title: Genetic polymorphisms in the promoter of the FSHB gene and their impact on transcription factor binding
Creators: name: Wiebusch, Viktoria Cleo
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2024
Subjects: subject: 610 Medicine and health

description: Follikelstimulierendes Hormon (FSH) ist essentiell für die männliche Fruchtbarkeit. Der SNP rs 10835638, G&gt;T, der sich im Promotor der FSH Beta-Untereinheit (FSHB) -211 Basenpaare 
stromaufwärts des Gens innerhalb einer der Bindungsstellen des aktivierenden Transkriptionsfaktors LHX3 befindet, führt zu einer Verringerung der FSH Produktion. 
Wir substituierten die Nukleotide A, T, G und C an der SNP-Position und deletierten weitere Teile der LHX3-Bindungsstelle, konnten jedoch keinen Einfluss auf die Promoteraktivität feststellen. 
Um zu untersuchen, ob der SNP möglicherweise mit anderen Regionen interagiert, identifizierten wir sechs weitere LHX3-Bindungsstellen im FSHB-Promotor und deletierten sie anschließend einzeln. Keine unserer Deletionen zeigte jedoch einen Effekt. Dies legt nahe, dass möglicherweise andere Bindungsstellen existieren, die für die LHX3-Bindung relevanter sind. Auch könnte die in vivo 3D-Konfiguration eine Rolle bei der Wirkung des SNP spielen.
description: 1. Introduction ..... 1
1.1. Male infertility ..... 1
1.1.1. Epidemiology ..... 1
1.1.2. Classification of semen analysis ..... 1
1.1.3. Causes ..... 1
1.1.4. Idiopathic infertility ..... 2
1.2. Endocrine regulation of spermatogenesis ..... 4
1.2.1. Hypothalamic-pituitary-gonadal axis ..... 4
1.3. FSH and infertility ..... 5
1.4.1. Activin and Sma/mothers against decapentaplegic (SMADs) ..... 6
1.4.2. Paired-like homeodomain transcription factor 2 (PITX2) ..... 7
1.4.3. Forkhead transcription factor 2 (FOXL2) ..... 7
1.4.4. Steroidogenic factor 1 (SF1) and nuclear transcription factor Y (NFY) ..... 8
1.4.5. LIM Homeodomain Transcription Factor 3 (LHX3) ..... 8
1.4.6. Enhancer ..... 9
1.5. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) ..... 10
1.5.1. Function of SNPs ..... 10
1.5.2. FSHB SNP rs10835638 and its impact on fertility ..... 10
1.5.3. FSHB SNP rs10835638 and its impact in vitro ..... 11
2. Hypothesis and Aims ..... 13
3. Material and Methods ..... 14
3.1. Working program ..... 14
3.2. Cell lines ..... 14
3.2.1. Cell culture ..... 15
3.3. In-vitro-Mutagenesis ..... 16
3.3.1. Plasmid vector ..... 16
3.3.2. Promoter constructs ..... 16
3.3.3. Renilla control construct ..... 18
3.3.4. LHX3 stimulation vector ..... 18
3.3.5. Positive and negative control constructs ..... 19
3.3.6. Mutagenesis / Plasmid amplification ..... 19
3.3.7. Primer ..... 20
3.3.8. Transformation / Plasmid amplification / Sanger Sequencing ..... 21
3.4. Transfection ..... 22
3.5. Dual Luciferase Assay ..... 22
3.6. Statistical analysis ..... 24
3.7. Bioinformatical analysis ..... 25
4. Results ..... 26
4.1. Stimulation with LHX3 ..... 26
4.2. Impact of nucleotide substitutions ..... 27
4.3. Impact of LHX3 binding site B deletions ..... 28
4.4. Bioinformatical Analysis ..... 29
4.4.1. Sequence Alignment ..... 29
4.4.2. Localization of putative LHX3 binding sites by JASPAR UCSC tracks ..... 30
4.4.3. Binding scores ..... 30
4.5. Impact of LHX3 binding sites A-F deletions ..... 32
5. Discussion ..... 34
5.1. LHX3 as an enhancer of FSHB transcription ..... 34
5.2. Relevance of the -211 SNP for FSHB synthesis ..... 35
5.3. The role of linkage disequilibrium and 3D interactions ..... 36
5.4. Nucleotide range of LHX3 binding site B ..... 37
5.5. Influence of other LHX3 binding sites on FSHB transcription ..... 38
5.6. Clinical relevance ..... 38
5.7. Limitations ..... 39
5.8. Prospects ..... 40
6. Sources ..... 42
7. Acknowledgements ..... 47
8. Supplements ..... 48
8.1. Abbreviations ..... 48
8.2. Table of reagents ..... 49
8.3. Solutions and buffer ..... 50
8.4. Material and Laboratory devices ..... 50
9. Curriculum vitae (Lebenslauf) ..... 51