Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου της φραταξίνης (FXN) στην καρδιακή διαφοροποίηση επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων ανθρώπου
Creators: name: Δαμδούμης, Σάββας Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Φραταξίνη
Επαγόμενα βλαστοκύτταρα
Καρδιομυοκύτταρα
Frataxin (FXN)
Induced pluripotent stem cells (IPSCs)
Cardiomyocytes (CM)

description: Η αταξία Friedreich είναι μία από τις συχνότερες νωτιοπαρεγκεφαλιδικές αταξίες. Η νόσος προκαλείται από μια μεγάλη αύξηση τρινουκλεοτιδικών επαναλήψεων GAA του γονιδίου της φραταξίνης (FXN) στον μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 9. Οι ασθενείς εμφανίζουν εκφύλιση στις οπίσθιες δέσμες, στα πυραμιδικά δεμάτια και στα νωτιοπαρεγκεφαλιδικά δεμάτια του νωτιαίου μυελού. Η κλινική εικόνα της νόσου ξεκινάει κατά την παιδική ηλικία με αταξία κυρίως στην βάδιση, μειωμένα τενόντια αντανακλαστικά, ατροφία και αδυναμία στα περιφερικά τμήματα των άκρων. Υπερτροφική καρδιομυοπάθεια, σκολίωση και κοιλοποδία εμφανίζονται στο 90% των περιπτώσεων και οι ασθενείς καταλήγουν συνήθως έπειτα από καρδιοπνευμονικές επιπλοκές. Μέχρι σήμερα δεν υπάρχει οριστική θεραπεία της νόσου η οποία αφορά την αντιμετώπιση των συμπτωμάτων και έχει παρηγορητικό χαρακτήρα. Ωστόσο νέες μέθοδοι που στοχεύουν στην γενετική τροποποίηση του γονιδίου της φραταξίνης βρίσκονται σε εξέλιξη με ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Τα επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (iPSCs) χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα για την καταπολέμηση της FRDA, καθώς επιτρέπουν την πρόσβαση σε άμεσα επηρεαζόμενους ιστούς της νόσου, οι οποίοι έχουν δύσκολη πρόσβαση (νευρικά κύτταρα, καρδιομυοκύτταρα και παγκρεατικά κύτταρα). Μέσω της διέγερσης και της καταστολής του μονοπατιού Wnt σε διάφορα στάδια της διαφοροποίησης καθώς και της χρήσης κατάλληλου θρεπτικού μέσου μπορούμε να καθοδηγήσουμε τα βλαστικά κύτταρα σε καρδιακό μεσόδερμα και τελικά στον σχηματισμό καρδιομυοκυττάρων με συσταλτική δραστηριότητα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μέσω της χρήσης τεχνικών γονιδιακής τροποποίησης με την βοήθεια του συστήματος CRISPR/CAS9 κατασκευάστηκαν κυτταρικές τράπεζες καρδιομυοκυττάρων με υπερέκφραση και υποέκφραση του γονιδίου της φραταξίνης για την μελέτη της ασθένειας in vitro και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης του γονιδίου της φραταξίνης στα διάφορα στάδια της καρδιακής διαφοροποίησης επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων ανθρώπου. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων πιστοποίησαν την επιτυχής ένθεση των αλληλουχιών αποσιώπησης και υπερέκφρασης του γονιδίου της φραταξίνης σε επαγόμενα ανθρώπινα βλαστοκύτταρα. Επίσης, η ανοσοαποτύπωση κατά Western ανέδειξε διαφορές στην πρωτεϊνική έκφραση της φραταξίνης στα διάφορα στάδια διαφοροποίησης των επαγόμενων βλαστοκυττάρων προς καρδιομυοκύτταρα. Η έκφραση της φραταξίνης εμφάνισε μια αύξηση την ημέρα 7 της διαφοροποίησης όπου τα κύτταρα είναι πλέον καρδιακοί προγεννήτορες και παρέμεινε αυξημένη την ημέρα 10 της διαφοροποίησης όπου τα κύτταρα είχαν διαφοροποιηθεί πλήρως σε καρδιακά κύτταρα με περισταλτισμό, γεγονός που καταδεικνύει την σημασία της φραταξίνης στην ανάπτυξη της καρδιάς.
description: Friedreich's ataxia is one of the most common spinocerebellar disorders. The disease is caused by multiple GAA trinucleotide repeats of the frataxin gene (FXN) located on the long arm of chromosome 9. Patients show degeneration of the posterior bundles, pyramidal bundles, and spinocerebellar bundles of the spinal cord. The clinical signs of the disease begin during childhood including ataxia mainly in walking, reduced tendon reflexes, atrophy and weakness in the peripheral parts of the limbs. Hypertrophic cardiomyopathy, scoliosis, and clubfoot occur in 90% of cases, and patients die mainly because of cardiopulmonary complications. To date, there is no treatment for the disease. However, new methods such as gene editing of frataxin gene are underway with encouraging results. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are widely used in FRDA research, as they allow access to directly affected tissues of the disease, such as neural cells, cardiomyocytes, and pancreatic cells. The stimulation and suppression of the Wnt pathway at specific developmental stages as well as the use of a suitable medium, guides the differentiation of stem cells into cardiac mesoderm and ultimately to the formation of cardiomyocytes with contractile activity. In this thesis, we tested the use of CRISPR/Cas9 using gene editing techniques with the help of CRISPR/CAS9 system, cardiomyocyte cell banks with knock in and knock out of the frataxin gene were constructed. Also, we studied the expression pattern of the frataxin gene at various stages of cardiac differentiation. The results of the experiments showed successful creation of iPSCs-induced cardiomyocytes with silencing and overexpression sequences of the frataxin gene. Also, Western immunoblotting revealed differences in the protein expression of frataxin at different stages of cardiac differentiation. Frataxin expression showed an increase at day 7 of differentiation where the cells were cardiac progenitors and remained elevated at day 10 of differentiation where the cells had fully differentiated into cardiomyocyte, highlighting the importance of frataxin in heart development.