title: Parallelisierte und individualisierte funktionelle Charakterisierung von ausgewählten Kandidatengenen im Pankreaskarzinom.
title: Parallelized and individualized functional Characterization of pre-screened Pancreatic Cancer Candidate Genes.
Creators: name: Honstein, Tatjana
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: ADRBK1 ,
pancreatic cancer
Bauchspeicheldrüsenkrebs
Naturwissenschaften
TTK
ADRBK1

description: Pancreatic adenocarcinoma is one
      of the deadliest cancers with an overall 5-year survival rate
      of &lt;3% and average survival time of 6 months. The poor
      patient prognosis illustrates the fact that the basic
      mechanisms of pancreatic cancer disease are not well
      understood to date. Based on the data of previously performed
      high-throughput analyses, 79 candidate genes were identified
      having a high probability to be of biological relevance or to
      be suitable as target genes for diagnostic or therapeutic
      applications and were thus selected for the further
      characterization. We used the technique of reverse
      transfection microarrays as an efficient technology to
      identify tumor-relevant genes and characterize important
      functional roles with high throughput. 11 out of 79 candidate
      genes with strong reproducible effects have been identified
      as promising candidates for the single gene characterization.
      Among them was the G-Protein Coupled Receptor Kinase 2 (GRK2,
      a.k.a. ADRBK1). We verified the high overexpression of ADRBK1
      in human pancreatic cancer tissue as compared to chronic
      pancreatitis and healthy pancreatic tissue. Detailed
      functional investigation uncovered a proliferative and cell
      cycle modulating phenotype of this candidate gene. The second
      part of the systematic approach for the identification of new
      promising candidates consisted of a kinome-wide screening
      using Ambion® Silencer® Select kinome-wide siRNA library. The
      effects of kinase down regulation in transformed Panc1 and
      non-transformed Hek293 cells on apoptosis activation were
      measured via automated apoptosis assays. This analysis
      identified the dual specificity protein Kinase TTK as a
      candidate whose repression induced apoptosis specifically in
      transformed cell lines. Our results show a high rate of
      overexpression of TTK in humane pancreatic cancer tissue in
      comparism to inflamed (chronic pancreatitis) and healthy
      pancreas controls. Further functional analyses based on the
      down regulation of the TTK revealed strong effects on cell
      viability and confirmed the apoptotic phenotype (detected via
      immunoblotting as well as flow cytometry). In addition, we
      demonstrated the involvement of the kinase in the maintenance
      of genomic stability. Furthermore, our soft agar clonogenic
      assays indicates a strong influence of TTK on the anchorage
      independent tumor cell growth.
description: Das duktale Pankreasadenokarzinom
      gehört mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von &lt;3% und
      mittlerer Überlebenszeit von ca. 6 Monaten nach
      Diagnosestellung zu den tödlichsten Tumor-erkrankungen
      weltweit. Die Vielfalt an Risikofaktoren sowie genetische
      Heterogenität der Pankreasneoplasien als auch die schlechten
      Prognosen, die ebenfalls mangelnden Therapieansätze und die
      hohen Mortalitätsraten zeigen auf, dass die grundlegenden
      Mechanismen dieser Erkrankung noch nicht ausreichend
      aufgeklärt sind. Beruhend auf früheren Forschungsarbeiten
      unserer Arbeitsgruppe konnte ein Kollektiv von 79
      Kandidatengenen mit einem spezifischen Expressionsmuster im
      Pankreastumorgewebe identifiziert werden. Um den Zeit- und
      Kostenaufwand für die Einzelgenanalyse der 79 Kandidaten zu
      minimieren, wurde die Methode der reversen Transfektion als
      eine adäquate Option ausgewählt. Die reverse transfection
      microarrays erlaubten die parallele Untersuchung einer großen
      Anzahl an Genen, mit der Möglichkeit zur Klärung der
      physiologischen Genfunktion und weiteren Eigenschaften der
      Genprodukte. Zusammenfassend ergab sich nach der Validierung
      eine Auswahl von 11 aus anfänglich 79 Kandidaten zur
      Einzelgencharakterisierung. Ein selektiertes Kandidatengen
      des reverse transfection screening ist die im
      Pankreaskarzinom überexpremierte G-Protein-gekoppelte
      Kinase-2 (GRK2, a.k.a. ADRBK1). Unsere tiefergehende
      Einzelgenanalysen zeigten einen proliferativen und
      zellzyklusmodulierenden Phänotyp dieses Kandidatengens. Ein
      zweiter systematischer Ansatz zur Identifikation neuer
      Kandidatengene umfasste das gesamte humane Kinom. Eine der
      Ambion® Silencer® Select kinom-wide siRNS Bibliothek wurde
      verwendet, um in vollautomatisiertem Format sowohl in der
      transformierten Panc1-Zelllinie als auch in
      nicht-transformierten Hek293-Zellen die Kinasen einzeln
      herunter zu regulieren und anschließend einen Apoptoseassay
      durchzuführen. Diese kinomweite Untersuchung identifizierte
      TTK als eine in transformierten Zellen repressionsabhängig
      apoptoseinduzierende Kinase. Die anfängliche Überprüfung der
      Expression in humanem Gewebe bestätigte eine signifikante
      pankreastumorspezifische Dysregulation der TTK-Expression.
      Unsere Resultate der Viabilitätsprüfung, die eine
      signifikante Reduktion lebender Zellen in Abhängigkeit der
      TTK-Expression in Tumorzelllinien belegen und sowohl via
      Immunoblotnachweise als auch mittels durchflusszytometrischen
      Analysen eine Apoptoseinduktion belegen, verdeutlichen eine
      pro-tumorigene Funktion von TTK. Darüber hinaus konnte
      ebenfalls ein Einfluss auf die genomische Stabilität in
      Tumorzellen sowie eine signifikante Reduktion des
      substratunabhängigen Wachstums von Tumorzellen in Abwesenheit
      der TTK-Expression nachgewiesen werden.