title: Immunreaktion bei Integration bakterieller DNA im Gehirn der Maus
Creators: name: Weisbach, Laura
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Medical sciences Medicine
Medizin

description: Die Integration artfremder Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen findet in der Natur ebenso wie im Labor häufig statt, vor allem im Rahmen der Klonierung von Konstrukten im experimentellen Setting, aber auch bei viralen Infektionen mit Retroviren, die in der Lage sind, ihre RNA in das Genom der Wirtszelle zu integrieren. Das Einbringen bakterieller DNA in eukaryotisches Genom ist hingegen kaum beschrieben. Einzelne Untersuchungen zeigen, dass zum Beispiel die Aufnahme bakterieller DNA über den Darmtrakt mittels Ingestion und anschließender Integration für einen begrenzten Zeitraum auch ohne gezielte Transfektions- oder Transduktionsmechanismen im experimentellen Setting möglich ist.
Im Rahmen der Erschaffung der transgenen Mauslinie F2b, in welche ein GFAP-TIMP-1-Konstrukt eingebracht wurde, kam es zu einer akzidentiellen Ko-Integration bakterieller E.-coli-DNA gemeinsam mit dem transgenen Konstrukt. Da diese Mauslinie eine im Vergleich zu den ebenso TIMP-1-transgenen Mauslinen F11 und F60 eigene Pathologie mit ausgeprägter Entzündungsreaktion aufwies, sollte der Einfluss des bakteriellen Abschnitts untersucht werden. Aufgrund der Immunreaktion mit Hochregulation der Zytokine CCL3, CCL4, CXCL1, Il-1ß, Il-6, Il-7 und TNFα, die vor allem den Signalwegen der angeborenen Immunität mittels PRRs wie TLRs zuzuordnen sind, wurden PAMPs wie einzelsträngige RNA, dsRNA und freie DNA genauso wie bakterielle Proteine als mögliche antigene Strukturen und somit Auslöser der beobachteten Immunreaktion angesehen.
Zunächst sollte die eingebrachte Sequenz der bakteriellen DNA genau charakterisiert werden. Es sollte geklärt werden, welchen Abschnitt der E.-coli-DNA das eingebrachte Stück umfasst und in welchem Zusammenhang das unwissentlich integrierte Konstrukt mit dem gewünschten Transgen steht. Zudem war es Ziel der Arbeit herauszufinden, ob die bakterielle DNA in der F2b-Maus transkribiert und auch zu einem Protein translatiert wird. Zuletzt sollte in primären Astrozytenkulturen anhand exemplarisch vom E.-coli-Abschnitt ausgewählter Gene untersucht werden, ob und das dieser Gene zu einer Hochregulation der Zytokine führt, wie sie in der F2b-Maus beobachtet wurde.
Mittels iPCR und multipler Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass ein ca. 11.580 bp langer E.-coli-Abschnitt in die Maus-DNA integriert wurde. Dieser umfasst die Gene von yciT bis anteilig SapB und geht sowohl in 5’- als auch in 3’-Richtung in das ursprünglich für die Integration intendierte GFAP-TIMP-Konstrukt über. Durch überlappende PCRs mit aus RNA-Extrakten der F2b-Mäuse hergestellter cDNA war der bakterielle Abschnitt von SapC bis mod auf RNA-Ebene nachweisbar, der möglicherweise als zusammenhängender Strang transkribiert wird. Für zwei der vier ausgewählten Gene, fab1 und rnb, konnte in E.-coli-Kulturen eine ausreichende Proteinmenge hergestellt werden, um damit eine Immunisierung von Kaninchen zur Antikörperherstellung durchzuführen. Mit diesen aufgereinigten selbst hergestellten Antikörpern konnte die Antigene fab1 und rnb ebenso wie die nativen Proteine in E.-coli-Proteinextrakten detektiert werden. Sowohl fab1 als auch rnb konnten jedoch nicht als Proteine in den F2b-Extrakten nachgewiesen werden. Gleichermaßen zeigte sich auch keine Expression der gesuchten Proteine in den transduzierten Astrozytenkulturen. Die transduzierten primären Astrozytenkulturen wiesen bei der quantitativen Untersuchung auf Zytokine, welche in der F2b-Maus hochreguliert waren, keine signifikanten Unterschiede zu den nicht-transduzierten oder mit Leervektor transduzierten Astrozytenkulturen auf.
Die Abfolge der letztlich integrierten Konstrukte mit je einem GFAP-TIMP-1-Konstrukt an jedem Ende der E.-coli-Sequenz birgt mit dem vorhandenen Promotor die Möglichkeit, dass die bakterielle DNA sowohl in Sense- als auch in Antisense-Richtung abgelesen wird. Somit stehen bakterielle DNA, bakterielle einzelsträngige mRNA (möglicher-weise in Sense- und Antisense-Richtung) genauso wie ein langer zusammenhängender RNA-Strang oder aneinander gelagerte komplementäre RNA-Stränge (sense und anti-sense) als mögliche Antigene für das Auslösen der Immunreaktion zur Diskussion. Die Proteine konnten mittels der selbst hergestellten Antikörper gegen fab1 und rnb nicht als Antigene detektiert werden. Dies könnte daran liegen, dass diese entweder nicht translatiert werden oder nur in Mengen unterhalb der Nachweisgrenze oder in anderer Form – zum Beispiel posttranslationale Modifikationen – für den Antikörper undetektierbar vorliegen. Die Ergebnisse der qPCRs deuten darauf hin, dass die in Sense-Richtung untersuchten Gene nicht für die Immunreaktion der F2b-Maus verantwortlich sind, da keine Hochregulation der entsprechenden Zytokine beobachtet werden konnte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen auf ein möglicherweise im Laboralltag auftretendes methodisches Problem bei der Erzeugung transgener Tiere hin. Da die Ko-Integration sehr wahrscheinlich auf einer Verunreinigung und versehentlichen Exzision gleichlanger Banden in der Gelextraktion beruht, ist nicht auszuschließen, dass solche Fehlintegrationen häufiger vonstattengehen und Auswirkungen auf die Untersuchungen transgener Mauslinien haben, ohne wissentlich berücksichtigt zu werden. Weiterhin weist die Mauslinie F2b eine Autoimmunreaktion auf, welche in dieser Arbeit in einem ersten Schritt näher eingegrenzt wurde. Weitere Untersuchungen sowohl mit Sense- als auch mit Antisense-Produkten der ausgewählten Gene geben Hinweise darauf, dass ein Antisense-Produkt des Gens SapC eine Zytokinhochregulation triggern könnte. In diesem Zusammenhang geben die Ergebnisse dieser Arbeit Anstoß für neue Untersuchungen zur Entstehung autoimmuner Prozesse und Erkrankungen in Zusammenhang mit dem Kontakt und Vorhandensein bakterieller Antigene.