title: Fragment based Drug Discovery; Design and Validation of a Fragment Library; Computer-based Fragment Screening and Fragment-to-Lead Expansion
title: Fragment-basierte Wirkstoffentwicklung; Entwicklung und Validierung einer Fragmentbibliotek; Computer-basierte Fragment-Suchen und Fragment zu Leitstruktur Entwicklung
Creators: name: Craan, Tobias Friedrich
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Fragmentbasierte Leitstrukturentwicklung
FBLD
Fragment library
Fragmentbibliotek
Naturwissenschaften
Fragment

description: In den letzten Jahren wurden
      vermehrt Fragment-basierte Verfahren verwendet, um neue
      Leitstrukturen zu identifizieren. Fragmente werden anhand der
      Astex-Dreier-Regel definiert. SPR, NMR, sowie biochemische
      Assays und Röntgenstrukturanalyse sind effiziente Verfahren
      um Fragmente zu entdecken. Diese Methoden müssen auf eine
      bestehende Fragmentbibliothek angewendet werden. Wir haben
      unsere eigene Fragmentbibliothek entwickelt. Während des
      Designs der Fragmentbibliothek haben wir die
      Astex-Dreier-Regel modifiziert. Es wurde kein strikter
      physiko-chemischer Filter verwendet. Im letzen Schritt wurden
      sie visuell inspiziert, was zu einer Bibliothek mit 364
      Fragmenten führte. Um die Güte der Bibliothek zu überprüfen,
      haben wir diese gegen Endothiapepsin getestet. Als Ergebnis
      erhielten wir 55 aktive Fragmente. Diese wurden
      kristallographisch untersucht, wobei elf Kristallstrukturen
      bestimmt werden konnten. Das Programm HotspotsX kann aufgrund
      von wissensbasierten Potentialen die
      Aufenthaltswahrscheinlichkeit von einem definierten Atomtyp
      in einer bestimmten Umgebung der Bindetasche des Zielenzyms
      vorhersagen. Mit Hilfe der elf Fragmentkristallstrukturen
      haben wir das Programm HotspotsX validiert. Durch die
      chemische Diversität und die diversen Posen der Fragmente
      erhielten wir Hinweise auf aromatische, Donor, Akzeptor,
      Doneptor und hydrophobe Binder. Die berechneten HotspotsX
      Karten passen hervorragend zu den experimentell ermittelten
      Bindungsposen der Fragmente. Das Programm HotspotsX wurde
      ebenfalls an Kristallstrukturen von Sonden-Molekülen wie
      Phenol, Harnstoff und Methylharnstoff getestet. Die
      Bindungsposen dieser Sonden konnten in verschiedenen
      Zielenzymen mit Hilfe von Röntgenstrukturanalysen ermittelt
      werden. Die meisten experimentell bestimmten bevorzugten
      Bindungsregionen passten hervorragend mit den
      computer-vorhergesagten Positionen überein. Beginnend mit der
      Sondenstruktur von Phenol in der cAMP abhängigen Protein
      Kinase A (PKA) haben wir Fragment-basierte Prinzipien
      angewendet. Sie beruhen auf dem Wachstum von inital
      entdeckten Fragmenten. In der Kristallstruktur findet man
      drei Phenolmoleküle, wobei zwei die ATP-Bindestelle besetzen
      und das andere auf der Glycin-reichen Schleife (G-Schleife)
      sitzt. Eine computer-basierte Suche wurde durchgeführt. Es
      wurden Phenol-artige Strukturen vorgeschlagen und für eine
      konnte eine Kristallstruktur bestimmt werden. Diese Struktur
      wurde verwendet, um die bevorzugten Bindungsregionen der
      Bindungstasche auszuleuchten. Das Programm schlug vor, den
      Liganden in Richtung der G-Schleife zu wachsen, in dieser
      Region eine aromatische Gruppe zu platzieren und Lys72 mit
      einer Akzeptorgruppe zu adressieren. Die erste Testverbindung
      hatte einen Inhibitionswert von 70µM. Im folgenden ersten
      Design-Zyklus konnte die Affinität auf 6.5µM gesteigert
      werden. Im zweiten Zyklus wurde eine zusätzliche Aminogruppe
      an die Leitstruktur synthetisiert, was das Verhältnis
      Schweratome zu Affinität auf 0.38 anhob. Im letzten Zyklus
      wurden eine bzw. zwei Methylen-Gruppen als Brücken für die
      Aminogruppe synthetisiert. Die Affinität für das
      synthetisierte Diastereomerengemisch zeigte eine Affinität
      von ca. 110nM. Die Struktur des Phenol-PKA Komplexes zeigte
      eine mögliche allosterische Bindetasche. Die G-Schleife in
      diesem Komplex liegt in einer eingeklappten Konformation vor.
      Diese Konformation könnte durch eines der drei
      Phenolmoleküle, das auf der G-Schleife sitzt, erzwungen
      werden. Mehrere Moleküldynamik (MD) Berechnungen wurden
      durchgeführt, wobei verschiedene Kombinationen bezüglich der
      Besetzung der drei Phenolmoleküle ausprobiert wurden, um
      einen Einblick in erste Schritte bei dem Öffnen der Schleife
      zu bekommen. Die MD Simulation, bei welcher das Phenolmolekül
      auf der Schleife fehlte, zeigte erste Anzeichen für ein
      Öffnen der Schleife, was die ersten Schritte eines
      kaskadenartigen Öffnens darstellen könnte. In einem weiteren
      Projekt wurde eine virtuelle Suche nach neuen Leitstrukturen
      der Aldose Reduktase durchgeführt. Von den besten
      Leitstrukturen wurden fünf Verbindungen synthetisiert und die
      Affinität gemessen. Unter diesen Leitstrukturen war eine
      Verbindung, die eine Affinität von 920nM aufwies. Die
      etablierten Affinitäts-Testsysteme sind, um Fragmente als
      Binder zu finden, noch nicht ausreichend. Die
      Herausforderungen liegen in der schwachen Affinität und der
      schlechten Löslichkeit der Fragmente. Daher wurde der
      bekannte Temperatur-Stabilitäts-Test auf Fragmente
      angewendet. Um die Methode zu etablieren, wurden verschiedene
      Mutanten von EctD charakterisiert. Im letzten Projekt wurden
      Bindungsposen von Arachidonsäurederivaten in einem K+ Kanal
      erzeugt, um eine Vorstellung zu bekommen, wie die Bindung
      aussehen könnte. Eine genaue Bindungspose konnte nicht
      bestimmt werden, es konnte allerdings gezeigt werden, dass
      nur ein einzelnes Arachidonsäuremolekül die innere Pore des
      Kanals blockieren kann.
description: In recent years, fragment screening
      has become a popular approach to identify new lead
      structures. Fragments are usually defined by the Astex ‘rule
      of three’ (RO3). Surface Plasmon Resonance (SPR), Nuclear
      Magnetic Resonance spectroscopy (NMR), biochemical assays and
      X-ray crystallography are efficient screening techniques to
      discover prospective fragments as binders. However, these
      methods need an assembled fragment library. We designed an
      in-house fragment library, starting from approx. 380,000
      commercially available fragments. During library design, we
      modified the RO3 and we did no strict filtering of
      physico-chemical properties during fragment enumeration (e.g.
      twice the number of H-bond acceptors was allowed). The
      fragments were stepwise reduced to 4,000 compounds. The last
      step was a visual inspection of the candidates, which lead to
      a final fragment library of 364 fragments. To validate the
      quality of the library, we screened it against
      endothiapepsin. The biochemical screening suggested 55 hits,
      which were entered into a crystallographic screen. Eleven
      complex crystal structures were determined, pointing out the
      remarkably high hit rate of the designed library. HotspotsX
      is a program which predicts (based on knowledge-based
      potentials) the probability of a certain atom type at a
      certain position in the binding pocket of a target enzyme.
      The eleven crystal structures obtained before were used to
      validate the program HotspotsX. Due to chemical diversity and
      the different binding modes of the fragments observed for the
      library examples we obtained binding through aromatic- ,
      H-bond donor- , acceptor- , doneptor- and hydrophobic
      interactions. The calculated HotspotsX maps coincide
      remarkably well with the crystallographically determined
      fragment positions inside the binding pocket. The program
      HotspotsX has also been validated with crystal structures of
      molecular probes like phenol, urea and methylurea. Crystal
      structures of these molecular probes were determined with
      different targets. Overall, the experimental hotspot analysis
      coincided well with the computed contour maps. Thus, the
      calculated maps by HotspotsX have an excellent predictive
      power. Based on the binding modes of the molecular probe
      phenol to the cAMP-dependent protein kinase A (PKA), we
      started a fragment growing approach. In the latter complex,
      three phenol molecules are bound. Two are occupying the ATP
      binding site and one is sitting on top of the glycine-rich
      loop (G-loop). A virtual screening, using the hinge binding
      phenol as constraint, suggested a phenol derivative for which
      a crystal structure could be determined. Starting from this
      hit, a hotspot analysis was performed. This analysis
      indicates that growth in the direction of the G-loop, placing
      an aromatic portion under the G-loop and an acceptor
      functionality capable to address Lys72 is desired. The first
      compound of this de novo design had an affinity of 70 µM. In
      the following first design cycle, we were able to enhance the
      affinity to 6.5 µM. In the second design cycle an additional
      amino function was introduced, which did not improve affinity
      dramatically, but enhanced ligand efficiency to 0.38. In the
      last cycle, a spacer of one and two methylene groups was
      introduced and the affinity could be increased to about 110
      nM for a diastereomeric mixture of four compounds. The
      phenol-PKA complex provides a putative allosteric site of
      PKA. The G-loop in this structure is in a closed state which
      is stabilized by two H-bonds. This G-loop conformation is
      probably induced by the phenol molecule sitting on top of the
      G-loop. Therefore, several molecular dynamics (MD) studies
      were performed, lacking different phenol molecules, to get
      insights into the G-loop opening. The MD studies suggest that
      after removal of the phenol sitting on top of the G-loop some
      first side chain movements are initiated that can indicate
      the first steps of the G-loop opening cascade. In a different
      project, a virtual screening approach was used to find new
      inhibitors for aldose reductase. A pre-filtered subset of the
      ZINC database was used as ligand dataset. For the best hit, a
      series of five compounds was synthesized. Among them one
      compound displayed an inhibition of 920 nM. The available
      assays to detect fragment hits are currently not sufficient.
      The challenges are the low affinity of the fragments and
      their poor solubility. Therefore, the known thermal shift
      assay was applied and adapted to detect fragment hits. To
      validate the method, it was used to characterize variant
      mutations of EctD. Lastly, a modeling study was used to get
      ideas about possible binding modes of arachidonic acid
      derivatives in a K+ ion channel. One predominant binding pose
      could not be suggested. The study proposes, however, that one
      arachidonic acid molecule can occupy the inner pore cavity,
      which is consistent with experimental data.