title: Die osmotische Schutzsubstanz Prolin: Regulation der Prolinbiosynthese und Bildung eines osmoadaptiven Prolin-Bypass-Weges durch die evolutionäre Anpassung des Argininanabolismus
title: The osmostress protectant proline: regulation of the proline biosynthesis and building of an osmoadaptive proline bypass route via the evolutionary adaptation of the arginine metabolism
Creators: name: Stecker, Daniela
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: no entry
keine Angabe
Prolin
proline, compatible solute
Kompatibles Solut, Osmostress
osmostress

description: B. subtilis lives in the upper
      layers of the soil and must therefore adapt to strong
      variations of osmolarity and water content. The soil
      bacterium can adapt to high osmolarity growth conditions
      through the osmotically induced de novo synthesis or the
      uptake of the compatible solute and osmostress protectant
      proline. B. subtilis possesses interlinked pathways for the
      synthesis of proline. The anabolic ProB-ProA-ProI route
      provides proline for protein biosynthesis, whereas the
      ProJ-ProA-ProH route is responsible for the high-level
      production of proline as an osmostress protectant. The first
      step of both pathways is catalyzed by the γ-glutamyl kinases
      ProB and ProJ. These isoenzymes show essential differences
      regarding their regulation. The transcription of the proBA
      operon is controlled in response to intracellular proline
      levels via a T-box regulatory element, whereas the
      transcription of the proHJ gene cluster is up-regulated in
      response to increases in the external osmolarity. ProB is
      feedback regulated by proline, but such a
      post-transcriptional regulation is unlikely to control the
      enzyme activity of ProJ. The enzyme-inhibitor-interaction is
      modulated by a flexible 16-residue loop in the active center
      of the γ-glutamyl kinase. ProB and ProJ from B. subtilis
      reveal a striking difference regarding the amino acid
      sequence of this loop. The feedback inhibited ProB enzyme
      possesses a negative glutamate residue at position 142 in the
      flexible loop, whereas the ProJ enzyme possesses a positively
      charged Arg residue at the corresponding region.
      Bioinformatic analysis revealed that the negative amino acid
      glutamate in enzymes of the ProB type and the positive amino
      acid arginine in enzymes of the ProJ type is highly conserved
      within the genus Bacillus. Based on these bioinformatic
      analysis we created B. subtilis mutants with a substitution
      of the negatively charged amino acid glutamate of the
      anabolic ProB enzyme against a positively charged amino acid
      arginine by site directed mutagenesis. Vice versa, we
      replaced arginine in the osmoadaptive ProJ enzyme by
      glutamate. The amino acid substitution in ProB caused a
      decreased allosteric regulation of the protein and led to an
      increase in the cellular proline pool and the osmotic
      tolerance. Conversely, the amino acid substitution in ProJ
      causes an increased allosteric regulation of the protein and
      led to a decreased proline accumulation in vivo and a reduced
      osmotic tolerance. Our data strongly suggest that the
      different allosteric controls of the ProB and ProJ are well
      integrated into the physiological functions of either the
      anabolic or osmostress adaptive proline synthesis routes of
      B. subtilis. The anabolic and the osmoadaptive proline
      pathways in B. subtilis are connected via the shared ProA
      protein. Because no paralogous protein to ProA exists, the
      deletion of the proA gene leads to a perturbation in proline
      biosynthesis. Suppressor mutations within the ahrC region and
      the argCJBD-carAB-argF region recruit enzymes of the arginine
      metabolism for the synthesis of proline. The suppressor
      mutations were of two types: First were mutations in the
      promoter region of argCJBD-carAB-argF, which encodes for
      genes of the arginine biosynthetic pathway. Second were
      mutations in the regulator protein AhrC, which represses the
      transcription of the argC operon. Both types of mutants
      result in a diminished binding of the transcription repressor
      AhrC to its operator region and enhance the transcription of
      the argC operon leading to increased amounts of ornithine
      within the cell. Ornithine can be converted via the RocD
      enzyme. RocD as part of the arginine degradation pathway
      synthesizes the same reaction product as the ProA enzyme and
      thereby bypassing the ProA mediated enzyme reaction.
      Furthermore our investigations suggest that under certain
      conditions the amino acid arginine can also be used as an
      osmostress protectant by B. subtilis. The data acquired in
      this dissertation demonstrate how effective bacteria can
      adapt to limitations on their essential biosynthetic
      pathways.
description: Das Bodenbakterium B. subtilis ist
      in seinem Habitat starken Schwankungen hinsichtlich
      Osmolaritäten und Wasserhaushalt ausgesetzt. B. subtilis ist
      in der Lage sich an hochosmolare Wachstumsbedingungen durch
      die Neusynthese oder die Aufnahme der osmoprotektiven
      Aminosäure Prolin anzupassen. Die Prolinbiosynthese in B.
      subtilis kann über zwei Wege realisiert werden. Der anabole
      ProB-ProA-ProI-Weg wird zur Prolinproduktion für die
      Proteinbiosynthese genutzt. Der osmoadaptive
      ProJ-ProA-ProH-Weg dient der Bereitstellung großer
      Prolinmengen für den Einsatz als Osmostress-Schutzsubstanz.
      Die γ-Glutamylkinasen ProB und ProJ sind Isoenzyme, welche
      den jeweils ersten Schritt der beiden Prolinbiosynthesewege
      katalysieren. Sie unterscheiden sich maßgeblich hinsichtlich
      ihrer Regulation. Die Expression des proBA-Operons wird in
      Anpassung an die intrazelluläre Prolinkonzentration durch ein
      T-Box-regulatorisches System kontrolliert. Die Expression des
      proHJ-Genclusters steht hingegen unter osmotischer Kontrolle
      und wird durch den Anstieg der externen Osmolarität
      induziert. Auf Proteinebene wird das anabole ProB-Enzym durch
      Prolin allosterisch Feedback-reguliert. Das osmoadaptive
      ProJ-Enzym unterliegt scheinbar keiner solchen
      posttranskriptionellen Regulation. Die Feedback-Inhibition
      wird durch einen 16 Aminosäuren langen flexiblen Loop im
      aktiven Zentrum der γ-Glutamyl-Kinase moduliert. Die
      γ-Glutamyl-Kinasen ProB und ProJ zeigen hinsichtlich ihrer
      Aminosäuresequenz einen signifikanten Unterschied in diesem
      Loop. Das durch Prolin Feedback-inhibierte Enzym ProB aus B.
      subtilis weißt einen negativen Glutamat-Rest an der
      Aminosäure-Position 142 im flexiblen Loop auf, während das
      ProJ-Protein einen positiv geladenen Arginin-Rest an der
      entsprechenden Position zeigt. Mit Hilfe bioinformatischer
      Analysen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden,
      dass die negative Aminosäure Glutamat in Enzymen des
      ProB-Typs und die positive Aminosäure Arginin in Enzymen des
      ProJ-Typ innerhalb der Gattung Bacillus hochkonserviert sind.
      Auf Grundlage dieser bioinformatischen Analysen wurden B.
      subtilis-Mutanten konstruiert, bei denen die negative
      Aminosäure Glutamat im anabolen ProB gegen die positive
      Aminosäure Arginin (E142R) ausgetauscht wurde. Umgekehrt
      wurde im osmoadaptiven ProJ-Enzym Arginin gegen Glutamat
      ausgetauscht. Die Aminosäuresubstitution in ProB führt zu
      einer verminderten allosterischen Regulation des Proteins,
      welche mit einer erhöhten Prolinakkumulation in vivo sowie
      einer gesteigerten osmotischen Toleranz einhergeht. Der
      Austausch in ProJ führt hingegen zu einer erhöhten
      allosterischen Regulation und bewirkt eine verminderte
      Prolinakkumulation sowie eine geringere osmotische Toleranz.
      Die gezeigten Daten beweisen, dass die γ-Glutamyl-Kinasen
      ProB und ProJ aufgrund ihrer unterschiedlichen allosterischen
      Regulation bestens auf ihre physiologische Funktion im
      anabolen oder osmoadaptiven Prolinbiosyntheseweg in B.
      subtilis abgestimmt sind. Die anabole und die osmoadaptive
      Prolinbiosynthese in B. subtilis sind über das gemeinsam
      genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Da kein paraloges
      Enzym existiert, führt die Deletion von ProA zu einer
      massiven Reduktion der Prolinbiosynthese. Die vorliegende
      Arbeit zeigt Suppressormutanten, die in der Lage sind über
      die Rekrutierung von Enzymen des Argininstoffwechsels sowohl
      die anabole als auch die osmoprotektive Prolinbiosynthese
      aufrecht zu erhalten. Zwei Klassen von Mutationen konnten
      identifiziert werden: Zum einen Mutationen in der
      Promotorregion von des argC-Operons, welches für Gene der
      Argininsynthese kodiert. Zum anderen Mutationen im
      Regulatorprotein AhrC, welches als Repressor für die
      Transkription des argC-Operons fungiert. Beide Klassen von
      Mutationen führen zu einer verschlechterten Bindung des
      Transkriptionsrepressors AhrC an seine Operatorregion im
      Promotorbereich des argC-Operons und folglich zu einer
      erhöhten Expression des argC-Operons und zu größeren
      Ornithin-Pools in der Zelle. B. subtilis ist dazu in der Lage
      ausgehend von Ornithin mittels RocD, einem Enzym des
      Arginin-Katabolismus, dasselbe Produkt wie ProA zu bilden und
      kann folglich dessen Fehlen ersetzen. Desweiteren liefert die
      vorliegende Arbeit erste Hinweise darauf, dass die Aminosäure
      Arginin unter bestimmten Voraussetzungen ebenfalls als
      osmotische Schutzsubstanz von B. subtilis genutzt werden
      kann. Die gezeigten Untersuchungen demonstrieren die
      Fähigkeit von Bakterien sich flexibel an Beeinträchtigungen
      essentieller Stoffwechselwege anzupassen.