Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικής μεθόδου HPLC για τον προσδιορισμό δοξορουβικίνης και των μεταβολιτών της σε πλάσμα αρουραίου μετά από μικροεκχύλιση με κάψουλα (CPME)
Creators: name: Μαμούνας Γεώργιος Θεοδοσίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Βιοανάλυση
Δοξορουβικίνη-μεταβολίτες
Μικροεκχύλιση με κάψουλα (CPME)
Bioanalysis
Doxorubicin-metabolites
Capsule phase microextraction (CPME)

description: Η δοξορουβικίνη είναι μία κυτταροτοξική ανθρακυκλίνη με αντικαρκινική δράση που αναστέλλει το ένζυμο τοποϊσομεράση ΙΙ. Χρησιμοποιείται είτε μόνη της, είτε σε συνδυασμό με άλλους αντικαρκινικούς παράγοντες για την θεραπεία πλήθους διαφορετικών ειδών καρκίνων. Η δοξορουβικίνη αδρανοποιείται κυρίως μέσω του μεταβολισμού της σε δύο κύριους μεταβολίτες, τη δοξορουβικινόλη και τη δοξορουβικινόνη. Μεταξύ των κυριότερων ανεπιθύμητων ενεργειών της δοξορουβικίνης είναι η συχνά εμφανιζόμενη καρδιοτοξικότητα. Στην αναλυτική χημεία, τα βιολογικά υποστρώματα αποτελούν ένα από τα πιο απαιτητικά είδη υποστρώματος για την απομόνωση και ποσοτικοποίηση ουσιών. Αυτό είναι κατανοητό αν σκεφτεί κανείς το πλήθος των ενδογενών ουσιών που μπορεί να υπάρχουν σ΄ αυτά. Μεταξύ αυτών είναι και το πλάσμα όπου η παρουσία ενώσεων όπως οι πρωτεΐνες μπορεί να καταστίσουν δυσχερή τη βιοανάλυση. Έτσι ο αναλυτής αναγκάζεται να καταφύγει σε δραστικές μεθόδους προκατεργασίας οι οποίες αφενός μπορεί να επηρεάσουν αρνητικά το δείγμα, αφετέρου να θέσουν σε κίνδυνο την ασφάλεια του ίδιου του αναλυτή ή να βλάψουν το περιβάλλον εξαιτίας της χρήσης επικίνδυνων χημικών. Στην τρέχουσα μελέτη, μία «όλα σε ένα» συσκευή μικροεκχύλισης χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση της δοξορουβικίνης και των δύο μεταβολιτών της από πλάσμα αρουραίου, πριν από τον προσδιορισμό τους με HPLC συζευγμένη με έναν ανιχνευτή φθορισμού. Το προσροφητικό που παρασκευάστηκε με την τεχνολογία sol-gel, παρασκευάσθηκε in situ και ενσωματώθηκε εντός δύο συνδεδεμένων μεταξύ τους καψουλών από πολυπροπυλένιο μαζί με μία κυλινδρική μαγνητική ράβδο ώστε να μην απαιτείται η χρήση εξωτερικής ανάδευσης. Ανάμεσα στα εξεταζόμενα προσροφητικά, το μετρίως πολικό πολυ(τετραϋδροφουράνιο) βρέθηκε να είναι το περισσότερο ευνοϊκό εξαιτίας της αποτελεσματικότητας του στην εκχύλιση των προσδιοριζόμενων ουσιών. Κατά την ανάπτυξη της τεχνικής έγινε μία συστημική διερεύνηση των κρίσιμων παραμέτρων που επηρέαζαν τα βήματα προσρόφησης και έκλουσης. Εξαιτίας του από της φύσεως του, μηχανισμού φιλτραρίσματος των πορωδών καψουλών, η απομόνωση των ουσιών έγινε απευθείας στο υπόστρωμα πλάσματος χωρίς να απαιτείται προηγούμενη κατεργασία του δείγματος (π.χ. καταβύθιση πρωτεϊνών, φυγοκέντρηση κ.ο.κ.). Η προτεινόμενη μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τους παράγοντες γραμμικότητα, ακρίβεια, επαναληψιμότητα, εκλεκτικότητα, ευαισθησία και σταθερότητα σύμφωνα με τις οδηγίες του FDA. Τα όρια ανίχνευσης (LOD) βρίσκονταν στο εύρος 1-2 ng/ml, ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης ορίστηκαν στα 10 ng/mL. Η ακρίβεια (εκφρασμένη ως % σχετικό σφάλμα) βρέθηκε μεταξύ -9,7-15,3%, εντός της ίδιας ημέρας και μεταξύ διαφορετικών ημερών. Η επαναληψιμότητα ήταν μεγαλύτερη του 13,4%. Τέλος, η δυνατότητα εφαρμογής της τεχνικής αποδείχθηκε με την ανάλυση των ουσιών σε πλάσμα αρουραίου, μετά από ενδοφλέβια χορήγηση δοξορουβικίνης ώστε να μελετηθεί το φαρμακοκινητικό προφίλ της
description: Doxorubicin belongs to the cytotoxic class of anthracyclines, with antitumor activity. It acts as an inhibitor of the topoisomerase II enzyme. Currently, it is used as a stand-alone therapy or in combination with other antitumor agents for the treatment of a variety of cancers. Doxorubicin is mainly eliminated by its metabolism into two main metabolites, doxorubicinol and doxorubicinone. Amongst its adverse effects, the most observed and critical one is cardiotoxicity. In analytical chemistry, biological matrices comprise one of the most challenging types of matrices for the isolation and quantification of target analytes. One of those biological matrices is blood plasma where large endogenous macromolecules such as proteins might intervene against the extraction process. Under those circumstances, the scientist is forced to adopt more drastic sample preparation processes that might influence the sample negatively or put him or the environment in more danger due to the use of hazardous chemicals. In this study, an “all-in-one” microextraction device was used for the extraction of doxorubicin and its two metabolites from rat plasma prior to their determination by HPLC coupled to fluorescence detector. A sol-gel-based sorbent has been in-situ synthesized and incorporated within two conjoined porous polypropylene capsules together with a cylindrical magnetic bar in order to avoid the need of an external stirring bar. Among other sorbents investigated, the moderately polarity monolithic poly(tetrahydrofuran) was found to be advantageous due to its efficiency towards the extraction of the analytes. Systematic investigation of the critical parameters affecting the adsorption and the desorption step was carried out. Due to the “built-in” filtration mechanism of the porous capsules, the isolation of the target analytes was performed directly in the plasma matrix without any previous sample pretreatment (i.e. protein precipitation, centrifugation etc). The proposed method was validated in terms of linearity, accuracy, precision, specificity, sensitivity, and stability according to the FDA guidelines. The limits of detection (LODs) ranged between 1 – 2 ng mL-1 while the LLOQs were set to 10 ng mL-1. The accuracy (expressed as % relative error) was found within -9.7 – 15.3% under both intra- and inter-day conditions. The precision was better than 13.4 % in all cases. Finally, the applicability of the fabricated stand-alone extraction device was demonstrated in the analysis of the target analytes in rat plasma after intravenous administration of doxorubicin in order to assess its pharmacokinetic profile