title: Analyse von posttranslationalen Modifikationen an Fe/S-Proteinen und Protein-Protein-Interaktionen zwischen Fe/S-Assemblierungsfaktoren in Mitochondrien von S. cerevisiae
title: Analysis of post-translational modifications on Fe/S proteins and characterisation of protein-protein interactions between Fe/S assembly factors in mitochondria of S. cerevisiae
Creators: name: Christ, Stefan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Saccharomyces cerevisiae
Fe/S-Proteine, posttranslationale Cysteinmodifikationen, Protein-Fragment-Komplementationssystem, Split-Luciferase-Assay
Sciences
Naturwissenschaften
split luciferase assay
S. cerevisiae
mitochondria, Fe/S-proteins
Mitochondrium
post-translational cysteine modifications, protein fragment complementation assay

description: In S. cerevisiae sind drei
      Proteinmaschinerien für die de novo Biogenese von
      Fe/S-Clustern und deren Inkorporation in Zielproteine
      verantwortlich: die mitochondriale ISC- (iron sulfur cluster)
      Assemblierungsmaschinerie, das ISC-Export-System sowie das
      CIA- (cytosolic iron-sulfur-protein assembly) System. Der
      Mechanismus der de novo Biogenese eines [2Fe-2S]-Clusters
      durch die Komponenten der Kern-ISC-Maschinerie ist bereits
      gut untersucht. Wenig ist hingegen über den Prozess der
      [2Fe-2S]- nach [4Fe-4S]-Cluster-Konversion bekannt, der durch
      die späten ISC-Komponenten katalysiert wird sowie über die
      Mechanismen, mit denen Fe/S-Zielproteine an die
      ISC-Maschinerie rekrutiert werden. Die vorliegende
      Dissertation beschäftigt sich mit diesen zwei Teilaspekten
      aus dem letzten Schritt der Fe/S-Cluster-Biogenese. Im ersten
      Teilprojekt dieser Arbeit wurde analysiert, in welcher Form
      Apo-Fe/S-Proteine an die ISC-Maschinerie herangeführt werden.
      Hierbei stand die Frage im Vordergrund, ob und wie die Zelle
      die freien Thiolgruppen von Fe/S-Cluster ligierenden
      Cysteinen in der Apo-Form vor oxidativen Modifikationen
      schützt. Mittels massenspektrometrischer Analyse wurde
      gezeigt, dass mitochondriale Fe/S-Proteine in Zellen mit
      Defekten in der ISC-Maschinerie mit mehreren Massenaddukten
      von +30 bis +32 Da modifiziert werden. Bei diesen
      Modifikationen handelt es sich wahrscheinlich um
      Schwefeladditionen an die Cysteinliganden der
      Apo-Fe/S-Proteine in Form von verbrückenden Polysulfiden.
      Diese Modifikationen treten ebenfalls in geringem Maße unter
      normalen Wachstumsbedingungen in Wildtypzellen auf und werden
      verstärkt unter Eisenmangelbedingungen beobachtet. Da die
      Cysteinaddukte reduktiv entfernt werden können, liegt der
      Schluss nahe, dass es sich bei der Modifikation der
      Cysteinliganden von Apo-Fe/S-Proteinen mit Per- oder
      Polysulfiden um einen physiologischen Schutzmechanismus vor
      oxidationsbedingter Degradation handelt. Im zweiten
      Teilprojekt wurde ein neues System zur systematischen Analyse
      von Protein-Protein-Interaktionen in Mitochondrien von S.
      cerevisiae entwickelt um Interaktionen der späten
      ISC-Komponenten Isa1, Isa2 und Iba57 zu charakterisieren. Die
      Daten dieses Renilla Split-Luciferase-Testsystems legen den
      Schluss nahe, dass Isa1, Isa2 und Iba57 einen trimeren
      Komplex ausbilden, dessen Assemblierung in vivo von einer
      funktionierenden ISC-Maschinerie abhängig ist. Isa1 und Isa2
      interagieren weiterhin mit dem Monothiol Glutaredoxin Grx5,
      welches den in der frühen ISC-Maschinerie synthetisierten
      [2Fe-2S]-Cluster von dem Gerüstprotein Isu1 übernimmt und an
      [2Fe 2S]-Zielproteine weiterreicht. Die Interaktion mit Isa1
      und Isa2 spricht dafür, dass Grx5 seinen [2Fe-2S]-Cluster
      ebenfalls an die späte ISC-Maschinerie zur Konversion in
      einen [4Fe-4S]-Cluster weiterreichen könnte. Zudem
      interagierte das mitochondriale Ferredoxin Yah1 mit den
      späten ISC-Komponenten. Dies könnte bedeuten, dass Yah1
      Elektronen für einen reduktiven Reaktionsschritt während der
      Fe/S-Cluster-Konversion bereitstellt. Da das Renilla
      Split-Luciferase-Testsystem zu einer konzentrationsabhängigen
      Assemblierung der Teildomänen in Mitochondrien tendiert,
      sollten die hier beobachteten Interaktionen mit einer
      weiteren Methode verifiziert werden.
description: In S. cerevisiae, three distinct
      protein machineries are responsible for the de novo
      biogenesis of Fe/S-clusters and their incorporation into
      target proteins: the mitochondrial ISC- (iron sulfur cluster)
      machinery, the ISC-export system and the CIA- (cytosolic
      iron-sulfur-protein assembly) system. The mechanism of the de
      novo biogenesis of a [2Fe-2S]-cluster by the core components
      of the ISC-machinery is well characterized on a functional
      level. On the contrary, little is known about the process of
      Fe/S-cluster conversion, catalyzed by the late acting
      ISC-components, or how Fe/S-target proteins are recruited to
      the ISC-machinery. This thesis focuses on the last step of
      Fe/S-cluster biogenesis; the incorporation of the
      Fe/S-cluster into target proteins. The goal of the first
      project was to analyze the status of the cysteine ligands of
      apo-Fe/S-proteins prior to the insertion of an Fe/S-cluster.
      Because the thiol-groups of these cysteines are exposed to
      the mitochondrial matrix, it seemed likely that the cell
      would manage to protect them against oxidative damage. Mass
      spectrometrical analysis of a mitochondrial Fe/S-protein
      revealed multiple increments in mass of +30 to +32 Da on
      Fe/S-proteins in cells with defects in the ISC-machinery.
      These modifications are most likely bridging polysulfides
      between the cysteine ligands of apo-Fe/S-proteins.
      Furthermore, these modifications were also found to a lesser
      degree in wildtype cells grown under standard conditions, and
      to a higher degree in cells which were cultured in iron poor
      medium. As the cysteine modifications could also be
      reductively cleaved, we suggest that the modification of the
      cysteine ligands of apo-Fe/S-proteins, with a per- or
      polysulfide, is actually a physiological protection mechanism
      against oxidation dependent protein degradation. In the
      second project, a protein-fragment complementation assay was
      established in mitochondria of S. cerevisiae in order to
      characterize interactions between the late acting
      ISC-components Isa1, Isa2 and Iba57. The data of this Renilla
      split-luciferase assay indicates a trimeric complex of these
      three proteins in vivo. The assembly of this complex seems to
      be dependent of a functional active ISC-machinery.
      Furthermore, Isa1 and Isa2 were found to interact with Grx5,
      the first ISC-component, which receives the de novo assembled
      [2Fe-2S]-cluster from Isu1 and transfers it to
      [2Fe-2S]-target proteins. The interaction with Isa1 and Isa2
      suggests that Grx5 can also donate its Fe/S-cluster to the
      late acting ISC-components for conversion into a
      [4Fe-4S]-cluster. The Renilla Split-Luciferase assay revealed
      interactions between Yah1 and Isa1, Isa2 and Iba57. This data
      proposes that the process of Fe/S-cluster conversion depends
      on the supply with reducing equivalents. Because the Renilla
      Split-Luciferase assay displayed a concentration dependent
      assembly of the two Luciferase domains in mitochondria, the
      interactions described here have to be verified with an
      independent method.