Μελέτη μοριακών δεικτών βλαστικών κυττάρων στο γυναικολογικό καρκίνο
Creators: name: Παπαμίχος, Σπύρος Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Βλαστικά κύτταρα
Γυναικολογικός καρκίνος
Ισομορφές γονιδίου OCT4
Γονίδιο NANOG
Stem cells
Gynecologic cancer
OCT4 gene isoforms
NANOG gene

description: Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η αξιόπιστη μελέτη έκφρασης των δύο εναλλακτικών ισομορφών του γονιδίου OCT4 καθώς και του γονιδίου NANOG σε πρωτοπαθείς όγκους των ωοθηκών και του ενδομητρίου· έγινε προσπάθεια αναγνώρισης συσχέτισης μεταξύ της OCT4/ NANOG γονιδιακής έκφρασης και της ιστολογικής διαβάθμισης των όγκων. Επιμέρους στόχο αποτέλεσε η διερεύνηση, εμμέσως, της πιθανής συμμετοχής της OCT4B-265 πρωτεΐνης στη διεργασία της ογκογένεσης· οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο αλλήλιο(G) του πολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 δεν δύνανται να εκφράσουν την OCT4B-265 πρωτεΐνη. Πραγματοποιήθηκε μελέτη ασθενών-μαρτύρων επικεντρωμένη στην αναζήτηση της δύναμης συσχέτισης μεταξύ του GG γονότυπου και της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών. Στη μελέτη έκφρασης των 2 ισομορφών του γονιδίου OCT4 και του γονιδίου NANOG περιελήφθησαν 46 πρωτοπαθείς επιθηλιακοί ορώδεις ωοθηκικοί όγκοι (28 κακοήθεις και 18 οριακής κακοήθειας), 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα του ενδομητρίου (10 ΙΒΚ Ι, 12 ΙΒΚ ΙΙ, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ). Για τις RT-PCR αντιδράσεις, σχεδιάστηκαν απολύτως ειδικοί ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία με τη χρήση των αντισωμάτων sc-5279 (anti-OCT4A) και sc-25401 (anti-OCT4B). Στη μελέτη του πολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 περιελήφθησαν 100 δείγματα περιφερικού αίματος από γυναίκες στις οποίες είχε προηγουμένως διαγνωσθεί πρωτοπαθής όγκος επιφανειακού επιθηλίου-στρώματος ωοθηκών καθώς και 324 δείγματα περιφερικού αίματος από ενήλικες γυναίκες με ατομικό αναμνηστικό ελεύθερο για νεοπλασματική νόσο των ωοθηκών. Από τα δείγματα περιφερικού αίματος εκχειλίστηκε DNA και επακολούθησε μελέτη του πολυμορφισμού rs3130932 με ανάλυση του μήκους των περιοριστικών θραυσμάτων του PCR προϊόντος. Η δύναμη της συσχέτισης μεταξύ της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών και του γονοτύπου (TT/TG/GG) κατεδείχθει με τον υπολογισμό του λόγου πιθανοτήτων σχετικών ενδεχοµένων μετά 95% διαστημάτων εµπιστοσύνης. Παρατηρήθηκε χαμηλή σχετική έκφραση mRNA των OCT4A και OCT4B ισομορφών, κύρια σε κακοήθεις ωοθηκικούς όγκους καθώς και σε καρκινώματα ενδομητρίου υψηλού βαθμού ιστολογικής κακοήθειας, η οποία αντανακλά, πιθανώς, την ύπαρξη εντός του όγκου ενός κυτταρικού υποπληθυσμού με χαρακτήρες πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων. Η παράλληλη mRNA έκφραση των δύο ισομορφών πιθανόν να συσχετίζεται με το βαθμό της ιστολογικής κακοήθειας. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας βρέθηκαν να μην συνάδουν με τα αντίστοιχα αποτελέσματα της γονιδιακής έκφρασης. Δεν ανιχνεύτηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα για την OCT4A πρωτεΐνη σε κανέναν από τους όγκους που παρουσίαζαν OCT4A γονιδιακή έκφραση· μη γνωστοί, έως σήμερα, μοριακοί μηχανισμοί μετα-μεταγραφικής/ μετα-μεταφραστικής ρύθμισης, πιθανόν να αναστέλλουν την παραγωγή της OCT4A πρωτεΐνης. Αξιοσημείωτο είναι το ότι τα sc-5279 και sc-25401 αντι- OCT4 αντισώματα δυνατόν να ανιχνεύουν πεπτίδια που κωδικοποιούνται από τα OCT4 ψευδογονίδια καθώς και πεπτίδια μη σχετιζόμενα με το γονίδιο OCT4,αντιστοίχως.Χαμηλή έκφραση NANOG mRNA έκφραση παρατηρήθηκε , σχεδόν, επί του συνόλου των δειγμάτων της μελέτης, τόσο σε όγκους όσο και σε μη νεοπλασματικούς, παρακείμενων των όγκων, ιστούς. Το ως άνω προφίλ έκφρασης τεκμηριώθηκε πρόσφατα στη διεθνή βιβλιογραφία. Οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο (G) αλλήλιο του SNP rs3130932 δεν παρουσιάζουν μεγαλύτερη ή μικρότερη σχετική πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση τόσο με τους ομοζυγώτες για το κυρίαρχο αλλήλιο (TT γονότυπος) όσο και με τους ετεροζυγώτες (TG γονότυπος). Οι OCT4B-265 και OCT4B1 πρωτεϊνικές ισομορφές, πιθανόν να μη μετέχουν στη διεργασία της ογκογένεσης.
description: The aim of this study is to validly investigate OCT4 isoforms and NANOG expression in ovarian and endometrial carcinomas. In parallel, we, indirectly, enquire into a putative role of OCT4B in oncogenesis; the minor allele (G) of the single nucleotide polymorphism rs3130932, locating in the OCT4B translation initiation codon, is expected to hamper OCT4B expression in homozygotes individuals. A case–control association study was conducted for validating the GG genotype as a risk factor for tumour development. 79 archival specimens were included in the gene expression study, namely 46 ovarian tumors (18 serous borderline and 28 serous carcinomas) and 24 endometrial carcinomas (10 grade I, 12 grade II and 2 grade III). Specific RT-PCR protocols were designed for the corresponding mRNA targets avoiding any known pseudogene matches. Anti-OCT4A (monoclonal, SC-5279) and anti-OCT4B (polyclonal, SC-25401) antibodies were used for immunohistochemical evaluation. With regard to the case–control association study, blood samples were collected from 100 female patients with, previously diagnosed, ovarian cancer and from 324 age-matched and sex-matched healthy individuals. DNA was tested by restriction fragment length polymorphism-PCR for the presence of rs3130932. Statistical association studies were carried out to investigate any association between hOCT4 genotypes and the onset of cancer. Low OCT4A and OCT4B mRNA expression levels may be detected mainly in malignant ovarian tumors and high grade endometrial carcinomas, reflecting the presence of a distinct cancer stem cell population within the tumor. The simultaneous mRNA expression of both molecules seems to be associated with the degree of malignancy. No correlation was observed between mRNA expression and immunohistochemistry results. OCT4A protein was not detected in tumors expressing OCT4A transcripts, likely, due to post-trancriptional/post-translational modifications. Importantly, sc-5279 and sc-25401 anti-OCT4 antibodies may, as well, detect pseudogene protein derivatives or OCT4-unrelated peptides, respectively. Low NANOG mRNA expression was detected in nearly all the samples examined, both cancerous and non-cancerous. This intriguing expression pattern has recently been validated, reflecting the presence of distinct, scarce populations of pluripotent stem cells in adult tissues and of cancer stem cells in somatic cancer, respectively. Of note, it was recently documented that stemness in human somatic cancer is mainly modulated via NANOGP8 protein, instead of the, previously considered, NANOG.The GG genotype in SNP rs3130932, hampering the expression of OCT4B-265 and OCT4B1 proteins, is not associated with increased/decreased ovarian cancer risk in individuals.