title: Charting the phosphoproteome
Creators: name: Janker-Bortel, Patricia
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine ubiquitäre, hochdynamische posttranslationale Modifikation (PTM), die einen großen Teil des menschlichen Proteoms betreffen kann. Als zentraler zellulärer Mechanismus der Signaltransduktion wird diese Modifikation durch Kinasen und Phosphatasen reguliert. Dysregulierte Kinaseaktivitäten, welche zu aberranten Phosphorylierungsmustern führen können, werden in verschiedenen pathologischen Zuständen wie entzündlichen Krankheiten sowie Krebserkrankungen beobachtet. In Anbetracht der essentiellen Rolle von Kinasen als Angriffspunkte für Medikamente ist die Untersuchung der Proteinphosphrylierung zur detaillierten Aufklärung ihrer Funktion in Gesundheit und Krankheit heutzutage eine Aufgabe von größter Bedeutung. Während man sich in den Anfängen der Proteomik hauptsächlich auf unmodifizierte Proteine fokussierte, hat sich dieser Forschungsbereich im Laufe der Zeit stark weiterentwickelt und ausgeweitet, indem immer mehr PTMs untersucht wurden. Um die Jahrhundertwende etablierte sich so die Unterkategorie der Phosphoproteomik. Seitdem ist die Phosphoproteomik die Methode der Wahl für die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung von phosphorylierten Peptiden und Proteinen im großen Maßstab. Trotz großer Fortschritte in diesem Forschungsgebiet innerhalb der letzten Jahre stellen die hohe Dynamik und die enorme Vielfalt des Phosphoproteoms die angewandten Analyseverfahren vor einige Herausforderungen. Diese Analyseverfahren umfassen in der Regel eine Vielzahl von Schritten, angefangen vom experimentellen Zellkulturdesign über die Probenvorbereitung inklusive Anreicherungsverfahren bis hin zu den Messungen mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie. Da jede dieser Ebenen die resultierenden Phosphoproteome massiv beeinflussen kann, ist die Identifizierung und Charakterisierung der potenziell beitragenden Faktoren von entscheidender Bedeutung, um fundierte Entscheidungen in Bezug auf alle angewandten Parameter und Methoden treffen zu können. Sogenannte „Omics“-Analysen, einschließlich der Phosphoproteomik, werden oft für Perturbationsstudien in Zellkulturmodellen verwendet, um behandlungsspezifische Effekte zu erfassen und eventuell sogar den Wirkmechanismus eines Wirkstoffes zu entschlüsseln. Während der Einfluss technischer Parameter während der Probenvorbereitung in der Phosphoproteomik-Gemeinschaft allgemein anerkannt ist, wurden mögliche beeinflussende Faktoren von Seiten der Zellkultur bisher wenig untersucht. Im Zuge der Behandlung von Krebszellen mit einem Krebsmedikament konnten wir nachweisen, dass sogenannte „Memory effects“ aus der vorhergehenden Subkultur, vor dem eigentlichen Perturbationsexperiment, bis in die Multi-omics Datensätze nachweisbar sein können und insbesondere die Phosphoproteom-Perturbationsprofile stark beeinflussen können. Die Kontrolle über solche „Memory effects“ kann dazu beitragen, die hypothesengenerierende Kraft solcher Studien zu maximieren. Bei der Untersuchung der Phosphoproteom-Probenvorbereitungsschritte sind wir noch einen Schritt weitergegangen und haben eine Reihe von Parametern während der Anreicherung von Phosphopeptiden systematisch optimiert, um eindeutige Schlussfolgerungen zu ziehen, wie sie sich auf wesentliche Benchmarks wie die Phosphoproteom-Tiefe und die Anreicherungseffizienz auswirken. Mit der Verwendung von geringen Peptidmengen als Ausgangsmaterial folgten wir der wachsenden Nachfrage nach hochsensiblen Workflows, die detaillierte Phosphoproteome liefern können. Wir haben die wichtigsten Einflussgrößen ermittelt, ein alternatives Anreicherungsverfahren mit sequenzieller Anreicherung entwickelt, und die optimierte Pipeline auf die neueste Generation von Massenspektrometern übertragen. Insgesamt könnte diese detaillierte Evaluierung als Leitfaden für hochempfindliche Phosphoproteomik-Analysen von Proben von geringer Input-Menge dienen. Solche sensitiven Phosphoproteomik-Analysen ermöglichen durch die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen an Proteinen innerhalb von Signalwegen deren Untersuchung und können daher für das Verständnis von pathologischen Zuständen relevant sein. Da diese Phosphorylierungsereignisse sehr dynamisch sind, kann die Aufklärung ihrer funktionellen Bedeutung durch die Erfassung ihres Zeit- und Stimulus-abhängigen Phosphorylierungsprofils verbessert werden. Diese Technik haben wir eingesetzt um die Reaktion von embryonalen Hautfibroblasten auf entzündliche und entzündungshemmende Stimuli mithilfe von zeitlich aufgetrennten Phosphoproteom-Profilen zu untersuchen. Dieser Ansatz erwies sich als sehr effizient und ermöglichte die Differenzierung zwischen behandlungsspezifischen und unspezifischen Effekten. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die hier etablierten und optimierten Ansätze dazu beitragen können, die bei der Phosphoproteomik auftretenden Herausforderungen zu überwinden. So kann die funktionelle Aussagekraft der entsprechenden Studien maximiert werden und es können Schlussfolgerungen zu krankheitsrelevanten Phosphorylierungsereignissen gezogen werden, welche eventuell für klinische Anwendungen von Bedeutung sind.
description: Protein phosphorylation is a ubiquitous, highly dynamic post-translational modification (PTM) affecting a large proportion of the human proteome. Being a key cellular mechanism for signal transduction, this pivotal modification is tightly controlled via kinases and phosphatases. Dysregulated kinase activities causing aberrant protein phosphorylation patterns are observed in several pathological conditions such as inflammatory diseases and various cancers. Given the central role of kinases as drug targets, investigating protein phosphorylation to elucidate its function in health and disease is nowadays a task of utmost importance. While mainly focusing on unmodified proteins in its early days, the field of proteomics has largely expanded and branched over the time, covering more and more PTMs and establishing the sub-discipline of phosphoproteomics at the turn of the century. Since then, phosphoproteomics has become the method of choice for the large-scale, unbiased identification and quantification of phosphorylated peptides and proteins. Despite major advancements in the field within the last years, the dynamic nature and the vast scale of the phosphoproteome still cause some challenges within phosphoproteomics workflows. Such workflows typically include a variety of steps, from experimental cell culture design over sample preparation incorporating enrichment procedures to liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) measurements. Each layer may substantially affect the obtained phosphoproteomes, thus, the identification and characterization of potential contributing factors are crucial to make educated decisions in regard to all of the applied parameters and methods. Omics analyses including phosphoproteomics are commonly applied in perturbation studies on cell cultures, aiming to capture treatment-specific effects and eventually deconvolute a drug’s mode of action (MoA). While the influence of technical parameters during sample preparation is commonly recognized in the phosphoproteomics community, potential contributors during cell culture have so far been investigated to a lesser extent. By employing a treatment of cancer cells with an anticancer drug, we evidenced that memory effects from prior subculture, before the actual perturbation experiment, can persist into the multi-omics readouts and especially affect phosphoproteomic perturbation profiles. Previously unnoticed, controlling for such memory effects can aid in maximizing the hypothesis-generating power of such studies. Taking one step further in phosphoproteomics pipelines, we systematically optimized a variety of parameters during phosphopeptide enrichment to draw clear conclusions on how they affect essential benchmarks such as phosphoproteome depth and enrichment efficiency. Employing minute input amounts, we followed the arising demand for highly sensitive workflows yielding deep phosphoproteomes. Pinpointing key influencing variables, we developed an alternative enrichment approach incorporating sequential enrichment and transferred the optimized pipeline to the newest generation of mass spectrometers. Overall, this detailed work could serve as a guide for highly sensitive phosphoproteomics analyses from low input samples. Such sensitive phosphoproteomics analyses enable the investigation of pathways relevant in pathological conditions by the identification of phosphorylation sites on involved proteins. Being highly dynamic, the understanding of their functional relevance can be enhanced by sampling their time- and stimuli-dependent phosphorylation profile. We explored this option by employing time-course phosphoproteomic profiling for studying the response of embryonic skin fibroblasts to pro- and anti-inflammatory stimuli. This approach proved to be highly efficient and allowed for the differentiation between treatment-specific and -unspecific effects. In summary, the presented, optimized approaches can aid in overcoming challenges commonly encountered in phosphoproteomics, maximize the functional readout of respective studies and eventually help to draw conclusions in disease-involved phosphorylation events relevant for clinical applications.