title: DNA-Methylierung als epigenetischer Regulator von fünf Genen im nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC)
Creators: name: Weinzierl, Marlene Maria Gertraud
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Das Lungenkarzinom ist eine der häufigsten Krebsarten mit jährlich über einer Million Todesopfer weltweit. Es handelt sich dabei um eine heterogene Erkrankung, die in den meisten Fällen erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird. Der Großteil aller Lungenkrebserkrankungen betrifft das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC, ca. 80 %), dem sich diese Forschungsarbeit widmet. Molekulare Abnormalitäten bei einer Lungenkrebserkrankung sind mannigfaltig. Genetische Veränderungen wie Mutationen sind ebenso Grund für maligne Entartungen der Zelle wie epigenetische Mechanismen. Zu letzteren zählt die DNA-Methylierung, die im Zusammenspiel mit Histonmodifikationen und Nukleosomen(re)positionierungen die Chromatinstruktur von Genen verändern und so die Genexpression beeinflussen kann. Aberrante Hypermethylierung von CpG-Inseln im Promoterbereich kann eine Inaktivierung der betreffenden Gene bewirken und führt in vielen Fällen zu deren Funktionsverlust. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der DNA-Methylierung bei der Pathogenese von NSCLC untersucht. Hierfür haben wir das Methylierungsmuster der Gene EVX1, HOXA9, IRX2, PCDHA12 und SFMBT2 in fünf NSCLC-Zelllinien sowie in Primärtumor- und korrespondierenden nicht-malignen Lungengewebsproben von 97 NSCLC-PatientInnen mittels methylierungssensitiver, hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) analysiert. Wir konnten eine statistisch signifikante tumorspezifische Methylierung der Gene (EVX1: 68%, HOXA9: 40%, IRX2: 56%, PCDHA12: 62%, SFMBT2: 45%) feststellen. Bestätigt wurden die Ergebnisse durch Sequenzierungsanalysen, die zeigten, dass 73 – 100 % der untersuchten CpGs im Tumorgewebe methyliert sind, während im assoziierten nicht-malignen Lungengewebe nur 0-1 % der untersuchten CpGs eine Methylierung aufwiesen. Zur Ermittlung einer potentiellen klinischen Relevanz dieser Ergebnisse wurde ein Vergleich der Methylierungsdaten mit den klinisch-pathologischen Charakteristika der PatientInnen angestellt. Dieser ergab, dass die Methylierung von EVX1 und SFMBT2 mit einem höheren Lebensalter der PatientInnen zum Zeitpunkt der Erkrankung in Zusammenhang steht, dass PatientInnen mit SFMBT2-Methylierung häufiger an einem Plattenepithelkarzinom erkrankt waren als an einem Adenokarzinom und dass eine Methylierung von HOXA9 bei Plattenepithelkarzinom-PatientInnen mit einem kürzeren krankheitsfreien Überleben im Vergleich zu PatientInnen ohne HOXA9-Methylierung korreliert. Um zu überprüfen, ob die Methylierung die Genexpression beeinflusst, wurden Western Blots zur Detektion der Proteinexpression von SFMBT2 in nicht-malignem Lungengewebe sowie in Lungenkrebs-Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, dass SFMBT2 im normalen, unmethylierten Lungengewebe exprimiert wird, während in methylierten Zelllinien keine Expression des Proteins stattfindet. Nach Behandlung der Lungenkrebs-Zelllinie A549 mit dem demethylierenden Agens 5-Aza-2‘-Deoxycytidin und/oder dem Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A hingegen konnte eine Hochregulierung der Genexpression von SFMBT2 beobachtet werden. Diese Resultate stützen unsere Vermutung, dass die tumorspezifische Methylierung bestimmter Gene als epigenetischer Regulator der Genexpression in NSCLC-Gewebe wirkt. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen weisen auf die DNA-Methylierung als wesentlichen Faktor in der Pathogenese des NSCLC und deren potentielle klinische Relevanz hin.
description: Lung cancer is one of the most frequently occurring cancer types with over a million deaths worldwide each year. It is a heterogeneous disease which is usually diagnosed in advanced stages. This master thesis is concerning non-small cell lung cancer (NSCLC) which accounts for the majority of all lung cancer diseases (~ 80 %). Certain molecular abnormalities have been identified in lung cancer. Genetic modifications such as mutations lead to malignant degeneration of cells as well as epigenetic mechanisms. The latter includes DNA methylation which alters chromatin structure together with histone modifications and chromatin remodeling complexes to control gene expression. Aberrant hypermethylation of CpG islands within a promoter region may inactivate the gene concerned and leads to loss of their function in many cases. In our studies we investigated the role of DNA methylation in the pathogenesis of NSCLC. Therefore we analysed patterns of methylation of the genes EVX1, HOXA9, IRX2, PCDHA12 und SFMBT2 in five NSCLC cell lines as well as in primary tumor and corresponding non-malignant lung tissues of 97 NSCLC patients with methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM). We observed statistically significant tumorspecific methylation of the genes (EVX1: 68%, HOXA9: 40%, IRX2: 56%, PCDHA12: 62%, SFMBT2: 45%). Our results have been approved by genomic bisulfite sequencing. While only 0-1 % of the analysed CpGs in non-malignant lung tissues were methylated, 73-100 % of the analysed CpGs in associated tumor tissues were methylated. To investigate if these results may be of potential clinical relevance, we compared methylation data with clinico-pathological characteristics of the patients. We found that methylation of EVX1 and SFMBT2 is associated with a higher age of patients at diagnosis of NSCLC. Furthermore, methylation of SFMBT2 was found more frequently in patients with squamous cell carcinoma than in adenocarcinomas. Methylation of HOXA9 in patients with squamous cell carcinoma correlates with a shorter disease-free survival as compared to patients without HOXA9 methylation. Moreover, to verify our hypothesis that methylation influences gene expression, we performed immunoblotting to detect protein expression of SFMBT2 in non-malignant lung tissue as well as in lung cancer cell lines. We observed expression of SFMBT2 in unmethylated normal lung tissue but no expression of this protein in methylated cell lines. After treatment of lung cancer cell line A549 with the demethylating agent 5-aza-2‘-deoxycytidine and/or the histone deacetylase inhibitor trichostatin A upregulation of SFMBT2 expression was observed. These results support our suggestion that tumorspecific methylation of certain genes acts as an epigenetic regulator of gene expression in NSCLC. Our findings indicate that DNA methylation is an important factor in the pathogenesis of NSCLC and suggest that DNA methylation of certain genes might be of potential clinical relevance.