title: On the role of superoxide dismutase and protein phosphatase type-2C beta in neuronal cell death
Creators: name: Grzeschik, Susanna Manuela
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2003
Subjects: Proteinphosphatase Typ-2C beta
Apoptosis
Nekrose
cold injury-induced brain trauma (CIBT)
Superoxiddismutase
protein phosphatase type-2C beta
3-Nitropropionsäure
3-nitropropionic acid
Kälte-induziertes Hirntrauma
superoxide dismutase
neuronal cell death
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
Zelltod
Neuronaler Zelltod
Hirnverletzung
Hirnforschung
Schlaganfall

description: The purpose of this study was to elucidate the role of enzymes, the endogenous free radical scavengers superoxide dismutase 1 and 2 (SOD1/2) as well as protein phosphatase type 2C (PP2C), in different models of neuronal cell death. This should improve the understanding of cellular mechanisms after neuronal damage like stroke, trauma, or neurodegenerative diseases like Huntington s disease in order to reveal new therapeutic targets. Two different in vivo-models of neuronal damage, cold injury-induced brain trauma (CIBT) and intrastriatal injection of the toxin 3-nitropropionic (3-NP) acid in mice, were employed to study the influence of quantitative modulation of SODs on brain damage. The possible role of PP2C, an enzyme participating in the reversible phosphorylation of proteins, in the induction of apoptosis was elucidated in cultured rat neurons. In the first part of this study it was demonstrated that the cytosolic Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) influences the development of the lesion after intrastriatal injection of 3-NP. Overexpression of SOD1 in transgenic mice was neuroprotective in this predominantly necrotic model of 3-NP injection, reducing lesion size and edema development, while diminished expression of this enzyme in knock-out mutants only significantly enhanced edema formation. The results of this study support the notion that also in this model of intrastriatal injection free oxygen radical production is a crucial factor of 3-NP intoxication as had been previously demonstrated in milder, systemic models of 3-NP intoxication. Understanding neuronal cell death due to lack of energy by 3-NP intoxication allows insight into neurodegenerative diseases like Huntingtons disease and guides the search for therapeutic targets to treat these diseases. As a next step, the role of mitochondrial Mn-superoxide dismutase (SOD2) in mice was examined using a model of cold injury-induced brain trauma (CIBT). The results of these experiments elucidate, on the one hand, the role of mitochondrial free oxygen radical production and, on the other hand, the development of the lesion after cold injury brain trauma (CIBT) at later time points, especially BBB breakdown and inflammatory response. Reduced expression of SOD2 in knock-out mutants did not influence the development of damage after CIBT. However, increased free oxygen radical production inside the lesion of CIBT was detected by hydroethidine assay. This result supports findings of previous publications postulating reactive oxygen species (ROS) production to play a crucial role in the damage after CIBT. Since SOD2 is localized in the mitochondria, this result allows to draw the conclusion that either the production of free radicals did not co-localize with SOD2 in the mitochondria, in which case SOD2 could not have an influence on the ROS level, or the amounts of ROS were already too devastating in wild type animals to allow an exacerbation of the lesion after reduction of SOD2. By observing the development of vasogenic edema and finding hemorrhagic transformations and inflammation at later time points, this study proved CIBT to be a reproducible model of a biphasic breakdown of the BBB. Stroke as well as trauma research might benefit from this model, since biphasic BBB breakdown and inflammation are factors contributing to the deterioration of these brain damages. Augmented knowledge gained from this study can contribute to the development of new therapies for improved prognosis of patients. The involvement of PP2C s role in neuronal apoptosis was the third focus of research of this thesis. Protein kinases and phosphatases, including PP2C, regulate numerous cellular mechanisms by reversible phosphorylation of proteins. The results of this study support the hypothesis of PP2C being involved in programmed neuronal cell death (apoptosis). Activators of PP2C, such as oleic acid or ginkgolic acids, were shown to induce apoptosis in a time- and concentration-dependent manner in cultured rat neurons while using the enantiomer trans-oleic acid (elaidic acid), known not to activate PP2C in vitro, instead of cis-oleic acid, did not induce apoptosis. A possible apoptotic mechanism, the induction of programmed cell death by dephosphorylation of the proapoptotic protein Bad by activated PP2C, was analyzed by Western blotting experiments. Bad phosphorylated at Ser155 and total Bad (phosphorylated + unphosphorylated) were detected in cultivated rat neurons which had been treated with oleic acid or ginkgolic acids. By the Western blotting method, changes in the amount of unphosphorylated Bad were not detectable since no antibody against unphosphorylated Bad was available. Without knowledge of the ratio of phosphorylated Bad to total Bad in non-treated cultured neurons, the proportion of phospho-Bad/total Bad in oleic acid-treated cells did not allow to draw conclusions about quantitative changes of unphosphorylated Bad.
description: Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von Enzymen, den endogenen Sauerstoffradikalfängern Superoxiddismutase 1 und 2 (SOD1/2) sowie der Proteinphosphatase Typ 2C (PP2C), bei verschieden Modellen von neuronalem Zelltod zu beleuchten, um das Verständnis der zellulären Vorgänge nach neuronaler Schädigung, wie Schlaganfall, Trauma oder neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Huntington, zu verbessern. Zwei verschiedene in vivo-Modelle, das Kälte-induzierte Hirntrauma (Cold injury-induced brain trauma, CIBT) und die intrastriatale Injektion des Toxins 3-Nitropropionsäure (3-NP), fanden Anwendung in Mäusen, um den Einfluss der Menge an SOD auf das Ausmaß von Hirnschädigung zu untersuchen. Die mögliche Rolle der PP2C bei der Induktion der Apoptose, eines Enzyms, welches an der reversiblen Phosphorylierung von Proteinen beteiligt ist, wurde an kultivierten Rattenneuronen beleuchtet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde demonstriert, dass das zytosolische Enzym Cu/Zn- Superoxiddismutase (SOD1) den Verlauf der Schädigung nach intrastriataler Injektion von 3-NP beeinflusst. Vermehrte Expression von SOD1 in transgenen Mäusen wirkte in diesem überwiegend nekrotischen Schädigungsmodell neuroprotektiv, verkleinerte die Läsion und verminderte Ödembildung, während eine Verminderung dieses Enzyms in knock-out - Mutanten allein die Ödembildung signifikant verstärkte. Die Ergebnisse dieser Studie untermauern die Hypothese, dass auch im Modell der intrastriatalen Injektion die Bildung von freien Sauerstoffradikalen ein wichtiger Faktor der Intoxikation durch 3-NP ist. Dieses Model erlaubt durch Erkenntnisse über den Zelluntergang durch Energiemangel Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen wie Chorea Huntington und erleichtert so die Suche nach therapeutischen Zielen zur Behandlung dieser Erkrankungen. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Rolle der mitochondrialen Mn-Superoxiddismutase (SOD2) anhand eines Modells von Hirntrauma durch Kälteschädigung (CIBT) untersucht. Die verminderte Expression von SOD2 in knock-out Mutanten beeinflusste den Schädigungsverlauf nach CIBT nicht. Dagegen wurde ein Anstieg der Produktion von freien Sauerstoffradikalen in der Läsion detektiert, welches Funde aus früheren Publikationen unterstützt, die postulieren, dass die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies eine wichtige Rolle in der Schädigung nach CIBT spielt. Da SOD2 in den Mitochondrien lokalisiert ist, erlaubt dieses Ergebnis den Rückschluss, dass entweder die Produktion von freien Radikalen nicht mit der SOD2 in den Mitochondrien kolokalisiert war, wobei SOD2 keinen Einfluss auf den Spiegel freier Sauerstoffradikale haben konnte, oder dass die Menge an freigesetzten Sauerstoffradikalen in Wildtyptieren schon zu schädigend war, um eine Verschlimmerung der Läsion nach Verringerung von SOD2 zuzulassen. Außerdem zeigte diese Studie durch Verfolgen der Ödementwicklung und den Befund von haemorrhagischen Veränderungen und Entzündungsreaktionen, dass CIBT ein reproduzierbares Modell für einen biphasischen Bluthirnschranken-Zusammenbruch ist. Biphasischer Zusammenbruch der Bluthirnschranke und Entzündungsreaktionen sind Faktoren, welche bei Schlaganfall oder Hirntrauma eine Rolle spielen. Das an diesen Modellen erarbeitete Wissen kann dazu beitragen, neue Therapien zu entwickeln, um die Prognose der Patienten zu verbessern. Die Untersuchung der Rolle der PP2C in der neuronalen Apoptose war der dritte Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit. Proteinkinasen und Phosphatasen, darunter PP2C, üben durch reversible Proteinphosphorylierung eine entscheidende regulierende Funktion in vielen zellulären Mechanismen aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Hypothese, daß PP2C am programmierten neuronalen Zelltod (Apoptose) beteiligt sein könnte. Es wurde gezeigt, dass Aktivatoren der PP2C, wie Ölsäure oder Ginkgolsäuren, in kultivierten Rattenneuronen zeit- und konzentrationsabhängig Apoptose hervorrufen. Dagegen zeigte sich bei Verwendung des Enantiomers trans-Ölsäure (Elaidinsäure), welche PP2C in-vitro nicht aktiviert, keine Induktion von Apoptose. Ein möglicher apoptotischer Mechanismus, die Induktion durch Dephosphorylierung des proapoptotischen Proteins Bad mittels aktivierter PP2C, wurde durch Bestimmung der Menge an Ser155-phosphoryliertem Bad sowie von Gesamt-Bad (phosphoryliert + unphosphoryliert) in kultivierten Rattenneuronen beleuchtet, welche mit Ölsäure oder Ginkgolsäuren behandelt wurden. Veränderungen von unphosphoryliertem Bad konnten durch die hier eingesetzte Westernblot-Methode nicht bestimmt werden, denn für den Nachweis von unphosphoryliertem Bad standen keine Antikörper zu Verfügung. Die gemessenen Phospho-Bad/Gesamt-Bad-Veränderungen in behandelten Zellen liessen ohne die Kenntnis über das Verhältnis von Gesamt-Bad zu phosphoryliertem Bad in unbehandelten Zellen ebenfalls keinen indirekten Rückschluss auf unphosphoryliertes Bad zu.