title: Mechanistische Untersuchungen zur Regulation der bakteriellen Transkription durch NusG-Proteine
Creators: name: Zuber, Philipp
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2023
Subjects: subject: Bakterielle Transkription
subject: NusG-Proteine
subject: NusG
subject: Spt5
subject: RfaH
subject: NMR-Spektroskopie
subject: Faltungswechselnde Proteine
subject: Proteinfaltung
subject: 530
subject: 540
subject: 570

description: Die Transkription ist als erster Schritt der Genexpression ein zentraler Prozess in allen Organismen. Katalysiert wird sie durch RNA-Polymerasen (RNAPs), die von zahlreichen Transkriptionsfaktoren reguliert werden, von denen die NusG- (Bakterien) bzw. Spt5- (Archaeen, Eukaryoten) Proteine die einzige universell konservierte Klasse darstellen. NusG besteht aus mindestens zwei flexibel verbundenen Domänen (N-/C-terminale Domäne, NTD/CTD), wobei die NusG-CTD auch als KOW-Domäne bezeichnet wird und eine beta-Fass-Struktur besitzt. In Escherichia coli (E. coli) bindet die NusG-NTD an die RNAP und erhöht deren Prozessivität, während die NusG-CTD unterschiedlichste Interaktionspartner hat. Daneben existieren spezialisierte NusG-Paraloge, wie E. coli RfaH, das spezifisch an Operons rekrutiert wird, die ein operon polarity suppressor (ops)-Element enthalten. Auch RfaH besteht aus einer NTD und einer CTD, die flexibel verbunden sind. Während die RfaH-NTD strukturell und funktionell homolog zur NusG-NTD ist, faltet sich die RfaH-CTD als alpha-hairpin und interagiert mit der RfaH-NTD, womit sie deren RNAP-Bindestelle maskiert und RfaH so autoinhibiert. Bei Rekrutierung an einen durch ops pausierten Elongationskomplex (ops-PEC) wird die Domäneninteraktion aufgehoben, die RfaH-NTD bindet an die RNAP und die isolierte RfaH-CTD faltet sich in ein NusG-CTD-ähnliches beta-Fass um, das mit S10 interagieren und so die Translation aktivieren kann. Da die Basis der Transkriptionsregulation durch NusG/Spt5 und RfaH noch immer zu großen Teilen unverstanden ist, wurden in dieser Arbeit die zugrundeliegenden Prinzipien auf molekularer Ebene durch Kombination von integrativer Strukturbiologie mit biophysikalischen und biochemischen Methoden untersucht. RfaH-kontrollierte Gene enthalten ein ops-Element, das im ops-PEC an der Oberfläche der RNAP zugänglich ist und von RfaH erkannt wird. Um die Basis für diese spezifische Erkennung zu untersuchen, wurde die Struktur des RfaH:ops-Komplexes bestimmt. Die ops-DNA bildet einen hairpin, wodurch die zentralen Basen des Motivs exponiert werden und eine spezifische Interaktion mit RfaH ermöglichen. Dies stellt einen neuen Modus der spezifischen Erkennung einzelsträngiger DNA dar. In-vitro-Transkriptionsassays zeigten zudem, dass die flankierenden ops-Nukleotide essenziell zur Einführung der Transkriptionspause sind. Das ops-Element stellt somit ein chimäres Pausierungs- und Rekrutierungssignal dar. Mittels für supramolekulare Systeme geeigneten Kernspinresonanz (NMR)-Methoden wurde der molekulare Auslöser für die Umfaltung der RfaH-CTD identifiziert. Weder die isolierte ops-DNA noch die isolierte RNAP können die Domänendissoziation und damit die Umfaltung der RfaHCTD induzieren; hierzu ist ausschließlich der ops-PEC in der Lage. Weiterhin wurde gezeigt, dass ops-PEC-gebundenes RfaH mit S10 interagieren kann, was die Grundlage für die Aktivierung der Translation ist, und dass RfaH nach Dissoziation von der RNAP wieder in den autoinhibierten Zustand zurückfaltet. RfaH agiert somit in einem geschlossenen Funktionszyklus. Auch die NusG-CTD bindet an S10 und könnte so die RNAP mit dem Ribosom verbrücken. Mittels supramolekularer NMR-Methoden wurde hier erstmals eine direkte, simultane Interaktion zwischen der RNAP, NusG und dem 70S-Ribosom demonstriert werden, was die strukturelle Basis für die NusG-vermittelte Transkriptions:Translations-Kopplung darstellt. In-vivo-Experimente ergaben zudem, dass NusG erst spät während der Transkription rekrutiert wird und dass dies von der Translation abhängt. Eukaryotische Spt5-Proteine enthalten 5-7 KOW-Domänen. Da nur wenige Daten über die KOW-Domänen 4, 6 und 7 des humanen Spt5 vorlagen, wurden deren Strukturen bestimmt. Die KOW4 faltet als beta-Fass, das von weiteren Strukturelementen flankiert wird. Letztere ermöglichen eine Interaktion mit Nukleinsäuren und dem Rpb4/7-stalk der RNAP-II, und erweitern so das funktionelle Repertoire der KOW-Domänen. KOW6 und 7 bilden ein Doppel-beta-Fass, dessen Funktion jedoch noch unbekannt ist. Die RfaH-CTD nimmt eine Sonderstellung unter allen bisher bekannten NusG/Spt5-KOW-Domänen ein, da sie einen vollständigen und reversiblen Faltungswechsel vollzieht. Um die zugrundeliegenden Prinzipien aufzuklären, wurden Stabilitäts- und Strukturdynamikstudien mit isolierten CTDs/KOW-Domänen von NusG/RfaH-Proteinen aus allen drei Domänen des Lebens durchgeführt. Diese ergaben, dass die RfaH-CTD thermodynamisch instabiler als die meisten anderen Domänen ist, weshalb sie im Gleichgewicht mit einer ungefalteten Spezies steht. Letztere weist jedoch helikale Reststrukturen auf und ist somit ein potenzielles Intermediat zwischen den beiden RfaH-CTD-Zuständen, was die Basis für die konformationelle Plastizität von RfaH darstellt. Somit erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur das Verständnis der Transkriptionsregulation durch NusG-Proteine, sondern gewähren Einblicke in die molekularen Grundlagen neuer regulatorischer Prinzipien und der Proteinfaltung.