title: Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide mediates differential signaling through PAC1 receptor splice variants and activates non-canonical cAMP dependent gene induction in the nervous system - Implications for homeostatic stress-responding
title: Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide aktiviert differenzielle Signaltransduktion via PAC1-Rezeptor-Splice-Varianten und nicht-kanonische cAMP-abhängige Geninduktion im Nervensystem - Implikationen für homöostatische Stressantworten
Creators: name: Holighaus, Yvonne
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Naturwissenschaften
signal transduction
neuropeptides
Stress
Nervensystem
nervous system
Neuropharmakologie
G-Protein gekoppelte Rezeptoren
stress
Genexpression
Neuropeptide
PACAP
gene expression
Signaltransduktion
G protein-coupled receptors
neuropharmacology

description: Pituitary adenylate
      cyclase-activating polypeptide (PACAP)-mediated activation of
      its G protein-coupled receptor PAC1 results in activation of
      the two G proteins Gs and Gq to alter second messenger
      generation and gene transcription in the nervous system,
      important for homeostatic responses to stress and injury.
      PAC1 occurs in different splice variants of the third
      intracellular loop, designated PAC1null, hop or hip,
      affecting second messenger generation as shown in non-neural
      cells. At the splanchnico-adrenomedullary synapse, PACAP is
      required for prolonged catecholamine secretion from
      chromaffin cells to restore homeostasis during prolonged
      periods of stress. In the central nervous system, PACAP is
      neuroprotective in neurodegenerative conditions associated
      with e.g., stroke. In the present study, PAC1 splice
      variant-specific second messenger production and activation
      of homeostatic responses were investigated in neuroendocrine
      and neural cells. Heterologous expression of the major PAC1
      splice variant of adrenomedullary chromaffin cells, PAC1hop,
      in PC12-G cells reconstituted a PACAP-mediated Ca2+ and
      prolonged secretory response similar to the one observed in
      primary chromaffin cells. The Ca2+ response mediated by
      PAC1null was somewhat smaller and PAC1hip failed to couple to
      Ca2+. Neither variant conferred prolonged catecholamine
      release, suggesting that expression of the hop cassette in
      the third intracellular loop of the receptor is required for
      sustained catecholamine release from neuroendocrine cells. In
      NG108-15 cells, heterologous expression of the PAC1hop, null
      and hip receptor conferred PACAP-mediated intracellular cAMP
      generation, while elevation of [Ca2+]i occurred efficiently
      in PAC1hop- and to a lesser extent in PAC1null-expressing
      cells. Expression of PAC1hip did not confer an intracellular
      Ca2+ response, indicating that PAC1hop is the receptor
      variant most efficiently coupled to combinatorial signaling
      through cAMP and Ca2+. PAC1hop-mediated signaling activated
      the mitogen-activated protein kinases (MAPK) extracellular
      signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2). Signaling to ERK
      proceeded through cAMP independently of the cAMP dependent
      protein kinase (PKA). PACAP induced transcription of the gene
      encoding the putative neuroprotectant stanniocalcin 1 (STC1),
      which has previously been implicated in neuronal resistance
      to hypoxic/ ischemic insult; gene induction proceeded through
      ERK but not PKA. Cyclic AMP generation by forskolin did not
      activate ERK in NG108-15 cells, but rather induced STC1 mRNA
      elevation through the canonical PKA dependent pathway. This
      suggests that activation of non-canonical cAMP signaling,
      mediating ERK-dependent gene induction, requires additional
      signaling through Ca2+ via PAC1hop in these cells. Primary
      rat cortical neurons expressed predominantly the PAC1hop and
      null variants. Exposure of cortical neurons to PACAP resulted
      in elevation of the two second messengers cAMP and Ca2+,
      activation of ERK1/2, and induction of STC1 gene
      transcription. PACAP-mediated ERK activation proceeded
      through cAMP but not PKA, and STC1 was induced via ERK but
      not PKA. Pharmacological stimulation of adenylate cyclases by
      forskolin also resulted in increased ERK phosphorylation and
      STC1 mRNA elevation independently of PKA. These results
      indicate that cAMP production alone is sufficient to activate
      ERK in differentiated cortical neurons, unlike in the less
      differentiated NG108-15 cell line. Induction of another PACAP
      target gene, brain-derived neurotrophic factor (BDNF),
      occurred through the canonical cAMP/PKA pathway. PACAP has
      been shown by our laboratory and others to be neuroprotective
      against ischemia in rodent stroke models. To begin to define
      the mechanism of this neuroprotection, we employed two cell
      culture stroke models. Rat cortical neurons subjected to
      either oxygen-glucose-deprivation or glutamate-induced
      excitotoxicity underwent cell death as expected. However,
      treatment with PACAP did not increase neuronal survival in
      either of the two models, and STC1 over-expression also
      failed to increase resistance to neuronal cell death during
      glutamate-induced excitotoxicity. These data suggest that the
      protective effects of the neurotrophic peptide PACAP and the
      putative neuroprotectant STC1 during neurodegenerative
      conditions in vivo are mediated through cells absent in
      cultures of cortical neurons, such as glial cells. In
      conclusion, the present study has demonstrated that
      expression of different PAC1 splice variants determines the
      degree of activation of two different second messenger
      pathways that may mediate different functional outcomes
      during stress-responding. PACAP mediates ERK activation and
      STC1 induction via non-canonical cAMP signaling. The
      selective pharmacological activation of this potentially
      neuroprotective pathway, which is different from the cAMP/PKA
      pathway critical for learning and memory, could have
      therapeutic implications for neuroprotection in vivo.
description: Aktivierung des
      G-Protein-gekoppelten Rezeptors PAC1 durch PACAP resultiert
      in Aktivierung von Gs und Gq und führt über Second
      Messenger-Produktion zur Aktivierung von Gentranskription,
      die essentiell für die homöostatische Stressantwort zu sein
      scheint. Durch differenzielles Splicing der dritten
      intrazellulären Schleife von PAC1 entstehen sogenannte
      PAC1null-, hop- und hip-Rezeptoren. In non-neuralen Zellen
      beeinflusst die Expression verschiedener Rezeptor-Varianten
      die Second Messenger-Generation. Als Kotransmitter an der
      splanchnico-adrenomedullären Synapse ist PACAP für anhaltende
      Katecholamin-Freisetzung von chromaffinen Zellen
      unentbehrlich, welche zur Wiederherstellung der Homöostase
      während anhaltendem Stress dient. Im zentralen Nervensystem
      ist PACAP neuroprotektiv in Assoziation mit z.B.
      Schlaganfall. In der vorliegenden Arbeit wurde die Produktion
      von Second Messengern durch verschiedene
      PAC1-Splice-Varianten und die Aktivierung homöostatischer
      Antworten in neuroendokrinen und neuralen Zellen untersucht.
      Heterologe Expression von PAC1hop, der Haupt-Variante
      chromaffiner Zellen, in PC12 Zellen, resultierte in einer
      PACAP-evozierten Ca2+- und anhaltenden sekretorischen
      Antwort, ähnlich der in primären chromaffinen Zellen. Auch
      die Aktivierung von PAC1null, jedoch nicht von PAC1hip,
      vermittelte eine intrazelluläre Ca2+-Antwort; diese war etwas
      geringer als die durch PAC1hop vermittelte. Weder PAC1null-
      noch PAC1hip-Aktivierung resultierte in anhaltender
      Katecholamin-Freisetzung. Dies zeigt die Notwendigkeit der
      Expression der hop-Kassette für anhaltende Freisetzung von
      Katecholaminen aus neuroendokrinen Zellen. Heterologe
      Expression von PAC1hop, null und hip in NG108-15 Zellen
      resultierte in PACAP-aktivierter cAMP-Produktion, während
      eine intrazelluläre Ca2+-Antwort nur durch PAC1hop und etwas
      geringer durch PAC1null vermittelt wurde. Diese Ergebnisse
      deuten darauf hin, dass eine Signalkopplung an Ca2+ durch
      Expression der hop-Kassette erhöht und durch Expression der
      hip-Kassette aufgehoben wird; eine effiziente duale
      Signaltransduktion durch cAMP und Ca2+ wird also nur durch
      die PAC1hop-Variante vermittelt. Diese resultierte in einer
      Aktivierung der MAP Kinasen ERK1/2. Zyklisches AMP, jedoch
      nicht die cAMP-abhängige Proteinkinase (PKA) waren in die
      Aktivierung von ERK involviert. PACAP induzierte das putativ
      neuroprotektive Gen Stanniocalcin 1 (STC1), welches laut
      Literaturstand neuronale Resistenz bei ischämischem Insult
      vermittelt; die Genaktivierung erfolgte via ERK, unabhängig
      von PKA. Direkte Stimulation von Adenylatzyklasen durch
      Forskolin hingegen löste keine ERK-Aktivierung aus und
      STC1-Induktion wurde durch kanonische (PKA-abhängige)
      Signaltransduktion vermittelt. In NG108-15 Zellen scheinen
      also zur Aktivierung von nicht-kanonischer cAMP-abhängiger
      Signaltransduktion, welche ERK-abhängige Geninduktion
      vermittelt, zusätzlich PAC1hop-aktivierte Ca2+-Signalwege
      nötig zu sein. Primäre kortikale Neuronen exprimierten
      hauptsächlich die PAC1hop- und PAC1null-Varianten.
      PACAP-Behandlung resultierte in einer intrazellulären
      Erhöhung von cAMP und Ca2+, ERK-Aktivierung und
      STC1-Induktion. Die ERK-Aktivierung war cAMP-abhängig und
      PKA-unabhängig. STC1-Induktion wurde durch ERK und nicht
      durch PKA vermittelt. Forskolin-Behandlung resultierte ebenso
      in PKA-unabhängiger ERK-Aktivierung sowie STC1-Induktion.
      Dies zeigt, dass in differenzierten kortikalen Neuronen
      gesteigerte cAMP-Produktion zur ERK-Aktivierung ausreicht.
      PACAP-vermittelte BDNF-Geninduktion hingegen war
      PKA-abhängig. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass PACAP
      im Zusammenhang mit Schlaganfall neuroprotektiv ist. Um erste
      Einsichten in den Mechanismus dieser Neuroprotektion zu
      bekommen, wurden zwei Zellkultur-Modelle für Schlaganfall
      angewandt. Sauerstoff-Glukose-Deprivation und
      Glutamat-induzierte Excitotoxizität lösten, wie erwartet, in
      kortikaler Neuronenkultur Zelltod aus, der sich jedoch als
      PACAP-resistent herausstellte. Auch durch STC1-Überexpression
      konnte der durch Excitotoxizität ausgelöste Zelltod nicht
      reduziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass
      die neuroprotektiven Effekte von PACAP und STC1 während
      neurodegenerativen Erkrankungen durch Zellen vermittelt
      werden, die in kortikaler Neuronenkultur fehlten, wie z.B.
      Gliazellen. Insgesamt weisen die Befunde dieser Arbeit darauf
      hin, dass die Expression verschiedener PAC1-Varianten den
      Aktivierungsgrad zweier Second Messengers bedingt und damit
      den funktionellen Ausgang nach Stress-Einwirkung bestimmt.
      PACAP-vermittelte ERK-Aktivierung und STC1-Induktion via
      nicht kanonischer cAMP-abhängiger Signaltransduktion
      unterscheidet sich von der kanonischen PKA-vermittelten
      Signaltransduktion, welche in physiologischen Prozessen wie
      Gedächtniskonsolidierung von Bedeutung ist. Die selektive
      pharmakologische Aktivierung dieses potenziell
      neuroprotektiven nicht-kanonischen Signalweges hat
      therapeutische Implikation für Neuroprotektion in
      vivo.