title: Crosstalk between enzymatic and non-enzymatic posttranslational modifications
Creators: name: Görlich, Judith
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die Aggregation von α-Synuclein (αSyn) wird bekanntermaßen mit der Parkinson-Krankheit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die allgemein als Synucleinopathien bezeichnet werden. Die hohe Anzahl von Lysinresten in diesem 140 Aminosäuren langen, intrinsisch ungeordneten Protein macht es zu einem offensichtlichen Ziel für elektrophile Metaboliten, die zur Bildung von fortgeschrittenen Advanced glycation end-product (AGE) führen. Insbesondere bei einem langlebigen Protein wie αSyn scheint die Neigung zur Bildung von AGEs, die zu Aggregation und Dysfunktion führen, ein plausibler Weg zu neurodegenerativen Ätiologien zu sein. In dieser Arbeit wurde das Zusammenspiel zwischen enzymatischen (Ubiquitinierung) und nicht-enzymatischen (Glykierung) posttranslationalen Modifikationen von αSyn analysiert. Expressed Protein Ligation wurde verwendet, um Zugang zu ortsspezifisch Nε-(Carboxyethyl)lysin (CEL) modifiziertem αSyn zu erhalten, um eine Bibliothek von homogen glykiertem αSyn zu generieren, wobei sich der Ort der Modifikation über die N-terminale Domäne (K6, K10, K12, K21, K23) erstreckt. Dafür wurde der C-terminale Teil αS(30-140) rekombinant mit einem N-terminalen Cystein hergestellt, während der N-terminale Teil αS(1-29) synthetisch mit einem C-terminalen Thioester unter Verwendung von Fmoc-SPPS hergestellt wurde. Sechs αSyn-Varianten in voller Länge wurden durch Ligation und metallfreie Entschwefelung gewonnen. Das Aggregationsverhalten aller Varianten wurde mit Hilfe des ThT-Versuchs und der SEM-Bildgebung verglichen. Dabei zeigten die modifizierten αSyn-Varianten im Durchschnitt eine geringere ThT-Fluoreszenzintensität als das Wildtyp-Protein, es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die modifizierten αSyn-Varianten wurden dann in einem in-vitro Ubiquitinierungsversuch getestet, um die Auswirkungen einer solchen ortsspezifischen CEL-Modifikation auf das Ubiquitinierungsprofil zu bestimmen. Der Ubiquitinierungsversuch zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Varianten. Dies legt die Vermutung nahe, dass nur eine durch CEL blockierte Lysinposition keinen Einfluss auf die Ubiquitinierung hat, da Ubiquitinketten auch an anderen Positionen anhaften können, was zu Unterschieden im Ubiquitinierungsmuster führt (hier nicht analysiert). Alle Varianten waren ubiquitiniert und es wurden hauptsächlich Mono- und Diubiquitinierungen gefunden.
description: α-synuclein (αSyn) aggregation is known to be associated with Parkinson’s disease and other neurodegenerative disorders generally termed as synucleinopathies. The high number of lysine residues in this 140 amino acid long, intrinsically disordered protein makes it an obvious target for electrophilic metabolites, leading to the formation of advanced glycation end (AGE) products. Especially for a long-lived protein, such as αSyn, the propensity of formation of AGEs leading to aggregation and dysfunction seems to be a plausible route towards neurodegenerative etiologies. In this thesis the interplay between enzymatic (ubiquitination) and non-enzymatic (glycation) posttranslational modifications of αSyn was analyzed. Expressed protein ligation was used to access site-specifically Nε-(carboxyethyl)lysine (CEL) modified αSyn, to generate a library of homogeneously glycated αSyn, where the site of modification spans the N-terminal domain (K6, K10, K12, K21, K23). Therefore, the C-terminal part αS(30-140) was produced recombinantly having an N-terminal cysteine, while the N-terminal part αS(1-29) was produced synthetically with a C-terminal thioester utilizing Fmoc-SPPS. Six full-length αSyn variants were obtained utilizing ligation and metal-free desulfurization. The aggregation behaviour of all variants was compared utilizing ThT assay and SEM imaging. Whereby, the modified αSyn variants showed, on average, a lower ThT fluorescence response than the wild type protein, but no significant differences could be pointed out. The modified αSyn variants were then tested in an in vitro ubiquitination set-up to determine the impact of such site-specific CEL modification on the ubiquitination profile. The ubiquitination assay showed no significant differences between the variants. Which leads to the assumption that only one lysine position blocked by CEL does not have an influence on the overall ubiquitination as ubiquitin chains can attach to other positions, leading to differences in the ubiquitylation pattern (not analyzed here). All variants were ubiquitinated and monoubiquitination and diubiquitination were mainly found.