Epigenetische Grundlagen der Synaptogenese, der Axon- und Dendritenplastizität in einem In-vitro-Modell der Epileptogenese
The epigenetic basis of synaptogenesis, axonal and dendritic plasticity in an in-vitro model of epileptogenesis
Creators: name: Miedl, Markus
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: Epilepsie
Epileptogenese
Epigenetik
Temporallappenepilepsie
Genexpression

description: Hintergrund und Ziele Epilepsie gehört zu den häufigsten chronisch-neurologischen Erkrankungen weltweit. Eine der häufigsten fokalen Epilepsieformen des Erwachsenen stellt dabei die Tempo rallappenepilepsie (TLE) dar. Da ein Großteil der Patienten mit TLE als therapie refraktär und schwer behandelbar gilt, stellt die Erkrankung eine starke psychosoziale Belastung für die Betroffenen dar. Dennoch bleibt trotz ausgiebiger Forschungs anstrengungen die Ätiopathogenese der Temporallappenepilepsie weiterhin unklar. Für ein besseres Verständnis der Erkrankung untersucht die vorliegende Arbeit die Entwicklung bestimmter Kandidatengene der neuronalen Zellarchitektur in einem In-vitro-Zellkulturmodell der Epileptognese. Es wurde die Expression der Proteine Synaptophysin, GAP-43, PSD-95 und βIII-Tubulin im zeitlichen Verlauf der Epilepto genese betrachtet. Die Rolle dieser vier Proteine soll damit näher charakterisiert und überprüft werden, ob die Ergebnisse aus dem vorliegenden Modell mit anderen Studien aus Tiermodellen oder Humanpräparaten korrelieren. Methoden (Material und Untersuchungsmethoden) Hippocampale Neurone wurden aus jungen Wistar-Raten extrahiert, nach Kiese et al. (2017) kultiviert sowie anschließend zur Simulation eines anfallsähnlichen Ereignisses mit Glutamat behandelt. Die Neurone wurden jeweils 3 und 7 Tage nach Behandlung untersucht und mit der Kontrollgruppe verglichen. Ferner wurde die Viabilität der Zellen durch eine PI-FDA-Färbung überprüft und der Anteil an Neuronen im Vergleich zu Gliazellen durch MAP2C-GFAP-Färbungen eruiert. Eine Umverteilung der Proteine innerhalb der Neurone wurde über Immunfluorenszenzfärbungen mit Antigen spezifischen Antikörpern analysiert. Daneben wurde die Genexpression vor und nach Glutamatexposition durch qPCR relativ quantifiziert und mit Hilfe der ΔΔCt-Methode verglichen. Anschließend wurde ein Western Blot zur Quantifizierung der tatsächlichen Proteinmenge durchgeführt. Ferner wurde die Technik der Chromatinimmuno präzipitation an HEK-293-Zellen erlernt und die Spezifität eines H3K9Ac-Antikörpers getestet. Ergebnisse und Beobachtungen Es konnte sowohl nach 3 Tagen als auch nach 7 Tagen kein signifikanter Unterschied beim Zellüberleben der Neurone zwischen mit Glutamat behandelten Neuronen und scheinbehandelter Kontrollgruppe festgestellt werden. Das Verhältnis Neurone zu Gliazellen beider Gruppen war ebenfalls vergleichbar. In Immunfluoreszenzfärbungen ließ sich kein verändertes Muster in Expression der untersuchten Proteine erkennen. Die Transkription in mRNA wurde für alle vier Gene nach Glutamatbehandlung deutlich verringert, wobei der Abfall nach 7 Tagen noch ausgeprägter war als nach 3 Tagen. Im Western Blot konnte keine Veränderung in der Proteinexpression beobachtet werden. Schlussfolgerungen Die vorliegende Arbeit bekräftigt die Hypothese, dass Neurone, die plötzlich einer exzessiven Überregung ausgesetzt sind, wie es bei einem initialen Anfallsereignis der Fall ist, zu Veränderungen in der Genexpression von Proteinen führt. Die Expression der Gene Syp, Gap43, Dlg4 und Tubb3 wird nach einem anfallsartigen Ereignis beein flusst. Ob die Veränderungen der untersuchten Gene jedoch langfristig bestehen, inwiefern dies zu einer Umstrukturierung des neuronalen Netzwerks führt und wie sich die Änderung der Proteine auf die Erregbarkeit der einzelnen Neurone auswirkt, kann mit dem vorliegenden Datensatz nicht geklärt werden.