title: Characterization of microRNA-mediated cleavage events in Arabidopsis embryos
Creators: name: Plotnikova, Aleksandra
Publisher: name: :none
Year: 2021

description: MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner regulatorischer RNAs, die Gene, sowohl in Pflanzen als auch in Tieren, unterdrücken. Bisher fanden wir heraus, dass miRNA-defiziente Arabidopsis-Embryonen eine Vielzahl an Zelldifferenierungs- und Entwicklungszeitdefekte aufweisen (Nodine and Bartel, 2010). Über die Beiträge spezifischer miRNAs zur Musterbildung ist jedoch wenig bekannt. Um die miRNA-Funktionen während der Embryogenese systematisch zu charakterisieren, haben wir kleine RNAs während der Embryogenese profiliert und dutzende von miRNA-Familien identifiziert, die während der Morphogenese-Phase der Embryonalentwicklung häufig vorkommen. Die Funktionen von miRNAs werden durch die Gene definiert, die sie regulieren. In Pflanzen haben miRNAs eine nahezu perfekte Komplementarität mit ihren Zielsequenzen und steuern typischerweise deren endonukleolytische Spaltung. In dieser Arbeit haben wir nanoPARE (parallele Analyse von RNA-Enden) entwickelt, eine Hochdurchsatzmethode, um miRNA-Spaltprodukte genomweit aus Sub-Nanogramm-Mengen der Gesamt-RNA zu profilieren. Wir haben nanoPARE auf RNA früher Embryonen angewendet und Dutzende von miRNA:Zielinteraktionen identifiziert, die während der Embryogenese ablaufen. Zusammen mit der Transkriptomanalyse von Wildtyp- und miRNA-defizienten Embryonen ermöglichten unsere nanoPARE-Daten die Identifizierung mehrerer miRNA-Familien, die unterschiedliche Familien von Transkriptionsfaktoren spalten und unterdrücken. Da die miRNA-vermittelte Regulation von Transkriptionsfaktoren für die Bildung embryonaler Muster besonders wichtig sein kann, haben wir diese miRNAs zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Wir verwendeten fluoreszierende proteinbasierte Methoden, um die Aktivitätsmuster dieser miRNAs bei zellulärer Auflösung während der Embryogenese zu bestimmen. Zusätzlich erzeugten wir transgene Pflanzen, die miRNA-resistente Versionen dieser Zieltranskriptionsfaktoren exprimierten, und untersuchten die Morphologie von Embryonen, um festzustellen, ob eine zellspezifische Repression von Transkriptionsfaktoren für eine ordnungsgemäße Embryonenmorphogenese erforderlich ist. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass miRNAs die räumlich-zeitliche Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren definieren, die für die Erstellung des Körperplans zu Beginn des Pflanzenlebens erforderlich ist.
description: MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs that repress genes in plants and animals. Previously we found that miRNA-deficient Arabidopsis embryos exhibit widespread cellular differentiation and developmental timing defects (Nodine and Bartel, 2010). However, little was known about the contributions of individual miRNAs to pattern formation. To systematically characterize miRNA functions during embryogenesis, we profiled small RNAs throughout embryogenesis and identified dozens of miRNA families that are abundant during the morphogenesis phase of embryo development. The functions of miRNAs are defined by the genes they regulate. In plants, miRNAs have nearly perfect complementarity to their targets and typically guide their endonucleolytic cleavage. We have developed a high-throughput method, nanoPARE (parallel analysis of RNA ends), to profile miRNA cleavage products genome-wide from sub-nanogram amounts of total RNA. We applied nanoPARE to early embryos and identified dozens of miRNA:target interactions operating during embryogenesis. Our nanoPARE data, together with transcriptome analysis of wild-type and miRNA-deficient embryos, enabled the identification of several miRNA families that cleave and repress distinct sets of transcription factors. Because miRNA-mediated regulation of transcription factors may be especially crucial for embryonic pattern formation, we selected these miRNAs for further characterization. We used fluorescent protein-based methods to determine the activity patterns of these miRNAs at cellular resolution during embryogenesis. In addition, we generated transgenic plants expressing miRNA-resistant versions of these target transcription factors and examined the morphology of embryos to determine whether cell-specific repression of transcription factors is required for proper embryo morphogenesis. Altogether, our results demonstrate that miRNAs define the spatiotemporal localization of transcription factors, which is determinative for establishing the body plan at the beginning of plant life.