title: On-line and off-line enrichment techniques combined with capillary electromigration separation methods in the analysis of highly hydrophilic analytes in biological and environmental samples
title: Online- und Offline-Anreicherungs-Techniken in Verbindung mit kapillarelektromigrativen Trennmethoden zur Analyse hochpolarer Analyte in Körperflüssigkeiten und Umweltproben
Creators: name: Rageh, Azza
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Kapillarelektromigrativen Trennmethoden
Micellar electrokinetic chromatography
Kapillarzonenelektrophorese
Hochpolarer Analyte
α-Aminocephalosporine,
Biological analysis
Laser-induzierte Fluoreszenz Detektion,Umweltanalytik
Capillary zone electrophoresis
Chemie
Nukleoside
Online- und Offline-Anreicherung
Mizellare elektrokinetische Chromatographie
Laser-induced fluorescence detection

description: In der vorliegenden Arbeit werden
      kapillarelektromigrative Trennmethoden als alternative
      Strategien zu existierenden Verfahren zur Bestimmung extrem
      hydrophiler Analyte untersucht. Es wird gezeigt, dass die
      entwickelte Methodik (unter Einschluss unterschiedlicher
      on-line und off-line Anreicherungstechniken) sich sowohl zur
      Analyse von biologischen Flüssigkeiten als auch zur Analyse
      von Umweltproben eignet. Für diese Studie wurden daher als
      polare Analyte im Urin enthaltene Nukleoside und als mögliche
      Umweltkontaminanten diskutierte α-Aminocephalosporine als
      Modell-Analyte gewählt. Nukleoside verfügen über eine
      cis-Diol-Struktureinheit, die es ihnen bei alkalischem pH
      ermöglicht, negativ geladene Komplexe mit
      Tetrahydroxyborat-Ionen zu bilden. Über die effektive
      elektrophoretische Mobilität wird gezeigt, dass der
      Komplexierungsgrad sogar bei sehr geringer
      Tetraborat-Konzentration (2,5 mmol L-1) nahe 1 liegt. Weil
      die für die untersuchten Nukleoside mit
      Kapillarzonenelektrophorese (CZE) unter Verwendung eines
      Borat-Borsäure-Puffers erreichbare Auflösung nicht
      ausreichend ist, sind zur vollständigen Trennung der
      untersuchten Nukleoside alternative Herangehensweisen
      erforderlich: (i) ein anderer Trennmodus oder (ii)
      Pufferadditive, die eine veränderte Trennselektivität
      ermöglichen. In einem ersten Schritt wird daher zunächst ein
      Verfahren entwickelt, welches mizellare elektrokinetische
      Chromatographie (MEKC) mit dem kationischen Tensid
      1-Tetradecyl-3-methylimidazoliumbromid (C14MImBr) in
      Gegenwart von Tetrahydroxyborat zur Trennung von in Urin
      enthaltenen Nukleosiden (nach Konversion in eine ionische
      Spezies) nutzt. Eine vollständige Trennung der hydrophilen
      Metabolite ist bereits bei geringer Konzentration des
      kationischen Tensids C14MImBr (20 mmol L-1) möglich
      (Hintergrundelektrolyt 5 mmol L-1 Dinatriumtetraborat, pH
      9,38). Es wird untersucht, welche Gleichgewichte bei
      Verwendung von C14MImBr als kationischem Tensid für die
      Trennung der im Urin enthaltenen Nukleoside und die Steuerung
      des Retentionsfaktors (entgegengesetzt geladene PSP)
      verantwortlich sind. Es wird gezeigt, dass die negativ
      geladenen komplexierten Nukleoside mit den C14MImBr Mizellen
      hauptsächlich elektrostatische Wechselwirkungen eingehen,
      während hydrophobe Wechselwirkungen als vernachlässigbar
      betrachtet werden können. Diesem Ergebnis entspricht, dass
      erhöhte Retentionsfaktoren sowohl mit reduzierter
      Borat-Konzentration als auch mit heraufgesetztem pH-Wert
      erhalten werden. Unter Bedingungen maximaler
      Nukleosid-Mizell-Wechselwirkung (quantifiziert durch
      Ermittlung der Gleichgewichtskonstanten) wird unter Rückgriff
      auf kombinierte on-line Anreicherungstechniken ein
      optimiertes und vollständig validiertes MEKC Verfahren zur
      Identifizierung und Quantifizierung von Nukleosiden in
      Urin-Proben entwickelt. Es wird gezeigt, dass
      “pseudostationary ion-exchanger” sweeping hauptsächlich für
      den beobachteten Anreicherungsprozess verantwortlich ist.
      C14MImBr kann jedoch aufgrund der niedrigen
      Retentionsfaktoren für Adenosin (Ado) and Cytidin (Cyd) nicht
      effizient für das Sweeping dieser Analyte eingesetzt werden.
      Außerdem komigrieren diese Nukleoside mit Bestandteilen der
      Urin-Matrix. Daher wurde zusätzlich das anionische Tensid SDS
      für ein Alternativverfahren zur Bestimmung von Ado und Cyd
      nach Überführung in kationische Spezies (unter sauren
      pH-Bedingungen) unter Verwendung von “pseudostationary
      ion-exchanger” sweeping als on-line Anreicherungsprinzip
      herangezogen. Dieses Alternativverfahren wurde erfolgreich
      angewendet, um Ado und Cyd in Urinproben zu bestimmen.
      Ergänzend wurde nachgewiesen dass mit einem
      Hintergrundelektrolyten, der ein Alkyl- oder Arylboronat
      zusätzlich zu C14MImBr enthält, die Retentionsfaktoren aller
      untersuchten Nukleoside signifikant erhöht sind. Diese
      Verschiebung der Retentionsfaktoren zu höheren Werten wird
      der Wechselwirkung mit der zusätzlich über die
      Alkyl/Aryl-Gruppe des Boronats eingeführten hydrophoben
      Struktureinheit zugeschrieben (Komplexbildung des Boronats
      mit der cis-Diol-Gruppe des Nukleosids). Es wird gezeigt,
      dass die entwickelten Optimierungsstrategien in validierten
      Verfahren genutzt werden können, die eine Identifizierung und
      Quantifizierung der untersuchten Nukleoside in Urin-Proben
      ermöglichen (Nachweisgrenzen im Bereich von 0,1-0,2 mg L-1).
      In einem zweiten Schritt wird 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin
      (2-HP-β-CD) als Puffer-Additiv in einem Borat-Borsäure-Puffer
      verwendet. Dieses Additiv ermöglicht eine Modifizierung der
      Trennselektivität und eine vollständige Trennung der
      untersuchten Nukleoside via CZE. Unter Nutzung der sehr hohen
      Komplexbildungskonstante zwischen Nukleosid und
      Tetrahydroxyborat unter gleichzeitiger Verwendung des
      selektivitätsmodifizierenden Additivs 2-HP-β-CD wird ein sehr
      empfindliches CZE-Verfahren entwickelt, dessen
      Nachweisgrenzen 10-40 μg L−1 erreichen. Dieses Verfahren
      stützt sich auf eine mehrstufige on-line Anreicherung unter
      Einbeziehung von dynamic pH junction, borate sweeping und
      large volume sample stacking (LVSS). Eine Validierung wird
      gemäß den Leitlinien der ICH durchgeführt. Das validierte
      Verfahren wird erfolgreich auf die Identifizierung und
      Quantifizierung von Nukleosiden in gespiktem und ungespiktem
      Urin angewandt. Die Ergebnisse dieses Teils der
      Untersuchungen werden nachfolgend auf die Analyse
      ausgewählter α-Aminocephalosporine in Oberflächenwasser
      übertragen. Unter Hinzuziehung einer hochempfindlichen
      Detektionsmethode (Laser-induzierte Fluoreszenz (LIF)
      Detektion) wird CZE mit LVSS-sweeping zur Analyse von
      Cefalexin und Cefadroxil in gespiktem Lahnwasser genutzt
      (Nachweisgrenzen 5-8 ng L-1).
description: The current work investigates
      capillary electromigration separation methods as alternative
      strategies to the existing methodologies for the analysis of
      highly hydrophilic analytes. Combined with different on-line
      and off-line enrichment techniques, the applicability of the
      developed approaches is demonstrated in either biological
      fluids or environmental samples. Urinary nucleosides and
      α-aminocephalosporins are selected as model analytes for the
      current study. Nucleosides possess a cis-diol moiety that
      enables them to form negatively charged complexes with
      tetrahydroxyborate under alkaline pH conditions. From the
      effective electrophoretic mobility data, it is shown that the
      degree of complexation is close to one even at very low
      tetraborate concentration (2.5 mmol L-1). Insufficient
      resolution of the studied nucleosides using capillary zone
      electrophoresis (CZE) as a standing alone technique (in the
      presence of tetraborate buffer as a background electrolyte
      (BGE)) necessitates using alternative approaches which are:
      (i) another CE mode or (ii) buffer additives that can provide
      a different separation selectivity to permit the complete
      separation of the studied analytes. Following the first
      approach, a micellar electrokinetic chromatographic method
      (MEKC) is developed for the separation of urinary nucleosides
      in their ionic form using the ionic liquid-type surfactant
      1-tetradecyl-3-methylimidazolium bromide (C14MImBr) as a
      cationic surfactant in the presence of tetrahydroxyborate. A
      complete separation of these hydrophilic metabolites is
      realized using a low concentration of C14MImBr (20 mmol L-1)
      in the BGE (5 mmol L-1 tetraborate, pH 9.38). Fundamental
      aspects underlying the separation of urinary nucleosides
      using C14MImBr are studied including the mode of interaction
      of these compounds with C14MImBr and regulation of the
      retention factors with respect to the oppositely charged PSP.
      It is proven that the negatively charged complexed
      nucleosides interact mainly with the C14MImBr micelles by
      electrostatic interaction, while hydrophobic interaction can
      be considered to be negligible. Moreover, it is demonstrated
      that the retention factors are increased with decreasing
      borate concentration and increasing pH of the BGE. Employing
      the conditions that maximize the interaction between the
      nucleosides and the C14MImBr micelles (quantified via the
      associated equilibrium constants), a fully optimized and
      validated MEKC method combined with different on-line
      enrichment techniques is successfully developed for the
      identification and quantification of nucleosides in urine
      samples. It is shown that “pseudostationary ion-exchanger”
      sweeping is the major contributor to the overall enrichment
      process. However, due to the low retention factors
      encountered for the nucleosides adenosine (Ado) and cytidine
      (Cyd), C14MImBr cannot be effectively employed for the
      sweeping of these analytes. In addition, these two
      nucleosides comigrate with urinary matrix constituents. As an
      alternative, SDS is investigated for the analysis of Ado and
      Cyd as positively charged species (under acidic pH
      conditions) together with “pseudostationary ion-exchanger”
      sweeping as on-line enrichment principle, which is applied
      successfully to the analysis of the two nucleosides in urine
      samples. Moreover, it is established that with a BGE
      containing the combination of an alkyl/aryl boronate and
      C14MImBr, the retention factors of all the studied
      nucleosides are significantly increased. The shift in the
      retention factors to higher values is attributed to the
      additional hydrophobic interaction sites introduced by the
      alkyl/aryl group of the boronate that forms a complex with
      the cis-diol group of the nucleoside. It is shown that these
      optimization strategies result in validated methods, which
      permit the successful analysis of the studied nucleosides in
      urine samples with limits of detection in the range of
      0.1-0.2 mg L-1. Following the second approach,
      2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2-HP-β-CD) is used as buffer
      additive in the presence of tetraborate buffer, which permits
      the modification of the separation selectivity and enables a
      complete separation of the investigated nucleosides via CZE.
      Taking advantage of the high complex formation constant
      between the nucleosides and tetrahydroxyborate and employing
      2-HP-β-CD as selectivity-tuning additive, a highly sensitive
      CZE method is developed based on a highly efficient on-line
      focusing procedure comprising three steps, which are dynamic
      pH junction, borate sweeping, and large volume sample
      stacking (LVSS). Limits of detection as low as 10-40 μg L−1
      are achieved. The proposed method is validated according to
      ICH guidelines and is successfully applied to the analysis of
      the nucleosides under investigation in blank and spiked urine
      samples. The outcomes of the second approach are successfully
      transferred to the analysis of selected α-aminocephalosporins
      in surface water samples. Together with the use of a highly
      sensitive detection method such as laser-induced fluorescence
      (LIF) detection, CZE with LVSS-sweeping is applied
      successfully to the analysis of cefalexin and cefadroxil in
      spiked Lahn water samples reaching limits of detection as low
      as 5-8 ng L-1.