Μελέτη της κληρονόμησης και της έκφρασης του γονιδίου gstu4 της σόγιας (Glycine max L.) σε διαγονιδιακά φυτά καπνού (Nicotiana tabacum L:
Creators: name: Κισσούδης, Χρήστος Θεόδωρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Μεταβολισμός ζιζανιοκτονίων
Αβιοτικές καταπονήσεις
Γενετική μηχανική
Herbicide metabolism
Abiotic stresses
Genetic engineering

description: Η οικογένεια των μεταφορασών της γλουταθειόνης (Glutathione Transferases, GSTs) των φυτών συνιστά κύριο μέλος του μηχανισμού μεταβολισμού των ζιζανιοκτόνων εντός των φυτών και προστασίας έναντι των αβιοτικών καταπονήσεων. To γονίδιο gstu4 της σόγιας, το οποίο κωδικοποιεί το ισοένζυμο GmGSTU4 με υψηλή καταλυτική δράση έναντι των ζιζανιοκτόνων alachlor και fluorodifen, προηγουμένως εισήχθη με την μέθοδο του Αγροβακτηρίου και υπερεκφράστηκε σε φυτά καπνού των ποικιλιών Μπασμά Ξάνθης, Virginia και Burley. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της κληρονόμησης και της έκφρασης του διαγονιδίου 35S:gstu4 στηνΤ1 γενιά των διαγονιδιακών φυτών καπνού καθώς και του ρόλου του, in planta, στο μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων των ομάδων των διφαινυλικών αιθέρων και των χλωρακεταμιδίων, αλλά και στην αντιμετώπιση αβιοτικών καταπονήσεων. H κληρονόμηση του διαγονιδίου στην T1 γενιά ακολούθησε μενδελική διάσπαση στις διαγονιδιακές σειρές που έφεραν μια ή δυο ενθέσεις του διαγονιδίου. Ωστόσο στις σειρές με τρεις ενθέσεις παρατηρήθηκε μικρότερη αναλογία διάσπασης από την αναμενόμενη. Η πλειοψηφία των T1 διαγονιδιακών σειρών των τριών ποικιλιών επέδειξαν υψηλότερη δράση GST στο υπόστρωμα CDNB , ενώ μόνο οι διαγονιδιακές σειρές της ποικιλίας Μπασμάς στο υπόστρωμα fluorodifen. Όλες οι T1 διαγονιδιακές σειρές επέδειξαν υψηλότερη ανθεκτικότητα, εκφρασμένη ως μειωμένη διαρροή ηλεκτρολυτών, μετά από εφαρμογή 200μΜ fluorodifen ή oxyfluorfen. Η ανθεκτικότητα των T1 διαγονιδιακών φυτών σε 7,5 mg/L alachlor, εξαρτήθηκε σε μεγάλο βαθμό από τις ποικιλίες, με τις διαγονιδιακές σειρές των ποικιλιών Μπασμάς και Burley να εμφανίζουν υψηλότερη ανθεκτικότητα, σε αντίθεση με τις σειρές της ποικιλίας Virginia, που δεν διέφεραν από τα αντίστοιχα φυτά αγρίου τύπου. Αντίθετα δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αυξημένη ανθεκτικότητα στο ζιζανιοκτόνο metolachlor, σε καμία από τις διαγονιδιακές σειρές, με εξαίρεση την σειρά BAGST-3 της ποικιλίας Μπασμάς. Προκειμένου να αποσαφηνιστεί η αιτία της διαφοροποίησης στην ανθεκτικότητα στο alachlor, προσδιορίστηκε η ποσοτική σχετική έκφραση του διαγονιδίου με Real Time qPCR. Παρατηρήθηκε σχεδόν 10 φορές υψηλότερη έκφραση του διαγονιδίου στις διαγονιδιακές σειρές των ποικιλιών Μπασμά και Burley σε σύγκριση με την αντίστοιχη της ποικιλίας Virginia.Aυξημένη ανθεκτικότητα παρατηρήθηκε σε όλες τις T1 διαγονιδιακές σειρές των τριών ποικιλιών στην οξειδωτική καταπόνηση μετά από εφαρμογή 0,4 μΜ paraquat. Παρομοίως υψηλότερη ανθεκτικότητα παρατηρήθηκε στην αλατότητα (150 mM NaCl) in vitro. Αντιθέτως καμία από τις διαγονιδιακές σειρές των τριών ποικιλιών δεν επέδειξε υψηλότερη ανθεκτικότητα στην ωσμωτική καταπόνηση (100 και 200 mM μανιτόλη) in vitro. Τέλος εξετάστηκε η ανθεκτικότητα στην αλατότητα και στην ξηρασία στο θερμοκήπιο, κατόπιν άρδευσης για 15 ημέρες με 100 και 200 mM NaCl ή την διακοπή της άρδευσης, για ίδιο χρονικό διάστημα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένη ανθεκτικότητα σε καμία από τις T1 διαγονιδιακές σειρές των τριών ποικιλιών, όπως αυτή προσδιορίστηκε μετρώντας φυσιολογικές παραμέτρους όπως περιεκτικότητα χλωροφύλλης, φωτοσυνθετική αποτελεσματικότητα, σχετικό υδατικό περιεχόμενο και συγκέντρωση K+, Na+ και ο λόγος Na+/ K+στις επεμβάσεις της αλατότητας. Συμπερασματικά η υπερέκφραση του ισοενζύμου GmGSTU4 σε διαγονιδιακά φυτά καπνού επιβεβαίωσε, in planta, το ρόλο του στο μεταβολισμό των ζιζανιοκτόνων fluorodifen και alachlor και στην ανθεκτικότητα στις αβιοτικές καταπονήσεις στη σόγια. Υπό αυτό το πρίσμα, οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης αποτελούν μια ενζυμική οικογένεια που χρήζει περαιτέρω μελέτης, για τη δημιουργία φυτών ανθεκτικών στα ζιζανιοκτόνα και τις αβιοτικές καταπονήσεις.
description: Plant glutathione transferases (GSTs) superfamily forms major part of plants herbicide detoxification and antioxidant enzyme network. The gstu4 gene from soybean, encoding GmGSTU4 isoenzyme with high catalytic activity towards alachlor and fluorodifen, was previously introduced and overexpressed in transgenic tobacco plants from three cultivars, Basmas, Virginia and Burley. The aim of this thesis was to study the inheritance and expression of the 35S:gstu4 transgene in the T1 generation of the transgenic tobacco plants and to evaluate in planta, its role in detoxificating diphenyl ether and chloroacetanilide herbicides, as also its contribution in abiotic stress alleviation, such as oxidative stress, salinity and drought. The inheritance of the transgene in the T1 generation was according to the Mendelian laws of inheritance in the transgenic lines with one or two transgene insertions. However lines with three transgene insertions exhibited a lower segregation ratio to that expected. Τhe majority of T1 GmGSTU4 overexpressing lines from the three cultivars exhibited increased GST activity towards CDNB, but only Basmas cultivar transgenic lines had higher GST activity towards fluorodifen. GmGSTU4 overexpressing lines from all cultivars exhibited, when treated with 200μΜ fluorodifen or oxyfluorfen, reduced relative electrolyte leakage compared to wild type plants. Tolerance of T1 GmGSTU4 overexpressing plants to 7.5 mg/L alachlor, was strongly influenced by cultivars, with Basmas and Burley transgenic lines showing increased tolerance, while Virginia transgenic lines were almost indistinguishable from the respective wild type plants. In contrast no increased tolerance was observed to metolachlor for any cultivar, except for line BAGST-3 of Basmas cultivar. For the elucidation of the observed differences in tolerance towards alachlor, the transgene relative expression was determined with Real Time quantitative PCR. Almost a 10-fold higher expression of the transgene was observed in Basmas and Burley transgenic lines compared to Virginia. The T1 GmGSTU4 overexpressing tobacco plants from all three cultivars were more tolerant, in terms of electrolyte leakage, to oxidative stress generated by 0.4 μΜ paraquat. Furthermore the transgenic lines from all three cultivars were more tolerant to salinity (150 mM NaCl) in vitro. However no increased tolerance was observed to dehydration stress in vitro, imposed to plants with the addition of 100 and 200 mM manitol in the growth medium. Finally the tolerance of transgenic plants to salinity and dehydration was tested in the greenhouse, by irrigation with 100 and 200 mM NaCl or by withholding irrigation, for a period of 15 days. No increased tolerance of transgenic lines was observed, for any cultivar and for any treatment according to the physiological parameters measured such as chlorophyll content, photosynthetic efficiency and leaf relative water content, as also K+, Na+ concentration and Na+/ K+ ratio for the salinity treatments. In conclusion, the overexpression of GmGSTU4 in transgenic tobacco plants confirmed in planta its contribution to fluorodifen and alachlor detoxification in soybean, as also its involvement in abiotic stress tolerance. In this context, plant glutathione transferases are an enzyme family that requires further research for their exploitation in the generation of herbicide or abiotic stress tolerant crops.