The School of Hard Nox: Characterization of human Nox1 and cyclized Rab7
Creators: name: Woo, Tammy T.
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2008
Subjects: subject: Rab7
subject: Cyclization of proteins
subject: Nox1
subject: 610

description: Deliberate enzymatic production of superoxide (O2.-) was originally thought to be restricted to the membrane-associated multi-subunit NADPH Oxidase in phagocytic cells, which use superoxide as a precursor to secondary reactive oxygen species (ROS) to destroy engulfed pathogens as a part of innate immunity. Recent discovery in nonphagocytic tissues of an entire family of proteins (Nox) homologous to the catalytic subunit of the phagocytic NADPH Oxidase has led to the recognition of the role of ROS in normal cellular signaling, with an increasing awareness of the pathological consequences when this signaling becomes dysregulated. These Nox proteins normally produce low-level, intracellular superoxide, although many factors can stimulate their activity. Nox1 has emerged as a key oxidase in the vasculature with the discovery that factors which promote vascular disease additionally stimulate its activity. Knowledge of the three-dimensional structure of the holoenzyme or of the cytosolic domain, which catalyzes the first electron transfer step, could aid in the design of specific inhibitors as novel therapeutics. In this work, methods were developed to produce recombinant human Nox1 suitable for structure determination by X-ray crystallography. Investigations to promote the heterologous expression of recombinant full-length human Nox1 in E. coli did not result in observable overexpression. In contrast, four constructs containing the cytosolic domain of human Nox1 were solubly expressed in low amounts. Expression and purification protocols were developed for these constructs. Of these, an N-terminally His-tagged truncated human Nox1 containing residues 290-564 was found to possess an intrinsic NADPH-dependent diaphorase activity of 0.95 mol reduced NBT/min/mol protein. This activity is similar in magnitude to that of a longer construct of the phagocytic homologue, and is higher than Nox1 activity measured in vivo. The purified truncated human Nox1 required high ionic strength conditions for stability, and incubation with phagocytic regulatory proteins slightly enhanced its intrinsic activity. This active truncated human Nox1 would be suitable for future structure determination studies. Protein backbone cyclization is a method to increase the inherent stability of a target protein, and may also be a useful tool to aid in the crystallization of proteins through stabilization of flexible loops. To evaluate the potential of this application, Rab7 GTPase (residues 7-185) was cyclized, characterized, crystallized in both GDP- and GTP-bound forms, and the corresponding structures were determined. Cyclization did not significantly alter the secondary structure of Rab7, but increased its thermal stability by 3.7°C. Cyclized Rab7 demonstrated similar GTPase activity and effector association-dissociation kinetics as an equivalent linear Rab7 construct. Cyclized Rab7*GDP crystallized readily and diffracted to significantly higher resolution than uncyclized Rab7*GDP. Crystal contacts involving residues from the linker used for cyclization stabilized the Switch I loop, which is disordered in Rab7*GDP structures, such that its structure could be determined. Cyclized Rab7*GppNHp was also crystallized, but these crystals were found to be pseudomerohedrally twinned with a high twinning fraction. In contrast to the stabilization seen in the cyclized Rab7*GDP structure, the final model of cyclized Rab7*GppNHp contained several regions of flexibility, including the Switch II loop, which is visible in other active Rab7 structures. These structures indicate that the N- and C- termini normally point in opposite directions. The linker used for cyclization may not be long enough to allow the protein to adopt this conformation, generating a strained conformation that affects other regions of the protein, like Switch II. In general, protein backbone cyclization can be a useful method to aid in the crystallization of proteins in which the N- and C-termini lie in close proximity to each other.
description: Bisher wurde angenommen dass die gezielte enzymatische Produktion von Superoxid (O2.-) ausschließlich in der membran-assoziierten NADPH-Oxidase in Phagozyten stattfindet. Diese verwenden Superoxid als Vorstufe sekundärer reaktiver Sauerstoff-Spezies (ROS), um im Rahmen der angeborenen Immunantwort umhüllte Pathogene zu zerstören. Die in letzter Zeit in nicht-phagozytischem Gewebe entdeckte ´"Nox" Protein-Familie, welche homolog ist zur katalytischen Untereinheit der phagozytischen NADPH-Oxidase, hat zu der Erkenntnis geführt dass ROS auch außerhalb von Phagozyten als Signalmoleküle eine wichtige Rolle spielen. Damit einher ging auch ein Verständnis für die pathologischen Konsequenzen einer Fehlregulation von ROS. Nox-Proteine produzieren normalerweise kleine Mengen intrazellulares Superoxid, obwohl viele verschiedene Faktoren diese Aktivität stimulieren können. Mit der Erkenntnis dass viele Herzkreislauferkrankungen verursachende Faktoren auch die Aktivität von Nox1 stimulieren können, wurde in Nox1 eine der wichtigsten NADPH-Oxidasen des Gefäßsystems erkannt. Die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des ganzen Enzyms Nox1 oder seiner cytosolischen Domäne, welche den ersten Elektronübergang katalysiert, würde die Entwicklung spezifischer Inhibitoren als potentielle neuartige Medikamente unterstützen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zur Strukturaufklärung mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse ein Expressionsprotokoll und ein Reinigungsprotokoll für die rekombinante Proteinerzeugnung des menschlichen Nox1s (hNox1) entwickelt. Untersuchungen der Expression des Volllängenproteins hNox1 in E. coli zeigten keine nennenswerte Protein-Produktion. Im Gegensatz wurden vier Konstrukte der zytosolischen Domäne in niedrigen Mengen löslich exprimiert. Eines dieser Konstrukte, welches einen N-terminalen Hexahistidin-Tag und die Aminosäurereste 290-564 einschließt, zeigte eine Aktivität von 0,95 mol reduziertes NBT/min/mol Protein. Diese Aktivität ist vergleichbar mit der Aktivität eines längeren verkürzten Konstrukts des phagozytischen Homologs, und größer als die für Nox1 in vivo gemessene Aktivität. Dieses gereinigte, verkürzte Konstrukt von hNox1 benötigte zur Stabilisierung Puffer mit einer hohen Ionenstärke. Die Inkubation mit phagozytischen zytosolischen Regulator-Proteinen führte zu einer leichten Erhöhung der intrinsischen Aktivität. Dieses aktive verkürzte Konstrukt könnte sich gut für zukünftige Röntgenstrukturanalysen eignen. Proteinzyklisierung ist eine Methode, die inhärente Stabilität eines Proteins zu erhöhen. Dadurch kann auch die Kristallisation eines Proteins ermöglicht werden, da z.B. flexible Bereiche des Proteins stabilisiert werden können. Um das Potential dieser Methode zu validieren, wurde die kleine GTPase Rab7 (Aminosäurereste 7-185) zyklisiert, charakterisiert, und in Komplex mit GDP und GTP kristallisiert. Die Zyklisierung verändert die Sekundärstruktur von Rab7 nicht bedeutsam, jedoch erhöht sich dadurch die thermische Stabilität des Proteins um 3,7°C. Zyklisiertes Rab7 hat eine mit linearem Rab7 vergleichbare GTPase-Aktivität und Assoziations/Dissoziations-Kinetik für Effektormoleküle. Zyklisiertes Rab7 hat die Kristallisation und Diffraktion von Rab7*GDP erheblich verbessert. Neue Kristallkontakte, welche Aminosäurereste des zur Zyklisierung verwendeten Linker-Bereichs involvieren, stabilisieren den normalerweise ungeordneten Switch I Bereich so weit dass die Kristallstruktur dieses Bereichs aufgeklärt werden konnte. Zyklisiertes Rab7*GppNHp wurde auch kristallisiert, aber die erhaltenen Kristalle waren hochgradig pseudomerohedral verzwillingt. Im Gegensatz zum zyklisierten Rab7*GDP zeigt die Kristallstruktur von zyklisiertem Rab7*GppNHp viele flexible Bereiche, welche auch den normalerweise sichtbaren Switch II Bereich einschließen. In Strukturen von aktivem Rab7 zeigt der N- und C-Terminus in entgegengesetzte Richtungen. Der zur Zyklisierung verwendete Linker scheint jedoch zu kurz zu sein um eine vergleichbare energetisch günstige Konformation zu ermöglichen. Dadurch wird eine weniger günstige Konformation erzwungen, in der einige Bereiche des Proteins wie Switch II eine hohe Flexibilität aufweisen. Allgemein kann Proteinzyklisierung als eine sehr nützliche Methode zur Unterstützung der Kristallisation von Proteinen eingesetzt werden, in denen der N- und C-Terminus in enger räumlicher Nähe zueinander liegen.