Ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης αντισωμάτων έναντι στον ιό Betanodavirus και έλεγχος των βιοχημικών αποκρίσεων στο είδος Dicentrarchus labrax
Creators: name: Δημητρακοπούλου, Ελένη Λεωνίδα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Betanodavirus
Εγκεφαλοπάθεια
Sandwich Elisa
Ευζωία
Στρες
Dicentrarchus labrax
Engephalopathy
VNN (Viral Nervous Necrosis)
Welfare
Stress

description: Από τις πιο σημαντικές ασθένειες της υδατοκαλλιέργειας είναι αυτή της νευρικής εγκεφαλοπάθειας και αμφιβληστροειδοπάθειας. Μέχρι σήμερα τα πρωτόκολλα που έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση του Betanodavirus είναι αρκετά, χωρίς όμως αποτελεσματικότητα όσον αφορά την ευζωία των ιχθύων. Παράλληλα, στη περίπτωση των γεννητόρων των οποίων η οικονομική αξία για την υδατοκαλλιέργεια είναι μεγάλη, η μέθοδος απομόνωσης ιστών είναι απαγορευτική. Είναι αναγκαία λοιπόν η δημιουργία μιας μεθόδου, για τη διάγνωση αυτή, με τη χρήση του ορού του αίματος των ιχθύων. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη μεθοδολογίας ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων με τη χρήση ορού από Μεσογειακό λαβράκι (Dicentrarchus labrax). Έγινε αιμοληψία σε υγιή και νοσούντα λαβράκια υδατοκαλλιέργειας και επιλέχθηκε η μέθοδος sandwich ELISA με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος anti-VNN, αντιγόνου από κυτταροκαλλιέργεια και μονοκλωνικού αντισώματος anti European sea bass. Μετά από δοκιμές με διαφορετικούς τρόπους επώασης, η ανίχνευση των αντισωμάτων ήταν δυνατή. Οι συγκεντρώσεις πρωταρχικών αντισωμάτων ήταν από 1000 ng/ mL έως 31,25 ng/mL σε συνδυασμό με τη συγκέντρωση του αντιγόνου 1:1 και 1:10. Οι διαφορές ανίχνευσης των αντισωμάτων για τις μικρότερες συγκεντρώσεις ήταν αμελητέες. Ακόμα δοκιμάστηκε η μέθοδος για αραιώσεις του αντιγόνου, σε 1:10, 1:50 και 1:100 και του πρωταρχικού αντισώματος, σε 30 ng/mL και 15 ng/mL, με τη καλύτερη απόδοση να φαίνεται για αραίωση αντιγόνου 1:50 σε συνδυασμό με το πρωταρχικό αντίσωμα έναντι του ιού στα 15 ng/mL. Παράλληλα, μελετήθηκαν βιοχημικοί παράγοντες οι οποίοι υποδηλώνουν τη παρουσία στρες, που προκαλούνται από το νόσημα, στους οργανισμούς. Η παρούσα εργασία είναι μια πρώτη προσέγγιση για την ανάπτυξη της μεθόδου η οποία μελλοντικά θα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της παρουσίας της ασθένειας στις υδατοκαλλιέργειες της Μεσογείου καθώς και την εποχιακή εξάπλωση του νοσήματος έτσι ώστε να γίνει διαχειριστικό σχέδιο αποτελεσματικής αντιμετώπισης μέσω εμβολιασμών
description: Nervous Necrosis is one of the most important diseases in aquaculture. To this day, plenty of protocols have been developed for the detection of Betanodavirus, but without effectiveness in respect of welfare. Moreover, in case of broodstock, the methodology developed on histological examination cannot be applied due to the economic significance of those organisms. The aim of the study was the development of an ELISA method for the detection of antibodies, against the virus, in the blood of Mediterranean sea bass (Dicentrarchus labrax). The samples were collected from healthy and diseased aquaculture fish and the sandwich Elisa was selected with the use of monoclonal primary antibody anti-VNN, antigen from cell culture and monoclonal secondary antibody anti European sea bass. After some tests in changing of incubation time, the detection of the antibody was possible. The concentration of the primary antibody used was from 1000 ng/ mL to 31,25 ng/mL in combination with the antigen used in concentration 1:1 and 1:10. The differences found for the concentration used of the antibody and the antigen were inconsiderable. The method was tested further for dilution of the antigen to 1:10, 1:50 and 1:100 and of the primary antibody to 30 ng/mL and 15 ng/mL, with the most efficient result for the dilution of antigen to 1:50 accompanied with the primary antibody to 15 ng/mL concentration. Also, biochemical parameters were analyzed to recognize the stress that the virus causes to sea bass. This method is the first step to reach a final protocol which could be used for the detection of the virus in Mediterranean Aquaculture and the seasonal outbrakes of the disease in order to form a management plan based on vaccination for the reduce of VNN