Μελέτη των περιοχών που καθορίζουν την υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών LBR και TM7SF2
Creators: name: Χάννας, Νικόλαος Βασίλειος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Υποδοχέας λαμίνης Β
7-διαμεμβρανική πρωτεΐνη της υπεροικογένειας 2
Πυρηνικός Φάκελος
Lamin B receptor (LBR)
Transmembrane 7 superfamily member 2 (TM7SF2)
Nuclear Envelope

description: Ο υποδοχέας της λαμίνης Β (LBR) εντοπίζεται στην εσωτερική πυρηνική μεμβράνη του πυρηνικού φακέλου, συμμετέχοντας στην οργάνωση της χρωματίνης και στην de novo σύνθεση της χοληστερόλης. Το Ν-τελικό άκρο του LBR συμβάλει στην αποσιώπηση των γονιδίων της ετεροχρωματίνης, αλληλεπιδρώντας άμεσα με εκείνη μέσω των περιοχών RS και tudor ή έμμεσα μέσω του μεταγραφικού αναστολέα HP1. Η διαμεμβρανική περιοχή του LBR δρα ως ένζυμο, ανάγοντας τον C14-ακόρεστο δεσμό της λανοστερόλης, μιας ενδιάμεσης αντίδρασης της μεταβολικής οδού της βιοσύνθεσης της χοληστερόλης. Παρουσιάζει ενδιαφέρον η ομολογία των αμινοξέων του διαμεμβρανικού τμήματος του LBR με την πρωτεΐνη TM7SF2 του ενδοπλασματικού δικτύου, η οποία δρα και αυτή ως αναγωγάση της λανοστερόλης. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο του LBR βάσει ερευνών προκαλούν εκτεταμένα προβλήματα υγείας, όπως σκελετική δυσπλασία Greenberg, γενετική ανωμαλία Pelger-Huet και σπονδυλομεταφυσιακή δυσπλασία. Η παρούσα διπλωματική εργασία αποσκοπεί στην δημιουργία κατάλληλων πρωτεϊνών αναφοράς σε σύντηξη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) για τον έλεγχο της υποκυτταρικής εντόπισης της συντηγμένης πρωτεΐνης LBRNtTM7SF2 από την διπλωματική εργασία της Σμαράγδας Πετρακίδου. Για τον λόγο αυτό, απομονώσαμε τα γονίδια του LBR, της TM7SF2 και του διαμεμβρανικού τμήματος του LBR (TMDLBR) και τα ενσωματώσαμε στους πλασμιδιακούς φορείς pGEM®-T Easy και pEGFP-N1. Σκοπός μας ήταν να επιμολύνουμε ευκαρυωτικά κύτταρα HeLa με τα επιθυμητά γονίδια ενσωματωμένα στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-N1 προκειμένου να γίνει αξιολόγηση της υποκυτταρικής κατανομής τους σε σύγκριση με την LBRNtTM7SF2. Από τα αποτελέσματα μας προκύπτει πως η συντηγμένη πρωτεΐνη LBRNtTM7SF2 εντοπίζεται κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο, παρόμοια δηλαδή υποκυτταρική κατανομή με τις πρωτεΐνες TM7SF2 και TMDLBR. Επομένως, η TM7SF2 φαίνεται να υπερισχύει ως προς την υποκυτταρική εντόπιση της συντηγμένης πρωτεΐνης LBRNtTM7SF2 και άρα, η N-τελική περιοχή του LBR δεν αποτελεί ικανή και αναγκαία συνθήκη για τον καθορισμό της υποκυτταρικής εντόπισης της εντός του πυρηνικού φακέλου. Άρα, χρειάζεται ένας συνδυασμός της N-τελικής και της διαμεμβρανικής περιοχής του LBR για να μπορέσει η πρωτεΐνη σύντηξης να εντοπιστεί στον πυρηνικό φάκελο. Η έρευνα αυτή μπορεί να συνεχιστεί για την μελέτη των περιοχών του γονιδίου Lbr που θα καθορίσουν την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης σύντηξης LBRNtTM7SF2 εντός του πυρηνικού φακέλου
description: The inner nuclear membrane of the nuclear envelope participates in chromatin organization and cholesterol biosynthesis. The N-terminus of LBR contributes to silence heterochromatin’s genes by interacting directly with heterochromatin through the RS and Tudor domain or indirectly via HP1 transcription inhibitor. The transmembrane domain of LBR acts as an enzyme, reducing the C14-unsaturated bond of lanosterol, an intermediate reaction of the metabolic pathway of cholesterol biosynthesis. The transmembrane domain of LBR shows extensive amino acid homology with TM7SF2, which is a protein of the endoplasmic reticulum that also acts as a reduction enzyme of lanosterol. Mutations in Lbr gene cause widespread health problems, such as Greenberg skeletal dysplasia, Pelger-Huet genetic abnormality, and vertebral metaphysical dysplasia. This present thesis aims to create appropriate reference proteins in fusion with green fluorescent protein (GFP) for the study of subcellular localization of the fused protein LBRNtTM7SF2. For this reason, we isolated the genes Lbr, Tm7sf2 and Tmdlbr (transmembrane domain of LBR) and integrated them into plasmid vectors pGEM®-T Easy and pEGFP-N1. Our aim was to transfect HeLa cells with these recombinant plasmid vectors pEGFP-N1 in order to evaluate their subcellular localization in comparison with LBRNtTM7SF2. Our results show that the fused protein LBRNtTM7SF2 is located mainly in the endoplasmic reticulum, similar to the TM7SF2 and TMDLBR protein. In other words, the N-terminus of the LBR is not enough to drive the LBRNtTM7SF2 protein from the endoplasmic reticulum to the nuclear envelope. In conclusion, a combination of N-terminus and a part of the transmembrane domain of LBR is needed for the fused protein LBRNtTM7SF2 to be detected in the nuclear envelope. This research can be continued to study the regions of the Lbr gene that will determine the subcellular localization of the fused protein LBRNtTM7SF2 within the nuclear envelope