title: Molekulare Charakterisierung der Liganden spezifischen Spannungsabhängigkeit der Opioid-Rezeptoren
title: Molecular characterization of the ligand-specific voltage dependance of the opioid-receptors
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Kirchhofer, Sina Birgitt
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: voltage dependance
Opioid Receptors
Medical sciences Medicine
Medizin
GPCR
Spannungsabhängigkeit
Opioid-Rezeptoren
µ Opioid-Rezeptor
FRET
µ Opioid Receptors

description: G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind einer der wichtigsten Angriffspunkte in der pharmakologischen Therapie. Hierbei stellen die Opioid-Rezeptoren, im speziellen der µ Opioid-Rezeptor, den wichtigsten Angriffspunkt in der Therapie von starken Schmerzen dar. Die schmerzstillende Wirkung der Opioide wird jedoch von starken Nebenwirkungen, wie das Atemdepression oder Abhängigkeit, beteiligt. Das hohe Risiko für Missbrauch und Überdosis führte in den USA zur Opioid-Krise, die alleine im Jahr 2019 für bis zu 50.000 Tote verantwortlich war. Die Mehrheit der Todesfälle ist hierbei auf synthetische Opioide, wie Fentanyl, zurückzuführen. Zur Schmerztherapie wird eine Vielzahl an Opioiden eingesetzt. Diese unterscheiden sich nicht nur in ihrer chemischen Struktur. Auch ihre Potenz, Effektivität und Kinetik in der Gi/o-Aktivierung ist variabel. Es gibt viele Versuche neue, effektivere und sicherere Opioide zu entwickeln. Jedoch ist es wichtig, basierend auf den genannten Unterschieden zwischen den Opioiden, die unterschiedlichen ausgelösten Effekte der Opioide besser zu verstehen. Eine wichtige Rolle spielt hierbei die Untersuchung der Liganden-Rezeptor-Interaktionen sowie ein besseres Verständnis für die Liganden-spezifische Modulation der Rezeptor-Aktivität bei Spannungsänderungen des Membranpotentials. In dieser Arbeit wurden die Liganden-Rezeptor-Interaktionen mittels molekularen Dockings und Interaktionsmuster verschiedener Gruppen von Opioiden mittels einer Fingerprint-Analyse dieser Liganden-Bindeposen definiert. Diese Interaktionen konnten experimentell mittels Mutations-Studien in FRET-basierten Assays verifiziert werden. Diese Kombination aus in silico und in vitro Untersuchung erlaubte zudem eine detaillierte Charakterisierung der Liganden-spezifischen Spannungsabhängigkeit des MORs. Hierfür wurde einerseits eine Vielzahl an klinisch relevanten Opioid-Agonisten sowie Antagonisten bezüglich ihres Spannungsverhaltens auf verschiedenen Ebenen der GPCR-Signalkaskade mittels FRET-Messungen unter Kontrolle des Membranpotentials sowie Messungen von K+-Strömen charakterisiert. Die untersuchten Liganden konnten hierbei bezüglich ihres spannungsinduzierten Verhaltens in verschiedene Gruppen aufgeteilt werden. Eine Gruppe von Liganden zeigte eine starke Erhöhung der Rezeptor-Aktivität induziert durch Depolarisation. Hierfür konnte gezeigt werden, dass es zu einer Modulation der Effektivität der Rezeptor-Aktivierung kommt. Eine weitere Gruppe an Liganden zeigte eine Depolarisations-induzierte Verminderung der Rezeptor-Aktivität. Es konnten aber auch Liganden gefunden werden, unter denen kein Spannungseffekt detektierbar war. Diese Effekte konnten im weiteren Verlauf dieser Arbeit in Korrelation mit den Interaktionsmuster der Liganden gebracht werden. Diese Korrelationen konnten wiederum durch Mutationsstudien untermauert werden. Hierbei ergaben sich Interaktionsmuster und Motive im Rezeptor, welche die Richtung und Ausprägung des Liganden-spezifischen Spannungseffekts des MORs definieren und Rückschlüsse auf einen potentiellen generellen Spannungsmechanismus für GPCRs zulassen. Des Weiteren wurde die Spannungsabhängigkeit der anderen Opioid-Rezeptoren charakterisiert. Auch hier ließ sich eine Liganden-spezifische Spannungsabhängigkeit für den DOR und KOR definieren. Für den Nozizeptin-Rezeptor konnte eine ausgeprägte Spannungsabhängigkeit nachgewiesen werden. Um weitere Untersuchungen der Opioid-Rezeptor-Familie zu ermöglichen, wurden zudem in dieser Arbeit FRET-basierte Rezeptor-Konformations-Sensoren für den MOR, KOR und NOP generiert und charakterisiert. Diese neu etablierten Sensoren eigneten sich für Messungen in Hochdurchsatz-Assays und geben somit eine neue, unkomplizierte Möglichkeit zur Charakterisierung der bereits in der Klinik eingesetzten Opioide sowie zur Testung neu entwickelter Opioide.
description: G-Protein coupled receptors are one of the most important targets in pharmacological therapy. Here, the opioid receptors, in particular the µ opioid receptor, represent the most important target in therapy of severe pain. However, the pain killing effects are accompanied by severe side effects, like respiratory depression or addiction. The high risk for abuse or overdose led to the opioid crisis in the US, responsible for more than 50.000 caused deaths in 2019 alone. The majority of deaths here are due to synthetic opioids, such as fentanyl. A wide variety of opioids are used for pain therapy. These differ not only in their chemical structure. Their potency, efficacy and kinetics to activate Gi/o proteins is variable. There are already attempts to develop more effective and safer opioids. However, based on the aforementioned differences between opioids, it is important to better understand the different triggered effects of opioids. In this context it is crucial to evaluate the ligand-receptor interactions as well as to better understand the ligand-specific modulation of receptor activity upon voltage changes in the membrane potential. In this study, molecular docking was used to define ligand-receptor interactions. In addition, a fingerprint analysis of these ligand-binding poses was used to identify interaction patterns of different groups of opioids. These interactions could be verified experimentally via site-directed mutagenesis in FRET-based assays. This combination of in silico and in vitro analysis allowed a detailed characterization of the ligand-specific voltage dependence of the MOR. For this purpose, on the one hand, a large number of clinically relevant opioid agonists as well as antagonists were tested with regard to their voltage sensitivity at different levels of the GPCR signal cascade based on FRET-measurements under control of the membrane potential as well as measurements of K+-currents. The investigated ligands could be divided into different groups with respect to their voltage-induced behavior. One group displayed a strong increase in receptor activity induced by a depolarization. For this, it has been shown that there is a modulation of the efficacy of receptors activation. Another group of ligands showed a depolarization-induced decrease in receptor activity. However, ligands could also be found under which no voltage effect was detectable. These effects could be correlated with the interaction patterns of the ligands in the further course of this work. These correlations could again be supported by site-directed mutagenesis. This revealed interaction patterns and motifs in the receptor that define the direction and extend of the ligand-specific voltage effect of the MOR and allows conclusions to be drawn about a potential general voltage sensing mechanism of GPCRs. Furthermore, the voltage dependence of other opioid receptors was characterized. Again, a ligand-specific voltage dependence could be defined for the DOR and KOR. A pronounced voltage dependence could also be demonstrated for the nociception receptor. In addition, to enable further investigations of the opioid receptor family, FRET-based receptor conformations sensors for the MOR, KOR, and NOP were generated and characterized in this work. These newly established sensors were suitable for high-throughput measurements, providing a new, straightforward way to characterize opioids already in use in the clinic or to test newly developed opioids.