title: The role of Galectin-3 during the apical transport of the H,K-ATPases' beta-Subunit in MDCK-cells
title: Untersuchung von Galectin-3 im apikalen Transport der Beta-Untereinheit der H,K-ATPase in MDCK-Zellen
Creators: name: Eilbracht, Mathias
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: MDCK-Zelle , apikal
Transport , Galectin-3
Beta-Untereinheit
apical
Medizin, Gesundheit
beta-subunit
H,K-ATPase
Transport
transport , galectin-3

description: Like many other cells at the
      boundary to environment, the gastric parietal cell is a polar
      epithelial cell. The membrane of these cells is subdivided
      into an apical and a basolateral part. Hence, single cells,
      organs and finally the whole apparatus are able to correctly
      perform necessary functions. Currently, two different sorting
      platforms are discussed that direct lipids and proteins to
      the apical membrane. On the one hand this sorting is mediated
      by lipid rafts. This mechanism concentrates proteins and
      lipids in microdomains of the membrane by forming clusters.
      These clusters are then transported to the apical cell
      surface. On the other hand there is a raft-independent route
      mediated by lectins. By cross linking the proteins and
      forming different clusters, Galectin-3 initializes the
      transport to the apical surface. The transport route guiding
      the gastric H,K-ATPase to the apical surface is still
      unknown. With respect to the transportation, the β-subunit
      seems to be of crucial relevance. Due to the strong
      glycosylation of the β-subunit it is the ideal target for
      lectins like galcetin-3. The scope of this work is to
      investigate the influence of galectin-3 on the transport of
      the H,K-ATPase’s β-subunit. Microscopic analysis suggests the
      coexistence of galectin-3 and the β-subunit in subapical
      structures. The number of co-localisations decreased with
      increasing cultivation time. Furthermore, the
      co-immunoprecipitations do not show an interaction between
      both proteins. Galectin-3 knockdown using siRNA does not
      significantly change polarized sorting of the β-subunit
      either. Only a slightly decreased fraction in the membrane
      and an increased intracellular fraction are detected. Hence,
      it is unlikely that Galectin-3 plays an important role in
      apical sorting of the β-subunit. Furthermore, microscopic
      analysis indicates the co-localisation of β-subunits with
      rab11. Rab11 is a marker of recycling endosomes which have
      noticeable similarities with the tubulovesicular system found
      in parietal cells. In the same way, a co-localisation of the
      β-subunit and the lipid raft marker caveolin-1 is detected.
      Subsequent raft-isolation confirms the microscopic
      observations. For the first time, the β-subunit is detected
      in raft-dependent transport routes. However, the direction of
      transportation and the existence of alternative transport
      routes call for further research. Summing up, the results
      presented in this work lead to the conclusion that a
      governing role of Galectin-3 in the sorting of the gastric
      H,K-ATPase is very unlikely. The experimental data rather
      suggest a raft-dependent transport of the β-subunit.
description: Die Parietalzelle des Magens ist,
      wie auch andere an die Außenwelt grenzende Zellen, eine
      polare Epithelzelle. Diese Zellen weisen eine
      charakteristische Trennung der Membran in eine apikale und
      eine basolaterale Seite auf, die wichtig für die einzelnen
      Funktionen des Zelltyps und für die Wirkungsweisen ganzer
      Organe und Organsysteme ist. Zur Zeit geht man für den
      apikalen Transport von zwei Sortierplattformen aus, durch die
      Proteine und Lipide zu ihrem Bestimmungsort geleitet werden.
      Zum einen über lipid rafts, welche Proteine und Lipide in
      bestimmten Bereichen konzentrieren und zum anderen als eine
      raft-unabhängige Form, in der durch Quervernetzung mittels
      Galectin-3 ebenfalls eine Anreicherung und damit Sortierung
      von Glykoproteinen stattfindet. Für die in Parietalzellen
      apikal lokalisierte H,K-ATPase ist bisher nicht geklärt,
      welche dieser Transportplattformen für die korrekte
      Sortierung verantwortlich ist. Im Zusammenhang mit dem
      Transport scheint der β-Untereinheit die entscheidende
      Bedeutung zuzukommen. Da die β-Untereinheit stark
      glykosyliert ist, war es Ziel dieser Arbeit, herauszufinden,
      ob das Lektin Galectin-3 eine Rolle in der Sortierung der
      ATPase spielt. Die mikroskopischen Untersuchungen legen nahe,
      dass Galectin-3 und die β-Untereinheit zusammen in
      Kompartimenten der Zelle vorkommen. Die Häufigkeit dieser
      Kolokalisationen nimmt jedoch mit längerer Kultivierungsdauer
      ab. In den durchgeführten Koimmunpräzipitationen konnte keine
      Interaktion der beiden Proteine festgestellt werden. Ein
      Knockdown von Galectin-3 zeigte keine signifikante Änderung
      der Lokalisation der β-Untereinheit. Lediglich der Anteil der
      sich in der basolateralen oder apikalen Membran befindlichen
      β-Untereinheiten sank leicht und der intrazelluläre Anteil
      erhöhte sich geringfügig. Diese Ergebnisse machen es
      unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine entscheidende Rolle in
      der Sortierung der β-Untereinheit und damit der H,K-ATPase
      spielt. Es konnte mikroskopisch nachvollzogen werden, dass
      viele der subapikal gelegenen Strukturen, welche die
      β-Untereinheit enthielten, Rab11 positiven apikalen Recycling
      Endosomen entsprachen, die eine Ähnlichkeit mit den in
      Parietalzellen zu findendem vesikulotubulären System
      aufweisen. Ebenso konnte die β-Untereinheit in Strukturen
      nachgewiesen werden, die Caveolin-1, einen lipid raft Marker,
      enthielten. Die nachfolgende raft-Isolation bestätigte diese
      visuellen Eindrücke. Es konnte so zum ersten Mal gezeigt
      werden, dass die β-Untereinheit der H,K-ATPase raft-abhängig
      transportiert wird. Die Richtung des Transportes und
      alternative Transportrouten werden zukünftig zu erforschen
      sein. Zusammengefasst machen es die Ergebnisse dieser
      Dissertation unwahrscheinlich, dass Galectin-3 eine Rolle in
      der Sortierung der H,K-ATPase spielt. Es konnte stattdessen
      ein raft-abhängiger Transport der β-Untereinheit nachgewiesen
      werden.