title: Synthesis and conformational analysis of polypeptides related to the inhibitor of the DNA binding and cell differentiation Id2
Creators: name: Colombo, Noemi
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: DNS-Bindung , Inhibitorproteine , Chemische Synthese , Konformationsanalyse , Zelldifferenzierung , , peptide synthesis and characterization
subject: 540 Chemie

description: Id proteins (Id1-4) are negative regulators of several bHLH transcription factors; the 134-residue long Id2 protein additionally interacts with the retinoblastoma protein (pRb), thus representing an interesting target for cancer therapy based on the inhibition of protein-protein interactions. This work deals with the synthesis and conformational characterization of peptides derived from point mutations and N-/C-terminal truncations of Id2. The largest sequence that could be obtained by stepwise solid-phase peptide synthesis (SPPS) with Fmoc strategy, is a 75-residue long fragment (36-110) that was less helical than the isolated HLH domain and had propensity to aggregate. By CD analysis of an equimolar mixture of the sequence 36-110 with the N-terminus 1-35, non covalent interactions between the two peptides were detected, while the mixture of the HLH domain with the N-terminus was characterized by a stabilized helix structure maintained also upon aging. Id2 possesses a C-terminal nuclear export signal (NES, residues 103-119) responsible for the transport of Id2 from the nucleus to the cytoplasm. The Id2 segment 103-124 was synthesized and characterized in water/alcohol mixtures, displaying a beta-sheet conformation that quickly precipitated in amorphous aggregates. Introduction of an N-terminal tail bearing three lysines prevented aggressive precipitation and led to aggregates consisting of long beta-sheet fibrils that bound thioflavin T. When the positively charged tail was introduced at the C-terminus, the peptide was able to stay in solution for a longer time and to adopt a helical conformation and formed highly ordered aligned fibrils. The last part of this PhD work has been focused on the synthesis of peptidomimetics as potential modulators of protein-protein interactions. To this purpose, the unnatural amino acid 3-carboxy-cyclopentylglycine (Cpg) has been used as N,N-linker of two peptide fragments to form covalent homodimers. This has been done for Id helix-2 fragments, and the effect of both enantiomers of Cpg on the conformation has been investigated by CD spectroscopy. It was found that the Cpg-linked dimer of the Id1 helix-2 fragment 91-101 could interact with the native Id1 HLH motif, leading to helix stabilization or destabilization of the latter depending on the Cpg configuration. The Cpg-containing peptide was also tested on human vascular smooth muscle cells (VSMC) presenting a synthetic phenotype and preliminary data suggest that these peptides might influence the activity of the Id proteins. A second unnatural amino acid, 3,4-(aminomethano)proline (Amp), has been used in this work to synthesize alpha/gamma-alternating peptides (hexamers and octamers) containing both enantiomers of Amp. CD and NMR characterization show that the Amp in the (2S, 1�R, 3R, 4R)-configuration favors a helical backbone, as supported also by computational analysis, whereas the Amp in the (2R, 1�S, 3S, 4S)-configuration might induce a bend-like structure. The Amp amino acid has been used also as a proline analogue. CD spectroscopy data suggest that the substitution of LPro by the Amp unit with the S-configuration at the alpha-carbon may lead in pentapetides to a stabilization of a polyproline II conformation. The Amp unit with the R-configuration at the alpha-carbon seems to be superior in the stabilization of a turn motif. In conclusion, the synthetic and conformational studies on Id2 protein fragments and on oligomers containing new structurally constrained amino acid building blocks have provided interesting data concerning the usefulness of the solid phase methodology for the preparation of large polypeptides, the ability of a short Id2 fragment to form highly ordered fibrillar structures, and the development of novel backbone-modified peptides with ordered conformations, as valuable tools in the design of peptidomimetics and foldamers for biological applications.
description: Die Id Proteine Id1-4 bilden eine Untergruppe der Helix-Loop-Helix (HLH) Proteinfamilie. Ein Teil ihrer Funktionen basiert auf der Wechselwirkung mit den zur selben Proteinfamilie gehörenden Transkriptionsfaktoren deren negative Regulatoren sie darstellen. Aber auch mit anderen Proteinen treten die Id Proteine in Wechselwirkung: so wurde mit dem Retinoblastoma Protein pRb ein Bindungspartner identifiziert, der ausschließlich mit Id2 interagiert. Da pRb als Tumorsuppressorprotein am Zellzyklus beteiligt ist, stellt die Erforschung der strukturellen Eigenschaften des Id2 Proteins, sowie seiner Protein-Protein Wechselwirkungen, ein wichtiges Ziel für das Verständnis krebsrelevanter Prozesse und der Entwicklung von Tumortherapeutika dar. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Festphasenpeptidsynthese am N- oder C-terminalen Ende verkürzte Peptidfragmente des Id Proteins hergestellt. Des Weiteren enthielten einige dieser Fragmente Punktmutationen, um die Bedeutung einzelner Aminosäurepositionen für die Stabilisierung der Gesamtstruktur zu erkennen. Zur strukturellen Untersuchung wurden die synthetisierten Peptide anschließend mittels Circulardichroismus (CD) spektroskopisch vermessen. Das längste hergestellte Fragment (36-110) zeigte dabei eine geringere Helizität im Vergleich zum isolierten HLH Motiv (36-76) und neigte zur Aggregation, was sich auf den Einfluss des zusätzlichen C-terminalen Teils zurückführen lässt. Darüber hinaus wurden äquimolare Mischungen der Peptide hergestellt und vermessen, um zu untersuchen, ob nonkovalente Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Fragmenten auftreten. Diese konnten unter anderem zwischen (36-110) und dem N-terminalen Fragment nachgewiesen werden, was vermuten lässt, dass diese Regionen auch im vollständigen Id2 Protein interagieren. Weitere Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konzentrierten sich auf Peptide, die das nukleare Exportsignal (NES, Position 103-119) aus dem C-terminalen Ende des Id2 Proteins enthielten. Diese funktionelle Domäne ist innerhalb der Id-Familie ausschließlich bei Id2 zu finden und sorgt für den Transport des Proteins aus dem Zellkern ins Cytoplasma. CD Messungen des Peptids (103-124) in Wasser/Alkohol-Mischungen deuten auf eine Beta-Faltblatt Konformation hin. Um die Löslichkeit dieses Peptids, das als amorphes Aggregat ausfiel, zu erhöhen, wurden bei weiteren Peptiden drei Lysine entweder am N-terminalen oder am C-terminalen Ende eingeführt. Das Peptid mit den drei N-terminalen Lysinen bildete lange Beta-Faltblatt Fibrillen aus, die sich mit Thioflavin T einfärben ließen, während bei dem Analogon mit dem C-terminalen Lysin-Rest eine höhere Löslichkeit auftrat und eine hochgeordnete Struktur aus helikalen Fibrillen zu beobachten war. Ein weiteres Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese von Peptidmimetika als potentiellen Modulatoren von Protein-Protein Wechselwirkungen. Dafür wurde die unnatürliche Aminosäure 3-Carboxycyclopentylglycin (Cpg) als Verbindungsstück zweier Peptidfragmente von Id1-Helix2 benutzt, um kovalent verbundene Homodimere zu erzeugen. CD spektroskopische Messungen der hergestellten Peptide ergaben zum einen, dass das Cpg-enthaltende Dimer der Id1-(91-101)-Fragmente mit dem nativen Id1 HLH Motiv interagieren kann, zum anderen, dass je nach Konfiguration des Cpg-Bausteins eine Stabilisierung bzw. Destabilisierung der HLH Region auftritt. In der Tat deuten erste bereits vorliegende Daten eines Tests der Cpg-Peptide an humanen vaskulären glatten Muskelzellen an, dass diese Peptide die Aktivität der Id Proteine beeinflussen können. Eine zweite unnatürliche Aminosäure, 3,4-(Aminomethano)prolin (Amp), wurde benutzt um alpha/gamma-alternierende Hexa- und Oktapeptide zu synthetisieren. Die strukturelle Untersuchungen mittels CD und NMR Spektroskopie zeigten, dass der Amp-Baustein in der (2S, 1�R, 3R, 4R)-Konfiguration zur Ausbildung einer helikalen Struktur führt, wie auch eine computergestützte Auswertung bestätigte. Der Amp-Rest in der enantiomeren Konfiguration führt dagegen zu einer Turn ähnlichen Struktur der Peptide. Schließlich wurde die Amp Aminosäure auch als Prolin-Analog genutzt. CD spektroskopische Untersuchungen an Pentapeptiden ergaben, dass der Austausch eines Prolins durch den Amp-Baustein mit (S)-Konfiguration am alpha-Kohlenstoff eine Polyprolin II Struktur stabilisiert. Die Amp-Einheit mit (R)-Konfiguration hingegen führt zur Stabilisierung eines Turn Motivs. Die vorgestellten strukturellen Untersuchungen von Peptidfragmenten des Id2 Proteins zeigen, dass die N- und C-Termini mit der HLH Domäne wechselwirken können und lassen eine wichtige strukturelle Rolle dieser Regionen im Gesamtprotein vermuten. Des Weiteren wurde die Anwendbarkeit zweier unnatürlicher Aminosäuren in der Festphasenpeptidsynthese demonstriert. Die dabei hergestellten Peptidanaloga wiesen dabei nicht nur interessante strukturelle Eigenschaften auf, sondern zeigten in ersten Tests auch ihr physiologisches Potential.