Untersuchungen zur optimalen Kultivierung von Leishmania tarentolae
Creators: name: Fritsche, Claudia Lieselotte Ella
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2008
Subjects: subject: Biotechnologie
subject: Leishmania
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 660.62
subject: 571.6382942

description: Die Arbeit beschäftigt sich mit der Identifizierung wichtiger Prozessparameter für eine optimale Kultivierung von Leishmania tarentolae, um eine biotechnologische Nutzung des Expressionssystems vorzubereiten. Das entwickelte YE-Medium enthält nur noch Hemin als Substanz tierischen Ursprungs und konnte erfolgreich für Wachstumsexperimente, auch unter limitierenden Glukose- oder Heminbedingungen (Chemostaten), eingesetzt werden. Mit den ermittelten Halbsättigungskonstanten des Monod-Modells für Glukose und Hemin, den maximalen spezifischen Wachstums- und Zellteilungsraten sowie den Ertragskoeffizienten für Glukose und Hemin ist die Basis für alle weiteren Fermentationsprozessentwürfe und -optimierungen gelegt. Durch die Nährmedien und die entwickelten Prozessstrategien können hohe Zelldichten (1,8x109 Zellen/ml; 14,5 g/l TBM) in Verbindung mit Verdopplungszeiten von 5 - 7 h erzielt werden. Die vorliegenden Untersuchungen belegen eine grundsätzliche Gültigkeit des Monod-Modells für das Wachstum von L. tarentolae, ausgenommen bei einer Glukoseinhibition. Weiterhin wurde deutlich, dass der Substrateinfluss größer als der Temperatur- oder pH-Einfluss ist. Dieses eröffnet gute Steuermöglichkeiten für die spezifische Wachstums- beziehungsweise Zellteilungsrate. Zudem bieten die morphologischen Änderungen der Zellen eine zusätzliche Charakterisierungsmöglichkeit des Wachstums. Definierte Medien mit Lösungsvermittlern für Hemin konnten entwickelt und durch Zugabe von Hefe-RNA nahezu eine Zelldichteverdopplung erzielt werden (Nmax = 2,8 - 3,3x108 Zellen/ml). Die am Wildtyporganismus gewonnenen Erkenntnisse wurden auf die Expression dreier Modellproteine übertragen. Besonders in der Expression des Glykoproteins Hyaluronidase-1 zeigte sich das große Potenzial dieses neuen Systems. Im Nährmedienüberstand wurde eine 8mal höhere spezifische Aktivität gemessen, als sie Hofinger et al. (2007) für Insektenzellen berichteten. Mit den Erkenntnissen dieser Arbeit sind die Voraussetzungen geschaffen, Promastigoten von L. tarentolae für die Produktion von rekombinanten Proteinen zur diagnostischen und therapeutischen Anwendung am Menschen einzusetzen. Durch die Möglichkeit der N-Glykosilierung von humanen Proteinen kann L. tarentolae als alternatives Expressionssystem zu Zellkulturen eingesetzt werden.
description: The thesis focuses on the identification of important process parameters for an optimal cultivation of Leishmania tarentolae to prepare the biotechnological use of this expression system. The developed YE-medium, containing only hemin as substance of animal origin, could be used successfully for growth experiments, also under limiting glucose or hemin concentrations (chemostate). With the determined constants of the Monod model for glucose and hemin, the maximal specific growth and cell division rates and the yield coefficients for glucose and hemin, a basis is created for further designs of fermentation strategies and optimizations. The nutrient media and the developed bioprocess strategies support high cell densities (1.8x109 cells/ml; 14.5 g/l CDW) in combination with doubling times of 5 - 7 h. The investigations of this work occupy, that under the used experimental conditions the Monodmodel is in power for the growth of L. tarentolae, excluding glucose inhibition. Moreover, it was clearly pointed out, that the effects of substrates are greater than the influence of temperature or pH. This inaugurates good control possibilities for the specific growth rate or the specific cell division rate, respectively. Furthermore, it could be shown that the morphological changes of the cells enable a supplemental characterization of growth. Defined media could be developed with stabilizing substances for hemin. By addition of yeast-RNA, the cell density was nearly doubled (2.8 - 3.3x108 cells/ml maximal cell density) in the defined media. The earned knowledge’s from the wild type strain were transferred to the expression of three model proteins. Particularly with the expression of the glycoprotein hyaluronidase-1, the great potential of this new system could be demonstrated. The specific activity in the media supernatant was eight times higher than the reported one for insect cells [Hofinger et al. (2007)]. With the results of this work, prerequisites are made for using L. tarentolae for the production of recombinant proteins for diagnostic or therapeutic purposes. Because of the possibility for N-glycosylation of human proteins, L. tarentolae is an alternative expression system to mammalian cells.