Διερεύνηση του ρόλου του microRNA, miR24, και του HNF-4α, στην κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό των ηπατοκυττάρων και στο ηπατοκαρκίνωμα:
Creators: name: Τσιάμη, Ιωάννα Πάσχου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Ηπατοκυτταρικός καρκίνος
Ηπατοειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες
Ηπατοκαρκινικά στελεχιαία κύτταρα
miR-24
HNF-4α
Hepatocellular carcinoma

description: Ο πυρηνικός υποδοχέας των ηπατοκυττάρων HNF-4α (NR2A1) είναι ένα ορφανό μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, που παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυϊκά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Παίζει ρόλο-κλειδί στην μεταγραφική ρύθμιση ηπατοειδικών γονιδίων και στη ρύθμιση της έκφρασης ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, κατέχοντας κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων. Οι μορφογενετικοί παράγοντες που βρίσκονται υπό τον έλεγχό του είναι απαραίτητοι για την κατάλληλη μορφολογία του ήπατος και για την οργάνωση του ηπατικού επιθηλίου. Μεταξύ αυτών η Ε-καδερίνη (Ε-cadherin), μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που συμμετέχει στο σχηματισμό των κυτταρικών συνδέσεων. Ανάλυση της αλληλουχίας των υποκινητών των δύο γονιδίων, HNF-4α και Ε-καδερίνη, αποκάλυψαν την ύπαρξη στους υποκινητές τους, μίας θέσης σύνδεσης για το μεταγραφικό παράγοντα Snail, ο οποίος ασκεί κατασταλτική δράση στη μεταγραφή των γονιδίων της Ε-καδερίνης και του HNF-4α. Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά μονόκλωνα RNAs, με μήκος 18-25 νουκλεοτίδια τα οποία μεταγράφονται από DNA και δεν μεταφράζονται σε πρωτεΐνη αλλά ρυθμίζουν την έκφραση άλλων γονιδίων, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, είτε μέσω αλληλεπίδρασης με τη μηχανή της πρωτεϊνοσύνθεσης είτε μέσω αποικοδόμησης mRNA-στόχων. Το microRNA miR-24 μπορεί να προκύψει στα θηλαστικά από δύο διαφορετικές γονιδιακές θέσεις. Έχει συσχετιστεί με την κυτταρική διαφοροποίηση καθώς παίζει σημαντικό ρόλο στην διαφοροποίηση των κυττάρων του αίματος και επάγει την διαφοροποίηση των μυοβλαστών. Επίσης ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Επίσης, σύμφωνα με παλαιότερα δεδομένα του εργαστηρίου μας το miR-24 προσδένεται στην περιοχή 878 – 899 bp της 3΄ UTR του mRNA του HNF-4α. Ο ηπατοκυτταρικός καρκίνος είναι μία από τις πιο επικρατείς κακοήθειες και αιτίες θανάτου στον κόσμο. Αποτελείται από ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς με την ικανότητα σχηματισμού όγκων να αποδίδεται σε μία μόνο κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (cancer stem cells). Το ηπατοκαρκίνωμα εξελισσόμενο περνά από μία καλά διαφοροποιημένη κατάσταση σε μία λιγότερο διαφοροποιημένη κατάσταση, διαδικασία που χαρακτηρίζεται από μείωση της κυτταρικής διαφοροποίησης, απώλεια της έκφρασης ηπατοειδικών γονιδίων και ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων (HNFs), αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, απώλεια της επιθηλιακής μορφολογίας, αυξημένη διεισδυτικότητα και εν τέλει μετάσταση του όγκου (ΕΜΤ μετάβαση). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του ρόλου του miR-24 και του HNF-4α στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Έτσι, πραγματοποιήθηκε ανάστροφη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς HepG2 με το pre-miR24, ώστε να αυξηθούν τα επίπεδα έκφρασης του miR-24. Επίσης, διερευνήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του miR-24 στην κυτταρική αύξηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στην ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης των HepG2 κυττάρων. Διαπιστώθηκε πως η υπερέκφραση του miR-24 οδηγεί σε αυξημένο ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού, σε αλλαγή της μορφολογίας των κυττάρων, σε μείωση της έκφρασης του γονιδίου του HNF-4α, σε μείωση της έκφρασης του γονιδίου της E-καδερίνης και σε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου του Snail, υποδεικνύοντας ογκογονική δράση του συγκεκριμένου microRNA στα HepG2. Επίσης, διερευνήθηκε η έκφραση του γονιδίου του HNF-4α και του γονιδίου του Snail, σε έναν υποπληθυσμό των HepG2, στα καρκινικά στελεχιαία κύτταρα (Cancer Stem Cells), όπου παρατηρήθηκαν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α και υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του Snail, συγκριτικά με τα HepG2 κύτταρα. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση τριών ηπατοειδικών μεταγραφικών παραγόντων, των HNF1α, HNF3β &amp; HNF4α, σε 27 δείγματα ανθρώπινων ηπατοκαρκινικών βιοψιών και 8 δείγματα παρακείμενου ιστού. Παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης και των τριών γονιδίων σε 17 εκ των 27 ηπατοκαρκινικών δειγμάτων σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν πιθανό ρόλο του miR-24 στην πρόοδο του ηπατοκυτταρικού καρκίνου, το οποίο πιθανώς ασκεί τη δράση του μέσω καταστολής της έκφρασης του HNF-4α.
description: Hepatocyte nuclear factor 4α (NR2A1) is an orphan member of the nuclear receptor superfamily, which has an important role in activation of transcription from the early embryonic development till maturity. In adults, it is mainly expressed in the liver where it regulates the expression of a large number of genes which participate in diverse metabolic pathways. HNF-4α is essential for the transcriptional activation of many hepatocyte specific genes and for regulating the expression of hepatocyte transcription factors, thereby having an essential role in hepatocytes’ differentiation. Furthermore, HNF-4α is responsible for the generation of the hepatic epithelium, through regulation of the expression of various morphogenetic factors, such as E-cadherin a transmembrane protein which participates in the formation of cellular junctions. Both, HNF-4α &amp; E-cadherin, have in their promoters, a binding site for the transcription factor, Snail. microRNAs (miRNAs) are small, monoclonal RNAs, 18-25 nucleotides long, which are transcribed by DNA but instead of producing a protein, they regulate the expression of other protein encoding genes. This regulation is achieved either by translational repression or by mRNA degradation. They are transcribed from the genome of plants, animals and viruses and they are highly conserved. MicroRNAs play important roles in regulating development, cellular differentiation, apoptosis, cellular proliferation and organogenesis. In mammals, microRNA miR-24, can be transcribed from two different genes. It seems to have an essential role in haematopoetic differentiation and in myoblast differentiation. Moreover, it regulates the expression of genes involved in cell cycle regulation and cell proliferation. According to previous results of our lab, miR-24 has a binding site in the 3’-UTR of HNF-4α mRNA. Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly malignant tumor and one of the most common death causes worldwide, with chronic hepatitis B &amp; C infection and prolonged exposure to hepatocarcinogens, being the main risk factors. HCC is comprised of various cellular types, among which only cancer stem cells are capable of producing tumors. HCC progression from a well-differentiated to a less differentiated form, is accompanied by a decrease in differentiation, an extinction of tissue-speciﬁc gene expression (HNFs), acceleration of cell proliferation, loss of epithelial morphology, increased invasiveness and ultimately metastasis (EMT transition). Snail has been shown to be greatly upregulated during dedifferentiation of HCC, while this upregulation is inversely correlated with the expression of E-cadherin. This project intended to study the potential role of miR-24 and HNF-4α in hepatocellular carcinoma. In order to achieve that goal, the HepG2 cell line was transfected with pre-miR24 molecule, so as to upregulate the expression level of miR-24. Then, the effect of that upregulation on cell proliferation and cell migration, was assessed. It was shown that miR-24 upregulation induced cell proliferation, causing changes in cell morphology in addition to downregulating HNF-4α, E-cadherin, and upregulating Snail, suggesting that miR-24 might act as an ‘oncomiR’ in HepG2 cell line. Furthermore the expression levels of HNF-4α and Snail, in cancer stem cells (CSCs) derived from HepG2 cell line, was studied. CSCs are characterized by a more aggressive phenotype and as such CSCs from HepG2 showed lower HNF-4α expression levels and higher Snail expression levels. Finally, it was studied the expression of hepatocyte nuclear factors HNF1α, HNF3β &amp; HNF4α, in 27 biopsies of human hepatocellular carcinoma and 8 biopsies of adjacent liver tissue. It was noticed a downregulation in 17 out of 27 samples. These results suggest a possible role of miR-24 in HCC pprogression, propably by repressing HNF-4α expression.