title: Function and mechanism of ethylbenzene dehydrogenase
title: Funktion und Mechanismus der Ethylbenzol Dehydrogenase
Creators: name: Knack, Daniel Horst
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Anaerober Stoffwechsel - Aromaten - Molybdänenzym - Biokatalyse - Enzymologie
Biowissenschaften, Biologie
Anaerobic Metabolism - Aromatic Compounds - Molybdenum Enzyme - Biocatalysis - Enzymology
Enzymologie
Anaerober Stoffwechsel
Aromaten , Biokatalyse

description: Typical initial reactions of
      anaerobic hydrocarbon degradation pathways are the
      hydroxylation of ethylbenzene and the addition of fumarate to
      toluene and to alkanes. The hydroxylation of ethylbenzene to
      (S)-phenylethanol initiates the anaerobic degradation of
      ethylbenzene in denitrifying bacteria like Aromatoleum
      aromaticum. This oxygen-independent and stereospecific
      reaction is catalyzed by ethylbenzene dehydrogenase (EbDH), a
      molybdenum/iron-sulfur/heme enzyme of the DMSO reductase
      family. In contrast, the anaerobic degradation of toluene in
      denitrifying bacteria like Thauera aromatica and the
      anaerobic degradation of alkanes in most of the
      sulphate-reducing bacteria is initiated by the addition of
      fumarate to the methyl-group of toluene and to the C2 atom of
      alkanes, respectively. The aim of this work was the further
      elucidation of the reaction mechanism of ethylbenzene
      dehydrogenase and investigations on the enzymes application
      potential. Furthermore, first investigations on the
      identification of a novel anaerobic alkane degradation
      pathway in the sulphate-reducing bacterium Desulfococcus
      oleovorans were performed. Based on kinetic studies of
      substrates and computational chemistry approaches, a reaction
      mechanism for EbDH was proposed. In the present work further
      enzyme kinetic studies with alternative substrates and
      inhibitors were performed which support the proposed reaction
      mechanism. The specific characteristics and kinetics of the
      substrates and inhibitors, respectively, and the nature of
      the hydroxylation products of the substrates, provide strong
      indication for the existence of the proposed radical- and
      carbocation-intermediate species in the catalytic mechanism
      of the enzyme. The results show that nature and position of
      specific substituents on the benzylic ring of substrates
      influences the reactivity with EbDH in a positive or negative
      way by stabilizing or destabilizing the proposed radical
      and/or carbocation intermediates. In contrast, the energy
      barriers for the formation of the radical- and/or the
      carbocation- intermediates cannot be overcome with EbDH
      inhibitors. In addition, in this work a novel class of
      inhibitors, which are BN-CC isosteres of ethylbenzene, was
      identified (Azaborines). The investigations show for the
      first time that artificial azaborine derivatives of organic
      compounds have a biochemical reactivity and provide the proof
      of concept that BN-CC isosterism can lead to novel compounds
      with novel properties. A further study of this work was the
      determination of the enantioselectivity of the hydrogen
      abstraction from the C1 atom of the ethyl-substituent of
      ethylbenzene as the initial step of the reaction mechanism.
      In doing so, specific deuterated ethylbenzene derivatives
      were synthesized which carry a deuterium atom instead of a
      hydrogen atom on the C1 atom, either in (S) or (R)
      configuration. With kinetic investigations, specific kinetic
      isotope effects were determined which indicate that the
      pro(S) hydrogen atom is abstracted by the enzyme in the
      initial step of the reaction. For the determination of the
      kinetic model of the EbDH reaction mechanism, enzyme kinetic
      investigations with two specific substrates and two specific
      artificial electron acceptors were performed. The evaluation
      of the data revealed that the enzyme follows most likely a
      Ping Pong mechanism. The sulphate-reducing bacterium
      Desulfococcus. oleovorans uses not a fumarate addition
      reaction as initial step of anaerobic alkane degradation, as
      other alkane-degrading microorganism do, but a so far unknown
      reaction. For the identification of this reaction, D.
      oleovorans was grown anaerobically on alkanes and fatty acids
      as carbon and electron donor. With cell free extract of these
      cultures, proteomic analyses were performed. It was observed
      that three proteins were exclusively induced in the cultures
      grown on alkanes. The analysis of the induced proteins by
      mass spectrometry showed that the proteins are the subunits
      of an ethylbenzene dehydrogenase-like enzyme. The amino acid
      sequence of the enzyme shows a high sequence identity to
      ethylbenzene dehydrogenase. For this reason, it is proposed
      that anaerobic alkane degradation in D. oleovorans is
      initiated by an oxygen-independent hydroxylation of
      alkanes.
description: Typische Initialreaktionen
      anaerober Kohlenwasserstoffabbauwege sind die Hydroxylierung
      von Ethylbenzol und die Addition von Fumarat an Toluol oder
      Alkane. Die Hydroxylierung von Ethylbenzol zu
      (S)-Phenylethanol leitet den anaeroben Abbau von Ethylbenzol
      in denitrifizierenden Bakterien wie Aromatoleum aromaticum
      ein. Diese sauerstoffunabhängige und stereospezifische
      Reaktion wird katalysiert durch die Ethylbenzol Dehydrogenase
      (EbDH), ein Molybdän/Eisen-Schwefel/Häm-Enzym aus der DMSO
      Reduktase Familie. Der anaerobe Abbau von Toluol in
      denitrifizierenden Bakterien wie Thauera aromatica und der
      anaerobe Abbau von Alkanen in den meisten sulfatreduzierenden
      Bakterien wird dagegen durch die Addition von Fumarat an die
      Methylgruppe von Toluol bzw. an das C2 Atom der Alkane
      eingeleitet. Ziel dieser Arbeit war es den
      Reaktionsmechanismus der Ethylbenzol Dehydrogenase weiter
      aufzuklären sowie Untersuchungen zum Anwendungspotential des
      Enzyms durchzuführen. Außerdem wurden die ersten
      Untersuchungen zur Identifizierung eines neuartigen anaeroben
      Alkanabbauweges in dem sulfatreduzierenden Bakterium
      Desulfococcus oleovorans durchgeführt. Anhand der Kinetik von
      Substraten und chemoinformatischen Berechnungen wurde ein
      Reaktionsmechanismus für die EbDH vorgeschlagen. In der
      vorliegenden Dissertation wurden enzymkinetische
      Untersuchungen mit alternativen Substraten und Inhibitoren
      durchgeführt, mit denen weitere Daten zur Bestätigung des
      postulierten Reaktionsmechanismus erhalten wurden. Das
      spezifische Verhalten bzw. die Kinetik der Substrate und
      Inhibitoren sowie die Natur der Hydroxylierungsprodukte der
      Substrate geben einen starken Hinweis auf die Existenz der
      vermuteten Radikal- und Carbokation-Intermediate im
      katalytischen Mechanismus des Enzyms. So wurde festgestellt,
      dass die Natur und Position bestimmter Substituenten am
      benzylischen Ring der Substrate die Reaktivität mit der EbDH
      positiv und negativ beeinflussen können, indem sie die
      vermuteten Radikal- und/oder Carbokation-Intermediate
      stabilisieren oder destabilisieren. Im Gegensatz dazu können
      mit den EbDH Inhibitoren die Energiebarrieren zur Bildung der
      Radikal- und/oder Carbokation-Intermediate nicht überwunden
      werden. Zudem konnte in dieser Arbeit eine neuartige Klasse
      von Inhibitoren in Form von BN-CC Isosteren von Ethylbenzol
      identifiziert werden (Azaborine). Diese Untersuchungen zeigen
      zum ersten Mal, dass künstliche Azaborin-Derivate von
      organischen Verbindungen biologische Aktivität aufweisen und
      erbringen daher den Nachweis des Konzepts das BN-CC Isosterie
      zu neuartigen Verbindungen mit neuartigen Eigenschaften
      führen kann. Eine weitere Untersuchung in dieser Arbeit war
      die Bestimmung der Enantioselektivität der
      Wasserstoffabspaltung vom C1 Atom des Ethylsubstituenten von
      Ethylbenzol als initialem Schritt des Reaktionsmechanismus.
      Dazu wurden spezifisch deuterierte Ethylbenzolderivate
      synthetisiert die am C1 Atom des Ethylsubstituenten jeweils
      ein Deuteriumatom an Stelle eines Wasserstoffatoms in (S)-
      oder (R)-Konfiguration tragen. Mit enzymkinetischen
      Untersuchungen wurden kinetische Isotopeneffekte gemessen
      werden, die darauf hinweisen, dass wie für den initialen
      Schritt des Reaktionsmechanismus postuliert, der pro(S)
      Wasserstoff abgespalten wird. Zur Bestimmung des kinetischen
      Modells des Reaktionsmechanismus der EbDH wurden
      enzymkinetische Untersuchungen mit zwei ausgewählten
      Substraten und zwei ausgewählten artifiziellen
      Elektronenakzeptoren durchgeführt. Die Auswertung der Daten
      ergab, dass das Enzym höchstwahrscheinlich einem Ping-Pong
      Mechanismus folgt. Das sulfatreduzierende Bakterium
      Desulfococcus oleovorans verwendet für den anaeroben
      Alkanabbau keine Fumarat-Additionsreaktion wie andere
      bekannte alkanabbauende Mikroorganismen, sondern eine
      unbekannte Initialreaktion. Zur Identifizierung dieser
      Initialreaktion wurde D. oleovorans in der vorliegenden
      Dissertation mit Alkanen bzw. Fettsäuren als Kohlenstoff- und
      Elektronenquelle anaerob kultiviert und mit dem Zellextrakt
      der Kulturen proteomische Analysen durchgeführt. Dabei wurde
      festgestellt, dass drei Proteine ausschließlich in den
      Kulturen die auf Alkanen gewachsen waren, induziert sind.
      Eine massenspektrometrische Analyse dieser induzierten
      Proteinbanden ergab, dass es sich dabei um die drei
      Untereinheiten eines Ethylbenzol Dehydrogenase-ähnlichen
      Enzyms handelt. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms zeigt
      eine hohe Sequenzidentität zur Ethylbenzol Dehydrogenase. Aus
      diesem Grund wird postuliert, dass der Alkanabbau in D.
      oleovorans durch eine sauerstoffunabhängige Hydroxylierung
      der Alkane initiiert wird.