title: Der Einfluss von MAGED2 auf NHE3 in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293)
Creators: name: Ruttkowski, Lars Lennart
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Bartter-Syndrom
MAGED2
Gitleman-Syndorm
Medical sciences Medicine
Medizin
Bartter
Nephrologie
antenatal
transient
Gitleman
NHE3
Kindernephrologie

description: Das transiente antenatale Bartter-Syndrom (taBS, OMIM # 300971) ist eine seltene X-chromosomal vererbte Erkrankung, die durch fetale Polyurie, Polyhydramnion, Frühgeburtlichkeit und transienten postnatalen renalen Salzverlust charakterisiert ist. Verantwortlich sind Mutationen des Maged2-Gens, welches einen Einfluss auf die posttranslationale Modifikation von Kanalproteinen im distalen Tubulus hat. Laghmani et al. konnten zeigen, dass NKCC2 und NCC in ihrer Expression durch mutiertes MAGED2 verringert werden. Grund hierfür scheint könnte eine gestörte Interaktion zwischen MAGED2 und dem Chaperon Hsp40, welches für die effiziente Faltung von NKCC2 und NCC notwendig ist, sein (Laghmani et al. 2016). Der extreme Phenotyp lässt vermuten, dass auch weitere Kanalproteine betroffen sind. NHE3 ist ein Na+/H+-Antiporter, der maßgeblich für die Na+-Rückresorption im proximalen Tubulus verantwortlich ist. MAGED2 wird im proximalen Tubulus jedoch nur im Fetus expremiert. Die Regulation von NHE3 ist noch nicht gut verstanden. Eine verminderte Aktivität würde infolge verminderter Salzrückresorption mit verminderter Harnkonzentrierung einhergehen. Ziel dieser Arbeit ist, einen etwaigen Einfluss von MAGED2 auf NHE3 zu überprüfen. Hierzu wurden HEK293-Zellen mit NHE3 und MAGED2 (Wildtyp und Mutante) transfiziert. Mittels SDS-PAGE und Western Blot-Analysen wurden die Proteine über ihre Tags, ihrer Größe entsprechend, identifiziert. Zur Ermittlung einer MAGED2-vermittelten Expression von NHE3 wurden Zellen mit steigenden Dosen MAGED2 (WT und MT) transfiziert. Analysiert wurde die Proteinhalbwertszeit durch Hemmung der Proteinsynthese mittels Cycloheximid (CC) in MAGED2 überexpremierten und knock-down Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Mittels Koimmunpräzipitation (CoIP) wurde nach Protein-Proteininteraktionen gesucht. Eine räumliche Nähe wurde mittels Proximity Ligation Assay (PLA) untersucht. Um die Zelloberflächenintegration zu beurteilen wurden die Zellen mit Biotin behandelt, über welches die Membranproteinfraktion isoliert werden konnte (CSB). Die Ergebnisse der CoIP und PLA entsprachen sich und deuten darauf hin, dass NHE3 und MAGED2 (WT und MT) einen Komplex bilden. In den CC-Versuchen konnten keine MAGED2 vermittelten Unterschiede in der Halbwertszeit von NHE3 gezeigt werden. Die Dose Response-Versuche zeigten keine Veränderung der intrazellulären NHE3-Mengen abhängig von MAGED2. Auch in der CSB zeigte sich keine verringerte Integration von NHE3 in den mit der MAGED2-Mutante transfizierten Zellen im Vergleich zum Wildtyp. Wir konnten mit diesen Versuchen zeigen, dass NHE3 mit MAGED2 einen Komplex bildet und eventuell über andere Proteine miteinander interagiert. Anders als bei NCC und NKCC2, hat MAGED2 jedoch scheinbar keinen Einfluss auf die Proteinstabilität, Zelloberflächenintegration von NHE3 oder auf die Gesamt-NHE3-Proteinmenge. NHE3 könnte jedoch in seiner Funktion eingeschränkt sein. Weitere Untersuchungen sollten dies in Betracht ziehen. NHE3 kann bei MAGED2 Versuchen als negative Kontrolle dienen.
description: The transient antenatal Bartters-Syndrome (taBS) is a rare, x-chromosomal genetic disease, which presents with polyuria, polyhydramnios, prematurity and transient postnatal salt wasting. Mutations of Maged2 were found to be responsible for the phenotype, most likely, by influencing the posttranslational modification of ion channel proteins in the distal kidney tubule. Laghmani et al. were able to show, that NKCC2- and NCC-expression was lowered in the presence of mutant MAGED2. This might be due to an altered interaction of MAGED2, Hsp40 and Gs-α. The severe pehontype suggests, that other ion channel proteins might be affected as well. NHE3 is a Na+/H+-antiporter, which is responsible for most of the Na+-reabsorption in the proximal tubule. However, MAGED2 is expressed in the proximal tuble only during the fetal period. NHE3 regulation is not well known. A lowered activity would present in lower urine concentration. The aim of this study is to find an influence of MAGED2 on NHE3. HEK293-cells were transfected with NHE3 and MAGED2 (wildtype and mutant). For analyzing the effect of MAGED2 on NHE3 protein stability cycloheximide chase (CC) experiments were performed, where protein synthesis was inhibited with cycloheximide in MAGED2 overexpressing cells, as well as MAGED2-knock-down cells, at different timepoints. The influence of MAGED2 on the expression of NHE3 was investigated by co-transfecting NHE3 with increasing doses of MAGED2 (WT and MT). The effect of MAGED2 on the cell surface integration of NHE3 was examined using cell surface biotinylation (CSB) studies. The results of the CoIP and PLA corresponded with one another and showed, that NHE3 and MAGED2 (WT and MT) may co-exist in a protein complex. In the CC, MAGED2 related changes in the halftime of NHE3 could not be observed. The dose response experiments showed no influence of MAGED2 on the levels of intracellular NHE3. Also the CSB could not show any changes in the cell surface integration of NHE3, when transfected with MAGED2 (WT or MT). We were able to show, that MAGED2 and NHE3 form a complex at some point in the cell and might be interacting through other proteins. Other than NCC and NKCC2, MAGED2 does not seem to have an influence on protein expression, protein stability and cell surface integration of NHE3. These studies however do not rule out the possibility that MAGED2 may influence NHE3 function. Further functional studies are required to study the effects of MAGED2 on NHE3 channel function. So far NHE3 can be used as a negative control in MAGED2-based experiments.