title: Characterisation of MUC16 (CA125) knockdown clones of a human ovarian cancer cell line
title: Charakterisierung von MUC16 (CA125) Knockdown Varianten einer humanen Ovarialkarzinomzellinie
Creators: name: Kage, Sophie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: shRNA Knockdown
Eierstockkrebs
Muzin
MUC16
Koloniebildung
CA125
mucin
Medizin, Gesundheit
Tumormarker
shRNA knockdown
Apoptosis
Proliferation

description: The tumor associated antigen CA125
      (MUC16) is commonly highly expressed in ovarian cancer and
      can also be detected in other tumour of epithelial origin.
      Although CA125 se-rum levels are frequently used to monitor
      patients with ovarian cancer, its physiological role is
      largely unkown. The aim of this study was to investigate the
      impact of MUC16 gene silencing on the growth properties of
      ovarian cancer cells. Therefore the cellular effects linked
      to oncogenesis, such as proliferation, cell cycle and
      apoptosis after transient and stable transfection with MUC16
      short hairpin RNA (shRNA) in the ovarian cancer cell line
      OAW-42H8+ were analysed. Furthermore, alterations in cell
      adhesion, migration, and in-vasion were evaluated in stable
      MUC16 knockdown clones. First of all, the results showed a
      significant suppression of growth by induction of
      caspase-dependent apoptosis after transient transfection with
      MUC16 shRNA. In these cells Caspase 3 was found to be
      activated and was associated with increased cleavage of PARP.
      Growth inhibition and increased apoptosis could be confirmed
      in stable MUC16 knock-down clones, although caspase-dependent
      death pathways seemed no longer to be activat-ed. Neither
      Caspase 3 activation nor PARP cleavage were detected in
      stable knockdown clones. Therefore these clones were analysed
      for mitochondrial release of caspase-independent cell death
      effectors. Indeed, translocation of AIF from mitochondria to
      the nucleus was observed in the stable MUC16 knockdown clone.
      The data indicate a shift from caspase-dependent apoptosis to
      caspase-independent cell death in stable long-term surviving
      MUC16 knockdown clones in ovarian cancer cell line OAW-42H8+.
      Besides inhibition of proliferation through induction of
      apoptosis a significantly reduced clonogenicity was observed
      after stable MUC16 knockdown. As the PI3K/AKT signaling
      pathway is often activated in ovarian cancer cells and is
      additionally involved in multiple cell functions like growth,
      cell cycle control and apoptosis, the influence of MUC16 on
      this pathway was further evaluated. AKT activation as well as
      AKT expression levels were suppressed in stable MUC16
      knockdown clones. Furthermore downstream effectors of AKT
      like 4EBP1 and S6, regulating protein translation and
      therefore tumor cell growth, were shown to be inhibited in
      MUC16 knockdown clones. Additionally the reduced AKT
      activation was linked to suppression of anti-apoptotic Bcl-2
      in these cells. The data pre-sented here provide further
      evidence for MUC16-mediated regulation of tumour growth
      through the PI3K/AKT pathway, although other signaling
      pathways may be involved. In contrast to cell growth and
      apoptosis MUC16 was shown to have no effect on migration and
      invasion in the OAW-42H8+ cell line. These cells in generally
      displayed a non-motile and non-invasive phenotype which was
      not altered by MUC16 knockdown. Our results provide evidence
      for a central role of MUC16 in ovarian cancer cell survival
      pathways. Thereby different apoptosis pathways as well as the
      PI3K/AKT signaling path-way are influenced by MUC16
      Knockdown. MUC16 is therefore a promising candidate for
      targeted cancer therapy. But to develop further therapy
      options a better understanding of its physiological function
      and interaction with signaling molecules in ovarian cancer
      cells in vivo and in vitro is necessary.
description: Das tumorassoziierte Antigen CA125
      (MUC16) wird häufig von Ovarialkarzinomen aber auch anderen
      epithelialen Tumoren überexprimiert. Obwohl CA125
      Serumspiegel häufig zur Verlaufskontrolle von
      Ovarialkarzinompatientinnen angewendet werden, ist die
      physi-ologische Funktion dieses Muzins weitgehend unbekannt.
      Ziel dieser Arbeit war es daher den Einfluss eines MUC16
      Knockdowns auf das Wachstum von Ovarialkarzinomzellen zu
      untersuchen. Nach transienter und stabiler Transfektion der
      Ovarialkarzinomzelllinie OAW-42H8+ mit MUC16 short hairpin
      RNA (shRNA) wurden daher Proliferation, Zellzyklus und
      Apoptoseraten in diesen Zellen analysiert. Daneben wurden
      zudem Veränderungen hinsichtlich Zelladhäsion, Migration und
      Invasion in stabilen MUC16 Knockdown Klonen untersucht. Nach
      transienter Transfektion von OAW-42H8+ mit MUC16 shRNA kam es
      zu einer sig-nifikante Hemmung des Wachstums durch Induktion
      einer caspasenabhängigen Apoptose. Dabei konnte eine
      Aktivierung von Caspase 3 sowie eine vermehrte Spaltung von
      PARP nachgewiesen werden. Wachstumshemmung und vermehrte
      Apoptoseraten wurden in stabilen MUC16 Knockdown Klonen so
      bestätigt. Allerdings zeigte sich hier keine Akti-vierung
      caspasenabhängiger Signaltransduktionswege mehr. Weder eine
      signifikante Akti-vierung der Caspase 3 noch eine Spaltung
      von PARP waren im stabilen MUC16 Knock-down Klon nachweisbar.
      Die Zellen wurden daher hinsichtlich einer mitochondrialen
      Frei-setzung von caspasenunabhängigen Faktoren untersucht. In
      der Tat konnte in stabilen MUC16 Knockdown Klonen eine
      Translokation von AIF aus dem Mitochondrium in den Zellkern
      nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse
      aus transienten und stabilen MUC16 Knockdown Versuchen einen
      Wechsel von caspasenabhängiger Apoptose hin zu einem
      caspasenunabhängigem Zelltod nach Langzeitkultivierung des
      stabilen MUC16 Knockdown Klons der Ovarialkarzinomzelllinie
      OAW-42H8+. Weiterhin zeigte sich neben einer
      Proliferationshemmung und Apoptoseinduktion auch eine
      signifi-kant verminderte Klonogenität nach stabilem MUC16
      Knockdown. Da der PI3K/AKT Signalweg in Ovarialkarzinomzellen
      häufig aktiviert ist und an multiplen zellulären Funk-tionen
      wie Wachstum, Zellzykluskontrolle und Apoptose beteiligt ist
      wurde daraufhin der Einfluss von MUC16 auf diesen Signalweg
      weiter untersucht. Sowohl die Aktivierung von AKT als auch
      die Expression von AKT waren im stabilen MUC16 Knockdown Klon
      un-terdrückt. Weiterhin wurden nachgeschaltete
      Effektormoleküle von AKT wie 4EBP1 und S6, die an der
      Regulation von Translation und Zellwachstum beteiligt sind,
      gehemmt. Die verminderte Aktivierung von AKT war zudem mit
      einer Hemmung des anti-apoptotisch wirksamen Bcl-2 im
      stabilen MUC16 Knockdown Klon verbunden. Damit beeinflusst
      MUC16 damit das Zellwachstum in Ovarialkarzinomen durch
      Interaktion mit dem PI3K/AKT Signalweg, wobei auch andere
      Signalwege an dieser Regulation beteiligt sein können. Im
      Gegensatz dazu hatte MUC16 keinen Einfluss auf Migration und
      Invasion der OAW-42H8+ Zelllinie. Allerdings weist diese
      Zelllinie generell einen eher unbeweglichen und
      nichtinvasiven Phänotyp auf, sodass Unterschiede durch MUC16
      Knockdown nicht nachweisbar waren. Zusammenfassend nimmt
      MUC16 eine zentrale Rolle am Überleben von
      Ovarialkarzi-nomzellen ein. Dabei werden sowohl verschiedene
      Apoptosesignalwege als auch der PI3K/AKT Signalweg
      beeinflusst. MUC16 ist damit ein idealer Angriffspunkt für
      eine zielgerichtete Krebstherapie. Zur Etablierung weiterer
      Therapieoptionen bedarf es jedoch einer steten Erweiterung
      des Verständnisses zur physiologischen Funktion und
      insbesonde-re Interaktion von MUC16 mit den verschiedenen
      Signalwegen in Ovarialkarzinomen in vitro und in
      vivo.