title: Function of the ATP-dependent chromatin remodeler Mi-2 in the regulation of ecdysone dependent genes in Drosophila melanogaster
title: Funktion des ATP-abhängigen Chromatin Remodelers Mi-2 in der Regulation von Ecdyson-abhängigen Genen in Drosophila melanogaster
Creators: name: Kreher, Judith
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Drosophila, Chromatin
Drosophila
Nucleosome
Nuclear receptor
Biowissenschaften, Biologie
Nucleosom
Chromatin , Kernrezeptor

description: The development of the fruitfly
      Drosophila melanogaster is regulated by the steroid hormone
      ecdysone. Ecdysone is released at the onset of metamorphosis
      and initiates a cascade of transcriptional events. First, it
      leads to the heterodimerisation of the Ecdysone receptor
      (EcR) with its binding partner ultraspiracle. This complex
      recruits the transcription machinery to ecdysone inducible
      genes and thereby initiates transcription of genes that
      contribute to pupariation and metamorphosis. ATP-dependent
      chromatin remodelers regulate transcription by altering DNA
      accessibility and often reside in multimeric protein
      complexes. Mi-2 is a member of the CHD family of
      ATP-dependent chromatin remodelers and can function both as
      co-repressor and co-activator in transcription regulation.
      The results described in this thesis investigate the function
      of the chromatin remodeler Mi-2 in the regulation of ecdysone
      dependent genes. Further, they provide a model by which Mi-2
      is targeted to and influences transcription of ecdysone
      dependent genes. In the first part of this thesis,
      genome-wide Mi-2 binding sites were mapped by chromatin
      immunoprecipitation followed by DNA-Sequencing (ChIPSeq) in
      untreated and ecdysone treated Drosophila S2 cells. This led
      to the identification of 103 Mi-2 binding sites that show
      increased binding of Mi-2 upon hormonal stimulation. Further
      analyses showed that a significant proportion of these
      binding sites resides in the close proximity of ecdysone
      inducible genes, implicating that Mi-2 functions in the
      regulation of these loci. Six ecdysone induced Mi-2 binding
      sites at two ecdysone dependent genes, the vrille and the
      broad loci were investigated in more detail. Here, depletion
      of Mi-2 resulted in a strong increase in expression of these
      genes in untreated and ecdysone treated cells. However,
      depletion of a different ATP-dependent chromatin remodeler,
      Iswi, did not result in derepression of broad and vrille,
      indicating that Mi-2 function is specific at the broad and
      vrille genes. In the second part of this thesis, interaction
      studies revealed that Mi-2 can bind to EcR. This interaction
      was found to be independent of the hormone ecdysone. Further,
      the interaction between Mi-2 and EcR was mapped to the ATPase
      domain of Mi-2. These results demonstrated the first
      described interaction between the catalytic domain of Mi-2
      and a nuclear receptor. In addition, the activation function
      2 (AF2 domain) of EcR was found to be important for the
      interaction with Mi-2. The finding that Mi-2 and EcR can
      physically interact led to the hypothesis that EcR can
      recruit Mi-2 to specific sites in the genome. Indeed, a
      significant overlap between EcR and Mi-2 binding sites was
      found in both untreated and ecdysone treated cells. In
      agreement with this hypothesis, depletion of EcR led to
      decreased ecdysone induced Mi-2 recruitment to the vrille and
      broad genes. These findings established a new recruitment
      model for Mi-2 by EcR to chromatin. Finally, Micrococcal
      nuclease (MNase) mapping demonstrated that Mi-2 functions at
      the vrille gene by maintaining a closed chromatin structure
      at this locus. Here, depletion of Mi-2 resulted in a more
      open chromatin structure, which correlated with an increase
      in expression of vrille.
description: Die Entwicklung der Fruchtfliege
      Drosophila melanogaster wird durch das Steroidhormon Ecdyson
      reguliert. Ecdyson wird zu Beginn der Metamorphose sekretiert
      und initiiert eine Kaskade von transkriptionellen
      Ereignissen. Zunächst führt es zur Heterodimerisierung des
      Ecdyson Rezeptors (EcR) mit seinem Bindungspartner
      ultraspiracle. Dieser Komplex rekrutiert die
      Transkriptionsmaschinerie an Ecdyson induzierbare Gene und
      initiiert dadurch die Transkription von Genen, welche direkt
      zur Verpuppung und Metamorphose beitragen. ATP-abhängige
      Chromatinremodeler regulieren die Transkription in dem sie
      die Zugänglichkeit der DNA ändern und befinden sich in
      multimeren Proteinkomplexen befinden. Mi-2 ist ein Mitglied
      der CHD Familie der ATP-abhängigen Chromatin Remodeler und
      fungiert als Korepressor und Koaktivator in der
      transkriptionellen Regulation. Die in dieser Arbeit
      beschriebenen Resultate untersuchen die Funktion des
      Chromatin Remodelers Mi-2 in der Regulation von
      ecdysonabhängigen Genen. Diese Ergebniss führten zu einem
      Modell welches beschreibt, wie Mi-2 an hormonregulierte Gene
      bindet und die Transkription von ecdysonabhängigen Genen
      beeinflußt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden genomweite
      Mi-2 Bindungsstellen durch Chromatin-Immunopräzipitation
      gefolgt von DNA-Sequenzierung (ChIPSeq) in unbehandelten und
      ecdysonbehandelten Drosophila S2 Zellen kartiert. Dies führte
      zur Identifizierung von 103 Mi-2 Bindestellen, die verstärkte
      Bindung von Mi-2 nach hormoneller Stimulation zeigen. Weitere
      Analysen zeigten, dass ein signifikanter Anteil dieser
      Bindungsstellen in der Umgebung von ecdysoninduzierbaren
      Genen liegt, was eine Funktion von Mi-2 in der Regulation
      dieser Loci impliziert. Sechs ecdysoninduzierte Mi-2
      Bindungsstellen an zwei ecdysonabhängigen Genen, broad und
      vrille, wurden eingehender untersucht. Hier führte
      Depletierung von Mi-2 zu einem starken Anstieg dieser Gene in
      unbehandelten und ecdysonbehandelten Zellen. Die Depletierung
      eines anderen ATP-abhängigen Chromatin Remodelers, Iswi,
      führte hingegen nicht zu einer Dereprimierung von broad und
      vrille. Dies deutet darauf hin, dass die Funktion von Mi-2 an
      den Genen broad und vrille spezifisch ist.
      Interaktionsstudien im zweiten Teil dieser Arbeit machten
      deutlich, dass Mi-2 an den EcR binden kann. Es wurde gezeigt,
      dass diese Interaktion unabhängig von dem Hormon Ecdyson ist.
      Desweiteren wurde die Interaktion zwischen Mi-2 und EcR auf
      die ATPase Domäne von Mi-2 kartiert. Diese Ergebnisse weisen
      zum ersten mal eine Interaktion zwischen der katalytischen
      Domäne von Mi-2 und einem Kernrezeptor nach. Zusätzlich dazu
      wurde beobachtet, dass die Aktivierungsfunktion 2 (AF2
      Domäne) des EcR wichtig für die Interaktion mit Mi-2 ist. Die
      Erkenntnis, dass Mi-2 und EcR physisch interagieren können,
      führte zu der Hypothese, dass EcR Mi-2 an spezifische Stellen
      im Genom rekrutieren kann. In der Tat wurde ein signifikanter
      Überlapp zwischen Mi-2 und EcR Bindungsstellen, sowohl in
      unbehandelten als auch in ecdysonbehandelten Zellen,
      gefunden. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese, führte
      eine Depletierung von EcR zu einer verminderten,
      ecdysoninduzierten Rekrutierung von Mi-2 an die Gene broad
      und vrille. Diese Ergebnisse etablierten ein neues Modell für
      die Rekrutierung von Mi-2 durch den EcR an das Chromatin.
      Schließlich zeigten MNase Kartierungsstudien mit
      Mikrokokkus-Nuklease (MNase), dass Mi-2 durch die
      Aufrechterhaltung einer geschlossenen Chromatinsstruktur am
      vrille Gen fungiert. Hier führte eine Depletierung von Mi-2
      zu einer geöffneten Chromatinstruktur, welche mit einer
      verstärkten Expression von vrille korrelierte.