title: Konstruktion einer Flagellum-Deletionsmutante in Natrialba magadii und Charakterisierung bestehender Natrialba magadii Mutanten
Creators: name: Alte, Beatrix
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Die Konstruktion einer Flagellum-Deletionsmutante von Nab. magadii sollte Licht in die Frage nach der Rolle des Flagellums bei der Adsorption des Phagen ϕCh1 an Nab. magadii bringen. Nach erfolgreicher Transformation des Konstrukts pKSII+ (delta)flaB2::novR erwies sich dieses im Genom als derart instabil, dass es bislang nicht möglich war, eine homozygote Kultur zu erhalten, mit der man die gewünschten Untersuchungen hätte durchführen können. Weiters wurden folgende bestehende Nab. magadii-Mutanten näher charakterisiert: Nab. magadii L11-ΔE, Nab. magadii L11-ΔORF79, Nab. magadii P3. Bei Letzterer sollte die Expression der Natrialba Extrazellulären Protease (NEP) hinsichtlich Beginn und Menge im Vergleich zu den Stämmen Nab. magadii P3 (pNB102-prt) und Nab. magadii L13 untersucht werden. Das dafür hergestellte Antiserum erkennt die NEP. Der Vergleich der aufgenommenen Zeitreihen der genannten Stämme mittels Western Blot weist auf Veränderungen des Stamms Nab. magadii P3 (pNB102-prt) hin. Für Nab. magadii L11-ΔE gilt unglücklicherweise Ähnliches wie für die Flagellum-Deletionsmutante: Zur Zeit der Übernahme war die Kultur heterozygot, daher sollte zunächst eine homozygote Kultur hergestellt werden. Trotz Bemühungen erwies sich die Kultur nach wie vor als heterozygot, was keine aussagekräftigen Experimente zuließ. Die Genexpressionsmuster von Nab. magadii L11-ΔORF79 und dem Wildtyp Nab. magadii L11 wurden anhand von Western Blots verglichen. Tatsächlich fanden sich zahlreiche Unterschiede wie etwa früheres Auftreten der Hüllenproteine und eine Intervallverkürzung zwischen deren erstem Nachweis und dem Einsetzen der Lyse in Nab. magadii L11-ΔORF79. Als letztes Thema ist die Identifizierung des durch Zugabe von Tryptophan induzierbaren Promotors tnaN in Nab. magadii zu nennen. Dessen Aktivität wurde ebenso wie die des Promotors tna aus Hfx. volcanii in Nab. magadii quantifiziert. Anschließende Analysen zur Funktion eines möglichen Holins unter der Kontrolle dieser Promtoren ließen bislang keine eindeutigen Schlüsse zu.
description: The construction of flagellum deficient mutant of Nab. magadii was supposed to shed light in the role of the flagellum concerning the adsorption of the phage ϕCh1 on Nab. magadii. After successful transformation of the construct pKSII+ (delta)flaB2::novR, it turned out to be unstable. Therefore it was not possible to receive a homozygous culture, with which the desired examination could have been performed. Moreover, the following pre-existing mutants of Nab. magadii were further characterized: Nab. magadii L11-ΔE, Nab. magadii L11-ΔORF79, Nab. magadii P3. Within the latter, the expression of the Natrialba Extracellular Protease (NEP) should be analyzed with regard to start of expression and expressed amount in contrast to the strains Nab. magadii P3 (pNB102-prt) and Nab. magadii L13. The antiserum produced for this purpose detects the NEP. Comparing the Western Blots resulting from time course experiments, one has to presume that some changes occurred in Nab. magadii P3 (pNB102-prt). Unfortunately, similar is true for Nab. magadii L11-ΔE as is was for the flagellum deficient mutant: When adopting, the culture was heterozygous and should therefore be made homozygous. Despite diverse effords, the culture stayed heterozygous until now, not enabeling meaningful analysis. The gene expression pattern of Nab. magadii L11-ΔORF79 and the wild type Nab. magadii L11 were compared by the use of Western Blots. Actually, several differences such as earlier appearance of capsid proteins and a shorter time span between this time point and the onset of lysis were observed in Nab. magadii L11-ΔORF79. The last topic is the identification of the promoter tnaN in Nab. magadii, which can be induced by adding tryptophane. Its activity as well as the one of the promoter tna from Hfx. volcanii was quantified in Nab. magadii. Subsequently performed analysis concerning the function of putative holin controlled by these promoters did not allow definite conclusions so far.