title: Biochemical and Molecular Investigations of Arabidopsis thaliana Transformed with Genes of Rosmarinic Acid Biosynthesis
title: Biochemische und molekulare Untersuchungen von Arabidopsis thaliana transformiert mit Genen der Rosmarinsäurebiosynthese
Creators: name: Chahyadi, Agus
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Arabidopsis, Pflanzentransformation
Plant transformation
Coleus blumei
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Hairy Root
Agrobacterium
hairy root
Rosmarinsäure Synthase
Arabidopsis thaliana, Rosmarinsäure
Rosmarinsäure
Arabidopsis
rosmarinic acid
Hydroxyphenylpyruvat Reduktase

description: Rosmarinic acid (RA) is an ester of
      caffeic acid and 3,4-dihydroxyphenyllactic acid (DHPL). This
      compound is present in various higher plants and some lower
      plants. However, the occurrence is not consistent since not
      all members in each level of plant taxa where RA has been
      shown to be present contain RA. Recent investigations confirm
      that a number of enzymes involved in the formation of RA are
      present in all higher plant species and also active in other
      metabolic pathways. In Arabidopsis thaliana (Brassicaceae),
      the presence of certain RA biosynthesis genes has been
      described, but one or more RA specific genes are missing and
      thus the plant is unable to synthesise RA. Therefore,
      introducing the cDNA of CbRAS into Arabidopsis might prove
      the role of enzymes such as HPR2 (a photorespiratory enzyme)
      and cytochrome P450 monooxygenases from the CYP98A family
      (enzymes in the formation of monolignols) in providing the
      substrates and finishing the formation of RA or RA-like
      esters. The transformed Arabidopsis thaliana was obtained via
      Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and has
      been successfully established as cell suspension cultures.
      The transformed cells were R-lines (plants transformed with
      the vector containing cDNA of CbRAS) and L-lines (control
      plants transformed with the empty vector). Molecular
      characterisation showed that the T-DNA parts, the RAS and
      CaMV 35S promoter sequences, have been stably integrated in
      the plant genome. However, the presence of the KanR gene (a
      non-T-DNA part) in all established cell suspension cultures
      revealed a phenomenon which is called the integration of the
      non-T-DNA binary vector backbone sequences. This has been
      reported in several plant transformation events. The optimum
      growth of cell suspension cultures including the cell biomass
      and protein contents was observed in the first week of the
      cultivation period. Overexpression of the RAS gene slightly
      reduced the cell growth but did not impair the cells. In
      addition, strong expression of the RAS gene did not increase
      the protein content. All the RA biosynthetic enzymes were
      found to be highly active during the logarithmic growth
      phase. Enzymes such as TAT, C4H and 4CL reached their maximum
      activity on day 4, while PAL and RAS on day 6. Overexpression
      of RAS gene had no influence on the activity of the enzymes
      in the upstream pathway of RA. Their activities were found to
      be cell line-specific. The strong expression of the RAS gene
      did not make all ras-transformed lines having RAS activity.
      Some of them had exhibited the activity, but later on, the
      activity was lost. Gene expression analysis did not show any
      post-transcriptional gene silencing (PTGS) event. Therefore,
      a complex regulation at the post-translational level might be
      involved. The transcript level of the RAS gene varied among
      ras-transformed lines which might be caused by the number and
      site(s) of T-DNA integration events or cellular responses of
      the cell lines. The expression pattern of other
      RA-biosynthetic genes cannot be clearly distinguished between
      ras-transformed lines, control lines and the wild type. In
      general, gene transcripts fluctuated and were line-specific.
      The attempt to overexpress two genes, CbHPPR and CbRAS, in
      Arabidopsis was achieved by generating hairy roots from
      ras-transformed lines with the help of Agrobacterium
      rhizogenes carrying the CbHPPR gene. Only one single hairy
      root line could be obtained containing both genes. However,
      the transformed roots exhibited neither RAS activity nor
      detectable levels of ras transcript; this might be caused by
      PTGS events. Also, the transformed roots did not show any
      significant change of the HPPR activity although high
      expression of the HPPR gene was clearly observed.
      Accordingly, the attempt to increase the formation of
      RAS-ester products by double expression of hppr and ras
      remains unsuccessful. Analysis of metabolite contents by
      LC-MS showed that ras-transformed cells probably accumulated
      RA and Caf-pHPL, although the yields were extremely low.
      Thus, the presence of RAS in Arabidopsis thaliana
      demonstrates the dual role of HP(P)R in primary and secondary
      metabolism, by providing glycerate (in photorespiration) and
      pHPL (for RA biosynthesis), respectively. It also leads us
      into new perspectives regarding the role of CYP98As in
      Arabidopsis, the biosynthetic pathway of RA, and the role of
      vacuoles for RA accumulation. This, however, should be
      answered in future experiments.
description: Rosmarinsäure (RA) ist ein Ester
      von Kaffeesäure und 3,4-Dihydroxyphenylmilchsäure (DHPL).
      Dieser Naturstoff kommt in verschiedenen höheren Pflanzen und
      einigen niedrigeren Pflanzen vor. Allerdings ist das
      Vorkommen nicht konsistent, da nicht alle Mitglieder in jeder
      Taxonebene, in der RA gezeigt worden ist, RA enthalten.
      Neuere Untersuchungen bestätigen, dass einige Enzyme, die an
      der Bildung von RA beteiligt sind, in allen höheren
      Pflanzenarten vorhanden und auch in anderen Stoffwechselwegen
      aktiv sind. In Arabidopsis thaliana (Brassicaceae) wurde die
      Anwesenheit bestimmter RA-Biosynthese-Gene beschrieben, aber
      ein oder mehrere RA-spezifische Gene fehlen und somit ist die
      Pflanze nicht in der Lage, RA zu synthetisieren. Daher könnte
      das Einbringen der cDNA von CbRAS in Arabidopsis zeigen, ob
      Enzyme wie HPR2 (ein photorespiratorisches Enzym) und
      Cytochrom P450 Monooxygenasen aus der CYP98A-Familie (Enzyme
      bei der Bildung von Monolignolen) an der Bereitstellung der
      Substrate und der Bildung von RA oder RA-ähnlichen Estern
      beteiligt sein können. CbRAS-transformierte Arabidopsis
      thaliana wurden durch Agrobacterium tumefaciens-vermittelte
      Transformation gewonnen und erfolgreich als
      Zellsuspensionskulturen etabliert. Es wurden R-Linien
      (Pflanzen, die mit dem Vektor transformiert wurden, der cDNA
      von CbRAS enthielt) und L-Linien (Kontrollpflanzen, die mit
      dem leeren Vektor transformiert wurden) gewonnen. Die
      molekulare Charakterisierung zeigte, dass die T-DNA-Teile
      (RAS- und CaMV-35S-Promotorsequenzen) stabil in das
      Pflanzengenom integriert wurden. Die Anwesenheit des
      KanR-Gens (eines Nicht-T-DNA-Teils) in allen etablierten
      Zellsuspensionskulturen zeigte jedoch ein Phänomen, das auf
      die Integration der Nicht-T-DNA-Sequenzen des Vektors beruht.
      Dies wurde schon mehrfach in der Literatur beschrieben.
      Optimales Wachstum der Zellsuspensionskulturen, bestimmt
      anhand der Zellbiomasse und des Proteingehalts, wurde in der
      ersten Woche der Kultivierungsperiode beobachtet. Die
      Überexpression des RAS-Gens verringerte das Zellwachstum
      leicht, beeinträchtigte aber die Zellen nicht. Die starke
      Expression des RAS-Gens erhöhte nicht den Proteingehalt. Alle
      RA-Biosynthese-Enzyme hatten ihre höchste Aktivität während
      der logarithmischen Wachstumsphase. Enzyme wie TAT, C4H und
      4CL erreichten ihre maximale Aktivität am 4. Tag, PAL und RAS
      am 6. Tag. Die Überexpression des RAS-Gens hatte keinen
      Einfluss auf die Aktivität der im RA-Biosyntheseweg
      vorgeschalteten Enzyme. Ihre Aktivitäten wurden als
      zelllinienspezifisch eingestuft. Die starke Expression des
      RAS-Gens führte nicht in allen ras-transformierten Linien zu
      einer messbaren RAS-Aktivität. Einige Linien hatten anfangs
      nachweisbare RAS-Aktivität, die jedoch mit zunehmender
      Passagenanzahl verloren ging. Die Genexpressionsanalyse
      zeigte, dass posttranskriptionelles Gen Silencing (PTGS)
      nicht die Ursache hierfür war. Daher könnte eine komplexe
      Regulation auf der posttranslationalen Ebene beteiligt sein.
      Die RAS-Transkriptmenge variierte unter den
      ras-transformierten Linien. Dies könnte durch die Anzahl und
      die Stelle(n) von T-DNA-Integrationsereignissen oder
      zellulären Reaktionen der Zelllinien verursacht werden. Das
      Expressionsmuster anderer an der RA-Biosynthese beteiligter
      Gene lässt sich nicht klar zwischen ras-transformierten
      Linien, Kontrolllinien und dem Wildtyp unterscheiden. Im
      Allgemeinen sind die Transkriptlevel schwankend und
      linienspezifisch. Der Versuch, zwei Gene, CbHPPR und CbRAS,
      gleichzeitig in Arabidopsis zu überexprimieren, wurde durch
      die Erzeugung von „Hairy Root“ aus ras-transformierten Linien
      mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes erreicht, das das
      CbHPPR-Gen tragen. Es konnte nur eine einzige „Hairy
      Root“-Linie erhalten werden, die beide Gene überführte. Die
      transformierten Wurzeln zeigten jedoch weder RAS-Aktivität
      noch nachweisbare Mengen an ras-Transkript. Dies könnte durch
      PTGS-Ereignisse verursacht werden. Außerdem zeigten die
      transformierten Wurzeln keine signifikante Veränderung der
      HPPR-Aktivität, obwohl das HPPR-Gen stark exprimiert wurde.
      Dementsprechend bleibt der Versuch erfolglos, die Bildung von
      RAS-Esterprodukten durch doppelte Expression von hppr und ras
      zu erhöhen. Die phenolischen Inhaltsstoffe wurden über LC-MS
      analysiert. Hierbei zeigte sich, dass ras-transformierte
      Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit RA und Caf-pHPL
      akkumulierten, obwohl die Ausbeute extrem niedrig war. Dies
      ist ein Hinweis darauf, dass bei Anwesenheit von RAS in
      Arabidopsis thaliana HP(P)R eine doppelte Rolle im Primär-
      und Sekundärmetabolismus hat, indem sie Glycerat (in der
      Photorespiration) und pHPL (für die RA-Biosynthese) lieferte.
      Daraus ergeben sich neue Fragen in Bezug auf die Rolle von
      CYP98As in Arabidopsis, den Biosyntheseweg der RA und die
      Rolle der Vakuolen für die RA-Akkumulation. Dies sollte
      jedoch in zukünftigen Experimenten geklärt werden.