title: Identifizierung von bioaktiven Verbindungen eines anthocyanreichen Heidelbeerextraktes
Creators: name: Brunner, Melanie Andrea
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Für die Entstehung von Tumoren ist neben dem Lebensstil, der Umwelt und der genetischen Prädisposition auch die Ernährung ein wichtiger Einflussfaktor. Die Initiation und Progression von Krebs wird mit der Veränderung spezifischer Signaltransduktionswege assoziiert, die die Proliferation, Differenzierung und die Induktion der Apoptose steuern. Aus diesem Grund ist es ein Ziel der Chemoprävention, Nahrungsmittelinhaltsstoffe zu identifizieren, die diese Signalkaskaden inhibieren können. Polyphenole können die Aktivierung der Rezeptoren inhibieren und damit die Signaltransduktion beeinflussen (Kern et al. 2005; Fridrich et al. 2007b; Teller et al. 2009a). Da Beeren und Äpfel reich an diesen Polyphenolen sind, haben sich bereits zahlreiche Studien mit polyphenolreichen Extrakten dieser Früchte beschäftigt und es konnten bereits hemmende Effekte sowohl auf die Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen als auch auf das Zellwachstum nachgewiesen werden. Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit soll die Wirkung eines anthocyanreichen Heidelbeerextraktes und diverser Subfraktionen, die von der Technischen Universität Braunschweig (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Winterhalter, Institut für Lebensmittelchemie) extrahiert wurden, sowie ausgewählter Inhaltsstoffe auf verschiedene proliferationsassoziierte biologische Endpunkte untersucht werden. Es sollte untersucht werden, ob diese Fraktionen sowie spezifische Inhaltsstoffe die Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seiner nachgeschalteten Signalelemente modulieren und ob sie das Zellwachstum beeinflussen können. Alle Versuche wurden in der humanen Kolonkarzinomzelllinie HT29 unter Zusatz von Katalase (100 U/ml) durchgeführt. Ein Heidelbeertresterextrakt (HBE) wurde mittels Membranchromatographie SARTOBIND (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Winterhalter, Institut für Lebensmittelchemie) in Fraktionen aufgetrennt. Die Untersuchungen zeigten, dass die sog. Filtratfraktion (FF), die keine Anthocyane enthält, im Gegensatz zur Anthocyanfraktion (AF) einen größeren Einfluss auf die Aktivität des EGFRs hatte. Die Polymerfraktion (PF) und Copigmentfraktion (CF) wiesen hingegen weniger inhibitorisches Potential als FF auf. Der Effekt der CF ließ eventuell auf das antagonistische Wechselspiel zwischen Chlorogensäure (CGA) und Quercetin zurückführen, die sich vermutlich in ihrer Wirkung überlagerten. Durch die polare (CFp) und unpolare Copigmentfraktion (CFu) wurde der Phosphorylierungsstatus des EGFRs nicht gehemmt. Freies Cyanidin (Cy) konnte den Rezeptor supprimieren, wohingegen sein Glucosid Cyanidin-3-glucosid die Aktivität des EGFRs nicht beeinflusste. Im Gegensatz dazu konnte CGA eine stimulierende Wirkung auf den Phosphorylierungsstatus des EGFRs zugewiesen werden. Frühere Untersuchungen aus diesem Arbeitskreis bestätigten diese Aktivierung (Daten entnommen aus Diplomarbeit Christine Krumböck). Daher stellte sich nun die Frage, ob CGA in Coinkubation mit AF, FF und Cy deren Supprimierung des Rezeptors aufhebte. Mittels Western Blot Analyse gelang es zu zeigen, dass die hemmenden Effekte dieser Fraktionen und von Cy teilweise kompensiert wurden. Daraus konnte geschlossen werden, dass das inhibitorische Potential der Subfraktionen und des HBE durch diesen antagonistischen Effekt beeinflusst wurde und somit für die unterschiedliche Hemmleistung der Fraktionen aufgrund konzentrationsbedingter Unterschiede der CGA beitrug. Diese Untersuchungen legten den Schluss nahe, dass für eine angestrebte Unterdrückung der EGFR-Aktivität von Naturstoffextrakten eine Anreicherung von CGA kontraproduktiv sein könnte. Im Bezug auf die Wachstumshemmung wies AF im Gegensatz zur FF den stärksten Effekt auf. Daraus konnte geschlossen werden, dass die Inhibierung des MAPK-Signalweges durch die Hemmung des EGFRs in diesem Falle nur einen untergeordneten Einfluss auf das Zellwachstum hatte und somit die zellwachstumshemmende Eigenschaft der Fraktionen und des HBE womöglich über die Hemmung eines anderen Signalweges erfolgte. PF und CF zeigten einen ähnlichen Effekt. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass in dem gewählten Testsystem der Anthocyananteil des HBE eine untergeordnete Rolle für die Unterdrückung der EGFR-Phosphorylierung spielte. Die Bioaktivität des HBE hinsichtlich des EGFR-Hemmpotentials war ein Resultat diverser antagonistischer und synergistischer Effekte weiterer Polyphenole und konnte keiner einzelnen Verbindung zugeordnet werden. Die Inhibierung des MAPK-Signalweges durch die Hemmung des EGFRs hatte keinen direkten Einfluss auf das Zellwachstum in den gewählten Zeitfenstern. Es konnte somit angenommen werden, dass die zellwachstumshemmende Eigenschaft der Fraktionen und des HBE entweder über die Hemmung eines anderen Signalweges oder aber zu einem anderen Zeitpunkt erfolgte.
description: In addition to lifestyle, environmental and genetic predisposition nutrition plays a crucial role in tumor development. Initiation and progression of tumorgenesis are associated with modification of specific signaling pathways, controlling proliferation, differentiation and induction of apoptosis. A major aim of chemoprevention research is to identify food constituents inhibiting these pathways. Polyphenols are a broad class of plant constituents known to inhibit the activation of various receptors and hence are able to influence downstream signal transduction (Kern et al. 2005; Fridrich et al. 2007b; Teller et al. 2009a). In particular, extracts of berries and apples, rich in bioactive polyphenols, were in the focus of numerous studies. It was shown that particularly anthocyanins, a class of intensively colored polyphenols are capable to inhibit receptor tyrosine kinases, a group of receptors associated with tumor growth. In this work anthocyanin-rich bilberry extract, various subfractions, isolated by the research group of Prof. Winterhalter (Institute of Food Chemistry, TU Braunschweig) and selected single compounds were investigated on their chemopreventive profile using different proliferation-associated in vitro endpoints. Focus was laid on polyphenol induced inhibition of EGFR activity (epidermal growth factor receptor) and tumor cell growth. All tests were performed using the human colon carcinoma cell line HT29 in the presence of catalase (100 U/ml). Complex bilberry extracts have been shown previously to inhibit the EGFR activity in vitro (unpublished data from the research group of Prof. Marko). In order to identify potent substance classes, a bilberry extract, containing &gt; 25 % anthocyanins (Symrise Holzminden, Germany) was fractionated by liquid-liquid extraction in a first attempt (Prof. Winterhalter, Institute of Food Chemistry TU Braunschweig). The resulting EGFR inhibitory activity could not been attributed to a specific class of compounds, because anthocyanins (and presumably other bioactive compounds) were omnipresent in all subfractions (Diplomarbeit Christine Krumböck, 2010). Therefore, HBE was fractionated again by membrane chromatography (Sartobind) to specifically separate the anthocyanin proportion. Studies with the new fractions demonstrated that the anthocyanin-free fraction (FF) has a stronger impact on the activity of EGFR than the anthocyanin-rich fraction (AF). This anthocyanin-free fraction subsequently was separated into a fraction containing mostly anthocyanin polymers (PF) and a fraction with diverse polyphenols (CF). Both of these 74 subfractions exhibited a clearly weaker inhibitory potential then FF. Further subfractions of CF, CFp and CFu, did not inhibit the phosphorylation status of the EGFR. Cyanidin (Cy), an anthocyanidin, was found to potently suppress the EGFR activity, whereas its corresponding anthocyanin, cyanidin-3-glucoside, had no inhibitory potential in equimolar concentrations. In contrast, CGA exhibited an inducing effect on the EGFR phosphorylation – an effect that was in line with previous studies from our research group (Diplomarbeit Christine Krumböck). The question arose whether CGA neutralizes the inhibiting effects of AF, FF or Cy on the EGFR activity. Therefore a coincubation with CGA and AF, FF and Cy respectively was performed to investigate the effect on the receptors activity. It revealed that the inhibitory effects of the tested substances were diminished partially due to CGA. Therefore it can be assumed that CGA is, at least in part, responsible for compensating effects in subfractions enriched with this substance. Concerning tumor cell growth inhibition due to the subfractions, a different inhibition pattern appeared. In contrast to the investigations on EGFR activity AF had a stronger inhibitory effect on cell growth compared to FF. Consequentially; both effects seem not to depend on each other. Thus cell growth inhibition due to the extract is mainly caused by anthocyanins, not regulated by EGFR signaling but conceivably by another pathway. Cell growth inhibition by PF and the CF also had a rather weak effect. In summary the anthocyanin content in the bilberry extract seems to play a minor role in suppression of EGFR activity. Instead the extracts bioactivity is assembled by additiv and compensating effects of further polyphenols. The inhibition of the MAPK signaling pathway as a result of the inhibition of EGFR did not directly influence cell growth in the selected time frame. Therefore, it can be assumed that the cell growth inhibitory properties of the extract and its fractions occur either via inhibition of other signaling pathways or within a different time period.