Additive Manufacturing in Biotechnology : Methods, Inks and Analytics for Biocatalytic Applications of Extrusion-Based 3D Bioprinting
Creators: name: Wenger, Lukas Fabian
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2022
Subjects: 3D Printing
Additive Manufacturing
Bioprinting
Biocatalysis

description: In den letzten zehn Jahren hat sich die Additive Fertigung (AM) von einer spezialisierten Nischenanwendung zu einem weit verbreiteten Standardwerkzeug entwickelt, das in vielen Bereichen der Forschung und Industrie unverzichtbar geworden ist. Dank neuer Technologien und Materialien, die die Herstellung hochwertiger Produkte ermöglichen, ist AM nicht nur für das schnelle Anfertigen von Prototypen relevant, sondern auch für die Herstellung von Produkten für Endverbraucher. Vor allem bei Produkten mit hohem Bedarf für kundenspezifische Anpassungen oder bei Produkten mit hoher geometrischer Komplexität können AM-Methoden als sinnvolle Alternative zu anderen Fertigungsverfahren in Betracht gezogen werden. In der Medizin und Bioverfahrenstechnik wird AM typischerweise für Anwendungen wie die Herstellung von Zahnimplantaten und Zahnschienen oder für maßgeschneiderte Laborgeräte, mikrofluidische Systeme und sogar Chromatographiesäulen eingesetzt. Die Kombination von biologischen Materialien und lebenden Zellen mit AM-Methoden hat dazu geführt, dass sich das Bioprinting als eigenständiger Bereich mit neuen Möglichkeiten und Herausforderungen etabliert hat. Bioprinting-Methoden ermöglichen die Herstellung von Objekten aus weichen, wasserbasierten Materialien, die sich für den physikalischen Einschluss von Enzymen eignen. Dadurch können biokatalytische Reaktoren direkt mit enzymhaltigen Tinten gedruckt werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, neue Werkzeuge für die Herstellung biokatalytisch aktiver Materialien zu schaffen, wobei der Schwerpunkt auf extrusionsbasiertem Bioprinting liegt. Neuartige Tinten werden in Kombination mit speziell angepassten Druckmethoden etabliert, um eine verbesserte Druckbarkeit zu erreichen. Um die Eignung der verschiedenen Materialien hinsichtlich der resultierenden biokatalytischen Aktivität zu bewerten, werden mikroplattenbasierte Aktivitätsassays mit zwei verschiedenen Enzymen und einer Reihe von 3D-gedruckten Materialien durchgeführt. Die Tinten und Hydrogele werden mit einer Reihe weiterer Analysemethoden wie Rheologie, mechanischen Tests oder Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert. Um die Durchlässigkeit von Hydrogelen für Substratmoleküle zu bestimmen, wird eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in Hydrogelen entwickelt. Als allgemeiner Beitrag zur Verbesserung der Prozessüberwachung und -steuerung beim extrusionsbasierten Bioprinting wird eine PID-basierte Drucksteuerung etabliert, um einen konstanten und reproduzierbaren Tintenfluss zu erzeugen. In einer ersten Studie wurde ein neuartiges Materialsystem für das Drucken enzymatisch aktiver Strukturen etabliert, indem hochkonzentrierte Emulsionen (high internal phase emulsions -- HIPEs) als Tinten verwendet wurden. HIPEs sind Emulsionen, die mindestens 74 % (v/v) an innerer Phase enthalten, was der dichtesten möglichen Packung von Tröpfchen entspricht, bevor eine Verformung eintritt. Als äußere Phase der HIPEs wurden polymerisierbare ölige Monomere verwendet und der wässrigen inneren Phase wurden Poly(ethylenglycol)diacrylat und Acrylsäure zugesetzt. Auch öl- bzw. wasserlösliche Photoinitiatoren wurden den jeweiligen Phasen zugesetzt. Die Polymerisation der Tinten führte zur Bildung eines offenporigen Polymergerüsts, das mit untereinander vernetzten Hydrogeltröpfchen gefüllt ist. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Kompositmaterialien mit hydrogelähnlichen Eigenschaften wie der Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle bei gleichzeitig höherer mechanischer Stabilität aufgrund der stützenden Wirkung des Polymergerüsts. Tinten für den extrusionsbasierten 3D-Druck als Emulsionen zu formulieren bringt deutliche Vorteile hinsichtlich der rheologischen Eigenschaften der Tinten, da Emulsionen aufgrund ihrer Fließgrenze ideal für Extrusionsdruck geeignet sind. Um die Herstellung kleiner Volumina von HIPEs zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Aufbau auf der Grundlage eines 3D-gedruckten spiralförmigen Rührblatts entwickelt, der die Herstellung von HIPEs in 50-mL-Falcon-Röhrchen ermöglichte. Durch die Minimierung von Materialverlust erlaubte die Produktion in kleinem Maßstab die Zugabe des Enzyms β-Galactosidase. Rheologische Messungen mit einer Reihe verschiedener HIPE-Zusammensetzungen zeigten, dass HIPEs mit einem hohen Anteil an Tensid in der äußeren Phase und mit einem hohen Volumenanteil an innerer Phase eine höhere Fließgrenze aufwiesen, was als Indikator für Druckbarkeit gilt. Im Allgemeinen wiesen die hergestellten HIPEs hervorragende rheologische Eigenschaften auf. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass sowohl die äußere, als auch die innere Phase der HIPEs polymerisiert werden konnte. Ein Versuchsaufbau mit vier um die Extrusionskanüle des Biodruckers herum angeordneten UV-LEDs wurde entwickelt, um die Polymerisation der Tinten während der Extrusion zu ermöglichen, was das Zerlaufen des Materials reduziert und so die Druckqualität weiter verbessert. Es wurden Hohlzylinder mit enzymhaltiger Tinte gedruckt, um Aktivitätsmessungen in 48-Well-Mikroplatten durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass die HIPEs biokatalytisch aktiver waren, wenn sie große Mengen an Monomer in der wässrigen Phase und einen hohen Volumenanteil an wässriger Phase enthielten. Die Anwesenheit von mindestens 7 % (v/v) Monomer in der wässrigen Phase führte zu einer mehr als fünffachen Steigerung der gemessenen Aktivität im Vergleich zu HIPEs ohne Monomer in der wässrigen Phase. Der Durchmesser der Extrusionskanüle konnte als weiterer wichtiger Parameter identifiziert werden, der die resultierende Aktivität beeinflusst. Diese Beobachtung könnte auf die durch das Trägermaterial bedingte Verringerung des Stofftransports zurückzuführen sein, die ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen allgemein vorteilhaft macht. Um ein breiteres Spektrum an Tintentypen abzudecken, wurden in der zweiten und dritten Studie dieser Arbeit Tinten auf der Basis von Agarose und Agar untersucht. Diese Tinten wiesen im Vergleich zu HIPEs deutlich andere Materialeigenschaften auf, sowohl im flüssigen Zustand als Tinte, als auch im verfestigten Zustand als Hydrogel. Um den Anforderungen dieser Tinten gerecht zu werden, wurden der Versuchsaufbau für den Druck und die eingesetzten Analyseverfahren speziell an die untersuchten Tinten angepasst. Die Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle wurde als eine der wichtigsten Eigenschaften der Materialien hinsichtlich ihrer Eignung für die Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Daher wurde eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Schätzung des Diffusionskoeffizienten eines Analyten in transparenten Hydrogelen entwickelt. Ein mikrofluidischer Chip mit drei Einlässen und einer Y-Verzweigung wurde verwendet, um eine Grenzfläche zwischen dem zu untersuchenden Hydrogel und einer Analytlösung zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde flüssige Tinte bei erhöhter Temperatur von einer Seite in den Chip injiziert, bis sie die Y-Verzweigung erreichte. Nach dem Ausgelieren der Tinte wurde die Analytlösung durch einen der anderen Einlässe injiziert und die Diffusion des Analyten durch das Hydrogel wurde mit einem UV-Flächendetektor überwacht. Die Diffusionskoeffizienten konnten durch das Fitten der gemessenen Konzentrationsprofile des Analyten entlang des mikrofluidischen Kanals mit einer analytischen Lösung des zweiten Fick'schen Diffusionsgesetzes geschätzt werden. In einer Fallstudie wurde der Diffusionskoeffizient von Lysozym in einer Reihe von Hydrogelen bestimmt und verglichen. Die untersuchten Hydrogele bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen von unmodifizierter Agarose bzw. modifizierter Hydroxyethylagarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Es wurde festgestellt, dass der Diffusionskoeffizient von 5(6)-Carboxyfluorescein in unmodifizierten Agarosehydrogelen etwas höher war als in Agarosehydrogelen mit niedrigem Schmelzpunkt. Dies stimmt gut mit der theoretischen Vorhersage überein, dass das Polymernetzwerk von Hydrogelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt kleinere Porengrößen aufweist. Der gleiche Trend wurde für die Polymerkonzentration festgestellt, wobei höhere Konzentrationen mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten und kleineren Poren einhergingen. In einer dritten Studie wurden Tinten auf Basis von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Agar als weniger komplexe Alternative zu Tinten auf HIPE-Basis untersucht. Das Gelierungsverhalten von Agarose- und Agarbasierten Tinten erforderte einen anderen Versuchsaufbau für den Druck als die photopolymerisierbaren HIPEs. Eine beheizbare Düse, bestehend aus einem 3D-gedruckten Metallkörper, einem Temperatursensor und einem Heizdraht, wurde in den Aufbau implementiert, um sicherzustellen, dass die Tinten in flüssigem Zustand bei einer definierten Temperatur extrudiert werden konnten. Die Tinten wurden auf ein gekühltes Substrat extrudiert, um den Gelierungsprozess zu beschleunigen und das Zerlaufen der Tinte zu reduzieren. Obwohl das individuell an die Tinten angepasste Equipment die Druckbarkeit im Vergleich zu früheren Studien mit agarosebasierten Tinten deutlich verbesserte, war sie der Druckbarkeit von HIPEs immer noch drastisch unterlegen, sowohl hinsichtlich der erzeugten Strangdicke, als auch bzgl. der erreichbaren geometrischen Komplexität. Es konnten nur einfache Gitterstrukturen ohne Überhänge gedruckt werden. Eine Polymerkonzentration von mindestens 4,5 % (w/w) erwies sich als vorteilhaft für den Druck, wobei Gitterstrukturen mit einer Höhe von 2 cm druckbar waren. Mit rheologischen Methoden wurden die Tinten auf ihre Fließeigenschaften sowie ihr Schmelz- und Gelierverhalten untersucht. Die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zeigte im Vergleich zu den Agartinten wie erwartet deutlich reduzierte Gelier- und Schmelztemperaturen. Die verfestigten Hydrogele wurden einer mechanischen Prüfung unterzogen. Eine Reihe der in den vorherigen Studien etablierten Analysemethoden wurden erneut angewandt, um die Hydrogele auf Agarose- und Agarbasis im Hinblick auf ihre Anwendung für die Immobilisierung von Enzymen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde den Tinten vor dem Druck das thermostabile Enzym Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius zugegeben. Zur Messung der enzymatischen Aktivität und des Auswaschens von Enzym aus den gedruckten Hydrogelproben wurden mikrotiterplattenbasierte Aktivitätsassays verwendet. Die mikrofluidikbasierte Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde eingesetzt, um die Durchlässigkeit der Hydrogele für 5(6)-Carboxyfluorescein zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die agarbasierten Hydrogele eine höhere Diffusionsfähigkeit und Aktivität aufwiesen, aber auch eine erhöhte Auswaschung von Enzym. Die Tendenz zum Auswaschen des Enzyms zeigte nicht nur die mangelnde Eignung von agarbasierten Hydrogelen für den Einsatz in durchströmten Reaktoren, sondern erklärt auch die scheinbar positiven Ergebnisse bei den durchgeführten Aktivitätsassays, da das ausgewaschene Enzym nicht mehr denselben Stofftransportbeschränkungen ausgesetzt ist wie immobilisiertes Enzym und dadurch eine höhere Aktivität aufweist. Aufgrund der geringen Auswaschung von Enzym und der akzeptablen Druckbarkeit wurden Agarosetinten mit einer Konzentration von mindestens 4,5 % (w/w) als geeignete Tinten für die Anwendung in biokatalytischen Reaktoren empfohlen. Unabhängig vom Tintentyp zeigten die bisherigen Studien einen allgemeinen Mangel an Reproduzierbarkeit bei pneumatischen Bioprinting-Verfahren, der auf schwankende und schlecht reproduzierbare Flussraten bei der Extrusion der Tinten zurückzuführen ist. Es wurde vermutet, dass neben der Viskosität der Tinte und dem Extrusionsdruck noch zusätzliche Faktoren wie der Füllstand der Kartusche, die teilweise Verstopfung der Düsen und Inhomogenitäten der Tinte die Extrusionsflussrate beeinflussen und Unregelmäßigkeiten in den Druckergebnissen verursachen. Unterschiede zwischen verschiedenen Tintenchargen und Temperaturschwankungen, die die Viskosität der Tinte beeinflussen, stellten eine zusätzliche Herausforderung dar. In der Studie zu agarose- und agarbasierten Tinten wurde jede gedruckte Probe gewogen, bevor sie für Aktivitätsmessungen verwendet wurde, und verworfen, wenn sie das vorgegebene Zielgewicht nicht innerhalb einer bestimmten Fehlertoleranz erreichte. Falls erforderlich, wurde der Extrusionsdruck manuell angepasst, um die Vergleichbarkeit der gedruckten Proben zu gewährleisten. Infolgedessen wurde eine Studie initiiert, um eine Inline-Prozessüberwachung für die Durchflussrate als wesentlichen Prozessparameter zu etablieren und eine automatisierte und reproduzierbare Methode zu entwickeln, um eine konstante Zielflussrate zu erzeugen, indem der Extrusionsdruck auf der Grundlage von Echtzeitflussdaten kontinuierlich angepasst wird. Um die benötigten Daten in einer Inline-Messung zu erhalten, wurde ein Durchflusssensor in den Aufbau eines pneumatischen Biodruckers mittels einer 3D-gedruckten Halterung integriert. Für die Kommunikation mit dem Flusssensor und die Verarbeitung der gemessenen Daten wurde ein auf Python basierendes Softwaretool entwickelt. Eine PID-Regelung wurde implementiert und mit den Echtzeit-Durchflussdaten gespeist. Auf Grundlage der eingespeisten Daten passte die Software den Extrusionsdruck des Druckers kontinuierlich an. Es wurden drei verschiedene Fallstudien durchgeführt, um die Leistung der PID-Regelung zu bewerten: a) Kontinuierliche Extrusion: Mehrere Durchläufe mit kontinuierlicher Extrusion zeigten, dass die automatische Druckanpassung erfolgreich eine vorgegebene Zielflussrate unabhängig vom Benutzer einstellen konnte. Im Vergleich zur konstanten Druckeinstellung erwies sich die adaptive Druckregelung als effektiv bei der Kompensation von umwelt- oder systembedingten Einflüssen wie Verstopfungen der Extrusionskanüle. b) Anpassung an Tinteninhomogenitäten: Ein realistischerer Anwendungsfall wurde untersucht, indem Hohlzylinder mittels einer Kartusche gedruckt wurden, die mit Schichten aus zwei unterschiedlich konzentrierten Poloxamer-407-Tinten gefüllt war, um Tinteninhomogenitäten zu simulieren. Die adaptive Druckregelung erwies sich als wirksam, eine konstante Durchflussrate zu erzeugen, indem der Druck während des Druckvorgangs entsprechend angepasst wurde. Dadurch konnten relativ gleichmäßige Zylinder gedruckt werden, während die konstante Druckeinstellung zu Zylindern mit stark voneinander abweichenden Wandstärken führte. c) Prozessübertragung auf andere Düsentypen: Um die Übertragbarkeit von Prozessen zwischen verschiedenen Versuchsaufbauten zu demonstrieren, wurden Testdrucke mit drei verschiedenen Typen von Extrusionskanülen mit gleichem Öffnungsdurchmesser durchgeführt. Die adaptive Druckregelung war in der Lage, mit allen drei Extrusionskanülen innerhalb von 30 bis 60 s die gewünschte Zielflussrate zu erzeugen. Die resultierenden Zylinder waren von gleichbleibender Qualität, unabhängig von der Kanüle. Beim Drucken mit konstanter Druckeinstellung wurde entweder zu wenig oder zu viel Tinte extrudiert, wenn der Druck nicht speziell für den entsprechenden Typ von Kanüle festgelegt wurde. Es wurde gezeigt, dass die PID-gesteuerte adaptive Druckregelung dazu beitragen kann, das extrusionsbasierte Bioprinting zuverlässiger zu machen und die Notwendigkeit umfangreicher Parameter-Screenings bei der Prozessentwicklung zu verringern. Die vorliegende Arbeit demonstriert neue Methoden für das Drucken von biokatalytisch aktiven Materialien. Es werden neuartige Tinten mit individuell angepassten Druckverfahren und analytischen Techniken vorgestellt. Die Anwendung von emulsionsbasierten Tinten zeigt die große Bandbreite an Materialien, die in Kombination mit Enzymen eingesetzt werden können. Materialscreenings können durch den Einsatz von Aktivitätsassays im Mikrotiterplattenformat beschleunigt werden. Die speziell für jede Tintenart angepassten Druckmethoden zeigen die Notwendigkeit einer Feinabstimmung zwischen Tinte und Druckverfahren. Der universelle Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit im pneumatischen Bioprinting unter Verwendung einer PID-basierten Druckregelung könnte auch für Anwendungen außerhalb der Biokatalyse von Nutzen sein.