Μεταφραστική μελέτη αναγέννησης οδοντίνης με βιομιμητικά ικριώματα χιτοζάνης-ζελατίνης-υδροξυαπατίτη και βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού: Μοριακή ανάλυση
Creators: name: Τρέντσιου, Μαρία Στέργιου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Ιστοτεχνολογία
Βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού
Ικριώματα χιτοζάνης/ζελατίνης/νανουδροξυαπατίτη
Αναγέννηση οδοντίνης
Οδοντογενής διαφοροποίηση
Tissue engineering
Dental pulp stem cells
Chitosan / gelatin / nanodroxyapatite scaffold
Dentin regeneration
Odontogenic differentiation

description: Η παρούσα διπλωματική εργασία θέτει ως στόχο την διερεύνηση της ικανότητας αναγέννησης ενασβεστιωμένου ιστού που προσομοιάζει την επανορθωτική οδοντίνη ως προς την δομή και την χημική σύνθεση, όταν συνδυαστούν βιομιμητικά ικριώματα χιτοζάνης/ζελατίνης/νανο-υδροξυαπατίτη (CS/Gel/nHA) με βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού ακολουθώντας τα μονοπάτια της Ιστοτεχνολογίας. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού (DPSCs) που απομονώθηκαν από πολφούς τρίτων γομφίων και χαρακτηρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ακολουθώντας την τεχνική της λυοφιλοποίησης ξεκίνησε η κατασκευή των βιομιμητικών ικριωμάτων χιτοζάνης/ ζελατίνης/νανο-υδροξυαπατίτη έχοντας αναλογία 40%:60% CS/Gel διασταυρούμενα με 0,1% γλουταραλδεύδη (GTA). Έπειτα ολοκληρώθηκε η κατασκευή τους με προσθήκη διαλύματος νανοϋδροξυαπατίτη σε αναλογία 55% ως προς το αρχικό μίγμα CS/Gel. Στα ικριώματα αυτά έγινε τοποθέτηση 2x106 DPSCs και καλλιέργεια σε μέσο καλλιεργειών για χρονικό διάστημα 0-14 ημερών, ανάλογα με τη εξεταζόμενη βιολογική διαδικασία. Τα δείγματα που ελήφθησαν σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές μελετήθηκαν με την μέθοδο της δοκιμασίας αναγωγής του άλατος του τετραζολίου (δοκιμασία ΜΤΤ) που αποσκοπούσε στον έλεγχο κυτταροτοξικότητας των ικριωμάτων. Παράλληλα στα δείγματα πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (real time PCR) για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων σχετιζόμενων με την οδοντογενή διαφοροποίηση των κυττάρων στα συμπλέγματα. Η βιωσιμότητα, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των DPSCs φαίνεται να ευνοούνται μέσα στα ικριώματα CS/Gel/nHA έως και την 14η ημέρα παρακολούθησης. Η δοκιμασία ΜΤΤ απέδειξε μια σταθερή δραστικότητα του ενζύμου μιτοχονδριακής αφυδρογονάσης μέχρι την 3η ημέρα. Ακολούθησε σημαντικά χρονικά εξαρτώμενη μείωση τις επόμενες μέρες έως την 14η, η οποία σηματοδοτεί την έναρξη της διαφοροποίησης των κυττάρων, μια διαδικασία που χαρακτηρίζεται με μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Οι διακυμάνσεις της γονιδιακής έκφρασης έδειξαν μια ταχεία οδοντογενή μεταστροφή των DPSCs. Παρατηρήθηκε αύξηση της σιαλοφωσφοπρωτεΐνης της οδοντίνης (DSPP) και του αυξητικού παράγοντα BMP-2 την 14η ημέρα, ενώ η αλκαλική φωσφατάση (ALP) και ο παράγοντας μεταγραφής RunX2 σημείωσαν έντονη αύξηση την 7η ημέρα. Τέλος ο παράγοντας μεταγραφής OSTERIX σημείωσε την μεγαλύτερη άνοδο την 3η ημέρα. Τα ικριώματα CS/Gel/nHA αναδείχθηκαν φιλικά κ ευνοϊκά ως προς την βιωσιμότητα των DPSCs και ικανά να υποστηρίξουν την οδοντογενή διαφοροποίηση τους in vitro. Η συμπεριφορά αυτήν των ικριωμάτων κινεί το ενδιαφέρον για περαιτέρω in vivo μελέτες ακολουθώντας τα μονοπάτια της Ιστοτεχνολογίας
description: The present dissertation aims to investigate the potential of dental stem cells to regenerate mineralized dentin-like tissue that mimics restorative dentin in structure and chemical composition. For this purpose, dental pulp stem cells (DPSCs) were seeded in biomimetic scaffolds of chitosan / gelatin / nano-hydroxyapatite (CS/Gel/nHA) following the paths of Tissue Engineering. Dental pulp stem cells were isolated from third molars and characterized by flow cytometry. CS/Gel/nHA scaffolds were initially constructed following the lyophilization technique with a ratio of 40%: 60% CS / Gel cross-linked with 0.1% glutaraldehyde (GTA), while a solution of nanohydroxyapatite with 55% ratio of the initial CS / Gel mixture was added. Then 2x106 DPSCs were placed in these scaffolds and cultured with medium for 14 days. Samples were taken and were analyzed with MTT assay in order to check the cytotoxicity of the scaffolds. Meanwhile, the samples were subjected to reverse transcriptase polymerase chain reaction (real time PCR) aiming to investigate the gene expression related to the odontogenic differentiation of cells in the complexes. CS / Gel / nHA scaffolds seems to support the viability, proliferation, and differentiation of DPSCs until day 14. The activity of the mitochondrial dehydrogenase in MTT assay was stable until day 3 and was followed by a time-dependent decrease in the following days up to 14. This downregulation in cell proliferation could equate to the beginning of cell differentiation, a process characterized by a decrease in cell proliferation rate. The gene expression patterns indicated a rapid odontogenic shift of DPSCs, evidenced by pronounced upregulation of DSPP, BMP-2, ALP, as well as the transcription factors RunX2 and Osterix. CS / Gel / nHA scaffolds appear to favor the viability of DPSCs and were able to support the in vitro cell differentiation. These results reveal a promising strategy for employment in dental TE