title: Role of the mitochondrial carrier Rim2 and the transcription factor Yap5 in the iron metabolism of Saccharomyces cerevisiae
title: Rolle des mitochondrialen Carriers Rim2 und des Transkriptionsfaktors Yap5 im Eisenmetabolismus von Saccharomyces cerevisiae
Creators: name: Rietzschel, Nicole
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Biowissenschaften, Biologie
Eisenmetabolismus
Yap5
mitochondriale Carrier
Iron-sulfur-cluster biogenesis
Iron metabolism
Saccharomyces cerevisiae
Eisen-Schwefel-Cluster
Rim2
Iron-sensing

description: Iron is an essential trace element
      for life and has a fundamental role in many metabolic
      processes including mitochondrial respiration, amino acid and
      nucleotide synthesis, ribosome assembly, DNA replication and
      DNA repair. However, elevated levels of cellular iron are
      highly toxic, necessitating sophisticated strategies for
      intracellular transport and sensing of iron to avoid both
      iron deprivation and iron overload. The current work was
      concentrated on the mechanism of mitochondrial iron supply
      and the mode of sensing high iron concentrations within the
      cytoplasm. Mitochondria utilize the majority of the cellular
      iron for the biogenesis of iron-sulfur (Fe/S) proteins and
      heme. Previous studies have identified a critical role of the
      mitochondrial carrier proteins Mrs3 and Mrs4 in iron uptake,
      yet deletion of their genes in yeast is not lethal. Since the
      process of Fe/S protein biogenesis is essential for cell
      viability, alternative pathways for iron uptake into
      mitochondria must exist. Recently, overproduction of the
      mitochondrial carrier Rim2 was shown to suppress the
      phenotype of mrs3/4Δ cells in iron transport suggesting that
      this carrier protein may serve as another iron transporter in
      S. cerevisiae. Surprisingly, Rim2 was also shown to function
      as a pyrimidine nucleotide transporter raising the question
      of how the latter well-defined role may be compatible with an
      iron transport function. The first part of this work provides
      evidence that the deletion of RIM2 in mrs3/4Δ cells
      exacerbated their poor growth, and had a further negative
      impact on the biogenesis of mitochondrial Fe/S proteins.
      Conversely, overexpression of RIM2 was able to restore Fe/S
      protein maturation and heme synthesis of mrs3/4Δ cells to
      wild-type levels suggesting that high concentrations of Rim2
      facilitate mitochondrial uptake of reasonable amounts of
      iron. Direct biochemical evidence for this idea was derived
      from in vitro transport experiments in collaboration with Dr.
      Wiesenberger and colleagues using sub-mitochondrial particles
      and a trapped fluorescent dye which is quenched by iron.
      Collectively, the combination of in vivo, in organello, and
      in vitro studies suggest that the mitochondrial carrier Rim2
      obligatorily co-translocates pyrimidine nucleotides and
      divalent metals including iron. Under physiological
      conditions, however, the majority of iron is transported via
      Mrs3 and Mrs4. The second part of this work was focused on
      the iron-sensing transcription factor Yap5 from S. cerevisiae
      that plays a central role in the adaptation of budding yeast
      to toxic iron levels. The divalent metal transporter Ccc1,
      the only known vacuolar iron importer in fungi and plants is
      crucial for this detoxification. Recently, the transcription
      factor Yap5 was shown to activate the expression of CCC1. The
      biochemical mechanism underlying iron sensing by Yap5 is so
      far unknown. Here, I show that the activator domain of Yap5
      (tYap5) binds radioactive iron (55Fe) when tYap5 is
      overproduced in yeast. Circular dichroism, electron
      paramagnetic resonance, and Mössbauer spectroscopy of
      recombinant tYap5 showed that the protein binds a [2Fe-2S]
      cluster after chemical reconstitution. This [2Fe-2S] cluster
      is coordinated by the N-terminal cysteine-rich domain (n-CRD)
      of the activator domain and is essential for transcriptional
      activity. Fe/S cluster binding to tYap5 induces a
      conformational change that likely modulates the
      transcriptional activity of Yap5. Surprisingly, in vitro Yap5
      binds a second Fe/S cofactor at the C-terminal CRD, yet this
      metal binding motif is not involved in iron sensing in vivo.
      The Fe/S cluster binding motif within the n-CRD regulatory
      domain of Yap5 is conserved in the basic leucine zipper
      transcription factor HapX that is wide-spread in fungi and
      that is crucial for virulence of fungal pathogens. Hence, the
      Fe/S cluster of Yap5 represents a novel sensor module that is
      frequently utilized by eukaryotic stress response regulators.
      Taken together, the work on Yap5 has provided fundamental new
      insights into the mechanism of high iron sensing and
      regulation by iron-responsive transcription factors in
      fungi.
description: Eisen ist ein essentielles
      Spurenelement mit entscheidenden Funktionen in einer Vielzahl
      an metabolischen Prozessen wie der mitochondrialen Atmung,
      Aminosäure- und Nukleotid-Synthese, Ribosomen-Assemblierung,
      DNA-Replikation und DNA-Reparatur. Jedoch sind erhöhte
      zelluläre Eisenkonzentrationen toxisch für die Zelle. Daher
      ist eine exakte Regulation des intrazellulären Transports und
      der Erfassung des Eisenstatus erforderlich, um sowohl
      Eisenmangel als auch Eisenüberschuss zu vermeiden. Die
      vorliegende Arbeit widmet sich deshalb dem Mechanismus der
      mitochondrialen Eisenaufnahme und der Adaption an erhöhte
      Eisenmengen. Mitochondrien sind essentielle Organellen, die
      unter anderem eine entscheidende Rolle in der
      Eisen-Schwefel-(Fe/S)-Cluster- und in der Häm-Biogenese
      spielen. Aufgrund dieser Stoffwechselleistungen konsumieren
      Mitochondrien den größten Anteil des in die Zelle
      aufgenommenen Eisens. Frühere Studien konnten die
      mitochondrialen Carrier-Proteine Mrs3 und Mrs4 als
      mitochondriale Eisentransporter charakterisieren. Allerdings
      ist die simultane Deletion beider Gene für die Hefezellen
      nicht letal. Da die Fe/S-Cluster Biogenese essentiell ist,
      lässt dies auf einen weiteren Carrier schließen, der
      ebenfalls in der Lage ist, Eisenionen zu transportieren. Ein
      vielversprechender Kandidat ist der mitochondriale Carrier
      Rim2. Auch wenn dieser ursprünglich als Pyrimidintransporter
      charakterisiert wurde, häufen sich die Hinweise auf eine
      zusätzliche Funktion in der Eisenaufnahme. Dabei stellt sich
      die Frage, inwiefern sich die gut dokumentierte
      Transportfunktion für Pyrimidine mit einer möglichen Rolle im
      Eisentransport vereinen ließe. Im ersten Teil dieser Arbeit
      konnte gezeigt werden, dass die zusätzliche Deletion von RIM2
      die in mrs3/4Δ Zellen vorhandene Defekte im Wachstum und in
      der Biosynthese von Eisen-abhängigen Proteinen verstärkt.
      Dagegen rettet die Überexpression von RIM2 in mrs3/4Δ Zellen
      die Maturierung der Fe/S-Proteine und der Häm-Synthese auf
      Wildtypniveau. Demzufolge sind hohe Konzentrationen von Rim2
      ausreichend, um die mitochondriale Eisenversorgung in mrs3/4Δ
      Zellen wiederherzustellen. Der direkte biochemische Nachweis
      für eine Transportfunktion von Rim2 wurde durch in vitro
      Transportexperimente mit sog. submitochondrialen Partikeln in
      Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Dr. Wiesenberger (Wien)
      geliefert. Zusammengenommen zeigen die in vivo, in organello
      und in vitro Experimente, dass Rim2 als mitochondrialer
      Carrier den obligatorischen Co-Transport von Pyrimidinen und
      divalenten Metallionen einschließlich Fe2+ vermittelt. Diese
      Modelvorstel-lung erklärt, wie die mitochondriale
      Eisenaufnahme in mrs3/4Δ Zellen gesichert werden kann und wie
      Rim2 als „high copy suppressor“ von mrs3/4Δ Zellen fungiert.
      Eine Funktion des Rim2 in der mitochondrialen Eisenhomöostase
      unter normalen physiologischen Bedingungen, d.h. in
      Anwesenheit von Mrs3 und Mrs4, ist jedoch vernachlässigbar.
      Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die
      Charakterisierung des Sensors für hohe Eisenkonzentrationen,
      Yap5, der eine zentrale Rolle bei der Anpassung an toxische
      Eisenmengen in S. cerevisiae spielt. Bei Eisenüberschuss
      aktiviert der Transkriptionsfaktor Yap5 die Expression von
      CCC1, dem einzigen bekannten vakuolären Eisenimporter, was
      zur Speicherung von Eisen in der Vakuole und damit zur
      Vermeidung einer toxischen Eisenakkumulation im Cytosol
      führt. Wie Yap5 biochemisch den Eisenstatus der Zelle
      erfasst, ist allerdings unklar. Zunächst konnte die direkte
      Bindung von radioaktivem Eisen (55Fe) an die Aktivator-Domäne
      von Yap5 (tYap5) in vivo nachgewiesen werden.
      Zirkular-dichroismus-, Elektronenspinresonanz- und
      Mößbauer-Spektroskopie des rekombinanten tYap5 belegten die
      Bindung eines [2Fe-2S]-Clusters an tYap5 nach chemischer
      Rekonsti-tution. Dieser [2Fe-2S]-Cluster wird durch die
      N-terminale Cystein-reiche-Domäne (n-CRD) in der
      Aktivator-Domäne koordiniert und ist entscheidend für die
      transkriptionelle Aktivität. Des Weiteren induziert die
      Fe/S-Cluster-Bindung an tYap5 eine Konformationsänderung, die
      möglicherweise geeignet ist, die Transkriptionsaktivität von
      Yap5 zu modulieren. Zusätzlich bindet Yap5 in vitro einen
      zweiten Fe/S-Cofaktor an der C-terminalen CRD, der nicht an
      der Regulation der transkriptionellen Aktivität von Yap5 in
      vivo beteiligt ist. Dagegen ist das
      Fe/S-Cluster-Bindungsmotiv innerhalb der regulatorischen
      n-CRD von Yap5 in mehreren Pilzarten konserviert, u.a. auch
      im Aspergillus Transkriptionsfaktor HapX. Daher könnte dieses
      Motiv als konservierte Bindungsstelle für einen sensorischen
      Fe/S-Cluster in der eukaryotischen Stressantwort fungieren.
      Zusammengefasst hat diese Arbeit an Yap5 grundlegende neue
      Einblicke in den transkriptionellen Mechanismus der Erfassung
      und Regulation des Eisenstatus in Pilzen geliefert. Yap5
      konnte somit als erster eukaryotischer Transkriptionsfaktor,
      der einen Fe/S-Cluster als Sensor für intrazelluläre
      Eisenkonzentrationen nutzt, charakterisiert werden.