title: Rekombinante Herstellung und Charakterisierung der Eierstielproteine aus Chrysoperla carnea
Creators: name: Neuenfeldt, Martin
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2019
Subjects: subject: Seide
subject: Florfliege
subject: qPCR
subject: Genomanalyse
subject: Rekombinante Proteine
subject: Fermentation
subject: Selbstassemblierung
subject: 570
subject: 620

description: Obwohl die Herstellung von Seide der Seidenspinnerraupe Bombyx mori seit einigen tausend Jahren vom Menschen kontrolliert wird, hat erst die in den vergangenen Jahrzehnten entwickelten biotechnologischen Methoden den technischen Zugang zu Seiden vieler anderer Organismen ermöglicht. Neben ihrem ästhetischen Erscheinungsbild stehen Seidenmaterialien auch aufgrund ihrer mechanischen und biomedizinischen Eigenschaften im Fokus des Interesses. In der vorliegenden Dissertation wurde das Seidensystem der europäischen Florfliege Chrysoperla carnea untersucht. Weibliche Florfliegen produzieren sogenannte Eierstiele, an deren Enden sie jeweils ein Ei anheften. Es ist bereits bekannt, dass die in diesen Fasern enthaltenen Seidenproteine vorwiegend in einer cross-beta Konformation vorliegen. Diese strukturelle Eigenschaft wird als hauptverantwortlich für die Biegesteifigkeit der Seidenfaser angesehen. Mittels einer Transkriptomanalyse wurden drei Gene identifiziert, welche jeweils für ein Seidenprotein kodieren. Diese drei Seidenproteine sind reich an Glycin-, Alanin- und Serinresten und wurden ChryC1, ChryC2 bzw. ChryC3 genannt. ChryC1 enthält zwei repetitive Kerndomänen, welche von zwei kleineren terminalen Domänen flankiert sind. ChryC2 und ChryC3 enthalten jeweils nur eine repetitive Kerndomäne. Der repetitive Charakter aller Kerndomänen zeichnet sich durch eine strikte Periodizität von 18 Aminosäureresten aus. Mittels einer quantitativen Analyse der Genexpression wurde gezeigt, dass in der Spinndrüse über 80 Molprozent der Seidenproteine von ChryC1 repräsentiert werden. Für die Genexpression von ChryC1 zu ChryC2 wurde ein Verhältnis von ca. 5,5:1 ermittelt. Alle drei natürlichen Gensequenzen wurden anschließend einem bakteriellen Expressionssystem zugeführt. Für die biotechnologische Herstellung aller drei Seidenproteine musste eine Fermentationsstrategie etabliert werden, welche die Seidenproteine vor zellulären Abbaureaktionen schützt. Hierfür erwiesen sich Fermentationen, bei denen die Induktion der Genexpression bei niedrigeren Zelldichten durchgeführt wurde, als besonders geeignet. Für die nachfolgende Aufarbeitung wurde für alle drei Proteine eine sequentielle selektive Fällungsstrategie etabliert. ChryC1 und ChryC3 wurden jeweils mittels aufeinanderfolgender Behandlung mit Hitze, Essigsäure und kosmotropen Salzen von den bakteriellen Proteinen abgetrennt. ChryC2 erwies sich zwar ebenfalls als hitze- und säurebeständig, es präzipitierte jedoch nicht in Gegenwart kosmotroper Salze. Stattdessen wurde zunächst dieses Seidenprotein zusammen mit bakteriellen Proteinrückständen durch Zugabe organischer Lösungsmittel gefällt und aus dem resultierenden Präzipitat mittels eines wässrigen Puffers selektiv resolubilisiert. Zum Verständnis der molekularen Grundlagen des natürlichen Spinnprozesses wurden anschließend die drei Seidenproteine auf ihre Selbstassemblierungseigenschaften untersucht. Für alle drei Proteine konnte gezeigt werden, dass sie in wässriger Lösung vorwiegend random coil Strukturen enthalten. Durch Zugabe von Ethanol konnten jeweils beta-Faltblattstrukturen induziert werden. Für ChryC3 stellte dies der einzige Selbstassemblierungsprozess dar, der in dieser Arbeit beobachtet wurde. ChryC1 wies als einziges Seidenprotein eine untere kritische Lösungstemperatur von 27,3°C auf; oberhalb dieser Temperatur wurde eine Mikrophasenseparation der Proteinlösung beobachtet. Aus konzentrierten Lösungen von ChryC1 heraus konnte außerdem die Formation von gleichmäßigen Filmstrukturen beobachtet werden, in diesen nativen Filmen (ohne Nachbehandlung) wurde ein Anteil von knapp 50% an beta-Faltblattstrukturen nachgewiesen. Lösungen von ChryC2 reagierten hingegen spontan zu Hydrogelen. Elektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass diese Hydrogele Nanofibrillen mit einem mittleren Durchmesser von 5 nm enthielten. Diese Fibrillen wiesen vorwiegend beta-Faltblattstrukturen auf. Im zweiten Teil der Dissertation wurde ChryC1 zu Nanovliesstoffen elektroversponnen. Über den Parameter der eingesetzten Proteinkonzentration konnte der durchschnittliche Faserdurchmesser der resultierenden Vliesstoffe beeinflusst werden. Um die Beständigkeit gegenüber Umwelteinflüssen zu erhöhen, wurden die versponnenen Vliesstoffe mittels Wasserdampf nachbehandelt. Spektroskopische Messungen ergaben, dass diese Nachbehandlung im erheblichen Umfang beta-Faltblattstrukturen in den Fasern induzierte. Nachfolgend wurden Vliesstoffe unterschiedlicher Belegungsdichten einem Filtertest zugeführt, um ihre Eignung zur Filtrierung von Feinstaub zu evaluieren. Als Vergleich wurde dieser Filtertest auch mit elektroversponnenen Nanovliesstoffen aus dem rekombinant hergestellten Spinnenseidenprotein e(ADF4)C16 sowie aus Polylaktid bzw. Polyethylenglycol durchgeführt. Mit dem Filtertest wurde gezeigt, dass bei höheren Belegungsdichten Vliesstoffe aus ChryC1 und aus eADF4(C16) ähnliche Abscheidungsraten an Feinstaubpartikeln aufwiesen, diese Filterleistung ging bei Vliesstoffen aus ChryC1 jedoch mit einem geringeren Druckabfall einher. Insgesamt stellen die Studien über die Selbstassemblierungseigenschaften von Seidenproteinen der Florfliege einen weiteren Baustein zum besseren Verständnis des natürlichen Spinnprozesses dar. Diese Erkenntnisse können zum Ziel beitragen, langfristig diesen Spinnprozess in vitro nachahmen zu können. Mit der Herstellung von Vliesstoffen aus ChryC1 wurde zudem eine vielversprechende Morphologie für technische Anwendungsmöglichkeiten vorgestellt.