title: Endothiapepsin and Proteinkinase A: Complex Structures of Novel Inhibitors, Screening of a Fragment Library and Probe- based Inhibitordesign
title: Endothiapepsin und Proteinkinase A: Komplexstrukturen mit neuartigen Inhibitoren, Durchmustern einer Fragmentbibliothek sowie Inhibitordesign ausgehend von einer Sonde
Creators: name: Köster, Helene
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Proteinkinase A
Aspartic proteinase
protein crystallography
Aspartylprotease . Proteinkristallographie
Naturwissenschaften
Arzneimitteldesign
Endothiapepsin

description: Structure-based drug design is a
      widely used, successful method in modern drug discovery. To
      obtain a potent inhibitor an initial lead compound is
      stepwise optimized to inhibit the target protein. One
      prerequisite is the knowledge of the binding mode which is
      normally provided by an X-ray crystal structure. The
      availability of an initial complex structure is often the
      time limiting step. The main focus of this work lies on the
      crystallographic binding mode determination of different
      ligands. All together 30 protein-ligand complex structures
      are presented which were determined in the course of two main
      projects. The first project deals with pepsin-like aspartic
      proteinases. These proteins play an important role in several
      severe diseases such as malaria (plasmepsins), Alzheimer’s
      disease (β secretase) and hypertension (renin).
      Endothiapepsin served as a model system to investigate the
      binding mode of several novel ligands. This way the binding
      mode of inhibitors based on the Gewald reaction, inhibitors
      with an azepin scaffold and pyrrolidin based inhibitors could
      be resolved. During this process some interesting details
      could be observed. In case of the inhibitors based on the
      Gewald reaction three distinct binding modes were obtained in
      which the catalytic water molecule plays three different
      roles: Once it is displaced, once it mediates an interaction
      towards the ligand as an H-bond acceptor and once as an
      H-bond donor. The complex structure containing an azepin
      derivative shows, besides the ligand interacting with
      catalytic aspartates, two bound fragments of this ligand in
      the binding pocket. This way almost the entire volume of the
      binding pocket is occupied which reveals interesting hints on
      preferred interactions. In the complex structure with the
      pyrrolidin derivative a disordered wide-open flap with a
      partly open flap pocket could be observed. This structure
      therefore provides insights on the flexibility of this
      protein family. Furthermore, ITC measurements of this complex
      assured a double deprotonated catalytic dyade. Additionally,
      complex structures with the clinically applied HIV-protease
      inhibitors ritonavir and saquinavir were obtained. With
      respect to ritonavir also a crystal structure with the
      secreted aspartic proteinase 2 (SAP2) succeeded. While the
      binding mode of ritonavir is equivalent with the one found in
      the HIV-protease, saquinavir shows an unusual addressing of
      the catalytic dyade. Another focus of this project is the
      fragment-based drug design. Benzamidine and a hydrazine
      derivative were used as examples to show that small
      low-affinity ligands can be successfully crystallized. In a
      second step an inhouse library containing 364 fragments was
      tested against Endothiapepsin. This led to 55 assay hits. Out
      of the 55 assay hits for eleven compounds a crystal structure
      was obtained. The fragments show diverse binding modes and
      cover almost the entire volume of the binding pocket.
      Furthermore, this study suggests a critical view on the “rule
      of three” which is frequently used in the design of fragment
      libraries. Especially the threshold on the maximal number of
      H-bond acceptors seems to be too strict. The second project
      deals with the optimization of a small unspecific probe
      molecule into a potent inhibitor. The protein kinase A (PKA)
      is used as an easy to handle model system. Based on phenol,
      and following several design cycles an inhibitor with an
      affinity in the low nanomolar range could be synthesized. To
      achieve this, the approach of a fragment based drug design
      was combined with the methods of a de-novo design. This study
      demonstrates how experimental and computer-based methods
      effective complement each other. Additionally for the first
      time a rather closed conformation of the glycine rich loop
      was observed. This provides a valuable starting point for
      further studies on the dynamic of this protein In summary,
      the presented crystal structures provide different starting
      points for further drug design. In case of the pepsin-like
      aspartic proteinases many novel possibilities to address the
      catalytic dyad were revealed. Furthermore, the structure
      showing an open flap in endothiapepsin as well as the one
      showing a rather closed glycine rich loop in PKA give a first
      glimpse on the dynamics of these proteins. New methodical
      aspects are contributed through the conduction of fragment
      based screenings as well as a probe-based drug design. Last
      but not least the diverse structures are supportive,
      especially in combination with computer based and further
      biochemical methods, to better understand the nature of
      protein-ligand interactions.
description: Das strukturbasiertes
      Wirkstoffdesign ist eine vielgenutzte, erfolgreiche Methode
      neue Arzneistoffe zu entwickeln. Mit dem Ziel einen
      hochaffinen Inhibitor zu erhalten, wird eine Verbindung
      schrittweise an ein Zielprotein angepasst. Eine
      Grundvoraussetzung für ein solches Design ist die Kenntnis
      des Bindungsmodus. In der Regel wird dazu eine
      Protein-Ligand-Komplexstruktur herangezogen. Die
      Verfügbarkeit einer initialen Komplexstruktur, welche meist
      röntgenkristallographisch erhalten wird, ist nicht selten der
      zeitbestimmende Schritt. Die kristallographische Aufklärung
      der Bindungsmodi unterschiedlicher Liganden ist der
      Schwerpunkt dieser Arbeit. Es werden insgesamt 30
      Ligand-Protein Komplexstrukturen vorgestellt, die im Rahmen
      zweier Projekte erhalten wurden. Das erste Projekt behandelt
      pepsinähnliche Aspartylproteasen als Zielproteine.
      Pepsinähnliche Aspartylproteasen spielen eine entscheidende
      Rolle bei einigen schwerwiegenden Erkrankungen, wie z.B.
      Malaria (Plasmepsine), Alzheimer (β Sekretase) und
      Bluthochdruck (Renin). Mit Endothiapepsin als Modellprotein
      wurden verschiedene neuartige Liganden untersucht. Auf diese
      Weise konnte der Bindemodus von Inhibitoren basierend auf der
      Gewaldreaktion und solchen mit einem Azepin- sowie
      Pyrrolidingrundgerüst aufgeklärt werden. Dabei wurden einige
      überraschende Details beobachtet. So wurden für die auf der
      Gewaldreaktion basierenden Inhibitoren drei grundverschiedene
      Bindungsmoden erhalten, in denen das katalytische Wasser in
      drei verschiedenen Rollen beobachtet wurde: einmal wird es
      verdrängt, einmal vermittelt es eine Interaktion zum Liganden
      als Wasserstoffbrücken-Akzeptor und einmal als Donor. Die
      Komplexstruktur mit einem Azepin-Derivat zeigt neben dem an
      die beiden Aspartate gebundenen Liganden zwei Bruchstücke
      desselben in der Bindetasche. Dadurch ist nahezu die gesamte
      Bindetasche besetzt, was wertvolle Hinweise auf bevorzugte
      Interaktionspunkte liefern kann. In der Komplexstruktur mit
      einem Pyrrolidin findet sich eine ungeordnete, weit geöffnete
      Flap-Region mit einer teilweise geöffneten Flap-Tasche. Diese
      Struktur gewährt damit einen Einblick in die Flexibilität
      dieser Proteine. Zudem konnte anhand dieses Komplexes mittels
      ITC eine zweifach deprotonierte katalytische Diade
      nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Komplexstrukturen
      mit den klinisch relevanten HIV-Protease Inhibitoren
      Ritonavir und Saquinavir erhalten, wobei mit Ritonavir auch
      eine Komplexstruktur mit der sekretorischen Aspartylprotease
      2 (SAP2) gelang. Während der Bindemodus von Ritonavir dem in
      der HIV-Protease entspricht, zeigt Saquinavir eine
      ungewöhnliche Adressierung der katalytischen Diade. Ein
      weiterer Schwerpunkt dieses Projekts ist das fragmentbasierte
      Design. Nachdem anhand von Benzamidin sowie eines Hydrazons
      gezeigt wurde, dass auch kleine Verbindungen mit schwacher
      Affinität erfolgreich kristallisiert werden können, wurde
      eine hauseigene 364 Fragmente umfassende Bibliothek gegen
      Endothiapepsin getestet. Von den 55 Assayhits konnte von elf
      Fragmenten eine Komplexstruktur erhalten werden. Die
      Fragmente zeigen dabei vielfältige Bindungsmodi und decken
      einen Großteil der Bindetasche ab. Zudem regt diese
      Untersuchung an, die für die Zusammenstellung vieler
      Fragmentbibliotheken angewandte Dreierregel, insbesondere die
      Anzahl der erlaubten Wasserstoffbrücken Akzeptoren, kritisch
      zu hinterfragen. Das zweite Projekt befasst sich mit der
      exemplarischen Optimierung einer kleinen unspezifischen Sonde
      zu einem hochaffinen Inhibitor. Dazu wurde die Proteinkinase
      A als einfach zu handhabendes Modellprotein ausgewählt. In
      mehreren Zyklen konnten ausgehend von Phenol durch eine
      Kombination der Methoden des fragmentbasierten sowie des
      de-novo Designs Inhibitoren mit einer Affinität im niedrig
      nanomolaren Bereich synthetisiert werden. Diese Studie
      demonstriert, wie sich experimentelle und computergestützte
      Methoden wirkungsvoll ergänzen. Darüber hinaus konnte
      erstmals eine weitgeschlossene Konformation der glycinreichen
      Schleife beobachtet werden. Zusammenfassend bieten die in
      dieser Arbeit vorgestellten Strukturen unterschiedliche
      Ansatzpunkte für eine weitere Wirkstoffentwicklung. So wurde
      für die pepsinähnlichen Aspartylproteasen eine Vielzahl neuer
      Möglichkeiten zur Adressierung der katalytischen Diade
      aufgezeigt. Zudem helfen die hier vorgestellten Strukturen
      einer geöffneten Flap von Endothiapepsin sowie einer
      weitgeschlossenen glycin-reichen Schleife der PKA die Dynamik
      dieser Proteine besser zu verstehen. Methodisch wurden neue
      Impulse zur Durchführung von fragmentbasierten Screenings
      sowie die Möglichkeit eines sondenbasierten Designs
      vorgestellt. Und nicht zuletzt helfen die vielfältigen
      Strukturen, insbesondere in Kombination mit
      computergestützten und weiteren biochemischen Methoden, die
      Natur von Ligand-Protein Wechselwirkungen besser zu
      verstehen.