title: Construction of virus φCh1 ORF43 and ORF43/44 deletion mutants
Creators: name: Kigili, Seyda
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Um mehr Verständnis über virale Transkriptionsregulation zu erlangen, ist das temperente Virus φCh1, das das haloalkaliphile Archäon Natrialba magadii infiziert, ein wichter Modelorganusmus. In früheren Studien wurde bestätigt, dass ORF43 und ORF44 einen überlappenden Start- und Stoppcodon aufweisen, sodaß beide Gene co-transkribiert und co-translatiert werden. Eine Pfam-Analyse zeigte eine PIN-Domäne in der Sequenz von gp44, die einzelsträngige RNA auf sequenzspezifische Weise spalten könnte. Aufgrund dieser Homolgie könnte gp44 ein Teil eines Toxin/Antitoxin (TA) Systems der Klasse Typ-II sein. Diese Homologlie deutet auf ein VapBC-TA-System hin. Zur Untersuchung der regulatorischen Rolle des Operons ORF43/44 von φCh1 wurde die Deletionsmutante N. magadii L11-ΔORF43/44 durch homologe Rekombination und Insertion einer Novobiocin-Resistenzkassette konstruiert. Nach der wachstumskinetischen Analyse des Wachstums des Stammes N. magadii L11-ΔORF43/44 ist das Lyseverhalten von Deletionsmutante und Wildtyp-Stamm gleich. Allerdings ist die Stabilität der Deletionsmutante nach der 4. Passage reduziert: ein unterschiedliches Lyseverhalten, das näher an dem Virus-losen Stamm N. magadii L13 lag, konnte hier beobachtet werden. Die Freisetzung von Virus-Partikeln ging dagegen nur leicht zurück. Eine Weiterführung des Experimentes mit einer signifikanten Erhhöhung der Passagen auf bis zu 12 ist deshalb erforderlich. Zur weiteren Analyse der regulatorischen Funktion von ORF43/44 wurden die Reporterassays mit BgaH durchgeführt. Hierfür wurden bereits fertiggestelle Konstrukte aus Haloferax volcanii in ein Plasmid für N. magadii transferriert. Here konnte gezeigt werden, das gpr43 eine Aktivierung der bgaH expression ergab. Hierbei stand die Kontrolle des bgaH Genes unter der intergenischen Region von ORF48 und ORF49 aus φCh1. Waren auf diesem Plasmid noch ebenfalls das Repressor Gen von φCh1 (ORF48) und ORF44 anwesent, so reduzierte sich die gemessene BgaH Aktivität signifikant.
description: In order to gain more understanding about viral transcriptional regulation, the temperate virus φCh1 infecting the haloalkaliphilic archaeon Natrialba magadii is an important field of research. It was confirmed by previous studies that ORF43 and ORF44 have overlapping start and stop codons, indicating that both genes are co-transcribed and co-translated, thereby forming operon. Preliminary experiments performed with ORF44 revealed that it confers a repressing and an endoribonucleolytic function. Pfam analysis demonstrated a PIN domain in gp44 cleaves single-stranded RNA in a sequence specific manner, therefore making gp44 the VapC of a VapBC TA system which belongs to type II toxin-antitoxin system. For investigation of regulatory role in operon system of φCh1, the deletion mutant of N. magadii L11-ΔORF43/44 was was constructed via homologous recombination by inserting the novobiocin resistance cassette. According to the growth kinetic analysis, lysis behavior of deletion mutant and wild-type strain are alike. However, the stability of deletion mutant showed different lysis behavior after 4th passage which closer to the cured strain N. magadii L13. Additionally, both virus titer analysis and morphology of plaques from deletion mutant suggested that passaging assay might be repeated and should be continued till at least 12th passage in order to get reliable results. For further demonstration of regulatory function of ORF43/44, the BgaH measurements were done with the constructs; the construct containing only antitoxin region called pMI-1/43 showed highest activity of BgaH, however, the construct containing additionally repressor gene, pMI-2/43/44, had significant dropped on the BgaH activity. According to that ORF43/44 exhibits an enhancing effect on bgaH expression with an enhancing activity of ORF43 on the intergenic region. Furthermore, in the presence of the ORF48 coding sequence the putative repressing activity of ORF44 was effective. Thereby it can be concluded that the putative repressing- or degrading activity of ORF44 would then be further evidence for the ORF43/44 toxin-antitoxin hypothesis.