Υπερέκφραση του γονιδίου της λίπασης του Thermus Thermophilis από κύτταρα E.coli. Καθαρισμός και μελέτη των ιδιότητων του παραγόμενου ενζύμου
Creators: name: Αθανασιάδης, Ιωάννης Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Υπερέκφραση
Λίπαση
Thermus Thermophilus
Overexpression
Lipase

description: Οι λιπάσες (E.C.3.1.1.3) είναι ιδιαίτερα γνωστοί βιοκαταλύτες λόγω των πολλών και καινοτόμων εφαρμογών τους στη βιομηχανία ελαίου, στην οργανική σύνθεση, στα απορρυπαντικά και στη διατροφή. Τα ένζυμα αυτά καταλύουν την υδρόλυση τους εστέρες των καρβοξυλικών οξέων και βρίσκονται σε διάφορους οργανισμούς όπως ζώα, φυτά, μύκητες και βακτήρια. Επιπρόσθετα, οι λιπάσες είναι μοναδικές καθώς καταλύουν την υδρόλυση των τριακυλογλυκερολών σε γλυκερόλη και ελεύθερα λιπαρά οξέα στη διεπιφάνεια νερού-ελαίου και μπορούν να καταλύσουν την αντίστροφη αντίδραση σε μη υδατικό περιβάλλον. Ο Thermus thermophilus HB8 ανήκει στο φύλο Deinococcus-Thermus και είναι ένα θερμοφιλο βακτήριο με βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης από 65 έως τους 72 οC. Είναι ένα βακτήριο το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί όχι μόνο για τη μελέτη των υπερθερμοφιλων βακτηρίων αλλά επίσης αποτελεί πηγή θερμοάντοχων ενζύμων τα οποια μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διάφορες βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Ανάλυση με BLAST έδειξε ότι το προϊόν του γονιδίου TTHA1268 του T. thermophilus μοιράζεται ομολογίες αντίστοιχων λιπασών και διαθέτει κουτί λιπάσης G-X-S/C-X-G το οποίο είναι χαρακτηριστικό της οικογένειας των λιπασών/εστερασών. Στην παρούσα εργασία, το γονίδιο TTHA1268 κλωνοποιήθηκε και το προϊόν της κλωνοποίησης χαρακτηρίστηκε. Η λιπάση υπερεκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με ουρά έξι ιστιδινών στο C-τελικό άκρο. Το ανασυνδυασμένο ένζυμο καθαρίστηκε με χρωματογραφία αγχιστείας ιόντος μετάλλου και μελετήθηκαν οι ιδιότητές του. Η δράση λιπάσης επιβεβαιώθηκε και το ανασυνδυασμένο ένζυμο επέδειξε παρόμοιες ιδιότητες με τη φυσιολογική, σημαντική θερμοσταθερότητα και ανοχή σε οργανικούς διαλύτες.
description: Lipases (E.C.3.1.1.3) are very prominent biocatalysts due to their novel and many applications in oleochemistry, organic synthesis, detergent formulation and nutrition. These enzymes catalyze the hydrolysis of carboxyl esters and are present in various organisms including animals, plants, fungi and bacteria. Moreover, lipases are unique in catalyzing the hydrolysis of fats into fatty acids and glycerol at the water-lipid interface and reversing the reaction in non-aqueous media. Thermus thermophilus HB8 belongs to the Deinococcus-Thermus phylum and is a thermophilic bacterium with an optimum temperature range of 65 to 72 °C. T. thermophilus is an appealing bacterium not only as a model for investigations on extreme thermopiles but also as a protein pool of vigorous and thermostable enzymes that can be utilized in various biotechnological applications. BLAST analysis over the conserved domain database indicated that the product of T. thermophilus TTHA1268 gene shares significant homologies with respective lipases and possess a lipase box G-X-S/C-X-G characteristic in lipase/esterase superfamily. In this work the TTHA1268 gene was cloned and its product was characterized. Lipase is overexpressed as a recombinant protein with a 6xHis tag at the C-terminal. The recombinant enzyme was purified closed to homogeneity with metal affinity chromatography and biochemically characterized. Lipase activity was confirmed and the recombinant enzyme revealed similar properties with the native one and significant thermostability and tolerance in organic solvents.