title: Characterization of the essential iron-sulfur-cluster biosynthesis components of the Bacillus subtilis Suf-system
title: Charakterisierung der essentiellen Eisen-Schwefel-Cluster Biosynthesekomponenten des Suf-Systems in Bacillus subtilis
Creators: name: Albrecht, Alexander Gerhard
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Heubacillus
Eisen-Schwefel-Proteide
Cysteindesulfurase
Biosynthese
Chemie
Iron-sulfur-cluster biosyntheses
Frataxin
Kinetik
Eisen-Schwefel-Cluster Biosynthese
Bacillus subtilis
Biochemie

description: Iron-Sulfur-Clusters are some of
      the most important and versatile cofactors in nature. Many
      essential metabolic pathways, like the respiratory chain or
      the citrate cycle are directly dependent on
      iron-sulfur-cluster containing enzymes. However the toxicity
      of free iron and sulfide required the development of
      biosynthetic pathways that minimize the concentrations of
      free iron or sulfide. This led to the development of
      evolutionary highly conserved biosynthetic machineries for
      the construction of iron sulfur-clusters that build upon
      three essential core components: A scaffold-protein on which
      the cluster is assembled, a cysteine desulfurase, which
      catalyzes sulfur mobilization and an iron donating protein,
      most likely a frataxin homolog. In this study the core
      components of the Bacillus subtilis iron sulfur-cluster
      biosynthesis system weres characterized. After the
      identification of the putative biosynthesis system via BLAST
      analysis, the function of the SufU scaffold protein was
      identified using deletion mutants. SufU was then further
      characterized by in vitro studies. We could show that reduced
      expression of SufU led to a severe growth phenotype of
      Bacillus subtilis and a reduced activity of iron sulfur
      proteins. Further it could be shown that recombinant SufU was
      able to bind an Fe/S-cluster and transfer this cluster to
      apo-Fe/S-proteins. In addition to the scaffold protein the
      second core component of the biosynthesis system was
      characterized: the cysteindesulfurase SufS. It could be shown
      that purified SufS is inactive and needs to be activated by
      apo-SufU. The activity is dependent on both the cysteine and
      SufU concentration and the reaction follows a
      ping-pong-reaction mechanism as shown by kinetic studies.
      Furthermore it was found that cysteine 41 of SufU plays an
      important role in the sulfur transfer mechanism between SufS
      and SufU. In the last part of this work the putative
      iron-binding protein Fra (YdhG) was characterized, which is a
      structural homolog of human frataxin. The deletion of the
      gene encoding Fra in B. subtilis led to a severe growth
      Phenotype and reduced activity of iron sulfur proteins,
      indicating a greater disturbance of the iron homeostasis. In
      vitro studies showed that Fra was able to bind iron and acts
      as an iron donating protein during iron sulfur cluster
      assembly on SufU.
description: Eisen-Schwefel-Cluster gehören zu
      den wichtigsten und vielseitigsten Cofaktoren in der Natur.
      Viele essentielle Stoffwechselwege, wie der Citratzyklus oder
      die Atmungskette sind direkt abhängig von
      Eisen-Schwefel-Enzymen. Durch die Toxizität von freiem Eisen
      und Sulfid sind die Organismen auf eine streng regulierte
      Biosynthese der Fe/S-Cluster angewiesen. Hierfür haben sich
      verschiedene Maschinerien entwickelt, die in allen Fällen auf
      drei essentiellen Kernkomponenten aufbauen: Einem
      Scaffoldprotein, auf dem der Cluster assembliert wird, eine
      Cysteindesulfurase zur Mobilisierung von Schwefel aus Cystein
      und ein Eisendonor, vermutlich ein Homologes von Frataxin. In
      dieser Arbeit wurden die Kernkomponenten des
      Eisen-Schwefel-Cluster-Biosynthese-systems von Bacillus
      subtilis untersucht. Nach der Identifizierung des
      potentiellen SufCDSUB-Systems durch BLAST-Analyse, wurde
      durch in vivo Untersuchungen an Deletionsmutanten zunächst
      das putative Scaffoldprotein SufU identifiziert. Es konnte
      gezeigt werden, dass eine verringerte Expression von SufU
      drastische Auswirkungen auf das Wachstum sowie eine
      reduzierte Aktivität von Eisen-Schwefel-Proteinen in Bacillus
      subtilis zur Folge hat. Weiterhin konnte in vitro gezeigt
      werden, dass SufU in der Lage ist, einen Fe/S-Cluster zu
      binden und diesen auf apo-Fe/S-Proteine zu transferieren.
      Neben dem Scaffoldprotein wurde die zweite Kernkomponente der
      Fe/S-Cluster Biosynthese charakterisiert: die
      Cysteindesulfurase SufS. Hier konnte gezeigt werden, dass
      SufS nur sehr geringe Aktivität aufweist und erst durch das
      Scaffoldprotein SufU aktiviert wird. Die Aktivierung von SufS
      ist dabei sowohl von der Cystein- als auch von der
      SufU-Konzentration abhängig. Durch weitere kinetische
      Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Sulfidtransfer
      zwischen SufS und SufU einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus
      folgt und Cystein 41 in SufU für den Mechanismus des
      Sulfidtransfers eine entscheidende Rolle spielt. Abschließend
      wurde Fra (YdhG) charakterisiert; ein Protein, das
      stukturhomolog zu humanem Frataxin ist. Eine
      Fra-Deletionsmutante zeigte einen Phänotyp, der auf eine
      deutliche Störung des gesamten Eisenhaushalts hindeutet. In
      vitro konnte gezeigt werden, dass Fra in der Lage ist Eisen
      zu binden und als Eisendonor für den Fe/S-Cluster Aufbau von
      SufU zu wirken.