Επίδραση απότομων μεταβολών της θερμοκρασίας στην κινητική συμπεριφορά πολύ μικρών πληθυσμών (2-10 κυττάρων) του παθογόνου Salmonella enterica ser. Typhimurium
Creators: name: Δανιάς, Παντελής Ευάγγελου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Salmonella Typhimurium
μεμονωμένα κύτταρα
θερμοκρασιακές μεταβολές
single cells
temperature shifts

description: Δεδομένου ότι η επιμόλυνση των τροφίμων με παθογόνους μικροοργανισμούς συμβαίνει συνήθως σε επίπεδα μερικών κυττάρων, η ποσοτική περιγραφή της διακυτταρικής παραλλακτικότητας είναι εξαιρετικά σημαντική για τον προσδιορισμό επικινδυνότητας. Επιπλέον, οι συχνές θερμοκρασιακές μεταβολές κατά τη συντήρηση και διακίνηση των τροφίμων καθιστούν ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα τη μελέτη της ατομικής μικροβιακής συμπεριφοράς σε δυναμικές συνθήκες θερμοκρασίας. Στην παρούσα διατριβή εφαρμόστηκε μία μικροσκοπική μέθοδος πραγματικού χρόνου για τη μελέτη της επίδρασης απότομων μεταβολών της θερμοκρασίας στην κινητική ατομική συμπεριφορά κυττάρων του παθογόνου Salmonella enterica ser. Typhimurium. Καταγράφηκε η αποικιακή ανάπτυξη 305 συνολικά μεμονωμένων κυττάρων S. Typhimurium σε στερεό εργαστηριακό θρεπτικό υπόστρωμα (tryptone soy agar). Εξετάστηκαν τρείς συνθήκες θερμοκρασίας: α) 15°C σταθερά, β) απότομη μείωση από 25°C σε 15°C κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης και γ) απότομη μείωση από 25°C σε 15°C κατά τη φάση προσαρμογής. Φωτογραφίες επιλεγμένης περιοχής του παρασκευάσματος λαμβάνονταν αυτόματα ανά τακτά χρονικά διαστήματα (5 min) και για συνολικό χρονικό διάστημα 20-30 ωρών από τον ενοφθαλμισμό. Μετά την καταμέτρησή του, ο αριθμός των κυττάρων κάθε αποικίας σε συνάρτηση με το χρόνο προσαρμόστηκε στο πρωτογενές μοντέλο των Baranyi και Roberts (1994) με στόχο την εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων ανάπτυξης, δηλαδή του μέγιστου ειδικού ρυθμού ανάπτυξης (μmax) και της διάρκειας της φάσης προσαρμογής (λ). Στην περίπτωση της μείωσης της θερμοκρασίας κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης, στο παραπάνω μοντέλο προσαρμόστηκε ο αριθμός των κυττάρων κάθε αποικίας σε σχέση με το χρόνο μετά τη μεταβολή της θερμοκρασίας, με σκοπό την εκτίμηση του μmax και της «επιπρόσθετης φάσης προσαρμογής» που προκλήθηκε από τη θερμοκρασιακή μεταβολή. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν μια σημαντική διακυτταρική παραλλακτικότητα στην κινητική συμπεριφορά μετά την πτώση της θερμοκρασίας. Στην περίπτωση της θερμοκρασιακής μεταβολής κατά την εκθετική φάση, παρατηρήθηκε μία «επιπρόσθετη φάση προσαρμογής» σε σημαντικό αριθμό κυττάρων η οποία κυμάνθηκε από 0 έως 1,26 ώρες (μέση τιμή = 0,294 ώρες) με συντελεστή παραλλακτικότητας (CV) 112,3%, ο οποίος σε σύγκριση με τον αντίστοιχο CV της φάσης προσαρμογής στους 15°C είναι αυξημένος κατά 57,8%. Μικρότερη παραλλακτικότητα παρατηρήθηκε στο μέγιστο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης μετά τη θερμοκρασιακή μεταβολή, με τον τελευταίο να έχει μέση τιμή 0.330 ώρες-1 και CV = 34,1% (αύξηση κατά 5,6% σε σχέση με τον αντίστοιχο CV του μmax στους 15°C). Οι κατανομές των παραπάνω κινητικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκαν για την προσομοίωση της επίδρασης των απότομων μεταβολών της θερμοκρασίας σε διάφορα επίπεδα πληθυσμών. Οι προσομοιώσεις Monte Carlo υπέδειξαν ότι η παραλλακτικότητα μειώνεται σε υψηλά πληθυσμιακά επίπεδα. Στην περίπτωση της θερμοκρασιακής μεταβολής κατά τη φάση προσαρμογής, παρατηρήθηκε αύξηση του CV της φάσης προσαρμογής κατά 21,9% σε σχέση με τη σταθερή θερμοκρασία (15°C), ενώ επιβεβαιώθηκε η ισχύς της αθροιστικής προσέγγισης για την εκτίμηση της φάσης προσαρμογής σε δυναμικές συνθήκες θερμοκρασίας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για την κατανόηση της αποικιακής ανάπτυξης μεμονωμένων κυττάρων κάτω από μεταβαλλόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη στοχαστικών μοντέλων πρόβλεψης της μικροβιακής συμπεριφοράς με στόχο τη βελτίωση των μελετών προσδιορισμού επικινδυνότητας.
description: Since contamination with pathogens usually occurs with very low numbers, the development of stochastic approaches that can describe the variability of single cell behavior are necessary for realistic estimations of safety risks. In addition, considering that temperature fluctuations are often during distribution and storage of foods, the study of the effect of temperature shifts on individual cell behavior is of great importance. In the present study a time-lapse microscopy method was applied to study the effect of abrupt temperature shifts on the kinetic behavior of very small populations of Salmonella enterica ser. Typhimurium. The colonial growth of 305 S. Typhimurium single cells on tryptone soy agar was monitored in the present study. Three temperature conditions were examined: a) constant 15ºC, b) abrupt shift from 25ºC to 15ºC during exponential growth phase, c) abrupt shift from 25ºC to 15ºC during lag phase. Images were taken at 5-min intervals for 20-30 hours after inoculation. After counting, the numbers of each colony cells vs time were fitted to the primary model of Baranyi and Roberts (1994) for the estimation of the growth kinetic parameters, that is the maximum specific growth rate (μmax) and the lag time (λ). Besides, in the case of the temperature reduction during exponential growth, the data fitted in the above model were the numbers of each colony cells vs time after the temperature shift so as to estimate the growth rate and the “additional lag” caused by the shift. The results showed a significant variability in the kinetic behavior after the temperature downshift. In the case of the temperature shift during exponential growth, the “additional lag” ranged from 0 to 1.26 h (mean=0.294 h) with a coefficient of variation (CV) of 112.3%, which is 57.8% higher than the CV of lag at constant 15ºC. The specific growth rate (mean=0.330 h-1) after the shift showed less but still significant variability with CV=34.1% (which is 5.6% higher than the CV of μmax at constant 15ºC). The above distributions of the kinetic parameters were used to simulate the effect of abrupt temperature shifts at various population levels. The Monte Carlo simulations showed that the variability is masked at high population levels. In the case of the temperature shift during lag phase, a 21.9% increase of the CV of lag was observed compared to the constant temperature (15ºC). Moreover, the validity of the cumulative approach was confirmed for the prediction of lag at dynamic temperature conditions. The results of the present study provide useful information for understanding the colonial growth of single cells under fluctuating temperature environments and can be used for the development of stochastic microbial growth models which can improve risk assessment studies.