title: Targeting the Intracellular Allosteric Binding Site (IABS) of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs)
title: Adressierung der intrazellulären allosterischen Bindungsstelle (IABS) von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)
Creators: name: Huber, Max Erhard
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: G Protein-coupled receptors
subject: Intracellular allosteric binding site
subject: NanoBRET
subject: Proteolysis targeting chimera

description: G protein-coupled receptors (GPCRs) are important membrane proteins that transduce signals from outside to inside of cells. Apart from the orthosteric binding side, where the endogenous ligands are binding, several allosteric pockets at GPCRs have been predicted and reported. One of these pockets is the highly conserved intracellular allosteric binding site (IABS) formed by the TM1 – 3, TM6, TM7, and helix 8, partially overlapping with the transducer binding site. Targeting the IABS of GPCRs offers a novel approach to modulating and fine-tuning the pharmacology of GPCRs. However, high-throughput binding assays are needed to explore and exploit the full potential of this strategy. The recently reported GPCR structures in complex with intracellular allosteric ligands enable the structure-based design of hetero-bifunctional ligands such as fluorescently labeled ligands. Therefore, the aim of this work is the development of a NanoBRET-based high-throughput screening platform for the IABS of the G protein-coupled receptors CCR1, CCR2, CCR9, CXCR2, and NSTR1. These assays enable straightforward and high-throughput ligand analysis, including kinetic measurements, fragment screening, and selectivity studies in a cell-free and cellular setup. This assay platform led to the discovery of novel intracellular GPCR ligands with improved pharmacodynamic profiles. For example, an intracellular CCR9 antagonist (AAA30) with enhanced affinity, activity, and selectivity, compared to vercirnon – the prior gold standard for intracellular CCR9 antagonists, has been developed. Further screening studies using the NanoBRET-based assay platform identified new promising chemotypes for intracellular CCR1 and NTSR1 modulation, respectively. Kinetic binding experiments with the fluorescent probes and unlabeled ligands showed a good correlation between residence time and affinity, indicating the high affinity to the IABS is mainly driven by slow off-kinetics. Extensive selectivity studies with known intracellular GPCR ligands revealed that many chemotypes for intracellular GPCR modulation are binding to the IABS of several receptors (e.g., biaryl sulfonamides to CCR2 and CCR9, pyrrolone derivatives to CCR1 and CCR2, or squaric acid derivatives to CXCR1 and CXCR2). Nevertheless, the examples of the biaryl sulfonamides AAA30 and vercirnon, as well as the pyrrolone V2Rinh-02, indicate that high on-target selectivity can be achieved by hit and lead optimization campaigns, respectively, even when starting from an unselective scaffold. In addition, the CCR9 NanoBRET assay enabled the discovery of the first GPCR-targeted PROTAC based on an intracellular ligand, thereby providing an innovative approach to modulate GPCR signaling. Overall, small molecule-based fluorescent probes enabled the detection of intracellular ligand binding to GPCRs in cells via NanoBRET-based assays and fluorescence microscopy. Thus, fluorescent probes are highly versatile molecular tools that will leverage drug discovery campaigns in the field of intracellular GPCR modulators.
description: G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind wichtige Membranproteine, die Signale von außen nach innen weiterleiten. Neben der orthosterischen Bindungsstelle, an die endogene Liganden binden, wurden mehrere allosterische Bindestellen an GPCRs vorhergesagt und beschrieben. Eine dieser Bindestellen ist die hochkonservierte intrazelluläre allosterische Bindungsstelle (IABS), die von TM1 – 3, TM6, TM7 und Helix 8 gebildet wird und sich teilweise mit der G-Protein Bindungsstelle überlappt. Die Adressierung der IABS von GPCRs bietet einen neuen Ansatz zur Modulation und Feinabstimmung der Pharmakologie von GPCRs. Um das volle Potenzial dieser Strategie zu erforschen und auszuschöpfen, sind jedoch Bindungsassays mit hohem Durchsatz erforderlich. Kürzlich veröffentlichte Strukturen von GPCRs im Komplex mit intrazellulären allosterischen Liganden ermöglichen das strukturbasierte Design von heterobifunktionellen Liganden, wie z. B. Fluoreszenz-markierte Liganden. Das Ziel dieser Arbeit ist daher die Entwicklung einer NanoBRET-basierten Hochdurchsatz-Screening-Plattform für die IABS der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren CCR1, CCR2, CCR9, CXCR2 und NSTR1. Diese Assays ermöglichten eine einfache und schnelle Untersuchung von Liganden einschließlich kinetischer Messungen, Screening- und Selektivitätsstudien unter zellfreien und zellulären Bedingungen. So führte die entwickelte Assay-Plattform zur Entdeckung neuer intrazellulärer GPCR-Liganden mit verbesserten pharmakodynamischen Profilen. Beispielsweise wurde ein intrazellulärer CCR9-Antagonist (AAA30) mit verbesserter Affinität, Aktivität und Selektivität im Vergleich zum bisherigen Goldstandard Vercirnon entwickelt. Weitere Screeningstudien mit der NanoBRET-basierten Plattform führten zur Identifizierung neuer vielversprechender Chemotypen für die intrazelluläre Modulation von CCR1 bzw. NTSR1. Kinetische Bindungsexperimente zeigten eine sehr gute Korrelation zwischen Rezeptorverweildauer und Affinität. Dies deutet darauf hin, dass eine hohe Affinität zur IABS hauptsächlich auf eine langsame Dissoziation zurückzuführen ist. Selektivitätsbindungsstudien mit bekannten intrazellulären GPCR-Liganden zeigten, dass viele bekannte Chemotypen an die IABS von mehreren Rezeptoren binden (z. B. Biarylsulfonamide an CCR2 und CCR9, Pyrrolonderivate an CCR1 und CCR2 oder Quadratsäurederivate an CXCR1 und CXCR2). Dennoch zeigen die Beispiele der Biarylsulfonamide AAA30 und Vercirnon sowie des Pyrrolons V2Rinh-02 deutlich, dass durch Optimierungskampagnen auch ausgehend von einem eher unselektiven Gerüst eine hohe Rezeptorselektivität erreicht werden kann. Darüber hinaus konnte mit dem CCR9-NanoBRET-Assay das erste auf einem intrazellulären Liganden basierende PROTAC entdeckt werden. Die Adressierung von GPCRs mit intrazellulär bindenden PROTACs könnte einen interessanten neuen Ansatz zur Modulation der Signaltransduktion darstellen. Zusammenfassend ermöglichen niedermolekulare Fluoreszenzsonden den Nachweis der intrazellulären Ligandenbindung an GPCRs durch NanoBRET-basierte Assays und die Fluoreszenzmikroskopie. Damit sind die Fluoreszenzsonden äußerst vielseitige molekulare Werkzeuge, die die Wirkstoffforschung auf dem Gebiet der intrazellulären GPCR-Modulatoren voranbringen werden.