Διερεύνηση για την πιθανή σχέση των ραμνολιπιδίων με τις πρωτεΐνες DING και φλαζελλίνη στο βακτήριο Bacillus cereus.:
Creators: name: Τσανακτσίδου, Θωμαή Παναγιώτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Ραμνολιπίδια
DING πρωτεΐνες
Φλαζελλίνη
Rhamnolipids
DING proteins
Flagellin

description: Ο σκοπός της διπλωματικής εργασίας ήταν η διερεύνηση της ύπαρξης σχέσης μεταξύ τριών συστατικών των βακτηρίων, των παθογόνων παραγόντων ραμνολιπιδίων, με τη φλαζελλίνη, το δομικό συστατικό των μαστιγίων των βακτηρίων, και των DING πρωτεϊνών που χαρακτηρίζονται από μια συντηρημένη αλληλουχία στο Ν-τελικό άκρο (DINGGG) στο βακτήριο Bacilluscereus. Στην Ψευδομονάδα η DING πρωτεḯνη εντοπίστηκε στους μίσχους των βακτηρίων.Το παρόν σύγγραμμα χωρίζεται σε τρείς κύριες θεματικές ενότητες:Στο πρώτο κεφάλαιο, το οποίο χωρίζεται σε τέσσερις υποενότητες, δίνονται πληροφορίες σχετικά με το βακτήριο, τα ραμνολιπίδια, τη φλαζελλίνη και τις DING πρωτεΐνες. Για το βακτήριο δίνονται γενικές πληροφορίες (γένος, οικογένεια, σχήμα), καθώς και πληροφορίες για την τοξικότητά του, την παθογένεια, τις λοιμώξεις που μπορεί να προκαλεί αλλά και τη θεραπεία αυτών. Για τα ραμνολιπίδια δίνονται πληροφορίες σχετικά με τη δομή και τις ιδιότητές τους και στη συνέχεια αναλύεται η βιοσύνθεση των ραμνολιπιδίων και η ρύθμιση αυτής στα διάφορα στάδια, καθώς και η εξειδικευμένη ρύθμιση από παράγοντες όπως η συγκέντρωση των φωσφορικών, και τέλος γίνεται αναφορά για την λοιμογόνο δράση τους. Αντίστοιχα με τα ραμνολιπίδια και για τους μίσχους γίνεται περιγραφή της δομής τους, της βιοσύνθεσής τους καθώς και της ρύθμισής της, αλλά και των πιθανών λειτουργιών τους στο κύτταρο. Στη συνέχεια γίνεται λεπτομερής περιγραφή των μαστιγίων, στα οποία οφείλεται η κίνηση των βακτηρίων, των οποίων δομικό συστατικό είναι η φλαζελλίνη. Συγκεκριμένα αναλύονται η δομή των μαστιγίων και η πορεία συναρμολόγησής τους, η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και η ρύθμιση της περιστροφής των μαστιγίων. Το τελευταίο κομμάτι αυτού του κεφαλαίου ανήκει στις DING πρωτεΐνες, όπου μπορούμε να βρούμε πληροφορίες σχετικά με τη δομή τους, την κατηγοριοποίησή τους σε υπο-οικογένειες, για τον τρόπο με τον οποίο δεσμεύουν τα φωσφορικά, αλλά και για το ρόλο τους σε διάφορες ασθένειες ή/και θεραπείες. Το δεύτερο κεφάλαιο περιλαμβάνει τη λεπτομερή περιγραφή των μεθόδων και των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Το τρίτο κεφάλαιο περιλαμβάνει τόσο την αναλυτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν κατά την διεξαγωγή των πειραμάτων, όσο και τα συμπεράσματα στα οποία καταλήξαμε ερμηνεύοντας αυτά τα αποτελέσματα. Συγκεκριμένα στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζεται καταρχήν η ύπαρξη ραμνολιπιδίων, φλαζελλίνης και DING πρωτεϊνών στο εξωκυττάριο υγρό αλλά και στους μίσχους (stalks), κάτι που αποδεικνύεται μέσω της μεθόδου Dot-Blot. Στη συνέχεια τα δείγματα των μίσχων υποβάλλονται σε ηλεκτροφόρηση SDS κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες και ακολουθεί westernblotting, ώστε να ανιχνεύσουμε τα συστατικά του δείγματος με τη χρήση τωντριών αντισωμάτων, anti-DING, anti-FliC και anti-RLs, και να δείξουμε την πιθανή σχέση μεταξύ των τριών συστατικών.Επιπλέον έγινε καθαρισμός ραμνολιπιδίων από το εξωκυττάριο υγρό και ανίχνευση των συστατικών στο δείγμα που απομονώθηκε με τη μέθοδο westernblotting, όπως αναφέραμε και παραπάνω. Τελευταία μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε είναι η ανοσοκατακρήμνιση των δειγμάτων, τόσο των μίσχων όσο και των απομονωμένων ραμνολιπιδίων, τα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε westernblotting με τα αντισώματα anti-RLs και anti-DING. Αποτέλεσμα των παραπάνω πειραμάτων ήταν τελικά να καταλήξουμε στο συμπέρασμα πως υπάρχει σχέση μεταξύ των ραμνολιπιδίων και των πρωτεϊνών DING και φλαζελλίνης. Η σχέση αυτή μπορεί να οφείλεται στην δημιουργία κάποια ισχυρού συμπλόκου μεταξύ των τριών.
description: The purpose of this essay was to investigate the existence of relationship between the three components of bacteria, pathogens rhamnolipids, with flagellin, which is a structural component of bacterial flagella, and DING proteins which are characterized by a conserved sequence at the N-terminus (DINGGG), in the bacterium Bacillus cereus. In Pseudomonas the DING protein is detected in the stalks of bacteria. This textbook is divided into three main themes: In the first chapter, which is divided into four subsections, information is given about the bacterium, the rhamnolipids, the flagellin and DING proteins. General information is given about the bacterium (genus, family, shape), as well as, information about its toxicity, pathogenicity, the infection that it can cause and the treatment. For rhamnolipids information is given concerning the structure and the properties and subsequently their biosynthesis is analyzed and regulation thereof in the different stages, and the specific regulation by factors such as the concentration of the phosphate, and finally becomes a reference for their virulence. Respectively with rhamnolipids, a description is also given for the structure of their stalks, their biosynthesis and its regulation, and the potential functions in the cell. Afterwards, a detailed description of the flagella is made, which is due to the movement of bacteria, whose structural component is flagellin. Specifically, the structure of flagella has been analyzed, as well as, their assembly pathway, the regulation of gene expression and the regulation of flagella rotation. The last part of this chapter belongs to the DING proteins, where we can find information on their structure, their categorization into subfamilies, the manner in which phosphate binds, but also on their role in various diseases and / or treatments. The second chapter includes a detailed description of the methods and materials used while conducting experiments. The third chapter includes both a detailed presentation of the results obtained by conducting the experiments, and the conclusions reached in interpreting these results. Primarily, in this chapter the existence of rhamnolipids, flagellin and DING proteins is shown in the extracellular fluid and stalks, which is proved through a Dot-Blot process. Samples of stalks were then subjected to SDS electrophoresis under denaturing conditions followed by western blotting, to detect the sample’s components using the three antibodies, anti-DING, anti-FliC and anti-RLs, and show potential relationship between these three components. Furthermore, purification of rhamnolipids from the extracellular fluid was made and detection of the components in the sample isolated by the method of western blotting, as we mentioned above. The last method used was the immunoprecipitation, both of the stalks and the isolated rhamnolipids, and the samples were then subjected to western blotting with antibodies anti-RLs and anti-DING. The result of the experiments above was, ultimately, to conclude that there is a relationship between rhamnolipids, DING proteins and flagellin. This relationship may be due to the creation of a strong complex between these three.