title: Role of potassium ion channels (K+ channels) on proliferation and development of colonic cancer
Creators: name: Spitzner, Melanie
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Ionenkanal , Spannungskontrollierter Ionenkanal , Proliferation , Dickdarmkrebs , Kaliumkanal , , ion channel , proliferation , colonic cancer
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: As shown in the past potassium ion channels (K+ channels) and chloride ion channels (Cl- channels) are important for proliferation and survival of cancer cells. These ion channels are differentially activated in cancer cells compared to normal tissue or cells. The human colonic cancer cell line T84 was used for in vitro studies on K+ channels and the putative Cl- channel Bestrophin 1 (Best1). The expression of many different K+ channel types was screened by RT-PCR. However, only voltage-gated (Kv) channels have an impact on cell proliferation. Measurements of cell volume, intracellular pH, and intracellular Ca2+ concentration demonstrate that Kv channels control proliferation by affecting intracellular pH and Ca2+ signaling, but not by cell volume regulation. In further cell culture experiments two different clones of T84 cells were generated: a slow proliferating clone (T84- slow) and a fast proliferating clone (T84- fast). Expression of the Kv channel Eag1 and the putative Cl- channel Best1 was enhanced in T84- fast as compared to T84- slow. ATP-induced enhancement of the intracellular Ca2+ concentration was increased in T84- fast, indicating that Kv channels hyperpolarize the cell membrane and therefore enhance the driving force for Ca2+, which is necessary for cell cycle progression. Down regulation of Eag1 or Best1 by RNAi decreased cell proliferation in T84-fast. Furthermore, Best1 over expression in T84-slow increased the proliferation rate by 30% and improved cell volume regulation. These experiments demonstrate that Eag channels and Best1 have an important role in proliferation of colonic cancer cells. For the second part of this study the role of Kv channels in colonic cancer was evaluated in vivo in an animal model. The molecular and functional expression of these ion channels found in vitro in T84 cells were examined first in a chemical mouse model. For this purpose BL6 mice were treated with the chemical carcinogens DMH and MNU to induce the development of colonic cancer and to investigate ion channel properties in early stages of carcinogenesis. In carcinogen treated mice electrogenic salt transport by the epithelial sodium channel ENaC and the chloride channel CFTR were attenuated. In addition, activity of Kv channels was enhanced. Already in the first weeks after treatment semi-quantitative PCR showed an mRNA upregulation of the Kv channels Kv1.3, Kv1.5, Kv3.1, Eag1, Elk1, and Erg1. At the same time an increased Eag1 protein expression could be demonstrated. Furthermore, in cooperation with a group in Basel a genomic amplification of Eag1 was found in 3.5% of human colorectal adenocarcinomas identified by fluorescence in situ hybridization analysis (FISH). A second in vivo study was performed in a genetic mouse model of colonic cancer. BL6 mice with a mutation in the tumor suppressor gene APC (APC-Min/+) develop polyps in the whole intestine. These APC-Min/+ mice showed a significant weight loss and a reduced lifespan during an observation period of 21 weeks. An increased mRNA expression of the Kv channel Eag1, the Ca2+ sensitive Kv channel BK and the sodium channel ENaC could be detected by real time PCR. Ussing chamber studies demonstrated an enhanced sodium absorption by ENaC and an enhanced activity of BK and Eag1 channels. In summary activity of Kv channels like members of Kv1, Eag, or Ca2+ sensitive BK showed a direct correlation to cell proliferation and cancer development in vitro and in vivo. These channels may represent an important target for diagnosis and novel therapeutics of colonic cancer.
description: Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Kaliumionenkanäle und Chloridionenkanäle sehr wichtig für die Zellproliferation und das Überleben von Krebszellen sind. Diese Ionenkanäle weisen eine unterschiedliche Aktivität auf, wenn man normalen Zellen mit Krebszellen vergleicht. Für in vitro Studien an Kaliumionenkanälen und dem mutmaßlichen Chloridionenkanal Bestrophin 1 (Best1) wurde die humane Kolonkarzinomzelllinie T84 benutzt. Die Expression unterschiedlicher Typen von Kaliumionenkanälen konnte durch RT-PCR gezeigt werden. Aber nur spannungsabhängige Kaliumionenkanäle (Kv Kanäle) hatten einen Einfluss auf die Zellproliferation. Messungen von Zellvolumen, intrazellulären pH und Kalziumionenkonzentration zeigten, dass Kv Kanäle den intrazellulären pH und das Kalziumsignal die Zellproliferation kontrollieren. Sie haben aber keinen Einfluss auf die Volumenregulation. In weiteren Zellkulturexperimenten konnten zwei unterschiedliche Klone von T84 Zellen generiert werden: ein langsam wachsender Klon (T84-slow) und ein schnell proliferierender Klon (T84-fast). Die Expression des Kv Kanals Eag1 und des mutmaßlichen Chloridionenkanals Best1 war im Vergleich zu T84-slow in T84-fast erhöht. Die ATP induzierte Erhöhung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration war in T84-fast ebenfalls erhöht, was auf die Zunahme der Aktivität von Kv Kanälen zurückgeführt werden kann. Kv Kanäle haben die Aufgabe das Membranpotential der Zellen zu hyperpolarisieren, was zu einem erhöhtem Einstrom von Kalziumionen in die Zelle führt, welches wiederum zum Durchlaufen des Zellzyklus bei der Zellteilung notwendig ist. Die Hemmung der Expression von Eag1 oder Best1 durch RNAi hatte eine verminderte Zellproliferation zur Folge. Des Weiteren führte eine Überexpression eines Best1-Plasmids in T84-slow zu einer 30%igen Steigerung der Proliferationsrate und zu einer verbesserten Volumenregulation. Diese Experimente zeigen, dass sowohl Eag1 als auch Best1 eine wichtige Rolle bei der Proliferation von Kolonkarzinomzellen spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden in vivo Experimente im Tiermodell durchgeführt. Die molekularen und funktionellen in vitro Befunde aus der Zellkultur wurden zuerst in einem chemischen Mausmodell für Kolonkarzinom überprüft. Dafür wurden BL6-Mäuse mit den karzinogenen Substanzen Dimethylhydrazine (DMH) und N-methyl-N-nitrosourea (MNU) behandelt, um die Entstehung von Kolonkarzinom zu induzieren. Die so behandelten Mäuse zeigten einen verminderten elektrogenen Salztransport durch den epithelialen Natriumionenkanal ENaC und den Chloridionenkanal CFTR. Zusätzlich konnte eine erhöhte Aktivität von Kv Kanälen nachgewiesen werden. Semiquantitative PCR zeigte schon in den ersten Wochen nach der Behandlung eine erhöhte Expression von den Kv Kanälen Kv1.3, Kv1.5, Kv3.1, Eag1, Elk1 und Erg1. Parallel dazu wurden Proteinexpressionsnachweise durch Western Blots für Eag1 durchgeführt. Es konnte eine Erhöhung von Eag1 auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Weiterhin konnte durch eine Kooperation mit einer Arbeitsgruppe in Basel eine genomische Amplifikation von Eag1 in 3,5% der untersuchten humanen kolorektalen Adenokarzinome mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung gezeigt werden. Eine zweite tierexperimentelle Studie wurde in einem genetischen Mausmodell durchgeführt. BL6-Mäuse mit einer Mutation in dem Tumorsuppressorgen APC (APC-Min/+) entwickeln während ihres Lebens Polypen im gesamten Darmtrakt. APC-Min/+ Mäuse zeigten einen signifikanten Gewichtsverlust und eine verkürzte Lebensspanne während der Beobachtungsperiode von 21 Wochen. Durch real time PCR konnte eine erhöhte mRNA Expression des Kv Kanals Eag1, des kalziumionenaktivierten Kaliumionenkanals BK und des Natriumionenkanals ENaC nachgewiesen werden. Messungen des epithelialen Transportes durch Ussingkammertechnik zeigten eine erhöhte Natriumionenabsorption durch ENaC und verstärkte Aktivität von BK- und Eag1-Kaliumionenkanälen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Aktivität von Kv Kanälen der Kv Ionenkanalfamilien Kv1, Eag oder BK, sowohl in vitro als auch in vivo direkt mit der Zellproliferation und Krebsentwicklung korrelieren. Diese Kanäle könnten damit als wichtiges Ziel für Diagnose und Behandlung von Kolonkarzinom dienen.