The role of Leishmania major proliferation for the interaction between the parasite and its tissue environment in vivo
Creators: name: Heyde, Sandrina
Publisher: name: Otto von Guericke University Library, Magdeburg, Germany
Year: 2019
Subjects: subject: Molekularbiologie
subject: 571

description: Leishmania major (L. major) survives within a variety of host phagocytes and undergoes cycles of replication, release from, and uptake into new cells. It is unclear whether distinct phases and host cell types within these cycles are permissive or inhibitory for pathogen proliferation. Therefore, a novel photoconversion-based proliferation reporter (mKikumeGR) was used in the presented thesis to determine L. major proliferation in relation to distinct phagocyte subpopulations in the ongoing infection. The thesis is divided into three main parts: (1) In the first part, the mKikumeGR reporter system, constitutively expressed in L. major (LmSWITCH), was improved for more efficient application of the system. Photoconversion of LmSWITCH with a LED diode array in vitro and in vivo as well as compatibility with flow cytometry analysis and immunohistochemical methods was successfully established. (2) In the second part of the thesis, the tissue niche of high and low proliferating L. major was defined, and a cell-intrinsic control mechanism for Leishmania proliferation was determined. Cells positive for the markers CD11c+ and Ly6C+ were defined as main cell type harboring rapidly proliferating L. major in the ongoing infection, irrespective of the activation state of the cells. Furthermore, high proliferating parasites were defined to represent the main L. major subpopulation capable of successful transfer to new host cells. Newly recruited host cells were infected irrespectively of their cell type, however among these newly infected cells, only cells positive for CD11c and Ly6C were permissive for efficient proliferation. (3) The third part provides perspectives for future analysis, like the analysis of antigen presenting cell (APC) – T cell interactions in the context of the proliferative state of the parasites. To this end, an approach including a specific transgenic T cell receptor and ovalbumin expressing LmSWITCH was successfully established for intravital 2-photon microscopy. Therefore, the interactions between APCs containing L. major of different proliferation states with specific Th1 CD4+ cells in the living host organism can be analyzed reliably and quantitatively. Taken together, this work provides for the first time a quantification of L. major proliferation rates with respect to different host cell types, and to different phases in the cell-to-cell transfer cycle, in an unperturbed infection setting. It is established that, besides their well-described function for priming and activating T cell effector functions against L. major, CD11c+ cells provide a reservoir for rapidly proliferating parasites that disseminate at the site of infection.
description: Leishmanien sind eukaryotische, einzellige Parasiten, die im Darm von Sandmücken persistieren und ihren Lebenszyklus im Säugetier vollenden. Dort leben und proliferieren die Parasiten in einer Vielzahl von professionellen Phagozyten. Sie durchlaufen Zyklen von Replikation, Freisetzung und erneuter Aufnahme in andere Phagozyten des Wirtsorganismus. Bis jetzt war es weitgehend unklar, ob die verschiedenen Phasen und Wirtszellen innerhalb dieser Zyklen die Pathogenproliferation begünstigen oder inhibieren. Dieses Thema hat eine hohe Relevanz, um einerseits das Überleben der Parasiten im Wirtsorganismus, und andererseits die erfolgreiche Induktion einer Immunantwort bei einer Infektion zu verstehen. Um diese Fragestellung auf Zellebene zu adressieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiger Fluoreszenzprotein-basierter Proliferationsreporter (mKikumeGR) angewendet. Leishmania major (L. major), die diesen photokonvertierbaren Reporter konstitutiv exprimieren, zeigen eine grüne Fluoreszenz, die durch Bestrahlung mit UV – Licht irreversibel zu roter Fluoreszenz konvertiert werden kann. Es wurde gezeigt, dass die Neuexpression von nicht konvertiertem, grün fluoreszierendem Protein, nach der Photokonversion, sowie die Verdünnung des rot fluoreszierenden Proteins, an die Zellteilung gekoppelt ist. Somit kann dieses System als Reporter für die Parasitenproliferation genutzt werden. Mit Hilfe dieses Reporters wurde in der vorliegenden Arbeit die L. major Proliferation während der aktiven Infektion in verschiedenen infizierten Zellpopulationen und deren Transmission in neue Wirtszellen gemessen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen sich in drei Hauptteile untergliedern: (1) Im ersten Teil der Arbeit wurde das mKikumeGR Proliferationsreportersystem in L. major (LmSWITCH) detaillierter charakterisiert, um ein breiteres Anwendungsspektrum zu erreichen und somit eine effektivere Analyse zu ermöglichen. Die erfolgreiche Anwendung eines LED Dioden Arrays zur Photokonversion konnte sowohl in vitro als auch in vivo etabliert werden, wodurch es möglich wurde, größere Flächen, zum Beispiel eine komplette Infektion im Mausohr, zu photokonvertieren. Des Weiteren konnte die Kompatibilität von LmSWITCH mit der Analyse von Proben im Durchflusszytometer und immunhistochemischen Methoden gezeigt werden. (2) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Nische von stark und gering proliferierenden Leishmanien im infizierten Gewebe, mittels Durchflusszytometrie, Multi-epitope ligand cartography (MELC) und intravitaler 2-Photonenmikroskpie, definiert. Dabei wurden Hinweise auf einen zell-intrinsischen Kontrollmechanismus für die Proliferation von L. major beobachtet, da die Mehrheit der Wirtszellen entweder stark proliferierende oder gering proliferierende Leishmanien beinhalteten, jedoch nur sehr selten verschiedene Subpopulationen unterschiedlich proliferierender Parasiten. Weiterhin konnten Zellen, die positiv für die Oberflächenmarker CD11c und Ly6C sind, als Hauptzelltyp für stark proliferierende Leishmanien definiert werden, unabhängig vom Aktivierungsgrad der Zellen. Dementsprechend sind gering proliferierende Leishmanien vorrangig in CD11c- Zellen lokalisiert, ebenfalls unabhängig von der Expression von Aktivierungsmarkern wie CD86 und MHC-Klasse-II. Des Weiteren wurden strak proliferierende Leishmanien als wichtigste Subpopulation für einen erfolgreichen Transfer von einer Wirtszelle in eine neue Wirtszelle definiert, wobei ein direkter Transfer von einer Zelle in die nächste Zelle sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden konnte. Neu rekrutierte Wirtszellen werden dabei unabhängig von ihrem Zelltyp infiziert, wobei jedoch nur Zellen, die positiv für CD11c und Ly6C sind, eine effiziente Parasitenproliferation zulassen. (3) Im dritten Teil der Arbeit wurden Ansätze für zukünftige Analysen etabliert. Um mögliche molekulare Mechanismen hinter den im zweiten Teil gewonnenen Erkenntnissen zu identifizieren, wurden Experimente zu eventuellen zell-intrinsischen Effekten von iNOS beziehungsweise der NADPH Oxidase etabliert. In ersten Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Leishmanienproliferation in iNOS-/--Zellen signifikant erhöht ist im Vergleich zu benachbarten Wildtyp-Zellen. Das deutet auf einen zell-intrinsischen Kontrollmechanismus von iNOS hin. Für die NADPH Oxidase hingegen, konnten solche Unterschiede nicht detektiert werden. Des Weiteren wurden Methoden etabliert, die die Analyse von Interaktionen zwischen L. major infizierten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und T-Helferzellen in Abhängigkeit vom Proliferationsstatus der Parasiten ermöglichen. Dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit ein OT II-Ovalbumin basiertes System für die Analyse mittels intravitaler 2-Photonenmikroskopie aufgesetzt. Hierfür wurde ein Ovalbumin exprimierender LmSWITCH Stamm (LmSWITCH_OVA) generiert. Mit diesem experimentellen Ansatz können Interaktionen zwischen APCs, die LmSWITCH_OVA mit unterschiedlichen Proliferationsstadien enthalten, mit antigenspezifischen CD4+ Zellen im lebenden Organismus quantitativ analysiert werden. Zusammengefasst liefert die hier präsentierte Arbeit zum ersten Mal eine Quantifizierung der Leishmanienproliferation innerhalb verschiedener Wirtszelltypen mit Betrachtung der unterschiedlichen Phasen des Zell-zu-Zell Transfers in einer Infektion. Demzufolge haben CD11c+ Zellen in der Haut, neben ihrer gut charakterisierten Rolle zur Aktivierung von Effektor-T-Zellen, eine Funktion als Reservoir für stark proliferierende Parasiten, die sich an der Infektionsseite ausbreiten. Diese Erkenntnisse sind von großer Relevanz für das Verständnis darüber, wie der Aufenthalt in einer spezifischen zellulären Nische Leishmanien dazu befähigt, sich effizient zu multiplizieren und an der Infektionsseite langfristig zu persistieren. Dieses Wissen könnte dabei helfen die Entwicklung von verlässlichen Impfstoffen voranzutreiben und effiziente Therapien zu entwickeln.