title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen von nichtribosomalen Peptidsynthetasen und Prenyltransferasen in der Biosynthese von Sekundärmetaboliten aus Ascomyceten
title: Molecular biological and biochemical analyses of nonribosomal peptidesynthetases and prenyltransferases in the biosynthesis of secondary metabolites of ascomycetes
Creators: name: Mundt, Kathrin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Prenyltransferasen
ascomycetes
fungi
Biochemie
nonribosomal peptidsynthetases
Molekularbiologie
Naturwissenschaften
Peptidsynthetasen
Schlauchpilze
prenyltransferases

description: In the course of evolution,
      microorganisms have developed the ability for production of a
      multiplicity of structural diverse and complex compounds.
      Under given environmental conditions, biosynthetic pathways
      are induced to synthesize complex metabolites that are often
      toxic toward their competing organisms. Especially production
      of secondary metabolites of filamentous fungi is one of the
      most important source of biological active substances, which
      can be used for the benefit of human health. Notably, the
      enzyme classes of polyketide synthases (PKS), nonribosomal
      peptide synthetases (NRPS) and NRPS/PKS-hybrids are
      responsible for the production of novel natural products that
      exhibit considerable therapeutic potential, e.g. antibiotics,
      antifungal and immunospuppressive drugs. These natural
      products can be further modified by other enzymes e.g.
      prenyltransferases, consequently leading to a huge structural
      diversity. For discovery and development of new drugs,
      understanding of reaction mechanism of enzymes in nature is
      mandatory and especially biochemical investigations become
      more important. In this thesis, functions of two unknown
      prenyltransferases (FtmPT3, CdpC2PT) of Neosartorya fischeri
      (N. fischeri) were biochemically identified and
      characterised. The gene ftmPT3, encodes a prenyltransferase,
      which catalyses in the presence of DMAPP the prenylation of
      verruculogen at OH-13 and therefore acts as the long-time
      missing O-prenyltransferase in the fumitremorgin A
      biosynthesis. Intensive sequence analyses of ftmPT3 and its
      adjacent neighbour genes revealed, in comparison to
      Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), an additional locus
      with a size of 9.6 kb and seven putative genes. The protein
      CdpC2PT, shows sequence identities of 40 % with the
      C2-prenyltransferase BrePT from Aspergillus versicolor and 42
      % with NotF from Aspergillus sp. on the amino acid level.
      Investigations of reaction mixtures of CdpC2PT with DMAPP,
      showed a broad substrate specifity towards cyclic dipetides
      with preference for (S)-benzodiazepindione and
      cyclo-L-Trp-L-Trp. NMR and MS analyses of the enzymatic
      products revealed unequivocally that CdpC2PT acts as a
      reverse C2-prenyltransferase and catalyses the mono- and
      diprenylation of cyclo-L-Trp-L-Trp. Literature search showed
      the existence of mono- and diprenylated derivatives of
      cyclo-L-Trp-L-Trp in Penicillium fellutanum (P. fellutanum),
      socalled fellutanines. Therefore, it can be speculated that
      CdpC2PT could be involved in the biosynthesis of fellutanines
      in N. fischeri. Sequence analyses of the neighbour genes
      revealed the existence of a putative amino oxidase EAW25547,
      which could be contribute to the biosynthesis of
      fellutanines. The coding gene NFIA_043660 was successfully
      amplified from genomic DNA (gDNA) of N. fischeri and
      subsequently cloned into both expression vectors pQE60 and
      pHIS8. After incubation under different expression conditions
      no protein overproduction could be shown. Furthermore, the
      gene NFIA_062330, encoding for the last unkonwon putative
      prenyltransferase of N. fischeri, was biochemically
      investigated. Sequence analyses revealed an orthologous gene
      ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus), with a
      sequence identity of 62 % on the amino acid level. Both genes
      NFIA_062330 and ACLA_042210 were amplified from gDNA and
      cloned into the expression vector pQE60. Expression of the
      genes was carried out successfully in the optimized
      overexpression E. coli strain M15 [pREP4]. Unfortunately no
      activity could be detected after testing a number of
      different substrates. Another project focused on the function
      of two homologous NRPS genes Pc21g15480 of Penicillium
      chrysogenum (P. chrysogenum) and NFIA_074300 of N. fischeri.
      Both genes were amplified from gDNA and successfully cloned
      into the expression vector pJW24. After protoplastation and
      transformation of the wildtype Aspergillus nidulans (A.
      nidulans) TN02A7 with the expression constructs, integration
      of genes was proven by PCR screening. After extraction of
      Pc21g15480 transformants, cyclo-L-Trp-L-His was detected by
      HPLC and NMR analyses. Analysis of the NFIA_074300
      transformants revealed, that one transformant produced an
      additional product peak in comparison to the wildtype.
      Surprisingly this substance was identified by NMR and MS
      analyses as pseurotin A, a product of a NRPS/PKS-hybrid and
      was not the expected substance. In addition, production of
      secondary metabolites by targeted co-expression of
      prenyltransferases genes with a NRPS gene was carried out in
      the dissertation. The genes NFIA_043650 and NFIA_074280,
      encoding for the prenyltransferases CdpC2PT and CdpC3PT,
      respectively, were primarily amplified from gDNA and
      afterwards cloned into the expression construct pCaW34. The
      expression constructs were transferred into transformant A.
      nidulans CaW03 (ftmPS). PCR screening of the transformants
      confirmed the ectopic integration of the prenyltransferase
      genes into the genome. HPLC analysis revealed clearly product
      accumulation in the resulted transformants and showed the
      successful strategy for production of biologically active
      substances by synthetic biology. Structure elucidation of the
      isolated products was carried out by NMR and MS
      analyses.
description: Im Laufe der Evolution, haben
      Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, eine Vielzahl an
      strukturell vielseitigen und komplexen Substanzen zu bilden.
      Unter bestimmten Umweltbedingungen werden Biosynthesewege von
      komplexen Metaboliten induziert, die wiederum oft eine
      toxische Wirkung gegenüber den konkurrierenden Organismen
      zeigen. Vor Allem die Sekundärmetabolit-Produktion von
      filamentösen Pilzen stellt dabei eine wichtige Quelle von
      biologisch aktiven Stoffen dar, welche zum Nutzen der
      menschlichen Gesundheit eingesetzt werden können.
      Insbesondere die Enzymklassen der Polyketidsynthasen (PKS),
      nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) und
      NRPS/PKS-Hybride sind für die Synthese von neuen Naturstoffen
      verantwortlich, welche großes therapeutisches Potential
      (Antimykotika, Antibiotika, Immunsuppressiva) besitzen. Die
      metabolisierten Naturstoffe, können weiterführend durch z.B.
      Prenyltransferasen modifiziert und somit die Strukturvielfalt
      enorm gesteigert werden. Für die Entdeckung und Entwicklung
      neuer Arzneistoffe ist das Verstehen von Reaktionsmechanismen
      einzelner Enzyme in der Natur zwingend notwendig und dafür
      sind vor allem biochemische Untersuchungen von großer
      Bedeutung. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die
      Funktionen von zwei unbekannten Prenyltransferasen (FtmPT3,
      CdpC2PT) aus Neosartorya fischeri (N. fischeri) aufgeklärt.
      Das Gen ftmPT3, codiert für eine Prenyltransferase, welche in
      Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die
      Prenylierung von Verruculogen an OH-13 katalysiert und somit
      die lang gesuchte O-Prenyltransferase innerhalb der
      Fumitremorgin A-Biosynthese darstellt. Intensive
      Sequenzuntersuchungen zu ftmPT3 und der angrenzenden
      Nachbargene, wiesen im Vergleich zu Aspergillus fumigatus (A.
      fumigatus) einen zusätzlichen Genbereich mit einer Größe von
      9,6 kb und sieben Genen auf. Das Protein CdpC2PT, wies
      Sequenzidentitäten von 40 % mit der C2-Prenyltransferase
      BrePT aus Aspergillus versicolor und 42 % mit NotF aus
      Aspergillus sp. auf. Die Analyse der Reaktionsgemische von
      CdpC2PT mit DMAPP, zeigte die Akzeptanz zyklischer Dipeptide
      mit Substratpräferenz zu (S)-Benzodiazepindion und
      cyclo-L-Trp-L-Trp auf. Durch die Analyse der enzymatischen
      Produkte mittels NMR und MS, konnte CdpC2PT eindeutig als
      eine reverse C2-Prenyltransferase nachgewiesen werden, welche
      außerdem die Mono- und Di-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Trp
      katalysiert. Literaturrecherche nach bekannten Naturstoffen
      wies die Existenz von mono- und diprenylierten
      cyclo-L-Trp-L-Trp Derivaten (Fellutaninen) in Penicillium
      fellutanum (P. fellutanum) nach und lässt folglich die
      Beteiligung von CdpC2PT in der Fellutanin-Biosynthese in N.
      fischeri vermuten. Die Sequenzanalyse der Nachbargene zeigte
      das Vorhandensein einer putativen Aminooxidase EAW25547 auf,
      welche in der Fellutanin-Biosynthese mitwirken könnte. Dieses
      Gen NFIA_043660 wurde aus der genomischen DNA (gDNA) von N.
      fischeri amplifiziert und in die beiden Expressionsvektoren
      pQE60 und pHIS8 kloniert. Nach der Untersuchung verschiedener
      Expressionsbedingungen konnte jedoch keine
      Proteinüberproduktion festgestellt werden. Desweiteren wurde
      in der vorliegenden Arbeit, die letzte putative
      Prenyltransferase aus N. fischeri codierend durch NFIA_062330
      untersucht. Sequenzanalysen ergaben ein orthologes Gen
      ACLA_042210 in Aspergillus clavatus (A. clavatus) mit einer
      62 %igen Übereinstimmung auf Aminosäureebene. Die Gene
      ACLA_042210 und NFIA_062330 konnten jeweils aus gDNA
      amplifiziert und in den Expressionsvektor pQE60 kloniert
      werden. Die Überexpression der Gene wurde erfolgreich in dem
      für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Stamm E.
      coli M15 [pREP4] durchgeführt. Für beide Enzyme wurde eine
      Vielzahl an diversen Substraten getestet, doch leider konnte
      bisher keine Aktivität nachgewiesen werden. Weiterhin wurden
      in dieser Arbeit die homologen NRPS-Gene Pc21g15480 aus
      Penicillium chrysogenum (P. chrysogenum) und NFIA_074300 aus
      N. fischeri in vivo funktionell untersucht. Beide Gene wurden
      erfolgreich aus gDNA amplifiziert und in den
      Expressionsvektor pJW24 überführt. Nach Protoplastierung und
      Transformation des Wildtyps Aspergillus nidulans (A.
      nidulans) TN02A7 mit den Expressionskonstrukten wurde die
      Integration der Gene für einige Transformanten mittels
      PCR-Screening nachgewiesen. Nach Extraktion der Kulturen der
      Pc21g15480-Transformanten konnte die deutliche Akkumulation
      zweier neuer Substanzen im Vergleich zum Wildtyp A. nidulans
      TN02A7 beobachtet werden. Nach Isolierung des ersten
      Produktes konnte mittels NMR- und MS-Analysen
      cyclo-L-Trp-L-His nachgewiesen werden. Die Untersuchung der
      NFIA_074300-Transformanten zeigte hingegen nur einen
      Transformanten mit einer zusätzlichen Produktbildung im
      Vergleich zu A. nidulans TN02A7 auf. Diese Substanz wurde
      mittels NMR und MS überraschenderweise als das
      PKS/NRPS-Produkt Pseurotin A identifiziert werden und stellte
      nicht die erwartete Substanz dar. Ein weiteres Projekt
      beschäftigte sich mit der gezielten Koexpression der
      Prenyltransferasegene cdpC2PT oder cdpC3PT mit dem NRPS-Gen
      ftmPS aus N. fischeri. Die codierenden Gene NFIA_043650 und
      NFIA_074280 wurden nach der entsprechenden Amplifikation in
      das Expressionskonstrukt pCaW34 eingebracht. Nach der in vivo
      Synthese von cyclo-L-Trp-L-Pro (Brevianamid F) durch die NRPS
      FtmPS, wurden die Expressionskonstrukte in den Transformanten
      A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Die ektopische
      Integration der Gene wurde durch PCR-Screening der erhaltenen
      Transformanten bestätigt. Die Analyse der
      Sekundärstoffproduktion mittels HPLC zeigte, eine deutliche
      Produktbildung in den einzelnen Transformanten auf.