Cellular droplet microarray: a miniaturized technique for high-throughput screening of small molecules and proteins
Creators: name: Liu, Yanxi
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2021
Subjects: high-throughput screening
miniaturization
droplet microarray
drugs
transfection
human induced pluripotent stem cells
pluripotency
proteins
xeno-free

description: Das Hochdurchsatz-Screening ist von großer Bedeutung und bildet einen der Eckpfeiler der aktuellen Life-Science-Research wie Biologie, Biotechnologie, Biochemie, Computerwissenschaft, medizinische Chemie und Pharmakologie. Das Interesse an einem Screening mit hohem Durchsatz unter akademischen, mittleren und kleinen Biotech-Unternehmen, staatlichen und gemeinnützigen Screening-Standorten, sowie Auftragsforschungsorganisationen wurde spürbar erhöht, da Hochdurchsatz-Screenings eine effiziente Analyse von einer Vielzahl von Stoffen in kürzester Zeit ermöglicht. Das steigende Interesse an dieser Methode führte zu einer schnellen Entwicklung von Screening-Technologien mit hohem Durchsatz in Kombination mit komplementären Technologien. Die Nachteile herkömmlicher Hochdurchsatz-Screenings beinhalten hohe Kosten und Materialverschwendung, lange Zykluszeiten, geringe Produktivität und die begrenzte Ausbaufähigkeit der existierenden Stoffbibliotheken. Die genannten Nachteile verdeutlichen die Wichtigkeit der Bemühungen zur Entwicklung von verbesserten miniaturisierten und automatisierten Hochdurchsatz-Screening Methoden. Droplet Microarray (DMA) ist eine dieser miniaturisierten Plattformen, welche durch die Vereinigung von Oberflächenchemie, Oberflächenfunktionalisierung und Biologie erschaffen wurde. Die hohe Tröpfchendichte auf DMA senkt die Kosten, Materialverschwendung, Zykluszeit des Screenings und erhöht die Effizienz des Verfahrens, während sie effektiv die Verwendung größerer chemischer und biologischer Bibliotheken unterstützt. Die weitere Entwicklung, Auswertung und Verbesserung der DMAs spielt nicht nur für den Fortschritt der Hochdurchsatz-Screenings eine wichtige Rolle, sondern beherbergt auch unermessliches Potential in pharmalogischen Bereichen und der Stammzellenforschung, in welcher es die Wirksamkeit von Gentransfers und das Kultivieren von undifferenzierten Stammzellen erleichtert. Pharmakologisches Priming (Drug Repurposing) wurde als adjuvante Strategie zur Verbesserung der Effizienz nicht-viraler Genübertragung angesehen. Dennoch ist die facettenreiche Anwendung des pharmakologischen Priming aufgrund der unerschwinglich hohen Kosten für Reagenzien und die Durchführung der Methode unweit verbreitet, was den aufkommenden Drang nach miniaturisierten Plattformen und Drug Repurposing erklärt. Abgesehen von der Dringlichkeit im pharmakologischen Bereich, um klinisches Potenzial zu realisieren, benötigt die Stammzellenforschung auch miniaturisierte Methoden um den Einfluss von Zelloberflächeninteraktionen und Zellkulturmedium auf das Verhalten von Stammzellen und die Effekte von Zusatzstoffen, und Oberflächenbeschichtungen einschließlich oberflächenabsorbierter Proteine auf Stammzellen zu beobachten. Das Ziel für den ersten Teil der Dissertation war es nach kleinen Molekülen (Stoffen) auf DMAs zu suchen, welche transfektionsverstärkende Effekte beinhalten, um eine mögliche Verbesserung in den Bereichen Gentransfer- und Therapie zu bieten. Eine Untersuchung der Einflüsse von 774 Food and Drug Administration (FDA)-zugelassenen Wirkstoffen auf die Transfektionseffizienz mit verschiedenen Zelltypen in miniaturisierter- und hochdurchsatzweise wurde mit Hilfe der DMAs veranlasst. Das Screening der FDA-zugelassenen Arzneimittelbibliothek identifizierte 14 einzelne Verbindungen, die eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektion aufwiesen. Diese Treffer wurden verifiziert und in großem Maßstab untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der auf DMA basierende Ansatz für das Drug Repurposing beständig ist und zur Untersuchung und Entwicklung wirksamerer nicht-viraler Genübertragungssysteme verwendet werden könnte. Das Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war es, den Einfluss von Oberflächeneigenschaften und sinkendem Volumen auf die Pluripotenz von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu bestimmen. Zwei künstliche Oberflächen mit unterschiedlichen chemischen Elementen und deren dazugehörigen DMAs wurden für die Kultivierung und Pluripotenz von hiPSCs in vitro untersucht. Die Oberflächen und DMAs wurden genutzt, um human induzierten pluripotenten Stammzellen in 2 ml und 200 nL-Volumen zu kultivieren. Die Ergebnisse zeigten, dass hiPSCs eine hohe Lebensfähigkeit, sowie die erwartete Morphologie und Pluripotenz in 200 nL Tröpfchen auf Typ A und Typ B DMAs ohne Matrigelbeschichtung nach 24 h Kultivierung aufwiesen. Dies beweist, dass DMAs eine vielseitige und simple Plattform für kurzzeitige und xeno-freie Hochdurchsatz-Screenings von hiPSCs sind. Als Ziel für den dritten Teil der Dissertation wurde das Identifizieren von chemisch definierten Proteinen, welche das Kultivieren und Aufrechterhalten der Plutipotenz von hiPSCs Zellen auf DMAs, sowie Mikrotiterplatten weiter verbessern könnten, angesetzt. Es ist möglich eine Proteinbeschichtung, Zellkultur und Immunfluoreszenzfärbung auf miniaturisierter Ebene parallel mit Hilfe von DMAs durchzuführen, was zu einer Reduzierung von Versuchsfehlern und Verbrauchsmaterialien führt. Auf Grund dessen wurden DMAs als Basis zur Überprüfung von elf verschiedenen Proteinen und deren verwandten binären und ternären Kombinationen (insgesamt 231 verschiedene Gruppen) auf ihre Fähigkeit zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs genutzt. Aus diesem Raster wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche die Proliferation und das Self-Renewal besser unterstützen könnten als mit Matrigel beschichtete Oberflächen. Die effizientesten Proteinkombinationen des primären Screenings wurden weiterhin in einer Langzeitkultur (fünf Wochen) verifiziert. Zusätzlich wurde die Formation von embryonalen Körperchen der auf den ausgewählten Proteinbeschichtungen kultivierten Zellen erzielt und es folgte die Differenzierung der hiPSCs in drei Keimblätter. Zusammengefasst, wurden DMAs als miniaturisierte Schnellscreening-Plattform verwendet, um mehrere biologische Fragen zu beantworten. Als erstes wurden 776 Wirkstoffe auf Nanoebene untersucht und somit kosten-, zeit- und arbeitssparend verwertet. Vierzehn Stoffe wiesen eine zwei- bis fünffache Verbesserung der Transfektionstechniken auf. Als zweites wurden chemische Komponente von Zellkulturoberflächen und kleinen Volumina (200nl) von Zellkulturmedium gefunden, die zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs beitragen. Als letztes wurden zehn Gruppen von ternären Proteinkombinationen identifiziert, welche das Kultivieren von undifferenzierten hiPSCs unterstützen. Zwei von ihnen wurden weiter untersucht, um eine Langzeitkultur von undifferenzierten hiPSCs zu erzielen, gefolgt von ihrer Differenzierung in drei Keimblätter. Eine Zusammenfassung und eine Aussicht auf die Zukunft befinden sich am Ende der Dissertation.