Pathways metabolici multipli per la degradazione di composti aromatici: uno studio di upper e lower pathways in Pseudomonas stutzeri OX1
Creators: name: Capasso, Paola
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: Pseudomonas stutzeri OXI utilizza come unica fonte di carbonio e di energia l’oxilene, il toluene, i cresoli ed alcuni dimetilfenoli (DMP). Pertanto il microorganismo
potrebbe essere efficacemente utilizzato per interventi di biorisanamento di aree inquinate da composti di natura aromatica. Lo stadio iniziale dell’ossidazione di molecole aromatiche è operato dalla Toluene/o-xilene Monoossigenasi (ToMO), e dalla Fenolo ossidrilasi (PH), che costituiscono l’upper pathway della via degradativa.
Le molecole prodotte sono poi convertite dagli enzimi del lower pathway in intermedi del ciclo di Krebs. Sia ToMO che PH agiscono su un range simile di substrati e
pertanto la loro funzione appare ridondante. I primi enzimi del lower pathway del batterio sono la catecolo 2,3 diossigenasi (C2,3O), enzima responsabile del taglio
idrolitico dell’anello aromatico, la semialdeide 2 idrossimuconica deidrogenasi (HMSD) e la semialdeide 2-idrossimuconica idrolasi (HMSH). E’ ancora da ricordare
che in P.stutzeri OX1 è presente un differente upper pathway, il TOL upper pathway, responsabile dei primi passaggi di ossidazione di composti quali il m- ed il p-xilene. Il primo enzima di tale pathway è la xilene monoossigenasi (XMO). La contemporanea espressione di XMO e di ToMO sembra tuttavia essere letale per il microrganismo.
L’obiettivo principale del presente progetto di tesi di dottorato è stata la comprensione delle proprietà di alcuni enzimi dei pathway catabolici di P. stutzeri
OX1. Tale progetto si è articolato in diversi punti.
In primo luogo è stato condotto uno studio cinetico degli enzimi ToMO e PH per comprendere le ragioni metaboliche della loro apparente ridondanza di funzioni.
L’analisi dei parametri cinetici ha evidenziato che ToMO è più efficiente nel primo passaggio di ossidrilazione, mentre PH è più efficiente nel secondo. Inoltre i due
enzimi mostrano una regioselettività diversa in entrambi gli stadi di ossidrilazione. I dati raccolti portano alla conclusione che le attività degli enzimi ToMO e PH non sono
ridondanti ma complementari. L’efficienza catalitica dei due enzimi e le loro proprietà di regioselettività sembrano aver consentito l’ampliamento delle capacità metaboliche di Pseudomonas stutzeri OX1. Inoltre, sulla base dei risultati della caratterizzazione cinetica sono stati realizzati e caratterizzati mutanti dell’enzima ToMO con alterata regioselettività. In particolare è stato osservato che l’accoppiamento del mutante ToMO-E103G con l’enzima PH incrementa l’efficienza dell’upper pathway portando alla formazione preferenziale di prodotti che possono entrare nel lower pathway.
In questo lavoro di tesi è inoltre riportato uno studio preliminare del primo enzima dell’upper TOL pathway, XMO, per investigare se alla base della letalità associata
alla contemporanea espressione dei due pathway (TOU e TOL) vi fosse qualche fenomeno di interferenza tra i due enzimi che iniziano le vie metaboliche, ToMO e XMO.I dati indicano che la contemporanea azione dei due enzimi porta a una perdita di efficienza metabolica, ma non permettono di avere indicazioni sulla eventuale dannosità dovuta all’accumulo di intermedi non ulteriormente metabolizzabili.
I dati presentati nella terza parte della tesi sono relativi allo studio di due enzimi del lower pathway, HMSD e HMSH, ed al loro utilizzo nella conversione dei prodotti
generati da forme mutate dell’enzima C2,3O. I dati indicano che i primi enzimi del pathway, nel nostro caso ToMO e PH, presentano bassa specificità di substrato e
quindi tendono ad ossidrilare un gran numero di composti aromatici. Al contrario gli enzimi successivi, come HMSD e HMSH, divengono progressivamente più specifici consentendo l’introduzione di poche molecole in pathway metabolici centrali. Alterare la specificità di substrato di un enzima localizzato in punti chiave del pathway (come
è la C2,3O) implica che le caratteristiche degli enzimi che seguono devono necessariamente accordarsi con le nuove proprietà cataboliche acquisite.