Ανάπτυξη Εργαλείων Γενετικής Μηχανικής για την κατασκευή LIP2 υπερ-παραγωγικών στελεχών Yarrowia lipolytica σε συνθήκες καλλιέργειας με βάση τη Γλυκερόλη
Creators: name: Παταβού, Βικτώρια Ζήση
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Γλυκερόλη
Υποκινητές
Λιπάση 2 (LIP2)
Μεταβολική μηχανική
Yarrowia lipolytica
Glycerol
Lipase 2 (LIP2)
Metabolic engineering

description: Η Yarrowia lipolytica είναι μια μη παθογόνος, ελαιογόνος ζύμη, με αυξανόμενο ενδιαφέρον σε ερευνητικό και εμπορικό επίπεδο για περισσότερες από πέντε δεκαετίες. Το ενδιαφέρον για τη Y. lipolytica πηγάζει από τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά και το μεταβολικό της δυναμικό. Έχει το πλεονέκτημα να χρησιμοποιεί και να συσσωρεύει υδρόφοβες ουσίες (SCO) καθώς και να παράγει υψηλές ποσότητες πολύτιμων μεταβολιτών. Αποτελεί ένα αναγνωρισμένο μικροβιακό σύστημα έκφρασης/έκκρισης ετερόλογων πρωτεϊνών ενώ συχνά η ίδια Y. lipolytica ήταν το τελικό προϊόν (SCP). Η πλήρης αλληλούχιση του γονιδιώματός της επέτρεψε την ανάπτυξη μοριακών εργαλείων για τη μηχανική της ζύμης. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει μια αναγνωρισμένη ανάγκη για νέα ρυθμιστικά στοιχεία για τη βελτίωση της έκφρασης και αποτελεσματική μεταβολική μηχανική. Στην προσπάθεια μας να επεκτείνουμε τη διαθέσιμη γενετική εργαλειοθήκη στοχεύσαμε για τον εντοπισμό νέων υποκινητών που θα οδηγούν την έκφραση σε υποστρώματα γλυκερόλης, του κύριου βιομηχανικού παρα-προϊόντος της βιομηχανίας βιοντίζελ. Οι υποκινητές των γονιδίων της ιστόνης 3 (H3), της πρωτεΐνης που δεσμεύει ακυλ-CoA (ACBP) και της ομοιάζουσας με τριμεθυλαμίνη πρωτεΐνη, με αναγνωρισμένη αυξημένη έκφραση σε μέσα με βάση τη γλυκερόλη, απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Ο υποκινητής PH3 του πιο εκφραζόμενου γονιδίου της ιστόνης 3 κλωνοποιήθηκε για χαρακτηρισμό σε επισωματικό σύστημα αναφοράς μέσω του γονιδίου LacZ. Η ισχύς του προσδιορίστηκε μέσω της δραστικότητας της β-γαλακτοσιδάσης και συγκρίθηκε με γνωστούς ισχυρούς Yarrowia υποκινητές (PEXP1 &amp; PFBA1in). Τα αποτελέσματά μας για τον νέο PH3 δείχνουν ότι πρόκειται για έναν ισχυρό υποκινητή αντίστοιχο του χαρακτηρισμένου PEXP1. Στη συνέχεια, στοχεύσαμε στην ανάπτυξης στελεχών υπερ-έκφρασης της ενδογενούς εξωκυτταρικής της λιπάσης YlLIP2. Ο πρόσφατα χαρακτηρισμένος υποκινητής PH3 επιλέχθηκε για την έκφραση του LIP2 και η απόδοση του συγκρίθηκε σε επίπεδο μεταγραφής με επίσης ανασυνδυασμένα στελέχη που έφεραν αντίστοιχες πλατφόρμες υπερ-έκφρασης υπό τον έλεγχο των γνωστών ισχυρών PEXP1 και PTEF1in. Για επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων τα συστήματα έκφρασης δοκιμάστηκαν τόσο στο φυσικό στέλεχος MUCL28849 όσο και στο εργαστηριακό GM στέλεχος Po1d (CLIB139). Ύστερα από ανάλυση με RT-qPCR ανιχνεύτηκε έως και 40 φορές πολλαπλάσια με υποκινητή τον PH3. Ωστόσο, τα αποτελέσματα μας δείχνουν αδυναμία εξαγωγής ασφαλών συμπερασμάτων σχετικά με το πρότυπο έκφρασης και την πιθανή υπεροχή μεταξύ των στελεχών. Συμπερασματικά, η έρευνά μας είναι η πρώτη που χαρακτήρισε τον υποκινητή PH3 και μαζί με τους υπόλοιπους νέους υποκινητές Y. lipolytica που επεκτείνουν την ικανότητά μας να σχεδιάζουμε άγρια στελέχη Yarrowia lipolytica και να αξιοποιούμε βιομηχανικά υποπροϊόντα
description: Yarrowia lipolytica is a non-conventional, oleaginous yeast. The yeast has been used for industrial applications for over four decades for the production of organic acids, enzymes, single cell oils and proteins. Perhaps one of the most unique characteristics of Y. lipolytica is its ability to utilize a wide range of unusual oily sources e.g., industrial byproducts, and wastes, and can accumulate intracellular lipids (SCOs) up to 70% of its dry biomass. The inherent ability of this yeast to secrete a variety of proteins and grow in high titers have made Y. lipolytica a popular host for heterologous production of proteins, enzymes and other chemicals. Recent advances in understanding of Y. lipolytica metabolic pathways and with a fully sequenced genome resulted in the establishment of a Yarrowia genetic toolbox. However, there is still a recognized need for additional components to improve heterologous protein expression and metabolic engineering. In an effort to expand the available toolbox a new set of gene transcription elements were chosen for characterization. These are the promoters of the genes of histone 3 (H3), acyl-CoA-binding protein (ACBP) and trimethylamine-like protein (TMAL) previously recognized to drive expression in glycerol-based media, the main by-product of biodiesel industry. Based on these elements we engineered a new Yarrowia episomal cloning library. Promoter of the higher expressed Η3 gene was chosen for further characterization via a LacZ reporter system. Expression level was quantified by β-galactosidase activity and benchmarked against known Yarrowia strong promoters (PFBA1in, PEXP1). Our results show that PH3 is a potent promoter equivalent to the known PEXP1. Next in this work, we selected the newly identified as strong PH3 along with the known PEXP1 and PTEF1in promoters to produce overexpression strains by amplification of the endogenous LIP2 gene. The production system, applied for the extracellular lipase, was tested in both wild-type MUCL 28849 and laboratory Po1d (CLIB139) strains. In transcription analysis with RT-qPCR the one with PH3 promoter in MUCL 28849 strain showed the highest LIP2 gene expression reaching a 40-fold increase compared to wild-type. Albeit all derivatives overexpressed LIP2 gene, no strong conclusions can be draw about promoters’ expression series or likely intrastrain variability. In conclusion, our research is the first to exhibit PH3 as a strong promoter. The new genetic engineering tools we developed allowed us to establish our approach for Yarrowia lipolytica overproducing strains along with a biotechnological method for glycerol valorization