title: Comprehensive analysis of peptidoglycan hydrolases in Caulobacter crescentus
title: Umfassende Analyse der Peptidoglucan-Hydrolasen in Caulobacter crescentus
Creators: name: Zielinska, Aleksandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: peptidoglycan, hydrolase
Caulobacter
Peptidoglucan
Zellwand, Hydrolasen
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Der Peptidoglucan-Sacculus ist ein
      (einzelnes) großes Makromolekül, welches die meisten
      bakteriellen Zellen umhüllt. Während des Zellzyklus muss
      dieser kontinuierlich remodelliert werden, um den
      Elongationsprozess und letztlich auch die Zellteilung zu
      ermöglichen. Dieser Prozess benötigt ein empfindliches
      Gleichgewicht aus synthetischen und hydrolythischen
      Reaktionen, welche von einer Vielzahl an verschiedenen
      Enzymen durchgeführt werden. Jedoch sind die Aufgaben der
      einzelnen Komponenten dieser komplexen Maschinerie, noch
      deren zeitliche und räumliche Regulation bisher vollständig
      aufgeklärt. Insbesonders die Funktion und die Signifikanz der
      meisten PG-Hydrolasen ist noch weitgehend unbekannt. Während
      PG-Hydrolasen in allen Phasen der Zellwand-Biogenese
      beteiligt sind, besitzen sie eine besonders wichtige Rolle
      während der Zellteilung, bei der sie die streng regulierte
      Invagination der Zellwand, während des Abschnürprozesses,
      ermöglichen. Frühere Arbeiten identifizierten das
      PG-Hydrolase Homolog DipM als eine Schlüsselkomponente des
      Caulobacter crescentus Divisoms. Indes ist der Umfang, in dem
      Hydrolasen an der PG-Remodelierung bei dieser Spezies
      beitragen, noch unklar. Um die zentralen Faktoren zu
      identifizieren und ihre Funktion zu beleuchten, wurden in
      dieser Arbeit alle Amidasen, lytische Transglycosylasen
      (LTasen), Endopeptidasen (EPasen) und LD-Transpeptidasen
      (LD-TPasen) die im Genom von C. crescentus kodiert sind,
      analysiert. Dazu generierte ich eine Vielzahl an
      Fluoreszenzfusionen und Deletionsmutanten und analysierte
      diese mit mikroskopischen und biochemischen Methoden. Die
      daraus gewonnenen Erkenntnisse zeigten, dass die
      PG-Hydrolasen von C. crescentus hochgradig redundante
      Funktionen aufweisen. Basierend auf der Analyse der
      Zellmorphologien, Lokalisierungsdynamiken, Stress- und
      Antibiotika-Resistenz, konnte eine besonders wichtige Rolle
      der EPasen bei der Sicherstellung des korrekten Zellwachstums
      identifiziert werden. Die Deletion der amiC- und chap-Gene,
      welche Proteine mit Amidase-Aktivität kodieren, hatten
      keinerlei Effekt. Im Gegensatz dazu bildeten Mutanten mit
      multiplen Deletionen in EPase Genen, welche in die NlpC/P60-
      oder LytM-Familie fallen, lange glatte Filamente und
      gelegentlich Zellketten. Darüber hinaus ist die NlpC/P60
      artige EPase NlpA zusammen mit Chap Amidasen redundant
      essentiell für das Zellwachstum. Eine Inaktivierung aller
      löslichen lytischen Transglycosylasen (SLTasen) führt zu
      einer Filamentierung zusammen mit der Bildung von
      Membranvesikeln. Depletion von DipM in Stämmen, in denen die
      SLTasen oder die verbleibenden LytM-Faktoren deletiert worden
      waren, führt zu einem kompletten Stillstand der Zellteilung
      und schließlich zum Zelltod. Interessanterweise wurde ein
      ähnlicher Phänotyp, auch bei Depletion von DipM in Zellen
      erhalten, denen die katalytisch inaktive EPase LdpF, fehlt.
      Eine Kultivierung unter Stress-Bedingungen zeigte eine
      eindeutige Funktion von LdpF, SdpA (einer SLTasen) und Chap
      bei der Zellhüllen-Biogenese, denn Deletionen in den
      entsprechenden Genen führten einerseits zu einer Osmo- oder
      Antibiotika-Sensitivität. Ferner zeigt SdpA ein dynamisches,
      Zellzyklus abhängiges Lokalisierungmuster, das dem von
      Divisom-assoziierten Proteinen entspricht, die an den finalen
      Schritten der Zellwandremodellierung beteiligt sind, was eine
      Funktion bei der Zellteilung unterstützt. Insgesamt stellt
      diese Arbeit die erste Umfassende Analyse von PG-Hydrolasen
      von C. crescentus dar und unterstreicht die
      Schlüsselfunktionder katalytisch inaktiven EPase-Homologe
      DipM und LdpF im autolytischen System in diesem
      Organismus.
description: The peptidoglycan (PG) sacculus is
      a large macromolecule enclosing most bacterial cells. During
      progression of the cell cycle, it needs to be continuously
      remodelled to enable elongation of the cell body and,
      finally, cell division. This process requires a delicate
      balance between synthetic and hydrolytic reactions, which are
      executed by an array of different enzymes. However, the roles
      of individual components in this complex machinery and the
      mechanisms underlying their temporal and spatial regulation
      are still incompletely understood. In particular, the
      functional significance of many PG hydrolases is still
      unclear. While acting at all stages of cell wall biogenesis,
      PG hydrolases have a particularly important role during cell
      division, facilitating the coordinated invagination of the PG
      layer as constriction proceeds. Previous work has identified
      the putative PG hydrolase DipM as a key component of the
      Caulobacter crescentus divisome. However, the extent to which
      other hydrolases contribute to PG remodelling during the
      constriction process in this species has remained unknown. To
      identify the major players and elucidate their function, I
      have analysed the full set of putative amidases, lytic
      transglycosylases (LTs), endopeptidases (EPases) and
      LD-transpeptidases (LD-TPases) encoded in the C. crescentus
      genome. For this purpose, I generated a variety of
      fluorescent fusions and deletion mutants and characterized
      them using microscopic and biochemical approaches. The
      results obtained indicate that the PG hydrolases of C.
      crescentus have highly redundant functions. Based on the
      observation of changes in cell morphology, localization
      dynamics, stress and antibiotic resistance I have identified
      a particularly important role of EPases in maintaining cell
      wall integrity. Deletion of the amiC and chap genes encoding
      proteins with PG amidase activity had no detectable effect.
      In contrast, mutants lacking multiple EPases of the NlpC/P60
      or LytM subgroups formed either long smooth filaments or
      occasionally cell chains. Furthermore, the presence of either
      NlpC/P60 domain containing EPase NlpA, or the Chap amidase is
      essential to maintain proper growth. Inactivation of all
      soluble lytic transglycosylases (SLTs), led to cell
      filamentation accompanied by outer-membrane blebbing.
      Depletion of DipM, an EPase homologue lacking catalytic
      activity in strains lacking either all SLTs or all of the
      remaining LytM factors (a subgroup of EPases), led to a
      complete block in cell division and finally to cell death.
      Interestingly, a similar morphological defect was observed
      upon depletion of a DipM in a strain lacking another LytM
      factor with degenerated active site, LdpF. Cultivation in
      stress conditions revealed critical functions of LdpF, SdpA
      (falling into the SLTs group) and Chap in cell envelope
      biogenesis, since single deletions of the respective genes
      led to either osmo- or antibiotic sensitivity. Moreover, SdpA
      displayed a dynamic localization pattern, characteristic for
      the divisome components implicated in the final stages of
      cell wall remodelling, indication a role in the cell
      division. Collectively, this work provides the first
      comprehensive analysis of PG hydrolases in C. crescentus and
      underscores the key role of the catalytically inactive EPase
      homologues DipM and LdpF in the autolytic system of this
      species.