title: Analyse von Skelettmuskelfaserkernen in drei Desminopathie-Mausmodellen
Creators: name: Zins, Mirjam
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Hintergründe und Ziele Das Intermediärfilament-Protein Desmin spielt eine wichtige Rolle bei der subzellulären Positionierung und Verankerung von Myofibrillen, Mitochondrien und Kernen in Skelett-, Herz- und glatten Muskelzellen. Mutationen im menschlichen Desmin-Gen (DES) verursachen Myopathien und Kardiomyopathien, sogenannte Desminopathien. Diese können autosomal-dominante, autosomal rezessive und sporadische Fälle von Patienten mit DES-Mutationen umfassen und gehören zur Gruppe der seltenen Krankheiten. Bei den selten auftretenden Patienten mit biallelischen DES-Mutationen, die zur Abwesenheit von Desmin führen, weist das klinische Erscheinungsbild eine früh einsetzende Muskelschwäche und -atrophie in Verbindung mit Kontrakturen und Herzbeteiligung auf. Dieser klinische Phänotyp ähnelt eher dem von Patienten mit Kernhüllen-assoziierten Erkrankungen wie Emery-Dreifuß-Muskeldystrophie (EDMD) als dem von Desminopathie-Patienten mit einer heterozygoten DES-Mutation. Darüber hinaus zeigte die histopathologische Analyse menschlicher Skelettmuskelbiopsien von Patienten ohne Desmin Hinweise auf Veränderungen der subzellulären Positionierung und der Form der Myonuklei. Diese klinischen und histopathologischen Merkmale deuten auf Veränderungen der Morphologie und Funktion dieser Myonuklei hin, die durch den Mangel an Desmin hervorgerufen werden - ein Aspekt, der bei Desminopathien noch nicht untersucht wurde. Ziel dieser Arbeit war es, die Frage zu beantworten, ob und inwieweit das Fehlen von Desmin sowie die mono- und biallelische Expression von mutiertem Desmin zu Veränderungen der Myonuklei in Skelettmuskelgewebe und kultivierten Myoblasten führt. Methoden Da Skelettmuskelbiopsien von Patienten mit Desminopathien selten sind, wurde diese Studie an Skelettmuskelgewebe von homozygoten Desmin-knock-out- (DKO), heterozygoten und homozygoten Desmin-R349P-knock-in- (DKI HET/HOM) und Wildtyp- (WT) Mäusen, sowie mit Myoblastenkulturen dieser Desminopathie-Modelle durchgeführt. Die myopathologische Analyse erfolgte an H&amp;E-gefärbten Schnitten des Musculus (M.) soleus- und gastrocnemius, die von Mäusen aller Genotypen stammen. Die dreidimensionale Morphologie der Myonuklei wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie von DAPI-gefärbten Querschnitten des M. soleus und gastrocnemius, sowie SiR-DNA-gefärbten Myoblastenkultur-Präparaten analysiert. Die aufgenommenen Bilder bestehend aus z-Stapeln wurden mittels FIJI-Bildsoftware analysiert. Die berechneten Werte beinhalten das Volumen, die Oberfläche, die Spherizität, die Elongatio und die Flatness der Myonuklei. Für künftige Studien zur subzellulären Lokalisierung und Proteinexpression wurden 22 primäre, gegen Kernhüllenproteine gerichtete, Antikörper durch indirekte Immunfluoreszenz- und Immunoblot-Experimente getestet. Die RNA-Sequenzierung (RNAseq) wurde mit Gesamt-RNA-Proben aus Skelettmuskelgewebe von DKO- und WT-Mäusen durchgeführt. Ergebnisse und Beobachtungen Die myopathologische Analyse ergab myopathische Veränderungen sowie vermehrt zentralisierte und pleomorphe Myonuklei im Soleus-Muskel sowohl bei homozygoten DKO- als auch bei DKI-Mäusen. Heterozygote DKI-Mäuse wiesen hierbei keine pathologischen Veränderungen auf. Die dreidimensionale morphometrische Analyse der Myonuklei im M. soleus und gastrocnemius von DKO- (n = 102 Kerne) und WT-Mäusen (n = 101 Kerne) ergab ein größeres mittleres Kernvolumen bei DKO-Mäusen, ohne jedoch einen statistisch signifikanten Unterschied für die berechneten Parameter Volumen, Oberfläche, Spherizität, Elongatio und Flatness zwischen den beiden Genotypen zu zeigen. Entsprechende Analysen von Myonuklei aus heterozygoten (n = 106 Kerne) und homozygoten (n = 100 Kerne) DKI- sowie der WT-Kontrolle (n = 105 Kerne) ergaben lediglich einen statistisch signifikanten Unterschied für den Parameter Elongatio im Vergleich zwischen heterozygoter DKI- und WT-Tieren. Die dreidimensionale morphometrische Analyse von Myonuklei aus kultivierten Myoblasten erfolgte an DKO- (n = 129 Kerne) und WT-Kontrollen (n = 112 Kerne), sowie heterozygote DKI- (n = 120 Kerne) und die entsprechenden WT-Proben (n = 246 Kerne). Der einzige dabei gefundene, statistisch signifikante Unterschied zeigte sich bei dem Parameter Elongatio zwischen DKO- und WT-Myonuklei. Zehn von 22 primären Antikörpern konnten für weitere Immunfluoreszenzanalysen von Geweben und Zellen validiert werden. Bei der Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten von DKO- und WT-Muskeln mit Schwerpunkt auf der Expression von 52 mit der Kernhülle- und Desmin-assoziierten Genen wurden insgesamt 14 Gene identifiziert, die eine statistisch signifikante Regulation aufweisen. Im DKO-Muskel zeigte sich eine signifikant erhöhte Expression von neun Genen Fhl1, Wfs1, Tmem43, Vma21, Lmna, Lmo7, Cnnm4, Nes und Macf1, während Des, Nup133, Ryr1, Creld1 und Tor1aip1 signifikant herunterreguliert waren. Schlussfolgerung und Diskussion Die myopathologische Analyse lieferte Hinweise, dass nicht nur die Abwesenheit von Desmin, sondern auch die biallelische Expression von mutiertem Desmin zu Veränderungen in der Morphologie und Positionierung der Myonuklei im M. soleus führt. Die dreidimensionale morphometrische Analyse von je etwa 100 Myonuklei in Skelettmuskelgewebe und kultivierten Myoblasten aus den hier verwendeten Desminopathie-Mausmodellen konnte diesen Befund jedoch nicht weiter untermauern. Die Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten ergab ein komplexes Muster mit einer signifikanten Dysregulation von 14 Genen, deren Genprodukte entweder als strukturelle Komponenten der Kernhülle dienen, mit dieser assoziiert sind oder mit Desmin in Interaktion stehen. Die funktionelle Bedeutung des letzteren Befundes ist derzeit unklar. Insgesamt liefert diese Arbeit sowohl positive als auch negative Ergebnisse in Bezug auf die Frage, ob das Fehlen von Desmin sowie die Expression von mutiertem Desmin zu morphologischen und funktionellen Veränderungen von Myonuklei führen.