Identification and biological characterization of indoline-based autophagy inhibitors
Creators: name: Rummelt, Marjorie A.
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2017
Subjects: subject: Autophagy
subject: Target identification
subject: Forward chemical genetics
subject: Proteomics
subject: Target prediction
subject: Structure-activity relationship
subject: Phenotypic screening
subject: 570

description: Autophagy is a vital catabolic process involved in the degradation of cellular components, which plays an important role in cancer and neurodegenerative disorders. Due to their high complexity, the pathways regulating autophagy have not been fully elucidated. The development of specific autophagy modulators and the identification of their cellular targets can provide valuable insight into the regulation of this process and, ultimately, its role in disease. Herein, a potent inhibitor of starvation-induced autophagy (IC50 = 520 +- 550 nM) was identified using a phenotypic screen. In a series of secondary assays, the compound was validated as an autophagy inhibitor. The structure–activity relationship for this compound class was derived from a synthesized compound collection of structural analogs and used for the preparation of a chemical probe for affinity-based proteomics ("pull-down"). Glutamate dehydrogenase (GDH) and calpain-1 were isolated by means of affinity-based proteomics but devalidated as targets of the inhibitor in various biophysical and biochemical assays. The ATP-gated ionotropic receptor P2X4 and the Ragulator component LAMTOR5 were the most promising targets determined by thermal proteome profiling and are currently under evaluation.Targets predicted using a computational approach based on chemical similarity included 5-hydroxytryptamine (5-HT) receptors and multiple kinases—rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF1) and related kinases, pyruvate kinase (PK), and abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1). Whereas no modulating effect on the predicted kinases was observed, the autophagy inhibitor was a potent antagonist of the G-protein-coupled serotonin receptor 5-HT6 (IC50 = 1 µM). However, as known antagonists of the receptor did not inhibit autophagy, 5-HT6 was considered an off-target. Given the strong antagonistic effect seen, G-protein-coupled receptors need to be further evaluated as potential targets of the identified inhibitor. The successful target identification of this potent inhibitor could help deliver further understanding of the complex mechanisms that regulate autophagy.
description: Autophagie ist ein lebensnotwendiger katabolischer Prozess, der am Abbau zellulärer Komponenten beteiligt ist und eine wichtige Rolle bei Krebs und neurodegenerativen Krankheiten spielt. Aufgrund der hohen Komplexität der Autophagie-regulierenden Signalwege konnten diese noch nicht vollständig entschlüsselt werden. Die Entwicklung spezifischer Autophagie-Modulatoren und die Identifizierung ihrer zellulären Zielproteine können einen wertvollen Einblick in die Regulierung von Autophagie und letztendlich ihre Rolle in Krankheiten gewähren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels phänotypischem Screening ein potenter Inhibitor von durch Aushungern induzierter Autophagie identifiziert (IC50 = 520 +- 550 nM). In einer Reihe sekundärer Assays wurde diese Verbindung als echter Autophagie-Inhibitor validiert. Die Struktur-Aktivitätsbeziehung für diese Verbindungsklasse wurde aus einer hergestellten Substanzkollektion abgeleitet, anhand derer eine chemische Sonde synthetisiert wurde. Glutamatdehydrogenase (GDH) und Calpain-1 wurden durch Affinitätschromatographie isoliert, allerdings anschließend in verschiedenen biophysikalischen und biochemischen Assays als Zielproteine des Autophagie-Inhibitors devalidiert. Mittels thermischem Proteomprofiling wurden der ATP-abhängige Ionenkanal P2X4 und die Ragulator-Komponente LAMTOR5 als vielversprechendste Zielproteine identifiziert und werden derzeit untersucht. 5-Hydroxytryptaminrezeptoren und mehrere Kinasen—rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF1) und verwandte Kinasen, Pyruvatkinase (PK) und abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1)—waren unter den Zielproteinen, die durch rechnergestützte Ansätze anhand von strukturellen Ähnlichkeiten vorausgesagt wurden. Während kein Effekt auf die PK beobachtet wurde, war der Autophagie-Inhibitor ein potenter Antagonist des G-Protein-gekoppelten Serotoninrezeptors 5-HT6 (IC50 = 1 µM). Da allerdings bekannte Antagonisten dieses Rezeptors Autophagie nicht inhibierten, wurde 5-HT6 als „Off-Target“ bezeichnet. Angesichts des beobachteten starken antagonistischen Effekts, müssen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren genauer als mögliche Zielproteine des identifizierten Inhibitors untersucht werden. Die erfolgreiche Identifizierung des Zielproteins dieses Inhibitors könnte dazu beitragen, weitere Einsicht in die komplexen Autophagie-regulierenden Mechanismen zu ermöglichen