OF MILK AND HONEY: MOLECULAR TOOLS TO MONITOR RESISTANCE IN HONEYBEE AND DAIRY COW DISEASES
Creators: name: DELL'ORCO, FRANCESCA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: L?utilizzo di strumenti molecolari per il monitoraggio del rischio delle malattie e per le strategie di controllo degli agenti patogeni in campo � ancora sottovalutato per molti motivi. Tra queste, bisogna considerare l?elevata complessit� e il costo di queste metodiche rispetto all?utilizzo della maggior parte dei metodi classici di monitoraggio e, alcune volte, l?utilizzo di protocolli standard incompleti in campo. Gli strumenti molecolari che sono stati validati per sensibilit�, specificit� e accuratezza, possono contribuire notevolmente al rilevamento degli agenti patogeni, soprattutto nei casi in cui i programmi di gestione delle malattie per la riduzione della patogenicit� e della mortalit� si basano sia su una rapida diagnosi specifica delle specie sia su un efficace profilo di virulenza di specie/ceppo e resistenza all'ospite. La biologia molecolare pu� supportare non solo l'identificazione e la caratterizzazione di patogeni target, ma pu� aiutare anche nelle strategie di allevamento per aumentare la resistenza naturale delle specie ospitanti. Questa tesi di dottorato � la conseguenza di una serie di attivit� e risultati sperimentali finalizzati ad una migliore applicazione della biologia molecolari per le strategie di controllo delle malattie nelle api, in particolare Apis mellifera e nelle vacche da latte. Questo approccio � stato selezionato in quanto le due specie producono cibo in sistemi di produzione molto diversi e quindi sono esposti a diversi agenti patogeni con elevate implicazioni epidemiologiche, patologiche e di controllo. Infatti, la salute dell'alveare pu� essere messa a rischio per le malattie delle api adulte, principalmente di origine virale e fungina, e anche per le malattie di covata, principalmente di origine batterica e parassitaria. Pertanto, un adeguato monitoraggio dell'alveare e la selezione di colonie resistenti dalle malattie di covata (un elevato comportamento igienico) portano dei benefici all'apicoltore professionista, in quanto questo implica un ridotto uso di farmaci con una maggiore sopravvivenza degli alveari. Invece, le vacche da latte possono essere affette da diversi patogeni con un diverso impatto sull?animale e sulla salute umana. Il latte pu� essere una buona fonte di patogeni alimentari, in quanto trasporta una variet� di microrganismi. Infatti, esso � a contatto diretto con i contaminati della stalla di mungitura, di origine ambiente e da animali infetti. In particolare, Escherichia coli � un patogeno batterico ampiamente diffuso, con diversi pattern di fattori di virulenza che pu� determinare gravi conseguenze sulla salute dell?allevamento. L'identificazione e la caratterizzazione dei ceppi patogeni di E. coli � molto importante per la salute pubblica in quanto pu� riprodursi negli animali, nell'uomo e nell'ambiente. Le diagnosi di routine e le differenziazione di ceppi intestinali e extraintestinali di E. coli nelle bovine da latte si basano su una combinazione di test biochimici; sierotipizzazione, saggi fenotipici sui fattori di virulenza e sui metodi di rilevazione molecolare. Il rilevamento dell'agente patogeno � molto importante per capire la sensibilit� innata dell?ospite a specifici ceppi di virulenti e per l?allestimento di una strategia di controllo efficace. In questo progetto � stata valutata la possibilit� di ottimizzare i metodi esistenti per una valutazione diagnostica affidabile e per un accurato profilo del rischio legata ai patogeni, come il rilevamento epidemiologica all'esposizione e alla sensibilit� dell?ospite. Per tutti gli approcci molecolari proposti � stato eseguito il confronto con i metodi standard gi� in uso, come step necessario per garantire affidabilit� e comparabilit� dei risultati. Primo capitolo, l'attivit� di ricerca si � concentrata sullo sviluppo di un metodo molecolare prognostico utilizzando dei biomarkers specifici per il comportamento igienico (HB) delle api nutrici, per verificare la potenziale applicazione in programmi di allevamento selettivo. Attualmente, gli apicoltori misurano i valori dell?HB nelle colonie con il pin-prick test o con il metodo dell?azoto liquido (FKB), durante i loro test in campo. Questi metodi sono molto imprecisi, richiedono tempo e molte risorse per gli allevatori, limitando cos� un'applicazione diffusa. La disponibilit� di biomarkers molecolari per il fenotipo igienico potrebbe velocizzare il riconoscimento di questo tratto e il processo di breeding. Questo lavoro � caratterizzato da un approccio trasversale: dalla caratterizzazione fenotipica del HB in campo con un metodo standard, al profilo dell'espressione dei geni target nelle api nutrici, per valutare la differente espressione dei geni tra le colonie selezionate per un alto e basso HB. I dati dell'espressione genica sono stati ottenuti tramite qPCR e i risultati hanno evidenziato Act5 e Obp4 tra i marcatori candidati per individuare un fenotipo igienico di una colonia. Questo approccio molecolare ha un grande potenziale per l'utilizzo nel campo come strumento affidabile per misurare la resistenza delle colonie ad differenti patogeni di covata. Secondo capitolo, un nuovo approccio basato su qPCR-HRMA per il monitoraggio della nosemosi nelle api. Si tratta di una malattia intestinale delle api adulti causata dalla microsporidia Nosema apis e N. ceranae. Queste due specie sono morfologicamente simili ma differiscono per il pattern epidemiologico e virulenza. Le strategie di controllo dell'infezione da parte degli apicoltori si basano su una corretta differenziazione delle specie. La discriminazione tra le due specie pu� essere fatta con dei metodi classici pu� essere problematico in quanto le spore di N. apis e N. ceranae non sono facilmente distinguibili tramite l?esame al microscopico. Questo pu� portare a una diagnosi errata soprattutto nei campioni da aree in cui sono presenti entrambi i microsporidi. La corretta identificazione delle specie richiede quindi un'analisi molecolare. Negli ultimi anni sono stati messi a punto diversi metodi molecolari con una elevata sensibilit� e specificit� rispetto alla microscopia classica. Tuttavia, rimane ancora necessario l?utilizzo di protocolli molecolari semplici, rapidi ed economici per discriminare tra N. ceranae e N. apis. High resolution melting analysis (HRMA) con Real Time PCR � una tecnica ampiamente utilizzata per mettere a punto i polimorfismi di sequenza in diverse specie senza la necessit� di eseguire sequenziamenti del DNA o di utilizzare sonde specie specifiche. Questo lavoro � finalizzato per progettare un metodo qualitativo e quantitativo per la rilevazione simultanea e la discriminazione delle infezioni causate da N. ceranae e N. apis, basato su HRMA accoppiato a Real-time PCR quantitativa (qPCR-HRMA). Un protocollo qPCR-HRMA veloce ed economico per individuare e differenziare simultaneamente e inequivocabilmente il DNA di N. ceranae e N. apis da DNA estratto dalle api. Questo metodo � pi� semplice della maggior parte degli altri metodi basati sul DNA e fornisce una discriminazione comparabile tra le due specie, utile anche come misura dell'esposizione e della sensibilit� delle api adulte in situazioni epidemiologiche definite. Terzo capitolo, l?attivit� di ricerca si � basata sulla presenza e sul profilo di virulenza dei ceppi patogeni di E. coli nel latte di massa e nei filtri della macchina della mungitura ed � stato valutato su un certo numero di campioni raccolti nelle aziende casearie. Per raggiungere questo scopo, le tecniche di isolamento e di identificazione classiche sono state accoppiate con un approccio diagnostico molecolare. I risultati hanno sottolineato il diverso pattern di rilevazione di E. coli patogeni nel latte di massa rispetto al filtri della macchina della mungitura, con particolare riguardo ai ceppi enteroinvasive E. coli (EIEC). L'unione dei metodi microbiologico e biomolecolari permette l'identificazione di E. coli da altri batteri su supporti specifici e dai profili dei fattori di virulenza, portando ad un'identificazione rapida e sensibile dei ceppi patogeni, step necessario per una corretta identificazione dell'esposizione per l?ospite e per l?uomo, e valutazione del rischio di salute inerente. In particolare, l'analisi dei filtri del latte potrebbe essere uno strumento utile per valutare la presenza del rischio di patotipi di E. coli sia a livello alimentare che ambientale. In generale, i risultati del presente progetto potrebbero contribuire alla caratterizzazione della sensibilit� degli ospiti per queste malattie e, infine, del rischio che questi patogeni possono provocare per la salute degli animali e/o degli esseri umani.