title: The role of p53 and CYLD in mitochondrial death pathways and mechanisms of neuronal necroptosis
title: Die Rolle von p53 und CYLD in mitochondrialen Signalwegen und Mechanismen der neuronalen Nekroptose
Creators: name: Diemert, Sebastian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: CYLD
Neuronal cell death
HT-22
Nekrose
Nervenzelle
Nuklearfaktor Kappa B
Zylindrom
Mitochondrium
Protein p53
Medizin, Gesundheit
RIP1
RIP3
Apoptosis

description: Neuronal cell death causes
      progressive loss of brain tissue and function after acute
      brain injury and in chronic neurodegenerative diseases.
      Although the pathological features of stroke and brain trauma
      or Alzheimer’s and Parkinson’s disease differ greatly, the
      underlying neuronal damage shares common molecular and
      cellular mechanisms. Despite extensive research and
      increasing knowledge on the molecular pathology, no efficient
      therapy has been born from these efforts until today. As a
      promising concept to overcome this plight, it has been
      suggested to enhance endogenous survival signaling pathways
      like the transcription factor NF-κB and thus obtain
      neuroprotection. Increasing neuroprotective NF-κB signaling
      can be achieved by blocking repressors of NF-κB
      transcriptional activity such as p53 and CYLD. Both factors
      may mediate cell death by mechanisms dependent on and
      independent of NF-ΚB signaling. Therefore, the major aim of
      this study was to explore the roles of p53 and CYLD in
      neuronal cell death and to connect their detrimental effects
      with NF-κB activity. This issue was addressed in immortalized
      mouse hippocampal HT-22 neurons and in primary neuronal
      cultures exposed to glutamate toxicity. Furthermore, an in
      vivo model system of traumatic brain injury was employed to
      compare infarct development after controlled cortical impact
      in wild-type and CYLD-/- mice. The present study revealed
      that both approaches, inhibiting p53 and CYLD successfully
      preserved mitochondrial integrity and function, and
      significantly attenuated neuronal cell death. Surprisingly,
      however, the pronounced neuroprotective effect of the
      p53-inhibitor pifithrin-α occurred independently of enhanced
      NF-κB activity in HT-22 cells. In addition, neuroprotection
      induced by silencing of CYLD was completely independent of
      NF-κB, despite of the previously established role of CYLD as
      a negative regulator of NF-κB in keratinocytes. In line with
      that notion, the NF-κB subunit expression and NF-κB
      transcriptional activity were not significantly altered in
      HT-22 neurons undergoing glutamate dependent cell death. In
      conclusion, these data suggested that the NF-κB pathway was
      neither significantly affected by glutamate dependent cell
      death, nor did it mediate the neuroprotective response of
      CYLD and p53 inhibition in this model system of glutamate
      toxicity. Interestingly, inhibiting p53 with pifithrin-α
      maintained mitochondrial morphology and mitochondrial
      membrane potential in HT-22 cells. This effect occurred
      independently of p53 dependent transcription. Investigating
      the underlying cause of neuroprotection associated with CYLD
      depletion, it was unveiled that glutamate-induced oxytosis in
      HT-22 cells occurred through mechanisms of necroptosis. This
      conclusion is based on the detection of RIP1/RIP3 complexes
      as a hallmark of necroptotic cell death in HT-22 cells
      exposed to glutamate. Further, silencing either RIP-kinase
      provided strong protection of the cells. Repressing CYLD, in
      turn, prevented the formation of the RIP1/RIP3 necrosome,
      suggesting that inhibition of necroptosis was the underlying
      mechanism of neuroprotection after CYLD depletion. In
      contrast, CYLD depletion had no effect on cell death in a
      model of glutamate excitotoxicity in primary cultured
      neurons, while inhibition of RIP1 kinase by necrostatin-1
      significantly enhanced neuronal survival. These data suggest
      a CYLD independent but RIP1 dependent mechanism of glutamate
      toxicity in primary neurons, which requires further
      investigation. In vivo, however, using a model of traumatic
      brain injury, CYLD knockout mice showed a significantly
      reduced infarct size compared to wild-type littermates
      suggesting a potent neuroprotective effect inherent with CYLD
      repression. In summary the data from this thesis highlight a
      yet unknown role of CYLD in neuronal cell death and unravel
      CYLD and p53-dependent mechanisms of cell death as a putative
      therapeutic approach for the treatment of acute and chronic
      neurodegenerative diseases. Future research, however, is
      warranted to further elucidate the exact mechanisms leading
      to CYLD and RIP-kinase activation in neurons and to determine
      the exact molecular link to mitochondria.
description: Der Untergang von funktionsfähigem
      Hirngewebe durch neuronalen Zelltod stellt eine zentrale
      Ursache für die klinische Manifestation von Spätschäden nach
      Schädel-Hirn Trauma und cerebraler Ischämie dar. Auch die
      Symptomatik fortgeschrittener chronisch neurodegenerativer
      Erkrankungen, wie der Alzheimer- und Parkinsonerkrankung ist
      auf den Verlust neuronaler Funktionalität zurückzuführen.
      Interessanterweise zeigen die zugrundeliegenden zellulären
      Mechanismen große Gemeinsamkeiten, so dass neuronaler Zelltod
      in diesen Erkrankungen ungeachtet ihrer grundsätzlich
      verschiedenen Ursachen und Ausprägungen in der Regel nach
      Signalwegen der Apoptose, Nekroptose, oder Autophagie
      erfolgt. Trotz intensiver Forschung ist es bis heute jedoch
      nicht gelungen das gewachsene Verständnis der molekularen
      Zusammenhänge in die Entwicklung einer effektiven
      neuroprotektiven Strategie zu überführen. Ein
      vielversprechender Ansatz, um diesem Mangel an
      Therapieoptionen in Zukunft zu begegnen, sieht die
      Verstärkung endogener Signalwege vor, die das zelluläre
      Überleben durch Neutralisierung von toxischen Einflüssen
      sichern. Ein wichtiger Vertreter dieser neuroprotektiven
      Signalwege ist der NF-κB Transkriptionsfaktor. Eine
      Steigerung der Transkriptionsaktivität von NF-κB kann durch
      Hemmung von p53 und CYLD erzielt werden, zwei wichtigen
      Proteinen, die das zelluläre Überleben nicht nur durch Ihren
      Einfluss auf NF-κB, sondern auch durch weitere Mechanismen
      beeinflussen können. Vor diesem Hintergrund war es ein
      zentrales Ziel dieser Arbeit die Bedeutung von p53 und CYLD
      im neuronalen Zelltod zu untersuchen und ihre Auswirkung auf
      den neuronalen NF-κB Signalweg zu analysieren. Um diese
      Fragestellung zu bearbeiten, wurden im Rahmen dieser Arbeit
      eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) wie auch
      Kulturen von primären kortikalen Neuronen eingesetzt. Darüber
      hinaus fand ein in vivo Modell zum Schädel- Hirn Trauma
      Anwendung, um die gewonnenen Erkenntnisse in einem
      physiologisch etablierten Tiermodel der akuten Hirnschädigung
      zu verifizieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen,
      dass Inhibition von p53 und CYLD neuronalen Zelltod
      verhindern und mitochondriale Funktionalität erhalten
      kann.Interessanterweise waren die protektiven Effekte beider
      Ansätze in HT-22 Zellen unabhängig vom NF-κB
      Transkriptionsfaktor. Im Einklang mit diesen Ergebnissen
      stand die Beobachtung, dass Glutamat- induzierter Zelltod in
      HT-22 Zellen keine detektierbare Veränderung des NF-κB
      Transkriptionsweges zeigte. In HT-22 Zellen scheint der NF-κB
      Transkriptionsfaktor daher eine untergeordnete Rolle zu
      spielen und ist zudem an der Vermittlung der neuroprotektiven
      Wirkung von p53 Inhibition und CYLD Depletion nicht
      beteiligt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass der
      schützende Effekt von Pifithrin-α vermittelter p53 Hemmung
      anteilig auf transkriptionsunabhängigen Effekten am
      Mitochondrium beruht. Der Mechanismus, der dem
      neuroprotektiven Effekt der CYLD-Depletion zugrunde liegt,
      konnte ebenfalls identifiziert werden. Entgegen dem früheren
      Verständnis haben jüngere Forschungsergebnisse gezeigt, dass
      Mechanismen des kontrollierten Zelltodes nicht rein
      apoptotische Vorgänge sein müssen. Im Einklang mit diesen
      Erkenntnissen konnte die vorliegende Arbeit das Verständnis
      über kontrollierte nicht-apoptotische Mechanismen des
      neuronalen Zelltods erweitern und zeigen, dass in HT-22
      Neuronen Glutamat induzierter Zelltod anteilig nach
      Signalwegen der Nekroptose erfolgt. Die Formierung des
      Nekrosoms, eines Komplexes aus den beiden RIP-Kinasen RIP1
      und RIP3, gilt gemeinhin als zentraler Induktions- und
      zugleich Exekutionsmechanismus der Nekroptose. Die Bildung
      dieses Komplexes konnte erstmalig für neuronale Zellen im
      Glutamat-abhängigem Zelltod nachgewiesen werden. Mit Blick
      auf den neuroprotektiven Effekt der CYLD Depletion konnte
      ferner gezeigt werden, dass der Verlust von CYLD die Bildung
      des Nekrosoms zu unterdrücken vermag. Die herausragende
      Bedeutung der beiden RIP Kinasen im Glutamat-abhängigen
      Zelltod in HT-22 Zellen konnte unter Anwendung von siRNA
      vermittelter selektiver Depletion von RIP1 und RIP3
      nachgewiesen werden. Der Verlust von jeweils einer der beiden
      RIP-Kinasen sowie die Inhibition der Kinase-Funktion von RIP1
      durch Necrostatin1 reduzierten signifikant die
      Glutamat-induzierte Toxizität und den Verlust mitochondrialer
      Funktionalität. Im exzitotoxischem Zelltod in primären
      kortikalen Neuronen konnte die vorliegende Arbeit keinen
      protektiven Effekt durch CYLD Depletion zeigen. Die Hemmung
      der RIP-1 Kinase durch Necrostatin1 hingegen ermöglichte in
      Analogie zum Model der HT-22 Zellen eine deutliche Reduktion
      des neuronalen Zelltodes. Diese Daten deuten auf einen CYLD
      unabhängigen, aber RIP1 anhängigen Mechanismus hin, der
      Gegenstand künftiger Forschungsbemühungen sein wird. Im
      Tiermodel zum Schädel Hirn-Trauma konnte die vorliegende
      Arbeit das protektive Potential der kontrollierten Hemmung
      von CYLD jedoch bestätigen und zeigen, dass CYLD defiziente
      Mäuse ein deutlich reduziertes Infarkt-Volumen und Hirnödem
      nach Schädel-Hirn Trauma aufweisen. Zusammenfassend konnte in
      dieser Arbeit erstmalig dargestellt werden, dass neuronaler
      Zelltod in vitro und in vivo durch Depletion von CYLD hemmbar
      ist. Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden,
      dass der neuroprotektive Effekt einer Hemmung von p53
      anteilig auf mitochondrialen Prozessen beruht. Weitere
      Forschungsbemühungen sind jedoch erforderlich, um den genauen
      Mechanismus zu identifizieren, der zu einer Aktivierung der
      CYLD und RIP- abhängigen Signalwege führt und die Effekte von
      p53 am Mitochondrium auf molekularer Basis erklärt.