title: Inhibitors of bacterial and mammalian hyaluronidases: design, synthesis and structure-activity relationships with focus on human enzymes
Creators: name: Spickenreither, Martin
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Enzyminhibitor , Struktur-Aktivitäts-Beziehung , Hyaluronsäure , Rekombinantes Protein , Hyaluronidasen , Vitamin C-Derivate , Hyal-1 , PH-20 , bovine testikuläre Hyaluronidase , ascorbic acid derivatives , indole-3-butyric acid , glucurono-6,3-lactone , hyaluronate lyase
subject: 540 Chemie
subject: 81.20.Ka
subject: 87.14.ej

description: There is a need for hyaluronidase inhibitors as pharmacological tools to study the (patho)physiological role of these enzymes. As such compounds could also be useful as drugs, e.g. in the treatment of (bacterial) infections, arthroses and cancer or as contraceptives, the goal of this thesis was the synthesis, identification and structural optimization of low molecular weight inhibitors. The synthesized compounds were tested in a turbidimetric assay for inhibition of the recombinantly expressed human hyaluronidases Hyal-1 and PH-20, bovine testicular hyaluronidase (BTH) and a bacterial hyaluronate lyase (SagHyal4755). In a first approach derivatives of the glucurono-6,3-lactone were synthesized. 1-O-Alkyl derivatives were inactive or only weakly active on human Hyal-1 and BTH but exhibited pronounced inhibition of human PH-20 and SagHyal4755. The inhibitory potency against all investigated hyaluronidases was increased by adding polar substituents (IC50 values in the lower micromolar range). Furthermore, 1-O-alkyl-gluco-furanosiduronic acids and -uronamides were prepared which proved to be preferably inhibitors of PH-20 and SagHyal4755. In a second approach various ascorbic acid derivatives with increased hydrophobicity were prepared since the inhibitors ascorbic acid and its 6-O-palmitoyl derivative were proven by X-ray crystallography to bind to the active center of a bacterial hyaluronidase. A clear correlation between chain length of the 6-alkanoyl residue and inhibitory potency was found. Whereas BTH, PH-20 and SagHyal4755 were most potently inhibited by ascorbic acid 6-O-palmitate, strongest inhibition of Hyal-1 was achieved with the 6-O-tridecanoate. The differences in inhibitory activity became even more prominent when compounds bearing biaryl residues were investigated: rather small modifications of the terminal phenyl residue led to different structure-activity relationships (SAR) for all investigated hyaluronidases. Among the ascorbic acid derivatives 6-O-[11-(4-phenylphenoxy)undecanoyl]ascorbic acid was identified as one of the most potent low molecular weight inhibitors of human PH-20 known so far with an IC50 value of 1.3 µM. �Bivalent� inhibitors, characterized by two vitamin C moieties connected by alkanedioyl spacer groups, proved to be roughly equipotent with the corresponding �monovalent� ligands. By contrast, 5,6-di-O-acylation of ascorbic acid led to significantly enhanced inhibition compared to monoacylation. The differences in IC50 values due to diacylation were most evident for human PH-20 where up to 26-fold higher potency was obtained. Introduction of carboxylic acid residues led to potent inhibitors of the hyaluronidases, e.g. 2-O-(5-carboxypentanoyl)-6-O-hexadecanoyl-L-ascorbic acid (IC50 [µM]: 8.3 (Hyal-1), 2.0 (PH-20), 27 (BTH), 2.8 (SagHyal4755)) represents the most potent inhibitor of human Hyal-1 developed in this work and thus is one of the most potent inhibitors of Hyal-1 known to date. Additionally 2-, 3- and 6-O-alkylated ascorbic acid derivatives were prepared with respect to higher stability under physiological conditions compared to carboxylic esters. Strikingly, distinct differences in the SAR for the mammalian and bacterial hyaluronidases are obvious in this series again. The recently published crystal structure of human Hyal-1 was used as a 3-D model to perform an automated (FlexiDock) as well as a manual docking using potent ascorbic acid based inhibitors as ligands. The suggested binding modes are appropriate to explain several characteristics of the SAR and thus could provide the basis for further structure-based development of Hyal-1 inhibitors. In a third synthetic approach indole based inhibitors were synthesized. Especially �bivalent� indole-3-butanoic acids, derivatives containing large hydrophobic fragments and manifold substituted indoles proved to be potent inhibitors of human PH-20 and bacterial hyaluronidase (e.g. 2-carboxy-5-(hexadecan-1-yl)oxy-1H-indole-3-butanoic acid, IC50 [µM]: 1.3 (PH-20), 3.4 (SagHyal4755)). These compounds are characterized by distinct selectivity for human PH-20 compared to the other investigated mammalian hyaluronidases. Previously, BTH has been broadly accepted as a model enzyme for human hyaluronidases. This working hypothesis is challenged by the results of this thesis as human PH-20 is strongly inhibited by some indoles and the bovine homolog is not. Whereas additional approaches to develop carbohydrate- or peptide-based inhibitors failed, rather potent inhibitors of human PH-20 and SagHyal4755 were identified among small series of melophlins and alkylphosphocholines. With respect to planned in vivo investigations selected hyaluronidase inhibitors were investigated in more detail. Whereas cytotoxicity was not detected and micelle formation and hemolytic activity became only prominent at irrelevantly high concentrations, the detected plasma protein binding must be considered in further investigations.
description: Selektive Hyaluronidase-Inhibitoren werden als pharmakologische Werkzeuge benötigt, um die (patho)physiologische Rolle dieser Enzyme zu untersuchen. Zudem könnten solche Verbindungen auch als Wirkstoffe z.B. bei (bakteriellen) Infektionen, Arthrosen und Krebs eingesetzt werden oder als Kontrazeptiva dienen. Ziel dieser Arbeit war die Synthese, Identifikation und Strukturoptimierung von Inhibitoren. Die synthetisierten Substanzen wurden turbidimetrisch auf Hemmung der rekombinant exprimierten humanen Hyaluronidasen Hyal-1 und PH-20, der bovinen testikulären Hyaluronidase (BTH) und einer bakteriellen Hyaluronat Lyase (SagHyal4755) getestet. Zunächst wurden Derivate des Glucurono-6,3-lactons synthetisiert. 1-O-Alkyl-Derivate zeigten keine oder nur schwache Hemmung von Hyal-1 und BTH, erwiesen sich jedoch gegenüber humanem PH-20 und SagHyal4755 als deutlich potenter. Polare Substituenten steigerten die Hemmwirkung gegenüber allen untersuchten Hyaluronidasen. Hergestellte 1-O-Alkylglucofuranosiduronsäuren und -uronamide zeigten eine präferentielle Hemmung von PH-20 und SagHyal4755. Im zweiten Teilprojekt wurden lipophile Vitamin C Derivate hergestellt. Basis dafür waren zuvor durchgeführte Röntgenstrukturanalysen, welche die Bindung von Ascorbinsäure und deren 6-O-Palmitoyl Derivat ans aktive Zentrum einer bakteriellen Hyaluronidase belegten. Zwischen der Kettenlänge des 6-Alkanoyl-Restes und der Inhibitorstärke besteht eine Korrelation. Während Ascorbinsäure-6-O-palmitat die Enzyme BTH, PH-20 und SagHyal4755 am stärksten hemmte, wurde maximale Hyal-1 Inhibition durch das Tridecanoat erzielt. In einer Reihe von Verbindungen mit Biarylresten beeinflusste die Modifikation des terminalen Phenlyrings Struktur-Wirkungs-Beziehungen für die untersuchten Enzyme in unterschiedlicher Weise. Unter den Vitamin C Derivaten wurde 6-O-[11-(4-Phenylphenoxy)undecanoyl]-ascorbinsäure als bislang potentester niedermolekularer PH-20-Hemmstoff identifiziert (IC50-Wert: 1,3 µM). �Bivalente� Inhibitoren, die sich durch zwei mittels Alkandioyl-Spacer verknüpfte Vitamin C Reste auszeichnen, zeigten etwa die gleiche Potenz wie die jeweiligen �monovalenten� Liganden. Im Gegensatz dazu führte 5,6-Di-O-acylierung von Vitamin C zu signifikant stärkerer Wirkung als die entsprechende Monoacylierung. Die Unterschiede zeigten sich am deutlichsten bei humanem PH-20, wo die Diacylierung eine bis zu 26-fache Aktivitätssteigerung ergab. Die Einführung von Carbonsäureresten führte zu potenten Hyaluronidase-Inhibitoren: So stellt 2-O-(5-Carboxypentanoyl)-6-O-hexa-decanoyl-ascorbinsäure (IC50 [µM]: 8,3 (Hyal-1), 2,0 (PH-20), 27 (BTH), 2,8 (SagHyal4755)) einen der potentesten Inhibitoren dar, die bis dato für humanes Hyal-1 identifiziert wurden. Zusätzlich wurden, wegen ihrer im Vergleich zu den betreffenden Ester-Derivaten höheren Stabilität unter physiologischen Bedingungen, 2-, 3-, und 6-O-alkylierte Vitamin C Derivate synthetisiert. Interessanterweise unterschieden sich auch in dieser Serie die Struktur-Wirkungs-Beziehungen für die verschiedenen Enzyme. Auf der Grundlage der kürzlich publizierten Röntgenkristallstruktur des humanen Hyal-1 wurde mit potenten Inhibitoren des Vitamin C Typs sowohl ein automatisches Docking (FlexiDock) als auch ein manuelles Docking durchgeführt. Die vorgeschlagenen Bindungsmodi erklären charakteristische Struktur-Wirkungs-Beziehungen und können als Basis für strukturbasiertes Design von Hyal-1 Inhibitoren genutzt werden. In einem dritten Teilprojekt wurden Indol-basierte Inhibitoren synthetisiert. Vor allem �bivalente� Indol-3-butansäuren, Derivate mit größeren hydrophoben Fragmenten und mehrfach substituierte Indole (z.B. 2-Carboxy-5-hexadecan-1-yl)oxy-1H-indol-3-butansäure, IC50 [µM]: 1,3 (PH-20), 3,4 (SagHyal4755)) stellten sich als potente Inhibitoren von humanem PH-20 und bakterieller Hyaluronidase heraus. Diese Verbindungen zeichnen sich generell durch Selektivität für humanes PH-20 gegenüber den anderen Säugetier-Hyaluronidasen aus. Die vormals allgemein akzeptierte Vorstellung, man könne BTH als Modell-Enzym zur Entwicklung von Inhibitoren humaner Hyaluronidasen heranziehen, wird durch Ergebnisse dieser Arbeit in Frage gestellt, da humanes PH-20 z.B. durch einige Indole stark, das homologe bovine Enzym jedoch nicht gehemmt wird. Während weitere Versuche, Inhibitoren auf Peptid- oder Kohlenhydratbasis zu entwickeln, fehlschlugen, konnten weitere potente PH-20- und SagHyal4755-Inhibitoren in kleineren Serien von Melophlinen und Alkylphosphocholinen identifiziert werden. Die vertiefte Untersuchung ausgewählter Hyaluronidase-Inhibitoren zeigte, dass die Substanzen keine Zytotoxizität besitzen und nur in irrelevant hohen Konzentrationen zur Mizellbildung neigen oder Hämolyse induzieren. Dagegen ist hohe Plasmaproteinbindung als Folge der Lipophilie der Substanzen ein Problem, das insbesondere bei zukünftigen In-vivo-Untersuchungen zur Rolle der Hyaluronidasen berücksichtigt werden muss.