title: Functional analyses of inner brain opsins in Zebrafish and Medaka
Creators: name: Tondl, Markus
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Es ist nun schon etwa 100 Jahre her, dass Karl von Frisch und Ernst Scharrer bei Elritzen Reaktionen auf Licht feststellten, auch wenn den Fischen Augen und Epiphyse operativ entfernt worden waren. Ähnliche Experimente an Wachteln führten ebenfalls zu der Erkenntnis, dass die Tiere nach wie vor auf Licht reagierten. Vor etwa 50 Jahren wurde darüber hinaus gezeigt, dass Licht sogar imstande ist, in die tieferen Gehirnregionen größerer Säugetiere wie z.B. Schafe vorzudringen. Obwohl diese Phänomene schon seit Jahrzehnten bekannt sind, ist die Funktion des Gehirns auf Licht zu reagieren weiterhin unklar. In unserem Labor arbeiten wir unter anderem mit Zebrabärblingen und Medaka. Beide Fischarten leben in unterschiedlichen Lebensräumen und sind verschiedener Saisonalität ausgesetzt. Während Medaka sich an sich ändernde Tageslängen über das Jahr angepasst hat, ist der Zebrabärbling an die An- und Abwesenheit vom Monsun angepasst. Beide Tierspezies entwickeln sich seit ungefähr 300 Millionen Jahren unabhängig voneinander; das entspricht etwa derselben Zeitspanne wie zwischen Vögeln und Säugetieren. Es ist interessant, dass beide Fischarten dennoch dieselben Photorezeptoren in ihren Gehirnen exprimieren, lässt es doch auf deren Wichtigkeit schließen. Säugetiere besitzen Encephalopsin, das der Subfamilie der TMT-Opsine der Fische sehr ähnlich ist. In der vorliegenden Arbeit verfolgten wir zwei verschiedene Ansätze, um der Funktion der Opsine auf die Spur zu kommen. Einerseits schalteten wir das Gen selbst aus, andererseits haben wir mit Fluoreszenz-Farbstoffen versucht, die Genprodukte zu markieren. Mit der TALEN-Technologie unterbanden wir die Expression von funktionellen TMT-Opsinen in Medaka. Unter Verwendung von Red/ET recombineering wollten wir den Marker für cholinerge Neuronen mit dem grünen Fluoreszenz-Farbstoff eGFP ersetzen. In einem anderen Projekt haben wir beide Ansätze kombiniert: so zerstörten wir tmt-1B in Medaka mit TALEN, stellten allerdings gleichzeitig ein kurzes DNA-Stück mit homologen Enden zur Verfügung, das die Zelle, den Doppelstrangbruch reparierend, eingebaut hat. Die DNA enthält die Sequenz von attP. Im nächsten Schritt injizieren wir ein Konstrukt mit attB und EGFP gemeinsam mit mRNA der φC31-Integrase, die, erst einmal translatiert, attP and attB miteinander unidirektional rekombiniert, was eGFP unter den Promotor von tmt-1B exprimiert. Dadurch lässt sich einerseits das Expressionsmuster von tmt-1B in vivo nachvollziehen, andererseits erleichtert es das Patchen cholinerger Zellen bei elektrophysiologischen Arbeiten. Zusammenfassend hoffe ich, mit meiner Arbeit einen Beitrag geleistet zu haben damit schließlich die Funktion der Opsine des Zebrabärblings und von Medaka aufgeklärt werden kann.
description: About 100 years ago Karl von Frisch and Ernst Scharrer demonstrated that minnows react to light even without eyes and pineal. Experiments with quails confirmed the reaction to light in ophtal- and pinealectomized animals. About 50 years ago BRUNT et al. reported that measur-able amounts of light penetration even reach into deep inner brain parts in mammals. Hitherto, several photoreceptors in the eye and in specific brain regions have been identified. However, their function is still unclear. We are working with the two teleosts zebrafish and medaka, which live in two different habitats and are exposed to different kinds of seasonality: medaka is exposed to a steady change in day length over the year, whereas zebrafish experiences monsoon season. Both fish species have been evolving independently of each other for about 300 million years; the same period as between birds and mammals. Interestingly, both fish express G protein-coupled photoreceptors (tmt-opsins and Valop) within their brains, suggesting functional im-portance. Furthermore, both teleosts possess encephalopsin, which is also known to be pre-sent in mammals. TMT opsins and encephalopsin are closely related, which makes zebrafish and medaka interesting model organisms for studying the function of tmt-opsins and encephalopsin. We used two different approaches to start elucidating the role of inner brain opsins: loss of function and labeling gene products in vivo. We used TALEN technology to knock out opsins. In addition, we tried to label cholinergic cells with fluorescent dyes using Red/ET recombineering. One interesting project combined both approaches: a knock-out of tmt-1B with TALENs and a knock-in of eGFP to label tmt-1B expressing cells. Therefore, we used the φC31 inte-grase with attP and attB. We co-injected TALEN mRNA for exon 1 of tmt-1B together with an ssDNA Oligo containing attP40 flanked by short homology arms. The DNA is cut by TALENs, the ssDNA Oligo serves as a template, and the cell integrates attP via homology-directed repair. In the next step a construct of attB and eGFP will be injected together with φC31 integrase mRNA. After translation, the φC31 integrase will recombine attP and attB unidirection-ally. The cells are now lacking tmt-1B and express EGFP instead, which can be traced under fluorescent light in vivo. Thus, we are able to observe where tmt-1B is expressed; moreover, the labeled cells ease patching in electrophysiology assays.