Ενδοκυττάρια μεταφορά της ανασυνδιασμένης ανθρώπινης ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα Κ-562:
Creators: name: Μπουτουρέλη, Χριστίνα ΝΙκολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: β-σφαιρίνη
Μεταγωγή πρωτεϊνών
β-Θαλασσαιμία
β-globin
Protein Transduction
β-Thalassemia

description: Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η παραγωγή της ανασυνδιασμένης ανθρώπινης ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ και ο έλεγχος της ενδοκυττάριας μεταφοράς της στα ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα Κ-562. Η β-σφαιρίνη είναι μία πρωτεΐνη που στον άνθρωπο συνδέεται με την α-σφαιρίνη για το σχηματισμό της αιμοσφαιρίνης Α (HbA:α2β2). Η αιμοσφαιρίνη Α αποτελεί την κύρια μορφή αιμοσφαιρίνης των ενήλικων ατόμων. Η αιμοσφαιρίνη είναι η κύρια πρωτεΐνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά οξυγόνου από τους πνεύμονες στους ιστούς. Μειωμένη ή/και ελλιπής έκφραση της β σφαιρίνης οδηγεί σε παθολογικές καταστάσεις, γνωστές ως αιμοσφαιρινοπάθειες. Η β-θαλασσαιμία είναι η κυριότερη ποσοτική αιμοσφαιρινοπάθεια γενετικής προέλευσης. Οι συμβατικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της συγκεκριμένης νόσου περιλαμβάνουν τις εφόρου ζωής μεταγγίσεις συνδυασμένες με μεθόδους αποσιδήρωσης και τη μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών. Τα τελευταία χρόνια γίνονται προσπάθειες χρήσης των τεχνολογιών της γονιδιακής θεραπείας για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της συγκεκριμένης νόσου. Μια εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση, η οποία προτείνεται στην παρούσα εργασία, είναι η πρωτεϊνική θεραπεία. Με την πρωτεϊνική θεραπεία προτείνεται η εισαγωγή της φυσιολογικής ανθρώπινης β σφαιρίνης στα ερυθροκύτταρα θαλασσαιμικών ατόμων μέσω της χρήσης της τεχνολογίας της μεταγωγής πρωτεϊνών με τη χρήση ειδικών πεπτιδίων, των PTDs (Protein Transduction Domains, δομικές αλληλουχίες μεταγωγής πρωτεϊνών) ή CPPs (Cell Penetrating Peptides, πεπτιδίων που διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη). Στη διπλωματική αυτή εργασία για την ενδοκυττάρια μεταγωγή της ανθρώπινης β σφαιρίνης χρησιμοποιήθηκε το πεπτίδιο Tat. Το πεπτίδιο Tat, προέρχεται από την πρωτεΐνη ΤΑΤ του ιού HIV-1 και έχει την ικανότητα να διαπερνά τη μεμβράνη του κυττάρου είτε μόνο του είτε συζευγμένο με κάποιο φορτίο. Στη συγκεκριμένη περίπτωση ως φορτίο χρησιμοποιήθηκε η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη β σφαιρίνη. Tο Tat πεπτίδιο πιστεύεται πως εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα των περισσότερων κυττάρων-στόχων μέσω ενός μηχανισμού ενδοκυττάρωσης, γνωστού ως μακροπινοκυττάρωση. Για την παραγωγή των ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ και β-σφαιρίνης αντίστοιχα, αρχικά έγινε απομόνωση του cDNA της β-σφαιρίνης που προέρχονταν από υγιή εθελοντή (διπλωματική εργασία: Ζαβέρδα Χαρά) και ακολούθησε η κλωνοποίησή του cDNA της ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ και του cDNA της β-σφαιρίνης στο βακτηριακό φορέα έκφρασης pET-16b. Ακολούθησε η έκφραση των παραπάνω πρωτεϊνών, οι οποίες ήταν συζευγμένες με την αλληλουχία των 10 ιστιδινών (His-tag) στα βακτηριακά κύτταρα έκφρασης BL21 (DE3) E.coli και C43 (DE3) E.coli αντίστοιχα καθώς και ο καθαρισμός και η απομόνωση αυτών από τα αδιάλυτα βακτηριακά έγκλειστα (ΙΒs). Οι παραπάνω ανασυνδιασμένες πρωτεΐνες διαλυτοποιήθηκαν σε διάλυμα 1Μ L-Arg. Για τον έλεγχο της ενδοκυττάριας μεταφοράς των ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ και β-σφαιρίνη, επιλέχτηκε ένα σύστημα μοντέλο για τη β-θαλασσαιμία, τα ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα Κ-562. Τα ανθρώπινα Κ-562 κύτταρα, παρότι φέρουν το γονίδιο που κωδικοποιεί τη β σφαιρίνη, εντούτοις δεν παράγουν ενδογενώς την αντίστοιχη πρωτεΐνη. Η προσθήκη των ανασυνδιασμένων πρωτεϊνών μας στα κύτταρα Κ-562 πραγματοποιήθηκε για δύο διαφορετικά χρονικά διαστήματα, 4 και 24 ωρών. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΤΑΤ-β-σφαιρίνη-ΗΑ διαπερνά τις μεμβράνες του κυττάρου και εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα των Κ-562 κυττάρων. Αντίθετα η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη β-σφαιρίνη δεν εισέρχεται στα κύτταρα Κ-562, όπως έδειξαν τα πειράματα μετά από ανοσοαποτύπωμα κατά Western του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των παραπάνω κυττάρων. Τα παραπάνω πειράματα υποδεικνύουν την επιτυχή ενδοκυττάρια μεταφορά της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης ΤΑΤ-β-σφαιρίνης-ΗΑ στο σύστημα μοντέλο των ευκαρυωτικών κυττάρων για τη β-θαλασσαιμία.
description: The aim of the present study was the bacterial production of recombinant human TAT-β globin-HA fusion protein intended for intracellular delivery into human K-562 CML cells. β globin is the human protein that coupled with a globin forming the adult hemoglobin A (HbA: α2β2). The adult hemoglobin A is the main protein of red blood cells which is responsible for the transport of oxygen from lungs to tissues. Absence or reduce of β globin production and expression results in pathological situations, known as hemoglobinopathies. The most known congenital hemoglobinopathy is β-thalassemia. The current treatments of β-thalassemia are repeated blood transfusions for a life span with parallel administration of chelating agents to remove excess of iron as well as bone marrow transplantation. Nowadays, globin gene therapy is under intensive investigation. An alternative therapeutic approach for β-thalassemia would be the protein therapy. Protein therapy proposes the insertion of normal β globin in the red blood cells of patients with β-thalassemia, applying the technology of protein transduction. Protein transduction technology uses small peptides, called PTDs (Protein transduction Domains) or CPPs (Cell Penetrating Peptides), to transduce the cell membrane, delivering also the therapeutic cargos, attached to them, intracellularly. In the present study, we use the Tat peptide as PTD. The Tat peptide is derived from the TAT protein of the HIV-1 virus and facilitates the intracellular delivery of therapeutic cargos possibly due to the mechanism of macropinocytosis. For the production of the recombinant human TAT-β-globin-HA fusion protein and the recombinant human β-globin protein, human β-globin cDNA was isolated from human healthy blood sample (master thesis of Ms. Zaverda Chara) and subsequently the β-globin cDNA and the TAT-β-globin-HA sequence were cloned in the expression vector pET-16b. Expressed fusion proteins bear tags like His-tag to facilitate protein purification and tag-HA which permits the detection of recombinant proteins using the anti-HA monoclonal antibody. By transfecting BL21 (DE3) E.coli και C43 (DE3) E.coli competent cells and inducing them with IPTG, we were able to produce recombinant human TAT-β-globin-HA fusion protein and recombinant human β globin protein, respectively. Then our recombinant proteins were purified from the bacterial inclusion bodies and refolded into a soluble form with the use of L-Arg 1M. Our goal was to transduce recombinant human TAT-β-globin-HA fusion protein intracelluraly into human K-562 CML cells. Human K-562 CML cells have the normal gene for β globin but they cannot produce the corresponding β globin protein. In the present study we treated human K-562 CML cells with the recombinant human TAT-β globin-HA fusion protein and the recombinant human β globin protein respectively, for 4 and 24 hours. Recombinant human TAT-β-globin-HA fusion protein was successfully transduced intracellularly into human K-562 CML cells as shown by Western Blot analysis, as expected, while recombinant human β-globin protein was not able to be transduced intracellularly into human K-562 CML cells. These data indicates the successful intracellular delivery of recombinant human TAT-β-globin-HA fusion protein into human K-562 CML cells, proposing protein therapy using the Protein Transduction Technology as a putative therapeutic approach for β-thalassemia.