title: Ca2+ dependent protein kinases in Arabidopsis thaliana
Creators: name: Mehlmer, Norbert
Publisher: name: :none
Year: 2008

description: Pflanzen sind nicht in der Lage, den Standort zu wechseln und müssen daher auf Änderungen der Umwelt adäquat reagieren um zu überleben und sich fortzupflanzen. Viele extrazelluläre Signale wie Licht, biotische und abiotische Stressfaktoren lösen in pflanzlichen - und auch in tierischen Zellen - eine kurzfristige Erhöhung der zellulären Ca2+ Konzentration aus, die als Signal wirkt. Ca2+ abhängige Protein Kinasen werden in der Gegenwart von erhöhtem Ca2+ aktiviert und leiten das ursprüngliche (Stress) Signal durch Protein Phosphorylierung weiter. Somit spielen diese Proteinkinasen eine zentrale Rolle in der Regulation der zellulären Stressantwort. In dieser Arbeit beschreibe ich die subzelluläre Lokalisierung von mehreren Ca2+ abhängigen Protein Kinasen (CDPKs) im Allgemeinem und CPK3 im Detail, und analysiere die Rolle von CPK3 in der Anpassung an abiotische Stressbedingungen. Durch Verwendung von CDPK-YFP Fusionsproteinen und biochemischer Zellfraktionierung war ich in der Lage zu zeigen, dass viele CDPKs Membranassoziiert sind. Ich konnte weiterhin zeigen, dass N-terminale Acylierungen (Myristoylierung und Palmitoylierung) für diese Lokalisierung verantwortlich sind. Diese Ergebnisse bestätigen die Beobachtung, dass N-Terminale Myristoylierung und Palmitoylierung eine wesentliche Rolle für die subzelluläre Lokalisation dieser Proteinkinasen spielen. CPK3 ist allerdings nicht palmitoyliert und infolgedessen auch im Zellkern lokalisiert. Dies erhöht die Anzahl von möglichen Zielproteinen, die durch CPK3 phosphoryliert werden können. Um molekulare Zielproteine von CPK3 zu isolieren, wurden mikrosomale Membranen isoliert und mit rekombinanter CPK3 phosphoryliert. Durch einen kombinierten Einsatz pho-spezifischer Antikörper und massenspektroskopischer Analyse konnten Phosphoproteine als CPK3 Targets identifiziert werden. Interessanterweise war ein Großteil dieser Proteine in den Transport von gelösten Substanzen und Ionen involviert, wie z.B. Ionen Pumpen und Kanal-Proteine, was für den salz-sensitiven Phänotyp der cpk3 Knock-out Linie verantwortlich sein dürfte.
description: Plants as sessile organisms have to respond to various external stimuli such as different forms of stress (i.e. pathogens, abiotic stress) or different light intensities. Many extra cellular signals such as light, biotic and abiotic stress factors elicit changes in the cellular Ca2+ concentrations in plant and animal cells (Harper et al., 2004; Cheng et al., 2002; Sanders et al., 2002). In plants, decoding of these calcium signals is performed by protein kinases such as calcium dependent protein kinases (CDPKs), which mediate cellular responses by either directly changing enzymatic activities via protein phosphorylation, or indirectly by changing gene expression patterns. In this work I describe the subcellular localization of several CDPKs, in particular that of CPK3 in detail and analyse the role of CPK3 in adaptation to abiotic stress conditions. Using expression constructs, in which the CDPKs were fused to yellow fluorescent protein (YFP) and in biochemical cell fractionation experiments, I was able to demonstrate the attachment of several CDPKs to cellular membranes. These results are consistent with the observed N-terminal myristoylation and palmitoylation of many CDPKs. However, CPK3 is not palmitoylated and localizes also to the nucleus, thus enabling targeting a great number of proteins with different subcellular localizations. To identify molecular targets of CPK3 isolated microsomal membranes were phosphorylated by recombinant CPK3 and identified phosphoproteins were analyzed by MS. Interestingly a major part of the identified proteins is involved in transport of solutes and ions including porins and ion pumps/channel proteins, which could explain the salt sensitive phenotype of the cpk3 knock-out line.