Charakterisierung des cysteinreichen Virulenzfaktors CyrA im Nematoden-fangenden Pilz Duddingtonia flagrans
Creators: name: Wernet, Nicole
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2022
Subjects: D. flagrans
C. elegans
Duddingtonia flagrans
Effektor proteine
Virulenzfaktor
Nematoden-fangende Pilze
Virulenz
filamentöse Pilze

description: Nematoden-fangende Pilze (NFP) sind eine Gruppe faszinierender, karnivorer Mikroorganismen. Bei Nährstoffmangel sind sie in der Lage vom saprotrophen Wachstum zu einem räuberischen Lebensstil zu wechseln. Dieser Wechsel geht mit der Ausbildung hoch-spezialisierter Fallenstrukturen und der Sekretion zahlreicher Signalmoleküle einher. Die Fallen werden ausgebildet, sobald die Pilze Nematoden-spezifische Ascaroside wahrgenommen haben. Nun locken die Räuber ihre Beute in die Fallen, indem sie attraktive, olfaktorische Signale abgeben. Es folgt ein ganzes Arsenal sekretierter Moleküle, um die Kolonisation der Nematoden durch die Pilze sicherzustellen. Dazu sind zunächst vor allem lytische Enzyme notwendig. Da der Fangvorgang der räuberischen Pilze relativ schnell abläuft und keine längerfristige Interaktion bestehen muss, stellt sich die Frage, ob neben den lytischen Enzymen auch kleine sekretierte Proteine eine Rolle spielen. Diese SSPs sind als Virulenzfaktoren und Effektorproteine in vielen tier- und pflanzenpathogenen Pilzen und Bakterien beschrieben. Da die Nematoden im Kontakt mit den Fallen Abwehrmechanismen aktivieren, könnten solche Virulenzfaktoren auch für die Überwindung der Strategien der Nematoden für NFP wichtig sein. In dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen dem Nematoden-fangenden Pilz Duddingtonia flagrans und dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans untersucht. Bioinformatische Analysen des Genoms haben ergeben, dass das Sekretom des NFPs 249 SSPs beinhaltet. Der Virulenzfaktor-Kandidat CyrA (cysteine rich protein A) ist eines dieser SSPs und wurde charakterisiert, um seine Rolle während der Attacke aufzuklären. Das sekretierte Protein ist außerdem eines der 170 cysteinreichen Proteinen und wurde bioinformatisch als putativer Effektor vorhergesagt. Die Induktion der Genexpression von cyrA in den Fallen wurde mit Hilfe einer qRT-PCR-Analyse und einem Promotor-Reporterassay gezeigt. Die Lokalisation mit fluoreszenten Proteinen ergab, dass CyrA in dynamischen, vesikelartigen Strukturen in den Fallen lokalisiert und hier an der Innenseite akkumuliert. Nach der Penetration lokalisierte das Protein im Infektionsbulbus, wo es vermutlich sekretiert wird. Besonderheiten des Sekretionswegs in den Fallen wurden durch die Fusion von GFP mit verschiedenen Signalpeptiden deutlich, die fast alle zur Lokalisation in Vesikeln in den Fallen führten, während im vegetativen Myzel keine Vesikel zu beobachten waren. Durch die Deletion des zu Saccharomyces cerevisiae exo70 orthologen Gens exoA, einer Komponente des Exocyst-Komplexes, wurde außerdem gezeigt, dass die Akkumulation von CyrA im Infektionsbulbus von diesem Proteinkomplex abhängig ist. Das cyrA Gen wurde mittels homologer Rekombination deletiert und Langzeitbeobachtungen des Infektionsprozess zeigten eine verringerte Virulenz der Mutante, die einen längeren Zeitraum für die Paralyse der Nematoden benötigte. Die heterologe Expression von cyrA in C. elegans führte zu einer verringerten Lebenszeit der Nematoden und gab Hinweise auf eine mögliche Rolle der C. elegans Coelomocyten während der Interaktion. Im Laufe dieser Arbeit wurde CyrA als Virulenzfaktor von D. flagrans identifiziert, der für die volle Virulenz des Pilzes benötigt wird. Es wurde die Hypothese bestätigt, dass SSPs eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen NFP und Nematoden spielen. Außerdem wurden wichtige Aspekte der Zellbiologie hinter der Sekretion von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze beleuchtet und erste Hinweise auf eine Rolle der Coelomocyten bei der Immunantwort von C. elegans erlangt. Diese Arbeit erlaubt einen ersten Einblick in das bisher noch weitestgehend unerforschte Feld der Analyse von Virulenzfaktoren Nematoden-fangender Pilze.