Μελέτη της μορφολογίας και των νανομηχανικών ιδιοτήτων ζωντανών κυττάρων με τη χρήση του μικροσκοπίου ατομικών δυνάμεων (AFM)
Creators: name: Κιρμιζής, Δημήτριος Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Κυτταρική μηχανική
Νανομηχανική σκληρομέτρηση
Μέτρο ελαστικότητας
Μικροσκόπιο ατομικών δυνάμεων
Νεφρικά ροδοκύτταρα
Κύτταρα helo
Cellular mechanics
Nanomechanics
Atomic force microscope
Youngs elastic modulus
Helo cells
Ronal podocytes

description: Οι μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων είναι στενά συνδεμένες με τη λειτουργικότητα των κυττάρων τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθούν με τη χρήση μικροσκοπίου ατομικών δυνάμεων (AFM) οι μηχανικές ιδιότητες αφενός σε καλλιέργειες αφενός νεφρικών ποδοκυττάρων (murine E11 podocyte line, CELL LINES SERVICE, Heidelbergh, Germany; Immorto-Mouse H-2kb-tsA58 strain), κυττάρων ιδιαίτερης σημασίας σε νεφρικά νοσήματα, αφετέρου κυττάρων HeLa (κυτταρική σειρά CCL-2, ATCC, USA), που αποτελούν πρότυπο μελέτης καρκινικών κυττάρων. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διενεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Οι μετρήσεις έγιναν με τεχνική contact mode, σε συσκευή AFM SMENA SOLVER (NT-MDT) και με τη χρήση ανιχνευτών νιτριδίου του πυριτίου (Si3N4) κωνικού σχήματος, με σταθερά ελατηρίου 0,01 N/m, ακτίνα του tip 6nm και γωνία α = 18ο. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου, μέσα σε υγρό (θρεπτικό υλικό ή PBS) στο fluid cell του AFM. Μετά τη λήψη ικανοποιητικής τοπογραφικής εικόνας των κυττάρων, προχωρήσαμε στη σκληρομέτρηση του δείγματος σε διάφορα σημεία (πλέγμα 10x10 σημείων), από την οποία πήραμε τις αντίστοιχες καμπύλες του ύψους του tip στον άξονα z και της απόκλισης του βραχίονα. Με βάση το μοντέλο του Hertz υπολογίστηκε η ασκούμενη δύναμη στο δείγμα και πάρθηκαν οι καμπύλες δύναμης-βάθους σκληρομέτρησης στα αντίστοιχα σημεία, και στη συνέχεια υπολογίστηκε σημείο προς σημείο το μέτρο ελαστικότητας του Young και απεικονίστηκε διαγραμματικά στις αντίστοιχες καμπύλες. Οι περιοχικές διαφορές στη δύναμη και το μέτρο ελαστικότητας που μετρήθηκαν ενδεχομένως αντικατοπτρίζουν τη συμβολή των υποκείμενων δομών του κυττάρου (πυρήνας, κυτταροσκελετός) στη μηχανική συμπεριφορά του. Περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την τυποποίηση της χρήσης του AFM στη μελέτη της κυτταρικής μηχανικής και συνδυασμένη χρήση του με ανάστροφο μικροσκόπιο φθορισμού/confocal για την τεκμηρίωση της συσχέτισης των μηχανικών ιδιοτήτων με τη λειτουργικότητά τους.
description: The mechanical properties of live cells are apparently correlated with their functionality in states of health as much as in states of disease. The aim of the present labor was to study the mechanical characteristics of live cells with the use of atomic force microscope (AFM). For this purpose, cell cultures of murine renal podocytes (E11 podocyte line, CELL LINES SERVICE, Heidelbergh, Germany; Immorto-Mouse H-2kb-tsA58 strain) as well as human HeLa cells (cell line CCL-2, ATCC, USA), were performed according to the guidelines of the supplier. AFM measurements were performed in contact mode with the use of SMENA SOLVER SPM (NT-MDT) and silicon nitride probes with a cone-shaped tip, spring constant 0,01 N/m, tip radius 6nm and opening corner 18ο. All measurements were made in room temperature, in liquid (medium or PBS) within the fluid cell of the apparatus. After topographic imaging of the cells, we performed indentation of the samples in multiple sites (10x10 array), which yielded the z-position-deflection curves. With the use of Hertz model, we obtained the corresponding indentation force-depth and pointwise elastic modulus-indentation depth curves. Regional differences within the cells in force and elastic modulus probably reflect the contribution of the various structures of the cell (eg nucleus, cytoskeleton) in its mechanical behaviour. Further studies with the use of AFM combined with inverted fluorescent/confocal microscope are warranted, in order to standardize and validate these measurements and correlate them with cell functionality.