Μελέτη τροποποιημένων νευρικών προγονικών κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος με την τεχνολογία CRISPR-Cas9
Creators: name: Κατσικά, Ευγενία Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Νευρικά Προγονικά Κύτταρα
Κεντρικό Νευρικό Σύστημα
CRISPR-Cas9
Neural Progenitor Cells
Central Nervous System

description: Τα τελευταία χρόνια αποκτά όλο και περισσότερο ενδιαφέρον η συμμετοχή του γονιδίου RTN4 με την παραγωγή της Nogo-A πρωτεΐνης, ως αναστολέας στην ανάπτυξη νευριτών σε νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ). Με τη γονιδιωματική τροποποίηση να εισέρχεται όλο και πιο δυναμικά στην εύρεση θεραπειών, θα ήταν αδύνατο να μη πραγματοποιηθούν έρευνες και για την ΠΣ. Τα Νευρικά Προγονικά Κύτταρα (ΝΠΚ) με μεταμόσχευση σε πειραματικά μοντέλα που εμφανίζουν ΠΣ φαίνεται να εξασφαλίζουν τη νευροπροστασία και να προάγουν την επαναμυελίνωση. Συνεπώς, στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε προσπάθεια τροποποίησης του γονιδίου RTN4 προκειμένου να αποτραπεί η παραγωγή της πρωτεΐνης Rtn4a/ Nogo-A, με τη χρήση τεχνολογίας CRISPR-Cas9 και τη δημιουργία ΝΠΚ χωρίς την έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου. Αρχικά, απομονώθηκαν ΝΠΚ από νεογέννητους C56BL/6 μύες και καλλιεργήθηκαν έως την τέταρτη μέρα, καθώς είχαν σχηματιστεί μεμονωμένα ΝΠΚ και λίγα νευροσφαιρίδια. Ακολούθησε η χρήση της τεχνολογίας CRISPR-Cas9 με στόχο την τροποποίηση του γονιδίου RTN4 και τη μειωμένη έκφραση του Nogo-A σε ΝΠΚ. Σχεδιάστηκαν τρία διαφορετικά guideRNAs που στοχεύουν σε θέσεις εξονίων του γονιδίου ενδιαφέροντος και χρησιμοποιήθηκαν ως ολιγονουκλεοτίδια για κλωνοποίησή τους στον πλασμιδιακό φορέα lentiCRISPRv2mCherry. Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια πακεταρίστηκαν μαζί με τα πλασμίδια pMD2.G και psPAX2 μέσω διαμόλυνσης των HEK293T. Οι τρεις λεντιιοί που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για τον μετασχηματισμό των ΝΠΚ την τέταρτη μέρα καλλιέργειας. Ακολούθησε καλλιέργεια για επιπλέον τρεις μέρες και παρατηρήθηκαν σε ανάστροφο μικροσκόπιο φθορισμού προκειμένου να επιβεβαιωθεί η επιτυχία του μετασχηματισμού. Επίσης, έγινε απομόνωση πρωτεϊνών και ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της Nogo-A με την τεχνική στυπώματος κατά Western για να επιβεβαιωθεί η απουσία της. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο από τον υπολογισμό του ποσοστού φθορισμού των ΝΠΚ και την ανάλυση στυπώματος κατά Western, φανέρωσαν επιτυχία μετασχηματισμού των κυττάρων και μείωση παραγωγής της Nogo-A. Επίσης, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν περισσότερες μελέτες για τη δυναμική των ΝΠΚ και της μειωμένης ικανότητας μετατροπής τους σε νευροσφαιρίδια μετά τον μετασχηματισμό τους. Είναι, λοιπόν, φανερή η αξία της έρευνας σχετικά με τη γονιδιωματική τροποποίηση των ΝΠΚ, καθώς ενδείκνυνται για την πιθανή θεραπεία νευροεκφυλιστικών νοσημάτων, όπως η ΠΣ.
description: In recent years, the involvement of the RTN4 gene in the production of the Nogo-A protein, as an inhibitor of neurite growth in neurodegenerative diseases, such as Multiple Sclerosis (MS), has gained more and more interest. With genomic modification influencing the quest for treatments, particularly for conditions that are currently thought to have no known cure, it would be impossible to avoid studying MS. Neural Progenitor Cells (NPCs) transplanted into experimental models of MS appear to confer neuroprotection and encourage remyelination. Therefore, in this thesis, an effort was made to modify the RTN4 gene in order to prevent the production of the Rtn4a/ Nogo-A protein, which acts as an inhibitory factor in the axonal regeneration of nerve cells in the central nervous system (CNS), using CRISPR-Cas9 technology and the generation of NPCs without the expression of the specific gene. First, NPCs were isolated from neonatal C56BL/6 muscles and cultured until day four, when single NPCs and few neurospheres were generated. This was followed using CRISPR-Cas9 technology with the aim of modifying the RTN4 gene and reducing the expression of Nogo-A in NPCs. Three different guideRNAs that target the genes of interest exon sites were designed and used as oligonucleotides to clone into the lentiCRISPRv2mCherry plasmid vector. Recombinant plasmids were co-packaged with pMD2.G and psPAX2 plasmids, by transfecting HEK293T cells. The three isolates were used to transform NPCs on the fourth day of culture. Transformed NPCs were cultivated for an additional three days and observed under an inverted fluorescent microscope to confirm the success of the transformation. Additionally, proteins were extracted from the transformed NPCs and Western blotting was used to assess the expression levels of the Nogo-A protein to confirm its absence. The results obtained both from the calculation of the fluorescence percentage of the NPCs and the Western blot analysis, showed a successful transfection of the cells and a decrease in Nogo-A production. Furthermore, additional research should be conducted on the dynamics of NPCs and their decreased ability to convert to neurospheres after transformation. Therefore, the value of research on the genomic modification of NPCs is obvious, as they are indicated for the possible treatment of neurodegenerative diseases, such as MS.