title: Uncovering the limitations and potential of Alzheimer's disease mouse models using mass spectrometry-based proteomics
Creators: name: Wenger, Kathrin
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
subject: Alzheimer's disease
subject: Tau
subject: PTM
subject: proteomics
subject: mass spectrometry

description: Advances in medicine extended the human life span, resulting in an aging population prone to age-related diseases, namely dementia. Alzheimer’s Disease (AD) is the most common type of dementia and is responsible for ~60% of all cases, affecting half of the worldwide population aged 85 and older. AD progression is marked by two major pathological hallmarks: amyloid-beta (Aβ) plaques and Tau tangles. However, the removal of Aβ plaques from the brain suggests that also other factors may contribute to AD progression, and therefore, Tau pathology has become a focus of AD research. On the molecular level, Tau tangles consist of aggregated, hypermodified Tau protein, and their abundance correlates with neuronal death and cognitive decline in symptomatic AD. In addition, aggregated Tau species spread from neuron to neuron in a prion-like manner, contributing to the spread of AD throughout the brain. The specificity and stoichiometry of Tau post-translational modifications (PTMs) have been shown to play a significant role in AD progression as they closely correlate with aggregation properties and pathogenicity of the Tau protein. Therefore, understanding how PTMs impact Tau structure and aggregation is crucial for characterizing the relationship between Tau modification and pathology formation. Currently, the distribution of Tau pathology and specific Tau phosphorylation sites of interest are visualized and measured using antibodies, assuming previous knowledge of target epitopes and the availability and specificity of reagents. Additionally, antibodies can only measure relative changes and cannot determine the absolute amount of Tau, the extent of modification at specific sites, or discover new disease-specific PTMs. In the first chapter of my thesis, I present the details of an optimized mass spectrometry (MS)-based discovery assay that characterizes the global qualitative and quantitative Tau modification landscape without a priori knowledge. This workflow uses detergent-based fractionation to extract the pathological, aggregated Tau species from as little as 30 mg of brain tissue. It applies a two-step MS approach to characterize and quantify Tau PTMs without bias, including i) an exploratory Tau PTM analysis and ii) a targeted Full-Length Expressed stable Isotope-labeled Tau (FLEXITau) assay, which monitors specific unmodified Tau peptides using an unmodified heavy isotope-labeled internal standard as a reference. This allows for the absolute quantification of the respective Tau peptides and the total Tau amount in the sample, thus providing the modification extent of Tau PTMs. The presented workflow enables the detailed molecular characterization of Tau species across multiple experiments, including a comparison between neurodegenerative diseases, stages of the disease, human patient heterogeneity, and characterization of animal models, which makes this assay essential in understanding the molecular features of pathological Tau in neurodegeneration. Today, a cure for AD remains elusive, given the repeated failures of most drug candidates in clinical studies. These candidates often demonstrate efficacy in preclinical mouse studies but not in human patients, raising the critical question of whether the current mouse models of AD pathology sufficiently represent the human disease. To address this knowledge gap and to define the extent of similarity between murine and human Tau pathology, I applied the presented FLEXITau assay to brain samples from two common tauopathy mouse models at different disease stages in the second chapter of my thesis. This study identified that Tau aggregation in the analyzed mouse models is primarily driven by progressive phosphorylation within the proline-rich domain and the C-terminus of the Tau protein. Comparing these findings to human dementia shows that the mouse models reflect the molecular characteristics of Tau pathology from early human AD stages and dementia patients carrying the P301L Tau mutation. These results indicate that the analyzed mouse models of tauopathy are a suitable tool for testing drug candidates that aim to intervene in the early formation of Tau pathology. However, the mouse models do not represent symptomatic late-stage human AD characterized by Tau ubiquitination and acetylation. Based on the findings of the second chapter, I use a mouse model of tauopathy to assess the influence of Apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4) — the most significant genetic risk factor for AD — on the onset of Tau pathology formation in the third chapter of my thesis. Using untargeted MS-based proteomics, I analyzed brain tissue samples from pre-disease stages of tauopathy mice with specific ApoE backgrounds (Null, ApoE3, and ApoE4). My analysis shows that the ApoE4 allele shifts the brain metabolism towards lipid degradation, thereby inducing the formation of detrimental lipid peroxides and oxidative stress. Examination of brain tissue samples from healthy human subjects between 33-50 years of age carrying either ApoE3/3 or 3/4 alleles at pre-disease conditions shows that the ApoE4-related pathway changes identified in the mice are also present in human subjects. These analogous changes were subsequently validated as especially prevalent in neurons and contributing to the initiation of Tau aggregation using orthogonal techniques such as immunohistochemistry and functional biological assays. This study presents a previously uncharted connection elucidating the interplay among ApoE4 presence, increased lipid metabolism, neuronal susceptibility, and the process of Tau pathology formation. In the fourth chapter of my thesis, I provide a comprehensive perspective on the current AD mouse models. This involves a thorough review of research studies that use state-of-the-art Omics technologies to quantify global brain changes in common AD mouse models. Furthermore, I compare the molecular changes observed in AD mice during disease progression to hallmarks of human AD to assess the translational relevance of the respective AD mouse models. The results show that AD mouse models reproduce some features of human AD, such as Tau hyperphosphorylation and global brain changes associated with the downstream toxicity of Aβ and Tau pathology, but they do not capture the full spectrum of molecular changes that drive human AD. I attribute this to differences in disease initiation, as mouse models use overexpression and specific risk mutations of Amyloid precursor protein (APP), Presenilin (PSEN), and Tau to induce high levels of pathology at a young age. Though mimicking familial AD, this approach does not reflect the complex interplay of systemic factors contributing to sporadic AD. Understanding these differences and similarities between AD mouse models and human AD is essential for effectively utilizing these animal models in basic AD research and for designing meaningful preclinical studies. In summary, my thesis shows that mouse models can be a valuable tool for AD research and drug development. Nonetheless, a comprehensive molecular analysis coupled with a comparison to human AD data is essential to precisely define the extent of molecular similarity between human and murine AD pathology. This knowledge is crucial for designing representative and meaningful research studies and preclinical testing strategies for novel therapeutics.
description: Der medizinische Fortschritt hat die menschliche Lebenserwartung verlängert, was zu einer alternden Bevölkerung geführt hat, die anfällig für Demenz ist. Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und für etwa 60 % aller Fälle verantwortlich, was die Hälfte der weltweiten Bevölkerung im Alter von 85 Jahren und älter betrifft. Der Verlauf der AD ist geprägt von zwei Hauptmerkmalen: Amyloid- Beta (Aβ)-Plaques und Tau-Tangles. Da jedoch neben Aβ-Plaques auch andere Faktoren Einfluss auf den Fortschritt der AD haben, ist die Tau-Pathologie zum Schwerpunkt der AD-Forschung geworden. Auf molekularer Ebene bestehen Tau-Tangles aus aggregiertem, hypermodifiziertem Tau-Protein, und ihre Anzahl korreliert mit neuronalem Tod und kognitiver Beeinträchtigung bei symptomatischer AD. Darüber hinaus verbreiten sich aggregierte Tau-Spezies von Neuron zu Neuron auf prionenartige Weise und tragen so zur Ausbreitung der AD im gesamten Gehirn bei. Die Spezifität und Stöchiometrie post-translationaler Tau-Modifikationen (PTMs) trägt dabei maßgeblich zum Fortschritt der AD bei. Die Präsenz und das Ausmaß bestimmter Tau-Modifikationen korrelieren eng mit den Aggregationseigenschaften und der Pathogenität des Proteins. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie PTMs die Struktur und das Aggregationsverhalten von Tau beeinflussen, um die Beziehung zwischen Tau-Modifikationen und der Bildung von Tau-Pathologie zu entschlüsseln. Derzeit wird die Verteilung der Tau-Pathologie und bestimmter Tau-Phosphorylierungsstellen mithilfe von Antikörpern gemessen und visualisiert. Allerdings muss dafür das Epitop bekannt und die benötigten Antikörper verfügbar und spezifisch sein. Darüber hinaus können Antikörper nur relative Veränderungen messen und sind für die absolute Bestimmung von Tau oder der Bestimmung des Ausmaßes der Modifikation ungeeignet. Im ersten Kapitel meiner Arbeit stelle ich die Details eines Massenspektrometrie basierten Verfahrens (MS) vor, welches die globale qualitative und quantitative Modifikation des Tau-Proteins ohne a priori Wissen bestimmt. Dabei werden zuerst die pathologischen Tau-Spezies mittels Detergens basierender Fraktionierung aus Gehirnmaterial extrahiert. Danach bestimmt eine zweiteilige MS-Methode die qualitative und quantitative Modifikation des Tau-Proteins. Die genannte MS-Methode beinhaltet i) eine explorativen Analyse der Tau-PTMs und ii) den FLEXITau-Assay, welcher bestimmte unmodifizierte Tau-Peptide unter Verwendung eines Isotopen-markierten internen Standards misst. Dieses Vorgehen ermöglicht die absolute Quantifizierung der unmodifizierten Tau-Peptide und bestimmt die Gesamtmenge an Tau in der Probe. Ebenso lässt sich damit die Stöchiometrie der einzelnen Tau-PTMs bestimmen, was eine detaillierte qualitative und quantitative molekulare Charakterisierung der Tau- Spezies ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren kann damit zum Vergleich verschiedener neurodegenerativen Krankheiten und verschiedener Krankheitsstadien von menschlichen AD Patienten und Tiermodellen eingesetzt warden, was wesentlich zum molekularen Verständnis der Tau-Pathologie von neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt. Heutzutage ist ein Medikament zur Heilung der AD aufgrund des wiederholten Scheiterns von Arzneimittelkandidaten in klinischen Studien nicht verfügbar. Dabei zeigten die Kandidaten Wirksamkeit in präklinischen Mausmodellen, was jedoch nicht in humanen AD Patienten reproduziert werden konnte. Dies wirft die entscheidende Frage auf, ob die momentan verfügbaren Mausmodelle die menschliche Krankheit ausreichend repräsentieren. Um diese Wissenslücke zu schließen und die Ähnlichkeit zwischen muriner und menschlicher Tau-Pathologie zu definieren, habe ich im zweiten Kapitel meiner Arbeit den vorgestellten FLEXITau-Assay auf Gehirnproben von zwei gängigen Tauopathie-Mausmodellen aus verschiedenen Krankheitsstadien angewandt. Die Studie ergab, dass die Tau-Aggregation in den analysierten Mausmodellen hauptsächlich durch Phosphorylierung innerhalb der prolinreichen Domäne und des C-Terminus des Tau-Proteins angetrieben wird. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit menschlicher Demenz zeigt, dass die Mausmodelle die molekularen Merkmale der Tau-Pathologie aus frühen Stadien der menschlichen AD und von Demenzpatienten, die die P301L-Tau-Mutation tragen, widerspiegeln. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die analysierten Tauopathie-Mausmodelle ein geeignetes Werkzeug für die Prüfung von Arzneimittelkandidaten sind, die in die frühen Stadien in die Bildung der Tau-Pathologie eingreifen sollen. Die Mausmodelle repräsentieren jedoch nicht die Ubiquitinierung und Acetylierung von Tau, die für die symptomatischen, späten Stadien der menschlichen AD wichtig sind. Basierend auf den Ergebnissen meiner vorherigen Analyse von AD-Mausmodellen erweiterte ich meine Forschung, um den Einfluss von ApoE4, dem größten genetischen Risikofaktor für AD, auf den Krankheitsbeginn zu bewerten. Im dritten Kapitel dieser Arbeit beschreibe ich die Verwendung von MS-basierter Proteomik auf Gehirngewebeproben aus frühen Stadien eines AD-Mausmodells mit spezifischen ApoE-Typen (Null, ApoE3 und ApoE4). Diese Analyse zeigt, dass das ApoE4-Allel den Gehirnstoffwechsel in Richtung Lipidabbau verschiebt, wodurch die Bildung schädlicher Lipidperoxide und oxidativer Stress induziert wird. Die Untersuchung von Gehirngewebeproben gesunder menschlicher Probanden im Alter von 33-50 Jahren, die entweder ApoE3/3 oder 3/4-Allele tragen, zeigt, dass die mit ApoE4 verbundenen Veränderungen des Gehirnstoffwechsels, die in Mäusen identifiziert wurden, auch bei Menschen eine Rolle spielen. Weitere Experimente mit orthogonalen Techniken wie Immunhistochemie und funktionelle biologische Assays zeigten, dass diese analogen Veränderungen besonders in Neuronen präsent sind und zur Bildung der Tau-Pathologie beitragen. Mit diesen Ergebnissen präsentiert diese Studie eine zuvor unerforschte Verbindung, zwischen der Präsenz des ApoE4-Allels, gesteigertem Lipidstoffwechsel im Gehirn, neuronaler Anfälligkeit und der Bildung von Tau-Pathologie. Im vierten Kapitel meiner Arbeit gebe ich einen molekularen Überblick über AD-Mausmodelle. Dies umfasst eine Zusammenfassung von Studien, die Omics-Technologien einsetzen, um globale Gehirnveränderungen in AD-Mausmodellen zu quantifizieren. Darüber hinaus vergleiche ich die molekularen Veränderungen von AD-Mäusen, mit den Hauptmerkmalen der menschlichen AD, um die translationsrelevante Bedeutung der jeweiligen Mausmodelle zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass AD-Mausmodelle zwar einige Merkmale der menschlichen AD reproduzieren, wie etwa die Tau- Hyperphosphorylierung und globale Gehirnveränderungen, die mit der Toxizität von Aβ und Tau- Pathologie in Verbindung stehen. Sie reroduzieren jedoch nicht das gesamte Spektrum an molekularen Veränderungen, die die menschliche AD antreiben. Diese Differenzen führe ich auf Unterschiede in der Initiierung zurück, da Mausmodelle Überexpression und spezifische Risikomutationen von APP, PSEN und Tau verwenden, um in jungen Jahren hohe Pathologielevel zu induzieren. Diese Vorgehensweise, ähnelt zwar der familiären AD, spiegelt aber nicht das komplexe Zusammenspiel systemischer Faktoren wider, die zur sporadischen AD beitragen. Die Kenntnis der Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen AD-Mausmodellen und menschlicher AD ist entscheidend für die effektive Nutzung dieser Tiermodelle in der grundlegenden AD-Forschung und bei der Gestaltung aussagekräftiger präklinischer Studien. Zusammenfassend zeigt meine Arbeit, dass Mausmodelle ein wertvolles Instrument für die AD-Forschung und Arzneimittelentwicklung sein können. Dennoch ist eine umfassende molekulare Analyse in Verbindung mit einem Vergleich zu menschlichen AD-Daten unerlässlich, um die Ähnlichkeit zwischen muriner und humaner AD-Pathologie präzise zu definieren. Dieses Wissen ist entscheidend für die Planung repräsentativer und aussagekräftiger Forschungsstudien sowie präklinischer Teststrategien für neue Therapeutika. Der medizinische Fortschritt hat die menschliche Lebenserwartung verlängert, was zu einer alternden Bevölkerung geführt hat, die anfällig für Demenz ist. Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und für etwa 60 % aller Fälle verantwortlich, was die Hälfte der weltweiten Bevölkerung im Alter von 85 Jahren und älter betrifft. Der Verlauf der AD ist geprägt von zwei Hauptmerkmalen: Amyloid- Beta (Aβ)-Plaques und Tau-Tangles. Da jedoch neben Aβ-Plaques auch andere Faktoren Einfluss auf den Fortschritt der AD haben, ist die Tau-Pathologie zum Schwerpunkt der AD-Forschung geworden. Auf molekularer Ebene bestehen Tau-Tangles aus aggregiertem, hypermodifiziertem Tau-Protein, und ihre Anzahl korreliert mit neuronalem Tod und kognitiver Beeinträchtigung bei symptomatischer AD. Darüber hinaus verbreiten sich aggregierte Tau-Spezies von Neuron zu Neuron auf prionenartige Weise und tragen so zur Ausbreitung der AD im gesamten Gehirn bei. Die Spezifität und Stöchiometrie post-translationaler Tau-Modifikationen (PTMs) trägt dabei maßgeblich zum Fortschritt der AD bei. Die Präsenz und das Ausmaß bestimmter Tau-Modifikationen korrelieren eng mit den Aggregationseigenschaften und der Pathogenität des Proteins. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie PTMs die Struktur und das Aggregationsverhalten von Tau beeinflussen, um die Beziehung zwischen Tau-Modifikationen und der Bildung von Tau-Pathologie zu entschlüsseln. Derzeit wird die Verteilung der Tau-Pathologie und bestimmter Tau-Phosphorylierungsstellen mithilfe von Antikörpern gemessen und visualisiert. Allerdings muss dafür das Epitop bekannt und die benötigten Antikörper verfügbar und spezifisch sein. Darüber hinaus können Antikörper nur relative Veränderungen messen und sind für die absolute Bestimmung von Tau oder der Bestimmung des Ausmaßes der Modifikation ungeeignet. Im ersten Kapitel meiner Arbeit stelle ich die Details eines Massenspektrometrie basierten Verfahrens (MS) vor, welches die globale qualitative und quantitative Modifikation des Tau-Proteins ohne a priori Wissen bestimmt. Dabei werden zuerst die pathologischen Tau-Spezies mittels Detergens basierender Fraktionierung aus Gehirnmaterial extrahiert. Danach bestimmt eine zweiteilige MS-Methode die qualitative und quantitative Modifikation des Tau proteins. Die genannte MS-Methode beinhaltet i) eine explorativen Analyse der Tau-PTMs und ii) den FLEXITau-Assay, welcher bestimmte unmodifizierte Tau- Peptide unter Verwendung eines Isotopen-markierten internen Standards misst. Dieses Vorgehen ermöglicht die absolute Quantifizierung der unmodifizierten Tau-Peptide und bestimmt die Gesamtmenge an Tau in der Probe. Ebenso lässt sich damit die Stöchiometrie der einzelnen Tau-PTMs bestimmen, was eine detaillierte qualitative und quantitative molekulare Charakterisierung der Tau- Spezies ermöglicht. Das vorgestellte Verfahren kann damit zum Vergleich verschiedener neurodegenerativen Krankheiten und verschiedener Krankheitsstadien von menschlichen AD Patienten und Tiermodellen eingesetzt warden, was wesentlich zum molekularen Verständnis der Tau-Pathologie von neurodegenerativen Erkrankungen beiträgt. Heutzutage ist ein Medikament zur Heilung der AD aufgrund des wiederholten Scheiterns von Arzneimittelkandidaten in klinischen Studien nicht verfügbar. Dabei zeigten die Kandidaten Wirksamkeit in präklinischen Mausmodellen, was jedoch nicht in humanen AD Patienten reproduziert werden konnte. Dies wirft die entscheidende Frage auf, ob die momentan verfügbaren Mausmodelle die menschliche Krankheit ausreichend repräsentieren. Um diese Wissenslücke zu schließen und die Ähnlichkeit zwischen muriner und menschlicher Tau-Pathologie zu definieren, habe ich im zweiten Kapitel meiner Arbeit den vorgestellten FLEXITau-Assay auf Gehirnproben von zwei gängigen Tauopathie-Mausmodellen aus verschiedenen Krankheitsstadien angewandt. Die Studie ergab, dass die Tau-Aggregation in den analysierten Mausmodellen hauptsächlich durch Phosphorylierung innerhalb der prolinreichen Domäne und des C-Terminus des Tau-Proteins angetrieben wird. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit menschlicher Demenz zeigt, dass die Mausmodelle die molekularen Merkmale der Tau-Pathologie aus frühen Stadien der menschlichen AD und von Demenzpatienten, die die P301L-Tau-Mutation tragen, widerspiegeln. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die analysierten Tauopathie-Mausmodelle ein geeignetes Werkzeug für die Prüfung von Arzneimittelkandidaten sind, die in die frühen Stadien in die Bildung der Tau-Pathologie eingreifen sollen. Die Mausmodelle repräsentieren jedoch nicht die Ubiquitinierung und Acetylierung von Tau, die für die symptomatischen, späten Stadien der menschlichen AD wichtig sind. Basierend auf den Ergebnissen meiner vorherigen Analyse von AD-Mausmodellen erweiterte ich meine Forschung, um den Einfluss von ApoE4, dem größten genetischen Risikofaktor für AD, auf den Krankheitsbeginn zu bewerten. Im dritten Kapitel dieser Arbeit beschreibe ich die Verwendung von MSbasierter Proteomik auf Gehirngewebeproben aus frühen Stadien eines AD-Mausmodells mit spezifischen ApoE-Typen (Null, ApoE3 und ApoE4). Diese Analyse zeigt, dass das ApoE4-Allel den Gehirnstoffwechsel in Richtung Lipidabbau verschiebt, wodurch die Bildung schädlicher Lipidperoxide und oxidativer Stress induziert wird. Die Untersuchung von Gehirngewebeproben gesunder menschlicher Probanden im Alter von 33-50 Jahren, die entweder ApoE3/3 oder 3/4-Allele tragen, zeigt, dass die mit ApoE4 verbundenen Veränderungen des Gehirnstoffwechsels, die in Mäusen identifiziert wurden, auch bei Menschen eine Rolle spielen. Weitere Experimente mit orthogonalen Techniken wie Immunhistochemie und funktionelle biologische Assays zeigten, dass diese analogen Veränderungen besonders in Neuronen präsent sind und zur Bildung der Tau-Pathologie beitragen. Mit diesen Ergebnissen präsentiert diese Studie eine zuvor unerforschte Verbindung, zwischen der Präsenz des ApoE4-Allels, gesteigertem Lipidstoffwechsel im Gehirn, neuronaler Anfälligkeit und der Bildung von Tau-Pathologie. Im vierten Kapitel meiner Arbeit gebe ich einen molekularen Überblick über AD-Mausmodelle. Dies umfasst eine Zusammenfassung von Studien, die Omics-Technologien einsetzen, um globale Gehirnveränderungen in AD-Mausmodellen zu quantifizieren. Darüber hinaus vergleiche ich die molekularen Veränderungen von AD-Mäusen, mit den Hauptmerkmalen der menschlichen AD, um die translationsrelevante Bedeutung der jeweiligen Mausmodelle zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass AD-Mausmodelle zwar einige Merkmale der menschlichen AD reproduzieren, wie etwa die Tau- Hyperphosphorylierung und globale Gehirnveränderungen, die mit der Toxizität von Aβ und Tau- Pathologie in Verbindung stehen. Sie reroduzieren jedoch nicht das gesamte Spektrum an molekularen Veränderungen, die die menschliche AD antreiben. Diese Differenzen führe ich auf Unterschiede in der Initiierung zurück, da Mausmodelle Überexpression und spezifische Risikomutationen von APP, PSEN und Tau verwenden, um in jungen Jahren hohe Pathologielevel zu induzieren. Diese Vorgehensweise, ähnelt zwar der familiären AD, spiegelt aber nicht das komplexe Zusammenspiel systemischer Faktoren wider, die zur sporadischen AD beitragen. Die Kenntnis der Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen AD-Mausmodellen und menschlicher AD ist entscheidend für die effektive Nutzung dieser Tiermodelle in der grundlegenden AD-Forschung und bei der Gestaltung aussagekräftiger präklinischer Studien. Zusammenfassend zeigt meine Arbeit, dass Mausmodelle ein wertvolles Instrument für die AD-Forschung und Arzneimittelentwicklung sein können. Dennoch ist eine umfassende molekulare Analyse in Verbindung mit einem Vergleich zu menschlichen AD-Daten unerlässlich, um die Ähnlichkeit zwischen muriner und humaner AD-Pathologie präzise zu definieren. Dieses Wissen ist entscheidend für die Planung repräsentativer und aussagekräftiger Forschungsstudien sowie präklinischer Teststrategien für neue Therapeutika.