title: Untersuchung der intramolekularen Interaktionen in nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen durch terminale Kommunikationsdomänen
Creators: name: Hermanns, Benedikt
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2025
Subjects: subject: 572 Biochemistry

description: In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion der COM-Domäne in der Tyrocidin Synthetase untersucht. Dazu wurden drei Module (TycA, TycB1 und TycB3), die ein natürliches (TycA/TycB1) und ein orthogonales (TycB3/TycB1) COM-Paar bilden, genutzt.
Auf Grundlage der ersten Kristallstruktur eines vollständigen in cis COM‑Domänenpaars aus der Bacitracin C Synthetase (Konstrukt: E-COMD-COMA-C) und eines Sequenzvergleichs wurde versucht, einen Spezifitätscode innerhalb der COM‑Interaktion zu identifizieren.

Des Weiteren wurden in dieser Arbeit Austauschversuche mit den COM-Domänen der einzelnen Module durchgeführt. Hierzu wurden Teile der COM-Domänen ausgetauscht und die Produktbildung dieser Hybridmodule wurde untersucht.
 
Zuletzt wurde die COM-Domäne hinsichtlich ihrer strukturgebenden Eigenschaft untersucht. Hierzu wurde die COM-Domäne des TycA-Moduls durch Deletions- und Insertionsmutationen strukturell verändert. Durch Produktbildung und Crosslink‑Studien mit einem TycB1(S5BzF)-Modul konnte die strukturgebende Eigenschaft der COM-Domäne eindeutig identifiziert werden.
description: Zusammenfassung ..... I 
Inhaltsverzeichnis ..... III 
Abkürzungsverzeichnis ..... VII 
1. Einleitung ..... 1 
1.1. Relevanz nicht-ribosomaler Peptide ..... 2 
1.2. Nicht-ribosomale Peptidsynthetasen – modulare Megaenzyme ..... 4 
1.2.1. Adenylierungsdomäne (A-Domäne) ..... 8 
1.2.2. Peptidyl-Carrier-Protein-Domäne (PCP-Domäne) ..... 12 
1.2.3. Kondensationsdomäne (C-Domäne) ..... 14 
1.2.4. Thioesterase-Domäne (TE-Domäne) ..... 17 
1.2.5. Epimerisierungsdomäne (E-Domäne) ..... 19 
1.3. Docking Domänen (DDs) ..... 22 
1.4. Communication-mediating Domäne (COM-Domäne) ..... 26 
1.5. Produktformation – Ein Indiz für NRPS-Interaktion ..... 29 
1.6. 4-Benzoyl-L-Phenylalanin (BzF) – Eine unnatürliche Crosslink-Aminosäure ..... 31 
2. Zielsetzung ..... 33 
3. Material ..... 35 
3.1. Geräte ..... 35 
3.2. Verbrauchsmaterialien ..... 37 
3.3. Oligonukleotid-Primer ..... 39 
3.4. Plasmide ..... 43 
3.5. Mikroorganismen und Vektoren ..... 47 
3.6. Puffer und Lösungen ..... 48 
3.7. Software ..... 50 
4. Methoden ..... 53 
4.1. Analytische Methoden ..... 53 
4.1.1. Agarose-Gelelektrophorese ..... 53 
4.1.2. Bestimmung von Proteinmassen durch LC-ESI-MS ..... 53 
4.1.3. Crosslink-Reaktion mit TycB1(S5BzF) ..... 54 
4.1.4. 2,5-Diketopiperazin-Assay (DKP-Assay) ..... 54 
4.1.5. Densitometrische Auswertung von Crosslink-Banden ..... 56 
4.1.6. Färben und Entfärben mittels Coomassie-Brilliant-Blue ..... 57 
4.1.7. Konzentrationsbestimmung von DNA ..... 57 
4.1.8. Konzentrationsbestimmung von rekombinanten Proteinen ..... 57 
4.1.9. Phosphopantetheinylierungsassay ..... 58 
4.1.10. SDS-PAGE ..... 58 
4.1.11. Thioesterbildungsassay ..... 59 
4.1.12. Western-Blot ..... 60 
4.2. Molekularbiologische Methoden ..... 61 
4.2.1. Aufreinigung von Plasmiden aus E. coli ..... 61 
4.2.2. DNA-Extraktion aus Agarosegelen ..... 61 
4.2.3. Erstellung von Plasmid- und Expressionskryostocks ..... 61 
4.2.4. Ortsgerichtete Punktmutagenese ..... 61 
4.2.5. Overlap extension Klonierung (OE-Klonierung) ..... 62 
4.2.6. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ..... 63 
4.2.7. Sequenzierung von Plasmiden ..... 63 
4.2.8. Transformation von hitze- und elektrokompetenten E. coli-Zellen ..... 64 
4.3. Proteinbiochemische Methoden ..... 65 
4.3.1. Affinitätschromatographische Aufreinigung rekombinanter Proteine
mittels C-terminalem His6-Tag ..... 65 
4.3.2. Affinitätschromatographische Aufreinigung rekombinanter Proteine
mittels N-terminalem SBP-Tag ..... 66 
4.3.3. Expression von rekombinanten Proteinen ..... 67 
4.3.4. Phosphopantetheinylierung von PCP-Domänen ..... 68 
4.3.5. Suppression von TycB1(S5BzF) ..... 68 
5. Ergebnisse und Diskussion ..... 70 
5.1. Auffinden von Schlüsselpositionen der Interaktion in einem in trans COMDomänenpaar
..... 71 
5.1.1. Die Kristallstruktur des in cis COM-Domänenpaars von BacC4‑C5 ..... 71 
5.1.2. Schlüsselpositionen innerhalb des in cis COM-Domänenpaars von
BacC4-C5 ..... 73 
5.1.3. Kontakte zwischen dem in cis COM-Domänenpaar von BacC4‑C5 und
der benachbarten E- und C-Domäne ..... 75 
5.1.4. Übertragung der Eigenschaften eines in cis COM‑Domänenpaars auf in
trans COM-Domänen ..... 79 
5.2. Untersuchung der in trans interagierenden COM-Domänen von TycA, TycB1
und TycB3 ..... 87 
5.2.1. Entwicklung eines Produktbildungsassays für die Modulpaare
TycA/TycB1 und TycB3/TycB1 ..... 87 
5.2.2. Erstellung einer Mutationsbibliothek in den COM-Domänen von TycA,
TyB1 und TycB3 ..... 92 
5.2.3. Kontrollassays für apo- und holo-Enzyme ..... 95 
5.2.4. Einfluss der COM-Domäne von TycA auf die DKP-Bildung ..... 99 
5.2.5. Einfluss der COM-Domäne von TycB3 auf die DKP-Bildung ..... 104 
5.2.6. Einfluss der COM-Domäne von TycB1 auf die DKP-Bildung ..... 110 
5.2.7. Zusammenfassung des Einflusses von Schlüsselpositionen ..... 120 
5.3. Umprogrammierung der COM-Interaktion durch Domänenaustausch ..... 123 
5.3.1. Interaktion von COM-Swap-Modulen mit Wildtyp-Modulen ..... 124
5.3.2. Einfluss der gatekeeping-Position K9 auf die Interaktion mit Wildtyp-
TycA/-TycB3 ..... 127 
5.3.3. Einfluss einer A14P-Mutation in TycB1(C1_short) auf die Interaktion mit
Wildtyp-TycA/-TycB3 ..... 129 
5.3.4. Interaktion von TycB3(A) mit COM-Swap-Modulen des TycB1 ..... 131 
5.3.5. Interaktion von TycA(B3) mit COM-Swap-Modulen des TycB1 ..... 133 
5.3.6. Zusammenfassung des Einflusses von COM-Swaps ..... 134 
5.4. Untersuchung der Interaktionsarchitektur von NRPS‑Modulen mittels BzFCrosslink
 ..... 139 
5.4.1. Erstellung eines Crosslink-Kontrollassays für TycA und TycB1(S5BzF) ..... 140 
5.4.2. Auswahl von Architekturmutationen innerhalb der COMD‑Domäne des
TycA ..... 143 
5.4.3. Einfluss der COMD-Architektur auf die DKP-Bildung von TycA/TycB3
und TycB1(S5BzF) ..... 145 
5.4.4. Einfluss der COMD-Architektur auf den Crosslink zwischen TycA/TycB3
und TycB1(S5BzF) ..... 148 
6. Zusammenfassung ..... 153 
7. Ausblick ..... 157 
8. Anhang ..... 161 
9. Literaturverzeichnis ..... 202 
10. Danksagung ..... 211