Ανάπτυξη αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό μυκοτοξινών και υπολειμμάτων γεωργικών φαρμάκων σε μήλα
Creators: name: Μάγγαλου, Μαρία Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Τεχνική εκχύλισης υποβοηθούμενη από μικροκύματα
Υγρή χρωματογραφία συζευγμένη με διπλή φασματομετρία μάζας
Επικύρωση μεθόδου
Microwave assisted extraction
Liquid chromatography-mass spectrometry / mass spectrometry
Method validation

description: Στις μέρες μας, περισσότερο από ποτέ, τα ασφαλή τρόφιμα αποτελούν ζητούμενο για τη διασφάλιση της υγείας του καταναλωτή. Τόσο η παρουσία τοξικών μεταβολιτών, όπως οι μυκοτοξίνες, που παράγονται από επιβλαβείς οργανισμούς όσο και τα υπολείμματα φυτοφαρμάκων στα τρόφιμα, σε περιεκτικότητα μεγαλύτερη των επιτρεπτών ορίων, αποτελούν κίνδυνο για τη Δημόσια Υγεία καθώς η κατανάλωσή τους μπορεί να επιφέρει σοβαρές επιπτώσεις στον ανθρώπινο οργανισμό. Η μηλιά αποτελεί μία από τις σημαντικότερες καλλιέργειες, τόσο σε εθνικό όσο και σε παγκόσμιο επίπεδο, λόγω των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών αλλά και της θρεπτικής αξίας των καρπών της. Μύκητες του γένους Alternaria spp. και το Penicillium expansum αποτελούν, συχνά, το αίτιο μείωσης της παραγωγής αλλά και παρουσίας μυκοτοξινών στα μήλα. Αποτελούν τα σημαντικότερα αίτια μετασυλλεκτικών σήψεων και, επομένως, υπάρχει μεγάλος κίνδυνος κατανάλωσης μήλων που περιέχουν τοξικές ουσίες προερχόμενες από τους συγκεκριμένους μύκητες. Για την αντιμετώπιση των απωλειών από τους μυκοτοξικογενείς μύκητες Alternaria spp. και Penicillium expansum αλλά και από όλους τους υπόλοιπους εχθρούς και ασθένειες που απειλούν την καλλιέργεια χρησιμοποιείται μεγάλος αριθμός γεωργικών φαρμάκων. Τα υπολείμματα στα μήλα που παραμένουν μετά την εφαρμογή αυτών των ουσιών δημιουργούν ανησυχία στο καταναλωτικό κοινό, και ειδικότερα όταν η χρήση τους δεν πραγματοποιείται σύμφωνα με την ορθή γεωργική πρακτική. Μεγάλη σημασία έχει, λοιπόν, η ανάπτυξη γρήγορων και εύκολων μεθόδων ταυτόχρονου προσδιορισμού αυτών των επικίνδυνων υπολειμμάτων στα μήλα. Έτσι, στην παρούσα μελέτη έγινε προσπάθεια ανάπτυξης μίας αναλυτικής μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό μυκοτοξινών που παράγονται από το γένος Alternaria spp. (αλτερναριόλη και μονομεθυλαιθέρας της αλτερναριόλης) και το είδος Penicillium expansum (πατουλίνη και κιτρινίνη) και ενός μεγάλου αριθμού γεωργικών φαρμάκων που έχουν έγκριση για την καλλιέργεια της μηλιάς στη χώρα μας. Για την εκχύλιση των ουσιών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική εκχύλισης υποβοηθούμενη από μικροκύματα, ενώ η χρωματογραφική ανάλυση και η ταυτοποίηση των προσδιοριζόμενων ουσιών πραγματοποιήθηκε με σύστημα υγρής χρωματογραφίας συζευγμένου με διπλή φασματομετρία μάζας. Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές με διαφορετικές αναλυτικές στήλες και κινητές φάσεις αλλά και διαφορετικούς διαλύτες, ποσότητα υποστρώματος, χρόνους και θερμοκρασία προκειμένου να βρεθούν οι πιο κατάλληλες συνθήκες για την εκχύλιση και ανάλυση των ουσιών. Η αναπτυχθείσα μέθοδος δεν περιλαμβάνει τεχνική καθαρισμού, μειώνοντας τον συνολικό χρόνο, το κόστος αλλά και τον κίνδυνο απώλειας ορισμένων ουσιών. Τέλος, η αποτελεσματικότητα της μεθόδου συγκρίθηκε με τη μέθοδο εκχύλισης στερεάς φάσεως υγρού γνωστή ως QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) QuEChERS, η οποία αποτελεί μία από τις πιο διαδεδομένες εργαστηριακές μεθόδους για τον έλεγχο της παρουσίας υπολειμμάτων και μυκοτοξινών σε τρόφιμα. Η πολυ-υπολειμματική μέθοδος επικυρώθηκε στα επίπεδα 0,03 μg/g και 0,1 μg/g ως προς τη γραμμικότητα, την ορθότητα και την πιστότητα, ενώ προσδιορίσθηκαν και τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης και η επίδραση του υποστρώματος. Η επικύρωση της μεθόδου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το έγγραφο της SANTE/11813/2017 και από τα στοιχεία προκύπτει ότι η μέθοδος για την πλειονότητα των αναλυόμενων ουσιών παρουσιάζει αποδεκτή γραμμικότητα με R2≥0,99, αποδεκτή ορθότητα με ποσοστά ανάκτησης 70-120% και πιστότητα με RSD≤20. Ως όριο ποσοτικοποίησης ορίσθηκε για ορισμένες ενώσεις το 0,03 μg/g ενώ για άλλες το 0,01 μg/g.
description: Nowadays, more than ever, safe food is a demand for consumer health. Both the presence of toxic metabolites, such as mycotoxins, and pesticide residues in food, when their quantity is greater than acceptable limits, are dangerous to Public Health, as their consumption cause lethal effects or long-term diseases on human body. So, it`s importance to develop fast and easy methods for simultaneously determination dangerous contaminants in food. Apple is one of the most important crops, both nationally and globally, because of its organoleptic characteristics and the nutritional value of its fruits. Alternaria spp. and Penicillium expansum, often, reduce production and produce mycotoxins in apples. They are the major causes of post-harvest sepsis, and, therefore, the risk of eating apples containing these toxic substances is high. To protect the apple crop from Alternaria spp., Penicillium expansum and all other enemies and diseases, many pesticides are used. When these substances are not applied in accordance with good agricultural practice, dangerous pesticide residues on apples remain, causing concern to the consumer public. It is, therefore, importance to develop rapid and easy methods for simultaneous determination of pesticide residue and mycotoxins produced by Alternaria spp. and Penicillium expansum in apples. Thus, the present study attempted to develop an analytical method for simultaneous determination of mycotoxins alternariol, alternariol monomethyl ether, patulin and citrinin and a large number of pesticides approved for apple cultivation in our country. Microwave Assisted Extraction was used for the extraction of the substances, and the chromatographic analysis was performed using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry / Mass Spectrometry. Tests were carried out with different analytical columns, mobile phases, solvents, matrix quantity, time and temperature to find the most suitable conditions for extraction and analysis of the substances. The developed method does not include cleaning techniques, reducing the total time, cost and risk of substances losses. Finally, QuEChERS extraction, one of the most widely used methods for controlling the presence of pesticide residues and mycotoxins in foods, was carried out to compare the results with this method. The multi-residual method was validated at the levels of 0.03 µg/g and 0.1 µg/g for linearity, accuracy, precision, detection limits, quantification limits and matrix effect. The validation of the method was carried out according to SANTE/11813/2017 document and the data show that the method for most of the analyzed substances has acceptable linearity with R2≥0.99, acceptable accuracy with 70-120% recovery rates and precision with RSD≤20. The limit of quantification was 0.03 µg/g for some compounds and 0.01 µg/g for others.