title: Untersuchungen zur Expression und subzellulären Lokalisation der v-SNARE Isoformen VAMP-1a und -1b
title: Studies on the expression and subcellular localization of the v-SNARE isoforms VAMP-1a and -1b
Creators: name: Rodepeter, Fiona Rosali
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Medizin, Gesundheit
Membranfusion
membrane fusion
VAMP
Phagosom
Lysosom
SNARE
Protein-Sortierung
Vesikel
Endosom
vesicle
protein sorting
Vamp
Intrazellulärer Transport
SNAP-Rezeptor

description: The so-called SNARE (soluble
      N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
      receptor) proteins are essential constituents of the
      intracellular trafficking machinery and are primarily
      involved in membrane fusion processes such as fusion of a
      transport vesicle with its cognate target membrane. The
      v-SNARE protein VAMP-1 (vesicle associated membrane protein
      1) that is found in transport vesicle membranes is a
      so-called type II membrane protein consisting of a dominant
      N-terminal cytosolic, a transmembrane and a short
      intraluminal C-terminal domain. The mechanism of alternative
      RNA-splicing that contributes to the existence of different
      VAMP isoforms could also be found in mammalian cells. This
      mechanism was demonstrated for the first time for the VAMP-1
      gene of the rat describing two differentially expressed
      VAMP-1 isoforms termed VAMP-1a and VAMP-1b. The newly
      identified VAMP-1b isoform differed from the known VAMP-1a
      isoform in its C-terminal intraluminal end and was mainly
      expressed in nonneuronal particularly secretory active
      tissues such as the parotid gland, whereas the known VAMP-1a
      isoform exhibited a primary distribution in the central
      nervous system. In addition, it was reported that a similar
      human VAMP-1 splice isoform exhibiting a variable
      intraluminal C-terminal end was sorted to mitochondria,
      pointing to the C-terminal end of these SNARE proteins to
      potentially act as sorting signals. The aim of the present
      study was to evaluate if both VAMP-1 isoforms differ in their
      subcellular localization by using a cell biological approach
      involving fluorescence microscopy since this could point to a
      role of the intraluminal C-terminal end for sorting of both
      isoforms to different subcellular compartments. To approach
      these questions GFP and RFP labelled VAMP-1a (GFP- and
      RFP-V1a) and VAMP-1b (GFP- and RFP-V1b) expression constructs
      were generated by PCR cloning and were cotransfected into
      HeLa cells with subsequent evaluation of the protein’s
      subcellular localization using fluorescence microscopy.
      Regions consistent with the endoplasmic reticulum (ER) and
      Golgi apparatus demonstrated a clear overlap of both signals.
      Since VAMP proteins are integrated into membranes of the ER
      after synthesis, and differences in the localization are
      expected to occur after sorting in the trans-Golgi network
      (TGN), this was an expected finding, in particular since
      VAMP-1 should play a role in the late secretory pathway. In
      the periphery of the cells, vesicular structures could be
      observed which seemed to express only one of both isoforms
      when coexpressed (GFP-V1a/RFP-V1b or GFP-V1b/RFP-V1a). To
      evaluate colocalization of both proteins in non-fixed vital
      cells, the method of total internal reflection fluorescence
      microscopy (TIRF) was implemented. For this, the respective
      constructs were expressed in COS-7 cells, since these were
      particularly suitable for TIRF microscopy, demonstrating good
      expression of the fluorescent proteins. Similarly as observed
      in HeLa cells, vesicular structures could also be seen that
      primarily expressed one of both isoforms. In addition,
      evidence for homotypic fusion events was found between
      vesicles that coexpressed VAMP-1a as well as VAMP-1b. To
      evaluate a possible localization of the two isoforms in
      compartments of the late secretory pathway, GFP-V1a or
      GFP-V1b were transfected into HeLa cells and subsequent
      immunocytochemistry was performed, using antibodies directed
      against marker proteins specific for mitochondria (TOM20),
      early endosomes (EEA1), lysosomes (LAMP-3) and autophagosomes
      (MAP LC3beta), as well as coexpression of RFP-V1a or RFP-V1b
      with the peroxisomal marker protein GFP-SKL. Taken together,
      no evidence was found for sorting of both VAMP-1 isoforms to
      mitochondria or peroxisomes. However, both isoforms were
      found to be expressed in a minor subset of singular vesicles
      that appeared associated with the early endosomal, lysosomal
      and autophagosomal compartment. Since vesicular structures
      were observed that expressed only one of the two transfected
      VAMP-1 isoforms, it is possible that only one of both
      isoforms is sorted to a yet unidentified compartment.
      Subsequent studies, using other methods such as subcellular
      fractionation, could help to further define these
      compartments.
description: Die sogenannten SNARE (soluble
      N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein
      receptor) - Proteine sind essentielle Bestandteile der
      zellulären Transportmaschinerie und maßgeblich beteiligt an
      Membranfusionsprozessen, wie z.B. der Fusion zwischen einem
      Transportvesikel- und seiner Zielmembran. Bei dem auf
      Transportvesikeln befindlichen vesikulären (v)-SNARE-Protein
      VAMP-1 (vesicle-associated membrane protein-1) handelt es
      sich um ein Typ II - Membranprotein, welches aus einem
      dominanten N-terminalen zytosolischen, einem transmembranen
      sowie einem kurzen intraluminalen C-Terminus besteht. Es
      konnte auch für Säugetierzellen gezeigt werden, dass der
      Mechanismus des alternativen RNA Spleißens zu einer Erhöhung
      der Zahl verschiedener VAMP-Isoformen beiträgt. Dieser
      Mechanismus wurde erstmals für das VAMP-1 Gen der Ratte
      beschrieben, wobei zwei verschiedene in Geweben differentiell
      exprimierte VAMP-1 Isoformen, VAMP-1a und -1b, identifiziert
      werden konnten. Die neu charakterisierte VAMP-1b Isoform
      unterschied sich von der bekannten VAMP-1a Isoform
      ausschließlich am C-terminalen, intraluminalen Ende und
      zeigte eine dominante Expression in nicht-neuronalen,
      insbesondere sekretorisch-aktiven, Geweben wie der Glandula
      Parotis, wohingegen die bekannte VAMP-1a Isoform eine
      vorherrschende Expression im Zentralnervensystem aufwies.
      Ebenfalls wurde berichtet, dass eine ähnliche humane VAMP-1
      Spleiß-Isoform, welche ebenfalls eine Veränderung am
      intraluminalen C-Terminus aufwies, zu Mitochondrien
      sortierte, was darauf hinweist, dass es sich bei dem
      C-terminalen Anteil dieser SNARE-Proteine möglicherweise um
      ein Sortierungssignal handelt. Das Ziel der vorliegenden
      Arbeit war es, über einen zellbiologischen Ansatz und Nutzung
      fluoreszenzmikroskopischer Methoden zu untersuchen, ob bei
      Vergleich beider VAMP-1 Isoformen Unterschiede in der
      subzellulären Lokalisation nachzuweisen sind, da dies auf
      eine Rolle des intraluminalen C-Terminus für die Sortierung
      beider Isoformen in verschiedene subzelluläre Kompartimente
      hinweisen würde. Um diesen Fragen nachzugehen, wurden mittels
      PCR-Klonierung N-terminal GFP- und RFP-markierte VAMP-1a
      (GFP- und RFP-V1a) und VAMP-1b (GFP- und RFP-V1b)
      Expressionskonstrukte hergestellt. Diese Konstrukte wurden
      jeweils als Kombination eines RFP-markierten und
      GFP-markierten VAMP-1 Konstrukts in HeLa-Zellen
      kotransfiziert und die subzelluläre Lokalisation der
      exprimierten Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie
      beurteilt. Es zeigten sich in Bereichen, welche dem
      Endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi-Apparat
      entsprechen, eine deutliche Kolokalisation beider Isoformen.
      Da VAMP Proteine nach Synthese zunächst in die Membranen des
      ER integriert werden und Unterschiede der Lokalisation erst
      nach Sortierung im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zustande
      kommen, war dies zu erwarten, zumal VAMP-1 erst im Bereich
      des späten sekretorischen Transportwegs funktionell eine
      Rolle spielt. Peripher zeigten sich jedoch zunehmend auch
      vesikuläre Strukturen, welche nur eine der beiden Isoformen
      aufzuweisen schienen. Um die Kolokalisation beider Proteine
      auch in nicht-fixierten vitalen Zellen zu beurteilen, wurde
      die Methode der TIRF (total internal reflection
      fluorescence)-Mikroskopie eingesetzt. Hierzu wurden die
      Konstrukte in COS-7 Zellen exprimiert, da diese in besonderem
      Maße für die TIRF-Mikroskopie geeignet sind und eine gute
      Expression der fluoreszierenden Proteine erlauben. Ähnlich
      wie zuvor in HeLa-Zellen beschrieben, so wurden auch hier
      vesikuläre Strukturen beobachtet, welche bevorzugt nur eine
      der beiden Isoformen exprimierten. Ebenfalls fanden sich
      Hinweise auf das Vorkommen homotypischer Fusionen zwischen
      Vesikeln, die sowohl VAMP-1a als auch VAMP-1b exprimierten.
      Um eine mögliche Lokalisation der zwei VAMP-1 Isoformen in
      definierten zellulären Kompartimenten des späten
      sekretorischen Transportweges zu untersuchen, erfolgte eine
      Transfektion von HeLa-Zellen mit GFP-V1a oder GFP-V1b, sowie
      nachfolgende Immunzytochemie mit einem Antikörper gegen ein
      Markerprotein für Mitochondrien (TOM20), frühe Endosomen
      (EEA1), Lysosomen (LAMP-3) sowie Autophagosomen (MAP LC3beta)
      bzw. eine Koexpression von RFP-V1a oder RFP-V1b mit dem
      peroxisomalen Markerprotein GFP-SKL. In den vorliegenden
      Untersuchungen zeigten sich keine Hinweise für eine
      Sortierung beider VAMP-1 Isoformen zu Mitochondrien oder
      Peroxisomen. Beide Isoformen waren jedoch vereinzelt in mit
      frühen Endosomen, Lysosomen sowie Autophagosomen assoziierten
      Vesikeln nachweisbar. Aufgrund der Beobachtung vesikulärer
      Strukturen, welche nur eine der transfizierten VAMP-1
      Isoformen aufzuweisen scheinen, ist es daher möglich, dass
      nur eine der beiden Isoformen in ein noch nicht näher
      definiertes Kompartiment sortiert. Weiterführende
      Untersuchungen, die andere Methoden, wie z.B. subzelluläre
      Fraktionierung, einsetzen, könnten dazu beitragen, diese
      Kompartimente näher zu definieren.