Μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας ιών του γένους Vitivirus που προσβάλλουν την άμπελο και αξιολόγηση δοκιμών RT- qPCR για την ανίχνευσή τους
Creators: name: Γεωργούση, Μαρίνα Δημήτριου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Άμπελος
Ιοί του γένους Vitivirus
Πραγματικού χρόνου RT-PCR
Grapevine
Vitiviruses
Real time RT-PCR

description: Η άμπελος αποτελεί μία από τις σημαντικότερες καλλιέργειες στην Ελλάδα και προσβάλλεται από έναν μεγάλο αριθμό ιών, συμπεριλαμβανομένων ιών του γένους Vitivirus. Οι ιοί A (grapevine virus A, GVA), B (grapevine virus B, GVB) και F (grapevine virus F, GVF) της αμπέλου, που ανήκουν στο γένος αυτό, παρουσιάζουν παγκόσμια εξάπλωση, με τους GVA και GVB να σχετίζονται με τo σύμπλοκο της βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου, ενώ ο ρόλος του GVF παραμένει αδιευκρίνιστος. Οι ιοί αυτοί παρουσιάζουν υψηλή γενετική παραλλακτικότητα, με αποτέλεσμα να υπάρχει η ανάγκη διαρκούς επικαιροποίησης των υπαρχόντων μοριακών εργαλείων αλλά και ανάπτυξης νέων για την έγκυρη ανίχνευσή τους. Πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής τέθηκε η μελέτη της γενετικής παραλλακτικότητας των πληθυσμών των τριών ιών σε αμπελώνες της χώρας μας. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση των αλληλουχιών που προέκυψαν με εφαρμογή της καινοτόμου τεχνολογίας υψηλής απόδοσης (HTS) σε δείγματα αμπέλου από διάφορες περιοχές της χώρας. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν την ύπαρξη υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας και στους τρεις ιούς και ιδιαίτερα στην περίπτωση των GVA και GVB. Ακολούθησε η ανάπτυξη και αξιολόγηση τριών νέων μεθόδων RT-qPCR για την ανίχνευση των ιών, με την χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών και ιχνηλατών που στοχεύουν στο γονίδιο της καψιδιακής πρωτεΐνης (ΚΠ) των GVA και GVB και στο πέμπτο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF5) του GVF, αντίστοιχα. Οι νέες μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς το εύρος ανίχνευσής τους, την αποτελεσματικότητα και ευαισθησία τους, καθώς και την εξειδίκευσή τους. Αφού επιτεύχθηκε μεγάλο εύρος ανίχνευσης και υψηλή αποτελεσματικότητα και εξειδίκευση, οι μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο δειγμάτων αμπέλου από τη συλλογή του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας του ΑΠΘ, τα οποία είχαν ήδη ελεγχθεί με μεθόδους συμβατικής RT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλότερα ποσοστά ανίχνευσης των ιών με τις νέες μεθόδους RT-qPCR, συγκριτικά με τις συμβατικές. Τέλος, πραγματοποιήθηκε έλεγχος δειγμάτων από διαφορετικούς ιστούς (φλοίωμα, φύλλα και μίσχους), από τρία πρέμνα διαφορετικών ποικιλιών που διατηρούνται στο Αγρόκτημα του ΑΠΘ, σε τρεις διαδοχικές εποχές (άνοιξη, καλοκαίρι, φθινόπωρο), για τον προσδιορισμό του καταλληλότερου φυτικού ιστού αλλά και της καταλληλότερης χρονικής περιόδου για την έγκυρη διάγνωση των GVA και GVF. Για τον έλεγχο χρησιμοποιήθηκαν οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή, με τα αποτελέσματα να αναδεικνύουν το φλοίωμα ως τον καταλληλότερο ιστό και το φθινόπωρο ως την καταλληλότερη εποχή δειγματοληψίας, χωρίς ωστόσο να αποκλείονται οι υπόλοιποι ιστοί και οι υπόλοιπες εποχές, καθώς σε όλες τις περιπτώσεις υπήρξε ανίχνευση των ιών.
description: Grapevine is one of the most important crops in Greece and it is infected by a high number of viruses, including members of the genus Vitivirus. Grapevine virus A (GVA), grapevine virus B (GVB) and grapevine virus F (GVF), which belong to the genus Vitivirus, have a worldwide distribution. GVA and GVB are associated with the Rugose Wood (RW) complex, whereas the role of GVF is still unclear. These viruses are characterized by high genetic variability, leading to a continuous demand for new and reliable detection methods. The first objective of this study was to investigate the genetic variability of the populations of the three viruses in Greek vineyards. For this purpose, comparative analysis of the sequences that were obtained by applying the innovative high throughput technology (HTS) was conducted in vine samples from different regions of Greece. The results confirmed the existence of high genetic variability in all three viruses, but especially in the case of GVA and GVB isolates. Subsequently, three new RT-qPCR methods were developed for the detection of the three viruses, using degenerate primers and probes that target the capsid protein (CP) of GVA and GVB and the ORF5 gene of GVF. The methods were evaluated based on their detection range, efficiency, specificity and sensitivity. Once wide range of detection and high efficiency, sensitivity and specificity were established, the new methods were used for testing of vine samples from the collection of the Plant Pathology Laboratoty of AUTH, that were already analysed using older RT-PCR methods. Testing with the new methods exhibited a higher detection rate in all three viruses, compared to the older methods. Finally, different types of plant tissues (bark scrapings, leaves and petioles) collected from different shoots of three grapevine plants infected with GVA or GVF from the Farm of the Aristotle University of Thessaloniki (AUTH) during three consecutive seasons (spring, summer, autumn) were tested, in order to determine the most suitable plant tissue and season for the valid detection of GVA and GVF. The newly developed methods of this study were used for testing these samples. The results showcased that bark scrapings are the most suitable type of tissue for sampling, in order to validly detect the viruses, while autumn is the most suitable season. However, it is worth noticing that the viruses were readily detected in all types of tissue and during all the three seasons, making them also suitable for sampling.