title: Interferometric beam shaping for three dimensional MINFLUX localisation microscopy
Creators: name: Geismann, Maximilian Korbinian
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die genaue Beeinflussung der Form und Position von Lichtstrahlen ist für eine Vielzahl von Anwendungen, die von optischer Kommunikation über optische Fallen und Mikroskopen reicht, wichtig. Besonders in den Biowissenschaften ist die Fluoreszenzmikroskopie ein unschätzbares Werkzeug, da es die präzise Markierung biologischer Proben, seien es einzelne Proteine oder gar ganze lebende Tiere, mit Fluorophoren ermöglicht. Die Untersuchung dichter Proben mit räumlichen Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts von etwa 200 bis 300 Nanometern erfordert jedoch Superauflösungstechniken. Eine kürzlich vorgestellte Methode mit der Bezeichnung ``MINFLUX'' hat gezeigt, wie das Konzept der Einzelmolekül-Lokalisierung mit Hilfe von geformten Strahlen erheblich verbessert werden kann: die Position des Moleküls wird anhand der Anzahl der Photonen effizient geschätzt, die während einer iterativen Abfolge von Anregungsstrahlen, die in der Regel ein ``Nullstelle'' im Intensitätsprofil aufweisen, detektiert werden. Bemerkenswert ist, dass MINFLUX eine isotrope Präzision im einstelligen Nanometerbereich in allen drei Dimensionen (3D) erreichen kann, was jedoch axiale Ablenkung der Strahlen erfordert. Dies stellt eine technologische Herausforderung für die Realisierung eines typischen MINFLUX-Zyklus im Sub-Millisekundenbereich dar. In dieser Arbeit untersuche ich einen Ansatz zur Strahlformung, der auf schneller dynamischer Polarisationsinterferometrie basiert. Sie ermöglicht die Manipulation von Strahlformen und deren Intensitätsnullstellen, insbesondere die axiale Ablenkung der Nullstelle eines Flaschenstrahls (``bottle beam'') die auch für die 3D MINFLUX Lokalisierung verwendet werden kann. Darüber hinaus präsentiere ich eine flexible Realisierung und Charakterisierung eines solchen inteferometrischen Strahlformers, der die Strahlen vier paralleler optischer Pfade formen kann und das Anregungsmodul eines vollwertigen 3D-MINFLUX Mikroskops bildet. Die Fähigkeiten des Aufbaus werden anhand der 3D-MINFLUX-Abbildung von DNA-Origami-Strukturen und Zellkernporenkomplexen unter Verwendung neuer MINFLUX-Schemata, die verschiedene Strahlformen innerhalb eines Zyklus mischen, um die Lokalisierungspräzision zu erhöhen, sowie die gleichzeitige 3D-MINFLUX Verfolgung zweier Fluorophore durch schnelles Schalten zwischen Anregungsmustern zweier Wellenlängen demonstriert.
description: Accurately manipulating the shape and position of light beams is essential to a wide variety of applications ranging from optical communications, optical tweezers and microscopes. Especially in the life sciences, fluorescence microscopy is an invaluable tool for its ability to precisely label biological samples --ranging from single proteins to whole living animals-- with fluorophores. However, studying dense samples with spatial features below the diffraction limit of light of approximately 200 to 300 nanometres requires super-resolution techniques. Prominently, a recent method termed MINFLUX demonstrated how the concept of single molecule localisation can be significantly boosted in precision utilising shaped beams: the molecule location is estimated through photon counts collected during an iterative sequence of excitation beams, that usually feature an intensity `zero', and their positions. Remarkably, MINFLUX allows isotropic single-digit nanometre precision in all three dimensions (3D) which, however, requires axially deflecting beams. This poses a technological challenge within a typical sub-millisecond MINFLUX cycle. In this work, I study a beam shaping approach based on fast dynamic polarisation interferometry that allows manipulation of beam shapes and their intensity zeros, notably the axial deflection of a bottle beam zero and how it can be used for enabling 3D MINFLUX localisation. Furthermore, I present a versatile realisation and characterisation of such a interferometric beam shaper working on four parallel optical paths, which forms the excitation module of a fully fledged 3D MINFLUX microscope. The setup's capabilities are demonstrated through 3D MINFLUX imaging of DNA origami structures and nuclear pore complexes using novel MINFLUX schemes that mix different beam shapes within one cycle for improved localisation precision as well as 3D MINFLUX tracking of two emitters by rapidly interleaving excitation patterns of two wavelengths.