title: Interferometric Scattering Microscopy at Solid-Liquid Interfaces - Investigation of Nanoparticle-Surface Binding and Illumination-Induced Polymer Desorption
title: Interferometrische Streumikroskopie an Fest-Flüssig-Grenzflächen - Untersuchung von Nanopartikel-Oberflächen-Bindung und belichtungsinduzierter Polymerdesorption
Creators: name: König, Katharina
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: iSCAT
subject: microscopy
subject: single-particle tracking
subject: nanoparticle-Surface binding
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 53 Physik :: 535 Licht, Infrarot- und Ultraviolettphänomene

description: The interaction of single molecules with solid-liquid interfaces plays a significant role in biological and medical research. In particular, the mobility of a molecule can provide information about the functionality of the underlying substrate. Such mobilities are frequently measured via the signal of a small nanoparticle label attached to the molecule of interest. A large field of research applying this technique focuses on the investigation of single lipids or proteins within cell membranes, as the mobility of these molecules can provide insights into fundamental processes such as cell signalling and trafficking. Considering functionalised substrates, the investigation of binding dynamics on the single molecule level can provide crucial information for the optimisation of functionalisation layers such as anti-fouling surfaces. These functionalisation layers are used to suppress nonspecific protein binding onto biosensing surfaces or medical implants. This thesis aims at providing an experimental basis for a more thorough understanding of the complex interactions of small nanoparticles and polymers with functionalised solid-liquid interfaces. For this purpose, microscopy based on the interferometric detection of scattered light (iSCAT) is used to investigate particle motion at solid-liquid interfaces with nanoscopic localisation precision and microsecond temporal resolution. In the first part of this thesis, single particle tracking is performed with 40 nm streptavidin-coated gold particles. The particles are tracked after adsorption onto various functionalised glass substrates. The substrate functionalisations differ in their specificity with respect to the nanoparticle coating, ranging from protein-repelling surfaces to surfaces which can specifically bind streptavidin. The dependence of the nanoparticle motion close to the interface on various experimental parameters is illustrated. These parameters include the functionalisation chemistries of the substrate and the nanoparticle itself, the medium in which the particles are immersed during the measurement, the illumination intensity and wavelength. The results demonstrate the potential of iSCAT microscopy to resolve distinct nanoparticle motion patterns with a localisation precision of better than 1 nm over 100 s of measurement. Specific confinements are found to be occupied repetitively. Consequently, the shapes of the trajectories are attributed to inhomogeneities in the surface structure of the underlying substrate which are probed via the nonspecific and/or specific binding of the functionalised nanoparticles. In particular, it is shown that completely nonspecific interactions between particle and substrate can result in particle trajectories which are qualitatively known from experiments on specifically bound labels. In the second part of this thesis, iSCAT microscopy is used to study the stability of a protein-repelling functionalisation layer adsorbed on a glass substrate. The investigated functionalisation is a graft copolymer that contains different functional groups: a polyacrylic backbone with nitro-catechol groups ensures a strong interaction with the underlying substrate, and poly-ethylene glycol (PEG) side chains prevent nonspecific protein binding to the substrate. In particular, it is shown that such a graft copolymer layer can desorb upon high-intensity illumination, which is attributed to the absorption of the nitro-catechol group in the polymer. The illumination-induced desorption is demonstrated with atomic force microscopy, fluorescence imaging and iSCAT using different illumination schemes, intensities and wavelengths. The measurements performed with iSCAT visualise the dynamics of desorption and temporary re-adsorption events of small polymer clusters at the solid-liquid interface. The experiments are conducted in an all-optical and label-free way and demonstrate iSCAT to be a suitable technique for investigating the stability of polymer-based functionalisation layers. The unifying theme throughout this thesis is the revelation of unexpected phenomena occurring at the examined solid-liquid interfaces. The findings present a promising starting point for future investigations of molecule-surface interactions. Most importantly, the presence, type and distribution of inhomogeneities in the surface of a substrate could be investigated on the nanoscopic level by measuring the motion of functionalised nanoparticles.
description: Die Wechselwirkung einzelner Moleküle mit Fest-Flüssig-Grenzflächen ist von großer Bedeutung für eine Vielzahl biologischer und medizischer Fragestellungen. Besonders die Mobilität eines Moleküls kann Informationen über die Funktionsweise des zugrundeliegenden Substrats liefern. Die Mobilität einzelner Moleküle wird üblicherweise über das Signal eines kleinen Nanopartikelmarkers gemessen, der an das Molekül gebunden wird. Ein großes Forschungsgebiet, das Gebrauch von dieser Technik macht, beschäftigt sich mit der Untersuchung einzelner Lipide oder Proteine in Zellmembranen, da die Bewegung dieser Moleküle Einblicke in grundlegende biologische Prozesse wie etwa der Signalweiterleitung und des Transports in der Zelle geben kann. Im Bereich funktionalisierter Oberflächen kann die Untersuchung von Bindungsdynamiken auf Einzelmolekülebene wertvolle Informationen für das Design und die Optimierung von Funktionalisierungsschichten wie etwa für antifouling-Oberflächen liefern. Diese Oberflächen werden dazu genutzt nichtspezifisches Binden von Proteinen zu unterdrücken, was eine wichtige Eigenschaft von Biosensoren oder medizinischen Implantaten darstellt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine experimentelle Grundlage für ein besseres Verständnis der komplexen Wechelwirkungen kleiner Nanopartikel und Polymere mit funktionalisierten Oberflächen zu schaffen. Dafür wird die Mikroskopiemethode der interferometrischen Detektion gestreuten Lichts (iSCAT) genutzt um die Partikelbewegung an der Grenzfläche mit nanoskopischer Lokaliserungsgenauigkeit und einer zeitlichen Auflösung von Mikrosekunden zu messen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Technik der Lokalisierung einzelner Partikel auf 40 nm große Goldnanoteilchen angewendet, die mit Proteinen, speziell Streptavidin, beschichtet sind. Die Partikel werden gemessen nachdem sie auf verschieden funktionalisierten Glassubstraten adsorbiert sind. Dabei variieren die Substratfunktionalisierungen hinsichtlich ihrer Spezifizität in Bezug auf die Goldteilchenfunktionalisierung. Sie umfassen sowohl Oberflächen, an die Streptavidin-funktionalisierte Goldteilchen spezifisch binden können, als auch Oberflächen, die solche Protein-beschichteten Teilchen abweisen. Die Abhängigkeit der Nanopartikelbewegung von zahlreichen experimentellen Parametern wird aufgezeigt. Zu diesen Parametern gehören die Funktionalisierungen des Substrats und des Nanopartikels selbst, das Medium, in dem sich die Partikel während der Messung befinden, sowie die Belichtungsintensität und -wellenlänge. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht das Potential der iSCAT Mikroskopie spezifische Bewegungsmuster der Nanoteilchen mit einer Auflösung von weniger als 1 nm über eine Dauer von 100 s zu messen. Es wird gezeigt, dass sich Partikel wiederholt in stark lokalisierten Bereichen auf der Oberfläche bewegen. Darauf basierend werden die Formen der Trajektorien mit Inhomogenitäten in der Oberflächenstruktur des zugrundeliegenden Substrats erklärt, mit denen die Nanopartikel über nichtspezifische und/oder spezifische Wechselwirkingen interagieren. Insbesondere wird aufgezeigt, dass aus aus vollkommen unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Partikeln und Substrat Bewegungsmuster resultieren können, deren qualitative Erscheinungsform aus Experimenten mit spezifisch gebundenen Goldnanoteilchen bekannt ist. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wird die iSCAT-Mikroskopie dazu verwendet, die Stabilität einer protein-abweisenden Polymerschicht, die auf einem Glassubstrat adsorbiert ist, zu untersuchen. Die untersuchte Funktionalisierung ist ein Graft-Copolymer, das verschiedene funktionelle Gruppen enthält: Polyacrylketten und Nitrocatecholgruppen ermöglichen eine starke Wechselwirkung mit dem Substrat, und Polyethyleneglycol (PEG)-Ketten verhindern ein nichtspezifisches Binden von Proteinen an das Substrat. Insbesondere wird gezeigt, dass solch eine Graft-Copolymer-Schicht unter Belichtung mit hohen Intensitäten vom Glassubstrat desorbieren kann. Die Desorption der untersuchten Funktionalisierungsschicht wird der Absorption des Lichts durch die Nitrocatecholgruppen zugeschrieben. Die belichtungsinduzierte Desorption wird mit Rasterkraftmikroskopie, Fluoreszenzbildgebung und iSCAT demonstriert, unter Anwendung verschiedener Belichtungsschemata, -intensitäten und -wellenlängen. Dabei wird mithilfe der iSCAT-Mikroskopie die Dynamik einzelner Desorptions- und temporärer Re-Adsorptionsprozesse kleiner Polymercluster an der Fest-Flüssig-Grenzfläche visualisiert. Die Untersuchung wird rein optisch und ohne den Einsatz von Markern durchgeführt. Es wird gezeigt, dass iSCAT eine geeignete Methode ist, um die Stabilität polymerbasierter Funktionalisierungsschichten zu untersuchen. Der gemeinsame Nenner beider Teile der vorliegenden Arbeit ist die Detektion unerwarteter Phänomene an den untersuchten Fest-Flüssig-Grenzflächen. Die hier gezeigten Ergebnisse bilden eine vielversprechende Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Wechselwirkungen von Molekülen und Oberflächen. Insbesondere könnte die Art und Verteilung von Inhomogenitäten in der Oberfläche eines Substrats durch die Messung der Mobilität funktionalisierter Nanopartikel auf nanoskopischer Ebene untersucht werden.