title: Function of the Myc-binding protein Miz1 in the mouse mammary gland
title: Funktion des Myc bindenden Proteins Miz1 in der Brustdrüse der Maus
Creators: name: Sanz Moreno, Adrian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Medizin, Gesundheit
stat5
Stat5
Miz1
mammary gland
Brustdrüse

description: Die Analyse von Proteinen, die für
      die embryonale Entwicklung sowie für Erkrankungen relevant
      sind, stellen wertvolle Informationen für die Entwicklung
      neuer therapeutischer Konzepte zur Verfügung. Das
      Protooncogen Myc ist zum Beispiel ein vielversprechendes
      Zielprotein in einer Reihe von unterschiedlichen Tumoren
      einschließlich des sogenannten „triple negativen“
      Brustdrüsenkarzinoms. In der vorliegenden Arbeit wurde zum
      ersten Mal die Funktion des Transkriptionsfaktors Miz1 in der
      Brustdrüse der Maus untersucht. Hierzu wurde ein
      konditionelles Miz1 knockout Mausmodell verwendet. Bei diesem
      Modell wird die POZ Domäne deletiert. Diese ist essentiell
      für die Ausbildung von Tetrameren, die dann stabil an das
      Chromatin binden können. Die Deletion wurde mit zwei
      unterschiedlichen Cre-Stämmen durchgeführt. Ein MMTV-Cre
      Stamm wurde verwand, um die POZ Domäne in nulliparen Mäusen
      zu deletieren, wobei die postnatale Morphogenese der Drüse,
      sowie die Brustdrüsenstammzellen untersucht wurden. Ein
      Wap-Cre Stamm wurde eingesetzt, um die Alveologenese und die
      Brustdrüsendifferenzierung während der Schwangerschaft und
      der anschließenden Laktation zu analysieren. Die Deletion der
      POZ Domäne mit MMTV-Cre erfolgt bereits im embryonalen Gewebe
      und führte zu einer Verzögerung der postnatalen Ausbildung
      und Verzweigung des Drüsenganges und einem zellärmeren
      Gangepithel. Weiterhin wurde eine von Myc unabhängige
      Anreicherung von Stamm- bzw. Vorläuferzellen in Miz1ΔPOZ
      Tieren beobachtet. Unterschiede in der Expression von
      luminalen und myoepithelialen Markern traten nicht auf. Die
      Verzögerung der postnatalen Gangentwicklung war in zwei
      Monate alten Tieren nicht mehr zu beobachten. Mit Hilfe der
      Immunhistochemie und mit Western Blots konnte gezeigt werden,
      dass die Expression von endogenem Miz1 in normalen Tieren
      während der Laktation stark erhöht ist, während am Ende der
      Schwangerschaft nur wenig Miz1 nachgewiesen werden konnte.
      Die Miz1 Expression wird also während bzw. kurz nach der
      Geburt sprunghaft erhöht. Wird die Involution eingeleitet,
      fällt die Miz1 Expression innerhalb von 48 Stunden auf Werte
      zurück, wie sie vor der Laktation beobachtet wurden. Die
      Deletion der POZ Domäne während der Schwangerschaft mit Hilfe
      von Wap-Cre erzeugte einen Laktationsdefekt während der
      ersten und der zweiten Schwangerschaft. Drüsen mit mutiertem
      Miz1 zeigte eine reduzierte Alveologenese, sowie eine
      verminderte Proliferation und Differenzierung. Dies konnte in
      der HC11 Zelllinie, die aus einer Maus-Brustdrüse isoliert
      wurde, verifiziert werden. HC11 Zellen mit geringer Miz1
      Expression proliferieren langsamer und expremieren weniger
      β-Casein, wenn sie mit einem „laktogenen Hormoncocktail“, der
      u.a. Prolactin enthält, behandelt werden. Dabei zeigt sich
      weder in vivo noch in vitro eine Änderung der Apoptoserate ,
      wenn die Miz1 POZ Domäne deletiert oder Miz1 ausgeschaltet
      wird. Brustdrüsen mit mutiertem Miz1 haben geringere Mengen
      an Stat5, was zu einer Reduktion der Expression
      entsprechender Zielgene wie α-Casein, β-Casein or whey acidic
      protein (Wap) führt. Negative Regulatoren des Jak2/Stat5
      Signalwegs wie Socs (Socs1, Socs2, Socs3) oder Caveolin-1
      (Cav1) waren in ihrer Expression nicht verändert. Im
      Gegensatz dazu wurde eine Verringerung des Prolactinrezeptors
      und von ErbB4 beobachtet. Beide Proteine sind wichtig für die
      Phosphorylierung von Stat5. Allerdings konnte mit Hilfe von
      CHIP-Seq Experimenten eine direkte Bindung von Miz1 an die
      Gene dieser beiden Proteine nicht gezeigt werden. Jedoch
      bindet Miz1 an verschiedene Gene, die für die Regulation des
      vesikulären Transportes, der Endozytose und der Autophagie
      entscheidend sind. Ein Modell, in dem die Störung des
      vesikulären Transportes der beiden Rezeptorproteine im
      Mittelpunkt steht, wird vorgeschlagen.
description: The study of the expression and
      function of proteins important for human health in normal
      development provides valuable information for the design of
      therapeutical opportunities in the context of disease. Myc is
      one of the current most promising targets for a number of
      cancer types including triple-negative breast cancer and Miz1
      has been shown to play an important role in Myc-mediated
      tumorigenesis. In the present work, the function of the
      Myc-binding protein Miz1 in the mammary gland is investigated
      for the first time using two different lines of transgenic
      mice expressing Cre-recombinase to conditionally knockout the
      POZ domain of Miz1 in the murine mammary gland. Deletion of
      this evolutionary-conserved region impedes multimerization
      and stable association of Miz1 with chromatin. MMTV-Cre
      mediated deletion was used to investigate Miz1 function in
      the virgin gland, considering branching morphogenesis and
      mammary stem/progenitor biology. Ablation under the Wap-Cre
      promoter provided information about alveologenesis and
      mammary differentiation. The mammary gland is a very suitable
      organ for stem cell and developmental studies as rounds of
      proliferation, differentiation and apoptosis occur after each
      pregnancy. POZ domain deletion using MMTV-Cre (Line A),
      already active in the embryo, led to a delayed ductal tree
      formation, less cellularity in knockout ducts and a
      Myc-independent accumulation of stem/progenitor cells in
      virgin mammary glands of Miz1DPOZ animals. No differences in
      the expression of luminal and myoepithelial markers were
      observed between control and Miz1DPOZ virgin mice. In
      addition, the delay in the development of the mammary ductal
      tree in knockout mice is rescued at around two months of age.
      Endogenous Miz1 expression in the mammary gland of control
      animals was found to be highly boosted during lactation by
      immunohistochemistry and Western blotting. Very low Miz1
      levels were detected at the end of pregnancy, which increased
      after parturition and diminished upon cessation of pup
      suckling at around 48 hours of forced involution. Miz1 POZ
      domain ablation in luminal alveolar mammary cells during
      pregnancy using the WAP-Cre transgenic line resulted in a
      lactation defect in mutant dams during the first two
      pregnancies analysed. Mutant lactating glands display a
      reduced alveologenesis as a result of a diminished mammary
      cell proliferation and differentiation. These data were also
      confirmed in vitro using the HC11 murine mammary cell line
      after retroviral infection for stable knockdown of Miz1. HC11
      cells with low levels of Miz1 show a reduced proliferation
      and a decreased expression of ß-casein after inducing
      differentiation by addition of a lactogenic hormone cocktail
      containing prolactin. Apoptosis is unaffected after either
      Miz1 POZ domain ablation in vivo or stable knockdown of Miz1
      in vitro. Mutant glands display lower levels of activated
      Stat5 which lead to a reduced expression of its
      transcriptional targets, mainly genes which code for milk
      proteins like a-casein, b-casein or whey acidic protein
      (WAP). Gene expression of negative regulators of the
      Jak2/Stat5 pathway like Socs (Socs1, Socs2 and Socs3) or
      Caveolin-1 (Cav1) is not upregulated in Miz1DPOZ lactating
      glands. In contrast, the expression of receptors important
      for a proper phosphorylation of Stat5, like the prolactin
      receptor or ErbB4, is decreased in lactating mutant glands.
      ChIP-Seq experiments revealed that genes encoding the
      prolactin receptor and ErbB4 are not direct targets of Miz1.
      Rather, Miz1 binds to genes which regulate vesicular
      transport and thus alters processes like endocytosis and
      autophagy in mammary gland cells. A model in which the
      vesicular transport of these receptors in mutant glands could
      be disrupted is proposed. In conclusion, this work shows for
      the first time that Miz1 is important for mammary
      stem/progenitor cell regulation in the virgin gland and for a
      proper proliferation and differentiation in the lactating
      mammary gland.