Μελέτη της επίδρασης διγουανιδίων στην καρδιακή μυογένεση στο πειραματικό στέλεχος Mus musculus BALB/c
Creators: name: Πεταλίδου, Αικατερίνη Θεοδώρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: καρδιακή αναγέννηση
πολλαπλασιασμός καρδιομυοκυττάρων
κυτταρικός μεταβολισμός
αλλαγή μεταβολισμού
γλυκόλυση
οξειδωτική φωσφορυλίωση
Μετφορμίνη
νεογέννητα ποντίκια
παράθυρο αναγέννησης
κρυοτραυματισμός
cardiac regeneration
cardiomyocyte proliferation
cell metabolism
metabolic switch
glycolysis
oxidative phosphorylation
Metformin
neonatal mice
regenerative window
cryoinjury

description: Η καρδιά των θηλαστικών διατηρεί την ικανότητα αναγέννησης μετά από τραυματισμό μόνο για μια σύντομη περίοδο μετά τη γέννηση, γνωστή ως «παράθυρο αναγέννησης», καθιστώντας τους ανθρώπους ευάλωτους σε καρδιακές παθήσεις. Μελέτες σε οργανισμούς μοντέλα με ικανότητα καρδιακής αναγέννησης καθ΄ όλη τη διάρκεια της ζωής τους, όπως το ψάρι ζέβρα, ή με παροδική ικανότητα καρδιακής αναγέννησης, όπως τα νεογέννητα ποντίκια, υποστηρίζουν ότι η αναγέννηση της καρδιάς διέπεται από την Ο2-εξαρτώμενη αλλαγή του μεταβολισμού. Η κατανόηση των μηχανισμών που συμμετέχουν στην αναγέννηση του μυοκαρδίου θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία νέων θεραπειών για την αναγέννηση του καρδιακού ιστού. Καθώς ο ρόλος του μεταβολισμού στην αναγέννηση της καρδιάς δεν είναι πλήρως κατανοητός, στόχος της παρούσας διπλωματικής ήταν να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η αλλαγή του μεταβολισμού των καρδιομυοκυττάρων από οξειδωτική φωσφορυλίωση σε γλυκόλυση επάγει τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων και την αναγέννηση της καρδιάς των θηλαστικών. Ο μεταβολισμός της γλυκόζης τροποποιήθηκε φαρμακολογικά σε νεογέννητα ποντίκια κατά τη διαδικασία της καρδιακής αναγέννησης με το αντιδιαβητικό διγουανίδιο Μετφορμίνη. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο καρδιακής αναγέννησης νεογέννητων ποντικιών μετά απο κρυοτραυματισμό. Συνοπτικά, ποντίκια ηλικίας μιας ημέρας χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες, την ομάδα εικονικής επέμβασης και την ομάδα κρυοτραυματισμού, ενώ ακολούθησαν καθημερινές υποδόριες ενέσεις με PBS (μάρτυρας), χαμηλή (2.5 mg/kg) ή υψηλή (100 mg/kg) δόση Μετφορμίνης. Μελετήθηκαν δύο διαφορετικά χρονικά στάδια, 7 και 21 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό (n=6 ποντίκια ανά ομάδα). Με τη μέθοδο της συνεστιακής μικροσκοπίας οπτικοποιήθηκαν και καταμετρήθηκαν τα μιτωτικά καρδιομυοκύτταρα με βάση τη συνεντόπιση της α-σαρκομερικής ακτινίνης και της φωσφορυλιωμένης στη σερίνη-10 ιστόνης Η3, 7 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό σε κρυοτομές καρδιακού ιστού. Επιπλέον, λήφθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από την κορυφή του κρυοτραύματος και μελετήθηκαν με ανοσοαποτύπωση οι μεταβολές στην έκφραση των πρωτεϊνών Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) και Hypoxia Inducible Factor 1α (HIF-1α), καθώς επίσης και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης στη Thr-172 της υπομονάδας α της κινάσης-στόχου της Mετφορμίνης AMP-activated protein kinase (pAMPKα). Τέλος, μέσω της ιστοχημικής χρώσης Picrosirius red, επιτεύχθηκε η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση της ινώδους ουλής σε κρυοτομές καρδιακού ιστού, 21 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό. Η χορήγηση υψηλής δόσης Μετφορμίνης είχε ως αποτέλεσμα χαμηλότερα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα και υψηλότερα επίπεδα γαλακτικού οξέος σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ η χαμηλή δόση οδήγησε σε υψηλότερα επίπεδα γλυκόζης στο αίμα. Η χορήγηση Μετφορμίνης φάνηκε ότι επηρέασε και τη δράση της AMPK με δοσοεξαρτώμενο τρόπο καθώς, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, παρατηρήθηκε ~διπλασιασμός και ~τετραπλασιασμός του λόγου pAMPK/AMPK στην καρδιά μετά τη χορήγηση χαμηλής (p=0.06) και υψηλής (p&lt;0.005) δόσης Μετφορμίνης, αντίστοιχα. Η διφασική δράση του φαρμάκου αποτυπώθηκε και από τη μείωση της έκφρασης του HIF-1α μετά τη χορήγηση της χαμηλής δόσης η οποία δεν παρατηρήθηκε στην ομάδα που έλαβε την υψηλή δόση. Η ανάλυση ανοσοφθορισμού μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας έδειξε ότι, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, μόνο η ομάδα που λάμβανε χαμηλή δόση Μετφορμίνης παρουσίασε σημαντική αύξηση μιτωτικών καρδιομυοκυττάρων 7 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μέσω ανοσοαποτύπωσης PCNA επιβεβαίωσε το παραπάνω αποτέλεσμα. Επιπλέον, η χαμηλή δόση του φαρμάκου επιτάχυνε σημαντικά την αναγέννηση του καρδιακού ιστού, εμφανίζοντας μικρότερη ινωτική ουλή σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, 21 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό. Συμπερασματικά, η παρούσα εργασία κατέδειξε οτι κατά την αναγέννηση του μυοκαρδίου στα θηλαστικά λαμβάνει χώρα εναλλαγή του κυτταρικού μεταβολισμού σε γλυκόλυση, η φαμακολογική αναστολή της οποίας, μέσω της χορήγησης χαμηλής δόσης διγουανιδίων, προάγει τον πολλαπλασιασμό και την αναγέννηση των καρδιακών μυοκυττάρων. Τα αποτελέσματα της εργασίας αναμένεται να συνεισφέρουν σημαντικά στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αναγέννηση του μυοκαρδίου στον άνθρωπο και συνεπώς την καταπολέμιση των καρδιακών παθήσεων.
description: Mammalian heart is capable of regeneration after injury only for a brief period after birth, known as "regenerative window", making humans vulnerable to heart diseases. Studies in model organisms with lifelong cardiac regenerative capacity, such as zebrafish, or transient regenerative capacity, such as neonatal mice, indicate that heart regeneration governed by an O2-dependent metabolic rewiring. Understanding the regenerative mechanisms of cardiac myogenesis could provide important insights for novel regenerative therapies. As the role of metabolism in heart regeneration remain incompletely understood, we sought to clarify if switch of cardiomyocyte metabolism from oxidative phosphorylation to glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation and heart regeneration in mammalian heart. Glucose metabolism was pharmacologically manipulated in neonatal mice undergoing heart regeneration using the antidiabetic drug Metformin. For this purpose, a neonatal mouse model of cardiac regeneration after cryoinjury was employed. One-day old mice were randomized to sham or cryoinjury operation, followed by daily subcutaneous injections of PBS (control), and either a low (2.5mg/kg) - or high (100 mg/kg) - dose of Metformin. Two different time-points were studied, 7 and 21 days after cryoinjury (n=6 mice per group). Immunofluorescence analysis of mouse heart tissues was performed in cryosections, in order to visualize and measure mitotic cardiomyocytes 7 days after cryoinjury. Also, histochemical stain was performed in heart tissue cryosections, to facilitate detection and quantification of fibrous scar, 21 days after cryoinjury. For the evaluation of protein levels, snap-frozen cardiac apical tissues homogenized and whole cell protein was extracted in order to perform Western blot assay. Treatment with high-dose Metformin resulted in lower blood glucose and higher lactate acid levels compared to the control group, while, low-dose led to higher blood glucose levels. Metformin also affected AMPK activity in a dose-dependent manner as, compared to the control group, a ∼2-fold and ∼4-fold increase in the pAMPK/AMPK ratio was observed in the heart after administration of low (p=0.06) and high (p &lt;0.005) Metformin dose, respectively. HIF-1α protein decrease was observed after daily low-dose administration, which was not observed after high-dose injections, indicates Metformin’s biphasic action. Confocal immunofluorescent analysis demonstrated that, compared to the control group, only the low-dose Metformin group showed a significant increase in mitotic cardiomyocytes 7 days after cryoinjury. Moreover, analysis of cell cycle activity through proliferating cell nuclear antigen (PCNA) Western blotting confirmed the above result. Consistently, only the low-dose Metformin significantly accelerated cardiac regeneration, exhibiting smaller fibrotic scar compared to control group, 21 days post cryoinjury. These findings indicate that glycolysis limits the rate of cardiomyocyte proliferation compared with the inhibition of glycolytic rewiring, which promotes cardiomyocyte proliferation and enhances the cardiac regenerative capacity of neonatal mouse. These results are expected to significantly contribute to the development of new therapeutic approaches for myocardial regeneration in humans, thus combating cardiac deseases.