title: Applications of Fungal Prenyltransferases in the Chemoenzymatic Synthesis
title: Anwendungen von pilzlichen Prenyltransferasen in der Chemoenzymatischen Synthese
Creators: name: Zhou, Kang
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Pharmakologie, Therapeutik
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Prenyltransferase

description: Pflanzen, Bakterien und Pilze
      produzieren vielseitige primäre und sekundäre
      Stoffwechselprodukte. Beispiele der Sekundärstoffe sind
      Flavonoide, Coumarine, Xanthone und Indolalkaloide. Das
      Anhängen von Isopreneinheiten (n x C5), wie Dimethylallyl
      (DMAPP), Geranyl (GPP) oder Farnesyl (FPP) an aromatischen
      Grundstrukturen des Sekundärmetabolismus ist ein weiterer
      Schritt in der Diversifizierung dieser Stoffe. Die
      prenylierten Naturstoffe zeigen häufig stärkere
      pharmakologische Aktivitäten als ihre nicht-prenylierten
      Vorgänger. In der Natur wird die Übertragung der
      Prenyleinheit von Prenyltransferasen realisiert. Aus diesem
      Grund können Prenyltransferasen genutzt werden, um
      aromatische Substanzen zu modifizieren und somit neue
      biologisch aktive Stoffe herzustellen. Prenylierte
      Acylphloroglucinole (APs), die sich durch bemerkenswerte
      chemische Strukturen und verblüffende biologische und
      pharmakologische Aktivitäten auszeichnen, sind
      charakteristische Sekundärstoffe verschiedener
      Pflanzenfamilien. Wichtige Strukturmerkmale von prenylierten
      APs sind hoch oxidiert und dicht verziert mit Prenylgruppen,
      wie Dimehylallyl- und Geranyleinheiten. Phlorisobutyrophenone
      (PIBP), Phlorisovaerophenone (PIVP) und Phlorbenzophenon
      (PBZP) sind die Vorstufen der meisten prenylierten APs. Im
      ersten Teil dieser Arbeit wurde die Akzeptanz der APs durch
      dreizehn pilzliche Prenyltransferasen in der Gegenwart von
      DMAPP untersucht. Neun regulär prenylierte Produkte wurden
      durch Einsatz von AnaPT erhalten. Die Ergebnisse weisen
      darauf hin, dass AnaPT dieselben Prenylierungen von PIBP und
      PIVP wie die membrangebundenen Prenyltransferasen, wie z.B.
      HIPT-1, katalysiert, welche in die Biosynthese von
      prenylierten APs in Pflanzen involviert sind. Die Umsatzrate
      mit AnaPT sind jedoch deutlich höher als mit HIPT-1.
      Allerdings wurden nur monoprenylierte Derivate in Gegenwart
      von DMAPP erhalten und die Umsatzraten von PIBP, PIVP und
      PBZP mit GPP als Prenyldonor waren sehr gering. Vor Kurzem
      wurde mit der pilzlichen Prenyltransferase AtaPT eine
      außergewöhnliche Promiskuität gegenüber diversen
      Arzneimittel-relevanten aromatischen Akzeptoren und
      Prenyldonoren, darunter DMAPP, GPP, und FPP, nachgewiesen.
      Daraufhin untersuchten wir das Verhalten von AtaPT gegenüber
      PIBP, PIVP und PBZP. Einundzwanzig prenylierte APs wurden
      isoliert und ihre Strukturen mittels NMR und MS aufgeklärt.
      Die Umsetzungen der drei APs wurden mit AtaPT und DMAPP
      bestimmt und waren deutlich höher als die mit AnaPT. Gleiche
      C-prenylierte Produkte wie AnaP-Reaktionen wurden
      identifiziert. O-prenylierte Produkte wurden aus den
      Reaktionen mit PIBP und PIVP erhalten. Auch Gem-diprenylierte
      Derivate konnten in den Reaktionsgemischen identifiziert
      werden. C-monoprenylierte Produkte wurden in Anwesenheit von
      DMAPP hauptsächlich zu gem-diprenylierte Derivate umgesetzt.
      GPP und FPP waren auch gute Prenyldonoren der
      AtaPT-Reaktionen. Nur ein einziges C-prenyliertes und ein
      O-prenyliertes Derivat konnten aus diesen Reaktionen
      identifiziert werden. Anschließend wurden Prenylierungen
      verschiedener Flavonoide, darunter Flavanone und Isoflavone
      durch AnaPT am C-6 des A-Rings und dem C-3´ des B-Rings
      untersucht. Zwölf prenylierte Flavonoide wurden in den
      Reaktionsgemischen von Flavonoiden und AnaPT in der Gegenwart
      von DMAPP produziert. Es ist bekannt, dass 7-DMATS Chalcone,
      Isoflavonoide und Flavanone deutlich besser als Flavone oder
      Flavonole akzeptiert und hauptsächlich die Prenylierung am
      C-6 katalysiert. AnaPT und 7-DMATS zeigen unterschiedliche
      Substratpräferenzen und Prenylierungspositionen. Im dritten
      Teil dieser Arbeit wurden die für die Interaktion von FtmPT1
      mit dem aromatischen Substrat Brevianamide F
      Schlüssel-Aminosäure Tyr205 identifiziert. Mittels
      Sättigungsmutagenese an dieser Position wurden Mutanten von
      allen übrigen 19 Aminosäuren hergestellt. FtmPT1_Y205N und
      FtmPT1_Y205L unterscheiden sich von FtmPT1 in ihrem Verhalten
      gegenüber den vier cyclo-Trp-Pro Isomeren. Regulär C2-
      prenylierte Derivate wurden als Hauptprodukte der FtmPT1 mit
      diesen Isomeren identifiziert. Dagegen waren revers
      C3-prenylierte Produkte die Hauptprodukte von Y205N und Y205L
      mit cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro und
      cyclo-L-Trp-D-Pro, während regulär C2- und C3-prenylierte
      Derivate mit cyclo-L-Trp-L-Pro nachgewiesen wurden. Diese
      Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Isomere in
      unterschiedlichen Positionen und Orientierungen im aktiven
      Zentrum vorliegen und Tyr205 für die Reaktion zwar wichtig
      ist, jedoch durch andere Aminosäuren ersetzt werden kann. Die
      Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass AtaPT und AnaPT
      vielversprechend Kandidaten für die Produktion von
      prenylierten APs, wie beispielweise -Bittersäuren im Rahmen
      der synthetischen Biologie sein können. AnaPT und 7-DMATS
      könnten komplementär für die Prenylierung der Flavonoide
      genutzt werden. Die Mutanten der FtmPT1 können für die
      Produktion von regulär C3-prenyliertem Brevianamid F in der
      synthetischen Biologie genutzt werden.
description: Plants, bacteria, and fungi provide
      diverse structures derived from their primary and the
      secondary metabolism. Representative substances from
      secondary metabolite pathways are flavonoids, coumarins,
      xanthones, and indole alkaloids. The attachment of isoprene
      units (n × C5) such as dimethylallyl (DMAPP), geranyl (GPP),
      or farnesyl (FPP) moieties to the backbones of aromatic
      secondary metabolites is a further step for the broad
      diversification. Prenylated natural products often exhibit
      stronger pharmacological activities than their non-prenylated
      precursors. The prenyltransferases (PTs) accomplish these
      prenyl transfer reactions in nature. Therefore, the
      investigation on the applications of prenyltransferases could
      be used for structural modification of aromatic substances to
      produce biologically active compounds. Prenylated
      acylphloroglucinols (APs), which have remarkable chemical
      structures and intriguing biological and pharmacological
      activities, are characteristic constituents of several plant
      families. Main structural features of prenylated APs are
      highly oxygenated and densely decorated with prenyl moieties,
      such as dimethylallyl and geranyl moieties.
      Phlorisobutyrophenone (PIBP), phlorisovalerophenone (PIVP),
      and phlorbenzophenone (PBZP) serve as precursors of most
      prenylated APs. In the first part of this thesis, the
      acceptance of APs catalyzed by thirteen fungal
      prenyltransferases in the presence of DMAPP was elucidated.
      Nine regular prenylated products were obtained from the
      reactions with AnaPT. The results indicated that AnaPT
      catalyzes the same prenylation of PIBP and PIVP as the
      membrane-bound prenyltransferases like HIPT-1 involved in the
      biosynthesis of the prenylated APs in plants, but with much
      higher conversion yields than HIPT-1. However, only
      monoprenylated derivatives were obtained in the presence of
      DMAPP and the conversion yields of PIBP, PIVP, and PBZP with
      GPP as prenyl donor were very low in AnaPT reactions.
      Recently, a fungal prenyltransferase AtaPT was demonstrated
      to carry an unprecedented promiscuity toward diverse
      drug-like aromatic acceptors and prenyl donors including
      DMAPP, GPP, and FPP. On the availability of AtaPT, we
      investigated the behavior of AtaPT toward PIBP, PIVP, and
      PBZP. Twenty-one prenylated APs were isolated and their
      structures were elucidated by NMR and MS analyses. Total
      conversion yields were calculated for the three APs with
      AtaPT and DMAPP, which are significantly higher than those of
      AnaPT. C-prenylated products are in consistent with the AnaPT
      products. O-prenylated products were also obtained from the
      reaction mixtures of PIBP and PIVP. Also Gem-diprenylated
      derivatives were identified in the reaction mixtures of these
      substrates respectively. C-monoprenylated products were
      converted into gem-diprenylated derivatives as predominant
      products in the presence of DMAPP. GPP and FPP also served as
      good prenyl donors for the reaction of AtaPT. Only one
      C-prenylated derivative and one Oprenylated derivative each
      were identified from these incubation mixtures. Subsequently,
      prenylation of different flavonoids including flavanones and
      isoflavones by AnaPT at C-6 of the A ring or C-3′ of the B
      ring was demonstrated. Twelve prenylated flavonoids from
      incubation mixtures of flavonoids with AnaPT in the presence
      of DMAPP were produced. Previous studies found that 7-DMATS
      accepted chalcones, isoflavonoids, and flavanones much better
      than flavones and flavonols and mainly catalyzed prenylation
      at C-6. AnaPT and 7-DMATS show different substrate
      preferences and prenylation positions. In the third part of
      this thesis, we identified a key amino acid residue Tyr205 in
      FtmPT1 for the interaction with its aromatic substrate
      brevianamide F. Saturation mutagenesis on this position
      resulted in all nineteen possible mutants. FtmPT1_Y205N and
      FtmPT1_Y205L differ from FtmPT1 in behaviors toward four
      cyclo-Trp-Pro isomers. Regularly C2- prenylated derivatives
      were detected as main products of FtmPT1 reactions with all
      these isomers. In contrast, the reversely C3-prenylated
      products were found to be the main products in Y205N and
      Y205L reactions with cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro,
      and cyclo-L-Trp- D-Pro, while regularly C2- and C3-prenylated
      derivatives were identified in their reaction mixtures with
      cyclo-L-Trp-L-Pro. These results indicated that the isomers
      are in different positions and orientations in the reaction
      chamber and Tyr205 is important for the prenyl transfer
      reaction, but can be replaced by other amino acids. The
      results obtained during this thesis demonstrate that AtaPT
      and AnaPT could be promising candidates for production of
      prenylated APs like -bitter acids by synthetic biology.
      AnaPT and 7-DMATS could be used complementarily for
      prenylation of flavonoids. The mutants of FtmPT1 can be used
      for production of regularly C3-prenylated brevianamide F in
      synthetic biology.