title: Darstellung und funktionelle Analyse von extrazellulären Vesikeln im Kontext epithelialer Aktivierungsprozesse bei Asthma bronchiale
Creators: name: Adler, Arlene
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Größenausschlusschromatografie,
Darstellung von EVs mittels Komfokalmikroskopie Funktionelle Analyse von EVs
Konfokalmikroskopie
EV
Asthma
Medical sciences Medicine
Medizin
CFSE
nanoFCM

description: Die zentrale Fragestellung der vorliegenden Arbeit bestand darin zu untersuchen, ob von Zellen sezernierte extrazelluläre Vesikel (EVs) eine Funktion in der interzellulären Kommunikation übernehmen und so zur Entstehung und Ausbreitung entzündlicher Prozesse in den Atemwegen bei Asthma bronchiale beitragen. Die Untersuchungen wurden in vitro mittels Zellen der humanen bronchialen Epithelzelllinie BEAS-2B durchgeführt. Es wurden EV-Proben verwendet, die aus Überständen von Air-liquid-interface-Kulturen primärer, bronchialer Epithelzellen von gesunden bzw. asthmatischen Spendern gewonnen wurden. Zur Isolation der EVs wurde eine Kombination aus Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie eingesetzt. Aus den Ergebnissen von Voruntersuchungen ging hervor, dass diese Methode gut geeignet ist, um EVs aus einer Probe zu konzentrieren und dabei ihre morphologischen sowie funktionellen Eigenschaften zu erhalten. 
Im Rahmen der Arbeit sollte zunächst die Hypothese überprüft werden, dass EVs durch epitheliale Empfängerzellen aufgenommen werden. Hierzu wurden EVs durch verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe markiert. Von den getesteten Farbstoffen stellte sich die Anfärbung mit Carboxyfluorescein-Succinimidyl-Ester (CFSE) als die beste Variante der Fluoreszenzmarkierung für apikal und basal freigesetzte EVs von primären humanen bronchialen Epithelzellen heraus. Im Folgenden wurde die Aufnahme von CFSE-markierten apikalen EVs durch Empfängerzellen konfokalmikroskopisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass diese EVs nach sechs Stunden zwar an Zellen gebunden vorlagen, sie schienen jedoch nicht durch Empfängerzellen aufgenommen worden zu sein. 
Des Weiteren wurde die Hypothese getestet, dass apikale EVs, die von Zellen asthmatischer Spender stammen, im Gegensatz zu EVs gesunder Donoren eine proinflammatorische Reaktion in gesunden Empfängerzellen auslösen. Hierzu wurden BEAS-2B Zellen für 24 Stunden durch EVs aus bronchialen Epithelzellen gesunder beziehungsweise asthmatischer Spender stimuliert. Die Reaktion der Zellen wurde durch quantitative-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-qPCR) zum Nachweis der Expression verschiedener Gene, Enzym-gekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) für Interleukin 8 und indirekte Stickstoffmonoxid-Quantifizierung nach Griess analysiert. Dabei wurden die Ergebnisse nach Stimulation durch EVs jeweils den Ergebnissen einer unstimulierten Negativkontrolle und einer durch Lipopolysaccharid stimulierten Probe gegenübergestellt. Für alle ausgewählten Gene der Tight-Junction-Proteine zeigten sich gegenüber der Negativkontrolle signifikant verminderte Expressionslevel nach Stimulation durch EVs asthmatischer Spender. Dies kann als Ausdruck einer gestörten Barrierefunktion und einer erhöhten Durchlässigkeit des Epithels im Rahmen einer asthmatischen Atemwegsentzündung gedeutet werden. Für die ausgewählten epithelialen Entzündungsmarker sowie das PYD- und CARD-Domäne-enthaltende-Gen wurden verminderte oder unveränderte Expressionslevel nach Stimulation durch EVs asthmatischen Ursprungs beobachtet. Im Gegensatz zu EVs von Asthma-Patienten konnten EVs gesunder Spender für keines der ausgewählten Gene eine signifikante Änderung der Genexpression auslösen. Allein die Translation von Interleukin 8 war auch nach Stimulation durch EVs gesunder Spender vermindert. 
Zusammenfassend weisen die erhaltenen Ergebnisse auf eine mögliche Beteiligung von EVs an der interzellulären Signalübermittlung bei Asthma hin. Sie scheinen zur Entstehung und Ausbreitung einer asthmatischen Entzündungsreaktion beizutragen. Somit könnte ihre weitere funktionelle Analyse ein bedeutender Aspekt sein, um ein tieferes Verständnis zugrundeliegender Pathomechanismen von Asthma bronchiale zu erlangen. Perspektivisch könnte es aufgrund der Heterogenität von Pathomechanismen von Asthma bronchiale sinnvoll sein, Endotypen von asthmatischen Spendern spezifisch zu analysieren, um Ergebnisse funktioneller Untersuchungen von EVs besser einordnen zu können. Weitere Untersuchungen anhand anderer experimenteller Systeme und ggf. auch anhand anderer Empfängerzellen sind notwendig, um die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse zu prüfen. Außerdem sollten neben EVs auch die zugehörigen EV-freien Proben im Hinblick auf eine Aktivierung von Zielzellen analysiert werden. Möglicherweise könnte eine synergistische Kombination von EVs und löslichen Bestandteilen wie Proteinen in den Überständen der Epithelzellkulturen erforderlich sein, um das volle Potential der Signalübermittlung durch EVs auszuschöpfen. 
Die Analyse der Funktionen von EVs für pathologische Prozesse bei Asthma bronchiale birgt großes Potential zugrundeliegende Pathomechanismen zu verstehen und beitragende Akteure des Entzündungsgeschehens zu identifizieren. Sollten sich EVs als wichtige Faktoren der Signalübermittlung bei Asthma erweisen, könnte eine Hemmung entsprechender Funktionen als innovativer Ansatz zur Entwicklung individualisierter Therapiekonzepte dienen. Daneben könnten EVs in Zukunft auch in der Diagnostik zur Identifikation von Asthma-Endotypen von Bedeutung sein, da sie in Abhängigkeit des Zustandes ihrer Ursprungszelle verschiedene Signalmoleküle transportieren. Darüber hinaus stellen EVs einen vielversprechenden Ansatz zur zielgerichteten Verteilung von Medikamenten dar. Sicherlich werden weitere methodische Verbesserungen entscheidend dazu beitragen das noch junge Forschungsfeld der EVs weiterhin und tiefergehender zu explorieren.