title: Einfluss der DNA-Bindungskooperativität von p53 auf die Tumorsuppressoraktivität &amp; Beobachtung der Entwicklungsdynamik von Tumorklonen in vitro &amp; in vivo mittels sekretierter Luciferasen
title: Influence of the p53 DNA binding cooperativity on the tumour suppressor activity &amp; Monitoring the dynamics of clonal tumour evolution in vitro &amp; in vivo using secreted luciferases
Creators: name: Charles, Joël Pierre Alexandre
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Tumor
Cypridina
Gaussia
sekretierte Luciferasen
DNA-Bindungskooperativität
DNA binding cooperativity
secreted luciferases
Medizin, Gesundheit
p53
Protein p53

description: Der Tumorsuppressor p53 wird als
      „Wächter des Genoms“ bezeichnet und spielt eine wichtige
      Rolle bei der Prävention von Krebserkrankungen. p53 ist ein
      sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der durch
      verschiedene Formen von Zellstress wie DNA-Schäden oder
      Onkogene aktiviert wird und in Abhängigkeit der Schwere der
      entstandenen Schäden eine Vielzahl verschiedener Zielgene
      transaktiviert, die Zellzyklus Arrest, Seneszenz,
      Differenzierung und Apoptose induzieren. Bei der Entscheidung
      über Überleben oder Sterben tragen posttranskriptionelle
      Modifikationen von p53 und Interaktionen mit Kofaktoren dazu
      bei, dass p53 bestimmte Gruppen von Zielgenen aktiviert. Es
      ist aber unklar, wie diese Entscheidung über das
      Zellschicksal auf der Ebene der Promotorbindung von Zielgenen
      durch p53 getroffen wird. Für die Bindung an die DNA bilden
      vier p53-Proteine ein Tetramer, wobei die DNA Bindungsdomänen
      kooperativ an die DNA binden. Dabei interagieren die
      H1-Helices der DNA-Bindungsdomänen zweier benachbarter
      p53-Monomere über eine Salzbrücke. Um den Einfluss der
      DNA-Bindungskooperativität für die tumorsuppressive Funktion
      von p53 zu untersuchen, wurden p53 H1-Helixmutanten
      generiert, die das komplette Spektrum von niedriger bis
      starker DNA-Bindungskooperativität aufweisen und bezüglich
      ihrer genomischen Bindung und Transaktivierung von Zielgenen
      sowie ihrer Antwort auf Stress untersucht. Die Ergebnisse
      zeigen, dass die Kooperativität eine Bindung an degenerierte
      Motive, wie sie in proapoptotischen Genen vorkommen,
      ermöglicht und so das Bindungsspektrum von p53 erweitert.
      Eine niedrige Kooperativität erlaubt die Induktion von
      Zellzyklus-Arrest, verhindert aber die Induktion von
      Apoptose. Somit moduliert die DNA-Bindungskooperativität die
      Entscheidung über das Zellschicksal, bestimmt die
      Eliminierung von geschädigten Zellen durch Apoptose und trägt
      zur Tumorsuppressoraktivität von p53 bei. Tumore sind
      heterogene Zellpopulationen, die aus genetisch
      unterschiedlichen Subklonen bestehen, die in einem iterativen
      Evolutionsprozess aus genetischer Mutation und Selektion
      entstehen. Die Mehrzahl der Tumorsubklone kann häufig
      therapeutisch zerstört werden, doch kann bei einer Therapie
      der starke Selektionsdruck das Auswachsen und Überleben
      resistenter Klone fördern. Das Verständnis über die
      genetischen Veränderungen in der klonalen Tumorentwicklung,
      die zur Tumorinitiation, Progression, Metastasierung,
      Therapieresistenz und Rezidiven beitragen, ist von großem
      Interesse, um Präventionsstrategien und Therapien zu
      entwickeln. Die Rolle einzelner Gene bei der Tumorentstehung
      kann spezifisch mittels RNA Interferenz unter Verwendung von
      short hairpin RNAs (shRNA) untersucht werden, die einen
      stabilen Funktionsverlust-Phänotyp generieren. Dabei werden
      in Experimenten shRNA-exprimierende Tumorzellen oft mit
      Fluoreszenzreportern markiert und verfolgt. Dies funktioniert
      gut in Zellkulturexperimenten oder Leukämie-Mausmodellen,
      aber nicht in soliden Tumoren, die 90% aller Tumore im
      Menschen ausmachen. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung
      eines Systems zur konstitutiven und induzierbaren Markierung
      von Tumorzellen mit sezernierten Luciferasen. Dafür wurde ein
      dualer Luciferase Assay entwickelt, der es ermöglicht, zwei
      unterschiedliche shRNA-exprimierende Tumorzellklone
      kompetitiv zu verfolgen, sowohl in vitro als auch in vivo.
      Die Aktivität der sezernierten Gaussia (GLuc) und Cypridina
      (CLuc) Luciferasen kann verlässlich und spezifisch in
      Überständen von Zellmischungen oder im Xenograft-Modell ohne
      größere Eingriffe durch minimalinvasive Methoden im Mausblut
      gemessen werden und korreliert mit der Tumorzellzahl, bzw.
      der Tumorgröße. Die Ergebnisse zeigen, dass sich mit diesem
      dualen Assay die Entwicklungsdynamik von Tumorsubklonen auch
      in soliden Tumoren zeitlich erfassen lässt, und etablieren
      die Anwendungsmöglichkeit zur Untersuchung einzelner Gene und
      deren Beitrag zur Tumorentwicklung, Metastasierung und
      Tumortherapie. Durch die Verwendung einer der Luciferasen als
      interne Kontrolle in diesem kompetitiven Ansatz zur
      Normalisierung der Daten ist die Varianz der Ergebnisse
      deutlich geringer und die Versuchstierzahlen können somit um
      bis zu drei Viertel reduziert werden. Durch Verwendung
      sezernierter Luciferasen konnte so unter Berücksichtigung des
      3R-Prinzips eine Methodik etabliert werden, um die Anzahl und
      die Belastung von Tieren in der Tumorforschung deutlich zu
      reduzieren.
description: p53 is known as the “guardian of
      the genome” and plays an important role in the prevention of
      cancer development. In response to different kinds of
      cellular stress like DNA damage or oncogene activity p53
      binds as a sequence specific transcription factor to the DNA
      and induces the expression of genes involved in cell cycle
      arrest, senescence, differentiation and apoptosis. It is
      known that interaction with cofactors and modifying enzymes
      is involved in the decision between survival and death by
      p53. Nevertheless it remains unclear how this decision is
      made at the level of p53 binding to promoters. p53 forms a
      tetramer and binds to the DNA in a cooperative manner via the
      DNA binding domain. For this the H1 helices of two adjacent
      p53 monomers interact by forming a salt bridge. To determine
      the role of p53 DNA binding cooperativity for tumour
      suppression, p53 H1 helix mutants which cover the whole range
      from low to high cooperativity were generated and analyzed
      with respect to their genomic binding profiles,
      transactivation of target genes and response to cellular
      stress. The results show that the binding spectrum of p53 is
      extended by DNA binding cooperativity to include degenerated
      response elements found in proapoptotic genes. Therefore low
      cooperativity p53 induces cell cycle arrest but prevents the
      induction of apoptosis. Hence, DNA binding cooperativity
      modulates the cell fate decision, determines the elimination
      of damaged cell through apoptosis and contributes to the
      tumour suppressor activity of p53. Tumours are heterogeneous
      cell populations that consist of genetically distinct
      subclones. These subclones arise through the reiterative
      process of genetic mutation and selection. Most of these
      cancer clones can be eliminated therapeutically but due to a
      strong selective pressure during therapy resistant variants
      can expand. The genetic mutations that contribute to tumour
      initiation, progression, metastasis and therapy resistance
      are attractive targets for the development of therapeutic
      treatments. The contribution of single genes to cancer can be
      analyzed specifically with RNA interference and the use of
      short hairpin RNAs (shRNA) by generating a loss-of-function
      phenotype. In such experiments tumour cells carrying shRNAs
      can be marked and tracked with fluorescent markers. This
      works well in in cell culture studies or in leukemia mouse
      models but not for solid tumours, which comprise 90% of all
      cancers. Hence a system was generated to mark tumour cells
      constitutively or in an inducible manner with secreted
      luciferases. We developed a dual luciferase assay to track
      the fate of two different shRNA-expressing tumour cell clones
      competitively, both in vitro and in vivo. The activities of
      the secreted Gaussia (GLuc) and Cypridina (CLuc) luciferases
      can easily and specifically be measured in the supernatant of
      cultured cells or minimal-invasively in mouse xenograft
      models in the blood of mice. The luciferase activities also
      correlate well with the tumour cell number or the tumour
      size. We show that this dual assay enables the time-resolved
      monitoring of clonal tumour evolution in a dynamic manner and
      its suitability for solid tumours as well as for the analysis
      of genes and their contribution to tumour development,
      metastasis and therapy. With one of the secreted luciferases
      as internal control for normalization the variance of the
      data is reduced and allows a reduction of animal numbers by
      approximately 75%. Using secreted luciferases and in
      consideration of the 3R principle we established a
      methodology to reduce the burden of animals in tumour
      research.