Μικροχλωρίδα του εδώδιμου χερσαίου σαλιγκαριού Cornu aspersum και ενίσχυση του αμυντικού του συστήματος
Creators: name: Ντούσκου, Εσμεράλντα Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Προβιοτικά
Λιστέρια
Συμβίωση
Δυσβίωση
Probiotics
Listeria
Symbiosis
Dysbiosis

description: Το σύνολο των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της εντερικής μικροχλωρίδας και του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, αποτελούν βασικό μηχανισμό για τη διατήρηση και ενίσχυση της ομοιόστασης. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες, όπως οι παθογόνοι μικροοργανισμοί, μπορούν να διαταράξουν την ομοιόσταση του οργανισμού, οδηγώντας σε καταστάσεις δυσβίωσης. H αναβίωση μπορεί να επιτευχθεί μέσω της χορήγηση προβιοτικών μικροοργανισμών. Ωστόσο, η γνώση μας έχει περιοριστεί κυρίως στο σύστημα των ανώτερων σπονδυλωτών, αφήνοντας πίσω αναπάντητα ερωτήματα για τη ρύθμιση της ανοσίας των ασπόνδυλων ζωών, συμπεριλαμβανομένων των σαλιγκαριών Cornu aspersum maxima. Στη παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά απομόνωση και χαρακτηρισμός υποψήφιων προβιοτικών και δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών. Η έρευνα εστιάστηκε: α) στην πιθανή προβιοτική δράση των αυτόχθονων της εντερικής μικροχλωρίδας Lactobacillus στελεχών (48 στελέχη), και β) στη λοιμογόνο δράση δυνητικά παθογόνων των σαλιγκαριών Listeria monocytogenes στελεχών (15 στελέχη), τα οποία είχαν απομονωθεί από εκτρεφόμενα σαλιγκάρια C. aspersum maxima και είχαν συσχετιστεί με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών. Η προβιοτική δράση των Lactobacillus στελεχών συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να διέρχονται από τους φραγμούς άμυνας του γαστρεντερικού σωλήνα, να αλληλοεπιδρούν με το εντερικό επιθήλιο και να ενισχύουν τις έμφυτες κυτταρικές και χυμικές αποκρίσεις της άμυνας των σαλιγκαριών, όπως η χημειόταξη και φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων, σε συνδυασμό με την ενίσχυση της αντιβακτηριακής δράσης του ορού της αιμολέμφου. Η λοιμογονικότητα των L. monocytogenes στελεχών χαρακτηρίστηκε από υψηλή ετερογένεια. Η ετερογένεια αυτή αποτυπώθηκε τόσο στο διαφορετικό βαθμό λοιμογονικότητας μεταξύ των στελεχών, όσο και στις διαφορές που εντοπίστηκαν σε γονιδιωματικό επίπεδο, μέσω της ανάλυσης των ηλεκτροφορητικών προτύπων περιορισμού (PFGE), και της αλληλούχισης του γονιδιώματος των στελεχών (WGS). Με βάση τα ποσοστά θνησιμότητας των σαλιγκαριών τα στελέχη χαρακτηρίστηκαν ως υπερ-λοιμογόνα, λοιμογόνα ή μη λοιμογόνα. H υπερ-λοιμογονικότητα συσχετίστηκε με την ικανότητα των στελεχών να αντιστέκονται στην αντι-μικροβιακή δράση του ορού της αιμολέμφου, να εισέρχονται στα αμοιβαδοκύτταρα και να τροποποιούν τις ανοσοαποκρίσεις του ξενιστή. Ως απόκριση στην παρουσία τους στην αιμόλεμφο των σαλιγκαριών παρατηρήθηκε υπέρμετρη αύξηση των αμοιβαδοκυττάρων, των υαλινοκυτταρων αλλά και νεκρών κυττάρων στην αιμολέμφο των σαλιγκαριών. Η ικανότητα των υπερ-λοιμογόνων στελεχών να διαφεύγουν της ανασοαπόκρισης συσχετίστηκε με την ικανότητα τους να καταστέλλουν τη φαγοκυτταρική ικανότητα των αμοιβαδοκυττάρων και να επάγουν ανοσοαποκρίσεις όπως η απόπτωση των κυττάρων της αιμολέμφου, η ενεργοποίηση του μονοπατιού της φαινολοξειδάσης και η παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) και νιτρικών οξειδίων (ΝΟ-). Επιπλέον παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλοιώσεις του εντερικού επιθηλίου και αύξηση των κυττάρων της βλέννας στο εντερικό επιθήλιο και στα κόπρανα των σαλιγκαριών. Σε γονιδιωματικό επίπεδο η λοιμογονικότητα ή μη των στελεχών συνδέθηκε εν μέρει με τη παρουσία και τη λειτουργία του MogR μεταγραφικού καταστολέα της έκφρασης της φλαγγελίνης. Η χορήγηση του προβιοτικού στελέχους των σαλιγκαριών L. plantarum Sgs14, το οποίο χαρακτηρίστηκε από αυξημένη αντι-βακτηριακή και ανοσοτροποποιητική δράση, ανέστειλε την εμφάνιση των παραπάνω κλινικοπαθολογικών συμπτωμάτων και μείωσε τα ποσοστά θνησιμότητας πάνω από 50% συμβάλλοντας στην αναβίωση των οργανισμών. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της διατριβής συμβάλλουν στην κατανόηση των έμφυτων μηχανισμών άμυνας που έχουν αναπτύξει οι ασπόνδυλοι οργανισμοί, όπως τα χερσαία γαστερόποδα, προκειμένου να αλληλεπιδρούν τόσο με τα στελέχη της αυτόχθονης μικροχλωρίδας τους όσο και με παθογόνους μικροοργανισμούς.
description: Gastro-intestinal microflora interact with host immune system, and together they constitute a mechanisms that assist to the maintenance and enhancement of homeostasis. Several genetic and environmental factors, such as microbial pathogens may disrupt the normally occurring gut microflora and impair homeostasis leading to dysbiotic inflammatory and infectious diseases. Rebiosis may be achieved by manipulation of host gut microflora by probiotic administration. However, our attention has focused mainly on vertebrate systems, while several questions regarding invertebrates’, such as the snail, immune system, remain unanswered. The aim of this thesis was to investigate the symbiotic and dysbiotic interactions between gut microflora and innate immune responses in snails. Snails’ presumptive probiotic and pathogenic strains were isolated and characterized for the first time. The research has focused on: a) the presumptive probiotic activity of snails’ gut commensal Lactobacillus strain (48 strains), and b) the virulence activity of snail-potential pathogenic Listeria monocytogenes strains (15 strains), that have been isolated from farmed C. aspersum maxima snails experiencing high mortalities. Probiotic potential of Lactobacillus strains was associated with their capacity to survive during passage through gastrointestinal tract barriers, to interact with intestinal epithelium and enhance cellular and humoral innate immune responses such as chemotaxis and phagocytic activity of amoebocytes, in association with the increase of antibacterial activity of haemolymph serum. Virulence of snail-derived L. monocytogenes strains was characterized by high heterogeneity. The heterogeneity was observed in the virulence capacity of the 15 potential pathogenic L. monocytogenes strains, as well as at the genomic level by comparative analysis of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) pulsotypes and whole sequencing analysis (WGS). L. monocytogenes stains were characterized as hypervirulent or virulent or non-virulent, according to snail mortality caused by injection of each strain to snails’ haemocoel. Hypervirulence activity was associated with strains cell surface properties as well as with strains’ capacity to tolerate the bactericidal activity of haemolymph serum, to invade amebocytes and modulate host innate immune responses. Snails over-increase the accumulated population of amoebocytes and hyalinocytes in haemolymph as a response to the presence of virulent strains. Hyper-virulent strains capacity to escape snail innate immune responses was associated with their capacity to suppress phagocytic activity of amoebocytes and induce immune responses wich further enhance their virulence, such as cell apoptosis, activation of phenoloxidase pathway and production of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO-). Also, alterations in intestinal epithelium morphology, as well as increased mucus-secreting cells in intestinal epithelium and feces was observed. At the genomic level, the virulence capacity of strains was linked to the presence and function of the MogR transcriptional repressor of flagellin. Rebiosis was achieved by the administration of the snail-gut commensal probiotic L. plantarum Sgs14 strain which abolished all the SN3-induced dysbiotic manifestations and increase snails’ survival up to 50% exhibiting strong antibacterial and immunomodulatory activity. Overall, the data presented in this thesis contribute to our understanding of the innate immune mechanism that have been evolved in invertebrates to interact with their gut commensal symbiotic strains and pathogenic microorganism.