Μελέτη του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α στην καρδιακή μυογένεση σε πειραματικά μοντέλα ανθρώπινων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων
Creators: name: Δάιου, Αγγελική Αστερίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Καρδιομυογένεση
Αναγέννηση του μυοκαρδίου
ΗIF-1α
Cardiomyogenesis
Cardiac regeneration

description: Η αδυναμία της ανθρώπινης καρδιάς να αντικαθιστά καρδιομυοκύτταρα που έχουν υποστεί βλάβη καθιστά τις καρδιαγγειακές παθήσεις την πιο συχνή αιτία νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Συνεπώς, καθίσταται αναγκαία η μελέτη των μοριακών και παθοφυσιολογικών μηχανισμών που διέπουν την απώλεια αναγεννητικής ικανότητας στον άνθρωπο, χρησιμοποιώντας αναπτυξιακά μοντέλα ανθρώπινων επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (hiPSCs), καθώς και in vivo μοντέλα καρδιακής αναγέννησης, όπως ψάρια ζέβρα, νεογέννητους μύες και γουρούνια. Υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι θηλαστικά όπως οι μύες και τα γουρούνια, η καρδιά των οποίων είναι εξελικτικά συγγενική με την ανθρώπινη, μπορούν να αναγεννούν πλήρως το μυοκάρδιό τους μετά από τραυματισμό κατά την πρώτη εβδομάδα ζωής τους, ενώ μετέπειτα το παράθυρο αναγέννησης κλείνει. Ο μεταγραφικός παράγοντας HIF-1α παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική απόκριση στα επίπεδα οξυγόνου. Μέχρι σήμερα πιστεύεται ότι η ανάπτυξη και αναγέννηση του μυοκαρδίου συντελούνται υπό συνθήκες υποξίας. Έχει προταθεί ότι η υποξία οδηγεί στη σταθεροποίηση του HIF-1α στα καρδιομυοκύτταρα, ο οποίος ενισχύει τη γλυκόλυση έναντι της β-οξείδωσης λιπαρών οξέων, με αποτέλεσμα την επανείσοδο των καρδιομυοκυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Ωστόσο, η υπόθεση αυτή αποτελεί βιολογικό παράδοξο καθώς, η εναλλαγή του καρδιακού μεταβολισμού σε γλυκόλυση στον ενήλικο άνθρωπο π.χ. μετά από οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου, οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο και τελικά στην ανάπτυξη καρδιακής ανεπάρκειας. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος του HIF-1α στην ανάπτυξη και αναγέννηση του μυοκαρδίου, χρησιμοποιώντας in vitro μοντέλο hiPSCs στα οποία έχει πραγματοποιηθεί απαλοιφή του HIF-1α (HIF1α-ΚΟ). Τα κύτταρα αυτά, καθώς και κύτταρα αγρίου τύπου (WT), διαφοροποιήθηκαν στοχευμένα σε καρδιομυοκύτταρα προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του HIF-1α στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κατά τα διαφορετικά στάδια καρδιακής ανάπτυξης. Η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου έγινε με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής, συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού και ανοσοστυπώματος πρωτεϊνών. Επιπλέον, για τη διερεύνηση της παρουσίας υποξίας και του ρόλου του HIF-1α στην αναγέννηση του μυοκαρδίου, χρησιμοποιήθηκε in vivo μοντέλο καρδιακής αναγέννησης νεογέννητων μυών μετά από κρυοτραυματισμό. Τα in vitro αποτελέσματα έδειξαν ότι, κατά τη φυσιολογική καρδιακή ανάπτυξη στον άνθρωπο, ο HIF-1α σταθεροποιείται μέσω οξυγονοανεξάρτητων μηχανισμών, ενώ η απαλοιφή του μέσω του συστήματος CRISPR/Cas9 ενισχύει την πολλαπλασιαστική ισχύ των καρδιομυοβλαστών. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι τα ποσοστά των καρδιογόνων μιτωτικών κυττάρων που υπόκεινται σε φωσφορυλίωση της σερίνης-10 στην ιστόνη-Η3 (PH3S10) και βρίσκονται στη φάση G2M του κυτταρικού κύκλου, εμφανίζονται σημαντικά αυξημένα στα HIF1α-ΚΟ σε σχέση με τα WT κύτταρα και η αύξηση αυτή κορυφώνεται την ημέρα 7 της διαφοροποίησης. Επιπλέον, τα in vivo αποτελέσματα έδειξαν ότι η χορήγηση YC-1, ενός αναστολέα μετάφρασης του HIF-1α, οδήγησε σε σημαντική αύξηση της μιτωτικής δραστηριότητας, ενώ αντίθετα, η ενίσχυση του HIF-1α με CoCl2, περιόρισε τη μιτωτική δραστηριότητα των καρδιομυοκυττάρων σε νεογνά ποντίκια, 7 ημέρες μετά τον κρυοτραυματισμό. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διπλωματικής εργασίας υποστηρίζουν ότι, τόσο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη στον άνθρωπο όσο και κατά την καρδιακή αναγέννηση σε νεογνά ποντίκια, ο HIF-1α σταθεροποιείται μέσω οξυγονο-ανεξάρτητων μηχανισμών και περιορίζει τον πολλαπλασιασμό των καρδιακών μυοκυττάρων. Τα ευρήματα αυτά έχουν σημαντικές θεραπευτικές προεκτάσεις, καθώς η παροδική απενεργοποίηση του HIF-1α θα μπορούσε να αποτελέσει νέο θεραπευτικό στόχο για την επαγωγή του κυτταρικού κύκλου και συνεπώς της αναγέννησης καρδιομυοκυττάρων, ως απόκριση σε καρδιακές παθήσεις
description: The inability of the human heart to replace damaged cardiomyocytes makes cardiovascular diseases the most common cause of morbidity and mortality worldwide. Cardiomyopathies are highly diverse due to differences in pathophysiology as well as in clinical data between the two sexes. Therefore, it becomes necessary to study the key molecular and pathophysiological mechanisms which contribute to the loss of regenerative capacity in humans. For this purpose, developmental models of human pluripotent stem cells, as well as in vivo models of cardiac regeneration, such as zebrafish, neonatal mice and pigs, are used. Existing research data indicate that mammals, such as mice and pigs, whose hearts are evolutionarily related to the human heart, can fully regenerate their myocardium post injury during the first week of life, however, the regenerative window closes thereafter. The transcription factor HIF-1α, also known as the hypoxia response factor, plays an important role in the cellular response to systemic oxygen levels. To date, it is thought that both the development and regeneration of cardiomyocytes, are driven by hypoxic conditions. In particular, it has been suggested that hypoxia leads to the stabilization of HIF-1α in cardiomyocytes, which activates a gene program that enhances glycolysis rather than fatty acid oxidation, resulting in cardiomyocyte cell cycle re-entry. However, this hypothesis remains paradoxical because a similar HIF1α-dependent glycolytic switch has been shown to drive heart failure, i.e. in response to ischemic heart disease. Here, we investigate the role of HIF-1α in the development and regeneration of the myocardium. In this context, an in vitro model of human induced pluripotent stem cells in which HIF-1α has been genetically inactivated (HIF1α-KO) was used. These cells, as well as wild-type (WT) cells, were subjected to stage-specific cardiomyocyte differentiation, and the role of HIF-1α in cell cycle activity was investigated at each developmental stage via flow cytometry, confocal microscopy, and protein immunoblotting. Furthermore, to investigate the role of HIF-1α in cardiomyocyte regeneration, an in vivo model of neonatal mouse heart regeneration after cryoinjury was used. Flow cytometry analysis of WT and HIF1α-KO cardiomyoblasts showed that, during human cardiomyogenesis, the knockout of HIF-1α induces a shift of the cell cycle towards the G2M phase and thus increases the percentage of mitotic cardiomyocytes; this result was confirmed by confocal fluorescence microscopy experiments. Accordingly, pharmacological inhibition of HIF-1α in the in vivo neonatal mouse model led to an increase in cardiomyocyte proliferation, whereas, in contrast, its aerobic stabilization reduced the proliferation of cardiac myocytes. The results of the present thesis indicate that, during human cardiomyogenesis, HIF-1α is stabilized through oxygen-independent mechanisms and limits cardiomyocyte proliferation. These findings could have important therapeutic implications for inducing cardiomyocyte regeneration in response to heart disease