title: Optimization of the Drug Design Process by Ligand Preorganization and Occupancy of Transient Binding Pockets Based on the Model Proteins Thrombin and Aldose Reductase
title: Optimierung des Wirkstoff-Design-Prozesses durch Liganden-Vororganisation und Besetzung von transienten Bindungstaschen anhand der Modellproteine Thrombin und Aldose-Reduktase
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Sandner, Anna Sophie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Ligandenpräorganisation
ligand preorganization
Medical sciences Medicine
Medizin
Aldosereduktase
Präorganisation
ALR-2
Blutgerinnung
blood coagulation
preorganization
aldose reductase
Trypsin
trypsin
Thrombin
transiente Tasche
transient binding pocke
sekundäre Homöostase
secondary homeostasis

description: The design and development of a drug is complex and usually extends over many years. Different approaches can facilitate lead optimization. This work focuses on specific aspects that could lead to advances in drug discovery. After an introduction to drug design and the two studied target proteins, the first section of this thesis (Chapter 2) deals with the analysis and understanding of the function of transient binding pockets and the resulting perspective to improve the optimization of a lead structure. For this project, the already well-studied specificity pocket of human aldose reductase (ALR-2) was chosen. This enzyme is considered a key player of the polyol pathway. When glycolysis, an important degradation pathway of energy metabolism, is saturated, e.g., due to increased glucose levels in diabetics, the mechanism of the polyol pathway is activated. As a result, ALR-2 is stimulated to convert D-glucose to D-sorbitol. A series of inhibitors with low steric demand and functional groups of different electronic nature at the terminal aromatic moiety or terminal substituent, as well as their structural and thermodynamic properties, were studied in detail by isothermal titration calorimetry (ITC) and X-ray crystallography. In addition, the electrostatic potentials and charge distribution at the terminal aromatic groups of the inhibitors and their effects on binding to the transient pocket were analyzed by electronic surface potential (ESP) calculations. These analyses confirmed the previously established theory that terminal aromatic systems of the inhibitors with an electron-deficient aromatic group can trigger the opening of the specificity pocket and lead to preferential π-interaction with the electronrich indole moiety of W111. The results also indicate that a certain volume of inhibitor seems to be a prerequisite for pocket opening, since too small substituents lead to more complex binding positions with increased residual mobility. It was further shown that a shift in pH between pH 5 and 8 has no effect on the binding position of the inhibitors in the crystal with respect to the opening of the specificity pocket. This allows a comparison between thermodynamic and crystallographic data obtained at different pH values. The following chapter of this thesis (Chapter 3) focuses on the strategy of preorganization used in latestage drug design for ligand optimization without having to resort to a completely different scaffold. Here, the S1 pocket of the also well-studied serine protease thrombin, whose conversion of fibrinogen to fibrin plays an important role in blood clotting, served as a model. In this work, we first present a series of congeneric thrombin ligands with a variety of functional groups that trigger preorganization prior to binding. The resulting structural fixation of a ligand in its bioactive conformation, either by fixation of the bound conformation in a suitable ring system or by fixation via intramolecular hydrogen bonds (H-bonds), has positive effects on affinity for entropic reasons. Fixation in solution and complex formation were characterized by crystallography, ITC, and molecular dynamics (MD) simulations. Clearly, these preorganizational modifications do not affect the overall binding mode, provided that the required bound conformation of the molecule with the archetypal binding mode is well reproduced by the modified molecules in the bound state. Thus, the most important interactions are preserved. However, the results of this study also show that the presence of an additional intramolecular contact, preferably in the form of a dominantly populated conformer, is equally important to achieve the expected affinity enhancement. At worst, the modified scaffold in solution adopts a new, strongly preferred conformation, and the preorganization effect, expected to enhance the affinity for the target, is lost. Based on these results, it can be shown that the thermodynamics of preorganization are largely governed by enthalpy rather than entropy. Furthermore, in this work, an important salt bridge is shielded by actively reducing its surface exposure, resulting in an improved enthalpic binding profile. Part three of this thesis (Chapter 4) discusses the selectivity-determining features in the S1 pockets of the serine protease thrombin, the previously described blood clotting factor, and the related enzyme trypsin, which is responsible for digestion. Human trypsin is a proteolytic enzyme produced by the duodenum whose function is to degrade larger proteins into smaller components in the intestine. Thus, it represents one of the most important digestive enzymes. In these studies, a series of ligands were evaluated for their selectivity toward both peptidases using X-ray and neutron crystallography along with ITC. The results revealed that the local geometry of the two S1 pockets is highly conserved. However, thrombin cleaves peptide chains only after arginine, whereas trypsin cleaves after lysine and arginine. Thrombin has a Na+ binding site near D189 which is not present in trypsin. This suggests that simple steric features cannot explain the selectivity difference. Although the E192Q exchange at the edge of the S1 pocket has very little effect on the steric and dynamic properties of ligand binding and the local geometry of the two serine proteases, the different partitioning into enthalpy and entropy contributions is a clear indication of a given difference. The analyses of this study suggest that E192, together with the thrombin-specific sodium ion, contribute to generate an electrostatic gradient in the S1 pocket. This feature is not present in trypsin and is therefore important, together with the differences in solvation patterns in the S1 pocket, for the selectivity of both enzymes. The observation of protonation effects induced in this context is the first evidence for significant charge attenuation at the carboxylate group of D189 in thrombin compared to trypsin. From these studies, it appears that this phenomenon is one of the most important selectivity-determining features between the two proteases and thus influences and controls the other selectivity-distinguishing features that are less obvious at first glance, such as the differences in the solvation pattern and in the arrangement of water molecules in the two enzymes. In summary, it can be deduced from this work that it is not straightforward to assign the selectivity-determining features in the S1 pockets of thrombin and trypsin to a single dominant factor. The last part of the thesis (Chapter 5) is an abbreviated subproject and deals with eight thrombin inhibitors that differ in the P1 residue. Due to the lack of time, only the crystal structures obtained by X-ray crystallography were used to analyze the binding behavior of the inhibitors. Their analysis shows that a P1 thiophene changes its binding behavior in the S1 pocket of thrombin once a halogen substituent is attached. The comparably electron-rich sulfur of a pure thiophene residue turns toward the inhibitor's own P2 and P3 carbonyl groups. In contrast, the sulfur of a P1-thiophene, which is rather electron-poor due to the halogen substituents, can serve as an H-bond acceptor and thus interact water-mediated with the π-system of Y228. However, a halogen atom in a P1-furan is not capable of recruiting such a water. Due to the shallower angle of oxygen compared to sulfur and the resulting change in geometry, the distance between the halogen and the ring of Y228 is optimized for a direct halogen-π-interaction. While a methoxy substituent in the para-position of a P1 6-ring does not exhibit a particularly strong interaction, the same substituent in the metha-position can also interact directly with Y228. However, compared to other P1 6-rings, this ring occupies a slightly different position. A hydroxy group in the ortho-position forms a water-mediated interaction with the π-system of Y228. Due to lack of time and the late takeover of data analysis by a former PhD student, additional thermodynamic and kinetic measurements of the binding process were not possible in the present work. Therefore, no definitive conclusions on the affinity and selectivity of thrombin can be derived based on this chapter.
description: Die Entwicklung von Arzneimitteln ist komplex und erstreckt sich in der Regel über viele Jahre. Verschiedene Ansätze können die Optimierung von Leitstrukturen erleichtern. Diese Arbeit konzentriert sich auf bestimmte Aspekte, die zu Fortschritten in der Arzneimittelforschung führen könnten. Nach einer Einleitung in das Thema Wirkstoffdesign und die Vorstellung der beiden Zielproteine, befasst sich der erste Abschnitt dieser Arbeit (Chapter 2) mit der Analyse und dem Verständnis der Funktion von transienten Bindetaschen und der daraus resultierenden Perspektive zur Verbesserung der Optimierung einer Leitstruktur. Für dieses Projekt wurde die bereits gut untersuchte Spezifitätstasche der menschlichen Aldose Reduktase (ALR-2) gewählt. ALR-2 gilt als Schlüsselenzym des Polyolweges. Ist die Glykolyse, ein zentraler Abbauweg des Energiestoffwechsels, beispielsweise durch erhöhte Glukosespiegel bei Diabetikern überlastet, wird der Mechanismus des Polyolweges in Gang gesetzt. Auf diese Weise wird ALR-2 dazu angeregt, D-Glukose in D-Sorbit umzuwandeln. Zunächst wurde eine Reihe von Inhibitoren mit geringen sterischen Anforderungen und funktionellen Gruppen unterschiedlicher elektronischer Natur am terminalen aromatischen Teil oder terminale Substituenten sowie ihre strukturellen und thermodynamischen Eigenschaften mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Röntgenkristallographie eingehend untersucht. Darüber hinaus erfolgte eine Analyse der elektrostatischen Potenziale und der Ladungsverteilung an den terminalen aromatischen Gruppen der Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bindung in die transiente Tasche durch Berechnungen des elektronischen Oberflächenpotenzials (ESP). Diese Analysen bestätigten die zuvor aufgestellte Theorie, dass terminale aromatische Systeme der Inhibitoren mit einer elektronenarmen aromatischen Gruppe eine Öffnung der Spezifitätstasche auslösen und zu einer bevorzugten π-Wechselwirkungen mit der elektronenreichen Indoleinheit der Aminosäure W111 führen können. Außerdem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass ein bestimmtes Volumen des Inhibitors eine Voraussetzung für die Taschenöffnung zu sein scheint, da zu kleine Substituenten zu komplexeren Bindungspositionen mit erhöhter Restmobilität führen. Es hat sich weiterhin erwiesen, dass eine Verschiebung des pH-Werts zwischen pH 5 und 8 keine Auswirkungen auf die Bindungsposition der Inhibitoren im Kristall in Bezug auf die Öffnung der Spezifitätstasche hat. Dies ermöglicht einen Vergleich zwischen thermodynamischen und kristallographischen Daten, die bei verschiedenen pH-Werten erhoben wurden. Das folgende Kapitel dieser Arbeit (Chapter 3) befasst sich mit der Strategie der Vororganisation, die in der späten Phase des Wirkstoffdesigns zur Liganden Optimierung eingesetzt wird, ohne auf ein komplett anderes Gerüst zurückgreifen zu müssen. In diesem Fall diente die S1 Tasche der ebenfalls gut untersuchten Serinprotease Thrombin, die durch die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielt, als Modell. In dieser Arbeit wird zunächst eine Reihe kongenerischer Thrombin Liganden mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen vorgestellt, die vor der Bindung eine Vororganisation auslösen. Die daraus resultierende strukturelle Fixierung eines Liganden in seiner bioaktiven Konformation, entweder durch Fixierung der gebundenen Konformation in einem geeigneten Ringsystem oder durch Fixierung über intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen (H-Bindungen), hat aus entropischen Gründen positive Auswirkungen auf die Affinität. Die Fixierung in Lösung und die Komplexbildung wurden durch Kristallographie, ITC und Molekulardynamiksimulationen (MD) charakterisiert. Es wird deutlich, dass diese präorganisatorischen Modifikationen den gesamten Bindungsmodus nicht beeinträchtigen, sofern die erforderliche gebundene Konformation des Moleküls mit dem archetypischen Bindungsmodus durch die modifizierten Moleküle im gebundenen Zustand gut reproduziert wird. Die wichtigsten Wechselwirkungen bleiben somit erhalten. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen jedoch auch, dass das Vorhandensein eines zusätzlichen intramolekularen Kontakts, vorzugsweise in Form eines dominant besiedelten Konformers, ebenso wichtig ist, um die erwartete Affinitätsverbesserung zu erzielen. Im ungünstigsten Fall nimmt das modifizierte Gerüst in Lösung eine neue, stark bevorzugte Konformation an, und der Präorganisations-Effekt und damit die dadurch gewonnene Affinität für das Target geht verloren. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich demonstrieren, dass die Thermodynamik der Präorganisation weitgehend von der Enthalpie und weniger von der Entropie dominiert wird. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine wichtige Salzbrücke durch aktive Verringerung ihrer Oberflächenexposition abgeschirmt, was zu einem verbesserten enthalpischen Bindungsprofil führt. Abschnitt drei der vorliegenden Arbeit (Chapter 4) befasst sich mit den selektivitätsbestimmenden Merkmalen in den S1 Taschen des bereits beschriebenen Blutgerinnungsfaktor Thrombin und der für die Verdauung verantwortliche Serinprotease Trypsin. Das menschliche Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das vom Zwölffingerdarm produziert wird und dessen Aufgabe es ist, größere Eiweißverbindungen im Dünndarm in kleinere Bausteine zu zerlegen. Damit stellt es eines der wichtigsten Verdauungsenzyme dar. Im Rahmen dieser Studien wurde eine Reihe von Liganden auf ihre Selektivität bezüglich beider Peptidasen mittels Röntgen- und Neutronenkristallographie sowie ITC untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die lokale Geometrie der beiden S1 Taschen in hohem Maße konserviert ist. Allerdings spaltet Thrombin Peptidketten nur nach Arginin, während Trypsin nach Lysin und Arginin spaltet. Thrombin verfügt über eine Na+-Bindungsstelle in der Nähe von D189, die bei Trypsin nicht vorhanden ist. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass einfache sterische Merkmale den Selektivitätsunterschied nicht erklären können. Obwohl der E192Q-Austausch am Rand der S1 Tasche nur einen sehr geringen Einfluss auf die sterischen und dynamischen Eigenschaften der Ligandenbindung und der lokalen Geometrie beider Serinproteasen hat, ist die unter-schiedliche Aufteilung in Enthalpie- und Entropiebeiträge ein starker Hinweis auf einen gegebenen Unterschied. Die Analysen dieser Studie legen nahe, dass E192 zusammen mit dem Thrombin-spezifischen Na+-Ion dazu beiträgt, einen elektrostatischen Gradienten in der S1 Tasche zu erzeugen. Diese Eigenschaft ist in Trypsin definitiv nicht vorhanden und ist daher zusammen mit Unterschieden im Solvatationsmuster in der S1 Tasche für die Selektivität beider Enzyme von Bedeutung. Die Beobachtung der in diesem Zusammenhang induzierten Protonierungseffekte stellt den ersten Hinweis auf eine signifikante Ladungsabschwächung an der Carboxylatgruppe von D189 in Thrombin im Vergleich zu Trypsin dar. Aus den Studien geht hervor, dass diese Eigenschaft eines der wesentlichen selektivitätsbestimmenden Merkmale zwischen den beiden Proteasen ist und somit die anderen, auf den ersten Blick weniger offensichtlichen Selektivitätsunterscheidungsmerkmale, wie die Unterschiede im Solvatationsmuster und der Anordnung der Wassermoleküle in den beiden Enzymen, beeinflusst und steuert. Schlussendlich geht aus dieser Arbeit hervor, dass es nicht ohne weiteres möglich ist, die selektivitätsbestimmenden Merkmale in den S1 Taschen von Thrombin und Trypsin einem einzigen dominanten Faktor zuzuordnen. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit (Chapter 5) stellt ein verkürztes Teilprojekt dar und beschäftigt sich mit acht Thrombininhibitoren, die sich im P1-Rest unterscheiden. Aus Zeitgründen wurden nur die mittels Röntgenkristallographie erhaltenen Kristallstrukturen zur Analyse des Bindungsverhaltens der Inhibitoren herangezogen. Ihre Analyse zeigt, dass ein P1-Thiophen sein Bindungsverhalten in der S1-Tasche von Thrombin ändert, sobald ein Halogensubstituent angefügt wird. Der vergleichsweise elektronenreiche Schwefel eines reinen Thiophen-Restes wendet sich den Inhibitoren eigenen Carbonylgruppen P2 und P3 zu. Im Gegensatz dazu kann der Schwefel eines P1-Thiophens, der aufgrund der Halogensubstituenten eher elektronen-arm ist, als H-Brückenakzeptor dienen und somit dem π-System von Y228 wasservermittelt interagieren. Ein Halogenatom in einem P1-Furan ist jedoch nicht in der Lage, ein solches Wasser zu rekrutieren. Aufgrund des flacheren Winkels des Sauerstoffs im Vergleich zum Schwefel und der daraus resultierenden Änderung der Geometrie ist der Abstand zwischen dem Halogen und dem Ring von Y228 für eine direkte Halogen-π-Wechselwirkung optimiert. Während ein Methoxysubstituent in der para-Position eines P1-6-Rings keine sonderlich starke Interaktion auszubilden scheint, ist derselbe Substituent in metha-Position ebenfalls in der Lage, direkt mit Y228 zu interagieren. Im Vergleich zu anderen P1-6-Ringen nimmt dieser Ring damit jedoch eine etwas andere Position ein. Eine Hydroxygruppe in ortho-Position bildet eine wasservermittelte Wechselwirkung mit dem π-System von Y228. Aufgrund von Zeitmangel und der späten Übernahme der Datenanalyse durch einen ehemaligen Doktoranden in diesem Kapitel waren zusätzliche thermodynamische und kinetische Messungen des Bindungsprozesses in der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Daher können auf der Grundlage dieses Abschnitts keine endgültigen Schlussfolgerungen zur Affinität und Selektivität von Thrombin gezogen werden.