title: The Role of C-terminal binding protein 1 (CtBP1) in neurodevelopment
title: Die Rolle des C-terminalen Bindeproteins 1 (CtBP1) in der Neuroentwicklung
Creators: name: Marx, Lena M.
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: CtBP1
subject: C-terminal binding protein
subject: neurodevelopment
subject: adult neurogenesis
subject: adult hippocampal neurogenesis
subject: adult subventricular neurogenesis
subject: transcriptional repression
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: C-terminal binding protein 1 (CtBP1) is a nuclear transcriptional co-repressor. As a component of chromatin-modifying complex, it acts in neurons in an activity-dependent manner to regulate neuronal plasticity. Under low activity, CtBP1 is localized in the nucleus where it co-represses the transcription of activity-dependent genes by binding to DNA-linking repressors and recruiting chromatin-modifying enzymes (e.g. histone deacetylases; HDACs). This repressor complex is released by shuttling of CtBP1 towards the presynapse upon increased neuronal activity. Therefore, CtBP1 links dynamically genetic reprogramming with synaptic activity (Ivanova et al., 2015). Interestingly, CtBP1 does not only have a function in plasticity of mature neurons but may also play a role in several aspects of neurodevelopment (Beck et al., 2016; Dias et al., 2014; Rocca et al., 2017). An important neurodevelopmental process is the generation of neurons during adulthood. This process, which is also termed adult neurogenesis, represents a prominent example of how the life-long activity of neurodevelopmental processes contributes to plasticity of brain networks. During adult neurogenesis, stem cells of neurogenic niches in the brain, namely subgranular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus (DG) and subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle wall, continuously generate granule neurons that can functionally integrate into the pre-existing synaptic circuits (Lledo et al., 2006). However, the influence of whether and how CtBP1 regulates adult neurogenesis was not yet investigated. Thus, to elucidate the involvement of CtBP1 in the processes of adult neurogenesis in both neurogenic niches in the brain was the main aim of this work. First, I characterized CtBP1 mouse line breeding. I observed that both male and female CtBP1 knockout (KO) mice weight less than their wildtype (WT) and heterozygous (HET) littermates. Furthermore, I revealed an increased early postnatal mortality rate of CtBP1 KO mice indicated by a lower number of animals genotyped for KO than expected and a reduced survival rate between birth and weaning of CtBP1 litter compared to C57BL/6 litters. Next, I confirmed the expression of CtBP1 in all stages of adult subgranular and subventricular neurogenesis by means of immunohistochemical stainings for CtBP1 and marker of neurogenesis in coronal brain sections of young adult C57BL/6 mice. Furthermore, quantitative Western Blotting of cytoplasmic and nuclear fractions of an in vitro model of adult neurogenesis using neural stem/progenitor cells (NSPCs) derived from SVZ of C57BL/6 mice revealed that CtBP1 is relatively most abundant in nucleus with a drop when proliferation is completed. This suggests that it is important that CtBP1-mediated gene expression of potential proliferation-regulating genes is repealed to finalize proliferation. Moreover, CtBP1 changes its absolute subcellular distribution from cytoplasmic to nucleus-associated localisation after proliferation and prior to differentiation leading to the conclusion that CtBP1 is also implicated in differentiation of neural progenitor cells. In order to reveal the role of CtBP1 in adult hippocampal neurogenesis in vivo, I quantified newly born neuronal progenitors and differentiated neurons in coronal brain sections of DG of 8 weeks old CtBP1 KO mice and compared with their WT and HET littermates. An altered number of neural stem cells (NSCs) was not observed, neither of total number, nor of NSCs having a process or activated NSCs. CtBP1 KO leads to increased number of proliferating cells, however, the utilized marker Mcm2 is not neuron-specific and thus, this phenotype may also be due to an upregulated number of dividing glia cells. Indeed, I found immunoreactivity for CtBP1 in microglia and astroglia within DG in C57BL/6 mouse brain sections. Moreover, CtBP1 KO results in increased number of intermediate progenitor cells (IPCs) but decreased amount of following immature neurons indicating an impaired transition of IPCs to immature neurons in DG as a consequence of a CtBP1 deletion. The potential explanation of an increased apoptotic rate due to CtBP1 KO was rejected, since immunohistochemical staining with an apoptotic marker could not detect altered numbers of apoptotic cells between the genotypes. In order to assess the influence of CtBP1 on proliferation, I isolated NSPCs from neurogenic niches of 7 - 9 weeks old CtBP1 WT, HET and KO mice and cultured them in suspension culture to obtain proliferative neurospheres. NSPCs derived from CtBP1 KO mice generated significantly smaller neurospheres compared to WT and HET cultures suggesting a crucial role of CtBP1 in proliferation. This phenotype together with the observation that CtBP1 KO derived neurospheres were not able to proliferate again after being dissociated, brought us to the hypothesis that CtBP1 may alter cell fate decision. Indeed, immunocytochemical staining of neurospheres revealed an increased maturation of neurons and astrocytes in CtBP1 KO neurospheres but a lack of mature oligodendrocytes. To sum up, results of this work could show that CtBP1 is required for proper proliferation as well as differentiation and cell fate decision of neurons and glia cells during adult neurogenesis. CtBP1-mediated transcriptional repression of its target genes influences the processes and decisions of adult neurogenesis potentially through the neurodevelopment-linked Wnt signalling pathway.
description: Das C-terminale Bindeprotein 1 (CtBP1) ist ein nuklearer transkriptionaler Co-Repressor. Als eine Komponente des Chromatin-modifizierenden Komplexes agiert es in Neuronen aktivitätsabhängig, um die neuronale Plastizität zu regulieren. Bei niedriger Aktivität ist CtBP1 im Nukleus lokalisiert, wo es die Transkription von aktivitätsabhängigen Genen co-reprimiert, indem es an DNA-bindende Repressoren bindet und Chromatin-modifizierende Enzyme (z.B. Histon-Deacetylasen; HDACs) rekrutiert. Dieser Repressor-Komplex wird aufgelöst, wenn sich CtBP1 in Richtung der Präsynapse als Antwort auf erhöhte neuronale Aktivität bewegt. Deswegen verbindet CtBP1 das genetische Umprogrammieren und die synaptische Aktivität dynamisch (Ivanova et al., 2015). Interessanterweise hat CtBP1 nicht nur eine Funktion bei der Plastizität von reifen Neuronen, sondern spielt wohl auch eine Rolle in verschiedenen Aspekten der Neuroentwicklung (Beck et al., 2016; Dias et al., 2014; Rocca et al., 2017). Ein wichtiger Prozess in der Neuroentwicklung ist die Generierung von Neuronen im Erwachsenenalters. Dieser Prozess, der auch adulte Neurogenese genannt wird, repräsentiert ein bekanntes Beispiel, wie die lebenslange Aktivität von neuroentwicklungsbezogenen Prozessen zur Plastizität des Netzwerks des Gehirns beiträgt. Während der adulten Neurogenese generieren Stammzellen innerhalb der neurogenen Nischen im Gehirn (subgranuläre Zone im Gyrus Dentatus des Hippokampus und subventrikulären Zone der lateralen Ventrikelwand) kontinuierlich granuläre Neurone, die funktional in die bestehenden synaptischen Kreise integriert werden (Lledo et al., 2006). Allerdings wurde der Einfluss, ob und wie CtBP1 die adulte Neurogenese reguliert, noch nicht untersucht. Deswegen war das Hauptziel dieser Arbeit, die Beteiligung von CtBP1 an den Prozessen der adulten Neurogenese in beiden neurogenen Nischen im Gehirn aufzudecken. Zuerst habe ich das Zuchtverhalten der CtBP1 Mauslinie charakterisiert. Ich beobachtete, dass sowohl männliche als auch weibliche CtBP1 Knockout (KO) Mäuse weniger wiegen als deren Wildtyp- (WT) und heterozygoten (HET) Wurfgeschwister. Außerdem deckte ich eine erhöhte frühe postnatale Sterblichkeit der CtBP1 KO Mäuse auf. Dies ist ausgezeichnet durch eine niedrigere Anzahl an KO-Tieren als erwartet und eine erniedrigte Überlebensrate zwischen der Geburt und dem Absetzen innerhalb der CtBP1 Würfe verglichen mit C57BL/6 Würfen. Anschließend habe ich die Expression von CtBP1 in allen Stadien der adulten subgranulären und subventrikulären Neurogenese mithilfe von immunohistochemischen Färbungen für CtBP1 und Markern für Neurogenese in koronalen Hirnschnitten von jungen erwachsenen C57BL/6 Mäusen bestätigt. Außerdem haben quantitative Western Blots von zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen eines in vitro Modells der adulten Neurogenese unter Einsatz von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs für neural stem/progenitor cells) aufgedeckt, dass CtBP1 im Nukleus relativ gesehen am meisten angereichert ist, mit einem Einbruch, wenn die Proliferation abgeschlossen ist. Das deutet an, dass es wichtig ist, dass die CtBP1-vermittelte Genexpression von potentiellen proliferationsregulierenden Genen für den Abschluss der Proliferation aufgehoben wird. Darüber hinaus ändert CtBP1 seine absolute subzelluläre Verteilung von zytoplasmatischer zu nukleus-assoziierter Lokalisation nach der Proliferation und vor der Differenzierung, was zum Schluss führt, dass CtBP1 auch an der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen beteiligt ist. Um die Rolle von CtBP1 in der adulten hippokampalen Neurogenese in vivo aufzudecken, habe ich neugeborene neuronale Vorläuferzellen und differenzierte Neuronen in koronalen Hirnschnitten vom Gyrus Dentatus von acht Wochen alten CtBP1 KO Mäusen quantifiziert und mit deren WT und HET Wurfgeschwistern verglichen. Eine veränderte Anzahl von neuralen Stammzellen (NSCs) wurde nicht beobachtet, weder von den gesamten, noch denen mit einem Prozess oder den aktivierten NSCs. CtBP1 KO führt zu einer erhöhten Zahl von proliferierenden Zellen, allerdings ist der verwendete Marker Mcm2 nicht Neuronen-spezifisch und deswegen könnte der Phänotyp auch auf eine hochregulierte Zahl von sich teilenden Gliazellen zurückzuführen sein. Tatsächlich fand ich Immunoreaktivität für CtBP1 in Mikroglia und Astroglia innerhalb des Gyrus Dentatus in Hirnschnitten von C57BL/6 Mäusen. Außerdem führt ein CtBP1 KO zu einer erhöhten Anzahl von intermediären Vorläuferzellen (IPCs für intermediate progenitor cells), aber zu einer erniedrigten Menge an folgenden unreifen Neuronen, was einen beeinträchtigten Übergang zwischen IPCs und unreifen Neuronen im Gyrus Dentatus als Konsequenz einer CtBP1-Deletion aufzeigt. Die mögliche Erklärung einer erhöhten apoptotischen Rate aufgrund des CtBP1 KOs wurde verworfen, da immunohistochemische Färbungen mit einem apoptotischen Marker keine veränderte Anzahl an apoptotischen Zellen zwischen den Genotypen feststellen konnten. Um den Einfluss von CtBP1 auf die Proliferation zu beurteilen, habe ich NSPCs aus den neurogenen Nischen von sieben bis neun Wochen alten CtBP1 WT, HET und KO Mäusen isoliert und in einer Suspensionskultur kultiviert, um proliferative Neurosphären zu erhalten. NSPCs von CtBP1 KO-Mäusen formten signifikant kleinere Neurosphären verglichen mit den Wildtyp- und heterozygoten Kulturen, was eine wesentliche Rolle von CtBP1 in der Proliferation andeutet. Dieser Phänotyp zusammen mit der Beobachtung, dass CtBP1 KO-abstammende Neurosphären nicht fähig waren zu proliferieren, nachdem sie dissoziiert wurden, brachte uns zu der Hypothese, dass CtBP1 die Entscheidung über das Zellschicksal ändern könnte. In der Tat ergaben immunozytochemische Färbungen von Neurosphären eine erhöhte Reifung von Neuronen und Astrozyten in CtBP1 KO Neurosphären, aber ein Fehlen von reifen Oligodendrozyten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass CtBP1 sowohl für eine ordnungsgemäße Proliferation als auch für die Differenzierung und die Entscheidung über das Zellschicksal von Neuronen und Gliazellen während der adulten Neurogenese gebraucht wird. Die CtBP1-vermittelte transkriptionale Repression seiner Zielgene beeinflusst die Prozesse und Entscheidungen der adulten Neurogenese möglicherweise durch den neuroentwicklungsbezogenen Wnt-Signalweg.