title: Synthetic Oligomers of Amyloidogenic Peptides by Reversible Chemistry
title: Synthetische Oligomere von amyloidogenen Peptiden durch reversible Chemie
Creators: name: Wuttke, André
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: boronic ester
Chemistry and allied sciences
Chemie
Boronsäureester
Gramicidin S , Strukturaufklärung
Peptidsynthese
reversible Chemie , Aβ-Miniamyloide
peptide oligomers
Prion-Peptid 106-118
antimikrobiell wirksame Peptide
Organische Chemie
Gramicidin S
NMR spectroscopy
Thiazolidinlactame
NMR-Spektroskopie
Organic chemistry

description: Isolierte oder in vitro
      dargestellte Oligomere von aggregationsfreudigen, in
      neurodegenerative Krankheiten involvierte Peptide und
      Proteine stellen Gemische aus verschiedenen Spezies mit
      unterschiedlichen Größenverteilungen sowie Morphologien dar.
      Ermittelte neurotoxische Eigenschaften können daher nicht auf
      ein bestimmtes Oligomer zurückgeführt werden. Im Rahmen
      dieser Arbeit wurde ein Modellsystem zur Darstellung eines
      bestimmten Oligomers im wässrigen Milieu entwickelt. Die
      Synthese solcher Spezies mit einem vorgegebenen
      Oligomerisierungsgrad über klassische, irreversible
      Reaktionen ist mit einem hohen Material- und Zeitaufwand
      verbunden. Daher wurde in dieser Arbeit die Ausbildung von
      reversiblen Bindungen an Templaten, die den
      Oligomerisierungsgrad kontrollieren, genutzt, um sogar
      größere Peptidoligomere mit einem wesentlich geringeren
      Aufwand darstellen zu können. Als Template wurden
      Homooligomere des diolhaltigen Thiazolidinlactams hot=Tap
      verwendet. Durch Boronsäureveresterung der Dioleinheiten mit
      entsprechend modifizierten Peptiden konnten
      Aβ(32-40)-Oligomere in DMSO-d6 und PrP(106-118)-Oligomere im
      wässrigen Milieu aufgebaut werden. Die Synthese der
      hot=Tap-Homooligomere konnte bis zum Hexamer erfolgreich
      durchgeführt werden. Ein quantitativer Umsatz zu
      Aβ-Oligomeren konnte mit einem Dreikomponentensystem in
      DMSO-d6 erreicht werden. Dabei wurden neben dem
      hot=Tap-Templat noch 2-Formylphenylboronsäure und das
      unmodifizierte Aβ(32-40)-Peptid verwendet. Über das
      N-terminale Amin und die Aldehydfunktion der
      2-Formylphenylboronsäure kommt es zur Ausbildung eines Imins.
      Darüber hinaus reagiert die Boronsäure mit einem Diol des
      Templats zum Boronsäureester. Die erhaltenen NMR-Spektren
      weisen eine hohe Dispersion auf, so dass mit Hilfe einer
      detaillierten strukturellen Analyse in Kombination mit
      Moleküldynamiksimulationen ein Strukturvorschlag für das
      boronsäureesterbasierende Aβ(32-40)-Trimer erstellt werden
      konnte. Auf den Erkenntnisse aus den Experimenten in DMSO-d6
      aufbauend wurden nachfolgend Peptidoligomere mit einem
      vorgegebenen Oligomerisierungsgrad über Boronsäureveresterung
      im wässrigen Milieu bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4
      dargestellt. Dabei wurde der wasserlösliche und biologisch
      relevante Ausschnitt 106-118 des Prion-Proteins genutzt. Als
      geeignetes Bindungsmotiv der Peptide an die hot=Tap-Template
      konnte das Benzoboroxol identifiziert werden. Mit dieser
      Boronsäure modifizierte PrP(106-118)-Peptide wurden
      erfolgreich durch Veresterung an den hot=Tap-Polyolen zur
      Darstellung von PrP-Oligomeren bis zum Hexamer eingesetzt.
      Die erfolgreiche Reaktion im wässrigen Milieu wurde dabei
      mittels NMR- und UV/Vis-Spektroskopie bestätigt. In der
      Arbeitsgruppe Dodel (Fachbereich Medizin,
      Philipps-Universität Marburg) wurden von Frau Albus mehrere
      Dot Blot-Experimente mit den synthetisierten
      PrP(106-118)-Oligomeren und dem monoklonalen
      Maus-Anti-Prion-Protein-Antikörper 3F4 durchgeführt. Durch
      diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die in dieser
      Arbeit dargestellten Oligomere mit einem Spacer zwischen
      PrP(106-118) und dem Benzoboroxol als Mimetika, bzw. Modell
      für die frühen Spezies der Aggregation des Prion-Proteins
      angesehen werden können. Weiterhin wurde im Rahmen dieser
      Arbeit die Eignung des hot=Tap als β-turn Mimetikum
      untersucht. Dazu wurden zwei zyklische Hexapeptide
      synthetisiert. Detaillierte strukturelle Untersuchungen
      mittels NMR-Spektroskopie und Kristallstrukturanalyse zeigten
      deutlich, dass der hot=Tap-Baustein nicht die Positionen i+1
      und i+2 einnimmt, welche typischerweise von β-turn-Mimetika,
      wie dem Hot=Tap, besetzt werden. Weiterhin wurden Gramicidin
      S-Derivate mit einem hot=Tap-Baustein synthetisiert, wobei
      ein D-Phe-Pro-turn des natürlichen antimikrobiell-wirkenden
      Gramicidin S substituiert wurde. Durch NMR- und
      CD-spektroskopische Untersuchungen konnte ermittelt werden,
      dass der Einbau des hot=Tap-Bausteins zu einer Abweichung,
      z.B. durch Verdrillung oder erhöhter Flexibilität des
      Rückgrats, von der für Gramicidin S typischen Struktur führt.
      Trotz dieser eher nachteiligen Eigenschaft konnte gezeigt
      werden, dass durch den Einbau von Alkylketten über Ketale zur
      Schützung der Diolgruppe des hot=Tap vergleichbare
      biologische Profile wie beim natürlichen Gramicidin S möglich
      sind. Die entsprechenden antimikrobiellen Tests zur
      Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen wurden in der
      Arbeitsgruppe Ulrich (Institut für Organische Chemie,
      Karlsruher Institut für Technologie) von Frau Dr. Berditsch
      durchgeführt. Die beiden sehr hydrophoben Verbindungen
      zeigten neben ihrer etwas geringeren antimikrobiellen
      Aktivität auch eine höhere hämolytische Wirkung als
      Gramicidin S. Eines der Derivate hatte jedoch im Vergleich
      zum natürlichen Gramicidin S eine vergleichbare
      antimikrobielle und schwächere hämolytische Aktivität, was
      diese Verbindung zur geeigneten Leitstruktur für weitere
      Optimierungen macht.
description: Isolated or in vitro generated
      oligomers of aggregation-prone peptides and proteins, which
      are associated with neurodegenerative diseases, are mixtures
      of several species with different sizes and morphologies.
      Therefore, determined neurotoxic properties can not be
      attributed to one specific oligomer. In this work a model
      system for the synthesis of a specific oligomer in aqueous
      solution was developed. The synthesis of such species with a
      given degree of oligomerization using classical and
      irreversible reactions is very time consuming and has a high
      material consumption. Therefore, reversible bond formation on
      templates, which control the degree of oligomerization, was
      used to obtain even large peptide oligomers with a much
      lesser effort. Homooligomers of the dihydroxylated
      thiazolidinelactam hot=Tap were used as templates and reacted
      with boronic acid modified peptides to synthesize boronic
      ester based Aβ(32-40)-oligomers in DMSO-d6 and
      PrP(106-118)-oligomers in aqueous solution. The synthesis of
      the hot=Tap homooligomers was successful up to the hexamer. A
      quantitative conversion to the Aβ-oligomers was achieved by
      using a three component system, which included a hot=Tap
      template, 2-formylphenylboronic acid and the unmodified
      Aβ(32-40) peptide. Besides the boronic ester, an imine was
      formed between the N-terminal amine of the peptide and the
      aldehyde of 2-formylphenylboronic acid. The high signal
      dispersion in the NMR spectra of the oligomers allowed a
      detailed structural analysis, whereby it was possible to
      generate a proposed structure of the boronic ester based
      Aβ(32-40)-trimer by using molecular dynamic simulations.
      Subsequently, based on the results of the experiments in
      DMSO-d6 peptide oligomers with a given degree of
      oligomerization using boronic ester formation in aqueous
      solution at a physiological pH value of 7.4 were synthesized.
      Therefore, the water soluble and biological relevant part
      106-118 of the prion protein was used. As suitable binding
      motif for the diols of the hot=Tap templates the
      benzoboroxole was identified and PrP oligomers up to the
      hexamer were synthesized with benzoboroxole modified
      PrP(106-118) peptides. The successful reaction in aqueous
      solution was confirmed by NMR and UV/Vis spectroscopy. Mrs
      Albus from the workgroup Dodel (Fachbereich Medizin,
      Philipps-Universität Marburg) performed Dot Blot experiments
      with these PrP(106-118) oligomers and the mouse anti prion
      protein antibody 3F4. These experiments revealed, that the
      oligomers with a spacer between the peptide sequence and the
      benzoboroxole can be used as mimetic or model for the early
      species of aggregation of the prion protein. Additionally,
      the suitability of the hot=Tap as β-turn mimetic was
      investigated. Two cyclic hexapeptides were synthesized and
      analyzed by NMR spectroscopy and X-ray crystallography. In
      contrast to a typical β-turn mimetic the hot=Tap does not
      occupy the positions i+1 and i+2 of the turn. Furthermore,
      some Gramicidin S derivatives with a hot=Tap, replacing one
      D-Phe-Pro turn of the antimicrobial active Gramicidin S, were
      synthesized. NMR and CD spectroscopic investigations revealed
      a distorted structure of the synthesized derivatives in
      comparison to the native Gramicidin S. Nevertheless, by
      incorporation of ketals with an alkyl chain as protecting
      group for the diol of the hot=Tap comparable biological
      profiles like for the native compound were achieved. The
      determinations of the minimal inhibitory concentrations were
      measured by Mrs Dr. Berditsch from the workgroup Ulrich
      (Institut für Organische Chemie, Karlsruher Institut für
      Technologie). For the two highly hydrophobic compounds higher
      minimal inhibitory concentrations and an increased hemolytic
      activity in comparison to Gramicidin S were determined.
      However, one derivative has comparable minimal inhibitory
      concentrations against the tested bacteria strains and is
      significant lower cytotoxic compared to Gramicidin S and is
      therefore a suitable lead compound for further
      optimizations.