title: RORα als Schlüsselregulator fibrotischer Signalwege am Beispiel der systemischen Sklerose
Creators: name: Sihler, Niclas Konstantin
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 61 Medizin und Gesundheit :: 616 Krankheiten

description: Abstract Objectives Systemic sclerosis is a disease characterized by uncontrolled activation of fibroblasts, followed by production of extracellular matrix. The illness causes considerable suffering in affected people, life expectancy is reduced drastically in some cases. So far, no causal therapy exists. Important key mediators for fibroblast activation have been identified, like TGFβ and Wnt signaling pathways. However, concrete mechanisms of their interactions remain mainly unknown. The retinoic-acid related orphan receptors (RORs) are ligand-dependent transcription factors. They play an important role in numerous physiological and pathological processes, like the development of autoimmune diseases. In this work, the role of RORα in the pathogenesis of fibrotic diseases shall be examined using the example of systemic sclerosis. Design &amp; Methods Fibroblast cultures were used to evaluate the relationship between profibrotic signaling pathways and RORα. RNA-expression was quantified using real-time PCR. The activity of the TGFβ/SMAD pathway was analyzed by use of reporter assays. RORαfl/flx Col1a2-CreER mice were bred to specifically knockout RORα in fibroblasts. RORα was also inhibited using the selective agonist SR3335. The role of RORα was examined in different mouse models: bleomycin-induced dermal and pulmonary fibrosis, TBRICAinduced dermal fibrosis, and Wnt-10b-transgenic mice. Using immunofluorescence, healthy and fibrotic tissue was tested for RORα expression. Later, the same method was used to stain macrophages, in order to investigate the influence of SR3335 on macrophage polarization. HE- and α-SMA stainings were produced to quantify skinthickness and myofibroblast content. Sirius red stainings of murine lung tissue were produced in order to quantify pulmonary fibrosis. For quantification of tissue collagen content, HP-assays were performed. Observations &amp; Results Human and murine fibroblasts showed an increased expression of RORα in fibrotic lungs. Overexpression of RORα led to an increase of mRNA levels of genes that are important for fibrosis. The knockout of RORα had the opposite effect, also under stimulation with TGFβ. Inhibition of RORα using SR3335 and SR1001 reduced production of collagen and led to lower levels of Col1a1- and Col1a2-mRNA, also under stimulation with TGFβ. Reporter assays showed that SR3335 and SR1001 had the same capability of inhibiting the effects of TGF as an inhibitor of the TBR-kinase, SD208. Inhibition of RORα mitigated TGFβ-dependent fibrosis in mice that overexpressed TBRICA. Activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway in fibroblasts led to an increase in RORα expression compared to the control group. Reporter assay showed that canonical Wnt-ligands increased the transcriptional activity of RORα. SR3335 was able to inhibit the effects of stimulation with Wnt1a- and Wnt3a just as much as the endogenous Wnt-inhibitor Dickkopf (DKK). SR3335 reduced the α-SMA content of Wnt-stimulated fibroblasts. Inhibition of RORα led to a reduction of the stimulating effects of Wnt in Wnt10b-transgenic mice. It also led to a reduction of the fibrotic effects of bleomycin. Skin thickness, differentiation of myofibroblasts and hydroxyproline levels were reduced significantly in both models when using SR3335 compared to vehicle treated controls. In addition, fibroblast specific inactivation of RORα in vivo protected from bleomycin-induced fibrosis. SR3335 and the knockout of RORα reduced bleomycin-induced lung fibrosis. Finally, SR3335 might influence macrophage polarization towards M1-macrophages, although further research is needed to confirm this. Conclusion In this work, the role of RORα as an important regulator of TGFβ- and Wnt-induced fibroblast activation is demonstrated. RORα promotes fibrotic processes in fibrotic diseases through interaction with TGFβ- and Wnt-pathways, two key signaling pathways of fibrosis. Inhibition of these signaling pathways has strong antifibrotic effects in different models and organ systems and might represent a starting point for finding causal therapeutic agents for the treatment of fibrotic diseases.
description: Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Die systemische Sklerose ist eine Erkrankung gekennzeichnet durch eine unkontrollierte Aktivierung der Fibroblasten, gefolgt von einer Produktion von Extrazellulärmatrix. Bei Betroffenen löst die Krankheit erhebliches Leid aus, die Lebenserwartung ist zum Teil deutlich reduziert. Eine kausale Therapie existiert bislang nicht. Für die Fibroblasten- Aktivierung wurden bereits wichtige Schlüsselfaktoren entdeckt, wie TGFβ- und Wnt- Signalwege. Jedoch bleiben die genaueren Mechanismen der Interaktion größtenteils unerforscht. Die Retinoic-acid related Orphan Receptors (RORs) sind Ligandenabhängige Transkriptionsfaktoren. Sie spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen, wie bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen. In dieser Arbeit soll die Rolle von RORα in der Pathogenese fibrotischer Erkrankungen am Beispiel der systemischen Sklerose untersucht werden. Methoden Fibroblasten-Kulturen wurden verwendet, um den Zusammenhang profibrotischer Signalwege mit RORα zu untersuchen. RNA-Expression wurde mittels quantitativer real-time PCR bestimmt. Die Aktivität des TGFβ/SMAD-Signalweges wurde mittels Reporter Assays analysiert. RORαfl/flxCol1a2-CreER Mäuse wurden gezüchtet, um einen RORα-Knockout spezifisch in Fibroblasten erzielen zu können. Auch wurde RORα durch den selektiven Antagonisten SR3335 inhibiert. Die Rolle von RORα wurde in verschiedenen Mausmodellen untersucht: Bleomycin-induzierte dermale und pulmonale Fibrose, TBRICA-induzierte dermale Fibrose und Wnt-10b-transgene Mäuse. Mittels Immunfluoreszenz wurden gesundes und fibrotisches Gewebe auf ihre RORα- Expression hin überprüft. Im weiteren Verlauf wurden damit Makrophagen dargestellt, um den Einfluss von SR3335 auf die Polarisierung von Makrophagen zu untersuchen. HE- und α-SMA Färbungen von Maushaut wurden angefertigt, um Hautdicke bzw. den Myofibroblasten-Gehalt zu bestimmen. Sirius Red Färbungen von Lungengewebe der Maus wurden angefertigt, um Lungenfibrose zu quantifizieren. Zur Quantifizierung des Kollagengehalts in Gewebe wurden HP-Assays durchgeführt. Ergebnisse In Fibroblasten von menschlichen und murinen fibrotischen Lungen zeigte sich eine erhöhte Expression von RORα. Eine Überexpression von RORα führte zu einer Erhöhung von mRNA-Levels fibrose-relevanter Gene. Der Knockout von RORα bewirkte das Gegenteil, auch unter Stimulation mit TGFβ. Die Hemmung von RORα durch SR3335 und SR1001 reduzierte die Produktion von Kollagen und führte zu niedrigeren Col1a1- und Col1a2-mRNA-Levels, auch unter Stimulation mit TGFβ. Reporter Assays konnten zeigen, dass SR3335 und SR1001 Effekte von TGF ebenso stark hemmten wie ein Inhibitor der TBR-Kinase, SD208. Hemmung von RORα milderte TGFβ-abhängige Fibrose in Mäusen, welche TBRICA überexprimierten. Aktivierung des kanonischen Wnt/beta-catenin Signalweges führte in Fibroblasten im Vergleich zur Kontrolle zu einem Anstieg der RORα-Expression. Reporter Assays zeigten, dass kanonische Wnt-Liganden die Transkriptions-Aktivität von RORα steigerten. SR3335 konnte die Effekte einer Wnt1a- sowie einer Wnt3a-Stimulation ebenso stark hemmen wie der endogene Wnt-Inhibitor Dickkopf (DKK). SR3335 reduzierte den α-SMA-Gehalt von Wnt-stimulierten Fibroblasten. Hemmung von RORα führte zu einer Reduktion der stimulierenden Effekte von Wnt in Wnt10b-transgenen Mäusen und vor fibrotischen Effekten von Bleomycin. Hautdicke, Myofibroblasten- Differenzierung und Hydroxyprolin-Gehalt waren bei Behandlung mit SR3335 in beiden Modellen signifikant reduziert, verglichen mit Vehikel-behandelten Kontrollen. Zusätzlich schützte Fibroblasten-spezifische Inaktivierung von RORα in vivo vor Bleomycin-induzierter Fibrose. SR3335 sowie der Knockout von RORα reduzierten die Bleomycin-induzierte Fibrose in der Lunge. Zuletzt könnte SR3335 die Makrophagen- Polarisierung in Richtung M1-Makrophagen verschieben, allerdings ist hier weitere Forschung nötig, um dies zu bestätigen. Schlussfolgerung In dieser Arbeit wird die Bedeutung von RORα als wichtiger Regulator von TGFβ- und Wnt-induzierter Fibroblasten-Aktivierung demonstriert. In fibrotischen Erkrankungen fördert RORα fibrotische Prozesse, indem er mit TGFβ- und Wnt-Signalwegen interagiert, zwei Schlüsselsignalwegen der Fibrose. Eine Hemmung dieser Signalwege wirkt in verschiedenen Modellen und Organsystemen stark antifibrotisch und stellt einen möglichen zielgerichteten Therapieansatz für die Behandlung fibrotischer Erkrankungen dar.