title: Die Verknüpfung onkogener Signalwege durch intrazelluläres NRN1 im malignen Melanom
Creators: name: Devitt, Lucia
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: Melanom, NRN1, Notch, STAT

description: Das Protein NRN1 (Neuritin-1, auch cpg15 (candidate plasticity gene 15)), welches Gegenstand dieser Arbeit ist, fungiert im malignen Melanom als Onkogen. Trotz nachweisbarer funktioneller Effekte auf das Verhalten von Melanomzellen sind bisher weder Rezeptoren für extrazelluläres NRN1, noch Signalwege, die durch NRN1 intrazellulär beeinflusst werden, bekannt. Die molekulare Aufklärung der durch NRN1 veranlassten Effekte im malignen Melanom war Ziel unserer Forschung. Durch eine lentivirale Überexpression von NRN1-GFP wurden sowohl der funktionelle Phänotyp als auch die molekularen Wirkmechanismen von NRN1 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proliferation (gemessen mittels RTCA (real time cell analysis)) durch die starke NRN1-Expression signifikant erhöht war. Sowohl die Koloniebildungsfähigkeit (Clonogenic Assay) als auch die 3D-Sphäroidgröße sowie das Wachstum unter Attachment-unabhängigen Bedingungen war im Vergleich zu GFP Zellen jeweils signifikant erhöht. Molekular konnten wir eine direkte Interaktion von NRN1 mit den N1ICD(NOTCH1 intracellular domain)- und N3ICD(NOTCH3 intracellular domain) Fragmenten des NOTCH-Signalwegs zeigen, was zu einer Inhibition des Signalwegs durch verringerte Transkription des Effektorproteins HES1 (hairy and enhancer of split 1) führte. Aufgrund der durch uSTAT3 regulierten Zielgene untersuchten wir ebenso verschiedene tumortypische Umwelteinflüsse in unserem Modellsystem. Unter Hypoxie fanden wir NRN1, wie bereits bekannt, im Melanom zusätzlich induziert. Spannenderweise konnten wir nachweisen, dass NRN1 auch unter normoxischen Bedingungen den als Hypoxiemarker bekannten Faktor ANGPTL4 (angiopoietin like 4) induzierte. Für VEGF A zeigte sich außerdem eine synergistische Induktion der mRNA-Level durch NRN1-Überexpression und Hypoxie. Somit könnte NRN1 direkt an der Regulation von Vaskularisierungsvorgängen im malignen Melanom beteiligt sein. Da wir auch eine Induktion des Efflux-Transporters MDR1 durch NRN1 über uSTAT3 zeigen, untersuchten wir außerdem die Effekte von chemotherapeutischem Druck auf GFP- und NRN1 GFP Zellen. Eine 24-stündige Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen von Cisplatin und Temozolomid zeigte keinerlei Unterschiede zwischen den Zellklonen. Allerdings konnte durch fortwährende, zyklische Behandlung mit IC50-Konzentrationen von Cisplatin eine resistente NRN1-GFP Subpopulation generiert werden, welche eine starke Induktion der NRN1- und MDR1-Expression aufwies. Zusätzlich konnten auch die für stammzellähnliche Charakteristika bekannten Gene JARID1B (lysine demethylase 5B) und NANOG (NANOG homeobox) als induziert nachgewiesen werden. Insgesamt konnten wir im malignen Melanom eine bis dato unbekannte Regulation des NOTCH- und STAT3-Signalwegs durch NRN1 zeigen, die deutliche onkogene Effekte auf den Phänotyp der Zellen hat. Damit trägt diese Arbeit weiter zum Verständnis der molekularen Mechanismen in dieser Tumorart bei, welche mögliche neue Angriffspunkte für zielgerichtete Therapien bieten könnten. Zusätzlich konnten wir auch einen Effekt der erhöhten NRN1-Expression auf den STAT3(signal transducers and activators of transcription)-Signalweg nachweisen. Interessanterweise zeigte sich hier eine erhöhte Menge an Gesamtprotein von STAT3 bei einer gleichzeitigen Abnahme der Phosphorylierungslevel. Dadurch war es uns möglich, im malignen Melanom eine alternative, auf uSTAT3 (unphosphoryliertem STAT3) basierende Signalachse nachzuweisen. Hierfür untersuchten wir aufgrund bestehender Literatur einige Zielgene, welche durch uSTAT3 transkriptionell aktiviert werden. Dabei konnten wir vor allem für VEGF A (vascular endothelial growth factor A) und MDR1 (multidrug resistance protein 1) eine Induktion in Abhängigkeit der NRN1-Expression zeigen. Aber auch das im malignen Melanom viel diskutierte Protein CD271 (nerve growth factor receptor) war in unserem Modellsystem stark induziert, wobei wir im Gegenzug eine verringerte MITF(melanocyte inducing transcription factor)-Expression in NRN1-GFP Zellen nachweisen konnten. Diese Wirkweise von NRN1 auf zwei essenzielle Signalwege in der Zelle führte zu nachfolgender Hypothese (Abbildung 1). Durch die hohe Menge an NRN1 wird NICD, der signalweiterleitende Teil des NOTCH-Signalwegs, im Zytoplasma der Zelle gebunden, wodurch weniger in den Zellkern gelangt und die Transkription des Effektorproteins HES1 verringert wird. Durch diese Inhibition des NOTCH-Signalwegs liegt schließlich weniger HES1 im Zytoplasma der Zelle vor. Da HES1 über JAK (Janus kinase) einen Phosphorylierungs Komplex mit STAT3 bilden kann, kommt es somit auch zu einer verringerten Menge an pSTAT3. Aufgrund der Akkumulation von uSTAT3 kommt es zu einer erhöhten transkriptionellen Aktivität dieses alternativen Signalwegs.