title: Structural and functional insights into class-IV lanthipeptide biosynthesis
Creators: name: Sigurdsson, Arnar
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
subject: protein structure
subject: lanthipeptide
subject: CuvL
subject: lanthionine synthetase
subject: RiPPs

description: Natural products have served various functions in human civilization for thousands of years. From food stuffs like caffeine to pharmaceuticals such as penicillin or vancomycin, they are constantly growing field that humans find new utility for each century. One such group is the Ribosomally Synthesized and Post-translationally Modified Peptides (RiPPs), a broad group exhibiting diverse modifications and bioactivities. RiPPs are, as the name implies, genetically encoded peptides that undergo a series of modifications and finally export from the cell as a mature peptide. Typically, each peptide has its own dedicated biosynthetic machinery that selectively introduces modifications. The selectivity between modification enzymes and the peptide substrate is guided by the amino acid composition of a recognition region in the precursor peptide, which has evolved to recognize its cognate enzymes. The largest family of RiPPs, are the lanthipeptides, which are characterized by the installation of thioether macrocycles termed lanthionines. There are five known classes of lanthipeptides, all categorized by their synthetases that install the lanthionines. However, limited structural information is known about the synthetases, and now four classes have their respective synthetases crystallized, and structures elucidated. Understanding the protein structures will be essential for future lanthipeptide engineering and research. Therefore, the effort toward crystallizing and elucidating the structures of new synthetases is essential for advancing the field. Thus, I focused on a class-IV lanthipeptide synthetase from a thermophilic actinomycete with a relatively small gene cluster. The investigation into the class-IV lanthipeptide curvocidin began by the cultivation of the native host Thermomonospora curvata but yielded miniscule amounts. Therefore, heterologous expression of the corresponding gene cluster was done in Streptomyces coelicolor to produce curvocidin. Structural elucidation efforts by mass spectrometry, revealed a tricyclic globular topology of the produced lanthipeptide, similar to that of cinnamycin or duramycin, lanthipeptides of a different class. So far, no bioactivity was discovered for curvocidin, and its biological role remains enigmatic. In fact, the class-IV lanthipeptides still do not have any reported bioactivity, whereas most other classes have been shown to be antimicrobial, antiallodynic, or morphogenic. In addition, utilizing heterologous expression of the synthetase CuvL and solid phase peptide synthesis of the precursor peptide, enabled us to investigate the mechanism of curvocidin biosynthesis. Most surprisingly, the lanthionine formation followed a non-linear pattern, starting at the central lanthionine bridge. This was followed by the adjacent bridge, bringing the N- and C-terminus of the peptide into proximity and finally closing the last thioether at the centre of the peptide. Exhaustive crystallization efforts resulted in a 2.9 Å crystal structure of the tri-domain lanthipeptide synthetase CuvL, revealing a circular topology. The circular topology is achieved by docking a not before described β-hairpin motif of the N-terminal lyase domain into the C-terminal cyclase domain. Additionally, the crystal structure displayed the precursor bound to its central kinase domain. Due to the conformational ensembles that the peptide adopted, we were unable to model the side chains of the peptide. Although, through the advances in artificial intelligence, we were able to use in silico modelling of the synthetase-peptide complex to show the interactions. The models highlighted an amphipathic α-helix conformation on the N-terminal region of the peptide, suggesting that these interactions are vital to peptide recognition, which was further confirmed by NMR spectroscopy and showing this to be a prevalent structural motif in class-III and -IV lanthipeptides for recognition. Lastly, genome mining and sequence analysis were performed to investigate some of the differences between CuvL and other class-IV lanthipeptide synthetases, which revealed insights into the organization of various class-IV lanthipeptide synthetases. Comparatively, their catalytic domains displayed a high degree of homology, yet significant differences were observed at the interface regions between these domains. The impact of this is still not known but could be implicated in the diverse biosynthesis of lanthipeptides. Overall, the herein presented work provides insights into the biosynthesis of class-IV lanthipeptides and the first crystal structure of their respective lanthipeptide synthetase. Although the lanthipeptide curvocidin did not display any bioactivity, genome mining revealed several interesting new lanthipeptide synthetases and peptides which might aid the investigation of the biological function of these intriguing secondary metabolites.
description: Naturstoffe werden seit tausenden Jahren von Menschen für verschiedene Funktionen genutzt: von ihren anvegenden Effekten von beispielsweise bei Koffein, bis hin zu bedeutenden Pharmazeutika wie Penicillin oder Vancomycin, haben diese Substanzen die Entwicklung der Menschheit mitbegleitet. Hierbei handelt es sich um ein stetig wachsendes Forschungsfeld, in dem im letzten Jahrhunderts in rapider Geschwindigkeit neue Subtanzen und Anwendungen dieser entwickelt wurden. Eine solche Naturstoffklasse stellen die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten Peptide (RiPPs) dar. Diese repräsentieren eine große Gruppe von Peptid-Naturstoffen mit diversen Modifikationen und bioaktiven Eigenschaften. Entsprechend dem Namen, handelt es sich bei ihnen um genetisch codierte Peptide, die nach der ribosomalen Synthese eine Reihe von Modifikationen durchlaufen und schließlich als fertiges RiPP aus der Zelle exportiert werden. Jedes Peptid verfügt in der Regel über seine eigene individuelle Biosynthese-Maschinerie. Die hohe Selektivität der Modifizierungsenzymen für ihr Peptidsubstrat wird durch eine spezifische Aminosäuresequenz in der sogenannten „Erkennungsregion“ im Vorläuferpeptid gesteuert. Die größte Familie der RiPPs stellen die Lanthipeptide dar, welche durch die Bildung von Thioether-Makrozyklen, wie Lanthioninen charakterisiert sind. Es gibt fünf bekannte Klassen von Lanthipeptiden. Diese werden durch die respektiven Synthetasen, die die Lanthionine ausbilden, kategorisiert. Allerdings ist wenig über die Struktur dieser Synthetasen bekannt und jetzt vier dieser Klassen sind mit Kristallstrukturen der Synthetasen strukturell aufgeklärt. Das Verständnis dieser Proteinstrukturen wird für die zukünftige Forschung von Lanthipeptidsystemen von zentraler Bedeutung sein. Daher ist die Fokussierung auf die Kristallisation und Strukturaufklärung neuer Synthetasen essentiell für die Weiterentwicklung des Fachgebiets. Aus diesem Grund wird im Zug dieser Arbeit eine Synthetase der Klasse-IV Untersucht, zu welcher es bisher noch keine strukturellen Informationen gibt. Die kleine Größe des zugehörigen Genclusters aus einem thermophilen Actinomyceten eröffnet hierbei die Möglichkeit diesen vollständig zu charakterisieren. Die Untersuchung dieses Klasse-IV Lanthipeptids, Curvocidin genannt, erfolgte zuerst durch die Kultivierung des natürlichen Produzenten, Thermomonospora curvata. Da die produzierte Menge von Curvocidin zu gering für Studien zur Strukturaufklärung war wurde ein alternativer Ansatz gewählt. Die heterologe Expression des Genclusters in Streptomyces coelicolor ermöglichte eine folgende Strukturaufklärung. Diese ermittelte eine trizyklische, globuläre Topologie, ähnlich Cinnamycin und Duramycin aus einer anderen Lanthipeptid klasse. Allerdings konnte keine Bioaktivität für Curvocidin festgestellt, und seine biologische Rolle bleibt rätselhaft. Bisher zeigten in der Literatur noch kein Klasse-IV Lanthipeptid eine klar nachweisbare Bioaktivität, während die meisten anderen Klassen als antimikrobielle, antiallodynische oder morphogene Wirkstoffe eingestuft werden konnten. Durch die heterologe Expression der Synthetase CuvL und der Festphasenpeptidsynthese des entsprechenden Vorläuferpeptids CuvA konnte der Mechanismus der Curvocidin-Biosynthese untersucht werden. Überraschenderweise folgt die Lanthioninbildung einem nicht-linearen Muster. Dieser beginnt mit der Ausbildung der zentralen Lanthioninbrücke, gefolgt von der benachbarten Brücke, die die N- und C-Termini des Peptids näher bringt, und so die Schließung des letztes Thioethers im Zentrum des Peptids ermögicht. Des Weiteren führten umfangreiche Kristallisationsbemühungen zu einer 2,9 Å Kristallstruktur der Lanthipeptid-Synthetase CuvL, die eine zirkuläre Topologie aufweist. Diese zirkuläre Struktur wird durch das Andocken eines zuvor nicht beschriebenen β-Haarnadel-Motivs der N-terminalen Lyase-Domäne in die C-terminale Cyclase-Domäne erreicht. Darüber hinaus zeigte die Kristallstruktur, dass das Vorläuferpeptid an die zentrale Kinase-Domäne gebunden wird. Aufgrund des Strukturensembles, dass das Peptid annahm, konnten die Seitenketten des Peptids jedoch nicht modelliert werden. Mit Hilfe von Fortschritte in der künstlichen Intelligenz konnten wir ein in silico-Modell des Synthetase-Peptid-Komplexes erstellen, um die atomaren Interaktionen zu untersuchen. Die Modelle zeigten eine amphipathische α-Helix-Konformation im N-terminalen Bereich des Peptids, was darauf hinweist, dass diese Interaktionen für die Peptiderkennung von entscheidender Bedeutung sind. Dies wurde weiterhin durch NMR-Spektroskopie Messungen bestätigt und diese Helixstruktur folgend als vorherrschendes strukturelles Erkennungsmotiv bei Klasse-III und -IV Lanthipeptiden ermittelt. Zuletzt wurden Genome Mining und Sequenzanalysen durchgeführt, um Unterschiede zwischen CuvL und anderen Klasse-IV Lanthipeptid-Synthetasen zu untersuchen. Dies gab Einblicke in die Organisation verschiedener Lanthipeptid-Synthetasen, deren katalytische Domänen hochgradig homolog sind, aber große Unterschiede in den Schnittstellenregionen zwischen den Domänen zeigen. Die Auswirkungen davon sind noch nicht bekannt, könnten jedoch bei der mehrstufigen Biosynthese von Lanthipeptiden eine Rolle spielen. Insgesamt bietet die hier vorgestellte Arbeit Einblicke in die Biosynthese von Klasse-IV-Lanthipeptiden und die erste Kristallstruktur ihre entsprechende Lanthipeptid-Synthetase. Obwohl das Lanthipeptid Curvocidin noch keine nachgewiesene Bioaktivität hat, zeigte das Genom-Mining mehrere neue Lanthipeptid-Synthetasen und Vorläuferpeptide, die mögliche Bioaktivität besitzen könnten.