title: Chemically and physically modified alginate-based bioinks for 3D biofabrication
Creators: name: Hazur, Jonas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: alginate
subject: bioprinting
subject: biofabrication
subject: bioink
subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 62 Ingenieurwissenschaften :: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten

description: Alginate is a cost-effective and biocompatible polysaccharide which can be crosslinked under mild, cell friendly conditions. Moreover, there are numerous ways of modifying the characteristics of alginate hydrogels chemically and physically. This versatility makes alginate one of the most studied biopolymers in the field of tissue engineering. There are a multitude of applications relying on alginate ranging from drug delivery systems, over 3D cell cultures to medically approved wound dressings. Furthermore, alginate is widely used in 3D extrusion based bioprinting (EBB). Bioinks, which are mostly hydrogel-based inks that contain living cells, need to fulfill a variety of requirements. They must be biocompatible and processible under non-cytotoxic conditions. Moreover, certain rheological characteristics are required so that the bioinks can be extruded well and retain their shape after that. Finally, the bioinks must be fixated in their shape after printing, for which a crosslinking step needs to be applied. The resulting hydrogels must fulfill specific degradation, mechanical and cell-adhesive characteristics in dependence of the targeted application. Thus, the research of the doctoral thesis “Chemically and physically modified alginate-based bioinks for 3D biofabrication” focuses on: ❖ Improving the printability of alginate-based bioinks ❖ Tailoring the mechanical properties and degradation behavior of post-crosslinked OA-Gel hydrogels ❖ Correlating hydrogel stress relaxation behavior with biological behavior of NIH/3T3 cells ❖ In vitro studies and bioprinting with NIH/3T3 and EA.hy926 cells First, two different alginates (Alg163S2 and Alg176) were broadly characterized physicochemically. Namely their degree of oxidation and the resulting degree of crosslinking with gelatin, but also their viscosity and molar mass change during oxidation were determined. By that, it was revealed that Alg176 has a higher viscosity which is advantageous for good printability. In addition, it was shown that Alg176 is more susceptible to molar mass loss during oxidation, which led to the conclusion that Alg163S2 is superior when producing oxidized alginate (OA). Based on these results, two standard materials are chosen for Alg and OA, which were predominantly used in the rest of the thesis. Two different methods of pre-crosslinking alginate-based bioinks by slowly releasing Ca2+ sources were developed and characterized. In one of them CaCO3 particles serve as inactive Ca2+ ion source, which are released by decreasing the pH with D-(+)-glucono-1,5-lactone (GDL). In contrast to that, Alg or OA hydrogel microparticles are mixed with fresh polymer solutions of the same origin, in order to gradually release Ca2+ ions for pre-crosslinking. These CaCO3 and HMP pre-crosslinking methods share many properties. Both methods clearly affect the rheological properties of alginate-based bioinks. With increasing amounts of either CaCO3 particles or HMPs, bioink viscosity increases, while the shear thinning properties remain. Moreover, all bioinks shifted from possessing a fluid-like behavior (tan(δ) &gt; 1) to being dominated by their elastic behavior (tan(δ) &lt; 1), by the application of any of the pre-crosslinking methods. In addition, the pre-crosslinking was in general accompanied by rising yield stresses, which can be beneficial for shape fidelity, too. Overall, Alg bioinks were more susceptible to both pre-crosslinking methods in comparison to OA bioinks, which is attributed to their higher molar mass. All these changes in the rheological properties are mirrored in the printability of bioinks. Of all rheological parameters, the tan(δ) turns out to be the most determining rheological parameter to influence printability, although viscosity and yield stress significantly correlate with printability, too. Apart from this, it was shown that the bioinks still have largely different mechanical properties and internal structures after post-crosslinking. Both pre-crosslinking methods clearly decrease the Young’s modulus, while in some hydrogels a stronger and faster stress relaxation behavior was observed, too. Since the observations in CaCO3 and HMP pre-crosslinking are so similar, a hypothesis on how the pre-crosslinking impacts the hydrogel structure is introduced. In short, when hydrogels are pre-crosslinked, less Ca2+ ions are absorbed during post-crosslinking due to a lower concentration gradient. Furthermore, pre-crosslinking causes a partial immobility of alginate molecules, which results in a less structured hydrogel network and consequently weaker crosslinks. A Taguchi design of experiments (DoE) was chosen to investigate the influence of crosslinking (type, time and concentration of ion) and material (degree of oxidation and pre-crosslinking) parameters on the Young’s modulus separately. It was shown that the Young’s modulus of OA-Gel hydrogels is affected foremost by the type of ion, but also by the ion concentration. Crosslinking time does not play a siginificant role. Moreover, both an increasing degree of oxidation and of CaCO3 pre-crosslinking led to lower Young’s moduli, but the effect of CaCO3 pre-crosslinking prevailed. This decrease of Young’s modulus is accompanied by faster degradation. Beyond that, the material parameters are attributed to stronger and faster stress relaxation when Young’s moduli are aligned with each other by using specific post-crosslinking parameters. Furthermore, the most significant differences in the swelling behavior occur in hydrogels crosslinked by different crosslinking ions, which in turn influences the gelatin release from OA-Gel hydrogels. In summary, the most determining parameters to tailor the Young’s modulus, stress relaxation, degradation and release behavior are identified. Varying Alg-Gel, OA-Gel and Alg-OA-Gel matrices were manufactured with the aim to tailor their stress relaxation behavior, while aligning their Young’s modulus. These hydrogels were used to embed NIH/3T3 cells and culture them for a period of 10 days. Characteristic biological read outs such as cell proliferation, migration and morphology clearly show a correlation with the stress relaxation amplitude. Specifically, a larger amplitude of the hydrogels led to stronger proliferation, faster migration and a more stretched morphology of the cells. In addition to the relaxation amplitude, the relaxation times (τ1 and τ2) were correlated with the biological read outs, but barely any significant correlations were found. This shows that increasing the relaxation amplitude can be an effective tool to improve the biological responses of cells to their hydrogel matrix. In addition to that, it shows that CaCO3 pre-crosslinking does not only help to enhance the printability of bioinks, but also their biological properties after post-crosslinking. Lastly, in vitro studies with OA-X hydrogels, where X is keratin (Ker), gelatin (Gel) or fibrinogen (Fib), were performed. The aim was to find suitable hydrogels for fibroblasts and endothelial cells. Due to the unexpectedly low molar mass of Ker, it failed to form hydrogels on its own. Apart from that, NIH/3T3 cells embedded in OA-Ker hydrogels did not reveal desired biological behavior. Thus, Ker hydrogels based on the source of α-keratin used in this doctoral thesis were found unsuitable for cell culture. OA-Fib hydrogels however led to better results, with stronger proliferation of NIH/3T3 cells when increasing the Fib concentration to up to 0.5 % (w/v). The proliferation of fibroblasts in these hydrogels was comparable to the standard OA-Gel hydrogels, but none of the non-pre-crosslinked OA-X hydrogels was suitable for 3D cell culture of EA.hy926. A slight increase in the proliferation of EA.hy926 cells was observed in pre-crosslinked Alg-Fib bioinks, but the read out was affected by strong degradation of the hydrogel. Next to that, three CaCO3 pre-crosslinked bioinks were successfully bioprinted with NIH/3T3 cells embedded in the bioinks. The flow behavior of each bioink was estimated and it was revealed that the shear stresses did not affect the viability of cells in any of the bioinks after printing. Lastly, two different bioinks - one containing EA.hy926, the other NIH/3T3 cells - were used to fabricate a hollow, vessel-like structure. While 3D printing was successful, all results suggest that only NIH/3T3 cells proliferated during cell culture within the constructs. Concludingly, a suitable bioink for endothelial cell lines is yet to be found. Alginate is a promising candidate as bioink component in future applications. With the results presented in this doctoral thesis, encouraging directions for further research are demonstrated. The strategies on how to improve printability and cell behavior simultaneously (e.g. proliferation, migration, morphology) can be applied by many researchers in the field. Moreover, the gained understanding about which material and crosslinking parameters are most determining for the mechanical and degradation behavior can help to tailor hydrogels for the needs of specific cell types. More sophisticated, in-depth studies of the biological processes with a larger variety of cell types are thus suggested for following research. With this, a cell specific, tailormade bioink platform may be achieved in the future.
description: Alginat ist ein kostengünstiges und biokompatibles Polysaccharid, das unter milden, zellfreundlichen Bedingungen vernetzt werden kann. Darüber hinaus gibt es vielfältige Möglichkeiten, die Eigenschaften von Alginathydrogelen chemisch und physikalisch zu verändern. Diese Vielseitigkeit macht Alginat zu einem der am meisten untersuchten Biopolymere im Bereich des Tissue Engineering. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen, die sich auf Alginat stützen, von Systemen zur Verabreichung von Medikamenten über 3D-Zellkulturen bis hin zu medizinisch zugelassenen Wundverbänden. Darüber hinaus wird Alginat auch beim 3D-Extrusions-Bioprinting (EBB) in großem Umfang eingesetzt. Biotinten, bei denen es sich meist um Tinten auf Hydrogelbasis handelt, welche lebende Zellen enthalten, müssen eine Reihe von Anforderungen erfüllen. Sie müssen biokompatibel und unter nicht zytotoxischen Bedingungen verarbeitbar sein. Außerdem sind bestimmte rheologische Eigenschaften erforderlich, damit sich die Biotinten gut extrudieren lassen und danach ihre Form beibehalten. Schließlich müssen die Biotinten nach dem Druck in ihrer Form fixiert werden, wofür ein Vernetzungsschritt erforderlich ist. Aber auch im vernetzten Zustand müssen die Biotinten in Abhängigkeit von der angestrebten Anwendung bestimmte Abbau-, mechanische und zelladhäsive Eigenschaften erfüllen. Die Forschung in der Dissertation Chemisch und physikalisch modifizierte Alginat-basierte Biotinten für die 3D-Biofabrikation konzentriert sich daher auf: ❖ Verbesserung der Druckbarkeit von alginatbasierten Biotinten ❖ Anpassung der mechanischen Eigenschaften und des Degradationsverhaltens von nachvernetzten OA-Gel-Hydrogelen ❖ Korrelieren des Spannungsrelaxationsverhaltens von Hydrogelen mit dem biologischen Verhalten von NIH/3T3-Zellen ❖ In-vitro-Studien und Bioprinting mit NIH/3T3- und EA.hy926-Zellen Zunächst wurden zwei verschiedene Alginate (Alg163S2 und Alg176) physiko-chemisch umfassend charakterisiert. Insbesondere wurden ihr Oxidationsgrad und der daraus resultierende Vernetzungsgrad mit Gelatine, aber auch ihre Viskosität und Molekulargewichtsänderung während der Oxidation bestimmt. Dabei zeigte sich, dass Alg176 eine höhere Viskosität aufweist, was für eine gute Druckbarkeit vorteilhaft ist. Es zeigte sich aber auch, dass Alg176 bei der Oxidation eher zu einem Molekulargewichtsverlust neigt, was zu der Schlussfolgerung führte, dass Alg163S2 bei der Herstellung von oxidiertem Alginat (OA) überlegen ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden zwei Standardmaterialien für Alg und OA ausgewählt, die im weiteren Verlauf der Arbeit überwiegend verwendet wurden. Es wurden zwei verschiedene Methoden zur Vorvernetzung von alginatbasierten Biotinten durch langsam freigesetzte Ca2+-Quellen entwickelt und charakterisiert. Bei der einen Methode dienen CaCO3-Partikel als inaktive Ca2+-Ionenquelle, die durch Absenkung des pH-Wertes mit D-(+)-Glucono-1,5-Lacton (GDL) freigesetzt werden. Im Gegensatz dazu werden Alg- oder OA-Hydrogel-Mikropartikel mit frischen Polymerlösungen desselben Ursprungs gemischt, um nach und nach Ca2+-Ionen für die Vorvernetzung freizusetzen. Diese CaCO3- und HMP-Vorvernetzungsmethoden haben viele Eigenschaften gemeinsam. Beide Methoden beeinflussen eindeutig die rheologischen Eigenschaften von Biotinten auf Alginatbasis. Mit zunehmender Menge an CaCO3-Partikeln oder HMPs steigt die Viskosität der Biotinte, während die scherverdünnenden Eigenschaften erhalten bleiben. Darüber hinaus wechselten alle Biotinten von einem flüssigkeitsähnlichen Verhalten (tan(δ) &gt; 1) zu einem elastischen Verhalten (tan(δ) &lt; 1), wenn eine der Vorvernetzungsmethoden angewendet wurde. Darüber hinaus ging die Vorvernetzung im Allgemeinen mit steigenden Fließspannungen einher, was auch für den Druck von Vorteil sein kann. Insgesamt waren die Alg-Biotinten im Vergleich zu den OA-Biotinten von beiden Vorvernetzungsmethoden stärker beeinflusst, was auf ihr höheres Molekulargewicht zurückzuführen ist. All diese Veränderungen in den rheologischen Eigenschaften spiegeln sich in der Druckbarkeit der Biotinten wider. Von allen rheologischen Parametern erweist sich der tan(δ) als der wichtigste rheologische Parameter, der die Druckbarkeit beeinflusst, obwohl auch die Viskosität und die Fließspannung signifikant mit der Druckbarkeit korrelieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Biotinten auch nach der Nachvernetzung weitgehend unterschiedliche mechanische Eigenschaften und innere Strukturen aufweisen. Bei beiden Vorvernetzungsmethoden sinkt der Elastizitätsmodul deutlich, während bei einigen Hydrogelen auch ein stärkeres und schnelleres Spannungs-Relaxationsverhalten beobachtet wurde. Da die Beobachtungen bei der Vorvernetzung von CaCO3 und HMP so ähnlich sind, wird eine Hypothese darüber aufgestellt, wie sich die Vorvernetzung auf die Hydrogelstruktur auswirkt. Kurz gesagt, wenn Hydrogele vorvernetzt sind, werden bei der Nachvernetzung aufgrund eines geringeren Konzentrationsgradienten weniger Ca2+-Ionen absorbiert. Außerdem führt die Vorvernetzung zu einer teilweisen Unbeweglichkeit der Alginatmoleküle, was zu einem weniger strukturierten Hydrogelnetzwerk und folglich zu schwächeren Vernetzungen führt. Es wurde ein Taguchi-Versuchsplan (DoE) gewählt, um den Einfluss der Vernetzungs- (Art, Zeit und Konzentration des Ions) und Materialparameter (Oxidationsgrad und Vorvernetzung) auf den Elastizitätsmodul getrennt zu untersuchen. Es zeigte sich, dass vor allem die Art des Ions, aber auch die Ionenkonzentration den Elastizitätsmodul von OA-Gel-Hydrogelen beeinflussen, während die Vernetzungszeit keine signifikante Rolle spielt. Darüber hinaus führten sowohl ein zunehmender Oxidationsgrad als auch eine zunehmende CaCO3-Vorvernetzung zu niedrigeren Elastizitätsmodulen, wobei der Effekt der CaCO3-Vorvernetzung überwiegt. Dieser Rückgang des Elastizitätsmoduls geht mit einer schnelleren Degradation einher. Darüber hinaus wird den Materialparametern eine stärkere und schnellere Spannungsrelaxation zugeschrieben, wenn die Elastizitätsmodule durch Verwendung spezifischer Nachvernetzungsparameter aneinander angeglichen werden. Darüber hinaus treten die größten Unterschiede im Quellverhalten bei Hydrogelen auf, die mit unterschiedlichen Vernetzungsionen vernetzt sind, was wiederum die Gelatinefreisetzung aus OA-Gel-Hydrogelen beeinflusst. Zusammenfassend kann man sagen, dass die wichtigsten Parameter für die Anpassung des Elastizitätsmoduls, der Spannungsrelaxation, des Abbaus und der Freisetzung herausgearbeitet wurden. Es wurden verschiedene Alg-Gel-, OA-Gel- und Alg-OA-Gel-Matrizen mit dem Ziel hergestellt, ihr Spannungsrelaxationsverhalten zu verändern und gleichzeitig ihren Elastizitätsmodul anzugleichen. In diese Hydrogele wurden NIH/3T3-Zellen eingebettet und über einen Zeitraum von 10 Tagen kultiviert. Charakteristische biologische Messwerte wie Zellproliferation, Migration und Morphologie zeigen eindeutig eine Korrelation mit der Spannungsrelaxationsamplitude. Insbesondere führte eine größere Amplitude der Hydrogele zu einer stärkeren Proliferation, schnelleren Migration und einer gestreckteren Morphologie der Zellen. Neben der Relaxationsamplitude wurden auch die Relaxationszeiten (τ1 und τ2) mit den biologischen Messwerten korreliert, wobei jedoch kaum signifikante Korrelationen gefunden wurden. Dies zeigt, dass die Erhöhung der Relaxationsamplitude ein wirksames Mittel zur Verbesserung der biologischen Reaktionen von Zellen auf ihre Hydrogelmatrix sein kann. Darüber hinaus zeigt sich, dass die CaCO3-Vorvernetzung nicht nur zur Verbesserung der Druckbarkeit von Biotinten beiträgt, sondern auch zu deren biologischen Eigenschaften nach der Vernetzung. Schließlich wurden In-vitro-Studien mit OA-X-Hydrogelen durchgeführt, wobei X für Keratin (Ker) oder Fibrinogen (Fib) steht. Ziel war es, geeignete Hydrogele für Fibroblasten und Endothelzellen zu finden. Aufgrund des unerwartet niedrigen Molekulargewichts von Ker konnte es selbst keine Hydrogele bilden. Außerdem zeigten NIH/3T3-Zellen, die in OA-Ker-Hydrogelen eingebettet waren, kein gutes biologisches Verhalten. Ker-Hydrogele, die auf der in dieser Dissertation verwendeten α-Keratin-Quelle basieren, erwiesen sich daher als ungeeignet für die Zellkultur. OA-Fib-Hydrogele hingegen führten zu besseren Ergebnissen, mit einer stärkeren Proliferation von NIH/3T3-Zellen bei Erhöhung der Fib-Konzentration auf bis zu 0,5 % (w/v). Die Proliferation von Fibroblasten in diesen Hydrogelen war vergleichbar mit den Standard-OA-Gel-Hydrogelen, aber keines der nicht vorvernetzten OA-X-Hydrogele war für die 3D-Zellkultur von EA.hy926 geeignet. Eine leichte Zunahme der Proliferation von EA.hy926-Zellen wurde in den vorvernetzten Alg-Fib-Biotintrn beobachtet, aber die Untersuchung der Hydrogele wurde durch deren starken Abbau beeinträchtigt. Darüber hinaus wurden drei vorvernetzte CaCO3-Biotinten mit NIH/3T3-Zellen, die in die Biotinten eingebettet waren, erfolgreich 3D gedruckt. Das Fließverhalten der einzelnen Biotinten wurde untersucht und es zeigte sich, dass die Scherspannungen die Lebensfähigkeit der Zellen in keiner der Biotinten nach dem Druck beeinträchtigten. Schließlich wurden zwei verschiedene Biotinten, von denen eine EA.hy926 und die andere NIH/3T3-Zellen enthielt, zur Herstellung einer hohlen, gefäßartigen Struktur verwendet. Obwohl der 3D-Druck erfolgreich war, deuten alle Ergebnisse darauf hin, dass nur NIH/3T3-Zellen während der Zellkultur in den Konstrukten wuchsen. Eine geeignete Biotinte für endotheliale Zelllinien muss also noch gefunden werden. Alginat ist ein vielversprechender Kandidat als Biotinten-Komponente für zukünftige Anwendungen. Mit den in dieser Dissertation vorgestellten Ergebnissen werden vielversprechende Richtungen für die weitere Forschung aufgezeigt. Die Strategien zur Verbesserung der Druckbarkeit und gleichzeitig des Zellverhaltens (z.B. Proliferation, Migration, Morphologie) können von vielen Forschern auf diesem Gebiet angewendet werden. Darüber hinaus kann das gewonnene Verständnis darüber, welche Material- und Vernetzungsparameter für das mechanische und Degradationsverhalten ausschlaggebend sind, dazu beitragen, Hydrogele auf die Bedürfnisse bestimmter Zelltypen zuzuschneiden. Anspruchsvollere, tiefer gehende Studien der biologischen Prozesse mit einer größeren Vielfalt von Zelltypen werden daher für die weitere Forschung vorgeschlagen. Auf diese Weise könnte in Zukunft eine zellspezifische, maßgeschneiderte Biotintenplattform geschaffen werden.