title: Einfluss des Transkriptionsfaktors Miz1 auf die Regulation des Autophagieprozesses in Fibroblasten
title: Impact of the transcription factor Miz1 on the regulation of the autophagic process in fibroblasts
Creators: name: Berliner, Sophie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Autophagie
Autophagy
Fibroblast
Medizin, Gesundheit
Miz1
Fibroblasten

description: Autophagie ist ein physiologischer
      und evolutionär hoch konservierter Prozess, bei dem zelluläre
      Bestandteile sequestriert und schließlich recycelt werden. Er
      ermöglicht es der Zelle, ihr Überleben unter
      Stressbedingungen zu sichern und sich veränderten
      Umweltbedingungen anzupassen. Hierfür werden Bestandteile des
      Zytoplasmas von einer Doppelmembran umschlossen, indem sich
      eine Phagophore bildet, die sich schrittweise verlängert und
      sich schließlich zu einem Autophagosom schließt. Das auf
      diese Weise sequestrierte zytoplasmatische Material wird
      einem Abbau durch lysosomale Enzyme zugeführt, indem das
      Autophagosom mit einem Lysosom fusioniert. An der Induktion
      der Autophagosomenbildung sowie an den einzelnen
      Reifungsschritten sind zahlreiche Proteine
      Autophagie-assoziierter Gene beteiligt. In Vorarbeiten gab es
      starke Hinweise dafür, dass der Transkriptionsfaktor Miz1 an
      der Regulati- on des autophagischen Prozesses beteiligt ist.
      Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Genexpres- sion von
      Miz1 durch AS-Entzug (EBSS Inkubation) induziert wird, was
      eine Rolle von Miz1 bei der Anpassung an nährstoffarme
      Bedingungen vermuten lässt. Auf morphologischer Ebene konnte
      die wichtige Funktion von Miz1 für den autophagischen Prozess
      bestätigt werden. Elektronenmikro- skopische Untersuchungen
      konnten einen Defekt der Reifung autophagischer Vakuolen in
      Zellen ohne Miz1 nachweisen. Zudem konnte gezeigt werden,
      dass dieser Defekt durch die Substitution von humanem Miz1
      aufgehoben werden kann. Die Tatsache, dass auch eine
      Inkubation mit EBSS die Fähigkeit von ∆POZ Zellen zur
      Autophagosomenreifung wiederherstellte, legt nahe, dass der
      autophagische Prozess in embryonalen Fibroblasten während
      basaler oder stimulierter Autophagie auf unterschiedliche Art
      und Weise reguliert wird. Die Blockierung der
      Autophagosomenreifung scheint bei Autophagie-Induktion durch
      Miz1-unabhängige Mechanismen überwunden zu werden. Um
      einzugrenzen, an welchen Teilschritten des autophagischen
      Prozesses Miz1 beteiligt ist, wur- den Genexpressionsanalysen
      Autophagie-assoziierter Gene in Zellen mit und ohne
      funktionstüch- tigem Miz1 durchgeführt. Für die Experimente
      wurden embryonale Mausfibroblasten verwendet, die entweder
      nach dem 3T3-Protokoll immortalisiert worden waren (3T3 MEFs)
      oder durch einen shRNA vermittelten Knockdown von p19ARF
      (MEFsARF ). Die Messungen ergaben, dass die Ex- pressionen
      der Autophagie-assoziierten Gene Atg9b und Atg16L2 während
      basaler Autophagie durch Miz1 reguliert werden. Zudem gab es
      Anhaltspunkte, dass möglicherweise noch weitere Ge- ne des
      Ubiquitin-ähnlichen Konjugationssystems durch Miz1 reguliert
      werden könnten. Es konnte somit gezeigt werden, dass Miz1 auf
      molekularer Ebene einen Einfluss auf einige Teilschritte der
      Autophagie ausübt und zwar insbesondere auf Schritte der
      Reifung von Autophagosomen. Diese Ergebnisse auf
      Genexpressionsebene ergänzen die auf morphologischer Ebene
      gefundenen Hin- weise auf gravierende Defekte in Zellen
      während der Reifung von Autophagosomen die lediglich das
      trunkierte Miz1 aufwiesen. Die Initiation der Autophagie
      scheint nach den Ergebnissen dieser Arbeit weitgehend
      unabhängig von Miz1 zu verlaufen. Darauf lassen die
      unveränderten Genexpres- sionen von ULK1 und ULK2 in Zellen
      mit oder ohne Miz1 schließen. Bestätigt wurde dies zudem
      durch die Tatsache, dass sowohl in Zellen mit als auch in
      Zellen ohne Miz1 autophagische Vakuolen ausgebildet wurden.
      Es ist bekannt, dass Miz1 seine transkriptionelle Aufgabe in
      Zusammenarbeit mit verschiede- nen Partnern vollbringt. Es
      konnte gezeigt werden, dass Miz1 die Genexpression seines
      wichtigsten Partners Myc reguliert. Außerdem legen die
      Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass ARF, ein weiterer Partner
      von Miz1 und Myc, entscheidenden Einfluss auf Miz1 hat: ARF
      scheint sowohl die Genex- pression von Miz1 als auch die
      Expressionsregulation anderer Gene durch Miz1 zu
      beeinflussen. Um für zukünftige Ansätze den Einfluss von Miz1
      auf die Autophagie weiter aufzuklären, ist es sinnvoll,
      weitere detaillierte morphologische Untersuchungen
      durchzuführen. Die Daten dieser Arbeit legen nahe, dass die
      Genexpressionsanalyse einzelner Atg-Gene für Untersuchungen
      akut induzierter Autophagie weniger aufschlußreich ist. Den
      Ergebnissen nach zu urteilen, scheint akute Autophagie nicht
      durch veränderte Expressionsmuster von Atg-Genen reguliert zu
      werden. Es wäre denkbar, dass sich als Antwort auf die EBSS
      Inkubation zunächst die Expression von Miz1 ändert und erst
      längerfristig die Expressionen Autophagie-assoziierter Gene
      angepasst werden. Dies würde bedeuten, dass bei Durchführung
      der Messungen sechs Stunden nach Autophagie-Induktion Ände-
      rungen der Genexpressionen von Atg-Genen nicht erfasst
      werden, da sie erst zu einem späteren Zeitpunkt
      eintreten.
description: Autophagy is a physiological and
      evolutionary highly conserved process in which cellular
      compo- nents are sequestered and then recycled. It enables
      the cell to secure its survival under starvation conditions
      and adapt to changing environmental situations. Cytoplasmic
      components are engulfed by a bilipidal membrane layer through
      formation of a phagophore which elongates gradually and
      finally closes to form an autophagosome. Fusion of the
      autophagosome with a lysosome enables the degradation of the
      sequestered cytoplasmic material by lysosomal enzymes.
      Numerous proteins of autophagy-related genes are involved in
      the induction of autophagosome formation as well as in the
      steps of maturation. Previous work provided evidence that the
      transcription factor Miz1 is involved in the regulation of
      the autophagic process. Results of this work show that
      withdrawal of amino acids (incubation with EBSS) induces gene
      expression of Miz1 which hints to a role of Miz1 in the
      adaptation to starvation conditions. The importance of Miz1
      for the autophagic process was confirmed on a morphological
      level. Electron microscopy showed a failure of maturation of
      autophagic vacuoles in cells lacking Miz1. Moreover, it could
      be shown that this defect could be abrogated by substitution
      of human Miz1. At the same time incubation with EBSS restored
      the ability for autophagosomal maturation in ∆POZ cells.
      These results indicate a different regulation of the
      autophagic process during basal or stimulated autophagy.
      After induction of autophagy the inhibition of autophagosomal
      maturation seems to be overcome by mechanisms independent of
      Miz1. To further identify which steps of the autophagic
      process are influenced by Miz1 a series of gene expression
      analysis of autophagy-associated genes was carried out using
      cells with and without fully functional Miz1. Experiments
      were conducted in mouse embryonic fibroblasts that were ei-
      ther immortalized through 3T3 protocol (3T3 MEFs) or through
      knockdown of p19ARF by shRNA (MEFsARF ). Results of this work
      show that the expression of autophagy-associated genes Atg9b
      and Atg16L2 is regulated through Miz1 during basal autophagy.
      Moreover, evidence could be ob- tained that further genes of
      the ubiquitin-like conjugation system might be regulated
      through Miz1. It could therefore be shown that Miz1 has an
      effect on certain steps of autophagy on a molecular basis and
      that this influence is exerted mainly on steps of maturation
      of autophagosoms. These results obtained through analysis of
      gene expression complement morphological results showing
      severe maturation defects of autophagosomes in cells
      containing solely the truncated Miz1. Initia- tion of
      autophagy seems to take place largely independently of Miz1.
      This can be concluded from unchanged levels of gene
      expression of ULK1 and ULK2 in cells with or without Miz1.
      The pre- vious findings were confirmed by the fact that
      autophagic vacuoles formed both in cells containing and in
      cells not containing fully functional Miz1. It is well known
      that Miz1 exerts its transcriptional function in cooperation
      with several partners. It could be shown that Miz1 regulates
      gene expression of its most important partner Myc. Moreover
      the results obtained indicate that ARF, another partner of
      Miz1 and Myc, has substantial influence on Miz1: ARF seems to
      affect both gene expression of Miz1 and regulation of gene
      expression of other genes through Miz1. To further define the
      influence of Miz1 on autophagy it might be useful to conduct
      more detailled morphological analysis. Results of this work
      suggest that analysis of gene expression of single Atg genes
      is not suitable for detecting mechanisms of acute induced
      autophagy. The results of this work suggest that autophagy is
      not regulated through altered expression patterns of Atg
      genes. Possibly it is the expression of Miz1 that is first
      adapted in response to incubation with EBSS whereas
      expression of autophagy-associated genes is modified only
      later. This would imply that modifications of gene expression
      of Atg genes are not detected when conducting experiments six
      hours after inducing autophagy because they only take place
      at a later date.