Νέοι μονωτές χρωματίνης ανθρώπου για ασφαλέστερη και αποτελεσματικότερη γονιδιακή θεραπεία
Creators: name: Ζουμπούλ Ναζλί Μουσταφά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Γονιδιακή θεραπεία
Φορείς γονιδιακής θεραπείας
Μονωτές χρωματίνης
Gene therapy
Vectors of gene therapy
Chromatin insulators

description: Παρά τα σημαντικά επιτεύγματα που έχουν σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στον τομέα της γονιδιακής θεραπείας των γενετικών παθήσεων, δύο σημαντικοί περιορισμοί δημιουργούν την επιστημονική ανάγκη επίλυσής τους για βελτιστοποίηση αυτής της θεραπευτικής προσέγγισης. Πιο συγκεκριμένα, τα επίπεδα έκφρασης του θεραπευτικού γονιδίου επηρεάζονται σημαντικά από την περιβάλλουσα χρωματίνης τη θέση ενσωμάτωσης, η οποία μπορεί να προκαλέσει ανομοιογένεια στην έκφραση ή ακόμα και αποσιώπηση του διαγονιδίου, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της μεθόδου. Επιπρόσθετα, η εισχωρητική μεταλλαξιγένεση που μπορεί να προκληθεί λόγω της ημι-τυχαίας ενσωμάτωσης του ιικού φορέα στο γονιδίωμα του κυττάρου-στόχος, μειώνει εν δυνάμει την ασφάλεια της μεθόδου, προκαλώντας φαινόμενα γενοτοξικότητας. Οι μονωτές χρωματίνης που ενσωματώνονται λειτουργικά στους ιικούς φορείς μπορούν να ελαχιστοποιήσουν τόσο τα φαινόμενα θέσεως (position effects) που προκαλούνται λόγω ποικίλης έκφρασης ή αποσιώπησης του διαγονιδίου (μονωτές με δράση φραγμού), όσο και την εισχωρητική μεταλλαξιγένεση (μονωτές με δράση διακόπτη – ενισχυτή). Αν και ο cHS4 αποτελεί τον καλύτερα χαρακτηρισμένο μονωτή διπλής δράσης, παρουσιάζει σημαντικά μειονεκτήματα όπως η αρνητική επίδραση στους τίτλους των ιικών φορέων , λόγω του μεγάλου μεγέθους του (1.2kb) και η περιορισμένη ικανότητα μόνωσης. Στο συνεργαζόμενο εργαστήριο του εκλιπόντος Δρ Σταματογιαννόπουλου (Πανεπιστήμιο Washington), ανακαλύφθηκαν 27 νέοι, μικρού μεγέθους (189-284bp) μονωτές χρωματίνης που εντοπίζονται φυσιολογικά στο γονιδίωμα του ανθρώπου και έχουν δράση τύπου διακόπτη-ενισχυτή, μειώνοντας τα φαινόμενα γενοτοξικότητας όταν ενσωματωθούν σε γ-ρετροϊικούς φορείς. Σε προηγούμενη έρευνα του εργαστηρίου μας, διερευνήθηκε μια σειρά από αυτούς τους νέους μονωτές χρωματίνης με δράση τύπου διακόπτη-ενισχυτή, ως προς την ταυτόχρονη δράση τους και ως μονωτές τύπου φραγμού. Δείξαμε ότι οι B4 και C1 αποτελούν τους μονωτές με την ισχυρότερη δράση τύπου φραγμού σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα. Σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η επιπλέον διερεύνηση της δράσης τύπου φραγμού των C1 και B4, σε in vivo μοντέλο πρωτογενών και δευτερογενών ληπτών, για τον έλεγχο της μακρόχρονης αποτελεσματικότητάς τους αλλά και η διερεύνηση της δράσης τύπου διακόπτη ενισχυτή, μετά από ενσωμάτωσή τους σε λεντι-ιικούς φορείς αναφοράς. Για τη αξιολόγηση της μακροχρόνιας αποτελεσματικότητας των μονωτών χρωματίνης, αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ανθρώπου (hCD34+) διαμολύνθηκαν με τους αντίστοιχους λεντι-ιικούς φορείς, και στη συνέχεια η δράση τους ελέγχθηκε in vivo σε ποντίκια με βαριά συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NBSGW), μετά από πρωτογενή και δευτερογενή μεταμόσχευση. Για τη διερεύνηση της δράσης τύπου διακόπτη ενισχυτή, αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ποντικού (Lineage-) διαμολύνθηκαν in vitro με τους αντίστοιχους λεντι-ιικούς φορείς, για την αξιολόγηση της ασφάλειας των λεντι-ιικών φορέων παρουσία των μονωτών χρωματίνης. Από τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας προκύπτει ότι οι δύο μονωτές χρωματίνης C1 και B4, αποτελούν μονωτές διπλής δράσης δηλαδή διαθέτουν ισχυρή δράση τόσο ως προς την ιδιότητα φραγμού, όσο και ως προς την ιδιότητα του διακόπτη – ενισχυτή, με αποτέλεσμα να μειώνουν σε σημαντικό βαθμό τα φαινόμενα θέσεως και τα φαινόμενα μεταλλαξιγένεσης, αντίστοιχα. Επομένως, η ενσωμάτωση των εν λόγω μονωτών χρωματίνης σε θεραπευτικούς ιικούς φορείς και η χρήση τους σε κλινικό επίπεδο, αναμένεται να βελτιώσει την έκβαση της γονιδιακής θεραπείας για κάθε μονογονιδιακή ασθένεια.
description: Despite the significant advances that have been made in recent years in the field of gene therapy of genetic diseases, two important limitations push the scientific community to address them to optimize the therapeutic approach. On the one hand, the expression levels of a therapeutic gene are significantly affected by the surrounding chromatin region, causing heterogeneity of expression, or silencing of the transgene, reducing the effectiveness of the therapeutic method. On the other hand, insertional mutagenesis caused by the semi-random integration of the viral vector into the target cell genome reduces potentially the safety of the method, causing genotoxicity. Chromatin insulators functionally incorporated into viral vectors have become a solution by minimizing both positional effects caused by heterogeneity of expression levels or silencing of the transgene (barrier insulators) and invasive mutagenesis (enhancer blocking insulators). Although cHS4 is the best-characterized dual functioning insulator, it has been associated with several disadvantages, such as producing low viral titers due to its large size (1.2kb) and limited insulation capacity. In the affiliate laboratory of Dr. Stamatogiannopoulos (University of Washington) were identified 27 new, small (189-284bp) chromatin insulators in the human genome with enhancer blocking activity, reducing the effects of genotoxicity. In previous research of our laboratory these chromatin insulators were investigated for the barrier activity, and it has been proved that the chromatin insulators B4 and C1 are the insulators with the strongest barrier activity in in vitro and in vivo experimental models. The purpose of this study was the further investigation of the barrier activity of C1 and B4 in in vivo models of primary and secondary recipients, to search their long-term effectiveness, and the investigation of enhancer blocking activity after incorporating them into lentiviral reference vectors. To evaluate the long-term effectiveness of the chromatin insulators, human hematopoietic stem cells (hCD34+) were transfected with the same insulated and uninsulated lentiviral vectors (GFP) and were transplanted into mice with severe combined immunodeficiency (NBSGW), where the expression of transgene (eGFP) was assessed in vivo in primary and secondary transplantation. To investigate the enhancer blocking activity, mouse hematopoietic stem cells (Lineage-) were transfected in vitro with the corresponding lentiviral vectors, to evaluate the safety of lentiviral vectors in the presence of chromatin insulators. In conclusion, the results of this master thesis statement show that the chromatin insulators C1 and B4 are dual action, with enhancer blocking and barrier activity, thus reducing mutagenesis and position effects, respectively. Therefore, the integration of these chromatin insulators into therapeutic viral vectors and their use at clinical level is expected to improve the outcome of gene therapy for any monogenic disease.