title: Evaluation of Novel Particle Detection Methods and their Application to Characterize the Process of Protein Aggregation
Creators: name: Groß-Rother, Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: particle detection
Proteinaggregation
protein aggregation
Partikeldetektion
no entry
keine Angabe

description: The biopharmaceutical sector is one of most promising and profitable sectors in medical treatment of a multitude of severe diseases. Biological molecules, however, lead to new challenges for the manufacturing companies. This thesis focused on one of the main challenges for therapeutic proteins: protein aggregation and the detection of the resulting particles. Within this thesis, three main tasks have been addressed: (1) the evaluation of emerging particle detection and characterization techniques, (2) the evaluation of novel technologies for aggregation and unfolding process characterization and (3) the investigation of the aggregation process of current therapeutic proteins (mABs). For the evaluation of particle detection and characterization techniques for the application on protein samples, the following three techniques have been selected: Nanoparticle tracking analysis (NTA), Tunable resistive pulse (TRPS) and STEP-technology® (space and time-resolved extinction profiles) applied in the LUMiSizer®. All techniques rely on different measurement principles and can be claimed as orthogonal methods. These techniques have been shown to be applicable for polystyrene particle suspensions and showed high agreement for the size and/ or concentration determinations of these particles. In the first step, all techniques have been evaluated in two comparative studies analyzing protein BSA standard particle suspensions and monoclonal antibody suspensions. In a second step, a more detailed evaluation of the NTA and the STEP-technology® was performed for monoclonal antibody samples. For the evaluation of novel technologies for the investigation and characterization of protein unfolding and aggregation processes, the following two techniques have been selected: Zetasizer Helix system and the SwitchSENSE®. The Zetasizer Helix system is an instrument combining dynamic light scattering and Raman spectroscopy. The three measurement modes (sample series, isothermal incubation, temperature ramp) have been successfully evaluated for selected therapeutic mABs. The outcome indicated differences in the aggregation mechanism. The same applies to the thermal ramp experiments. In addition, the obtained melting temperatures and aggregation onset fit to the results of orthogonal methods (DSC, ITF, SwitchSENSE). In conclusion, the Zetasizer Helix is an instrument that is not applicable in a high throughput manner, but it gives valuable information for better understanding the correlation between structural changes and aggregation behavior. The SwitchSENSE® technology is a chip-based analytical platform using a specific DNA-based biosurface system to investigate molecular interactions, such as binding kinetics and affinities or enzymatic activities. Out of the various applications of the SwitchSENSE technology, the following applications were evaluated for therapeutic proteins: protein sizing, protein interaction and thermal melting approaches. The most promising approach was the usage of the SwitchSENSE system as orthogonal method for the characterization of the thermal melting behavior. The combination of sizing step and thermal melting step gave information about the refolding potential. Comparative investigations with DSC and ITF showed good coincidence of unfolding start and melting temperature determinations. The system development and application identification is ongoing and continuous updates are necessary for further potential approaches. For the protein aggregation case studies, three monoclonal antibodies (mAB1, mAB2 and mAB3) have been selected. Following these model systems have been investigated considering their biophysical characterization, stability and aggregation behaviour using established and novel techniques and technologies. For the aggregation studies three approaches have been addressed, temperature ramp experiments, isothermal experiments and further protein stress factors, such as extreme temperature, mechanical stirring, extreme acidic pH, reducing stress. In summary, the results of these case studies describe the stability and aggregation processes of the three monoclonal antibodies. Depending on different stress factors (temperature, pH, reducing conditions, etc.) and different approaches (temperature ramp, isothermal incubation and extreme conditions), molecule specific aggregation mechanisms were postulated. The application of the evaluated technologies in the case studies outline their suitability for practical stability studies.
description: Der Einsatz von Biopharmazeutika ist ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten. Diese biologischen Moleküle, bspw. therapeutische Antikörper, führen allerdings zu neuen Herausforderungen, denen sich die Pharmaindustrie stellen muss. Eine Herausforderung von therapeutischen Proteinen sind bspw. Aggregationsprozesse und folglich die Detektion der resultierenden Proteinpartikel mit geeigneten Methoden. Die Ziele dieser Arbeit waren daher die Evaluierung neuaufkommender Techniken für die Partikeldetektion und - charakterisierung, die Evaluierung neuer Technologien zur Untersuchung von Proteinentfaltungs- und Aggregationsprozessen und die Untersuchung des Aggregationsverhalten von drei therapeutischen Modellproteinen (monoklonale Antikörper). Für die Evaluierung neuaufkommender Techniken für die Partikeldetektion wurden drei Technologien untersucht: Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Tunable Resistive Pulse Sensing angewendet in dem Gerät qNano (TRPS) und die STEP-technology® angewendet in dem Gerät LUMiSizer®. Die initiale Vergleichbarkeit der Technologien und der Analyseergebnisse wurde zunächst gezeigt mit Hilfe von Latexpartikel Standard Suspensionen. Die anschließende Analyse von drei BSA (bovine serum albumin) Proteinpartikel Standard Suspensionen (mit nominalen Partikelgröße BSA1~150 nm; BSA2~500 nm und BSA3~750 nm) zeigte, vor allem für die heterogeneren Suspensionen BSA2 und BSA3 mit höherer Polydispersität, schon erste Herausforderungen für die Techniken. Während der TRPS-Analyse (Coulter Counter Prinzip) traten die Blockade der Pore sowie eine Proteinschicht auf der Membran auf. Diese Probleme wurden während der Analyse von gestressten therapeutischen Antikörperproben bestätigt und das TRPS-Gerät wurde für die Anwendung für Proteinproben als ungeeignet bewertet. Für NTA und den LUMiSizer® konnte in einer detaillierten Evaluierung hingegen die Anwendbarkeit demonstriert werden. Das NTA, eine Lichtstreu-basierte Methode, bietet dabei eine quantitative Methode zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung im nanometer-Größenbereich (150 nm bis ca. 1000 nm). Die Herausforderung bildet dabei die Einstellung geeigneter Messparameter (z.B. Detection Threshold). Der LUMiSizer®, eine Photozentrifuge, ist hingegen nicht für Konzentrationsbestimmungen geeignet, ermöglicht allerdings eine non-destruktive Analyse der Partikelgrößenverteilung über den nanometer und mikrometer Größenbereich. Die Herausforderung der Methode ist eine ausreichende Trübung der Probe, um die Partikelbewegung detektieren zu können. Zur Untersuchung von Proteinentfaltungs- und Aggregationsprozessen wurden zwei Technologien evaluiert: der Zetasizer Helix, eine Kombination aus Dynamischer Lichtstreuung und Raman Spektroskopie und die SwitchSENSE Technologie, eine chip-basierter Biosensorplattform. Der Zetasizer Helix ermöglicht die simultane Untersuchung von Partikelbildung (kolloidaler Stabilität) und Proteinstrukturänderungen (konformative Stabilität). Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass dieser Ansatz für Proteinaggregationsstudien gut geeignet ist. Die SwitchSENSE Technologie bietet ein breites Einsatzgebiet. In dieser Arbeit konnte eine orthogonale Methode für die Untersuchung des Entfaltungsprozesses von mABs evaluiert werden. Für weitere Anwendungen zur Untersuchung von Proteinaggregation konnten keine neuen Vorteile durch die Verwendung der SwitchSENSE Technologie aufgezeigt werden. Im dritten Abschnitt der Arbeit wurden Aggregationsprozesse der Modellantikörper mAB1, mAB2 und mAB3 untersucht. Die Proteinsuspensionen wurden zunächst biophysikalisch untersucht, um die kolliodale und konformative Stabilität zu beschreiben. Während mAB1 und mAB2 vergleichbar stabil waren, zeigte mAB3 eine signifikant geringere Stabilität. Anschließend wurden die Aggregationsprozesse unter verschiedenen Stresskonditionen (u.a. Temperaturrampen, isothermer Stress oder extrem saurer pH-Wert) untersucht. Der Aggregationsprozess von mAB1 ist gekennzeichnet durch einen langsamen Verlauf, als rate-limiting Schritt kann der Entfaltungsschritt angenommen werden und der gesamte Prozess scheint entfaltungsgetrieben. Der Aggregationsprozess von mAB2 ist gekennzeichnet durch einen schnellen Verlauf, als rate-limiting Schritt kann die Formation eines irreversiblen Nukleus (Nukleationskontrolliert) angenommen werden und der Einfluss der Entfaltung scheint nach dem Aggregationsstart reduziert. Der Aggregationsprozess von mAB3 scheint hingegen gekennzeichnet durch Selbstassoziation der Monomere, einen schnellen Verlauf und als rate-limiting Schritt kann die Monomeraddition angenommen werden. Zusammenfassend konnten fünf neue Technologien evaluiert und in Aggregationsstudien implementiert werden, um die Aggregationsprozesse/-charakteristika von drei Modellantikörpern zu beschreiben. Die Beschreibung und das Verständnis von Aggregationsprozessen unterstützen die Entwicklung einer stabilen Formulierung von therapeutischen Proteinen und bildet daher einen wertvollen Beitrag für die Entwicklung solcher Biopharmazeutika.