title: Characterization of immune factors involved in the regulation of intestinal stem cell homeostasis
Creators: name: Sträußnigg, Hannah Maria
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Das Regenerationspotenzial des Darmepithels wird durch sich schnell teilende Darm-Stammzellen (ISCs) an der Basis der Krypte etabliert. Zytokine, die von angeborenen und adaptiven Immunzellen des Darms ausgeschüttet werden, spielen eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des empfindlichen Gleichgewichts zwischen der Regeneration und Differenzierung von ISCs. Viele Studien deuten darauf hin, dass Zytokine an der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beteiligt sind, sowohl im physiologischen als auch im pathologischen Kontext. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Bildung von ROS im Colon hauptsächlich durch die NADPH-Oxidase 1 (NOX1), welche die Proliferation von Colon-Stammzellen antreibt, gefördert wird. In dieser Arbeit wurde die Rolle ausgewählter Zytokine in der Funktion und Entwicklung von ISCs untersucht, um eine Verbindung zwischen der Proliferation von Stammzellen und der NOX1-vermittelten ROS-Produktion herzustellen. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit des Wnt3a-Surrogats NGS Wnt-Fc untersucht, die Kultivierung von ISCs zu ermöglichen, mit dem Ziel, eine NGS Wnt-Fc-exprimierende Zelllinie zu etablieren, um somit die Kultivierung von Organoiden zu optimieren. Im ersten Teil des Projekts wurde die Auswirkung einer Auswahl von Zytokinen auf aus Mausmodellen etablierte Organoid-Kulturen getestet und ihr Effekt auf Proliferation und Differenzierung mithilfe von Mikroskopie, Fluoreszenz- und Lumineszenz-basierten Plate-Reader-Assays und Massenspektrometrie ausgewertet. Im zweiten Teil der Studie wurde unter Verwendung von DNA-Klonierungstechniken eine mutierte NGS Wnt-Fc-Version hergestellt und die Proteinproduktion in HEK293T-Zellen nach transienter und stabiler Transfektion analysiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Interleukin-13 (IL-13) und Interleukin-22 (IL-22) die Differenzierung von Becherzellen maßgeblich fördern, wobei IL-13 selbst in Gegenwart stammzellenerhaltender Faktoren differenzierungsfördernde Effekte aufweist. Darüber hinaus identifizierten wir Interleukin-17A (IL-17A) als starken Förderer der NOX1-vermittelten Bildung von ROS im Colon, mit uneindeutigen Auswirkungen auf die Zellproliferation. Letztendlich wird gezeigt, dass NGS Wnt-Fc die Kultivierung von Organoiden unterstützt und dass die Proteinproduktion nach transienter Transfektion mit einem optimierten Plasmid erhöht wurde. Weitere Untersuchungen sind jedoch erforderlich, um eine stabile Expression von NGS Wnt-Fc in HEK293T-Zellen zu erreichen.
description: The regenerative potential of the intestinal epithelium is established by rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs), residing at the base of the crypt. Cytokines, secreted from gut-resident innate and adaptive immune cells, play a crucial role in maintaining the delicate balance of ISC renewal and differentiation. A large body of evidence points towards the involvement of these cytokines in the production of reactive oxygen species (ROS), both in a physiological as well as in a pathological context. Recently, it has been shown that ROS generation in the colon is mainly driven by NADPH oxidase 1 (NOX1), which promotes the proliferation of colonic stem cells. In this study, we aimed to elucidate the role of selected cytokines on ISC function and development, with the goal of establishing a link between stem cell proliferation and NOX1-mediated ROS production. Moreover, we investigated the capacity of NGS Wnt-Fc, a Wnt3a surrogate, to support ISC maintenance and aimed to establish a NGS Wnt-Fc-expressing cell line in order to optimize organoid culture conditions. For the first part of the project, we tested a library of cytokines on colonic organoid cultures established from mouse models and assessed their effects on proliferation and differentiation using microscopy, fluorescence- and luminescence-based plate-reader assays and mass spectrometry. For the second part, we created a mutated NGS Wnt-Fc version using DNA cloning techniques and studied protein production upon transient and stable transfection into HEK293T cells. Our results have identified interleukin-13 (IL-13) and interleukin-22 (IL-22) as potent drivers of goblet cell differentiation, with IL-13 demonstrating differentiation-promoting effects even in the presence of stem cell-maintaining cues. Furthermore, we describe interleukin-17A (IL-17A) as a strong promoter of NOX1-mediated ROS generation in the colon with ambiguous effects on proliferation. Lastly, we show that NGS Wnt-Fc reliably sustained organoid growth and that protein production was increased upon transient transfection with an optimized plasmid. However, further efforts are required in order to generate stable protein expression of NGS Wnt-Fc in HEK293T cells.