Shedding light on protein-chromophore-interactions: spectroscopy-based characterization of carotenoid binding in the orange carotenoid protein
Creators: name: Moldenhauer, Marcus
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: 500
subject: 570
subject: 572
subject: 541
subject: 540
subject: orange carotenoid protein
subject: carotenoids
subject: cyanbacteria
subject: photosynthesis
subject: non-photochemical quenching
subject: OCP
subject: Carotinoide
subject: Cyanobakterien
subject: Photosynthese
subject: nicht-photochemisches Quenching

description: Photosynthesis is the most crucial process on Earth that harnesses energy from the sun in form of light and converts it into organic matter. All plants rely on photosynthesis and need light energy for growth and thriving. Plants are the foundation of almost every food chain and therefore serve as universal supplier of nutrients and energy as they produce glucose by utilizing light energy and splitting water. The release of oxygen in photosynthesis is the main source of atmospheric oxygen and is strictly needed for respiration. Two billion years ago in the Great Oxygenation Event, phototrophic bacteria such as cyanobacteria are supposed to be the source of oxygen in the atmosphere providing the life-friendly conditions on Earth. During photosynthesis, electrons are excited by light absorption which drives an electron transport cascade in which electrons are transferred within several protein complexes in photosynthetic structures, known as thylakoid membranes. While electrons are moved along the complexes in the membrane, under strong sun light conditions the absorbed energy is not sufficiently transferred and the electron transport reaches a saturated state. Under these conditions, electrons react with other molecules or produce reactive oxygen species (ROS) which are energy-rich compounds causing cell damage up to cell death. All phototrophic organisms developed strategies to cope with rising ROS levels. While plants stimulate carotenoid biosynthesis, cyanobacteria produce a carotenoid-binding protein, named as Orange Carotenoid Protein (OCP), which gets photoactivated by strong sunlight. Under irradiation, the OCP is photoconverted to the red photoactive state which binds to the cyanobacterial light-harvesting antennae, the phycobilisomes. The bound OCP quenches energy absorbed by phycobilisomes and dissipates the excess of energy as heat. This mechanism is known as non-photochemical quenching (NPQ) and is one of the most important processes of phototrophic organisms to avoid permanent energetic stress. The OCP is functionally active by binding ketolated carotenoids, such as 3’-hydroxyechinenone or canthaxanthin via hydrogen bonds from a specific tryptophan and a tyrosine. The production of OCP in cyanobacteria is time consuming and therefore functional studies on specific OCP residues are complex. Mechanistic aspects of photoconversion and relaxation are still unknown and not fully understood. Moreover, the structure of the red active OCP is still elusive. In this study, the expression of OCP in combination with carotenoid biosynthesis in E. coli is utilized to investigate OCP variants and mutants and furthermore, the incorporated carotenoids from cellular membranes are distinguished. For the examination of the carotenoid binding, a specific protein variant, noted as OCP W288A, is firstly studied and characterized by absorption spectroscopy and kinetic measurements of photoconversion and relaxation under blue light irradiation. Mutagenesis of this critical tryptophan resulted in a pink variant of OCP which was not photoswitchable but able to quench the fluorescence from phycobilisomes similarly to the red OCP state. Therefore, the OCP W288A variant protein can be designated as red active OCP, allowing the study of the photocycle and also the structure of this red OCP equivalent. In addition, this study integrates emerging methods from synthetic biology to incorporate non-canonical amino acids into OCP, resulting in the creation of an OCP W288BTA variant. This approach led to a OCP variant in which the ability to form the specific hydrogen bond was eliminated at the atomic level, achieved by substituting the nitrogen in the tryptophan side chain with a sulfur atom. The OCP W288BTA variant protein was characterized by crystallization and kinetic absorption measurements of photoconversion and relaxation facilitated the calculation of the energy of the hydrogen bond. This thesis firstly demonstrates that the single domain of OCP, named as CTD (C-terminal domain), is able to bind carotenoids independently from the N-terminal domain. The expression of C-terminal domain in the carotenoid-producing E. coli cells created a purple-colored protein, wherein two CTD proteins bind a single canthaxanthin molecule. This discovery unveiled a novel function within the OCP family as carotenoid carriers and manifested a new class of protein which was termed as C-terminal domain homologs (CTDH). The photocycle of OCP involves a second protein, known as Fluorescence Recovery Protein (FRP). FRP binds to OCP and detaches the red form from the phycobilisome core, reinstating the energy flow when energy dissipation is no longer required. In this study, the complex of FRP with an OCP variant, named as OCP ∆NTE, was investigated utilizing small-angle scattering techniques (SAXS and SANS). OCP ∆NTE exhibits two variants, an orange state equivalent and a red state equivalent, both form stable complexes with FRP. In contrast, the wild-type OCP binds FRP only transiently. By partial deuteration of either FRP or OCP ∆NTE variants the formed complexes were examined in SANS measurements to extract structural information about the formed complexes. The pink OCP ∆NTE variant forms stable dimers within the complex with FRP, associated over the C-terminal domains. Additionally, FRP undergoes significant structural changes in the formed OCP-complex. The obtained structural data provided new insights into intermediates in the OCP photocycle and were assigned in the presence of FRP for the first time.
description: Die Photosynthese ist der wichtigste Prozess auf der Erde, der die Energie der Sonne in Form von Licht nutzt und dabei organische Materie aufbaut. Alle Pflanzen auf der Erde sind auf Photosynthese angewiesen und benötigen Lichtenergie für ihr Wachstum. Pflanzen bilden außerdem die Grundlage nahezu jeder Nahrungskette und dienen in dieser als universeller Nährstoff- und Energielieferant. Der bei der Photosynthese freigesetzte Sauerstoff ist die Hauptquelle des Sauerstoffs in der Atmosphäre und wird für die Atmung aller Lebewesen benötigt. Es wird angenommen, dass vor rund zwei Milliarden Jahren Cyanobakterien den gesamten Sauerstoff der heutigen Atmosphäre gebildet haben, was als große Sauerstoffkatastrophe bezeichnet wird. Damit gehören Cyanobakterien mit zu mit den ältesten noch heute lebenden Wesen auf der Erde. Bei der Photosynthese sind viele verschiedene Proteinkomplexe beteiligt, die in speziellen sogenannten Thylakoidmembranen eingebettet sind. Dabei werden Elektronen in Pigmenten wie Chlorophyll durch das Licht angeregt und über diese Proteinkomplexe transportiert. Falls die Sonneneinstrahlung und damit die gesammelte Energie zu intensiv wird, können die Elektronen in der Transportkette nicht ausreichend schnell übertragen werden, da die Elektronentransportkette gesättigt ist. Unter diesen Bedingungen reagieren Elektronen mit anderen Molekülen oder erzeugen reaktive bzw. energiereiche Sauerstoffradikale, die erhebliche Zellschäden und sogar den Zelltod verursachen können. Aus diesem Grund haben alle phototrophen Organismen Strategien entwickelt, um der Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen entgegenzuwirken. Während Pflanzen gegen Sauerstoffradikale die Synthese von Carotinoiden aktivieren, produzieren Cyanobakterien ein Carotinoid-bindendes Protein namens Orange Carotenoid Protein (OCP), das durch intensive Sonneneinstrahlung in eine aktive Form überführt wird. Nur in dieser roten, lichtaktivierten Form bindet das OCP an den Lichtsammelkomplexen der Cyanobakterien, die auch Phycobilisomen genannt werden. Das gebundene OCP nimmt die absorbierte Energie der Phycobilisomen auf und gibt die überschüssige Energie in Form von Wärme an die Umgebung wieder ab. Dieser Mechanismus ist als Non-Photochemical Quenching (NPQ) bekannt und einer der wichtigsten Prozesse der Cyanobakterien zur Vermeidung von dauerhaftem energetischem Stress. OCP wird funktionell aktiv, wenn es ketolierte Carotinoide wie 3’-Hydroxyechinenon oder Canthaxanthin über Wasserstoffbrückenbindungen von einem spezifischen Tryptophan und einem Tyrosin des Proteins zur Ketogruppe des Carotinoids bindet. Die Produktion von OCP in Cyanobakterien ist zeitintensiv und daher sind funktionelle Studien zu spezifischen OCP-Mutationen aufwendig. Außerdem sind die genauen Abläufe bzw. gebildete Intermediate während der Photokonversion bzw. Relaxation noch nicht vollständig beschrieben. Darüber hinaus ist die Struktur des roten aktiven OCPs immer noch unklar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die C-terminale Domäne von OCP (CTD) ebenfalls in der Lage ist, Carotinoide zu binden, ohne dass die N-terminale Domäne benötigt wird. Durch die Expression der C-terminalen Domäne in Carotinoid-produzierenden E. coli entsteht ein violett gefärbtes Protein, in dem zwei CTD-Proteine an einem Canthaxanthin gebunden sind. Diese Studie führte zur Entdeckung einer neuen Funktion innerhalb der OCP-Familie (CTD als Carotinoid-Träger) und brachte eine neue Proteinklasse hervor, die als C-terminale Domänen-Homologe (CTDH) bezeichnet wird. Proteine aus der CTDH-Klasse können das gebundene Carotinoid an N-terminale Domänen und deren Homologe sowie an OCP weitergeben. Bei der Bindung von OCP an Phycobilisomen ist noch ein zweites Protein beteiligt, das als Fluorescence Recovery Protein (FRP) bezeichnet wird. FRP bindet am OCP und löst dabei die lichtaktivierte Form von den Phycobilisomen ab, um den ursprünglichen Energiefluss wiederherzustellen. In dieser Studie wurde der Komplex von FRP mit einer OCP-Variante, die als OCP ∆NTE bezeichnet wird, mit Kleinwinkelstreutechniken (SAXS und SANS) untersucht. OCP ∆NTE bildet zwei farblich unterscheidbare Varianten, ein Äquivalent des orangen Zustands und ein Äquivalent des roten Zustands, wobei beide Varianten stabile Komplexe mit FRP bilden können, während das Wildtyp-OCP und FRP nur vorübergehend Komplexe bilden. Durch partielle Deuterierung von entweder FRP oder den OCP ∆NTE-Varianten wurde der gebildete Komplex in SANS-Messungen untersucht, um Strukturinformationen des gebildeten Komplexes zu erhalten. Die rosa OCP ∆NTE-Variante bildet im FRP-Komplex stabile Dimere, die über die C-terminalen Domänen assoziiert sind, und darüber hinaus wurden auch strukturelle Veränderungen des FRPs im gebildeten OCP-Komplex festgestellt. Die hierbei erhaltenen Strukturinformationen lieferten neue Erkenntnisse über Zwischenprodukte im OCP-Photozyklus und konnten auch erstmals mit der Gegenwart von FRP zugeordnet werden.