title: One ring to rule them all : Identification and characterization of the type IV pili secretin associated protein TsaP and analysis of the type IV secretion system of Neisseria gonorrhoeae
title: Ein Ring sie zu knechten : Identifizierung und Charakterisierung des type IV Sekretin assoziierten Proteins Tsap und Analyse des type IV seketions Systems von Neisseria gonorrhoeae
title: Ein Ring sie zu knechten : Identifizierung und Charakterisierung des type IV Sekretin assoziierten Proteins Tsap und Analyse des type IV seketions Systems von Neisseria gonorrhoeae
Creators: name: Siewering, Katja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: type iv secretion system
Neisseria gonorrhoeae
typ IV Pili
Sciences
Naturwissenschaften
type IV pili
pili
secretin
Sekretion , Pili

description: Over the years, N. gonorrhoeae has
      evolved and acquired different mechanisms to protect itself
      against a variety of antibiotics and chemotherapeutic agents.
      One reason for the rapid spread of antibiotic resistance in
      gonococci is the highly effective horizontal gene transfer.
      The transferred DNA is either provided directly via
      conjugation, or via the environment via autolysis or the
      gonococcal type IV secretion system (T4SS), which secretes
      ssDNA into the extracellular milieu. DNA uptake from the
      environment in Neisseria involves the type IV pili (T4P) and
      the competence system, transporting the DNA across the outer
      and the inner membrane, respectively. Functional
      characterization of the type IV secretion system and DNA
      uptake system and thus the type IV pili machinery in N.
      gonorrhoeae could provide starting points in the exploration
      of new therapeutic strategies. To better understand the
      transcriptional regulatory network of the type IV secretion
      system of N. gonorrhoeae transcriptional mapping of genes
      essential for DNA secretion was performed. This revealed that
      genes essential for DNA secretion are encoded within four
      different operons. Additional analysis of a region, which is
      not essential for DNA secretion, encoding the single-stranded
      DNA binding protein SsbB and the topoisomerase TopB showed
      that these genes are significantly more highly transcribed
      then genes that are involved in DNA secretion, such as the
      coupling protein TraD and the relaxase TraI. To investigate
      whether the single-stranded DNA, which is secreted via the
      T4SS encoded within the GGI facilitates biofilm formation,
      biofilm formation of N. gonorrhoeae strains were analyzed in
      continuous flow-chamber systems by confocal laser scanning
      microscopy. This showed that the ssDNA secreted via the T4SS
      plays a role in the early stages of biofilm formation. In
      Neisseria gonorrhoeae, the native PilQ secretin ring embedded
      in OM sheets is surrounded by an additional peripheral
      structure, consisting of a peripheral ring and seven
      extending spikes. To unravel proteins important for formation
      of this additional structure, we identified proteins that are
      present with PilQ in the OM. One such protein, which was
      named TsaP, the T4P secretin-associated protein, was
      identified as a widely conserved component that co-occurs
      with genes for T4P in Gram-negative bacteria. TsaP contains
      an N-terminal carbohydrate-binding lysin motif (LysM) domain
      and a C-terminal domain of unknown function. In N.
      gonorrhoeae, lack of TsaP results in the formation of
      membrane protrusions containing multiple T4P, concomitant
      with reduced formation of surface-exposed T4P. Lack of TsaP
      did not affect the oligomeric state of PilQ, but resulted in
      loss of the peripheral structure around the PilQ secretin.
      TsaP binds peptidoglycan and associates strongly with the
      outer membrane in a PilQ-dependent manner. In addition, we
      identified that TsaP contains apart from the LysM domain, two
      FlgT-like domains and a linker region, which is specific for
      Neisseria spp. We could show that the linker domain plays an
      important role in pilus biogenesis in the β-proteobacterium
      N. gonorrhoeae. In order to determine if TsaP directly
      interacts with PilQ via the B2 domain, PilQ and TsaP of N.
      gonorrhoeae and M. xanthus were heterologously expressed and
      purified. Characterization of the heterologously expressed
      and purified proteins showed that TsaP is able to form
      SDS-stable complexes, resembling a ring-like structure, and
      that it might interact with PilQ, forming a double ring
      structure. In general, we propose that TsaP anchors the
      secretin to the PG to enable the secretin to withstand the
      forces generated during pilus extension and retraction.
      Because T4P play an important role in the pathogenesis of
      many bacteria and TsaP is found in all bacteria that express
      T4aP and plays an important role in T4aP biogenesis, it might
      be an important future drug target.
description: Im Laufe der Jahre hat Neisseria
      gonorrhoeae verschiedene Mechanismen entwickelt, um sich
      gegen eine Vielzahl von Antibiotika und Chemotherapeutika zu
      schützen. Die Hauptursache für diese rasche Ausbreitung von
      Resistenzen ist ein sehr effizienter horizontale Gentransfer.
      Die zu transferierende DNA wird dabei entweder mittels
      Konjugation direkt übertragen oder durch Autolyse der
      Gonokokken bzw. durch Sekretion von Einzelstrang DNA durch
      ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS) an das extrazelluläre
      Milieu abgegeben. Die Aufnahme von DNA aus dem
      extrazellulären Milieu erfolgt in N. gonorhoeae durch
      Typ-IV-Pili (T4P) sowie das Kompetenz-System, welche DNA über
      die äußere und die innere Membran transportieren. Die
      funktionelle Charakterisierung des Typ-IV-Sekretions¬systems
      und des DNA-Aufnahme-Systems und somit der
      Typ-IV-Pili-Maschinerie könnte neue Anhaltspunkte für die
      Entwicklung therapeutischer Strategien liefern. Um das
      Transkriptionsnetzwerk des Typ-IV-Sekretionssystems in N.
      gonorrhoeae besser zu verste¬hen, wurden die für die
      DNA-Sekretion essentiellen Gene transkriptionell kartiert.
      Dieser Ansatz ergab, dass diese Gene in vier verschiedenen
      Operons enthalten sind. Die Analyse einer für die
      DNA-Sekretion nicht essentiellen Region, welche für das
      Einzelstrang-DNA bindende Protein SsbB sowie die
      Topoisomerase TopB kodiert, zeigte ferner, dass diese Gene
      signifikant höher exprimiert wurden als die an der
      DNA-Sekretion essentiell beteiligten Gene. Um zu untersuchen,
      ob die Einzelstrang-DNA, welche über das T4SS sekretiert
      wird, die Bildung von Biolfilm erleichtert, wurde die
      Fähigkeit verschiedener N. gonorrhoeae-Stämme zur
      Biofilm-Bildung mittels konfokaler Laser Scanning-Mikroskopie
      untersucht. Diese Analysen zeigten, dass die durch das T4SS
      sekretierte Einzelstrang-DNA eine Rolle in den frühen Stadien
      der Biofilmbildung spielt. In N. gonorrhoeae ist der in der
      äußeren Membran lokalisierte und durch PilQ gebildete
      Sekretin-Ring von einer zusätzlichen periphere Struktur
      umgeben. Diese besteht aus einem peripheren Ring und sieben
      davon ausgehenden Zacken. Um Proteine zu identifizieren, die
      für die Bildung der peripheren Struktur wichtig waren, wurden
      Proteine analysiert, die mit PilQ in der äußeren Membran
      lokalisiert sind. Durch dieses Vorgehen konnte ein Protein,
      das TsaP, kurz für Type-IV-Pilus-Sekretin-assoziiertes
      Protein, genannt wurde, als stark konservierte T4P-Komponente
      identifiziert werden. TsaP enthält ein N-terminales
      Kohlenhydrat bindendes Lysin-Motiv, auch als LysM-Domäne
      bekannt, und eine C-terminale Domäne mit unbekannter
      Funktion. In N. gonorrhoeae resultierte die Deletion von TsaP
      in der Bildung von Membranausstülpungen, die mit einer
      verminderten Bildung von oberflächenexponierten T4P
      einherging. Ferner konnte gezeigt werden, dass eine Deletion
      von TsaP keinen Einfluss auf den oligomerisations Zustand von
      PilQ hatte, jedoch zu einem Verlust der peripheren Struktur
      um PilQ führte. Weitere Analysen zeigten, dass TsaP an
      Peptidoglycan band und in Abhängigkeit von PilQ mit der
      äußeren Membran assoziierte. Darüber hinaus konnten neben der
      LysM-Domäne zwei FlgT-ähnliche Domänen und eine
      Linker-Region, die spezifisch für Neisseria spp. ist,
      ermittelt werden. Wir konnten zeigen, dass die Linker-Domäne
      in N. gonorrhoeae eine wichtige Rolle bei der Pilus-Biogenese
      spielte. Um festzustellen, ob TsaP direkt mit der B2-Domäne
      von PilQ interagierte, wurden TsaP und PilQ von N.
      gonorrhoeae und M. xanthus heterolog überexprimiert und
      gereinigt. Die Charakterisierung dieser Proteine zeigte, dass
      TsaP in der Lage war, SDS-stabile Komplexe zu bilden, welche
      eine ringförmige Struktur aufwiesen, und dass TsaP
      wahrscheinlich durch Interaktion mit PilQ eine
      Doppelringstruktur bildete. Wir vermuten, dass TsaP durch
      direkte Protein-Protein-Interaktion mit PilQ den
      Sekretin-Ring in der Peptidoglycan-Zellwand verankert und es
      dem Sekretin-Ring dadurch ermöglicht, den während der
      Pilus-Bildung und -Retraktion erzeugten Kräfte standzuhalten.
      Da T4P eine wichtige Rolle für die Pathogenität vieler
      Bakterien spielen und TsaP in Bakterien, die T4aP
      exprimieren, vorkommt und eine wichtige Funktion bei der
      T4aP-Biogenese hat, könnte TsaP einen neuen Angriffspunkt für
      zukünftige therapeutische Strategien darstellen.