Συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση του εγκεφαλονωτιαίου υγρού σε σκύλους με ιδιοπαθή και με επίκτητη επιληψία
Creators: name: Μπάκα, Ουρανία Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Πρωτεωμική ανάλυση
Ιδιοπαθής επιληψία
Εγκεφαλονωτιαίο υγρό
Σκύλος
TMT-based proteomics
Idiopathic epilepsy
Cerebrospinal fluid
Dogs

description: Οι επιληπτικές κρίσεις αποτελούν την κύρια κλινική εκδήλωση των μεταβολικών, των οργανικών και των γενετικών εγκεφαλοπαθειών (ιδιοπαθής επιληψία). Το εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), λόγω της άμεσης επαφής του με το κεντρικό νευρικό σύστημα, είναι το ιδανικό βιολογικό υλικό για τον προσδιορισμό ειδικών βιοδεικτών και τη διαγνωστική προσέγγιση διαφόρων νευρολογικών παθήσεων μέσω της πρωτεωμικής ανάλυσης. Ο στόχος της μελέτης ήταν η συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση του ΕΝΥ των σκύλων που εκδήλωναν επιληπτικές κρίσεις (ιδιοπαθής και επίκτητη επιληψία) και των κλινικά υγιών σκύλων, χωρίς ιστορικό επιληπτικών κρίσεων. Μελετήθηκαν 34 σκύλοι, οι οποίοι κατανεμήθηκαν σε 4 ομάδες (Ομάδα Α: κλινικά υγιείς σκύλοι, Ομάδα Β: σκύλοι με ιδιοπαθή επιληψία υπό αντιεπιληπτική αγωγή, Ομάδα Γ: σκύλοι με ιδιοπαθή επιληψία χωρίς αντιεπιληπτική αγωγή, Ομάδα Δ: σκύλοι με επίκτητη επιληψία). Η συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση των δειγμάτων έγινε με την μέθοδο σχετικής ποσοτικοποίησης Tandem Mass Tag χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία νάνο-ροής υψηλής αποδόσεως συζευγμένη σε σειρά με φασματόμετρο μάζας Q Exactive Mass με δυνατότητα διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS). Η ανίχνευση και η σχετική ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνών έγινε με τη χρήση του προγράμματος Proteome Discoverer και η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη γλώσσα προγραμματισμού R. Η ανάλυση των γονιδίων έγινε χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων για το Canis lupus familiaris. Από την στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψαν 18 πρωτεΐνες με στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των 4 ομάδων (P&lt;0.05). Στις ομάδες Β και Δ οι πρωτεΐνες: μεταλλοπεπτιδάση 2 της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMP2) και EGF- που περιέχει το ινώδες της εξωκυτταρικής πρωτεΐνης 2 του υποστρώματος (EFEMP2) ήταν ρυθμισμένες προς τα κάτω, ενώ οι πρωτεΐνες απτοσφαιρίνη (HP) και APO-A1 ήταν ρυθμισμένες προς τα πάνω. Οι πρωτεΐνες τετρανεκτίνη (CLEC3B) και η δεσμευτική πρωτεΐνη της φωσφατιδιλεθανολαμίνης (PEBP4) βρέθηκαν ρυθμισμένες προς τα πάνω ενώ η πρωτεΐνη απολιποπρωτεϊνη Α1 (APO-A1) ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω (Ομάδα Γ). Η πρωτεΐνη ανοσοσφαιρίνη L1 (IGLL1) ήταν ρυθμισμένη προς τα κάτω στις ομάδες Β και Γ και ρυθμισμένη προς τα πάνω στην ομάδα Δ. Η πρωτεΐνη EFEMP2 ήταν η μοναδική κοινή πρωτεΐνη που ανιχνεύθηκε ανάμεσα στις 4 ομάδες των σκύλων ενώ η PEBP4 ήταν η μόνη κοινή πρωτεΐνη ανάμεσα στις ομάδες των σκύλων με επιληπτικές κρίσεις. Για να αξιολογηθούν οι μεταβολές της απτοσφαιρίνης (HP) που προέκυψαν από την πρωτεωμική ανάλυση, έγιναν επιπλέον η δοκιμή ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών κατά Western (Western Blot) και η ανοσολογική δοκιμή SPARCL. Τόσο η δοκιμή Western Blot όσο και η δοκιμή SPARCL, έδειξαν ικανοποιητική συσχέτιση με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την πρωτεωμική ανάλυση (r = 0.712 και r = 0.703, αντίστοιχα). Η πρωτεωμική ανάλυση του ΕΝΥ των σκύλων που εκδηλώνουν επιληπτικές κρίσεις έδειξε ότι η βιολογική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MMP2, HP και APO-A1 υποδεικνύει τη διαταραχή της ακεραιότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού μέσω της φλεγμονής που προκαλείται στον εγκέφαλο από τα επαναλαμβανόμενα επιληπτικά επεισόδια. Οι μεταβολές της MMP2 συνάδουν με την ενεργοποίηση προστατευτικών μηχανισμών στον εγκέφαλο. Η αντιεπιληπτική αγωγή επιδρά σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες που υποδηλώνεται από τις διαφορές στη βιολογική συμπεριφορά των πρωτεϊνών του ΕΝΥ, όπως φαίνεται μέσω της πρωτεωμικής ανάλυσης των δειγμάτων ΕΝΥ των σκύλων που λάμβαναν και που δεν λάμβαναν αντιεπιληπτική αγωγή.
description: Epileptic seizures are the clinical manifestations of structural brain abnormalities, metabolic disturbances, and inflammatory processes or genetic causes. Veterinary Proteomics is an evolving scientific field that can provide evidence regarding diagnostic and prognostic biomarkers and set therapeutic targets. Proteomic analysis was performed in several types of biological materials; cerebrospinal fluid (CSF) is a promising source to identify biomarkers for neurological diseases due to the direct contact with the central nervous system (CNS). This prospective study included four dog groups (group A: healthy dogs, group B: dogs with idiopathic epilepsy under antiepileptic medication (AEM), group C: dogs with idiopathic epilepsy without AEM administration, group D: dogs with structural epilepsy). The purpose of the study was to compare the proteomic profile among the four groups. Samples were analyzed by a quantitative Tandem Mass Tags labeling approach using high performance nano-liquid chromatography coupled on-line with a Q-Exactive-Plus mass-spectrometer, able to perform tandem mass spectrometric analysis (MS/MS). Identification and relative quantification were performed using Proteome Discoverer, and data were analyzed using R. Gene ontology terms were analyzed based on Canis lupus familiaris database. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD018893. Eighteen proteins were statistically significant among the four groups (P &lt;0.05). Matrix metalloproteinase 2 (MMP2) and epidermal growth factor (EGF)- containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 (EFEMP2) appeared down-regulated whereas haptoglobin (HP) and apolipoprotein A1 (APO-A1) were up-regulated (groups B, D). Tetranectin (CLEC3B) and phosphatidylethanolamine- binding protein 4 (PEBP4) were up-regulated whereas APO-A1 was down-regulated (group C). Immunoglobulin-lambda 1 (IGLL1) was down-regulated (groups B, C) and up-regulated (group D). EFEMP2 was the only protein detected among the four groups and PEBP4 was significantly different among the epileptic dogs. Western blot and SPARCL immunoassay were used to quantify HP abundance change, validating proteomic analysis. Both, showed good correlation with HP levels identified through proteomic analysis (r = 0.712 and r = 0.703, respectively).The proteomic analysis from CSF of dogs with epileptic seizures could reflect that MMP2, HP and APO-A1 may contribute to a blood-brain barrier disruption through the seizure-induced inflammatory process in the brain. MMP2 change may indicate the activation of protective mechanisms within the brain tissue. Antiepileptic medication could influence several cellular responses and alter the CSF proteome composition.