Βιολογική δράση του καρβοξαμιδικού μυκητοκτόνου fluopyram και χαρακτηρισμός ανθεκτικών στελεχών του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea:
Creators: name: Βελούκας, Θωμάς Ζ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Καρβοξαμιδικά
Βοτρύτης
Ανθεκτικότητα
Προσαρμοστικότητα
SDHIs
Botrytis
Resistance
Fitness

description: Ο σκοπός της διατριβής αυτής ήταν να μελετηθεί η βιολογική δράση του fluopyram εναντίον του B. cinerea και να μετρηθεί η ευαισθησία άγριων πληθυσμών, να χαρακτηριστούν μοριακά τα ανθεκτικά στελέχη και να αναπτυχθεί μοριακή μέθοδος με σκοπό τη γρήγορη ανίχνευση των ανθεκτικών στελεχών, να διερευνηθούν οι σχέσεις διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ των μελών της ομάδας των καρβοξαμιδικών (SDHIs) μυκητοκτόνων και να μετρηθούν διάφορες παράμετροι προσαρμοστικότητας με σκοπό να αξιολογηθεί η ενδεχόμενη επίδραση του κόστους προσαρμοστικότητας στην ανάπτυξη και εξέλιξη της ανθεκτικότητας. Η επιμήκυνση του μήκους του βλαστικού σωλήνα των κονιδίων είναι το πιο ευαίσθητο στάδιο ανάπτυξης του μύκητα στο fluopyram, ενώ η μυκηλιακή ανάπτυξη το λιγότερο ευαίσθητο. Το fluopyram έδειξε εξαιρετική προστατευτική δράση εναντίον του Botrytis cinerea σε καρπούς φράουλας που μολύνθηκαν τεχνητά πριν τη μόλυνση και πολύ καλή θεραπευτική δράση όταν εφαρμόσθηκε στη συγκέντρωση των 100 μg ml-1 24 ώρες μετά τη μόλυνση, αλλά όταν οι επεμβάσεις έγιναν 48 και 96 ώρες μετά τη μόλυνση, η καταπολέμηση της ασθένειας ήταν μέτρια ως χαμηλή. Σε όλους τους πληθυσμούς του μύκητα που ελέγχθηκαν, η βασική γραμμή ευαισθησίας παρουσίαζε ένα μέγιστο και οι τιμές EC50 κυμάνθηκαν από 0.03 ως 0.29 μg ml-1. Για τις ανθεκτικές στο boscalid απομονώσεις τoυ μύκητα που συλλέχθηκαν από την Ελλάδα, η ανάλυση της αλληλουχίας του sdhB γονιδίου αποκάλυψε τις μεταλλαγές H272R, H272Y, H272L, N230I και P225F, οι οποίες προσδίδουν στο μυκητοκτόνο μέτρια ως υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας. Με σκοπό την γρήγορη ανίχνευση αυτών των μεταλλαγών που σχετίζονται και με την ανθεκτικότητα στο fluopyram, αναπτύχθηκε η μοριακή μέθοδος ανίχνευσης της PIRA-PCR. Διερευνήθηκαν οι σχέσεις διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ πολλών SDHIs σε απομονώσεις του μύκητα με διαφορετικές μεταλλαγές στo sdhB και αξιολογήθηκε in vivo η επίδραση αυτών των μεταλλαγών στην αποτελεσματικότητα καταπολέμησης της ασθένειας με το boscalid και το fluopyram. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υφίστανται διαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας και διαφορετικές σχέσεις ανθεκτικότητας μεταξύ των δομικά διαφορετικών SDHIs. Τα στελέχη με την μεταλλαγή P225F ήταν ανθεκτικά σε όλα τα μυκητοκτόνα SDHI. Παρόμοια, οι απομονώσεις με την μεταλλαγή H272L ήταν ισχυρά ανθεκτικές στο boscalid αλλά έδειξαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στα άλλα SDHIs. Όσον αφορά τις μετρήσεις διαφορετικών παραμέτρων προσαρμοστικότητας, τα αποτελέσματα έδειξαν πως μυκηλιακή ανάπτυξη παρόμοια με τις άγριας ευαισθησίας απομονώσεις, είχαν αυτές με την μεταλλαγή H272R στους 7 οC και αυτές με την μεταλλαγή H272L στους 20 οC. Η βλαστικότητα των κονιδίων επηρεάστηκε ισχυρά στη χαμηλή θερμοκρασία επώασης των 7 οC, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη βλαστικότητα στους 20 και 30 οC. Οι απομονώσεις με την μεταλλαγή H272L παράγουν σημαντικά περισσότερα (P&lt;0.05) σκληρώτια από ότι οι απομονώσεις των άλλων γενότυπων. Η μεγαλύτερη βιωσιμότητα παρατηρήθηκε στα άγριας ευαισθησίας στελέχη καθώς και σε αυτά με την μεταλλαγή G143A, ενώ δεν υπήρξε καμιά βιωσιμότητα σκληρωτίων στα H272L στελέχη, τα οποία έχασαν πλήρως τη βιωσιμότητά τους. Η υψηλότερη ικανότητα σποριοποίησης παρατηρήθηκε στις άγριας ευαισθησίας και στις H272R απομονώσεις. Οι απομονώσεις με τις sdhB μεταλλαγές ήταν πιο ευαίσθητες στην οξειδωτική καταπόνηση που προκλήθηκε όταν στο υπόστρωμα ανάπτυξης προστέθηκε diquat, σε σύγκριση με της άγριας ευαισθησίας ή με αυτές που έφεραν μόνο την μεταλλαγή G143A.
description: The aim of the present thesis was the investigation of the biological activity of fluopyram against B. cinerea and to obtain the fungal baseline sensitivity, the development of a molecular method that enables the rapid detection and characterization of the resistant strains, the determination of the differential effects of the sdhB gene mutations of the resistant strains of B. cinerea on the sensitivity to SDHI fungicides and the measurement of different fitness parameters in order to predict the involvement of possible fitness costs in the evolution and development of resistance. The inhibition of germ tube elongation was found to be the most sensitive growth stage affected by fluopyram, while mycelial growth was found to be the least sensitive growth stage. Fluopyram provided excellent protective activity against B. cinerea of the strawberry fruit. Similarly, fluopyram showed a high curative activity when it was applied at 100 μg mL−1 24h post-inoculation, but when applications were conducted 48 or 96 h post-inoculation, disease control efficacy was modest or low. The measurement of baseline sensitivity showed that it was unimodal in all the populations tested. The individual EC50 values for fluopyram ranged from 0.03 to 0.29 μg mL−1. Concerning the Botrytis cinerea isolates that has been collected in Greece, the sequence analysis of the sdhB gene revealed the following five different mutations Η272R, H272Y, H272L, N230I and P225F in the SdhB, which are moderate and high resistance to boscalid. For the rapid detection of these mutations associated also with resistance to fluopyram, a primer-introduced restriction analysis polymerase chain reaction (PIRA-PCR) was developed. The cross-resistance relationships within several SDHI fungicides among B. cinerea isolates possessing different Sdh mutations and the assessement of the impact of each mutation on the efficacy of boscalid or fluopyram in in vivo assays, has been investigated. The results showed different sensitivities and cross-resistance patterns between structurally different SDHIs. P225F mutants were resistant in vitro to all SDHIs tested. Similarly, isolates possessing the H272L mutation were highly resistant to boscalid but showed low to moderate levels of resistance to other SDHIs. Concerning the measurement of different fitness parameters the results shown that the mycelial growth, is similar to that of the wild-type isolates only for the H272R isolates at 7oC and the H272L isolates at 20oC. Conidial germinability was severely affected by the lower incubation temperature of 7oC, while no differences were observed in conidial germinability at 20 and 30oC. Isolates possessing the H272L mutation produced significantly (P&lt;0.05) more sclerotia than the other groups of isolates. The higher viability was observed in the sclerotia of the wild-type and the G143A isolates, while sclerotia of the H272L isolates lost totally their viability. Higher sporulation capacity was observed in the wild-type and the H272R isolates. Isolates possessing the sdhB mutations were more sensitive to oxidation stress imposed by diquat amendment in the growth medium, compared to wild-type isolates or the isolates with single resistance to QoIs.