Enzymatic Synthesis of Glycolipid Surfactants : Utilization of Sustainable Media and Substrates
Creators: name: Siebenhaller, Sascha
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2019

description: Tenside sind eine vielfältige Gruppe von amphiphilen Molekülen, die die Oberflächenspannung redu-zieren und als Waschmittel, Emulgator oder Netzmittel wirken können. Aufgrund dieser Eigenschaf-ten sind sie ein bedeutender Wirtschaftsfaktor und werden im Millionen Tonnen Maßstab produziert.
Tenside sind ein gutes Beispiel für das derzeitige Umdenken in unserer Wirtschaft. Früher wurden Tenside ausschließlich chemisch auf Rohölbasis produziert. Heute jedoch werden dazu häufig erneu-erbare Rohstoffe eingesetzt und umweltfreundliche enzymatische Syntheseverfahren zu ihrer Herstel-lung angewandt oder etabliert.
Diese Arbeit ist eingebettet in das BBW ForWerts Graduiertenprogramm des Landes Baden-Württemberg (Bioökonomie Baden-Württemberg: Exploring Innovative Value Chains). Deren Ziel ist die enzymatische Synthese neuartiger und nachhaltiger Tenside, vor allem von Glykolipiden aus er-neuerbaren Substrate in umweltfreundlichen Medien.
Glykolipide sind Tenside mit einem polaren Zuckermolekül als Kopfgruppe und einem hydrophoben Schwanz. Sie zeigen verschiedene nützliche Eigenschaften wie eine geringe Toxizität, sie sind gut biologisch abbaubar und weisen eine hohe Oberflächenaktivität auf, meist in Kombination mit einem niedrigen CMC-Wert. Sie können chemisch oder durch eine umweltfreundliche enzymatische Reak-tion hergestellt werden. Dazu wird ein nahezu wasserfreies Lösungsmittel benötigt, um das Reakti-onsgleichgewicht in Richtung Acylierung zu verschieben. Als Substrate kommen verschiedene Koh-lenhydrate in Frage, die in den benötigten wasserfreien unpolaren organischen Lösungsmitteln jedoch schwer löslich sind. Daher wurde in dieser Arbeit (Kapitel 2) ein umweltfreundliches, tiefes eutekti-sches Lösungsmittelsystem (DES) für die enzymatische Glykolipidsynthese etabliert. Durch Mischen und Erhitzen des Ammoniumsalzes Cholinchlorid und eines Zuckers im geeigneten Molverhältnis wurden mehrere DES gebildet. Das so gebildete DES wirkt simultan als umweltfreundliches Reakti-onsmedium und Substrat für eine lipasekatalysierte Synthese von Glykolipiden. Insgesamt wurden fünf Zucker, drei Zuckeralkohole und ein Anhydrozucker in Kombination mit bis zu neun Fettsäuren verwendet. Die erfolgreiche Bildung von Tensiden wurde durch Dünnschichtchromatographie, Mas-senspektrometrie und NMR-Analysen nachgewiesen. Zudem wurde erstmals ein DES aus einem Anhydrozucker hergestellt und darin eine erfolgreiche enzymatische Synthese durchgeführt.
In Kapitel 3 wurden die zeitabhängigen Produktbildung und Reaktionsausbeuten von Arabinoselaurat und –dilaurat bestimmt, welches als Referenzglycolipid dient. Zuerst wurde das am besten geeignete Verhältnis von Cholinchlorid und Arabinose und als zweites der optimale Wassergehalt bzw. die Wasseraktivität für die DES-Reaktionsmedien bestimmt, um die enzymatische Arabinoselauratsyn-these zu optimieren. Als dritter Parameter wurde die Synthesedauer untersucht. Um die zeitabhängige Bildung von Arabinoselaurat und -dilaurat zu bestimmen, wurden mehrere Reaktionen durchgeführt und mittels Hochleistungsdünnschichtchromatographie analysiert. Weiterhin wurden die kritische Micellbildungskonzentration sowie das Potenzial zur Reduzierung der Wasseroberflächenspannung mittels Arabinoselaurat bestimmt. Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von Wassermengen von bis zu ca. 8 % die Ausbeute von Arabinoselaurat nach 48 h verdoppeln kann (bis zu 49,6 %); Arabino-sedilaurat entsteht hingegen nur, wenn kein zusätzliches Wasser zugegeben wird. Bei höheren Was-serkonzentrationen nimmt die Ausbeute durch die Hydrolyse der Produkte leicht ab. Die meisten Produkte wurden innerhalb von 24 Stunden synthetisiert, längere Reaktionszeiten haben nur einen geringen Einfluss auf die Ausbeute. Darüber hinaus hatte das Verhältnis der DES-Komponenten ebenfalls nur einen geringen Einfluss auf die Ausbeute. Arabinoselaurat weist vielversprechende Eigenschaften auf. Es senkt die Oberflächenspannung von Wasser deutlich auf 23 mN/m senken, wobei der CMC-Wert mit 530 mg/L viel höher als bei anderen bekannten Glykolipiden liegt.
Kapitel 4 behandelt die Verwendung von Zucker aus Buchenholz als nachhaltige Quelle für den Zu-ckeranteil von Glykolipiden. Die entsprechenden Kohlenhydrate wurden durch einen säurekatalysier-ten Organosolv-Prozess gewonnen, bei dem Buchenholz in eine Faserfraktion umgewandelt wurde, die anschließend enzymatisch hydrolysiert wurde, um Monosaccharide zu erhalten. Nach der Reini-gung und Trocknung wurde diese stark Glukose- und Xylose haltige Fraktion verwendet, um damit ein DES herzustellen. Durch die Verwendung in diesem bereits etablierten Reaktionssystem dient der Zucker gleichzeitig als Lösungsmittel und Substrat für die lipasekatalysierte Reaktion. Schließlich wurde die erfolgreiche Synthese von Glykolipiden durch ESI-Q-ToF Massenspektrometrie und mul-tidimensionale NMR-Experimente bestätigt. Darüber hinaus wurde mittels LC-MS/MS eine Ausbeute von 4,8 % bestimmt.
Um Zuckerester vollständig auf Basis von nachhaltigen Rohstoffen herzustellen, ist eine geeignete Quelle für die Fettsäuren notwendig. Um die Verwendung von Pflanzenölen zu vermeiden, wurde in Kapitel 5 die ungereinigte Monosaccharidlösung aus Buchenholz als Kohlenstoffquelle für die Her-stellung von „Single Cell Oil“ (SCO) mit der Hefe Cryptococcus curvatus verwendet. Im Gegensatz zu Pflanzenölen können mikrobielle Lipide unabhängig von Jahreszeit, Klima und Standort produziert werden; sie benötigen keine Anbaufläche und eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen, z.B. Abfallströ-me aus der Lebensmittelindustrie, können für ihre Herstellung genutzt werden. Außerdem haben sie oft eine ähnliche Fettsäurezusammensetzung wie Pflanzenöle. Durch die Kombination des so herge-stellten SCO mit den Ergebnissen aus Kapitel 4 konnte enzymatisch ein Glykolipid-Gemisch herge-stellt werden, das vollständig auf nachhaltigen Ressourcen basiert. Diese Glykolipide wurden über Dünnschichtchromatographie, verschiedene Massenanalysemethoden und NMR identifiziert.
Neben Lignocellulose gibt es viele andere potenzielle natürliche Substrate für die Glykolipidproduk-tion. Alternativen könnten Honig oder Agavensirup sein, die zu mehr als 80 % aus verschiedenen Zuckern bestehen. Sie werden als Süßstoffe verwendet und sind Bestandteile von Kosmetika oder medizinischen Salben. Darüber hinaus haben beide einen geringen Wassergehalt, sind oft bei Raum-temperatur flüssig und ähneln somit einigen bekannten zuckerbasierten DES. Um ihre Eignung als Glykolipidsubstrat zu testen, wurde in Kapitel 6 wichtige Merkmale des verwendeten Honig- und Agavensirups bestimmt und mit anderen verglichen. Anschließend wurde eine enzymatische Umeste-rung von vier Fettsäurevinylestern in normalem Honig und Agavensirup durchgeführt. Ungeachtet des hohen Wassergehalts des Lösungsmittels wurde die erfolgreiche Glykolipidbildung durch Dünn-schichtchromatographie nachgewiesen und mit einem Zuckerester verglichen, die in einem herkömm-lichen DES synthetisiert wurde. Für einen eindeutigen Nachweis der synthetisierten Glykolipide wur-den deren Massen bestimmt und eine NMR-Analyse durchgeführt. Diese umweltfreundlich herge-stellten Zuckerester haben das Potenzial, in Kosmetika oder Arzneimitteln eingesetzt zu werden und ihre Wirksamkeit zu erhöhen.