Βιοτεχνολογική παραγωγή της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης β- αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης για ενδοκυτταρική μεταφορά μέσω της PTD τεχνολογίας: εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση ασθενών με β-θαλασσαιμία:
Creators: name: Νεντούδη, Καλλιόπη Αναστασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες
Πρωτεϊνική θεραπεία
Β-θαλασσαιμία
Recombinant proteins
Protein therapy
Beta thalassemia

description: Πρωταρχικός στόχος της διπλωματικής εργασίας υπήρξε η κλωνοποίηση του cDNA της ανθρώπινης β-σφαιρίνης μέσα σε βακτηριακό φορέα έκφρασης του ΤΑΤ. Από τα διάφορα PTDs που έχουν απομονωθεί, το ΤΑΤ είναι το πιο μελετημένο. Μέσω γενετικής μηχανικής από GMOs [βακτηριακό σύστημα έκφρασης πρωτεϊνών p TAT / p TAT-HA της ερευνητικής ομάδας του Steve Dowdy και τον pETM30] έγινε προσπάθεια παραγωγής της πρωτεΐνης σύντηξης 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνης -ΤΑΤ-ΗΑ για τη μελέτη της ενδοκυττάριας μεταφοράς της. Επιπλέον έγινε προσπάθεια κλωνοποίησης του cDNA της β-σφαιρίνης στον ίδιο βακτηριακό φορέα, με σκόπο την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνης, η οποία θα χρησιμοποιηθεί ως αρνητικό control στα πειράματα ενδοκυτταρικής μεταφοράς. Παράλληλα, η πρωτεΐνη σύντηξης θα χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώματος ενάντια στη β-σφαιρίνη. Η κλωνοποίηση της αλληλουχίας β-globin-ΤΑΤ-ΗΑ στον πλασμιδικό φορέα pETM30 όπως επίσης και η κλωνοποίηση του cDNA του γονιδίου της β-σφαιρίνης ήταν επιτυχής. Προχωρήσαμε στην έκφραση, παραγωγή και καθαρισμό των δύο ανασυνδυασμένων πρωτεΐνών. Διαπιστώθηκε ότι και οι δύο πρωτεΐνες, ανεξάρτητα από τη θερμοκρασία και το χρόνο επαγωγής της έκφρασης τους, εντοπίζονται κυρίως στα έγκλειστα (αδιάλυτο ίζημα) των βακτηριακών κυττάρων. Η διαλυτοποίηση των εγκλείστων πραγματοποιήθηκε με αποδιατακτικούς παράγοντες (6Μ υδροχλωρικής γουανιδίνης και 8Μ ουρίας). Για τον καθαρισμό των υβριδικών πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε χρωματογραφία αγχιστείας (σφαιρίδια Ni-NTA). Παρατηρήθηκε ότι έκλουση της πρωτεΐνης 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνη-ΤΑΤ-ΗΑ από τη στήλη Ni-αγαρόζης επιτυγχάνεται με διάλυμα έκλουσης που περιέχει 800mM ιμιδαζόλιο και έχει pH 4.5. Στην προσπάθεια έκλουσης της ίδιας πρωτεΐνης με διάλυμα έκλουσης 500mM ιμιδαζόλιο και pH 8.0 διαπιστώθηκε ότι σχεδόν όλη η πρωτεΐνη παραμένει δεσμευμένη στα σφαιρίδια αγαρόζης-Ni. Αντίθετα, η 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνη εκλούεται από τη στήλη Ni-αγαρόζης τόσο με διάλυμα 800mM ιμιδαζόλιο και pH 4.5 όσο και με διάλυμα 500mM ιμιδαζολίου και pH 8.0 (με τη διαφορά ότι στην πρώτη περίπτωση η απόδοση της έκλουσης είναι μεγαλύτερη). Η διαφορετική αυτή συμπεριφορά, κατά την έκλουση από τη στήλη Ni-αγαρόζης, μεταξύ των δύο πρωτεϊνών 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνη-ΤΑΤ-ΗΑ και 6His-GST-TEVsite-β-σφαιρίνη, πιθανά να οφείλεται στην παρουσία της αλληλουχίας του ΤΑΤ. Η αναδίπλωση των πρωτεϊνών, προκειμένου να ανακτήσουν τη λειτουργική τους διαμόρφωση, πραγματοποιήθηκε με απομάκρυνση των αποδιατακτικών παραγόντων. Στην παρούσα εργασία για την αναδίπλωση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε το Refolding CA Kit της εταιρείας TAKARA. Η αναδίπλωση της πρωτεΐνης 6His-GST-β-σφαιρίνη με τη χρήση του Refolding CA kit της Takara πραγματοποιήθηκε με το απορρυπαντικό Tween®60 και σε μικρότερο βαθμό με το απορρυπαντικό CTAB. Σε αντίθεση, η πρωτεΐνη 6His-GST-β-σφαιρίνη-ΤΑΤ-ΗΑ αναδιπλώθηκε σε ακόμη μικρότερο βαθμό με το ίδιο kit και το απορρυπαντικό Tween®60, ενώ δεν παρατηρήθηκε αναδίπλωση όταν χρησιμοποιήθηκε το απορρυπαντικό CTAB. Πιθανόν και σε αυτή την περίπτωση οι διαφορές που παρατηρούνται ανάμεσα στις δύο πρωτεΐνες κατά την αναδίπλωση να οφείλονται στην παρουσία/απουσία της αλληλουχίας του ΤΑΤ.
description: The primary objective of this thesis was to clone the cDNA of human b-globin in a bacterial TAT-expression vector. Among the various PTDs isolated TAT is more thoughtful. Through genetic engineering of GMOs [protein expression bacterial system p TAT / p TAT-HA from Steve’s Dowdy research team and pETM30] the production of the fusion protein 6His-GST-TEVsite-beta-globin-TAT-HA was attempted for the study of its intracellular transduction. Moreover the cloning of cDNA of beta-globin in the same bacterial body was attempted in order to produce the recombinant protein 6His-GST-TEVsite-beta-globin, which will be used as a negative control experiments in intracellular transport. Furthermore, the fusion protein will be used for the production of polyclonal antibody against beta-globin. The cloning of the sequence b-globin-TAT-HA in the plasmid vector pETM30 as well as the cloning of the cDNA gene beta-globin was successful. We proceeded to the expression, production and purification of two recombinant proteins. It was found that both proteins, regardless of the temperature and time of induction of expression are found mainly in inclusion bodies (insoluble residue) of the bacterial cells. The dissolution of the inclusion bodies was held by denaturing agents (6M guanidine hydrochloride and urea 8M). For the purification of hybrid proteins we used affinity chromatography (Beads Ni-NTA). It was observed that elution of the protein 6His-GST-TEVsite-beta-globin-TAT-HA by Ni-agarose column was obtained by elution solution containing 800mM imidazole pH 4.5. When we attempted to elute the same protein with elution solution 500mM imidazole pH 8.0, we found that almost all the protein remains bound to agarose beads-Ni. On the contrary, the 6His-GST-TEVsite-beta-globin was eluted from Ni-agarose column with a 800mM imidazole pH 4.5 solution as well as with a 500mM imidazole pH 8.0 solution (with the exception that in the first case the elution yeld is higher). This difference in behavior during the elution from the Ni-agarose column, between the two proteins 6His-GST-TEVsite-beta-globin-TAT-HA and 6His-GST-TEVsite-beta-globin, was due to the presence of the TAT sequence. The refolding of proteins to regain their functional configuration was made by removal of denaturating agents. In this study we used for the refolding of the recombinant proteins the Refolding CA Kit, TAKARA. The refolding of the protein 6His-GST-beta-globin using Refolding CA kit of Takara was obtained with the Tween ® 60 detergent and to a lesser extent with the CTAB detergent. On the contrary, protein 6His-GST-beta-globin-TAT-HA rolled back to an even lesser extent with the same kit and the Tween ® 60 detergent, while there was no refold when using the CTAB detergent. Perhaps in this case the differences in refolding between the two proteins were due to the presence / absence of the TAT sequence.