title: Die Phosphorylierung des Ebolavirus VP30 reguliert die virale Transkription und Replikation
title: Phosphorylation of Ebola virus VP30 regulates viral transcription and replication
Creators: name: Biedenkopf, Nadine
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Nukleokapsidproteine
Ebola virus
Mononegavirales
replication
RNS-Viren
Medizin, Gesundheit
Replikation
nucleocapsid proteins
VP30
transcription
Transkription
Ebola-Virus

description: Das Ebolavirus bildet zusammen mit
      dem Marburgvirus die Familie der Filoviridae, die ein
      einzelsträngiges nichtsegmentiertes RNA Genom in negativer
      Orientierung besitzen. Filoviren verursachen schwere
      hämorrhagische Fieber in Menschen und Affen, weswegen sie als
      BSL4-Pathogene klassifiziert werden. Die Transkriptions- und
      Replikationseinheit des Virus bildet der Nukleokapsidkomplex,
      der sich aus dem RNA-Genom sowie den Nukleokapsidproteinen
      NP, VP30, VP35 und L zusammensetzt. Dabei agiert VP30 als
      essentieller Ebolavirus-spezifischer Transkriptionsfaktor,
      der für die Replikation nicht benötigt wird. Die Aktivität
      als Transkriptionsfaktor wird über die Phosphorylierung des
      Proteins reguliert. Nichtphosphoryliertes VP30 unterstützt
      die Synthese der viralen mRNAs in einem Minigenomsystem,
      während das phosphorylierte VP30 die Transkription nicht
      aktivieren kann. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde
      der Einfluss der VP30 Phosphorylierung auf die Regulation des
      Übergangs von viraler Transkription zu Replikation
      untersucht. Dabei stand im Vordergrund der Einfluss der
      Phosphorylierung auf die Replikation. Mit Hilfe von
      phospho-mimetischen Mutanten des VP30 konnte gezeigt werden,
      dass phosphoryliertes VP30 die Replikation fördert, während
      dephosphoryliertes VP30 einen hemmenden Effekt auf die
      Replikation besaß. Weiterhin wurde die Interaktion von VP30
      mit den anderen Komponenten des Nukleokapsidkomplexes
      untersucht. Dabei wurde eine bisher unbekannte Interaktion
      des VP30 mit dem Polymerase Co-Faktor VP35 beschrieben, die
      vom Phosphorylierungsstatus des VP30 beeinflusst wurde.
      Möglicherweise führt die phosphorylierungsabhängige
      Interaktion des VP30 mit VP35 zu einem Ausschluss von VP30
      aus einem putativen Transkriptasekomplex und dadurch zur
      Hemmung der Transkription und Stimulierung der Replikation.
      Außerdem konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden,
      dass eine dynamische Phosphorylierung des VP30 essentiell für
      die initialen Schritte der Primären Transkription in frühen
      Stadien des viralen Lebenszyklus ist. Eine dynamische
      Phosphorylierung des VP30 an Serinrest 29 war ausreichend für
      die Generierung eines rekombinanten Ebolavirus mit
      wildtypischen Eigenschaften. Im Gegensatz dazu ließ sich ein
      stabiles rekombinantes Virus mit Serinrest 30 als einziger
      Phosphoakzeptorstelle nicht herstellen und resultierte im
      Auftreten von kompensatorischen Mutationen innerhalb der VP30
      Phosphorylierungsdomäne. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen
      Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der VP30
      Phosphorylierung für den viralen Replikationszyklus: die
      dynamische Phosphorylierung des VP30 ist in frühen Stadien
      des Infektionszyklus für die Primäre Transkription essentiell
      und besitzt ebenfalls einen Einfluss auf den Übergang von
      viraler Transkription zu Replikation.
description: Ebola virus is a negative strand
      RNA virus, belonging to the family Filoviridae together with
      the closely related Marburg virus. Since filoviruses cause
      outbreaks of a severe hemorrhagic fever with high mortality
      rates in humans and nonhuman primates in central Africa they
      are classified as BSL4 pathogens. Transcription and
      replication of the virus requires the viral nucleocapsid
      complex: the single stranded RNA genome in negative
      orientation which is surrounded by the nucleoprotein NP
      together with the viral polymerase complex consisting of L
      and VP35 as well as the fourth nucleocapsid protein VP30.
      VP30 represents an Ebola virus specific transcription factor
      which is essential for viral transcription but dispensable
      for viral replication. The activity of VP30 as
      transcriptional activator is regulated via its
      phosphorylation state: nonphosphorylated VP30 induces the
      initial steps of viral mRNA synthesis whereas phosphorylation
      of VP30 leads to a block in viral transcription. In the first
      part of the thesis we investigated the role of VP30
      phosphorylation for the regulation of viral transcription /
      replication by using VP30 mutants mimicking the different
      phosphorylation states of the protein. We demonstrate that
      viral replication was favored when VP30 was phosphorylated
      whereas nonphosphorylated VP30 diminished replication. By
      analyzing the interaction of VP30 phosphorylation mutants
      with the other components of the nucleocapsid complex, we
      identified a novel VP30-VP35 interaction which was shown to
      be regulated via VP30 phosphorylation. We propose a model in
      which the phosphorylation of VP30 might interfere with the
      VP35 interaction leading to the dissociation of the
      phosphorylated VP30 from the transcriptase complex in order
      to promote viral replication by VP35, L and NP. Furthermore
      we could demonstrate that the dynamic phosphorylation of VP30
      was essential for the initiation of primary transcription at
      very early stages of viral infection. We describe that a
      possible phosphorylation of VP30 serine residue 29 was
      sufficient for rendering VP30 transcriptional active in order
      to generate a recombinant Ebola virus with only one phosphate
      acceptor site within VP30. The generated virus showed no
      significant differences regarding morphology or growth
      kinetics compared with a wildtyp virus. Moreover, the
      generation of a viable recombinant EBOV with VP30 serine 30
      as unique phosphate acceptor was not possible and attended by
      the development of compensatory mutations within the VP30
      phosphorylation site indicating a high evolutionary pressure
      on this region. These results underline the significance of
      the VP30 phosphorylation for the viral life cycle: while the
      dynamic phosphorylation is an essential requirement for the
      earliest steps of viral life cycle, our study suggests
      further a modulating role of VP30 phosphorylation for the
      composition of the viral polymerase complex resulting in the
      transition from transcription to replication
      processes.