title: LIMP-2 as a Tool for Stabilizing and Modulating Beta-Glucocerebrosidase in Lysosomal Pathologies
title: LIMP-2 als Werkzeug zur Stabilisierung und Modulation der Lysosomalen Beta-Glucocerebrosidase
Creators: name: Dobert, Jan
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften::50 Naturwissenschaften::500 Naturwissenschaften und Mathematik

description: Lysosomes are acidic organelles present in every eukaryotic cell. They are the central hub for degradative processes, mediating metabolic signaling, clearance of waste and recycling of cellular material or organelles. All this is achieved by a tightly woven protein network made up of lysosomal membrane proteins and lysosomal hydrolases that work in tandem to maintain lysosomal function. Dysfunction of this crucial network can lead to an insufficient clearance and thus accumulation of substrates, which can be detrimental to the host cell and manifest in lysosomal storage disorders. However, the role of lysosomal dysfunction in disease seems to be more nuanced that this, as slight disbalances in lysosomal processes can already contribute to the progression or manifestation of other, more complexly related diseases. In recent years, the lysosome has emerged as a key player in neurodegenerative diseases. Here, pathology is often caused by protein aggregates that accumulate slowly over time, causing cell death and leading to progressive loss of neurons. One of the most prominent proteins identified at the interface of lysosomal and neurodegenerative diseases is β-glucocerebrosidase (GCase), a lysosomal hydrolase. Originally identified as the enzyme defective in Gaucher disease (GD), the most common lysosomal storage disorder, recent research has additionally identified GCase dysfunction as a main mechanism in the pathology of Parkinson disease (PD). Mutations in the GBA1 gene coding for GCase are the largest known genetic risk factor for PD. With no disease-modifying treatment approach available for PD at the time of writing, research is desperate for new molecular targets, and GCase activation has become a promising goal for new clinical studies. Understanding the interactions of GCase with its substrate and interaction partners is crucial for the design of new, GCase-targeting treatments. One of these interaction partners is LIMP-2, a lysosomal membrane protein that functions as a proprietary transporter for GCase. This transporting mechanism is peculiar because it is independent from the conventional mannose-6-phosphate-receptor pathway used by most other lysosomal enzymes. Therefore, interaction with LIMP-2 is indispensable for GCase function. Additionally, recent studies have suggested that LIMP-2 may be more than a transporter and also functions as regulator of GCase activity, which could be confirmed in this study. Understanding the interplay of the two proteins in both health and disease could provide a valuable understanding of disease mechanisms and may reveal new treatment avenues. In this thesis, purification of native, untagged GCase stabilized by an engineered LIMP-2 construct was established. Using cryo electron microscopy, the protein structure of the LIMP-2/GCase complex was determined, allowing extensive molecular interpretation of the interaction interface and crucial amino acids that mediate binding. Further, the effect of LIMP-2 on GCase and disease-associated GCase variants was investigated, confirming that LIMP-2 can activate GCase and even rescue the PD-associated E326K variant. Based on these findings, a LIMP-2-derived peptide was designed that boosted GCase activity both in vitro and in lysosomes of primary fibroblasts obtained from PD-patients. This study cements LIMP-2 as a key interaction partner of GCase function and unveils it as powerful tool for stabilization, purification and activity modulation, thereby advancing the search for novel PD or GD treatments targeting GCase and lysosomal dysfunction.
description: Lysosomen sind Organellen mit saurem pH-Wert, die in jeder eukaryotischen Zelle zu finden sind. Sie sind das Zentrum für Degradation, Stoffwechsel und Recycling von zellulärem Material. Ein engmaschiges Netzwerk aus lysosomalen Membranproteinen und Hydrolasen arbeiten zusammen, um das Lysosom am Laufen zu halten. Bei einer Fehlfunktion dieses Netzwerks kann es zu unvollständigem Abbau und zur Ablagerung von lysosomalem Material kommen, welches lysosomalen Speichererkrankungen verursachen kann. Die genaue Rolle lysosomaler Dysfunktion in Krankheit ist jedoch komplexer, denn sogar kleine Dysbalancen im Lysosom können bereits zur Entstehung oder dem Fortschreiten von Krankheiten führen, deren Zusammenhänge mit dem Lysosom weniger eindeutig sind. In den letzten Jahren wurden viele neurodegenerative Erkrankungen sowohl klinisch, als auch genetisch mit einer lysosomalen Fehlfunktion in Verbindung gebracht. Hier kommt es oft zu einer Ablagerung von Proteinaggregaten über lange Zeit, welche nach und nach zum Verlust von Neuronen im Gehirn führt. Eines der wichtigsten Proteine an der Schnittstelle zwischen lysosomalen und neurodegenerativen Erkrankungen ist die β-Glucocerebrosidase (GCase), ein lysosomales Enzym. Eine Fehlfunktion der GCase wurde ursprünglich als Auslöser der häufigsten lysosomalen Speichererkrankung, dem Gaucher-Syndrom (GD, für „Gaucher disease“) identifiziert. Neue Studien fanden jedoch heraus, dass die GCase auch ein zentraler Knotenpunkt in der neurodegenerativen Parkinson Erkrankung (PD, für „Parkinson disease“) ist. Mutationen im zugehörigen GBA1-Gen erhöhen das Risiko, an Parkinson zu erkranken, signifikant. Da es bis heute kein Medikament für PD gibt, welches den Krankheitsverlauf beeinflusst, suchen Forscher dringend nach neuen molekularen Zielen für Medikamente. Eine Aktivierung der GCase und Rettung der lysosomalen Funktion ist hierbei ein vielversprechender neuer Ansatz, weshalb die Erforschung der GCase und ihrer Interaktionspartner ein wichtiger Teil der aktuellen Parkinson-Forschung ist. Ein essentieller Interaktionspartner der GCase ist das lysosomale Membranprotein LIMP-2, welches als Transporter der GCase fungiert. Neue Studien konnten außerdem eine regulatorische Funktion von LIMP-2 auf GCase zeigen, welche in dieser Arbeit bestätigt werden konnte. Daher spielt diese Interaktion sowohl in gesundem, als auch in pathologischem Kontext eine große Rolle und könnte ein potentielles Ziel für neue Therapieansätze sein könnte. In dieser Arbeit wurde ein Aufreinigungsprotokoll für native GCase im Komplex mit einem stabilisierenden LIMP-2-Konstrukt etabliert. Über Kryo-Elektronenmikroskopie konnte dadurch die Proteinstruktur dieses wichtigen Transportkomplexes aufgelöst werden, um die Interaktion beider Proteine auf Aminosäure-Basis zu analysieren. Des Weiteren wurde der regulatorische Effekt von LIMP-2 auf GCase und genetische Varianten der GCase untersucht und es konnte gezeigt werden, dass LIMP-2 den Wildtyp und die PD-assoziierte E326K-Variante der GCase in vitro und in humanen Zellen aktivieren kann. Diese Aktivation wurde sogar mit einem kleinen, in dieser Arbeit konzipierten Peptid erreicht, welches die Bindung von LIMP-2 imitiert. Diese Thesis manifestiert LIMP-2 als essentiellen Interaktionspartner der GCase und zeigt, dass LIMP-2 als Werkzeug verwendet werden kann, um GCase aufzureinigen, zu stabilisieren und zu modulieren. Diese Ergebnisse unterstützen die Suche nach neuen Therapiestrategien zur Wiederherstellung der GCase-Aktivität und der lysosomalen Funktion in PD und GD.