title: Systematische Studie der Transfektion von Säugerzellen mittels PDMAEMA-basierter paramagnetischer Nanosterne
Creators: name: Stahlschmidt, Ullrich
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2019
Subjects: subject: ATRP
subject: cellular uptake
subject: CHO cells
subject: EGFP
subject: gene delivery
subject: magnetic nanoparticles
subject: PDMAEMA
subject: PDEGMA
subject: polycation
subject: transfection
subject: SPION
subject: Transfektion
subject: TEM
subject: 500
subject: 540
subject: 570
subject: 610
subject: 620

description: Der Transfer genetischen Materials in Säugerzellen („Transfektion“) ist von großer Bedeutung für die Erzeugung genetisch modifizierter Zellen und kann heute mit verschiedenen Techniken bewerkstelligt werden. Bei der nicht-viralen Transfektion werden synthetische Vektoren (z.B. polykationische Polymere) eingesetzt, um das
genetische Material (z.B. Plasmid-DNA) zu binden und in Form von sogenannten Polyplexen in die Zelle zu schleusen. Über die Mechanismen der Aufnahme der Polyplexe und die Freisetzung der DNA im Zellinneren ist jedoch bislang nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige sternförmige Nanopartikel
vorgestellt, die sich zur Transfektion von Säugerzellen eignen. Diese "Nanosterne" bestehen aus einem festen γ-Fe2O3-Kern, der mit einer Silica-Hülle beschichtet und via Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) mit Poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylat (PDMAEMA) funktionalisiert wurde. Durch den Eisenoxid-Kern sind die Nanosterne paramagnetisch. Eine Bibliothek dieser
Nanosterne, bei der sich die einzelnen Varianten hauptsächlich in Anzahl und Länge der PDMAEMA-Arme unterscheiden, wurde mit verschiedenen physikochemischen Methoden charakterisiert und die Transfektion von verschiedenen Säugerzellen untersucht. Die gebildeten Polyplexe aus Nanosternen und pDNA wurden auf ihre
Größe und Oberflächenladung über Bestimmung des Zetapotenials und dynamischer Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. Die Ladung der Polyplexe korrelierte mit dem N/P Verhältnis (Molverhältnis der Polymer-Aminogruppen zu den Phosphatgruppen der DNA) und erreichte je nach Nanostern ab einem N/P-Verhältnis ≥ 15 einen Sättigungswert von 15 bis 22 mV. Auch die Größe der Polyplexe zeigte eine Abhängigkeit vom N/P-Verhältnis, wobei eine Erhöhung von letzterem bis zu einer Sättigungsgrenze zu einer Verkleinerung der hydrodynamischen Radien führte. Eine Ausnahme bildeten die Nanosterne mit der kleinsten Armdichte, bei denen Aggregationsbildung beobachtet wurde. Der Grund liegt vermutlich in der geringeren elektrostatischen und sterischen Abstoßung der Nanosterne. Die Stabilität der Polyplexe wurde mit dem ΔT-Assay untersucht. Dabei zeigten Polyplexe in HBG Lösung mit steigenden N/P-Verhältnis eine höhere Stabilität als in NaCl-Lösung (150
mM). Als Ursache könnte ein pH-Effekt, der zu einer Veränderung der Ladungsdichte führt, in Betracht kommen. Diese Hypothese wurde durch zusätzliche pH-Messungen bestärkt. Für die Transfektionsstudien wurden Polyplexe aus verschiedenen Varianten der Nanostern-Bibliothek und einem Plasmid, welches für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert, gebildet und verschiedene Zelllinien transfiziert (CHO-K1, HEK-293, L929, Jurkat). Transfektionseffizienz und Zytotoxizität korrelierten mit dem N/P Verhältnis und der Architektur der Nanosterne, wobei die Vertreter mit einer Armdichte von ~ 0,06 Ketten/nm² die besten Transfektionsergebnisse zeigten. Des Weiteren wurde der zelluläre Magnetismus untersucht: Mit Nanosternen assoziierte Zellen zeigten magnetische Eigenschaften und konnten durch das Anbringen eines
Magnetfeldes von den übrigen Zellen abgetrennt werden. Dabei wurde kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Zahl an magnetischen Zellen und der Transfektionseffizienz beobachtet. Auffällig war dabei der hohe Anteil magnetischer
Zellen bei der Transfektion mit Nanosternen mit einer geringen Armdichte. Modifizierung der PDMAEMA-Arme mit zusätzlichen äußeren PDEGMA-Blöcken führte in Transfektionsexperimenten zu einer verbesserte Serumkompatibilität gegenüber den unmodifizierten Varianten. Im letzten Teil der Arbeit wurden CHO-K1 Zellen mit verschiedenen Vertretern der Nanostern-Bibliothek transfiziert und in Abhängigkeit von der Kinetik der Interaktion
zwischen Zelle und Nanostern für die Dokumentation per TEM
(Transmissionselektronenmikroskopie) präpariert und chemisch fixiert. Dabei konnten für alle untersuchten Nanostern-Varianten intrazelluläre Aggregationen auf den TEM-Aufnahmen lokalisiert werden. Auffällig war dabei die Co-Lokalisation mit multivesikulären Strukturen (MVBs; „multivesicular bodies“), bei denen es sich vermutlich um späte Endosomen oder Heterolysosomen handelte. Es wurden keine freien Nanopartikel im Zytoplasma oder im Zellkern gefunden. Darüber hinaus wurde
demonstriert, wie die Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) die Unterscheidung von Nanopartikeln und kontrastiertem biologischem Material ermöglicht. Ausnahme bildeten die Nanosterne mit der kleinsten Armdichte, bei denen Aggregationsbildung beobachtet wurde. Der Grund liegt vermutlich in der geringeren elektrostatischen und sterischen Abstoßung der Nanosterne. Die Stabilität der Polyplexe wurde mit dem ΔT-Assay untersucht. Dabei zeigten Polyplexe in HBG-Lösung mit steigenden N/P-Verhältnis eine höhere Stabilität als in NaCl-Lösung (150 mM). Als Ursache könnte ein pH-Effekt, der zu einer Veränderung der Ladungsdichte führt, in Betracht kommen. Diese Hypothese wurde durch zusätzliche pH-Messungen bestärkt. Für die Transfektionsstudien wurden Polyplexe aus verschiedenen Varianten der Nanostern-Bibliothek und einem Plasmid, welches für das grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert, gebildet und verschiedene Zelllinien transfiziert (CHO-K1, HEK-293, L929, Jurkat). Transfektionseffizienz und Zytotoxizität korrelierten mit dem N/P Verhältnis und der Architektur der Nanosterne, wobei die Vertreter mit einer Armdichte von ~ 0,06 Ketten/nm² die besten Transfektionsergebnisse zeigten. Des Weiteren wurde der zelluläre Magnetismus untersucht: Mit Nanosternen assoziierte Zellen zeigten magnetische Eigenschaften und konnten durch das Anbringen eines
Magnetfeldes von den übrigen Zellen abgetrennt werden. Dabei wurde kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Zahl an magnetischen Zellen und der Transfektionseffizienz beobachtet. Auffällig war dabei der hohe Anteil magnetischer
Zellen bei der Transfektion mit Nanosternen mit einer geringen Armdichte. Modifizierung der PDMAEMA-Arme mit zusätzlichen äußeren PDEGMA-Blöcken führte in Transfektionsexperimenten zu einer verbesserte Serumkompatibilität gegenüber den unmodifizierten Varianten. Im letzten Teil der Arbeit wurden CHO-K1 Zellen mit verschiedenen Vertretern der Nanostern-Bibliothek transfiziert und in Abhängigkeit von der Kinetik der Interaktion
zwischen Zelle und Nanostern für die Dokumentation per TEM
(Transmissionselektronenmikroskopie) präpariert und chemisch fixiert. Dabei konnten für alle untersuchten Nanostern-Varianten intrazelluläre Aggregationen auf den TEM-Aufnahmen lokalisiert werden. Auffällig war dabei die Co-Lokalisation mit multivesikulären Strukturen (MVBs; „multivesicular bodies“), bei denen es sich vermutlich um späte Endosomen oder Heterolysosomen handelte. Es wurden keine freien Nanopartikel im Zytoplasma oder im Zellkern gefunden. Darüber hinaus wurde
demonstriert, wie die Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) die Unterscheidung von Nanopartikeln und kontrastiertem biologischem Material ermöglicht.