title: Diagnostik der minimalen Resterkrankung beim Multiplen Myelom anhand von Immunglobulin-Leichtketten-Rearrangements in zellfreier DNA
Creators: name: Hartmann, Sören Manfred
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Hämatologie
Multiples Myelom
liquid biopsy
zellfreie DNA (cfDNA)
MRD
minimal residual disease
Medical sciences Medicine
Medizin
Minimale Resterkrankung
cfDNA
hematology
multiple myeloma
Liquid Biopsy

description: Mit der Einführung zahlreicher neuer Substanzklassen hat sich die Prognose des Multiplen Myeloms (MM) in den letzten Dekaden substanziell verbessert. Inzwischen ist das Therapie-ziel nicht mehr bloß das Erreichen einer Krankheitskontrolle, sondern das Erzielen möglichst tiefer Remissionen und langer Überlebenszeiten. Ein großer Anteil der Patienten erzielt mit den aktuellen Therapieprotokollen eine komplette Remission (CR). Dennoch erleiden prak-tisch alle Patienten früher oder später ein Rezidiv der Erkrankung. Die Ursache dafür liegt wahrscheinlich in der Persistenz einer minimalen Resterkrankung (MRD), die mit routinemä-ßigen Kontrolluntersuchungen, d.h. Laborparametern, bildgebenden Verfahren und der Beur-teilung der Plasmazellinfiltration des Knochenmarks (KM), kaum zu erfassen ist. Zur MRD-Diagnostik werden daher sensitivere, zytologische (Durchflusszytometrie) und mo-lekulare Verfahren, insbesondere Next Generation Sequencing (NGS) und ASO RQ-PCR, an-gewandt. In bisherigen MM-MRD-Studien lag der Fokus v.a. auf der Untersuchung von KM-Proben. So lässt sich auf Basis der derzeitigen Studienlage konstatieren, dass MRD-Negativität – im Vergleich zu MRD-Positivität – mit signifikant längeren Überlebensraten assoziiert ist. Im Gegensatz dazu ist die aktuelle Datenlage zur nichtinvasiven MRD-Diagnostik beim MM mittels NGS anhand von peripherem Blut (PB) sehr begrenzt. Zwar wurde in einigen Pilotstu-dien die prinzipielle Praktikabilität dieser Methode gezeigt, der konkrete klinische Nutzen wurde aber bislang nicht genau herausgearbeitet und viele Fragen sind noch unbeantwortet. Zur MRD-Diagnostik beim MM mittels NGS werden üblicherweise Immunglobulin (Ig)-Gen-Rearrangements als „Target“ genutzt, die eine eindeutige Identifikation des Tumor-spezifischen Rearrangements ermöglichen. In bisherigen Veröffentlichungen lag der Schwer-punkt vorwiegend auf der Analyse von Ig-Schwerketten (IGH)-Rearrangements. In der vorlie-genden Arbeit wurde untersucht, ob sich auch ein „genomischer Leichtkettentest“, also die Sequenzierung von Igκ (IGK-) und Igλ (IGL)-Leichtketten (LC-)-Rearrangements – ohne Be-rücksichtigung von IGH – zur MRD-Diagnostik und Verlaufskontrolle des MMs eignet. Zu diesem Zweck wurden von 65 Myelom-Patienten insgesamt 130 PB-Proben gesammelt, aus denen zellfreie DNA (cfDNA) isoliert wurde. Die variablen Regionen der Ig-LCs wurden mit gut validierten BIOMED-2-Primern amplifiziert und die PCR-Produkte nach weiterer Aufbereitung auf einem Illumina® MiSeq™ sequenziert. Die erhaltenen Sequenzdateien wur-den mit MiXCR und VDJtools (bioinformatischer Software) aufbereitet und analysiert. Um eine möglichst eindeutige Identifikation von Myelom-assoziierten Rearrangements zu ermög-lichen, wurden zusätzlich 37 genomische DNA (gDNA)-Gewebeproben (vorwiegend FFPE-KM) von 35 Patienten aus derselben Studienkohorte sequenziert und ausgewertet. Bei der Analyse der PB-Proben zeigte sich, dass die cfDNA-Konzentrationen bei Patienten mit hoher Krankheitslast („high disease burden“ – bei Erstdiagnose/Dx, Progress/PD, stabiler Er-krankungssituation, minimalem Ansprechen sowie partieller Remission vor autologer Stamm-zelltransplantation) im Mittel und Median höher waren als bei Patienten in einer guten Re-mission („good responders“ – bei kompletter Remission/CR, sehr guter partieller Remissi-on/VGPR sowie partieller Remission nach autologer Stammzelltransplantation). Die klonale Diversität war in cfDNA-Proben, die während hoher Krankheitslast abgenommen wurden, geringer als in Proben, die während einer guten Remission entnommen wurden. Überrepräsentierte Klone (&gt;33,3% des LC-Repertoires einer Probe) im PB wurden nicht nur in 61,1% der Dx- und 82,4% der PD-Proben identifiziert, sondern u.a. auch in 60,0% der CR-Proben. Basierend auf den vorliegenden Daten wurden Kriterien zur Definition von wahrscheinlichen MM-Klonen festgelegt. Insgesamt erfüllten 35 Patienten der Studienkohorte prinzipiell die Voraussetzung für die Identifikation solcher Klone. Für 16/35 (45,7%) Patienten konnten wahrscheinliche MM-Klone identifiziert werden, für sieben dieser Patienten war hierfür sogar die alleinige Betrachtung von cfDNA-Proben (ohne Gewebeproben) ausreichend. Alle auswertbaren CR-Proben (n=5) waren negativ für wahrscheinliche MM-Klone. Die Klon-häufigkeiten (%) der wahrscheinlichen MM-Klone in cfDNA waren bei hoher Krankheitslast und nachweisbarem Paraprotein in der Serumproteinelektrophorese signifikant größer als wäh-rend guter Remissionen bzw. bei nicht-nachweisbarem Paraprotein. Zudem zeigte sich eine signifikante Korrelation der Klonhäufigkeiten (%) mit der Ratio der freien LCs im Serum. Der Abgleich der quantitativen Verläufe wahrscheinlicher MM-Klone mit klinischen und sero-logischen, in der Klinik routinemäßig eingesetzten Parametern, zeigte, dass ein Anstieg der prozentualen Häufigkeit des wahrscheinlichen MM-Klons in cfDNA einem klinischen Pro-gress der Erkrankung vorausgehen kann. Bei einer vergleichenden Gegenüberstellung parallel abgenommener cfDNA- und FFPE-/gDNA-Proben zeigte sich eine moderat positive – wenngleich nicht signifikante – Korrelation der prozentualen Klonhäufigkeiten der wahrscheinlichen MM-Klone in den beiden Probenar-ten. Abgesehen von den wahrscheinlichen MM-Klonen fanden sich kaum gemeinsame Klone mit einer prozentualen Häufigkeit &gt;5%, die in den LC-Repertoires beider parallel gesammelter Proben nachweisbar waren. Zusammengefasst war für die Identifikation von wahrscheinlichen MM-Klonen die ergänzen-de Analyse von Dx- bzw. PD-Gewebeproben (gDNA/FFPE) sehr nützlich. Die Ergebnisse die-ser Arbeit deuten an, dass die Sensitivität der hier genutzten Methode zur Detektion der MRD den etablierten serologischen Myelomparametern nicht überlegen ist. Allerdings zeigte sich – insbesondere bei Patienten mit oligo- und asekretorischen Myelomen – ein möglicher Nutzen für die Verlaufskontrolle der Erkrankung.
description: Along with the introduction of several new agents, the prognosis for patients with multiple myeloma (MM) has improved substantially in the past few decades. Nowadays, the treatment goal is not only to control the disease, but also to achieve deep responses and long survival times. A large fraction of patients achieves complete responses (CR) under currently available treatment protocols. Nonetheless, most patients eventually relapse. This might be due to per-sistence of minimal residual disease (MRD) which cannot be assessed adequately by routine workups, such as laboratory studies, imaging and evaluation of plasma cell infiltration in the bone marrow (BM). In order to allow for MRD assessment, more sensitive cytological (flow cytometry) and mo-lecular approaches, such as next generation sequencing (NGS) and ASO RQ-PCR, are needed. Recent MM-MRD studies mainly focused on evaluation of MRD in the BM. Available studies suggest that negativity for MRD in the BM is associated with significantly improved survival rates, as compared to MRD positivity. Fewer emphasis has been placed on noninvasive MM-MRD monitoring using NGS of periph-eral blood (PB) samples. Even though there are a few pilot studies available which provided evidence for the general applicability of this approach, the specific clinical utility has not yet been established and there are still a lot of unanswered questions. MM-MRD monitoring using NGS is generally carried out by targeting MM-specific immuno-globulin (Ig) gene rearrangements which are thought to be an unambiguous molecular mark-er. Recent studies often put their emphasis on analysis of Ig heavy chain (IGH) rearrange-ments. In the present work, it is evaluated whether a genomic light chain test, i.e. sequencing of Igκ (IGK) as well as Igλ (IGL) light chain rearrangements without consideration of IGH, can also be applied for disease monitoring and MRD assessment in MM. For this purpose, 130 PB samples were collected from 65 MM patients. Cell-free DNA (cfDNA) was isolated and variable regions of Ig light chains were amplified using well-validated BIOMED-2 primers. PCR products were further processed and eventually sequenced on an Illumina® MiSeq™ instrument. The obtained sequencing data were analyzed using MiXCR and VDJtools (bioinformatical software). Additionally, in order to allow for an unam-biguous identification of MM-related rearrangements, 37 genomic DNA (gDNA) tissue sam-ples (mainly FFPE BM) from 35 patients of the same study cohort were sequenced and ana-lyzed. PB samples obtained at the time of „high disease burden“ (samples taken at first diagnosis/Dx, progressive disease/PD, stable disease, minimal response or partial response before autologous stem cell transplantation) exhibited higher median and mean cfDNA concentrations than “good responders” (samples taken at CR, very good partial response/VGPR, partial response after autologous stem cell transplantation). Clonotype diversity was lower in PB samples obtained at the time of high disease burden compared to good responders. Overrepresented clonotypes, i.e. clonotypes accounting for &gt;33.3% of the Ig light chain repertoire in their sample, were not only identified in 61.1% of Dx and 82.4% of PD samples, but also, inter alia, in 60.0% of CR samples. Based on the data from this work, criteria for identification of probable MM clones were estab-lished. In total, 35 patients of the study cohort met the criteria for potential identification of MM clones. A probable MM clone was found for 16/35 (45.7%) patients. Solely based on analysis of cfDNA samples, i.e. without consideration of FFPE/gDNA samples, probable MM clones could be identified for seven patients. All evaluable CR samples (n=5) were negative for the probable MM clones. Clonotype fre-quencies of probable MM clones in cfDNA were significantly higher during high disease bur-den and in samples with a detectable paraprotein in serum protein electrophoresis, as com-pared to good responders and samples with no detectable serum paraprotein, respectively. Fur-thermore, there was a significant correlation between (probable) MM clonotype frequencies in cfDNA and serum free light chain ratios. Tracking probable MM clonotypes over time, it was found that an increase of (probable) MM clonotype frequencies in cfDNA preceded clinical progression in some cases, as confirmed by established serological and clinical parameters. Comparing parallelly obtained cfDNA and FFPE/gDNA samples, a moderate positive correla-tion was observed regarding (probable) MM clonotype frequencies. Of note, nearly all overlap-ping &gt;5% clonotypes in the matching samples corresponded to probable MM clones. In summary, in order to allow for reliable identification of probable MM clones, additional analysis of Dx/PD tissue samples (gDNA/FFPE) was very helpful. The results suggest that the sensitivity of the assay used in this work does not exceed the sensitivity of serological parame-ters for MRD detection. However, the method presented here might be particularly valuable for monitoring patients with non- and oligosecretory myeloma.