Development of Bright Staining Reagents for Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy
Creators: name: Reiber, Thorge Rasmus
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: Durchflusszytometrie
subject: Fluoreszenzmikroskopie
subject: Multimerisierung
subject: PEG
subject: Multiplex-Analyse
subject: fluoreszierende Peptide
subject: zyklische Immunofluoreszenz
subject: CAR T-Zellen
subject: Proteinmarkierung
subject: flow cytometry
subject: fluorescence microscopy
subject: fluorophore multimerization
subject: multiplexing
subject: fluorescent peptides
subject: cyclic immunofluorescence
subject: CAR T cells
subject: protein labeling
subject: 572 Biochemie
subject: 547 Organische Chemie

description: Die Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie sind zentrale Techniken zur Analyse von Zellen, Geweben und Organen. Besonders in der Immunologie werden sie zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomolekülen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet. Fluoreszenzmarker müssen je nach Anwendung hohe Helligkeit, geringe Größe und minimierte Löschung des Signals aufweisen. Stark markierte Konstrukte leiden jedoch oft unter Fluoreszenzlöschung oder großen Molekularmassen. Diese Arbeit untersucht verzweigtes Polyethylenglykol (PEG) als Träger für Fluorophore. PEG-Ketten wurden als räumliche Trennmittel identifiziert und an Aminodextran gekoppelt, wodurch hochgradig multimerisierte Fluorophor-PEG-Dextran-Zwischenprodukte entstanden. Diese Konjugate, gekoppelt mit Antikörpern, zeigen hohe Fluoreszenzintensität und wurden bei der Detektion von CAR SUP-T1-Zellen erfolgreich eingesetzt. PEG-basierte Reagenzien durchdringen jedoch oft die Zellmembran nicht, was für intrazelluläre Ziele und größere Gewebe wichtig ist. Sequentielle Multiplex-Analysen sind durch unvollständige Spaltung und Restsignale problematisch. Deshalb wurden synthetische Peptide als Rückgrat für die Fluorophor-Multimerisierung untersucht. Diese Konstrukte, verbunden mit Nanokörpern, zeigten erhöhte Helligkeit und Gewebepenetration in der Lichtblattmikroskopie von Mausorganen. Zudem wurde ein dualer Entfernungsmechanismus in die REAdyelease-Technologie integriert. Basierend auf Oligonukleotiden, Disulfiden oder Peptiden in Kombination mit Aminodextran konnte eine schnellere Signalreduktion ermöglicht werden. Dies wurde in der Konfokalmikroskopie an einer Pankreastumorzelllinie demonstriert.
description: Flow cytometry and fluorescence microscopy are crucial for analyzing cells and tissues, especially in immunology, where immunofluorescence is used for identifying, visualizing, and characterizing biomolecules with fluorescently labeled antibodies. These labels must meet various requirements: high brightness, small size, and the ability to be rendered non-fluorescent. However, highly labeled constructs often suffer from fluorescence self-quenching or high molecular masses, limiting their effectiveness. This work demonstrates that branched polyethylene glycol (PEG) serves as an efficient fluorophore multimerization platform for protein labeling. I explored factors critical for preventing fluorophore self-quenching in multi-fluorophore systems. Fluorescent PEGs were multimerized on an amino-dextran scaffold, generating highly multimerized fluorophore-PEG-dextran intermediates. When conjugated to antibodies, these intermediates allowed bright labeling of biomarkers on cells and tissues and were successfully used in detecting CAR SUP-T1 cells. Despite their strengths, PEG-based reagents often lack deep tissue penetration, essential for intracellular targets and 3D organ imaging. To enhance tissue penetration, I designed small peptide-based backbones for fluorophore multimerization. These constructs, coupled with nanobodies, produced homogeneous fluorescent conjugates that quickly penetrated mouse organs and enabled bright staining in light-sheet microscopy. The final part of the thesis focuses on synthesizing labels for cyclic immunofluorescence. I addressed the issue of incomplete label removal by creating erasable conjugates with two release sites. Fluorescent conjugates based on oligonucleotides, disulfides, or peptides combined with amino-dextran can be rapidly erased from labeled epitopes using a dual-release approach. This method was demonstrated in confocal microscopy and used for iterative imaging of biomarkers on a sample of a pancreatic tumor cell line.