Comparative immunohistochemical analysis of postoperative macrophage polarization in bisphosphonate-altered bone healing in the jaw and tibia using the experimental MRONJ model of the Wistar rat
Vergleichende immunhistochemische Analyse der postoperativen Makrophagenpolarisation bei Bisphosphonat-alterierter Knochenheilung in Kiefer und Tibia am experimentellen MRONJ-Modell der Wistar-Ratte
Creators: name: Mike, Melanie
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: Bisphosphonate
subject: Aminobisphosphonate
subject: MRONJ
subject: Kiefernekrose
subject: BRONJ
subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 61 Medizin und Gesundheit :: 610 Medizin und Gesundheit

description: The aim of the present study was to determine the effects of aminobisphosphonates on macrophage polarization after mandibular tooth extraction and tibial fracture healing after induced fracture and plate osteosynthesis in the Wistar rat. Macrophages play a different role in inflammatory processes with regard to their polarization (M1 vs. M2) and thus provide an indication of whether a proinflammatory event is present in the tissue or whether wound healing is taking place. From a developmental biology perspective, it is known that craniofacial bone differs from the rest of the axial skeleton in terms of formation, remodeling and wound healing. Despite contradictory information in the literature regarding macrophage and osteoclast polarization, there is clear evidence that bisphosphonates (BPs) influence the immune response in the jaw by inhibiting Msx1 (Muscle segment homeobox gene 1), which is essential in jaw-specific remodeling. The focus of this work is on the potential immunomodulating influence of bisphosphonate application on the operative site of the jaw and the tibia and their comparison. The expression behaviour of macrophages (CD68 and CD163) in the individual bone compartments of the jaw (bone marrow and cancellous bone) and in the tibia (bone marrow and scar tissue) was investigated and compared with each other in order to be able to make differentiated statements about the inflammatory processes in the respective tissue depending on previous bisphosphonate medication and surgery. For the study, rat samples obtained from the DFG project WE 52721/1-1 were used and immunohistochemically analysed. Wistar rats were divided into 4 experimental groups (G1, G2, G3, G4). Groups 1 and 2 were not operated, in contrast to 3 and 4. The animals from groups 2 and 4 received a weekly injection of zoledronate for 8 weeks. After surgery in the jaw and tibia in groups 3 and 4, samples were taken from the surgical site and the unoperated opposite side at regular intervals. Sections were made from the fixed samples, which were stained immunohistochemically and completely digitized. Representative sections were then evaluated using a computer program. Thus the number of CD68- and CD163-positive cells per area was determined as well as the labeling index (LI) consisting of the number of positive cells per total cell count and the ratio of CD163- to CD68-positive cells. The data obtained from each sample and test unit were summarized and quantitatively presented using medians, standard deviation and p-value (p≤0.05 significant; Mann-Whitney-U-Test). Since the research question focuses on bisphosphonate-dependent macrophage polarization in the operated jaw or tibia, group 3 and group 4 were the subject of this study. The data from group 1 and 2, which were analysed in other dissertation projects, were used for comparison purposes, but were not discussed in detail. After tooth extraction in the jaw, CD68 expression in the bone marrow area was significantly higher under the additional influence of aminobisphosphonates than by tooth extraction alone (p&lt;0.001). In cancellous bone of the jaw, CD68 expression was significantly higher on the jaw side with tooth extraction and on the opposite side where no defect occurred after BP administration (OP side: p&lt;0.001, control side: p=0.004). The ratio of CD163 to CD68 was lower in the region of the cancellous bone than in the bone marrow of the jaw (group 3: p=0.011, group 4: p=0.029), independent of the BP administration after tooth extraction. In the bone marrow of the tibia, the additional zoledronate administration had no influence on the expression of CD68, CD163 and on the ratio of CD163 to CD68 after osteotomy and osteosynthesis. In the scar tissue of the tibia a significant increase of CD68-positive cells in group 4 receiving bisphosphonates (p=0.020) was observed. The scar area showed an increase in CD68 expression (p=0.020) and a lower CD163 to CD68 ratio (p&lt;0.001) than the bone marrow of the operated tibia under the influence of zoledronate. Comparing the compartments of the jaw with the bone marrow of the tibia during wound healing, a significantly higher expression of CD68 and a significantly lower ratio of CD163 to CD68 in the jaw was observed. On the other hand, no significant differences in the expression of CD68 and in the ratio of CD163 to CD68 in the jaw compared to the scar region of the tibia were observed. The present results show that aminobisphosphonates have an immunomodulatory influence on the tissue specific inflammation in the jaw and tibia after surgical intervention. After tooth extraction in the jaw, increased macrophage expression was seen through additional application of zoledronate. Irrespective of the administration of BP, the cancellous bone showed a higher M1 polarization than the bone marrow of the jaw. The additional BP medication in the bone marrow of the operated tibia did not induce any changes in macrophage expression whereas in comparison there was a shift in macrophage polarization to the proinflammatory M1 macrophages in the scar region of the tibia. The scar tissue of the tibia showed macrophage expression similar to that of the jaw. Defects in the jaw or tibia are not the only decisive factor for macrophage expression. The embryologically different origin of the two types of bone could provide a starting point for the explanation of the compartment-dependent macrophage polarization.
description: Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Auswirkungen von Aminobisphosphonaten auf die postoperative Makrophagenpolarisierung nach Zahnextraktion im Unterkiefer und Frakturheilung der Tibia nach Osteotomie und Plattenosteosynthese bei der Wistar-Ratte zu ermitteln. Makrophagen spielen hinsichtlich ihrer Polarisierung (M1 vs. M2) eine unterschiedliche Rolle bei Entzündungsprozessen und geben somit einen Hinweis darauf, ob ein proinflammatorisches Geschehen im Gewebe vorliegt oder eine Wundheilung stattfindet. Aus entwicklungsbiologischer Sicht ist bekannt, dass sich der kraniofaziale Knochen vom restlichen Axialskelett hinsichtlich Entstehung, Remodeling und Wundheilung unterscheidet. Trotz widersprüchlicher Angaben in der Literatur bezüglich der Makrophagen- und Osteoklastenpolarisierung gibt es eindeutige Belege, die zeigen, dass Bisphosphonate (BPs) die Immunantwort im Kiefer beeinflussen durch Hemmung von Msx1 (Muscle segment homeobox gene 1), das wesentlich am kieferspezifischen Remodeling beteiligt ist. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag bei dem potenziell immunmodulierenden Einfluss der Bisphosphonat-Applikation auf den Operationssitus des Kiefers und der Tibia sowie deren Vergleich. Dabei wurde das Expressionsverhalten der Makrophagen (CD68 und CD163) in den einzelnen Knochenkompartimenten des Kiefers (Knochenmark und Spongiosa) sowie in denen der Tibia (Knochenmark und Narbengewebe) untersucht und miteinander verglichen, um differenzierte Aussagen über das Entzündungsgeschehen im jeweiligen Gewebe treffen zu können, abhängig von vorangegangener Bisphosphonat-Medikation und Operation. Für die Studie wurden die aus dem DFG-Projekt WE 52721/1-1 gewonnene Rattenproben herangezogen und immunhistochemisch analysiert. Die Wistar-Ratten wurden in 4 Versuchsgruppen unterteilt (G1, G2, G3, G4). Die Gruppen 1 und 2 wurden im Gegensatz zu 3 und 4 nicht operiert. Die Tiere aus Gruppe 2 und 4 erhielten eine wöchentliche Zoledronat-Injektion über 8 Wochen. Nach Defektsetzung in Kiefer und Tibia bei Gruppe 3 und 4 wurden in regelmäßigem Abstand gleichzeitig Proben aus dem Operationssitus und der nicht operierten Gegenseite entnommen. Von den fixierten Proben wurden Schnitte angefertigt, die immunhistochemisch gefärbt und vollständig digitalisiert wurden. Repräsentative Ausschnitte wurden daraufhin mittels eines Computerprogramms ausgewertet. Es folgte die Ermittlung der Anzahl der CD68- und CD163-positiven Zellen pro Fläche wie auch des Labeling Index (LI), bestehend aus der Anzahl der positiven Zellen pro Gesamtzellzahl, und das Verhältnis von CD163- zu CD68-positiven Zellen. Die gewonnenen Daten aus jeder Probe und Untersuchungseinheit wurden zusammengefasst und quantitativ mittels Medians, Standardabweichung und p-Wertes (Signifikanz p≤0.05; Mann-Whitney-U-Test) dargestellt. Aufgrund der Fragestellung hinsichtlich der Bisphosphonat-abhängigen Makrophagenpolarisation im operierten Kiefer bzw. in der operierten Tibia, waren Gruppe 3 und Gruppe 4 Gegenstand der Untersuchung in dieser Arbeit. Die Daten aus Gruppe 1 und 2, die in anderen Dissertationsprojekten analysiert wurden, dienten zu Vergleichszwecken, wurden aber nicht näher thematisiert. Nach Zahnextraktion im Kiefer war im Bereich des Knochenmarks die CD68-Expression signifikant höher unter zusätzlichem Einfluss von Aminobisphosphonaten als durch die Zahnextraktion allein (p&lt;0.001). In der Spongiosa des Kiefers wiesen die operierte Kieferseite und die Gegenseite, in der keine Defektsetzung stattfand, eine signifikant höhere CD68-Expression nach BP-Gabe auf (OP-Seite: p&lt;0.001, Kontrollseite: p=0.004). Das Verhältnis aus CD163 zu CD68 war unabhängig von der BP-Gabe nach Zahnextraktion im Gebiet der Spongiosa niedriger als im Knochenmark des Kiefers (Gruppe 3: p=0.011, Gruppe 4: p=0.029). Im Knochenmark der operierten Tibia nahm die zusätzliche Zoledronat-Applikation keinen Einfluss auf die Expression von CD68, CD163 und auf das Verhältnis von CD163 zu CD68 nach Osteotomie und Osteosynthese. Im Narbengewebe der Tibia zeigte sich ein signifikanter Anstieg von CD68-positiven Zellen in Gruppe 4, die Bisphosphonate erhielt (p=0.020). Das Narbengebiet wies eine Zunahme der CD68-Expression (p=0.020) und ein niedrigeres Verhältnis von CD163 zu CD68 (p&lt;0.001) als das Knochenmark der operierten Tibia unter Zoledronat-Einfluss auf. Vergleicht man postoperativ die Kompartimente des Kiefers mit dem Knochenmark der Tibia, sah man eine signifikant höhere Expression von CD68 und ein signifikant niedrigeres Verhältnis von CD163 zu CD68 im Kiefer. Dagegen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Expression von CD68 und im Verhältnis von CD163 zu CD68 im Kiefer, verglichen mit der Narbenregion der Tibia. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass Aminobisphosphonate einen immunmodulierenden Einfluss auf die gewebespezifische Entzündung in Kiefer und Tibia nach chirurgischer Intervention haben. Nach Zahnextraktion im Kiefer war eine vermehrte Makrophagenexpression zu sehen durch zusätzliche Zoledronat-Applikation. Die Spongiosa wies dabei unabhängig von der BP-Gabe eine höhere M1-Polarisation als das Knochenmark des Kiefers auf. Die zusätzliche BP-Medikation löste im Knochenmark der operierten Tibia keine veränderte Makrophagenexpression aus, wohingegen im Vergleich dazu in der Narbenregion der Tibia ein Shift in der Makrophagenpolarisation zu den proinflammatorischen M1-Makrophagen stattfand. Das Narbengewebe der Tibia zeigte eine ähnliche Makrophagenexpression wie die des Kiefers. Die Defektsetzung in Kiefer bzw. Tibia sind nicht ausschlaggebend allein für die Makrophagenexpression. Die embryologisch unterschiedliche Abstammung beider Knochenarten könnte einen Ansatz für die Erklärung der Kompartiment-abhängigen Makrophagenpolarisierung liefern.