Διερεύνηση της επίδρασης των βασικών αμινοξέων L-ιστιδίνης και L-αργινίνης στη βιοσύνθεση λυκοπενίου στα κύτταρα του ζυγομύκητα Blakeslea trispora σε διάφορα υποστρώματα:
Creators: name: Αθανασιάδης, Ιωάννης Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Λυκοπένι
Βασικά αμινοξέα
Εκλεκτικότητα
Lycopene
Basic amino acids
Selectivity

description: Η αποδεδειγμένη ικανότητά του λυκοπενίου να λειτουργεί ως αποδιεγέρτης του οξυγόνου απλής κατάστασης (singlet oxygen quencher) και να δεσμεύει ελεύθερες ρίζες, το καθιστούν μία από τις πιο σημαντικές ενώσεις με αντιοξειδωτική δράση. Για το λόγο αυτό, τα τελευταία χρόνια, η βιοτεχνολογική παραγωγή του αποτέλεσε αντικείμενο έντονης ερευνητικής δραστηριότητας στους κόλπους της επιστημονικής κοινότητας καθώς τόσο η παραλαβή του από φυτικούς ιστούς όσο και η χημική σύνθεσή του παρουσιάζουν σημαντικά μειονεκτήματα. Το βιοτεχνολογικώς παραγόμενο λυκοπένιο, σύμφωνα με την απόφαση 2006/721/EC του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου επιτρέπεται να συντίθενται από το μύκητα Blakeslea trispora και χαρακτηρίζεται ως κατ’ ουσίαν ισοδύναμο με το φυσικό προϊόν που παραλαμβάνεται από την τομάτα (Lycopersicon esculentum). Το κρίσιμο σημείο της βιοτεχνολογικής παραγωγής του είναι η αναστολή της β-κυκλάσης του λυκοπενίου, ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη μετατροπή του λυκοπενίου σε γ- και β-καροτένιο. Μέχρι πρότινος, οι ενώσεις που έχουν χρησιμοποιηθεί για το σκοπό αυτό, είναι τριτοταγής αμίνες και ετεροκυκλικές ενώσεις όπως πυριδίνες, ιμιδαζόλια και παράγωγά τους. Το κοινό γνώρισμα των ενώσεων αυτών είναι η παρουσία ενός μονήρους ζεύγους ηλεκτρονίων στο άτομο του αζώτου, εξαιτίας του οποίου οι παραπάνω είναι βασικές. Εντούτοις, ο τοξικός χαρακτήρας των παραπάνω ενώσεων αποτελεί μειονέκτημα για τη χρήση τους στη βιοδιεργασία. Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εμπίπτει στο πλαίσιο ευρύτερης ερευνητικής δραστηριότητας σχετικά με την αναζήτηση food-grade ενώσεων-παρεμποδιστών της αντίδρασης κυκλοποίησης του λυκοπενίου στη βιοδιεργασία παραγωγής καροτενοειδών από το μύκητα Blakeslea trispora. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν τα βασικά αμινοξέα ιστιδίνη και αργινίνη λόγω δομικής συγγένειας του πρώτου με το ιμιδαζόλιο ή το 2-μεθυλο-ιμιδαζόλιο (άριστοι αναστολείς της β-κυκλάσης του λυκοπενίου), και λόγω της βασικότητας των δυο παραπάνω αμινοξέων. Με βάση τα αποτελέσματα των πειραματικών δοκιμών, τα αμινοξέα ιστιδίνη και αργινίνη δεν βρέθηκε να είναι εξίσου αποτελεσματικά όσον αφορά την εκλεκτική παραγωγή λυκοπενίου σε σχέση με τη δράση του 2-μεθυλο ιμιδαζολίου. Συγκεκριμένα, η ιστιδίνη επέδειξε μερική ανασταλτική δράση στην κυκλοποίηση του λυκοπενίου (43,7% των συνολικών καροτενοειδών) γεγονός το οποίο αποδόθηκε στο μηχανισμό αποικοδόμησής της κατά τον οποίον η ιστιδίνη μετατρέπεται σε ουροκανικό οξύ και απεκκρίνεται στον εξωκυττάριο χώρο. Αντίθετα, η αργινίνη ευνόησε σημαντικά την καροτενογένεση (αύξηση της απόδοσης της βιοδιεργασίας σε συνολικά καροτενοειδή κατά 7,2 φορές) πιθανόν λόγω της συνεισφοράς μορίων ακετυλο-CoA ως πρόδρομες ενωσεις των καροτενοειδών. Έχοντας υπόψη τα παραπάνω, εξετάστηκε η συνεργιστική δράση της αργινίνης και του 2-μεθυλο-ιμιδαζολίου με σκοπό την εύρεση κατάλληλου υποστρώματος για την παραγωγή λυκοπενίου. Πειραματικές δοκιμές σε διάφορα υποστρώματα έδειξαν ότι η υποκατάσταση της ασπαραγίνης με αργινίνη και μείωση της γλυκόζης από 50 σε 20 g/L οδήγησαν σε αισθητή αύξηση της απόδοσης της βιοδιεργασίας σε λυκοπένιο [από 555,1 mg/L (Pegklidou et al. 2008) σε 792,1 mg/L], με παράλληλη μείωση του κόστους παραγωγής.
description: It is a fact that lycopene can act as a singlet oxygen quencher and bind free radicals. Thus, it is one of the most important antioxidants. Recently its biotechnological production has been studied thoroughly because both its extraction from tomatoes and its clinical synthesis have serious disadvantages. Biotechnologically produced lycopene according to the decision 2006/72/EC of the European Commission is allowed to be synthesized from the fungus Blakeslea Trispora and is characterized as sustainably equivalent to the natural product from tomatoes (Lycopersicon esculentum). The key point of the biotechnological production is the inhibition of lycopene beta-cyclase, an enzyme which converts lycopene to β- and γ- carotene. Until recently the compounds used for that cause were: tert-amines and heterocyclic compounds (pyridines, imidazoles and their derivatives). All these compounds have a nitrogen atom with a lone electron pair and as a result they are bases. However, their toxicity makes them unsuitable for the current bioprocess. The cause of the present research was to find food-grade inhibitors of the cyclization of lycopene in the bioprocess. Such compounds can be the amino acids L-histidine and L-arginine. L-histidine has a similar chemical structure with imidazole or 2-methyl-imidazole (excellent inhibitors of lycopene beta-cyclase) and both of the above amino acids are basic. According to the results, in the matter of selectivity L-histidine and L-arginine were not as effective as 2-methyl-imidazole. Specifically, histidine showed partial inhibition in lycopene cyclization (43,7% of total carotenoids) due to its degradation mechanism in which histidine is converted to urocanic acid and excreted to extracellular space. On the contrary, arginine stimulated carotenogenesis (increasing the yield of the bioprocess 7,2 fold) probably because of the contribution of acetyl-CoA molecules as precursors of the carotenoids. Considering all the above, the synergistic action of arginine and 2-methyl-imidazole was examined in order to find a suitable substrate for lycopene production. Experiments on various substrates proved that substitution of asparagine to arginine and glucose reduction from 50 to 20 g/L caused a significant increase of the bioprocess yield and at the same time a reduction of the production cost.