title: Bioprocess strategies for efficient microbial conversion of acetate as alternative biotechnological carbon source derived from lignocellulose streams
Creators: name: Kiefer, Dirk
Publisher: name: Universität Hohenheim
Year: 2024
Subjects: subject: 570

description: In near future, humanity will be faced with the global challenges from climate change, fossil fuel depletion to food shortage. Our current economic system will thus need to make a transition into a sustainable bioeconomy which uses key technologies like biotechnology for conversion of renewable feedstocks. The majority of all biotechnological carbon sources is generated from food plants. In context to the global population growth coming along with food insecurity, competing use of these food plants for human and animal nutrition creates a substrate dilemma for future biotechnology. Future biorefineries will thus need to realize a paradigm shift to carbon sources generated from non-competing or waste resources. As such, especially lignocellulosic biomass is regarded as the central feedstock for a bio-based industry. Among the different substrate streams obtained by lignocellulose refining strategies, the C2 carboxylic acid acetic acid (from now on referred to as acetate) is one of the most common occurring components. In contrast to its high economic role as building block in the chemical industry, acetate shows low relevance as biotechnological carbon source yet. This is mainly related to its inhibitory characteristic, the reason for why acetate has been used in food preservation for thousands of years. However, most industrial platform organisms are also capable to grow on acetate as sole carbon source. It also shows several attractive characteristics for bioprocessing which is why research studies on microbial acetate conversion have significantly increased in the past years. Together with the potential routes to generate non-fossil bio-acetate in large quantities from non-food competing resources like lignocellulose and biomass-derived/waste C1 gas streams, acetate might become a next-generation platform substrate for a future bio-industry. In order to make acetate-based bioprocesses competitive to those using conventional sugar-based carbon sources, adapted process strategies for efficient acetate conversion need to be established. The present thesis is aimed to address efficient bioprocess strategies for biotechnological conversion of lignocellulosic acetate into microbial biomass and growth-coupled products under fed-batch culture conditions. The experimental studies presented in this work were divided into two parts: In Part I, the potential of acetate as carbon source for high cell density cultivation of industrial platform bacterium Corynebacterium glutamicum was evaluated. Preliminary growth studies with different initial acetate concentrations revealed a high natural acetate tolerance for wild-type ATCC 13032 with growth at high acetate levels up to 60 g/L. In addition, it was shown that maximum growth rates (μmax) of 0.47 h-1 for acetate concentrations below 10 g/L are competitive to that on D-glucose as common carbon source. By implementation of an online feeding control which enables automated supply of pure acetic acid (HAc) via pH control, high cell density cultivation on lignocellulosic acetate was demonstrated for the first time in a 42 L stirred-tank bioreactor. Optimization of the molar carbon-to-nitrogen feeding ratio resulted in a highly efficient bioprocess yielding cell densities up to 80.2 g/L CDW after 28.9 h with biomass yields (YXIS) of 0.35 g/g and space-time yields (STY) of 66.6 g/L·d. Part II focused on the potential of acetate as carbon source for integrated protein production in C. glutamicum. Batch cultures of genome-reduced strains MB001/MB001(DE3) demonstrated that acetate clearly shows no inhibitory effect on protein production of eYFP as model protein using C. glutamicum as production host. Interestingly, comparative expression studies with C. glutamicum T7 expression system indicated an up to 83 % higher biomass-specific production on acetate compared to D-glucose as carbon source. By transferring the implemented pH-coupled online feeding control for high cell density cultivation of strain MB001(DE3) pMKEX2-eyfp in a 42 L stirred-tank bioreactor, this study showed efficient protein accumulation on lignocellulosic acetate yielding final protein titers of 2.7 g/L after 27 h with product yields (YPIX) of 40 mg/g and volumetric productivities (PV) of 0.10 g/L·h. In conclusion, the presented results demonstrate the high biotechnological potential of acetate as alternative carbon source. In contrast to most other studies before, it is shown that a suitable process strategy based on pH-coupled online feeding control allows efficient microbial acetate conversion under industry-relevant fed-batch culture conditions. This work provides exemplary proof-of-concept bioprocesses for high cell density cultivation on lignocellulosic acetate and its growth-coupled conversion into protein using industrial platform organism C. glutamicum. Therefore, the presented thesis contributes to the development of efficient concepts for microbial conversion of next-generation platform substrates like lignocellulosic acetate.
description: In naher Zukunft wird die Menschheit noch stärker mit den globalen Herausforderungen wie Klimaerwärmung, Erschöpfung fossiler Brennstoffe bis hin zur Nahrungsmittelknappheit konfrontiert. Unser derzeitiges Wirtschaftssystem wird daher einen Übergang zu einer nachhaltigen Bioökonomie mit Technologien wie der Biotechnologie zur Umwandlung nachwachsender Rohstoffe erfordern. Bislang wird der Großteil aller biotechnologischen C-Quellen aus Nahrungspflanzen gewonnen. In Anbetracht des weltweiten Bevölkerungswachstums und der damit einhergehenden Ernährungsunsicherheit stellt diese konkurrierende Nutzung ein Substratdilemma für die zukünftige Biotechnologie dar. Aus diesem Grund müssen zukünftige Bioraffinerien daher einen Paradigmenwechsel zu neuartigen C-Quellen aus nicht-konkurrierenden oder Abfallressourcen vollziehen. Insbesondere Lignozellulosehaltige Biomasse stellt hierbei einen zentralen Rohstoff für die zukünftige Bioindustrie dar. Unter den verschiedenen Lignozellulose-Substratströmen zählt die C2-Carbonsäure Essigsäure (im Folgenden als Acetat bezeichnet) zu der am häufigsten vorkommende Komponente. Im Gegensatz zu seiner hohen wirtschaftlichen Bedeutung in der Chemieindustrie besitzt Acetat bis dato nur eine geringe biotechnologische Bedeutung. Dies hängt vor allem mit seiner inhibitorischen Charakteristik zusammen, weshalb Acetat seit Jahrtausenden in der Lebensmittelkonservierung eingesetzt wird. Die meisten industriellen Plattformorganismen sind jedoch in der Lage, auch auf Acetat als C-Quelle zu wachsen. Des Weiteren weist es vielversprechende Eigenschaften für die Bioprozessierung auf, weshalb Forschungsarbeiten zur mikrobiellen Acetatumwandlung erheblich zugenommen haben. Zusammen mit der möglichen Erzeugung von nicht-fossilem Acetat aus Lignozellulose und C1-Abgasströmen, könnte Acetat zu einem Plattformsubstrat einer bio-basierten Industrie werden. Um Acetat-basierte Bioprozesse jedoch wettbewerbsfähig zu gestalten, müssen angepasste Prozessstrategien zur effizienten Acetat-Umwandlung etabliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, effiziente Bioprozessstrategien für die mikrobielle Umwandlung von Lignocellulose-Acetat in Biomasse sowie wachstumsgekoppelte Produkte unter Fed-Batch-Kulturbedingungen zu adressieren. Die in dieser Arbeit vorgestellten experimentellen Teile waren zwei-gegliedert: In Teil I wurde das Potenzial von Acetat als C-Quelle zur Hochzelldichtekultivierung des industriellen Plattformbakteriums Corynebacterium glutamicum untersucht. Initiale Wachstumsstudien mit verschiedenen Acetatkonzentrationen zeigten eine hohe natürliche Acetattoleranz für den Wildtyp ATCC 13032 mit Wachstum bei hohen Acetatkonzentrationen von bis zu 60 g/L. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die maximale Wachstumsrate (μmax) von 0,47 h-1 für Acetatkonzentrationen unter 10 g/L mit deren von D-Glucose als übliche C-Quelle konkurrenzfähig ist Durch Implementierung einer Online-Zufütterungssteuerung für die automatisierte Zufuhr von reiner Essigsäure (HAc) über die pH-Kontrolle wurden in einem 42 L Rührkessel-Bioreaktor erstmals Hochzelldichten auf Basis von Lignocellulose-Acetat demonstriert. Die Optimierung des molaren C/N Verhältnisses führte zu einem hocheffizienten Prozess, welcher Zelldichten von 80,2 g/L BTM nach 28,9 h mit Biomasseausbeuten (YXIS) von 0,35 g/g und Raum-Zeit-Ausbeuten von 66,6 g/L·d erbringen konnte. Teil II untersuchte das Potenzial von Acetat als C-Quelle für die integrierte Proteinproduktion in C. glutamicum. Batch-Kulturen der genomreduzierten Stämme MB001/MB001(DE3) zeigten dabei eindeutig, dass Acetat keine hemmende Wirkung auf die Produktion des Modellproteins eYFP in C. glutamicum als Produktionswirt hat. Vergleichende Expressionsstudien im T7 Expressionssystem zeigten eine bis zu 83 % höhere biomassespezifische Produktion für Acetat im Vergleich zu D-Glucose als C-Quelle. Durch Transfer der implementierten Online-Zufütterungssteuerung für die Hochzelldichtekultivierung von Stamm MB001(DE3) pMKEX2-eyfp in einem 42 L Rührkessel-Bioreaktor konnte eine effiziente Proteinakkumulation auf Lignocellulose-Acetat demonstriert werden, welche Proteintiter von 2,7 g/L nach 27 h mit Produktausbeuten (YPIX) von 40 mg/g und Produktivitäten (PV) von 0,10 g/L·h aufwies. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren das biotechnologische Potenzial von Acetat als alternative C-Quelle. Mithilfe einer geeigneten Prozessstrategie konnte eine effiziente Acetatumsetzung unter industrierelevanten Fed-Batchbedingungen ermöglicht werden, dabei konnten beispielhafte Bioprozesse für die Hochzelldichtekultivierung des Plattformorganismus C. glutamicum auf Acetat sowie dessen wachstumsgekoppelte Umsetzung in Protein gezeigt werden. Die vorliegende Arbeit leistet damit einen Beitrag zur Entwicklung effizienter Konzepte zur mikrobiellen Umsetzung von zukünftigen Plattformsubstraten wie Lignozellulose-Acetat.