title: The influence of ultra-soft 3D hydrogels and fiber scaffolds on the migration behavior and gene expression of glioblastoma and breast cancer cells in vitro.
title: Der Einfluss von ultraweichen 3D Hydrogelen und Fasergerüsten auf das Migrationsverhalten und die Genexpression von Glioblastom- und Brustkrebszellen
Creators: name: Wieland, Annalena
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most malignant human brain tumor characterized by its high proliferation rate, aggressive invasion of surrounding tissues and resistance to conventional therapies leading to poor patient survival. Triple negative breast cancer (TNBC) is also associated with a bad prognosis as this subtype is defined by an aggressive phenotype with high rates of recurrence and metastases. Therefore, regarding both tumor types it is crucial to gain a better understanding of tumorigenesis, progression as well as migration mechanisms to develop new therapeutic strategies. In-vivo cells grow within a complex tissue-specific 3D microenvironment, the extracellular matrix (ECM), which has a major influence on cell behavior. Thus, one could predict that the ECM also plays an essential role in tumor cell migration and invasion. It is known that conventional 2D cell culture models cannot mimic a 3D microenvironment. That is why the development of physiologically relevant 3D models play a fundamental role in biomedical research. The aim of this project was to mimic the ECM of the brain. However, the brain is one of the softest organs of the human body, which features low mechanical properties with a low Elastic Modulus. Therefore, the establishment of 3D models with comparable biological as well as mechanical properties can be challenging due to the instability of soft hydrogels. To mimic the mechanical properties of the brain and overcome these challenges, ultra-soft hydrogels were reinforced with meltelectrowritten (MEW) Poly-ε-Caprolacton (PCL) - scaffolds. The GBM-cell lines U87 and LN18 as well as the TNBC cell line HTB26 were grown in these 3D composites and assessed for 3D-induced changes using qPCR, fluorescence staining and live cell imaging. Especially U87 showed a high affinity towards the PCL-scaffold as well as an interaction with the PCL-fibers, which also had a prominent influence on gene expression. In comparison to the PTEN wildtype GBM cell line LN18, which did not show an active interaction with the PCL-scaffold, U87 harbored a loss of function mutation in the PTEN gene, an aspect, which gained great importance in the later part of this project. It was previously shown that GBM cells and possibly TNBC-derived brain metastases use existing brain structures, such as white matter tracts and blood vessels as migratory cues. Here we developed a MEW-PCL based 3D migration model, so-called PCL-tracks, to mimic the migratory cues of the brain. These 3D PCL-tracks were used to analyze the migratory behavior of GBM- as well as TNBC-cells by live-cell imaging. Moreover, by using different inhibitors, we identified a new PTEN-dependent RHOB-ROCK migration signaling pathway, which was further confirmed by RNA-sequencing. We could show that the two cell lines U87 and HTB132, with PTEN loss of function and high RHOB expression, showed an active migration towards and along the PCL-tracks with an amoeboid morphology, whereas LN18 and HTB26, carrying the PTEN wildtype gene, did not show a directed migration and displayed a stretched mesenchymal-like morphology. Lastly, we unraveled a PTEN-RHOB-dependent caterpillar-like cell movement composed of a dynamic sequence of different plasticity modes by high-resolution live-cell imaging. In a further part of this thesis, we implemented different hydrogels as 3D matrices and analyzed their influence on GBM cell morphology and gene expression. In addition to Matrigel (MG), ALG, ADA-Gel, HA-SH and Collagen were used to establish ultra-soft 3D GBM-models, with a stiffness between 50-200 Pa (Elastic Modulus), which were analyzed by immunofluorescent staining and RNA-sequencing (RNA-Seq). We showed that U87 formed complex astrocytic 3D networks in MG, whereas in ALG, ADA-Gel and HA-SH a round cluster- or spheroid formation was observed. Additionally, RNA-Seq data showed significant differences between 2D and 3D cell cultures. Finally, it was shown that some hydrogels, particularly ALG, induced a (pro-) inflammatory phenotype, indicated by increased expression levels of IL-6, IL-8 and TNFa. The ALG-induced cell behavior and morphology as well as expression of (pro-) inflammatory genes, strongly suggest an induction of cellular senescence. This hypothesis was supported by the detection of senescence biomarkers, such as ß-Galactosidase (ß-Gal) and DNA-damage. Overall, this study showed that not only the cellular genotype of tumor cells drastically impacts the cell behavior in 3D, but also individual hydrogels actively change the overall cell functionality. Therefore, it is crucial to consider these interactions for future 3D cell culture models.
description: Glioblastoma Multiform (GBM) ist aufgrund seiner hohen Proliferationsrate, der aggressiven Invasion in umliegendes Gewebe, sowie Resistenzen gegenüber Therapien, der bösartigste humane Hirntumor. Ein Umstand, der sich auch in einer sehr schlechten Patientenprognose widerspiegelt. Auch Triple-Negative Brustkarzinome (TNBCs) implizieren eine schlechte Prognose, da dieser Brustkrebs-Subtyp zum einen mit einem sehr aggressiven Phänotyp und zum anderen mit hohen Rezidiv- und Metastasenraten einhergehen kann. Aus diesem Grund ist es von großer klinischer Bedeutung ein besseres Verständnis für die Tumorentstehung und Progression, sowie für die grundlegenden Mechanismen der Tumormigration zu erlangen, um neue Therapiestrategien zu entwickeln. Zellen wachsen in-vivo in einer komplexen, gewebespezifischen 3D Mikroumgebung, der Extrazellulären Matrix (ECM), welche einen großen Einfluss auf das Zellverhalten hat. Demzufolge spielt die ECM auch eine essenzielle Rolle bei der Migration und Invasion von Tumorzellen. Diese in-vivo 3D Mikroumgebung kann in-vitro nicht von konventionellen 2D-Zellkulturmodellen imitiert werden, weswegen die Entwicklung physiologischer 3D Modelle für die Forschung essenziell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden die ECM Attribute des Gehirns simuliert, welche vor allem eine sehr geringe mechanische Steifigkeit mit niedrigem Elastizitätsmodul aufweist. Jedoch können 3D Modelle mit vergleichbaren mechanischen Eigenschaften des Gehirns aufgrund der Instabilität weicher Hydrogele eine große technische Herausforderung darstellen. Um die mechanischen Gegebenheiten der Hirn-ECM zu imitieren, wurden ultraweiche Hydrogele mit Meltelectrowriting (MEW) – gedruckten Poly-ε-Caprolacton (PCL) -Gerüsten verstärkt. Die GBM-Zelllinien U87 und LN18, sowie die TNBC-Linien HTB26 und HTB132 wurden in diesen verstärkten Hydrogelen kultiviert und mittels qPCR, Fluoreszenzfärbungen und Live-Cell-Imaging auf 3D-induzierte Veränderungen untersucht. Vor allem U87 zeigte eine hohe Affinität an das PCL-Gerüst und diese Interaktion hatte wiederum einen großen Einfluss auf die Regulation der Genexpression. Verglichen mit der PTEN Wildtyp GBM-Zelllinie LN18, welche keine aktive Interaktion mit dem PCL-Gerüst aufwies, konnte bei U87 eine Mutation im PTEN-Gen nachgewiesen werden, ein Umstand, welcher im weiteren Verlauf dieser Arbeit eine zentrale Bedeutung erlang. GBM- und möglicherweise auch TNBC-Zellen, welche häufig ins Hirn metastasieren, nutzen vorhandene Hirnstrukturen, wie beispielsweise Axonbündel und Blutgefäße, als Migrations-Wegweiser. Aus diesem Grund wurde basierend auf der Architektur des PCL-Gerüsts, ein 3D-Migrationsmodell bestehend aus PCL-Faserbündel (PCL-Tracks) entwickelt, welche diese Migrations-Wegweiser imitierten. Die Migration der GBM und TNBC Zellen auf den PCL-Tracks wurde mittels Live-Cell-Imaging analysiert und unter der Anwendung verschiedener Inhibitoren konnte ein PTEN-abhängiger RHOB-ROCK Migrationssignalweg identifiziert werden. Die Expression der involvierten Gene konnte auch mittels RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und qPCR bestätigt werden. Die Zelllinien U87 und HTB132, mit PTEN-Funktionsverlust und hoher RHOB-Expression, zeigten eine amöboide Zellmorphologie und migrierten, im Gegensatz zu den PTEN-Wildtyp Zelllinien LN18 und HTB26, aktiv an und entlang der PCL-Tracks. Schlussendlich konnte durch hochauflösendes Live-Cell-Imaging eine PTEN-RHOB abhängige „raupenartige“ Zellbewegung beschrieben werden, welche sich aus einer dynamischen Abfolge verschiedener Plastizitätsmodi zusammensetzte. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden systematisch verschiedene Hydrogele als 3D Matrix und deren Einfluss auf die Morphologie und Genexpression von GBM-Zellen getestet. Neben Matrigel (MG) wurden ultraweiche 3D GBM-Modelle mit einer Steifigkeit zwischen 50 und 200 Pa (Elastizitätsmodul) aus ALG, ADA-Gel, HA-SH und Kollagen etabliert und mittels Fluoreszenzfärbungen und RNA-Sequenzierung analysiert. U87 formte in MG komplexe astrozytäre 3D Netzwerke, während die Zellen in ALG, ADA-Gel und HA-SH eine runde Morphologie mit Sphäroidformation präsentierten. Die RNA-Seq Daten von U87 in 2D oder in 3D mit MG, ALG, ADA-Gel, HA-SH und Kollagen zeigten große Unterschiede in der Genexpression. Zuletzt wurde dargestellt, dass einige Hydrogele, wie vor allem ALG, die Expression der Zytokine IL 6, IL-8 und TNFa induzierten und somit einen (pro-) inflammatorischen Phänotyp herbeiführten. Das Zellverhalten, die Morphologie, sowie die Expression (pro-)inflammatorischer Zytokine deuteten auf eine Induktion zellulärer Seneszenz hin. Diese Annahme konnte durch den Nachweis von Seneszenz-Biomarkern, wie ß-Galaktosidase Aktivität und DNA-Schädigung unterstützt werden. In der Gesamtheit zeigt diese Arbeit, dass der jeweilige Zellgenotyp der Tumorzellen großen funktionellen Einfluss auf das 3D Zellverhalten hat, aber dass auch die jeweiligen 3D Hydrogele die Zellen aktiv funktionell verändern. Diese Interaktionen sollten zukünftig bei der Etablierung von 3D-Kulturen berücksichtigt werden.