Ανάπτυξη συστήματος επαγωγής της έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld βασισμένο σε τροποποίηση της τεχνολογίας γενετικής τροποποίησης CRISPR/Cas
Creators: name: Μυρωνίδου, Ειρήνη Έντμοντ
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: ογκοκατασταλτικό γονίδιο Cyld
υπερέκφραση ενδογενούς γονιδίου
CRISPR
Cyld tumor suppressor gene
endogenous gene overexpression

description: Η CYLD είναι μια ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη με δράση αποουβικιτινάσης που επηρεάζει πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταρικές λειτουργίες με σημαντικές συνέπειες για την ομοιόσταση των κυττάρων και των ιστών. Είναι αρνητικός ρυθμιστής μονοπατιών που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό, συμπεριλαμβανομένων των NF-κB και JNK. Mεταλλάξεις στο γονίδιο Cyld έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη της οικογενούς κυλινδρωμάτωσης, του πολλαπλού οικογενούς τριχοεπιθηλιώματος και του συνδρόμου Brooke-Spiegler και έχει αναγνωριστεί ότι σε αυτές τις ασθένειες εμπλέκεται αποκλειστικά το γονίδιο Cyld. Αδρανοποιητικές μεταλλάξεις στο γονίδιο αυτό έχουν παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου. Η απορρύθμιση της έκφρασης και συγκεκριμένα η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου Cyld έχει βρεθεί ότι μπορεί επίσης να συμβάλλει στην ογκογένεση. Tο σύστημα CRISPR-Cas9 και οι παραλλαγές του έχουν γίνει η πιο ευρύτατα χρησιμοποιούμενη τεχνολογία γενετικής επεξεργασίας σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας σε όλο τον κόσμο λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων τους που περιλαμβάνουν τον απλό και γρήγορο σχεδιασμό, το μικρό κόστος, την σχετικά υψηλή αποδοτικότητα και ειδικότητα, την επαναληψιμότητα και την ευελιξία που δίνει τη δυνατότητα χρήσης τους σε ένα ευρύ φάσμα οργανισμών και σε ποικίλες εφαρμογές. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να αναπτυχθεί ένα σύστημα, που βασίζεται σε παραλλαγή του συστήματος CRISPR/Cas9, για την επαγωγή της υπερέκφρασης του ενδογενούς γονιδίου Cyld και να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητά του να αυξάνει την έκφραση της πρωτεΐνης CYLD. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο συστήματα CRISPRa (dCas9-VP64 και SAM) σε σειρές ανθρώπινων αθανατοποιημένων εμβρυονικών κυττάρων νεφρού HEK293NT. Υπερέκφραση του ενδογενούς γονιδίου Cyld επιτεύχθηκε και με τα δύο συστήματα. Στο μέλλον θα γίνουν προσπάθειες βελτίωσης των συστημάτων αυτών για ακόμη μεγαλύτερη αύξηση της έκφρασης της CYLD. Τα συγκεκριμένα συστήματα θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου στις οποίες η CYLD υποεκφράζεται (όπως μαστού, ήπατος, παχέoς εντέρου, χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας, μελανώματος), ώστε να μελετηθεί η δράση του γονιδίου Cyld και να διερευνηθεί αν τα συστήματα αυτά έχουν θεραπευτικές προεκτάσεις.
description: Αγγλική Περίληψη CYLD is a tumor suppressor protein with deubiquitinase activity that affects many signaling pathways and cellular functions with significant consequences for cell and tissue homeostasis. It is a negative regulator of several pathways related to cell survival and proliferation, including NF-κB and JNK. Mutations in the Cyld gene have been associated with development of familial cylindromatosis, multiple familial trichoepithelioma, and Brooke-Spiegler syndrome, and the Cyld gene has been identified to be exclusively involved in these diseases. Inactivating mutations in this gene have been observed in various types of cancer. Dysregulation of expression and specifically suppression of Cyld gene expression has been found to also contribute to tumorigenesis. The CRISPR-Cas9 system and its variants have become the most widely used genome editing technology in molecular biology laboratories worldwide due to the advantages of simple and fast design, low cost, relatively high efficiency and specificity, repeatability and flexibility that enables their use in a wide range of organisms and in a variety of applications. The aim of this study was to develop a system, based on a variant of the CRISPR/Cas9 system, to induce the overexpression of the endogenous Cyld gene and to evaluate its efficiency in increasing the expression of the CYLD protein. For this purpose, two CRISPRa systems (dCas9-VP64 and SAM) were used in human immortalized embryonic kidney (HEK293NT) cell lines. Overexpression of the endogenous Cyld gene was achieved with both systems. In the future, efforts will be made to improve these systems to further increase the expression of CYLD. These systems could be used in cancer cell lines in which CYLD is underexpressed (such as breast, liver, colon, chronic lymphocytic leukemia, melanoma), in order to study the action of the Cyld gene and to investigate whether these systems can be used for therapeutic purposes.