title: The species-specific effects of guinea pig adaptive mutations in Marburg virus VP40 and L on the protein’s functions and viral fitness
title: Spezies-spezifische Effekte von adaptiven Mutationen eines Meerschweinchen-letalen Marburg Virus auf die Proteinfunktionen von VP40 und L und die virale Fitness
Creators: name: Köhler, Alexander
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Virologie
Matrix Protein
virale Polymerase, Virale Fitness
L
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Adaption
Medizin, Marburg Virus
VP40

description: Marburg virus (MARV) is a highly
      pathogenic virus that causes severe, often lethal diseases
      specifically in humans and non-human primates. In rodents
      MARV is non-pathogenic. However, sequential passaging of MARV
      in rodents results in selection of a rodent-lethal virus.
      Lofts et al. established a guinea pig-lethal MARV containing
      only four non-silent amino acid changes in viral genome
      (Lofts et al., 2007). One amino acid substitution (D184N) was
      detected in the viral matrix protein VP40 and three amino
      acid substitutions were detected in the RNA-dependent RNA
      polymerase L (S741C, D758A and A759D). We analyzed the
      effects of the guinea pig-adaptive mutations on the functions
      of VP40 and L in a comparative study including human and
      guinea pig cells. Functional analyses were performed with
      ectopically expressed VP40D184N and L mutants by using
      different assays. The influence of the D184N mutation in VP40
      on the replicative capacities of MARV in guinea pig cells was
      analyzed by infection of cells with recombinant MARV
      containing the D184N mutation in VP40. The first part of the
      study demonstrated that a recombinant rMARV containing only
      the D184N amino acid substitution in VP40 displayed a higher
      level of viral fitness specifically in guinea pig, but not in
      human cells. The mutant virus showed higher replicative
      capacities, enlarged inclusion bodies and enhanced
      infectivity only in guinea pig cells. Detailed comparative
      analysis of VP40 functions, in human and guinea pig cells,
      indicated that the membrane binding capabilities and the
      interferon antagonistic function were not altered by the
      D184N amino acid substitution. However, presence of the D184N
      mutation in VP40 enhanced the production of VP40-induced
      virus-like particles (VLPs) specifically in guinea pig cells.
      In addition, the amount of NP in infectious virus-like
      particles (iVLPs) and virus preparations was enhanced in
      presence of the D184N mutation in VP40 specifically in guinea
      pig cells. These data might partially explain the higher
      infectivity of VP40D184N containing iVLPs compared to
      wildtype VP40 containing iVLPs. Most importantly, the
      inhibitory capacity of VP40 on replication and transcription
      was species-specifically lowered by the D184N mutation in
      VP40, allowing significantly higher levels of replication and
      transcription in guinea pig cells. The second part of the
      study focused on the importance of the mutations in the L
      protein observed in the guinea pig-lethal MARV.
      Interestingly, only the S714C substitution increased
      replication in both species while the other mutations, D758A
      and A759D severely impaired the polymerase function. All L
      mutant proteins displayed proper expression and were able to
      localize into inclusion bodies which represent the sites of
      viral transcription/replication. Finally, co-expression of
      plasmids encoding L with the S741C amino acid substitution
      and VP40D184N in guinea pig cells resulted in eight fold
      higher levels of replication and transcription in comparison
      to human cells. This suggested that the D184N mutation in
      VP40 and the S741C mutation in L together significantly
      improve replication of MARV in guinea pig cells. Altogether
      these data suggests that the D184N substitution in VP40 and
      the S714C substitution in L can contribute to the increased
      pathogenicity of guinea pig-lethal MARV.
description: Das Marburg Virus (MARV) ist
      hochpathogen und verursacht häufig schwere oft tödlich
      verlaufende Infektionen in Primaten. In Nagetieren hingegen
      verursacht das MARV jedoch keine Erkrankung. Sequentielles
      Passagieren des MARV in Nagetieren führt jedoch zur Selektion
      von Virusvarianten die eine tödliche Erkrankung in Nagetieren
      hervorrufen. Lofts et al. konnten durch sequentielles
      Passagieren ein Meerschweinchen adaptiertes MARV etablieren,
      das sich vom wildtypischen MARV lediglich durch vier
      ausgetauschte Aminosäuren unterschied, für die Tiere aber
      tödlich war (Lofts et al., 2007). Eine, Mutation, D184N,
      befindet sich in VP40 dem viralen Matrix Protein und drei
      weitere Mutationen, S741C, D758A, A759D, befinden sich in der
      viralen RNA-abhängigen RNA Polymerase, dem L Protein. Die
      molekularen Mechanismen, die durch diese Mutation beeinflusst
      wurden blieben unklar. Ziel dieser Arbeit war es zu
      analysieren ob diese adaptiven Mutationen im
      Meerschweinchen-letalen MARV die Funktionen der Proteine VP40
      und L in Meerschweinchenzellen im Vergleich zu menschlichen
      Zellen beeinflussen. Dazu untersuchten wir durch verschiedene
      Assays mit Hilfe von ektopischer Überexpression der
      rekombinanten Proteine VP40 mit der D184N Mutation und für
      verschiedene L Protein Varianten die jeweiligen
      Proteinfunktionen. Zusätzlich wurde der Einfluss der D184N
      Mutation in VP40 auf die replikative Fitness eines
      rekombinanten MARV bestimmt, welches lediglich die D184N
      Mutation in VP40 trägt (rMARVVP40(D184N)). Im ersten Teil
      dieser Arbeit wurde gezeigt das rMARVVP40(D184N) spezifisch
      in Meerschweinchenzellen eine gesteigerte Fitness besitzt.
      Die viralen Transkription/Replikation war verstärkt, es
      fanden sich vergrößerten viralen Einschlusskörperchen in den
      infizierten Zellen und die Infektiösität von rMARVVP40(D184N)
      war spezifisch für Meerschweinchenzellen erhöht. VP40 ist ein
      multifunktionelles Protein, welches bei der Abwehr der
      Interferonantwort der Zelle sowie beim Zusammenbau und
      Abknospen der Viren und bei der Regulation von
      Transkription/Replikation beteiligt ist. Vergleiche der
      einzelnen VP40 Funktionen in humanen und
      Meerschweinchenzellen zeigten, dass die D184N Mutation den
      VP40-mediierten Interferon Antagonismus sowie die Assoziation
      von VP40 mit Zellmembranen nicht beeinflussten. Jedoch führte
      die D184N Mutation in VP40 zu einer Zunahme der Abknospung
      von VP40-induzierten virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) in
      Meerschweinchenzellen. Zudem führte die D184N Mutation in
      VP40 zu einer Erhöhung der Menge an Nukleoprotein (NP) in
      infektiösen virus-ähnlichen Partikeln (iVLPs) lediglich in
      Meerschweinchenzellen. Diese Daten zeigen, dass viele der
      Funktionen des VP40 durch die D184N Mutation exklusiv in
      Meerschweinchenzellen beeinflusst werden und erklären
      zumindest teilweise die gesteigerte Infektiösität von
      VP40D184N enthaltenden iVLPs in Meerschweinchenzellen. Der
      bedeutendste spezies-spezifische Unterschied durch die D184N
      Mutation in VP40 betraf jedoch die VP40-vermittelten
      Inhibition der viralen Replikation und Transkription. Diese
      führte zu einer signifikanten Steigerung der viralen
      Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen was
      die Geschwindigkeit des Viruswachstums deutlich beeinflusste.
      Der zweite Teil dieser Arbeit untersuchte die Bedeutung der
      deri Mutationen im L Protein des Meerschweinchen-letalen
      MARV. Interessanterweise führte die S741C Mutation im L
      Protein zu einer deutlichen, spezies-unabhängigen, Steigerung
      der viralen Replikation und Transkription. Die Mutationen
      D758A und A759D hingegen hatten einen massiven Verlust der
      Polymerase Funktion des L Proteins zur Folge. Abschließend
      wurde durch Ko-expression der L Variante mit der S741C
      Mutation und VP40D184N gezeigt dass die Kombination dieser
      beiden Mutationen zu einer achtfachen Steigerung der viralen
      Replikation und Transkription in Meerschweinchenzellen
      gegenüber humanen Zellen führte. Die Daten dieser Arbeit,
      lassen vermuten, dass die D184N Mutation in VP40 und die
      S741C Mutation in L zu der hohen Letalität des
      Meerschweinchen-adaptierten MARV beitragen.