Lysinuric proetin intolerance: molecular and cellular bases of an inherited multi-system disorder
Creators: name: Sperandeo, Maria Pia
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: [ITALIANO] Introduzione: L’ intolleranza alle proteine con lisinuria, ereditata come carattere autosomico recessivo, è causata da un difettivo trasporto di aminoacidi cationici (CAA) alla membrana basolaterale delle cellule epiteliali di intestino e rene. I pazienti sono usualmente asintomatici durante il periodo dell'allattamento; dopo lo svezzamento, allorché il contenuto dell’ apporto proteico aumenta, si manifestano i segni clinici della malattia: vomito, diarrea, epatosplenomegalia, osteoporosi, episodi di coma iperammoniemico, ritardo mentale, coinvolgimento polmonare (principalmente come proteinosi alveolare), anomalie ematologiche, alterata risposta immunologica, malattia cronica renale. L' alterazione metabolica nella LPI è caratterizzata da: ridotto assorbimento intestinale di CAA, aumentata escrezione renale di CAA e una disfunzione del ciclo dell'urea che porta ad iperammonemia ed oroticoaciduria. 
La LPI è causata da mutazioni del gene SLC7A7, che codifica per la proteina y+LAT1, appartenente alla famiglia dei trasportatori eterodimerici. Questo trasportatore di aminoacidi è composto da una catena pesante, 4F2hc, codificata dal gene SLC3A2, e da una catena leggera, y+LAT1, unite mediante un ponte disolfuro. La co-espressione di 4F2hc e di y+LAT1 induce il trasporto di CAA di tipo y+L.
Specifici obiettivi: Il principale obiettivo della ricerca è stato la conoscenza delle basi cellulari e molecolari della fisiopatologia della LPI.
Le strategie di ricerca utilizzate sono state:
1. Analisi mutazionale di pazienti affetti da LPI;
2. Analisi funzionale di mutanti del gene SLC7A7;
3. Creazione di modelli animali e cellulari di LPI.
Risultati: Analisi mutazionale di pazienti affetti da LPI. Lo studio ha evidenziato la presenza di un elevato numero di mutazioni, distribuite lungo tutta la sequenza codificante del gene SLC7A7. 
Analisi funzionale di mutanti del gene SLC7A7. Gli studi funzionali hanno apportano nuove informazioni sulla patogenesi della LPI: a) un nuovo modello del trasportatore di CAA con struttura multieterodimerica e b) una possibile interferenza tra la proteina y+LAT1 e la proteina y+LAT2 (gene SLC7A6), proteina altamente omologa a y+LAT1 ed appartenente alla stessa famiglia dei trasportatori eterodimerici. Quest’ interferenza potrebbe spiegare perché sia possibile un meccanismo compensatorio, noto nei linfoblasti di pazienti LPI, ove è stata dimostrata una over-espressione di SLC7A6.
Creazione di modelli animali di LPI. E’ stato generato il primo modello animale della LPI come topo knock-out (KO) costitutivo per il gene Slc7a7 mediante il sistema d’inserzione casuale gene-trap in cellule ES. Lo studio del fenotipo di tale animale non ha fornito i contributi auspicati alla comprensione dei meccanismi patogenetici della LPI; infatti, per la letalità dell’ animale, si sta procedendo alla creazione di un modello murino di tipo condizionale mediante la delezione del gene Slc7a7 in specifici tessuti e con temporale controllo dello spegnimento del gene. 
Creazione di un modello cellulare di LPI. Il primo modello cellulare di LPI è stato ottenuto mediante isolamento di cellule di tubulo renale dalle urine dei pazienti affetti da LPI. Tale modello cellulare è stato utilizzato per valutare la relazione tra l’interessamento renale riscontrato in molti pazienti affetti da LPI ed il metabolismo dell’ossido nitrico (NO). I nostri dati preliminari confermano una possibile relazione tra la produzione di NO, l’apoptosi indotta ed il coinvolgimento renale.
Conclusioni: Il lavoro descritto in questa tesi ha portato alle seguenti conclusioni:
1.	nuova organizzazione multieteromerica del trasportatore di aminoacidi cationici;
2.	generazione di un modello knock-out (KO) costitutivo del gene Slc7a7, il cui fenotipo è caratterizzato da un grave ritardo di crescita che non si accompagna ad alterazioni strutturali durante lo sviluppo embrionale.
3.	lo studio delle cellule di tubulo renale ha indicato una chiara relazione tra il coinvolgimento renale nell’uomo e l’apoptosi indotta da elevati livelli di NO sintetizzato in tali cellule.
4.	questi risultati suggeriscono che i protocolli convenzionali dovrebbero essere rivalutati in quanto l’eccesso di citrullina, che giornaliermente è somminstrata ai pazienti, potrebbe indurre un danno cellulare maggiore dovuto alla neo-sintesi di arginina. / [ENGLISH] Background: Lysinuric protein intolerance (LPI; MIM 222700) is caused by a defective transport of cationic amino acids (CAA for Cationic Amino Acids) to the basolateral membrane of the epithelial cells of intestine and kidney. Clinical manifestations of LPI include:vomiting, diarrhea, stunted growth, visceromegaly, osteoporosis, episodes of coma, mental delay, severe pulmonary (pulmonary alveolar proteinosis, PAP) and renal involvements. The metabolic derangement of this disease includes: reduced intestinal absorption of CAA, increased CAA renal excretion and impairment of the urea cycle that brings to hyperammonemia and increased orotic aciduria. The molecular basis of LPI is a defective transport of CAA normally exerted by system y+L. The y+L activity is induced by a heterodimer composed of: 
•	the heavy chain 4F2hc, encoded by the SLC3A2 gene;
•	a light chain that can be either y+LAT1 (encoded by the SLC7A7 gene) or y+LAT2 (encoded by the SLC7A6 gene). 
We found that the SLC7A7 gene is mutated in LPI patients and we also characterized most of the mutations found so far in Italian and non-Italian patients.
Specific objectives: The overall aim of the present thesis is to contribute to the elucidation of the pathophysiology of LPI, using three different approaches: 
1.	Mutational analysis of LPI patients; 
2.	 Functional studies of SLC7A7 mutants; 
3.	 Creation of animal and cellular models of LPI.	
Results: Our functional results revealed a new scenario in the knowledge on LPI disorder. In fact, our results provide further insight into the molecular pathogenesis of LPI: a putative multiheteromeric structure of both [4F2hc/y+LAT1] and [4F2hc/y+LAT2], and the interference between y+LAT1 and y+LAT2 proteins. This interference can explain why the compensator mechanism (via an increased expression of SLC7A6 seen in lymphoblasts and renal tubular cells from LPI patients) may not be sufficient to restore the y+L system activity.
The first animal model of LPI, a constitutive knock-out of Slc7a7, has been generated to study the pathophysiology of LPI and explore new therapeutic protocols. At the moment, we have succeeded in generating this model but it turned out to be lethal in the perinatal period. This lethality limited our studies. To circumvent the problem, we are generating a conditional Slc7a7 gene mouse model, using the Cre/loxP recombination system. With this mouse model, single aspects of the disease can be investigated without the risk of a full-blown clinical phenotype, which caused the lethality in the constitutive knock-out mouse. 
The first cellular model of LPI was obtained by isolation of renal tubular cells from urine of LPI patients. Using this cellular model we studied the relation between renal compliance and the nitric oxide metabolism. Our preliminary results confirm a possible relation between production of nitric oxide and renal involvement known in LPI.
Conclusions: The work described in this thesis has led to the following results:
1.	putative new model of y+L transporter with a putative multiheteromeric structure;
2.	ablation of Slc7a7 causes severe prenatal growth retardation with no gross developmental abnormalities but with unbalanced NO metabolism;
3.	unbalanced NO metabolism might be the key to understand the pathophysiology of many complications of LPI in man;
4.	renal involvement in human LPI has a clear relationship with apoptosis induced by high levels of NO synthesis in renal tubular cells;
5.	conventional therapeutic protocols of LPI should be revised immediately in order to avoid excessive citrulline intake and possible iatrogenic complications arising from disease.