title: The influence of the RNA helicase Mss116 on CBP2-assisted splicing of the bI5 group I intron in vitro
Creators: name: Debeljak, Franka
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Um ihre Funktionen korrekt ausführen zu können muss RNA in ihrer nativen Faltungsform vorhanden sein. Der Faltungsweg hängt von der jeweiligen RNA-Art ab. Bisher wurden RNA-Faltung an katalytisch aktiven RNAs, besonders an Gruppe I Introns untersucht, da die Ausbildung ihres natürlichen Faltungszustandes als katalytische Funktion gemessen werden kann. Introns der Gruppe I sind katalytisch aktiv und können in vitro, in Verbindung mit hoher Magnesiumkonzentration, selbst-spleißen. Unter nahezu physiologischen Bedingungen benötigen sie zusätzlich Protein Co-Faktoren, welche die Intronfaltung begünstigen und damit auch das Selbst-spleißen. Zum Beispiel benötigt das mitochondriale bI5 Gruppe I Intron aus Hefe zusätzlich das Cytochrom B pre-mRNA Prozessierungsprotein 2, CBP2, als Co-Faktor für effizientes Spleißen in vitro und in S.cerevisiae. CBP2 stabilisiert die Struktur von bI5, wenn es spezifisch an das Intron bindet und ermöglicht die Ausbildung von Tertiärstrukturen. Diese Bindung ermöglicht bI5 seine natürliche Faltungsform zu erreichen wodurch das Intron spleißen kann. In vivo wird ein weiteres Protein, Mss116, benötigt um ein effektives Spleißen einzuleiten. Mss116 gehört zu der Gruppe von DEAD-box Helikasen, die das Spleißen aller mitochondrialen Introns, Gruppe I und Gruppe II begünstigt, sowie für das Aufwinden und Strang-Annealing benötigt wird. Beide Proteine gemeinsam werden zum Spleißen in vivo benötigt. Das Ziel dieser Diplomarbeit ist erste Erkenntnisse über die Rolle von Mss116 bei CBP2-unterstützter Faltung vom bI5 Intron in vitro zu gewinnen. Dementsprechend haben wir zuerst das Expressions- und Aufreinigungsprotokoll für CBP2 angepasst. Nach erfolgreicher Bestätigung, dass CBP2 das bI5 Spleißen in vitro unter nahezu physiologischen Bedingungen begünstigt, haben wir gezeigt, dass CBP2 keinen Einfluss auf die ATPase Aktivität von Mss116 hat. Dies erlaubte uns weiter das Spleißverhalten von bI5 in Abwesenheit sowie Anwesenheit von einem oder beiden Proteinen zu untersuchen. Wir bestimmten die Spleißeffizienz von bI5 durch gleichzeitige Zugabe von Mss116 und CBP2 zu der denaturierten bI5 pre-RNA oder durch Zugabe von Mss116 zum CBP2-bI5 Komplex. In beiden Fällen förderte Mss116 das CBP2-unterstütze bI5 Spleißen. Dies wird durch die 2-fach – 5.5-fach erhöhte Geschwindigkeitskonstante, verglichen mit CBP2-unterstütztem bI5 Spleißen in Abwesenheit von Mss116, gezeigt. Wenn sowohl Mss116 als auch CBP2 in höherer Konzentration vorhanden waren, stieg die Spleißrate nur 2-fach an. Eine Erklärung dafür wäre, dass Mss116 den CBP2-RNA Komplex bis zu einem gewissen Grad stört und somit die Spleißeffizienz senkt. Folglich ist der Zeitpunkt der Mss116-Zugabe kein entscheidender Faktor; Mss116 dürfte sowohl frühere als auch spätere Faltungsschritte während dem CBP2-unterstützten bI5 Faltungsweg beeinflussen. Zuletzt erwogen wir die Möglichkeit, dass Mss116 nur benötigt wird um die Faltung von vollständigem Intron zu begünstigen. Dementsprechend untersuchten wir verschiedene Bedingungen, welche das Selbst-spleißen des vollständigen bI5 Introns mit kurzen Exons in Anwesenheit beider Spleißfaktoren ermöglichen würden. Bisher wurde aber kein Spleißen dieses Konstruktes unter verschiedensten Bedingungen beobachtet. Es ist möglich, dass Mss116 nicht unbedingt für die korrekte Faltung von großen peripheren Verlängerungen notwendig ist, jedoch für die Auflösung inhibitorischer Strukturen in den Exons. Solch eine Rolle wurde auch beim ai5γ Gruppe II Intron, welches lange Exons enthält, vorgeschlagen.
description: RNA has to fold into its native fold to carry out its proper functions. The folding pathways vary for different types of RNA. So far, RNA folding principles have mostly derived from catalytic RNA, in particular from group I introns, as native state formation can be measured as a function of catalysis. Group I introns are catalytically active and have self-splicing ability under high magnesium concentrations in vitro. At near physiological conditions they require the addition of protein co-factors to promote intron folding and in turn self-splicing. For example, the yeast mitochondrial bI5 group I intron requires the cytochrome b pre-mRNA processing protein 2, CBP2, as an essential co-factor for efficient splicing both in vitro and in S. cerevisiae. CBP2 stabilizes the bI5 structure by binding in a specific manner to the intron and capturing tertiary interactions. This allows bI5 to reach its native fold and to carry out splicing. In vivo, a second protein Mss116 is needed to promote efficient bI5 splicing. Mss116 is a DEAD-box helicase promoting splicing of all mt introns, group I and group II introns, as well as showing unwinding and strand-annealing activity. Both proteins are needed in vivo to stimulate efficient splicing. The aim of this diploma thesis was to provide the first insights into the role of Mss116 in CBP2-assisted folding of the bI5 intron in vitro. Accordingly, we first adapted the previously published expression and purification protocol for CBP2. After confirming the ability of CBP2 to promote bI5 splicing in vitro under near-physiological conditions, we were able to show that CBP2 does not affect the ATPase activity of the DEAD-box helicase Mss116. This allowed us to study the efficiency of bI5 splicing in the absence and presence of either or both proteins. We determined the bI5 splicing efficiency by adding Mss116 and CBP2 concomitantly to the denatured bI5 pre-RNA or Mss116 to the native CBP2-bI5 complex. In both cases, the DEAD-box protein did enhance CBP2-assisted bI5 splicing. This is indicated by the fact that the observed rate constant of splicing is 2-fold – 5.5-fold increased, when compared to that of CBP2-mediated bI5 splicing in the absence of Mss116. When Mss116 and CBP2 were present at higher concentrations during the bI5 folding, the splicing efficiency was only 2-fold enhanced. Among other explanations, it is possible that Mss116 disrupts the CBP2-RNA complex to some extent, thereby reducing the splicing efficiency. Thus, the time point of Mss116 addition is not a critical determinant; it may influence both earlier and later steps along the CBP2-assisted bI5 folding pathway. At last, we considered that Mss116 is only required to facilitate folding of the full-length intron. Accordingly, we attempted to identify conditions that allow self-splicing of the natural bI5 intron flanked by short exons in the presence of both splicing factors. So far, splicing of this constructs has not been observed under a variety of conditions. It is well possible that Mss116 is not necessary for proper folding of the large peripheral extensions, but to resolve inhibitory structures within the exons. Such a role has also been proposed for the ai5γ group II intron when embedded within long exons.