Σύγκριση των μεθόδων ανάλυσης του ρεπερτορίου των Τ-κυτταρικών υποδοχέων σε ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία: Κλασσική υποκλωνοποίηση και αλληλούχηση κατά Sanger έναντι αλληλούχησης νέας γενιάς μεγάλης κλίμακας
Creators: name: Βλαχονικόλα, Ελισάβετ Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Τ-κυτταρικός υποδοχέας
Ρεπερτόριο
Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία
T-cell receptor
Repertoire
Chronic Lymphocytic Leukemia

description: Η Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία (ΧΛΛ) αποτελεί νεόπλασμα των ώριμων Β λεμφοκυττάρων. Η κλινική πορεία των ασθενών με ΧΛΛ είναι εξαιρετικά ετερογενής και φαίνεται πως στην παθογένεια της συνεισφέρει συνδυασμός γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων. Τα πειραματικά δεδομένα καταδεικνύουν πως ο ιδιοτυπικός Β-κυτταρικός υποδοχέας διαδραματίζει κεντρικό ρόλο για την παθοφυσιολογία της νόσου, ενώ όλο και περισσότερα δεδομένα υποστηρίζουν πως η διαρκής αλληλεπίδραση ανάμεσα στο λευχαιμικό κλώνο και τα Τ λεμφοκύτταρα επάγει σε αυτά φαινοτυπικές και λειτουργικές αποκλίσεις. Επίσης, με δεδομένη τη συμμετοχή των αντιγόνων στην επιλογή των κλωνογενών Β λεμφοκυττάρων στη ΧΛΛ, έχει εξαιρετικό ενδιαφέρον να διευκρινιστεί ο τρόπος με τον οποίο μπορούν τα αντιγόνα να επιδρούν και στα Τ λεμφοκύτταρα. Η καθιερωμένη τεχνική που χρησιμοποιείται για τη μελέτη του ρεπερτορίου των Τ- και Β-κυτταρικών υποδοχέων της προσαρμοστικής ανοσίας είναι η κλασική υποκλωνοποίηση, ακολουθούμενη από αλληλούχηση κατά Sanger. Τα τελευταία χρόνια, οι νέες τεχνολογίες μαζικής αλληλούχησης κερδίζουν διαρκώς έδαφος στον τομέα της ανοσογενετικής έρευνας, επιτρέποντας αναλύσεις μεγάλης κλίμακας και υποσχόμενες την πλήρη και ακριβή αποτύπωση του ανοσογενετικού προφίλ. Για το λόγο αυτό, έγινε συγκριτική ανάλυση του ρεπερτορίου της β αλυσίδας του Τ-κυτταρικού υποδοχέα με τις δύο προαναφερόμενες τεχνικές σε ασθενείς που εντάσσονται στα στερεότυπα υποσύνολα της ΧΛΛ #1 και #2, σε ασθενείς που δεν εντάσσονται σε κάποιο στερεότυπο υποσύνολο (IGHV-Μ και IGHV-UΜ), καθώς και σε υγιή άτομα. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο από τη μέθοδο υποκλωνοποίησης και αλληλούχησης κατά Sanger, όσο και από την τεχνική NGS κατέδειξαν επιλεκτικότητα στο ρεπερτόριο γονιδίων TRBV και ολιγοκλωνικότητα. Πιο συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν 6 γονίδια TRBV (TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV10-3,TRBV28, TRBV19, TRBV27) τα οποία συμμετέχουν στη δημιουργία κλωνοτυπικών εκπτύξεων. Επίσης, τα δείγματα των ασθενών εμφανίζονται σημαντικά πιο ολιγοκλωνικά σε σύγκριση με τα πολυκλωνικά υγιή δείγματα. Παρά τη σχετικά κοινή εικόνα που λαμβάνουμε για την κλωνικότητα και τη σύσταση του ρεπερτορίου και με τις δύο τεχνικές, διαπιστώθηκαν πολύ μεγάλες αποκλίσεις ως προς την εκτίμηση της συχνότητας των κλωνοτύπων κάθε δείγματος. Το γεγονός αυτό οφείλεται: i) στην υπερεκτίμηση της συχνότητας εμφάνισης των κλωνοτύπων και των γονιδίων TRBV από την τεχνική αλληλούχησης κατά Sanger, λόγω του περιορισμένου αριθμού αλληλουχιών που αναλύονται και ii) στην υποεκτίμηση της ανάλογης συχνότητας κατά την τεχνική NGS, λόγω της συσσώρευσης τεχνικών σφαλμάτων κατά τη διαδικασία που μεταβάλλουν τη νουκλεοτιδική ακολουθία των αλληλουχιών.
description: Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) is a malignancy of mature clonal B lymphocytes, which exhibits a high degree of heterogeneity between patients. Recent investigations have enhanced our understanding of the pathophysiology of the disease, which seems to be the result of the combination between genetic and environmental factors. Additionally, new evidences support that the idiotypic B-cell receptor appears to have a major role in the CLL incidences formation, while the intricate crosstalk of CLL B cells with T cells causes a number of T-cell defects. Considering all above and taking into account the role of antigen(s) in the B-cell leukemogenesis, it is interesting to investigate the role of these antigens in shaping the T-cell repertoire in chronic lymphocytic leukemia. The most well-established technique for the repertoire profiling of the receptors, which participate in the adaptive immunity, is the method of subcloning followed by Sanger sequencing. Nevertheless, the next generation sequencing (NGS) methods are now being applied for immunogenetic analysis with great success, promising to minimize genotyping ambiguity and to accomplish extensive polymorphism discovery. In the present study, we performed a comparative analysis of the T-cell receptor β chain (TRB) gene repertoire, with the two provided techniques, in chronic lymphocytic leukemia patients, focusing on cases assigned to well-characterized subsets with stereotyped clonotypic B-cell receptor immunoglobulins, as well as in patents not assigned in any stereotyped subset, and in aged-matched healthy individuals. Remarkable repertoire skewing and oligoclonality were observed, irrespectively with both methods. More precisely, 6 TRBV genes (TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV10-3,TRBV28, TRBV19, TRBV27) participate with increased frequency in the most clonotypic rearrangements, highlighting a remarkable bias within the CLL TRBV gene repertoire. Moreover, the all of the patients exhibited greater extent of oligoclonality as compared to age-matched healthy controls. Despite the coherent results that came from both methods, subcloning and Sanger sequencing versus NGS, a great divergence was observed regarding the estimation of each clonotype’s frequency. This observation is due to: i) the overestimation of the frequency of each clonotype and TRBV gene during the subcloning and Sanger sequencing, because of the small number of analyzed sequences (low-throughput technique) and ii) the underestimation of the same phenomenon, because of the accumulation of technical errors during the procedure, which change the true nucleotide sequences resulting to the division of each clonotype into others quasi-identical clonotypes with lower frequency.