CHARACTERIZATION OF NOVEL SMALL RNA BASED REGULATORY NETWORKS IN THE OPPORTUNISTIC PATHOGEN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Creators: name: FALCONE, MARILENA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: I piccoli RNA sono corte sequenze di RNA non codificante che regolano l?espressione di numerosi elementi coinvolti nella virulenza di batteri patogeni, in particolar modo quelli coinvolti nell?interazione con l?ospite. In Pseudomonas aeruginosa, patogeno opportunista che causa infezioni potenzialmente mortali in soggetti immunodepressi ed in pazienti affetti da fibrosi cistica, i piccoli RNA rivestono un ruolo di grande interesse nello scenario dei regolatori post-trascrizionali, modulando importanti meccanismi regolativi alla base della patogenesi di questo microrganismo. Il progetto di ricerca discusso in questa tesi di dottorato ha come obiettivo la caratterizzazione di due piccoli RNA di P. aeruginosa, denominati ErsA e PesA, conservati sia in ceppi clinici che ambientali. Come descritto in Ferrara et al. 2015, l?espressione di ErsA � sotto il controllo del fattore sigma ?alternativo? ?22 (AlgT/U), implicato nella patogenesi in risposta a diversi stress ambientali, e l?espressione di ErsA viene modulata da segnali connessi con la transizione ambiente esterno ospite, cambiamenti della temperatura oppure modulazione dei livelli di ossigeno, Nel ceppo standard di laboratorio PAO1, ErsA regola negativamente a livello post-trascrizionale l?RNA messaggero (mRNA) di AlgC codificante per un enzima cruciale nella sintesi degli zuccheri utilizzati nella produzione di esopolisaccaridi, componente principale della matrice del biofilm batterico. Partendo da questo scenario, abbiamo usato diverse strategie sperimentali per delineare in modo pi� dettagliato il contributo di ErsA nella formazione di biofilm come analisi in silico, in vivo ed in vitro, corroborate da studi fenotipici e genetici (RNA-sequencing) eseguiti su un ceppo di PAO1 deleto del gene codificante per ErsA (PAO1 ?ersA). I risultati ottenuti dall?analisi fenotipica, suggeriscono un?influenza positiva di ErsA sul corretto sviluppo del biofilm di P. aeruginosa, presumibilmente modulando a livello post-trascrizionale l?espressione di AmrZ, identificato come nuovo target diretto di ErsA. AmrZ � un regolatore trascrizionale che controlla l?espressione di numerosi geni coinvolti nella produzione di strutture necessarie allo sviluppo del biofilm batterico, alcuni dei quali risultano essere deregolati in assenza di ErsA come emerso dall?analisi del profilo trascrizionale del ceppo PAO1 ?ersA. In parallelo allo studio su ErsA, abbiamo caratterizzato anche un secondo piccolo RNA, PesA, codificato dall?isola di patogenicit� PAPI-1 del ceppo PA14. I nostri risultati mostrano che la delezione di pesA in PA14 (PA14 ?pesA) determina una minore virulenza del ceppo rispetto al suo corrispondente wild-type, come evidenziato dall?alta percentuale di sopravvivenza delle cellule epiteliali bronchiali derivate da pazienti affetti da fibrosi cistica in seguito all?infezione con il ceppo PA14?pesA. Inoltre, abbiamo evidenziato una regolazione positiva che PesA esercita sull?operone pyoS3A-I deputato alla produzione di piocine S3, batteriocine importanti per la virulenza e la colonizzazione di nuove nicchie ecologiche. Infine, la mancanza di PesA contribuisce alla maggiore sensibilit� all?antibiotico fluorochinolone ciprofloxacina e al trattamento con raggi UV suggerendo un potenziale coinvolgimento delle piocine S3 nella riparazione dei danni al DNA.