Ανάπτυξη και έλεγχος πρωτεϊνικού βιοαισθητήρα σε γενετικά τροποποιημένη κυτταρική σειρά για τη μέτρηση επιπέδων γλυκόζης
Creators: name: Σίσκα, Ευαγγελία Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Γλυκόζη
Βιοαισθητήρας
Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα
Γενετική τροποποίηση
Glucose
Biosensor
Mesenchymal stem cells
Genetic manipulation

description: Ο διαβήτης είναι μία χρόνια νόσος που χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Οι διαβητικοί ασθενείς θα πρέπει να ομαλοποιήσουν αυτά τα επίπεδα για να αποφύγουν τις βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες κλινικές επιπλοκές. Επί του παρόντος, η παρακολούθηση της γλυκόζης στο αίμα εξαρτάται από το συνεχές τρύπημα των δακτύλων των ασθενών και συστήματα που βασίζονται σε ένζυμα τα οποία αναλύουν το έλκον αίμα. Οι αναλυτές συνεχούς μέτρησης της γλυκόζης αίματος βρίσκονται ήδη στην αγορά, αλλά παρουσιάζουν τεχνικά προβλήματα, ανακρίβειες και σύντομο χρόνο ζωής ως προς τη λειτουργία τους. Μια νέα προσέγγιση για τη συνεχή παρακολούθηση της γλυκόζης είναι η ανάπτυξη εμφυτεύσιμων κυτταρικών βιοαισθητήρων που εκπέμπουν φωτεινά σήματα που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Τέτοιες συσκευές χρησιμοποιούν γενετικώς τροποποιημένα κύτταρα που εκφράζουν χιμαιρικά γονίδια με ιδιότητες σύνδεσης της γλυκόζης. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) είναι καλοί υποψήφιοι ως κύτταρα-φορείς, καθώς μπορούν να τροποποιηθούν γενετικά και να επεκταθούν σε μεγάλους αριθμούς. Διαθέτουν επίσης ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες οι οποίες, μειώνοντας την τοπική φλεγμονή, μπορούν να επεκτείνουν το χρόνο ζωής της λειτουργίας των συσκευών παρακολούθησης της γλυκόζης. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δημιουργήσαμε μια νέα αθανατοποιημένη ανθρώπινη κυτταρική σειρά μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων που εκφράζει ταυτόχρονα το γονίδιο της τελομεράσης (hTERT) και ένα βιοαισθητήρα έκκρισης της γλυκόζης (GB), χρησιμοποιώντας την τεχνολογία μεταφοράς του τρανσποζονίου Sleeping Beauty (SB). Τα γενετικά τροποποιημένα MSC διατήρησαν τα μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά τους. Η σταθερή έκφραση των διαγονιδίων επιβεβαιώθηκε βιοχημικά. Η αυξημένη έφραση της hTERT οδήγησε στην αθανατοποίηση των MSC τα οποία δαιτήρησαν σταθερούς τους δείκτες της πολυδυναμικότητάς τους. Επιπλέον, αυτά τα κύτταρα κατάφεραν να καταστείλουν αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος (PBMC) σε αναλύσεις μεικτών λεμφοκυτταρικών καλλιεργειών (MLR assays), υποδεικνύοντας ότι διαθέτουν ανοσορρυθμιστικές ιδιότητες. Τέλος, η πρωτεΐνη του βιοαισθητήρα που παράγεται από τα MSCs χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της γλυκόζης σε δοκιμασίες χωρίς κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα αθανατοποιημένα MSC μας είναι κατάλληλα για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων γλυκόζης σε ένα φυσιολογικό εύρος. Επομένως, είναι κατάλληλα για την ενσωμάτωσή τους σε μια κυτταρική ανοσοπροληπτική ιατρική συσκευή παρακολούθησης της γλυκόζης ή μπορούν να αποτελέσουν ένα εναλλακτικό σύστημα μέτρησης της γλυκόζης στο εργαστήριο.
description: Diabetes is a chronic disease characterized by high levels of blood glucose. Diabetic patients should normalize these levels in order to avoid short and long term clinical complications. Presently, blood glucose monitoring is dependent on frequent finger pricking and enzyme based systems that analyze the drawn blood. Continuous blood glucose monitors are already on market but suffer from technical problems, inaccuracy and short operation time. A novel approach for continuous glucose monitoring is the development of implantable cell-based GBs that emit light signals corresponding to glucose concentrations. Such devices use genetically modified cells expressing chimeric genes with glucose binding properties. MSCs are good candidates as carrier cells, as they can be genetically engineered and expanded into large numbers. They also possess immunomodulatory properties that, by reducing local inflammation, may assist long operation time. Here, we generated a novel immortalized human MSC line co-expressing hTERT and a secreted glucose GB transgene using the Sleeping Beauty transposon technology. Genetically modified hMSCs retained their mesenchymal characteristics. Stable transgene expression was validated biochemically. Increased activity of hTERT was accompanied by elevated and constant level of stem cell pluripotency markers and subsequently, by MSC immortalization. Furthermore, these cells efficiently suppressed PBMC proliferation in MLR transwell assays, indicating that they possess immunomodulatory properties. Finally, GB protein produced by MSCs was used to quantify glucose in cell-free assays. Our results indicate that our immortalized MSCs are suitable for measuring glucose concentrations in a physiological range. Thus, they are appropriate for incorporation into a cell-based, immune-privileged, glucose-monitoring medical device.