title: Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie
title: Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie
title: Characterization of DNA replication in genetically modified Escherichia coli strains by new methods of synthetic biology
Creators: name: Milbredt, Sarah
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Replikation , Synthetische Biologie
synthetic microbiology,
Escherichia coli
Escherichia coli, DNA replication
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Eukaryoten und Prokaryoten
      unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome.
      Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom,
      welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das
      eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare
      Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung
      enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation
      der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende
      Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für
      die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet
      werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia
      coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und
      Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es
      wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und
      etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“
      aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie
      folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen
      zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der
      aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer
      zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem
      Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae.
      Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz,
      die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die
      DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als
      extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die
      DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird
      aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem
      gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen
      Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung
      von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in
      Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding
      Randomized Sequence Generator) geschrieben und das
      MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist
      es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität
      aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen.
      Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz
      zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu
      vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter
      DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG
      und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und
      der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und
      schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue
      Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal
      konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System)
      stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular
      Fluorescence complementation and Repressor Operator System)
      basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten
      Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden,
      wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu
      einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich
      zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte
      Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die
      an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob
      BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt
      werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt.
      Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte
      Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen
      werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional
      zunehmen sollte.
description: Eukaryotes and prokaryotes differ
      in the organization of their genomes. Most prokaryotes
      contain a single, circular chromosome that is replicated by
      one single replication origin. Contrary, eukaryotes possess
      multiple, linear chromosomes, which are replicated by more
      than one replication origin. Whether, and to what extent,
      Escherichia coli tolerates an eukaryotic genome organization
      is an exciting question whose answer could help to develope
      construction rules for synthetic chromosomes. This thesis
      presents DNA replication studies of E. coli strains with
      multiple-origins on the chromosome and an E. coli strain with
      two linear chromosomes. Additionally, a fluorescence-based
      single-cell method has been designed and established, which
      has an improved "signal to background ratio". The main
      results can be summarized as follows: I. E. coli tolerates
      additional replication origins on the native chromosome,
      which are able to initiate DNA replication. DNA replication
      activity of extra copies of oriC or oriII, the replication
      origin of the second chromosome of V. cholerae, could be
      verified. A shortened sequence of oriC, which does not
      contain DnaA box R4, is not sufficient to initiate DNA
      replication on the native chromosome. If oriII is used as
      additional replication origin, DNA replication shows
      dysregulated patterns, which are abolished if oriC and oriII
      locate on two different replicons within the cell. II. For
      design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal
      integration into bacteria the program MARSeG (Motif Avoiding
      Randomized Sequence Generator) was written and the modular
      cloning system MoClo was modified. MARSeG allows the design
      of sequences with a high variability and the simultaneous
      exclusion of certain motifs. MoClo has been optimized to
      increase cloning efficiency, to simplify assembly operations
      in library scale and to facilitate genomic integration of
      assembled DNA fragments. MARSeG and the modified MoClo vector
      were used to design and construct a LacO/TetO hybrid FROS
      array. III. A low background FROS (Fluorescence Repressor
      Operator System) was designed and established. The new method
      BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and
      Repressor Operator System) is based on fusions of repressor
      proteins with a split fluorescent protein, which bind to a
      hybrid FROS array resulting in fluorescence signals due to
      bimolecular fluorescence complementation. Background
      fluorescence is reduced, because only proteins that are bound
      to the hybrid FROS array fluoresce. In order to analyze
      whether BiFCROS could be used for copy number determination
      of gene loci, it was further developed in this direction.
      Thus, total cell fluorescence intensity should reveal the
      copy number of the hybrid FROS array, because it should
      increase proportionally with increasing copy number.