Die Rolle der miR-488-5p und miR-483-3p in der Entstehung und Progression des Malignen Melanoms
Creators: name: Arnold, Jessica Bianca
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023

description: Hintergrund und Ziele Die moderne Antitumortherapie entwickelt sich zunehmend in Richtung zielgerichteter Therapien. Aufgrund der weltweit steigenden Inzidenz maligner Erkrankungen – so auch des malignen Melanoms – wird der Grundlagenforschung heute eine große Bedeutung beigemessen. Durch den hier erzielten Fortschritt werden die Ursachen für die Entartung von Zellen besser verstanden und auf der Basis dieses Wissens können dann neue Therapieansätze entwickelt werden. Die Rolle der microRNAs miR-483-3p und miR-488-5p als Tumorsuppressoren wird bereits seit einiger Zeit in der Literatur diskutiert. Ziel dieser Arbeit war es, die beiden microRNAs mit der Entartung von Melanomzellen und so mit der Entstehung des Malignen Melanoms in Verbindung zu bringen und die Auswirkungen einer Fehlregulation zu untersuchen. Methoden In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden angewandt. Bezüglich der Arbeiten mit microRNAs erfolgten Transfektionen von mimics und antagomirs der jeweiligen miRs in der Zellkultur von Melanomzelllinien und primären Melanozyten (NHEM). Es wurden sowohl funktionelle Assays durchgeführt (Scratch Assay, Boyden Kammer, Clonogenic Assay, Sphäroid Assay, RTCA), als auch FACS Analysen und Topflash / Fopflash Luciferase Assays. Zudem erfolgten Nukleinsäure-Methoden (qRT-PCR) sowie proteinchemische Methoden (Kernpräparation, Westernblot Analysen, Immunfluoreszenz-Versuche). Um die in vitro generierten Ergebnisse in vivo zu verifizieren erfolgte eine In Situ Hybridisierung. Ergebnisse und Beobachtungen Wir konnten durch unsere Arbeit eine Fehlregulation der beiden microRNAs miR-483-3p und miR-488-5p im Sinne einer verminderten Expression in Melanomzellen nachweisen. Mittels verschiedener Versuche war es uns möglich, hierdurch veränderte Zelleigenschaften darzustellen. So zeigt sich in den Melanomzellen durch die Herabregulierung der microRNAs insbesondere ein gesteigertes Wachstumsverhalten, sowie ein verstärktes Migrations- und Invasionsverhalten. Die Zelleigenschaften von Melanomzellen mit einer geringeren Konzentration der microRNAs zeigen eine größere Ähnlichkeit zu Stammzellen im Clonogenic Assay. Spezifisch für den endogenen Verlust der miR-488-5p wurde eine Vermeidung von Apoptose in FACS Assays und Western blot Analysen für die Melanomzellen detektiert. Des Weiteren konnte das Protein DIXDC1 als Targetgen der miR-488-5p identifiziert werden. Durch die verminderte Konzentration der miR-488-5p zeigt sich in Melanomzellen eine abgeschwächte Inhibition der Proteintranslation. Somit weisen Melanomzellen mit verminderter miR-488-5p Konzentration eine erhöhte DIXDC1-Konzentration auf. Auswirkungen hat dies auf den Wnt/β-Catenin-Signalweg. Die Fehlregulation der miR-488-5p und die somit erhöhte DIXDC1- Proteinkonzentration bewirken eine insgesamt erhöhte Konzentration von β-Catenin, welches im Nukleus akkumuliert und in Interaktion mit spezifischen Transkriptionsfaktoren TCF/LEF tritt. Eine pathologisch erhöhte β-Catenin-Konzentration begünstigt die Entartung von Zellen und somit die Entstehung verschiedener Erkrankungen, darunter auch das Maligne Melanom. Schlussfolgerung und Ausblick Durch unsere Arbeit und die gewonnenen Ergebnisse konnten die beiden microRNAs miR-483-3p und miR-488-5p bzw. die Fehlregulation dieser als ein weiterer, begünstigender Faktor für die Entartung von Melanozyten hin zu Melanomzellen identifiziert werden. Im Besonderen der Einfluss der miR-488-5p auf das Protein DIXDC1 und damit auf den Wnt-/β-Catenin-Signalweg führt zu veränderten Zelleigenschaften, die das Maligne Melanom zu einer aggressiven und rasch progredienten Tumorentität machen. Teilergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Arnold J, Engelmann JC, Schneider N, Bosserhoff AK, Kuphal S. miR-488-5p and its role in melanoma. Experimental and Molecular Pathology. 2019 November 22. doi: 10.1016/j.yexmp.2019.104348 PMID: 31765608. [Epub 2019 Nov 22], (Arnold et al. 2020). In Zukunft muss noch geklärt werden, in welchen Signalweg die miR-483-3p direkt eingreifen kann und welches ein direktes Target dieser microRNA im Melanom sein könnte. Diese microRNA ist nicht an Apoptosevorgängen, sondern eher an Migration und Invasion des Melanoms beteiligt und könnte eine größere Rolle für Metastasierungsvorgänge spielen. Für die miR-488-5p sollte in Zukunft noch genauer die Rolle im Wnt-/β-Catenin-Signalweg analysiert werden. Dabei ist es wichtig, die Regulierbarkeit von DIXDC1 durch miR-448-5p in Primärtumorlinien und Metastasenzelllinien zu prüfen und die funktionelle Rolle von DIXDC1 im Melanom zu validieren. Um die Ergebnisse weiter zu vertiefen, sollte der genaue Mechanismus der Fehlregulation beider microRNAs in Melanomzellen untersucht werden. Mithilfe dieses Wissens könnte in Zukunft eine weitere zielgerichtete Therapieoption etabliert werden.
description: Objectives In modern medicine targeted therapy is a more and more upcoming treatment strategy for malignant diseases with genetic mutations which can be addressed directly. Therefore, basic research on the development of those malignant diseases gets even more important. MicroRNAs are an important research object because of their ability to influence multiple pathways at once by regulating a variety of target genes simultaneously. A few studies already show the function of miR-488-5p and miR-483-3p as tumor suppressors in various cancer entities. However, the role especially in melanoma remain unclear. This study has been performed to show the influence of miR-483-3p and miR-488-5p on characteristics of melanoma cells and its malignancy. Design and Methods The methods used in this study included the work with cell cultures and functional assays, such as Scratch Assay, Boyden Chamber, Clonogenic Assay, Spheroid Assay and real time cell analysis (RTCA) and assays with isolated proteins (e.g. Westernblot Assay, Immunoflourescence Assay). Furthermore, qualitative real time PCR (qRT-PCR), FACS analyses and Topflash / Fopflash Luciferase Assays were performed. To verify the results in vivo the study includes In Situ Hybridisation. Observations and Results This study showed a dysregulation of both the miR-483-3p an miR-488-5p in melanoma cells with reduced expression which leads to an increase of proliferation, migration and growth of colonies. In contrast to that transfection of the miR-483-3p and miR-488-5p mimics weakened those processes. Furthermore, it was possible to identify the protein DIXDC1 as an indirect target gene of miR-488-5p. By regulating its expression, the microRNA intervenes in the Wnt/β-Catenin pathway. Conclusions We could prove the function of miR-483-3p and miR-488-5p as tumor suppressors and their loss during the development of melanoma cells out of melanocytes. This we could confirm in vivo by in situ hybridization on melanoma tissue in comparison to normal skin tissue. The involvement of miR-488-5p in the Wnt/β-catenin pathway and its influence on DIXDC1 results in an increased concentration of βcatenin and by that a degeneration of melanoma cells is encouraged. All those facts are part of why melanoma is such an aggressive and rapidly progressive cancer entity. Some of the results of this study are publishes in: Arnold J, Engelmann JC, Schneider N, Bosserhoff AK, Kuphal S. miR-488-5p and its role in melanoma. Experimental and Molecular Pathology. 2019 November 22. doi: 10.1016/j.yexmp.2019.104348 PMID: 31765608. [Epub 2019 Nov 22], (Arnold et al. 2020). In order to deepen the knowledge, the exact mechanism which leads to the dysregulation of both the microRNAs should be investigated. With the help of further studies, it may be possible to establish another targeted therapy in the future.