title: Machine learning guided optimization of an artificial carbon dioxide fixation cycle and its extension towards value-added compounds
Creators: name: Diehl, Christoph
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Natural sciences &amp; mathematics
Naturwissenschaften
biochemistry, synthetic biology, synthetic metabolism, carbon dioxide fixation, machine learning, polyketide synthases, value-added compounds,

description: The global carbon cycle is a highly balanced exchange system of carbon between the geo-, hydro- and atmosphere. Since the industrial revolution, the combustion of fossil fuels is one of the main reasons for the shift of carbon levels towards higher concentrations in the hydro- and atmosphere. The amount of carbon dioxide (CO2) in the air is comparibly low but it is a highly potent greenhouse gas due to its structural properties. Its capability of absorbing infrared light, which would otherwise escape into space, leads to an increase in atmospheric temperatures. Because CO2 molecules are very stable, the conversion into multi-carbon-molecules is energy demanding and mainly done by organisms which use light as an energy source. Therefore, the main workhorses of capturing CO2 from the atmosphere are plants and algae, which incorporate the carbon for the production of biomass. In these complex organisms the Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (RuBisCO) is responsible for the carboxylation reaction. RuBisCO is considered a slow catalyst with a high error rate in accepting oxygen (O2) instead of CO2. In 2016, Schwander et al. published a new-to-nature pathway for the fixation of CO2. The so-called crotonyl-coenzyme A (CoA) /ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA (CETCH) cycle was designed to circumvent RubisCO. In contrast to the Calvin cycle, the CETCH cycle is based on a highly efficient crotonyl-CoA carboxylase/reductase (Ccr), which does not display any side reaction with oxygen such as RuBisCO. Due to the overall pathway design, including Ccr as the key catalyst, the CETCH cycle has a higher net efficiency than natural aerobic CO2-fixation pathways and thus harbors the potential to play an important role in the reduction of atmospheric CO2 levels. To gain insights into this complex in vitro assay consisting of more than 25 components, we established a high-throughput workflow that enabled us to test hundreds of reaction conditions simultaneously. Prerequisite was the implementation of an acoustic liquid handling robot with a minimal pipetting volume of 25 nl. This enabled a fast reaction assembly and a drastic reduction in assay volume while maintaining a high pipetting accuracy. The acquired data was used to subsequently train an XGBoost-based machine learning algorithm aiming to optimize the CETCH cycle reaction parameters. After five rounds of optimization, the final model predicts reaction parameters for assay conditions with a ten-fold improvement on the manually optimized pathway version published in 2016. In addition, the algorithm identified the important components of the pathway and revealed one enzyme as a potential bottleneck of the current assay. Follow up experiments showed that the loss of intermediates by side reactions or hydrolysis is the limiting factor of the assay. Furthermore, we sought to extend the product portfolio of the CETCH cycle beyond its primary product glyoxylate. To this end, we first coupled the CETCH cycle to the β-hydroxyaspartate cycle. This enabled the production of oxaloacetate from two molecules glyoxylate. Adding only three additional enzymes from the serine cycle leads to the formation of acetyl-CoA, which we used to produce different terpenes via the mevalonate pathway. Despite the wide range of products, their synthesis has remained limited to the use of molecules produced downstream of the CETCH cycles primary product glyoxylate. Intermediates of the cycle were inaccessible, as their removal would lead to stalling of the pathway and a pre-mature arrest of CO2–fixation. To enable the utilization of CETCH cycle intermediates, we implemented anaplerotic routes that use the fixed CO2 to replenish drained cycle intermediates. We successfully reconstituted three anaplerotic pathways that enabled the production of the polyketide 6-deoxyerythronolide B (6-dEB). The biosynthesis of 6-dEB (C21) requires one molecule of propionyl-CoA and six molecules methylmalonyl-CoA, both intermediates of the CETCH cycle. The biosynthesis of complex molecules from CO2 in context of different highly convoluted pathways with up to 50 reactions highlights the robustness and versatility of the CETCH cycle.
description: Der globale Kohlenstoffkreislauf ist ein hochgradig ausgewogenes System welches den Kohlenstoffaustausch zwischen Geo-, Hydro- und Atmosphäre umfasst. Seit der industriellen Revolution ist die Verbrennung fossiler Brennstoffe der Hauptgrund für den Anstieg des Kohlenstoffgehalts in der Atmosphäre, sowie im Wasser. Zwar ist die Konzentration an Kohlenstoffdioxid (CO2) in der Luft nach wie vor sehr gering, da es jedoch aufgrund seiner strukturellen Eigenschaften ein hochwirksames Treibhausgas ist, hätte eine Verdopplung der Menge katastrophale Auswirkungen auf das Klima. Seine Fähigkeit Infrarotlicht zu absorbieren, welches sonst ins Weltall entweichen würde, führt zu einem Anstieg der atmosphärischen Temperaturen. Da CO2-Moleküle sehr stabil sind, ist die Umwandlung in langkettige Kohlenstoff-Moleküle sehr energieaufwändig und erfolgt hauptsächlich durch Organismen die Licht als Energiequelle nutzen. Die Hauptakteure bei der Aufnahme von CO2 aus der Atmosphäre sind daher Pflanzen und Algen, die den Kohlenstoff zur Erzeugung von Biomasse aufnehmen. In diesen komplexen Organismen ist die Ribulose-1,5-Bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RuBisCO) für die Carboxylierung verantwortlich. RuBisCO gilt als langsamer Katalysator mit einer hohen Fehlerquote bei der Aufnahme von Sauerstoff (O2) anstelle von CO2. 2016 wurde eine Studie von Schwander et al. veröffentlicht, in welcher ein neuartiger Stoffwechselweg zur Fixierung von CO2 vorgestellt wurde. Der sogenannte Crotonyl-Coenzym A (CoA)/Ethylmalonyl-CoA/Hydroxybutyryl-CoA (CETCH)-Zyklus wurde entwickelt, um RubisCO zu umgehen. Im Gegensatz zum Calvin-Zyklus basiert der CETCH-Zyklus auf einer hocheffizienten Crotonyl-CoA Carboxylase/Reduktase (Ccr), bei der keine Nebenreaktionen mit Sauerstoff auftreten. Aufgrund der Nutzung von Ccr und dem restlichen Aufbau des Stoffwechselweges hat der CETCH-Zyklus eine höhere Nettowirksamkeit als natürliche aerobe CO2-Fixierungswege und hat somit das Potential, eine wichtige Rolle bei der Reduzierung des atmosphärischen CO2-Gehalts zu spielen. Um Einblicke in dieses komplexe in vitro Reaktionsnetzwerk aus mehr als 25 Komponenten zu gewinnen, haben wir eine Hochdurchsatzverfahren etabliert um Hunderte von Reaktionsbedingungen gleichzeitig zu testen. Voraussetzung war die Implementierung eines akustischen Pipettier-Roboters mit einem minimalen Pipettiervolumen von 25 nl. Dies ermöglichte einen schnelleren Durchsatz und eine drastische Verringerung des Reaktionsvolumens ohne Verluste bei der Pipettiergenauigkeit. Die gewonnenen Daten wurden verwendet um einen XGBoost-basierten Machine Learning Algorithmus zu trainieren, um die Reaktionsparameter des CETCH-Zyklus zu optimieren. Durch fünf Runden Optimierung konnten die Reaktionsparameter so verändert werden, dass der CETCH-Zyklus im Vergleich zur publizierten Version von 2016 um den Faktor zehn verbessert werden konnte. Darüber hinaus konnten durch den Algorithmus die wichtigsten Komponenten des Stoffwechselwegs identifiziert werden und ein Enzym als potentieller Engpass ausgemacht werden. Des weiteren konnte durch anschließende Experimente gezeigt werden, dass der Verlust von Metaboliten durch Nebenreaktionen oder Hydrolyse der begrenzende Faktor ist. Neben der Optimierung des CETCH-Zyklus erweiterten wir dessen Produktportfolio um CO2 direkt in höherwertige Chemikalien umzuwandeln. Zu diesem Zweck koppelten wir zunächst den CETCH-Zyklus mit dem β-Hydroxyaspartat-Zyklus. Dies ermöglichte die Herstellung von Oxaloacetat aus zwei Molekülen Glyoxylat. Durch drei weitere Enzyme aus dem Serin-Zyklus konnten wir Acetyl-CoA synthetisieren, welches wir zur Herstellung verschiedener Terpene verwendeten. Zwar konnten wir die Produktion von verschiedenen Stoffen demonstrieren, die Synthese beschränkte sich jedoch auf Produkte welche aus dem Primärprodukt Glyoxylat gewonnen werden. Die Nutzung von CETCH Metaboliten war nicht möglich, da dies zu einem vorzeitigen Stillstand der CO2-Fixierung führen würde. Um die Konzentrationen von CETCH-Metaboliten zu erhöhen, implementierten wir von der Natur inspirierte, anaplerotische Sequenzen, welche das fixierte CO2 in den Zyklus zurückführen. Dazu rekonstituierten wir erfolgreich vier anaplerotische Routen, von welcher drei die Produktion des Polyketids 6-Desoxyerythronolid B (6-dEB) ermöglichten. Die Biosynthese von 6-dEB (C21) erfordert ein Molekül Propionyl-CoA und sechs Moleküle Methylmalonyl-CoA, beides Zwischenprodukte des CETCH-Zyklus. Durch die Biosynthese komplexer Moleküle aus CO2 in hochgradig komplexen Stoffwechselwegen mit über 50 Reaktionen konnten wir die Robustheit und Vielseitigkeit des CETCH-Zyklus demonstrieren.