Κατασκευή και χαρακτηρισμός τρισδιάστατα εκτυπωμένων δομών κυτταρικών σειρών δέρματος
Creators: name: Χακίμ, Ζένα Ουαλίντ
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Τρισδιάστατη Βιοεκτύπωση
Βιομελάνι
Ιστομηχανική Δέρματος
3D Bioprinting
Bioink
Skin tissue engineering

description: Οι δερματικές παθήσεις αποτελούν την 4η κύρια αιτία μη θανατηφόρου νόσου σε παγκόσμιο επίπεδο. Το κόστος ιατρικής βοήθειας για οξείες και χρόνιες θεραπείες πληγών κυμαίνονταν το 2018 από 28,1 έως 96,8 δισεκατομμύρια δολάρια. Οι θεραπείες που ακολουθούνται σε περιπτώσεις παθολογικών καταστάσεων ή τραυματισμών του δέρματος και που χρησιμοποιούνται ευρέως μέχρι σήμερα περιλαμβάνουν τη χρήση αυτομοσχευμάτων, αλλομοσχευμάτων και ξενομοσχευμάτων δηλαδή με αντικατάσταση του δέρματος που έχει υποστεί βλάβη με υγειούς περιοχής δέρμα του ασθενούς, το δέρμα δότη ή το δέρμα από άλλο είδος, αντίστοιχα. Ωστόσο, λόγω του περιορισμένου αριθμού των δοτών, αυτές οι μέθοδοι χρησιμοποιούνται σε μικρής κλίμακας βλάβες. Επομένως, είναι αναγκαία η εύρεση εναλλακτικών θεραπειών. Η τρισδιάστατη βιοεκτύπωση είναι μια νέα προσέγγιση της Ιστομηχανικής για τη δημιουργία κυτταρικών δομών και αναλόγων ιστών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την προώθηση της αναγέννησης του δέρματος μετά από τραυματισμό. Η τεχνική της τρισδιάστατης βιοεκτύπωσης χρησιμοποιεί βιομελάνια, για τη δημιουργία κυτταρικών τρισδιάστατων δομών, δηλαδή βιοϋλικά που έχουν τη δυνατότητα να φιλοξενήσουν στο εσωτερικό τους κύτταρα αλλά και την ικανότητα να εκτυπωθούν δίνοντας ακέραιες δομές. Οι υδρογέλες είναι από τις πιο διαδεδομένες πρώτες ύλες για τη δημιουργία βιομελανιών. Η κύρια πρόκληση σε αυτήν την προσέγγιση είναι η επιτυχής εκτύπωση αυτών των υδρογελών διατηρώντας παράλληλα τη βιωσιμότητα και τη λειτουργικότητα των κυττάρων, και διασφαλίζοντας τη δομική ακεραιότητα του τελικού προϊόντος. Στην παρούσα εργασία, διερευνάται η επίδραση των ιδιοτήτων της υδρογέλης και της διαδικασίας βιοτεκτύπωσης εξώθησης, στη βιωσιμότητα, τη συμπεριφορά και μορφολογία των κυττάρων ώστε να αναπτυχθεί ένα πρωτόκολλο για την παραγωγή τρισδιάστατων κυτταρικών δομών με πιθανή εφαρμογή στη μηχανική ιστών και στην αναγέννηση δέρματος. Αρχικά, παρασκευάστηκαν τρία μείγματα υδρογέλης με σταθερή συγκέντρωση ζελατίνης και αυξανόμενη συγκέντρωση αλγινικού άλατος, ώστε να δημιουργηθεί ένα μέσο ενθυλάκωσης κυττάρων και βιοεκτύπωσης με προσαρμόσιμες μηχανικές ιδιότητες. Ακολούθησε χαρακτηρισμός των υδρογελών ως προς τις ρεολογικές τους ιδιότητες, την ικανότητά τους να απορροφούν νερό και την επιφανειακή τους τραχύτητα με χρήση μικροσκοπίου ατομικών δυνάμεων AFM. Έπειτα, και εφόσον ορίστηκαν οι βέλτιστες παράμετροι εκτύπωσής τους (θερμοκρασία, πίεση, ταχύτητα) ώστε να προκύπτουν συνεχείς δομές με μεγάλη ακρίβεια εκτύπωσης, ακολούθησε μελέτη της κυτταροτοξικότητας των υδρογελών έπειτα από επαφή τους με κύτταρα της σειράς L929 και NIH-3T3, με χρήση της μεθόδου MTT, που έδειξε πολύ καλή κυτταροσυμβατότητα. Ακολούθησε η δημιουργία βιομελανιών με χρήση των μειγμάτων υδρογέλης με ενθυλακωμένα κύτταρα των σειρών L929 και ΝΙΗ-3Τ3 με τρείς διαφορετικές συγκεντρώσεις κυττάρων , ώστε να μελετηθεί η βιωσιμότητα , η συμπεριφορά και η μορφολογία τους στις τελικές τρισδιάστατες δομές μέσω χρώσης FDA/PI και παρατήρησής τους σε μικροσκόπιο φθορισμού και μέσω ενδεικτικής ιστολογικής μελέτης.
description: Skin diseases are the 4th leading cause of non-fatal disease burden worldwide. The cost of medical care for acute and chronic wound healing ranged from $ 28.1 billion to $ 96.8 billion in 2018. The treatments followed in cases of pathological conditions or skin injuries and that are widely used to date include the use of autografts, allografts and xenografts, ie by replacing the damaged skin with healthy area of the patient's skin, the donor skin or the skin from another species, respectively. However, due to the limited number of donors, these methods are used in small-scale lesions. Therefore, it is necessary to find alternative therapies. 3D bioprinting is a novel approach in Tissue Engineering, to create cell-laden structures and tissue equivalents that could be used to promote skin regeneration after injury. The technique of three-dimensional bio-printing uses bio-inks to create cell-laden 3D structures, ie biomaterials that can encapsulate cells but they can also ensure structural integrity post-printing. Hydrogels are considered the most common materials used to create bio-inks. The main challenge in this approach is the successful printing of these hydrogels while maintaining the viability and functionality of the cells and ensuring the structural integrity of the final product. The purpose of this study is to investigate the effect of the hydrogel properties and the extrusion-based bioprinting process on the viability, behavior, and morphology of the cells, in order to develop a protocol for the production of three-dimensional cell structures with possible application in tissue engineering and skin regeneration. Initially, three hydrogel mixtures were prepared with a constant gelatin concentration and an increasing alginate concentration to create a scaffold with tunable mechanical properties. This was followed by characterization of hydrogels in terms of their rheological properties, their ability to absorb water (swelling study) and their surface roughness using an AFM atomic force microscope. Then, once the optimal printing parameters (temperature, pressure, velocity) were defined, to produce continuous structures with high printing accuracy, ΜΤΤ cytotoxicity assay using L929 and NIH-3 cell lines showed very good cell compatibility. This was followed by the development of bio-inks using hydrogel mixtures with three different cell concentrations of encapsulated L929 or NIH-3T3 cells, to study their viability, behavior and morphology in the final three-dimensional structures using FDA / PI staining and by an indicative histological study.