title: Analysis of Arabidopsis thaliana N-degron pathways with tandem fluorescent protein timer constructs
Creators: name: Böhm, Jessica
Publisher: name: :none
Year: 2023

description: Pflanzen als sessile Organismen sind auf den schnellen und präzisen Abbau von Proteinen als Reaktion auf Stress oder Umweltveränderungen angewiesen. Ein Weg, die Protein Abundanz zu regulieren, ist der „N-degron pathway“, der die N-terminale Aminosäure eines Proteins mit seiner Halbwertszeit verknüpft. Um den Abbau von Substraten durch die pflanzliche E3 Ligase von Interesse zu analysieren, wurden „tandem fluorescent timer protein“ Konstrukte mit unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren zusammen mit der Ligase in Hefezellen exprimiert, deren endogener N-degron pathway stillgelegt wurde. Diese Arbeit zeigt, dass neben Typ I auch Typ II N-degron Konstrukte Substrate für PRT6 sind und sie sich eine Interaktionsdomäne teilen. Zusätzlich wurden potenzielle Mutationen zur Unterbrechung der Bindung hydrophober N-degrons identifiziert. Außerdem wurde gezeigt, dass das potenzielle N-recognin BIG tatsächlich zum Abbau von Substraten führt, wenn es in Kombination mit UPL2 und UBC2 exprimiert wird. Die Mutation von UPL2s C3625 zu Alanin führte zur Stabilisierung der Substrate und der Annahme, dass das Protein eine katalytische Funktion in dem System hat. Um den Gebrauch von Translationsinhibitoren für weitere Experimente in Hefe zu ermöglichen, wurde ein UBR1 defizienter Stamm ohne die vormals eingefügte KanMX Kassette entwickelt. Darüber hinaus wurden diverse N-degron Substrate in A. thaliana Pflanzen transformiert und mittels Western Blot Linien mit einfacher Insertion identifiziert, die das Konstrukt exprimieren. Diese Pflanzen können für mikroskopische Analysen verwendet werden, um die subzelluläre Lokalisation und Unterschiede im Abbauverhalten abhängig von Umwelteinflüssen, Entwicklungsstadien oder Behandlung mit diversen Substanzen zu ermitteln.
description: Plants as sessile organisms rely on rapid and precise protein degradation in response to stress and environmental changes. One way of regulating protein abundance is the N-degron pathway, which links the N-terminal amino acid of a protein to its half-life. To analyze the degradation of substrates by the plant E3 ligase of interest from this pathway, tandem fluorescent protein timer constructs with different N-terminal amino acids were co-expressed in yeast with defect in its endogenous N-degron pathway. This work shows, that besides type I also type II N-degron constructs are substrates for PRT6 and that they share one interaction domain. Additionally, potential mutations to interrupt binding of hydrophobic N-degrons were identified. Furthermore, it was shown that the potential N-recognin BIG indeed leads to degradation of substrates, when expressed in combination with UPL2 and UBC2. The mutation of UPL2´s cysteine (3625) to alanine led to a stabilization of the substrates and the assumption that the protein has a catalytic function in the system. To enable the use of translation inhibitors for further experiments in yeast, a UBR1 deficient strain lacking the previously introduced KanMX cassette was developed. On top of this, various N-degron substrates were transformed into A. thaliana plants and lines with single insertions, expressing the constructs were identified via Western blots. These plants can be used for microscopy approaches to determine subcellular localization and changes in degradation behavior depending on environmental influences, developmental stages, or treatment with diverse substances.