Ανίχνευση και μοριακός χαρακτηρισμός του γένους Vitivirus που προσβάλλουν την άμπελο
Creators: name: Παναηλίδου, Πωλήνα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Αμπέλι
Ιός Ε της αμπέλου
Ιός F της αμπέλου
Ιός Ι της αμπέλου
Μοριακός χαρακτηρισμός
Vitivirus
Grapevine virus E, GVE
Grapevine virus F, GVF
Grapevine virus I, GVI

description: Η άμπελος προσβάλλεται από μεγάλο αριθμό ιών, μεταξύ των οποίων και πολλά μέλη του γένους Vitivirus. Οι viti-ιοί είναι ευρέως διαδεδομένοι και κάποιοι από αυτούς έχουν συσχετιστεί με το σύνδρομο της βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου (Grapevine rugose wood – RW). Τα τελευταία χρόνια η ευρεία εφαρμογή της τεχνολογίας αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High - Throughput Sequencing) στην άμπελο οδήγησε στην ανίχνευση πολλών νέων ιών του γένους Vitivirus (Οικογένεια Betaflexiviridae). Το 2017, στα πλαίσια επισκοπήσεων αμπελώνων και συλλογών της χώρας, πραγματοποιήθηκε ανάλυση HTS σε δείγμα (D2-1) της ποικιλίας Δαφνιά, που είχε συλλεχθεί από το Ινστιτούτο Αμπέλου (ΕΛΓΟ-ΔΗΜΗΤΡΑ) στη Λυκόβρυση, Αθήνα. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων βρέθηκαν για πρώτη φορά στη χώρα μας μεταξύ άλλων και οι ιοί Ε (grapevine virus E, GVE), F (grapevine virus F, GVF) και I της αμπέλου (grapevine virus I, GVI), που ανήκουν στο γένος Vitivirus. Ως πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής τέθηκε η επιβεβαίωση της παρουσίας των τριών ιών στο δείγμα D2-1, με μια επιπλέον μέθοδο ανίχνευσης. Αυτό πραγματοποιήθηκε με την ανάπτυξη και εφαρμογή εξειδικευμένων μεθόδων RT-PCR για κάθε ιό και με την εκ νέου ενίσχυση και αλληλούχηση τμημάτων του γονιδιώματός τους με τη μέθοδο αλληλούχησης κατά Sanger. Έτσι, επιβεβαιώθηκε η παρουσία των τριών ιών, δεδομένο που ώθησε, στη συνέχεια, στη διερεύνηση της συχνότητας εμφάνισης των GVE, GVF και GVI στους αμπελώνες της ελληνικής επικράτειας. Από τον έλεγχο ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων διαπιστώθηκε η παρουσία των τριών ιών στους ελληνικούς αμπελώνες, κυρίως σε εμβολιασμένες γηγενείς ποικιλίες αμπέλου, με τον GVF να ανιχνεύεται σε μεγαλύτερη συχνότητα (24,5%) σε σχέση με τους GVI (2,4%) και GVE (1,7%). Τέλος, διερευνήθηκε και η γενετική παραλλακτικότητα που εμφανίζουν οι ελληνικές απομονώσεις μεταξύ τους καθώς και με απομονώσεις των ιών από διάφορες χώρες. Η αλληλούχηση και συγκριτική ανάλυση τμημάτων των γονιδίων της πολυμεράσης και της καψιδιακής πρωτεΐνης των τριών ιών, και επιπλέον τμήματος της πρωτεΐνης διακυτταρικής μετακίνησης του GVI, έδειξε την ύπαρξη γενετικής παραλλακτικότητας μεταξύ των ελληνικών και ξενικών απομονώσεων και στους τρεις ιούς, με τον GVE να είναι ο πιο διαφοροποιημένος. Υψηλή παραλλακτικότητα διαπιστώθηκε και μεταξύ των ελληνικών απομονώσεων των GVE και GVF, ενώ οι πληθυσμοί του GVI εμφάνισαν μεγάλη ομοιογένεια. Η φυλογενετική ανάλυση που ακολούθησε έδειξε την επίδραση της διακίνησης και του εμβολιασμού μολυσμένου πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου στην εξέλιξη των ιών. Επιπλέον φαίνεται ότι σε τοπικό επίπεδο μπορεί να γίνεται διασπορά των ιών αυτών, και ιδιαίτερα του GVI, με φορείς που πιθανώς ενδημούν στον ελλαδικό χώρο. Η συλλογή περαιτέρω πληροφοριών για αυτούς τους τρεις νέους ιούς της αμπέλου στη χώρα μας θα οδηγήσει στην καλύτερη διαχείρισή τους.
description: Grapevine is infected by a high number of viruses, including many members of the genus Vitivirus. Vitiviruses are widespread and some of them are associated with Grapevine Rugose Wood complex (RW). Recently, the widespread application of High-Throughput Sequencing (HTS) technology has led to the detection of many new grapevine viruses, which were classified in the genus Vitivirus. In 2017, HTS was conducted in a grapevine sample of Dafnia variety (D2-1) which was collected from the Grapevine Institute (ELGO-DEMETER) in Lykovrisi, Athens, during a survey of commercial vineyards and grapevine collections. Subsequent analysis of HTS data revealed the presence of a high number of viruses, including Grapevine virus E (GVE), Grapevine virus F (GVF) and Grapevine virus I (GVI), which belong to the genus Vitivirus (family Betaflexiviridae) and whose presence in Greece, until then, remained unknown. The first objective of this study was to confirm the presence of these three viruses in the sample D2-1, with an additional detection method. This was accomplished by the development and application of species-specific RT-PCR and re-amplification and sequencing of segments of their genome by Sanger sequencing. Thus, the presence of these viruses in Greece was confirmed, a fact that fostered the investigation of their incidence in vineyards of the Greek territory. Testing of a large number of samples revealed the presence of these three viruses in Greek vineyards, mainly in grafted indigenous grapevine varieties, with GVF being detected more frequently (24.5%) than GVI (2.4%) and GVE (1.7%). Finally, the intraspecies genetic variability of the three viruses was investigated. Sequencing and comparative analysis of segments of the replicase and the coat protein genes of each virus, and also a segment of the movement protein gene of GVI, revealed the existence of genetic variability between Greek and foreign isolates in all three viruses, with GVE being the most divergent. High variability was also found between the Greek isolates of GVE and GVF, while the populations of GVI showed great homogeneity. Further phylogenetic analysis showed the effect of movement of infected grapevine propagation material and grafting onto rootstocks in the evolution of these viruses. Moreover, it seems that all three viruses and especially GVI can be spread in local level, with vectors that are probably endemic locally in Greece. Further studies on these three new grapevine viruses in our country will lead to their effective management.