title: The reciprocal influence of alpha-synuclein aggregation and lysosomal homeostasis in Parkinson’s disease
title: Die Wechselwirkung von Alpha-Synuclein Aggregation und lysosomaler Homöostase in der Parkinson-Krankheit
Creators: name: Drobny, Alice
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 61 Medizin und Gesundheit :: 616 Krankheiten

description: Lysosomal impairments and deficits are associated with various neurodegenerative diseases, such as Parkinson’s disease (PD). This has been addressed in several molecular, clinical and genetic studies that point out a key role of lysosomal pathways and proteins contributing to the pathogenesis of PD. The hallmark of PD that belongs to the group of synucleinopathies is the presence of intracellular inclusions called Lewy bodies comprising aggregated alpha-synuclein (aSyn). During disease progression, the physiological form of the small synaptic protein aSyn shifts from soluble monomers via different intermediate states to pathological insoluble amyloid fibrils. Recently, pathological aSyn has been demonstrated to interfere with various intracellular pathways including the autophagy-lysosomal pathway that is essential for enzymatic degradation of cellular material. Functional impairment of lysosomes and reduced capacity of lysosomal enzymes such as cathepsins contribute to PD pathology since cathepsins are directly involved in lysosome-mediated aSyn degradation. The overall aim of this thesis is to improve the understanding of the bidirectional interplay between aSyn and the lysosome, and to investigate potential therapeutic approaches to increase lysosomal function and thereby reducing aSyn pathology. In the first part, this thesis aims to delineate the structural properties of aSyn under lysosomal acidic pH 5, when engulfed by lysosomes and under cytosolic neutral pH 7.4 when escaping into the cytosol. By using different biochemical analyses, it was demonstrated that aSyn fibrillated much faster under pH 5 conditions compared to cytosolic pH 7.4. Furthermore, when exposing pH 5 fibrils to pH 7.4, they collapsed into partly soluble conformers that exerted cellular toxicity. Moreover, lysosome-derived aSyn was able to seed its aggregation under neutral pH indicating that aSyn that escaped from the lysosomal system and thus has not been efficiently degraded, might disturb the cellular homeostasis by interfering with intracellular pathways. In a second approach, the effects of aggregated aSyn on lysosomal function and homeostasis were investigated. In this regard, different in vitro and in vivo models of synucleinopathy were used including H4 neuroglioma cells, PD-derived induced pluripotent stem cells that were differentiated to midbrain dopaminergic neurons and a mouse line that expresses A53T aSyn in dopaminergic neurons. In H4 cells overexpressing aSyn, it was demonstrated that the lysosomal pH was deacidified, most likely through direct interactions of aSyn with the vacuolar-ATPase, a proton pump that maintains acidic lysosomal pH. Furthermore, the proteolytic activity, maturation and lysosomal localization of the cathepsin D (CTSD), CTSB and CTSL were diminished in the different synucleinopathy models. Vice versa, the inhibition of their enzymatic activity increased the formation of pathological aSyn resulting in a vicious cycle of inefficient aSyn degradation. This pathological mechanism was reversed by applying a farnesyl-transferase inhibitor that promotes hydrolase transport and restored the functional activity of all three cathepsins. The last part of this thesis focused on therapeutic interventions to enhance CTSD function and aSyn clearance. Since the lysosomal activity of CTSD was significantly impaired in different models of synucleinopathy, it was tested whether external application of recombinant pro CTSD (rHsCTSD) had beneficial effects on aSyn and lysosomal homeostasis. It was validated that rHsCTSD was transported into the lysosome and exerted its activity inside the lysosomal compartment. Importantly, rHsCTSD treatment resulted in reduced pathological aSyn in the lysosome, diminished aSyn seeding capacity and improved lysosomal function. In addition, it did not induce any cellular toxicity, electrophysiological alterations of dopaminergic neurons, or lysosomal composition changes, indicating a safe and tolerable use of rHsCTSD. In summary, the results in this work demonstrate the vital role of lysosomes in PD pathology and highlight lysosomal cathepsins as promising therapeutic targets to combat aSyn burden in PD and other synucleinopathies.
description: Die Beeinträchtigung und das Defizit der lysosomalen Funktion ist mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Parkinson-Krankheit, assoziiert. Dies wurde in einer Reihe von molekularen, klinischen und genetischen Studien untersucht, die die Schlüsselrolle von lysosomalen Signalwegen und Proteinen identifizierten, die zur Pathogenese der Erkrankung beitragen. Ein typisches Merkmal der Parkinson-Krankheit, die zur Gruppe der Synucleinopathien gehört, ist das Vorhandensein von intrazellulären Einschlüssen von aggregiertem alpha-synuclein (aSyn), die Lewy Körperchen genannt werden. Während des Fortschreitens der Erkrankung verändert das kleine synaptische Protein aSyn seine physiologische lösliche monomere Form über verschiedene Zwischenstufen zu unlöslichen pathologischen amyloiden Fibrillen. Es wurde gezeigt, dass diese pathologische Form verschiedene intrazelluläre Funktionen sowie das lysosomale System behindert, das für den Abbau von Zellmaterial verantwortlich ist. Die Beeinträchtigung der lysosomalen Funktion und ihrer enzymatischen Kapazität, die durch verschiedene Proteasen wie den Cathepsinen vermittelt wird, trägt maßgeblich zur aSyn Pathologie bei, da lysosomale Cathepsine direkt am Abbau von aSyn beteiligt sind. Das zentrale Ziel dieser Thesis war, das Verständnis der bidirektionalen Interaktion zwischen aSyn und Lysosom zu verbessern und mögliche therapeutische Ansätze zur Verbesserung der lysosomalen Funktion und Reduktion der aSyn Pathologie zu identifizieren. Der erste Teil dieser Arbeit zielte darauf ab, die strukturellen Eigenschaften von aSyn unter lysosomalen saurem pH 5 zu ermitteln, entsprechend dem Fall, wenn aSyn von Lysosomen aufgenommen wird, und zum anderen unter zytosolischem pH 7,4, wenn es aus den Lysosomen ins Zytosol entweicht. Mithilfe von verschiedenen biochemischen Analysen konnte gezeigt werden, dass aSyn unter pH 5 Bedingungen schneller Fibrillen bildete als unter pH 7,4. Darüber hinaus zerfielen pH 5 Fibrillen unter pH 7,4 Bedingungen in teilweise lösliche Konformere, die zelluläre Toxizität induzierten. Außerdem war das aus den Lysosomen isolierte aSyn in der Lage, die Aggregation von monomeren aSyn unter neutralem pH anzuregen. Das deutet darauf hin, dass das nicht vollständig abgebaute aSyn aus Lysosomen die zelluläre Homöostase beeinflussen könnte, indem es mit intrazellulären Signalwegen interferiert. Aus diesen Gründen wurde in einem zweiten Ansatz die Auswirkungen von aggregiertem aSyn auf die lysosomale Funktion untersucht. Zu diesem Zweck wurden verschiedene in vitro und in vivo Modelle für Synucleinopathien, wie aSyn überexprimierende H4 Neurogliomazellen, induzierte pluripotente Stammzellen von PD-Patienten, die zu dopaminergen Neuronen differenziert wurden, und eine Mauslinie, die pathologisches (A53T) aSyn in dopaminerge Neuronen exprimiert, verwendet. Es wurde gezeigt, dass der lysosomale pH-Wert in aSyn überexrimierende H4 Zellen erhöht war, höchstwahrscheinlich ausgelöst durch die direkte Interaktion von aSyn mit der vakuolären-ATPase, eine Protonpumpe, die für die Aufrechterhaltung des lysosomalen pH verantwortlich ist. Interessanterweise war die proteolytische Aktivität, die Reifung und die lysosomale Lokalisation von Cathepsin D (CTSD), CTSB und CTSL in den verschiedenen Synucleinopatie Modellen signifikant vermindert. Umgekehrt erhöhte sich die Bildung von pathologischem aSyn, wenn die Aktivität der Cathepsine durch Inhibitoren gehemmt wurde. Die verminderte Cathepsin-Aktivität resultierte in einem Teufelskreis, der den Aggregationsprozess von aSyn verstärkt. Dieser Abwärtszyklus konnte durch die Anwendung eines Farnesyltransferase-Inhibitors durchbrochen werden, indem dieser den Transport von lysosomalen Hydrolasen förderte und die Aktivität von CTSD, CTSB und CTSL erhöhte. Weiterhin wurde die therapeutische Anwendung von rekombinantem Pro-CTSD (rHsCTSD) auf die Regulierung von aSyn und auf die lysosomale Homöostase untersucht. Zunächst wurde mit Hilfe von CTSD defizienten H4 Zellen verifiziert, dass das Enzym ins Lysosom gelangt und dort aktiv ist. Bemerkenswerterweise konnte in aSyn überexprimierende H4 Zellen und in dopaminergen Neuronen mit einer A53T aSyn Mutation demonstriert werden, dass die externe Applikation von rHsCTSD zu einer Reduktion von pathologischem aSyn in Lysosomen führt und die Aggregations-fördernde Kapazität von aSyn verringerte. Zudem könnte die Behandlung mit rHsCTSD die allgemeine lysosomale Funktion signifikant verbessern. Die Applikation von rHsCTSD induzierte zudem keine zelluläre Toxizität, beeinflusste nicht die elektrophysiologischen Eigenschaften der dopaminergen Neurone und veränderte auch nicht die Zusammensetzung lysosomaler Proteine, was auf eine sichere und tolerierbare Anwendung von rHsCTSD schließen lässt. Zusammenfassend bestärken die Ergebnisse dieser Arbeit die wesentliche Rolle von Lysosomen für den Abbau von aSyn und heben lysosomale Cathepsine als therapeutischen Ansatz zur Bekämpfung von aSyn Aggregation in der Parkinson-Krankheit und anderen Synucleinopathien hervor.