Η επίδραση της RNA στοιχειοθεσίας στο προφίλ της μικρογλοίας σε in vivo πειραματικό μοντέλο μυός με την νόσο scrapie
Creators: name: Κοβάτση, Έλενα Κότσο
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: RNA στοιχειοθεσία
Μικρογλοία
Scrapie
RNA editing
Microglia
Tρομώδης νόσος των αιγοπροβάτων

description: Οι ασθένειες Prion είναι σπάνιες θανατηφόρες νευροεκφυλιστικές ασθένειες γνωστές ως μεταδοτικές σπογγώδεις εγκεφαλοπάθειες (Transmissible Spongiform encephalopathies, TSE) και επηρεάζουν τόσο τα ζώα όσο και τους ανθρώπους. Το βασικό συμβάν στην παθολογία της νόσου συνίσταται στη μετατροπή της υψηλά συντηρημένης πρωτεΐνης Prion που κωδικοποιείται από τον ξενιστή από τη φυσιολογική (PrPC) στην παθολογική λανθασμένης αναδίπλωσης ισομορφής (PrPSc), η οποία συσσωματώνεται σε πλάκες αμυλοειδούς στον εγκέφαλο. Αυξανόμενες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι μεταβολές σε επίπεδο RNA, μπορεί να εμπλέκονται σε νευροεκφυλιστικές πρωτεϊνοπάθειες. Η επεξεργασία RNA αναφέρεται σε μια μετα-μεταγραφική ενζυματική διαδικασία, με την οποία ένα νουκλεοτίδιο αντικαθίσταται στην αλληλουχία του RNA και οδηγεί σε αλλαγή αμινοξέων στην τελική πρωτεΐνη. Σήμερα, έχουν εντοπιστεί δύο τύποι επεξεργασίας RNA στα θηλαστικά, οι οποίοι αφορούν στην απαμίνωση των νουκλεοτιδίων. Ένας τύπος αντιπροσωπεύει την επεξεργασία αδενοσίνης (Α) προς ινοσίνη (Ι) RNA, που καταλύεται από τις αποαμινάσες αδενοσίνης που δρουν επί RNA (ADARs). Ο δεύτερος τύπος αντιπροσωπεύει την απαμίνωση της κυτοσίνης (C) σε ουρακίλη (U) ιστοειδικά, και καταλύεται από την απαμινάση ΑΙD/Apobec1. Ο κύριος αντιπρόσωπος της οικογένειας AID/APOBEC, το ένζυμο APOBEC1, που αποτελεί την πρώτη απαμινάση που χαρακτηρίστηκε για το C-to-U RNA editing που επιτελείται στο mRNA της απολιποπρωτεΐνης Β (αpoB), δεν έχει μελετηθεί καθόλου αναφορικά με την επίδραση του στα νευροεκφυλιστικά νοσήματα. Η επεξεργασία RNA έχει αναφερθεί ότι διαφοροποιεί τις κωδικοποιημένες πληροφορίες, επηρεάζει τo εναλλακτικό μάτισμα και τέλος αυξάνει την ποικιλότητα των πρωτεϊνών και των νευρωνικών mRNA,. Πρόσφατα δημοσιευμένη έρευνα στηριζόμενη στην αλληλούχιση νέας γενιάς του RNA (RNA sequencing), αποκάλυψε νέους στόχους-μετάγραφα του Apobec1 σε ιστούς μυών, που σχετίζονται με νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως το γονίδιο ΑΡΡ που σχετίζεται άμεσα με τη νόσο του Alzheimer, υποδηλώνοντας πιθανή λειτουργική σημασία αυτού του ενζύμου στην παθογένεση και εξέλιξη νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως της νόσου prion. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση του Apobec1 στην εμφάνιση και εξέλιξη της νόσου prion χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά ποντίκια Apobec1 knock-out (KO) τα οποία έχουν προσβληθεί με την σπογγώδη μεταδιδόμενη εγκεφαλοπάθεια. Η μελέτη επικεντρώθηκε στην επίδραση του Apobec1 στον πληθυσμό των μικρογλοιακών κυττάρων, καθώς αποτελούν βασικό παράγοντα στην νευροφλεγμονή του κεντρικού νευρικού συστήματος και αρκετών νευροεκφυλιστικών νόσων. Επιπροσθέτως, δεδομένα αλληλούχισης του μεταγραφώματος εγκεφάλου μυός υποδεικνύουν ότι το Apobec1 υπερεκφράζεται στην μικρογλοία, η οποία είναι απαραίτητη για την ομοιόσταση του ΚΝΣ και έχει τόσο νευροπροστατευτικό όσο και νευροεκφυλιστικό ρόλο. Για να εκτιμηθεί ο ρόλος τoυ RNA editing απο το Apobec1 στην απόκριση της μικρογλοίας, ελέγξαμε το προφίλ έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της μικρογλοίας σε ποντίκια Apobec1 WT (+/+) και Apobec1 KO (-/-) RML. Ακόμα, ο ρόλος του Apobec1 εκτιμήθηκε και μέσω της μελέτης της έκφρασης γονιδίων, που σχετίζονται με την ενεργοποίση των αστροκυττάρων και των νευρώνων. ‘Ενας ακόμη στόχος ήταν η ταυτοποίση της RNA στοιχεοθεσίας απο το Αpobec1 στο 3’ αμετάφραστο άκρο (3’UTR) γονίδιων στόχων που έχουν συσχετιστεί προηγουμένως με νευροεκφυλιστικές ασθένειες αλλά και με τις TSE. Τα γονίδια αυτά προέκυψαν ως πιθανοί στόχοι απο την βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων αλληλούχισης RNA εγκεφάλων μυών που φέρουν την ανθρώπινη PrPC και ενοφθαλμίστηκαν με παρασκευάσματα της ασθένειας CJD, αλλά και μυών που αποτελούν την ομάδα ελέγχου.
description: Prion diseases are fatal neurodegenerative diseases known as Transmissible Spongiform Encephalophaties (TSE) and affect both animals and humans. Prion diseases include scrapie in sheep and goats, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle and Creutzfeldt-Jacob disease (CJD), Kuru, Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), the new variant of CJD as well as several iatrogenic forms in humans. According to the protein only hypothesis, the key event of the disease pathology consists in the conversion of the highly conserved host-encoded prion protein (termed PrPC) into a pathological misfolded isoform (PrPSc) which aggregates into amyloid plaques in the brain. Apart from this key molecular event, little is known regarding other mechanisms associated with prion diseases. Increasing evidence suggest that alterations at the level of the transcriptome, such as RNA editing, may be involved in neurodegenerative proteinopathies. RNA editing refers to an important post-transcriptional enzymatic process by which a nucleotide is replaced in the RNA transcript and results in amino acid change in the proteome. Today, two types of RNA editing have been identified, both involving deamination of nucleotides. One type represents Adenosine (A) to Inosine (I) RNA editing, catalyzed by members of the enzyme family knows as adenosine deaminases that act on RNA (ADARs). The second type represents Cytidine (C) to Uridine (U) deamination in RNA or DNA, in a species and tissue-specific manner which is catalyzed by Apobec1 (Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic peptide 1), the prototype member of the cytidine deaminases family. RNA editing has been reported to affect alternative splicing, to increase protein diversity and neuronal mRNA, to regulate gene expression and diversify the encoded information. Recently published data on transcriptome-wide sequencing has revealed novel mRNA targets of Apobec1 associated with neurodegenerative diseases, such as the APP gene that encodes for the amyloid precursor protein and is directly correlated with Alzheimer’s disease, suggesting a possible functional importance of this enzyme in prion disease progression. The aim of this study was to investigate whether there is a link between RNA editing and prion disease onset and progression utilizing transgenic Apobec1 knock-out (KO) mice challenged with mice-adapted scrapie strain (RML). We focused our study on microglial cells from prion challenged animals determining the impact of Apobec1 in the expression response of microglia enriched genes, since mouse brain transcriptome data indicate that Apobec1 expression is enriched in microglia, which are essential for CNS homeostasis, participate in neuronal network formation and have both neuroprotective and neurodegenerative role. Also, expression profile of mRNA of genes enriched in astrocytes and neurons was determined through qRT-PCR. Another aspect of the study, is validation of editing events (either by Apobec1 or ADAR) in target genes detected by in silico analysis of already published RNA seq data from humanized CJD mice RNA material in RML model. Editing events validated at 3’UTR target genes possibly associated with neurodegeneration may arise significant outcome on the role of Apobec1 in prion diseases with edited gene markers playing key role.