Strukturbiologische Untersuchung und zelluläre Charakterisierung kovalent-allosterischer Akt-Inhibitoren
Creators: name: Landel, Ina
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2020
Subjects: subject: Akt
subject: Strukturbasiertes Wirkstoffdesign
subject: Medizinische Chemie
subject: Kovalente Inhibitoren
subject: 570
subject: 540
subject: Medizinische Chemie
subject: Wirkstoffdesign

description: Aufgrund der Schlüsselposition der Proteinkinase Akt im PI3K/Akt-Signalweg resultiert aus genetischen Läsionen vorgeschalteter Proteine eine Überaktivierung der Kinase in verschiedenen Tumorerkrankungen. Zudem sind onkogene Mutationen der Akt-Kinase wie die E17K-Mutation bekannt, sodass die zielgerichtete Adressierung von Akt von großem Interesse in der medizinalchemischen Forschung ist. Dabei konnte das enorme Potential einer kovalent-allosterischen Modulation mit der Leitstruktur Borussertib durch dessen herausragende inhibitorische Potenz und Selektivität im Vergleich zu den in klinischen Studien untersuchten allosterischen und ATP-kompetitiven Akt-Inhibitoren bereits aufgelöst werden. Mit den in dieser Arbeit etablierten Zellsystemen konnten weiterführend die gesteigerte anti-proliferative Aktivität von Borussertib im Vergleich zu den Referenzinhibitoren gezeigt und die selektive Inhibition der Akt-Kinase und der nachgeschalteten Signalkaskaden durch Borussertib intrazellulär bestätigt werden. Außerdem konnte die in vivo-Wirksamkeit von Borussertib in Kombination mit dem MEK-Inhibitor Trametinib in KRas-mutierten Patienten-abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) nachgewiesen werden. Um eine ausreichende orale Bioverfügbarkeit zu erreichen, ist jedoch die weitere Optimierung von Borussertib im Rahmen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns (SBDD) erforderlich. Dafür konnte in dieser Arbeit ein verlässliches Kristallisationssystem für die Akt1-Kinase etabliert und somit 35 Kristallstrukturen im Komplex mit einer Vielzahl von kovalent-allosterischen Inhibitoren gelöst werden. Die erhaltenen Komplexstrukturen bestätigen die Bindung in der allosterischen Interdomänentasche sowie die kovalente Adressierung der in der Aktivierungsschleife befindlichen Cysteine. Zudem konnte mit dem vertieften Verständnis der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR) die Grundlage für die weitere Optimierung der CAAIs geliefert werden. Um das SBDD auch zur Adressierung der onkogenen Akt1 E17K-Mutante zu ermöglichen, wurden zahlreiche Kristallisationsexperimente durchgeführt, welche letztendlich zur Identifizierung vielversprechender Bedingungen führten. Weiterhin konnten sowohl die biochemische als auch zelluläre Charakterisierung mit dem in dieser Arbeit generierten Ba/F3 Akt1 E17K-Zellsystem die Überlegenheit der CAAIs im Vergleich zu den klinischen Akt-Inhibitoren auch hinsichtlich der Adressierung der Akt1 E17K-Mutante auflösen. Die validierten Methoden zur Etablierung eines Kristallisationssystems konnten außerdem auf die Rezeptortyrosinkinasen c-Kit- und PDGFR, welche prominente Zielproteine in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) darstellen, transferiert werden. Durch Reproduktion der beschriebenen Expressions-, Reinigungs- und Kristallisationsbedingungen konnten Kristalle des c-Kit Wildtyp-Proteins sowie vielversprechende Ansätze für PDGFR erhalten werden. Die Strukturanalyse der c-Kit-Kristalle lieferte dabei neue Ansätze zur Optimierung des Kristallisationskonstrukts.