title: Untersuchungen zur Interaktion zwischen dem Kaliumkanal TREK-1 und Hämoxygenasen
title: Analyses of interaction between the potassium channel TREK-1 and hemeoxygenases
Creators: name: Kocher , Vivien-Isabell (Geb. Lauer)
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Kaliumkanal
TEVC
Hefe-zwei-Hybrid-System
Hämoxgenase
potassium channel TREK-1 hemeoxygenase Yeast-two hybrid TEVC
Medizin, Gesundheit
TREK-1

description: Introduction The mechanosensitive
      K2P-channel TREK-1 is expressed at high levels in the nervous
      system and is regulated by diverse physical and chemical
      stimuli and interaction partners. Several in vivo studies
      have demonstrated that TREK-1 is involved in
      pathophysiological processes like neuroprotection, pain and
      depression. TREK-1 channels stabilize the resting membrane
      potential of neurons and consequently have a key role in the
      regulation of membrane excitability. The aim of this study
      was to compare the direct interaction of the inducible enzyme
      heme oxygenase 1 (HO-1) and the constitutively expressed heme
      oxygenase 2 (HO-2) with TREK-1 and to identify amino acid
      regions responsible for the interaction. Material and Methods
      To characterize the direct interaction of TREK-1 with HO-1
      und HO-2, the split-ubiquitin yeast two-hybrid system was
      used, which is specialized for membrane proteins. This method
      utilizes complementation between separable domains of
      ubiquitin to study protein interactions. The C-terminal half
      of ubiquitin (Cub), along with an artificial transcription
      factor complex was fused to TREK-1 (bait) and the N-terminal
      half of ubiquitin (NubG) was fused to HO-1 or HO-2 (preys).
      Interaction between bait and prey proteins brings Cub and
      NubG together which activates the transcription factor
      complex. This complex enters the nucleus and activates the
      expression of several reporter genes which in turn enable the
      yeast cells to grow on a selective medium lacking histidine
      and turn blue in a -galactosidase assay. To investigate the
      physiological relevance of the interaction of TREK-1 with
      HO-1 and HO-2 the channel and the two heme oxygenase isoforms
      were co-expressed in Xenopus laevis oocytes and the TREK-1
      currents were measured with the two-electrode voltage-clamp
      method. In order to produce TREK-1 constructs with specific
      antigenic epitopes the HA-epitope (N-terminally) and the EGFP
      (C-terminally) were fused to the TREK-1 by using the
      site-directed mutagenesis method. Subsequently the fusion
      constructs were characterized with the Westernblot technique.
      Results Specific and strong interactions between several
      K2P-channels (TREK-1, TREK-2c and TASK-1) and HO-2 but not
      with its closely related isoform HO-1 could be demonstrated
      using a yeast two-hybrid direct interaction study.
      Additionally, it could also been shown that neither HO-2 nor
      HO-1 interacted with the inwardly rectifying potassium
      channel Kir2.1. Furthermore, physiological significance of
      the interaction between TREK-1 and HO-2 was demonstrated by
      two-electrode voltage-clamp measurements showing an increase
      in channel currents following the co-expression of TREK-1 and
      HO-2 in Xenopus laevis oocytes. On the contrary,
      co-expression of TREK-1 with HO-1 did not yield any changes
      in the channel currents. Discussion From the two studied heme
      oxygenases only HO-2 could be identified as a specific
      interaction partner of TREK-1 and other K2P-channels.
      Functionally, the interaction between TREK-1 and HO-2 leads
      to an increase of the channel currents, which in turn
      stabilizes the membrane potential of the cells in which both
      proteins are expressed. Although HO-1 and HO-2 have a high
      similarity (76 %) in their amino acid sequences, they exhibit
      several structural differences especially in the distal
      C-termini and the heme regulatory motifs of HO-2. These
      structural differences could be responsible for the absence
      of interaction between HO-1 and TREK-1 and in contrary be
      important for the specific interaction between HO-2 and
      TREK-1. Further analysis of defined HO-2 deletion mutants and
      the exchange of the distal C-termini between HO-2 and HO-1
      could give more information about the importance of these
      regions for their interaction with TREK-1. Designing more
      experiments with the TREK-1 fusion constructs could be
      helpful for carrying out further immunochemical studies.
      Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese mit TREK-1 fusioniert.
      Anschließend wurden die Fusionskonstrukte durch
      Westernblot-Analysen immunochemisch charakterisiert.
      Ergebnisse Es konnten spezifische und starke Interaktionen
      zwischen verschiedenen K2P-Kanälen (TREK-1, TREK-2c und
      TASK-1) und HO-2 mit Hilfe der Hefe-Zwei-Hybrid-Methode
      gezeigt werden, die für den nahen Verwandten HO-1 nicht
      nachweisbar waren. Zudem konnte gezeigt werden, dass weder
      HO-2 noch HO-1 mit dem einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal
      Kir2.1 interagieren. Die physiologische Relevanz der
      Interaktion zwischen TREK-1 und HO-2 konnte durch Messungen
      mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gezeigt werden, bei
      denen es nach Coexpression beider Proteine in Xenopus laevis
      Oozyten zu einer signifikanten Erhöhung des Ionenkanalstroms
      kam. Im Gegensatz dazu führte die Coexpression von TREK-1 und
      HO-1 zu keinen signifikanten Änderungen der Ionenkanalströme.
      Diskussion Von beiden untersuchten Hämoxygenasen konnte nur
      HO-2 als ein spe-zifischer Interaktionspartner für TREK-1 und
      andere K2P-Kanäle nachge-wiesen werden. Funktionell wirkt
      sich die Interaktion zwischen TREK-1 und HO-2 in einer
      Zunahme des Ionenkanalstroms aus, wodurch das
      Membran-potential von Zellen, in denen beide Proteinpartner
      exprimiert werden, stabilisiert werden könnte. Obwohl HO-1
      und HO-2 auf Ebene der Amino-säuresequenzen eine hohe
      Similarität (76 %) haben, zeigen sich einige strukturelle
      Unterschiede, vor allem in den distalen C-Termini und bei den
      hämregulatorischen Motiven der HO-2. Diese strukturellen
      Unterschiede könnten zum einen für die fehlende Interaktion
      von HO-1 und TREK-1 verant-wortlich sein und zum anderen für
      die spezifische Interaktion von HO-2 und TREK-1 wichtig sein.
      Weitere Untersuchungen von speziellen HO-2 Deletions-mutanten
      und der Austausch der distalen C-Termini zwischen HO-2 und
      HO-1 könnten Aufschluss über die Wichtigkeit dieser Regionen
      bei der Interaktion mit TREK-1 geben. Experimente mit den
      TREK-1 Fusionskonstrukten könnten bei weiteren
      immunochemischen Charakterisierungen hilfreich sein.
description: Einleitung Der mechanosensitive
      K2P-Kanal TREK-1 ist stark in neuronalem Gewebe exprimiert
      und wird durch verschiedene chemische und physikalische
      Stimuli und einige Interaktionspartner reguliert.
      Verschiedene Studien haben gezeigt, dass TREK-1 an
      pathophysiologischen Prozessen wie Neuroprotektion, Schmerz
      und Depression beteiligt ist. TREK-1-Kanäle können das
      Ruhemembranpotential von Neuronen stabilisieren und spielen
      damit eine wichtige Rolle bei der Regulation der
      Membranerregbarkeit. Ziel dieser Arbeit war es, die direkte
      Interaktion der induzierbaren HO-1 und der konstitutiv
      exprimierten HO-2 mit TREK-1 zu vergleichen und
      Aminosäureregionen zu identifizieren, die für die Interaktion
      wichtig sind. Material und Methoden Um die direkte
      Interaktion von TREK-1 mit HO-1 und HO-2 zu testen, wurde das
      Split-Ubiquitin Hefe Zwei-Hybrid-System zur Untersuchung von
      Membran-proteinen verwendet. Dieses System nutzt die
      funktionelle Zusammenlagerung der beiden separierbaren
      Domänen des Ubiquitins, um Proteininteraktionen zu
      untersuchen. Die C-terminale Hälfte des Ubiquitins (Cub), an
      das ein artifizieller Transkriptionsfaktorkomplex gebunden
      ist, wurde an TREK-1 (Bait) fusioniert und die N-terminale
      Hälfte des Ubiquitins (NubG) wurde an HO-1 und HO-2 (Prey)
      fusioniert. Die Interaktion zwischen den Bait und Prey
      Proteinen bringt beide Ubiquitinhälften Cub und NubG
      zusammen, wodurch der Transkriptionsfaktorkomplex freigesetzt
      wird, in den Zellkern transloziert und dort die Expression
      von Reportergenen aktiviert. Die Hefezellen sind dann
      befähigt auf einem histidinfreien Selektionsmedium zu wachsen
      und beim -Galaktosidase-Assay eine Blaufärbung zu ergeben.
      Um die physiologische Relevanz der Interaktion von TREK-1 mit
      HO-1 und HO-2 zu untersuchen, wurden das Kanalprotein und die
      beiden Hämoxy-genasen in Xenopus laevis Oozyten coexprimiert
      und die TREK-1-Ströme mit Hilfe der
      Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen. Zur Herstellung von
      TREK-1-Konstrukten, die spezifische antigene Epitope
      enthalten, wurden das HA-Epitop (N-terminal) und das EGFP
      (C-terminal) mit Material and Methods To characterize the
      direct interaction of TREK-1 with HO-1 und HO-2, the
      split-ubiquitin yeast two-hybrid system was used, which is
      specialized for membrane proteins. This method utilizes
      complementation between separable domains of ubiquitin to
      study protein interactions. The C-terminal half of ubiquitin
      (Cub), along with an artificial transcription factor complex
      was fused to TREK-1 (bait) and the N-terminal half of
      ubiquitin (NubG) was fused to HO-1 or HO-2 (preys).
      Interaction between bait and prey proteins brings Cub and
      NubG together which activates the transcription factor
      complex. This complex enters the nucleus and activates the
      expression of several reporter genes which in turn enable the
      yeast cells to grow on a selective medium lacking histidine
      and turn blue in a -galactosidase assay. To investigate the
      physiological relevance of the interaction of TREK-1 with
      HO-1 and HO-2 the channel and the two heme oxygenase isoforms
      were co-expressed in Xenopus laevis oocytes and the TREK-1
      currents were measured with the two-electrode voltage-clamp
      method. In order to produce TREK-1 constructs with specific
      antigenic epitopes the HA-epitope (N-terminally) and the EGFP
      (C-terminally) were fused to the TREK-1