Keap1/Nrf2 Pathway Profiling: Uncovers Molecular Intersection With Notch Pathway In Small Cell Lung Cancer
Creators: name: FABRIZIO, FEDERICO PIO
Publisher: name: Universit� degli Studi di Foggia
Year: 2019

description: Il tumore polmonare a piccole cellule (SCLC), detto anche microcitoma, costituisce circa il 20% dei tumori polmonari e rappresenta una delle istologie pi� aggressive nell?uomo in quanto � caratterizzato da una iniziale responsivit� alla chemio e alla radioterapia, a seguito della quale sviluppa velocemente resistenza ai trattamenti. Negli ultimi anni l?efficacia nel colpire i meccanismi molecolari che sono alla base dell?insorgenza e dello sviluppo dei tumori nell?uomo, ha spinto i ricercatori ad identificare e caratterizzare sempre nuove proteine che potessero fungere da bersaglio molecolare per la cura dei tumori polmonari. Gli scarsi dati in tal senso sui microcitomi polmonari sono dovuti alla sua elevata complessit� molecolare ed alla scarsa disponibilit� del materiale biologico da analizzare in una tipologia di tumore normalmente non destinato all?intervento chirurgico. La cascata cellulare regolata da KEAP1 ed NRF2 � un meccanismo conosciuto di difesa che le cellule adottano in condizioni di normalit� per rispondere allo stress ossidativo e al possibile danno prodotto dalle sostanze tossiche e xenobiotiche con le quali entrano in contatto. Nelle cellule tumorali, questa cascata cellulare viene alterata ed � alla base della resistenza ai trattamenti chemio e radioterapici. La correlazione tra le alterazioni molecolari di questa cascata ed i tumori polmonari non a piccole cellule (Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) � ben nota e l?alterata espressione dell?NRF2 si correla alla prognosi dei pazienti e alla risposta alla chemio e alla radioterapia. D?altra parte, la crescita e la progressione dei tumori polmonari sembra coinvolgere ed intersecarsi con altre pathway ben note nel contesto dell?invasivit� cellulare e metastatizzazione, come quella di NOTCH, con importanti ricadute in ambito farmacologico. Attualmente, i dati riguardanti eventuali meccanismi di alterazione genetica ed epigenetica della cross-talk molecolare tra le pathway KEAP1/NRF2 e NOTCH risultano solo parziali e poco indagate nel microcitoma polmonare. Il lavoro di tesi si propone di ampliare le conoscenze dei meccanismi di intersezione tra KEAP1/NRF2 e NOTCH e delle basi genetiche ed epigenetiche della deregolazione della cross-talk nei microcitomi polmonari. Ulteriore finalit� sar� quella di indagare mediante esperimenti in vitro gli effetti prodotti da queste ultime sulla risposta a terapie convenzionali e inibitori di NOTCH. Tutte le analisi sono state condotte su una collezione di linee cellulari di SCLC sulle quali � stato realizzato in primis il profilo molecolare dei geni KEAP1, NFE2L2 e NOTCH1 ed epigenetico della regione promotore del gene KEAP1. In particolare, per le determinazioni epigenetiche � stata implementata la gi� descritta metodica della PCR quantitativa metilazione-specifica in real-time (RT-QMSP, real time-quantitative methylation specific PCR) con saggi di pirosequenziamento. E? stata identificata una sola mutazione missenso nel gene KEAP1 gi� descritta in letteratura, mentre il 42% delle linee cellulari analizzate hanno mostrato ipermetilazione a livello della regione promotrice del gene KEAP1, con una perfetta corrispondenza tra i risultati ottenuti in RT-QMSP e pirosequenziamento. Su alcune delle linee cellulari selezionate sono stati eseguiti studi di silenziamento genico del KEAP1 mediante short interfering RNA inhibition, analisi di espressione proteica mediante western blot e saggi farmacologici al fine di valutare la risposta farmacologica delle cellule in condizioni di silenziamento del KEAP1. I risultati ottenuti mostrano come 1) Il silenziamento del gene KEAP1 abbia effetto sulla cascata NRF2 mediata andando ad alterare sia l?espressione di NRF2 che quella di alcuni dei suoi geni target; 2) la soppressione dell?attivit� del KEAP1 mediante silenziamento genico produca una variazione significativa nella risposta delle cellule di microcitoma al trattamento chemioterapico (Etoposide, Cisplatino e loro combinazione) riducendo l?effetto di quest?ultimo sull?induzione dell?apoptosi e sull?inibizione della proliferazione cellulare. Sulla stessa linea KEAP1 silenziata si � verificato che l?inibizione dell?espressione di KEAP1 porta ad una parziale modulazione dei livelli di NOTCH e della sua attivit� e non sembra avere effetti sulla risposta al trattamento con il DAPT, inibitore delle ?-secretasi. I risultati ottenuti corroborano nel complesso l?ipotesi di una modulazione negativa da parte del KEAP1, di NRF2 e della sua attivit� nei SCLC, inoltre correlata con la resistenza delle cellule tumorali al trattamento chemioterapico con etoposide e cisplatino. Mostrano, inoltre, una prima evidenza di interazione tra NRF2/NOTCH nei SCLC ma non ancora chiaramente correlabile all?attivit� di KEAP1 che ad oggi non pu� essere considerato un marcatore predittivo di risposta di SCLC al trattamento con DAPT. Saranno necessarie ulteriori indagini allo scopo di trarre delle conclusioni definitive relativamente al ruolo dell?interazione KEAP1-indipendente/dipendente tra le pathway dell?NRF2 e del NOTCH nella modulazione del processo proliferativo ed apoptotico nel microcitoma polmonare. La robusta evidenza di un coinvolgimento della pathway KEAP1/NRF2 nei SCLC suggerisce come questa possa fornire invece gi� importanti indicazioni sulla resistenza all?uso di terapie convenzionali e rappresentare una indicazione terapeutica interessante per il trattamento del microcitoma polmonare.