title: Identification and Characterization of Siderophore Binding Proteins from Bacillus subtilis
title: Identifizierung und Charakterisierung von Siderophorbindungsproteinen aus Bacillus subtilis
Creators: name: Peuckert, Florian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Eisen
MALDI-MS
FeuA
Elektronensprayionisations-Massenspektrometr
Siderophor
iron
FpiA
Kristallographie
Chemie
Affinitätschromatographie
siderophore
transport
CD-Spektroskopie
Proteine
Kristallisation
Transport

description: To ensure the supply with the
      essential nutrient and trace element iron, microorganisms
      have evolved several strategies. The secretion of low
      molecular weight, chelating molecules, the so called
      siderophores, takes a very prominent role among the bacterial
      iron acquisition strategies. The uptake of the iron-loaded
      siderophores through microorganisms constitutes a key step in
      this strategy and is therefore an attractive target for
      potential antibiotic agents. High affinity binding of
      siderophores is accomplished by substrate binding proteins,
      which are part of ATP-binding cassette transporters. The
      potential exploitation of the transport mechanisms through
      pharmacological agents demands a comprehensive functional and
      structural characterization of the involved proteins. In this
      work an affinity chromatography-based approach for the
      isolation and identification of substrate binding proteins
      from crude cell extracts through direct interaction with its
      natural ligand has been established. Synthetic derivatives of
      the siderophore petrobactin were immobilized on an
      agarose−streptavidin matrix and treated with the cell lysate
      of a Bacillus subtilis culture, which allowed the successful
      identification of the petrobactin binding protein FpiA. The
      subsequent biochemical and physiological characterization of
      the protein confirmed its significance for petrobactin import
      and proved therefore the potential of this new method.
      Furthermore, the triscatecholate binding protein FeuA from B.
      subtilis was structurally and functionally characterized.
      Cocrystal structures with the siderophores bacillibactin and
      enterobactin and the siderophor mimic mecam showed a nearly
      identical binding mode for these three related, but
      nevertheless distinct iron-complexanions. A basic triad
      within the binding pocket was identified as the main binding
      motif for the substrates and was examined through
      site-directed mutagenesis and subsequent characterization of
      the variants through fluorescence spectroscopy and
      ligand-dependent melting point analysis. Crystallographic and
      CD-spectroscopic experiments showed that the binding pocket
      accepts solely lambda-stereoconfigured substrates, therefore
      the delta-stereoconfiguration of the iron-complex of
      enterobactin is inverted through binding by FeuA. Noticeable
      was the nearly identical binding mode of the protein for the
      different substrates, which is attended by a tilting of the
      two domains of FeuA of about 20°, the greatest experimentally
      observed domain movement of a class III substrate binding
      protein so far. This similarity of the binding modes implies
      its importance for the subsequent recognition of FeuA by the
      cognate transmembrane domains FeuBC of the transporter, which
      is facilitated through the correct positioning of conserved
      glutamate residues on the surface of FeuA. This work shows a
      new approach for the identification of bacterial substrate
      binding proteins and presents detailed structural and
      functional insights into the binding of triscatecholate
      siderophore by such proteins.
description: Um die Versorgung mit dem
      essentiellen Spurenelement Eisen sicherzustellen, haben
      Mikroorganismen eine Vielzahl von Strategien entwickelt. Die
      Sekretion von niedermolekularen, chelatisierenden Molekülen,
      den sogenannten Siderophoren, nimmt unter den bakteriellen
      Eisenakquirierungsstrategien eine besonders prominente Rolle
      ein. Die Wiederaufnahme der eisenbeladenen Siderophore durch
      Mikroorganismen stellt dabei einen Schlüsselprozess dar und
      ist daher ein attraktives Ziel für potentielle Antibiotika.
      Hochaffine Bindung der Siderophore erfolgt durch
      Substratbindungsproteine, die Teil von
      ATP-Bindungskassetten-Transportern sind. Die potentielle
      Ausnutzung der Transportwege durch Wirkstoffe verlangt eine
      umfassende funktionelle und strukturelle Charakterisierung
      der beteiligten Proteine. In dieser Arbeit wurde ein
      Affinitätschromatographie-basiertes Verfahren zur Isolierung
      und Identifizierung eines Substratbindungsproteins aus
      Zelllysaten durch direkte Wechselwirkung mit seinem
      natürlichen Liganden entwickelt. Synthetische Derivate des
      Siderophors Petrobactin wurden auf einer
      Agarose‒Streptavidin-Matrix immobilisiert und mit dem
      Zelllysat einer Bacillus subtilis-Kultur behandelt, was die
      erfolgreiche Identifizierung des Petrobactin-
      Bindungsproteins FpiA ermöglichte. Die anschließende
      biochemische und physiologische Charakterisierung des
      Proteins bestätigte seine Signifikanz für die
      Petrobactin-Aufnahme und belegt damit das Potential dieser
      neuen Methode. Weiterhin wurde das
      Triscatecholat-Bindungsprotein FeuA aus B. subtilis
      strukturell und funktionell charakterisiert.
      Cokristallstrukturen mit den Siderophoren Bacillibactin und
      Enterobactin sowie dem Siderophor-Mimetikum mecam zeigten
      einen nahezu identischen Bindungsmodus für die drei
      verwandten, aber dennoch verschiedenen Eisenkomplexanionen.
      Eine basische Triade in der Bindungstasche wurde als
      Hauptbindungsmotiv für die Substrate identifiziert und durch
      ortsgerichtete Mutagenese und nachfolgende Charakterisierung
      der Varianten durch Fluoreszenzspektroskopie und
      ligandenabhängige Schmelzpunktanalyse untersucht.
      Kristallographische und CD-spektroskopische Experimente
      zeigten, dass die Bindungstasche nur
      Lambda-stereokonfigurierte Siderophore zulässt, daher wird
      beispielsweise die Delta-Stereokonfiguration des
      Eisenkomplexes von Enterobactin bei Bindung durch FeuA
      invertiert. Auffällig war der nahezu identische Bindungsmodus
      des Proteins für die verschiedenen Substrate, welcher mit
      einer Kippbewegung der zwei Domänen von FeuA um etwa 20°
      einhergeht, der größten bisher experimentell beobachteten
      Domänenbewegung eines Substratbindungsproteins der Klasse
      III. Diese Ähnlichkeit des Bindungsmodus impliziert seine
      Bedeutung für die nachfolgende Erkennung von FeuA durch die
      kognaten Transmembrandomänen FeuBC des Transporters, die
      durch Positionierung konservierter Glutamatreste auf der
      Oberfläche von FeuA ermöglicht wird. Diese Arbeit zeigt einen
      neuartigen Ansatz zur Identifizierung bakterieller
      Substratbindungsproteine und bietet einen detaillierten
      strukturellen und funktionellen Einblick in die Bindung von
      Triscatecholatsiderophoren durch solche Proteine.