title: Identification of unknown epigenetically regulated genes in non-small cell lung cancer
Creators: name: Babinsky, Valerie
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Um ein besseres Verständnis der Pathogenese des nicht-kleinzelligem Lungenkarzinoms zu erlangen, haben wir die Bedeutung der DNA Methylierung in NSCLC Zelllinien untersucht. Drei NSCLC Zelllinien wurden mit 5-aza-2'-deoxycytidine (Aza-dC) und/oder Trichostatin A (TSA) behandelt und das Geneexpressionsmuster von behandelten mit unbehandelten Zellen verglichen. Mit dieser Methode kann DNA Methylierung indirekt über die Analyse der differentiellen Gene Expression identifiziert werden. Wir haben 4560 Gene wurden identifiziert, deren Expression nach Behandlung mit den epigenetisch aktiven Agenzien in mindestens einer Zelllinie verstärkt war. 30% der verstärkt exprimierten Gene nach Behandlung mit Aza-dC wurden synergistisch hinauf reguliert nach Behandlung mit Aza-dC und TSA. Weiters wurden die drei NSCLC Zelllinien sowie „normal human bronchial epithelien cells“ (NHBEC) mit einer weiteren Genom-weiten DNA Methylierungsanalyse untersucht. Die Methode MeDIP-Chip wurde in den letzten Jahren entwickelt und kann DNA Methylierung direkt identifizieren. Basierend auf Immunopräzipitation werden in dieser Technik methylierte DNA Fragmente angereichert und mittels Microarray mit der Ausgangsprobe verglichen. Wir identifizierten 47 tumorspezifisch methylierte Gene. 45% dieser Gene waren auch in den Ergebnissen der ersten Methode präsent. Identifizierte Gene wurden durch eine genespezifische Methode, nämlich Methylierungs-spezifische PCR (MSP), bestätigt. Unter den identifizierten Genen befinden sich bereits bekannte Targetgene für Methylierung in NSCLCs sowie Gene, deren Methylierung bis dato unbekannt war. Eine Vielzahl der identifizierten Gene hat Einfluss auf Krebsassoziierte Signaltransduktionswege. Ein weiteres Resultat dieser Arbeit ist, dass neben der Methylierung einzelner Genen auch DNA Methylierung ganzer Gencluster wie HOXA und PCDHA identifiziert wurden. Insgesamt ist es uns gelungen, eine Vielzahl bis dato unbekannter Targetgene für DNA Methylierung zu identifizieren und somit, die Wichtigkeit der DNA Methylierung in der Pathogenese von NSCLC hervor zu heben.
description: Lung cancer is the number one of death reasons among cancer patients causing ~ one million deaths each year worldwide. Adenocarcinomas represent the predominant histological subtype of non-small cell lung cancers (NSCLC). Beside genetic aberrations, epigenetic changes lead to de-regulation of gene expression during the pathogenesis of lung cancer. The so far best studied epigenetic change in NSCLCs is DNA methylation. Several genes, including RASSF1A or DAPK have already been identified to be methylated in NSCLC. To gain further insight into DNA methylation changes in NSCLCs we performed two different approaches for whole genome DNA methylation analysis in three lung adenocarcinoma cell lines. The first approach is based on the observation that epigenetic changes are reversible. Thus, cell lines were treated with the epigenetically active drugs 5-aza-2’-deoxycytidine (Aza-dC), a DNA methyltransferase inhibitor, and trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor. Since synergistic effects of these two drugs are known cells were also treated with a combination of Aza-dC and TSA. Consequently, gene expression patterns of treated and untreated cells were compared by Affymetrix microarray analyses. Using this approach, we identified 4560 uniquely up-regulated genes after Aza-dC/TSA treatment. Since, Aza-dC and TSA are cytotoxic drugs up-regulation of certain genes may be due to secondary effects. To address this issue, we established an approach for direct identification of methylated DNA fragments: methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) combined with microarray analysis (MeDIP-chip). With this method methylation of ~28.000 CpG islands was analyzed in each of the 3 lung adenocarcinoma cell lines and in normal human bronchial epithelial cells (NHBEC). By comparing microarray data obtained from the adenocarcinoma cell lines and NHBE cells we identified 47 tumor-specifically methylated genes. Genes which were so far unknown to be de-regulated in lung cancer and which are affiliated to cancer associated pathways like cell differentiation, apoptosis or cell migration were identified (e.g. POU4F2, PAX6 and HOXA9). 21 out of the 47 genes identified were also found to be up-regulated after treatment with epigenetically active drugs. Results of the two whole genome level approaches were verified using methylation-specific PCR (MSP). MSP analyses in NSCLCs and corresponding non-malignant lung tissue samples obtained from 10 NSCLC patients verified the tumor-specific methylation of the genes identified. In conclusion, using genome-wide approaches for DNA methylation analysis we identified a large number of so far unknown methylated genes in NSCLC.