Ανίχνευση με ανοσοαισθητήρα και άλλες ανοσολογικές μεθόδους της όξινης ινώδους πρωτεΐνης των γλοίων (GFAP) σε βιολογικά υγρά ασθενών με Alzheimer. Συσχέτισή της με παράγοντες νευροφλεγμονής
Creators: name: Κατσίπης, Γεώργιος Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Νόσος Alzheimer
Όξινη ινώδης πρωτεΐνη των γλοίων
Νευροφλεγμονή
Alzheimer’s Disease
Glial fibrillary acidic protein
Neuroinflammation

description: Η νόσος του Alzheimer (ΝΑ) είναι νευροεκφυλιστική ασθένεια και η πλέον διαδεδομένη μορφή άνοιας. Η διάγνωση της νόσου γίνεται με αβεβαιότητα και όταν τα συμπτώματά της έχουν ήδη εκδηλωθεί. Ακόμα, οι φαρμακευτικές αγωγές είναι ευκαιριακές και ανίκανες να αναστρέψουν την εξέλιξή της. Συνεπώς, η καθιέρωση ευαίσθητων βιοδεικτών που θα βοηθούν στην έγκυρη και έγκαιρη διάγνωση, κρίνεται απαραίτητη. Είναι κρίσιμο ακόμα αυτοί οι δείκτες να είναι εύκολα προσβάσιμοι και να μπορεί να γίνει προσδιορισμός τους με απλές, οικονομικές μεθόδους, ώστε να επιτρέπεται η εύκολη διερεύνηση του πληθυσμού. Τα βασικά νευροπαθολογικά χαρακτηριστικά της ΝΑ είναι ανώμαλα συσσωματώματα της σχετιζόμενης με τους μικροσωληνίσκους ταυ πρωτεΐνης (νευροϊνιδιακά συμπλέγματα) και του πεπτιδίου β-αμυλοειδές (πλάκες Αβ). Παράλληλα εντοπίζεται ατροφία του εγκεφαλικού φλοιού και φλεγμονή εντός του νευρικού συστήματος (νευροφλεγμονή). Το αίτιο της ΝΑ δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί. Το 95% των περιπτώσεων δεν έχουν κάποια εμφανή γενετική αιτιολογία και χαρακτηρίζονται ως σποραδικές, ενώ το 5% παρουσιάζει μεταλλάξεις σε κρίσιμα γονίδια για το μεταβολισμό της Αβ. Η υπόθεση της επαγώμενης ΝΑ από Αβ είναι η πλέον διαδεδομένη. Διαταραχές στη χολινεργική νευροδιαβίβαση, στην ομοιόσταση του ενδονευρωνικού αστεστίου, η παρουσία χρόνιων φλεγμονωδών καταστάσεων και μεταβολικές διαταραχές, έχουν στοχοποιηθεί κατά καιρούς ως πιθανοί επαγωγείς της ΝΑ. Ιδιαίτερα η νευροφλεγμονή έχει αποδειχθεί πως συνοδεύει την εξέλιξη της ΝΑ και ενδεχομένως συμμετέχει στη νευροπαθολογία της. Στην παρούσα ερευνητική εργασία μελετήθηκε η παρουσία και τα επίπεδα νευροφλεγμονωδών πρωτεϊνών, όπως η όξινη ινώδης πρωτεΐνη των γλοίων (GFAP) και οι κυτταροκίνες TNFα και IL-6, στο σίελο ασθενών με ΝΑ και ήπια γνωστική εξασθένιση (ΗΓΕ). Η GFAP είναι το βασικό μέλος των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταροσκελετού των ενεργοποιημένων αστροκυττάρων. Η έκφραση της αυξάνεται σε περιπτώσεις νευροφλεγμονής, συνοδεύοντας την υπερτροφία και αντίδραση των αστροκυττάρων στη νόσο. Η έκφρασή της έχει βρεθεί πως επάγεται από κυτταροκίνες και άλλες ουσίες. Η GFAP εντοπίστηκε μειωμένη στο σίελο ασθενών με ΗΓΕ (-18%, p=0,4) και σε ασθενείς με ΝΑ (-59%, p=0,03) και αυτή η μείωση μπορεί να αξιοποιηθεί ως καλός διαγνωστικός δείκτης, όπως δείχτηκε με καμπύλη ROC (AUC=0,81). Μειωμένες εντοπίστηκαν και οι ποσότητες των TNFα και η IL-6 στο σίελο και η ποσότητά τους σχετίζεται με την GFAP. Και οι τρεις πρωτεΐνες βρέθηκαν να αυξάνονται στον ορό. Ωστόσο, στο σίελο εντοπίστηκε υψηλή πρωτεολυτική δράση καλπαΐνης – μιας πρωτεάσης της GFAP που συνδέεται με την απόπτωση – μόνο σε ασθενείς με ΝΑ, καθώς και υψηλά ποσοστά αυτοαντισωμάτων έναντι της GFAP. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έναν πιθανό μηχανισμό απόκρυψης αναλυτικά χρήσιμων πληροφοριών στο σίελο. Παράλληλα, κατασκευάστηκε ένας βιοαισθητήρας για τη μέτρηση της GFAP. Ο αισθητήρας βασίζεται σε νανοσωλήνες άνθρακα (swCNTs), στους οποίους καθηλώθηκε αντίσωμα έναντι της GFAP έπειτα από οξείδωση και χημεία EDC/NHS. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η προσθήκη πρότυπων διαλυμάτων GFAP οδηγεί σε γραμμική, ειδική αύξηση της αντίστασης του αισθητήρα. Ο χαρακτηρισμός του με φασματοσκοπία Raman και SEM απέδειξε την επιτυχημένη βιο-τροποποίηση. Άμεσος στόχος αποτελεί η βελτιστοποίηση του, ώστε να επιστρατευτεί στην καθημερινή κλινική πρακτική.
description: Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease and the most common form of dementia. Diagnosis is made with uncertainty, when the symptoms have already appeared. Furthermore, medications against it are opportunistic and unable to reverse the development. Therefore, the introduction of sensitive biomarkers to assist in timely and accurate diagnosis is essential. It is also critical that these biosensors are easily accessible and can be determined with simple, economic methods, to allow easy screening of the population. The main neuropathological characteristics of AD are abnormal aggregates associated with microtubule-associated tau protein (neurofibrillary tangles) and of the beta-amyloid peptide (Aβ plaques). Furthermore, atrophy of the cerebral cortex and inflammation within the nervous system (neuroinflammation) are noticed. The cause of AD is not clear yet. 95% of the cases have no apparent genetic etiology and characterized as sporadic, while 5% possess mutations in critical genes for the metabolism of Aβ. The amyloid cascade hypothesis is the most widespread. Disturbances in the cholinergic neurotransmission, intraneuronal calcium homeostasis, the presence of chronic inflammatory conditions and metabolic disorders, have occasionally been targeted as potential inducers of AD. Particularly neuroinflammation has been shown to accompany the development of AD and possibly involved in the neuropathology. Τhe presence and levels of neuroinflammatory proteins such as fibrillary acidic protein glial (GFAP) and cytokines TNF and IL-6, in the saliva of patients with AD and mild cognitive impairment (MCI), have been examined. GFAP is a key member of the intermediate filaments of the cytoskeleton of activated astrocytes. Its expression is increased in cases of neuroinflammation, accompanying hypertrophy and response of astrocytes to the disease. It has been found to be induced by cytokines and other substances. The GFAP was decreased in patients’ saliva with MCI (-18%, p = 0,4) and in patients with AD (-59%, p = 0,03) and this reduction can be used as a good diagnostic marker, as was shown with ROC curve (AUC = 0,81). The amounts of TNF and IL-6 in the saliva are also decreased and are related to GFAP. All three proteins were found to increase in serum. However, in saliva high proteolytic activity of calpain - a protease of GFAP associated with apoptosis - was detected only in patients with AD, as well as high levels of autoantibodies against GFAP. These results suggest a possible concealment of analytically useful information in saliva. Furthermore, a biosensor has been constructed for measurement of GFAP. The sensor is based on linking of a GFAP antibody on carbon nanotubes (swCNTs), after oxidation and EDC / NHS chemistry. The results showed that the addition of standard GFAP solutions leads to linear and specific increase of the sensor resistance. The characterization by Raman spectroscopy and SEM demonstrated the successful biofunctionalization. The immediate objective is to optimize this biosensor, in order for it to be employable in everyday clinical practice.