Mechanismen der reversiblen enzymatischen Adenylylierung von Rab‐Proteinen
Creators: name: Müller, Matthias Philipp
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2013
Subjects: subject: Adenylylierung
subject: DrrA
subject: Legionella pneumophila
subject: Posttranslationale Modifikation
subject: Rab
subject: 570

description: Including more than 60 members in humans, Rab proteins constitute the largest subfamily of the Raslike superfamily of small GTPases which act as molecular switches and can exist in a GDP‐bound (inactive) and a GTP‐bound (active) conformation. The conversion between these states is carried out by regulatory factors: GTPase activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis and guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyze the GDP‐GTP exchange. Rab proteins interact with effector proteins only in the active state, thereby regulating vesicular trafficking in eukaryotic cells. For this purpose, the activity and the intracellular localization of Rab proteins need to be tightly regulated. In order to ensure their own survival, some intracellular pathogens have developed intriguing strategies for manipulation of intracellular vesicular transport processes and in particular of the Rab proteins involved. A prominent example of an intracellular pathogen that manipulates Rab proteins for its own benefit is Legionella pneumophila. In particular, the Legionella protein DrrA (defect in Rab recruitment A) was identified in the recent past as a protein that manipulates the intracellular localization and activity of Rab1. At the beginning of this work, structural studies on this protein showed the presence of an additional, previously uncharacterized domain possessing adenylyltransferase activity towards Rab1. The characterization of this enzymatic activity was the central subject of this work. Within this work, the x‐ray crystal structure of adenylylated Rab1 was solved. This structure showed that Rab1 was specifically modified on a tyrosine residue in the functionally important switch II region. Further studies of the effects of this modification showed that the interaction of Rab1‐AMP with GAPs and the human effector Mical‐3 are drastically inhibited, whereas the interaction with the GEF domain of the Legionella protein DrrA and the Legionella effector protein LidA are not significantly inhibited. Characterisation of the enzyme kinetics of DrrA and the recently identified deadenylylating enzyme SidD showed that Rab1:GTP is the preferred substrate of adenylylation by DrrA while SidD possesses a significantly lower substrate specificity towards the active or inactive conformation of Rab1. This work includes the first description and characterization of adenylylation as a posttranslational modification of Rab proteins. In the context of the current literature, the results of this work allowed the proposal of a model in which adenylylation temporarily inhibits deactivation of Rab1 by GAPs and thus the extraction of Rab1 from the Legionella containing vacuolar (LCV) membrane by GDI and Rab1 is entrapped at the LCV membrane. At a later stage of infection, deadenylylation by SidD allows for deactivation and extraction by GDI.
description: Rab‐Proteine bilden mit mehr als 60 Mitgliedern im Menschen die größte Unterfamilie der Superfamilie Ras‐ähnlicher kleiner GTPasen, welche als molekulare Schalter in einer GDP‐gebundenen (inaktiven) und einer GTP‐gebundenen (aktiven) Konformation vorliegen können. Die Konversion der Aktivitätszustände erfolgt durch regulatorische Faktoren: GTPase aktivierende Proteine (GAPs) stimulieren die GTPHydrolyse und Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) katalysieren den GDP‐GTP‐Austausch. In der aktiven Konformation interagieren Rab‐Proteine mit Effektorproteinen und regulieren den vesikulären Transport in eukaryotischen Zellen. Um vesikuläre Transportwege zum eigenen Vorteil zu nutzen haben einige intrazellulär lebende Pathogene erstaunliche Methoden zur Manipulation von Rab‐Proteinen entwickelt. Ein prominentes Beispiel eines solchen Pathogens ist Legionella pneumophila und insbesondere das Legionellenprotein DrrA (engl.: defect in Rab recruitment A), welches die intrazelluläre Lokalisation und den Aktivitätszustand von Rab1 manipuliert. Strukturelle Untersuchungen vor Beginn dieser Arbeit offenbarten eine weitere funktionelle Domäne von DrrA, welche Adenylyltransferase‐ Aktivität gegenüber Rab1 besitzt. Die Charakterisierung dieser Aktivität war zentrales Thema dieser Arbeit. Die innerhalb dieser Arbeit bestimmte Röntgenkristallstruktur des adenylylierten Rab1 zeigte, das Rab1 spezifisch an einem Tyrosin im Bereich des funktionell wichtigen switch II modifiziert wird. Weiterführende Untersuchungen offenbarten starke inhibitorische Effekte der kovalenten Modifizierung auf die Interaktion von Rab1 mit GAPs und dem humanen Effektorprotein Mical‐3, wohingegen die Interaktionen mit der GEF‐Domäne von DrrA und dem Legionellen Effektorprotein LidA nicht signifikant gestört sind. Enzymkinetische Untersuchungen von DrrA und dem kürzlich identifizierten deadenylylierenden Enzym SidD zeigten, dass die aktive Konformation von Rab1 das bevorzugte Substrat der Adenylylierung durch DrrA ist, wohingegen SidD beide Aktivitätszustände von Rab1 gleichermaßen als Substrat akzeptiert. Diese Arbeit umfasst die erste Beschreibung und Charakterisierung der Adenylylierung als posttranslationale Modifikation eines Rab‐Proteins. Im Kontext der aktuellen Literatur erlaubten die Ergebnisse dieser Arbeit die Erstellung eines Modells, in dem eine Deaktivierung von Rab1 durch GAPs und somit eine Extraktion von der Membran der Legionellen enthaltenden Vakuole (LCV) durch GDI temporär durch die kovalente Modifikation unterbunden wird und Rab1 an der LCV‐Membran arretiert wird. Erst durch das deadenylylierende Enzym SidD wird zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion eine Deaktivierung und Extraktion wieder ermöglicht.