Die Bedeutung neuronaler Transkriptionsfaktoren in der melanozytären Differenzierung im adulten Organismus
Creators: name: Stüfchen, Isabel
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: 1. Hintergrund und Ziele Melanozyten der Haut befinden sich in der Epidermis und in den Haarfollikeln und versorgen die sie umgebenden Keratinozyten mit dem Pigmentfarbstoff Melanin. Entwicklungsbiologisch entstammen Melanozyten den multipotenten Neuralleistenzellen. Die verschiedenen Differen-zierungswege der Neuralleistenzellen werden von einem Netzwerk an Transkriptionsfaktoren reguliert, einschließlich dem SRY-related HMG box Transkriptionsfaktor 9 (Sox9). Im adulten Organismus sind melanozytäre Stammzellen für die kontinuierliche Neubildung der Melanozy-ten verantwortlich. Diese Stammzellen sind in der Stammzellnische des Haarfollikels – der Wulstregion – zusammen mit keratinozytären und anderen, multipotenten Stammzellen lokali-siert. Eine Fehlregulation von Melanozyten und auch melanozytären Stammzellen kann zur Entstehung des malignen Melanoms führen, dem tödlichsten Hautkrebs. Tierexperimentelle Forschung an melanozytären Zellen liefert neben funktionellen in vivo Analysen unter physio-logischen Bedingungen auch ein erweitertes Grundverständnis der melanozytären Differenzie-rung sowie der Melanomentstehung und -progression. Aus wissenschaftlicher Sicht sind sie daher bis heute alternativlos. Dennoch sollte die Verwendung von Tierexperimenten bedacht und in der Zahl möglichst begrenzt erfolgen. Ein weit verbreitetes murines Modellsystem ist das induzierbare Cre/loxP-System, welches eine konditionale Genmodifikation unter zeitlicher und räumlicher Kontrolle ermöglicht. Aufgrund ihres embryologischen Ursprungs in der Neural-leiste exprimieren Melanozyten im Vergleich zu anderen Hautzellen verstärkt neuronale Gene. Hierauf basierend sollte in dieser Studie untersucht werden, ob zwei induzierbare CreERT2-loxP Mausmodelle, die üblicherweise in neurowissenschaftlicher Forschung zur gezielten Un-tersuchung neuronaler (Stamm)Zellen Anwendung finden, auch für Untersuchungen an mela-nozytären Zellen verwendet werden können. Der interdisziplinäre Austausch von tierexperi-mentellen Methoden, in diesem Fall die Anwendung einer Mauslinie in zwei verschiedenen Forschungsgebieten, bewirkt neben dem Zugewinn von neuen Mausmodellen in der Melanom-forschung auch einen nachhaltigeren Nutzen von Tierexperimenten. Im zweiten Teil der Studie sollte exemplarisch unter Zuhilfenahme der Nestin-CreERT2 Mauslinie sowie Reporter- und spezifischen knockout-Mauslinien die Rolle neuronaler Transkriptionsfaktoren in adulten Me-lanozyten/melanozytären Vorläuferzellen untersucht werden. Im Fokus dieser Untersuchung stand aufgrund der embryologischen Relevanz der Transkriptionsfaktor Sox9. 2. Methoden Voraussetzung für die Verwendung der CreERT2 Mausmodelle ist die Aktivität der (stamm)zellspezifischen Promotor Nestin und Aldh1L1. Erste Hinweise für die Aktivität der Promotor in melanozytären Zellen lieferten in silico (cDNA-Microarray, RNA-Seq) und in vitro (qRT-PCR) Expressionsanalysen beider Gene in Melanozyten verschiedener Differenzie-rungsstadien (humane Melanozyten, Melanoblasten, Primärmelanomzellen und metastasierte Melanomzellen). Zur Bestätigung der Daten in vivo wurden beide Tamoxifen-induzierbare CreERT2 Mauslinien mit CAG CAT GFP Reporterlinien verpaart (Nestin/Aldh1L1-CreERT2; GFP), womit nach Systeminduktion im adulten Organismus mittels Tamoxifen-Injektionen die Visualisierung der Rekombination ermöglicht werden konnte. Immunhistochemische Färbun-gen muriner Schwanzhaut dienten zur Analyse des Rekombinationsmusters. Das Expressi-onslevel der im zweiten Teil der Arbeit exemplarisch zu untersuchenden Zielgene wurde eben-falls in silico (cDNA-Microarray, RNA-Seq), in vitro (qRT-PCR, Western Blot) und in vivo (im-munhistochemische Färbung muriner Schwanzhaut) in melanozytären Zellen verschiedener Differenzierungsstadien ermittelt. Zur spezifischen Analyse der Sox9-Funktion in der mela-nozytären Differenzierung von Nestin-exprimierenden (Nestin+) melanozytären Stammzellen im adulten Haarfollikel wurde die Nestin-CreERT2; GFP Mauslinie mit einer Sox9-knockout-Mauslinie verpaart. Die Systeminduktion erfolgte im adulten Organismus. Immunhistochemi-sche Färbungen zu drei verschiedenen Analysezeitpunkten dienten zur Detektion von kurz- und langfristigen Effekten des knockouts auf die Zellzahl sowie das Proliferations- und Migra-tionsverhalten der Zellen. 3. Ergebnisse In den Analysen der Studie zeigte sich, dass sowohl mit der Nestin-CreERT2; GFP Mauslinie als auch der Aldh1L1-CreERT2; GFP Linie die melanozytäre Differenzierung von ursprünglich rekombinierten multipotenten/melanozytären Stammzellen (Nestin+) des adulten Haarfollikels verfolgt und untersucht werden kann. Demnach können beide Modelle zur Untersuchung und auch Modulation adulter melanozytärer Stammzellen und ihrer Nachkommen in vivo verwen-det werden. Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit weisen auf eine verstärkte Expression von Sox9 in undifferenzierten Melanozyten hin. Immunhistochemische Analysen nach Induktion des Sox9-knockouts in adulten Nestin+ Stammzellen zeigten eine verminderte Anzahl an mela-nozytären Nachkommen im Haarfollikel und eine erhöhte Zahl an glialen Zellnachkommen im Interfollikularraum. Innerhalb der Stammzellpopulation resultierte der knockout in einer Imba-lance des Proliferationsverhaltens mit initialer Hyperproliferation und anschließend verminder-ter absoluter Zahl an Stammzellen im HF. 4. Schlussfolgerung und Diskussion Die Ergebnisse der Studie demonstrieren, dass eine interdisziplinäre und damit nachhaltigere Verwendung von tierexperimentellen Modellsystemen möglich ist. Inhaltlich und funktionell zeigten die Analysen, dass Sox9 essenziell für die melanozytäre Differenzierung Nestin+ Stammzellen ist und außerdem als Regulator der melano-glialen Schicksalsentscheidung der Zellen fungiert. Des Weiteren konnte der Einfluss von Sox9 auf das Proliferationsverhalten und damit den Selbsterhaltungsprozess der Stammzellen ermittelt werden. Aufgrund der Parallelen zwischen Melanomzellen, insbesondere Melanom-Stammzellen, einer Subpopulation fähig zur Selbsterneuerung und Tumorinvasion, und Neuralleistenzellen (Nes-tin+), verhelfen neue Erkenntnisse bezüglich Schicksalsregulation, Proliferation, Migration und Differenzierung der adulten Nestin+ Stammzellen zu einem besseren Verständnis der Mela-nomprogression. (Teil-)Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden veröffentlicht in: Stüfchen, I., Beckervordersandforth, R., Fischer, S., Kappelmann-Fenzl, M., Bosserhoff, A. K., &amp; Beyer, F. (2022). Two novel CreERT2 transgenic mouse lines to study melanocytic cells in vivo. Pigment Cell &amp; Melanoma Research, Volume 35, Issue 6 613– 621. doi: 10.1111/pcmr.13061 Stüfchen, I., Beyer, F., Staebler, S., Fischer, S., Kappelmann, M., Beckervordersandforth, R. &amp; Bosserhoff, A. K. (2023) Sox9 regulates melanocytic fate decision of adult hair follicle stem cells. iScience, Volume 26, Issue 6, 106919. doi: 10.1016/j.isci.2023.106919.