Ανάπτυξη μεθοδολογιών για τον προσδιορισμό επιμολυντών σε βιολογικά υποστρώματα
Creators: name: Μπουζούκα, Ιωάννα Αντρέα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ζεαραλενόνη
Χολή
Υγρή χρωματογραφία
Φασματομετρία μάζας
Zearalenone
Bile sample
HPLC - MS

description: Η ζεαραλενόνη (ΖΕΝ) ανήκει στις μη-στεροειδείς μυκοτοξίνες που παράγονται από τους μύκητες του γένους Fusarium και προκαλούν διαταραχές της αναπαραγωγής σε διάφορα είδη ζώων, με τους χοίρους να αποτελούν την πιο ευπαθή ομάδα. Η μόλυνση από ζεαραλενόνη μπορεί να προκαλέσει σημαντικές οικονομικές απώλειες, καθώς και να θέσει σε κίνδυνο την υγεία των ανθρώπων και των ζώων. Ειδικότερα στους χοίρους έχουν αναφερθεί συμπτώματα υπεροιστρογονισμού ακόμα και σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από 1 mg/kg. Για να αποφευχθούν τέτοιες ανεπιθύμητες επιδράσεις, είναι απαραίτητη η ύπαρξη αξιόπιστων μεθόδων για τον προσδιορισμό της ΖΕΝ σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις σε προϊόντα δημητριακών και κατά συνέπεια η ανάπτυξη μεθόδων υψηλής ευαισθησίας για την ανίχνευση της ΖΕΝ ακόμα και σε επίπεδα κάτω του ppb για την ακριβή εκτίμηση κινδύνου λόγω της παρουσίας της, καθώς και τη χρήση τους σε μελέτες μεταβολισμού. Στη μελέτη αυτή, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα χολής από νεαρά χοιρίδια για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση της ΖΕΝ. Με βάση την εντεροηπατική κυκλοφορία, η μυκοτοξίνη αυτή μπορεί να ανιχνευτεί στο ήπαρ για μεγαλύτερο διάστημα απ’ ότι στο αίμα. Επιπλέον, όταν η συγκέντρωσή της στο αίμα είναι χαμηλή ή μη ανιχνεύσιμη, η χολή αποτελεί ιδανικό βιολογικό δείγμα λόγω των πολύ υψηλότερων συγκεντρώσεων της ΖΕΝ και των μεταβολιτών της που παρατηρούνται εκεί. Σύμφωνα με τις διαθέσιμες έρευνες, αυτό οφείλεται στη συσσώρευση της ΖΕΝ και των μεταβολιτών της στη χολή. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό ιχνών ζεαραλενόνης σε δείγματα χολής ή και σε άλλα βιολογικά υγρά. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υπερ-υψηλής απόδοσης (UHPLC) συζευγμένο με το φασματόμετρο μάζας (MS) Q Exactive Focus Orbitrap. Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός έγινε σε πρόγραμμα βαθμωτής έκλουσης με χρήση μείγματος μεθανόλης-νερού ως κινητής φάσης. Στις παραμέτρους του MS επιλέχθηκε αρνητικός ιοντισμός μέσω πηγής ηλεκτροψεκασμού (ESI) και για τη στοχευμένη ανάλυση της ΖΕΝ εφαρμόστηκε η μέθοδος της επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (Single Ion Monitoring, SIM). Για την ανάπτυξη της μεθόδου, αξιολογήθηκαν διαφορετικές συνθήκες προκατεργασίας δείγματος και βελτιστοποιήθηκαν οι παράμετροι στη χρωματογραφία, στην πηγή και τον ανιχνευτή. Η τελική μέθοδος προκατεργασίας περιλαμβάνει εκχύλιση στερεάς φάσης (SPE) με τη χρήση στηλών ανοσοσυγγένειας (IAC) έπειτα από υδρόλυση του δείγματος. Επιτεύχθηκαν επίπεδα ανάκτησης της τάξεως του 83-113% και ένα όριο ανίχνευσης 0,01 ppb. Η ακρίβεια και η πιστότητα ελέγχθηκαν και ήταν εντός των επιτρεπτών ορίων στην περιοχή συγκεντρώσεων που μελετήθηκε. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΖΕΝ σε δείγματα χολής από χοιρίδια που προέρχονταν από μία πειραματική μελέτη αποτελούμενη από δύο υποομάδες (positive and negative control). Συμπερασματικά, η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο έκθεσης των χοίρων ή και άλλων ζώων παραγωγής ακόμα και σε πολύ χαμηλά επίπεδα ΖΕΝ, ιδιαίτερα όταν οι αντίστοιχες ζωοτροφές δεν είναι πλέον διαθέσιμες για ανάλυση
description: Zearalenone (ZEN) is a nonsteroidal mycotoxin produced by Fusarium fungi. Pigs among other animal species are the most vulnerable to ZEN’s estrogenic effects. Contaminated products can cause significant economic losses and pose a risk to animals and humans. Particularly in pigs, symptoms of hyperestrogenism have been reported even at concentrations below 1 mg/kg. To prevent these effects, methods for reliable determination of ZEN at low concentrations in food and feed are needed, thus methods with sensitivities down to the sub ppb levels are required to enable accurate risk assessment and studies on ZEN metabolism. In this study, bile samples from weaned pigs were studied to investigate the presence of ZEN due to contamination. Based on enterohepatic circulation, ZEN may be present in bile for a longer period of time than in blood. Additionally, when blood concentrations are low or non-detectable, bile may be the preferred matrix since the concentration of ZEN and its metabolites in bile is substantially greater, as reported in several investigations, due to the accumulation of ZEN and its metabolites in bile. The aim of the present study was to develop an analytical method for the determination of ZEN at low concentrations in bile or other biological fluids. An UHPLC coupled to a Q Exactive Focus Orbitrap Mass Spectrometer was employed. The chromatographic separation was achieved under a water-methanol gradient elution and single ion monitoring (SIM) acquisition was performed using the negative ionization mode. For method development, different sample preparation conditions and different MS parameters were evaluated. The optimum protocol includes an SPE step by the use of immunoaffinity columns (IAC). The recoveries were in the range of 83-113 % and an LOQ of 0.03 ppb was achieved. Precision and accuracy were within acceptable values in the working concentration range. The method has been successfully used for the quantitative determination of ZEN in weaned pig bile samples from a feeding trial with two groups (positive and negative control). Τhe method can be used to trace ZEN exposure of pigs and possibly other farm animals, if the corresponding feed is no longer available for analysis