Απομόνωση και ταυτοποίηση συνδετικών ως προς την αιμίνη πρωτεϊνών σε Κ562 λευχαιμικά κύτταρα
Creators: name: Τσολάκη, Βασιλική-Δήμητρα Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Αιμίνη
Πρωτεΐνες-Άνθρωπος
Hemin
Proteins-Human

description: Η παρούσα διπλωματική, μεταπτυχιακή εργασία είχε ως στόχο να εντοπίσει συνδετικές με την οξειδωμένη μορφή της αίμης, δηλαδή την αιμίνη, ενδοκυττάριες πρωτεΐνες σε λευχαιμικά, ανθρώπινα κύτταρα Κ562. Τόσο η τοξικότητα της ελεύθερης αίμης – αιμίνης όσο και το ακόμη αρκετά ασαφές ενδοκυττάριο trafficking, δηλαδή σύστημα μεταφοράς αυτής της χρωστικής της ζωής σε ανθρώπινο μοντέλο κυττάρων, μιας και σε πιο απλές μορφές ζωής, όπως βακτήρια, ζύμες, σκώληκες, η γνώση σχετικά με αυτές τις συνοδούς πρωτεΐνες είναι πιο προηγμένη, κατέστησε το ερώτημα αυτής της εργασίας ως ιδιαίτερα ενδιαφέρον και καίριο. Πειραματικά, αρχικά επιβεβαιώθηκε ο ήδη γνωστός διαφοροποιητικός ρόλος της αιμίνης επί των Κ562. Εν συνεχεία, επιτεύχθηκε να απομονωθούν σε κύτταρα μάρτυρες (untreated K562), αλλά και σε επωασμένα με αιμίνη (hemin-treated K562), αρχικά, κυτταροπλασματικές κι, εν συνεχεία, πυρηνικές και μιτοχονδριακές πρωτεΐνες. Mε χρήση στήλης αγχιστείας αιμίνης- αγαρόζης, έγινε εφικτό να δεσμευτούν και να απομονωθούν μόνο οι προσδετικές ειδικά στην αίμη πρωτεΐνες τόσο μέσω σταδιακής έκλουσης με ήπια μέσα (αλατούχα διαλύματα διαφορετικής ιονικής ισχύος και τιμών pH ) όσο και με χαοτροπικό παράγοντα επιλογής, την ουρία, που αποκόπτει από τη στήλη όλες τις συνδεδεμένες στη στήλη πρωτεΐνες , ανεξαιρέτως. Έγινε αλληλούχιση αυτών των πρωτεϊνών μέσω MS και βιοπληροφορική επεξεργασία αυτών των αποτελεσμάτων. Μέσω της παρούσας εργασίας, υποστηρίζεται η παρουσία τόσο προαναφερθέντων στη βιβλιογραφία όσο και νέων, συγκεκριμένων προσδετικών της αιμίνης πρωτεϊνών, όπως μέλη της πρωτεινικής οικογένειας των hsp90 (heat shock protein-90), ο ευκαρυωτικός παράγοντας μεταφραστικής επιμήκυνσης-1 (eElF 1-eucaryotic elongation factor 1) κι η α-ακτινίνη-4. Γεγονός, που δίνει μια νέα προοπτική όσον αφορά την αποσαφήνιση του ενδοκυττάριου μηχανισμού μεταφοράς και κατανομής της αίμης στα
description: The central objective of the present master thesis was the detection, isolation and characterization of cytoplasmic, mitochondrial and nuclear proteins derived from hemin treated as well as untreated K562 leukemia cells. More specifically, an attempt was made to identify proteins contributing to the intracellular trafficking of heme into different cellular compartments (cytoplasm, mitochondria and nucleus). Proteins extracted from untreated and hemin treated cells were selected and separated by column hemin-agarose affinity chromatography, which binds a fraction of these that share affinity to heme. Stepwise elution under slightly acidic or alkaline conditions permitted the apocope from the column and identification of these proteins using SDS electrophoresis and MS analysis. The use of urea as a chaotropic agent caused the dispatch of all the proteins attached to hemin-agarose column. Afterwards, protein sequencing complemented our basic hypothesis revealing specific proteins that share common structural homology with others detected in bacteria and other forms of life. Members of the Heat Shock Protein-90 family, eukaryotic Elongation Factor-1 and alpha Actinin-4 are recommended as hemin binding proteins. These valuable results will facilitate our understanding of the intracellular trafficking and distribution of heme in human cells.