title: Flagellar motor tuning - The hybrid motor in Shewanella oneidensis MR-1
title: Flagellar motor tuning - The hybrid motor in Shewanella oneidensis MR-1
title: Flagellenmotor-Tuning - Der Hybridmotor in Shewanella oneidensis MR-1
Creators: name: Paulick, Anja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Flagellenmotor
Biowissenschaften, Biologie
Bacteria
Bakterien
Flagellar motor
Flagellen
Motility
Flagella
Bewegung
Shewanella oneidensis MR-1

description: Bakterien sind in ihren
      Lebensräumen ständig wechselnden Bedingungen ausgesetzt. Dies
      erfordert eine aktive und gerichtete Fortbewegung, um das
      Überleben und die Anpassungsfähigkeit zu sichern. Ein höchst
      effizienter Weg der Fortbewegung wird durch die Rotation von
      Flagellen vermittelt. Der Modellorganismus Shewanella
      oneidensis MR-1 stammt – im Gegensatz zu anderen Shewanellen
      – aus einem Süßwasserhabitat und besitzt eine polare
      Flagelle, die sowohl von einem natriumabhängigen PomAB- als
      auch von einem protonenabhängigen MotAB-Statorsystem
      getrieben werden kann. Zwar wird der Flagellenmotor in S.
      oneidensis in erster Linie von PomAB betrieben, jedoch sind
      beide Statorsysteme durchgehend präsent und werden für
      maximale Geschwindigkeit der Flagellenrotation unter
      natriumlimitierenden Bedingungen benötigt. Für die Erzeugung
      des Drehmoments, bzw. der Rotation der Flagelle ist der
      Flagellenmotor – bestehend aus einem rotierendem Element, dem
      Rotor, und mehreren statischen Elementen, den Statoren – von
      essentieller Wichtigkeit. Obwohl die Statoren – welche den
      Rotor als ringähnliche Struktur einfassen – zur Erzeugung des
      Drehmoments fest in der Zellwand verankert sind, werden
      dessen Elemente stetig ausgetauscht, was erstaunlicherweise
      auch während der Rotation des Motors funktioniert. Klar ist
      bislang nur, dass sowohl Natrium- als auch Protonenabhängige
      Statoren denselben Motor antreiben können, jedoch wurde noch
      nie ein Hybridmotor beschrieben für dessen volle Leistung
      zwei verschiedene, gleichzeitig arbeitende Statorsysteme
      unabdingbar sind. Das wirft die Frage auf, wie PomAB und
      MotAB von S. oneidensis in einem Flagellenmotorsystem
      arbeiten. Während meiner Arbeit konnte ich ein neuartiges
      Modell für den dynamischen Statoraustausch, als Anpassung an
      unterschiedliche Salzkonzentrationen, im Flagellenmotor von
      S. oneidensis entwerfen. Eine wichtige Voraussetzung für
      dieses Modell war eine synchrone und von der
      Salzkonzentration unabhängige Expression von pomAB und motAB,
      deren Nachweis über transkriptionelle Fusionen an lucB
      erbracht wurde. Mit Hilfe von Fluoreszensfusionen der
      B-Untereinheiten der Statoren an mCherry wurde deutlich, dass
      eine Fraktion von PomB – im Gegensatz zu MotB – unabhängig
      von der Natriumkonzentration polar lokalisiert. Bei hohem
      Salzgehalt wird PomB effizienter rekrutiert und erschwert
      somit vermutlich den Einbau von MotAB in den Statorring.
      Dagegen ließ das Lokalisationsmuster unter niedrigen
      Natriumkonzentrationen auf einen zeitgleichen Einbau von
      PomAB und MotAB in den Statorring schließen.
      Interessanterweise wird MotB in Abwesenheit von PomAB unter
      allen Natriumbedingungen zum flagellierten Pol rekrutiert.
      Wird jedoch PomAB wieder produziert, wird MotAB aus dem
      Statorring in die Membran verdrängt und von PomAB ersetzt.
      Über eine Quantifizierung von sfGfp-PomB Molekülen wurde
      deutlich, dass sich die Anzahl von mindestens neun in
      salzhaltiger auf fünf PomAB Komplexe in salzarmer Umgebung
      reduziert. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die
      Inkorporation von PomAB dynamisch und in direkter Antwort auf
      die Natriumbedingung erfolgt, während die Rekrutierung von
      MotAB von der Anzahl an inkorporierten PomAB Statoren
      abhängig ist. Zwei weitere Proteine, MotX und MotY wurden im
      Laufe dieser Arbeit als essentiell für die Funktionalität,
      jedoch nicht für die Rekrutierung, von PomAB oder MotAB in
      den Flagellenmotor beschrieben. Zusammenfassend unterstützen
      diese Daten das Modell des dynamischen Statoraustausches zur
      Anpassung des Flagellenmotors an wechselnde
      Umweltbedingungen. Der zeitgleiche Einbau von PomAB und MotAB
      in einen funktionellen Statorring lässt auf die Existenz
      eines Hybridmotors in S. oneidensis schließen. Es bleibt zu
      zeigen, welche Rolle MotAB in diesem bislang einzigartigen
      Hybridmotor übernimmt. Daher sole sich nun der zweite
      Abschnitt meiner Arbeit mit der biophysikalischen
      Charakterisierung des Flagellenmotors auf Einzelzellebene und
      somit mit der Analyse der Beteiligung von MotAB und PomAB an
      der Flagellenrotation beschäftigen. Dafür wurden zwei Assays
      etabliert, zum einen der “bead assay” und zum anderen der
      “tethered cell assay”. Die Vorrausetzungen dafür waren, eine
      lateral lokalisierte Flagelle und ein Antikörper gegen
      natives Flagellin, um sowohl die Anheftung der “beads” an die
      Flagelle, als auch die Anheftung der Flagelle an eine
      Oberfläche zu gewährleisten. Während der “Bead Assay” auf
      Kurzzeitmessungen beschränkt war, konnte der “tethered cell
      assay” funktional etabliert werden. Letzterer erlaubt nun
      einen konstanten Pufferwechsel und eine Modulierung des
      Statorproteinlevels. Erste Ergebnisse zeigten, dass der Motor
      des Wildtyps bei geringen Natriumkonzentrationen signifikant
      schneller rotiert, als der rein natriumabhängige Motor.
      Desweiteren konnte über die kontrollierte Produktion von
      PomAB ein schrittweiser Anstieg der Rotationsgeschwindigkeit
      beobachtet werden. Die Produktion von MotAB hingegen senkte
      die Geschwindigkeit eines PomAB-getriebenen Motors
      schrittweise ab. In anderen Arbeiten konnte bereits zuvor
      gezeigt werden, dass MotAB-getriebene Motoren geringere
      Rotationsgeschwindigkeiten erreichen, als PomAB-getriebene.
      Diese Ergebnisse deuten auf einen Einbau von MotAB hin, was
      in der Folge zu einem Abbremsen des PomAB getriebenen Motors
      führt. Die alleinige Produktion von MotAB konnte die Rotation
      des Zellkörpers nicht wiederherstellen. Jedoch können Zellen,
      welche nur MotAB besitzen, schwimmen, was impliziert dass
      MotAB prinzipiell funktional ist. Statorhomolgievergleiche
      deuten darauf hin, dass MotAB erst vor kurzem – vermutlich
      über lateralen Gentransfer in Zusammenhang mit der Anpassung
      an niedrige Salzbedingungen im Oneida See – in S. oneidensis
      gelangte. Die Aufnahme eines protonenabhängigen Stators
      erleichtert eventuell die Rotation der Flagelle im
      natriumarmen Süßwasserhabitat. Eine bioinformatischen Analyse
      aller sequenzierten bakteriellen Genome zeigte, dass multiple
      Statorsets bei Organismen mit nur einem Flagellensystem
      häufiger vorkommen, als bisher angenommen. Der dynamische
      Statoraustausch, mit dem S. oneidensis vermutlich seinen
      Flagellenmotor adaptiert, könnte auch in anderen Organismen
      eine Strategie zur Anpassung an schnell wechselnde
      Umweltbedingungen darstellen. S. oneidensis besitzt einen
      Hybridmotor, der sich vermutlich noch immer in einem Prozess
      der Optimierung befindet. Die spezifische Charakterisierung
      von MotAB und dessen Beitrag zur Rotation in einem dual
      getriebenen Statorring ist notwendig, um die Existenz eines
      funktionalen Hybridmotors auf biophysikalischer Ebene zu
      beweisen.
description: Bacteria are exposed to constantly
      changing environments. An efficient way to navigate towards
      favourable conditions is flagella-mediated motility.
      Flagellar rotation is achieved by the bacterial flagellar
      motor, composed of the rotor and stator complexes which
      surround the rotor in a ring-like structure. As an exception
      among the Shewanella species, the fresh-water organism S.
      oneidensis MR-1 harbours two different stator complexes, the
      sodium-ion dependent PomAB and the proton-dependent MotAB,
      differentially supporting rotation of a single polar
      flagellum. Both PomAB and MotAB are simultaneously present
      and required for full speed under low sodium-ion conditions.
      Although tightly anchored to the cell wall, stators are
      constantly exchanged even during ongoing rotation. Moreover,
      sodium-ion and proton-dependent stators can function with the
      same rotor. This raises the question of how PomAB and MotAB
      contribute to rotation of a single flagellum and whether
      PomAB and MotAB coexist in the stator ring of S. oneidensis
      MR-1, forming a hybrid motor. Here, I report a novel model
      for the dynamic adaptation of the rotor-stator configuration
      in response to the environmental sodium ion level in S.
      oneidensis MR-1. Transcriptional fusions to lucB revealed
      that both pomAB and motAB are concurrently transcribed. By
      using fluorescence microscopy, functional fusions of mCherry
      to the B-subunits revealed that in sharp contrast to MotB, a
      fraction of PomB is polarly positioned independently of the
      sodium-ion concentration. At low sodium-ion concentration,
      PomB and MotB appear to coexist in the flagellar motor.
      However, in the absence of PomAB, MotB is recruited to the
      flagellated pole independently of the sodium-ion
      concentration. Interestingly, induced production of PomAB
      displaces polar MotB from the motor and confines it to the
      membrane. By quantifying single sfGfp molecules fused to
      PomB, I could show that the number of PomB in the stator ring
      is reduced from nine to five complexes when cells were
      shifted from a high to a low sodium-ion concentration. Thus,
      the incorporation efficiency of PomAB is directly modified in
      response to the sodium-ion concentration, whereas the
      association of MotAB into the stator ring rather depends on
      the presence of PomAB. Furthermore, two auxiliary proteins,
      MotX and MotY, were identified and shown to be essential for
      functionality of both PomAB and MotAB. Localisation studies
      revealed that, in contrast to Vibrio MotXY are not required
      for recruitment of the stator complexes to the flagellated
      pole. Taken together, my data support the model of dynamic
      stator swapping to tune the flagellar motor in response to
      environmental conditions, e.g. the availability of sodium
      ions. The concurrent presence of PomB and MotB at low
      sodium-ion concentration suggests the existence of a hybrid
      motor in S. oneidensis. Since it remains to be demonstrated
      whether MotAB stators are functionally incorporated in this
      hybrid motor, the second aim of this work was to
      biophysically analyse the contribution of MotAB and PomAB to
      motor rotation at the single cell level. To this end, a ‘bead
      assay’ and a ‘tethered cell assay’ were established. These
      set-ups required the delocalisation of the polar filament to
      a lateral position, the preparation of a highly specific
      antibody against the modified filament and, for the bead
      assay the attachment of polystyrene beads to the filament.
      While the bead assay was limited to short-term measurements,
      the tethered cell assay was optimised for long-term studies.
      The optimisation now permits a constant buffer exchange as
      well as the modulation of the stator complex level by an
      inducible promoter upstream of pomAB and motAB. Single cell
      analysis comparing the wild-type and the PomAB-driven motor
      revealed a significantly higher rotation speed for the
      wild-type motor at low sodium-ion concentration. Moreover,
      induced production of PomAB in a stator deletion background
      resurrected rotation speed in a stepwise manner, whereas
      production of MotAB in a PomAB-driven motor decreased
      rotation speed stepwise. These results strongly indicate that
      MotAB is incorporated into the force-generating
      PomAB-occupied stator ring, slowing down motor rotation.
      MotAB production in a stator deletion background did not
      restore rotation. However, swimming assays revealed that
      MotAB is sufficient to drive flagellar rotation in a
      subpopulation of cells, strongly suggesting that both stators
      are able to function together in a single motor. To clearly
      characterise the role of MotAB and PomAB in the hybrid motor
      of S. oneidensis MR-1 further biophysical studies are
      required. The genome wide bioinformatic analysis of all
      sequenced bacterial genomes revealed that dual or multiple
      stator complexes along with a single flagellar system are
      surprisingly widespread among bacterial species. Moreover,
      stator complex homology comparison in S. oneidensis MR-1
      indicated that MotAB has recently been acquired by lateral
      gene transfer as a consequence of adaptation to a fresh-water
      environment. Thus, the flagellar motor might still be in a
      process of optimisation. Collectively, I hypothesize that S.
      oneidensis tunes its flagellar motor by exchanging stator
      complexes and that stator swapping represents a common
      mechanism applicable to other bacteria to adapt to changing
      environments.