Tight Junction-bindendes C-terminales Clostridium perfringens Enterotoxin für Goldnanopartikel-vermittelte Optoperforation von Zellen : neue Methode für die Krebstherapie
Creators: name: Becker, Annegret
Publisher: name: Hannover : Institutionelles Repositorium der Leibniz Universität Hannover
Year: 2019
Subjects: subject: Cancer cells
subject: claudins
subject: Krebszellen
subject: Claudine
subject: C-CPE
subject: GNOME-LP
subject: Dewey Decimal Classification::500 | Naturwissenschaften::570 | Biowissenschaften, Biologie

description: Tight Junctions sind apikale interzelluläre Proteinverbindungen zwischen Epithelzellen. Die Überexpression von bestimmten Proteinen der Tight Junctions wie z.B. Claudin-3, -4 und -7 ist für einige Krebsarten charakteristisch. In der Krebsdiagnose und -therapie könnten diese Claudine als Marker verwendet werden, um Krebszellen zielgerichtet zu detektieren und behandeln zu können. Das C-terminale Fragment vom Clostridium perfringens Enterotoxin (C-CPE) kann spezifisch an diese Claudine binden. In dieser Arbeit wurden Goldnanopartikel (AuNP) mit dem rekombinanten C-CPE (Aminosäuren 194 bis 319) funktionalisiert, um die spezifische Ablation von Claudin-exprimierenden Krebszellen mit der Goldnanopartikel-vermittelten Laserperforation (GNOME-LP) Technik zu etablieren. Mit der Analyse der Claudin-Expression von verschiedenen Krebszellen mittels quantitativer real-time PCR und Immunfluoreszenz konnten Claudin-3, -4 und -7 positive humane Darm- (Caco-2), Brust- (MCF-7) und Ösophaguskrebszelllen (OE-33) sowie Hundebrustkrebszellen (TiHoDMglCarc1305) identifiziert werden. Die transepithelialen elektrischen Widerstandsmessungen und Lokalisationsstudien zeigten, dass das rekombinante C-CPE194-319 spezifisch an die Claudin-3, -4 und -7 positiven Krebszellen binden konnte. Die Optoperforation von mit 5 µg/ml C-CPE funktionalisierten AuNP behandelten Krebszellen mittels der GNOME-LP Technik tötete über 70 % der Claudin-positiven Krebszellen bei einer Laserfluenz von 60 mJ/cm² und einer Scangeschwindigkeit von 5 mm/s. Nicht-funktionalisierte AuNP verursachten keinen Zelltod. Zusätzlich konnte mit dieser optischen Methode die Struktur von Sphäroiden aus Ösophagus- und Brustkrebszellen in Matrigel geschädigt werden. Für eine zukünftige in vivo Anwendung ist es wesentlich die Zelltod-induzierenden physikalischen und biologischen Mechanismen zu verstehen. Bezogen auf die C-CPE-Funktionalisierung der AuNP, konnte mit einer höheren C-CPE-Konzentration von 20 µg/ml die Tötungseffizienz der Krebszellen mit einer reduzierten Laserfluenz auf 30 mJ/cm² maximiert werden. Unabhängig von der verwendeten Laserfluenz wurde eine maximale Tötungseffizienz bei einer Scangeschwindigkeit von 5 mm/s erreicht. Die Optoperforation von aus Darmkrebszellen bestehenden Sphäroiden im Matrigel zerstörte nachhaltig die Sphäroidstruktur. Sphäroide bestehend aus Ösophaguskrebszellen wurden stärker beschädigt als die optoperforierten Sphäroide mit 5 µg/ml C-CPE funktionalisierten AuNP. Die Betrachtung der biologischen Mechanismen zeigte, dass die GNOME-LP von mit C-CPE-AuNP behandelten Zellen eine Bindung von Annexin V an die Membran und eine reduzierte Aktivität der Mitochondrien aufwiesen. Die Aktivität der Caspase-3/-7 war in den Zellen nicht erhöht. Die gelelektrophoretische Analyse der DNA nach der Behandlung zeigte keine Apoptose-vermittelte Fragmentierung der DNA. Die Ergebnisse deuten vielmehr auf einen durch die GNOME-LP/C-CPE-AuNP Applikation hervorgerufenen nekrotischen als auf einen apoptotischen Zelltod hin. Damit ist die GNOME-LP mit C-CPE funktionalisierten AuNP eine vielversprechende effiziente Methode zur Ablation von Claudin-positiven Krebszellen. Die Tötungseffizienz sollte zukünftig in Xenotransplantaten erforscht werden, um die optobasierte Methode präziser an in vivo Bedingungen anzupassen.
description: Tight Juctions are apical intercellular protein connections between epithelial cells. The over expression of specific tight junction proteins like claudin-3, -4 and -7 is characteristic for some cancer types. In cancer diagnosis and therapy these claudins can be used as markers to target, detect, and treat cancer cells. The non-cytotoxic C-terminal fragment of Clostridium perfringens enterotoxin (C-CPE) binds specifically on these claudins. In this thesis, gold nanoparticles (AuNPs) were functionalized with the recombinant C-CPE (amino acids 194 to 319) as a tool to establish a new method for a specific ablation of claudin expressing cancer cells by using the gold nanoparticle-mediated laserperforation (GNOME-LP) technique. Analysis of the claudin expression in different cancer cells with quantitative real-time PCR and immunofluorescence experiments revealed the human colon (Caco-2), breast (MCF-7) and esophagus (OE-33) cell lines as well as the canine mammary cell line (TiHoDMglCarc1305) as claudin-3, -4 und -7 positive cancer cells. Transepithelial electrical resistance measurements and localization experiments showed binding of the recombinant C-CPE194-319 on the claudin-3, -4 and -7 positive cancer cells. The optoperforation of 5 µg/ml C-CPE functionalized AuNPs treated cancer cells by the gold nanoparticle-mediated laser perforation (GNOME-LP) technique killed over 70 % of the claudin-positive cancer cells at a laser fluence of 60 mJ/cm² and a scanning speed of 5 mm/s. The same laser fluence did not kill the cells when incubated with non-functionalized AuNPs. Furthermore, by using the optical method the formation of spheroids composed of esophagus cancer cells or breast cancer cells in Matrigel was reduced. For future in vivo application, it will be crucial to know the physical and biological mechanisms induced by cell death. Regarding the C-CPE functionalization of the AuNPs, increased C-CPE concentration of 20 µg/ml for the C-CPE-AuNP complex formation maximized the killing efficiency with a reduced laser fluence of 30 mJ/cm². Independently of the applied laser fluence, the maximal killing efficiency was achieved at a scanning speed of 5 mm/s. The optoperforation of spheroids composed of colon cancer cells in Matrigel permanently destroyed the complete spheroid formation. The formation of spheroids composed of esophagus cancer cells was more effectively reduced compared to optoperforated spheroids with 5 µg/ml C-CPE functionalized AuNPs. At the biological level, GNOME-LP of C-CPE-AuNPs treated cells showed annexin V binding to the cell membrane and a reduced mitochondria activity. The activity of caspase-3/-7 in the cells was not increased. Gel electrophoretic analysis of the DNA after optical treatment demonstrated no apoptosis-related DNA fragmentation. The results suggest that the GNOME-LP/C-CPE-AuNPs application induced rather necrotic than apoptotic reaction in cancer cells. Finally, the GNOME-LP with C-CPE functionalized AuNPs is a promising efficient approach for ablation of caludin-positive cancer cells. The killing efficiency should be investigated on xenograft in future to rationally adapt the opto-based method for future in vivo conditions.