A MULTIDISCIPLINARY APPROACH TO CHARACTERIZE THE ROLE OF PROKINETICIN RECEPTOR 2 (PROKR2) IN CONGENITAL HYPOGONADOTROPIC HYPOGONADISM (CHH)
Creators: name: BASSI, IVAN
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2017

description: L?ipogonadismo ipogonadotropo congenito (CHH) � una malattia rara ed eterogenea con una importante componente genetica. Sono descritte tutte le forme di ereditariet� possibili, sia autosomica che X-linked. Dal punto di vista clinico i soggetti con CHH presentano sia delle alterazioni a carico del sistema riproduttivo ma anche dei fenotipi non riproduttivi. Dal punto di vista riproduttivo possiamo avere tratti quali il criptorchidismo e/o il micropene e/o l?ipospadia nei maschi gi� in epoca neonatale, oppure, in entrambi i sessi, uno sviluppo puberale assente o parziale in epoca adolescenziale e infertilit� in et� adulta. Per quanto riguarda i fenotipi non riproduttivi, quello pi� caratteristico � rappresentato dai difetti olfattivi, quali ipo- o anosmia. L?associazione di difetto olfattivo e CHH viene identificato come sindrome di Kallmann (KS), mentre le forme di CHH senza difetti olfattivi sono denominate CHH normosmico (nCHH). Altri fenotipi non riproduttivi associati possono essere la presenza di sincinesie bimanuali, difetti della linea mediana (come labio e/o palatoschisi), difetti renali (agenesia o disgenesia), difetti uditivi (sordit� neurosensoriale), difetti dentali (agenesia dentale), daltonismo, nistagmo. A causa della ridotta/assente fertilit� spontanea di questi soggetti, prevalgono i casi sporadici rispetto ai casi famigliari anche se il progressivo perfezionamento delle tecniche di procreazione medicalmente assistita sta sempre pi� cambiando questa realt�. Proprio grazie alla presenza dei casi famigliari, agli studi su modelli animali e alle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione siamo oggi in grado di associare 25 geni candidati alle forme di CHH. Va tuttavia segnalato che l?espressivit� e/o la penetranza di questi difetti genetici � estremamente variabile. Questo � in parte giustificato dall?evidenza che questa malattia non sia di fatto monogenica, come si pensava inizialmente, ma invece oligogenica. D?altro canto per�, � anche possibile che vi siano meccanismi genetici e/o epigenetici aggiuntivi che restano ancora da descrivere. Con lo scopo di comprendere meglio la componente genetica del CHH, nella prima parte del lavoro presentato in questa tesi e` stato condotto uno screening genetico dei principali geni coinvolti in CHH sulla pi� grande coorte di pazienti italiani (n=512). Questa operazione ha permesso l'identificazione di un totale di 204 varianti nel 32,2% dei casi clinici esaminati. L'analisi delle varianti ha evidenziato una componente oligogenica nel 4,6% dei pazienti. Tra i geni pi� frequentemente coinvolti nella nostra coorte un ruolo sicuramente importante � quello del gene PROKR2 che presenta varianti nel 7,5% dei casi. Lo screening genetico ha infatti permesso di individuare ben 17 varianti alleliche in questo gene di cui quattro mai state descritte in letteratura (p.G70S, p.D99N, p.C208S, p.M278K). PROKR2 � un gene noto per avere un ruolo importante, bench� non pienamente compreso, durante il processo di migrazione dei neuroni GnRH. E? noto che mutazioni di questo gene nell'uomo possono causare sia la KS che il nCHH e che siano associate a un?estrema varaiblit� fenotipica sia intra che inter-familiare. A seguito dei risultati ottenuti, abbiamo deciso di focalizzare la seconda parte di questo lavoro sulla caratterizzazione di queste varianti in vitro e in vivo allo scopo di meglio chiarire il ruolo del recettore della prochineticina 2 durante il processo di migrazione dei neuroni GnRH e ,di conseguenza, nel CHH. In particolare abbiamo caratterizzato dal punto di vista farmacologico le 4 varianti di nuova identificazione (p.G70S, p.D99N, p.C208S, p.M278K) unitamente ad altre 4 varianti gi� note in letteratura (p.R47W, p.M64V, p.R85H, p.P290S) ma ancora prive di caratterizzazione funzionale. Gli studi funzionali condotti hanno rivelato come queste varianti alleliche missenso possano influire in grado differente e indipendente sia sui meccanismi di trasporto in membrana del recettore PROKR2 che sulle vie di trasduzione del segnale intracellulari (Gs e Gq) da quest`ultimo mediate. In particolare, le varianti alleliche p.G70S, p.C208S e p.P290S producono una grave compromissione sia del meccanismo di trasporto in membrana che dell`attivazione delle vie Gs e Gq, mentre le mutazioni p.R47W, p.M64V e p.R85H colpiscono principalmente il trasporto in membrana. E` inoltre interessante notare come le varianti p.M278K e p.D99N , in seguito a stimolazione, hanno mostrato una quasi assente attivazione della via Gs in presenza di una buona conservazione nella funzionalita` della via Gq. Questi risultati sottolineano la necessit� di valutare l'integrit� di entrambi i meccanismi mediati da PROKR2: produzione di cAMP attraverso la via Gq e accumulo intracellulare di inositolo fosfato (IP) attraverso la via Gs, per un corretta valutazione dell`impatto funzionale delle varianti alleliche ritrovate. La parte finale di questo lavoro � stata incentrata sulla generazione di un modello in vivo per studiare il ruolo di PROKR2 nella migrazione dei neuroni GnRH utilizzando il modello animale di zebrafish (ZF). Pochi dati sono attualmente disponibili in letteratura sui recettori delle prochineticine in zebrafish. L'analisi bioinformatica condotta preliminarmente ha rivelato la presenza di due loci ben conservati all`interno del genoma di ZF: uno situato su chr1 ,denominato prokr1a, e una regione sul chr13, denominata prokr1b. Per valutare la loro espressione durante lo sviluppo di zebrafish, sono stati effettuati esperimenti di qRT-PCR Real-Time e Whole mount In Situ Hybridization (WISH) i quali hanno evidenziato un`espressione del solo gene prokr1b nei territori di migrazione ed espressione del gene GnRH3 (omologo in ZF di GnRH umano). Al fine di comprendere i ruoli funzionali di prokr1a e prokr1b, sono stati successivamente eseguiti esperimenti di knockdown iniettando sequenze oligonucletidiche sintetiche antisenso chiamate morpholino. I risultati hanno mostrato come la downregolazione di prokr1b, ma non prokr1a, colpisca la migrazione dei neuroni GnRH3 suggerendo cosi che prokr1b sia il gene omologo di PROKR2 umano. Per analizzare ulteriormente l'impatto di prokr1b sulla migrazione dei neuroni GnRH, e` stata inoltre generata una linea ZF knockout per il gene prokr1b. L` analisi delle fibre nervose dei neuroni GnRH in questa linea knockout ha mostrato gli stessi difetti di migrazione osservati durante gli esperimenti di downregolazione confermando cosi il ruolo di prokr1b nella migrazione dei neuroni GnRH. In conclusione, il presente lavoro di dottorato rappresenta l`applicazione di un approccio multidisciplinare per studiare i meccanismi genetici e molecolari coinvolti nel CHH, concentrandosi sul ruolo del gene PROKR2 in questa patologia. Attraverso analisi genetiche e` stato infatti possibile identificare nuove varianti genetiche di PROKR2 le quali, attraverso esperimenti in vitro, sono state farmacologicamente caratterizzate permettendo di evidenziare come le varianti possano influenzare in maniera differente le via di trasduzione del segnale intracellulari mediate dal recettore o il meccanismo di traslocazione in membrana. Infine, attraverso esperimenti di knockdown e knockout, e` stato identificato in zebrafish il gene ortologo di PROKR2 umano e generato un nuovo modello in vivo, che potrebbe essere importante al fine di svelare il ruolo preciso del pathway prochineticine nella patogenesi di CHH.