Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish
Creators: name: Marcato, Daniel
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2018
Subjects: Zebrafish
Automation
Phenotype
Behavior

description: Der Zebrabärbling hat sich in den letzten Jahrzehnten als ein beliebter und vielversprechender
Modellorganismus herausgestellt. Mit seiner Hilfe werden zunehmend die grundlegenden
biologischen Funktionsweisen von Wirbeltieren untersucht und anhand der Erkenntnisse
neue Therapien und Medikamente für Krankheiten entwickelt. Zusätzlich hat sich die
Verhaltensforschung als Gebiet mit hohem Potential für neue Entdeckungen entpuppt, da
es hier möglich ist, deutlich feinere Unterscheidungen und Effekte nachzuvollziehen als es
bei stark abgegrenzten Endpunkten wie Verformungen oder Toxizität der Fall ist.
Im frühen Stadium bis fünf Tage nach Befruchtung zeigen die Embryonen und Larven des
Zebrabärblings einige charakteristische Verhaltensweisen, die durch künstliche Stimulation
hervorgerufen werden können. Noch in der Eischale bei einem Alter von nur 30 bis 42
Stunden nach der Befruchtung reagieren die Embryonen auf einen Lichtblitz mit erhöhter
Bewegung, der sogenannten Photomotor Response. Bei wiederholtem Belichten bleibt diese
Reaktion aus, was als ein typisches Verhaltensmuster interpretiert werden kann. Werden die
Embryonen jedoch Chemikalien oder Mutationen ausgesetzt, kann sich dieses Muster verändern
und es können Rückschlüsse über die Funktionsweise der verursachenden Methoden
gewonnen werden. Als zusätzliche Verhaltensweisen lassen sich die beiden Schreckreaktionen
auf Vibration und Berührung nutzen. Bereits in der Eischale lassen sich die Embryonen
durch Berührung zum Bewegen bringen. Sobald sie in einem Alter von ca. drei Tagen
nach Befruchtung geschlüpft sind, wird die Reaktion als C-Krümmung bezeichnet, da
die Larve eine charakteristische Biegung entlang ihrer Körperachse einnimmt bevor sie
davonschwimmt. Dasselbe gilt für die Vibrationsreaktion ab einem Alter von ca. fünf Tagen
nach Befruchtung.
Um diese Verhalten sinnvoll nutzen zu können sind automatisierte Lösungen notwendig,
die die Vorbereitung, die Abläufe und die Analyse soweit vereinfachen, dass kaum noch
menschliches Eingreifen notwendig ist. Nur so kann der notwendige Durchsatz und die
Reproduzierbarkeit gewährleistet werden um statistisch aussagekräftige Effekte nachzuweisen.
Aus diesem Grund wurden drei unabhängige mechatronische Systeme entwickelt,
die je eines der drei genannten Verhaltensmuster automatisiert auslösen, aufzeichnen und
analysieren können. Dazu waren neben der Hard- und Softwareentwicklung auch biologische
Vorgehensweisen notwendig um die Systeme zu validieren und sie bereits in ersten
biologischen Untersuchungen einzusetzen.
Für das PMR System wurde ein hochautomatisierter Versuchsablauf entwickelt, der anhand
eines Roboters die Embryonen zur Vorbereitung sortiert und anschließend in einem automatisierten
Mikroskop mit vollständig eigenentwickelter Steuerungssoftware die Aufzeichnung
der Reaktion gewährleistet. Anschließend können die Rohdaten in Form von Videos automatisiert
analysiert werden um numerische Daten aus den Bildreihen zu extrahieren.
Das Vibrationssystem umfasst einen neuentwickelten Vibrationserreger in Form eines modifizierten
Lautsprechers, der es erlaubt, mehrere Proben parallel zu untersuchen. Dazu
wurde der Erreger ausgiebig charakterisiert um zu gewährleisten, dass die erzielten Beschleunigungswerte
sowie die Impulsdauer und Frequenz den angestrebten Werten von
14 g, 1 ms und 500 Hz entsprechen. Durch den Einsatz von Beschleunigungssensoren wurden
die Erreger kalibriert und die Steuerungssoftware an die Ergebnisse so angepasst, dass
ein einheitlicher Effekt zwischen den Erregern gewährleistet ist. Die Implementierung einer
Hochgeschwindigkeitskamera erlaubt die Aufzeichnung der Reaktion bei bis zu 1000
Bildern pro Sekunde, was aufgrund der äußerst schnellen Reaktionszeit der Larven im
Millisekundenbereich notwendig ist um den vollen Umfang der Reaktion abzubilden.
Um Hochdurchsatzversuche zur Berührung der Larven zu ermöglichen, wurde das erste automatisierte
System entwickelt, welches durch den Einsatz einer motorisiert positionierbaren
Nadel einen computergesteuerten Berührungsvorgang ermöglicht. Ein berührungsempfindliches
Mehrachsensystem wurde so konstruiert, dass der Nutzer über eine grafische Oberfläche
das System fernsteuern kann und so die subjektiven und unnötig langwierigen Aspekte
von manuellen Versuchsaufbauten umgangen werden können. Das System wurde mit einer
digitalen Objekterkennung so erweitert, dass auch autonome Versuche möglich wurden.
Die Systeme wurden im Rahmen von mehreren biologischen Untersuchungen am ITG
ausgiebig getestet. Mit Hilfe des PMR Systems wurde eine mehrere hundert Proben
umfassende Sammlung von Cannabinoid-ähnlichen Substanzen auf ihre neuroaktive Wirkung
untersucht. So konnten charakteristische Reaktionsmuster identifiziert werden, die nun
dabei helfen können, das Verständnis über die Struktur- und Wirkungszusammenhänge
zu erhöhen. An den beiden Schreckreaktionen konnte die unterschiedliche Wirkung von
Anästhetika auf Phänokopien von genetisch veränderten Zebrabärblingen nachgewiesen
werden, was die Einsatzfähigkeit für chemische sowie genetische Versuche substantiiert.