title: Influence of Growth differentiation factor-15 (GDF-15) on the gene and protein expression in gastrocnemius muscle of hypercholesterolemic (knockout) mice.
title: Einfluss des Wachstums-Differenzierungs-Faktors-15 (GDF-15) auf die Gen- und Proteinexpression des Musculus gastrocnemius bei hypercholesterinämischen (knockout) Mäusen.
title: Einfluss des Wachstums-Differenzierungs-Faktors-15 (GDF-15) auf die Gen- und Proteinexpression des Musculus gastrocnemius bei hypercholesterinämischen (knockout) Mäusen.
Creators: name: Wagner, Moritz
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Growth differentiation factor
ApoE
ApoE, atherosclerosis
Wachstums-Differenzierungs-Faktor, GDF-15
GDF-15
Arteriosklerose
Muskel
muscle

description: Introduction: Growth
      differentiation factor-15 (GDF-15) is a distant member of the
      TGF-β superfamily and is induced under inflammatory and
      stress conditions particularly in macrophages, smooth muscle
      cells, cardiomyocytes, adipocytes and endothelial cells
      (Schlittenhardt et al., 2004; Bauskin et al., 2005; Bermúdez
      et al., 2008; Ding et al., 2009; Adela and Banerjee, 2015).
      In former studies we showed an induction of GDF-15 protein
      and mRNA expression in human arteriosclerotic vessel walls
      and a localisation in macrophages (Schlittenhardt et al.,
      2004; Schlittenhardt et al., 2005). GDF-15 is a new biomarker
      for cardiovascular stress and is associated with heart
      failure and cardiac remodeling (Andersson et al., 2016;
      Meijers et al., 2016). Recently, we have shown that GDF-15
      deficiency inhibits atherosclerosis development and
      progression (de Jager et al., 2011; Bonaterra et al., 2012).
      The aim of the present study was to investigate the influence
      of GDF-15 on the expression of inflammatory, angiogenic,
      apoptotic and atrophy genes/proteins in the skeletal muscle
      of mice fed a cholesterol-enriched diet in a mouse model for
      experimental atherosclerosis (ApoE-/-). Methods: GDF-15
      deficient (GDF-15-/-) mice were generated using a LacZknockin
      construct (Strelau et al., 2009). These GDF-15-/- mice were
      cross-bred with ApoE-/- mice, yielding the following
      genotypes: GDF-15+/+/ApoE+/+ (wild type; WT),
      GDF-15-/-/ApoE+/+, GDF-15+/+/ApoE-/- and GDF-15-/-/ApoE-/-.
      10 weeks old mice received a cholesterol-enriched diet (CED)
      for 12 or 20 weeks. The weight and the blood lipid
      concentrations of the animals were measured before CED and
      after feeding a cholesterol-enriched diet for 12 or 20 weeks.
      Afterwards the gastrocnemius muscles were dissected and
      shock-frozen. RNA and proteins were isolated, relevant genes
      for inflammation, apoptosis, angiogenesis, atrophy and
      nicotinic acetylcholine receptor (AChR) were analysed by
      quantitative Real-Time RT-PCR (qRT-PCR). Proteins in skeletal
      muscle were quantified for pro-/anti-inflammatory cytokines
      and pro-/anti-angiogenic chemokines using a “Proteome
      Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit” system. Results: The
      weight was increased in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks
      CED (10 %; p≤0.01) and in GDF-15-/-/ApoE-/- mice before CED
      (6 %; p≤0.01) and after 12 (16 %; p≤0.01) or 20 weeks CED (34
      %; p≤0.001) compared with WT or GDF-15+/+/ApoE-/- mice (Kubo,
      2013). The serum cholesterol level was increased in
      GDF-15-/-/ApoE-/- mice before CED (22 %; p≤0.05) and after 12
      (34 %; p≤0,001) or 20 weeks CED (14 %; p≤0,05) compared with
      GDF-15+/+/ApoE-/- animals (Kubo, 2013). Further, the serum
      triglyceride level was increased in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice
      after 12 (54 %; p≤0.05) or 20 weeks CED (35 %; p≤0.05) and in
      GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks CED (95 %; p≤0.01) in
      comparison with WT or GDF-15+/+/ApoE-/- mice (Kubo, 2013).
      After 12 weeks CED, qRT-PCR showed in gastrocnemius muscle of
      GDF-15-/-/ApoE+/+ mice a 21- and 6-fold (p≤0.05) IL-6 and
      IL-1β expression compared with WT. After 20 weeks CED, a 69 %
      and 98 % (p≤0.05) decrease of IL-6 and IL-1β expression in
      this group was measured. Pro-apoptotic Bax mRNA expression
      was 31-fold increased (p≤0.05) in gastrocnemius muscle of
      GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 12 weeks CED compared with WT.
      Moreover, we found in gastrocnemius muscle of
      GDF-15-/-/ApoE-/- mice a 86 % (p≤0.05) decrease of Bax
      expression compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice after 20
      weeks CED. Expression of pro-angiogenic Notch1 gene was 97 %
      decreased (p≤0.05) in gastrocnemius muscle of
      GDF-15-/-/ApoE-/- compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice after
      20 weeks CED. Expression of atrophy gene Fbxo32 was 23-fold
      increased (p≤0.05) in GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 12 weeks
      CED compared with WT mice. Furthermore, the analysis with
      membrane-based sandwich immunoassay (Proteome Profiler™ Mouse
      Cytokine Array Kit) showed in gastrocnemius muscle of
      GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks CED a 1.5-3.1-fold
      increased protein expression of pro-inflammatory (e.g. IL-1β,
      IL-6, IL-17, IFN-γ and TNF-α) and a 1.2-2.5-fold increased
      protein expression of anti-inflammatory (e.g. IL-4, IL-10 and
      IL-13) cytokines compared with WT mice. In gastrocnemius
      muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks CED, a 39-85
      % decrease of pro- and anti-inflammatory protein expression
      was measured compared with GDF-15+/+/ApoE-/- mice. The
      protein expression of inflammatory and pro-/anti-angiogenic
      chemokines (e.g. CCL2, CXCL1 and CXCL9) in gastrocnemius
      muscle of GDF-15-/-/ApoE+/+ mice after 20 weeks was
      1.1-2.7-fold increased compared with WT mice. Protein
      expression of inflammatory and angiogenic chemokines in
      gastrocnemius muscle of GDF-15-/-/ApoE-/- mice after 20 weeks
      CED was 45-73 % decreased compared with GDF-15+/+/ApoE-/-
      mice. Conclusion: The lack of GDF-15 seems to modulate the
      expression of pro-/anti-inflammatory, pro-/anti-angiogenic,
      apoptotic and atrophy genes/proteins in gastrocnemius muscle
      dependent from the duration of CED application. Furthermore,
      GDF-15 influences the weight and the blood lipid
      concentrations.
description: Einleitung: Der
      Wachstums-Differenzierungs-Faktor-15 (GDF-15) gehört zur
      TGF-β-Superfamilie und wird bei Entzündungen und
      Stressexposition insbesondere von Makrophagen,
      Gefäßmuskelzellen, Kardiomyozyten, Adipozyten und
      Endothelzellen vermehrt exprimiert (Schlittenhardt et al.,
      2004; Bauskin et al., 2005; Bermúdez et al., 2008; Ding et
      al., 2009; Adela and Banerjee, 2015). In früheren Arbeiten
      haben wir gezeigt, dass die Protein- und mRNA-Expression von
      GDF-15 in arteriosklerotischen Gefäßwänden induziert und dort
      in Makrophagen lokalisiert ist (Schlittenhardt et al., 2004;
      Bonaterra et al., 2012). GDF-15 dient als neuer Biomarker für
      kardiovaskulären Stress und ist u.a. mit Herzinsuffizienz und
      kardialem Remodeling assoziiert (Andersson et al., 2016;
      Meijers et al., 2016). Außerdem wurde gefunden, dass bei
      GDF-15-Defizienz die Entstehung und Progression der
      Arteriosklerose gehemmt ist (de Jager et al., 2011; Bonaterra
      et al., 2012). In der vorliegenden Studie sollte der Einfluss
      von GDF-15 auf die Expression inflammatorischer,
      angiogenetischer, apoptotischer bzw. atrophischer
      Gene/Proteine in der Skelettmuskulatur bei
      cholesteringefütterten Mäusen in einem Mausmodell für
      experimentelle Arteriosklerose (ApoE-/-) untersucht werden.
      Material und Methoden: Mithilfe eines LacZknockin-Konstrukts
      wurden GDF-15-defiziente Mäuse generiert (Strelau et al.,
      2009) und anschließend mit ApoE-/--Mäusen gekreuzt, sodass
      folgende Genotypen zur Verfügung standen: GDF-15+/+/ApoE+/+
      (Wildtyp), GDF-15-/-/ApoE+/+, GDF-15+/+/ApoE-/- und
      GDF-15-/-/ApoE-/-. Im Alter von zehn Wochen wurden die Tiere
      mit einem cholesterinreichen Futter (CHF) über einen Zeitraum
      von 12 bzw. 20 Wochen gefüttert. Das Gewicht sowie die
      Serum-Cholesterin- und -Triglyzeridspiegel der Mäuse wurden
      dabei vor CHF-Gabe und nach 12 bzw. 20 Wochen
      cholesterinreicher Fütterung bestimmt. Anschließend wurde der
      M. gastrocnemius entnommen und RNA sowie Proteine isoliert.
      Die mRNA-Expression von relevanten Genen für Inflammation,
      Apoptose, Angiogenese, Atrophie und nikotinerge
      Acetylcholin-Rezeptoren (AChR) wurde mithilfe quantitativer
      Real-Time RT-PCR (qRT-PCR) untersucht. Auf Proteinebene
      wurden im Skelettmuskel u.a. pro-/anti-inflammatorische
      Zytokine und pro-/anti-angiogenetische Chemokine mittels
      „Proteome Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit“-System
      quantifiziert. Ergebnisse: Das Gewicht war bei
      GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 20 Wochen CHF (10 %; p≤0,01)
      und bei GDF-15-/-/ApoE-/--Tieren vor CHF (6 %; p≤0,01) und
      nach 12 (16 %; p≤0,01) bzw. 20 Wochen CHF (34 %; p≤0,001)
      höher als bei Wildtyp- bzw. GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo,
      2013). Der Serum-Cholesterinspiegel war bei
      GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen vor CHF (22 %; p≤0,05) und nach 12
      (34 %; p≤0,001) bzw. 20 Wochen CHF (14 %; p≤0,05) höher als
      bei GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo, 2013). Des Weiteren waren
      bei GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 12 (54 %; p≤0,05) bzw. 20
      Wochen CHF (35 %; p≤0,05) und bei GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen
      nach 20 Wochen CHF (95 %; p≤0,01) die
      Serum-Triglyzeridspiegel höher als bei Wildtyp- bzw.
      GDF-15+/+/ApoE-/--Mäusen (Kubo, 2013). Nach 12 Wochen CHF
      zeigte die quantitative Real-Time RT-PCR im M. gastrocnemius
      von GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen eine 21- und 6fach (p≤0,05)
      höhere IL-6- bzw. IL-1β-Expression im Vergleich zu
      Wildtyp-Tieren. Nach 20 Wochen CHF konnte eine 69 % bzw. 98 %
      (p≤0,05) niedrigere IL-6- bzw. IL-1β-mRNA-Expression in
      dieser Gruppe festgestellt werden. Die Expression des
      pro-apoptotischen Bax-Gens war im M. gastrocnemius von
      GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 12 Wochen CHF 31fach (p≤0,05)
      höher als bei Wildtyp-Tieren. Darüber hinaus fanden wir nach
      20 Wochen CHF in GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen eine 86 % (p≤0,05)
      niedrigere Bax-Expression als bei GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren.
      Die Expression des pro-angiogenetischen Notch1-Gens war nach
      20 Wochen CHF im M. gastrocnemius von
      GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen 97 % (p≤0,05) niedriger als bei
      GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren. Die mRNA-Expression des
      Fbxo32-Atrophie-Gens war nach 12 Wochen CHF in
      GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen 23fach höher (p≤0,05) als bei
      Wildtyp-Tieren. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung
      mittels membranbasiertem Sandwich-Immunassay (Proteome
      Profiler™ Mouse Cytokine Array Kit) im M. gastrocnemius von
      GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen nach 20 Wochen CHF eine 1,5-3,1fach
      erhöhte Proteinexpression pro-inflammatorischer (z.B. IL-1β,
      IL-6, IL-17, IFN-γ und TNF-α) und eine 1,2-2,5fach erhöhte
      Proteinexpression anti-inflammatorischer (z.B. IL-4, IL-10
      und IL-13) Zytokine im Vergleich zu Wildtyp-Tieren. Im M.
      gastrocnemius von GDF-15-/-/ApoE-/--Mäusen war nach 20 Wochen
      CHF die Expression sowohl pro- als auch
      anti-inflammatorischer Proteine 39-85 % im Vergleich zu
      GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren erniedrigt. Die Proteinexpression
      inflammatorischer und pro-/anti- angiogenetischer Chemokine
      (z.B. CCL2, CXCL1 und CXCL9) war im M. gastrocnemius von
      GDF-15-/-/ApoE+/+-Mäusen verglichen mit Wildtyp-Tieren nach
      20 Wochen CHF 1,1-2,7fach erhöht. GDF-15-/-/ApoE-/--Mäuse
      hatten nach 20 Wochen CHF im M. gastrocnemius im Vergleich zu
      GDF-15+/+/ApoE-/--Tieren eine 45-73 % niedrigere
      Proteinexpression inflammatorischer und angiogenetischer
      Chemokine. Schlussfolgerung: GDF-15 scheint im M.
      gastrocnemius die Expression pro-/anti-inflammatorischer,
      pro-/anti-angiogenetischer, apoptose- und atrophierelevanter
      Gene/Proteine abhängig von der Fütterungsdauer zu
      beeinflussen. Des Weiteren moduliert GDF-15 das Gewicht sowie
      die Serum-Cholesterin- bzw. -Triglyzeridspiegel.