Ανασταλτική δράση των βιοπαραγόντων των γενών Bacillus, Pseudomonas και Serratia επί φυτοπαθογόνων μυκήτων in vitro και in planta
Creators: name: Γκιούρα, Αννα Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Βιολογική καταπολέμηση
Βιομεμβράνη
Σκληρώτια
Biological control
Biofilm
Sclerotium

description: Η διαχείριση των εδαφογενών φυτοπαθογόνων μυκήτων αποτελεί ένα δυσεπίλυτο πρόβλημα εξαιτίας του πεδίου δράσης τους (έδαφος), των ανθεκτικών μορφών επιβίωσης που παράγουν και της μειωμένης ύπαρξης αποτελεσματικών δραστικών ουσιών για την καταπολέμηση τους. Δεδομένης της έντονης ανάγκης για τον περιορισμό της αλόγιστης χρήσης των χημικών σκευασμάτων στις μέρες μας αλλά και για την ύπαρξη αποτελεσματικών μέσων καταπολέμησης με το λιγότερο περιβαλλοντικό κόστος, η στροφή της φυτοπροστασίας στη βιολογική καταπολέμηση φαντάζει περισσότερο από ποτέ επιβεβλημένη. Η παρούσα διατριβή κινήθηκε στα πλαίσια της βιολογικής καταπολέμησης με τη διερεύνηση της ανασταλτικής δράσης εννέα βακτηριακών στελεχών (Bacillus cereus S76, S79, Serratia marcescens PiHa5II, S47, S52, Serratia rubidaea S55, S49, Pseudomonas chlororaphis Toza7, PCL1391) έναντι έξι φυτοπαθογόνων μυκήτων (Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Sclerotium rolfsii, Botrytis cinerea και Rhizoctonia solani) σε πειράματα in vitro και in planta. Η δράση του συνόλου των βακτηριακών στελεχών ελέγχθηκε in vitro σε διπλές καλλιέργειες, με την χρήση δύο υποστρωμάτων ανάπτυξης, και αφορούσε παρατήρηση ζώνης αναστολής στη μυκηλιακή ανάπτυξη ή αποικισμό των υφών. Επιπλέον in vitro ελέγχθηκε η αναστολή ανάπτυξης των μυκήτων V. dahliae και B.cinerea υπό την επίδραση οργανικών εκχυλισμάτων και ακατέργαστων υπερκειμένων 24ωρης και 72ωρης βακτηριακής καλλιέργειας σε πλάκα μικροτιτλοποίησης, των παραπάνω βακτηριακών στελεχών, εκτός των S79 και PCL1391. Ακόμη in vitro ελέγχθηκε η βιωσιμότητα των σκληρωτίων των μυκήτων S. sclerotiorum και S. rolfsii μετά από επώαση σε βακτηριακή καλλιέργεια, βακτηριακό υπερκείμενο και αιώρημα βακτηριακών κυττάρων, των στελεχών S. marcescens PiHa5II, S52, S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76. Ενώ ελέγχθηκε επίσης in vitro η ικανότητα των στελεχών να σχηματίζουν βιομεμβράνη σε πλάκα μικροτιτλοποίησης σε δύο υποστρώματα ανάπτυξης, σε δύο χρόνους επώασης και εφαρμόζοντας δύο διαφορετικά πρωτόκολλα. Tα πειράματα in planta περιελάμβαναν τρία διαφορετικά παθοσυστήματα και σε καθένα από αυτά ελέγχθηκε η ικανότητα των στελεχών να περιορίσουν την ασθένεια που προκαλεί ο εκάστοτε μύκητας. Το πρώτο παθοσύστημα, περιελάμβανε φυτά ντομάτας, το μύκητα Forl και τα στελέχη B. cereus S76 και P. chlororaphis ToZa7 και επιπλέον το αργιλοπυριτικό ορυκτό ζεόλιθος. Σε αυτό μετρήθηκε και η προαγωγή ανάπτυξης των φυτών. Το δεύτερο παθοσύστημα περιελάμβανε φυτά πιπεριάς, το μύκητα V. dahliae και τα στελέχη B. cereus S76 και S. rubidaea S55. Τέλος το τρίτο παθοσύστημα, περιελάμβανε ηλίανθο τον μύκητα S. sclerotiorum και τα βακτηριακά στελέχη S. marcescens PiHa5II, S52, B. cereus S76, P. chlororaphis Toza7 και S. rubidaea S55, ενώ συμπεριλήφθηκαν και επεμβάσεις με τα μυκητοκτόνα fludioxonil και metelaxyl-M. Η ικανότητα αναστολής της βλάστηση των σκληρωτίων, κρίθηκε επιτυχής στο σύνολο το στελεχών που δοκιμάστηκαν, ενώ in vitro μελέτες στα τρυβλία έδειξαν ότι η ανασταλτική δράση επηρεάζεται απόλυτα από το υπόστρωμα ανάπτυξης αλλά και από το ίδιο το παθογόνο, με το τελευταίο να συμφωνούν απόλυτα και τα αποτελέσματα της βιοδοκιμής στην πλάκα μικροτιτλοποίησης. Ο σχηματισμός βιομεβράνης έδειξε να υπερτερεί για τα στελέχη των βακτηρίων S. marcescens και S. rubidaea, έναντι των B. cereus και P. chlororaphis και επηρεάστηκε έντονα από τις συνθήκες του χρόνου και της μεθόδου επώασης. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων in planta έδειξαν πως οι δύο βιοπαράγοντες B. cereus S76 και P. chlororaphis ToZa7 περιόρισαν τη σήψη λαιμού και ριζών της τομάτας από τον μύκητα Forl και έδειξαν να προάγουν την ανάπτυξη φυτών. Αντίθετα η καταστολή της βερτισιλλίωσης στην πιπεριά, δεν επετεύχθη, δείχνοντας πως η δράση των στελεχών εξαρτάται από το παθογόνο και πιθανόν και από τον ξενιστή, αφού το στέλεχος S76 ήταν κοινό και στα δύο παθοσυστήματα. Τέλος στο ηλίανθο η δράση των βακτηρίων έδειξε να επηρεάζεται άμεσα από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τρεις σημαντικούς βιοπαράγοντες, τους B. cereus S76, P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55 για τη βιολογική καταπολέμησης του S. sclerotiorum, αναδεικνύοντας επίσης τη συνεργατική δράση των βιοπαραγόντων με τα μυκητοκτόνα fludioxonil και metelaxyl-M.
description: The management of soil-borne plant pathogenic fungi is an intractable problem because of their action area (soil), their resistant survival forms, and the lack of effective chemicals for their control. Due to the strong need to reduce the excessive use of chemical preparations and to replace them with alternative effective means with the least environmental costs, nowadays a shift to the use of biological control seems more than ever imperative. The present study was excecuted in the framework of biological control in order to investigate the inhibitory effect of nine bacterial strains (Bacillus cereus S76, S79, Serratia marcescens PiHa5II, S47, S52, Serratia rubidaea S55, S49, Pseudomonas chlororaphis Toza7, PCL1391) against six phytopathogenic fungi (Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium dahliae, Fusarium oxysporum f.sp. radicis lycopersici, Sclerotium rolfsii, Botrytis cinerea and Rhizoctonia solani) in vitro and in planta experiments. The effect of all bacterial strains was tested in vitro in dual cultures with all fungi, using two different growth media, whereas the inhibition zone in mycelial growth or hyphal colonization was recorded. Additionally, inhibition of V. dahliae and B. cinerea at the presence of bacterial culture supernatants (24 and 72-hour bacterial culture) or their crude extracts of most bacterial strains, except for S79 and PCL1391, was tested using a microtiter bioassay. Also, viability of S. sclerotiorum and S. rolfsii sclerotia was tested after incubating them in bacterial culture, bacterial culture supernatant and bacterial cell suspension of S. marcescens PiHa5II, S52, S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 and B. cereus S76 strains. Moreover, the ability of all strains to form biofilm in two growth media, two incubation periods, and applying two different protocols in a microtiter plate was also tested. On the other hand, in planta experiments included three different pathosystems and in each of them the inhibition ability of each bacterial strain against a fungal pathogen was tested. The first pathosystem consisted of tomato, Forl, and strains B. cereus S76 and P. chlororaphis ToZa7. Bacteria were applied via aluminosilicate mineral zeolite. Disease severity and growth promotion of plant was measured. The sencond pathosystem included pepper and fungus V. dahliae. Bacterial strains used as biocontrol agents were B. cereus S76 and S. rubidaea S55. In the third pathosystem, sunflower seeds coated or not, with the fungicides fludioxonil and metalaxyl-M, the fungus S. sclerotiorum and the bacterial strains of S. marcescens PiHa5II, S52, B. cereus S76, P. chlororaphis Toza7 and S. rubidaea S55 were applied. The inhibition of sclerotial germination was successful using all tested strains, while the inhibitory effect depended on the growth substrate and the pathogen. These effects were also observed in the microtiter assay. The biofilm formation ability was superior in S. marcescens and S. rubidaea strains, but not almost nonexisting to B. cereus and P. chlororaphis and was significantly affected by the incubation period as well as the protocol applied. The results of experiments in planta showed that both B. cereus S76 and P. chlororaphis ToZa7 inhibited Forl and were able to promote the growth of tomato plants. On the other hand, suppression of Verticillium wilt on pepper in the second pathosystem was not induced, a finding that indicate on the dependence on the pathogen itself, since the strain S76 was common in both the above pathosystems. Finally, in sunflower, the activity of bacteria was directly affected by environmental conditions such as rain. In addition, three major biocontrol agents, B. cereus S76, P. chlororaphis ToZa7 and S. rubidaea S55, were effective against S. sclerotiorum, addressing the need for compined applications of biocontrol agents and the fungicides fludioxonil and metelaxyl-M.