title: Bioabbaubare multifunktionelle Nanotransporter für pDNA- und siRNA-Delivery
title: Biodegradable multifunctional nanocarriers for pDNA and siRNA delivery
Creators: name: Zheng, Mengyao
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Gene delivery
Medizin, Gesundheit
DNA
Gen Transfektion
Gene transfection
siRNA

description: In this thesis, biodegradable
      non-viral polymeric nucleic acids delivery vectors were
      characterized concerning biophysicochemical parameters. In
      the first part of this research, to answer the questions: why
      the principle of DNA transfection cannot be directly applied
      for siRNA transfection, we investigated the complexation and
      aggregation mechanism of nucleic acids/polycations on the
      atomic and molecular scale. The MD and ITC data showed us the
      different nature and the different hierarchical mechanism
      related polycation-siRNA and polycation-pDNA complexes. All
      our results emphasized one point: lower N/P-ratios are
      especially effective for polycationic nanocarrier-based siRNA
      delivery, because siRNA aggregation results in a more uniform
      and stable complex formation at low N/P ratios already, which
      lead to increased siRNA delivery efficiency. This could have
      broad implications for the delivery of siRNA as less toxic
      and yet efficient delivery systems have been the bottle-neck
      for the translation of this promising approach into the
      clinical arena. In chapter 3, novel biodegradable amphiphilic
      copolymers hy-PEI-g-PCL-b-PEG were prepared by grafting
      PCL-b-PEG chains onto hyper-branched poly(ethylene imine) as
      non-viral gene delivery vectors. With the question: how can
      the graft densities of PCL-b-PEG chains influence the in
      vitro DNA delivery efficiency, our study began with the
      characterization of physico-chemical properties and expected
      that with the introducing of the grafted PCL-b-PEG chains,
      the in vitro DNA delivery efficiency with the grafted
      PCL-b-PEG chains could be improved. Of all the experimental
      results, buffer-capacity has almost exactly the same tendency
      as transfection efficiency. We assume that in all processes
      of DNA transfection, the endosomal escape has a really
      important and rate-limiting role. This opens new perspectives
      to advance the rational design of new gene delivery systems.
      The further investigation of these biodegradable grafted
      amphiphilic copolymers hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n as potential
      siRNA delivery vectors was showed in chapter 4. The purpose
      in this section was to enhance the in vivo blood circulation
      time and siRNA delivery efficiency of biodegradable
      copolymers
      polyethylenimine-graft-polycaprolactone-block-poly(ethylene
      glycol) (hyPEI-g-PCL-b-PEG) by introducing high graft
      densities of PCL-PEG chains. Our study indicated that the
      effect of PEG on prolonged circulating depends not only on
      its content in a copolymer (length or percentage), but also
      on the structure or the shape of the amphiphilic copolymer.
      We demonstrated that polymeric micelles, which are formed
      with amphiphilic block polymers have advantages especially
      for in vivo siRNA delivery, and that the graft density of the
      amphiphilic chains can enhance the blood circulation, which
      is a key parameter to promote the development of safe and
      efficient non-viral polymeric siRNA delivery in vivo.
      Although the copolymers hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n showed positive
      results as pDNA and siRNA delivery vectors in chapter 3 and
      4, the delivery of gene materials with these non-targeted
      copolymers is achieved mainly passively by the passive
      targeting. Therefore, to optimize these polymeric gene
      delivery vectors with targeting function, in chapter 5,
      folate conjugated PEI-g-PCL-b-PEG was examined for targeted
      gene delivery. Lower cytotoxicity was observed for
      PEI-g-PCL-b-PEG-Fol than PEI-g-PCL-b-PEG and the cellular
      uptake of polyplexes was enhanced by PEI-g-PCL-b-PEG-Fol in
      FR over-expressing KB cells compared with those by
      PEI-g-PCL-b-PEG. Importantly, this enhancement was inhibited
      by free folic acid, while did not appear in FR-negative A549
      cells. All these suggested the specific cell uptake of
      PEI-g-PCL-b-PEG-Fol/pDNA polyplexes via folate
      receptor-mediated endocytosis. Consequently,
      PEI-g-PCL-b-PEG-Fol/pDNA polyplexes revealed higher
      transfection than PEI-g-PCL-b-PEG/pDNA. Additional studies on
      gene transfection in vivo and utilizing these described
      folate-conjugated copolymers for targeted siRNA delivery are
      in proceeding. In Chapter 6, the novel siRNA delivery systems
      based on hyperflexible generation 2-4 triazine dendrimers was
      identified by correlating physico-chemical and biological in
      vitro and in vivo properties of the complexes with their
      thermodynamic interaction features simulated by molecular
      modeling and the influence of dendrimer flexibility has
      systematically been investigated and discussed. In this
      study, molecular modeling helped to understand experimental
      parameters based on the dendrimers’ structural properties and
      molecular imaging non-invasively predicted the in vivo fate
      of the complexes, both techniques can efficiently support the
      rapid development of safe and efficient siRNA formulations
      that are stable in vivo.
description: In der vorliegenden Arbeit wurden
      neue bioabbaubare Polymere für den Transport von
      Nukleinsäuren bezüglich ihrer biophysikochemischen
      Eigenschaften charakterisiert. Im ersten Teil dieser Arbeit
      (Kapitel 2) untersuchten wir die Komplexierung und den
      Aggregationsmechanismus von Nukleinsäuren mit Polykationen
      auf atomarer und molekularer Ebene unter Verwendungen der
      molekularen Modellierung, molekulardynamischen Simulation,
      isothermen Titrationskalorimetrie und anderen
      Charakterisierungsmethoden, um die Frage zu beantworten,
      warum ein guter pDNA-Vektor nicht unbedingt eben so gut für
      siRNA funktioniert. Diese Daten zeigten uns sehr
      unterschiedliche natürliche Eigenschaften und den
      hierarchischen Mechanismus der Komplexbildung von
      Polykationen/siRNA und Polykationen/pDNA. Mit der folgenden
      Untersuchung der Beziehung zwischen dem
      Nukleinsäuren/Polykationen-Aggregationsmechanismus und der
      in-vitro-siRNA-Delivery-Effizienz, konnten wir zeigen, dass
      niedrige N/P-Verhältnisse (Stickstoff/Phosphat) exzellente
      siRNA-Delivery-Effizienz ermöglichen, dies wurde aber in den
      bisherigen Untersuchungen für siRNA-Transfektion mit
      Polykationen vernachlässigt. In Kapitel 3 wurden neue
      bioabbaubare, amphipathische Copolymere hy-PEI-g-PCL-b-PEG
      durch die Kupplung von PCL-b-PEG-Ketten auf dem
      hyper-verzweigten Poly(ethylenimin) als nicht-virale
      Gentransfer-Vektoren charakterisiert. Der Einfluss der
      Kupplungsdichten von PCL-b-PEG-Ketten auf
      physikalisch-chemische Eigenschaften, DNA-Komplexierung und
      Transfektionseffizienz wurde untersucht und diskutiert. In
      dieser Studie wurde keine Korrelation zwischen den Größen der
      Polyplexe und Transfektionseffizienz gezeigt, während sich
      die Puffer-Kapazität, Zytotoxizität und Zeta-Potential als
      die entscheidenden Faktoren für Erklärung der Ergebnisse der
      Gentransfektion erwiesen. Von allen experimentellen
      Ergebnissen, zeigte die Puffer-Kapazität fast genau die
      gleiche Tendenz wie die Transfektionseffizienz. Wir gehen
      daher davon aus, dass in allen Prozessen der
      DNA-Transfektion, der „endosomal escape“ eine wichtige und
      geschwindigkeitsbestimmende Rolle spielt. Weitere
      Untersuchungen dieser biologisch abbaubaren amphipathischen
      Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n als potentiale
      siRNA-delivery Vektoren wurden in Kapitel 4 berichtet. Der
      Zweck der Untersuchungne dieses Kapitels war, die in vivo
      Blutzirkulationszeit und die siRNA Transfektionseffizienz der
      bioabbaubaren Copolymere hy-PEI-g-(PCL-b-PEG)n zu erhöhen.
      Unsere Studie zeigte, dass die Wirkung von PEG auf längere
      Blutzirkulationszeit nicht nur vom prozentualen Inhalt in
      einem Copolymer abhängt, sondern auch von der Struktur oder
      Form des Copolymers. Die Polymere-Mizellen, die mit
      amphipathischen Blockpolymeren entstehen, haben Vorteile für
      siRNA Transfektion z.B. effektive in vivo siRNA Transfektion
      und verlängerte Blutzirkulation. Im Kapitel 5, wurde das mit
      der Folsäure konjugierte Polymer PEI-g-PCL-b-PEG-Fol
      bezüglich seiner biophysikochemischen Eigenschaften
      charakterisiert. Geringere Zytotoxizität wurde bei
      PEI-g-PCL-b-PEG-Fol beobachtet. Die zelluläre Aufnahme wurde
      durch die Kupplung von Folsäure verbessert. Wichtig ist, dass
      diese Verbesserung durch freie Folsäure gehemmt wurde, und
      dass diese Verbesserung auch nicht in
      Folat-Rezeptor-negativen A549-Zellen beobachtet wurde. Alle
      Daten bestätigen die Aufnahme der PEI-g-PCL-b-PEG-Fol/pDNA
      Polyplexe über Folat-Rezeptor-vermittelte Endozytose. Die in
      vitro DNA Transfektionseffizienz wurde deutlich erhöht durch
      die Kupplung von Folsäure. Die zusätzlichen Untersuchungen in
      vivo und Nutzung dieser beschriebenen Folat-konjugierten
      Copolymeren für gezielte siRNA Transfektion sind in
      Bearbeitung. In Kapitel 6 wurden hyperflexible
      Triazin-Dendrimere der Generationen 2-4 als neuartige
      siRNA-Delivery-Systeme bezüglich ihrer
      physikalisch-chemischer und biologischer in vitro und in vivo
      Eigenschaften untersucht und diskutiert. In diesem Kapitel
      wurden die thermodynamische Eigenschaften durch molekulare
      Modellierung simuliert, und der Einfluss der Flexibilität
      wurde systematisch untersucht und diskutiert.