Μελέτη της πρωτεΐνης ORF3a του SARS-CoV-2
Creators: name: Κεραμιδάς, Παναγιώτης Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Φλεγμονή
SARS-CoV-2
ORF3a
Inflammation

description: Ο SARS-CoV-2, είναι ένας ιός θετικού μονόκλωνου RNA, με μέγεθος γονιδιώματος περίπου 30.000 βάσεις και ο οποίος κωδικοποιεί τριών ειδών πρωτεΐνες (δομικές, μη δοκιμές και βοηθητικές). Η πρωτεΐνη ORF3a, η οποία είναι η μεγαλύτερη από τις βοηθητικές πρωτεΐνες του SARS-CoV-2, αποτελείται από 274 αμινοξέα (~33 kDa) και συμβάλλει τόσο στον σχηματισμό νέων ιοσωματίων όσο και στην παθογένεια του ιού. Στα πλαίσια της εργασίας αυτής, διερευνάται ο βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης ORF3a, σε κύτταρα του πνεύμονα (Α549) και του εντέρου (Caco-2), ως συστατικά των κύριων ιστών που προσβάλλονται κατά την μόλυνση του ξενιστή από τον SARS-CoV-2. Προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός δράσης της πρωτεϊνης αυτής μετά την «ενθυλάκωση» του γενετικού υλικού (mRNA) του ιού στο κύτταρο, το γονίδιο της ORF3a κλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pT7-IRES-His-C DNA για να παραχθεί το mRNA-ORF3a και να εισαχθεί στα κύτταρα που προαναφέρθηκαν. Πειράματα με την τεχνική της qPCR έδειξαν την έκφραση των αποπτωτικών παραγόντων BID, κασπάση 8, BIM, BAX, BAK, BAD, Bcl-2, RIP-1 και CHOP και επομένως την εμπλοκή της ORF3a στην εξωγενή οδό της απόπτωσης. Η αναμενόμενη φλεγμονώδης απόκριση των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα και του εντέρου μετά την επιμόλυνσή τους με το mRNA-ORF3a επιβεβαιώθηκε με την έκφραση των φλεγμονωδών παραγόντων IL1β, IL18, IL6, IL8, ISG15 και nF-κΒ. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η υποκυτταρική κατανομή της ORF3a ως πρωτεΐνη σύντηξης με την GFP (Green Fluorescent Protein). Σε εντερικά κύτταρα Caco-2, η ORF3a-GFP εντοπίζεται κυρίως στο πυρηνόπλασμα και στο κυτταρόπλασμα, αφήνοντας άδειους τους πυρηνίσκους, ενώ σε κύτταρα Α549 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, αφήνοντας άδειους τους πυρήνες. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία η αλληλεπίδρασή της με τον μεταγραφικό παράγοντα HCFC1 (Host Cell Factor C1) θα μπορούσε να είναι μία πιθανή εξήγηση, η οποία όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης
description: SARS-CoV-2, is positive single-stranded RNA virus, with a genome size of approximately 30,000 bases and which encodes three types of proteins (structural, non-structural and accessory). The ORF3a protein, which is the largest among the accessory proteins of SARS-CoV-2, consists of 274 amino acids (~33 kDa) and contributes to both the formation of new virions and virus pathogenicity. In this project, the biological role of the ORF3a protein is examined, in lung (A549) and intestinal (Caco-2) epithelial cells, as components of the main tissues affected during SARS-CoV-2 infection. In order to study the mechanism of action of this protein after the "encapsulation" of the viral genetic material (mRNA) in the cell, the ORF3a gene was cloned into the pT7-IRES-His-C DNA plasmid vector to produce mRNA-ORF3a and to transfect the above cell lines. The expression of the apoptotic factors BID, caspase 8, BIM, BAX, BAK, BAD, Bcl-2, RIP-1 and CHOP and therefore the involvement of ORF3a in the extrinsic pathway of apoptosis, was demonstrated by qPCR experiments. The expected inflammatory response of lung and intestinal epithelial cells after their transfection by mRNA-ORF3a was confirmed by the expression of inflammatory factors IL1β, IL18, IL6, IL8, ISG15 and nF-κB. In addition, the subcellular localization of ORF3a as a fusion protein with GFP (Green Fluorescent Protein) was examined by confocal microscopy. In intestinal Caco-2 cells, ORF3a-GFP is localized mainly in the nucleoplasm and cytoplasm, leaving the nucleoli area vacant, whereas in A549 cells it is mainly localized in the cytoplasm, leaving empty nuclei. According to the literature, ORF3a interaction with the transcription factor HCFC1 (Host Cell Factor C1) could be a possible explanation, which, however, needs further investigation