Μοριακός χαρακτηρισμός, εξελικτικές σχέσεις και ανίχνευση ιών της αμπέλου ενός διακριτού φυλογενετικού κλάδου του γένους Ampelovirus και εξυγίανση πολλαπλασιαστικού υλικού
Creators: name: Μαλιόγκα, Βαρβάρα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Αμπέλι
Ampelovirus
Εξέλιξη
Φυλογενετική ανάλυση
Ανίχνευση
Εξυγίανση
Grapevine
Evolution
Phylogenetic analysis
Detection
Virus elimination

description: Μελετήθηκαν οι εξελικτικές σχέσεις μιας ομάδας γενετικά συγγενών ampelo-ιών (GLRaV-4,-5,-6,-9 και δύο νέες απομονώσεις GLRaV-Pr και GLRaV-De) με αναλύσεις γενετικής παραλλακτικότητας, θετικής επιλογής και φυλογένειες μέγιστης πιθανοφάνειας (ML). Χρησιμοποιήθηκαν ομάδες αλληλουχιών της HSP70h (Ν-τελικό τμήμα) και της CP. Οι ML τοπολογίες επιβεβαίωσαν τις στενές φυλογενετικές σχέσεις των παραπάνω ampelo-ιών (Υποομάδα Ι) και αποκάλυψαν την παρουσία πολύ μικρών δια-ειδικών εξελικτικών αποστάσεων. Η φυλογένεια τμήματος της HSP70h, συνοδευόμενη από ανάλυση bootstrap, διευκόλυνε την αναγνώριση ειδών μέσα στην ομάδα, ενώ παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη ταχεία ταξινόμηση των παραπάνω ιών. Οι υπολογισμοί dN/dS έδειξαν ότι, μέσα στην Closteroviridae, οι ιοί αυτοί υπόκεινται στους πιο ισχυρούς περιορισμούς αντικατάστασης αμινοξέων. Αυτό δείχνει μια ανεξάρτητη εξελικτική πορεία για τους ιούς-μέλη της ομάδας, που πιθανώς σχετίζεται με την επιτυχή τους προσαρμογή στον ξενιστή, μετάδοση με αγενή πολλαπλασιασμό και απουσία φορέων με μεγάλη αποτελεσματικότητα μετάδοσης. Οι αλληλουχίες της HSP70h χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό νέων εκκινητών για τη γενική ανίχνευση ιών-μελών αυτής της γενεαλογίας και την ειδική διάγνωση κάθε είδους. Προσδιορίστηκε η πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία του GLRaV-Pr, η οποία έχει μήκος 13.696 νουκλεοτίδια και περιλαμβάνει 7 ΑΠΑ ενώ παράχθηκε ειδικό αντίσωμα εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του ιού. Επίσης, προσδιορίστηκε ένα τμήμα μήκους 4.319 νουκλεοτιδίων της ακολουθίας του GLRaV-De. Τα αποτελέσματα ορολογικών, γονιδιακών και φυλογενετικών αναλύσεων στηρίζουν τη μελλοντική αποδοχή των GLRaV-Pr και -De ως νέα είδη με τις πιθανές ονομασίες GLRaV-10 και -11. Συγκρίσεις αλληλουχιών έδειξαν ότι, η υποομάδα Ι εμφανίζει μεγάλη ομοιομορφία στη γονιδιακή οργάνωση και περιλαμβάνει τους μικρότερους και απλούστερους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. Αυτή η διαπίστωση, σε συνδυασμό με τις φυλογενετικές αναλύσεις επιβεβαίωσε ότι τα είδη αυτά ακολουθούν μια ξεχωριστή εξελικτική πορεία μέσα στο γένος Ampelovirus. Συνεπώς, η γενεαλογία αυτή θα μπορούσε στο μέλλον να αποτελέσει ένα ξεχωριστό γένος. Τέλος, έγινε προσπάθεια εξυγίανσης δύο οινοποιήσιμων ποικιλιών, της Μαντηλαριάς και του Πρεβεζάνικου, από τους GLRaV-Pr και GRSPaV (οικ. Flexiviridae), με εφαρμογή in vitro θερμοθεραπείας και καλλιέργειας βλαστικών κορυφών. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ευκολότερη εξυγίανση των φυτών της αμπέλου από ιούς της Closteroviridae, σε σχέση με εκείνη του GRSPaV.
description: The evolutionary relationships of a group of genetically related ampeloviruses, namely GLRaV-4,-5,-6,-9 and two new isolates (GLRaV-Pr and GLRaV-De), were studied based on molecular variability, positive selection analysis and maximum likelihood (ML) phylogenies. Datasets corresponding to the N terminal HSP70h and full CP genes were analysed. ML topologies established the closer phylogenetic relationships of GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr and GLRaV-De (subgroup I) in regard to the other ampeloviruses, revealing very low inter-species evolutionary distances. The HSP70h phylogeny and bootstrap analysis enabled the identification of species providing a useful taxonomic tool for the rapid demarcation of these viruses. dN/dS estimations showed that, within the Closteroviridae, these viruses are subjected to the strongest constrains against amino acid substitutions demonstrating a distinct evolutionary trait for this lineage probably related to successful adaptation to the host, transmission through vegetative propagation and lack of vectors with high transmission efficiency. The HSP70h data set was used for designing new primers for the generic detection of members of this lineage and the specific diagnosis of each species. The complete nucleotide sequence of GLRaV-Pr was determined. It is 13696 nt long and contains 7 ORFs. A virus specific antibody was raised against the recombinant CP of GLRaV-Pr and was applied in serological assays. A 4319 nt region was also determined for GLRaV-De. The genomic, serological and phylogenetic data obtained herein, confirmed that GLRaV-Pr and -De are distinct Ampelovirus species for which the tentative designations GLRaV-10 and -11 are proposed. Sequence comparisons revealed that subgroup I exhibits high uniformity on genome organization bearing the smallest and simplest viruses within the Closteroviridae. This observation coupled by phylogenetic analysis, indicate that these species follow a distinct evolutionary course within the genus Ampelovirus. Consequently, this lineage should in the future constitute a separate genus. Finally, elimination studies of GLRaV-Pr were carried out in two wine cultivars, Mantilari and Prevezaniko, also infected with GRSPaV (Flexiviridae). Virus elimination was achieved by combining in vitro thermotherapy and meristem or shoot tip culture. The results confirmed that virus elimination in grapevine is easier to occur on Closteroviridae species than on GRSPaV.