title: Negative feedback loops in inflammation
Creators: name: Ertl, Iris Elisabeth
Publisher: name: :none
Year: 2009

description: Entzündung ist im Prinzip eine schützende Reaktion des Organismus auf verschiedenste schädigende Reize. Kommt es aber zu einer übertriebenen oder ständigen Entzündungsreaktion, so werden durch den ursprünglich nutzbringenden Abwehrmechanismus Schädigungen verursacht. Chronische Entzündungen sind in die Pathogenese von vielen unterschiedlichen Erkrankungen involviert. Die Aufklärung von Mechanismen, die die adäquate Beendigung dieser Reaktion ermöglichen ist daher ein wichtiges Ziel der Entzündungsforschung. Neben verschiedenen Immunzellen tragen auch endotheliale Zellen aktiv zu einer Entzündung bei. Das Endothelium kleidet die Vaskulatur aus und bildet unter normalen Bedingungen eine anti-koagulante Oberfläche und eine Barriere zwischen dem Blutstrom und dem umliegenden Gewebe. Als Reaktion auf pro-inflammatorische Stimulation kommt es zu phenotypischen Veränderungen der endothelialen Zellen, die es den Immunzellen erlauben diese Schranke zu passieren und ins Gewebe einzuwandern. Auf molekularer Ebene sind diese Prozesse hauptsächlich durch verschiedene induzierbare Transkriptionsfaktoren (e.g. NF-κB, AP-1, NFAT) reguliert. Ihre Aktivierung führt nicht nur zur Expression einer Vielzahl von pro-inflammatorischen Genen, sondern auch von solchen, die in einem späteren Stadium einer Entzündungsreaktion deren Ende induzieren. Die Proteine, die von solchen Genen codiert werden, formen so genannte „negative feedback loops“. Um neue „negative feedback loops“ zu identifizieren wurden Gene selektiert, die in Endothelzellen aus der humane Nabelschnur (HUVECs) durch das pro-inflammatorische Cytokin IL-1 induziert werden und inhibitorisches Potential aufweisen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden einige diese Kandidatengene in passende Expressionsvektoren kloniert und ihr Einfluss auf Transkriptionsfaktoren und Signaltransduktionswege die bei der Entzündung eine wichtige Rolle spielen, mittels Reportergen Assays analysiert. Eines der untersuchten Gene, GG2-1, kodiert ein FLICE–inhibierendes, anti-apoptotisches Protein mit onkogenem Potential. Reportergen Assays in HEK293 zeigten, dass Überexpression von GG2-1 einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf die Aktivität von NF-κB und AP-1 hat, wenn deren Aktivierung durch Transfektion der MAP3 Kinase MEKK1 erreicht wurde. Damit übereinstimmend wurde beobachtet, dass die MEKK1-induzierte Aktivität des IL-8-Promoters ebenfalls proportional zu steigenden Mengen von GG2-1 sinkt. Detektierung des Proteins mittels „Western Blotting“ zeigte, dass die Inhibierung der Reportergen Expression mit abnehmenden Proteinmengen von MEKK1 assoziiert ist. Die Konzentrationen von anderen MAP3 Kinasen wurde durch die Anwesenheit von GG2-1 nicht beeinflusst, was die Vermutung erlaubt, dass der beobachtete Effekt spezifisch für MEKK1 ist. Durch Co-Immunopräzipitaton wurde eine direkte Interaktion zwischen den beiden Proteinen ausgeschlossen. JAG1 kodiert Jagged-1, einen der vier Liganden von Notch 1. Aktives Notch setzt Signalkaskaden in Gang, die essentiell für die Zell-Zell Kommunikation sowie diverse Entwicklungsprozesse sind. Mutationen in JAG1 verursachen das Alagille Syndrom (AGS), eine autosomal dominate Erbkrankheit, die Auswirkungen auf verschiedenste Bereiche des Organismus hat. In endothelialen Zellen ist Jagged-1 in die Kontaktinhibierung involviert, wahrscheinlich durch Regulierung des Retinoblastoma Proteins (Rb). In anderen Zelltypen zeigt Jagged-1 onkogene Eigenschaften. Die durchgeführten Reportergen Assays zeigten keinen signifikanten inhibitorischen Effekt von Jagged-1 auf pro-inflammatorische wirkende Transkriptionsfaktoren. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität des Tumorsuppressors p53 stark unterdrückt, was vermuten lässt, dass Jagged-1 auch in endothelialen Zellen einen Einfluss auf onkogene Prozesse haben könnte.
description: Inflammation is a beneficial response of the organism to harmful stimuli, but it can have detrimental effects if not resolved in time or occurs exaggerated. Chronic inflammatory conditions play a role in the pathogenesis of various severe diseases. Thus, mechanisms that cause shutting down of inflammation are important targets of studies. Endothelial cells lining the vasculature are actively contributing to inflammatory reactions. Upon pro-inflammatory stimulation they undergo phenotypic changes that enable the passage of immune cells through the endothelium to the side of injury. On the molecular level these processes are mainly regulated by inducible transcription factors like NF-κB, AP-1 and NFAT. Amongst their target genes are not only pro-inflammatory genes, but also genes encoding proteins that cause the resolution of the reaction at later stages. These gene products represent “negative feedback loops”. For the identification of novel negative feedback loops, some genes were selected that were found previously to be inducible in human vascular endothelial cells (HUVEC) by the pro-inflammatory cytokine IL-1, and are supposed to have repressive potential. These genes of interest were cloned into mammalian expression vectors and used to perform different reporter gene assays. One of the examined genes, GG2-1, encodes a member of the FLICE-inhibitory family of anti-apoptotic proteins that possesses oncogenic potential. In AP-1 and NF-κB reporter gene assays, the protein exhibited significant inhibitory effects on the transcription factors when their activation was achieved by co-transfection of MEKK1. Accordingly, the activity of the IL-8 promoter was suppressed by GG2-1. Western blotting revealed that the decrease of MEKK1 on the protein level correlated with increasing concentrations of GG2-1. This effect seemed to be specific for MEKK1, since protein levels of other MAP3K were not influenced by GG2-1 overexpression. Co-immunoprecipitation excluded direct protein interaction between the two proteins. Another target of studies was JAG1 that encodes one of the ligands of Notch1, Jagged-1. Notch signalling is involved in cell-cell communication and developmental processes. Mutations of JAG1 cause the Alagille syndrom (AGS), an autosomal dominant disorder affecting various systems of the body. In endothelial cells Jagged-1 plays a role in contact-inhibition by regulating the Retinoblastoma (Rb) protein, in other cell types Jagged-1 exhibits oncogenic properties. In reporter gene assays examining pro-inflammatory transcription factors, Jagged-1 did not show considerable inhibitory effects, whereas the activity of the tumor-suppressor p53 was significantly suppressed.