Μελέτη της επίδρασης της ερυθροποιητίνης (rhEpo-a) στην ανάπτυξη &amp; διαφοροποίηση των ανθρώπινων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του πολφού των δοντιών (SHED &amp; SCAP):
Creators: name: Βασίλη, Αγγελίνα Σπύρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα
Ερυθροποιητίνη
Διαφοροποίηση
Mesenchymal Stem Cells
Erythropoietin
Differentiation

description: Κεντρικό θέμα της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η μελέτη των ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (hMSCs) οδοντικής προέλευσης, υπό την επίδραση συγκεκριμένων παραγόντων και συνθηκών ανάπτυξης προς ενδοθηλιακά κύτταρα. Απώτερος στόχος καθορίσθηκε η πιθανή χρήση τους στην επαγωγή αγγειογενετικών διαδικασιών ιστών ή/και οργάνων σε διαταραχές ισχαιμίας. Ως σύστημα – μοντέλο μελέτης χρησιμοποιήθηκαν τα hMSCs, προερχόμενα τόσο από τον πολφό νεογιλών δοντιών (SHED), όσο και από την περιακροριζική θηλή μόνιμων δοντιών (SCAP), που εμφανίζουν χαρακτηριστικά αντιγόνα επιφανείας (CD). Τα κύτταρα SHED και SCAP αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής, ενώ ακολούθως, μελετήθηκε το δυναμικό πολλαπλασιασμού και θανάτου τους. Κεντρικό πυρήνα της διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η αξιολόγηση της επίδρασης της ανθρώπινης ανασυνδιασμένης ερυθροποιητίνης (rhEpo-a/αυξητικής ορμόνης με αιμοποιητική δραστηριότητα) επί του πολλαπλασιασμού, επιβίωσης και ικανότητας ενδοθηλιακής διαφοροποίησης των SHED και SCAP κυττάρων. Αρχικά, προσδιορίστηκε η βέλτιστη συγκέντρωση της rhEpo-a (40U/ml), τόσο για τα SHED όσο και τα SCAP κύτταρα. Επιπλέον, εξετάσθηκε η δράση της rhEpo-a σε συνδυασμό: α) με άλλους επαγωγικούς παράγοντες, όπως τη δεξαμεθαζόνη (Dex) (σε συγκέντρωση 5x10-9Μ), στην οποία δεν προέκυψε κάποια επιπλέον συνεργιστική επαγωγική δράση σε σχέση με αυτή που επιτυγχάνεται μόνο από την rhEpo-a, καθώς και β) υπό την επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων ορού στο μέσο ανάπτυξης (15%, 2.5% και 0% v/v). Από τη μελέτη όλων των ανωτέρω συνθηκών προέκυψε ότι ο βέλτιστος σχηματισμός αγγειογενετικών σχηματισμών επιτεύχθηκε παρουσία 40U/ml rhEpo-a σε περιβάλλον 15% v/v ορού. Η ικανότητα επαγωγής ενδοθηλιακής διαφοροποίησης των SHED και SCAP κυττάρων υπό την επίδραση της rhEpo-a επιβεβαιώθηκε και μέσω RT-PCR ανάλυσης, στην οποία αποδείχθηκε η ενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων του σηματοδοτικού μονοπατιού της Epo (EpoR, JAK2, STAT-1,-3,-5, MEK-1,-2 και ERK-1,-2), καθώς και χαρακτηριστικών αγγειογενετικών δεικτών (VEGFR1, vWF και CDH5). Επίσης, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της in vitro σύγκλεισης τομών / επούλωσης τραύματος (scratch / wound healing assay), μέσω της οποίας παρατηρήθηκε πως τα κύτταρα παρουσία του συνδυασμού 40U/ml rhEpo-a και 15% v/v ορού επιτάχυναν την επούλωση του προκληθέντος τραύματος, σε σύγκριση με αυτά που αναπτύχθηκαν απουσία rhEpo-a ή/και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις ορού. Επιπρόσθετα, επιβεβαιώθηκε η ενισχυμένη ενζυμική δραστικότητα της μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (MMP-2/χαρακτηριστική της αγγειογενετικής δραστηριότητας) με τη χρήση ζυμογραφίας ζελατίνης, μελετώντας τα υπερκείμενα των κυτταροκαλλιεργειών που αναπτύχθηκαν παρουσία της rhEpo-a, ως ένας επιπλέον χαρακτηριστικός αγγειογενετικός δείκτης. Τέλος, η ανάπτυξη των ανωτέρω καλλιεργειών σε υπόστρωμα εμπλουτισμένο με κολλαγόνο τύπου I, έδειξε πως η παρουσία rhEpo-a οδήγησε στο σχηματισμό χαρακτηριστικών αγγειογενετικών δομών (capillary-like structure formation), σε αντίθεση με τις καλλιέργειες μάρτυρες. Συμπερασματικά, η παρούσα διπλωματική εργασία αναδεικνύει τον κυρίαρχο ρόλο της Epo στην επαγωγή της ενδοθηλιακής μετατροπής μεσεγχυματικών αρχέγονων κυττάρων οδοντικής προέλευσης, γεγονός που μπορεί να αποτελέσει ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό εργαλείο στην κυτταρική θεραπεία ισχαιμικών παθήσεων, όπως εμφράγματος του μυοκαρδίου και ισχαιμικών εγκεφαλικών επεισοδίων.
description: The central objective of the present Master Thesis work was to investigate if human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) of dental origin are able to differentiate into endothelial cells under certain culture conditions. This possibility could have remarkable clinical implications into cell therapy angiogenic/ischemic disorders. hMSCs derived both from Pulp Exfoliated Deciduous Teeth (SHED) and from Apical Papilla (SCAP), were first characterized by flow cytometry analysis and then examined for their potential to proliferate under certain conditions. The major objective of the present Master Thesis was to evaluate the effect of recombinant human erythropoietin-alpha (rhEpo-a), a biosynthetic hormone with hematopoietic activity, on the proliferation, survival and differentiation of SHED and SCAP cells. First of all, the optimum inducing concentration of rhEpo-a (40U/ml) was determined for SHED and SCAP cells. Moreover, was examined and assessed the effect of rhEpo-a: (a) in combination with other differentiation inducing agents, such as dexamethasone (Dex) (5x10-9M) and (b) in the presence of different concentrations of serum (15%, 2.5% and 0% v/v). The characteristic ability of rhEpo-a to induce endothelial differentiation of SHED and SCAP cells was assessed, in addition, at gene expression level by RT-PCR analysis. The results obtained indicate the following: (a) Exposure to rhEpo-a activated to expression of specific genes (EpoR, JAK2, STAT-1, -3, -5, MEK-1, -2 and ERK-1, -2), involved in the Epo-EpoR signaling pathway, as well as genes encoding VEGFR1, vWF and CDH5. (b) Exposure to rhEpo-a for 7, 12 and 20 days promoted pro-endothelial differentiation of SHED and SCAP cells, that formed tubular-like structures when transferred to grow on collagen-coated plates. (c) rhEpo-a (40U/ml) under specific serum conditions in culture (15% v/v) accelerated wound healing process and enhanced the enzymatic activity of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), a characteristic angiogenic marker. In conclusion, this Master Thesis highlights the potential role of Epo as an inducer of dental hMSCs differentiation. These findings may have clinical implications into cell therapy of ischemic diseases such as myocardial infarction and ischemic stroke.