Προκλινική αξιολόγηση νέων ανθρώπινων μονωτών χρωματίνης ενσωματωμένων σε λεντιικούς φορείς για την ενίσχυση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας της γονιδιακής θεραπείας
Creators: name: Παπαγιάννη, Γεωργία Πηνελόπη Α.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Γονιδιακή θεραπεία
Μονωτής χρωματίνης
Θέση πρόσδεσης ctcf
Λεντι-ιικός φορέας
Gene therapy
Chromatin insulator
Ctcf binding site
Lenti-viral vector

description: Παρά τη σημαντική πρόοδο, η γονιδιακή θεραπεία (ΓΘ) αντιμετωπίζει περιορισμούς, συμπεριλαμβανομένης της εισχωρητικής μεταλλαξιγένεσης και της χαμηλής έκφρασης του διαγονιδίου μακροπρόθεσμα. Η χρήση μονωτών χρωματίνης (ΜΧ) τύπου διακόπτη ενισχυτή ή/και τύπου φραγμού έχει προταθεί ως μία προσέγγιση που δυνητικά θα ξεπερνούσε αυτούς τους περιορισμούς, αντίστοιχα. Ωστόσο, ο πρότυπος μέχρι σήμερα ΜΧ, cHS4, προερχόμενος από την όρνιθα, δεν εξασφαλίζει επαρκή μόνωση ενώ επηρεάζει αρνητικά τον τίτλο και τη σταθερότητα του ιικού φορέα. Διερευνήθηκε η δράση μιας σειράς νέων ΜΧ, οι οποίοι εμφανίζουν υψηλή συχνότητα πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα CTCF (CCCTC-Binding Factor). Αυτοί οι ΜΧ που προέρχονται από τον άνθρωπο και ανακαλύφθηκαν πρόσφατα, εμφανίζουν αποδεδειγμένη δράση τύπου διακόπτη ενισχυτή σε πλασμιδιακούς και ρετροϊικούς φορείς. Επιπλέον, οι εν λόγω ΜΧ ταξινομήθηκαν μετά από διαμόλυνση με πλασμιδιακούς φορείς και μακρόχρονη καλλιέργεια, της ερυθροειδικής κυτταρικής σειράς 6C2, με βάση τη δυνατότητά τους να προστατεύουν πλήρως, μερικώς ή καθόλου το διαγονίδιο (IL2R) από την αποσιώπηση. Η λειτουργία αυτή φάνηκε να σχετίζεται με παρουσία μοτίβων ενεργού ιστόνης. Η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο την in vitro και in vivo διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των νέων μονωτών χρωματίνης ανθρώπου ενσωματωμένων σε λεντι-ιικούς φορείς, ως προς τη δράση τύπου φραγμού και ως προς τη δράση τύπου διακόπτη ενισχυτή, με απώτερο στόχο την εύρεση του βέλτιστου, διπλής δράσης μονωτή χρωματίνης, για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας και της ασφάλειας της γονιδιακής θεραπείας. Οι δύο ΜΧ που εμφάνισαν πλήρη δράση τύπου φραγμού (Β4 και C1), ελέγχθηκαν, ως προς τη δυνατότητά τους να προστατεύουν την έκφραση του διαγονιδίου από την αποσιώπηση, μετά από ενσωμάτωσή τους σε αυτό-αδρανοποιούμενους (SIN) λεντι-ιικούς φορείς και διαμόλυνση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων ανθρώπου (CD34+). Λόγω του μικρού τους μεγέθους (≤243bp), οι ιικοί τίτλοι δεν επηρεάστηκαν αρνητικά ενώ επιβεβαιώθηκε in vitro και in vivo η δράση τους ως ΜΧ τύπου φραγμού, σε ανάλυση κλώνων που προήλθαν από CD34+ κύτταρα. Με χρήση διαθέσιμων πληροφοριών σε βάσεις δεδομένων για το γονιδίωμα του ανθρώπου, αποκλείστηκε η πιθανότητα, η υψηλή έκφραση του διαγονιδίου να οφείλεται σε πιθανή δράση των αλληλουχιών αυτών ως ενισχυτές, υποδεικνύοντας ότι η μακροχρόνια διατήρηση της έκφρασης του διαγονιδίου σχετίζεται με δράση φραγμού των ΜΧ. Η δράση των Β4 και C1 ως μονωτών ασκούνταν ανεξάρτητα από τον ορθόδρομο (forward) ή ανάδρομο (reverse) προσανατολισμό τους, με ισχυρότερη δράση φραγμού, ιδίως για τον μονωτή C1, στον ορθόδρομο προσανατολισμό. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε ένα ευαίσθητο μοντέλο ελέγχου της γενοτοξικότητας των ιικών φορέων που διαθέτουν χαρακτηριστικά υψηλής ασφάλειας (SIN-lenti), μέσω της κυτταρικής σειράς 32D και C3H/HeJ ποντικών για να επιβεβαιωθεί η μείωση της γενοτοξικότητας και κατ’επέκταση η πρόσθετη δράση των Β4 και C1 ως μονωτών τύπου διακόπτη ενισχυτή. Δείχθηκε ότι οι νέοι μονωτές χρωματίνης μειώνουν την πιθανότητα ανάπτυξης ογκογένεσης συγκριτικά με τους μη μονωμένους ιικούς φορείς, σε αυτοαδρανοποιούμενους λεντι-ιικούς φορείς αναφοράς. Συνολικά, οι νέες αλληλουχίες που εντοπίστηκαν στο γονιδίωμα του ανθρώπου με υψηλή συχνότητα πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα CTCF, φάνηκε ότι διαθέτουν τόσο δράση τύπου διακόπτη ενισχυτή όσο και δράση τύπου φραγμού. Η ενσωμάτωση αυτών των μορίων διπλής δράσης σε θεραπευτικούς ιικούς φορείς αναμένεται να αποδώσει μια νέα γενιά ασφαλέστερων και αποδοτικότερων in vivo λεντι-ιικών φορέων για όλες τις εφαρμογές ΓΘ με ενσωματούμενους ιικούς φορείς.
description: Despite the unequivocal success of gene therapy, limitations still exist including genotoxicity and variegation/silencing of transgene expression. A class of DNA regulatory elements known as chromatin insulators (CI) can mitigate both, vector transcriptional silencing (barrier CIs) and vector-induced genotoxicity (enhancer-blocking CIs) and have been proposed as genetic modulators to minimize unwanted vector-genome interactions. The prototypic, dual functioning vertebrate insulator cHS4, has been associated with several limitations including suboptimal titers due to its large size (1.2kb) and only partial insulation. Recently, a number of human, small-sized and compact CIs with high-affinity CTCF-binding (CCCTC-Binding Factor), bearing strong enhancer-blocking activity were identified. After initial screening of a series of these enhancer-blocking insulators for potential barrier activity in chicken erythroid 6C2 cells, using a human IL2R-reporter gene, three distinct categories with no, partial or full protection against transgene silencing have been identified. The full barrier activity insulators demonstrated higher active (H3K4me2, H3K9/14ac) and lower repressive (H3K9me2, H3K27me3) histone marks over the uninsulated clone confirming the hypothesis that these elements mediate the deposition of histone modifications as “terminator” marks to prevent heterochromatinization. In this PhD thesis, in order to ultimately uncover an ideal CI with a dual, enhancer-blocking and barrier activity, we interrogated these elements in vitro and in vivo, using lenti-viral vectors. The two CIs with full barrier activity (B4 and C1) were tested for their ability to protect against position effects in primary cells, after incorporation into lentiviral vectors and transduction of human CD34+ cells. B4 and C1 did not adversely affect vector titers due to their small size while they performed as strong barrier insulators in CD34+cells, both in vitro and in vivo, shielding transgene’s long-term expression, in either orientation but more robustly when placed in the forward orientation. In addition, using publicly available datasets from ENCODE we didn’t reveal any evidence for enhancer activity of these elements. Moreover, we developed a sensitive in vitro and in vivo genotoxicity assay with 32D cells and C3H/HeJ mice and then we proved that insulated self-inactivated reporter vectors are safer than their uninsulated control. Overall, the incorporation of these dual-functioning CTCF-elements into therapeutic viral vectors will potentially provide a new generation of safer and more efficient lentiviral vectors for all hematopoietic stem cell gene therapy applications.