title: “Purifiaión y caracterización del proceso del pegilación de la casa Pleurotus ostreatus”
Creators: name: Franco González, Ramón José
Publisher: name: Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
Year: 2024
Subjects: subject: MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD::CIENCIAS MÉDICAS::OTRAS ESPECIALIDADES MÉDICAS::OTRAS
subject: Medicine
subject: Purificación y caracterización
subject: Proceso de PEGilación
subject: Casa de Pleurotus ostreatus

description: 0000-0002-2826-2518
description: La lacasa es una enzima versátil con numerosas aplicaciones biotecnológicas, gracias a su capacidad para oxidar diversos sustratos, incluidos compuestos aromáticos, mientras convierte el oxígeno molecular en agua. Ha sido ampliamente utilizada en áreas como la producción de papel, la biorremediación y la biomedicina. Recientemente, se ha descubierto que algunas lacasas bacterianas, como las de Bacillus sp. MSK-01 puede inhibir el crecimiento de células tumorales, lo que abre nuevas posibilidades para su uso en tratamientos contra diversas enfermedades. Sin embargo, su uso terapéutico presenta retos importantes, sobre todo en términos de estabilidad, vida media en circulación y especificidad en entornos fisiológicos. Un obstáculo común para las enzimas terapéuticas, incluida la lacasa, es su vulnerabilidad a la degradación por proteasas y su rápida eliminación del cuerpo, lo que reduce su efectividad. Para superar estos inconvenientes, una estrategia habitual es la PEGilación, que consiste en la unión covalente de polietilenglicol (PEG) a las proteínas. Esta modificación puede mejorar las propiedades farmacológicas de las enzimas, aunque con frecuencia disminuye su actividad enzimática al afectar sus sitios activos o su estructura. El objetivo de este estudio fue minimizar la pérdida de actividad mediante una reacción de PEGilación sitio-específica. Al orientar la unión del PEG hacia el extremo amino terminal de la lacasa, se evitan modificaciones en los sitios catalíticos, preservando su función enzimática. En este trabajo se purificó y PEGiló la lacasa obtenida de Pleurotus ostreatus, un hongo conocido por su eficacia en la degradación de compuestos aromáticos. La purificación se realizó combinando cromatografía de intercambio aniónico y exclusión por tamaño, logrando un factor de purificación de 7.22 y un rendimiento del 42.93%. La enzima mostró una masa molecular de aproximadamente 63 kDa, con un radio hidrodinámico de 4.45 nm y una carga superficial de -3.07 mV, lo que sugiere la formación de oligómeros en solución acuosa. Se evaluaron los parámetros cinéticos de la enzima usando los sustratos 2,6-DMP y ABTS, observando que el pH óptimo para la lacasa era 4.5 con DMP y 4.0 con ABTS. Además, la enzima mostró una mayor afinidad por DMP (Km: 0.36 mM para DMP y 0.73 mM para ABTS) y una mayor velocidad de reacción con ABTS (Vmáx: 14.99 μmol/min Purificación y caracterización del proceso de PEGilación de la lacasa de Pleurotus ostreatus 15 para ABTS y 1.48 μmol/min para DMP), resultados en consonancia con estudios previos sobre la isoforma POXA1b. La PEGilación del grupo amino N-Terminal de la lacasa de Pleurotus ostreatus se llevó a cabo utilizando cianoborohidruro de sodio como reductor y metoxi PEG propionaldehído 30 kDa, en condiciones de pH 5.1. Se probaron diferentes combinaciones de temperatura, relación molar y tiempo de reacción. Se observó una disminución notable en la actividad enzimática tras la reacción; sin embargo, mediante el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño, se pudo determinar que el pH de 5.1 produce una mayor cantidad de proteína PEGilada, al relacionar las señales de los picos con la concentración de proteína. Este enfoque de PEGilación específica ofrece una solución prometedora para mejorar las características farmacológicas de la lacasa sin comprometer de manera sustancial su actividad enzimática, lo que la hace más viable para aplicaciones biomédicas.