title: Quantifizierung der in-vivo Affinität von PI(4,5)P2-Effektoren und Sensoren mit der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP
title: Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP
title: Quantification of the in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP
Creators: name: Rjasanow, Alexandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Kir
Phosphate
KCNQ
tubby
Naturwissenschaften
Phosphatidylinositphosphatkinase &lt;1-Phosphatidylinosit-4-Phosphatkinase&gt;
Spannungsk
Ci-VSP
Rapamycin
HCN-Kanal
Ionenkanal

description: Zusammenfassung Quantifizierung der
      in-vivo Affinität von PI(4,5)P2- Effektoren und Sensoren mit
      der Phosphoinositidphosphatase Ci-VSP Phosphoinositide (PI)
      sind Mitglieder einer Familie kleiner Membranphospholipide,
      die wichtige Aufgaben in vielen eukaryotischen
      Signaltransduktionswegen übernehmen. Das PI
      Phosphoinositid(4,5)biphosphat (PI(4,5)P2) z.B. ist
      vorwiegend in Plasmamembranen lokalisiert und reguliert viele
      zelluläre Funktionen, wie z.B. die Aktivierung von Proteinen
      (z.B. Ionenkanäle). In Anbetracht der Vielfalt zellulärer
      PI(4,5)P2 abhängiger Funktionen ist es unklar, wie eine
      Spezifität dieser Signalwege erzielt werden kann, so dass
      z.B. nur ein Teil potentieller Effektorproteine auf eine
      gegebene PI(4,5)P2 Konzentrationsänderung antwortet. Ein
      wichtiger Faktor, der die Spezifität der PI(4,5)P2-Signalwege
      in Bezug auf die verschiedenen Zielproteine bestimmt, ist die
      PI(4,5)P2-Affinität dieser Effektoren. Um den Einfluss
      dynamischer PI(4,5)P2 Konzentrationsänderungen auf
      Effektorproteine zu verstehen, ist es notwendig die
      PI(4,5)P2-Affinitäten dieser Proteine zu kennen. Jedoch
      fehlte den bisherigen Methoden das Potential, die
      PI(4,5)P2-Affinität der Effektoren (z.B. Ionenkanälen) unter
      physiologischen Bedingungen, wie z.B. in der lebenden Zelle,
      zu untersuchen. Deshalb müssen die PI(4,5)P2-Affinitäten
      vieler Proteine immer noch bestimmt werden. In dieser Studie
      wurde eine spannungsgesteuerte 5’ Phosphatase des Ascids
      Ciona intestinalis (Ci-VSP) als neues Werkzeug verwendet um
      die PI(4,5)P2- Affinitäten von Effektoren und Sensoren zu
      quantifizieren. Ionenkanäle stellen eine Klasse physiologisch
      relevanter PI(4,5)P2-Effektoren mit verschiedenen PI(4,5)P2-
      Affinitäten dar und ihre Regulation durch PIs war Gegenstand
      weitreichender Untersuchungen. Die Aktivität von einwärts
      rektifizierenden Kalium-(Kir) Kanälen wird z.B. durch die
      Bindung von PI(4,5)P2 reguliert. Deshalb wurden Kir-Kanäle
      als Modellsystem verwendet um abzuschätzen, wie gut Ci-VSP
      geeignet ist, die PI(4,5)P2-Affinität dieser Kanäle
      festzustellen. Kir-Ströme wurden während der Ci-
      VSP-Aktivität mit Hilfe von Whole-cell Patch-Clamp an
      CHO-Zellen und mit Hilfe von Zwei-Elektroden Voltage-Clamp an
      Xenopus laevis Oocyten abgeleitet. Die Kir- Ströme nahmen bei
      Depolarisation aufgrund der Ci-VSP-vermittelten PI(4,5)P2- iv
      Depletion ab und nahmen bei Repolarisation aufgrund der
      endogenen PI(4,5)P2- Resynthese wieder zu. Der
      Gleichgewichtszustand der Kanaldeaktivierung bei gradueller
      Ci-VSP-Aktivierung diente dem Auslesen des Grades der
      PI(4,5)P2- Affinität. Aufgrund ihrer verschiedenen
      Affinitäten musste die Ci-VSP unterschiedlich stark aktiviert
      werden um die untersuchten Kir-Kanäle zu deaktivieren. In
      Übereinstimmung mit früheren Studien wurde ermittelt, dass
      Kir2.1WT-Kanäle eine hohe, Kir1.1WT-Kanäle eine mittlere und
      Kir3-Kanäle eine niedrige PI(4,5)P2-Affinität haben.
      Ebenfalls wurde die reduzierte PI(4,5)P2-Affinität von
      Mutanten (z.B. R228Q in Kir2.1), die zu schweren Erkrankungen
      wie das Anderson Syndrom führen können, erfolgreich mit Hilfe
      der Ci-VSP detektiert. Genauso konnte erfolgreich die sich
      ändernde PI(4,5)P2-Affinität von Kir3-Kanälen bei Modulation
      durch Gβγ nachvollzogen werden. Diese Ergebnisse zeigten,
      dass die Verwendung der Ci-VSP, verglichen mit früheren
      Methoden PI(4,5)P2-Level zu manipulieren und Protein-
      PI(4,5)P2-Affinitäten zu quantifizieren, eine graduelle und
      reversible Titration des endogenen PI(4,5)P2 in intakten
      Zellen erlaubt. Die Reliabilität der Ci-VSP wurde bekräftigt
      durch den Vergleich der erhaltenen Resultate mit einer
      unabhängigen Methode PI(4,5)P2 zu depletieren. Die Depletion
      wurde durch eine chemisch gesteuerte Membranrekrutierung
      einer 5’ Phosphatase, der Inp54p, erzielt. Die Ströme aller
      untersuchten Kir-Kanäle nahmen infolge der Inp54p-induzierten
      PI(4,5)P2-Depletion, ähnlich wie bei Ci-VSPAktivierung
      beobachtet, ab. Zuletzt wurde die Ci-VSP dazu verwendet die
      kontroversen PI(4,5)P2- Affinitäten zweier
      PI(4,5)P2-Bindungsdomänen (PLCδ1-PH-Domäne und tubby-CT)
      aufzulösen um ihre Tauglichkeit in Bezug auf die
      Visualisierung von PI(4,5)P2- Dynamiken in künftigen Studien
      abzuschätzen. Der dynamische Bereich des tubby- CT-Sensors
      stimmte mit dem physiologischen
      PI(4,5)P2-Konzentrationsbereich überein, welcher durch die
      Aktivität von KCNQ2-Kanälen in simultanen Messungen mit
      Patch-Clamp angezeigt wurde. Zusammengefasst zeigen die
      Resultate, dass Ci-VSP als neues Werkzeug geeignet ist
      zuverlässig PI(4,5)P2-Level in lebenden Zellen reversibel und
      graduell zu manipulieren. Ci-VSP erlaubt die quantitative
      Ermittlung von PI(4,5)P2-Sensitivitäten zellulärer Effektoren
      und genetisch kodierter fluoreszierender Sensoren von
      PI(4,5)P2-Signalwegen.
description: Summary Quantification of the
      in-vivo affinity of PI(4,5)P2 effectors and sensors with the
      phosphoinositide phosphatase Ci-VSP Phosphoinositides (PIs)
      constitute a family of membrane phospholipids which play
      important roles in many eukaryotic signal transduction
      pathways. The PI phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate
      (PI(4,5)P2) is predominantly located in the plasma membrane
      and regulates many cellular functions including protein
      activation (e.g. ion channels). PI(4,5)P2-mediated signalling
      usually occurs via dynamic changes in the PI(4,5)P2
      concentration. Given the multitude of cellular functions that
      depend on PI(4,5)P2, it is not fully understood how
      specificity of signalling is achieved, i.e. how only a subset
      of potential effector proteins can respond to a given change
      in the PI(4,5)P2 concentration. One major factor determining
      signalling specificity may be the PI(4,5)P2 affinity of these
      effectors. Thus, to understand the impact of dynamic
      PI(4,5)P2 concentration changes on effector proteins it is
      necessary to know their PI(4,5)P2 affinity. However, methods
      to define PI(4,5)P2 affinities used so far have serious
      limitations in their potential to assess the affinities of
      PI(4,5)P2 effectors (e.g. ion channels) under physiological
      conditions, i.e. in the living cell. Therefore, the PI(4,5)P2
      affinity of many proteins has yet to be established. In this
      study, the voltage sensor-containing PI(4,5)P2 5’ phosphatase
      of Ciona intestinalis (Ci-VSP) was established as a novel
      tool to quantify the PI(4,5)P2 affinity of effector and
      sensor proteins. Ion channels are a physiologically relevant
      class of cellular PI(4,5)P2 effectors with various PI(4,5)P2
      affinities, and their regulation by PIs has been the subject
      of wide-ranging investigation. The activity of inwardly
      rectifying potassium (Kir) channels, for example, is
      controlled by PI(4,5)P2 binding. Thus, Kir channels were used
      as a model system to establish the potential of Ci-VSP for
      estimating PI(4,5)P2 affinities. Kir currents were recorded
      during Ci-VSP activity using whole-cell patch-clamp
      recordings on CHO cells or two-electrode voltage clamp
      recordings on Xenopus laevis oocytes. Kir currents declined
      upon depolarization due to PI(4,5)P2 depletion by Ci-VSP
      activity, and recovered upon repolarization as a result of
      endogenous PI(4,5)P2 resynthesis. Steady state channel
      deactivation upon gradual Ci-VSP activation served as a
      readout for the level of channel-PI(4,5)P2 ii affinity.
      Different degrees of Ci-VSP activity were required for
      channel deactivation, consistent with their different
      PI(4,5)P2 affinities. Kir2.1WT channels were found to have a
      high PI(4,5)P2 affinity, Kir1.1WT channels an intermediate
      one, and Kir3 channels a low one. The reduced
      channel-PI(4,5)P2 affinity occurring as a result of amino
      acid mutations (e.g. R228Q in Kir2.1) that lead to severe
      diseases such as Andersen’s syndrome was reliably detected
      with Ci-VSP. Similarly, using Ci-VSP allowed to track
      successfully a change in the PI(4,5)P2 affinity of Kir3
      channels modulated by Gβγ. These data revealed that Ci-VSP
      allowed, in contrast to earlier established approaches, the
      reversible and gradual titration of endogenous PI(4,5)P2 in
      intact cells. The reliability of Ci-VSP was confirmed by
      comparison of these results with those obtained with an
      independent approach to deplete PI(4,5)P2. PI(4,5)P2
      depletion was achieved by chemically triggered recruitment of
      the PI(4,5)P2 5’ phosphatase, Inp54p, to the plasma membrane.
      Kir currents of all channels investigated declined upon
      Inp54p-induced PI(4,5)P2 depletion similar to the results
      obtained with Ci-VSP. Finally, Ci-VSP was used to resolve the
      controversial PI(4,5)P2 affinities of two PI(4,5)P2 sensor
      proteins, PLCδ1-PH domain and tubby-CT, with the purpose of
      assessing their usefulness for monitoring PI(4,5)P2 dynamics
      in intact cells in future studies. Total internal reflection
      fluorescence (TIRF) microscopy on CHO cells showed that the
      PI(4,5)P2 affinity of tubby-CT is lower than that of PLCδ1-PH
      domain. The dynamic range of the tubby-CT sensor corresponded
      to the physiological range of PI(4,5)P2 concentration, as
      indicated by KCNQ2 channel activity recorded simultaneously
      by patch-clamp. In conclusion, the results establish Ci-VSP
      as a novel experimental tool for rapid, reversible and
      gradual manipulation of PI(4,5)P2 in living cells. Ci-VSP
      allows for the quantitative examination of PI(4,5)P2
      sensitivities of cellular effectors and genetically encoded
      fluorescent sensors of PI(4,5)P2 signaling.