Χαρακτηρισμός και ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης ιών του γένους Closterovirus, foveavirus και vitivirus σε φυτικούς ιστούς αμπέλου
Creators: name: Δόβας, Χρυσόστομος Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2002
Subjects: Closterovirus
Foveavirus
Vitivirus

description: Παρά την αύξηση των γνώσεων σε ότι αφορά την αιτιολογία της συστροφής των φύλλων και της βοθροίωσης του ξύλου της αμπέλου, ο μεγάλος αριθμός των ιών που σχετίζονται με τις ασθένειες αυτές και τα μειονεκτήματα των διάφορων δοκιμών ανίχνευσης/ταυτοποίησης, καθιστούν τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού μι διαδικασία σύνθετη, με μικρή αξιοπιστία, χρονοβόρα και με υψηλό κόστος. Η συνεχιζόμενη ανακάλυψη νέων closter0-, viti- και fovea-ιων, δείχνει ότι στην αιτιολογία των ασθενειών εμπλέκονται και άλλοι ιοί για τους οποίους δεν υπάρχει δυνατότητα ανίχνευσης. Αντικείμενο της διατριβής ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης καθώς και ο χαρακτηρισμός νέων άγνωστων ιών που σχετίζονται με τις δύο ασθένειες. Αρχικά, έγινε ιολογικός έλεγχος πρέμνων αμπέλου προερχόμενων από κλωνική επιλογή, με τις διαθέσιμες ορολογικές και μοριακές και τεχνικές, με στόχο τη συλλογή clostro-, viti και fovea-ιών. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μια μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR η οποία χρησιμοποιεί εκκινητές με εκφυλισμό, για την ταυτόχρονη ανίχνευση viti-και fovea-ιώ. Η μέθοδος αυτή συνδυάστηκε με μια απλουστευμένη και αξιόπιστη μέθοδο επεξεργασίας των δειγμάτων και με μια δοκιμή, ανιχνέυει ταυτόχρονα RSPaV-1, GVS, GVB και GVD στο αμπέλι. Επίσης, αναπτύχθηκε μια ακόμη μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση clostero-, viti και fovea-ιών όπου μαζί με τους εκκινητές οι οποίοι στις ομόλογες περιοχές, περιέχου δεοξυγουανοσίνη στη θέση της dl. Οι μέθοδοι αυτοί αξιολογήθηκαν με τον έλεγχο, κατά τη διάρκεια του έτους, πρέμνων γνωστής ιολογικής κατάστασης. Τέλος, έγινε χαρακτηρισμός ενός clostero-ιού που ανακαλύφθηκε και αναπτύχθηκε μια εστιασμένη RT-PCR μέθοδος για την εξειδικευμένη ανίχνευση του
description: A spot nested RT-PCR assay using degenerate deoxyinosine-containing primers was developed, allowing the rapid and simultaneous detection of Closterovirus sequences. Nected PRC amplification increased the specificity and sensivity of detection. The sensivity was also increased by a factor of ten by using in addition to the dl-containing primers, respective homologous primers in which dl was shorter, have lower degeneracy and higher amplification efficiency than the dl-containing primers. This method was coupled to a similar nested RT-PCR amplification of sequences belonging to the tree genera in the same reaction tube and the two subsequent nested PCR amplifications(one for closteroviruses and one for viti-and foveaviruses) to run in parallel. Different primers and amlification parameters(additives and thermocycling conditions) were evaluated and optimised, respectively, in order to amplify efficiently all the different templates. These improvements permitted the multiplex detection of fovea- and closteroviruses in petiole and cortical scraping preparations from 23 infected field-grown grapevines throughout the year, with the eception of GLRaV-1 in petioles that was only possible from june onwards. Preliminary results show that this method can reliably detect virus species from three genera in grapevine allowing simple, fast and cost-effective analysis of a large number of samples in certification schemes