title: Molekulare Mechanismen des Durchbrechens der Onkogen-induzierten Seneszenz im Rahmen der Melanomentstehung
Creators: name: Kluge, Viola
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Signaltransduktion durch Wnt-Moleküle und dem Hippo-Signalweg in Melanozyten und dem Melanom. Sowohl der Wnt- als auch der Hippo-Signalweg spielen eine zentrale Rolle bei vielen physiologischen Prozessen während der Embryonalentwicklung, Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose. Inwieweit die beiden Signalwege an der frühen Entwicklung vom Nävus zum malignen Melanom beteiligt sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Benigne Nävi und Melanome weisen häufig eine Mutation im BRAF- (B-Raf proto-oncogene) Gen auf, was darauf hindeutet, dass die Mutation die Melanom Entstehung nicht alleinig auslöst aber begünstigt. Durch die onkogene Mutation weisen die Melanozyten zunächst eine erhöhte Proliferation auf, bevor sie dann in eine Ruhephase, die sogenannte Onkogen-induzierten Seneszenz (OIS), übergehen. In der vorliegenden Arbeit sollten die molekularen Prozesse des Durchbrechens der OIS definiert werden. Für die Analysen wurde ein etabliertes Modell der (OIS) verwendet, in dem Melanozyten (NHEM) zur Induktion von Seneszenz lentiviral mit dem BRAFV600E-Gen (BRAFm) transduziert wurden. Unsere Daten zeigen, dass der Wnt/β-Catenin-Signalweg an der Überwindung der OIS und der damit verbundenen Entwicklung von Melanomen beteiligt ist (Abb. 1). Aktiviert wird die Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion über die Bindung von Wnt-Liganden an die Fz-(frizzled) Rezeptoren. Eine Signalkaskade führt dazu, dass β-Catenin frei in der Zelle vorliegt, in den Zellkern translozieren kann und mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren, klassischerweise TCF (T-cell-factor)/LEF1 (lymphoid enhancer binding factor), die Transkription aktiviert. Expressionsanalysen zeigten, dass bei der Entstehung von OIS keine Veränderung der Expression von Wnt-Molekülen zu detektieren war, überraschenderweise aber einige Wnt-Liganden im Vergleich zwischen Melanom und Melanozyten differentiell reguliert wurden. Die Bedeutung dieser regulierten Wnt-Liganden beim Durchbrechen der OIS wurde bestätigt, da zum einen der Knockdown von Wnt6 und Wnt10b die Seneszenz in Melanomzellen induzierte und ferner die Behandlung von BRAFm NHEM mit Wnt5a, Wnt6 und Wnt10b zum Durchbrechen von Seneszenz führte. Gleiche Seneszenz-brechende Effekte konnten durch die Überexpression eines konstitutiv aktiven β-CateninS33Y in BRAFm NHEM erzeugt werden. Der Wnt/β-Catenin-Signalweg spielt daher beim Durchbrechen der Onkogen-induzierten Seneszenz eine große Rolle, allerdings konnten wir in weiteren Experimenten nicht belegen, dass der Signalweg über seine klassischen, ausführenden Transkriptionsfaktoren der TCF-Familie agiert. Unklar blieb daher bisher, wie Wnt/β-Catenin diesen Prozess auf transkriptioneller Ebene differenziert steuern könnte. Die Analysen belegten des Weiteren, dass auch der YAP/TEAD-Signalweg eine große Rolle sowohl in BRAFm NHEMs als auch in Melanomen spielt. Das Haupteffektorprotein des Hippo-Signalweges ist YAP (yes associated transcriptional regulator), das unphosphoryliert in den Zellkern translozieren kann und mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren, klassisch TEAD1-4 (TEA domain transcription factor, TEA-domain family 1-4), die Transkription startet. Unsere Daten zeigten bereits in der OIS eine Akkumulation von YAP im Zellkern und eine Heraufregulation von klassischen YAP-Zielgenen wie AREG (amphiregulin), AXL (AXL receptor tyrosine kinase) und CTGF (connective tissue growth factor). Auch in Melanomzelllinien blieb die Akkumulation von YAP im Zellkern und eine starke transkriptionelle TEAD-Aktivität erhalten. Dieser Signalweg ist sowohl in der OIS als auch im Melanom aktiv, was vermuten lässt, dass die Aktivierung von YAP allein nicht zum Durchbrechen der OIS führt. Wir haben daher analysiert, ob der YAP/TEAD-Signalweg eventuell mit dem Wnt/β-Catenin-Signalweg verknüpft sein könnte. Durch die Verbindung könnten Vermittlermoleküle wie YAP und β-Catenin über die Transkriptionsfaktoren TEAD und TCF/LEF1 an räumlich in der Nähe liegende Konsensusstellen in Promotorbereichen der DNA binden. Durch die Ko-Bindung könnten Gene für das Entkommen aus der Seneszenz reguliert werden und dadurch zur Melanomentstehung beitragen. Unsere Ko-Immunpräzipitationsexperimente und EMSA-Daten zeigten, dass YAP und β-Catenin mit dem Transkriptionsfaktor TEAD interagieren. Weitere Experimente und bioinformatische Analysen zeigten eine zusätzliche Beteiligung von LEF1 an der gemeinsamen Regulation von Genen, die zu einem Durchbrechen der OIS führen. Bioinformatische Analysen weisen dabei auf Gene hin, die an der ribosomalen Biosynthese beteiligt sind, und zudem Tumor-initiierend sein könnten. Zusammenfassend zeigen die Daten meiner Dissertation einen alternativen β-Catenin-YAP-Signalweg auf, der über die Transkriptionsfaktoren LEF1 und TEAD zum Durchbrechen der OIS führt, was wiederum zur Entstehung des Melanoms beiträgt.