title: Etude de la toxicité hépatique de la cocaïne associée à de l'alcool
title: Effets de l'éthanol sur le métabolisme de la cocaïne dan les hépatocytes de rat en suspension et dans un modèle enzymatique humain
titleType: Subtitle
Creators: name: Berthoin, Karine
Publisher: name: Unknown
Year: 0

description: Le but essentiel de notre travail a été d’étudier la capacité du foie, premier organe de métabolisation des xénobiotiques, à dégrader la cocaïne en présence d’éthanol, à l’aide de deux modèles expérimentaux, à savoir un modèle cellulaire (les hépatocytes de rat en suspension) et un modèle acellulaire (modèle reconstitué in vitro à partir d’enzymes purifiées de foie humain). La première partie a pour objectifs de rechercher les voies de métabolisation de la cocaïne qui sont inhibées et / ou stimulées en présence d’éthanol, sur hépatocytes isolés de rat. Dans ce but, une méthode originale permettant de séparer et de quantifier simultanément la cocaïne, le cocaéthylène et huit de leurs métabolites respectifs a été développée par Chromatographie Phase Gazeuse couplée à la Spectrométrie de Masse (CPG / SM). Nos résultats préliminaires indiquent que l’éthanol aux trois concentrations testées (20, 40 et 80 mM) n’a aucun effet sur la cinétique de métabolisation de la cocaïne. Notre étude confirme que l’addition d’éthanol à des cellules hépatiques de rat en suspension supplémentées en cocaïne résulte en la formation précoce de benzoylecgonine et de cocaéthylène. L’apparition retardée d’ecgonine méthyl ester démontre l’activation d’une deuxième voie de détoxification. La production tardive d’ecgonine indique une dégradation de la benzoylecgonine et de l’ecgonine méthyl ester. De plus, la voie d’oxydation intervenant dans l’induction du stress oxydant en produisant de la norcocaïne est tardivement stimulée. Enfin, notre étude montre une métabolisation complète de la concentration initiale en éthanol par les hépatocytes de rat en suspension. La deuxième partie a pour but de déterminer s’il existe d’autres enzymes que les carboxylesterases formes 1 et 2 humaines ayant une capacité à métaboliser la cocaïne seule ou associée à de l’éthanol. Pour ce faire, une méthode de micropurification par chromatographie liquide (Smart System®) a été mise au point. Dans le cadre de nos dosages in situ de la cocaïne, du cocaéthylène, de la benzoylecgonine, de l’acide benzoïque et de la lidocaïne, une technique par Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à une Détection par Barrette de Diode (CLHP / DBD) et une méthode de dosage de l’éthanol par Chromatographie Phase Gazeuse couplée à une Détection par Ionisation de Flamme équipée d’un injecteur à espace de tête (espace de tête CPG / DIF) ont été développées. La procédure de purification nous a permis de suspecter la présence d’autres enzymes que les carboxylesterases formes 1 et 2 de foie humain impliquées dans le métabolisme de la cocaïne et déjà isolées. A partir d’un modèle enzymatique reconstitué in vitro, nos résultats préliminaires indiquent que d’autres esterases que les formes 1 et 2 de foie humain sont impliquées dans l’élimination de la cocaïne, produisant benzoylecgonine et ecgonine méthyl ester. De plus, nous avons montré que les sensibilités de ces enzymes à l’éthanol sont variables.
description: The main purpose of our work was to study the ability of the liver, as the first organ to metabolise xenobiotic substances, to degrade cocaine in the presence of ethanol. In order to do this, we used two experimental models, namely a cellular model (rat liver cells in suspension) and an a-cellular model (model reconstructed in vitro from purified human liver enzymes). The purpose of the first part of our study was to look for cocaine metabolising processes which were inhibited and / or stimulated by the presence of ethanol, in isolated rat liver cells. With this aim in mind, an original method for simultaneously separating and quantifying cocaine, cocaethylene and eight of their respective metabolites was developed by Vapour Phase Chromatography coupled with Mass Spectrometry (VPC / MS). Our preliminary results point out that ethanol at three tested concentrations (20, 40 et 80 mM) have no effect on the kinetic of metabolisation of cocaine. Our study confirms that the addition of alcohol to rat liver cells in suspension, supplemented with cocaine, results in the premature formation of ecgonine benzoyl ester and cocaethylene. The delayed appearance of ecgonine methyl ester shows that a second detoxification process is activated. The delayed production of ecgonine indicates a degradation of the ecgonine benzoyl ester and the ecgonine methyl ester. Moreover, the oxidising process which occurs during the induction of the oxidising stress, producing norcocaine, is stimulated at a late stage. Finally, our study shows the complete metabolisation of the initial alcohol concentration by the rat liver cells in suspension. The second part consisted in determining if enzymes other than human carboxylesterases 1 and 2, able to metabolise cocaine on its own or with alcohol, existed. To do this, a micropurification method us ing liquid phase chromatography (Smart System®) was developed. A technique based on High Performance Liquid Chromatography coupled with a Diode Array Detection (HPLC / DAD) in the in situ proportioning of cocaine, cocaethylene, ecgonine benzoyl ester, benzoic acid and lidocaine, and a method for proportioning alcohol by quantifying the head space using Vapour Phase Chromatography coupled with a Flame Ionisation Detection (head space VPC / FID) were used. The purification procedure pointed to the presence of enzymes other than the human liver carboxylesterases, forms 1 and 2, involved in the metabolism of cocaine and already isolated. The preliminary results drawn from an enzymatic model reconstructed in vitro indicate that human liver carboxylesterases, other than forms 1 and 2, are involved in the elimination of cocaine, producing ecgonine benzoyl ester and ecgonine methyl ester. Moreover, we have shown that the sensitivity of these enzymes to alcohol is variable.
description: Thèse de doctorat en co-tutelle avec l'Université Joseph Fourier-Genoble I