Identifizierung neuer Komponenten der Lichtwahrnehmung in Aspergillus nidulans und Untersuchung der Rolle zweier Hämoxygenasen in der Chromophorbildung von Phytochrom in Alternaria alternata
Creators: name: Streng, Christian Pascal
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2020
Subjects: Aspergillus nidulans
Licht
FphA
Biliverdin
Alternaria alternata
Hämoxygenase
HoxA
HoxB

description: Eine Vielzahl von Organismen ist in der Lage Licht, als ubiquitäres Signal wahrzunehmen. Hierfür sind Photorezeptoren notwendig, die Licht verschiedener Wellenlängen detektieren. Blaulicht wird in Pilzen duch kleine LOV Proteine, Cryptochrome oder White Collar wahrgenommen. Grünlicht wird durch Opsine und Rotlicht durch Phytochrom detektiert. All diese Proteine teilen sich die Eigenschaft einen Chromophor zu binden, um ihre Funktion zur Lichtwahrnehmung zu erhalten. Die Charakteristik bei der Absoption von Licht des Chromophors bestimmt die detektierte Wellenlänge des Proteins. Fehlt der Chromophor oder sind die Proteine nicht in der Lage diesen zu binden, führt dies zu einem „blinden“ Photorezeptor. Die Chromophore von Phytochrom aus Bakterien, Cyanobakterien und Pflanzen sind bekannt. Sie alle binden einen Bilin Chromophor und verwenden entweder Biliverdin direkt oder ein Derivat davon. All diese Organismen und Tiere bilden Biliverdin aus Häm durch Hämoxygenasen. Das Phytochrom, FphA, wurde intensiv in A. nidulans analysiert. Bei einem Mutageneseansatz wurden die HOG MAP Kinasekaskade als neue Komponente des Lichtsignalweges identifiziert. Eine putative Hämoxgenase wurde allerdings nicht gefunden. Bioinformatische Analysen ergaben auch keine Hinweise auf eine Hämoxygenase in A. nidulans. Deshalb wurde ein erneuter Mutageneseansatz mit dem Auxotrophiemarker Gen, pyr4, unter dem lichtinduzierbaren Promotor von conJ, durchgeführt. Durch komplette Genomsequenzierung wurden die Mutationen in zwei isolierten Mutanten identifiziert. Die Gene, prp8 und rsrA, waren bereits beschrieben. Prp8 ist eine Untereinheit des Spliceosoms. RsrA ist bereits aus der Wahrnehmung von oxidativem Stress bekannt und reguliert ebenfalls bereits bekannte lichtinduzierbare Gene. Der genaue Zusammenhang der beiden Gene mit der phytochromabhängigen Lichtwahrnehmung wird zurzeit in einer Master und einer Doktorarbeit unersucht. Stattdessen wurde der Fokus dieser Studie weiter auf die Hämoxygenase aus Aspergillus nidulans gelegt. Eine erneute bioinformatische Analyse des Genoms mit Domänen von Hämoxygenasen ergab tatsächlich einen Kandidaten für eine Hämoxygenase, HoxB. Da Alternaria alternata ebenfalls Rotlicht mittels Phytochrom (FphA) wahrnehmen kann, wurde dieser Organismus ebenfall in die Suche einbezogen. In A. alternata wurden sogar zwei putative Hämoxygenasen identifiziert, HoxA und HoxB, wovon HoxB homolog zu A. nidulans HoxB ist. Wie im Fall von Ho-2 aus A. thaliana fehlte in beiden HoxB das konservierte Histidin, welches für die katalytische Aktivität von anderen Hämoxygenasen essenziell scheint. Es zeigte sich, dass eine künstliche Mutation der Aminosäure an besagter Stelle zum konservierten Histidin nicht in der Lage ist, die Aktivität in vitro wiederherzustellen. Eine Deletion der Hämoxygenasegene aus A. alternata führten beide zu einem „blinden“ Phänotyp. Die Deletion von hoxB in A. nidulans hatte allerdings keinen Effekt auf die Rotlichwahrnehmung. Die Hämoxygenase Deletionsstämme aus A. alternata ähneltem dem fphA Deletionsstamm aus A. alternata. So waren die Hämoxygenase Deletionsstämme auf oxidativen Stress ebenfalls wie der fphA Deletionsstamm resistenter, wiesen aber keine Reduktion der Sporulation auf. Um die A. alternata Hämoxygenasen biochemisch zu charakterisieruen, wurden sie gemeinsam mit der photosensorischen Domäne von FphA, PGP, in E. coli exprimiert. Hierbei konnte 10x mehr funktionales FphA PGP detektiert werden, wenn beide Hämoxygenasen exprimiert wurden im Vergleich zur einzelnen Expression von HoxA. HoxB allein war nicht in der Lage, funktionales FphA PGP zu bilden. Für HoxA konnte ein C-terminaler Anker, wie er aus Hämoxygenasen aus Säugern bekannt ist, nachgewiesen werden. Zur Verbesserung der Löslichkeit wurde dieser für in vitro Studien deletiert. HoxA und HoxB waren beide in der Lage Häm in vitro zu binden, aber nur bei Anwesenheit beider Hämoxygenasen konnte der Chromophor gebildet werden. Der Chromophorsyntheseweg konnte in vitro nachgebildet werden, indem zusätzlich FphA zugegeben wurde. Durch die Fusion der Proteine mit GFP, konnte die Lokalisation am Mitochondrium nachgewiesen werden. Hierbei lokalisierten die Hämoxygenasen an der äußeren Membran der Mitochondrien. Die Hämoxygenasen bilden hierbei sowohl Homodimere als auch Heterodimere. Diese Dimere interagieren mit FphA. Hieraus ergibt sich ein neues Modell zur Chromophorsynthese und den Weg von FphA in der Zelle dar. FphA wird im Kern transkribiert und anschließend an den Ribosomen translatiert. Währenddessen wird Häm im Mitochondrium synthetisiert. Das FphA Apoprotein gelangt zu den Hämoxygenasen, um mit HoxA und HoxB zu interagieren. Häm wird derweil aus dem Mitochondrium exportiert und gelangt durch Häm-bindende Enzyme zu den Hämoxygenasen. Die Hämoxygenasen bilden aus Häm den Chromophor Biliverdin für FphA. Dieser Chromophor wird von FphA gebunden. Sobald Rotlicht wahrgenommen wird, kommt es zur Aktivierung des HOG Signalweges und zur Lichtantwort. Außerdem ist eine Funktion von FphA in den Zellkernen beschrieben, so dass eine Fraktion von Holo FphA in die Zellkerne importiert werden muss.