title: NET-PET: novel radiotracers for the norepinephrine transporter and metabolic considerations
Creators: name: Eberherr, Nadine
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Der Norepinephrin-Transporter (NET) besitzt eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung physiologischer Prozesse im gesamten Körper und wird mit wichtigen pathophysiologischen Zuständen des Gehirns in Zusammenhang gebracht. Es gibt Hinweise darauf, dass eine Fehlregulation der Expression dieses Transporters in verschiedenen Gehirnregionen bei Krankheiten wie Depression, Schizophrenie, Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Alzheimer vorliegt. In diesem Zusammenhang besteht starkes Interesse daran, die Veränderungen der Transporterdichten im Gehirn quantifizieren zu können, um Informationen über den jeweiligen Krankheitsverlauf und ein Therapieansprechen auf molekularer Basis zu erhalten. Unter Verwendung von Positronenemissionstomographie (PET) als nichtinvasive, diagnostische Methode der Wahl, konnten bereits durch den Einsatz des radioaktiven Tracers [18F]FMeNER-D2, einem Derivat des Antidepressivums Reboxetin, sehr gute Resultate bezüglich der Visualisierung des Wiederaufnahmetransporters NET erzielt werden. Seine Anwendung erlaubt jedoch momentan keine Quantifizierung des Transporters in allen Gehirnarealen, da es aufgrund eines bis dato unbekannten Mechanismus zu einer unspezifischen Anreicherung von Radioaktivität in gehirnnahen Regionen kommt, wodurch ein störendes Hintergrundsignal vorliegt. Es wird angenommen, dass dieses Störsignal durch die Bindung des intakten Tracers oder seiner radioaktiven Metaboliten an Schädelknochen oder angrenzende Gewebe hervorgerufen wird. Das primäre Ziel der Arbeit war es, Stabilitätstests von [18F]FMeNER-D2 in vitro durchzuführen, um Aussagen über den Metabolismus in vivo treffen zu können. Im Voraus sollte dabei die Bindungsaffinität des Tracers an Knochen mit anderen klinisch relevanten PET-Tracern sowie einigen Forschungstracern verglichen werden. Anhand von Inkubationsuntersuchungen mit zentral vorkommenden Enzymen wie Monoaminooxidase A und B (MAO A /B) und Catechol-O-methyltransferase (COMT), sowie mit in erster Linie hepatischen Multienzymkomplexen von Mensch (HLM) bzw. Ratte (RLM) und sieben humanen Cytochrom-P450 Einzelenzymen soll der Tracer-Abbau in vivo nachgeahmt werden. Die Stabilität gegenüber Esterasen wurde mittels 3 unterschiedlicher Isoenzyme der humanen Carboxylesterase (hCES) und Schweineleberesterase (CE porcine) überprüft. Inhibitionsassays mit chemischen Inhibitoren von humanen CYP450 Isoformen in HLM- und RLM-Inkubationen sollen der Identifizierung von für den Abbau verantwortlichen CYP450-Enzymen dienen. Da die Anwendbarkeit von [18F]FMeNER-D2 und die Aussagekraft von erhaltenen PET-Scans aufgrund seiner geringen Stabilität, begrenzter spezifischer Bindung und komplexer Radiosynthese eingeschränkt wird, ist die Erforschung neuer Liganden für diesen Monoamintransporter von großer Wichtigkeit. Hierbei repräsentiert [11C]Me@APPI einen vielversprechenden Kandidaten der bereits in-vitro evaluiert wurde und vergleichbare Ergebnisse bezüglich Selektivität sowie erhöhte Stabilität aufweist. Computergestützte „in-silico“ Analysen führten zu der Annahme, dass fluor-substituierte Strukturanaloga von Me@APPI eine darüber hinaus erhöhte Affinität gegenüber den NET zeigen sollen. Der zweite Teil der Arbeit widmet sich daher der Synthese und Charakterisierung von zwei neuen NET-PET Vorstufen mit einer Benzo[d]imidazol-Grundstruktur, FAPPI1:0 und FAPPI3:0. Außerdem sollen in Vorversuchen die optimalen Bedingungen für die radioaktive Markierung als Basis für up-scaling Experimente gefunden werden und eine geeignete Trennmethode für das radioaktive Rohprodukt aufgestellt werden. In-vitro Untersuchungen haben gezeigt, dass nur eine geringfügig erhöhte Bindung von [18F]FMeNER D2 an Hydroxylapatit bzw. an humanes Knochenmaterial im Vergleich zu klinisch angewandten PET-Tracern stattfindet. Enzyminkubationen und Inhibitionstests haben ergeben, dass [18F]FMeNER-D2 dem Abbau durch die menschlichen Cytochrom-P450-Isoenzymen CYP2D6, CYP2C19 und CYP3A4 unterliegt, wobei darüber hinaus CYP1A2 eine reduzierte Stabilität bewirken könnte. Die durch PET-Bilder angedeutete starke Anreicherung im Schädelknochen kann nicht durch enzymatische Defluorierung erklärt werden, da in keinem der Experimente freies [18F]Fluorid nachgewiesen werden konnte. Ein Vergleich der Retentionszeiten der entstandenen radioaktiven Metaboliten aus HPLC-Messungen mit jener von [18F]Bromfluormethan macht die partielle O-Demethylierung des Tracers in vitro unwahrscheinlich. Schlussendlich sollen die erbrachten Ergebnisse als Basis für Metabolismustudien in-vivo dienen, um Möglichkeiten zu finden, in die Biotransformation des NET-Liganden eingreifen zu können, was letztlich zu einer aufschlussreicheren Evaluierung von NET-PET Bildern führen soll. Des Weiteren ist es gelungen zwei neue Vorstufen von potentiellen NET-Tracern, FAPPI1:0 und FAPPI3:0 in einer 4-stufigen bzw. 7-stufigen Synthese, herzustellen. Ausgehend von 1-Phenyl-1H-benzo[d]imidazol-2(3H)-on wurde FAPPI1:0 in einer Ausbeute von 12.6% erhalten. FAPPI:3 konnte im Zuge einer längeren Synthese anhand der Ausgangssubstanzen 2-Fluoranilin und 1-Fluor-2-nitrobenzol in einer Gesamtausbeute um 2% synthetisiert werden. Die radiochemische Markierung mittels [11C]Methyltriflat lieferte die beiden Tracer in exzellenter radiochemischer Ausbeute, wobei letztlich noch die optimalen Bedingungen für eine chromatographische Trennung mittels semi-präparativer HPLC gefunden werden müssen.
description: The norepinephrine transporter (NET) is relevant for important physiological and pathophysiological functions of the brain. Dysregulation of NET expression in various brain regions is assumed to be involved in diseases such as depression, schizophrenia, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and Alzheimer’s disease. In this context, it is of high interest to quantify the changes in NET density in healthy and treated individuals to provide information about the course of a disease and therapeutic outcome on a molecular basis. [18F]FMeNER-D2, a derivative of the antidepressant reboxetine, has shown best results as a molecular biomarker of the reuptake transporter of noradrenaline when using positron emission tomography (PET) as the diagnostic method. However, its application faces limitations due to unspecific binding in neighboring regions of the brain, which impedes a correct quantification of the NET signal in defined brain areas. This background signal in PET images is presumed to be caused by radioactive metabolites of [18F]FMeNER-D2 or the intact tracer itself via binding to the skull bone or adjacent tissues. The aim of the thesis was to compare [18F]FMeNER-D2 with other PET tracers concerning its bone affinity before the implementation of in vitro metabolic stability tests. These studies ought to give information about the localization of [18F]FMeNER-D2 metabolism using monoamine oxidase A (MAO A), MAO B and catechol-O-methyltransferase (COMT) as primarily centrally occurring enzymes, and human liver microsomes (HLM), rat liver microsomes (RLM) and seven human cytochrome P450 single enzymes (hCYP450) to mimic hepatic metabolism in vivo. Stability of our radioactive tracer against mammalian esterases was tested using three different isozymes of human carboxylesterase (hCES) and porcine carboxyl esterase. To identify the responsible CYP450 isoforms, inhibition experiments in HLM and RLM were carried out using CYP450 selective chemical inhibitors. The detection and identification of radiometabolites was achieved using reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with radiodetection. Since reboxetine-derived analogues such as [18F]FMeNER-D2 exhibit limitations in their applicability as NET-PET tracers in terms of metabolic stability, complex radiosynthesis and specific binding, there is still need for further investigation of different ligands for this important monoamine transporter. One of these promising candidates is [11C]Me@APPI, which already underwent full in vitro evaluation. Computational “in silico” studies of fluoro-substituted structural analogues of methylated APPI indicate even higher affinity towards NET. In the second section of the thesis, two novel PET precursors possessing a benzo[d]imidazole core structure, namely FAPPI1:0 and FAPPI3:0, were synthesized and characterized. Beyond that, optimum conditions for small-scale radiolabeling of both substances as a basis for up-scaling experiments were found and a suitable purification method for the crude tracer was evaluated. In vitro tests revealed that only minor increase in binding of [18F]FMeNER-D2 to hydroxyapatite or human bone material (diaphysis) compared to clinically applied PET-tracers can be observed. Incubation experiments showed degradation via human CYP2D6, CYP2C19 and CYP3A4, whereas CYP1A2 might as well be responsible for reduced stability of [18F]FMeNER-D2 against human enzymes in vitro. Intense signals in cranial bone cannot be explained via enzymatic defluorination, as no free [18F]fluoride was detected in any experiment. Comparison of the RP-HPLC retention times of the emerging polar radiometabolites with those of the labeling progenitor [18F]bromofluoromethane does not indicate partial O-demethylation of our tracer in vitro. In summary, these results constitute the basis for further in vivo investigations of [18F]FMeNER-D2 metabolism to finally enable an interference in tracer degradation, facilitating the evaluation of NET-PET images. Beyond that, the novel precursors FAPPI1:0 and FAPPI3:0 were successfully prepared in a 4- and 7-step synthesis, respectively. Successful preparation of FAPPI1:0 was achieved starting from 1 phenyl-1H-benzo[d]imidazole-2(3H)-one in an overall yield of 12.6%. FAPPI3:0 was obtained using 2-fluoroaniline and 1-fluoro-2-nitrobenzene as starting materials giving the precursor in 2.0% overall yield. Radiochemical labeling gave the final tracers [11C]Me@FAPPI1 and [11C]Me@FAPPI3 in high radiochemical yields, while an optimum setup for purification has yet to be found.