Επίδραση του RNA editing στο πειραματικό μοντέλο της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας
Creators: name: Κεμπαπίδου, Γαρυφαλιά Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Αυτοάνοση πειραματική εγκεφαλομυελίδα
Πολλαπλή Σκλήρυνση
Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις
Experimental autoimmune encephalomyelitis
Multiple sclerosis
RNA editing

description: Η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νευροεκφυλιστική ασθένεια η οποία χαρακτηρίζεται από επιθέσεις μεσολαβούμενες από το ανοσοποιητικό σύστημα στο έλυτρο της μυελίνης. Γενετική προδιάθεση, περιβαλλοντικοί παράγοντες, καθώς και επιγενετικοί παράγοντες, μπορεί να εμπλέκονται στην παθογένεση της ΠΣ.. Η ενεργοποίηση της μικρογλοίας συνοδεύει την ανάπτυξη της ΠΣ και ρύθμιση της λειτουργίας της μικρογλοιας αλλάζει το αποτέλεσμα της νόσου.Το RNA editing είναι μια συν-ή μετα-μεταγραφική διαδικασία η οποία έχει ως αποτέλεσμα την τροποποίηση της αλληλουχίας του RNA έτσι ώστε να διαφέρει από εκείνη που προβλέπεται από την αλληλουχία DNA. Στα θηλαστικά πραγματοποιείται εξειδικευμένη ως προς τη θέση απαμίνωση βάσεων από δύο κύριες οικογένειες ενζύμων, τις ADAR και τις AID / APOBEC. Οι ADAR καταλύουν τη μετατροπή της αδενίνης σε ινοσίνη (A-to-I), ενώ οι AID / APOBEC μετατρέπουν την κυτοσίνη σε ουρακίλη (C-to-U). Υπάρχουν ήδη μελέτες που συσχετίζουν το RNA editing που καταλύεται από τις ADAR, με νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η Αμυοτροφική Πλευρική Σκλήρυνση.Το APOBEC1 είναι το πρωτότυπο της οικογένειας AID / APOBEC, πρόσφατες μελέτες αλληλούχισης επόμενης γενιάς αποκάλυψαν μια πληθώρα μεταγράφων ,που εκφράζονται σε ιστούς ποντικού in νίνο, που το APOBEC1 αναγνωρίζει και καταλύει την C-to-U μετατροπή μεταξύ των οποίων το mRNA του γονιδίου ΑΡΡ που κωδικοποιεί την προδρόμη πρωτεΐνη αμυλοειδούς και σχετίζεται άμεσα με τη νόσο του Alzheimer. Επιπλέον, η αλληλουχιση RNA εγκεφάλου αποκαλύψε έκφραση του Apobec1 σε διάφορα είδη εγκεφαλικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένης και της μικρογλοίας.Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί στους οποίους βασίζεται η πολλαπλή σκλήρυνση, το πιο συνηθισμένο ζωικό μοντέλο που χρησιμοποιείται είναι η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ). Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε την υπάρξη μεταβολών στο RNA editing των μικρογλοιακών κυττάρων κατά την ανάπτυξη ΠΑΕ, οι οποίες θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην πρόοδο της νόσου. Επιπλέον, ερευνήσαμε εάν η διαγραφή μιας από τις δύο οδούς του RNA editing, η μεσολαβούμενη από το Apobec1, έχει αντίκτυπο στην εξέλιξη της νόσου της ΠΑΕ.Για το πρώτο κομμάτι, εκμεταλλευτήκαμε δημόσια διαθέσιμα δεδομένα RNA seq (Lewis et al., 2014) από μικρογλοιακά κύτταρα ποντικού δύο χρονικών σημείων της ΠΑΕ, αφελούς και οξείας. Με in house βιοπληροφορική ανάλυση, δημιουργήθηκαν λίστες υποψηφίων μεταγράφων, τόσο για τα ADAR όσο και για τα AID / APOBEC. Για τρία μετάγραφα επιβεβαιώθηκε διαφορικό μεταξύ των δύο σταδίων της νόσου editing στο 3’UTR μεσω αλληλούχησης Sanger (Ctsb, Mpeg1 και Β2m). Επαληθεύσαμε επίσης τα προφίλ έκφρασής τους όπως προέκυψαν από τους Lewis et.al μέσω PCR πραγματικού χρόνου. Για το δεύτερο μέρος χρησιμοποιήθηκαν για την επαγωγή της ΠΑΕ ποντίκια C57Bl/6 Apobec1-/- και άγριου τύπου ηλικίας 8 έως 10 εβδομάδων. Η απαλοιφή του γονιδίου Apobec1 συσχετίστηκε με την πρώιμη εμφάνιση της νόσου και τη χειρότερη πορεία της. Οι ιστοί εγκεφάλου και νωτιαίου μυελού συλλέχθηκαν από τα ποντίκια και ακολούθησε ιστοχημική ανάλυση με τη χρώση Αιματοξυλίνης Εοσίνης. Επίσης διεξήχθη ανοσοϊστοχημεία για τα Iba1, GFAP και CD3. Παρατηρήθηκε αυξημένη απομυελίνωση, νευρωνική βλάβη, διήθηση κυττάρων στο ΚΝΣ και ενεργοποίηση των γλοιακών κυττάρων.Συμπερασματικά, η μεσολαβούμενη από Apobec1 επεξεργασία του RNA φαίνεται ότι έχει προστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου και τη σοβαρότητα των συμπτωμάτων
description: Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory neurodegenerative disease that is characterized by immune-mediated attacks to myelin sheath. Genetic predisposition, environmental factors as well as epigenenetic factors, may be involved in the pathogenesis of MS. More recent studies indicated microglia, the innate immune cells of the Central nervous system (CNS), may be a promising target of therapeutic studies. Microglia activation classically accompanies MS development, and regulation of microglia function changes the outcome of the disease. RNA editing is a co- or post-transcriptional process that results in sequence modification such that it differs from that predicted by the DNA sequence. In mammals it is represented by site-specific deamination of bases by two main enzyme families, the ADARs and AID/APOBEC. ADARs catalyze the conversion of adenine to inosine bases (A-to-I), while AID/APOBEC the conversion of cytosine to uracil bases (C-to-U). Already there are studies that correlate A-to-I RNA editing, catalyzed by the ADARs, with neurodegenerative diseases, like Amyotrophic Lateral Sclerosis. The APOBEC1 is the prototype of the AID/APOBEC family, recent next generation sequencing studies (RNA sequencing), revealed a variety of transcripts, expressed in mouse tissues in vivo, that APOBEC1 recognizes and catalyzes C-to-U RNA editing, amongst which is the mRNA of the APP gene, that codes for the amyloid precursor protein and is directly correlated with Alzheimer’s disease. Additionally brain RNA seq has revealed Apobec1 expression in multiple brain cells, including microglia cells.To explore mechanisms underlying MS, the most commonly used animal model is Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE). EAE, like MS, targets oligodendrocytes, the myelin producing cells and microglia activation has been shown to occur early in the disease progression. In the present study we investigated whether there are changes in the microglial RNA editing indexes during EAE development, which could contribute to the disease progression. Furthermore, we investigated if the deletion of one of the two RNA editing pathways, the Apobec1 mediated has an impact in EAE disease progression. For the first part, we exploited publicly available RNA seq data (Lewis et al., 2014) from murine microglial cells of two time points of EAE, naïve and acute. By an in house bioinformatic analysis, lists of candidate editing transcripts were generated, for both ADARs and AID/APOBEC. Three differentially edited transcripts on 3’UTR between the two disease stages were validated by Sanger sequencing, Ctsb, Mpeg1 and B2m. We also verified their expression profiles as resulted by Lewis et.al via Real-time PCR. For the second part Apobec1 knockout and wild type 8-to-10 weeks old female C57Bl6 mice were utilized for the induction of EAE. Remarkably depletion of Apobec1 gene correlates with early disease onset and worst disease outcome. Brain and spinal cord tissues were harvested from naïve and acute phase mice and the sections were HE and immunohistochemistry was performed for Iba1, GFAP and CD3. We observed increased demyelination, neuronal damage, cell infiltration into the CNS, and Glial activation. Conclusively, Apobec1 mediated RNA editing seems to have a protective role in the progression of the disease and the severity of the symptoms.