Ιικοί φορείς για τη γονιδιακή θεραπεία της αταξίας του Φρίντριχ
Creators: name: Πιπερίδου, Χαρούλα Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Αταξία του Φρίντριχ
Γονιδιακή θεραπεία
Ιικοί φορείς
Friedreich’s ataxia
Gene therapy
Viral vectors

description: H αταξία του Φρίντριχ (Friedreich’s Ataxia - FRDA) είναι μονογονιδιακή νόσος που συγκαταλέγεται στις νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει θεραπεία ίασης της νόσου, ενώ οι υπάρχουσες θεραπείες επικεντρώνονται στην ανακούφιση των επιμέρους συμπτωμάτων. Η αταξία του Φρίντριχ οφείλεται σε μετάλλαξη του γονιδίου της φραταξίνης που εμποδίζει τη μεταγραφή της, υποδεικνύοντας την γονιδιακή θεραπεία ως μια υποσχόμενη λύση. Η γονιδιακή θεραπεία (ΓΘ) μονογονιδιακών ασθενειών έχει αναπτυχθεί αρκετά τα τελευταία χρόνια και συχνά χρησιμοποιείται για τη θεραπεία αιμοσφαιρινοπαθειών και αιμορροφιλίας. Πρόσφατες μελέτες ΓΘ της αταξίας του Φρίντριχ μέσω γονιδιακής προσθήκης οδήγησαν σε υπερέκφραση της φραταξίνης και κυτταροτοξικότητα των στοχευμένων ιστών, υπογραμμίζοντας την ύπαρξη ιστοειδικών θεραπευτικών ορίων έκφρασης της πρωτεΐνης. Παράλληλα, η χρήση αδενοσυσχετιζόμενων ιικών φορέων, που εμφανίζουν περιορισμένο τροπισμό και χαμηλή αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης, εφιστούν την προσοχή μας για την επιλογή του κατάλληλου φορέα και το σχεδιασμό της βέλτιστης κασέτας για την γονιδιακή προσθήκη της φραταξίνης. Τα αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα χρησιμοποιούνται επιπλέον για την θεραπεία των νευροεκφυλιστικών ασθενειών μέσω του φαινομένου της διασταυρούμενης επιδιόρθωσης. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν τις προσεγγίσεις της γονιδιακής θεραπείας που σε συνδυασμό με την πολύπλευρη δράση των HSCs δύνανται να πετύχουν τα επιθυμητά αποτελέσματα. Αρχικά o ιικός φορέας που επιλέξαμε για την γονιδιακή θεραπεία της FRDA είναι ο χιμαιρικός αδενο-ιικός φορέας HDAd 5/35++, ο οποίος εμφανίζει υψηλή συγγένεια με τον CD46 υποδοχέα που εκφράζεται σε όλους τους ιστούς και σε υψηλότερα ποσοστά στα αρχέγονα αιμοποιητικά CD34+ κύτταρα. Προχωρήσαμε με τον σχεδιασμό της κασέτας του φορέα, που περιλαμβάνει το γονίδιο της φραταξίνης απουσία ιντρονίων, η έκφραση του οποίου ελέγχεται από έναν μικρού μεγέθους υποκινητή της β σφαιρίνης μαζί με τον longLCR, ένα τμήμα της μεγάλης περιοχής ελέγχου (Long Control Region, LCR) της β σφαιρίνης που έχει δράση ενισχυτή μήκους 21 kb. Με την χρήση ερυθροειδικών ρυθμιστικών στοιχείων στοχεύεται η υψηλή έκφραση του διαγονιδίου από τα HSCs και η χαμηλή αλλά σταθερή έκφραση από τους περιφερικούς ιστούς. Ο HDAd 5/35++ φορέας φραταξίνης χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόλυνση δύο κυτταρικών σειρών αίματος, των Κ562 και HUDEP-2 κυττάρων αλλά δεν κατάφερε να διαμολύνει ικανοποιητικά τα κύτταρα και να αυξήσει τα επίπεδα της φραταξίνης. Για το λόγο αυτό προχωρήσαμε με την ανεύρεση εναλλακτικών διαγονιδίων και πιο συγκεκριμένα ενισχυτών για την έκφραση της φραταξίνης. Επιλέξαμε τρεις ερυθροειδικούς ενισχυτές, τους μικρού μεγέθους PPARa και PVT1 που ταυτοποιήθηκαν πρόσφατα για την επανενεργοποίηση της γ σφαιρίνης από τους Psatha et al., και τον micro-LCR ενισχυτή (uLCR), που έχει μικρότερο μέγεθος από τον longLCR. Αρχικά, πραγματοποιήσαμε κλωνοποίηση της φραταξίνης στους πλασμιδιακούς φορείς με τα επιλεγμένα ρυθμιστικά στοιχεία για την δημιουργία της κασέτας φραταξίνης. Για άμεσο έλεγχο των νέων διαγονιδίων, παράχθηκαν λεντιικοί φορείς φραταξίνης για την διαμόλυνση K562 κυττάρων, αλλά και CD34+ κυττάρων τα οποία στη συνέχεια υποβάλλαμε σε ex vivo ερυθροειδική διαφοροποίηση. Με τα πειράματα αυτά διαπιστώσαμε την σημαντική αύξηση των επιπέδων φραταξίνης απουσία επίδρασης στην ωρίμανση, τον πολλαπλασιασμό, το οξειδωτικό στρες αλλά και την ερυθροποίηση των CD34+ κυττάρων. Συνολικά, η επιλογή των εναλλακτικών ενισχυτών, αποδείχθηκε επιτυχής για την ανάπτυξη προσέγγισης γονιδιακής θεραπείας για την αταξία του Φρίντριχ χωρίς να ξεπερνάει πιθανά θεραπευτικά όρια έκφρασης σε κύτταρα αίματος.
description: Friedreich’s ataxia is a monogenic disease which belongs to neurodegenerative diseases. To date, there is no cure, while existing treatments focus on relieving the symptoms caused by ataxia. Friedrich's ataxia is caused by a mutation in the frataxin gene that blocks its transcription, suggesting gene therapy as a promising solution. Gene therapy (GT) for monogenic diseases has developed considerably in recent years and is often used for the treatment of hemoglobinopathies and hemophilia. Recent studies about the application of gene therapy for Friedrich's ataxia by gene addition leading to overexpression of frataxin and cytotoxicity of targeted tissues, highlighting the existence of tissue-specific therapeutic limits of protein expression. Furthermore, the use of adeno-associated viral vectors, which exhibit limited tropism and low transduction efficiency, draws our attention to the selection of the appropriate vector and the design of the optimal cassette for gene addition of frataxin. Hematopoietic stem cells are also used for treatment of neurodegenerative diseases based on the cross correction phenomenon. These data support gene therapy approaches which in combination with the multifaceted function of HSCs, may achieve the desired results. First of all, the viral vector we selected for the gene therapy of FRDA is the Helper Dependent chimeric adenoviral vector HDAd 5/35++, which shows high affinity to the CD46 receptor expressed in all tissues and at higher rates in hematopoietic CD34+ stem cells. We continued with the design of the vector cassette that includes the frataxin gene in absence of introns and which expression is controlled by a small β-globin promoter together with longLCR, a part of the β-globin long control region (LCR) that has enhancer activity and is 21 kb in length. Using erythroid regulatory elements aims high expression of the transgene from HSCs and low but stable expression from peripheral tissues. The HDAd 5/35++ frataxin vector was used for transduction of two blood cell lines, K562 and HUDEP-2 cells, but failed to successfully transduct the cells and increase frataxin levels. We therefore proceeded with searching alternative transgenes and more specifically enhancers for frataxin expression. We chose three erythroid enhancers, the small-sized PPARa and PVT1 recently identified for the reactivation of γ globin by Psatha et al., and the micro-LCR enhancer (uLCR), which is smaller in size than longLCR. First of all, we accomplished the cloning of frataxin into the plasmid vectors with the selected regulatory elements to generate the frataxin cassette. For direct check of the new transgenes, lentiviral frataxin vectors were produced for the transduction of K562 cells as well as CD34+ cells, which we then subjected to ex vivo erythroid differentiation. With these experiments we found significant increase of frataxin levels in the absence of any effect on cell maturation, proliferation, oxidative stress and erythropoiesis of CD34+ cells. Overall, the choice of alternative enchancers was successful in developing a gene therapy approach for Friedreich's ataxia without exceeding potential therapeutic expression thresholds in blood cells.