MOLECULAR FARMING APPLIED TO VETERINARY SCIENCE:NICOTIANA TABACUM PLANTS EXPRESSING ANTIGENIC PROTEINS FROM ESCHERICHIA COLI AS A MODEL OF EDIBLE VACCINE IN WEANED PIGLETS
Creators: name: LOMBARDI, ANGELA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2017

description: ?Medical Molecular farming? o ?Agricoltura molecolare? � un termine usato per indicare la produzione su larga scala di molecole ad interesse medico o farmaceutico in pianta. In tale ambito un?importate attenzione � rivolta ai vaccini edibili: piante ingegnerizzate per l?espressione di proteine immunogene in grado di indurre, dopo somministrazione orale, una risposta immunitaria locale protettiva nei confronti del patogeno contro il quale sono state progettate.
I vaccini edibili offrono numerosi vantaggi correlati alla facilit� di somministrazione, ai bassi costi, alla facilt� di stoccaggio nonch� alla possibilit� di indurre una risposta immunitaria locale laddove il patogeno ha accesso nell?organismo.
Questo studio si concentra sui semi vaccinali contro i ceppi Escherichia coli verocitotossico (VTEC) nei suinetti. La terza generazione (R3) di semi di due linee di Nicotiana tabacum che esprimono, rispettivamente la fimbria adesiva F18 (n: 80) e la subunit� B della tossina VT2e (n: 80) derivanti da un ceppo di E. coli verocitotossico, sono state coltivate in serra con un livello di contenimento 1. Nello specifico, sono stati raccolti quattrocentosettanta grammi di semi F18 positivi (F18s) e quattrocentocinquanta grammi di semi VT2e-B positivi (VT2eBs). Anche se, non sono state osservate differenze nell'indice di germinazione (F18s: 73,3%; VT2e-B: 76,6%; WT: 78,5%), i semi F18s e VT2eBs hanno germinato quattro giorni pi� tardi rispetto ai semi di Nicotiana tabacum ?wild type?. Questo aspetto � probabilmente correlato all?uso tardivo dei corpi di inclusione (proteine e lipidi) da parte delle variet� ingegnerizzate, come osservato nei tessuti vegetali attraverso analisi morfologiche con microscopia ottica ed elettronica. Le analisi di PCR, effettuate su DNA di piante vaccinali, hanno confermato l'integrazione stabile dei geni di origine batterica nel genoma vegetale. La quantit� delle proteine F18 e VT2e-B � stata stimata essere rispettivamente circa 6,6-7,4 ?g e 34-37 ?g per 10 g di semi tramite saggi ELISA competitivo indiretto. L'effetto protettivo della somministrazione orale dei semi vaccinali nei confronti con ceppi VTEC � stato valutato, attraverso una sperimentazione in-vivo, effettuata presso il Centro Zootecnico Didattico Sperimentale dell'Universit� degli Studi di Milano. Nello specifico 36 suinetti svezzati a 21 giorni sono stati suddivisi casualmente in due gruppi sperimentali: controllo (CG, n:18) e trattamento (TG, n:18). Considerando l?inizio della sperimentazione il giorno 0, i soggetti del gruppo TG hanno ricevuto nei giorni 0, 1, 2, 5 e 14 un trattamento corrispondente a 20 g di semi vaccinali macinati miscelati con 40 grammi di latte ricostituito in polvere. Il gruppo controllo ha invece ricevuto 20 g di semi di tabacco wild type. Al giorno 20, 12 suinetti rispettivamente del gruppo controllo e del gruppo trattamento sono stati infettati sperimentalemente con 1010 CFU del sierotipo O138 di E. coli. Durante tutto il periodo sperimentale (0-29 giorni), performances zootecniche e stato di salute sono stati monitorati e sono stati raccolti individualmente campioni biologici. Dopo il periodo di immunizzazione (giorno 20), il titolo di IgA intestinali totali � risultato essere superiore nei suinetti trattati, che inoltre mostravano un significativo aumento del titolo fecale di immunoglobuline A anti-F18 e anti-VT2e-B rispetto ai controlli. La strategia adottata, tramite somministrazione orale � risultata efficace nel ridurre i segni clinici dopo l'infezione da VTEC ed � stata in grado di stimolare l'immunit� locale nel tratto gastroenterico. Inoltre, la conoscenza delle tecniche immunologiche e un approfondimento sull?immunit� mucosale locale sono state sviluppate in collaborazione con l?Universit� di Denver, Colorado. In particolare � stato messo a punto un metodo per caratterizzare gli effetti di diversi batteri patogeni mucosali, come Moraxella catarrhalis, (Mcat), Heamophilus influenzae di tipo b (Hib), Haemophilus influenzae non tipizzabile (NTHi), Staphilococcus aureus Cowan I (SAC) sulla produzione di anticorpi di cellule B umane.