title: Microrespirometry with sensor-equipped microtiterplates
Creators: name: Arain, Sarina
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Atmung , Fluoreszenz , Sauerstoffsensor , Toxizitätstest , Wasserstoffionenkonzentration , Chemischer Sensor , Pseudomonas putida , Mikrotiter-Platte , pH-Sensor , Atmungshemmtest , Toxikologische Tests , respirometry , pH sensor , oxygen sensor , fluorescence , Pseudomonas putida
subject: 540 Chemie

description: In this work, the P. putida respiration inhibition test was successfully transferred into the microplate format. Microplates with embedded fluorescent sensors warrant a high throughput and high sensitivity. Although intensity-based, the fluorescence signals showed excellent accuracy and reproducibility due to internal referencing using an analyte-inert reference dye. This makes the assay independent of well-to-well variations in film thickness or fluctuations in the excitation light intensity or the sensitivity of the detector and enables a calibration-free application of the set-up. Cross-sensitivities towards turbidity or fluorescent sample ingredients were excluded by optical isolation (pH sensor) and choice of a rather long-wave oxygen indicator. Concerning oxygen detection, the well-known complications resulting from oxygen ingress into the sample was investigated using various plate sealings and shaking speeds. The experiments were confirmed by mathematical simulations and the oxygen ingress roughly compared via kLa fits. Whereas the use of paraffin oil sealings cause fast oxygen ingress due to convection, rigid sealings were found to be quite effective considering the prevention of oxygen ingress. However, homogenous application of these sealings is rather complicated and cannot be automated. Small gas phases remaining between cover and sample lead to outliers which have to be sorted out manually, making evaluation rather time-consuming. Therefore, 150 µL of paraffin oil in combination with a low plate acceleration of the MTP in the reader were chosen for the screening tests due to much better well-to-well reproducibility and repeatability. Effects of the oxygen ingress on oxygen-consuming reactions were illustrated using an enzyme kinetic. For low enzyme concentrations and rather permeable plate sealings like paraffin oil, the oxygen content does not converge towards zero, but a steady-state is formed between oxygen ingress and consumption. The level of this steady-state depends on the enzyme activity. Here, enzyme activities cannot be obtained as the initial slope of the kinetic because oxygen ingress partially compensates the consumption, leading to incorrect kinetic parameters. However, formation of a steady-state can be used for endpoint evaluations. The properties of the sensor proved to be vital for the obtained results: Using relatively thick sensor layers of high oxygen solubility, the response time of the sensor is increased considerably because the sensor serves as an oxygen reservoir which releases oxygen into the sample. This results in too slow kinetics and corrupted kinetic parameters. Toxicological tests using the oxygen-sensitive MTP were investigated with respect to the reproducibility and accordance to a comparative experiment using a closed system. The assay was optimised with respect to the storage conditions of the bacteria solution, the MTP sealing and bacteria concentration. The resulting calculated inhibitions using 100 µL of paraffin oil as plate sealing combined with a low plate acceleration were constant over several hours and in good accordance with the comparative experiment and with values given in literature. The toxicological test was further performed with pH-sensitive MTPs and optimised considering the test solution ingredients and bacteria concentrations. Here, addition of 100 mM of NaCl and a higher bacteria concentration than used for the oxygen experiments was found to be vital, although shifting the dose-response curves towards higher inhibitor concentrations and therefore making the test less sensitive. The dose-response curves agreed very well with the ones detected with the oxygen measurements recorded with the same composition of test solution and bacteria concentration. Dose-response curves for different inhibitors were recorded with the oxygen- and the pH-sensitive MTPs. The resulting dose-response curves match rather well. This makes both the pH- and the oxygen-sensitive MTP an appropriate alternative to the oxygen electrode which enables high throughput screening of a large number of samples.
description: In der vorliegenden Dissertation wurde der P. putida Atmungshemmtests erfolgreich auf das Mikrotiterplattenformat übertragen. Mikrotiterplatten mit integrierten Fluoreszenzsensoren gewähren einen hohen Durchsatz und eine hohe Empfindlichkeit dieser Methode. Durch interne Referenzierung mit einem zweiten, analytunabhängigen Fluoreszenzfarbstoff weisen die Fluoreszenzsignale trotz Verwendung der Intensität als Messparameter eine ausgezeichnete Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. Dadurch ist das Signal unabhängig von der Schichtdicke der Sensorspots, Schwankungen in der Intensität der Anregungslichtquelle oder der Detektorempfindlichkeit, was kalibrierfreie Messungen ermöglicht. Quer-empfindlichkeiten gegenüber trüben oder fluoreszierenden Probenbestandteilen wurden durch optische Isolierung des pH-Sensors bzw. Wahl eines langwelligen Sauerstoffindikators ausgeschlossen. Bei den Sauerstoffmessungen wurde das wohlbekannte Problem des Sauerstoffeintrags in die Probe unter Verwendung verschiedener Abdeckungen und Schütttelgeschwindigkeiten untersucht. Die Experimente wurden durch mathematische Simulationen bestätigt und der ungefähre Sauerstoffeintrag mittels kLa-Fits verglichen. Feste Abdeckungen stellten sich als relativ effektiv bezüglich der Verhinderung des Sauerstoffeintrags heraus, wogegen die Verwendung von Paraffinöl als Abdeckung schnellen Sauerstoffeintrag durch Konvektion zur Folge hat. Gleichmäßiges Aufbringen der festen Abdeckungen auf die Probe ist jedoch relativ schwierig und nicht automatisierbar. Kleine Gasblasen zwischen Abdeckung und Probe führen zu Ausreißern, die per Hand aussortiert werden müssen, wodurch sich die Auswertung sehr zeitaufwändig gestaltet. Deshalb wurden 150 µL Paraffinöl kombiniert mit einer langsamen Plattengeschwindigkeit der MTP im Reader für die Screening-Tests verwendet, welche eine um einiges bessere well-zu-well- und zeitliche Reproduzierbarkeit zur Folge hat. Die Auswirkung des Sauerstoffeintrags auf sauerstoffverbrauchende Reaktionen wurde anhand einer Enzymkinetik veranschaulicht. Bei geringen Enzymaktivitäten und relativ durchlässigen Abdeckungen wie Paraffinöl sinkt der Sauerstoffgehalt nicht auf 0. Statt dessen stellt sich ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Sauerstoffverbrauch und Sauerstoffeintrag ein, dessen Lage von der Enzymaktivität abhängt. Hierbei können Enzymaktivitäten nicht als Anfangssteigung der Kinetik bestimmt werden, da der Sauerstoffeintrag den Sauerstoffverbrauch teilweise kompensiert und zu falschen kinetischen Konstanten führt. Die Ausbildung eines dynamischen Gleichgewichts kann jedoch für Endpunkt-Bestimmungen verwendet werden. Auch die Eigenschaften des Sensors selbst beeinflussen das Ergebnis: Bei relativ dicken Sensorschichten und hoher Sauerstofflöslichkeit des verwendeten Polymers erhöht sich die Ansprechzeit des Sensors erheblich, da der Sensor als Sauerstoffreservoir fungiert, der Sauerstoff an die Probe abgibt. Dadurch werden kinetische Messungen erheblich verfälscht. Toxikologische Tests mit der sauerstoffempfindlichen MTP wurden bezüglich ihrer Reproduzierbarkeit und Übereinstimmung mit Ergebnissen aus Vergleichsexperimenten mit geschlossenen Systemen untersucht. Der Test wurde in Hinblick auf die Bedingungen bei der Aufbewahrung der Bakterienlösung, die Art der Abdeckung und die Bakterienkonzentration optimiert. Die berechnete Hemmung bei geschüttelter Aufbewahrung der Bakterien in 50 mM Phosphatpuffer war über einige Stunden hinweg konstant. Die Verwendung von 100 µL Paraffinöl als Abdeckung kombiniert mit einer möglichst langsamen Plattengeschwindigkeit ergab eine gute Übereinstimmung der Hemmung mit der des Vergleichsexperiments und mit Literaturwerten. Der toxikologische Test wurde außerdem in MTPs mit fluoreszierenden pH-Sensorspots durchgeführt und in Hinblick auf die Bestandteile der Testlösung und die Bakterienkonzentration optimiert. Hierbei waren die Zugabe von 100 mM NaCl und eine höhere als bei den Sauerstoffmessungen verwendete Bakterienkonzentration erforderlich, wobei dies die Dosis-Wirkungskurven in Richtung höhere Hemmstoffkonzentrationen verschiebt. Die Dosis-Wirkungskurven stimmten sehr gut mit denen der Sauerstoffmessungen überein, die unter Verwendung derselben Probenzusammensetzung und Bakterienkonzentration durchgeführt wurden. Dosis-Wirkungs-Kurven wurden für verschiedene Hemmstoffe sowohl mit der sauerstoff- als auch mit der pH-empfindlichen MTP aufgenommen. Diese stimmen in den meisten Fällen sehr gut überein. Daher sind sowohl die MTP mit Sauerstoffsensoren als auch die mit pH-Sensoren eine geeignete Alternative zur Sauerstoffelektrode, die einen hohen Durchsatz einer großen Anzahl von Proben ermöglicht.