title: The Fibroblast Growth Factor-binding Protein (FGF-BP) and the Human Epidermal Growth Factor Receptor-2 (HER-2): functional studies on two gene products relevant in Ovarian cancer
Creators: name: Abuharbeid Shaker
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2005
Subjects: Tumoren
FGFG-BP
Fibroblasten
Confocal microscope
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
HER-2
Ovarialkarzinome
Ovarian cancer

description: Ovarialkarzinome gehören zu den weitverbreitetsten und lebensgefährlichsten gynäkologischen Tumoren mit bislang begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Ein besseres Verständnis der genetischen Änderungen in der Pathogenese des Ovarialkarzinoms ist von entscheidender Bedeutung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden  zwei Genprodukte analysiert: das Fibroblasten-Wachstumsfaktor-bindende Protein (FGF-BP) und der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER-2).    FGF-BP ist ein Heparin-bindendes Protein, das mit FGFs wechselwirkt, sie von der extrazellulären Matrix freisetzt und folglich eine bedeutende Rolle in der extrazellulären FGF-Bioaktivität spielt. In dieser Doktorarbeit wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen an Tissue Microarrays (TMAs) erstmals gezeigt, dass FGF-BP in 40% aller Ovarialkarzinome überexprimiert ist. Da keines der normalen Ovarialgewebe eine vergleichbar starke immunhistochemische Färbung zeigte, deuten diese Daten an, dass die Überexpression von FGF-BP eine bösartige phänotypische Eigenschaft des Ovarialkarzinoms darstellen kann.    Um die molekularen Mechanismen der FGF-BP-Wirkung weiter zu untersuchen, wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Abhängig von der Zellinie war FGF-BP entweder im Zytoplasma lokalisiert und wurde durch einen klassischen Sekretionsweg über ERGIC sekretiert, oder es wurde, trotz eines klassischen Signalpeptides, eine nukleäre Lokalisation gefunden. Bei der Koexpression mit nukleärem FGF-2 wurde interessanterweise das zytoplasmatische FGF-BP in den Zellkern transloziert und eine nukleäre Kolokalisation von FGF-BP und FGF-2 beobachtet. Zusätzlich wurde die Abhängigkeit der zellulären Aufnahme von exogenem FGF-BP von der Expression und Interaktion mit FGF-2 demonstriert. Verschiedene Verkürzungsmutanten des FGF-BP zeigten, dass Verkürzungen am C-terminalen Ende keinen Effekt auf die subzelluläre Lokalisation und FGF-2-Wechselwirkung haben, während bei N-terminalen Verkürzungsmutanten die nukleäre Kolokalisation und Interaktion des FGF-BP mit FGF-2 nicht mehr auftrat. In Proliferationsassays wurde beobachtet, dass die biologischen Effekte von FGF-BP von der jeweiligen Zellinie abhängen. Während in SW-13-Nebennierenkarzinom-Zellen die konstitutive Expression des FGF-BP Zellproliferation induzierte, wurde in COS-7 Zellen ein Proliferations-hemmender Effekt demonstriert. Außerdem unterblieb in Soft Agar-Assays bei N-terminalen Verkürzungsmutanten in SW-13-Zellen die FGF-BP-vermittelte Stimulation der Kolonienbildung, während bei C- und N-terminalen Verkürzungsmutanten in COS-7-Zellen der hemmende Effekt des FGF-BP auf die Zellproliferation aufgehoben wurde. Die durch FGF-2 vermittelte Induktion des Zellwachstums in den FGF-Rezeptor-positiven COS-7-Zellen wurde durch endogene Expression oder exogene Zugabe des FGF-BP inhibiert.    Zusätzlich zu seiner bereits beschriebenen extrazellulären Rolle entfaltet FGF-BP somit auch intrazelluläre, nukleäre Funktionen. Insbesondere zeigt FGF-BP, abhängig von der jeweiligen Zellinie, hemmende oder stimulierende Aktivitäten, die offensichtlich auf der Wechselwirkung mit FGF-2 im Zellkern beruhen.    HER-2 gehört zur Familie der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren und spielt eine wichtige Rolle in menschlichen Tumoren. Die klinischen und experimentellen Daten bezüglich der Effekte der HER-2-Überexpression auf die zelluläre Sensitivität von Tumoren gegenüber Chemotherapie sind jedoch widersprüchlich, insbesondere, ob eine erhöhte HER-2-Expression zu einer höheren Resistenz oder einer erhöhten Sensitivität von Tumoren führt. Dies gilt besonders für Ovarialkarzinome und Ovarialkarzinom-Zellinien, in denen HER-2-Überexpression zu einem hohen Prozentsatz gefunden wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle der HER-2-Expression und HER-2-vermittelten Signaltransduktion in der zellulären Resistenz gegenüber Paclitaxel und rViscumin untersucht.    Die Behandlung von SKOV-3-Zellen mit zwei neu entwickelten niedermolekularen HER-2-Tyrosinkinase-Inhibitoren führte zu erhöhter zellulärer Resistenz gegenüber Paclitaxel. Diese Daten bestätigten vorherige Ergebnisse bezüglich der Behandlung mit Anti-HER-2 Antikörpern (Herceptin), die in der Tumortherapie etabliert sind. Anhand verschiedener SKOV-3-Zellinien mit ribozymbedingt verminderter HER-2-Expression wurde ein „HER-2-Gen-Dosis-Effekt“ etabliert, während Doxorubicin- und Cisplatin-Zytotoxitäten unverändert blieben. Zur näheren molekularen Charakterisierung der zugrundeliegenden Mechanismen dieses Effektes wurden Paclitaxel- oder HER-2-vermittelte Veränderungen in der Phosphorylierung der MAP-Kinasen p42/p44, der stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase SAPK/JNK und der p38 MAP-Kinase, sowie des Effekts auf die Aktivierung von Caspase-3 und Caspase-7 und bcl-2 analysiert. Die Aktivierung der MAP-Kinasen war abhängig von der HER-2-Expressions, aber änderte sich nicht unter Paclitaxel-Behandlung. Eine beobachtete Paclitaxel-induzierte bcl-2-Phosphorylierung und -Hyperphosphorylierung war HER-2-unabhängig. Schließlich wurde gezeigt, dass Paclitaxel in SKOV-3 Zellen über einen Caspase-unabhängigen Weg Apoptose induziert.     Die selektive HER-2-Reduktion durch Ribozyme-Targeting führte in SKOV-3-Zellen auch zur Verminderung der Sensitivität gegenüber dem rekombinanten zytostatischen Mistellektin rViscumin. Wiederum wurde eine „HER-2-Gen-Dosis“-abhängige Sensitivität der Zellen gegenüber rViscumin beobachtet, die nicht durch eine geänderte zelluläre rViscumin-Bindung oder -Internalisierung vermittelt wird. Die Analyse der zugrundeliegenden molekularen Effekte zeigte, dass die Mitglieder der MAPK-Familie p42/p44, SAPK/JNK und p38 in HER-2- und rViscumin-konzentrationsabhängiger Weise aktiviert werden. Während keine rViscumin-vermittelte Aktivierung der Caspasen-3 und -7 beobachtet wurde, zeigte sich eine HER-2-abhängige Herunterregulation des antiapoptotischen Moleküls bcl-2.    Zusammenfassend konzentriert sich diese Arbeit auf zwei Krebs-relevante Gene. FGF-BP wird als neues mögliches Zielmolekül in Ovarialkarzinom-Therapie etabliert und bezüglich seiner intrazellulären Wirkmechanismen analysiert. Die hier vorgestellten Untersuchungen zeigen ferner neue Daten zur Rolle der HER-2-Expression bezüglich der Sensitivität von Ovarialkarzinomen gegenüber Zytostatika wie Paclitaxel oder rViscumin, was für die Bewertung der Wirksamkeit dieser Chemotherapeutika in der klinischen Verwendung relevant sein könnte.
description: Ovarian cancer is one of the most widespread and lethal gynecological malignancies with so far limited treatment options. A better understanding of the genetic changes in ovarian pathogenesis is of critical importance. In this thesis, two gene products were studied: the fibroblast growth factor-binding protein (FGF-BP) and the human epidermal growth factor receptor-2 (HER-2).     FGF-BP is a heparin-binding protein which interacts with FGFs releasing them from the extracellular matrix and hence playing a significant role in extracellular FGF bioactivation. In this work, the immunohistochemical analysis of tissue microarrays (TMAs) revealed for the first time FGF-BP overexpression in 40% of invasive ovarian carcinomas. Since none of the normal ovarian tissues showed similar FGF-BP immunopositivity, these data suggest that FGF-BP overexpression may represent an acquired malignant phenotypic feature of ovarian carcinoma.     To further explore the molecular mechanism of FGF-BP action, confocal microscopy was employed. Dependent on the cell line, FGF-BP was either localized in the cytoplasm and released through a classic secretion pathway employing ERGIC or, despite a classical signal peptide, showed a nuclear localization. Interestingly, upon coexpression with nuclear FGF-2, cytoplasmic FGF-BP was translocated and colocalized with FGF-2 in the nucleus. Additionally, the dependence of the cellular uptake of exogenous FGF-BP on the expression of and interaction with FGF-2 was demonstrated. Various truncated FGF-BP mutant constructs showed that extensive truncations at the C-terminal end of FGF-BP had no effect on the subcellular localization and FGF-2 interaction, while upon N-terminal truncations nuclear colocalization and interaction of FGF-BP with FGF-2 was lost. Proliferation assays provided evidence that biological effects of FGF-BP depend on the cell line. While in SW-13 adrenal carcinoma cells the stable transfection of FGF-BP induced cell proliferation, inhibitory activity of FGF-BP in COS-7 cells was demonstrated. Moreover, FGF-BP-mediated stimulation of colony formation in soft agar was lost upon N-terminal truncations of FGF-BP in SW-13 cells, whereas C- or N-terminal truncations abolished the inhibitory effect of FGF-BP on COS-7 cell proliferation. The induction of cell proliferation resulting from the expression of FGF-2 in COS-7 cells, which also express FGF receptors, was lost upon endogenous expression or exogenous addition of FGF-BP.  Hence, in addition to its already published extracellular role, FGF-BP exerts intracellular, nuclear functions. More specifically, dependent on the cell line FGF-BP displays inhibitory or stimulating activities upon interaction with FGF-2 in the nucleus.   HER-2 belongs to the epidermal growth factor (EGF) receptor family and plays an important role in human tumors. However, clinical and experimental data indicating effects of HER-2 overexpression on tumor cell sensitivity towards chemotherapy are conflicting as to whether elevated HER-2 levels lead to increased resistance or higher sensitivity of tumors. This is particularly true for ovarian carcinomas and ovarian carcinoma cell lines, where HER-2 overexpression has been found in considerable percentages. In this work, the role of HER-2 expression and signaling levels pertaining to paclitaxel and rViscumin chemoresistance were explored.  Treatment of SKOV-3 cells with two newly developed low molecular weight inhibitors of HER-2 tyrosine kinase activity resulted in a decrease in the cellular paclitaxel sensitivity. These data confirmed previous data regarding treatment with the HER-2 inhibitory antibody trastuzumab (Herceptin), which is well established in tumor therapy. Using various isogenic SKOV-3 cell lines with ribozyme-mediated stable reduction of HER-2 expression levels, a ‘HER-2 gene dose effect’ of paclitaxel cytotoxicity was established, while doxorubicin and cisplatin cytotoxicity remained unchanged. To elucidate the underlying mechanisms of this effect, paclitaxel- or HER-2-mediated alterations in phosphorylation of MAP kinase p42/44, stress-activated protein kinase/Jun-terminal kinase (SAPK/JNK), and p38, and effects on the activation of caspase-3, caspase-7, and bcl-2 were analyzed. Activation of MAP kinases was dependent on HER-2 expression levels but did not change upon paclitaxel treatment. Paclitaxel-induced bcl-2 phosphorylation and hyperphosphorylation was independent of HER-2 expression levels. Finally, it was shown that paclitaxel utilizes a caspase-independent pathway of induction of apoptosis in SKOV-3 ovarian carcinoma cells.  The selective depletion of HER-2 by ribozyme-targeting also decreased the cellular sensitivity of SKOV-3 cells towards the recombinant cytostatic mistletoe rViscumin, establishing a ‘HER-2 gene dose’ dependence of rViscumin cytotoxicity, which is not mediated by altered cellular rViscumin binding/internalization. The analysis of the underlying molecular effects of rViscumin treatment demonstrated that members of the MAPK family, p42/44, SAPK/JNK, and p38 are activated in a HER-2 and rViscumin concentration-dependent manner. While no rViscumin-mediated activation of caspase-3 and caspase-7 were observed, HER-2-dependent downregulation of the anti-apoptotic molecule bcl-2 was demonstrated.  In conclusion, by focusing on two cancer-relevant genes, this work establishes FGF-BP as a new potential target molecule in ovarian cancer therapy and explores its intracellular mechanism of action. Furthermore, this thesis provides new insights into the role of HER-2 in ovarian cancer sensitivity towards cytostatic drugs like paclitaxel or rViscumin which may allow to better assess the efficacy of both drugs in a clinical setting.