Κλωνοποίηση του δασικού είδους Pyrus spinosa Forssk. με εδώδιμους καρπούς
Creators: name: Αλεξανδρή, Στυλιανή Νεοκλή
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Pyrus spinosa
Γενότυπος
Μικροπολλαπλασιασμός
Genotype
Micropropagation

description: Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκαν οι συνθήκες κλωνοποίησης δύο γενοτύπων του είδους Pyrus spinosa. Από τον ώριμο Γενότυπο 1 (&gt;15 ετών) συλλέχθηκαν χειμερινά κλαδιά (10-15 εκ.) από τη βάση του δέντρου, το Φεβρουάριο 2014 και διατηρήθηκαν σε συνθήκες θαλάμου ανάπτυξης φυτών (24±1°C, 16 ώρες φωτοπερίοδο και ένταση φωτισμού 35 μmol.m-2s-1). Ο Γενότυπος 2, τριών ετών περίπου, διατηρήθηκε στις ίδιες συνθήκες περιβάλλοντος (Φεβρουάριος 2015). Οι νέοι βλαστοί που εκπτύχθηκαν και από τους δύο γενοτύπους χρησιμοποιήθηκαν ως έκφυτα. Η πλέον επιτυχημένη διαδικασία επιφανειακής απολύμανσης, από τις τρεις που δοκιμάστηκαν, για το Γενότυπο 1 (75±6,85%) αποδείχθηκε: η εμβάπτιση των εκφύτων σε διάλυμα αντιοξειδωτικών για 16 λεπτά, ακολουθούμενη από εμβάπτιση σε 12% v/v NaOCl για 7 λεπτά. Η ίδια μεταχείριση για το Γενότυπο 2 απέδωσε 80,5±6,26%. Τα έκφυτα και των δύο γενοτύπων τοποθετήθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα τροποποιημένου MS εγκατάστασης (thiamine-HCl 1 mg/l-1, nicotinic acid 1 mg/l-1, pyridoxine-HCl 1 mg/l-1) εμπλουτισμένο με 5 μΜ ΒΑ. Στο συγκεκριμένο στάδιο τα έκφυτα του Γενοτύπου 2, για την ανάπτυξη καλύτερης ποιότητας καλλιεργειών, διατηρήθηκαν κατά τις 2 πρώτες εβδομάδες σε 10 μmol.m-2s-1 και ακολούθως εκτέθηκαν σε 35 μmol.m-2s-1 για άλλες δύο εβδομάδες. Στο στάδιο του πολλαπλασιασμού, σε όλα τα πειράματα και για τους δυο γενοτύπους, χρησιμοποιήθηκε το θρεπτικό υπόστρωμα Pear Medium 1. Για την παραγωγή καλύτερης ποιότητας καλλιεργειών και για μεγαλύτερη αύξηση των δύο γενοτύπων δοκιμάστηκαν τρεις διαφορετικές εντάσεις φωτισμού: 10 μmol.m-2s-1 κατά τις 2 πρώτες εβδομάδες και στη συνέχεια 35 μmol.m-2s-1 για άλλες δύο, καθώς και 35 μmol.m-2s-1 και 100 μmol.m-2s-1 για τέσσερεις εβδομάδες. Καλύτερη αποδείχθηκε η πρώτη μεταχείριση. Η παραπάνω ένταση φωτισμού χρησιμοποιήθηκε για όλες τις ακόλουθες πειραματικές διαδικασίες του σταδίου αυτού. Ο καλύτερος συνδυασμός ρυθμιστών αύξησης για την παραγωγή νέων βλαστών ανά έκφυτο και την επιμήκυνσή τους ήταν 5 μΜ ΒΑ+0,0246 μΜ ΙΒΑ, ο οποίος απέδωσε 1,350±0,266 και 4,666±0,406 βλαστούς ανά έκφυτο και ικανοποιητική επιμήκυνση 0,506±0,128 εκ. και 1,280±0,133 εκ. για το Γενότυπο 1 και το Γενότυπο 2 αντίστοιχα. Παρατηρήθηκαν μορφολογικές δυσμορφίες στα έκφυτα του Γενοτύπου 2, λόγω των υψηλών συγκεντρώσεων κυτοκινίνης, καθώς και της υψηλής σχετικής υγρασίας (100%) μέσα στα σκεύη των καλλιεργειών. Η μορφολογία των καλλιεργειών αποκαταστάθηκε πλήρως με μία πολύ απλή και οικονομική πρακτική, δηλαδή χωρίς την κάλυψη των καλλιεργειών με parafilm. Για το Γενότυπο 2 από τις μεταχειρίσεις ριζοβολίας in vitro που δοκιμάστηκαν η πλέον επιτυχημένη περιλάμβανε ένα αρχικό στάδιο πρόκλησης ριζοβολίας με τη χρήση τροποποιημένου MS ρίζωσης (½ NH4NO3, ½ KNO3) και την προσθήκη 24,6 μΜ ΙΒΑ, καθώς και τη διατήρηση των μικροβλαστών σε πλήρες σκοτάδι για 7 ημέρες. Στο ακόλουθο στάδιο ανάπτυξης των ριζών, οι μικροβλαστοί μεταφέρθηκαν στο ίδιο θρεπτικό υπόστρωμα χωρίς την παρουσία αυξίνης και εκτέθηκαν σε ένταση φωτισμού 10 μmol.m-2s-1, για άλλες τέσσερεις εβδομάδες. Με την μεταχείριση αυτή τα ποσοστά ριζοβολίας έφτασαν το 83,33±5,89%, ενώ ο αριθμός των ριζών τις 6,2±0,49 ρίζες ανά μικροβλαστό με μικρό σχετικό μήκος (0,56±0,055 εκ.) και τη δημιουργία κάλλου στη βάση τους. Στο στάδιο σκληραγώγησης τα ριζωμένα φυτάρια μεταφέρθηκαν σε μικρά θερμοκήπια, σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών σε περλίτη ή βερμικουλίτη. Μετά από 4 εβδομάδες τα φυτάρια σε περλίτη παρουσίασαν ικανοποιητική επιβίωση (60%). Η κλωνοποίηση του ώριμου Γενοτύπου 1 δεν ήταν επιτυχής.
description: Cloning conditions of two Pyrus spinosa genotypes were studied in the present research. Winter branches (10-15 cm) from the lower part of the mature Genotype 1 (&gt;15-year-old) were selected in February 2014 and maintained under plant growth chamber conditions (24±1°C, 16 hr photoperiod and 35 μmol.m-2s-1 light intensity). Genotype 2, three years of age, was maintained in the same environmental conditions (February 2015). Newly emerged shoots of both genotypes were used as explants. Τhe most successful surface sterilization procedure of the three tested, for Genotype 1 (75±6,85%), was proved the soaking of explants in an antioxidant solution for 16 min, followed by a 7 min soaking in 12% v/v NaOCl. The same procedure was applied with optimal results for the juvenile Genotype 2 (80,5±6,26%). Εxplants of both genotypes were established on a modified MS establishment nutrient medium (thiamine-HCl 1 mg/l-1, nicotinic acid 1 mg/l-1, pyridoxine-HCl 1 mg/l-1) supplemented with 5 μΜ ΒΑ. Genotype 2 explants, in this particular stage, for the development of better quality cultures, were kept for the first two weeks under 10 μmol.m-2s-1 light intensity followed by their exposure at 35 μmol.m-2s-1 for the rest two weeks of culture. In all the experiments of the multiplication stage, nutrient medium Pear Medium 1 was used for both genotypes. The effect of light intensity was studied in this stage for the production of better quality cultures for both genotypes. Of the three different light intensities tested: 10 μmol.m-2s-1 for the first two weeks followed by 35 μmol.m-2s-1 for another two weeks, as well as 35 μmol.m-2s-1 and 100 μmol.m-2s-1 for four weeks. The first treatment was proved the best. The above light intensities were used in all the following experimental procedures of this stage. The best growth regulator combination for the production of new shoots per explants and their elongation was: 5 μΜ ΒΑ+0,0246 μΜ ΙΒΑ, which produced 1,350±0,266 and 4,666±0,406 shoots per explants and sufficiently good elongation 0,506±0,128 cm and 1,280±0,133 cm for Genotype 1 and Genotype 2 respectively. Morphological aberrations were observed in the multiplication stage for the explants of Genotype 2, due to relatively high concentrations of cytocinin as well as high relative humidity (100%) in culture vessels. Τhe morphology of cultures was fully restored by applying a simple and economical practice i.e. by not sealing culture vessels with parafilm. For Genotype 2 of the in vitro rooting treatments tested the most successful included an initial rooting induction stage using a modified MS rooting medium (½ NH4NO3, ½ KNO3) with the addition of 24,6 μΜ ΙΒΑ maintaining microshoots in complete darkness for 7 days. Subsequently, in the stage of root development, microshoots were transferred in the same medium without auxin, exposed at 10 μmol.m-2s-1 light intensity for another four weeks. In this particular treatment rooting percentage reached 83,33±5,89%, root number 6,2±0,49 roots per microshoot with relatively small length (0,56±0,055 cm) and callus development at the basis of microshoots. In the final stage of acclimatization, rooted plantlents of the previous stage were transferred on perlite or vermiculite in mini greenhouses maintained under controlled environmental conditions. After 4 weeks plantlents on perlite presented adequate survival 60%. Cloning of the mature Genotype was not successful.