Διερεύνηση της δράσης μονοκλωνικών Φυσικών Αυτοαντισωμάτων τάξης IgM σε καλοήθεις και καρκινικές κυτταρικές σειρές
Creators: name: Τσιροπινά, Δέσποινα Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Φυσικά Αυτοαντισώματα
Καλοήθεις και καρκινικές κυτταρικές σειρές
Μακροσφαιριναιμία Waldenström (WM)
Natural autoantibodies
Benign and cancerous cell lines
Waldenström macroglobulinemia (WM)

description: Τα Φυσικά αντισώματα (ΦΑ) αποτελούν αντισώματα που προέρχονται από κλώνους αυτοδραστικών Β λεμφοκυττάρων, ανήκουν σε όλες τις τάξεις των ανοσοσφαιρινών και ανευρίσκονται στο αίμα καθώς και σε άλλα βιολογικά υγρά. Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι η αυτοδραστικότητα και η πολυδραστικότητα, δηλαδή η ικανότητα να αναγνωρίζουν περισσότερα του ενός, ξένα ή εαυτά αντιγόνα. Τα ΦΑ συμμετέχουν σε μια σειρά από βιολογικές λειτουργίες, καθοριστικές για τη διατήρηση της ομοιόστασης και τη φυσιολογική λειτουργία του ανοσιακού συστήματος. Ο ρόλος τους στην ανοσορρύθμιση και η αντικαρκινική τους δράση είναι από τους σημαντικότερους, που καθιστούν τα ΦΑ πολύτιμα εργαλεία του οργανισμού στην αντιμετώπιση πολυάριθμων ασθενειών και του καρκίνου. Η μακροσφαιριναιμία Waldenström (WM), ως μια λεμφοϋπερπλαστική διαταραχή, χαρακτηρίζεται από την υπερβολική αύξηση των επιπέδων της μονοκλωνικής ανοσοσφαιρίνης, τάξης IgM (mIgM) στον ορό των ασθενών. Το γεγονός πως η επιλογή του Β κλώνου που επικρατεί κατά την εξέλιξη της WM, είναι τυχαία αποτελεί ισχυρή ένδειξη πως κάποιοι από αυτούς τους κλώνους πιθανά να αποτελούν κλώνους που παρήγαγαν -κάτω από φυσιολογικές συνθήκες- ΦΑ. Συνέπεια αυτού του γεγονότος είναι ο ορός των ασθενών αυτών να αποτελεί πλούσια πηγή mIgM-ΦΑ. Σε παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου απομονώθηκαν mIgM από ορούς ασθενών με WM και χαρακτηρίστηκαν ως προς την επίδρασή τους και την ικανότητά τους για κυτταροδιείσδυση σε καρκινικά κύτταρα μαστού, MDA-MB-231. Η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά επιλέχθηκε καθώς χαρακτηρίζεται ως τριπλά-αρνητική -στερείται τον υποδοχέα οιστρογόνου (ER), προγεστερόνης (PR) και τον υποδοχέα ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER2)-και είναι άρα ανθεκτική σε ορμονο-θεραπείες και θεραπείες στόχευσης του πρωτο-ογκογονιδίου HER-2/Neu. Αν και σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε κυτταροδιείσδυση των mIgM, το υψηλό μοριακό τους βάρος (900kDa) επιβάλει την επιβεβαίωση του φαινομένου από το μονομερές της ίδιας mIgM. Η επεξεργασία των mIgM και η αξιοποίηση του μονομερούς τμήματος (μονομερής-mIgM), ως μικρότερο μόριο (150kDa), με πιθανά ισχυρότερη κυτταροδιεισδυτική και άρα κυτταροτοξική δράση αποτέλεσε έναν από τους άξονες μελέτης της παρούσας εργασίας. Στόχος της μελέτης ήταν ο χαρακτηρισμός της δράσης των mIgMs σε καλοήθη (ΜΕΤ5Α) και καρκινικά (ZL34) κύτταρα μεσοθηλιώματος καθώς και η απομόνωση της μονομερούς-mIgM και ο περαιτέρω χαρακτηρισμός της. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καθαρισμός μονοκλωνικών ανοσοσφαιρινών τάξης IgM από επτά ορούς ασθενών με WM, οι οποίες ελέγχθηκαν για την καθαρότητά τους και εξετάσθηκαν ως προς τον τύπο της ελαφριάς αλυσίδας τους. Με τη χρήση ανοσοδοκιμασιών ELISA για έξι αντιγόνα πιθανούς στόχους ΦΑ (ακτίνη, μυοσίνη, τουμπουλίνη, DNA, TNP, ιστόνες) και έμμεσου ανοσοφθορισμού σε καρκινικά κύτταρα μαστού MDA-MB-231, προσδιορίστηκε η πολυδραστικότητά τους. Από την όλη διαδικασία επιλέχθηκε μία mIgM ως ισχυρά πολυδραστική [mIgM-WM(201)], καθώς αναγνώριζε ισχυρά και τα έξι αντιγόνα του πάνελ. Επίσης το προφίλ της mIgM στον έμμεσο ανοσοφθορισμό επιβεβαίωσε τη δοκιμασία ELISA, αποδεικνύοντας την έντονη δραστικότητα της mIgM ενάντια σε πυρηνικά (Sp-100, PML proteins, MJ/NXP-2) και κυτταροπλασματικά [Jo-1 (ιστιδύλ-tRNAσυνθετάση)] αντιγόνα-χαρακτηριστικό προφίλ φθορισμού πολυδραστικών ΦΑ. Έπειτα πραγματοποιήθηκε χαρακτηρισμός της προ-αποπτωτικής και κυτταροτοξικής επίδρασης της mIgM σε καλοήθη και καρκινικά κύτταρα μεσοθηλιώματος, στο πλαίσιο συγκριτικής μελέτης με τις υπόλoιπες απομονωμένες mIgMs. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε πέψη της πενταμερούς-mIgM με διαφορετικές συγκεντρώσεις 2-μερκαπτοαιθυλαμίνης, σε κατάλληλο pH και αλκυλίωση με ιοδοακεταμίδιο, ενώ η απομόνωση της μονομερούς έγινε με Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (Fast protein liquid chromatography -FPLC). Αφού προσδιορίστηκαν οι κατάλληλες συνθήκες αντίδρασης για την παρασκευή της μονομερούς-mIgM σε επαρκή ποσότητα, χαρακτηρίστηκε η mIgM ως προς την καθαρότητα, αλλά και ως προς την αντισωματική της δράση, σε σύγκριση με την πενταμερή, με ανοσοδοκιμασίες ELISA έναντι τριών αντιγόνων αντιγόνων, μια πρωτείνη (ακτίνη), ένα νουκλεικό οξύ (nDNA)/, ένα απτένιο (TNP), και έμμεσου ανοσοσφθορισμού σε μονιμοποιημένα καρκινικά κύτταρα μαστού, MDA-MB-231. Από την ανάλυση αυτή, η μονομερής-mIgM χαρακτηρίστηκε ως ισχυρότερα δραστική έναντι της ακτίνης συγκριτικά με την πενταμερή, ενώ για τα άλλα δύο αντιγόνα εμφάνισε δραστικότητα ασθενούς βαθμού. Επίσης, το προφίλ του μονομερούς-mIgM στον έμμεσο ανοσοφθορισμό διέφερε από του πενταμερούς, καθώς εμφανίζονταν διάχυτο στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο ειδικό. Στη συνέχεια της μελέτης επιβεβαιώθηκε η μονοκλωνικότητα της μονομερούς-mIgM μέσω Ισοηλεκτρικής εστίασης και πραγματοποιήθηκαν πειραματικές δοκιμές προσδιορισμού τυχόν κυτταροδιεισδυτικής ικανότητας και κυτταροτοξικής δράσης σε καρκινικά και καλοήθη κύτταρα. Η μελέτη της βιολογικής δράσης της επιλεγμένης mIgM [mIgM-WM(201)], μέσω κυτταρομετρίας ροής (FACs) με τη χρήση διπλής χρώσης με Αννεξίνη V και Ιωδιούχο Προπίδιο, έδειξε ότι η mIgΜ είχε την ικανότητα να επάγει σε πολύ υψηλό βαθμό απόπτωση των καρκινικών κυττάρων και να προκαλεί μειωμένα-συγκριτικά με τις άλλες mIgMs- επίπεδα κυτταρικού θανάτου στα καλοήθη κύτταρα. Παράλληλα με τη δοκιμασία ΜΤΤ η πενταμερής-mIgM, σε αντίθεση με την μονομερή που προκάλεσε πλήρη κυτταρικό θάνατο σε όλες τις κυτταρικές σειρές, οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα κυτταροτοξικότητας μόνο στα καρκινικά κύτταρα και μηδενικά στα καλοήθη. Τέλος, έγινε μια αρχική προσπάθεια διερεύνησης της ικανότητας της μονομερούς-mIgM συγκρητικά με την πενταμερή-mIgM, να διεισδύει σε ζώντα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης προελεύσεως (MDA-MB-231). Από το ένα και μοναδικό (λόγω του περιορισμένου χρόνου και της περιορισμένης ποσότητας μονομερούς-mIgM, στο πλαίσιο πραγματοποίησης της μελέτης πιλοτικά, για πρώτη φορά στο εργαστήριο) πείραμα κυτταροδιείσδυσης (το οποίο πραγματοποιήθηκε) φάνηκε πως τόσο η πενταμερής όσο και η μονομερής-mIgM, δεν μεταφέρθηκαν στο εσωτερικό των κυττάρων (στη συγκέντρωση και τις συνθήκες που μελετήθηκαν). Όμως, απαιτούνται περισσότερα πειράματα προκειμένου να αποσαφηνιστεί η τυχόν ικανότητα των μονομερών-mIgM να διεισδύουν σε ζωντανά κύτταρα. Συμπερασματικά, επιβεβαιώθηκε πως οι οροί ασθενών με WM αποτελούν μια αξιοποιήσιμη πηγή μονοκλωνικών ΦΑ, παρέχοντας τη δυνατότητα περαιτέρω μελέτης των χαρακτηριστικών και των βιολογικών ιδιοτήτων των αντισωμάτων αυτών. Μελλοντικοί στόχοι του εργαστηρίου είναι η περαιτέρω διερεύνηση της κυτταροδιεισδυτικής ικανότητας των mIgMs, η βελτιστοποίηση της μεθόδου απομόνωσης της μονομερούς-mIgM, η μελέτη της βιολογικής του δράσης σε καρκινικά και καλοήθη κύτταρα, καθώς και η παραγωγή ανασυνδυασμένων μονοκλωνικών IgM-ΦΑ, με απώτερο στόχο την αξιοποίηση των μονοκλωνικών ΦΑ στη θεραπεία.
description: Natural antibodies (NAbs) are antibodies derived from autoreactive B-lymphocyte clones. They belong to all classes of immunoglobulins and are found in the blood as well as in other biological fluids. Their main characteristics are autoreactivity and polyreactivity, meaning the ability to recognize more than one foreign or self-antigen of distinct composition and structure. NAbs participate in a number of biological functions vital for maintaining homeostasis and ensuring the normal functioning of the immune system. Among their most important roles are the immune regulation and the anti-cancer activity, making NAbs valuable tools for the body to fght various diseases, including cancer. Waldenström macroglobulinemia (WM), a lymphoproliferative disorder, is characterized by an excessive increase in monoclonal immunoglobulin levels, of IgM class (mIgM), in the serum of patients. The random selection of the prevailing B-cell clone during the development of WM strongly suggests that some of these clones likely produced NAbs under normal conditions. As a result, the serum of these patients becomes a rich source of mIgM-NAbs. In earlier studies conducted by the laboratory, mIgMs were isolated from the sera of WM patients and characterized for both their effects and their ability to penetrate cells. The studies were conducted on MDA-MB-231 cells, which are classified as triple-negative breast cancer cells, due to the lack of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and human epidermal growth factor receptor (HER2). As a result, they do not respond to hormonal therapies or medicines that target the HER2 protein. Although mIgM showed cell-penetrating ability in some cases, its high molecular weight (900 kDa) necessitates confirmation of the phenomenon using its monomeric form. Processing the mIgM to utilize its monomeric part, a smaller molecule (150 kDa), with potentially greater cell-penetrating and cytotoxic ability, became one of the main goals of this thesis. More specifically, the study aimed to characterize the action of mIgMs in benign (MET5A) and cancerous (ZL34) mesothelioma cells, as well as to the isolation and further characterization of monomeric IgM (mIgM-monomer). For this purpose, IgM monoclonal immunoglobulins were isolated and purified from the sera of seven WM patients, and their purity and light chain type were examined. Subsequently, their polyreactivity was assessed using ELISA for six antigens, which are potential NAbs targets (actin, myosin, tubulin, DNA, TNP, histones), and by indirect immunofluorescence, in MDA-MB-231 breast cancer cells. From this analysis, one mIgM was identified as highly polyreactive [mIgM-WM(201)], as it strongly recognized all six antigens. In addition, the profile of mIgM in indirect immunofluorescence confirmed the ELISA results, demonstrating strong activity of the mIgM against nuclear (Sp-100, PML proteins, MJ/NXP-2) and cytoplasmic (Jo-1/histidyl-tRNA synthetase) antigens. Next, the pro-apoptotic and cytotoxic effects of the mIgM on benign and cancerous mesothelioma cells were characterized in a comparative study with the other isolated mIgMs. Furthermore, the mIgM pentamer was reduced with different concentrations of 2-mercaptoethylamine and alkylated with iodoacetamide, in order to be determined the appropriate reaction conditions for the preparation of mIgM-monomer in sufficient quantity. The mIgM-monomer was isolated using size-exclusion chromatography (Fast protein liquid chromatography; FPLC). The isolated IgM fraction was characterized for its purity and its antibody reactivity, by ELISA against three antigens (actin, DNA, TNP) and indirect immunofluorescence on fixed cancerous cell lines MDA-MB-231, compared to the pentamer. This analysis showed that mIgM-monomer recognized strongly actin (more than the pentamer), but its recognition of DNA and TNP was weaker. Additionally, the fluorescence profile of the monomer was more diffuse in the cytoplasm and less specific compared to the pentamer. Subsequently, its monoclonality was confirmed by isoelectric focusing, and its potential cell-penetrating and cytotoxic activity in cancerous and benign cells were evaluated. The study of the biological activity of the selected mIgM [mIgM-WM(201)], using the Flow cytometry analysis technique (FACS), with double staining of Annexin V and Propidium Iodide (PI), demonstrated strong ability to induce apoptosis in cancer cells, while causing lower levels of cell death in benign cells compared to the other isolated mIgMs. In parallel, the MTT assay revealed that mIgM -in contrast to mIgM-monomer, which caused complete death in all cell lines- exhibited increased cytotoxicity in cancer cells, without inducing the same effect on benign cells. Finally, an attempt to study the ability of mIgM-monomer, compared to the pentameric form, to penetrate in human live cells (MDA-MB-231) was carried out. From the one and only experiment that was conducted (due to the lack of time and insufficient quantity of mIgM-monomer, in the context of performing the study for the first time in the lab) it was shown that, neither the pentamer nor the monomer-IgM was translocated inside the cells, at the concentration and conditions examined. However, more experiments on the cell-penetrating ability of monomeric mIgM need to be performed to clarify this property. In conclusion, this diplomatic thesis confirmed that the sera of patients with WM are a valuable source of monoclonal NAbs, allowing further investigation of their characteristics and biological activities. Aiming to investigate the therapeutic potential of monoclonal NAbs, future studies would allow the assessment of the cell-penetrating abilities of mIgM and their monomers, optimizing IgM-monomer isolation methods, and further exploring the biological activities of monomeric IgM in both cancerous and benign cell lines.
description: Τμήμα Ιατρικής, της Σχολής Επιστημών Υγείας του Α.Π.Θ. (επισπεύδον) σε συνεργασία με το Τμήμα Φαρμακευτικής του Α.Π.Θ.