title: Towards Improved Aldose Reductase Inhibitors - Structural and Thermodynamic Investigation of Mutant and Wild Type Aldose Reductase Inhibitor Complexes
title: Auf dem Weg zu verbesserten Aldosereduktaseinhibitoren - Strukturelle und thermodynamische Untersuchung von Wildtyp- und Mutantenkomplexen der Aldosereduktase
Creators: name: Koch, Cornelia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Kalorimetrie
Diabetes mellitus
Isothermal titration calorimetry
Inhibitor
Röntgenstrukturanalyse
aldose reductase
Aldosereduktase
Chemie
Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
Isothermale Titrationskalorimetrie
diabetes
X-ray
drug design
Wirkstoffdesign

description: Rational drug design for flexible
      proteins like human aldose reductase comprises special
      challenges to find novel lead compounds or to improve known
      inhibitors. In this thesis, diverse aspects of the complexity
      of such a task were investigated to find promising new lead
      scaffolds and enhance the affinity of known aldose reductase
      inhibitors. Within different design cycles, the prediction of
      ligand binding modes in a binding pocket capable to adapt to
      a bound ligand is such a challenging task. A benzothiazole
      scaffold originating from a virtual screening run was
      kinetically and structurally evaluated. An unexpected binding
      mode in complex with wild-type aldose reductase and a new
      protein conformer provided the basis for a further drug
      design cycle to optimize the scaffold. The benzothiazole core
      was expanded to explicitly address an additional subpocket of
      the protein to enhance both affinity and selectivity over a
      closely related protein. Flexibility is a common feature of
      many proteins. For human aldose reductase, a variety of
      conformers are adopted with different inhibitors. In Chapter
      3, the known inhibitors zopolrestat and IDD393 each in
      complex with a threonine 113 mutant and a benzothiazole
      inhibitor in complex with the wild type of aldose reductase
      were investigated with respect to the impact of inhibitor
      binding on protein conformation. Though the interaction to
      the mutated residue does not directly alter the binding mode
      of zopolrestat, a shift of its basic scaffold is induced and
      subsequently affects the interaction to a flexible loop and
      introduces disorder. With IDD393, two distinct binding site
      conformations resulting in different crystal forms can be
      directly compared. Improvements of the computational methods
      for affinity prediction from the structure of protein-ligand
      complexes requires a better understanding of the nature of
      molecular interactions and biomolecular recognition
      principles. In Chapter 4, the binding of two chemically
      closely related human aldose reductase inhibitors have been
      studied by high resolution X-ray analysis (0.92A-1.35A) and
      isothermal titration calorimetry against a series of
      single-site mutants of the wild-type protein. A crucial
      active site threonine, thought to be involved in a short
      bromine-to-oxygen halogen bond to the inhibitors in the wild
      type has been mutated to the structurally similar residues
      alanine, cysteine, serine, and valine. Overall, structurally
      the binding mode of the inhibitors is conserved; however,
      small but significant geometrical adaptations are observed as
      a consequence of the spatial and electronic changes at the
      mutation site. They involve the opening of a central bond
      angle and shifts in consequence of the lost or gained halogen
      bonds. Remarkably, the tiny structural changes are responded
      by partly strong modulation of the thermodynamic profiles.
      Even though the free energy of binding is maximally perturbed
      by only 7kJ/mol, much stronger modulations and shifts in the
      enthalpy and entropy signature are revealed which indicate a
      pronounced enthalpy/entropy compensation. However, facing
      these perturbances against the small structural changes, an
      explanatory correlation can be detected. This also provides
      deeper insights how single-site mutations can alter the
      selectivity profile of closely related ligands against a
      target protein. High resolution structural data of protein
      inhibitor complexes is the key to rational drug design.
      Synchrotron radiation allows for atomic resolution but is
      frequently accompanied by radiation damage to protein
      complexes. In Chapter 5, a human aldose reductase mutant
      complexed with a bromine substituted inhibitor was determined
      to atomic resolution. Though the radiation dose was moderate,
      a selective disruption of a bromine-inhibitor bond during the
      experiment was observed while the protein appears unaffected.
      A covalent bond to bromine is cleaved and the displaced atom
      is not scattered throughout the crystal but can most likely
      be assigned as a bromide ion to an additional difference
      electron density peak observed in the structure: The bromide
      relocates to an adjacent unoccupied site where promising
      interactions to protein residues stabilize its position.
      These findings were verified by a second similar structure
      determined with considerably higher radiation dose.
description: Rationales Wirkstoffdesign für
      flexible Proteine wie die humane Aldosereduktase ist mit
      verschiedenen Herausforderungen verbunden. Um neue
      Leitstrukturen zu finden und die Affinität bekannter
      Inhibitoren zu verbessern wurden innerhalb dieser Arbeit
      verschiedene Methoden angewendet, und dabei die
      unterschiedlichen Aspekte und deren Komplexität beleuchtet.
      Innerhalb aufeinanderfolgender Designzyklen ist die
      Voraussage von Bindungsmodi eines Liganden in einer
      anpassungsfähigen Bindetasche ein sehr komplexes Problem. Ein
      Benzothiazepin, das in einem vorhergehenden virtuellen
      Screening gefunden worden war, wurde kinetisch und
      strukturell im Komplex mit Aldosereduktase charakterisiert.
      Der dabei beobachtete, unerwartete Bindungsmodus mit einem
      neuen, bisher unbekanntem Proteinkonformer stellte die Basis
      für einen weiteren Designzyklus dar. Um das Grundgerüst zu
      optimieren, wurden Substituenten eingeführt, die eine
      Subtasche des Proteins direkt adressieren und neben der
      Affinität auch die Selektivität des Liganden gegenüber einem
      nahe verwandten Protein erhöhen sollten. Proteinflexibilität
      ist eine verbreitete Eigenschaft in Proteinen verschiedenster
      Funktionalität. Von Aldosereduktase sind eine Reihe
      unterschiedlicher Konformere bekannt, die im Komplex mit
      verschiedenen Bindungspartnern eingenommen werden. In einem
      Teil der Arbeit wurde der Einfluss von Inhibitoren auf die
      Ausbildung der verschiedenen Bindetaschenkonformere anhand
      von Zopolrestat und IDD393 im Komplex mit einer
      Threonin-113-Mutante sowie einem Benzothiazepin-Inhibitor im
      Komplex mit der Wildtypvariante von Aldosereduktase
      untersucht. Obwohl die direkte Interaktion zwischen
      Zopolrestat und der mutierten Aminosäure den Bindungsmodus
      nicht verändert, bewirkt sie eine Verschiebung des
      Inhibitorgrundgerüstes. Dies beeinflusst die Wechselwirkung
      mit einem benachbarten, beweglichen Loop, wodurch dieser
      weniger fixiert ist und Unordnung erfährt. Im Komplex mit
      IDD393 konnten zwei abweichende Bindetaschenkonformationen
      gefunden werden. Diese führten zu unterschiedlichen
      Kristallformen und konnten direkt miteinander verglichen
      werden: Die Verbesserung computergestützter Methoden zur
      Affinitätsvorhersage aus Protein-Ligand-Komplexen verlangt
      nach einem detaillierten Wissen um die Natur molekularer
      Wechselwirkungen und biomolekularer Erkennungsprinzipien.
      Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Bindung zweier chemisch
      sehr ähnlicher Aldosereduktaseinhibitoren. Hochaufgelöste
      Röntgenstrukturen (0,92 - 1,35A) und kalorimetrische
      Bindungsdaten dieser Inhibitoren im Komplex mit einer Serie
      von Bindetaschenmutanten der Aldosereduktase wurden
      analysiert. Ein entscheidendes Threonin, das vermutlich an
      einem kurzen Brom-Sauerstoff-Kontakt, einer sogenannten
      Halogenbindung, beteiligt ist, wurde durch die strukturell
      ähnlichen Aminosäuren Alanin, Cystein, Serin und Valin
      ausgetauscht. Während sich der Bindungsmodus, oberflächlich
      betrachtet, nicht verändert, sind kleinste, aber signifikante
      geometrische Anpassungen erkennbar, die das Resultat der
      räumlichen und elektrostatischen Veränderungen durch die
      Mutation sind. Dazu gehören die Aufweitung eines zentralen
      Bindungswinkels im Inhibitor sowie die Verschiebung des
      Inhibitorgerüstes durch den Verlust oder die verstärkte
      Halogenbindung. Bemerkenswert ist die Übertragung dieser
      kleinen geometrischen Änderungen in starke Änderungen der
      thermodynamischen Bindungsprofile. Obwohl die freie
      Bindungsenergie sich insgesamt um nur etwa 7 kJ/mol ändert,
      lassen sich deutlich stärkere Anpassungen in den
      enthalpischen und entropischen Bindungsbeiträgen erfassen.
      Eine ausgeprägte Enthalpie-Entropie-Kompensation wird deshalb
      vermutet. Diese Effekte lassen sich durch die strukturellen
      Änderungen erklären. Diese Erkenntnisse liefern Hinweise, wie
      Mutationen das Selektivitätsprofil von chemisch ähnlichen
      Liganden beeinflussen können. Hochaufgelöste strukturelle
      Daten von Protein-Inhibitor-Komplexen bilden die Basis für
      wissensbasiertes Wirkstoffdesign. Die Verwendung von
      Synchrotronstrahlung ermöglicht atomare Auflösungen solcher
      Komplexstrukturen, ist allerdings mit der Gefahr von
      Strahlungsschäden an Protein oder Inhibitor verbunden. In
      einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Struktur eines
      bromsubstituierten Inhibitors im Komplex mit einer
      Aldosereduktase-Mutante mit atomarer Auflösung bestimmt.
      Obwohl eine moderate Strahlungsdosis während des Experiments
      vorlag und kein Einfluss auf Proteinreste zu erkennen war,
      wurde der Bromsubstituent selektiv abgespalten. Die kovalente
      Bindung zum Brom wurde zerstört, wobei das abgespaltene Atom
      wider Erwarten wahrscheinlich als Bromid einem zusätzlichen
      Elektronendichtepeak zugeordnet werden konnte: Das Bromid
      nimmt eine neue Position in der Nähe ein, die durch
      vielversprechende Interaktionen mit benachbarten Aminosäuren
      stabilisiert wird.