title: Interaktion von Kv7.1-Kaliumkanälen mit der Untereinheit KCNE1 und der β-Sekretase BACE1.
Creators: name: Freimuth, Melanie Anja Maria
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025
Subjects: subject: Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle
subject: BACE1
subject: Patchclamp Technik
subject: Long-QT-Syndrom
subject: Diabetes mellitus

description: Hintergrund und Ziele: Die β-Sekretase BACE1 spielt bei der Entstehung von Morbus Alzheimer eine entscheidende Rolle und moduliert darüber hinaus Ionenkanäle ähnlich einer β-Untereinheit. Durch die nicht-proteolytische Interaktion von BACE1 mit dem Kv7.1 (KCNQ1) wird die viel diskutierte Stöchiometrie des IKS-Stromes (KCNQ1/KCNE1), der u.a. bei der Regulation der Herzaktion eine wichtige Rolle spielt, um einen weiteren Faktor erweitert. Sowohl BACE1 als auch der Kv7.1 werden zudem im Pankreas exprimiert, wo u.a. eine Rolle bei der Insulinsekretion vermutet wird. Die nur geringe β-Sekretase-Aktivität trotz starker Expression in diesem Gewebe wurde durch Splicevarianten erklärt, die in enzymatisch inaktive Isoformen der BACE1 translatiert werden. Ihre biologische Funktion ist bis heute nicht bekannt. Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Stöchiometrie von KCNQ1 (Q1) mit KCNE1 (E1) und BACE1 (B1). Als sekundäres Ziel wurde die Interaktion von KCNQ1 mit pankreasspezifischen BACE1-Isoformen BACE1-476 und BACE1-455 untersucht. Methoden: Zur Untersuchung der Stöchiometrie von KCNQ1 mit KCNE1 und BACE1 (Q4:E1-4:B1-4) wurden zwei Assays aus Fusionsproteinen verwendet, die jeweils eine definierte Stöchiometrie (4:4, 4:2 oder 4:1) aus KCNQ1 und KCNE1 bzw. KCNQ1 und BACE1 erzeugen. Diese wurden im heterologen System mittels Patch-Clamp-Technik in Whole-Cell-Konfiguration elektrophysiologisch charakterisiert. Zur Betrachtung der Interaktion der pankreasspezifischen BACE1-Splicevarianten mit dem KCNQ1 wurde deren Genprodukt durch molekularbiologische DNA-Modifikation im heterologen Ex¬pressionssystem nachempfunden und ebenfalls elektrophysiologisch untersucht. Die subzelluläre Lokalisation der verkürzten BACE1 Proteine wurde durch Immunfluoreszenz dargestellt. Ergebnisse und Beobachtungen: Die KCNQ1-Referenzmessungen zeigten über die Zeit eine deutliche Variabilität in der Morphologie des KCNQ1-Stromes, welche aus einer verlangsamten Aktivierungskinetik resultierte. Die Co-Transfektion von BACE1 veränderte die Morphologie der KCNQ1-Ströme und bewirkte eine Verlangsamung der Aktivierungskinetik, eine Rechtsverschiebung der Halbaktivierungsspannung V1/2 sowie eine Verringerung der Ratio der Amplitudenfaktoren für Reopening und Deaktivierung aus Tailcurrent-Analysen. Die Fusionsproteine erlaubten demgegenüber nur eine Beurteilung in Form der normierten Leitfähigkeit, wobei die V1/2 der KCNQ1-BACE1-Fusionsproteine mit zunehmendem BACE1-Anteil im Sinne von (B1)1-(Q1)4 &lt; (B1)2-(Q1)4 &lt; (B1)4-(Q1)4 anstieg. Die Co-Transfektion von BACE1 oder KCNE1 bewirkte eine weitere Rechtsverschiebung in der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung, wobei BACE1 bei (B1)4-(Q1)4 keine Effekte zeigte. Die V1/2 von (B1)4-(Q1)4 + E1 war größer als die V1/2 von (B1)1-(Q1)4 + E1. Wie bereits in der Literatur beschrieben stieg die Halbaktivierungsspannung V1/2 der KCNQ1-KCNE1-Fusionsproteine mit zunehmendem KCNE1-Anteil. Die Co Transfektion von BACE1 bewirkte eine weitere Rechtsverschiebung, wobei die V1/2 von (E1)4-(Q1)4 + B1 größer war als die V1/2 von (E1)1-(Q1)4 + B1. Die verkürzten BACE1-Varianten zeigten in der Immunfluoreszenz eine intrazelluläre Lokalisation und bewirkten in der Elektrophysiologie lediglich eine reduzierte Amplitude des KCNQ1-Stroms ohne Effekte auf die Stromkinetik. Schlussfolgerungen und Diskussion: Die Variabilität der KCNQ1-Ströme innerhalb einer Zelllinie wird in der Literatur ebenfalls repräsentiert. Charakteristische Auswertungsparameter wie Stromhöhe, Aktivierungskinetik oder Leitfähigkeit zeigten sich innerhalb einer Messreihe konstant. Der BACE1-Effekt konnte in allen Kontrollexperimenten nachgewiesen werden, womit die Validität der Experimente gewährleistet ist. Die Fusionsproteine repräsentieren BACE1-Effekte nur teilweise, was an den unnatürlichen Bindungsverhältnissen der konkatemeren Strukturen liegen könnte. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass pro KCNQ1-Homotetramer bis zu vier KCNE1- oder BACE1-Einheiten binden können (folgend: Q4:E4 oder Q4:B4). Die Stöchiometrie von Q4:E1:B1 ist existent und ebenso mindestens eine höhere Stöchiometrie, wobei nicht zwischen Q4:E2:B2 und Q4:E4:B4 unterschieden werden kann. Durch die unterschiedliche Wirkung von KCNE1 und BACE1 an (Q1)4-(B1)4 erscheint es möglich, dass KCNE1 und BACE1 unterschiedliche Bindungsstellen am Kv7.1 haben, was für eine maximale Stöchiometrie Q4:E4:B4 sprechen würde. Die physiologische Bedeutung einer variablen Stöchiometrie von Q4:E1:B1 bis Q4:E4:B4 bedarf weiterer experimenteller Abklärung und ist möglicherweise bei der Entwicklung von Antiarrhythmika von Bedeutung. Die pankreasspezifischen verkürzten BACE1-Isoformen wirken wahrscheinlich nur indirekt auf den KCNQ1, zum Beispiel durch Beeinflussung des Traffickings oder der Proteinexpression. Da einer pankreatischen β-Zell-Dysfunktion oxidativer Stress zugrunde liegt und oxidativer Stress wiederum eine erhöhte BACE1-Expression bewirkt, wäre ein kompensatorischer Mechanismus im Rahmen der Entstehung von Diabetes mellitus Typ 2 denkbar.
description: Objectives: The β-secretase BACE1 plays a key role in the pathogenesis of Alzheimer's disease and modulates certain voltage-gated ion channels in a β-subunit-like manner. The non-proteolytic interaction of BACE1 with Kv7.1 (KCNQ1) adds another factor to the much-discussed stoichiometry of the IKS current (KCNQ1/KCNE1), which plays an important role in the regulation of cardiac function. Both BACE1 and Kv7.1 are also expressed in pancreas and are thought to play a role in insulin secretion. The low β-secretase activity despite high expression in this tissue has been explained by splice variants that are translated into enzymatically inactive isoforms of BACE1 with unknown biological function. The first aim of the thesis was to investigate the stoichiometry of KCNQ1 (Q1) with KCNE1 (E1) and BACE1 (B1). As a secondary goal, the interaction of KCNQ1 with the pancreas-specific isoforms BACE1 476 and BACE1-455 was investigated. Design and Methods: To investigate the stoichiometry of KCNQ1 with KCNE1 and BACE1 (Q4:E1-4:B1-4), two assays of fusion proteins generating a defined stoichiometry (4:4, 4:2 or 4:1) of KCNQ1 and KCNE1 or KCNQ1 and BACE1 were studied in heterologous system using the patch-clamp technique in the whole cell configuration. To investigate the interaction of pancreas-specific BACE1 splice variants with KCNQ1, their gene products were modeled by molecular biological DNA modification in heterologous expression system and studied electrophysiologically. The subcellular localization of the truncated BACE1 proteins was visualized by immunofluorescence. Results: KCNQ1 reference measurements showed a variability in the morphology of the KCNQ1 current over time resulting from slowed activation kinetics. Co-transfection of BACE1 altered the morphology of KCNQ1 currents and caused further slowing of activation, a rightward shift in half-activation voltage V1/2, and a reduction in the ratio of reopening and deactivation amplitude factors from tail current analyses. The V1/2 of the KCNQ1-BACE1 fusion proteins was progressively depolarized with an increasing proportion of tethered BACE1 proteins in the sense of (B1)1-(Q1)4 &lt; (B1)2 (Q1)4 &lt; (B1)4-(Q1)4. Co-transfection of BACE1 or KCNE1 caused a further rightward shift in the voltage dependence of activation, with BACE1 having no effect on (B1)4-(Q1)4. The V1/2 of (B1)4-(Q1)4 + E1 was higher than the V1/2 of (B1)1 (Q1)4 + E1. As previously described in the literature, the half-activation voltage V1/2 of the KCNQ1-KCNE1 fusion proteins became progressively depolarized with an increasing proportion of tethered KCNE1-subunits. Co-transfection of BACE1 caused a further rightward shift, and V1/2 of (E1)4-(Q1)4 + B1 was higher than V1/2 of (E1)1-(Q1)4 + B1. The truncated BACE1 variants showed an intracellular localization in immunofluorescence and only caused a decreased amplitude of the KCNQ1 current without affecting current kinetics in patch-clamp-recordings. Conclusions: The variability of KCNQ1 currents within a cell line has also been reported in literature before. Characteristic parameters such as current amplitude, activation kinetics or conductivity remained constant throughout a series of measurements. The BACE1 effect was detected in all control experiments. This ensures the validity of the experiments. The fusion proteins consisting of KCNQ1 and BACE1 only partially represent the effects of BACE1, possibly due to the unnatural binding properties of the concatemeric structures. However, there is evidence that up to four KCNE1 or BACE1 units can bind per KCNQ1 homotetramer (Q4:E4 or Q4:B4). The stoichiometry of Q4:E1:B1 exists, as well as at least one higher stoichiometry. However, there is no distinction between Q4:E2:B2 and Q4:E4:B4. Based on the different effects of KCNE1 and BACE1 at (Q1)4-(B1)4, it seems possible that KCNE1 and BACE1 have different binding sites at Kv7.1, which would suggest a maximum stoichiometry of Q4:E4:B4. The physiological significance of a variable stoichiometry from Q4:E1:B1 to Q4:E4:B4 requires further experimental clarification and may be relevant for the development of antiarrhythmic drugs. The pancreas specific truncated BACE1 isoforms are likely to have only an indirect effect on KCNQ1, for example by affecting trafficking or protein expression. Since pancreatic β-cell dysfunction is based on oxidative stress and oxidative stress causes increased BACE1 expression, the expression of the short BACE1 isoforms may be a compensatory mechanism in the initial state of type 2 diabetes mellitus.