title: Extraction of Waltheria indica compounds via accelerated solvent extraction and identification of relevant molecule classes for optimized cyclooxygenase-2 inhibition
Creators: name: Termer, Michael
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Technology (Applied sciences)
Technik

description: Inflammation is the bodies response to infection or tissue injury in order to restore and maintain homeostasis. Prostaglandin E2 (PGE-2) derived from arachidonic acid (AA), via up-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) is a key mediator of inflammation and can also be induced by several other factors including stress, chromosomal aberration, or environmental factors. Targeting prostaglandin production by inhibiting COX-2 is hence relevant for the successful resolution of inflammation. Waltheria indica is a traditional medicinal plant with reported anti-inflammatory properties whose extracts have demonstrated COX-2 inhibitory activity. However, the compounds responsible for the activity were merely assumed and, in most cases, unknown or assigned to molecules, such as tiliroside, whose content in the tested extracts during the investigations was unknown. For the preparation of extracts with effective anti-inflammatory properties, characterization of these substances is vital. In this thesis, this challenge was addresses by characterizing of substances responsible for the COX-2 inhibitory activity in the extracts and the generation of a prediction models to quantify the COX-2 inhibitory activity without the biological testing. The inhibitory potential of the probes against the COX-2 enzyme was assessed with a fluorometric COX-2 inhibition assay. The results obtained demonstrated that Waltheria indica extracts inhibited the inflammatory key mediator COX-2 with the activity related to the extraction parameters governing the composition of the extract. The examinations on tiliroside activity and content in the extracts revealed that although tiliroside demonstrated COX-2 inhibitory activity in a concentration-dependent manner, the content of tiliroside in the extracts was not sufficient to contribute to the observed activity with the extracts. For the identification of contributors to the observed COX-2 inhibitory activity, an extract was separated into fractions by means of centrifugal partition chromatography (CPC) and their COX-inhibitory activity evaluated. The characterization of compounds in fractions with highest COX-2 inhibitory activity were done by high resolution mass spectrometry (HPLC-MS/MS). It was found that these fractions contained alpha-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid, identified and reported for the first time in Waltheria indica leaf extracts. After analyzing their content in extracts obtained varying extraction parameters, it could be demonstrated that these fatty acids contribute up to 41% to COX-2 inhibition observed with Waltheria indica extract. Additional quantification of phytochemicals in the extract fractions established that substances from the group of steroidal-saponins and triterpenoid-saponins also contribute to the COX-2 inhibitory activity. Based on the content of compounds contributing to COX-2 inhibition two mathematical models were successfully developed both with a root mean square error (RMSE) = 1.6% COX-2 inhibitory activity, demonstrating a high correspondence between predicted versus observed values. The results of the predictive models further suggest that the compounds contribute to COX-2 inhibition in the order linoleic acid &gt; alpha linolenic acid &gt; steroidal-saponins &gt; triterpenoid-saponins. Based on the developed mathematical models in this project, a more targeted development of extraction procedures is possible in order to obtain Waltheria indica extracts with improved anti-inflammatory properties related to the inhibition of COX-2. Furthermore, the transfer of the approach presented in this work to the prediction of other biological endpoints would be of great interest for future studies.
description: Entzündungen sind die Reaktion des Körpers auf Infektionen oder Gewebeverletzungen, um die Homöostase wiederherzustellen und zu erhalten. Prostaglandin E2 (PGE-2), das aus Arachidonsäure (AA) über eine Hochregulierung der Cyclooxygenase-2 (COX-2) gewonnen wird, ist ein wichtiger Mediator von Entzündungen und kann auch durch verschiedene Faktoren wie Stress oder Umweltfaktoren ausgelöst werden. Die gezielte Steuerung der Prostaglandinproduktion durch die Hemmung von COX-2 ist daher für die erfolgreiche Behebung von Entzündungen von großer Bedeutung. Waltheria indica ist eine traditionelle Heilpflanze mit nachgewiesenen entzündungshemmenden Eigenschaften, deren Extrakte eine hemmende Wirkung auf COX-2 gezeigt haben. Die für die Aktivität verantwortlichen Verbindungen wurden jedoch lediglich vermutet und waren in den meisten Fällen unbekannt oder wurden Molekülen wie Tilirosid zugeordnet, deren Gehalt in den getesteten Extrakten während der Untersuchungen unbekannt war. Für die Herstellung von Extrakten mit wirksamen entzündungshemmenden Eigenschaften ist die Charakterisierung dieser Substanzen unerlässlich. In dieser Arbeit wurde diese Herausforderung durch die Charakterisierung der für die COX-2 hemmende Aktivität verantwortlichen Substanzen in den Extrakten und die Erstellung eines Vorhersagemodells zur Quantifizierung der COX-2 hemmenden Aktivität ohne biologische Tests angegangen. Das hemmende Potenzial der Proben gegen das COX-2-Enzym wurde mit einem fluorometrischen COX-2-Hemmtest bewertet. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Extrakte von Waltheria indica den Entzündungsmediator COX-2 hemmen, wobei die Aktivität von den Extraktionsparametern abhängt, die ebenfalls die Zusammensetzung des Extraktes bestimmen. Die Untersuchungen der Tilirosid-Aktivität und des Tilirosid-Gehalts in den Extrakten ergaben, dass Tilirosid zwar eine konzentrationsabhängige COX-2-hemmende Aktivität zeigte, der Gehalt in den Extrakten jedoch nicht ausreichte, um zur beobachteten Aktivität der Extrakte beizutragen. Zur Identifizierung der Substanzen, die zur COX-2-hemmenden Wirkung beitragen, wurde ein Extrakt mittels Zentrifugalpartitionschromatographie (CPC) in Fraktionen aufgetrennt und deren COX-hemmende Wirkung analysiert. Die Charakterisierung der Verbindungen in den Fraktionen mit der höchsten COX-2-hemmenden Aktivität erfolgte durch hochauflösende Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS). Es wurde festgestellt, dass diese Fraktionen alpha-Linolensäure, Linolsäure und Ölsäure enthalten, die zum ersten Mal in Waltheria indica Blattextrakten identifiziert und beschrieben wurden. Nach der Analyse ihres Gehalts in den Extrakten konnte nachgewiesen werden, dass diese Fettsäuren bis zu 41 % zur COX-2-Hemmung beitragen, die mit Waltheria indica Extrakten beobachtet wurde. Eine zusätzliche Quantifizierung der Phytochemikalien in den Extraktfraktionen ergab, dass Substanzen aus der Gruppe der Steroid-Saponine und Triterpenoid-Saponine ebenfalls zur COX-2-hemmenden Aktivität beitragen. Auf der Grundlage des Gehalts an Verbindungen, die zur COX-2-Hemmung beitragen, wurden erfolgreich zwei mathematische Modelle entwickelt, die beide einen mittleren quadratischen Gesamtfehler von 1,6 % für die COX-2-hemmende Aktivität aufwiesen und damit eine hohe Übereinstimmung zwischen vorhergesagten und beobachteten Werten. Die Ergebnisse der Vorhersagemodelle deuten ferner darauf hin, dass die Verbindungen zur COX-2-Hemmung in der Reihenfolge Linolsäure &gt; alpha-Linolensäure &gt; Steroid-Saponine &gt; Triterpenoid-Saponine beitragen. Die entwickelten mathematischen Modelle ermöglichen eine gezieltere Entwicklung von Extraktionsverfahren, um Extrakte aus Waltheria indica mit verbesserten entzündungshemmenden Eigenschaften im Zusammenhang mit der Hemmung von COX-2 zu erhalten. Darüber hinaus wäre die Übertragung des in dieser Arbeit vorgestellten Ansatzes auf die Vorhersage anderer biologischer Endpunkte für zukünftige Studien von großem Interesse.