Παραγωγή ανοσορυθμιστικών κυτταροκινών στη χρόνια Hπατίτιδα C
Creators: name: Γιγή, Ελένη Π.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: Αυτοπεριορισθείσα HCV λοίμωξη
Real time PCR
Self resolved HCV infection

description: Η χρόνια ηπατίτιδα C αναγνωρίζεται σήμερα ως η κύρια αιτία χρόνιας ηπατικής νόσου και η συχνότερη ένδειξη μεταμόσχευσης ήπατος παγκόσμια. Η γνώση της ανοσοπαθογένειας της HCV λοίμωξης θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση της φυσικής ιστορίας της νόσου και πιθανόν στην ανεύρεση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, με απώτερο σκοπό το μεγαλύτερο ποσοστό ασθενών με μακρόχρονη ιολογική ανταπόκριση. Οι ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου κυτταροκίνες φαίνεται ότι επηρεάζουν την έκβαση της ιογενούς λοίμωξης και καθορίζουν την ισορροπία μεταξύ άμυνας και ιστικής καταστροφής. Τα αποτελέσματα όμως των μελετών που αφορούν τον ρόλο των ΤΗ1 και ΤΗ2 τύπου κυτταροκινών στην ανοσιακή απάντηση έναντι του ιού ή στη γένεση της ηπατοκυτταρικής βλάβης στη χρόνια ηπατίτιδα C, είναι συχνά αντιφατικά. Για τον σκοπό αυτόν σχεδιάστηκε η παρούσα μελέτη η οποία επικεντρώθηκε στην έκφραση του mRNA των κυτταροκινών αυτών μετά από καλιέργεια των περιφερικών λεμφοκυττάρων παρουσία του NS3 αντιγόνου του γονιδιώματος του HCV. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Στην παρούσα μελέτη συμμετείχαν 60 άτομα τα οποία διαχωρίστηκαν σε δύο ομάδες: ΟΜΑΔΑ Α. Αποτελείτο από 31 ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C, 21 άνδρες / 10 γυναίκες, ηλικίας 18-74 ετών (μέση ηλικία 36.39±10.04) . Οι ασθενείς είχαν antiHCV(+), αυξημένα επίπεδα τρανσαμινασών και ΗCVRNA (+), τόσο στην ποιοτική όσο και στην ποσοτική ανίχνευση (PCR, Combas Amplicor HCV και Amplicor HCV Monitor- ROCHE Diagnostics) σε επανειλλημένους ελέγχους. Στους ασθενείς προσδιορίσθηκε επίσης ο γονότυπος του HCV (ΙΝΝΟLIPA, BAYER Diagnostics). Προς εκτίμηση της νεκροφλεγμονώδους αντίδρασης του ήπατος (ΗΑΙ=Histological activity Index) και του σταδίου της ίνωσης, χρησιμοποιώντας το τροποποιημένο σύστημα αξιολόγησης Knodell, έγινε βιοψία ήπατος σε 21/31 ασθενείς οι οποίοι και δέχτηκαν. Το ως άνω σύστημα αξιολογείται ως εξής: α) ΗΑΙ: 0-3 καθόλου, 4-8 ήπια, 9-12 μέτρια και 13-18 έντονη φλεγμονή και β) ίνωση: μετράται σε 4 στάδια, το δε 4 είναι πλέον ανάπτυξη κίρρωσης του ήπατος. Οι ασθενείς δεν είχαν υποβληθεί σε κανένα θεραπευτικό σχήμα όταν έγινε η αιμοληψία. ΟΜΑΔΑ Β. Αποτελείτο από 29 άτομα 11 άνδρες/18 γυναίκες, ηλικίας 23-67 ετών (μέση ηλικία 36.83±12.37), τα οποία είχαν αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C όπως διαπιστώθηκε από την παρουσία στον ορό antiHCV (+), μόνιμα φυσιολογικά επίπεδα τρανσαμινασών και HCVRNA (-) (σε πολλαπλούς ελέγχους κατά 6μηνα χρονικά διαστήματα).Στις δύο ομάδες μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των ΤΗ1 (IFΝ-γ, IL-2) και ΤΗ2 (IL-4, IL-10) τύπου κυτταροκινών από τα περιφερικά λεμφοκύτταρα μετά από καλλιέργειά τους με ή χωρίς την παρουσία του NS3 μη δομικού αντιγόνου του γονιδιώματος του HCV. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το ανασυνδυασμένο σε E.Coli NS3 αντιγόνο (HCA-110-4) που καλύπτει τα αμινοξέα 1190 (αλανίνη) μέχρι 1457 (κυστεΐνη). Στη συνέχεια, έγινε η απομόνωση του ολικού κυτταρικού RNA, η ανίχνευση του RNA, η μετατροπή του σε κυκλικό DNA (cDNA) με RT-PCR, ο σχηματισμός μιάς πρότυπης καμπύλης και καμπύλης του γονιδίου αναφοράς (housekeeping gene) και τελικά η ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του mRNA κάθε κυτταροκίνης σε σχέση με τα γονίδια αναφοράς με την τεχνική Real Time PCR χρησιμοποιώντας primers και probes των κυτταροκινών και των γονιδίων αναφοράς τα οποία σχεδιάστηκαν ειδικά για την παρούσα μελέτη και τη χρησιμοποίηση για πρώτη φορά του COBAS TAQMAN 48 για την εφαρμογή ερευνητικού πρωτοκόλου. Το τελικό αποτέλεσμα κάθε δείγματος ήταν ένας απόλυτος αριθμός, που εκφράζει τη συγκέντρωση του εξεταζόμενου γονιδίου κανονικοποιημένη ως προς το γονίδιο σταθερής έκφρασης. Κατά συνέπεια, η τελική έκφραση είναι σε «φορές», δηλαδή πόσες φορές η έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου που εξετάζεται είναι διαφορετική από το γονίδιο σταθερής έκφρασης (σχετική ποσοτικοποίηση=relative quantification)ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Όπως διαπιστώθηκε, οι ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C παρουσίαζαν την εξής κατανομή γονοτύπων : γονότυπος 1: 8 ασθενείς, γονότυπος 3: 18 ασθενείς, γονότυπος 2: 1 ασθενής,γονότυπος 4: 3 ασθενείς. Όσον αφορά στην ηπατική βλάβη , διαπιστώθηκαν τα εξής α) ΗΑΙ ελάχιστη: 2 ασθενείς , ήπια: 16 ασθενείς, μέτρια: 3 ασθενείς και β) ίνωση 1 σταδίου: 12 ασθενείς, 2 σταδίου: 4 ασθενείς, 2-3 σταδίου: 2 ασθενείς, 3 σταδίου: 1 ασθενής. Όσον αφορά στην έκφραση των επιπέδων του mRNA των κυτταροκινών διαπιστώθηκαν τα εξής: α) στην ΟΜΑΔΑ Α: σημαντική διαφορά στα επίπεδα της μετρούμενης με αντιγόνο σε σύγκριση με τα επίπεδα χωρίς διέγερση με αντιγόνο έκφρασης του mRNA της IFN-γ (p&lt; 0,001), της IL-2 (p&lt;0,001), της IL-4 (p=0,005), κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε για το mRNA της IL-10 (p= 0,193). Πιο συγκεκριμένα, μετά τη διέγερση με αντιγόνο τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IFN-γ ήταν 11,5 φορές υψηλότερα σε σχέση με τα επίπεδα χωρίς διέγερση με αντιγόνο. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-2 μετά τη διέγερση με αντιγόνο ήταν 1,84 φορές μεγαλύτερα συγκριτικά με τα επίπεδά χωρίς διέγερση με αντιγόνο. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-4 μετά τη διέγερση με αντιγόνο ήταν 1,35 φορές μεγαλύτερα σε σχέση με τα επίπεδα χωρίς διέγερση με αντιγόνο β) στην ΟΜΑΔΑ Β: στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα της μετρούμενης με και χωρίς διέγερση με αντιγόνο έκφρασης του mRNA της IFN-γ (p&lt; 0,001), της IL-2 (p&lt;0,001), της IL-4 (p=0,002), κάτι το οποίο δεν παρατηρήθηκε για το mRNA της IL-10 (p= 0,064).Πιο συγκεκριμένα, μετά τη διέγερση με αντιγόνο τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IFN-γ ήταν 7,9 φορές υψηλότερα σε σχέση με τα επίπεδά χωρίς διέγερση με αντιγόνο. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-2 μετά τη διέγερση με αντιγόνο ήταν 2,05 φορές μεγαλύτερα συγκριτικά με τα επίπεδα χωρίς διέγερση με αντιγόνο. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-4 μετά τη διέγερση με αντιγόνο ήταν 1,30 φορές μεγαλύτερα σε σχέση με τα επίπεδά χωρίς διέγερση με αντιγόνο.Κατά τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του mRNA των κυτταροκινών (τόσο πριν όσο και μετά τη διέγερση με αντιγόνο) μεταξύ ασθενών και ατόμων με αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C, διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IFN-γ χωρίς διέγερση με αντιγόνο (p= 0,015) και στην IL-10 με (p= 0,045) αλλά και χωρίς διέγερση με αντιγόνο (p= 0,036) , δηλαδή τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IFN-γ χωρίς διέγερση με αντιγόνο ήταν 1,78 φορές μεγαλύτερα στην ομάδα των ασθενών συγκριτικά με την ομάδα των ατόμων με αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης της IL-10 ήταν μεγαλύτερα στην ομάδα των ατόμων με αυτοπεριορισθείσα ηπατίτιδα C συγκριτικά με την ομάδα των ασθενών 1,59 φορές μεγαλύτερα ύστερα από διέγερση με αντιγόνο και 1,66 φορές μεγαλύτερα χωρίς διέγερση με αντιγόνο. Με σκοπό να διαπιστωθεί αν υπάρχει κάποια σημαντική (γραμμική) συσχέτιση μεταξύ των εξής παραγόντων: ηλικίας, φύλου, ιικού φορτίου, γονότυπου, επιπέδων αμινοτρανσφερασών , βαθμού ΗΑΙ , σταδίου ίνωσης και των επιπέδων έκφρασης του mRNA των κυτταροκινών: IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10, χρησιμοποιήθηκε η μονοπαραγοντική ανάλυση όπου κάθε παράγοντας συσχετίζεται χωριστά και διαπιστώθηκε μία μέση θετική γραμμική συσχέτιση (rho= 0,5) μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IFN-γ (τόσο πριν όσο και μετά διέγερση με αντιγόνο) και της ίνωσης σε επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας (p&lt; 0,05). Eπίσης, διαπιστώθηκε μία ασθενής (rho= 0,36), αλλά στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p&lt; 0,05) του άρρενος φύλου και της αύξησης των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IL-10 μετά διέγερση με αντιγόνο. ΣΥΜΕΡΑΣΜΑΤΑ: τα ευρήματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι: 1) Τα περιφερικά λεμφοκύτταρα των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα C διατηρούν την ικανότητα σε καλλιέργεια, αυτόματα ή όταν διεγερθούν με αντιγόνα του HCV, να εκφράζουν mRNA κυρίως της IFN-γ, της IL-2 και της IL-4. 2) Τα λεμφοκύτταρα των ατόμων με αυτοπεριορισθείσα HCV λοίμωξη έχουν παρόμοια συμπεριφορά , μικρότερης όμως έντασης. 3) Κατά την σύγκριση των 2 ομάδων, διαπιστώνεται σημαντική αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IFN-γ χωρίς αντιγόνο, στους ασθενείς σε σχέση με την ομάδα Β. Στην χρόνια HCV λοίμωξη, τα περιφερικά λεμφοκύτταρα ήδη ευρίσκονται σε κατάσταση συνεχούς διέγερσης, εφόσον εκτίθενται συνεχώς στο αντιγονικό ερέθισμα, δηλαδή στον HCV. Για τον λόγο αυτόν και κατά τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IFN-γ μετά από καλλιέργεια χωρίς αντιγόνο αυτά είναι σημαντικά υψηλότερα από τα αντίστοιχα επίπεδα της ομάδας των ατόμων με αυτοπεριορισθείσα λοίμωξη. Μετά τη διέγερση με αντιγόνο, η διαφορά αυτή μειώνεται και εμπίπτει σε μη σημαντικά όρια, διότι τα λεμφοκύτταρα της ομάδας Β, διατηρώντας την ανάμνηση έναντι αντιγόνων του HCV (όπως ήδη αναφέρθηκε παραπάνω), εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα mRNΑ της IFN-γ. 4) Η IFN-γ ευθύνεται για την ηπατοκυτταρική βλάβη στους ασθενείς, όπως διαπιστώνεται από τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της με το στάδιο της ίνωσης και δεν στοχεύει στην ανοσιακή απάντηση έναντι του ιού και την κάθαρσή του. Η υπόθεση αυτή τεκμηριώνεται από τη μη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της IFN-γ με τα επίπεδα ιαιμίας. 5) Τα σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του mRNA της IL-10 στα άτομα με αυτοπεριορισθείσα HCV λοίμωξη μάλλον αντανακλούν την αντισωματική απάντηση έναντι του HCV
description: AIM: HCV infection is now recognized as the major cause of chronic liver disease and the most common indication for liver transplantation worldwide. The understanding of the immunopathogenesis of chronic hepatitis C will highlight the natural history of the disease and will possibly lead to the implication of new therapeutic approaches leading to a sustained virological response in a higher proportion of patients. TH1 and TH2 cytokines play an important role in the defense against viral infections and the outcome of the disease determining the predominant host responses and the inhibition of viral replication or causing of liver damage. The results of previous studies on the role of these cytokines in the immune response against the virus or the grade of liver injury in chronic hepatitis C, have been conflicting. The present study has focused on the detection of the mRNA expression levels of TH1 and TH2 cytokines of peripheral lymphocytes from patients with chronic hepatitis C, in the presence of NS3 antigen of the HCV genome. PATIENTS AND METHODS: Thirty-one chronic hepatitis C patients, 21 men, mean age 36.39±10.04, age range 18-74 years, were included in the study consisting Group A. All patients were antiHCV(+), had elevated serum aminotransferases levels and were HCVRNA positive both in the qualitative (Combas Amplicor HCV) and the quantitative (Amplicor HCV Monitor, ROCHE Diagnostics) PCR assays, in consecutive blood samples. HCV genotypes were characterized in all patients (INNOLIPA, BAYER Diagnostics). Liver biopsies undertaken in 21/31 patients, were graded (HAI) and staged (fibrosis) according to a modified Knodell scoring system in which HAI is evaluated as :0-3=minimal inflammatory reaction, 4-8=mild, 9-12=moderate and 13-18 severe and 4 stages of fibrosis, where stage 4 is cirrhosis. No patients had received previous anti-viral or immunomodulatory treatment. Twenty-nine subjects, 11 men, mean age 36.83±12.37, age range 23-67 years, with self-limited HCV infection as documented by the presence of antiHCV(+), normal serum aminotransferases levels and HCVRNA(-) in serial blood samples (taken in 6 months intervals), were also included in the study and consisted Group B. In both groups, mRNA expression levels of TH1 (IFN-γ, IL-2) and TH2 (IL-4, IL-10) type cytokines were studied in the peripheral blood lymphocytes after culturing them in the presence or not of the NS3 non-structural antigen of the HCV genome. The NS3 antigen was a recombinant antigen, prepared in Escherichia Coli, covering the aminoacids from 1190(alanine) to 1457(cysteine). After the end of the culture time, lymphocytes were harvested for total RNA extraction, followed by the detection of RNA and the synthesis of cDNA by RT-PCR and finally, the detection of mRNA expression levels of the four cytokines was studied by Real Time PCR and the use of COMBAS TAQMAN 48 which was used for the first time for a research protocol.The primers and probes of the cytokines and the reference genes used, were scheduled for the purposes of the present study. Since the relative changes of the mRNA expression levels were most important, as in most mRNA studies, the most appropriate method was Relative Quantification which calculates the target concentration in each sample relative to a housekeeping gene, which is constant. The absolute values for the target and reference concentrations were automatically determined by the Utility Channel Analysis Data and the data were then entered into MS Excel, in order to calculate the target/housekeeping ratio. RESULTS: The distribution of HCV genotypes in the patient group was: genotype 1=8, 2=1, 3=18 and 4=3 patients. The histological study revealed that a) concerning HAI, 2 patients had minimal inflammatory reaction, 16 had mild, and 3 moderate and b) concerning fibrosis, 12 patients had stage 1, 4 had stage 2, 2 had stage 2-3 and 1 had stage 3. In the group A, mRNA expression levels of IFN-γ were found to be significantly higher (X11.5, p&lt;0.001) in response to antigen stimulation and the same was found for IL-2 (X1.84, p&lt;0.001) and IL-4 (X1.35, p=0.005). No significant difference was recorded for IL-10. In the group B, results were similar being significantly higher for IFN-γ (X7.9, p&lt;0.001) , IL-2 (X2.05. p&lt;0.001) and IL-4 (X1.30, p=0.002). Similarly, no significant difference for IL-10 was found. Furthermore, a significant difference in the mRNA expression levels of IFN-γ without antigen stimulation, was noted between patients and subjects with self-limited disease (p=0.015) being X1.78 times higher in the patient group. In contrast, mRNA expression levels of IL-10 both with (X1.66) or without (X1.59) antigen stimulation (p=0.045) were significantly higher in the group of subjects with self-limited disease. In the bivariate regression analysis where the following clinical and histological markers: age, sex, viral load, genotype, serum levels of aminotransferases, HAI and fibrosis were correlated with mRNA expression levels of cytokines, a significant linear correlation between IFN-γ mRNA expression levels and stage of fibrosis (p&lt;0.05) as well as a weak, significant though (p&lt;0.05), between ΑΡΡΕΝ sex and mRNA expression levels of IL-10 was found. CONCLUSIONS: The findings of the present study have shown: 1. Peripheral blood lymphocytes of patients with chronic hepatitis C maintain the ability, both in response to HCV antigen or spontaneously, of mRNA expression of IFN-γ (mainly) as well as IL-2 and IL-4. 2. Lymphocytes from subjects with self-limited HCV infection showed similar behavior, although in lower levels. 3. When results were compared between the two groups, it was found that lymphocytes of patients with chronic hepatitis C, cultured without antigen showed a significantly higher mRNA production of IFN-γ. Peripheral blood lymphocytes from patients with chronic hepatitis C are being continuously exposed in vivo to the antigenic stimulus, i.e HCV. This could explain the fact that mRNA expression levels of IFN-γ are higher in cultured lymphocytes even without antigen compared to subjects with selflimited disease. However, this difference is decreased falling in non-significant levels between the two groups, when lymphocytes are stimulated with antigen, since subjects with self-limited disease are reported to maintain the ability to mount a CD4+ immune response against HCV antigens for up to many years or even for life. The finding that mRNA expression of IFN-γ correlates with fibrosis could suggest that IFN-γ is possibly playing an important role in hepatocellular injury rather than contributing in viral clearance, resulting in poor virus control. The latter is supported by the fact that no correlation of IFN-γ mRNA expression and viral load was found in the present study. Significant higher mRNA expression levels of IL-10 in the group of subjects with self-limited disease could suggest that humoral immunity against HCV prevails in this group