title: Construction, characterization and optimization of the synthetic, secondary chromosome synVicII in Escherichia coli
title: Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung des synthetischen, sekundären Chromosoms synVicII in Escherichia coli
Creators: name: Messerschmidt, Sonja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: secondary replicon
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
DNA replication, Synthetic Microbiology
Synthetische Biologie
Escherichia coli, sekundäres Replikon
Replikation

description: Synthetic secondary chromosomes
      are valuable tools to study chromosome maintenance systems.
      Important construction rules for synthetic chromosomes can be
      derived from their design, assembly and characterization.
      Furthermore, synthetic secondary chromosomes can be used to
      genetically modify microorganisms for biotechnology. For all
      applications, it is important that the synthetic secondary
      replicon employed is well described and characterized. In
      this work the synthetic secondary chromosome synVicII was
      established and characterized in the monochromosomal
      bacterium E. coli. The natural occurring secondary chromosome
      II of Vibrio cholerae, a bacterium which possesses two
      different sized chromosomes, was used as template for
      synVicII. The replication origin of V. cholerae chromosome II
      oriII, the initiator gene rctB and the specific chromosome II
      segregation system parABII were successfully integrated into
      synVicII. Transformation of synVicII proved that the
      synthetic secondary chromosome is able to replicate in E.
      coli. For the efficient assembly, modification and transfer
      of synVicII, different elements were inserted in synVicII:
      For example, an integrated oriT allows the conjugal transfer
      of synVicII, a yeast replication origin and a selection
      marker allows the assembly in yeast and a Flp-FRT-cassette
      allows the removal of elements only needed for construction
      after transfer to final strain. SynVicII was developed to be
      compatible with ModularCloning, which allows the fast and
      efficient integration of new DNA sequences. In the second
      part of this work synVicII was investigated regarding typical
      chromosome characteristics such as stability, copy number and
      genetic integrity. With a newly developed flow-cytometry
      based stability assay it was shown that synVicII is more
      stable than an oriC-based replicon, synEsc. A plate counting
      test confirmed these results and further demonstrated that
      synVicII is more unstable than a 100 % stable synF-plasmid.
      With a developed directed evolution experiments, new stable
      synVicII variants were identified. synVicII revealed in E.
      coli a comparable low copy number relative to oriC, the
      replication origin of the E. coli chromosome, which was shown
      by qPCR and microarray analysis. Copy number analysis also
      indicated that synVicII replicates in E. coli similarly to
      chromosome II in V. cholerae. Thus, synVicII probably starts
      DNA replication later than the E. coli chromosome. Southern
      Blot experiments demonstrated that synVicII in comparison to
      synEsc does not integrate into the E. coli chromosome.
      Besides secondary chromosomes, tertiary chromosomes could
      also be applied in biotechnology. Therefore, the diversity of
      secondary chromosomes of Vibrionaceae was investigated.
      Marker frequency analysis indicated that the eleven analyzed
      members of Vibrionaceae initiate DNA replication of the
      secondary chromosomes later than that of the primary
      chromosome; replication of both chromosomes is terminated
      simultaniously. Nine new synthetic secondary chromosomes with
      different Vibrionaceae replication origins were assembled and
      their potential as tertiary chromosome was initially tested.
      Conjugation experiments showed that all used Vibrionaceae
      replication origins are not compatible with each other. Taken
      together and based on the characteristics so far, synVicII
      revealed great potential to be applied in basic research and
      biotechnology.
description: Synthetische, sekundäre Chromosomen
      sind ein wertvolles Werkzeug, um
      Chromosomenorganisationssysteme zu untersuchen. Anhand ihres
      Designs, ihrer Assemblierung und ihrer Charakterisierung
      können auch wichtige Konstruktionsregeln für synthetische
      Chromosomen abgeleitet werden. In der Biotechnologie könnten
      außerdem synthetische, sekundäre Chromosomen genutzt werden,
      um Mikroorganismen genetisch zu verändern. Für alle
      Anwendungen ist es wichtig, dass das verwendete synthetische,
      sekundäre Replikon gut charakterisiert und beschrieben worden
      ist. In dieser Arbeit wurde das synthetische, sekundäre
      Chromosom synVicII im monochromosomalen Bakterium Escherichia
      coli etabliert und charakterisiert. Als Vorbild für synVicII
      diente das natürlich vorkommende sekundäre Chromosom II von
      Vibrio cholerae, einem Bakterium, welches zwei
      unterschiedlich große Chromosomen besitzt. So wurden der
      Replikationsursprung des zweiten V. cholerae Chromosoms
      oriII, das Initiatorgen rctB und das eigene Chromosomen II
      Segregationssystem parABII in synVicII integriert.
      Transformation in E. coli bewies, dass synVicII erfolgreich
      in E. coli replizieren kann. Für die effiziente
      Assemblierung, Modifizierung und den Transfer von synVicII
      wurden verschiedene Elemente eingebaut: Beispielsweise macht
      ein integrierter oriT synVicII konjugierbar, ein
      Hefereplikationsursprung und ein Selektionsmarker erlauben
      die Assemblierung in S. cerevisiae und eine Flp-FRT-Kassette
      erlaubt die Entfernung von nur für die Konstruktion wichtigen
      Elementen. SynVicII wurde ModularCloning kompatibel
      entwickelt, sodass schnell und effizient neue DNA-Sequenzen
      eingebaut werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde
      synVicII auf wesentliche Charakteristika bakterieller
      Chromosomen wie die Stabilität, die Kopienzahl und die
      genetische Integrität untersucht. Mit einem neu entwickelten
      Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest konnte gezeigt
      werden, dass synVicII deutlich stabiler als ein
      oriC-basiertes Replikon, synEsc, ist. Ein Plattentest
      bestätigte die mit dem neu entwickelten
      Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest bestimmte
      Replikonverlustrate von synVicII. Der Plattentest
      demonstrierte auch, dass synVicII instabiler als ein 100 %
      stabiles synF-Plasmid ist. Mit einem neu entwickelten
      Evolutionsexperiment konnten neue stabilere
      synVicII-Varianten entwickelt und identifiziert werden.
      synVicII besitzt in E. coli eine vergleichbar niedrige
      Kopienzahl relativ zu oriC, was anhand von qPCR und
      Microarray-Analysen geklärt werden konnte. Die
      Kopienzahl-Analyse deutete sogar darauf hin, dass synVicII in
      E. coli ähnlich wie das zweite Chromosom in V. cholerae
      repliziert. Demnach startet synVicII vermutlich später die
      DNA-Replikation als das E. coli Chromosom. Southern Blot
      Analysen demonstrierten, dass synVicII im Gegensatz zu synEsc
      nicht in das E. coli Chromosom integriert. Neben sekundären
      Chromosomen könnten auch noch zusätzlich tertiäre Chromosomen
      in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Deswegen wurde die
      Diversität der sekundären Chromosomen von Vibrionaceae
      untersucht. Marker-Frequency-Analysen deuten darauf hin, dass
      alle sekundären Chromosomen in den 11 untersuchten Vertretern
      der Vibrionaceae die DNA-Replikation später initiieren als
      das erste Chromosom und beide Chromosomen zusammen
      terminieren. Neun neue synthetische Chromosomen mit
      verschiedenen Vibrionaceae Replikationsursprüngen wurden
      assembliert und ihre Eignung als tertiäres Chromosom initial
      getestet. Mit Konjugationstests wurde demonstriert, dass alle
      verwendeten Vibrionaceae Replikationsursprünge untereinander
      nicht kompatibel sind. Zusammengefasst besitzt synVicII mit
      seinen bisherigen charakterisierten Chromosomeneigenschaften
      schon großes Potenzial, um in der Grundlagenforschung und
      Biotechnologie eingesetzt werden zu können.