title: Autophagy and apoptosis contribute to neuronal survival in a model system of oxytosis in vitro
title: Autophagie und Apoptose tragen bei zu neuronalem Überleben in einem in vitro Modellsystem der Oxytose
Creators: name: Neunteibl, Stefanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Autophagie
Naturwissenschaften
Apoptose
Apoptosis
Autophagy

description: Autophagie und Apoptose sind
      hochregulierte, komplexe Mechanismen, die eine bedeutende
      Rolle in der Entwicklung, Funktion und Homöostase von Zellen
      und Geweben eines Organismus einnehmen. Apoptose ist durch
      die Aktivität spezifischer Enzyme, der Caspasen,
      gekennzeichnet, die festgelegte programmierte Signalkaskaden
      in Gang setzten, was u.a. einen schnellen Abbau von
      Organellen und anderen zellulären Strukturen zur Folge hat.
      Autophagie ist ein hoch konservierter und in der Regel
      protektiver Prozess, bei dem zytoplasmatische Bestandteile in
      so genannte Autophagosomen eingeschlossen und transportiert
      werden und schließlich in den in Lysosomen degradiert werden.
      Bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Parkinson,
      Morbus Alzheimer und akuten Gehirnerkrankungen sind in den
      letzten Jahren zunehmend auch Mechanismen der Autophagie und
      Apoptose detektiert worden. Diese Befunde führten zu der
      Schlussfolgerung, dass bei diesen Erkrankungen die erhöhte
      Aktivität von Apoptose und Autophagie zum fortschreitenden
      Zelltod der Neurone und dem progressiven Verlust der
      Hirnfunktionen essentiell beitragen. Das Ziel dieser Arbeit
      war es daher, die möglichen Funktionen von Autophagie und
      Apoptose in Modellsystemen von Glutamat-Toxizität in
      kultivierten Neuronen in vitro zu untersuchen, um die Rolle
      dieser Mechanismen beim neuronalem Zelltod zu klären. Die
      Rolle von Autophagie wurde im Modellsystem von
      Glutamat-induziertem oxidativem Stress in neuronalen HT-22
      Zellen untersucht. Eine Zielsetzung war, den Effekt von
      oxidativer Glutamat-Toxizität auf die Aktivierung von
      Autophagie-Mechanismen in den Neuronen zu bestimmen und so zu
      klären, ob und in welchem Ausmaß hier Autophagie zum Zelltod
      beiträgt. Zudem wurde in Modellsystemen der
      Glutamat-Toxizität auch der neuroprotektive Effekt des
      vielfach verwendeten Autophagie-Inhibitors 3-Methyladenin
      (3-MA) untersucht. In HT-22 Zellen und primären kortikalen
      Neuronen (PCN) war die Glutamat-induzierte Toxizität von
      einem deutlichen Anstieg von Autophagie-Markern begleitet.
      Der Glutamat-induzierte Zelltod wurde durch den
      Autophagie-Inhibitor 3-MA signifikant vermindert. Allerdings
      induzierte 3-MA selbst Autophagie in HT-22 Zellen. Im
      Gegensatz dazu gelang es nicht, die Zellen mit Hilfe von
      genetischer Regulation der Autophagie gegen die
      Glutamat-Schädigung zu schützen. Die siRNA-vermittelte
      Expressionshemmung von Schlüsselregulatoren der Autophagie
      reduzierte zwar erwartungsgemäß die autophagische Aktivität,
      war aber nicht in der Lage, den Zelltod dauerhaft
      aufzuhalten. Der Inhibitor 3-MA verhinderte zudem die
      Glutamat-induzierte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies
      und den Verlust von ATP, wobei sowohl das
      Mitochodrienmembranpotential als auch die mitochondriale
      Morphologie erhalten blieben. Die Aktvierung der PI3K/Akt-
      und der MAPK/Erk-1/2 Signalwege sind offenbar nicht an der
      3-MA vermittelten Neuroprotektion beteiligt. Schlussfolgernd
      zeigen diese Daten, dass Glutamat-Toxizität mit einer
      Aktivierung der Autophagie einhergeht. Allerdings lieferte
      die siRNA-vermittelte spezifische Hemmung der Expression von
      Schlüsselregulatoren der Autophagie keine protektiven
      Effekte, so dass die gemessene autophagische Aktivität nicht
      entscheidend zum Glutamat-induzierten Zelltod beiträgt. Die
      Induktion von Autophagie ist in diesem Zusammenhang offenbar
      eine Gegenregulation der Zellen, über die eine Anpassung an
      den Stress vermittelt wird. In den untersuchten Neuronen
      trägt die Autophagie eher zum Überleben und zur zellulären
      Homöostase bei und ist nicht als Mechanismus des Zelltodes zu
      verstehen. Weiterhin zeigen die Ergebnisse, dass der
      protektive Effekt von 3-MA in den Mitochondrien der Neurone
      unabhängig von einer Inhibition der Autophagie erfolgt,
      obwohl die Substanz vielfach als Inhibitor der Autophagie
      verwendet wird. Basierend auch auf den vorliegenden
      Ergebnissen sind also Daten, die mit 3-MA in
      Autophagiestudien erhoben werden, zurückhaltend zu
      interpretieren, insbesondere dann, wenn mitochondriale
      Schädigungen den Zelltod vermitteln. Der Beitrag von Apoptose
      zu neuronalem Überleben durch interzelluläre Signale zwischen
      sterbenden (Stamm) Zellen und Neuronen wurde in Modellen des
      Nährstoffentzugs in neuronalen Vorläuferzellen und im
      Glutamat-Schädigungsmodell in den HT-22 Zellen untersucht.
      Therapeutische Effekte von Stammzellen und neuronalen
      Vorläuferzellen sind in Modellsystemen von akuten und
      chronischen neurodegenerativen Erkrankungen umfangreich
      nachgewiesen worden. In experimentellen Studien steigerten
      beispielsweise entsprechende Zelltransplantate das neuronale
      Überleben und die Erhaltung und Regeneration von
      Gehirnfunktionen. Jedoch sterben die meisten Zellen nach der
      Transplantation in das Gehirngewebe schnell ab und auch der
      exakte Mechanismus der therapeutischen Effekte von solchen
      Zelltransplantationen ist bislang weitgehend unbekannt. Die
      vorliegende Arbeit untersuchte, inwieweit das Absterben von
      neuronalen Vorläuferzellen für die beobachteten protektiven
      Effekte von transplantierten Zellen von Bedeutung ist. Zu
      diesem Zweck wurden die Transplantationsbedingungen in vitro
      nachgeahmt indem aus dem Medium von neuronalen
      Vorläuferzellen (NPC) die Wachstumsfaktoren EGF und FGF
      entfernt wurden, um so apoptotischen Zelltod zu induzieren.
      Das konditionierte Medium von diesen apoptotischen Zellen
      sollte ähnliche zelluläre Komponenten enthalten, die auch
      nach der Transplantation von den sterbenden Stamm- oder
      Vorläuferzellen im Gehirn in vivo freigesetzt werden und die
      möglicherweise die neuroprotektiven Effekte vermitteln. Das
      konditionierte Medium der apoptotischen neuronalen
      Vorläuferzellen wurde im Modell der Glutamatschädigung in
      HT-22 Zellen auf neuroprotektive Effekte untersucht.
      Weiterhin wurde die Zusammensetzung des konditioniertem
      Mediums der sterben Progenitorzellen analysiert, um die
      wirksamsten protektiven Komponenten zu identifizieren, die
      dann vielleicht in vitro und in vivo an Stelle des
      konditionierten Mediums oder zellulärer Transplantate
      appliziert werden könnten. Der Wachstumsfaktorentzug
      induzierte in den NPC einen Caspase-abhängigen Zelltod. Das
      konditionierte Medium (CM) von den apoptotischen NPC zeigte
      deutliche dosisabhängige protektive Effekte und verhinderte
      in HT-22 Zellen und kortikalen Neuronen den Zelltod nach
      Wachstumsfaktorentzug und Glutamatbehandlung. Der protektive
      Effekt des konditionierten Mediums wurde durch
      Hitzeinaktivierung bei 95°C für 30 Minuten aufgehoben.
      Weiterhin verstärkte das CM die Phosphorylierung von Erk 1/2
      und PKB/Akt in primären Neuronen in einem ähnlichen
      Zeitrahmen wie das Neurotrophin BDNF. Autophagieinhibition in
      NPC schwächte die beschriebene neuroprotektive Wirkung nicht
      ab. Konditioniertes Medium, das von den NPC nach Induktion
      von Autophagie durch Spermidin gewonnen wurde, zeigte
      keinerlei protektiven Effekte in dem Modell der
      Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen. Die Aktivierung von
      Autophagie in NPC ist also im Gegensatz zur Apoptose offenbar
      nicht ausreichend, um protektive Faktoren zu bilden und in
      das konditionierte Medium abzugeben. Zusammenfassend deuten
      diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass apoptotische NPC
      neuroprotektive Faktoren sezernieren, die
      neurotrophin-ähnliche Überlebenssignalwege stimulieren und so
      protektive Effekte gegen Nährstoffentzug und
      Glutamat-Toxizität vermitteln. Die Resultate des in vitro
      Modellsystems in dieser Arbeit sind übertragbar zum adulten
      Organismus. Die vorliegenden Erkenntnisse sind die Basis für
      die Entwicklung einer zellfreien, standardisierten und
      potenten neuroprotektiven Komposition, die eine Alternative
      zur Stammzelltransplantation darstellt und neue
      therapeutische Optionen für die zukünftige Behandlung von
      akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen bieten
      kann.
description: Autophagy and apoptosis play major
      roles in determining the cellular fate. Accordingly, they
      participate in development, cellular homeostasis, and both in
      physiological as well as in pathological processes. Apoptosis
      is executed by activated caspases, which are specific enzymes
      that participate in signaling cascades that culminate in the
      rapid removal of organelles and other cellular structures.
      Autophagy is a highly conserved cytoprotective process
      whereby cytoplasmic contents are sequestered, transported via
      double-membrane autophagosomes to lysosomes, and degraded.
      Along with regulated necrosis and other forms of programmed
      cell death, pathological mechanisms of autophagy and
      apoptosis have been detected in neurodegenerative diseases,
      such as Parkinson’s disease or Alzheimer’s disease and acute
      brain injuries. The aim of this thesis was to investigate the
      role of autophagy and apoptosis for neuronal resilience
      versus neuronal cell death in model systems of glutamate
      toxicity in vitro. The role of autophagy was investigated in
      the model system of glutamate-induced oxidative stress, i.e.
      oxytosis in neural HT-22 cells. The objectives were to
      determine the effect of oxidative glutamate toxicity on
      autophagic flux and to investigate if oxytosis involves
      autophagy pathways of cell death. Moreover the
      neuroprotective effect of 3-Methyladenine (3-MA), a widely
      used autophagy inhibitor, was explored in the model systems
      of glutamate-induced oxytosis and excitotoxicity in neural
      HT-22 cells and primary cortical neurons, respectively.
      Glutamate clearly enhanced autophagy markers and induced cell
      death in HT-22 cells and PCN. Cell death was prevented by
      3-MA, a widely used inhibitor of autophagy. Interestingly,
      3-MA itself induced autophagy in HT-22 cells. A gene
      silencing approach targeting key regulators of autophagy
      reduced the autophagic flux, but failed to prevent cell death
      persistently. 3-MA prevented the glutamate-induced ROS
      formation, the loss of ATP, and preserved the mitochondrial
      membrane potential as well as mitochondrial morphology. The
      activation of the PI3K/Akt pathway and the MAPK/Erk-1/2
      pathway do not play a role in 3-MA mediated neuroprotection.
      In conclusion, these data suggest that glutamate toxicity is
      associated with increased markers of autophagy. However,
      specific gene silencing of key regulators of autophagy did
      not provide protective effects, suggesting that the increased
      autophagic flux was dispensable for cell death induced by
      glutamate. The induction of autophagy can rather be
      interpreted as the ultimate attempt to adapt to lethal stress
      after glutamate challenge und is rather prosurvival and
      contributes to cellular homeostasis in HT-22 cells. Further,
      the findings clearly demonstrate that protective effects by
      3-MA occur independently of autophagy inhibition, although
      the compound is widely used as an inhibitor of autophagy.
      Nowadays, 3-MA is used frequently in experimental studies in
      vivo and in vitro. Based on the present findings, caution is
      recommended in the interpretation of data obtained with 3-MA
      in the context of autophagy studies, in particular, if
      mitochondrial alterations are connected. The contribution of
      apoptosis to neuronal survival through intercellular
      signaling between dying cells and neurons was investigated
      using conditioned medium of neural progenitor cells (NPC) and
      HT-22 cells. Stem cells as well as progenitor cells have been
      widely used in model systems of neurodegenerative diseases
      and acute brain injuries where transplantation of these cells
      into the brain improved neuronal survival and brain functions
      in experimental settings. However, most transplanted cells
      die after transplantation in vivo, and the exact mechanism of
      action of stem cell or progenitor cell transplantation still
      remains unknown. To investigate mechanisms of intercellular
      signaling underlying the protective effects of transplanted
      stem cells, the transplantation conditions were mimicked in
      vitro by preparation of conditioned medium (CM) obtained from
      dying neuronal progenitor cells. This CM should contain
      similar cellular components as released during cell death of
      the progenitor cell transplants, and this CM should therefore
      also provide neuroprotective effects. Thus, the CM of
      dying/apoptotic cells was applied in model systems of cell
      death in vitro for to test its potential to mediate
      neuroprotection. Further, the composition of the conditioned
      medium obtained from the dying progenitor cells was analysed
      for identifying the most potent protective components that
      may be applied as neuroprotectants in vitro and in vivo
      instead of the CM or the cellular transplants. In order to
      mimic the conditions of transplantation, NPC were exposed to
      medium lacking growth factors such as FGF and EGF. Such
      growth factor deprivation induced caspase-dependent cell
      death in NPC in a time-dependent manner. The conditioned
      medium obtained from apoptotic NPC significantly attenuated
      cell death induced by growth factor withdrawal and glutamate
      exposure in HT-22 cells and cortical neurons in a
      dose-dependent manner. The protective effect of NPC CM
      against glutamate neurotoxicity was abolished by heat
      inactivation at 95°C for 30 min. Further, NPC CM enhanced
      phosphorylation of PKB/Akt and Erk 1/2 in neurons in a
      similar time frame as the neurotrophin BDNF. Inhibition of
      autophagy did not diminish the protective effect of NPC CM.
      Also the use of spermidine conditioned medium (Sp CM) from
      HT-22 cells, whose production aimed on the specific
      activation of autophagy, indicated that the induction of
      autophagy is not essential for the protective effect of
      conditioned medium. In total, these findings suggest that NPC
      secrete neuroprotective factors that stimulate
      neurotrophin-like survival signaling thereby providing
      protective effects against growth factor withdrawal and
      glutamate neurotoxicity. The results obtained from the in
      vitro model system in this thesis are transferable to the
      adult organism. Thus, the results are the basis for the
      development of a highly potent, standardized composition for
      the therapy of neurodegenerative diseases and acute brain
      injury. Therefore, CM and its active components could serve
      as an alternative therapeutic option to stem cell
      transplantation.