title: Proof-of-principle for the in vivo StreptoTag method-based isolation of RNA binding proteins
Creators: name: Glanz, Stephan
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: RNA-Protein Interaktionen spielen eine Schlüsselrolle in fundamentalen zellulären Prozessen aller lebenden Organismen. Diese Art der Interaktion ist vor allem in pathogenen Netzwerken involviert und folglich von besonderem Interesse. Eine Vielzahl in vitro basierender Methoden für die Isolierung RNA bindender Proteine wurde etabliert, wobei diese jedoch oftmals zur Isolierung von Artefakten führen, welche unter zellulären Bedingungen nicht anzutreffen wären. Die hier vorgestellte neuartige Methode ist eine Technik zur Identifizierung von RNA-Protein Interaktionen basierend auf einem in vitro transkribierten RNA Aptamer (STag) und dessen spezifischer Bindung an Streptomycin. RNA-bindende Proteine aus rohem Zellextrakt binden im Folgenden an die chromatographisch immobilisierte Ziel-RNA und können durch Zugabe von Streptomycin co-eluiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System für eine Anwendung in vivo angepasst. Hierzu wurden eine STag-RNA mit einer Protein-bindenden Sequenz transient in eukaryonten Zellen exprimiert, und damit die RNA-Protein Interaktion unter zellulären Bedingungen ermöglicht. Zum Nachweis, dass dieses Prinzip grundsätzlich funktioniert, wurde das HIV-1 RNA-bindende Protein Rev aus HEK293 transfizierten Zellen isoliert. Für die Standardisierung der Methode war ein hohes Syntheselevel der Ziel RNA in transfizierten Zellen sowie die Optimierung der Bindungskonditionen von Rev zur SRS-RNA ausschlaggebend. Im finalen Schritt wurden HEK293 Zellen mit dem RNA- sowie dem Protein-kodierenden Vektor co-transfiziert und das Rev Protein erfolgreich durch Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die hiermit etablierte in vivo StreptoTag Methode sollte zukünftig die Isolierung sowie Identifizierung von bislang unbekannten RNA-bindenden Proteinen sowie Protein-interagierenden Faktoren in zellulärem Umfeld erleichtern.
description: RNA-protein interactions play a key role in fundamental cellular processes in living organisms. As this type of interaction is a common regulator in pathogenic networks, it is of special interest to be investigated. A number of in vitro methods have been established to isolate RNA binding proteins. However, these in vitro approaches may result in artificial interactions that would not occur within cellular conditions. Here, the “StreptoTag” method for isolation of RNA binding proteins in vivo is presented. The StreptoTag method, a novel technique to identify RNA-protein interactions, employs in vitro transcribed RNA target sequences, which are tagged with an RNA aptamer (STag) specifically binding to streptomycin. RNA binding proteins from crude cell extracts may bind to the chromatographically immobilised target RNA and are then co-eluted by addition of streptomycin. In the presented work, the system was adapted for in vivo applications. Therefore, putative protein target STag-RNA was transiently expressed in eukaryotic cells, allowing RNA-protein interactions to occur under physiological conditions. For a proof-of-principle, we isolated the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) RNA binding protein Rev from HEK293 cells by expressing STag-RNA harbouring the Rev responsive element (RRE). Standardisation of the method included high-level target RNA synthesis in transfected cells and optimisation of binding conditions, allowing high affinity interaction of Rev with the STag-RRE-RNA. In the final step, target RNA and Rev protein were co-expressed in HEK293 cells and successfully purified by affinity chromatography. In conclusion, the established in vivo StreptoTag method may facilitate isolation and identification of currently unknown RNA binding proteins and further protein interacting factors in cellular environments.