title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Enzymen in der Biosynthese von prenylierten Indolalkaloiden
title: Molecular biological and biochemical investigations on enzymes in the biosynthesis of prenylated indole alkaloids
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Coby, Lindsay
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Fungi, bacteria and plants produce a large number of secondary metabolites. Their advantage in the organism itself is often not yet clear, nevertheless numerous secondary metabolites have an extraordinary significance for humanity. Penicillin has shaped medicine to this day, but lovastatin is also a good example of the potential of secondary metabolites in fungi. Among others the prenylated indole alkaloids are also an interesting group of secondary metabolites. Compared to the respective unprenylated substance, the introduction of a prenyl moiety and the associated increase in lipophilicity can improve biological activity. Indole alkaloids can be composed of tryptophan-containing cyclic dipeptides. Due to the heteroatoms and the versatility in the side chains of the amino acids, the diketopiperazine scaffold of the cyclic dipeptides provides an ideal prerequisite for further modifications such as acetylations, methylations, cyclizations or oxidations. The resulting modifications and functional groups lead to a variety of simple and complex natural products with interesting biological activities. The natural product group of ardeemines from Aspergillus fischeri is a fumiquinazoline (FQ) tripeptide framework of anthranilic acid, D-Ala and L-Trp. A very efficient biosynthetic pathway consisting of the NRPS ArdA and the prenyltransferase ArdB leads to a hexacyclic system (ardeemin) and the acetyltransferase ArdC subsequently forms 5-N-acetylardeemine. Both structures, ardeemin and 5-N-acetylardeemin, exhibit interesting biological activity as a multi-drug resistance export pump inhibitor. Due to the pharmaceutically relevant and promising activities as chemotherapy drugs, fumiquinazolins and related structures have been part of research for years. Through the use of the cyclic dipeptide prenyltransferases FtmPT1, BrePT, CdpNPT, CdpC3PT and AnaPT in this work, 14 different ardeemin FQ and ent Ardeemin FQ derivatives were identified and characterized by LC-MS and NMR analyses. These enzymes catalyzed the prenyl transfer to all the six different positions N1, C2, C3, C5, C6 and C7 of the indole ring. Ardeemin FQ was much better accepted with conversions of up to 77% than its enantiomer ent Ardeemin FQ with total conversions of maximum 22%, which were usually spread over several products. In a second project, 5-DMATS and FgaPT2 mutants were generated by site-directed mutagenesis to enable the production of C5-prenylated cyclo-L-Trp-L-Pro. Despite the successfully produced mutants 5-DMATS_R243L, 5-DMATS_R243L_L327G and FgaPT2_R244L_Y398F, they hardly showed any activity or only little of the desired product was detected. Parallel to these mutants, the multiple prenylating enzyme EchPT2 was mutated with the aim of controlling the multiprenylations and expanding the acceptance of the donor GPP. The successfully obtained mutants EchPT2_A404W, EchPT2_A404F, EchPT2_A404Y and EchPT2_A404L showed no activity towards C2-reverse prenylated cyclo-L-Trp-L-Pro, C2-reverse prenylated cyclo-L-Trp-L-Ala or Tryprostatin B. The mutant EchPT2_A404Y, however, accepted the unprenylated substrate cyclo L-Trp-L-Pro leading to two product peaks. The mutant EchPT2_L334G catalyzed the transfer of GPP to C2-revers prenylated cyclo-L-Trp-L-Pro substrate with a moderate conversion of 14% spread over at least three products. In the third project the substrate specificity of cytochrome P450 (CYP) enzymes were investigated by heterologous expression of the CYP genes ftmP450-1 and ftmP450-2 from Neosartorya fischeri in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) and subsequent feeding of prenylated substrates such as mainly cyclo L-Trp-L-Pro derivatives. The prenylated substrates were either produced by co-expression of a prenyltransferase together with the respective CYP genes in S. cerevisiae or chemo-enzymatically with recombined proteins and then fed. The following heterologous expression systems were successfully established in S. cerevisiae KO3: for monoexpression of ftmP450-1, ftmP450-2, ftmPT1 and brePT as well as for co-expression of ftmPT1 with ftmP450-1, brePT with ftmP450-1 and ftmPT1 with ftmP450-2. For the heterologous expression systems in S. cerevisiae containing a prenyltransferase, unprenylated cyclic dipeptides were fed. Overall these cyclic dipeptides were well accepted and converted to the prenylated products. For the heterologous expression systems with ftmP450-1 or ftmP450-2, but without a prenyltransferase, the regular C2-prenylated cyclic dipeptides cyclo-L-Trp-L-Pro (tryprostatin B), cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-L-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro, cyclo-L-Trp-L-Leu and cyclo-L-Trp-L-Ala were tested. In comparison ftmP450-2 showed to be more tolerant towards these substrates than ftmP450-1, which mostly showed no conversion. Nevertheless, ftmP450-1 could also be used to test substrates that contained modifications in the prenyl moiety, as it is not directly involved in the oxidation reaction. For this reason, it was possible to feed cyclo-L-Trp-L-Pro derivatives with reverse prenylation at C2, regular prenylation at C4 – C7 or regular geranylation at C2. The shift of the prenyl group to the positions C4 - C7 did not lead to any conversion with ftmP450-1, however, the substrates that carried a modified prenyl unit at C2 were also well accepted, showing the necessity of the prenylation at C2. The products of ftmP450-1 were characterized by LC-MS and NMR analysis.
description: Pilze, Bakterien und Pflanzen stellen zahlreiche Sekundärmetabolite her. Ihr Nutzen in dem Produzenten selbst ist oft noch nicht geklärt, dennoch haben viele Sekundärmetabolite eine außerordentliche Bedeutung für die Menschheit. Penicillin hat die Medizin bis heute geprägt, aber auch Lovastatin ist ein Bespiel dafür, welches Potenzial in den Sekundärmetaboliten von Pilzen steckt. Eine interessante Gruppe der Sekundärmetaboliten sind die prenylierten Indolalkaloide. Im Vergleich zur jeweils unprenylierten Substanz kann die Einführung einer Prenylgruppe und die damit verbundene Erhöhung der Lipophilie die biologische Aktivität verbessern. Indolalkaloide können aus tryptophanhaltigen cyclischen Dipeptiden aufgebaut sein. Das Diketopiperazin-Grundgerüst der cyclischen Dipeptide liefert durch die Heteroatome und der Vielseitigkeit in den Seitenketten der Aminosäuren eine ideale Voraussetzung für weitere Modifikationen wie z. B. Acetylierungen, Methylierungen, Cyclisierungen oder Oxidationen. Die hierdurch eingeführten Modifikationen und funktionellen Gruppen führen zu einer Vielfalt an einfachen sowie komplexen Naturstoffen mit interessanten biologischen Aktivitäten. Der Naturstoffgruppe der Ardeemine aus Aspergillus fischeri liegt eine Fumiquinazoline (FQ) Tripeptidgrundstruktur aus Antranilsäure, D-Ala und L-Trp zugrunde. Ein sehr effizienter Biosyntheseweg bestehend aus der NRPS ArdA und der Prenyltransferase ArdB führt zu einem hexacyclischem System (Ardeemin) und die Acetyltransferase ArdC bildet anschließend 5 N Acetylardeemin. Beide Strukturen, Ardeemin und 5 N Acetylardeemin, weisen eine biologische Aktivität als Multi-Drug-Resistance Exportpumpeninhibitor auf. Aufgrund der pharmazeutisch relevanten und vielversprechenden Aktivitäten als Chemotherapeutika sind Fumiquinazoline sowie verwandte Strukturen seit Jahren Teil der Forschung. Durch den Einsatz der Prenyltransferasen für cyclische Dipeptide FtmPT1, BrePT, CdpNPT, CdpC3PT und AnaPT gelang es im Rahmen der vorliegenden Arbeit 14 verschiedene Ardeemin FQ und ent Ardeemin FQ Derivate zu identifizieren und diese mittels LC-MS sowie NMR-Analyse zu charakterisieren. Die Enzyme katalysierten den Transfer der Prenyleinheit an insgesamt sechs unterschiedlichen Positionen N1, C2, C3, C5, C6 und C7. Ardeemin FQ wurde mit Umsätzen von bis zu 77% sehr viel besser akzeptiert als das Enantiomer ent-Ardeemin FQ mit Gesamtumsätzen von maximal 22%, die sich meist auch auf mehreren Produkten verteilen. In einem weiteren Projekt wurde durch die zielgerichtete Mutagenese 5-DMATS und FgaPT2 Mutanten hergestellt, die zur Substratherstellung von C5-prenyliertem cyclo-L-Trp-L-Pro eingesetzt werden sollten. Trotz der erfolgreich hergestellten Mutanten 5-DMATS_R243L, 5 DMATS_R243L_L327G sowie FgaPT2_R244L_Y398F konnte entweder kaum Aktivität oder nur wenig von dem gewünschten Produkt detektiert werden. Parallel zu diesen Mutanten wurde das mehrfachprenylierende Enzym EchPT2 mutiert mit dem Ziel die Mehrfachprenylierungen zu steuern und die Akzeptanz gegenüber dem Donor GPP zu erweitern. Die erfolgreich hergestellten Mutanten EchPT2_A404W, EchPT2_A404F, EchPT2_A404Y und EchPT2_A404L zeigten keinerlei Aktivität gegenüber revers C2 prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro, revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Ala oder Tryprostatin B, allerdings konnte bei EchPT2_A404Y mit dem unprenyliertem Substrat cyclo-L-Trp-L-Pro zwei Produktpeaks detektiert werden. Die Mutante EchPT2_L334G katalysiert den Transfer von GPP auf revers C2-prenyliertes cyclo-L-Trp-L-Pro mit moderatem Gesamtumsatz von 14% verteilt auf mindestens drei Produkten. Für das Projekt der heterologen Expression der Cytochrom P450 (CYP) Gene ftmP450-1 bzw. ftmP450-2 aus Neosartorya fischeri in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) zur Untersuchung der Substratspezifität der CYP Enzyme, wurden u. a. prenylierte cyclo-L-Trp-L-Pro Derivate für die Zufütterung benötigt. Die prenylierten Substanzen wurden entweder als Co-Expression der Prenyltransferase zusammen mit den jeweiligen CYP Gene in S. cerevisiae oder chemo-enzymatisch mit rekombiniertem Protein produziert und anschließend zugefüttert. Es wurden die folgenden heterologen Expressionssysteme erfolgreich in S. cerevisiae KO3 etabliert: die Monoexpression von ftmP450-1, ftmP450-2, ftmPT1 und brePT sowie die Co-Expression von ftmPT1 mit ftmP450-1, brePT mit ftmP450-1und ftmPT1 mit ftmP450-2. Für die heterologen Expressionssysteme mit einer Prenyltransferase in S. cerevisiae wurden unprenylierte cyclische Dipeptide zugefüttert, die insgesamt gut umgesetzt wurden. Für die Systeme mit ftmP450-1 bzw. ftmP450-2, allerdings ohne Prenyltransferase, wurden die regulär C2-prenylierten cyclischen Dipeptide wie cyclo-L-Trp-L-Pro (Tryprostatin B), cyclo-D-Trp-D-Pro, cyclo-L-Trp-D-Pro, cyclo-D-Trp-L-Pro, cyclo-L-Trp-L-Leu und cyclo-L-Trp-L-Ala getestet. Dabei zeigte sich ftmP450-2 toleranter gegenüber diesen Substraten als ftmP450-1. Mit ftmP450-1 konnten zusätzlich Substrate getestet werden, die Modifikationen in der Prenyleinheit enthielten, da diese nicht unmittelbar an der Oxidationsreaktion beteiligt ist. Aus diesem Grund war es möglich cyclo-L-Trp-L-Pro Substrate zu testen, die an C4 – C7, C2 revers prenyliert oder an C2 regulär geranyliert waren. Die Verschiebung der Prenylgruppe zu den Positionen C4 – C7 führten zu keiner Umsetzung durch ftmP450-1, allerdings wurden die Substrate, die an C2 eine modifizierte Prenyleinheit trugen, gut umgesetzt und zeigt die Wichtigkeit einer Prenylierung an C2. Diese Produkte von ftmP450-1 wurden mittels LC-MS und NMR-Analyse charakterisiert.