Ποσοτικός προσδιορισμός ζωντανού Lactobacillus acidophilus σε μίγματα ζωντανών και θανατωμένων με εφαρμογή ATR-FTIR φασματοσκοπίας και χημειομετρικών μεθόδων
Creators: name: Τόζιου, Περιστέρα-Μαρία Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: Οξεόφιλος γαλακτοβάκιλος
Φασματοσκοπία ATR-FTIR
Μοντέλα πρόβλεψης
Lactobacillus acidophilus
ATR-FTIR spectroscopy
Prediction models

description: Δεδομένου ότι οι μέθοδοι που βασίζονται σε μικροβιακές καλλιέργειες είναι δαπανηρές και χρονοβόρες, εναλλακτικές μέθοδοι είναι υπό έρευνα για τον ποσοτικό προσδιορισμό των προβιοτικών σε εμπορικά προϊόντα. Στην παρούσα εργασία εφαρμόστηκε η φασματοσκοπία δόνησης attenuated total reflection fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) για το διαχωρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό ζωντανού Lactobacillus (La 5) σε μίγματα ζωντανών και θανατωμένων σε όξινο περιβάλλον, παρουσία και απουσία του εντερικού πολυμερούς Eudragit® L 100-55. Παρασκευάστηκαν εναιωρήματα ζωντανού (La 5_L) και θανατωμένου σε όξινο περιβάλλον βακίλλου (La 5_K) και διμερή μίγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων La 5_L. Αυτά χρησιμοποιήθηκαν για ανάπτυξη καλλιεργειών και μέτρηση αποικιών, καθώς και για φασματοσκοπική ανάλυση και ποσοτικό προσδιορισμό σε συνδυασμό με εφαρμογή χημειομετρικών μεθόδων - παλινδρόμηση μερικών ελαχίστων τετραγώνων partial least squares regression (PLSR) και τεχνητά νευρωνικά δίκτυα artificial neural networks (ANNs). Η αύξηση του αριθμού αποικιών ζωντανού La 5_L αυξανομένης της αναλογίας του στο μείγμα με θανατωμένα ήταν λογαριθμική (R2=0.926). Ο διαχωρισμός του La 5_L από το La 5_K ήταν δυνατός απευθείας από το εμβαδό της κορυφής στα 1635 cm-1 (περιοχή αμιδίων πρωτεϊνών και πεπτιδίων), και η σχέση μεταξύ του %La 5_L και του εμβαδού κορυφής La 5_L ήταν γραμμική. Εφαρμογή της PLSR έδωσε λογική πρόβλεψη του %La 5_L (RMSEp=6.48) στα διμερή μίγματα ζωντανών και θανατωμένων La 5, αλλά κακή πρόβλεψη όταν προστέθηκε πολυμερές στο μίγμα La 5 (RMSEp=11.75). Η εφαρμογή των ANNs βελτίωσε σημαντικά την ικανότητα πρόβλεψης του %La 5_L τόσο παρουσία όσο και απουσία του πολυμερούς (RMSEp=8.11*10-8 απουσία και RMSEp=8.77*10-8 παρουσία του πολυμερούς). Η φασματοσκοπία FTIR αποτελεί μια απλή, χαμηλού κόστους και ταχεία μέθοδο, η οποία σε συνδυασμό με χημειομετρικές μεθόδους επιτρέπει την εξέταση, το διαχωρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό βακτηρίων σε στερεή ή υγρή κατάσταση. Η φασματοσκοπία ATR-FTIR μπορεί να διαχωρίσει απευθείας ζωντανά La 5 σε μίγματα ζωντανών και θανατωμένων από διαφορές στις εντάσεις των φασματικών κορυφών. Ωστόσο, για τον ποσοτικό προσδιορισμό απαιτείται η εφαρμογή πολυμεταβλητών αναλυτικών μεθόδων. Η παλινδρόμηση μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLSR) έδωσε λογική πρόβλεψη του ποσοστού ζωντανών La 5 σε διμερή μίγματα ζωντανών και θανατωμένων La 5, αλλά απέτυχε παρουσία του Eudragit® L 100-55. Η εφαρμογή των ANNs έδωσε μοντέλα με εξαιρετικά βελτιωμένη ικανότητα πρόβλεψης, η οποία αποδίδεται στην ικανότητά τους να μοντελοποιούν δεδομένα με μη γραμμικά χαρακτηριστικά.
description: Since culture-based methods are costly and time consuming, alternative methods are investigated for the quantification of probiotics in commercial products. In this work attenuated total reflection fourier transform infrared (ATR-FTIR) vibration spectroscopy was applied for the differentiation and quantification of live Lactobacillus (La 5) in mixed populations of live and acid-killed La 5, in the absence and in the presence of enteric polymer Eudragit® L 100-55. Suspensions of live (La 5_L) and killed in acidic environment bacillus (La 5_K) were prepared and binary mixtures of different percentages were used to grow cell cultures for colony counting and spectral analysis. For the quantification of live La 5 in mixed populations of live and killed, spectral analysis was combined with chemometrics – partial least squares regression (PLSR) and artificial neural networks (ANNs). The increase in the number of colonies with added %La 5_L to the mixture was log-linear (R2=0.926). Differentiation of La 5_L from La 5_K was possible directly from the peak area at 1635 cm-1 (amides of proteins and peptides) and a linear relationship between %La 5_L and peak area was obtained. Application of partial least squares regression (PLSR) gave reasonable prediction of %La 5_L (RMSEp=6.48) in binary mixtures of live and killed La 5 but poor prediction (RMSEp=11.75) when polymer was added to the La 5 mixture. Application of artificial neural networks (ANNs) improved greatly the predictive ability for %La 5_L both in the absence and in the presence of polymer (RMSEp=8.11*10-8 for La 5 only mixtures and RMSEp=8.77*10-8 with added polymer). Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) is a simple, low cost and rapid method which in conjunction with chemometrics enables examination, differentiation and quantification of bacteria in the solid or liquid state. ATR-FTIR spectroscopy could directly discriminate live La 5 in mixed populations of live and killed from differences in peak intensities. However, for quantification the application of multivariate analytical methods is required. Partial least squares regression (PLSR) gave reasonable prediction of live La 5 in binary mixtures of live and killed La 5 but failed in the presence of Eudragit® L 100-55. Application of artificial neural networks gave regression models with greatly improved predictive ability, which is attributed to their ability to model data having non-linear characteristics.