Τρόπος δράσης και θεραπευτικό όφελος της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης μεσεγχυματικών κυττάρων λιπώδους ιστού και νανοφορέων anti-VEGF σε επαγόμενο, ζωικό μοντέλο φλεβικής απόφραξης του αμφιβληστροειδούς
Creators: name: Γούναρη, Ελένη Α.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Απόφραξη φλέβας αμφιβληστροειδούς
Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα
Anti-vegf
Νανοφορείς
Retinal vein occlusion
Mesenchymal stromal cells
Nanocarriers

description: Τα τελευταία χρόνια, η χρήση αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (anti-VEGF) έχει συμβάλλει ενεργά στη θεραπεία της απόφραξης φλέβας αμφιβληστροειδούς (RVO) την ίδια στιγμή που πολυμερικοί νανοφορείς για διαρκή αποδέσμευση του φαρμάκου αναδύονται ταχύτατα. Παράλληλα τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) έχουν συσχετιστεί με την προστασία των γαγγλιακών κυττάρων, περιορίζοντας την εκφύλιση. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της συνδυαστικής επίδρασης MSCs προερχόμενων από το λιπώδη ιστό (ASCs) και νανοφορέων anti-VEGF με βελτιωμένες ιδιότητες σε ένα PD0325901 (αναστολέα κινάσης ΜΕΚ) φαρμακευτικά επαγόμενο μοντέλο RVO. Στην in vitro προσέγγιση της μελέτης, ο αναστολέας PD0325901 χρησιμοποιήθηκε για να επάγει την έκφραση EPCR (Endothelial Protein C Receptor), ενός κοινού για την RVO δείκτη, σε πρωτογενή σειρά ενδοθηλίου. Αντίσωμα anti-VEGF ενθυλακώθηκε σε νανοσωματίδια τροποποιημένης θειολωμένης χιτοζάνης (ThioCHI) και συνδυαστικά με MSCs εφαρμόστηκαν σε καλλιέργειες προσομοίωσης RVO. ThioCHI νανοσωματίδια επιλέχτηκαν ως πολυμερική μήτρα βελτιωμένων ιδιοτήτων βιοπροσκόλλησης για την ενθυλάκωση του anti-VEGF. Για τις in vivo πειραματικές δοκιμές, ASCs απομονώθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης λιπώδους ιστού που λήφθηκε από τη βουβωνική χώρα κονίκλου και τροποποιήθηκαν γενετικά προκειμένου να εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP. Εικοσι-τέσσερις κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν: Ομάδα Ι ASCs, ομάδα ΙΙ ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF, ομάδα III RVO και ομάδα IV ελέγχου. Για την επαγωγή RVO οι ομάδες Ι-ΙΙΙ έλαβαν ενδοϋαλοεδικά PD0325901 ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε BSS μόνο. Δώδεκα ημέρες αργότερα τα προτεινόμενα θεραπευτικά σχήματα χορηγήθηκαν στις ομάδες I-II ενώ οι ομάδες ΙΙΙ-IV έλαβαν BSS. Πριν την ευθανασία, δύο εβδομάδες αργότερα, έγινε οφθαλμολογική αξιολόγηση, ακολούθησε ιστολογική ανάλυση, ELISA για ποσοτικοποίηση εκκρινόμενων παραγόντων και Q-PCR για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης σχετιζόμενων με απόφραξη ή φλεγμονή γονιδίων. Μικρού μεγέθους παρόμοια των εμβρυϊκών βλαστοκύτταρων (VSELs) απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα των πειραματοζώων, 12 και 36 ημέρες μετά την επαγωγή και χαρακτηρίστηκαν. Τα μη φυσιολογικά επαυξημένα επίπεδα EPCR που μετρήθηκαν στο in vitro μοντέλο προσομοίωσης RVO μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά 24 και 48 ώρες μετά την έκθεση του πάσχοντος ενδοθηλίου στα nanoThioCHI-anti-VEGF και τα MSCs. Περιορισμένο οίδημα, αιμορραγίες και αποκολλήσεις αμφιβληστροειδούς παρατηρήθηκαν στις ομάδες Ι και ΙΙ σε σύγκριση με τα παθολογικά συμπτώματα της ομάδας ΙΙΙ που παρουσίαζε εικόνα πλήρους ιστολογικής αποδιοργάνωσης συνδυασμένη με θετ/ική χρώση ανοσοϊστοχημείας για δείκτες νεοαγγείωσης (FVIII) ή σχετιζόμενους με την απόφραξη. Σημαντική μείωση των υψηλών επιπέδων εκκρινόμενων φλεγμονωδών κυτοκινών μετρήθηκαν στο υαλοειδές υγρό των ομάδων Ι και ΙΙ, ενώ η έκφραση RVO-σχετιζόμενων γονιδίων και γονιδίων φλεγμονής μειώθηκε επίσης σημαντικά και ειδικότερα στην ομάδα ΙΙ. Θετικές χρώσεις ανοσοϊστοχημείας για δείκτες κυτταρικής αναγέννησης (ki-67, GFAP) παρατηρήθηκαν στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία. GFP+ ASCs, ικανά για διαφοροποίηση προς προγενήτορες νευρικών κυττάρων, ανιχνεύτηκαν στα κυτταρικά εναιωρήματα των ιστών της ομάδας ΙΙ. Η θετική χρώση αλκαλικής φωσφατάσης σε συνδυασμό με την υπερέκφραση των γονιδίων Oct3/4, Nanog και Sox-2 επιβεβαίωσε την ύπαρξη αδιαφοροποίητων κυττάρων με εμβρυϊκά χαρακτηριστικά ως απόκριση στην επαγόμενη βλάβη. Συμπερασματικά η παρούσα διατριβή προτείνει μία θεραπεία βασισμένη στη χρήση βλαστοκυττάρων λιπώδους ιστού συνοδευόμενη από τη διαρκή και χρονοελεγχόμενη απελευθέρωση anti-VEGF από βελτιωμένους νανοφορείς με στόχο το συνδυασμό της παρακρινούς δράσης των βλαστοκυττάρων με τον σταδιακό περιορισμό της παθολογικής νεοαγγείωσης για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της RVO.
description: In recent years, anti-angiogenic therapeutic agents (anti-VEGF) have contributed to the treatment of retinal vein occlusion (RVO) while polymeric nanocarriers for sustained-release ophthalmic drug delivery are emerged rapidly. Mesenchymal Stromal Cells-mediated therapies (MSCs) are associated with ganglion cells’s protection, limiting eye degeneration. The aim of the present study is to determine the effect of adipose derived-MSCs (ASCs) combination with nanocarriers of anti-VEGF in a PD0325901 (MEK kinase inhibitor)-mediated induced animal model of RVO. In an in vitro approach, PD0325901 was used to induce the expression of EPCR (Endothelial Protein C Receptor), a common related to RVO marker, on primary endothelial cell culture. Anti-VEGF encapsulated in thiolated chitosan (ThioCHI) nanoparticles, MSCs and a combination of these was applied to the cultures. ThioCHI nanoparticles were selected as polymeric matrix for anti-VEGF encapsulation. Following 24-hour exposure of endothelium to PD0325901, the effect of anti-VEGF nanoparticles, MSCs, and a combination of these was assessed by quantifying the secreted EPCR. For in vivo experiments, ASCs were isolated from rabbits and genetically modified to secrete the green fluorescence GFP. Twenty-four New Zealand rabbits were divided: Group I ASCs, group II ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF, group III RVO and group IV control. For the RVO induction groups I-III received intravitreal (iv) injections of PD0325901 while the control group received BSS only. Twelve days later therapeutic regiments were administered at groups I-II while groups III-IV received BSS. Two weeks later the animals were sacrificed to determine the therapeutic efficacy of all the administered regimens. The retinal lesions were evaluated via detailed ophthalmic examinations, histological analysis, ELISA for secreted cytokines and Q-PCR for the expression of related to the occlusion and inflammatory genes. Very small embryonic like stem cells (VSELs) isolated from animals peripheral blood, 12 and 36 days after the induction and characterized. The abnormal EPCR levels were statistically significantly reduced after 24- and 48-hours following exposure of the abnormal endothelium either to the anti-VEGF nanoparticles or to MSCs. Mild retinal edema, hemorrhages and limited retinal detachment were observed in Groups I and II compared with the pathological symptoms of Group III which presented a totally disorganized retinal structure, following of positive immunostaining for neovascularization (FVIII) and related to RVO markers. Important reduction of the high secreted levels of inflammatory cytokines were quantified in Groups I and II vitreous fluid, while the expression of the RVO-related and inflammatory genes has been significantly decreased especially in group II. Positive immunostaining was observed for tissue regeneration markers (ki-67, GFAP) in groups which received one of the proposed therapies. GFP+ ASCs, capable of being differentiated towards neural progenitors, detected in dissociated retina tissues of group II. The positive alkaline phosphatase staining, in combination with the overexpression of the Oct3/4, Nanog and Sox-2 transcription factors confirmed the existence of undifferentiated cells with embryonic like features as a response to damage. A stem cell-based therapy for RVO is proposed, accompanied by sustained and time-controlled release of anti-VEGF, in order to combine the paracrine action of ASCs and the progressive reduction of neovascularization.