title: Expression der Rezeptoren von Fibroblastenwachstumsfaktoren und Etablierung von IIIc-Spleißvarianten-Reportersystemen in Weichteilsarkomzellen aus Mensch und Hund
Creators: name: Munoz Perez, Victor Manuel
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Weichteilsarkome (STS) stellen eine sehr inhomogene Krankheitsgruppe dar und sie sind bösartige Neoplasien der Weichteile des Körpers. Die Rezeptoren der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFR) sind notwendige Elemente für die verschiedenen Signalübertragungswege, welche in der Proliferation, Differenzierung, Migration und Metabolismus von Zellen involviert sind. Bis heute sind 5 FGF-Rezeptoren charakterisiert, die aufgrund verschiedener spezifischer Spleißvorgänge eine weit größere Zahl an Rezeptormolekülen erzeugen, die spezifische physiologische Funktionen haben. Die Untersuchung dieser Spleißvorgänge ist essentieller Teil der Erforschung der physiologischen Funktion von FGF-Rezeptoren. pRGIIIc ist ein fluoreszierendes Reporterplasmid, das für solche Untersuchungen geeignet ist. Abhängig von der Inklusion oder Exklusion des IIIc Exons von FGFR2 produziert es 2 alternative fluoreszierende Proteine. Im Rahmen dieser Diplomarbeit sollte als erste Aufgabe die Expression der FGF-Rezeptoren (1-5) und ihrer Varianten IIIb/IIIc in den verschiedenen STS Zelllinien untersucht werden. Als zweite Aufgabe wurden die Tumorzelllinien mit dem Plasmid pRGIIIc transfektiert, um Information über die Funktionalität dieses fluoreszierenden Konstrukts (pRGIIIc) zu erhalten, das zukünftig für Untersuchungen der Epithelial-Mesenchymal-Transition eingesetzt werden soll. Daher wurden zwei Zelllinien verwendet SW480 (Adenokarzinom des Darm, epithelial) und MBSa (Weichteilsarkomes des Hundes; mesenchymal) Mittels PCR, RT-PCR und Western Blot wurde die Expression von pRGIIIc analysiert. Auf RNA-Ebene konnten beide spezifischen Produkte von pRGIIIc in den Zelllinien HTB91, SW480 und MBSa identifiziert werden, was zeigt, dass die Zellen das Exons IIIc sowohl inkludieren als auch skippen können. Auf Protein-Ebene konnte nur das GFP-Produkt von pRGIIIc nachgewiesen werden, das Inklusion des Exons IIIc anzeigt. Das Proteinniveau ist in den Zelllinien SW480 und HTB91 niedrig und in der Zelllinie HTB82 nicht nachweisbar. Als dritte Aufgabe wurde eine in Silico-Analyse mit der IIIb- und IIIc-Sequenz des FGF-Rezeptors 2 (FGFR2) des Menschen und der Ratte durchgeführt. Laut Hersteller des Plasmides pRGIIIc stammt die Exon-IIIc Sequenz samt umgebender Introns von der Ratte. Das Ziel dieses Versuches war es, nach Ähnlichkeiten zwischen den Exon Sequenzen von beiden Spezies und der experimentel erhaltenen Sequenz von pRGIIIc zu suchen. Bei der Untersuchung wurden Modifikationen innerhalb der Exon-IIIc Sequenz von pRGIIIc identifiziert, die künstlich eingebaut wurden. Die Ergebisse der Sequenzvergleiche lokalisierten auch die funktionellen Teile von pRGIIIc, wie zum Beispiel die Sequenzen für DsRed, EGFP und Exon-IIIc auf pRGIIIc. Spleiβvarianten mit Exon-IIIb/IIIc Sequenzen. Zusammenfassend wurde in im Rahmen dieser Arbeit ein Überblick über die Expression der FGF-Rezeptoren und ihre Varianten IIIb/IIIc in Weichteilsarkomen gegeben. Die Versuche mit den Reportern dienten dafür, um einerseits die Funktionalität des Reporters pRGIIIc in STS-Zelllinien besser zu charakterisieren und andererseits die epithelial-mesenchymal-Transition in den STS-Zelllinien mit dieser nicht invasiven Methode zu beobachten.
description: Soft Tissue Sarcomas (STSs) represent a heterogenous group of malignant tumors of the soft connective tissue of the body. The fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are necessary elements for the different pathways of signal transduction which are involved in the proliferation, differentiation, migration and metabolism of cells. There are 5 FGF-receptors genes in the human genome that code for a variety of receptor proteins by stringently regulated mechanisms of alternative splicing. The analysis of such splicing events is an essential part of elucidating the roles of FGFR-signaling in physiological processes. pRGIIIc is one of the tools that can be used in such studies. It is a fluorescent reporter plasmid; this is able to express two different fluorescent proteins depending on inclusion or exclusion of the IIIc exon of FGFR2 of the rat. The first task was analysis of the expression of the FGF-Receptors 1-5 und their IIIb/IIIc variants in the different STS cell lines. In all examined cell lines are the FGF receptors expressed, with the exception of FCHT cells and the Wi38 cells, in which no products were determined for FGF receptor 2 and its variants IIIb/IIIc. The second task was transfection of the pRGIIIc plasmid into tumor cell lines in order to get information about the functionality of this reporter construct that will be used in future projects investigating FGFR2 in epithelial-mesenchymal-transition (EMT/MET). Therefore, two cell lines were used: SW480 (adenocarcinoma of the colon; epithelial origin) and MBSa (STS-cell line of the dog; mesenchymal origin) were transfected. Expression from pRGIIIc was determined by means of PCR, RT-PCR and Western Blot detecting the two specific products from pRGIIIc. Both mRNAs could be identified in the cell lines HTB91, SW480 and MBSa indicating that the cells have both included and skipped exon IIIc from pRGIIIc. At protein-level only the product of GFP from pRGIIIc could be proved. The GFP-product from pRGIIIc is associated with the inclusion of the Exon IIIc. The results showed a low production of the protein GFP in the transfected cell lines SW480 and HTB91, with the exception of the cell line HTB82, in which the product of GFP could not be proved. 9 The third task was an in silico analysis with the IIIb and IIIc sequence of the FGFR 2 carried out with species human and rat. The exon IIIc sequence together with the surrounding introns of the plasmid pRGIIIc is of rat origin according to the manufacturer. The aim of this experiment was to look for similarities between the exon sequences of both species and the experimental sequence obtained from pRGIIIc. In the investigation, artificially added modifications were identified within the exon IIIc sequence of pRGIIIc. The results of sequence comparisons also localized the functional parts of pRGIIIc, such as the sequences for fluorescent reporters DsRed and EGFP, and exon IIIc on pRGIIIc. This analysis is the basis for the preparation of other reporter systems with a possible exchange of ortho-and paralogous sequences of Exon-IIIb/IIIc sequences. In summary, this work provides an overview of the expression of FGFRs and their variants IIIb/IIIc in STS. These first results with the reporter system demonstrated the functionality of the plasmid pRGIIIc in STS cell lines of human and canine origin. Such non-invasive system may allow observing plasticity of the epithelial-mesenchymal transition in the STS cell lines.