title: Chemoenzymatic Synthesis of Chromodepsipeptides and Natural Product Discovery via Genome Mining
Creators: name: Robbel, Lars
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2010
Subjects: Thioesterase II
hydroxylation
NRPS
Modifikation
Zyklodimerisierung
cyclodimerization
Acetylierung
Genanalyse
Sekundärmetabolit
genome mining
Hydroxylierung
Chemistry and allied sciences
Chemie
Genomische Mining
acetylation

description: Recent advances in the development of sequencing technologies have enabled the identification of a multitude of bacterial gene clusters, putatively involved in the biosynthesis of nonribosomal peptides (NRPs). Peptides of nonribosomal origin constitute a class of structurally and functionally diverse natural products, which are assembled by multimodular nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). These compounds exhibit a broad pharmacological spectrum, ranging from antibacterial- to immunosuppressive properties. Understanding the assembly mechanisms in combination with rational genome mining approaches will provide opportunities for the discovery of new bioactive natural products. Within this study one approach was utilized to generate thiocoraline analogs via chemoenzymatic synthesis and the second strategy focused on the de novo natural product discovery via genome mining. Thiocoraline represents a pseudosymmetrical chromophore-capped octathiodepsipeptide, in which the symmetrical halves are linked via thioester bonds. In this study, the cyclodimerization potential of the thioesterase domain of the thiocoraline biosynthetic machinery (TioS PCP-TE) was investigated to obtain further insights into the iterative assembly of chromodepsipeptides. To address this objective, the recombinant enzyme was incubated with synthetically derived tetrapeptidyl substrates, resembling thiocoraline precursors. It was shown that the enzyme catalyzes the cyclodimerization of linear precursor molecules and an unprecedented macrothiolactonization. Evaluation of the biocombinatorial potential established the thioesterase as a robust and versatile catalyst for the generation of chromodepsipeptide analogs, harbouring thioester- or ester-linkages. As thiocoraline attains its antitumor activity from DNA-bisintercalation, the chemoenzymatically generated macrocycles were isolated and investigated towards DNA-bisintercalation activity in vitro. In the second part of this study, bioinformatic analysis of the 8.2 Mb Saccharopolyspora erythraea genome revealed two cryptic NRPS gene clusters related to hydroxamate-type siderophore biosynthesis. Detailed analysis of adenylation domain substrate-specificity and module organization enabled the establishment of a highly selective and sensitive radio-LCMS-guided genome mining approach. Application of this approach resulted in the discovery of the siderophore erythrochelin. Structure elucidation of erythrochelin was accomplished via NMR- and MSn-analysis and revealed the sequence of the tetrapeptide siderophore to be: α-N-acetyl-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-D-ornithine-D-serine-cyclo(δ-N-hydroxy-L-ornithine-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-L-ornithine). Erythrochelin assembly requires the proliferation of δ-N-hydroxy-L-ornithine (L-hOrn) and δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-L-ornithine (L-haOrn). The corresponding modifying enzymes, the FAD-dependent monooxygenases EtcB and Sace_1309 together with the bifunctional malonyl-CoA decarboxylase/N-acetyltransferase were identified and biochemically characterized. In vitro studies revealed EtcB and Sace_1309 to exclusively catalyze the δ-N-hydroxylation of free L-ornithine. The second tailoring enzyme, Mcd, was shown to catalyze malonyl-CoA decarboxylation and subsequent acetyltransfer onto the δ-hydroxamino group of L-hOrn, affording L-haOrn. Based on the elucidation of precursor biosynthesis (L-haOrn), a model for the entire erythrochelin assembly is presented.
description: Die Entwicklung neuartiger Sequenzierungstechnologien ermöglicht die Identifizierung einer Vielzahl von kryptischen bakteriellen Genclustern, welche an der Biosynthese nichtribosomaler Peptide (NRPs) beteiligt sind. Peptide nichtribosomalen Ursprungs konstituieren eine Klasse strukturell diverser Naturstoffe, welche durch multimodulare Peptidsynthetasen (NRPSs) assembliert werden. Nichtribosomale Peptide weisen ein breites pharmakologisches Spektrum als Antitumor-Wirkstoffe, Antibiotika oder Immunosuppressiva auf. Das eingehende Verständnis der nichtribosomalen Assemblierungsmechanismen, in Kombination mit rationalem genomischen Mining ermöglicht die Identifizierung neuartiger, bioaktiver Verbindungen. Die vorliegende Arbeit umfasst neben der chemoenzymatischen Synthese von Thiocoralin-Analoga die de novo Identifizierung neuer Naturstoffe durch genomisches Mining. Thiocoralin stellt ein makrozyklisches Oktathiodepsipeptid dar, in welchem die mit exozyklischen Chromophoren funktionalisierten Oligopeptide über zwei Thioesterbindungen verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das Zyklodimerisierungspotential der Thiocoralin Thioesterase-Domäne (TioS PCP-TE) untersucht, um ein genaueres Verständnis der iterativen Assemblierung der Chinolin- und Chinoxalinchromodepsipeptide zu erhalten. Hierzu wurde das Enzym rekombinant produziert und mit synthetischen, linearen Peptidylsubstratanaloga inkubiert. TioS PCP-TE katalysierte die Zyklodimerisierung der linearen Tetrapeptidylsubstrate unter Ausbildung verschiedener Makrothiolaktone. Die Evaluierung des biokombinatorischen Potentials ergab eine relaxierte Substratspezifität des Enzyms und ermöglichte die Generierung von Chromodepsipeptid-Analoga. Die chemoenzymatisch generierten makrozyklischen Laktone oder Thiolaktone wurden isoliert und auf ihre DNA-Bisinterkalationsaktivität hin untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit resultierte die bioinformatische Analyse des 8.2 Mb umfassenden Genoms von Saccharopolyspora erythraea in der Identifizierung von zwei kryptischen Hydroxamat-Siderophor NRPS Genclustern. Die Analyse der Adenylierungs-Domänen Substratspezifität und der modularen Organisation ermöglichte die Etablierung eines hochselektiven und hochsensitiven Radio-LCMS-geleiteten genomischen Mining Ansatzes. Die Anwendung dieses Ansatzes resultierte in der Entdeckung des Siderophors Erythrochelin. Die strukturelle Charakterisierung von Erythrochelin wurde mittels NMR-spektroskopischen sowie massenspektrometrischen Studien realisiert und ergab für die Sequenz des Tetrapeptid-Siderophors: α-N-Acetyl-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-D-Ornithin-D-Serin-zyklo(δ-N-Hydroxy-L-Ornithin-δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin). Die Assemblierung von Erythrochelin erfordert die Synthese von δ-N-Hydroxy-L-Ornithin (L-hOrn) und δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin (L-haOrn). Zur Untersuchung der korrespondierenden Biosynthesen wurden die FAD-abhängigen Monooxygenasen EtcB und Sace_1309, sowie die bifunktionelle Malonyl-CoA Decarboxylase/N-Acetyltransferase Mcd, identifiziert und biochemisch charakterisiert. Mittels in vitro-Studien wurde gezeigt, dass EtcB und Sace_1309 ausschließlich die δ-N-Hydroxylierung von freiem L-Ornithin katalysieren. Mcd katalysierte die Decarboxylierung von Malonyl-CoA und einen anschließenden Acetyltransfer auf die δ-Hydroxamino Funktionalität von L-hOrn unter Bildung von L-haOrn. Die Aufklärung der Biosynthese des Vorläufermoleküls L-haOrn resultierte in der Postulierung eines umfassenden Modells für die Assemblierung von Erythrochelin.