title: Förderung der Mitose von Fibroblasten in einer Zellkultur durch ein Gemisch von hochkonzentriertem Fibrin(ogen) und rehydrierten, lydophilisierten Thrombozyten
Creators: name: Braun, Florian
Publisher: name: :none
Year: 2008

description: In einer Zellkultur von Fibroblasten wurde die Mitoserate mittels Einbau von 3H-Thymidin am Tag 3, 5 und 7 der Kultur gemessen. Die Fibroblasten wurden unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet, wobei in einer Gruppe dem Nährmedium fetales Kalbserum(FCS) zugesetzt wurde, in den anderen entweder ein Gemisch von Fibrin(ogen), Thrombin und nativen Thrombozyten, oder ein Gemisch von Fibrin(ogen), Thrombin und rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten, bzw. dem durch Zentrifugieren von rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten gewonnenen Überstand, bzw. Zellrest. Die Wachstumsfaktoren PDGF, TGF-ß, EGF, IGF-I, wurden mittels Western blot in rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten, die mit Thrombin inkubiert wurden, sowie im Überstand und Zellrest von rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten ohne Inkubation mit Thrombin bestimmt. Weiters wurde das Integrin GP IIb-IIIa im Überstand und Zellrest bestimmt. Die Mitoserate von Fibroblasten betrug nach drei Tagen Kultur, in der Gruppe, denen im Nährmedium Fibrin(ogen), Thrombin und native Thrombozyten beigegeben wurde 46297,5 +/- 19951,2 cpm/ml. In der Gruppe mit Fibrin(ogen), Thrombin und rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten betrug die Mitoserate 32551,7 +/- 17505,8 cpm/ml und war damit um mehr als achtmal so viel wie die Mitoserate in der Kultur mit FCS (3840 +/-1599 cpm/ml). Der Unterschied ist statistisch hoch signifikant. Die Mitoseraten in den Gruppen, denen der Überstand, bzw. der Zellrest von rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten zugefügt wurden zeigte keinen Unterschied zur der Gruppe mit rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten. Nach 5 und 7 Tagen Kultur nahm die Mitoserate in allen Gruppen ab, in der Gruppen mit rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten, und ihren Fraktionen Überstand, bzw. Zellrest signifikant weniger, als in der Gruppe mit nativen Thrombozyten. In der Gruppe, in der der Zellrest von rehydrierten, lyophilisierten Thrombozyten zugegeben wurde, war nach 7 Tagen die Mitoserate deutlich geringer als in allen anderen Gruppen. Werden rehydrierte, lyophilisierte Thrombozyten mit Thrombin in einer Konzentration von 5,0 U/ml inkubiert lassen sich alle vier Wachstumsfaktoren nachweisen, bei einer Thrombinkonzentration von 0,5 U/ml nur PDGF, TGF-ß EGF, nicht aber IGF. Ohne Inkubation mit Thrombin finden sich in CF alle vier Wachstumsfaktoren in S nur PDGF und TGF-ß. In S und CF konnte das Integrin GP IIb-IIIa nachgewiesen werden und zwar in S deutlich mehr, als in CF. Werden dem Medium einer Fibroblasten-Zellkultur mit rehydrierten, lyophilisierten, bzw. mit CF und S, Fibrin(ogen) und Thrombin Antikörper gegen Wachstumsfaktoren beigegeben und die Mitoserate am dritten Tag gemessen, so ist sie gehemmt, wenn Antikörper gegen PDGF alleine, bzw. Antikörper gegen alle vier Wachstumsfaktoren zugesetzt wurden. Der Zusatz von Antikörper gegen TGF-ß, EGF und IGF alleine zeigt keinen statistisch gesicherten Effekt auf die Mitoserate. Wird der Zellkultur der Fibroblasten mit rehydrierten lyophilisierten Thrombozyten und Thrombin ein Inhibitor von GP IIb-IIIa dazugegeben wird die Mitoserate gehemmt, allerdings erst bei sehr hohen Konzentrationen des Inhibitors. Diese Wirkung ist dosisabhängig. Eine Zellkultur mit Fibrin(ogen), Thrombin, CF und S und zusätzlichem Inhibitor von GP IIb-IIIa in einer Konzentration von 0.1mg/ml enthält nach drei Tagen im Nährmedium ausreichend Wachstumsfaktoren,und zwar in gleicher Verteilung wie im in vitro Versuch ohne Zellkultur. Durch vorliegende Untersuchungen konnte bewiesen werden, dass rehydrierte, lyophilisierte Thrombozyten auf die Mitoserate von Fibroblasten die gleiche Wirkung, wie native Thrombozyten haben. Allerdings haben lyophilisierte Thrombozyten den Vorteil, dass sie einer Hitzesterilisation zugeführt werden können, somit für die Anwendung am Menschen besser geeignet sind. Durch die Lyophilisierung werden die Zellstrukturen der Thrombozyten und die Bindungen der Wachstumsfaktoren an Zellstrukturen unterschiedlich zerstört. PDGF und TGF-ß werden durch den Vorgang der Lyophilisierung aus den Granula herausgelöst und befinden dann in S, während EGF und IGF weiters an Zellstrukturen gebunden bleiben, sich in CF nachweisen lassen und erst durch Zusatz von Thrombin in Lösung gehen. Die Bindung von IGF an seine Zellstruktur scheint auch eine stärkere zu sein als bei den anderen Wachstumsfaktoren, da es eine höhere Konzentration von Thrombin bedarf es aus seiner Bindung zu lösen. Für eine gesteigerte Mitose der Fibroblasten sind zwei Bedingungen notwendig. Einerseits Wachstumsfaktoren, wobei PDGF die stärkste Wirkung hat, anderseits die Verbindung der Fibroblasten entweder miteinander (Zelle an Zelle ), oder an ein Matrixprotein wie Fibrin(ogen). Diese Bindungen werden durch das Integrin GP IIb-IIIa vermittelt. Wird das Integrin GP IIb-IIIa gehemmt, ist auch die Wirkung der Wachstumsfaktoren vermindert.