title: Präklinische Mausmodelle zur Untersuchung tumorrelevanter Faktoren der p53 Protein Familie
title: Establishment and characterization of preclinical mouse models for evaluation of oncogenic and tumor-suppressive properties of p53 family members
Creators: name: Fuchs, Jeannette
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
p53 p73 Tumorbiologie
p53 p73 tumor biology

description: Cancer development is a multistep
      process which leads to tumors composed of diverse cell
      populations originating from one cell which underwent
      differential genetic changes over time. Within one tumor,
      such heterogeneity provides distinct subpopulations with
      selection advantages promoting metastasis as well as therapy
      resistance. In the course of targeted cancer therapies tumor
      composition is meanwhile monitored via circulating tumor DNA
      from blood samples during treatment and accordingly allows
      adjustment of therapy. In experimental models of solid tumor
      xenografts in mice, however, this method is not applicable as
      required blood volumes exceed blood volume of animals, hence
      limiting investigation of tumorrelevant genes in preclinical
      mouse models. Here, a method was developed which facilitates
      simultaneous monitoring of growth dynamics of two distinct
      tumor cell populations within one tumor xenograft. Therefore,
      cells were labelled by stable expression of either Gaussia
      luciferase (GLuc) or Cypridina luciferase (CLuc) prior to
      injection. Both luciferases are secreted into the blood
      stream of transplanted mice. This allows asessment of tumor
      composition by enzyme activity of both luciferases requiring
      only very low blood volumes. Moreover, to facilitate
      investigation of the impact of targeted genetic manipulations
      luciferases were linked with (non)-targeting shRNAs. To
      establish this method, shRNAs were used targeting the p53
      familiy members p53 and p73. Whereas p53 is acknowledged as
      the most important tumor suppressor, p73 can occur in two
      N-terminally different isoforms with opposing attributes: the
      tumorsuppressive full length isoform TAp73 and the
      N-terminally truncated tumorpromoting isoform Np73. The
      dominant negative function of Np73 includes its ability to
      form hetero-oligomers with its family members p53 and TAp73,
      thereby interfering with their transcriptional activity.
      Linking the luciferases to (non)-targeting shRNAs, the
      differential growth properties of transplanted cells in
      presence and absence of p53 (or p73) can be monitored
      simultaneously. The here established method was successfully
      validated in a model of experimental metastasis as well as
      under therapeutic conditions. Moreover, it could be
      demonstrated that the growth behaviour of p73-high-expressing
      cells Hs 766T is highly dependent on the relative abundance
      of both N-terminal isoforms. The shRNA-mediated reduction of
      both isoforms strongly reduces tumorigenicity of these cells.
      In accordance with previous publications, the reintroduction
      of Np73 rescued this growth defect, whereas ectopic
      expression of TAp73 further attenuates proliferation. In
      order to further investigate Np73´s role in tumor
      development, an inducible Np73 transgenic mouse model was
      characterized. Whereas mere overexpression of Np73 exhibited
      no tumorrelevant properties, the combination with
      heterozygous knockout of p53 entailed earlier and accelerated
      tumor development particularly of lung tumors and lymphoma.
      The loss of the second p53 allele in lung tumors suggests
      that the dominant negative effect of Np73 rather impacts
      TAp73 than p53. Accordingly, the observed fertility and
      embryonic developmental defects in this transgenic model
      rather pointed towards a TAp73-dependent effect of Np73 as,
      in contrast to p53-deficient mice, severe and partially
      comparable defects have been described in TAp73- and complete
      p73-deficient mice. Finally, transcriptomewide analysis of
      Np73-overexpressing murine embryonic fibroblasts revealed
      positive regulation of metastasis-promoting factors like
      ITGB4, JAG1 and 2. This tumorpromoting property of Np73 goes
      in line with accelerated dissemination of lymphoma into lungs
      of Np73;p53+/- mice. Taken together, these results clearly
      demonstrate growth- as well as metastasis-promoting traits of
      Np73. However, the specific virtue of Np73 are largely cell
      context-dependent.
description: Die Tumorentwicklung ist ein
      mehrstufiger Prozess, bei dem sich aus einer einzigen
      Ursprungszelle durch Akkumulierung diverser Mutationen
      Tumoren entwickeln, die aus mehreren Populationen
      unterschiedlichen genetischen Status bestehen. Diese
      Heterogenität führt zu Selektionsvorteilen einzelner
      Subpopulationen innerhalb eines Tumors, die unter anderem
      Metastasierung sowie Therapieresistenz begünstigen. Zur
      Verbesserung der gezielten Krebstherapie von Patienten kann
      mittlerweile während des Therapieverlaufs die Zusammensetzung
      der Tumoren durch im Blut zirkulierende Tumor DNA verfolgt
      und die Therapie demensprechend angepasst werden. In
      experimentellen Ansätzen, wie Transplantationsmodellen
      solider Tumoren in Mäusen, kann diese Methode allerdings
      nicht angewandt werden, da das Blutvolumen der Versuchstiere
      zu klein ist. Dies limitiert die Untersuchung tumorrelevanter
      Faktoren in präklinischen Studien im Mausmodell. In dieser
      Arbeit wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die
      Wachstumsdynamiken zweier unterschiedlicher Zellpopulationen
      in einem einzigen Tumorzellimplantat simultan verfolgt werden
      können. Hierzu wurde vor der Transplantation jeweils eine
      Zellpopulation durch stabile Expression von Gaussia
      Luziferase (GLuc) oder Cypridina Luziferase (CLuc) markiert.
      Beide Luziferasen werden aus den Zellen sezerniert und ins
      Blut der Versuchstiere abgegeben. Kleinste Blutproben sind
      bereits ausreichend, um die Tumorkomposition mittels Messung
      der Enzymaktivität beider Luziferasen zu bestimmen. Um die
      Auswirkungen gezielter genetischer Manipulationen untersuchen
      zu können wurden die Luziferasen zusätzlich an
      (un)spezifische shRNAs gekoppelt. Zur Etablierung wurden
      shRNAs verwendet, die sich gegen die p53 Familienmitglieder
      p53 und p73 richten. Während p53 als der wichtigste
      Tumorsuppressor bekannt ist, gibt es von p73 zwei N-terminal
      unterschiedliche Isoformen, die entgegesetzte Funktionen
      besitzen: das ebenfalls tumorsuppressive TAp73 und das
      tumorfördernde Np73. Die dominant negative Wirkung von Np73
      liegt unter anderem in der Komplexierung seiner
      Familienmitglieder p53 und TAp73, wodurch diese die Fähigkeit
      verlieren an ihre Zielgene zu binden. Durch Kopplung der
      Luziferasen an unspezifische bzw. experimentelle shRNAs
      konnte die unterschiedliche Wachstumsdynamik transplantierter
      Zellen in An- bzw. Abwesenheit von p53 (oder p73) simultan
      verfolgt werden. Die in dieser Arbeit etablierte Methode
      wurde sowohl in einem Modell der experimentellen
      Metastasierung als auch unter therapeutischen Bedingungen
      erfolgreich validiert. Darüberhinaus konnte gezeigt werden,
      dass das Wachstumsverhalten p73-hochexprimierender Hs 766T
      Zellen abhängig vom relativen Verhältnis beider N-terminaler
      Isoformen zueinander ist. Eine shRNA-vermittelte Reduktion
      beider Isoformen hemmt die Tumorigenität dieser Zellen. In
      Übereinstimmung mit dem aktuellen Wissensstand wurde dieser
      Effekt durch ektopische Expression von Np73 wieder
      aufgehoben, wohingegen die Wiedereinführung von TAp73 die
      Proliferation noch weiter reduzierte. Um die Rolle von Np73
      während der Tumorentwicklung genauer zu untersuchen, wurde
      zudem ein induzierbares Np73-transgenes Mausmodell
      charakterisiert. Obwohl die alleinige Überexpression von
      Np73 keinen tumorigenen Effekt aufwies, führte die
      Kombination mit heterozygotem Verlust von p53 zu einer
      früheren und verstärkten Tumorentstehung, insbesondere von
      Lungentumoren und Lymphomen. Der Verlust des zweiten p53
      Allels in den Lungentumoren lässt eher auf eine dominant
      negative Wirkung von Np73 auf TAp73 als auf p53 schließen.
      Auch die beobachteten Fertilitäts- und embryonalen
      Entwicklungsdefekte dieser transgenen Mäuse weisen vielmehr
      auf einen TAp73-abhängigen Effekt von Np73 hin, da im
      Gegensatz zu p53-defizienten Mäusen bereits ähnliche Defizite
      in TAp73- und gesamt-p73-defizienten Mäusen beschrieben
      wurden. Letztlich wurde durch die transkriptomweite Analyse
      Np73-überexprimierender muriner embryonaler Fibroblasten
      eine positive Regulation metastasierungsrelevanter Faktoren
      (ITGB4, JAG1, JAG2) festgestellt. Diese onkogene Eigenschaft
      von Np73 geht einher mit der Beobachtung dass Lymphome aus
      Np73;p53+/- Mäusen verstärkt in die Lungen disseminierten.
      Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Np73 sowohl
      wachstums- als auch metastasierungsfördernde Eigenschaften
      besitzt, die genauen Wirkungsmechanismen allerdings abhängig
      vom Zellkontext sind.