title: Decoding Complex Architectures of K48- and K63-linked Ubiquitin Chains
Creators: name: Waltho, Anita
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: Proteine
subject: Zell
subject: Ubiquitin
subject: Massenspektrometrie
subject: Huntington Erkrankung
subject: post-translational modification
subject: Molecular biology
subject: Protein
subject: Cell
subject: Ubiquitin
subject: Mass spectrometry
subject: Huntington's disease
subject: Posttranslational modification
subject: Molecular biology
subject: 570 Biologie
subject: 572 Biochemie

description: Ubiquitinierung ist eine posttranslationalen Modifikation (PTM), die nahezu alle zellulären Prozesse reguliert. Diese Fähigkeit wird durch den Ubiquitin (Ub)-Code erreicht, der durch Merkmale wie Verknüpfungstyp, Kettenlänge und Verknüpfungskombinationen definiert wird. Wichtige Komponenten des Ub-Systems sind die Ub-bindenden Proteine (UbBPs), die den Ub-Code lesen und in zelluläre Funktionen übersetzen. Obwohl viele verknüpfungsspezifische UbBPs beschrieben wurden, ist nicht vollständig verstanden, wie sie komplexere Ub-Architekturen entschlüsseln. Ub-Verzweigungen, bei denen ein Ub mit mehr als einem anderen Ub verbunden ist, und die Ub-Kettenlänge sind solche Merkmale, die noch unzureichend erforscht sind. In dieser Arbeit wurden die beiden häufigsten Verknüpfungstypen K48- und K63-gebundenes Ub auf Verzweigungs- und Längenspezifische UbBPs untersucht. Dies erfolgte durch enzymatische Synthese und Reinigung von Ub-Ketten sowie die Etablierung einer Ub-Interaktor-Anreicherung gekoppelt mit Massenspektrometrie. Mit dieser Methode konnten Ub-Ketten-Interaktoren identifiziert und deren Kettentyp-Präferenz ermittelt werden. Einige der ersten K48/K63-gebundenen verzweigten Ub-spezifischen Interaktoren wurden identifiziert, darunter PARP10/ARTD10, E3-Ligasen UBR4 und HIP1. Es wurden auch Interaktoren mit einer Präferenz für Ub3 gegenüber Ub2-Ketten bestimmt, darunter DDI2, CCDC50 und FAF1. Zusätzlich zur Identifizierung von Verzweigungs- und Längenspezifischen UbBPs wurde die Eignung von zwei Deubiquitinase-Inhibitoren getestet. Schließlich wurde die zelluläre Funktion von K48/K63-gebundenem, verzweigtem Ub in Folgeexperimenten untersucht.
description: Ubiquitination is a post-translational modification (PTM) which regulates almost all cellular processes. The capacity to regulate such a wide range of processes is achieved through the ubiquitin (Ub) code. This denotes the wide array of complex Ub architectures which can be characterised by features such as linkage type, chain length and linkage combinations. Key to the Ub system are the Ub-binding proteins (UbBPs) which read the Ub code and translate it into cellular functions. Although many linkage-specific UbBPs have been described, how UbBPs are able to decode more complex Ub architectures is not fully understood. Ub branches, when a single Ub has more than one other Ub attached to it, and Ub chain-length are two of such architectural features which remain understudied. In this work, the two most abundant linkage types K48- and K63-linked Ub were interrogated for branch- and length-specific UbBPs. This was achieved by Ub chain enzymatic synthesis and purification, followed by the establishment of an Ub interactor enrichment coupled with mass spectrometry method. This method was able to identify Ub chain interactors and using statistical comparisons elucidate their chain type preference. Some of the first K48/K63-linked branched Ub-specific interactors were identified, including histone ADP-ribosyltransferase PARP10/ARTD10, E3 ligase UBR4 and huntingtin-interacting protein HIP1. Ub interactors with a preference for Ub3 over Ub2 chains were also determined, including Ub-directed endoprotease DDI2, autophagy receptor CCDC50 and p97-adaptor FAF1. Alongside the identification of branch- and length-specific UbBPs, the suitability of two different deubiquitinase inhibitors for use in this type of binding screen was tested. Finally, the cellular function of K48/K63-linked branched Ub was investigated in follow-up experiments based on the branch-specific interactors identified.