Analisi degli effetti citotossici del diclofenac in linee cellulari di melanoma umano
Creators: name: Albano, Francesco
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2013

description: Il melanoma è un cancro cutaneo molto aggressivo, la cui incidenza è in crescente aumento negli ultimi anni, soprattutto nelle fasce di popolazione più giovani. La risposta infiammatoria acuta, che si registra dopo l’escissione del melanoma primario, può influenzare l’attivazione e/o la regolazione dell’invasione e della metastasi del melanoma. I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), molto diffusi nella terapia clinica come inibitori delle ciclossigenasi, sono molecole che hanno anche un effetto citotossico su alcune linee cellulari tumorali, e per questo motivo è stato considerato un loro possibile impiego farmacologico in combinazione con le radio/chemioterapie tumorali convenzionali. Il diclofenac, in particolare, che è uno dei FANS più usati nella terapia clinica, ha un effetto antiproliferativo su varie linee cellulari tumorali, attraverso un’alterazione dell’equilibrio redox intracellulare. È stato valutato il potenziale antineoplastico del diclofenac in linee cellulari umane di melanoma A2058 e SAN, paragonando i risultati ottenuti con una linea cellulare umana di fibroblasti non maligni, BJ-5ta. Particolare attenzione, è stata rivolta ai processi che inducono la disfunzione mitocondriale. L’analisi mediante microscopia a contrasto di fase delle cellule trattate con diclofenac, ha evidenziato i tipici cambiamenti morfologici che insorgono nel corso dell’apoptosi. Questi effetti sono evidenti nelle due linee di melanoma A2058 e SAN, dopo 24 ore di trattamento con diclofenac, mentre nessun cambiamento sostanziale è visibile nelle cellule BJ-5ta. Per verificare la natura (apoptotica o necrotica) degli effetti morfologici indotti dal diclofenac nelle cellule A2058, SAN e BJ-5ta, l’apoptosi è stata monitorata mediante incorporazione di ioduro di propidio, seguita da analisi citofluorimetrica. In questo modo è stato osservato che il trattamento con diclofenac induce un incremento dell’apoptosi nel tempo, principalmente nelle due linee cellulari di melanoma. È stata, inoltre, misurata l’attività di caspasi-3 nel corso del trattamento con diclofenac. Mediante analisi spettrofluorimetrica è stato evidenziato un netto aumento dell’attività enzimatica di caspasi 3 negli estratti cellulari delle cellule A2058 e SAN. L’analisi del rapporto tra i livelli intracellulari di bcl-2 e bax, ha confermato l’effetto pro-apoptotico del diclofenac. Infatti, esperimenti di western blotting, hanno mostrato una riduzione dei livelli di espressione di bcl-2 soltanto negli estratti proteici delle cellule A2058 e SAN trattate con il farmaco. Nelle cellule BJ-5ta trattate con diclofenac, invece, è stato evidenziato un aumento dei livelli proteici di bcl-2. Questi dati suggeriscono che le linee cellulari di melanoma, A2058 e SAN, sono più sensibili all’effetto pro-apoptotico del diclofenac, rispetto alla linea di fibroblasti normali, BJ-5ta. L’enzima SOD2 è uno dei più importanti regolatori dell’equilibrio redox cellulare, e in particolar modo dell’omeostasi redox mitocondriale. Sono stati valutati eventuali cambiamenti nei livelli intracellulari dei ROS utilizzando le sonde fluorescenti diidroetidio (DHE), che permette di misurare i livelli di anione superossido, e diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA), che permette di misurare i livelli intracellulari del perossido d’idrogeno e di altri ROS derivati dal superossido. L'analisi con DHE ha mostrato un incremento d’intensità di fluorescenza precoce solamente nelle linee cellulari di melanoma umano. Diversamente, nei fibroblasti BJ-5ta, il farmaco non provoca incrementi significativi dei livelli di superossido; piuttosto, è stata osservata una riduzione dei livelli di superossido dopo 15 minuti di incubazione con diclofenac. Per quanto riguarda la misurazione dei livelli di ROS intracellulari con DCFH-DA, è stato possibile osservare un aumento dell’intensità di fluorescenza solamente dopo un’incubazione più lunga con il diclofenac sia nelle cellule A2058 che nelle SAN. Parallelamente non è stato registrato nessun aumento dei livelli di ROS nelle cellule BJ-5ta durante il trattamento con diclofenac. Sono stati valutati, inoltre, i livelli di espressione proteica e di attività della SOD2 nel nostro sistema sperimentale ed è stato osservata una riduzione dose/tempo-dipendente dei livelli proteici e di attività della SOD2 nelle linee cellulari di melanoma, mentre nessuna variazione è stata riscontrata nelle cellule BJ-5ta. Le cellule sono state, inoltre, trasfettate con siRNA specifici per il messaggero della SOD2 e successivamente incubate per 24 ore con diclofenac. È stato verificato che in assenza di trattamento con diclofenac, il silenziamento della SOD2 non ha effetti significativi sull’induzione dell’apoptosi, mentre, dopo trattamento con diclofenac, l’effetto proapoptotico è amplificato significativamente in entrambe le linee cellulari di melanoma. È stato quindi approfondito il coinvolgimento del mitocondrio nel meccanismo attraverso cui il diclofenac induce l’apoptosi nelle cellule di melanoma, valutando i livelli di alcune proteine tipicamente mitocondriali come citocromo c e SOD2. In estratti proteici cellulari differenziali citosol/mitocondrio, è stato osservato che, in seguito a trattamento con diclofenac per 24 ore, citocromo c trasloca da mitocondrio a citosol, evento tipico che avviene durante l’induzione dell’apoptosi intrinseca. Contemporaneamente è stata osservata anche un’alterazione della localizzazione subcellulare della SOD2, con un significativo aumento della proteina nella frazione citosolica. Questo stesso risultato è stato osservato in entrambe le linee cellulari tumorali di melanoma A2058 e SAN, mentre non è stata osservata nessuna variazione della localizzazione delle due proteine nei fibroblasti non tumorali BJ-5ta. Ad ulteriore conferma di questo dato interessante riguardante SOD2, sono stati eseguiti degli esperimenti di immunofluorescenza, in seguito a trattamento con diclofenac per 24 ore. È stato possibile confermare, tramite microscopia confocale, l’effettiva traslocazione di SOD2 dal mitocondrio al citosol nelle cellule tumorali di melanoma A2058 e SAN, mentre non sono state osservate variazioni, nei fibroblasti non tumorali BJ-5ta. È stata, infine, dosata l’attività enzimatica della caspasi-9 attraverso un dosaggio spettrofluorimetrico. Il trattamento con diclofenac per 24 ore, provoca un incremento significativo dell’attività della caspasi-9 in entrambe le linee cellulari di melanoma, ma non nella linea di fibroblasti non tumorali. Considerando la totalità dei dati raccolti, è possibile quindi affermare che il trattamento con diclofenac delle linee cellulari di melanoma A2058 e SAN, inficia la funzionalità mitocondriale, inducendo l’apoptosi attraverso l’attivazione della via intrinseca, mentre gli effetti sui fibroblasti non tumorali BJ-5ta, sono scarsi o nulli. Questi dati aumentano le conoscenze sugli effetti esercitati dal diclofenac e suggeriscono l’implementazione di nuovi trattamenti antineoplastici, che potrebbero essere basati sul ruolo fondamentale che esercita il mitocondrio nello sviluppo tumorale. In ragione di queste considerazioni si potrebbe considerare di sviluppare nuovi trattamenti diretti contro SOD2.