Βελτιστοποίηση των συνθηκών ανάλυσης τετραδοτοξίνης με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και παραγώγιση μετά τη στήλη
Creators: name: Τάνης, Δημήτριος Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης
Τετραδοτοξίνη
Αντίδραση παραγώγισης μετά τη στήλη
High-performance liquid chromatography
Tetrodotoxin
Post-column reaction

description: Στην παρούσα διπλωματική εργασία, συζητήθηκε θεωρητικά και ερευνήθηκε πειραματικά ο σχεδιασμός ενός συστήματος παραγώγισης μετά τη στήλη της υγρής χρωματογραφίας με φθορισμομετρικό ανιχνευτή για την ανάλυση της τετραδοτοξίνης στο λαγοκέφαλο Lagocephalus sceleratus. Το σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) περιλαμβάνει τη χρήση ενός περφθοροκαρβοξυλικού οξέος (δεκατριαφθοροεπτανοϊκό οξύ) για τον διαχωρισμό της τετραδοτοξίνης (ΤΤΧ) και της 4,9-ανυδρο-τετραδοτοξίνης (4,9-ανυδρο-ΤΤΧ) από το υπόστρωμα. Η αντίδραση παραγώγισης (PCD) που μελετήθηκε για την φθορισμομετρική ανίχνευση (FLD) της τετραδοτοξίνης βασίστηκε στη μετατροπή της σε ένα φθορίζον παράγωγο την υδροξυκουιναζολόνη με τη χρήση ισχυρών αλκαλικών συνθηκών (4N NaOH). Η επιλογή των σχεδιαστικών χαρακτηριστικών του αντιδραστήρα παραγώγισης καθορίζεται κυρίως από τον απαιτούμενο χρόνο αντίδρασης: μελετήθηκαν και οι δύο τύποι αντιδραστήρων (ελικοειδείς και πεπλεγμένοι). Οι αρχές για την βελτιστοποίηση της ακτινικής ανάμιξης σε αντιδραστήρες ανοιχτού τύπου αξιοποιήθηκαν για τους ελικοειδείς και για τους πεπλεγμένους αντιδραστήρες. Οι επιδόσεις αυτών των αντιδραστήρων συγκρίνονται με ελικοειδείς και πεπλεγμένους ανοιχτούς σωλήνες, χρησιμοποιώντας γραφικές παραστάσεις του ύψους της πλάκας ως προς τη γραμμική ταχύτητα (h vs. u) και υπολογισμούς της σχετικής διεύρυνσης της ζώνης του αναλύτη. Με τα συμπεράσματα από αυτές τις γραφικές παραστάσεις μπορούν να εξαχθούν κάποιοι κανόνες για τον βέλτιστο σχεδιασμό αυτών των αντιδραστήρων. Οι πειραματικές μελέτες αφορούν τις παραμέτρους που επηρεάζουν την ευαισθησία, τη χρωματογραφική διεύρυνση της ζώνης του αναλύτη και τη σταθερότητα της αντίδρασης παραγώγισης. Οι παράγοντες επικύρωσης της μεθόδου HPLC-PCD-FLD για την TTX (γραμμικότητα, ευαισθησία, ακρίβεια, εκλεκτικότητα) βρέθηκαν να κυμαίνονται σε υψηλός ικανοποιητικά επίπεδα. Η γραμμική περιοχή προσδιορισμού για την τετραδοτοξίνη ήταν στα 40-3000 ppb και για την 4,9-ανυδρο-τετραδοτοξίνη στα 80-3000 ppb αντίστοιχα. Το LOD για την τετραδοτοξίνη και την 4,9-ανυδρο-τετραδοτοξίνη προσδιορίστηκε στα 12 και 26 ppb αντίστοιχα, ενώ το LOQ στα 41 και 85 ppb. Η ακρίβεια εκτιμήθηκε με πειράματα ανάκτησης και κυμάνθηκε για την τετραδοτοξίνη μεταξύ του 90.7% και 93.6%. Η μέθοδος HPLC-PCD-FLD εφαρμόσθηκε για τον προσδιορισμό της τετραδοτοξίνης και της 4,9-ανυδρο-τετραδοτοξίνης στο λαγοκέφαλο L. Sceleratus και οι χρωματογραφικές κορυφές ταυτοποιήθηκαν με LC/MS/MS χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες κινητής φάσεις όπως και στην μέθοδο HPLC-PCD-FLD.
description: A post-column fluorescence reaction system for the high-performance liquid chromatographic (HPLC) determination of tetrodotoxin in the silver-cheeked toadfish Lagocephalus sceleratus is discussed theoretically and investigated experimentally. Ion-pair chromatography with volatile ammonium perfluoroheptanoate was used for the separation of tetrodotoxin and 4,9-anhydro-tetrodotoxin. The post-column reaction was based on tetrodotoxin conversion to a quinazoline fluorescent compound in strong alkaline conditions. All post-column parameters were optimized that affected the sensitivity, dispersion, and stability. Helically coiled and knitted open tubular reactors composed of polyetheretherketone were constructed and characterized in detail. The performance of these reactors was evaluated on the bases of sensitivity and dispersion. Their optimal design is reported. The knitted reactors were more efficient than the relevant helically coiled reactors when higher reaction times are required. A 1,500 μL polyetheretherketone knitted coil with 0.010″ internal diameter was optimum exhibiting higher pressure tolerances than Teflon coils. The HPLC post-column reaction method was evaluated in terms of linearity, sensitivity, accuracy, precision, and ruggedness. The linear dynamic ranges for tetrodotoxin and 4,9-anhydro-tetrodotoxin were 40 to 3,000 ppb and 80 to 3,000 ppb, respectively. The limits of detection and quantification were 12 and 41 ppb for tetrodotoxin and 26 and 85 ppb for 4,9-anhydro-tetrodotoxin. The accuracy was evaluated by recovery measurements and the values for tetrodotoxin were between 90.7% and 93.6%. The use of a volatile perfuorocarboxylic acid as an ion-pair reagent allowed confirmation of of analytes in sample matrix by high-performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry using identical mobile phase conditions.