title: New approaches to the chemotherapy of glioblastoma: investigations on doxorubicin nanoparticles, inhibition of PDGF receptors and kinesin Eg5, with emphasis on confocal laser-scanning microscopy
Creators: name: Gross, Dietmar
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Glioblastom , Doxorubicin , Nanopartikel , Platelet-derived Growth Factor , Rezeptor , Kinesin , Chemotherapie , Doxorubicin-Nanopartikel , PDGF Rezeptor , Kinesin Eg5 , glioblastoma , doxorubicin , nanoparticles , PDGF receptor , kinesin Eg5
subject: 540 Chemie

description: The treatment of malignant brain tumors poses a basic challenge in todays cancer therapy. Since the quantitative resection is hardly possible due to the invasive growth of the tumor, prevention of relapse after resection by concomitant irradiation treatment and chemotherapy is of major importance for patient outcome. While surgery and irradiation therapy seem to be exploited, new approaches in the chemotherapy may provide hope for the future. Amongst them are the exploration of new transport pathways across the blood-brain barrier and the overcome of the p-glycoprotein (pgp)-mediated multi-drug resistance, respectively, and the evaluation of new pharmacological targets, allowing selective inhibition of tumor growth, while minimizing cytotoxic side effects. The objective of this work was to investigate, whether doxorubicin-loaded polybutylcyanoacrylate (PBCA) nanoparticles are able to provide overcome of the pgp-mediated multi-drug resistance in vitro, and to investigate the mechanism of the enhanced antiproliferative activity of doxorubicin nanoparticles compared to the efficiency of the drug in solution. The nanoparticle formulations exceeded the antiproliferative effect of the dissolved drug against pgp-overexpressing KBv1 cells. Flow cytometric determination of the cell-associated doxorubicin fluorescence after incubation with the different drug formulations indicated an enhanced drug uptake with the nanoparticle formulations in pgp-negative glioblastoma cells as well as in KBwt cells with weak pgp expression. No differential fluorescence increase was observed in KBv1 cells at a drug concentration equivalent 500 nM doxorubicin, but at a concentration of 2 µM doxorubicin KBv1 cells showed increased fluorescence after incubation with nanoparticle-bound drug. Confocal microscopic (CLSM) studies with living KBwt cells showed similar cytoplasmic doxorubicin distribution after incubation with different drug formulations. A higher overall doxorubicin fluorescence was observed after incubation with the nanoparticle-bound drug, and the cells were hemmed by doxorubicin fluorescence. With a mixture of empty PBCA nanoparticles and lucifer yellow, pgp-negative U-373 MG were hemmed by lucifer yellow derived fluorescence. The results from CLSM studies indicate that the nanoparticles do not enter the cells. In conclusion, the enhanced antiproliferative effect of the nanoparticle-bound doxorubicin against pgp-overexpressing cells, can be explained by a concentration gradient of drug, released from nanoparticles after adsorption to the cell surface, leading to saturation and overcome of the pgp-mediated drug efflux transport. As a non-cytotoxic approach in the chemotherapy of malignant glioblastoma, the concept of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor kinase inhibition was evaluated as the second part of this work. PDGF receptor expression and activity were demonstrated in human glioblastoma cell lines. However, the inhibition of PDGF receptors in human glioblastoma cells, using various selective PDGF receptor kinase inhibitors, amongst them the registered drug imatinib, did not affect cell growth in therapeutically relevant concentrations. Moreover, no enhanced cytotoxicity was observed when imatinib was combined with paclitaxel. The cells lacked expression of the resistance proteins pgp and breast cancer resistance protein (bcrp), demonstrating that lack of antiproliferative activity of the PDGF receptor inhibitors cannot be ascribed to these drug resistance mechanisms. Moreover glioblastoma cell proliferation was independent of PDGF. These results suggest that the single PDGF receptor inhibition by selective tyrosine kinase inhibitors, including imatinib, does not represent a suitable approach in the treatment of glioblastoma. The selective inhibition of the Eg5 kinesin by small molecule inhibitors such as monastrol is currently preclinically evaluated as a new approach to the treatment of malignant tumors. The potency of the first identified selective Eg5 inhibitor monastrol is rather low. Several new monastrol analogs exhibited higher antiproliferative activity against human glioblastoma cells. In the last part of this work, the effects of these new monastrol analogs on the spindle formation and the cytoskeleton of mitotic and quiescent glioblastoma cells were evaluated by CLSM. Except for the two compounds VS-17 and VS-48 all other tested compounds led to the characteristic monoaster spindle formation with a potency of at least one order of magnitude higher than that of monastrol. Although the expression of the Eg5 kinesin in the human glioblastoma cells was not limited to the mitosis phase, the microtubule and actin cytoskeleton remained unaffected by the new compounds. These results support the hypothesis that selective Eg5 inhibitors may represent an interesting class of potential anticancer drugs, predicted to exhibit less cytotoxic side effects in comparison to classical tubulin inhibitors.
description: Die Therapie maligner Hirntumore stellt eine grundlegende Herausforderung in der heutigen Krebstherapie dar. Die Prävention von Rezidiven mittels Strahlen- und Chemotherapie nach operativer Tumorentfernung ist von entscheidender Bedeutung für das Patientenüberleben. Da die Grenzen der Effektivität von Chirurgie und Strahlentherapie derzeit erreicht sind, liegen die Zukunftshoffnungen in neuen Ansätzen zur Chemotherapie. Darunter fallen die Erforschung neuer Transportwege über die Blut-Hirn Schranke bzw. die Überwindung der p-Glycoprotein (pgp)-vermittelten Multidrug Resistenz (MDR), sowie die Untersuchung neuer pharmakologischer Zielstrukturen zur selektiven Hemmung des Tumorwachstums. In dieser Arbeit wurden Doxorubicin beladene Polybutylcyanoacrylat (PBCA)-Nanopartikel als Träger zur Überwindung der pgp-vermittelten MDR in vitro und der Mechanismus der verbesserten antiproliferativen Aktivität, verglichen mit gelösten Wirkstoff, untersucht. Die Nanopartikel-Formulierungen zeigten einen höheren antiproliferativen Effekt gegen pgp-überexprimierende KBv1 Zellen. In pgp-negativen Glioblastom-Zellen sowie KBwt Zellen (schwache pgp-Expression) deutete die flowzytometrische Messung der zellassoziierten Doxorubicin-Fluoreszenz auf eine verbesserte Wirkstoffaufnahme nach Inkubation mit Nanopartikel-gebundenem Doxorubicin hin. In KBv1 Zellen blieb dieser Effekt bei einer Konzentration entsprechend 500 nM Doxorubicin aus. Bei 2 µM Doxorubicin ergab sich ein ähnlicher Effekt wie für die pgp-negativen bzw. schwach exprimierenden Zellen. Konfokalmikroskopische (CLSM) Untersuchungen mit lebenden KBwt Zellen zeigten eine ähnliche zytoplasmatische Doxorubicin-Verteilung nach Inkubation mit verschiedenen Wirkstoff-Formulierungen. Nach Inkubation mit Nanopartikel-gebundenem Wirkstoff wurde eine höhere Gesamtfluoreszenz der Zellen beobachtet, wobei die Zellen von einer saumartigen Doxorubicin-Fluoreszenz umgeben waren. Inkubation von pgp-negativen U-373 MG Glioblastom-Zellen mit einer Mischung von unbeladenen Nanopartikeln und Lucifer-Gelb, führte ebenfalls zur Bildung eines fluoreszierenden Saums um die Zellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Nanopartikel nicht in die Zellen aufgenommen werden. Die verbesserte antiproliferative Wirkung des Nanopartikel-gebundenen Doxorubicins gegen KBv1 Zellen kann durch die Bildung eines Konzentrationsgradienten von Doxorubicin erklärt werden, welcher nach Freisetzung von an die Zellmembran adsorbierten Nanopartikeln entsteht, und zu einer Sättigung und dabei zu einer Überwindung des pgp-vermittelten Wirkstoff-Efflux führt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Hemmung der Platelet-derived growth factor Rezeptor (PDGFR) Tyrosin-Kinase als nicht-zytotoxischer Ansatz der Chemotherapie des malignen Glioblastoms untersucht. Trotz Expression aktiver PDGF Rezeptoren in humanen Glioblastom-Zell-Linien wurde mit verschiedenen selektiven PDGFR-Inhibitoren, darunter Imatinib, keine antiproliferative Wirkung in therapeutisch relevanten Konzentrationen erreicht. Weiterhin wurde durch Kombination von Imatinib mit Paclitaxel keine verbesserte Wirksamkeit erzielt. Die verwendeten Zell-Varianten zeigten keine Expression von pgp oder bcrp (breast cancer resistance protein), wodurch ein Ausbleiben der antiproliferativen Wirkung von Imatinib aufgrund dieser beiden Resistenztransporter ausgeschlossen werden kann. Darüberhinaus wurde PDGF-unabhängiges Wachstum der Glioblastom-Zellen beobachtet. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die alleinige Hemmung von PDGF-Rezeptoren durch selektive Tyrosin-Kinase Inhibitoren, wie z.B. Imatinib, keinen geeigneten Ansatz in der Behandlung von Gliolastomen darstellt. Die selektive Hemmung des Kinesin Eg5 mit kleinen Wirkstoffmolekülen wie Monastrol steht derzeit im Fokus präklinischer Untersuchungen als neuer Ansatz zur Behandlung maligner Tumoren. Die Potenz des ersten selektiven Eg5-Inhibitors Monastrol erwies sich als eher gering. Gegen humane Glioblastom-Zellen zeigten verschiedene neue Monastrol-Analoga eine wesentlich höhere antiproliferative Aktivität. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die Effekte dieser neuen Monastrol-Analoga auf die Ausbildung der Mitosespindel und auf das Zytoskelett mitotischer und ruhender Glioblastom-Zellen mittels CLSM untersucht. Alle getesteten Substanzen außer VS-17 und VS-48 führten zur Bildung charakteristischer Monoastral-Spindeln, bei mindestens zehnfacher Potenz verglichen mit Monastrol. Mikrotubuli und das Aktin-Zytoskelett wurden durch die neuen Verbindungen nicht geschädigt. Diese Ergebnisse bekräftigen die Hypothese, dass selektive Eg5 Inhibitoren neue potentielle Chemotherapeutika darstellen, die, verglichen mit klassischen Tubulin-Inhibitoren, weniger zytotoxische Nebenwirkungen verursachen.