title: Systematic Correlation of Structural, Thermodynamic and Residual Solvation Properties of Hydrophobic Substituents in Hydrophobic Pockets Using Thermolysin as a Case Study
title: Systematische Korrelation der Eigenschaft von Struktur, Thermodynamik und der Solvathülle von Hydrophoben Substituenten in Hydrophoben Taschen unter Verwendung von Thermolysin als Fallbeispiel
Creators: name: Krimmer, Stefan Günter
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Chemistry and allied sciences
Chemie

description: Water molecules participate besides
      protein and ligand as an additional binding partner in every
      in vivo protein–ligand binding process. The displacement of
      water molecules from apolar surfaces of solutes is considered
      the driving force of the hydrophobic effect. It is generally
      assumed that the mobility of the water molecules increases
      through the displacement, and, as a consequence, entropy
      increases. This explanation, which is based on experiments
      with simple model systems, is, however, insufficient to
      describe the hydrophobic effect as part of the highly complex
      protein–ligand complex formation process. For instance, the
      displacement of water molecules from apolar surfaces that
      already exhibit an increased mobility before their
      displacement can result in an enthalpic advantage.
      Furthermore, it has to be considered that by the formation of
      the protein–ligand complex a new solvent-exposed surface is
      created, around which water molecules have to rearrange. The
      present thesis focuses on the impact of the latter effect on
      the thermodynamic and kinetic binding properties of a given
      ligand. A congeneric ligand series comprised of nine ligands
      binding to the model protein thermolysin (TLN) was analyzed
      to determine the impact of the rearrangement of water
      molecules around the surface of a newly formed protein–ligand
      complex on the thermodynamic binding properties of a ligand.
      The protein–ligand complexes were characterized structurally
      by X-ray crystallography and thermodynamically by isothermal
      titration calorimetry (ITC). The only structural difference
      between the ligands was their strictly apolar P2’
      substituent, which changed in size from a methyl to a
      phenylethyl group. The P2’ group interacts with the flat,
      apolar, and well-solvated S2’ pocket of TLN. Depending on the
      bound ligand, the solvent-exposed surface of the
      protein–ligand complex changes. The ITC measurements revealed
      strong thermodynamic differences between the different
      ligands. The structural analysis showed ligand-coating water
      networks pronounced to varying degrees. A pronounced water
      network clearly correlated with a favorable enthalpic and
      less favorable entropic term, and overall resulted in an
      affinity gain. Based on these results, new P2’ substituents
      were rationally designed with the aim to achieve stronger
      stabilization of the adjacent water networks and thereby
      further increase ligand affinity. First, the quality of the
      putative water networks was validated using molecular
      dynamics (MD) simulations. Subsequently, the proposed ligands
      were synthesized, crystallized in complex with TLN, and
      analyzed thermodynamically. Additionally, a kinetic
      characterization using surface plasmon resonance (SPR) was
      performed. The crystallographically determined water networks
      adjacent to the P2’ substituents were in line with their
      predictions conducted by MD simulations. The ligands showed
      increasingly pronounced water networks as well as a slight
      enthalpy-drive affinity increase compared to the ligands from
      the initial study. The ligand with the highest affinity
      showed an almost perfect water network as well as a
      significantly reduced dissociation constant. To analyze the
      influence of the ligand-coating water networks on the kinetic
      binding properties of a ligand, seventeen congeneric TLN
      ligands exhibiting different P2’ groups were kinetically (by
      SPR) and crystallographically characterized. The different
      degree of the water network stabilization showed only a minor
      influence on the binding kinetic properties. By contrast, the
      strength of the interaction between the ligand and Asn112
      proved crucial for the magnitude of the dissociation rate
      constant. A strong interaction resulted in a considerably
      prolonged residence time of the ligand by hindering TLN to
      undergo a conformational transition that is necessary for
      ligand release. In the last study, the reason for the
      exceptionally high affinity gain for addressing the deep,
      apolar S1’ pocket of TLN with apolar ligand portions was
      investigated. Therefore, a congeneric TLN ligand series
      substituted with differently large apolar P1’ substituents
      (ranging from a single hydrogen atom to an iso-butyl group)
      was analyzed. The exchange of the hydrogen atom at the P1’
      position with a single methyl group already results in a
      100-fold affinity increase of the ligand. To elucidate the
      molecular mechanism behind this considerable affinity gain,
      the solvation state of the S1’ pocket was carefully analyzed.
      The results strongly indicate that the S1’ pocket is
      completely free of the presence of any water molecules. Thus,
      the huge affinity gain was attributed to the absence of an
      energetically costly desolvation step. The data presented in
      this thesis show that to describe the thermodynamic signature
      of the hydrophobic effect it is necessary to explicitly
      consider the change of the thermodynamic properties of every
      involved water molecule. Solely considering the buried apolar
      surface area and assigning an entropic term to it is not
      sufficient. The increasing stabilization of the water network
      adjacent to the protein-bound ligand represents a promising
      approach — quite independent of specific properties of the
      target protein — to optimize the thermodynamic profile of a
      given ligand. This approach also allows fine-tuning of the
      kinetic binding parameters.
description: Wassermoleküle nehmen neben
      Protein und Ligand als zusätzlicher Bindungspartner an jedem
      in vivo Protein–Ligand Bindungsprozess teil. Die Verdrängung
      von Wassermolekülen von apolaren Oberflächen gelöster
      Moleküle in die umgebende flüssige Phase wird als treibende
      Kraft des hydrophoben Effekts angesehen. Die gängige Annahme
      ist, dass die Beweglichkeit der Wassermoleküle durch ihre
      Verdrängung erhöht wird, was einen Anstieg der Entropie zur
      Folge hat. Diese Erklärung, die auf Experimenten mit
      einfachen Modellsystemen beruht, reicht jedoch nicht aus, um
      den hydrophoben Effekt als Teil eines hochgradig komplexen
      Protein–Ligand Komplexbildungsprozesses zu beschreiben. So
      kann zum Beispiel die Verdrängung von Wassermolekülen von
      apolaren Oberflächen, die bereits vor der Verdrängung eine
      erhöhte Beweglichkeit aufweisen, zu einem enthalpischen
      Vorteil führen. Desweiteren muss berücksichtigt werden, dass
      durch die Bildung des Protein–Ligand Komplexes eine neue, zur
      Wasserphase hin exponierte Oberfläche ausgebildet wird, um
      die sich Wassermoleküle neu anordnen müssen. Diese Arbeit
      behandelt den Einfluss dieses Effektes auf die
      thermodynamische und kinetische Bindungseigenschaft eines
      Liganden. Um den Einfluss der Neuanordnung von
      Wassermolekülen um die Oberfläche eines neu gebildeten
      Protein–Ligand Komplexes auf das thermodynamische
      Bindungsprofil eines Liganden zu ermitteln, wurde eine
      homologe Serie aus neun Liganden, die an das Modellprotein
      Thermolysin (TLN) binden, analysiert. Die Protein–Ligand
      Komplexe wurden strukturell mittels Röntgenkristallographie
      und thermodynamisch mittels isothermaler
      Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert. Der einzige
      strukturelle Unterschied zwischen den Liganden stellte deren
      strikt apolarer P2‘ Substituent dar, dessen Größe von einer
      Methylgruppe bis zu einer Phenylethylgruppe variiert wurde.
      Die P2‘ Gruppen adressieren die flache, apolare und gut
      solvatisierte S2‘ Tasche von TLN. Je nach gebundenem Ligand
      ändert sich die Form der wasserexponierten Oberfläche des
      Protein–Ligand Komplexes. Die ITC Messungen ergaben starke
      thermodynamische Unterschiede zwischen den einzelnen
      Liganden. Die strukturelle Analyse zeigte eine
      unterschiedlich starke Ausprägung der die gebundenen Liganden
      überziehenden Wassernetzwerke. Ein ausgeprägtes
      Wassernetzwerk korrelierte deutlich mit einem günstigen
      enthalpischen und einem ungünstigen entropischen Beitrag, und
      insgesamt mit einem Affinitätsanstieg. Auf diesen Ergebnissen
      aufbauend wurden zusätzliche P2‘ Substituenten rational
      entworfen mit dem Ziel eine stärkere Stabilisierung der
      angrenzenden Wassernetzwerke zu erreichen und dadurch die
      Ligandaffinität weiter zu erhöhen. Zunächst wurde die
      Qualität der putativen Wassernetzwerke mittels
      molekulardynamischer (MD) Simulationen validiert.
      Anschließend wurden die vorgeschlagenen Liganden
      synthetisiert, im Komplex mit TLN kristallisiert und
      thermodynamisch analysiert. Eine kinetische Charakterisierung
      mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) wurde
      ebenfalls durchgeführt. Die an die P2‘ Substituenten
      angrenzenden, kristallographisch bestimmten Wassernetzwerke
      entsprachen den Vorhersagen der MD Simulationen. Die Liganden
      zeigten ausgeprägtere Wassernetzwerke sowie eine leichte,
      enthalpiegetriebene Affinitätserhöhung im Vergleich zu den
      Liganden der ersten Studie. Der Ligand mit der höchsten
      Affinität zeigte ein nahezu perfektes Wassernetzwerk sowie
      eine signifikant reduzierte Dissoziationskonstante. Um den
      Einfluss der ligandüberziehenden Wassernetzwerke auf die
      kinetischen Bindungseigenschaften eines Liganden zu
      untersuchen, wurden 17 homologe TLN Liganden mit
      unterschiedlichen P2‘ Gruppen kinetisch mittels SPR und
      kristallographisch charakterisiert. Die
      Wassernetzwerkstabilisierung zeigte nur einen geringen
      Einfluss auf die Bindungskinetik. Im Gegensatz dazu erwies
      sich die Stärke der Interaktion zwischen Ligand und Asn112
      als bestimmend für die Größe der Dissoziationskonstante. Eine
      starke Wechselwirkung führte zu einer deutlichen Verlängerung
      der Aufenthaltszeit des Liganden durch die Erschwerung einer
      konformativen Änderung von TLN, die jedoch notwendig für die
      Freisetzung des Liganden ist. In der letzte Studie wurde die
      Ursache für den außergewöhnlich großen Affinitätsanstieg bei
      einer Adressierung der tiefen, apolaren S1‘ Tasche von TLN
      mit apolaren Ligandgruppen untersucht. Dafür wurde eine
      homologe TLN Ligandserie mit unterschiedlich großen, apolaren
      P1‘ Gruppen (von einem Wasserstoffatom bis zu einem
      Isobutylrest) analysiert. Bereits der Austausch des
      Wasserstoffatoms an der P1‘ Position durch eine Methylgruppe
      führte zu einem 100-fachen Affinitätsanstieg des Liganden. Um
      den molekularen Mechanismus hinter dieser
      Affinitätssteigerung aufzuklären, wurde die S1‘ Tasche genau
      auf ihren Solvatationszustand hin untersucht. Die Ergebnisse
      sprechen deutlich dafür, dass die S1‘ Tasche komplett frei
      von Wassermolekülen ist. Die Affinitätssteigerung wurde
      deshalb auf das Fehlen eines energetisch kostspieligen
      Desolvatationsschrittes zurückgeführt. Die im Rahmen dieser
      Arbeit diskutierten Daten legen dar, dass für die
      thermodynamische Beschreibung des hydrophoben Effekts die
      Änderung des thermodynamischen Zustandes jedes einzelnen
      involvierten Wassermoleküls explizit berücksichtigt werden
      muss. Die alleinige Berücksichtigung der vergrabenen
      Oberfläche und die Zuweisung eines entropischen Beitrags ist
      nicht ausreichend. Die Erhöhung der Stabilisierung der
      Wasserstruktur, die angrenzend an einen proteingebundenen
      Liganden ausgebildet wird, stellt ein generelles und
      planbares — und vom Zielprotein relativ unabhängiges —
      Konzept dar, um das thermodynamische Profil eines gegebenen
      Liganden zu optimieren. Zu gewissem Maße kann dadurch auch
      Einfluss auf die Bindungskinetik genommen werden.