title: Molekulare Autopsie der nah verwandten ABC-Transporter OpuB und OpuC aus Bacillus subtilis
Creators: name: Teichmann, Laura
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2018
Subjects: Bacillus subtilis osmotischer Stress ABC Transporter Hybrid Salzstress
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: In seinem natürlichen Habitat ist das Bodenbakterium B. subtilis zahlreichen Stressfaktoren ausgesetzt. Eine aktive Adaption an Stresssituationen, welche es der Zelle ermöglicht gezielt auf Veränderungen in der Umwelt zu reagieren, ist essentiell für das Überleben in einem solchen Lebensraum. Um sich vor einer zu hohen Osmolarität zu schützen, akkumuliert B. subtilis organische Osmolyte, sogenannte kompatible Solute. Glycin Betain ist eines der weit verbreitetsten und wichtigsten kompatible Solute. Dieses Substrat kann auch über die Enzyme GbsA und GbsB aus dem Vorläufer Cholin synthetisiert werden. Der Cholin-sensitive Repressor GbsR reguliert hierbei sowohl die Expression des gbsAB Operons als auch des opuB Operons. Der ABC Transporter OpuB gehört zu den fünf Osmolyt Aufnahmesystemen von B. subtilis. Dieser Importer ist hoch spezifisch und transportiert mit hoher Affinität nur Cholin. Der nah verwandte ABC Transporter OpuC, welcher strukturell sehr ähnlich zu OpuB ist, ist in der Lage eine große Vielzahl an unterschiedlichen kompatiblen Soluten in die Zelle zu transportieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Substratbindeproteine von OpuB und OpuC modular genutzt werden können. Hybride ABC Transporter, in denen die SBPs OpuBC und OpuCC ausgetauscht wurden, sind funktionell im Transport osmoprotektiver Substanzen. Die Substrat-spezifitäten der ursprünglichen Wildtyp ABC Transporter OpuB und OpuC wurden durch das Implantieren des jeweilig anderen SBPs ausgetauscht. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass B. subtilis in-vivo ein einzelnes OpuCC SBP ohne weitere Komponenten, als Bindeprotein für den vollständigen OpuB Transporter nutzen kann. Die unterschiedliche Substratspezifität von OpuB und OpuC kommt durch strukturellen Begebenheiten in der Ligandenbindetasche der SBPs zu Stande. Ein Threonin im promiskuitiven OpuCC SBP und ein negativ geladenes Aspartat im OpuBC SBP determiniert das Substratspektrum des ganzen ABC Transporters. Bioinformatische Analysen zeigten, dass OpuCC-Typ SBPs immer ein Threonin und OpuBC-Typ SBPs immer ein Aspartat besitzen. Mit Hilfe dieser Ergebnisse und phylogenetischen Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das spezifische OpuB System, als Anpassung an die Gegebenheiten im Boden, durch Genduplikation aus dem OpuC Transporter entstanden ist. Im Zuge dieser bioinformatischen Analyse wurde ein neuer wichtiger ABC Transportertyp der Ordnung Bacillales gefunden. Dieser OpuF Importer besitzt ein hybrides SBP-TMD Protein. Drei fusionierte OpuF ABC Transporter aus der Gattung Bacillus konnten heterolog in B. subtilis charakterisiert werden. Physiologische sowie kinetische Untersuchungen bewiesen, dass es sich bei zwei der untersuchten Transporter um hoch affine Glycin Betain Aufnahmesysteme handelt. Mit Hilfe eines genetischen Suppressor Screens konnte die Struktur/Funktions-Beziehung des Repressors der Glycin Betain Synthese GbsR näher untersucht werden. Durch eine Charak-terisierung von verschiedenen Suppressor Mutanten konnte die Bedeutsamkeit einer flexiblen Linkerdomäne des Proteins herausgestellt werden. Nicht nur die Domäne, welche im direkten Kontakt mit der DNA steht, spielt eine essentielle Rolle bei der Repression von opuB und gbsA. Durch den flexiblen Linker des Proteins wird eine dynamische Konformationsänderung von GbsR ermöglicht und die DNA-Bindung ist von dieser Dynamik abhängig. Schließlich wurde ein neues kompatibles Solut für B. subtilis gefunden. Das Cholin-Derivat Homocholin kann sowohl über den spezifischen OpuB und als auch über den OpuC importiert werden und wird dann über die promiskuitiven Dehydrogenasen GbsA und GbsB zu dem Osmolyt Homobetain oxidiert. Dieser Syntheseweg wird von GbsR reguliert, allerdings ist eine Bindung von Homocholin an GbsR natürlicherweise nicht möglich. Ein genetischer Screen identifizierte einen einzelnen Aminosäureaustausch, durch welchen es möglich war, eine gbsAB Induktion durch Homocholin durch die Bindung von GbsR zu erlangen. Demnach konnte der Mechanismus der osmoprotektiven Eigenschaft des Cholin-Derivats Homocholin molekular aufgeklärt werden.
description: In its natural habitat the soil bacterium Bacillus subtilis is exposed to various stressfactors. To protect itself against osmotic stress it accumulates compatible solutes in the cell. Glycine betaine is a powerful osmostress protectant for B. subtilis. It can either be imported or synthesized from the precursor choline. The OpuB and OpuC ABC-transporters both serve for choline uptake, while OpuC is promiscuous and imports also glycine betaine and a wide range of other compatible solutes. The oxidation of choline takes place via the two dehydrogenases GbsB and GbsA. The encoding genes are organized in the genome of B. subtilis as an operon. Next to the operon the gene gbsR is located. Expression of the opuB operon, along with the glycine betaine synthesis genes (gbsAB) is controlled by GbsR, a MarR-type transcriptional repressor, with choline serving as the inducer. The two closely related ABC-type osmoprotectant uptake systems OpuB and OpuC are indispensable for acquiring a variety of compatible solutes under osmotic stress conditions in B. subtilis but possess strikingly different substrate specificities. Whereas the substrate-binding protein OpuCC recognizes a broad spectrum of compatible solutes, its 70% sequence-identical paralogue OpuBC only binds choline. In this study the OpuBC substrate binding protein of the OpuB system was substituted with OpuCC in order to analyze the functionality and substrate specificity of the hybrid ABC-transporter. The substrate profile of the narrow substrate-specific transporter OpuB can be synthetically broadened to that of the OpuC transporter by recombinantly implanting the gene for the OpuCC substrate binding protein into the opuB operon. Molecular analysis of the difference in substrate profile has been conducted by ectopically expressing the gene for the OpuCC substrate-binding protein in a strain possessing only an intact OpuB transporter. This genetic manipulation led to the imposition of the substrate profile of the OpuC system onto OpuB. Guided by the crystal structures of the OpuBC and OpuCC substrate-binding proteins, the focus was set on residue 74 (an Asp residue in OpuBC, and a Thr residue in OpuCC) as it provides stabilizing interactions with the corresponding ligands and is critically for the stable closure of the two lobes of the binding protein upon substrate entrapment. In this study it is shown that an Asp to Thr substitution in OpuBC is sufficient to endow OpuB with the promiscuous substrate profile of OpuC. Crystal structures of the mutant OpuBC protein in complex with choline, glycine betaine, carnitine, or dimethylsulfoniopropionate (DMSP) provided detailed insight into the architecture of the ligand-binding site. The hybrid ABC transporter OpuB::OpuCC possessed a high affinity for their substrates but the transport capacity was moderate. Suppressor mutants leading to single amino acid substitutions in the GbsR repressor controlling opuB expression greatly improved OpuB::OpuCC-mediated osmolyte transport through upregulation of opuB transcription. Each of the studied 54 mutants harbored alterations in gbsR. In most strains, gbsR was inactivated by frame-shift mutations or stop-codons. However, nine gbsR variants contained interesting mutations leading to single amino-acid substitutions. These occurred either in (i) the presumed choline binding pocket, (ii) the DNA-reading head, or (iii) in a flexible linker region connecting the winged HTH-motif with the dimerization domain of GbsR. DNA-binding studies with representatives of these three classes revealed that the corresponding GbsR variants were all defective in DNA-binding. In addition, a new member of the Opu family of transporters within the genus Bacillus was found and characterized, OpuF. It is a representative of a sub-group of ABC transporters in which the substrate-binding protein is fused to the trans-membrane domain. A common property of the examined OpuF systems is their substrate profile; OpuF allows the import of glycine betaine, proline betaine, homobetaine and dimethylsulfoniopropionate (DMSP). An in silico model of the substrate-binding protein domain was established. It revealed the presence of an aromatic cage, a structural feature characteristic for ligand-binding sites present in components of compatible solute importers.