title: Voltage-dependence of adrenoceptor activity : Mechanisms and signal transduction
title: Spannungsabhängigkeit der Aktivität von Adrenozeptoren : Mechanismen und Signaltransduktion
Creators: name: Birk, Alexandra Christine
Publisher: name: Philipps-Universität
      Marburg
Year: 2016
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Gs Protein
Adrenozeptoren, Spannungsabhängigkeit
efficacy
affinity
G Protein-gekoppelte Rezeptoren
voltage-dependence
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
Spannungssensor, intrinsische Aktivität
mechanism of voltage-dependence

description: G Protein-gekoppelte Rezeptoren
      bilden eine Superfamilie von Membranproteinen, die
      extrazelluläre Stimuli ins Zellinnere weiterleiten.
      Adrenozeptoren (AR) sind G Protein-gekoppelte Rezeptoren
      (GPCRs), die der α-Untergruppe der Rhodopsin-Familie
      angehören. Die endogenen Katecholamine Noradrenalin und
      Adrenalin führen über die Aktivierung von Adrenozeptoren zur
      Regulation verschiedenster neuronaler, endokriner,
      kardiovaskulärer, vegetativer und metabolischer Funktionen.
      Zusätzlich zur klassischen Aktivierung von GPCRs durch
      Agonistenbindung an einen Rezeptor konnte die Regulation der
      Aktivität durch eine Veränderung des Membranpotentials für
      eine Reihe Gi- und Gq-gekoppelter Rezeptoren gezeigt werden.
      Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch noch keine Untersuchung
      zur Spannungsabhängigkeit Gs-gekoppelter Rezeptoren
      beschrieben. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Aktivität der
      Gs Protein-gekoppelten Adrenozeptoren β1-AR und β2-AR
      hinsichtlich ihrer Modulation durch das Membranpotential
      untersucht. Die Kombination Förster-Resonanz-Energie-Transfer
      (FRET)-basierter Messungen und der patch-clamp Methode im
      voltage-clamp Modus ermöglichte die Aufzeichnung agonist- und
      spannungsabhängiger Änderungen von Proteinkonformationen oder
      von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Es wurden
      intramolekulare FRET-basierte Rezeptor-Fusionsproteine
      eingesetzt, um den Einfluss des Membranpotentials auf
      Bewegungen im aktivierten Rezeptormolekül direkt zu
      untersuchen. Für die Untersuchung von
      Protein-Protein-Wechselwirkungen kamen intermolekulare
      FRET-Sensoren zum Einsatz. Mithilfe der Kombination aus FRET
      und elektrophysiologischen Messungen konnte in dieser Arbeit
      die Spannungsabhängigkeit des β1-AR gezeigt werden, die sich
      in einer Aktivitätsabnahme bei Depolarisation äußerte. Auch
      der eng verwandte β2-AR zeigte eine depolarisationsabhängige
      Abnahme der Aktivität, jedoch war diese schwächer ausgeprägt
      als bei β1-AR. Die Spannungsabhängigkeit übertrug sich für
      beide Rezeptoren auch auf die nachgeschaltete Signalkaskade.
      Diese Ergebnisse erweitern den Kreis spannungsabhängiger
      Rezeptoren um die Gruppe Gs-gekoppelter Rezeptoren. Im Falle
      des β1-AR wurde die Spannungsabhängigkeit hauptsächlich über
      eine Änderung der intrinsischen Aktivität der Agonisten
      Isoprenalin und Adrenalin vermittelt. Dies ist erstaunlich,
      da bisher die Spannungsabhängigkeit von Rezeptoren, die durch
      endogene Agonisten aktiviert wurden, nur eine Regulation der
      Agonistaffinität bekannt war. Es konnte ebenfalls eine
      agonistspezifische Komponente der β1-AR Spannungsabhängigkeit
      ermittelt werden: Mit Dopamin aktivierte Rezeptoren zeigten
      eine Zunahme ihrer Aktivität während der Depolarisation
      während die Isoprenalin-, Noradrenalin-, Adrenalin- und
      Dobutamin-vermittelte Aktivität bei positiven
      Membranpotentialen abnahm. Der entgegengesetzten
      Spannungsabhängigkeit von Dopamin-aktivierten Rezeptoren
      könnte ein geändertes Bindungsverhalten von Dopamin in der
      Rezeptorbindetasche zugrunde liegen. Der zweite Teil dieser
      Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des molekularen
      Mechanismus, der der Spannungsabhängigkeit zugrunde liegt.
      Hierfür wurden verschiedene Aminosäuren im
      spannungsabhängigen α2A-AR mutiert. Die Neutralisation einer
      geladenen Aminosäure und der Änderung einer Aminosäure, die
      an der Agonistbindung beteiligt ist, schienen die
      Spannungsabhängigkeit nicht zu beeinflussen. Jedoch führte
      das Einbringen einer zusätzlichen, positiven Ladung in die
      Nähe des hochkonservierten Aspartats D2.50 in TM2 zu einer
      Reduktion der Spannungsabhängigkeit. Diese Aminosäure könnte
      eine Komponente des Spannungssensors des α2A-AR sein, jedoch
      sind weitere Experimente nötig, um diese Hypothese zu
      untermauern. Zusammengefasst erweitern die in dieser Arbeit
      vorgestellten Daten die Gruppe der spannungsabhängigen GPCR
      um jene, die ihr Signal über stimulatorische Gs-Proteine
      vermitteln. Besonders in erregbaren Geweben wie dem Herzen,
      das β1-AR exprimiert, könnte das Membranpotential für eine
      zusätzliche Feinregulation der Rezeptoraktivität sorgen. Dies
      könnte sich im zeitlichen Rahmen kardialer Aktionspotentiale
      abspielen und ohne die Dissoziation des Agonisten vor sich
      gehen. Auf molekularer Ebene ist eine Beteiligung des
      hochkonservierten Aspartats in TM2 (D2.50) an der Erkennung
      von Spannungsänderungen der Plasmamembran im α2A-AR denkbar.
      Ob sich dies auch auf andere spannungsabhängige GPCRs
      übertragen lässt, bleibt zu ermitteln.
description: G protein-coupled receptors
      comprise a large superfamily of membrane proteins which
      transmit extracellular stimuli into intracellular responses.
      Adrenoceptors (AR) belong to the α-group of Rhodopsin-family
      G protein-coupled receptors. Physiological activation of
      adrenoceptors is mediated by binding of the endogenous
      catecholamines noradrenaline and adrenaline and leads to the
      regulation of neuronal, endocrine, cardiovascular, vegetative
      and metabolic functions. In addition to the classical
      activation of GPCRs by binding of ligands, experimental
      evidence has accumulated showing that GPCR activation can be
      modulated by the membrane potential. In this study
      adrenoceptors β1-AR and β2-AR have been investigated in
      regard to the modulation of their activity by the membrane
      potential. Both receptors couple to the stimulatory Gs
      protein. They were used as model receptors because despite
      increasing knowledge of voltage-dependent regulation of Gi-
      and Gq-coupled receptor activity, no data has been published
      on the voltage-sensitivity of Gs-coupled receptors. Förster
      resonance energy transfer (FRET)-based assays were combined
      with whole-cell patch-clamp in a voltage-clamp mode in order
      to monitor agonist- and voltage-dependent alterations in
      either protein conformation or protein-protein interaction.
      Conformational changes of the receptor molecule upon
      stimulation with catecholamines in the presence or absence of
      depolarizing steps were directly monitored using FRET-based
      intramolecular receptor fusion proteins. By means of the
      combination of FRET and patch-clamp, voltage-dependence of
      β1-AR and to smaller extent β2-AR activation was shown to be
      an intrinsic property of these Gs-coupled receptors and was
      transmitted to downstream signaling. Receptor activity and
      downstream signaling decreased during depolarization. This
      expands voltage-dependent GPCRs to the group that couple to
      stimulatory G proteins. Voltage-dependence of β1-AR was
      mainly mediated via an alteration in efficacy of either Iso
      or Adr and occurred with highest sensitivity at physiological
      membrane potentials. Regarding Adr this is a unique finding
      since voltage-dependence of other GPCRs activated by their
      endogenous ligands were shown to rely on alterations in
      ligand affinity. Agonist-specificity of voltage-dependence
      was also apparent as dopamine-induced β1-AR interaction with
      arrestin 3 was enhanced during depolarization whereas it was
      reduced when induced by adrenaline, isoprenaline,
      noradrenaline or dobutamine. A different binding mode of
      dopamine might be responsible for these differences. The
      second part of this thesis focused on the molecular mechanism
      underlying voltage-dependence. Mutation of a charged amino
      acid and a residue involved in agonist binding did not seem
      to alter voltage-dependence or only yielded inconclusive
      results. However, the introduction of an additional positive
      charge in the vicinity of a highly conserved aspartic acid in
      TM2 (D2.50) reduced voltage-dependence of the mutant
      receptor. We might have identified this aspartic acid as one
      residue of a voltage-sensor in α2A-AR but further experiments
      are required in order to corroborate this hypothesis. Taken
      together these data expand voltage-dependent GPCRs to the
      group coupling to Gs proteins. Especially in excitable tissue
      like the heart, which expresses voltage-dependent β1-AR the
      membrane potential could fine-tune adrenoceptor signaling on
      a time scale within cardiac action potentials and in the
      presence of endogenous or synthetic catecholamines. On a
      molecular level we suggest a possible involvement of the
      highly conserved aspartic acid D2.50 in the detection of
      alterations in the membrane potential in α2A-AR. Whether this
      conclusion is also transferable to other G protein-coupled
      receptors remains to be investigated.