title: Sekretionsprozesse als begrenzender Faktor der Proteinproduktion bei Bacillus
title: Secretion processes as a limiting factor of protein production in Bacillus
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Strach, Manuel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Proteinsekretion
Gram-positive cell wall
Bacterial cell biology
Protein secretion
Gram-positive Zellwand
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Amylase
bakterielle Zellbiologie

description: Zusammenfassung
Die Proteinsekretion umfasst mehrere wichtige aufeinander folgende Schritte. Zunächst müssen die
zu sekretierenden Proteine erkannt und ihre translokations-kompetente Konformation gewährleistet
werden. Danach müssen zwei Barrieren überwunden werden, die Zellmembran und die Zellwand.
Der aktive Transport durch die Membran kann durch mehrere gut untersuchte Mechanismen
erfolgen, insbesondere durch den sogenannten "general secretory" (Sec) und den "twin-arginine
translocation" (Tat). Für die Passage durch die Zellwand hingegen fehlt das Verständnis noch fast
vollständig.
In dieser Arbeit untersuchte ich diesen Prozess in Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis, indem
ich AmyE-mCherry während der Sekretion, mittels superhochauflösender Fluoreszenzmikroskopie,
sichtbar machte. Das überproduzierte Fusionsprotein lokalisierte als deutliche Foci in
der Zellhülle, welche beim Abbau der bakteriellen Zellwand, durch Behandlung mit Lysozym,
größtenteils verloren gingen. Ich konnte zeigen, dass AmyE an bestimmten Zonen aus den Zellen
freigesetzt wird, die Ähnlichkeit zu den Foci von fluoreszenzmarkiertem AmyE in der Hülle
aufweisen. Die hochperformante Proteinsekretion erreichte ihren Höhepunkt beim Übergang vom
exponentiellen Wachstum zur stationären Phase und scheint auf eine Teilpopulation von Zellen
beschränkt zu sein, was vermutlich auch für die native Proteinsekretion zutrifft.
Zeitrafferexperimente zeigten, dass die AmyE-mCherry-Foci über mehrere Minuten hinweg statisch
fixiert blieben, im Gegensatz zur hohen lateralen Mobilität der Sec-Maschinen-assoziierten
Membranproteine SecA und SecDF, die mit mNeonGreen markierten wurden. Interessanterweise
zeigten die AmyE-mCherry-Foci erhebliche Fluoreszenzintensitätsschwankungen innerhalb von
Minuten, was auf eine sichtbare Diffusion des Proteins entlang der Passage durch die
Zellwandmatrix hindurch schließen lässt. Diese Annahme von Diffusion wird durch jüngste AFMImaging-
Ergebnisse von B. subtilis unterstützt, die eine heterologe Zellwandstruktur mit tiefen
Poren in der Oberfläche des Peptidoglykans zeigen.
Für weite Teile der industriellen Biotechnologie ist die Sekretion von mikrobiell produzierten
Enzymen und Proteinen in den Kulturüberstand von enormer Bedeutung, da diese Methode im
Gegensatz zum Aufschluss der produzierenden Zellen, mit geringeren Kosten für die
Weiterverarbeitung verbunden ist. Untersuchungen zur Sekretionseffizienz bei Bacillus-Vertretern
haben zahlreiche Einflussfaktoren enthüllt.
Da die bakterielle Zellwand bei der Suche nach Sekretionsengpässen oft übersehen wird, habe ich
mich auf Autolysine konzentriert, welche die Zellwanddicke und die Dichte des Maschenwerks
beeinflussen können. Während das Fehlen von LytD nur geringe Auswirkungen auf die Sekretion
hatte, beeinträchtigte die Deletion von LytC und LytF den Transport von AmyE in die Umgebung
der Zelle erheblich. Durch die Einführung zusätzlicher Gene, die für die Autolysine LytC und LytF
oder die Zellwandhydrolase PBP5 (dacA) kodieren, konnte ich die Sekretion um bis zu 200%
verbessern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Durchlässigkeit der Zellwand für
sekretierte Proteine durch die Autolysin-Aktivität moduliert wird.
Flotilline, von denen man annimmt, dass sie in B. subtilis funktionelle Membranmikrodomänen
(FMM) bilden, werden oft mit der Sekretion in Verbindung gebracht, obwohl die Art dieser
Verbindung noch unklar ist. Um sich diesem Thema zu nähern, habe ich einen ΔyuaG (FloT)-
Deletionsstamm mit verminderter AmyE-Sekretion verwendet und konnte zeigen, dass die Zugabe
des Membranfluidisators Benzylalkohol, das Wildtyp-Sekretionsniveau wiederherstellen kann.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Flotilline die Proteinsekretion in B. subtilis durch ihre
Fähigkeit zur Verbesserung der Membranfluidität beeinflussen. Außerdem konnte ich die Effizienz
der AmyE-Sekretion von B. subtilis verdoppeln, indem ich ein zusätzliches Gen einführte, das für
FloT kodiert.