Exploring Pathogenic Mutations at Phosphorylation Sites through a Peptide-Based Proteomics Screen
Creators: name: Rrustemi, Trëndelina
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: Protein-Protein-Interaktion
subject: IDR
subject: SLiMs
subject: Punktmutation
subject: Peptid-Screening
subject: Massenspektrometrie
subject: Protein-Protein Interactions
subject: IRD
subject: Point Mutations
subject: Peptide Screen
subject: Mass spectrometry
subject: 570 Biologie

description: Mit der Entwicklung und der Anwendung moderner Genomsequenzierungstechnologien können weitere Genmutationen identifiziert werden. Nach jetzigem Stand sind etwa 20% dieser Mutationen in Bereichen von Proteinen vorzufinden, die keine eindeutige 3D-Struktur haben. Diese werden intrinsisch ungeordnete Regionen genannt (intrinsic disordered regions, IDRs). Die IDRs sind für die Steuerung biologischer Prozesse wichtig. Sie enthalten kurze, lineare Abschnitte (SLiMs), die bei der Interaktion von Proteinen eine Rolle spielen und mittels Phosphorylierung reguliert werden können. Um Krankheiten besser zu verstehen, ist es entscheidend zu erforschen, wie diese IDR-Mutationen die Interaktionen von Proteinen beeinflussen. In dieser Doktorarbeit wird eine Methode verwendet, bei der synthetische Peptide, die den mutierten Proteinsequenzregionen entsprechen, auf eine Membran aufgebracht werden, um die Wechselwirkungen dieser Peptidsequenzen mit zellulären Proteinen systematisch zu untersuchen. Zusätzlich werden Änderungen dieser Interaktionen zwischen normalen, phosphorylierten oder zusätzlich sequenzveränderten Peptidvarianten untersucht, um die Auswirkungen der Genmutationen besser zu verstehen. Diese Arbeit zeigt deutliche Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen phosphorylierten und nicht-phosphorylierten Peptiden auf. Sie sind größtenteils auf die Störung der phosphorylierungsabhängigen SLiMs zurückzuführen. Unter den Proteinen sticht insbesondere die S102P Mutation im Transkriptionsfaktor GATAD1 heraus, die mit einer Herzmuskelerkrankung in Verbindung steht. Wir haben festgestellt, dass diese Mutation eine Phosphorylierungsstelle stört, die für die Bindung an 14-3-3-Proteine verantwortlich ist. Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, um diese Interaktion besser nachvollziehen zu können. Diese Arbeit trägt dazu bei, die molekularen Mechanismen von Krankheiten besser zu verstehen und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen und Therapieansätze auf.
description: Approximately 20% of disease-linked point mutations are situated within protein regions devoid of 3D structure, known as intrinsically disordered regions (IDRs). IDRs harbour short linear motifs (SLiMs) that mediate protein-protein interactions (PPIs), often through post-translational modifications such as phosphorylation. Investigating the impact of these IDR mutations on protein-protein interactions is essential to comprehend human diseases. In this doctoral thesis, I present a comprehensive exploration of a peptide-based proteomics screen, employed to study 36 disease-associated mutations that impair phosphorylation sites within IDRs. This approach, uses immobilized synthetic peptides, corresponding to the mutated regions, to capture interacting proteins from cellular extracts. This method facilitated the simultaneous comparison of interaction partners among wild-type, phosphorylated, and mutated peptide forms, enabling the functional assessment of individual mutations. Our analysis uncovered significant disparities between the interactomes of phosphorylated and non-phosphorylated peptides. Building on our findings, we placed particular emphasis on the S102P mutation within the transcription factor GATAD1, a mutation associated with dilated cardiomyopathy. Our screening demonstrated that this mutation disrupts a phosphorylation site responsible for 14-3-3 protein binding. To delve deeper into this interaction, we conducted a thorough investigation, employing techniques such as isothermal titration calorimetry, X-ray crystallography, and alanine scanning coupled with mass spectrometry. Our analyses hinted at the regulatory role of 14-3-3 binding in GATAD1's nucleocytoplasmic transport, achieved by masking its nuclear localization signal. The insights from our research shed fresh light on potential molecular mechanisms underpinning the development of various human diseases, offering a promising avenue for further investigation and therapeutic exploration.