title: Role of TRPM7 on Myocardin-related transcription factor A in tumorigenesis
Creators: name: Voringer, Sandra
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the deadliest human malignancies worldwide. Due to the current limitations of therapeutic options, there is a pressing need to elucidate the molecular mechanism underlying human hepatocarcinogenesis and to identify novel targets for systemic therapy. It has been already shown that the known tumor suppressor Deleted in Liver Cancer1 (DLC1) encodes a Rho GTPase activating protein (RhoGAP) and its allele is lost in 50 % of liver cancers. Myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) acts as a coactivator of the transcription factor Serum Response Factor (SRF) reinforcing the expression of genes associated with tumor growth and spreading. DLC1 loss results in constitutive nuclear localization of MRTF-A leading to increased cell migration, differentiation, and cytoskeletal organization. Since MRTF-A depletion averts HCC progression, we aimed to identify novel MRTF-A inhibitors. We found that the known Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 7 (TRPM7) inhibitor NS8593 redistributes MRTF-A in the DLC1 negative cell lines HuH7 and HuH6 to the cytoplasm. TRPM7 is an ubiquitously expressed plasma membrane protein containing a transmembrane ion channel gating prevalently divalent cations as well as a cytosolic serine/threonine protein kinase. In this thesis we identified a new pathway to regulate MRTF-A and SRF activity in HCC via TRPM7. TRPM7 inhibition and depletion resulted in a significant reduction of MRTF/SRF target gene expression and the dissociation of MRTF/FLNA interaction. We found RhoA inactivation upon TRPM7 inhibition in HCC cells and activation of Ras activity. The blockade with NS8593 provoked a proliferation arrest in the treated cells. We demonstrated that oncogene-induced senescence (OIS) is responsible for the anti-proliferative effect of TRPM7 inhibition. Increased p16 expression and upregulation of the OIS associated secretome proved the OIS induction. Surprisingly, further investigations confirmed a novel interaction between RhoA and TRPM7 regulating the RhoA activity. In vitro kinase assays verified the phosphorylation of RhoA at Serine 188 through the TRPM7 kinase. New cell lines were generated with CRISPR/Cas9 strategy to establish a functional TRPM7 knockout or TRPM7 P1040R pore mutant or TRPM7 K1648R kinase-dead cells. The different mutants made clear that channel and kinase function are a prerequisite for MRTF-A regulation. Moreover, we were able to show the therapeutic potential of the compound through application in an in vivo HCC xenograft model. The treatment with intravenous injections of NS8593 abolished the tumor growth and significantly reduced MRTF/SRF target gene expression in vivo proving the therapeutic efficacy. Given these results the regulation of MRTF-A through TRPM7 inhibition constitutes a promising novel therapeutic option.
description: Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) gehört weltweit zu den tödlichsten malignen Erkrankungen des Menschen. Aufgrund der stark eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten besteht ein dringender Bedarf den molekularen Mechanismus aufzuklären, der der humanen Hepatokarzinogenese zugrunde liegt, und neue Ziele für die systemische Therapie zu identifizieren. Es wurde bereits gezeigt, dass der bekannte Tumorsuppressor Deleted in Liver Cancer 1 (DLC1), der als Rho GTPase aktivierendes Protein (RhoGAP) fungiert, bei 50% der Leberkrebserkrankungen aufgrund von Deletion inaktiviert vorliegt. Myocardin-related transcription factor A (MRTF-A) wirkt als Cofaktor des Transkriptionsfaktors Serum Response Factor (SRF) und verstärkt die Expression von Genen, die mit Zellmigration, Proliferation und zytoskelettaler Organisation assoziiert sind. Der Verlust von DLC1 führt zu einer konstitutiven Kernlokalisation von MRTF-A, was zu einer erhöhten Zellmigration, Differenzierung und Zytoskelettorganisation führt. Da die MRTF-A-Depletion das HCC-Xenograft-Wachstum verhindert, ist die Identifikation von neuen MRTF-A Inhibitoren notwendig. Wir konnten feststellen, dass der bekannte Inhibitor des Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member 7 (TRPM7) NS8593 zu einer Umverteilung von MRTF-A in den DLC1-negativen Zelllinien HuH7 und HuH6 führt. TRPM7 ist ein ubiquitär exprimiertes Plasmamembranprotein mit einem Transmembrankanal für bevorzugt divalente Kationen und einer zytosolischen Serin/Threonin-Proteinkinase. Im Zuge dieser Arbeit ist es gelungen, einen neuen Signalweg für die Regulation der MRTF-A und SRF-Aktivität im HCC über TRPM7 aufzudecken. Die Inhibierung und Ausschaltung von TRPM7 bewirkte eine signifikante Reduktion der MRTF/SRFZielgenexpression und die Dissoziation der bekannten Interaktion zwischen MRTF-A und FLNA. Wir konnten eine RhoA-Inaktivierung und gleichzeitig die Aktivierung von Ras als Folge der TRPM7-Blockade in HCC Zellen feststellen. NS8593 löste einen Proliferationsarrest in den behandelten Zellen aus. Es zeigte sich, dass Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS) verantwortlich für den anti-proliferativen Effekt der Inhibition von TRPM7 ist. Dies konnte durch eine gesteigerte p16-Expression und einer Hochregulation des OIS-assoziierten Sekretoms verifiziert werden. Überraschenderweise ergaben weitere experimentelle Untersuchungen, dass es eine bis dato vollkommen unbeschriebene Interaktion zwischen RhoA und TRPM7 gibt, durch die die Aktivität von RhoA reguliert werden kann. Dies konnte zusätzlich durch in vitro Kinase Assays belegt werden, die zeigten, dass RhoA an Serin188 durch die TRPM7-Kinase phosphoryliert werden kann. Mithilfe von CRISPR/Cas9 konnten neue TRPM7-Mutanten Zelllinien mit einer funktionellen TRPM7-Ausschaltung, einer Porenmutation durch eine P1040R Punktmutation und einem funktionellen Kinaseverlusts durch K1648R erstellt werden, die dazu betrugen die Funktionen von TRPM7-Kanal und -Kinase bei der Regulation von MRTF-A genauer zu bestimmen. Darüber hinaus konnte durch die Verwendung des Inhibitors in einem in vivo HCC Xenograft-Mausmodell gezeigt werden, dass NS8593 auch Potential für eine therapeutische Anwendung hat. Eine intravenöse Behandlung mit der Substanz reduzierte das HCC-Xenograft-Wachstum stark und führte zu einer deutlichen Verringerung der MRTF/SRF Zielgenexpression. Aus diesen Gründen stellt die Regulation von MRTF-A durch TRPM7-Hemmung eine vielversprechende Therapieoption im HCC dar.