Επίδραση της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 στην υποκυτταρική εντόπιση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην απόκριση HeLa κυττάρων σε δίκλωνες θραύσεις του DNA
Creators: name: Λουγιάκη, Φαίδρα Φρειδερίκη Σπυρίδωνος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Δίκλωνες θραύσεις DNA
BCLAF1
THRAP3
SRPK1
DNA double strand breaks

description: Σκοπός της μεταπτυχιακής αυτής εργασίας ήταν να ελέγξουμε την υπόθεση εάν παρουσία δίκλωνων θραύσεων του DNA η πρωτεϊνική κινάση SRPK1 εισέρχεται στον πυρήνα και επηρεάζει την εντόπιση των BCLAF1 και THRAP3. Οι δύο αυτές πρωτεΐνες, που εμπλέκονται τόσο στη μεταγραφή όσο και στη διαδικασία του ματίσματος και ωρίμανσης του mRNA, φέρουν επαναλαμβανόμενα RS διπεπτίδια στα αμινο-τελικά άκρα τους και επομένως αποτελούν εν δυνάμει υποστρώματα της SRPK1. Αρχικά, κλωνοποιήσαμε τα cDNAs που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες BCLAF1 και BCLAF1Δ160, από την οποία έχει αφαιρεθεί ένα τμήμα 160 αμινοξέων στο αμινο-τελικό της άκρο όπου περιέχονται τα επαναλαμβανόμενα διπεπτίδια RS, στον πλασμιδιακό φορέα HA-pcDNA3.1. Τα αντίστοιχα cDNAs που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες THRAP3 και THRAPΔ190 μας παραχωρήθηκαν ευγενικά από τον Dr. Woan-Yuh Tarn (National Taiwan University, Taiwan), κλωνοποιημένα στον πλασμιδιακό φορέα pCEP4. Και οι τέσσερις πρωτεΐνες εκφράζονται σε ευκαρυωτικά κύτταρα ως πρωτεΐνες σύντηξης με το επίτοπο της αιμαγλουτινίνης (ΗΑ). Στη συνέχεια, αφού επιβεβαιώσαμε την έκφραση των πρωτεϊνών HA-BCLAF1, HA-BCLAF1Δ160, HA-THRAP3, και HA-THRAP3Δ190 σε HeLa κύτταρα, προχωρήσαμε στον έλεγχο της υποκυτταρικής τους κατανομής με τη διαδικασία του έμμεσου ανοσοφθορισμού. Και οι τέσσερις πρωτεΐνες εμφάνισαν μια διάχυτη πυρηνική εντόπιση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αφαίρεση των RS διπεπτιδίων δεν επηρεάζει την εντόπισή τους. Επίσης, η μετατόπιση της SRPK1 στον πυρήνα υπό την επίδραση γενοτοξικών παραγόντων, καθώς και η αναστολή της δραστικότητας της κινάσης και η υπερέκφρασή της δεν φάνηκε να μεταβάλλουν τη διάχυτη πυρηνική εντόπιση των HA-BCLAF1 και HA-THRAP3 σε HeLa κύτταρα. Σε μελλοντικά πειράματα θα ελεγχθεί αν η SRPK1 επηρεάζει τη λειτουργικότητα των BCLAF1 και THRAP3
description: The aim of this master thesis was to investigate the hypothesis that upon DNA double strand breaks, SRPK1 enters the nucleus and affects the localization of BCLAF1 and THRAP3. The amino-terminal domains of these two proteins, which are involved in both the transcription, as well as the mRNA splicing and maturation processes, are rich in RS dipeptides and therefore represent potential targets of SRPK1. First, we cloned the cDNAs encoding BCLAF1 and BCLAF1Δ160, which lacks a fragment of 160 amino acids at its amino-terminal domain containing the RS dipeptides, into the plasmid vector HA-pcDNA3.1. The respective cDNAs encoding THRAP3 and THRAP3Δ190 cloned into the plasmid vector pCEP4 were kindly provided by Dr. Woan-Yuh Tarn (National Taiwan University, Taiwan). Thus, the proteins are expressed in eukaryotic cells as fusion proteins with the hemagglutinin epitope (HA). After confirming the expression of HA-BCLAF1, HA-BCLAF1Δ160, HA-THRAP3 and HA-THRAP3Δ190 in HeLa cells by Western blotting, we studied their subcellular localization by indirect immunofluorescence. All four proteins showed diffuse nuclear staining, suggesting that the removal of the RS dipeptides does not affect their localization. Furthermore, the nuclear translocation of SRPK1, upon treatment of HeLa cells with genotoxic agents, as well as the overexpression of the kinase or the inhibition of its activity did not alter the diffuse nuclear localization of HA-BCLAF1 and HA-THRAP3 in HeLa cells. It remains to be tested in future experiments whether SRPK1 affects the function of BCLAF1 and THRAP3 in transcription or mRNA splicing