title: Zellselektives aktives Targeting mit proteinbasierten Nanopartikeln
Creators: name: Tran, Xenia
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2025
Subjects: subject: 500 Natural sciences and mathematics

description: In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von Albumin-basierten Nanopartikeln mit kovalent gebundenem Trastuzumab zum aktiven Targeting an HER2/neu-überexprimierende Zellen unter verschiedenen Aspekten untersucht. Hierbei wurden fluoreszenzmarkierte Nanopartikel im Co-Kulturmodell und an dreidimensionalen Tumorsphäroiden untersucht und durchflusszytometrisch ausgewertet. Um die Effektivität des Nanopartikelsystems als selektives Drug-Delivery-System zu bewerten, wurde das zelltoxische Puromycin über einen Cathepsin B-spaltbaren Linker an die Albumin-Matrix der Nanopartikel gebunden. Es konnte gezeigt werden, dass diese wirkstoffbeladenen Nanopartikel die Zellviabilität von nur HER2/neu-positiven Zellen reduzierten, während HER2/neu-negative Zellen geschützt wurden. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen die erfolgreichen aktiven Targeting-Eigenschaften des beschriebenen Partikelsystems.
description: A EINLEITUNG ..... 1
1 Nanoträgersysteme auf Proteinbasis ..... 2
1.1 Eigenschaften von humanem Serumalbumin ..... 2
1.2 Nanoträgersysteme auf Basis von humanem Serumalbumin ..... 4
1.3 Oberflächenmodifikation: PEGylierung ..... 5
2 Selektivität und targeting ..... 7
2.1 Der Begriff der Selektivität ..... 7
2.2 Konzepte zur zielgerichteten Therapie ..... 7
2.3 Überblick über die Arten von targeting ..... 8
2.3.1 Passives targeting mit Nanopartikeln ..... 8
2.3.2 Aktives targeting mit Nanopartikeln ..... 9
3 HER2/neu als target der Arzneimitteltherapie ..... 11
3.1 HER2/neu ..... 11
3.2 Monoklonale Antikörper gegen HER2/neu ..... 12
3.3 Tyrosinkinaseinhibitoren Lapatinib und Neratinib ..... 13
4 Besondere Zellkulturmodelle ..... 14
4.1 Co-Kulturen ..... 14
4.2 Sphäroide ..... 15
B ZIELE UND MOTIVATION DER ARBEIT ..... 17
C MATERIAL UND METHODEN ..... 19
1 Allgemeine Materialien und Verbrauchsmaterialien ..... 19
1.1 Chemikalien ..... 19
1.2 Verbrauchsmaterialien ..... 22
1.3 Geräte und Software ..... 24
1.4 Puffer und Lösungen ..... 27
1.5 Zellen und Zellkulturmedien ..... 28
2 Allgemeine Methoden ..... 31
2.1 Gravimetrie ..... 31
2.2 Proteinaufreinigung ..... 31
2.2.1 Proteinaufreinigung per Dialyse ..... 31
2.2.2 Proteinaufreinigung per Säulenchromatographie ..... 31
2.3 Proteincharakterisierung ..... 32
2.3.1 Bestimmung von primären Aminogruppen ..... 32
2.3.2 Bestimmung von Thiolgruppen ..... 32
2.3.3 Bestimmung des isoelektrischen Punkts eines Proteins ..... 32
2.4 Lagerung und Gefriertrocknung ..... 33
3 Nanopartikel ohne Wirkstoffbeladung ..... 34
3.1 Nanopartikelherstellung (Standardmethode) ..... 34
3.1.1 Oberflächenmodifikation zum aktiven targeting ..... 34
3.1.2 Kontrollpartikelherstellung ..... 34
3.1.3 Fluoreszenzmarkierung von HSA ..... 35
3.1.4 Gewinnung von Trastuzumab aus Fertigarzneimitteln ..... 36
3.1.5 Thiolierung von Antikörpern ..... 36
3.2 Herstellung von Partikeln unterschiedlicher Partikelgrößen ..... 37
3.3 Charakterisierung von Nanopartikeln ..... 37
3.3.1 Photonenkorrelationsspektroskopie ..... 37
3.3.2 Elektronenrastermikroskopie ..... 38
3.3.3 Indirekte Quantifizierung der Antikörperkopplungseffizienz ..... 38
3.3.4 Bestimmung relativer Fluoreszenzintensitäten ..... 39
4 Versuche zur Wirkstoffeinbettung: Lapatinib ..... 40
4.1 HPLC-Methode ..... 40
4.2 Wirkstoffeinbettung unter Desolvatation ..... 40
4.2.1 Wirkstoffeinbettung unter Desolvatation mit Ethanol ..... 40
4.2.2 Wirkstoffeinbettung unter Desolvatation mit PEG4 ..... 40
4.3 Wirkstoffeinbettung durch ionische Wechselwirkung ..... 41
4.3.1 Herstellung von sucHSA ..... 41
4.3.2 Desolvatation von sucHSA und Wirkstoffbeladung ..... 41
4.4 Wirkstoffeinbettung über komplexe Koazervation ..... 42
4.4.1 Herstellung von catHSA ..... 42
4.4.2 Nanopartikelherstellung mit komplexer Koazervation ..... 42
4.4.3 Wirkstoffeinbettung mit komplexer Koazervation ..... 42
5 Versuche zur Wirkstoffeinbettung: Neratinib ..... 44
5.1 HPLC-Methode ..... 44
5.2 Untersuchung der kovalenten Bindung von Neratinib an HSA ..... 44
5.3 Partikelherstellung mit HSA(NER) ..... 45
5.4 Freisetzungsversuche aus HSA(NER)-Nanopartikeln ..... 45
6 Versuche zur Wirkstoffeinbettung: Puromycin ..... 46
6.1 HPLC-Methode ..... 46
6.2 Vorversuche zur Reduktion und Thiolreaktivität von HSA ..... 46
6.2.1 Reduktion von HSA ..... 46
6.2.2 Umsetzung mit N-Ethylmaleimid ..... 47
6.3 Herstellung eines HSA-linker-Puromycin-Konjugats ..... 47
6.3.1 Charakterisierung mittels IR-Messungen ..... 47
6.3.2 Charakterisierung mittels HPLC ..... 48
6.4 Bestimmung der Beladungseffizienz ..... 48
6.4.1 Kontrolle des drug loads ohne Cathepsin B-Verdau ..... 48
6.4.2 Kontrolle des drug loads mit Proteinkinase K-Verdau ..... 48
6.5 Nanopartikelherstellung mit HLP und HoLP ..... 49
7 Zellkulturuntersuchungen ..... 50
7.1 Kryostock, Auftauen und Inkubationsbedingungen ..... 50
7.2 Passagieren ..... 50
7.3 Zellzählung ..... 50
7.4 Fluoreszenzmessungen ..... 51
7.4.1 Fluorophore ..... 51
7.4.2 Durchflusszytometrie ..... 52
7.5 Bestimmung des HER2/neu-Status ..... 52
7.5.1 Immunfluoreszenzfärbung von oberflächenfixierten Zellen ..... 53
7.5.2 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen in Suspension ..... 54
7.6 Bestimmung der Zellviabilität mittels WST-1-assay ..... 54
7.7 Co-Kultur ..... 55
7.7.1 Co-Kultur: SK-Br-3 und MCF-7 Nuclight Green ..... 56
7.7.2 Co-Kultur: Vampiro SK-Br-3 und MCF-7 ..... 56
7.7.3 Partikelinkubation und Probenvorbereitung ..... 56
7.7.4 Durchflusszytometrische Auswertung ..... 57
7.7.5 Bestimmung des Rezeptorstatus in Co-Kultur mittels
Durchflusszytometrie ..... 58
7.8 Sphäroid-Kultur ..... 59
7.8.1 Kultivierung von Sphäroiden ..... 59
7.8.2 Redispergierung der Sphäroide mit Trypsin oder Accutase ..... 59
7.8.3 Statische Partikelinkubation ..... 59
7.8.4 Dynamische Partikelinkubation ..... 60
7.8.5 Probenvorbereitung zur Durchflusszytometrie ..... 60
7.8.6 Probenvorbereitung zur Fluoreszenzmikroskopie ..... 60
7.8.7 Bestimmung der Eindringtiefe ..... 61
7.8.8 Bestimmung des Rezeptorstatus an Sphäroiden ..... 61
8 Statistische Methoden ..... 62
D ERGEBNISSE UND DISKUSSION ..... 63
1 HER2/neu-Expressionsstatus der Zelllinien ..... 63
1.1 Rezeptorexpression in monolayer-Monokulturen ..... 63
1.2 Rezeptorexpression in monolayer-Co-Kultur ..... 65
1.3 Rezeptorexpression in Sphäroiden (Monokultur) ..... 65
2 Partikelherstellung ohne Wirkstoffbeladung ..... 67
2.1 Partikelherstellung nach Standardprotokoll ..... 67
2.2 Biosimilars in der Partikelherstellung ..... 69
2.2.1 Thiolierung und Antikörperkopplungseffizienz ..... 69
2.2.2 Zellkulturuntersuchungen mit biosimilar Nanopartikeln ..... 71
2.3 Herstellung von Partikeln unterschiedlicher Größe ..... 72
3 Co-Kultur ..... 75
3.1 Co-Kultur: SK-Br-3 und MCF-7 Nuclight Green ..... 75
3.2 Co-Kultur: Vampiro SK-Br-3 und MCF-7 ..... 77
3.2.1 Vergleich Co-Kultur und Monokultur ..... 78
3.2.2 Einfluss von Partikelkonzentration und Inkubationsdauer ..... 79
3.2.3 Selektive und unselektive Partikelinteraktionen ..... 82
3.2.4 Kontrollpartikelsysteme und Vorinkubation mit Trastuzumab ..... 83
4 Sphäroid-Zellkultur ..... 87
4.1 Sphäroide in der Fluoreszenzmikroskopie ..... 88
4.1.1 Vorinkubation in Paraformaldehyd ..... 88
4.1.2 Auswahl der Schnittfläche ..... 89
4.2 Sphäroide in der Durchflusszytometrie ..... 89
4.2.1 Redispergierung in Einzelzellsuspensionen ..... 90
4.2.2 Mittelwert- und Medianbetrachtung der Fluoreszenzintensität ..... 91
4.2.3 Auswahl der Zellpopulation ..... 92
4.2.4 MCF-7 Nuclight Green-Sphäroide in der Durchflusszytometrie ..... 97
4.2.5 Einfluss statischer und dynamischer Inkubation ..... 98
4.3 Einfluss der Partikelkonzentration und Inkubationsdauer ..... 101
4.4 Sphäroidinteraktion mit Kontrollpartikelsystemen ..... 104
4.5 Vergleich von Sphäroiden mit einer monolayer-Zellkultur ..... 105
4.6 Einfluss der Partikelgröße ..... 107
4.7 Vorinkubation mit Trastuzumab ..... 112
4.8 Co-Inkubation von Monokultursphäroiden ..... 113
5 Versuche zur nicht-kovalenten Wirkstoffbeladung ..... 116
5.1 Wirkstoffeinbettung durch Desolvatation von HSA ..... 116
5.1.1 Desolvatation mit Ethanol ..... 116
5.1.2 Desolvatation mit Polyethylenglykol ..... 117
5.2 Wirkstoffeinbettung über ionische Wechselwirkung ..... 117
5.2.1 Herstellung von sucHSA ..... 118
5.2.2 Herstellung von wirkstofffreien Nanopartikeln mit sucHSA ..... 119
5.2.3 Herstellung von wirkstoffbeladenen Nanopartikeln mit sucHSA ..... 120
5.3 Wirkstoffeinbettung über komplexe Koazervation ..... 121
5.3.1 Herstellung und Charakterisierung von catHSA ..... 122
5.3.2 Herstellung von wirkstofffreien Nanopartikeln durch komplexe
Koazervation ..... 123
5.3.3 Herstellung von wirkstoffbeladenen Nanopartikeln durch komplexe
Koazervation ..... 125
6 Versuche zur kovalenten Wirkstoffbeladung ..... 126
6.1 Neratinib: Wirkstoffeinbettung über direkte kovalente Bindung ..... 126
6.1.1 Bindungseffizienz von Neratinib an HSA ..... 127
6.1.2 HSA(NER)-Nanopartikel und ihre Oberflächenmodifikation ..... 129
6.1.3 Freisetzung von Neratinib aus HSA(NER)-Nanopartikel ..... 129
6.1.4 WST-1-assays ..... 131
6.2 Puromycin: Wirkstoffeinbettung über einen spaltbaren linker ..... 133
6.2.1 Reaktion zwischen linker und Puromycin ..... 135
6.2.2 Reduktion von HSA zur Gewinnung von Thiolgruppen und
Verwendung bei der Desolvatation ..... 138
6.2.3 MC-Val-Ala-Puromycin-Konjugat mit redHSA ..... 139
6.2.4 Direkte Quantifizierung der Wirkstoffbeladung ..... 139
6.2.5 Nanopartikelherstellung aus HoLP und HLP ..... 142
6.2.6 WST-1-assays mit HoLP- und HLP-Formulierungen ..... 143
E ZUSAMMENFASSUNG ..... 149
E SUMMARY ..... 153
F ANHANG ..... 157
1 Abkürzungsverzeichnis ..... 157
2 Literaturverzeichnis ..... 159
3 Lebenslauf ..... 171
4 Veröffentlichungen ..... 172