Characterization and Prediction of Protein Solution Stability by Rheological Methods
Creators: name: Schermeyer, Marie-Therese
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2017
Subjects: biopharmaceutics
protein solution stability
phase diagrams
rheology
viscoelasticity
monoclonal antibody
highly concentrated protein solutions

description: Neue Erkenntnisse im Bereich der Biotechnologie ermöglichen es Vorgänge im Körper bis ins kleinste Detail zu verstehen und bei Abweichungen regulierend einzugreifen. Eine Art des Eingreifens ist die Behandlung von Krankheiten mit rekombinanten Proteinen, wie Antikörpern oder Enzymen. Die Wirkspezifität dieser biopharmazeutischen Wirkstoffe ermöglicht die Behandlung von bisher schwer zu therapierenden Erkrankungen wie maligne Neoplasie oder multiple Sklerose. Je komplexer der Wirkmechanismus des eingesetzten Medikaments ist, desto komplexer ist das Biomolekül welches zum Einsatz kommt. Diese Komplexität hat Auswirkungen auf die Prozessierbarkeit des Biopharmazeutikums. Insbesondere die kolloidale und konformelle Stabilität des Zielmoleküls ist eine Herausforderung während des Herstellungsprozesses, des Aufreinigungsprozesses und der Formulierung. Proteinlösungsinstabilitäten können Prozessverzögerungen oder im schlimmsten Fall lebensbedrohliche Immunreaktionen im Körper des Patienten verursachen und sind daher wichtig zu kontrollieren.
Die Stabilität des Biomoleküls ist abhängig von der Beschaffenheit des Moleküls an sich sowie den Umgebungsbedingungen. Ein Lösungsparameter mit hohem Einfluss ist die Proteinkonzentration. Um die Prozesskosten zu senken und die Verabreichung des Medikaments zu erleichtern, wird die Konzentration des Zielmoleküls während der Verarbeitung und der Formulierung maximal erhöht. Die Erhöhung der Proteinkonzentration hin zu hochkonzentrierten Bedingungen hat nicht nur Auswirkungen auf die Proteinstabilität sondern erhöht auch die mögliche Anzahl von Mechanismen, die diese beeinflussen. Der Parameterraum vergrößert sich mit dem zunehmenden Einfluss von hauptsächlich attraktiven kurzreichweitigen Wechselwirkungen. Zusätzlich werden, durch die Erhöhung der Molekülzahl, die in idealer Lösung vorliegenden zweidimensionalen Protein-Wechselwirkungen mehrdimensional, sodass eine Charakterisierung mittels herkömmlicher prädiktiver Analysemethoden an ihre Grenzen stößt. Um die Lösungsstabilität von hochkonzentrierten Proteinlösungen und Formulierungen sicherzustellen ist es wegen fehlender prädiktiver Methoden gängige Praxis, das Molekül von Interesse unter variierenden Lösungsbedingungen über eine Zeit von 12-24 Monaten zu lagern und daraufhin auf Entfaltung oder Aggregation zu analysieren. Diese Methode ist zeit- und kostenintensiv. Mit Hilfe dieser Methode wird außerdem ausschließlich Wissen über den Stabilitätsbereich gewonnen, allerdings keine Informationen über den Mechanismus dahinter, welcher für die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere Moleküle oder Lösungsbedingungen von Bedeutung wäre.
Es werden innovative, neuartige Methoden gefordert, welche das Verhalten von Proteinen in hochkonzentrierten Bereich besser charakterisieren können. Außerdem gilt es Parameter zu evaluieren, die eine Vorhersage der Lösungsstabilität auch im hochkonzentrierten Bereich ermöglichen. Eine vielversprechende Methode zur Analyse komplexer Flüssigkeiten, wie hochkonzentrierte Proteinlösungen, ist die Rheologie.
Rheologie ist die Lehre der fließenden Stoffe und beschreibt damit das Fließverhalten und die Verformung von Materie. Nach der Lehre der Rheologie werden Versuchsobjekte nach ihrer Elastizität beziehungsweise ihrer Viskosität unterteilt. Bei einem ideal elastischen Körper ist das Ausmaß der Deformation direkt proportional zur eingesetzten Spannung und der Körper bewegt sich nach der Krafteinwirkung in seine Ausgangslage zurück. Ein ideal viskoser Körper reagiert auf eine Krafteinwirkung mit einer zeitlich verzögerten Deformation und die Verformung ist irreversibel. Proteinlösungen verhalten sich viskoelastisch. Das bedeutet, dass sie nach Aufbringung einer Kraft nur unvollständig relaxieren, also teilweise elastisches, teilweise viskoses Verhalten aufweisen. Die viskoelastischen Eigenschaften von Fluiden sind von der Größe und Anzahl der Moleküle in Lösung, deren Flexibilität, Vernetzungs- und Interaktionsgrad abhängig. Die Änderungen des viskoelastischen Verhaltens von Fluiden können sehr genau durch das Speicher- und das Verlustmodul (G' und G'') beschrieben werden. Im Gegensatz zu Industriezweigen wie der Lebensmittel- oder Kosmetikindustrie ist die Charakterisierung des viskoelastischen Verhaltens von Proteinlösungen in der biopharmazeutischen Industrie noch nicht etabliert.
Ziel dieser Arbeit war es deshalb, das Potenzial der Rheologie für die biopharmazeutische Prozess- und Formulierungsentwicklung zu untersuchen. Hierbei lag der Fokus auf der Charakterisierung des viskoelastischen Verhaltens hochkonzentrierter Proteinlösungen. Darüber hinaus wurden die ermittelten rheologischen Parameter auf ihre Eignung zur Vorhersage der Langzeitstabilität von Proteinlösungen geprüft. Um den prädiktiven Ansatz zu verfeinern, wurden in einem nächsten Schritt die rheologischen Messungen mit Ergebnissen orthogonaler Analytikmethoden kombiniert. Darüber hinaus wurde die Mikrorheologische Technik durch ein Tracer-Partikel-Screening optimiert.
Vorbereitend zur rheologischen Charakterisierung, wurde die Handhabung und Standardanalytik von hochkonzentrierte Proteinlösungen optimiert. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung eines analytischen Mikrofluidik-Chips der die automatisierte Messung der Proteinkonzentration mittels UV Absorption ermöglicht.
Bei kommerziell erhältlichen Geräten, für die Bestimmung der Proteinkonzentration, ist entweder die Hochdurchsatzkompatibilität oder der Messbereich limitierender Faktor. Für die exakte Bestimmung der Proteinkonzentration, müssen daher hochkonzentrierte Proteinlösungen um ein vielfaches verdünnt werden, was bei geringem Probenvolumen zu hohen Abweichungen und Zeitverlust führen kann. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit für die automatisierte Hochdurchsatzmessung im Mikrolitermaßstab ein Silikon-Chip entwickelt, der die direkte Bestimmung der Absorption von hochkonzentrierten Proteinlösungen zulässt. Der Chip wurde nach ICH Guidelines validiert und die Anwendung mit Hilfe einer Fallstudie demonstriert. Die Verwendung des Chips ermöglicht Absorptionsmessungen im 96-well kompatiblen Maßstab in einem Protein-Konzentrationsbereich von 0.1-100~mg/ml mit einer Genauigkeit von 99.2 %.
Als zweiter vorbereitender Schritt wurde ein Roboter-basiertes Verfahren zur Generierung von Proteinphasendiagrammen auf hochkonzentrierte Proteinlösungen angepasst. Die so erzeugten Proteinphasendiagramme wurden verwendet, um das Langzeitstabilitätsverhalten der Proteine mit den rheologischen Messungen zu vergleichen. Diese Methodik wurde zur Herstellung von mehr als 20 Phasendiagrammen mit variierender Proteinart, Proteinkonzentration, Additivart und Konzentration sowie variierendem pH-Wert verwendet.
Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der rheologischen Charakterisierung und der Interpretation der erhaltenen viskoelastischen Eigenschaften von Proteinlösungen unter wechselnden Prozess- und Formulierungsbedingungen. Für die schwach viskoelastischen Proteinlösungen wurden für die Ermittlung der rheologischen Parameter Oszillationsversuche im Hochfrequenzbereich durchgeführt. Hierbei wurden G' und G'' über einen Frequenzrampe bei oszillierender Quetschströmung ermittelt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die Definition geeigneter viskoelastischer Parameter zunächst ein rheologisches Screening mit dem Modellprotein Lysozym aus Hühnerei in einem Konzentrationsbereich von 100-225 mg/ml unter variierenden Lösungsbedingungen durchgeführt. Mit Hilfe dieses Screenings konnte gezeigt werden, dass hochkonzentrierte Proteinlösungen ein für Polymere charakteristisches viskoelastisches Verhalten aufweisen. Des Weiteren wurde der ωCO Wert aller vermessenen Proben zum Zeitpunkt t0 berechnet und erfolgreich mit dem Phasenverhalten von Lysozym nach 40 Tagen Inkubationszeit (t40) korreliert. Das groß angelegte Screening ermöglichte es eine Löslichkeitsgrenze für Lysozym basierend auf den ωCO Werten zu ziehen. Der ermittelte ωCO Grenzwert schafft die Voraussetzung die Langzeit-Lösungsstabilität von Lysozym, mit nur einer rheologischen Messung, direkt nach Probenpräparation bestimmen zu können.
In einem nächsten Schritt wurde der prädiktive rheologische Ansatz mit  Molekulardynamik (MD)-Simulationen kombiniert. Die in dieser Arbeit eingesetzten MD-Simulationen geben Aufschluss über die Oberflächencharakteristik der untersuchten Proteine und können somit die Langzeit-Lösungsstabilität, welche durch den rheologischen Ansatz vorhergesagt wurde, begründen. Hierzu wurde eine Fallstudie mit Glutathione-S-Transferase in ihrer Reinform und fusioniert mit einem potentiell löslichkeitserhöhenden Tag (Cherry-TagTM) unter variierenden Lösungsbedingungen durchgeführt. Die rheologische Charakterisierung der beiden Proteine ermöglichte eine präzise Vorhersage der kolloidalen und konformellen Lösungsstabilität. Das rheologische Screening gab Aufschluss über den stark löslichkeitserhöhenden Charakter des verwendeten Cherry-TagsTM. In Kombination mit den Ergebnissen der MD-Simulation, konnte die Löslichkeitserhöhung auf eine starke Änderung der Oberflächenladung und der Oberflächenhydrophobizität, hervorgerufen durch den Cherry-Tag, zurückgeführt werden.
Monoklonale Antikörper und ihre Untergruppen besitzen das am schnellsten wachsende Anwendungsfeld in der pharmazeutischen Industrie. Durch die Komplexität und die Größe dieser Moleküle wird deren Langzeitstabilität als besonders kritisch eingestuft. Erschwerend kommt hinzu, dass neue Applikationsformen Antikörpertiter von mehr als 100 mg/ml in der Endformulierung voraussetzen. Um diesen Herausforderungen entgegenzutreten, wurde die Untersuchung der Viskoelastizität auf Antikörper unter prozessrelevanten Bedingungen übertragen. Es konnte gezeigt werden, dass viskoelastische Messungen sehr sensitiv gegenüber Änderungen der Lösungsbedingungen von Antikörperformulierungen sind, und dass der vorgestellte Parameter ωCO die kolloidale Stabilität des untersuchten Antikörpers exakt vorhersagen kann. Die rheologische Analytik wurde zudem mit etablierten, orthogonalen Methoden zur Charakterisierung der Proteinoberfläche, der Proteinmobilität und thermischen Stabilitätsuntersuchungen verknüpft. Die Anwendung der so entstandenen analytischen Toolbox gewährleistet eine präzise Vorhersage der Proteinlösungsstabilität und ist somit ein wichtiger Beitrag für die schnelle Entwicklung stabiler und sicherer Formulierungen von Biopharmazeutika.
Die Anwendung mechanische Hochfrequenz-Rheologie, die für die oben aufgeführten Screenings verwendet wurde, ist in der pharmazeutischen Industrie nicht etabliert, und eine entsprechendes Gerät ist derzeit nicht im Handel erhältlich. Daher wurde parallel zur Verwendung der mechanischen Rheologie die Optimierung der mikrorheologischen Technik vorangetrieben. Bei mikrorheologischen Messungen werden die Parameter G' und G'' mittels dynamischer Lichtstreuung bestimmt. Um reproduzierbare, korrekte Ergebnisse zu erzielen, ist es erforderlich, dass die Tracerpartikel nicht mit den Proteinen in Lösung wechselwirken. In einer Studie wurden daher die Oberflächencharakteristik und die Interaktionsneigung vier unterschiedlicher Tracerpartikel untersucht. Festgestellt wurde, dass die Wahl des Tracerpartikels einen großen Einfluss auf die rheologischen Ergebnisse hat. Ein intern hergestelltes Polystyrolpartikel mit modifizierter Oberfläche stellte sich als einzig geeigneter Tracerpartikel für die rheologische Untersuchung von in dieser Studie untersuchten Proteinlösungen heraus. Mit diesem konnte eine hohe Messgenauigkeit und eine gute Korrelation mit den Ergebnissen mechanischer Rheometer erreicht werden.
Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein umfassendes Bild der viskoelastischen Eigenschaften von hochkonzentrierten Proteinlösungen gewonnen. Im Speziellen konnte eine ausführliche Charakterisierung hochkonzentrierter Proteinlösungen erreicht und ein rheologischer Parameter, ωCO eingeführt werden, der prädiktive Aussagen über die Lösungsstabilität der hochkomplexen Lösungen zulässt. Der eingeführte und validierte Parameter ermöglicht, gerade in Kombination mit weiteren hier verwendeten analytischen Verfahren, eine schnelle und sichere Charakterisierung von viskoelastischen Fluiden und kann so auch in anderen Forschungsdisziplinen Anwendung finden.