title: Synthesis, modification and characterisation of magnetic micro-matrices for covalent immobilisation of biomolecules. Model investigations with penicillin amidase from E.coli
Creators: name: Bozhinova, Daniela Petrova
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2004
Subjects: subject: Enzym , Enantioselektivität , Magnetpartikel , Immobilisierung , Penicillin amidase , Immobilisation magnetic matrices , Enzym immobilisation , Penicillin amidase
subject: 540 Chemie

description: The subject of this work was to develop and characterise magnetic micro-matrices for covalent immobilisation of enzymes. As a model biocatalyst penicillin amidase from E.coli - an enzyme of high industrial importance for the production of semi-synthetic b-lactam antibiotics, was used. Poly(vinylacetate) (PVAc) and poly(methylacrylate) (PMA) magnetic beads of sizes in a range 2-20 µm were synthesised by an oil-in-water suspension polymerisation method. Cross-linked poly(methyl methacrylate) (PMMA) beads of 6 µm diameter were converted into magnetic particles by a swell-deswell manufacturing procedure in a toluene-based magnetic fluid comprising of nano-crystals of magnetite covered by a bi-layer of surfactant. Amino-silanised magnetic particles of 1-2 µm diameter were produced by co-precipitation of Fe(II) and Fe(III) salts at high alkaline pH and covered by amino-silane and finally by poly(glutaraldehyde) layers. Poly(vinylalcohol) beads under the trade name M-PVA, of 1-3 µm diameter, were donated by chemagen Biopolymer Technologie AG and largely studied here. All of the magnetic matrices investigated had sizes in a range of 1-20 µm and showed superparamagnetic behaviour e.g. no magnetic memory effects once they were set out of an external magnetic field. Modification of the magnetic bead surfaces mainly with epoxy-, or amino- and subsequent aldehyde- spacers, was done in order to create sites, suitable for the covalent immobilisation of enzymes. Penicillin amidase from E.coli was covalently immobilised onto magnetic matrices investigated in this work via different spacers/reactions. For M-PVA commercial beads, with increasing of the spacer length an increase in the amount of the covalently bound active protein, of up to 22 mg enzyme per gram dry beads for the functionalised with hexamethylene diamine / glutardialdehyde (20.8 Å length) spacer matrix at low (0.2 M) ionic strength of the immobilisation buffer was observed. For comparable immobilisation conditions, the same carrier with shorter (6.0 Å length) epoxy-spacer immobilised only 4 mg enzyme per gram dry beads. Comparable results were obtained for subsequently modified amino-silanised magnetic particles with a different number of hexamethylene diamine / glutardialdehyde �spacer units� at the above-mentioned low ionic strength of the immobilisation buffer. For the last matrix an immobilisation maximum of 74 mg enzyme per gram dry beads at four spacer units (64.9 Å length) was evaluated. This result was also the maximum enzyme loading obtained with the magnetic matrices studied here for the chosen biocatalyst and immobilisation conditions. For poly(vinylacetate) magnetic beads with increasing spacer length from 6.0 Å (epoxy-spacer) to up to 21.0 Å (hexamethylene diamine / glutardialdehyde spacer), the amount of the immobilised active penicillin amidase increased from 3 to up to 24 mg·g-1 dry beads. Furthermore, for M-PVA magnetic beads the influence of the immobilisation buffer ionic strength on the achievable enzyme loadings was more pronounced for the matrices modified with shorter epoxy- (epichlorohydrine) and imidazolyl-carbamate (N,N´-carbonyl diimidazole) spacers. For both spacers a significant increase - of almost three folds of the amount of the covalently bound enzyme, with rising ionic strength of up to 1 M, was observed. This can be due to minimising of un-desirable charge-charge interactions between the matrix surface (negative zeta potential at pH 7.5 determined) and the enzyme molecule (negative charge at pH 7.5) during the immobilisation process. It is logical, that the effect of the ionic strength was more significant in the case of the above-mentioned shorter spacers, which means shorter distances and stronger electrostatic repulsions between the matrix and the enzyme. Amino-modified and further glutardialdehyde-functionalised poly(methylacrylate) magnetic beads showed enzyme loading capacities comparable to those obtained with the commercial M-PVA matrices at similar immobilisation conditions. With a prolongation of the immobilisation reaction time from 24 h to 72 h, the amount of bound penicillin amidase increased from 35 to 54 mg per gram dry beads. The apparent kinetic constants Km and kcat of the penicillin amidase from E.coli covalently immobilised onto the studied magnetic matrices were investigated here for the hydrolysis of penicillin G. The evaluated apparent Km constants were several fold higher compared to the one for the free enzyme, but were one or two orders of magnitude lower compared to those for penicillin amidase bound onto larger (&gt;100 µm) porous carriers. The selectivity of the enzyme immobilised onto M-PVA beads was investigated in kinetically controlled synthesis of cephalexin from R-phenylglycine amide and 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid at 5 °C and an excess of nucleophile. The observed immobilised enzyme selectivity, calculated as nsyn/nhyd= 8 was comparable to this of the free penicillin amidase from E.coli e.g. nsyn/nhyd= 13. Enantioselectivity of the penicillin amidase from E.coli immobilised onto different magnetic matrices was studied for the equilibrium controlled hydrolysis of racemic phenylacetylphenylalanine and kinetically controlled condensation of R-phenylglycine amide with pure enantiomers or racemic mixture of phenylalanine. All studied enzymes, immobilised onto magnetic micro-particles, showed Ehyd,rac &gt;100 for the investigated hydrolysis reaction.
description: Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung von magnetischen Mikroträgern für die kovalente Immobilisierung von Biokatalysatoren. Als Modellenzym wurde Penicillin Amidase aus E. coli herangezogen. Zu diesem Zweck wurden Magnetpartikel mit einer Größe von 2 bis 20 µm aus Polyvinylacetat (PVAc) und Polymethylacrylat (PMA) durch die �Öl-in-Wasser-Suspensions-Polymerisationsmethode� synthetisiert. Quervernetzte Polymethylmethacrylat (PMMA) Träger mit einem Durchmesser von 6 µm wurden durch die Einlagerung von Magnetitnanokristallen aus einem magnetischem Fluid mit Toluen als Lösungsmittel im �swell-deswell�-Verfahren mit magnetischen Eigenschaften ausgestattet und mit einer Tensiddoppelschicht versehen. Aminosilanisierte magnetische Partikel mit einem Durchmesser von 1�2 µm wurden durch die Fällung von Eisen(II)- und Eisen(III)salzen in stark alkalischen Milieu dargestellt und mit jeweils einer Schicht aus Aminosilan und Polyglutaraldehyd umgeben. Polyvinylalkoholträger, bekannt unter dem Handelsnamen M-PVA und mit einem Partikeldurchmesser von 1�3 µm, wurden von der chemagen Biopolymer Technologie AG zur Verfügung gestellt und eingehend untersucht. Alle untersuchten Magnetträger hatten eine Größe von einigen Mikrometern (1�20 µm) und zeigten superparamagnetisches Verhalten, so dass sie keine Remanenzmagnetisierung aufwiesen. Das Zetapotential der Trägeroberflächen in wässriger Lösung wurde für den pH-Bereich von 7.0 bis 7.5 bestimmt. Es ist für die Immobilisierung von Enzymen auf der Oberfläche von entscheidender Bedeutung, insbesondere bei der Verwendung kurzer Spacer zwischen Enzym und Träger. Die Oberflächen der Magnetträger wurden hauptsächlich mit Epoxy- oder Amino- und Aldehyd- Spacern modifiziert, um geeignete funktionelle Gruppen zur kovalenten Immobilisierung zu erhalten. Penicillin Amidase aus E.coli wurde mittels diverser Spacer und Kopplungsreaktionen kovalent an die untersuchten Magnetträger gebunden. Für die kommerziell erhältlichen M-PVA-Träger konnte gezeigt werden, dass die Menge an gebundenem Enzym mit zunehmender Spacerlänge bis zu einem Maximalwert von 22 mg Enzym pro Gramm getrockneten Träger bei 20.8 Å zunimmt. Unter vergleichbaren Immobilisierungsbedingungen (I = 0.2 M) konnte auf demselben Trägertyp mit einem Spacer von 6.0 Å Länge nur 4 mg Enzym pro Gramm getrockneten Träger gebunden werden. Analoge Ergebnisse wurden für amino-silanisierte Magnetpartikel mit einer unterschiedlichen Anzahl an Hexamethylendiamin / Glutardialdehyd � Spacereinheiten unter denselben Reaktionsbedingungen beobachtet. Für diese Träger wurde ein Immobilisierungsmaximum von 74 mg pro Gramm getrockneten Träger bei einer Spacerlänge bestehend aus 4 Spacereinheiten, was einer Länge von 64.9 Å entspricht, erreicht. Dieses Enzymimmobilisierungsmaximum war auch die größte Beladung, welche im Rahmen dieser Arbeit mit dem gewählten Enzym und bei diesen Immobilisierungsbedingungen erzielt wurde. Für Polyvinylacetatträger nahm die Menge an immobilisiertem Enzym von 3 auf 24 mg bei einer Verlängerung des Spacers von 6.0 Å (epoxy spacer) auf 21.0 Å (Hexamethylendiamin / Glutardialdehyd Spacer) zu. Des weiteren wurde für M-PVA-Träger ein stärkerer Einfluss der Ionenstärke der Pufferlösung, in der die Immobilisierung erfolgte, bei der Verwendung kürzer Epoxy- und Imidazolyl-carbamat- Spacer, als bei längeren festgestellt. Für beide Spacertypen wurde eine signifikante Zunahme bis zur dreifachen Menge an immobilisiertem Enzym erreicht, als die Ionenstärke auf bis zu I = 1 M erhöht wurde. Dies konnte auf die Minimalisierung von unerwünschten Ladungswechselwirkungen zwischen der Trägeroberfläche (negatives Zeta-potential bei pH = 7.5) und den Enzymmolekülen (negativ geladen bei pH = 7.5) während der Immobilisierung zurückgeführt werden. Logischer Weise ist dieser Effekt der Ionenstärke bei kürzeren Spacern signifikanter als bei längeren, da die Stärke der elektrostatischen Wechselwirkungen mit zunehmendem Abstand des Enzyms vom Träger abnimmt. Vergleichbare Ergebnisse wurden für Polyvinylacetatpartikel erhalten. Die scheinbaren kinetischen Konstanten Km und kcat der immobilisierten Penicillin Amidase aus E.coli wurden anhand der Hydrolyse von Penicillin G untersucht. Die ermittelten scheinbaren Km � Konstanten waren um ein vielfaches höher, als die des freien Enzyms, aber um ein bis zwei Größenordnungen kleiner als die für an große poröse Partikel (&gt;100 µm) gebundene Penicillin Amidase. Die Selektivität des auf M-PVA-Trägern immobilisierten Enzyms wurde anhand der kinetisch kontrollierten Synthese von Cephalexin aus R-Phenylglycinamid und 7-Aminodeacetoxycephalosporansäure bei 5 °C mit einem Nucleophilüberschuß untersucht. Die Selektivität des gebundenen Enzyms betrug nsyn / nhyd = 8 und ist vergleichbar mit der des freien Enzyms (nsyn / nhyd = 13). Die Enantioselektivität der immobilisierten Penicillin Amidase aus E.coli wurde mittels der gleichgewichtskontrollierten Hydrolyse racemischer Mischungen von Phenylacetylphenylalanin und der kinetischkontrollierten Kondensation von R-Phenylglycinamid mit racemischem oder enatiomerenreinem Phenylalanin bestimmt.