title: Developing and refining a FRAP-based transport assay in combination with RNAi to identify key molecular players regulating peripheral ER to nuclear envelope connections
Creators: name: Geppner, Clemens
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Das endoplasmatische Retikulum (ER) ist ein weitreichendes Netzwerk aus Membranen, welches viele wichtige Funktionen ermöglicht und mit den meisten Bereichen der Zelle in Kontakt steht. Besonders wichtig ist die Kernhülle, ein Teil des ER, der den Zellkern umschließt und daher an der Aufrechterhaltung der Zellfunktion und -gesundheit beteiligt ist. Der Hauptfokus dieser Arbeit liegt besonders auf der Verbindung des ER mit der Kernhülle (nuclear envelope, kurz: NE). Unsere Hypothese lautet hier, dass diese ER-NE Verbindungen unmittelbar für die korrekte Funktion zellulärer Transportprozesse verantwortlich sind und daher potenziell an der Ausbildung von Krankheitsbildern beteiligt. Frühere Experimente haben gezeigt, dass es Unterschiede zwischen den Verbindungen des ER-ER und ER-NE gibt. ER-ER-Verbindungen scheinen im Allgemeinen größer zu sein und weisen mehr Variation in den gemessenen Durchmessern des Lumen Raums auf, während ER-NE Verbindungen enger sind und nur wenig Variabilität aufweisen. Ein Versuch an HeLa-Wildtyp-Zellen zeigte, dass die ER-NE Verbindungen auf einen Durchmesser von nur etwa 20 nm verengt sind, was deutlich kleiner ist als die ER-ER-Verbindungen. Dies deutet auf eine strenge Regulierung der ER-NE Verbindungen hin. Die enge Regulierung der ER-NE Verbindungen könnte auf ihre Funktion in der Zellkernintegrität und Genexpression zurückzuführen sein. Wie genau diese Verbindungen jedoch reguliert werden und welche Gene daran beteiligt sind ist noch unerforscht. Es gilt weiters zu unterscheiden, dass die ER-NE Verbindungen sowohl Einfluss auf den luminalen Transport als auch auf den Transport von membrangebundenen Proteinen nehmen können. In dieser Arbeit beschränke ich mich auf den luminalen Transport und von welchen Genen dieser reguliert sein könnte. Hierfür wird ein gezielter Ansatz zum knock-down bestimmter Gene mittels RNAi gekoppelt mit einem FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) -basierten Transport Assay verwendet. Die mikroskopische Bilderfassung erfolgt in einem „confocal spinning disc microscope“ welches die Messung der „fluorescence recovery“ an lebenden Zellen erlaubt. Mit Hilfe eines mathematischen Modells konnte die Geschwindigkeit der Transportprozesse somit ermittelt werden. Dies ermöglichte einen direkten Vergleich sämtlicher durchgeführter Experimente. Die ersten Versuche zeigten jedoch deutlich die Limitierungen des gewählten Ansatzes auf, da die Ergebnisse stark schwankten und nicht reproduzierbar waren. Durch gezielte Eliminierung von externen Einflüssen, konnte die Methode Stück für Stück verbessert werden, wodurch es letztendlich möglich war, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Wir konnten somit zeigen, dass bestimmte Gene einen Einfluss auf die generelle Transportkinetik des ERs haben. Es war jedoch noch nicht möglich ein Gen zu identifizieren welches einen nachweisbaren Einfluss auf die Regulierung der ER-NE Verbindungen hatte.
description: The endoplasmic reticulum (ER) is an extensive membrane network that spans large parts of the cellular complex and facilitates a variety of critical functions. It is in contact with most cellular compartments, but most critically, one portion of the ER, the nuclear envelope (NE) encapsules the entire nucleus and therefore is indirectly and directly involved in maintaining correct cellular function and health. The focus of this thesis lies specifically on the interface between the peripheral ER and the nuclear envelope (NE). We hypothesize that these ER-NE connections are at the center of many crucial transport processes and therefore potentially linked to various disease phenotypes. It was established in previous experiments, that there are measurable differences in the way the endoplasmic reticulum (ER) and the nuclear envelope (NE) interface, when compared to ER-ER connections. While ER-ER connections, or three-way junctions, generally appear to be larger in terms of the luminal space, they also show more size variation when measured. ER-NE connections however appear to be much more tightly restricted and show little variability. When analyzing electron microscopy images of HeLa wild-type cells, it was shown that the ER-NE connections are constricted down to a size of only 20nm. Seeing how tightly these connections seem to be regulated, it can be speculated that some sort of control mechanism is in place that maintains this ER-NE interface. However, how this connection is regulated or what molecular players are involved is not known. When looking at which proteins could be involved in the regulation of ER-NE connections, we have to differentiate between two areas of interest: Firstly, ER-NE connections can affect the luminal transport of molecules to and from the nucleus. Secondly, as the ER-NE connections also connect the outer membranes of the ER and NE, membrane bound proteins could traverse these connections, unless there is some kind of restriction happening. In this work, we focus on the luminal transport and which molecular players are potentially involved in its regulation. To analyze this, we decided on a targeted approach that knocks-down candidate genes via RNAi followed by a fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) based transport assay using a confocal spinning disc microscope for measuring recovery kinetics in live-cells. The resulting recovery curve was fitted to a one-phase association model from which a recovery rate was extracted to directly compare all generated data. Initial transport screenings highlighted the limitations of the chosen approach by yielding inconsistent results with poor reproducibility. In an iterative manner, we improved the method little by little until we were able to generate reproducible results. This then allowed us to show how certain genes affect the overall transport rates throughout the entire ER network. At this stage however, no conclusive evidence, directly linking one of the investigated genes to altered ER-NE connections has been found.