title: Analysis of the molecular and biological functions of the transcription factor Sp2
title: Untersuchungen zur molekularen und biologischen Funktion des Transkriptionsfaktors Sp2
Creators: name: Nau, Kerstin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Medizin, Gesundheit
Transcription factor
Transkriptionsfaktor

description: The transcription factor Sp2
      belongs to the Sp/KLF family of transcription factors. This
      family is characterized by a C-terminal DNA-binding domain
      composed of three zinc fingers of the C2H2 type. The zinc
      finger domains mediate binding to GC-rich DNA elements, so
      called GC- or GT-boxes. These elements are found in a number
      of promoters, directing transcription of diverse genes, such
      as house keeping genes or genes that are regulated by
      specific stimuli. When this work was initiated, little was
      known about the function of the Sp2 protein. DNA-binding of
      the full length protein was not observed, although the Sp2
      zinc finger region showed DNA-binding in EMSAs. Also,
      activation of reporter genes was not detected. DNA-binding
      analyses of deletion mutants indicated, that an N-terminal
      region might inhibit DNA binding of full-length Sp2, possibly
      by mediating interactions with other proteins. A transgenic
      Sp2 knock-out mouse line had already been generated and it
      had been shown, that mice lacking Sp2 protein die during
      early embryonic development. The aims of this work were (I)
      to analyze the DNA-binding properties of Sp2 in more detail,
      (II) to test if Sp2 interacts with other proteins and, if so,
      identify these interaction partners, and (III) to establish
      Sp2 deficient MEFs as well as a conditional Sp2 knock-out
      mouse line in order to allow further analysis of the
      biological function of Sp2. To analyze the DNA-binding
      capacity of Sp2 in more detail, a series of deletion mutants
      was examined in EMSA in parallel with full-length Sp2.
      DNA-binding of full-length Sp2 was never observed under the
      conditions tested. In addition, it was shown that at least
      three regions in the Sp2 protein inhibit DNA binding,
      possibly by mediating protein-protein interactions. Size
      exclusion chromatography indicated that Sp2 most likely
      interacts with other proteins, as Sp2 was found in several
      high molecular weight fractions. To identify these
      interacting proteins, a yeast-two-hybrid screen was performed
      and RNF197 and RACK1 were found to interact with Sp2. But
      these interactions could not be validated by
      co-immunoprecipitation experiments. Therefore, a second
      approach was employed for the identification of interaction
      partners. Co-immunoprecipitation experiments using Sp2-3Flag
      were performed followed by mass spectrometric analyses. In
      total, 279 proteins were found to co-elute with Sp2-3Flag.
      The potential interactions of E2F6 and RBBP4 with Sp2 were
      analyzed by co-immunoprecipitation experiments, but could not
      be validated. To analyze the function of Sp2 in vivo, MEFs
      were isolated from E9.5 Sp2 knock-out embryos but these MEFs
      did not proliferate in culture. Therefore, a conditional Sp2
      knock-out mouse line was generated and MEFs were isolated
      from E13.5 embryos for further analysis. Depletion of Sp2
      from these MEFs lead to inhibition of proliferation.
      Therefore, Sp2 is not only essential for normal mouse
      embryonic development, but also for proliferation of cells in
      culture.
description: Der Transkriptionsfaktor Sp2 gehört
      zur Familie der Sp/KLF Transkriptionsfaktoren. Diese Proteine
      besitzen eine charakteristische C-terminale DNA-Bindedomäne,
      die aus drei Zinkfingern vom Typ C2H2 besteht und die Bindung
      an spezifische DNA-Sequenzen, sogenannte GC- und GT-Boxen,
      vermittelt. Diese DNA-Elemente findet man in Promotoren
      zahlreicher Gene, wie z.B. Haushaltsgene oder Gene, die einer
      spezifischen Regulation unterliegen. Über den
      Transkriptionsfaktor Sp2 war zu Beginn dieser Arbeit wenig
      bekannt. Eine DNA-Bindung des volle-Länge Proteins in EMSAs
      konnte nicht nachgewiesen werden, ebenso wenig eine Funktion
      als transkriptioneller Aktivator. Es gab Hinweise, dass es
      eine Region im Sp2 Protein gibt, die die DNA Bindung
      inhibiert oder reguliert, möglicherweise durch die
      Interaktion mit anderen Proteinen. Die Herstellung einer
      transgenen Sp2 knock-out Mauslinie zur Untersuchung der
      Funktion von Sp2 in vivo war bereits erfolgt, und es war
      bekannt, dass Mäuse Sp2-defiziente Mäuse in einem frühen
      Embryonalstadium sterben. Die Ziele dieser Arbeit bestanden
      darin, (I) die DNA-Bindungseigenschaften von Sp2 näher zu
      untersuchen, (II) zu testen, ob Sp2 mit anderen Proteinen
      interagiert und diese gegebenenfalls zu identifizieren und
      (III) die Analyse der Funktion von Sp2 in vivo durch die
      Etablierung von Sp2 knock-out MEFs sowie einer konditionellen
      Sp2 knock-out Linie zu ermöglichen. Um die
      DNA-Bindungseigenschaften von Sp2 im EMSA zu analysieren,
      wurde neben dem volle-Länge Sp2 Protein eine Reihe von
      Deletionsmutanten verwendet. Diese Analysen ergaben, dass
      volle-Länge Sp2 unter keiner der getesteten Bedingungen im
      EMSA DNA bindet. Zudem wurde gezeigt, dass es im Sp2 Protein
      mindestens drei Regionen gibt, die die DNA-Bindung
      inhibieren, wobei der zugrundeliegende Mechanismus nicht
      aufgeklärt werden konnte. Möglicherweise vermitteln diese
      Regionen die Interaktion mit anderen Proteinen, die dann die
      DNA-Bindung von Sp2 inhibieren. Größenfraktionierungen
      mittels Gelchromatographie zeigten, dass Sp2 in mehreren
      hochmolekularen Fraktionen zu finden ist. Dieser Befund ist
      ein Indiz dafür, dass Sp2 mit anderen Proteinen interagiert.
      Um diese Interaktionspartner zu identifizieren, wurde ein
      Hefe-zwei-Hybrid Screen durchgeführt. Zwei Proteine, RNF197
      und RACK1, wurden als Interaktionspartner von Sp2
      identifiziert. Jedoch konnten diese Interaktionen nicht durch
      Co-Immunpräzipitationen validiert werden. Um
      Interaktionspartner von Sp2 mit einer anderen Methode zu
      identifizieren, wurden unter Verwendung von Sp2-3xFlag
      Co-Immunpräzipitationen mit anschließender
      massenspektrometrischer Analyse durchgeführt. Dabei wurden
      insgesamt 279 potentielle Interaktionspartner gefunden. Zwei
      von ihnen, E2F6 und PBBP4, wurden ausgewählt, um ihre
      Interaktion mit Sp2 mittels Co-Immunpräzipitation zu
      validieren. Jedoch konnten diese Interaktionen weder
      bestätigt noch ausgeschlossen werden. Um die Funktion von Sp2
      in vivo untersuchen zu können, sollten Sp2-defiziente MEFs
      hergestellt werden. Sp2 knock-out MEFs wurden aus E9,5
      Embryonen isoliert, allerdings proliferierten diese in Kultur
      nicht weiter. Um dennoch die Funktion von Sp2 in vivo
      untersuchen zu können, wurde eine Mauslinie hergestellt, die
      es ermöglicht, Sp2 konditionell zu depletieren. Aus E13,5
      Embryonen wurden MEF Kulturen etabliert, die im Rahmen von
      zwei Diplomarbeiten für weiterführende Experimente verwendet
      wurden. Dabei wurde gezeigt, dass die Depletion von Sp2 durch
      die Infektion mit einem Retrovirus, der für Cre-Rekombinase
      kodiert, die Proliferation dieser Zellen inhibiert. Sp2 ist
      also sowohl für die normale Entwicklung von Mausembryonen als
      auch für die Proliferation von Zellen in Kultur
      essentiell.