title: Spatiotemporal analysis of cell wall synthesis related enzymes and the influence of cell wall stress factors
Creators: name: Stuckenschneider, Lisa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Bakterien
Mikroskopie
Bacillus
Fluoreszenzmikroskopie
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Fluorophore
Zellwandsynhtese
Antibiotika
Einzelmolekülverfolgung
PBP
Bacillus subtilis
cell wall
cell wall stress factorsn antibiotics
single molecule tracking
penicillin binding proteins
cell wall synthesis
Zellwand
Penicillin Binde Proteine

description: Bakterien haben ein vielseitiges Erscheinungsbild, welches größtenteils durch die Zellwand und andere formgebende Komponenten beeinflusst wird. Trotz jahrzehntelanger Forschung auf dem Gebiet der Zellwandsynthese gibt es immer noch viele offene und ungeklärte Fragen zur Organisation des bakteriellen Peptidoglykan Sacculus, aber auch zur räumlichen und zeitlichen Verteilung der an der Peptidoglykan Synthese beteiligten Proteinen, die sogenannten Penicillin Binde Proteine oder kurz PBPs, welche die letzten Reaktionen der Peptidoglykansynthese katalysieren. Das Bacillus subtilis Genom kodiert für eine große Anzahl von verschiedenen PBPs mit verschiedenen enzymatischen Eigenschaften bei denen jedoch nicht immer bekannt ist, wann oder unter welchen Bedingungen diese aktiviert werden. Einige PBPs sind dafür bekannt mit Proteinkomplexen, Elongasom and Divisom genannt, zu interagieren, welche für die Zellwandsynthese zuständig sind und meiste durch Zytoskelettelemente wie MreB und FtsZ organisiert werden. Um die Lokalisation und Funktion besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit verschiedene PBPs und MreB, als Indikatoren für den Ort der Zellwandsynthese, unter verschiedenen Bedingungen untersucht, wobei der Fokus auf der zeitlichen und räumlichen Verteilung dieser Proteine lag. Fünf PBPs wurden exemplarisch aus den verschiedenen Klassen ausgewählt und n-Terminal mit einem mVenus-Fluorophor fusioniert. Diese wurden mit Hilfe einer hochauflösende zeitliche und räumliche Mikroskopie Technik die Einzel-Molekül Verfolgung („Single-molecule-tracking“ genannt) untersucht und der Diffusionskoeffizient der Moleküle wurde bestimmt. Zwei verschiedene dynamische Populationen wurden entdeckt und nachgewiesen: eine langsam diffundierende, wahrscheinlich enzymatisch aktive, und eine schnelle, frei bewegliche inaktive Molekül-Population. Wobei die meisten PBPs 50% langsame Moleküle aufweisen und damit ungefähr die Hälfte der Moleküle an Substrat gebunden ist. Darüber hinaus sollte die Reaktion der PBPs auf verschiedene Umweltfaktoren getestet werden, dazu wurden die Zellen mit osmotischen Stressoren (NaCl und Sorbitol) sowie mit Antibiotika (Vancomycin, Penicillin G, Nisin, Fosfomycin und Bacitracin) behandelt. Hierbei konnten Veränderungen des Diffusionskoeffizienten der Proteine festgestellt werden. Vor allem wenn die Verfügbarkeit der Peptidoglykanbausteine durch die Anwesenheit der Antibiotika abweicht. Auch MreB reagiert auf die verfügbare Menge von Peptidoglykanbausteinen mit einer Veränderung der dynamischen Populationen, allerdings nicht so stark wie die meisten untersuchten PBPs. Des Weiteren wurde an die Ergebnisse einer vorherigen Doktorarbeit der Arbeitsgruppe angeknüpft (geschrieben von Dr. Simon Dersch). Die Reaktionen von am Elongasom beteiligten Proteinen (PbpH, Pbp2a und MreB) und jeweiligen Deletionen (∆pbpA und ∆pbpH) bzw. Depletion (MreB wurde durch ein Cas9 System in der Zelle auf ein niedriges Niveau gebracht) wurden im genetischen Hintergrund mit denselben Antibiotika untersucht. Die Dynamiken der beiden redundanten Transpeptidasen PbpH und Pbp2a veränderten sich merkbar im korrespondierenden Deletionsstamm unter dem Einfluss der Antibiotika. Während das niedrige Niveau von MreB in der Zelle nur einen geringen Einfluss auf die Diffusionskonstanten von PbpH oder Pbp2a hat, verändert sich das Verhalten von PbpH doch stark unter dem Einfluss von Antibiotika.
description: Bacteria have a highly varied appearance and shape, which is primarily affected by the cell wall and other components that give shape to the cells. Despite decades of research in the field of cell wall synthesis there are still many open questions regarding the organisation of the bacterial peptidoglycan sacculus, but also regarding the spatiotemporal distribution of proteins that are involved in peptidoglycan synthesis. An essential class of these, the so-called Penicillin Binding Proteins, or PBPs for short, are all performing the last steps and some additional steps of the peptidoglycan synthesis. The Bacillus subtilis genome codes for a large number of different PBPs, which have different enzymatic properties, and it is not yet clear for all of these proteins, when – or under which conditions – they become active. Some of the PBPs are known to interact with cell wall synthesis machineries, the so called elongasome or divisome, both being partly organised by cytoskeletal elements like MreB or FtsZ. To better understand their localisation and function, different PBPs and MreB were used in this thesis as indicators for the location of cell wall synthesis. They were investigated under different conditions, where the main focus was the spatiotemporal distribution of these proteins. Five different PBPs from different classes were selected, and n-terminally tagged with an mVenus fluorophore. These were then investigated with the help of a high-resolution microscopy method called single-molecule tracking, and the diffusion coefficients of the molecules were determined. Two different dynamic molecular populations could be discovered, one a slow-diffusing, likely enzymatically active population, and the other a fast-moving inactive population. Most PBPs demonstrate a 50% slow diffusing population, which means that roughly half of the molecules are bound to their substrate. Additionally, the reactions involving the PBPs were tested in the presence of different environmental conditions – to achieve this, the cells were treated with osmotic stressors (NaCl and sorbitol), as well as antibiotics (vancomycin, penicillin G, nisin, fosfomycin, bacitracin). Through these experiments, changes in the diffusion coefficients of the proteins were observed. Particularly the availability of peptidoglycan building blocks was altered by the presence of antibiotics. MreB also reacts to the available amounts of peptidoglycan building blocks through a change in its dynamic populations, but not as strongly as most studied PBPs. Additionally, this thesis builds on the results of a previous doctoral thesis from the same research group (written by Dr. Simon Dersch). Therefore, this thesis (written by Lisa Stuckenschneider) also investigated the elongasome components PbpH, Pbp2a and MreB through corresponding deletion (∆pbpA and ∆pbpH) and depletion genetic backgrounds (MreB levels were strongly reduced in the cell by a Cas9 system), with the same antibiotics. The dynamics of both of the redundant transpeptidases PbpH and Pbp2a change strongly in the corresponding deletion strains and under the influence of antibiotics. Although the decreased MreB levels in the cell had only a minor effect on the diffusion constants of PbpH or Pbp2a. The absence of MreB made the diffusion of PbpH more susceptible to antibiotic treatment, and to a similar degree as in the ∆pbpA background.