title: Rolle und Funktion der 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen in Digitalis lanata
Creators: name: Leykauf, Tim
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Bereits seit ihrer Entdeckung in Digitalis lanata wurde angenommen, dass 3β-Hydroxy-Δ5-Steroid-Dehydrogenasen (3βHSDs) an der Biosynthese von 5β-Cardenoliden beteiligt sind. Über verschiedene gentechnische Experimente konnte dies hier erstmals bewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überdies ein bisher unbekanntes 3βHSD (Dl3βHSD2) Gen aus Digitalis lanata Sprosskulturen isoliert und das encodierte Enzym rekombinant in E. coli produziert. Verglichen mit der rekombinanten rDl3βHSD1 ergibt sich für die rDl3βHSD2 eine Aminosäureidentität von 70 %. Beide rekombinanten Enzyme waren in der Lage, verschiedene 3-Oxopregnane zu reduzieren und 3-Hydroxypregnane zu oxidieren. Allerdings war nur die rDl3βHSD2 in der Lage, kleine Ketone und sekundäre Alkohole in signifikanten Mengen umzusetzen. Beim Vergleich von Dl3βHSD1 zu Dl3βHSD2 in D. lanata Sprossen ist festzustellen, dass die neu entdeckte Dl3βHSD2 dort schwächer exprimiert wird als die bereits bekannte Dl3βHSD1. Um einen tiefen Einblick in physiologische Funktionen der Dl3βHSDs zu erlangen, wurde durch eine Agrobakterien-vermittelte Transformation von mit dem CaMV-35:S-Promotor fusionierten Dl3βHSD Genen D. lanata Wildtyp Sprosskulturen (WT) auf Genomebene verändert und so Überexpressions Sprosskulturlinien (OE) von beiden Dl3βHSDs erzeugt. Auf diese Art transformierte Sprosse (OE Dl3βHSD1 und OE Dl3βHSD2) akkumulierten weniger Cardenolide als der Wildtyp (WT) und die Vektorkontrolle (VK). Einen Erklärungsansatz lieferte der erhöhte Gehalt an reduziertem Glutathion (GSH) in den OE Dl3βHSD1 Linien, welcher über Beeinflussung des Redoxstatus in planta die Cardenolidgehalte negativ beeinflussen kann. In den hier transformierten OE Dl3βHSD1 Linien konnte der Cardenolidspiegel mittels einer kombinierten Fütterung aus Pregnan-3,20-dion, einer Cardenolid-Vorstufe und Buthionin-Sulfoxim (BSO), einem Inhibitor der GSH-Biosynthese die Cardenolidgehalte wieder auf WT-Level gebracht werden. Der RNAi vermittelte Knock-Down (KD) von Dl3βHSD1 war erfolgreich und hatte einen stark negativen Einfluss auf die Cardenolidgehalte in diesen Linien. Diese Abnahme konnte durch die Fütterung der Downstream-Zwischenstufen der 3βHSD Reaktion, nämlich Pregnan-3β-ol-20-on wieder ausgeglichen werden, wohingegen Upstream-Zwischenstufen wie Progesteron hier keinen Effekt zeigten. Durch diese Ergebnisse kann erstmals die Beteiligung der Dl3βHSD1 an der 5β-Cardenolid-Biosynthese in D. lanata als bewiesen angesehen werden.
description: Since their discovery in Digitalis lanata, 3β-hydroxy-Δ5-steroid dehydrogenases (3βHSDs) have been assumed to be involved in the biosynthesis of 5β-cardenolides. This was proven here for the first time through various genetic engineering experiments. As part of this work, a previously unknown 3βHSD (Dl3βHSD2) gene was isolated from Digitalis lanata shoot cultures and the encoded enzyme was produced recombinantly in E. coli. Compared to the recombinant rDl3βHSD1, the rDl3βHSD2 has an amino acid identity of 70%. Both recombinant enzymes were able to reduce various 3-oxopregnans and oxidize 3-hydroxypregnanes. However, only the rDl3βHSD2 was able to convert small ketones and secondary alcohols in significant amounts. When comparing Dl3βHSD1 to Dl3βHSD2 in D. lanata shoots, it can be seen that the newly discovered Dl3βHSD2 is expressed weaker there than the already known Dl3βHSD1. In order to gain a deep insight into the physiological functions of the Dl3βHSDs, D. lanata wild-type shoot cultures (WT) were modified at the genome level by an Agrobacteria-mediated transformation of Dl3βHSD genes fused with the CaMV-35:S promoter, thereby overexpressing shoot culture lines (OE). generated by both Dl3βHSDs. Shoots transformed in this way (OE Dl3βHSD1 and OE Dl3βHSD2) accumulated fewer cardenolides than the wild type (WT) and the vector control (VK). One possible explanation was the increased content of reduced glutathione (GSH) in the OE Dl3βHSD1 lines, which can negatively influence the cardenolide content by influencing the redox status in planta. In the OE Dl3βHSD1 lines transformed here, cardenolide levels were brought back to WT levels using a combined feeding consisting of pregnane-3,20-dione, a cardenolide precursor and buthionine sulfoxime (BSO), an inhibitor of GSH biosynthesis become. RNAi-mediated knock-down (KD) of Dl3βHSD1 was successful and had a strong negative impact on cardenolide levels in these lines. This decrease could be compensated for by feeding the downstream intermediates of the 3βHSD reaction, namely pregnan-3β-ol-20-one, whereas upstream intermediates such as progesterone had no effect here. These results mean that the involvement of Dl3βHSD1 in 5β-cardenolide biosynthesis in D. lanata can be considered proven for the first time.