title: The Role of the avian PB1 gene in the emergence of pandemic Influenza viruses
title: Die Rolle des aviären PB1 Gens bei der Entstehung pandemischer Influenza-A-Viren
Creators: name: Wendel, Isabel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: virale Transmission
Pandemie
Grippe
PB1 Gen
viral transmission
replication efficiency
PB1 gene
Replikationseffizienz
Biowissenschaften, Biologie

description: The 1957 and 1968 pandemic
      influenza viruses emerged via reassortment and contained HA
      and PB1 gene segments of avian origin. It is well known that
      the acquisition of an antigenically novel avian HA allowed
      the emerging virus to overcome pre-existing immunity in the
      human population. At the same time, the biological
      significance of the presence of the avian PB1 in pandemic
      influenza viruses remains elusive. In this work we wished to
      address this longstanding question, and to determine whether
      avian PB1 provided pandemic influenza viruses with some
      replicative advantage in humans. In the first part of the
      thesis, I modelled the reassortment event that led to the
      emergence of the 1968 pandemic influenza virus from its avian
      and human precursors. Using human H2N2 virus
      A/California/1/66 (Cal66), two recombinant Cal66 virus pairs
      were generated, in which the human-origin PB1 and/or HA gene
      segments were substituted by corresponding avian-like gene
      segments of the pandemic strain A/Hong Kong/1/68 (HK68). To
      test, whether avian PB1 facilitated viral replication and
      transmission of the pandemic virus, competitive replication
      experiments in human bronchial epithelial cells (Calu-3), as
      well as competitive contact transmission experiments in
      guinea pigs were performed. Viral competition in Calu-3 cells
      was studied by making consecutive passages starting from a
      1:1 mixture of viruses and determining composition of the
      passage 3 material by sequencing. In addition competitive
      rescue experiments were performed by transfecting cells with
      a whole set of reverse genetics plasmids which included a 1:1
      mixture of PB1Cal and PB1HK plasmids. The composition of
      rescued virus mixtures was determined by sequencing. To study
      contact transmission efficiency of the viruses, a group of
      four guinea pigs was inoculated with an equal mixture of
      viruses. One day post-infection (p.i.) four naïve animals
      were co-housed with infected animals and at different days
      p.i. nasal washes were taken and characterized by sequencing.
      These studies demonstrated, that avian PB1 enhances viral
      replication independently of the origin of the HA gene
      segment, possibly due to an enhanced viral polymerase
      activity. The human-adapted avian PB1 of the 1968 pandemic
      virus differed from the avian consensus sequence by three
      amino-acid substitutions. In the second part of the thesis, I
      determined whether these three substitutions affected viral
      polymerase fidelity during the emergence of the pandemic
      virus. To this end, I generated recombinant HK68 viruses,
      which contained either individual mutations back to the avian
      consensus sequence or a combination of all three mutations.
      The mutation frequency of the triple mutant was slightly
      enhanced in comparison to that of the original HK68 virus. By
      contrast, two of the three tested single mutants
      (rHK-PB1HK-V212L and rHK-PB1HK-K327R) showed a significantly
      enhanced mutation frequency. These results suggest that
      mutation(s) in PB1 that emerged during the avian-to-human
      transmission could decrease fidelity of the polymerase, and
      that the polymerase fidelity was later restored by additional
      mutation(s). This scenario would agree with the generally
      accepted hypothesis that a temporary decrease in fidelity
      could provide selective advantage for zoonotic transmission
      and that the fidelity is restored as soon as the virus
      becomes adapted to a new host species. In summary, data
      obtained in this thesis demonstrate for the first time that
      the avian-origin PB1 of the pandemic 1968 virus served to
      promote viral replication and transmission. In addition, our
      results suggest that a temporarily reduced polymerase
      fidelity could have facilitated human adaptation of the
      emerging pandemic virus.
description: Die pandemischen Influenza-Viren
      von 1957 und 1968 sind durch Reassortierung entstanden und
      tragen neben einem Hämagglutinin ebenfalls ein PB1-Gensegment
      aviären Ursprungs. Für das Hämagglutinin ist seit langem
      bekannt, dass Änderungen in dessen Epitopen entstehenden
      pandemischen Influenza-Viren ermöglichen der humanen
      Immunantwort zu entgehen. Im Gegensatz dazu ist die
      biologische Signifikanz des aviären PB1 bei der Entstehung
      pandemischer Influenza-Viren bislang noch ungeklärt. Ziel
      dieser Arbeit war es, diese seit langem bestehende
      Fragestellung zu untersuchen und aufzuklären, ob das aviäre
      PB1-Gen pandemischen Influenza-Viren einen replikativen
      Vorteil in humanen Zellen unterbreitet. Im ersten Teil dieser
      Arbeit wurde die Reassortierung, welche zur Entstehung des
      pandemischen Virus von 1968 führte, mit Hilfe der Gensegmente
      aviärer und humaner Vorläuferviren modelliert. Ausgehend von
      dem humanen H2N2 Vorläufervirus A/California/1/66 (Cal66)
      wurden zwei rekombinante Cal66-Viruspaare generiert, deren
      Viren sich lediglich im Ursprung des PB1-Gensegments
      unterscheiden (PB1Cal oder PB1HK) und die entweder das humane
      HA des Cal66-Virus oder das aviäre HA des pandemischen A/Hong
      Kong/1/68 (HK68) Virus enthalten. Um zu untersuchen, ob das
      aviäre PB1 die virale Replikations- und
      Transmissionseffizienz des pandemischen HK68-Virus steigerte,
      wurden kompetitive Infektionen in humanen
      Bronchial-Epithelzellen (Calu-3), sowie kompetitive
      Kontaktübertragungsstudien in Meerschweinchen durchgeführt.
      Für die kompetitiven Infektionen wurden zum einen 1:1
      Mischungen von Viren mit aviärem (PB1HK) und humanem PB1
      (PB1Cal) über drei Passagen in Calu-3-Zellen passagiert und
      die Zusammensetzung der nach Passage 3 erhaltenen
      Virusmischungen mittels Sanger-Sequenzierung bestimmt. Zum
      anderen wurden Viren, welche sich im PB1-Gensegment
      unterscheiden, mittels reverser Genetik kompetitiv generiert.
      Hierfür wurden Zellen mit einem kompletten Set reverser
      Genetik-Plasmide, sowie einer 1:1 Mischung der Plasmide
      PB1Cal und PB1HK transfiziert und die Zusammensetzung der
      erhaltenen Virusmischung mittels Sequenzierung bestimmt. Um
      die Kontaktübertragungseffizienz von Viren mit aviärem PB1 zu
      untersuchen, wurde eine Gruppe von vier Meerschweinchen mit
      einer 1:1 Mischung der Viren rCal-HAHK und rCal- (HA+PB1)HK
      infiziert. Einen Tag nach Inokulation wurden die inokulierten
      Tiere mit vier naiven Kontakttieren in Kontakt gebracht und
      an verschiedenen Tagen nach Inokulation wurden Nasenspülungen
      durchgeführt, die gesammelt und mittels Sequenzierung
      charakterisiert wurden. Im Rahmen der kompetitiven
      Replikationsstudien zeigte sich, dass Viren mit aviärem PB1,
      unabhängig vom Ursprung des HA-Gensegments, effizienter
      replizieren. Zudem wiesen humane Polymerasekomplexe mit
      aviärem PB1 eine erhöhte Polymerase-Aktivität auf, welche die
      beobachtete erhöhte virale Replikationseffizienz bedingen
      könnte. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des
      aviären PB1 auf die virale Polymerase- Genauigkeit
      untersucht. Für das human-adaptierte aviäre PB1 des
      pandemischen HK68 Virus wurde beobachtet, dass dieses sich in
      drei human-adaptiven Mutationen von der aviären
      Konsensus-Sequenz unterscheidet. Um zu untersuchen, ob diese
      adaptiven Mutationen die Polymerase-Genauigkeit des
      entstehenden pandemischen Virus beeinflusst haben, wurden
      rekombinante HK68-Viren hergestellt, welche ein PB1
      enthielten, das entweder an allen drei oder an einzelnen
      Aminosäure-Positionen die aviäre Konsensus-Sequenz aufwies.
      Für die Dreifach-Mutante mit aviär-ähnlichem PB1 war zu
      beobachten, dass diese gegenüber dem pandemischen HK68-Virus
      eine geringfügig erhöhte Mutations-Frequenz aufwies, während
      die Einzelmutanten rHK-PB1HK-V212L und rHK-PB1HK-K327R eine
      deutlich erhöhte Mutations- Frequenz zeigten. Diese Daten
      lassen vermuten, dass zunächst eine bzw. mehrere adaptive
      Mutationen die Polymerase-Genauigkeit der initialen
      Reassortante herabsetzten, während nach Adaptation der
      Reassortante an den Menschen durch Erwerb einer bzw. weiterer
      Mutationen die Polymerase-Genauigkeit wiederhergestellt
      wurde. Dieses Szenario würde mit der weithin akzeptierten
      Hypothese übereinstimmen, nach der zeitweilig reduzierte
      Polymerase-Genauigkeiten zu einer breiten
      Quasispezies-Diversität führen und somit zoonotischen Viren
      eine effiziente Adaptation an die neue Wirtsspezies
      ermöglichen. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit
      gezeigt werden, dass das aviäre PB1-Gen des pandemischen
      HK68-Virus sowohl die virale Replikationseffizienz, als auch
      die virale Übertragungseffizienz, vermutlich in Folge einer
      erhöhten Polymerase-Aktivität steigerte. Zudem könnte eine
      zeitweilig reduzierte Polymerase-Genauigkeit die Adaptation
      der initialen Reassortante an den Menschen erleichtert und
      damit zur Entstehung der Pandemie von 1968 beigetragen
      haben.