Απομόνωση και λειτουργικός χαρακτηρισμός γονιδίων που κωδικοποιούν για μονοοξυγενάσες κυτοχρώματος P450, που πιθανώς εμπλέκονται στο βιοσυνθετικό μονοπάτι των φαινολικών διτερπενίων στα φυτά Salvia fr
Creators: name: Κορεκτσίδου, Μαρία-Ραχήλ Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Μονοοξυγενάσες Κυτοχρώματος P450
Φαινολικά Διτερπένια
Βιοσύνθεση Καρνοσικού οξέος
Cytochrome P450 Monooxygenases
Phenolic Diterpenes
Biosynthesis of Carnosic Acid

description: Τα Rosmarinus officinalis και Salvia fruticosa είναι φυτικά είδη της μεσογειακής βλάστησης, τα οποία αποτελούν οικονομικά σημαντικά βότανα για τις εταιρείες καλλυντικών και σήμερα οι βιομηχανίες τροφίμων και φαρμακευτικών προϊόντων ενδιαφέρονται για τους δευτερογενείς μεταβολίτες τους. Αυτά τα δύο είδη Lamiaceae είναι πλούσια σε φαινολικά διτερπένια, ιδιαίτερα σε καρνοσικό οξύ, καρνοσόλη και ροσμανόλη, τα οποία μπορεί να έχουν φαρμακευτικές εφαρμογές, λόγω των ισχυρών αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών, αντικαρκινικών ιδιοτήτων τους και έχουν προταθεί ως προληπτικοί και θεραπευτικοί παράγοντες για νευροεκφυλιστικές διαταραχές. Η βιοσυνθετική οδός του καρνοσικού οξέος έχει πρόσφατα αποσαφηνιστεί σε S. pomifera, S. fruticosa και R. officinalis. Επομένως, η διαθεσιμότητα των γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση του καρνοσικού οξέος ανοίγει ευκαιρίες για μελλοντική εκμετάλλευση του στη φαρμακoβιομηχανία. Ο κύριος στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η απομόνωση και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των γονιδίων που κωδικοποιούν μονοοξυγενάσες κυτοχρώματος P450 (CYP) που πιθανώς εμπλέκονται στη βιοσύνθεση φαινολικών διτερπενίων. Γι’ αυτό το σκοπό, υποψήφια γονίδια CYP, απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν λειτουργικά σε συστήματα ετερόλογης έκφρασης, όπως ζυμομύκητες (Saccharomyces cerevisiae) και Nicotiana benthamiana. Με το λειτουργικό χαρακτηρισμό σε ζυμομύκητα και την ανάλυση των προϊόντων με αέριο χρωματογραφία-φασματοσκοπία μαζών προσδιορίστηκε ότι το ένζυμο CYP71AxSf3 από S. fruticosa φέρει δραστικότητα συνθετάσης σαλβιόλης. Επιπλέον, κρίθηκε ενδιαφέρον να μελετηθεί η γονιδιακή ρύθμιση της βιοσύνθεσης του καρνοσικού οξέος. Γι’ αυτό το σκοπό, διερευνήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα που συμμετέχουν σε αυτή τη βιοσυνθετική οδό ως απόκριση σε συνθήκες καταπόνησης από υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων και σε σήματα άμυνας (μεθυλ-ιασμονικό οξύ). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης με RT-qPCR δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης των περισσότερων γονιδίων που μελετήθηκαν επηρεάστηκαν από αυτές τις επεμβάσεις, όπως η αλατότητα και η επεξεργασία με μεθυ-ιασμονικό οξύ και κάτι τέτοιο μπορεί να έχει ισχυρό αντίκτυπο στο συνολικό δυναμικό ως προς το καρνοσικό οξύ των εκχυλισμάτων δενδρολίβανου.
description: Rosmarinus officinalis and Salvia fruticosa are indigenous plant species of the Mediterranean basin, which have been economically important herbs for cosmetic companies, as well as for food and pharmaceutical industries for their secondary metabolites. These two Lamiaceae species are known to be rich in phenolic diterpenes, especially carnosic acid, carnosol and rosmanol, which may also have pharmaceutical applications, due to its strong antioxidant, anti-inflammatory, anticancer and neuroprotective properties. The biosynthetic pathway of carnosic acid has recently been elucidated in S. pomifera, S. fruticosa and R. officinalis. Therefore, the availability of the genes participating in the biosynthesis of carnosic acid opens opportunities for its future exploitation in pharmaceutical industry. The main aim of the present work is the isolation and functional characterization of genes coding for cytochrome P450 monooxygenases (CYP) potentially involved in the phenolic diterpenes biosynthesis. For this, candidate CYP genes, were isolated and functionally characterized in heterologous expression systems, such as yeast (Saccharomyces cerevisiae) and Nicotiana benthamiana. Assays in yeast and product analysis by gas chromatography-mass spectrometry have revealed that the S. fruticosa enzyme CYP71AxSf3 codes for a salviol synthase. Furthermore, it seemed interesting to study the gene expression of the carnosic acid biosynthesis. For this, the expression levels of genes encoding enzymes participating in this biosynthetic pathway were investigated in response to salinity stress and defense signals (methyl-jasmonate). The results of the RT-qPCR analysis show that the expression levels of most genes studied were affected by these treatments like salinity and methyl-jasmonate and suggests that can be used to induce carnosic acid biosynthesis