title: Mutationssuche in regulatorischen Sequenzen der Gene der Apolipoproteine AI, AIV und CIII mithilfe der denaturierenden Gradientengelelektrophorese
title: Search for mutations in regulatory sequences of the apolipoprotein AI, AIV and CIII genes using the denaturing gradient gel electrophoresis
Creators: name: Stünckel, Malte Kristof
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: denaturing gradient gel electrophoresis
Medizin, Gesundheit
triglycerides , polymerase chain reaction
apolipoprotein
Denaturierende Gradientengelelektrophorese
lipoprotein metabolism
Triglyceride , Polymerase-Kettenreaktion
Koronare Herzkrankheit
Apolipoprotein , Lipoproteinstoffwechsel

description: Adipositas and high concentrations
      of triglycerides in human plasma apart from high LDL,
      cholesterol, lipoprotein(a) and low HDL concentrations and
      diabetes mellitus, smoking, arterial hypertension, age and
      familial predisposition are known risk factors for the
      development of coronary artery disease (CAD). In general,
      adipositas leads to the release of free fatty acids leading
      to hypertriglyceridemia. However, some patients develop
      hypertriglyceridemia although suffering from only mild
      adipositas. The apolipoproteins AI, AIV and CIII are key
      players in the metabolism of triglycerides. Their regulatory
      elements, the promoters and enhancers, are crucial for
      sufficient expression. The goal of this work was to search
      for mutations in regulatory regions of the genes of
      apolipoproteins AI, AIV and CIII that were able to explain a
      low body mass index (BMI) and high triglyceride concentration
      in plasma at the same time. We designed a case control study
      to be able to proof a correlation of found mutations and the
      BMI-triglyceride-constellation. The DNA target segments have
      then been screened for mutations. 264 patients of the
      “Marburger Praeventionsallianz” were assigned to a case group
      (BMI under 25kg/m2 and triglycerides above 150mg/dl, 134
      patients) and a control group (BMI under 25kg/m2 and
      triglycerides under 150mg/dl, 130 patients). The DNA of all
      patients was isolated from EDTA blood and the target
      sequences amplificated by polymerase chain reaction. A
      denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) followed to
      show differences in electrophoretic mobility. At present, the
      DGGE is described as the most effective method for screening
      a population for specific mutations. Its sensitivity reaches
      about 95 per cent and it is possible to examine a rather big
      number of samples at a time. Samples showing a mobility shift
      were sequenced. The segments examined in this study are
      organized in a joint gene cluster on the long arm of
      chromosome 11. The ApoAI promoter sequence in this work
      consisted of 229bp reaching from nucleotide 116708439 to
      116708667 (position -329 to -101 with regard to the
      transcription start point). The ApoAIV promoter sequence
      covered nucleotides 116693995 to 11669444231 (-439 bis -3,
      437bp). The ApoCIII promoter sequence spanned 226bp
      (nucleotides 116700604 to116700351, -251 bis -26). Different
      mutations are known in all regions. However, their clinical
      significance has not been clarified yet. Only the ApoCIII
      enhancer gene (340bp, nucleotides 116700210 to 116699819,
      -800 to -471) has certain polymorphisms with known effects
      that were examined in different studies. In this work we
      found one mutation in the gene of apolipoprotein AIV
      (-63C--&gt;G), that was validated by the 1000genome project
      and published as rs5090 by now. The high sensitivity of the
      DGGE that has been described in different studies could not
      be supported by our study. Although a frequency of 4 to 6%
      for the C-allel of the rs5090 SNP has been described only one
      out of 264 samples showed a variation. No more polymorphisms
      could be found in the study population. More studies have to
      be carried out to show the mutation’s possible effect on
      triglyceride metabolism, for example, in an expression
      model.
description: Adipositas und hohe
      Triglyzeridkonzentrationen sind neben erhöhten LDL-,
      Cholesterin- und Lipoprotein(a)- sowie niedrigen
      HDL-Spiegeln, Diabetes mellitus, Nikotinkonsum, arterieller
      Hypertonie, hohem Alter und familiärer Prädisposition
      anerkannte Risikofaktoren für die Entwicklung einer koronaren
      Herzkrankheit (KHK). Im Allgemeinen führt eine Adipositas zu
      einer verstärkten Freisetzung von freien Fettsäuren und
      darüber zu einer Hypertriglyzeridämie. Es gibt jedoch noch
      eine Vielzahl anderer Ursachen für eine Hypertriglyzeridämie,
      und einige Patienten entwickeln eine Hypertriglyzeridämie
      auch bei relativ gering ausgeprägter Adipositas. Die
      Apolipoproteine AI, AIV und CIII spielen sowohl im
      Cholesterin- als auch im Triglyzeridstoffwechsel
      Schlüsselrollen. Ihre regulatorischen Genabschnitte, die
      Promoter und Enhancer, sind unerlässlich für ihre Expression.
      Die vorliegende Arbeit sollte untersuchen, ob Mutationen im
      ApoAI, ApoAIV oder ApoCIII Promoter, sowie dem ApoCIII
      Enhancer eine Erklärung für einen niedrigen BMI bei
      gleichzeitig erhöhtem Triglyzeridspiegel bieten können. Zu
      diesem Zweck wurde zunächst eine Fall-Kontroll-Studie
      entworfen, um einen Zusammenhang zwischen eventuellen
      häufigen Mutationen und der BMI-Triglyzerid-Konstellation
      belegen zu können. Die Zielabschnitte der DNA der gesamten
      Studienpopulation wurden dann auf Mutationen gescreent. Dazu
      wurden 264 EDTA-Blut-Proben von Patienten der Marburger
      Präventionsallianz in eine Fallgruppe (BMI unter 25kg/m2 und
      Triglyzeridplasmaspiegel über 150mg/dl, 134 Proben) und eine
      Kontrollgruppe (BMI unter 25kg/m2 und
      Triglyzeridplasmaspiegel unter 150mg/dl, 130 Proben)
      eingeteilt. Die DNA der Probanden wurde isoliert und mittels
      Polymerasekettenreaktion amplifiziert. Die Amplifikate wurden
      mithilfe der denaturierenden Gradientengelelektrophorese
      (DGGE) auf Auffälligkeiten im Laufverhalten untersucht. Die
      DGGE wurde vielfach als das zurzeit effektivste
      Screeningverfahren zur Mutationssuche mit einer Sensitivität
      von etwa 95% und der Möglichkeit, relativ viele Proben
      zeitgleich zu untersuchen, beschrieben. In der DGGE
      detektierte auffällige Proben wurden sequenziert. Die
      untersuchten Abschnitte sind in einem gemeinsamen Gencluster
      auf dem langen Arm des Chromosoms 11 organisiert. Die hier
      untersuchte Sequenz des ApoAI Promoters umfasste 229bp
      zwischen den Nukleotiden 116708439 bis 116708667 (-329 bis
      -101 in Bezug auf den Transkriptionsstart). Die untersuchte
      ApoAIV Promotersequenz umfasste 437bp zwischen den
      Nukleotiden 116693995 bis 11669444231 (-439 bis -3). Die
      ApoCIII Promotersequenz umfasste 226bp zwischen den
      Nukleotiden 116700604 bis 116700351 (-251 bis -26). In allen
      Bereichen gibt es vereinzelte bekannte Mutationen, deren
      Bedeutung jeweils noch nicht geklärt ist. Lediglich im
      ApoCIII Enhancergen (hier untersucht: 340bp zwischen den
      Nukleotiden 116700210 bis 116699819, -800 bis -471) gibt es
      mehrere Polymorphismen, deren Auswirkungen in Studien belegt
      werden konnten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten wir eine
      Mutation (-63C--&gt;G) im ApoAIV Promotergen nachweisen.
      Diese wurde mittlerweile unter anderem durch das
      1000Genome-Projekt validiert und als rs5090 veröffentlicht.
      Die in anderen Arbeiten beobachtete, durchweg sehr hohe
      Sensitivität der DGGE ließ sich in dieser Arbeit nicht
      bestätigen. Trotz einer beschriebenen C-Allelfrequenz des
      rs5090-SNP von 4 bis 6%, fand sich in 264 Proben lediglich
      eine Mutation. Weder bei den Kontrollpersonen noch bei den
      Patienten mit Hypertriglyzeridämie fanden sich weitere
      Mutationen. Weitere Studien sollten folgen, um zum Beispiel
      in einem Expressionsmodell die Relevanz der gefundenen
      Mutation zu überprüfen.