title: Regulation des anaeroben Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in Aromatoleum aromaticum EbN1
title: Regulation of anaerobic hydrocarbon degradation in Aromatoleum aromaticum EbN1
Creators: name: Muhr, Enrico
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Two-component sytem
Mikrobiologie
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Bioreporter , Zweikomponentensysteme
Regulation , Kohlenwasserstoffe
hydrocarbon
Micobiology , Regulation

description: Das genomsequenzierte
      β-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum Stamm EbN1 und
      einige verwandte Arten weisen die ungewöhnliche
      Stoffwechselaktivität des anaeroben Abbaus von
      Kohlenwasserstoffen sowie phenolischen Verbindungen auf.
      Hierfür besitzt A. aromaticum mehrere sehr
      substratspezifische Stoffwechselwege. Trotz der starken
      chemischen Ähnlichkeit einiger Verbindungen, erfolgt die
      spezifische Induktion der katabolischen Enzyme ausschließlich
      in Anwesenheit des jeweiligen Substrates und nicht durch
      chemisch analoge Verbindungen. Mittelpunkt dieses
      Promotionsprojektes war der Mechanismus der spezifischen
      Sensierung von Kohlenwasserstoffen und phenolischen
      Substraten, sowie die Regulation der Induktion der jeweiligen
      Abbauwege. Durch die Kombination aus neu entwickelten und
      bereits etablierten biochemischen und molekularbiologischen
      Methoden, wurde eindeutig gezeigt, dass Ethylbenzol und
      p-Ethylphenol, trotz ihrer starken chemischen Ähnlichkeit,
      durch zwei vollständig getrennte Abbauwege mit spezifisch
      induzierten Enzymen metabolisiert werden. Hierfür wurden
      Kulturen des Stammes EbN1 unter denitrifizierenden
      Bedingungen neben Ethylbenzol und p-Ethylphenol auch auf
      Acetophenon, einem wichtigen Zwischenprodukt des anaeroben
      Ethylbenzolstoffwechsels, kultiviert. Die Messung der
      Aktivitäten aller beteiligten Enzyme, der Häm-Färbungen sowie
      der Immun- und Biotin-Blot-Analysen ermöglichten die
      Identifizierung und Differenzierung der Enzyme der beiden
      anaeroben Abbauwege. Weiterhin wurden Lücken des postulierten
      p-Ethylphenolabbauweges durch neu identifizierte Enzyme
      geschlossen. Zu den identifizierten Enzymen gehörte unter
      anderem eine Biotin-abhängige
      p-Hydroxyacetophenon-Carboxylase. Das aromatische Keton
      Acetophenon, Intermediat des anaeroben Ethylbenzolabbaus,
      kann durch A. aromaticum sowohl unter anaeroben als auch
      aeroben Bedingungen über eine ATP-abhängige
      Acetophenon-Carboxylase (ApcABCDE) metabolisiert werden. Um
      die Bedingungen genauer zu analysieren, unter denen das
      apc-bal Operon exprimiert ist, wurde ein Reporterstamm mit
      einem fluoreszierenden mCherry-Protein konstruiert. Dieser
      bildete die Grundlage für die Entwicklung eines spezifischen
      Acetophenon Bioreportersystems. Zu diesem Zweck, wurde eine
      Fusion des mCherry Gens mit dem ersten Gen des Operons (apcA)
      erstellt und in das Chromosom von A. aromaticum integriert.
      Die Expression dieses Fusionsproteins sowie dessen
      Fluoreszenzaktivität entsprach dem Expressionsmuster der
      Enzyme des Acetophenonmetabolismus. Zum anderen wurde
      nachgewiesen, dass die zugesetzte Acetophenonkonzentration,
      in einem Bereich von 25 bis 250 μM, proportional zur
      produzierten Menge an ApcA-mCherry war. Mit Ausnahme der
      beiden 1-Phenylethanol Enantiomere, welche von A. aromaticum
      leicht zu Acetophenon umgesetzt werden können, zeigten alle
      getesteten chemisch analogen Verbindungen keine oder deutlich
      schwächere Signale. Ein weiterer Teil dieser Dissertation
      betraf die Analyse des adiRS Operons, das für ein
      Zweikomponenten-Regulationssystem (TCS) kodiert, welches
      wahrscheinlich die Acetophenon-abhängige Induktion des
      apc-bal Operons in A. aromaticum reguliert. Hierfür wurde
      durch homologe Rekombination eine Chloramphenicol-resistente
      Mutante konstruiert, bei der die adiRS Gene deletiert wurden.
      Entgegen den Erwartungen wuchs die adiRS Deletionsmutante
      noch immer mit Acetophenon und Ethylbenzol. Allerdings wurden
      reduzierte Acetophenon-Carboxylase-Aktivitäten in Extrakten
      dieser Kulturen nachgewiesen. Überraschenderweise zeigte die
      Mutante zudem ungewöhnliche Induktionsmuster der EbDH und
      zwei paraloger Biotin-Carboxyl-Carrier-Proteine (XccB und
      XccB2), welche in Acetophenon- bzw. Ethylbenzol-abbauenden
      Zellen des Wildtyp-Stammes nicht induziert sind. Die
      Komplementation der adiRS Gene auf einem Plasmid führte nur
      zu einem teilweisen Ausgleich der beobachteten Abweichungen
      und nicht zum Phänotyp des Wildtyps. Weiterhin wurde das
      bereits beschriebene apcA-mCherry Reporterkonstrukt in das
      Chromosom der Deletionsmutante integriert. Die ermittelten
      Ergebnisse gaben Indizien für eine zeitverzögerte und
      verminderte Expression der apcA-mCherry Fusion, wenn die
      adiRS Gene deletiert waren. Die erhaltenen Daten sind
      konsistent mit der Annahme, dass die Acetophenon-abhängige
      Induktion des apc-bal Operons neben dem AdiRS-System
      möglicherweise durch ein zweites parallel wirkendes TCS
      beeinflusst wird. Ein möglicher Kandidat sind die xdiRS
      Genprodukte, welche hohe Ähnlichkeit zu AdiRS aufweisen.
      Abschließend wird ein vorläufiges Modell zur potentiellen
      Rolle der beiden TCS AdiRS und XdiRS in der Substraterkennung
      und -unterscheidung in A. aromaticum Stamm EbN1 vorgestellt.
      Schließlich wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von
      Primer-Extension-Analysen erstmals putative
      Transkriptionsstartpunkte für die am anaeroben Ethylbenzol-
      und Acetophenonabbau beteiligten Operons experimentell
      ermittelt. Den identifizierten Startpunkten, wurden durch den
      Vergleich mit Konsensussequenzen σ70-abhängiger Promotoren
      putative -35 und -10 Regionen zugeordnet. Im Falle des
      apc-bal Operons könnten der umfangreiche 5‘-untranslatierte
      Bereich und die vorhergesagte Sekundärstruktur mit einer
      berechneten minimalen freien Energie von -61,4 kcal mol-1 ein
      Indiz dafür sein, dass diese RNA-Struktur an der
      transkriptionellen oder translationellen Regulation beteiligt
      ist.
description: The genome-sequenced Aromatoleum
      aromaticum strain EbN1 and several related β-proteobacterial
      genera have the unusual metabolic capability of degrading
      aromatic hydrocarbons as well as phenolic compounds under
      anaerobic conditions. A. aromaticum possesses numerous highly
      substrate-specific metabolic pathways which are activated
      only in the presence of the respective substrate and not by
      chemically analogous compounds that leads to the induction of
      highly specific and interesting catabolic enzymes. Focus of
      this PhD Thesis was the investigation of the mechanism of
      specific sensing of hydrocarbons and phenolic substrates as
      well as the metabolic regulation of induction of the
      respective Degradation pathways. By the combination of newly
      developed and already established biochemical and molecular
      biological methods, it was possible to show that, despite
      having a very similar chemical structure, ethylbenzene and
      p-ethylphenol were metabolized by completely separate
      pathways with specifically induced enzymes. Therefore,
      cultures of strain EbN1 were grown under denitrifying
      conditions on ethylbenzene, p-ethylphenol and acetophenone as
      important intermediate in the anaerobic ethylbenzene
      metabolism. The results of all determined Enzyme activities,
      heme-staining as well as immuno- and biotin-blotting analyses
      allowed the identification and differentiation of the key
      enzymes involved in both anaerobic Degradation pathways.
      Additionally, the proposed p-ethylphenol degradation pathway
      was substantiated by newly identified enzymes including a
      novel biotin-dependent p-hydroxyacetophenone carboxylase. The
      aromatic ketone acetophenone, an intermediate of anaerobic
      ethylbenzene degradation, is metabolized by A. aromaticum
      either anaerobically or aerobically by an ATP-dependent
      acetophenone carboxylase (ApcABCDE). A mCherry reporter
      strain was constructed to study the conditions under which
      the genes encoding the carboxylase were expressed. This
      Reporter strain provides a basis for the development of a
      specific acetophenone bioreporter system. For this purpose, a
      gene fusion of the mCherry gene and the first gene of the
      apc-bal operon (apcA)was created and integrated into the
      chromosome of A. aromaticum. It could be shown that the
      induction of the fusion protein and its fluorescence activity
      responded consistently with the expression pattern of the
      acetophenone-metabolic enzymes. Furthermore, the recorded
      amounts of ApcA-mCherry production were proportional to the
      applied acetophenone concentrations within a range of 25 to
      250 μM. With the exception of both 1-phenylethanol
      enantiomers which are easily converted to acetophenone by A.
      aromaticum, all further tested analogous compounds showed a
      significantly weaker signal response or none at all.
      Furthermore, this thesis investigates the adiRS operon
      encoding a two-component regulatory system which was proposed
      to regulate the acetophenone-dependent induction of the
      apc-bal operon in A. aromaticum. Therefore, a chloramphenicol
      resistant deletion mutant lacking the adiRS operon was
      constructed by homologous recombination. In contrast to the
      expectations, the adiRS gene deletion strain still grew on
      acetophenone and ethylbenzene. However, reduced acetophenone
      carboxylase activities were detectable in extracts of these
      cultures. Surprisingly, the mutant strain showed uncommon
      induction of EbDH and two paralogous biotin-containing
      carrier proteins (XccB and XccB2) which are not induced in
      the wildtype strain grown on acetophenone or ethylbenzene,
      respectively. Restoring the adiRS genes in trans only
      resulted in a partial reversal of the observed deviations.
      Moreover, a mCherry reporter strain lacking the adiRS operon
      was constructed as described above. The results indicated a
      probable timedelayed and decreased expression of the
      apcA-mCherry gene fusion in the reporter strain lacking the
      genes encoding AdiRS. The obtained data led to the
      assumption, that acetophenonedependent induction of the
      apc-bal operon is possibly mediated by a second two-component
      regulatory system (XdiRS) closely related to AdiRS. Finally,
      this study presents a tentative model of the potential role
      of the AdiRS and XdiRS regulatory systems in substrate
      recognition and discrimination in A. aromaticum strain EbN1.
      Finally, it was possible to map putative transcription start
      sites of the catabolic operons involved in the anaerobic
      ethylbenzene and acetophenone degradation by using primer
      extension Analysis for the first time experimentally.
      Upstream of all determined starting points putative -35 and
      -10 boxes could be identified by comparison with consensus
      sequences of σ70-dependent promoters. In case of the apc-bal
      operon an extensive 5’-untranslated region and the predicted
      secondary structure with a calculated minimum free energy of
      -61.4 kcal mol-1 could indicate that this RNA structure has
      an influence on transcriptional or translational
      regulation.