title: Untersuchung zum Einfluss verschiedener Bisphosphonate auf Zellviabilität und Migrationsfähigkeit von Osteoblastem, Fibroblasten, HUVEC und EPC sowie ihrer Beeinflussung durch Geranyl-Geraniol Substitution
Creators: name: Lux, Christine
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2019
Subjects: Zellviabilität
Geranyl Geraniol
Bisphosphonate
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
Migrationsfähigkeit

description: Bisphosphonates are osteoanabolic drugs commonly used in the treatment of bone  disseases including malignant bone neoplasia, bone metastasis, muliple myeloma,  Paget´s dissease or osteoprosis. Despite their therapeutical properties one main  side effect is the development of osteonecrosis of the jaw (BP-ONJ). The  pathogenesis of BP-ONJ remains unclear, however it is assumed to be  mulitfactoriell. Although the main mechanism of action of bisphosphonates is the  inhibition of osteoclasts leading to a reduced bony remodelling, extra-sceletall  effects of bisphonsphonates have been published throughout literatur. Regarding  the generations of the bisphosphonate there are two different molecular  mechanisms of action. While first generation bisphosphates like Clodronate induced  their effect by incooperation in an ATP-analoga, recent bisphosphonat generations  inhibit enzymes in the mevalonat pathway. This leads to a reduced activation of  small GTP-binding proteins. The following cellular signaling-pathways are impaired.  The aim of this study was to analyse the impact of four bisphosphonates (Clodronat,  Pamidronat, Ibandronat and Zoledronat) on four different celllines (Osteoblasts,  Fibroblasts, Endothelial Progenitor Cells and Endothel Cells of the human umbilical  cord). Furthermore the influence of geranyl-geraniol substitution should be  investigated.  The data of the present study revealed a significant depressing effect of all four  bisphosphonates on the migration ability of fibroblasts, endothelial progenitor cells  and osteoblasts. The nitrogen containing bisphosphonates (pamidronate,  ibandronate and zoledronate) had furthermore a significant inhibitory impact on  HUVEC. The results of the MTT assay demonstrated a decreased cellviability of  HUVEC of all four bisphosphonates in a 50μM concentration. The bisphosphonates  with increased biological potency (zoledronat, ibandronat) revealed even an  inhibitory effect of cellviability in 5μM concentration. The cellviability of fibroblast  was decreased in the MTT assay in 50μM concentration of clodronate, ibandronate  and zoledronate. All four bisohosphonates showed a depressing effect on  endothelial progenitor cells typical characteristic of colony forming even in a 5μM  concentration.  Geranyl-Geraniol substitution demonstrated an attenute impact on bisphosphonate  effect on all four cell lines. The migration ability of cells of angiogenesis (EPC and  HUVEC) was significantly elevated with geranyl-geraniol subsitution of allbisphosphonates. Geranyl-geraniol substitution led to a significantly improved  migration ability of fibroblasts when added to the bisphosphonates clodronate,  pamidronate and ibandronate. Also a significant increase of migration after geranylgeraniol  substitution could be observed in osteoblasts when pretreated with  ibandronate.  The tests on the viability showed an improvement after geranyl-geraniol subsitution.  The viability of fibroblasts could be significantly increased after geranyl-geraniol  susbstitution when pretreatment with ibandronate in 50μM or 5μM and zoledronate  50μM concentration had been performed. In HUVEC a significantly enhanced  viability could be observed after geranyl-geraniol subsitution in the 50μM clodronate  and 5 and 50μM zoledronate group. The impact on the typical characteristic of EPC  the colony forming property could be significantly improved after geranyl geraniol  subsitution within all four bisphosphonate groups regardsless of the tested  concentrations (5, 25 and 50μM).  Bisphosphonates have an inhibtory effect on the migration ability of all tested cells.  Furthermore they highly influence the cell-viability. Both characterics can be weaked  by the subsitution of geranyl-geraniol. These in vitro findings are a promising  approach for further testing in an in vivo model as a potential local therapeutical  agency against bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw.
description: Die Medikamentengruppe der Bisphosphonate gehört zu den osteoanabolen  Stoffen, die bei einer Vielzahl von Krankheiten des Knochengewebes eingesetzt  werden. Wesentliche Indikationen sind Osteoporose, Morbus Paget sowie  onkologische Krankheitsbilder wie das Multiple Myelom oder ossäre Metastasen.  Eine Nebenwirkung ist die Entstehung von Kiefernekrosen unter  Bisphosphonattherapie. Die Bisphosphonat assoziierte Kiefernekrose kennzeichnet  sich durch einen freiliegenden nekrotischen Kieferknochen und stellt eine  wesentliche Beeinträchtigung der oralen Gesundheit der betroffenen Patienten dar.  Die Pathogenese der Bisphosphonat assoziierten Kiefernekrose ist derzeit nicht  vollständig geklärt, wird aber als multifaktorieller Genese angesehen. Neben dem  Haupteffekt auf den Knochen üben Bisphosphonate auch eine extraskelettale  Wirkung aus. Die Wirkung erfolgt, abhängig vom applizierten Bisphosphonat, über  einen Einbau als ATP-Analogon oder über die Hemmung wichtiger Enzyme des  Mevalonatstoffwechsels. Bei Letzterem kommt es zur verminderten Bildung von  Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat und konsekutiver Beeinflussung wichtiger zellulärer  Signalproteine der kleinen GTPasen. Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss  verschiedener Bisphosphonate aus unterschiedlichen Generationen (Clodronat,  Pamidronat, Ibandronat und Zoledronat) auf den Knochen (Osteoblasten), das  Weichgewebe (Fibroblasten) sowie das Gefäßsystem (HUVEC und EPC) zu  untersuchen. Des Weiteren soll der Effekt der Substitution des lipophilen Geranyl-  Geranyl-Pyrophosphat-Analoga Geranyl-Geraniol analysiert werden.  Im Rahmen dieser Studie konnte ein generalisierter inhibitorischer Effekt aller  Bisphosphonate auf alle untersuchten Zelllinien festgestellt werden. Hierbei wurde  das Migrationsverhalten von humanen Osteoblasten, endothelialen  Progenitorzellen, maturen Endothelzellen der Nabelschnur und Fibroblasten durch  alle getesteten Bisphosphonate signifikant gehemmt. Bei den Endothelzellen der  Nabelschnur (HUVEC) konnte bei allen stickstoffhaltigen Bisphosphonaten  (Pamidronat, Ibandronat und Zoledronat) eine signifikante Einschränkung der  Migrationsfähigkeit demonstriert werden. Eine Ausnahme bildete hierbei das nichtnitrogenhaltige  Clodronat, bei dem dieser Effekt nicht festgestelltbar war. Bei einer  Analyse der HUVEC über den MTT Assay zeigten alle Bisphosphonate in einer  Konzentration von 50μM eine Einschränkung der Viabilität. Eine signifikante  Verminderung der Viabilität bei 5μM konnte nur bei den Bisphosphonaten mit hoherbiologischer Wirksamkeit (Ibandronat und Zoledronat) und nicht bei Clodronat und  Pamidronat gezeigt werden. Einen inhibitorischen Einfluss auf die Zellviabilität der  Fibroblasten übten nur Clodronat, Pamidronat und Zoledronat in 50μM  Konzentration aus. Besonders ausgeprägt war der Einfluss aller Bisphosphonate  auf die typische Eigenschaft der EPC, die Formation von Kolonien. Es wurde bei  allen Bisphosphonaten ab einer 5μM Konzentration eine signifikante Verminderung  dieses zelltypischen Verhaltensmusters festgestellt.  Die Zugabe von Geranyl-Geraniol, wie sie im Rahmen sämtlicher durchgeführter  Versuchsreihen zusätzlich analysiert wurde, zeigte einen abschwächenden Effekt  der Bisphosphonatwirkung. Während bei den Osteoblasten im Migrationsassay eine  generalisierte Abschwächung der Bisphosphonatwirkung unter Substitution von  Geranyl-Geraniol beobachtet wurde, war dieser Effekt nur bei Ibandronat  signifikant. Bei der Versuchsreihe mit Fibroblasten wurde bei allen  Bisphosphonaten außer Zoledronat eine signifikante Verbesserung der  Migrationstendenz durch die Substitution von Geranyl-Geraniol beobachtet. Der  inhibitiorische Effekt bei der Migration konnte bei beiden Zellen der Angiogenese  (EPC und HUVEC) durch die Gabe von Geranyl-Geraniol signifikant verbessert  werden. Auch bei der Zellviabilität wurde ein abschwächender Effekt der  Bisphosphonatwirkung durch Geranyl-Geraniol demonstriert. Dieser war beim MTT  Assay bei HUVEC Zellen bei Clodronat in 50μM Konzentration und Zoledronat in  5μM und 50μM Konzentration zu verzeichnen. Die Fibroblasten zeigten eine  signifikante Verminderung der Bisphosphonatwirkung durch Geranyl-Geraniol-  Substitution bei Zoledronat 50μM und Ibandronat in 5μM und 50μM Konzentration.  Geranyl-Geraniol sorgte für eine signifikante Verbesserung der EPC in der  Formation von Kolonien in 5μM, 25μM und 50μM Konzentration bei allen getesteten  Bisphosphonaten.  Bisphosphonate üben einen inhibitorischen Einfluss auf Osteoblasten und  extraskelettale Zellen wie Fibroblasten, Endothelzellen (HUVEC) und endotheliale  Vorläuferzellen (EPC) aus. Dieser konnte sowohl auf die Zellviabilität als auch auf  das Migrationsverhalten dieser Zellen demonstriert werden. Die Subsitution von  Geranyl-Geraniol verminderte diesen Effekt. Durch die anaploretische Eigenschaft  des Geranyl-Geraniol auf den Mevalonatstoffwechsel könnte eine lokale  Verminderung der Bisphosphonatwirkung vielleicht auch in vivo erreicht werden.  Dies würde insbesondere zur Behandlung der Bisphosphonat assoziierten  Kiefernekrose eine mögliche therapeutische Option darstellen. Diese Eigenschaftsollte in Folgearbeiten weiter untersucht werden und würde einen ersten  therapeutischen Ansatz der Bisphosphonat-induzierten Kiefernekrose darstellen.