Einfluss von Arsen auf die DNA-Doppelstrangbruchreparatur und damit assoziierte zelluläre Signalwege
Creators: name: Niemand, Rebecca Katharina
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2018
Subjects: DNA-Doppelstrangbruchreparatur
Arsen
Homologe Rekombination
Nicht-homologes end-joining
Genexpression
Zellzyklus
Apoptose
Mikrokerne
PIG-A

description: Arsen ist eine ubiquitär vorkommende Kontaminante. Weltweit sind daher 100 Millionen Menschen einer erhöhten Exposition durch verschiedene Arsenverbindungen über das Trinkwasser sowie Lebensmittel ausgesetzt. Diese Exposition gegenüber Arsen wird mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Hierzu zählen unter anderem „black foot disease“, Arteriosklerose sowie das vermehrte Auftreten von Haut-, Lungen- und Blasentumoren. Vor allem anorganische Arsenverbindungen, wie beispielsweise Natriumarsenit, weisen dabei ein hohes toxisches Potential auf. Es konnte gezeigt werden, dass arseninduzierten Schäden bereits in umweltrelevanten Konzentrationen auftreten können. Primär wird davon ausgegangen, dass die Induktion von oxidativem Stress und die Hemmung von DNA Reparaturprozessen eine entscheidende Rolle in der arseninduzierten Kanzerogenese spielen. Bezüglich der DNA Doppelstrangbruchreparatur gibt es bis dato jedoch nur wenig Untersuchungen, inwieweit Arsen diese beeinflusst.
Durch Untersuchung der DNA Doppelstrangbruchreparatur konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Arsen selbst keine Doppelstrangbrüche induziert, jedoch den Reparaturvorgang strahlungsinduzierter DNA Doppelstrangbrüche inhibiert. Pulsfeld Gelelektrophorese visualisierte ein vermehrtes Auftreten von kleineren DNA Fragmenten im Agarosegel infolge einer Arseninkubation. Dementgegen konnte, nach Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen, durch die Betrachtung von phospho-ATM Foci (ataxia-telangiectasia mutated), γH2AX Foci sowie 53BP1 Foci (p53 binding protein 1) kein Einfluss auf die Schadenserkennung der DNA Doppelstrangbruchreparatur beobachtet werden, was auf eine Inhibition nach der Schadenserkennung schließen ließ. Zur detaillierten Betrachtung der beiden Hauptreparaturmechanismen von DNA Doppelstrangbrüchen wurden Markerproteine ausgewählt. Hierbei standen DNA PKcs (katalytische Untereinheit der DNA abhängige Proteinkinase) für das NHEJ (nicht homologes end joining) sowie Rad51 für die HR (homologe Rekombination) im Vordergrund. Es ergab sich eine Repression der Foci Dissoziation von Rad51, woraufhin nachfolgend BRCA1 (breast cancer 1) sowie Rad54 als potentielle Targetproteine von Arsen untersucht wurden. Hieraus resultierte in beiden Fällen ein Einfluss auf die Assoziation der Proteine an induzierte DNA Doppelstrangbrüche.
Die Untersuchung des Zellzyklus verdeutlichte einen konzentrationsabhängig eintretenden G2/M Arrest durch Arsen, wobei bei hohen Dosen (ab 15 µM NaAsO2) der Zellzyklusstopp aufgehoben wurde. Eine kombinierte Behandlung mit Arsen und Bestrahlung wurde zusätzlich untersucht, da die Bestrahlung zur Induktion von DNA Doppelstrangbüchen diente. In Kombination mit Bestrahlung konnte der fehlende Zellzyklusstopp bei geringeren Konzentrationen (ab 10 µM NaAsO2) beobachtet werden. Eine Untersuchung der Viabilität zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg der apoptotischen Vorgänge in Anwesenheit von Arsen. Durch eine zusätzliche Bestrahlung zeigte sich kein vermehrtes Auftreten apoptotischer Vorgänge.
Darüber hinaus wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Arsen auf die Genexpression in HeLa S3 Zellen untersucht. Dabei wurden 95 Gene betrachtet, die hinsichtlich der DNA Schadensantwort eine bedeutende Rolle spielen. Diese können den Signalwegen Apoptose, Zellzyklusregulation und Proliferation, oxidative Stressantwort und DNA Reparatur zugeordnet werden. Zusätzlich wurden wichtige Transkriptionsfaktoren, die maßgeblich an der Regulation der untersuchten Gene beteiligt sind, berücksichtigt. Hierbei wurde ebenfalls der zusätzliche Einfluss von Röntgenstrahlung zur Induktion von DNA Doppelstrangbrüchen in Kombination mit Arsen betrachtet. Eine Behandlung der Zellen mit Arsen führte zu zahlreichen Veränderungen des Genexpressionsmusters, wobei eine zusätzliche Bestrahlung keine additiven Effekte aufwies.
Zusammenfassend lassen die Ergebnisse auf eine Herabsetzung der genomischen Stabilität schließen. Strahlung alleine induziert DNA Doppelstrangbrüche, die durch die NHEJ und die HR repariert wurden, wohingegen in Anwesenheit von Arsen die HR, als fehlerfreier DNA Doppelstrangbruchreparaturmechanismus, inhibiert wurde. Ferner wurde der Zellzyklusstopp bei hohen Arsenkonzentrationen aufgehoben und viele stressinduzierte Gene in Anwesenheit von Arsen vermehrt exprimiert. Aus diesem Grund wurde der Einfluss von Arsen auf die genomische Stabilität mittels spezifischer Analysen näher betrachtet. Anhand der Mikrokernuntersuchung konnte ein klastogener Effekt von Arsen nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte eine Bestrahlung in Kombination mit Arsenbehandlung ein erhöhtes Aufkommen von Genmutationen.
Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass Arsen einen nachteiligen Effekt auf die genomische Stabilität in Kombination mit Strahlung besitzt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Arsen spezifisch die HR inhibiert, während das NHEJ nicht beeinträchtigt wird. Der fehlerfreie Reparaturweg kommt zum Erliegen, wodurch die durch Röntgenstrahlung induzierten DNA Doppelstrangbrüche ausschließlich durch den fehlerbehafteten Reparaturweg (NHEJ) repariert werden können. Die Inhibierung der DNA Reparatur in Kombination mit der Aufhebung des Zellzyklusarrests verstärkt die Brisanz der Wirkungsweise von Arsen.