title: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung neuartiger Transkriptionsmodulatoren
title: Structural and functional characterisation of novel modulators of transcription
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Nee, Iris
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2019
Subjects: Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik
protein expression
SAR
protein crystallisation
target idenfication
SAR-Studie
PPAR
Proteinexpression
Target-Identifizierung
Proteinkristallisation

description: Für die Wirkstoffforschung ist eine vollständig aufgeklärte Wirkweise eines Targets inklusive bekanntem Bindungsmodus essentiell, damit dessen Modulatoren unter anderem besser hinsichtlich ihrer Potenz, der Selektivität und der Pharmakodynamik optimiert werden können. Deshalb ist für die Mechanismusaufklärung die Entwicklung selektiver und potenter Substanzen wichtig, wodurch die beteiligten Komponenten identifiziert und die Interaktionen dieser Proteine und Cofaktoren untersucht werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum einen die Target-Identifizierung und Mechanismusaufklärung bei zwei verschiedenen Transkriptionsregulations-Prozessen untersucht. Für die Entwicklung neuer potenter Modulatoren des Hedgehog-Signalweges wurde die Struktur-Wirkungsbeziehung in einem zell-basierten Assay untersucht, um die identifizierte Strukturklasse durch Modifizierungen der Substituenten bezüglich ihrer Potenz zu verbessern. Anhand dieser strukturellen Erkenntnisse konnte eine biotinylierte Substanz entwickelt werden, mit der in einem pull-down Experiment das unbekannte Target isoliert und anschließend über massenspektrometrische Analyse identifiziert werden könnte. Zum anderen wurde die zuvor beobachtete Differenzierungsförderung bei myeloiden Knochenmarkzellen zu dendritischen Zellen durch Vertreter der Stilben-Strukturklasse (DG172) näher untersucht, die einem anderen Genexpressions-regulationsmechanismus zugrunde liegen. Bei vorherigen Untersuchungen dieser Substanzklasse auf die Differenzierung wurde ein PPARβ/δ-unabhäniger Effekt beobachtet, dessen Entstehung und Target vollkommen unbekannt sind. Daher wurde ein entwickeltes biotinyliertes PPARβ/δ-inaktives Derivat hinsichtlich der Potenz auf die Differenzierungsverschiebung zur Bildung der Dendriten geprüft, um anschließend das Targetprotein oder den Komplex isolieren und identifizieren zu können. Die Analyse erfolgte über die Oberflächenmarkierung mittels anti-MHC II und anti-CD11c sowie anti-Ly-6B und anti-Ly-6G Antikörpern zur Bestimmung des Anteils an dendritischen Zellen beziehungsweise neutrophilen Granulozyten über FACS-Analyse. Die biotinylierte Verbindung LD253 war sehr schwach aktiv und die Zelldifferenzierung daher sehr wahrscheinlich noch nicht vollständig abgeschlossen. Deshalb bedarf das Experiment weiterer Optimierung, um einen klaren Effekt der Verschiebung der Zelldifferenzierung beobachten und daraufhin das Target erfolgreich identifizieren zu können. Neben der Target-Identifizierung und der Begleitung des Liganden-basierten Wirkstoffdesigns wurde der Bindungsmodus zwischen Transkriptionsmodulatoren und dem Target PPARβ/δ untersucht. Zur Zeit existiert keine Proteinstruktur in Komplex mit inversen Agonisten, weshalb die Bedingungen für eine optimale Generierung von Proteinkristallen untersucht wurden. Das Herstellungsprotokoll für die PPARβ/δ-LBD konnte erfolgreich auf eine Ausbeute von 26,7 mg L 1eingesetztem Medium beziehungsweise 1.482,0 µg g 1 Zellen nach der Affinitätschromatographie optimiert werden, sodass nun eine ausreichende Proteinmenge für ein Kristallisationsscreening zur Verfügung gestellt werden konnte. Dies entspricht einer fünffachen Verbesserung zu den bisherigen publizierten Protokollen beziehungsweise einer 110fachen Steigerung der Ausbeute im Vergleich zu Gruppe um Sinz. Bei der Kristallisation wurden zwei Ansätze verfolgt, einerseits die Co-Kristallisation mit dem für die Stabilisierung essentiellen CoRepressor und andererseits die direkte Zugabe des CoRepressors beim Screen. In beiden Ansätzen wurde bisher noch kein Proteinkristall der PPARβ/δ-LBD im Komplex mit den potenten inversen β/δ-Agonisten ST247, PT-S264 oder DG172 erhalten, aber die Platten werden weiterhin inkubiert und beobachtet. Zusammenfassend wurden durch funktionelle Studien sowie Untersuchungen der Struktur-Wirkungsbeziehung die Strategien zur Target-Identifizierung geprüft und validiert, um anschließend das Zielprotein und die Cofaktoren bestimmen zu können. Basierend auf diesen Studien wurden Substanzen entwickelt, mit denen das Target isoliert werden könnte. Weiterhin wurde versucht den Bindungsmodus zwischen dem Liganden-induzierten Transkriptionsfaktor PPARβ/δ-LBD und selektiven inversen Agonisten verschiedener Strukturklassen über Proteinkristallographie visualisieren zu können, um in einem Struktur-basierten Ligandendesign den Wirkstoff-Kandidaten weiter optimieren zu können. Dafür konnte ein stabiler Herstellungsprozess für die PPARβ/δ-LBD etabliert und bezüglich der Ausbeute optimiert werden, sodass nun in großen Mengen sehr sauberes Protein isoliert werden konnte. Diese gewonnenen Ergebnisse bieten einen tieferen Einblick in den vielschichtigen Prozess der Transkriptionsregulation, mit dem Ziel durch Einsatz potenter Modulatoren dieses gezielt zu regulieren und somit als Angriffspunkt und damit einen weiteren Bereich in der Wirkstoffforschung zu eröffnen.
description: To facilitate the development of potent protein modulators in drug discovery, the exact mechanism of action must be elucidated. As biological processes in organisms are very complex and many different components are involved, the identification of these is of outmost importance for the efficient optimisation of the selectivity and potency of the respective modulators. The transcriptional regulation of target gene expression is a very important mechanism to regulate in many biological functions and therefore the mode of action of several modulators was analysed in this thesis. The hedgehog signalling pathway is the essential process in the embryogenesis, but the exact mechanism and the cofactors being involved in this complex transcriptional regulation are still not completely understood. An identified and validated structural class of ligands of the hedgehog signalling pathway was analysed and the structure activity relationship of this class was further determined, to improve the potency of these novel modulators of the hedgehog signalling pathway. Based on the established structure activity relationship, new biotinylated substances bearing different linkers were developed in order to isolate the target in a pull down experiment, to enable target identification via mass spectrometry. Besides the hedgehog signalling pathway, the mode of action of the nuclear receptor PPARβ/δ was analysed, which acts as a ligand-induced transcription factor. Previous work has shown, that one compound (DG172) of the identified structural class, bearing a stilbene moiety, promotes differentiation of myeloic cells from murine bone marrow cells, an effect that was not PPARβ/δ related. In the presence of the substance, a higher amount of mature and fully differentiated dendritic cells was observed, which was determined via FACS analysis utilizing the antibodies against MHC II, CD11c, Ly-6B and Ly-6G. The PPAR-inactive substance LD253 with a biotinylated substituent at the PPAR-essential part of the molecule was tested and was shown to be less active than the substance DG172. As the differentiation into dendritic cells was not fully stimulated by LD253, the experiment must be further optimised to allow for the isolation of the target. DG172 is one of the most potent PPARβ/δ inverse agonists besides two other potent ligands ST247 and PT-S264 that were identified and optimised in a ligand-based approach for generating novel potential drug candidates. Up to date, the X-ray structure of the PPARβ/δ-ligand binding domain was published in complex with an agonist but the structure with an inverse agonist has still not been elucidated so far. As specific corepressors, which in both cases lead to a stabilisation of the respective complexes, are recruited to the PPARβ/δ-complex with an inverse agonist compared to the essential coactivator recruitment to the PPARβ/δ:agonist-complex, the whole transfer of the published crystallisation conditions will most likely not be successful. In order to find suitable crystallisation conditions, protein crystallisation screenings were either by co-crystallising the three substances with a corepressor peptide, or by directly adding this corepressor peptide during the screening. The protocol of protein isolation and purification was optimised to 26.7 mg L 1 medium or 1482.0 mg g 1 cells after affinity chromatography, because a huge protein amount is needed for performing the crystallisation screening. Unfortunately, no crystals formed so far. In summary, different modulators of gene expression were studied to get more insights into the mechanism and mode of action of these essential regulation processes. Based on the results of the performed structure-activity relationship study, selective substances were developed for identifying the target. Furthermore, a robust and reproducible protein isolation method was established, and protein purification and yield were substantially improved which allows for high-throughput screening for crystallisation conditions.