Downstream processing of lentiviral vectors with focus on steric exclusion chromatography
Creators: name: Labisch, Jennifer Julia
Publisher: name: Hannover : Institutionelles Repositorium der Leibniz Unversität Hannover
Year: 2023
Subjects: subject: Lentiviral vectors
subject: clarification
subject: steric exclusion chromatography
subject: infectious titer analytics
subject: Lentivirale Vektoren
subject: Klarfiltration
subject: Sterische Ausschlusschromatographie
subject: Analytik infektiöser Titer
subject: Dewey Decimal Classification::500 | Naturwissenschaften::570 | Biowissenschaften, Biologie

description: Lentiviral vectors (LV) are widely used to deliver therapeutic genes for gene therapy and gene-modified cell therapy and have shown success in chimeric antigen T cell therapies. The ongoing market growth leads to an increasing demand for purified LV which requires efficient downstream processes. Due to the lower stability of LV, new demands are placed on the process. Existing unit operations must be greatly optimized and research into new, alternative methods is essential. In a holistic approach, the work focused on identified bottlenecks and presents new approaches for clarification, analytics, and chromatographic purification. In the first part of this work, a vacuum-based clarification method with diatomaceous earth was improved for LV which were produced by suspension cell culture. This clarification method allowed fast and high throughput clarification and improved handling by eliminating the centrifugation step and increasing filter capacity. Thus, clarification of LV with diatomaceous earth laid the foundation for subsequent chromatography studies. To improve the analytical sample throughput and accelerate process development the second part of this thesis deals with the development of a high throughput assay with automated readout and analysis for the determination of the infectious titer, which is the key process variable for enveloped viral vectors. For this purpose, transduced cells are quantified by immunological detection in a real-time live-cell analysis system using software-based image evaluation. Eventually, the third and fourth parts focused on steric exclusion chromatography. It could be demonstrated that process parameters like the buffer mixing strategy and flow rate are crucial for this thermodynamically driven process of depletion interaction between the LV and the membrane. Moreover, it was shown that an ideal PEG molecular weight and concentration must be identified. The visualization of the LV on the membrane showed that the LV were mainly found on the first membrane layer after loading. Therefore, the surface area-specific flow rate was crucial for scale-up. The mechanistic understanding of the process and the process optimizations enabled reproducibly high LV recoveries and removal of impurities.
description: Lentivirale Vektoren (LV) werden zur Übertragung therapeutischer Gene für die Gen- und Zelltherapie eingesetzt, vornehmlich für die Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen. Das Marktwachstum führt zu einer steigenden Nachfrage nach LV. Die geringe LV-Stabilität stellt Anforderungen an einen schonenden Prozess. Bestehende Verfahren müssen stark optimiert werden und die Erforschung neuer, alternativer Methoden ist unerlässlich. In einem ganzheitlichen Ansatz fokussiert sich die Arbeit auf gefundene Schwachstellen und stellt für die Klarfiltration, die Analytik und die chromatographische Reinigung neue Ansätze vor. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine vakuumbasierte Klärungsmethode mit Kieselgur für LV etabliert, die durch Suspensionszellkultur hergestellt wurden. Diese Klärungsmethode ermöglichte eine schnelle Filtration mit hohem Durchsatz und verbesserte die Handhabung durch den Wegfall des Zentrifugationsschritts und die Erhöhung der Filterkapazität. Die Klarfiltration von LV legte damit die Grundlage für nachfolgende Chromatographiestudien. Um den analytischen Probendurchsatz zu verbessern und die Prozessentwicklung zu beschleunigen, befasste sich der zweite Teil dieser Arbeit mit der Entwicklung eines Hochdurchsatzassays mit automatisierter Erfassung und Auswertung zur Bestimmung des infektiösen Titers, welcher für umhüllte virale Vektoren die wichtigste Prozessgröße darstellt. Transduzierte Zellen werden hierbei durch immunologische Detektion in einem Echtzeit-Lebendzell-Analysesystem mit softwarebasierter Bildauswertung quantifiziert. Der dritte und vierte Teil befasste sich mit der sterischen Ausschlusschromatographie (SXC). Es konnte gezeigt werden, dass die Mischstrategie der Puffer und die Flussrate für den thermodynamisch getriebenen Prozess der Verarmungsinteraktion zwischen den LV und der Membran entscheidend sind. Weiterhin wurde identifiziert, dass die Parameter PEG Konzentration und Größe entscheidend für den Erfolg sind und dementsprechend optimiert werden müssen. Die Visualisierung der LV auf der Membran zeigte, dass hauptsächlich die oberste Membranlage für die Abscheidung genutzt wurde. Daher war die oberflächenspezifische Flussrate für die Hochskalierung entscheidend. Das mechanistische Verständnis des Prozesses und die Prozessoptimierungen ermöglichten reproduzierbar hohe LV-Wiederfindungen und die Entfernung von Verunreinigungen.