Μελέτη των μηχανισμών της κυτταρικής μνήμης στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα Mel:
Creators: name: Σωτηρίου, Διαμαντής Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Κυτταρική μνήμη
Κύτταρα Mel
Απόπτωση
Αλυσιδρωτή αντίδραση πολυμεράσης
Κινητική ανάλυση διαφοροποίησης
Κυτταρικός πολλαπλασιασμός
Cell memory
Mel cells
Apoptosis
Rt-pcr
Kinetic analysis of differentation
Cellular proliferation

description: Τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL αποτελούν εδώ και 40 περίπου χρόνια ένα πρότυπο σύστημα ανάλυσης in vitro μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ερυθροδιαφοροποίηση και στη μεταγραφή των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης. Η ικανότητα των συγκεκριμένων κυττάρων να θυμούνται προηγούμενη έκθεσή τους σε κάποιον χημικό επαγωγέα, το φαινόμενο δηλαδή της κυτταρικής μνήμης, αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης της παρούσας πειραματικής εργασίας. Η συγκεκριμένη πειραματική προσέγγιση που ακολουθήθηκε έδειξε ότι όταν ο χημικός επαγωγέας HMBA απομακρύνεται για χρονικό διάστημα 12 ωρών ή μικρότερο από την καλλιέργεια, η κυτταρική μνήμη διατηρείται και τα κύτταρα μετά την επαναπροσθήκη του επαγωγέα συνεχίζουν να διαφοροποιούνται χωρίς να εμφανίζεται η λανθάνουσα περίοδος. Αντίθετα, όταν το χρονικό διάστημα απομάκρυνσης του επαγωγέα είναι ίσο ή μεγαλύτερο των 18 ωρών τότε η κυτταρική μνήμη χάνεται, η λανθάνουσα περίοδος εμφανίζεται και τα κύτταρα που δεν είχαν δρομολογηθεί για διαφοροποίηση συμπεριφέρονται όπως και κατά την πρώτη επαφή τους με τον επαγωγέα. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν το γεγονός ότι τα κύτταρα μπορούν να μεταβιβάσουν στους απογόνους τους την κυτταρική μνήμη, αφού αυτή η ικανότητα διαρκεί περισσότερο από τον χρόνο διπλασιασμού των κυττάρων που είναι περίπου 12 ώρες. Η ικανότητα αυτή μάλιστα που μπορεί να μεταβιβαστεί στους απογόνους δεν μπορεί να διατηρηθεί για περισσότερες από μία κυτταρικές διαιρέσεις. Στα πλαίσια μιας προκαταρκτικής μοριακής ανάλυσης του φαινομένου της κυτταρικής μνήμης, μελετήθηκε η έκφραση σημαντικών γονιδίων που είναι βασικά στην έναρξη του προγράμματος ερυθροδιαφοροποίησης των κυττάρων MEL in vitro. Ως τέτοια σημαντικά γονίδια θεωρούνται αυτά του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, όπου τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι τα κύτταρα MEL που εκτίθενται αρχικά στον επαγωγέα και στην συνέχεια αυτός αφαιρείται χωρίς περαιτέρω προσθήκη του ( απουσία μνήμης ), αντιδρούν άμεσα και συνεχίζουν να συμπεριφέρονται ως αδιαφοροποίητα κύτταρα, δηλαδή με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και σχεδόν μηδαμινή απόπτωση. Αντίθετα, τα κύτταρα MEL που εκτέθηκαν στον επαγωγέα, αφαιρέθηκε από την καλλιέργεια και στην συνέχεια επαναπροστέθηκε μετά από την πάροδο 12 ωρών, συνεχίζουν να διαφοροποιούνται από το σημείο που είχαν αρχικά σταματήσει, δηλαδή να εμφανίζουν μειωμένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αυξημένη απόπτωση και να παράγουν αιμοσφαιρίνη. Τα πειραματικά αποτελέσματα κινούνται στην κατεύθυνση κατανόησης των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στις αποφάσεις των κυττάρων για διαφοροποίηση, κυτταρική ανάπτυξη και απόπτωση. Μια περαιτέρω προσπάθεια για την ανάλυση συγκεκριμένων γενετικών αλλά και επιγενετικών φαινομένων ( π.χ. μεθυλίωση και ακετυλίωση των ιστονών ) που αφορούν είτε μεμονωμένα γονίδια και των προιόντων τους, είτε σηματοδοτικά μονοπάτια, αναμένεται να αναδείξει το ρόλο μορίων σε αυτή τη διαδικασία και να βοηθήσει στην κατεύθυνση της φαρμακολογικής τους εκμετάλλευσης.
description: Murine erythroleukemia ( MEL ) cells have been extensively studied for more than 40 years as a model system to uncover molecular mechanisms impinging on the developmental program of erythropoiesis and the transcriptional activation of globin genes. The ability of these cells to respond and differentiate along the erythrocytic pathway upon their exposure to chemical inducers in vitro has allowed the identification of specific molecular mechanisms that govern the decisions of cells to control their proliferation, differentiation and/or apoptosis status. A main characteristic of differentiating MEL cells is their ability to remember their previous exposure to chemical inducers, i.e. the phenomenon of cellular memory that permits cells to fulfil their erythroid maturation program in the absence of the inducer. The phenomenon of memory of MEL cells is the subject of the present experimental work. In particular, both kinetic analysis and molecular approaches were firstly applied to establish conditions in the culture where the memory of cells to chemical inducer exists, and secondly, to assess the steady-state level of mRNAs of specific genes involved in the differentiation program. The experimental approach adopted, has showed that when the chemical inducer HMBA is removed from the culture for 12 hours or even less, the cellular memory is preserved. These cells, after the restoration of the inducer, continue their differentiation program allowing the accumulation of differentiated cells in the culture to happen without the initial lag period. In contrast, when the duration of the removal of the inducer is equal to or more than 18 hours, the cellular memory is lost, the lag period is apparent and the cells that were not commited to differentiate at that time, respond in the same way as they do cells upon their first contact with the inducer. Such data have suggested that cells can transmit their cellular memory to their daughter cells, since this ability lasts for more than the time required for the cells to be duplicated, which is approximately 12 hours. In fact, this transmitting ability cannot be preserved for more than one cellular division. By establishing the conditions in culture where the memory of cells to previous exposure to inducer is shown or not, we proceeded towards a preliminary molecular analysis of the phenomenon of memory of MEL cells, by assesing by RT- 10 PCR the expression profile of genes that are essential for their initiation of the erythroid differentiation programme. Among those genes are the ones involved in the cell cycle ( cdk2, cdk4, cdk6, p27 and c-myc ) and in apoptosis ( bcl-2 and bax ). Also, the assessment of two genes, βmajor globin and β-actin, was also monitored as control genes upon thus experimental approach. The data obtained thus far have shown that MEL cells that are initially exposed to the inducer for 30hrs and the inducer removed afterwards ( lack of memory ), continue behaving like non-differentiated cells, that is with increased cellular proliferation potential and almost no apoptosis. In contrast, MEL cells that were exposed to the inducer for 30hrs, then continue without the inducer for 12hrs and the inducer restored afterwards, continue their initial differentiation program and behave like MEL cells exposed continuously to the inducer. In particular, these cells exhibit decreased cellular proliferation potential, increased apoptosis and production of hemoglobin. Altough these experimental results move towards the understanding of the mechanisms that are involved in the decisions of MEL cells upon their exposure to chemical inducers, a further attempt to analyse those genetic and epigenetic phenomena ( for instance, methylation and acetylation of the histones ) concerning either individual genes and their products or specific signalling pathways, is expected to reveal the role of molecules in establishing the phenomenon of memory in MEL cells and thus enhancing their potential pharmacological exploitation in the future.