Ανάπτυξη ηλεκτροχημικών DNA βιοαισθητήρων συνθετικών πολυνουκλεοτοδίων που περιέχουν ανάλογα βάσεων ή μεθυλιωμένη κυτοσίνη, αλληλεπιδράσεις με προφλαβίνη
Creators: name: Αλεξιάδου, Δέσποινα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Ηλεκτροχημικοί DNA βιοαισθητήρες
Προϊόντα PCR
Ανάλογα βάσεων
5-μεθυλο-κυτοσίνη
Προκλαβίνη
Electrochemical DNA biosensors
Amplicons
Analogue bases
5-methyl-cytosine
Proflavine

description: Ο σκοπός της διατριβής αυτής είναι η ανάπτυξη ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων για τη μελέτη της μεθυλίωσης στο DNA. Ως μοντέλα μεθυλίωσης χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά DNAs, προϊόντα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR products-amplicons), τα οποία περιείχαν είτε φυσικές βάσεις, είτε ανάλογα βάσεων, είτε το φυσικό ανάλογο 5-μεθυλο-κυτοσίνη. Τα συνθετικά αυτά DNAs ακινητοποιήθηκαν στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου, ώστε να μελετηθούν οι φυσικοχημικές ιδιότητές τους, καθώς και οι διαφοροποιήσεις στην αλληλεπίδρασή τους με την προφλαβίνη, η οποία είναι μία ένωση που παρεμβάλλεται στο DNA. Αρχικά επιτεύχθηκε η σύνθεση προϊόντων PCR αντικαθιστώντας τους τριφωσφορικούς εστέρες των φυσικών δεοξυνουκλεοζιτών με τριφωσφορικούς εστέρες της 5-μεθυλο-2΄-δεοξυ-κυτιδίνης (5m-dCTP), της 2΄-δεοξυ-ινοσίνης (dITP) και της 7-δεαζα-2΄-δεοξυ-γουανοσίνης κατά τη διάρκεια της PCR. Τα ανάλογα βάσεων ενσωματώθηκαν καλύτερα στα προϊόντα PCR, όταν 60% των φυσικών βάσεων αντικαταστάθηκε από τα ανάλογα βάσεων. Στη συνέχεια αναπτύχθηκαν ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες ακινητοποιώντας στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου προϊόντα PCR. Η εφαρμογή βολταμμετρίας διαφορικού παλμού αποδείχθηκε χρήσιμη για τη διάκριση ανάμεσα σε πρότυπα DNA συστήματα, την ύπαρξη ινοσίνης ή μεθυλο-κυτοσίνης. Η αλληλεπίδραση της προφλαβίνης με προϊόντα PCR διαφορετικής σύνθεσης (περιεκτικότητας σε GC, εξόνιο 5 και 6 του γονιδίου p53) και με προϊόντα PCR που περιείχαν ανάλογα βάσεων (5-μεθυλο-κυτοσίνη και ινοσίνη) μελετήθηκε χρησιμοποιώντας τους ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες που αναπτύχθηκαν. Διαπιστώθηκε ότι η παρεμβολή της προφλαβίνης σχετίζεται με την περιεκτικότητα σε γουανοσίνη και με τη θερμική σταθερότητα των συνθετικών DNA συστημάτων, καθώς ήταν μεγαλύτερη στα προϊόντα με χαμηλή περιεκτικότητα σε γουανοσίνη και με χαμηλή θερμική σταθερότητα. Συνοψίζοντας όλα τα παραπάνω αποτελέσματα, η ηλεκτροχημική ανάλυση μπορεί να αποδειχτεί χρήσιμη για την ανίχνευση επιγενετικών τροποποιήσεων στο DNA
description: This thesis is focused on the development of electrochemical biosensors for studying methylation of DNA. Synthetic DNAs, PCR products (amplicons) containing natural bases or analogue bases or 5-methyl-cytosine were used as methylation models. These PCR products were immobilized on the electrode surface in order to study their physicochemical properties and their differences in the interaction with proflavine, which is an intercalator. PCR products (amplicons) containing at some percentage 5-methyl-cytosine, inosine and 7-deaza-guanosine were synthesized by substituting the native bases during PCR amplification. Analogue bases were most efficiently incorporated in amplicons when 60% of the natural bases were substituted by analogue bases. Electrochemical amplicon biosensors were developed by immobilizing on the electrode’s surface amplicons containing analogue bases and 5-methyl-cytosine. Differential pulse voltammetry was found to be useful in differentiating between model DNA systems containing inosine and methyl-cytosine. The interaction of proflavine with amplicons of different composition (GC content, exon 5 and exon 6 of gene p53) containing different base analogues (5-methyl-cytosine and inosine) was studied using amplicon biosensors. Proflavine intercalation correlated with the guanosine content and thermal stability of the synthetic DNA systems, being greater for amplicons of lower guanosine content and lower thermal stability. Considering the speed, simplicity of instrumentation, and low cost of this procedure, the above results show electrochemical analysis is promising for the identification of epigenetic modification of DNA