title: Funktionale Analysen zur SUMOylierung des transkriptionellen Repressors L3MBTL2
title: Functional analyses on SUMOylation of the transcriptional repressor L3MBTL2
Creators: name: Stielow, Christina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: polycomb
Ubiquitin-ähnliche Proteine
SUMOylation
Sumo , Posttranslationale Änderung
Medizin, Gesundheit
L3MBTL2 , malignant brain tumor
Transkription
Epigenetik , Repressorproteine

description: L3MBTL2 belongs to the family of
      MBT domain proteins. MBT domains are chromatin-reading
      modules that mediate binding to methylated lysine residues
      within histone tails. L3MBTL2 acts as a transcriptional
      repressor and is associated with several multisubunit
      complexes. In mice, L3MBTL2 is essential for embryonic
      development and affects proliferation of murine embryonic
      stem cells. In this study L3MBTL2 was identified as a
      substrate for SUMOylation. Mutational analysis demonstrated
      lysine residues 675 and 700 in the most C-terminal region of
      the protein to be specifically modified with SUMO2/3. In
      vitro SUMOylation experiments identified PIAS1 as an E3
      ligase of L3MBTL2 SUMOylation. Functional analysis showed
      that SUMOylation of L3MBTL2 neither affects binding of
      L3MBTL2 to methylated histone tails nor its recruitment to
      chromatin. The genome-wide binding sites of endogenous
      L3MBTL2 as well as overexpressed wild-type and
      SUMOylation-deficient L3MBTL2 were identified by ChIP-seq.
      L3MBTL2 is recruited to promoters that possess an active
      initiation of transcription. E2F6 and RING2, both stably
      associated with L3MBTL2, as well as monoubiquitinated H2A
      were also present at selected L3MBTL2 target promoters. The
      E-box emerged to be the most overrepresented motif within
      L3MBTL2 binding sequences. L3MBTL2 is stably associated with
      the heterodimeric E-box-binding transcription factor MGA/MAX.
      Thus, the recruitment of L3MBTL2-containing complexes
      presumably does not occur via E2F6, but is likely mediated by
      MGA/MAX. Genome-wide expression analysis revealed weakly
      bound L3MBTL2 target genes to be specifically repressed by
      SUMOylated L3MBTL2. Besides analyzing the role of L3MBTL2
      SUMOylation, the effect of proteome-wide SUMOylation on the
      composition of L3MBTL2-containing complexes was investigated.
      Conservation of SUMOylation stabilized multisubunit
      complexes, whereas L3MBTL2 SUMOylation did not affect complex
      stability. Mass spectrometry of purified L3MBTL2-containing
      complexes identified potential interaction partners of
      L3MBTL2 showing no significant differences between wild-type
      and mutant L3MBTL2-containing complexes. However, due to
      conserved SUMOylation several proteins like GMPS, SUPT16H or
      SSRP1, so far not known to be associated with L3MBTL2, were
      identified with high confidence. Many of these proteins
      themselves are targets for SUMOylation. Thus, it can be
      proposed that SUMOylation of several proteins rather than
      SUMOylation of a single protein affects stability of
      L3MBTL2-containing complexes.
description: L3MBTL2 ist ein Mitglied der
      Familie von MBT-Domänen Proteinen. MBT-Domänen vermitteln die
      Bindung an methylierte Lysinreste innerhalb der N-Termini von
      Histonen. L3MBTL2 wurde als transkriptioneller Repressor
      beschrieben und ist ein Bestandteil verschiedener
      Multiproteinkomplexe. In Mäusen besitzt L3MBTL2 eine
      essentielle Funktion für die Embryonalentwicklung und
      beeinflusst die Proliferation muriner embryonaler
      Stammzellen. In dieser Arbeit wurde L3MBTL2 als Substrat der
      SUMOylierung identifiziert. Mutationsanalysen zeigten, dass
      die spezifische Konjugation von SUMO2/3 an den Lysinresten
      675 und 700 im äußersten C-Terminus des Proteins erfolgt. In
      vitro SUMOylierungs-Experimente identifizierten PIAS1 als E3
      Ligase der L3MBTL2 SUMOylierung. Analysen zur molekularen
      Funktion der SUMOylierung von L3MBTL2 ergaben, dass die
      SUMOylierung weder die Bindung des Proteins an N-terminale
      Histonenden, noch dessen Rekrutierung an Chromatin
      beeinflusst. Mithilfe von ChIP-Seq-Experimenten wurden die
      genomweiten Bindungsstellen von endogenem L3MBTL2, sowie von
      überexprimiertem wildtypischem und SUMOylierungs-defizientem
      L3MBTL2 identifiziert. Endogenes L3MBTL2 wird an Promotoren
      rekrutiert, die eine aktive Initiation der Transkription
      aufweisen. Die mit L3MBTL2 in stabilen Multiproteinkomplexen
      assoziierten Proteine E2F6 und RING2 sowie
      monoubiquitiniertes H2A wurden ebenfalls an ausgewählten
      L3MBTL2 Zielpromotoren nachgewiesen. Innerhalb der
      Bindungssequenzen von L3MBTL2 wurde die E-Box als das am
      stärksten überrepräsentierte Motiv ermittelt. L3MBTL2 ist mit
      dem E-Box-bindenden, heterodimeren Transkriptionsfaktor
      MGA/MAX in stabilen Multiproteinkomplexen assoziiert. Die
      Rekrutierung L3MBTL2-enthaltender Proteinkomplexe erfolgt
      daher vermutlich nicht über E2F6, sondern wird wahrscheinlich
      durch MGA/MAX vermittelt. Mithilfe genomweiter
      Expressionsanalysen wurden Gene mit einer schwachen
      L3MBTL2-Rekrutierung als spezifisch durch SUMOyliertes
      L3MBTL2 reprimierte Zielgene identifiziert. Neben der Analyse
      der SUMOylierung von L3MBTL2 wurde der Effekt der
      proteomweiten SUMOylierung auf die Zusammensetzung
      L3MBTL2-enthaltender Proteinkomplexe untersucht. Dabei führte
      die Konservierung der proteomweiten SUMOylierung zur
      Stabilisierung von Multiproteinkomplexen. Die SUMOylierung
      von L3MBTL2 alleine nahm keinen Einfluss auf die
      Komplexstabilität. Mithilfe einer massenspektrometrischen
      Analyse nach Aufreinigung L3MBTL2-enthaltender Komplexe
      wurden potentielle Interaktionspartner von L3MBTL2
      identifiziert. Dabei konnten keine signifikanten Unterschiede
      zwischen wildtypischem und SUMOylierungs-defizientem L3MBTL2
      festgestellt werden. Jedoch wurden infolge der Konservierung
      der proteomweiten SUMOylierung Proteine wie zum Beispiel
      GMPS, SUPT16H oder SSRP1 identifiziert, die bislang nicht als
      Interaktionspartner von L3MBTL2 beschrieben wurden. Viele
      dieser Proteine stellen selbst Substrate der SUMOylierung
      dar. Daher kann angenommen werden, dass verschiedene
      SUMOylierte Komplexkomponenten synergistisch auf die
      Stabilität eines Komplexes wirken. Die Modifikation eines
      einzelnen Proteins spielt dagegen eine untergeordnete
      Rolle.