title: Moleculare identification of a new type of the desmosomal plaque protein PKP3 and its characterization
title: Molekulare Identifizierung einer neuen Variante des desmosomalen Plaqueproteins PKP3 und deren Charakterisierung in normalem und pathologischem humanen Gewebe
Creators: name: Mühmer, Mario
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Plakophilin 3
tumorigenesis
Medizin, Gesundheit
Desmosom
RACE
Tumorentstehung
Variante
Epithel

description: Desmosomes are plaque containing
      adhesion structures of the cell, anchoring intermediate
      filaments. They are mostly found in tissues, which are prone
      to mechanical stress, e.g. the human skin. Plakophilin 3,
      family member of the desmosomal plaque proteins PKP1 – 3,
      which are expressed in a tissue specific manner, inherits not
      only the adherent function in desmosomes, but also additional
      functions in regulation of protein biosynthesis and
      tumorigenesis. It acts as a tumor suppressor or an oncogene,
      depending on carcinoma type. At present, 2 different splice
      variants are described for PKP1 and 2, while none are known
      for PKP3. In this thesis, a novel variant of PKP3 was
      identified, designated as PKP3b in analogy to PKP1 and PKP2.
      This variant differs from the known PKP3 (PKP3a) due to a
      newly identified exon positioned about 1600 bp upstream of
      the known exon1. This novel exon-1 is spliced into the coding
      sequence of PKP3a. The resulting mRNA was characterized on
      molecular level including the completion of the 5’-end by a
      modified RACE method. Bearing a distinct translation start,
      the mRNA of PKP3b differs within the first 112 nucleotides as
      compared to PKP3a, thereby coding for a protein of 812 amino
      acids (AA) with a calculated molecular mass of 88.655 Da. The
      first 27 AA of PKP3b and respectively the first 12 of PKP3a
      are unique for each of them, while the remaining sequence of
      both variants is identical. Polyclonal antisera against PKP3a
      and 3b were generated and purified and used in
      immunobiochemical, immuncyto- and immunohistochemical
      analyses of both variants. Immunofluorescene microscopy
      demonstrated the expression of PKP3b in cell lines derived
      from multi-layered epithelia (HaCat, A431), here in typical
      desmosomal localization. Cell lines from single layered
      epithelia showed less (MCF-7, HT-29) or no PKP3b (CaCo-2,
      A549) expression. Similar to the results in cell cultures,
      both variants were identified in immunofluo-rescence analyses
      on tissue sections of different human tissues und tumors
      where PKP3b is particularly expressed in stratified
      epithelia. The results demonstrate a differential expression
      of PKP3b in various cell types in comparison to PKP3a.
      Identification of specific promoter elements substantiates an
      independent regulation of the PKP3b variant, which might
      explain the differential expression pattern of both proteins.
      Whether the varying expression of PKP3b in some malignant
      transformed cell lines is altered during cell culture has to
      be evaluated in future experiments. Further experiments have
      to address specific interaction partners of PKP3b and the
      distinct expression profile, thereby resolving the functional
      role of PKP3b.
description: Desmosomen sind plaquehaltige und
      Intermediärfilament-verankernde Zell-Adhäsionsstrukturen, die
      vor allem in Geweben zu finden sind, die mechanischer
      Beanspruchung ausgesetzt sind, wie z.B. der menschlichen
      Haut. Plakophilin 3 gehört zu einer Gruppe von drei
      verwandten desmosomalen Plaque-Proteinen (PKP1 – PKP3),
      welche gewebespezifisch exprimiert werden. Neben der
      Desmosom-assoziierten Adhärenzfunktion sind für die
      Plakophiline zusätzli-che Funktionen in der Regulation der
      Proteinbiosynthese beschrieben. PKP3 spielt außerdem eine
      Rolle bei der Tumorentstehung. Abhängig vom Karzinom-Typ
      fungiert PKP3 entweder als Tumorsuppressor oder als Onkogen.
      Während jeweils 2 Spleißvarianten für PKP1 und PKP2
      beschrieben worden sind, konnte für PKP3 bisher keine weitere
      Isoform nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit
      wurde eine neue Variante von PKP3 identifi-ziert und in
      Analogie zu PKP1 und 2 als PKP3b bezeichnet. Die neue
      Variante unterscheidet sich durch ein neues Exon-1, das ca.
      1600 bp vor dem ersten bislang bekannten Exon liegt. Das neu
      identifizierte Exon von PKP3b wird in den kodie-renden
      Bereich der bekannten Variante PKP3a gespleißt. Die mRNA von
      PKP3b wurde in dieser Arbeit molekularbiologisch in
      Gesamtzell-mRNAs verschiedener Zelllinien beschrieben. Das
      5’-Ende der mRNA von PKP3b wurde mittels einer modifizierten
      RACE-Methode identifiziert. Die PKP3b-mRNA verfügt über einen
      eigenen Translationsstart und unterscheidet sich damit in den
      ersten 112 Nukleotiden von PKP3a und kodiert für ein 812
      Aminosäuren langes Protein mit einer molekularen Masse von
      88.655 Da. Die ersten 27 Aminosäuren von PKP3b
      beziehungsweise die ersten 12 Aminosäuren von PKP3a sind für
      die einzelnen Varianten charakteristisch, wohingegen die
      übrige Sequenz identisch ist. Des Weiteren wurden polyklonale
      Antiseren gegen PKP3a und PKP3b hergestellt, aufgereinigt und
      für den immunbiochemischen, immunzyto- und
      immunhisto-chemischen Nachweis beider Varianten verwendet.
      Die Existenz des PKP3b-Proteins konnte in
      Immunfluoreszenz-mikroskopischen Analysen von Zelllinien aus
      mehrschichtigen Epithelien (HaCaT, A431) in
      Desmosomen-typischer Lokali-sation nachgewiesen werden. In
      Zelllinien aus einschichtigen Epithelien ließ sich wenig
      (MCF-7, HT-29) bis kein PKP3b nachweisen (CaCo-2, A549).
      Analog zu den Zellkulturergebnissen konnten in verschiedenen
      humanen Geweben und Tu-moren Immunfluoreszenz-mikroskopisch
      beide Varianten nachgewiesen werden, wobei PKP3b vor allem in
      mehrschichtigen Epithelien exprimiert wird. Die Ergebnisse
      zeigen eine gegenüber der bekannten Variante PKP3a
      differentiel-le Expression der neu identifizierten Variante
      PKP3b in verschiedenen epithelialen Zelltypen auf.
      Spezifische Promoter-Bindungsstellen untermauern eine eigene
      Regulation der PKP3b Variante und könnten das abweichende
      Expressionsmuster erklären. Ob im Zuge der Entartung von
      Epithelzellen in der Zellkultur die Ex-pression beeinflusst
      wird, konnte bisher nicht geklärt werden. Weiterführende
      Untersuchungen werden der Suche nach spezifischen
      Protein-Interaktionspartner von PKP3b und dem veränderten
      Expressionsprofil nachgehen und damit letztlich die
      funktionelle Bedeutung von PKP3b klären.