Improving in vitro embryo production: the use of oocyte chromatin configuration and cumulus cell gene expression to set up customized pre-IVM protocols
Creators: name: DIECI, CECILIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2018

description: L'efficienza delle tecnologie di produzione di embrioni in vitro (IVP) � ancora limitata sia in ambito zootecnico che in clinica umana. L'IVP consiste in 4 fasi principali in cui si verificano in laboratorio gli eventi chiave dello sviluppo di un nuovo organismo: 1) il recupero di ovociti immaturi (arrestati in profase I della divisione meiotica) da donatrici vive o isolati da ovaie raccolte da animali macellati; 2) la maturazione in vitro (IVM), cio� la coltura degli ovociti fino allo stadio di metafase II della meiosi; 3) la fecondazione in vitro (IVF) e 4) la coltura in vitro dell'embrione (IVC), durante la quale, gli embrioni di nuova formazione, raggiungono lo stadio di blastocisti. Dopo la fecondazione in vitro, gli embrioni possono essere trasferiti in riceventi attraverso il trasferimento embrionario o essere congelati per un uso successivo. Nonostante i potenziali progressi offerti dai sistemi IVP, la percentuale di successo nella specie bovina � rimasta pressoch� stabile negli ultimi 30 anni ed � limitata ad un terzo degli ovociti isolati dall'ovaio che raggiungono lo stadio di blastocisti. Questa condizione � purtroppo comune ad altre specie. La qualit� degli ovociti � cruciale per l'efficienza dei protocolli di IVP e la maturazione dell'ovocita rappresenta il primo processo limitante di tutto il sistema. Al momento della rimozione dai follicoli ovarici antrali, gli ovociti si trovano arrestati alla profase della prima divisione meiotica, la cosiddetta fase della vescicola germinale (GV), in cui la cromatina � racchiusa all'interno dell'involucro nucleare. Gli ovociti allo stadio GV abitualmente utilizzati nelle pratiche di IVP sono raccolti da follicoli antrali di medie dimensioni e, in quanto tali, devono ancora completare i passaggi finali di crescita e differenziamento necessari ad acquisire la cosiddetta "competenza di sviluppo", ossia il corredo di organuli e molecole necessario a sostenere la fecondazione e lo sviluppo dell'embrione. Inoltre, poich� lo sviluppo dei follicoli dei mammiferi avviene a ondate successive, uno dei fattori limitanti � rappresentato dall'eterogeneit� intrinseca degli ovociti sottoposti a IVM e dalla mancanza di approcci in vitro dedicati per finalizzare il loro processo di differenziamento. Gli studi condotti durante il programma di dottorato mirano a definire parametri morfologici e funzionali non invasivi che possano essere utilizzati come marker del differenziamento degli ovociti e che possano essere considerati per migliorare l'efficienza delle tecniche attuali. Gli studi sono stati condotti sui modelli animali suino e bovino. In entrambe le specie, i cambiamenti progressivi nella configurazione su larga scala della cromatina, che caratterizzano il processo di differenziamento degli ovociti, sono stati utilizzati come marker di acquisizione della competenza allo sviluppo embrionale. In particolare, l'ipotesi di lavoro principale � stata quella di utilizzare la configurazione della cromatina come indicatore dell'eterogeneit� della popolazione di ovociti sottoposti a IVM e di mettere a punto protocolli personalizzati di maturazione con maggiore efficienza ed efficacia, che consentissero di massimizzare lo sfruttamento della riserva ovarica. Nella prima parte di studi, sono stati caratterizzati i diversi pattern di configurazione della cromatina GV negli ovociti suini e queste informazioni sono state utilizzate per realizzare un protocollo di prematurazione in grado di migliorare la competenza allo sviluppo dell'ovocita. Nella seconda parte, nel modello bovino, sono stati studiati i profili di trascrizione delle cellule del cumulo basati sulla configurazione della cromatina nell?ovocita allo stadio di GV quali marker di competenza allo sviluppo embrionale. In questi studi, l'uso combinato dei parametri morfologici insieme all'analisi dei profili trascrittomici delle cellule del cumulo, ci ha permesso di convalidare un protocollo di coltura di base per la prematurazione dell'ovocita bovino. In conclusione, i nostri dati indicano che il miglioramento dell?efficienza dei protocolli di IVP richiede la selezione di una popolazione di ovociti pi� omogenea, che deve essere trattata considerando specifici bisogni colturali dell'ovocita, quindi progettando un sistema di prematurazione personalizzato. In particolare, i nostri risultati contribuiscono all'identificazione di specifici biomarcatori non invasivi dello stato di differenziamento e di salute dell'ovocita che possono fornire strumenti utili per la selezione di ovociti di buona qualit� e per migliorare il potenziale riproduttivo nei mammiferi di interesse zootecnico.