title: Die zeitliche Stabilität und zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die Rezeptorphosphorylierung determiniert.
title: Receptor phosphorylation determines temporal stability and cellular localization of arrestin-receptor-complexes
Creators: name: Zindel, Diana
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Phosphorylierung , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Tandem-Massenspektrometrie
GPCRs
arrestins, phosphorylation
FRAP
PTH1R
LC-MS/MS
Sciences
Naturwissenschaften
G-Protein gekoppelte Rezeptoren , Arrestine
FRET

description: Agonist-induced phosphorylation of
      GPCRs is a significant prerequisite for the interaction with
      arrestins and receptor desensitization. Yet, it is unclear
      how different phosphorylation patterns impact on the
      interaction of arrestins with receptors and determine
      subsequent trafficking patterns of arrestin receptor
      complexes. In the present thesis this question was
      investigated at the β2-adrenoceptor and the parathyroid
      hormone receptor. First, an additional serine cluster was
      inserted into the proximal part of the β2-adrenoceptor´s C
      terminus. This receptor mutant, termed β2AR SSS, showed
      enhanced agonist dependent phosphorylation and an increase in
      the affinity for arrestin 3. In addition, the intracellular
      trafficking of arrestin 3 with this receptor was altered. The
      arrestin recruitment and the stability of arrestin receptor
      complexes were determined in real time by FRET and FRAP. It
      could be demonstrated that arrestin 3 dissociated quickly
      from the β2AR whereas the interaction with the β2AR SSS was
      two-to fourfold prolonged. The interaction of arrestin with a
      β2V2 chimera was poorly reversible during the timescale of
      the experiment. Further experiments revealed that the
      additional phosphorylation sites in the β2AR SSS led to
      colocalization of arrestin receptor complexes on early
      endosomes in response to agonist. In contrast, the wild type
      receptor interacted only transiently with arrestin at the
      plasma membrane. Furthermore the β2AR SSS internalized more
      efficiently than the β2AR whereas the recycling kinetics were
      very similar for both receptors. It was thus possible to show
      that the affinity between arrestins and receptors could be
      increased with minimal receptor modification. This was
      sufficient to alter the trafficking pattern of arrestin. In
      the second part of this thesis the ligand-dependent
      phosphorylation sites of the human PTHR were determined by
      LC-MS/MS. Ten phosphorylation sites could be identified of
      which three had not been described so far: T503, S519 and
      T547. The quantification of the ligand-dependent
      phosphorylation in PTHR mutants revealed that the first large
      serine cluster between S489-S495 in the C-terminal tail of
      the PTHR was massively phosphorylated or important for the
      phosphorylation of subsequent serine and threonine residues.
      Mutation of Ser and Thr residues between S501 and T506 showed
      that these residues play a crucial role for the interaction
      with arrestin 3. However, the extent of ligand dependent
      phosphorylation within this second cluster was smaller than
      the phosphorylation within the first cluster. T503 und S504
      within the second cluster were essential for the robust
      interaction with arrestin-3. Although the mutation of
      phosphorylation sites in the proximal part of the C-terminus
      of the PTHR to alanine massively reduced the interaction with
      arrestin 3, in none of the receptor mutants was the
      interaction with arrestin abolished entirely The stability of
      arrestin-receptor-complexes can not only be influenced on the
      level of receptors but can also be modified by modifications
      in arrestin. Two lysine to arginine mutations within
      phosphate-sensing elements in the N-terminus of arrestin 3
      (K11,12R) were able to reduce the arrestin 3 affinity towards
      the β2AR, the β2AR SSS and the PTHR. Notably this impacted on
      the compartmentalization of these receptors with arrestin.
      Whereas the colocalization of Arrestin K11,12R on endosomes
      with the β2AR SSS or the β2V2R was reduced, no cotrafficking
      of ArrestinK11,12R could be observed with the PTHR. This
      suggests that, depending on the receptor subtype,
      phosphate-sensing elements within arrestin may be of varying
      significance. In summary the experiments in this thesis show
      that arrestin is able to sense differential phosphorylation
      patterns in the proximal part of the C-terminus of GPCRs. The
      temporal stability of arrestin-receptor complexes is
      determined by the number and the localization of
      phosphorylation sites in the C-terminus of the GPCRs that
      were examined in this thesis. Importantly, this impacts on
      the cellular localization of arrestin-receptor complexes. The
      higher the temporal stability of an arrestin receptor
      complex, the greater the probability will be that it can be
      found in endocytic compartments. These findings collectively
      suggest that arrestin is able to form receptor specific and
      phosphorylation specific complexes.
description: Die Phosphorylierung
      G-Protein-gekoppelter Rezeptoren spielt eine bedeutende Rolle
      für die Interaktion mit Arrestinen und die
      Rezeptordesensibilisierung. Es ist jedoch unklar, wie
      unterschiedliche Phosphorylierungsmuster die Interaktion von
      Arrestin mit Rezeptoren und den nachfolgende Transportmuster
      von Arrestin Rezeptorkomplexen beeinflussen. In dieser Arbeit
      wurden zusätzliche Phosphorylierungsstellen in den C-Terminus
      des β2-adrenergen Rezeptors eingefügt. Es konnte gezeigt
      werden, dass die Rezeptormutante β2AR SSS verstärkt
      phosphoryliert wurde und eine Erhöhung der Affinität zu
      Arrestin 3 aufwies. Darüber hinaus war das Transportmuster
      von Arrestin-3 mit diesem Rezeptor verändert. Die
      Rekrutierung von Arrestin-3 und die Stabilität von
      Arrestin-3-Rezeptorkomplexen wurden in Echtzeit mittels FRET
      und FRAP bestimmt. Es wurde gezeigt, dass Arrestin-3 schnell
      und fast vollständig vom β2AR dissoziiert, während die
      Interaktion mit dem β2AR SSS 2-4 fach verlängert war. Die
      Arrestin-Interaktion mit einer β2V2-Rezeptorchimäre war
      innerhalb des betrachteten Zeitfensters kaum reversibel.
      Weitere Untersuchungen der Arrestin 3 Lokalisation ergaben,
      dass zusätzliche Phosphorylierungsstellen im β2AR SSS zur
      Kolokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen auf Endosomen
      führte. Der Wildtyp-Rezeptor hingegen interagiert nur
      transient mit Arrestin an der Plasmamebran. Der β2AR SSS
      internalisierte stärker als der β2AR, das Recycling für beide
      Rezeptoren verlief jedoch sehr ähnlich. Somit konnte diese
      Arbeit zeigen, dass die Interaktion zwischen Arrestin und
      Rezeptoren durch minimale Rezeptormodifikationen verstärkt
      werden kann und dass diese Veränderung ausreicht, um das
      Transportverhalten von Arrestin zu verändern. Im zweiten Teil
      dieser Arbeit konnten durch MS/MS Experimente
      ligandenabhängige Phosphorylierungsstellen im C-Terminus des
      humanen PTHR bestimmt werden. Dabei wurden drei bisher nicht
      identifizierte Stellen detektiert: T503, S519 und T547. Die
      Quantifizierung der agonistabhängigen PTHR-Phosphorylierung
      ergab, dass vor allem der Bereich zwischen S489 und S495
      stark phosphoryliert wird oder für die Phosphorylierung
      nachfolgender Serin und Threoninreste erforderlich ist. Bei
      der funktionellen Charakterisierung der
      Phosphorylierungsstellen stellte sich hingegen heraus, dass
      insbesondere die Phosphorylierung zwischen S501-T506, im
      proximalen PTHR-C-Terminus für die Interaktion mit Arrestin-3
      relevant ist. Dieser Bereich spielt für das Ausmaß der
      Gesamtphosphorylierung des Rezeptors nur eine untergeordnete
      Rolle. Innerhalb dieses Clusters nehmen T503 und S504 eine
      wichtige Rolle für die robuste Interaktion mit Arrestin 3
      ein. Obwohl die Mutation der Phosphorylierungsstellen im
      proximalen PTHR-C-Terminus zu Alanin die Interaktion mit
      Arrestin massiv beeinträchtigte, konnte mit keinem der in
      dieser Arbeit getesteten Rezeptorkonstrukte eine vollständige
      Inhibierung der Arrestin-3-Interaktion mit dem PTHR erzielt
      werden. Dass die Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen
      nicht nur durch Modifikationen auf Rezeptorebene, sondern
      auch durch Modifikationen in Arrestin beeinflusst werden
      kann, wurde im dritten Teil dieser Arbeit gezeigt. Selbst
      konservierende Mutationen in phophatsensitiven Elementen im
      N-Terminus von Arrestin-3 führten zur Reduktion der Affinität
      zum β2AR, dem β2AR SSS, dem β2V2R und dem PTHR. Dadurch wurde
      auch die Kompartimentalisierung dieser Rezeptoren mit
      Arrestin beeinträchtigt. Die Kolokalisation von Arrestin
      3K11,12R mit dem β2V2R und dem β2AR SSS auf Endosomen war
      zwar verringert, jedoch nicht ganz aufgehoben. Mit dem PTHR
      hingegen war kein endosomaler Kotransport mit Arrestin
      3K11,12R zu beobachten. Daraus geht hervor, dass die Rolle
      der beiden Lysine für die Kompartimentalisierung von
      Arrestin-Rezeptorkomplexen nicht für alle Rezeptoren
      einheitlich ist. Zusammenfassend zeigen die Resultate dieser
      Arbeit, dass Arrestin unterschiedliche
      Phosphorylierungszustände im proximalen C-Terminus
      G-Protein-gekoppelter Rezeptoren erkennen kann. Die zeitliche
      Stabilität von Arrestin-Rezeptorkomplexen wird durch die
      Anzahl und die Lokalisation von Phosphorylierungsstellen im
      C-Terminus von Rezeptoren bestimmt. Dies wirkt sich auch auf
      die zelluläre Lokalisation von Arrestin-Rezeptorkomplexen
      aus: Je höher die zeitliche Stabilität eines
      Arrestin-Rezeptor-Komplexes ist, desto größer ist die
      Wahrscheinlichkeit, dass diese in intrazellulären
      Kompartimenten, wie Endosomen zu finden sind. Diese Befunde
      unterstützen die Hypothese, dass Arrestin rezeptorspezifische
      und phosphorylierungsspezifische Komplexe bilden
      kann.