In vitro χαρακτηρισμός της αντιμικροβιακής και κυτταροτοξικής δράσης του χημικού παράγοντα S-(3,4-Dichlorobenzyl)isothiourea hydrochloride [Α22], ως αναστολέα της κυτταροσκελετικής πρωτεΐνης MreB
Creators: name: Κοτζιαλάμπου, Αναστασία Σπυρίδωνος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Νέοι αντιμικροβιακοί παράγοντες
Κυτταροσκελετική πρωτεΐνη MreB
S-(3,4-Dichlorobenzyl)isothiourea hydrochloride
Novel antimicrobial compounds
Cytoskeletal protein MreB

description: Η εμφάνιση και η ραγδαία εξάπλωση πολύ-ανθεκτικών παθογόνων προκάλεσε σοβαρή ανησυχία όσο αφορά τη χημειοθεραπεία των βακτηριακών λοιμώξεων και η εύρεση νέων αντιμικροβιακών παραγόντων με εναλλακτικούς στόχους κρίνεται επιτακτική. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν ο in vitro χαρακτηρισμός της αντιμικροβιακής και κυτταροτοξικής δράσης του χημικού παράγοντα S-(3,4-Dichlorobenzyl)isothiourea hydrochloride (Α22), ως αναστολέα της κυτταροσκελετικής πρωτεΐνης MreB. Η αντιμικροβιακή δράση του Α22 μελετήθηκε στα Gram αρνητικά παθογόνα βακτήρια Pseudomonas aeruginosa (NCIMB 12469), Pseudomonas A1, Escherichia coli (NCIMB 8879), Shigella flexneri (ATCC 12022), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) και στο Gram θετικό Bacillus subtilis (NCIMB 3610), σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014). Προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις MIC/MBC και ακολούθησε φαρμακοδυναμική μελέτη του Α22 σε πλαγκτονικά κύτταρα. Διερευνήθηκε η βακτηριοκτόνος δράση του σε επαγόμενο βακτηριακό βιοφίλμ ενώ παράλληλα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του με καλώς χαρακτηρισμένες αντιμικροβιακές ουσίες, η επίδραση του στη διαδικασία της σπορίωσης αλλά και η ικανότητα των βακτηριακών στελεχών να αναπτύξουν ταχεία αντίσταση σε αυτό. Τέλος, μελετήθηκε η κυτταροτοξικότητα του A22 σε ευκαρυωτικές κυτταρικές σειρές (Vero, Caco-2, HuH-7) με τις δοκιμασίες ΜΤΤ και Neutral Red. Το Α22 προκάλεσε δόσο-εξαρτώμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και χρόνο-εξαρτώμενη βακτηριοκτόνο δράση, με τιμές MIC από 2 έως 32 μg/ml. Παρουσίασε μετά-αντιβιοτική δράση (PAE) 2 ωρών στη συγκέντρωση 5xMIC και οδήγησε σε μετατροπή των ραβδόμορφων κυττάρων σε σφαιρικά. Εκδήλωσε συνέργεια με το αντιβιοτικό Τριμεθοπρίμη-Σουλφομεθοξαζόλη και προσθετική δράση με εκπροσώπους της κλάσης των β-λακταμών, μακρολίδων, αμινογλυκοσίδων, τετρακυκλίνων και κινολονών. Το Α22 παρουσίασε υψηλή βακτηριοκτόνο δράση σε πρώιμο (24h) και ώριμο (48h) βακτηριακό βιοφίλμ. Στο βακτήριο B.subtilis ανέστειλε τη σπορίωση σε χρονικό διάστημα 120h και παρεμπόδισε τη βλάστηση των σπορίων. Δεν παρατηρήθηκε ικανότητα των βακτηριακών στελεχών να αναπτύξουν ταχεία αντίσταση στο Α22 και δεν εκδηλώθηκε κυτταροτοξικότητα μέχρι και τη συγκέντρωση 128 μg/ml. Τα παραπάνω δεδομένα, αποτελούν πρώτο βήμα για το χαρακτηρισμό του Α22 ως πιθανού νέου αντιβιοτικού με εναλλακτικό στόχο την κυτταροσκελετική πρωτεΐνη MreB.
description: The emergence of multi-drug-resistant pathogens provoked serious concern regarding the chemotherapy of bacterial infectious diseases. Therefore, the need to find novel antimicrobial agents with alternative targets is imperative today. The present work focused on antimicrobial and cytotoxic activity of the chemical compound S-(3,4-Dichlorobenzyl)isothiourea hydrochloride (Α22) by inhibition of the bacterial cytoskeletal protein MreB. The antimicrobial activity of A22 was studied on the Gram negative pathogens Pseudomonas aeruginosa (NCIMB 12469), Pseudomonas A1, Escherichia coli (NCIMB 8879), Shigella flexneri (ATCC 12022), Salmonella typhimurium (ATCC 14028) and on the Gram positive Bacillus subtilis (NCIMB 3610), according to CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014) instructions. To assess the antimicrobial activity of A22 against planktonic cells susceptibility assays consisting of MIC/MBC determination combined with killing kinetics studies were performed. Measurements of the bactericidal activity of A22 on biofilms were performed and the effects of antibiotics and A22 in combination were determined. Also we studied the effect of A22 on sporulation as well as the ability of the bacteria to develop rapid resistance against A22. Finally, cytotoxicity of A22 on eykaryotic cell lines (Vero, Caco-2, HuH-7) was evaluated through MTT and Neutral Red uptake assays. It was estimated, that A22 inhibited the bacterial growth by a dose-dependent manner with MICs varying from 2 μg/ml to 32 μg/ml and performed time-dependant bactericidal activity. Measurable PAE (Post Antibiotic Effect) at 5xMIC A22 concentration was 2 hours. A22 caused morphological changes on cells which were gradually transformed from rod-shaped to spherical. The combination experiments suggest synergy between A22 and Trimethoprim/Sulfomethoxazole and additive effect between A22 and β-lactams, macrolides, aminoglycocides, tetracyclines and quinolones. A22 showed high bactericidal activity against biofilms forming bacteria after 24h and 48h of incubation. In B.subtilis, the presence of A22 induced suspension of sporulation up to 120h and spore germination. Bacteria failed to develop rapid resistance against A22 and no cytotoxicity was observed up to 128 μg/ml A22. The above data constitute a first step for the characterization of A22 as a potential antibiotic with a novel alternative target, the cytoskeletal protein MreB.