title: Foxing of paper caused by fungi and molecular monitoring of conservation treatments
Creators: name: Michaelsen, Astrid
Publisher: name: :none
Year: 2010

description: Mikroorganismem sind an der Zerstörung unseres kulturellen Erbes beteiligt, welches in der Mehrheit schriftlich auf Papier festgehalten wurde. “Foxing spots” oder Stockflecken treten in Dokumenten auf die aus Paper bestehen, und eine Beteiligung von Pilzen an ihrer Enstehung wurde schon lange postuliert, wobei die bisherigen Ergebnisse nicht eindeutig für sich sprechen, da die meisten Pilze die in diesem Zusammenhang identifiziert wurden als universell bekannt sind und kein Zusammenhang zwischen Ursache und Wirkung formuliert werden konnte. Das Ziel dieser Studie lag darin, Pilze die am Entstehen dieser Stockflecken beteiligt sind zu benennen, indem natürlich auftretende Stockflecken auf verschiedenen Papiersorten unterschiedlichen Alters untersucht wurden. Für die Identifizierung wurden molekulare Techniken angewandt, die ausgiebig in der umweltbezogenen Mikrobiologie eingesetzt wurden, mit Fokus auf eine Probennahme die keine zusätzliche Zerstörung erfordert oder mit minimaler Menge an Probe auskommt. Protokolle für die Extraktion von DNA wurden verglichen und optimisiert um DNA direkt von Papier zu extrahieren, die dann unmittelbar in Polymerase-Kettenreaktionen eingesetzt werden kann. Verschiedene Arten von Papier wurden hierfür mit Pilzsarten beimpft die häufig auf Papier gefunden wurden, um die genannten Protokolle zu evaluieren. Abhängig von der Ausbeute an DNA von den künstlich hergestellten Proben wurde ein Extraktionsprotokol ausgesucht, welches ezymatische und mechanische Schritte der Zellauflösung mit einem kommerziell erhältlichen Kit kombimiert. Mehrere Primerpaare die auf die ‘internal transcribed spacer’ (ITS) Region zwischen den kodierenden rRNA Regionen von Pilzen zielen, wurden verglichen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zwischen den ausgesuchten Pilzen unterscheiden zu können, um für die Erstellung von Fingerabdrücken der Lebensgemeinschaften eingesetzt zu werden. Ein tieferes Verständnis der Pilzgemeinschaften, die mit den Stockflecken assoziiert werden wurde durch die molekulare und phylogenetische Analyse von diesen ITS Regionen der Pilze erzielt. Hierfür wurden Originalpapierproben unterschiedlich in Zusammensetzung und Alter, welche alle Stockflecken aufwiesen aber mit konventionellen Kultivierungsmethoden kein Ergebnis erzielten, mit den molekularen Techniken untersucht und das Vorhandensein von Pilzen wurde durch eine Analyse der DNA Sequenzen bestimmt. Eine breite Palette an Pilzen die bisher nicht in den Zusammenhang mit Stockflecken gebracht waren wurde identifiziert und moegliche Mitverursacher wurden diskutiert. Rasterelektronenmikroskopie (REM oder SEM) und energiedispersive Spektroskopie (EDS) wurden zusätzlich eingesetzt um die Zusammensetzung des Papiers und die organischen und anorganischen Elemente auf der Oberfläche des Papiers in und um den Stockflecken zu bestimmen, um eine Bedeutung bei ihrer Entstehung ableiten zu koennen, aber es konnte kein Kausalzusammenhang zwischen chemischer Zusammensetzung und des Vorhandenseins von Stockflecken hergestellt werden. Eine Einbindung des entwickelten Protokols in die Konservierungsstrategien von zwei Einzelstücken von kultureller Bedeutung lieferte wichtige Daten für Restauratoren und konnte Beschränkungen von traditionellen Massnahmen wie Kultivierung und visueller Identifizierung überwinden. Desweiteren wurden Papierproben mit Pilzsporen infiziert und dann verschiedenen Verfahren der Papierkonservierung unterzogen (Gefriertrocknung, Bestrahlung mit Gamma Strahlen und Begasung mit Ethylenoxid), um deren Langzeitwirkung zu evaluieren indem DNA und RNA als Anzeiger für das Vorhandensein und die Lebensfähigkeit der Pilze herangezogen wurde. Nur Ethylenoxid konnte eine vollständige Reduktion des Pilzbefalls erzielen, und die anderen Verfahren resultierten in überlebenden Pilzen auf dem behandelten Papier.
description: Microorganisms can be responsible for the destruction of cultural heritage, and most of our written heritage is stored on paper objects. Foxing spots are occurring on paper based documents and the involvement of fungi in the formation of foxing has long been postulated but results so far have been inconclusive as most fungi identified are regarded as ubiquitous and no cause and effect relationship has been determined. The aim of this study was to identify fungi involved in the formation of foxing by examining naturally occurred foxing spots on paper of different manufacture and age. To identify the fungi involved, molecular techniques that are widely used in environmental microbiology were applied focussing on non-destructive sampling procedures or use of minimal sample amount. DNA extraction protocols were optimised and compared to allow DNA extraction directly from paper for use in PCR. Different qualities of paper that were inoculated with fungal species frequently found on paper were used to evaluate DNA extraction protocols. According to the degree of recovery of nucleic acid material from the artificially prepared samples, a DNA extraction protocol combining enzymatic and mechanical lysis and a commercially available kit was chosen. Several primer pairs targeting the internal transcribed spacer (ITS) region of fungi between the rRNA coding regions were tested for their ability to discriminate between selected fungal species to be used for fingerprinting of the communities. A deeper understanding of the fungal flora associated with foxing spots on paper was achieved through molecular and phylogenetic analysis of fungal ITS fragments. Paper samples from several objects of art of different age and composition displaying foxing spots that tested negative for fungal growth with conventional culturing techniques were subjected to molecular analysis and fungal abundance was determined through DNA sequence analysis. A broad palette of fungi hitherto not related to foxing was identified and their possible role in the formation of foxing was discussed. An implementation of the developed molecular protocol in real conservation strategies of two specific items of cultural value delivered important data for restaurators involved and could help overcome restrictions imposed by conventional methods like culturing and visual identification. Scanning electron microscopy (SEM) and energy dispersive spectroscopy (EDS) were used to compare the composition of the paper and the organic and inorganic elements found on the surface in vicinity of foxing spots in order to determine their impact on the formation of foxing but no causal link between chemical composition and foxing could be established. Furthermore, paper samples were infected with fungal spores and submitted to conservation treatments (freeze-drying, gamma ray irradiation and ethylene oxide fumigation) used for paper to monitor their effectiveness using cutlturing, DNA and RNA as indicator for fungal existence and viability at different time-points after the treatments. Only ethylene oxide achieved a complete removal of fungal material with the other treatments resulting in paper harbouring active fungi.