title: Reversible Cyclisierung von Peptiden – neue Synthesewege für Peptidantibiotika
title: Reversible Cyclization of Peptides – Novel Synthesis Routes for Peptide Antibiotics
Creators: name: Lamping, Matthias
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Peptidsynthese , Magnetische Kernresonanz
Chemistry and allied sciences
Chemie
MicrocinJ25
Antibiotikum , Disulfide
organic synthesis
Peptide
peptide design, peptide synthesis
Organische Chemie , Strukturaufklärung
Lassopeptide, Peptidaldehyde
Festphasenpeptidsynthese
Sekundärstruktur

description: Lasso peptides have a very unique
      structure which is not comparable with structurally simpler
      biopolymers found in nature. The formed cyclic structure can
      be described by the macroscopic form of the eponymous lasso
      and is synthesized in nature by enzymes. The synthesis of
      such structures is a major challenge in organic-synthetic
      chemistry and until now there is no synthetic procedure known
      which leads to the correct topological isomer. To reduce the
      energy barrier of this cyclization process and to analyze the
      ratio between the macrocycle and the chain in the chemical
      equilibrium we performed the cyclization in a reversible
      manner. This was achieved by the substitution of a peptide
      bond for an imine or oxime which transforms irreversible
      macrocyclization into a reversible process. In this work
      bioorthogonal synthetic methods for C-terminal and sidechain
      peptide aldehydes were developed. The cyclization tendency of
      these peptides as well as the spatial arrangement of the
      cyclic products, formed in chemical equilibrium, were
      analyzed in buffered solution by NMR-spectroscopy. By means
      of NMR-based molecular modelling the peptides were evaluated
      and the corresponding structures calculated. The cyclization
      tendency of C terminal peptide aldehydes was examined for the
      cyclic hexapeptide Segetalin A by NMR-spectroscopy. Instead
      of the expected head-to-tail cyclization the sidechain
      cyclization of the Trp-NH-indole was observed. Besides
      Segetalin A, several additional cyclic hexapeptides were
      cyclized reversibly and their structures characterized by
      NMR-spectroscopy. In contrast to the head-to-tail cyclization
      novel monomers for the head-to-sidechain cyclization had to
      be developed and synthesized in multi gram scale for the use
      in solid phase peptide synthesis. For the reversible
      cyclization of peptide aldehydes via the sidechain of
      glutamic acid two different synthetic routes were performed
      and analyzed. The first route which was focused on a
      precursor-based strategy involved the synthesis of the
      unnatural amino acid homoallyglycine. Derivatives of this
      amino acid were prepared and the oxidative cleavage of the
      terminal olefin to the corresponding aldehyde was
      investigated. The second synthesis route fashioned a
      sidechain dipeptide consisting of glutamic acid and a
      protected glycinal or glycinal precursor in the sidechain was
      performed. This significantly simplified the synthesis of the
      amino acid aldehydes, led to higher overall yields and a
      stable amino acid derivative which is synthesizable in a
      multi gram scale. The insertion of the synthetic amino acid
      in peptides was performed by manual and automated solid phase
      peptide synthesis. All sidechain peptide aldehydes which were
      synthesized in this way were analyzed by their cyclization
      tendency in buffered solution by NMR-spectroscopy. The
      establishment of the chemical equilibrium was achieved at pH
      6.5 in buffered solution whereby a fast H/D exchange
      occurred. Because of the resulting signal broadening the
      quality of the measured NMR-spectra was too low for a
      complete assignment of the signals. By reductive amination of
      the reactive imines the equilibrium was shifted and the
      obtained macrocyclic peptides could be analyzed more easily.
      The analysis showed that the intramolecular interactions
      itself were not sufficient to form the correct lasso
      topology, only cyclic-branched peptides were isolated. Based
      on the insufficient pre-folding of the linear lasso peptide
      the C-terminal end was linked to the backbone by a disulfide
      bridge. The performed macrocyclization of the N-terminal ring
      should then lead to the correct folded lasso peptide. The
      isolation of the topologically correct peptide failed either.
      For the reversible cyclization of the N-terminal ring an
      amide bond was replaced by another disulfide bridge. By
      orthogonal protected cysteines which could be flexibly
      substituted in the primary sequence different disulfide
      patterns were synthesized and analyzed. The biological
      activity of the synthesized di- and tetrasulfides which
      showed the strongest similarity to the native Microcin J25
      was investigated. Growth curves of gram-negative bacteria
      like Salmonella paratyphi, Shigella flexneri,
      enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Escherichia
      coli AS19 were measured in the presence of the synthetic
      peptides and their growth-inhibitory activity were
      characterized. In contrast to the native Microcin J25 the
      biological activity of the synthetic peptides was quite
      low.
description: Unter den in der Natur üblichen
      Kettenmolekülen fallen Lassopeptide mit ihrer räumlichen
      Struktur aus der Rolle. Sie weisen eine cyclische Anordnung
      auf, die räumlich einem Lasso gleicht und in der Biosynthese
      unter Verwendung von Enzymen ausgebildet wird. Die Synthese
      solcher Strukturen stellt eine große Herausforderung in der
      organisch-synthetischen Chemie dar und konnte bis heute nicht
      erfolgreich durchgeführt werden. Um die Energiebarriere
      dieses Cyclisierungsprozesses zu verringern und das
      Verhältnis zwischen Ring und Kette im Gleichgewicht zu
      analysieren wurde die Cyclisierung reversibel gestaltet. Dies
      erfolgte mittels der Substitution einer Amidbindung durch
      eine Imin- oder Oxim-Bindung, welche die irreversible
      Macrocyclisierung eines Peptids in einen reversiblen Prozess
      transformiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioorthogonale
      Synthesemethoden für C terminale und
      Seitenketten-Peptidaldehyde entwickelt und die
      Cyclisierungstendenz dieser Peptide sowie die räumliche
      Anordnung der im Gleichgewicht entstehenden Produkte mittels
      NMR-Spektroskopie in wässriger Lösung untersucht. Mittels
      NMR-basierter, molekularer Modellierung wurden die Peptide
      analysiert und entsprechende Strukturen berechnet. Die
      Cyclisierungstendenz von C-terminalen Peptidaldehyden wurde
      im Rahmen des cyclischen Hexapeptids Segetalin A
      NMR-spektroskopisch untersucht und entgegen der erwarteten
      Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung eine Seitenketten-Cyclisierung
      über das NH-Indol des Tryptophans beobachtet. Neben Segetalin
      A wurden weitere cyclische Hexapeptide reversibel cyclisiert
      und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Im
      Gegensatz zur Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung musste für die
      Kopf-zu-Seitenketten-Cyclisierung neue in der
      Festphasensynthese einsetzbare Bausteine entwickelt und im
      Multigramm-Maßstab synthetisiert werden. Für die reversible
      Cyclisierung von Peptidaldehyden über die Seitenkette der
      Glutaminsäure wurden zwei verschiedene Synthesemethoden
      durchgeführt und untersucht. Im Rahmen der ersten
      Syntheseroute, die auf einem Precursor-basierten Ansatz
      beruht, wurde eine Synthese der unnatürlichen Aminosäure
      Homoallylglycin und dessen Derivate entwickelt und die
      oxidative Spaltung des terminalen Olefins zum Aldehyd
      analysiert. Der zweite Syntheseweg beinhaltete die Synthese
      eines Seitenketten-Dipeptids, bestehend aus Glutaminsäure und
      einem geschützten Glycinaldehyd oder einem
      Glycinaldehyd-Precursor in der Seitenkette. Dies vereinfachte
      die Synthese der Aldehyd-Aminosäuren erheblich, führte zu
      höheren Gesamtausbeuten und ergab ein im Multigramm-Maßstab
      herstellbares, stabiles Aminosäure-Derivat. Die Insertion der
      synthetischen Aminosäure in Peptide erfolgte mittels
      manueller und automatisierter Festphasenpeptidsynthese.
      Sämtliche, auf diese Art hergestellten,
      Seitenketten-Peptidaldehyde wurden auf ihre
      Cyclisierungstendenz in wässrigem Phosphatpuffer mittels
      NMR-Spektroskopie analysiert. Die Einstellung des chemischen
      Gleichgewichts erfolgte bei pH 6.5 in wässrigem
      Phosphatpuffer, wodurch ein schneller H/D-Austausch stattfand
      und die NMR-Spektren basierend auf der Signalverbreiterung
      eine geringe Qualität aufwiesen. Durch reduktive Aminierung
      wurde die Gleichgewichtsreaktion abgefangen und es konnte
      gezeigt werden, dass alleine durch intramolekulare
      Wechselwirkungen keine Lasso-Topologie ähnlich dem Naturstoff
      erhalten wurde, sondern ausschließlich das
      cyclisch-verzweigte Peptid. Aufgrund der nicht ausreichenden
      Vorfaltung innerhalb des linearen Lassopeptids wurde mit
      Hilfe einer Disulfidbrücke das C-terminale Ende kovalent an
      das Rückgrat gebunden, sodass eine mögliche
      Macrolactamisierung des N-terminalen Rings zu einem korrekt
      eingefädelten Lassopeptid führen sollte. In diesem Fall wurde
      erneut kein topologisch korrektes Lassopeptid erhalten. Es
      wurde für die reversible Cyclisierung des N-terminalen Rings
      eine weitere Disulfidbrücke eingeführt, die die Amidbindung
      ersetzt, aber die native Ringgröße nicht verändert. Durch
      orthogonal geschützte Cysteine, die flexibel in der
      Primärsequenz substituiert wurden, konnten unterschiedliche
      Disulfidmuster synthetisiert und analysiert werden. Die
      synthetisierten Di- und Tetrasulfide, welche die höchste
      Analogie zum nativen Microcin J25 aufwiesen, wurden auf ihre
      biologische Aktivität untersucht. Unter Zugabe der
      synthetischen Peptide wurden Wachstumskurven von
      gram-negativen Bakterien wie Salmonella paratyphi, Shigella
      flexneri, Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) und
      Escherichia coli AS19 gemessen und die Wachstums-inhibierende
      Wirkung analysiert. Im Gegensatz zum nativen Microcin J25
      zeigten die in dieser Arbeit synthetisierten Peptide keine
      ausgeprägte biologische Aktivität.