Προσδιορισμός βιταμίνης Β12 σε δείγματα σιέλου με HPLC μετά από εκχύλιση προσρόφησης με υφασμάτινο μέσο
Creators: name: Κορπέτη, Αναστασία Σωτηρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Βιταμίνη Β12
Υγρή χρωματογραφία
Εκχύλιση προσρόφησης με υφασμάτινο μέσο
Vitamin B12
Liquid Chromatography
Fabric Phase Sorptive Extraction

description: Στο πλαίσιο της παρούσας διπλωματικής εργασίας αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μια ολοκληρωμένη αναλυτική μεθοδολογία για τον προσδιορισμό της βιταμίνης Β12 σε ανθρώπινο σίελο. Η βιταμίνη Β12 είναι μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη που συμμετέχει στο μεταβολισμό κάθε κυττάρου του ανθρώπινου σώματος, βρίσκεται φυσικά σε τρόφιμα όπως ψάρια, κρέας, γάλα ή γαλακτοκομικά προϊόντα και η ανεπάρκειά της μπορεί να προκαλέσει σοβαρές νευρολογικές βλάβες. Ως τεχνική προκατεργασίας χρησιμοποιήθηκε η Εκχύλιση Προσρόφησης σε Υφασμάτινο μέσο, μια νέας γενιάς τεχνική μικροεκχύλισης. Ως υπόστρωμα επιλέχθηκε πολυεστέρας, ο οποίος είναι χημικώς επικαλυμμένος με sol-gel υβριδικό οργανικό-ανόργανο προσροφητικό (Carbowax 20M) σε μια μορφή λεπτής επίστρωσης. Πραγματοποιήθηκε πειραματικός σχεδιασμός για την άμεση βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης, θεωρώντας ως κρίσιμους παράγοντες την ταχύτητα ανάδευσης, το χρόνο εκχύλισης και τον όγκο του δείγματος. Μετά την εκχύλιση, τα δείγματα σιέλου οδηγήθηκαν για ανάλυση με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης. Η προσδιοριζόμενη ένωση (βιταμίνη Β12) ανιχνεύθηκε και ταυτοποιήθηκε με ανιχνευτή υπεριώδους. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες γραμμικότητας με τριπλή ανάλυση που κάλυπτε το εύρος 0,1-10 μg/mL και κατασκευάστηκαν καμπύλες αναφοράς με συντελεστή συσχέτισης R=0,9999. Η επαναληψιμότητα εντός της ίδιας ημέρας είχε ανακτήσεις μεταξύ 89-113% και ποσοστιαία σχετική τυπική απόκλιση περίπου στα 4,65%, ενώ μεταξύ διαφορετικών ημερών, οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 88-119% και %RSD περίπου 2,78%. Η επικυρωμένη μέθοδος εφαρμόστηκε σε σίελο εθελοντών έπειτα από φυγοκέντρηση σε Salivette, ενός απλού και γρήγορου τρόπου δειγματοληψίας σιέλου, εμπλουτισμένου με βιταμίνη Β12 σε μορφή χαπιού και σπρέι.
description: Vitamin B12 is a water-soluble vitamin that participates in the metabolism of every cell in the human body. It occurs naturally in food such as fish, meat, milk or dairy products, and its deficiency can cause serious neurological damage. To this end, an integrated analytical methodology for the determination of vitamin B12 in human saliva was established and validated. As a sample preparation technique, Fabric Phase Sorptive Extraction (FPSE), a new generation microextraction technique, was used. Polyester was chosen as the substrate, which is chemically coated with a sol-gel hybrid organic-inorganic sorbent (Carbowax 20M) in a thin coating form. An experimental design was carried out to optimize the extraction conditions, considering stirring rate, extraction time and sample volume as critical factors. After extraction, the saliva samples were analyzed by the High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC) technique. Vitamin B12 was identified and detected with an Ultraviolet (UV) Detector. Linearity studies were performed in triplicate covering the range 0.1-10 µg/mL and reference curves were constructed with a correlation coefficient of R=0.9999. The intra-day precision parameters indicate recoveries of analyte between 89-113% and, in terms of relative standard deviations (RSDs), were 4.65%. Inter-day recoveries ranged between 88-119%, while %RSD was about 2.78%. The application of the optimized and validated method was performed on volunteers’ saliva samples (enriched with vitamin B12 in pill and spray form), using the Salivette, a simple and rapid way of saliva sampling.