title: Optimierung der Präanalytik für die NGS-basierte (Next Generati-on Sequenzierung) Nukleinsäurediagnostik an Tumorgewebe
title: Optimization of preanalytics for NGS-based (Next Generati-on Sequencing) nucleic acid diagnostics on tumor tissue
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Janßen, Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: individualized medicine
preanalytics
Next Generation Sequencing
Personalisierte Medizin
zielgerichtete Krebstherapie
Medical sciences Medicine
Medizin
personalized cancer therapies
Gewebematrices, Translationsmedizin, personalisierte Onkologie, Evidenzlevel
Gewebevergleich, Konservierungsmöglichkeiten, Qualitätsvergleich
targeted therapies
lung cancer
Präanalytik
Lungenkarzinom

description: Summary: NGS as a fundament of personalized cancer therapy The investigation of the NGS offers a comprehensive method for the identification of therapeutically attackable target structures in cancer therapy. Currently, fresh tissue is used as starting material, but its extraction is usually associated with invasiveness for the pa-tient. Therefore, the question arises as to whether the NGS examination, with optimal pre-analytics, could also be carried out with another source tissue, e.g. FFPE tissue already generated in the course of routine diagnostics. Which material shows the highest quality results? Furthermore, the results of a local panel sequencing and the much more complex and expensive Whole Exome sequencing were compared. For the establishment of an optimal preanalytics three tissue forms were compared under qualitative, financial and practical aspects (fresh tissue, FFPE and cryo). Fresh tissue was stored with a RNAlater Stabilization Solution and cryopreserved by shock freezing in liquid nitrogen. The FFPE samples have already been established in clinical practice. After the respective nucleic acid isolation, the quality and quantity of the samples were evaluated by spectrometry, tape-gel electrophoresis and an internal sequencing QC assay by Archer. Furthermore, an exempla-ry comparison of the sequencing results of four patients who received a panel sequencing (63 genes) at the University Hospital Marburg from FFPE samples and a WES from fresh tissue at the University Hospital Heidelberg was performed. It was shown that in principle all three methods of tissue preservation can be used for the investigation of NGS. The comparatively lowest amounts and the lowest quality scores were found in the FFPE samples. The highest quantity and quality in combination with low costs and a good feasibility showed the fresh tissue preserved in RNAlater. The comparison of the results of the 4 exemplary examined patients with Panel + WES revealed newly discov-ered mutations in both sequencing approaches, but none of the four patients showed a therapeutic success. In general, the approach of personalized oncology provides the basis for current controversial discussions about advantages and disadvantages (MOSCATO study vs. DRUP trials). In order to integrate these inconsistent findings into a clinically oriented estimate, it would be a comprehensible approach to focus on gene panel diagnos-tics, through which most therapy-relevant mutations can be found. The optimization and continuous updating of panel sequencing with current drug targets and new effective ther-apies should be in the focus. This could be performed on mostly existing FFPE samples without further invasiveness for the patient. Furthermore, in case of therapy failure a more detailed sequencing could be considered individually. Thus, a targeted panel analysis could be equivalent to the more time and cost intensive overall genome sequencing.
description: NGS als Grundlage für die personalisierte Krebstherapie Die Untersuchung des NGS bietet eine umfangreiche Methode der Identifizierung von therapeutisch angreifbaren Zielstrukturen in der Krebstherapie. Derzeit wird Frischgewe-be als Ausgangsmaterial verwendet, dessen Gewinnung allerdings meist mit einer Invasi-vität für den Patienten verbunden ist. Daher stellt sich die Frage ob die NGS Untersu-chung bei optimaler Präanalytik auch mit einem anderen Ausgangsgewebe, umsetzbar wäre, bspw. im Rahmen der Routinediagnostik bereits generiertes FFPE Gewebe. Wel-ches Material zeigt die qualitativ hochwertigsten Ergebnisse? Weiterhin wurden die Er-gebnisse einer lokalen Panelsequenzierung und der sehr viel aufwendigeren und teureren Whole Exome Sequenzierung verglichen. Für die Etablierung einer optimalen Präanalytik wurden drei Gewebeformen unter qualitativen, finanziellen und praktischen Gesichts-punkten verglichen (Frischgewebe, FFPE und Kryo). Die Lagerung erfolgte bei Frisch-gewebe mithilfe einer Stabilisierungslösung (RNAlater Stabilization Solution) und bei der Kryokonservierung durch Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff. Die FFPE Proben wurden bereits etabliert im klinischen Alltag hergestellt. Nach der jeweiligen Nukleinsäu-renisolation wurden diese mittels Spektrometrie, Tapegelelektrophorese und einem se-quenzierungsinternen QC Assay der Firma Archer in ihrer Qualität und Quantität beurteilt. Außerdem erfolgte ein exemplarischer Vergleich der Sequenzierungsergebnisse von vier Patienten, welche eine Panelsequenzierung (63 Gene) am Universitätsklinikum Marburg aus FFPE Proben und eine WES aus Frischgewebe am Universitätsklinikum Heidelberg erhalten haben. Es zeigte sich, dass prinzipiell alle drei Methoden der Gewebekonservie-rung für die Untersuchung des NGS genutzt werden können. Die vergleichsweise ge-ringsten Mengen und die geringsten Qualitätscores lagen bei den FFPE Proben vor. Die höchste Quantität und Qualität in Kombination mit geringen Kosten und einer guten Um-setzbarkeit zeigte das in RNAlater konservierte Frischgewebe. Der Vergleich der Ergeb-nisse der 4 exemplarisch untersuchten Patienten mit Panel + WES ergab neu entdeckte Mutationen in beiden Sequenzierungsansätzen, jedoch zeigte keiner der vier Patienten einen therapeutischen Erfolg. Generell bietet der Ansatz der personalisierten Onkologie die Grundlage für aktuelle, kontroverse Diskussionen über Vor- und Nachteile (MOSCA-TO-Studie vs. DRUP-Trials). Um diese uneinheitlichen Befunde in eine klinisch orien-tierte Schätzung zu integrieren, wäre es ein nachvollziehbarer Ansatz, sich auf die Genpa-nel-Diagnostik zu konzentrieren, durch welche die meisten therapierelevanten Mutationen gefunden werden können. Die Optimierung und kontinuierliche Aktualisierung der Panel-Sequenzierung mit aktuellen medikamentös behandelbaren Zielmolekülen und neuen wirksamen Therapien, sollte im Fokus stehen. Dies könnte an meist vorhandenen FFPE-Proben ohne weitere Invasivität für den Patienten durchgeführt werden. Weiterhin könnte bei Therapieversagen eine detailliertere Sequenzierung individuell erwogen werden. So kann eine gezielte Panelanalyse der zeit- und kostenintensiveren Gesamtgenomsequenzie-rung gleichwertig sein.