Upgrading a pyrolytic side stream by utilization as substrate for fungal L-malic acid production
Creators: name: Kubisch, Christin
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2023

description: Der Klimawandel, das zunehmende Bevölkerungswachstum sowie die damit verbundene Verknappung von Ressourcen zählen zu den zentralen Herausforderungen des 21. Jahrhunderts und erfordern langfristig eine Umstrukturierung der auf fossilen Energieträgern basierenden Wirtschaft hin zu einem verstärkten Einsatz nachwachsender Rohstoffe in ressourcenschonenden, kreislauffähigen Prozessen. Lignocellulosehaltige Restströme aus der Land- und Forstwirtschaft eignen sich in besonderem Maße als solche Rohstoffe, da sie dank ihrer hohen Verfügbarkeit kostengünstig sind und zudem den Vorteil bieten, nicht in Konkurrenz zur Lebensmittelindustrie zu stehen. Das wässrige Kondensat, das bei der pyrolytischen Umwandlung von Weizenstroh zu flüssigen Biokraftstoffen entsteht, fällt aufgrund seines hohen Wassergehalts und niedrigen Heizwertes derzeit als ein solcher lignocellulosebasierter Reststrom an. Es enthält jedoch diverse organische Kohlenstoffverbindungen, die es für eine stoffliche Verwertung als Substrat in mikrobiellen Fermentationen interessant machen. Als besonders vielversprechend ist dabei der Einsatz für eine biotechnologische L-Äpfelsäureproduktion mit dem Schimmelpilz Aspergillus oryzae anzusehen, da der natürliche Säureproduzent in der Lage ist, mit Acetat einen der Hauptbestandteile des Pyrolysekondensats zu verstoffwechseln. Da Äpfelsäure aktuell weitestgehend über chemische Synthese aus fossilen Rohstoffen gewonnen wird, könnte mit diesem Vorhaben gleichzeitig das Anfallen eines ungenutzten Reststromes vermieden und ein bio-basierter Säureproduktionsprozess etabliert werden, der aufgrund der geringen Substratkosten wirtschaftlich konkurrenzfähiger zu herkömmlichen Herstellungsverfahren ist. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand daher in der Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung dieser vor allem für die Lebensmittelindustrie bedeutsamen organischen Säure auf Basis des Pyrolysekondensats. Da das sogenannte Schwelwasser neben verwertbaren Kohlenstoffen jedoch auch eine Vielzahl an Komponenten enthält, die das mikrobielle Wachstum erschweren, wurden in der aktuellen Arbeit auch potentielle Ansätze zur Erhöhung der pilzlichen Toleranz gegenüber dem Pyrolysekondensat untersucht. Mittels Transkriptom-Analyse sollten dafür im 3. Kapitel dieser Dissertation Gene identifiziert werden, die bei der Verwendung von Schwelwasser als Substrat in Schüttelkolbenkulturen eine stark veränderte Expression im Vergleich zu Glucose und Acetat aufweisen. Solche Gene könnten in Zukunft als Ansatzpunkte für Manipulationen des Genoms von A. oryzae interessant sein, die auf die Verbesserung der Schwelwasserverwertbarkeit abzielen. Da Acetat ein Hauptbestandteil des Schwelwassers ist, zeigten sich für beide Substrate verglichen mit Glukose teilweise ähnliche Änderungen in der Genexpression. Als zentrale transkriptionelle Reaktion auf das Wachstum in den acetathaltigen Kulturen wurde dabei die Hochregulierung von Genen beobachtet, die mit dem Glutathion-System sowie der Biosynthese der Aminosäuren Arginin, Serin, Cystein und Tryptophan assoziiert sind. Solche Expressionsänderungen wurden bereits als typische Reaktion auf externe Stressoren beschrieben und zeigen demnach, dass selbst der Einsatz von Acetat als alleiniges Substrat eine pilzliche Stressantwort induziert. Über den direkten Vergleich der Genexpression bei Wachstum auf Acetat und Schwelwasser konnte zudem ein Einblick in die transkriptionelle Antwort von A. oryzae auf die im Pyrolysekondensat vorhandenen Inhibitoren gewonnen werden. Der Pyruvat-Metabolismus erwies sich dabei als der einzige Stoffwechselweg mit einer signifikant unterschiedlichen Expression und umfasste in erster Linie Gene, die für verschiedene Alkoholdehydrogenasen sowie für am Abbau von Methylglyoxal beteiligte Enzyme kodieren. Zudem hatte sich bei Wachstum auf Schwelwasser eine stark erhöhte Expression eines sogenannten „old yellow enzymes“ ergeben. All diese Enzyme sind von großem Interesse für die Erhöhung der pilzlichen Schwelwassertoleranz mittels genetischer Modifikation, da sie mit dem Abbau der teils toxisch wirkenden Schwelwasserkomponenten Furfural, Acetol und 2-Cyclopenten-1-on in Verbindung stehen. Aber auch eine gezielte Variation des Expressionslevels von Genen des Glutathion-Systems und der Aminosäuresynthese können sich positiv auf die allgemeine Stressresistenz des Pilzes auswirken und zukünftig das Wachstum auf Schwelwasser erleichtern. Da der A. oryzae DSM1863 Wildtypstamm ohne eine vorherige Entfernung inhibierender Komponenten nicht in der Lage ist, das Schwelwasser als Substrat zu nutzen, musste bereits im Vorfeld der Transkriptom-Analyse eine Detoxifizierung des Pyrolysekondensats mittels Overliming, Rotationsverdampfen und anschließender Aktivkohlebehandlung erfolgen. Die dadurch erzielte Steigerung der pilzlichen Schwelwassertoleranz war jedoch nicht ausreichend, um eine Malatproduktion zu gewährleisten, so dass im Kapitel 4 dieser Arbeit eine weitere Optimierung der Vorbehandlungsprozedur angestrebt wurde. Neben den bereits genannten Methoden zur Detoxifizierung des Schwelwassers wurde auch eine enzymatische Behandlung mit Laccase aus dem Weißfäulepilz Trametes versicolor durchgeführt, die sich vor allem gegen phenolische Komponenten des Kondensats richtet. Für jede einzelne Vorbehandlungsmethode wurden diverse Reaktionsbedingungen untersucht und die Detoxifizierungseffizienz anhand von Wachstumstests und der Analyse ausgewählter Schwelwasserkomponenten beurteilt. Dabei zeigte sich für die Laccasebehandlung trotz der Entfernung phenolischer Substanzen mit einem Wachstum auf maximal 1,25 % Schwelwasser keine nennenswerte Verbesserung der pilzlichen Toleranz im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Im Gegensatz dazu ermöglichten die Behandlungen mit Aktivkohle, Overliming und Rotationsverdampfung unter optimierten Bedingungen ein pilzliches Wachstum auf Schwelwasserkonzentrationen von bis zu 1,625 %, 12,5 % bzw. 30 %. Als optimal wurde dabei für die Aktivkohlebehandlung eine Kohlenstoffkonzentration von 10 % und eine Behandlungsdauer von 10 min ermittelt, während die Overlimingbehandlung idealerweise bei einem mit NaOH eingestellten initialen pH-Wert von 12 und 100 °C durchgeführt werden sollte. Die besten Detoxifizierungsergebnisse wurden mit der 4-stündigen Rotationsverdampfung bei 200 mbar erzielt, da eine vollständige Entfernung von Guajakol und eine starke Verringerung der Konzentrationen von Acetol, Furfural, 2-Cyclopenten-1-on und Phenol um 84,9 %, 95,4 %, 97,7 % bzw. 86,2 % beobachtet wurden. Nach der Identifizierung der optimalen Reaktionsbedingungen wurden Kombinationen der einzelnen Detoxifizierungsmethoden durchgeführt und festgestellt, dass eine sequentielle Behandlung des Pyrolysekondensats mittels Rotationsverdampfung, Overliming und Aktivkohle die Nutzung von 100 % Schwelwasser als alleiniges Substrat für das Wachstum von A. oryzae ermöglicht. In Kapitel 5 dieser Dissertation wurde schließlich evaluiert, inwieweit sich das Kondensat aus der Schnellpyrolyse nach einer Behandlung mit dem optimierten Detoxifizierungsverfahren auch für die pilzliche L-Äpfelsäureproduktion eignet. Nachdem die Transkriptom-Analyse bereits erste Hinweise darauf ergeben hatte, sollte jedoch zuvor geprüft werden, ob mit Acetol auch der zweite Hauptbestandteil des Schwelwassers von A. oryzae als Substrat verwertet werden kann. Es wurden daher verschiedene Konzentrationen des Ketons als alleinige C-Quelle sowie in einfachen Schwelwassermodellmischungen mit 40 g/L Acetat auf ihre Eignung für die pilzliche Biomassebildung und Malatproduktion untersucht. Dabei zeigte sich, dass Acetolgehalte von bis zu 40 g/L für das Wachstum von A. oryzae eingesetzt werden können, wobei jedoch mit steigender Konzentration eine zunehmende Inhibierung festgestellt wurde. Eine Äpfelsäureproduktion alleine auf Basis des Ketons schien hingegen nicht möglich. Auch in den Kultivierungen mit Modellschwelwässern war eine zunehmende inhibierende Wirkung des Ketons zu beobachten, so dass für Konzentrationen über 20 g/L Acetol weder Wachstum noch eine Malatproduktion verzeichnet werden konnten. Demnach erscheint eine Entfernung des Ketons aus dem Schwelwasser über entsprechende Vorbehandlungen in der Tat notwendig, um eine effektive Säureproduktion zu gewährleisten. Mithilfe der optimierten Detoxifizierungsprozedur aus dem vorherigen Kapitel konnte die Acetolkonzentration im Schwelwasser auf ca. 3 g/L herabgesetzt und so in einer ersten Schüttelkolbenkultivierung ein maximaler Malattiter von 3,37 ± 0,61 g/L erzielt werden. Der hohe pH-Wert der Kulturen wurde dabei als ein kritischer Faktor identifiziert, der die Produktion noch höherer Äpfelsäurekonzentrationen verhinderte. Es erfolgte daher nachfolgend eine Optimierung des Anfangs-pH-Wertes unter Verwendung von 96 % Schwefelsäure und 100 % Essigsäure, die eine Steigerung der Malatproduktion auf 8,29 ± 0,26 g/L bzw. 9,77 ± 0,55 g/L ermöglichte. Abschließend wurde ein Scale-up des optimierten Prozesses in 500 mL Bioreaktoren vorgenommen und dabei mit einer Gesamtproduktivität von 0,051 ± 0,002 g/(L∙h) der bisher höchste Wert unter allen in dieser Arbeit durchgeführten Schwelwasserkultivierungen erzielt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Verwendung des Pyrolysekondensats als Substrat für die Malatproduktion mit A. oryzae durch die Wahl geeigneter Detoxifizierungsmethoden grundsätzlich realisierbar ist. Um jedoch eine möglichst ganzheitliche Verwertung des Schwelwassers zu gewährleisten und die Kosten und den Aufwand für Vorbehandlungen so gering wie möglich zu halten, sollte auch der Ansatz einer genetischen Modifikation des Pilzes zukünftig weiterverfolgt werden. Mit dieser Arbeit wurde eine gute Grundlage für solche Ansätze geschaffen, da Gene identifiziert wurden, die an der Reaktion des Pilzes auf das Vorhandensein von Schwelwasser und den darin enthaltenen Inhibitoren beteiligt sind.