Ρύθμιση του ηπατοειδικού πυρηνικού υποδοχέα ΗΝF-4α και των καθοδικών του στόχων από το miR-24:
Creators: name: Τιφτικίδης, Γεώργιος Κυριάκου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: ΗΝF-4α
miR-24
apoC-III

description: Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων 4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4, ΗNF-4), ή NR2A1 σύμφωνα με το ενιαίο σύστημα ονοματολογίας, αποτελεί μέλος της υπεροικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων. Θεωρείται ορφανός, καθώς μέχρι σήμερα δεν έχει αναγνωριστεί κάποιο μόριο ως προσδέτης του. Έχει εντοπιστεί σε μια μεγάλη ποικιλία ειδών, από έντομα μέχρι τον άνθρωπο, ενώ είναι πολύ καλά συντηρημένος. Ουσιαστικά, η αλληλουχία του είναι μια από τις πιο διατηρημένες, ανάμεσα στους πυρηνικούς υποδοχείς. Προσδένεται στο DNA αποκλειστικά ως ομοδιμερές, ενώ παρουσιάζει έντονη τάση διμερισμού ακόμα και απουσία DNA. Ο ρόλος του ΗNF-4 είναι σημαντικός, από τα αρχικά στάδια της ανάπτυξης ως την ενήλικη ζωή. Η σημασία του στη γαστριδιοποίηση έχει αποδειχτεί σε έμβρυα ποντικών που δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα, αφού σε αυτά δεν ολοκληρώνεται η συγκεκριμένη διαδικασία, οπότε τα έμβρυα δεν είναι βιώσιμα. Στην ενήλικη ζωή, ενεργοποιεί μεταγραφικά μια πληθώρα γονιδίων, μεταξύ των οποίων εκείνα που εμπλέκονται στον ενδιάμεσο μεταβολισμό, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού της γλυκόζης, των λιπαρών οξέων, της χοληστερόλης, των ξενοβιοτικών και των φαρμάκων. Επιπλέον, ρυθμίζει μεταγραφικούς παράγοντες, οι οποίοι ελέγχουν την έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων, με αποτέλεσμα να διατηρεί κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων. Τα microRNAs είναι μικρά μόρια RNA, που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα των ιών, των φυτών και των ζώων. Παρουσιάζουν αρκετά υψηλή συντήρηση ανάμεσα στα είδη, ενώ το μήκος τους κυμαίνεται μεταξύ 20 και 22 νουκλεοτιδίων. Η ρύθμιση των γονιδίων στόχων τους γίνεται σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, κυρίως μέσω σύνδεσής τους σε συμπληρωματικές τους θέσεις στην 3’ αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου. Tα microRNAs φαίνεται να συμμετέχουν σε μια μεγάλη ποικιλία διαδικασιών, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ο κυτταρικός θάνατος, η απόπτωση και η διαφοροποίηση των κυττάρων, ενώ η απορρύθμισή τους συνδέεται με ασθένειες, όπως ο καρκίνος. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της ρύθμισης του ΗΝF-4α από το miR-24. Επίσης, η ρύθμιση των καθοδικών στόχων του παράγοντα, όπως η apoC-III, από το ίδιο microRNA. Για την επίτευξη των στόχων αυτών έγιναν πειράματα στην κυτταρική σειρά HepG2, η οποία εκφράζει ενδογενώς τον υποδοχέα. Συγκεκριμένα, τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με κατάλληλες ουσίες, που επάγουν ή αποσιωπούν την έκφραση του miR-24. Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι οι ΗΝF-4α και apoC-III μειώθηκαν κατά την υπερέκφραση του miR-24, σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης, με Real-Time PCR και ανάλυση κατά Western αντίστοιχα. Αντίθετα, η αποσιώπηση του miR-24 αύξησε τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης, του ΗΝF-4α αλλά και της apoC-III. Επιπλέον, μελετήθηκε ένα μονοπάτι ρύθμισης του miR-24 από τον NF-κB. Για το λόγο αυτό, κύτταρα HepG2 διαμολύνθηκαν με κατάλληλο πλασμίδιο ενεργοποίησης του NF-κB και στη συνέχεια μετρήθηκαν τα επίπεδα του miR-24 με Real-Time PCR και βρέθηκαν αυξημένα. Επιπροσθέτως, με στόχο τον προσδιορισμό της έκφρασης σημαντικών παραγόντων, όπως ο ΗΝF-4α και το miR-24, στο ηπατοκαρκίνωμα, ή οι HNF-3α, HNF-4α, miR-24 και miR-122 σε πρόδρομες καταστάσεις του, μετρήθηκε η έκφραση καθενός με Real-Time PCR. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κατάλληλες βιοψίες και παρά τις δυσκολίες φάνηκε μια τάση αύξησης του miR-24, σε συνδυασμό με τη μείωση του HNF-4α στους καρκινοπαθείς. Αντίθετα, δεν προέκυψε τίποτα σημαντικό για τους ασθενείς με ηπατίτιδα, την πρόδρομη κατάσταση του ηπατοκυτταρικού καρκίνου.
description: Hepatocyte Nuclear Factor 4 (Nuclear Receptor 2A1) is a member of the nuclear receptor superfamily. ΗNF-4 is considered to be orphan, since there has not been yet identified any ligand for this factor. ΗNF-4 has been identified in a great variety of species, from insects to human, and is highly conserved. Actually, the aminoacid sequence of this factor is one of the most highly conserved, between the nuclear receptors. HNF-4 binds DNA exclusively as a homodimer, while it also exhibits strong homodimerization activity in the absence of DNA. HNF-4 plays an important role from the early development till the adulthood. Mouse embryos lacking HNF-4 die before completing gastrulation, due to visceral endoderm dysfunction, showing how important this factor is. During adulthood, HNF-4 activates the expression of hundreds of genes, especially those involved in intermediary metabolism, including glucose, fatty acid, cholesterol and xenobiotic and drug metabolism. Furthermore, it regulates transcription factors, which induce the expression of hepatocyte specific genes. As a result, it fulfills an essential role in differentiation of hepatocytes. microRNAs are short RNA molecules, encoded by the genome of viruses, plants and animals. They are highly conserved among species, consisting of 20 to 22 nucleotides. They suppress their target genes post-transcriptionally, mainly through base pairing to the complementary sequences in the 3’ untranslated regions (3’ UTRs) of targeted genes. They seem to participate in a variety of circumstances, like cell proliferation, cell death, apoptosis and cell differentiation, but their deregulation results in diseases, such as cancer. This project intended to study the regulation of ΗΝF-4α by miR-24 and its downstream target genes like apoC-III. In order to investigate this, HepG2 cells were used, which express endogenously ΗΝF-4α. Thus, cells were transfected with pre-miR-24 or anti-miR-24, to overexpress or silence miR-24, respectively. Using Real-Time PCR and Western analysis, respectively, it was found that both mRNA and protein levels of HNF-4α and apoC-III were reduced upon pre-miR treatment. On the contrary, inhibition of miR-24, induced the expression of HNF-4α and apoC-III, both in mRNA and protein levels. In addition, we studied a regulatory pathway of miR-24 by NF-κB. For this, HepG2 cells were transfected with a plasmid that activates NF-κB and then, miR-24 levels were evaluated, and found upregulated, using Real-Time PCR. Finally, we determined the expression of some important factors, like ΗΝF-4α and miR-24 in hepatocellular carcinoma, or HNF-3α, HNF-4α, miR-24 and miR-122 in cancer-related situations, namely hepatitis B and C, using Real-Time PCR. We were provided with human biopsies and we observed a tremendous variation among the various samples. However, a trend of opposite expression between miR-24 and HNF-4α was observed in biopsies from patients with hepatocellular carcinoma. No changes were noted in biopsies from patients with hepatitis.