title: Molecular, structural, and in vivo analysis of the dominant plectin mutation plectin EBS-Ogna
Creators: name: Jaksic, Nevena
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Plectin, ein großes multifunktionelles Cytoskelettprotein vernetzt Intermediärfilamente und vermittelt ihre Interaktion mit Aktinfilamenten und Mikrotubuli, den beiden anderen Cytoskelett-Filamentsystemen. Plectin verankert auch Intermediärfilamente an strategisch wichtigen Stellen der Zelle, wie Hemidesmosomen in basalen Keratinozyten, Costamere, Z-Scheiben und neuromuskuläre Endplatten in Muskelzellen, der axonalen Membran von Schwann-Zellen, fokalen Adhäsionen, Mitochondrien und dem Zellkern. Aufgrund dieser Eigenschaften und der zusätzlichen Fähigkeit kompakte oligomere Strukturen ausbilden zu können, wirkt Plectin Zell- und Gewebe-stabilisierend und zeichnet für die Aufrechterhaltung der Integrität, insbesondere von Geweben die großen mechanischen Belastung ausgesetzt sind, wie Haut, Skelettmuskel und Blutgefäße, verantwortlich. Plectin wird in einer Vielzahl von Zelltypen und Geweben exprimiert, und zwar in Form mehrerer Proteinisoformen, die durch differentielles Spleißen alternativer erster Exons aus einem einzigen Gen (PLEC) entstehen. Durch die Verwendung unterschiedlicher Promotoren für die einzelnen ersten Exons kommt es zur Zelltyp-spezifischen Expression der Isoformen. Mutationen im Plectingen werden autosomal-rezessiv vererbt und führen zu Epidermolysis bullosa simplex (EBS) assoziiert mit Muskeldystrophie und/oder Myasthenie-Syndrom, Pylorusatresie, Ptosis und Ophthalmoplegie. Die einzige autosomal-dominante Mutation im Plectingen ist als „Ogna-Mutation“ bekannt und beruht auf einer Missense-Mutation in einer Domäne des Proteins, die in allen Isoformen vorkommt. Träger dieser Mutation zeigen einen Phänotyp, der sich nur in der Haut manifestiert. Diese natürlich vorkommende Mutation stellt somit ein ideales System dar, um etwaige Haut-spezifische Funktionen von Plectin zu identifizieren und den Pathomechanismus der Mutation auf molekularen Ebene untersuchen. Im ersten Abschnitt meiner Dissertationsarbeit stellte ich eine („knock-in“) Mauslinie her, bei der das Plectingen in einem der beiden Allele mit einem die Ogna-Mutation enthaltendem Gen ersetzt wurde. Dieser Teil der Arbeit umfasst Kapitel über die Konstruktion des Targeting-Vektors, die Züchtung, Elektroporation, und Selektion von embryonalen Stammzellen mit nur einem mutierten Allel, die Produktion von chimären Mäusen nach Blastozysteninjektion und den Nachweis der Keimbahntransmission. Ferner Summary 4 werden Versuche beschrieben, welche die Expression der Mutation in verschiedenen Mausgeweben und primären Keratinozyten bestätigen. Im zweiten Teil der Arbeit präsentiere ich die phänotypische Charakterisierung dieser Knock-in-Mauslinie. Als wichtigste pathologische Merkmale, fand ich deutlich erhöhte Fragilität der Haut, und weniger, kleinere, und nicht-funktionelle Hemidesmosomen, gekennzeichnet durch eine Störung der Verankerung von Keratinfilamenten am inneren hemidesmosomalen Plaque. Unter Verwendung Isoform-spezifischer Antikörpern konnte ich zeigen, dass die als P1a bekannte Plectinisoform in der Epidermis von Ogna-Mäusen sowie daraus isolierter primärer Keratinozyten fehlt. Weitere ex-vivo-Studien mit primären Keratinozyten zeigten, dass aus Ogna-Mäusen isolierte Keratinozyten weniger widerstandsfähig gegen Stress (z.B. hypo-osmotischer Schock) sind, schneller migrieren als ihre Wildtyp-Gegenstücke, und keine Integrin-Clusterbildung aufweisen. Außerdem fand ich, dass nach transienter Expression von Wildtyp-P1a, im Gegensatz zu anderen Isoformen, die normale Keratin-Cytoskelett-Organisation in Plectin-defizienten Keratinozyten wieder hergestellt werden konnte. Skelett- und Herzmuskel zeigten keine funktionellen oder strukturellen Anomalien. Diese Daten weisen eindeutig auf eine große Bedeutung von P1a für die Struktur und Funktionalität von Hemidesmosomen hin. Für den letzten, mehr biochemischen Teil meiner Arbeit, exprimierte ich die zentrale Stabdomain von Plectin in Sf9-Zellen mit Hilfe rekombinanter Baculoviren. Ich konnte zeigen, dass die Stabdomäne in der Lage ist zu dimerisieren und weitere Formen hochgeordneter oligomerer Strukturen zu bilden. Im Vergleich zu Wildtyp-Oligomeren, erwiesen sich die aus Ogna-mutiertem Plectn gebildeten Oligomere als weniger resistent gegenüber Hitze und Denaturierungsmitteln wie Harnstoff. Die geringere Stabilität der Ogna-Stabdomäne ist wahrscheinlich auf die lokale Entfaltung ihrer coiled-coil-Struktur und die damit verbundene verminderte Sekundärstruktur-Ausbildung zurückzuführen. Eine Suche nach Bindungspartnern der mutierten Stabdomäne offenbarte seine Assoziation mit Serin-Proteasen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente führten zur Entwicklung eines neuen, die Selbstassoziation von Plectinmolekülen miteinbeziehenden Strukturmodells für Hemidesmosomen, und sie geben Einblicke in die molekularen Mechanismen die zur Blasenbildung der Haut bei EBS-Ogna führen.
description: SUMMARY Plectin is a large multifunctional cytoskeletal protein that cross-links intermediate filaments and mediates their interaction with actin filaments and microtubules, the other two major cytoskeletal filament systems. Plectin also anchors intermediate filaments at strategic cellular sites, such as hemidesmosomes in basal keratinocytes, costamers, Zdisks, and the neuromuscular junction in muscle cells, the abaxonal membrane of Schwann cells, focal adhesions, mitochondria, and the nucleus. Due to these functions, and the additional ability to form compact oligomeric structures, plectin stabilizes cells and tissues, maintaining tissue integrity, particularly of tissues subjected to great mechanical stress, such as skin, skeletal muscle, and blood vessels. Plectin is expressed in a wide range of cell types and tissues in form of several protein isoforms that are generated by differential alternative first exon splicing from a single gene (PLEC). The use of alternative first exons, endowed with their own promoters, allows for cell-type specific expression of the isoforms. Mutations in the plectin gene are inherited in an autosomal recessive manner and result in epidermolysis bullosa simplex (EBS) combined with muscular dystrophy and/or myasthenic syndrome, pyloric atresia, ptosis and ophthalmoplegia. The only autosomal dominant mutation identified in the plectin gene, known as the “Ogna mutation”, is due to a missense mutation in a domain of the protein common to all isoforms. Its carriers exhibit a skin-only phenotype. The study of this naturally occurring mutation, thus represents an ideal system, to reveal skin-specific functions of plectin, and to explain the pathomechanism of the mutation on the molecular level. In the first part of this thesis, I describe the generation of a mouse line carrying the Ogna mutation. This work included the construction of a targeting vector, growing, electroporation and selection of ES cells carrying the mutation in only one allele, production of chimeric mice by blastocyst injection and confirmation of germ line transmission. I also confirmed the expression of the mutation in different mouse tissues and primary keratinocytes. In the second part, I present the phenotypic characterization of the Ogna knock-in mouse line. As its main pathological features, I found skin fragility, and less, smaller, and non-functional hemidesmosomes characterized by impaired attachment of keratin filaments to the inner hemidesmosome plaque. Using isoform-specific antibodies I could Summary 2 show that plectin isoform P1a was missing in the skin of Ogna mice and in monolayers of cultured primary keratinocytes. Additional ex vivo studies with primary keratinocytes showed that keratinocytes isolated from Ogna mice are less resistant to stress (eg. hypoosmotic shock), migrate faster that their wild-type counterparts, and fail to promote integrin clustering. Furthermore I found that upon transient expression only wild-type P1a was able to rescue the aberrant keratin cytoskeleton organization of plectin-null keratinocytes. Skeletal muscle and heart showed no functional or structural abnormalities. These data clearly established the importance of P1a for the structure and functionality of hemidesmosomes. In the last, more biochemical part of my thesis I expressed plectin’s rod domain in Sf9 cells using recombinant baculovirus. This enabled me to demonstrate that the plectin rod is able to dimerize and further form highly ordered oligomeric structures. However, compared to wild-type oligomers, rod oligomers carrying the Ogna mutation turned out to be less resistant towards heat and denaturing agents, such as urea. As the Ogna mutation brings about a local unfolding of the coiled-coil rod structure, its lower resistance could be attributed to a reduced stability of plectin’s secondary structure. A search for binding partners of the mutated rod revealed its association with serine proteases. The work done for this thesis led to the proposal of a novel model for the structural reinforcement/stabilization of hemidesmosomes through self-association of plectin molecules and it provided insights into the the molecular basis of the skin blistering disease EBS-Ogna.