title: Subcellular function and regulation of INF2
Creators: name: Uecker, Felix
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2024
Subjects: subject: 570 Biology

description: Die dynamische Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts ist grundlegend für viele zelluläre Prozesse und wird durch Aktin-bindende Proteine präzise reguliert. Inverted-formin 2 (INF2) kann zum Beispiel durch Kalziumeinstrom eine schnelle Umstrukturierung des F-Aktins auslösen, bekannt als Calcium-mediated Actin Reset (CaAR). Das Ausmaß und die Dynamik der CaAR-Reaktion deuten auf einen speziellen Regulationsmechanismus für INF2 hin und machen es zu einem potenziellen Modell für das Studium der zellulären Mechanismen der forminabhängigen Aktin-Polymerisation sowie der Kinetik ihres Regulationsmechanismuses. Die Analyse strukturgestützter INF2-Mutanten durch CaAR und Einzelmolekülmikroskopie zeigt, dass die Bindung von Calmodulin die Autoinhibition von INF2 unterbricht und INF2s N-Terminus seine Reinhibition durch Bindung an F-Aktin fördert. Die Untersuchung der mechanistischen Grundlagen von CaAR liefern Einblicke in die zelluläre Aktindynamik und den zellulären Mechanismus der forminabhängigen Aktin-Polymerisation.
description: 1 Introduction ..... 1
1.1 Actin ..... 1
1.2 Cellular control of actin polymerisation ..... 4
1.3 Formins ..... 6
1.3.1 The mechanism of formin-mediated actin polymerisation ..... 7
1.3.2 Cellular regulation of formin activity ..... 9
1.4 INF2 ..... 12
2 Material and Methods ..... 15
2.1 Cell culture ..... 15
2.1.1 Cultivation and passaging ..... 15
2.1.2 Transfection ..... 16
2.2 Cloning ..... 16
2.2.1 Plasmid design ..... 16
2.2.2 Site-directed mutagenesis ..... 17
2.2.3 Restriction digest ..... 18
2.2.4 PCR reaction ..... 19
2.2.5 Gibson assembly ..... 19
2.2.6 Restriction enzyme cloning ..... 20
2.2.7 Oligomer cloning ..... 20
2.2.8 Preparation of competent cells ..... 21
2.2.9 Transformation ..... 22
2.3 Microscopy ..... 22
2.3.1 Ablation ..... 23
2.3.2 FRAP ..... 23
2.3.3 cATP assay ..... 23
2.3.4 Single speckle microscopy ..... 24
2.3.5 Drug treatments ..... 24
2.4 Data analysis ..... 24
2.4.1 Data presentation ..... 25
2.4.2 FRAP ..... 25
2.4.3 CaAR ..... 26
2.4.4 SMFM ..... 27
2.4.5 Colocalisation ..... 28
2.5 Structural biology ..... 28
2.5.1 Structure prediction with alphafold ..... 28
2.5.2 Structure building with modeller ..... 29
2.5.3 Measurements and visualisation ..... 29
3 Results ..... 30
3.1 The mechanism of CaAR ..... 30
3.2 The regulatory mechanism of INF2 ..... 59
3.3 Product inhibition facilitates INF2 autoinhibition ..... 87
3.4 Dual dimerisation facilitates cooperative autoinhibition ..... 118
3.5 Cellular characterisation of INF2s actin polymerisation activity ..... 129
3.6 The INF2 C-terminus as a multifunctional interaction hub ..... 146
4 Discussion ..... 159
4.1 Cellular autoinhibition of INF2 ..... 159
4.2 Cellular activation of INF2 ..... 161
4.3 Functional consequences of INF2 filament side binding ..... 163
4.4 Kinetic regulation of formin activity ..... 165
4.5 The impact of N-terminal dimerisation on autoinhibition ..... 167
4.6 Codependent optimisation of INF2s regulatory interactions ..... 168
4.7 Cellular functions of INF2 ..... 170
4.8 CaAR and cellular actin distribution ..... 175
4.9 Limitations of this study ..... 182
5 Appendix ..... 184
5.1 Supplemental discussion ..... 184
5.1.1 The matter of severing ..... 184
5.2 Supplemental figures ..... 185
5.3 Materials ..... 187
5.4 Acknowledgements ..... 202
5.5 CV ..... 203