title: The role of the putative antifeeding prophage of Amoebophilus asiaticus during infection
Creators: name: Harreither, Agnes
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Amoebophilus asiaticus ist ein obligat intrazellulärer Symbiont von Akanthamöben und besitzt einen zweistufigen Lebenszyklus mit einer extrazellulären, infektiösen und einer intrazellulären, replikativen Phase. Die eingeschränkte Genomgröße und limitierten biosynthetischen Kapazitäten deuten auf eine enge symbiotische Beziehung und starke Abhängigkeit vom Wirt hin. Erstaunlicherweise findet sich im Genom keines der bekannten Typ I–VI Sekretionssysteme für den Transfer von Effektorproteinen in das Zytoplasma des Wirts. Jedoch besitzt A. asiaticus ein Cluster aus 13 Genen mit hoher Ähnlichkeit zum “antifeeding” Prophagen des insektenpathogenen Bakteriums Serratia entomophila. In A. asiaticus könnte dieser Prophage als abgeleitetes Sekretionssystem dienen. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels eines quantitativen Echtzeit-PCR Ansatzes die Expression eines repräsentativen Gens aus dem Cluster, dem “prophage tail sheath”-Gen, zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Infektionszyklus untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das “prophage tail sheath”-Gen in der extrazellulären und intrazellulären Phase differentiell exprimiert wird. Zwei Gene des Clusters wurden kloniert und in Escherichia coli heterolog exprimiert, mit dem Langzeitziel, Antikörper für Immunfluoreszenz herzustellen. Proben für konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie und Cryo-Elektronenmikroskopie wurden vorbereitet. Die mikroskopische Analyse zeigte Bündel filamentöser zytoplasmatischer Strukturen, bei denen es sich vermutlich um den Prophagen handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern erste plausible Hinweise auf eine Beteiligung des mutmaßlichen Prophagen am Infektionsprozess.
description: Amoebophilus asiaticus is an obligate endosymbiont of Acanthamoeba sp., exhibiting a biphasic lifestyle with an extracellular, infectious intermediate and an intracellularly replicating stage. Its small genome size and limited repertoire of genes for essential biosynthetic pathways point towards a close symbiotic relationship and strict dependency on the host. Surprisingly, none of the currently known type I–VI secretion systems needed for the delivery of putative effector proteins to the host cytoplasm is present in the genome of A. asiaticus. However, A. asiaticus encodes a cluster of 13 genes which closely resembles the antifeeding prophage (afp) of the insect pathogen Serratia entomophila and is hypothesised to act as a derived secretion device. In this study, a quantitative real-time PCR (RT-qPCR) approach was used to analyse the expression of one representative gene from the afp-like cluster of A. asiaticus, the prophage tail sheath, at different infection time points. It could be demonstrated that the prophage tail sheath is differentially expressed in the extracellular versus the intracellular stage of A. asiaticus. Two afp proteins were cloned for heterologous expression in Escherichia coli with the long-term goal to produce antibodies for immunofluorescence against the purified proteins. Samples for conventional transmission electron microscopy and cryo-electron microscopy were prepared. Microscopic analysis revealed bundles of filamentous cytoplasmic structures in the extracellular, but not in the intracellular stage of A. asiaticus, which could represent the putative prophage. The results of this thesis provide first evidence for a possible involvement of the putative prophage in the infection process.