title: Fruit Pigment Biogenesis in Raspberry Cultivars: Characterisation of Anthocyanin and Carotenoid Biosynthesis
Creators: name: Rafique, Muhammad Zubair
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2019
Subjects: Pharmakologie, Therapeutik
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs

description: Raspberry (Rubus idaeus L.) is a nutrient-rich fruit crop containing high yields of natural bioactive compounds, such as flavonoids and carotenoids, which are known to have potential health benefits in humans. Various colored raspberry fruits offer a unique possibility to study the genetics of pigment biosynthesis in this important soft fruit. Anthocyanidin synthase (Ans) catalyzes the conversion of colorless leucoanthocyanidins to colored anthocyanidins, a key step in biosynthesis of anthocyanins. The current study revealed that reduced anthocyanins in yellow raspberry (“Anne”) were due to loss of function mutation or inactive ans allele. A 5-bp insertion (ans+5) in the coding region creates a premature stop codon resulting in a truncated protein of 264 amino acids, compared to 414 amino acids of wild type ANS of red raspberry “Tulameen”. Apparently, the mutated ans gene transcripts are suppressed as a secondary effect because of nonsense-mRNA mediated decay (NMD). Functional characterization and complementation of Ans/ans alleles in planta provide strong proof of inactive ANS protein of “Anne” as compared to the functional protein of “Tulameen”. Further, molecular screening of various colored raspberries for Ans/ans alleles indicated that most of the yellow and orange fruiting raspberries contain various types of ans mutations that cause frameshifts and initiate premature stop codons leading to loss of function of the ANS proteins. In anthocyanin-free varieties, yellow/orange fruit pigmentation seems to exist as a net result of accumulation/degradation of specific carotenoids at ripe stage. The putative carotenoid pathway genes from Rubus “Anne” inserted in standard expression cassettes along with plasmids capable of generating different carotenoid precursors resulted in the successful characterization of the pathway genes via complementation in a bacterial host. It suggests that accumulation of β-branch carotenoids like β-carotene and xanthophylls (lutein) are the principal components that provide yellow coloration to anthocyanin-free raspberry fruits. Taken together, molecular and functional characterization of the carotenoid pathway genes helped to predict a preliminary pathway map for pigmentation in non-red (yellow, orange) fruiting raspberries.
description: Die Himbeere (Rubus idaeus L.) ist eine Beerenfrucht mit hohen Gehalten an natürlichen, bioaktiven Verbindungen wie Flavonoiden und Carotinoiden, von denen bekannt ist, dass sie verschiedene förderliche Eigenschaften auf die menschliche Gesundheit haben. Himbeerfrüchte mit unterschiedlichen Farben bieten zudem eine einzigartige Möglichkeit, die Genetik der Pigmentbiosynthese in dieser wichtigen Frucht zu untersuchen. Die Anthocyanidinsynthase (ANS) katalysiert die Umwandlung von farblosen Leukoanthocyanidinen in die farbigen Anthocyanidine. Dies ist ein wichtiger Schritt in der Biosynthese der Anthocyane. Die aktuellen Untersuchungen ergaben, dass die fehlenden Anthocyane in der gelben Himbeersorte "Anne" auf einen Funktionsverlust der ANS bzw. ein inaktives ANS-Allel zurückzuführen sind. Eine 5-bp-Insertion (ans+5) im kodierenden Bereich führt dabei zu einem vorzeitigen Stopcodon, das wiederum zu einem verkürzten Protein von nur noch 264 Aminosäuren führt, verglichen mit 414 Aminosäuren der Wildtyp ANS aus der roten Himbeere "Tulameen". Es liegt nahe, dass die mutierten und genetisch veränderten Transkripte als Nebeneffekt des Nonsense-mRNA vermittelten Zerfalls (nonsense-mediated decay, kurz NMD) unterdrückt werden. Die funktionelle Charakterisierung von Ans/ans-Allelen mittels Komplementierung von Mutanten in planta lieferte einen eindeutigen Beweis für das inaktive ANS-Protein von "Anne" im Vergleich zum funktionellen von "Tulameen". Weiterhin zeigte ein Screening der Ans/ans-Allele in verschiedenfarbigen Himbeeren, dass die meisten gelben und orangefruchtigen Genotypen verschiedene Arten von Mutationen enthalten, die ebenfalls Frameshifts verursachen und damit vorzeitige Stopcodons initiieren, was vermutlich auch hier zu einem Funktionsverlust der Proteine führt. Bei anthocyanfreien Sorten ist die gelb-orange Fruchtfarbe auf die Akkumulation bzw. den Abbau bestimmter Carotinoide während der Reife der Beeren zurückzuführen. Die wichtigsten Carotinoid-Biosynthesegene von "Anne" wurden in Standard-Expressionskassetten kloniert, und zusammen mit entsprechenden Plasmiden, die in der Lage sind, verschiedene Carotinoid-Vorstufen zu synthetisieren, zur funktionellen Expression in Bakterien gebracht. Die nachgewiesene erfolgreiche Synthese der jeweiligen Produkte ist ein Indiz für die enzymatische Aktivität der jeweiligen Proteine. Die Akkumulation von β-Carotinoiden, wie β-Carotin und Xanthophylle (Lutein), deutet darauf hin, dass diese die Hauptkomponenten in den anthocyanfreien Himbeerfrüchten und verantwortlich für die gelbe Färbung sind. Diese molekulargenetische und funktionelle Charakterisierung der Gene des Carotinoidwegs hat es ermöglicht, ein vorläufiges Schema der Biosynthese bei nicht roten (gelb, orange) fruchtenden Himbeeren zu erstellen.