Μελέτη της παρουσίας, της κατανομής και της παθογένειας των αμυλοειδικών πλακών στα εγκεφαλικά ημισφαίρια, στην παρεγκεφαλίδα, στον προμήκη μυελό και στο οπτικό νεύρο προβάτων με τυπική και άτυπη μορφή της Τρομώδους Νόσου
Creators: name: Τσαούση, Παναγιώτα Ν.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Αμυλοειδικές πλάκες
Τρομώδης νόσος
Εγκέφαλος
Αμφιβληστροειδής
Amyloid plaques
Scrapie
Brain
Retina

description: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της παρουσίας, της κατανομής και της παθογένειας των πλακών αμυλοειδούς στον εγκέφαλο καθώς και των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων και της εντόπισης της PrPSc στον οφθαλμό και στο οπτικό νεύρο προβάτων με τυπική και άτυπη ΤΝ. Για την έρευνα αυτή χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 33 πρόβατα. Τα ζώα προέρχονταν από 15 ποίμνια και με βάση την κλινική εξέταση που διενεργήθηκε, θεωρήθηκαν ύποπτα προσβολής από την κλασική και την άτυπη μορφή της ΤΝ (30 και 3 πρόβατα αντίστοιχα). Πριν από τη θανάτωση των ζώων δείγματα αίματος λαμβάνονταν σε φυαλίδιο που περιείχε αντιπηκτικό EDTA, με στόχο την απομόνωση γενετικού υλικού και την ανίχνευση των πολυμορφισμών του γονιδίου που κωδικοποιεί την prion πρωτεΐνη. Ακολουθούσε η θανάτωση των ζώων, η εξαίρεση των οφθαλμών τους με μέρος του οπτικού νεύρου μήκους 1 εκ. περίπου και η λήψη ιστοτεμαχίων από οχτώ περιοχές του εγκεφάλου (προμήκης μυελός στα επίπεδα του μοχλού και του τραπεζοειδούς σώματος, μέσο της γέφυρας, μέσος εγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα, εγκάρσιες τομές στο ύψος του μαστίου και του οπτικού χιάσματος και προσθίως του μεσολοβίου), για ιστοπαθολογική και ανοσοϊστοχημική εξέταση, καθώς και για την ανίχνευση της PrPSc με τη μέθοδο WB. Για τη μελέτη της ιστοπαθολογικής εικόνας των προαναφερόμενων περιοχών του εγκεφάλου, των οφθαλμών και του οπτικού νεύρου τομές παραφίνης χρωματίζονταν με ΗΕ. Για την ανίχνευση της PrPSc εφαρμόστηκε η ανοσοϊστοχημική μέθοδος LSAB. Επιπρόσθετα, σε διαδοχικές τομές εγκεφάλου σημάνθηκαν ανοσοϊστοχημικά με τη μέθοδο ΑBC οι πρωτεΐνες SAP, 4-HNE, ΑpoE και τα πεπτίδια Αβ40, Αβ42 και Αβ43. Συνεκτιμώντας τα ευρήματα από την ιστοπαθολογική, ανοσοϊστοχημική και τη WB εξέταση, η κλασική ΤΝ επιβεβαιώθηκε σε 30 πρόβατα. Αντίθετα, η παθολογική prion πρωτεΐνη δεν ανιχνεύτηκε με τις παραπάνω τεχνικές στον εγκέφαλο κανενός από τα πρόβατα, τα οποία είχαν θεωρηθεί ύποπτα προσβολής από την άτυπη ΤΝ. Παράλληλα, από τη μελέτη των πολυμορφισμών του PRNP γονιδίου στα κωδικόνια 136, 154 και 171 στα 30 πρόβατα με κλασική ΤΝ ταυτοποιήθηκαν συνολικά 7 γονότυποι (ARQ-ARQ, ARQ-ARH, ARQ-AHQ, VRQ-VRQ, ARQ-TRQ, ARQ-ARR και AHQ-THQ). Οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν στον εγκέφαλο των προβάτων με ΤΝ ήταν εκφυλιστικές, είχαν αμφοτερόπλευρη και συμμετρική κατανομή και χαρακτηρίζονταν από κενοτοπίωση των νευρώνων, σπογγίωση του νευροπιλήματος, γλοίωση, ενώ διαπιστώθηκαν και σφαιροειδή. Παράλληλα, με την εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής εξέτασης ανιχνεύτηκαν στον εγκέφαλο η παρουσία της PrPSc και οι ενδοκυτταρικοί (ενδονευρωνικός, ενδοαστροκυτταρικός), οι σχετικοί με τα κύτταρα της νευρογλοίας (περιαγγειακός, υποεπενδυματικός, υπό τη χοριοειδή μήνιγγα) και το νευροπίλημα (διάστικτος, γραμμικός, περινευρωνικός) τύποι εναπόθεσής της. Στο νευροπίλημα συχνό εύρημα αποτελούσε η παρουσία μη ινιδιακού τύπου πλακών αμυλοειδούς. Στις πλάκες αυτές, ανιχνεύτηκε η prion πρωτεΐνη PrPSc του αμυλοειδούς. Οι πλάκες αυτές διακρίνονταν σε δύο κατηγορίες, τις διάχυτες και τις αστεροειδείς. Οι πλάκες αμυλοειδούς ανιχνεύθηκαν με μεγαλύτερη συχνότητα σε ζώα με ARQ/ARQ γονότυπο. Επιπρόσθετα, στον εγκέφαλο 1 προβάτου με VRQ/VRQ γονότυπο και 2 προβάτων με ARQ/ARQ γονότυπο παρατηρήθηκαν εναποθέσεις της PrPSc του αμυλοειδούς με τη μορφή CAA. Σύμφωνα με τα ευρήματά μας καταδεικνύεται ότι η CAA ανευρίσκεται με χαμηλή συχνότητα στον εγκέφαλο προβάτων με φυσική μορφή της ΤΝ. Παράλληλα, η διαπίστωση CAA σε πρόβατα που δεν έφεραν το αλληλόμορφο γονίδιο V136 πιθανότατα υποδηλώνει την επίδραση και άλλων παραγόντων στην παθογένειά της, όπως του στελέχους του παθογόνου παράγοντα. To SAP ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο όλων των προβάτων στα οποία διαγνώσθηκε ΤΝ και εντοπίστηκε στο τοίχωμα των εγκεφαλικών αγγείων, στον ορό του αίματος και στο κυτταρόπλασμα ορισμένων νευρώνων. Η ανίχνευση του SAP στον εγκέφαλο προβάτων με ΤΝ, ανεξάρτητα από το γονότυπο της PrPC, θα μπορούσε να αποδοθεί σε διαταραχή της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού στην ΤΝ. H ApoE ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο ενός μόνο προβάτου με γονότυπο VRQ/VRQ και εντοπίστηκε στο τοίχωμα των αγγείων του φλοιού, στα οποία είχε προηγηθεί η ανίχνευση της παθολογικής prion πρωτεΐνης. Αντίθετα, δεν ανιχνεύτηκε στις μή ινιδιακού τύπου πλάκες που παρατηρήθηκαν στο νευροπίλημα. Η ΑpoE στην ΤΝ ενδεχομένως δε διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη συσσώρευση της ΡrPSc με τη μορφή εναποθέσεων αμυλοειδούς. Ο δείκτης οξειδωτικής καταπόνησης 4-HNE ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο όλων των προβάτων με ΤΝ. Η παρουσία του 4-HNE στον εγκέφαλο δε συνδεόταν με το γονότυπο της PrPC, γεγονός που καταδεικνύει ότι ο εγκέφαλος στην ΤΝ υφίσταται οξειδωτική καταπόνηση ανεξάρτητα από την ευαισθησία του ξενιστή στη νόσο. Επιπρόσθετα, η συγκέντρωση του 4-ΗΝΕ στα αστροκύτταρα καταδεικνύει πιθανές αρνητικές συνέπειες στη νευροτροφική τους λειτουργία. Το πεπτίδιο Αβ42 ανιχνεύτηκε στον εγκέφαλο 1 παρήλικου προβάτου (7 ετών), το οποίο δεν είχε ΤΝ και εντοπίστηκε στα επιθηλιακά κύτταρα του χοριοειδούς πλέγματος. Η παρουσία της Αβ στον εγκέφαλο του προβάτου συνδεόταν με την ηλικία και όχι με την παθογένεια της ΤΝ. Παράλληλα, στον αμφιβληστροειδή χιτώνα σε 7 πρόβατα με ΤΝ και με γονότυπο ARQ/ARQ διαπιστώθηκαν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις οι οποίες περιελάμβαναν κατά περίπτωση ατροφία της εξωτερικής δικτυωτής στιβάδας, αποδιοργάνωση της αρχιτεκτονικής δομής της εσωτερικής κοκκώδους στιβάδας, παρουσία κενοτοπίων στο σώμα των γαγγλιακών κυττάρων και σε κάποιες περιπτώσεις υπερτροφία των κυττάρων Μϋller, απώλεια του εξωτερικού αφοριστικού υμένα και της αρχιτεκτονικής δομής της εξωτερικής κοκκώδους στιβάδας. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στους υπόλοιπους χιτώνες του οφθαλμού και στο οπτικό νεύρο κανενός από τα πρόβατα που διαγνώσθηκαν με ΤΝ. Με την τεχνική της ανοσοϊστοχημείας, η PrPSc ανιχνεύτηκε στον αμφιβληστροειδή χιτώνα των 7 προβάτων και εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των γαγγλιακών κυττάρων, ενώ δεν ανιχνεύτηκε σε κανένα οπτικό νεύρο. Σύμφωνα με τα παραπάνω ευρήματα θα μπορούσαμε να καταλήξουμε στο συμπέρασμα ότι η PrPSc πιθανότατα δε μεταφέρεται στον αμφιβληστροειδή χιτώνα μέσω του οπτικού νεύρου, αλλά μέσω κάποιων άλλων οδών, όπως για παράδειγμα από τον υπαραχνοειδή χώρο στον περινευρικό χώρο του οπτικού νεύρου και ακολούθως στο σκληρό, στο χοριοειδή και στον αμφιβληστροειδή χιτώνα του οφθαλμού
description: The aim of this study was to detect the presence, the distribution and the pathogenesis of amyloid plaques in the brain as well as the histopathological lesions and the distribution of PrPSc in the eye and the optic nerve of sheep with typical and atypical Scrapie. 33 sheep were used in this study. The animals originated from 15 Greek flocks and according to their physical examination, they were suspect for typical and atypical Scrapie (30 and 3 sheep respectively). EDTA-treated blood was collected from all animals in order to detect the polymorphisms of PRNP gene. The brains and the eyes, including a segment of the optic nerve (1cm), were routinely fixed and eight coronal slices of the brain (medulla oblongata at the level of the obex and the trapezoid body, middle of the pons, mesencephalon, cerebellum and mammilary body, hypophyseal infudibulum and rostral to corpus callosum levels) were selected for histopathological and immunohistochemical examination and for the examination for the presence of PrPSc by WB. For histopathological examination of the above brain areas, the eye and the optic nerve, paraffin sections were stained with HE. The LSAB method was performed for the detection of PrPSc. Subsequently, serial paraffin sections of the brain samples were examined immunohistochemically by avidin-biotin peroxidase complex (ABC) method to detect the presence of SAP, 4-HNE, ΑpoE and Αβ40, Αβ42 and Αβ43 peptides. Regarding the results of histopathological, immunohistochemical and WB examination, typical Scrapie was confirmed in 30 sheep. In contrast, PrPSc was not detected in the brain of the 3 sheep that were suspect for the atypical Scrapie. Moreover, according to PRNP polymorphisms at codons 136, 154, 171, 7 genotypes were confirmed in the 30 sheep with typical Scrapie (ARQ-ARQ, ARQ-ARH, ARQ-AHQ, VRQ-VRQ, ARQ-TRQ, ARQ-ARR and AHQ-THQ). The histopathological lesions that were observed in the brain of sheep with Scrapie, were degenerative, bilateral and symmetrical and included neuronal and neuropil vacuolation, gliosis and the presence of spheroids. Immunohistochemical examination revealed the presence of PrPSc and the intracellular (intraneuronal, intraglial), the associated with neurogloia (perivascular, subependymal, subpial) and the neuropil (fine punctuate, linear, perineuronal) types of PrPSc deposits. In neuropil, a common finding was the presence of non-fibrillar amyloid plaques. PrPSc amyloid prion protein was immumohistochemically detected in these plaques. The amyloid plaques were divided into two distinct types,the diffuse and the stellate. Amyloid plaques were mainly detected in sheep with ARQ/ARQ genotype. Furthermore, in the brain of 1 VRQ-VRQ and 2 ARQ-ARQ sheep, CAA consisting of PrPSc was observed. According to our findings, CAA is rarely detected in sheep with natural Scrapie. The detection of CAA in sheep that did not carry the V136 allele might indicate the contribution of other factors in the pathogenesis of CAA, such as the strain of the agent. SAP was detected in the brain of all Scrapie-affected sheep and was localized in the wall of cerebral vessels, the blood serum and the cytoplasm of some neurons. The detection of SAP in the brain of all sheep with Scrapie, regardless their genotype could be explained by the impairment of the blood-brain barrier in natural Scrapie. ApoE was detected in the brain of 1 VRQ/VRQ sheep and was localized in the wall of cerebral vessels, in which PrPSc was previously detected. In contrast, ΑpoE was not detected in the non-fibrillar amyloid plaques that were observed in neuropil. ApoE might not play a significant role to the aggregation of ΡrPSc in amyloid deposits. 4-HNE was detected in the brain of all Scrapie-affected sheep. The presence of 4-HNE was not correlated with PrP genotype, a finding that indicates that the brain in Scrapie undergoes oxidative stress, regardless the sensitivity of the host. Moreover, the accumulation of 4-HNE in astrocytes implicates possible negative consequences to their neurotrophical functions. Αβ42 peptide was detected in the brain of an old sheep (7 year olds), that was not affected by Scrapie. Αβ42 was detected in the cytoplasm of choroid plexus epithelial cells. The presence of Αβ was an age related finding and was not associated with the pathogenesis of Scrapie. Histopathological lesions were observed in the retina of seven ARQ/ARQ Scrapie-affected sheep and included atrophy of outer plexiphorm layer, disorganization of inner nuclear layer, presence of vacuoles in the ganglion cells and occasionally hypertrophy of Μϋller cells, loss of outer limiting membrane and disorganization of outer nuclear layer. In contrast, histopathological lesions were not observed in the optic nerve in any of the Scrapie-affected sheep. PrPSc was detected in the cytoplasm of the ganglion cells of the retina of the seven sheep, while it was not detected in the optic nerve. According to our results, we could conclude that PrPSc is not transferred to the retina through optic nerve, but with oher routes, such as from the subarachnoid space, into the perineural space of the optic nerve to the epichoroidal and episcleral tisues of the eyeball