title: Entwicklung und Validierung zweier kompetitiver ELISAs zur Detektion von potentiell allergener Lupine in Lebensmitteln
Creators: name: Ertl, Anna
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurden zwei indirekte kompetitive ELISAs (IgG-ELISA und IgY-ELISA) zur Detektion von Lupine in Lebensmitteln entwickelt, optimiert und validiert. Die Entwicklung der ELISAs umfasste das Optimieren der Schritte des Coatings, des Blockens und der Ermittlung der Konzentrationen und Inkubationszeiten sowohl des primären als auch des sekundären Antikörpers. Die Kriterien der Optimierung waren, einen möglichst hohen Signalunterschied zwischen höchster und niedrigster Antigen-Konzentration und einen hohen OD-Wert am Wendepunkt der Kalibrierfunktion zu erzielen. Das Antigen, welches für das Coating bzw. für die Erstellung der Standardreihe genutzt wurde, wurde aus Lupinenmehl der Spezies Lupinus albus extrahiert. Der IgG-ELISA wurde mit einem Antiserum, das durch Immunisierung eines Kaninchens gewonnen wurde, entwickelt. Zur Entwicklung des IgY-ELISAs wurden polyklonale Antikörper, die durch Immunisieren einer Henne gewonnen wurden, verwendet. Durch die Durchführung von Kreuzreaktivitätstests auf 31 verschiedene Lebensmittel konnte gezeigt werden, dass beide ELISAs eine geringe Kreuzreaktivität zur Pekannuss aufweisen. Mit beiden ELISAs können sowohl weiße, blaue als auch gelbe Lupine nachgewiesen werden. Zur Ermittlung des Einflusses von Lebensmittelmatrizes wurde der Lupineextrakt zur Erstellung der Kalibrierfunktion mit sechs lupinefreien Lebensmittelextrakten verdünnt (Brot, Nudeln, Grünkernlaibchen, Zwieback, Tofu und Vollkornkekse). Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensmittelextrakte 1:10 mit PBS verdünnt werden müssen, um Matrixeffekte zu reduzieren. Zur Bestimmung der Wiederfindung wurden gespikte Lebensmittel sowie Modelllebensmittel (Kekse, Nudel, Laibchen und Brot) analysiert. Mit Hilfe der Modelllebensmittel wurde die Wiederfindung in rohen und verarbeiteten Produkten verglichen. Es wurde festgestellt, dass sowohl die Lebensmittelmatrix als auch die Art der Verarbeitung einen Einfluss auf die Wiederfindung haben. Beispielsweise war die Wiederfindung von Lupinenmehl in der rohen Laibchenmasse und im Brothefeteig niedriger (zwischen 60 und 80%) als im Keks- und Nudelteig (zwischen 80 und 100%). Außerdem war die Wiederfindung von Lupine in den verarbeiteten Produkten (mit Ausnahme der Nudeln) geringer als in den rohen Produkten. Im Keksextrakt lag die Wiederfindung zwischen 30 und 70% und im Nudelextrakt zwischen 80 und 130%. In den Laibchen betrug die Wiederfindung in etwa 30% und im Brot zirka 10%.
description: The present diploma thesis deals with the development, optimisation and validation of two indirect competitive ELISAs for the detection of potentially allergenic lupine in food. Optimisation included the steps of coating, blocking as well as the incubation time and concentration of the first and second antibody. The aims were to achieve a big difference in the OD values between the highest and the lowest antigen concentration as well as a high OD value at the point of inflection of the calibration curve. The antigen, which was used for coating and for preparing the standard solutions, was extracted from lupine flour of the species Lupinus albus. The IgG-ELISA was developed with an antiserum from an immunized rabbit. The polyclonal antibodies used in the IgY-ELISA were isolated from the yolk of an egg of an immunized hen. Cross-reactivity tests of 31 different food samples indicated that both ELISAs show a low cross-reactivity to pecan. Both assays are applicable to detect white, blue and yellow lupine. To investigate the influence of matrix effects, standards used for establishing the calibration curve were prepared by diluting the lupine extract with six different kinds of blank food matrices (bread, pasta, vegetarian patties, wholemeal cookies, rusk and tofu). The results indicated that sample extracts have to be diluted 1:10 with PBS in order to reduce matrix effects. The recovery was determined in blank food samples spiked with lupine flour as well as in model foods (cookies, pasta, vegetarian patties and bread). The analysis of model foods made it possible to compare the recovery in raw and processed foods. The recovery of lupine flour was found to be in the range from 80 to 100% in almost all raw food samples. Only in complex matrices e.g. dough of bread and vegetarian patties the recovery was between 60-80%. Both the matrix and the kind of processing were found to show an influence on the recovery. Both ELISAs yielded, for example, lower recovery in processed food than in raw food, with the exception of pasta. In cookies the recovery for lupine ranged from 30 to 70% and in pasta from 80 to 130%. In the vegetarian patties about 30% and in bread only 10% of lupine could be found.