title: Entwicklung von Antikörper-basierten Tests zum quantitativen Nachweis von Antibiotika in Serum und Plasma
title: Development of antibody-based assays for the quantitative detection of antibiotics in serum and plasma
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Buschfort, Friederike
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
quantitativ
Antikörper
Nachweis
serum

description: Schwere Sepsis und septischer Schock gehören mit einem Anteil von 20–80 % der Erkrankungen und einer Sterblichkeitsrate von 22–76 % bei Intensivpatienten zu den dringendsten Problemen der modernen Medizin. Das Verbundprojekt „DiabKON“ (Diagnostische Antibiotika-Therapie-Kontrolle), aus dem diese Dissertation hervorgegangen ist, versucht die Behandlung von Intensivpatienten durch eine kontrollierte Antibiotikatherapie zu verbessern. Im Mittelpunkt steht dabei das Therapiemonitoring, bei dem eine erneuten Antibiotikagabe in Abhängigkeit von der zeitnahen Bestimmung der Antibiotikakonzentration im Blut des Patienten erfolgen sollte. Das Projekt wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung in der Fördermaßnahme „KMU-innovativ: Medizintechnik” (FKZ 13GW0354 A-F) gefördert. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung von Immunoassays, welche die schnelle, kostengünstige und quantitative Bestimmung der Antibiotika Linezolid und Ceftazidim aus humanen Blutproben erlauben. Die Ergebnisse der zwei Immunoassays sollten mit der Referenzmethode LC-MS/MS vergleichbar sein.
Dazu wurden in einem ersten Schritt zunächst monoklonale Antikörper generiert, indem Mäuse mit den an Trägerproteinen gebundene Antibiotika immunisiert wurden. Milzzellen von Mäusen mit dem höchsten Antikörpertiter wurden danach mit Myelomzellen zu Hybridomzellen fusioniert. Die Selektion der besten positiven Klone erfolgte anschließend über einen direkten kompetitiven ELISA über mehrere Screening-Runden. Die Entwicklung der Assays für Linezolid und Ceftazidim beinhaltete die Optimierung der Testprozedur mit der Prüfung mehrerer Testformate sowie die Etablierung einer Standardkurve für einen quantitativen Nachweis. Eine Optimierung der verwendeten Reagenzien konnte zudem die Stabilität des Assays und damit die Zuverlässigkeit der Messung maßgeblich verbessern. Nach der Entwicklung konnten im Zuge der Verifizierung und Validierung der beiden Tests alle erforderlichen Leistungsparameter der Assays ermittelt werden. Es zeigte sich, dass beide Tests alle regulatorischen Anforderungen bezüglich Genauigkeit, analytischer Sensitivität, Stabilität und Reproduzierbarkeit erfüllten. Die Methodenvergleiche zeigten eine sehr gute Vergleichbarkeit zur Referenz-Methode LC-MS/MS. Beide Tests können auf dem Instrument DRG:HYBRiD-XL der Firma DRG Instruments GmbH vollautomatisch durchgeführt werden. Sie dienen der schnellen quantitativen Erfassung der Antibiotikakonzentration von Linezolid und Ceftazidim im Blut und ermöglichen somit eine enge und zeitnahe Kontrolle der Antibiotika-Therapie.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit tragen dazu bei, weitere Tests gegen häufig verwendete Antibiotika zu entwickeln, die dann zum Therapiemonitoring der Antibiotikabehandlung verwendet werden können