title: Bone tissue engineering from marrow stromal cells: effects of growth factors and biomaterials
Creators: name: Lieb, Esther
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2004
Subjects: subject: Zellkultur , Biomaterial , Knochen , Osteoblast , RGD-Sequenz , Tissue Engineering , Wachstumsfaktoren , Stromazelle , growth factors , biomaterials , tissue engineering of bone , bone marrow stromal cell
subject: 540 Chemie

description: The tissue engineering of bone is a promising new field of research to address the problems arising from the loss of bony tissue occurring through infection, loss of blood supply or disease, such as osteoporosis, or as a complication of a fracture or genetic disorders. However, due to the complex composition of bone and many critical parameters in the tissue engineering (osteogenic factors, scaffold material, mechanical forces applied on cell-polymer constructs, cell source) influencing bone formation, there are still many obstacles that need to be surmounted to obtain in vitro engineered bone-like tissue. The goal of this thesis was to optimize two of the key factors that influence tissue engineering, the osteogenic agents and the scaffold material, in order to improve the formation of bone-like tissue. The strategy that we applied to engineer bone-like tissue involved aspiration of rat marrow stromal cells (rMSCs) from the bone marrow, cell expansion in two-dimensional cell culture to obtain a high cell number, dynamic cell seeding on poly(L-lactic-co-glycolic acid) (PLLGA) fiber meshes in spinner flasks, and finally in vitro cultivation of the cell-polymer constructs under treatment with osteogenic agents. At first, the optimization of the culture conditions for the bone cell culture of rMSCs was a necessary prerequisite for a successful approach to bone tissue engineering. To this end, we investigated the optimum cell seeding density at rMSC isolation, the influence of basal media with different nutrient concentrations and the time point, at which the osteogenic supplements may most advantageously be added. To improve bone tissue engineering, it is essential to overcome the problem of limited extracellular matrix formation in cell-polymer constructs of rMSCs when cultured with the standard osteogenic agents (dexamethasone, ß-glycerophosphate and ascorbic acid). Thus, we included transforming growth factor-ß1 (TGF-ß1), which was considered to be a promising growth factor to improve the matrix formation in our three-dimensional cell culture system, in order to solve the outlined problem. It was shown that the application of TGF-ß1 in addition to the standard osteogenic agents is indispensible to obtain a coherent bone-like extracellular matrix. We established culture conditions and dosing regimens, such that TGF-ß1 preserved or even increased osteoblastic cell differentiation. Furthermore, the combined application of the growth factors TGF-ß1 and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) offers a chance to enhance the osteoblastic differentiation of rMSCs in three-dimensional cell culture. Concerning the key factor the scaffold material, the examination of various biomaterials revealed that poly(D,L-lactic acid)-poly(ethylene glycol)-monomethyl ether (Me.PEG-PLA) diblock copolymers, especially Me.PEG2-PLA40 (PEG block of 2 kDa, PLA block of 40 kDa) are promising candidates for the use as scaffold materials in bone tissue engineering, because they provide controlled protein adsorption and positively influenced osteoblastic differentiation. At last, the successful grafting of an amine-reactive derivative [ST-NH-PEG2-PLA20] [1] of the low-adhesive Me.PEG-PLA diblock copolymers with an RGD (Arg-Gly-Asp)-peptide � the alphavbeta3/alphavbeta5 integrin subtype specific cyclic RGD-peptide [c(-RGDfK-)] [2] � was demonstrated by a receptor-ligand mediated cell adhesion. These results bear a great potential to achieve selective cell adhesion in implant technology and tissue engineering. References 1. Tessmar, J. K., Mikos, A. G., and Göpferich, A. (2002). Amine-reactive biodegradable diblock copolymers. Biomacromolecules. 3, 194-200. 2. Kantlehner, M., Schaffner, P., Finsinger, D., Meyer, J., Jonczyk, A., Diefenbach, B., Nies, B., Holzemann, G., Goodman, S. L., and Kessler, H. (2000). Surface Coating with Cyclic RGD Peptides Stimulates Osteoblast Adhesion and Proliferation as well as Bone Formation. Chembiochem.Europ.J.Chem.Biol. 1, 107-114.
description: Die künstliche Gewebezüchtung (Tissue Engineering) von Knochen ist ein neues, vielversprechendes Forschungsgebiet, um Knochendefekte aufgrund von Infektionen, mangelhafter Blutversorgung oder Krankheiten wie Osteoporose, sowie als Folge einer komplizierten Fraktur oder auch aufgrund von genetischen Defekten zu beheben. Der komplizierte Aufbau von Knochengewebe and die kritischen Parameter des Tissue Engineering (osteogene Faktoren, Gerüstmaterialien, mechanische Belastung der Konstrukte, Zellquelle), welche die Knochenbildung beeinflussen, führen jedoch zu einigen Problemen bei der in vitro Züchtung von Knochengewebe. Das Ziel dieser Dissertation bestand darin, zwei von den oben genannten Schlüsselfaktoren, und zwar die osteogenen Zusätze und das Gerüstmaterial, die einen großen Einfluss auf die Gewebebildung haben, zu optimieren, um hierdurch das entstehende knochenähnliche Gewebe positiv zu beeinflussen. Für die Züchtung des Knochengewebes wurden Stromazellen aus dem Knochenmark von Ratten (rMSCs) verwendetet. Die isolierten Zellen wurden zunächst in zwei-dimensionaler Zellkultur vermehrt, um eine möglichst hohe Zellzahl für die anschließende Aussaat auf die Poly(L-milchsäure-co-glykolsäure) (PLLGA) Fasergerüste zu gewinnen. Die Besiedelung erfolgte dynamisch in Bioreaktoren. Im Anschluss wurden die Zell-Polymergerüste unter Gabe von osteogenen Zusätzen in vitro kultiviert. Als eine wichtige Voraussetzung für die erfolgreiche Gewebezüchtung wurden in einem ersten Versuch, die Kultivierungsbedingungen für die Knochenzellkultur mit rMSCs optimiert. Hierzu untersuchten wir die optimale Aussaatdichte bei der Zellisolation aus dem Knochenmark, den Einfluss von Grundmedien mit verschiedenen Nährstoffzusammensetzungen, und schließlich den günstigsten Zeitpunkt für die Gabe des Differenzierungsmediums. Bei der Optimierung des Tissue Engineering von Knochen ist es unerlässlich, die unzureichende Extrazellularmatrixbildung auf den Zell-Polymerkonstrukten bei alleiniger Gabe der Standarddifferenzierungsfaktoren (Dexamethason, ß-Glycerolphosphat and Ascorbinsäure) zu beheben. Infolgedessen gaben wir zusätzlich zu den Standarddifferenzierungsfaktoren den Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor-ß1 (TGF-ß1), den wir als geeigneten Faktor betrachteten, die Matrixbildung in unserem drei-dimensionalen Zellkultursystem zu erhöhen, um damit das beschriebene Problem zu lösen. Wir konnten hierbei zeigen, dass die Gabe von TGF-ß1 zusätzlich zu den Standarddifferenzierungsfaktoren unerlässlich ist, um eine zusammenhängende knochen-ähnliche Extrazellularmatrix zu erhalten. Wir etablierten Kultivierungsbedingungen und Dosierungsschemata, so dass die Differenzierung der Stromazellen zum Phänotyp des Osteoblasten bei Gabe von TGF-ß1 erhalten blieb oder sogar erhöht wurde. Weiterhin erwies sich die kombinierte Applikation der Wachstumsfaktoren TGF-ß1 and Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) als eine Chance, die Differenzierung der rMSCs in drei-dimensionaler Zellkultur zu steigern. Im Hinblick auf den Schlüsselfaktor das Gerüstmaterial, zeigte die Untersuchung von verschiedenen Gerüstmaterialien, dass Poly(D,L-milchsäure)-poly(ethylenglykol)-monomethylether (Me.PEG-PLA) Diblockcopolymere, insbesondere Me.PEG2-PLA40 (PEG-Block: 2 kDa, PLA-Block: 40 kDa) vielversprechende Kandidaten für den Einsatz als Gerüstmaterialien im Tissue Engineering von Knochen sind, da die Proteinadsorption auf ihnen kontrolliert und außerdem die Knochenzelldifferenzierung positiv beeinflusst wird. Im Anschluss wurde ein zyklisches alphavbeta3/alphavbeta5-Integrin-Subtyp spezifisches RGD (Arg-Gly-Asp)-Peptid [c(-RGDfK-)] [1], erfolgreich in einem Instantverfahren an ein amino-reaktives Derivat [ST-NH-PEG2-PLA20] [2] der die Proteinadsorption reduzierenden Me.PEG-PLA Diblockcopolymere angebunden, was anhand von Zelladhäsionsstudien gezeigt wurde. Die Ergebnisse weisen auf ein großes Potential hin, um die Zelladhäsion in der Implantattechnologie als auch im Tissue Engineering selektiv zu beeinflussen. Referenzen 1. Kantlehner, M., Schaffner, P., Finsinger, D., Meyer, J., Jonczyk, A., Diefenbach, B., Nies, B., Holzemann, G., Goodman, S. L., and Kessler, H. (2000). Surface Coating with Cyclic RGD Peptides Stimulates Osteoblast Adhesion and Proliferation as well as Bone Formation. Chembiochem.Europ.J.Chem.Biol. 1, 107-114. 2. Tessmar, J. K., Mikos, A. G., and Göpferich, A. (2002). Amine-reactive biodegradable diblock copolymers. Biomacromolecules. 3, 194-200.