title: Analyse biologischer Effekte eines Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindenden Proteins (FGF-BP) in Tumoren über verschiedene Knockdown-Strategien
title: Analysis of biological effects of fibroblast growth factor-binding protein (FGF-BP) through different knockdown strategies
Creators: name: Schulze, Daniel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Krebs
Apoptosis
Colonkrebs
Fibroblastenwachstumsfaktor
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindendes Protein (FGF-BP)
Rezeptor-Tyrosinkinasen
Medizin, Gesundheit
RNS-Interferenz
fibroblast growth factor-binding protein (FGF-BP)
Hammerkopf-Ribozym

description: Fibroblast growth factors (FGFs)
      are important regulators of cell proliferation and
      differentiation. In neoplastic growth, they act as powerful
      mitogens inducing cell migration and invasion. Since some
      cancer-relevant FGFs are tightly bound to the extracellular
      matrix (ECM), their release is one of the critical steps in
      FGF bioactivation. The FGF-binding protein (FGF-BP) is a
      secreted, heparin-binding protein that interacts with certain
      FGFs, releasing them from their extracellular storage. Hence,
      FGF-BP plays a significant role in FGF bioactivation. It has
      been shown to interact non-covalently with FGF1, FGF2, FGF7,
      FGF10 and FGF22. FGF-BP is upregulated in several tumors and
      it is associated in particular with early stages of tumor
      formation, where angiogenesis plays a critical role. In a
      nude-mouse model FGF-BP is a rate-limiting factor in tumor
      growth. In this thesis, various knockdown strategies were
      explored to examine the contribution of FGF-BP to
      proliferation and apoptosis. By means of vector-based RNAi,
      isogenic colon carcinoma cell lines with permanently reduced
      FGF-BP levels were generated. It was shown that depletion of
      endogenous FGF-BP exerts anti-proliferative as well as
      pro-apoptotic effects in tumor cells. By selection of several
      clones with a robust gene knockdown, a dose-dependence of
      cell proliferation and apoptosis on the FGF-BP expression was
      established. To address the underlying cellular and molecular
      mechanisms in more detail, a variety of methods including
      flow cytometry, protease assays and Western blotting were
      emplyed. Compared to the parental cells the
      knockdown-phenotype exhibited distinct changes in cellular
      survival-, MAPK- and apoptosis signalling. FGF-BP
      downregulation induced increased levels of BH3-only domain
      proteins Bad and Bax, leading to enhanced Caspase 3/7
      activity. In parallel, suppression of Akt kinases, activation
      of SAPK/ JNK and increased levels of GSK3β were detected.
      Alterations in the cell cycle distribution upon knockdown of
      FGF-BP with a marked increase of cells in the G0/G1-Phase
      could be demonstrated by FACS analysis. Additionally,
      upregulation of p21WAF1/CIP1 protein and cell cycle
      prolongation were observed. Furthermore, these
      loss-of-function mutants showed alterations in O2 consumption
      and in the redox status. Antibody arrays revealed increased
      levels of HIF1α and downregulation of catalase, indicating an
      impaired protection of cancer cells against oxidative stress
      upon depletion of FGF-BP. In a cervical cancer model it could
      be demonstrated that ribozyme-mediated reduction of FGF-BP
      led to altered sensitivities towards certain anticancer
      drugs. Synergistic effects of FGF-BP knockdown and
      chemotherapy were observed in the case of the topoisomerase I
      inhibitor irinotecan but not for microtubule-interfering
      agents emphasizing the cell cyle phase dependency of FGF-BP
      action. Beyond these in vitro experiments, an RNAi-based
      treatment study for therapeutic inhibition of FGF-BP in vivo
      was performed. Through polyethylenimine-based polymeric
      nanoparticles, siRNA-delivery was achieved that resulted in a
      specific FGF-BP knockdown and tumor-inhibiting effects in an
      s.c. colon carcinoma model. In order to screen for novel
      binding partners of FGF-BP, full-length FGF-BP as well as
      various mutant FGF-BP deletion constructs were cloned and
      recombinantly expressed. Protein-protein interaction studies
      revealed new ligands for FGF-BP within the FGF family (FGF4,
      FGF8). Moreover, the DNA-associated high-mobility group A
      (HMGA) protein was identified as a new binding partner for
      FGF-BP. In vitro stabilization assays revealed the affinity
      of FGF-BP to nucleic acids. In the presence of genomic DNA
      enhanced protein stability was observed. Taken together,
      these data support the hypothesis of a recently discovered
      and so far unexplored intracellular mechanism of FGF-BP
      action. In conclusion, this thesis elucidates the role of
      FGF-BP in a complex network of cytoprotective and
      proliferative effects. It could be demonstrated that the
      selective depletion of FGF-BP increases the cellular rate of
      apoptosis and causes cell cycle prolongation, leading to
      reduced tumor growth. Moreover, the findings allow to better
      evaluate the efficacy of an antitumoral therapy based on the
      knockdown of FGF-BP expression. Thus, FGF-BP represents a
      promising therapeutic target in the treatment of
      cancer.
description: Fibroblasten Wachstumsfaktoren
      (FGFs) spielen eine bedeutende Rolle bei der
      Zellproliferation und -differenzierung. Bei neoplastischem
      Wachstum fungieren FGFs als potente Mitogene. Einige der
      tumorrelevanten FGFs binden jedoch mit hoher Affinität an
      eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix
      (EZM) und die Freisetzung der FGFs aus der EZM stellt einen
      kritischen Schritt in der FGF-Bioaktivierung dar. Das
      FGF-bindende Protein FGF-BP ist ein sekretiertes
      Heparin-bindendes Protein, welches mit mehreren FGFs, wie
      FGF1, FGF2, FGF7, FGF10 sowie FGF22, spezifisch interagiert
      und diese aus ihrem extrazellulären Speicherort freisetzt.
      FGF-BP ist in verschiedenen Tumoren, insbesondere in der
      frühen Phase der Karzinogenese, hochreguliert. Die
      (Über-)expression von FGF-BP in Tumorzellen stellt einen
      limitierenden Faktor für die Etablierung solider Tumore dar.
      Im Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene
      Knockdown-Strategien exploriert um FGF-BP hinsichtlich seines
      Beitrags zu Proliferation und Apoptose sowie zum in
      vivo-Tumorwachstum zu untersuchen. Unter Verwendung von
      vektorbasierter RNAi wurden isogene Kolonkarzinom-Zelllinien
      mit permanent vermindertem FGF-BP-Level generiert. Es wurde
      gezeigt, dass die Reduktion der FGF-BP-Level sowohl
      antiproliferative Effekt als auch pro-apoptotische Effekte
      hervorruft. Die Herunterregulation von FGF-BP ging einher mit
      komplexen zellulären und molekularen Veränderungen, u.a. in
      der MAPK- und Apoptose-Signaltransduktion. Im Vergleich zu
      den parentalen Zellen wies der knockdown-Phänotyp erhöhte
      Spiegel an aktiviertem Bad und Bax auf, was zu einer
      gesteigerten Aktivität der Effektorcaspasen 3 und 7 führte.
      Gleichzeitig wurde in FGF-BP-herunterregulierten Zellen eine
      Suppression von Akt Kinasen, eine Aktivierung von SAPK/JNK
      und eine Induktion der GSK3β detektiert. Klone mit
      vermindertem FGF-BP-Gehalt akkumulierten vermehrt in der
      G0/G1-Phase des Zellzyklus und wiesen erhöhte Konzentrationen
      an aktiviertem p21WAF1/CIP auf. Darüber hinaus zeigten diese
      loss-of-function-Mutanten Alterationen im Redoxstatus auf,
      was sich in einer erniedrigten Katalasekonzentration sowie
      erhöhten Konzentrationen an HIF1α widerspiegelte. In einem
      Zervixkarzinom-Modell wurde mit Hilfe eines
      Ribozym-Targetings gezeigt, dass FGF-BP die Sensitivität
      gegenüber Chemotherapeutika beeinflusst. Synergistische
      Effekte eines Knockdowns und einer Antitumorbehandlung waren
      nachweisbar bei dem Topoisomerase I Inhibitor Irinotecan,
      nicht aber bei den Spindelgiften Docetaxel und Vinorelbin. In
      einem in vivo-Experiment gelang es, mit Hilfe einer auf
      Polyethylenimin (PEI) basierenden Applikation von
      therapeutischen Nukleinsäuren (FGF-BP-siRNAs) einen
      spezifischen FGF-BP-Knockdown sowie einen antitumoralen
      Effekt im Kolonkarzinom-Nacktmausmodell zu erzielen. Um neue
      Interaktionspartner für FGF-BP aufzufinden, wurden
      unterschiedliche full length- sowie Deletionsmutanten des
      Proteins kloniert und rekombinant exprimiert. Durch
      Protein-Protein-Interaktions-Analysen konnten weitere
      Liganden für FGF-BP innerhalb der FGF-Familie ermittelt
      werden (FGF4, FGF8). Darüber hinaus wurde das DNA-assoziierte
      High-Mobility Group A-Protein (HMGA) als neuer Bindepartner
      für FGF-BP identifiziert. Ferner zeigten in
      vitro-Untersuchungen eine Affinität von FGF-BP zu
      Nukleinsäuren. In Anwesenheit von genomischer DNA wies FGF-BP
      eine erhöhte Proteinstabilität auf. Diese Daten unterstützen
      die Hypothese eines erst kürzlich ermittelten und bislang
      noch nicht näher untersuchten intrazellulären Mechanismus von
      FGF-BP. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass FGF-BP BP bei
      proliferativen sowie zytoprotektiven Vorgängen in ein
      komplexes molekulares Netzwerk eingebunden ist. Die in dieser
      Arbeit ermittelten Daten demonstrieren, dass eine gezielte
      Verminderung der FGF-BP-Expression das Ausmaß der zellulären
      Apoptose erhöht, eine anti-proliferative Wirkung hervorruft
      und das Tumorwachstum in vivo vermindert. Die beschriebenen
      Untersuchungen zur Chemoresistenz erlauben eine Abschätzung
      der selektiven Sensitivität von Tumorzellen gegenüber
      verschiedenen Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der
      FGF-BP-Expression. Es kann somit gefolgert werden, dass
      FGF-BP ein vielversprechendes Zielmolekül (target) in der
      Antitumortherapie darstellt.