title: Expression of the CD83 molecule by macrophages and its role on microglia in the context of experimental autoimmune encephalomyelitis
title: Expression des CD83 Moleküls durch Makrophagen und seine Rolle auf Mikroglia im Zusammenhang mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis
Creators: name: Sinner, Pia
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: The CD83 molecule possesses robust immunomodulatory properties, with numerous investigations underscoring its importance as a critical checkpoint in the resolution of inflammation. Membrane-bound CD83 (mCD83) has been characterized as an activation marker for dendritic cells (DCs) but it is also expressed on various other immune cell types, including regulatory T cells, thymic epithelial cells, B cells, and macrophages (MΦ). Several studies also reported expression of CD83 within microglia of the central nervous system (CNS), where it is associated with distinct cellular phenotypes. In accordance with findings in other immune cell populations, the absence of CD83 results in heightened pro-inflammatory activity in murine MΦ, indicating an important role in determining the pro-resolving polarization of these cells. However, the expression kinetics of CD83 following the activation of bone marrow-derived macrophages (BMDM) with lipopolysaccharide (LPS) remained unexplored. Furthermore, the spatial distribution of microglial CD83 as well as its regulation and relevance for cellular functions have not been described until now. Thus, the aims of this thesis were (i) to decipher the regulation of intracellular trafficking of CD83 in LPS-activated BMDM as well as (ii) the molecule’s spatial expression and biological function in microglia during homeostasis and inflammation. Within the first aim of this thesis we elucidated the expression kinetics and characterized the trafficking of CD83 subsequent to LPS-induced activation of BMDM. Herein, we report a rapid, but temporary expression of CD83 on BMDM between one and six hours after LPS stimulation. Additionally, we observed that CD83 expression in BMDM preceded the early activation antigen CD69 and other macrophage polarization markers. This increase in CD83 expression thus represents an immediate-early response, indicating its pivotal role in dictating cellular fate. Through pharmacological inhibition we delineated the intracellular trafficking of CD83 in LPS-activated BMDM which comprises: (i) a remarkably rapid de novo synthesis of the protein, (ii) trafficking through the Golgi apparatus and extensive glycosylation, (iii) a hitherto unreported dynamin-dependent endocytosis mechanism of CD83 from the surface of BMDM, followed by (iv) the lysosomal degradation of the protein. Regarding the regulation and function of CD83 in microglia, which was the second aim of this thesis, we elucidated the kinetics of CD83 expression following the inflammatory activation of microglia. We demonstrated a remarkable similarity to CD83 expression kinetics in LPS-activated BMDM, suggesting a potential analogous regulatory mechanism for CD83 expression across different macrophage lineages. Additionally, we assessed the spatial distribution of CD83 on microglial cells under conditions of both homeostasis and disease, unveiling an elevated expression of CD83 in the caudal, white matter-rich regions of the cerebellum and spinal cord. While investigating the spatial distribution of CD83 during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the murine model for multiple sclerosis (MS), we observed a sustained expression of Cd83, which is associated with a pro-resolving phenotype in these cells. Employing a CD83 conditional knock-out in microglia (CD83ΔMG) and single-cell RNA sequencing, we identified an exacerbated pro-inflammatory activation of microglia derived from CD83ΔMG mice, as evidenced by their increased propensity to associate with a cluster exhibiting elevated expression of microglial activation markers (i.e. Cd74, Apoe, Cst7, Ctsb, Lilrb4, and Eef1a1) during EAE. Conversely, microglia derived from control mice (CD83wtCre) mice retained a more homeostatic phenotype characterized by the expression of Csmd3, Cst3, P2ry12, Siglech, and Gpr34. Additionally, we reported a more pronounced expression of genes involved in the activation of antigen-presenting cells and leukocyte-mediated immunity in CD83ΔMG microglia. In contrast, Cd83 expression in microglia during EAE correlated with genes implicated in negative regulation of the response to external stimuli and immune system regulation. Taken together, our findings demonstrate that, similar to its effects on other immune cell types, the depletion of CD83 in microglia results in heightened pro-inflammatory responses and compromised resolution of inflammation in degenerative disorders associated with this specific cell lineage. Thus, CD83 expression in microglia serves not only as a marker of cellular activation but also signifies its pivotal role as a regulatory molecule in dampening neuroinflammatory processes. Throughout the second aim of this thesis, we have substantiated that CD83 expression on microglia operates as a regulator of cellular activation. Furthermore, microglial cells emerge as the primary CD83-expressing entities within the central nervous system. A soluble isoform of CD83 (sCD83) exhibited proven potent immune-modulatory capabilities across multiple in vivo models and increased serum levels were found in patients diagnosed with rheumatoid arthritis and hematological malignancies. Consequently, the third aim of this dissertation entailed the evaluation of sCD83 levels in both serum and cerebrospinal fluid of patients with MS. We hereby unveiled a remarkable correlation between both patient age and gender, and the secretion of sCD83 into the cerebrospinal fluid. Furthermore, we reported that administering glucocorticoids to patients with relapsing-remitting MS significantly augmented sCD83 concentration in their cerebrospinal fluid. We thereby elucidated a hitherto unreported positive impact of immune-modulatory treatment on sCD83 levels in individuals with autoimmune disorders.
description: Das Molekül CD83 besitzt robuste, immunmodulatorische Eigenschaften und zahlreiche Untersuchungen konnten seine Bedeutung als entscheidenden Kontrollpunkt bei der Auflösung von Entzündungen verdeutlichen. Das membrangebundene CD83 (mCD83) wurde ursprünglich zwar als Aktivierungsmarker für dendritische Zellen (DZ) charakterisiert, ist jedoch auch auf verschiedenen anderen Immunzelltypen vorhanden, einschließlich regulatorischer T-Zellen, thymischer epithelialer Zellen, B-Zellen und Makrophagen (MΦ). Mehrere Studien berichteten auch über die Expression von CD83 in Mikroglia des zentralen Nervensystems (ZNS), wo es mit verschiedenen zellulären Phänotypen in Verbindung gebracht wird. In Übereinstimmung mit Befunden in anderen Immunzellpopulationen führte das Fehlen von CD83 zu einer erhöhten pro-inflammatorischen Aktivität in murinen MΦ, was auf eine wichtige Rolle von CD83 in der Entzündungs-auflösenden Polarisation dieser Zellen hinweist. Die Expressionskinetik von CD83 nach der Aktivierung von aus dem Knochenmark generierten Makrophagen (BMDM) mit Lipopolysaccharid (LPS) blieb jedoch unerforscht. Darüber hinaus wurden die räumliche Verteilung von mikroglialem CD83 sowie dessen Regulation und Relevanz für zelluläre Funktionen bisher nicht beschrieben. Daher waren die Ziele dieser Arbeit, erstens die Regulation des intrazellulären Transports von CD83 in LPS-aktivierten BMDM, sowie zweitens die räumliche Expression und biologische Funktion der CD83 Expression in Mikroglia während der Homöostase und Entzündung zu entschlüsseln. Im Rahmen des ersten Ziels dieser Arbeit haben wir die CD83-Expressionskinetik und den Transport von CD83 nach der LPS-induzierten Aktivierung von BMDM charakterisiert. Hierbei stellten wir eine schnelle, aber transiente Expression von CD83 auf BMDM zwischen einer und sechs Stunden nach LPS-Stimulation fest. Zusätzlich beobachteten wir, dass die CD83-Expression in BMDM der Expression des frühen Aktivierungsantigen CD69 und anderen Polarisationsmarkern von MΦ vorausgeht. Diese Zunahme der CD83-Expression stellt somit eine sofortige Antwort auf die LPS-Stimulation dar, die auf ihre entscheidende Rolle bei der Bestimmung des zellulären Schicksals hinweist. Durch pharmakologische Hemmung haben wir den intrazellulären Transport von CD83 in LPS-aktivierten BMDM aufgeschlüsselt. Dieser umfasst 1. eine bemerkenswert schnelle de-novo-Synthese des Proteins, 2. den Transport durch den Golgi-Apparat und eine umfangreiche Glykosylierung sowie 3, einen bislang – für CD83 – unbekannten, Dynamin-abhängigen Endozytosemechanismus von der Oberfläche von BMDM und 4. den lysosomalen Abbau des Proteins. Hinsichtlich der Regulation und Funktion der CD83 Expression in Mikroglia, deren Erörterung das zweite Ziel dieser Arbeit waren, haben wir die Kinetik der CD83-Expression nach der entzündlichen Aktivierung von Mikroglia aufgeklärt. Wir enthüllten eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit der CD83-Expressionskinetik in LPS-aktivierten BMDM, was auf potenziell analoge, regulatorische Mechanismen für die CD83-Expression in verschiedenen Makrophagen-Linien hindeutet. Darüber hinaus haben wir die räumliche Verteilung von CD83 auf Mikrogliazellen während Homöostase und Krankheit analysiert und dabei eine erhöhte Expression von CD83 in den kaudalen, weißen Substanz-reichen Regionen des Kleinhirns und des Rückenmarks festgestellt. Bei der Untersuchung der räumlichen Verteilung von CD83 während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), dem murinen Modell für Multiple Sklerose (MS), beobachteten wir eine anhaltende Expression von Cd83, die mit einem immun-auflösenden Phänotyp in diesen Zellen assoziiert ist. Mittels konditionalem CD83-Knockout in Mikroglia (CD83ΔMG) und der Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifizierten wir eine verstärkte proinflammatorische Aktivierung von CD83ΔMG Mikroglia. Dies wurde durch ihre verstärkte Assoziation mit einem Cluster, der eine erhöhte Expression von Mikroglia-Aktivierungsmarkern (z. B. Cd74, Apoe, Cst7, Ctsb, Lilrb4 und Eef1a1) während der EAE aufweist, belegt. Im Gegensatz dazu behielten Mikroglia, die von Kontrollmäusen (CD83wtCre) stammen, einen homöostatischen Phänotyp bei, der durch die Expression von Csmd3, Cst3, P2ry12, Siglech und Gpr34 gekennzeichnet ist. Darüber hinaus identifizierten wir in CD83ΔMG-Mikroglia eine ausgeprägte Expression von Genen, die an der Aktivierung von antigenpräsentierenden Zellen und der leukozytären Immunität beteiligt sind. Im Gegensatz dazu korrelierte die Cd83-Expression in Mikroglia während der EAE mit Transkripten, die an der negativen Regulation der Immunantwort auf externe Reize beteiligt sind. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass die Depletion von CD83 in Mikroglia, ähnlich wie bei anderen Immunzelltypen, zu verstärkten pro-inflammatorischen Reaktionen und einer beeinträchtigten Auflösung von Entzündungen führt. Somit dient die CD83-Expression in Mikroglia nicht nur als Marker für die zelluläre Aktivierung, sondern nimmt auch eine entscheidende Rolle bei der Regulation neuro-inflammatorischer Prozesse ein. In Vorarbeiten unserer Abteilung wurde darüber hinaus gezeigt, dass die lösliche Isoform von CD83 (sCD83) sowohl in vitro als auch in vivo starke immunmodulatorische Fähigkeiten besitzt. Außerdem konnten bereits in der Vergangenheit erhöhte sCD83-Serumspiegel bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und hämatologischen Malignitäten nachgewiesen werden. Folglich umfasste das dritte Ziel dieser Dissertation die Analyse der sCD83 Konzentration sowohl im Serum als auch im Liquor von MS-Patienten. Hierbei stellten wir eine bemerkenswerte Korrelation zwischen Patientenalter und dem Geschlecht, sowie der Sekretion von sCD83 in den Liquor fest. Darüber hinaus führte die Behandlung von Patienten mit schubförmig-remittierender MS mit Glukokortikoiden, zu einer signifikant erhöhten sCD83-Konzentration im Liquor. Wir haben somit einen bislang unbekannten, positiven Einfluss des sCD83 Moleküls bei MS Patienten entdeckt.