title: Identification of novel molecular mechanisms of cold atmospheric plasma treatment in melanoma cells
title: Identifikation zentraler Wirkmechanismen von kaltem atmosphärischem Plasma im malignen Melanom
Creators: name: Zimmermann, Tom
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: Cold atmospheric plasma (CAP) describes a weakly ionized gas with manifold biological effects. Several studies showed strong antitumor activity of CAP treatment, thereby suggesting a potential application for tumor therapy. These studies include several works from our research group on CAP effects on malignant melanoma. Strong dose-dependent cytotoxicity with induction of senescence and apoptosis was found in melanoma cells, while healthy cells remained largely unaffected. The resulting tumor selectivity, in combination with its strong cytotoxicity, render CAP a promising approach for melanoma therapy. The exact mechanisms of such treatments are, however, currently not fully understood. This thesis aimed at identification of molecular and cellular mechanisms that mediate CAP effects in melanoma cells. The thesis consists of two parts, each focusing on a central aspect of CAP treatment. In the first part, we assessed CAP-induced reactive species in CAP-treated solutions and found elevated levels of nitrite and nitrate. We then applied those reactive nitrogen species to melanoma cells to simulate CAP treatment and evaluate their contribution to CAP-induced cytotoxicity. This was combined with another major CAP effect, which is strong extracellular acidification. While nitrate did not affect melanoma cells, nitrite showed synergistic effects with the extracellular acidification, resulting in apoptosis and senescence. Cytotoxicity was greatly reduced in healthy human fibroblasts, thereby suggesting similar tumor selectivity as CAP. The second part aimed at investigating molecular mechanisms with a focus on the unfolded protein response (UPR). This cellular stress response is activated by proteotoxic stress and was hypothesized to contribute to CAP-induced apoptosis in melanoma cells. When assessing several biomarkers of the UPR, a strong activation after CAP treatment was found. This was, at least partly, caused by protein misfolding and aggregation, as well as calcium release from the endoplasmic reticulum. We then performed an untargeted metabolic analysis of CAP-treated melanoma cells using liquid chromatography–mass spectrometry. During this analysis, a severe reduction of ceramides and ceramide metabolites was found, which was then linked to CAP-induced UPR activation and apoptosis. Further, pharmacological inhibition of ceramide metabolisms was shown to increase cytotoxicity of CAP treatments both in vitro and ex vivo. Taken together, this thesis provides a comprehensive analysis of CAP effects on melanoma cells, which led to the identification of essential molecular mechanisms of CAP-induced apoptosis. It thereby improves the understanding of CAP antitumor effects and facilitates development of novel therapeutic approaches.
description: Kaltes atmosphärisches Plasma (KAP) ist ein schwach ionisiertes Gas mit umfangreichen biologischen Effekten. In zahlreichen Studien wurde eine starke, antitumorale Wirkung kurzer KAP-Behandlungen nachgewiesen, eine potenzielle Anwendung für die Therapie onkologischer Erkrankungen gewann zunehmend an Bedeutung. Im Bereich des malignen Melanoms konnte unsere Arbeitsgruppe in der Vergangenheit wichtige Eigenschaften und Mechanismen der KAP-Behandlung aufklären. So zeigte sich eine dosisabhängige Induktion von Seneszenz und Apoptose in Melanomzellen, während gesunde Zellen weitestgehend unversehrt blieben. Diese Tumorselektivität stellt einen zentralen Vorteil der KAP-Behandlungen im Vergleich mit anderen, etablierten Therapieformen dar. Zusätzlich wurden einige molekulare Mechanismen, unter anderem eine Calciumfreisetzung in das Zytoplasma, sowie eine starke extrazelluläre Ansäuerung, beschrieben. Die verantwortlichen reaktiven Spezies und zellulären Mechanismen waren jedoch zu Beginn dieser Arbeit nicht vollständig aufgeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion von reaktiven Stickstoffspezies (RNS) während der KAP-Behandlung von Melanomzellen untersucht. Mittels Raman-Spektroskopie und kolorimetrischen Analysen konnte eine KAP-induzierte Produktion von Nitrat und Nitrit nachgewiesen werden. Zur Nachstellung des KAP-Effektes wurde die zuvor beschriebene, extrazelluläre Ansäuerung mit den gemessenen Mengen Nitrat bzw. Nitrit kombiniert, wobei ein synergistischer Effekt von Nitrit und saurem pH-Wert beobachtet werden konnte. Dabei führten bereits kurze Behandlungen von 5 min zur Induktion von Apoptose und Seneszenz in Melanomzelllinien. Da die zytotoxische Wirkung auf Fibroblasten deutlich geringer war, ist von einer Tumorselektivität der Behandlung auszugehen. Auf molekularer Ebene zeigten sich einige Unterschiede in der Wirkung von KAP und sauren Nitritlösungen, die vermutlich auf das Fehlen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Letzterem zurückzuführen sind. Der zweite Teil beschäftigte sich mit den molekularen Mechanismen der KAP-induzierten Apoptose und sollte die Rolle der Unfolded protein response (UPR) untersuchen. Diese zelluläre Stressreaktion wird durch die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen aktiviert, ein Zusammenhang mit KAP war bisher kaum untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit gelang der erste Nachweis einer KAP-induzierten Aktivierung der UPR in Melanomzellen, einhergehend mit der erhöhten Expression des pro-apoptotischen Transkriptionsfaktors CHOP. Als Auslöser wurde eine gestörte Proteinfaltung sowie ein Calciumverlust im endoplasmatischen Retikulum (ER) identifiziert. Zur Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen kam eine metabolische Analyse mittels kombinierter Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LC/MS) zum Einsatz. Dabei wurden weitreichende, KAP-induzierte Veränderungen detektiert. Unter anderem kam es in den Melanomzellen zu einer Verringerung von zwei wichtigen Sphingolipiden, C16:0- und C24:1-Ceramid, sowie des gesamten Ceramidmetabolismus. Dies stand in direktem Widerspruch zu zahlreichen Studien, die eine Akkumulation und pro-apoptotische Wirkung von Ceramiden während therapeutischen Behandlungen von Tumorzellen beschrieben haben. Um die Beobachtungen zu validieren, erfolgte eine Zugabe der betroffenen Ceramide direkt auf die Zellen, wodurch die KAP-Wirkung deutlich abgeschwächt werden konnte. Im Gegensatz dazu führte eine zusätzliche, pharmakologische Verringerung der Ceramidmenge zu einer Verstärkung der KAP-induzierten Apoptose. Dies wurde nicht nur in vitro, sondern auch ex vivo anhand primärer Melanome des Tg(Grm1)EPv-Mausmodells bestätigt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit ein zentraler Wirkmechanismus der KAP-Behandlung von Melanomzellen identifiziert werden. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der antitumoralen Wirkung von KAP bei und unterstützt damit die Entwicklung von neuartigen Therapiekonzepten. Darüber hinaus stellt der hier beschriebene Zusammenhang zwischen Ceramidverlust und UPR-Aktivierung einen bisher unbekannten, aber vielversprechenden Ansatzpunkt für weiterführende Studien dar.