Study of biomacromolecule conformational changes by Scanning Force Microscopy
Creators: name: Valle, Francesco
Publisher: name: Unknown
Year: 0

description: L’objectif de ce travail de thèse est l’étude des changements conformationels des biomacromolecules à l’échelle d’une molécule unique. Pour cela on a utilisé la Microscopie à Force Atomique (AFM) appliqué à l’étude des protéines et des acides nucléiques déposés sur une surface. Dans ce type de microscopie, une pointe très fine attachée à l’extrémité d’un levier est balayée au dessus d’une surface. L’interaction de la pointe avec la surface de l’échantillon induit la déflection du levier et ce phénomène permet de reconstruire la topographie de l’échantillon. Très importante dans cette technique est la possibilité de travailler en liquide. Cela permet de étudier les biomolécules en conditions quasi-physiologiques sans qu’elles perdent leur activité. On a étudié GroEL, la chaperonin de E.coli, qui est un homo oligomère avec une structure à double anneau qui joue un rôle très important dans le repliement des protéines dénaturées et celles qui viennent d’être synthétisées. En particulier on a focalisé notre attention sur la stabilité mécanique et sur les changements conformationels qui ont lieu pendant l’activité de GroEL. Une analyse détaillée des changements dans la stabilité mécanique et des effets produits par la liaison et l’hydrolyse de l’ATP est présentée dans ce travail. On a montré que le point le plus faible dans la structure de GroEL est l’interface entre les deux anneaux et que l’étape critique dans l’affaiblissement de la structure est l’hydrolyse de l’ATP. En ce qui concerne le changement conformationel, le passage d’une surface hydrophobe à hydrophile, induit par l’hydrolyse de l’ATP, a été montré. Ensuite on a étudié le changement dans la conformation et dans la topologie de l’ADN résultant de l’interaction avec des molécules spécifiques et en réponse à l’exposition des cellules de E.coli à des conditions de stress. Le niveau de surenroulement est un paramètre très sensible, de façon variée, à tous ces facteurs. Les cellules qui ont crus à de températures plus élevées que leur température optimale ont la tendance à diminuer le nombre de surenroulements négatif pour augmenter la stabilité thermique de leur plasmides. L’interaction avec des agents intercalant induit une transition d’un surenroulement négatif à un surenroulement positif d’une façon dépendante de la température. Finalement, l’effet de l’interaction de l’ADN avec des surfaces différentes a été étudié et une application pratique sur les noeuds d’ADN est présentée.
description: The aim of the present thesis work is to study the conformational changes of biomacromolecules at the single molecule level. To that end, Atomic Force Microcopy (AFM) imaging was performed on proteins and nucleic acids adsorbed onto a surface. In this microcopy technique a very sharp tip attached at the end of a soft cantilever is scanned over a surface, the interaction of the tip with the sample’s surface will induce the deflection of the cantilever and thus it will make possible to reconstruct the topography. A very important feature of AFM is the possibility to operate in liquid, it means with the sample immersed in a buffer solution. This allows one to study biomolecules in quasi-physiological conditions without loosing their activity. We have studied GroEL, the chaperonin of E.coli, which is a double-ring homooligomer which pays a very important role in the refolding of unfolded and newly synthetized polypeptides. In particular we focus our attention on its mechanical stability and on the conformational change that it undergoes during its activity cycle. A detailed analysis of the change in mechanical stability and how it is affected by the binding and hydrolysis of nucleotides is presented. It has been shown that the weak point of the chaperonin complex is the interface between the two rings and that the critical step to weaken the structure is the hydrolysis of ATP. Concerning the conformational change we have directly measured, with a nanometer scale resolution, the switching from a hydrophobic surface to a hydrophilic one taking place inside its cavity induced by the ATP hydrolysis. We have further studied the change in the DNA conformation and topology as a consequence of the interaction with specific DNA-binding molecules and the exposition of the E.coli cells to stress conditions. The level of supercoiling has been shown to be a very sensitive parameter, even if at different extents, to all these factors. Cells grown at temperatures higher than their optimum one tend to decrease the number of the negative superhelical turns in their plasmids in order to increase their thermal stability. The interaction with intercalating molecules induced a transition from positive to negative supercoiling in a temperature dependent way. The effect of the interaction of the DNA with different surfaces has been investigated and a practical application to DNA complex knots is reported.
description: Observer les objets biologiques en le touchant Schématiquement le Microscope a Force Atomique (AFM) consiste en une pointe très fine fixée a l’extrémité d’un levier Lors de l’imagerie, la pointe de l’AFM gratte la surface de l’échantillon, la topographie de celui-ci induit des déflections du levier qui sont enregistrées au moyen d’un rayon laser réfléchi par le levier. Ces donnés sont ensuit utilisés par un ordinateur pour reconstituer en 3D la surface de l’échantillon. La résolution de l’instrument est fonction entre autre de la dureté, de la rugosité de l’échantillon et de la forme de la pointe. Selon l’échantillon et la pointe utilisée la résolution de l’AFM peut aller de 0.1 A (sur des cristaux) a quelque dizaine de nanomètres (sur des cellules). Cet instrument est particulierment intéressant en biologie en raison de sa capacité à imager des échantillons immergés dans un liquide, c’est à dire dans des conditions