Ο ρόλος των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων στην ενίσχυση της εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων σε πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης:
Creators: name: Ελεμηνιάδου, Ευρυδίκη Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα
Εμφύτευση
Γενετικά τροποποιημένα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα
Mesenchymal stromal cells
Engraftment
Genetically modified hematopoietic stem cells

description: Σκοπός της μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων (MSCs) στην προαγωγή της εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) με λεντι-ιικό φορέα αναφοράς eGFP, σε πειραματικό μοντέλο μεταμόσχευσης. Επειδή όχι μόνο η κυτταρική επαφή (MSCs- HSCs) μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων αλλά και οι εκκρινόμενοι από τα MSCs διαλυτοί παράγοντες, διερευνήθηκε επιπλέον η συμβολή τους στην προαγωγή της εγκατάστασης/εμφύτευσης των γενετικά τροποποιημένων HSCs. Στα in vitro πειράματα, η συγκαλλιέργεια μη επεξεργασμένων HSCs-MSCs οδήγησε σε σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των HSCs, σε σχέση με αυτή των κυττάρων που δε συγκαλλιεργήθηκαν με MSCs. Αντίθετα, στην περίπτωση των HSCs που ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs πριν τη διαμόλυνση, η μετανάστευση μειώθηκε κατά το ήμισυ, σε σχέση με τα HSCs που καλλιεργήθηκαν με το συμβατικό τρόπο, πιθανότατα για τεχνικούς λόγους. Παρά το γεγονός ότι δε διαπιστώθηκε αύξηση της συνολικής μεταναστευτικής ικανότητας των HSCs που ενεργοποιήθηκαν σε στρώμα MSCs πριν τη διαμόλυνση, είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι η πλειονότητα των HSCs που καλλιεργήθηκαν με αυτόν τον τρόπο και μετανάστευσαν προς τον SDF-1 ήταν διαμολυσμένα και με υψηλό ποσοστό έκφρασης της GFP πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα, αναδείχτηκε για πρώτη φορά η θετική συμβολή των εκκρινόμενων διαλυτών παραγόντων από τα MSCs στη μετανάστευση των HSCs in vitro, καθώς παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των μη επεξεργασμένων αλλά και διαμολυσμένων HSCs, σε σχέση με αυτή των HSCs απουσία υπερκειμένου. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως οι διαλυτοί εκκρινόμενοι παράγοντες από τα MSCs δημιουργούν ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον, το οποίο ωθεί τα HSCs προς μετανάστευση προς τον παράγοντα SDF-1. Αντίθετα όμως με ότι παρατηρήσαμε με τη συγκαλλιέργεια HSCs –MSCs, το υπερκείμενο καλλιέργειας MSCs ενίσχυσε μεν τη συνολική μετανάστευση των HSCs αλλά επηρέασε αρνητικά τη μεταναστευτική ικανότητα των διαμολυσμένων κυττάρων. Στα in vivo πειράματα, κατά τη συγχορήγηση μη επεξεργασμένων HSCs και MSCs αναδείχτηκε ο υποστηρικτικός ρόλος των MSCs, τόσο στη βραχυπρόσθεσμη όσο και στη μακροπρόθεσμη εμφύτευση των αιμοποιητικών stem cells. Επιπρόσθετα, φάνηκε πως τα MSCs ενισχύουν, τουλάχιστον τη βραχυπρόθεσμη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων HSCs, καθώς στην ομάδα που έλαβε συνδυασμό γενετικά τροποποιημένων HSCs-MSCs παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της εμφύτευσης, σε σχέση με την ομάδα που έλαβε μόνο διαμολυσμένα HSCs. Αντίθετα, στην περίπτωση της in vivo συγχορήγησης συμπυκνωμένου υπερκειμένου καλλιέργειας MSCs με μη γενετικά τροποποιημένα HSCs, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην ικανότητα εμφύτευσης των κυττάρων, πιθανό λόγω της έντασης του προπαρασκευαστικού σχήματος. Συνολικά, τα δεδομένα μας προτείνουν ότι τα MSCs προσδίδουν ένα πλεονέκτημα εγκατάστασης/εμφύτευσης στα γενετικά τροποποιημένα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα μετά από μεταμόσχευση. Αυτό θα επαληθευτεί στη συνέχεια με μεγαλύτερο αριθμό πειραμάτων και μετά από δευτερογενείς μεταμοσχεύσεις που θα καταδείξουν οριστικά εάν τα MSCs βελτιώνουν σημαντικά τη μακροπρόθεσμη εμφύτευση των γενετικά τροποποιημένων HSCs.
description: The purpose of this dissertation was to explore the role of mesenchymal stromal cells (MSCs) in the process of engraftment of genetically modified hematopoietic stem cells (HSCs), using a lenti-viral vector which encodes eGFP, in a transplantation experimental model. As it is not predefined whether MSCs promote homing/engraftment of HSCs through their interaction in cellular level or through the secreted soluble factors, their role was further investigated. Regarding the in vitro experiments, the co-cultivation of MSCs and fresh bone marrow cells resulted in a significant increase of the migration of HSCs in relation to those that were not co-cultivated with MSCs. In contrast, the pre-stimulation of HSCs on MSCs layer, before the transduction resulted in a half-fold decrease, probably due to technical issues, in relation to those cultivated without the presence of MSCs. Despite the fact that it hasn’t been noted any increase of the migration of those HSCs pre-stimulated on MSCs layer, it was interesting that the majority of HSCs manipulated in such way and showed migration towards SDF-1 factor, were transduced and had a high percentage of GFP protein expression. In addition has been highlighted the positive contribution of the secreted soluble factors of MSCs to the migration of HSCs, as well in non-manipulated, as in genetically modified in relation to HSCs in absence of supernatant. This result therefore implicated that the secreted soluble factors of MSCs produced a micro-environment, which tends to promote HSCs migration towards SDF-1 factor. In contrast to what was observed in the co-cultivation of MSCs-HSCs, the MSCs supernatant enhanced the HSCs migration but shown an opposite effect in the migration ability of transduced HSCs. The in vivo administration of non-manipulated HSCs and MSCs clearly denoted the supportive role of MSCs, regarding not only to the short but also to the long- term engraftment of hematopoietic stem cells. Additionally it was shown that MSCs enhance, at the minimum the short-term engraftment of genetically modified HSCs, as the same result observed when genetically modified HSCs were administrated with MSCs. Contrary to the facts highlighted above, the result of the in vivo co-administration of a condensed MSCs culture supernatant with non-manipulated HSCs, didn’t give rise to significant differences in the engraftment of hematopoietic stem cells, probably due to the conditioning. In summary the data collected suggest that MSCs assign an advantageous effect that promotes homing /engraftment of genetically modified hematopoietic stem cells after the transplantation process. The current results can be further examined and verified using a larger set of experimental data derived from secondary transplantations that will denote permanently if MSCs could enhance the long-term engraftment of the genetically modified HSCs.