Μικροβιακή παραγωγή του βιοαποικοδομήσιμου πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικού) εστέρα (PHB) με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες: πειραματική βελτιστοποίηση και μαθηματική προσομοίωση
Creators: name: Πενλόγλου, Ιωάννης Σ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή
Βιοπλαστικά
Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες
Πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικός) εστέρας
Biodegradable polymers
Bioplastics
Polyhydroxyalkanoates
Poly(3-hydroxybutyrate)

description: Μπροστά στις αναρίθμητες εφαρμογές των πλαστικών υλικών, τα βιοαποικοδομήσιμα πλαστικά θεωρούνται η λύση για την αντιμετώπιση των περιβαλλοντικών επακόλουθων των συμβατικών υλικών. Οι πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) αποτελούν μια οικογένεια πλήρως βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών, τα οποία σχηματίζονται στο κυτταρόπλασμα μικροοργανισμών ως αποθήκες ενέργειας και πηγής άνθρακα. Παρουσιάζουν εξαιρετική βιοσυμβατότητα και καθόλου τοξικότητα, ενώ παράγονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες. Παρόλα αυτά, το μεγαλύτερο εμπόδιο στην πλήρη εμπορευματοποίηση τους σε βιομηχανικό επίπεδο είναι το υψηλό κόστος παραγωγής, με αποτέλεσμα κατά το παρόν να χρησιμοποιούνται μόνο σε περιορισμένες εφαρμογές (π.χ., υλικά συσκευασίας και βιοϊατρικά προϊόντα). Συνεπώς, η ανάπτυξη νέων μεθόδων παραγωγής PHAs, οικονομικά βιώσιμων, αποτελεί ζήτημα τεράστιας σημασίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή το βακτήριο άγριου τύπου Alcaligenes latus χρησιμοποιείται για τη μικροβιακή παραγωγή του πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικού) εστέρα (PHB). Η μελέτη πραγματοποιείται με βάση τις σημαντικότερες διατροφικές και λειτουργικές παραμέτρους κάτω από ασυνεχείς και ημισυνεχείς συνθήκες καλλιέργειας. Η επίδραση των παραμέτρων αυτών (αρχική σύσταση του μέσου ανάπτυξης συνθήκες μεταφοράς οξυγόνου, χρόνος παραμονής στη στατική φάση) στην ανάπτυξη των κυττάρων, στη συσσώρευση PHB και στα μοριακά χαρακτηριστικά του, μελετάται διεξοδικά. Βρέθηκε ότι κάτω από ασυνεχείς συνθήκες λειτουργίας πολυεστέρες με στοχευμένες μοριακές ιδιότητες μπορούν να παραχθούν, μετά την επιλογή των παραπάνω παραμέτρων σε συγκεκριμένες τιμές. Επίσης, εφαρμόστηκε μια απλή πολιτική τροφοδοσίας/αραίωσης ενός σταδίου με σκοπό τη μεγιστοποίηση της απόδοσης της παραγωγής PHB ως προς τη μάζα της καταναλισκόμενης σακχαρόζης και του ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB στην ξηρή μάζα κυττάρων. Οι συγκεντρώσεις του βιοπολυμερούς και της συνολικής βιομάζας ενισχύθηκαν περαιτέρω στο βιοαντιδραστήρα με την εφαρμογή μιας συνεχούς πολιτικής τροφοδοσίας, κάτω από συνθήκες επάρκειας της πηγής αζώτου. Από την άλλη πλευρά, το μέγιστο μέσο κατά βάρος μοριακό βάρος επετεύχθη κάτω από συνθήκες μικρής ανάπτυξης της υπολειπόμενης βιομάζας. Για την ανάκτηση και το καθαρισμό του ενδοκυττάριου βιοπολυμερούς πέντε διαφορετικές μέθοδοι εφαρμόστηκαν και συγκρίθηκαν με βάση την αποτελεσματικότητα ανάκτησης και την επιρροή στην κατανομή μοριακού βάρους. Ο συνδυασμός μηχανικής διάρρηξης των κυτταρικών μεμβρανών με υπέρηχους και χημικής εκχύλισης του βιοπολυμερούς με χλωροφόρμιο εντοπίστηκε πειραματικά να μεγιστοποιεί την αποτελεσματικότητα ανάκτησης και να ελαχιστοποιεί το συνολικό απαιτητό χρόνο επεξεργασίας και την επιρροή στην κατανομή μοριακού βάρους. Εφαρμόζοντας τις βέλτιστες συνθήκες της μεθόδου σε δείγματα με υψηλή συσσώρευση PHB, υψηλή αποτελεσματικότητα ανάκτησης και καθαρότητα προϊόντος μπορούν να επιτευχθούν. Επίσης, για τη μείωση του κόστους παραγωγής του PHB, η δυνατότητα του A. latus να μεταβολίζει τη λακτόζη από τυρόγαλα ως τη μόνη πηγή άνθρακα και να συσσωρεύει PHB σε υψηλά ποσοστά παρουσιάζεται για πρώτη φορά. Η μαθηματική προσομοίωση και πρόβλεψη των καλλιεργειών του A. latus πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη μαθηματική προσέγγιση, αποτελούμενη από τρία διαφορετικά υπό-μοντέλα: κινητικό, μεταβολικό και μακροσκοπικό. Η προτεινόμενη προσέγγιση είναι ικανή να προβλέπει, τόσο ποσοτικά όσο και ποιοτικά χαρακτηριστικά του συστήματος. Ανάμεσα στην πληθώρα εργασιών που εστιάζουν στη μικροβιακή παραγωγή PHB με υψηλή απόδοση, η παρούσα διατριβή περιγράφει μια στρατηγική βελτιστοποίησης της παραγωγής του βιοπολυμερούς υπό βελτιστοποιημένες ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας, με μέγιστη αποτελεσματικότητα ανάκτησης και παράλληλα με την αξιοποίηση φθηνών και εναλλακτικών πρώτων υλών.
description: In view of the innumerable applications of plastics, biodegradable polymers are urgently needed so that the adverse environmental effects of conventional plastics can be ameliorated. Polyhydroxyalkanoates (PHAs) is a class of biodegradable polymers that are produced intracellularly by various bacterial species as energy and carbon reserves. PHAs exhibit excellent biodegradability, biocompatibility and zero-toxicity characteristics. Moreover PHAs are made from renewable sources. However, a major problem in the commercialization of PHAs is their high production cost. As a result, they are mostly employed in biomedical applications. Therefore, research and development efforts leading to the economical production of PHAs are of utmost significance. In the present dissertation, the wild-type strain Alcaligenes latus was employed for the microbial production of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The production process was thoroughly investigated in terms of nutritional and cultivation conditions under batch and fed-batch fermentation policies. The effect of key process variables on the biomass growth rate, the PHB content and its associated MWD, were analyzed in a comprehensive way. It was shown that a polyester with tailor-made molecular properties can be produced via an optimal selection of the controlling nutritional and process variables, under batch conditions. Moreover, a single-shot fed-batch fermentation policy that maximized the polymer to saccharose yield and the PHB content was applied. In addition, the overall biomass and PHB concentrations were enhanced by the application of a continuous substrate feeding regime in the bioreactor, under nitrogen sufficient conditions. On the other hand the maximum weight average molecular weight was achieved during nitrogen limiting conditions under low biomass growth rate. For the recovery of the intracellular product five different post-treatment techniques were performed and assessed in terms of the polymer recovery efficiency and the effect on the molecular properties. A combined mechanical/chemical cells post-treatment process (i.e., cells disruption by sonication and polymer extraction by chloroform) that maximized the PHB recovery efficiency and minimized the overall treatment time and the effect on the molecular weight distribution, was experimentally identified. Moreover, the ability of Alcaligenes latus cells to grow on lactose from cheese whey as the only available carbon source and accumulate PHB efficiently was demonstrated in the present work for the first time. The mathematical simulation and prediction of A. latus cultures was performed using a novel ‘multi-scale’ modelling approach, consisting of three different sub-models: kinetic, metabolic and macroscopic. The proposed mathematical framework is able to predict quantitative and qualitative characteristics of the overall process. Among the various reports focusing on the high-yield microbial production of PHB, the present dissertation demonstrates a strategy of reducing the overall production cost by producing PHB efficiently under optimized fed-batch conditions, maximum polymer recovery and by utilizing alternative inexpensive raw materials.