title: Entwicklung von Polymerfaser-Systemen in künstliche, biomimetische, polylactid basierte, ultra-hoch poröse Schwämme für Anwendungen in der Leber-Gewebezucht
Creators: name: Mader, Michael
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2021
Subjects: subject: Sponge
subject: electrospinning
subject: 3D scaffold
subject: tissue engineering
subject: degradable
subject: nonwoven
subject: cell culturing
subject: coating
subject: drug-delivery system
subject: 3D imaging
subject: 540

description: Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, bekannte Konzepte der bisher nur auf anorganischen Materialien oder nicht-abbaubaren Polymeren basierenden PFS, auch mit abbaubaren Polymeren zu realisieren und für Anwendungen in der biomimetischen Gewebezucht nutzbar zu machen. Der Fokus wurde auf die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung monolithischer PFS aus Polylactid (PLA) sowie Mischsystemen aus PLA und Polycaprolacton (PCL) gelegt. Die resultierenden PFSEigenschaften, die einzelnen Herstellungsschritte und die dafür entscheidenden Einflussfaktoren wurden systematisch variiert und analysiert. Hierzu wurden mehrere qualitative als auch quantitative Analysen herangezogen. Der Einfluss der Polymer-eigenschaften sowie ihre chemisch-thermische Modifizierbarkeit wurde bestimmt, um den Zusammenhang zwischen Material- und PFS-Eigenschaften identifizieren und die Grenzen der Leistungsfähigkeit der Systeme evaluieren zu können. Hierzu wurde die PFS-Integrität, Belastbarkeit und Elastizität u.a. in Abhängigkeit zur thermischen Vernetzung, eingesetzten Faserdichte und unter Einfluss unterschiedlicher Umgebungsbedingungen quantifiziert. Um die Biokompatibilität und allgemeine Zellkultur Eignung der PFS zu evaluieren wurden statische Zellbesiedlungsexperimente durchgeführt. Zell-Verteilung, Zell-Viabilität und Zellpenetration ins Innere des PFS wurde ex-situ verfolgt und quantifiziert. Hierzu wurden digitale Licht- (LM), konfokale Laser Raster- (CLSM) sowie Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Aufnahmen angefertigt und ausgewertet. Die verwendeten, nicht-adhärenten Zellen konnten zwar nahezu ungehindert in den PFS eindringen, sich jedoch im Rahmen der Einschränkungen einer statischen Kultur nur oberflächlich vermehren. Dieser Umstand sollte unter Einsatz einer dynamischen Kultur und durch Einführen einer chemischen PFS-Biomodifizierung ausgeglichen werden. Zwei verschiedene Techniken zur Biomodifizierung von PLASchwämmen mit Galaktose (Gal) wurden verfolgt, um daraus elektrogesponnene Fasermatten und biomimetische PFS für die Leber- Gewebezucht herzustellen. Dies geschah durch Kombination von PLA mit Gal in Form eines PLA-Galaktose Copolymers (Gal-Träger). Die zunächst zu validierende Hypothese war, ob die Gal-Funktionalität des Gal-Trägers die literatur-bekannte Affinität zu Leberzellen vorweist und ob sich diese für die Zellbesiedlung der PFS förderlich zeigt. Für die Validierung wurden PLA-Gal Fasermatten durch Mischen beider Komponenten (PLA/Gal-Träger) über Elektrospinnen (ES) hergestellt und anschließend unter statischer Kultur mit unterschiedlichen Leber-Zelltypen gegenüber Referenzsystemen validiert. Zur Validierung wurde der Einfluss der Gal in-situ und ex-situ, in Gegenüberstellung parallel zellkulturierter Proben aus sowohl PLA-Gal wie auch PLA basierten Referenzsystemen variabler Hydrophilie quantifiziert. Die in-situ und ex-situ Ergebnisse der Zellkultur mit PLA-Gal Fasermatten geben eine signifikant erhöhte Zellaffinität und Proliferationssteigerung gegenüber den Referenzsystemen preis. Die Rezeptor- Interaktion von Hepatozyten und Gal wurde in-situ durch Regulierung mit Blocker-Ionen verfolgt und verifiziert. Nach Validierung wurden die PLA-Gal Fasermatten zu PFS weiterverarbeitet, um ihre Eignung als Basis für die Entwicklung einer 3D Leber-biomimetischen Zelltest- Plattform auch unter dynamischer Zellkultur zu prüfen. Ein Perfusions- Bioreaktor wurde entwickelt, welcher einen PFS vollständig umschließt und seine stetige Perfusion ermöglicht. Im Gegensatz zu PLAPFS, zeigen die Bioreaktor-Kultur Ergebnisse mit PLA-Gal PFS eine maßgeblich verbesserte, gleichmäßige Zellverteilung innerhalb des PFS. Um zukünftig die für eine Galaktosylierung von PLA Fasersystemen, wie das Misch-Elektrospinn Verfahren, benötigte Menge an Gal- Träger Material reduzieren zu können, wurde eine Methode zur Beschichtung von PLA-Schwämmen entwickelt. Auf Grund einer unerwartet ausgeprägten Photolumineszenz des Gal-Trägers stellten sich CLSM Messungen für den Nachweis der Beschichtung und der Analyse seiner Qualität als hoch vielversprechend heraus. Die spektroskopisch charakterisierte, ausgeprägte Autofluoreszenz des Gal-Trägers ermöglicht eine hochauflösende, 3D Visualisierung galaktosylierter PLA-Gal Fasern und somit des Schwamm Faser-Netzwerks unter UV-CLSM. Die Ergebnisse belegen, dass monolithische PLA-PFS erfolgreich und gleichmäßig mit dem Gal-Träger beschichtet und so nachhaltiger biomodifiziert werden können. Monolithische PLA-PFS wurden für Untersuchungen mit pharmazeutischer Anwendungsrelevanz modifiziert, um sie zur Klärung grundlegender physikalischer und pharmazeutischer Frage-stellungen einsetzen zu können. Die Weiterentwicklung der PFS beinhaltet deren Beschichtung und anschließende Beladung mit physiologisch relevanten Flüssigkeiten, wie eines in der Pharmazie gebräuchlichen Öls, als mögliche flüssig-Medikamententräger. Die äußere und innere PLA-PFS Oberfläche wurde mit Poly-(para-xylylen) beschichtet und charakterisiert in Bezug auf die PFS Beschichtungsqualität, den Oberflächeneigenschaften sowie der Medium-Beladungskapazität. Es wurden genaue Analysen der mechanischen Belastbarkeit und Elastizität der PFS in trockenem Zustand sowie nach Beladung mit Öl durchgeführt. Hierbei wurden die PFS im Hinblick auf Ihre Fähigkeiten zur Öl-Rückhaltung und Wiederaufnahme nach Freisetzung unter Kompression, auch bei unterschiedlicher prozentualer Öl-Beladung, untersucht. Unterschiedliche in-vivo Transplantationssituationen wurden simuliert, um die Aufnahme von Flüssigkeiten in den PFS und die Rückhaltung im Schwamm-Gerüst zu untersuchen. Im Direktvergleich wurde das Freisetzungsprofil eines Modell-Medikaments im Ölbeladenen PFS gegenüber der aus freiem Öl analysiert. Mit Mikro- Computertomographie (μCT) und Elektronen-paramagnetische Resonanzspektroskopie (EPR) wurden 3D Aufnahmen der Medium- Penetration in den PFS angefertigt, analysiert und quantifiziert. Mit Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) wurde das Verhaltens des freien und im PFS-Gerüst gehaltenen Mediums und seiner Interaktion mit dem PFS analysiert. Unterschiede in der molekularen Relaxation und Diffusion der Flüssigkeit wurden bestimmt, um die Auswirkungen auf die Freisetzung von Medikamenten evaluieren zu können.