title: Design, Synthese und Evaluation von Inhibitoren der bakteriellen RNase P und der Dengue-Virus-Protease
title: Design, Synthesis and Evaluation of Inhibitors of the bacterial RNase P and the Dengue Virus Protease
Creators: name: Ehlert, Fabian Gert Robert
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Triton X-100
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
RNase P
Denguefieber
protease, detergent

description: Das Auffinden neuer Targets und
      Wirkstoffe, um bakterielle und virale Infektionen auch in
      Zukunft behandeln zu können, ist ein zentraler Bestandteil
      der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Im ersten Teil
      dieser Arbeit konnte ausgehend von einem Screeninghit, der
      ein Inhibitor der bakteriellen RNase P ist, eine
      Syntheseroute entwickelt werden, die nicht nur das
      Bereitstellen des Screeninghits in größeren Mengen, sondern
      auch eine einfache Variation der Substituenten des
      Screeninghits erlaubte. Mit Hilfe dieser Synthese konnten
      Verbindungen hergestellt werden, die besser löslich und
      aktiver im in vitro Assay waren und im Agar-Diffusionstest
      einen größeren Hemmhof als der initiale Screeninghit
      aufwiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit, der das de novo
      Design von Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease zum Ziel
      hatte, wurden Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease
      dargestellt, deren Grundstruktur sich von den bisher
      publizierten Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease
      unterscheidet. Aufgrund einer wenig ausgeprägten SAR der
      synthetisierten Inhibitoren galt es zunächst, eine
      unspezifische Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die
      erhaltenen Inhibitoren auszuschließen. Eine spezifische
      Inhibition der Dengue-Virus-Protease durch die
      synthetisierten Inhibitoren konnte schließlich durch eine
      Verbesserung der Löslichkeit des Inhibitors im verwendeten
      Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay und durch Anwendung
      der dynamischen Lichtstreuung nachgewiesen werden. Die
      Verbesserung der Löslichkeit wurde durch ein Steigern des
      DMSO-Anteils im Assay erreicht. Der gesteigerte Anteil an
      DMSO im Fluoreszenz-basierten Inhibitionsassay ließ sich auch
      auf den verwendeten Thermal-Shift-Assay und das Soaking von
      Kristallen der Dengue-Virus-Protease übertragen. Sowohl im
      Thermal-Shift-Assay, als auch beim Soaking von DV3pro
      Kristallen konnte der DMSO-Anteil auf über 30% gesteigert
      werden. Dieser sehr hohe DMSO-Gehalt ermöglicht es, weniger
      potente oder schlecht lösliche Inhibitoren in hohen
      Konzentrationen auf eine Inhibition der Dengue-Virus-Protease
      zu testen und so mögliche Ausgangspunkte für ein weiteres
      Design von Inhibitoren zu erhalten. Im dritten Teil dieser
      Arbeit wurde schließlich der Effekt des nicht-ionischen
      Detergenzes Triton X-100, welches Aggregate aufbrechen und
      damit unspezifische Inhibition verhindern soll, untersucht.
      Es konnte gezeigt werden, dass die bei dem Test von
      spezifischen Inhibitoren der Dengue-Virus-Protease
      beobachteten Effekte von Triton X-100 auch bei weiteren
      Proteasen und Assaysystemen auftreten. Zunächst konnte durch
      Verwenden von Pepstatin A, einem peptidischen und
      kompetitiven Inhibitor von Aspartylproteasen, gezeigt werden,
      dass Triton X-100 nicht das gesamte Assaysystem beeinflusst,
      da das Inhibitionsverhalten von Pepstatin A gegen die
      HIV-1-Protease und Endothiapepsin nicht beeinflusst wurde.
      Durch das Testen von strukturell unterschiedlichen
      Inhibitoren der HIV-1-Protease und Endothiapepsin konnte
      nachgewiesen werden, dass Triton X-100 bestimmte Inhibitoren
      beeinflusst, andere strukturell verwandte Inhibitoren aber
      nicht in ihrem Inhibitionsverhalten gegenüber der Protease
      gestört werden. Da in Screenings, in denen Inhibitoren unter
      Verwendung von Triton X-100 als Detergenz keine Inhibition
      mehr zeigen, davon ausgegangen wird, dass deren Inhibition
      nicht spezifisch ist, also durch Aggregate verursacht
      wird,118 führt der beobachtete Inhibitionsabfall der
      spezifischen Aspartylproteasen-Inhibitoren unter Triton X-100
      zu falsch-negativen Hits in diesen Screenings. Um solche
      falsch-negativen Hits zu vermeiden, konnte gezeigt werden,
      dass alternativ in Dengue-Protease-, HIV-1-Protease- und
      Endothoapepsin-Assays das Detergenz CHAPS eingesetzt werden
      kann, da dieses Detergenz im vorliegenden Fall keine
      falsch-negativen Hits generiert. Zusammenfassend konnten im
      Rahmen dieser Arbeit Inhibitoren durch die unterschiedlichen
      Methoden der medizinischen Chemie von sowohl bakteriellen als
      auch viralen Krankheitserregern gefunden und optimiert
      werden. Der DMSO-Gehalt der bei der Suche nach Inhibitoren
      der Dengue-Virus-Protease verwendeten Assaysysteme konnte
      deutlich gesteigert werden und es konnte nachgewiesen werden,
      dass Triton X-100 Inhibitoren beeinflussen kann und es daher
      nicht das optimale Detergenz für Screening-Kampagnen
      darstellt. Unter Berücksichtigung der in dieser Arbeit
      erhaltenen Ergebnisse können Inhibitoren der RNase P und der
      Dengue-Virus-Protease entworfen und weiter optimiert werden
      und dank der Aussagen über die Verwendung Triton X-100 in
      Screening-Kampagnen lässt sich in Zukunft die Anzahl von
      potentiellen Ausgangspunkten für eine weitere
      Strukturoptimierung möglicherweise deutlich erhöhen.
description: The discovery of new targets and
      drugs to treat bacterial and viral infections in the future
      is an integral part in fighting infectious diseases. In the
      first part of this thesis a synthetic route for a screening
      hit, an inhibitor of the bacterial RNase P, was developed, in
      order to provide the screening hit in larger quantities and
      to allow an easy variation of its substituents. This
      synthetic route delivered compounds with better solubility
      and improved activity in the in vitro assay as well as in the
      agar diffusion test compared to the initial screeninghit,
      resulting in an increased diameter of the inhibition zone.
      The second part of this thesis aimed at the de novo design of
      inhibitors of the dengue virus protease. Inhibitors of the
      dengue virus protease with a core structure different from
      what has been published so far, were synthesized. Due to a
      sparsely pronounced SAR of the inhibitors synthesized an
      unspecific inhibition of the dengue virus protease by the
      inhibitors had to be ruled out. By increasing the solubility
      of the compounds in the fluorescence-based inhibition assay
      and by using dynamic light scattering to detect aggregates in
      solution, a specific inhibition of the dengue virus protease
      was finally proven. The increased solubility was achieved by
      increasing the concentration of DMSO in the assay. The
      increased DMSO concentration in the fluorescence-based
      inhibition assay was also successfully applied to the thermal
      shift assay and to the soaking conditions for dengue virus
      protease crystals. Both in the thermal shift assay and for
      the soaking of the dengue virus protease crystals the DMSO
      percentage was increased to &gt;30%. This very high
      concentration of DMSO allows to test less potent or poorly
      soluble compounds at higher concentrations for an inhibition
      of the dengue virus protease and thus can serve as a starting
      point for the development of new inhibitors. In the third
      part of this thesis the effect of the non-ionic detergent
      Triton X-100, which is used to break up aggregates in
      solution in order to prevent unspecific inhibition, was
      studied. It could be shown that the effects observed when
      using Triton X-100 together with specific inhibitors of the
      dengue virus protease were not limited to this protease but
      also occurred with different proteases and assay setups. By
      using Pepstatin A, a peptidic and competitive inhibitor of
      aspartic proteases, it could be shown that Triton X-100 does
      not negatively affect the assay system, as the inhibition of
      Pepstatin A versus HIV-1 protease and endothiapepsin was not
      altered. When testing structurally different inhibitors of
      the HIV-1 protease and endothiapepsin it could be shown that
      Triton X-100 influences the inhibition of both proteases by
      some inhibitors, while other structurally related inhibitors
      remained entirely unaffected, consequently resulting in false
      negatives. In screenings it is assumed that the inhibitor
      acts non-specific, via aggregation, when showing a lower
      inhibition when used together with Trition X-100 as
      detergent. Consequently, the decline of inhibition observed
      for specific aspartyl protease inhibitors together with
      Trition X-100 as a detergent would lead to false negative
      results. In order to avoid false negative results it could be
      shown that CHAPS as a detergent in dengue virus protease,
      HIV-1 protease and endothiapepsin inhibition assays did not
      produce false-negative hits. In summary, by applying
      different medicinal chemistry methods, the detection and an
      optimization of inhibitors of bacterial and viral targets
      could be achieved. The DMSO concentration used in the assay
      systems when screening for inhibitors of the dengue virus
      protease was increased and it was shown, that Triton X-100
      influences specific inhibitors of different proteases,
      leading to false-negatives and thus being not the optimal
      detergent for screening campaigns. Taking into account the
      results of this thesis, inhibitors of the bacterial RNase P
      and the dengue virus protease can be designed and further
      optimized and due to the results of the Triton X-100 studies
      the hit rate of screening campaigns can eventually be
      increased, leading to more starting points for further hit
      optimization processes.