title: New approaches to the therapy of glioblastoma: investigations on RNA interference, kinesin Eg5 and ABCB1/ABCG2 inhibition
Creators: name: Müller, Christine
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Glioblastom , Kinesin , Inhibitor , RNS , Transfektion , TmHU , RNAi , Kinesin Eg5 , ABCB1 , ABCG2 , TmHU , RNAi , Kinesin Eg5 , ABCB1 , ABCG2
subject: 540 Chemie

description: No effective chemotherapy for the treatment of malignant brain tumors, especially glioblastoma, exists so far. Despite the progress in surgical techniques and advances in the irradiation treatment, the concomitant chemotherapy is essential for the prevention of relapse and of major importance for patient outcome. The introduction of temozolomide combined with radiation in clinical practice led to slightly improved long-term survival, but malignant gliomas remain resistant to cancer chemotherapy. Thus, new strategies for the treatment of brain tumors are still needed. Objectives of this work were the evaluation of the TmHU protein as siRNA transfection reagent (Chapter 2), investigations on new kinesin Eg5 inhibitors, which specifically inhibit cell division during mitosis (Chapter 3), and the exploration of new tariquidar analogs as ABCB1 and ABCG2 inhibitors (Chapter 4). Due to the selective down-regulation of oncogene expression by small interfering RNA, siRNAs are considered as promising anticancer agents allowing the selective killing of tumor cells. The suitability of the non-toxic TmHU protein as siRNA transfection reagent was explored in vitro and in vivo in order to investigate the down-regulation of gene expression in human glioblastoma cells. The efficient transfection of the cancer cells is a prerequisite for this new concept, and, therefore, reliable in vitro and in vivo models were developed for the proof of principle. A suitable and convenient in vitro method was established for the quick detection of siRNA effects on the EGFP or DsRed2 expression, respectively, with respect to total cell number by using a fluorescence plate reader. In order to study siRNA effects in vivo subcutaneous tumor models were established in nude mice and two fluorescence detection methods were evaluated. The fluorescence intensity was quantified by confocal laser scanning microscopy of paraffin embedded tumor sections and by in vivo imaging. In preliminary tests with micro-osmotic pumps the continuous release of a suspension and the practicability of subcutaneous implantation were assured. Unfortunately, the established in vivo methods could not be used for the intended investigations on TmHU because this protein was not suitable for siRNA transfection. Nevertheless, these methods are recommendable for the investigation of promising in vivo transfection reagents. The inhibition of kinesin Eg5 by small molecules such as monastrol is currently evaluated as an approach to develop a novel class of antiproliferative drugs for the treatment of malignant tumors. Therefore, the effects of new monastrol analogs on the proliferation of human U-87 MG, U-118 MG, and U-373 MG glioblastoma cells were investigated. Compared to monastrol, the new cell cycle specific compounds showed an at least one order of magnitude higher antiproliferative activity. The compounds were neither inactivated by hydrolysis nor by binding to serum proteins. Due to the necessity of overcoming the blood�brain barrier (BBB) in the treatment of brain tumors, it was investigated if the new monastrol analogues are modulators or substrates of the ABCB1 transporter by a flow cytometric calcein-AM efflux assay. The tested compounds showed no modulating effects on the ABCB1 function. With respect to the treatment of primary and secondary CNS tumors, the results suggest that the new monastrol analogs represent an interesting class of potential anticancer drugs, predicted to be less neurotoxic in comparison to classical tubulin inhibitors. The efflux of cytostatics due to expression of ABC transporters such as ABCB1 and ABCG2 at the BBB leads to extremely low drug concentrations in the brain and is therefore a major limitation in cancer chemotherapy. A strategy to overcome the BBB is the administration of an efflux inhibitor in combination with a cytostatic. The 3rd generation inhibitor tariquidar led to better brain/plasma ratios of paclitaxel but could not increase the paclitaxel brain levels compared to co-administration of the 2nd generation inhibitor valspodar. The very high tariquidar brain levels indicate that the very lipophilic tariquidar is trapped in the lipid compartment of the brain. Aiming at tariquidar analogs with improved solubility and pharmacokinetics, more hydrophilic analogs were synthesized. The compounds were investigated on ABCB1 overexpressing Kb-V1 and ABCG2 overexpressing MCF-7/Topo cells for inhibitory activity and for cytotoxicity, alone and in combination with cytostatics. Surprisingly, slight structural modifications resulted in ABCG2 selective inhibitors. Three analogs have IC50 values of 55, 100, and 154 nM, comparable with the most potent reported ABCG2 inhibitor Ko143. Some ABCG2 inhibitors showed specific toxicity which could be advantageous regarding the treatment of brain tumors. These very potent and selective ABCG2 inhibitors should be useful pharmacological tools for in vitro and in vivo investigations.
description: Trotz der Fortschritte in der Chirurgie und v.a. der Bestrahlungstechnik ist die Prognose für Patienten mit malignen Hirntumoren äußerst ungünstig. Für die Behandlung von Glioblastomen gibt es bisher noch keine effektive Chemotherapie. Daher werden neue Strategien zur Behandlung von Gehirntumoren dringend benötigt. Die Ziele dieser Arbeit waren die Untersuchung des TmHU Proteins auf dessen Eignung als siRNA-Transfektionsreagenz (Kapitel 2), die Untersuchung neuer Kinesin Eg5 Inhibitoren (Kapitel 3), und die Erforschung neuer Tariquidar-Derivate als ABCB1 und ABCG2 Inhibitoren (Kapitel 4). Der Einsatz von �small interfering RNA� (siRNA) wird aufgrund der Möglichkeit, selektiv die Oncogen-Expression herunter zu regulieren, als vielversprechende neue Strategie zur Behandlung von Tumoren betrachtet. Ein wesentliches Problem besteht dabei in der effizienten Transfektion der Krebszellen. Aufgrund vielversprechender Vorarbeiten wurde die Eignung des TmHU Proteins aus Thermotoga maritima als siRNA Transfektionsreagenz an humanen Glioblastomzellen untersucht. Zur Validierung dieses Prinzips war der Aufbau zuverlässiger In-vitro- und In-vivo-Modelle erforderlich. Dazu dienten stabil mit EGFP oder DsRed2 transfizierte Glioblastomzellen. Die Expression dieser fluoreszierenden Proteine ermöglicht die schnelle In-vitro-Detektion der Effekte entsprechender siRNA mittels eines Fluoreszenz-Platten-Lesers unter Berücksichtigung der Zellzahl. Um siRNA Effekte in vivo an subkutanen Tumormodellen in Nacktmäusen untersuchen zu können, wurden zwei Methoden zur Fluoreszenzdetektion evaluiert. Die Fluoreszenzintensität wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie von Paraffinschnitten der Tumoren und durch In-vivo-Imaging quantifiziert. In Voruntersuchungen mit osmotischen Pumpen wurden die gleichmäßige Freisetzung einer Suspension und die Durchführbarkeit der subkutanen Implantation sichergestellt. Leider konnten die etablierten In-vivo-Methoden für die geplanten Untersuchungen von TmHU nicht genutzt werden, da sich herausstellte, dass dieses Protein entgegen den Erwartungen nicht als siRNA-Transfektionsreagenz geeignet ist. Dennoch sind diese Methoden für die Untersuchung anderer vielversprechender Transfektionsreagenzien in vivo wertvoll. Niedermolekulare Hemmstoffe des mitotischen Kinesins Eg5 wie Monastrol stellen eine neue Klasse antiproliferativ wirkender Verbindungen dar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Wirkung neuer Monastrol-Derivate auf die Proliferation menschlicher U-87 MG, U-118 MG, and U-373 MG Glioblastomzellen. Im Vergleich zu Monastrol zeigten die neuen Zellzyklus-spezifischen Verbindungen eine um mindestens eine Zehnerpotenz höhere antiproliferative Aktivität. Die Verbindungen wurden weder durch Hydrolyse noch durch Bindung an Serumproteine inaktiviert. Der Angriff von Chemotherapeutika an Hirntumoren setzt die Überwindung der Blut-Hirn Schranke (BHS) voraus. Die durchflusszytometrische Untersuchung ergab, dass die neuen Monastrol-Derivate keine Modulatoren oder Substrate des ABCB1 Transporters sind, der als Effluxpumpe in der BHS die intrazerebral erreichbare Konzentration zahlreicher Zytostatika limitiert. Im Hinblick auf die Behandlung primärer und sekundärer ZNS-Tumoren, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Monastrol-Derivate eine interessante Klasse potentieller Zytostatika darstellen, die im Vergleich zu klassischen Tubulin-Hemmern wahrscheinlich eine geringere Neurotoxizität aufweisen. Die Expression von ABC Transportern wie ABCB1 und ABCG2 an der BHS ist für den Efflux zahlreicher Zytostatika verantwortlich und stellt die Hauptursache für das Versagen bestimmter Chemotherapien zur Behandlung von Hirntumoren dar. Eine Strategie, die BHS zu überwinden, besteht in der Verabreichung von Efflux-Inhibitoren in Kombination mit Zytostatika. Tariquidar, ein Inhibitor der 3. Generation, führte zu einem höheren Hirn/Plasma Konzentrationsverhältnis von Paclitaxel, aber nicht zu einem erhöhten Gehirnspiegel des Zytostatikums, im Vergleich zur Koapplikation mit Valspodar, einem Inhibitor der 2. Generation. Die sehr hohen Gehirnspiegel von Tariquidar deuten darauf hin, dass sich das sehr lipophile Tariquidar im Lipid-Kompartiment des Gehirns anreichert. Mit dem Ziel, Tariquidar-Derivate mit verbesserter Löslichkeit und Pharmakokinetik zu erhalten, wurden hydrophilere Analoga synthetisiert. Die Substanzen wurden an ABCB1 exprimierenden Kb-V1 und ABCG2 exprimierenden MCF-7/Topo Zellen auf inhibitorische Aktivität sowie auf Zytotoxizität alleine und in Kombination mit Zytostatika untersucht. Überraschenderweise führten geringe Strukturveränderungen zu ABCG2-selektiven Inhibitoren. Drei der Derivate sind mit IC50-Werten von 55, 100, und 154 nM stärker wirksam als der potenteste literaturbekannte ABCG2 Inhibitor Ko143. Interessanterweise sind einige ABCG2 Inhibitoren zudem zytotoxisch. Dies könnte von Vorteil sein, um Tumorstammzellen zu bekämpfen, die typischerweise ABCG2 exprimieren.