Γενετική τροποποίηση υβριδίων τομάτας με το γονίδιο gmgstu4 της σόγιας και μελέτη της ανθεκτικότητας των δαγονιδιακών φυτών μετά από προσβολή με το βακτήριο Pseudomonas syringae pv. tomato και τον μύκητα Botrytis cinerea
Creators: name: Τζιούτζιου, Νικολέτα Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Τομάτα
Βιοτικές καταπονήσεις
Γενετική τροποποίηση
Βακτηριακή στιγμάτωση
Τεφρά σήψη
Solanum lycopersicum
Agrobacterium tumefaciens
Pseudomonas syringae
Botrytis cinerea

description: Η οικογένεια των ισοενζύμων των S-μεταφορασών της γλουταθειόνης (GST) εντοπίζονται σε όλους τους οργανισμούς και συμμετέχουν στην αντιοξειδωτική άμυνα των φυτών έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων. Το γονίδιο gmgstu4 της σόγιας κωδικοποιεί το ισοένζυμο GmGSTU4 το οποίο χαρακτηρίζεται από υψηλή δράση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GST/GPOX) και δρα ως εκκαθαριστής των ενεργών μορφών οξυγόνου και των προϊόντων της οξείδωσης των λιπιδίων. Η παρούσα εργασία αποτελείται από: 1) τον σχηματισμό γενετικά τροποποιημένων σειρών του υβριδίου τομάτας CLX3731 με το γονίδιο gmgstu4 μέσω της μεθόδου του Agrobacterium tumefaciens, την επιλογή, την ταυτοποίηση και τον έλεγχο της έκφρασης του διαγονιδίου και 2) τη μελέτη της ανθεκτικότητας διαγονιδιακών σειρών των υβριδίων τομάτας CLX3731, CLX3711 και Don Jose οι οποίες υπερέκφραζαν το παραπάνω γονίδιο, μετά από προσβολή με το βακτήριο Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 και τον μύκητα Botrytis cinerea αντίστοιχα. Για τη γενετική τροποποίηση χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα κοτυληδόνων του υβριδίου CLX3731. Τα αναγεννημένα γενετικά τροποποιημένα φυτά ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο της PCR και ελέγχθηκε η έκφραση του διαγονιδίου με τη μέθοδο της RT-PCR. Για τη μελέτη της ανθεκτικότητας σε βιοτικές καταπονήσεις, σκληραγωγημένα γενετικά τροποποιημένα και άγριου τύπου φυτά μολύνθηκαν με το βακτήριο P. syringae pv. tomato DC3000 και 5 ημέρες μετά μετρήθηκαν ο αριθμός μολυσμένων φύλλων και νεκρωτικών κηλίδων ανά φυτό. Παράλληλα, προσδιορίστηκε η ανθεκτικότητα των φυτών στην οξειδωτική καταπόνηση με μέτρηση της σχετικής διαρροής ιόντων φυλλικών δίσκων, δύο ημέρες μετά την προσβολή. Επιπλέον, αποκομμένα φύλλα μολύνθηκαν επιφανειακά με τον μύκητα B. cinerea. Η ένταση των συμπτωμάτων προσδιορίστηκε μετά από 3 ημέρες, με υπολογισμό του μέσο όρου της διαμέτρου των νεκρωτικών κηλίδων που σχηματίστηκαν ανά φύλλο. Παράλληλα, προσδιορίστηκε η ενζυμική δράση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης μετά από καταπόνηση με το βακτήριο και τον μύκητα. Τα γενετικά τροποποιημένα φυτά και των τριών υβριδίων παρουσίασαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην προσβολή με το βακτήριο P. syringae pv. tomato σε σύγκριση με τα φυτά άγριου τύπου. Οι σειρές Α1 και Α5 του υβριδίου CLX3711 και Β3 και Β7 του υβριδίου CLX3731 εμφάνισαν κατά μέσο όρο 1,5 φορές μικρότερο αριθμό μολυσμένων φύλλων ανά φυτό σε σύγκριση με τα φυτά άγριου τύπου ενώ οι σειρές C16 και C26 του υβριδίου Don Jose δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Όλες οι γενετικά τροποποιημένες σειρές παρουσίασαν κατά μέσο όρο 4 φορές μικρότερο αριθμό νεκρωτικών κηλίδων ανά φυτό όταν συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα φυτά άγριου τύπου καθώς και μικρότερη σχετική διαρροή ιόντων με τις σειρές Α1, Β3, Β7 και C26 να διαφέρουν στατιστικά σημαντικά από τους αντίστοιχους μάρτυρες. Επιπλέον, κατά τα πειράματα καταπόνησης με τον μύκητα, οι γενετικά τροποποιημένες σειρές παρουσίασαν κατά μέσο όρο 1,5 φορές μικρότερο μέγεθος διαμέτρου των νεκρωτικών κηλίδων ανά φύλλο σε σχέση με τα αντίστοιχα φυτά άγριου τύπου. Παρατηρήθηκε κατά μέσο όρο 3 και 3,6 φορές μεγαλύτερη ενζυμική δράση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης για τις γενετικά τροποποιημένες σειρές σε σχέση με τα αντίστοιχα φυτά μάρτυρες μετά από καταπόνηση με το βακτήριο και τον μύκητα. Η μελέτη του gstu4 γονιδίου σε διαγονιδιακά φυτά τομάτας αναμένεται να προσφέρει καινούριες δυνατότητες στην αντιμετώπιση των βιοτικών καταπονήσεων.
description: The GST isoenzymes form a large enzymatic superfamily which is abundant in all living organisms. They basically participate in the antioxidative defense mechanism of plants contributing to resistance against biotic and abiotic stress factors. The gmgstu4 gene codes for the GmGSTU4 isoenzyme which is previously characterized by high glutathione peroxidase activity catalyzing the detoxification of reactive oxygen species and lipid peroxidation byproducts. The basic aim of our study was: 1) the formation of genetically transformed lines of the tomato hybrid CLX3731, by inserting the gmgstu4 gene using the Agrobacterium tumefaciens method and also the selection, verification and determination of the expression of the transgenes. 2) To study the resistance of transformed lines of the tomato hybrids CLX3731, CLX3711 and Don Jose overexpressing the gmgstu4 gene, under the bacterial speck and gray mould diseases. Cotyledon explants of the CLX3731 tomato hybrid were used for the genetic transformation through cotyledon regeneration, on selection MSR medium. The verification of the genetically modified plants that derived was performed using the PCR method and the quantitative expression of the transgene was determined with the RT-PCR method. Two genetically transformed lines (B3 and B7) were selected and their clones were transferred into a greenhouse where they went through acclimation. In order to study the resistance against biotic stresses, in vivo transformed and wild type plants were infected using the bacterium P. syringae pv. tomato and 5 days later the number of infected leaves and the number of necrotic lesions were measured. Also, the resistance to oxidative stress was determined by calculating the relative electrolyte leakage of leaf disks 2 days after the infection. Furthermore, detached leaves were surface infected using the fungus B. cinerea. The intensity of the symptoms was determined 3 days after the infection by measuring the diameter length of the necrotic lesions that developed on the leaves. The glutathione peroxidation activity of the transgene was determined after infection with the above pathogens. The genetically transformed plants were in general characterized by higher resistance against P. syringae pv. tomato, DC3000 comparing to the wild type ones. The lines Α1, Α5 of the CLX3711 hybrid and Β3, B7 of the CLX 3731 hybrid showed 1,5 times less infected leaves per plant, whereas C16 and C26 lines did not show significant differences comparing to the wild type Don Jose plants. All the genetically transformed lines showed 4 times less necrotic lesions per plant and the Α1, Β3, Β7 and C26 lines showed less relative electrolyte damage comparing to the wild type plants. Also all lines showed 1,5 times less diameter length of the necrotic lesions formed per leaf after the infection with the fungus comparing to the wild type plants. The observed enzymatic activity was 3 and 3,6 times by average higher for the transgenic lines comparing to the wild type plants after infection with the bacterium and the fungus respectively. Concluding, overexpression of the GmGSTU4 isoenzyme in genetically transformed tomato plants contributed to their resistance against the two pathogens.