title: Charakterisierung der Terminase-Untereinheiten des Humanen Cytomegalievirus (HCMV)
Creators: name: Knoblauch, Marie
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: HCMV
subject: Terminase
subject: ATPase
subject: Komplexformation
subject: HCMV
subject: terminase
subject: ATPase
subject: complex formation
subject: 570 Biologie

description: Ein essenzieller Schritt in der Replikation des Humanen Cytomegalievirus ist die Verpackung der concatemeren dsDNA in vorgeformte Prokapside. Der Transport und das Schneiden des Concatemers werden durch die virale Terminase gesteuert. Diese besteht aus der ATPase-Untereinheit pUL56, der Nuklease-Untereinheit pUL89 und weiteren Proteinen, die einen ringförmigen Komplex bilden. Aus wie vielen Untereinheiten dieser besteht ist ungeklärt. Das Protein pUL51 gilt, aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung des Komplexes und Lokalisation in den Zellkern, als dritte Untereinheit. Um den Einfluss von pUL51 zu untersuchen, wurden die Proteine pUL56, pUL89 und pUL51 simultan über rekombinante Baculoviren in Insektenzellen synthetisiert. Analysen zur Komplexbildung wurden mittels Cross-Linking, SDS-PAGE und Western-Blot durchgeführt. Das führte zur Detektion homologer Komplexe aus pUL51, und 180 kDa großer Komplexe aus pUL51/pUL56/pUL89, die eine Untereinheit des Komplexes darstellen könnten. Die Lokalisation der Proteine nach (Ko-)Infektion wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Dabei zeigte sich keine typische nukleäre Lokalisation in diesem Modell-System. Eine wichtige Funktion der Terminase stellt die ATP-Hydrolyse von pUL56 dar. Das Vorkommen typischer ATP-Bindungsmotive in dem Nuklease-Protein pUL89 deutet auf seine Involvierung bei der ATP-Hydrolyse hin. Bindungsvorhersagen bestärkten eine mögliche ATPase-Funktion des Proteins über die konservierten Aminosäuren GKT der Walker A Box. Im ATPase-Assay zeigten Substitutionen dieser Aminosäuren erstmals eine Auswirkung auf die ATP-Hydrolyse von pUL89. Zur Kontrolle wurden pUL56 und dessen essenzielle Substitutionen mitgeführt, die zum Verlust der Aktivität führten. Obwohl pUL89 eine niedrigere Hydrolyse als pUL56 aufwies, führte die Substitution pUL89 G217A zu einer erhöhten Aktivität. Zuletzt konnte die Reduktion der ATPase-Aktivität von pUL56 durch den HCMV-spezifischen Inhibitor Letermovir aufgewiesen werden.
description: A crucial step in the replication cycle of Human Cytomegalovirus (HCMV) is the packaging of the concatemeric dsDNA in pre-formed pro-capsids. The transportation and cutting of the Concatemer is mediated by the viral terminase. This consists of the ATPase-subunit pUL56, the nuclease-subunit pUL89 and other proteins, which form a ring-shaped complex. It remains unknown how many subunits the complex consists of. The pUL51 protein is said to be the third subunit, because it plays an important role in complex formation and subcellular localization of the terminase-proteins within the nucleus compartment. To examine the effects of pUL51, recombinant Baculoviruses were used to co-synthesize pUL56, pUL89 and pUL51 in insect cells. SDS-PAGE, Western-Blot analysis and cross-linking techniques were used to investigate the structure. The cross-linking led to a detection of homologous multimers of pUL51, as well as 180 kDa complexes consisting of pUL51/pUL56/pUL89, which could resemble a subunit of the complex. The localization of the proteins after (co-)infection was studied by fluorescence microscopy. But the typical intranuclear localization was not seen in insect cells. A critical function of the terminase is the ATP-hydrolysis by pUL56. The presence of typical ATP-binding motifs in the nuclease-protein pUL89 suggests its involvement in ATP-hydrolysis. Binding-predictions support a possible ATPase-activity of the protein via conserved amino acids GKT of the Walker A box. An ATPase-assay estimates for the first time the effect of substitutions of these amino acids on the ATP-hydrolysis of pUL89. As a control pUL56 and its essential substitutions, which led to a loss of activity, were included. Although pUL89 showed lower activity than pUL56, the substitution pUL89 G217A led to an increased activity. Finally, the specific reduction of pUL56`s ATPase-activity by the HCMV-specific inhibitor letermovir was shown, which gives insight into its up-to-now unknown mode of action.