Evaluation of the Application of Dental Pulp-derived Stem Cells and their Secretome in the Management of Chronic Inflammatory Disorders of the Temporomandibular Joint
Creators: name: Μπουσνάκη, Μαρία I.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού
Εκκρίτωμα
Κροταφογναθική διάρθρωση
Οστεοαρθρίτιδα
Dental pulp stem cells
Secretome
Temporomandibular joint
Osteoarthritis

description: Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής (Δ.Δ.) ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας εφαρμογής των παρακρινικών προϊόντων (secretome) των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων οδοντικής προέλευσης σε σχέση με την τριάδα της ιστοτεχνολογίας (συμπλέγματα ικριωμάτων/βλαστικών κυττάρων/διεγερτικών παραγόντων) που γίνεται προσπάθεια να εφαρμοστεί τα τελευταία χρόνια, στη διαχείριση των χρόνιων φλεγμονωδών παθήσεων της Κροταφογναθικής Διάρθρωσης-ΚΦΓΔ. Στις πρώτες πειραματικές ενότητες (Μέρος 2.1 και 2.2), χρησιμοποιήθηκαν βιομιμητικά ικριώματα από φυσικά πολυμερή βιοϋλικά (χιτοζάνη/αλγινικό και χιτοζάνη/ζελατίνη) τα οποία συνδυάστηκαν με βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολτού (DPSCs), και αξιολογήθηκε η δυνατότητα προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε αυτά με έλεγχο ζωντανών/νεκρών κυττάρων, αξιολόγηση πολλαπλασιασμού/ζωτικότητας με τη μέθοδο Presto blue και ΜΤΤ, και αξιολόγηση της μορφολογίας των κυττάρων που προσκολλήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Ο έλεγχος της διαφοροποίησης με των κυττάρων και τα χαρακτηριστικά του ιστού αξιολογήθηκαν με ιστολογικές χρώσεις, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ανοσοαποτύπωση, μικροσκοπική απεικόνιση των αναγεννηθέντων ιστών με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης και συνεστιακή μικροσκοπία και ανάλυση των μηχανικών ιδιοτήτων τους. Τα προτεινόμενα συμπλέγματα κυττάρων/ικριωμάτων ευνόησαν την προσκόλληση των κυττάρων, τη βιωσιμότητα, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την άφθονη παραγωγή ινοχόνδρινης εξωκυττάριας ουσίας, οδηγώντας τελικά σε παραγωγή ιστού, με ιδιότητες που προσομοιάζουν αυτές του ανθρώπινου διάρθριου δίσκου της ΚΦΓΔ. Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω αξιολόγησης της επίδρασης τροποποιημένων περιβαλλοντικών συνθηκών στην κυτταρική συμπεριφορά και τις ιδιότητες του αναγεννημένου κατασκευάσματος, με εφαρμογή υποξίας και καλλιέργεια του συμπλέγματος κυττάρων/ικριώματος σε δυναμική καλλιέργεια με τη χρήση βιοαντιδραστήρα. Η δυναμική καλλιέργεια με βιοαντιδραστήρα σε ένα υποξικό περιβάλλον προωθούσε την άφθονη παραγωγή ινοχόνδρινης εξωκυττάριας ουσίας και ενίσχυσε τις μηχανικές ιδιότητες του αναγεννημένου ιστού. Στην 2η πειραματική ενότητα (Μέρος 3.1 και 3.2) της παρούσας Δ.Δ., πραγματοποιήθηκε πρωτεομική ανάλυση των κυτταρολυμάτων και του εκκριτώματος (παρακρινών παραγόντων που εκκρίνονται στο καλλιεργητικό μέσο)(secretome) των DPSCs υπό μεταβλητές μικροπεριβαλλοντικές συνθήκες, συμπεριλαμβανομένης της έντασης οξυγόνου (20% O2 έναντι υποξίας 2% O2) και παρουσία / απουσία προ-φλεγμονώδους διέγερσης με παράγοντα νέκρωσης όγκου (± TNF-α). Τα δείγματα συλλέχθηκαν, συμπυκνώθηκαν και υποβλήθηκαν σε τυπική ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) ακολουθούμενη από ανάλυση με υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μαζών (LC-MS / MS). Τα δεδομένα αναλύθηκαν από τις βάσεις δεδομένων Gene Ontology, Reactome και String. Οι αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες των δειγμάτων secretome αναλύθηκαν σε ένα in vitro μοντέλο φλεγμονής με χρήση μακροφάγων κυττάρων που έχουν διεγερθεί με λιποπολυσακχαρίτη (LPS), όπου ακολούθησε διερεύνηση της βιωσιμότητας/πολλαπλασιασμού κυττάρων (δοκιμασία MTT) και ανάλυση της έκφρασης γονιδίων για προ- και αντιφλεγμονώδεις δείκτες με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι συνολικά 2.413 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν στο δείγμα CM_Norm, 2.479 στο CM_Norm + TNF-a, 1.642 στο CM_Hyp και 2.002 στο CM_Hyp + TNF-α. Η σύγκριση του CM_Norm με το CM_Norm + TNF-α έδειξε ότι το πρώτο περιείχε μεγαλύτερη ποσότητα πρωτεϊνών που εμπλέκονταν σε μονοπάτια που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα. Το CM_Norm περιείχε υψηλότερες ποσότητες πρωτεϊνών που σχετίζονται με την οργάνωση και την αναγέννηση της εξωκυττάριας ουσίας, συμπεριλαμβανομένου του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-βήτα (TGFβ1, TGFβ2), κολλαγόνων (COL1A1, COL1A2, COL2A1) και αναστολέα των μεταλλοπρωτεασών (TIMP1 και TIMP2). Η εφαρμογή του secretome στο in vitro μοντέλο φλεγμονής οδήγησε σε μείωση της έκφρασης των προφλεγμονωδών δεικτών (MMP-3, MMP-9, MMP-13, MCP-1) και αύξησε την έκφραση της αντιφλεγμονώδους πρωτεΐνης IL -10. Υπό τις συνθήκες που μελετήθηκαν, το CM_Norm εμφανίστηκε ως το πιο υποσχόμενο για μελλοντική θεραπευτική χρήση. Περεταίρω τροποποίηση των μικροπεριβαλλοντικών συνθηκών (5% Ο2 και εφαρμογή του παράγοντα TNF-α για 24 ώρες έναντι 2, και συλλογή του secretome μετά από 48 ώρες έναντι 24 ώρες) και αξιολόγηση της αντιφλεγμονώδους δράσης έδειξε ότι το δείγμα που προέκυψε από τις νέες συνθήκες, CM_5%Hyp+TNF-a, φάνηκε να έχει παρόμοιες αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες με το CM_Norm ενώ εμφανίζει μειωμένη κυτταροτοξικότητα, αναδεικνύοντας έτσι την πιο υποσχόμενη σύνθεση secretome για μελλοντική θεραπευτική χρήση. Στην 3η πειραματική ενότητα (Μέρος 4) πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση του πιθανού θεραπευτικού ρόλου της βέλτιστης σύνθεσης του secretome σε ένα μοντέλο αρουραίου όπου είχε προηγηθεί πειραματικά επαγόμενη Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) της ΚΦΓΔ. Συγκεκριμένα, στις ΚΦΓΔ όλων των ζώων εργαστηρίου (ετερόπλευρα) προκλήθηκε πειραματική ΟΑ με ενδο-αρθρική έγχυση έγχυση ιωδοοξικού νατρίου και στη συνέχεια εφαρμόστηκε η θεραπεία. Υπήρχαν 2 πειραματικές ομάδες, στην 1η ομάδα πραγματοποιήθηκε αρθροκέντηση και πλύση της άρθρωσης με φυσιολογικό ορό, και στη 2η ομάδα πραγματοποιήθηκε αρθροκέντηση, πλύση με φυσιολογικό ορό και έγχυση secretome. Η αξιολόγηση του θεραπευτικού αποτελέσματος έγινε με εβδομαδιαία καταγραφή του ουδού απομάκρυνσης της κεφαλής μετά από εφαρμογή πίεση, της ποσότητας προσλαμβανόμενης τροφής και του βάρους. Επιπρόσθετα, 4 και 8 εβδομάδες μετά την έναρξη της θεραπείας έγινε ευθανασία των ζώων εργαστηρίου, μονιμοποίηση, και ακολούθησε ακτινογραφικός έλεγχος των αρθρώσεων με αξονική τομογραφία (μCT) και με ιστολογικές χρώσεις για αξιολόγηση του θεραπευτικού αποτελέσματος. Η ενδο-αρθρική τοποθέτηση του secretome είχε ως αποτέλεσμα να βελτίωση την πρόσληψη τροφής και το βάρος σε τιμές συγκρίσιμες με το φυσιολογικό. Επιπρόσθετα, η χορήγηση του secretome οδήγησε σε μείωση της φλεγμονής, όπως υποδεικνύεται από την επαναφορά του ουδού απομάκρυνσης της κεφαλής μετά από εφαρμογή πίεσης σε φυσιολογικά επίπεδα. Οι βελτιώσεις σε αυτές τις μεταβλητές ήταν στατιστικά σημαντικές σε σχέση με την ομάδα που χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός. Η ακτινογραφική αξιολόγηση των αρθρώσεων επίσης έδειξε ότι η εφαρμογή του secretome είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του πάχος των οστικών δοκίδων και την αύξηση της οστική πυκνότητας. Η ιστολογική αξιολόγηση έδειξε ότι εφαρμογή του secretome ενίσχυσε την επούλωση του ινοχόνδρινου ιστού και της επιφανειακής στιβάδας της αρθρικής επιφάνειας του κονδύλου, επούλωση και αποκατάσταση των οστικών βλαβών μέσω της διέγερσης του ενδογενούς δυναμικού επούλωσης, ανακουφίζοντας έτσι τον εκφυλισμό της ΚΦΓΔ. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν πολλά υποσχόμενα στοιχεία για μελλοντική χρήση του secretome στη διαχείριση των χρόνιων φλεγμονωδών παθήσεων της ΚΦΓΔ σαν θεραπεία χωρίς άμεση εφαρμογή κυττάρων.
description: Aim of the present thesis was to assess the application of dental pulp-derived stem cells in the management of chronic inflammatory diseases of the Temporomandibular Joint (TMJ). In Part 2.1 and 2.2 biomimetic scaffolds from natural biomaterials were combined with dental pulp stem cells (DPSCs), targeting TMJ disc regeneration. The effect of modified environmental conditions was further assessed on the cell behavior and properties of the regenerated construct, showing that dynamic culture with perfusion bioreactor in a hypoxic environment promoted abundant fibrocartilaginous ECM production, leading to a tissue construct that approaches the properties of the human TMJ disc. In Part 3 and 4, the DPSC secretome was analyzed and its potential therapeutic role was assessed in a rat model of experimentally-induced TMJ-Osteoarthritis (TMJ-OA). Secretome characterization revealed the abundant presence of proteins with anti-oxidative, anti-inflammatory and regenerative properties. In vivo application of secretome suppressed inflammation, enhanced cartilage repair and subchondral bone repair and regeneration through stimulating endogenous healing potential, thus alleviating TMJ degeneration.