title: Identification of inhibitors of A to l editing
Creators: name: Tariq, Aamira
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: RNA-editing ist ein konservierter Mechanismus zur Diversifizierung der RNA von der genetisch codierten Information. Adenosin zu Inosin (A zu I) Editing bewirkt eine Informationsänderung an der RNA von A zu G und wird durch Doppelsträngige RNA spezifische Adenosin Deaminasen (ADARs)positionsabhängig katalysiert. Die biologische Bedeutung von Editing ist weitreichend und umfasst antivirale Mechanismen, alternatives Splicing, selektive Codonumwandlung, als auchModulierung der microRNA Prozessierung. Defekte in der Regulation des RNA Editings werden mit verschiedenen neuronalen Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht wie Depression und Epilepsie. Auch wurde vermindertes RNA Editing als Eigenschaft von Tumorgewebe identifiziert. Bislang wird angenommen, dass die Aktivität von ADAR2 über RNA Splicing und post-translationelle Modifikationen reguliert wird. Um potentielle Modulatoren der ADAR2 Proteinaktivität zu identifizieren, wurde ein Editing System in Hefe konstruiert. Dieses System enthält ein mutiertes URA3 Gen, in dessen 5‘ Region ein UAG Stop Codon liegt, dieses jedoch durch ADAR2 in ein codierendes Tryptophan Codon editiert wird. Die Konvertierung dieses internen Stop Codons gestattet in Folge die Expression von URA3. Durch Anwesenheit des Selektionsmittels 5-FOA (5-Fluororotsäure) wird nun das Wachstum der URA3 exprimierenden Zellen jedoch verhindert. Um Editing inhibierende Proteine zu finden, wurde eine humane cDNA Bibliothek in das Systemtransformiert. Durch 5-FOA können Kolonien nur aus jenen Transformanten hervorgehen, in denen ADAR2 Editing inhibiert wurde. DiecDNA möglicher Editinginhibitoren wurde aus den gewonnenen Transformanten isoliert. Um die Relevanz potentieller ADAR2 Inhibitoren in Säugerzellen zu bestimmen, wurde für die Sekundäranalyse ein Zellkulturreportersystem in Säugerzellen etabliert und eingesetzt. Letztlich konnten drei RNA bindende Proteine, RPS-14 (kleine ribosomale Untereinheit, Protein 14), SFRS-9 (Splicing Faktor, Arginin/Serin-reich 9), und DDX-15 (DEAH-box protein 15), als wahrscheinliche Editing-Inhibitoren identifiziert werden. Mittels Kolokalisations- und Koimmunopräzipitationsexperimenten konnten RPS-14 und SFRS-9 als ADAR2-Interaktoren identifiziert werden. Weiters konnte für RPS-14, SFRS-9 und DDX-15 eine Beteiligung in der Editing-Inhibierung an endogenen ADAR2 Substraten nachgewiesen werden. Zudem konnte die Editing inhibierende Aktivität von DDX-15im Fadenwurm Caenorhabditis elegans wiedergefunden werden, Indiz für einen konservierten Mechanismus. Unsere Resulate lassen daher auf die erfolgreiche Identifikation von drei bisher unbekannten Inhibitoren des ADAR2 vermittelten RNA Editings, RPS-14, SFRS-9 und DDX-15, schliessen.
description: RNA editing is a conserved posttranscriptional mechanism diversifying RNA and proteins from limited genetic information. A to I editing is carried out by ADARs (Bass). Editing has profound effect in various biological processes as anti-viral defense, alternation of splicing, codon changes and modulation of microRNA processing. Editing deregulation has been linked to CNS diseases as depression and epilepsy. Recently, global hypoediting has been found in tumor tissues indicating a correlation between editing and cancer. Until now, splicing and post translational modifications are proposed to modulate ADAR2 activity. To identify potential cellular modulators of ADAR 2 activity a yeast-editing assay was established. In this assay, an amber stop codon located in a stem loop in the 5’ region of the URA3 gene can be edited into a tryptophan codon by ADAR2. Conversion of the amber codon to a tryptophan codon thereby allows URA3 expression. However, addition of the drug 5-FOA selectively kills the cells expressing URA3. To identify cellular proteins that inhibit editing, a human cDNA library was transformed into the reporter strain. In the presence of 5-FOA only colonies that fail to express URA3, i.e colonies in which editing was inhibited could grow. A tissue culture reporter assay was established for secondary screening of the potential inhibitors in the mammalian system. Three RNA binding candidate proteins RPS-14 (small subunit ribosomal protein 14), SFRS-9 (splicing factor, arginine/serine rich 9), and DDX-15 (DEAH-box protein 15, pre-mRNA processing factor) were isolated from this screen as inhibitors of editing in mammalian cells. Further co-localization and co-immunoprecipitation studies are done in order to dissect the mode of interaction. RPS-14 and SFRS-9 were found to interact with ADAR2. RPS-14, SFRS-9, and DDX-15 show editing inhibition on endogenous substrates. DDX-15 entailed ADAR2 activity inhibition is conserved in Caenorhabditis elegans when compared to other RNA helicases. Our results indicate that RPS-14, SFRS-9 and DDX-15 are potential cellular inhibitors of ADAR2 mediated editing, proving the functionality of the candidates in mammalian cells.