Μελέτη της ικανότητας πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των κυττάρων MEL μετά από μόνιμη επιμόλυνση με το πλήρους μήκους αντινοηματικό RPS5 cDNA
Creators: name: Ζοπουνίδου, Ελένη Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Ριβοσωμική πρωτεϊνη S5
MEL-antisenseRPS5
Ριβοσωμοπάθειες
RPS5
Ribosomopathies

description: Τα τελευταία χρόνια το διεθνές ερευνητικό ενδιαφέρον αναφορικά με τη συμμετοχή των ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε κλινικές οντότητες που συμπεριλαμβάνονται στις διαταραχές της ερυθροποίησης εντείνεται. Με νοσήματα αναφοράς την DBA (Diamond-Blackfan Anemia) και το σύνδρομο del5q γίνεται προσπάθεια αποκρυπτογράφησης των παθοφυσιολογικών μηχανισμών στους οποίους συμμετέχουν ορισμένες ριβοσωμικές πρωτεϊνες που έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με τα παραπάνω σύνδρομα. Τα κύτταρα MEL-Parental έχουν αποτελέσει επί μακρόν ερευνητικό εργαλείο του εργαστηρίου μας αναφορικά με τη μελέτη της ερυθροδιαφοροποίησης. Ιδιαίτερα η ριβοσωμική πρωτεϊνη RPS5 μελετήθηκε τόσο στα κύτταρα MEL-Parental όσο και σε κυτταρικές σειρές που προέκυψαν από τη γενετική τροποποίησή τους όπως τα κύτταρα MEL-C14 και τα κύτταρα MEL-siRPS5 (προϊόν παροδικής επιμόλυνσης με siRNA για την RPS5). Στο πλαίσιο της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας κύριο αντικείμενο μελέτης αποτέλεσαν τα κύτταρα MEL που έχουν επιμολυνθεί μόνιμα με το πλήρους μήκους αντινοηματικό RPS5 cDNA. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν αναφορικά με το δυναμικό πολλαπλασιασμού φάνηκε ότι : α) Τα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 διατηρούν υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού όταν καλλιεργούνται απουσία επαγωγέα διαφοροποίησης, ενώ εμφανίζουν αδυναμία πολλαπλασιασμού όταν καλλιεργούνται παρουσία του χημικού επαγωγέα διαφοροποίησης ΗΜΒΑ β) Τα ποσοστά θανάτου των κυττάρων MEL-antisenseRPS5 αγγίζουν το 80-90% παρουσία του ΗΜΒΑ. Αναφορικά με την ικανότητα ερυθροδιαφοροποίησης προέκυψαν τα εξής αποτελέσματα: α) Τα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 καταφέρνουν να διαφοροποιηθούν σε ποσοστό 50% μόνο, β) Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου β-major μειώνονται προοδευτικά από την έναρξη της δέσμευσης προς διαφοροποίηση μέχρι τα τελικά στάδια αυτής και γ) Η ποσοτική συσσώρευση της αιμοσφαιρίνης στα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 υπολείπεται σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα MEL-Parental και τα κύτταρα MEL-C14, γεγονός που υπογραμμίζει την ανεπαρκή δέσμευση των κυττάρων MEL-antisenseRPS5 προς διαφοροποίηση και την πιθανή σημασία του antisense μετάγραφου της RPS5 στην εξέλιξη του υποπρογράμματος της διαφοροποίησης, το οποίο αφορά την έκφραση ερυθροκυτταρικών δεικτών και την παραγωγή της αιμοσφαιρίνης στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL. Κατά τη φαινοτυπική μελέτη προέκυψε ότι: α) Τα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 διαφοροποιούνται φαινοτυπικά από τα MEL-Parental και τα MEL-C14 περιλαμβάνοντας στον πληθυσμό τους κύτταρα ευμεγέθη σε διάμετρο, ανομοιογένεια στην καλλιέργεια, ενώ παρουσία του ΗΜΒΑ εικόνα κατακερματισμού με κύτταρα που πεθαίνουν και αδυνατούν να λάβουν τον ερυθροειδή φαινότυπο που αντιστοιχεί σε κύτταρα MEL όταν αυτά δεσμεύονται προς διαφοροποίηση. β) Τα κύτταρα MEL-Parental με τη χρώση May-Grunwald-Giemsa (MGG) λαμβάνουν φαινότυπο δικτυοερυθροκυττάρων και ώριμων ερυθρών, σε αντίθεση με τα κύτταρα MEL-antisenseRPS5 στα οποία η πλειοψηφία απαρτίζεται από κύτταρα νεκρά και ελάχιστα εξ’αυτών με φαινότυπο νορμοβλαστών. Τέλος, το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των ριβοσωμικών πρωτεϊνών RPS5 και RPS19 ελαττώνεται ραγδαία από την έναρξη της δέσμευσης προς διαφοροποίηση με ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα στις 96 ώρες. Εν κατακλείδι, η επιμόλυνση των κυττάρων MEL-Parental με το πλήρους μήκους αντινοηματικό RPS5 cDNA φαίνεται να μεταβάλλει τα ιδιαίτερα γνωρίσματα της καλλιέργειας, τόσο αναφορικά με τη φαινοτυπική τους απεικόνιση, όσο και σχετικά με την κινητική συμπεριφορά τους. Υπάρχουν ενδείξεις οτι η RPS5 επιτελεί σημαντικό ρόλο σε πρώιμες αποφάσεις του κυττάρου που αφορούν τις διαδικασίες της ανάπτυξης, της απόπτωσης και της δυνατότητας ερυθροδιαφοροποίησης.
description: Over the past few years there has been major and growing scientific interest regarding the involvement of individual RPs in human pathophysiology and more specifically in certain disorders of erythropoiesis. The latter, include Diamond-Blackfan Anemia (DBA) and 5q deletion syndrome (del5q). DBA and del5q syndrome are considered as disorders of erythropoiesis directly related to abnormalities identified in ribosomal protein genes. Murine erythroleukemia (MEL) cells have long been a very useful research tool for the in vitro study of erythropoiesis. The RPS5 has been studied in MEL cells and in MEL cell lines established through genetic modification leading either to RNAi-mediated RPS5 gene silencing (MEL-siRPS5) or to RPS5 gene over-expression (MEL-C14 respectively). In the context of this study we used MEL cells stably transfected with the full length antisense mouse RPS5 cDNA (MEL-antisenseRPS5 cells) to further explore the role of RPS5 in MEL cell erythroid maturation program. The results obtained as far as the proliferation potential of MEL-antisenseRPS5 cells have showed that: a) These cells maintain their proliferation capacity when grown in culture untreated; b) Upon exposure of cells with HMBA, MEL-antisenseRPS5 significantly lose their proliferation capacity, being unable to grow as compared to untreated cultures; and c) 80-90% of MEL-antisenseRPS5 cells die when cultured in the presence of the chemical inducer HMBA. Furthermore, the experimental results obtained by assessing the differentiation potential have showed that: a) Only 50% of MEL-antisenseRPS5 cells can differentiate after 96 hrs in culture; b) Surprisingly, the gene expression profile of βmajor gene seems to decline from the beginning of commitment and even to 96 hours later; c) The hemoglobin accumulation levels in the cytoplasm of MEL-antisenseRPS5 cells are far below those achieved by MEL-Parental and MEL-C14 cultures, a finding that supports the previous data regarding the low rates seen in differentiation (Bz+ cells) on MEL-antisenseRPS5 cell cultures. The data obtained upon assessing the cell phenotype have indicated that: a) Τhere is a different cellular phenotype observed for MEL-antisenseRPS5 cells in comparison to MEL-Parental and MEL-C14 cells. MEL-antisenseRPS5 cells seem to have larger diameter and the culture exhibits extensive cellular heterogeneity. Interestingly, upon exposure to HMBA, fragmentation of cells has been observed whereas very few appear to be differentiated; b) Ιmportantly, ΜEL-Parental cells stained with MGG seem to correlate phenotypically with reticulocytes and mature red blood cells, in contrast to MEL-antisenseRPS5 cells that mostly appear to be dead in culture. The RT-PCR analysis of various gene expression profiles have showed that expression for RPS5 and RPS19 declines from the beginning of commitment to erythroid differentiation up to 96 hours thereafter. In conclusion, the stable transfection of MEL-Parental cells with the full length antisense mouse RPS5 cDNA seems to modify the characteristics of MEL cells not only on their phenotype but also on their proliferation capacity and differentiation potential. Overall, the data obtained in this study implement our previous results showing that RPS5 may play an important role in early MEL cell decisions concerning proliferation, apoptosis and/or erythroid differentiation potential.