Μελέτη μοριακών παραμέτρων στον καρκίνο του θυρεοειδούς για την αναγνώριση δεικτών πρόβλεψης ευαισθησίας σε στοχευμένη θεραπεία:
Creators: name: Χαραλάμπους, Ελπίδα Χ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Καρκίνος
Θυρεοειδής
Στοχευμένη
Μοριακή
Thyroid
Cancer
Molecular
Marker

description: Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση των αυξητικών μοριακών οδών και των επιμέρους μορίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του θυρεοειδούς, με στόχο την αναγνώριση πιθανών διαγνωστικών δεικτών, αλλά και δεικτών πρόβλεψης ευαισθησίας σε συγκεκριμένους θεραπευτικούς αναστολείς. Επιλέχθηκαν δείκτες που αφορούν στις μοριακές οδούς που έχουν αναφερθεί ότι φέρουν γενετικές/ λειτουργικές αλλαγές στον καρκίνο του θυρεοειδούς και αποτελούν φαρμακευτικούς στόχους. Υλικά και μέθοδοι: Εξετάστηκαν συνολικά 20 κυτταρικές σειρές και 220 δείγματα ασθενών. Στα δείγματα έγινε γονοτυπική ανάλυση με Real Time PCR και ταυτοποίηση αλληλουχίας καθώς και ανάλυση σχετικής mRNA έκφρασης με Real Time PCR για επιλεγμένα γονίδια (υποδοχείς, μοριακοί συνοδοί και γονίδια που εκφράζουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αγγειογένεση). Ακόμα, ελέγχθηκε η έκφραση τριών miRNA (MIRN146b, MIRN221, MIRN222), που φαίνεται να σχετίζονται με τον καρκίνο του θυρεοειδούς, με in situ υβριδισμό και Real Time PCR, καθώς και η επίδραση δύο αναστολέων κινασών της τυροσίνης [vandetanib (ZD6474, Zactima™, AstraZeneca, Wilmington, DE) και το Sunitinib (SU11248, Sutent ®, Pfizer, New York, NY)] σε καρκινικές κυτταρικές σειρές θυρεοειδούς. Αποτελέσματα: Η μετάλλαξη V600E του BRAF βρέθηκε στο 38% περίπου του συνόλου των δειγμάτων (50,8% των θηλωδών καρκινωμάτων) και φαίνεται να είναι χαρακτηριστική για τα PTC. Τα αναπλαστικά καρκινώματα φάνηκε ότι έχουν σημαντικά διαφορετικό προφίλ έκφρασης της HER2, που φαίνεται να αυξάνεται, και της var3 του EGFR, που φαίνεται να μειώνεται, συγκριτικά με τον μη καρκινικό ιστό (p=0,006 και p=0,00105 αντίστοιχα), καθώς και διαφορές στο αγγειογενετικό προφίλ που ελέγχθηκε σε σχέση με τους υπόλοιπους ιστολογικούς τύπους. Επιπλέον, διαφορές παρατηρήθηκαν στο προφίλ έκφρασης μεταξύ ιστολογικών δειγμάτων και κυτταρικών σειρών, στο σύνολο σχεδόν των μορίων που μελετήθηκαν. Θετικότητα και για τα 3 miRs που μελετήθηκαν, παρατηρήθηκε μόνο σε θυρεοειδικά καρκινώματα, ενώ το προφίλ υπερέκφρασης και των 3 miR ήταν σημαντικά συχνότερα θετικό σε PTCs σε σχέση με τα MTCs (p=0.007) και τα ATCs (p=0.0001). Οι TKIs vandetanib και sunitinib, κατέστειλαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χωρίς όμως να οδηγήσουν σε απόπτωση. Παρατηρήθηκε παροδική αναστολή της φωσφορυλίωσης των MAP και MEK κινασών, καθώς και αλλαγή στη σχετική έκφραση της DUSP6 (φωσφατάση διπλής ειδικότητας 6) και της THBS1 (θρομβοσπονδίνη 1). Δεν παρατηρήθηκε συνέργεια με άλλα χημειοθεραπευτικά. Συμπεράσματα: Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στα ATC σχετικά με την έκφραση ισομορφών των EGFR / HER2, οι οποίες αποτελούν ενδογενείς HER αναστολείς ίσως θα πρέπει να ληφθούν υπ’ όψη κατά το σχεδιασμό μελετών με εξωγενείς αναστολείς αυτών των υποδοχέων. Επιπλέον, τα ATC παρουσιάζουν χαρακτηριστικό αγγειογενετικό προφίλ έκφρασης που πιθανώς συνδέεται με την επιθετική τους συμπεριφορά και ίσως αποτελέσει στόχο για φαρμακευτική αναστολή, ενώ τα PTC και MTC χαρακτηρίζονται από σημαντικές αλλαγές έκφρασης των γονιδίων για τις HSP90 πρωτεΐνες, οι οποίες ίσως συμμετέχουν στην ανάπτυξη αυτών των όγκων. Το προφίλ υπερέκφρασης και των τριών miRs146b/221/222 φαίνεται ότι χαρακτηρίζει τα PTC και σχετίζεται πιθανόν με καλύτερη βιολογική συμπεριφορά, ενώ μπορεί να διερευνηθεί in situ με την μέθοδο που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη. Οι TKIs vandetanib και sunitinib αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς in vitro χωρίς να οδηγούν σε απόπτωση, αναστέλλοντας παροδικά την φωσφορυλίωση των ΜΑΡ και ΜΕΚ κινασών, πιθανόν μέσω παρέμβασης της DUSP6 φωσφατάσης.
description: In the present study we investigated the molecular pathways and individual molecules involved in thyroid carcinogenesis in order to identify potential diagnostic markers, as well as markers predictive of sensitivity to specific therapeutic inhibitors. The selected molecules are involved in molecular pathways that have been reported to exhibit genetic/ functional changes in thyroid cancer and represent pharmaceutical targets. Materials and methods: 20 cell lines and 220 patient samples were studied. Genotypic analysis was carried out utilising both Real Time PCR and direct sequencing. Furthermore, the relative mRNA expression of a variety of targets (receptors, molecular chaperones, genes encoding proteins associated with angiogenesis) was evaluated, as well as the expression of three miRNAs (MIRN146b, MIRN221, MIRN222), which seem to be associated with thyroid cancer, using in situ hybridisation and Real Time PCR. In addition, the effect of two of tyrosine kinase inhibitors (TKIs [Vandetanib (ZD6474, Zactima ™, AstraZeneca, Wilmington, DE) and Sunitinib (SU11248, Sutent ®, Pfizer, New York, NY)] in thyroid cancer cell lines was studied. Results: BRAF V600E mutation was present in 38% of thyroid cancer samples (50.8% of PTCs), and seems to be characteristic of PTC. Anaplastic carcinomas appear to have significantly different expression profiles of HER2 and var3 of EGFR compared to non-cancerous tissue (p = 0.006 and p = 0.00105, respectively), with HER2 exhibiting an increase in relative expression, whereas EGFR var3 expression appears downregulated. Significant differences were observed in expression profiles between tissue samples and cell lines, for almost all the molecules studied. Only thyroid carcinomas were positive for all 3 miRs studied, while among thyroid carcinomas, overexpression of all 3 miR was significantly more frequent in PTCs compared with MTCs (p = 0.007) and ATCs (p = 0.0001). The two TKIs investigated seemed to inhibit cell proliferation but did not lead to apoptosis. A transient inhibition in the phosphorylation of MEK and MAP kinases was observed, as well as a change in the relative expression of DUSP6 (dual specificity phosphatase 6) and THBS1 (thrombospondin 1). However, no synergy with other chemotherapeutic agents was observed. Conclusions: The observed differences in ATC on expression profiles of EGFR/HER2 and their splice variants, which are known to be endogenous HER inhibitors, should be taken into account when designing studies on the use of exogenous HER inhibitors. ATC appear to have a characteristic angiogenic factor expression profile, which may suggest an association with their aggressive behaviour and may also constitute a target for pharmacological inhibition. PTC and MTC , are characterized by changes in HSP90 related mRNA expression, pointing to a role of these genes in the progression of these tumors. Overexpression of miRs146b/221/222 appears to characterize PTC. The miR in situ hybridisation method applied in this study could eventually be integrated as a diagnostic tool in cytologic specimens. The TKIs vandetanib and sunitinib inhibit cell proliferation in vitro, but do not lead to apoptosis. They seem to transiently inhibit MAP and MEK kinase phosphorylation, possibly through DUSP6 phosphatase intervention.