title: Expression and modulation of TRP channels in human microvascular endothelial cells
title: Expression und Modulation von TRP-Kanälen in humanen mikrovaskulären Endothelzellen
Creators: name: Klockner, Annette Elisabeth Astrid
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: calcium signaling
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
endotheliale Stimulation
Medizin, Gesundheit
endothelial cells, TRP channels
Calciumsignal, TRP-Kanäle
endothelial stimulation, RT-PCR
Endothelzelle

description: The importance of the vascular
      endothelium in the regulation of cardiovascular homeostasis
      has become more and more apparent because of an increasing
      quantity of data. The endothelial activation und dysfunction
      plays an important role in the pathogenesis of numerous
      cardiovascular diseases. To fulfill their diverse functions
      endothelial cells express a multitude of membrane ion
      channels. The control of the calcium influx and the
      modulation of the membrane potential of the endothelial cell
      are therefore of particular importance. The alteration of the
      intracellular calcium concentration results from release of
      calcium from the intracellular space as well as via calcium
      influx from extracellular. The extracellular calcium influx
      is thereby, among others, mediated by non-selective cation
      channels. These include the 28 human members of the TRP
      family. The importance of TRP channels in human endothelial
      cells is not yet completely understood. The aim of the
      present study was to examine systematically the expression of
      all human TRP channels in human dermal microvascular
      endothelial cells (HMEC-1) using the Real-Time RT-PCR, a
      well-established method. GAPDH was used as a house-keeping
      gene, the expression of the endothelial marker vWF was
      likewise studied. To verify the results of every carried out
      RT-PCR, a gel electrophoresis was performed for every RT-PCR.
      In addition the quality of every primer was validated by
      applying linearity analyzes. The expression of the mRNA of
      TRPC1, TRPC4, TRPC6, TRPC7, TRPV1, TRPV2 and TRPV4, TRPM4,
      TRPM5, TRPM6, TRPM7, TRPM8 as well as TRPA1, TRPML2, TRPP1
      and PKD2like1 could be demonstrated. The notably high
      expression of TRPC1, TRPC4, TRPC6, TRPM6, TRPM7, TRPM8 and
      TRPP1 was noteworthy. Little is known about activation and
      modulation of TRP channels in human endothelial cells.
      Therefore, using RT-PCR, HMEC-1 were subsequently stimulated
      with different vasoactive (bradykinin, histamine,
      endothelin-1) and proangiogenic factors (VEGF, erythropoetin)
      to investigate whether these modulate the expression of TRP
      channels in HMEC-1. A gel-electrophoresis confirmed the
      results of the RT-PCR. A significant higher expression of
      TRPM8 after stimulation of HMEC-1 with VEGF as well as a
      significant higher expression of TRPM4, TRPM5 and TRPM8 after
      stimulation with bradykinin was able to be demonstrated. In
      conclusion the results of this underlying study confirm that
      the human microvascular endothelial cells HMEC-1 express
      specific TRP channels. In addition it was able to be shown
      that some of the TRP channels (TRPM4, TRPM5, TRPM8) have a
      significantly higher expression after endothelial
      stimulation. Hence, on the basis of endothelial stimulation
      it was demonstrated that vasoactive and proangiogenic factors
      can modulate the expression of TRP channels in the
      endothelium. In contrast to all expectations an extraordinary
      expression of certain TRP channels after stimulating despite
      statistical significance HMEC-1 with diverse substances was
      not shown. The deeper understanding of the physiological
      function of the endothelium and of the vascular system in
      general provides the key to understanding pathophysiological
      processes and discloses new therapeutically perspectives. In
      the future, because of their complex functions in the
      cardiovascular system, TRP channels may gain importance for
      medical drug development.
description: Die Bedeutung des vaskulären
      Endothels für die Regulation der kardiovaskulären Homeostase
      ist, aufgrund einer zunehmenden Zahl an Daten, offensichtlich
      geworden. Die endotheliale Aktivierung und Dysfunktion spielt
      eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese zahlreicher
      kardiovaskulärer Erkrankungen. Um ihre Aufgaben erfüllen zu
      können, exprimieren Endothelzellen eine Vielzahl von
      membranständigen Ionenkanälen. Besondere Bedeutung weist
      dabei die Kontrolle des Ca2+-Einstroms und die Modulation des
      Membranpotentials der Endothelzelle auf. Die Veränderung der
      [Ca2+]i erfolgt sowohl über die Freisetzung von Ca2+ aus dem
      Intrazellulärraum als auch durch den Ca2+-Einstrom von
      außerhalb der Zelle. Der extrazelluläre Ca2+-Einstrom wird
      unter anderem über nicht-selektive Kationenkanäle vermittelt.
      Zu diesen gehören die 28 humanen Mitglieder der TRP-Familie.
      Die Bedeutung der TRP-Kanäle in humanen Endothelzellen ist
      bislang nicht abschließend geklärt. Das Ziel dieser Arbeit
      war die systematische Untersuchung der Expression aller
      humanen TRP-Kanäle in humanen dermalen mikrovaskulären
      Endothelzellen (HMEC-1) mittels der etablierten Methode der
      Real-Time RT-PCR. Als house-keeping-Gen diente GAPDH, als
      endothelialer Marker vWF, deren Expression ebenfalls
      untersucht wurden. Zur Verifizierung der durch RT-PCR
      gewonnenen Daten erfolgte von jeder durchgeführten RT-PCR
      eine Gelelektrophorese. Zusätzlich wurde die Qualität jedes
      Primers mittels Linearitätsanalysen validiert. Hierbei konnte
      die Expression der mRNA von TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPC6 und
      TRPC7, TRPV1, TRPV2 sowie TRPV4, TRPM4, TRPM5, TRPM6, TRPM7
      und TRPM8, TRPA1, TRPML2, TRPP1 und PKD2like1 gezeigt werden.
      Von diesen TRP-Kanälen war eine besonders hohe Expression von
      TRPC1, TRPC4, TRPC6, TRPM6, TRPM7, TRPM8 sowie TRPP1
      nachweisbar. Da wenig bekannt ist über die Aktivierung und
      Modulation von TRP-Kanälen in Endothelzellen, wurde
      anschließend mittels RT-PCR untersucht, ob die Stimulation
      der HMEC-1 mit verschiedenen vasoaktiven (Bradykinin,
      Histamin, Endothelin-1) und pro-angiogenetischen Faktoren
      (VEGF, Erythropoetin) zu einer Modulation der Expression der
      28 humanen TRP-Kanäle in HMEC-1 führt. Auch hier wurden
      mittels Gelelektrophorese die gewonnenen Daten der RT-PCR
      bestätigt. Hierbei konnte nach Stimulation mit VEGF eine
      signifikant erhöhte Expression von TRPM8 aufgezeigt werden,
      ebenso war nach Stimulation mit Bradykinin eine signifikant
      erhöhte Expression von TRPM4, TRPM5 und TRPM8 aufzuweisen.
      Insgesamt konnte anhand der Ergebnisse der vorliegenden
      Studie bestätigt werden, dass humane mikrovaskuläre
      Endothelzellen von Typ HMEC-1 spezifische TRP-Kanäle
      exprimieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die
      Expression einiger dieser Kanäle nach endothelialer
      Stimulation erhöht wird. Somit konnte anhand der
      Stimulationsversuche gezeigt werden, dass vasoaktive und
      pro-angiogenetische Faktoren die Expression der TRP-Kanäle im
      Endothel modulieren können. Entgegen der Erwartungen war
      keine jedoch keine deutlich intensivere Expression einzelner
      TRP-Kanäle, trotz statischer Signifikanz nach Stimulation der
      HMEC-1, zu beobachten. Das bessere Verständnis der
      physiologischen Funktion des Endothels und des vaskulären
      Systems liefert den Schlüssel zum Verständnis
      pathophysiologischer Prozesse und eröffnet neue
      therapeutische Perspektiven. So ist es vorstellbar, dass in
      Zukunft TRP-Kanäle aufgrund ihrer komplexen Funktionen im
      kardiovaskulären System an Bedeutung für die Entwicklung
      neuer Pharmaka gewinnen.