title: Einfluss des oxidativen Metabolismus von Genistein auf die Toxizität und Apoptoseinduktion in humanen Kolonkarzinomzellen
Creators: name: Stornig, Karin
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Eine hohe Aufnahme an Isoflavonen wird aufgrund epidemiologischer Studien mit zahlreichen gesundheitsfördernden und chemopräventiven Wirkungen in Verbindung gebracht [Brzezinski und Debi, 1999; Wu et al., 2008; Yan und Spitznagel, 2009; Yan et al., 2010]. Dies hat dazu geführt, dass isoflavonreiche NEM als „natürliche“ und „risikofreie“ Wirkmittel vermarktet werden, wobei diese Isoflavonaufnahme, die über die Ernährung erreichte Aufnahme um ein Vielfaches übersteigen kann [BfR, 2007]. Neben potentiell positiven Wirkungen konnte für das Isoflavon Genistein in hohen Konzentrationen auch genotoxisches Potential in vitro beobachtet werden [Kulling et al., 1999; Salti et al., 2000]. Dies wirft Fragen nach der Unbedenklichkeit einer Einnahme von hochdosierten Isoflavon-Supplementen auf. Auch über die potentiellen Wirkungen der im Organismus gebildeten Metabolite ist bisher noch wenig bekannt [BfR, 2007]. Im Fokus dieser Arbeit stand die Frage, ob die Bioaktivität von Genistein durch den oxidativen Metabolismus verändert wird. Die im Zuge des Phase I-Stoffwechsels entstehenden Metabolite 3`-OH-Genistein und 6-OH-Genistein unterscheiden sich nur durch die Stellung einer zusätzlichen Hydroxylgruppe und konnten bereits im Urin nach sojareicher Kost detektiert werden [Kulling et al., 2001]. Im Rahmen der Dissertation von Anika Schröter wurden Genistein und die oxidativen Metabolite hinsichtlich ihres genotoxischen Potentials im Comet-Assay untersucht. Hierbei zeigten die Testsubstanzen unterschiedliches Potential DNA-Strangbrüche zu induzieren. So konnte nach 24-stündiger Inkubation für 3`-OH-Genistein stärkere DNA-strangbrechende Wirkungen als für die Muttersubstanz bei gleichen Konzentrationen festgestellt werden, wohingegen nach Inkubation mit 6-OH-Genistein keine signifikante Erhöhung der DNA-Strangbruchrate zu beobachten war. Aufgrund dieser Beobachtung wurden die Testsubstanzen hinsichtlich Zytotoxizität, DNA-Schädigung, Zellzyklus sowie Apoptoseinduktion untersucht, um Unterschiede im toxischen Potential der Testsubstanzen zu erfassen und um mögliche sekundäre Effekte, die zu einer Erhöhung der DNA-Strangbruchrate im Comet-Assay beitragen können, zu ermitteln. Hierbei wurden alle Versuche in der Kolonkarzinomzelllinie HT-29 unter Zusatz von Katalase (100 U/ml) durchgeführt. Um zytotoxische Eigenschaften der Testsubstanzen zu erfassen, wurden als Testsysteme der LDH-Assay und WST-1 gewählt, um Einflüsse auf die Membranintegrität und Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen zu erfassen. Nach einstündiger Inkubationszeit konnte für keine der Testsubstanzen zytotoxische Effekte festgestellt werden. Jedoch zeigte sich nach 24-stündiger Inkubationszeit mit Genistein und 3`-OH-Genistein in hohen Konzentrationen (≥200 µM) eine Verringerung der mitochondrialen Dehydrogenasen-aktivität. Hierbei führte 3`-OH-Genistein zu einer stärkeren Abnahme der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen als die Muttersubstanz bei gleichen Konzentrationen. Hingegen konnten nach Inkubation mit 6-OH-Genistein keine zyototoxischen Effekte festgestellt werden. Um mögliche DNA-schädigende Wirkungen der Testsubstanzen zu erfassen, wurde dessen Einfluss auf den Phosphorylierungsstatus des Proteins p53 mittels Western Blot untersucht. Das Tumorsuppressorprotein p53 wird bei DNA-Strangbrüchen rasch phosphoryliert, wobei der Phosphorylierungsgrad des Proteins ein Maß für die DNA-Schädigung durch die Testsubstanzen darstellt. Hierbei konnte bereits nach einstündiger Inkubationszeit für Genistein sowie für beide oxidativen Metabolite eine DNA-schädigende Wirkung festgestellt werden. Auch hier zeigte 3`-OH-Genistein stärkere und 6-OH-Genistein schwächere DNA-schädigende Wirkungen als die Muttersubstanz. Jedoch konnte trotz beobachteter Aktivierung des Tumorsuppressors p53 kein Zellzyklusarrest nach Exposition der Zellen mit Genistein zu unterschiedlichen Inkubationszeiten festgestellt werden. Da sich hinsichtlich der Ergebnisse im Comet-Assay die Frage stellt, ob die Erhöhung der DNA-Strangbruchrate zum Teil auch auf eine mögliche apoptotische Fragmentierung zurückzuführen ist, wurden die Testsubstanzen auf ihre apoptoseinduzierende Wirkung untersucht. Hierbei zeigte sich nach Inkubation mit Genistein und 3`-OH-Genistein eine Erhöhung der Apoptoserate. Ebenso schien 3`-OH-Genistein zu einer potenteren Apoptoseinduktion zu führen als die Muttersubstanz bei gleichen Konzentrationen. Nach Inkubation mit 6-OH-Genistein zeigte sich im Gegensatz dazu keine Erhöhung des Anteils an apoptotischen Zellen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das toxische Potential und das biologische Wirkprofil von Genistein durch den oxidativen Metabolismus verändert wird. Je nach Stellung der zusätzlichen Hydroxylgruppe wird somit die Wirkung von Genistein verstärkt oder verringert.
description: Epidemiological studies have associated a high isoflavone-intake with a variety of beneficial effects on human health [Brzezinski und Debi, 1999; Wu et al., 2008; Yan und Spitznagel, 2009; Yan et al., 2010]. Due to these observations the popularity of isoflavon-rich supplements is increasing. They are claimed as “natural” and “risk-free” products, whereas the daily intake of isoflavones may exceed by far those from normal diet [BfR, 2007]. Beside of potential beneficial effects the isoflavone genistein has been reported to exhibit genotoxic potential in vitro [Kulling et al., 1999; Salti et al., 2000]. These results have raised concern about possible adverse effects due to extensive isoflavone intake. Additionally the potential effects of the metabolites have not been fully clarified. In this work the influence of oxidative metabolism on the bioactivity profile of the isoflavone genistein has been investigated. During phase I-metabolism genistein is metabolized by cytochrome P450-dependent monooxygenases to 3`-OH-genistein and 6 OH-genistein, which differ in the position of an additional hydroxyl group and were already detected in urine following soy consumption [Kulling et al., 2001]. In the dissertation of Anika Schröter genistein and the oxidative metabolites were investigated with respect to the genotoxic potential using the comet assay. The test substances showed different DNA strand-breaking potential. 3`-OH-genistein significantly exceeded the strand-breaking potential of genistein, whereas 6-OH-genistein showed no significant genotoxic effects. Due to this observation the influence of the test substances on cytotoxicity, DNA-integrity, cell cycle distribution and induction of apoptosis was determined to estimate differences in the toxicological potential and to investigate possible secondary events which might contribute to an increase of DNA-damage in the comet assay. All experiments were conducted in the human colon carcinoma cell line HT-29 in the presence of catalase (100 U/ml). To determine cytotoxic effects WST-1 and LDH-assay were performed to investigate the influence of the test substances on membrane integrity and mitochondrial activity. No significant cytotoxic effects were detectable after one hour of incubation. However after 24 hours of incubation a decrease in mitochondrial activity of the cells were observed for genistein and 3`-OH-genistein in high concentrations (≥200 µM). In addition 3´-OH-genistein significantly exceeded the cytotoxic potential of the parent compound, whereas 6-OH-genistein showed no effects. To investigate potential DNA-damaging effects the influence of genistein and the oxidative metabolites on the phosphorylation status of p53 protein was determined using Western blot. Already after one hour of incubation with the test substances phosphorylation of p53 found to be increased. 3`-OH-genistein showed stronger and 6-OH-genistein weaker DNA-damaging potential than the parent compound. Although activation of the tumor suppressor p53 was observed, no cell cycle arrest was detectable after incubation with genistein. Because possible apoptotic events could result in the generation of false-positive results in the comet assay, the test substances were tested with respect to their potential to induce apoptosis. After incubation with genistein und 3´-OH-genistein an increase of apoptotic cells was detectable, whereby the 3´-OH-metabolite seems to have more potential to induce apoptosis than the parent compound. On the contrary, after incubation with 6-OH-genistein no increase of apoptotic cells was detectable. Taken together, the results indicate that oxidative metabolism leads to a modulation in the toxic potential and biological activity of genistein. Depending on the position of the additional hydroxyl group the potential of the parent compound is either enhanced or decreased.