title: Deep and fast volumetric imaging of neuronal activity
Creators: name: Berlage, Caroline
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: Mikroskopie
subject: Neurobiologie
subject: Lichtstreuung
subject: Phasenmodulation
subject: microscopy
subject: neurobiology
subject: light scattering
subject: phase modulation
subject: 621 Angewandte Physik

description: Optische Methoden wie die Multiphotonenmikroskopie, kombiniert mit fluoreszenzbasierten Sensoren, ermöglichen es, Hunderte oder sogar Tausende von Neuronen parallel zu untersuchen. Dennoch gibt es bei der in vivo Bildgebung des gesamten Gehirns mit räumlicher Auflösung unter einem Millimeter und zeitlicher Auflösung im Millisekundenbereich weiterhin erhebliche Herausforderungen. Diese Arbeit befasst sich mit zwei wesentlichen Hindernissen der optischen Bildgebung in der neurobiologischen Forschung: der begrenzten Bildgebungstiefe und den langsamen volumetrischen Bildraten. Erstens wird die optische Mikroskopie durch Gewebestreuung grundlegend eingeschränkt. In der ersten Studie dieser Arbeit habe ich eine Methode zur Messung und Korrektur gestreuter Wellenfronten mittels Drei-Photonen-Anregung entwickelt. 3-Photonen F-SHARP profitiert von verbesserter Bildgebungstiefe aufgrund der höhergradigen nichtlinearen Anregung und längeren Anregungswellenlänge. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass die Konvergenzgeschwindigkeit und Robustheit des Algorithmus zur Wellenfrontmessung im Vergleich zur Zwei-Photonen-Variante verbessert wird. Zweitens ist die volumetrische funktionelle Bildgebung tiefer Gehirnbereiche häufig durch den langsamen Prozess des sequentiellen Abrasterns begrenzt. Die Abtastrate kann durch das Durchlaufen vorselektierter Ziele (sogenanntes Random Access Scanning) erhöht werden. In der zweiten Studie habe ich einen neuartigen Random-Access-Scanning-Ansatz entwickelt, beruhend auf einem schnellen, MEMS-basierten Spatial Light Modulator (SLM) mit Pixeln in einer eindimensionalen Linienkonfiguration. Diese Methode, genannt SPARCLS, erreicht eine dreidimensionale Abtastrate von 340 kHz. Zusammenfassend erleichtern die in dieser Arbeit entwickelten Methoden sowohl die Gewebepenetration als auch die volumetrische Bildgebung mit höherer Abtastrate und ermöglichen so eine tiefere und schnellere Untersuchung neuronaler Aktivität mittels optischer Methoden.
description: Optical methods, such as multiphoton microscopy combined with fluorescence-based sensors, make it possible to study hundreds or even thousands of neurons in parallel. Nevertheless, in vivo whole-brain imaging at sub-micrometer spatial and millisecond temporal resolution still faces significant challenges. This thesis addresses two major obstacles for in vivo imaging in neurobiological research: limited imaging depth and slow volumetric imaging rates. First, optical microscopy is fundamentally limited by tissue scattering. In the first study presented in this thesis, I developed a method for the measurement and correction of scattered wavefronts using three-photon excitation. Three-photon F-SHARP profits from the improved penetration depth due to the longer wavelength light and higher-order nonlinear excitation. Furthermore, I demonstrated that the convergence speed and robustness of the wavefront sensing algorithm are improved compared to its two-photon counterpart. Second, volumetric functional imaging of deep brain areas is often constrained by the slow process of raster scanning. Random access scanning iterates through preselected targets and can significantly speed up the sampling rate. In the second study, I developed a novel random access scanning approach making use of a fast MEMS-based spatial light modulator (SLM). This method, termed SPARCLS, achieves three-dimensional scanning at 340 kHz update rate using SLM pixels arranged in a one-dimensional line configuration. SPARCLS scanning was validated by visualizing glutamate dynamics in mouse organotypic slices as well as zebrafish larvae using the genetically encoded glutamate indicator iGluSnFR3. Together, the methods developed in this thesis facilitate both tissue penetration and rapid volumetric scanning for deeper and faster imaging of neuronal activity.