title: Der Einfluss von Pdcd4 auf die Expression des Proteins Angiopoietin2
title: Knock-down of Pdcd4 Impairs Angiogenesis Via Up-regulation of Angiopoietin-2
Creators: name: Krug, Sebastian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Angiopoietin2
angiopoietin-2
tumor suppressor
Medizin, Gesundheit
Pdcd4
Angiogenese
angiogenesis
Tumorsuppressor

description: Pdcd4 (programmed cell death 4) ist
      ein neuer Tumorsuppressor. In vielen Tumoren oder während
      maligner Transformation ließen sich supprimierte Pdcd4 Mengen
      nachweisen. Hohe Pdcd4 Spiegel wiederum verhinderten eine
      neoplastische Umwandlung. Bislang schienen aber die Wirkungen
      von Pdcd4 abhängig vom Zelltyp zu sein. Ang2 (Angiopoietin2),
      ein Wachstumsfaktor, der an der Neubildung von Gefäßen
      beteiligt ist, könnte ein zelltypübergreifendes Zielgen von
      Pdcd4 darstellen. Eine gezielte Suppression von Pdcd4 mittels
      siRNA (siPdcd4) in verschiedenen Tumorzelllinien der Mamma,
      der Leber, des pankreatiko-gastro-intestinalen Traktes sowie
      in Endothelzellen bestätigte in Western Blots eine Steigerung
      von Ang2 Protein. Zusätzlich zeigte sich in semiquantitativen
      RT- und RTD-PCRs eine Regulierung auf transkriptionaler
      Ebene. Damit ist Ang2 tatsächlich ein in mehreren
      Tumorzelltypen reguliertes Zielgen von Pdcd4. Nachdem eine
      erhöhte Ang2 Proteinexpression unter Pdcd4 Suppression in
      Western Blot Untersuchungen belegt werden konnte, ließen sich
      auch in Mediumüberständen von stabil (shPdcd4) oder transient
      (siPdcd4) transfizierten Zelllinien erhöhte Ang2 Mengen im
      Vergleich zur Kontrolle nachweisen. Dies sprach für eine
      gesteigerte Sekretion von Ang2 Protein. Die funktionelle
      Bedeutung der erhöhten Ang2 Spiegel wurde in Tube Formation-
      und Boyden Chamber Assays untersucht und dabei die
      immortalisierte humane mikrovaskuläre endotheliale Zelllinie
      HMEC-1 verwendet. Die im konditionierten Medium von stabil
      shPdcd4 transfizierten BON-1- und HCT116-Zellen erhöhten Ang2
      Spiegel führten in Tube Formation Assays, im Vergleich zum
      Kontrollmedium, zu einer gesteigerten Gefäßneubildung. Anhand
      von Verzweigungen und Länge der Tubes erfolgte eine
      Software-basierte Auswertung. Bestätigt wurden diese
      Ergebnisse in Tube Formation Assays mit rekombinanten Ang2.
      Dabei ließen sich im Einklang mit der bestehenden Literatur
      zwei Auswirkungen nachweisen. Zum einen zeigten sich
      proangiogenetische Effekte von Ang2 in Verbindung mit Medium
      mit 10% FBS, zum anderen gefäßregressive Wirkungen von Ang2
      in Medium mit 1% FBS. Vermutlich liegt das an den
      unterschiedlichen VEGF Konzentrationen, die mit steigendem
      FBS Gehalt des Mediums auch zunehmen. Zusätzlich ließ sich
      die Fähigkeit von Ang2, Migration von endothelialen Zellen zu
      fördern, in Boyden Chamber Assays nachweisen. Hierbei zeigten
      die gesteigerten Ang2 Konzentrationen im konditionierten
      Medium der stabil transfizierten BON-1- und HCT116 Zellen mit
      1% und 10% FBS promigratorische Effekte auf die HMEC-1 Zellen
      im Vergleich zur Kontrolle. Im Rahmen dieser Arbeit konnte
      gezeigt werden, dass Ang2 in diversen Tumorzelllinien ein
      Zielgen des Tumorsuppressors Pdcd4 ist. Durch Verringerung
      von Pdcd4 mittels siRNA wurde Ang2 vermehrt transkribiert,
      translatiert und sezerniert. Die funktionelle Bedeutung der
      gesteigerten Ang2 Sekretion ließ sich in Tube Formation
      Assays (angiogenetische Wirkung) und Boyden Chamber Assays
      (promigratorische Wirkung) nachweisen. Mit der Steuerung von
      Ang2 durch Pdcd4 bindet sich der Tumorsuppressor direkt in
      die Neoangiogenese von Tumoren ein und unterstreicht damit
      seine Bedeutung in der Entwicklung maligner Neoplasien.
      Insgesamt gesehen ist eine Wiederherstellung der Pdcd4
      Expression in Tumoren und die damit verbundene Überführung in
      die aktive Rolle als Tumorsuppressor ein Hauptanliegen
      möglicher therapeutischer Ansätze.
description: Pdcd4 (programmed cell death 4) is
      a new tumour suppressor. Pdcd4 levels are reduced in various
      tumours and during malignant transformation. Furthermore,
      high amounts of Pdcd4 showed the potential to repress
      malignant transformation. So far, the effects of Pdcd4 seemed
      to be cell type specific. The growth factor Ang2
      (Angiopoietin2), which is involved in angiogenesis, could be
      a cell type independent target gene of Pdcd4. Selective
      down-regulation of Pdcd4 by siRNA (siPdcd4) showed enhanced
      Ang2 levels in Western Blots of tumour cell-lines of the
      mammary, liver, pancreas, gastrointestinal tract and in
      endothelial cells. Additionally, semiquantitative RT- and
      RTD-PCRs indicated a transcriptional regulation. Therefore
      Ang2 represents a target gene of Pdcd4 in various tumour
      cell-lines. After proving the elevated Ang2 expression by
      Pdcd4 suppression in Western Blots, investigations of
      supernatants of stably (shPdcd4) and transiently (siPdcd4)
      transfected cell-lines revealed higher Ang2 amounts in
      comparison to the control, indicating an augmented secretion
      of Ang2 protein. Tube Formation- and Boyden Chamber Assays
      were done to show the relevance of high Ang2 levels. We used
      the immortalized microvascular endothelial cell-line HMEC-1
      for these experiments. The higher Ang2 levels in the
      conditioned medium of stably shPdcd4 transfected BON-1- und
      HCT116- cells caused an increased angiogenic activity in Tube
      Formation Assays in comparison to the mock control. Length
      and junctions of the tubes were software based evaluated.
      Tube Formation Assays with recombinant Ang2 confirmed these
      results. According to the existing literature Ang2 acted in
      two ways. On the one hand Ang2 increased the angiogenic
      activity in medium with 10% FBS, on the other hand Ang2
      repressed angiogenesis in medium with 1% FBS. The predictable
      reasons are the different VEGF amounts in Medium with 1% and
      10% FBS. Next to angiogenesis Ang2 had migrational potential
      on HMEC-1 cells in Boyden Chamber Assays. The higher levels
      of Ang2 in the conditioned medium of stably shPdcd4
      transfected BON-1- and HCT116 cells with 1% and 10% FBS
      caused an increased migration on HMEC-1 cells in comparison
      to the mock control. In summary, this study shows that Ang2
      is a target gene of Pdcd4 regulated in various tumour
      cell-lines. The suppression of Pdcd4 by siRNA led to a higher
      transcription, translation and secretion of Ang2. The
      functional importance of increased Ang2 amounts was seen in
      Tube Formation and Boyden Chamber Assays. Pdcd4 controls
      angiogenesis via regulation of Ang2 and is thus involved in
      the development of malignant neoplasms. All in all, a
      putative restoring of Pdcd4 in tumours and with it an active
      role as a tumour suppressor could be a promising therapeutic
      target.