AN INTEGRATED PROTEOMIC AND ANALYTICAL APPROACH FOR ELUCIDATING THE MECHANISM OF ACTION OF HISTIDINE DIPEPTIDES AND SYNTHETIC DERIVATES
Creators: name: GILARDONI, ETTORE
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2021

description: ?-alanil-L-istidina (carnosina) � un peptide endogeno che possiede innumerevoli propriet� (chelante dei metalli, antiossidante, sequestrante delle specie reattive carboniliche). Diversi studi clinici hanno dimostrato un?attivit� farmacologica della carnosina in malattie su base ossidative, tuttavia il meccanismo dell?attivit� in vivo non � ancora noto. Questo progetto ha come scopo quello di comprendere il meccanismo in vivo della carnosina. Per far ci�, sono stati sviluppati nuovi metodi analitici di cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa per la quantificazione in campioni biologici dei peptidi istidinici, loro derivati e gli addotti con le specie reattive carboniliche. Come prima cosa, un metodo analitico basato su una colonna ad interazione idrofiliche � stato sviluppato per l?analisi del carnosinolo in matrici biologiche di modelli animali di sindrome metabolica. La concentrazione di carnosinolo � stata determinata in diversi tessuti e, per la prima volta, l?addotto carnosinolo-acroleina � stato identificato in omogenato di fegato. Questo conferma l?attivit� del carnosinolo e dei peptidi istidinici come sequestranti delle specie reattive carboniliche in vivo. Tuttavia, � stata identificata l?instabilit� metabolica dell?addotto carnosinolo-HNE in diversi tessuti. Saranno quindi necessari ulteriori studi per la caratterizzazione del metabolismo di questi addotti e l?identificazione della corretta entit� chimica da ricercare nelle matrici biologiche come indice dell?attivit� sequestrante di carnosina e derivati. Il metodo basato su colonne ad interazioni idrofiliche � stato anche utilizzato per sviluppare un metodo a rivelazione diretta per determinare l?attivit� idrolitica del siero umano della carnosina. La carnosinasi serica � stata identificata come principale enzima impiegato nel metabolismo della carnosina. Rispetto ad altri metodi pubblicati in letteratura, quello sviluppato in questo elaborato si basa su una determinazione diretta della carnosina, senza dover effettuare processi complessi di preparazione del campione. I dati ottenuti sono stati convalidati con dati presenti in letteratura, dimostrando che il nostro metodo risulta essere affidabile ed accurato. � stato possibile anche condurre esperimenti di competizione fra substrati naturali e alcune molecole per valutare le principali interazioni substrato/enzima, con l?obiettivo di identificare inibitori della carnosinasi. I dati ottenuti sono stati condivisi con colleghi chimici computazionali che attraverso esperimenti di docking, virtual screening e dinamica molecolare hanno identificato dei possibili inibitori naturali della carnosinasi serica umana. Un nuovo meccanismo d?azione della carnosina � stato approfondito, in quanto recenti pubblicazioni hanno evidenziato un ruolo della carnosina nella prevenzione della formazione di addotti fra la 3,4-diidrofenilglicolaldeide (DOPEGAL), un metabolita intermedio del catabolismo della noradrenalina, e le proteine. La capacit� della carnosina di legare covalentemente la DOPEGAL tramite la formazione di un prodotto di Amadori � stata determinata in vitro e in lisato cellulare dove la DOPEGAL � stata formata aggiungendo noradrenalina al lisato enzimaticamente attivo. Studi futuri dovranno caratterizzare la stabilit� metabolica di quest?addotto e le caratteristiche della sua formazione in matrici biologiche in quanto risulta essere un interessante biomarcatore di tossicit� noradrenalinergica. In fine � stata valutato l?impatto della carnosina e del carnosinolo sul proteoma di cellule endoteliali umane derivanti dalla vena ombelicale. � ormai noto che i farmaci non agiscono unicamente col meccanismo d?azione per il quale sono stati sviluppati, ma possono interferire con l?espressione delle proteine cellulari, aumentandone, o diminuendone l?espressione e di conseguenza attivando o disattivando vie biologiche. Carnosina e carnosinolo non inducono una variazione nell?espressione delle proteine in cellule sane. Questo conferma la sicurezza delle molecole, soprattutto prevedendone un uso come terapia cronica. In futuro l?effetto del trattamento andr� valutato su cellule in condizioni patologiche, per comprendere se, in queste condizioni, carnosina o carnosinolo riescono a influenzare vie metaboliche e risposte cellulari. Sebbene ci siano ancora diverse domande che sono rimaste senza risposta, i dati ottenuti in questo elaborato hanno portato all?aumento della conoscenza del meccanismo d?azione di carnosina e derivati e all?identificazione di composti inibitori della carnosinasi.