title: Comparative analysis of basal and stress-induced expression as well as localization of the heat-shock proteins of 70 kilodalton molecular weight HSPA1A and HSPA1B (Hsp70) in human tumor cells
title: Vergleichende Analyse von basaler und stressinduzierter Expression sowie Lokalisation der Hitzeschockproteine von 70 Kilodalton Molekulargewicht HSPA1A und HSPA1B (Hsp70) bei humanen Tumorzellen
Creators: name: Schink, Christian Wolfgang
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Plasmamembran
Mikrovesikel
microvesicles
Hsp70
plasmamembrane
Zelllinie , Mikroskopie
Sciences
Naturwissenschaften
expression
Lokalisation
Immunoblot
Expression
localization
Hitzeschock-Proteine

description: Im Gegensatz zu gesunden humanen
      Zellen weisen Tumorzellen eine erhöhte basale Expression von
      HSPA1A und HSPA1B (Hsp70) auf und exponieren die Chaperone
      auf ihren Zelloberflächen. Stressinduziert wird Hsp70
      allgemein verstärkt exprimiert, was nicht nur zytoprotektive,
      sondern auch zytotoxische Effekte auslösen kann. Auch der
      Export von freiem Hsp70 und die Sekretion von Hsp70
      enthaltenden extrazellulären Vesikel werden unter
      Stressbedingungen intensiviert, was immunstimulatorische
      Wirkungen hervorrufen kann. Allerdings können basale und
      stressinduzierte Expressions- und Lokalisationsmuster von
      Hsp70 bei einzelnen Tumorzelltypen variieren. Eine
      einheitliche Korrelation zwischen Expressionsintensität und
      Behandlungsprognose konnte bislang nicht hergestellt werden.
      Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit
      MCF7-Brust-Adenokarzinom-, T47D-Brust-Duktalkarzinom- und
      U2OS-Osteosarkom-Zellen bezüglich basaler
      Expressionsintensität, Verlauf und Ausprägung der
      Stressantwort sowie Lokalisation von Hsp70 charakterisiert.
      Zur biochemischen Charakterisierung der basalen und
      stressinduzierten Expressionsmuster wurden ungestresste und
      gestresste Zellen homogenisiert, mittels differentieller
      Zentrifugation in zellkernfreie Homogenate, Zytosol- und
      Membranfraktionen getrennt und mittels Gelelektrophorese,
      Westernblot sowie densitometrischer Quantifizierung
      analysiert. Hierbei zeigte sich, dass T47D- und MCF7-Zellen
      unter physiologischen Bedingungen mehr Hsp70 exprimierten als
      U2OS-Zellen. Die Höhen der basalen Expressionsniveaus
      bestimmten die Intensitäten der Stressantworten: Je mehr
      Hsp70 die Zellen unter physiologischen Bedingungen
      synthetisierten, desto schwächer fielen die stressinduzierten
      Expressionssteigerungen aus. Davon abgesehen zeigten die
      Tumorzelllinien auch auffällige Gemeinsamkeiten. So verliefen
      die stressinduzierten Hsp70-Expressionsschwankungen in
      Zytosol- und Membranfraktionen stets vergleichbar, die
      Verhältnisse von zytosolischem zu Membran-assoziiertem Hsp70
      blieben konstant. Die Expressionssteigerungen erreichten die
      Maxima bei allen drei Tumorzelllinien vier bis sechs Stunden
      nach Stressexposition. Auch die zwischen sechs und 24 Stunden
      auftretenden Expressionsreduktionsraten waren ähnlich
      ausgeprägt. Bezüglich der Expressionsmuster des konstitutiv
      exprimierten Hsc70 zeigten die T47D-Zellen hingegen
      Besonderheiten: Diese Zellen exprimierten bereits unter
      physiologischen Bedingungen nur wenig Hsc70 und reduzierten
      die Expression nach Stressexposition, während MCF7- und
      U2OS-Zellen die Synthese verstärkten. Dies lässt vermuten,
      dass zytotoxische Effekte die maximal erreichbaren
      Expressionsniveaus der Chaperone begrenzen. Die Analyse der
      subzellulären Lokalisationsmuster wurde mittels indirekter
      Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung
      unpermeabilisierter und permeabilisierter Zellen realisiert.
      Hierbei zeigten sich entweder keine (T47D, MCF7) oder nur
      geringfügige (U2OS) Unterschiede zwischen ungestressten und
      gestressten Zellen. Hsp70 blieb innerhalb der Zellen
      überwiegend gleichmäßig verteilt, die subzellulären
      Lokalisationsmuster blieben weitgehend konstant.
      Dementsprechend kann davon ausgegangen werden, dass die bei
      anderen Tumorzelltypen beobachtete stressinduzierte nukleäre
      Akkumulation von Hsp70 kein genereller Bestandteil der
      Stressantwort ist. Auf den Oberflächen der
      unpermeabilisierten Zellen kolokalisierte Hsp70 mit GAPDH und
      α-Tubulin in sphärisch oder globulär erscheinenden Clustern
      von drei (MCF7) bis zehn (T47D, U2OS) Mikrometern
      Durchmesser. Die Formen und Größen der Cluster sowie das
      Vorhandensein von Alix in der unmittelbaren Umgebung
      derselben deuten darauf hin, dass es sich bei diesen um
      extrazelluläre Vesikel ähnlich den großen Onkosomen handeln
      könnte. Des Weiteren waren auch LDH, Centrin, Untereinheiten
      von Na+/K+-ATPasen und Galektin-3 auf den Oberflächen der
      Tumorzellen detektierbar. Die Lokalisationsmuster einiger der
      letztgenannten Proteine variierten zwischen den
      Tumorzelllinien jedoch erheblich. Dies lässt darauf
      schließen, dass die Komposition der auf den vesikulären
      Strukturen vorhandenen Proteine für einzelne Tumorzelltypen
      spezifisch sein könnte. Zusammenfassend betrachtet lassen die
      Ergebnisse der biochemischen Analysen vermuten, dass die
      Stressresistenz von Tumorzellen nicht nur durch die Höhe des
      basalen Hsp70-Expressionsniveaus determiniert wird. Vielmehr
      scheint auch die Menge des über die basale Expression hinaus
      noch synthetisierbaren Hsp70 eine Rolle zu spielen. Die
      Resultate der immunfluoreszenzmikroskopischen Analysen weisen
      darüber hinaus darauf hin, dass die Freisetzung großer
      extrazellulärer Vesikel kein Merkmal bestimmter
      Tumorzelltypen, sondern ein relativ weit verbreitetes
      Phänomen sein könnte. Die Konzentration immunaktivierender
      Moleküle auf den Vesikeln sowie die Abschnürung derselben
      könnte es den Tumorzellen ermöglichen, die gegen sie
      gerichtete Reaktion des Immunsystems zu unterlaufen.
description: In contrast to healthy human
      cells, tumor cells frequently overexpress HSPA1A and HSPA1B
      (Hsp70) and present the chaperones on their cell surfaces.
      Stress-induced, the expression of Hsp70 is generally
      upregulated, which can cause cytoprotective and cytotoxic
      effects. Also the export of soluble Hsp70 and the secretion
      of extracellular vesicles containing Hsp70 are intensified
      under stress conditions, which can provoke immunostimulatory
      effects. In general, the basal and stress-induced expression
      patterns as well as the subcellular localizations of Hsp70
      can vary between different types of tumor cells. A clear
      correlation between expression intensity and treatment
      prognosis could not be established so far. Therefore, in this
      study, the breast adenocarcinoma cell line MCF7, the breast
      ductal carcinoma cell line T47D and the osteosarcoma cell
      line U2OS were characterized regarding basal expression
      intensity, progression and features of the stress response as
      well as localization of Hsp70. To characterize the basal and
      heat-shock altered expression patterns, unstressed and
      stressed cells were homogenized and separated into
      nuclear-free homogenates, cytosolic and membrane fractions by
      differential centrifugation. The samples were analyzed by gel
      electrophoresis, western blot and densitometric
      quantification. The results revealed that MCF7 and T47D cells
      expressed considerably higher quantities of Hsp70 than U2OS
      cells under physiological conditions. The strength of the
      basal expression determined the intensity of the stress
      response: The more Hsp70 was expressed under physiological
      conditions, the weaker was the stress-induced expression
      increase. Beside these differences, the tumor cell lines
      shared noticeable similarities: The temporal progression of
      the heat-shock induced expression fluctuations in cytosolic
      and membrane fractions was comparable; the ratios of
      cytosolic to membrane-associated Hsp70 remained constant.
      Furthermore, the Hsp70 expression increase reached its peak
      four to six hours post-stress in all tumor cell lines
      analyzed. Also the expression decrease rates between six and
      24 hours post-stress were comparable. However, regarding the
      expression pattern of the constitutively expressed Hsc70, the
      T47D cells showed interesting particularities: Although these
      cells already expressed only low amounts of Hsc70 under
      physiological conditions, they reduced the expression in
      response to stress-exposure, whereas the MCF7 and the U2OS
      cells reinforced the synthesis. Thus, it seems likely that
      the maximal achievable expression levels of the chaperones
      are limited by cytotoxic side effects. The analysis of the
      subcellular localization patterns was accomplished by
      indirect immunofluorescence microscopy using
      non-permeabilized and permeabilized cells. The results
      indicated no (T47D, MCF7) or just slight (U2OS) differences
      between unstressed and stressed cells. Hsp70 remained more or
      less evenly distributed within the cells; the subcellular
      localization patterns remained essentially constant.
      Accordingly, it can be assumed that the stress-induced
      nuclear accumulation of Hsp70, observed in case of other
      tumor cell lines, is not a general part of the stress
      response. On the surfaces of the non-permeabilized cells,
      Hsp70, GAPDH and α-Tubulin colocalized in clusters of
      spherical or globular appearance with three (MCF7) to ten
      (T47D, U2OS) micrometer diameter. Size and shape of these
      clusters as well as the presence of Alix exclusively in
      immediate vicinity to them suggest that they may represent
      extracellular vesicles similar to the large oncosomes.
      Furthermore, also LDH, Centrin, subunits of Na+/K+-ATPases
      and Galectin-3 were detectable on the cell surfaces. However,
      the localization patterns of some of the latter proteins
      differed between the cells lines to a considerable degree.
      Therefore, it can be assumed that the composition of the
      proteins exposed on the vesicular structures might be
      specific for certain types of tumor cells. Taken together,
      the results of the biochemical analyses lead to the
      assumption that the stress resistance of tumor cells is not
      solely depending on the intensity of the basal Hsp70
      expression. Rather, it appears that also the amount of Hsp70
      which can be synthesized in addition to the basal expression
      level might play a role. The results of the
      immunofluorescence microscopic analyses suggest moreover that
      the shedding of large vesicles is not a special
      characteristic of certain tumor cell types, but a relatively
      widespread phenomenon. The concentration of immunoactivating
      molecules on these vesicles and their release could enable
      tumor cells to circumvent the antitumor response of the
      immune system.