title: Chondrozytärer Kohlenhydratmetabolismus und Zellvitalität boviner artikulärer Knorpelexplantate in statischer Kultur zur Analyse der Bedeutung von FCS und des nutritiven Potentials von Fructose für Knorpel in vitro
title: Chondrocyte carbohydrate metabolism and cell viability of bovine articular cartilage explants in a static culture for analysing the relevance of FCS and the nutritive potential of fructose for cartilage in vitro
Creators: name: Teifke, Elisa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Knorpel
FCS
Metabolismus
Chondrozyt , Fructose
cartilage , chondrocyte
metabolism
fructose
Medizin, Gesundheit

description: Unter Beleuchtung des
      chondrozytären Kohlenhydratstoffwechsels und Zellüberlebens
      in vitro sollten im Rahmen dieser Studie folgende Fragen
      beantwortet werden: 1. Ist FCS als Nährmediumsupplement
      zusätzlich zu ITS vorteilhaft? 2. Kann Fructose Glucose im
      Medium als chondrozytäres Energiesubstrat mit Minimierung von
      Lactatproduktion und pH-Wert-Verschiebung ersetzen? 3. Wie
      hoch ist der Energiebedarf des kultivierten Knorpels und hat
      die Höhe des nutritiven Angebots Auswirkungen auf
      Zellmetabolismus bzw. -vitalität? Dazu wurden 96 Knorpelchips
      aus den Schultergelenken eines eineinhalb Jahre alten Rindes
      16 Versuchsgruppen zugeordnet und bei 37° C sowie
      atmosphärischem O2- und CO2-Gehalt unter statischen
      Bedingungen in Multiwell-Platten inkubiert. Das Nährmedium
      (DMEM) wurde alle 48 h gewechselt und in 4 Varianten
      eingesetzt: M1A - 1 g/L Fructose; M1B - 1 g/L Fruct, 2% (V/V)
      FCS; M2A - 1 g/L Glucose; M2B - 1 g/L Gluc, 2 % (V/V) FCS.
      Alle enthielten 2 mM Glutamin und 1 % (V/V) ITS. Für jeden
      Mediumtyp gab es eine mit 2 mL versorgte Gruppe und eine
      weitere mit 5 mL. Jede dieser Bedingungen fand sich in einer
      8- und einer 16-tägig geführten Gruppe wieder. Als Kontrollen
      wurden 10 Chips direkt nach der Biopsie ohne Kultivierung in
      Formaldehyd-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Auch
      die kultivierten Knorpel wurden bei Versuchsende so
      aufgearbeitet. Anhand der an Gewebeschnitten durchgeführten
      HE-Färbung und immunhistochemischen Methoden TUNEL bzw. M30
      CytoDEATH® wurde der Vitalitätszustand der Chondrozyten
      bestimmt und am Lichtmikroskop quantifiziert. In
      Mediumüberständen wurden Glucose- bzw. Fructose- sowie
      Lactat- und LDH-Gehalt nach photometrischem Prinzip bestimmt
      und der pH-Wert gemessen. Die statistische Auswertung
      erfolgte nicht-parametrisch mit dem Kruskal-Wallis-(H-)Test
      und post hoc einem Bonferroni-korrigierten
      Mann-Whitney-U-Test. Dabei wurden i. R. des U-Tests Paare
      verglichen, die sich in nur einer Versuchsbedingung
      unterschieden. Der Anteil histomorphologisch vitaler Zellen
      der nicht kultivierten Kontrollen lag bei durchschnittlich
      90,8 ± 5,3 %, in den Versuchsgruppen global bei 66,4 ± 18,9
      %. Während die Vitalität der Kontrollen das Zellüberleben des
      kultivierten Knorpels gesamt überstieg (geschätzter
      Lageunterschied ~Δ: 20,5 %; p-Wert &lt; 0,05), gab es keine
      signifikanten Vitalitätsunterschiede zwischen den
      Versuchsgruppen für die i. R. des U-Tests durchgeführten
      Paarvergleiche. Letzteres galt auch für die Beurteilung des
      Zellüberlebens anhand des freigesetzten biochemischen
      Zelltodmarkers LDH. Der Kohlenhydratverbrauch betrug maximal
      ca. ein Viertel des Angebots. Er war in den Glucosegruppen
      während der ersten 12 Versuchstage sämtlich größer als in den
      entsprechenden Fructosegruppen (U-Test: ~Δ: 0,2-0,98 mg;
      p-Wert &lt; α’ für alle Paarvergleiche, α’ = 0,05/12= 0,0042
      nach Bonferroni). In den letzten beiden
      Inkubationsintervallen gab es diesen Unterschied in 25 % der
      Vergleiche bei ansonsten nicht signifikanten Differenzen. Ein
      Mehrangebot an Nährmedium förderte in den Paarvergleichen „2
      mL vs. 5 mL“ mit signifikantem Unterschied (p-Wert &lt; α’,
      α’ = 0,05/12= 0,0042) den Zuckerverbrauch (~Δ: 0,15-0,58 mg).
      Die Vergleiche für FCS ergaben, dass FCS in einigen Fällen zu
      einer signifikanten Erhöhung, in anderen zu einer
      Erniedrigung des Kohlenhydratstoffwechsels geführt hatte. Die
      chondrozytäre Lactatproduktion war mit einem ~Δ von 0,14 mg
      bis 0,64 mg (p-Wert &lt; α’, α’ = 0,05/4= 0,0125) für alle 4
      Paarvergleiche „Fructose vs. Glucose“ zu jedem
      Versuchszeitpunkt bis auf eine Ausnahme (p &gt; α’) in den
      Glucosegruppen höher. Sie korrelierte negativ mit dem pH-Wert
      (Pearson-Koeffizient: -0,62; p-Wert &lt; 0,05), der in den
      Fructosemedien im Versuchsverlauf ausnahmslos signifikant
      größer - i. e. näher an den physiologischen 7,4 (van den
      Berg, 2003) - als in den Glucosemedien war (~Δ: 0,11-0,39).
      Als Fazit bleibt unter Berücksichtigung der eingangs
      gestellten Fragen dies festzuhalten: 1. FCS im Nährmedium
      bringt Chondrozyten keinen Überlebensvorteil und erhöht ihren
      Kohlenhydratstoffwechsel nicht. Somit kann es in dieser
      Hinsicht als Supplement nicht empfohlen werden. 2. Fructose
      kann Glucose im Medium ersetzen. Im Rahmen dieser Studie
      wurde meines Wissens erstmalig gezeigt, dass Knorpelzellen
      Fructose zur Energiegewinnung verstoffwechseln können. Ohne
      Auswirkung auf die Zellvitalität bewirkt Fructose im
      Vergleich zu Glucose eine niedrigere
      Kohlenhydratausschöpfung, Lactatproduktion und
      pH-Wert-Verschiebung in den Kulturmedien. 3. Der
      Nährstoffbedarf von Knorpel lag weit unter der angebotenen
      Menge und könnte in Zukunft auf ca. ein Drittel (~o,33 mg/L)
      reduziert werden. Bei höherem Zuckerangebot waren
      Kohlenhydratstoffwechsel, Lactatanfall und
      pH-Wert-Verschiebung ebenfalls größer, die Zellvitalität
      blieb unbeeinflusst.
description: By assessing chondrocyte
      carbohydrate metabolism and cell viability in vitro this
      study aimed at answering the following questions: 1. Is FCS a
      beneficial nutritive supplement in addition to ITS
      (Insulin-Transferrin-Selenium)? 2. As an alternate to glucose
      in the culture medium, can fructose serve as a chondrocyte
      energy source minimizing lactate production and pH-shift? 3.
      How much is the energy demand of the cultured cartilage and
      how does it influence cell metabolism and viability? 96 chips
      of bovine articular cartilage were obtained from the shoulder
      joints of an 18 months old animal and assigned to 16
      different test groups. Static incubation was carried out in
      culture multiwell plates at 37° C under atmospheric pressure
      of O2 and CO2. The culture medium (DMEM) was exchanged every
      48 hours and used in 4 different variants: M1A - 1 g/L
      Fructose; M1B - 1 g/L Fruct, 2 % (V/V) FCS; M2A - 1 g/L
      Glucose; M2B - 1 g/L Gluc, 2 % (V/V) FCS. Each type contained
      2 mM glutamine and 1 % (V/V) ITS. For every variant there was
      one group provided with 2 mL and another one supplied with 5
      mL of medium. Each of these conditions was applied both to a
      group being cultivated 8 days and to another with 16 days of
      incubation. 10 freshly excised samples were used as controls
      and formalin-fixed and paraffin-embedded without cultivation.
      The cultured cartilage was processed in the same manner after
      8 or 16 days, respectively. Tissue sections were HE-stained
      and immunohistochemically treated (TUNEL and M30 CytoDEATH®)
      for assessing and quantifying chondrocyte viability with a
      light microscope. Glucose-/fructose-, lactate- and
      LDH-content was analysed in the medium by photometric
      methods. The pH-values were measured with a pH meter. The
      statistical analysis was done by applying the non-parametric
      Kruskal-Wallis (H) test followed by a Bonferroni corrected
      Mann-Whitney U post-hoc test which compared groups that
      differed in one experimental condition. The portion of
      histomorphologically viable cells averaged out at 90,8 ± 5,3
      % for the controls (freshly excised, not cultivated) and
      overall at 66,4 ± 18,9 % for the test groups. While viability
      of the controls was higher than cell survival in the
      collective of cultivated cartilage (estimated difference ~Δ:
      20,5 %; p-value &lt; 0,05), the U test indicated no
      significant differences of viability between the different
      experimental groups. Evaluating cell survival on the basis of
      liberated LDH as a marker of cell death also did not show
      statistical differences between the test groups. Carbohydrate
      uptake was four or more times lower than the supplied sugar
      amount. The carbohydrate use in the glucose groups exceeded
      the consumption in the fructose groups during the first 12
      days with no exception (U test: ~Δ: 0,2-0,98 mg; p-value &lt;
      α’ for each comparison done, α’ = 0,05/12= 0,0042 Bonferroni
      corrected). During the last two intervals of incubation 25 %
      of the comparisons yielded the same result while the
      remaining comparisons showed no statistical significance.
      When comparing the 2-mL- with the 5-mL-supply significant
      results (p-value &lt; α’, α’ = 0,05/12= 0,0042) showed that
      higher medium supply resulted in higher carbohydrate uptake
      (~Δ: 0,15-0,58 mg). Assessing the effect of FCS there were
      cases with significant increases of metabolized sugar as well
      as others in which FCS decreased carbohydrate metabolism.
      Chondrocyte lactate production was significantly higher in
      the glucose than in the fructose groups. With one exception
      (p &gt; α’), this difference was found for all of the 4
      comparisons done for each incubation interval. It amounts to
      a range of ~Δ between 0,14 mg and 0,64 mg (p-value &lt; α’,
      α’ = 0,05/4= 0,0125). There was a negative correlation
      between lactate production and pH-value (Pearson correlation
      coefficient: -0,62; p-value &lt; 0,05). The pH-value was
      significantly higher, i. e. closer to the physiological value
      of 7,4 (van den Berg, 2003), in the fructose than in the
      glucose groups (~Δ: 0,11-0,39). In conclusion, the questions
      posed at the beginning can be answered as follows: 1.
      Supplementing culture medium with FCS is not beneficial for
      chondrocyte viability and does not increase cartilage
      carbohydrate metabolism. In this regard it cannot be
      recommended as a medium additive. 2. Fructose can replace
      glucose in the medium. To my knowledge, this study is the
      first to show that chondrocytes can metabolize fructose for
      energy production. Without affecting cell viability fructose
      yields lower carbohydrate consumption with lower lactate
      production and a more stable pH-value in the culture medium
      than glucose. 3. Cartilage nutritive demand was far lower
      than the amount supplied and can be reduced to approximately
      one third (~o,33 mg/L) in the future. A high carbohydrate
      supply resulted in an increase in carbohydrate metabolism,
      lactate production and pH-shift while it did not influence
      cell viability.