title: Molecular biological analysis of the role of placenta-specific 8 in the context of tumour progression in pancreatic ductal adenocarcinoma
title: Molekularbiologische Analyse der Rolle von Placenta-specific 8 im Zusammenhang mit der Tumorprogression beim pankreatisch duktalen Adenokarzinom
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Stark, Maren
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Plac8
Medical sciences Medicine
Medizin
Onzin
PDAC

description: Trotz intensiver Forschung ist die Prognose für Patienten, die an einem Pankreaskarzinom erkranken, mit einer 5‑Jahres Uf berlebensrate von nur 9‑10 % weiterhin sehr schlecht. Gründe dafür sind unter anderem das Fehlen von spezifischen Symptomen und geeigneten Biomarkern zur Früherkennung, die hohe Aggressivität dieser Krebserkrankung, die hohe Therapieresistenz gegenüber den zur Zeit verfügbaren Therapieformen sowie die hohe Heterogenität zwischen den einzelnen Tumorerkrankungen. Aus den genannten Gründen ist es zwingend erforderlich, Biomarker zu finden, die eine frühere Diagnosestellung ermöglichen, sowie effektivere, auf den jeweiligen Tumor abgestimmte Therapieformen zu entwickeln. Da unsere Arbeitsgruppe PLAC8 als ein stark überexprimiertes Gen in einer Subgruppe von pankreatisch duktalen Adenokarzinomtumoren identifizieren konnte, könnte für Patienten mit Tumoren dieser Subgruppe eine Targeted Therapy, die gegen PLAC8 oder ein downstream von PLAC8 reguliertes Gen gerichtet ist, eine neue Therapieform darstellen. Da diese Therapie spezifischer als die herkömmlichen Krebstherapien auf den Tumor wirken würde, könnte mit einer solchen Therapie die Prognose für diese Patienten verbessert werden. Analysen bezüglich der Wirkungsweise von PLAC8 zeigten, dass PLAC8 über den Eingriff in den Zellzyklus die Proliferation von pankreatisch duktalen Adenokarzinomzellen fördert. Weitere Analysen von CRISPR/Cas9 Klonen ließen außerdem die Schlussfolgerung zu, dass dieses nicht über das PLAC8 Protein, sondern über die PLAC8 RNA vermittelt wird. Basierend darauf wurde vermutet, dass die PLAC8 RNA ähnlich wie eine long non‑coding RNA auf die Proliferation dieser Zellen wirken könnte. Würde diese These tatsächlich zutreffen, würde sich dieses unter anderem darin zeigen, dass es nicht möglich sein sollte, eine PLAC8 RNAde fiziente pankreatisch duktale Adenokarzinomzelllinie zu generieren, da eine solche Zelllinie nicht mehr proliferations‑ und somit lebensfähig wäre. Ein Ziel dieser Arbeit war, diese These zu prüfen. Ein weiteres Ziel war außerdem, den genauen Wirkmechanismus von PLAC8 auf molekularer Ebene zu entschlüsseln. Um sich diesen Zielen zu nähern, sollte zunächst untersucht werden, ob sich bei der Analyse von weiteren CRISPR/Cas9 Klonen, die von der pankreatisch duktalen Adenokarzinomzelllinie S2‑007 abstammten, die Gegenselektion gegen eine PLAC8 RNA‑defiziente Zelllinie weiter bestätigen würde. Würde sich dieses zeigen, sollte in weiteren CRISPR/Cas9 Ansätzen untersucht werden, ob es möglich wäre, den endogenen PLAC8 Lokus mittels CRISPR/Cas9 auszuschalten, vorausgesetzt, dass gleichzeitig ein rekombinantes, nicht‑kodierendes PLAC8 Konstrukt in die Zelle eingebracht wird. Die Idee dabei war, dass das PLAC8 Konstrukt ‑ nach genomischer Integration ‑ die Funktion des endogenen PLAC8 Lokus übernehmen könnte und somit das Ausschalten dieses Lokus ermöglichen würde. Wäre dies möglich, wäre dies ein starkes Indiz dafür, dass die Ausgangsthese richtig ist und würde zudem zeigen, welche der in S2‑007 Zellen exprimierten PLAC8 Transkriptvarianten die für die Proliferationsfähigkeit dieser Zellen essentielle/n ist/sind. Um ein genaueres Bild von der Wirkungsweise von PLAC8 auf molekularer Ebene zu erlangen, sollten RNA Sequenzierungen mit cDNA Proben von S2‑007 Zellen mit und ohne PLAC8 Knockdown durchgeführt werden. Würden sich hier nach PLAC8 Knockdown veränderte Expressionsmuster in Genen zeigen, würden daran anschließend weitere Analysen durchgeführt werden, um einen funktionellen Zusammenhang zwischen diesen Genen und PLAC8 zu prüfen. Die bereits zuvor beobachtete Gegenselektion gegen eine PLAC8 RNA‑defiziente S2‑007 Zelllinie konnte im Rahmen der in dieser Arbeit vorgestellten Analysen weiter gestärkt werden. So hatte sich zunächst gezeigt, dass es trotz der Analyse von 38 CRISPR/Cas9 Klonen, die von dem PLAC8 Protein‑defizienten S2‑007 Klon G2#1 abstammten, nicht möglich gewesen war, den endogenen PLAC8 Lokus und somit die PLAC8 RNA Expression auszuschalten. Da dieser Klon auf Grund eines vorausgegangenen CRISPR/Cas9‑vermittelten Genome Editing (unter Verwendung einer Donorkassette mit Transkriptiosstopp‑Signal) nur noch über ein verbliebenes „wildtyp“‑Allel am PLAC8 Lokus verfügt hatte und die CRISPR/Cas9 Technologie grundsätzlich sehr effektiv ist, deutet dies sehr stark darauf hin, dass die PLAC8 RNA für die Lebensfähigkeit der S2‑007 Zelllinie essentiell zu sein scheint. Zusammen mit der Tatsache, dass für PLAC8 Protein‑defiziente S2‑007 Klone weiterhin ein Wachstums‑inhibierender Phänotyp nach der Behandlung mit PLAC8‑spezifschen siRNAs nachgewiesen werden konnte, kann dieses Ergebnis darauf zurückgeführt werden, dass die Expression der PLAC8 RNA für die Proliferationsfähigkeit der S2‑007 Zellen essentiell zu sein scheint, was das Entstehen einer PLAC8 RNA‑defizienten Zelllinie verhindert. Diese These wird weiterhin dadurch gestärkt, dass es auch in 248 weiteren CRISPR/Cas9 Klonen, die sowohl von dem Klon G2#1 als auch der Ausgangszelllinie S2‑007 abstammten, nicht möglich gewesen war, einen Knockout im endogenen PLAC8 Lokus zu erzeugen. Das bei der Herstellung dieser Klone eigentlich verfolgte Ziel, den endogenen PLAC8 Lokus auszuschalten und die essentielle Funktion dieses Lokus durch das Einbringen eines rekombinanten PLAC8 Konstrukts zu ersetzen, konnte bis jetzt noch nicht erfolgreich umgesetzt werden. Aus diesem Grund ist es weiterhin nicht möglich, eine Schlussfolgerung dahingehend zu treffen, ob eine oder mehrere der in S2‑007 Zellen exprimierten PLAC8 Transkriptvarianten für die Proliferationsfähigkeit dieser Zellen essentiell ist/sind. Da im Rahmen von Long‑Read Sequenzierungen 6 verschiedene PLAC8 Transkriptvarianten in cDNA Proben von S2‑007 Zellen identifiziert werden konnten, liegt es nahe anzunehmen, dass über eine oder mehrere dieser Transkriptvarianten die Proliferation der S2‑007 Zellen reguliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit war es bis jetzt noch nicht möglich, einen genauen Wirkmechanismus von PLAC8 auf molekularer Ebene nachzuweisen. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierungen hatten zwar für die Gene E2F1, E2F2 und E2F5 sowie HYOU1, CHPT1, TGOLN2 und B3GALT5 eine Herunterregulation in der RNA Expression nach PLAC8 Knockdown gezeigt, doch konnte bis jetzt für keines dieser Gene in weiteren Analysen ein funktioneller Zusammenhang mit PLAC8 bestätigt werden. Damit ist weiterhin offen, ob PLAC8 in seiner Rolle als long non‑coding RNA über die Regulation eines oder mehrerer dieser oder anderer Gene seinen pro‑proliferativen Effekt in S2‑007 Zellen vermittelt.
description: Despite intensive research, the prognosis for patients suffering from pancreatic cancer remains poor with a 5‑year survival rate of only 9‑10 %. Causes for this include the lack of specific symptoms and suitable biomarkers for early detection, the high aggressiveness of this cancer, the high resistance to the currently available forms of therapy and the high heterogeneity between the individual tumours. For the reasons mentioned, it is mandatory to find biomarkers that enable earlier diagnosis and to develop more effective forms of therapy tailored to the respective tumour. Since our group was able to identify PLAC8 as a strongly overexpressed gene in a subgroup of pancreatic ductal adenocarcinoma tumours, a targeted therapy directed against PLAC8 or a gene downstream regulated by PLAC8 could represent a new form of therapy for patients with tumours of this subgroup. Since this therapy would act more specifically on the tumour than conventional cancer therapies, such a therapy could improve the prognosis for these patients. Analyses regarding the mode of action of PLAC8 showed that PLAC8 promotes proliferation of pancreatic ductal adenocarcinoma cells by interfering with cell cycle. Further analyses of CRISPR/Cas9 clones suggested that this is not mediated via the PLAC8 protein, but via the PLAC8 RNA. Based on that, it was assumed that the PLAC8 RNA could act similar to a long non‑coding RNA on proliferation of these cells. If this were indeed true, it would be reflected, among other things, in the fact that it should not be possible to generate a PLAC8 RNA‑deficient pancreatic ductal adenocarcinoma cell line, as such a cell line would no longer be capable of proliferation and would thus no longer be viable. One aim of this work was to examine this thesis. Another aim was to also unravel the exact mode of action of PLAC8 on the molecular level. To approach these goals, it was first aimed to be tested whether the selection against a PLAC8 RNA‑deficient cell line would be further confirmed in the analysis of further CRISPR/Cas9 clones derived from the pancreatic ductal adenocarcinoma cell line S2‑ 007. If this was shown to be the case, further CRISPR/Cas9 approaches were to be carried out to investigate whether it would be possible to switch off the endogenous PLAC8 gene locus completely using CRISPR/Cas9, provided that a recombinant, non‑coding PLAC8 construct would be introduced into the cell at the same time. The idea was that ‑ after genomic integration ‑ the recombinant construct could take over the essential function of the endogenously expressed PLAC8 transcripts and would thus allow the silencing of the endogenous PLAC8 gene locus. If this were possible, it would be a strong indication that the initial hypothesis is correct and would also show which of the PLAC8 transcript variants, expressed in the S2‑007 cell line, is/are the one/s being essential for sustained proliferation of this cell line. To obtain a more accurate picture of the mode of action of PLAC8 on the molecular level, RNA sequencing was aimed to be performed with cDNA samples of S2‑007 cells with and without PLAC8 knockdown. If altered expression patterns in genes were found after PLAC8 knockdown, further analyses would then be carried out to test for a functional relationship between these genes and PLAC8. The previously observed selection against a PLAC8 RNA‑deficient S2‑007 cell line could further be strengthened in the analyses presented in this work. Initially, it had been shown that despite the analysis of 38 CRISPR/Cas9 clones derived from the PLAC8 protein‑deficient S2‑ 007 clone G2#1, it had not been possible to switch off the endogenous PLAC8 gene locus and thus PLAC8 RNA expression. As this clone only had one remaining „wild type“‑allele at the PLAC8 gene locus due to a preceding CRISPR/Cas9 editing (using a donor cassette encoding for a transcriptional stop signal) and the CRISPR/Cas9 techology in general is very effective, this strongly suggests that the expression of the PLAC8 RNA seems to be essential for the viability of the S2‑007 cell line. Together with the fact that for PLAC8 protein‑deficient S2‑007 clones a growth‑inhibitory phenotype could still be detected after treatment with PLAC8‑specific siRNAs, this result can be traced back to the fact that the PLAC8 RNA seems to be essential for sustained proliferation of these cells, preventing a PLAC8 RNA‑deficient cell line from being created. This thesis is further supported by the fact that it had neither been possible to switch of the endogenous PLAC8 gene locus in 248 other clones that originated from clone G2#1 or the parental cell line S2‑007. However, the actual aim of generating these clones, to switch off the endogenous PLAC8 gene locus and to replace the essential function of this locus by introducing a recombinant PLAC8 construct, has not yet been successfully realised. For this reason, it is still not possible to draw a conclusion as to whether one or more of the PLAC8 transcript variants, expressed in S2‑007 cells, are essential for sustained proliferation of these cells. Since 6 different PLAC8 transcript variants had been identified via long‑read sequencing in cDNA samples of S2‑007 cells, it is reasonable to assume that the proliferation of these cells is regulated by one or more of these PLAC8 transcript variants. In the framework of this work it had not yet been possible to determine a specific mode of action of PLAC8 on the molecular level. Although, by performing RNA sequencing analyses, a downregulation in the RNA expression had been shown for the genes E2F1, E2F2 and E2F5, as well as HYOU1, CHPT1, TGOLN2 and B3GALT5 after PLAC8 knockdown, no functional relationship between PLAC8 and one of these genes could yet be confirmed in further analyses. Therefore, it is still an open question whether PLAC8 mediates its pro‑proliferative effect in its role as a long non‑coding RNA via the regulation of one or more of these or any, so far unidentified, genes in S2‑007 cells.