Κατασκευή ανασυνδυασμένου ιού του απλού έρπητα τύπου Ι (HSV-1) με αντικατάσταση του γονιδίου UL44 με γονίδιο αναφοράς
Creators: name: Νταλλή, Αννα Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: ιός απλού έρπητα τύπου γλυκοπρωτεΐνη C (gC)
ανασυνδυασμός-HSV-1
gC minus virus
recombination

description: Σκοπός της παρούσας διατριβής υπήρξε η κατασκευή ενός ανασυνδυασμένου ιού του απλού έρπητα τύπου 1 (HSV-1) στον οποίο έχει αντικατασταθεί το ιικό γονίδιο της UL44 με το γονίδιο αναφοράς lacZ που κωδικοποιεί τη β-γαλακτοσιδάση. Το γονίδιο UL44 κωδικοποιεί τη γλυκοπρωτεΐνη C (gC) του ιού HSV-1, η οποία εμπλέκεται στις διαδικασίες μόλυνσης του ιού και αποφυγής του από το ανοσοποιητικό σύστημα του οργανισμού-ξενιστή, ενώ έχει χαρακτηριστεί ως μη απαραίτητη για την ανάπτυξη του ιού in vitro. Για να επιτευχθεί η παραπάνω αντικατάσταση της UL44 με τη LacZ, κατασκευάσαμε μια σειρά από κατάλληλους πλασμιδιακούς φορείς όπου η LacZ τοποθετήθηκε ανάμεσα σε ιικές αλληλουχίες με διάφορα μεγέθη και η έκφραση της ρυθμίζονταν υπό τον έλεγχο του υποκινητή της UL44. Οι ιικές αλληλουχίες επιλέχθηκαν έτσι ώστε να εμφανίζουν ομολογία με τις αλληλουχίες της UL44 στο γονιδίωμα του ιού, για να επιτρέψουν την στοχευμένη αντικατάσταση του lacZ με το γονίδιο της gC. Για να επιτευχθεί περαιτέρω αύξηση στην έκφραση του γονιδίου lacZ, προχωρήσαμε στην κατασκευή ενός πλασμιδιακού φορέα που φέρει α) τη LacZ υπό τον έλεγχο ενός ισχυρού υποκινητή, δηλαδή τον υποκινητή του γονιδίου της ΙΕ-3 του HSV-1, και β) ενσωματωμένες ανασυνδυασμένες αλληλουχίες Kozak στην περιοχή έναρξης της μετάφρασης του γονιδίου lacZ. Η έκφραση της β-γαλακτοσιδάσης ελέγχθηκε πραγματοποιώντας δοκιμές ελέγχου της λειτουργικότητας της σε εκχυλίσματα 293Τ κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί, παροδικά, με τους πλασμιδιακούς φορείς που την περιείχαν. Η κατασκευή των ανασυνδυασμένων ιών επιχειρήθηκε με πειράματα συνδιαμόλυνσης σε κύτταρα Vero μεταξύ ιικών νουκλεοκαψιδίων και ανασυνδυασμένων πλασμιδιακών φορέων, και ακολούθησε απομόνωση και έλεγχος μεμονομένων ιικών πλακών. Η εξακρίβωση της αντικατάστασης της gC και ύπαρξης της LacZ πραγματοποιήθηκε με διάφορες τεχνικές όπως χρώση των κυττάρων in situ, PCR και δοκιμασίες ανοσοαποτύπωσης. Παρόλου που ο πρωταρχικός στόχος αυτής της στρατηγικής, ο οποίος ήταν η δημιουργία ενός ανασυνδυασμένου HSV-1 με την β-γαλακτοσιδάση να έχει αντικαταστήσει τη γλυκοπρωτεΐνη gC, δεν επιτεύχθηκε, η παρούσα δουλειά επέτυχε την δημιουργία όλων των απαραίτητων εργαλείων για την μελλοντική του επίτευξη.
description: The aim of the present thesis was the construction of a recombinant herpes simplex type 1 virus (HSV-1) by substitution of the viral gene, UL44, with lacZ, encoding β-galactosidase. The UL44 gene encodes the non-essential glycoprotein C (gC) of HSV-1, which plays an active role in viral attachment and modification of the host immune system. To achieve UL44 gene replacement with lacZ, we generated a series of appropriate vectors where lacZ was placed between viral sequences of varying lengths and its expression was under the control of the UL44 promoter. These flanking sequences were designed to provide regions of homology with the UL44 sequences within the virus genome and allow the targeted substitution of lacZ for gC. To enhance lacZ expression further steps were taken: a) lacZ was placed under a strong promoter, i.e. that of the HSV-1 IE-3 gene, and b) recombinant Kozak sequences overlapping the lacZ translational start site were generated. LacZ expression was monitored by performing β-galactosidase activity assays in extracts from 293T cells that had been transiently transfected with the generated constructs. The generation of recombinant HSV-1 viruses with a UL44 to lacZ substitution was attempted by cotransfecting viral nucleocapsids and recombinant constructs in Vero cells and isolating individual viral plaques. The verification of the lack of gC and presence of LacZ was done by a number of techniques such as in situ staining, PCR and immunoblotting analyses. Although the primary aim of the strategy, i.e. is to make a recombinant HSV-1 virus that encodes the β-galactosidase in the place of gC, was not achieved, the present work was successful in generating all the appropriate tools required for the successful future completion of this task.