Εξωκυτταρικές μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών σε πειραματικά μοντέλα αθηρωμάτωσης:
Creators: name: Παραστατίδης, Ιωάννης Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Νιτροτυροσίνη
Αθηροσκλήρωση
Ινωδογόνο
Πρωτεομική
Nitrotyrosine
Atherosclerosis
Fibrinogen
Proteomics

description: Η απολιποπρωτεΐνη Α-Ι, η βασική πρωτεΐνη εντός του μορίου της υψηλής πυκνότητας χοληστερόλης (HDL), έχει συσχετισθεί με αθηροπροστατευτικές ιδιότητες μέσω του μηχανισμού της ανάδρομης μεταφοράς χοληστερόλης από την περιφέρεια προς το ήπαρ. Ωστόσο, αντιφλεγμονώδεις και αντιοξειδωτικές ιδιότητες έχουν επίσης προταθεί. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι με την ανίχνευση και ποσοτική μέτρηση των επιπέδων νιτροτυροσίνης, τόσο στις αορτικές ρίζες, όσο και στο πλάσμα αθηροσκληρωτικών μοντέλων μυών τύπου LDLr -/- υπό την παρουσία (μοντέλα LA) ή απουσία (μοντέλα LA–apoA-I-/-) της απολιποπρωτεΐνης Α-Ι. Τα επίπεδα νιτροτυροσίνης στις αορτικές ρίζες των μοντέλων LA–apoA-I-/-, βρέθηκαν 6 φορές υψηλότερα συγκριτικά με τα μοντέλα LA. Η παρατήρηση αυτή επαληθεύθηκε με τη χρήση μεθόδων ανοσοϊστοχημείας και ανοσοηλεκτρονικής μικροσκοπίας, τα οποία έδειξαν εντονότερη χρώση για νιτροτυροσίνη στις αθηρωματικές αλλοιώσεις των μοντέλων που δεν εκφράζουν την απολιποπρωτεΐνη Α-Ι. Επιπρόσθετα, με την εφαρμογή της τεχνολογίας της πρωτεομικής, ανιχνεύθηκαν 44 πρωτεΐνες – στόχοι προς νίτρωση στις αθηρωματικές πλάκες και 17 πρωτεΐνες – στόχοι προς νίτρωση στο πλάσμα των μοντέλων LA–apoA-I-/-. Το ινωδογόνο βρέθηκε νιτρωμένο τόσο εντός του πλάσματος, όσο και μέσα στο αθήρωμα. Επειδή σε προηγούμενες εργασίες βρέθηκε ότι η νίτρωση του ινωδογόνου in vitro οδηγεί σε επιταχυνόμενη δημιουργία θρόμβου, υποθέσαμε πως η μετα-μεταφραστική τροποποίηση αυτού με νίτρωση in vivo μπορεί να προκαλεί αυξημένη τάση για θρομβωτικά επεισόδια. Οι λειτουργικές επιπτώσεις της νίτρωσης μελετήθηκαν σε δείγματα ινωδογόνου που απομονώθηκαν από το πλάσμα υγιών ατόμων. Με την εφαρμογή της πρωτεομικής αναγνωρίσθηκαν τα υπολείμματα τυροσίνης 292 και 422 στο καρβοξυτελικό άκρο της β-αλύσου του μορίου του ινωδογόνου ως οι κύριοι στόχοι προς νίτρωση in vivo. Πειράματα με ανοσοηλεκτρονική μικροσκοπία απέδειξαν ότι τα νιτρωμένα μόρια πολυμερίζονται και ενσωματώνονται στο σχηματιζόμενο θρόμβο. Αποδείξαμε ότι η νίτρωση του ινωδογόνου προκαλεί 4 λειτουργικές επιπτώσεις: i) αύξηση της ταχύτητας πολυμερισμού, ii) μεταβολή της αρχιτεκτονικής του θρόμβου ινικής, iii) αύξηση της σκληρότητας και ελάττωση της πλαστικότητας του θρόμβου και iv) ελάττωση της ταχύτητας ινωδόλυσης από το ένζυμο πλασμίνη. Στα πειράματα ελέγχου η εκλεκτική αφαίρεση των νιτρωμένων μορίων είχε ως αποτέλεσμα την ελάττωση της ταχύτητας πολυμερισμού και την εξάλειψη των μεταβολών στην αρχιτεκτονική του θρόμβου. Επιπρόσθετα πειράματα με τη χρήση των μιμητικών πεπτιδίων των κομβίων “B” Gly-His-Arg-Proam και Ala-His-Arg-Proam υποδηλώνουν πως τα νιτρωμένα μόρια οδηγούν στις παραπάνω λειτουργικές επιπτώσεις μέσω της επιτάχυνσης της πλάγιας συγκόλλησης των ινών ινικής. Τα δεδομένα αυτά αναδεικνύουν έναν νέο παράγοντα κινδύνου, το νιτρωμένο ινωδογόνο, που εξηγεί την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ οξειδωτικού stress και αθηροθρομβωτικών επεισοδίων.
description: Apolipoprotein A-I (apoA-I), the major protein constituent within high-density lipoprotein (HDL), has been associated with antiatherogenic protection by mechanisms that include reverse cholesterol transport and anti-inflammatory functions. To evaluate the proposed protective function of apoA-I, proteins modified by nitrating oxidants were evaluated in the aortic tissue and plasma of mice lacking the low-density lipoprotein receptor and apobec (LA) and LA mice with genetic deletion of apoA-I (LA–apoA-I-/-). The levels of nitrated proteins in aortic tissue quantified by liquid chromatography with online electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC/ESI/MS/MS) were 6-fold higher in the LA–apoA-I-/- as compared with the LA mice. The quantitative analyses were corroborated by immunohistochemical and high-resolution immunoelectron microscopic evaluation of the lesions, which revealed abundant staining for nitrated proteins in the atherosclerotic lesions of LA–apoA-I-/- as compared with the LA mice. Proteomic approaches based on affinity enrichment and site-specific adduct mapping identified 44 proteins in the atherosclerotic lesions and 17 proteins in the plasma of LA–apoA-I-/- models. In particular, the nitration of fibrinogen was shown to accelerate fibrin clot formation. Another consequence of the augmented levels of nitrated proteins was the induction of humoral responses documented by the increased circulating immunoglobulins that recognize nitrotyrosine in the plasma of LA–apoA-I-/- as compared with the LA mice. Furthermore, we evaluated the role of fibrinogen nitration on the development of thrombotic complications in humans. Previous data demonstrated elevated levels of nitrated fibrinogen in subjects with coronary artery disease, and accelerated clotting when fibrinogen was nitrated in vitro. We hypothesized that a potential mechanism for an increased prothrombotic state is the post-translational modification of fibrinogen by tyrosine nitration. Utilizing state of the art proteomic approaches we identified the tyrosine residues 292 and 422 at the carboxyl terminus of the β-chain as the principal sites of fibrinogen nitration in vivo. Immunoelectron microscopy confirmed the incorporation of nitrated fibrinogen molecules in fibrin fibers. The nitration of fibrinogen in vivo resulted in four distinct functional consequences: increased initial velocity of fibrin clot formation, altered fibrin clot architecture, increased fibrin clot stiffness, and reduced rate of clot lysis. The rate of fibrin clot formation and clot architecture was restored upon depletion of the tyrosine-nitrated fibrinogen molecules. An enhanced response to the knob “B” mimetic peptides Gly-His-Arg-Proam and Ala-His-Arg-Proam suggests that incorporation of nitrated fibrinogen molecules accelerates fibrin lateral aggregation. The data provide a novel biochemical risk factor that could explain epidemiological associations of oxidative stress and inflammation with thrombotic complications.