title: Παρουσία και τύχη βακτηρίων ανθεκτικών στα αντιβιοτικά στις μονάδες επεξεργασίας
υγρών αποβλήτων
Creators: name: Πηττας Θεοδωρος
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2018

description: Οι φαρμακευτικές ουσίες και τα αντιβιοτικά είναι ενώσεις που χρησιμοποιούνται εκτεταμένα στην ιατρική και στις ανθρώπινες δραστηριότητες (κτηνοτροφία, γεωργία) και παρατηρείται αύξηση των συγκεντρώσεών τους σε νερά και εδάφη. Συνέπεια αυτού είναι η εμφάνιση και ο επιπολασμός ανθεκτικών παθογόνων βακτηρίων που προκαλεί ιδιαίτερες ανησυχίες στην παγκόσμια υγεία και έχει χαρακτηριστεί ως ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα  που καλείται να αντιμετωπίσει η ανθρωπότητα. Η αύξηση στον αριθμό των ανθεκτικών βακτηρίων (ARB, Antibiotic Resistant Bacteria) έχει συνδεθεί με τη μετάδοση γονιδίων ανθεκτικότητας (ARGs, Antibiotic Resistance Genes) μεταξύ διαφορετικών στελεχών και ειδών και ο συχνός εντοπισμός τους σε διάφορες περιβαλλοντικές μήτρες είχε συνέπεια το χαρακτηρισμό τους ως αναδυόμενους ρυπογόνους παράγοντες. Ιδιαίτερη ανησυχία δε προκαλεί η ανθεκτικότητα των ARB και ARGs στις διάφορες τεχνικές επεξεργασίας που εφαρμόζονται στις μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων, καθώς η παρουσία τους είναι αισθητή και στις εκροές. Η αδυναμία, λοιπόν, της σωστής επεξεργασίας των υδάτων και των υγρών αποβλήτων που περιέχουν τέτοια παθογόνα αλλά και άλλες τοξικές ουσίες και η έλλειψη πολλές φορές βασικών υπηρεσιών υγιεινής, μπορεί να ευνοήσει τη διάδοση των ARB και ARGs στο περιβάλλον. 
Με βάση την υπόθεση ότι οι μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων προσφέρουν ιδανικές συνθήκες για την ανάπτυξη και διάδοση των ARB και ARGs με ποικίλες μορφές, η παρούσα μελέτη αφορά: 1)  στην εξέταση της παρουσίας των ARB και ARGs στην είσοδο, στην έξοδο και κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των υγρών αποβλήτων στην Εγκατάσταση Επεξεργασίας Υγρών Αποβλήτων (Ε.Ε.Υ.Α) της πόλης των Χανίων, 2) στον εντοπισμό και στην ποσοτικοποίηση των ARGs στα διάφορα στάδια επεξεργασίας και 3) στη συνολική εκτίμηση της αντιμετώπισης των ARB και ARGs σε μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων. 
Προχωρήσαμε, λοιπόν, στην απομόνωση εκπροσώπων των Gram αρνητικών και θετικών βακτηρίων και συγκεκριμένα των Escherichia coli, Enterococci και Staphylococci, από τα υγρά απόβλητα της Ε.Ε.Υ.Α. Χανίων (πληθυσμιακό ισοδύναμο 117500). Η συλλογή των δειγμάτων έγινε την περίοδο Σεπτέμβριος – Δεκέμβριος 2017 και εφαρμόστηκε η μέθοδος της διήθησης με μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (μέγεθος πόρων 0,45 μm, διάμετρος 47 mm, Pall – Gelman Laboratory) και η καλλιέργεια των βακτηρίων σε εκλεκτικά μέσα. Η μελέτη της  ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά έγινε με τη μέθοδο της μικροαραίωσης και τον προσδιορισμό της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) για την Αμπικιλλίνη, Σιπροφλοξασίνη, Τετρακυκλίνη και Σουλφομεθοξαζόλη/Τριμεθοπρίμη. Η MIC60 ορίζεται ως η χαμηλότερη συγκέντρωση ενός αντιμικροβιακού παράγοντα που μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του 60% του αρχικού πληθυσμού ενός μικροοργανισμού μετά την έκθεση αυτού για 18 – 24 h. Οι τιμές της MIC εκτιμήθηκαν με τον εγκιβωτισμό αποστειρωμένων πλακών τιτλοδότησης με 96 βυθίσματα με διαδοχικές αραιώσεις των αντιβιοτικών με βάση τα standards που προτείνονται από το EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Standards). Η προετοιμασία του βακτηριακού ενοφθαλμίσματος για κάθε πείραμα έγινε με χρήση του Müller Hinton Broth (Merck) και προστίθενταν σε κάθε βύθισμα κατόπιν επίτευξης τελικής συγκέντρωσης 105 CFU/mL. Οι πλάκες τιτλοδότησης μεταφέρονταν σε επωαστικό θάλαμο στους 37οC για 18 – 24 h και ακολουθούσε μέτρηση της οπτικής απορρόφησής τους στα 630 nm με ειδικό φασματοφωτόμετρο (microplate reader, Labtech LT-4000 Plate Reader) και λογισμικό (Manta LML). Ακολούθησε η επιλογή συγκεκριμένων ARGs στα υπό μελέτη αντιβιοτικά και η συγκέντρωσή τους εκτιμήθηκε με την εφαρμογή της qPCR (μέθοδος SYBR green) και τη χρήση του StepOnePlus System (Applied Biosystems). 
Η μικροβιολογική ανάλυση των υγρών αποβλήτων έδειξε την παρουσία αρκετών βακτηρίων, σε ικανές ποσότητες, σε όλα τα στάδια της επεξεργασίας ακόμα και σε εκείνο της απολύμανσης – συγκεκριμένα μεταξύ των ανθεκτικών στελεχών της εξόδου τα περισσότερα ανήκαν στο είδος E. coli. Το αποτέλεσμα αυτό αφενός επιβεβαιώνει την ανθεκτικότητα των βακτηρίων σε τέτοιες εγκαταστάσεις αφετέρου εγείρει ανησυχίες στη δημόσια υγεία, καθώς η παρουσία μικροοργανισμών όπως οι S. aureus και E. faecalis στις εκροές έχει σχετιστεί με τη μετάδοση πολλών υδατογενών λοιμώξεων. Τα μεγαλύτερα ποσοστά ανθεκτικότητας καταγράφτηκαν για τα E. coli και Enterococci  στην Αμπικιλλίνη και για τους Staphylococci στην Τετρακυκλίνη. Μεταξύ των βακτηρίων, η E. coli έφερε τα μεγαλύτερα ποσοστά ARGs. 
Επιπλέον κομμάτι της έρευνας αφορούσε στη συμπεριφορά μικτών πληθυσμών ανθεκτικών – ευαίσθητων στελεχών από το ίδιο είδος, που αναπτύσσονται σε διαφορετικά περιβάλλοντα όπου μπορεί να επικρατούν συνθήκες στέρησης τροφής και ενέργειας, στα αντιβιοτικά. Γι' αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκαν πειράματα κατά τα οποία ανθεκτικά και ευαίσθητα στελέχη από το ίδιο είδος καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά θρεπτικά μέσα (1) Müller Hinton Broth και (2) υγρό απόβλητο (εκροή δευτεροβάθμιας επεξεργασίας) σε κανονικές συνθήκες θερμοκρασίας και πίεσης. Στο κάθε θρεπτικό μέσο εφαρμόσαμε μια επιπλέον διάλυση (1:3) για την προσομοίωση των ολιγοτροφικών συνθηκών οι οποίες κυριαρχούν στα υδατικά περιβάλλοντα. Η διάρκεια των καλλιεργειών ήταν 5 ημέρες, η δειγματοληψία γινόταν την 3η και 5η ημέρα και ο μικτός πληθυσμός υποβαλλόταν σε έλεγχο ανθεκτικότητας με τη γνωστή μέθοδο της μικροαραίωσης και εφαρμογή του εκάστοτε αντιβιοτικού. Οι πληθυσμοί όλων των βακτηρίων ήταν ανθεκτικοί στο πυκνό Müller Hinton Broth στις 3 και στις 5 ημέρες. Οι πληθυσμοί των E. coli και Staphylococci που ανακτήθηκαν την 3η ημέρα παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα ανθεκτικότητας και ειδικά στην περίπτωση του αραιωμένου Müller Hinton Broth. Αντίθετα, οι πληθυσμοί αυτών των βακτηρίων ήταν ευαίσθητοι στο αντιβιοτικό στις καλλιέργειες στο υγρό απόβλητο, ενώ οι Enterococci έδειξαν ανθεκτικότητα ειδικότερα στην περίπτωση του αραιωμένου υγρού αποβλήτου. 
Συνοπτικά, μπορούμε να πούμε ότι ήταν προφανής η παρουσία ARB και ARGs στην Ε.Ε.Υ.Α. Χανίων και, ειδικά στην περίπτωση κάποιων ARGs (sul1), ακόμα και η απολύμανση δεν ήταν αρκετή για την αποτελεσματική επεξεργασία τους. Το ενδεχόμενο να είναι οι βιολογικοί καθαρισμοί χώροι που ευνοοούν την οριζόντια μετάδοση τέτοιων γονιδίων μεταξύ διαφόρων μικροοργανισμών είναι ακόμη υπό διερεύνηση.