In vitro και in vivo αξιολόγηση νέων, ισχυρών μονωτών χρωματίνης ανθρώπου ενσωματωμένων σε λεντι-ιικούς φορείς αναφοράς e-GFP
Creators: name: Γκουντής, Αντώνιος-Μάριος Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Ιικοί φορείς
Μονωτές χρωματίνης
Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα
Viral vectors
Chromatin insulators
Hematopoietic stem cells

description: Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στη γονιδιακή θεραπεία των γενετικών κυρίως νοσημάτων, παραμένει ανάγκη βελτιστοποίησης της μεθόδου. Η ενσωμάτωση του διαγονιδίου σε έκτοπη θέση στο γονιδίωμα κυττάρων-στόχων μέσω ιικών φορέων συνδέεται άμεσα με προβλήματα έκφρασης του διαγονιδίου όπως η αποσιώπηση ή η ανομοιογένεια της έκφρασης και με εισχωρητική ογκογένεση. Για την ελαχιστοποίηση αυτών των προβλημάτων έχει προταθεί η χρήση μονωτών χρωματίνης στο σχεδιασμό των ιικών φορέων. Ιδανικά, μονωτές χρωματίνης που έχουν διπλή δράση τύπου φραγμού (barrier activity) για την προστασία από την αποσιώπηση της έκφρασης αλλά και τύπου διακόπτη-ενισχυτή (enhancer-blocking activity) για την αποτροπή ενεργοποίησης ογκογονιδίων από τον ενισχυτή του ιού, θα μπορούν να άρουν μερικούς από τους σημαντικότερους περιορισμούς για την επιτυχή εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας. Μέχρι πρόσφατα, ο cHS4 (Emery et al.,2000; Yannaki et al.,2002) , αποτελούσε τον πρότυπο μονωτή χρωματίνης και τον καλύτερα χαρακτηρισμένο. Είναι ένας μονωτής με διπλή δράση που όμως λόγω του μεγάλου του μεγέθους επηρεάζει αρνητικά τους τίτλους των ιικών φορέων. Πολύ πρόσφατα, στο συνεργαζόμενο εργαστήριο του Dr. G. Stamatoyannopoulos (Seattle, WA) ανακαλύφθηκαν με τεχνικές υψηλής ανάλυσης του ανθρώπινου γονιδιώματος και ταυτοποιήθηκαν ως ισχυροί διακόπτες ενισχυτών (με ικναότητα μόνωσης παρόμοια ή μεγαλύτερη του cHS4), 27 μονωτές χρωματίνης τύπου διακόπτη ενισχυτών. Στην παρούσα εργασία, έγινε έλεγχος εάν οι 5 εξ’ αυτών ( Α1, Α4, C1, Β4, Ε2), εμφανίζουν ταυτόχρονα ικανότητα δράσης ως μονωτές τύπου φραγμού και άρα μπορούν να βελτιώσουν τόσο την ασφάλεια όσο και την αποτελεσματικότητα της γονιδιακής θεραπείας. Οι μονωτές χρωματίνης ενσωματώθηκαν σε λέντι ιικούς φορείς αναφοράς (GFP) με τους οποίους διαμολύνθηκαν ανθρώπινα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+) και ελέγχθηκαν σε καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης και ερυθροποιητικής διαφοροποίησης καθώς και σε ποντίκια με ομόζυγη σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NSG) μετά από μεταμόσχευση, έναντι μη μονωμένου φορέα αλλά και φορέα με ενσωματωμένη μια ουδέτερη αλληλουχία. Πραγματοποιήθηκαν in vitro και in vivo πειράματα, από τα οποία τα τελευταία είναι σε εξέλιξη. Ολοι οι νέοι μονωτές, Α1, Α4, C1, Β4, Ε2, δεν επηρέασαν αρνητικά τον ιικό τίτλο (λόγω τιυ μικρού μεγέθους του) με την ενσωμάτωσή τους σε GFP λεντι-ιικούς φορείς και αύξησαν, σε σχέση με το μη μονωμένο φορέα (control), τα ποσοστά έκφρασης GFP και τη μέση ένταση φθορισμού (MFI) σε αποικίες μεθυλοκυτταρίνης και σε καλλιέργεια ερυθροειδικής διαφοροποίησης των διαμολυσμένων κυττάρων. Η αύξηση αυτή της έκφρασης του διαγονιδίου των μονωμένων φορέων δεν ήταν αποτέλεσμα ενίσχυσης της ικανότητας διαμόλυνσης καθώς οι νέοι μονωτές δεν επηρέασαν τα ποσοστά διαμόλυνσης ή/και τον αριθμό ιικών αντιγράφων (VCN) συγκριτικά με την ομάδα control αλλά ήταν αποκλειστικά αποτέλεσμα της προστασίας που παρείχαν από την επίδραση των φαινομένων θέσεων. Αυτή η ικανότητα μόνωσης τύπου φραγμού των νέων χρωματινικών μονωτών αποδείχτηκε σε μονήρεις αποικίες με ταυτόχρονη ανάλυση της έκφρασης του διαγονιδίου GFP (ΜFI) και του αριθμού ιικών αντιγράφων (VCN) στην ίδια αποικία και με προσαρμογή στη συνέχεια, της έντασης της έκφρασης στο VCN (ΜFI/VCN) : οι μονωμένοι φορείς και ιδιαίτερα ο Β4-μονωμένος φορέας, απέδωσαν αυξημένη έκφραση GFP ανά ιικό αντίγραφο σε σχέση με το μη μονωμένο. Δεν παρατηρήθηκε δράση τύπου φραγμού των Ε2 και Α4 μονωτών χρωματίνης μετά τη διαμόλυνση CD34+ κυττάρων με μονωμένους λεντι-ιικούς φορείς. Σε εν εξελίξει in vivo πειράματα, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση GFP σε NSG λήπτες διαμολυσμένων CD34+ κυττάρων με τον Β4-μονωμένο φορέα έναντι των ληπτών που έλαβαν κύτταρα διαμολυσμένα με τον μη μονωμένο φορέα, τον 1ο μήνα μετά τη μεταμόσχευση. Συνοψίζοντας, φαίνεται πως οι μονωτές B4, C1, και Α1 αποτελούν ισχυρούς μονωτές χρωματίνης διπλής δράσης στα CD34+ κύτταρα ανθρώπου που δεν επηρεάζουν αρνητικά τον τίτλο του ιικού φορέα. Οι νέοι μονωτές θα μπορέσουν να βελτιώσουν σημαντικά την έκβαση της γονιδιακής θεραπείας, ως προς την ασφάλεια και αποτελεσματικότητά της, εφόσον τα αποτελέσματά μας επιβεβαιωθούν και από τα in vivo πειράματα τα οποία είναι σε εξέλιξη
description: Despite the recent progress in the gene therapy of genetic diseases, there is still need for the optimization of the method. The semi-random transgene integration in the genome of the target cells mediated by viral vectors is directly correlated with problems such as the vector silencing and the variegation of the transgene expression levels and also insertional mutagenesis. The use of chromatin insulators in the viral vector designing has been suggested in recent studies, aiming the minimalization of the upper obstacles. Ideally, chromatin insulators armed with both barrier activity for the protection against the transgene expression silencing as well as enhancer blocking activity for the prevention of oncogene activation via the vector enhancer, could remove some of the most significant limitations for the successful gene therapy application. Until recently, the cHS4 insulator posed as the model and most well characterized one (Emery et al.,2000, Yannaki et al.,2002). Although a dual functioning insulator, due to its large size it negatively affects the vector titers. Towards this direction, in the affiliate laboratory of dr.George Stamatoyannopoulos (Seattle,WA) 27 new potent enhancer blocking chromatin insulators (with similar or even enhanced ability versus cHS4) were identified through high throuput analysis techniques of the human genome. In the present study, we evaluated whether 5 of them (A1,A4,C1,B4,E2) also display barrier insulating capability aiming the improvement of the safety as well as the efficacy of gene therapy. The chromatin insulators were integrated in eGFP lenti-viral vectors for the transduction of human hematopoietic stem cells (CD34+) and were checked in methocult as well as erythroid differentiation culture and mice with homozygous severe combined immunodeficiency (NSG) upon transplantation, versus the uninsulated vector, the model and animal origin cHS4 insulator and also a spacer sequence one. Both in vitro and in vivo experiments were carried out, with the latter ones still in progress. The new insulators C1, B4 and A1 didn’t affect the vector titer (thank to their small size) following integration in eGFP lenti-viral vectors and increased , versus the uninsulated control vector, the GFP expression levels and MFI in both methocult derived colonies and during erythroid differentiation of transduced CD34+ cells. The amplification of the transgene expression with the use of the insulated vectors doesn’t reflect an augmentation of the transduction efficiency, because the new insulators neither affect the transduction levels nor the vector copy number (VCN) versus the uninsulated control group. The barrier insulation ability of the new chromatin insulators was proved in single colonies with simultaneous analysis of the GFP expression and VCN, and a subsequent calculation of the MFI/VCN ratio: the insulated vectors and especially the B4 insulated vector, yielded increased GFP expression levels versus the uninsulated one. In addition, the potential barrier insulation capability of other insulators, armed with enhancer-blocking ability (E2,A4) was evaluated following CD34+ cell transduction. In ongoing in vivo experiments, an elevated GFP expression in NSG recipients, infused with B4 transduced CD34+ cells was observed versus the recipients, which received uninsulated GFP transduced cells 1 month post-transplantation. . To sum up, it seems that the new insulators B4, C1 and A1 are potent dual functioning chromatin insulators in CD34+ cells and don’t affect the vector titer. The new insulators could significantly improve the gene therapy outcome, towards its safety and efficacy, as long as our results shall be confirmed through our ongoing in vivo experiments