Kinetic characterisation of microgram quantities of myosins using a novel flash photolysis apparatus
Creators: name: Weiß, Stefan
Publisher: name: Universität Dortmund
Year: 2002
Subjects: subject: myosin
subject: actin
subject: flash photolysis
subject: caged ATP
subject: kinetic studies
subject: muscle
subject: stopped-flow
subject: Toxoplasma gondii
subject: Myosin
subject: Aktin
subject: Blitzlichtphotolyse
subject: Kinetische Studien
subject: Muskel
subject: 540

description: Im Muskel wird Kraft erzeugt durch die zyklische Interaktion der Proteine Myosin und Aktin unter Hydrolyse von ATP. Traditionelle kinetische Methoden, wie z.B. Stopped-Flow oder Queched-Flow, haben viel dazu beigetragen, die molekularen Grundlagen zu erforschen, auf der die Muskelkontraktion basiert. Allerdings brauchen diese Methoden relativ große Proteinmengen (&gt; 0,1 mg) und sind daher auf Extraktion der Proteine aus ganzen Muskeln oder Proteinpräparationen von effektiven Expressionssystemen beschränkt.In dieser Arbeit wird ein Blitzlichtphotolyse-(Flash Photolysis)-System vorgestellt, in dem die Freisetzung von ATP aus einem chemisch inerten Vorgängermolekül (cagedATP) die Dissoziation eines Aktin-Myosin-Komplexes einleitet. Unter Benutzung eines Probenvolumens von nur 10 µl können wichtige biochemische Informationen über das Aktin-Myosin-System ermittelt werden, darunter die Geschwindigkeitskonstante der ATP induzierten Dissoziation, die Affinität von ADP zum Komplex und die katalytische Aktivität. Die Methode ist sensitiv genug um mit Komplexkonzentrationen von 50 nM zu arbeiten. Im Überschuß eines der Proteine reichen daher 250 ng myosin, 62 ng S1 oder 25 ng Aktin für eine Messung aus. Die vorgestellte Methode ist damit ideal für die Messung kleiner Proteinmengen geeignet und beschränkt sich nicht nur auf Untersuchungen an Aktin und Myosin, sondern kann auch für andere Proteine genutzt werden, wie es in Messungen mit Kinesin demonstriert werden konnte.Die Flash-Photolysis-Methode erlaubte es zum ersten Mal pure Isoformen der schweren Kette des Myosins zu untersuchen. Aus einzelnen Muskelfasern können oft reine Isoformen extrahiert werden, wogegen Präparationen aus ganzen Muskeln immer in einer Mischung verschiedener Isoformen resultiert. Aus einer einzelnen Muskelfaser von 1,5 cm Länge können etwa 2 µg Myosin gewonnen werden. Die Menge war ausreichend für Untersuchungen mit der Flash-Photolysis-Methode, in denen die Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung der ATP induzierten Dissoziation (K1k+2) als auch die ADP-Affinität des Aktin-Myosin-Komplexes (1/KAD)bestimmt wurde. Die Reinheit und der Typ der Isoform kann durch Gelelektrophorese bestimmt werden. Es wurden alle 4 Isoformen des erwachsenen Säugetiermuskels der Ratte untersucht (MHC-I, IIA, IIB, IIX) sowie 2 Isoformen des Menschen (MHC-I, MHC-IIA). Bei den Isoformen der Ratte steigt die Geschwindigkeit der ATP induzierten Dissoziation (K1k+2 = 0.17 - 0.26 µM-1s-1) in der gleichen Reihenfolge wie die ADP-Affinität abnimmt (KAD = 250 - 930 µM): MHC-I, IIA, IIX, IIB. Die Werte des Menschen steigen in der gleichen Reihenfolge der Isoformen (MHC-1, IIA), liegen allerdings unter den Werten der Ratte mit Werten 0.18 und 0.26 µM-1s-1 für K1k+2 und 163 und 237 µM für KAD. Der Wert KAD kann in allen Fällen gut mit der Kontraktionsgeschwindigkeit einer Muskelfaser, die die gleiche Isoform enthält, korreliert werden. Wenn die Assoziation von ADP an den Aktin-Myosin-Komplex als ein diffusionskontrollierter Prozeß der Größenordnung 107 angesehen wird der für alle Myosine ähnlich ist, kann mittels des Wertes KAD die Geschwindigkeitskonstante für die Freisetzung von ADP k-AD vom Aktin-Myosin-Komplex berechnet werden. Der Wert für k-AD ist in allen Fällen langsamer als die Geschwindigkeit der ATP induzierten Dissoziation bei physiologischen ATP Konzentrationen. Der Vergleich mit einem theoretisch ermittelten Wert, der die Kontraktionsgeschwindigkeit limitieren könnte, zeigt, daß k-AD langsam genug ist um diese Rolle auszufüllen. In Anbetracht der verschiedenen kinetischen Eigenschaften der Isoformen ergaben Untersuchung der geringen Unterschiede zwischen den Sequenzen der verschiedenen Isoformen, insbesondere bei gleichen Isoformen in verschiedenen Spezies, wichtige Erkenntnisse über Struktur-Funktions-Beziehungen in Muskelmyosinen.Die kinetische Untersuchung eines Myosins XIV, TgMyoA, aus dem malaria-ähnlichen Parasiten Toxoplasma gondii ergab ähnliche biochemische Werte wie für typische schnelle Muskelmyosine. Obwohl die Rolle dieses Myosins für die Penetration des Parasiten in die Wirtszelle ein schnelles Myosin, das für eine schnelle Bewegung eher als das Tragen von Lasten geeignet ist, erwarten ließ, war es, wegen bis zu dieser Studie fraglich, ob TgMyoA diese Rolle erfüllen kann, weil sich seine Sequenz stark von der anderer Myosine unterscheidet. TgMyoA besitzt im Vergleich zu typischen Muskelmyosinen eine stark veränderte Converter-Domäne, keine typischen IQ-Motive in der Nackenregion und eine sehr kurze Schwanzregion. Es scheint an eine neuartige Form der leichten Kette zu binden. Die kinetische Charakterisierung einer Mutante mit verkürzter Schwanzregion mittels der Stopped-Flow-Methode zeigte typischen Muskelmyosinen sehr ähnliche Eigenschaften, insbesondere eine niedrige ADP-Affinität des Aktin-Myosin-Komplexes. Die Flash-Photolysis-Methode wurde genutzt, um zu zeigen, daß sich TgMyoA voller Länge, das sich nur in kleinen Mengen aufreinigen läßt, kinetisch nicht von der Mutante unterscheidet. Neben den ähnlichen kinetischen Eigenschaften weist TgMyoA eine ähnliche Schrittlänge, eine ähnliche Aktivierung der Hydrolyseaktivität von ATP sowie eine ähnliche Geschwindigkeit in Motility-Assays auf im Vergleich zu konventionellen Muskelmyosinen. Somit konnte gezeigt werden, daß TgMyoA die Bedingungen erfüllt, um die für den Invasionsprozeß nötige schnelle Bewegung zu erzeugen. Aufgrund der erheblich unterschiedlichen Sequenz im Vergleich zu konventionellen Myosinen ergeben sich interessante Fragestellungen für Struktur-Funktions-Beziehungen.