Νέες προσεγγίσεις για την γονιδιακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας
Creators: name: Πασχούδη, Κυριακή Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: β-θαλασσαιμία
Γενετική επιδιόρθωση
Γονιδιακή θεραπεία
beta-thalassemia
Genome editing
Gene therapy

description: Η ανάπτυξη της γονιδιακής θεραπείας για την β-Θαλασσαιμία αποτελεί μία καινοτόμο και πολλά υποσχόμενη προσέγγιση με στόχο την πλήρη ίαση της νόσου. Τα τελευταία χρόνια οι κλινικές μελέτες ex vivo γονιδιακής θεραπείας για την β-θαλασσαιμία στηρίζονται στην μεταφορά του θεραπευτικού γονιδίου της β- ή της γ- σφαιρίνης με την χρήση ενσωματούμενων αυτό-αδρανοποιούμενων λεντιικών φορέων. Πρόσφατα, η ανάπτυξη σχεδιασμένων νουκλεασών (custom designed nucleases) όπως οι CRISPR/Cas9 ενδονουκλεάσες, που επιτρέπουν στοχευμένη γονιδιωματική επεξεργασία σε προεπιλεγμένη θέση στο γονιδίωμα και θεωρητικά καλύτερο προφίλ ασφάλειας. Έχει βρεθεί πως η συνύπαρξη της Κληρονομική Παραμονή της Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης (Hereditary Persistence of Human Hemoglobin–HPHF) σε ασθενείς με β-αιμοσφαιρινοπάθειες αμβλύνει τα κλινικά συμπτώματα και μπορεί να καταργήσει την ανάγκη μεταγγίσεων. Παράλληλα, η ανακάλυψη μεταλλάξεων που συνδέονται άμεσα με την εμφάνιση της HPFH κατέστησε δυνατή την στοχευμένη τροποποίηση γενετικών τόπων, με στόχο την επανενεργοποίηση της ενδογενούς γ-σφαιρίνης. Προκειμένου να προσομοιώσουμε αυτή την κατάσταση, χρησιμοποιήσαμε την CRISPR/Cas9 ενδονουκλεάση, με σκοπό την αδρανοποίηση του ερυθροειδικού ενισχυτή του καταστολέα της γ-σφαιρίνης-BCL11A με ταυτόχρονη κατάργηση της θέσης πρόσδεσής του στους υποκινητές των γονιδίων HBG1 και ΗBG2 (Ad-dCRISPR). Για την μεταφορά του συστήματος CRISPR-Cas9 χρησιμοποιήθηκε ένας μη-ενσωματούμενος αδενοιϊκός φορέας (HDAd5/35++) που παρουσιάζει μεγάλη συγγένεια με τον υποδοχέα hCD46, ο οποίος εκφράζεται σε υψηλά ποσοστά στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+).Αρχικά θελήσαμε να ελέγξουμε την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα του φορέα σε CD34+ στελεχιαία αιμοποιητικά κύτταρα από ασθενείς με β-θαλασσαιμία, που είχαν λάβει μέρος σε προηγούμενη κλινική μελέτη κινητοποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων της Μονάδας Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας. Μετά τη διαμόλυνση με τον Ad-dCRISPR ιικό φορέα τα CD34+κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ερυθροειδικής διαφοροποίησης. Για να διαπιστωθεί η επίδραση της γονιδιακής επεξεργασίας στην ωρίμανση και την διαφοροποίηση των HSCs, έγινε έλεγχος του ανοσοφαινοτύπου των κυττάρων, μετά το τέλος της ερυθροειδικής καλλιέργειας διαφοροποίησης. Η ex vivo διαμόλυνση των CD34+κυττάρων με τον Ad-dCRISPR ιικό φορέα, δεν επηρέασε την πορεία ωρίμανσης και διαφοροποίησής τους και οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης της ενδογενούς γ-σφαιρίνης. Αυτό μεταφράστηκε σε βελτιωμένη ερυθροποίηση in vitro των γενετικά τροποποιημένων κυττάρων. Βασιζόμενοι στα παραπάνω δεδομένα προχωρήσαμε στην ανάπτυξη ενός in vivo πρωτοκόλλου γονιδιακής θεραπείας. Για τον σκοπό αυτό δημιουργήσαμε ένα ζωικό μοντέλο ανθρώπινης αιμοποίησης, μετά από μεταμόσχευση CD34+ κυττάρων σε NSBGW λήπτες. Ακολούθησε κινητοποίηση των στελεχιαίων αιμοποιητικών κυττάρων από τον μυελό των οστών στο περιφερικό αίμα και χορήγηση του ιικού φορέα. Ακολούθησε θυσία των ζώων και προσδιορισμός του ποσοστού εμφύτευσης των κυττάρων καθώς και έλεγχος τη έκφρασης γ-σφαιρίνης στα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα. Παράλληλα, έγινε έλεγχος του ποσοστού των ROS, της βιωσιμότητας των κυττάρων και της μορφολογίας τους. Τέλος, ακολούθησε δευτερογενής μεταμόσχευση με στόχο την ανίχνευση τοξικών φαινομένων μακροπρόθεσμα. Η in vivo διπλή γονιδιωματική τροποποίηση αποδείχθηκε ασφαλής και αποτελεσματική, οδηγώντας σε αυξημένη παραγωγή γ-σφαιρίνης. Συμπερασματικά, παρουσιάζουμε μία εναλλακτική προσέγγιση που στηρίζεται στην γονιδιωματική τροποποίηση των HSCs με στόχο την επανενεργοποίηση της έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, η οποία θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μία αποτελεσματική και απλοποιημένη μέθοδος in vivo γονιδιακής θεραπείας της β-θαλασσαιμίας.
description: Recently, gene therapy of β-thalassemia, involving ex vivo lentivirus vector-mediated βglobin gene addition in hematopoietic stem cells (HSCs) has provided therapeutic clinical responses. In parallel, alternative approaches using gene editing platforms are being intensely explored as novel, curative and potentially safer opportunities for patients with hemoglobinopathies. Given that the hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH) greatly ameliorates the clinical phenotype of β-thalassemia, we used CRISPR/Cas9-mediated gene editing to simultaneously disrupt both the binding sites of the gamma globin suppressor BCL11A within HBG1 and HBG2 promoters and the erythroid BCL11A enhancer, thus reactivating the expression of γ-globin. For the delivery of CRISPR/Cas9, a non-integrating helper-dependent adenoviral HDAd5/35++ vector (HDAd-CRISPR-Dual) was used, displaying high affinity to the hCD46 receptor which is uniformly expressed on human hematopoietic stem and progenitor cells. This CRISPR/Cas9 system was tested in CD34+ cells from thalassemia-major patients, previously enrolled in mobilization trials. Following 48-hour transduction, the cells were cultured in erythroid differentiation medium and the efficacy of genome editing was evaluated by T7E1 assay for cleavage rates and flow cytometry for γ-globin expression. Gene disruption by T7 assay was stable for both BCL11A enhancer and HBG1/HBG2 sites in thalassemic CD34+ cells translating into significantly increased γ-globin expression post erythroid differentiation. During erythroid differentiation, HbF expression was again significantly higher in the edited over non-edited differentiated erythroid cells. After the successful ex vivo genome editing of CD34+ from thalassemic donor, we established an in vivo therapy protocol for beta-thalassemia. First, we generated a thalassemic xenotransplant mouse model after the transplantation of thalassemic CD34+ cells into NSBGW recipients. Six weeks after transplantation HDAd-CRISPR Dual vector was injected into NSBGW recipients. The double editing of a repressor binding site and the BCL11A enhancer yields more than 35% of thal human HBF-expressing cells in the bone marrow and an increased level of HbF per cell. Importantly, these expression levels in both primary and secondary recipients and improves thalassemic phenotype. 10 Overall, we present a novel and potentially effective approach of HSC gene editing by CRISPR/Cas9-mediated reactivation of γ-globin expression that can be used as an alternative gene therapy platform for the treatment of hemoglobinopathies.