Μοριακή έρευνα και επιδημιολογική συσχέτιση στελεχών ψευδομονάδων που παράγουν μεταλλο-Β-λακταμάσες
Creators: name: Μπισικλής, Αλέξανδρος Γ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Μεταλλο-β-λακταμάσες
Γονίδια αντοχής
Αντιμικροβιακή αντοχή
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου
Μοριακή επιδημιολογία
Pseudomonas aeruginosa
Metallo-b-lactamases
Resistance genes
Antimicrobial resistance
Real-time PRC
Molecular epidemiology

description: Η ιμιπενέμη και η μεροπενέμη είναι β-λακταμικά αντιβιοτικά που ανήκουν στις καρβαπενέμες και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία λοιμώξεων από Pseudomonas aeruginosa είτε ως μονοθεραπεία, είτε σε συνδυασμό με άλλα αντιβιοτικά τα οποία έχουν αντιψευδομοναδική δράση. Οι μεταλλο-β-λακταμάσες αποτελούν τον νεώτερο μηχανισμό αντοχής στην ιμιπενέμη και στη μεροπενέμη. Οι μεταλλο-β-λακταμάσες ταξινομούνται σε 5 υποτάξεις που ονομάζονται IMP, VIM, SPM, GIM και SIM. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν: α) η μοριακή διερεύνηση των μεταλλο-β-λακταμασών ως επίκτητου μηχανισμού αντοχής στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη σε στελέχη Pseudomonas aeruginosa, β) η μοριακή διερεύνηση διασποράς στο νοσοκομειακό χώρο των στελεχών Pseudomonas aeruginosa με γονίδιο μεταλλο-β-λακταμάσης, και γ) ο προσδιορισμός παραγόντων κινδύνου για την εμφάνιση ανάλογων στελεχών. Για το λόγο αυτό εξετάσθηκαν 361 στελέχη Pseudomonas aeruginosa, τα οποία απομονώθηκαν από την καλλιέργεια δειγμάτων που λήφθηκαν από ασθενείς, νοσηλευτικό προσωπικό και το χώρο του νοσοκομείου. Τα 106 ανθεκτικά στην ιμιπενέμη και μεροπενέμη στελέχη (ποσοστό 29,3%) εξετάσθηκαν φαινοτυπικά για την παραγωγή μεταλλο-β-λακταμάσης. Ποσοστό 35,8% των ανθεκτικών στελεχών παρήγαγαν μεταλλοένζυμο. Με τη δοκιμασία της Real-Time PCR και την εφαρμογή ενός νέου πρωτοκόλλου, εμπνευσμένο από τις ανάγκες τις μελέτης, ανιχνεύθηκε blaVIM γονίδιο στα 38 από τα 106 (ποσοστό 35,8%) ανθεκτικά στις καρβαπενέμες στελέχη Pseudomonas aeruginosa. Το πρωτόκολλο δίνει τη δυνατότητα ελέγχου σε μία αντίδραση 15 από τα 22 blaVIM και 11 από τα 24 blaIMP γονίδια. Με τη μέθοδο της αλληλούχισης ( DNA Sequencing) βρέθηκε ότι στα 33 από τα 38 στελέχη το blaVIM γονίδιο ήταν τμήμα της μεταβλητής περιοχής του ιντεγκρονίου τάξης 1. Στα 28 από τα 32 στελέχη, το blaVIM-2 γονίδιο συνυπήρχε στην μεταβλητή περιοχή του ιντεγκρονίου με γονίδιο αντοχής αμινογλυκοσίδης. Με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο έγινε ανάλυση του DNA των στελεχών με blaVIM γονίδιο και από τη σύγκριση των ηλεκτροφορητικών αποτυπωμάτων τους προέκυψε ότι υπήρξαν τέσσερις επιδημικοί κλώνοι με διασπορά σε διάφορα τμήματα και μονάδες εντατικής θεραπείας του νοσοκομείου. Η στατιστική ανάλυση επιδημιολογικών δεδομένων των ασθενών, που έγινε με τη δοκιμασία x2 (Chi-squere test) έδειξε ότι υπάρχουν παράγοντες κινδύνου, όπως η νοσηλεία με μονάδα εντατικής, η διασωλήνωση, η τοποθέτηση ουροκαθετήρα, ρινογαστρικού καθετήρα και η λήψη κορτικοστεροειδών, η παρουσία των οποίων είναι καταλυτική για την εμφάνιση στελεχών Pseudomonas aeruginosa με αντοχή στις καρβαπενέμες
description: Imipenem and meropenem are b- lactams which belong to carbapenems and are used for the treatment of infections caused by Pseudomonas aeruginosa either as monotherapy or in combination to other drugs with anti-pseudomonal action. Metallo-b-lactamases consist of the most novel mechanism of resistance to imipenem and meropenem. Metallo-b-lactamases are classified into 5 subgroups which are named IMP, VIM, SPM, GIM and SIM. The aim of this thesis was: a) the molecular investigation of metallo-b-lactamases as an acquired mechanism of resistance to imipenem and meropenem in Pseudomonas aeruginosa isolates b) the molecular detection of dissemination of Pseudomonas aeruginosa isolates with metallo-b-lactamase gene in the nosocomial setting c) the determination of risk factors for the development of these isolates. For these purposes, a total of 361 clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa were isolated from cultures of specimens collected from hospital patients, personnel and hospital environment. The 106 isolates resistant to imipenem and meropenem (29,3%) were phenotypically tested for the production of metallo-b-lactamase. 35,8% of the resistant strains were positive for the metalloenzyme. Real-Time PCR and a new protocol was performed based on the needs of this study and thus blaVIM gene was detected in 38 out of 106 isolates of Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenems (35,8%). This protocol provides the advantage of testing 15 out of 22 blaVIM and 11 out of 24 blaIMP genes in one reaction. Using the DNA Sequencing method it was revealed that in 32 out of 38 isolates blaVIM gene was part of the variable region of the integron class 1.In 28 out of 32 isolates, blaVIM-2 gene co-existed in the variable region of the integron area with an aminoglycoside resistant gene. Using palse field gel electrophoresis (PFGE), DNA analysis of the isolates which carried the blaVIM gene was performed and the comparison of their electrophoretic profiles showed that four epidemic clones existed with dissemination to different parts and intensive care units of the hospital. Statistical analysis of the patients’ epidemiological data using x2 test (Chi-square test) showed that risk factors exist, such as treatment in the intensive care unit, intubation, installation of urocatheters, rhinogastric catheterization, administration of corticosteroids,. The presence of these risk factors is crucial for the development of Pseudomonas aeruginosa strains resistant to carbapenems.Finally, statistical analysis revealed that patient mortality is statistically significantly relevant to infections caused by pseudomonas spp resistant to carbapenems