Exploitation of winery by-products as immune modulators in sheep
Creators: name: INGHESE, CRISTINA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Foggia
Year: 2018

description: Il presente lavoro di tesi � incentrato sul possibile recupero di scarti derivanti dall?industria enologica al fine ottenere sostanze bioattive dal ruolo immunomodulante che possano essere introdotte, quali supplemento, nell?alimentazione dei ruminanti. Recentemente, il Parlamento Europeo ha introdotto la ?Waste Framework directive? (Direttiva 2008/98/EC) con l?intento di promuovere il riciclo e il recupero degli scarti e dei sottoprodotti per ottenere nuove materie prime. Come, infatti, � descritto nella direttiva suddetta, un sottoprodotto �: un ?prodotto?, che deriva dalla dal processo produttivo, ma che non rappresenta l?oggetto ultimo della produzione. Il progetto si staglia in uno scenario che vede da una parte una ingente produzione di scarti agroindustriali e dall?altra la crescente preoccupazione del consumatore rispetto alla salubrit� dei prodotti di origine animale e al benessere animale. � noto che l'uva e i prodotti enologici sono ricchi di sostanze antiossidanti quali i polifenoli a cui � associato un ruolo antiossidante, antimicrobico e anticarcinogenico accanto alla capacit� di modulare il sistema immunitario e il metabolismo ormonale. Il lavoro � suddiviso in tre prove, condotte in vitro, e mira al recupero di due sottoprodotti: i wine lees e i grape pomace. Al fine di valorizzare la produzione locale e l?economia Pugliese, i sottoprodotti sono stati prelevati presso due aziende locali: Cantine La Marchesa (Lucera, FG) e Cantine Pirro (Troia, FG). I sottoprodotti scelti derivano dalla lavorazione di vitigni autoctoni: Bombino e Trebbiano d'Abruzzo per le vinificazioni in bianco (Cantine La Marchesa) e Nero di Troia per le vinificazioni in ros� e rosso (Cantine Pirro). Al fine di operare in un?ottica di basso impatto ambientale i solventi e le procedure utilizzate sono state attentamente scelte. Nel primo trial i wine lees, per definizione il residuo che si ritrova sul fondo dei silos al termine delle operazioni di svinamento, bianchi, ros� e rossi sono stati prelevati e sottoposti ad estrazione microonde assistita (MAE) con i seguenti solventi: acqua, alcool e la loro miscela 1:1, in presenza o meno di catalizzatore e quattro diverse temperature 50�C, 100�C, 150�C e 200�C. Al termine della fase estrattiva, gli estratti sono stati sottoposti ad analisi spettrofotometrica al fine di determinare il contenuto di fenoli totali, antociani, flavonoidi e la capacit� antiossidante. Gli estratti sono stati poi testati a due differenti concentrazioni, 0,4 mg/mL e 0,8 mg/mL, in vitro su culture di PBMC ovine al fine di ottenere informazioni relative alla proliferazione linfomonocitaria e alla produzione di citochine. Sui surnatanti, inoltre, � stata determinata la presenza di proteine Bax e Bcl2 legate all?apoptosi cellulare. Infine, negli estratti, tramite analisi GC-MS/MS � stata determinata la presenza di 5-idrossimetilfurfurale e tramite analisi enzimatica si sono ottenute informazioni circa la presenza di solfiti e acidi organici con lo scopo di escludere un loro impatto sulla capacit� antiossidante degli estratti. I risultati ottenuti da questo primo trial evidenziano che il contenuto in fenoli totali � legato alla tipologia di wine lees e al solvente utilizzato per l?estrazione: i wine lees derivanti dalla vinificazione in bianco presentano un maggiore contenuto di flavonoidi mentre i wine lees ottenuti dalla vinificazione in rosato contengono pi� antociani, infine i wine lees della vinificazione in rosso presentano una capacit� antiossidante in termine di potere scavenging superiore agli altri wine lees selezionati. I test condotti in vitro sui PBMC hanno confermato la capacit� degli estratti di wine lees di agire sul sistema immunitario ovino portando ad una riduzione massiva della proliferazione linfomonocitaria indifferentemente dall?estratto preso in considerazione. Nessuna variazione significativa � stata ritrovata per ci� che riguarda le citochine pro-infiammatorie al contrario, un incremento significativo dell?IFN-? e dell?IL-10 � stato evidenziato per l?estratto ottenuto da wine lees Nero di Troia vinificato in rosso ed estratto in acqua (ReW). Questo risultato dimostra la capacit� immunostimolante di questo estratto che pu� essere associata alla sua elevata capacit� scavenging (ABTS+). Quest?ultima attivit� pu� essere attribuita alla presenza di 5-idrossimetilfurfurale (5-HMF) cos� come riportato dai risultati ottenuti dall?analisi gas cromatografica del Nero di Troia estratto in acqua (ReW). Il 5-HMF pu� influenzare l?apoptosi cellulare agendo a livello della famiglia delle proteine dell?apoptosi Bcl2 e nel presente studio l?incremento delle proteine pro-apoptotiche Bax sembrerebbe essere legato alla presenza di 5-HMF nell?estratto ReW. Nel secondo trial gli estratti ottenuti per estrazione al microonde in acqua a 200�C, sono stati sottoposti a separazione mediante imbuto separatore e successivamente a purificazione tramite cromatografia flash (FLC) e le frazioni cos� ottenute sono state sottoposte ad analisi GC-MS/MS. Dall?analisi gas cromatografica � risultata la presenza di dichetopiperazine con una diversa distribuzione isomerica a seconda della frazione considerata. Sulla base di questi risultati, le frazioni sono state accorpate e per ogni wine lees due diversi accorpamenti F1 ed F2 sono stati scelti come campioni da testare a due diverse concentrazioni (0,4mg/mL e 0,8 mg/mL) in vitro su PBMC ovini. Il secondo trial � stato suddiviso in due esperimenti di cui uno condotto in condizione di stress termico (43�C) per 24h e l?altro condotto in condizioni di normotermia (37�C) per 48h; per entrambi gli esperimenti sono stati valutati la proliferazione dei linfomonociti e la produzione di citochine, inoltre sull?esperimento condotto in condizioni di stress termico � stata effettuata una valutazione della salute mitocondriale mediante il microscopio EVOS FL Cell Imaging System (Thermo Fisher) utilizzando il kit HCS Mitochondrial Health (Invitrogen). Recenti studi hanno riportato che le dichetopiperazine hanno capacit� antiossidanti, antivirali, antimicrobiche e immunomodulanti. I risultati ottenuti in questo studio riportano una marcata riduzione della proliferazione dei PBMC e della vitalit� cellulare in condizioni di normotermia e in maniera pi� accentuata nello stress termico. Per quanto concerne la produzione di citochine, in condizioni di normotermia si osserva un decremento della produzione di IL-6 nei surnatanti delle cellule coltivate in presenza di WhF1, RoF1 a 0,8 mg/mL, ReF1 a 0,8 mg/mL e ReF2, mente un aumento della IL-10 si osserva in presenza della frazione F2 del wine lees da vinificazione in bianco. In condizioni di stress termico, invece, la IL-6 subisce una riduzione nei surnatanti delle cellule in presenza della F2 di ciascun wine lees e della concentrazione 0,8 mg/mL del ReF1; contrariamente, a 39�C si registra un decremento di questa citochina in presenza della concentrazione 0,8 mg/mL di RoF1. Il livello di IFN-? aumenta in presenza di ReF2 a 0.8 mg/mL in condizioni di stress termico dimostrando la capacit� di questa frazione di favorire la produzione di citochine anti-infiammatorie a scapito delle pro-infiammatorie. Il terzo trial mira alla valorizzazione dei grape pomace che sono principalmente composti da semi e bucce. I grape pomace di Nero di Troia sono stati sottoposti ad estrazione MAE e alla analisi spettrofotometrica cos� come riportato per il primo trial. Gli estratti ottenuti sono stati poi testati a due diverse concentrazioni (0,4 mg/mL e 0,8 mg/mL) su PBMC ovini separati da sangue periferico durante il transition period. A tal fine il sangue � stato prelevato 15 giorni (t1), 7 giorni (t2) prima del parto, al parto (t3) and 7 giorni (t4) dopo il parto. I risultati ottenuti da questo trial dimostrano come i diversi estratti abbiano un?azione differente sulla proliferazione linfomonocitaria. La proliferazione aumenta al tempo t3 e t4 in presenza di tutti gli estratti tranne con quello a 200�C in acqua ad entrambe le concentrazioni e in etanolo a 0.8 mg/mL in corrispondenza dei quali si osserva un decremento della proliferazione dei PBMC. Il livello di IL-6 aumenta per tutti i tempi considerati quando le cellule sono stimolate con i grape pomace estratti in acqua/etanolo e in solo etanolo rispettivamente a 150�C e 200�C. Al momento del parto e 7 giorni dopo esso, si registra un aumento della IL.10. L?incremento della concentrazione di questa citochina e della IL-6 che si verifica con alcuni estratti potrebbe essere associato all?attivazione del sistema immunitario innato. Infine il livello di IFN-? risulta pi� elevato 7 giorni dopo il parto nei surnatanti delle cellule stimolate con grape pomace estratti in etanolo e catalizzatore e in solo etanolo. Da quanto suddetto � possibile concludere che, gli estratti di wine lees possono trovare applicazione come immunostimolanti e antiossidanti e le loro frazioni, purificate cos� come nel secondo trial, possono essere utilizzate come chemioterapici ed immunomodulanti. In ultimo, gli estratti di grape pomace possono trovare impiego quali anti-infiammatori ed immunomodulanti anche in condizioni di stress come quello legato al transition period. Ulteriori studi dovrebbero essere orientati alla valutazione dell?impatto che questi estratti e frazioni possono avere sul sistema immunitario dell?animale in vivo.