title: Guanidine-acylguanidine bioisosteric approach to address peptidergic receptors: pharmacological and diagnostic tools for the NPY Y1 receptor and versatile building blocks based on arginine substitutes
Creators: name: Keller, Max
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Neuropeptid Y , Argininderivate , Isotopenmarkierung , Positronen-Emissions-Tomographie , Fluoreszenzspektroskopie , Bioisosterie , Acylgruppe , Y1-Rezeptorantagonist , Radioligand , Fluoreszenzligand , bivalenter Ligand , Argininamid BIBP 3226 , neuropeptide Y , Y1 receptor antagonist , labeled ligand , bivalent ligand , argininamide BIBP 3226
subject: 540 Chemie

description: Neuropeptide Y (NPY) is one of the most abundant neuropeptides in the central and peripheral nervous system. This 36-amino acid peptide is involved in the regulation of numerous physiological functions such as food intake, blood pressure, stress, nociception and hormone secretion. In humans, the action of NPY is mediated by four receptor subtypes (Y1, Y2, Y4 and Y5), members of the superfamily of G-protein coupled receptors (GPCRs). The Y1 receptor (Y1R) is expressed e.g. in vascular smooth muscle, adipose tissue, in the gastrointestinal tract and in distinct brain regions such as the cerebral cortex and the hypothalamus. Recently, the Y1R gained new interest as it was reported to be expressed in malignancies (e.g. breast and prostate cancer, ovarian and adrenal tumors). The first highly potent and selective Y1R antagonist was the (R)-argininamide BIBP 3226, a C-terminal mimic of NPY. NG-Acylation of BIBP 3226 was demonstrated to retain or even increase the Y1R affinity, thereby improving the pharmacokinetic properties. Taking advantage of these phenomena led to selective radio- and fluorescence labeled argininamide-type Y1R antagonists described in this thesis. NG-substitution with [2,3-3H]-propanoic acid yielded the easily accessible, highly potent and selective tritiated Y1R antagonist [3H]-UR-MK114 (KB = 0.8 nM, KD = 1.2 nM), which was shown to be a useful pharmacological tool for the radiochemical determination of Y1R ligand affinities, the quantification of Y1R binding sites and for autoradiography. Another high affinity potential tritium ligand (Ki = 1.3 nM), containing an aminocarbamoyl linker between the BIBP 3226 pharmacophore and tritiated propionic acid, was prepared and investigated pharmacologically. Aiming at molecular probes for in vivo imaging of Y1Rs, several potential Y1R antagonistic PET ligands were prepared and characterized. For this purpose, omega-aminocarboxylic acids of different length and chemical structure were attached to the guanidine of BIBP 3226, yielding amine precursors for coupling with small fluorinated carboxylic acids (2-fluoropropanoic and 4-fluorobenzoic acid). Two Y1R antagonists with Ki values in the low two-digit nM range were prepared as prototype 18F-labeled PET ligands and administered intravenously to nude mice bearing Y1R expressing subcutaneous SK-N-MC xenografts. One of these PET ligands enabled the detection of the tumor during an early period (&lt; 25 min) after administration, but late imaging of the tumor after systemic clearance of the tracer failed. The relatively high lipophilicity of the PET ligands (logP in the range of 1 � 4) led to rapid biliary excretion, requiring optimization of the physicochemical properties. Diverse BIBP 3226 derived amine precursors were also used for the preparation of a series of Y1R selective fluorescent ligands. In terms of retaining affinity, low molecular weight pyrylium dyes as well as a newly prepared benzothiazolium derivative proved to be superior to cyanine dyes such as S0436. The majority of the most potent fluorescent Y1R antagonists (Ki = 10 - 50 nM) was successfully applied in confocal microscopy and flow cytometric equilibrium binding studies. As bivalent ligands are considered as potential tools to study the dimerization of GPCRs, a series of bivalent Y1R antagonists was prepared through the connection of two BIBP 3226 pharmacophoric entities by dicarboxylic acids of different chain length (8 � 36 atoms) and structure. To exploit the fact that the distomer of BIBP 3226, the (S)-enantiomer, is more than 1000 times less potent, sets of (R,R)-, (R,S)- and (S,S)-configured bivalent ligands were synthesized. The most potent bivalent ligand (Ki = 9 nM), consisting of a 20 atom spacer, revealed a moderately lower Y1R affinity for the (R,S)-stereoisomer compared to the (R,R)-enantiomer (factor of 5), which was not observed for other pairs of (R,R)- and (R,S)-configured bivalent ligands. Interestingly, among the (R,R)-configured ligands only minor differences in affinities (Ki values 9 - 63 nM), irrespective of spacer length and chemical diversity, were observed. A potential bivalent radioligand (Ki = 18 nM) is considered as a potential tool to perform investigations on the stoichiometry of binding sites in combination with monovalent radioligands. The achievements in the Y1R antagonists motivated the preparation of NG-Boc-Na-Fmoc-arginine bearing an appropriate NG�-acyl residue as a versatile building block for solid phase synthesis of modified peptides. The incorporation of such an arginine substitute into angiotensin II (AT) resulted in amino-functionalized and fluorescence-labeled AT derivatives with retained agonistic potency at the AT1 receptor (EC50: 21 and 80 nM, AT: 17 nM). As these arginine derivatives could be universally applied to prepare ligands for any peptidergic receptor, the proof of concept described in this thesis could promote the development and broaden the spectrum of molecular imaging tools.
description: Neuropeptid Y (NPY) ist eines der am häufigsten vorkommenden Neuropeptide im zentralen und peripheren Nervensystem. Das 36-Aminosäuren-Peptid ist an der Regulation einer Vielzahl physiologischer Funktionen wie z.B. Nahrungsaufnahme, Blutdruck, Hormonfreisetzung und Nozizeption beteiligt. NPY-Effekte werden beim Menschen von vier Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y4, Y5), die zur Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) gehören, vermittelt. Der Y1 Rezeptor (Y1R) wird z.B. in der Gefäßmuskulatur, im Fettgewebe, im Gastrointestinaltrakt und in diversen Hirnarealen (z.B. Cortex und Hippocampus) exprimiert. In neueren Untersuchungen wurde eine Y1R-Expression in verschiedenen Tumoren, z.B. Ovarial- und Mammakarzinomen sowie Tumoren der Nebennierenrinde, nachgewiesen. Als erster hochpotenter Y1R-Antagonist wurde das (R)-Argininamid BIBP 3226 beschrieben (1994). NG-Substitution dieses Argininamids mit Elektronen-ziehenden Resten führt zu Derivaten mit vergleichbarer oder sogar höherer Affinität, sowie zu einer Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften. Dieses Phänomen der Bioisosterie wurde im Rahmen dieser Arbeit aufgegriffen und zur Herstellung von Y1R-selektiven Radio- und Fluoreszenzliganden genutzt. Durch NG-Substitution mit einem [2,3-3H]-Propionylrest war der hochpotente selektive tritiierte Y1R-Antagonist [3H]-UR-MK114 (KB = 0.8 nM, KD = 1.2 nM) leicht zugänglich. Dessen Eignung zur radiochemischen Bestimmung von Y1R-Affinitäten und Quantifizierung von Y1R-Bindungsstellen sowie für autoradiographische Experimente wurde gezeigt. Ein weiterer hochaffiner, potentieller Tritiumligand (Ki = 1.2 nM) wurde synthetisiert und pharmakologisch evaluiert. Im Hinblick auf die Entwicklung molekularer Sonden für das In-vivo-Imaging von Y1R wurde eine Reihe potentieller PET-Liganden hergestellt und charakterisiert. Dazu wurde BIBP 3226 an der Guanidinfunktion mit Omega-Aminoacylresten unterschiedlicher Struktur funktionalisiert, um Amino-Precursoren für die Einführung fluorierter Carbonsäuren zu erhalten. Zwei prototypische PET-Liganden mit Ki-Werten im zweistelligen nM-Bereich wurden unter Verwendung von [18F]-2-Fluorpropansäure erhalten und Nacktmäusen mit subkutanen Y1R-positiven SK-N-MC-Tumoren appliziert. Einer der PET-Liganden ermöglichte die Darstellung des Tumors im frühen Stadium nach der Applikation (&lt; 25 min), aber eine Anreicherung im Tumor wurde nicht beobachtet. Die hohe Lipophilie der potentiellen PET-Liganden (logP = 1-4) begünstigt eine rasche biliäre Ausscheidung, so dass eine Optimierung der physikochemischen Eigenschaften erforderlich erscheint. Die von BIBP 3226 abgeleiteten Amino-Precursoren wurden auch zur Herstellung Fluoreszenz-markierter Y1R-Antagonisten verwendet. Hierbei stellten sich die nieder-molekularen Pyryliumfarbstoffe sowie ein neu synthetisiertes Benzothiazolium-Derivat als besonders geeignet heraus. Die Mehrzahl der potentesten Fluoreszenzliganden (Ki = 10 � 50 nM) konnte erfolgreich in durchflusszytometrischen und konfokalmikroskopischen Bindungs¬studien eingesetzt werden. Da bivalente Liganden als potentielle Werkzeuge zur Untersuchung der Dimerisierung von GPCRs gelten, wurde auch eine Serie von bivalenten Y1R-Antagonisten durch Verknüpfung zweier BIBP-3226-Einheiten mit Dicarbonsäuren unterschiedlicher Länge und Struktur hergestellt. Um hinsichtlich der Prüfung auf Stereoselektivität die mehr als 1000-fach geringere Affinität des (S)-konfigurierten Distomers BIBP 3435 einzubeziehen, wurden von bestimmten Verbindungen die (R,R)-, (R,S)- und (S,S)-Isomeren synthetisiert. Der potenteste, (R,R)-konfigurierte bivalente Ligand (Ki = 9 nM), der einen Linker von 20 Atomen Länge besitzt, wies eine etwa 5-fach höhere Affinität als das (R,S)-Stereoisomer auf. Für andere Paare von (R,R)- und (R,S)-konfigurierten Liganden wurde dies nicht beobachtet. Interessanterweise war das Affinitätsfenster für die (R,R)-konfigurierten Liganden ungeachtet der Linker-Länge und der Strukturdiversität relativ klein (Ki-Werte: 9 - 63 nM). Ein bivalenter Radioligand (Ki = 18 nM) wird als potentielles Werkzeug zur Bestimmung der Anzahl von Y1R-Bindungsstellen, u. a. zur Klärung der Bindung an Y1R-Dimere, angesehen. Die Erfolge mit den Y1R-Antagonisten gaben Anlass zur Herstellung von NG-Boc-Na-Fmoc-Arginin, substituiert mit einem geeigneten NG�-Acylrest, als universell einsetzbarer Baustein für die Festphasensynthese von modifizierten Peptiden. Der Einbau solch eines Argininderivats in das Octapeptid Angiotensin II (AT) resultierte in einem Amino-funktionalisierten und einem Fluoreszenz-markierten AT-Derivat mit agonistischer Potenz am AT1-Rezeptor (EC50 = 21 and 80 nM, AT: 17 nM). Da sich solche Argininderivate im Prinzip zur Herstellung von Liganden für verschiedenste peptiderge Rezeptoren eignen, kann die in dieser Arbeit gezeigte Strategie dazu beitragen, die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Werkzeuge voran zu bringen und das Spektrum an Liganden für das molekulare Imaging zu erweitern.