Μελέτη της λιποπρωτεΐνης LDL με τη χρήση Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης (AFM) σε παιδιά με Νεανική Ιδιοπαθή Αρθρίτιδα
Creators: name: Σγουροπούλου, Βασιλική Φωτίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Λιποπρωτεΐνη
Νεανική Ιδιοπαθής Αρθρίτιδα
Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης
LDL
Juvenile Idiopathic Arthritis
Atomic Force Microscopy

description: Η χρόνια φλεγμονή, σε ενήλικες με Ρευματοειδή Αρθρίτιδα, συσχετίσθηκε με αυξημένο κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου, μέσω της διαταραχής που προκαλούν στο λιποπρωτεϊνικό φαινότυπο. Ανάλογες παρατηρήσεις στα παιδιά που πάσχουν από Νεανική Ιδιοπαθή Αρθρίτιδα, σχετικά με διαταραχή του λιπιδαιμικού profil και υποκλινική αθηροσκλήρωση, άρχισαν να εμφανίζονται, αλλά οι πληροφορίες είναι ακόμη περιορισμένες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε το σωματίδιο LDL (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη) σε παιδιά που πάσχουν από Νεανική Ιδιοπαθή Αρθρίτιδα (ΝΙΑ) με τη χρήση του μικροσκοπίου ατομικής δύναμης (AFM) και στη συνέχεια ακολούθησε συσχέτιση των ευρημάτων με την κατάσταση ενεργότητας της νόσου (έξαρση – ύφεση). Στη μελέτη συμμετείχαν 6 ασθενείς με ΝΙΑ, που χωρίστηκαν σε 2 ομάδες με κριτήριο την κατάσταση ενεργότητας της νόσου (ομάδα 1 ασθενείς χωρίς ενεργότητα νόσου και ομάδα 2 με ενεργή νόσο). Πραγματοποιήθηκε συλλογή ολικού αίματος και φυγοκέντρησή του, ενώ μετά από κατάλληλη επεξεργασία τα δείγματα υπερφυγοκεντρήθηκαν, προκειμένου να απομονωθεί η λεπτή στιβάδα που περιέχονται οι λιποπρωτεΐνες LDL. Ακολούθησε ποσοτικός προσδιορισμός της LDL με τη χρήση της μεθόδου της φασματοφωτομετρίας και κατάλληλη προετοιμασία δυο διαφορετικών υποστρωμάτων (γυαλί και πυρίτιο) για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Η μελέτη των δειγμάτων έγινε με τη διάταξη Solver P47H Pro της εταιρείας “NT-MDT”. Από την παρατήρηση των δειγμάτων προέκυψε ότι μακροσκοπικά οι λιποπρωτεΐνες σχηματίζουν ενδιαφέρουσες δομές με χαρακτηριστική δενδροειδή διάταξη καθώς και ότι τα σωματίδια LDL έχουν την τάση να συσσωματώνονται και να δημιουργούν σχηματισμούς της τάξης των 100-250 nm. Δε διαπιστώθηκε διαφοροποίηση σε ότι αφορά την απεικόνιση και μέτρηση της LDL πάνω στα δύο διαφορετικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν. Για τη μελέτη της LDL απαιτείται φρέσκο πλάσμα, καθώς κατά την κατάψυξη των δειγμάτων αλλάζει η στερεοδιάταξη του σωματιδίου. Διαπιστώνεται ότι στην 1η ομάδα μελέτης η διάμετρος των σωματιδίων LDL είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τη 2η ομάδα. Στην ομάδα των παιδιών με ενεργή νόσο διαπιστώνονται υψηλότερα ποσοστά sdLDL (small dense LDL) συγκριτικά με την ομάδα χωρίς ενεργότητα (84,4% έναντι 68,8%).
description: Chronic inflammation has been related to increased risk for cardiovascular diseases in patients with Rheumatoid Arthritis (RA), due to atherogenic, structural alterations in low density lipoprotein (LDL) particles. Children with Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA) present with atherogenic lipid profile. The aim of the present study was to observe LDL particles in plasma of children with JIA, with the use of Atomic Force Microscopy (AFM), which is an instrument able to provide nanometer-scale resolution images and it has been used for the examination of biomolecules in various cases in biology-biomaterial research. Blood EDTA plasma was obtained from 6 children with JIA, divided into two groups, according to the severity of the disease (1st group without disease activity and 2nd group with disease activity). LDL were isolated by sequential ultracentrifugation at 10◦C in 55,000rpm for 3 hours, using a Beckmann XL-90 ultracentrifuge (75Ti rotor). Experiments were performed on two smooth and clean substrates of different hydrophobicity (glass and c-Si). Samples were rinsed gently, substrates were dried and AFM measurements were performed with Solver P47H Pro (NT-MDT). After initial observation, samples were frozen in -80◦C for a week and observed again. Macroscopically, LDL particles formed aggregations in a dendroid layout. There were no differences between images taken from both substrates. Frozen samples presented significantly smaller LDL particles, than fresh ones. Children with active JIA had smaller diameter of LDL particles than those with remission of the disease. In the group of children with disease activity is observed higher percentage of small dense – sdLDL than the other group (84,4% versus 68,8%).