title: Entwicklung und Validierung neuer nicht-invasiver Diagnosesysteme für Mucociliary Clearance Disorders (MCCD)
Creators: name: Mete, Vanessa
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2023
Subjects: subject: 570 Biology
subject: 500 Natural sciences and mathematics

description: Mukoviszidose (CF) ist die häufigste genetische Krankheit in der kaukasischen Bevölkerung. Durch die eingeschränkte Funktion des epithelialen Chloridkanals CFTR wird der Mukus in den Atemwegen visköser. Die Kanal Aktivität kann mit elektrophysiologischen Methoden untersucht werden. Hier wurde eine 'current clamp' Ussing Kammer verwendet, die den Widerstand und die Spannung misst, womit der Strom berechnet werden kann. Es standen Primärkulturen von Gesundkontrollen und CF-Patienten zur Verfügung, dessen Funktion der Kanäle CFTR und ENaC ausgiebig untersucht wurde. Außerdem wurde getestet, ob der Effekt der Vertex Modulatoren gemessen werden kann, sowie die Transfektion mit experimentell hergestellten Chitosan-Nanokapseln als Transfektionsvektor. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die %ENaC Aktivität in Gesundkontrollen und CFZellen unterschied. In Zellen, die als 'liquid covered culturen' gezüchtet waren, wurde, wie in der Literatur beschrieben, eine Hyperabsorption von Natrium in den CF-Zellen beobachtet. In Kulturen, die als air 'liquid interface' gezüchtet wurden, zeigten die CF-Zellen eine geringere Aktivität des ENaC. Um die Wirkung der Modulatoren zu bewerten war die Betrachtung der Spannung von besonderer Bedeutung, da sich der Widerstand bzw. die Leitfähigkeit kaum veränderten. Dagegen war die Leitfähigkeit ein aussagekräftigerer Parameter nach der Transfektion mit Chitosan-Nanokapseln, die deutlich effizienter war, als mit einem kommerziellen Vektor. Die MTECC Ussing Kammer erwies sich als präzises Werkzeug, um umfangreiche elektrophysiologische Messungen von Epithelzellen zu machen.
description: 1. Einleitung ..... 1
1.1 Lungenepithel ..... 1
1.2 Cystische Fibrose ..... 4
1.2.1 Diagnose von Mukoviszidose ..... 5
1.2.2 CFTR – Molekulare Eigenschaften ..... 7
1.2.3 Interaktion zwischen CFTR und ENaC ..... 9
1.3 Kultivierungsmethoden von Modell Systemen ..... 10
1.4 Therapeutische Behandlung von Mukoviszidose ..... 13
1.4.1 Symptomatische Patienten Versorgung ..... 13
1.4.2 Modulatoren zur kausalen Behandlung von Mukoviszidose ..... 13
1.5 Potenzielle mRNA Behandlung ..... 17
1.6 Ussing Kammer – Messung des transepithelialen Stroms ..... 20
1.6.1 Vereinfachter Schaltkreis einer Zellschicht ..... 21
1.6.2 Schaltplan der MTECC Ussing Kammer ..... 24
1.7 Ziel und Fragestellung ..... 27
2. Material und Methoden ..... 29
2.1 Molekulare Methoden ..... 29
2.1.1 Linearisierung ..... 29
2.1.2 DNA Gelelektrophorese ..... 30
2.1.3 In vitro Transkription ..... 31
2.1.4 RNA Gelelektrophorese ..... 32
2.2 Zellkultur ..... 33
2.2.1 Zelllinien ..... 33
2.2.2 Primärkultur ..... 36
2.2.3 Probenentnahme und Vorkultur ..... 37
2.2.4 'Air liquid interface' Kulturen ..... 38
2.2.5 'Liquid covered' cultures ..... 40
2.2.6 Osmolalität bestimmen ..... 40
2.3 Transfektion von primär Kulturen ..... 41
2.3.1 Transfektion mit Nanokapseln ..... 41
2.3.2 Transfektion mit Lipofectamine™ MessengerMAX™ ..... 42
2.4 Ussing Kammer Messung mit MTECC ..... 43
2.4.1 Bestimmung der CFTR Funktion ..... 45
2.4.2 Bestimmung der ENaC Aktivität ..... 46
2.4.3 Wirkungsresonanz der Vertex Modulatoren ..... 47
2.5 Immunfluoreszenz Mikroskopie ..... 48
2.5.1 Kryoschnitte von Primärzellen ..... 48
2.5.2 Immunfluoreszenzfärbung von ALI Kulturen ..... 49
2.6 Statistik ..... 50
2.6.1 Box Plots zur nichtparametrischen Statistik ..... 50
2.6.2 Abhängiger t-Test und Zweistichproben-'t'-Test ..... 50
3. Ergebnisse ..... 51
3.1 Mikroskopie Bilder der 'air liquid interface' Kulturen ..... 51
3.2 Initialer Widerstand von Epithelschichten in der Zellkultur ..... 54
3.2.1 Initiale Widerstände verschiedener Kulturen ..... 54
3.2.2 Initialer Widerstand nach mehreren Messungen ..... 56
3.2.3 Initialer Widerstand von CF-Zellen und Gesundkontrollen ..... 57
3.3 Funktion des Epithelialen Natrium Kanals (ENaC) ..... 58
3.3.1 Modifikation des ENaC Messprotokolls ..... 62
3.4 CFTR Untersuchung in Zelllinien ..... 63
3.5 CFTR Messungen mit 'air liquid interface' Kulturen ..... 68
3.5.1 Zellenanzahl auf den 'air liquid interface' Kulturen ..... 68
3.5.2 Zellzähler für 'liquid covered culture' Kulturen ..... 70
3.5.3 Messkurven von Gesundkontrollen und Mukoviszidose Patienten ..... 72
3.5.4 CFTR Inhibitor -172 ..... 76
3.6 Transfektion von ALI Kulturen mit mRNA ..... 78
3.6.1 Widerstand vor und nach Transfektion mit Nanokapseln ..... 78
3.6.2 Transfektion von Gesundkontrollen via Chitosan-Nanokapseln ..... 79
3.6.3 Transfektion von CF-Kulturen via Nanokapseln ..... 83
3.6.4 Vergleich von Transfektion mit Lipofectamine™ und Nanokapseln ..... 85
3.7 Vertex Modulatoren ..... 88
3.7.1 Gesundkontrollen und CF-Zellen reagieren auf Ivacaftor ..... 89
3.7.2 Wirkung von Lumacaftor auf ΔF508 Mutationen ..... 93
3.7.3 Wirkung von Tezacaftor auf ΔF508 Mutationen ..... 97
3.7.4 Wirkung von Elexacaftor auf ΔF508/ ΔF508 Mutationen ..... 100
3.7.5 Fallstudie eines seltenen Genotyps ..... 103
4. Diskussion ..... 107
4.1 Current clamp der MTECC Ussing Kammer ..... 107
4.1.1 Multilayer der ALI Kulturen beeinflusst die Spannungsmessung ..... 108
4.1.2 Adäquate Berechnung des Stroms ..... 109
4.2 Art der Kultivierung beeinflusst die Widerstände der Epithelien ..... 111
4.3 ENaC Regulation im Zusammenhang mit Mukoviszidose ..... 112
4.3.1 Standardisierung des ENaC Protokolls in der Ussing Kammer ..... 114
4.4 Zelllinien als Modell zur CFTR Untersuchung ..... 114
4.5 Zellzähler zur Standardisierung der ALI Kulturen ..... 115
4.6 Begrenzte Wirkung des CFTR(Inh)-172 Inhibitors ..... 116
4.7 Transfektionen mit Nanokapseln ..... 117
4.7.1 Einfluss von Capsaicin auf den transepithelialen Widerstand ..... 117
4.7.2 Gesundkontrollen regulieren Überexpression ..... 118
4.7.3 Erfolgreiche Wiederherstellung der CFTR Funktion in CF-Zellen ..... 118
4.1.2 Chitosan-Nanokapseln effizienter als kommerzieller Vektor ..... 120
4.8 Wirkung der Modulatoren konnte gemessen werden ..... 120
4.8.1 Fallstudie: Wirkung der Modulatoren an seltener Mutationen ..... 123
4.9 Ausblick ..... 124
5. Literatur ..... 126
6. Anhang ..... 149
6.1 Patientendaten ..... 149
6.2 Antikörper ..... 150
6.3 Chemikalienliste ..... 150
6.4 Reagenzien und Kits ..... 151
6.5 Geräteliste ..... 153