Επαγωγή της ενδοθηλιακής διαφοροποίησης των ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (MSCs) οδοντικής προέλευσης, με τη χρήση ανασυνδυασμένης ανθρώπινης ερυθροποιητίνης (rhEPO) και δισθενών ιόντων χαλκού (C
Creators: name: Κουτσουμπάρης, Αναστάσιος Ηλία
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Ενδοθηλιακή διαφοροποίηση
Μεσεγχυματικά κύτταρα
Ερυθροποιητίνη
Endothelial differentiation
Mesenchymal stem cells
Erythropoietin

description: Κεντρικό αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η αξιολόγηση του αγγειογενετικού δυναμικού των ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων οδοντικής προέλευσης (SCAP). Συγκεκριμένα εξετάστηκε η ικανότητα αγγειογένεσης παρουσία ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (rhEPO) και δισθενών ιόντων χαλκού (Cu++). Αρχικά έγινε RT-PCR ανάλυση για τα γονίδια του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3K/AKT, για να διαπιστωθεί εάν η rhEPO το διεγείρει αντιδρώντας με τον υποδοχέα της EPO-R, καθώς και για γονίδια - τελικούς δείκτες της αγγειογένεσης. Βρέθηκε ότι τα SCAP έχουν ένα βασικό επίπεδο έκφρασης των γονιδίων EPOR και VEGFA, το οποίο αυξάνεται παρουσία των αγγειογενετικών παραγόντων. Επίσης αυξήθηκε η έκφραση των αγγειογενετικών δεικτών PI3KCA και PECAM1. Κατόπιν, αξιολογήθηκε η έκφραση και η ενζυμική δραστικότητα της μεταλλοπρωτεϊνάσης του στρώματος MMP-2, που αποτελεί εξειδικευμένο δείκτη των ενδοθηλιακών κυττάρων, με τη μέθοδο της ζυμογραφίας ζελατίνης. Παρατηρήθηκε αυξημένη ενζυμική δραστηριότητα στα δείγματα που επωάσθηκαν με ιόντα χαλκού. Ποιοτικός προσδιορισμός της πρωτεΐνης HIF-1α κατά Western έγινε για να διαπιστωθεί εάν τα Cu++ ευθύνονται για τη σταθεροποίησή της. Αυτό ισχύει στην περίπτωση των Cu++, ενώ με την rhEPO δεν ανιχνεύτηκε HIF-1α στον πυρήνα. Καλλιέργεια των SCAP, μετά από την επίδραση rhEPO και Cu++ σε Matrigel® κατέδειξε την ανάπτυξη χαρακτηριστικών τριχοειδών-αγγειογενετικών δομών. Τέλος, έγινε δοκιμασία επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωο με τη χρήση των SCAP σε ικρίωμα κολλαγόνου. Δεν παρατηρήθηκε φλεγμονή και η πληγή επουλώθηκε πλήρως. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας δείχνουν την ενδοθηλιακή διαφοροποίηση παρουσία rhEPO και Cu++ με μηχανισμούς επαγωγής που μπορεί να διαφέρουν, καθώς και πιθανές κλινικές εφαρμογές στην επούλωση των τραυμάτων.
description: The central objective of this thesis was to assess the angiogenic potential of human mesenchymal stem cells, of dental origins (SCAP). We examined the potential of erythropoietin (rhEPO) and divalent copper ions (Cu++), to induce endothelial differentiation. SCAP were cultured and assessed for growth, morphology and differentiation. We utilized collagen and Matrigel® scaffolds in order to achieve this goal. Furthermore, RT-PCR was employed to study the expression of genes in the PI3K/AKT signaling pathway, downstream of EPO-R, which leads to VEGF-A production and transcription of several endothelial-specific genes. The enzymatic activity of MMP-2, an endothelial-secreted protein, was evaluated by gelatin zymography. Also, the presence in the cell nucleus of HIF-1α, was determined by Western blot. Finally, we investigated whether treated SCAP can contribute to wound healing of an in vivo model. The results obtained were as follows: a) Culture on Matrigel®, revealed tubular-like structures - evidence of angiogenesis. These structures were also present, with Cu++ treatment for at least 72 hours, on the plastic surface of the culture plates. b) RT-PCR revealed that VEGF-A expression was up-regulated in the presence of rhEPO and/or Cu++. Expression of endothelial-specific markers PI3K-CA and PECAM1 was also up-regulated. c) MMP-2 activity was optimal in samples treated with Cu++. Cu++ also inhibited the degradation of HIF-1α in the cell nucleus. d) Wound healing in vivo was complete, showing no signs of inflammation. In conclusion, this thesis presents evidence of endothelial differentiation, induced by rhEPO and Cu++, possibly with different mechanisms. These findings may lead to clinical applications in ischemic episode treatment