title: Identification and characterization of genes with specific expression in dendritic cells
Creators: name: Heinz, Sven
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2003
Subjects: subject: Dendritische Zelle , Monozyten-Makrophagen-System , Genexpression , Genregulation , MCP-4 , Hep27 (DHRS2) , Promotor , CpG-Methylierung , MCP-4 , Hep27 (DHRS2) , 15-Lipoxygenase , complement C1q C-chain , folate receptor beta
subject: 540 Chemie
subject: molecular biology
subject: immunology

description: Dendritische Zellen (DC) gehören neben Makrophagen und B-Lymphozyten zu den professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC) des Körpers. Bisher sind nur wenige DC-spezifisch exprimierte Markergene bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden über Repräsentationsdifferenzanalyse (RDA) der Expressionsprofile von aus Monozyten in vitro generierten DC versus Monozyten und parallel aus Monozyten differenzierten Makrohagen die Gene DC-CK1, 15-Lipoxygenase, MCP-4, Hep27 (DHRS2), Komplement C1q C-Kette und Beta-Folatrezeptor als spezifisch in DC exprimiert identifiziert und ihre Expression im Laufe der DC-Differenzierung näher untersucht. Analyse des MCP-4-Promotors als möglichem DC-Promotor-Prototyp ergab, daß der in DC benutzte MCP-4-Promotor identisch mit dem in Fibroblasten beschriebenen ist. In DC, nicht aber in Monozyten, Makrophagen, T- und B-Lymphozyten oder monozytären Zellinien, konnte über Bisulfit-Sequenzierung die spezifische Demethylierung dreier TATA-Box-proximaler CpG-Motive des MCP-4-Promotors nachgewiesen werden. Elektrophoretische Mobilitätsveränderungsuntersuchungen (EMSA) zeigten, daß an eines der CpG-Motive bei �80 bp ein nukleärer Faktor bindet, wobei die Bindung durch Methylierung des CpG-Motives inhibiert wird. In transienten Promotoraktivitätsanalysen in monozytären THP-1-Zellen erwies sich, daß die Bindung dieses Faktors an den proximalen MCP-4-Promotor zur maximalen Aktivierung in diesen Zellen beiträgt, was in bezug auf DC vermuten läßt, daß auch hier dieser Faktor eine Rolle bei der Regulation der MCP-4-Expression spielt. Für Hep27 wurde die Genstruktur aufgeklärt sowie ein neuer, DC-spezifischer Promotor aufgefunden. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß der in HepG2-Zellen aktive Promotor von einem endogenen Retrovirus abstammt und daß Hep27-Transkription unter der Kontrolle dieses Promotors in einem breiten Spektrum von Zellen über den Histondeactylase-Hemmer Natriumbutyrat induzierbar ist.
description: To gain further insight into the differentiation pathways and lineage-commitment steps of dendritic cells (DCs) vs. macrophages as well as to define new molecular DC markers, genes with specific expression in DCs during differentiation from blood monocytes were identified by representational difference analysis (RDA). Subsequently, the expression pattern of the genes, namely DC-CK1, 15-LOX, MCP-4, Hep27, complement C1q C-chain and FR-beta, during DC vs. macrophage differentiation was further analysed by Northern blot hybridization and polymerase chain reaction (PCR). As a putative prototype of a DC-specific promoter, the MCP-4 promoter was examined Owing to the lack of DC cell line models suitable for classical reporter analysis to define a minimal promoter, the CpG methylation status of the MCP-4 promoter in monocytes, monocyte-derived macrophages and monocyte-derived DCs was analyzed by bisulfite sequencing. Exclusive CpG demethylation of two CpG sites at �80 bp and �20 bp, respectively, was detected in DCs. In electrophoretic mobility shift assays (EMSAs), binding of a nuclear factor to the demethylated but not the methylated or mutated �80 bp CpG motif could be demonstrated. In reporter assays in THP-1 cells, binding of the nuclear factor proved to be necessary to confer maximal MCP-4 promoter activation. DC specificity of expression of the SDR family member Hep27 (HUGO nomenclature: DHRS2) was confirmed in Western blots. Hep27 mRNA could not be detected in a number of hematopoietic cells. Low level Hep27 mRNA expression could be demonstrated in all tissues examined; high level expression was found in heart and skeletal muscle, liver, kidney and placenta, spleen and fetal liver. Several splice variants of Hep27 were identified and analysed in DCs and HepG2 cells, which differ in their 5'-ends and overall length and seem to reflect the mature transcripts of distinct length detected in tissue Northern blots.