title: Die Bedeutung von cfDNA im 24h-Urin beim Multiplen Myelom
Creators: name: Neuse, Carl Jannes
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2023
Subjects: subject: 610 Medicine and health

description: Mit dieser Studie wurde untersucht, inwiefern circulating-free-DNA (cfDNA) im 24h-Urin von Patienten mit Multiplem Myelom (MM) ein möglicher zukünftiger Parameter in liquid biopsies darstellen könnte. Hierfür wurden Urin-, Blut- und Knochenmarkproben von MM-Patienten gesammelt. Anschließend wurde die cfDNA im Urin konzentriert und aus Urin und Serum extrahiert. Aus mononukleären Zellen des Knochenmarks wurde Tumor-DNA isoliert. Im Anschluss wurden die Urin-cfDNA, die Serum-cfDNA und die Tumor-DNA mittels ultra-low-pass whole genome sequencing sequenziert und mittels ichorCNA analysiert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass von MM-Zellen stammende cfDNA hochwahrscheinlich in Patientenurin gelangt. Die Urin-cfDNA wies einige der copy number alterations auf, welche mittels diagnostischem Goldstandard vorbeschrieben waren. Hierauf aufbauend kann nun untersucht werden, inwiefern Urin-cfDNA klinische Anwendung beim MM finden kann, beispielsweise zur Einschätzung des Therapieansprechens.
description: Abbildungsverzeichnis ..... IV
Tabellenverzeichnis ..... V
Abkürzungsverzeichnis ..... VI
1 Einleitung ..... 1
1.1 Das Multiple Myelom ..... 1
1.1.1 Pathogenese des Multiplen Myeloms ..... 1
1.1.2 Klinik und Diagnostik ..... 2
1.2 Circulating-free-DNA als Biomarker in Liquid Biopsies ..... 4
1.2.1 Vorteile von Liquid Biopsies gegenüber konventionellen Biopsien ..... 4
1.2.2 Biologie der circulating-free-DNA ..... 4
1.2.3 Historie und Zukunft der klinischen Anwendung von cfDNA ..... 5
1.2.4 Vor- und Nachteile der Analyse von Urin-cfDNA ..... 5
1.3 Ablauf der Studie ..... 6
1.4 Zielsetzung ..... 7
2 Material und Methoden ..... 8
2.1 Urin Prä-Verarbeitung ..... 8
2.2 Urin-Konzentration ..... 8
2.2.1 Urin-Konzentration in den USA ..... 8
2.2.2 Urin Konzentration in Deutschland ..... 9
2.3 Gewinnung von cfDNA aus dem Urin ..... 9
2.4 Blutproben-Prozessierung ..... 10
2.4.1 Serum-Gewinnung ..... 10
2.4.2 Gewinnung von PBMCs ..... 10
2.4.3 Gewinnung von cfDNA aus dem Serum ..... 11
2.5 Knochenmark-Prozessierung ..... 12
2.6 DNA-Gewinnung aus BMMCs ..... 12
2.7 Bestimmung des cfDNA-Gehalts im Extrakt aus Urin und Serum ..... 13
2.7.1 Bioanalyzer ..... 13
2.7.2 PicoGreen® dsDNA Quantitation Assay ..... 14
2.8 Erstellung der Genomic-Libraries ..... 14
2.9 Sequenzierung mittels Ultra-Low-Pass Whole Genome Sequencing ..... 15
2.10 ichorCNA Analyse der Sequenzierungsdaten ..... 15
2.11 Statistik ..... 15
2.12 Transport in die USA ..... 15
3 Ergebnisse ..... 17
3.1 cfDNA ist im 24h-Urin von Patienten mit MM nachweisbar ..... 17
3.2 Membranbasierte cfDNA Konzentration im Urin ..... 18
3.3 Tumor-fraction der Urin-cfDNA, der Serum-cfDNA und der tDNA ..... 19
3.4 Detektion von einzelnen Copy-number events durch Sequenzierung von Urin-cfDNA ..... 20
3.4.1 ULP-WGS Ergebnisse Patient 2 ..... 21
3.4.2 ULP-WGS Ergebnisse Patient 4 ..... 22
3.4.3 ULP-WGS Ergebnisse Patient 5 ..... 23
3.4.4 ULP-WGS Ergebnisse Patient 6 ..... 24
3.4.5 ULP-WGS Ergebnisse Patient 7 ..... 25
3.4.6 ULP-WGS Ergebnisse Patient 8 ..... 26
3.4.7 ULP-WGS Ergebnisse Patient 9 ..... 27
3.4.8 ULP-WGS Ergebnisse Patient 10 ..... 28
3.4.9 Zusammenfassung der ULP-WGS Ergebnisse ..... 29
4 Diskussion ..... 31
4.1 Patientenurin als cfDNA Reservoir bei Patienten mit MM ..... 31
4.1.1 Vorteile von Urin-cfDNA ..... 31
4.1.2 uDNA weist eine geringe tumor-fraction auf ..... 32
4.1.3 Protokolloptimierungsansätze zur Erhöhung der tumor-fraction in uDNA ..... 33
4.2 ULP-WGS und ichorCNA Analyse der Sequencing Daten ..... 33
4.3 Analyse von einzelnen copy number variations in der Urin-cfDNA durch ULP-WGS ..... 34
4.4 cf-DNA als zukünftiger Biomarker in Liquid Biopsies beim MM ..... 35
4.4.1 cfDNA als Parameter zur Beobachtung von Patienten mit Vorstufen des MM ..... 35
4.4.2 Einsatz von Urin-cfDNA bei der Diagnose des MM ..... 36
4.4.3 cfDNA-Analyse zur Abschätzung der Prognose von Patienten mit MM ..... 37
4.4.4 Kontrolle des Therapie-Ansprechens mittels cfDNA-Analyse ..... 38
4.4.5 Minimal Residual Disease Monitoring mittels cfDNA-Analyse ..... 39
4.5 Zusammenfassung und Ausblick ..... 40
Literaturverzeichnis ..... 41
Danksagungen ..... 50
Lebenslauf ..... 51
Anhang ..... 52
Patientenaufklärung ..... 52
Bewilligungsschreiben der Ethikkommission ..... 59