title: Charakterisierung der antiviralen Aktivität von Rocaglamid-Derivaten und Validierung der humanen RNA-Helikase eIF4A als Target
title: Characterization of the antiviral activity of rocaglates and validation of the human RNA helicase eIF4A as target
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Obermann, Wiebke
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Coronavirus
antivirales Breitbandmedikament
Rocaglamide
Ebolavirus
Rocaglates
Silvestrol
CR-31-B (-)
Coronaviren
host targeting
Hepatitis-E-Virus
RNA-Helikase
Ebola Virus
RNA helicase
eIF4A
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Broad-spectrum antiviral

description: The ongoing COVID-19 pandemic (coronavirus disease 2019) shows the urgency for the development of new antiviral drugs. In this context, an antiviral compound with broad-spectrum activity could help to combat newly emerging viral infections. For such an approach an appropriate target, as well as specific drugs that efficiently inhibit the target and thereby viral replication are required. Since RNA viruses are able to adapt to new environmental conditions within a very short time through mutations in their genome, they might develop resistance to the drugs. A suitable target could therefore be a host factor, such as the eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A), which is used by a large number of viruses for their protein synthesis in infected host cells. In cancer research, eIF4A is already a well characterized target, but its validation as an antiviral target is still rather incomplete. A focus of this thesis was therefore the validation of the RNA helicase eIF4A as an antiviral target. During translation initiation, eIF4A unwinds secondary structures within the 5’-UTR of a mRNA to enable protein synthesis. Since many viral mRNAs have highly structured 5‘-UTRs, viral protein synthesis often depends on this helicase activity. Inhibition of eIF4A would consequently inhibit the synthesis of viral proteins and thus stop the viral replication in infected cells. Previous cell culture experiments have already shown that the natural eIF4A inhibitor Silvestrol has an antiviral activity at low nanomolar concentrations against several pathogenic RNA viruses. Therefore, it was another focus of this work to identify new specific eIF4A inhibitors and characterize their antiviral activity. For this purpose, the cytotoxicity of potential synthetic eIF4A inhibitors was determined in a human cancer cell line. Then a reporter assay (dual luciferase assay, DLA) was carried out to validate the eIF4A specificity of the compounds. In addition, the binding of the ligands to recombinantly purified human eIF4A was characterized using a thermal shift assay (TSA) established in this work. With this approach the synthetic rocaglate CR-31-B (-) could be identified as a potent eIF4A inhibitor with comparable antiviral activity to Silvestrol. In addition, the rocaglate HGW-3 showed an activity at medium nanomolar concentrations in the DLA. In order to predict a possible eIF4A dependency of viral protein synthesis based on the mRNA composition, various RNA structure and sequence elements were analyzed in the DLA. In addition to viral 5‘-UTRs, variations of viral hairpin structures or unstructured RNA motifs with specific sequence patterns were also investigated. Moreover, the natural rocaglate Silvestrol was compared to the synthetic rocaglate CR-31-B (-) in the DLA. It was found that for CR-31-B (-) a polypurine stretch within the investigated RNA substrate is required, while with Silvestrol also RNA substrates without polypurine sequences but with RNA hairpin structures can mediate eIF4A dependency. This suggests differences in the molecular interaction mechanism. To understand the mode of action of rocaglates in more detail, the interaction sites of eIF4A with the substrate RNA and the eIF4A inhibitors Silvestrol and CR-31-B (-) were investigated using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS). Here, the interaction site that was postulated for RocA with eIF4A and the polypurine RNA could be confirmed. Nevertheless, no differences were found between Silvestrol and CR-31-B (-). Using a microscale thermophoresis assay (MST), a dissociation constant for the binding of the two ligands to eIF4A could be determined. Finally, based on a published crystal structure of eIF4A (PDB: 5ZC9), docking experiments could be performed and the binding mode and the binding affinity of potential eIF4A inhibitors could be predicted. A possible binding pocket consisting of arginine residues could be identified through which an additional interaction with Silvestrol might be formed. This would explain differences in the mode of action between Silvestrol and CR-31-B (-). Furthermore, the virtual mutation of eIF4A enabled the prediction of presumably rocaglate-sensitive and -resistant eIF4A variants, which can be found in various human pathogenic organisms.
description: Die COVID-19-Pandemie (coronavirus disease 2019) zeigt momentan sehr eindringlich, wie wichtig die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente ist. Insbesondere ein Virostatikum mit Breitbandwirkung könnte dazu beitragen, auch neu auftretenden, bisher unbekannten Virusinfektionen entgegenzuwirken. Um einen solchen Ansatz zu verfolgen, bedarf es geeigneter Zielstrukturen, sogenannter Targets, sowie spezifischer Wirkstoffe, die das Target und somit die Virusvermehrung effizient hemmen. Da viele RNA-Viren in der Lage sind, sich durch Mutationen in ihrem Genom innerhalb kürzester Zeit an neue Umweltbedingungen anzupassen, muss bei der Adressierung virus-spezifischer Faktoren mit der Entwicklung von Resistenzen gerechnet werden. Ein geeignetes Zielmolekül könnte daher ein körpereigener Faktor, wie der eukaryontische Initiationsfaktor 4A (eIF4A) sein, der von vielen Viren für die Vermehrung in infizierten Wirtszellen genutzt wird. In der Krebsforschung stellt eIF4A bereits ein vielfach charakterisiertes und adressiertes Zielmolekül dar, hingegen ist die Validierung der Helikase als Target einer antiviralen Therapie noch unvollständig. Ein Fokus dieser Arbeit lag daher auf der Validierung der RNA-Helikase eIF4A als antivirales Zielmolekül. EIF4A entwindet Sekundärstrukturen innerhalb der 5‘-UTR einer mRNA, damit die Proteinbiosynthese initiiert werden kann. Da viele virale mRNAs über hochstrukturierte 5‘-UTRs verfügen, sind Viren bei ihrer Proteinsynthese häufig auf diese Helikase-Aktivität angewiesen. Eine Inhibition von eIF4A würde demnach die Synthese von Virusproteinen hemmen und infolgedessen die Vermehrung von Viren in infizierten Zellen stoppen. In vorherigen Zellkultur-Experimenten konnte bereits gezeigt werden, dass der natürlich vorkommende eIF4A-Inhibitor Silvestrol eine antivirale Aktivität im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich gegenüber verschiedenen pathogenen RNA-Viren aufweist. Es war daher ein weiterer Fokus dieser Arbeit, neben Silvestrol weitere spezifische eIF4A-Inhibitoren zu identifizieren und deren antivirale Aktivität zu charakterisieren. Hierfür wurde zunächst die Zytotoxizität der potentiellen synthetischen eIF4A-Inhibitoren in einer humanen Krebszelllinie bestimmt und mit einem Reporter-Assay (Dual-Luciferase-Assay, DLA) fortgefahren, um die eIF4A-Spezifität der Verbindungen zu validieren. Zusätzlich wurde die Bindung der Liganden an rekombinant aufgereinigtes humanes eIF4A mithilfe eines in dieser Arbeit etablierten Thermal-Shift-Assays (TSA) charakterisiert. Dabei konnte das synthetische Rocaglamid-Derivat CR-31-B (-) als hochwirksamer eIF4A-Inhibitor mit einer vergleichbaren antiviralen Aktivität wie Silvestrol identifiziert werden. Außerdem zeigte das Rocaglamid-Derivat HGW-3 im DLA eine Wirksamkeit im mittleren nanomolaren Bereich. Um zukünftig anhand der mRNA-Beschaffenheit Vorhersagen über eine mögliche eIF4A-Abhängigkeit der viralen Proteinsynthese machen zu können, wurden mithilfe des DLAs verschiedene RNA-Struktur- und -Sequenzelemente untersucht. Neben viralen 5‘-UTRs wurden auch Variationen viraler Haarnadel-Strukturen oder unstrukturierte RNA-Motive mit bestimmten Sequenzmustern untersucht. Zudem wurde der Naturstoff Silvestrol mit dem synthetischen CR-31-B (-) im DLA verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass für CR-31-B (-) hinsichtlich der eingesetzten RNA-Substrate eine Purin-Abhängigkeit zu bestehen scheint, während mit Silvestrol auch RNA-Substrate mit stabilen Haarnadel-strukturen ohne Polypurin-Sequenzen eine eIF4A-Abhängigkeit vermittelten. Dies lässt auf Unterschiede im molekularen Interaktionsmechanismus schließen. Zur Aufklärung des Wirkmechanismus von Rocaglamid-Derivaten wurde daher mithilfe der Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) die Interaktions-fläche von eIF4A mit der Substrat-RNA und Silvestrol bzw. CR-31-B (-) auf Proteinebene analysiert. Hier konnte die bereits für RocA postulierte Interaktionsfläche mit eIF4A und der Polypurin-RNA bestätigt, jedoch keine Unterschiede zwischen Silvestrol und CR-31-B (-) festgestellt werden. Mit einem Microscale-Thermophoresis-Assay (MST) konnte eine Dissoziationskonstante für die Bindungen beider Liganden bestimmt werden. Zuletzt konnten, ausgehend von einer publizierten Kristallstruktur von eIF4A (PDB: 5ZC9), Docking-Experimente durchgeführt und so Vorhersagen über den Bindungsmodus und die Bindungsaffinität potentieller Inhibitoren an eIF4A gemacht werden. Dabei konnte eine mögliche Bindetasche bestehend aus Arginin-Resten identifiziert werden, über die eine zusätzliche Interaktion mit Silvestrol ausgebildet werden könnte. Diese könnte Unterschiede in der Wirkweise zwischen Silvestrol und CR-31-B (-) erklären. Weiterhin ermöglichte die virtuelle Mutation von eIF4A die Vorhersage von vermutlich Rocaglamid-sensitiven und -resistenten eIF4A-Varianten, die in verschiedenen human-pathogenen Organismen zu finden sind.