Χαρακτηρισμός απομονώσεων του μύκητα Botrytis cinerea από υποκείμενα πυρηνοκάρπων και γιγαρτοκάρπων
Creators: name: Κωνσταντίνου, Σωτήριος Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Botrytis cinerea
Υποκείμενα
Τήξεις φυταρίων
Seedlings
Damping-off disease

description: Η δενδροκομία αποτελεί σημαντικό κομμάτι της αγροτικής παραγωγής, ενώ οι σύγχρονες μέθοδοι καλλιέργειας αποφέρουν σημαντικά κέρδη στους παραγωγούς. Αυτές οι σύγχρονες μέθοδοι επιβάλλουν τη χρησιμοποίηση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστού υλικού, συμπεριλαμβανομένων και υποκειμένων που θα καλύψουν τις ανάγκες της κάθε καλλιέργειας. Ο πιο σύγχρονος και ασφαλής τρόπος για την παραγωγή τέτοιου υλικού είναι η ιστοκαλλιέργεια, όπου εξασφαλίζεται ο πολλαπλασιασμός των ζητούμενων γενοτύπων σε σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα. Κατά το τελευταίο στάδιο όμως, της παραγωγής, τα φυτώρια αντιμετωπίζουν συχνά προβλήματα τήξεων λόγω προσβολής των νεαρών φυτών από παθογόνους μύκητες, με αποτέλεσμα η ζημιά, ανάλογα με την εποχή και το παθογόνο, να φτάνει ακόμα και στο 90%. Ειναι σημαντική, επομένως, η γνώση των παθογόνων που προκαλούν αυτές τις απώλειες, ώστε να εφαρμόζεται το κατάλληλο σχέδιο αντιμετώπισης τους. Αυτός ήταν και ο αρχικός σκοπός της παρούσας εργασίας. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν 8 δειγματοληψέιες, την Άνοιξη και το Φθινόπωρο των ετών 2012 και 2013, από 10 διαφορετικά υποκείμενα πυρηνοκάρπων και γιγαρτοκάρπων που εμφάνιζαν συμπτώματα τήξεων κατά το στάδιο του εγκλιματισμού και της σκληραγώγησής τους. Τα αποτελέσματα από την απομόνωση και ταυτοποίηση των μυκήτων από τα προσβεβλημένα φυτά, έδειξαν πως το κυριότερο παθογόνο αίτιο των τήξεων ήταν ο Botrytis spp., με ποσοστό εμφάνισης 62,2 %. Επίσης, το 32,6 % των απομονώσεων αναγνωρίσθηκε πως ανήκει σε 5 διαφορετικά είδη Fusarium, τα F. equiseti, F. oxysporum, F. proliferatum, F. armeniacum και F. avenaceum. Σε αρκετά χαμηλές συχνότητες ανιχνεύθηκαν και τα παθογόνα Alternaria alternata (1,3 %) και Stemphylium sp. (3 %). Τέλος, με ποσοστό 0,9 % ανιχνεύθηκε και ο Rhizoctonia solani AG4, ο οποίος αν και θεωρείται σημαντικό παθογόνο τήξεων σε πολλούς ξενιστές παγκοσμίως, στη συγκεκριμένη περίπτωση βρέθηκε σε πολύ χαμηλό ποσοστό, λόγω της χρησιμοποίησης βιολογικών παραγόντων του γένους Trichoderma στη ρίζα των φυτών. Η κατανομή των παθογόνων μεταξύ των δύο ετών που πραγματοποιήθηκαν οι δειγματοληψίες, έδειξε πως ενώ τη πρώτη χρονιά ο Botrytis spp.απομονώθηκε σε σχετικά χαμηλά ποσοστά που έφταναν το 41,6 %, τη δεύτερη χρονιά το ποσοστό του έφτασε το 86 %, ενώ η εποχική κατανομή έδειξε πως οι απομονώσεις του προέρχονταν κυρίως απο δειγματοληψίες που πραγματοποιήθηκαν την Άνοιξη. Επίσης, και μεταξύ των υποκειμένων, τα ποσοστά του ήταν πολύ υψηλά, με τα είδη του Fusarium να ακολουθούν και σε μερικούς ξενιστές να εμφανίζονται ως τα κυρίαρχα παθογόνα με μικρές διαφορές ωστόσο, σε σχέση με τον Botrytis. Όμως, από τα πειράματα παθογόνου ικανότητας φάνηκε πως τα είδη Fusarium που απομονώθηκαν, λειτουργούν ως παθογόνα αδυναμίας στους συγκεκριμένους ξενιστές, και τους προσβάλλουν μόνο όταν έχουν υποστεί κάποια άλλη βιοτική ή αβιοτική κατταπόνιση, σε αντίθεση με τους άλλους μύκητες, όπου ύστερα από τις τεχνητές μολύνσεις σε διάφορα υποκείμενα, εμφανίστηκαν συμπτώματα σε φύλλα (A. alternata, Stemphylium sp. και Botrytis cinerea), στέλεχος (B. cinerea sensu stricto) και ρίζα (R. solani).Στόχος του δεύτερου κομματιού της εργασίας ήταν να διερευνηθεί η δομή του πληθυσμού και η ανθεκτικότητα των στελεχών σε μυκητοκτόνα, του κυριότερου παθογόνου τήξεων, όπως προέκυψε από το πρώτο σκέλος της έρευνας, του Botrytis spp.Ο χαρακτηρισμός των απομονώσεων έγινε σύμφωνα με τη παρουσία δύο μεταθετών στοιχείων Boty και Flipper, και την ανίχνευση της παρουσίας δύο εισαγωγών 21 bp και 18 bp στο γονίδιο του μεταγραφικού παράγοντα mrr, για το διαχωρισμό του Botrytiscinereasensustricto από ένα νέο κλάδο μέσα στο πληθυσμό του Botrytis, τον BotrytisGroupSαλλά και τον B. pseudocinerea. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως κυρίαρχα ήταν τα στελέχη τύπου transposa σε ποσοστό 83,6%, τα οποία φέρουν στο γονιδίωμα τους και τα δύο μεταθετά στοιχεία, ενώ στελέχη τύπου Boty, Flipper ή Vacuma εμφανίστηκαν σε ποσοστό 11.9, 1.5 και 3%, αντίστοιχα. Όσο αφορά τα στελέχη B. cinereasensustricto, καταγράφηκαν σε ποσοστό 69.7%, ενώ σε σημαντικά μεγάλο ποσοστό (29.6%) βρέθηκαν και στελέχη BotrytisGroupS. Επίσης, για πρώτη φορά στην Ελλάδα, ανιχνεύθηκε 1 στέλεχος του B. pseudocinerea.Σε ότι αφορά την ανθεκτικότητα των στελεχών στα βοτρυδιοκτόνα, αυτή οφειλόταν κυρίως σε σημειακές μεταλλάξεις. Υψηλά ποσοστά ανιχνεύθηκαν στους παρεμποδιστές του συμπλόκου III της αναπνοής (89.8%), τους παρεμποδιστές της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος (73%) και τα βενζιμιδαζολικά μυκητοκτόνα (64.6%), ενώ σε χαμηλότερα ποσοστά βρέθηκαν στελέχη με ανθεκτικότητα στις ανιλινοπυριμιδίνες, τα υδροξυανιλίδια, τα δικαρβοξαμιδικά και τα φαινυλοπυρρόλια. Επίσης, μελετήθηκε η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο sdhB, οι οποίες προσδίδουν ανθεκτικότητα στα μυκητοκτόνα της ομάδας των SDHIs, και βρέθηκε πως στο 89,8 % των ανθεκτικών στελεχών σε τουλάχιστον ένα εκ των δύο μυκητοκτόνα αυτής της ομάδας, έφεραν τη μετάλλαξη H272R. Επίσης, το 6,3 % των απομονώσεων είχε τη μετάλλαξη Ν230Ι, ενώ για πρώτη φορά παγκοσμίως, ανιχνεύθηκε μία νέα μετάλλαξη, που μάλιστα φαίνεται να συσχετίζεται με ανθεκτικότητα και στο boscalid και στο fluopyram, όπου αντικαθίσταται η προλίνη από ιστιδίνη στο κωδικόνιο 225 (P225H).Μικρός αριθμός στελεχών (6.7%) που εμφάνισαν ανθεκτικότητα σε όλα τα μυκητοκτόνα, χαρακτηρίστηκαν ως MDR1h, καθώς ανιχνεύθηκε η απουσία 3 ζ.β. από το γονίδιο mrr1, και αυτή είναι η πρώτη καταγραφή τους στην Ελλάδα.
description: Arboriculture is an important part of agriculture production. Εspecially, modern farming methods generate substantial profits for the producers. These modern methods require the use of certified propagating material, and more specifically the use of rootstocks that could meet the needs of each occasion. The most contemporary and secure way to produce such a quality propagating material is tissue culture. This multiplication method ensure a high number of rootstocks with the desirable genotype, at short time intervals. However, at the final stage of production, nurseries often face significant damages due to fungal pathogens that cause damping off diseases, and in some cases, losses can reach 90 %. Thus, it is important to identify these pathogens that cause damping off diseases in rootstock seedlings, in order to apply the suitable control strategy.The primary aim of current study was the creation of a database with the causal agents of damping off diseases in micropropagated stone- and pomefruit rootstock seedlings. In total, 248 isolates were collected during 2012 and 2013 from 10 different rootstock seedlings. Results showed that, Botrytis spp. was the major pathogen with an incidence of 62,2 %. Also, 32,6 % of the isolates were identified as five different species of Fusarium, while Alternaria alternata (1,3 %) and Stemphylium sp. (3%) were isolated in low rates. Although, Rhizoctonia solani AG4 is considered to be an important pathogen of damping off diseases in many crops worldwide, in that case was detected in very low frequencies (0,9 %), because of the use of the biological agent Trichoderma used for the control of soilborne pathogens. The pathogen ditribution between the two sampling years showed that, while in 2012 Botrytis was detected in low rates (41,6 %) compared with Fusarium spp. (48,3 %), in 2013 the frequency reached a value of 86 %. The seasonal distribution showed that Botrytis was isolated mainly in Spring samplings. Among the different rootstock, the rates of Botrytis were very high in most cases, while in several hosts, Fusarium seemed to be the predominant pathogen, but with minor differences compared to Botrytis. The artificial inoculations revealed the inability of Fusarium species to infect rootstock seedlings, if these hosts have not undergone any biotic or abiotc stress, previously. In contrast, inoculation in various hosts with the remainings isolated fungi had resulted in the appearance of symptoms on leaves (A. alternata, Stemphylium sp. and Botrytis cinerea) and root (R. solani).The second part of this research was contucted to investigate the population structure and the resistance profile of Botrytis spp., that originated from the first part.The population structure was investigated on 134 isolates, using two molecular markers, the presence of two transposable elements (TAs, Boty and Flipper) and the presence of a 21bp insertion in the mrr1 gene, encoding a transcription factor, that distincts B.cinerea sensu stricto, from Botrytis Group S, a novel clade within Botrytis populations. Results showed that transposa isolates (both TAs present) were predominant (83.6%), while Boty, Flipper or Vacuma (both TAs absent) isolates were found at frequencies of 11.9, 1.5 and 3%, respectively. Similarly, was found that B. cinerea sensu stricto was predominant in the population (69.7%). However a significant proportion of the isolates were identified as Botrytis group S (29.6%), while 1 isolate was identified as B. pseudocinerea, constituting the first report of this pathogen in Greece.Measurements of fungicide sensitivity revealed the presence of high frequencies of multiple resistance to more than 2 different fungicide classes, mostly associated with target site mutations. Higher frequencies of resistance were observed for QoIs, SDHIs and benzimidazoles with values of 89.8, 73 and 64.6%, respectively, while frequencies of resistance to anilinopyrimidines, hydroxyanilides, dicarboximides and phenylpyrroles were lower. Furthermore, mutations in the sdhB gene which is associated with resistance to SDHIs, were determined. Results showed three different amino acids substitutions in the SdhB subunit. The substitution of histidine to arginine at codon 272 (H272R) was the predominant mutation in a population of isolates which were resistant to boscalid. Moreover, 6,3 % of isolates had the N230I mutation, while for first time worldwide,the substitution of proline to histidine at codon 225 was detected. This is a novel mutation which is associated with resistance both to boscalid and fluopyram. A small proportion of the population (6.7%) was resistant to all fungicide classes. This type of resistance was found to be associated with a 3bp deletion mutation in the gene encoding the mrr1 transcription factor. Isolates with this mutation called MDR1h, and showed high rates of resistance to anilinopyrimidines and phenylpyrrole botryticides. This was the first report of this type of resistant isolates in Greece.