title: Tumor-Nekrose-Faktor und die Kontrolle des intrazellulären Parasiten Leishmania major in Mäusen und Menschen
Creators: name: Winkelmann, Johanna
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025
Subjects: subject: Leishmania, TNF, Erythropoese, Arginase

description: Hintergrund: Die Neutralisation oder Deletion von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) führt zum Verlust der immunologischen Kontrolle von Infektionen mit intrazellulären Erregern in Mäusen und Menschen. Die zugrundeliegenden Mechanismen hierfür sind immer noch nicht vollständig aufgeklärt. Auch TNF-defiziente C57BL/6 Mäuse können die lokale kutane Infektion mit dem intrazellulären Parasiten Leishmania (L.) major nicht effizient eindämmen und entwickeln eine progressive und viszerale Erkrankung, obwohl die protektiv wirkenden IFNγ-produzierenden T-Helfer-Zellen vom Typ1 (Th1) ausreichend gebildet werden und die induzierbare oder Typ 2 Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS, NOS2) unverändert exprimiert wird. Das Enzym NOS2 metabolisiert die Aminosäure L-Arginin zu Citrullin und dem antimikrobiell wirksamen NO. Bei gleichzeitiger Expression des Enzyms Arginase 1 (Arg1) kann es zur Substratkompetition kommen, da Arg1 L-Arginin zu Harnstoff und Ornithin verstoffwechselt. Vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass das Fehlen von TNF zur Überexpression der Arg1 führt und dadurch eine verminderte Produktion des leishmaniziden NO verursacht wird. Hypothese, Zielsetzung und Fragestellungen: Basierend auf den Vorbefunden wurde die Hypothese formuliert, dass die progredient verlaufende viszerale Leishmaniose in L. major-infizierten Tnf-/- Mäusen durch eine gleichzeitige Deletion von Arg1 verhindert werden kann. Gleichzeitig wurde postuliert, dass TNF vor allem in den inneren Organen (Milz) kritisch für die Erregerkontrolle ist und auch beim Menschen die Arginase 1-Expression unterdrückt. Die funktionelle Bedeutung der Arg1 in der L. major Infektion wurde mit Hilfe von Mäusen, denen neben TNF zusätzlich die Arg1 in hämatopoetischen Zellen und Endothelzellen fehlt, genauer untersucht werden. Da die Arg1 vor allem in der infizierten Haut und im drainierenden Lymphknoten (dLN), nicht aber in der Milz von Tnf-/- Mäusen hochreguliert wird, wurde im Rahmen dieser Dissertation weiterhin analysiert, durch welche Abwehrmechanismen TNF in der Milz zur Kontrolle der Infektion beiträgt. Zusätzlich sollte die Regulation der Arg1 in Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) bzw. Psoriasis vor und nach der Behandlung mit anti-TNF-Antikörpern untersucht werden. Ergebnisse: Überraschenderweise entwickelten die Doppel-Knockout Mäuse Tnf-/- Tekcre+/- Arg1fl/fl unverändert eine progressive kutane Leishmaniose, vergleichbar mit der Infektion in den Tnf-/- Mäusen, obwohl die NO Produktion im infizierten Gewebe wiederhergestellt war. Die Parasitenbeladung ist besonders hoch in der Milz der Tnf-/- Mäuse. In diesem Organ ist jedoch die Kontrolle der Leishmanien viel mehr abhängig von der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als von der NO Produktion. Bei der Analyse mit Hilfe des in vivo Imaging Systems (IVIS) wurde jedoch kein Mangel an ROS, sondern sogar eine erhöhte ROS Produktion in den Tnf-/- Mäusen festgestellt. Während der Akutphase der Infektion war im Lymphozyten-Kompartiment der infizierten Tnf-/- Mäusen die Anzahl an CD4+ Th-Zellen und die IFNγ-Produktion im Vergleich zu den WT Kontrollen signifikant erhöht. Die akkumulierten CD4+ T-Zellen und auch die CD8+ T-Zellen zeigten eine erhöhte Expression des inhibitorischen Oberflächenmoleküls programmed cell death protein (PD) 1. Die Tatsache, dass die Blockade von PD-1 keinen Einfluss auf den Infektionsverlauf in den Tnf-/- Mäusen hatte und sehr hohe Mengen von IFNγ von den CD4+ T-Zellen freigesetzt wurden, deutet darauf hin, dass die erhöhte PD-1 Expression eher die starke Aktivierung der T-Zellen und nicht eine supprimierte T-Zellantwort widerspiegelt. Parallel zu der vermehrten Zahl an CD4+ Th-Zellen wurde in den Tnf-/- Mäusen eine stark erniedrigte Anzahl an immunregulatorischen Foxp3+ T-Zellen (Tregs) im dLN und in der Milz detektiert. Dies könnte ursächlich für die überschießende Th-Antwort sein. Im B-Zell-Kompartiment konnte eine erhöhte Anzahl an Plasmablasten im dLN, in der Milz und im Knochenmark (KM) bei TNF-defizienten Tieren nachgewiesen werden. Um bisher unbekannte TNF-abhängige Kontrollmechanismen in der Milz zu identifizieren, wurde Gesamt-RNA der Milz von L. major-infizierten Tnf-/- Mäusen vs. WT Kontrollen zu zwei Zeitpunkten während der Infektion sequenziert und analysiert. Unter anderem konnte in der Tnf-/- Milz zu beiden Zeitpunkten eine signifikant erniedrigte Expression des hämatopoetischen Oberflächengens Rezeptor-Typ Tyrosin-Proteinphosphatase C (CD45, PTPRC) detektiert werden. Dieser Befund wurde in der Milz von Tnf-/- Mäusen mittels Durchflusszytometrie in Form eines signifikanten Anstiegs einer CD45-negativen Population bestätigt. Die CD45- Lineage- (Lin-) Population wurde auch im KM von L. major-infizierten WT und Tnf-/- Mäusen detektiert, die Anzahl der Zellen veränderte sich dort im Verlauf der Infektion jedoch nicht. Durch Analyse verschiedener Oberflächenmoleküle wurde ausgeschlossen, dass es sich bei den stark akkumulierten CD45-negativen Zellen in der Tnf-/- Milz um hämatopoetische Stammzellen (HSCs), Endothelzellen oder Fibroblasten handelte. Durch eine RNASeq-Analyse der CD45-Lin- Zellen und mit Hilfe der Durchflusszytometrie konnte die Population als CD71+Ter119+ Erythroblasten charakterisiert werden. Diese Erythroblasten unterschieden sich in den Tnf-/- Mäusen nicht nur durch ihre erhöhte Anzahl, sondern auch durch die Expression der durch IFNγ stimulierbaren Aktivierungsmarker major histocompatibility complex I (MHC I), MHC II und stem cell antigen-1 (Sca-1). Die temporäre Behandlung von L. major-infizierten Tnf-/- Mäuse mit anti-IFNγ Antikörpern führte neben der verringerten Expression der Aktivierungsmarker auch zum Rückgang der Erythroblasten in der Milz. Die übersteigerte Bildung von proliferierenden Erythroblasten ging einher mit einer reduzierten Abgrenzung der weißen Pulpa durch die Marginalzone und einer zunehmenden Desorganisation der Milz in L. major-infizierten Tnf-/- Mäusen. Die extramedulläre Stress-Erythropoese war auf die erhöhten Mengen an Erythropoetin (Epo) zurückzuführen, die von der Niere und Leber infolge der starken IFNγ-Stimulation ausgeschüttet wurden. Bei L. major-infizierten WT Mäusen, bei denen die Bildung von Erythroblasten durch die Applikation des Hormons Epo angeregt wurde, kam es zu einer Verschlechterung des Infektionsverlaufes und einer erhöhten Parasitenlast im KM, in der Milz und in der Leber. In den Proben von Patienten mit RA bzw. Psoriasis ließ sich keine eindeutige Veränderung der Arg1 Expression durch die anti-TNF-Behandlung in den mononukleären Zellen (PBMCs) und den Neutrophilen (PMNs) ermitteln. Schlussfolgerungen: In den L. major-infizierten Tnf-/- Mäusen liegt während der Akutphase der Infektion eine Überaktivierung der CD4+ Th1-Zellen vor, die sehr wahrscheinlich durch eine reduzierte Anzahl an Tregs bedingt ist und zu einer systemischen Anreicherung von IFNγ führt. Die dadurch ausgelöste Epo-Produktion und Stress-Erythropoese in der Milz zerstören die Milzarchitektur, was die Interaktion zwischen Immunzellen und eine koordinierte Abwehrreaktion in der Milz erschwert. Dadurch könnte eine erfolgreiche Kontrolle von L. major in der Milz verhindert werden.