Κατασκευή Ανασυνδυασμένων Ιών του Απλού Έρπητα Τύπου Ι (HSV-1) που εκφράζουν γονίδια αναφοράς για χρήση στην εύρεση νέων αντιικών ουσιών
Creators: name: Γερακούδης, Κωνσταντίνος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: ερπητοϊοί
ανασυνδυασμένοι ιοί
αντιική δράση
γονίδια αναφοράς
Herpes virus
recombinant viruses
antiviral screening
reporter genes

description: Ο ιός του απλού έρπητα τύπου Ι (HSV-1) είναι ένα διαδεδομένο παθογόνο, που προκαλεί λυτικές ή λαναθάνουσες λοιμώξεις για το υπόλοιπο της ζωής του ξενιστή. Η σοβαρότητα των HSV λοιμώξεων ποικίλλει από σχετικά ασήμαντες μέχρι πολύ σοβαρές, ακόμη και απειλητικές για τη ζωή καταστάσεις (ιδιαίτερα σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς). Τα παρόντα διαθέσιμα αντί-ερπητικά φάρμακα (πχ ακυκλοβίρη και τα ανάλογα της), που αναστέλλουν τη σύνθεση του DNA του ιού, απαιτούν ενεργοποίηση από την ιική κινάση της θυμιδίνης (TK) και καθίστανται ανενεργά από μεταλλάξεις στο γονίδιο της tk. Συνεπώς, υπάρχει σημαντική ανάγκη για νέα αντιικά φάρμακα με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Ο στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν να κατασκευαστούν ανασυνδυασμένοι ιοί, που να εκφράζουν γονίδια αναφοράς, όπως την ενισχυμένη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (EGFP) και τη λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (LUC), τα οποία μπορούν εύκολα να παρατηρηθούν in vivo ή να μετρηθούν in vitro. Πλασμιδιακός φορέας κατασκευάστηκε όπου το γονίδιο της EGFP τοποθετήθηκε ενδιάμεσα από τις 5’ και 3’ ρυθμιστικές περιοχές του γονιδίου της tk του HSV-1 ώστε να επιτραπεί εξειδικευμένος σε θέση ομόλογος ανασυνδυασμός στο ιικό γονιδίωμα. Παρόμοια δουλειά είχε γίνει για το γονίδιο της LUC. Τα γονίδια αναφοράς εισάχθηκαν στον αγρίου τύπου HSV-1 (κλώνος 17) και απόγονοι του ιού δημιουργήθηκαν ακολουθώντας συνδιαμόλυνση των πλασμιδιακών φορέων με HSV-1 νουκλεοκαψίδια. Ιοί εκφράζοντες τα γονίδια αναφοράς απομονώθηκαν και εξακριβώθηκαν έπειτα από απομόνωση πλακών. Οι ανασυνδυασμένοι ιοί εξέφραζαν τα επιθυμητά γονίδια αναφοράς κάτω υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών περιοχών της tk και εμφάνιζαν προφίλ κινητικής ανάπτυξης παρόμοιο με αυτό του πατρικού ιού. Η χρησιμότητά τους στον έλεγχο ενώσεων για αντιική δράση εξακριβώθηκε ελέγχοντας μία σειρά από χαλκόνες και κυκλοεξενόνες, οι οποίες είχαν συντεθεί στο εργαστήριο φαρμακευτικής χημείας. Ο έλεγχος αυτός οδήγησε στην εύρεση δύο ενεργών αντιικών ενώσεων. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας υποδεικνύουν ότι οι ανασυνδυασμένοι ιοί που κατασκευάστηκαν εκφράζουν τα γονίδια αναφοράς και είναι ισχυρά και ευαίσθητα εργαλεία για ταχείς και ποσοτικοποιήσιμους έλεγχους νέων αντιικών ενώσεων. Ως αποτέλεσμα, ο χρόνος, η προσπάθεια και το κόστος τέτοιων διαδικασιών μειώνεται σημαντικά
description: Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1) is a widespread pathogen, which causes acute or latent infections for the lifetime of the host. The severity of HSV infections varies from relatively minor to very serious, even life-threatening, conditions (especially in immuno-compromised patients). Currently available anti-herpes drugs (e.g. acyclovir and its analogs), which inhibit virus DNA synthesis, require activation by the virus thymidine kinase (TK) and they are rendered inactive by tk gene mutations. Therefore, a serious need for novel antivirals with diverse modes of actions exists. The aim of the present master thesis was to construct recombinant viruses that express reporter genes, i.e. enhanced green fluorescent protein (EGFP) and firefly luciferase (LUC), that can be easily assayed in vivo or in vitro. Transfer vector was constructed where the EGFP gene was flanked by 5’ and 3’ regulatory sequences of the HSV-1 tk gene to allow site-specific homologous recombination with the virus genome. Similar work was already made for LUC gene. The reporter genes were introduced in wild-type HSV-1 strain 17 and virus progeny was generated following cotransfection of the transfer vectors with HSV-1 nucleocapsids. Viruses expressing the reporter genes were plaque isolated and verified. The recombinant viruses expressed the expected reporter genes under the control of the tk regulatory elements and displayed growth kinetics similar to those of their parent virus. Their usefulness in antiviral screening was verified by testing a battery of chalcones and cyclohexenones, which were synthesized in the lab of pharmaceutical chemistry. This test led to the identification of two active antiviral compounds. In conclusion, the results of the present master thesis indicate that the recombinant viruses that were constructed express the reporter genes and are powerful and sensitive tools for rapid and quantitative screenings of novel antivirals. As a result, time, effort and cost of such processes are significantly reduced