Διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης Wnt10b στη διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων ποντικού MEL:
Creators: name: Γιαννούδη, Ολγα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2007
Subjects: Διαφοροποίηση ερυθρολευχαιμικών κυττάρων
Wnt10b
Ερυθρολευχαιμικά κύτταρα ποντικού
Differentiation
Murine erythroleukemia cells
MEL

description: Η χρήση πρότυπων κυτταρικών μοντέλων in vitro αποτελεί εδώ και μερικές δεκαετίες ένα σημαντικό εργαλείο στο χώρο της Μοριακής Βιολογίας του καρκίνου, αλλά και πολύτιμη μεθοδολογική προσέγγιση στη σύγχρονη Μοριακή Φαρμακολογία για τη διευκρίνιση τόσο βασικών μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, όσο και στην ανάπτυξη καινοτόμων αντικαρκινικών θεραπευτικών. Ένα τέτοιο πρότυπο αποτελούν και τα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL, τα οποία παρέχουν τη δυνατότητα μελέτης της διαφοροποίησης των αιμοποιητικών κυττάρων κατά μήκος της ερυθράς σειράς, αλλά και ανάπτυξης καινοτόμων αντικαρκινικών φαρμάκων ως επαγωγέων της διαφοροποίησης των λευχαιμικών κυττάρων. Τα τελευταία μόρια με την ενεργοποίηση της διαφοροποίησης οδηγούν σε «δέσμευση» (commitment) των νεοπλασματικών κυττάρων σε μια κατάσταση όπου παρατηρείται αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και παραγωγή συγκεκριμένων πρωτεϊνών-δεικτών της διαφοροποιημένης κατάστασης, π.χ. αιμοσφαιρίνης στην περίπτωση των κυττάρων MEL. Προηγούμενη, λοιπόν, ερευνητική δουλειά που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής Α.Π.Θ., έδειξε ότι οι χημικοί επαγωγείς, -ενώσεις που ενεργοποιούν το πρόγραμμα ερυθροδιαφοροποίησης των κυττάρων MEL στην καλλιέργεια,- φαίνεται να συνδέονται με μια άγνωστη, μέχρι σήμερα, πρωτεΐνη ~38 kDa (p38) κατά τη λανθάνουσα περίοδο, πριν την τελική δέσμευσή τους για διαφοροποίηση. Επιπρόσθετα, η πρωτεΐνη p38 βρέθηκε με τη χρήση μεθόδων βιοπληροφορικής να παρουσιάζει δομική ομολογία με την πρωτεΐνη Wnt10b, που επίσης διαδραματίζει ρόλο στη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων. Το έναυσμα για την παρούσα εργασία δόθηκε από τα παραπάνω αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, ο σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η περαιτέρω διερεύνηση της συσχέτισης των πρωτεϊνών p38 και Wnt10b, τόσο σε δομικό όσο και σε λειτουργικό επίπεδο, ώστε να προκύψουν κάποια συμπεράσματα για το ρόλο της p38 στην έναρξη της διαφοροποίησης των κυττάρων MEL in vitro. Επιπρόσθετα, στόχος ήταν η διερεύνηση της έκφρασης του γονιδίου της Wnt10b σε πρωτεϊνικό επίπεδο αλλά και σε επίπεδο mRNA σε αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα MEL κύτταρα που αναπτύσσονται στην καλλιέργεια, ώστε να διαπιστωθεί ο περαιτέρω ρόλος της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων in vitro. Σε μια πρώτη προσπάθεια διερεύνησης της συσχέτισης των πρωτεϊνών Wnt10b και p38, έγινε η χρήση ειδικών αντισωμάτων έναντι των συγκεκριμένων μορίων και η εφαρμογή τεχνικών ανοσοκατακρήμνισης και ανάλυσης κατά Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ανίχνευση των δύο πρωτεϊνών: α) Σε πρωτεϊνικά κλάσματα των κυττάρων MEL που είχαν υποστεί διαδικασία εμπλουτισμού σε πρωτεΐνη p38 με χρωματογραφική στήλη αγχιστείας και μοριακής διήθησης. β) Σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα εμπλουτισμένα με ανοσοκατακρήμνιση σε Wnt10b, με τη χρήση των αντισωμάτων anti-Wnt10b και anti-p38, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά ενίσχυσαν την άποψη που ήδη υπήρχε από τη βιοπληροφορική ανάλυση ότι υπάρχει κάποιου βαθμού δομική ομολογία ανάμεσα στις δύο αυτές συγκεκριμένες πρωτεΐνες. H περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης της Wnt10b σε πρωτεϊνικό επίπεδο, σε αδιαφοροποίητα και διαφοροποιημένα MEL κύτταρα έδειξε ότι: α) Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη ανιχνεύεται στο κυτταρόπλασμα των αδιαφοροποίητων κυττάρων. β) Τα επίπεδά της μειώνονται σταδιακά, όσο προχωρά η διαφοροποίηση των κυττάρων μετά την επώασή τους με χημικούς επαγωγείς. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση για την εξαγωγή ασφαλέστερων συμπερασμάτων, αφού η συγκεκριμένη ομάδα αφορά μόρια πρωτεϊνών που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον οπότε το επίπεδό τους ενδοκυτταρικά θεωρείται μικρό. Όσον αφορά στην ανάλυση έκφρασης του γονιδίου Wnt10b στο επίπεδο του mRNA, φαίνεται ότι το γονίδιο αυτό ακολουθεί ένα μηχανισμό ρύθμισης που σχετίζεται τόσο με την ανάπτυξη των κυττάρων στην καλλιέργεια καθώς τα κύτταρα περνούν από τη λογαριθμική στη στατική (plateau) φάση ανάπτυξής τους, όσο και με την έναρξη της διαφοροποίησης που ενεργοποιείται από τους χημικούς επαγωγείς. Συγκεκριμένα: α) Τα επίπεδα του mRNA της Wnt10b αυξάνονται σημαντικά καθώς τα κύτταρα MEL εισέρχονται στη στατική φάση της ανάπτυξής τους. β) Αντίστοιχα, κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων MEL, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του συγκεκριμένου γονιδίου αυξάνονται μετά από 48 ώρες επώασης με χημικούς επαγωγείς, μειώνονται στη συνέχεια για να αυξηθούν όμως ξανά μετά από 96 ώρες. Η συγκεκριμένη διφασική κινητική έκφρασης του mRNA της Wnt10b στα διαφοροποιημένα κύτταρα ΜΕL αποτελεί ένα ενδιαφέρον πειραματικό στοιχείο που αξίζει περαιτέρω διερεύνησης. Το γεγονός της μη παρατήρησης αυξημένης έκφρασης του συγκεκριμένου mRNA στις 48 ώρες κατά τη διαφοροποίηση κυττάρων MEL που αναπτύσσονται σε αρκετά πυκνή αρχική κυτταρική συγκέντρωση, ενώ αντίθετα παρατηρείται η αύξηση μετά από 96 ώρες, δείχνει τη πιθανή συσχέτιση των αντίστοιχων δεδομένων με φαινόμενα είτε κυτταρικής ανάπτυξης είτε διαφοροποίησης, αντίστοιχα. Η αρχική λοιπόν διακύμανση μπορεί να οφείλεται στη διαφοροποίηση, ενώ η μετέπειτα σε φαινόμενα αναστολής της ανάπτυξης λόγω της αναπτυσσόμενης κυτταρικής επαφής στην καλλιέργεια (cell-cell contact inhibition). Τα συγκεκριμένα πειραματικά δεδομένα παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην ανάλυση βασικών μηχανισμών ελέγχου του προγράμματος διαφοροποίησης των κυττάρων MEL και αξίζουν περαιτέρω διερεύνησης.
description: Murine erythroleukemia (MEL) and other neoplastic cells that are induced to differentiate in culture into mature non-dividing cells, serve as model systems for studying various cellular and molecular aspects of “Differentiation Therapy of Cancer”. The precise mechanism(s) via which small molecular weight chemical inducers promote differentiation of leukemic or other neoplastic cells still remain elusive. However, the elucidation of the mechanisms involved in differentiation of leukemic cells are of vast importance in both understanding the molecular basis of the initiation of in vitro differentiation of cancer cells as well as the development of new innovative anticancer therapeutics. Previous work from the laboratory of Pharmacology, Department of Pharmaceutical Sciences, Aristotle University of Thessaloniki has shown that an inducer-binding protein (p38) isolated from MEL cells shares structural similarity with Wnt10b. The purification of p38 was achieved by using inducer-sepharose affinity chromatography and gel filtration methodology. Interestingly enough, the inducer-p38 complexes was found to exist during the early phase of the induction process but not at the later stages of differentiation indicating that may be related with initiation of commitment. To this end, although only portion of the primary structure of the p38 is still known from microsequencing, in this study we further investigated the structural relationship of these proteins (p38 and Wnt10) and assessed the protein and mRNA levels of Wnt10b in MEL cells grown in the presence or the absence of an inducer in culture. The results obtained have indicated that: a) the detection of p38 was achieved by Western blot analysis using an anti-serum antibody raised against p38 (anti-p38) in immunoprecipitated cellular extracts of untreated control MEL cells with anti-wnt10b Ab; b) the detection of Wnt10b was assessed by Western blot analysis using anti-wnt10b mAb in highly-purified fractions of p38 from MEL cells; c) the intracellular protein level of Wnt10b in control untreated parental MEL cells is very low, since was assessed only after immunoprecipitation of cellular extracts with anti-Wnt10b and Western blot analysis with the same antibody; d) on the contrary, no detection of Wnt10b was seen in differentiating MEL cells exposed to inducer HMBA after 96hr; e) assessment of mRNA steady-state level of wnt10b gene by RT-PCR analysis in non-differentiating control parental MEL cells has indicated that an increase happened as cells reach maximum growth rate and enter the plateau growth phase; f) upon differentiation of parental MEL cells initiated with HMBA, the expression of wnt10b gene has exhibited an initial increase at 48hr, followed by a decrease thereafter and finally has been increased again at late stages of differentiation after 96hr; g) however, the initial increase at 48hr has not been observed when parental MEL cells were exposed to HMBA at high cell density from the beginning of differentiation. The latter implies at the first increase may be related to differentiation program itself, whereas the second increase at late stages of differentiation after 96hr exposure to growth arrest due to cell-cell contact inhibition. Overall, the experimental data obtained add valuable information on the expression profile of wnt10b gene during differentiation of MEL cells in culture and also further verify the existence of structural similarities between Wnt10 and p38.