunosensors into a portable electrochemical analyzer is presented, proposing the use of a smartwatch as a processing unit, in order to create an AMI-specified PoC system.