title: Development of MS-based analytical tools to support discovery of metabolic biomarkers in breast cancer cell culture
Creators: name: Schmidt, Pia
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Metabolimik gehört im Gegensatz zu seinen Verwandten Genomik, Transktiptomik und Proteomik zu den Newcomern der Omics-Technologien, die versuchen genetische Prozesse mit externen Faktoren zu korrelieren, um den Phänotyp einer Zelle zu erforschen. Nicht alle Gene werden in aktive Produkte übersetzt, aber interne und externe Veränderungen haben einen sofortigen Einfluss auf die Metabolitkonzentrationen einer Zelle und repräsentieren eine wertvolle Momentaufnahme des gesunden oder pathogenen Phänotyps. Das ultimative Kennzeichen von Krebs ist eine Neuverkabelung des Stoffwechsels, um dessen Proliferation voranzutreiben. Mehr und mehr Beweise führen zu der Annahme, dass die Betrachtung von Krebs als rein genetische Erkrankung zu sehr vereinfacht ist. Die Annäherung von Krebsentstehung in Zusammenhang mit des veränderten Stoffwechselmusters, ermöglicht ein tieferes Verständnis des Krankheitsbeginns und -fortschritts und kann zu neuen therapeutischen Angriffspunkten und Entdeckung krebsspezifischer Biomarker führen. Da das Metabolom ein komplexes Gemisch von Stoffklassen mit sehr unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften ist, besteht die größte Herausforderung darin, eine Methode zu implementieren, die ein breites Spektrum abdecken kann. Die Kombination von Flüssigkeitschromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht eine hoch empfindliche Messung eins breiten Spektrums an Stoffwechselprodukten, welche in Krebsspezifische pathologische Prozessen involviert sind. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung einer Methode, die eine breite Detektion von Metaboliten im Zuge eines “untargeted metabolomic” Ansatzes ermöglicht. Unter Verwendung von ultra-hochleistungs Flüssigkeitschromatographie (UHPLC) und hochauflösendem Q-ExactiveTM Massenspektrometer (Thermo Scientific) konnte gezeigt werden, dass LC-MS ein vielversprechender Weg ist mit der Aufdeckung krebsspezifischer Metabolitmuster und deren Korrelation mit den aktivierten Stoffwechselwegen, die Biomarker Forschung voranzutreiben. Zunächst wurden die optimalen Bedingungen bezüglich Probenvorbereitung, Säulenwahl des LC- Systems, sowie MS- Bedingungen durch Analyse von Zellkulturmediums bewertet. Der Schwerpunkt lag auf der Erfassung der maximalen 5 Identifikationen sowie der besten Peakformen und -trennungen im Chromatogramm. Die Ergebnisse zeigen, dass mit der Vorbereitung der Probe mit Methanol (MeOH), Gefriertrocknung und Re-Suspendierung in Wasser und der Verwendung von zwei Säulentypen, C18 sowie der Amidsäule, um polare und apolare Metabolite abzudecken, die höchste Anzahl von Identifikationen erreicht wird. Unter Verwendung der optimalen Einstellungen wurden relevante Proben von Brustkrebszellen, die zu verschiedenen Subtypen gehören, analysiert. Abgesehen von der allgemein anerkannten Verlagerung von aerober zu anaerober Glykosylierung zeigen die am Lipidstoffwechsel beteiligten Stoffwechselwege Veränderungen, um die Kanzerogenese voranzutreiben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die LC-MS-Metabolomik als ein wirksames Instrument zur Beobachtung von Unterschieden in den Stoffwechselsignaturen erweist, die durch den pathologischen Zustand der Zelle ausgelöst werden. Das tiefere Verständnis von molekularen Pfaden, die an der der Krankheitsprogression beteiligt sind, kann die Entwicklung neuer Biomarker, Diagnoseansätze oder therapeutische Angriffspunkte fördern.
description: Metabolomics, in contrast to its relative’s genomics, transcriptomics and proteomics, is one of the newcomers of omics technologies trying to target the connection between genetic processes and external factors directly linked to a cell’s phenotype. Not all genes are translated into active products, but metabolite concentrations are instantaneously influenced by intra- and extracellular alterations allowing a valuable snapshot of the healthy or pathogenic phenotype. The ultimate hallmark of cancer is a rewiring in metabolism to foster proliferation. More and more evidence lead to the assumption that considering cancer solely as genetic disease is an oversimplification but approaching cancer in the context of its altered metabolic pattern allows a deeper understanding of the disease onset and progress and may help finding new therapeutic targets and biomarkers. Since the metabolome is a complex mixture of compounds with very diverse physicochemical properties, the biggest challenge is to implement a method that covers a high number of different metabolites. The combination of liquid chromatography and high-resolution mass spectrometry (LC-MS) enables a highly sensitive measurement of a broad spectrum of metabolites involved in cancer-specific pathological processes. In this thesis, the aim was to establish a method that allows to detect a broad number of metabolites in an untargeted approach, using ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) separation coupled to a high-resolution mass spectrometer, the Q-ExactiveTM hybrid quadrupole OrbitrapTM (Thermo Scientific). This method demonstrates that LC-MS metabolomics can be applied in revealing cancer specific metabolite patterns by identifying pathways and metabolite classes and further use this information in biomarker discovery. In this work, first the best conditions regarding sample preparation, choice of column and MS conditions were evaluated by profiling cell culture media. The focus was to acquire the maximum identifications as well as the best peak shapes and separations in the chromatogram. When precipitating the sample with methanol (MeOH), lyophilizating and resuspending it in water and using two types of columns, C18 and amide, to cover polar and apolar metabolites, the highest amount of identifications could be detected. Using the optimal settings, relevant samples of breast cancer cells 3 belonging to different subtypes were analysed Apart from the well-recognized shift from aerobic to anaerobic glycosylation, metabolic pathways involved in lipid metabolism show alterations in order to support carcinogenesis. In conclusion, LC- MS metabolomics turns out to be a potent tool to observe differences in metabolic signatures triggered by the cell’s pathological state. Developing new biomarkers, diagnostic approaches or treatment targets grounding on a deeper understanding of molecular pathways involved in disease progression, can be achieved.