title: Untersuchung der Stabilität der Endonuklease Autotaxin in humanen Blutproben zur Vermeidung prä-analytischer und analytischer Fehlerquellen
Creators: name: Wolff, Freya
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: Autotaxin
subject: EDTA
subject: Divalente Kationen

description: Hintergrund und Ziele: Autotaxin (ATX) ist ein Enzym, welches Zellmigration, Inflammation und Bildung neuer Blutgefäße reguliert. Es katalysiert mit seiner Lysophospholipase D Aktivität die Umwandlung von Lysophosphatidylcholin (LPC) zu Lysophosphatidsäure (LPA). LPA ist ein potenter Me-diator, der über mindestens sechs spezifische G-Protein-gekoppelte-LPA-Rezeptoren (LPAR1-6) wirkt. Da Expression und Aktivität von ATX mit zahlreichen Erkrankungen in Zusammen-hang steht, prädestiniert ATX sich sowohl als therapeutisches Ziel als auch als potenziellen diagnostischen Biomarker. Ein valider Nachweis und stabile Aktivität ex vivo sind von beson-derem Interesse. In dieser Arbeit wurden die optimalen Bedingungen für die Gewinnung und Lagerung menschlicher Blutproben für einen zuverlässigen ATX-Nachweis untersucht und die Auswirkungen präanalytischer und analytischer Techniken ermittelt. Methoden: Gesunden Frauen und Männern (n = 5-20) wurde Blut mittels verschiedener Blutabnahmesys-teme zur Gewinnung von Serum, EDTA-, Heparin- und Citrat-Plasma entnommen. Die Pro-ben wurden unterschiedlichen Lagerungsbedingungen ausgesetzt, wobei die Temperaturen von 37 °C bis -80 °C und die Lagerungsdauer von einem Tag bis zu sechs Monaten reichte. Mittels Antigen-ELISA wurde die ATX-Konzentration und mittels Enzym-gekoppelten Akti-vitäts-Assay die ATX-Aktivität in allen Proben quantifiziert. Darüber hinaus wurde der Ein-fluss der Zugabe eines Protease- und/oder Phosphatase-Inhibitors, der Zeitpunkt der Abtren-nung des Überstands von den Zellen und der Einfluss verschiedener Konzentrationen zwei-wertiger Kationen wie Ca2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Mn2+ und Cu2+, die den EDTA-Plasmaproben zugesetzt wurden, untersucht. Einflüsse auf die Struktur, Faltung und Bindungsstellen von ATX wurden mittels Zirculardichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) bei humanem rekombinantem ATX (rATX) aus HEK293-Zellen analysiert. Beobachtungen und Ergebnisse: Während die Konzentration von ATX in Serum und EDTA-Plasma vergleichbar war und bei allen Temperaturen über 180 Tage kaum abnahm, erwies sich die ATX-Aktivität im EDTA-Plasma geringer als im Serum und nahm über die Zeit stark ab. Im Gegensatz dazu blieb die ATX-Aktivität in Heparinsulfat- und Citrat-Plasma stabil. Der Zeitpunkt der Abtrennung des Überstands von zellulären Bestandteilen und die Zugabe von Phosphatase- und Proteinase-Inhibitoren hatten keinen Einfluss auf die Aktivität in EDTA-Plasma. Allerdings stellte die Zugabe von 10 mM Ni2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, Co2+ oder 100 mM Ca2+ die Aktivität im EDTA-Plasma wieder her. Ähnliche Ergebnisse konnten mit rATX erzielt werden. Nach wiederholten Auftau-Einfrier-Zyklen scheint rATX allerdings instabiler als ATX in Blutproben zu sein. Nach Zugabe von EDTA zu rATX konnte in vorläufigen CD-Spektroskopie-Experimenten keine wesentliche Änderung der Konformation festgestellt werden. Schlussfolgerungen: Die ATX-Proteinkonzentration kann verlässlich in Serum oder verschiedenen Plasmaderiva-ten, unabhängig von Temperatur oder Lagerungsbedingung, gemessen werden. Daher ist ATX ein zuverlässiger Parameter für den täglichen Gebrauch als diagnostischer Marker im mensch-lichen Blut für verschiedene Erkrankungen. Die Messung der ATX-Enzymaktivität im Serum ist wegen des Aktivitätsverlustes in EDTA-Plasma vorzuziehen. Das Binden divalenter Katio-nen durch EDTA kann vermutlich die sekundäre Struktur von ATX verändern und so einen Aktivitätsverlust herbeiführen, welcher jedoch nicht in gefrorenem Plasma stattfindet. Alter-nativ kann die Aktivität zuverlässig in Heparin oder Citrat-Plasma gemessen werden. Weitere Studien sind erforderlich, um mögliche Konformationsänderungen durch EDTA zu bestäti-gen.
description: Objectives &amp; Design: Autotaxin (ATX) is an enzyme that plays an important role in the regulation of cell migra-tion, inflammation, and the formation of new blood vessels. ATX catalyzes the conversion of lysophosphatidylcholine (LPC) to lysophosphatidic acid (LPA) by its lysophospholipase D activity. LPA is a potent bioactive lipid mediator that acts through at least six specific G pro-tein-coupled LPA receptors (LPAR1-6). Because its expression and activity are related to mul-tiple diseases, it became a potential therapeutic target as well as diagnostic biomarker. The reliable detection and stable activity ex vivo are of enormous interest. In this thesis, the opti-mal acquisition and storage conditions of human blood samples for a reliable ATX detection was investigated, identifying the impact of preanalytical and analytical techniques. Methods: Blood was collected with different media such as serum, EDTA plasma, heparin sulfate plas-ma, and citrate plasma from healthy male and female volunteers (n = 5-20). Samples were exposed to different storage conditions with temperatures ranging from 37 °C to -80 °C and times ranging from one day to six months. Samples were analyzed for their ATX concentra-tion by ELISA and their ATX activity by an enzyme-linked activity assay. Moreover, the in-fluence of supplementing a protease and/or phosphatase inhibitor, the timing of supernatant separation from cells, and the influence of different concentrations of divalent cations such as Ca2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, and Cu2+ added to EDTA plasma samples were investigated. The influence of a lack of divalent cations on protein structure, binding pocket and folding of re-combinant human ATX (rATX) was assessed with circular dichroism spectroscopy. Observations &amp; Results: While ATX concentration in serum and EDTA plasma was comparable and hardly declined at all storage temperatures within 180 days, ATX activity in EDTA plasma samples was lower and descreased over time. In contrast, ATX activity in heparin sulfate and citrate plasma re-mained stable. The timing of supernatant separation from cells and the addition of phospha-tase and protease inhibitors did not affect ATX activity in EDTA plasma. However, addition of 10 mM Ni2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, Co2+ or 100 mM Ca2+ restored activity in EDTA plasma. The same results could be observed using rATX. However, performing freeze-thaw-cycles, rATX appears less stable compared to ATX in blood samples. When EDTA was added to rATX, no major change of conformation could be detected in preliminary CD spectroscopy experiments. Conclusions: It is possible to reliably measure ATX protein concentration in serum or any type of plasma regardless of temperature or storage time. Therefore, it is a reliable parameter for daily use as a diagnostic marker in human blood for various diseases. Measurement of the ATX enzyme activity in serum should be preferred, because of the loss of activity in EDTA plasma. Binding of divalent cations by EDTA presumably alters the secondary structure of ATX, resulting in a loss of activity, which is not the case in frozen plasma. Alternatively, enzymatic activity can be reliably measured in heparin- or citrate plasma. Further studies are required to confirm pos-sible conformational changes due to EDTA.