title: Verification of drug delivery concept of "lipid - nucleoside and polysaccharide conjugates of 5-fluorouracil"
title: Überprüfung des Drug Delivery Konzepts von „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugaten von 5-Fluorouracil“
Creators: name: Farhat, Anisa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: 5-fluorouracil
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
5-Fluorouracil

description: In 2012 malignant diseases were
      ranked at second position in German mortality statistics
      (Becker &amp; Holzmeier 2012). Chemotherapy is one of the
      most important components in the therapy of malignant tumors.
      However, despite great advances in recent years only a
      marginal improvement of the survival of the patients could be
      achieved (Bourret et al. 1979, Krook et al. 1991).
      5-Fluorouracil (5-FU) - an uracil analogue - is an
      antimetabilte, which is widely used in the therapy of
      malignant illnesses (Bodner-Adler et al. 2007, Carrato 2008,
      Khosravi Shahi et al. 2007, Kish et al. 1994, Zhao et al.
      2013). One of the major handicaps of many chemotherapeutics-
      like 5-FU- is the insufficient penetration through cell
      membranes due to high hydrophobicity (Malecki et al. 2013a).
      Therefore, Prof. Dr. Rosemeyer und Dr. Malecki developed in a
      cooperation project (Prof. Rosemeyer, Osnabrück/Prof.
      Kinscherf, Marburg) several derivatives of 5-FUrd (2a)
      carrying lipophilic moieties at the N(3)- and/or in the
      2‘3‘-O-position (3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b) with the aim to
      improve the penetration and to achieve less side-effects due
      to higher lipophilicity (Malecki 2013, Köstler et al. 2013,
      Malecki et al. 2013b, Malecki et al. 2014, Malecki &amp;
      Rosemeyer 2010, Rosemeyer, H., Malecki, E., Rosemeyer, H.,
      Malecki, E., Werz, E., Korneev, S., Gall, K., Werz et al.
      2013). Additionally, the 2‘3‘-O-Nonadecylidene derivative of
      uridine, 3c, was compounded for comparative reasons (Köstler
      et al. 2013). This dissertation describes the in vitro
      testing of the drug delivery concept of the
      „lipid-nucleoside- and polysaccharide-conjugate of 5-FU (2a,
      3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b) towards three carcinoma cell lines
      HT-29 (human colon carcinoma), HepG2 (human hepatoblastoma),
      RENCA (murine renal adenocarcinoma) and on differentiated
      human THP-1 macrophages. We incubated HT-29 cells for 24 h
      with ATTO 245®-conjugated substances (2c, 3b-7b) in order to
      find out, if the substances are able to pass the cell
      membrane and if so, in which cell compartment they were
      located after penetration. All derivatives passed the cell
      membrane and accumulated in the cytoplasm, all avoiding the
      nuclei, except derivative 5-FUrd (2c), which showed a
      granulated distribution in the cytoplasm (Malecki et al.
      2013a). The impact of the absorption of the derivatives
      (3a-7a, 3c) on proliferation and apoptosis of the cells (in
      comparison with 5-FU (1) and 5-FUrd (2a)) set up priorities
      in this dissertation. After 24 h, 48 h or 72 h of incubation
      of HT-29 human colon carcinoma cells with the derivatives 1
      (5-FU) (14-23%, 35-46% and 30-58%) or 2a (5-FUrd) (33-45%,
      60-67% and 58-67%) the survival of the cells was
      significantly decreased, in comparison to the negative
      control. Additionally, after 24 h treatment of the HT-29
      cells at concentrations of 40 µm and 80 µm with the
      derivatives 3a (77% and 95%), 5a (30% and 86%) and 3c (89%
      and 96%) significantly reduced the viability of the HT-29
      cells in comparison to the negative control. These three
      derivatives showed after 24 h of incubation of HT-29 cells at
      concentrations of 40 µm and 80 µm a significant reduction of
      the viability in comparison to the positive control (1)
      (61-81%, 73% and 80-82%), too. Incubation (48 h) of the HT-29
      cells with the derivatives showed that four derivatives at
      concentrations of 40 µm and 80 µm significantly reduced the
      viability in comparison to 5-FU (~positive control): at the
      derivatives 3a (9-54%), 5a (5-48%), 7a (2-30%) and 3c
      (53-63%). Derivatives 4a and 6a did not affect the viability
      of the HT-29 cells. The derivatives 3a, 5a, 7a and 3c also
      showed a significant decrease of viability in other cancer
      cell lines (RENCA and HepG2): After 48 h of incubation of the
      RENCA cells, the derivatives 3a (51-57%) and 5a (56%) showed
      a significant decrease of viability compared to 5-FU. The
      derivative 3c (38-49%) and 7a (25-44%) revealed similar
      cytotoxic effects on the viability of RENCA cells like
      substance 1 (29-48%) and 2a (41-46%). After 48 h incubation
      of HepG2 cell lines, the derivatives 3a (72-75%), 5a (53%),
      7a (43%) and 3c (22-74%) showed a significant decrease of
      viability in comparison to 5-FU. Investigations of the
      derivatives using differentiated macrophages (THP1) were of
      major importance for the discrimination between cytotoxic-
      and side-effects. The derivative 5a showed a significant
      6-27% increase of the viability in comparison to 5-FU
      (~positive control) after 48 h of incubation. The ATTO
      425®-conjugated derivatives 3b, 4b, 5b, 6b and 7b were tested
      regarding their anticancer activity in human HT-29 cells
      after 24 h and 48 h of treatment. All of the derivatives lost
      their anticancer activity after conjugation with ATTO 425® at
      all concentrations under test (10-80 µm) in comparison to the
      control. Using concentrations of 10-80 µM only the ATTO
      425®-conjugated derivative 5-FUrd (2c) showed a significant
      31-52% or 41-57% reductions of the viability in comparison to
      the control . Furthemore, we tested the impact of the
      derivatives on induction of apoptosis or proliferation in
      HT-29 cells after 1 h, 2 h, 4 h or 6 h of incubation in
      comparison to 5-FU (1) and 5-FUrd (2a). The derivative 5a
      showed the highest increase of apoptosis at a concentration
      of 80 µM - after 2 h (3.1-fold), 4 h (3-fold) and 6 h
      (4-fold). After 6 h of treatment at concentration 40 µM a
      significant 3.3-fold increased apoptosis rate was observed.
      Moreover, the effects of the treatment of HT-29 cells with
      the substances on gene signatures were part of the
      investigation. In real time PCR (qRT-PCR) the derivative 5a
      (40 µM) showed a significant 2-fold increase of the tumor
      suppressor gene p53 expression compared to the negative and
      positive control (5-FU), and a 1.5-fold increased expression
      of the proapoptotic Caspase-3 gene. This dissertation shows
      that the cytotoxicity of several derivatives of 5-FUrd (2a)
      was more effective than 5-FU, respectively, 5-FUrd using
      several cancer cell lines. Especially the derivative 5a is of
      major interest, because it has no cytotoxic effects on
      differentiated human macrophages (~ immune cell), despite of
      its high cytotoxic activity on several cancer cell lines.
      Thus, the derivative 5a could be a novel potential cytotoxic
      multipotent chemotherapeutic drug. For the final assessment
      of the pharmacological/therapeutic potential, additional
      investigations, such as microtumors/-spheres, animal studies,
      and prospective clinical trials are needed.
description: 2012 standen maligne Erkrankungen
      an zweiter Stelle der Todesursachenstatistik in Deutschland
      (Becker &amp; Holzmeier 2012). Einen wichtigen Baustein in
      der Therapie der malignen Erkrankungen stellt die
      Chemotherapie dar. Trotz großer Fortschritte in den
      vergangenen Jahren konnte nur eine geringe Verbesserung des
      Überlebens der Patienten erzielt werden (Bourret et al. 1979,
      Krook et al. 1991). Das Uracil-Analogon 5-Fluorouracil (5-FU)
      ist ein Antimetabolit, der weit verbreitet in der
      Chemotherapie maligner Tumoren Anwendung findet (Bodner-Adler
      et al. 2007, Carrato 2008, Khosravi Shahi et al. 2007, Kish
      et al. 1994, Zhao et al. 2013). Eines der größten Handicaps
      von Chemotherapeutika, wie 5-FU, ist die insuffiziente
      Penetration der Zellmembran, die durch eine hohe Hydrophilie
      bedingt ist (Malecki et al. 2013a). Daher haben Prof. Dr.
      Rosemeyer und Frau Dr. Malecki im Rahmen eines
      Kooperationsprojekts (Prof. Rosemeyer, Osnabrück/Prof.
      Kinscherf, Marburg) verschiedene Derivate von 5-Fluorouridine
      (5-FUrd, 2a) entwickelt, welche lipophile Reste in N(3)-
      und/oder in 2‘3‘-O-Position tragen (3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b),
      mit dem Ziel durch erhöhte Lipophilie der Derivate eine
      verbesserte Penetration und eine geringere Rate an
      Nebenwirkungen zu erreichen (Köstler et al 2013, Malecki et
      al. 2013a, Malecki et al. 2013b, Malecki et al. 2014, Malecki
      &amp; Rosemeyer 2010, Rosemeyer et al. 2012, Rosemeyer &amp;
      Malecki 2012, Werz et al. 2013). Zusätzlich wurde zum
      Vergleich das 2‘3‘-O-Nonadecylidene Derivat von Uridin, 3c,
      hergestellt (Köstler et al. 2013). In dieser Dissertation
      erfolgte die in vitro-Testung des Drug Delivery Konzeptes der
      „Lipid-Nucleosid- und Polysaccharid-Konjugate von 5-FU (2a,
      3a-7a, 3c, 2c, 3b-7b)“ an den Krebszelllinien HT-29 (humanes
      Kolonkarzinom), HepG2 (humanes hepatozelluläres Karzinom),
      sowie RENCA (murine Nierenzellkarzinom) und an Zellen des
      Immunsystems, d.h. differenzierten, humanen Makrophagen
      (THP-1). Um die Frage zu klären, ob die Substanzen die
      Zellmembran passieren können, und in welchem Zellkompartiment
      sie danach lokalisiert sind, wurden HT-29-Zellen mit ATTO
      245®-konjugierten Test-Substanzen (2c, 3b-7b) für 24 h
      inkubiert. Alle Derivate passierten die Zellmembran und
      akkumulierten im Zytoplasma, unter Aussparung des Zellkerns.
      Nur das Derivat 2c zeigte eine granulierte Verteilung im
      Zytoplasma. Ein Schwerpunkt dieser Dissertation war es, den
      Einfluss der Aufnahme der Testsubstanzen (3a-7a, 3c) auf die
      Proliferation und Apoptose der Zellen und die
      zytostatische/zytotoxische Aktivität der Derivate im
      Vergleich zu 5-FU (1) und 5-FUrd (2a) zu untersuchen. Nach 24
      h, 48 h bzw. 72 h Inkubation der humanen
      Kolonkarzinomzellinie HT-29 mit den Derivaten 1 (5-FU)
      (14-23%, 35-46%, bzw. 30-58%) und 2a (5-FUrd) (33-45%,
      60-67%, bzw. 58-67%) konnte im Vergleich zur Negativkontrolle
      eine signifikante Reduktion der Viabilität der Zellen
      beobachtet werden. Nach 24 h Inkubation der HT-29-Zellen
      zeigten in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM die Derivate
      3a (77% und 95%), 5a (30% und 86%) und 3c (89% und 96%) eine
      signifikante Abnahme der Viabilität im Vergleich zur
      Negativkontrolle. Diese drei Derivate zeigten nach 24 h
      Inkubation in den Konzentrationen 40 µM und 80 µM ebenfalls
      im Vergleich zur Positivkontrolle (1) eine signifikante
      Abnahme der Viabilität der HT-29-Zellen (61-81%, 73% bzw.
      80-82%). Nach 48 h Inkubation der HT-29-Zellen mit den
      Derivaten konnte bei vier Derivaten in den Konzentrationen 40
      µM und 80 µM eine signifikante Abnahme der Viabilität im
      Vergleich zu 5-FU (~Positivkontrolle) beobachtet werden: 3a
      (9-54%), 5a (5-48%), 7a (2-30%) und 3c (53-63%). Die Derivate
      4a und 6a zeigten keinen Effekt auf die Viabilität der
      HT-29-Zellen. Die Derivate 3a, 5a, 7a und 3c zeigten auch bei
      anderen Krebszelllinien (RENCA und HepG2) eine signifikante
      Abnahme der Viabilität: Nach 48 h Inkubation der
      RENCA-Zelllinie mit den Derivaten, zeigten die Derivate 3a
      (51-57%) und 5a (56%) eine signifikante Abnahme der
      Viabilität im Vergleich zu 5-FU. Die Derivate 3c (38-49%) und
      7a (25-44%) wiesen bei RENCA-Zellen ähnliche zytostatische
      Effekte auf, wie die Substanzen 1 (29-48%) und 2a (41-46%).
      Nach 48 h Inkubation der HepG2-Zelllinie mit den Derivaten
      konnte bei den Derivaten 3a (72-75%),5a (53%), 7a (43%) und
      3c (22-74%) eine signifikante Abnahme der Viabilität im
      Vergleich zu 5-FU beobachtet werden. Von besonderem Interesse
      war das Ergebnis der Testung der Derivate an differenzierten
      THP-1-Makrophagen, um zwischen zytotoxischen Effekten und
      Nebenwirkungen unterscheiden zu können. Das Derivat 5a zeigte
      nach 48 h Inkubation eine signifikant um 6-27% erhöhte
      Zunahme der Viabilität im Vergleich zu 5-FU
      (~Positivkontrolle). Die mit ATTO 425®-konjugierten
      5-Fluorouridinderivate 3b, 4b, 5b, 6b und 7b wurden bzgl.
      ihrer Effekte auf die Viabilität der
      HT-29-Kolonkarzinomzellen getestet, nach 24 h und nach 48 h
      Inkubationszeit. Die mit ATTO 425®-konjugierten 5-FUrd
      Derivate zeigten in allen getesteten Konzentrationen (10-80
      µM) im Vergleich zur Kontrolle keine Unterschiede bzgl.
      Viabilität der Zellen. Nur das mit ATTO 425®-konjugierte
      5-FUrd (2c) zeigte in den Konzentrationen 10-80 µM im
      Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Abnahme der
      Viabilität der HT-29-Zellen um 31-52% bzw. 41-57%. Zusätzlich
      testeten wir den Einfluss der Derivate auf die Induktion der
      Apoptose und Proliferation im Vergleich zu 5-FU (1) und
      5-FUrd (2a) bei HT-29-Zellen nach 1 h, 2 h, 4 h und 6 h
      Inkubationszeit. Das Derivat 5a zeigte signifikante Zunahmen
      der Apoptose bei 80 µM nach 2 h Inkubationszeit (um das
      3,1-Fache), nach 4 h (um das 3-Fache) bzw. 6 h (um das
      4-Fache). Nach 6 h Inkubation konnte bei 5a auch bei 40 µM
      eine signifikante Zunahme der Apoptose um das 3,3-Fache
      beobachtet werden. Des Weiteren wurde die Gensignatur (zur
      Testung der Signaltransduktion) der HT-29-Zellen nach
      Behandlung mit diesen Substanzen untersucht. In der Real-time
      PCR (qRT-PCR) zeigte das Derivat 5a bei 40 µM eine
      signifikante Zunahme der Expression des Tumorsuppressorgens
      p53 um das 2-Fache im Vergleich zur Negativ- und
      Positivkontrolle (5-FU), sowie eine 1,8-fache Zunahme der
      Expression des proapoptotischen Caspase 3 Gens. In dieser
      Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei mehreren
      Krebszelllinien einige Derivate von 5-FUrd (2a) effektiver in
      ihrer Zytotoxizität sind, als 5-FU (1) oder 5-FUrd (2a).
      Besonders das Derivat 5a ist von großem Interesse, da es
      trotz der hohen zytotoxischen Aktivität bei Krebszelllinien,
      keine zytotoxischen Effekte bei differenzierten Makrophagen
      (~Immunzellen) zeigt. Das Derivat 5a könnte somit ein
      neuartiges, zytotoxisches, multipotentes Chemotherapeutikum
      darstellen. Zur abschließenden Beurteilung des
      pharmakologischen/therapeutischen Potentials sind allerdings
      weitere Untersuchungen, z. B. an Mikrotumoren/-sphären, sowie
      tierexperimentelle und prospektive klinische Studien
      notwendig.