title: Investigation of toxicokinetic and toxicodynamic mixture effects of plant protection products using new approach methodologies
Creators: name: Karaca, Mawien
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::547 Organische Chemie
subject: mixtur effects
subject: toxicokinetic
subject: toxicodynamic
subject: NAMs
subject: liver steatosis

description: Plant protection products contain at least one active substance (a.s.), often more than one a.s., to increase efficiency as well as a varying number of co-formulants. The a.s. are responsible for the functionality and toxicity of PPPs. Therefore, the a.s. must be investigated extensively. The authorization process for products relies only on testing for acute and topological toxicities. In addition to the a.s., co-formulants are usually added to PPPs to improve their applicability and enhance their features. Co-formulants are called inert by manufacturing companies and are thus not required to be rigorously tested for toxicity. However, consumers are exposed to the products and, thus, to multiple residues of several pesticides and even multiple residues of different PPPs via the diet. In some cases, combinations of certain a.s. and co-formulants may result in increased toxicity of the respective products, resulting in insufficient evaluations based on single compounds and the additivity principle. Moreover, such combinations have never been systematically evaluated for complex and long-term toxicological endpoints. This results in a great demand for standardized and reliable new approach methodologies (NAMs) for evaluating mixture effects. Therefore, this thesis aims to provide a proof-of-concept for the evaluation of mixture effects by NAMs, focusing on toxicodynamic and toxicokinetic interactions, thereby understanding the underlying mechanisms. Regarding toxicodynamics, the focus was on the liver as the target organ because it is the most frequently affected target organ upon oral exposure to pesticides. Regarding toxicokinetics, the focus has been on absorption and metabolism. In the pharmaceutical field, several drug-drug-interactions are based on interference with cytochrome P450 (CYP)-mediated phase I metabolism, with CYP3A4 being the most involved. Furthermore, several surfactants, such as tweens, cremophors, and pluronic block copolymers, have been shown to inhibit transporters in the gastrointestinal tract. Most P-glycoprotein (Pgp) transporters are effectively inhibited by these substances. Therefore, we first investigated in a case study the effects of surface-active co-formulants on the cytotoxicity of two PPPs based on the a.s. abamectin and fluroxypyr-meptyl using Caco-2 cells. In addition, the effect of co-formulants on increased cellular permeation was quantified using LC–MS/MS, while potential kinetic mixture effects were addressed by fluorescence anisotropy measurements, ATPase assays, FITC-dextran flux, and TEER measurements. In the second case study, we investigated the effect of three frequently used co-formulants on the toxicokinetics and toxicodynamics of the representative a.s. combinations of tebuconazole (Teb) and prothioconazole (Pro) or cypermethrin (Cpm) and piperonylbutoxid (Pip), respectively. With all four a.s. as potential liver steatogens, cytotoxicity and triglyceride accumulation in HepaRG cells were used as primary endpoints. Concomitantly, transcriptomics and biochemical studies have been conducted to investigate for effects on gene expression and inhibition of CYP3A4 as key enzyme for functionalization. In the third article, we developed a protocol describing an in vitro test battery using the human liver cell lines HepaRG and HepG2 to analyze chemical substances and mixtures for their potential to induce liver triglyceride accumulation and, thus, liver steatosis, based on a liver steatosis AOP described previously. The results showed that surface-active co-formulants significantly increased the cytotoxicity of the investigated PPPs, partially leading to synergistic mixture effects. Moreover, analytical investigations showed higher efflux ratios for both a.s. and the metabolite fluroxypyr in combination with certain concentrations of surfactants. These results further point to the significant and concentration-dependent inhibition of Pgp transporters by most surfactants, as well as increased membrane fluidity. Some of the tested combinations of Teb + Pro and Cpm + Pip (only a.s., but also products containing co-formulants) clearly showed more than additive effects, partly due to CYP3A4 enzyme inhibition. Other effects include modulation of the expression and activity of steatosis-related nuclear key receptors. The less than additive effects on liver triglyceride accumulation by the mixture of Teb and Pro can be explained by the dissimilar modes of action of the individual substances regarding this endpoint. The most pronounced more than additive effect was observed for liver triglyceride accumulation induced by Cpm and Pip. This mixture effect was associated with both toxicokinetic and toxicodynamic interactions. The high involvement of several molecular initiating events in liver steatosis AOP likely contributes to the respective more than additive effects on triglyceride accumulation. Altogether, these findings highlight the need for a more systematic consideration of toxicodynamic and toxicokinetic mixture effects during the assessment of PPPs. A first step towards this is our protocol describing an in vitro test battery that allows the classification of compounds and mixtures as steatotic or non-steatotic, respectively. Furthermore, understanding the underlying mechanisms and grouping of substances into CKGs and CAGs offers the possibility of prioritizing products for mixture risk assessment.
description: Pflanzenschutzmittel enthalten mindestens einen Wirkstoff, oft aber auch mehrere zur Steigerung der Wirksamkeit, sowie eine unterschiedliche Anzahl an Beistoffen. Die Wirkstoffe sind für die Funktionalität aber auch für die Toxizität von Pflanzenschutzmitteln verantwortlich. Daher müssen die Wirkstoffe umfangreich untersucht werden. Der Zulassungsprozess für Produkte basiert jedoch ausschließlich auf der Prüfung der akuten und topologischen Toxizität. Zusätzlich zu den Wirkstoffen werden Pflanzenschutzmitteln in der Regel Beistoffe zugesetzt, um ihre Anwendbarkeit sowie ihre Eigenschaften zu verbessern. Beistoffe werden von Herstellern als inert bezeichnet und müssen daher nicht streng auf Toxizität getestet werden. Allerdings sind Verbraucher den Produkten und damit mehreren Rückständen mehrerer Pestizide und sogar mehreren Rückständen verschiedener Pflanzenschutzmittel über die Nahrung ausgesetzt. In einigen Fällen können jedoch Kombinationen bestimmter Wirkstoffe und Beistoffe zu einer erhöhten Toxizität der jeweiligen Produkte führen, was wiederum zu einer unzureichenden Bewertung auf der Grundlage der einzelnen Verbindungen und des Additivitätsprinzipes führt. Darüber hinaus wurden solche Kombinationen nie systematisch auf komplexe und langfristige toxikologische Endpunkte untersucht. Daraus ergibt sich ein großer Bedarf an standardisierten und zuverlässigen neuen Ansatzmethoden (NAMs) zur Bewertung von Mischungseffekten. Das Ziel dieser Arbeit war daher ein „Proof of Concept“ von NAMs zur Bewertung von Mischungseffekten, mit dem Schwerpunkt auf toxikodynamischen und toxikokinetischen Wechselwirkungen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen. Im Hinblick auf die Toxikodynamik wurde der Schwerpunkt auf die Leber als Zielorgan gelegt, da sie das Organ mit der größten toxikologischen Besorgnis bei oraler Verabreichung darstellt. Bei der Toxikokinetik lag der Fokus auf der Resorption und dem Metabolismus. Im pharmazeutischen Bereich basieren mehrere Arzneimittelwechselwirkungen (DDIs) auf Interaktionen des Cytochrom P450 (CYP) vermittelten Phase-I-Metabolismus, wobei CYP3A4 am häufigsten beteiligt ist. Andererseits wurde beschrieben, dass mehrere Tenside, u.a. Tweens, Cremophore und Pluronic-Blockcopolymere, Transporter im Magen-Darm-Trakt hemmen. Insbesondere die P-Glykoprotein (Pgp) Transporter werden durch diese Substanzen wirksam gehemmt. Daher untersuchten wir zunächst die Auswirkungen oberflächenaktiver Beistoffe auf die Zytotoxizität zweier PPPs, basierend auf den Wirkstoffen Abamectin und Fluroxypyr-meptyl, in einer Fallstudie mit Caco-2-Zellen. Darüber hinaus wurde die Wirkung der Beistoffe auf die erhöhte Zellpermeation mittels LC-MS/MS quantifiziert, während mögliche Mechanismen kinetischer Mischungseffekte durch Fluoreszenzanisotropie-messungen, ATPase-Assays, FITC-Dextran-Fluss und TEER-Messung untersucht wurden. In einer zweiten Fallstudie untersuchten wir die Wirkung von drei häufig verwendeten Beistoffen auf die Toxikokinetik und Toxikodynamik der Wirkstoffkombination Tebuconazol (Teb) und Prothioconazol (Pro) bzw. Cypermethrin (Cpm) und Piperonylbutoxid (Pip). Da es sich bei allen vier Wirkstoffen um potenzielle Lebersteatogene handelt, wurden Zytotoxizität und Triglyceridakkumulation in HepaRG Zellen als primäre Endpunkte herangezogen. Gleichzeitig wurden transkriptomische und biochemische Studien durchgeführt, um Auswirkungen auf die Genexpression und die Inhibition von CYP3A4 als Schlüsselenzym für die Funktionalisierung zu untersuchen. In Artikel III haben wir ein Protokoll entwickelt, das eine In-vitro-Testbatterie basierend auf dem Lebersteatose AOP beschreibt, die die menschlichen Leberzelllinien HepaRG und HepG2 verwendet, um chemische Substanzen und Mischungen auf ihr Potenzial zu analysieren, eine Lebertriglyceridakkumulation (TGA) und damit Lebersteatose zu verursachen. Die Ergebnisse zeigen, dass oberflächenaktive Beistoffe die Zytotoxizität der getesteten Pflanzenschutzmittel deutlich erhöhen, was zu synergistischen Mischeffekten führt. Darüber hinaus zeigen analytische Studien höhere Efflux-Werte beider Wirkstoffe und des Metaboliten Fluroxypyr in Kombination mit bestimmten Tensiden. Die Ergebnisse deuten auch auf eine signifikante und konzentrationsabhängige Hemmung der Pgp-Transporter sowie eine erhöhte Membranfluidität durch die meisten Tenside hin. Andererseits zeigten einige der getesteten Kombinationen von Teb + Pro und Cpm + Pip (nur Wirkstoffe, aber auch Produkte mit Beistoffen) überadditive Effekte, was teilweise auf die Hemmung des CYP3A4-Enzyms zurückzuführen ist. Zu den weiteren Effekten gehörte die Modulation der Expression und Aktivität von Steatose-bezogenen nukleäre Rezeptoren. Der weniger als additive Effekt der Mischung aus Teb und Pro auf die Triglyceridakkumulation in der Leber lässt sich durch die unterschiedliche Wirkweisen der einzelnen Substanzen in Bezug auf diesen Endpunkt erklären. Der stärkste überadditive Effekt wurde für die Triglyceridakkumulation in der Leber durch Cpm und Pip festgestellt. Dieser Mischungseffekt ist mit einer toxikokinetischen, aber auch toxikodynamischen Wechselwirkung verbunden. Die hohe Beteiligung mehrerer nukleärer Rezeptoren trägt höchstwahrscheinlich zu den überadditiven Effekten hinsichtlich der Triglyceridakkumulation bei. Insgesamt unterstreichen die Ergebnisse die Notwendigkeit einer systematischeren Berücksichtigung toxikodynamischer und toxikokinetischer Mischungseffekte bei der Bewertung von Pflanzenschutzmitteln. Ein erster Schritt hierzu ist unser Protokoll, welches eine In-vitro-Testbatterie beschreibt, die die Klassifizierung von Verbindungen und Mischungen als steatotisch oder nicht-steatotisch ermöglicht. Darüber hinaus bietet das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und die damit verbundene Gruppierung in CKGs und CAGs auch die Möglichkeit, Produkte für die Risikobewertung von Mischungen zu priorisieren.