Βελτιωμένη παραγωγή ανασυνδυασμένων CXC χημειοκινών σε βακτήρια με τη μορφή Hsp70-υβριδίων
Creators: name: Μπέλλου, Θεοδώρα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: CXC χημειοκίνες
Hsp70-υβρίδια
Πρωτεϊνική αναδίπλωση
CXC chemokines
Hsp70 fusions
Protein folding

description: Οι χημειοκίνες είναι μικρές σηματοδοτικές πρωτεΐνες οι οποίες αποτελούν τους βασικούς καθοδηγητές της μετανάστευσης των κυττάρων σε φυσιολογικές ή/και παθολογικές διεργασίες. Λόγω των δυνητικά μεγάλων διαγνωστικών και θεραπευτικών εφαρμογών τους είναι ιδιαίτερα χρήσιμη η αποτελεσματική βιοτεχνολογική παραγωγή ανασυνδυασμένων χημειοκινών. Στην παρούσα μελέτη θέσαμε ως στόχο να αναπτύξουμε τέτοια συστήματα που να επιτρέπουν την παραγωγή ορθά αναδιπλωμένων χημειοκινών και συγκεκριμένα δύο CXC χημειοκινών, της CXCL12α (ή Stromal cell-derived factor-1α/SDF-1α) και της CXCL10 (ή Interferon-γ inducible protein-10/IP-10). Παραγωγή ανασυνδυασμένων χημειοκινών στο βακτήριο Escherichia coli οδήγησε στη συσσώρευσή αδιάλυτων μορφών τους τους στα βακτηριακά έγκλειστα. Παράλληλα παρατηρήθηκε σχηματισμός πολυμερισμένων μορφών χημειοκινών λόγω σχηματισμού διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ των μονομερών τους. Αντίθετα, έκφραση των SDF-1α και IP-10 με μορφή υβριδίων με την DnaK, την Hsp70 πρωτεΐνη συνοδό του βακτηρίου E. coli, οδήγησε στην παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων διαλυτών DnaK-SDF1α και DnaK-IP10 με παράλληλη ελαχιστοποίηση των διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών. Η εξειδίκευση των παραπάνω αποτελεσμάτων και ο ουσιαστικός ρόλος της DnaK στη διαλυτότητα των υβριδικών χημειοκινών υπογραμμίζεται και από τη παρατήρησή μας ότι έκφραση των χημειοκινών ως υβριδίων με τη GST, μιά πολύ διαλυτή πρωτεΐνη, δε βελτίωσε τη διαλυτότητα τους. Αντίθετα, οι υβριδικές πρωτεΐνες GST-SDF1α και GST-IP10 συσσωρεύθηκαν σχεδόν αποκλειστικά στα βακτηριακά έγκλειστα. Επιπλέον, ακόμη και όταν η DnaK ήταν συζευγμένη στο καρβοξυ-τελικό άκρο των χημειοκινών, δεν φάνηκε να επηρεάζει την ορθή αναδίπλωσή τους, καθώς τα υβρίδια SDF1α-DnaK και IP10-DnaK εντοπίζονταν στο διαλυτό κυτταρόπλασμα. Αρχικά πειράματα «επούλωσης τραύματος» σε καλλιέργειες ευκαρυωτικών MCF7 κυττάρων έδειξαν ότι τα ανασυνδυασμένα υβρίδια των παραπάνω χημειοκινών ήταν βιολογικώς ενεργά.
description: Chemokines are signaling molecules that regulate cell migration and are considered as molecules of major biological importance both in physiological and pathological conditions. Given their significance, recombinant chemokines have become valuable research/diagnostic and therapeutic tools. The aim of the present thesis was to develop a bacterial expression system that permits the expression of large amounts of properly folded chemokines in bacteria. Overproduction of two recombinant CXC chemokines, CXCL12α (or Stromal cell-derived factor-1α/SDF-1α) and CXCL10 (or Interferon-γ inducible protein-10/IP-10), in E. coli, leads to their aggregation and deposition in inclusion bodies, as covalently linked protein multimers. This multimerization is attributable to the formation of aberrant intermolecular disulfide bonds, instead of the proper intramolecular ones. Production of SDF-1α and IP-10 as fusions with DnaK, the Hsp70 family member in E. coli, resulted in high levels of soluble DnaK-chemokine expression and negligible formation of intermolecular disulfide bonds. These effects do not stem from the presence of a highly soluble, bulky protein fusion partner of the chemokine, since they are not reproduced when the chemokine are expressed as fusions with another protein like GST. On the contrary, both GST-SDF1α and GST-IP10 accumulated within inclusion bodies. The order of the protein partners within the fusion protein does not appear to affect protein folding and solubility, since both SDF1α-DnaK and IP10-DnaK fusion proteins partitioned almost exclusively in the soluble fraction. Furthermore, performance of wound healing assays in MCF7 cells using the above recombinant fusion proteins, indicated that all fusions were biologically active.