MOLECULAR HETEROGENEITY OF MULTIPLE MYELOMA: THE BIOLOGICAL AND CLINICAL RELEVANCE OF NOVEL GENE MUTATIONS BY NEXT GENERATION SEQUENCING
Creators: name: MANZONI, MARTINA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: Il mieloma multiplo (MM) � una proliferazione maligna fatale delle plasmacellule (PC) secernenti anticorpi del midollo osseo (BM), caratterizzata da un ampio spettro clinico e da una profonda instabilit� genomica. Per quanto riguarda in particolare il panorama mutazionale, recenti studi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) nei pazienti con MM hanno indicato la mancanza di una mutazione pilota universale, ma diversi geni mutati ricorrenti appartenenti a percorsi chiave coinvolti nella malattia, come la via MAP-chinasi. La caratterizzazione del MM attualmente si basa sull'analisi mutazionale effettuata sugli aspirati di BM. Tuttavia, questo approccio potrebbe non catturare la presunta eterogeneit� spaziale e genetica della malattia e imporre ostacoli tecnici che ne limitano il trasferimento nel laboratorio diagnostico di routine e clinico, riducendo anche la possibilit� di un monitoraggio longitudinale dei marcatori molecolari della malattia. Ciononostante, recenti dati relativi a cancri solidi indicano che il DNA circolante nel sangue periferico (PB) pu� essere usato come fonte di DNA tumorale per fornire informazioni sulla massa tumorale, sulla malattia residua e sul genotipo tumorale, con ovvi vantaggi in termini di accessibilit�. Sulla base delle osservazioni precedenti, gli obiettivi del progetto erano: (i) la valutazione dell'incidenza delle mutazioni nei geni ?driver? del MM (KRAS, NRAS, TP53, BRAF, FAM46C e DIS3) in una coorte ampia e rappresentativa di pazienti a diversi stadi di discrasia plamacellulare (132 MM e 24 casi di leucemia plasmacellulare primaria (pPCL), entrambi all'esordio, e in 11 pazienti con PCL secondaria (sPCL)); (ii) il confronto del profilo mutazionale del DNA libero da cellule circolante (cfDNA) e del DNA derivato dal BM in una piccola serie di pazienti rappresentativa di diversi stadi clinici di tumori plasmacellulari. Nello specifico, abbiamo valutato, mediante NGS ad alta profondit�, l'incidenza di mutazioni in BRAF (esoni 11 e 15), NRAS (esoni 2 e 3) e KRAS (esoni 2-4), DIS3 nei domini funzionali PIN (esoni 1-4) e RNB (esoni 10-18), TP53 (esoni 4-9) e FAM46C (esone 2). Complessivamente, la via MAPK � risultata affetta da mutazioni nel 60,1% dei pazienti (63,6% di quelli con sPCL, 59,8% di quelli con MM e 41,7% di quelli con pPCL). In particolare, il 12% dei pazienti � stato trovato mutato in BRAF, il 23,9% in NRAS e il 29,3% in KRAS. Mutazioni di DIS3 sono state riscontrate, rispettivamente, nel 18,5% dei pazienti con MM alla diagnosi, nel 25% delle pPCL e nel 30% delle sPCLs, con una maggior frequenza nei pazienti IGH-traslocati/non iperdiploidi. In FAM46C sono state identificate 24 mutazioni tumore-specifiche interessanti 18/162 (11%) pazienti. In particolare, la frequenza delle mutazioni di FAM46C era dell'11,7% nei MM di nuova diagnosi, e del 4,2% e del 20%, rispettivamente, nelle PCL primarie e secondarie. TP53 era mutato in 4/129 (3%) MM, 6/24 (25%) casi di pPCL e 2/10 (20%) di sPCL. Una frequenza simile associata all'aggressivit� della malattia (5%, 29,2% e 44% rispettivamente) � stata osservata per la delezione di TP53. In tutti i geni analizzati, le mutazioni coesistenti tendevano a verificarsi a diverse frequenze di varianti alleliche (VAFs), sostenendo in tal modo la presenza di subcloni tumorali. L'analisi longitudinale alla diagnosi e alla recidiva in un sottogruppo di 19 pazienti, che includeva casi di MM e PCL, ha rivelato diversi modelli di mutazione in BRAF/NRAS/KRAS. Abbiamo osservato la presenza di varianti clonali ad entrambe le tempistiche; l'acquisizione/espansione clonale delle varianti nel campione successivo; e persino la scomparsa di varianti a valori di VAF relativamente alti, ma sempre in concomitanza con l'emergenza/l?espansione clonale di un'ulteriore mutazione in un altro gene della via MAPK. Queste analisi longitudinali hanno evidenziato alcuni casi di aumento del carico di mutazione di DIS3 durante la progressione della malattia. Al contrario, in FAM46C abbiamo osservato una riduzione o scomparsa di tre mutazioni primarie con una VAF abbastanza costante nei casi all'esordio; invece, abbiamo notato l'acquisizione di mutazioni di TP53 in tre dei diciannove casi analizzati in recidiva. La maggior parte delle varianti di BRAF/DIS3/FAM46C nei casi mutati erano comparabilmente rilevabili a livello trascrizionale. Complessivamente, la scoperta che gli alleli mutati di FAM46C avevano un'espressione biologica rilevabile e, in alcuni casi, sembrava addirittura trascritta preferenzialmente, suggerisce che le mutazioni qui identificate possono avere implicazioni funzionali. Lo studio sul cfDNA come fonte accessibile di materiale genomico nei pazienti con MM � stato condotto su una serie di 28 pazienti con disordini plasmacellulari, dei quali abbiamo raccolto: (1) cfDNA isolato dal plasma; (2) DNA genomico (gDNA) tumorale da PC di BM CD138+ purificate, per scopi comparativi e (3) gDNA germinale estratto da granulociti da PB, per filtrare i polimorfismi. L'approccio ?NGS CAPP-seq ultra-deep targeted? � stato eseguito per genotipizzare un pannello genico specificamente progettato per massimizzare l?identificazione delle mutazioni nei tumori plasmacellulari. Complessivamente, all'interno dei geni interrogati, 18/28 (64%) pazienti avevano almeno una mutazione somatica non sinonima rilevabile nel cfDNA. Coerentemente con lo spettro dei geni mutati nei disordini delle PC, la genotipizzazione del cfDNA nel plasma ha rivelato varianti somatiche di NRAS (25%); KRAS (14%); TP53, TRAF3 e FAM46C (11%, rispettivamente); CYLD e DIS3 (7%, rispettivamente); e BRAF e IRF4 (4%, rispettivamente). La genotipizzazione del cfDNA ha identificato correttamente il 72% delle mutazioni (n=28/39) rilevate nelle PC tumorali e, nel complesso, le VAFs nei campioni di plasma correlavano con quelle delle biopsie tumorali. Va notato che le rimanenti mutazioni non rilevate nel cfDNA avevano una bassa rappresentazione nelle PC midollari purificate (VAF mediana=2,5%). L'analisi ROC ha mostrato che la genotipizzazione di cfDNA aveva la massima sensibilit� (100%) se le mutazioni erano rappresentate con una VAF&gt; 5% nelle PC di BM purificate. I risultati del nostro studio confermano ed estendono le evidenze pubblicate in precedenza che l'attivazione del pathway delle MAPK � ricorrente nel MM, e la scoperta che essa � mediata da mutazioni in BRAF in una frazione significativa di pazienti ha implicazioni cliniche potenzialmente immediate. Inoltre, l'analisi del profilo di espressione genica in pazienti DIS3-mutati ha identificato una ?signature? trascrizionale suggestiva per la riduzione della funzione dell?esosoma dell'RNA. I nostri dati supportano ulteriormente la rilevanza patologica delle mutazioni di DIS3 nelle discrasie plasmacellulari e suggeriscono che DIS3 possa rappresentare un potenziale gene soppressore del tumore in tali disordini. E 'anche rafforzata la crescente evidenza che FAM46C sia coinvolto nella patogenesi del MM come potenziale gene oncosoppressore, anche se il suo ruolo rimane da chiarire. I nostri risultati confermano anche che le mutazioni di TP53 sono rare nel MM all?esordio e rappresentano piuttosto un marker di progressione, analogamente alla del(17p); tuttavia, il loro verificarsi anche in assenza di delezioni supporta l'importanza della loro valutazione in pazienti con discrasia plasmacellulare, in termini sia di stratificazione del rischio sia di implicazioni terapeutiche. I nostri risultati dimostrano anche che la genotipizzazione di cfDNA � un approccio fattibile, non invasivo, in tempo reale in grado di rilevare mutazioni somatiche clonali e subclonali rappresentate in almeno il 5% degli alleli nelle PC tumorali, supportando cos� la consigliabile introduzione di questo metodo negli studi clinici che monitorano le discrasie plasmacellulari.