Κατασκευή πλασμιδιακών φορέων για την αντικατάσταση του γονιδίου της γλυκοπρωτεΐνης D του HSV-1 με γονίδιο αναφοράς και για την δημιουργία κυτταρικής σειράς που εκφράζει την γλυκοπρωτεΐνη D
Creators: name: Μαλαμίδου, Αγγελική Ανέστη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Ανασυνδυασμένος HSV-1
Πλασμιδιακοί φορείς
Κυτταρική σειρά που εκφράζει την γλυκοπρωτείνη D
Recombinant HSV-1
Plasmids
Cell line expressing glycoprotein D

description: Ο πρωταρχικός στόχος της παρούσας εργασίας είναι η παρασκευή ιικών σωματίων του HSV-1 στα οποία η κωδική περιοχή της gD έχει αντικατασταθεί με την κωδική περιοχή της β-γαλακτοσιδάσης προκειμένου να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς για την μεταφορά ετερόλογων γονιδίων. Για αυτό τον σκοπό είναι απαραίτητη η δημιουργία μίας κυτταρικής σειράς, η οποία εκφράζει την πρωτεΐνη σύντηξης gD-φθορίζουσα πρωτεΐνη. Στην συγκεκριμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε ως φθορίζουσα πρωτεΐνη, η Venus. Για την διαδικασία αυτή επιλέχθηκε η γλυκοπρωτεΐνη D η οποία είναι υπεύθυνη για την διείσδυση των ιικών σωματίων στα κύτταρα του ξενιστή. Επομένως, η έλλειψή της εμποδίζει την εξάπλωση των ιικών σωματίων στα γειτονικά κύτταρα και την εξάπλωση της νόσου. Προκειμένου να γίνει η εισαγωγή της επιθυμητής αλληλουχίας στο γονιδίωμα του ιού αρχικά εισάγεται ένα γονίδιο αναφοράς, όπως είναι το LacZ (β-γαλακτοσιδάση) το οποία μπορεί να εισαχθεί στο γονιδίωμα του ιού-φορέα μέσω του ομόλογου ανασυνδιασμού. Σε δεύτερο στάδιο γίνεται αντικατάσταση του LacZ πάλι μέσω ομόλογου ανασυνδιασμού με το γονίδιο ενδιαφέροντος. Ωστόσο για την παρασκευή των ανασυνδυασμένων ιών είναι προφανώς απαραίτητος ο πολλαπλασιασμός τους. Γι ’αυτό το λόγο πρέπει να κατασκευαστεί μία κυτταρική σειρά η οποία προσφέρει in trans τα γονίδια τα οποία έχουν αφαιρεθεί από τον ιό έτσι ώστε να μπορέσει να γίνει η παραγωγή και η συσκευασία του ιού σε μεγάλη κλίμακα. Έτσι κρίθηκε απαραίτητη η δημιουργία μιας κυτταρικής σειράς η οποία θα εξέφραζε την πρωτεΐνη gD. Αρχικά κατασκευάστηκε ο φορέας pgDvecH-gDVenus, ο οποίος φέρει της κωδικές περιοχές της gD και της Venus σε κοινό αναγνωστικό πλαίσιο και θα χρησιμοποιηθεί για την δημιουργία της κυτταρικής σειράς. Έπειτα θελήσαμε να διαπιστώσουμε αν τελικά παράγεται η υβριδική πρωτεΐνη gDVenus καθώς επίσης και αν παράγεται η πρωτεΐνη gD από τον πατρικό του φορέα pgDvecH-gD. Επειδή επανειλημμένες προσπάθειες παρατήρησης των παραγόμενων πρωτεϊνών ήταν ανεπιτυχείς αποφασίσαμε να εισάγουμε τις κωδικές περιοχές των γονιδίων gD και gDVenus υπό τον έλεγχο ενός ισχυρού υποκινητή. Γι’ αυτό το λόγο κατασκευάστηκαν τα πλασμίδια pCS2-gD και pCS2-gDVenus που στο γονιδίωμα τους φέρουν τον ισχυρό υποκινητή του γονιδίου IE94 του μεγαλοκυτταροιού. Τα πλασμίδια pCS2-gD και pCS2-gDVenus ελέχθησαν για την ικανότητα τους να παράγουν τις πρωτεΐνες gD και gDVenus, οπού και διαπιστώθηκε ότι έχουν την ικανότητα να παράγουν πρωτεΐνες και μάλιστα λειτουργικές αφού το υβρίδιο gDVenus παρήγαγε φθορισμό όπως αναμένετο. Συμπερασματικά, κατασκευάστηκαν και ελέχθησαν, ως προς την λειτουργικότητα τους, τα εργαλεία που θα χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή της νέας κυτταρικής σειράς που θα εκφράζει ετερόλογα την υβριδική πρωτεΐνη gDVenus. Ταυτόχρονα με την δημιουργία της κυτταρικής σειράς, κατασκευάστηκαν τα πλασμίδια που θα χρησιμοποιηθούν στην δημιουργία των ανασυνδυασμένων ιών, οι οποίοι θα στερούνται το γονίδιο της gD αφού αυτό θα έχει αντικατασταθεί από το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης. Όταν αυτοί οι αναδυνδυασμένοι ιοί θα μολύνουν κύτταρα της κυτταρικής σειράς που εκφράζει την gDVenus, μετά από προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος θα παράγουν μπλε πλάκες. Το πλασμίδιο pgDv-lacZ, που κατασκευάστηκε για τον σκοπό αυτό, φέρει το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών περιοχών του γονιδίου της gD. Διαμόλυνση με το πλασμίδιο pgDv-lacZ και ταυτόχρονη μόλυνση με τον ιό HSV-1 σε κύτταρα που εκφράζουν ετερόλογα την gD θα οδηγούσε σε πιθανό ομόλογο ανασυνδυασμό και αντικατάσταση της ιικής gD από την lacZ στο γονιδίωμα του ιού. Συνοψίζοντας, στην παρούσα διατριβή έχουν κατασκευαστεί τα κατάλληλα εργαλεία πλασμίδια για την επίτευξη των πρωταρχικών στόχων της, την παραγωγή δηλαδή ανασυνδασμένων ιοσωμάτων HSV-1 που στερούνται της gD και την δημιουργία μιας νέας κυτταρικής σειράς που εκφράζει ετερόλογα στην γλυκοπρωτεΐνη D. Εκτός όμως από αυτά εδραιώθηκαν στρατηγικές και κατασκευάστηκαν τα μέσα για την διαπίστωση της ορθής πορείας της πειραματικής διαδικασίας.
description: The primary objective of this work is the preparation of viral particles of HSV-1 in which the coding region of gD has been replaced with the coding region of the beta- galactosidase so that they can be used as vectors for transferring heterologous genes. For this purpose it is necessary to generate a cell line, which expresses the fusion protein gD - fluorescent protein . In this case it was used the Venus as a fluorescent protein. For the process chosen glycoprotein D which is responsible for the penetration of virus particles into host cells. Therefore, the lack of it prevents the spread of viral particles in the neighboring cells and the spread of disease. In order to insert the desired sequence into the viral genome initially introduced a reporter gene such as LacZ ( beta- galactosidase ) which can be inserted into the genome of the virus vector by homologous recombination. In a second take place the replacement of LacZ again by homologous recombination with the gene of interest. However for the preparation of the recombinant virus is necessary to proliferation. For this reason it’s necessary to construct a cell line which provides in trans the genes which have been removed from the virus. Thus it was deemed necessary to generate a cell line which expressed the protein gD. Initially constructed vector pgDvecH - gDVenus , carrying the coding regions of the gD and Venus in a common reading frame , and used to generate cell line . Then we wanted to see if it is produced by the hybrid protein gDVenus and also whether the gD protein produced by the parent pgDvecH - gD vector. Because repeated attempts observation of the produced proteins were unsuccessful decided to introduce the coding regions of gD and gDVenus genes under the control of a strong promoter. For this reason constructed plasmids pCS2-gD and pCS2-gDVenus which in their genome carrying the strong promoter of the gene of IE94 of cytomegalovirus. The plasmids pCS2-gD and pCS2-gDVenus tested for their ability to produce the proteins gD and gDVenus, it was found to have the ability to produce proteins and functional even after gDVenus hybrid produced fluorescence as expected. In conclusion, constructed and tested about functionality, the tools to be used for construction of the new cell line expressing the heterologous fusion protein gDVenus. Simultaneously, constructed plasmids to be used in the production of recombinant viruses, which will lack the gD gene after it has been replaced by the beta- galactosidase gene. When these recombinant viruses will infect cells of cell line expressing gDVenus, after addition of suitable substrate will produce blue plaques. The pgDv - lacZ plasmid, which was constructed for the purpose, carrying the beta-galactosidase gene under the control of the regulatory regions of the gD gene. Transfection with plasmid pgDv - lacZ and simultaneous infection with HSV - 1 in cells heterologously expressing the gD will likely lead to homologous recombination and replacement of the viral gD with lacZ in the virus genome. In summary, in this thesis we have constructed suitable plasmids to achieve the primary objective to produce recombinant HSV-1 viruses gD lacking and the generation of a new cell line expressing the heterologous glycoprotein D. In addition to these were established strategies and constructed the tools to verify the proper progress of the experimental procedure .