title: Extracellular vesicles and their impact on the epithelial plasticity of hepatocellular carcinoma cells
Creators: name: Martinez Turtos, Adriana
Publisher: name: :none
Year: 2018

description: Leberkrebs ist der weltweit sechsthäufigste maligne Tumor, der zur zweithäufigsten Mortalität aller Krebserkrankten führt. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist der vorherrschende primäre Leberkrebs. Die schlechte Prognose von HCC Patienten ist mit fehlenden Biomarkern für die diagnostische Früherkennung sowie einer häufig auftretenden Metastasierung nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors begründet. Darum sind geeignete Diagnosen und Therapien für die erfolgreiche Bekämpfung des HCC von äußerster Wichtigkeit. Tumor-abgeleitete Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die von Tumoren produziert werden und diese in vielen ihrer Entwicklungsstadien beeinflussen und regulieren können. Kürzliche Studien haben gezeigt, dass metastasierende HCC Zellen sEVs freisetzen können, welche die Migration und Invasivität von differenzierten Hepatozyten mittels eines epithelial zu mesenchymalen Transition (EMT)-ähnlichen Prozesses induzieren. Das Verständnis der sEV Funktionen in der metastatischen Kaskade des HCC könnte die Basis für die Entwicklung einer neuen zielgerichteten Therapie sein. In dieser Studie wurden differenzierte HepG2 Zellen verwendet, um herauszufinden, ob sEVs von EMT- transformierten HCC Zellen einen Einfluss auf die Zellplastizität von epithelialen Zellen haben. Die, von mesenchymalen HCC Zellen gewonnen, EVs konnten eine Veränderung der epithelialen Zellplastizität der HepG2 Zellen durch Verminderung der E-Cadherin Expression induzieren. Die reduzierte E-Cadherin Expression war unabhängig von einer verstärkten Abundanz mesenchymaler Marker oder charakteristischen EMT-Transkriptionsfaktoren. Die für das Experiment verwendeten EVs wurden vorab bezüglich ihrer Größe und EV- spezifischer Marker charakterisiert. Zudem wurde der Anteil der sEVs innerhalb der EV Population mittels Nanopartikelanalyse bestimmt. Die durch differentielle Ultrazentrifugation (DUC) gewonnene sEV–Fraktion betrug über 50%. Kommerziell erhältliche Kits, die auf Membranaffinität basieren, zeigten eine geringere sEV Ausbeute verglichen mit der DUC- Methode. Western Blot Analysen der DUC isolierten EVs ergaben eine Anreicherung mit den Tetraspanin-Proteinen CD63 und CD81 sowie das Vorhandensein von TSG101 und das Fehlen des Endoplasmatischen-Reticulum Proteins GRP78. Zusätzlich wurden CD63-GFP exprimierende HCC Zelllinien für die Freisetzung von GFP-markierten sEVs generiert, die für weiterführende in vivo Untersuchungen zur Funktion einer prämetastatischen Nische eingesetzt werden sollen. CD63-GFP markierte EVs wurden mittels Immunfluoreszenzmikroskopie, Western Blot Analyse und Durchflusszytometrie nachgewiesen und einzelne Zellklone selektiert. In diesen Experimenten soll der Effekt von EVs auf die Ausbildung einer prämetastatischen Nische nach Xenotransplantation in immundefizienten Mäusen geklärt werden. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Rolle von EVs als Vermittler in der Zell-Zell Kommunikation zwischen mesenchymalen und epithelialen HCC Zellen auf. Es konnte gezeigt werden, dass EVs von mesenchymalen Zellen eine Änderung in der Plastizität von epithelialen Zellen induzieren. Zusätzlich wurden GFP- markierte EVs mittels der für uns am besten geeignete Methode der DUC isoliert, charakterisiert und selektiert. Diese Zellmodelle stehen nun als Werkzeug für die Untersuchung der prämetastatischen Nische des HCC zur Verfügung.
description: Globally, liver cancer represents the sixth most common cause of cancer and ranks second in the mortality of cancer patients. Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common subtype of primary liver cancer. Poor survival of HCC patients reflects the lack of specific biomarkers for early diagnostics as well as high levels of metastasis and recurrence after surgical resection. This highlights the urgent need of anti-cancer therapies to combat HCC. Tumor-derived exosomes are bio-nanoparticles involved in several steps during tumor development. For instance, these small extracellular vesicles (sEVs) derived from highly metastatic human HCC cells induce higher migration and invasion of non-motile immortalized human hepatocytes in a process that resembles epithelial to mesenchymal transition (EMT). Therefore, elucidating the role that these sEVs are playing in the metastatic cascade of HCC could bring novel insights for design of new targeted therapies. In order to investigate whether sEVs derived from EMT-transformed HCC cells have an impact on the cell plasticity of epithelial HCC cells, in vitro EV treatment of well-differentiated HepG2 cells was performed. EVs isolated from mesenchymal HCC cells induced changes in the epithelial plasticity of HepG2 cells by downregulation of E-cadherin transcript levels. Reduction of E-cadherin expression was independent of the transcriptional repression exerted by EMT-transcription factors and upregulation of other mesenchymal markers. Previous to EV treatment of HepG2 cells, EVs derived from cell culture conditioned medium of mesenchymal-like HCC cells were characterized by their size and the presence of a combination of markers specific for sEVs. Characterization of those EVs by nanoparticle tracking analysis demonstrated that upon isolation by differential ultracentrifugation (DUC), the sEV fraction represented more than 50% of the EV population. The use of a membrane affinity-based commercial kit for isolation of EVs yielded a lower representation of sEVs as compared to DUC. Characterization of DUC-isolated EVs by immunoblotting resulted in co- enrichment of the tetraspanin members CD63 and CD81, unique presence of TSG101 and the lack of the endoplasmatic reticulum protein GRP78. In addition, CD63-GFP-expressing HCC cells were generated with the aim of investigating the role of EVs in pre-metastatic niche formation in vivo. Those HCC cells released GFP-labeled EVs as demonstrated by immunodetection, immunofluorescence microscopy and flow cytometry analyses. Further selection of single cell clones was performed for future EV education of immunodeficient mouse models prior to xenotransplantation. Altogether, this study shows the role of EVs as messengers mediating cell-to-cell communication between mesenchymal-like and epithelial HCC cells leading to induction of changes in the epithelial plasticity. GFP-labeled EVs were isolated by DUC as the method of choice, characterized and selected to provide a valuable tool for studying in vivo formation of the pre-metastatic niche of HCC cells.