title: Vesikulärer Transfer ("Transsekretion") von Membrankomponenten auf bovine Nebenhodenspermien
title: The vesicle transfer ("trans secretion") of membrane components to bovine epididymal sperm
Creators: name: Schwarz, Anja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Spermium
Epididymis
Nebenhoden
apokrine Sekretion
Sperm
Ca2+-ATPase-Aktivität
PMCA
Naturwissenschaften
Ca2+-ATPase-activity
Transsekretion
Epididymosomen
Epididymosomes
Trans secretion
Apocrin secretion

description: During the passage through the
      male reproduction tract spermatozoa interact with factors,
      which amongst others are released from the epididymis. The
      outcome of the spermatozoa modification is essential for the
      maturation to full functional germ cells. During the
      differentiation in the epididymis the epididymosomes (apocrin
      secreted epididymal vesicles) play a crucial role. Previous
      work of our group demonstrated a switch of the plasma
      membrane Ca2+-ATPase isoform 4 (PMCA4) splice variants from
      PMCA4b in bovine caput spermatozoa membrane to PMCA4a in
      bovine cauda spermatozoa membrane. In addition the
      Ca2+-ATPase activity of spermatozoa increased significantly
      during the transit through the epididymidis. The possibility
      of a transfer of PMCA4a from epididymosomes to spermatozoa
      was postulated (Sanchez-Luengo et al. 2004, Brandenburger et
      al. 2011). The aim of the present study was analyze the
      fusogen properties of epididymosomes closely. Therefore,
      epididymal vesicles were isolated from different epididymal
      regions. After this, epididymosomes were characterized
      morphologically as well as biochemically. Furthermore, the
      vesicle transfer of membrane components (lipids, proteins)
      was analyzed, especially the potential transfer of PMCA to
      bovine epididymal spermatozoa. Electron microscopical
      analyses showed, that cauda epididymosomes are greater than
      caput epididymosomes. Lipid analyses of caput and cauda
      epididymosomes proved an increase of the
      cholesterol/phospholipid rate with a decrease of cholesterol
      and phospholipid concentration. The phospholipids
      Phosphatidylethanolamine (PE), Phosphatidylcholine (PC) and
      Sphingomyeline(SM) were predominantly detected, whereby the
      concentration in caput and cauda epididymosomes was not
      significantly modified. For protein analyses, the author
      focused on PMCA. By means of Westernblot analyses, it could
      be shown, that cauda vesicles exhibit more PMCA4a than caput
      vesicles. Also the Ca2+-ATPase activity increased
      significantly from caput to cauda epididymosomes. To
      determine in in vitro experiments, the fusogen properties of
      bovine epididymosomes with spermatozoa, bovine epididymosomes
      were labeled with the fluorescent dye Octadecylrhodamin B
      (R18). Caput spermatozoa showed a higher fusion rate than
      cauda spermatozoa. The optimal pH value for the fusion was in
      the acid area (pH 5 - 6). Lipid analyses of epididymal
      spermatozoa proved a decrease of the cholesterol/phospholipid
      rate from caput to cauda spermatozoa. This could also be
      achieved after in vitro fusion of caput spermatozoa with
      epididymosomes. Therefore, it is postulated, that this
      modification is a result of the interaction from spermatozoa
      with epididymosomes. In vivo it was documented that the
      concentration of PE, PC and SM decreased in spermatozoa
      during passing through the epididymis, whereby in vitro no
      alterations were etermined. After labeling the epididymosomes
      with Biotin, a transfer of biotin-labeled proteins of
      epididymosomes on epididymal spermatozoa membrane could be
      shown by in vitro fusion. In fact the Ca2+-ATPase activity
      increased significantly after in vitro fusion of
      epididymosomes with spermatozoa. Nevertheless, transfer of
      PMCA4a could not be clarified definitively by immuncytology,
      because the antibody against PMCA4a reacted deficient on
      spermatozoa smear. Using the antibody against PMCA4 a slight
      increase of fluorescence was shown in the middle piece of
      spermatozoa tail. Furthermore, previous work of our group
      showed that the Ca2+-ATPase activity of epididymal
      spermatozoa is stimulated organ-specific by the seminal
      vesicle major protein PDC-109 respectively (no significant
      stimulation in heart and kidney) (Sanchez-Luengo et al.
      2004). In this study, this stimulation could also be
      documented for epididymosomes and spermatozoa after in vitro
      fusion. It is well-known that PDC-109 binds on phospholipids
      and that the PMCA activity can be affected by phospholipids.
      Further analyses have to display potential correlation
      between lipid modification and the increase of Ca2+-ATPase
      activity in spermatozoa after in vitro fusion. In summary,
      the trans secretion (cell-to-cell transfer) between
      epididymosomes and spermatozoa resulted in a disposition of
      lipids and proteins with influencing
      Ca2+-ATPase-activity.
description: Bei der Passage durch den
      männlichen Reproduktionstrakt interagieren Spermatozoen mit
      Faktoren, die u.a. vom Nebenhoden sezerniert werden. Die
      daraus resultierende Modifikation der Spermatozoen ist
      essentiell für die Ausreifung zu voll funktionsfähigen
      Keimzellen. Bei der Ausdifferenzierung im Nebenhoden spielen
      vermutlich u. a. auch die Epididymosomen (apokrin sekretierte
      Nebenhodenvesikel) eine wichtige Rolle. In vorausgehenden
      Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden,
      dass sich die Plasmamembran-Ca2+-ATPase Isoform 4 (PMCA4)
      Spleißvarianten-Ausstattung in der Membran von Bullenspermien
      von PMCA4b in Caputspermien zu PMCA4a in Caudaspermien
      ändert. Zudem nahm auch die Ca2+-ATPase Aktivität der
      Spermien während der Passage durch den Nebenhoden signifikant
      zu. Die Möglichkeit eines Transfers der PMCA4a von
      Epididymosomen auf Spermien wurde postuliert (Sanchez-Luengo
      et al. 2004,Brandenburger et al. 2011). Ziel der vorliegenden
      Arbeit war es, die fusogene Eigenschaft boviner
      Epididymosomen näher zu untersuchen. Dafür wurden
      Nebenhodenvesikel aus den verschiedenen Nebenhodenabschnitten
      isoliert und sowohl morphologisch, als auch biochemisch
      charakterisiert. Weiterhin wurde der vesikuläre Transfer von
      Membrankomponenten (Lipide, Proteine) und speziell der
      potentielle Transfer der PMCA auf bovine Nebenhodenspermien
      untersucht. Elektronenmikroskopische ntersuchungen zeigten,
      dass Cauda Epididymosomen größer sind als Caput
      Epididymosomen. Lipidanalysen von Caput- und Cauda
      Epididymosomen belegten eine Zunahme des
      Cholesterin/Phospholipid-Verhältnisses bei einer Abnahme der
      Cholesterol- und der Phospholipidkonzentration. Hauptanteilig
      konnten die Phospholipide Phosphatidyethanolamin (PE),
      Phosphatidylcholin (PC) und Sphingomyelin(SM) nachgewiesen
      werden, wobei sich der Gehalt in Caput- und Cauda
      Epididymosomen nicht signifikant veränderte. Bei der
      Proteinanalyse spezialisierte sich die Autorin auf die PMCA.
      Mittels Westernblot-Analysen konnte gezeigt werden, dass in
      Cauda Vesikeln mehr PMCA4a nachzuweisen war als in Caput
      Vesikeln. Auch die Ca2+-ATPase Aktivität stieg von Caput- zu
      Cauda Epididymosomen signifikant an. Um in in vitro
      Experimenten die fusogene Eigenschaft der Epididymosomen mit
      Spermien zu untersuchen, wurden bovine Epididymosomen mit dem
      Fluoreszenzfarbstoff Octadecylrhodamin B (R18) markiert. Für
      Caputspermien konnte eine höhere Fusionsrate als für
      Caudaspermien nachgewiesen werden. Der für die Fusion
      optimale pH lag dabei im sauren Bereich (pH 5 - 6).
      Lipidanalysen von Nebenhodenspermien belegten eine Abnahme
      des Cholesterin/Phospholipid-Verhältnisses von Caput- zu
      Caudaspermien. Dies konnte auch nach in vitro Fusion von
      Caputspermien mit Epididymosomen erzielt werden. Daher wird
      postuliert, dass diese Veränderungen ein Ergebnis aus der
      Interaktion der Spermien mit den Epididymosomen sind. In vivo
      konnte in Spermien eine Abnahme von PE, PC und SM im Verlauf
      des Nebenhodentraktes dokumentiert werden, die jedoch in
      vitro nicht nachgeahmt werden konnte. Nach Markierung der
      Epididymosomen mit Biotin konnte eine Übertragung
      Biotin-markierter Proteine von Epididymosomen auf die
      Nebenhodenspermienmembran mittels in vitro Fusion gezeigt
      werden. Die Ca2+-ATPase-Aktivität nahm zwar signifikant nach
      in vitro Fusion von Epididymosomen mit Nebenhodenspermien zu,
      ob aber auch die PMCA4a übertragen wird, konnte mittels
      Immunhistologie nicht abschließend geklärt werden, da der
      Antikörper gegen die Spleißvariante PMCA4a auf
      Spermienausstrichen unzureichend färbte. Lediglich mit dem
      Antikörper gegen PMCA4 konnte eine leichte Fluoreszenzzunahme
      im Mittelstück dokumentiert werden, die auf eine Übertragung
      hindeuten könnte. Weiterhin konnte in vorausgehenden
      Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass die
      Ca2+-ATPase Aktivität in Nebenhodenspermien organspezifisch
      (z.B. keine signifikante Stimulation in Herz und Niere) durch
      das Bläschendrüsenprotein PDC-109 signifikant stimuliert
      werden kann (Sanchez-Luengo et al. 2004). Diese Stimulation
      konnte in der vorliegenden Arbeit auch für Epididymosomen und
      Spermien nach in vitro Fusion dokumentiert werden. Es ist
      bekannt, dass PDC-109 an Phospholipide bindet und auch die
      Aktivität der PMCA durch Phospholipide beeinflusst werden
      kann. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob es einen
      Zusammenhang zwischen der Lipidveränderung und der erhöhten
      Ca2+-ATPase Aktivität in Spermien nach der Fusion gibt.
      Zusammenfassend führt die Transsekretion
      (Zell-zu-Zelltransfer) zwischen Epididymosomen und Spermien
      zur Übertragung von Lipiden und Proteinen mit Einfluss auf
      die Ca2+-ATPase-Aktivität.