title: TAT-SMN1-mediated protein delivery into mammalian cells
Creators: name: Kurtovic, Azra
Publisher: name: :none
Year: 2018

description: Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine schwerwiegende, autosomal-rezessiv vererbte neurodegenerative Erkrankung mit einer Trägerwahrscheinlichkeit von 1:40–1:60. Die Erkrankung betrifft eine von 10.000 Lebendgeburten pro Jahr. Spinale Muskelatrophie wird durch die Deletion des survival motor neuron 1 (SMN1) Gens bzw. durch eine Mutation desselben verursacht. Dadurch kommt es zur Verminderung der SMN1-Proteinmenge, der sich im Verlust von Alpha-Motorneuronen im Rückenmark äußert. Dieser Verlust führt zu einer Schwäche der Glieder- und Rumpfmuskulatur. Die Krankheit wird in vier Gruppen untergliedert, die vom Schweregrad und dem Ausbruchsalter abhängen. Unterschiedliche therapeutische Maßnahmen werden derzeit untersucht, aber bis jetzt gibt es noch keine Heilung von SMA. Einer der bedeutendsten Ansätze liegt in der Erhöhung der SMN1- Proteinmenge in den Motorneuronen, sodass diese wieder auf das Niveau eines Gesunden angeglichen wird. Es konnte gezeigt werden, dass das zellpenetrierende Peptid TAT (transactivating transcriptional activator) die Zellmembran, wie auch die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. In dieser Forschungsarbeit wurde ein Protokoll zur Aufreinigung von TATSMN1, einem Fusionsprotein, erstellt. Wir konnten aufzeigen, dass das Protein über einen Zeitraum von 72 Stunden stabil ist und dass es keinen zytotoxischen Auswirkungen auf NIH3T3-Zellen hatte. Wir untersuchten die Fähigkeit des Proteins, die Zellmembran zu passieren und in die Zelle bzw. den Zellkern einzutreten. Dies wurde mithilfe von Westernblot-Versuchen bestätigt. Unsere Resultate bilden eine vielversprechende Basis für weitere Versuche an anderen Zelltypen bzw. für in-vivo Versuche in der Zukunft.
description: Spinal muscular atrophy (SMA) is a severe autosomal recessive disease with a carrier frequency of 1:40–1:60 that affects 1 in 10.000 live births. SMA is caused by either deletions or mutations within the survival motor neuron 1 (SMN1) gene. This sort of changes leads to decreased levels of full-length SMN protein, resulting in a loss of alpha-motor neurons in the spinal cord that leads to atrophy and weakness of limb and trunk muscles. The disease is categorized into four groups, depending on age of onset and severity. Currently, there is no cure for SMA. Different therapeutic strategies are under investigation. One approach involves restoring SMN to physiological concentrations in motor neurons. This should lead to a rescue of the phenotype. Trans-activating transcriptional activator (TAT) has been shown to cross the cell membrane and the blood-brain barrier (BBB). In this study, we aimed to establish a protocol for purification of a previously expressed TAT-SMN1 fusion protein. We were able to show that the protein is stable for over 72 hours and has almost no cytotoxic effect on NIH3T3 cells. We tested TAT-SMN1’s ability to cross cell membranes and enter the cytoplasm and cell nuclei. Immunodetection has indicated that upon treatment of NIH3T3 cells with TAT-SMN1, the protein can be localized within cells and their nuclei. Western blot analysis of TAT-SMN1 previously treated with lysates confirmed this result. Our observations serve as a promising basis for further experiments in other cell types and for in vivo experiments in the future.