Μεταβολές δεικτών οξειδωτικού στρες σε κύτταρα Saccharomyces cerevisiae παρουσία πυροκατεχικού οξέος
Creators: name: Σαμαρά, Ευφροσύνη Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Οξειδωτικό στρες
Saccharomyces cerevisiae
Πυροκατεχικό οξύ
Καταλάση
Λιπιδική υπεροξείδωση
Oxidative stress
Pyrocatechuic acid
Catalase
Lipid peroxidation

description: Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται η αξιοποίηση του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae ως πειραματικό μοντέλο ευκαρυωτικών οργανισμών για τη διερεύνηση/κατανόηση της δράσης ενώσεων φυτικής προέλευσης στους κυτταρικούς μηχανισμούς απόκρισης στο οξειδωτικό στρες. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση, για πρώτη φορά, της επίδρασης που έχει η έκθεση των κυττάρων του S. cerevisiae στη φαινολική ένωση πυροκατεχικό οξύ σε ορισμένους δείκτες οξειδωτικού στρες, συγκριτικά με δύο άλλες φαινολικές ενώσεις με μικρές δομικές διαφορές, το πρωτοκατεχικό οξύ και την κατεχόλη. Οι παραπάνω ενώσεις επιλέχθηκαν αφενός γιατί είναι φυσικά μόρια και αφετέρου έχουν ως κοινό δομικό χαρακτηριστικό την κατεχολική ομάδα που αναμένεται να ενισχύσει τη δραστικότητά τους και κατά συνέπεια τον κυτταροπροστατευτικό τους ρόλο έναντι του οξειδωτικού στρες. Για το σκοπό αυτό, αρχικά εκτιμήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης και του χρόνου έκθεσης διαφορετικών οξειδωτικών παραγόντων (υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2) και υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (CHP)) στην κυτταροτοξική δράση τους ώστε να ορισθούν οι συνθήκες που προκαλούν οξειδωτικό στρες in vivo (H2O2 5 mM ή CHP 150 μΜ, 2 h). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε η ελάχιστη συγκέντρωση, στην οποία οι φαινολικές ενώσεις δεν εμφάνισαν αντιμικροβιακή δράση (≤ 200 μΜ). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμές με αυξανόμενη συγκέντρωση του πυροκατεχικού οξέος (2-10 μΜ), του πρωτοκατεχικού οξέος (3-200 μΜ) ή της κατεχόλης (5-200 μΜ), παρουσία των οξειδωτικών παραγόντων σε συνθήκες έντονου οξειδωτικού στρες στρες (20-25% κυτταρική επιβίωση). Η προστατευτική δράση των τριών φαινολικών ενώσεων έναντι του οξειδωτικού στρες παρακολουθήθηκε μέσω της εκτίμησης της κυτταρικής επιβίωσης, της δραστικότητας της καταλάσης και της συγκέντρωσης των ενώσεων που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBARS), δοκιμή που έχει εφαρμοστεί στο συγκεκριμένο μοντέλο. Για την πραγματοποίηση των παραπάνω προσδιορισμών αναδείχτηκε η ανάγκη εύρεσης κατάλληλης μεθόδου κατεργασίας των κυττάρων ώστε να παραληφθεί ικανοποιητική ποσότητα κυτταρικού εκχυλίσματος ελεύθερο από ενώσεις με παρεμποδιστική δράση. Με βάση τα ευρήματα, το πυροκατεχικό οξύ εμφάνισε μέγιστη θετική επίδραση στην κυτταρική επιβίωση σε συγκέντρωση τουλάχιστον 15 φορές μικρότερη από εκείνες που απαιτήθηκαν για την κατεχόλη και το πρωτοκατεχικό οξύ, ανεξαρτήτως οξειδωτικού παράγοντα. Η κυτταροπροστατευτική δράση της κατεχόλης ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του πρωτοκατεχικού οξέος παρουσία CHP αλλά μικρότερη παρουσία Η2Ο2. Από τις υπό εξέταση φαινολικές ενώσεις, μόνο η κατεχόλη βρέθηκε να επάγει τη δραστικότητα της καταλάσης παρουσία CHP. Τα αποτελέσματα της μεθόδου TBARS ανέδειξαν την αποτελεσματικότητα των φαινολικών ενώσεων στη μείωση του βαθμού οξείδωσης των κυτταρικών συστατικών παρουσία Η2Ο2, ενώ παρουσία CHP δεν παρατηρήθηκε κάποια επίδραση. Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι το CHP ευνοεί την οξείδωση των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης, η αδυναμία εκτίμησης του βαθμού οξείδωσης με τη μέθοδο TBARS αναδεικνύει την ανάγκη για αναθεώρηση της χρήσης της όσον αφορά το συγκεκριμένο πειραματικό μοντέλο. Συνολικά, η αποτελεσματικότητα των υπό εξέταση φαινολικών ενώσεων και ο μηχανισμός δράσης τους συζητείται με βάση τα δομικά χαρακτηριστικά τους και πώς αυτά δυνητικά μπορεί να επηρεάζουν την ικανότητά τους να διαπερνούν τις βιολογικές μεμβράνες, να δεσμεύουν τα οξειδοαναγωγικώς ενεργά ιόντα μεταβατικών μετάλλων και τις δραστικές ελεύθερες ρίζες, και να επάγουν την έκφραση αντιοξειδωτικών ενζύμων.
description: In recent years, there is an increasing interest in exploiting yeast Saccharomyces cerevisiae as a eukaryotic model organism to investigate/understand the role of dietary compounds in the cellular response to oxidative stress. The purpose of this study was to investigate the effect of exposure of S. cerevisiae cells to the phenolic compound pyrocatechuic acid in the presence of specific oxidative stress markers, in comparison with two other phenolic compounds (protocatechuic acid and catechol). The above compounds were chosen on the one hand because they are natural molecules and on the other hand, because they have as a common structural feature the catechol group which is expected to enhance their antioxidant activity and consequently their cytoprotective role against oxidative stress. For this purpose, the effect of the concentration and time of exposure of different oxidizing agents (hydrogen peroxide (H2O2) and cumene hydroperoxide (CHP)) was initially assessed on their cytotoxic activity to determine the conditions that inducing oxidative stress in vivo (H2O2 5 mM or CHP 150 μM, 2 h). Thereafter, the minimum concentration at which the phenolic compounds did not show antimicrobial activity (≤ 200 μM) was determined. Cells were tested with increasing concentration of pyrocatechuic acid (2-10 μM), protatechuic acid (3-200 μM) or catechol (5-200 μM), in the presence of oxidizing agents under intense oxidative stress conditions. The oxidative stress assessment was performed by measuring cell survival, catalase activity and concentration of thiobarbituric acid-reactive compounds (TBARS). In order to carry out the above assays, the need for a suitable method of treating the cells to obtain a satisfactory amount of cellular extract without the presence of compounds with inhibitory activity has been demonstrated. Based on the experimental findings, pyrocatechuic acid showed a maximum positive effect on cell survival at a concentration at least 15 times lower than that required for catechol and protonatechic acid, irrespective of the oxidizing agent. The cytoprotective effect of catechol was lower than that of the protocatechuic acid in the presence of H2O2 and greater in the presence of CHP. Of the phenolic compounds tested, only catechol was found to induce catalase activity in the presence of CHP. The results of the TBARS method revealed the efficacy of the compounds in reducing the degree of oxidation of the cellular components in the presence of H2O2, with no effect observed in the presence of CHP. As CHP is expected to favor cell membrane lipid oxidation, the inability to estimate the degree of oxidation by the TBARS method highlights the need for reevaluation of its use for this specific application. Overall, the efficacy of the phenolic compounds tested and their mechanism of action is discussed based on their structural characteristics and how they potentially affect their ability to permeate biological membranes, binding redox active metal ions, inhibiting free radicals and induce the expression of antioxidant enzymes.