title: Expression und Funktion der Toll-Like Rezeptoren TLR-4 und TLR-9 an Zelllinien des Harnblasenkarzinoms
title: Expression and function of toll-like receptors TLR-4 and TLR-9 on bladder cancer cell lines
Creators: name: Kesch, Claudia Verena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Blasenkrebs
Toll-like-Rezeptoren
Toll-like receptors
Medizin, Gesundheit
BCG
Bladder cancer

description: Bladder cancer is among the most
      common malignancies worldwide. The majority (75%-85%) of the
      patients are diagnosed early, prior to muscle invasive stage.
      BCG immunotherapy, in addition to transurethral resection, is
      recommended in high risk non muscle invasive tumors. This is
      often the only therapy required. The mechanism of action of
      BCG has not been fully elucidated. Toll-like receptors,
      modulators of innate immunity, play a major role in its
      therapeutic mechanisms. In a mouse model, the TLR-9 ligand
      CpG-ODN has proven more effective than BCG in treating early
      stage bladder cancer. Little is known about the direct effect
      of TLRs on bladder cancer cells. This work studied the
      expression of TLR-4 and TLR-9 on various bladder cancer cell
      lines. On activation of these receptors outcomes measured
      were cytokine expression, cell viability and cell
      invasiveness. The cell lines tested universally expressed
      TLR-9 mRNA, and most expressed TLR-4 mRNA. From those cell
      lines and based on their TLR mRNA expression four cell lines
      were chosen for further investigation. In these cell lines
      TLR expression was verified using Immuncytology (for TLR-4)
      and Western Blot (for TLR-9). T24 cells in which high TLR-4
      and BFTC cells in which no TLR-4 expression was detected,
      were subjected to the TLR-4 agonist LPS. In T24 cells this
      significantly induced IL-6 and TNFα. There was no effect on
      BFTC. No impact on cell viability in either cell line. UMUC3
      cells, in which high TLR-9 and RT112 cells, in which low
      TLR-9 expression was detected, were subjected to the TLR-9
      agonists CpG-A and CpG-B. In this work it was demonstrated
      that INTERFERin® increased the uptake of CpG-ODN making it
      available to intracellular TLR-9.To some extend it enhanced
      CpG-ODN effects. In UMUC3 CpG-A boosted with INTERFERin®
      significantly induced IL-8, TNFα, INFß, VEGF-A and PlGF.
      Whereas CpG-B boosted with INTERFERin® only induced IL-8 and
      INFß. In RT112 no induction was noted in the CpG-A group.
      However in the CpG-B group both IL-8 and TNFα were induced.
      Cell viability of UMUC3 was reduced when exposed to CpG-B
      alone or in combination with INTERFERin®. However, CpG-A
      reduced cell viability only when boosted with INTERFERin®. In
      RT112, only CpG-B reduced viability. This effect was seen
      with and without INTERFERin®. Cell invasion in both tested
      cell lines was increased significantly by CpG-ODN. CpG-B
      caused the highest increase. Immunotherapeutics, in current
      use (BCG) or those being under investigation (CpG-ODN,
      mycobacterial cell wall-DNA complex) mediate their effect
      partially via TLR-4 and TLR-9. This means, that a direct
      effect on the tumor cells has to be taken into concern,
      because many tumors are expressing functionally active TLRs,
      too. Findings in this work suggest these effects to be
      inhibitory regarding tumor growth and stimulatory regarding
      metastasis. Further research is needed to verify these
      effects and their therapeutic relevance in the hope that
      therapies with BCG and potential future immunotherapeutics
      become more predictable.
description: Das Harnblasenkarzinom ist eine der
      häufigsten malignen Tumorerkrankungen weltweit. 75%-85% der
      Patienten werden noch in nicht-muskelinvasiven Stadien
      diagnostiziert. Für einen Teil dieser Patienten stellt die
      Dispositionsprophylaxe mittels BCG-Instillation nach TUR eine
      effektive Therapie dar und wird empfohlen. Bis heute ist der
      Wirkungsmechanismus von BCG nicht vollständig geklärt, aber
      es ist bekannt, dass Bestandteile von BCG mit Toll-like
      Rezeptoren, unter ihnen TLR-4 und TLR-9, interagieren und
      dass CpG-ODN, ein TLR-9-Agonist, in vitro und in
      Tierversuchen dem BCG sogar überlegen ist. Trotzdem gibt es
      bisher nur wenige Untersuchungen zur Existenz und
      Funktionalität von Toll-like Rezeptoren auf
      Harnblasenkarzinomzellen selbst. Ziel dieser Arbeit war es
      daher, die Expression von TLR-4 und TLR-9 an verschiedenen
      Zelllinien des Harnblasenkarzinoms zu untersuchen und zu
      überprüfen, ob eine Stimulation dieser Rezeptoren durch ihren
      spezifischen Liganden zu Veränderungen im
      Zytokinexperssionsmuster, in der Zellproliferation und in der
      Zellinvasion führt. Alle untersuchten
      Harnblasenkarzinomzelllinien exprimierten TLR-9 mRNA und
      zumeist auch TLR-4 mRNA. Exemplarisch wurden für alle
      weiteren Untersuchungen vier Zelllinien gewählt. An ihnen
      wurde zunächst die TLR-4- und TLR-9- Proteinexpression
      mittels Immunzytologie bzw. Western Blot untersucht. Diese
      zeigte übereinstimmende Ergebnisse mit der mRNA-Expression.
      Zur Untersuchung der LPS-Effekte wurden T24 als Zelllinie mit
      starker TLR-4- Expression und BFTC als Zelllinie ohne
      TLR-4-Expression gewählt. LPS induziert eine signifikante
      IL-6- und TNFα-Antwort in der Zelllinie T24, nicht aber in
      BFTC. LPS hatte keinen Einfluss auf die Zellproliferation.
      Zur Untersuchung der CpG-ODN-Effekte wurden UMUC3 als
      Zelllinie mit starker TLR-9-Expression und RT112 als
      Zelllinie mit schwacher TLR-9-Expression gewählt. Es konnte
      gezeigt werden, dass INTERFERin® die Aufnahme von CpG-ODN in
      das Zellinnere, also den Ort der TLR-9-Expression, verstärkt.
      Daher wurde teilweise mit INTERFERin® gearbeitet, um minimale
      CpG-ODN-Effekte besser charakterisieren zu können. In der
      Zelllinie UMUC3 verstärkte CpG-A + INTERFERin® die Expression
      von IL-8, TNFα, INFß, VEGF-A und PlGF signifikant. CpG-B +
      INTERFERin® verstärkte nur die Expression von IL-8 und INFß.
      In der Zelllinie RT112 hatte CpG-A + INTERFERin® hingegen
      keine Effekte. CpG-B + INTERFERin® verstärkte die IL-8- und
      TNFα-Expression signifikant. Die Zellproliferation der
      Zelllinie UMUC3 wurde sowohl durch CpG-B alleine, als auch
      durch CpG-B + INTERFERin®, sowie durch CpG-A +INTERFERin®
      signifikant vermindert. Die Zellproliferation der Zelllinie
      RT112 wurde durch CpG-B und durch CpG-B + INTERFERin®
      signifikant vermindert. Beide CpG-Motive verstärkten in
      beiden Zelllinien die Zellinvasion signifikant, CpG-B hatte
      hierbei einen noch ausgeprägteren Effekt, als CpG-A. Dies
      zeigt, dass BCG und potentiell zukünftige Immunotherapeutika
      des nicht-muskelinvasiven Harnblasenkarzinoms, die ihre
      Wirkung über Toll-like Rezeptoren entfalten, immer auch
      Einfluss auf die Tumorzellen direkt nehmen, da diese selbst
      auch funktionelle Toll-like Rezeptoren exprimieren. Die
      Untersuchungen zu Zytokinexpression, Zellproliferation und
      Invasion verdeutlichen, dass dies, therapeutisch gesehen,
      sowohl positive, als aber auch negative Folgen haben kann.
      Diese Mechanismen und vor allem ihre Signalwege sollten noch
      genauer untersucht werden, um die Wirkung von
      Immunotherapeutika zu optimieren und einen Therapieerfolg
      vorhersehbarer zu machen.