title: A chemical genetics approach to Polo-like kinase inhibition in Trypanosoma brucei
Creators: name: Lozano Núñez, Ana
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Polo-ähnliche Kinasen sind wichtige regulatorische Enzyme des eukaryotischen Zellzyklus. Der Erreger der Afrikanischen Trypanosomiasis, Trypanosoma brucei, besitzt nur eine einzige Polo-ähnliche-Kinase, genannt TbPLK. TbPLK ist notwendig für den Aufbau einer Reihe von Zytoskelettstrukturen, die mit dem Flagellum assoziiert sind. Das Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der molekularen Mechanismen durch die TbPLK die Biogenese dieser Strukturen reguliert. Bisherige Studien basierten auf der Nutzung von RNA-Interferenz oder Inhibitoren mit unbestimmter Spezifität. Im Gegensatz dazu haben wir eine analog-sensitive Strategie verwendet, die die selektive und akute Inaktivierung von Kinasen ermöglichte. Dazu wurde eine funktionell stille Mutation in das katalytische Zentrum der Kinase eingebaut. Ein abgeänderter Kinase-Inhibitor kann dann das katalytisches Zentrum der modifizierten Kinase besetzen und deren Aktivität hemmen. Alle endogenen Kinasen der Zelle werden von diesem modifizierten Inhibitor nicht beeinträchtigt. Die generierte analog-sensitive TbPLK wird in vitro und in vivo jedoch von diesem modifizierten Kinase-Inhibitor gehemmt. Normalerweise folgt TbPLK während des Zellzyklus einem charakteristischen Migrationsmuster. Nach der Inhibition verbleibt die analog-sensitive TbPLK aber im posterioren Ende der Zelle. In synchronisierten Zellkulturen konnten wir zeigen, dass TbPLK für die Biogenese des Bilobes, einem Organell, das mit dem Flagellum assoziiert ist, und für den Aufbau und die Verlängerung der Flagellum-Attachment-Zone (FAZ), welche das Flagellum mit der Zelloberfläche verbindet, direkt erforderlich ist. Außerdem konnten wir demonstrieren, dass die TbPLK Aktivität für die Rotation der duplizierten Basalkörper benötigt wird. Aufgrund all dieser beschriebenen Defekte kann die Zytokinese nicht beendet werden. Durch die Nutzung mehrerer quantitativer Proteomics-Methoden von jetzt an besteht die Möglichkeit,neue TbPLK-Substrate identifizieren zu können.
description: Polo-like kinases are known to regulate different cell cycle stages in eukaryotes. In the protist parasite Trypanosoma brucei, the organism causing African trypanosomiasis, the single PLK homolog TbPLK is necessary for the assembly of a series of cytoskeletal structures associated with the flagellum. Since the molecular mechanisms that regulate the biogenesis of these structures are partially understood, this work set out to further investigate the different TbPLK functions. Previous studies have relied on RNA interference or inhibitors of undefined specificity, but here we used an analog sensitive approach to selectively and acutely inhibit TbPLK. This strategy consists of introducing a functionally silent mutation in the enzyme's catalytic pocket that makes it sensitive to an enlarged inhibitor, while all other non-engineered kinases remain unaffected. Although TbPLK is a highly motile kinase, inactive TbPLK cannot migrate effectively and remains trapped in the posterior of the cell throughout the cell cycle. Using synchronized cells, we showed the direct requirement of TbPLK activity for the replication of the bilobe, an organelle of still unclear function, and for the assembly and subsequent extension of the flagellum attachment zone, which maintains the flagellum adhered to the cell surface. TbPLK is also necessary for the rotation of the duplicated basal bodies, an event which positions the new flagellum so that it can extend without colliding with the old flagellum. As a consequence of all these unsuccessful events, cells develop defects in flagellar attachment and cannot complete cytokinesis. The next step involves the application of quantitative proteomics methods aimed at identifying novel TbPLK substrates.