title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen der Biosynthese und Metabolisierung von cyclischen Dipeptiden in Actinobacteria
Creators: name: Brockmeyer, Kirsten
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2019
Subjects: cyclische Dipeptide, Cyclodipeptidsynthase, Cyclodipeptidoxidase, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces noursei
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: 2,5-Diketopiperazines are the basic structures of some already approved drugs with different indications and therefore represent important skeletons for new potential biological active structures. This basic structure can be formed by cycliodipeptide synthases (CDPSs). It has been postulated that special motifs in the active center allow a prediction of possibly formed cyclic dipeptides. In this work, a cyclodipeptide synthase from Nocardiopsis prasina named CDPS-Np was analyzed. According to the motives in the active center, this CDPS is proposed to produce phenylalanine-containing cyclic dipeptides. After experimental proof, CDPS-Np was shown to produce tyrosine-containing cyclic dipeptides with cyclo(L-Tyr-L-Phe) as the main and cyclo(L-Tyr-L-Tyr), cyclo(L-Tyr-L-Met) and cyclo(L-Tyr-L-Leu) or cyclo(L-Tyr-L-Ile) as minor products. These results provided evidence that this kind of prediction allows to become a hint of possible product formation, but an experimental proof is necessary. Due to the deviation of the actual from the expected product formation, motifs in the active center were analyzed. The substrate specificity should be changed by site-directed mutagenesis in the two binding pockets P1 and P2. For this purpose, various mutations were first introduced in position Thr82 and Tyr196 in binding pocket P1 of CDPS-Np. The original intention to change the substrate specificity could not be achieved by these experiments. However, an 8-fold increase in product formation of cyclo(L-Tyr-L-Phe) and 10-fold of cyclo(L-Tyr-L-Tyr) were detected in the case of the mutant CDPS-Np_T82V_Y196 compared to that of the wild type. Site-directed mutagenesis in the binding pocket P2 also did not change the product spectrum. While the CDPSs are able to form the basic structure of potential active agents, different enzymes are able to modify these structures. Methyltransferases are able to attach a methyl-residue to either C- or O-atoms. Cytochrome P450 enzymes are for example able to bild C-C-bonds and to introduce hydroxy groups or double bonds. In this work, cyclodipeptide oxidases (CDOs) were analyzed, which introduce double bonds at positions 3 and 6 of 2,5-diketopiperazine skeleton. CDOs consist of two subunits, which are only together active for introduction of double bonds. Until now only two CDOs has been analyzed in details. AlbA and AlbB from Streptomyces noursei and Ndas_1146 and Ndas_1147 from Nocardiopsis dassonvillei. The third CDO named CDOA-Np and CDOB-Np from Nocardiopsis prasina has been analyzed in this work. For this purpose, the overlapping nucleotide sequence was cloned into a vector for overproduction of CDOA-Np and CDOB-Np in E. coli. By identifying the enzymatic products of a biotransformation of the natural substrate cyclo(L-Tyr-L-Phe) in E. coli, the functionality of CDOA-Np and CDOB-Np could be confirmed. Furthermore, the activity of His6-CDOA-Np and CDOB-Np-His6 was also shown. For futher investigations, the separated genes of the cyclodipeptide oxidases from Nocardiopsis prasina and Nocardiopsis dassonvillei were already cloned into different expression vectors for overproduction in E. coli. This requires the optimization of overproduction and purification of CDOA-Np-His6, CDOB-Np-His6, Ndas-1146-His6 and Ndas-1147-His6. Furthermore, the cyclodipeptide oxidase from Nocardiopsis prasina was compared with the alrady known cyclodipeptide oxidases from Nocardiopsis dassonvillei and Streptomyces noursei. For this purpose, the overlapping nucleotide sequence from Streptomyces noursei was cloned into an expression vector for overproduction of AlbA and AlbB in E. coli. Subsequently, the biotransformation of various cyclic dipeptides by CDOA-Np/ CDOB-Np, Ndas_1146/Ndas_1147 as well as AlbA/AlbB was investigated. After identification of the enzymatic products by LC-MS, these results were compared. In this context it was the first time that these three cyclodipeptide oxidases has been compared with each other. These enzymes share similar, but not identical behaviors. The mechanism of the CDO reaction is unknown. A direct dehydration, α-hydroxylation followed by loss of water or imine formation and a following isomerization are possible scenarios. The mechanism was analyzed by biotransformation of deuterated cyclo(L-Tyr-L-Phe) using CDOA-Np/CDOB-Np from Nocardiopsis prasina, Ndas_1146/Ndas_1147 from Nocardiopsis dassonvillei and AlbA/AlbB from Streptomyces noursei in E. coli. After analysis of the products by LC-MS, no product indicating an imine-intermediate were detected. These results suggest a direct dehydration as plausible mechanism of the reaction.
description: 2,5-Diketopiperazine sind die Grundgerüste von einigen bereits zugelassenen Arzneistoffen mit unterschiedlichen Indikationen und stellen ebenso wichtige Grundstrukturen für weitere potentielle Wirkstoffe dar. Das Grundgerüst der 2,5-Diketopiperazine kann unter anderem von Cyclodipeptid-synthasen (CDPSs) synthetisiert werden. Es wurde bereits berichtet, dass die Motive im aktiven Zentrum dieser Enzyme eine Vorhersage über die potentiell gebildeten cyclischen Dipeptide zulassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine putative Cyclodipeptidsynthase namens CDPS-Np aus Nocardiopsis prasina analysiert. Nach der Betrachtung der Motive im aktiven Zentrum zufolge waren hierbei phenylalanin-haltige cyclische Dipeptide zu erwarten. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CDPS-Np mit cyclo(L-Tyr-L-Phe) als Hauptprodukt und cyclo(L-Tyr-L-Tyr), cyclo(L-Tyr-L-Met) und cyclo(L-Tyr-L-Leu) oder cyclo(L-Tyr-L-Ile) als Nebenprodukte tyrosin-haltige cyclische Dipeptide synthetisiert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass diese Vorhersagen zwar einen Hinweis auf die Synthese cyclischer Dipeptide ermöglichen, der experimentelle Nachweis der tatsächlichen Produkte jedoch unverzichtbar ist. Aufgrund der Abweichung der tatsächlichen von der erwarteten Produktbildung von CDPS-Np wurden die Motive im aktiven Zentrum genauer betrachtet. Durch zielgerichtete Mutagenese innerhalb der zwei Bindetaschen P1 und P2 des aktiven Zentrums von CDPS-Np solllte deren Substratspezifität verändert werden. Hierfür wurden zunächst verschiedene zielgerichtete Mutationen innerhalb der Bindetasche P1 in den Positionen Thr82 und Tyr196 eingeführt. Die ursprüngliche Absicht die Substratspezitität von CDPS-Np zu verändern konnte durch diese Experimente jedoch nicht erzielt werden. Allerdings konnte bei CDPS-Np_T82V_Y196F im Vergleich zum Wildtypen die 8- bzw. 10-fache Produktion von cyclo(L-Tyr-L-Phe) bzw. cyclo(L-Tyr-L-Tyr) festgestellt werden. Gezielt eingeführte Mutationen innerhalb der Bindetasch P2 von CDPS-Np führten ebenso nicht zur Änderung des Produktspektrums. Während die Cyclodipeptidsynthasen die Grundstruktur für potentielle Wirkstoffe bilden, können diese durch unterschiedliche Enzyme derivatisiert werden. Hierbei können zum einen Methyltransferasen Methyl-Reste auf C- oder O-Atomen anfügen. Zum anderen können Cytochrom P450 Enzyme C-C-Bindungen, Hydroxygruppen oder Doppelbindungen einfügen. In dieser Arbeit wurden Cyclodipeptidoxidasen (CDOs), welche Doppelbindungen an Positionen 3 und 6 in 2,5-Diketopiperazin-Grundgerüste einfügen können, analysiert. Cyclodipeptidoxidasen bestehen aus zwei Untereinheiten, welche nur zusammen zu der enzymatischen Bildung einer Doppelbindung führen. Bisher wurden zwei Cyclodipeptidoxidasen genauer analysiert. Zum einen AlbA und AlbB aus Streptomyces noursei und zum anderen Ndas_1146 und Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei. In dieser Arbeit wurde eine weitere putative Cyclodipeptidoxidase, CDOA-Np und CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, genauer betrachtet. Hierfür wurde die überlappende Gensequenz in einen Vektor zur Überproduktion von CDOA-Np und CDOB-Np in E. coli kloniert. Durch die Identifizierung der enzymatischen Produkte einer Biotransformation des naturlichen Substrats cyclo(L-Tyr-L-Phe) in E. coli konnte die Aktivität von CDOA-Np und CDOB-Np bestätigt werden. Des Weiteren konnte ebenso die Aktivität von His6-CDOA-Np und CDOB-Np-His6 gezeigt werden. Für weitere Untersuchungen wurden die einzelnen Gensequenzen der Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis prasina und Nocardiopsis dassonvillei in verschiedene Expressionsvektoren für E. coli kloniert. Hierbei bedarf es der Optimierung der Überproduktion und Reinigung von CDOA-Np-His6, CDOB-Np-His6, Ndas-1146-His6 und Ndas-1147-His6. Des Weiteren sollte die Cyclodipeptidoxidase aus Nocardiopsis prasina mit den bereits bekannten Cyclodipeptidoxidasen aus Nocardiopsis dassonvillei und Streptomyces noursei verglichen werden. Hierfür wurde zunächst die überlappende Gensequenz aus Streptomyces noursei zur Überproduktion von AlbA und AlbB in E. coli kloniert. Anschließend wurde die Biotransformation verschiedener cyclischer Dipeptide durch CDOA-Np/CDOB-Np, Ndas_1146/Ndas_1147 sowie AlbA/AlbB untersucht. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produktbildung durch die drei Cyclodipeptidoxidasen mittels LC-MS wurden diese miteinander verglichen, was bisher noch nicht betrachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass diese sich sehr ähnlich, jedoch nicht gleich verhalten. Der Reaktionsmechanismus der CDOs ist weitgehend unbekannt. Es kommt hierbei eine direkte Dehydrierung, eine α-Hydroxylierung mit anschließender Dehydratation oder eine Imin-Bildung in Verbindung mit einer anschließenden Isomerisierung in Frage. In dieser Arbeit wurde der Reaktionsmechanismus anhand einer Biotransformation von deuteriertem cyclo(L-Tyr-L-Phe) durch CDOA-Np/CDOB-Np aus Nocardiopsis prasina, Ndas_1146/Ndas_1147 aus Nocardiopsis dassonvillei und AlbA/AlbB aus Streptomyces noursei in E. coli analysiert. Nach der Identifizierung der enzymatischen Produkte mittels LC-MS konnten keine Produkte, welche auf Bildung einer Imin-Zwischenstufe hindeuten, festgestellt werden. Diese Ergebnisse deuten somit auf eine direkte Dehydrierung.