title: Η συμβολή των μικροπλαστικών στην εξάπλωση γονιδίων ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά κατά την επεξεργασία υγρών αποβλήτων
title: The contribution of microplastics to the spread of antibiotic resistance genes
during wastewater treatment
Creators: name: Λεωνιδου Ευαγγελια
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2022

description: Τα μικροπλαστικά έχουν ανιχνευθεί σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων ως αποτέλεσμα της ανθρώπινης δραστηριότητας στη σύγχρονη εποχή.  Από την αφθονία των φαρμακευτικών ενώσεων που υπάρχουν στα λύματα, τα αντιβιοτικά ανιχνεύονται σε σημαντικές συγκεντρώσεις, που κυμαίνονται από ng/L έως μg/L.  Τα μικροπλαστικά συμβάλλουν στην προσκόλληση και ανάπτυξη μικροοργανισμών, ευνοώντας την ανάπτυξη βιοϋμενίου (βιοφίλμ).  Το βιοφίλμ διευκολύνει τη μεταφορά μεταξύ των αποικιστών, συμβάλλοντας έτσι στη διάδοση των γονιδίων ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (Antibiotic Resistance Genes - ARGs).  Ως αποτέλεσμα, τα αστικά λύματα αποτελούν μια από τις κυριότερες πηγές εξάπλωσης των αντιβιοτικών και των ανθεκτικών γονιδίων στο περιβάλλον.  Η απελευθέρωση επεξεργασμένων υγρών αποβλήτων στο περιβάλλον και η χρήση επεξεργασμένης ιλύος για γεωργικούς σκοπούς καθιστούν επιτακτική τη μελέτη της μεταφοράς των ARGs που συνδέονται με τα μικροπλαστικά στο περιβάλλον.
Ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν να προσδιοριστεί κατά πόσο τα μικροπλαστικά που ανιχνεύονται στις δεξαμενές μιας τυπικής μονάδας επεξεργασίας λυμάτων συμβάλλουν στη διασπορά των ARGs στο υδάτινο περιβάλλον.  Για το λόγο αυτό, ελήφθησαν δείγματα από την ενεργό ιλύ και την έξοδο μίας τοπικής μονάδας επεξεργασίας λυμάτων που βρίσκεται στα Χανιά της Κρήτης κατά τους ζεστούς (τουριστική περίοδο) και κρύους (μη τουριστική περίοδο) μήνες του έτους 2020.  Από κάθε δείγμα επιλέχθηκε καθορισμένος αριθμός μικροπλαστικών και διαχωρίστηκε το μικροβιολογικό φορτίο που ήταν προσκολλημένο στην επιφάνεια τους.  Επιπλέον, λήφθηκαν δείγματα από την ενεργοποιημένη ιλύ, χωρίς προηγούμενη επεξεργασία, για την απομόνωση του συνολικού DNA και τη μέτρηση του συνολικού φορτίου των ARGs. Το διαχωρισμό ακολούθησε ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των πολυμερών από τα δείγματα εξόδου, ενώ το βιοφίλμ από όλα τα δείγματα έτυχε μοριακής ανάλυσης RT-PCR για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των ARGs που είναι υπεύθυνα για την αντοχή στις κινολόνες, τις β-λακτάμες, τις τετρακυκλίνες και τις σουλφοναμίδες.  Συγκεκριμένα, τα γονίδια στόχοι ήταν qnrA, ampC, tetA και sul2.
Οι κύριοι τύποι πολυμερών που προσδιορίστηκαν ήταν HDPE, PP και PET.  Υψηλότερη συγκέντρωση ARGs καταγράφηκε στα δείγματα εξόδου σε σχέση με τα δείγματα ενεργού ιλύος.  Το γεγονός αυτό εγείρει ανησυχίες για τα μικροπλαστικά και τη μεταφορά ARGs, καθώς τελικός αποδέκτης των επεξεργασμένων λυμάτων είναι το θαλάσσιο περιβάλλον.  Επιπλέον, καταγράφηκαν υψηλότερες τιμές στα δείγματα που ελήφθησαν από το βιοφίλμ των μικροπλαστικών από ό,τι στα δείγματα που δεν υποβλήθηκαν σε περαιτέρω επεξεργασία.  Μεταξύ των τεσσάρων γονιδίων που αξιολογήθηκαν, το ampC και το tetA ανιχνεύθηκαν στα περισσότερα δείγματα, υποδεικνύοντας ότι οι β-λακτάμες και οι τετρακυκλίνες είναι τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά στη συγκεκριμένη κοινότητα.  Επιπρόσθετα, η μελέτη έδειξε μεταβαλλόμενη ανίχνευση της ποσότητας των ARGs κατά την περίοδο δειγματοληψίας.  Αυτό δείχνει δυνητικά την υπέρμετρη χρήση αντιβιοτικών ή ακόμη και την λανθασμένη κατανάλωσή τους για ιογενείς λοιμώξεις.
Επομένως, η έρευνα συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση της μεταφοράς και της απελευθέρωσης ARGs μέσω των Ε.Ε.Λ, καλύπτοντας τυχόν κενά της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, με απώτερο στόχο την προστασία του περιβάλλοντος και την αειφόρο ανάπτυξη.

description: Microplastics have been detected in wastewater treatment plants (WWTPs) as a result of human activity in modern times.  Among the broad variety of pharmaceutical compounds present in wastewater, antibiotics are detected in significant concentrations, ranging from ng/L to μg/L.  Microplastics contribute to the adhesion and growth of microorganisms, forming biofilm.  The biofilm facilitates transmission between colonists and it contributes to the spread of antibiotic resistance genes (ARGs).  As a result, municipal wastewater is one of the main sources of antibiotics and resistance genes in the environment.  The release of treated wastewater into the environment and the use of treated sludge for agricultural purposes make it imperative to study the transport of ARGs associated with microplastics into the environment.
The aim of this work is to determine whether the microplastics detected in a typical wastewater treatment plant contribute to the dispersion of ARGs in the aquatic environment.  For this reason, samples were taken from the activated sludge and the effluent of a local wastewater treatment plant located in Chania, Crete during the hot (tourist season) and cold (non-tourist season) months in 2020.  A specified number of microplastics was selected from each sample and the microbiological load attached to their surface was separated.  Furthermore, additional samples were taken from the activated sludge, without any prior treatment, to isolate the total DNA and measure the total load of ARGs.  The separation was followed by the qualitative and quantitative determination of polymers from the effluent samples, while the biofilm from all the samples was subjected to RT-PCR molecular analysis to detect and quantify the ARGs responsible for resistance to quinolones, β-lactams, tetracyclines and sulfonamides.  Specifically, the target genes were qnrA, ampC, tetA and sul2.
The main types of polymers identified were HDPE, PP and PET.  Also, higher concentration of ARGs was recorded in the effluent samples compared to the activated sludge samples.  This fact, raises concerns about microplastics and the transport of ARGs, as the ultimate recipient of treated wastewater is the marine environment.  In addition, higher concentration of the ARGs was recorded in the samples obtained from the biofilm of the microplastics than in the samples that were not further processed.  Among the four genes evaluated, ampC and tetA were detected in the most samples, indicating that β-lactams and tetracyclines are the most commonly used antibiotics in this community.  Moreover, the study showed variable detection of the amount of ARGs during the sampling period.  This indicates the overuse of antibiotics or wrong consumption even for viral infections.
Therefore, this research contributes to the better understanding of the transport and release of ARGs through WWTPs, covering any gaps in the existing literature, with the ultimate goal of protecting the environment and sustainable development.