Charakterisierung des endogenen Metaboliten Phenylacetylglutamin als Substrat und Inhibitor des pharmakokinetisch-relevanten Transportproteins Organischer Anionentransporter 1 (OAT1)
Creators: name: Scheuerlein, Sofie
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025

description: Hintergrund und Ziele Um die Homöostase verschiedener Prozesse im Organismus aufrecht zu erhalten, ist die Aufnahme, Verteilung und Elimination endo- und exogener Substanzen notwendig. Hierbei spielen Trans- portproteine in Zellmembranen eine wichtige Rolle. Transportproteine in der basolateralen und apikalen Membran der proximalen Nierentubuluszelle fungieren als Aufnahmetransporter und Effluxpumpen und ermöglichen zusammen die Elimination von Substanzen. Im Fokus der vorlie- genden Forschungsarbeit ist der Aufnahmetransporter Organischer Anionentransporter 1 (OAT1), ein Mitglied der SLC22-Familie. Das OAT1-Transportprotein ist in der basolateralen Membran der proximalen Nierentubuluszellen lokalisiert. Paraaminohippurat (PAH) und Prostaglandin E2 (PGE2) stellen Beispiele für endogene Substrate dieses Transportproteins dar, während Arzneimittel wie β-Lactam-Antibiotika und Schleifendiuretika wie Furosemid Beispiele für exogene Substrate sind. Phenylacetylglutamin (PAG) ist ein endogener Metabolit, der tubulär sezerniert, anschließend über den Urin ausgeschieden wird und bei eingeschränkter Funktion der Niere im Blut akkumuliert. In der Literatur lässt sich aktuell kein Hinweis finden, welches Transportprotein die renale Sekretion von PAG vermittelt. Die physikochemischen Eigenschaften des endogenen Metaboliten legen jedoch die Vermutung nahe, dass PAG über OAT-Transportproteine (wie z. B. OAT1) renal sezerniert werden könnte. Daher war es das Ziel dieser Forschungsarbeit, mithilfe von in vitro-Transportversuchen herauszufinden, ob PAG ein Substrat beziehungsweise einen Inhibitor des OAT1-Transportproteins darstellt. Die Forschungsarbeit wurde hierfür in drei Abschnitte unterteilt. Methoden Für die in dieser Forschungsarbeit durchgeführten Versuche wurden humane embryonale Nieren- zellen (HEK) Zellen verwendet, die das humane OAT1-Transportprotein stabil überexprimieren (HEK-OAT1) sowie als Kontrolle HEK Zellen, die mit dem Leervektor transfiziert wurden (HEK- VK). Zunächst stand im Vordergrund die Funktionalität dieser am Lehrstuhl für Klinische Pharma- kologie und Klinische Toxikologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg bereits etablierten, aber bisher unzureichend charakterisierten Zelllinien nachzuweisen. Hierfür wurden Aufnahmeversuche mit den bereits bekannten OAT1-Substraten PGE2 und PAH durchgeführt. Die intrazelluläre Akkumulation der beiden Substrate in den HEK-OAT1 Zellen wurde jeweils mit der entsprechenden Akkumulation in den HEK-VK Zellen verglichen, um einen OAT1-vermittelten Transport zu bestimmen. Die folgenden Inhibitionsversuche hatten das Ziel, die hemmende Wir- kung des bekannten OAT1-Transport-Inhibitors Probenecid auf den OAT1-vermittelten Transport von PGE2 und PAH zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde die Netto-Akkumulation von PGE2 und PAH bei Koapplikation mit Probenecid mit der ohne Koapplikation des Inhibitors verglichen. Die Netto-Akkumulation wurde berechnet, indem die Akkumulation des Substrates in den HEK-VK Zellen von der in den HEK-OAT1 Zellen subtrahiert wurde. Im zweiten Teil der Promotionsarbeit wurden Aufnahmeversuche mit dem endogenen Metabo- liten PAG als Transport-Substrat unter gleichen Versuchsbedingungen durchgeführt. Die Mes- sung der PAG Aufnahme in Zellen erfolgte mittels der Flüssigkeitschromatographie-Tandem- Massenspektrometrie (LC-MS/MS, liquid chromatography-tandem mass spectrometry). Die intra- zelluläre Akkumulation von PAG in den HEK-OAT1 Zellen wurde mit der in den HEK-VK Zellen verglichen. Anschließend folgten Inhibitionsversuche mit PAG als Substrat und dem bekannten OAT1-Transport-Inhibitor Probenecid. Hierbei wurde die Netto-Akkumulation von PAG bei Ko- applikation mit Probenecid mit der ohne Koapplikation des Inhibitors verglichen. Zur Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante (Km-Wert) für den OAT1-vermittelten Transport von PAG wurden konzentrationsabhängige Aufnahmeversuche mit PAG durchgeführt. Abschließend wurde die potenziell inhibitorische Wirkung von PAG auf die Transportfunktion des OAT1-Transportproteins untersucht. Als Substrat wurde PAH verwendet. Die Netto-Akkumulation von PAH bei Koapplikation mit PAG wurde mit der Netto-Akkumulation ohne Koapplikation des potenziellen Inhibitors verglichen. Ergebnisse und Beobachtungen Im ersten Abschnitt der in vitro-Transportversuche mit HEK-OAT1 Zellen konnte gezeigt werden, dass sowohl PGE2 (5 μM) wie auch PAH (30 μM) im Vergleich zu den HEK-VK Zellen signifikant stärker intrazellulär akkumulieren (Transportratio 1,26 ± 0,05; p &lt; 0,001 für PGE2 und Transport- ratio 4,22 ± 0,21; p &lt; 0,0001 für PAH). Dies deckt sich mit früheren Publikationen, die zeigten, dass sowohl PGE2 wie auch PAH Substrate des renalen OAT1-Transportproteins sind. Wurde zusätzlich der OAT1-Transport-Inhibitor Probenecid (10 μM) koappliziert, zeigte sich sowohl für PGE2 als auch für PAH eine signifikant geringere Netto-Akkumulation im Vergleich zur Netto- Akkumulation ohne simultane Koapplikation des Inhibitors (Transportratio 0,20 ± 0,25; p &lt; 0,05 für PGE2 und Transportratio 0,57 ± 0,03; p &lt; 0,0001 für PAH). Somit wurde die Funktionalität der am Lehrstuhl für Klinische Pharmakologie und Klinische Toxikologie vorhandenen HEK-OAT1 und der HEK-VK Zellen bestätigt. Im zweiten Teil wurde in initialen Transportversuchen gezeigt, dass PAG als Substrat in den Konzentrationen 10 μM und 100 μM nach 5 min signifikant stärker in HEK-OAT1 Zellen im Vergleich zu den HEK-VK akkumuliert [Transportratio 8,62 ± 0,80; p &lt; 0,0001 für PAG (10 μM) und Transportratio 11,41 ± 0,93; p &lt; 0,0001 für PAG (100 μM)]. Bei der simultanen Koapplikation von PAG (10 μM und 100 μM) mit dem OAT1-Transport-Inhibitor Probenecid (10 μM) zeigte sich eine signifikant geringere Netto-Akkumulation des endogenen Metaboliten im Vergleich zur Netto-Akkumulation ohne Koapplikation des Inhibitors [Transportratio 0,42 ± 0,02; p &lt; 0,001 für PAG (10 μM) beziehungsweise Transportratio 0,46 ± 0,12; p &lt; 0,01 für PAG (100 μM)]. Durch die Bestimmung der konzentrationsabhängigen Netto-Aufnahme von PAG (5 − 500 μM) konnte ein Km-Wert von 68,0 ± 36,4 μM ermittelt werden. Im letzten Teil wurde die potenziell inhibitorische Wirkung von PAG auf den OAT1-vermittelten Transport von PAH untersucht. Bei diesen Versuchen wurde als Substrat PAH (30 μM) mit PAG in den Konzentrationen 10 μM und 100 μM eingesetzt. Interessanterweise konnte hierbei keine signifikant geringere Netto-Akkumulation von PAH im Vergleich zur Netto-Akkumulation ohne Koapplikation des potenziellen Inhibitors PAG nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen Zusammenfassend konnte in dieser Forschungsarbeit gezeigt werden, dass PAG, vermittelt durch das OAT1-Transportprotein, in Zellen aufgenommen wird. Dem OAT1-Transportprotein kann somit eine Bedeutung für den renalen Transport von PAG eingeräumt werden. Die Aufnahme von PAG aus dem Blut in proximale Nierentubuluszellen stellt den ersten Schritt der tubulären Sekretion des endogenen Metaboliten dar. Dieser Schritt kann durch das OAT1-Transportprotein in der basolateralen Membran vermittelt werden. Darüber hinaus stellt sich nun die Frage, ob PAG durch weitere Transportproteine der basolateralen Membran in die Nierenzellen aufgenommen werden kann. Studien zur renalen Sekretion des endogenen Metaboliten PAG sollten fortgeführt werden, da das Transportprotein, das verantwortlich für die tubuläre Sekretion über die apikale Membran der proximalen Nierentubuluszelle ist, bisher nicht identifiziert wurde.