title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen aus Stigmatella aurantiaca und Aspergillus fumigatus
title: Molecular biological investigations on prenyltransferases from Stigmatella aurantiaca and Aspergillus fumigatus
Creators: name: Stec, Edyta
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Dimethylallyl-Transferase
Stigmatella aurantiaca
Aspergillus fumigatus
Aurachine
Prenyltransferase
Medizin, Gesundheit
Ortspezifische Mutagenese
Aurachins

description: Prenylated compounds are widely
      distributed in all living organisms and often posses
      biological activities differing from their non-prenylated
      precursors. Transfer reactions of an isoprene moiety from a
      prenyl donor onto an acceptor molecule, e. g. a terpenoid, a
      serine residue of a protein or an aromatic molecule, are
      catalyzed by prenyltransferases. Aromatic prenyltransferases
      are responsible for prenylation of aromatic compounds and
      found as membrane-bound or soluble enzymes in bacteria, fungi
      and plants. They contribute to the diversity of primary and
      secondary metabolites. During the last decades, many
      prenylated natural products were isolated from different
      microorganisms. These natural products include aurachins, a
      group of quinoline alkaloids from myxobacteria. In this
      thesis the gene auaA from the putative biosynthetic gene
      cluster of aurachins in the myxobacterium Stigmatella
      aurantiaca Sg a15 was heterologously expressed in E. coli and
      the gene product was subsequently characterized
      biochemically. AuaA was unequivocally demonstrated to
      function as a farnesyltransferase catalyzing the prenylation
      of 2-methyl-4-hydroxyquinoline at position C3 of the
      quinoline ring. The enzymatic reaction of AuaA followed
      apparently Michaelis-Menten-kinetics and was strictly
      dependent on the presence of divalent metal ions. KM-values
      were determined for 2-methyl-4-hydroxyquinoline and FPP at
      0.27 mM and 0.043 mM, respectively. The maximum reaction
      velocity Vmax was determined at 2.21 nmol/min*mg. Like other
      aromatic prenyltransferases AuaA showed also flexibility
      towards aromatic substrates. In addition to its natural
      substrate 2-methyl-4 hydroxyquinoline, this membrane-bound
      enzyme accepted also six other 4-hydroxyquinolines and low
      conversion was even observed for two of six tested
      flavonoids. In contrast to the promiscuity towards aromatic
      substrates, AuaA was found to be relatively specific for FPP.
      GPP was accepted only with a relative activity of 3.3 % in
      comparison to FPP. Selected amino acid residues in the
      aspartate-rich motifs, which are characteristic for
      membrane-bound aromatic prenyltransferases, were investigated
      in AuaA by site-directed mutagenesis. By mutation of the
      conserved aspartate residues, the importance of these
      residues was confirmed. Mutation of the arginine residue in
      the first aspartate-rich motif (NRxxDxxxD) revealed that the
      amino acid at this position is not directly involved in the
      AuaA reaction, which is in contrast to the results obtained
      for LePGT1, another prenyltransferase from this group. The
      enzymes FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS from Aspergillus fumigatus
      belong to aromatic prenyltransferases of the DMATS-family and
      catalyze the transfer of a prenyl moiety onto an indole ring.
      In contrast to membrane-bound aromatic prenyltransferases,
      they do not contain aspartate-rich motifs for binding of
      prenyl diphosphate via divalent metal ions and their
      activities are independent of the presence of metal ions.
      Therefore it was speculated that basic amino acid residues in
      prenyltransferases of the DMATS-family coordinate the prenyl
      diphosphate residue. To investigate the importance of three
      conserved basic amino acid residues for the catalytic
      activites, site-directed mutagenesis experiments were carried
      out with FgaPT2, FtmPT1 and 7-DMATS. The results indicated
      that two lysine residues are involved in the prenyl transfer
      catalyzed by these enzymes. Mutation of arginine, the third
      chosen amino acid residue, led only in FgaPT2 to a strong
      decrease of enzyme activity, indicating that the
      corresponding arginine residues in FtmPT1 and 7-DMATS are not
      directly involved in the prenylation reactions. After
      solution of the crystal structure of FgaPT2 and analyzes of
      the enzyme complex with L-tryptophan and DMASPP, a substrate
      analogue to dimethylallyl diphosphate (DMAPP), a reaction
      mechanism was postulated. In this mechanism the amino acid
      residues E89, R100 and K174 should play essential roles. In
      order to verify this hypothesis, mutagenesis experiments of
      the suggested residues were carried out and the effects of
      the mutations on the enzyme activity were determined.
      Mutation of E89 and R100 confirmed the essential roles of
      these residues for the catalysis of FgaPT2. In contrast,
      substitution of K174 by glutamine did not support the
      importance of this residue for the postulated reaction
      mechanism.
description: Prenylierte Naturstoffe sind in
      allen lebenden Organismen weit verbreitet und weisen häufig
      biologische Aktivitäten auf, die sich oft von ihren nicht
      prenylierten Vorstufen unterscheiden. Transferreaktionen von
      Isopreneinheiten von einem Prenyldonor auf ein
      Akzeptormolekül, wie z.B. ein Terpenoid, ein Serinrest oder
      einen Aromaten, werden von Prenyltransferasen katalysiert.
      Für die letzte Reaktion sind die sogenannten aromatischen
      Prenyltransferasen verantwortlich, die als membrangebundene
      oder lösliche Enzyme in Pflanzen, Pilzen und Bakterien
      auftreten und zu einer großen Vielfalt an Primär- und
      Sekundärmetaboliten beitragen. Im Laufe der letzten
      Jahrzehnte sind viele prenylierte Substanzen mit
      interessanten biologischen Aktivitäten aus Mikroorganismen
      isoliert worden, deren Biosynthese großteils noch unbekannt
      war. Zu diesen Naturstoffen gehörten unter anderem die
      Aurachine, eine Gruppe von Chinolinalkaloiden aus
      Myxobakterien. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte
      das Gen auaA aus dem putativen Gencluster für
      Aurachinbiosynthese in dem Myxobakterium Stigmatella
      aurantiaca Sg a15 heterolog in E. coli exprimiert und das
      Genprodukt anschließend biochemisch charakterisiert werden.
      Dabei wurde eindeutig gezeigt, dass AuaA als eine
      Farnesyltransferase fungiert und die Bildung von Aurachin D
      durch Prenylierung von 2-Methyl-4-Hydroxychinolin an Position
      C3 des Chinolinrings katalysiert. Die enzymatische Reaktion
      folgte der Michaelis-Menten-Kinetik und war strikt abhängig
      von divalenten Metallionen. Die KM-Werte für
      2-Methyl-4-Hydroxychinolin und FPP betrugen 0.27 mM und 0.043
      mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit 2.21
      nmol/min*mg. AuaA zeigte Flexibilität gegenüber aromatischen
      Substraten, da es neben dem natürlichen Substrat auch sechs
      weitere 4 Hydroxychinoline akzeptierte und sogar zwei von
      sechs getesteten Flavonoiden in geringem Maße umsetzte. Im
      Gegensatz dazu war das Enzym relativ spezifisch in Bezug auf
      den Prenyldonor. Neben FPP akzeptierte AuaA zwar GPP, jedoch
      nur mit einer relativen Aktivität von 3.3 %. Mittels
      zielgerichteter Mutagenese wurden ausgewählte Aminosäurereste
      in den für membrangebundene aromatische Prenyltransferasen
      charakteristischen aspartatreichen Motiven in AuaA
      untersucht. Durch die Mutationen konnte die essentielle
      Bedeutung der konservierten Asparaginsäurereste bestätigt
      werden. Die Mutation des Arginins im ersten aspartatreichen
      Motiv (NRxxDxxxD) zeigte, dass die Aminosäure an zweiter
      Position in dem Motiv nicht direkt in die von AuaA
      katalysierte Reaktion involviert ist, was einen Unterschied
      zu LePGT1, einer weiteren Prenyltransferase dieser
      Enzymgruppe, darstellt. Die Enzyme FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS
      aus Aspergillus fumigatus gehören zu aromatischen
      Prenyltransferasen der DMATS-Familie und katalysieren den
      Transfer eines Prenylrests auf einen Indolkörper. Anders als
      membrangebundene aromatische Prenyltransferasen enthalten sie
      keine konservierten aspartatreichen Motive zur Bindung des
      Prenyldiphosphates durch divalente Metallionen und ihre
      Aktivität ist ionenunabhängig. Diese Tatsache führte zu der
      Vermutung, dass in den Prenyltransferasen der DMATS-Familie
      basische Aminosäuren die Rolle der Metallionen bei der
      Koordination von Prenyldiphosphat übernehmen könnten. Mit
      Hilfe von zielgerichteter Mutagenese wurde die Bedeutung von
      drei konservierten basischen Aminosäureresten für die
      katalytische Aktivität der Prenyltransferasen FgaPT2, FtmPT1
      und 7-DMATS untersucht. Die Experimente zeigten, dass zwei
      Lysinreste in die von allen drei Enzymen katalysierten
      Prenylierungsreaktionen involviert sind, während die Mutation
      des ausgewählten Argininrests nur in FgaPT2 zu einem
      deutlichen Aktivitätsverlust führte. Dies deutete darauf hin,
      dass dieser Argininrest in FtmPT1 und 7-DMATS nicht direkt an
      der Prenylierung beteiligt ist. Durch Aufklärung der Struktur
      von FgaPT2 und Analysen des Enzymkomplexes mit L-Tryptophan
      und DMASPP, dem Substratanalogon von Dimethylallyldiphosphat
      (DMAPP), konnte ein Prenylierungsmechanismus postuliert
      werden, bei dem die Aminosäurereste E89, R100 und K174 eine
      essentielle Rolle spielen sollten. Zur Überprüfung der
      Hypothese wurden diese Aminosäurereste mutiert und
      anschließend die Auswirkung der Mutationen auf die Aktivität
      von FgaPT2 untersucht. Der im Rahmen dieser Arbeit
      durchgeführte Austausch von E89 und R100 bestätigte die
      essentielle Rolle dieser Reste für die Katalyse von FgaPT2.
      Dagegen konnte die Substitution von K174 durch Glutamin die
      Notwendigkeit dieser Aminosäure für den Reaktionsmechanismus
      nicht unterstützen.