title: Absence of glucosylation on N-linked glycans
Creators: name: Rifatbegovic, Fikret
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Während des Transports von sekretorischen Proteinen vom Zytosol zu deren endgültigen Destinationen, durchqueren sie mehrere zelluläre Kompartimente, in denen die Proteine gefaltet, modifiziert und assembliert werden. Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist nicht nur das Organell, wo die Faltung, Modifizierung und Assemblierung von Proteinen stattfindet, sondern auch das Kompartiment, wo die Qualitätskontrolle (ERQC) erfolgt. Diese Diplomarbeit befasst sich mit der Rolle der Glykosylierung (bzw. der Glukosylierung) in der ERQC, und vor allem für den ER- assoziierten Proteinabbau (ERAD). Dazu wurde das Schicksal von zwei potentiellen ERAD Substraten (RI332 und RI332-6HA) in zwei unterschiedlichen Zelllinien von Chinesischen Hamster Fibroblasten analysiert. Die G3 Zelllinie besitzt eine voll funktionsfähige Glykosylierung, während die QC Zelllinie in der Glukosylierung defekt ist. Die während dieser Diplomarbeiten erhaltenen Resultate deuten klar auf die Wichtigkeit der Glukosylierung im Kontext von ERAD hin. Missgefaltete Glykoproteine, die nicht glukosyliert werden, können teilweise den CNX Weg umgehen. Als Konsequenz gelangen diese ERAD Substrate schneller in den Abbauweg, wodurch sie um das Zwei- bis Dreifache kürzere Halbwertszeiten haben. Es konnte weiters gezeigt werden, dass die ERAD substrate dramatisch stabilisiert werden, wenn das Mannose – Trimming des Oligosaccharids in G3 Zellen blockiert wird. Stabilisierung erfolgt auch nach Inhibierung des Proteasoms. Die Resultate der Diplomarbeit deuten auch auf eine stärkere, aber zeitlich begrenzte, Interaktion von mono-glukosylierten Proteinen mit CNX hin. Es wurde auch die intrazelluläre Lokalisierung der zwei ERAD Substrate analysiert. Dafür wurden die mit Antikörpern markierten Substrat-Proteine mikroskopisch visualisiert, und die relative Colokalisierung mit zellulären Kompartimenten ermittelt. Die beiden ERAD – Substrate lokalisieren überwiegend zum ER.
description: During the journey of secretory proteins from the cytosol to their final destinations, they must pass a number of cellular compartments in which folding, modification and assembly occurs. The endoplasmic reticulum (ER) is not only an organelle in the secretory pathway where folding, modification and assembly occur, but also a compartment in which quality control (ERQC) of protein folding takes place. This diploma thesis is focused on understanding the importance of glycosylation (more precise glucosylation) for ERQC and especially ER-associated degradation (ERAD). For this purpose, the destiny of two potential ERAD substrates (RI332 and RI332-6HA) was analyzed in two different Chinese hamster fibroblast cell lines. One cell line (G3) has a fully operative glycosylation, while the other cell line (QC) is not able to glucosylate the glycoproteins. Results obtained during this diploma thesis clearly point to the importance of glucosylation in context of ERAD. Misfolded glycoproteins which are not glucosylated enter the degradative pathway faster and thus have a half life that is two- to three- times shorter. It could be further shown that the ERAD substrates are dramatically stabilized when mannose trimming of the oligosaccharide is prevented in G3 cells. The results of this diploma thesis demonstrate a stronger interaction of mono-glucosylated glycoproteins with CNX as compared to non-glucosylated glycoproteins. The intracellular localization of the two model ERAD substrates was also analyzed. For this purpose, the immunolabeled RI332 and RI332-6HA proteins were visualized by microscopy. Both ERAD substrates are predominantly located in the ER.