title: Comparison of fixation methods and immunohistochemical staining methods on Luciferase-positive murine lung tissue
Creators: name: Stefanich, Katharina
Publisher: name: :none
Year: 2018

description: Die histologische Untersuchung von Gewebeproben ist ein wichtiges Werkzeug in verschiedenen Bereichen der Forschung und Medizin. Die Beurteilung von morphologischen Veränderungen in der Lunge ist beispielsweise essentiell, um das Fortschreiten eines Emphysems zu bewerten, oder um den histologischen Typus und das Voranschreiten von Krebs zu beurteilen. Um die Fixierung der während unserer Forschung verwendeten Lungen zu optimieren, wurden drei verschiedene Fixierungsmethoden vorgenommen: Inflationsfixation, intratracheale Instillation und keine intratracheale Fixation. Danach wurden die Durchmesser der Alveolen verglichen und als Parameter für die Beurteilung der Eignung der jeweiligen Fixationsmethode verwendet. Hierbei stellte sich die intratracheale Instillation als Methode für die Fixation von Mäuselungen als die am besten geeignete heraus. Die natürliche Lungenanatomie war weitgehend erhalten, die Wände der Alveolen waren dünnwandig und hatten einen kleinen Durchmesser. Nach erfolgreichem Evaluieren der idealen Fixierungsmethode begannen wir mit dem Versuch, mithilfe von IHC die Expression von Luciferase nach nicht-viralem Gentransfer nachzuweisen. Wir versuchten, den Erfolg jenes Gentransfers nachzuweisen, indem wir das expremierte Protein Firefly-Luciferase mit einem polyklonalen und monoklonalen Antikörper, welche jenes Enzym als Antigen erkennen, mittels IHC Staining anfärbten. Die Experimente mit dem polyklonalen Antikörper wurden mithilfe eines bereits etablierten Protokolls durchgeführt. Hierbei erzielten wir sowohl mit als auch ohne Isotypkontrolle befriedigendere Resultate als mit dem monoklonalen Antikörper, der nach Durchführung verschiedener Antigen-Demaskierungsprozesse auf dem Gewebe angewendet wurde. Zusammenfassend kann man über die Ergebnisse aller drei behandelten Themen sagen, dass die ideale Fixierungsmethode für murine Lungen intratracheale Instillation ist. Die Expression von Firefly-Luciferase konnte mit dem polyklonalen Antikörper erfolgreich nachgewiesen werden. Das Ziel, ein Protokoll für den monoklonalen Antikörper zu entwickeln, konnte nicht erreicht werden.
description: The evaluation of tissue is an important tool in various fields of research and medicine. The study of morphological alteration in the lung is for example essential to rate the degree of emhysema and also the histologic type and progress of lung cancer. To optimize the fixation of lung tissue, we performed three different methods for lung fixation: Inflation fixation, intratracheal instillation and no intratracheal fixation. Afterwards, the alveoli diameters were compared and used as a parameter to rate the qualification of each fixation method for our experiments. As the best method for lung fixation intratracheal instillation was identified. The lung anatomy was most of all preserved, the alveoli walls were thinwalled and had a small diameter. After successfully identifying the ideal fixation technique, we started an immunohistochemistry (IHC) approach to detect Firefly-Luciferase after its non-viral gene transfer to the lung. We wanted to evaluate the success of this gene-transfer by detecting the expressed protein Firefly-Luciferase with a polyclonal and monoclonal antibody directed against it. The experiments with the polyclonal antibody were performed following an established protocol. The staining results with and without an Isotype control were more satisfying than the results obtained with the monoclonal antibody after applying different antigen retrieval methods. In summary, it was found that intratracheal instillation was the ideal method for the fixation of murine lungs. Concerning the IHC we successfully proved the expression of Firefly-Luciferase with the polyclonal antibody. The goal to establish a protocol for the monoclonal antibody could not be fulfilled.