title: Monitoring and characterization of T-lymphocyte reconstitution after allogeneic stem cell transplantation
Creators: name: Abu-Khader, Ahmad
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Rekonstitution , Transplantat-Wirt-Reaktion , Homotransplantation , Blutstammzelle , Allogene Stammzelltransplantation , GvL , CMV , WT1 , HY , Allogeneic stem cell transplantation , reconstitution , GvHD , GvL , CMV , WT1 , HY
subject: 610 Medizin

description: After administration of the hematopoietic stem cells inoculum into the eligible patients in the allogeneic setting, many hematopoietic cells reconstitute in the following months to years after transplantation. The reconstituted cells can be pathogen-specific (e.g. cytomegalovirus (CMV)-reactive T cells), leukemia-specific (i.e. graft versus leukemia (GvL) effect) or recipient-specific (e.g. graft-versus-host disease (GvHD)). Thus, valid in vitro immune monitoring strategies should broaden the understanding of CMV immunity, GvL and GvHD, which seems essential for further improvements in allogeneic stem cell transplantation (SCT). Furthermore, approaches of this type should help to dissect allo-specific from tumor-specific immune responses and will help to clarify, how both mechanisms are interconnected and how they can be best put in action for therapeutic purposes. The CMV-specific T cells reconstitution was monitored efficiently, in allogeneic transplanted patients, by classical approaches such as tetramer (TM) staining, intracellular cytokine (ICC) flow cytometry and enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay, in addition to the newly introduced real time-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. In general, the RT-PCR assay was highly sensitive in comparison to the other methods, and was also correlated to all of them. Interestingly, the use of the pp65 protein as CMV antigen enhanced the monitoring capabilities in comparison to the pp65 HLA-A2-restricted peptide, and allowed testing of HLA-A2 negative patients. As an example for assessment of the GvL effect in allogeneic transplanted patients, the Wilms' tumor suppressor gene (WT1)-specific T cells were monitored. Unfortunately the WT1-specific T cells were not detectable by a sensitive ELISPOT assay, but on the other hand and for the first time the established RT-PCR assay was able to track two types of WT1-reactive T cell clones in the same samples. In addition and as not described before, the RT-PCR assay was able to monitor the reconstitution of WT1-specific T cells in patients who were suffering AML and ALL before transplantation. As the minor histocompatibility antigens (mHAgs) play a dual role in the GvL and GvHD, the reconstitution of male-specific mHags (HY)-specific T cells were monitored. The adopted sensitive ELISPOT assay did not detect any HY-specific T cells in all of the tested patients� samples. On the contrary, the established RT-PCR assay successfully detected the HY-specific T cells in one patient who later developed eosinophilia as a GvHD complication. As for the first time these cells were detectable by RT-PCR assay in the allogeneic transplanted patients� peripheral blood, this give a novel concept of predicting GvHD due to the generation of mHAg-specific T cells in the patients body. Due to the still insufficient knowledge on mechanisms involved in GvHD, it was considered a major aim to tailor the allo-reactive T cells in the patients� peripheral blood in order to avoid fatal courses of GvHD. An allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR) model was established and optimized to simulate the presence of the allo-reactive T cells in the GvHD patients� blood. After applying the established MLR model on some patients� samples, weak but significant allo-reactive T cells could be monitored in few samples by using the RT-PCR assay but not ICC flow cytometry. For better detection of the allo-reactive T cells in the patients� peripheral blood, the use of RT-PCR assay is strongly advised for monitoring GvHD. Finally more patients and other cytokines are suggested to be further monitored to give better view. Overall, the results of this work strongly support that monitoring methods can be established to be used in clinical practice in the near future.
description: Die Rekonstitution hematopoetischer Zellen nach allogener Stammzelltransplantation (SCT) kann Monate bis Jahre in Anspruch nehmen. Die wieder hergestellten (rekonstituierten) Zellen können Krankheitserreger-spezifisch (z.B. gegen das Zytomegalievirus (CMV-reaktive T- Zellen), Leukämie-spezifisch (d.h. Transplantat-gegen-Leukämie (GvL)) oder Empfänger-spezifisch sein (z.B. bei der Transplantat-gegen-Wirtskrankheit (GvHD)). So sollten geeignete in vitro Immun-Überwachungsstrategien das Verständnis der CMV-Immunität, des GvL-Effektes und der GvHD erweitern, was für weitere Verbesserungen bei der allogenen SCT wesentlich scheint. Ausserdem sollten Annäherungen dieser Art helfen, allo-spezifische von Tumor-spezifischen Immunantworten zu unterscheiden und helfen zu erklären, wie beide Mechanismen zusammenhängen und wie sie am besten zu therapeutischen Zwecken umgesetzt werden können. Die Rekonstitution CMV-spezifischer T Zellen wurde bei allogen transplantierten Patienten effizient durch klassische Vorgehensweisen wie Tetramer (TM) Färbung, der intrazellulären Zytokin Durchflußzytometrie (ICC) und des Enzym-gebundenen Immunospot-Testes (ELISPOT) überwacht, zusätzlich zur neu eingeführten Echt-Zeit-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR). Im allgemeinen war die RT-PCR im Vergleich zu den anderen Methoden deutlich sensitiver (in hohem Grade empfindlich). Die RT-PCR korrelierte auch mit den anderen Methoden. Der Gebrauch des pp65 Proteins, als CMV-Antigen erhöhte interessanterweise die Nachweismöglichkeiten im Vergleich mit dem pp65 HLA-A2- restringierten Peptid und erlaubte die Überprüfung von HLA-A2 negativen Patienten. Als Beispiel für die Einschätzung des GvL Effektes bei allogen transplantierten Patienten wurden Wilms-Tumorsuppressor-Gen (WT1)-spezifische T Zellen überwacht. Leider waren die WT1-spezifischen T Zellen nicht durch den ELISPOT nachweisbar. Andererseits war es mittels der neu etablierten RT-PCR erstmalig möglich zwei für WT1-spezifische T Zellklone in denselben Proben nachzuweisen. Zusätzlich konnte die Rekonstitution WT1-spezifischer T Zellen bei Patienten, die vor Transplantation an AML und ALL erkrankt waren, anhand der RT-PCR nachgewiesen werden. Zumal die minor Histokompatibilitätsantigene (mHAgs) einen wichtigen Einfluß sowohl auf den GvL-Effekt, als auch auf die GvHD haben, wurde die Rekonstitution der Y-Chromosom-spezifischen (HY)-spezifischen T-Zellen überwacht. Mit dem ELISPOT konnte in keiner der gemessenen Patientenproben HY-spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Im Gegensatz hierzu konnten mit Hilfe der RT-PCR erfolgreich HY-spezifische T-Zellen bei einem Patienten, der später als Komplikation der GvHD eine Eosinophilie entwickelte, nachgewiesen werden. Da zum ersten Mal diese Zellen im peripheren Blut von allogen transplantierten Patienten durch RT-PCR nachweisbar waren, ergibt sich hiermit eine neue Möglichkeit zur Vorhersage von GvHD aufgrund der Entstehung von mHAg-spezifischen T-Zellen im Patientenkörper. Aufgrund des nach wie vor unzulänglichen Wissens über die Mechanismen, die bei der GvHD beteiligt sind, galt es als ein Hauptziel, allo-reaktive T-Zellen im peripheren Blut von Patienten (maßzuschneidern) aufzuspüren / zu verfolgen, um tödliche Verläufe der GvHD zu vermeiden. Ein Modell der allogenen gemischten Lymphozytereaktion (MLR) wurde etabliert und optimiert, um das Vorhandensein allo-reaktiver T-Zellen im Blut von Patienten mit GvHD zu simulieren. Nachdem das etablierte Modell der allogenen MLR an einigen Patientenproben angewendet wurde, konnten anhand der RT-PCR Methode in einigen wenigen Proben schwache aber auch signifikante Signale von allo-reaktiven T Zellen nachgewiesen werden, nicht jedoch mit der ICC. Um die GvHD zu überwachen, wird der Gebrauch der RT-PCR stark empfohlen, um damit allo-reaktive T Zellen im Blut von Patienten nachzuweisen (aufzuspüren). Um einen besseren Einblick zu erhalten sollten mehr Patienten und andere Zytokine überwacht werden. Zusammengefaßt unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Immun-Überwachungsstrategien etabliert werden können, die in naher Zukunft in der klinischen Praxis angewendet werden können.