Development of a FRET-Based Fluorescent Biosensor for ERK2 Activity
Creators: name: Klüßendorf, Thies
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2011
Subjects: subject: Biosensor
subject: ERK2
subject: ES-Imaging
subject: FRET
subject: signal transduction
subject: 570

description: Die dynamischen Eigenschaften von biologischen Systemen sind das Ergebnis der zugrundliegenden dynamischen Wechselbeziehungen der individuellen Komponenten. Die Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK)-Kaskade ist ein evolutionär konserviertes Signalweiterleitungsmodul, das das Schicksal von Zellen wie Wachstum oder Differenzierung reguliert. Die Aktivierung von Extracellular Signal-Regulated Kinase 2 (ERK2) folgt einer komplexen zeitlichen und räumlichen Dynamik, die eine wichtige Rolle für bestimmte nachgeordnete Signaleffekte spielt. Eine der Hauptherausforderungen für das Verständnis von MAPK Signalweiterleitung und der Mechanismen, die Signalweiterleitung innerhalb der Zelle ermöglichen, ist der Mangel an Methoden um Kinase-Aktivität mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in lebenden Zellen zu erfassen. Während traditionelle, biochemische Methoden auf Messungen von Durchschnittswerten aus einer Vielzahl von Zellen begrenzt sind, haben bereits veröffentlichte, auf FRET basierende Biosensoren für ERK2-Aktivität mehrere schwere Nachteile wie die nur indirekte Ermittlung von ERK2-Aktivität über die Phosphorylierung eines Substrats oder über eine Konformationsänderung, einen niedrigen, dynamischen Messbereich und ungenügende räumliche Auflösung (Fujioka et al., 2006; Sato et al., 2007; Harvey et al., 2008a). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit eine Methode entwickelt, um ERK2-Aktivität in einzelnen Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung und einem grossen dynamischen Messbereich sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Der direkteste Ansatz um Kinase-Aktivität in lebenden Zellen zu messen ist die Sichtbarmachung von kurzlebigen Enzym-Substrat (ES) Wechselwirkungen. Die Bildung eines ES-Komplexes kann über die Messung von Förster-Resonanzenergietransfer/ Fluoreszenzlebenszeiten (FRET/FLIM) zwischen einer Donor-markierten Kinase und einem Akzeptor-markierten Substratpeptid nachgewiesen werden (Yudushkin et al., 2007). Allerdings sind FLIM-Methoden auf ein grossen Anteil an Donormolekülen angewiesen, die FRET eingehen (d.h. einen hohen Anteil an Enzym im Komplex mit seinem Substrat) und kurze Peptide aus bekannten ERK2-Substraten haben KM-Werte in einem Bereich von 100 μM - 1 mM. Es ist deshalb schwierig, ausreichend hohe Substratkonzentration innerhalb von Zellen zu erreichen. In einem Versuch, die lokale Substratkonzentration zu erhöhen, wurde das Substratpeptid über einen flexiblen Peptidlinker mit ERK2 verbunden. Der Aufbau von ERK2 Activity Sensor 4 (EAS4) sollte prinzipiell auf alle Kinasen anwendbar sein. Er basiert auf der reversiblen Bindung und Phosphorylierung eines kurzen Substratpeptids durch die untersuchte Kinase. Die Bindung des Substratpeptids im aktiven Zentrum der Kinase verursacht eine umfassende Konformationsänderung von EAS4, die über eine Änderung des FRET-Signals erfasst werden kann, das durch Anhängen eines FRET-Paares fluoreszierender Protein erzielt wird. Deshalb ist dieser neu entwickelte, auf FRET basierende, fluoreszierende ERK2-Biosensor der Erste, der direkte Kinase-Aktivität in Raum und Zeit anzeigt, indem kurzlebige ES-Wechselwirkungen sichtbar gemacht werden. EAS4 zeichnet sich ausserdem durch einen dynamischen Messbereich und eine räumliche Auflösung aus, die zuvor veröffentlichten ERK2 Biosensoren überlegen ist. Zusätzlich konnte mit Hilfe von EAS4 gezeigt werden, dass Heregulin (HRG)-vermittelte, anhaltende ERK Aktivität in MCF-7 Zellen vornehmlich im Zytosol zu finden ist, während HRG-vermittelte ERK2-Aktivität im Zellkern sowie EGF-vermittelte ERK2-Aktivität transient ist. Dies zeigt das Potential von EAS4 für die weitere Untersuchung von biologischen Fragestellungen.