Προσδιορισμός ενδογενών μεταβολιτών σε δείγματα σταφυλιού και γλεύκους ποικιλίας Μοσχάτου Αλεξανδρειας με την τεχνική UPLC(HILIC)-MS/MS
Creators: name: Κετσετζή, Αναστασία Παντελεήμονος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Μεταβολλομική ανάλυση
Μοσχάτο Αλεξανδρείας
Υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μάζας
Metabolomic’s analysis
Muscat of Alexandria
UPLC (HILIC)-MS/MS

description: Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία διερευνήθηκε η ποικιλία Μοσχάτο Αλεξανδρείας. Αποτελεί ποικιλία αμπέλου του είδους Vitis vinifera με μεγάλο οικονομικό και διαθρεπτικό ενδιαφέρον, καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί πέρα από την παραγωγή του κυρίως καρπού, σταφυλιών, για την παραγωγή σταφίδων, αλλά και ιδιαιτέρως, για την παραγωγή αρωματικών οίνων. Η ποικιλία αυτή είναι ευρέως διαδομένη σε όλες τις αμπελουργικές περιοχές της Ελλάδας, κυρίως στη Λήμνο, όπου παράγει λευκούς οίνους με προστατευόμενη ονομασία προέλευσης. Κατά την έρευνα αυτή, αναλύθηκε αποκλειστικά η χημική σύσταση σταφυλιών και γλεύκους μονο-ποικιλιακών αμπέλων της Λήμνου, που παράγουν τον ΠΟΠ (ΟΠΕ) Μοσχάτο Λήμνου οίνο. Στόχος ήταν ο εμπλουτισμός της υπάρχουσας ελλιπούς βιβλιογραφίας, όσον αφορά, το μεταβολικό προφίλ, των υδρόφιλων ενώσεων, της ποικιλίας αυτής, καθώς και η διερεύνηση της μεταβολής του, μεταξύ διαφορετικών αμπελώνων της Λήμνου, στα διάφορα στάδια ωρίμανσης της σταφυλής αλλά και κατά την αλκοολική ζύμωση του γλεύκους. Πιο συγκεκριμένα, σκοπός της διπλωματικής εργασίας ήταν ο στοχευμένος ποιοτικός προσδιορισμός μικρών πολικών ενώσεων σε δείγματα ραγών σταφυλής και γλεύκους, ποικιλίας Μοσχάτου Αλεξανδρείας, με τη μέθοδο Υγρής Χρωματογραφίας Υπέρ Υψηλής Απόδοσης (UHPLC) συζευγμένη με διαδοχική Φασματομετρία Μαζών (MS/MS). Η επιλογή των ενώσεων έγινε με βάση μέθοδο ανίχνευσης 101 πολικών πρωτογενών μεταβολιτών, που είχε αναπτυχθεί σε προηγούμενη έρευνα της ομάδας «Biomic», του ΑΠΘ. Η τεχνική σάρωσης, που επιλέχθηκε, ήταν η παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων θραυσματοποίησης ιόντων (MRM) MS/MS και ως τύπος χρωματογραφίας, η Υγρή Χρωματογραφία Υδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων (HILIC). Η προκατεργασία των δειγμάτων βασίστηκε σε εργασία του κυρίου Γεώργιου Θεοδωρίδη (Theodoridis G. et al, 2012), όπου διερευνήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες προκατεργασίας των συγκεκριμένων υποστρωμάτων για τον προσδιορισμό ενδογενών ενώσεων με μέθοδο ανάλυσης LC-MS/MS. Συνολικά, αναλύθηκαν με τη μέθοδο HILIC‐MS/MS είκοσι εφτά δείγματα ραγών σταφυλών, που λήφθηκαν σε τρεις χρονικές στιγμές κατά τη φυσιολογική ωρίμανση των σταφυλών, από τρείς διαφορετικούς αμπελώνες της Λήμνου και δέκα δείγματα γλεύκους, ένα για κάθε ημέρα που διήρκησε η αλκοολική ζύμωση. Τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά. Ανιχνεύθηκαν και ταυτοποιήθηκαν 52 πρωτογενείς μεταβολίτες στα δείγματα γλεύκους και 35 στα δείγματα ραγών σταφυλών. Κατά την ωρίμανση των σταφυλών καταγράφηκε, ως αναμενόταν, μείωση των οξέων με παράλληλη αύξηση των σακχάρων, ενώ κατά την αλκοολική ζύμωση μείωση των σακχάρων και αύξηση των οξέων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε και στις δύο περιπτώσεις έντονη βιοσύνθεση οργανικών αζωτούχων ενώσεων. Στη συνέχεια, εφαρμόσθηκε μονοπαραμετρική και πολυπαραμετρική στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, με σκοπό τη διερεύνηση των διαφορών μεταξύ των μεταβολικών προφίλ των δειγμάτων. Τα λογισμικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το MS Excel (Microsoft, USA) και SIMCA 13.0 (Umetrics, Umea). Εφαρμόσθηκαν αλγόριθμοι T-test, One-way ANOVA, Two-way ANOVA. Επίσης, η εκτίμηση των αποτελεσμάτων βασίστηκε στην p-value, στη RSD% και στο fold change %. Από τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι κατά την ωρίμανση των σταφυλών επηρεάζονται μεταβολικά μονοπάτια του κύκλου του Krebs, της γλυκόλυσης, της βιοσύνθεσης-καταβολισμού των αζωτούχων ενώσεων (αμινοξέων, αμινών, νουκλεοσιδίων), με τον χρόνο/στάδιο ωρίμανσης της σταφυλής να αποτελεί στατιστικά σημαντικότερο παράγοντα ως προς την επιρροή που ασκεί στο μεταβολικό προφίλ σε σύγκριση με τις περιβαλλοντικές συνθήκες (μικροκλίμα, συνθήκες καλλιέργειας) που επικρατούν στον αμπελώνα. Όσον αφορά την αλκοολική ζύμωση, παρατηρήθηκε επιρροή του κύκλου των φωσφορικών πεντοζών και της βιοσύνθεσης-καταβολισμού των αζωτούχων ενώσεων
description: In this master diploma thesis, was analysed a V. vinifera specie’s variety, Muscat of Alexandria. It consists a variety with great commercial and nutritional interest, since it can be used in addition to the production of the main fruit, grape, for the production of raisins, and especially, for the production of aromatic wines. This variety is widespread in all the wine-growing regions of Greece, mainly in Lemnos, where it produces wines with protected designation of origin (PDO). In this research, the chemical composition of grapes and must, from single-variety vines of Lemnos, which produce the PDO Moschato Lemnos wine, was analysed. The aim was to enrich the existing poor literature about the metabolic profile, of hydrophilic compounds, of this grape variety, as well as to examine its variation between different vineyards in Lemnos, at different stages of grape maturation and during the alcoholic fermentation of the must. More specifically, the aim of the study was the targeted qualitative determination of small polar compounds in both grape and must samples of Muscat of Alexandria white grape variety, by using an Ultra High Performance Chromatography (UHPLC) method coupled with sequential MS/MS spectrometry. The selection of compounds was based on a method that detects 101 polar primary metabolites, developed in previous study of the research team “Biomic”, of AUTH. As scanning technique, the monitoring multiple ion-fragmentation reactions (MRM) MS/MS was selected and as type of chromatography, the Hydrophilic Liquid Chromatography (HILIC). The pretreatment of samples was based on a research of Mr. George Theodoridis (Theodoridis G. et al, 2012), in which the optimal pretreatment conditions for the determination of endogenous compounds by LC-MS/MS in grapes were studied. A total of twenty-seven grape samples, harvested at three time points during the natural maturation of the grapes, from three different Lemno's vineyards and ten must samples, one for each day of the alcoholic fermentation, were analyzed by HILIC-MS/MS method. The results were satisfactory, as 52 primary metabolites were detected and identified in must samples and 35 in grape samples. During the ripening process of wine grapes, was observed, as expected, a reduction in organic acids, with a parallel increase in sugars, while in alcoholic fermentation a decrease in fermented sugars and an increase in acids. In addition, in both cases, intense biosynthesis of organic nitrogenous compounds was indicated. Furthermore, one- and multi-parametric statistical treatments of the results were applied to investigate the differences between the metabolic profiles of the samples. The MS Excel (Microsoft Corporation, USA) and SIMCA 13.0 (Umetrics, Umea) softwares were used and the T-test, One-way ANOVA, Two-way ANOVA algorithms were applied. In addition, the estimation of the results was based on the p-value, the RSD% and the fold change%. The statistical processing of the results revealed, that during grape ripening, metabolic pathways of Kreb’s cycle, of glycolysis, of biosynthesis-catabolism of nitrogen compounds (amino acids, amines, nucleosides) are affected and that the stage of grape maturation is statistically a more important factor to the influence it exerts on the metabolic profile compared to the environmental conditions (microclimate, cultivation conditions) prevailing in the vineyard. As concern the alcoholic fermentation, statistically important affection of the phosphate pentose cycle and biosynthesis-catabolism of nitrogen compounds was observed