title: Ansätze zur Entwicklung und Charakterisierung von Inhibitoren gegen die Serinprotease Thrombin, die Dengue-Virus-Protease und die bakterielle RNase P
title: Approaches to the development and characterization of inhibitors against the serine protease thrombin, dengue virus protease, and bacterial RNase P
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Scanlan, James Helmut William
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Röntgenstruktur
drug design
selectivity
Denguevirus
elektrondensity
Vorhofflimmern
Thrombin
xray structure
antibiotics
Proteaseinhibitor
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
blood coagulation
RNase P
Selektivität
Wirkstoffdesign
protease inhibitor
Anitbiotika
Antikoagulantien

description: Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Projekte auf Grundlage unterschiedlicher Vorarbeiten realisiert. Dabei kamen in allen drei Projekten die Methoden des rationalen Wirkstoffdesigns zur Anwendung. Im ersten Teilprojekt wurde eine Fragmentbibliothek aus 96 verschiedenen Kleinmolekülen gegen die Serinprotease Thrombin gescreent. Sieben verschiedene Fragmentmoleküle konnten anschließend ihrer komplementären Elektronendichte in den Röntgenstrukturen zugeordnet und ihre Bindungsmodi evaluiert werden. Das entspricht einer Trefferquote von 7.3%. Im Zuge der Evaluation wurde festgestellt, dass die Fragmente die Spezifitätstaschen (S1-S4) der Protease adressieren. Außerdem wurden zielgerichtete Interaktionen mit den katalytisch akti-ven Aminosäuren im Falle der Fragmente J77, J80 und J89 identifiziert. Des Weiteren konn-ten Beiträge zum Verständnis der selektivitätsbestimmenden Charakteristika zwischen den Serinproteasen Trypsin und Thrombin abgeleitet werden. Die Serinprotease Thrombin nimmt eine Schlüsselfunktion in der Blutgerinnungskaskade ein und die Inhibition wird vor allem zur Behandlung des Vorhofkammerflimmerns oder der Prävention von Schlaganfällen ange-strebt. So können die identifizierten Fragmentmoleküle als Startpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren mit verbesserter Bioverfügbarkeit, Selektivität und Wirksamkeit dienen. Außerdem lassen sich die gewonnenen Erkenntnisse auf die Entwicklung von Inhibitoren gegen Serinproteasen mit ähnlichem Faltungsmuster übertragen. Da bis heute keine spezifische therapeutische Behandlung des Denguefiebers, eine durch Arthropoden übertragene Krankheit, zur Verfügung steht beschäftigt sich diese Arbeit im zweiten Teilprojekt mit der Entwicklung und Evaluation von allosterischen Inhibitoren gegen die Dengue-Virus-Protease (Serotyp 3). Aufbauend auf einem in silico docking wurden 15 verschiedenen Verbindungen erworben und mittels fluoreszenzbasiertem Enzym-Assay getes-tet. Die wirksamste dieser Verbindungen (KMH14, IC50=136±16 μM) zeigte einen nicht-kompetitiven Bindungsmodus und die Kernstruktur wurde als Ausgangspunkt für anschlie-ßende Designzyklen verwendet. Im zweiten Zyklus wurden 17 weitere Verbindungen, die auf dem Kernmotiv von KMH14 aufbauen, in vitro getestet. Die potenteste Verbindung (KMD027, IC50=28±7.9 μM) zeigte eine signifikant erhöhte Aktivität gegen die Dengue-Virus-Protease (Serotyp 3) und ein allgemeines Strukturmotiv für die allosterische Inhibition konnte daraus abgeleitet werden. Im letzten Designzyklus wurde so die Aktivität mittels ge-zielter SAR-Studie auf IC50=12.3±3.5 μM gesteigert. Begleitend wurde versucht, die identifi-zierten Verbindungen kristallographisch zu untersuchen. Dabei gelang es, die Kristallisation in unserem Kristalllabor zu etablieren und stabile soaking-Bedingungen zu identifizieren. Zusätzlich wurde ein binäres Zika-Virus-Konstrukt mutiert, um die Bindetasche zu vergrö-ßern und eine kristallographische Untersuchung der entwickelten Dengue-Virus-Inhibitoren zu ermöglichen. Außerdem konnte eine geringe Zytotoxizität der Liganden ermittelt werden. Alles in allem stellen die Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit einen sehr guten Ausgangspunkt für die Entwicklung weiterer potenter Inhibitoren gegen die Dengue-Virus-Protease dar. Der dritte und letzte Teil dieser Arbeit diente der Identifizierung neuer Ansatzpunkte für die Entwicklung von antibiotisch wirksamen Substanzen. Dafür wurde als neues target das P-Protein der RNase P ausgewählt. Da durch Resistenzentwicklungen der Bakterien und fehlen-de Entwicklung neuer Antibiotika eine Zunahme von Infektionskrankheiten mit Todesfolge droht, ist auch hier die Entwicklung von neuartigen Wirkstoffen ein Ziel der Arzneimittelfor-schung. Zunächst wurde das P-Protein der RNase P des pathogenen Organismus Mycobac-terium ulcerans erfolgreich isoliert und mit hoher Ausbeute aufgereinigt. Außerdem wurden Versuche unternommen dieses Protein zu kristallisieren und erste Bedingungen konnten identifiziert werden. Ein bereits literaturbekannter Inhibitor der RNase P konnte in weiteren Experimenten als PAIN (Pan-Assay Interference Compound) identifiziert und dessen postu-lierte Reaktion als Aggregation aufgeklärt werden. Somit ist eine auf falschen Messdaten beru-hende Wirkstoffentwicklung nicht mehr möglich. Zusätzlich können neue Inhibitoren auf-bauend auf den Vorarbeiten entwickelt werden.