title: A new facet in the adaptation of Bacillus subtilis to high salinity : The analysis of the osmotic induced yqiHIK operon
title: Eine neue Facette im zellulären Anpassungsprozess von Bacillus subtilis an hohe Salinitäten : Die Analyse des osmotisch induzierten yqiHIK Operons
Creators: name: Fischer, Kathleen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: cell wall hydrolase
osmoregulation
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Biowissenschaften, Biologie
Bacillus subtilis , Osmoregulation
Bacillus subtilis
Zellwandhydrolasen

description: In seinem natürlichen Lebensraum
      ist der Mikroorganismus Bacillus subtilis zahlreichen
      Stressfaktoren ausgesetzt. Durch komplexe Regulations- sowie
      Differenzierungsprozesse (Biofilm-Formation, Sporulation)
      besitzt dieses Bakterium die Fähigkeit, sich an diverse
      Stresssituationen anzupassen. Die Verfügbarkeit von Wasser
      ist ein Beispiel für einen solchen Stressfaktor. Als eine
      zentrale Anpassungsstrategie an hyperosmotische
      Kulturbedingungen, konnte in B. subtilis die Akkumulation von
      kompatiblen Soluten durch Synthese und Aufnahme identifiziert
      werden. In Transkriptom-Analysen hyperosmotisch gestresster
      B. subtilis Kulturen wurden jedoch zahlreiche Gene
      identifiziert, die unter Hochsalz Bedingungen eine Induktion
      in der Genexpression zeigten. Interessanterweise
      kristallisierte sich bei der Analyse dieser
      Transkriptom-Daten eine Gruppe von Genen heraus, denen eine
      Beteiligung am Zellwandmetabolismus zugesprochen werden
      konnte. Beispiele dafür sind die Gene yqiH sowie yqiI. Das
      Gen yqiH kodiert vermutlich für ein Lipoprotein, wohingegen
      das Protein YqiI Sequenzähnlichkeiten zu der Enzymklasse der
      N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidasen aufweist. Diese Enzyme
      gehören zu der Gruppe der Zellwandhydrolasen (Autolysine),
      die in wichtige zelluläre Prozesse involviert sind. Mit Hilfe
      der Zymographie konnte im Verlauf dieser Arbeit die
      hydrolytische Fähigkeit für das Protein YqiI in vitro
      bestätigt werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die
      Kultivierung von B. subtilis unter hyperosmotischen
      Bedingungen zu einer drastischen Veränderung in der
      Zellmorphologie führte, die ausschließlich während der
      Anpassungsphase auftrat. Die Ergebnisse der
      Transkriptom-Analysen und auch die Beobachtung der
      morphologischen Veränderungen führten zu der Hypothese, dass
      die Restrukturierung der Zellhülle eine neue Facette in der
      Adaptation von B. subtilis an hochsaline Bedingungen
      darstellen könnte. Um eine mögliche Beteiligung der Proteine
      YqiH sowie YqiI zu untersuchen wurden, diese im Rahmen der
      vorliegenden Arbeit einer biochemischen, physiologischen
      sowie regulatorischen Charakterisierung unterzogen. Durch
      eine RT-PCR-basierende Methode konnte eine Co-Transkription
      der yqiHI Gene mit einem weiteren Gen yqiK erstmals gezeigt
      werden. Die Charakterisierung einer yqiHIK Deletionsmutante
      zeigte unter normalen physiologischen sowie hyperosmotischen
      Bedingungen eine Wachstums-verzögerung im Vergleich zum
      Wildtyp, was alleinig auf das Fehlen der Amidase YqiI
      zurückgeführt werden konnte. Darüber hinaus konnte
      ausgeschlossen werden, dass die YqiHIK Proteine wesentlich an
      der Restrukturierung der Zellwand beteiligt sind. Durch
      Reportergenstudien wurde die osmotische Induktion des yqiHIK
      Operons näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine
      Expression des yqiHIK Genclusters nur bei sehr hohen
      NaCl-Konzentrationen erfolgte (&gt; 0,7 M NaCl). Die
      Expression wird dabei über einen SigA-Promotor vermittelt,
      der mit Hilfe einer Primer-Extension-Analyse identifiziert
      werden konnte und ferner einer detaillierten
      Mutagenese-Studie unterzogen wurde. Verkürzungen in der
      yqiHIK Promotorregion führten zu der Identifikation einer
      AT-reichen Region, die kritisch für die Induktion des Operons
      unter hohen osmotischen Bedingungen war. Diese AT-reiche
      Region wurde als mögliche Binderegion für den Regulator DegU
      aus B. subtilis wiedererkannt. Die Beteiligung des
      Zwei-Komponenten-Systems DegS/DegU an der Induktion der
      Expression des yqiHIK Operons unter salinen Bedingungen,
      stellte dabei ein zentrales Ergebnis dieser Arbeit dar, wobei
      somit erstmalig ein Hinweis darauf gegeben wurde, wie die
      Zelle in der Lage ist, hohe NaCl-Konzentrationen wahrzunehmen
      und darauf zu reagieren. Neben der Induktion des yqiHIK
      Operons unter hyperosmotischen Bedingungen wurden im Verlauf
      dieser Dissertation noch zwei weitere regulatorische
      Besonderheiten dieses Genclusters aufgedeckt. Zum einen
      konnte gezeigt werden, dass eine Induktion der Expression des
      yqiHIK Operons direkt nach Initiation der Sporulation
      erfolgte. Dabei wurde eine Beteiligung des SinR Regulators
      nachgewiesen, welcher auch die Expression dieses Operons
      unter normalen Wachstumsbedingungen verhindert. Darüber
      hinaus konnte eine Erhöhung der Transkription des yqiHIK
      Genclusters in der sogenannten „Todeszone“ beobachtet werden.
      Für beide dieser regulatorischen Aspekte wurde eine
      Beteiligung des zuvor identifizierten SigA-Promotors
      ausgeschlossen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden somit
      drei physiologische Prozesse aufgedeckt, an denen die
      Genprodukte des yqiHIK Operons beteiligt zu sein scheinen,
      wobei die Transkription des yqiHIK Genclusters über
      mindestens zwei unterschiedliche Promotoren erfolgt.
      Zusätzlich wurden zwei Transkriptionsfaktoren identifiziert,
      die die Expression des yqiHIK Operons kontrollieren. Die
      Regulation des yqiHIK Operons ist ein gutes Beispiel dafür,
      wie facettenreich Bakterien ihre Umwelt wahrnehmen und
      genetisch darauf reagieren können.
description: The microorganism Bacillus
      subtilis lives in a challenging habitat, i.e. the upper
      layers of the soil. Due to its ability to differentiate
      between several developmental programs (e.g. Biofilm
      formation, sporulation) the organism is able to adapt to
      various environmental stress conditions as well as nutrient
      limitation. Water availability is a crucial factor for all
      microorganisms. A key feature during the acclimatization
      process of salt stresses B. subtilis cells is the
      accumulation of large amounts of compatible solutes. Based on
      a genome-wide profiling study of osmotically stressed cells a
      plenty of salt induced genes could be identified. However,
      the majority of these gene products are uncharacterized so
      far. Interestingly, among the osmotically induced genes there
      are several cell wall modifying proteins. Members of this
      group of osmotically induced genes are for example the genes
      yqiH and yqiI. The yqiH gene codes for a putative lipoprotein
      of unknown function whereas the gene yqiI is predicted to
      code for an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. These enzymes
      belong to the group of cell wall hydrolases (autolysins)
      which are involved in several important cellular processes.
      The hydrolytic activity of the YqiI protein was confirmed in
      this study by the in vitro zymogram technique. Furthermore,
      drastic but transient, changes in the morphology of salt
      challenged B. subtilis cells could be observed during the
      acclimatization process. In sum, the transcription profiling
      study as well as the cross morphological deformations lets me
      hypothesize that modifications of the cell wall could be a
      new and so far unexplored facet in the osmo adaptation
      process in B. subtilis. To address a possible impact of the
      encoded YqiH and YqiI proteins on this process, a
      physiological characterization as well as a genetic analysis
      of the transcription of the yqiHIK operon was performed in
      this PhD thesis. RT-PCR based analyses revealed a
      co-transcription of the yqiHI genes with a third gene, yqiK.
      The analysis of a yqiHIK deletion mutant showed a delayed
      growth phenotype under normal and hyper osmotic growth
      conditions. This growth defect was exclusively due to the
      lack of the amidase YqiI. In addition, I could show that the
      YqiHIK proteins were not critically involved in the reshaping
      of the cell wall under hyperosmotic conditions. Reporter gene
      studies revealed an expression of the yqiHIK gene cluster
      only when the B. subtilis cell was exposed to a significant
      level of osmotic stress (&gt; 0.7 M NaCl). Primer extension
      analyses lead to the identification of a SigA-type promoter
      that is responsible for osmotic induced transcription of the
      yqiHIK gene cluster which was furthermore subject of a
      detailed mutagenesis study. A deletion analysis of the yqiHIK
      regulatory region was performed that showed an AT-rich DNA
      segment that is critical for activity and osmotic regulation
      of the yqiHIK operon. Additionally, the AT-rich region was
      identified as a target for the response regulator DegU from
      B. subtilis. As a key aspect of this thesis, it could be
      demonstrated that the two component system DegS/DegU is
      crucial for the regulation of the expression of the yqiHIK
      genes at high salinity growth conditions. This result pointed
      to, how the B. subtilis cell is able to recognize differences
      in the external NaCl concentration. Beside the salt stress
      induction of the yqiHIK operon, two additional regulatory
      aspects of the yqiHIK gene cluster were discovered. On the
      one hand it was found that the expression of this
      transcriptional unit was initiated directly after the cells
      have entered the sporulation pathway. The SinR protein
      contributes to this regulatory facet and is also involved in
      preventing the yqiHIK expression under normal physiological
      growth conditions. On the other hand an increase of the
      yqiHIK transcription could be observed in the so called
      “death zone”, after the cells have passed through the
      stationary growth phase. An involvement of the SigA promoter
      mediating osmotic control of the yqiHIK expression could be
      excluded with respect to both of the above described
      regulatory aspects. In conclusion, the YqiHIK proteins seem
      to be involved in three different physiological processes:
      (1) Adaptation to hyperosmotic growth conditions, (2)
      sporulation and (3) peptidoglycan recycling. The expression
      of the yqiHIK operon is at least regulated by two differently
      controlled promoters. Furthermore, two transcriptional
      regulators could be discovered that manage the expression of
      the yqiHIK operon. The complex pattern of the transcription
      of the yqiHIK gene cluster is an informative example of how
      bacteria can recognize changes in their environment and
      adjust to these changes by selectively triggering gene
      expression.