title: Bacterial ghosts as carrier of Her-2/neu subunit vaccines
Creators: name: Meitz, Andrea
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Her-2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) steht als Onkogen im Mittelpunkt vieler Bestrebungen ein therapeutisches Mittel gegen Brustkrebs zu entwickeln. Als Mitglied der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) ist es in 30% der Brust-und Prostatakarzinomen überexprimiert und ist mit einem progressiven Verlauf der Krankheit und einer hohen Rückfallquote verbunden. Teilstrukturen dieses Oberflächenrezeptors zeigten in Immunisierungsstudien an Mäusen bereits Induktion von anti Her-2/neu Antikörper, die eine Inhibition des Tumorwachstums zur Folge hatte. Ziel dieser Arbeit war es die Bacterial Ghost Platform Technology als Delivery System dieser Teilstrukturen einzusetzen. Dafür sollten die Peptidsequenzen P4, P6 und P7- lineare Epitope von Her-2/neu gekoppelt als Multiepitop p467, ebenso wie das Konformationsepitop, Herzeptin Mimotop (hm), in den Vektor pMal-p2x kloniert und in E. coli transformiert werden. Der resultierende Vektor (pMal-467, pMal-hm) erzeugt durch IPTG-Induktion eine Maltose-Bindeprotein (MBP) Fusion mit dem Peptid (MBP-467, MBP-hm) und die Signalsequenz von MBP leitet das Fusionsprotein in das Periplasma des Bakteriums. Das Periplasma sollte vor allem dem über Schwefelbrücken zirkularisierten Herzeptin Mimotop durch die oxydative Umgebung gute Voraussetzungen bieten, um die vorgesehene Konformation, die ja nur als solche immunogen ist, einzunehmen. Zur Produktion von Bacterial Ghosts (BGs) wird die Expression von Fusionsproteinen mit nachgeschalteter Protein E vermittelter Lyse durchgeführt. Resultat ist eine nicht lebensfähige Bakterienhülle, deren periplasmatischer Raum mit dem Fusionsprotein gefüllt ist. Diese mit Tumorantigenen bestückten BGs sind als Vakzin konzipiert, das durch aktive Immunisierung eine präventive Langzeitimmunität gegen Brutkrebs erzeugen soll. In Vorversuchen wurde die erfolgreiche Expression des Fusionsproteins MBP-467 mit p467 spezifischen Antiseren mittels Western Blot Analyse nachgewiesen und es wurde eine Lyseeffizienz von 99.9% erreicht. Daraufhin wurden E. coli NM522 (pGLysivb, pMal-467) BGs in einem 20l Fermenter produziert und das fertige Produkt in einer Immunisierungstudie an Balb-c Mäusen getestet. Es konnte eine Induktion peptidspezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Vorversuche für das zyklische Herzeptin Mimotop verliefen im Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgreich. DNA Sequenzierung des klonierten Vektors pMal-hm zeigte zwar, dass das Mimotop im korrekten Leserahmen war und somit als Fusionsprotein erzeugt werden sollte, aber ein eindeutiger Nachweis über den Her-2/neu spezifischen Antikörper Trastuzumab (Handelsname Herzeptin) gelang nicht. Der Nachweis über den MBP-Teil zeigte in der Western Blot Analyse vermutlich überwiegend ein Abbauprodukt des Fusionsproteins, nur bei einzelnen Klonen war eine schwache Bande für die zu erwartende Peptidgröße sichtbar. Das Ausmaß der Expression, des Transports und der korrekten Faltung des Proteins war also entweder für einen Nachweis zu gering, oder das Fusionsprotein war instabil und wurde abgebaut.
description: In the development of therapeutic agents for treatment of breast cancer, many studies focus on Her-2/neu (human epidermal growth factor receptor 2). This oncogen that is a member of the human epidermal growth factor- receptor- family (EGFR) is over expressed in 30% of breast and prostate carcinoma and linked to poor prognosis and a high cancer relapse. Peptide structures displaying parts of the extracellular domain of Her-2/neu showed in immunization experiments of mice already induction of Her-2/neu-specific antibodies inhibiting tumor progression. The aim of this work was to use these extracellular structures for Delivery by the Bacterial Ghost Platform Technology. For this, the peptide sequences P4, P6 and P7- linear epitopes of Her-2/neu – should be coupled as multiepitope and as well as the conformational epitope of Her-2/neu, herceptin mimotope (hm), cloned into the vector pMal-p2x (resulting in pMal-467, pMal-hm) and transformed into E. coli. By induction with IPTG a fusion protein of the maltose binding protein (MBP) and the peptide is produced (MBP-467, MBP-hm). The signal sequence of MBP directs the fusion protein to the periplasmic space. The oxidative surrounding of the periplasmic space should enable disulfide bridging especially for the circularized herceptin mimotope - which is very important since the natural conformation is essential for immunogenicity. Production of Bacterial Ghosts (BGs) is accomplished by expression of these fusion proteins - followed by E-mediated lysis resulting in non-living bacterial cell envelopes carrying the desired fusion proteins in the PPS. Active immunization with tumor antigen loaded BGs should generate preventive long term immunity against breast cancer. Preliminary studies prove expression of MBP-467 by detection with p467 specific antisera in Western blot analysis. Lysis efficiency resulted in 99.9% and E. coli NM522 (pGLysivb, pMal-467) was used for BG production in a 20l Techfors fermenter. The final product was tested in immunization studies using BALB-c mice and showed induction of p467 specific antibodies. Preliminary experiments for detection of the circularized herceptin mimotope were not successful. Although DNA-sequencing of the vector showed the mimotope in the correct reading frame, detection with the monoclonal antibody Trastuzumab (trademark Herceptin) was not possible. Detection of the MBP portion by western blot analysis showed mainly a degradation product of the fusion protein and only for individual clones a faint band at the anticipated molecular weight of the target protein. The degree of expression, transport or correct folding of the protein was either too low to be detected or due to instability the fusion protein was degraded.