title: Role and visualization of the single-stranded and double-stranded DNA in the biofilm of Neisseria gonorrhoeae
title: Rolle und Visualisierung von Einzelstrang- und Doppelstrang-DNAs im Biofilm von Neisseria gonorrhoeae
Creators: name: Zweig, Maria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Neisseria
SSB
Biofilm, Neisseria
GGI, SSB
GGI
Biowissenschaften, Biologie
Biofilm

description: Neisseria gonorrhoeae, der Erreger
      der sexualübertragenden Erkrankung Gonorrhoe, ist ein
      gram-negatives menschen-adaptiertes Diplococcus. 80% der
      klinischen Isolate enthalten durch den horizontalen
      Gentransfer erworbene Gonoccale Genetische Insel (GGI),
      welche ein ungewöhnliches Type-Vier-Secretionssystem (T4SS)
      kodiert. In manchen Stämmen von N. gonorrhoeae ist
      Einzelstrang-DNA-Bindendes Protein (SSB) nicht nur auf dem
      Chromosom kodiert, es gibt ein zweites SSB, SsbB, welches
      innerhalb der GGI kodiert ist. SSB sind hoch konservierte,
      essentielle Proteine, die in allen Domänen des Lebens
      vertreten sind. Diese Proteinklasse bindet mit sehr niedriger
      Sequenzspezifität und gleichzeitig mit sehr hoher Affinität
      an die Einzelstrang-DNA (ssDNA), außerdem sind sie bei der
      DNA-Rekombination, Replikation und Reparatur unerlässlich.
      Die zweite Kopie von SSB kann entweder auf einem Chromosom
      oder einem Plasmid kodiert sein. Diese SSBs sind bei diversen
      Mechanismen wie natürliche Kompetenz, Plasmidtrennung und DNA
      Transport, tätig. Wir haben die physiologische Rolle von SsbB
      Protein analysiert, sowie seine Funktionen biochemisch
      charakterisiert. Wir stellten fest, dass die nähesten
      Homologe von SsbB innerhalb konservierter genetischer Kluster
      auf den genetischen Inseln verschiedener Proteobacteria
      lokalisiert sind. Diese Kluster kodieren DNA Prozessierungs
      Enzyme wie ParA und ParB, Partitionierungsproteine, TopB,
      Topoisomerase und vier konservierte hypothetische Proteine.
      Die in diesen Klustern gefundene SsbB Homologe bilden eine
      separate/gesonderte von den anderen Familie der einzelstrang
      DNA Binde Proteine. Wir konnten demonstrieren, dass im
      Gegensatz zu den meisten anderen SSBs, SsbB kann nicht
      Escherichia coli ssb Deletionsmutante komplementieren.
      Aufgereinigtes SsbB bildete ein stabiles Tetramer.
      Elektrophoretische Mobilitäts Gel-Shift Assay,
      Fluoreszenztitrationsassay und die Raster-Kraft Mikroskopie
      demonstrierten, dass SsbB mit hoher Affinität an die ssDNA
      bindet. Ein SsbB-Tetramer braucht minimum 15 nucleotide, Zwei
      SsbB-Tetramere brauchen 70 Nukleotide, um an die ssDNA zu
      binden. Der Bindungsmotif war von Mg2+ oder NaCl
      Konzentration unabhängig. Wir konnten keine Rolle von SsbB
      weder für die DNA Sekretion noch für die DNA Aufnahme zeigen,
      jedoch wir konnten demonstrieren, dass SsbB die Aktivität der
      Topoisomerase I stimuliert. Wir vermuten, dass SsbB eine noch
      unbekannte Rolle für die Erhaltung der genetischen Inseln
      spielt. Bemerkenswerterweise wurde für die T4SS von N.
      gonorrhoeae Secretion von ssDNA gebunden an die Relaxase
      direkt ins Medium gezeigt. Derzeit ist fast nichts über die
      exakte Funktion der sekretierten DNA bekannt. Studien haben
      gezeigt, dass nicht nur die Exopolysaccharide aber auch die
      extrazellulare DNA (eDNA) eine wichtige Rolle für die
      anfängliche Etablierung von Biofilmen spielen kann. Die
      Zusammensetzung und der Ursprung der eDNA sind nicht komplett
      erforscht. Die Biofilme von N. gonorrhoeae enthalten große
      Mengen der eDNA, welche eine wichtige Rolle für die
      Biofilmbildung spielt. Um die Rolle der ssDNA für die
      Biofilmbildung zu untersuchen, wurde der Verlauf der
      Biofilmbildung von N. gonorrhoeae Stamm MS11 mit dem
      MS11ΔTraB Stamm, welcher in Secretion von ssDNA beeinträgtigt
      ist, und dem komlementierten Stamm MS11 ΔtraB::traB, wo die
      Secretion wieder hergestellt ist, verglichen. Des Weiteren
      wurde die Rolle der ssDNA für die Biofilmbildung durch die
      Behandlung der Biofilme mit der Exonuklease I, welche
      spezifisch nur ssDNA degradiert, untersucht. Diese
      Experimente demonstrierten, dass die secretierte ssDNA stark
      die Biofilmbildung stimuliert, vor allem aber in der Phase
      der anfänglichen Anhaftung. Darüber hinaus haben wir eine
      einzigartige Methode entwickelt, um die ssDNA and dsDNA
      separat zu detektieren. Für die Visualisierung der ssDNA,
      wurden SSB Proteine, welche mit sehr niedriger
      Sequenzspezifität und gleichzeitig mit sehr hoher Affinität
      an die ssDNA binden, eingesetzt. Das hochstabile SSB Protein
      aus Thermoanaerobacter tengcongensis sowie verschiedene
      Cysteine-Mutanten in diesem Protein wurden isoliert. Die
      verschiedenen Cystein-enthaltene Proteine wurden mit
      umweltempfindlichen Fluoreszenzproben markiert. Die
      spezifischen Kombinationen von Cystein- Mutanten und
      Fluoreszenzproben wurden getestet, um solche Kombinationen zu
      erhalten, bei denen eine Zunahme der Fluoreszenz nach der
      Bindung des Proteins stattfindet. Für die Detektion der dsDNA
      wurde das thermostabile dopple-strang DNA bindendes Protein
      Sac7d aus Sulfolobus acidocadarius verwendet. Beide Proteine
      wurden für die Visualisierung von ssDNA und dsDNA in den
      Biofilmen sowie planktonischen Kulturen verwendet.
      Bemerkenswerterweise, konnte mit dieser Methode nur dsDNA in
      den Biofilmen von N. gonorrhoeae detektiert werden. Wir
      schlussfolgern, dass ssDNA eine wichtige Rolle für die
      Biofilmbildung spielt, jedoch sind die Mengen der ssDNA in
      den Biofilmen viel geringer als der dsDNA.
description: Neisseria gonorrhoeae, the
      causative agent of the sexually transmitted disease
      gonorrhoea, is a Gram-negative human-adapted diplococcus. 80%
      of the clinical N. gonorrhoeae isolates encode an unusual
      Type IV secretion system (T4SS) within the horizontally
      acquired region - the Gonococcal Genetic Island (GGI). Next
      to the Single Stranded DNA binding protein (SSB) encoded on
      the chromosome, a second SSB, SsbB, is encoded within the
      GGI. SSBs are highly conserved, essential proteins found in
      all kingdoms of life. They bind single stranded DNA (ssDNA)
      with high affinity, have low sequence specificity and are
      involved in DNA recombination, DNA replication and DNA
      repair. A second copy of SSBs can be encoded on the
      chromosome or on a plasmid. These SSBs can be involved in
      diverse mechanisms like natural competence, plasmid
      segregation and DNA transport. We analyzed the physiological
      role of SsbB and characterized its function biochemically. We
      found that close homologs of SsbB are located within a
      conserved genetic cluster found in genetic islands of
      different proteobacteria. This cluster encodes DNA processing
      enzymes such as the ParA and ParB partitioning proteins, the
      TopB topoisomerase and four conserved hypothetical proteins.
      The SsbB homologs found in these clusters form a family
      separated from other ssDNA binding proteins. Remarkably, in
      contrast to most other SSBs, SsbB did not complement the
      Escherichia coli ssb deletion mutant. Purified SsbB formed a
      stable tetramer. Electrophoretic mobility shift assays,
      fluorescence titration assays, as well as atomic force
      microscopy demonstrated that SsbB binds ssDNA specifically
      with high affinity. SsbB binds single stranded DNA with
      minimal binding frames of 15 and 70 nucleotides for one or
      two SsbB tetramersrespectively. The binding mode was
      independent of increasing Mg2+ or NaCl concentrations. No
      role of SsbB in ssDNA secretion or DNA uptake could be
      identified, but SsbB strongly stimulated Topoisomerase I
      activity. We propose that these novel SsbBs play an unknown
      role in the maintenance of genetic islands. Remarkably the
      T4SS of N.gonorrhoeae was shown to secrete ssDNA directly
      into the medium. Currently nothing is known about the exact
      function of the secreted DNA. Studies have shown that not
      only exopolysaccharides but also extracellular DNA (eDNA) can
      play an important role in the initial establishment of
      biofilms. The composition and the origin of the eDNA are not
      completely understood. N. gonorrhoeae biofilms contain large
      amounts of extracellular DNA which play an important role in
      biofilm formation. To study the role of ssDNA in biofilm
      formation, the development of biofilms of N. gonorrhoeae
      strain MS11 was compared with a MS11 ΔtraB strain, which is
      impaired in ssDNA secretion and the MS11 ΔtraB::traB
      complementation strain in which ssDNA secretion is restored.
      Furthermore, the role of ssDNA in biofilm formation was
      studied by treating biofilms with Exonuclease I which
      specifically degrades ssDNA. These experiments demonstrated
      that the secreted ssDNA strongly stimulated biofilm formation
      especially during initial attachment. Furthermore, we
      developed a unique technique to separately detect ssDNA and
      dsDNA. To visualize ssDNA, SSB proteins, which specifically
      bind ssDNA with high affinity in a sequence-independent
      manner, were employed. The highly stable SSB protein from
      Thermoanaerobacter tengcongensis, and different cysteine
      mutants within this protein were purified to homogeneity. The
      different cysteines containing proteins were labelled with
      environmentally sensitive fluorescent probes. Specific
      combinations of cysteine mutants and fluorescent probes were
      selected to obtain proteins that showed a strongly increased
      fluorescence upon binding of ssDNA. To visualize dsDNA the
      thermostable double stranded DNA binding protein Sac7d of
      Sulfolobus acidocadarius was used. Both proteins were applied
      to visualize single- and double-stranded DNA in biofilms and
      planktonic cultures. Remarkably, only dsDNA could be detected
      in N. gonorrhoeae biofilms using this approach. We conclude
      that ssDNA plays an important role in biofilm formation, but
      that the amount of ssDNA necessary is much lower than the
      amount of dsDNA found in mature biofilms.