title: Optimization of microalgae growth and separation processes for the production of high added value products
title: Βελτιστοποίηση διεργασιών ανάπτυξης και διαχωρισμού μικροφυκών για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας
Creators: name: Μακαρογλου Γεωργιος
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2023

description: Microalgae are unicellular photosynthetic microorganisms that can grow in diverse environments, by developing adaptation mechanisms. They are found in freshwater, saline water, ice, soil, and even in wastewater. According to their pigmentation, arrangements of photosynthetic membranes or other morphological features, microalgae are classified as diatoms, green algae, golden algae, and cyanobacteria. Microalgae share similar growth mechanisms as terrestrial plants, with the difference that they are cellular microorganisms. They use sunlight to sequester CO2 dissolved in the growth medium for biomass and O2 production. Cultivation of microalgae takes place in open ponds or photobioreactors, comprising of various types. Sunlight or artificial light (e.g., fluorescent, LED) can be used for boosting photosynthesis. However, light can be a limiting factor for microalgae growth as high chlorophyll causes a “shadow effect” to microalgae growing near the center of photobioreactors. Microalgae have various applications such as biofuels, food supplements, cosmetics, and animal feed, being rich in proteins, lipids, carbohydrates, fatty acids, pigments, and vitamins. Production of microalgae biomass could be boosted by channeling CO2 supply during cultivation. In this way, food productivity can be increased and CO2 from flue gas be decreased. Furthermore, industrial flue gas typically contains 4-14% or more (v/v) CO2 concentration and toxic compounds such as SOx, NOx, and trace elements, which are emitted at high flow rate, having high temperatures ranging from 80 to 120 ℃ or above. For this reason, microalgae should be able to withstand this extreme environment, to mitigate CO2. Flue gas from natural gas could be used to lessen the negative effects on microalgae growth. 
Τhe present PhD thesis consists of four main research parts. The initial scope was the mutation of wild-type Stichococcus sp. microalgae strain which led to a new strain with reduced chlorophyll content, and increased biomass and lipids productivity (namely EMS1). Mutation was achieved by the chemical reagent ethyl methanesulfonate (EMS) which causes random mutations in the DNA. The purpose of the mutation is that high chlorophyll can inhibit light penetration in the inner part of the culture, cultivated in photobioreactors. Thus, leading to reduced biomass productivity. The mutant strain EMS1 showed 51% less chlorophyll, 12% higher biomass, and 45% higher lipids productivity, compared to the wild-type.
The second scope was to further investigate the strains and select one which will be optimized on small scale with the ultimate goal to be scaled up in pilot photobioreactors and fixate CO2 from industrial flue gas. Experiments on wild-type and EMS1 Stichococcus sp. strains were conducted at laboratory scale (beaker vessels, 150 mL culture volume) with Bold’s Basal growth medium diluted in artificial seawater. Microalgae were grown attached on horizontal sandblasted glass tiles placed at the bottom of the vessels, as a measure to minimize harvesting costs. Agitation, CO2 capture efficiency, cultivation duration, nitrogen starvation duration, biomass, and bio-products production were examined. It was found that the absence of agitation had a minor effect on the reduction of biomass production. The addition of CO2 to reach 5% concentration in the gaseous phase resulted in up to 300% increase in biomass, while microalgae required 25 days to grow sufficiently. Also, the application of nitrogen starvation three days before harvesting enhanced intracellular lipids production. Screening of the two strains resulted in the selection of mutant EMS1 strain for optimization of its biomass and bio-products production (i.e., lipids, pigments, proteins, and carbohydrates). Taguchi’s Design of Experiments (DOE) was implemented to find the least required experimental runs. Also, microalgae were fed with synthetic flue gas (for CO2 fixation), to simulate real conditions from combustion of natural gas from industrial power plants. Five optimal combinations of the growth parameters were found from the statistical analysis of the data, maximizing each of the measured characteristics. Changes in aeration rate did not have a significant effect in biomass and total bioproducts production. Higher illuminance intensity (6,600 lux), continuous lighting and higher NaNO3 concentration (0.75 g L-1) resulted in higher yield in biomass and bio-products. Maximum value for biomass was equal to 45.7 ± 1.3 g m-2, while bio-products and their corresponding values were: lipids 11.6 ± 0.4 g m-2, pigments 0.22 ± 0.02 g m-2, proteins 9.5 ± 0.5 g m-2, carbohydrates 19.0 ± 1.5 g m-2, and total bio-products 34.8 ± 2.2 g m-2. Stichococcus sp. was found to be an excellent carbohydrates producer, having content up to 52%. Lipids production constituted up to 40% and the total bio-products yield was up to 91% of the biomass. Flashing light (1,000 Hz) effect triggered chlorophyll production by an average 8%, while three-day nitrogen starvation increased lipids production by an average 22%. Experimental maximum values were compared with regression analysis models for each of the five optimal conditions. Theoretical and experimental results were similar, with R2 of the models ranging from 84 to 99%. Following the lab-scale experiments, EMS1 Stichococcus sp. strain was scaled up in flat-panel photobioreactor (15 L culture volume) with the microalgae immobilized on sandblasted glass tiles. The experimental conditions were selected for biomass maximization and results showed biomass production equal to 49.2 g m-2, while total bio-products accounted for 41.7 g m-2. Microalgae were also fed with synthetic flue gas. 
The third scope of the PhD thesis was to test Stichococcus sp. in real conditions with an industrial flue gas supply for CO2 mitigation. Experiments were conducted in Lavrio power station, located in the region of Attica in Greece. EMS1 Stichococcus sp. strain adapted to this extreme environment and produced biomass values up to 50.5 g m-2 and the total bio-products measured were equal to 39.8 g m-2.
As a final scope of the present thesis, dewatering and drying processes of microalgae grown i) suspended and ii) immobilized were evaluated. Cultures of suspended microalgae were harvested by vacuum filtration, centrifugation, and chitosan flocculation coupled with the aforementioned processes. Immobilized microalgae were harvested by scraping of the sandblasted glass tiles, as a means of cultivating microalgae in specific places, thus lowering harvesting costs. Based on the experimental results, even though biomass scraping showed lower recovery rates by 18%, compared to harvesting of suspended microalgae, it showed the lowest energy consumption (0.7  0.1 kWh kg-1 of dry biomass), which verified the scope of cultivating immobilized biomass. Growth medium removed from the bulk liquid of immobilized microalgae cultures could possibly be retained for future use, as it contains a portion of the previous culture and nutrients. Harvested biomass was further processed by drying of the excess liquid. Convective, solar, and freeze drying processes were tested for their efficacy and their influence on microalgae biomass and bio-products. Convective drying required the greater electrical energy consumption (58.5 kWh kg-1 of wet biomass), but it dried the biomass in the shorted period (5.5 hours). Extracted bio-products (i.e., lipids, pigments, proteins, and carbohydrates) were found to be linked with the drying processes. Lipids and total chlorophyll recovery were greater after the application of freeze-drying with their values equal to 0.26  0.01 g g-1 and 0.70  0.0410-2 g g-1 of biomass. Carbohydrates recovery was maximized by applying solar and convective drying, with a maximum value of 0.45  0.01 g g-1 biomass. In the case of proteins, each drying process showed similar recovery rates with an average value equal to 0.19  0.02 g g-1 biomass. The above indicate that drying processes should be considered for maximization of the end-products. The main conclusions that derived from the present PhD thesis is that microalgae are a sustainable source of valuable products and biofuels, through CO2 conversion for greenhouse effect mitigation. Cultivation of immobilized microalgae in seawater with the appropriate conditions can significantly reduce cultivation costs, by maximizing biomass and bio-products yield.
description: Τα μικροφύκη είναι μονοκύτταροι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί που μπορούν να αναπτυχθούν σε διαφορετικά περιβάλλοντα, αναπτύσσοντας μηχανισμούς προσαρμογής. Βρίσκονται σε γλυκό νερό, αλατούχο νερό, πάγο, έδαφος, ακόμη και σε υγρά απόβλητα. Σύμφωνα με τη χρώση τους, τις διατάξεις των φωτοσυνθετικών μεμβρανών ή άλλα μορφολογικά χαρακτηριστικά, τα μικροφύκη ταξινομούνται ως διάτομα, πράσινα φύκη, χρυσά φύκη και κυανοβακτήρια. Τα μικροφύκη μοιράζονται παρόμοιους μηχανισμούς ανάπτυξης με τα χερσαία φυτά, με τη διαφορά ότι είναι κυτταρικοί μικροοργανισμοί. Χρησιμοποιούν το ηλιακό φως για να δεσμεύσουν το CO2 που είναι διαλυμένο στο μέσο ανάπτυξης για παραγωγή βιομάζας και O2. Η καλλιέργεια των μικροφυκών λαμβάνει χώρα σε ανοιχτές λίμνες ή σε φωτοβιοαντιδραστήρες, που αποτελούνται από διάφορους τύπους. Το ηλιακό φως ή το τεχνητό φως (π.χ. φθορίζον, LED) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση της φωτοσύνθεσης. Ωστόσο, το φως μπορεί να είναι ένας περιοριστικός παράγοντας για την ανάπτυξη μικροφυκών, καθώς η υψηλή χλωροφύλλη προκαλεί ένα «φαινόμενο σκίασης» στα μικροφύκη που αναπτύσσονται κοντά στο κέντρο των φωτοβιοαντιδραστήρων. Τα μικροφύκη έχουν διάφορες εφαρμογές όπως σε βιοκαύσιμα, συμπληρώματα διατροφής, καλλυντικά και ζωοτροφές, καθώς είναι πλούσια σε πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες, λιπαρά οξέα, χρωστικές ουσίες και βιταμίνες. Η παραγωγή βιομάζας μικροφυκών θα μπορούσε να ενισχυθεί με τη διοχέτευση της παροχής CO2 κατά την καλλιέργεια. Με αυτόν τον τρόπο, μπορεί να αυξηθεί η παραγωγικότητα των τροφίμων και να μειωθεί το CO2 από τα καυσαέρια. Επιπλέον, τα βιομηχανικά καυσαέρια περιέχουν συνήθως 4-14% ή περισσότερο (v/v) συγκέντρωση CO2 και τοξικές ενώσεις όπως SOx, NOx και ιχνοστοιχεία, τα οποία εκπέμπονται με υψηλή ταχύτητα ροής και υψηλή θερμοκρασία που κυμαίνεται από 80 έως 120 ℃ ή υψηλότερη. Για το λόγο αυτό, τα μικροφύκη θα πρέπει να είναι σε θέση να αντέξουν αυτό το ακραίο περιβάλλον, ώστε να μετριάσουν το εκπεμπόμενο CO2. Τα καυσαέρια από φυσικό αέριο θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη μείωση των αρνητικών επιπτώσεων στην ανάπτυξη των μικροφυκών.
Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από τέσσερα κύρια ερευνητικά μέρη. Ο αρχικός στόχος ήταν η μετάλλαξη του άγριου στελέχους μικροφυκών Stichococcus sp. που οδήγησε σε ένα νέο στέλεχος με μειωμένη περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη και αυξημένη παραγωγικότητα βιομάζας και λιπιδίων (ονομασία EMS1). Η μετάλλαξη επιτεύχθηκε με το χημικό αντιδραστήριο Ethyl Methanesulfonate (EMS) που προκαλεί τυχαίες μεταλλάξεις στο DNA. Ο σκοπός της μετάλλαξης είναι ότι η υψηλή χλωροφύλλη μπορεί να αναστείλει τη διείσδυση φωτός στο εσωτερικό μέρος της καλλιέργειας, που αναπτύσσεται σε φωτοβιοαντιδραστήρες. Έτσι, οδηγεί σε μειωμένη παραγωγικότητα βιομάζας. Το μεταλλαγμένο στέλεχος EMS1 έδειξε 51% λιγότερη χλωροφύλλη, 12% υψηλότερη βιομάζα και 45% υψηλότερη παραγωγή λιπιδίων, σε σχέση με τον άγριο τύπο.
Ο δεύτερος στόχος ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των στελεχών και η επιλογή ενός που θα βελτιστοποιηθεί σε μικρή κλίμακα με απώτερο στόχο την κλιμάκωση σε πιλοτικούς φωτοβιοαντιδραστήρες και τη δέσμευση CO2 από βιομηχανικά απαέρια. Πειράματα με το άγριο και EMS1 στέλεχος Stichococcus sp. πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακή κλίμακα (ποτήρια ζέσεως, όγκος καλλιέργειας 150 mL) με μέσο ανάπτυξης Bold's Basal αραιωμένο σε τεχνητό θαλασσινό νερό. Τα μικροφύκη αναπτύχθηκαν προσαρτημένα σε οριζόντια γυάλινα πλακίδια αμμοβολής στο κάτω μέρος των δοχείων, ως μέτρο για την ελαχιστοποίηση του κόστους συγκομιδής. Εξετάστηκαν η ανάδευση, η αποτελεσματικότητα δέσμευσης CO2, η διάρκεια καλλιέργειας, η διάρκεια της πενίας αζώτου, η παραγωγή βιομάζας και βιο-προϊόντων. Διαπιστώθηκε ότι η απουσία ανάδευσης είχε μικρή επίδραση στη μείωση της παραγωγής βιομάζας. Η προσθήκη 5% αερίου CO2 είχε ως αποτέλεσμα έως και 300% αύξηση της βιομάζας και τα μικροφύκη χρειάστηκαν 25 ημέρες για να αναπτυχθούν επαρκώς. Επίσης, η εφαρμογή της πενίας αζώτου τρεις ημέρες πριν από τη συγκομιδή ενίσχυσε την ενδοκυτταρική παραγωγή λιπιδίων. Ο έλεγχος των δύο στελεχών οδήγησε στην επιλογή του μεταλλαγμένου στελέχους EMS1 για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής βιομάζας και βιο-προϊόντων (δηλαδή λιπίδια, χρωστικές ουσίες, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες). Η μέθοδος Taguchi – Design of Experiments (DOE) εφαρμόστηκε για να βρεθούν οι λιγότερο απαιτούμενες πειραματικές εκτελέσεις. Επίσης, τα μικροφύκη τροφοδοτήθηκαν με συνθετικά καυσαέρια (για δέσμευση CO2), με σκοπό την προσομοίωση πραγματικών συνθηκών από την καύση φυσικού αερίου από βιομηχανικούς σταθμούς ηλεκτροπαραγωγής. Από τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων βρέθηκαν πέντε βέλτιστοι συνδυασμοί των παραμέτρων ανάπτυξης, μεγιστοποιώντας κάθε ένα από τα μετρούμενα χαρακτηριστικά. Οι αλλαγές στον ρυθμό αερισμού δεν είχαν σημαντική επίδραση στη βιομάζα και τη συνολική παραγωγή βιο-προϊόντων. Η υψηλότερη ένταση φωτισμού (6.600 lux), ο συνεχής φωτισμός και η υψηλότερη συγκέντρωση NaNO3 (0,75 g L-1) είχαν ως αποτέλεσμα την υψηλότερη απόδοση σε βιομάζα και βιο-προϊόντα. Η μέγιστη τιμή για τη βιομάζα ήταν ίση με 45,7 ± 1,3 g m-2, ενώ τα βιο-προϊόντα και οι αντίστοιχες τιμές τους ήταν: λιπίδια 11,6 ± 0,4 g m-2, ολική χλωροφύλλη 0,22 ± 0,02 g m-2, πρωτεΐνες 9,5 ± 0,5 g m- 2, υδατάνθρακες 19,0 ± 1,5 g m-2 και συνολικά βιο-προϊόντα 34,8 ± 2,2 g m-2. Το στέλεχος Stichococcus sp. βρέθηκε ότι είναι εξαιρετικός παραγωγός υδατανθράκων, με περιεκτικότητα έως και 52%. Η παραγωγή λιπιδίων αποτελούσε έως και το 40% και η συνολική απόδοση βιο-προϊόντων ήταν έως και 91% της βιομάζας. Η επίδραση του φωτός με αναλαμπές (1.000 Hz) που εφαρμόστηκε αύξησε την παραγωγή χλωροφύλλης κατά μέσο όρο 8%, ενώ η πενία αζώτου τριών ημερών αύξησε την παραγωγή λιπιδίων κατά μέσο όρο 22%. Οι πειραματικές μέγιστες τιμές συγκρίθηκαν με μοντέλα γραμμικής παλινδρόμησης για καθεμία από τις πέντε βέλτιστες συνθήκες. Τα θεωρητικά και τα πειραματικά αποτελέσματα ήταν παρόμοια, με το R2 των μοντέλων να κυμαίνεται από 84 έως 99%. Έπειτα από τα πειράματα εργαστηριακής κλίμακας, το στέλεχος EMS1 Stichococcus sp. κλιμακώθηκε σε επίπεδο φωτοβιοαντιδραστήρα (όγκος καλλιέργειας 15 L) με τα μικροφύκη ακινητοποιημένα σε γυάλινα πλακίδια αμμοβολής. Οι πειραματικές συνθήκες επιλέχθηκαν για τη μεγιστοποίηση της βιομάζας και τα αποτελέσματα έδειξαν παραγωγή βιομάζας ίση με 49,2 g m-2, ενώ τα συνολικά βιο-προϊόντα αντιστοιχούσαν σε 41,7 g m-2 επιφάνειας. Τα μικροφύκη τροφοδοτήθηκαν επίσης με συνθετικά καυσαέρια.
Ο τρίτος σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η δοκιμή του Stichococcus sp. σε πραγματικές συνθήκες με παροχή βιομηχανικών καυσαερίων για τη δέσμευση CO2. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν στον ηλεκτροπαραγωγικό σταθμό Λαυρίου, που βρίσκεται στην περιοχή της Αττικής. Το στέλεχος EMS1 Stichococcus sp. προσαρμόστηκε στο ακραίο αυτό περιβάλλον και παρήγαγε τιμές βιομάζας έως 50,5 g m-2 και τα συνολικά βιο-προϊόντα που μετρήθηκαν, ήταν ίσα με 39,8 g m-2.
Ως τελικό αντικείμενο της παρούσας διατριβής, αξιολογήθηκαν οι διαδικασίες αφυδάτωσης και ξήρανσης μικροφυκών σε i) εναιώρημα και ii) ακινητοποιημένα. Καλλιέργειες αιωρούμενων μικροφυκών συλλέχθηκαν με διήθηση κενού, φυγοκέντριση και κροκίδωση χιτοζάνης σε συνδυασμό με τις προαναφερθείσες διαδικασίες. Η συγκομιδή των ακινητοποιημένων μικροφυκών έγινε με απόξεση των πλακιδίων με αμμοβολή, μειώνοντας έτσι το κόστος συγκομιδής. Με βάση τα πειραματικά αποτελέσματα, παρόλο που η απόξεση βιομάζας έδειξε χαμηλότερα ποσοστά ανάκτησης κατά 18% σε σύγκριση με τη συγκομιδή αιωρούμενων μικροφυκών, έδειξε τη χαμηλότερη κατανάλωση ενέργειας (0,7 ± 0,1 kWh kg-1 νερού που αφαιρέθηκε), η οποία επαλήθευσε το εύρος της καλλιέργειας ακινητοποιημένης βιομάζας. Το μέσο ανάπτυξης που αφαιρέθηκε από τις ακινητοποιημένες καλλιέργειες μικροφυκών θα μπορούσε ενδεχομένως να διατηρηθεί για μελλοντική χρήση, καθώς περιέχει ένα μέρος της προηγούμενης καλλιέργειας και θρεπτικών συστατικών. Η συλλεγόμενη βιομάζα υποβλήθηκε σε περαιτέρω επεξεργασία με ξήρανση της περίσσειας υγρού. Η ξήρανση σε κλίβανο, ηλιακή ξήρανση και λυοφιλίωση δοκιμάστηκαν για την αποτελεσματικότητά τους και την επιρροή τους στη βιομάζα και στα βιο-προϊόντα των μικροφυκών. Η ξήρανση στον κλίβανο απαίτησε τη μεγαλύτερη κατανάλωση ηλεκτρικής ενέργειας (58,5 kWh kg-1 υγρής βιομάζας), αλλά ξήρανε τη βιομάζα σε σύντομο χρονικό διάστημα (5,5 ώρες). Τα ανακτημένα βιο-προϊόντα (δηλαδή, λιπίδια, χρωστικές ουσίες, πρωτεΐνες και υδατάνθρακες) βρέθηκαν να συνδέονται με τις διαδικασίες ξήρανσης. Τα λιπίδια και η ολική ανάκτηση χλωροφύλλης ήταν μεγαλύτερη μετά την εφαρμογή λυοφιλίωσης με τις τιμές τους να είναι ίσες με 0,26 ± 0,01 g g-1 και 0,70 ± 0,0410-2 g g-1 βιομάζας. Η ανάκτηση υδατανθράκων μεγιστοποιήθηκε με την εφαρμογή ηλιακής ξήρανσης και ξήρανσης σε κλίβανο, με μέγιστη τιμή 0,45 ± 0,01 g g-1 βιομάζας. Στην περίπτωση των πρωτεϊνών, κάθε διαδικασία ξήρανσης έδειξε παρόμοια ποσοστά ανάκτησης με μέση τιμή ίση με 0,19 ± 0,02 g g-1 βιομάζας. Τα παραπάνω δείχνουν ότι οι διαδικασίες ξήρανσης πρέπει να λαμβάνονται υπόψη για τη μεγιστοποίηση των τελικών προϊόντων. Τα κύρια συμπεράσματα που προέκυψαν από την παρούσα διδακτορική διατριβή είναι ότι τα μικροφύκη αποτελούν βιώσιμη πηγή πολύτιμων προϊόντων και βιοκαυσίμων, μέσω της μετατροπής του CO2 για τον μετριασμό του φαινομένου του θερμοκηπίου. Η καλλιέργεια ακινητοποιημένων μικροφυκών σε θαλασσινό νερό με τις κατάλληλες συνθήκες μπορεί να μειώσει σημαντικά το κόστος καλλιέργειας, μεγιστοποιώντας την απόδοση βιομάζας και βιο-προϊόντων.