title: Mechanismen der Abnahme des L-Typ-Ca2+-Stroms linksventrikulärer Kardiomyozyten der Ratte in Primärkultur
Creators: name: Nay, Sandra
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025

description: Hintergrund und Ziele: Kardiomyozyten in primärer Zellkultur sind ein wesentliches und gut etabliertes Modell für verschiedenste elektrophysiologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Erforschung kardialer (Patho-)Physiologie. Im Verlauf der Kultur kommt es zu Veränderungen der Morphologie und elektrophysiologischer Eigenschaften der Kardiomyozyten. Die Mechanismen dieser Veränderungen sind bisher nur unzureichend verstanden. Der L-Typ-Ca2+-Strom spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie der ventrikulären Kontraktion und ist daher untrennbar in die Pathogenese einer Vielzahl von Herzerkrankungen involviert. Seine Regulation erfolgt über ein komplexes Zusammenspiel verschiedener intrazellulärer Signalwege. In dieser Arbeit wurden die Veränderungen des L Typ-Ca2+-Stroms sowie der Zellkapazität als Maß für die Zelloberfläche linksventrikulärer Kardiomyozyten in Primärkultur charakterisiert und auf eine Beteiligung der mTOR- und GR-Signalwege, des Zytoskelettes sowie Veränderungen der Proteinsynthese untersucht. Methoden: Nach Isolation linksventrikulärer Kardiomyozyten adulter Wistar Ratten wurden die Zellen in Primärkultur überführt und nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation mit entsprechenden Pharmaka bzw. unter Kontrollbedingungen mittels der Patch-Clamp-Technik in der whole-cell Konfiguration untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen: Zunächst konnte gezeigt werden, dass sich unter Kontrollbedingungen im zeitlichen Verlauf der Zellkultur eine signifikante Abnahme des L-Typ-Ca2+-Stroms sowie Veränderungen einiger kinetischer Eigenschaften einstellen. Die Zellkapazität zeigte sich ebenfalls reduziert. In den Inkubationsversuchen konnten diese Veränderungen durch den Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid antagonisiert werden. Dexamethason führte darüber hinaus noch zu einer Zunahme des L-Typ-Ca2+-Stroms über das Niveau frisch isolierter Kardiomyozyten, wobei dieser Effekt durch den GR-Antagonist Mifepriston aufgehoben werden konnte. Unter Inkubation mit Colchicin, einem Tubulindisruptor, zeigte sich eine beschleunigte Abnahme des L-Typ-Ca2+-Stroms sowie der Zellkapazität verglichen zu Kontrollbedingungen. Für den mTOR-Inhibitor Rapamycin zeigte sich kein wesentlicher Effekt. Schlussfolgerungen und Diskussion: In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen des L-Typ-Ca2+-Stroms in Primärkultur entsprechend der komplexen Regulation des L-Typ-Ca2+-Kanals am ehesten multifaktoriell bedingt sind. Eine wichtige Rolle scheint unter anderem die unter Kulturbedingungen fehlende GR-Stimulation zu spielen. Somit bekräftigen die vorliegenden Ergebnisse die Hypothese, dass der GR-Signalweg nicht nur bei der Entwicklung kardialer Erkrankungen beteiligt, sondern auch für die Aufrechterhaltung der physiologischen kardialen Funktion elementar ist. Zudem scheinen Veränderungen der Proteinsynthese die Grundlage der beobachteten Abnahme des L-Typ-Ca2+-Stroms zu sein, da diese durch Inhibition der Translation mit Cycloheximid gänzlich antagonisiert werden konnten. Da unter Tubulindisruption eine Beschleunigung der unter Kontrollbedingungen beschriebenen elektrophysiologischen Veränderungen festgestellt werden konnte, lässt dies die Vermutung zu, dass Mikrotubuli am intrazellulären Transport und somit der Aufrechterhaltung der L-Typ-Ca2+-Kanal-Dichte beteiligt sind und möglicherweise daher ein progredienter Verlust dieses Systems in mehrtägiger Kultur auftritt. Eine Beteiligung des mTOR-Signalweges konnte nicht sicher objektiviert werden.
description: Objectives: Cardiomyocytes in primary cell culture are an essential and well-established model for a broad variety of electrophysiological and molecular biological studies to investigate cardiac (patho-)physiology. Circumscribed changes in cardiomyocyte morphology and electrophysiological properties are known to occur over time in culture. To this date, the mechanisms of these changes are poorly understood. The L-type Ca2+ current plays a crucial role in the physiology of ventricular contraction and is therefore involved in the pathogenesis of various cardiac diseases. Its regulation occurs through a complex interplay of different intracellular signaling pathways. In this work, the changes in L-type Ca2+ current as well as cell capacity as a marker of cell surface area of left ventricular cardiomyocytes were characterized in primary culture. Incubation experiments were used to investigate the involvement of the mTOR and GR signaling pathways, the cytoskeleton, and changes in protein synthesis. Design &amp; Methods: After isolation of left ventricular cardiomyocytes from adult Wistar rats, the cells were transferred to primary culture. Incubation with colchicine, rapamycin, cycloheximide, and dexamethasone/dexamethasone &amp; mifepristone or a control solution was performed. Immediately after as well as 24, 48 and 72 hours after isolation, L-type Ca2+ current and cell capacity were examined by patch-clamp technique in whole-cell configuration. Observations &amp; Results: First, it was shown that under control conditions, there is a significant decrease in L-type Ca2+ current and changes in some kinetic properties over time in cell culture. Cell capacity was also shown to be reduced. In the incubation experiments, these changes could be antagonized by the protein synthesis inhibitor cycloheximide. Dexamethasone further induced an increase in L-type Ca2+ current above the level of freshly isolated cardiomyocytes, although this effect could be abolished by the GR antagonist mifepristone. Incubation with colchicine, a tubulin disruptor, showed an accelerated decrease in L-type Ca2+ current as well as cell capacity compared to control conditions. No significant effect was seen for the mTOR inhibitor rapamycin. Conclusions: In the present study, we show that the changes in L-type Ca2+ current in primary culture are most likely multifactorial, in accordance with the complex regulation of the L-type Ca2+ channel. Among other factors, the lack of GR stimulation under culture conditions appears to play an important role. Thus, the present results reinforce the hypothesis that the GR signaling pathway is not only involved in the development of cardiac disease but is also elementary for the maintenance of physiological cardiac function. Moreover, changes in protein synthesis appear to be the basis of the observed decrease in L-type Ca2+ current, as these could be antagonized entirely by inhibition of translation with cycloheximide. Since an acceleration of the electrophysiological changes described under control conditions was observed under tubulin disruption, this suggests that microtubules are involved in intracellular transport and thus maintenance of L-type Ca2+ density and possibly a progressive loss of this system occurs in multi-day culture. Involvement of the mTOR signaling pathway could not be objectified with certainty.