DEVELOPMENT OF AN IN-VITRO HUMANIZED MICROFLUIDIC PLATFORM TO STUDY NEURONAL TAU AGGREGATION AND PROPAGATION
Creators: name: FICULLE, ELENA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2021

description: Introduzione: la patologia di Alzheimer (AD) � la causa pi� comune di demenza ed � caratterizzata da depositi extracellulari di ?-amiloide e da aggregati intracellulari chiamati grovigli neurofibrillari (NFTs) formati dalla proteina tau iperfosforilata. Poich� � stato dimostrato che il declino cognitivo dei pazienti di AD correla con la diffusione degli aggregati di tau pi� che con la presenza di ?-amiloide, � fondamentale capire i meccanismi molecolari che causano la propagazione di tau. Studi hanno dimostrato come la diffusione temporale e spaziale degli NFTs sia costante nei vari pazienti e che sia dovuta alla propagazione attraverso il network assonale tra neuroni connessi a livello sinaptico. Ad oggi infatti, alcuni degli ?early phase Clinical Trials? e degli studi si stanno concentrando sulla propagazione di tau al fine di poter prevenire la sua internalizzazione da parte delle cellule riceventi, ancora sane, sia con uso di molecole che con anticorpi. Ci sono stati diversi studi per riprodurre in vitro un modello di network neuronale al fine di valutare in maniera appropriata delle terapie mirate prima che esse venissero testate in vivo, e la maggior parte di questi si basano sull?uso di microfluidica. Tuttavia, in questi modelli spesso sono stati utilizzati degli approcci poco fisiologici come l?over-espressione o la mutazione di tau o l?utilizzo di tags fluorescenti che possono compromettere l?affidabilit� di questi sistemi. Per questo motivo � necessario lo sviluppo di una nuova metodologia che possa migliorare questo approccio e che potr� in fine essere utilizzata per un efficiente ed affidabile screening di nuove terapie per la malattia di Alzheimer. Scopo del lavoro: il principale obiettivo di questa ricerca � stato quello di stabilire una nuova piattaforma neuronale umanizzata di microfluidica, che potesse modellare e che permettesse lo studio, dell?aggregazione e propagazione di tau in modo sia qualitativo che quantitativo. I dispositivi di microfluidica rappresentano un?alternativa miniaturizzata per ricapitolare la propagazione di aggregati proteici come quelli di tau; infatti, essi permettono la coltura di popolazioni neuronali sinapticamente connesse ma fisicamente isolate che possono essere indotte allo sviluppo di aggregati e, conseguentemente, alla loro propagazione. Questo modello potrebbe essere ideale per testare gli effetti di potenziali terapie contro tau che vadano a contrastare la propagazione trans neuronale. Materiali &amp; Metodi: al fine di sviluppare un modello di propagazione nei dispositivi di microfluidica, � stato in primo luogo validato un protocollo per stimolare l?aggregazione di tau endogena in neuroni corticali di ratto (RCN) utilizzando come induttore del materiale derivato da cervelli umani di pazienti AD (hAD seed). Successivamente, usando le stesse condizioni, sono stati sviluppati diversi protocolli di microfluidica per RCN che hanno mostrato non solo aggregazione ma anche propagazione di tau utilizzando tecniche quali High Content Imaging (HCI) ed un software di immagine che � stato sviluppato internamente. Infine, � stato sviluppato una versione umanizzata e miniaturizzata di questo protocollo al fine di avere una piattaforma fisiologicamente rilevante per poter testare terapie contro tau umana. Risultati: in questo progetto � stato sviluppato un modello cellulare umanizzato che permette lo studio della propagazione endogena di tau, da neurone a neurone, usando dispositivi di microfluidica. Dopo una prima fase di ottimizzazione, � stato dimostrato che utilizzando hAD seed � possibile indurre in neuroni corticali piastrati in dispositivi di microfluidica, l?aggregazione della proteina tau endogena e la sua propagazione in maniera trans-neuronale in modo quantificabile. Inoltre, questo modello � stato validato statisticamente ed � stato successivamente convertito in uno miniaturizzato per aumentare il ?throughput? della piattaforma passando cos� da 6 a 16 unit� di microfluidica contenute in una piastra. Infine, questo metodo � stato umanizzato al fine di studiare l?aggregazione e la propagazione della forma umana di tau usando una cultura primaria di neuroni murini che esprimono solo la proteina tau umana. E? stato dimostrato che Anle 138b, una molecola conosciuta in letteratura per le sue capacit� antiaggreganti, pu� bloccare l?aggregazione e il trasferimento trans-neuronale di tau, suggerendo che questo nuovo sistema possa essere usato per valutare i meccanismi di propagazione di tau e trovare nuove terapie. Conclusioni: In questo lavoro � stato sviluppato con successo un metodo di microfluidica quantitativo e riproducibile che pu� modellare le taupatie sporadiche umane come la malattia di Alzheimer. Usando sia RCN che neuroni corticali hTau trattati ed indotti con hAD seed, � stata osservata e quantificata la formazione e la propagazione di aggregati endogeni di tau ed � stato testato l?effetto di una molecola inibitoria su questi due meccanismi. � stato inoltre dimostrato come questi modelli possano essere anche utilizzati per condurre studi esplorativi come quelli volti al monitoraggio dell?attivit� e della connettivit� neuronale e gli studi sul ruolo dei diversi tipi cellulari presenti in cultura, nell?aggregazione e propagazione di tau. Soprattutto, � stato dimostrato come questo modello possa essere utilizzato come piattaforma di screening per testare potenziali inibitori della propagazione di tau murina ed umana.