ROLE OF JAGGED IN MULTIPLE-MYELOMA-ASSOCIATED ANGIOGENESIS
Creators: name: PALANO, MARIA TERESA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2019

description: Il mieloma multiplo � una neoplasia delle plasma cellule ancora incubabile, caratterizzata dall?accumulo di cellule tumorali nel midollo osseo. Durante la progressione dalla fase di Gammopatia monoclonale a significato incerto (MGUS) a mieloma multiplo diverse modifiche avvengono sia nelle plasma cellule sia nel microambiente del midollo osseo. � stato infatti dimostrato che le cellule di mieloma presentano la deregolazione della via di segnalazione di Notch causata dall?aumento dell?espressione dei ligandi Jagged1 e Jagged2. L?aumentata espressione di Jagged2 si riscontra anche durante la fase di MGUS, invece, Jagged1 risulta iper-espresso solo nella fase di mieloma multiplo. I ligandi Jagged possono attivare la via di segnalazione di Notch nelle cellule vicine, inducendo quindi un?attivazione di Notch non solo tra le stesse cellule di mieloma ma anche nelle cellule del microambiente midollare quali osteoclasti e cellule stromali. Un?altra importante caratteristica della progressione del mieloma multiplo � l?aumento dell?angiogenesi nel midollo. L? angiogenesi � una caratteristica comune e peculiare di molti tumori poich� � fondamentale per la sopravvivenza e la crescita del tumore ed inoltre � sfruttato come via preferenziale per la formazione di metastasi. Diverse evidenze indicano che l?angiogenesi si sviluppa di pari passo con la progressione del mieloma multiplo. Infatti, le cellule endoteliali di pazienti affetti da mieloma mostrano un differente fenotipo rispetto a quelle derivanti da pazienti affetti da MGUS o rispetto a cellule sane. L?endotelio derivante da soggetti con mieloma multiplo ha un?aumentata capacit� migratoria e organizzativa in saggi condotti in vitro ed inoltre esprime in misura maggiore fattori angiogenici. L?angiogenesi � un evento complesso controllato da diversi fattori solubili e da diverse vie di segnalazione. Tra questi il fattore di crescita dell?endotelio vascolare (VEGF) e la via di segnalazione di Notch svolgono un ruolo fondamentale nella formazione e nell?organizzazione dei vasi di nuova formazione. Da queste premesse iniziali si sviluppa questo lavoro che mira a studiare il ruolo dei ligandi Jagged1 e Jagged2 nella stimolazione dell?angiogenesi associata al mieloma multiplo. Sono stati considerati tre eventi associati alla progressione dell?angiogenesi che sono: l?adesione delle cellule endoteliali ad una matrice extracellulare, la migrazione e l?organizzazione di strutture simil-tubulari. Per questo studio sono state utilizzate tre linee cellulari umane di mieloma multiplo nelle quali l?espressione dei ligandi Jagged1 e 2 � stata silenziata con il conseguente decremento dell?attivazione della via di segnalazione di Notch. L?effetto del silenziamento dei ligandi Jagged � stato studiato da due diversi punti di vista. � stata valutata la modulazione del potenziale angiogenico dei fattori solubili rilasciati dal mieloma multiplo usando il medium condizionato delle cellule di mieloma. Tutti i saggi effettuati mostrano che il silenziamento dei Jagged nelle cellule di mieloma causa un decremento del potenziale angiogenico dei medium condizionati. Inoltre, abbiamo valutato la presenza e l?eventuale modulazione di VEGF ed abbiamo dimostrato che i ligandi Jagged e quindi la via di segnalazione di Notch, � in grado, nelle cellule di mieloma, di regolare la produzione di VEGF che � uno dei principali fattori che regolano il proce II Inoltre, abbiamo valutato l?eventuale attivazione di Notch nelle cellule endoteliali mediate contatto diretto con le cellule di mieloma esprimenti o meno i ligandi Jagged. Presumendo che il contatto diretto tra cellula di mieloma e cellula endoteliale avvenga nel momento in cui i vasi neoformati raggiungono la massa tumorale e che questo influisca sull?organizzazione vascolare, abbiamo sviluppato un saggio di co-coltura tra cellule di mieloma e cellule endoteliali per valutare l?effetto dei ligandi Jagged nella modulazione dell?organizzazione endoteliale. I risultati ottenuti indicano che i ligandi Jagged hanno un ruolo essenziale nel promuovere l?organizzazione dell?endotelio. Per avere ulteriore conferma di questo effetto, lo stesso saggio � stato condotto sfruttando una forma solubile di Jagged1. In tal modo abbiamo potuto escludere l?influenza derivante dai fattori solubili rilasciati dalle cellule di mieloma e il dato cos� ottenuto conferma il ruolo centrale di Jagged1 nella stimolazione diretta dell?endotelio di cui promuove l?organizzazione. Nella seconda parte del lavoro, abbiamo valutato se l?interazione tra mieloma e cellula stromale fosse in grado di aumentare il potenziale angiogenico dello stroma. Infatti, diverse evidenze indicano che le cellule di mieloma hanno la capacit� d modellare il comportamento delle cellule circostanti incluse le cellule stromali di midollo, aumentando la loro capacit� di sostenere il tumore promuovendone la crescita, la sopravvivenza e inducendo lo sviluppo di meccanismi di resistenza farmacologica. Abbiamo deciso di studiare in particolare le cellule stromali poich� esse sono tra le maggiori produttrici di fattori solubili pro-tumorali alcuni dei quali coinvolti nella progressione dell?angiogenesi come il VEGF. Per questo scopo � stato sfruttato un sistema di co-cultura tra la linea cellulare umana di stroma midollare, HS5, e le 3 linee cellulari mieloma silenziate o meno per i ligandi Jagged. Il potenziale angiogenico dei medium condizionati delle co-culture, confrontato con quello derivante dalla coltura singola di cellule stromali, � stato valutato nei tre saggi di adesione, motilit� e organizzazione endoteliale. I nostri risultati confermano che I ligandi Jagged del mieloma attivano nello stroma la via di segnalazione di Notch e stimolano una maggiore produzione di VEGF sia rispetto alla coltura singola che rispetto alla cocultura in assenza dei Jagged. Il medium condizionato derivante dalla co-cultura in presenza di un?attiva segnalazione di Notch induce un aumento nell?adesione, nella motilit� e nell?organizzazione dell?endotelio, caratteristiche che si riducono notevolmente nella stimolazione con medium condizionato derivante da co-culture in assenza dei jagged. L?effetto pro-angiogenico dei ligandi Jagged � ulteriormente stato confermato utilizzando un modello embrionale di Zebrafish. Questo modello ha il vantaggio di essere di facile manipolazione e permette di ottenere una elevata riproducibilit�; inoltre, risulta essere meno oneroso rispetto ad un modello murino che comporta tempi di sperimentazione pi� lunghi. Nel nostro modello di Zebrafish, l?iniezione di cellule di III mieloma esprimenti i ligandi stimola la formazione di numerose ramificazioni vascolari dal plesso di vasi intestinali preesistenti. Al contrario, l?assenza dei Jagged nel mieloma riduce notevolmente questo effetto. Infine, abbiamo cercato di ricapitolare i risultati ottenuti in vitro ed in vivo per verificare se il meccanismo pro-angiogenico attivato dai ligandi Jagged potesse essere efficace anche nei pazienti affetti da mieloma multiplo. L?ultima parte del presente lavoro si concentra sulla valutazione dell?effetto dei Jagged nell?angiogenesi tumorale in biopsie umane di midollo osseo. Sono stati identificati 3 gruppi di pazienti con mieloma multiplo in base al loro grado di infiltrazione: i pazienti con infiltrazione di cellule di mieloma minore del 20% sono stati classificati come basso grado; con infiltrazione dal 21% al 50% come grado medio e con infiltrazione superiore al 51% come grado alto. Le analisi immunoistochimiche hanno mostrato che Jagged1 ed HES6 aumentano parallelamente al grado di infiltrazione delle cellule di mieloma, all?espressione di VEGF e alla quantit� di nuovi vasi (cellule positive al marcatore CD34). Questi risultati sono coerenti con le precedenti evidenze ottenute sia in vitro che in vivo che indicano che i ligandi Jagged svolgono un ruolo pro-angiogenico. Inoltre, le analisi sulle biopsie di midollo sembrano suggerire che l?effetto angiogenico � limitato ad uno dei due ligandi, in particolare Jagged1, poich� Jagged2 presenta alti livelli di espressione in tutti i gradi di infiltrazione e non mostra alcuna correlazione con l?espressione di VEGF e con la presenza di vasi. In conclusione, questo studio mostra il ruolo centrale della via di segnalazione di Notch nell?attivazione dell?angiogenesi tumorale mediata dalla iper-espressione dei ligandi Jagged espressi dal mieloma e suggerisce che il ruolo principale � svolto da Jagged1. Ci� conferma ulteriormente il ruolo chiave dei ligandi Jagged espressi dalla cellula di mieloma nel riprogrammare il microambiente circostante per promuovere la progressione del tumore stesso. In particolare, questo lavoro attribuisce ai ligandi Jagged un ruolo anche nella stimolazione dell?angiogenesi, che si aggiunge ad altri effetti tra cui il supporto alla crescita tumorale, l?induzione delle lesioni ossee e lo sviluppo di resistenza a trattamenti farmacologici contribuendo cos� a fornire un razionale per l'uso di ligandi Jagged come bersagli terapeutici promettenti nel trattamento di pazienti con mieloma multiplo.