title: Έλεγχος οικοτοξικότητας και απομάκρυνσης ανθεκτικών βακτηρίων σε αντιβιοτικά κατά την επεξεργασία αστικών υγρών αποβλήτων
title: Study of ecotoxicity and elimination of antibiotic resistant bacteria during municipal wastewater treatment
Creators: name: Στουραιτη Νικολεττα
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2022

description: Η ανθεκτικότητα βακτηρίων σε αντιβιοτικά σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (World Health Organization) αποτελεί μία από τις σημαντικότερες απειλές που δημιουργούν ιδιαίτερη ανησυχία στην επιστημονική κοινότητα. Συνδέεται άμεσα με την εκτεταμένη χρήση αντιμικροβιακών ουσιών, και η Ελλάδα παρά το γεγονός ότι έχει περιορίσει την αλόγιστη χρήση τους τα τελευταία χρόνια, παρουσιάζεται ανάμεσα στις χώρες Ευρωπαϊκής Ένωσης με τις υψηλότερες θέσεις στην κατάχρηση αντιβιοτικών παραγόντων (ESAC).
Μία από τις κύριες πηγές ανακυκλοφορίας στο περιβάλλον αντιμικροβιακών ουσιών είναι ο άνθρωπος. Με την κατανάλωση τους από αυτόν και τον ελλιπή μεταβολισμό τους, καταλήγουν σε αστικά λύματα, τα οποία με τη σειρά τους, μετά την επεξεργασία τους σε ειδικές εγκαταστάσεις καταλήγουν σε περιβαλλοντικούς αποδέκτες. Στην παρούσα διπλωματική εργασία θα μας απασχολήσουν αστικά λύματα από το βιολογικό καθαρισμό του Δήμου Πλατανιά Χανίων. Οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων, δεχόμενες μεγάλες ποσότητες ανθρώπινων αποβλήτων και σε συνδυασμό με τις ευνοϊκές για βακτήρια συνθήκες που επικρατούν στο περιβάλλον τους, επιτρέπουν την συνεχή έκθεση βακτηρίων σε αντιμικροβιακές ουσίες, οδηγώντας σε ανάπτυξη της αντοχής τους σε αυτές. Έρευνες έχουν δείξει πως παρά την υποβολή των λυμάτων σε απολύμανση, ένα μεγάλο ποσοστό βακτηρίων παραμένει ανθεκτικό σε αντιβιοτικά κατά την έξοδο, θέτοντας σε κίνδυνο την ανθρώπινη υγεία και το φυσικά, το περιβάλλον.
Η δειγματοληψία στο πλαίσιο της διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε για τους μήνες Οκτώβριο 2021 - Φεβρουάριο 2022 και Μάιο 2022 και τα λύματα συλλέχθηκαν (i) ανεπεξέργαστα από την είσοδο του βιολογικού, (ii) επεξεργασμένα μετά τη δευτεροβάθμια επεξεργασία της εγκατάστασης και (iii) επεξεργασμένα μετά την υποβολή τους σε χλωρίωση από την έξοδο της εγκατάστασης. Σκοπός ήταν αρχικά, η απομόνωση βακτηριακών δεικτών κοπρανώδους μόλυνσης (Escherichia coli και Enterococcus sp.) και στη συνέχεια ο έλεγχος ανθεκτικότητάς τους σε διάφορα αντιβιοτικά. Συγκεκριμένα, τα αντιβιοτικά που δοκιμάστηκαν ήταν η Amoxicillin, η Sulfamethoxazole και η Ciprofloxacin. Η μέθοδος ελέγχου που εφαρμόστηκε, ήταν αυτή της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης (MIC) και χρησιμοποιήθηκε για την εύρεση της συγκέντρωσης στην οποία επήλθε 60% μείωση του εκάστοτε βακτηριακού πληθυσμού. Η μεγαλύτερη ανθεκτικότητα των στελεχών εμφανίστηκε στο αντιβιοτικό της Σουλφαμεθοξαζόλης, ενώ η Σιπροφλοξασίνη δεν εμφάνισε κανένα ανθεκτικό βακτηριακό στέλεχος. Μεταξύ εισόδου και εξόδου, δεν μπορεί να προκύψει κάποιο ακέραιο συμπέρασμα για το προφίλ ανθεκτικότητας, καθώς υπήρξαν περιπτώσεις που τα επεξεργασμένα στελέχη εξόδου εμφάνισαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα μετά την απολύμανση των λυμάτων. Η παραμένουσα ανθεκτικότητα των βακτηρίων μετά την απολύμανση με χλωρίωση επιβεβαιώνει την υποψία πως τα λύματα αποτελούν σημαντικούς φορείς στοιχείων αντιμικροβιακής αντοχής και ενθαρρύνει τις ανησυχίες της επιστημονικής κοινότητας. Τα στελέχη τηςE.coli εμφάνισαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην Amoxicillin, ενώ του Enterococcus sp. στη Sulfamethoxazole. Ακολούθησε ανίχνευση και ποσοτικοποίηση γονιδίου ανθεκτικότητας στα δείγματα καθώς και ποσοτικοποίηση του γονιδίου 16S rRNA. Το γονίδιο ανθεκτικότητας που ελέγχθηκε ήταν το ampC που σχετίζεται με το υπό μελέτη αντιβιοτικό Αμοξικιλλίνη. Από τα αποτελέσματα προέκυψε μεγάλη μείωση τόσο του γονιδίου ampC, όσο και του 16S rRNA, στα δείγματα μεταξύ εισροής και εκροής. Αντιθέτως, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των συγκεντρώσεων του γονιδίου ampC ως προς το 16S rRNA κατά τα λύματα εξόδου σε σύγκριση με αυτά της εισόδου και συγκεκριμένα, η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε κατά την έξοδο του μήνα Ιανουαρίου και ήταν της τάξης των 6Logs. Το γεγονός ότι το ampC ανά λίτρο λύματος εμφάνισε καλά αποτελέσματα απομάκρυνσης κατά την έξοδο, αλλά οι συγκεντρώσεις του ως προς το συνολικό βακτηριακό γενετικό υλικό αυξήθηκαν σημαντικά κατά την έξοδο, αποδεικνύουν ότι το ampC αποτελεί μεγάλο ποσοστό του συνολικού γενετικού υλικού και κατά την έξοδο και επιβεβαιώνει την υποψία πως μια εγκατάσταση επεξεργασίας λυμάτων θεωρείται επικίνδυνη ως προς την διάδοση της αντιμικροβιακής ανθεκτικότητας.
Το δεύτερο σκέλος της παρούσας διπλωματικής εργασίας αφορά στον έλεγχο οικοτοξικότητας των δειγμάτων με τη χρήση του βιοδείκτη Vibrio fischeri. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν τα λύματα εισόδου και εξόδου τοξικά απέναντι στο βιοδείκτη, με 100% και 90% θνησιμότητά του στο μη αραιωμένο δείγμα, αντίστοιχα. Το LD50 αναγνωρίστηκε στα λύματα εισόδου να κυμαίνεται μεταξύ των αραιώσεων 3,1-6,3%, ενώ στα λύματα εξόδου σε αραίωση 12,5%.
Συνοψίζοντας, οι εγκαταστάσεις επεξεργασίας υγρών αποβλήτων εξ’ ορισμού τους θεωρούνται κυρίαρχη λύση για την μείωση βακτηριακών δεικτών πριν την εναπόθεση των λυμάτων στο περιβάλλον. Συγκεκριμένα η διεργασία της χλωρίωσης αποτελεί το τελευταίο και καθοριστικό στάδιο πριν την εναπόθεση στους υδάτινους αποδέκτες. Παρά το γεγονός όμως ότι παρουσιάζουν καλές αποδόσεις απομάκρυνσης μικροβιακού φορτίου, δεν μπορεί να προκύψει το ίδιο συμπέρασμα και για την απομάκρυνση των ARGs που αποτελούν μεγάλο περιβαλλοντικό κίνδυνο, αλλά και απειλή για τον άνθρωπο.
description: The antibiotic resistance of bacteria according to the World Health Organization is one of the most important threats that cause particular concern in the scientific community. It is linked directly to the extensive use of antimicrobial substances, and Greece, despite the fact that it has limited their reckless use in the recent years, is among the European countries with the highest ranking in the misuse of antibiotic agents (ESAC).
One of the main sources of environmental recirculation of antimicrobial substances is humans. Their consumption and incomplete metabolism by humans, lead them to end up as domestic wastewater and consequently, despite being treated in special facilities, contaminate environmental recipients. In this thesis, we will be concerned with domestic sewage coming from the wastewater treatment plant of the Municipality of Platanias, Chania. Wastewater treatment plants, receiving large amounts of human effluents and providing with favorable conditions in their environment, they allow bacteria to be continuously exposed to antimicrobial substances. As a result, this allows them to develop high resistance to them. Research has shown that despite the wastewater’s submission to decontamination, a large quota of bacteria remains resistant to antibiotics at the outflaw, endangering human health and, of course, the environment.
Sampling in the context of this thesis was carried out for the months of October 2021-February 2022 and May 2022 and the wastewater was collected (i) untreated from the biological facility’s inlet (ii) treated after the treatment plant’s secondary processing and (iii) treated after being subjected to chlorination from the facility’s outlet. The purpose was initially, the isolation of fecal contamination markers (Escherichia coli και Enterococcus sp.) and then, the testing of their resistance to various antibiotics. Specifically, the antibiotics which were used are Amoxicillin, Sulfamethoxazole and Ciprofloxacin. The method applied was that of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and was used to determine the concentration at which the 60% reduction of the respective bacterial population, occurred. The highest resistance of the strains appeared to the antibiotic Sulfamethoxazole, while Ciprofloxacin did not show any resistant bacterial strains. Between inlet and outflaw, no accurate conclusion can be drawn, as far as the resistance profile is concerned, as there were cases where the treated strains showed greater resistance after wastewater decontamination. The continued resistance of bacteria after decontamination by chlorination, confirms the suspicion that wastewater is an important carrier of antimicrobial resistance elements and encourages the concerns of the scientific community. E. coli strains showed greater resistance to Amoxicillin, while Enterococcus sp. to Sulfamethoxazole. This was followed by the detection and quantification of the resistance gene in the samples as well as the quantification of the 16S rRNA gene. The resistance gene tested was ampC related to the antibiotic under study Amoxicillin. The results showed a large decrease in both the ampC gene and 16S rRNA in the samples between inflow and outflow. On the contrary, a significant increase in the concentrations of the ampC gene in terms of 16S rRNA was observed in the effluent compared to the inlet, and in particular, the greatest increase was observed in the January discharge which reached up to 6Logs. The fact that ampC per liter of sewage showed good removal results at the outlet, but its concentrations in terms of total bacterial genetic material rose significantly at the outlet, demonstrates that ampC constitutes a large proportion of the total genetic material at the outlet as well and confirms the suspicion that a wastewater treatment facility is considered dangerous in terms of the issue of antimicrobial resistance.
The second purpose of this thesis concerns the ecotoxicity testing of the samples to the bacterium Vibrio fischeri. The results showed that the inlet and outlet effluents were toxic to the bacterium, causing 100% and 90% bacterial reduction at the undiluted sewage, respectively. LD50 was identified in the input samples to range between dilutions of 3,1-6,3 %, while in the output effluent at a dilution of 12,5 mg/L.
           In summary, wastewater treatment facilities are a dominant solution for the reduction of bacterial indicators before the discharge of wastewater into the environment. Specifically, the chlorination process is the last and most decisive stage before the sewage’s deposition in the water receivers. However, despite the fact that they lead to high microbial load removal efficiencies, the same conclusion cannot be reached for the removal of ARGs, which constitute high environmental risk, but also a great threat to humans.