title: Exploring the impact of posttranslational modifications on function and structure of heat shock protein 90 via protein semisynthesis
Creators: name: Gajsek, Oliver
Publisher: name: :none
Year: 2025

description: Molekulare Chaperone, wie die Hitzeschockproteine (Hsp), spielen eine entscheidende Rolle als Wächter der Zelle, indem sie sowohl unter normalen als auch unter Stressbedingungen die Proteostase aufrechterhalten. Innerhalb dieser Proteinfamilie gehört das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) zu den am häufigsten vorkommenden Vertretern und ist essenziell für die Faltung, Stabilisierung und Aktivierung hunderter Substrate – Proteine, die auf die Chaperonaktivität von Hsp90 angewiesen sind. Ein zentraler Regulationsmechanismus von Hsp90 sind posttranslationale Modifikationen (PTMs), die nachweislich alle wichtigen Schritte des Chaperonprozesses beeinflussen. Zu den häufigsten PTMs zählen Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung, die in allen drei Hauptdomänen von Hsp90 – der Amino-terminalen Domäne (NTD), der mittleren Domäne (MD) und der Carboxy-terminalen Domäne (CTD) – auftreten. Auch seltenere PTMs wie SUMOylie-rung, S-Nitrosylierung oder Ubiquitinierung wurden bei Hsp90 identifiziert. Trotz ihrer Bedeutung sind die spezifischen Auswirkungen dieser Modifikationen sowie ihre Wechselwirkungen bislang nur unzureichend verstanden, was zur Prägung des Begriffs „Chaperon-Code“ führte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mithilfe der Proteinsemisynthese ein Zugang zu ortsspezifisch modifizierten, homogenen Hsp90-Varianten geschaffen, um neue Einblicke in diesen Chaperon-Code zu gewinnen. Hierzu wurden drei verschiedene Semisynthesestrategien untersucht. Durch native chemische Ligation wurde versucht, phosphorylierte Varianten der N-terminalen Domäne (NTD) von Hsp90 herzustellen. Gleichzeitig gelang es mithilfe der EPSL-Methode (expressed protein selenoester ligation), vier verschiedene Varianten der C-terminalen Domäne (CTD) zu generieren, sowohl phosphorylierte als auch unmodifizierte. Die Auswirkungen dieser PTMs auf die Sekundärstruktur der CTD wurden durch CD-Spektroskopie untersucht. Außerdem wurde deren Einfluss auf die thermische Denaturierung und Chaperonaktivität der CTD analysiert. Die EPSL-Strategie wurde durch zwei zusätzliche sequenzielle Ligationen erweitert, wodurch erstmals die Synthese von unmodifiziertem humanen Hsp90α in voller Länge gelang. Diese Methode eröffnet neue Möglichkeiten zur Erforschung des Chaperon-Codes, da sie die gezielte Erzeugung einer Vielzahl von Hsp90-Varianten mit ortsspezifischen Modifikationen in der CTD und/oder MD ermöglicht.
description: As molecular chaperones, heat shock proteins are essential guardians of the cell by ensuring proteostasis under basal and stress conditions. Heat shock protein 90 (Hsp90) belongs to one of the most abundant representatives of the Hsp family, with several hundred known client proteins. Many of these client proteins are part of signal transduction cascades, making the chaperoning activity of Hsp90 play an essential role in many cellular processes. Hsp90 is highly regulated by posttranslational modifications (PTMs), which influence all significant steps of the chaperoning process. These modifications include phosphorylation, acetylation, and methylation, which occur in all major domains: The amino-terminal domain NTD, middle domain (MD), and C-terminal domain (CTD). Also, rarer PTMs such as SUMOylation, S-nitrosylation, and ubiquitination have been identified. However, the impact of specific modifications and their crosstalk are still primarily unknown or hinted at, giving birth to the term chaperone code This thesis aims to apply protein semi-synthesis technology to gain access to site-specifically modified homogenous Hsp90 variants, which can provide novel insight into the chaperone code. Three semi-synthesis routes have been explored to achieve this goal, which aim to generate human Hsp90α amino-terminal domain (NTD), carboxy-terminal domain (CTD), and full-length protein variants. A native chemical ligation strategy generated NTD variants bearing two different phosphorylations. The expressed protein selenoester ligation (EPSL) methodology successfully provided access to four phosphorylated and unmodified Hsp90 CTD variants. The CTD variants were refolded, and the impact of the PTMs on the secondary structure was characterized by CD spectroscopy as well as their thermal denaturation and chaperone activity assessed, which indicates a minor effect of double phosphorylation on the thermal stability of Hsp90 CTD. Furthermore, the EPSL strategy for generating semisynthetic CTD was extended by applying two additional C-to-N sequential ligation steps, allowing the generation of (unmodified) full-length hHsp90α. This strategy will allow further study of the chaperone code by potentially generating a variety of full-length Hsp90 variants bearing site-selective modifications in the CTD and/or the MD.