title: Charakterisierung pathogener Auto-Antikörper gegenüber Desmoglein 3 und Desmocollin 3 in Seren von Pemphigus Patienten.
title: Characterization of pathogenic auto-antibodies directed against desmoglein 3 and desmocollin 3 in sera of pemphigus patients.
Creators: name: Rafei-Shamsabadi, David Ali
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: antibodies , pathogenic
Pemphigus
pemphigus , desmoglein 3
Desmoglein 3 , Desmocollin 3
Medizin, Gesundheit
Autoantikörper , Pathogenität
desmocollin 3

description: Pemphigus vulgaris (PV) represents
      the most frequent clinical type of the pemphigus group of
      autoimmune bullous skin disorders. There is substantial
      evidence that blister formation in pemphigus patients is
      mediated by auto-antibodies (auto-Abs) targeted against
      certain desmosomal cadherins, namely desmoglein1 (Dsg1) and
      desmoglein3 (Dsg3). Several pathogenic epitopes of Dsg3 are
      located at the amino-(NH2)-terminal end of the Dsg3
      ectodomain, namely the extracellular domain 1 (EC1). On the
      other hand a great number of pemphigus patients exhibit
      auto-Abs directed against the more carboxy-(COOH)-terminal
      epitopes of Dsg3, e.g. within the EC4- and EC5-domain and
      these domains may play an essential role in maintaining
      desmosomal adhesion. Some pemphigus patients exhibit
      additional or solely auto-Abs against other desmosomal
      cadherins, especially desmocollin 3 (Dsc3). However, the
      pathogenic relevance of Dsc3-reactive immunoglobulin G (IgG)
      has not been directly shown. This study aimed to first
      establish a method to specifically isolate Dsg3-reactive IgG
      from PV sera and to further investigate their pathogenic
      capacity using a keratinocyte based in vitro assay. This
      method was further applied to sera of four Japanese patients
      suffering from atypical pemphigus all of them exhibiting a
      positive IgG reactivity against Dsc3. Sepharose based
      affinity chromatochraphy columns coated with recombinant
      baculovirus produced proteins of the extracellular domains of
      Dsg3 and Dsc3, respectively, were used to specifically
      isolate auto-Abs from pemphigus sera. Affinity purified IgG
      fractions were subsequently tested for antigen specificity
      using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and
      immunoblotting (IB). Reactivity with native Dsg3- and
      Dsc3-protein, respectively, was proven by immunofluorescence
      (IF) on cultured human keratinocytes, monkey esophagus and
      frozen sections of normal human skin. Finally, a keratinocyte
      based so-called dissociation assay served to investigate the
      in vitro pathogenicity of the affinity purified IgG
      fractions. Eight Dsg3-reactive PV patients showed
      Dsg3-domain-specific auto-antibodies by ELISA. Four of these
      patients were selected for further investigation based on
      their antibody profile, i.e. their epitope specificity. Two
      patients (#1 and #8) exhibited IgG directed against Dsg3EC1
      and Dsg3EC4. Patient #2 exclusively expressed auto-Abs
      directed against Dsg3EC1 whereas patient #6 showed IgG
      reactivity against Dsg3EC4, only. Serum IgG was then affinity
      purified using the respective recombinant Dsg3-subdomains.
      Antigen specificity of the eluted IgG-fractions was
      subsequently verified by IB and ELISA. Isolated IgG fractions
      showed a characteristic intercellular staining pattern by IF
      using cultured human keratinocytes indicating positive
      reactivity with native Dsg3-protein. Finally Dsg3-, Dsg3EC1-
      and Dsg3EC4-specific IgG caused keratinocyte dissociation
      which was comparable to the positive control, a monoclonal
      antibody (AK23) directed against the NH2-terminus of Dsg3.
      These techniques were then applied to the sera of four
      atypical, i.e. two pemphigus vegetans and two pemphigus
      herpetiformis patients, in order to isolate Dsc3-specific
      IgG. All but one of these patients, who showed additional
      Dsg1 reactivity, exhibited IgG reactivity exclusively against
      Dsc3 but no other desmosomal cadherin. From all sera IgG
      fractions were successfully isolated and antigen specificity
      to Dsc3 was verified. Dsc3-reacitve IgG showed a
      characteristic intercellular staining pattern by IF on
      cultured human keratinocytes, monkey esophagus and human
      skin. Finally all isolated IgG fractions were able to induce
      loss of keratinocyte adhesion in vitro.Taken together this
      data strongly suggests a significant acantholytic effect of
      IgG directed against COOH-terminal epitopes of Dsg3 in
      addition to the well known pathogenic epitopes at the
      NH2-terminus of this auto-antigen. Moreover Dsc3-reactive IgG
      isolated from patients with atypical pemphigus variants
      proved to be pathogenic in vitro. For the first time these
      results directly show the acantholytic effect of
      Dsc3-reactive IgG and provides evidence for the pathogenic
      relevance of Dsc3-IgG in pemphigus patients lacking
      reactivity against other desmosomal cadherins. Further
      investigations are needed to elucidate the mechanisms by
      which auto-Abs directed against COOH-terminal epitopes of
      Dsg3 induce acantholysis. The pathogenic relevance of other
      epitopes of Dsg3 needs to be addressed. Finally screening of
      pemphigus patients’ sera for Dsc3-reactive IgG should provide
      further knowledge about their correlation with atypical
      pemphigus variants.
description: Pemphigus vulgaris (PV)
      repräsentiert die häufigste klinische Variante innerhalb der
      Pemphigus-Gruppe der autoimmunen bullösen Hautkrankheiten.
      Blasenbildung beim Pemphigus wird durch Auto-Antikörper
      (auto-Ak) gegen die desmosomalen Cadherine Desmoglein 1
      (Dsg1) und Desmoglein 3 (Dsg3) ausgelöst. Einige pathogene
      Epitope des Dsg3 liegen im amino-(NH2)-terminalen Bereich
      dieses Moleküls, genau genommen in der extrazellulären Domäne
      1 (EC1). Andererseits weist eine große Anzahl an Pemphigus
      Patienten auto-Ak gegen Carboxy-(COOH)-terminale Epitope des
      Dsg3, z.B. innerhalb der EC4- oder EC5-Domänen auf. Manche
      Pemphigus Patienten besitzen zusätzlich oder ausschließlich
      auto-Ak gegen andere desmosomale Cadherine, besonders
      Desmocollin 3 (Dsc3). Die pathogenetische Relevanz dieser
      Dsc3-reaktiven auto-Ak konnte bislang nicht direkt gezeigt
      werden. Zunächst wurde eine Methode etabliert, um
      Dsg3-reaktives Immunglobulin G (IgG) aus PV Seren spezifisch
      zu isolieren und die pathogenetische Wirkung mithilfe eines
      Zell-basierten in vitro Assays zu untersuchen. Diese Methode
      wurde anschließend auf Seren von vier japanischen Patienten
      mit atypischem Pemphigus, welche alle eine positive
      IgG-Reaktivität gegen Dsc3 aufwiesen, angewendet. Mithilfe
      von Affinitätschromatographie-Säulen, die rekombinante
      Proteine der extrazellulären Domänen von Dsg3 bzw. Dsc3
      enthielten, wurden auto-Ak aus den Seren von Pemphigus
      Patienten spezifisch isoliert. Die isolierten IgG-Fraktionen
      wurden bezüglich ihrer Antigenspezifität mittels
      enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und Immunoblotting
      (IB) getestet. Immunfluoreszenz (IF) Untersuchungen auf
      humanen Keratinozyten, Affenösophagus und Gefrierschnitten
      menschlicher Haut wiesen die Reaktivität mit nativem Dsg3
      bzw. Dsc3 nach. Ein mit Keratinozyten durchgeführter,
      funktioneller „Dissoziations-Assay“ diente der Untersuchung
      der in vitro-Pathogenität der aufgereinigten IgG-Fraktionen.
      Acht PV Patienten zeigten im ELISA Dsg3-spezifische auto-Ak.
      Vier dieser Patienten wurden aufgrund ihres geeigneten
      Antikörperprofils, d.h. der Epitopspezifität, für die
      weiteren Untersuchungen ausgewählt. Zwei Patienten (#1 und
      #8) zeigten IgG-Reaktivität gegen Dsg3EC1 und Dsg3EC4. Das
      Serum von Patient #2 beinhaltete ausschließlich auto-Ak gegen
      Dsg3EC1, wohingegen Patient #6 nur IgG-Reaktivität gegen
      Dsg3EC4 zeigte. Serum-IgG wurde anschließend mithilfe der
      jeweils entsprechenden rekombinanten Dsg3-Ektodomäne
      spezifisch aufgereinigt. Die Antigenspezifität der eluierten
      IgG-Fraktionen konnte mittels IB- und ELISA-Analysen
      verifiziert werden. Alle isolierten IgG-Fraktionen zeigten
      ein charakteristisches interzelluläres Färbemuster in der IF
      auf kultivierten humanen Keratinozyten. Durch diese
      Experimente wurde die positive Reaktivität mit rekombinantem
      und nativem Dsg3 nachgewiesen. Dsg3-, Dsg3EC1- und
      Dsg3EC4-spezifisches IgG induzierte die Dissoziation von
      Keratinozyten in einem vergleichbaren Ausmaß wie die
      Positivkontrolle, ein monoklonaler Antikörper gegen den
      NH2-Terminus von Dsg3 (AK23). Diese Technik wurde
      anschließend auf die Seren von vier atypischen, d.h. zwei
      Pemphigus Vegetans und zwei Pemphigus Herpetiformis
      Patienten, angewendet, um Dsc3-spezifisches IgG zu isolieren.
      Alle außer einem dieser Patienten, welcher zusätzlich
      Dsg1-reaktives IgG aufwies, zeigten ausschließlich
      Serum-Reaktivität gegen Dsc3 aber gegen kein anderes
      desmosomales Cadherin. Von allen vier Seren konnte
      Dsc3-reaktives IgG erfolgreich isoliert und die
      Antigenspezifität bestätigt werden. Die IgG-Fraktionen
      zeigten ein charakteristisches interzelluläres Färbemuster in
      der IF auf kultivierten humanen Keratinozyten, Affenösophagus
      und humaner Haut und induzierten den Adhäsionsverlust
      epidermaler Keratinozyten in vitro. Zusammengefasst legen
      diese Daten nahe, dass auch IgG gegen COOH-terminale Epitope
      des Dsg3, zusätzlich zu den bereits bekannten pathogenen
      NH2-terminalen Epitopen, einen akantholytischen Effekt
      aufweist. Dsc3-reaktives IgG, isoliert aus Seren von
      atypischen Pemphigus Patienten, ist pathogen in vitro. Diese
      Untersuchungen zeigen erstmalig den akantholytischen Effekt
      von Dsc3-reaktivem IgG und geben Hinweise auf die pathogene
      Relevanz von Dsc3-IgG in Seren von Pemphigus Patienten die
      keine Reaktivität gegen andere desmosomale Cadherine
      aufweisen. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die
      Mechanismen zu untersuchen, die dem akantholytischen Effekt
      von auto-Ak gegen COOH-terminale Dsg3-Epitope zugrunde
      liegen. Zudem sollte die pathogene Relevanz anderer Epitope
      des Dsg3 näher untersucht werden. Schließlich erscheint das
      Screening von Pemphigus Patienten hinsichtlich Dsc3-reaktiven
      IgG sehr vielversprechend, um weitere Erkenntnisse über
      mögliche Korrelationen mit atypischen Varianten des Pemphigus
      zu erhalten.