title: The influence of selected natural products on nuclear receptors controlling cholesterol homeostasis in intestinal cells and macrophages
Creators: name: Hiebl, Verena
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Atherosklerose ist eine chronische Erkrankung der Arterien, gekennzeichnet durch die Entstehung von Plaques, die Cholesterinkristalle sowie lipidreiche Schaumzellen enthalten. Die aus Atherosklerose resultierenden Komplikationen, wie Schlaganfall und Herzinfarkt, gehören zu den häufigsten Todesursachen in Industrieländern. Daher ist die Modulierung der Cholesterinaufnahme und -ausscheidung von großem Interesse. Da der Darm eine wichtige Schnittstelle in Cholesterinaufnahme und -ausscheidung ist, stellt er ein interessantes pharmakologisches Ziel dar. Darüber hinaus spielen Makrophagen eine entscheidende Rolle in der Entstehung von Atherosklerose, da ihre Aufnahme von Lipiden in der Entstehung von Schaumzellen resultiert, welche das Fortschreiten von Atherosklerose begünstigen. Die nukleären Rezeptoren LXR, FXR, PPAR und ihr Heterodimer-Partner RXR, sind wichtige Regulatoren von metabolischen Vorgängen. Ihre Zielgene umfassen bedeutende Cholesterintransporter sowohl im Darm als auch in Makrophagen, wie zum Beispiel ABCA1, ABCG1, ABCG5/G8 und NPC1L1, was ihr großes Potenzial als Wirkstoffziele verdeutlicht. Das Ziel dieser Arbeit war, Protokolle für die in vitro Untersuchung intestinaler Cholesterintransport-Prozesse aufzusetzen und ausgewählte Naturstoffe hinsichtlich ihres Einflusses auf die Cholesterinaufnahme sowie -ausscheidung in Makrophagen und intestinalen Zellen zu testen. Um den Effekt eines bestimmten Naturstoffes auf den intestinalen Cholesterintransport untersuchen zu können, wurde die humane intestinale Caco-2 Zelllinie in unserem Labor etabliert. Viele Publikationen existieren bereits, welche die Caco-2 Zelllinie verwenden, jedoch unterscheidet sich die verwendete Methodik zwischen den verschiedenen Laboratorien, oder sie wird nur skizzenhaft beschrieben, wodurch die Reproduktion erschwert wird. Umfangreiche Protokolle für die Kultivierung der Caco-2 Zelllinie und die Viabilitätsbestimmung wurden erstellt und einer Qualitätskontrolle unterzogen. Ein Cholesterinaufnahme- und ein Cholesterinefflux-Assay wurden aufgesetzt, ebenso wie ein Luziferase-Reportergen-Assay, welcher eine potentielle Aktivierung von nukleären Rezeptoren zeigen soll. Die Messung der Protein- und mRNA-Level von Cholesterintransportern stellte eine große Herausforderung dar, weshalb kritische Schritte und alternative Herangehensweisen evaluiert wurden. Naturstoffe sind ein interessanter Pool an potentiellen Liganden für nukleäre Rezeptoren und eine wichtige Ressource für die Wirkstoffentwicklung. Soraphen A, ein Naturstoff aus der Gruppe der Polyketide, ist ein Inhibitor von Acetyl-CoA Carboxylasen, wodurch es die de novo Fettsäuresynthese hemmt und die Fettsäure β-Oxidation erhöht. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass Soraphen A den Cholesterinefflux aus Makrophagen über den ABCA1 Transporter erhöht. Soraphen A induzierte die Expression von ABCA1 über eine Erhöhung der transkriptionellen Aktivität von LXR. Es zeigte sich, dass die Aktivierung von LXR die Konsequenz einer Erhöhung freier Cholesterin-Level ist, welche höchstwahrscheinlich auf die Inhibierung der Fettsäuresynthese zurückzuführen ist. Piperin, ein in Piper nigrum L. vorkommender Scharfstoff aus der Gruppe der Alkaloide, besitzt kardioprotektive Eigenschaften in vivo. Eine Reihe von Piperin-Derivaten wurde synthetisiert und in Bezug auf die ABCA1 Protein-Expression untersucht, wobei LAU398 als potentestes Piperin-Derivat identifiziert wurde. LAU398 erhöhte den Cholesterinefflux aus Makrophagen über ABCA1, während es die intestinale Aufnahme von Cholesterin verringerte. Die Verbindung aktivierte keine nukleären Rezeptoren, erhöhte aber die Protein-Expression von LXRα. In früheren Studien wurde gezeigt, dass LAU398 Capsaicin-induzierte Ströme durch TRPV1-Kanäle verstärkt. Nichtsdestotrotz konnte weder die Co-Applizierung mit einem TRPV1-, noch mit einem LXR-Antagonisten die Effekte auf die Cholesterinaufnahme aufheben. Der exakte Wirkmechanismus von LAU398 bleibt noch zu klären. Kurz zusammengefasst beschreibt diese Arbeit die Etablierung von Protokollen für die Untersuchung des intestinalen Cholesterintransports basierend auf der Verwendung der Caco-2 Zelllinie. Sie zeigt den Einfluss des Naturstoffes Soraphen A sowie des Naturstoff-Derivates LAU398 auf die Cholesterinhomöostase und analysiert die zugrundeliegenden molekularen Wirkmechanismen.
description: Atherosclerosis is a chronic disease affecting the arterial walls, characterized by the development of plaques that contain cholesterol crystals and lipid-laden foam cells. Its complications, stroke and myocardial infarction, are major causes of death in industrialized countries. Therefore, modulating cholesterol absorption and excretion pathways is of particular interest. As the intestine is an important interface in cholesterol uptake and efflux, it constitutes a pharmacologically interesting target tissue. In addition, macrophages play a crucial role in the development of atherosclerosis, as their uptake of lipids results in the formation of foam cells that drive the progression of atherosclerosis. The nuclear receptors LXR, FXR, PPAR and their heterodimeric partner RXR are crucial regulators of metabolic processes. Their target genes include major cholesterol transporters in the intestine and in macrophages, e.g. ABCA1, ABCG1, ABCG5/G8 and NPC1L1, highlighting their great potential as drug targets. The aims of this study were to set up protocols for assessing intestinal cholesterol transport processes in vitro and to test selected natural products for their influence on cholesterol uptake and efflux in macrophages and intestinal cells. To assess the effect of a certain natural compound on intestinal cholesterol transport, the human intestinal Caco-2 cell line was established in our laboratory. Many publications using the Caco-2 cell line exist, however, the used methodology differs between laboratories, or descriptions are undetailed, therefore not allowing reproduction. Comprehensive and quality-controlled protocols for the cultivation of the Caco-2 cell line and for viability assessment were established. A cholesterol uptake and efflux assay were set up, as well as a luciferase reporter gene assay for the purpose of determining nuclear receptor activation. Since measurement of protein and mRNA levels of cholesterol transporters in differentiated cells turned out very challenging, critical steps and alternative approaches were evaluated. Natural products represent an interesting pool of potential nuclear receptor modulators and a valuable source for drug discovery. Soraphen A, a polyketide natural product, was shown to be an inhibitor of acetyl-CoA carboxylases, thereby inhibiting de novo fatty acid synthesis and increasing fatty acid β-oxidation. In this study, we could show that soraphen A increases cholesterol efflux from macrophages via ABCA1. Soraphen A induced ABCA1 expression by increasing the transcriptional activity of LXR. The increase in LXR activity turned out to be a consequence of increased free cholesterol levels, most likely due to soraphen A-related inhibition of fatty acid synthesis. Piperine, the major pungent alkaloid of Piper nigrum L., was shown to have cardioprotective effects in vivo. A series of piperine derivatives was synthesized and investigated in regard to ABCA1 protein expression in macrophages, identifying LAU398 as the most potent piperine derivative. LAU398 increased cholesterol efflux from macrophages in an ABCA1-dependent manner, while it reduced intestinal cholesterol uptake. This compound did not activate nuclear receptors, but it increased the protein expression of LXRα. It was shown in previous studies that LAU398 increases capsaicin-induced currents through TRPV1 channels. Co-administration of either TRPV1 or LXR antagonists could not reverse the effect of LAU398 on cholesterol uptake. The exact mechanism of action of LAU398 on cholesterol transport still remains to be elucidated. In summary, this work describes the establishment of protocols based on the use of the Caco-2 cell line for assessing intestinal cholesterol transport. It shows the impact of the natural product soraphen A and of the natural product derivative LAU398 on cholesterol homeostasis and analyses the underlying molecular mechanisms.