Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen – Verfahrensentwicklung, Produktcharakterisierung und Erprobung
Creators: name: Hildebrandt, Ellen
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2017
Subjects: Arzneimitteltransportsysteme
Liposomen
Zentrifugation
Emulsionen
Phospholipide
Lipoproteine
Grenzflächencharakterisierung
Adsorption
Tropfen-Profil-Analyse Tensiometrie
DLS
NMR
in vitro Studien
Lektine
Zell-Proliferation
Tumortherapie

description: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Erzeugung funktionaler Lipidkapseln aus Nanoemulsionen sowie der Verfahrensentwicklung und Charakterisierung einzelner Prozesse und Zwischenprodukte. Insbesondere geht diese Ausarbeitung auf Grenzflächenphänomene in kolloidalen Systemen ein, die für pharmazeutische Anwendungen relevant sind. Fernerhin ist die Erprobung von Wirkstoffen auf zellulärer Ebene ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Arbeit.
Die zentrifugale Herstellung von Liposomen aus Nanoemulsionen nach Pautot et.al. [1, 2] zeigt, dass der Transport von wässrig dispergierter Phase aus der Ölphase in eine unterliegende Wasserphase prinzipiell möglich ist. Der Nachweis erfolgt durch die Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Emulgators sowie der Untersuchung der beteiligten Phasen mittels dynamischer Lichtstreuung. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass Phospholipide, welche im Öl gelöst sind, nach der Zentrifugation nur zu maximal 5% in dieser ursprünglich gelösten Phase verbleiben. Daraus und aus den Informationen der Analyse der wässrigen Phase nach der Zentrifugation kann abgeleitet werden, dass sich die Phospholipide zu mindestens 50% an dem Aufbau der Grenzfläche zwischen Wasser und Öl, zur Stabilisierung der Emulsionströpfchen, beteiligen.
Die Ergebnisse der Charakterisierung der gebildeten Partikel, welche nach der Zentrifugation in der Wasserphase zu finden sind, weisen darauf hin, dass das Verfahren in seiner technologisch realisierten Form, basierend auf dem Prozess von Pautot et.al. [1, 2], nicht zu den gewünschten Einkapselungseffizienzen führt. Es ergaben sich präzisierte Aufgabenstellungen sowie offene Fragen zur exakten Bildung von Phospholipid-Mono- bzw. Doppelschichten, welche hinsichtlich der Stabilität der Grenzflächen maßgeblich sind. Der Transport der Wasser-in-Öl Emulsionen in die unterliegende Wasserphase führt vermutlich zu einer Deformation der Emulsionströpfchen, bevor diese an der Phasengrenze von einer zweiten Phospholipidschicht ummantelt werden, was in einer ungewollten Freisetzung von Wirkstoff resultiert. Dies äußert sich in Partikeln oder Liposomen, die im Durchschnitt etwa die Hälfte der Partikelgröße der zuvor erzeugten Emulsionen aufweisen sowie in Einkapselungseffizienzen von etwa 25%. Um ein besseres Verständnis über das Adsorptionsverhalten der Emulgatormoleküle, den Phospholipiden, zu erreichen, liegt der Fokus dieser Arbeit auf tensiometrischen Untersuchungen an der Wasser/Öl-Grenzfläche. Diese Analysen liefern einen Einblick in die Flächendichte der Moleküle an der Phasengrenze, was zur Optimierung und späteren Realisierung stabiler Lipidschichten im Zentrifugationsprozess ohne zu hohen Wirkstoffverlust, von Bedeutung ist.
Die Charakterisierung der Struktur und des Aufbaus von Schichten adsorbierter Phospholipidmoleküle, an der Grenzfläche zwischen Wasser und einer zweiten organischen Phase, erfolgt mit Hilfe der Tropfen-Profilanalyse Tensiometrie (PAT). Mittels PAT werden Untersuchungen von Phospholipiden unterschiedlicher Sättigung in den verschiedenen pharmazeutisch relevanten Ölphasen Squalen und Squalan durchgeführt, die Rückschlüsse über die Packungsdichte adsorbierter Moleküle zulassen. In Abhängigkeit von der Sättigung der Ölphasen, in denen die Phospholipide gelöst sind, lassen sich darüber hinaus klare Indizien für eine Monoschichtbildung in der ungesättigten Phase Squalen und für eine Multischichtbildung in der gesättigten Phase Squalan ableiten. Dieses Ergebnis erlaubt zudem Rückschlüsse auf die Stabilität von Emulsionen, was jedoch in dieser Arbeit nicht Gegenstand weiterer Untersuchungen ist.
Die systematische Variation der Tropfenphase und der umgebenden Phase bei der tensiometrischen Analyse ergibt zudem signifikante Unterschiede, die in vergleichender Form noch nicht in der Literatur beschrieben sind. Um deren Ursache aufzuklären und um verifizierte tensiometrische Messergebnisse zu erhalten, kommt zusätzlich Chloroform mit dem Phospholipid DPPC als Referenz zum Einsatz, das als gut beschriebenes Stoffsystem gilt. Durch diese ergänzenden Betrachtungen, auch mit Hilfe weiterer Messmethoden wie der dynamischen Lichtstreuung, Kernspinresonanzspektroskopie und Phosphatanalytik, ist die Ursache für diese Messunterschiede näher beschreibbar. Es wurde eine Abreicherung von Phospholipiden aus der Ölphase in die Wasserphase beobachtet, die stärkere Auswirkungen auf die Phospholipidkonzentration aufweist, wenn das lipidhaltige Reservoir die um den Faktor 100 kleinere Volumenphase darstellt. Dies ist in dem in der Literatur ausschließlich verwendeten Messaufbau, eines Phospholipid-haltigen Öltropfens in 100-fach größeren umgebenden Wasserphasenvolumen, der Fall. Aus diesem Grund kann mit dem invertierten tensiometrischen Messaufbau eines Wassertropfens in Öl eine Empfehlung gegeben werden, der diese Artefakte ausschließt bzw. minimiert.
Die systematische Analyse an der Grenzfläche zweier kaum mischbarer Phasen vermittelt ein umfangreiches Verständnis über das Löslichkeits- und Adsorptionsverhalten von Phospholipiden in den verwendeten pharmazeutischen Ölen Squalen und Squalan. Eine erhöhte Löslichkeit ungesättigter Phospholipide gegenüber gesättigten Phospholipide im ungesättigten Öl lässt sich auf mögliche Lösemittel-Phospholipid-Interaktionen, an den jeweiligen Doppelbindungen der beiden Moleküle (π-π-Interaktionen), zurückführen.
Des Weiteren wird die Anwesenheit oxidativer Verunreinigungen von Squalen genauer untersucht, ein mehrstufiges Aufreinigungsverfahren etabliert und die Auswirkungen dieser Verunreinigungen in Form einer erhöhten Löslichkeit gesättigter Phospholipide beschrieben. Die beobachtete Löslichkeitserhöhung wird im Zusammenhang mit physiologischen Emulsionen, den sogenannten Lipoproteinen, und deren Beteiligung an pathologischen Vorstufen der Entstehung von Arteriosklerose diskutiert. Dies geschieht ebenfalls unter dem Aspekt möglicher Interaktionen zwischen dem Phospholipid und der Ölphase sowie deren Einfluss auf die Stabilität von Lipoproteinen im menschlichen Körper und deren medizinischer Relevanz.
Informationen zur Zytotoxizität unterschiedlicher Wirkstoffe sowie zur Sensitivität verschiedener Tumorentitäten sind für die Durchführung von in vivo-Versuchen von essentiellem Interesse. Daher wird unverkapselter Wirkstoff, pharmazeutisch zugelassener Präparate aus Viscum album (der weißbeerigen Mistel), zur Erprobung auf Tumorzellen verwendet. Dies sind Pflanzenextrakte, die abhängig von der verwendeten Wirtspflanze, auf denen die Mistel wächst, Unterschiede in ihrer Viscotoxin (VT)- und Mistellektin (ML)-Zusammensetzung aufweisen. abnobaVISCUM® (aV) Fraxini, Quercus und Pini, welche in ihrer ML-Konzentration sowie ML-Isoform stark variieren, wurden in vitro auf murinen Zelllinien untersucht.
Die Durchführung von Zellproliferationstests dient zur Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration der aV Präparate und zur Auswahl möglichst sensitiver Zelllinien für in vivo-Experimente. aV Pini, das den niedrigsten ML-Gehalt, jedoch überwiegend die ML-Isoform III aufweist, zeigt eine deutlich stärkere Inhibierung der Zellproliferation der Melanomzellen B16-F10 und der Makrophagen RAW264.7 als im Vergleich zu den ML-reicheren Präparaten aV Fraxini und Quercus. Zusätzlich wird die Wirkung von extrahiertem ML I, welches aus Rohmaterial von der Esche gewonnen wurde, in einer vergleichenden in vitro Studie untersucht. Obwohl das getestete ML I für alle untersuchten Zelllinien zytotoxischen ist, sind in Abhängigkeit vom Zelltyp deutliche Unterschiede beobachtbar. Die murinen Dickdarmkarzinomzellen der Zelllinie C26 zeigen dabei die höchste Empfindlichkeit auf das isolierte ML I und sind daher für nachfolgende in vivo Versuche zu empfehlen.