title: Die Rolle des Kristallographen im strukturbasierten Wirkstoffdesign für die Pim-1 Kinase sowie den Kernrezeptor PPARβ/δ
title: The role of the crystallographer in structure-based drug design for the Pim-1 kinase and the nuclear receptor PPARβ/δ
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Hochban, Phil Marvin Mac
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Proteinkristallographie
drugdesign
Wirkstoffdesign
PPAR
Pim-1 kinase
Drug
nuclear receptor PPAR
Pim-1 Kinase
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik
Pim1
Pim
Pim-1
Kernrezeptor
X-Ray
strukturbasiert
Kinase
X-ray crystallography
Wirkstoffentwicklung
Design

description: Im Rahmen dieser Arbeit wird der Einfluss und das Potential der Strukturaufklärung mit-tels der Proteinkristallographie auf verschiedene Bereiche des strukturbasierten Wirk-stoffdesigns untersucht und diskutiert. Dafür wurden drei Projekte durch kristallographi-sche oder alternative, strukturaufklärende Methoden begleitet.
Im ersten Projekt wurde ein Fragment-basiertes Wirkstoffdesign durch röntgenkristallo-graphische Strukturaufklärung unterstützt. Ziel dabei war die Entwicklung von potenten Inhibitoren der Pim-1-Kinase, die einen maßgeblichen Einfluss auf die Zellproliferation und Apoptose von diversen Tumorarten hat. Durch die Kristallisation und Aufklärung der Bindungsmodi von verschiedenen Fragmenten konnten viele Interaktionspunkte in der Pim-1 Bindetasche identifiziert werden. Durch die Bestimmung der Aktivität in einem Lumineszenz-Assay konnten erste Überlegungen zu den komplexen Beiträgen dieser In-teraktionen zur Gesamtaffinität der einzelnen Fragmente angestellt werden. Dieses Projekt führte zu zwei vielversprechenden Inhibitor-Grundkörpern, den Chinoxalinen und den 2-Amino-Benzimidazolen und ihren Derivaten. Dank der gesammelten Erkenntnisse konn-ten Ideen zur weiteren strukturbasierten Optimierung hin zu potentiellen Inhibitoren der Pim-1 entwickelt und ausführlich diskutiert werden.
 
In einem zweiten Projekt konnte anhand der Pim-1 gezeigt werden, wie die rationale und strukturbasierte Optimierung eines hits sich gegenseitig ergänzen und so die Entwicklung von affinen Inhibitoren ermöglichen. Die computergestützte Modifizierung eines Frag-mentes führte zu der vielversprechenden Ausgangsverbindung 3.13, die erfolgreich kris-tallisiert wurde. Basierend auf der Röntgenstruktur dieser Startverbindung konnten im Zuge weiterer Optimierungsprozesse, zwei Inhibitorserien entwickelt werden: Die Indo-lin-2-one und die Stilbene. Die verschiedenen Derivate beider Serien zeigten bereits eine hohe Aktivität und inhibierten die Pim-1 Kinase in einstellig mikromolaren bis hin zu na-nomolaren Konzentrationen effektiv. Verbindungen aus beiden Serien wurden ebenfalls mit der Pim-1 Kinase kristallisiert und die Strukturen aufgeklärt. Durch die Analyse der Bindungsmodi konnten für das inhibitorische Potential dieser Verbindungen bedeutende Interaktionen identifiziert und diskutiert werden.
 
Die Stilben Serie zeigte außerdem eine bisher kaum untersuchte Konformationsänderung der Pim-1 auf: Bei der Bindung der trans-Derivate konnte beobachtet werden, dass die Glycin-reiche Schleife oberhalb der Bindetasche zum Liganden verschoben wurde und die Bindetasche sich um den Liganden schließt. Anhand der Röntgenstrukturen wurde diese Beobachtung auf potentielle -Interaktionen der Aromaten der Liganden mit Phe49 in dieser Schleife zurückgeführt. Bei den cis-Derivaten wurde diese Konformationsänderung nicht beobachtet.
Das dritte Projekt im Rahmen dieser Arbeit befasst sich mit dem Kernrezeptor PPARβ/δ, der als Transkriptionsfaktor die Expression verschiedener Gene reguliert, die mit dem Stoffwechsel, Entzündungsreaktionen und Tumorwachstum und -metastasierung in Ver-bindung gebracht werden. Durch die Kristallisation und Aufklärung der Struktur war da-bei das Ziel, die Bindungsmodi von inversen Agonisten zu untersuchen, die durch ihre Bindung die Rekrutierung eines Co-Repressors und die damit einhergehende Absenkung der Rezeptoraktivität unter ein basales Level auslösen.
Neben der Testung verschiedener literaturbekannter Kristallisationsbedingungen für die Ligandenbindungsdomäne des PPARβ/δ und anderer Subtypen, wurden dafür auch groß-angelegte, automatisierte Screens durchgeführt. Die Probleme und Schwierigkeiten sowie potentielle Lösungsansätze, die sich dabei ergeben haben, wurden analysiert und diskutiert und können für weitere Kristallisationsansätze herangezogen werden. Es wurden auch alternative Methoden zur Strukturaufklärung in Betracht gezogen: Durch die Methode der HDX-Massenspektrometrie konnte die Bindung der inversen Agonisten an die Liganden-bindungsdomäne des PPARβ/δ bewiesen werden. Außerdem wurde mit diesem Experi-ment bestätigt, dass die Bindung eines Antagonisten keine Rekrutierung des Co-Repressor-Motivs SMRT auslöst, wie es bei der Bindung von inversen Agonisten der Fall ist. Die gewonnen Erkenntnisse helfen in Kombination mit anderen Methoden die Mechanismen der PPARβ/δ Regulation vollständig zu verstehen und weitere rationale Optimierungen der Inhibitoren zu ermöglichen.