Ανάπτυξη και εφαρμογή νέων μοριακών εργαλείων στη Yarrowia lipolytica για την αύξηση συσσώρευσης λιπιδίων
Creators: name: Τσιλιγκάκη, Χριστίνα Ευθυμίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Yarrowia lipolytica
Παραγωγή λιπιδίων
Γενετική μηχανική
Lipid production
Genetic engineering

description: Η αύξηση της ζήτησης ενέργειας, των τιμών του πετρελαίου, των εκπομπών διοξειδίου του άνθρακα από ορυκτά καύσιμα, η κλιματική αλλαγή, καθώς και η μείωση των ορυκτών αποθεμάτων, έχουν εντείνει την αναζήτηση για ανανεώσιμες πηγές ενέργειας με χαμηλή περιεκτικότητα σε άνθρακα, όπως είναι τα βιοκαύσιμα. Ωστόσο, η παραγωγή βιοκαυσίμων πρώτης γενιάς εγείρει έντονες ανησυχίες σχετικά με τη διαθεσιμότητα πρώτων υλών, τις επιπτώσεις στη βιοποικιλότητα, τη διαθεσιμότητα γης για ανάπτυξη γεωργικών καλλιεργειών, και την παγκόσμια επισιτιστική κρίση. Για την επίλυση των προβλημάτων, οι ερευνητές έχουν στραφεί στη χρήση μικροβιακών ελαίων, τα οποία έχουν παρόμοια σύνθεση λιπαρών οξέων και ενεργειακή απόδοση με τα φυτικά έλαια, και είναι κατάλληλα για την παραγωγή βιοντίζελ. Μεταξύ των μικροοργανισμών, οι οποίοι είναι γνωστό ότι συσσωρεύουν λιπίδια σε επίπεδα μεγαλύτερα από 20% της βιομάζας τους, ανήκει η Yarrowia lipolytica. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία παρουσιάζεται η προσπάθεια τροποποίησης του συνθετικού θρεπτικού μέσου και η αντικατάσταση του θειϊκού αμμωνίου με διαφορετικές πηγές αζώτου, με απώτερο στόχο τη βελτίωση της απόδοσης και τη μείωση του κόστους καλλιέργειας. Έτσι, στέλεχος Y. lipolytica MUCL28849 που φέρει το γονίδιο αναφοράς mCherry, καλλιεργήθηκε σε πέντε θρεπτικά μέσα: 1) συνθετικό θρεπτικό με θειϊκό αμμώνιο, 2) συνθετικό θρεπτικό με εκχύλισμα ζύμης, 3) YPG, 4) συνθετικό μέσο με ουρία και 5) συνθετικό μέσο με πεπτόνη. Από τη μελέτη της ανάπτυξης του στελέχους στα παραπάνω θρεπτικά, καθώς και από τη μελέτη για την έκφραση της mCherry, και για την συσσώρευση ενδοκυτταρικών λιπιδίων, επιλέχθηκε το συνθετικό θρεπτικό με πεπτόνη, ως βέλτιστο και οικονομικό θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. Ακόμη, στην παρούσα εργασία, παρουσιάζεται η προσπάθεια δημιουργίας νέων ανασυνδυασμένων στελεχών Y. lipolytica, για την αύξηση της περιεκτικότητας σε λιπίδια. Για την υπερέκφραση γονιδίων του μεταβολισμού των λιπιδίων, επιλέχθηκε το στέλεχος του εργαστηρίου YLE155, το οποίο προέκυψε έπειτα από την Εργαστηριακή Προσαρμοστική Εξέλιξη του στελέχους Y. lipolytica MUCL28849 σε προηγούμενη εργασία, και εμφανίζει βελτιωμένα χαρακτηριστικά ως προς την ανάπτυξη και την συσσώρευση λιπιδίων. Σε αυτό το στέλεχος έγινε εισαγωγή επιπλέον αντιγράφων των ενδογενών γονιδίων DGA2 και LRO1, καθώς και του γονιδίου CAT2 από το είδος Saccharomyces cerevisiae. Τα νέα τροποποιημένα στελέχη (YLE155/DGA2, YLE155/DGA2/LRO1, YLE155/DGA2/ScCAT2, YLE155/DGA2/LRO1/ScCAT2), καθώς και το πατρικό στέλεχος YLE155, αναπτύχθηκαν σε 10% v/v συνθετικό μέσο ακατέργαστης γλυκερόλης με προσθήκη πεπτόνης, και εξετάστηκαν ως προς την ανάπτυξή τους και την συσσώρευση λιπιδίων. Από τον έλεγχο συσσώρευσης ενδοκυτταρικών λιπιδίων με κυτταρομετρία ροής και με μία χρωματομετρική μέθοδο που στηρίζεται στην αντίδραση σουλφο-φωσφο-βανιλίνης (SPV) προέκυψε, ότι η ενσωμάτωση του γονιδίου DGA2 βελτίωσε τον σχηματισμό ενδοκυτταρικών λιπιδίων, με την περιεκτικότητα λιπιδίων να είναι 1,5 φορές υψηλότερη σε σχέση με το πατρικό YLE155, ενώ τα υπόλοιπα τροποποιημένα στελέχη χρήζουν περαιτέρω βελτίωση, με σκοπό τη δημιουργία αποδοτικότερων στελεχών Y. lipolytica.
description: The increase in energy demand, oil prices, carbon dioxide emissions from fossil fuels, climate change, as well as the reduction of mineral resources have intensified the search for low-carbon renewable energy sources, such as biofuels. However, the production of first-generation biofuels raises serious concerns, regarding the availability of raw materials, the impact on biodiversity, the availability of land for agricultural development and the global food crisis. To solve the problems, researchers have turned to the utilization of microbial oils, which have similar fatty acid composition and energy efficiency to plant oils, and are suitable for biodiesel production. Among the microorganisms known to accumulate lipids at levels higher than 20% of their biomass, is Y. lipolytica. This master thesis presents the attempt to modify the synthetic medium and the replacement of ammonium sulfate with different nitrogen sources, with the ultimate goal of improving yield and reducing cultivation costs. Thus, Y. lipolytica MUCL 28849 carrying the mCherry reporter gene, was cultured in five media: 1) synthetic medium with ammonium sulfate, 2) synthetic medium with yeast extract, 3) YPG, 4) synthetic medium with urea and 5) synthetic medium with peptone. After the examination of the growth profile of the strain in the above media, as well as from the analysis of the expression of mCherry and the accumulation of intracellular lipids, the synthetic medium with peptone was chosen as the optimal and economical culture medium. Also, this thesis presents the attempt to create new engineered strains of Y. lipolytica to increase their lipid content. For the expression of lipid metabolism genes, the YLE155strain obtained through Adaptive Laboratory Evolution of Y. lipolytica MUCL 28849 in previous work, was selected. This strain showed improved growth and lipid accumulation characteristics. Additional copies of the endogenous DGA2and LRO1genes, as well as the CAT2gene from Saccharomyces cerevisiae, were introduced into this strain. The novel engineered strains (YLE155/DGA2, YLE155/DGA2/LRO1, YLE155/DGA2/ScCAT2, YLE155/DGA2/LRO1/ScCAT2), as well as the parental strain YLE155, were grown in 10% v/v synthetic crude glycerol medium supplemented with peptone, and were examined for their growth and lipid accumulation. Lipid characterization, using flow cytometry and a colorimetric method based on the sulfo-phospho-vanillin reaction (SPV) showed that integration of the DGA2gene improved intracellular lipid formation, with lipid content being 1.5-fold higher than the parental strain, while the rest of the engineered strains need further improvement, in order to create more efficient Y. lipolytica strains.