Design and synthesis of photoactivatable myristic acid analogues for UNC119 cargo interactions and target identification of autophagy inhibitors
Creators: name: Kaiser, Nadine
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2019
Subjects: subject: UNC119
subject: Diazirine
subject: Autophagy
subject: Target identification
subject: 570
subject: Chaperone
subject: Protein

description: UNC119 is a chaperone protein, which regulates the trafficking of myristoylated proteins between cellular membranes. Even though these chaperones were extensively studied in the past two decades, only few of their interaction partners are known to date. In the course of this thesis three different photoactivatable myristic acid analogues (Pacman 1-3) were designed and synthesized to study this protein-myristate interaction. Exclusively Pacman-3-based probes covalently labeled UNC119 proteins. The photocrosslinking site of Pacman-3 probes within the hydrophobic pocket of UNC119 was characterized. The myristate analogues binding mode is similar to the native myristate moiety. Substrate recognition of Pacman-3 by N-myristoyl transferase (NMT) enzymes from different organisms was investigated. Pacman-3 was not incorporated into a peptide substrate by human NMT. Remarkably, NMT derived from the protozoan parasite Leishmania and Trypanosoma recognized Pacman 3 as a substrate. Conclusively, Pacman-3 can serve as a valuable tool to investigate the role of UNC119 protein in these parasites and to identify novel myristoyl-interaction partners. The second project of this thesis focused on autophagy. Autophagy is an essential biological process for the regulation of cellular homeostasis and energy supply. Modulators of autophagy can provide insight into the regulation of autophagic flux and unravel its role in various diseases. In order to identify novel autophagy modulators, a phenotypic screen was performed. Three structurally different potential inhibitors of autophagy were investigated in detail. The first compound was a representative of the oxazolidinone-scaffold, namely Autoxain. Initial experimental results indicated a similar mode of action as the antibiotics linezolid and tedizolid, which exert their antibacterial activity by inhibition of protein biosynthesis via the ribosome. The second small molecule was Autoquin, which prevents autophagosome-lysosome fusion. An affinity enrichment experiment suggested a similar mode of action to the known autophagy inhibitors salinomycin and ironomycin, which sequester iron in the lysosome. Autophagy plays a crucial role in maintenance of cellular iron homeostasis and novel tool compounds, which could shed light on this biological process are highly relevant. The autophagy inhibitor Authipyrin interferes with mitochondrial respiration by direct inhibition of complex I. Complex I activity is required for regular autophagic flux. Furthermore, mitophagy is frequently dysregulated in patients suffering from Parkinson’s disease. However, the exact mechanism underlying this interplay remains to be elucidated.
description: UNC119 ist ein Chaperon-Protein, welches den Transport myristoylierter Proteine zwischen zellulären Membranen reguliert. Obwohl dieses Chaperon in den vergangenen zwei Jahrzehnten intensiv erforscht wurde, sind bislang nur wenige Interaktionspartner bekannt. Im Verlauf dieser Dissertation wurden drei verschiedene photoaktivierbare Myristatanaloga entworfen und synthetisiert um diese Protein-Myristoyl Interaktion zu untersuchen. Ausschließlich Pacman-3 basierte Proben gingen eine kovalente Querverbindung mit UNC119 Proteinen ein. Charakterisierung der Lage der Photomarkierung durch Pacman-3 innerhalb der hydrophoben Tasche zeigte, dass der Bindungsmodus des Myristinsäureanalogs ähnlich zu dem der nativen Myristinsäure-Gruppe ist. Anschließend wurde die Substraterkennung von Pacman-3 durch N-Myristoyl Transferase (NMT) Enzyme aus unterschiedlichen Organismen untersucht. Pacman-3 wurde nicht durch die humane NMT auf das Peptidsubstrat übertragen. Bemerkenswerterweise erkannten NMTs, aus den parasitischen Protozoen Leishmania und Trypanosoma, Pacman-3 als Substrat. Daher könnte Pacman-3 als wertvolles Hilfsmittel dienen, um die Rolle von UNC119 in diesen Parasiten zu erforschen und neue Myristoyl-Interaktionspartner zu identifizieren. Autophagie ist ein essentieller biologischer Prozess für die Regulierung der zellulären Homöostase und Energieversorgung. Autophagie-Modulatoren sind äußert wertvolle Hilfsmittel, welche Einsicht in die Regulierung der Autophagie verschaffen und deren Rolle in verschiedenen Krankheiten entschlüsseln können. Um neue Autophagie-Modulatoren zu finden und zu charakterisieren wurde ein phänotypischer Screen durchgeführt. Drei strukturell unterschiedliche potentielle Autophagie Inhibitoren wurden genauer untersucht. Die erste Verbindung ist ein Stellvertreter des Oxazolidin-Gerüsts, genannt Autoxain. Erste experimentelle Ergebnisse wiesen auf ein ähnliches Wirkprinzip, wie das der Oxazolidin-basierten Antibiotika Linezolid und Tedizolid hin. Beide dieser Therapeutika üben ihre antibakterielle Wirkung durch die Inhibierung der Proteinbiosynthese durch das Ribosom aus. Die nächste Substanz war Autoquin, welche die Fusion des Autophagosoms mit dem Lysosom verhindert. Ein Experiment zur Affinitätsanreicherung wies auf ein ähnliches Wirkprinzip, wie die bekannten Autophagie-Inhibitoren Salinomycin und Ironomycin hin, welche Eisen im Lysosom anreichern. Autophagie spielt eine wichtige Rolle in der Erhaltung der zellulären Eisen-Homöostase und neue Hilfsmittel, welche diesen biologischen Prozess aufklären können, sind hochrelevant. Der Autophagie-Inhibitor Authipyrin beeinträchtigt die mitochondrielle Atmung durch die direkte Inhibierung von Komplex I. Komplex I Aktivität wird für den normalen Verlauf der Autophagie benötigt. Weiterhin weißt die Mitophagie häufig Fehlfunktionen in Patienten auf, welche unter Parkinson leiden. Allerdings ist der genaue Mechanismus, welcher dieser Erkrankung zugrunde liegt noch ungeklärt.