title: Unconventional Secretion and Endocytosis of Galectin-3
title: Unkonventionelle Sekretion und Endozytose von Galectin-3
Creators: name: Schneider, Dominik
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Unconventional secretion
Galectine
Unkonventionelle Sekretion
Glykobiologie
Medizin, Gesundheit
Galectins
Protein transport
Endocytose
Proteintransport
Endocytosis
Glycobiology

description: Epithelial cells are characterized
      by a morphological and a functional partitioning of their
      membranes into an apical and a basolateral domain which is
      maintained by a highly specific polarized sorting of lipids
      and proteins. For the apical transport a variety of different
      pathways are assumed to exist which can be subdivided by the
      affinity of the transported proteins to lipid rafts. Sorting
      of non-raft associated from raft-associated glycoproteins is
      thought to occur in a post-Golgi compartment through the
      formation of high molecular weight clusters mediated by the
      galactose-binding lectin galectin-3. The importance of
      galectin-3 in the apical sorting of non-raft glycoproteins is
      a empirically established and also the molecular mechanisms
      leading to this process are beginning to be unraveled.
      However, the molecular identity of the sorting compartment
      remains to be explored. The present work addressed this
      question by investigating the uptake of galectin-3 by MDCK
      cells with the underlying hypothesis that endocytosed
      galectin-3 is recycled back to the plasma membrane and ought
      to traverse the sorting compartment during this process. It
      was found that the endocytosis of galectin-3 is a
      glycan-dependent process leading to the accumulation of this
      lectin in an acidified compartment. Endocytosed galectin-3 is
      most likely sorted into a recycling instead of a degradative
      pathway as assessed by colocalization studies with
      fluorescently labeled Dextran. The finding that galectin-3
      colocalizes with the apical recycling endosome marker Rab11
      after the start of the endocytosis further backs this
      assumption. In line with these results are the observations
      that under steady state conditions galectin-3 is found in
      acidified, Rab4-CFP-positive structures in COS cells as well
      as colocalized with miscellaneous endosomal marker proteins
      in MDCK cells. Besides the intracellular trafficking of
      galectin-3 the unconventional secretion pathway of this
      protein is under extensive debate. In the present work it
      could be shown that galectin-3 is found in the exosomal but
      not the microvesicular fraction of the cell culture
      supernatant of MDCK cells. In this fraction galectin-3
      associates with structures that share characteristics such as
      morphology, density and the presence of marker proteins with
      exosomes. Using proteinase K protection assays, it could be
      shown that galectin-3 accumulates in the lumen of these
      exosomes and, moreover, that the breakdown of these
      structures and subsequent release of their content is not due
      to an unstable nature of the vesicles per se but rather seems
      to involve cellular factors. Although galectin-3 colocalizes
      with various components of endosomal sorting complexes
      required for transport (ESCRTs) in COS 7 cells, the exosomal
      release of galectin-3 from MDCK II cells seems to be an
      ESCRT-independent process as assessed by studies with a
      dominant-negative mutant of the ESCRT disassembly factor
      Vps4a and RNAi dependent depletion of the ESCRT-I component
      Tsg101. In addition, influences of membrane blebbing or
      autophagy on the exosomal secretion of galectin-3 were ruled
      out. Moreover, possible signal sequences and the mechanisms
      that target this lectin into an unconventional secretion
      pathway remain to be uncovered. In this context, a putative
      late domain for interaction with Tsg101 could be identified
      by in silico methods in the amino acid motif known to be
      essential for secretion of an acylated form of galectin-3 in
      COS cells. The importance of this domain for exosomal
      localization of galectin-3 was tested but lead to ambiguous
      results. Still, it cannot be ruled out that the putative late
      domain might play a role in the secretion of galectin-3.
      Finally, the molecular identity of the endogenous MDCK
      sialoglycoprotein gp114 as the canine homologue of CEACAM1
      could be confirmed as both proteins shared the same
      characteristics in terms of antibody detection, apical
      localization and glycosylation.
description: Epitheliale Zellen sind
      charakterisiert durch eine morphologische und funktionelle
      Unterteilung ihrer Membran in eine apikale und eine
      basolaterale Domäne, welche durch einen hoch-spezifischen,
      polarisierten Sortiervorgang von Lipiden und Proteinen
      aufrechterhalten wird. Im apikalen Transport kann die
      Vielzahl verschiedener Transportwege aufgrund der Affinität
      der darin transportierten Proteine zu lipid rafts in einen
      raft abhängigen und einen raft-unabhängigen Transport
      untergliedert werden. Die Trennung der beiden Transportwege
      in einem Post-Golgi-Kompartiment beruht auf der Ausbildung
      hochmolekularer Cluster, vermittelt durch das
      galactosebindende Lectin Galectin 3. Die Bedeutung von
      Galectin-3 in der apikalen Sortierung von
      Nicht-raft-Glykoproteinen ist eine anerkannte Tatsache und
      auch die molekularen Mechanismen, die zu diesem Prozess
      führen, werden zunehmend enträtselt. Die Identität des
      Sortierkompartiments jedoch ist weiterhin schleierhaft.
      Basierend auf der Hypothese, dass endozytiertes Galectin-3
      zur Plasmamembran zurücktransportiert wird und während dieses
      Prozesses höchstwahrscheinlich auch das Sortierkompartiment
      durchquert, wurde die Aufnahme von Galectin 3 in MDCK
      II-Zellen studiert. Hierbei handelt es sich um einen
      glykanabhängigen Prozess, der zur Anreicherung dieses Lectins
      in angesäuerten Kompartimenten führt. Durch
      Kolokalisationsstudien mit fluoreszenzmarkiertem Dextran und
      Rab11, einem Marker für das apikale Recyclingendosom wurde
      nachgewiesen, dass Galectin-3 höchstwahrscheinlich in einen
      Recyclingweg und nicht in einen degradativen Weg einsortiert
      wird. Die Ergebnisse der Analyse der Endozytose von
      Galectin-3 stimmen zudem mit Beobachtungen überein, dass
      dieses Lectin in COS-Zellen in angesäuerten,
      Rab4-CFP-positiven Strukturen zu finden ist, sowie in
      MDCK-Zellen mit verschiedenen endosomalen Markerproteinen
      kolokalisiert. Neben dem intrazellulären Transport von
      Galectin-3 ist auch dessen unkonventionelle Sekretion Thema
      ausführlicher Diskussionen. In der hier vorgestellten
      Dissertation konnte gezeigt werden, dass Galectin-3 zwar in
      der exosomalen, nicht aber in der mikrovesikulären Fraktion
      des Zellkulturüberstandes von MDCK-Zellen zu finden ist. In
      dieser Fraktion ist Galectin-3 mit Strukturen assoziiert,
      deren Morphologie und Dichte sowie die Anreicherung von
      Markerproteinen für ihre Identität als Exosomen sprechen. Mit
      Hilfe von Proteinase K-Protektionsversuchen konnte zudem eine
      Lokalisation von Galectin-3 im Lumen der Exosomen gezeigt
      werden und weiterhin, dass das Auseinanderbrechen und die
      anschließende Frei-setzung des Inhalts dieser Strukturen
      nicht auf eine instabile Natur der Vesikel per se
      zurückzuführen ist, sondern vielmehr zelluläre Faktoren
      vorauszusetzen scheint. Obwohl Galectin-3 mit verschiedenen
      Komponenten der ESCRTs (endosomal sorting complex required
      for transport) in COS 7-Zellen kolokalisiert, scheint die
      exosomale Freisetzung von Galectin-3 in MDCK II-Zellen ein
      ESCRT-unabhängiger Prozess zu sein. Hinweise hierfür fanden
      sich in Studien mit der dominant-negativen Mutante des
      ESCRT-Dissassemblierungsfaktors Vps4a und RNAi-Experimenten
      zum knock down der ESCRT-I-Komponente Tsg101. Zusätzlich
      konnten Einflüsse der Mikrovesikelbildung und der Autophagie
      auf die exosomale Sekretion von Galectin-3 ausgeschlossen
      werden. Als mögliches Signal zur Sortierung in diesen
      unkonventionellen Sekretionsweg konnte in silico eine
      mutmaßliche late domain zur Interaktion mit der
      ESCRT-I-Komponente Tsg101 in der Aminosäuresequenz
      identifiziert werden, die eine essentielle Rolle in der
      Sekretion einer acylierten Form von Galectin-3 aus COS-Zellen
      spielt. Die Bedeutung dieser Domäne für die exosomale
      Lokalisation von Galectin-3 wurde getestet, die
      entsprechenden Experimente führten jedoch zu keinem
      eindeutigen Ergebnis. Eine Beteiligung der late domain in der
      Sekretion von Galectin-3 kann allerdings auch nicht
      ausgeschlossen werden. Schlussendlich konnte auch die
      molekulare Identität des in MDCK-Zellen endogen exprimierten
      Sialoglykoproteins gp114 als canines Homolog von CEACAM1
      bestätigt werden, da beide Proteine in Bezug auf
      Antikörperdetektion, apikale Lokalisierung und Glykosylierung
      identische Charakteristika aufweisen.