title: Evaluation of phosphopeptide enrichment strategies for perturbation studies on in vitro systems employing ion mobility mass spectrometry
Creators: name: Bortel, Patricia
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen und stellt einen Schlüsselprozess in der zellulären Signalweiterleitung dar. Sie beeinflusst Prozesse wie Zellmetabolismus, -proliferation und Apoptose und eine Störung regulatorischer Signaltransduktionskaskaden wird mit diversen Krankheiten assoziiert. Die Identifikation von regulatorischen Protein-Phosphorylierungsstellen stellt eine wichtige Rolle in der Erforschung von zellulären Signalweiterleitungsprozessen dar. Analysemethoden für das Phosphoproteom inkludieren meist Massenspektrometrie und ermöglichen die Identifikation von phosphorylierten Proteinen und Peptiden. Da Phosphopeptide meist in substöchiometrischen Mengen vorliegen, werden selektive Anreicherungsverfahren angewendet, welche die Sensitivität für phosphorylierte Peptidspezies erhöhen. Für die Optimierung einer phosphoproteomischen Analyse in Bezug auf Spezifität der Anreicherung, Robustheit und Effizienz des proteolytischen Verdaus wurden verschiedene proteolytische Verdau-Protokolle in Kombination mit titandioxid-basierter Affinitätschromatographie evaluiert. Die Evaluierung wurde anhand einer Perturbationsstudie mit einem Phorbolester als chemischen Trigger, angewendet in einem in vitro Jurkat Zellmodell, durchgeführt, um die der T-Zell Differenzierung zugrunde liegenden biologischen Mechanismen zu erforschen. Für die Evaluierung der Eignung von normalen proteomischen Analysen für die Identifikation von phosphorylierten Peptiden wurden die Ergebnisse des analysierten Phosphoproteoms gegen ein normales Proteom verglichen. Die Analyse der Proben wurde mittels moderner Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie durchgeführt und durch die Aufnahme von Fluoreszenz-Zellbildern erweitert. Von den evaluierten Verdau-Protokollen wurden mit dem über Nacht-Verdau in Kombination mit der titandioxid-basierten Phosphopeptid-Anreicherung die meisten Peptide identifiziert. Es wurde ein Phosphopeptid-Anreicherungsfaktor von 98% erreicht, wobei 11,110 Phosphopeptide identifiziert wurden. 70% der identifizierten Phosphopeptide wurden als Klasse I Phosphopeptide klassifiziert. Wie erwartet wurden im normalen Proteom nur geringe Regulationen festgestellt, da die Phorbolester-Behandlungsdauer von drei Stunden keinen großen Einfluss auf die Proteinexpression hat. Die Phosphopeptid-Regulationen, welche phorbolester-bindende und endomembran-assoziierte Proteine beinhalteten, bestätigten die erfolgreiche Phorbolester-Behandlung. Die Fluoreszenz-Zellbilder zeigten Veränderungen im Endomembran Sytem und unterstützten die Ergebnisse der phosphoproteomischen Analyse. Die Annotation der identifizierten Phosphorylierungsstellen wurde via PhosphoSitePlus evaluiert und unterstrich die Notwendigkeit von funktionellen phosphoproteomischen Analysen, da die Hälfte der Phosphorylierungsstellen entweder keine biologische Funktion aufwiesen oder gar keine Annotation gefunden werden konnte. Der optimierte Anreicherungsprozess erwies sich als wichtige Analysemethode, um eine umfassende Interpretation von zellulären Signalweiterleitungsprozessen in proteomischen Studien zu ermöglichen.
description: Protein phosphorylation, being the most widespread posttranslational protein modification, is a key process in cellular signaling. Influencing cell metabolism, proliferation and apoptosis, its regulation is a sophisticated cascade process and the disruption of its regulatory pathways is associated with various diseases. The identification of regulatory protein phosphorylation sites is crucial for understanding cellular signaling. Phosphoproteomic workflows including analysis by mass spectrometry facilitate the identification of phosphorylated proteins and peptides. As phosphopeptides are present in a sub-stoichiometric manner, specific phosphopeptide enrichment strategies are employed, increasing sensitivity towards phosphopeptide species. In order to optimize a phosphoproteomic workflow in terms of enrichment specificity, robustness and proteolytic digestion efficiency, different proteolytic digestion conditions in combination with subsequent titanium dioxide affinity chromatography based phosphopeptide enrichment were evaluated. The evaluation was performed using an in vitro Jurkat cell line model, performing a perturbation study with a phorbol ester as a chemical trigger in order to gain insights into the biological mechanisms driving differentiation of T-lymphocytes. For the evaluation of the drawbacks of normal proteomic analyses for the identification of phosphorylated peptides, results from the obtained phosphoproteome were compared against a background proteome. Sample analysis was performed employing “state-of-the-art” ion mobility mass spectrometry. Additionally, fluorescence cell imaging was performed. Out of the evaluated phosphoproteomic workflows, the overnight digest in combination with titanium dioxide phosphopeptide enrichment yielded the most peptide identifications. A phosphopeptide enrichment factor of 98%, with a total of 11,110 phosphopeptides with 70% class I phosphopeptides, exhibiting highly confident phosphosite positions, was obtained. While the regular proteome showed, as expected, only minor alterations due to the short phorbol ester treatment of three hours, which is not sufficient for greatly altering protein expression, phosphopeptide regulations including phorbol ester binding and endomembrane proteins confirmed a successful treatment, strongly supported by the obtained fluorescence cell images which showed major disturbances in the endomembrane system. Annotation of the identified phosphosites was evaluated via PhosphoSitePlus, highlighting the need for functional phosphoproteomic analyses as half of the phosphosites were not annotated with a function or not annotated at all. The optimized phosphoproteomic workflow was demonstrated to be an important tool for the investigation and comprehensive interpretation of cellular signaling events in proteomic studies.