Adaption der Zellmorphologie durch Aktomyosin-Kontraktilität auf mikrostrukturierten Zellkultursubstraten
Creators: name: Weißenbruch, Kai
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2020

description: Die Zellmorphologie wird durch die räumliche Anordnung des Zytoskeletts und der Aktomyosin-Kontraktilität reguliert. In nicht-muskulären Zellen wird die Kontraktilität von drei verschiedenen Isoformen nicht-muskulärer Myosin II Motorproteine (NM IIA, NM IIB und NM IIC) vermittelt. Die NM II-Isoformen assemblieren dabei zu homotypischen oder heterotypischen Minifilamenten. Anhand des Spannungs-Elastizitätsmodells (TEM) wurde deutlich, dass die Zellmorphologie nicht ausschließlich durch kontraktile Zugspannungen erklärt werden kann, sondern dass auch elastische Komponenten in den Aktinstrukturen erforderlich sind. Bisher ist ungeklärt, wie die verschiedenen NM II-Isoformen den Aufbau der Kontraktilität und die Steuerung der Zellmorphologie vermitteln. Im ersten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe von mikrostrukturierten 3D-Substraten gezeigt, dass die Zellmorphologie auch in 3D durch Spannung und Elastizität in den Aktinfasern gesteuert wird und anhand eines erweiterten TEM beschrieben werden kann. Im Hauptteil der Arbeit wurden mittels CRISPR/Cas9 KO-Zelllinien hergestellt, um die Funktionen der einzelnen NM II-Isoformen zu untersuchen. Der Verlust von NM IIA geht mit drastischen Defekten bei der Morphogenese sowie der Bildung von Aktin-Stressfasern einher und hat Auswirkungen auf Zelladhäsion und Zellmigration. Der Knockout von NM IIB und NM IIC zeigt hingegen keine offensichtlichen Effekte auf den Phänotyp. Für eine quantitative Evaluierung der Phänotypen wurden die Zellen auf strukturierten 2D-Substraten analysiert. Für NM IIA und NM IIB zeigten sich klare Effekte, die anhand des TEM erklärt werden können: NM IIA steuert durch den Aufbau von Spannung die Struktur der Aktin-Stressfasern und die Morphogenese der Zellen. NM IIB fungiert als elastisches Element, wodurch die NM IIA-generierten Spannungen ausbalanciert und die Kontraktilität in den Aktin-Stressfasern aufrechterhalten wird. Dadurch zeigte sich, dass NM IIA und NM IIB komplementäre Funktionen beim Aufbau der Aktomyosin-Kontraktilität in nicht-muskulären Zellen ausüben. Für NM IIC konnten keine Funktionen in diesen Assays gezeigt werden. Die komplementären Funktionen von NM IIA und NM IIB wurden in Kolokalisationsstudien weiter analysiert. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass sich die Aktomyosin-Kontraktilität nicht wie bisher angenommen, durch stochastische Co-Polymerisation von NM IIA und NM IIB zu einzelnen Minifilamenten gleichermaßen aufbaut, sondern durch präferenzielle Aktivierung von NM IIA-Hexameren initiiert wird. NM IIB co-assembliert hingegen in aktivierte NM IIA-Pionierfilamente, wodurch NM IIA und NM IIB permanent zu heterotypischen Filamenten assemblieren und als eine Einheit fungieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass NM IIA als Initiator von Minifilamenten und somit der Aktomyosin-Kontraktilität fungiert, wodurch die Bildung von Aktin-Stressfasern und die Morphogenese der Zellen definiert werden. NM IIB nimmt hingegen eine stabilisierende und regulierende Funktion ein, indem es zusätzlich in die Minifilamente eingebaut wird. NM IIB balanciert somit die NM IIA-induzierte Kontraktilität aus und koordiniert dadurch die Dynamik der Aktin-Stressfasern. Die komplementären Funktionen von NM IIA und NM IIB werden dabei durch die direkte Interaktion der Isoformen in heterotypischen Filamenten vermittelt. Auf diese Weise sind Zellen in der Lage, ihre Morphologie zügig und effizient an wechselnde extrazelluläre Gegebenheiten anzupassen.