title: Establishment of a PCR based method for detection of mollicutes
title: Etablierung einer PCR-basierten Methode zur Detektion von Mollicutes
Creators: name: Broge, Anne
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Quality Control
Biowissenschaften, Biologie
Novartis Vaccines &amp; Diagnostics
Polymerase-Kettenreaktion
Mycoplasma
EP
Mollicutes
Control of absence
Prüfung der Abwesenheit
USP
Microarray
Qualitätskontrolle

description: A PCR-based method for detecting
      the absence of mycoplasmas (Mollicutes) was established in
      the laboryitories of the microbiological quality control of
      Novartis Vaccines &amp; Diagnostics (NVD) in Marburg in this
      doctoral thesis. The objective was to create the bases for
      the subsequent validation and approval of this method by the
      authorities, so that both the test methods currently used for
      the release of vaccines (cultivation test and indicator cell
      test in accordance with the European Pharmacopoeia) can be
      replaced by the new procedure. To this end the most suitable
      method for the PCR-based detection of Mollicutes was the
      CytoInspectTM System made by Greiner Bio-One GmbH, the
      principle of which is based on a touchdown PCR, followed by a
      microarray analysis for the detection and identification of
      PCR products. Three ready-to-use kits were considered in
      direct comparison. The main criteria were the sensitivity
      measured in practical trials for samples with high cell
      (&gt;107 cells/ml) and virus concentrations, the specificity,
      and the positive controls for monitoring the functionality of
      each individual test. Reference standards for ten different
      Mollicutes species were established for the validation of the
      PCR-based procedure and comparison with the previous
      cultivation-based methods. These were aliquoted and
      deep-frozen cell suspensions. The main criterion for the
      suitability of these standards was the lowest and most
      uniform ratio possible of gene copies (GC) per colony forming
      unit (CFU) in the individual aliquots of the respective cell
      suspensions. All ten reference standards exhibited a stable
      titer (CFU/ml) and a ratio of &lt; 20 GC/CFU. The sensitivity
      of the CytoInspectTM Kit was determined in the form of the
      detection limit. For the ten Mollicutes species tested in
      this study this lay between 22 and 0.5 GC/ml (which
      corresponded to 4.5 – 0.1 CFU/ml), in a sample volume of 10
      ml. It was comparable with the detection limit of the
      cultivation test, which was measured in this study at 2 to
      0.1 CFU/ml. Due to the likewise high sensitivity in the
      detection of free DNA from cells which had already died this
      method also offers the possibility of preventing living
      contaminations in the production facilities. The robustness
      of the procedure and the specific (exclusive) detection of
      Mollicutes with the CytoInspectTM Kit could be demonstrated
      by the practical tests. The safety of the test procedure was
      assessed in the context of establishing the method as a
      routine application for the batch release of vaccines under
      the local conditions prevailing in the laboratories of the
      microbiological quality control of NVD in Marburg. This took
      place, on the one hand, through the evaluation of the
      critical steps which could lead to a false-negative result.
      On the other hand, the risk of false-positive results, which
      could occur due to contaminations of the samples during the
      conduction of the tests, was assessed and minimized through
      corresponding measures.
description: Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde
      eine PCR-basierte Methode zum Nachweis der Abwesenheit von
      Mykoplasmen (Mollicutes) in der mikrobiologischen
      Qualitätskontrolle der Firma Novartis Vaccines &amp;
      Diagnostics (NVD) am Standort Marburg etabliert. Ziel war es,
      die Grundlagen für die anschließende Validierung und
      Zulassung dieser Methode durch die Behörden zu schaffen,
      sodass beide, aktuell zur Freigabe der Impfstoffe verwendeten
      Test-Methoden (Kultivierungstest und Indikatorzelltest gemäß
      Europäischem Arzneibuch) durch das neue Verfahren ersetzt
      werden können. Die hierfür am besten geeignete Methode zur
      PCR-basierten Detektion der Mollicutes war das CytoInspectTM
      System der Firma Greiner Bio-One, deren Prinzip auf einer
      touch-down PCR, gefolgt von einer Microarray Analyse zur
      Detektion und Identifizierung der PCR-Produkte, beruhte. Im
      direkten Vergleich wurden drei „ready-to-use“-Kits
      betrachtet. Die Hauptkriterien waren dabei die in praktischen
      Versuchen gemessene Sensitivität für Proben mit hohen Zell-
      (&gt;107 Zellen/ml) und Viruskonzentrationen, die Spezifität
      und die Positivkontrollen zur Überwachung der Funktionalität
      jedes einzelnen Tests. Für die Validierung des PCR-basierten
      Verfahrens und den Vergleich mit den bisherigen Methoden auf
      Kultivierungsbasis wurden Referenzstandards von zehn
      verschiedenen Mollicutes-Spezies etabliert. Es handelte sich
      dabei um aliquotierte und tiefgefrorene Zellsuspensionen. Das
      Hauptkriterium für die Eignung dieser Standards war ein
      möglichst niedriges und gleichmäßiges Verhältnis von
      Genkopien (GC) pro koloniebildender Einheit (KBE) in den
      einzelnen Aliquots der jeweiligen Zellsuspensionen. Alle zehn
      Referenzstandards wiesen einen stabilen Titer (KBE/ml) und
      ein Verhältnis von &lt; 20 GC/KBE auf. Die Sensitivität des
      CytoInspectTM Kits wurde in Form der Nachweisgrenze bestimmt.
      Für die zehn, in dieser Arbeit getesteten Mollicutes-Spezies
      lag sie zwischen 22 und 0,5 GC/ml (entsprach 4,5 0,1 KBE/ml),
      bei einem Probenvolumen von 10 ml. Sie war vergleichbar mit
      der Nachweisgrenze des Kultivierungstests, die in dieser
      Arbeit bei 2 bis 0,1 KBE/ml gemessen wurde. Durch die
      ebenfalls hohe Sensitivität bei der Detektion freier DNA von
      bereits abgestorbenen Zellen, bietet diese Methode zusätzlich
      die Möglichkeit zur Prävention lebender Kontaminationen in
      den Produktionsanlagen. Die Robustheit des Verfahrens und die
      spezifische (ausschließliche) Detektion von Mollicutes mit
      dem CytoInspectTM Kit konnten durch praktische Tests gezeigt
      werden. Im Rahmen der Etablierung der Methode als
      Routineanwendung zur Chargenfreigabe von Impfstoffen unter
      den örtlichen Gegebenheiten in den Laboren der
      mikrobiologischen Qualitätskontrolle von NVD in Marburg wurde
      die Sicherheit des Testverfahrens bewertet. Dies erfolgte zum
      einen durch die Evaluierung der kritischen Schritte, die zu
      einem falsch-negativen Ergebnis führen könnten. Zum anderen
      wurde das Risiko für falsch-positive Ergebnisse, die durch
      Kontaminationen der Proben während der Testdurchführung
      entstehen könnten, bewertet und durch entsprechende Maßnahmen
      minimiert.