title: Establishing Cas9 expression in γδ T cell lymphoma cells for in vitro and in vivo CRISPR/Cas9 loss-of-function screens
Creators: name: Franz, Stefan
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Das hepatosplenische γδ-T-Zell-Lymphom ist eine seltene, aber aggressive Erkrankung, die vorwiegend bei jungen Erwachsenen mit einem Durchschnittsalter von 34 Jahren auftritt. Die Krankheit ist durch ein schnelles Fortschreiten mit einer medianen Überlebenszeit von nur 16 Monaten gekennzeichnet. Bei etwa einem Drittel der HSTL-Patienten ist die STAT5BN642H-Mutation für die Hyperaktivierung des JAK/STAT-Signalwegs verantwortlich, was zu einer verstärkten Transkription von Genen führt, die für die Zellproliferation und das Überleben notwendig sind. Wir stellten die Hypothese auf, dass durch die gezielte Beeinflussung wichtiger Zielgene, die das Fortschreiten der Krankheit vorantreiben, die onkogene Signalübertragung blockiert werden könnte, und dass solche Ziele neue therapeutische Optionen für diese Patienten darstellen könnten. Um Werkzeuge zur Identifizierung solcher Zielgene zu entwickeln, verwendeten wir eine zuvor in unserem Labor hergestellte murine HSTL-Zelllinie und integrierten entweder einen konstitutiv oder induzierbar exprimierenden Cas9-Vektor für die künftige Verwendung in einem in vitro- oder in vivo- whole-genome CRISPR loss-of-function screen. Wir haben erfolgreich eine klonale, konstitutive Cas9-exprimierende HSTL-Zelllinie mit hoher Knockout-Effizienz erzeugt, getestet und ausgewählt, die in zukünftigen Studien für ein in vitro-screening der funktionellen Genomik verwendet werden kann. Wir haben auch mehrere Dox-induzierbare Cas9-exprimierende klonale Zelllinien erzeugt und getestet und dabei drei Klone identifiziert, die in Abwesenheit von Dox praktisch keine Cas9-Expression aufweisen, während sie in Anwesenheit des Induktors volles Induktionspotenzial zeigen. Nach zukünftiger Validierung einer angemessenen Kontrolle der Cas9-Geneingabe könnte einer dieser Klone in einem in vivo CRISPR/Cas9-screen verwendet werden. Darüber hinaus untersuchten wir Methoden zur Verbesserung des üblicherweise verwendeten Tetracyclin-Derivats Doxycyclin (Dox)-induzierbaren Tet-On-Systems, um die Hintergrundaktivität in Abwesenheit des Induktors in großen Zellpopulationen zu eliminieren und die Notwendigkeit klonaler Analysen transgener Zellen zu verringern. Diese Modifikationen bestanden in der Implementierung eines Cumate-Genschalters, zweier AU-reicher Destabilisierungselemente in das Cas9-Plasmid oder der Veränderung des reversen Tetracyclin-Transaktivators. Wir experimentierten auch mit dem Tet-Off-System, indem wir den Tetracyclin-Repressor verwendeten. Unsere Daten zeigten, dass die Hinzufügung einer zweiten Transkriptionskontrollschicht (Cumate-Operator) oder die Implementierung eines Tetracyclin-Repressors den Anteil der undichten HEK293-Zellen in einem Bulk-Zellformat leicht verringerte, wobei jedoch in einer Teilmenge der Zellen weiterhin Genveränderung in Abwesenheit von Dox beobachtet wurde. Aufgrund dieser verringerten Hintergrundaktivität könnten diese neuartigen Werkzeuge jedoch dazu beitragen, den arbeitsintensiven Prozess des Screenings einzelner Zellklone zu beschleunigen, indem der Anteil der dichten Cas9-induzierbaren Zellen erhöht wird. Insgesamt legt die Etablierung von HSTL-Zelllinien mit konstitutiver oder induzierbarer Cas9-Expression den Grundstein für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionellen Abhängigkeiten und potenziellen neuen Zielen für die Therapie dieser STAT5BN642H-getriebenen Krankheit.
description: Hepatosplenic γδ T cell lymphoma is a rare, yet aggressive disease occurring in predominantly young adults with a median age of 34 years. The disease is characterized by rapid progression with a median survival of only 16 months. In around one third of HSTL patients, the STAT5BN642H mutation is responsible for hyperactivation of the JAK/STAT signalling pathway, leading to enhanced transcription of genes necessary for cell proliferation and survival. We hypothesized that by targeting key target genes that drive disease progression, oncogenic signalling could be blocked, and such targets may represent new therapeutic treatment options for these patients. To establish tools in order to identify such targets, we used a murine HSTL cell line previously established in our lab and integrated either a constitutively- or inducible-expressing Cas9 vector, for future use in an in vitro or in vivo whole-genome CRISPR loss-of-function screen, respectively. We successfully generated, screened and selected a clonal, constitutive Cas9 expressing HSTL cell line with high knockout efficiency, which in future studies can be used for an in vitro functional genomics screen. We also generated and screened multiple dox-inducible Cas9 expressing clonal cell lines, identifying three clones that appear to exhibit virtually no Cas9 expression in the absence of dox while showing full induction potential in the presence of the inducer. After future validation of suitably tight Cas9 gene editing control, one of these clones could be used in an in vivo CRISPR/Cas9 screen. Additionally, we investigated methods to improve the commonly used tetracycline derivative doxycycline (dox)-inducible Tet-On-System, to eliminate background activity in the absence of the inducer in bulk cell populations and reduce the need for clonal analyses of transgenic cells. These modifications consisted of the implementation of a cumate gene switch, two AU-rich destabilization elements to the Cas9 plasmid or altering the reverse tetracycline transactivator. We also experimented with the Tet-Off-system, by using the tetracycline repressor. Our data highlighted that the addition of a second transcriptional control layer (cumate operator) or the implementation of a tetracycline repressor slightly decreased the proportion of leaky HEK293 cells in a bulk cell format, however gene editing in the absence of dox was still observed in a subset of cells. Nevertheless, based on this reduced leakiness, these novel tools could help to expedite the labor-intensive process of screening single cell clones by increasing the proportion of tight Cas9-inducible cells. Overall, the stablishment of HSTL cell lines equipped with constitutive or inducible Cas9 expression lays the foundation for investigating disease mechanisms, functional dependencies and potential novel targets for therapy in this STAT5BN642H -driven disease.