title: Investigation of Substrate Specificity in tRNA-Guanine-Transglycosylase and Characterization of the eucaryotic TGT
title: Untersuchung der Substratspezifität der tRNA-Guanin-Transglykosylase (TGT) aus Eukaryoten und Prokaryoten und Charakterisierung der eukaryotischen TGT
Creators: name: Biela, Inna
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Proteine
Guanin
tRNA-Guanin Transglykosylase
Eucaryotic
Naturwissenschaften
Eukaryoten
Substratspezifität
Substrate Specificity
tRNA-Guanine-Transglycosylase
Protein

description: Bacterial tRNA-guanine
      transglycosylase (TGT) catalyses the exchange of the
      genetically encoded guanine at the wobble position of
      tRNAsHis,Tyr,Asp,Asn by the premodified base preQ1, which is
      further converted to the fully modified queuine base at the
      tRNA level. As this enzyme is essential for the pathogenicity
      of Shigellae, the causative agents of bacterial dysentry, it
      represents an attractive target for the rational design of
      anti-Shigellosis compounds. However, also eucaryotes and,
      therefore, humans possess a TGT. In contrast to the
      homodimeric procaryotic TGT the eucaryotic enzyme constitutes
      a heterodimer consisting of a catalytic and a non-catalytic
      subunit, with both subunits, however, being homologous to the
      bacterial protomer. In addition, the physiological substrate
      of the eucaryotic TGT is not preQ1 but the fully modified
      queuine, since eucaryotes are not able to synthesise queuine
      de novo. Rather, they acquire this base from their diet or
      from the gut flora. As in a mouse model eucaryotic TGT was
      shown to be indirectly required for the conversion of
      phenylalanine to tyrosine, it seems of utmost importance to
      create compounds inhibiting the procaryotic but not the
      eucaryotic enzyme. Elsewise, phenylketonurea-like secondary
      effects have to be expected. Obviously, a detailed knowledge
      about the differences between procaryotic and eucaryotic TGT
      is a precondition to design specific inhibitors of the
      bacterial enzyme. Although no crystal structure of a
      eucaryotic TGT has been determined yet, homology models of
      the Caenorhabditis elegans and the human TGT suggest that the
      exchange of Cys158 and Val233 in bacterial TGT (Z. mobilis
      TGT numbering) by valine or rather glycine in eucaryotic TGT
      have a large impact on substrate specificity. Accordingly, in
      the first part of this work, mutated variants of bacterial
      TGT were generated in order to investigate the influence of a
      Cys158Val and a Val233Cys exchange on catalytic activity and
      substrate specificity. The analysis of the mutated variants
      was carried out via determination of their enzyme kinetic
      parameters, via "microscale thermophoresis", via a gel shift
      experiment and, lastly, via crystal structure analyses. The
      results show that the exchange of Cys158 to valine results in
      a decreased affinity of the enzyme to the physiological
      substrate of the bacterial enzyme, preQ1. In contrast, the
      exchange of Val233 to glycine leads to an enlarged substrate
      binding pocket which is required to accommodate queuine, the
      physiological substrate of the eucaryotic TGT, in a
      conformation compatible with the intermediately covalently
      bound tRNA. Contrary to our expectations, we found that a
      priori queuine is recognised by the binding pocket of
      bacterial Tgt without, however, being used as a substrate.
      The goal of the second part of this thesis was the
      biochemical characterisation of the eucarytic TGT as well as
      the attempt to crystallise this enzyme as a basic
      prerequisite for crystal structure determination. For this
      purpose, expression plasmids were constructed allowing the
      recombinant production of the murine and human TGT subunits
      in Escherichia coli. The (separate) production and
      purification of the murine catalytical subunit (mQTRT1) and
      of the non-catalytical subunit (mQTRTD1v1) resulted in
      satisfying yields of ca. 4 mg per Liter of bacterial culture,
      each. In contrast, the purification of the recombinant human
      TGT subunits was significantly less successful (in each case
      &lt; 0.4 mg per Liter of bacterial culture), so that the
      biochemical analysis as well as crystallisation trials
      remained largely confined to the murine enzyme. NanoESI-MS
      experiments confirmed the heterodimeric quarternary structure
      of the eucaryotic TGT and showed that, simultaneously, only
      one tRNA molecule can be accomodated and converted by one
      heterodimer. Another finding gained by nano-ESI-MS was that
      the catalytic QTRT1 subunit is, in the absence of its
      interaction partner, present as a monomer in solution. In
      contrast, the non-catalytic QTRTD1v1 subunit tends to form a
      homodimer in the absence of QTRT1. Enzyme kinetic analyses
      confirmed former reports of other research groups who had
      shown that solely the QTRT1/QTRTD1v1 heterodimer is
      enzymatically active, while the separate subunits are not.
      Thermal shift measurements finally showed that both QTRT1 and
      QTRTD1v1 are much more stable under high salt conditions
      (1000 mM NaCl) than under low salt conditions.
      Crystallisation trials performed with the two subunits as
      well as with the heterodimeric functional enzyme yielded, in
      the case of QTRTD1v1, reproducable crystals. When exposed to
      highly focussed synchrotron radiation, these crystals
      diffracted to ca. 2.8 Å. A data set recorded at beamline
      14.1 of BESSY II (Helmholtz center, Berlin) allowed the
      structure determination via molecular replacement using the
      coordinates of Thermotoga maritima TGT (pdb code: 2ASH) as
      model coordinates. The refined QTRTD1v1 structure reveals
      that, within the crystal, the protein is present as a
      homodimer whose architecture strikingly resembles the
      homodimer of bacterial TGT. A detailed biochemical and
      structural knowledge of the eucaryotic TGT is a basic
      requirement for the design of inhibitors which specifically
      inhibit the bacterial TGT while leaving the eucaryotic enzyme
      unaffected. The recombinant production and purification of
      both subunits of a eucaryotic TGT as well as the
      determination of a first crystal structure which were
      achieved in the present work constitute an impotant basis for
      this goal.
description: Die bakterielle
      tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT) katalysiert den Austausch
      des genetisch kodierten Guanins in der "Wobble"-Position der
      tRNAsHis,Tyr,Asp,Asn gegen die prämodifizierte Base preQ1,
      welche dann auf der tRNA-Ebene weiter in die vollständig
      modifizierte Base Queuin überführt wird. Da das Enzym für die
      Pathogenität von Shigellen, den Erregern der Bakterienruhr,
      essentiell ist, stellt es ein attraktives Zielmolekül für das
      computergestütze Design von Wirkstoffen gegen die Shigellose
      dar. Jedoch verfügen auch Eukaryoten und somit der Mensch
      über eine TGT. Im Gegensatz zur homodimeren prokaryotischen
      TGT stellt die eukaryotische TGT ein Heterodimer aus einer
      katalytischen und einer nicht-katalytischen Untereinheit dar,
      wobei beide Untereinheiten Homologie zum Protomer des
      bakteriellen Enzyms aufweisen. Darüber hinaus ist das
      physiologische Substrat der eukaryotischen TGT nicht preQ1
      sondern die vollmodifizierte Base Queuin, denn Eukaryoten
      sind nicht in der Lage, Queuin de novo zu synthetisieren.
      Vielmehr erhalten sie diese Base über die Nahrung und über
      die Darmflora. Da am Mausmodell gezeigt wurde, dass die TGT
      indirekt für die Umwandlung von Phenylalanin zu Tyrosin
      erforderlich ist, scheint es dringend geboten, Inhibitoren zu
      entwickeln, die die bakterielle, nicht jedoch die
      eukaryotische TGT hemmen. Andernfalls dürfte mit
      Nebenwirkungen zu rechnen sein, die dem Krankheitsbild der
      Phenylketonurie ähneln. Es scheint einleuchtend, dass eine
      möglichst genaue Kenntnis der Unterschiede zwischen dem
      prokaryotischen und dem eukaryotischen Enzym eine
      Voraussetzung für die Entwicklung bakterienspezifischer
      TGT-Inhibitoren ist. Obwohl noch keine Kristallstruktur einer
      eukaryotischen TGT bestimmt wurde, deuten Homologiemodelle
      der TGT aus Caenorhabditis elegans und aus dem Menschen
      darauf hin, dass der Austausch von Cys158 und Val233 in der
      bakteriellen TGT (Z. mobili TGT-Nummerierung) durch Valin
      bzw. Glycin in der eukaryotischen TGT einen wichtigen
      Einfluss auf die Substratspezifität hat. So wurden im ersten
      Teil der vorliegenden Arbeit mutierte Varianten der
      bakteriellen TGT erzeugt, um die Auswirkungen eines
      Cys158Val- und eines Val233Gly-Austausches auf die
      katalytische Aktivität und Substratspezifität zu analysieren.
      Die Untersuchung der Varianten erfolgte durch Bestimmung
      ihrer enzymkinetischen Parameter, durch
      "Microscale-Thermophorese", durch Gelshift-Analysen und
      schließlich durch Röntgenstrukturanalyse. Obwohl es im Rahmen
      dieser Studie nicht gelang, eine bakterielle TGT-Variante zu
      erzeigen, die in der Lage ist, Queuin in die tRNA einzubauen,
      zeigen die Ergebnisse, dass der Austausch von Cys158 zu Valin
      eine herabgesetzte Affinität des Enzyms zu preQ1, dem
      natürlichen Substrat des bakteriellen Enzyms, zur Folge hat.
      Der Austausch von Val233 zu Glycin führt dagegen zu einer
      signifikanten Vergrößerung der Substratbindetasche, welche
      erforderlich ist, um Queuin, das Substrat der eukaryotischen
      TGT, in einer Konformation zu binden, die mit der intermediär
      kovalent gebundenen tRNA kompatibel ist. Ein unerwartetes
      Ergebnis der Studie ist, dass Queuin a priori in die
      Bindetasche der prokaryotischen TGT binden kann, ohne jedoch
      als Substrat umgesetzt zu werden. Ziel des zweiten Teils der
      Dissertation war die biochemische Charakterisierung der
      eukaryotischen TGT sowie die Durchführung von
      Kristallisationsversuchen als Vorausetzung für eine
      Röntgenstrukturanalyse. Zu diesem Zweck wurden zunächst
      Expressionsplasmide konstruiert, die die effiziente
      rekombinante Produktion der beiden TGT-Untereinheiten aus der
      Maus sowie aus dem Menschen in Escherichia coli ermöglichen
      sollten. Die (separate) Produktion und Reinigung der
      katalytischen Untereinheit (QTRT1) sowie der
      nicht-katalytischen Untereinheit (QTRTD1v1) der Maus-TGT
      erfolgte mit zufriedenstellenden Ausbeuten von jeweils ca. 4
      mg pro Liter Bakterienkultur. Dagegen gelang die Reinigung
      der rekombinanten menschlichen TGT-Untereinheiten nur in
      unzureichendem Umfang (jeweils &lt; 0,4 mg pro Liter
      Bakterienkultur), sodass die biochemischen Untersuchungen
      sowie Kristallisationsversuche weitgehend auf das Maus-Enzym
      beschränkt blieben. Enzymkinetische Untersuchungen
      bestätigten frühere Befunde von anderen Arbeitsgruppen, die
      gezeigt hatten, dass ausschließlich das
      QTRT1/QTRTD1v1-Heterodimer Enzymaktivität zeigt, während die
      separaten Untereinheiten völlig inaktiv sind. Darüber hinaus
      wurde durch NanoESI-MS-Experimente die heterodimere
      Quartärstruktur der eukaryotischen TGT bestätigt und gezeigt,
      dass pro Heterodimer gleichzeitig nur ein tRNA-Substrat
      gebunden und umgesetzt werden kann. Ein weiterer durch
      NanoESI-MS erhaltener Befund war, dass die katalytische
      QTRT1-Untereinheit in Abwesenheit des Interaktionspartners in
      Lösung als Monomer vorliegt, wogegen die nicht-katalytische
      QTRTD1v1-Untereinheit zumindest in höherer Konzentration ein
      Homodimer ausbildet. Thermal Shift-Messungen zeigten
      schließlich, dass sowohl QTRT1 als auch QTRTD1v1 in
      Hochsalzpuffer (1000 mM NaCl) eine deutlich höhere Stabilität
      aufweisen als unter Niedrigsalzbedingungen.
      Kristallisationsversuche, die mit beiden Untereinheiten sowie
      mit der heterodimeren TGT durchgeführt wurden, lieferten im
      Fall der nicht-katalytischen QTRTD1v1 reproduzierbare
      Kristalle, die bei Anwendung von hochfokussierter
      Synchrotronstrahlung ein Streuvermögen von ca. 2,8 Å
      zeigten. Von dieser Kristallform wurde an der Beamline 14.1
      des BESSY II (Helmholtz-Zentrum, Berlin) ein Datensatz
      aufgenommen, der die Strukturaufklärung mit der Methode des
      Molekularen Ersatzes erlaubte. Als Modellkoordinaten dienten
      dabei die Koordinaten der TGT aus dem Bakterium Thermotoga
      maritima (PDB-Code 2ASH). Die verfeinerte QTRTD1v1-Struktur
      zeigt, dass das Protein im Kristall als Homodimer vorliegt,
      das dem Homodimer der bakteriellen TGT in seinem Aufbau
      frappierend ähnelt. Voraussetzung für das Design von
      Inhibitoren, welche spezifisch die bakterielle, nicht jedoch
      die menschliche TGT inhibieren, ist ein detailliertes
      biochemisches und strukturelles Verständnis des
      eukaryotischen Enzyms. Durch die hier erfolgte rekombinante
      Produktion und Reinigung beider eukaryotischer
      TGT-Untereinheiten sowie durch die Bestimmung einer ersten
      Kristallstruktur wurde eine wichtige Grundlage für dieses
      Ziel geschaffen.