title: Microbiological-ecological assessment of Austrian groundwaters
Creators: name: Jimenez Salvador, Ayac Iuan
Publisher: name: :none
Year: 2025

description: Grundwasserökosysteme spielen eine wichtige Rolle für den Erhalt und die Funktionsfähigkeit zahlreicher terrestrischer Ökosysteme und erbringen essentielle Ökosystemleistungen für Mensch und Umwelt. Trotz ihrer Wichtigkeit werden die ökologischen Aspekte von Grundwasserökosystemen zumeist übersehen, mit der Folge, dass diese in aktuellen Richtlinien und Managementstrategien wenig Beachtung finden. Um den ökologischen Zustand von Grundwasser Ökosystemen feststellen zu können, werden verlässliche Methoden benötigt. Auch wenn in jüngerer Vergangenheit mehrere Methoden basierend auf Grundwasserorganismen entwickelt wurden, gilt es—um die ökologische Bewertungen von Grundwasserökosystemen voranzutreiben—folgende Wissenslücken zu schließen: (1) die Definition von natürlichen Referenzbedingungen und (2) die Entwicklung eines biologisch fundierten Klassifizierungssystems für Grundwasserökosysteme. Aufgrund ihrer zentralen Rolle in Grundwasserökosystemen werden Mikroorganismen als vielversprechende Bioindikatoren für die ökologische Bewertung von Grundwasserökosystemen gesehen. Sie sind allgegenwärtig, tragen wesentlich zum Stoffumsatz bei und stellen den größten Anteil an Biomasse dar. Der kürzlich entwickelte B-A-(E) Index ist eine Methode zur mikrobiologisch-ökologischen Bewertung von Grundwasserökosystemen, die auf grundlegenden und leicht messbaren Eigenschaften mikrobieller Gemeinschaften, wie der Biomasse (B) und Aktivität (A) prokaryotischer Organismen basiert. Um die Sensitivität dieser Methode zu verbessern, kann die Analyse durch zusätzliche Messgrößen erweitert werden. Dies können einerseits weitere mikrobielle Variablen oder Informationen zur verfügbaren Energie (E), wie der Menge und/oder Qualität des gelösten organischen Kohlenstoffs sein. Der B-A-(E) Index konnte bereits erfolgreich auf lokaler und regionaler Ebene angewendet werden. Hierfür konnten Referenzbedingungen durch das Einbeziehen von Expertenwissen, sowie durch die Identifikation Menschen- und Oberflächenwasser-bedingter Störungen ermittelt werden. Da allerdings solch eine Datenlage und Expertenwissen nicht flächendeckend für Österreich verfügbar sind, können Referenzbedingungen auf nationaler Ebene nicht mit derselben Vorgehensweise ermittelt werden. Mit dem Ziel mikrobielle Referenzbedingungen auf nationaler Ebene zu definieren wurden im Rahmen dieser Studie mikrobielle Variablen von mehr als 3700 Grundwasserproben ausgewertet. Diese waren im Rahmen der regulären Gewässerzustandsüberwachung im Jahr 2019—koordiniert durch das Umweltbundesamt und den zuständigen Landesstellen—erhoben worden. Gemessen wurden die mikrobiellen Variablen von der Arbeitsgruppe Grundwasserökologie, unter Anleitung von Prof. Dr. Christian Griebler, an der Universität Wien. Die Biomasse wurde mit der Anzahl prokaryotischer Zellen mittels Durchflusszytometrie gemessen und als Gesamtzellzahl (GZZ) quantifiziert. Die Aktivität aller prokaryotischer Zellen wurde mit einem Zelllyse-Lumineszens-Assay gemessen und als intrazelluläres Adenosintriphosphat (ATP) quantifiziert. Eine zusätzliche mikrobielle Variable—der Anteil der Zellen mit hohem Nukleinsäuregehalt (High Nucleic Acid content cells Proportion, HNAP)—die mit durchflusszytometrischen Messungen aquatischer Proben assoziiert ist, konnte extrahiert und in die Auswertung mit einbezogen werden. HNAP—auch bekannt als zytometrischer Fingerabdruck—kann vom Fluoreszenzsignal der Nukleinsäuren abgeleitet werden, die zur Zellzählung mittels Durchflusszytometrie angefärbt wird. Diese Messgröße enthält potenziell weitere Informationen über den physiologischen Status oder die Genomgröße der identifizierten Zellen und könnte so einen (groben) Einblick in die phylogenetische Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften geben. In einem ersten Schritt der Auswertung wurde auf Basis der verfügbaren hydrochemischen natürlichen Hintergrundwerte für oberflächennahes Grundwasser in Österreich ein Referenzdatensatz erstellt. Mit diesem Ansatz konnten 586 Grundwasserproben identifiziert werden, die hinsichtlich der angewandten hydrochemischen Kriterien keine menschliche Beeinflussung zeigten. Dieser Referenzdatensatz ermöglichte es, saisonale Dynamiken und Korrelationen der mikrobiellen Variablen zu untersuchen und Einblicke in die Zusammensetzung des Gesamt-ATP-Pools zu gewinnen. In einem nächsten Schritt wurden explorative analytische Methoden eingesetzt, um eine typologische Grundlage für weitere Analysen zu schaffen. Hierfür wurde der Einfluss von Geologie, Sauerstoffbedingungen, Zusammensetzung der Hauptwasserionen, Entfernung zur Oberfläche (gemessen am Grundwasserspiegel) und Landnutzung auf die mikrobiellen Variablen getestet. Zusätzlich wurde evaluiert ob die mikrobiellen Variablen durch die unterschiedlichen Brunnentypen und Protokolle der Probennahmen verzerrt waren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass natürliche Einflüsse auf die mikrobiellen Variablen vorwiegend von geologischen und Sauerstoffbedingungen ausgeübt werden. Auf einer überregionalen Ebene konnte gezeigt werden, dass geologische Charakteristika die Gesamtzellzahl und HNAP beeinflussen. Auf regional-lokaler Ebene wurde festgestellt, dass die vorherrschenden Sauerstoffbedingungen einen starken Einfluss auf die Gesamtzellzahl haben. Darüber hinaus konnten unerwartete Einblicke in die mikrobielle Signatur von Tiefengrundwasser)—mit erhöhten Werten der Gesamtzellzahl, HNAP und Aktivität—gewonnen werden. Schwächere und weniger aussagekräftige Effekte wurden für die Landnutzung und Entfernung zur Oberfläche sowie für die verschiedenen Brunnentypen und Arten der Probennahme beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein erstes Klassifikationsschema für die oberflächennahen Grundwasservorkommen Österreichs und Referenzbedingungen für die Eigenschaften mikrobieller Gemeinschaften etabliert. Diese können nun zur mikrobiologisch-ökologischen Bewertung von Grundwasserökosystemen auf nationaler Ebene genutzt werden. Zusätzlich integriert das abgeleitete Klassifikationsschema mikrobiologische Aspekte und kann dadurch eine differenziertere Grundlage für fortführende erklärend-analytische Untersuchungen bieten, um die Beziehung zwischen Umweltfaktoren und mikrobiellen Gemeinschaften mittels mechanistischer und vorhersagender Modelle näher untersuchen zu können.
description: Groundwater ecosystems play a critical role in supporting terrestrial ecosystems and providing essential services to humans. However, these elusive ecosystems are frequently overlooked and their ecological protection remains significantly underdeveloped in current policies and management strategies. For an appropriate ecological assessment, reliable methodologies are needed. While several approaches utilizing groundwater organisms have been developed in the recent past, critical scientific gaps persist, including: (1) the definition of natural reference conditions, and (2) the development of a biological informed classification system for groundwater ecosystems. Microorganisms are promising bioindicators due to their pivotal role in groundwater ecosystems. As they are the primary contributors of biomass, intimately involved in the processing of matter and ubiquitously present, microorganisms can provide valuable ecological information. The recently developed D-A-(C) index represents an innovative approach for a microbiological-ecological assessment of groundwater ecosystems. This approach is based on fundamental and easy to measure properties of microbial communities, such as prokaryotic cell density (D) and microbial activity (A). Furthermore, the approach allows the inclusion of additional measures to enhance the sensitivity of the assessment. Thus, the analysis can be supplemented with additional microbial variables or information on the available energy, such as the quantity and/or quality of dissolved organic carbon (C). The D-A-(C) index has been successfully applied on the local to regional scale. So far, the critical step of defining reference conditions has been accomplished by employing expert knowledge and indicators of anthropogenic and surface water influences. However, such measures are not readily available for the identification of reference conditions on a nation-wide scale. To define microbial reference conditions on a nation-wide scale, more than 3700 groundwater samples were evaluated in this study. These were taken during the national groundwater monitoring program in 2019, coordinated by the Austrian Federal Environmental Agency and provincial state authorities. Measurements of microbial variables were conducted by the Groundwater Ecology working Group, led by Prof. Dr. Christian Griebler at the University of Vienna. Cell density was measured by flow cytometry and quantified as Total Cell Counts (TCC). The overall activity of prokaryotic cells was measured with a cell-lysis luminescence assay and quantified as intracellular adenosine triphosphate (ATP). An additional microbial measure---the proportion of cells with High Nucleic Acid content (HNAP—was included in the analysis, which is associated with flow cytometric measurements of aquatic samples. HNAP—also known as a cytometric fingerprint—is based on the fluorescence signal of nucleic acid which is stained for cell enumeration by flow cytometry. This measure potentially contains further information about the physiological status, or the genome sizes, and thus may provide a rough insight into the phylogenetic composition of microbial communities. As a preliminary step relevant metadata was collected from different sources and plausibility assessments were conducted for the microbial variables. In the first step of the evaluation, a reference dataset was established based on the available hydrochemical Natural Background Values (NBV) for shallow groundwater in Austria. This approach resulted in 586 groundwater samples lacking any sign of human influences regarding the employed hydrochemical criteria. This reference dataset allowed studying the seasonal dynamics and correlations of the microbial properties and to gain insights into the composition of the total ATP pool. In a next step, exploratory analytical techniques were employed to construct a typological foundation. Several categorical factors—expected to affect life conditions in groundwater ecosystems—such as geology, oxygen conditions, composition of the major water ions, distance to surface (indicated by the groundwater table), and land cover, were tested for their influence on the microbial variables in groundwater ecosystems. In addition, potential sampling biases due to the different well &amp; spring types and sampling procedures were evaluated. The results suggest that under natural conditions microbial properties are mainly affected by geology and the prevalent oxygen conditions. On a supra-regional scale geological features were observed to influence cell density and HNAP. On a regional-to-local scale, oxygen conditions were observed to have a strong effect on the cell density. Furthermore, intriguing insights were gained from the distinct microbial signature of deep (isolated) groundwater occurrences, that showed elevated levels of cell density, HNAP and activity. Small and less conclusive effects were observed for the land cover and distance to the surface as well as for the distinct types of wells and sampling procedures. Based on these results, a first microbiologically informed classification scheme and reference conditions for the properties of microbial communities were delineated for shallow groundwater in Austria, which can now be used to assess the microbiological-ecological status of groundwater ecosystems on a nation-wide scale. Furthermore, the established classification scheme (typology) allows the application of explanatory analytical techniques on a more nuanced basis, in order to learn about the relationship between environmental factors and microbial properties at a mechanistic and predictive level.