Σχεδιασμός, σύνθεση και Φαρμακοχημική μελέτη νέων υβριδικών παραγώγων κινναμωμικών οξέων με πιθανή βιολογική δράση
Creators: name: Πεπερίδου, Αικατερίνη Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Κινναμωμικά παράγωγα
Υβριδικά φάρμακα
Αντιφλεγμονώδης δράση - Αναστολείς λιποξυγονάσης
Cinnamic acid derivatives
Hybrid drugs
Antiinflammatory activity - Lipoxygenase inhibitors

description: Τα κινναμωμικά οξέα αποτελούν μια ομάδα χημικών ενώσεων με τεράστια ποικιλία βιολογικών δράσεων. Μερικές από τις δράσεις είναι η αντιφλεγμονώδης δράση, μέσω της αναστολής της δράσης διαφόρων ενζύμων που εμπλέκονται στο φαινόμενο της φλεγμονής, η αντιοξειδωτική δράση μέσω της παγίδευσης ελευθέρων ριζών, η αντιβακτηριακή και η υπολιπιδαιμική δράση. Επιπλέον, τα παράγωγα του κινναμωμικού οξέος αποτελούν συστατικά διαφόρων φυτών, καθώς συμμετέχουν στις βιοχημικές οδούς φαινυλοπροπανοειδών και σικιμικών εστέρων. Οι ενώσεις αυτές παρουσιάζουν συνθετικό ενδιαφέρον τόσο ως τελικά, αλλά και ως ενδιάμεσα προϊόντα. Η φαρμακολογική θεραπεία ασθενειών, που εμφανίζουν πολύπλοκη ετερογενή παθογένεια, αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα, καθώς ένα μόνο φάρμακο μπορεί να καθίσταται ανεπαρκές για τον έλεγχο της ασθένειας κι έτσι να απαιτείται συνδυασμός φαρμάκων με διαφορετικά φαρμακοθεραπευτικά προφίλ. Τα υβριδικά φάρμακα συνδυάζουν «δύο φάρμακα» σε ένα μόνο μόριο με στόχο τη δημιουργία μιας χημικής οντότητας φαρμακολογικά δραστικότερης από τα επιμέρους συστατικά της. Τα τελευταία χρόνια πραγματοποιήθηκε μεγάλη πρόοδος στη σύνθεση πολυλειτουργικών υβριδικών μορίων. Παλιότερα, στο εργαστήριο μας ένας μεγάλος αριθμός κιναμμωμικών οξέων κατάλληλα υποκατεστημένων συντέθηκε και πραγματοποιήθηκε in vivo/in vitro μελέτη ως προς την αντιφλεγμονώδη/αντιοξειδωτική συμπεριφορά και την ικανότητα αναστολής της δράσης της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης. Στα πλαίσια του ορθολογικού σχεδιασμού δραστικών μορίων χρησιμοποιούνται μελέτες πρόσδεσης (virtual screening) σε διάφορα μοντέλα λιποξυγονάσης για τον σχεδιασμό και τη σύνθεση ενός νέου αναστολέα της LOX, του υβριδικού παραγώγου του κινναμωμικού οξέος (ΚΡ1) με την παρακεταμόλη. Το οξύ ΚΡ1 που χρησιμοποιήθηκε παρουσιάζει την καλύτερη ανασταλτική δράση επί της LOX. Έτσι, αυτή η μελέτη πρόσδεσης επί του ενζύμου της LOX αποτέλεσε το έναυσμα για να προχωρήσουμε στη σύνθεση μιας σειράς υβριδικών παραγώγων του κινναμωμικού οξέος με κάποια γνωστά φαρμακομόρια ή «φαρμακομιμητικά» μόρια. Τα νέα υβριδικά παράγωγα διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: α)εστέρες κινναμωμικού οξέος και β) αμίδια κινναμωμικού οξέος. Η σύνθεση των κινναμωμικών οξέων στηρίζεται στην αντίδραση Knoevenagel-Doebner μεταξύ της κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης και του μηλονικού οξέος παρουσία βάσεων. Οι ενώσεις αυτές λήφθηκαν με πολύ καλές αποδόσεις, ενώ τα φασματοσκοπικά και φυσικοχημικά δεδομένα ταυτίζονται με τα αναφερόμενα στη σχετική βιβλιογραφία. Για τη σύνθεση των νέων υβριδικών ενώσεων, εφαρμόστηκαν γνωστές αλλά και τροποποιημένες αντιδράσεις και τεχνικές απλές στην εφαρμογή αλλά και αποτελεσματικές στην απόδοση. Για την ταυτοποίηση των δομών, χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι ενόργανης ανάλυσης, φασματοσκοπία IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS(ΕSI), στοιχειακή ανάλυση και χρωματογραφικές μέθοδοι. Εφαρμόστηκε το πρόγραμμα Silicon Graphics (Spartan) για εξαγωγή φυσικοχημικών ιδιοτήτων και απεικονίσεων. Η λιποφιλικότητα είναι μια φυσικοχημική ιδιότητα που καθορίζει την απορρόφηση, κατανομή, δράση και απέκκριση των μορίων. Οι τιμές λιποφιλικότητας των ενώσεων υπολογίστηκαν με τη θεωρητική υπολογιστική μέθοδο ClogP και πειραματικά με τη μέθοδο χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης ως τιμές RM. Οι ενώσεις μελετήθηκαν με τη βοήθεια πειραμάτων in vitro και in vivo για τη δράση τους ως αντιφλεγμονώδη, αναλγητικά, αντιοξειδωτικά και ως πιθανοί αναστολείς του ενζύμου της τρυψίνης που εμπλέκεται στην διαδικασία της φλεγμονής. Ειδικότερα, οι ενώσεις δοκιμάστηκαν στα παρακάτω πειράματα: Φαρμακοχημικές δοκιμασίες in vitro: 1. Αλληλεπίδραση των ενώσεων με την ελεύθερη σταθερή ρίζα του 1,1-διφαινυλο-πικρυλυδραζυλίου (DPPH) 2. Αναστολή της υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος 3. Αναστολή του ενζύμου της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης (από σόγια) 4. Αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της τρυψίνης 5. Μελέτη της δράσης της εστεράσης τρυψίνης επί των υβριδικών ενώσεων 6. Μελέτη της σταθερότητας υβριδικού μορίου ΚΡ3 σε συνθήκες που προσομοιάζουν με τα υγρά του στομάχου και του εντερικού σωλήνα Βιολογικά πειράματα in vivo: 1. Αναστολή της εμφάνισης του οιδήματος του άκρου ποδός επίμυα που προκαλείται από την ενδοδερμική χορήγηση της καρραγενίνης 2. Μελέτη αναλγητικής δράσης μέσω πρόκλησης πόνου με χημικό ερέθισμα (Writhing Test) 3. Πειράματα συμπεριφοράς για την αξιολόγηση βλάβης περιφερικού νεύρου και πιθανής αποκατάστασης της βλάβης μετά από χορήγηση του υβριδικού παραγώγου του οξέος ΚΡ1 με την παρακεταμόλη. Από τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις παραπάνω σειρές πειραμάτων, διαπιστώνουμε ότι όλες οι ενώσεις έδειξαν χρωματογραφικά ότι αλληλεπιδρούν με τη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPPH. Οι περισσότερες ενώσεις παρουσίασαν υψηλή ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος που επάγεται από το AAPH (90-100 %), με εξαίρεση το αμιδικό παράγωγο ΚΡ16. Μάλιστα οι νέες υβριδικές ενώσεις εμφανίζουν μεγαλύτερη αντιλιπιδική δράση σε σχέση με τα πρόδρομα κινναμωμικά οξέα. Η αναστολή της λιποξυγονάσης φυτικής προέλευσης μελετήθηκε σε όλες τις ενώσεις και έγινε προσπάθεια υπολογισμού των τιμών IC50. Την καλύτερη ανασταλτική δράση επί της LOX φυτικής προέλευσης έδειξε η ένωση ΚΡ20 (ΙC50=10 μΜ) με ακόλουθη την ένωση ΚΡ19 ( ΙC50=55μ M). Η ένωση ΚΡ21 (ΙC50=5 μΜ) εμφανίζει ιδιαίτερα ισχυρή αντιπρωτεολυτική δράση. Επίσης, τα υβριδικά παράγωγα ΚΡ3, ΚΡ12, και ΚΡ13 παρουσιάζουν πολύ ισχυρή αναστολή της πρωτεολυτικής δράσης της τρυψίνης με τιμές IC50 = 10 μΜ. Φαίνεται ότι οι ενώσεις ΚΡ3 (73 %) και ΚΡ7 (77 %) υφίστανται ισχυρότερα τη δράση της τρυψίνης ως εστεράσης και έτσι διασπάται ο εστερικός δεσμός τους μετά την πάροδο 90 λεπτών. Η εστερική ένωση ΚΡ3 παραμένει σταθερή σε συνθήκες μιμούμενες το περιβάλλον του στομάχου και του εντερικού σωλήνα. Οι ενώσεις ΚΡ3 και ΚΡ7 διαπιστώθηκε ότι αναστέλλουν το οίδημα που προκαλείται από καρραγενίνη (35-45%) σε μικρό ποσοστό. Οι περισσότερες υβριδικές ενώσεις μελετήθηκαν in vivo, ως προς την αναλγητική τους δράση (μοντέλο πρόκλησης πόνου από χημικό ερέθισμα: 0,6 % διαλύματος οξικού οξέος) και βρέθηκαν να αναστέλλουν τον πόνο που προκλήθηκε από χημικό ερεθισμό. Την καλύτερη δράση έδειξε η ένωση ΚΡ3 με 91 % προστασία. Aυτό το υβριδικό μόριο επιταχύνει την λειτουργική αποκατάσταση του ισχιακού νεύρου σε επίμυες και φαίνεται να αποτελεί έναν πολλά υποσχόμενο παράγοντα για την θεραπεία τραυματισμών του περιφερικού νεύρου. Γίνεται προσπάθεια α) να συσχετισθούν ποσοτικά τα in vitro/in vivo αποτελέσματα με τις σημαντικότερες φυσικοχημικές ιδιότητες των δομικών στοιχείων των μορίων με την βοήθεια της υπολογιστικής φαρμακοχημείας και την εφαρμογή του υπολογιστικού προγράμματος C-QSAR και β) να διευκρινισθεί η συσχέτιση των δράσεων μεταξύ τους ώστε να προταθεί ένας πιθανός μηχανισμός δράσης. Οι ενώσεις ΚΡ20, ΚΡ3 και ΚΡ21 παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Η πρώτη θα αποτελέσει οδηγό ένωση για τον σχεδιασμό νέων αναστολέων λιποξυγονάσης, ενώ η ΚΡ3 για τον σχεδιασμό αναστολέων της τρυψίνης με αναλγητική δράση. Η ένωση ΚΡ21 μπορεί να αποτελέσει οδηγό ένωση για τον σχεδιασμό νέων αναστολέων σερινοπρωτεασών.
description: The cinnamic acids are a group of chemical compounds with a wide variety of biological effects. Some of them are: anti-inflammatory effect by inhibiting the action of various enzymes involved in inflammation, antioxidant activity, scavenging of free radicals, antibacterial and hypolipidemic action. Furthermore, derivatives of cinnamic acid are components of various plants, as well as they are important intermediates in the biochemical pathways of phenylnylopropanoeid and shikimate esters. These compounds are of particular synthetic interest both as ultimately, and as intermediates. The pharmacological treatment of diseases having complex heterogeneous pathogenesis represent a problem, as a single drug is not always able to adequately control the illness and the combination of drugs with different pharmaco-therapeutic profile may be needed. Hybrid drugs, combine two drugs in a single molecule with the goal of creating a chemical entity more medically effective than its individual components. Today, there is an increase interest in the combination of two pharmacophores on the same scaffold. In our laboratory a large number of appropriately substituted cinnamic acids was synthesized and subjected in vivo / in vitro studies as anti-inflammatory / antioxidant agents regarding the inhibition of the activity of soybean lipoxygenase. For the rational design of active molecules, docking simulations binding studies are used (virtual screening- lipoxygenase in various models) for the design and synthesis of a new LOX inhibitor, the hybrid derivative of cinnamic acid (KP1) with paracetamol. The KP1 acid had the best inhibitory activity of LOX. Thus, the binding study’s result on the enzyme LOX triggered us to synthesize a series of hybrid derivatives of cinnamic acid with a known drug molecule or "drug-mimetic" molecules. These new hybrid derivatives are divided into two categories: a) esters of cinnamic acid and b) amides of cinnamic acid. The synthesis of cinnamic acid is based on the Knoevenagel-Doebner reaction between the appropriately substituted aldehyde and malonic acid in the presence of bases. These compounds were obtained in good yields, and the physicochemical and spectroscopic data are identical to those reported in the relevant literature. For the synthesis of novel hybrid compounds were applied known and modified reactions and simple techniques, which lead to good yields. The structures of the compounds are confirmed by IR, 1 H-NMR, 13 C-NMR, LC/MS ESI + and elemental analysis. Silicon Graphics (Spartan) Program was applied for extraction of the physicochemical properties and depictions. Lipophilicity is a physical property that determines the absorption, distribution, action and excretion of molecules. Lipophilicity values of compounds were calculated theoretically by the ClogP method and experimentally by reversed chromatography method as RM values. The compounds were studied through in vitro and in vivo experiments for their activity as anti-inflammatory, antioxidant, analgesic and as inhibitors of enzyme involved in inflammation. In particular, the compounds were tested in the following experiments: Pharmacochemical tests in vitro: 1. DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical scanvenging assay 2. Inhibition of lipid peroxidation using AAPH [2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide] 3. Soybean lipoxygenase inhibition assay 4. Inhibition of proteolytic action of trypsin 5. Esterase activity of trypsin on hybrid compounds 6. Study of the stability of KP3 hybrid molecule under gastrointestinal –mimetic conditions Biological experiments in vivo: 1. Inhibition of the carrageenin-induced paw edema (CPE) 2. Study of antinociception activity using the Writhing Test 3. Behavioural tests for the evaluation of peripheral nerve damage and possible recovery after administration of the hybrid derivative KP3. In the above series of experiments, we found that all the compounds showed that interact with the stable free radical DPPH. Most of the compounds showed high ability to inhibit lipid peroxidation of linoleic acid induced by AAPH (90-100%), with the exception of the amide derivative KP16. Indeed, the novel hybrid compounds exhibit greater anti-lipidic action relative to the precursor cinnamic acids. Most of the compounds showed medium inhibitory effect on LOX and for some compounds were trying to calculate values of IC50. KP20 showed quite a strong inhibitory effect on LOX (IC50 = 10 μM) followed by compound KP19 (IC50 = 55 μM). Hybrid derivatives KΡ3, KΡ12, and KΡ13 exhibit very strong inhibition of the proteolytic activity of trypsin with values of IC50 at 10 μM whereas KP21 (IC50 = 5 μM) is the strongest. It appears that the ester bond in compounds KΡ3 (73%) and KΡ7 is hydrolyzed under the activity of esterase after 90 minutes. The ester compound KP3 remains stable under gastrointestinal-mimetic conditions. Compounds KP7 and KP3 were found to inhibit limited the carrageenin-induced paw edema (35-45%). Most hybrid compounds were studied in vivo for their antinociception effect and were found to inhibit the pain caused by chemical stimulus. The best action is given by compound KP3 with 91% protection. This hybrid molecule accelerates functional recovery following sciatic nerve crush in the rat and it appears to be a promising agent for treating peripheral nerve injuries. Efforts are conducted a) to analyze and correlate quantitatively the in vitro / in vivo results with the most important physicochemical properties and take QSAR models using the C-QSAR and b) to clarify the correlation of actions among them and c) to propose a possible mechanism of action. Compound KP20 can be used as a lead compound for the design of new LOX inhibitors, KP21 as a lead molecule for the design of trypsin inhibitors, whereas KP3 as a lead molecule for the design of trypsin inhibitors with a combined antinociception effect.