Στοχευμένη γενετική τροποποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων νεφρού και μαστού με την τεχνική CRISPR/Cas9
Creators: name: Γωνίδας, Χρήστος Παναγιώτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Ογκοκατασταλτικό γονίδιο CYLD
Γενετική τροποποίηση
CRISPR/Cas9
Tumor suppressor CYLD
Genetic modification

description: Η πρωτεΐνη CYLD είναι μια ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη με δράση αποουβικουιτινάσης, που εξειδικεύεται στην υδρόλυση αλυσίδων πολυουβικουιτίνης που συνδέονται είτε γραμμικά είτε μέσω λυσίνης 63. Η CYLD συμμετέχει στην αρνητική ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών η ενεργοποίηση των οποίων εξαρτάται από τη γεφύρωση στοιχείων τους μέσω αλυσίδων πολυουβικουιτίνης. Από αυτά, καλύτερα χαρακτηρισμένα είναι τα μονοπάτια του NF-κB και της JNK. Μέσω της εμπλοκής της στη σηματοδότηση παίζει ρόλο στη ρύθμιση φυσιολογικών διεργασιών, που περιλαμβάνουν την κυτταρική επιβίωση και διαίρεση, την ανοσοαπόκριση, τη φλεγμονή και τη διαφοροποίηση συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων, ενώ η απουσία της συμβάλλει στην καρκινογένεση. Στo πλαίσιo της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε απαλοιφή της έκφρασης της πρωτεΐνης CYLD αγρίου τύπου με στοχευμένη τροποποίηση του αντίστοιχου γονιδίου, σε σειρές επιθηλιακών κυττάρων νεφρού (HEK293FT) και μαστού (HCC1937). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το σύστημα CRISPR/Cas9. Οι κλώνοι που προέκυψαν χαρακτηρίστηκαν ως προς της ενεργότητα του NF-κB, όπου και διαπιστώθηκε η αυξημένη διέγερση του μονοπατιού σε σχέση με φυσιολογικά κύτταρα. Ο έλεγχος της απόκρισης σε βλάβες του DNA στους κλώνους δεν έδειξε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα της γH2AX σε σχέση με φυσιολογικά κύτταρα. Οι κλώνοι που δημιουργήθηκαν θα αποτελέσουν εργαλεία για μια σειρά από δοκιμασίες για τον έλεγχο της εμπλοκής της CYLD σε διάφορα φυσιολογικά φαινόμενα.
description: The tumor suppressor CYLD is a deubiquitinase that hydrolizes preferentially polyubiquitin chains linked linearly or via lysine 63. CYLD participates in the inhibition of signaling pathways the activation of which depends upon proximity-induced activation of signaling molecules which is mediated by anchoring onto polyubiquitin chains. The best characterized of these pathways are the NF-κB and JNK activation pathways. Through its participation in signaling, CYLD regulates a number of physiological processes, including survival and proliferation, immune response and inflammation, as well as specific differentiation pathways. Additionally, the loss of CYLD has been found to contribute to carcinogenesis. In this particular study, the expression of full length CYLD protein was abrogated by targeted genetic modification of the CYLD gene locus using the CRISPR/Cas9 system, in kidney (HEK293FT) and breast (HCC1937) epithelial cell lines. The isolated clones were characterized with regard to the NF-κB transcriptional activity. The basal and induced activity of NF-κB was markedly enhanced in the clones that lacked expression of the CYLD protein in comparison to normal cells. Testing the DNA damage response in clones that lacked the CYLD protein did not reveal a difference in the levels of γH2AX protein compared to normal cells. The isolated clones can be used as a tool in order to investigate the potential role of the CYLD protein in a number of physiological phenomena.