title: A reverse genetic approach to analyse ploidy-associated gene silencing in Arabidopsis thaliana
Creators: name: Milos, Michael
Publisher: name: :none
Year: 2006

description: Polyploidisierung, die Vervielfachung des gesamten Chromosomensatzes, ist eine von mehreren Möglichkeiten, die genetische Vielfalt zu erhöhen und kann dadurch zur Reaktion auf umweltbedingten Veränderungen beitragen. Dieser Mechanismus ist in Pflanzen weit verbreitet und hat vermutlich die Entstehung einer Vielzahl von Phänotypen ermöglicht und polyploide Pflanzen evolutionär erfolgreich gemacht. Unter anderem ist Polyploidisierung vielfach mit transkriptioneller Genstilllegung durch epigenetische Mechanismen verknüpft. Epigenetisch stillgelegte Zustände können über Generationen hinweg stabil weitervererbt werden und zeichnen sich durch DNA Methylierung, diverse Histonmodifikationen und verdichtete Chromatinstrukturen aus. Verschiedene Pflanzengene, die epigenetische Suppression und Chromatineigenschaften regeln, sind bekannt, darunter Methyltransferasen, Histonmodifikationsenzyme, Polycombproteine, sowie Proteine, die Chromatin zusammensetzen bzw. umbauen oder an RNA Interferenz beteiligt sind. Viele Elemente dieser verschiedenen Gruppen interagieren in komplexen Netzwerken. Ob und wie sie auch in die polyploidie-assoziierten epigentischen Regulationen integriert sind, ist jedoch nicht bekannt. Ich habe einen reversen genetischen Ansatz in Arabidopsis thaliana verwendet, um zu testen, welche der bekannten Regulatoren an der Aufrechterhaltung der polyploidie-assoziierten Genstilllegung beteiligt sind. Ich habe verschiedene Pflanzen mit definierten Mutationen in Genen für einzelne epigenetische Regulatoren mit Pflanzen der Linie (C2S), die ein Hygromycinresistenzgen (HPT) trägt, gekreuzt. Diese Linie ist ein diploider Abkömmling von einem tetraploiden Vorläufer, in dem das HPT Gen eine transkriptionelle Genstilllegung erfahren hat. Nach dem Kreuzen habe ich die F1 Hybride zur Erzeugung von F2 Generationen verwendet. Diese sollten Pflanzen enthalten, die homozygot für die Mutation und hemi-oder homozygot für das HPT Gen sind. Die F2 Generationen wurden durch Selektionsversuche auf hygromycin-haltigem Medium auf die Reaktivierung des stillgelegten Gens getestet. Ohne Selektion aufgezogene Geschwisterpflanzen wurden genotypisiert und die gewünschten Pflanzen durch Selbstbefruchtung bis in die F4 Generation gebracht. Geeignetes Material wurde ebenfalls durch Selektionsversuche auf die Reaktivierung des HPT Gens getestet und mit molekularen Methoden auf HPT Expression und Methylierungsstatus des HPT Gens untersucht.
description: Polyploidization, the multiplication of whole chromosome sets, is one of several possibilities to increase genetic diversity and therefore may help to react to environmental changes. The mechanisms is very common in plants and believed to create a variety of different phenotypes, making polyploid plants evolutionary successful. Among other consequences, polyploidization is frequently associated with transcriptional silencing of genes by means of epigenetic mechanisms. Silent epigenetic states can be stably inherited throughout generations and are manifest by methylation of DNA, diverse modifications of histones and a more condensed chromatin structure. Several plant genes are known to regulate epigenetic transcriptional silencing and chromatin properties in general, including methyltransferases, histone modification enzymes, chromatin assembly/remodeling factors, RNAi processing components and Polycomb proteins. Many elements of these different groups are interacting in complex networks. However, if and how they contribute to polyploidy-associated gene silencing is not known. I have used a reverse genetic approach in Arabidopsis thaliana to test which of these regulators is also involved in maintenance of polyploidy-associated silencing. I crossed several plants carrying defined mutations in genes for epigenetic regulators with plants of a line (C2S) carrying a hygromycin resistance gene (HPT). This line is a diploid derivative derived from a tetraploid progenitor in which the HPT gene had undergone transcriptional gene silencing (TGS). After crossing, F1 hybrids were grown into F2 populations that are expected to contain plants homozygous for the mutations and hemi - or homozygous for the HPT gene. F2 populations were assayed for reactivation of the silenced marker by selection on hygromycin. Siblings grown without selection were genotyped and appropriate plants further propagated to F4. Suitable material was screened on hygromycin for reactivation of the silenced HPT gene and analyzed with molecular methods for HPT expression and DNA methylation status at the HPT gene.