Ανάπτυξη και Επικύρωση Μεθόδου LC-MS/MS για τον Προσδιορισμό των Μονο-υδροξυλιωμένων Μεταβολιτών 25OHD2 και 25OHD3 της Βιταμίνης D σε Δείγματα Ορού Αίματος
Creators: name: Ραπτοπούλου, Φωτεινή Σωτηρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Βιταμίνη D
Μεταβολίτες
Ανάπτυξη μεθόδου
Vitamin D
Metabolites
LC-MS/MS

description: Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μία νέα αναλυτική μέθοδος Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης – Φασματομετρίας Μαζών σε σειρά (UPLC-MS/MS) για τον προσδιορισμό των μονοϋδροξυλιωμένων μεταβολιτών της βιταμίνης D, 25OHD2 και 25OHD3, σε ορό αίματος. Τα δείγματα κατεργάστηκαν με MeOH:ACN 70:30 v/v για καταβύθιση των πρωτεϊνών (Protein Precipitation, PP), εξάνιο για εκχύλιση των επιθυμητών μεταβολιτών (Liquid-Liquid Extraction, LLE) και, στη συνέχεια, παραγωγοποιήθηκαν με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης 4- phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione (PTAD). Η αντίδραση διακόπηκε με τη χρήση νερού μετά από 1 ώρα παραγωγοποίησης. Η ανάλυση έγινε σε σύστημα Acquity Waters (Waters Corporation, Milford, MA, USA) αντίστροφης φάσης (Reversed Phase, RP) και για τον διαχωρισμό χρησιμοποιήθηκε αναλυτική στήλη ReproShell ODS-3 (2 mm × 50 mm, 2.7 μm) (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany). Η στήλη θερμοστατήθηκε στους 50˚C, ο εσωτερικός χώρος του αυτόματου δειγματολήπτη στους 10˚C και ο όγκος έγχυσης του δείγματος ορίστηκε στα 10 μL. Ως εσωτερικό πρότυπο επιλέχθηκε η ένωση 25-Hydroxyvitamin D3 (6,19,19-d3). Η ταχύτητα ροής της κινητής φάσης ήταν 0.3 mL∙min-1 με διαλύτες A) νερό με 0.1% φορμικό οξύ (FA) και B) μεθανόλη με 0.1% FA. Το βαθμωτό σύστημα έκλουσης ρυθμίστηκε ως εξής: 60% Β (0-0.50 λεπτά), 60% σε 100% Β (1.00 λεπτό), ακολούθησε ισοκρατική έκλουση για 2 λεπτά, επαναφορά στην αρχική σύσταση 60% Β (3.01 λεπτά) και εξισορρόπηση για ακόμα 3.5 λεπτά. Με το σύστημα αυτό, ο τελικός χρόνος ανάλυσης διαμορφώθηκε στα 6.50 λεπτά. Το σύστημα συνδέθηκε με φασματογράφο μάζας SCIEX API 3200 TM system (SCIEX AB, Sciex Pte. Ltd, USA) για τον ιοντισμό των ενώσεων με ηλεκτροψεκασμό σε λειτουργία θετικού ιοντισμού (ESI+), ενώ η επεξεργασία των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού Analyst SCIEX software (AB Sciex Pte. Ltd, USA). Οι συνθήκες στο φασματογράφο μάζας βελτιστοποιήθηκαν ξεχωριστά για κάθε ένωση με απευθείας έγχυση στον φασματογράφο μάζας και για την ανίχνευσή τους εφαρμόστηκε λειτουργία παρακολούθησης πολλαπλών αντιδράσεων (MRM), με παρακολούθηση των μετατοπίσεων m/z 570.238 → 298.000, m/z 558.160 → 298.000 και 561.160 → 301.200 για τις 25OHD2-PTAD, 25OHD3-PTAD και το παραγωγοποιημένο εσωτερικό πρότυπο, αντίστοιχα. Η ακρίβεια της μεθόδου για τον μεταβολίτη 25OHD3 κυμάνθηκε από 86% έως 123% , ενώ ο συντελεστής RSD για την επαναληψιμότητα από 0,1% έως 8,0%. Οι διακυμάνσεις για τον μεταβολίτη 25OHD2 βρέθηκαν μεταξύ 98-117% και 1,0-9,0%, αντίστοιχα. Η μέθοδος εμφανίζει πολύ καλή γραμμικότητα, με τον συντελεστή γραμμικής συσχέτισης, R2 , να είναι &gt; 0,99 και για τις δύο ενώσεις. Η ανάκτηση υπολογίστηκε μεταξύ 85% - 90% για τις δύο ενώσεις. Αναφορικά με τα όρια ανίχνευσης, το LOD ισούται με 0,67 ng/mL, και 2,23 ng/mL για τις 25OHD3 και 25OHD2, ενώ το LOQ είναι ίσο με 2,21 ng/mL και 7,37 ng/mL, αντίστοιχα. Η μέθοδος που 6 αναπτύχθηκε μπορεί να εφαρμοστεί με επιτυχία σε αναλύσεις ρουτίνας και αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την ταχεία ανάλυση δειγμάτων.
description: A novel Ultra-High Pressure Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS) analytical method has been developed for the determination of monohydroxylated vitamin D metabolites, 25OHD2 and 25OHD3, in human serum. Samples were treated with MeOH/ACN 70:30 v/v (PP) and hexane (LLE) and a Diels-Alder reaction with 4-phenyl-1,2,4- triazoline reagent -3,5-dione (PTAD) followed. The reaction was stopped with water addition after 1 hour of derivatization. The chromatographic separation was performed on an Alliance HT Waters 2790 (Waters Corporation, Milford, MA, USA) reversed-phase (RP) system, and a ReproShell ODS-3 analytical column (2 mm × 50 mm, 2.7 μm) (Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany) was used. The column temperature was 50˚C, the autosampler temperature was 10˚C, and the sample injection volume was set at 10 µL. 25- Hydroxyvitamin D3 (6,19,19-d3) was used as internal standard (IS). The flow rate of the mobile phase was 0.3 mL∙min-1 with A) water with 0.1% formic acid (FA) and B) methanol with 0.1% FA. The gradient elution system was set up as follows: 60% B (0-0.50 min), 60% to 100% B (1.00 min), followed by isocratic elution for 2 min, return to the original 60% B (3.01 min), and equilibration for 3.5 more minutes. The total run time was 6.50 minutes. The system was connected to a SCIEX API 3200 TM Mass Spectrometry system (SCIEX AB, Sciex Pte. Ltd, USA) in positive electrospray ionization (ESI+) mode and the data were processed by SCIEX Analyst software (AB Sciex Pte. Ltd, USA). Mass spectrometry conditions were individually optimized for each compound by direct injection into the mass spectrometer and multiple reaction monitoring (MRM) mode was applied for the fragments m/z 570.238 → 298.000, m/z 558.160 → 298.000 and 561.160 → 301.200 for 25OHD2-PTAD, 25OHD3-PTAD and internal standard, respectively. The accuracy of the method ranged between 86%-123% for 25OHD3, while the RSD coefficient ranged from 0% to 8%. Corresponding ranges for the 25OHD2 metabolite were estimated to be 98–117% and 1–9%. The coefficient of determination, R2, being &gt; 0.99 for both compounds indicates a satisfying linearity, while recovery was estimated to be 85-90%. In terms of detection limits, the limit of detection (LOD) is equal to 0.67 ng/mL and 2.23 ng/mL, while the limit of quantification (LOQ) is equal to 2.21 ng/mL and 7.37 ng/mL for 25OHD3 and 25OHD2, respectively. The developed method can be successfully applied in routine analyzes and is a valuable tool for the rapid analysis of patient samples.