title: Vergleichende Analysen der nukleär/zytoplasmatischen Exporteigenschaften von SR-ähnlichen Proteinen und ihre regulatorische Funktion im mRNA Spleißing-Prozess
title: Comparative analysis of the nuclear/cytoplasmic export requirements of SR-like proteins and their regulatory function in mRNA splicing process
Creators: name: Hackmann, Alexandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Intracellular transport
Biowissenschaften, Biologie
messenger-RNP
Messenger-RNP
Saccharomyces cerevisiae
RNS-Spleißen
Gbp2
Npl3
Intrazellulärer Transport
Kernporen-Komplex

description: In eukaryotic cells the separation
      into a nuclear and cytoplasmic compartment leads to an
      advantage for regulation of an efficient gene expression.
      Gene expression starts in the nucleus with the transcription
      of DNA to premature mRNAs. These transcripts are extensively
      processed and mature to the export competent mRNA within the
      messenger ribonucleoprotein particle (mRNP). Three mRNA
      binding SR-like proteins Npl3p, Gbp2p, and Hrb1p are loaded
      co-transcriptionally onto the mRNA and Npl3p interacts with
      the export receptor Mex67p-Mtr2p which translocates the
      processed and export competent mRNA through the nuclear pore
      complex into the cytoplasm. Once in the cytoplasm the mRNA
      encoded genetic information is translated into protein at the
      ribosoms. In general, NPL3 is essential in most yeast strains
      and npl3 mutants lead to mRNA export defects. However, in a
      worldwide deletion project a viable npl3∆ strain was created
      in the BY4741 background. Interestingly, in npl3∆ no mRNA
      export defects were detected, suggesting a further yet
      unknown function for NPL3. However GFP-localization studies
      of representing reporter proteins revealed a nuclear export
      defect for the ribosomal pre-60S but not for the 40S subunit
      in npl3∆. Npl3p physically interacts with the ribosomal
      protein Rpl25p and binds to the 25S rRNA of the pre-60S
      subunit. Nevertheless export defects unlikely refer to
      preribosome processing defects as in npl3∆ a nucleolar
      mislocalization was not observed and rRNA processing defects
      were not detected. In fact, Npl3p physically interacts with
      pre-60S export adapter Nmd3p and the export receptor Mex67p
      which marks for the export competent pre-60S subunit. Npl3p
      is not acting as an adapter for these factors as npl3∆ does
      not influence the binding of these factors to the pre-60S
      subunit. Here, we propose a novel function for Npl3p as an
      independent adapter for the export of the pre-60S subunit as
      it interacts directly with the pre-60S subunit and a deletion
      of NPL3 leads to export defects of this ribosomal subunit in
      the nucleus. Furthermore Npl3p has the potential to mediate
      the contact of these macromolecules to the nuclear pore
      complex via an interaction with the nucleoporin Nup60p
      associated Mlp1p. The second part of this thesis leads to a
      characterization of the export requirements of Gbp2p, Hrb1p
      and Npl3p. For a first time a yet unknown link to late steps
      of the splicing process was observed for Gbp2p and Hrb1p but
      not for Npl3p. In a screen the splicing factor mutants
      prp8-908/988 and prp17-Q336* were identified, that lead to
      severe nuclear export defects for Gbp2p and Hrb1p but not for
      Npl3p. GBP2 and HRB1 deletion show genetic interactions with
      these splicing factor mutants in contrast to the deletion of
      NPL3 which showed neither physical nor genetic interactions.
      Gbp2p and Hrb1p interact with Prp17p and Prp43p, a factor of
      the postspliceosomal complex. The nuclear mislocalization of
      Gbp2p and Hrb1p are effect of substantially reduced mRNA
      binding levels in prp8-908/988, prp17∆ and prp43-S247A while
      the amount of bound mRNAs to Npl3p only little is affected.
      RIP-Chip and qRT-PCR analysis revealed a preference for Gbp2p
      and Hrb1p binding to mRNAs that contain introns. Especially
      the double deletion strain gbp2∆ hrb1∆ shows slight splicing
      defects and significant reduced protein expression levels of
      intron containing genes. Gbp2p and Hrb1p are novel identified
      mRNA export adapters for the interaction with the export
      receptor Mex67p. These adapter-receptor interactions are
      highly reduced in prp8-908/988 and prp17∆ that may deplete
      the export of unspliced mRNAs. Furthermore, Gbp2p and Hrb1p
      interact with the nuclear pore associated Mlp1p which
      performs a function in the quality control of spliced mRNAs
      before they leave into the cytoplasm and Gbp2p and Hrb1p may
      contribute to this final mRNA quality check at the nuclear
      pores. These findings lead to a following model: Gbp2p and
      Hrb1p in contrast to Npl3p are recruited to the mRNAs by the
      splicing machinery and the interaction of Gbp2p and Hrb1p
      with the export receptor Mex67p promotes the export of
      spliced mRNAs. Contrary, Npl3p is a general export adapter
      that interacts regardless of intron status with bulk mRNA and
      interacts with the mRNA export receptor Mex67p. It is well
      known that Npl3p is early recruited to the mRNA by action of
      RNA polymerase II while Gbp2p and Hrb1p are recruited to mRNA
      during transcription elongation. However, with the
      co-transcriptional association of the spliceosome, a direct
      interaction of Gbp2p and Hrb1p with splicing factors of the
      late splicing phase ascertains a strong binding to spliced
      mRNAs and allows for a recruitment of Mex67p molecules via
      physical interactions with Gbp2p and Hrb1p. In this way these
      factors promote an efficient and controlled transport of the
      spliced mRNAs into the cytoplasm.
description: Eukaryontische Zellen zeichnen sich
      durch ihre Kompartimentierung in Zytoplasma und Zellkern aus,
      die eine regulierte Genexpression ermöglicht. Im Zellkern
      erfolgt die Transkription der Gene in prä-mRNAs, die nach
      extensiver Prozessierung zur Export kompetenten mRNA im
      Ribonukleoprotein-Komplex („messenger ribonucleoprotein
      particle“ = mRNP) heranreifen. Die SR-ähnlichen mRNA
      Bindeproteine Npl3p, Gbp2p und Hrb1p assoziieren während der
      Transkription mit der mRNA im Zellkern und Npl3p interagiert
      mit dem Export Rezeptor Mex67p-Mtr2p, der die
      Export-kompetente mRNA durch die Kernporen-Komplexe der
      Kernmembran in das Zytoplasma transportiert. Dort erfolgt an
      den Ribosomen die Proteintranslation anhand der mRNA
      kodierten genetischen Information. Npl3p ist in vielen
      Saccharomyces cerevisiae Stämmen ein essentielles Protein und
      Mutationen führen zu mRNA Export-Defekten. In einem
      weltweiten Deletionsprojekt wurde eine überlebensfähige
      NPL3-Deletion im Stammhintergund BY4741 hergestellt.
      Interessanterweise sind in npl3∆ keine signifikanten mRNA
      Export Defekte vorhanden, was auf eine weitere, bisher
      unbekannte Funktion von NPL3 hindeutet. In
      Lokalisationsstudien wurden jedoch nukleäre Export-Defekte
      der ribosomalen prä-60S, nicht aber der 40S Untereinheit in
      npl3∆-Zellen nachgewiesen. Npl3p interagiert physikalisch
      sowohl über das ribosomale Protein Rpl25p als auch über die
      25S rRNA mit der prä-60S Untereinheit. Eine Funktion von
      Npl3p in der Prozessierung des ribosomalen Vorläufers ist
      aufgrund von nicht detektierten rRNA Prozessierungsdefekten
      und nukleolaren Mislokalisationen in npl3∆ unwahrscheinlich.
      Npl3p interagiert mit den Faktoren der Export kompetenten
      prä-60S Untereinheit Nmd3p und dem ebenfalls im prä-60S
      Export agierenden Export-Rezeptor Mex67p. Eine Deletion von
      NPL3 beeinflußt jedoch nicht die Rekrutierung dieser prä-60S
      Exportfaktoren zur ribosomalen Untereinheit. Da Npl3p die
      prä-60S Untereinheit physikalisch bindet und seine Deletion
      nukleäre Export-Defekte hervorruft, wirkt Npl3p als
      unabhängiger Exportadapter im prä-60S Transportprozess. Npl3p
      hat das Potential den Kontakt zwischen der prä-60S
      Untereinheit und den Kernporen-Komplexen über eine
      physikalische Interaktion mit dem Nup60p assoziierten Mlp1p
      zu vermitteln. In einem zweiten Kapitel dieser Arbeit
      erfolgte die vergleichende Analyse der Exporteigenschaften
      von Gbp2p, Hrb1p und Npl3, welche erstmalig eine Verbindung
      zum Spleißing-Prozess aufzeigt. In einem „Screen“ wurden die
      Spleißingfaktor-Mutanten prp8-908/988 und prp17-Q336*
      identifiziert, die starke nukleäre Export-Defekte von Gbp2p
      und Hrb1, nicht aber von Npl3p hervorrufen. GBP2 und HRB1
      Deletionen interagieren genetisch mit diesen
      Spleißingfaktor-Mutanten der Spleißing Spätphase, während
      eine NPL3 Deletion weder genetisch noch physikalisch mit
      diesen Faktoren interagiert. Gbp2p und Hrb1p zeigen
      Protein-Protein Wechselwirkungen mit Prp17p und mit Prp43p
      des postspleißosomalen Komplexes. Die nukleären
      Mislokalisationen von Gbp2p und Hrb1p in Spleißing-faktor
      Mutanten der Spleißing Spätphase beruhen auf eine starke
      Störung der mRNA Bindung, die in RNA-Co IP Studien ermittelt
      wurden. Für Gbp2p und Hrb1p wurde in RIP-Chip und
      qRT-PCR-Studien eine präferentielle Bindung für mRNAs
      identifiziert, die Intronsequenzen enthalten. Marginale
      Spleißing Defekte, aber signifikante
      Proteinexpressionsabnahmen Intron-haltiger Gene wurden vor
      allem in der Doppel-Deletion gbp2∆ hrb1∆ nachgewiesen. Gbp2p
      und Hrb1p interagieren mit dem Export-Rezeptor Mex67p und
      sind somit als neue mRNA Export Adapter identifiziert worden.
      In Spleißingfaktor-Mutanten sind diese Adapter-Rezeptor
      Bindungen gestört, wodurch der Export von ungespleißten mRNAs
      vermutlich zurückgehalten wird. Gbp2p und Hrb1p zeigen eine
      Verbindung zum Kernporen-Komplex assoziierten Mlp1p. Dieser
      Faktor hat eine Funktion in der finalen Qualitätskontrolle
      von gespleißten mRNAs bevor diese den Zellkern verlassen
      können. Daraus ergibt sich folgendes Modell: Gbp2p und Hrb1p
      werden Spleißing-abhängig zur mRNA rekrutiert und
      unterstützen den Export von gespleißten mRNAs über eine
      Interaktion mit dem Export-Rezeptor Mex67p. Im Gegensatz dazu
      agiert Npl3p als universeller Export-Adapter, der unabhängig
      vom Intron-Status der mRNA Mex67p bindet. Bekannterweise wird
      Npl3p über die RNA Polymerase II frühzeitig auf alle mRNAs
      geladen, während Gbp2p und Hrb1p in der Elongations- phase
      zur mRNA gelangen. Eine stabile Assoziation von Gbp2p und
      Hrb1p mit der mRNA erfolgt erst durch die Assemblierung des
      Spleißosom, mit dessen Komponenten der Spleißing-Spätphase
      sie physikalisch interagieren. Diese Wechselwirkungen
      unterstützen Spleißing und ermöglichen über die sich
      anschließende Adapter-Rezeptor Interaktion einen effizienten
      und kontrollierten Export von gespleißten mRNAs.