Der Einfluss von GDF11 auf die myogene Differenzierung primärer Myoblasten und ADSC auf PCL-Kollagen-I-PEO-Nanofaser-Scaffolds unter serumfreien Bedingungen
Creators: name: Schneider, Paul Benedikt
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Hintergrund und Ziele Die regenerative Medizin hat in den vergangenen Jahren enorme Fortschritte gemacht. Von der Produktion funktioneller Skelettmuskulatur ist man jedoch noch weit entfernt. Das zentrale Ziel dieser Arbeit war es, das Verständnis über die myogene Differenzierung zu vertiefen und grundlegende Prinzipien für weitere Forschung zu schaffen. Als geeignete Zellarten hatten sich Myoblasten, myogene Vorläuferzellen mit Stammzelleigenschaften, sowie adipogene Stromazellen (ADSC) mit ausgeprägter Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit, etabliert. Den Fokus dieser Arbeit stellten die Wirkungen von GDF11 auf die myogene Differenzierung dar. Bisherige Ansätze zur Erforschung der Wirkung von GDF11, einem Mitglied der TGFbeta-Familie, hatten in den vergangenen Jahren verschiedene, teils stark voneinander abweichende Publikationen erbracht. Besonderes Interesse galt hierbei insbesondere der potenziellen „verjüngenden Wirkung“ von GDF11 auf den alternden Organismus sowie auf die Embryonalent- wicklung und die Einflüsse von GDF11 hierauf. Aufgrund der Tatsache, dass viele in-vitro-Studienansätze auf serumhaltigen Medien basieren, bestehen Einschränkungen in der Erforschung der Effekte einzelner Faktoren. Voraussetzung hierfür war die Etablierung geeigneter serumfreier Kulturbedingungen. Um potenziell funktionellen Skelettmuskel zu konstruieren, wird eine biokompatible, dreidimensionale Matrix benötigt, die der physiologischen Struktur der Skelettmuskulatur möglichst nahekommt. Mithilfe dieser Arbeit soll gezeigt werden, dass Zellen humanen Ursprungs sich in diesen dreidimensionalen Konstrukten kultivieren lassen. Als weiterer zentraler Aspekt soll zudem der Effekt von GDF11 auf die Ko-Kultur von Myoblasten und ADSC unter serumfreier Differenzierung erforscht werden. Material und Methoden In dieser in-vitro-Studie wurden primäre Myoblasten und ADSC humanen Ursprungs genutzt. Die Charakterisierung der Zellen erfolgte mittels Mikroskopie, Immunfluoreszenz, verschiedenen Assays zur Differenzierungsfähigkeit sowie Durchflusszytometrie. Als biokompatible, 3D Matrix wurden parallel gesponnene PCL-Kollagen-I-PEO-Nanofaser-Scaffolds für die 3D-Ko-Kultur-Versuche verwendet. Das Hauptziel bestand darin, den Effekt von GDF11 auf die myogene Differenzierung von humanen Myoblasten in Ko-Kultur mit hADSC unter serumfreien Kulturbedingungen auf parallel gesponnenen PCL-Kollagen-I-PEO-Nanofaser-Scaffolds zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene Experimente in 2D- und 3D-Ko-Kultur mittels CK-Assay, WST-8-Assay, Immunfluoreszenz, Rasterelektronenmikroskopie (REM), RNA-Isolierung und qRT-PCR durchgeführt. Ergebnisse und Beobachtungen Basierend auf Ergebnissen vorangegangener Studien erfolgten Ko-Kultur-Versuche mit humanen Myoblasten und ADSC sowie die Analyse der myogenen Differenzierung unter Einfluss von Growth Differentiation Factor 11 (GDF11). Im Rahmen der 2D Ansätze zeigte die Gruppe mit einer Konzentration von 25ng/ml die höchste Kreatinkinase-Aktivität, weshalb für die darauffolgenden Versuche diese Konzentration verwandt wurde. Im Rahmen der darauffolgenden 2D und 3D Ko-Kultur-Versuche konnte gezeigt werden, dass unter dem Einfluss von GDF11 myogene Differenzierung grundsätzlich möglich ist. Es konnte mittels CK Assay (3D), MyHC-Immunfluoreszenz und -mikroskopie (2D und 3D) sowie qRT- PCR (3D) verifiziert werden, dass myogene Differenzierung unter dem Einfluss von GDF11 möglich ist. Bezogen auf die Zellviabilität konnte zudem ein Trend im Sinne einer Steigerung der Zellviabilität, jedoch ohne statistische Signifikanz, erkannt werden. Die Veränderung der Kreatinkinase-Aktivität über die Zeit hingegen zeigte, abgesehen von den Ergebnissen der Kontrollgruppe, eher einen Trend im Sinne einer Senkung der Kreatinkinase-Aktivität. Im Rahmen der genetischen Expression konnte lediglich zwischen der serumfreien Gruppe und der GDF11-Gruppe eine statistisch signifikante Differenz der MYH2-Expression zugunsten der GDF11-Gruppe gezeigt werden. In der ACTA1-Expression konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden. Schlussfolgerungen In dieser Arbeit konnten verschiedene Erkenntnisse gesammelt werden. Einerseits konnte gezeigt werden, dass humane primäre Myoblasten in Ko-Kultur mit ADSC, unter serumfreien Bedingungen sowohl in 2D- als auch 3D-Kultur myogen differenzieren können. Andererseits lassen sich jedoch deutliche Indizien dafür finden, dass dreidimensionale Bedingungen vorteilhafter für myogene Differenzierung, insbesondere hinsichtlich langfristiger Kultivierung, dem Überleben der Kulturen sowie der Ausbildung myotubenartiger Strukturen, zu sein scheinen. Der Effekt von GDF11 auf die myogene Differenzierung lässt sich mithilfe der Ergebnisse dieser Studie nicht definitiv bestimmen, weder eine fördernde noch hemmende Wirkung konnte mit statistischer Signifikanz nachgewiesen werden. Es zeigte sich lediglich zwischen der serumfreien und GDF11 Gruppe ein statistisch signifikanter Unterschied bezüglich der MYH2 Expression zugunsten der GDF11 Gruppe, während die CK-Aktivität einen, jedoch nicht statistisch signifikanten, Rückgang im zeitlichen Verlauf der 3D-Experimente aufzeigte. Zudem konnte jedoch gezeigt werden, dass PCL-Kollagen-I-PEO-Nanofaser-Scaffolds als geeignete biokompatible Matrix für das Skelettmuskel Tissue Engineering dienen können. Insbesondere für zukünftige in-vivo-Ansätze mit dem Ziel einer Vaskularisierung des TE-Konstrukts dienen die Ergebnisse dieser Arbeit als vielversprechende Grundlage.
description: Objectives Regenerative medicine has made great improvements over the last years. Yet, the creation of functional skeletal muscle is still a long way off. Therefore, the main goal of this study was to come one step closer to understanding myogenic differentiation and provide knowledge about possible ways for further studies. In this study, the co-culture of myoblasts, myogenic progenitor cells and adipose derived stromal cells (ADSC), a subgroup of mesenchymal stromal cells with distinct proliferation- and differentiation capacities, has been used. The main objective of this study was to show the effects, that growth differentiation factor 11 (GDF11) has on myogenic differentiation. Previous approaches to investigating the effect of GDF11, a member of the transforming growth factor beta (TGFbeta) family, had yielded various, sometimes strongly divergent publications in recent years. Of particular interest was the potential "rejuvenating effect" of GDF11 on the aging organism as well as the influence of GDF11 regarding embryonic development. Unfortunately, many in-vitro-studies are based on serum-containing media, what makes it impossible to understand different factors individually. Therefore, an established serum-free medium containing Ultroser G as serum-substitute has been used. For a skeletal muscle to become functional, a biocompatible threedimensional (3D) matrix is essential. The goal was to establish a method using varying parallel aligned polycaprolactone-collagen-I-polyethylenoxide-nanofiber-scaffolds (PCL-collagen-I-PEO-nanofiber-scaffolds). In this study we aimed to prove, that cells originating from human tissue are able to proliferate and differentiate on said scaffolds and to investigate the effect of GDF11 on co-cultured my- oblasts and ADSC under serum-free differentiation conditions. Design and Methods This study was designed as an in-vitro-study. The cells which were used were myoblasts and mesenchymal stromal cells originating from human tissue, which have been characterized by microscopy, immunofluorescence, differentiation assays and fluorescence activated cells sorting (FACS). As a biocompatible matrix, PCL-collagen-I-PEO-nanofiber-scaffolds were used in 3D-co-culture. After previous experiments showed, that serum-free myogenic differentiation is possible, serum-free media with varying components have been used. The main goal of this study was to explore the effects of GDF11 on myogenic differentiation in a 3D setting using PCL-collagen-I-PEO-nanofiber-scaffolds as biocompatible matrix, serum-free media, and a co-culture of human skeletal muscle myoblasts (HSMM) and human adipose derived stromal cells (hADSC). Different experiments in 2D- and 3D-co-culture, using creatine kinase (CK) assay, WST-8-assay, immunofluorescence, scanning electron microscopy (SEM), RNA-isolation and quantitative real-time-polymerase-chain-reaction (qRT-PCR) have been performed. Observations and Results Based on the investigations of this work, various findings could be collected. In the two-dimensional (2D) approaches to determine the optimal GDF11 concentration, the group with a concentration of 25ng/ml showed the highest CK activities, which is why this concentration was used for the following experiments. In the subsequent 2D and especially 3D co-culture experiments, CK assay (3D), myosin-heavy-chain (MyHC) immunofluorescence and microscopy (2D and 3D) and qRT-PCR (3D) verified, that myogenic differentiation is possible under the influence of GDF11. Regarding cell viability, a trend in the sense of an increase in cell viability, but without statistical significance, could also be detected. The change in CK activity over time, on the other hand, showed more of a trend in the sense of a decrease in creatine kinase activity, apart from the results of the control group. In the context of genetic expression, a statistically significant difference in MYH2 expression in favor of the GDF11 group was shown solely between the serum-free group and the GDF11 group. No significant differences could be shown in ACTA1 expression. Conclusions Based on the results of this work, several findings could be collected. On the one hand, it was shown, that human primary myoblasts in co-culture with ADSC, can differentiate myogenically under serum-free conditions in both 2D and 3D culture. On the other hand, however, strong indications can be found that three-dimensional conditions seem to be more favorable for myogenic differentiation regarding enhanced long-term differentiation, survival of the cultures and formation of myotube-like formations. Unfortunately, the effect of GDF11 on myogenic differentiation cannot be definitively deter- mined using the results of this study; neither a clearly promoting nor clearly inhibitory effect could be demonstrated with statistical significance, while statistical significance only between serum-free and GDF11-containing differentiation regarding MYH2 expression could be shown. Furthermore, a decrease of CK activity under the influence of GDF11 was shown. PCL-collagen-I-PEO-nanofiber-scaffolds were shown to serve as a suitable biocompatible matrix for skeletal muscle tissue engineering. Especially for future in vivo approaches aiming at vascularization of the tissue engineered (TE) construct, the results of this work serve as a promising basis.