title: Vergleich kommerzieller DNA-Isolierungsmethoden zur Speziesidentifizierung in Käse mittels Real-Time PCR
Creators: name: Kaar, Nicole
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Aufgrund des immer häufigeren Auftretens von Verfälschungen und fehlerhaften Deklarationen übernimmt die Authentizitätsbestimmung von Lebensmitteln eine essentielle Rolle beim Schutz des Konsumenten. Die Entwicklung DNA-basierter Methoden zur Aufdeckung dieser Verfälschungen nimmt dabei eine besonders wichtige Stellung ein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl mit einer spezies-spezifischen PCR zum qualitativen, als auch mit der Real-Time PCR zum quantitativen Kuhmilchnachweis gearbeitet. Die verwendeten Primer zielten dabei auf das mitochondriale 12S rRNA Gen von Rindern ab, wobei sie ein Amplikon von 256 bp lieferten. In der Real-Time PCR wurde dabei SYBR Green I als Fluoreszenzfarbstoff verwendet, wobei mit Hilfe einer Schmelzkurvenanalyse die Spezifität der amplifizierten Produkte überprüft wurde. Beim Evaluieren einer optimalen DNA-Isolierungsmethode wurden zwei Isolierungskits miteinander verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass die Wizard-Methode mit einem zweimaligen Eluieren in je 50 µl AE-Puffer die höchste DNA-Ausbeute, aber auch –Qualität lieferte. Um den Kuhmilchanteil der unbekannten Handelsproben nachweisen zu können, mussten zuerst zwei Standardreihen evaluiert werden. Die Wolfpassing-Reihe zeigte sich dabei als stabilere Standardreihe, jedoch wiesen schon die Absorptionsmessungen auf eine niedrigere DNA-Konzentration hin. Bei der Quantifizierung der unbekannten Proben konnte beobachtet werden, dass die Wolfpassing-Reihe nicht kompatibel mit den Handelsproben war. Dies bestätigte sich auch im Vergleich der Standardgeraden, denn die Wolfpassing-Standardgerade lag im Vergleich zur Bryndza-Gerade nach oben versetzt, was bei gleichen Ct-Werten der Handelsproben einen weitaus höheren Kuhmilchanteil bedeuten würde. Diese Ergebnisse unterstreichen einerseits die Bedeutung von adäquaten und äquivalenten Standards und andererseits die hohe Variabilität der Real-Time Ergebnisse beim Vergleich mit der IEF-Methode.
description: Food authenticity has increasingly acquired importance due to the increasing problem of adulteration of dairy products and the lack of declaration. Therefore consumers have to be protected against mislabeling and fraud. Hereby ovine and caprine products get adulterated with cheaper bovine milk. DNA-based methods, which can detect very small amounts of DNA, have been developed and therefore play an important role in species identification. In this thesis a species-specific PCR was applied for the qualitative detection of bovine milk in different cheeses, whereas a Real-Time PCR was used for quantification. Primers were used targeting the bovine mitochondrial 12 ribosomalRNA gene obtaining a 256 bp amplified fragment. Real-Time PCR used a fluorescence detection system working with SYBR Green I as dye using the melting-curve analysis for improving the specificity. To evaluate the optimal DNA isolation method, two isolation kits were compared. Both, a photometric absorption measurement and also the Real-Time PCR showed that the Wizard method with a two-time elution in 50 μl AE-buffer led to the highest DNA quality and quantity. Two standard series were used to quantify unknown samples, which both showed outliers, which had to be excluded of the series. Wolfpassing series showed more stable data, but the general DNA concentration was lower according to the photometric absorption results. By quantifying the unknown samples with the Wolfpassing series, it was shown that this series was not compatible with the samples. This was supported by comparing the two standard series, because the Wolfpassing series was shifted above, leading to different percentages of cow milk with the same Ct value of the sample. These findings emphasize on the one hand the use of adequate standards, which are equivalent to the samples, and on the other hand the high fluctuation of the Real-Time PCR method results compared to the results of the isoelectric focusing method.