Η επίδραση των β2-αδρενεργικών αγωνιστών και των κορτικοστεροειδών, πρωτεογλυκανών και μεταλλοπρωτεασών του συνδετικού ιστού, σε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων από πνέυμονες ανθρώπου
Creators: name: Κλάγκας, Ιωάννης Η.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Υαλουρονικό οξύ
Γλυκοζαμινογλυκάνες
Ασθμα
ΧΑΠ (Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια)
Λεία μυϊκά κύτταρα από βρόγχους
Πρωτεογλυκάνες
Hyaluronic acid
Glycosaminoglycans
Asthma
COPD (Chronic obstractive pulmonary diseases)
Airway smooth muscle cells
Proteoglycans

description: Οι νόσοι του αναπνευστικού, όπως η χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) και το άσθμα, αποτελούν μία από τις συχνότερες αιτίες θανάτου. Το άσθμα αποτελεί μεγάλο πρόβλημα υγείας παγκοσμίως. Υπολογίζεται πως περισσότερα από 300 εκατομμύρια άνθρωποι όλων των ηλικιών και των εθνοτήτων υποφέρουν από άσθμα. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization) αναφέρει πως η θνησιμότητα που οφείλεται στο άσθμα αγγίζει τις 180,000 περιπτώσεις ετησίως και αυξάνεται κατά 50% κάθε δεκαετία, ειδικά στα παιδιά. Επιπροσθέτως το άσθμα είναι η κύρια αιτία ιατρικής περίθαλψης μικρών παιδιών στις βιομηχανικά αναπτυγμένες χώρες. Η ΧΑΠ έχει υποτιμημένη νοσηρότητα καθώς δεν μπορεί να διαγνωστεί έγκαιρα και με ακρίβεια, ώστε να αντιμετωπιστεί. Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, η ΧΑΠ καταλαμβάνει την 4η θέση στις αιτίες θανάτου. Το 2020 η ΧΑΠ προβλέπεται ότι θα αποτελεί την 3η αιτία θανάτου. Το άσθμα και η ΧΑΠ είναι παθήσεις του αναπνευστικού που χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγμονή και αναδιαμόρφωση των αεραγωγών. Σε μη παθολογικές καταστάσεις η ομοιόσταση των ιστών συντηρείται λόγω της ισορροπίας στη σύνθεση και αποδόμηση του εξωκυττάριου χώρου. Η ισορροπία αυτή διαφοροποιείται στο άσθμα και στη ΧΑΠ, οδηγώντας σε δομικές αλλαγές όπως η αυξημένη απόθεση μορίων του εξωκυττάριου χώρου. Τα βρογχικά λεία μυϊκά κύτταρα και οι ινοβλάστες είναι η κύρια πηγή κολλαγόνου και GAGs. Με τη σειρά του ο εξωκυττάριος χώρος επηρεάζει την κυτταρική ανάπτυξη, μετανάστευση, διαφοροποίηση και έκκριση κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Με τον τρόπο αυτό, ο εξωκυττάριος χώρος διαιωνίζει τη φλεγμονώδη διαδικασία καθώς και την αναδιαμόρφωση, συμβάλλοντας στην εξέλιξη και την δριμύτητα των παθήσεων. Εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή και β2-αδρενεργικοί αγωνιστές αποτελούν τα φάρμακα θεραπείας 1ης γραμμής για το άσθμα και τη ΧΑΠ, αλλά η επίδραση τους στην αναδιαμόρφωση των αεραγωγών δεν είναι ξεκάθαρη. Ο σκοπός αυτής της διατριβής είναι να διερευνήσει την επίδραση των κορτικοστεροειδών και των β2-αδρενεργικών αγωνιστών στα μόρια του εξωκυττάριου χώρου όπως GAGs, PGs και MMPs, ώστε να διευκρινιστεί ο ρόλος αυτών των μορίων στην εξέλιξη της φλεγμονής και της αναδιαμόρφωσης των αεραγωγών. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων από αεραγωγούς (Airway Smooth Muscle Cells) που απομονώθηκαν από φυσιολογικούς πνεύμονες δοτών όταν δεν υπήρχε συμβατότητα για μεταμόσχευση (n=10) καθώς και από ενδοβρογχικές βιοψίες ασθενών με άσθμα (n=11) και ΧΑΠ (n=10). Όλοι οι ασθενείς διαγνώστηκαν με άσθμα και ΧΑΠ σύμφωνα με τα πρότυπα διάγνωσης GINA και GOLD. Οι καλλιέργειες αυτές αναπτύχθηκαν σε 5% FCS απουσία και παρουσία 10-8 Μ βουδεσονίδης, 10-8 Μ φορμοτερόλης και 10-8 Μ συνδυασμού βουδεσονίδης-φορμοτερόλης για 0, 12 και 24 h. Στη συνέχεια διαχωρίστηκε το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό από το κυτταρικό στρώμα (κύτταρα και εξωκυττάριος χώρος) κάθε καλλιέργειας. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε απομόνωση των GAGs με απολιπίδωση, εξαντλητική πέψη με προνάση, πέψη με DNase, και εν τέλει οι ολικές GAGs συλλέχθηκαν με καταβύθιση με αιθανόλη. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των ουρονικών οξέων στις ολικές GAGs με χρωματομετρική μέθοδο (Bitter και Muir ). Στη συνέχεια οι GAGs αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε οξικές κυτταρίνες, ταυτοποιήθηκαν με ειδικά ένζυμα, μετρήθηκε το ΗΑ που εκκρίνεται με ELISA, προσδιορίστηκε η μοριακή μάζα του ΗΑ με πηκτή πολυακρυλαμιδίου, ενώ ακόμα από τις αρχικές καλλιέργειες απομονώθηκε mRNA και πραγματοποιήθηκε RT-PCR καθώς και ανοσοαποτύπωση κατά western. Από τα αποτελέσματα μας διαπιστώθηκε ότι η έκκριση του ΗΑ μειώνεται στατιστικά σημαντικά στα ASMC ασθενών με άσθμα και ΧΑΠ σε σχέση με τους μάρτυρες. Η μείωση αυτή οφείλεται στην μείωση της έκφρασης της HAS1 και HAS2 καθώς και στην αύξηση της έκφρασης της HYAL1. Η έκφραση του υποδοχέα CD44 μειώνεται στα ASMC ασθενών με άσθμα και ΧΑΠ σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ ο υποδοχέας RHAMM εκφράζεται μόνο στα ASMC από φυσιολογικούς μάρτυρες. Η επίδραση των κορτικοστεροειδών και των β2-αδρενεργικών αγωνιστών έχει σαν αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή ΗΑ, με στατιστικά σημαντικότερη αύξηση στους ασθενείς με άσθμα και ΧΑΠ. Η αύξηση αυτή οφείλεται σε αύξηση της έκφρασης της HAS-1 και σε μείωση της έκφρασης της HYAL-1. Η έκφραση του υποδοχέα CD44 αυξάνεται μετά την επίδραση των φαρμάκων στoυς ασθενείς με άσθμα και ΧΑΠ, ενώ ο υποδοχέας RHAMM εκφράζεται και στα ASMC των ασθενών με άσθμα και ΧΑΠ. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας υποδεικνύουν πως το άσθμα και η ΧΑΠ σχετίζονται με διαταραγμένη ομοιόσταση του ΗΑ στα ASMC. Η φαρμακευτική αγωγή αναστρέφει εν μέρει αυτή τη διαταραχή. Ενδεχόμενα τα ένζυμα που εμπλέκονται στην ομοιόσταση του ΗΑ να αποτελέσουν στόχο στοχευμένης φαρμακολογικής παρέμβασης για τη θεραπεία του άσθματος και της ΧΑΠ
description: Lung diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are among the world’s most prevalent diseases. Asthma is a major health problem throughout the world. It is estimated that as many as 300 million people of all ages and ethnic origins suffer from asthma. The World Health Organization (WHO) reported that mortality due to asthma has now reached over 180.000 cases annually and that its prevalence is rising by 50% every decade, especially among children. Furthermore, asthma is a leading cause of hospitalization in young children in industrialized countries. COPD is not accurately diagnosed and treated, resulting in underestimation of the actual burden of the disease. Based on data from the WHO in 2004, COPD is ranked as the 4th leading cause of death worldwide. By 2020, COPD is predicted to become the 3rd leading cause of death. Asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are characterized by chronic airway inflammation and remodeling. In nonpathological conditions tissue homeostasis is maintained by the balance between extracellular matrix (ECM) synthesis and degradation. However, this equilibrium is altered in asthma and COPD leading to structural changes such as increased extracellular matrix deposition. Fibroblasts and airway smooth muscle cells (ASMC) are the main source of collagen and GAGs. In turn, the extracellular matrix influences cell proliferation, migration, differentiation, and secretion of cytokines and growth factors. Thus, extracellular matrix deposition may perpetuate the inflammatory and remodeling processes, contributing to progression and severity of diseases. Inhaled corticosteroids and long acting β2-agonists are the current therapy for asthma and COPD but their effect on airway remodelling is not clear. The purpose of this thesis was to investigate the effect of corticosteroids and long acting β2-agonists on extracellular matrix molecules such as GAGs, PG and MMPs in order to define their role in airway inflammation and tissue remodelling. For this purpose, primary cultures of ASMC were established from dissected airway muscle bundles obtained from isolated bronchi of 10 control subjects (organ donors), or from endo-bronchial biopsies of 11 patients with mild to moderate asthma, and 6 patients with COPD. All patients included in this study have been diagnosed with asthma or COPD following the GINA and GOLD standard definition. The cell cultures were developed under serumfree condition to reflect a non-inflammatory environment or with 5% fetal calf serum (FCS) in the absence and presence of 10-8 Μ budesonide, 10-8 Μ formoterol and 10-8 Μ of the combination of the two drugs, for 0, 12 και 24 h. Cell culture media were collected separately from the cell layers. GAGs were isolated and purified from the culture media and the cell layers by lipid extraction, digestion with pronase enzyme, DNA digestion and the extracted GAG were precipitated by the addition of ethanol. Colorimetric determination of uronic acids was performed according to Bitter and Muir. Fractionation of GAGs was achieved by electrophoresis on cellulose acetate membranes, each fractionated GAG was confirmed by enzymatic treatment with specific GAG-degrading enzymes, quantitation of secreted HA was performed by ELISA, determination of the HA molecular mass was achieved with 4% polyacrylamide gels, the expression of HA metabolizing enzymes was investigated by RT-PCR and western blot analysis. ASMC obtained from patients with asthma and COPD secreted lower amounts of fragmented HA, and this was associated with decreased gene and protein expression of HAS1 and HAS2, increased gene and protein expression of HYAL1, decreased gene and protein expression of CD44 and lack of the HA receptor RHAMM, as compared to ASMC from normal lung tissue. The effect of corticosteroids and long acting β2-agonists on ASMC obtained from patients with asthma and COPD was secretion of higher amounts of HA, and this was associated with increased gene expression of HAS1, decreased gene expression of HYAL1 and increased gene expression of CD44 and RHAMM, as compared to ASMC from normal lung tissue. These results indicates that reduced levels of HA contribute to the pathogenesis of asthma and COPD. Corticosteroids and long acting β2- agonists reverse this reduction. In the future, HA metabolizing enzymes could be considered as a specific pharmacological target for asthma and COPD therapy