title: Cloning of butyrogenic genes from Clostridium difficile and metabolic pathway reconstitution in Escherichia coli
title: Klonierung und Expression von Clostridium difficile Butyrate synthetische Gene in Escherichia coli
title: Cloning of butyrogenic genes from Clostridium difficile and metabolic pathway reconstitution in Escherichia coli
Creators: name: Aboulnaga, El-Hussiny Ahmed Ahmed Ali
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Enzymcharakterisierung
Butyrate production
Butyrat Produktion,
Klonierung und Expression butyrogene Gene
enzyme characterization
Biowissenschaften, Biologie
Stoffwechselweg Design
cloning and expression butyrogenic genes
Metabolic pathway design

description: Die vorliegende Arbeit stellt die
      Entwicklung eines neuartigen Modellsystems dar, welches die
      Implementierung kompletter Stoffwechselmodule in geeignete
      Akzeptororganismen zur systematischen Anwendung in der
      synthetischen Biologie erlaubt. Das bisher wenig untersuchte
      butyrogene Stoffwechselmodul aus Clostridium difficile wurde
      hierzu in Escherichia coli transferiert, bestehend aus den
      individuellen Enzymen Thiolase (EC 2.3.1.9),
      -Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (EC 1.1.1.157), Crotonase
      (EC 4.2.1.17), Butyryl-CoA-Dehydrogenase einschließlich der
      zwei Elektronen transferierenden Flavoprotein-Untereinheiten
      (EC 1.3.99.2), Phosphotransbutyrylase (EC 2.3.1.19) sowie
      Butyratkinase (EC 2.7.2.7). Die Enzyme wurden zunächst
      einzeln in E. coli produziert, funktionell getestet und in
      vitro charakterisiert. Die dabei erhaltenen kinetischen
      Parameter sowie Daten zur Substratspezifität und Stabilität
      gaben Aufschluss über die Fähigkeit der Enzyme zur Produktion
      von Intermediaten innerhalb von Modulen zur Produktion
      kurzkettiger Fettsäuren. In diesem Kontext wurden neue
      Aktivitätstests für Phosphotransbutyrylase und Butyratkinase
      etabliert. Im Zuge der Entwicklung einer vereinfachten
      Methode zur Messung der verzweigten Butyryl-CoA-Dehydrogenase
      in der physiologischen Reaktionsrichtung konnte die Annahme
      erhärtet werden, das C. difficile entgegen dem intensiv
      untersuchten C. acetobutylicum mithilfe dieses Enzyms zur
      Energiekonservierung mit reduziertem Ferredoxin fähig ist.
      Der potentielle Einfluss derartiger Enzyme bei der Produktion
      von Butan-1-ol in rekombinanten Stämmen wird in diesem
      Kontext diskutiert. Zur Konstruktion des kompletten
      artifiziellen Stoffwechselmoduls wurden die Gene für oben
      erwähnte Enzyme erfolgreich zu einem synthetischen Operon
      assembliert, resultierend in den Expressionsplasmiden
      pASG.wt_BUTD und pASG.wt_BUTAC, welche sich lediglich in der
      Herkunft des Butyryl-CoA-Dehydrogenase/ETF-Komplexes
      unterscheiden. Die Gene für den besagten Komplex stammten
      entweder aus C. difficile (pASG.wt_BUTD) oder C.
      acetobutylicum (pASG.wt_BUTAC). Die rekombinanten Butyrogenen
      Stoffwechselmodule wurden in vivo untersucht durch
      Kombinationen aus Enzymtests in zellfreien Extrakten und die
      Analyse des Fermentationsprozesses im Bezug auf
      Substrataufnahme, Biomasse-, Produkt- sowie
      Nebenproduktbildung zum Verständnis des Massenflusses
      innerhalb des Systems. Tatsächlich waren lediglich die
      rekombinanten Stämme zur Butyrat-Produktion fähig, mit
      maximalen Konzentrationen von 3,1 bzw. 3,7 mM im Medium.
      Während keine großen Unterschiede zwischen den beiden
      rekombinanten Stämmen bezüglich Wachstum, Substratverbrauch
      und Produktausbeute beobachtet werden konnten, hatte die
      Herkunft der jeweiligen Butyryl-CoA-Dehydrogenase dramatische
      Auswirkungen auf die Kinetik der Produktbildung, eine
      Beobachtung, die besonders im Bezug auf den potentiellen
      Einsatz in der biotechnologischen Lösemittelproduktion
      diskutiert wird.
description: In this study, a novel strategy
      for systematic applications in synthetic biology aiming the
      transfer of metabolic capacities from a donor to an acceptor
      organism was elucidated. As a model system, it was chosen the
      butyrate fermentation of Clostridium difficile, which has not
      been studied in details before. In order to succeed,
      individual enzymes, thiolase (EC 2.3.1.9),
      -hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (EC 1.1.1.157), crotonase
      (EC 4.2.1.17), butyryl-CoA dehydrogenase with its two
      electron transferring flavoprotein subunits (EC 1.3.99.2),
      phosphate butyryltransferase (EC 2.3.1.19) and butyrate
      kinase (EC 2.7.2.7), were initially produced in E. coli in
      order to demonstrate their functional production, followed by
      an initial characterization in vitro. Substrate specificity,
      stability and kinetic parameters were established in order to
      address their capability for the synthesis of various
      metabolic intermediates in volatile fatty acid biosynthetic
      pathways. In this context, novel enzyme tests for phosphate
      butyryl-transferase and butyrate kinase were developed and a
      facile method for testing of bi-forking butyryl-CoA
      dehydrogenase in the physiological reaction was established.
      Using the latter assay, evidence was obtained for a
      bi-forking butyryl-CoA dehydrogenase in C. difficile, which
      could allow energy conservation aided by reduced ferredoxin,
      an ability lacking in the most intensively studied pathway of
      C. acetobutylicum. The impact of such enzymes, and of the
      second rate limiting one (3-hydroxybutyryl-CoA
      dehydrogenase), in butan-1-ol-forming recombinant strains is
      discussed. Successively, the enzyme encoding genes were
      assembled in a synthetic operon in order to create an
      artificial metabolic pathway module, which was expressed from
      a single plasmid and enabled the formation of the predicted
      product, butyrate. Two different butyrate metabolic pathway
      modules, pASG.wt_BUTD and pASG.wt_BUTAC, were constructed,
      which contained the butyrate fermentation genes (thia1, hbd,
      crt2, pbt and buk) from C. difficile, but differed in the
      origin of the butyryl-CoA dehydrogenase/ETF complex genes.
      These genes were either from C. difficile (pASG.wt_BUTD) or
      C. acetobutylicum (pASG.wt_BUTAC). The recombinant
      butyrogenic pathways were analyzed in vivo by a combination
      of enzymes activity measurements in cell free extracts and
      analysis of the fermentation process: substrate uptake,
      biomass-, product- and by-product- formations were
      established in order to understand the mass flows in the
      process. Only the recombinant strains were capable to produce
      butyrate with a maximum concentration of 3.1 and 3.7 mM,
      respectively. While growth characteristics, substrate
      consumption and product yields were rather similar in the
      recombinant strains, the butyryl-CoA dehydrogenase of
      different origin and sub-class caused remarkable different
      kinetics of butyrate formation, which are discussed with
      regard to their potential applications in
      solventogenis.