title: Bid als Zielstruktur zur Erhaltung der mitochondrialen Funktion - Bid Kristallisation, neue Mechanismen und Bid Inhibitoren
title: Targeting Bid for mitoprotection - Bid crystallization, new mechanisms and inhibitory compounds
Creators: name: Oppermann, Sina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Mitochondrien
Inhibitoren
Neuroprotektion
Kristallisation
mitochondrium
crystallization
mitochondria
drugs
Naturwissenschaften
Protein-Protein Interaktionen
Bid
neuroprotection
protein interactions
inhibitory compounds

description: Mitochondrial demise is a key
      feature of the progressive neuronal death in age-related
      neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease or
      Parkinson’s disease and after acute brain injury. Oxidative
      stress or impaired calcium homeostasis converge at
      mitochondria where the permeabilization of the mitochondrial
      outer membrane (MOMP) are considered as ´point of no return´
      in the cell’s commitment to die. The pro-apoptotic Bcl-2
      family protein Bid has been identified as a key regulator of
      mitochondrial injury and mitochondrial pathways of neuronal
      cell death. Upon its transactivation to mitochondria, Bid
      induces mitochondrial fragmentation and MOMP thereby
      accelerating the production of reactive oxygen species (ROS)
      and the release of death promoting factors into the cytosol
      that trigger the final steps of intrinsic cell death. The
      pivotal role of Bid in neuronal cell death has been further
      shown in models of cerebral ischemia and traumatic brain
      injury in vivo. Since it has been shown that inhibition of
      Bid maintains mitochondrial integrity and function thereby
      preventing mitochondrial cell death, Bid serves as a target
      for mitoprotection and neuronal cell survival. However, the
      precise mechanisms how Bid triggers mitochondrial impairment
      and disruption are still unknown and have to be explored to
      achieve efficient strategies for inhibition of Bid-mediated
      cell death pathways. Therefore, the present study was aimed
      to elucidate the mechanisms of Bid-dependent mitochondrial
      demise and addressed the associated Bid-protein interactions.
      Furthermore, the thesis focused on Bid crystallization
      campaigns and the development of Bid-inhibiting compounds
      with high impact for novel therapeutic perspectives in
      neurological diseases. Bid-mediated cell death pathways were
      mainly addressed in immortalized mouse hippocampal HT-22
      neurons exposed to toxic glutamate concentrations that induce
      oxidative stress through glutathione depletion. The findings
      were additionally confirmed in a model of tBid-induced
      toxicity by over-expressing tBid in the HT-22 cell line and
      in vitro studies using recombinant proteins. Overall, the
      present thesis highlights the pro-apoptotic protein Bid as a
      promising druggable target for mitoprotection and neuronal
      survival and indicates recombinant Bid constructs as suitable
      for Bid crystal structure analysis. Furthermore, the data
      gained new insights in the mechanisms of Bid-dependent
      mitochondrial injury and the involvement of VDAC1 in
      mitochondrial apoptosis, connecting the controversial
      hypothesis of MOMP initiated by Bid and Bcl-2 family proteins
      or VDAC-mediated mPTP, respectively. Targeting the Bid-VDAC1
      interaction serves as a promising therapeutic approach aiming
      at preserved mitochondrial function and neuronal survival
      with high relevance for the treatment of neurological
      disorders, where oxidative stress and mitochondrial demise
      are prominent.
description: Mitochondriale Prozesse des
      Zelltods spielen eine entscheidende Rolle für den
      progressiven Verlust von Neuronen bei neurodegenerativen
      Erkrankungen (M. Alzheimer, M. Parkinson) und nach akuter
      Hirnschädigung durch Schädel-Hirn-Trauma oder zerebraler
      Ischämie. Eine Schlüsselfunktion nimmt hierbei das
      pro-apoptotische Bcl-2 Protein Bid ein. Durch die Aktivierung
      und mitochondriale Translokation von Bid kommt es zur
      Schädigung und Fragmentierung von Mitochondrien und letztlich
      zur Freisetzung von weiteren pro-apoptotischen Faktoren (AIF,
      Cytochrom C, Smac/DIABLO), die den Untergang der Neurone
      steuern. Um in Zukunft Bid als potentielles Target für die
      Therapie von akuten und chronischen neurologischen sowie
      nicht neurologischen Erkrankungen nutzen zu können, müssen
      die bisher ungeklärten Mechanismen der Bid-induzierten
      mitochondrialen Schädigung, sowie die Interaktionen von
      aktiviertem Bid mit weiteren am Zelltod beteiligten Proteine
      aufgeklärt werden. Ziel dieser Arbeit war daher die
      Untersuchung Bid-abhängiger, mitochondrialer Zelltod
      Mechanismen und beteiligter Protein-Wechselwirkungen. Darüber
      hinaus stand die Entwicklung neuer Leitstrukturen für
      protektive Bid-Inhibitoren sowie die Etablierung erster
      Kristallisationsansätze verschiedener Bid Konstrukte im Fokus
      dieser Arbeit. Als Modellsyteme mitochondrialer Prozesse des
      Zelltods dienten vor allem immortalisierte hippokampale
      Neurone (HT-22 Zellen), in denen eine Behandlung mit Glutamat
      den durch oxidativen Stress gekennzeichneten Zelltod
      induziert. Als weiteres Schädigungsmodell wurde die
      Überexpression von aktiviertem Bid (tBid) eingesetzt. Zum
      Nachweis von Proteininteraktionen wurden weiterhin eine
      primäre neuronale Zellkultur und ein in vivo-Modell der
      zerebralen Ischämie verwendet, sowie verschiedene
      Untersuchung mit rekombinanten Proteinen durchgeführt. Neue
      niedermolekulare Bid-Inhibitoren aus drei strukturell
      verschiedenen Substanzklassen wurden mittels
      Zellviabilitätsmessungen auf neuroprotektive Effekte geprüft.
      Sieben Substanzen zeigten nicht nur deutliche Protektion
      gegenüber dem Glutamat- und tBid-induzierten Zelltod, sondern
      konnten ebenso die Bid-abhängige mitochondriale Schädigung
      verhindern. Weiterhin bietet die Arbeit Einblicke in die
      Kristallisation von rekombinantem Bid Protein, welche als
      Basis für ein grundlegendes Verständnis der molekularen
      Proteinfunktion sowie der Struktur-basierten
      Wirkstoffentwicklung dient. Durch Verfolgung wichtiger
      Strategien im Konstruktdesign konnte eines der verwendeten
      Bid Konstrukte erfolgreich kristallisiert werden und lieferte
      eine Strukturauflösung von 3.75 bis 3.95 Ǻ unter
      Synchrotronstrahlung. Weiterhin wurde der Effekt der
      rekombinanten Proteine Bid, cBid und Bax auf
      Fluoreszenz-Liposomen getestet, um die Mechanismen der
      Bid-abhängigen mitochondrialen Membranpermeabilisierung zu
      untersuchen. Es konnte hier eine Schlüsselrolle für das
      mitochondriale Lipid Cardiolipin gezeigt werden, in dessen
      Abhängigkeit Caspase-8 aktiviertes Bid (cBid) eine
      Membrandestabilisierung vermittelte, welche durch die
      Koexistenz von Bax gesteigert werden konnte. Letztlich konnte
      erstmals eine direkte Interaktion zwischen Bid und dem
      mitochondrialen Porin VDAC1 in kultivierten Neuronen sowie in
      einem in vivo Modell der zerebralen Ischämie nachweisen. Die
      Inhibition von VDAC1 mittels Einsatz des
      Anionen-Kanal-Blockers DIDS sowie der Verwendung von VDAC1
      siRNA konnte sowohl die Funktion als auch die Integrität der
      Mitochondrien nach Glutamat- und tBid-induzierter Schädigung
      schützen und bestätigte somit die essentielle Rolle von VDAC1
      im Bid-abhängigen Zelltod. Weitere Untersuchungen zeigten
      erstmalig, dass beide Proteine, Bid und VDAC1, gleichermaßen
      im neuronalen Zelltod involviert sind und offensichtlich
      zusammen eine Schädigung der mitochondrialen Membran
      induzieren. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass die
      Isoform VDAC2 nur eine untergeordnete Rolle im
      Bid-induzierten Zelltod in Neuronen spielt. Die nachgewiesene
      Bid-VDAC1 Wechselwirkung besitzt hohe Relevanz für die
      mitochondrialen Prozesse des Zelltods. Damit verbindet die
      vorliegende Arbeit die bisher kontrovers betrachten
      Mechanismen der mitochodrialen Membranschädigung, die zuvor
      entweder auf die alleinige Aktivität der Bcl-2 Proteine oder
      auf VDACs zurückgeführt wurde. Mit der Identifizierung neuer
      potentieller Bid-Inhibitoren sowie durch Etablierung
      wichtiger Grundlagen für die Aufklärung der Kristallstruktur
      von Bid, stellt die Arbeit einen wesentlichen Beitrat für die
      strukturbasierte Wirkstoffentwicklung und Therapie
      verschiedener neurologischer und nicht neurologischer
      Erkrankungen dar, in welchen Bid-abhängige mitochondriale
      Prozesse des Zelltods eine wesentliche Rolle spielen.