Фітохімічне вивчення та стандартизація лікарських засобів антиоксидантної дії з листя зеленого чаю
Creators: name: Маслов О.Ю.
Publisher: name: Zenodo
Year: 2023
Subjects: дієтична добавка
лист зеленого чаю
антиоксидантна актив- ність
рідкий екстракт
валідація
біологічні активні речовини
гранули

description: У дисертаційної роботі наведено результати експериментального вирішення <br> наукової задачі, яка полягає у фітохімічному вивченні екстрактів листя зеленого <br> чаю та розробці методів аналізу лікарських засобів з антиоксидантною дією, ство-<br> рених на їх основі. <br> Обґрунтовано доцільність визначення антиоксидантної активності потенціо-<br> метричним методом; обрані оптимальний робочий електрод (платиновий), елект-<br> роліт (0,067 моль/л фосфатний буфер з рН = 7,2 – 7,6) і склад медіаторної системи <br> (співвідношення K3[Fe(CN)6] і K4[Fe(CN)6] – 0,002/0,00002 моль/л). <br> Досліджено вплив концентрації етанолу при визначенні рівня сумарної анти-<br> оксидантної активності. Для одержання коректного значення АОА, величину зага-<br> льної зміни потенціалу, яку було визначено під час аналізу зразка слід зменшити <br> на величину потенціалу, відповідну концентрації етилового спирту аналізованого <br> розчину. Етанольні розчини мають відсоток вкладу в АОА: 1,85 %, 3,56 %, 4,89 %, <br> 6,76 %, 7,63 % для 20, 40, 60, 80 та 96 % етанолу, відповідно. Розроблено підхід і <br> запропоновано рівняння для розрахунку сумарної АОА з урахуванням впливу кон-<br> центрації етанолу. <br> Розроблена потенціометрична методика визначення антиоксидантної актив-<br> ності епігалокатехін-3-О-галлату, проведена її валідація за показниками: ліній-<br> ність, правильність (відсоток відновлення 96,01-101,61 %), збіжність (1,86 %) і про-<br> міжна прецизійність (1,34 %). <br> Запропоновано терміни, що виражають АОА досліджуваних зразків. Для <br> створення таких термінів як «золотий» стандарт був обраний епігалокатехін-3-O-<br> галат, оскільки ЕГКГ має найвищу здатність інактивувати вільні радикали. Встано-<br> влено АОА максимальної допустимої рекомендованої добової дози ЕГКГ <br> (562 ммоль-екв./г) і дієтичних добавок «Green Tea Extract» (Source Naturals, США) <br> - 36,51±0,46 ммоль/таб., «Екстракт зеленого чаю» (Еліт-фарм, Україна) - 29,78±0,35 <br> ммоль/таб., «Зелений чай» (Pharmacom, Україна) - 16,67±0,29 ммоль/таб.. Значення <br> АОА дієтичних добавок також були розраховані в ммоль-екв./г, щоб класифікувати <br> їх за запропонованими умовними термінами. В цьому випадку антиоксидантна ак-<br> тивність «Green Tea Extract» склала 205,00±4,10 ммоль-екв./г, «Екстракту зеленого <br> чаю» і «Зеленого чаю» (Pharmacom, Україна) - 104,10±2,08 ммоль-екв./г та <br> 60,05±1,20 ммоль-екв./г. відповідно. <br> Проведено стандартизацію листя зеленого чаю відповідно вимог ЄФ 9.0 за <br> параметрами: опис, макроскопія, мікроскопія, ідентифікація (тонкошарова хрома-<br> тографія), втрата в масі при висушуванні - 6,2±0,12 % (не більше 8,0 %), загальна <br> зола - 6,5±0,13 % (не більше 9,0 %), вміст катехінів - 25,78±0,52 % (не менше 8,5 %) <br> і кофеїну - 2,8±0,06 % (не менше 1,5 %). <br> Фітохімічний скринінг основних груп БАР листя зеленого чаю показав наяв-<br> ність катехінів, флавоноїдів, алкалоїдів, гідроксикоричних та органічних кислот. <br> Методом ТШХ були ідентифіковані епікатехін, епігалокатехін-3-О-галат, рутин, <br> кофеїн, теобромін, хлорогенова, лимона, янтарна і оксалатна кислоти. Всі дослі-<br> джені дієтичні добавки містять епігалокатехін-3-О-галат і епікатехін, кофеїн - в слі-<br> дових кількостях; флавоноїди та гідроксикоричні кислоти не визначені. <br> Спектрофотометричним методом встановлено, що в листі зеленого чаю су-<br> марний вміст фенольних сполук становить 24,12 %, катехінів – 20,79 %, флавоної-<br> дів – 1,27 %, гідроксикоричних кислот і кофеїну – 0,67 % та 2,56 % відповідно. <br> Проведено вивчення фенольних сполук у листі зеленого чаю методом ВЕРХ. <br> Було ідентифіковано та визначено кількісний вміст 4 флавонолів (1,34 %), 3 флаво-<br> нонів (0,25 %), 2 флавонів (0,64 %), 4 фенолкарбонових кислот (1,39 %) і 5 доміну-<br> ючих флаван-3-олів (20,56 %). <br> Серед флаван-3-олів превалюють епігалокатехін-3-О-галат – 9,85 %, епікате-<br> хін галат – 4,12 %, епігалокатехін – 4,03 %. Епікатехіну (2,95 %) та катехіну (0,61 <br> %) значно менше. На підставі високих показників подібності до стандартних речо-<br> вин IT і IL було ідентифіковано 4 флаваноли: кверцетин-3-O-рутенозид – 0,16 %, <br> кемпферол-7-O-глікозид – 0,13 %, кверцетин – 0,16 %, мірицетин-3-O-глікозид – <br> 0,22 %; 3 флаванони: нарінгенін – 0,02 %, гесперидин – 0,19 %, гесперітин – 0,04 <br> %; 2 флавони: лютеолін-6-C-глікозид – 0,33 %, апігенін-8-C-глікозид – 0,31 %. Фе-<br> нольні кислоти представлені галовою – 0,21 %, кофейною – 1,16 %, коричною – <br> 0,01 %, феруловою – 0,01 % кислотами. <br> Розроблена потенціометрична методика кількісного визначення суми віль-<br> них органічних кислот у листі зеленого чаю, проведена її валідація за параметрами: <br> специфічність, лінійність, правильність, прецизійність, стабільність. Для визна-<br> чення оптимальних умов екстракції органічних кислот з сировини проведена оці-<br> нка впливу таких факторів, як співвідношення «сировина:екстрагент», темпера-<br> тура, кількість та тривалість часу екстракції. Найбільш повне вилучення органічних <br> кислот може бути досягнуто за 2 цикли екстракції при 100 ºC зі співвідношенням <br> «сировина:екстрагент» 1:20 протягом 120 хв. За розробленою методикою вміст <br> суми органічних кислот в листі зеленого чаю визначений на рівні 1,83±0,03 %. <br> Відповідно до розділу «Дієтичні добавки» ДФУ 2.0, всі дієтичні добавки по-<br> винні відповідати фармако-технологічним вимогам до дозованих форм за вмістом <br> важких металів, залишкових кількостей пестицидів та мікробіологічною чистотою. <br> Проте відсутні будь-які вимоги до визначення якісного складу та кількісного вмі-<br> сту основних діючих речовин. <br> За результатами моніторингу фармакопей різних країн було з'ясовано, що Фа-<br> рмакопея США містить монографію «Декофеїнізований екстракт зеленого чаю», в <br> якій зазначені вимоги щодо якісного складу та кількісного вмісту катехінів у дієти-<br> чній добавці на основі екстракту зеленого чаю. Кількісний вміст поліфенолів у пе-<br> рерахунку на епігалокатехін-3-О-галат має бути не менше 60 %, а кофеїну - не пе-<br> ревищувати 0,1 %. Оскільки не існує інших нормативних документів, що регулю-<br> ють вміст катехінів у дієтичних добавках з екстрактом зеленого чаю, нами були <br> взяті за основу саме вимоги Фармакопеї США 38. <br> Для визначення кількісного вмісту катехінів у дієтичних добавках розроб-<br> лена спектрофотометрична методика, відповідно якої встановлено, що сумарний <br> вміст катехінів у «Green Tea Extract» складає 156,80±1,36 мг, «Екстракті зеленого <br> чаю» – 89,00 ± 0,88 мг, «Зеленому чаї» – 38,00±0,75 мг. Дієтичні добавки «Green <br> Tea Extract» і «Екстракт зеленого чаю» відповідають вимогам Фармакопеї США 38 <br> щодо вмісту катехінів; всі три досліджувані дієтичні добавки за всіма критеріями <br> також відповідають вимогам ДФУ 2.3. <br> За розробленою методикою визначено сумарну антиоксидантну активність <br> листя, спиртових настоянок і настою зеленого чаю. Максимальна сумарна антиок-<br> сидантна активність листя зеленого чаю становить 660,75 ммоль-екв./mсух.зал..; на-<br> стоянка на 60 % етанолі виявляє активність на рівні 48,27±1,44 ммоль/mсух. зал., 96 % <br> настоянка дещо їй поступається (47,49±1,42 ммоль/mсух. зал.), а активність настою - <br> в 2,7 разів менша. <br> Проведено дослідження по визначенню оптимального екстрагенту і кратно-<br> сті екстракції для одержання рідкого екстракту з листя зеленого чаю. Як екстраге-<br> нти використовували спирт етиловий різної концентрації – 96, 60, 40, 20 %; воду та <br> хлороформ. За результами досліджень кількісного вмісту основних груп БАР вста-<br> новлено, що з листя зеленого чаю 60 % етанолом забезпечується найкраща екстра-<br> кція катехінів; оптимальна кратність екстракції з цієї сировини складає два рази. <br> Регресійним аналізом визначено, що найбільш висока кореляція (R = 0,9255) спо-<br> стерігається між рівнем АОА і вмістом фенольних сполук у витягах листя зеленого <br> чаю. <br> Розроблено параметри стандартизації рідкого екстракту листя зеленого чаю <br> за такими показниками: опис, розчинність, ідентифікація (якісні реакції, ТШХ), <br> вміст етанолу (не менше 60,0 %), метанол і 2-пропанол (не більше 0,05 % (об/об) <br> метанолу і 0,05 % 2-пропанолу), сухий залишок (не менше 20 %), важкі метали (не <br> більше 100 ppm), мікробіологічна чистота, вміст суми фенольних сполук (у перера-<br> хунку на галову кислоту – не менше 17,00 %), вміст гідроксикоричних кислот (у <br> перерахунку на хлорогенову кислоту – не менше 1,00 %), антиоксидантна актив-<br> ність (не менше 529 ммоль-екв./mсух. зал.). Досліджено 5 серій на відповідність роз-<br> робленим вимогам та розроблено проект МКЯ «Екстракт зеленого чаю рідкий». <br> Обґрунтовано склад і технологію одержання гранул з екстрактом листя зеле-<br> ного чаю; розроблено параметри їх стандартизації досліджено 5 серій на відповід-<br> ність розробленим вимогам. <br> Проведена стандартизація дієтичної добавки «Кахінол» за вимогами ДФУ і <br> параметром антиоксидантної активності.