Αξιολόγηση νέων, ισχυρών μονωτών χρωματίνης ανθρώπου ενσωματωμένων σε λεντι-ιικούς φορείς για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της γονιδιακής θεραπείας
Creators: name: Χριστοφή, Παναγιώτα Χριστάκη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Γονιδιακή Θεραπεία
Μονωτές Χρωματίνης
Λεντι-ιικοί φορείς
Gene Therapy
Chromatin Insulators
Lentiviral vectors

description: Παρά την αδιαμφισβήτητη πρόοδο που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στη γονιδιακή θεραπεία των γενετικών νοσημάτων, εξακολουθούν να υπάρχουν σημαντικοί περιορισμοί που απαιτούν επίλυση. Η εμφάνιση εισχωρητικής μεταλλαξιγένεσης που προκαλείται από την ημι-τυχαία ενσωμάτωση των ιικών φορέων, αν και έχει ελαχιστοποιηθεί με τη χρήση των αυτοαδρανοποιούμενων(SIN) λεντι-ιικών φορέων, εξακολουθεί να αποτελεί τη σημαντικότερη αιτία τοξικότητας της μεθόδου. Επιπρόσθετα, τα φαινόμενα θέσεως που εκδηλώνονται με αποσιώπηση ή ανομοιογένεια στην έκφραση του διαγονιδίου λόγω των επιδράσεων της περιβάλλουσας χρωματίνης και της μετάπτωσης μιας ευχρωματινικής περιοχής σε ετεροχρωματινική, αποτελούν κύριο παράγοντα μείωσης της αποτελεσματικότητας της μεθόδου. Η ενσωμάτωση μονωτών χρωματίνης στις κατασκευές των ιικών φορέων έχει προταθεί ως ένα μέσο μείωσης της γενοτοξικότητας(μονωτές με δράση διακόπτη-ενισχυτή) ή/και των φαινομένων θέσεως(μονωτές με δράση φραγμού). Μέχρι σήμερα, ο πρότυπος και καλύτερα χαρακτηρισμένος μονωτής χρωματίνης cHS4, από το γονιδίωμα της όρνιθας, παρόλο που διαθέτει διπλή δράση(διακόπτη-ενισχυτή και φραγμού), έχει συσχετισθεί με χαμηλούς τίτλους στην παραγωγή των ιικών φορέων λόγω του μεγάλου μεγέθους του(1.2 kb) αλλά και με μερική μόνο μόνωση in vivo. Το εργαστήριο του εκλειπόντος Δρ. Γ. Σταματογιαννόπουλου (University of Washington)ανακάλυψε νέους, μικρού μεγέθους μονωτές(119-284bp) από το γονιδίωμα του ανθρώπου, με δράση διακόπτη-ενισχυτή, οι οποίοι μείωσαν τη γενοτοξικότητα των γ-ρετροιικών φορέων. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η αξιολόγηση 6 από τους 27, πρόσφατα ανακαλυφθέντες μονωτές χρωματίνης ανθρώπου με δράση διακόπτη-ενισχυτή(Α1,Α2,B4,C1,Ε2,F1) ως προς την πιθανή τύπου φραγμού πρόσθετη δράση τους. Οι μονωτές χρωματίνης Α1,Α2, B4,C1,Ε2, F1 ενσωματώθηκαν σε λέντι-ιικούς φορείς αναφοράς(GFP) οι οποίοι διαμόλυναν αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ανθρώπου(hCD34+) και ελέγχθηκαν σε καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης και ερυθροειδικής διαφοροποίησης ως προς την ικανότητα διαμόλυνσης των hCD34+ καθώς και ως προς την έκφραση του διαγονιδίου GFP συγκριτικά με τον μη μονωμένο φορέα. Οι μονωτές που έδειξαν ισχυρότερη δράση in vitro(A2,B4 και C1) ελέγχθηκαν και in vivo, σε ποντίκια με σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια(NSG). Όπως αναμενόταν, οι νέοι, μικρού μεγέθους μονωτές δεν επηρέασαν αρνητικά τους ιικούς τίτλους μετά την ενσωμάτωσή τους στους λεντι-ιικούς φορείς. Η έκφραση GFP σε διαμολυσμένα hCD34+ με τους Α2-GFP,Β4-GFP,C1-GFP μονωμένους λεντι-ιικούς φορείς ήταν υψηλότερη(%Έκφραση GFP: 47,40,43 vs 27,p&amp;amp;lt;0,05) συγκριτικά με τον μη μονωμένο φορέα. Στην ερυθροειδική καλλιέργεια παρατηρήθηκαν υψηλότερα ποσοστά έκφρασης GFP μετά από διαμόλυνση με τον Β4-GFP, ενώ σε ερυθρές και μυελικές αποικίες μεθυκυτταρίνης παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά έκφρασης GFP και μέσης έντασης φθορισμού (MFI) στα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με τους Β4-GFP και C1-GFP φορείς, συγκριτικά με τον μη μονωμένο GFP φορέα. Αυτή η αυξημένη έκφραση του διαγονιδίου αποδείχθηκε ανεξάρτητη της ικανότητας διαμόλυνσης δεδομένου ότι: 1) ο αριθμός των ιικών αντιγράφων ανά κύτταρο(VCN) ήταν παρόμοιος για όλους τους φορείς και 2)μετά από κανονικοποίηση της μέσης έντασης φθορισμού ως προς VCN=1(ΜFI/VCN) σε μονήρεις αποικίες, οι Β4 και C1 μονωμένοι φορείς απέδωσαν την υψηλότερη έκφραση GFP ανά ιικό αντίγραφο. Επίσης, in vivo παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση GFP στους λήπτες που έλαβαν Β4- και C1-διαμολυσμένα κύτταρα έναντι των ληπτών που έλαβαν κύτταρα διαμολυσμένα με τον μη μονωμένο φορέα. Συνοψίζοντας, φαίνεται πως ο Β4 και ο C1 αποτελούν ισχυρούς μονωτές χρωματίνης διπλής δράσης που η ενσωμάτωσή τους σε θεραπευτικούς φορείς αναμένεται να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της γονιδιακής θεραπείας.
description: Despite the unequivocal success of hematopoietic stem cell gene therapy for various genetic diseases, gene therapy still faces major challenges. Self-inactivating lentiviral vectors (SIN-LVs), although safer and less susceptible to position effects than γ-retroviral vectors, still carry the risk of genotoxicity (especially when incorporate strong enhancers like the globin-vectors) and position effect variegation/silencing of gene expression. Chromatin insulators incorporated in viral vectors have been proposed as a means to minimize vector-mediated genotoxicity (enhancer-blocking chromatin insulators) or limit transgene silencing/variegation (barrier chromatin insulators). Nevertheless, up to now, the prototypic and dual functioning vertebrate insulator is the cHS4, which has been associated with several limitations including suboptimal titers due to its large size (1.2kb) and only partial insulation. Recently, human, small-sized (119-284bp) chromatin insulators have been discovered and identified as robust enhancer-blocking insulators from the collaborating laboratory of late Dr. G. Stamatoyannopoulos (University of Washington), reducing the genotoxicity of a γ-retroviral vector (Liu M, Nat.Biotech 2015) without detrimentally affecting vector titers. The aim of the present thesis was to evaluate whether the newly discovered human chromatin insulators characterized as enhancer blocking insulators (Α1, Α2, B4, C1, Ε2, F1) function also as barrier insulators. Our ultimate goal is the identification of an ideal, dual functioning chromatin insulator to potentially mitigate both silencing and genotoxicity, which will lead to the generation of optimized viral vectors for increased efficacy and safety of gene therapy. We tested six of the 27 chromatin insulators identified as strong enhancer-blocking insulators, incorporated in reporter SIN-LVs (GFP, Α1-GFP, Α2-GFP, Β4-GFP, C1-GFP, E2-GFP, F1-GFP). Transduced normal human CD34+ cells were seeded in methylcellulose or cultured in erythroid differentiation medium or/and transplanted into sublethally ablated recipients with homozygous severe combined immunodeficiency (NOD-SCID). The tested chromatin insulators did not negatively affect vector titers. After transduction, GFP expression was significantly higher in cells transduced with the insulated Α2-GFP-, Β4-GFP-, C1-GFP-LVs over the uninsulated vector GFP-LV. Post erythroid differentiation, Β4-GFP-LV showed higher GFP expression over the parental vector. Myeloid &amp;amp; erythroid colony pools and individual colonies, demonstrated higher GFP expression and mean fluorescence intensity (MFI) when transduced with Β4- and C1-GFP-LVs compared to GFP-LV. The increased expression was VCN-independent, given that i) the VCN was similar between the insulated vectors and the uninsulated parental vector and ii) after normalization of MFI per VCN in single split colonies, the superiority in expression remained statistically significant for Β4- and C1-GFP-LVs. In vivo, GFP blood and marrow expression was significantly higher at all times tested, in Β4- and C1-GFP-LV over the GFP-LV-transplanted recipients. In conclusion, the novel chromatin insulators have no negative effect on vector titers. B4, followed by C1, apart from being powerful enhancer-blocking insulators, they also possess strong barrier activity, demonstrating superior, VCN-independent transgene expression. The incorporation of these double functioning elements in therapeutic vectors could significantly improve the gene therapy outcome, as regards safety and efficacy