Differential diagnosis of Gaeumannomyces graminis and Nakataea oryzae based on the hyphopodia. New report of Gaeumannomyces oryzicola in Cuba
Creators: name: Barrios, Luis Manuel
Publisher: name: figshare
Year: 2018
Subjects: subject: Microbiology
subject: FOS: Biological sciences
subject: FOS: Biological sciences
subject: 60409 Molecular Evolution
subject: 60505 Mycology
subject: 60704 Plant Pathology
subject: 60207 Population Ecology
subject: 70101 Agricultural Land Management
subject: FOS: Other agricultural sciences
subject: FOS: Other agricultural sciences

description: INTRODUCCIÓN<br>Los hongos constituyen un grupo importante de microorganismos que inciden positiva o negativamente en la vida del hombre. Por tal motivo, conocer las interacciones planta-hongo, las estructuras y metabolitos que intervienen en esta relación es de vital importancia en la biotecnología vegetal y aplicada en la actualidad. El estado vegetativo típico de los hongos es el micelio compuesto por las hifas, quien soporta todas sus estructuras y constituye un punto estratégico en su diagnóstico. (Recio y Maldonado, 2013; Zhang et al., 2013). <br><br>Los Ascomycota, como los patógenos Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx &amp; Olivier var. graminis (Ggg) y Nakataea oryzae (Catt.) J. Luo &amp; N. Zhang (Ns), pueden formar ascorarpos, “esclerocios”, hifopodios y otras estructuras pleomorficas. (Hernández et al., 2016; Zhang et al., 2016). El talo es septado, haploide y bien desarrollado, con hifas gruesas y delgadas muy ramificadas. El mismo puede desarrollar estructuras de gran importancia diagnóstica, como son los hifopodios lobulados y no lobulados. Estos los describe Barnet (1972), como 1 ó 2 o varias ramificaciones celulares del micelio, los cuales no deben confundirse con los apresorios ya que tienen funciones biológicas completamente diferentes. <br><br>Ggg y Ns, son hongos del suelo que causan enfermedades en muchas gramíneas. Tal es el caso de Oryza sativa L, una de las plantas de mayor importancia alimenticia a nivel mundial. Estos son considerados en la actualidad en Cuba altamente peligrosos para el cultivo, donde causan pudriciones oscuras en la base de los tallos, vainas y raíces y segregación hacia las semillas (Neninger et al., 2002). Anualmente el número de hectáreas por sembrar en la isla aumenta, fundamentalmente de las variedades Perla, IAC-14, Reforma y J-101, con aproximadamente entre un 5-85% de área sembrada (FAOSTAT, 2017).<br><br>Frecuentemente, el diagnóstico tradicional de Ggg es confundido con Ns debido a la similitud en las gamas de sintomatologías, en la formación de hifopodios y en la pigmentación de la colonia que es igual. Lo que conlleva la aplicación de medidas de biocontrol erróneas en los cultivos y la demora en la liberación de los lotes de germoplasma. (Yang et al., 1994).<br><br>Debido a la importancia que tiene realizar un diagnóstico más seguro y certero de los patógenos Ggg y Ns en el arroz y al ser los hifopodios las estructuras con importancia taxonómica que primero son observadas en ambos hongos, el objetivo del presente trabajo es realizar una descripción taxonómica de los hifopodios, confeccionar una clave de diagnóstico para estadios tempranos y ampliar los conocimientos existentes en la isla de las cepas autóctonas en ambos, lo que permitirá emitir un informe fitosanitario rápido y seguro, y tomar las medidas agro-técnicas más adecuadas para evitar pérdidas de las cosechas.<br><br>MATERIALES Y METODOS<br>Se analizaron muestras de arroz depositadas en la micoteca y germoplasma del laboratorio de biotecnología del Centro de Investigaciones de Bioelementos Naturales. 218 muestras frescas sintomáticas de tallos, raíces, hojas y 500 semillas manchadas de diferentes variedades de arroz procedentes principalmente de pequeños agricultores y recolectadas de varias zonas arroceras del país (San José, El Corojal, Los Naranjos, Nueva Paz, Mayabeque, Guantánamo, Las Tunas, Bayamo-Granma, Matanzas, Cienfuegos, Sancti Spiritu, Santiago de Cuba, La Coca, Camagüey y La Habana) con sintomatologías descritas para Ggg y Ns según los criterios descritos por CPC (2001). Se emplearon 5 réplicas por tratamiento. Todas las observaciones se realizaron a partir del tercer día y hasta los 14, todos los días y a la misma hora para observar el desarrollo de los hifopodios.<br><br>Las muestras se analizaron mediante los métodos convencionales de laboratorio. Las observaciones de las cámaras húmedas y de los medios de cultivos se realizaron a los 3 días y se describieron las características morfológicas de los hifopodios. Se realizaron observaciones de las raíces y tallos bajo el microscopio estereomicroscopio Stemi 2000, para detectar la presencia de hifas pigmentadas y/o peritecios de Ggg, “esclerocios” y/o conidios de Ns. Las estructuras detectadas fueron inoculadas en placas con agar-agar agua (agar 20 g/L Applichem + sulfato de estreptomicina a 300 ppm) e incubadas a 28 ºC por 3-14 días en oscuridad continua. Los aislados se purificaron por trasferencia continua de ápices hifales en Agar Papa Dextrosa (PDA -papa natural pelada 200g/L + Dextrosa 20 g/L + Agar 20 g/L) e incubados bajo las mismas condiciones. Los medios de cultivos se filtraron y esterilizaron por 15 minutos a 121 ºC. (Torres, 2002).<br><br>Para obtener un mayor número de cepas puras aisladas se cortaron zonas necrosadas, manchas o podredumbres a razón de 1 cm2 aproximadamente, los cuales se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 5 minutos, aclarado con abundante agua estéril e inoculación profunda en placas petri con agar agua más sulfato de estreptomicina a 300 ppm, pH = 8, oscuridad continua y 28 ºC. Los granos manchados se desinfectaron por 5 minutos en hipoclorito de sodio al 1%, lavados con abundante agua estéril y posteriormente analizados siguiendo la metodología del ISTA (1976). Se colocaron 50 semillas por placas de Petri de 12 cm de diámetro en cámaras húmedas, se incubaron en alternancia luz–oscuridad (8h/16h) y a 20–24 ºC, durante 8 días. Las identificaciones se hicieron con base en las estructuras reproductivas observadas microscópicamente, usando lactofenol como líquido de montaje. Se realizaron inoculaciones asépticas de las estructuras vegetativas a placas con agar-agar agua (agar 20 g/L, Applichem + sulfato de estreptomicina a 300 ppm) e incubadas a 28 ºC por 3-14 días en oscuridad continua. Se siguieron los criterios taxonómicos descritos por Hernández et al., 2016; Barrios 2004; Torres 2002; Chidambaram et al., 1973 y Benoit y Marthur 1970.<br><br>Para la obtención de los cultivos puros, se siguieron los criterios morfo-culturales descritos por Torres (2002), la incubación se prolongó hasta los 60 días, para permitir así que todas las estructuras de reproducción de ambos hongos se formaran. Luego por transferencias apicales de las hifas, por ascosporas, peritecios y conidios, se obtuvieron los cultivos puros. <br>Se realizaron nuevas réplicas de los cultivos puros obtenidos de Ggg y Ns para observar nuevamente la formación de los hifopodios desde el inicio del crecimiento hifal desde los cultivos puros. A este estudio se la nombró como “punto cero”. El pH de los medios de cultivos se ajustó a 8. Las ilustraciones se prepararon mediante el uso de una cámara lúcida con aumento de 200-400 X. <br><br>Se realizaron montajes de las cepas puras obtenidas por el método de microcultivo de Rivalier y de Seydel y descrito por Torres (2002) y usando medio de cultivo PDA con sulfato de estreptomicina (300 ppm) e incubadas a 28 ºC por 7-14 días en oscuridad continua. Siguiendo este diagrama de flujo: Se prepararon cámaras húmedas con PDA esterilizado a 55ºC. Con pipeta estéril se tomó 1 ml de PDA y se depositó una gota en el portaobjetos seco. Inocular en 4 lados opuestos punciones del cultivo puro, retirar y esterilizar con el mechero en cada una de las inoculaciones. Colocar sobre el medio un cubreobjetos y presionarlo ligeramente, pero dejando un espacio para que circule el aire. Observaciones entre las 24-48 horas al microscopio óptico <br><br>