Κλωνοποίηση, έκφραση και διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της E3 λιγάσης ουβικιτίνης, WWP1
Creators: name: Τασιούλης, Κωνσταντίνος Στέργιου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: WWP1
Καρκίνος
Κυτταρικός πολλαπλασιασμός
Cancer
Cell proliferation

description: Ο άξονας μελέτης της προκείμενης διπλωματικής εργασίας κινήθηκε σε δυο επίπεδα. Αρχικά, διερευνήθηκε η διακύμανση των επιπέδων έκφρασης της E3 λιγάσης ουβικιτίνης, WWP1 στον ορό ογκολογικών ασθενών διαγνωσμένων με νεοπλάσματα ποικίλης εντόπισης, πριν και μετά την ανοσοθεραπεία σε μια προσπάθεια εξεύρεσης νέων προβλεπτικών ή προγνωστικών βιοδεικτών ανταπόκρισης στην ανοσοθεραπεία. Τα αποτελέσματα των μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν ανέδειξαν την εντόπιση της WWP1 στον ορό των ασθενών με σημαντικές διαφορές πριν και μετά την ανοσοθεραπεία τόσο μεταξύ των ασθενών όσο και χρησιμοποιώντας μια κοόρτη υγιών ενηλίκων, ως ομάδα ελέγχου. Μάλιστα, η αύξηση της συγκέντρωσης της WWP1 στον ορό φαίνεται να είναι ανάλογη της εκλεκτικής καταστροφής των καρκινικών κυττάρων από την ανοσοθεραπεία. Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω η εμπλοκή της WWP1 στον καρκίνο, το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο της ενισχύθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο ολικό κυτταροπλασματικό RNA από εκχύλισμα της καρκινικής κυτταρικής σειράς μαστού MCF-7. Το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο της WWP1 κλωνοποιήθηκε σε κατάλληλο πλασμιδιακό φορέα, τον pT7-IRES HIS-C DNA, ο οποίος προσδίδει στο επιθυμητό γονίδιο μια ποικιλία χαρακτηριστικών και ιδιοτήτων. Αναλυτικά, η ύπαρξη του Τ7 προαγωγέα επιτρέπει την in vitro παραγωγή του mRNA που κωδικοποιεί για την παραπάνω πρωτείνη, ενώ η εσωτερική θέση εισόδου του ριβοσώματος (Internal Ribosome Entry Site, IRES) από τον ιο της εγκεφαλομυοκαρδίτιδας (EMCV) συνιστά ένα μη κωδικοποιητικό RNA θραύσμα που χαρακτηρίζεται από την ικανότητα του να επάγει την έναρξη της πρωτεινοσύνθεσης, σε ευκαρυωτικά κύτταρα ή εκχυλίσματα τους, ακόμη και χωρίς την ύπαρξη καλύπτρας στο 5’ άκρο των mRNA μορίων. Στα παραγόμενα mRNA μόρια προστέθηκε ένα δομικό ανάλογο της καλύπτρας 7-μεθυλογουανοσίνης (Αnti-Reverse Cap Analogue, ARCA), ώστε να εξασφαλιστεί ο προσανατολισμός με κατεύθυνση 5’→3’. Παράλληλα, ο ίδιος πλασμιδιακός φορέας προσδίδει στο γονίδιο μια αλληλουχία 6 ιστιδινών (His-Tag), ώστε να επιτευχθεί εκλεκτική ανίχνευση της παραγόμενης πρωτεΐνης. Καρκινικά κύτταρα μαστού ZR-75-1, που στερούνται έκφρασης της PTEN, ενός βασικού υποστρώματος της WWP1, επιμολύνθηκαν με το mRNA της παραπάνω πρωτεΐνης προκειμένου να διερευνηθεί μια πιθανή συσχέτιση της με τα κοινά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων (Cancer hallmarks). Η επιμόλυνση πραγματοποίηθηκε και σε μεσεγχυματικά κύτταρα οδοντικού πολφού (Dental Pulp Stem Cells, DPSCs) ως κυτταρική σειρά ελέγχου (control). Η επιβεβαίωση της επιμόλυνσης των δυο κυτταρικών σειρών πραγματοποιήθηκε με RT-qPCR και ανοσοαποτύπωμα κατά Western. Ο προσδιορισμός σε επίπεδο mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με τα κοινά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων σε εκχυλίσματα των δυο επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών ανέδειξε μια ισχυρή εμπλοκή στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη διήθηση, τη μετάσταση καθώς και την αγγειογένεση. Παράλληλα, αναδεικνύεται μια πιθανή συσχέτιση της WWP1 με την πρόκληση stress στο ενδοπλασματικό δίκτυο, σε τέτοια επίπεδα, ώστε το κύτταρο να μην αποπίπτει αλλά να προωθείται η εξέλιξη φαινομένων άμεσα συνδεδεμένων με την καρκινογένεση.
description: The present dissertation’s study axis moved on two levels. First, we investigated the variation in the expression levels of the E3 ubiquitin ligase, WWP1 in the serum of oncology patients diagnosed with neoplasms of various locations, before and after immunotherapy in an attempt to investigate new predictive or prognostic biomarkers as a response to immunotherapy. The methods used highlighted the existence of WWP1 in patients’ serum with significant differences before and after immunotherapy between patients as well as using a cohort of healthy adults, as a control group. In fact, the increase in serum WWP1 expression seems to be proportional to the selective destruction of cancer cells by immunotherapy.To further elucidate the involvement of WWP1 in cancer, its open reading frame was amplified by RT-PCR using total cytoplasmic RNA from MCF-7 breast cancer cell line extract as a template. The WWP1 open reading frame was cloned into an appropriate plasmid vector, pT7-IRES HIS-C DNA, which imparts to the desired gene a variety of characteristics and properties. In detail, the existence of the T7 promoter allows the in vitro production of the mRNA that codes for the above protein, while the Internal Ribosome Entry Site (IRES) from the encephalomyocarditis virus (EMCV) constitutes a non-coding RNA fragment characterized by its ability to induce the initiation of protein synthesis, in eukaryotic cells or their extracts, even without the existence of a cap at the 5' end of mRNA molecules. A structural analogue of the 7-methylguanosine cap (Anti-Reverse Cap Analogue, ARCA) was added to the produced mRNA molecules, to ensure the appropriate orientation and thw translation in the 5'→3' direction. Simultaneously, the same plasmid vector confers a 6-histidine sequence (His-Tag) to the gene for selective detection of the protein produced. ZR-75-1 breast cancer cells, which lack the expression of PTEN, a critical substrate of WWP1, were transfected with the mRNA of the above protein in order to investigate a possible association with cancer hallmarks. Transfection was also carried out in dental pulp mesenchymal cells (Dental Pulp Stem Cells, DPSCs) as a control cell line. Confirmation of transfection of the two cell lines was performed by RT-qPCR and Western blotting. mRNA-level determination of genes associated with cancer hallmarks in extracts of the two transfected cell lines revealed a strong involvement in cell proliferation, survival, invasion, metastasis as well as angiogenesis. At the same time, a possible association of WWP1 with the induction of stress in the endoplasmic reticulum, at such levels, so that the cell does not undergo apoptosis, but promotes the development of phenomena directly linked to carcinogenesis.