title: Hyalocytes in tissue engineering - First steps towards a cell-based vitreous substitute
Creators: name: Sommer, Florian
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Tissue Engineering , Glaskörper , Vitrektomie , Zellkultur , Transforming Growth Factor beta 1 , Wachstumsfaktor , Fibroblastenwachstumsfaktor , Hyaloz Fibroblastenwachstumsfaktor yt , Glaskörperersatzstoff , Pyruvat , hyalocyte , vitreous replacement , vitreous substitution , ocular tissue engineering
subject: 610 Medizin

description: The vitreous body represents the main compartment of the eye. This unique tissue is free of cells in its centre, however, in the cortex of the vitreous body and in the vitreous base, there are a sparse number of cells, designated as hyalocytes. In an increasing number of clinical situations, removal of the vitreous body becomes necessary to prevent blindness. Subsequent to this surgical procedure, the removed tissue has to be replaced by an artificial substitute. At the moment, however, all materials in clinical use are associated with a plethora of side effects, especially in the long-term use. To overcome these limitations, a novel concept for vitreous replacement based on tissue engineering strategies was developed. By incorporation of the native cells of the vitreous body, namely hyalocytes, into a suitable and biocompatible material, a cellular vitreous substitute can eventually be developed. This proposed system may be reorganized by the embedded cells and, therefore, could yield a biocompatible vitreous substitute with long-term stability. To pursue this development, it seemed mandatory to gain extensive knowledge about hyalocytes to allow for their precise control within a vitreous substitute. However, information about hyalocytes was almost completely missing. To overcome these limitations, the presented work addressed some basic aspects of hyalocytes that were of importance for tissue engineering applications. The first part of this thesis aimed at the development of suitable culture conditions for hyalocytes. The outlined isolation and culture system is based on enzymatic digestion of the vitreous bodies and guarantees a suitable yield of porcine hyalocytes after second passage. Since differentiation markers for hyalocytes were still unknown, it was critical to identify markers that allow for the assessment of cell function. The quantitative accumulation of extracellular matrix components (ECM), of which the vitreous is made, was hypothesized to be a suitable surrogate. To that end, analytical tools that allowed quantification of glycosaminoglycan (GAG) and collagen accumulation by the cells were developed. Using the established methods, ascorbic acid was demonstrated to clearly enhance hyalocyte proliferation and collagen accumulation in a 2-dimensional (2D) and a 3-dimensional (3D) culture system. Further investigations into the mechanism of the ascorbic acid effect indicated that the enhanced collagen production was at least partly due to an enhanced expression of mRNA coding for collagen type V/XI. In a follow up study, the observed effect of ascorbic acid was found to be dependent upon the presence of pyruvate within the medium. Although the exact mechanism of this interaction remained to be elucidated, these two factors were identified as important supplements for in vitro hyalocyte culture. Further improvements in control of hyalocyte behavior were achieved by supplementation of basic fibroblast growth factor (bFGF) or transforming growth factor beta-1 (TGF-beta1) to the culture medium. Both factors were demonstrated to clearly affect the cell morphology as well as the actin organization. Furthermore, bFGF was demonstrated to enhance cell proliferation, thereby decreasing the ECM production, whereas TGF-beta1 increased the accumulation of ECM while inhibiting cell proliferation. Moreover, accelerated cells expansion due to the use of bFGF was found to increase collagen production in the propagated cells, while the GAG accumulation remained unaffected. To enable investigations into cell-biomaterial interactions, in vitro culture systems that mimic the native environment of the cells were designed and tested with collagen type I as model material. The established systems proved suitable, although their relevance to in vivo situations remained to be elucidated. As there were two reports on morphologically different types of hyalocytes in literature, it seemed reasonable to separate these populations prior to cultivation and/or characterization. Using fluorescence activated cell sorting, separation of clearly defined hyalocyte populations became possible without any additional staining. Further studies of the two populations indicated that only one population of cells adheres to and proliferates on tissue culture plastics. To conclude, the present thesis provided fundamental methods and techniques that allow for in vitro investigations into hyalocyte characteristics and functions in 2D, as well as 3D culture systems. Using these techniques, ascorbic acid and pyruvate were demonstrated to be key factors for in vitro cultivation. Furthermore, bFGF and TGF-beta1 were identified as tools that may allow for the control of hyalocyte proliferation as well as accumulation of ECM. Finally, an isolation method for distinct hyalocyte populations instead of a mixture of populations was developed. This enabled for the first time characterization of distinct hyalocyte populations in their native state.
description: Der Glaskörper, das größte Kompartiment des Auges, stellt ein einzigartiges Gewebe dar, das im Zentrum zellfrei ist, jedoch im Randbereich sowie in der Nähe des Ziliarkörpers eine geringe Anzahl an Zellen, sogenannte Hyalozyten, enthält. Zur Behandlung bestimmter, stetig zunehmender Augenerkrankungen muss der Glaskörper aus dem Auge entfernt werden, um ein Erblinden des Patienten zu verhindern. Anschließend ist es in vielen Fällen notwendig, den Glaskörper zu ersetzen. Bisher sind jedoch alle klinisch eingesetzten Glaskörperersatzstoffe mit vielerlei Nebenwirkungen behaftet, insbesondere bei deren Langzeitanwendung. Einen therapeutischen Fortschritt könnte die Entwicklung eines zellbasierten Glaskörperersatzes darstellen. Durch die Kombination von glaskörpereigenen Zellen, den Hyalozyten, mit geeigneten Biomaterialien unter Anwendung von Methoden des Tissue Engineering, könnte ein langzeitverträglicher Glaskörperersatz entstehen, der möglicherweise von den glaskörpereigenen Zellen reorganisiert wird und damit dauerhaft funktionell bleibt. Um Hyalozyten innerhalb eines solchen Systems kontrollieren zu können, schien ein detailliertes Wissen über die Zellen unabdingbar zu sein. Da bisher jedoch nur sehr wenig über Hyalozyten bekannt war, beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit grundlegenden Aspekten dieser Zellart, insbesondere deren Eignung für das Tissue Engineering. Erstes Ziel der Arbeit war die Entwicklung geeigneter Kultivierungsmethoden für Hyalozyten, die, basierend auf einem enzymatischen Verdau des Glaskörpers, eine ausreichende Anzahl von primären Hyalozyten nach zweiter Passage zur Verfügung stellten. Da im Weiteren keine Differenzierungsmerkmale der Zellen bekannt waren, wurde deren Akkumulation an extrazellulärer Matrix (ECM) als Surrogatmarker angenommen und analytische Methoden zur Quantifizierung von Glycosaminoglykanen und Kollagen als typische Extrazellulärmatrixkomponenten des Glaskörpers etabliert. Unter Nutzung dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass Vitamin C die Zellproliferation sowie die Akkumulation von Kollagen in einem zweidimensionalen (2D) wie auch in einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem erhöht. Eingehendere Untersuchungen zeigten, dass dies zumindest teilweise auf eine erhöhte Expression von mRNA für Kollagen Typ V/XI zurückzuführen ist. Eine Anschlussstudie ergab, dass der beobachtete Effekt von Vitamin C abhängig von der Pyruvatkonzentration im Kulturmedium ist. Obwohl der exakte Mechanismus dieser Interaktion noch geklärt werden muss, konnten die beiden Substanzen als wichtige Faktoren für die in vitro Kultivierung von Hyalozyten erkannt werden. Durch den Einsatz von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) sowie von transformierendem Wachstumsfaktor beta1 (TGF-beta1) konnte eine weitere Verbesserung der Zellkontrolle erreicht werden. Beide Faktoren beeinflussten deutlich die Morphologie sowie das Aktingerüst der Zellen. Während bFGF die Proliferation der Zellen steigerte und dabei deren ECM Akkumulation erniedrigte, hemmte TGF-beta1 die Zellproliferation unter Erhöhung der ECM Produktion. Darüber hinaus steigerte eine durch den Einsatz von bFGF beschleunigte Zellproliferation die spätere Akkumulation von Kollagenen. Die Produktion an GAG dagegen blieb unbeeinflusst. Um im Weiteren die Interaktion zwischen Zellen und Biomaterialien untersuchen zu können, wurden Kultursysteme etabliert, die dies unter glaskörperähnlichen Bedingungen erlauben. Die Systeme erwiesen sich in einem Test mit dem Modellmaterial Kollagen I als geeignet; ihre Aussagekraft für die in vivo Situation sollte noch untersucht werden. Da zwei Hinweise in der Literatur zu finden waren, die morphologisch unterschiedliche Arten von Hyalozyten beschreiben, erschien es sinnvoll, diese vor ihrer Kultivierung und/oder Charakterisierung zu trennen. Mittels Durchflusszytometrie und anschließendem Zellsortieren gelang es ohne zusätzliche Färbung, zwei klar definierte Zellpopulationen zu isolieren. In weiteren Untersuchungen zeigte sich jedoch nur eine der beiden Populationen als adhärent und proliferierend auf Zellkulturplastik. Abschließend bleibt festzuhalten, dass in der vorliegenden Arbeit grundlegende Methoden und Techniken erarbeitet wurden, die in vitro Untersuchungen von Charakteristika und Funktionen von Hyalozyten sowohl in 2D, als auch in 3D Kultursystemen ermöglichen. Mit Hilfe dieser Methoden konnten Ascorbinsäure und Pyruvat als Schlüsselfaktoren der in vitro Kultivierung von Hyalozyten erkannt werden. Weiterhin zeigten sich die Faktoren bFGF und TGF-beta1 als nützlich, um die Proliferation, wie auch die Akkumulation an ECM von Hyalozyten zu steuern. Zuletzt wurde eine Isolierungsmethode für definierte Hyalozytenpopulationen zur Verfügung gestellt, die erstmals eine Charakterisierung dieser Populationen in ihrem nativen Zustand erlaubt.