Σύνθεση και καθαρισμός ενός βιοπολυμερούς με ιδιότητες ελαστίνης για χρήση στην αναγεννητική ιατρική
Creators: name: Ριζιώτης, Ιωάννης Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Βιοπολυμερή
Ελαστίνη
Αναγέννηση ιστών
Biopolymers
Elastin
Tissue regeneration

description: Στα πλαίσια της εργασίας αυτής κατασκευάστηκε ένα πρωτόκολλο σχεδιασμού, βιοτεχνολογικής σύνθεσης, και καθαρισμού δύο ελαστομερών πολυπεπτιδίων με ιδιότητες ελαστίνης (Elastin-Like Polypeptides –ELPs) τα οποία μπορούν δυνητικά να χρησιμοποιηθούν για νανοβιοτεχνολογικές εφαρμογές όπως η μηχανική ιστών και η διανομή φαρμάκων. Με μεθόδους μοριακής βιολογίας πραγματοποιήθηκε in vitro σύνθεση αμιγώς τεχνητών γονιδίων τα οποία κωδικοποιούν για δύο πεπτίδια ELP μεγέθους ~60 kDa τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την παρουσία ενός μοτίβου πρόσδεσης βιοτίνης. Το μοτίβο αυτό μπορεί να χρησιμεύσει για την βιολειτουργικοποίηση των πεπτιδίων κατά βούληση, μέσω αγκυροβόλησης βιοτινυλιωμένων δραστικών μορίων (π.χ. παραγόντων κυτταρικής διαφοροποίησης). Τα πολυπεπτίδια ELPs υπερπαράχθηκαν σε βακτηριακό σύστημα ετερόλογης υπερέκφρασης E. coli μετά από μετασχηματισμό με τα αντίστοιχα γονίδια, και έγινε διερεύνηση ως προς τις βέλτιστες συνθήκες υπερπαραγωγής τους. Ο καθαρισμός των ELPs έγινε με διαδικασία δύο σταδίων, ενός μη χρωματογραφικού με χρήση οργανικών διαλυτών και ενός σταδίου χρωματογραφίας αγχιστείας Ni-NTA. Η μέθοδος καθαρισμού βελτιστοποιήθηκε ούτως ώστε να λαμβάνονται προϊόντα υψηλής καθαρότητας (&gt;85%) με σχετικά μικρές απώλειες. Εκτιμάται ότι τα πεπτίδια αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοϋλικά για την κατασκευή ικριωμάτων που προσομοιάζουν την μεσοκυττάρια θεμέλια ουσία (Extra-Cellular Matrix –ECM) για την αναγέννηση ιστών οι οποίοι έχουν ενδογενώς μεγάλη ελαστικότητα, όπως ο χόνδρος ή ο τένοντας. Επιπλέον με τη δυνατότητα επιλεκτικής βιολειτουργικοποίησης είναι εφικτός ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση πρόδρομων κυττάρων προς χονδροκύτταρα, κύτταρα τένοντα ή δέρματος. Επιπλέον το πρωτόκολλο που κατασκευάστηκε μπορεί να τροποποιηθεί ποικιλοτρόπως με σκοπό την κατασκευή διαφορετικών πρωτεϊνικών βιοϋλικών, λειτουργώντας έτσι ως σημαντικό εργαλείο της νανοβιοτεχνολογίας στον τομέα της ανάπτυξης προηγμένων βιοϋλικών.
description: In this project, a protocol was constructed for the design, biotechnological synthesis and purification of two elastomeric polypeptides that mimic the endogenous mammal elastin (Elastin-Like Polypeptides –ELPs). These polypeptides can be potentially used in nanobiotechnological applications, namely tissue engineering and drug delivery. Using molecular biology methods, we in vitro constructed entirely artificial genes that code for two ELP peptides of approximate molecular mass 60 kDa which differ with each other in the presence of a biotin binding peptide sequence motif. This motif can facilitate biofunctionalization of the peptides at will, through docking of biotinylated functional molecules (for instance, cell proliferation promoting factors). The studied ELP polypeptides were synthesized in vivo in a heterologous E. coli bacterial overexpression system after transformation with the corresponding genes, and the overexpression conditions were optimized for each protein to achieve maximum yield. Subsequently, purification of the ELPs was carried out in two steps, one non-chromatographic using organic solvents, and one step of Ni-NTA affinity chromatography. The purification method was optimized to obtain high-purity protein products (&gt;85%) with minor loss during the procedure. We anticipate that these ELP peptides can be used as biomaterials to construct scaffolds that imitate the Extra-Cellular Matrix (ECM) for the regeneration of endogenously highly elastic tissues, such as cartilage or tendon. Additionally, the protocol constructed in this project can be modified in various ways in order to produce different protein-based biomaterials, potentially being a convenient and robust nanobiotechnological tool in developing advanced biomaterials.