title: Optimierung und Vergleich bioinformatischer Methoden zur kalkulierten Karyotypisierung der Akuten Myeloischen Leukämie mittels Next Generation Sequencing
Creators: name: Koch, Vera
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Bioinformatik
Next Generation Sequencing
Copy number variations
bioinformatics
CNV
Sequenzierungstiefe
read depth
Akute Myeloischen Leukämie
oncology
AML
acute myeloid leukemia
Onkologie
kalkulierte Karyotypisierung
calculated karyotyping
Medical sciences Medicine
Medizin

description: Die akute myeloische Leukämie ist eine genetisch heterogene Erkrankung, die aufgrund von rasantem Verlauf und einer massiven Beeinträchtigung der Betroffenen durch das Verdrängen des Knochenmarks durch die malignen Zellen einer schnellen Diagnosestellung und Therapie bedarf. In aktuellen Klassifikations- und Risikostratifizierungssystemen, die zur Abschätzung der Prognose und damit zur Auswahl einer risikoadaptierten Therapie genutzt werden, stellen molekular- und zytogenetische Charakteristika der Erkrankung die wichtigsten Kriterien dar. Mit next-generation-sequencing-Verfahren ist es möglich, alle relevanten Informationen aus Sequenzierdaten abzuleiten, sofern die Daten mit entsprechend geeigneten bioinformatischen Algorithmen analysiert werden.
Im Laufe dieser Arbeit wurde coriandR Software – ChrOmosomal abeRration Identifier AND Reporter in R – ein Tool zur Schätzung des kalkulierten Karyotyps und der copy number variations in den ultra lowcoverage whole-genome sequencing Daten – entwickelt, die in verschiedenen Bereichen der genetisch-onkologischen Diagnostik eingesetzt werden kann bei gleichzeitig geringen Kosten und einer hohen Übereinstimmung mit der Goldstandardmethode der Karyotypisierung – der konventionellen Zytogenetik.
Für die Schätzung des kalkulierten Karyotyps und der copy number variations einer Blut- bzw. Tumorprobe wird ein Panel of normals aus den Sequenzierdaten generiert, die aus derselben Gewebeart unter selben Bedingungen aufgearbeitet wurden wie die Blut- bzw. Tumorproben und einen normalen Karyotyp aufweisen (z.B. Blutproben gesunder Probanden oder histologisch tumorfreie Gewebe). Diese Sequenzierungsdaten werden nach dem Alignment durch Bowtie2 mit featureCounts in tabellarische Form überführt und durch die mediane Sequenzierungstiefe pro Bin normalisiert. Im nächsten Schritt erfolgt die Standardisierung mit Bildung der Pseudo-Z-Werte für die Verteilung der Reads in den Bins. Später werden sie mit einer Normalverteilung der Reads in den Bins verglichen. Nach dem Ausschluss von den Bins mit einem abnormen GC-Gehalt und/oder einer großen Varianz kann das Panel of normals für weitere Berechnungen genutzt werden.
Die Schätzung des kalkulierten Karyotyps für die Tumorproben basiert auf einem zweiseitigen Normalverteilungstest. Die berechneten p-Werte werden anschließend nach Benjamini-Hochberg-Methode unter Einhaltung der false discovery rate von 5 % adjustiert. Nach dem Erhalt der adjustierten p-Werte werden die abweichenden Bins berechnet. In dem coriandR Bericht werden der Übersichtsplot für die Verteilung der Reads in der Tumorprobe, der kalkulierte Karyotyp, die Liste der copy number variations und die Chromosomenplots abgebildet.
Durch die Erstellung eines probenspezifischen Panel of normals kann die Methode von coriandR bei den Sequenzierdaten mit einer unterschiedlichen präanalytischen Aufarbeitung oder mit unterschiedlichen Typen von Ausgangsmaterial (Blut-/Knochenmarkproben oder Proben aus dem Formalin-fixierten Paraffineingebetteten Gewebe) zur Schätzung eines kalkulierten Karyotyps eingesetzt werden.
coriandR zeichnet sich durch geringe Laufzeit und die Unabhängigkeit von den Datenformaten anderer Programme aus, so dass die Analyse bereits mit den rohen Sequenzierungsdaten und Eingabe des Geschlechts des Patienten oder der Patientin begonnen werden kann. Die Darstellung der Chromosomenplots mit Giemsa-Banden erlaubt eine einfache Beurteilung durch einen Experten.
Die Ergebnisse bei der Schätzung des kalkulierten Karyotyps durch coriandR wurden durch einen Vergleich mit dem Programm Genome Analysis Toolkit validiert und zeigten eine hohe Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieses populären Programms.
Die kalkulierte Karyotypisierung hat in den Zeiten der sinkenden Kosten für die Genomsequenzierung das Potential, in Kombination mit anderen gezielten Untersuchungen, zum Beispiel Fusionspanels, die konventionelle Zytogenetik bei der Diagnostik der akuten myeloischen Leukämie abzulösen. Darüber hinaus ist es mit dem Ansatz auch möglich, solide Tumoren auf der Ebene von Chromosomensätzen genetisch zu charakterisieren, was wichtige Erkenntnisse für das Verständnis der klinischen Ausprägungen liefern kann.