title: Untersuchungen zum intrazellulären Transportmechanismus von Marburgvirus Nukleokapsiden
title: Investigations on the intracellular transport mechanism of Marbugvius nucleocapsids
Creators: name: Schudt, Gordian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: VP40, VP30
Aktin
Medizin, Gesundheit
virology
actin
Mikroskopie
Virologie, Lebendzellmikroskopie
cytosceleton
Life-cell microscopy
GFP
Marburgvirus

description: Marburgvirus together with
      Ebolavirus constitute the family of Filoviridae. Both viruses
      possess a non-segmented single strand RNA genome in negative
      orientation and therefore belong to the order
      Mononegavirales. Marburgvirus causes severe hemorrhagic fever
      with high case fatality rates in humans and non-human
      primates. Seven genes are encoded by the viral ge-nome, five
      of the gene products, the nucleoprotein NP, the viral
      proteins VP24, VP30 and VP35 together with the polymerase L
      form the nucleocapsid. The nucleocapsid is surrounded by the
      matrix protein VP40 which connects the nucleocapsid with the
      lipid bilayer in which the glyco-protein GP is inserted.
      Viral replication takes place in the cytoplasm. This doctoral
      thesis inves-tigated the intracellular transport of
      nucleocapsids. Analyses were based on molecular biologi-cal
      and imaging techniques, mainly live-cell imaging, accompanied
      by confocal microscopy and scanning electron microscopy. To
      generate a fluorescently labeled Marburgvirus, a reverse
      genetic system was used to integrate an additional open
      reading frame into the viral genome, coding for a red
      fluorescently labeled VP40 (RFP-VP40). The constructed genome
      was used to rescue a recombinant Marburg virus
      (rMARVRFP-VP40) which expressed the fluorescent VP40.
      Expressing a green fluorescent VP30 (VP30GFP) in cells
      infected with rMARVRFP-VP40 both, the nucleocapsid and the
      matrix protein could be visualized in order to study their
      transport and interaction. By dual-color imaging,
      virally-induced inclusions were identified as the origin of
      new nucleocapsids that were transported to the plasma
      membrane. Although VP40 was re-cruited into inclusions, no
      detectable amount of VP40 was detected in freshly released
      nucle-ocapsids. Once released into the cytoplasm,
      nucleocapsids were transported in a seemingly random
      actin-based long-distance transport at speeds between 200 and
      500 nm/s. Microtu-bules were not essential for the
      intracellular movement of Marburg virus nucleocapsids. Once
      nucleocapsids reached the cell periphery, movement slows down
      to ± 100 nm/s. At the plasma membrane, nucleocapsid became
      associated with the matrix protein which was a prerequisite
      for the subsequent exit process. Interaction of the matrix
      protein with the nucleocapsids is supported by Tyrosine
      phosphorylation of VP40 and also enables the recruitment of
      nucle-ocapsids into filopodia. Inside filopodia nucleocapsids
      were cotransported with an actin-based motor protein, Myosin
      10.
description: Das Marburgvirus bildet zusammen
      mit dem Ebolavirus die Familie der Filoviridae. Beide Viren
      lösen beim Menschen und bei nicht-menschlichen Primaten ein
      starkes hämorrhagisches Fie-ber mit hoher Sterblichkeitsrate
      aus. Die Viren besitzen ein einzelsträngiges,
      nicht-segmentiertes RNA-Genom in negativer Orientierung und
      gehören somit in die Ordnung der Mononegavirales. Die RNA
      codiert für sieben virale Strukturproteine, von denen fünf
      das Ge-nom enkapsidieren: das Nukleoprotein NP, die viralen
      Proteine VP24, VP30 und VP35 sowie die Polymerase L. VP40
      umgibt als Matrixprotein den als Nukleokapsid bezeichneten
      Komplex. In die Lipidhülle, die das längliche Virus umgibt,
      ist das Glykoprotein GP inseriert. Diese Arbeit beschäftigt
      sich mit dem intrazellulären Transport von Nukleokapsiden in
      der Marburgvirus-infizierten Zelle. In erster Linie wurde
      hierfür die Methode der Lebendzellmikroskopie ver-wendet, die
      von konfokaler Mikroskopie und Scanning Elektronenmikroskopie
      ergänzt wurde. Durch ein reverses Marburgvirus-spezifisches
      Genetiksystem wurde ein zusätzlicher Leserah-men für ein rot
      markiertes VP40 in das virale Genom integriert und ein
      rekombinantes Virus hergestellt (rMARVRFP-VP40). In
      Kombination mit der Plasmid-gestützten Expression von grün
      fluoreszierenden VP30 (VP30GFP) konnte in
      rMARVRFP-VP40-infizierten Zellen, neben dem Mat-rixprotein
      auch das Nukleokapsid sichtbar gemacht werden. Die
      Zweifarbmarkierung erlaubte es, sogenannte Inclusions als den
      Ursprungsort von neu gebildeten Nukleokapsiden zu
      identi-fizieren. Obwohl VP40 in Inclusions vorliegt, tragen
      neugebildete Nukleokapside nach Freiset-zung aus den
      Einschlusskörpern keine detektierbare Menge des
      Matrixproteins. Nukleokapsi-de werden in einem scheinbar
      zufällig ablaufenden, aktinbasierten Langstreckentransport
      mit Geschwindigkeiten zwischen 200 und 500 nm/s entlang von
      Aktinfilamenten transportiert. Nach einem mehrere Mikrometer
      langen Transportweg verlangsamen Nukleokapside ihre Bewegung
      auf ca. 100 nm/s und an der Plasmamembran treffen
      Matrixprotein und Nukleoka-pside aufeinander. Es kommt zur
      dynamischen Assoziation mit dem Matrixprotein, die von der
      Phosphorylierung des Matrixproteins an Tyrosinresten abhängig
      ist. Die Assoziation der Nuk-leokapside mit dem Matrixprotein
      ist erforderlich für den Austrittsprozess der Viren.
      Mar-burgviren nutzen längliche Zellausläufer (Filopodien), um
      die Zelle zu verlassen. Die Nukleo-kapside werden in den
      Filopodien gemeinsam mit Myosin 10 entlang von Aktinbündeln
      transportiert.