title: Pro-inflammatorische, Interleukin-17 produzierende CD8+ T-Lymphozyten in Multipler Sklerose und duktalem Adenokarzinom des Pankreas
title: Pro-inflammatory, Interleukin-17 producing CD8 T-Lymphocytes in Multiple Sclerosis and Pancreatic Cancer
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Picard, Felix Simon Ruben
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: CD8 Antigen, Interleukin-17
T-Lymphocyte
Interleukin-17
Multiple Sklerose
Bauchspeicheldrüsenkrebs
Antigen CD8
Adenokarcinoma, Pancreas
Lymphozyt
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Multiple Sclerosis

description: Tc17 cells represent a non-cytotoxic, interleukin-17 producing subtype of CD8+ cells. They are characterized by RORyt expression and IL-17 production and are shown to be immunoprotective against fungal infections in various clinical conditions, relevant to skin milieu homeostasis and lesion repair. On the other hand, Tc17 cells have also been described as pro-inflammatory in colorectal cancer, psoriasis, and asthma. Publications exist on IL-17 signalling pathways as amplifiers or inducers of (auto)immune responses in multiple sclerosis (MS) and pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). The role of Tc17 cells is further explored in this dissertation in the context of both MS and PDAC. Dimethyl fumarate (DMF) is a drug used in MS therapy. Due to the only partially elucidated mechanism of action and previously published observations on DMF as a reactive oxygen species (ROS)inducing immunomodulator, the mode of action of DMF in CD8+ T cells was analyzed for this dissertation in the context of preclinical EAE and T cell phenotyping of a human DMF treatment cohort. RNA sequencing of murine in vitro differentiated CD8+ T lymphocytes and human CD45RA- CD8+ T lymphocytes from MS patients demonstrated the influence of DMF treatment on the positive regulation of genes of the ROS pathway. The gene signatures of DMF-treated CD8+ IL-17+ T lymphocytes correlate with the signature of canonical CTLs and non-Tc17 cells, suggesting the induction of a CTL-like phenotype by DMF. Using multiple inhibitors and a murine knockout model, the influence of DMF on the PI3K-AKT-mTOR and the PI3K-AKT-T-bet signalling cascades in CD8+ T lymphocytes was shown to negatively affect IL-17 production in both cases. The influence of DMF on the IL-2-STAT5 signalling cascade and the resulting repression of IL-17 production was also demonstrated. Also, the IL-2 signalling pathway exerts an influence on histone deacetylases (HDACs). Chromatin immunoprecipitation demonstrated that DMF reduces transcription-enhancing acetylations of Il17a promoter and Il17a enhancer-5 regions. These clinical data, collected in vivo and in vitro, suggest that DMF acts as a repressor of the IL-17-mediated central nervous system inflammatory response. The metabolic and epigenetic modifications and changes in intracellular signalling pathways in Tc17 cells induced by DMF therapy led to a phenotype change toward CTLs. This leads to a loss of IL-17 mediated "immune crosstalk" between Th17 and Tc17 cells in MS lesions. The results were published in "IL-17+ CD8+ T cell suppression by dimethyl fumarate associates with clinical response in multiple sclerosis" in Nature Communications. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is histologically a solid tumor with a desmoplastic microenvironment (TME), with up to 80% stromal content. These are primarily tumor-associated fibroblasts (CAFs). CAFs can be classified into different subtypes in PDAC-TME, induced by two mutually exclusive signalling pathways: 1. myofibroblastic tumor-associated fibroblasts (myCAF), induced by TGF-b, involved in encapsulation and tumor restriction. 2. inflammatory tumor-associated fibroblasts (iCAF), induced by IL-1 and the Jak/STAT signalling pathway, involved in secretion of pro-inflammatory tumor-promoting cytokines. In addition, both CD4+ and CD8+ tumor-infiltrating T lymphocytes (TILs) are found in PDAC-TME. IL-17-mediated PanIN development in the context of KRAS-mutated epithelial cells has been shown previously. In this dissertation, the role of Tc17 T lymphocytes as IL-17 producing TILs in the PDAC context is investigated. For this purpose, analyses of fresh tissue from primary PDAC patient samples, histological and clinical analyses of a patient cohort, in vitro and murine in vivo models were used. Histological analysis from tumor resections of 112 PDAC patients revealed CD8+ IL-17+ tumor-infiltrating T lymphocytes (TIL) in the PDAC TME. There was a significant negative correlation between the total Tc17 count as well as the Tc17 proportion within the CD8+ TILs and the probability of patient survival. In the murine congenic allograft model, there was a positive effect of exogenously supplied Tc17 cells on tumor growth and frequency of endogenous IL-17+ CD8+ T lymphocytes. However, in murine and human in vitro 3D culture, no effect of IL-17 on tumor cell growth could be detected. In vitro experiments with Tc17 supernatants and pancreatic stellate cells (qPSCs, CAF precursors) showed the iCAF phenotype-inducing influence of IL-17A and IL-17F on qPSCs, detected by FACS and qPCR. In murine immune-deficient subcutaneous tumor cells, the significant tumor growth-promoting effect of Tc17-driven iCAFs over myCAFs and qPSCs was demonstrated. Similarly, the iCAF phenotype could be induced in vivo in the subcutaneous tumor model in wild-type mice by Tc17 co-injection, accompanied by significantly higher tumor burden compared with co-injections with Tc17 cells generated from Il17A/F double-knockout mice, indicative of the iCAF phenotype-inducing, indirect tumor-promoting influence of Tc17 cells. RNA sequencing of tumor cells from co-culture with Tc17-iCAFs, TGF-b-myCAFs, and qPSCs identified 1400 differentially expressed genes. Gene ontology analysis by GSEA revealed the positive influence on proliferation, extracellular matrix organization, cell adhesion, energy metabolism, cholesterol biosynthesis, and negative regulation of extrinsic apoptosis signals in tumor cells by Tc17-induced iCAFs. The identified mRNA signatures also correlated positively with mRNA signatures of human pancreatic tumors, indicative of a possible influence of Tc17-induced iCAFs in human PDAC. The results are scheduled for publication "IL-17-producing CD8 + T cells promote PDAC via induction of inflammatory cancer-associated fibroblasts" in GUT.
description: Tc17-Zellen stellen einen nicht-zytotoxischen, Interleukin-17 produzierenden Subtyp der CD8+ Zellen dar. Sie sind durch RORyt-Expression und IL-17-Produktion gekennzeichnet und zeigen sich unter verschiedenen klinischen Bedingungen als immunoprotektiv gegenüber Pilzinfektionen, sind relevant für die Homöostase des Hautmilieus und für die Reparatur von Läsionen. Andererseits aber sind Tc17 Zellen auch als pro-inflammatorisch in Darmkrebs, Psoriasis und Asthma beschrieben. Es existieren Veröffentlichungen über IL-17-Signalwege als Verstärker oder Verursacher (Auto)immuner Reaktionen im Krankheitsbild der Multiplen Sklerose (MS) und im duktalem Adenokarzinom des Pankreas (PDAC). Die Rolle der Tc17 Zellen wird hier im Kontext beider Krankheiten, der MS und des PDACs, näher erforscht. Dimethylfumarat (DMF) ist ein in der MS-Therapie eingesetztes Medikament. Aufgrund des nur partiell aufgeklärten Wirkmechanismus‘ und bereits publizierter Beobachtungen zu DMF als Reaktive Sauerstoffspezies (ROS)-modulierender Immunmodulator wurde für diese Dissertation der Wirkmechanismus von DMF in CD8+ T-Zellen im Kontext von präklinischem EAE und der T-Zell-Phänotypisierung einer humanen DMF-Behandlungskohorte analysiert. Es konnte durch RNA-Sequenzierung von murinen in vitro differenzierten CD8+ T-Lymphozyten und humanen CD45RA- CD8+ T-Lymphozyten aus MS Patienten der Einfluss der DMF-Behandlung auf die positive Regulation von Genen des ROS-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Gensignaturen von DMF-Behandelten CD8+ IL-17+ T-Lymphozyten korrelieren mit der Signatur kanonischer CTLs und nicht Tc17-zellen, was die Induktion eines CTL-like-Phänotpys durch DMF nahelegt. Mittels Einsatzes mehrerer Inhibitoren und eines murinen Knockout Modells konnte der Einfluss von DMF auf die PI3K-AKT-mTOR- und die PI3K-AKT-T-bet-Signalkaskaden in CD8+ T-Lymphozyten gezeigt werden, welches in beiden Fällen die IL-17 Produktion negativ beeinflusst. Der Einfluss von DMF auf die IL-2-STAT5-Signalkaskade und die daraus resultierende Repression der IL-17 Produktion konnte ebenso belegt werden. Auch nimmt der IL-2-Signalweg Einfluss auf Histondeacetylasen (HDACs). Durch Chromatin-Immunopräzipitation konnte nachgewiesen werden, dass DMF transkriptionsverstärkende Acetylierungen der Il17a Promotor und Il17a Enhancer-5-Regionen reduziert. Diese klinischen, in vivo und in vitro gesammelten Daten legen nahe, dass DMF als ein Repressor der IL-17-vermittelten Entzündungsreaktion des Zentralnervensystems agiert. Die von der DMF-Therapie erwirkten metabolischen und epigenetischen Modifikationen und Veränderungen intrazellulärer Signalwege in Tc17-Zellen führen zu einer Phänotyp Veränderung hin zu CTLs. Dies führt zu einem Verlust des durch IL-17 vermittelten „Immune Crosstalks“ zwischen Th17 und Tc17 Zellen in MS-Läsionen. Die Ergebnisse wurden in “IL-17+ CD8+ T cell suppression by dimethyl fumarate associates with clinical response in multiple sclerosis” in Nature Communications veröffentlicht. Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist histologisch betrachtet ein solider Tumor mit desmoplastischer Mikroumgebung (TME), mit bis zu 80% Stromaanteil. Dies sind vornehmlich tumor-assoziierte Fibroblasten (CAFs). CAFs lassen sich im PDAC-TME in verschiedene Subtypen klassifizieren, induziert durch zwei sich gegenseitig ausschließende Signalwege: 1. Myofibroblastische Tumor-assoziierte Fibroblasten (myCAF), durch TGF-b induziert, involviert in Verkapselung und Tumor-restriktion. 2. Inflammatorische, Tumor-assoziierte Fibroblasten (iCAF), induziert durch IL-1b und den Jak/STAT Signalweg, involviert in Sekretion von pro-Inflammatorischen, Tumor-fördernden Zytokinen. Zudem werden sowohl CD4+ als auch CD8+ tumorinfiltrierende T-Lymphozyten (TILs) im PDAC-TME gefunden. Die IL-17-vermittelte PanIN-Entstehung im Kontext von KRAS-mutierten Epithelzellen wurde bereits gezeigt. Im Rahmen dieser Dissertation wird die Rolle von Tc17 T-Lymphozyten als IL-17 produzierende TILs im PDAC Kontext untersucht. Hierzu wurden Analysen von Frischgewebe aus primären PDAC Patientenproben, histologische und klinische Analysen einer Patientenkohorte, in vitro und murine in vivo Modelle verwendet. Die histologische Analyse aus Tumor-Resektionen von 112 PDAC-Patienten zeigte CD8+ IL-17+ tumorinfiltrierende T-Lymphozyten (TIL) im PDAC TME. Es zeigte sich eine signifikant negative Korrelation zwischen der Tc17-Gesamtzahl sowie dem Tc17-Anteil innerhalb der CD8+ TILs und der Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten. Im murinen, kongenen Allograft-Modell zeigte sich ein positiver Einfluss exogen zugeführter Tc17-Zellen auf Tumorwachstum und Frequenz endogener IL-17+ CD8+ T-Lymphozyten. In muriner und humaner in vitro 3D-Kultur konnte aber kein Einfluss von IL-17 auf das Tumorzellwachstum nachgewiesen werden. In vitro Versuche mit Tc17-Überständen und Pankreassternzellen (qPSC, CAF-Vorläufer) zeigten den iCAF-Phänotyp induzierenden Einfluss von IL-17A und IL-17F auf qPSCs, nachgewiesen durch FACS und qPCR. In murinen, immun defizienten, subkutanen Tumordellen zeigte sich der signifikante, Tumorwachstum fördernde Effekt von Tc17-getriebenen iCAFs gegenüber myCAFs und qPSCs. Ebenso konnte der iCAF Phänotyp in vivo im subkutanen Tumormodell in Wildtyp-Mäusen durch Tc17-Ko-Injektion induziert werden, einhergehend mit signifikant höherer Tumorlast gegenüber Ko-Injektionen mit Tc17-Zellen generiert aus Il17A/F-/- Knockout-Mäusen, indikativ für den iCAF-Phänotyp induzierenden, indirekt tumorfördernden Einfluss von Tc17-Zellen. Die RNA-Sequenzierung von Tumorzellen aus Ko-Kultur mit Tc17-iCAFs, TGF-b-myCAFs und qPSCs identifizierte 1400 differentiell exprimierte Gene. Die Gene Ontology-Analyse mittels GSEA zeigte den positiven Einfluss auf Proliferation, Extrazelluläre Matrix Organisation, Zelladhäsion, Energiestoffwechsel, Cholesterol-Biosynthese und negative Regulation extrinsischer Apoptose Signale in Tumorzellen durch Tc17-induzierte iCAFs. Die identifizierten mRNA-Signaturen korrelierten zudem positiv mit mRNA-Signaturen humaner Pankreastumore, indikativ für einen möglichen Einfluss von durch Tc17 induzierte iCAFs im humanen PDAC. Die Ergebnisse sind zur Veröffentlichung “IL-17-producing CD8 + T cells promote PDAC via induction of inflammatory cancer-associated fibroblasts” in GUT vorgesehen.