title: Analyse der Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase DgcZ aus Escherichia coli
title: Analysis of the regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ from Escherichia coli
Creators: name: Lacanna, Egidio
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Biofilm , Zink
DgcZ
Diguanylate cyclase
Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP)
Escherichia coli
Diguanylat-Zyklase , DgcZ
Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP)
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Zyklisches-dimeres-GMP (c-di-GMP)
      ist ein weit verbreiteter sekundärer Botenstoff, der
      verschiedenste zelluläre Prozesse reguliert, einschließlich
      bakterieller Motilität, Biofilmbildung und Virulenz. Die
      c-di-GMP-Menge in der Zelle wird von zwei Enzym-Typen
      reguliert: sogenannten Diguanylat-Zyklasen (DGCs), die
      c-di-GMP synthetisieren, und Phosphodiesterasen (PDEs), die
      es abbauen. DGCs besitzen eine charakteristische
      GGDEF-Domäne, während PDEs entweder eine EAL- oder eine
      HD-GYP Domäne aufweisen. In Escherichia coli K-12 MG1655
      wurden 29 Proteine identifiziert, die eine GGDEF- und/oder
      eine EAL-Domäne aufweisen. In E. coli hat die
      Diguanylat-Zyklase DgcZ (früher YdeH) den größten Einfluss
      auf die c-di-GMP-abhängige Produktion des Exopolysaccharids
      Poly-N-Acetylglucosamine (Poly-GlcNAc, PGA), das wiederum bei
      der Biofilmbildung eine Rolle spielt. DgcZ verfügt über eine
      GGDEF-Domäne, welche verantwortlich für die
      c-di-GMP-Produktion ist, sowie über eine sensorische Domäne.
      Diese wurde erstmals im Chemorezeptor TlpD von Helicobacter
      pylori identifiziert und aufgrund ihrer Fähigkeit, Zink zu
      binden, Chemorezeptor-Zink-Binde-Domäne (CZB-Domäne) genannt.
      Forscher vom Biozentrum der Universität Basel haben die
      dreidimensionale Struktur des DgcZ-Proteins gelöst und dabei
      tatsächlich ein Zink-Ion im 3His/1Cys-Motiv der CZB-Domäne
      entdeckt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Aktivität von
      DgcZ in vitro durch Zink mit einer Konstante Ki im
      subfemtomolaren Bereich gehemmt wird. Die vorliegende Studie
      untersucht die Regulation und Funktion der Diguanylat-Zyklase
      DgcZ in E. coli. Um den Einfluss von Zink auf die Aktivität
      von DgcZ in vivo zu analysieren, wurden mittels
      ortsgerichteter Mutagenese dgcZ-Allele konstruiert, in deren
      Proteinprodukten die für die Zink-Koordination
      verantwortlichen Aminosäuren ausgetauscht waren, wodurch die
      Affinität von Zink reduziert oder vollständig aufgehoben
      wurde. Die Aktivität dieser DgcZ-Varianten wurde durch
      Messung der Menge an PgaD bestimmt, eines Enzyms im
      Exopolysaccharid-Syntheseweg, und der Menge des
      Exopolysaccharids Poly-GlcNAc (PGA); beides ist proportional
      zur c-di-GMP-Produktion durch DgcZ. Während einzelne
      Mutationen in der CZB-Domäne die Proteinaktivität geringfügig
      beeinflussten, zeigte eine DgcZ-Variante mit zwei
      Aminosäureaustäuschen (H79L und H83L) eine deutliche
      Steigerung der Proteinaktivität. Der Einfluss von Zink-Ionen
      auf die Aktivität von DgcZ wurde darüber hinaus untersucht,
      indem bei steigenden Konzentrationen von ZnSO4 im Medium die
      Fähigkeit der Bakterien zur Bildung eines PGA-Biofilms
      ermittelt wurde: Wird Zink extern hinzugegeben, hemmt es die
      PGA-Biofilmbildung in einer DgcZ- und c-di-GMP-abhängigen Art
      und Weise. Die in vivo-Ergebnisse bestätigen damit die in
      vitro-Experimente und belegen, dass die Diguanylat-Zyklase
      DgcZ allosterisch durch Zink reguliert wird. Die Bedeutung
      dieses regulatorischen Mechanismus ist noch offen; mögliche
      Erklärungsansätze wären, dass er den Bakterien hilft,
      zwischen Nischen mit hohen und niedrigen Zink-Konzentrationen
      zu unterscheiden, oder den metabolischen Zustand der
      Bakterienzelle selbst widerspiegelt. Neben diesen Studien zur
      allosterischen Kontrolle wurde die physiologische Rolle von
      DgcZ untersucht, denn dessen primäre Funktion und die
      Bedingungen, unter denen das Protein aktiv ist, sind nach wie
      vor nicht ausreichend verstanden. DgcZ-Lokalisationsstudien
      im Rahmen dieser Arbeit zeigen, dass es bei einer Kombination
      von Kohlenstoffmangel und alkalischem pH (8,7) zu einer
      Lokalisation an einem Pol der Bakterienzelle kommt. Diese
      Lokalisation konnte nur bei sich nicht teilenden Bakterien
      beobachtet werden und ist bei erneuter Nährstoffgabe
      reversibel. Auf eine eventuelle Funktion dieses Phänotyps
      gibt es bis jetzt allerdings keine Hinweise. Des Weiteren
      wurden Co-Immunpräzipitation-Experimente durchgeführt, in
      deren Verlauf 11 Proteine identifiziert werden konnten. Unter
      diesen 11 Proteinen war auch FrdB, eine Untereinheit des
      Fumarat-Reduktase-Komplexes (FRD), für die anschließend eine
      Interaktion mit DgcZ mittels eines bakteriellen
      Zwei-Hybrid-System bestätigt werden konnte. Darüber hinaus
      erwies sich der FRD-Komplex als essenziell in einer
      Superoxid-stimulierten Zunahme von DgcZ abhängigen Biofilmen,
      was auf eine neue Rolle dieses Komplex einerseits und von
      oxidativem Stress andererseits in der DgcZ-abhängigen
      Biofilm-Bildung hindeutet. Abschließend wurde die Rolle von
      DgcZ in der durch CpxAR vermittelten Oberflächenadhäsion
      untersucht, denn es war bekannt, dass dgcZ durch dieses
      Zweikomponentensystem transkriptionell reguliert wird. Der
      Cpx-Komplex wiederum ist für die Oberflächendetektion
      verantwortlich und stimuliert die Zelladhäsion durch einen
      bislang unbekannten Mechanismus. Diese Arbeit zeigt nun eine
      Beteiligung von DgcZ in der Cpx-vermittelten
      Oberflächenadhäsion und belegt damit eine physiologische
      Funktion dieser Diguanylat-Zyklase im Übergang von
      Oberflächendetektion zur Adhäsion.
description: Cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) is a
      widespread second messenger regulating several processes
      including bacterial motility, biofilm formation, and
      virulence. The enzymes responsible for c-di-GMP production
      and degradation, diguanylate cyclases (DGCs) and
      phosphodiesterases (PDEs), respectively, are abundant and
      often present in multiple copies within bacterial genomes.
      DGCs possess a characteristic GGDEF domain, whereas PDEs have
      either an EAL or an HD-GYP domain. In the Escherichia coli
      K-12 strain MG1655, 29 proteins containing GGDEF and/or EAL
      domains have been identified. In E. coli, the diguanylate
      cyclase DgcZ (formerly YdeH) is the major DGC controlling the
      production of the exopolysaccharide poly-N-Acetylglucosamine
      (poly-GlcNAc, PGA), which is involved in biofilm formation.
      DgcZ contains a GGDEF domain, responsible for c-di-GMP
      production, and a sensory domain. First identified in the
      chemoreceptor TlpD of Helicobacter pylori, this domain was
      named chemoreceptor zinc-binding (CZB) domain after its
      capability to bind zinc. Researchers from the University of
      Basel’s Biozentrum solved the three-dimensional structure of
      the DgcZ protein and indeed found a zinc ion bound to the
      3His/1Cys motif of the CZB domain. Additionally, zinc was
      shown to inhibit the activity of DgcZ in vitro with a
      subfemtomolar constant Ki. This study investigates the
      regulation and function of the diguanylate cyclase DgcZ in E.
      coli. To ascertain the role of zinc in the function of DgcZ
      activity in vivo, site-directed mutagenesis was employed to
      construct dgcZ alleles encoding protein variants with amino
      acid exchanges in the CZB domain involved in zinc
      coordination, thus reducing or abolishing binding. The
      activity of these DgcZ variants was derived by measuring the
      levels of PgaD, an enzyme involved in exopolysaccharide
      production, and of the exopolysaccharide poly-GlcNAc (PGA)
      produced, both proportional to DgcZ-derived c-di-GMP.
      Although single exchanges of zinc binding amino acids did not
      strongly affect the protein activity, a DgcZ variant carrying
      two such exchanges (H79L and H83L) displayed a significant
      increase of protein activity. The influence of zinc ions on
      DgcZ activity was further tested by applying increasing
      concentrations of ZnSO4 and measuring the ability of bacteria
      to form a PGA biofilm. Externally applied zinc inhibited PGA
      biofilm formation in a DgcZ- and c-di-GMP-dependent fashion.
      The evidence obtained in vivo therefore confirms the results
      from the in vitro experiments showing that the diguanylate
      cyclase DgcZ is allosterically regulated by zinc. The
      relevance of this regulatory mechanism is still unsettled,
      but potential explanations are that it might help the
      bacteria discriminate among different niches, characterized
      by high or low levels of zinc, or that it could “signal” the
      cell´s own physiological condition. Following these studies
      on allosteric regulation, the physiological role of DgcZ was
      examined, as its primary function and the conditions in which
      the protein is active are still not well defined. Analyses of
      DgcZ protein localization performed in this study revealed
      that a combination of carbon starvation and alkaline pH (8.7)
      induces localization at one bacterial cell pole. Polar
      localization occurred in non-dividing bacteria and
      disappeared after restoring nutrient-sufficient conditions.
      The role of this localization phenotype until now remains
      elusive. Further, Co-Immunoprecipitation analyses were
      performed and 11 proteins identified with a significant
      score. Among these, FrdB, a subunit of the fumarate reductase
      complex (FRD), interacted with DgcZ within a bacterial
      two-hybrid system. The FRD complex proved essential in the
      superoxide-stimulated increase of DgcZ-dependent biofilm,
      suggesting new roles of this complex and oxidative stress in
      DgcZ-mediated biofilm formation. Finally, the role of DgcZ in
      CpxAR-mediated surface adhesion was investigated, as it had
      already been established that dgcZ is transcriptionally
      regulated by this two-component system. The Cpx complex in
      turn had been shown to be responsible for surface sensing and
      to stimulate bacterial adhesion through an up to now unknown
      mechanism. This work reveals an involvement of DgcZ in
      Cpx-mediated surface adhesion, providing evidence for a
      physiological function of this diguanylate cyclase in
      connecting the processes of surface sensing and surface
      attachment.