title: Biochemical and ecophysiological characterization of BNI (Biological Nitrification Inhibition) by Brachiaria humidicola
Creators: name: Egenolf, Konrad
Publisher: name: Universität Hohenheim
Year: 2021
Subjects: subject: BNI
subject: Biological nitrification inhibition
subject: Urochloa humidicola
subject: Brachialactone
subject: Nitrification kinetics
subject: Root exudation
subject: Secondary transport
subject: 630

description: In perennial grasslands, especially Brachiaria humidicola (syn. Urochloa humidicola) dominated swards, one hypothesized mechanism of high N efficiency is the plant exerted control of nitrification via the synthesis and release of nitrification inhibitors (NI) into the soil. This phenomenon has been conceptualized as Biological Nitrification Inhibition (BNI). This doctoral thesis was conducted with the aim of broadening our fundamental understanding on BNI ecophysiology, with a special emphasis on the edaphic parameters soil pH and soil texture as factors shaping the soil microbial community composition. The overarching objectives were to (1) screen root exudates of B. humidicola for major bioactive secondary metabolites with nitrification inhibiting activity, to (2) proof the significance of rhizosphere pH and nutritional N form for NI release and understand the underlying exudation mechanism, and to (3) elucidate the influence of soil pH and soil texture on the ammonia oxidizer community composition and BNI performance of B. humidicola. Root exudate screening via LC-MS and NMR techniques revealed several novel NI compounds with significantly higher NI activity compared to previously described brachialactone, i.e. the brachialactone isomers/derivatives 3-epi-brachialactone (ED50 ~ 20 µg ml-1, ED80 ~ 40 µg ml-1) and 3,18-epoxy-9-hydroxy-4,7-seco-brachialactone (ED50 ~ 40 µg ml-1) as well as the phenol aldehyde vanillin (ED50 ~ 12.5 µg ml-1, ED80 ~ 20 µg ml-1). In the case of the described brachialactone derivatives, internal tissue concentrations were extremely low (2-8 µg g-1 root DM), suggesting so far undiscovered cytosolic precursors. In the case of vanillin, its chemical proximity to other phenolic compounds previously described as NI, i.e. methyl-coumarate, methyl-ferulate and methyl 3-(4-hydroxyphenyl) propionate, drew the attention to phenylalanine and coumaric acid as common precursors and possible BNI breeding target. With regard to the NI exudation, the hypothesized positive effect of low rhizosphere pH and NH4+ nutrition was confirmed for both the brachialactone isomers/derivatives and vanillin. However, for 3-epi-brachialactone it was demonstrated that NH4+ did not constitute an essential prerequisite for NI synthesis and release. In contrast, NI release correlated with the transmembrane proton gradient, which in turn depends on soil pH and is favored by rhizosphere acidification occurring under cation-dominant nutrition (e.g. NH4+). These findings were considered as evidence for an active NI release via secondary transporters (possibly MATE transporters). The effects of soil pH and soil texture on the ammonia oxidizer community and BNI performance of B. humidicola were investigated through a three-factorial pot trial including liming and different soil types as experimental factors. No clear conclusion could be drawn with regard to the hypothesized effects of soil pH, soil texture and the ammonia oxidizer community composition on BNI performance of B. humidicola. In the presented pot trial, B. humidicola reduced net nitrification rates by 50-85% compared to the non-planted control, but this reduction was observable irrespective of soil pH, soil texture and the ammonia oxidizer community composition. Furthermore, the reduction of net nitrification was largely dependent on microbial N immobilization and efficient plant N (probably NO3-) uptake rather than BNI. This absence of a clear BNI effect was mainly attributed to high N inputs, which is in accordance with previous studies indicating that BNI was impaired in high nitrifying environments. The argument was underlined by theoretical enzyme-kinetic calculations, revealing a strong influence of substrate (NH4+) availability on soil nitrification dynamics, but as well BNI performance: Assuming soil NI concentrations at ED50 (~ effective dose 50% inhibition), it could be shown that – with the only exception of AOA populations suppressed by non-competitive inhibitors – the efficacy of NI is severely disrupted by increasing soil NH4+ availability. Besides contrasting AOA and AOB sensitivities towards NI, the inter-domain differences of ammonia-monooxygenase (AMO) kinetics probably delivers an additional explanation for the observation, that under field conditions BNI has mainly been confirmed for AOA, and to a lesser extent for AOB. Based on the findings of the presented doctoral thesis, it was concluded that BNI may play an important role in extensive B. humidicola pasture systems, especially on acid, coarse textured and AOA dominated soils. Intensification, especially increasing N amendments, will most likely disrupt the nitrification inhibiting effect and under these circumstances, N immobilization and efficient plant N uptake may display the dominant factors controlling net nitrification rates.
description: Viele Savannen-Ökosysteme, insbesondere Brachiaria humidicola (syn. Urochloa humidicola) dominiertes Grasland, besitzen eine hohe N-Nutzungseffizienz, was auf eine allelopathische Hemmung der Nitrifikation im Boden zurückgeführt wird (engl. Biological Nitrification Inhibition - BNI). Das ökophysiologische Wissen um dieses Phänomen ist jedoch noch sehr begrenzt. Diese Wissenslücke stellt den Ausgangspunkt der vorliegenden Doktorarbeit dar, in der insbesondere der Einfluss der Bodenparameter pH, Textur und der durch diese beiden Größen beeinflussten bodenmikrobiellen Gemeinschaft auf das BNI-Phänomen näher beleuchtet wurde. Die spezifischen Ziele dieser Doktorarbeit waren (1) die Untersuchung der Wurzelexsudate von B. humidicola auf bioaktive und nitrifikationshemmende Sekundärmetabolite, (2) eine nähere Betrachtung des Einflusses von Rhizosphären-pH und N-Form auf die Ausschüttung der identifizierten Nitrifikationshemmer und die Untersuchung des zugrundeliegenden Exsudationsmechanismus sowie (3) die Klärung des Einflusses der Bodenparameter pH und Textur auf die Zusammensetzung der Nitrifikanten-Population und den durch B. humidicola induzierten BNI-Effekt. Bei der Untersuchung der Wurzelexsudate von B. humidicola konnten mehrere, bisher unentdeckte biologische Nitrifikationshemmer identifiziert werden. Die wichtigsten Entdeckungen waren dabei zwei Isomere/Derivate des Brachialactons, nämlich 3-epi-Brachialacton (ED50 ~ 20 µg ml-1, ED80 ~ 40 µg ml-1) und 3,18-Epoxy-9-hydroxy-4,7-seco-Brachialacton (ED50 ~ 40 µg ml-1), außerdem das Phenolaldehyd Vanillin (ED50 ~ 12,5 µg ml-1, ED80 ~ 20 µg ml-1). Im Fall von Vanillin ist die chemische Verwandtschaft zu anderen phenolischen Verbindungen, die zuvor als biologische Nitrifikationshemmer beschrieben worden sind, auffällig, z.B. Methyl-Cumarat, Methyl-Ferulat und Methyl-3-(4-Hydroxyphenyl)-Propionat. Die gemeinsamen Vorstufen dieser Verbindungen, Phenylalanin und Cumarsäure, könnten somit einen interessanten Ansatzpunkt für die Pflanzenzucht darstellen. In Bezug auf die Ausschüttung der beschriebenen Nitrifikationshemmer, konnte bestätigt werden, dass eine Kombination aus niedrigem Rhizosphären-pH und NH4+-Ernährung die Exsudation deutlich erhöhte. Am Beispiel des 3-epi-Brachialactons konnte jedoch nachgewiesen werden, dass eine NH4+-Ernährung keine grundsätzliche Voraussetzung für die Synthese und Abgabe dieser Wirkstoffe darstellt. Die Exsudation dieser Verbindungen korrelierte lediglich mit dem transmembranen Protonengradienten, der sowohl durch ein saures Bodenmilieu als auch durch die aus einer kationendominanten Ernährung (z.B. NH4+, aber auch K+) folgenden H+-Ausschüttung verstärkt wird. Diese Befunde wurden als Beweis für eine aktive Ausschüttung der Nitrifikationshemmer durch sekundären Transport gewertet. Die Auswirkungen der Bodenparameter pH und Textur auf die Gemeinschaft der Ammonium-Oxidierer und den durch B. humidicola induzierten BNI-Effekt wurden in einem drei-faktoriellen Topfversuch mit Kalkung und verschiedenen Bodentypen als Versuchsfaktoren untersucht. Es konnte keine eindeutige Schlussfolgerung hinsichtlich des Einflusses der untersuchten Faktoren auf den BNI-Effekt gezogen werden. Wenngleich die Netto-Nitrifikationsraten in den mit B. humidicola bepflanzten Varianten um 50-85% niedriger als in der nicht bepflanzten Kontrolle waren, war diese Reduktion weitestgehend unabhängig vom Boden-pH, der Bodentextur und der Nitrifikantenpopulation. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Reduktion der Netto-Nitrifikation größtenteils durch Unterschiede in der mikrobiellen N-Immobilisierung und durch eine effiziente N-Aufnahme durch die Pflanze (wahrscheinlich weitestgehend in Form von NO3-) zu erklären war und eher nicht durch einen BNI-Effekt. Das Ausbleiben desselbigen wurde hauptsächlich auf die hohen N-Düngergaben zurückgeführt. Dieses Argument wurde zuletzt durch theoretische enzymkinetische Berechnungen untermauert, die einen starken Einfluss der Substratverfügbarkeit (NH4+) auf die Nitrifikationsdynamik im Boden, aber auch auf den BNI-Effekt belegen: Unter der Annahme einer 50% Hemmung (ED50 – effektive Dosis 50%) konnte gezeigt werden, dass – mit der einzigen Ausnahme von AOA-Populationen, die durch nicht-kompetitive Inhibitoren gehemmt werden – die Wirksamkeit der Nitrifikationshemmer mit ansteigender NH4+-Verfügbarkeit im Boden zunehmend schwächer wird. Basierend auf den Ergebnissen dieser Dissertation wurde gefolgert, dass eine verbesserte N-Nutzungseffizienz durch BNI nur in extensiven Weidesystemen zu erwarten ist, insbesondere auf sauren, leichten und AOA-dominierten Böden. Eine Intensivierung dieser Systeme, insbesondere eine Erhöhung der N-Düngung, wird höchstwahrscheinlich die nitrifikationshemmende Wirkung stören. Unter diesen Umständen bestimmen zunehmend andere Prozesse, wie die mikrobielle N-Immobilisierung und die effiziente N-Aufnahme durch die Pflanzen, die N-Dynamik im Boden.