Determinazione dei peptidi negli alimenti mediante HPLC-ESI-MS: correlazione con i trattamenti tecnologici e attività biologica
Creators: name: Aquino, Giancarlo
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: La proteolisi rappresenta il più complesso e, in molti casi, il più importante tra i fenomeni biochimici che hanno luogo nei formaggi durante la fase di maturazione, e contribuisce in modo decisivo allo sviluppo delle caratteristiche finali del formaggio stesso, in quanto i peptidi che ne derivano svolgono un ruolo fondamentale nel determinare le proprietà funzionali, nutrizionali, e sensoriali dell’alimento. 
L’interesse per gli oligopeptidi originati dalla degradazione delle  proteine alimentari è inoltre incrementato dalla scoperta che molti di essi sono biologicamente attivi; si tratta di molecole che risultano inattive quando sono presenti nella sequenza della proteina nativa, ma che assumono attività farmacologica nel momento in cui vengono liberati. Un gran numero di peptidi ad attività oppioide o ACE-inibitrice sono stati isolati a partire da digeriti enzimatici di diverse proteine alimentari, sia di origine animale che vegetale; da questo punto di vista le proteine del latte, caseine in particolare, rappresentano una fonte molto importante di peptidi bioattivi, quali le casomorfine ed i caseinofosfopeptidi.
In una prima parte del lavoro di tesi è stata valutata l’efficacia dell’analisi HPLC-ESI-MS applicata allo studio della frazione oligopeptidica di diversi formaggi, al fine di seguirne le variazioni nel corso della stagionatura. Sono state analizzate sia tipologie di formaggi da latte ovino (pecorino) che da latte vaccino (caciotta), e per entrambe sono state studiate tre diverse tecnologie produttive (da latte crudo, da latte omogeneizzato con alte pressioni, e da latte pastorizzato), con lo scopo di valutare se e come la diversa tecnologia possa influenzare la composizione della frazione oligopeptidica, e quindi le diverse caratteristiche che funzionali ed organolettiche dei prodotti. L’analisi della frazione peptidica mediante HPLC-ESI-MS si è mostrata particolarmente efficace nel distinguere i formaggi a diversa tecnologia di produzione, in quanto il profilo peptidico appare estremamente distintivo del trattamento di sanitizzazione subito dal latte; in particolare i campioni da latte pastorizzato mostrano un andamento molto diverso rispetto a quelli da latte crudo ed omogeneizzato, tra loro piuttosto simili. L’analisi statistica applicata ai dati ha permesso, inoltre, di    ipotizzare possibili percorsi proteolitici. 
Dal confronto tra la frazione oligopeptidica di formaggi da latte vaccino e quella di formaggi da latte ovino, è stato possibile evidenziare la presenza di sequenze peptidiche derivanti da siti di taglio comuni tra le caseine ovine e bovine; tali peptidi hanno la stessa localizzazione nella sequenza caseinica, ma possono differire per alcuni residui amminoacidici, rappresentando, in questo modo, dei potenziali marker del latte di origine. In particolare abbiamo focalizzato l’attenzione sul frammento αS1-CN(f1-14), che è fortemente rappresentato in entrambe le tipologie di formaggio, ma con diversi pesi molecolari (1624Da per la sequenza ovina, 1665Da per quella vaccina); il suo utilizzo come marker di origine del latte ha permesso di rivelare adulterazioni già al 5% di taglio di latte ovino con quello vaccino. 
In una seconda parte del lavoro di tesi, si è investigata la potenziale bioattività di peptidi naturalmente presenti nel Parmigiano Reggiano, focalizzando l’attenzione sull’attività ACE-inibitrice ed immunomodulante. 
Per quanto riguarda l’attività di ACE-inibizione, è stato utilizzato un test spettrofotometrico molto affidabile e veloce, che ci ha consentito di testare sia singoli peptidi naturalmente presenti nei formaggi, e sintetizzati in laboratorio, sia miscele peptidiche a maggiore complessità estratte dai formaggi, frazionate per via cromatografica e caratterizzate mediante HPLC-ESI-MS. 
Per la valutazione dell’attività immunomodulante sono stati invece utilizzati in parallelo due metodi colorimetrici in micropiastra, condotti sui linfociti T umani Jurkat presso i Laboratoire de Recherche en Genie Industriel Alimentaire (LRGIA) dell’Università “Claude Bernard” di Lioni, in collaborazione con il gruppo di ricerca della prof.ssa Martial: tale metodologia è risultata  particolarmente versatile ed efficace, ed ha mostrato ancora una volta una buona affidabilità sia nel caso di estratti di formaggio che di molecole singole. La frazione oligopeptidica estratta dal  Parmigiano Reggiano ha mostrato una buona capacità immunostimolante, ed il suo successivo frazionamento in HPLC preparativo ha consentito di evidenziare le singole frazioni responsabili per tale attività, principalmente quelle ad elevato peso molecolare.
Buoni risultati si sono, inoltre, ottenuti quando il test è stato eseguito su singole molecole naturalmente presenti nei formaggi. 
Infine, in una terza parte della tesi è stata valutata la potenzialità della digestione triptica, congiunta ad analisi HPLC-MS della miscela peptidica derivante, al fine di ricavare informazioni sulla sequenza di una proteina allergenica: si è focalizzata l’attenzione sulla lipid transfer protein (LTP) della pesca, Pru p 3, allergene noto in letteratura per la sua elevata resistenza ai trattamenti termici ed alla digestione enzimatica. Tale resistenza alla digestione enzimatica deriva dal fatto che la LTP della pesca, come tutte le LTP  finora note, è caratterizzata dalla presenza di 8 residui di cisteina altamente conservati, che si organizzano a formare 4 ponti disolfuro responsabili della conformazione altamente ripiegata della proteina; a tale proposito, particolarmente efficace si è rivelata l’idea di effettuare la riduzione dei ponti disolfuro, e la successiva alchilazione dei residui di cisteina liberi, non sulla proteina tal quale, ma sulla miscela di peptidi derivanti dalla digestione triptica della proteina. Una procedura di questo tipo ci ha permesso di ottenere  informazioni utili sulla sequenza proteica grazie all’ottenimento dei peptidi corrispondenti al core centrale, difficilmente accessibile.