title: Analysis of B-lymphocyte Subsets from Gut-Associated Lymphoid Tissue
title: Analyse von B-lymphozytären Subpopulationen des darmassoziierten lymphatischen Gewebes
Creators: name: Maskow, Corinna
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: DNS-Sequenz
Antigen
Immunkomplex , Immunglobulin A
CDR3
Immunglobulin M
Medizin, Gesundheit

description: SUMMARY Background: The primary
      and secondary immunoglobulin repertoires represent an
      important basis of the pathogen defence in the vertebrate.
      The mucosa-associated lymphoid tissue plays a crucial role in
      the establishment and maintenance of mucosal homeostasis
      against invasive infections. Inside mucosal tissues,
      Immunoglobulin A (Ig A) is the predominating immunoglobulin
      that is secreted into the blood plasma, as well as onto the
      mucous membrane. The differentiation of antigen-activated
      B-cells into plasma and memory cells allows a quicker and
      more effective immune response in case of a recurrent
      confrontation with the same pathogen. Basic mechanisms
      concerning the development of B-cell and antibody repertoires
      are still unclear. Objective: It remains uncertain which
      selective pressure acts upon the B-cell repertoire during the
      class switch recombination from IgM to IgA in germinal
      centres. Furthermore it is unknown which criteria drive the
      recruitment of lymphocytes into the pool of IgA producing
      memory and plasma cells. In this work, we tested the
      hypothesis that subpopulations of IgA producing memory and
      plasma cells are not recruited by chance, but on the basis of
      their antigen binding properties. Methods: IgM producing
      B-cells as well as IgA producing memory and plasma cells were
      separated from Peyer’s patches of four adult BALB/C wildtype
      mice using flow cytometry. Using reverse transcriptase-PCR,
      we selectively amplified and cloned IgM and IgA transcripts
      of the immunoglobulin heavy chains. The transcripts were
      sequenced and nucleotide sequences were compared with the
      IMGT databases of germline sequences (Alignment via IMGT
      VQuest). Results: We collected a total number of 413
      immunoglobulin sequences in four independent experiments of
      which 323 (78%) were unique. The IgA sequences of memory and
      plasma cells showed a significantly lower clonal diversity
      than IgM sequences (74% and 72% vs. 94%; p &lt;0.01). IgA
      sequences of memory and plasma cells contained more somatic
      mutations than IgM sequences (37‰ and 35‰ vs. 14‰, p
      &lt;0.01). IgA transcripts from memory cells contained a
      lower number of random, so-called n-nucleotides within the
      CDR3-regions than IgA transcripts from plasma cells (p
      &lt;0.01). In comparison to the IgM sequences, the IgA
      sequences from memory cells showed significantly shorter CDR3
      regions (p = 0.02) and significantly shorter NDN regions
      (p=0.0002). A similar trend was observed with IgA plasma
      sequences; however this was not statistically significant.
      Moreover, we found a preference of single JH segments
      depending on the rearranged VH family. Discussion: IgA showed
      the typical signs of classical antigen selection. In
      comparison to IgM transcripts from the same tissue sample,
      the limited clonal diversity and the increased mutation rate
      of IgA memory and plasma cell transcripts document an antigen
      dependent focused selection during the class switch from IgM
      to IgA. Interestingly, CDR3-regions from IgA of memory cells
      and IgM were differently composed. As a consequence, IgA of
      memory cells showed a lower structural variety and, on
      average, a deeper antigen binding grove compared to IgM
      facilitating a closer interaction with the antigen. In
      contrast to earlier assumptions, the use of the VH family
      influences the JH utilization and the composition of the CDR3
      region. Conclusion: IgA producing memory and plasma cells
      represent separate populations with differing repertoires of
      antigen binding sites inside their antibodies. They both show
      characteristic features of an individual antigen dependent
      selection. Our data demonstrate that the CDR3 region is an
      important selection factor during class switch recombination
      to IgA in germinal centers.
description: ZUSAMMENFASSUNG Hintergrund: Das
      primäre und sekundäre Immunglobulinrepertoire bilden eine
      bedeutende Grundlage der Pathogenbekämpfung im Wirbeltier.
      Das Mukosa-assoziierte lymphatische Gewebe stellt hierbei die
      erste Front des humoralen Immunsystems gegen invasive
      Infektionen dar. An der Mukosa überwiegt das Immunglobulin A,
      welches sowohl in das Plasma als auch auf die Schleimhaut
      sezerniert werden kann. Eine Differenzierung der
      B-Lymphozyten zu Plasma- und Gedächtniszellen gewährleistet
      bei erneuter Infektion mit dem gleichen Pathogen eine viel
      schnellere und effektivere Immunantwort. Fragestellung:
      Unklar sind grundlegende Fragen zur Entwicklung der B-Zell-
      bzw. Antikörper-Repertoires im darmassoziierten lymphatischen
      Gewebe (gut-associated lymphoid tissue: (GALT): Welchem
      Selektionsdruck unterliegt das B-Zell-Repertoire während des
      Klassenwechsels zu IgA? Weiterhin ist nicht bekannt, nach
      welchen Kriterien Lymphozyten in den Pool der IgA-bildenden
      Gedächtnis- und Plasmazellen rekrutiert werden. In dieser
      Arbeit haben wir die Hypothese geprüft, dass IgA-bildende
      Subpopulationen der Gedächtnis- und Plasmazellen nicht
      zufällig, sondern aufgrund ihrer
      Antigen-Bindungseigenschaften rekrutiert werden. Methoden:
      Wir haben mittels Durchflusszytometrie Plasma- und
      Gedächtniszellen aus Peyerschen Plaques adulter BALB/C
      Wildtyp-Mäuse separiert und mittels Reverse Transkriptase-PCR
      selektiv IgM- und IgA-Transkripte der schweren
      Immunglobulin-Ketten amplifiziert und kloniert. Die so
      gewonnenen Transkripte wurden sequenziert und mittels
      Datenbankanalyse (Alignment mittels IMGT VQuest) ausgewertet.
      Ergebnisse: Es wurden insgesamt 413 Immunglobulinsequenzen in
      vier unabhängigen Experimenten erhoben, von denen sich 323
      (78%) als nicht-redundante Transkripte erwiesen.
      Immunglobulin A-Sequenzen der Gedächtnis- und Plasmazellen
      wiesen mit 74% bzw. 72% eine signifikant niedrigere klonale
      Diversität auf als Immunglobuline der Klasse M (94%; jeweils
      p&lt;0,01). Immunglobulin A-Sequenzen der Gedächtnis- und
      Plasmazellen enthielten mehr somatische Mutationen (37‰ bzw.
      35‰) als IgM-Sequenzen (14‰, p&lt;0,01). Bei IgA-Sequenzen
      aus Gedächtniszellen waren weniger zufällige, sogenannte
      N-Nukleotide innerhalb der Antigen-Bindungsstelle vorhanden
      als bei IgA-Sequenzen aus Plasmazellen (p&lt;0,01).
      Zusätzlich wiesen IgA-Sequenzen aus Gedächtniszellen im
      Vergleich zu IgM-Sequenzen signifikant kürzere CDR3-Regionen
      auf (p&lt;0,05) bei signifikant kürzeren NDN-Regionen
      (p&lt;0,01). Ein ähnlicher Trend war bei IgA-Sequenzen aus
      Plasmazellen erkennbar. In unserer Studie korrelierte zudem
      die Nutzung von JH- und VH-Gen-Familien. Diskussion:
      IgA-Sequenzen weisen die typischen Anzeichen der klassischen
      Antigenselektion auf. Die eingeschränkte klonale Diversität
      und die erhöhte Mutationsrate der IgA-Transkripte aus
      Gedächtnis- und Plasmazellen gegenüber IgM-Transkripten der
      gleichen Gewebeproben belegt eine Antigen-abhängige
      fokussierte Selektion während des Klassenwechsels von IgM zu
      IgA. Interessanterweise wiesen Immunglobuline A der
      Gedächtniszellen eine andere Binnenstruktur innerhalb der
      Antigen-Bindungsstelle (CDR-H3) auf als Immunglobuline M.
      Daher haben IgA aus Gedächtniszellen gegenüber IgM eine
      geringere strukturelle Vielfalt und im Durchschnitt eine
      flachere Antigen-Bindungsstelle, wodurch eine engere
      Interaktion mit dem Antigen möglich ist. Im Gegensatz zu
      früheren Annahmen beeinflußt die VH-Segment-Nutzung die
      JH-Segment-Nutzung und damit die Zusammensetzung der
      CDR3-Region eines Immunglobulins. Schlussfolgerung:
      Immunglobulin A produzierende Gedächtnis- und Plasmazellen
      stellen separate Populationen mit unterschiedlichen
      Repertoires an Antigen-Bindungsstellen innerhalb ihrer
      Antikörper dar. Sie weisen alle Charakteristika einer
      individuellen Antigen-abhängigen Selektion auf. Dies weist
      darauf hin, dass die CDR3-Region ein entscheidender
      Selektionsfaktor während des Klassenwechsels zu IgA
      darstellt.