Produção De Proteínas Heterólogas Em Microalga
Creators: name: Molino, JVD
Publisher: name: Zenodo
Year: 2017

description: <strong>Resumo</strong>

Microalgas são um sistema atrativo para expressão de proteínas recombinantes por sua<br>
facilidade de produção em larga escala e baixo custo de cultivo.<br>
Microalgas quando usadas em estratégias de secreção de proteínas alvo são especialmente<br>
interessantes pois o processo de secreção permite:<br>
● separar e purificar a proteína alvo de uma matriz simples, impactando custo e<br>
qualidade;<br>
● cultivar as células com perfusão, aumentando produtividade e reduzindo tamanho de<br>
unidades de processamento;<br>
● usar certos maquinários moleculares para modificações pós-traducionais, como<br>
glicosilação.<br>
Apesar de todas as vantagens listadas, nós identificamos pelo menos duas lacunas<br>
relacionadas ao desenvolvimento dessa plataforma de expressão:<br>
(1) estudos com peptídeo sinal (PS) são escassos, não permitindo escolha de PS com<br>
maior eficiência de secreção e normalmente obtêm baixos rendimentos<br>
(2) fotobiorreatores de escala laboratorial comerciais, não permitem paralelização de<br>
experimentos por seu custo proibitivo, reduzindo velocidade de desenvolvimento<br>
Para reduzir essas lacunas o trabalho foi organizado em duas partes:<br>
● melhoramento das ferramentas moleculares, com avaliação de 7 proteínas<br>
fluorescentes (PF) como repórteres de secreção em Chlamydomonas reinhardtii e<br>
avaliação de 10 PSs,<br>
● desenvolvimento de equipamentos de baixo custo para cultivo de microalgas<br>
recombinantes<br>
Realizado de forma a permitir comparação direta entre os PSs e cultivo da cepa recombinante<br>
em condições de alta produtividade (fotobiorreator), o trabalho objetivou obter alto rendimento<br>
de secreção pelas cepas recombinantes.<br>
Apesar do sucesso na secreção das 7 proteínas fluorescentes (ciano: mCerulean; verde: GFP<br>
e Emerald; laranja: cOFP, tdTomato; e vermelho mCherry), a eficiência de cada PF como<br>
repórter foi influenciada por sua região de fotoatividade. Os resultados sugerem que na região<br>
do laranja e vermelho há uma menor interferência pelos pigmentos celulares, já que elevadas<br>
relações sinal ruído (SN = 7,7 - 16,0) foram obtidas nessa região. Além disso, essas PFs<br>
apresentaram alta frequência de colônias positivas (&gt;75%), com exceção da tdTomato (&lt;9%).<br>
A mCherry foi escolhida para ser fusionada aos PSs selecionados para o estudo, 4 obtidos na<br>
literatura ( binding protein 1 – BiP1; arilsulfatase 1 – ARS1, anidrase carbônica 1 – CAH1], e<br>
ice-binding protein 1 – IBP1) e 6 de 2221 novos PSs previstos pelo software SignalP 4.0. Os<br>
peptídeos sinais com maior eficiência de secreção foram PS 5 e 7, ambos novos, com<br>
aumento de pelo menos 25% na capacidade de secreção de mCherry frente ao melhor<br>
peptídeo dos descritos na literatura (ARS1). Para estender a avaliação, o peptídeo sinal PS 5foi utilizado para secretar hialuronidase, um biofármaco, obtendo colônias com atividade<br>
hialuronidásica no sobrenadante.<br>
Na última parte do trabalho, foi desenvolvido o fotobiorreator tubular fechado, para cultivo dos<br>
organismos geneticamente modificados, que alcançou produtividade de 10 mg/L.d de<br>
mCherry, com velocidade máxima de crescimento de 1,27 d -1 , a uma fração dos custo das<br>
alternativas comerciais.<br>
Os resultados e recursos gerados nesse trabalho, fomentarão o desenvolvimento de<br>
bioprocessos para a produção de proteínas por microalgas recombinantes, por identificar<br>
peptídeos sinais mais eficientes, identificar as PFs úteis como repórteres e demonstrar a<br>
viabilidade da construção de fotobiorreatores esterilizáveis em escala laboratorial.

 

<strong>PRODUÇÃO INTELECTUA</strong>L<br>
<strong>Artigos publicados em periódicos</strong>

Molino JVD , de Carvalho JCM, Mayfield S. Evaluation of secretion reporters to microalgae<br>
biotechnology: blue to red fluorescent proteins. Algal Research. 2018. 31: 252–261.<br>
DOI:10.1016/j.algal.2018.02.018<br>
Molino JVD, de Carvalho JCM, Mayfield S. Comparison of secretory signal peptides for<br>
heterologous protein expression in microalgae: Expanding the secretion portfolio for<br>
Chlamydomonas reinhardtii . PLoS ONE. 2018. 13(2): e0192433. https://doi.org/10.1371/<br>
Molino JVD , et al. Chimeric spider silk production in microalgae: a modular bionanomaterial.<br>
Research Ideas and Outcomes 2. 2016. e9342 DOI 10.3897/rio.2.e9342

<strong>Trabalhos publicados em anais de eventos (completo)</strong><br>
Molino JVD , et al. Construção de uma Centrífuga e de um Sistema de Eletroforese de baixo<br>
custo: Fabricação Digital como alternativa para a Educação. 1 a . Conferência FabLearn Brasil,<br>
2016, São Paulo.

<strong>Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo)</strong><br>
Molino, JVD , et al. AlgAranha. International Genetically Engineered Machine - iGEM - 2016,<br>
Boston.<br>
Molino JVD , Rasala B, Mayfield S, de Carvalho JCM. Signal Peptides development for Algae.<br>
Food &amp; Fuel for the 21st Century Symposium, 2015, San Diego.

<strong>Produtos tecnológicos</strong><br>
Molino JVD . Cisluminator for agarose gel. Zenodo. 2017, São Paulo. Zenodo<br>
http://doi.org/10.5281/zenodo.494977<br>
Molino JVD , Diaz CA, Camargo, LSF, Tanaka, AE, &amp; Carvalho, JCM. Tubular Photobioreactor<br>
- For microalgae. 2017, São Paulo. Zenodo. http://doi.org/10.5281/zenodo.495196<br>
Molino JVD , &amp; de Carvalho, JCM. LED Panel - microalgae. 2017 Zenodo.<br>
http://doi.org/10.5281/zenodo.495204<br>
Molino JVD , &amp; Vieira, D. OpenCyclop - a in situ microscope. 2017. São Paulo Zenodo<br>
http://doi.org/10.5281/zenodo.495192<br>
Molino JVD &amp; Arico B, et al. Microcentrifuga - Centrífuga Seletora<br>
https://github.com/Brunoarico/centrifuge

<strong>Demais produções técnicas</strong><br>
<strong>Banco de dados</strong><br>
Molino JVD , Carvalho JCM, &amp; Mayfield S. In silico identified signal peptides of<br>
Chlamydomonas reinhardtii [Data set]. 2017. Zenodo. http://doi.org/10.5281/zenodo.556792

<strong>Educação e Popularização de C &amp; T</strong><br>
Molino JVD, Apresentação da tese de doutorado. Vídeo. 2017.<br>
https://youtu.be/4DQDCijnwoQ<br>
Molino JVD , Possibly mating algae - Chlamydomonas reinhardtii. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=aNZfJbw9hB4<br>
Molino JVD , Swimming algae - Chlamydomonas reinhardtii. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=YZDDe_sQGH8<br>
Molino JVD , Como calcular quantidade de proteínas com o ImageJ. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=NJO0CLwwpmw

Molino JVD , Como planejar a expressão de uma proteína. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=xvvWs9vQtk4<br>
Molino JVD , Técnica de esterilização - Autoclavação. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=6Vt5IfaPbbQ<br>
Molino JVD , Mendeley Referencias. Vídeo. 2017.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=_IDL0_lVkRg<br>
Molino JVD , Enzimas - Cinética Enzimática. Vídeo. 2016<br>
https://www.youtube.com/watch?v=rzySA3FWB7g<br>
Molino JVD , Imobilização de Enzimas. Vídeo. 2016.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=YXHhEFSsH7g<br>
Molino JVD , Enzimas - Intro. Vídeo. 2016. https://www.youtube.com/watch?v=W0-iatnGm8A<br>
Molino JVD, Processo Contínuo. Vídeo. 2016.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=Y_pZwXHyPnI<br>
Molino JVD , Velocidade Específica de Crescimento e Fator de Conversão. Vídeo. 2016<br>
https://www.youtube.com/watch?v=TZWrCfB11tY<br>
Molino JVD , Como desenhar primers para USER. Vídeo. 2016.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=PeM66bcTGQo<br>
Molino JVD , Fermentação alcoólica industrial. Vídeo. 2016.<br>
https://www.youtube.com/watch?v=cEhzNRC6IfI