title: Understanding metabolic robustness of Escherichia coli using genetic and environmental perturbations
Creators: name: Donati, Stefano
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Mikrobiologie
Metabolism
Escherichia coli
Systembiologie

description: Metabolism provides the essential biochemical intermediates and energy that enable life and its growth. In this thesis we studied robustness of Escherichia coli metabolism, by perturbing it with different methods and measuring the response at a molecular level. In Chapter 1, we introduce the latest insight into metabolic regulation and optimality in microbial model organisms. Overall, we identified and described two major gaps in knowledge: the limited amount of known metabolite-protein interactions and the unknown objectives towards which cells optimize their enzyme levels. Moreover, we provide a short introduction to the relevant methods utilized in this thesis. In Chapter 2, we describe a series of experiments which confirmed that CRISPRi is a reliable tool to specifically perturb metabolism in E. coli. We showcase the advantage of using a CRISPRi system integrated in the genome, which is suitable to apply inducible knockdowns of essential genes. We demonstrate this by characterizing growth for a library of over 100 strains and verifying inducibility and specificity with proteomics data. In Chapter 3 we applied the validated CRISPRi setup to perturb and study metabolism systematically. First, we used a pooled CRISPRi library to knock down all metabolic genes in E. coli. By following the appearance of growth defects with next generation sequencing, we show that metabolic enzymes are expressed at higher levels than strictly necessary. We then focused on a panel of 30 CRISPRi strains and characterize their response to lower enzyme levels with metabolomics and proteomics. We show that the metabolome can buffer perturbations of enzyme levels in two different stages: first, metabolites increase enzyme activity to maintain optimal growth and only later they activate gene regulatory feedbacks to specifically upregulate perturbed pathways. In Chapter 4 we employed a different approach to perturb bacterial metabolism, by growing E. coli in different environmental conditions and measuring the response at the metabolome level. We could show that in exponentially growing cells key biosynthetic products as amino acids and nucleotides are kept at relatively stable levels across different environments. We compared our dataset to a matching published proteomics dataset, showing that unlike the proteome, metabolite levels are independent from growth effects.
description: Der Stoffwechsel, oder auch Metabolismus, stellt die essentiellen Bausteine und die Energie bereit, die Leben und zelluläres Wachstum voraussetzen. In dieser Doktorarbeit wurde die Robustheit des Metabolismus von Escherichia coli untersucht, indem er mit verschiedenen Methoden perturbiert und die zelluläre Antwort auf molekularer Ebene verfolgt wurde. In Kapitel 1 werden die neuesten Erkenntnisse über die Regulation und Optimalität des Metabolismus in mikrobiellen Modellorganismen betrachtet. Zusammenfassend ließen sich zwei große Probleme feststellen: Zum einen die niedrige Zahl an nachgewiesenen Metabolit-Protein Interaktionen und zum anderen die unbekannten Ziele, auf deren Grundlage Bakterien ihre Enzymlevel regulieren und einstellen. Darüber hinaus werden in diesem Kapitel die für diese Arbeit relevanten und verwendeten Methoden besprochen. In Kapitel 2 werden eine Reihe von Experimenten beschrieben, die bestätigen, dass CRISPRi eine zuverlässige Methode ist, um den Metabolismus in E. coli spezifisch zu perturbieren. Außerdem werden die Vorteile von einem genomisch integriertem CRISPRi-System gezeigt, das dazu verwendet werden kann die Expression von essentiellen Genen induzierbar zu reprimieren. Die Induzierbarkeit und Spezifität konnten durch ein Wachstumsscreening von 100 Stämmen und Proteom-Analysen belegt werden. In Kapitel 3 wird dargestellt, wie das im vorherigen Kapitel beschriebene CRISPRi- System verwendet wurde, um den Metabolismus systematisch zu perturbieren und zu untersuchen. Zunächst wurde das Wachstum von Stämmen in einer gepoolten CRISPRi-Library, welche alle Gene im zentralen Stoffwechsel von E. coli beinhaltete, mittels Next-Generation Sequencing verfolgt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Enzyme im zentralen Metabolismus in höheren Mengen von der Zelle hergestellt werden, als es für die Aufrechterhaltung des Wachstums nötig wäre. Es wurden 30 CRISPRi Stämme mit Hilfe von Metabolomics und Proteomics genauer untersucht, um die zelluläre Antwort auf niedrigere Enzymlevel zu studieren. Hierbei konnte festgestellt werden, dass das Metabolom die Störung von Enzymleveln auf zwei unterschiedliche Wege puffern kann. Zunächst erhöhen Metabolite die Aktivität von Enzymen, um optimales Wachstum zu gewährleisten, und erst später aktivieren sie genregulatorische Feedback-Mechanismen, um perturbierte Stoffwechselwege spezifisch hochzuregulieren. In Kapitel 4 wird geschildert, wie eine alternative Methode, nämlich das Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, genutzt wurde, um den Metabolismus zu perturbieren und anschließend die metabolische Antwort zu bestimmen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass in exponentiell wachsenden Zellen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen die Konzentrationen von Schlüsselbausteinen, wie Aminosäuren und Nukleotiden, stabil gehalten werden. Diese Daten wurden zudem mit einem passenden, bereits publizierten Proteomics Datensatz verglichen und es konnte gezeigt werden, dass Metabolitkonzentrationen, im Gegensatz zu Proteinkonzentrationen, unabhängig von Wachstumseffekten sind.