title: Strukturelle und thermodynamische Charakterisierung der Fragment und Liganden Bindung an Thrombin
title: Structural and Thermodynamic Characterization of Fragment and Ligand Binding to Thrombin
Creators: name: Rühmann, Eggert Henning
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: chrystallography
ITC, Kristallogrphie
ligand
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
thrombin , fragment
ITC
Fragment , Ligand
Thrombin

description: ITC displacement titrations and
      direct ITC titrations at low c-value can be used as a
      reliable technique to study low-affinity interactions as
      usually given for the binding of a fragment to a target
      protein. Important aspects can be concluded from this study.
      First of all, for ITC displacement titrations the fragment
      must bind to a part of the protein binding pocket that
      overlaps with the binding pose region of the applied
      reference ligand. Secondly, the selected reference ligand
      must have a significant higher or lower binding enthalpy so
      that a heat difference signal can be recorded for the
      fragment. Furthermore, it has to be regarded that, as for any
      displacement titration, all errors affecting the parameter
      determinations of the reference ligand will add to the
      accuracy of the parameters obtained for the fragment.
      Finally, if no suitable reference ligand is available and the
      fragment binds enthalpically enough, low c-value titrations
      can be applied as an alternative. In this case, however, some
      anticipated knowledge about the expected binding affinity of
      the fragment must be available to estimate the required
      excess concentration of the fragment at the end of the
      titration. The solubility of the fragment and the protein are
      the most crucial issues in low c-value titrations because the
      required high concentrations of the fragment to be studied in
      the injection syringe should exceed the final sample cell
      concentrations with respect to the fragment’s KD value. In
      order to estimate the required concentration of the fragment,
      a crude estimate of the fragment’s KD obtained from an
      independent experiment is highly recommended. It is very
      important that measured binding enthalpies should not be
      compared quantitatively across different experimental
      conditions, but only relative to each other by using one
      suitable measurement protocol. Remarkably, different
      reference ligands used for the displacement of pre-incubated
      fragments reveal deviating enthalpic signals. Most likely
      these differences are caused by differences in the water
      structure and thus in the residual solvation pattern at the
      binding site of the different ligands used for titration. The
      consideration of the relative enthalpy differences across the
      different displacement experiments showed a consistent
      relative difference. This allows to characterize the studied
      fragments relative to each other. The detailed interpretation
      of the enthalpic signature requires a comparison of the
      corresponding crystal structures in order to select fragments
      as superior enthalpy-dominated candidates for further
      development. To achieve this goal, high-resolution crystal
      structures of six fragments binding to the S1 pocket of
      thrombin were determined and analyzed with respect to the
      thermodynamic binding profiles. Binding affinity is not only
      determined by the properties of the formed protein-ligand
      complex but some differences can already discriminate ligands
      in aqueous solution prior to any protein binding.
      Conformationally restricted ligands can experience a
      significant binding advantage over more flexible ligands if
      the correct protein-bound geometry is well preorganized in a
      rigidified skeleton. A new derivative of a
      3-amidinophenylalanine matriptase inhibitor was crystallized
      with thrombin and the resulting complex was superimposed with
      a representative X-ray crystal structure of matriptase bound
      to a related inhibitor. From the superimposition of these
      structures information could be extracted regarding the
      selectivity profiles towards serine proteases observed in
      this study. Due to the large homology of amino acids in the
      binding pocket of thrombin and matriptase, reliable
      predictions about the possible binding mode of the inhibitor,
      can be made for matriptase.
description: ITC-Verdrängungstitrationen und
      direkte ITC-Titrationen bei niedrigen c-Werten können als
      zuverlässige Technik verwendet werden kann, um schwache
      Wechselwirkungen zu untersuchen, wie sie üblicherweise für
      die Bindung von Fragmenten an ein Zielprotein vorkommen.
      Hierfür müssen jedoch einige Grundbedingungen erfüllt werden.
      Zuallererst ist für ITC Verdrängungstitrationen wichtig, dass
      das untersuchte Fragment mit einem Teil der
      Proteinbindetasche interagieren muss, der mit dem
      Bindungsbereich des verwendeten Referenzliganden überlappt.
      Zweitens muss der ausgewählte Referenzligand eine signifikant
      höhere oder niedrigere Bindungsenthalpie besitzen, so dass
      eine Wärmedifferenz zu dem untersuchten Fragment gemessen
      werden kann. Ferner ist zu beachten, dass bei jeder
      ITC-Verdrängungstitration, alle Fehler, die für die
      Referenzliganden ermittelt wurden, einen Einfluss auf die
      Genauigkeit der für das Fragment erhaltenen Parameter haben.
      Schließlich kann, wenn kein geeigneter Referenzligand zur
      Verfügung steht und das Fragment enthalpisch genug bindet,
      eine direkte Titration bei niedrigen c-Werten als Alternative
      verwendet werden. In diesem Fall ist jedoch ein gewisses
      Vorwissen über die zu erwartende Bindungsaffinität des
      Fragments nötig, um die erforderliche Überschuss
      Konzentration des Fragments am Ende der Titration abschätzen
      zu können. Die Löslichkeit des Fragments und des Proteins
      sind ebenfalls wichtige Aspekte bei der Titration mit
      niedrigen c-Werten, da hohe Konzentrationen des Fragments in
      der Injektionsspritze erforderlichen sind, um in der
      Probenzelle eine Konzentration des Fragments zu erreichen,
      die den KD-Wert des Fragments überschreitet. Daher ist eine
      Messung des KD-Werts des Fragments in einem unabhängigen
      Experiment sehr zu empfehlen, um die erforderliche
      Konzentration des Fragments abzuschätzen. Letztlich ist er
      sehr wichtig, dass die unter den verschiedenen
      Versuchsbedingungen gemessen Bindungsenthalpien nicht
      quantitativ verglichen werden sollten, sondern nur relativ
      zueinander durch Verwendung eines sorgfältig ausgewählten
      Messprotokolls. Es ist bemerkenswert, dass mit verschiedenen
      Referenzliganden, die für die Verdrängung der Fragmente
      verwendet wurden, abweichende enthalpische Signale beobachtet
      wurden. Wahrscheinlich wird dies durch Unterschiede in der
      Wasserstruktur der verschiedenen Liganden in der Bindetasche
      verursacht. Die Betrachtung der relativen
      Enthalpiedifferenzen in den verschiedenen
      Verdrängungsexperimenten zeigte dagegen eine konsistente
      relative Differenz. Dies ermöglicht es, die untersuchten
      Fragmente relativ zueinander zu charakterisieren. Die
      detaillierte Interpretation der enthalpischen Signaturen
      erfordert jedoch einen Vergleich der Kristallstrukturen der
      Fragmente. Röntgenkristallstrukturen von sechs Fragmenten,
      die die S1 Tasche von Thrombin adressieren und der
      Referenzliganden wurden bestimmt und in Bezug auf die
      thermodynamischen Bindungsprofile analysiert. Die
      Bindungsaffinität eines Liganden wird nicht nur durch die
      Eigenschaften des gebildeten Protein-Ligand-Komplexes
      bestimmt, sondern auch durch die Unterschiede von Liganden in
      wässriger Lösung vor Proteinbindung. Konformativ
      eingeschränkte Liganden können einen signifikanten
      Bindungsvorteil gegenüber flexiblen Liganden haben, wenn in
      einem rigiden Ligandgrundgerüst eine Geometrie bereits
      präorganisiert ist, die dem Liganden in gebundenem Zustand
      ähnlich ist. Ein neuer vom 3-Amidinophenylalanin abgeleiteter
      Matriptase Inhibitor wurde in Thrombin kristallisiert und die
      Röntgenkristallstruktur eines repräsentativen, verwandten
      Inhibitortyps in Matriptase mit dieser überlagert. Aus der
      Überlagerung dieser Strukturen konnten Informationen
      hinsichtlich der in dieser Studie beobachteten
      Selektivitätsprofile zu anderen Serinproteasen gezogen
      werden. Durch die große Homologie der mit dem Inhibitor
      interagierenden Aminosäuren in der Bindetasche von Thrombin
      und Matriptase können zudem zuverlässige Vorhersagen über den
      möglichen Bindungsmodus in Matriptase getroffen
      werden.