title: Flavonolignan Biosynthesis in Silybum marianum – Potential Regulatory Mechanisms and Candidate Genes
title: Flavonolignan Biosynthese in Silybum marianum – Mögliche Regulationsmechanismen und Kandidatengene
Creators: name: Poppe, Lennart
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Dirigierende Proteine
Mariendistel
Flavonolignane , Phenylpropanstoffwechsel
silymarin, dirigent protein
In-vitro-Kultur , Silibinin
Biosynthese
chemotypes
Kandidatengen
Peroxidase
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Silymarin, ein
      Flavonolignangemisch aus der Mariendistel (Silybum marianum,
      Asteraceae), wird überwiegend zur unterstützenden Therapie
      von chron. Lebererkrankungen sowie zur Prävention tox.
      Leberschäden genutzt. Zusätzlich werden positive Effekte wie
      Tumorhemmung und immunmodulatorische Mechanismen beschrieben.
      Die Pflanze reichert Silymarin hauptsächlich in der
      Samenschale und Fruchtwand an. Dies dient zum Schutz des
      Keimlings gegen Pflanzenfresser und um Bakterien-, Pilz- oder
      Virusinfektionen einzudämmen oder zu verhindern. Der letzte
      Schritt im Biosyntheseweg von Silymarin ist noch nicht
      vollständig aufgeklärt. Ausgangssubstrat ist die Aminosäure
      L-Phenylalanin, die zu 4-Cumaroyl-CoA umgewandelt wird,
      welches eine essentielle Vorstufe für die Synthese von
      Flavonoiden und Monolignolen ist. Ein Flavonoid (Taxifolin)
      und ein Monolignol (Coniferylalkohol) reagieren dann über
      Radikalbildung, Verknüpfung, Umlagerung und anschließendem
      Ringschluss zu Silymarin. Dabei entstehen mehrere
      Positionsisomere (hauptsächlich Silychristin, Silydianin,
      Silybin und Isosilybin), wobei die beiden zuletzt genannten
      als Diastereomerenpaare vorliegen. Die Verteilung der
      Regioisomere unterscheidet sich in Ökotypen/Kultursorten und
      Genotypen. Für die Radikalbildung ist sehr wahrscheinlich
      eine Peroxidase verantwortlich. Es ist nur sehr wenig darüber
      bekannt, wie die Differenzierung zwischen den Regioisomeren
      und Diastereomeren in der Pflanze abläuft, deshalb wurde eine
      mögliche Beteiligung von dirigierenden Proteinen untersucht.
      Aus Keimlingen dreier S. m. Varianten wurden in-vitro
      Kulturen angelegt, um zusätzliche Erkenntnisse über Gehalt
      und Zusammensetzung der Flavonolignane zu erhalten. Weiterhin
      wurde die Sekretion der Sekundärstoffe in Zellwand und Medium
      von Suspensionskulturen untersucht. Eine Kulturlinie wurde
      über einen zweiwöchigen Zeitraum in Bezug auf verschiedene
      Mediumskenngrößen, Silymarinbildung und entsprechende
      Enzymaktivitäten charakterisiert. Mit der gleichen
      Kulturlinie wurde auch eine Elicitierung durchgeführt. Obwohl
      eine geringe Zunahme an Silymarinkomponenten beobachtet
      werden konnte, sind die in Suspensionszellen von S. m.
      produzierten Mengen an Flavonolignanen leider sehr gering.
      Bemerkenswert dabei war ein Zusammenhang zwischen den
      einzelnen Positionsisomeren des Silymarins, extrahiert aus
      den reifen Fruchtschalen, und den entsprechenden in-vitro
      Kulturen. Die Zusammensetzung der Regioisomere in den
      Suspensionszellen hat Ähnlichkeit mit dem Chemotyp der
      Pflanzenherkunft. Dies untermauert die Annahme von
      genotypischen Variationen und eine mögliche Beteiligung
      regulatorischer Mechanismen. Erhöhte Taxifolinkonzentrationen
      in Enzymassays steigerten zwar die Bildung von zwei
      spezifischen Regioisomeren, weitere direkte Wege der
      Differenzierung konnten jedoch nicht gefunden werden. Da auch
      das Medium der Suspensionszellen Enzymaktivität und
      Flavonolignane aufwies, spielen vermutlich auch
      Transportsysteme eine Rolle. Durch molekularbiologische
      Methoden konnten eine sekretorische Peroxidase (Klasse III),
      eine Laccase der Cupredoxin-Familie und zwei dirigierende
      Proteine im Genpool von S. m. identifiziert werden. Die
      Expression dieser Gene in verschiedenen E. coli und
      Hefestämmen erwies sich leider als sehr schwierig. Diese
      Problematik wurde verstärkt durch die Anwesenheit von
      Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, welche
      wichtig für Aufbau und Funktion der Proteine sind. Für die
      Gewinnung rekombinanter Proteine wäre eine weitere
      Optimierung notwendig. Die an der Kopplungsreaktion zwischen
      Taxifolin und Coniferylalkohol beteiligen Enzyme konnten auch
      aus in-vitro Zellen und dem Medium gewonnen werden. Das
      verantwortliche Enzym konnte durch chromatographische
      Trennverfahren erfolgreich als Peroxidase mit einem
      Molekulargewicht von etwa 45 kDa bestimmt werden. Im
      Allgemeinen sollte sie in Struktur und Funktion der
      Meerrettich-Peroxidase (HRP) ähneln. Allerdings konnte dieses
      Protein allein nicht die Bildung einzelner Regioisomere des
      Silymarins gezielt steuern. Obwohl dirigierende Proteine auf
      genomischer Ebene nachgewiesen wurden, konnte ihre Gegenwart
      in Enzymextrakten oder ihre tatsächliche Beteiligung an der
      Bildung unterschiedlicher Silymarinkomponenten nicht belegt
      werden. Sie könnten organspezifisch oder zu verschiedenen
      Entwicklungstadien der Pflanze exprimiert werden. Eine
      Beteiligung nur während der Fruchtentwicklung und
      Reifungsphase wäre denkbar. Zusammenfassend lässt sich sagen,
      dass im Rahmen dieser Arbeit Enzyme untersucht wurden, die
      vermutlich den letzten Schritt der Silymarin-Biosynthese
      katalysieren. Zahlreiche Faktoren wurden angesprochen, die
      möglicherweise die Zusammensetzung der Positionsisomere
      regulieren. Während die Expression der rekombinanten Proteine
      eine Herausforderung bleibt, wurden weitere Lösungsvorschläge
      vorgestellt. Eine Fortsetzung dieses Projektes scheint
      vielversprechend und hinsichtlich einer weiteren Aufklärung
      dieses Themas sehr interessant.
description: Silymarin, a flavonolignan mixture
      from milk thistle (Silybum marianum, Asteraceae), is mainly
      used for the supportive therapy of chronic liver diseases or
      to prevent toxic liver damage. In addition, beneficial
      effects for human health like tumor inhibition and
      immunomodulatory mechanisms have been reported. The plant
      produces and accumulates silymarin mainly in the testa and
      pericarp for protection of its sporophytic embryo against
      plant herbivores and to limit or prevent bacterial, fungal or
      viral infections. The final step in the biosynthetic pathway
      of silymarin is not yet fully elucidated. Starting point is
      the amino acid L-phenylalanine which is converted to
      4-coumaroyl-CoA which is the essential precursor for
      flavonoids and monolignols. A flavonoid (taxifolin) and a
      monolignol (coniferyl alcohol) then are transformed to
      silymarin by radical formation (oxidation), coupling,
      rearrangement and subsequent cyclisation. Several positional
      isomers (mainly silychristin, silydianin, silybin and
      isosilybin) occur, the latter two being present as
      diastereomeric pairs. The distribution of these regioisomers
      differs in ecotypes/cultivars and genotypes. Whereas a
      peroxidase (POD) is probably responsible for the radical
      formation, very little is known about how the plant
      discriminates between its regioisomers and diastereomers. A
      potential involvement of dirigent proteins (DIRs),
      controlling the formation, has been investigated. In vitro
      cultures have been established from seedlings of three
      Silybum marianum varieties for further insights into
      flavonolignan content and composition in suspension cultures
      and the release of flavonolignans to the outer compartments.
      Additionally, over a period of two weeks, one culture line
      was characterised based on various medium parameters,
      silymarin formation and corresponding enzyme activities. The
      same culture line was also subjected to an elicitation
      attempt. However, despite a slight increase in the quantities
      of the specialised metabolites of the silymarin mixture, the
      amounts of flavonolignans produced in suspension cells of
      Silybum marianum are very low. Interestingly, a connection
      between the individual positional isomer amounts of silymarin
      extracted from the mature fruit skins and the respective in
      vitro cells could be determined. The regioisomer composition
      in suspension cells resembled the chemotype of the plant
      origin. This underlined the assumption of the existence of
      high genotypic variations and the possible presence of
      involved regulatory mechanisms. Higher taxifolin
      concentrations increased the formation of two specific
      regioisomers in enzyme assays but no further direct mechanism
      for discrimination could be found. Since enzyme activity and
      flavonolignans could also be detected in the medium of
      suspension cells, transport systems might play a role as
      well. A class III secretory peroxidase, a laccase of the
      cupredoxin superfamily and two different dirigent proteins
      could be identified to be a part of the gene pool of Silybum
      marianum. Unfortunately, the expression of these genes in
      different E. coli and yeast strains turned out to be a big
      hurdle. Signal peptides and several glycosylation sites,
      crucial for structure and activity, greatly contribute to
      this. Optimisation at some points would be necessary in order
      to yield recombinant proteins. On the other hand, the
      enzyme(s) involved in the coupling reaction between taxifolin
      and coniferyl alcohol could be extracted from in vitro cells
      and the respective medium. The radical-forming protein could
      successfully be identified as a peroxidase with a molecular
      weight of about 45 kDa using chromatographical methods. In
      general, structure and function should be similar to the
      versatile used horseradish peroxidase (HRP). However, this
      protein alone could not specifically regulate the formation
      of individual silymarin regioisomers. Even though dirigent
      proteins could be identified on the genomic level their
      presence in enzyme preparations or an actual involvement
      could never be proven. Their expression and utilisation could
      be plant organ- and/or time-specific, namely active only
      during the fruit development and maturation phase. In
      summary, in the scope of this thesis, enzymes probably
      involved in the final step of the silymarin biosynthesis and
      numerous factors possibly regulating the positional isomer
      ratios were discussed and highlighted. While issues
      concerning the expression of recombinant proteins remained to
      be challenging, reasonable solutions were presented. A
      continuation of this project seems promising and very
      interesting for further clarification of this
      subject.