title: Natural NADH and FAD Autofluorescence as Label-Free Biomarkers for Discriminating Subtypes and Functional States of Immune Cells
Creators: name: Lemire, Sarah
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: inflammatory bowel diseases; cell autofluorescence; immune cells; NADH; FAD; flow cytometry; multiphoton microscopy

description: 1 ZUSAMMENFASSUNG Die Publikation mit dem Titel Natural NADH and FAD Autofluorescence as Label-Free Biomarkers for Discriminating Subtypes and Functional States of Immune Cells (Natürlich vorkommende Autofluoreszenzsignale von NADH und FAD als Label-Freie Biomarker zur Unterscheidung von Subtypen und funktionellen Zuständen von Im-munzellen) wurde am 20. Februar 2022 im Wissenschaftsjournal International Jour-nal of Molecular Sciences (Special Issue Solving the Puzzle: Molecular Research in Inflammatory Bowel Diseases) veröffentlicht. 1.1 Hintergrund und Ziele Immunzellen spielen eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Aufrechterhal-tung von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED). Sie sind daher wesent-liche klinisch-diagnostische Parameter zur Beurteilung von Art, Ausmaß und Fort-schreiten der Erkrankung. In diesem Zusammenhang könnten neue optische Tech-nologien, wie die Multiphotonenmikroskopie, klinische Relevanz erlangen, da sie na-türlich vorkommende, label-freie Autofluoreszenzsignale der Stoffwechselmoleküle NADH und FAD diagnostisch nutzbar machen können. Vielversprechende Erfolge dieser Technologie konnten bei der Evaluation von entzündetem Darmgewebe ge-zeigt werden. Allerdings war es bisher nicht möglich, einzelne Immunzellen innerhalb dieses Gewebes zu identifizieren. Ziel dieser Arbeit war es daher, NADH- und FAD-Autofluoreszenzsignale von Immunzellen mit Multiphotonenmikroskopie und Durch-flusszytometrie zu erfassen, um damit verschiedene Typen von Immunzellen in un-stimuliertem Zustand unterscheiden zu können. Außerdem sollten Auswirkungen von in-vitro Stimulation und Zelltod auf die Autofluoreszenzsignale untersucht werden. 1.2 Methoden Sechs verschiedene Immunzelltypen wurden aus der Milz (CD4+ / CD8+ T-Zellen, B-Zellen) und dem Knochenmark (neutrophile Granulozyten, Makrophagen, dendriti-sche Zellen) von Wildtyp C57BL/6 Mäusen isoliert. Alle Zelltypen wurden sowohl in nativem Zustand als auch nach in-vitro Stimulation und im Zelltod untersucht. Auto-fluoreszenzsignale von NADH und FAD wurden mit den beiden unterschiedlichen Methoden Multiphotonenmikroskopie und Durchflusszytometrie gemessen. Für die statistische Auswertung wurde das Programm GraphPad verwendet. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Im Vergleich der sechs unstimulierten Zelltypen wurden signifikante Unterschiede zwischen den Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems beo-bachtet. So zeigten neutrophile Granulozyten, Makrophagen und dendritische Zellen sowohl in den Messungen der Multiphotonenmikroskopie als auch in der Durch-flusszytometrie höhere Werte für NADH und FAD. Dies ermöglichte, in einer ge-mischten Zellsuspension von CD4+ T-Zellen und neutrophilen Granulozyten die An-teile dieser beiden Zelltypen allein anhand ihrer NADH-Signale zu bestimmen. In-vitro Stimulation erhöhte signifikant NADH- und FAD- Autofluoreszenzwerte in den Zellen des adaptiven Immunsystems sowie in Makrophagen. In dendritischen Zellen und neutrophilen Granulozyten wurde kein wesentlicher Effekt der in-vitro Stimulation beobachtet. In der Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass Zelltod die NADH-Signale signifikant erniedrigt, während die FAD-Signale gleichblieben. 1.4 Schlussfolgerungen und Diskussion Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Autofluoreszenzsignale einzelner Im-munzellen mithilfe von Multiphotonenmikroskopie und Durchflusszytometrie evaluiert werden können. Zelltyp, Stimulationszustand und Zelltod wurden in dieser präklini-schen Studie als wichtige Einflussfaktoren auf die Stärke der Autofluoreszenz identi-fiziert und können damit in der immunologischen Charakterisierung mukosaler Ent-zündung eine wichtige Rolle spielen. So könnten beispielsweise verschiedene Sub-typen, sowie aktivierte oder tote Immunzellen in der Darmschleimhaut allein durch veränderte Autofluoreszenzsignale erkannt werden. Langfristig ergibt sich mithilfe dieser Technik eine interessante klinische Anwendungsmöglichkeit in der Diagnostik, Aktivitätsbeurteilung und Therapieüberwachung von Patienten mit CED. Da viele ak-tuell genutzte Therapeutika auf die Aktivität von Immunzellen Einfluss nehmen, könn-te die Messung von Autofluoreszenzsignalen in der Darmschleimhaut in Zukunft eine elegante Methode zur Kontrolle des Therapieerfolges sein. Um diese Ziele zu errei-chen ist allerdings noch weitere Forschung nötig. Diese könnte zum Beispiel die Ana-lyse von Immunzellen in Biopsien von entzündetem Darmgewebe mittels Autofluo-reszenz beinhalten. Langfristig wären auch KI-Systeme denkbar, die allein anhand von Autofluoreszenzsignalen in der Lage wären, einzelne Immunzellen im Darmge-webe zu identifizieren und in ihrem Stimulationsstatus zu beschreiben. Dies könnte die klinische Diagnostik von CED erheblich vereinfachen.