Der direkte Blick auf die Magnetosomen-Kette: PEEM- und SEM-Untersuchungen am intakten Magnetospirillum magnetotacticum
Creators: name: Keutner, Christoph
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2015
Subjects: subject: PEEM
subject: SEM
subject: SEM-EDX
subject: MTB
subject: Photoemission
subject: UHV-Präparation
subject: intakte Bakterien
subject: MCD
subject: Synchrotronstrahlung
subject: Magnetismus
subject: Strukturabbildung
subject: 530
subject: Magnetosom
subject: Photoemissionselektronenmikroskopie
subject: Rasterelektronenmikroskopie
subject: Synchrotronstrahlung
subject: magnetischer Sinn

description: In dieser Arbeit wurden magnetotaktische Bakterien der Spezies M. magnetotacticum mittels PEEM und SEM-EDX untersucht. Diese Bakterien zählen zu den interdisziplinär interessantesten Mikroorganismen. Aktuelle und potentielle zukünftige Anwendungen finden sie neben der Geologie, Astrobiologie und Paleomagnetik vor allen in der Nanorobotik, der Medizintechnik und anderen Biowissenschaften. Hierbei ist ein Verständnis ihrer Magnetosomenstruktur und ihres Magnetsinnes von außerordentlicher Wichtigkeit. Ziel dieser Arbeit war es daher Methoden zu entwickeln, mit denen sich diese Bakterien relativ schnell und einfach präparieren lassen, um das extrem schwierige Kultivieren der Bakterien zu umgehen. Gleichzeitig muss diese Methode Proben liefern, die sich durch ihre Oberflchenbeschaffenheit für mikroskopische Untersuchungen mit elektronenoptischer Bildgebung eignen. Mit diesen Proben wurden PEEM- und SEM-EDX-Untersuchungen durchgeführt um die Magnetosomen-Ketten im Inneren der Bakterien abzubilden und auf ihre chemische wie magnetische Struktur hin zu untersuchen. Auf dem Weg hierzu wurde eine neue Software entwickelt, die im Vergleich mit dem bisherigen Vorgehen eine ffektivere wie auch effzientere Durchführung der PEEM-Experimente ermöglicht. So wird die Anzahl der manuell durchzuführenden Arbeitsschritte am Experiment und der Strahllinie deutlich reduziert. Die Undulator-Lücke und die Position der Monochromatorelemente erfolgt hiermit ebenso vollautomatisch wie die Aufnahme der einzelnen PEEM-Bilder und des zugehörigen Photonenflusses. Dies reduziert die Fehleranfälligkeit deutlich und ermöglicht gleichzeitig eine schnellere Durchführung der Messungen. Im Zuge der Entwicklung einer geeigneten Probenpräparation wurde zunächst das natürlich Verhalten der Bakterien ausgenutzt. So reichert sich M. magnetotacticum selbstständig durch die Magneto-Aerotaxis in der OATZ an. Allein hiermit lässt sich jedoch noch keine geeignete Probe präparieren. Wie hier gezeigt sind die Bakterien noch von zu vielen Nährmediumsrückständen umgeben. Eine Reduktion dieser Rückstände konnte mittels eine Reihe von Waschprozeduren erzielt werden, die aus wiederholtem Zentrifugieren, Dekantieren und Resuspendieren bestehen. Als Nebenprodukt der Reduzierung der Nährmediumsrückstände treten hiernach vermehrt Salzreste auf der Probenoberfläche auf. Diese erschweren die Abbildung der Bakterien, da sie eng von den Salzresten umgeben sind und teils verdeckt werden. Eine Abbildung der M. magnetotacticum gelang in diesem Stadium nur mittels einer Goldbeschichtung der gesamten Probenoberfläche. Beschichtungen dieser Art sind jedoch nicht wünnschenswert, da sie eine nähere Untersuchung des Bakterieninneren verhindern. Aus diesem Grunde wurden mehrere Nachbehandlungen der gewaschenen Bakterienlösung getestet, mit dem Ziel diese Salzreste zu minimieren. Aus den in dieser Arbeit vorgestellten Behandlungen hat sich eine Kombination aus Verdünnung der Bakterienlösung mit anschließendem Abschwemmen der getrockneten Probenoberfläche als geeignetste Methode ergeben. So ließ sich eine hohe Dichte an freiliegenden Bakterien, bei gleichzeitiger Reduktion der verbleibenden Salzreste erzielen. Hierüber hinaus wurde zusätzlich eine alternative Methode entwickelt. Diese liefert Proben mit einer vergleichbaren Oberflächenbeschaffenheit zur oben beschriebenen Methode. Dabei kommt sie weitgehend ohne zusätzliche weitere Arbeitsschritte wie das Zentrifugieren aus. Der reduzierte Aufwand wirkt sich dabei zu Ungunsten der Bakteriendichte aus. Trotzdem liefert diese Alternative Proben mit einer höheren Bakteriendichte, als dieser Arbeit vorangegangene Präparationen. Anknüpfend an die ersten Abbildung des M. magnetotacticum mittels PEEM erfolgten weitere Untersuchungen an diesen Bakterien, präpariert nach den hier entwickelten Methoden. Da die Ortsauflösung in der Hochenergie-Emission verglichen mit der Schwellenwert-Emission geringer ist, wurde zunächst untersucht, wie sich die Bakterien in PEEM-Aufnahmen identifizieren lassen. Hierzu wurden mittels PEEM-Aufnahmen in Schwellenwert-Emission sowie mittels lichtmikroskopischer Aufnahmen Kriterien zur Identifizierbarkeit und Verwendbarkeit der Bakterien für weitere Untersuchungen aufgestellt. Unter Verwendung dieser Kriterien ließen sich nun erstmals auch Messungen an M. magnetotacticum in Hochenergie-Emission durchführen. Aus PEEM-XAS Aufnahmen und den hieraus extrahierten Spektren an der Eisen-Kante ließ sich dabei die Zugänglichkeit der Magnetosomen-Ketten in den MTB mittels PEEM eindeutig nachweisen. Obwohl die Magnetosomen lediglich einen kleinen Bruchteil der Bakterien ausmachen, ist deren Eisen-Signal eindeutig erkennbar. Mittels zirkular polarisiertem Licht konnte darüber hinaus sogar auf die magnetische Struktur der Magnetosomen- Kette zugegriffen werden. Anhand des Vergleiches mit theoretischen Berechnungen beider Magnetit-Untergitter gelang es ferner Rückschlüsse auf die magnetische Orientierung der einzelnen Magnetosomen in der Kette zu treffen. Demnach liegen die einzelnen Magnetosomen in der Magnetosomen-Kette in einer ferromagnetischen Anordnung vor. Komplementär zu den PEEM-Untersuchungen wurden die M. magnetotacticum-Proben ebenfalls mittels SEM und SEM-EDX untersucht. Bis zum Zeitpunkt dieser Arbeit gab es dabei lediglich indirekte Nachweise der Magnetosomen-Kette mittels SEM. In dieser Arbeit gelang es erstmals Partikelketten mittels SEM direkt innerhalb intakter MTB zu beobachten. Die weiteren Untersuchungen dieser Strukturen ergab dabei den Nachweis, dass es sich bei diesen um die Magnetosomen-Ketten der Bakterien handelt. Die erzielbare Auflösung erlaubt es dabei einzelne Magnetosomen innerhalb der Kette abzubilden. Mittels dieser Methodik lassen sich relativ schnell Informationen wie die Größe und Form der einzelnen Magnetosomen und die Länge der Magnetosomen-Kette gewinnen. Ohne die Magnetosomen extrahieren zu müssen, konnte so eine Analyse ihrer speziestypischen Charakteristika erfolgen. Die Ergebnisse ergaben dabei eine sehr gute Übereinstimmung mit vorherigen Analysen. Zudem konnte so auch die typische Anzahl an Magnetosomen pro Individuum betrachtet werden. Hierbei handelt es sich um eine Größe, die bei der Analyse extrahierter Magnetosomen nicht zugänglich ist. Mittels der SEM-EDX-Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass es sich bei den Partikelketten in den SEM-Bildern eindeutig um die eisenhaltigen Magnetosomen handelt. Auch die chemischen Unterschiede, zwischen dem Bereich der Magnetosomen-Kette und dem Referenzbereiche, ließen sich durch das unterschiedliche Signalverhalten entlang der Magnetosomen-Kette klären. Hierdurch konnte ebenfalls auf die Komposition der Magnetosomen aus Magnetit geschlossen werden. Die in dieser Arbeit beschriebene Methodik erlaubt es demnach mittels SEM und einer präparierten Probe mehrere Aspekte eines MTB zu analysieren. Diese reichen von Form und Struktur des Bakteriums, der Kette und der einzelnen Magnetosomen bis hin zur chemischen Zusammensetzung. Die Untersuchungen haben dabei gezeigt, dass ein Einblick in intakte Bakterien sowohl mittels PEEM als auch SEM möglich ist. Besonders für die Untersuchung neu entdeckter MTB-Spezies ist dies von Bedeutung. So sind bislang mehrere unterschiedliche Präparate erforderlich um an diese Information zu gelangen. Ein Kultivieren der Bakterien ist demnach nahezu unumgänglich, was sich für die meisten Spezies als äußerst schwierig erwiesen hat. Folglich ging der Erkenntnisgewinn in diesem Feld zeitweise schleppend vonstatten. Hier ist es nun möglich mit der selben Probe an diese Informationen zu gelangen und im Anschluss sogar PEEM-Messungen durchzuführen um die magnetischen Eigenschaften der Bakterien zu ergründen. Nachdem in dieser Arbeit die wichtigen und grundlegenden Techniken sowohl entwickelt als auch demonstriert wurden und ein Einblick in die magnetische Struktur der Magnetosomen-Kette des M. magnetotacticum gelang, gilt es in folgenden Arbeiten diese auf die Breite der unterschiedlichen MTB-Spezies zu übertragen. So ist bereits bekannt, dass die Form und Größe der Magnetosomen charakteristisch für einzelne Spezies ist. Eine Untersuchung der Anzahl der Magnetosomen pro Kette verschiedener Spezies würde Aufschluss geben, ob es sich hier ebenfalls um eine derartige Charakteristik handelt. Ebenso wäre eine Weiterentwicklung der PEEM-Systeme hin zu einer besseren maximal erzielbaren Ortsauflösung wünschenswert. Hiermit ließen sich in Zukunft einzelne Magnetosomen individuell und im Zusammenspiel mit den andern Magnetosomen der Kette untersuchen.