Evaluation of the putative healthy effects of food phytochemicals: effect on blood antioxidant status, human cells and enzyme activities
Creators: name: ALFARANO, MICHELA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Foggia
Year: 2018

description: Negli ultimi decenni, gli antiossidanti alimentari hanno ricevuto crescente attenzione, soprattutto in ambito biologico, medico e nutrizionale, in relazione alla loro capacit� di contrastare lo stress ossidativo implicato nella patogenesi di diverse patologie cronico-degenerative. Numerosi sono i metodi attualmente disponibili in letteratura per valutare la capacit� antiossidante (CA) in vitro degli alimenti. In tutti i casi si tratta di metodi semplici, rapidi e poco costosi che consentono di misurare la CA sia su composti puri che su matrici complesse, come alimenti e campioni biologici. Tuttavia, i metodi per valutazione della CA in vitro, spesso evidenziano numerose limitazioni sia tecniche che concettuali. La principale limitazione tecnica � legata alla natura chimica sulla quale si fondano che rende difficile il confronto fra i valori di CA ottenuti con le diverse metodiche analitiche. La principale limitazione concettuale, invece, � legata alla difficolt� di poter attribuire alle misure di CA un reale significato fisiologico. Le misure di CA degli alimenti, infatti, non consentono di valutare quella che � la reale biodisponibilit� dei composti antiossidanti assunti con la dieta. Esse, infatti non tengono conto n� della stabilit� in vivo, n� della ritenzione nei tessuti n� della reattivit� in situ dei composti antiossidanti. Pertanto, il target di questa ricerca � stato quello di mettere a punto un nuovo approccio che, mediante l?utilizzo di metodologie innovative, consenta di ottenere informazioni sul potenziale valore salutistico degli alimenti che siano realmente indicative della risposta che essi procurano in vivo. Lo studio si � articolato su tre livelli sequenziali di indagine. Il primo livello ha riguardato l?analisi in vitro dell?alimento effettuata mediante misure di CA sui diversi estratti ottenuti dall?alimento. A questo livello, � stato in primo luogo condotto un avanzamento del metodo "QUENCHERABTS" (QUICK, Easy, New, CHEap and Reproducible); il metodo si basa sulla reazione diretta del radicale cationico ABTS?+ con particelle fini di alimenti solidi senza che venga effettuata una preliminare estrazione degli antiossidanti. Mediante una nuova procedura di calcolo, l'applicabilit� del metodo QUENCHERABTS � stata estesa allo studio di particelle pi� grandi (fino a 0,5 mm). Questo pu� essere interessante nel caso di alcuni prodotti dell?industria molitoria. Oltre all?avanzamento del metodo QUENCHERABTS, la ricerca relativa al primo livello di indagine ha riguardato lo sviluppo del nuovo metodo Lipoxygenase (LOX) -Fluorescein (FL). Il nuovo metodo LOX-FL si basa su un approccio pi� vicino alle condizioni fisiologiche rispetto ad altri metodi ampiamente utilizzati in letteratura. Esso utilizza l?isoforma 1 della lipossigenasi di soia per produrre specie radicaliche fisiologiche e la fluoresceina come probe per rilevare queste specie in fluorescenza. Il metodo LOX-FL � stato applicato sia alla misura della CA degli estratti ottenuti dall?integratore alimentare ricco in composti bioattivi Lisosan G sia alla misura della CA del siero (di sette soggetti) durante i 240 minuti successivi all?assunzione di 20 g dell?integratore. Per quanto riguarda l?analisi in vitro, il metodo LOX-FL � stato in grado di discriminare in termini di CA tra i quattro diversi estratti del Lisosan G, in modo simile ai metodi ORAC e TEAC, utilizzati come confronto. Al contrario, solo il metodo LOX-FL � stato in grado di evidenziare un aumento generale della CA del siero fino al 40% 30 minuti dopo l'assunzione di Lisosan G. Per la duplice propriet� di poter essere applicato sia a misure in vitro che ex vivo di CA, il metodo LOX-FL � stato utilizzato anche nel secondo livello di indagine, quello relativo alla valutazione dello stato antiossidante del sangue umano dopo l'assunzione dell?alimento. Data la semplicit� nelle misure di CA e il facile accesso ai campioni di sangue umano, le misure di CA sul siero si sono diffuse tantissimo negli ultimi anni e hanno generato un elevatissimo numero di pubblicazioni. Purtroppo, i risultati sono abbastanza contrastanti; in alcuni casi, infatti, si � osservato solo un lieve aumento o addirittura un decremento della CA. Ci� suggerisce l'inadeguatezza delle misurazioni della sola CA del sangue e la necessit� di considerare anche i cambiamenti dello stato ossidato del siero. Alla luce di ci�, � stato proposto l'uso di un nuovo parametro, definito ?Antioxidant/Oxidant Balance? (AOB), che rappresenta il rapporto tra la CA e lo stato ossidato del siero, valutato come "Peroxide Level" (PxL). L'approccio basato sull?uso dell?AOB � stato applicato per valutare gli effetti sullo stato antiossidante del siero nelle prime quattro ore successive all'assunzione di due putative paste funzionali, la pasta Bran Oleoresin (BO) e la pasta Bran Water (BW), arricchite rispettivamente con antiossidanti lipofili e idrofili/ fenolici estratti dalla crusca di frumento duro. Analogamente al Lisosan G altamente bioattivo, l'assunzione di pasta BO ha procurato un significativo incremento dell?AOB del siero, fino al 70% quando calcolato come LOX-FL/PxL. Al contrario, la pasta BW ha un effetto ossidante sul siero, analogamente alla pasta controllo (Reference pasta) e al glucosio, usati come confronto. Complessivamente, questi risultati indicano che il parametro AOB appare uno strumento eccellente per evidenziare l?effetto del consumo di alimenti ricchi di antiossidanti sul sangue; tale effetto, inoltre, non pu� essere assolutamente previsto dalle misure in vitro della matrice, ne dall'analisi ex vivo della sola CA del siero. Il terzo livello di indagine � quello relativo alla valutazione degli effetti esercitati dai composti bioattivi a livello cellulare e subcellulare. In particolare, gli effetti biologici di alcuni phytochemicals alimentari sono stati valutati sull'attivit� degli enzimi: i) Gliossalasi I (GloI), implicato nella difesa cellulare contro gli effetti dannosi dello stress da carbonilazione ii) Sirtuine, una famiglia di deacetilasi NAD+-dipendenti coinvolte nella regolazione di importanti processi cellulari quali trascrizione genica, apoptosi, metabolismo e divisione cellulare. Per quanto riguarda l?enzima Glo I, sono stati effettuati due studi. Nel primo studio � stato valutato l?effetto del sulforafano (SR), un isotiocianato abbondante nei broccoli, sull'espressione e l'attivit� di GloI e sui livelli di glutatione ridotto (GSH) in cellule mononucleate di sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs). L'incubazione per 24/48 ore dei PMBCs con 2,5 ?M SR (che simula la quantit� assunta con una porzione di broccoli) non ha indotto un aumento sostanziale dell'attivit� e dell'espressione di GloI, mentre ha causato una riduzione fino al 73% dei livelli di GSH rispetto alle cellule di controllo. Ci� suggerisce la formazione di un addotto GSH-SR che, riducendo significativamente la reale concentrazione di SR all'interno delle cellule durante l'incubazione, spiegherebbe la mancanza di un sostanziale effetto sull'espressione di GloI osservata in questo studio. Nel secondo studio � stato valutato l'effetto di alcuni phytochemicals sull'attivit� di GloI nella frazione mitocondriale altamente purificata isolata da plantule di frumento duro (Wheat Mitochondria, WM). � stata studiata la GloI mitocondriale poich� i mitocondri rappresentano uno dei principali bersagli della carbonilazione oltre che dello stress ossidativo. In questi organelli � stata dapprima misurata un'elevata attivit� di GloI; lo studio della cinetica di reazione ha consentito di osservare una dipendenza iperbolica dall?attivit� enzimatica dalla concentrazione di substrato e di misurare Km e Vmax che sono pari a 0,27 mM e 0,133 UE / mg di proteine, rispettivamente. Per quanto riguarda lo studio della modulazione, tra i phytochemicals testati soltanto curcumina e quercetina sono risultate in grado di inibire l'attivit� di GloI in WM. Uno studio dettagliato dell?inibizione ha consentito, inoltre, di verificare la natura competitiva dell?inibizione e di calcolare valori di Ki pari a 20 ?M e 55 ?M per la curcumina e la quercetina, rispettivamente. Infine, � stato condotto uno studio finalizzato a sviluppare un nuovo approccio sperimentale che consenta di misurare in modo affidabile l'attivit� sirtuina in estratti cellulari e/o in organelli subcellulari. Questo approccio consiste nell?uso combinato di due diversi sistemi di dosaggio basati su un razionale molto diverso, il dosaggio SIRT-Glo? che lavora in luminescenza e un metodo basato sulla tecnologia HTRF, e confronto con l?enzima ricombinante umano SIRT1 (human SIRT1, hSIRT1). Usando l'approccio appena descritto, � stata determinata un'attivit� specifica di sirtuine in WM molto alta, pari a 268 � 10 mU ? mg-1 di proteine, con saggio HTRF�, e di 166 � 12 ng di hSIRT1 eq. ? mg- 1 di proteine, con il metodo bioluminescente. Per quanto riguarda la modulazione dell?attivit� di sirtuina, utilizzando il saggio HTRF�, non � stato osservato nessun significativo effetto da parte di resveratrolo e quercetina sull?attivit� di sirtuina in WM. Globalmente, i risultati riportati in questa tesi dimostrano l'importanza cruciale dell'approccio metodologico nella valutazione delle potenziali propriet� salutistiche dei phytochemicals alimentari; ci�, infatti, � assolutamente necessario se si vuole evitare un?interpretazione errata e fuorviante dei dati relativi alle propriet� antiossidanti degli alimenti.