title: Zweifache Rolle von PACAP beim Melanom: Autokrine und parakrine Wirkmechanismmen auf Tumor- und Immunzellen
title: Dual Role of Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in Melanoma: Autocrine and Paracrine Mechanisms on Tumor and Immune cells
title: Dual Role of Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) in Melanoma: Autocrine and Paracrine Mechanisms on Tumor and Immune cells
Creators: name: Choi, Su Kyung
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Melanom
PACAP
Generalities
Melanoma

description: This thesis is based on
      investigation of PACAP and PAC1R expression and functional
      roles of PACAP in human melanoma as well as immune cells. In
      the first part, the study demonstrates for the first time the
      expression of PACAP in primary and metastatic melanoma
      tissues. PACAP is distributed in two distinct subtypes, PACAP
      27 and PACAP 38. PACAP 38 expression seems to be more
      prevalent in primary melanomas but metastatic melanomas
      profoundly produce PACAP 27. Another very interesting result
      is the predominant expression of high affinity PACAP
      receptor, PAC1R, in metastatic melanoma but not in primary
      melanoma. Co-expression of PACAP 27 and PAC1R can be also
      detected in metastatic melanoma cell lines. This finding let
      us consider that PACAP may regulate melanoma cells in an
      autocrine manner. PACAP function has been investigated on
      cell survival, cell growth, and cytokine production. Two
      melanoma lines were selected, SK-Mel 37 and NW-Mel 450, which
      express similar tumor-antigens, such as NY-ESO/LAGE-1, and
      MAGE 3, and have different morphological features and size.
      PACAP supplement achieved a positive regulation on survival
      or cell growth in SK-Mel 37, which is clearly susceptible to
      serum-starvation for reduced survival, in contrast to NW-Mel
      450. Gene or protein expressions related to cell survival
      (BCL-2) and proliferation (Ki67) were induced by PACAP.
      Moreover, PACAP positively modulated protein expression of
      cell differentiation (i.e. MITF) and of chemokine receptor
      (i.e. CCR7) in melanomas. These factors are considered as
      important checkpoints for malignancy of melanoma. In
      addition, the spontaneous cytokine production of both
      melanoma lines is different. SK-Mel 37 releases IL-10, an
      immunosuppressive cytokine, while NW-Mel 450 produces IL-6, a
      cytokine associated with tumor growth and angiogenesis. Our
      results show that PACAP up-regulates IL-6 release in NW-Mel
      450 but may not change IL-10 production in SK-Mel 37. These
      observations clarify, that PACAP induced pro-tumor features
      by different mechanisms. In the second part of the thesis
      PACAP-treated immune cells were investigated showing
      noticeable differences from untreated cells in the aspect of
      suppressive regulation. Two separated T cell subsets,
      CD4+CD25+CD127low/- T cells (regulatory T cells, Treg) and
      CD4+CD25- T cells (effector or responder T cells, Teff or
      Tresp) were studied. Both T cell subsets following PACAP
      supplement showed not only elevated gene transcripts of
      hallmarks for Treg, FoxP3 and CTLA-4, and of
      anti-inflammatory cytokines, IL-10 and TGF-β, but also
      significantly increased chemokine receptors, CCR4 and CCR7,
      being responsible for migration into dedicated tissue sites.
      Interestingly, a stronger effectiveness of PACAP on RNA level
      is observable in Treg cells compared to Teff/Tresp cells.
      This activity of PACAP may be predominantly mediated by the
      type II receptor, VPAC1R, which is present on CD4+ T cells.
      Our study, however, shows for the first time the expression
      of type I receptor, PAC1R, on T cells following activation
      with α-CD3/CD28 and particularly PACAP supplement. This
      finding let us consider, that perpetually provided PACAP by
      tumor cells may induce PAC1R expression on T cells. In
      addition in Treg functional assay a stronger suppression of
      cell growth of Teff/Tresp cells was observed, when
      co-culturing in the presence of PACAP. Taken together, for
      the first time our results show the expression of PACAP and
      high affinity PACAP receptor, PAC1R, in melanoma and the
      ability of PACAP to influence not only the cellular
      activation in cell growth and cytokine production of melanoma
      but also to enhance the characteristic features of Treg.
      Therefore, reducing the PACAP effect in melanoma may become
      valuable to influence the course of the disease. Further
      investigation of the cellular mechanism triggered by PACAP in
      melanoma and the PACAP-mediated suppressive regulation of
      Treg through PAC1R will be required.
description: Die vorliegende Arbeit basiert auf
      Untersuchungen von PACAP und PAC1R Expression und von den
      funktionalen Rollen von PACAP beim Melanom und Immunzellen.
      Im ersten Teil zeigt unsere Untersuchung die Expression von
      PACAP in primären und metastatischen Melanomgeweben. PACAP
      tritt in zwei Subtypen auf, PACAP 27 und PACAP 38. PACAP 38
      scheint ausgeprägter in primären Melanomen aufzutreten,
      während in metastatischen Melanomen eine verstärkte
      Expression von PACAP 27 vorliegt. Ein weiteres interessantes
      Ergebnis ist die vorwiegende Expression von hoch-affinem
      PACAP-Rezeptor, PAC1R, in metastasierenden Melanomen, nicht
      aber in primären Melanomen. Die Co-Expression von PACAP 27
      und PAC1R kann auch in den Zellinien von metastasierenden
      Melanomen nachgewiesen werden. Anhand dieser Resultate nehmen
      wir an, dass PACAP das Melanom in autokriner Weise regulieren
      kann. Die Wirkung von PACAP wurde bezüglich Zellwachstum und
      Cytokin-Produktion in Tumorzellinien untersucht. Zwei
      Melanom-Zellinien, SK-Mel 37 und NW-Mel 450 wurden
      ausgewählt, welche ähnliche Tumorantigene, wie NY-ESO/LAGE-1
      und MAGE- 3 exprimieren, aber unterschiedliche Morphologie in
      Struktur und Größe aufweisen. Bei SK-Mel 37, deren Überleben
      deutlich von der Serumkonzentration abhängig ist, bewirkt die
      Zugabe von PACAP im Gegensatz zu NW-Mel 450, eine positive
      Regulation des Zellüberlebens oder -wachstums. Die Gen- oder
      Proteinexpression für Zellüberleben (BCL-2) sowie
      Zellproliferation (Ki67) wird durch PACAP induziert.
      Zusätzlich moduliert PACAP auch die Proteinexpression
      betreffend Zelldifferenzierung (z.B. MITF) und
      Chemokinrezeptor (z.B. CCR7) in Melanomen positiv. Die oben
      genannten Faktoren werden als eine wichtige Schaltstelle für
      die Malignität des Melanoms betrachtet. Auch die
      Zytokinproduction in beiden Melanom-Zellinien unterscheidet
      sich. SK-Mel 37 setzt IL-10 frei, während NW-Mel 450 IL-6
      produziert. PACAP-Zugabe fördert die IL-6 Freisetzung aus
      NW-Mel 450, nicht aber die IL-10 Produktion aus SK-Mel 37.
      Diese Beobachtungen erläutern, dass trotz unterschiedlicher
      Regulation von PACAP auf Melanom-Zellinien, PACAP zur
      Förderung von Tumor-begünstigenden Funktionen führt. Im
      zweiten Teil der Arbeit zeigten PACAP-behandelte Immunzellen
      im Unterschied zu unbehandelten Zellen einen deutlichen
      Unterschied in Hinblick auf die immunsuppressive Regulation.
      Zwei isolierte T-Zell-Untergruppen, CD4+CD25+CD127low/-
      T-Zellen (regulatorische T-Zellen, Treg) und CD4+CD25-
      T-Zellen (Effektor oder Responder T-Zellen, Teff oder Tresp)
      wurden untersucht. Beide PACAP-behandelten
      T-Zell-Untergruppen erreichten nicht nur erhöhte
      Transkription spezieller Gene für die regulatorische
      Funktion, FoxP3 und CTLA-4, und für anti-inflammatorischen
      Zytokine, IL-10 und TGF-β, sondern auch eine erhöhte
      Genexpression von Chemokinrezeptoren, CCR4 und CCR7, die für
      die Wanderung der T-Zellen in bestimmte Gewebe verantwortlich
      sind. Interessanterweise kann eine stärkere Wirksamkeit von
      PACAP jedoch auf Treg im Vergleich mit den Teff/Tresp auf
      RNA-Ebene beobachtet werden. Diese Aktivität von PACAP wird
      überwiegend durch den Typ-II Rezeptor, VPAC1R, vermittelt, da
      auf CD4+ T-Zellen VPAC1R vorhanden sind. Weiterhin zeigt
      unser Experiment eine Expression von Typ-I Rezeptor, PAC1R,
      auf CD4+ T-Zellen nach der Aktivierung mit α-CD3/CD28 und
      PACAP-Zugabe. Dieses Resultat lässt uns vermuten, dass
      kontinuierlich freigesetztes PACAP aus Tumorzellen die
      PAC1R-Expression auf T-Zellen induziert. Entsprechend wurde
      in T-Zell-Suppressionstests ein stärker unterdrücktes
      Zellwachstum von Teff/Tresp in Co-Kultur mit Treg unter
      Zusatz von PACAP beoachtet. Zusammengefasst zeigen unsere
      Daten erstmals die Expression von PACAP und von hochaffinem
      PACAP Rezeptor, PAC1R, beim Melanom und die Fähigkeit von
      PACAP zur zellulären Aktivierung nicht nur des Zellwachstums
      und der Zytokinproduktion von Melanomzellen, sondern auch zur
      Verstärkung der charakteristischen Merkmale von Treg-Zellen.
      Daher könnte die Unterdrückung der PACAP-Wirkung beim Melanom
      eine wertvolle Strategie zur Beeinflussung des
      Krankheitsverlaufes werden. Somit ist es erforderlich, die
      PACAP-induzierten zellulären Mechanismen beim Melanom sowie
      die PACAP-vermittelte Regulation von Treg durch PAC1R genauer
      zu untersuchen.