Η Επίδραση της Απρεμιλάστης σε Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με Συστηματική Σκλήρυνση
Creators: name: Δεμιρτζόγλου, Γεώργιος Σάββα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Απρεμιλάστη
Συστηματική Σκλήρυνση
Τ λεμφοκύτταρα
Apremilast
Systemic Sclerosis
T lymphocytes

description: Εισαγωγή: Η Συστηματική Σκλήρυνση (ΣΣκ) αποτελεί ένα συστηματικό χρόνιο αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από αγγειοπάθεια, ανοσιακή εκτροπή και ίνωση, η οποία μειώνει το προσδόκιμο επιβίωσης. Η ίνωση σχετίζεται με τη γενετική ευθραυστότητα, επιγενετικές τροποποιήσεις και με έκκριση Th2 κυτταροκινών. Η απρεμιλάστη είναι ένας αναστολέας PDE4 που έχει ένδειξη για τη θεραπεία της ψωρίασης και της ψωριασικής αθρίτιδας. Πειραματικά δεδομένα από προκλινικά μοντέλα ΣΣκ (μακροφάγων-ινοβλαστών) υποστηρίζουν την πιθανή αντι-ινωτική δράση της απρεμιλάστης. Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική εργασία έχει σαν σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης της απρεμιλάστης στο DNA καλλιεργημένων Τ λεμφοκυττάρων με κυτταρογενετικές μεθόδους και της πιθανής αντι-ινωτικής της δράσης μέσω της μέτρησης των επιπέδων IL-13. Η παραπάνω μελέτη αφορά τόσο υγιείς αιμοδότες όσο και ασθενείς με ΣΣκ. Υλικό και Μέθοδος: Έγινε επιλογή έξι υγιών αιμοδοτών και έξι ασθενών με ΣΣκ βάσει προκαθορισμένων κριτηρίων. Για όλους τους συμμετέχοντες έγινε καταγραφή δημογραφικών στοιχείων . Επιπλέον, για κάθε ασθενή, καταγράφηκε η διάρκεια, ο κλινικός φαινότυπος της νόσου, τα προσβεβλημένα όργανα στόχοι η φαρμακευτική αγωγή, το ατομικό αναμνηστικό και η παρουσία ειδικών αυτοαντισώματων. Ακολούθησε ενημέρωση των συμμετεχόντων, λήψη έγγραφης συγκατάθεσης και φλεβοκέντηση υπό άσηπτες συνθήκες. Ο ορός των συμμετεχόντων προετοιμάστηκε για μέτρηση IL-13 και καταψύχθηκε στους -80οc. Παρασκευάσθηκαν διαλύματα απρεμιλάστης 2,4,6 μg/ml τα οποία προστέθηκαν στις καλλιέργειες των Τ λεμφοκυττάρων, οι οποίες χωρίστηκαν σε 4 ομάδες ανά συμμετέχοντα (μία για κάθε διάλυμα απρεμιλάστης και η καλλιέργεια μάρτυρας). Τα λεμφοκύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. Το υπερκείμενο προετοιμάστηκε κατάλληλα για μέτρηση IL-13. Ακολούθησε απομόνωση DNA από το ίζημα και χρώση του με τη μέθοδο Fluorescence Plus Giemsa. Από τα παρασκευάσματα προσδιορίστηκαν με το οπτικό μικροσκόπιο τρεις κυτταρογενετικοί δείκτες (SCEs, PRI, MI). Μετρήθηκαν με ELISA τα επίπεδα της IL-13 στον ορό και στα υπερκείμενα των καλλιεργειών των συμμετεχόντων. Οι μετρήσεις διενεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η στατιστική επεξεργασία έγινε στο στατιστικό πρόγραμμα SPSS Version 22.0 με μη παραμετρικά κριτήρια (U test κατά Mann Whitney, Kruskal-Wallis test, συντελεστής συσχέτισης Spearman). Αποτελέσματα: Οι μεταβολές στις συχνότητες των SCEs στα λεμφοκύτταρα των ασθενών διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με των υγιών (p&lt;0.027). Οι μεταβολές στις συχνότητες των SCEs που παρατηρούνται από τις υπό μελέτη συγκεντρώσεις τις απρεμιλάστης διαφέρουν στατιστικά σημαντικά μόνο στην περίπτωση του διαλύματος απρεμιλάστης 2μ/ml στους ασθενείς. Δεν προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά στις μεταβολές των τιμών του PRI των λεμφοκυττάρων των ασθενών σε σχέση με τις μεταβολές του PRI στην ομάδα ελέγχου. Για τις δυο ομάδες προέκυψε στατιστικά σημαντική μείωση των τιμών του αναφορικά με τις συγκεντρώσεις τις απρεμιλάστης. Ο ΜΙ δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε καμία από τις δύο ομάδες. Τα επίπεδα της IL-13 μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά μόνο για την ομάδα των ασθενών υπό την επίδραση διαλύματος απρεμιλάστης 2μg/ml. Παρατηρήθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση για τις μεταβολές των SCEs και IL-13 στην ομάδα των ασθενών. Συμπεράσματα: Η μείωση των SCEs και η πτώση της IL-13 ενισχύουν τις ενδείξεις για την πιθανή αντι-ινωτική δράση της απρεμιλάστης με μηχανισμούς που ίσως σχετίζονται με επιγενετικές τροποποιήσεις αλλά χρειάζονται περισσότερες μελέτες για να προκύψουν ασφαλή συμπεράσματα
description: Background: Systemic Sclerosis (SSc) is a chronic autoimmune disease characterized by the distinctive pathogenetic triad of microvascular damage, immune (innate and adaptive) dysregulation and multiple organ fibrosis. Fibrosis, the disease’s hallmark is the leading cause of increased mortality. Genetic instability, epigeletic alterations and Th2 cytokine secretion are involved in fibrosis pathogenesis. Apremilast is a PDE4 inhibitor. It indicates for psoriasis and psoriatic arthritis treatment. Apremilast is thought to have possible antifibrotic actions due to preclinical data of SSc animal models and fibroblast-macrophage cultures. Objectives: The evaluation of apremilast’s effect on cultured T lymphocyte DNA using cytogenetic methods (SCEs, PRI and MI). The possible antifibrotic effect of the drug will be also evaluated by measuring IL-13 levels. Methods: Six consecutive donors for each group were chosen for enrolling the study and the demographic characteristics were recorded. For patient group members, the disease characteristics, major organ involvement, treatment and patient’s medical history were recorded. Apremilast solutions were prepared (2,4,6 μg/ml) and blood from both patients and healthy individuals was used for T lymphocyte culture for 72 hours. Serum was preserved at -80oC for IL-13 measurement. Each group divided into four subgroups (3 for different apremilast concentrations and one control). The supernatant from all cultures was used for IL-13 measurement. DNA was isolated and was dyed using Fluorescence Plus Giemsa method. The cytogenetic indices (SCEs, PRI and MI) were estimated with an optical microscope. ELISA was used for IL-13 measurement. Statistical analysis took place using SPSS version 22.0. Results: The SCE score alterations are significantly different between healthy controls and SSc patients (p&lt;0.027). The reduction in SCEs values concerning the patient group is statistically significant only at the lowest (2μg/ml) apremilast concentration. Although PRI score drops significantly due to apremilast’s effecs t for both groups, PRI values do not differ significantly between the two groups. MI alterations do not differ between the two groups. The reduction in IL-13 values concerning the patient group is statistically significant only at the lowest (2μg/ml) apremilast concentration. This finding is strongly correlated with SCEs reduction. Conclusions: SCEs and IL-13 reduction support the possible antifibrotic effect of apremilast but further study needs for the evaluation of these findings. Epigenetic alterations may be involved