Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της γενοτοξικής πρόσμιξης, υδραζίνη, σε φαρμακευτικά σκευάσματα αλλοπουρινόλης με UHPLC – FLD
Creators: name: Χριστοφή, Μάρλεν Αναξαγόρα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Υδραζίνη
Γενοτοξικές προσμίξεις
Χρωματογραφία υπέρ – Υψηλής Απόδοσης
Hydrazine
Genotoxic impurities
Ultra High Pressure Liquid Chromatography

description: Την ενασχόληση με το παραπάνω θέμα στην παρούσα Διπλωματική Εργασία πυροδότησε το ενδιαφέρον που στρέφουν οι ρυθμιστικές αρχές και οι φαρμακοβιομηχανίες τα τελευταία χρόνια στην ανάλυση των γενοτοξικών προσμίξεων στα φαρμακευτικά προϊόντα. Πιο συγκεκριμένα, η παρούσα προσέγγιση αποτελεί μία ενδιαφέρουσα μέθοδο για την ποσοτικοποίηση υπολειμμάτων της γενοτοξικής πρόσμιξης της υδραζίνης σε φαρμακευτικά σκευάσματα αλλοπουρινόλης, χρησιμοποιώντας την υγρή χρωματογραφία υπερ-υψηλής απόδοσης, συζευγμένη με ανιχνευτή φθορισμού. Η υδραζίνη παραγωγοποιήθηκε πριν την είσοδο της στη στήλη μέσω μιας ξεχωριστής χημείας, με ορθο – φθαλαλδεΰδη σε όξινες συνθήκες. Με τη χρήση μιας πολύ όξινης κινητής φάσης, το παράγωγο παρουσιάζει έντονο φθορισμό και έτσι καθίσταται κατάλληλο για ανίχνευση και ποσοτικοποίηση. Οι παράγοντες που επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης, καθώς και οι χρωματογραφικές παράμετροι διερευνήθηκαν διεξοδικά. Η επικύρωση της αναπτυχθείσας μεθόδου πραγματοποιήθηκε σε εύρος από 10 έως 200% του ορίου συγκέντρωσης «στόχου» του αναλύτη, με τη χρήση «των προφίλ ακριβείας» (accuracy profiles). Τα αναμενόμενα διαστήματα ανοχής, β, δεν υπερβαίνουν τα κριτήρια αποδοχής ±20, γεγονός που εγγυάται ότι το 95% των μελλοντικών αποτελεσμάτων θα βρίσκονται εντός των καθορισμένων ορίων μεροληψίας (bias). Το εύρος των σχετικών σφαλμάτων κυμάνθηκε μεταξύ 6,0 και 0,5% και οι τιμές της σχετικής τυπικής απόκλισης για την επαναληψιμότητα και την ενδιάμεση πιστότητα ήταν χαμηλότερες από 6,9% σε όλες τις συγκεντρώσεις. Το όριο ανίχνευσης (LOD) και το κατώτερο όριο ποσοτικοποίησης (LLOQ) ήταν επαρκή για τον συγκεκριμένο σκοπό και βρέθηκαν να είναι 0,3 ng/mL (που αντιστοιχούν σε 0,03 μg/g σε στερεό δείγμα) και 0,25 μg/g αντίστοιχα. Επιπρόσθετα, με σκοπό την αξιολόγηση της ανθεκτικότητας της μεθόδου, χρησιμοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός τόσο για τις χρωματογραφικές συνθήκες, όσο και για τη διαδικασία παραγωγοποίησης. Τέλος, ως απόδειξη της γενικής ιδέας, η επικυρωμένη μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς στην ανάλυση παρτίδων και δισκίων της δραστικής φαρμακευτικής ουσίας αλλοπουρινόλης, υποδεικνύοντας ότι η εν λόγω μεθοδολογία μπορεί να υιοθετηθεί από τα εργαστήρια ελέγχου ποιότητας
description: The analysis of genotoxic impurities in pharmaceuticals has drawn the attention of regulatory agencies and pharmaceutical industries. The present approach poses an interesting way to quantify residues of the genotoxic impurity hydrazine in allopurinol and its pharmaceutical formulations using ultra high performance liquid chromatography coupled to fluorescence detection. Hydrazine was pre-column derivatized through a unique chemistry with o-phthalaldehyde under acidic conditions. Using highly acidic mobile phase the derivative exhibits a strong fluorescence intensity. Derivatization (reaction time, pH, reagent concentration etc) and chromatographic (mobile phase pH, buffer concentration, gradient elution program, etc) parameters were thoroughly investigated. The validation of the developed method has been carried out in the range of 10 to 200 % of the target concentration limit of the analyte using the accuracy profiles as a graphical decision making tool. The β-expectation tolerance intervals did not exceed the acceptance criteria of ± 20% which means that 95% of future results will be included in the defined bias limits. The variation of the relative bias ranged between ─ 6.0 and 0.5 % and the RSD values for repeatability and intermediate precision were lower than 6.9 % in all cases. The achieved limit of detection (LOD) and the lower limit of quantification (LLOQ) were adequate for the specific purpose and found to be 0.3 ng mL-1 (corresponding to 0.03 μg g-1 in solid sample). Experimental designs were constructed to study the robustness of the instrumental method and the derivatization procedure. As proof-of-concept, the validated method was successfully applied in the analysis of allopurinol API batches and tablets indicating that this methodology could be adopted from QC laboratories