title: High-performance liquid chromatography with packed microchips
title: High-performance liquid chromatography mit gepackten Mikrochips
Creators: name: Ehlert, Steffen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: HPLC
Chemie
Dispersion
Porosität
Chromatographie
Microchips
Chromatography
van Deemter
Mikrochips

description: Die Arbeit beschäftigt sich mit dem
      Einfluss der Packungsporosität zylindrischer Kapillaren und
      nicht-zylindrischen Kanalgeometrien von Mikrochips auf die
      Trenneffizienz. Die Reduzierung der Peakdispersion
      einhergehend mit einer Verbesserung der chromatographischen
      Trenneffizienz ist das größte Problem was bei Mikro- und
      Nanotrennsystemen gelöst werden muss, damit alle positiven
      Einträge die durch die Miniaturisierung erreicht werden auch
      vollständig ausgenutzt werden können. Hierzu wurden
      zylindrische Kapillaren mit einem Durchmesser von 30 bis 250
      µm mit 5 µm Partikeln gepackt und diese hinsichtlich ihrer
      Porosität in Abhängigkeit von der Kanalquer-schnittsfläche
      bei konstantem Partikeldurchmesser untersucht (Kapitel 2).
      Zusätzlich wurden zwei individuelle Messmethoden evaluiert
      die erste basierend auf der inversen
      Grössenausschlusschromatographie und die zweite auf der
      Donnan-Ausschluss-Chromatographie, die es ermöglichten die
      Porosität der gepackten Strukturen sicher zu bestimmen
      (Kapitel 3). Kapitel 4 beschäftigt sich mit der
      Weiterentwicklung eines HPLC (high performance liquid
      chromatography) Mikrochips von Agilent Technologies
      (Waldbronn, Germany). Hierzu wurden systematische Studien der
      Trenneffizienz in Abhängigkeit von der Porosität der
      nicht-zylindrichen Kanalgeometrie der Chips erstellt und
      mittels UV-Detektion vermessen. Dazu wurden verschiedene
      Packprozesse evaluiert (Variation der Packdrücke und die
      Implementierung von Ultraschall in den Packprozess) und die
      sich daraus ergebenden Packungsporositäten und
      Trennleistungen unter isokratischen Bedingungen untersucht.
      Die Daten zeigten klar, dass sich mit optimierter
      Packungsporosität die isokratischen Trennleistungen durch die
      optimierten Dispersions- und Massentransfer-eigenschaften der
      gepackten nicht-zylindrischen Trennkanäle deutlich erhöhen
      ließen. In Kapitel 5 wurden die Ergebnisse der Untersuchungen
      aus Kapitel 4 auf die kommerziell erhältlichen HPLC/MS-Chips
      übertragen und unter isokratischen Bedingungen evaluiert und
      verglichen. Wie nicht anders zu erwarten, konnte eine sehr
      hohe Übereinstimmung der Trenneffizienzen in Abhängigkeit von
      der Packungsporosität zwischen den beiden Systemen (HPLC/UV
      und HPLC/MS-Chips) festgestellt werden. Kapitel 5 und 6
      beschäftigen sich mit der Evaluierung der
      Trenneffizienzsteigerung unter Gradientenelutionsbedingungen.
      Dafür wurden kleine pharmazeutische Moleküle und etwas
      komplexere biologische Proben (BSA und Cohn Fraktion IV-4)
      chromatographisch vermessen. Die Daten zeigten, dass selbst
      unter der Verwendung von steilen Gradienten sich die
      Trenneffizienz deutlich erhöhte, einhergehend mit einer
      gesteigerten Peptididentifikationsrate und Peakkapazität für
      die untersuchten Analytzusammensetzungen. Dieses liegt
      begründet in den reduzierten Dispersionseigenschaften der
      optimiert gepackten Festbetten, die zu deutlich schmäleren
      Peaks (reduzierte Peakbreiten) führte. Die Arbeit zeigt im
      Detail in Kapitel 2 (Packing density of slurry-packed
      capillaries at low aspect ratios) den Einfluss des
      geometrischen Wandeffektes in polyimid-ummantelte
      Glaskapillaren (fused silica) in Abhängigkeit vom
      Partikeldurchmesser (dP) zu Säulenquerschnitt (dC) Verhältnis
      von 5 &lt; dC/dP &lt; 50. Hierzu wurden die Kapillaren (30 µm
      -250 µm Durchmesser) mittels einer Suspension aus
      chromatographischem Packmaterial (5 µm Partikel) gepackt und
      hinsichtlich ihrer Porosität des generierten Packungsbettes
      untersucht. Die Bestimmung der Packungsdichten beruhte dabei
      auf dem Größenausschluss von Polystyrolstandards definierter
      Masse, die sich im verwendeten Laufmittel Dichlormethan in
      Abhängigkeit ihrer Molmasse zu definierten Kugeln knäulen und
      somit vom intrapartikulären Porenraum der Packungsmaterialien
      sterisch ausgeschlossen werden [1, 2]. Die Elutionszeit der
      ausgeschlossenen Polystyrole kann somit zur Bestimmung des
      sogenannten Zwischenkornvolumen oder auch interpartikulären
      Porosität (inter) herangezogen werden. Zunächst konnte
      festgestellt werden, dass die intrapartikuläre Porosität
      (intra) der Partikel erwatungsgemäß unabhängig vom
      dC/dP-Verhältnis ist (intra ≈ 0,29), da die Porosität der
      Partikel als unabhängige konstante Größe angenommen werden
      konnten. Im Gegensatz dazu nahmen die Packungsporositäten von
      inter ≈ 0,47 bei dC/dP = 5 bis hin zu inter = 0,36-0,37 bei
      dC/dP = 40-50 ab. Die systematische Zunahme von inter und
      total (totale Porosität) mit abnehmendem Säulendurchmesser,
      also mit abnehmendem dC/dP-Verhältnis, ist abhängig vom
      geometrischen Wandeffekt, der die realisierbaren Porositäten
      stark beeinflusst. An der starren Wandregion kann nur eine
      sehr viel höhere Porosität erzielt werden (direkt an der Wand
      ist die Porosität 1). Die Anordnung der Partikel und die sich
      daraus ableitende ortsgebundene Porosität verteilt sich
      statistisch in einer gedämpften Schwingung über einen Bereich
      von 4-5 Partikeldurchmessern bis hin zu einer zufälligen
      (random) Anordnung in der Mitte des Kanalquerschnittes, wenn
      diese Region überhaupt erreicht wird. Es ist daher nicht
      verwunderlich, dass bei sehr kleinen Kanalquerschnitten und
      daraus resultierenden geringen dC/dP-Verhältnissen der
      Einfluss der höheren Porosität in der Wandregion auf die
      Porosität über gesamten Kanalquerschnitt steigt. Dieses
      Zusammenspiel zwischen Wand- und Kernregion ist entscheidend
      für die Homogenität der Verteilung einer Packungsstruktur
      über den Kanalquerschnitt. Es sollte das dC/dP-Verhältnis
      entweder so groß gewählt werden, dass der relative Einfluss
      der Wandregion zurückgedrängt wird, oder so klein das er
      vorherrschend ist. Es ist daher nicht verwunderlich, das in
      den Arbeiten von Jorgenson [3, 4] die Trenneffizienz der 5 µm
      Partikel basierten Packungen bei einer Reduzierung des
      Kanalquerschnitts von 50 auf 12 µm ansteigt. Bei so kleinen
      dC/dP-Verhältnissen dominiert die „lose“ gepackte Wandregion,
      was aber zu einer effektiv höheren Homogenität der Packung
      führt und somit das dispersive Verhalten der Analyten
      innerhalb der Packungsstruktur angleicht (homogenisiert).
      Kapitel 3 (Determination of the interparticle void volume in
      packed beds via intraparticle Donnan exclusion) stellt einen
      sehr einfachen und vertrauenswürdigen Alternativansatz zur
      inversen Größenausschlusschromatographie (ISEC) zur
      Bestimmung der Packungsporositäten in zylindrischen
      Kapillaren vor. Basierend auf dem elektrostatischen
      Ausschluss (Donnan-Ausschluss) eines geladenen (nicht
      retardierenden) Analyten (Nitrat-Ionen) ist es möglich das
      interpartikuläre Volumen (Vinter) und somit die
      interpartikulare Porosität (inter) zu bestimmen. Dazu wurden
      Kapillaren mit einem Durchmesser von 75 µm mit verschiedenen
      Partikelgrößen, Porengrößen und unterschiedlichen
      Oberflächenmodifikationen in Abhängigkeit der
      Pufferzusammensetzung (Tris-HCl-Puffer) evaluiert. Die
      Theorie des elektrostatischen Ausschlusses liefert eine klare
      und eindeutige Abgrenzung der Grenzflächenphänomene der
      ladungsselektiven Mesoporen (Porenraum innerhalb der
      Partikel) und der nicht-ladungsselektiven Makroporen
      (Porenraum zwischen den Partikeln). Dieser Ansatz erlaubt es
      den Donnan-Ausschluss geladener Analyten in Abhängigkeit der
      etablierten elektrischen Doppelschichtüberlappung (EDL
      overlap) unter den gegebenen physikalischen Bedingungen
      (Porengröße, Partikeldurchmesser und Pufferstärke) zu
      etablieren. Die dabei bestimmten Porositäten stimmten sehr
      gut mit den durch die ISEC-Methode erzielten überein. Die
      Limitierungen der beiden Methoden (ISEC-und
      Donnan-Ausschluss) basieren auf denselben Bedingungen. Sind
      die Partikel zu klein (&lt; 3 µm), kann es zu einem
      Größenausschluss der Polystyrole vom Außenraum kommen, genau
      wie es zu einem elektrostatischen Ausschluss der Nitrat-Ionen
      kommen kann, wenn die Doppelschichtdicken sich zwischen den
      Partikeln zu überlappen beginnen. Zudem ist es schwierig die
      Ausschlussbedingungen für sehr große Porengrößen (1000 Å) zu
      erzielen, da unter diesen Bedingungen die Polystyrole so groß
      und die Pufferstärken so niedrig gewählt werden müssen, dass
      es auch zu einem zwischenpartikulären Ausschluss der Analyten
      kommen kann und somit eine genaue Bestimmung der Porosität
      nicht ohne weiteres möglich ist. Basierend auf den
      Untersuchungen die mit Hilfe der zylindrischen Glaskapillaren
      ausgearbeitet wurden (Kapitel 2 und 3), bestand die
      Hauptaufgabe der Arbeit darin, den Einfluss der
      Packungsporosität des HPLC-Chips Systems von Agilent
      Technologies (Waldbronn, Germany), das eine
      nicht-zylindrische Kanalgeometrie (trapezförmig) aufwies, in
      Abhängigkeit des Packprozesses zu untersuchen (Kapitel 4 -
      Separation Efficiency of Particle-Packed HPLC-Microchips).
      Simulationen in unserer Gruppe haben deutlich gezeigt, dass
      die dispersiven Eigenschaften eines Analyten und die daraus
      resultierenden Trenneffizienzen stark von der Porosität und
      der Kanalgeometrie abhängen [5]. Diese Arbeiten zeigen, dass
      mit abnehmender Symmetrie der Kanalquerschnittsfläche
      (Zylinder  Quadrat  Rechteck  Halbkreis) und hohen
      Packungsporositäten (inter = 0,48) der Einfluss der „Ecken“
      auf die Homogenität des Flussfeldes der mobilen Phase (und
      somit auch der sich darin befindlichen Analyten) abnimmt.
      Dies geht einher mit der Zunahme der Dispersion und einer
      reduzierten Trenneffizienz. Ist es jedoch möglich, die
      nicht-zylindrichen Kanalgeometrien effektiv und dicht zu
      Packen (vor allem die „Ecken“), reduziert sich der zusätzlich
      dispersive Eintrag dieser, bis hin zu äquivalenten
      dispersiven Eigenschaften zwischen zylindrischen und
      nicht-zylindrischen Trennkanälen. Somit ist eine annähernd
      gleiche Trenneffizienz zwischen den verschiedenen
      Kanalgeometrien realisierbar, wenn die interpartikuläre
      Porosität hin zu optimieren Packungsstrukturen reduziert
      werden kann (inter ≤ 0,40). Zur Bestimmung der
      Packungsdichten musste jedoch zuerst ein Prototyp HPLC-Chips
      Design entwickelt werden, da die zur Bestimmung der
      Packungsporositäten verwendete ISEC-Methode auf die
      kommerziell erhältlichen HPLC/MS-Chips nicht anwendbar war
      (Kapitel 4). Hierzu wurde ein Chip neu erstellt, der eine
      on-Chip UV Detektion ermöglichte, um die UV-aktiven
      Polystyrole als auch die zur Trenneffizienz verwendeten
      Analyten untersuchen und detektieren zu können. Beide
      Chipsysteme wiesen eine hohe Übereinstimmung im Verhältnis
      zwischen Trennkanalvolumen zu on-Chip Totvolumen auf (110 für
      den HPLC/UV Chip und 150 für den HPLC/MS Chip), was einen
      späteren Vergleich der Trenneffizienzen erst ermöglichte. Im
      Einzelnen ist in Kapitel 4 beschrieben, dass die
      Packungsporosität für die HPLC/UV Chips mit zunehmendem
      Packdruck und der Implementierung von Ultraschall in den
      Packprozess systematisch reduziert werden kann. Dazu wurden
      folgende Packzyklen miteinander Verglichen: 150 bar ohne
      Ultraschall, 150 bar mit Ultraschall, 300 bar ohne
      Ultraschall und 300 bar mit Ultraschall. In Abhängigkeit der
      applizierten Packprozesse konnte eine stetige Abnahme der
      Porositäten von inter = 0,475, inter = 0,46, inter = 0,45,
      bis hin zu inter = 0,42 beobachtet werden. Die erzielen
      Porositäten für den Packprozess mit 300 bar und Ultraschall
      waren vergleichbar zu denen, die mit kommerziell erhältlichen
      zylindrischen Glaskapillaren mit vergleichbaren
      Kanalquerschnitt und den gleichen Packungsmaterialen (inter
      = 0,42) erhalten wurden. Wie nicht anders zu erwarten, wurden
      die chromatographischen Trenneffizienzen mit abnehmender
      Porosität verbessert. Dies zeigte sich in der Darstellung von
      Bodenhöhenkurven die mit den einzelnen Chips vermessen
      wurden. Mit abnehmender Porosität reduzierten sich die
      zusätzlichen dispersiven Einträge innerhalb des Trennkanals
      und die generierten Packungen waren homogener. Die Mimima der
      Bodenhöhenkurven wurden zu höheren linearen Geschwindigkeiten
      verschoben und der Anstieg vor allem im C-Term wurde deutlich
      reduziert [6]. Dies bedeutet, dass der
      Massentransferwiderstand deutlich reduziert werden konnte auf
      Grund der Reduzierung des Einflusses des geometrischen
      Wandeffektes, einhergehend mit dem Zurückdrängen des
      dispersiven Eintrages der „Ecken“ durch eine dichtere Packung
      der nicht-zylindrischen Kanalgeometrie. Für den
      abschließenden Vergleich der Ergebnisse, die mit den HPLC/UV
      Chips erzielt werden konnten, wurden die kommerziellen
      HPLC/MS-Chips mit den gleichen Packprozessen gepackt und
      hinsichtlich ihrer Trenneigenschaften unter isokratischen und
      Gradientenelutionsbedingungen evaluiert (Kapitel 5 -
      Performance of HPLC/MS microchips in isocratic and gradient
      elution modes). Hierzu wurden basierend auf den
      Permeabilitätsdaten der HPLC/UV Chips die Porositäten der
      HPLC/MS Chips abgeschätzt (basierend auf deren
      Permeabilitäten). Es war festzustellen, dass die HPLC/MS
      Chips noch einmal eine etwas geringere Porosität innerhalb
      der Trennkanäle aufwiesen (5 µm Partikel, 150 bar ohne
      Ultraschall, inter ≈ 0,46; 5 µm Partikel, 300 bar und
      Ultraschall, inter ≈ 0,41; und für 3.5 µm Partikel 300 bar
      und Ultraschall, inter ≈ 0,39). Dieses lag darin begründet,
      dass die Trennkanäle der HPLC/MS Chips mit 43 mm etwas kürzer
      waren als die der HPLC/UV Chips (73 mm) und somit bei
      gleichem applizierten Druck während des Packprozesses, sich
      ein steilerer Druckgradient über die Kanallänge etablierte,
      der die kürzere Kanalstrecke begünstigte. Es war jedoch
      festzustellen, dass die HPLC/MS Chips bei niedrigen
      Retentionsfaktoren (k’) der Analyten trotzdem eine
      schlechtere Trennleistung aufwiesen. Diese konnte darauf
      zurückgeführt werden, dass es bei den MS Chips, operativ
      bedingt (auf Grund der MS-Detektion), zusätzliche externe
      Volumenbeiträge (externe Banden-verbreiterungsbeiträge) durch
      die Überführung der ionisierten Analyten in das
      Massenspektrometer gab. Um diesen absoluten Beitrag zur
      Bandenverbreiterung zu minimieren, wurden die Analysen bei
      sehr hohen k’-Werten durchgeführt, da dort der relative
      Beitrag zur Gesamtdispersion vernachlässigt werden kann [7].
      Daher wurde der Vergleich der Trenneffizienzen der beiden
      Chipsysteme bei k’ = 35 (UV) und k’ = 28 durchgeführt. Der
      Unterschied in den Retentionsfaktoren, trotz gleicher
      Laufmittelzusammensetzung (50/50 Acetonitril/Wasser (v/v)),
      beruhte auf den unterschiedlichen Temperaturen während der
      Messungen (298 K ± 1 UV; Raumtemperatur und 313 K ± 1 MS;
      Temperatur im MS-System). Die höheren Temperaturen während
      der massenspektrometrischen Untersuchungen reduzieren die
      Viskosität und Dichte des Laufmittels und sorgen zusätzlich
      für einen erhöhten Massentransfer der Analyten im Trennkanal,
      was Retentionsverhalten der zu trennenden Substanzen
      beeinflusst und zu geringeren Retentionsfaktoren führt [7].
      Die erzielten reduzierten minimalen Bodenhöhen (hmin) für die
      optimierten Packungsbetten der HPLC/UV Chips lagen somit bei
      hmin = 2,5 und für die HPLC/MS Chips bei hmin = 2,1. Diese
      Werte zeigten deutlich die Konkurrenzfähigkeit der
      optimierten Packungsstrukturen des HPLC/MS Chipsystems im
      Vergleich zu anderen kommerziell erhältlichen nano-Säulen.
      Der Trend der erhöhten Trenneffizienzen in Abhängigkeit der
      Packungsstruktur wurde dann in der Anwendung mittels kleiner
      pharmazeutischer und komplexer biologischer Analyten
      vervollständigt (Kapitel 5 - Performance of HPLC/MS
      microchips in isocratic and gradient elution modes). Dazu
      wurden 11 pharmazeutische Analyten mit den HPLC/MS Chips
      untersucht unter Verwendung verschiedener
      Gradientensteilheiten. Dabei beschränkte sich die Evaluierung
      der Effekte auf die Chips gepackt mit 5 µm 150 bar ohne
      Ultraschall, 5 µm 300 bar mit Ultraschall und 3,5 µm 300 bar
      und Ultraschall. Hierbei war deutlich festzustellen, relativ
      unabhängig vom verwendeten Gradienten, dass sich die
      Peakbreiten um ~ 15% verringerten und die Auflösung der Peaks
      um ~ 20% erhöht wurde, wenn man die beiden 5 µm Festbetten
      miteinander verglich. Dieselbe Peakbreitenverbesserung (~
      15%) und Auflösungserhöhung (~ 20%) war festzustellen
      zwischen den optimierten 5 µm und den optimierten 3,5 µm
      Packungsstrukturen. Diese Daten korrespondierten in sehr
      guter Übereinstimmung mit den bereits evaluierten
      isokratischen Messungen aus Kapitel 4. In Kapitel 6 (Improved
      particle-packed HPLC/MS microchips for proteomic analysis)
      wurden abschließend ein tryptischer Verdau des wenig
      komplexen BSA und der hoch komplexen Cohn4-IV-Fraktion in die
      Bestimmung der chromatographischen Trenneffizienzen
      integriert. Hier zeigten sich vier deutliche Trends: 1. Die
      Reproduzierbarkeit der Messungen gerade bei sehr niedrigen
      injizierten Konzentrationen verbesserte sich mit zunehmender
      Packungsqualität, was eine Anwendung der Chips für
      Langzeitstabilitätsuntersuchungen begünstigt. 2. Es war
      möglich, die Nachweisgrenze hin zu geringeren Konzentrationen
      zu verschieben, was eine Anwendung in der Spurenanalytik
      weiter bevorteilt, und 3. war es möglich, die
      Identifikationsrate von Peptiden mit der Cohn-Fraktion mit
      verbesserter Packungsqualität zu erhöhen. So konnten mit der
      nicht optimierten 5 µm Packung nur 126, mit der optimierten 5
      µm Packung 143 und mit der optimierten 3,5 µm sogar 175
      Peptide identifiziert werden. Dies bedeutete einen
      Identifikationsgewinn in einem chromatographischen Lauf von
      fast 40%. Durch die verbesserten Peakbreiten und Auflösungen
      war es möglich, mehr diskret von einander getrennte Peaks in
      das MS zu überführen, was die Ionenverdrängung (ion
      suppression) herabsetzte. 4. Es konnten auch die
      Peakkapazitäten mit abnehmender Packungsporosität deutlich
      erhöht werden. Im Einzelnen konnten Verbesserungen der
      Peakkapazitäten für den BSA-Verdau von ca. 40% für die
      optimierten 5 µm (300 bar und Ultraschall) und zwischen
      76-94% für die Packungen mit 3,5 µm (300 bar und Ultraschall)
      erzielt werden im Vergleich mit den 5 µm Packungsstrukturen
      die mit 150 bar ohne Ultraschall generiert wurden.
      Diesbezüglich wurden für den Cohn-Verdau eine Erhöhung der
      Peakkapazitäten von 58% und 94% im Vergleich erreicht.
      Zusammenfassend kann man sagen, dass es von äußerster
      Wichtigkeit ist, mikrofluidische Trennsysteme mit einer
      effizienten und niedrigen Packungsporosität auszustatten.
      Dazu ist es wichtig, die Packprozesse für die Trennkanäle zu
      optimieren, was sowohl die Applikation von hohem Druck als
      auch Ultraschall während der Packungsgenerierung beinhaltet.
      Nur so ist es möglich, effiziente chromatographische
      Trennungen durchzuführen und das Potenzial der
      Miniaturisierung und der damit einhergehenden Minimierung
      externer Bandenverbreiterungsbeiträge auch wirksam
      auszunutzen. Diese Verbesserungen führen gerade bei denen in
      der pharmazeutischen Industrie häufig angewendeten
      Gradientenelutionen zu einem Identifikationsgewinn vor allem
      bei komplexen Probenmatrizes, einer verbesserten
      Langzeitstabilität und zu einer hoch effizienten Trennung von
      kleinen und komplexen Analysenmolekülen. Es ist möglich auf
      mikrofluiden Trennsystemen Packungsporositäten zu erreichen
      die vergleichbar mit denen der weitverbreiteten zylindrischen
      Kapillaren sind. Grundvoraussetzung hierfür ist jedoch, dass
      die miniaturisierten Trennsysteme ausreichend druckstabil
      sind, um den erforderlichen Drücken und der Applikation von
      Ultraschall während des Packprozesses und den Drücken im
      Betrieb stand halten zu können. Gerade die Verwendung von
      Ultraschall ist bei geringen
      Säulenquerschnittsflächen-zu-Partikeldurchmesser-Verhältnissen
      essenziell, um eine hohe Packungsdichte und somit eine
      effiziente Trennung zu erreichen. Das als Basis nehmend, kann
      der Effekt der Miniaturisierung und Integration der
      Chromatographie auf ein einzelnes Gerät (miniaturisierte
      Gesamtanalysensysteme; µTAS) mit allen seinen Vorteilen
      hinsichtlich der Reduzierung von Analytkonzentrationen,
      Dispersion und Wegstrecken der Analyten durch das System voll
      zum tragen kommen und verspricht die best mögliche
      Trennleistung in der Chromatographie im Nanomaßstab.
      Literatur [1] Ehlert, S.; Rösler, T.; Tallarek U. J. Sep.
      Sci. 2008, 31, 1719-1728. [2] Halász, I.; Martin, K. Angew
      Chem. Int. Ed. 1978, 17, 901-908. [3] Kennedy, R. T.;
      Jorgenson, J. W. Anal. Chem. 1989, 61, 1128-1135. [4] Hsieh,
      S.; Jorgenson, J.W. Anal. Chem. 1996, 68, 1212-1217. [5]
      Khirevich, S.; Höltzel, A.; Hlushkou, D.; Tallarek, U., Anal.
      Chem. 2007, 79, 9340- 9349. [6] Ehlert, S.; Kraiczek, K.;
      Mora, J.-A.; Dittmann, M.; Rozing, G. P.; Tallarek, U. Anal.
      Chem. 2008, 80, 5945-5950. [7] Guiochon, G. J. Chromatogr. A
      2006, 1126, 6-49.
description: This work is explaining the
      importance of generating a densely packed chromatographic bed
      to achieve optimum separation efficiency in miniaturized
      liquid chromatography. The reduction of peak dispersion and
      enhancement of separation efficiency is the important problem
      in micro- and nano-separation that is to be solved to
      generate highly efficient chromatographic systems that can
      exploit all advantages of miniaturization. Therefore, the
      influence of the geometrical wall effect in cylindrical
      nanobore columns and its influence to the obtained packing
      porosities were determined, by varying the column diameter
      from 30 µm to 250 µm and constant particle diameter (5 µm)
      (Chapter 2). In addition, two independent porosity data
      generating chromatographic approaches based on inverse size
      exclusion and Donnan exclusion chromatography were
      investigated, to prove the reliability of the porosity data
      (Chapter 3). Chapter 4 is explaining the optimization of the
      Agilent chromatographic chip system packing process by
      varying the packing conditions (pressure and implementation
      of ultrasound) and provides an experimental analysis and
      consistent interrelation of the packing procedure, resulting
      packing density (interparticle porosity), pressure drop over
      the packed inherent noncylindrical microchannel, and
      separation efficiency. The data revealed a significant
      improvement in separation efficiency with improved bed
      porosity received at different packing conditions. This was
      evaluated by use of isocratic measure of plate height curves.
      Chapter 5 and 6 investigated the enhanced separation
      efficiencies based on the improved bed porosities under
      isocratic and gradient elution conditions for small
      pharmaceutical molecules and more complex biological
      applications (BSA and Human plasma protein fraction; Cohn
      fraction IV-4) with the Agilent high performance liquid
      chromatography mass spectrometry chip system. The data showed
      that the separation efficiency and identification of peptides
      is significantly improved, even under gradient elution with
      continuously improved bed porosities. The improvement in peak
      width and resolution lead to better identifications and
      quantification of the more complex biological chromatographic
      problem. In particular, this work provides evidence for the
      operation of a geometrical wall effect in slurry-packed
      capillaries in a range of capillary diameter (dc) to particle
      diameter (dp) ratios of 5 &lt; dc/dp &lt; 50 (Chapter 2 -
      Packing density of slurry-packed capillaries at low aspect
      ratios). Packing densities are assessed by a polystyrene
      standard which is size-excluded from the intraparticle pore
      space of the packings [1, 2]. It is noted first that, as
      expected, the values for the intraparticle porosity (intra 
      0.29) remain independent of dc/dp because the available
      intraparticle pore space with respect to the overall particle
      volume for rigid particles should remain unaffected by the
      actual density of a packed bed. In contrast, the packed beds
      external porosity shows a steady decrease from inter  0.47
      at dc/dp = 5 towards inter = 0.36-0.37 at dc/dp = 40-50.
      This systematic increase in inter (interparticle porosity)
      and total (total porosity) at decreasing capillary diameter
      (or in other words decreasing dc/dp) lends support to the
      operation of a geometrical wall effect which affects and even
      limits the achievable packing density due to the inherent
      oscillations of interparticle voidage in a transition region
      between the hard inner surface of the fused-silica
      capillaries and the bulk, random-close packing of particles,
      if the latter can be reached at all which depends on the
      actual dc/dp-ratio. When the volumetric contribution of this
      critical wall region to the overall volume of the packed bed
      becomes significant, the interparticle porosity is expected
      to increase. This interplay between a more loosely packed
      wall region and a more tightly packed core region forms the
      basis for explaining the improved performance of fused-silica
      capillaries packed with 5 µm-sized porous C18-silica
      particles in the work of Jorgenson and co-workers [3, 4] as
      the capillary inner diameter is decreased from 50 to 12 µm.
      With such a decrease in aspect ratio the core region
      ultimately disappears and the packing structure is dominated
      by the loosely packed wall region; the packing structure
      becomes effectively more homogeneous. This thesis also
      presents a very simple, fast, and reliable approach for the
      analysis of packing densities by using the interparticle
      Donnan (electrostatic) exclusion method (Chapter 3 -
      Determination of the interparticle void volume in packed beds
      via intraparticle Donnan exclusion). Therefore, interparticle
      void volumes (Vinter) and porosities (inter) of
      particle-packed beds within 75 µm i.d. fused-silica
      capillaries have been determined. The theory of electrostatic
      exclusion provides a clear, physically sharp definition of
      the boundary conditions between (charge-selective) mesopore
      space and (charge-nonselective) macropore space in porous
      media like packed beds. Hence, a complete intraparticle
      Donnan exclusion of an unretained co-ionic tracer (nitrate
      ions) was established and used to determine the porosity of
      the investigated packed beds with different pore and particle
      sizes, and with different surface modifications (bare silica,
      reversed-phase, and strong cation-exchange materials) or
      surface charge densities of the particles, in dependence of
      the mobile phase ionic strength (Tris-HCl buffer). This
      approach allowed the investigation of donnan exclusion of the
      charged analyte based on the electrical double layer (EDL)
      overlap under the aforementioned conditions. The determined
      interparticle porosities agreed well with those analyzed by
      inverse size-exclusion chromatography (ISEC) [2]. Limitations
      to the use of Donnan exclusion (electrostatic exclusion) and
      ISEC (mechanical exclusion) arose from the same principle.
      Exclusion becomes noticeable in the cusp regions between
      particles if the particles became very small (3 µm or less)
      in conjunction with a low bed porosity, and when the
      intraparticle pore diameter is so large that complete
      electrostatic and size exclusion is difficult to realize.
      Nevertheless, this simple and fast technique provides
      reliable porosity data and can be used for, e.g., quality
      control of packed conduits, if the particle packed beds are
      investigated due to the applicability of this approach. Based
      on the findings in chapter 2 and 3, this work also provides
      an experimental analysis and consistent interrelation of the
      packing procedure, resulting packing density (interparticle
      porosity), pressure drop over the packed inherent
      noncylindrical microchannel, and separation efficiency under
      both isocratic and gradient elution conditions for packed
      beds employed in microchip-HPLC (High Performance Liquid
      Chromatography) (Chapter 4 Chapter 4 - Separation Efficiency
      of Particle-Packed HPLC-Microchips). First, a new prototype
      HPLC/UV-microchip design was developed based on the
      commercial HPLC/MS (mass spectrometry) microchips, to ensure
      a suitable porosity measurement of the established beds. This
      became necessary due to the used ISEC-method [2] which needed
      an UV-detection mode and was not applicable with MS. The size
      excluded polystyrene standards reflecting the bed porosity in
      a chromatographic run, were not able to be ionized with the
      electrospray ionization (ESI) mode used with the commercially
      available microchips. Therefore an almost dead volume free
      on-chip UV-detection was implemented to overcome this issue.
      Both chip types had a high, comparable ratio of the
      separation channel volume (packed conduit) to the chip dead
      volume (on chip external volume) of about 110 for the HPLC/UV
      chip design and 150 for the HPLC/MS chip design. This allowed
      investigating the two different chip systems more in detail
      without remarkable aberrations in external contributions
      (external band broadening on-chip). In particular, it is
      demonstrated that the separation channels of suitable
      microfluidic analysis systems, which often cannot tolerate
      the high packing pressures used in conventional column
      packing and the application of ultrasound, can be packed as
      densely as the cylindrical fused-silica capillaries commonly
      used in nano-HPLC (inter = 0.42, with 5 µm-size packing
      materials) (Chapter 4 - Separation Efficiency of
      Particle-Packed HPLC-Microchips). The achieved packing
      densities were comparable to those in nano-HPLC for capillary
      columns characterized by similar column-to-particle size
      ratios as the trapezoidal microchip separation channels when
      packed with the same particles. A consistent decrease in
      inter of the microchips with increasing separation
      efficiency was found. inter decreased in the following
      series of packing modes: 150 bar &gt; 150 bar &amp;
      ultrasound &gt; 300 bar &gt; 300 bar &amp; ultrasound being
      accompanied by a decrease in plate height by a factor of
      about three (with 80/20 acetonirtile/water (v/v)) from the
      microchip packed at 150 bar (inter = 0.475) to the one
      packed at 300 bar and with ultrasound assistance (inter =
      0.42) for the particles with 5 µm size. These complementary
      data confirm that the improvement in separation efficiency
      can be explained by higher packing densities achieved by the
      increased packing pressure and simultaneous application of
      ultrasound [5]. For a final comparison of the data determined
      with the prototype HPLC/UV chips, the HPLC/MS chips were
      packed in analogy to the developed packing procedure of the
      HPLC/UV chips (Chapter 5 - Performance of HPLC/MS microchips
      in isocratic and gradient elution modes). The data clearly
      showed the same trend, as expected. The packing porosity
      decreased for the MS chips from inter ≈ 0.46 (150 bar) to
      inter ≈ 0.41 (300 bar &amp; ultrasound) for the 5 µm
      particles. For the investigated 3.5 µm particles, bed
      porosities of inter = 0.40 (UV chips) and inter ≈ 0.39 (MS
      chips) were found. The slightly different porosities
      determined could be explained by the difference in separation
      channel lengths (UV chips 73 mm and MS chips 43 mm) which
      generated a different pressure drop over the length during
      the packing procedure favoring the MS chips. The separation
      efficiency was investigated by using octanophenone at 50/50
      acetonitrile/water (v/v) at a k’ = 28 (HPLC/MS) and k’ = 35
      (HPLC/UV). The decreased retention on the HPLC/MS chips with
      the same stationary and mobile phases is a consequence of the
      elevated temperature inside the MS-chip-cube compartment (313
      ± 1 K) [6], while the separations with the prototype HPLC/UV
      chips were carried out at 298 ± 1 K. Both ultrasound and high
      pressure are crucial during packing to obtain improved
      separation efficiencies, where the minimum of the plate
      height curves (Hmin) is shifted to lower plate heights and
      higher velocities. For chips packed with 3.5 µm particles at
      300 bar and ultrasonication a good chromatographic
      performance was obtained as reflected by the reduced minimum
      plate heights of hmin = 2.5 (HPLC/UV) and hmin = 2.1
      (HPLC/MS). Even more important, the slope of the plate height
      curves at higher velocities is smaller for the chips packed
      under optimal conditions, enabling shorter analysis times
      without significant reduction of resolution. Surprisingly,
      the separation efficiency for the HPLC/MS chips at low
      k’-values was significantly reduced compared to the HPLC/UV
      chips. Both compartments showed a k’ dependent separation
      efficiency, but the HPLC/MS chips revealed a much stronger
      one at low k’ than the HPLC/UV chips. Assuming that the
      injection process and the separation channel to on chip dead
      volumes were comparable, the diminished efficiency of the
      HPLC/MS is explained by extra-column band broadening that
      occurs after the chromatographic separation. While external
      contributions to peak dispersion have a constant value, their
      relative contribution to peak width became less pronounced at
      high k’-values where the peak is more dispersed due to its
      longer residence time inside the separation conduit [6]. The
      trend of increased separation efficiencies with the packing
      quality is also clearly confirmed under gradient elution
      conditions. For the investigated pharmaceutical test mixtures
      the resolution and peak width is remarkably improved with
      decreased bed porosities. Even for steep gradients, the peak
      width is decreased by ~15% and the resolution is increased by
      ~20% after changing the packing conditions from 150 bar
      without ultrasound to 300 bar and ultrasound for the 5 µm
      particles. Reduction of particle size from 5 to 3.5 µm
      decreased the peak width further by ~15% and increased the
      resolution by ~20%. These findings correspond to the results
      from the isocratic elution experiments and demonstrate that
      the analytical performance of the HPLC/MS chip is critically
      affected by the quality of the chromatographic separation
      even under gradient elution conditions. Last but not least,
      the separation efficiency with a low complexity (BSA tryptic
      digest) and a highly complex (Cohn4-IV fraction digest)
      biological samples were investigated (Chapter 6 - Improved
      particle-packed HPLC/MS microchips for proteomic analysis).
      The improved packing quality led to four trends important for
      the field application. First, the reproducibility of
      independently accomplished separation improved with the
      packing quality, which is favorable for the longtime
      investigations and process control. Secondly, it was possible
      to reduce the lower limit of quantification (LOQ) for the BSA
      digest from 10 fmol for the 5 µm particles packed with 150
      bar to 1 fmol for the packings packed at 300 bar and with
      ultrasound (3.5 µm). The impressive improvement in peak width
      and resolution led to a significantly reduced co-elution of
      peaks and therefore to a better quantification due to the
      detection of discrete (independent) peaks. Thirdly, because
      the higher chromatographic resolution yields a larger number
      of discrete peaks it was also possible to identify a higher
      number of peptides with the complex biological probe
      (Cohn4-IV fraction digest). However, the optimized packing
      conditions for the 3.5 µm particles enabled an average number
      of 175 identified peptides from the tryptic digest, an
      improvement by 22% and 39% compared with the chips packed
      with 5 µm and 150 bar and those with 5 µm, 300 bar and
      ultrasound, respectively. Fourth, the peak capacities improve
      significantly with the optimized packing conditions, similar
      to the sequence coverage and peptide identification data.
      With respect to the 5 µm particles packed at 150 bar without
      ultrasound it was found a relative improvement in peak
      capacity of about 37-41% and 76-94% for the different BSA
      concentrations and nearly 58% and 89% for the Cohn fraction,
      when the 5 and 3.5 µm particles are packed at 300 bar with
      ultrasound, respectively. To conclude, this work demonstrates
      the fundamental importance to generate a densely packed
      chromatographic bed to achieve an excellent, reliable and
      reproducible chromatographic performance. A lower porosity
      (denser bed) leads to significantly improved separation
      efficiency especially in inherently noncylindrical conduits.
      Basically, under gradient elution conditions, widely used in
      the pharmaceutical industry, the improved peak width and
      resolution lead to better identifications, peak capacities
      and quantification mainly for complex matrices. However, it
      is possible to generate packing densities comparable to
      widely used cylindrical nanobore columns, the only
      restriction is made by the stability of the microfabricated
      conduit, whether it can withstand high packing pressures. The
      application of ultrasound particularly for low aspect ratio
      conduits is crucial for the generation of a densely packed
      separation channel. Taking this as a basis, the effect of
      miniaturization and integration of chromatography onto single
      devices (micro total analyzing systems; µTAS) and all its
      positive contributions due to reduction of band broadening
      and traveled distances for the analytes, is more pronounced
      and promises the best separation on nanoscale chromatography
      platforms. References [1] Ehlert, S.; Rösler, T.; Tallarek U.
      J. Sep. Sci. 2008, 31, 1719-1728. [2] Halász, I.; Martin, K.
      Angew Chem. Int. Ed. 1978, 17, 901-908. [3] Kennedy, R. T.;
      Jorgenson, J. W. Anal. Chem. 1989, 61, 1128-1135. [4] Hsieh,
      S.; Jorgenson, J.W. Anal. Chem. 1996, 68, 1212-1217. [5]
      Ehlert, S.; Kraiczek, K.; Mora, J.-A.; Dittmann, M.; Rozing,
      G. P.; Tallarek, U. Anal. Chem. 2008, 80, 5945-5950. [6]
      Guiochon, G. J. Chromatogr. A 2006, 1126, 6-49.