Interaction of Arthrobotrys flagrans with Caenorhabditis elegans involves G-protein dependent signaling
Creators: name: Hu, Xiaodi
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2023
Subjects: nematode-trapping fungus
G-protein coupled receptor

description: Nematodenfressende Pilze (NFP) sind eine große Gruppe von räuberischen Mikroorganismen, von denen einige dreidimensionale Fangnetze bilden, um Nematoden zu fangen. Bei Nährstoffmangel in ihrem Lebensraum und in Gegenwart von Nematoden gehen sie vom Saprotrophismus zu einer räuberischen Lebensweise über. Die Produktion von Fangzellen und die Sekretion von niedermolekularen Verbindungen sind Indikatoren für die Änderung der Lebensweise. Ich habe den NTF Arthrobotry flagrans (früher Duddingtonia flagrans) untersucht und Caenorhabditis elegans als Beute verwendet. Die räuberischen Pilze geben attraktive Geruchsstoffe ab, um ihre Beute anzulocken, und das Polyketid Arthrosporole, um die Falleninduktion zu hemmen. Andererseits sondert Caenorhabditis elegans Ascaroside als Pheromone ab, die viele Entwicklungsprozesse in C. elegans steuern. Sie werden auch von A. flagrans erkannt und induzieren die Fallenbildung durch Herunterregulieren des Arthrosporol-Biosynthesewegs. Es stellt sich die Frage, wie der Räuber die von den Nematoden stammenden Askaroside wahrnimmt und wie die externen Signale übertragen werden, um die Arthrosporol-Biosynthese des Pilzes herunterzuregulieren. Ich nahm an, dass diese Aufgabe von G-Protein-abhängigen Signalen erfüllt wird. Heterotrimere G-Proteine sind in allen Eukaryonten konserviert und sind entscheidende Elemente für die Wahrnehmung und Übertragung extrazellulärer Signale in die Zellen, um die richtigen biochemischen und physiologischen Reaktionen auszulösen. G-Protein-Signalwege umfassen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren GPCRs (G-protein-coupled receptors) und α-, β- und γ-Untereinheiten eines G-Proteins sowie eine Vielzahl von Regulatoren. Wenn ein GPCR externe Signale bindet, aktiviert er die G-α-Untereinheit, um GDP gegen GTP auszutauschen, was die Dissoziation von Gα-GTP aus dem βγ-Dimer beschleunigt und nachgeschaltete zelluläre Reaktionen auslöst. Ich analysierte die Hauptkomponenten der G-Protein-Kaskaden, die G-alpha-Untereinheiten (G-alpha subunits, Gas). In A. flagrans wurden drei kodierende Gene für Gas-Proteine identifiziert, nämlich gasA, gasB und gasC, und sie wurden einzeln durch homologe Rekombination deletiert. Im Gegensatz zum Wildtyp zeigte der GasA-Deletionsstamm in Anwesenheit von C. elegans oder angereicherten Ascarosiden keine Herabregulierung des artA-Clusters, was darauf hindeutet, dass GasA eine Rolle bei der Erkennung von Ascarosiden spielt, die von Nematoden stammen. Daher produzierte der Stamm keine Fallen. Ein Stamm mit GasB-Deletion produzierte weniger Konidien und Lufthyphen und deutlich weniger Fallen, jedoch mehr als die GasA-Mutante. In den Substrathyphen waren die Transkriptionshäufigkeiten des artA-Genclusters in dem gasB-mutanten Stamm höher als im Wildtyp. In einem gasC-Deletionsstamm wurde kein Defekt beobachtet. Kurz gesagt, GasA fungiert als Schalter für die Falleninduktion, während GasB die Fallenanzahl moduliert. Die im GasB-Deletionsstamm beobachteten Phänotypen wurden durch Zugabe von 8'-Bromo-cAMP (einem Analogon von cAMP) gerettet, was darauf hindeutet, dass GasB cAMP als zweiten Botenstoff verwendet. Außerdem wirkt der Transkriptionsfaktor Ste12 stromaufwärts des artA-Clusters, indem er dessen Expressionsniveau reguliert. Ich habe auch die Rolle von G-Protein-gekoppelten Rezeptorproteinen (GPCRs) untersucht. In A. flagrans wurden GPCRs aus konservierten Gruppen identifiziert, und einer der Rezeptoren der Kohlenstoffklasse, GprC, war für die Herstellung von Fallen wesentlich. Interessanterweise konnte die normale Morphogenese der Fallen in einem gprC-Deletionsstamm wiederhergestellt werden, indem ein chimäres Protein eingeführt wurde, das aus der N-terminalen Hälfte der C. elegans-Rezeptoren SRBC-64, SRBC-66 oder Daf-38 und der von A. flagrans stammenden C-terminalen Hälfte von GprC besteht. Dies könnte der erste Beweis für einen horizontalen Gentransfer (horizontal gene transfer, HGT) sein. Zusätzlich zur Analyse der G-Protein-Signalwege in A. flagrans wurde ein mutmaßliches Effektorprotein (putative effector protein, PefD) in diesem Pilz charakterisiert. Das Gen pefD beherbergt ein Signalpeptid und ein Propeptid. Das Signalpeptid erwies sich als funktionell, was darauf hindeutet, dass PefD sezerniert wird. Das Vorhandensein eines Propeptids deutet auf eine weitere Verarbeitung hin, um das reife Protein zu erhalten. Das pefD-Gen wurde in Fallen induziert, wie sowohl durch quantitative RT-PCR als auch durch einen Reporter-Assay nachgewiesen wurde. Eine mit fluoreszierenden Proteinen markierte Lokalisierungsanalyse ergab, dass sich PefD während des Nematodenfangs an der Penetrationsstelle anreichert. Ein A. flagrans-Stamm, der PefD überexprimiert, zeigte eine hohe nematizide Aktivität, was darauf hindeutet, dass PefD an der Bekämpfung von Nematoden beteiligt ist. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der Kommunikation zwischen einem Pilz und einem Nematoden bei und wirft ein Licht auf die molekularen Komponenten, die an der Signalübertragung und am Abtötungsprozess beteiligt sind.