SVILUPPO DI METODI IFENATI ASSOCIATI ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA MALDI: APPLICAZIONI PROTEOMICHE E GLICOSFINGOLIPIDOMICHE.
Creators: name: TORRETTA, ENRICA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2014

description: L?interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l?applicazione di tecniche ifenate � generato dalla necessit� di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo lavoro affronta l?applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di: a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica ifenata per l?analisi di glicosfingolipidi. Negli studi di proteomica clinica, destinati all?identificazione di nuovi biomarcatori, i maggiori problemi sono legati all?incompatibilit� dell?intervallo di sensibilit� degli strumenti di rivelazione con l?intervallo di concentrazione delle specie proteiche e peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poich� l?intervallo di sensibilit� degli strumenti di rivelazione non pu� essere variato, il passaggio cruciale � rappresentato dalla riduzione dell?intervallo di concentrazione tra le specie pi� abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del siero ci� � stato ottenuto grazie all?eliminazione della frazione contenente le proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze statisticamente significative nell?espressione di alcune componenti proteiche, rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in diagnostica clinica � rappresentato dall?identificazione delle specie proteiche contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all?ifenazione tra tecniche cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, � stato possibile identificare il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, � stata confermata attraverso un esperimento di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e controlli. L?aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via alternativa del sistema del complemento impedendo l?associazione del fattore C3b al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti ?falsi negativi?. Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della diagnostica clinica � rappresentato da una classe di molecole di segnale che si sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tumori, malattie d?accumulo lisosomiale e sindrome metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l?analisi dei glicosfingolipidi non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili. Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l?utilizzo di precursori radioattivi, oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi III LC-MS di grande precisione ma dispendiosi in termini di tempo e di coinvolgimento dell?operatore. Attraverso l?ifenazione diretta HPTLC-MALDI, � stato possibile effettuare una fine analisi qualitativa e quantitativa del profilo glicosfingolipidomico estratto da mioblasti murini, distinguendo per ogni glicosfingolipide tutte le varianti a diversa catena di acido grasso presenti. Un aspetto importante � che lo sviluppo metodologico � stato accoppiato ad una analisi di campioni biologici i cui risultati sono stati confrontati con quelli precedentemente ottenuti attraverso l?utilizzo di precursori radioattivi e successiva analisi densitometrica su glicosfingolipidi estratti da mioblasti wild-type e overesprimenti la sialidasi NEU3. Pertanto, l?ifenazione proposta si � rivelata di grande applicabilit� alla caratterizzazione dei glicosfingolipidi in quanto riduce i passaggi analitici necessari evitando l?uso di precursori radioattivi e di procedure di estrazione della banda dal gel di silice, e potr� essere applicata allo studio di diverse condizioni fisiologiche e patologiche per identificare potenziali biomarcatori.