Επίδραση του φλεγμονώδους προτύπου της γήρανσης στην επαγωγή μηχανισμών κυτταρικής φθοράς
Creators: name: Αλεξάκου, Έλλη Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2025
Subjects: Κυτταρική γήρανση
Προφλεγμονώδεις παράγοντες
Φλεγμονή
Senescence
Pro-inflammatory stimulus
Inflammageing

description: Σκοπός της παρούσας ερευνητικής πρότασης είναι η μελέτη της επίδρασης της ήπιας, φλεγμονής στην επαγωγή μηχανισμών κυτταρικής γήρανσης σε κύτταρα πρωτογενών καλλιεργειών ουλικών ινοβλαστών. Απώτερος στόχος είναι η ανίχνευση βιοδεικτών που σχετίζονται με την κυτταρική γήρανση στους ανθρώπινους ουλικούς ινοβλάστες (hGFs) μετά από ήπια, συνεπή έκθεση σε διάφορους προ-φλεγμονώδεις παράγοντες και η διερεύνηση της πιθανής απόκτησης ενός φαινοτύπου SASP υπό την επίδραση των προαναφερθέντων προ-φλεγμονώδων παραγόντων.Υλικά &amp; Μέθοδος: Πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες ουλικών ινοβλαστών, που είχαν ήδη αναπτυχθεί στα πλαίσια προγενέστερων εργασιών μελών της ομάδας μας ,που έχουν λάβει έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας του Τμήματος Οδοντιατρικής ΑΠΘ (22/11-01-2016) (Apatzidou DA et al., 2018) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση βιοδεικτών που σχετίζονται με την κυτταρική γήρανση (Senescence-associated secretory phenotype- SASP) μετά από ήπια, συνεχή έκθεση τους σε διαφορετικούς τύπους προ-φλεγμονωδών σημάτων, συμπεριλαμβανομένων αντιπροσωπευτικών στοματικών βακτηριακών ενδοτοξινών (π.χ. λιποπολυσακχαρίτης, LPS), προ-φλεγμονωδών κυτοκινών που υπάρχουν σε φλεγμαίνοντες ουλικούς ιστούς (π.χ. παράγοντας νέκρωσης όγκων-α, TNFa), καθώς και ολικού υγρού (Gingival Cervical Fluid, GCF) που έχει συλλεγεί από τρεις φλεγμαίνοντες περιοδοντικούς θυλάκους. Για την ανάλυση έκφρασης δεικτών SASP, πρωτεϊνικά εκχυλίσματα (κυτταρολύματα), καθώς και υπερκείμενα καλλιέργειας που συλλέχθηκαν κάτω από τις ανωτέρω προγραφείσες συνθήκες επαγωγής προφλεγμονωδών σημάτων υποβλήθηκαν σε κατάλληλη επεξεργασία για ανάλυση έκφρασης δεικτών SASP μέσω συστοιχιών αντισωμάτων που βασίζονται σε χημειοφωταύγεια (Proteome ProfilerTM Arrays R&amp;D Systems). Επιπλέον, μελετήθηκε η κυτταρική γήρανση των ουλικών ινοβλαστών μέσω της ποσοτικοποίησης της έκφρασης του χαρακτηριστικού ενζύμου β-γαλακτοσιδάση (β-galactosidase) με τη χρήση αντίστοιχης δοκιμασίας (κιτ) φασματομετρικής ανάλυσης (Sigma-Aldrich). Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική γήρανση, κατόπιν έκθεσης στους προαναφερόμενους προ-φλεγμονώδεις παράγοντες, με τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR). Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα έδειξαν στατιστικά σημαντική αυξήση (p&lt;0,05) του αριθμού των θετικών στη βήτα-γαλακτοσιδάση γηρασμένων κυττάρων μετά από έκθεση στους διαφορετικούς προφλεγμονώδεις παράγοντες. Τα γονίδια που σχετίζονται με τη γήρανση εμφάνισαν μείωση της έκφρασης των CCND1,C2CD5, SUSD6 και STAG1, που είναι ενδεικτική για την κυτταρική γήρανση. Συνολικά, η προφλεγμονώδης επίδραση στα ήδη γηρασμένα κύτταρα προκάλεσε πιο έντονα αποτελέσματα σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε χρόνια έκθεση. Η πρωτεομική ανάλυση έδειξε επαγωγή του SASP που αποδεικνύεται από την αύξηση της έκφρασης αρκετών προφλεγμονωδών πρωτεϊνών (π.χ. IL-6, IL-10, IL-16, IP-10, MCP-1, MCP-2, M-CSF, MIP-1a, MIP-1b, TNFb, sTNF-RI, sTNF-RII, TIMP-2) που εμπλέκονται στην κυτταρική γήρανση και τις ανοσολογικές αποκρίσεις. Η μικρότερη επίδραση στο SASP παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες που εκτέθηκαν στην LPS και η μεγαλύτερη σε αυτές που εκτέθηκαν σε GCF. Συμπεράσματα: Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η μακροχρόνια έκθεση των hGFs σε διάφορα προφλεγμονώδη ερεθίσματα επιτάχυνε την κυτταρική γήρανση και τα πιο σημαντικά αποτελέσματα σημειώθηκαν στα ήδη γηρασμένα κύτταρα. Λέξεις κλειδιά: inflammageing, γήρανση, προφλεγμονώδεις παράγοντες, SASP
description: Tissue inflammation has the potential to provoke cellular senescence, a process known as “inflammageing”, driving living cells to a state of permanent cell cycle arrest due to chronic antigenic irritation. This in vitro study aimed to shed light on the mechanisms of “inflammageing” on human oral cells. Materials &amp; Methods: Primary cultures of human gingival fibroblasts (hGFs) were exposed to pro-inflammatory stimuli, including lipopolysaccharide (LPS), Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFa), and gingival crevicular fluid (GCF) collected from active periodontal pockets of systemically healthy patients. Inflammageing was studied through two experimental models, employing either “aged” hGFs after prolonged passaging (p.10) that were exposed to the pro-inflammatory stimuli or young hGFs long-term exposed to the above stimuli from early- (p.1) to late- (p.10) passaging. Cells were evaluated for the expression of beta-galactosidase (histochemical staining) expression, senescence-associated genes (qPCR analysis), and for Senescence Associated Secretory Phenotype (SASP) biomarkers (proteomic quantitation analysis followed by bioinformatics analysis). Results: Significant increase (p&lt;0.05) of beta-galactosidase positive cells was observed after exposure to each of the pro-inflammatory stimuli. The senescence-associated genes profile included downregulation for CCND1, C2CD5, SUSD6 and STAG1, which is typical for cellular senescence. Overall, pro-inflammatory licensing of late-passage cells caused more pronounced effects compared to long-term exposure of early-passage cells to the stimuli. The proteomic analysis showed induction of SASP evidenced by upregulation of several pro-inflammatory proteins (e.g. IL-6, IL-10, IL-16, IP-10, MCP-1, MCP-2, M-CSF, MIP-1a, MIP-1b, TNFb, sTNF-RI, sTNF-RII, TIMP-2) implicated in cellular aging and immune responses. The smallest impact on SASP was provoked by LPS and the most pronounced by GCF. Conclusion: This study demonstrated that long-term exposure of hGFs to various pro-inflammatory signals induced and accelerated cellular senescence with the most significant effects noted for the aged cells. Keywords: inflammageing, senescence, proinflammatory stimulus, SASP