title: Rationale Strategien zur Isolierung bakterieller Lassopeptide - Struktur, Biosynthese und Anwendungspotential
title: Rational strategies for the isolation of bacterial lasso peptides - structure, biosynthesis and applications
Creators: name: Knappe, Thomas
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Lassopeptide
Biosynthesis
Molecular scaffold
Chemie
Peptide antibiotics
Lasso peptides
Genomisches Mining
Genome mining
Biosynthese
Peptidantibiotikum
Peptidgerüste

description: Bacterial lasso peptides are
      ribosomally assembled, bioactive peptides consisting of 16 -
      21 proteinogenic amino acids. They share a branched cyclic
      primary structure characterized by an N-terminal macrolactam
      ring and a linear exocyclic C-terminus, which is threaded
      through the macrocycle and trapped either by steric hindrance
      of bulky side chains or covalently via disulfide bonds. The
      resulting lasso structure shows a remarkable stability
      towards proteolytic degradation, high temperatures and
      chemical denaturants and accounts in combination with the
      genetic encoding and the bacterial origin for the increasing
      interest in these unique structured peptides. In this study a
      genome mining based approach for the identification of novel
      lasso peptide biosynthetic gene clusters in bacteria was
      developed. Using this rational approach a cryptic gene
      cluster was identified in the genome of Burkholderia
      thailandensis E264 and a compound matching the predicted mass
      of the postulated lasso peptide could be detected in culture
      supernatants. Structural studies applying mass spectrometry
      and NMR spectroscopy confirmed the lasso structure of the
      isolated compound, which was named capistruin. The 19-aa
      lasso peptide showed antibacterial activity against members
      of the pathogenic Burkholderia cepacia complex and could be
      produced heterologously in Escherichia coli upon expression
      of the entire biosynthetic gene cluster. Subsequent
      mutational analysis of the ribosomal precursor protein led to
      the identification of four positions within the lasso
      sequence being critical for the maturation of the peptide.
      Inside the leader peptide a threonine residue at the P2
      position of the protease cleavage site was found to be
      essential for the processing of the precursor. Stability
      studies of selected capistruin variants gave insights into
      structure stability relationships and identified Arg15 as the
      residue which is solely responsible for the trapping of the
      C-terminus within the 9-residue macrolactam ring. In
      addition, the capistruin R15A/F16A variant was the first
      temperature sensitive lasso peptide which could be thermally
      unfolded into a branched-cyclic structure in vitro.
      Furthermore, the branched-cyclic peptides BI-32169 and
      anantin were analyzed by mass spectrometry and NMR
      spectroscopy. The postulated lasso structure, which was
      assumed based on similarities of their primary structures
      with known lasso peptides, could be proven for both peptides.
      As the glucagon receptor antagonist BI-32169 differs from
      lasso peptides of class I and II, it can be considered as the
      first representative of the novel class III. The relaxed
      substrate specificity of the biosynthetic machinery of lasso
      peptides suggested their application as stable molecular
      scaffolds for the presentation of pharmacophors in order to
      combine their intrinsic stability with the function of
      bioactive epitopes. The conversion of the lasso peptide
      microcin J25 into a nanomolar inhibitor of avb3 and avb5
      integrins with antiangiogenic activity by grafting of the
      integrin binding motif RGD onto the stable peptide framework
      demonstrates the so far unexplored pharmaceutical potential
      of lasso structured peptides. The results of this study
      provide significant insights into the structure, stability
      and biosynthesis of bacterial lasso peptides, which will
      improve genome mining for lasso structured peptides in the
      future and therefore contribute to the identification of
      novel, alternative peptide scaffolds for rational drug
      design.
description: Bakterielle Lassopeptide sind
      ribosomal synthetisierte, bioaktive Peptide, die sich aus 16
      bis 21 proteinogenen Aminosäuren zusammensetzen. Sie zeichnen
      sich durch eine verzweigt-zyklische Primärstruktur aus, die
      durch einen N-terminalen Makrolaktamring und einen linearen
      C-Terminus charakterisiert ist. Der C-Terminus ist nicht frei
      beweglich, sondern durch den makrozyklischen Ring hindurch
      gefädelt und dabei entweder durch sterische Hinderung
      voluminöser Aminosäureseitenketten oder kovalent durch
      Disulfidbindungen verankert. Die daraus resultierende
      Lassostruktur führt zu einer außerordentlichen Stabilität
      gegenüber Proteasen, hohen Temperaturen und chemischen
      Denaturierungsmitteln und begründet in Kombination mit der
      genetischen Kodierung und bakteriellen Herkunft das steigende
      Interesse an diesen einzigartig strukturierten Peptiden. In
      dieser Arbeit wurde ein auf Genomischem Mining basierendes
      Verfahren zur Identifizierung neuer
      Lassopeptidbiosynthesecluster in Bakterien entwickelt. Mit
      Hilfe dieser Strategie konnte ein kryptisches Gencluster im
      Genom von Burkholderia thailandensis E264 identifiziert und
      eine Verbindung mit der Masse des postulierten Lassopeptids
      im Kulturüberstand nachgewiesen werden.
      Strukturuntersuchungen mittels Massenspektrometrie und
      NMR-Spektroskopie belegten die Lassostruktur der isolierten
      Verbindung, die Capistruin genannt wurde. Das 19-AS
      Lassopeptid, das eine antibakterielle Aktivität gegen
      Vertreter des pathogenen Burkholderia cepacia-Komplexes
      zeigte, konnte durch Expression des Genclusters in
      Escherichia coli heterolog produziert werden. Die
      anschließende Mutationsanalyse des ribosomalen
      Vorläuferproteins führte zur Identifizierung von vier
      Positionen innerhalb der Lassopeptidsequenz, die kritisch für
      die Reifung des Peptids waren. Innerhalb des Leaderpeptids
      erwies sich Threonin an der P2-Position der
      Proteaseschnittstelle als essentiell für die Prozessierung
      des Vorläufers. Durch eine Stabilitätsanalyse ausgewählter
      Capistruinvarianten wurden Einblicke in
      Struktur-Stabilitäts-Beziehungen erhalten und Arg15 als der
      für die Verankerung des C-Terminus verantwortliche Rest
      identifiziert. Ferner wurde mit Capistruin R15A/F16A das
      erste temperatursensitive Lassopeptid generiert, das
      thermisch in eine verzweigt-zyklische Struktur entfaltet
      werden kann. Darüber hinaus wurden die zwei
      verzweigt-zyklischen Peptide BI-32169 und Anantin
      massenspektrometrisch und NMR-spektroskopisch untersucht.
      Dabei konnte für beide Peptide die postulierte Lassostruktur
      bewiesen werden, die aufgrund der Ähnlichkeit ihrer
      Primärstruktur mit der von Lassopeptiden vermutet worden war.
      Der Glucagonrezeptorantagonist BI-32169 unterscheidet sich
      dabei von den bisherigen Lassopeptiden der Klassen I und II
      und kann daher als Begründer der neuen Klasse III angesehen
      werden. Die relaxierte Substratspezifität der
      Biosynthesemaschinerie von Lassopeptiden legte eine
      Verwendung der stabilen Peptidgerüste zur Präsentation von
      Pharmakophoren nahe, um die intrinsischen
      Stabilitätseigenschaften mit den Funktionen bioaktiver
      Epitope zu kombinieren. Die Konversion des Lassopeptids
      MccJ25 in einen nanomolaren Inhibitor von avb3 und avb5
      Integrinen mit anti-angiogenetischer Wirkung durch die
      Insertion des Integrinbindungsmotivs RGD in das stabile
      Peptidrückgrat verdeutlicht dieses bisher ungenutzte
      Potential lassostrukturierter Peptide. Die Ergebnisse dieser
      Arbeit liefern einen Einblick in die Struktur, Stabilität und
      Biosynthese von bakteriellen Lassopeptiden und werden in
      Zukunft das Genomische Mining nach lassostrukturierten
      Peptiden erleichtern und damit zur Identifizierung von neuen,
      alternativen Peptidgerüsten beitragen, die zur Präsentation
      von bioaktiven Epitopen verwendet werden können.