title: Ex vivo assays for measuring luciferase activity in tissues of transgenic mice
Creators: name: Beyhan, Christina
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Heutzutage werden Versuchstiere im Labor immer noch in den verschiedensten Bereichen der Forschung, vor allem im Bereich der Krebsforschung, eingesetzt. Mäuse werden für bestimmte Anwendungen gentechnisch verändert, um Modelle mit spezifischen Funktionen zu erhalten. Diese Mäuse, auch transgene Mäuse genannt, können genetisch (z.B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion) oder phänotypisch (z.B. mit Biolumineszenz-Imaging, falls das Reportergen in die transgenen Mäuse zuvor eingebracht wurde) charakterisiert werden. Die Expression und die Steuerung eines Gens kann mit Hilfe von Reportergen Assays, die auf der Biolumineszenz basieren überwacht werden, wie es bei Firefly Luciferase der Fall ist. In dieser Masterarbeit wird ein Protokoll entwickelt und optimiert, um die ex vivo Aktivität von Firefly Luciferase in Geweben von transgenen Mäusen zu untersuchen. Als Erstes wurde ein Protokoll zur Homogenisierung verschiedener Gewebe von Mäusen entwickelt und optimiert. Dafür wurden die Organe von nicht-transgenen Mäusen verwendet, mit rekombinantem Firefly Luciferase Protein versehen und in verschiedenen Arbeitsschritten untersucht (vor bzw. nach der Homogenisierung). Es wurden dazu einige Parameter verwendet und angepasst (Puffer, Dauer der Homogenisierung, Zentrifugieren). Nach der Optimierung haben wir dieses Protokoll für Gewebe transgener Mäuse, die Firefly Luciferase (Luc) als Reportergen exprimieren, verwendet. Es wurden zwei transgene Linien dafür untersucht, Tg Sp-C-Luc und Tg Thy-1.2-Luc. Als letzten Schritt haben wir unsere ex vivo Ergebnisse mit dem Genotyp und dem Phänotyp Status aus in vivo Untersuchungen verglichen, um einen Zusammenhang in der Aktivität des Luciferase Enzyms aufzeigen zu können. Mit dieser Arbeit zeigen wir ein erfolgreich entwickeltes Homogenisierungsprotokoll, um die Aktivität von zugefügten rekombinanten Firefly Luciferase Protein nachweisen zu können. Wir stellten fest, dass CCLR 1X (BSA) die besseren Ergebnisse als Puffer liefert. Ausgehend von unserem gewählten Equipment beträgt die optimale Homogenisierungszeit für Gehirngewebe 15 Sekunden, bzw. 10 Sekunden für Lunge, Leber und Haut. Ein 10 Zentrifugierungsschritt ist unabdingbar, um gleichbleibende Bedingungen für die Messung zu erhalten. Die optimierten ex vivo Assays zeigen messbare Aktivität des Luciferase Enzyms in beiden untersuchten transgenen Linien. Im Großen und Ganzen entsprechen diese Ergebnisse dem jeweiligen Genotyp und Phänotyp Status aus den in vivo 2D BLI basierten Untersuchungen. In einigen Fällen ist die Übereinstimmung jedoch auf Grund von möglichen Ausreißern nicht erkennbar. Es könnten weitere Versuche mit mehr Gewebeproben durchgeführt werden, um aussagekräftigere Ergebnisse zu erzielen.
description: Nowadays laboratory animals are still used as models in several areas of research, especially in the field of cancer research. For specific applications, mice are genetically modified to obtain models with a specific function. These mice, called transgenic mice, can be characterized genetically (e.g. polymerase chain reaction) and by phenotype (e.g. bioluminescence imaging incase the reporter gene was included within the transgenic mice). The expression and regulation of a gene can be monitored by reporter gene assays which are based on bioluminescence e.g. Firefly luciferase. This master thesis investigates optimization of protocols for ex vivo activity measurements of Firefly luciferase in tissues of transgenic mice. Firstly, a homogenization protocol was developed and further optimized for different mouse tissues by employing organs from non-transgenic mice and spiking them with recombinant Firefly luciferase protein at different steps (before homogenization vs after homogenization). For this, various parameters were used and adjusted (buffer, homogenization time, centrifugation). After optimization, we applied the optimized protocol for tissues of transgenic mice expressing Firefly luciferase (Luc) as a reporter gene. Two transgenic mouse strains were therefore examined, Tg Sp-C-Luc and Tg Thy-1.2-Luc. As a last step, to reveal correlation in luciferase activity, our ex vivo results were compared with the genotypic and phenotypic status of in vivo analyses. In our work, we show a successfully optimized homogenization protocol for detecting the activity of spiked recombinant Firefly luciferase protein. We observed that CCLR 1X (BSA) works best as a buffer. With the equipment we have used, the ideal homogenization time for brain tissue is 15 seconds, for lung, liver and skin 10 seconds, respectively. A centrifugation step is inevitable to obtain consistent conditions for the measurement. The optimized ex vivo assays show measurable activity of Firefly luciferase for both transgenic strains. Generally speaking, these results correspond to the respective genotype and phenotypic status of in vivo 2D BLI imaging based phenotyping. However, in some cases, the correlation is not detectable because of probable outliers. Further experiments with more tissue samples could be done to obtain more significant results.