title: Neue Gentargeting-Strategien auf Basis der RNA interference RNAi
title: New gene targeting strategies based on RNAi
Creators: name: Werth, Stephanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: PEI, PTN
Polyethylenimin , Vascular endothelial Growth Factor
RNAi
RNS-Interferenz
Biowissenschaften, Biologie

description: RNA Interferenz ist ein natürlicher
      Prozess in eukaryoten Zellen, der zur spezifischen
      Herunterregulation der Genexpression (Gen-Silencing) führt.
      Der Mechanismus der RNAi wird durch 21 - 23 nt lange
      doppelsträngige RNA-Moleküle (siRNA) vermittelt, welche
      sequenzspezifisch den Abbau und die Degradation ihrer
      Ziel-mRNA herbeiführen, indem sie den RISC-Komplex im Zytosol
      zu seiner Ziel-mRNA dirigieren. Ein Kriterium bei der
      Transfektion der Zellen mit siRNA ist der schnelle Abbau der
      Nukleinsäuren durch Ribonukleasen und damit eine verminderte
      Transfektionseffizienz. Polyethylenimine sind synthetische
      Polymere, die in verschiedenen Molmassen vorliegen und die
      eine hohe kationische Ladungsdichte aufweisen. Aufgrund
      dieser Protonierung sind sie in der Lage, Komplexe mit siRNA
      oder DNA zu bilden. Als positiv geladene Polyplexe
      interagieren sie dann mit der Zellmembran und werden per
      Endozytose in das Zytosol aufgenommen. Die Pufferkapazität
      der Polyethylenimine ermöglicht das Verlassen der Lyosomen
      nach deren Platzen (Protonenschwammhypothese) und schützt die
      Nukleinsäuren vor der Degradation. In dieser Arbeit wurde die
      gelpermeationschromatographische Trennung der Lösung eines
      verzweigten 25-kDa-Polyethylenimins zur Herstellung eines Low
      molecular weight Polyethylenimins genutzt. Dieses als
      F25-LMW-PEI bezeichnete Polyethylenimin zeigte eine
      verbesserte Transfektionseffizienz sowie eine geringere
      Zytotoxizität, die bei Transfektionsversuchen mit den
      Zelllinien SKOV3, U87 und PC3 näher untersucht wurden. Hier
      konnten bei Co-Transfektionen mit DNA hervorragende
      Transfektionseigenschaften nachgewiesen werden. Gleichfalls
      war die durch siRNA vermittelte Herunterregulation der
      Luciferase bei stabil Luciferase-exprimierenden
      SKOV3-10-Zellen unter verschiedenen Transfektionsbedingungen
      eindeutig nachweisbar. Auch nach Lyophilisierung und
      Resolubilisierung der PEI/siRNA/DNA-Komplexe konnte ein
      Genknockdown durch RNAi beobachtet werden. Zur weiteren
      Charakterisierung des F25-LMW-PEI-vermittelten
      siRNA-Targetings tumorrelevanter Genprodukte wurden die
      Prostatakarzinomzelllinie PC3 sowie die Glioblastomzelllinie
      U87 verwendet. Die Prostatakarzinomzellen PC3 exprimieren den
      wichtigen Angiogenese-Faktor VEGF, welcher vermehrt beim
      Tumorwachstum und der damit verbundenen Angiogenese
      nachgewiesen wird. Eine Vielzahl von Krebsarten geht mit
      einer erhöhten VEGF-mRNA-Expression einher. Die Möglichkeit
      des wirkungsvollen siRNA-Targetings und des Knockdowns wurde
      durch ein vermindertes PC3-Zellwachstum im WST-Assay
      dargestellt. U87-Zellen exprimieren den Heparin-bindenden
      Wachstumsfaktor Pleiotrophin (PTN), welcher vermehrt bei
      bösartigen Erkrankungen gefunden wird. Die protoonkogene
      Wirkung des PTN-Gens beruht hauptsächlich auf der Stimulation
      der Proliferation von Tumorzellen und der Angiogenese. Bei
      den U87-Zellen konnte bei den mit der spezifischen PTN-siRNA
      transfizierten Zellen eine PTN-Herunterregulation auf mRNA-
      und Protein-Ebene nachgewiesen werden, was zu einer
      verminderten Zellproliferation führte. Die Möglichkeit der
      Lyophilisierung der F25-LMW-PEI/siRNA-Komplexe war auch bei
      Transfektion der PC3- sowie der U87-Zellen eindeutig
      nachweisbar und es zeigten sich nach der Transfektion mit den
      spezifischen siRNAs ein vermindertes Zellwachstum der
      malignen Zellen sowie eine verminderte Konzentration von PTN
      auf Proteinebene.
description: RNA interference is a natural
      process in eukaryotic cells leading to the specific
      down-regulation of gene expression (gene silencing). The
      mechanism of RNAi is mediated through 21-23 nt long
      double-stranded RNA molecules (siRNA) which
      sequence-specifically induce the degradation of their
      target-mRNA. One critical factor that determines the success
      of RNAi is the rapid degradation of nucleic acids by
      ribonucleases and reduced transfection efficiency.
      Polyethylenimines are synthetic polymers which are present in
      different molecular weights and which have a high cationic
      charge density. Due to their protonation they are able to
      form complexes with DNA or siRNA. As positively charged
      polyplexes they interact with the cell membrane and are
      absorbed by endocytosis into the cytosol. By fractionation of
      a commercially available 25kDa PEI using gel permeation
      chromatography, a low molecular weight polyethylenimine
      (F25-LMW-PEI) with superior transfection efficacy and low
      toxicity in the cell lines SKOV3, U87 and PC3 was obtained.
      Upon lyophilization and reconstitution of
      F25-LMW-PEI/siRNA/DNA complexes, siRNAs are still able to
      efficiently induce RNAi. To further demonstrate their
      applicability, lyophilized PEI/siRNA complexes are employed
      for targeting the growth factors VEGF and PTN. Treatment of
      the PC3 prostate carcinoma cells or U87 glioblastoma cells
      with fresh or with lyophilized complexes results in decreased
      cell proliferation in different assays due to the
      siRNA-mediated downregulation of VEGF and PTN. In conclusion,
      siRNAs can be applied in lyophilizes formulations, and
      lyophilized F25-LMW-PEI-based siRNA complexes represent a
      powerful, inexpensive, non-toxic and simple ready-to-use
      platform for the specific and efficient targeting of genes in
      vitro.