title: The role of innate lymphoid cells in cutaneous and visceral leishmaniasis
title: Die Rolle von lymphoiden Zellen des angeborenen Immunsystems in der kutanen und viszeralen Leishmaniose
Creators: name: Sasse, Carolin
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: Background: Despite the fact that millions of people worldwide are affected by leishmaniasis [1], the underlying mechanisms of disease progression and resolution have still not been identified to a full extent. Recent advances in flow cytometry and RNAsequencing techniques have led to the discovery of innate lymphoid cells, thus adding a new possible player in the immune responses against Leishmania spp. The aim of this study was to determine the role of type 1 and type 2 innate lymphoid cells (ILC1, conventional natural killer cells [cNK] and ILC2) in mouse models of cutaneous (CL) and visceral leishmaniasis (VL). Methods: For experimental CL, mice on a C57BL/6 or BALB/c background (wildtype, 4get-B6 and 4get-BALB/c) were used. ILC1 and cNK in VL were analyzed in mice with a C57BL/6 background (wildtype, il12p35-/-, il-18-/-, STNK-Cre and Hobit-/-). Experimental CL was induced by intradermal infection with 1 x 105 viable L. major promastigotes. For experimental VL, 1 x 107 viable L. infantum promastigotes were injected intravenously. Analysis of ILC1, cNK and ILC2 and other cell populations in the target organs of experimental CL (ear skin, skin draining lymph nodes) and VL (liver and spleen) was performed using flow cytometry. The production of cytokines by ILC1 and cNK was examined by ex vivo culture in medium containing brefeldin A, subsequent intracellular staining of IFN-γ and analysis by flow cytometry. mRNA expression levels in the target organs were determined by RT-qPCR. Cytokine levels in the serum of infected mice were analyzed by sandwich-ELISA. Hematoxylin/eosin staining was used to analyze hepatic granuloma formation in tissue sections from mice with VL. Results: In experimental CL, ILC2 did not show signs of activation or proliferation during the first five days of infection. Expression levels of cytokines known to activate ILC2 in other disease models (IL-18, IL-25, IL-33, TSLP) were not upregulated at this time point. We observed an increase in IL-4 mRNA expression in whole ear tissue at d5 post infection (p.i.), which was not due to an increase in IL-4 production by ILC2, but to an influx of IL-4-positive eosinophils to the site of infection. Five days p.i., an increase in IL-27 and IFN-γ mRNA levels was observed, suggesting that ILC2s were inhibited. Interestingly, no major differences in the ILC2 population and cytokine expression was observed between C57BL7/6 and BALB/c mice. Systemic infection with L. infantum led to the activation of hepatic ILC1 and cNK, resulting in (a) changes in the size of the cell populations, (b) production of IFN-γ and (c) local proliferation during the first three days p.i. The number of ILC1, but not of cNK, was strongly reduced at 12 h p.i. Population size was restored again by d3 p.i., possibly via local replenishment. ILC1 did not show signs of increased apoptosis or egress from the tissue and IFN-γ production preceded the peak in proliferation in both ILC1 and cNK. To determine the contribution of hepatic ILC1 to the outcome of VL, Hobit-/- mice were used. Despite a strong reduction in hepatic ILC1 in these mice, both short- and long-term parasite burdens were similar in Hobit-/- and WT mice. However, long-term infection with L. infantum led to phenotypical changes in the ILC1 and cNK populations in the liver, resulting in a third “ILC1-like” population. Conclusions: While dermal ILC2 do not seem to become activated during CL; their presence in the skin might contribute to the influx and activation of eosinophils. The immune response in C57BL/6 and BALB/c mice did not differ significantly during the first five days of infection with L. major, indicating that factors other than the innate responses contribute to the differences in the disease outcome between these mouse strains. Upon infection with L. infantum, hepatic ILC1 become activated by IL-12 and IL-18 and therefore produce IFN-γ and proliferate. However, their absence, e.g., in Hobit-/- mice, did not affect the overall course of the disease. The increase in “ILC1-like” cells during long-term infection indicated that changes in the microenvironment of the liver occur during long-term infection, possibly affecting effector functions of cNK and ILC1.
description: Hintergrund: Obwohl weltweit Millionen von Menschen von Leishmaniose betroffen sind [1], sind die zugrundeliegendenen Krankheitsmechanismen bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Fortschritte im Bereich der Durchflusszytometrie und der RNASequenzierung haben zur Entdeckung der lympoiden Zellen des angeborenen Immunsystems („innate lymphoid cells“, ILC) beigetragen. Diese könnten potenziell zur Immunantwort gegen Leishmania spp. beitragen. Die hier beschriebenen Analysen hatten zum Ziel die Rolle von Typ 1 und Typ 2 innaten lymphoiden Zellen (ILC1, cNK und ILC2) in Mausmodellen der kutanen (CL) und viszeralen Leishmaniose (VL) zu untersuchen. Methoden: Die Immunantwort bei der CL wurde mithilfe von Mäusen mit C57BL/6 und BALB/c Hintergrund (Wildtyp, 4get-C57BL/6 und 4get-BALB/c) untersucht. ILC1 und cNK wurden im Modell der VL in Mäusen mit einem C57BL/6-Hintergrund (Wildtyp, il12p35-/-, il18-/-, STNK-Cre und Hobit-/-) analyisiert. Im Mausmodell der CL wurden 1 x 105 L. major Promastigote intradermal injiziert. VL wurde durch die intravenöse Injektion von 1 x 107 L. infantum Promastigoten ausgelöst. Die Zellpopulationen der Zielorgane (CL: Ohrhaut, drainierende Lymphknoten; VL: Leber und Milz) wurden mithilfe von durchflusszytometrischen Analysen untersucht. Mittels ex vivo-Kultur in Medium mit Brefeldin A, intrazellulärer Färbung und anschließender Durchflusszytometrie wurde außerdem die Zytokinproduktion von ILC1 und cNK untersucht. Genexpressionsanalysen von Gewebeproben der Haut, Lymphknoten, Leber und Milz wurden mithilfe von RT-qPCR durchgeführt. Zytokinkonzentrationen in Serum und Plasma infizierter Mäuse wurden mittels Sandwich-ELISA bestimmt. Die Bildung von Granulomen in der Leber im Modell der VL wurde anhand von Gewebeschnitten und anschließender Hämatoxylin/Eosin-Färbung untersucht. Ergebnisse: Im Mausmodell der CL zeigten ILC2 in den ersten fünf Tagen nach Infektion keine Anzeichen für Aktivierung oder Proliferation. Aus anderen Krankheitsmodellen bekannte ILC2-aktivierende Zytokine (IL-18, IL-25, IL-33, TSLP) zeigten keine erhöhte Genexpression in diesem Zeitraum. Am Tag 5 nach Infektion konnte eine Zunahme der IL-4 Genexpression beobachtet werden, die jedoch nicht durch eine Zunahme IL-4-produzierender ILC2 verursacht wurde, sondern durch einen Influx von IL-4-positiven Eosinophilen zum Ort der Infektion. Ebenfalls 5 Tage nach Infektion konnte ein Anstieg der Genexpressionslevel von IL-27 und IFN-γ beobachtet werden, was auf eine Inhibition der dermalen ILC2 hinweisen könnte. Überraschenderweise konnten in der Frühphase der Infektion keine signifikanten Unterschiede zwischen C57BL/6- und BALB/c-Mäusen in den ILC2-Populationen und der Zytokinexpression beobachtet werden. Die Infektion mit L. infantum führte zur Aktivierung von ILC1 und cNK in der Leber, was in (a) einer Veränderung der Zellzahlen, (b) der Produktion von IFN-γ und (c) einer lokalen Proliferation in den ersten 3 Tagen nach Infektion resultierte. Die Anzahl von ILC1, jedoch nicht von cNK, war 12 Stunden nach Infektion signifikant reduziert. Am Tag 3 nach Infektion war die Anzahl wieder vergleichbar mit naiven Mäusen, ein Effekt der möglicherweise auf eine lokale Regeneration zurückzuführen ist. Die Reduktion der ILC1-Zahl war nicht assoziiert mit erhöhter Apoptose oder der Migration von ILC1 aus der Leber heraus. Die Produktion von IFN-γ durch cNK und ILC1 ging einer kurzen, aber signifikanten Zunahme der Proliferation voraus. Um den Einfluss von Leber-ILC1 auf den Verlauf der VL zu untersuchen, wurden Hobit-/- Mäuse analysiert. Trotz der stark reduzierten Anzahl an hepatischen ILC1 in diesen Mäusen im naiven Zustand, zeigten Hobit-/- Mäuse über kurze und lange Infektionszeiträume keine Veränderungen in der Parasitenlast verglichen mit Wildtyp-Mäusen. Die Langzeitinfektion mit L. infantum führte jedoch zu phänotypischen Veränderungen von hepatischen ILC1 und cNK, die sich in einer zusätzlichen dritten “ILC1-ähnlichen” Population niederschlugen. Schlussfolgerungen: Obwohl Haut-ILC2 im Rahmen der CL nicht aktiviert wurden, könnten sie einen Beitrag leisten zum Influx und zur Aktivierung von Eosinophilen. Die Immunantwort von C57BL/6- und BALB/c-Mäusen unterschied sich nicht signifikant in den ersten 5 Tagen der Infektion. Dies deutet darauf hin, dass andere Faktoren für die Unterschiede im Infektionsverlauf der beiden Mausstämme verantwortlich sind. Die Infektion mit L. infantum führt zur Aktivierung von ILC1 in der Leber mittels IL-12 und IL-18, welche daraufhin IFN-γ produzieren und proliferieren. Die Abwesenheit von hepatischen ILC1, z.B. in Hobit-/- Mäusen, bewirkte jedoch keine Veränderung des Infektionsverlaufes. Die Zunahme von “ILC1-ähnlichen” Zellen mit der Infektionsdauer deutet darauf hin, dass sich das Gewebemilieu im Laufe der Infektion verändert und dies möglicherweise einen Einfluss auf die Effektorfunktionen von cNK und ILC1 hat.