title: Protein-protein interactions mediated by Cys2His2 zinc-fingers
Creators: name: Giesecke, Astrid
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Zink-Finger-Proteine , Proteindesign , Protein-Protein-Wechselwirkung , Bakterielles Two-Hybrid System , Ikaros/Hunchback Transkriptionsfaktor , Bacterial Two-Hybrid System , Ikaros/Hunchback Transcriptionfactor
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: The C2H2 zinc finger motif is a compact ~ 30 amino acid molecular recognition domain that comprises a beta-hairpin followed by an alpha-helix. These domains are typically found as tandem arrays that mediate specific interactions with various macromolecules including DNA, RNA and other proteins. Although very well characterized as a DNA-binding domain, relatively little is currently understood about the molecular details of protein-protein interactions mediated by C2H2 ZFs. The Ikaros and Hunchback transcription factor family provides an ideal model system for studying ZF mediated protein-protein interactions. Ikaros, the founding member of this family is defined as a classical C2H2 ZF protein composed of a cluster of four C2H2 ZFs at the N-terminus and two additional C2H2 ZFs at the C-terminus. While the N-terminal ZFs are involved in specific DNA recognition, the C-terminal domain (termed as Dimerization Zinc Finger or DZF domain) has been shown to mediate the homo- and hetero-typic interactions. In this thesis, the DZF domains found in the Ikaros and Hunchback transcription factor family have been examined using a combination of genetic, biochemical and functional assays. To test if protein-interacting C2H2 ZFs can be used to create novel protein-protein interaction specificities, libraries of synthetic DZFs were constructed by shuffling individual C2H2 ZFs from DZF domains found in the human Ikaros and other related transcription factors. Using a bacterial-based selection system, we identified synthetic heterodimeric DZFs that can mediate activation of a reporter gene in bacterial cells. These protein-protein interaction domains can also be used to reconstitute a synthetic bi-partite activator in the nucleus of a human cell, which results in transcriptional activation of the endogenous VEGF-A gene. In addition, these synthetic two-finger domains can be linked together to create more extended protein-protein interaction interfaces. Analysis of the interaction specificities of these domains led to the discovery of a novel anti-parallel interaction mode for the DZF domain. The homo-typic interaction mediated by different DZF domains was examined in greater detail using mutational analysis. These studies narrowed down residues that are likely to be important for dimerization mediated by the Hunchback DZF domain. To obtain further information about the physical and chemical interaction surface we attempted to purify active peptides consisting of different DZF domains for X-ray crystallography. Although highly purified DZF peptides were obtained, various attempts to refold these peptides into active domains resulted in the formation of aggregates consisting of the various DZFs. Based on findings in the bacterial and cell culture systems, we started exploring if Hunchback dimerizes in Drosophila melanogaster using its DZF domain and if dimerization is essential for the function of the protein. Constructs encoding the full-length Hunchback protein harboring various natural and modified DZF domains were generated and expressed in transgenic flies. These transgenics were used to perform functional in vivo studies of the Hunchback DZF domain in Neuroblast specification during Drosophila melanogaster development. We confirmed previous studies that the C-terminal domain in Hunchback is important for maintaining the function of Hunchback in specifying early-born temporal identity in Drosophila neural stem cell lineages. Importantly, our results indicate that this domain can be functionally replaced with a heterologous (i.e., non fly) DZF domain, suggesting that the importance of the DZF domain is due to its ability to mediate dimerization.
description: Das C2H2 Zink Finger Motiv besteht aus etwa 30 Aminosäuren, die eine kompakte Zink-bindende Domäne bilden. In Proteinen kommt dieses Motiv gewöhnlich als repetitive Einheit vor, die aus einer antiparallelen beta-Haarnadel und einer alpha-Helix besteht. C2H2 Zinkfinger Domänen können mit verschiedenen Makromolekülen wie z.B. DNA, RNA und Proteinen spezifische Interaktionen eingehen und sind in ihrer Funktion als DNA-Bindungsmotive sehr gut charakterisiert. Im Gegensatz dazu ist darüber, wie dieses Motiv Wechselwirkungen mit anderen Proteinen eingeht, kaum etwas bekannt. Die Familie der Ikaros und Hunchback Transkriptionsfaktoren stellt ein ideales Modellsystem dar, um Protein-Protein Interaktionen zwischen C2H2 Zinkfingern zu untersuchen. Bei Ikaros handelt es sich um ein klassisches C2H2 Zinkfinger Protein, das aus vier N-terminalen und zwei C-terminalen Zinkfingern besteht. Während die N-terminalen Finger spezifisch an DNA binden, bilden die beiden C-terminalen Zinkfinger Dimere mit sich selbst und mit anderen Proteinen der Ikaros Familie und werden deshalb als Dimerisations-Zink-Finger oder DZF Domäne bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene DZF Domänen der Ikaros und Hunchback Trankriptionsfaktoren mittels genetischer, biochemischer und funktioneller Assays untersucht. In einem Projekt sollte die Frage beantwortet werden, ob C2H2 Zinkfinger verwendet werden können, um neue synthetische Protein-Protein Interaktionsdomänen herzustellen. Dafür wurden Bibliotheken aus synthetischen DZF Domänen konstruiert, indem individuelle C2H2 Zinkfinger aus verschiedenen wildtypischen DZF Domänen beliebig miteinander kombiniert wurden. Interagierende DZFs wurden dann mit Hilfe eines bakteriellen Selektionssystems identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese synthetischen Domänen die Aktivität des menschlichen VEGF-A Genes stimulieren können, indem sie ein binäres Aktivatorprotein rekonstituieren. Diese Domänen können darüberhinaus miteinander verbunden werden, um erweiterte Interaktionsdomänen zu konstruieren. Untersuchungen ihrer Spezifität weisen ausserdem darauf hin, dass DZF Domänen anti-parallel aneinader binden. Um die Homodimerisierung auf molekularer Ebene näher zu untersuchen wurden Mutationen in die verschiedenen DZF Domänen eingefügt und analysiert. Diese Experimente führten zur Identifizierung von Aminosäuren, die möglicherweise direkt in den Prozess der Dimerisierung involviert sind. Weiterhin wurden mehrere Versuche unternommen, verschiede aktive DZF Peptide zu reinigen mit dem Ziel, diese anschliessend für strukturelle Analysen zu verwenden. Schliesslich wurde eine funktionelle Analyse der Hunchback DZF Domäne in Drosophila melanogaster durchgefuehrt, die aufdecken sollte, ob die Dimerisierung von Hunchback für die Entwicklung des Nervensystems wichtig ist. Es konnte bestätigt werden, dass die Hunchback DZF Domäne notwendig ist, um die frühe temporale Identität von neuralen Stammzellen festzulegen. Ferner konnte die wildtypische DZF Domäne von Hunchback durch eine heterologe DZF Domäne ausgetauscht werden, was darauf hinweist, dass die Fähigkeit der DZF Domäne Dimere zu bilden, wichtig für die Funktionalität von Hunchback ist.