Ανάπτυξη αυτόματης μεθόδου για τον προσδιορισμό της ανηγμένης και της οξειδωμένης γλουταθειόνης σε δείγματα μαγιάς και συμπληρώματα διατροφής με την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων, μέσω παραγωγοποίησης με ο-φθαλαδιαλδεΰδη
Creators: name: Τσιασιώτη, Αποστολία Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: subject: Αναλυτική Χημεία
subject: Τεχνική των Διαδοχικών Εγχύσεων σε Ροή
subject: Γλουταθειόνη
subject: Analytical Chemistry
subject: FOS: Chemical sciences
subject: Sequential Injection Analysis
subject: Glutathione

description: Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη αυτόματης μεθόδου για τον φθορισμομετρικό προσδιορισμό ανηγμένης και οξειδωμένης γλουταθειόνης, με την τεχνική των διαδοχικών εγχύσεων σε ροή, μέσω παραγωγοποίησης με ο-φθαλαδιαλδεΰδη (ΟPA). Η ανηγμένη γλουταθειόνη αντιδρά με την OPA σε ελαφρώς αλκαλικό περιβάλλον (pΗ = 8,0) και απουσία πυρηνόφιλων αντιδραστηρίων, σχηματίζοντας ένα φθορίζον παράγωγο (340/425 nm). Η οξειδωμένη γλουταθειόνη πρώτα ανάγεται, παρουσία ισχυρού αλκαλικού περιβάλλοντος ( 0,2 mol L-1 NaOH) σε συνθήκες ροής και έπειτα αντιδρά με την OPA. Η εφαρμογή ενός σταδίου αναχαίτισης ροής 60 δευτερολέπτων σε αυξημένη θερμοκρασία (60 oC) προσέφερε επαρκή ευαισθησία (LOD = 0,06 μmol L-1 για την ανηγμένη και 0,05 μmol L-1 για την οξειδωμένη γλουταθειόνη αντίστοιχα). Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των δύο μορφών της γλουταθειόνης σε μίγματά τους ήταν εφικτός, εφόσον η ανηγμένη δεσμεύονταν από το αντιδραστήριο Ν-αιθυλ-μαλεϊμίδη. Η προτεινόμενη μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανάλυση δειγμάτων ξηρής και νωπής μαγιάς και συμπληρωμάτων διατροφής. Γλουταθειόνη ανιχνεύτηκε μόνο στα δείγματα ξηρής μαγιάς, ενώ τα ποσοστά ανάκτησης και στα δύο είδη μαγιάς ήταν ικανοποιητικά. Σχετικά με τα συμπληρώματα διατροφής, έγινε μελέτη της οξειδωτικής αποικοδόμησης της γλουταθειόνης στο σκεύασμά της και επικυρώθηκε μια μέθοδος HPLC για σύγκριση με την προτεινόμενη μέθοδο. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στον διαχωρισμό της γλουταθειόνης και του προϊόντος οξείδωσης της με κατάλληλη στήλη αντίστροφης φάσης, συζευγμένη με ανιχνευτή UV στα 210 nm. Διάλυμα 3% m/V Η2Ο2 παρείχε γρήγορη οξείδωση, περισσότερο από 95% γλουταθειόνης, σε χρονικό διάστημα 180 λεπτών. Ο μηχανισμός της οξείδωσης αποδείχθηκε ότι ακολουθεί κινητική ψευδο-πρώτης τάξης.
description: This master thesis reports a fully automated method for the determination of glutathione by sequential injection analysis, using o-phthalaldehyde (OPA) as derivatization reagent. Reduced glutathione reacts on-line with OPA in a unique way, that is in slightly alkaline medium (pH = 8.0) and in the absence of nucleophylic reagents, to form a fluorescent derivative (340/425 nm). Oxidized glutathione is first reduced in strong alkaline medium (0.2 mol L-1 NaOH) under flow conditions and then reacts with OPA. The adaptation of a 60 s long stopped-flow step at elevated temperature (60 oC) offered adequate sensitivity (LOD = 0.06 μmol L-1 for reduced glutathione and 0.05 μmol L-1 for oxidized glutathione). Simultaneous determination of reduced and oxidized glutathione in mixtures was feasible, since the former was incubated with the N-ethyl maleimide. The proposed method was applied on analysis of yeasts and in glutathione-containing dietary supplements. Glutathione was detected only in fresh yeasts and the percent recoveries rates were satisfactory both in dry and fresh yeast samples. Regarding the oxidative forced degradation of glutathione in its nutraceutical formulations, an HPLC method was validated to be compared with the proposed method. This method is based on the separation of glutathione and its oxidation product by a suitable analytical column coupled to direct UV detection at 210 nm. A solution of 3% m/V H2O2 provided fast oxidation of more than 95% of glutathione to yield oxidized-glutathione in a time period of 180 min. The mechanism of the oxidation was proved to follow pseudo-first order kinetics.