Καθορισμός της γενετικής σύστασης πληθυσμών ειδών του γένους Brachionus με χρήση μοριακών δεικτών
Creators: name: Παπακώστας, Σπυρίδων Μ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Ζωοπλαγκτό
Kρυπτικά είδη
Mιτοχόνδριακό DNA
16S rRNA
Zooplankton
Cryptic species
Mitochondrial DNA

description: Τα τροχόζωα του γένους Brachionus είναι μικροσκοπικοί ζωοπλαγκτικοί οργανισμοί ιδιαίτερης οικονομικής σημασίας. Η παρουσία κρυπτικών ειδών στο γένος Brachionus επιβάλλει τη χρησιμοποίηση μεθόδων γενετικής ταυτοποίησης στο πλαίσιο της μελέτης των πληθυσμών τους. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ένας μεγάλος αριθμός κατατεθειμένων στην GenBank ακολουθιών COI, προκειμένου να αναπτυχθεί η μέθοδος RFLP στο συγκεκριμένο γενετικό δείκτη. Επιπλέον, σχεδιάστηκαν ειδικοί για το Brachionus εκκινητές που να ενισχύουν ένα τμήμα της περιοχής 16S rRNA του μιτοχονδρίου. Χρησιμοποιώντας αυτούς τους εκκινητές σε δείγματα τροχοζώων από τους πληθυσμούς που μελετήθηκαν, βρέθηκαν οι ακολουθίες πρωτοδιάταξης, στο συγκεκριμένο δείκτη, αρκετών κρυπτικών ειδών/βιοτύπων Brachionus. Χρησιμοποιώντας τις ακολουθίες 16S rRNA, κατασκευάστηκε ένας δεύτερος «χάρτης περιορισμού». Τα δεδομένα αυτού του «χάρτη» χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με εκείνα του «χάρτη περιορισμού» COI για το γενετικό χαρακτηρισμό δειγμάτων τροχοζώων κρυπτικών ειδών/βιοτύπων Brachionus στους πληθυσμούς που μελετήθηκαν. Η δυνατότητα ενίσχυσης επτά μικροδορυφορικών τόπων (Bp1 ως Bp7) στο είδος B. plicatilis s.s., οδήγησε στην ευκρινέστερη περιγραφή των πληθυσμών του είδους. Έλεγχος συν-ενίσχυσης των τόπων αυτών στα είδη/βιοτύπους που βρέθηκαν, έδειξε πως τρείς από αυτούς (Bp4, Bp5, Bp7) ενισχύονται στο βιότυπο B. sp. Austria. Με τη χρησιμοποίηση των αποτελεσμάτων γενοτύπησης των μικροδορυφορικών δεικτών, έγινε δυνατή η περιγραφή των πληθυσμών τόσο του B. plicatilis s.s. όσο και του B. sp. Austria σε επίπεδο παρθενογενετικά αναπτυσσόμενου κλώνου. Με τη συνδρομή των παραπάνω γενετικών δεικτών και μεθόδων, καθορίστηκε η γενετική σύσταση πληθυσμών τροχοζώων του γένους Brachionus των εξής τριών κατηγοριών: α) πληθυσμών που συντηρούνται σε ερευνητικά εργαστήρια ανά τον κόσμο, β) πληθυσμών που καλλιεργούνται σε εκκολαπτήρια ευρωπαϊκής κυρίως προέλευσης και γ) φυσικών πληθυσμών από την Ελλάδα, την Ιταλία και την Κίνα, με ιδιαίτερη έμφαση τους πληθυσμούς Brachionus από τη λίμνη Κορώνεια. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση του θρεπτικού μέσου στον ανταγωνισμό τόσο μεταξύ κλώνων του ίδιου είδους όσο και μεταξύ διαφορετικών ειδών/βιοτύπων Brachionus. Επίσης, μελετήθηκε η γενετική πορεία των μαζικών καλλιεργειών (mass cultures) του εκκολαπτηρίου Maricoltura di Rosignano Solvay (MRS) και εξετάστηκε αν η γενετική σύσταση των καλλιεργούμενων πληθυσμών σχετίζεται με πληθυσμιακές καταρρεύσεις ή γενικότερα προβλήματα στην απόδοση των καλλιεργειών. Ακόμη, διερευνήθηκε η εξέλιξη των πληθυσμών Brachionus από τη λίμνη Κορώνεια σε σχέση με τις παραμέτρους της θερμοκρασίας, του διαλυμένου οξυγόνου, του pH και της αλατότητας, για ένα χρονικό διάστημα εννέα διαδοχικών μηνών. Τέλος, εξετάστηκαν οι σχέσεις των τροχοζώων B. plicatilis s.s. και B. sp. Austria που βρέθηκαν στα εκκολαπτήρια και στους φυσικούς πληθυσμούς, με βάση τους γενότυπους των μικροδορυφορικών τόπων. Τα αποτελέσματα καθορισμού της γενετικής σύστασης των πληθυσμών Brachionus που μελετήθηκαν, έδειξαν ότι τόσο οι εργαστηριακοί πληθυσμοί όσο και η πλειονότητα των πληθυσμών των εκκολαπτηρίων, απαρτίζονται από ένα είδος ή βιότυπο Brachionus κάθε φορά. Στην περίπτωση των εκκολαπτηρίων, από τα 28 στελέχη που μελετήθηκαν, συνολικά απαντήθηκαν πέντε διαφορετικά κρυπτικά είδη/βιότυποι του συμπλέγματος B. plicatilis (B. plicatilis s.s., B. sp. Austria, B. sp. Manjavacas, B. sp. Nevada, B. sp. Cayman), από τα τουλάχιστο 14 που έχουν προταθεί πως υπάρχουν. Αρκετά συχνή ήταν η παρουσία του βιοτύπου B. sp. Cayman (περίπου 60% των περιπτώσεων). Η γενοτύπηση των στελεχών στα οποία βρέθηκαν τα B. plicatilis s.s. και B. sp. Austria, έδειξε αξιοσημείωτη γενετική ομοιότητα μεταξύ τους. Αντίστοιχη ήταν και η γενετική ομοιομορφία που διαπιστώθηκε στις μαζικές καλλιέργειες του εκκολαπτηρίου MRS. Σε όλες τις καλλιέργειες του στελέχους MRS, ανεξαρτήτως απόδοσης, βρέθηκε ο βιότυπος B. sp. Cayman. Φάνηκε, ωστόσο, ότι το στάδιο μετάβασης των καλλιεργειών από αποθεματικές σε μαζικές, είναι κρίσιμης σημασίας για τη μετέπειτα απόδοση των μαζικών καλλιεργειών. Στα πειράματα που έγιναν, φάνηκε ότι το θρεπτικό μέσο ίχε σημαντική επίδραση στον ανταγωνισμό μεταξύ κλώνων διαφορετικών ειδών/βιοτύπων Brachionus (B. plicatilis s.s., B. sp. Cayman, B. sp. Nevada). Το μικροφύκος Nannochloropsis sp. ευνόησε το B. sp. Cayman, ενώ η τεχνητή τροφή CS-Plus τα B. plicatilis s.s. και B. sp. Nevada. Διαπιστώθηκε ακόμη ότι ξεχωριστοί κλώνοι του ίδιου είδους (κλώνοι 10, L1, L3 του B. plicatilis s.s.) μπορεί να εμφανίζουν διαφορετική ικανότητα ανάπτυξης σε περίπτωση συνύπαρξής τους στην ίδια καλλιέργεια. Η μελέτη των εννέα διαδοχικών μηνιαίων δειγματοληψιών από τη λίμνη Κορώνεια αλλά και των αβγών διάπαυσης του ιζήματος της λίμνης, αποκάλυψε την παρουσία συνολικά έξι ειδών/βιοτύπων Brachionus (B. plicatilis s.s., B. sp. Austria, B. ibericus, B. dimidiatus, B. calyciflorus, B. urceolaris). Τα δύο τελευταία βρέθηκαν μόνο σε αβγά διάπαυσης που συλλέχθηκαν από το ίζημα της λίμνης. Η συσχέτιση της παρουσίας των υπόλοιπων τεσσάρων ειδών/βιοτύπων με τις φυσικοχημικές παραμέτρους των νερών της λίμνης, έδειξε ότι τα B. plicatilis s.s. και B. sp. Austria προτιμούν κατά κύριο λόγο χαμηλότερες θερμοκρασίες σε σχέση με τα B. ibericus και B. dimidiatus. Ο καθορισμός των γενοτύπων των τροχοζώων B. plicatilis s.s. και B. sp. Austria από τη λίμνη Κορώνεια έδωσε σαφείς ενδείξεις παρουσίας του φαινομένου της «επιλογής κλώνων». Η έντονη ανάπτυξη συγκεκριμένων σύνθετων γενότυπων σε ορισμένες από τις δειγματοληψίες που έγιναν, θα μπορούσε να τροφοδοτήσει την υπόθεση ανάπτυξης οικολογικά προσαρμοσμένων κλώνων σε κάθε περίπτωση, ωστόσο, κάτι τέτοιο μένει να διερευνηθεί διεξοδικότερα
description: The Brachionus rotifers are small zooplanktonic organisms that can be found in continental water bodies. They are economically important organisms, since they are commonly used as live food for fish larvae in the aquaculture industry. The presence of cryptic species in Brachionus rotifers necessitates the use of genetic characterisation methods for the study of their populations. In this dissertation, a considerable number of COI sequences deposited in the GenBank was used to develop an RFLP method for the genetic characterisation of the cryptic Brachionus rotifers. Additionally, Brachionus-specific primers for the 16S rRNA mitochondrial region were designed and employed to the studied rotifer populations to yield a collection of 16S rRNA sequences. Sequencing analysis revealed that the 16S rRNA marker is superior to the COI, when deep divergences are studied in Brachionus rotifers. Thus, by combining these two markers a more robust mitochondrial-based Brachionus phylogeny can be inferred. The 16S rRNA sequences were also used to develop a second restriction map. The data from both the COI and 16S maps were used successfully to genetically characterise rotifers from the studied populations. A total of seven microsatellite loci (Bp1 to Bp7) were also used to describe more accurately the populations of the species B. plicatilis s.s. By applying the microsatellite primers on DNA samples from all other Brachionus species/biotypes that were found among the populations studied, it has been revealed that three of them (Bp4, Bp5, Bp7) are also amplified in B. sp. Austria. Genotyping of the B. plicatilis s.s. and B. sp. Austria rotifer populations, enabled their detailed description at the level of α clone. With the use of the above markers and methods, the genetic structure of the following Brachionus populations was determined: a) populations grown in several laboratories and institutes worldwide, b) populations cultured in numerous, mainly European, hatcheries and c) wild populations from Greece, Italy and China, with emphasis to those from the lake Koronia. The impact of the diet on the competition between different clones of the same and of different Brachionus species/biotypes was also investigated. In addition, the genetic course of a number of mass cultures of the Maricoltura di Rosignano Solvay (MRS) hatchery was followed and it was examined whereas the genetic composition of the cultures can be associated with the observed crashes or with the productivity of some of the mass cultures. Furthermore, the Brachionus populations of the lake Koronia were monitored for a nine-month period and their species/biotype composition was correlated with a number of parameters, including temperature, dissolved oxygen, pH and salinity. Finally, the relationships of the hatchery and wild B. plicatilis s.s. and B. sp. Austria populations were examined, based on their microsatellite genotypes. The analysis of the studied Brachionus populations revealed that all laboratory samples and most of the hatchery strains were comprised by a single species/biotype. In hatcheries, a total of 28 strains were studied. Five different species/biotypes of the B. plicatilis complex were found (B. plicatilis s.s., B. sp. Austria, B. sp. Manjavacas, B. sp. Nevada, B. sp. Cayman). The most common was the B. sp. Cayman biotype (approx. 60% of the cases). From the genotypes of the B. plicatilis s.s. and B. sp. Austria rotifers it has been revealed that their strains are genetically closely related. The B. sp. Cayman was the only species/biotype found in all mass cultures of the MRS strain. Thus, it was not possible to associate the genetic composition of the mass cultures with the efficiency of the culture. Nevertheless, it has been found that the few observed crashes occurred soon after upscaling. Diet and temperature changes during this process seem to be important factors leading to this outcome. It has been found that diet change had a significant impact on the outcome of cultures where three clones of different Brachionus species/biotypes were mixed (B. plicatilis s.s., B. sp. Cayman, B. sp. Nevada). Nannochloropsis sp. promoted the growth of B. sp. Cayman, whereas the artificial diet CS-Plus favoured the B. plicatilis s.s. and B. sp. Nevada. In addition, different clones of the same species (clones 10, L1, L3 of the species B. plicatilis s.s.) could have distinctive growth capabilities. In all the cultures examined (Nannochloropsis sp. and CS-Plus diets), clone 10 was the one that finally prevailed. Such phenomena ("clonal selection") have been suggested to occur also in wild populations of B. plicatilis s.s. By analysing the genetic structure of the nine consecutive monthly samplings from the lake Koronia and from the resting eggs found in the sediment samples, a total of six Brachionus species/biotypes were found (B. plicatilis s.s., B. sp. Austria, B. ibericus, B. dimidiatus, B. calyciflorus, B. urceolaris). The species B. calyciflorus and B. urceolaris were encountered only in the resting egg samples. By correlating the presence of the remaining four species/biotypes with the measured abiotic parameters, it has been revealed that B. plicatilis s.s. and B. sp. Austria prefer lower temperatures than B. ibericus and B. dimidiatus. Additionally, the analysis of the genotypes of the B. plicatilis s.s. and B. sp. Austria rotifers from the lake Koronia revealed that "clonal selection" is evident in both cases. The abundance of some of the clones in particular samplings could lead to the hypothesis of ecologically adapted clones. However, this requires further investigation