title: Molecular biological and biochemical investigations of prenyltransferases and NRPS-enzymes of Ascomycetes
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungenvon Prenyltransferasen und NRPS-Enzymen aus Ascomyceten
Creators: name: Wunsch, Carsten
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: NRPS
cyclic dipeptides
Nichtribosomale Peptidsynthetasen
Ascomyceten
Medical sciences, Medicine
Prenyltransferasen
Aspergillus
zyklische Dipeptide

description: Die Produktion sekundärer Stoffwechselprodukte durch Mikroorganismen stellt ein beachtliches Reservoir an biologisch-aktiven Naturstoffen da, die auch pharmazeutische Bedeutung haben können. Darunter fallen Antibiotika, Zytostatika oder auch Immunsuppressiva. Diese sind im Gegensatz zu Metaboliten des Primärstoffwechsels zunächst für Wachstum und Entwicklung entbehrlich, jedoch auf den zweiten Blick essentiell für die Bewältigung zahlreicher Wechselwirkungen des Individuums mit seiner Umwelt. Auch die filamentösen Pilze tragen ihren Teil zur Diversität der Naturstoffe bei. Die Grundstrukturen solcher Substanzen beruhen häufig auf der Mitwirkung von Nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), NRPS-ähnlichen Enzymen, Polyketidsynthasen (PKS) und Hybridenzymen aus NRPS/PKS. Durch den Einfluss weiterer Modifikationsenzyme (tailoring enzymes), wie Prenyltransferasen, wird die biologische Vielfalt und Aktivität deutlich gesteigert. Zur gezielten chemoenzymatischen Synthese neuer Naturstoffe sind daher fundierte Kenntnisse über die Reaktionsmechanismen, sowie der biochemischen Eigenschaften dieser Enzymklassen von zentraler Bedeutung. Mit dieser Arbeit sollten fünf putative Prenyltransferasen aus A. terreus charakterisiert werden. Für zwei Vertreter CdpC7PT und EAU34068 konnte dieses Vorhaben bisher erfolgreich absolviert werden. CdpC7PT ist hierbei zum einen für die C7-Prenylierung von tryptophanhaltigen zyklischen Dipeptiden verantwortlich und stellt zum anderen die erste beschriebene Prenyltransferase der DMATS-Superfamilie dar, welche eine O-Prenylierung in Anwesenheit von tyrosinhaltigen zyklischen Dipeptide vollführt. Bei der Suche nach geeigneten Substraten für EAU34068 konnten trotz der Sequenzidentitäten von bis zu 42 % auf Aminosäureebene zu zyklischen Dipeptid-akzeptierenden Prenyltransferasen, diese Subtratgruppe leider nicht bestätigt werden. Erst eine ausgedehnte Suche zeigte die Flavanone Eriodictyol und Naringenin, die Hydroxynaphthaline 1-Naphtol und 1,7-Dihydroxynaphthalin, sowie das Xanthon 1,3,6-Trihydroxyxanthon als Substrate für eine Geranylierung auf. Dabei wurden regioselektive Prenylierungen bei allen diesen Substanzen beobachtet. Zwei weitere putative Prenyltransferasegene ATEG_02823 und ATEG_01730 befinden sich derzeit im Klonierungsstadium und eine weitere bedarf weiterer Expressionsoptimierungen ATEG_06111 zum Erhalt des gewünschten rekombinanten Proteins (EAU33872).   Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Charakterisierung der NRPS EAA61517 und EAW25548, sowie des NRPS-ähnlichen Enzyms EAU36364. Die zugehörigen Gene AN9226, NFIA_043670 und ATEG_03090 stammen entsprechend der Reihenfolge aus A. nidulans, N. fischeri und A. terreus und sollten in ein geeignetes Konstrukt zur Expression in A. nidulans TN02A7 überführt werden. Für AN9226, sowie NFIA_043670 konnten positive Transformanten erhalten werden. Durch den Vergleich mit dem untransformierten Stamm A. nidulans TN02A7 wurde anschließend die Sekundärmetabolitproduktion analysiert. Insbesondere für AN9226 wurden zahlreiche Strategien zur Optimierung der Expression und damit verbundener Produktzunahme verfolgt, wie beispielsweise die Mitwirkung des konstitutiven gpdA Promotors. Zum jetzigen Zeitpunkt konnte jedoch kein Produkt in direkten Zusammenhang mit dem jeweiligen inserierten Gen gebracht werden, aber in jedem Fall wurde die unerwartete Akkumulation des Polyketides Sterigmatocystin beobachtet.   Durch die Kombination der NRPS FtmPS aus N. fischeri, dessen Ortholog aus A. fumigatus cyclo-L-Trp-L-Pro synthetisiert, mit verschiedenen Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie in A. nidulans sollten zum einen die in vitro erhaltenen Ergebnisse bestätigt werden und zum anderen auf diesem Wege ein System zur gezielten in vivo Synthese gewünschter prenylierter Derivate etabliert werden. Das NRPS-Gen NFIA_093690 wurde zu diesem Zweck unter die Kontrolle des konstitutiven gpdA Promotors, sowie des trpC Terminators gestellt und in den zur Transformation geeigneten Vektor pJW24 integriert. Nach erfolgreicher Transformation von A. nidulans TN02A7 konnte durch Analyse der Sekundärmetabolitproduktion das erstrebte cyclo-L-Trp-L-Pro bestätigt werden. Anschließend erfolgte die Koexpression der beiden reversen C2-Prenyltransferasen CdpC2PT und BrePT aus N. fischeri und A. versicolor, sowie der reversen C3-Prenyltransferasen CdpC3PT und CdpNPT aus N. fischeri und A. fumigatus. Die kodierenden Gene wurden ebenfalls mit den bereits erwähnten regulatorischen Elementen und dem Selektionsmarker pyroA in einem Vektor zusammengefügt und in den ftmPS-Transformanten A. nidulans CaW03 (ftmPS) eingebracht. Durch weiterführende Arbeiten von Frau Dr. Kathrin Mundt konnten vergleichend zu A. nidulans CaW03 (ftmPS) zusätzliche Produkte im Sekundärmetabolitspektrum identifiziert werden. Die Strukturaufklärung erbrachte im Fall von CdpC2PT und BrePT die Bestätigung einer reversen C2-Prenylierung von cyclo-L-Trp-L-Pro, für CdpNPT ein syn-cis konfiguriertes reverses C3-prenyliertes Derivat und bei CdpC3PT sowohl reverse C3- und C2-prenylierte Derivate, als auch eine reguläre Prenylierung an Position N1.
description: The production of secondary metabolites by microorganisms represents a considerable reservoir of biologically active natural products, which can exhibit pharmaceutical importance like antibiotics, antitumor drugs or immunosuppressives. These are in contrast to metabolites of primary metabolism initially dispensable for growth and development, but at second glance essential for the management of numerous interactions of the individual with its environment. The filamentous fungi contribute to the diversity of natural products. The backbone structures of these substances are often based on the participation of nonribosomal peptide synthetases (NRPS), NRPS-like enzymes, Polyketide synthases (PKS), and hybrid enzymes of NRPS/PKS. Due to the influence of other tailoring enzymes like prenyltransferases the biodiversity and biological activity is significantly increased. For selective chemoenzymatic synthesis of new natural products a well-founded understanding of the reaction mechanisms, as well as the biochemical properties of these classes of enzymes are of crucial significance. With this work, five putative prenyltransferases from A. terreus should be characterized. For two representatives, CdpC7PT and EAU34068 this intension was successfully realized. CdpC7PT is responsible for the C7-prenylation of tryptophan-containing cyclic dipeptides and additionally functions as the first reported prenyltransferase of the DMATS superfamily which performs an O-prenylation in the presence of tyrosine-containing cyclic dipeptides. In the case of EAU34068 sequence identities of up to 42 % at the amino acid level were found between this enzyme and other characterized cyclic dipeptide prenyltransferases. This prompted us to test such compounds but without success. After extensive testing of different substrate classes, the flavanones eriodictyol and naringenin, the hydroxynaphthalenes 1-naphthol and 1,7-dihydroxynaphthalene, and the xanthone 1,3,6-trihydroxyxanthone could be confirmed as aromatic substrates for geranylation. EAU34068 exhibited a high regioselectivity of the prenylation for all of these substrates. Two additional putative prenyltransferase genes ATEG_02823 and ATEG_01730 are currently at the cloning vectors pCaW5 and pCaW17, respectively, and another putative prenyltransferase gene ATEG_06111 is already subcloned in the expression vector pCaW9 to obtain the desired recombinant protein (EAU33872).   Another focus of this work was the characterization of the nonribosomal peptide synthetases EAA61517 and EAW25548, as well as the NRPS-like enzyme EAU36364. The corresponding genes AN9226, NFIA_043670 and ATEG_03090 from A. nidulans, N. fischeri and A. terreus, respectively, should be cloned in a suitable construct for expression in A. nidulans TN02A7. At least for AN9226 and for NFIA_043670, positive transformants were obtained. Screening for additional secondary metabolites were performed by comparing the transformants with the untransformed strain A. nidulans TN02A7. In particular, for AN9226 numerous strategies were carried out to gain an increased product formation, e.g. expression mediated by the constitutive gpdA promoter. However, until now no product formation could be identified, with one exception of the unexpected accumulation of the polyketide Sterigmatocystin.   By combination of the NRPS FtmPS from N. fischeri, whose ortholog from A. fumigatus is known to produce cyclo-L-Trp-L-Pro, with different prenyltransferases of the DMATS superfamily in A. nidulans, the results of in vitro assays with recombinant proteins should be confirmed in vivo. Additionally, a suitable technique to produce desired prenylated derivatives by in vivo synthesis should be established. For this purpose the nonribosomal peptide synthetase gene NFIA_093690 was placed under the control of the constitutive gpdA promoter, trpC terminator and afterwards integrated in the appropriate vector pJW24 for transformation of A. nidulans TN02A7. After successful transformation of A. nidulans TN02A7 with this vector, an additional and distinctive product could be identified by analyzing secondary metabolite production in comparison to the untransformed strain. This product could be confirmed by structure elucidation as the favoured cyclo-L-Trp-L-Pro. By coexpression of the prenyltransferase genes in one of the transformants which already comprises the ftmPS gene prenylated derivatives should be produced. As representatives two C2 reverse prenyltransferases CdpC2PT and BrePT from N. fischeri and A. versicolor, as well as the reverse C3-prenyltransferases CdpC3PT and CdpNPT from N. fischeri and A. fumigatus were selected. The encoding genes have also been combined with the aforementioned regulatory elements and the pyroA selection marker for the transformation of the selected transformant A. nidulans CaW03 (ftmPS). By further work of Dr. Kathrin Mundt concerning the identification of additional products in comparision to the untransformed strain additional products were observed. After structure elucidation the products of CdpC2PT and BrePT were confirmed as reversely C2-prenylated cyclo-L-Trp-L-Pro. In the case of CdpNPT a syn-cis-configured reversely C3-prenylated derivative and for CdpC3PT both reversly C3- and C2-prenylated derivatives, as well as a regular prenylation at position N1 were obtained.