title: Interaktion von Ebola-Virus mit der zellulären Stressantwort und Etablierung eines EGFP exprimierenden Marburg-Virus
title: Analysis of the Host Stress Response to Ebola Virus Infection and Generation of a Recombinant Marburg Virus Expressing EGFP to Study Viral Spread
title: Analysis of the Host Stress Response to Ebola Virus Infection and Generation of a Recombinant Marburg Virus Expressing EGFP to Study Viral Spread
Creators: name: Schmidt, Kristina Maria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Ebola-Virus
Ebola virus
Processing body
VP30
PACT
Stressreaktion
Biowissenschaften, Biologie
Fluoreszenz
Marburg-Virus-Krankheit
Stress granule
PKR
Protein-Serin-Threonin-Kinasen
NP
Recombinant Marburg virus expressing EGFP
VP35

description: Die hoch pathogenen Filoviren
      Ebola- (EBOV) und Marburg-Virus (MARV) sind Erreger eines
      hämorrhagisches Fiebers mit Lethalitätsraten von bis zu 90%.
      Bislang sind weder spezifische antivirale Medikamente noch
      eine Impfung für den Einsatz am Menschen verfügbar. Die hohe
      Sterblichkeitsrate sowie die fehlende Therapie und Prophylaxe
      bedingen, dass Filoviren als Erreger der höchsten
      biologischen Sicherheitsstufe (4) klassifiziert werden und
      somit eine Erforschung nur in Hochsicherheitslaboratorien
      erlaubt ist. Herstellung eines rekombinanten Marburg-Virus
      mit Fluoreszenzmarker Ziel dieses Projekts war die
      Herstellung eines rekombinanten MARV, welches das „enhanced
      green fluorescence protein“ (EGFP)-Gen von einer
      zusätzlichen, in das virale Genom eingefügten
      Transkriptionseinheit exprimiert. Viren, die fluoreszierende
      Proteine exprimieren, erleichtern die Untersuchung des
      viralen Vermehrungszyklus und sind wertvolle Hilfsmittel für
      das „Screenen“ von potentiellen antiviralen Medikamenten. Das
      EGFP-Gen wurde zwischen dem zweiten Gen des MARV-Genoms, dem
      VP35-Gen, und dem nachfolgenden VP40-Gen eingefügt. Das
      rekombinante Virus (rMARV-EGFP) wurde über ein
      cDNA-Zwischenprodukt in transfizierten Zellen generiert und
      anschliessend in „live-cell imaging“ Versuchen eingesetzt.
      Eine Expression von EGFP wurde 32 Stunden nach Infektion
      erstmals detektiert und eine Infektion von Nachbarzellen nach
      55 Stunden. Im Vergleich zum rekombinanten Wildtyp-MARV wurde
      ein eingeschränktes virales Wachstum festgestellt. Dies ist
      wahrscheinlich auf die Insertion einer zusätzlichen
      Trankriptionseinheit zurückzuführen, da Gene, die hinter dem
      eingefügten EGFP-Gen liegen, weniger stark exprimiert wurden.
      In filoviralen Infektionen können charakteristische virale
      Einschlusskörper (inclusion bodies) detektiert werden, die
      sich im Zytoplasma infizierter Zelle bilden. Initiiert wird
      die Bildung dieser Einchlusskörper durch die Akkumulation des
      viralen Nukleoproteins (NP). Immunfluoreszenzanalysen von
      Zellen, die mit rMARV-EGFP infiziert waren, zeigten eine
      Akkumulation des EGFP in viralen Einschlusskörpern. In
      Tansfektionsexperimenten wurde die Relokalisierung
      verschiedener Fluoreszenzproteine in filovirale
      Einschlusskörper untersucht. Dies zeigte, dass ektopisch
      exprimierte Fluoreszenzproteine sowohl mit MARV- als auch mit
      EBOV-spezifischen Einschlusskörpern colokalisierten. Des
      Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die Expression von
      NP in der Abwesenheit anderer viraler Proteine ausreichend
      für die Akkumulation von EGFP in den Einschlusskörpern ist.
      Im Gegensatz dazu akkumulierten ektopisch exprimierte
      GFP-Fusionsproteine, die ein zelluläres Lokalisierungssignal
      besitzen, nicht in MARV-spezifischen Einschlusskörpern. Dies
      lässt darauf schließen, dass ektopisch exprimierte Proteine
      unspezifisch in den viralen Einschlusskörpern akkumulieren,
      wenn sie kein Lokalisierungssignal besitzen. Durch
      Immunfluoreszenzanalysen konnte zudem gezeigt werden, dass
      die EGFP-Aggregate zwar durch die Autofluoreszenz detektiert
      werden konnten, aber nicht in der Antikörperfärbung sichtbar
      waren. Dies weist darauf hin, dass Antikörper nicht in der
      Lage sind, virale Einschlusskörper zu durchdringen. Die
      zelluläre Stressantwort in Ebola-Virus Infektion Ebola-Viren
      sind in der Lage, essentielle antivirale Signalwege der
      Interferon-induzierten Immunantwort zu hemmen. Im Rahmen
      dieser Arbeit wurde die Interaktion von EBOV mit einem
      weiteren antiviralen Abwehrmechanismus, der zellulären
      Stressantwort, untersucht. Exogen induzierter Stress kann zur
      Aktivierung vier verschiedener Kinasen führen, die in
      aktivierter Form die α-Untereinheit des eukaryotischen
      Initiationsfaktors 2 (eIF2) phosphorylieren. Dies wiederum
      führt zu einer Hemmung der Proteinsynthese, welche mit der
      Bildung von cytoplasmatischen „stress granules“(SG) und
      „processing bodies“ (PB) einhergeht. Viren, die auf den
      zellulären Proteinsyntheseapparat angewiesen sind, haben
      vielseitige Abwehrstrategien gegen die zelluläre
      Stressantwort entwickelt. Im Folgenden wurde untersucht, wie
      EBOV mit SG und PB interagiert. Aufgrund der dynamischen
      Struktur von SG und PB wurden vorwiegend mikroskopische
      Analysen durchgeführt. Zunächst wurde untersucht, ob
      filovirale Infektionen eine Stressantwort induzieren. Es
      konnte gezeigt werden, dass in EBOV-infizierten Zellen keine
      endogenen SG gebildet werden. Die Behandlung von
      EBOV-infizierten Zellen mit dem Stressinduktor Natriumarsenit
      (As) führte zur Bildung von SG, allerdings in einer
      geringeren Anzahl von infizierten Zellen, verglichen mit
      nicht infizierten, behandelten Zellen. Die Ergebnisse weisen
      auf eine Hemmung von SG in mit EBOV infizierten Zellen hin.
      Zur besseren Visualisierung von SG wurde für die weiteren
      Untersuchungen eine Zelllinie verwendet, die das
      SG-Markerprotein „ras-GAP SH3 domain binding protein 1“
      (G3BP) konstitutiv exprimiert. In mit EBOV infizierten,
      G3BP-exprimierenden Zellen wurden SG mit zwei verschiedenen
      Toxinen induziert, As und Hippuristanol (Hip). Während As die
      Phosphorylierung von eIF2α induziert, bewirkt Hip die Hemmung
      der eIF4A-abhängigen Translationsinitiation, ein Prozess, der
      unabhängig von der Phosphorylierung von eIF2α zu der Bildung
      von SG führt. SG-Bildung wurde durch beide Toxine in mit EBOV
      infizierten Zellen ausgelöst, eine Reduktion wurde allerdings
      nur für die Bildung von As-induzierten SG in mit EBOV
      infizierten Zellen beobachtet. Interessanterweise wurden
      zudem SG-ähnliche G3BP-EGFP-Aggregate in den viralen
      Einschlusskörpern beobachtet, die sowohl in behandelten als
      auch in nicht behandelten EBOV-infizierten Zellen auftraten.
      Es konnte weiterhin durch Transfektionsversuche gezeigt
      werden, dass die Bildung viraler Einschlusskörper, die durch
      die Expression von Nukleokapsidproteinen induziert wurde,
      nicht ausreichend war, um die Aggregation von G3BP-EGFP in
      den viralen Einschlusskörpern zu bewirken. Dies lässt darauf
      schließen, dass andere Faktoren, wie beispielsweise virale
      RNA, benötigt werden, um SG-Komponenten in die viralen
      Einschlusskörper zu rekrutieren. Diese Ergebnisse weisen auf
      eine Hemmung der zellulären Stressantwort durch EBOV hin, die
      auf der Inhibition der Bildung von SG und auf einer
      Sequestierung essentieller SG-Komponenten beruht. Zur
      weiteren Charakterisierung der Inhibition von SG durch EBOV
      wurden in Transfektionsversuchen die RNA-bindenden EBOV
      Proteine NP, VP30 und VP35 einzeln exprimiert. Während VP30
      mit SG kolokalisierte ohne diese zu beeinträchtigen, wurde
      für das dsRNA-bindende VP35 eine inhibierende Wirkung auf die
      Bildung von SG beobachtet. In Zellen, die VP30 oder VP35
      gemeinsam mit NP exprimierten, wurden beide Proteine in die
      von NP induzierten Einschlusskörper rekrutiert, und die
      Kolokalisation mit SG war entweder stark reduziert oder nicht
      vorhanden. Dies wurde auch in mit EBOV infizierten Zellen
      beobachtet. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass
      VP30 und VP35 nur in ungebundener Form mit SG interagieren.
      Die Menge an freien VP30- und VP35-Proteinen in
      EBOV-infizierten Zellen ist wahrscheinlich zu gering, um in
      der Immunfluoreszenzanalyse detektiert zu werden. Unter
      As-induzierten Stressbedingungen wird die „dsRNA dependent
      protein kinase“ (PKR) von dem zellulären Protein „PKR
      activating protein“ (PACT) aktiviert. Aktivierte PKR
      phosphoryliert eIF2α, was zur Bildung von SG führt. Die
      Aktivierung von PKR durch dsRNA wird von dem EBOV-Protein
      VP35 effizient inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte
      gezeigt werden, dass die As-induzierte Aktivierung von PKR
      nicht von EBOV inhibiert werden kann. Fabrozzi et al. (2011)
      konnten bereits eine Bindung zwischen VP35 und PACT in nicht
      gestressten Zellen nachweisen. In dieser Arbeit wurde diese
      Bindung durch Coimmunpräzipitationsanalysen bestätigt und
      zudem gezeigt, dass in mit As behandelten Zellen VP35 nicht
      in der Lage ist an PACT zu binden. Dies könnte eine Bindung
      von PACT an PKR ermöglichen und damit zu der beobachteten
      Aktivierung von PKR führen. Die Aktivierung von PKR in mit
      EBOV infizierten Zellen nach As-Behandlung könnte auch die
      Bildung von SG in diesen Zellen erklären. Aus der
      beobachteten Reduktion von As-induzierten SG in
      EBOV-infizierten Zellen wird geschlossen, dass VP35
      SG-Komponenten inhibiert oder relokalisiert. Dies scheint mit
      der Expressionsrate von VP35 zusammenzuhängen. Zur weiteren
      Charakterisierung der zellularen Stressantwort wurde die
      Rolle von PB in EBOV infizierten Zellen näher untersucht.
      Hierzu wurde eine Zelllinie verwendet, die das
      PB-Markerprotein „mRNA-decapping enzyme 1A” (DCP1a)
      exprimiert. Eine Rekrutierung von As-induzierten PB an die
      viralen Einschlusskörper, die aber nicht zu einer
      Kolokalisation führte, konnte in EBOV infizierten Zellen
      beobachtet werden. Diese wurde auf die von NP initiierte
      Bildung von Einschlusskörpern zurueckgefuehrt.
      Expressionsstudien zeigten, dass PB mit VP35 kolokalisierten,
      aber nicht mit VP30 oder NP. Des Weiteren konnte gezeigt
      werden, dass in Zellen, in denen es zu einer durch VP35
      bedingten Hemmung der SG-Bildung kam, die entstandenen,
      diffusen G3BP-EGFP-Aggregate nicht nur mit VP35
      kolokalisierten, sondern auch mit PB interagierten. Dies
      weist darauf hin, dass VP35 mit SG- und PB-Komponenten
      interagiert und diese verbindet. Zusammengefasst zeigen die
      Ergebnisse dieser Arbeit, dass EBOV Mechanismen zur Kontrolle
      der antiviralen zellulären Stressantwort entwickelt hat, in
      denen VP35 eine wichtige Rolle spielt, da es mit Komponenten
      von SG und PB interagiert. Des Weiteren scheint die Bindung
      zwischen VP35 und PACT eine wichtige Rolle in der Kontrolle
      von PKR zu spielen.
description: Ebola virus (EBOV) and Marburg
      virus (MARV) belong to the filovirus family and cause
      outbreaks with case fatality rates up to 90%. Currently there
      is no approved vaccine or antiviral treatment available.
      Therefore filoviruses are classified as priority A select
      agents, which can only be handled in high containment
      biosafety level 4 laboratories. Generation of an infectious
      Marburg virus clone expressing EGFP The generation of
      recombinant viruses expressing enhanced green fluorescent
      protein (EGFP) has significantly improved the study of their
      replication cycle and opened up the possibility for the rapid
      screening of antiviral drugs. The goal of this part of the
      work was to generate a recombinant MARV expressing EGFP from
      an additional transcription unit inserted between the second
      and third genes, encoding VP35 and VP40, respectively. The
      recombinant MARV containing the EGFP gene (rMARV-EGFP) was
      successfully rescued and used in live-cell imaging to follow
      viral spread in real time, revealing EGFP expression at 32
      hours post infection (hpi), and infection of neighboring
      cells at 55 hpi. A slight growth restriction of rMARV-EGFP
      compared to the wt rMARV was observed which might be due to
      the additional gene insertion. During filovirus infection
      characteristic viral inclusions are formed in the cytoplasm
      of infected cells, induced by self-aggregation of the
      nucleoprotein (NP). Immunofluorescence analysis of
      rMARV-EGFP-infected cells revealed an accumulation of EGFP in
      these viral inclusions. This was reproduced by transient
      expression of both EGFP and other fluorescent proteins (FPs)
      along with filovirus nucleocapsid proteins, which further
      showed that NP-induced inclusion formation was sufficient for
      the recruitment. In contrast, ectopic GFP fusion proteins
      containing a localization signal were not relocated into
      inclusions formed by MARV NP and VP35. Taken together, the
      observed relocalization of ectopically expressed, untagged
      FPs suggests an unspecific recruitment to the viral
      inclusions based on a weak interaction. Interestingly, EGFP
      aggregates observed by autofluorescence were undetected by
      antibody-based immunofluorescence. This indicates that
      antibodies might not be able to penetrate viral inclusions.
      Cellular stress response to Ebola virus infection EBOV is
      known to antagonize various antiviral signaling pathways
      including the interferon response. Here, the interaction of
      EBOV with another host antiviral defense mechanism, the
      cellular stress response, was analyzed. During environmental
      stress a small range of kinases phosphorylate the eukaryotic
      initiation factor 2α (eIF2α), which plays a central role in
      the control of translational arrest. Cellular stress is also
      accompanied by the formation of cytoplasmic stress granules
      (SGs) and processing bodies (PBs) containing stalled
      messenger ribonucleoprotein bodies. Since viruses depend on
      the cellular translation apparatus for viral protein
      synthesis, many viruses have evolved strategies to antagonize
      cellular stress response mechanisms. Here we demonstrate that
      EBOV interferes with the cellular stress response. Since, SGs
      and PBs are highly dynamic structures, which cannot be
      isolated from cells, most of the studies presented here were
      performed by microscopic analysis. Formation of endogenous
      SGs was not observed in EBOV-infected cells, suggesting that
      filovirus infection per se does not induce a stress response.
      This raised the question of whether SG formation is actively
      inhibited in EBOV-infected cells. The oxidative stressor
      sodium arsenite (As) induces eIF2α phosphorylation and SG
      formation. After As- treatment, SGs formed in EBOV-infected
      cells, albeit in fewer cells compared to non-infected cells,
      indicating that EBOV is able to inhibit As-induced SG
      formation to a certain level. For better visualization SG
      formation was further analyzed in U2OS cells expressing an
      EGFP-tagged SG maker protein, ras-GAP SH3 domain binding
      protein 1 (G3BP). In EBOV-infected G3BP-EGFP-expressing
      cells, SG formation was induced by As and Hippuristanol
      (Hip). Hip leads to SG formation by inhibiting
      eIF4A-dependent translation initiation, a process, which does
      not involve phosphorylation of eIF2α. In some EBOV-infected
      cells treated with As, G3BP-EGFP was diffusely distributed
      and SG formation was impaired. This was not seen in
      Hip-treated cells, suggesting that EBOV inhibits SG formation
      to a certain level in response to phospho-eIF2α-mediated
      stress. This inhibition seemed to be dependent on the size of
      the viral inclusions, suggesting that the level of viral
      protein expression is important for the inhibition.
      Intriguingly, G3BP-EGFP SG-like aggregates were observed
      within the viral inclusions in unstressed and in stressed
      EBOV-infected cells. Transient expression of viral
      nucleocapsid proteins leading to inclusion formation was not
      sufficient for the aggregation of G3BP granules inside the
      inclusions, suggesting that other viral components, including
      the viral RNA, are needed to sequester SG components in the
      inclusions. Together this data suggest a mechanism of EBOV to
      interfere with SGs by sequestering SG components in the viral
      inclusions. To further understand how EBOV interacts with
      SGs, the EBOV RNA-binding proteins NP, VP30, and VP35 were
      individually examined for their ability to interact with SGs.
      While VP30 colocalized with SGs without affecting their
      structure, the double-strand (ds) RNA-binding protein VP35
      inhibited SG formation induced by phospho-eIF2α-mediated
      stress when expressed at high levels. However, when VP30 and
      VP35 were coexpressed with NP, both proteins were relocated
      into NP-derived viral inclusions and colocalization with SGs
      was strongly reduced or absent, which was also observed in
      EBOV-infected G3BP-EGFP cells. This indicates that only free
      VP35 and VP30 are able to colocalize with SGs and that both
      proteins are preferentially relocated to viral inclusions. It
      is conceivable that the amount of free VP35 and VP30 in
      infected cells is too low to be detected by IFA. In
      As-treated cells the dsRNA-dependent protein kinase (PKR) is
      activated by the cellular protein, PKR activating protein
      (PACT). Activated PKR phosphorylates eIF2α, inducing SG
      formation. In EBOV-infected cells, activation of PKR by dsRNA
      has been shown to be efficiently inhibited by VP35. Our data
      revealed that EBOV was not able to block As-induced PKR
      activation. This indicates that PKR activation by PACT cannot
      be antagonized by VP35. Previous studies have reported that
      VP35 binds to PACT in unstressed cells (Fabozzi et al., 2011)
      Here we show that the VP35-PACT interaction was disrupted in
      stressed cells. This indicates that VP35 loses the ability to
      sequester PACT from binding to PKR, such that PKR can be
      activated. This further explains the presence of SGs in
      EBOV-infected cells but the questions remains, how
      eIF2α-induced SG formation is inhibited in EBOV-infected and
      VP35 expressing cells? Possible mechanisms include the
      inhibitory function of VP35 on SG formation or the
      sequestering of SG components. To analyze the role of PBs in
      EBOV infection, a U2OS cell line expressing the PB marker
      protein mRNA-decapping enzyme 1A (DCP1a) fused to mRFP was
      used. In EBOV-infected cells, As-induced PBs were observed to
      surround viral inclusions, suggesting a recruitment of PBs.
      In transient transfection experiments, PBs colocalized with
      VP35 but not with VP30 or NP. Expression of VP35 in U2OS
      cells containing both G3BP-EGFP and DCP1a-mRFP resulted in
      diffusely aggregated SGs that colocalized with VP35 and
      intermingled with PBs. This suggests that VP35 interacts and
      links constituents of PBs and SGs. The results indicate that
      EBOV exhibits antiviral control strategies at the level of
      the host stress response, where VP35 functions as a key
      player, since it directly interacts with cellular stress
      components of both SGs and PBs. Furthermore, the binding
      between VP35 and PACT seems to play an important role in the
      control of PKR.