title: Radiochemical and luminescence-based binding and functional assays for human histamine receptors using genetically engineered cells
Creators: name: Mosandl, Johannes
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Calcium , Durchflusscytometrie , Fluoreszenz , Radioaktivität , Aequorin , CRE , Histaminrezeptor , Ligand , Biologische Aktivität , G-Protein gekoppelter Rezeptor , chimäres G-Protein , Fura-2 , pharmakologische In-vitro-Assays , HEK293 Zellen , G-protein coupled receptor , chimeric G-protein , fura-2 , pharmacological in vitro assays , HEK293 cells
subject: 540 Chemie

description: For the discovery and detailed pharmacological characterisation of new ligands of G-protein coupled receptors simple, robust and reliable in vitro assays using whole cells are required. This thesis aimed at the development of new binding and functional assays for the human histamine H1, H2 and H4 receptor (hH1R, hH2R, hH4R), respectively. Whereas the ratiometric fura-2 based calcium assay in cuvettes has been state of the art for the determination of intracellular calcium for decades, non-ratiometric dyes like fluo-4 are preferred in high throughput screening. In order to combine the advantages of ratiometric calcium measurements with increased throughput in the microplate format, hH1R expressing U-373 MG cells were used as a model. The characterisation of the agonist histamine yielded reliable data both in 96-well and 384-well plates. The determination of antagonistic activity was most effective in the 384-well format and validated using standard H1R antagonists. Sequential reduction of the measurement time enabled the characterisation of 480 samples in one assay per day in the 384-well format. As a proof-of-concept, the applicability of this approach was confirmed by the identification of potent hH1R antagonists as lead compounds from a library of more than thousand new chemical entities. Due to the lack of appropriate wild-type cells expressing the hH2R or the hH4R, HEK293 cells were investigated for their suitability to express those receptor subtypes both on the mRNA level and by Western blot. Although a band corresponding to the hH2R was identified by mRNA analysis, the respective receptor protein was not detected in Western blots. Therefore, HEK293 cells were considered appropriate for the expression of human histamine receptor subtypes. To establish a functional assay, HEK293 cells were stably co-transfected with the hH2R and the chimeric G-protein qs5-HA, thereby redirecting the agonist-mediated receptor stimulation to a robust calcium signal. For validation, radioligand binding experiments were performed comparing the co-transfected cells (HEK293-hH2R-qs5-HA cells) with HEK293-FLAG-hH2R-His6 cells as reference. The affinities determined for the investigated standard ligands were on both cell types and on membranes from HEK293-hH2R-qs5-HA cells in the same order of magnitude and mainly in agreement with data reported in literature, except for the H2R agonist arpromidine, which showed lower affinity than reported for binding experiments performed in a different model (fusion proteins of the hH2R and the short splice variant of Gs-alpha). Generally, the binding properties of the investigated ligands were not significantly influenced by the co-expression of qs5-HA in HEK293-hH2R-qs5-HA cells. As an alternative to the use of radioligands, fluorescence-based binding assays were developed. The specific binding of a cyanine-dye-labelled H2R antagonist to HEK293-hH2R-qs5-HA cells was visualized by confocal microscopy. In addition, flow cytometric saturation binding experiments were performed on HEK293-hH2R-qs5-HA cells with this cyanine-labelled compound and with a pyrylium(Py)-dye-labelled H2R ligand. Although the fluorescent ligands showed moderate submicromolar affinities, these compounds are appropriate for binding assays, since their unspecific binding is extremely low. Affinities determined in binding experiments by displacing the Py-labelled ligand with H2R standard ligands were slightly lower for several compounds than reference data from literature, possibly due to the need for DMSO as a co-solvent in the assay. For the determination of the functional activity of hH2R ligands, fura-2 assays were established in cuvettes and in the microtitre format. Data obtained in the fura-2 assays were in agreement with results reported for calcium measurements performed with fluo-3 and were essentially in the same order of magnitude as reported for GTPase activity. Preliminary experiments aiming at the development of binding and functional assays for the hH4R were performed. Taken together, the established flow cytometric binding assay using fluorescence-labelled ligands and stably co-transfected cells represents an innovative alternative to radioligand binding assays for the determination of ligand affinity on the hH2R. The principle of stable co-expression of receptor and chimeric G-protein qs5-HA allowed the development of fluorescence-based calcium measurements, which can be performed in the microtitre format, thereby enabling reasonable throughput. The developed methods will contribute to the characterisation of compounds on histamine receptor subtypes with regard to affinity, receptor subtype selectivity, quality of action and potency.
description: Zur Identifizierung und vertieften pharmakologischen Charakterisierung neuer Liganden G-Protein gekoppelter Rezeptoren werden zelluläre In-vitro-Testsysteme (Assays) benötigt, die sich durch leichte Durchführbarkeit, Robustheit und Verlässlichkeit auszeichnen. Die vorliegende Arbeit hatte die Entwicklung neuer Bindungs- und Aktivitätsassays für die humanen Histamin Rezeptoren H1, H2 und H4 (hH1R, hH2R, hH4R) zum Ziel. Die Bestimmung des intrazellulären Calciumspiegels wird klassisch in Küvetten mit dem ratiometrischen, calciumchelatisierenden Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 durchgeführt, während im Hochdurchsatz-Format bevorzugt nicht-ratiometrische Farbstoffe wie Fluo-4 verwendet werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Vorteile der ratiometrischen Methode und des erhöhten Durchsatzes im Mikrotiterplattenformat am Beispiel von U-373 MG Zellen, welche den hH1R exprimieren, vereint. Die Charakterisierung des Agonisten Histamin lieferte sowohl in 96-Loch- als auch in 384-Loch-Platten verlässliche Ergebnisse, wohingegen die Bestimmung der antagonistischen Aktivität bekannter Liganden des H1R im 384-Loch-Format am besten funktionierte. Im Antagonisten-Modus ermöglichte die schrittweise Verkürzung der Messzeit die Untersuchung von 480 Proben pro Tag in einem Arbeitsgang. Die Methode wurde mit Erfolg zur Identifizierung stark wirksamer hH1R Antagonisten aus einer Substanzbibliothek von &gt;1000 Verbindungen eingesetzt. Da geeignete Wildtypzellen, die den hH2R oder den hH4R tragen, nicht verfügbar sind, wurden HEK293 Zellen als Expressionsmodell ausgewählt. Zunächst wurde das endogene Expressionsprofil bezüglich histaminerger Rezeptorsubtypen auf mRNA- und Proteinebene (Western Blot) charakterisiert. Mittels mRNA-Analyse ließ sich nur für den hH2R eine entsprechende Bande nachweisen. Das zugehörige Protein wurde jedoch im Western Blot nicht identifiziert, so dass sich HEK293 Zellen für die Expression humaner Histamin Rezeptoren eignen. Zur Etablierung eines funktionellen Assays wurden HEK293 Zellen stabil mit dem hH2R und dem chimären G-Protein qs5-HA co-transfiziert, um die agonistvermittelte Aktivierung des Rezeptors auf ein robustes Calciumsignal umzuleiten. Radioligandbindungsstudien wurden mit diesen co-transfizierten Zellen (HEK293-hH2R-qs5-HA Zellen) und zum Vergleich mit HEK293-FLAG-hH2R-His6 Zellen durchgeführt. Die Affinitäten der untersuchten Liganden lagen an beiden Zelltypen und an Membranen von HEK293-hH2R-qs5-HA Zellen in der gleichen Größenordnung und stimmten im Wesentlichen mit Literaturdaten überein; die Affinität des H2R Agonisten Arpromidin war aber geringer als diejenige, die an einem anderen Modell (Fusionsproteine aus hH2R und der kurzen Splicevariante des Gs-alpha Proteins) bestimmt wurde. Insgesamt wurde die Bindung der untersuchten Liganden an HEK293-hH2R-qs5-HA Zellen durch die Co-Expression von qs5-HA nicht signifikant beeinflusst. Als Alternative zur Verwendung von Radioliganden wurden fluoreszenzbasierte Bindungsassays entwickelt. Die spezifische Bindung eines mit einem Cyanin-Farbstoff markierten H2R Antagonisten an HEK293-hH2R-qs5-HA Zellen wurde mit dem Konfokalmikroskop sichtbar gemacht. Zudem wurden durchflusszytometrische Bindungsassays an HEK293-hH2R-qs5-HA Zellen mit diesem Fluoreszenzliganden und einem mit einem Pyrylium(Py)-Farbstoff markierten Antagonisten durchgeführt. Diese Fluoreszenzliganden erwiesen sich trotz moderater, submikromolarer Affinität für Bindungsstudien geeignet, da sie sich durch eine extrem niedrige unspezifische Bindung auszeichnen. Die Affinitäten von H2R Standardliganden wurden in Kompetitionsexperimenten mit dem Py-markierten Liganden bestimmt. Diese waren für einige der untersuchten Liganden etwas niedriger als in der Literatur beschrieben, möglicherweise durch die Notwendigkeit, DMSO in den durchflusszytometrischen Bindungsassays zuzusetzen, bedingt. Zur Bestimmung der funktionellen Aktivität von hH2R Liganden wurden Fura-2 Assays in Küvetten und Mikrotiterplatten durchgeführt. Die Daten des Fura-2 Assays stimmten mit Literaturdaten eines Fluo-3 Assays überein und sind im Wesentlichen mit Ergebnissen aus GTPase Assays vergleichbar. Darüber hinaus wurden Vorarbeiten zum Aufbau von Bindungs- und Aktivitätsassays für den hH4R durchgeführt. Der entwickelte durchflusszytometrische Bindungsassay für den hH2R unter Einsatz fluoreszenzmarkierter Liganden und co-transfizierter Zellen ist eine innovative Alternative zu konventionellen Radioligandbindungsstudien. Das Prinzip der stabilen Co-Expression von Rezeptor und chimärem G-Protein qs5-HA ermöglichte die Entwicklung fluoreszenzbasierter Calciumassays, die wegen der Durchführbarkeit im Mikrotiterformat einen akzeptablen Durchsatz gewährleisten. Die entwickelten Methoden tragen zur Charakterisierung von Liganden histaminerger Rezeptoren bezüglich Affinität, Rezeptor-Subtyp-Selektivität, Wirkqualität und Potenz bei.