Δομημένα συστήματα ενθυλάκωσης για την ενισχυμένη προστασία προβιοτικών μικροοργανισμών σε προϊόντα τροφίμων
Creators: name: Τσιλιγιάννη, Ελένη Αθανασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ενθυλάκωση
Προβιοτικά
Σύμπλοκη Συσσωρευματοποίηση
Encapsulation
Probiotics
Complex Coacervation

description: Η παρούσα εργασία είχε στόχο την ανάπτυξη συστημάτων εγκλεισμού για την ενισχυμένη προστασία και τη στοχευμένη απελευθέρωση των προβιοτικών μικροοργανισμών σε προϊόντα λειτουργικών τροφίμων. Για τον σκοπό αυτό, κύτταρα του προβιοτικού στελέχους Lactobacillus plantarum (2035) ενθυλακώθηκαν σε κάψουλες που παρασκευάστηκαν μέσω της σύμπλοκης συσσωρευματοποίησης, μια φυσικοχημική μέθοδος η οποία περιλαμβάνει τη σύνδεση αντίθετα φορτισμένων βιοπολυμερών μέσω ηλεκτροστατικής έλξης, με τη χρήση πρωτεΐνης πατάτας (PPI) και χαμηλού βαθμού μεθυλίωσης πηκτίνης (LMP), σε αναλογία ανάμιξης PPI:LMP = 5:1 w/w και στις ιδανικές συνθήκες pH (pH 4.0) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Επιπρόσθετα, παρασκευάστηκαν κάψουλες πηκτίνης σε μορφή σφαιριδίων με ενσωματωμένα συσσωρεύματα μέσω της ιοντικής πηκτωματοποίησης, με την ενσωμάτωση ποσότητας συσσωρευμάτων PPI:LMP σε διάλυμα LMP 3% w/w, και τη μεταφορά του τελικού μίγματος στάγδην σε διάλυμα CaCl2 (5% w/w). Οι δομές εγκλεισμού που παρασκευάστηκαν εκτέθηκαν υπό την επίδραση δυσμενών παραγόντων, οι οποίοι συναντώνται κατά τη διαδικασία παραγωγής και αποθήκευσης των τροφίμων και κατά τη διέλευση μέσω του γαστρεντερικού σωλήνα, ώστε να προσδιοριστεί ο βαθμός προστασίας που παρέχουν στη βιωσιμότητα των μικροβιακών κυττάρων. Συγκεκριμένα, τα ενθυλακωμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε συνθήκες αυξημένης οξύτητας (pH 2.6) στους 4 οC κατά την περίοδο συντήρησης, καθώς και υψηλών θερμοκρασιών. Επιπρόσθετα, τα ενθυλακωμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε συνθήκες in vitro πέψης, με έκθεση σε συνθήκες χαμηλού pH, υψηλής συγκέντρωσης χολικών αλάτων και υπό την επίδραση ενζύμων. Τα συσσωρεύματα με PPI:LMP αποτέλεσε το σύστημα με τη βέλτιστη προστασία σε όλες τις εφαρμογές καταπόνησης στις οποίες υποβλήθηκαν τα μικροβιακά κύτταρα. Αναλυτικά, τα ενθυλακωμένα κύτταρα σε συσσωρεύματα επέδειξαν αξιοσημείωτη βιωσιμότητα σε συνθήκες χαμηλού pH (pH 2.6) καθ’ όλη τη διάρκεια συντήρησης των 30 ημερών, διατηρώντας τον πληθυσμό &gt;107 CFU/g κάψουλας, σε αντίθεση με τα ελεύθερα κύτταρα τα οποία θανατώθηκαν εντός 48 ωρών. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά από την εφαρμογή θερμικής επεξεργασίας στους 82 οC και σε συνθήκες in vitro πέψης, όπου η επιβίωση βελτιώθηκε σημαντικά σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, με τον πληθυσμό να καταγράφεται στο τέλος της μεταχείρισης σε επίπεδα &gt; 105 CFU/g και &gt; 106 CFU/g κάψουλας συσσωρευμάτων, αντίστοιχα. Το σύστημα διπλής ενθυλάκωσης προσέδωσε μειωμένο βαθμό προστασίας σε σχέση με τα συσσωρεύματα σε συνθήκες pH 2.6, ενώ κατά τη θερμική καταπόνηση και την in vitro αξιολόγηση δεν παρατηρήθηκε διαφορά στη βιωσιμότητα σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η ενθυλάκωση σε σφαιρίδια πηκτίνης χωρίς συσσωρεύματα, όχι μόνο δεν προσέδωσε καμία προστασία στα προβιοτικά κύτταρα, αλλά αυτά παρουσίασαν αυξημένη ευαισθησία σε σχέση με τα ελεύθερα κατά τη διάρκεια των καταπονήσεων. Συμπερασματικά, τα συσσωρεύματα με PPI:LMP που παρασκευάστηκαν μέσω της μεθόδου της σύμπλοκης συσσωρευματοποίησης αποτέλεσαν αποτελεσματικούς φορείς προστασίας προβιοτικών για την επιτυχημένη μεταφορά, αλλά και στοχευμένης απελευθέρωσης στο έντερο, αφού η κάψουλα διαλύθηκε σε περιβάλλον εντέρου (pH 7.0).
description: The aim of this study was to develop cell immobilization systems for the protection and target delivery of probiotic bacteria and their successful incorporation into functional food products. Encapsulated cells of the probiotic strain Lactobacillus plantarum (2035) by complex coacervation, a method based on a physicochemical approach involving the interaction of two oppositely charged biopolymers followed by the formation of insoluble particles (coacervates), and ionotropic gelation, were tested under harsh conditions of low pH (pH 2.6) at 4 οC during storage, and high temperatures to evaluate their survival. Moreover, the encapsulated cells were exposed to acidic conditions, high bile acid concentration and in the presence of enzymes to assess their survivability during gastrointestinal tract. More specifically, coacervates were formed by mixing potato protein isolate (PPI) and low methoxy pectin (LMP) aqueous solutions, in a ratio of PPI:LMP = 5:1 w/w, and subsequently dropping the pH to 4.0, at room temperature. Double encapsulation in pectin beads was achieved by mixing the coacervates with 3% LMP solution and dropwise adding the mixture using a syringe into a CaCl2 (5 % w/w) solution. The newly formed gel spheres were formed via crosslinking of pectin molecules with divalent calcium ions. Results showed that bacterial cells encapsulated in coacervates of PPI:LMP demonstrated the highest viability in all of the treatments applied. Encapsulation in coacervates of PPI:LMP conferred remarkable protection at pH 2.6 during storage period of 30 days, maintaining the population above the level of 107 CFU/g of coacervates compared with free cells, where no viable cells were counted after 48 h. During heat treatment at 82 οC and simulated gastrointestinal conditions coacervates of PPI:LMP conferred adequate protection on bacterial cells, maintaining population levels above 105 CFU/g and 106 CFU/g of coacervates, respectively. Pectin beads with embedded coacervates conferred lower degree of protection compared to coacervates under low pH, maintaining the bacterial population above 104 CFU/g at the end of storage period. However, double encapsulation did not show any significant difference in survivability compared to free cells during heat treatment, as well as in vitro evaluation. Interestingly, encapsulation into pectin beads alone, not only did not provide any protection during the treatments, but also the encapsulated microbial cells showed increased sensitivity compared to free cells. Overall, the cell immobilization systems produced by complex coacervation served as effective vehicles of probiotic cells for their successful delivery and controlled release into the intestine (capsule dissolved at gut pH 7.0).