Fluorescent sensors for the small GTPase switch
Creators: name: Voß, Stephanie
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2017
Subjects: subject: GTPhase
subject: FRET
subject: Biosensor
subject: FLIM
subject: Rab
subject: Ras
subject: 570

description: Kleine GTPasen regulieren eine Vielzahl an hoch dynamischen Prozessen, welche von Signaltransduktion und Cytoskelettorganisation bis zum nuklearen und vesikulären Transport reichen. Sie erfüllen ihre regulatorische Rolle indem Sie als molekulare Schalter agieren, die zwischen einer aktiven, GTP-gebunden Form und einer inaktiven, GDP-gebundenen Form hin- und herwechseln. Der Wechsel zwischen der aktiven und der inaktiven Form geht mit einer Konformationsänderung der Proteinstruktur einher und wird durch GTPase-aktivierende Proteine (GAPs) und Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) gesteuert. Zudem weisen die meisten GTPasen eine charakteristische subzelluläre Lokalisation auf und zirkulieren zwischen verschiedenen Zellkompartimenten. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle in komplexen zellulären Vorgängen sind GTPasen ein beliebtes Ziel für die Entwicklung von Biosensoren, die einen Einblick in die zeitlichen und räumlichen Aspekte ihrer Aktivität ermöglichen. Die meisten der bisher etablieren Sensoren basieren auf der spezifischen Bindung einer modifizierten Effektordomäne an die aktivierte GTPase. Ein Nachteil dieser Strategie ist, dass zunächst für jede GTPase eine passende Effektordomäne identifiziert und optimiert werden muss und daher einmal etablierte Sensoren nicht einfach auf andere GTPasen übertragen werden können. Zudem erfordern konventionelle Sensorkonstrukte häufig die Modifikation der Proteintermini, was die native Lokalisation der GTPase beeinträchtigen kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuartiger Ansatz zur Entwicklung von GTPase-Sensoren verfolgt, der auf alle GTPasen übertragbar ist und nur eine minimale Modifikation der Proteine erfordert. Der Sensor basiert auf einem intramolekularen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Paar, das es ermöglicht die Konformationsänderung der GTPase im Zuge des Nukleotidaustausches direkt auszulesen. Das Sensordesign wurde zunächst auf Rab1 und später auf KRas angewandt. Der Erhalt der nativen Funktionalität von Rab1 im Sensorkonstrukt wurde zunächst durch die eingehende Charakterisierung der Interaktion mit dem GEF DrrA, dem GAP TBC1D20 und den Effektorproteinen OCRL und LidA überprüft. Anschließend wurde in Zellstudien der Anteil an aktivem Rab1 im Cytoplasma und am Golgi quantifiziert. Der für KRas entwickelte Sensor offenbarte ein polarisiertes Aktivitätsprofil von KRas in COS7 Zellen mit geringerer Aktivität an der freien Zellkante. Zudem zeigte der KRas Sensor, dass EGF Stimulation zu einem globalen Anstieg der intrazellulären KRas-Aktivität führt. Ergänzend wurde der dynamische Austausch von Rab1 zwischen Cytoplasma und Golgi durch Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Studien und Experimente mit photoaktivierbarem GFP quantifiziert. Die Versuche weisen darauf hin, dass der Übergang von Rab1 zwischen Cytoplasma und Golgimembran eng mit der Fähigkeit verknüpft ist zwischen aktivem und inaktivem Zustand zu wechseln.
description: Small GTPases regulate a variety of highly dynamic biological processes ranging from signal transduction, cytoskeleton rearrangement and gene expression to nuclear and vesicular transport. They exert their regulatory role by acting as molecular switches, cycling between an active GTP-bound and an inactive GDP bound form. The switching between the active and the inactive state involves distinct conformational changes in the GTPase structure and is tightly regulated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs). Most small GTPases exhibit a characteristic subcellular localization and cycle between different cellular compartments. This spatial cycle constitutes an additional level of regulation. Due to their key role in highly dynamic processes, GTPases have been a popular target for the development of biosensors that provide insight into the spatiotemporal aspects of their functioning. Most GTPase sensors rely on an indirect signal read out, generated through binding of an engineered effector domain to the activated, GTP-bound GTPase. However, the versatility of this approach is limited. It requires a suitable effector domain, which has to be identified and optimized for each target GTPase. Moreover, these conventional sensor designs often involve modification of the protein’s termini, affecting native GTPase functioning and localization. In the course of this thesis a new GTPase activation sensor that avoids the aforementioned drawbacks of conventional designs was established. By employing Förster energy transfer (FRET) between a N-terminal fluorescent protein and an organic dye, the intrinsic conformational change of the GTPase-fold can be used as the primary indicator for GTPase activation. The sensor design was first applied to Rab1 and later extended to KRas. Retained native behavior and sensitivity of Rab1 in the sensor constructs was assessed by monitoring their interaction with GEFs, GAPs and effector proteins. In cellular studies, using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), the ratio of active to inactive Rab1 in the cytoplasm and on the Golgi was quantified. Rab1 was found to be mostly active in the cytoplasm and largely inactive when localized on the Golgi, suggesting that the Golgi organelle serves as the terminal of the Rab1 functional cycle. The KRas sensor revealed polarized KRas activity at the plasma membrane with lower KRas activity at the cell edges. Upon EGF-stimulation the sensor indicated a global increase in activated KRas. The work based on the GTPase activation sensor in this thesis is complemented with an analysis of the dynamics of Rab1 trafficking between the cytoplasmic pool and the Golgi organelle. Using fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation experiments, the effect of impaired Rab1 function on Rab1’s spatial cycling was assessed. These experiments indicate, that the ability to cycle between its active and inactive state is essential for sustained Rab1 trafficking between cytoplasm and Golgi.