title: Offering a new perspective - Characterisation of deubiquitinating enzymes by single molecule microscopy
Creators: name: Welke, Robert-William
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: Deubiquitinasen
subject: Einzelmolekül-Mikroskopie
subject: DUBs
subject: Ubiquitin
subject: USP2
subject: USP5
subject: TIRF
subject: Ubiquitin
subject: DUB
subject: DUBs
subject: Deubiquitinating Enzymes
subject: USP2
subject: USP5
subject: Single molecule microscopy
subject: TIRF
subject: 570 Biologie

description: Ubiquitin (Ub) wird meist in Kettenform an Lysine von anderen Proteinen gekoppelt und bestimmt somit, ob das Substrat beispielsweise vom Proteasom abgebaut oder an der Reparatur des Erbguts beteiligt wird. Die Regulierung dieses Signals ist entscheidend für die zelluläre Homöostase, Fehler führen zu Krankheiten wie Parkinson und Krebs. Die wohl wichtigsten Regulatoren sind deubiquitinierende Enzyme (DUBs). Ein tiefes Verständnis über deren enzymatischen Mechanismus ist daher unerlässlich für die Entwicklung von therapeutischen Ansätzen. Biochemische Methoden ermöglichten bisher grundlegende Erkenntnisse darüber, wie DUBs Ubiquitinketten prozessieren. Allerdings werden dabei viele überlappende Reaktionen analysiert, wodurch viele relevante Details schwer oder gar nicht erkennbar sind. Diese Arbeit bietet durch die Etablierung einer Einzelmolekül-Mikroskopie-Methode eine neue Perspektive auf die Interaktion zwischen DUBs und Ubiquitinketten. Dafür wurden Messkammern mit Ubiquitinketten bestückt. Verschiedene DUBs und die Ubiquitinketten wurden mit Fluorophoren markiert und mit Hilfe von interner Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Am Beispiel des DUBs USP5 konnten dadurch erstmals die Bindung sowie das darauffolgende Schneiden einer Ubiquitinkette direkt und in Echtzeit beobachtet werden. Anschließende Auswertungen gewährten neue Einblicke in die Unterschiede zwischen produktiven und unproduktiven Bindungen und auch auf das heterogene Bindungsverhalten von USP5 vor dem Schneiden der Kette. Mit Anpassungen am Versuchsaufbau konnten am Beispiel von USP2 und drei verschiedenen Ubiquitinketten diverse kinetische Parameter bestimmt werden. Diese Ergebnisse unterstützen ein bestehendes Modell, nach dem USP2 nach der Bindung eine Konformationsänderung durchlaufen muss, um Ubiquitinketten zu schneiden. Zusätzlich weisen die Messungen darauf hin, dass diese Konformationsänderung der entscheidende Faktor für die Substratspezifität von USP2 ist.
description: Ubiquitin (Ub) is a post-translational modification attached to substrate proteins, often in the form of Ub chains. Depending on the length and linkage type of those chains the substrates can, for example, be targeted for proteasomal degradation or initiate DNA repair mechanisms. Regulation of this signal is crucial for cellular homeostasis and errors cause diseases like Parkinson´s or cancer. The main regulators are deubiquitinating enzymes (DUBs) which cleave Ub chains. Deeply understanding their enzymatic mechanism is necessary for the development of medical intervention strategies. Biochemical methods have enabled a fundamental understanding about Ub cleavage. However, this results from population measurements, where individual mechanistic details are hard or impossible to be determined. By establishing a single-molecule microscopy method, the work in hand offers a new perspective on the enzymatic reactions between DUBs and Ub chains. Here, self-made imaging chambers were decorated with Ub chains. These Ub chains and a selection of DUBs were labelled with fluorescent dyes and analysed by total internal reflection fluorescence microscopy in real-time. Using USP5, this set-up enabled a DUB-Ub chain interaction with subsequent cleavage reaction to be directly observed for the first time. In-depth analyses revealed several insights into the enzymatic mechanism, including a clear difference between productive and unproductive binding events, as well as two populations of USP5 with different binding times before Ub chain cleavage. By adapting the experimental set-up, several kinetic parameters were determined on the example of USP2 and three differently linked Ub chains. These measurements provided evidence for a published model proposing that USP2 must undergo a conformational change after Ub chain binding to enable processing. The analyses further indicated this conformational change to be the crucial factor for USP2 substrate specificity.