Μελέτη της βιοτινυλιωμένης επικράτειας D της πρωτεΐνης SpA του Staphylococcus aureus σε ικριώματα
Creators: name: Καρατζά, Μελπομένη Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Σταφυλοκοκκική πρωτεΐνη Α
In vivo Βιοτινυλίωση
Πρωτεϊνικά ικριώματα
Staphylococcal protein A
In vivo Biotinylation
Protein Scaffolds

description: Ένας από τους σημαντικότερους λοιμογόνους παράγοντες, ο Staphylococcus aureus, που καλεί τους επιστήμονες σε συνεχή αγώνα για την εξάλειψή του, μελετήθηκε στα πλαίσια της προκείμενης εργασίας. Η πρόοδος της βιοτεχνολογίας είναι το εργαλείο και μέσο κατανόησης, ειδικά σε μοριακό επίπεδο, της πολυδιάστατης και πολύπλοκης δράσης του βακτηρίου στον ξενιστή. Το έξυπνο αυτό βακτήριο διαθέτει πολλούς και ευφυείς μηχανισμούς απόδρασης από την άμυνα του ξενιστή, καθιστώντας την εύρεση κατάλληλης θεραπείας, πρόκληση για την επιστημονική κοινότητα. Η διττή του ύπαρξη, αφενός ως φυσιολογική μικροχλωρίδα σε ιστούς του ανθρώπου, αφετέρου, ως λοιμογόνος παράγοντας, ανάλογα με την παρουσία του σε ευπαθείς ή μη ιστούς και ξενιστές, ταλανίζει την ιατρική κοινότητα διότι οι παραδοσιακές μέθοδοι της ιατρικής τεχνολογίας έχουν εξαντλήσει τα όρια παρέμβασής τους. Με την παρούσα εργασία δίνεται η έναρξη ενός σχεδίου με σκοπό την εξέταση πιθανής αντιμικροβιακής δράσης παραγόντων με καθήλωση τους σε πρωτεϊνικής φύσης ικριώματα που προσομοιάζουν βιολειτουργικές επιφάνειες με χαρακτηριστικά των φυσιολογικών ιστών. Στη λοιμογόνο δράση του S. aureus, διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο μία πρωτεΐνη, η πρωτεΐνη Α, που λόγω ότι εκτίθεται στην επιφάνεια του κυτταρικού τοιχώματός του, καθιστά δυνατή την αλληλεπίδραση του βακτηρίου από τη μία με διάφορους παράγοντες του ξενιστή, προς αποφυγή της ανοσολογικής άμυνας και από την άλλη με γειτονικά βακτήρια επιτρέποντας το σχηματισμό βιομεμβρανών και αποικισμό του, σε μέχρι πριν, υγιείς ιστούς. Η πρωτεϊνική επικράτεια D της πρωτεΐνης Α του S. aureus (SpAD) έχει τον πρωταγωνιστικό ρόλο στην διπλωματική αυτή διατριβή. Με αφορμή προηγούμενα πειράματα όπου αξιοποιείται και μελετάται η δράση της και καθήλωσή της, επιχειρείται σε αυτή την εργασία μία εναλλακτική προσέγγιση. Αρχικά εκμεταλλευόμενοι την υψηλής αγχιστείας αλληλεπίδραση της βιοτίνης με τη στρεπταβιδίνη, σχεδιάστηκε σε γονιδιακό επίπεδο η έκφραση και η in vivo βιοτινυλίωση της επικράτειας SpAD. Η απομόνωση ενός υψηλής καθαρότητας και συγκέντρωσης προϊόντος βιοτινυλιωμένης SpAD, είναι η αρχή για τη μετέπειτα χρήση της σε πειράματα για την εύρεση αντιμικροβιακών ιδιοτήτων και αλληλεπιδράσεων της SpAD, όντας καθηλωμένη σε βιολειτουργικά ικριώματα με δυνατότητα αναγνώρισης και δέσμευσης βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών
description: One of the most important infectious agents, Staphylococcus aureus, which invites scientists to a continuous struggle for its elimination, was studied in the context of the present work. The advancement of biotechnology is the tool and means of understanding, especially at the molecular level, the multidimensional and complex action of the bacterium on the host. This clever bacterium has many clever escape mechanisms from the host's defenses, making finding a suitable treatment a challenge for the scientific community. Its dual existence, on the one hand, as a normal microflora in human tissues, on the other, as an infectious agent depending on its presence in susceptible or non-susceptible tissues and hosts, plagues the medical community because the traditional methods of medical technology have exhausted their limits of intervention. With this work, the beginning of a project is given with the aim of examining the possible antimicrobial action of factors by immobilizing them in protein scaffolds that simulate biofunctional surfaces with characteristics of normal tissues. In the virulence of S. aureus, a dominant role is played by a protein, protein A, which, because it is exposed on the surface of its cell wall, enables the interaction of the bacterium with various factors of the host, to avoid the immune defense and on the other hand with neighboring bacteria allowing the formation of biofilms and its colonization, in previously healthy tissues. The protein domain D of Staphylococcal protein A (SpAD) has the leading role in this diploma thesis. Based on previous experiments where its action is exploited and studied and its fixation, an alternative approach is attempted in this work. Initially exploiting the high-affinity interaction of biotin with streptavidin, expression and in vivo biotinylation of the SpAD domain was engineered at the gene level. Isolation of a highly purified and concentrated product of biotinylated SpAD, is the principle for its subsequent use in experiments to find antimicrobial properties and interactions of SpAD, being immobilized on biofunctional scaffolds capable of recognizing and binding biotinylated proteins