DSB repair by illegitimate and homologous DNA recombination in Arabidopsis thaliana
Creators: name: Kyryk, Anzhela
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2001
Subjects: Elektronische Publikation
Zsfassung in dt. Sprache

description: In der vorliegenden Arbeit wurde für die Modellpflanze Arabidopsis thaliana die Doppelstrangbruch (DSB) Reparatur durch illegitime und homologe Rekombination charakterisiert. Zur Analyse der illegitimen Rekombination wurde in transgenen Arabidopsispflanzen mittels des selten schneidenden Restriktionsenzyms I-SceI DSBs in einem negativen Selektionsmarkergen induziert. Nach der Selektion auf den Verlust der Markergenfunktion wurden vierzig durch die DSB Reparatur neuverknüpfte Gensequenzen isoliert und sequenziert. Die meisten rekombinierten Moleküle wiesen Deletionen zwischen 1400 und 2300 Basenpaaren auf. Homologe Sequenzbereiche von wenigen Nukleotiden konnten in den meisten Fällen an den neu entstandenen Verknüpfungsstellen gefunden werden. Das Ergebnis der DSB Reparatur zwischen den beiden dikotyledonen Pflanzen Arabidopsis und Tabak, die sich um mehr als zwanzigfach in ihrer Genomgröße unterscheiden, wurde verglichen. Dabei konnten überraschende Sequenzspezifische Unterschiede entdeckt werden. In Arabidopsis waren die Deletionen im Durchschnitt länger als im Tabak. In diese Deletionen hatten, nicht wie häufig beim Tabak, "Fillersequenzen" insertiert. Die gefundenen Unterschiede in der DSB Reparatur mögen auf der eine Seite eine Ursache für die kleine Genomgröße von Arabidopsis darstellen, auf der anderen mögen sie auch für die größere Komplexität des Tabakgenoms mitverantwortlich sein. Um die DSB Reparatur durch homologe Rekombination zu untersuchen wurden ein Zweikomponentensystem entwickelt. Auf der einen Seite wurden ein Rekombinationssubstrat hergestellt, dass zwischen überlappende nicht funktionelle Hälften eines β-Glucuronidasegens eine I-SceI Schnittstelle insertiert hatte, auf der anderen Seite eine Expressionskassette, in der das I-SceI Gen unter der Kontrolle des DMC1 Promoters in planta exprämiert wurde. Da der DMC1 Promoter sowohl die Expression in der Meiose als auch in meristematischen und embryonalen Zellen bewirkt, war es so prinzipiell möglich die homologe Rekombination im somatischen, im germinalen und im meiotischen Gewebe zu induzieren. Tatsächlich führte im somatischen Gewebe die Anwesenheit der I-SceI Expressionskassette zu einer starken Erhöhung der Rekombinationsfrequenz (um zwei Größenordnungen). Dies deutet darauf hin, dass homologe Rekombination ein wichtiger Weg der DSB Reparatur in Pflanzen sein kann, wenn sich homologe Sequenzen in der Nähe des Bruches befinden. Die für das Rekombinationssubstrat homozygote Linien wiesen eine 1,27 bis 1,6 mal höhere Frequenz auf als die heterozygote Linien. Rekombinationsereignisse in der meiotischen oder generativen Phasen führen zu Nachkommen, die in all ihren Zellen ein rekombiniertes ß-Glucuronidasegen aufweisen. Die Anwesenheit der I-SceI Expressionskassette führte zu einem drastischen Anstieg von solchen Rekombinationsereignissen. Die Frequenz solcher Ereignisse war im Falle von homozygoten Elternpflanzen 5 bis 6 mal höher als bei Pflanzen, die für das Rekombinationssubstrat heterozygot waren. Dies deutet tatsächlich auf DSB-induzierte meiotische Rekombinationsereignisse hin, da nur bei dieser Art von Rekombination allelische Sequenzen bevorzugt rekombinieren.
description: DSB repair via illegitimate and homologous recombination was characterised in Arabidopsis thaliana. To characterize illegitimate recombination DSBs in a negative selectable marker gene within the Arabidopsis genome were generated by expression of the rare cutting endonuclease I-SceI. After applying selection for the loss of the enzyme activity junctions of forty recombination events were isolated and sequenced. Most of the recombined junctions had deletions in the range between 1400 and 2300 bp. No inserted sequences were found associated with the deletions. Small patches of homologous nucleotides between rejoined DNA strands were detected in most recombination junctions. The outcome of DSB repair by illegitimate recombination was compared between Arabidopsis and tobacco, two dicotyledonous plant species with more than 20 fold difference in genome size. Surprising species-specific differences were found. In Arabidopsis larger deletions than in tobacco occurred and these deletions were not accompanied by insertions of filler sequences as in tobacco. These differences in DSB repair might be on the one hand the basis for the evolution of the small genome size of Arabidopsis and on the other hand the basis for increased complexity of tobacco genome. To study of the DSB repair by homologous recombination a two-component assay system was set up. The system consists of an intrachromosomal recombination substrate based on a binary vector that contains an I-SceI site between overlapping non-functional parts of the marker gene β-glucuronidase and another binary vector containing the expression cassette of the I-SceI gene under the DMC1 promoter control for the induction of DSBs in plants. Since the DMC1 promoter is active during meiosis as well as in meristematic and embryonic tissue, homologous recombination in principle could be induced in somatic, germinal and meiotic tissue. Strong enhancement (two order of magnitude) of homologous recombination in the GUIUS transgene was obtained via induction of DSBs by I-SceI expression under control of the DMC1 promoter in somatic tissue with differences between homo- and hemizygous lines between 1.27 - 1.6 times. This indicates that homologous recombination can be a prominent pathway of DSB repair in plants if homologies are available close to the DNA break. Recombination events in meiotic or germinal haploid phase result in the next generation in progeny being genetically uniform for the recombined substrate. The presence of the I-SceI endonuclease drastically increased the recombination frequency. Moreover the frequency for homozygous GUIUS lines was 5 to 6 times higher than for the corresponding plants hemizygous for the recombination substrate. This can most easily be explained by the DSB-mediated induction of meiotic recombination as allelic sequences are the preferred target for this kind of recombination.