title: Genetic and biochemical characterization of the itaconic acid biosynthesis in Ustilago maydis
title: Genetische und biochemische Charakterisierung der Itaconsäure-Biosynthese in Ustilago maydis
Creators: name: Przybilla, Sandra Kathrin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Gencluster
gene cluster
Biotechnologie
bio-based chemical building block
Itaconsäure
Ustilago zeae
secondary metabolism
Sekundärmetablismus
Biowissenschaften, Biologie
metabolic engineering

description: Die ungesättigte Dicarbonsäure
      Itaconsäure wird durch mikrobielle Fermentation erzeugt und
      dient als Ausgangsstoff für die Produktion von Kosmetika,
      Klebstoffen oder sogar Biokraftstoff. Der phytopathogene
      Basidiomycet Ustilago maydis produziert unter bestimmten
      Bedingungen eine Vielzahl an Sekundärmetaboliten, zu denen
      auch die Itaconsäure gehört. Der Biosyntheseweg der
      Itaconsäure war jedoch in diesem Pilz bisher noch nicht
      bekannt. In dieser Arbeit wurden die für die
      Itaconsäure-Biosynthese in U. maydis verantwortlichen Gene
      identifiziert und charakterisiert. Alle beteiligten Gene sind
      in einem Gencluster organisiert, der durch den
      Transkriptionsfaktor Ria1 spezifisch reguliert wird. Anhand
      von Deletionsanalysen der entsprechenden Gene konnte gezeigt
      werden, dass in U. maydis zwei Enzyme essentiell für die
      Synthese von Itaconat sind. Im Verlauf dieser Arbeit wurde
      die enzymatische Aktivität dieser Enzyme bestimmt. Dabei
      wurde gezeigt, dass das PrpF-ähnliche Protein
      Aconitat-Δ-Isomerase (Adi1) die Umwandlung von cis- zu
      trans-Aconitat und damit den ersten Schritt der
      Itaconsäure-Biosynthese in U. maydis katalysiert. Der zweite
      Schritt wird durch das zweite essentielle Enzym
      trans-Aconitat-Decarboxylase (Tad1) katalysiert, das die
      Decarboxylierung von trans-Aconitat zu Itaconat vermittelt.
      Basierend auf diesen Daten konnte ein Modell für den
      Itaconsäure-Biosyntheseweg in U. maydis aufgestellt werden.
      Es wird angenommen, dass cis-Aconitat durch den
      mitochondriellen Transporter Ctp1 vom Mitochondrium ins
      Cytosol exportiert wird. Dort dient es als Substrat für Adi1,
      das die Isomerisierung zu trans-Aconitat katalysiert.
      Trans-Aconitat wird anschließend durch Tad1 zu Itaconat
      decarboxyliert, das vermutlich durch den
      Plasmamembran-Transporter Itp1 aus der Zelle transportiert
      wird. Der Itaconsäure-Gencluster ist während der pathogenen
      Entwicklung von U. maydis stark exprimiert. In dieser Arbeit
      konnte jedoch gezeigt werden, dass die Produktion von
      Itaconsäure während der biotrophen Phase nicht essentiell
      ist. Damit bleibt die biologische Rolle der
      Itaconsäure-Produktion für U. maydis weiterhin unklar. Im
      Verlauf dieser Arbeit wurde noch ein zweiter Gencluster in U.
      maydis identifiziert, der Ähnlichkeiten zum
      Itaconat-Gencluster aufweist. Dieser Gencluster enthält ein
      Gen für eine Aconitat Δ-Isomerase (adi2 ), die in der Lage
      ist, die Funktion von Adi1 vollständig zu ersetzen. Durch
      Wachstumstests konnte gezeigt werden, dass der
      Adi2-Gencluster für die Verstoffwechselung von cis- und
      trans-Aconitat essentiell ist, das sich auch in der
      Wirtspflanze Zea mays findet. Die Fähigkeit, trans-Aconitat
      als Kohlenstoffquelle zu verwenden, ist für U. maydis während
      der pathogenen Entwicklung möglicherweise von Vorteil, es
      konnte jedoch gezeigt werden, dass diese Fähigkeit nicht
      essentiell für die pathogene Entwicklung von U. maydis
      ist.
description: The unsaturated dicarboxylic acid
      itaconic acid is a bio-based chemical building block used in
      the industrial production of plastics, paints and cosmetics.
      Currently, itaconic acid is produced by fermentation of
      Aspergillus terreus. The phytopathogenic basidiomycete
      Ustilago maydis produces a variety of secondary metabolites
      e.g. itaconic acid under certain environmental conditions.
      The biosynthetic route of itaconate in this fungus, however,
      has not been elucidated, yet. The U. maydis genome contains a
      gene cluster comprising all the genes required for itaconic
      acid biosynthesis. This gene cluster is specifically
      regulated by the transcriptional regulator Ria1. Deletion
      analysis showed that U. maydis contains two genes essential
      for itaconate production coding for a PrpF-like enzyme and a
      CMLE-like enzyme. The activity of these enzymes has been
      identified by in vitro studies with the purified proteins.
      The PrpF-like enzyme aconitate-∆-isomerase (Adi1) catalyzes
      the first step of the itaconic acid biosynthesis pathway by
      isomerisation of cis-aconitate. The resulting trans-aconitate
      serves as a substrate for the trans-aconitate decarboxylase
      (Tad1), which catalyzes decarboxylation of trans-aconitate to
      form itaconate. A hypothetical pathway for itaconic acid
      biosynthesis in U. maydis has been modeled based on these
      data: cis-aconitate, which is a natural intermediate of the
      citric acid cycle, is probably exported from the mitochondria
      into the cytoplasm by the mitochondrial transporter Ctp1. In
      the cytoplasm cis-aconitate is converted to trans-aconitate
      by Adi1 and trans-aconitate is subsequently decarboxylated to
      itaconate by Tad1. Finally itaconate secretion into the
      surrounding medium is probably mediated by the MFS-transport
      protein Itp1. The itaconic acid gene cluster is highly
      expressed during pathogenic development of U. maydis. It has
      been demonstrated, however, that biosynthesis of itaconate is
      not essential for pathogenic development. Therefore, the
      biological role of itaconate for U. maydis is still unknown.
      The U. maydis genome contains a second gene cluster, which
      shows some similarities to the itaconic acid gene cluster.
      The PrpF-like enzyme Adi2, which is part of this gene
      cluster, is able to replace Adi1 in the itaconic acid pathway
      in vitro and also in vivo. Furthermore, growth assays showed
      that the small gene cluster of Adi2 is required for the
      metabolization of cis- and trans-aconitate. Trans-aconitate
      is known to be produced by the U. maydis host plant Zea mays.
      Therefore the ability to metabolize trans-aconitate might be
      an advantage for the fungus, even though pathogenicity tests
      showed that the Adi2 gene cluster is not required for the
      pathogenic development of U. maydis.