title: Site-directed mutagenesis and purification studies of recombinant glycosylated horseradish peroxidase
Creators: name: Rossetti, Laura
Publisher: name: TU Wien
Year: 2014
Subjects: subject: Enzym Herstellung
subject: Reinigung und Charakterisierung
subject: Enyzme production
subject: purificaiton and characterization

description: Meerrettich Peroxidase (HRP) ist ein weit bekanntes Enzym welches normalerweise aus der Meerrettich-Wurzel (Armoracia rusticana) isoliert wird und sowohl in der Industrie als auch in der Medizin häufig angewandt wird. Aufgrund der mühsamen Gewinnung aus der Pflanze wurden viele Versuche angestellt, das Enzym mittels rekombinanter Mikroorganismen herzustellen was sich aber aufgrund der intrinsischen Eigenschaften der HRP sehr schwierig gestaltet. Hefen wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris sind bedeutende Wirtsorganismen für die Herstellung heterologer glykosylierter Proteine. Allerdings hyperglykosyliert P. pastoris extrazelluläre Proteine, was eine herkömmliche chromatographische Reinigung erschwert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein schnelles und effizientes 2-stufiges Reinigungsprotokoll mittels Hydrophober-Ladungs-Induktions-Chromatographie (HCIC) und einer monolithischen Säule entwickelt, wobei beides im Negativ-Modus durchgeführt wurde. Das finale Enzympräparat wurde von der rohen Fermentationsbrühe mehr als 12-fach gereingt, was die rekombinante Herstellung von HRP eine interessante Alternative zur konventionellen Pflanzenextraktion macht. Des Weiteren kann die Glykosylierung rekombinanter HRP Abwehrreaktionen im menschlichen Körper hervorrufen, wenn sie für medizinische Zwecke wie beispielsweise Krebstherapien verwendet werden soll. Deswegen wurde eine der 9 in HRP vorkommenden N-Glykosylierungsstellen durch den Austausch des Asparagin-Rests an der Stelle N57 gegen die drei strukturell ähnlichen Aminosäuren Glutamin, Serin und Asparagin in einem molekularbiologischen Ansatz entfernt. Die stabilste und aktivste Enzymvariante wurde im Bioreaktor produziert und ausführlich charakterisiert und mit dem Wild-Typ Enzym aus P. pastoris verglichen. Die finale Enzymvariante N57S war mehr als 2-mal so aktiv und zeigte eine erhöhte thermische Stabilität, was durch Austausch einer einzigen Aminosäure erreicht wurde.
description: To date, the enzyme horseradish peroxidase (HRP), which is frequently applied in industry and medicine, is mainly isolated from the horseradish root. Because of the cumbersome purification from the plant-source, many attempts to express the enzyme in different recombinant hosts have been progressed but several steps are required to obtain purified enzyme and yields are low. Yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris are valuable host organisms for large scale production of heterologous glycosylated proteins. However, P. pastoris hyperglycosylates secreted proteins which impairs a conventional chromatographic purification. Within the first part of this thesis, a fast and efficient 2-step protocol using hydrophobic charge induction chromatography (HCIC) and a monolithic colum for the purification of rHRP was developed, operating both systems in a negative mode. The final enzyme preparation was purified more than 12-fold from the crude fermentation broth, which makes the recombinant expression of rHRP in P. pastoris an interesting alternative to conventional HRP production. Moreover, the extensive glycosylation of rHRP produced in P. pastoris may cause severe immunogenic responses in humans when rHRP will be applied in medicine e.g. for targeted cancer treatment. For this reason, one of the N-glycosylation sites present in rHRP was removed in a molecular biology approach by substituting the Asparagine residue at site N57 to the three structural similar amino acids Glutamine, Serine and Arginine. The most stable and active enzyme variant was expressed in a bioreactor and characterized thoroughly and compared to the wild type enzyme from P. pastoris. The final enzyme variant N57S was &gt;2-fold more active as the wild type enzyme and had a higher thermal stability, which was achieved by substituting a single amino acid only.