title: Studien zur Biosynthese von Sactipeptiden: Charakterisierung der an der Thioetherbrückenbildung beteiligten Radical SAM Enzyme AlbA und SkfB
title: Biosynthesis of Sactipeptides: Characterization of the thioether bond forming Radical SAM enzymes AlbA und SkfB
Creators: name: Flühe, Leif
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Radical based Reaction Mechanism
ribosomale Peptide
Reaktionsmechanismus
Sactipeptides
Lanthipeptide
Chemie
Peptide Biosynthesis
Charakterisierung neuer Enzymklasse
Peptide
Sactipeptide
Radical SAM Enzyme
Enzym
Thioether
Naturstoff
Biosynthese

description: Sactipeptides are a new class of
      ribosomal assembled and posttranslational modified, mostly
      bioactive peptides, which are assembled of 26 to 35
      proteinogenic amino acids. Their character-istic feature is a
      thioether bond linking the sulfur atom of a cysteine residue
      with the α-carbon of an acceptor amino acid. Until now the
      amino acids phenylalanine, threonine, methionine,
      aspar-agine, serine, alanine and tyrosine were identified as
      acceptors. All known sactipeptides pos-sess of an inflexible
      helical fold. Partial a cyclized peptide backbone is found.
      The sporulation killing factor (SKF) contains an additional
      disulfide bridge as posttranslational modification be-sides
      the sactipeptide like thioether linkage. In this thesis the
      biosynthesis of the thioether bond formation in the
      sactipeptides subtilosin A and SKF was investigated. It was
      shown that enzymes AlbA (subtilosin A) and SkfB (SKF)
      cata-lyze the generation of the thioether linkages. These
      proteins were identified as radical SAM en-zymes, as they
      were only able to catalyze the cleavage of
      S-adenosylmethionine into methio-nine and the
      5’-deoxyadenosylradical under reductive condition and after
      the enzymes were fully loaded with iron- and sulfide-ions.
      Furthermore it was shown, that both enzymes contains two
      [4Fe-4S]-Clusters. Therefore the iron- and sulfur-content of
      the proteins and protein variants were measured. As well the
      proteins and protein variants were analyzed by several
      spectro-scopic techniques. The [4Fe-4S]-Cluster, which is
      coordinated by the characteristic radical SAM enzyme like
      CXXXCXXC motif is responsible for the cleavage of SAM,
      whereas the second [4Fe-4S]-Cluster plays a key role during
      thioether bond formation. By carrying out precursor peptide
      modification assays with and without the addition of
      iodoa-cetamide and subsequent HPLC-HRMS analysis, it was
      shown that AlbA and SkfB are able to catalyze the thioether
      linkage generation in the respective precursor peptide (SboA,
      SkfA). By assaying leaderpeptide less SboA and SkfA variants
      it was elucidated that the AlbA and SkfB catalyzed reactions
      are the first step during the biosynthesis of both
      sactipeptides. Precursor peptide modification assays with
      AlbA and SkfB variants, as well as interaction studies with
      Al-bA, AlbA variants and SboA showed an interaction between
      the second [4Fe-4S]-Cluster and the precursor peptide.
      Additional assays with SkfA variants, which should address
      issues con-cerning the substrate specificity of SkfB towards
      the donor and acceptor positions, were carried out. Within
      these assays it was e.g. shown that the enzyme class is not
      able to catalyze the formation of an ether linkage. Based on
      the obtained results a completely new radical based mechanism
      for thioether bond formation during sactipeptide biosynthesis
      is proposed and veri-fied.
description: Sactipeptide sind eine neue Klasse
      ribosomal synthetisierter, meist bioaktiver Peptide, die aus
      26 bis 35 proteinogenen Aminosäuren bestehen. Ihr
      charakteristisches Merkmal ist eine Thio-etherbindung, die
      das Schwefelatom einer Cysteingruppe mit dem
      α-Kohlenstoffatom einer Ak-zeptoraminosäure verknüpft. Als
      Akzeptoren wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt die Aminosäu-ren
      Phenylalanin, Threonin, Methionin, Asparagin, Serin, Alanin
      und Tyrosin identifiziert. Alle bekannten Sactipeptide
      verfügen über eine relativ starre helikale Struktur.
      Teilweise wird auch ein zyklisches Peptidrückgrat gefunden.
      Der Sporulation Killing Factor (SKF) verfügt neben der
      Thioetherbrücke über eine Disulfidbindung zwischen zwei
      Cysteinen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese der
      Thioetherbildung in den Sactipeptide Subti-losin A und SKF
      untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bildung der
      Thioetherbrücken von den Enzymen AlbA (Subtilosin A) und SkfB
      (SKF) katalysiert wird. Diese beiden Proteine wurden als
      Radical SAM Enzyme identifiziert, da sie nur in der mit Eisen
      und Schwefel beladenen Form und nur unter reduktiven
      Bedingungen in der Lage sind S-Adenosylmethionin (SAM) in
      Methio-nin und das 5’-Deoxyadenosylradikal zu spalten. Des
      Weiteren wurde durch die Bestimmung des Eisengehaltes
      von-Varianten der beiden Enzyme und auch durch
      spektroskopische Unter-suchungen dieser Proteinvarianten
      gezeigt, dass AlbA wie auch SkfB zwei [4Fe-4S]-Cluster
      binden. Der über ein für Radical SAM Enzyme
      charakteristisches CXXXCXXC-Motiv gebundene [4Fe-4S]-Cluster
      ist für die Spaltung von SAM verantwortlich wohin gegen der
      andere [4Fe-4S]-Cluster eine wichtige Rolle in der Synthese
      des Thioethers spielt. Durch
      Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit und ohne Zugabe von
      Iodacetamid, die anschlie-ßend per HPLC-HRMS analysiert
      wurden, wurde gezeigt, dass die Enzyme jeweils für die
      Syn-these der Thioetherbrücken in dem dazugehörigen
      Vorläuferpeptid (SboA, SkfA) verantwortlich sind. Durch
      Leaderpeptidlose SboA und SkfA-Varianten wurde gezeigt, dass
      die Reaktion den ersten Schritt in der jeweiligen Biosynthese
      bildet. Durch AlbA und SkfB-Varianten wie auch
      Interaktionsstudien mit AlbA, AlbA-Varianten und SboA wurde
      eine Wechselwirkung des zwei-ten gebundenen [4Fe-4S]-Clusters
      und dem Vorläuferpeptid nachgewiesen. Des Weiteren wur-den
      SkfA-Varianten hergestellt die Fragen zur Substratspezifität
      im Bezug auf Donor- und Ak-zeptorposition in der SkfB
      katalysierten Reaktion beantworten sollten. Dabei wurde u.a.
      gezeigt, dass die Enzymklasse nicht in der Lage ist die
      Synthese von Etherbindungen zu katalysieren. Aufbauend auf
      den dabei erhaltenen Ergebnissen wurde ein vollständig neuer,
      über radikale Zwischenstufen verlaufender Mechanismus für die
      Synthese der Thioetherbindungen vorge-schlagen und
      verifziert.