title: Polyethylenimine-derived gene carriers and their complexes with plasmid DNA. Design, synthesis and characterization
Creators: name: Lungwitz, Uta
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: DNS , Gentransfer , Polyethylenimin , Nanopartikel , Transfektion , Plasmid , , DNA , gene transfer , polyethylenimine , nanoparticle , transfection
subject: 540 Chemie

description: In recent years viral as well as non-viral gene transfer emerged as a promising technique in molecular medicine as well as in basic research. Branched polyethylenimine (bPEI) has been introduced as a synthetic non- viral gene carrier. Unfortunately, its applicability is still limited by a low transfection efficacy and eminent cytotoxicity. The goal of this thesis was the design, synthesis and characterization of polyethylenimine (PEI) - derived DNA condensing agents and of its corresponding polyplexes, aimed to facilitate efficient and cell-compatible in vitro plasmid DNA (pDNA: pEGFP-N1 reporter plasmid) delivery. We synthesized per-N-methylated linear (lPMEI) and branched polyethylenimine by the complete N-methylation of the corresponding PEI 25 kDa precursors. The corresponding tertiary polyamines built polyplexes with pDNA, which exhibited similar hydrodynamic diameters, surface charge and endosomolytic activity, were internalized by CHO-K1 cells to a comparable degree, and were significantly less cytotoxic, compared to unmodified PEI - pDNA complexes. However, the capacity to transfect cells in vitro was almost diminished. Based on these results, we postulated that a sufficient overall basicity and linear architecture may be favorable prerequisites for an efficient and cell- compatible gene carrier, respectively. Using a parallel synthesis approach, we synthesized a series of low molecular weight lPEIs (lmw lPEI) with relative number average molecular weights (Mn) between 1 and 8.1 kDa by the cationic ring-opening polymerization of 2-ethyl-2-oxazoline and acid- catalized hydrolysis of the corresponding poly (2-ethyl-2-oxazoline). Depending on the complexation medium used, lmw lPEIs condensed pDNA under the formation of nanoparticles between 100 nm and a few micrometers, irrespective to the molecular weight of the polyamine or Nitrogen / Phosphate ratio (Ratio of the polyamine-Nitrogen to the phosphates of the nucleic acid: N/P ratio) applied. Polyplexes built with lPEI of 8.1 kDa and lPEI 5 kDa exhibited an enhanced transfection efficacy and improved cell compatibility, compared to the standard lPEI 25 kDa- and bPEI 25 kDa-derived transfection systems. However, we observed that a high lPEI Mn led to a high polymer as well as polyplex cytotoxicity. In order to design gene carriers of high efficacy and low cytotoxicity, we cross-linked low molecular weight lPEI by reducible disulfide linkages, leading to a series of polymers, that differed by the molecular weight of the lPEI component (2.6 and 4.6 kDa), the linker type, and linker / lPEI ratio. The cross-linked lPEIs formed polyplexes between 200 and 2500 nm with pDNA, which were destabilized in the presence of disulfide reducing agents. The efficacy of gene transfer to CHO-K1 and the cell compatibility after transfection was improved several-fold compared to the corresponding linear or branched PEI 25 kDa - pDNA complexes, modulated by the lPEI molecular weight, the linker / lPEI ratio, and the N/P ratio applied. To enable an in vivo application of the gene carriers, we synthesized a series of methoxy poly (ethylene glycol) (mPEG) - lmw lPEI copolymers. All mPEG - lmw lPEI copolymers condensed pDNA under the formation of nanoparticles between 150 and 420 nm, showed a similar potential to impair ion-induced particle aggregation, and showed a reduced non-specific internalization of polyplexes by CHO-K1 cells. The series of polyamines were used to identify the most promising derivatives. The combination of the single classes of polymers will allow for the manufacture of tailor-made non-viral vectors optimized to the specific therapeutic concept or laboratory application.
description: Der Transfer von Genen wurde in den letzten Jahren zu einer wichtigen Arbeitstechnik in der Forschung und mag zukünftig auch als Therapiekonzept Anwendung finden. 1995 wurde das verzweigte Polyethylenimin (PEI) als vielversprechender nicht-viraler Genträger eingeführt. Aufgrund der niedrigen Transfektionseffizienz und eminenten Zytotoxizität findet jedoch bisher noch keine breite Anwendung. Ziel dieser Arbeit war das Design, die Synthese und Charakterisierung von PEI-basierten Genträgern und deren Polyamin-DNA- Komplexen zur Entwicklung effizienter und zell-kompatibler in vitro plasmid DNA (pDNA: pEGFP-N1 Reporterplasmid) Transfer Systeme. Wir haben per-N-methyliertes lineares (lPMEI) und verzweigtes Polyethylenimin (bPMEI) durch die N-Methylierung der jeweiligen PEI 25 kDa synthetisiert. Die entsprechenden Polyamin - pDNA Polyplexe besaßen eine vergleichbare Partikelgröße, Oberflächenladung, endosomolytische Aktivität und wurden in vergleichbarer Menge von CHO-K1 Zellen internalisiert. Sie waren weniger zytotoxisch als PEI - pDNA Komplexe, verloren jedoch auch ihre Gentransferaktivität. Davon ausgehend, dass für eine hohe Transfektionseffizienz und niedrige Zytotoxizität eine ausreichende Basizität und lineare Polymerstruktur grundlegend sind, haben wir eine Serie linearer Polyethylenimine (lPEI) mit relativen zahlenmittleren Molmassen zwischen 1 und 8,1 kDa synthetisiert. Lineares niedermolekulares Polyethylenimin wurde dabei in einem Parallelsyntheseansatz durch die Ringöffnungspolymerisation von 2-Ethyl-2- oxazolin und anschließender Hydrolyse der resultierenden Poly (N- acylethylenimine), erhalten. In Abhängigkeit vom verwendeten Komplexierungsmedium, jedoch unabhängig von der Molmasse des Polyamins oder N/P-Verhältnisses, bildeten sich mit pDNA Polyplexe einer Partikelgröße zwischen 100 nm und einigen Mikrometern. lPEI 8,1 und 5 kDa - pDNA Polyplexe zeigten in vitro eine höhere Transfektionseffizienz und verbesserte Zellkompatibilität im Vergleich zu Standard lPEI- und bPEI 25 kDa - pDNA Vectoren. Mit zunehmendem Polymerisationsgrad des Polyamins stieg jedoch die Zytotoxizität des Polymers und der entsprechenden Polyplexe an. Um Transfektionsreagenzien herzustellen, die die niedrige Zytotoxizität niedermolekularer PEIs mit der hohen Effizienz höhermolekularer PEIs verbinden, haben wir eine Serie Disulfid-quervernetzter lPEIs synthetisiert. Die Polymere unterschieden sich in der Molmasse der lPEI-Komponente (2.6 and 4.6 kDa), dem verwendeten Disulfid-Linker und dem stöchiometrischen Linker / lPEI - Verhältnis. Die quervernetzten lPEIs bildeten mit Plasmid-DNA 200 bis 2500 nm große Polyplexe, die ihre Kompaktheit und Partikelgröße in der Gegenwart von Reduktionsmitteln veränderten. Diese Transfektionsreagenzien erreichten eine um ein Vielfaches höhere Transfektionseffizienz und Zellkompatibilität als die vergleichbaren lPEI 25 kDa- oder bPEI 25 kDa - pDNA Polyplexe. Beide Größen waren dabei abhängig von der lPEI-Molmasse, dem Linker / lPEI - Verhältnis und dem verwendeten N/P-Verhältnis. Um die Grundlage für eine in vivo Anwendung dieser Transfektionssysteme zu schaffen haben wir eine Reihe von Methoxypolyethylenglycol (mPEG) - lPEI Copolymere synthetisiert. Alle verwendeten Copolymere komplexierten Plasmid-DNA und formten Nanopartikel mit einer Größe zwischen 150 and 420 nm, zeigten eine geringe Tendenz zur Partikelaggregation und wurden nur vereinzelt von CHO-K1 Zellen unspezifisch aufgenommen. In allen Serien wurden die Polymere mit den für ihre Anwendung besten Eigenschaften ermittelt. Ihre Kombinierbarkeit ermöglicht es maßgeschneiderte non-virale Vektoren herzustellen, die optimiert werden können für ein bestimmtes therapeutisches Konzept oder ihre Verwendung im Labor.