title: Chromosome dynamics in Bacillus subtilis -Characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex
Creators: name: Mascarenhas, Judita
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2004
Subjects: SMC
Bacillus subtilis
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Bacillus
Chromosome condensation

description: Alle Zellen müssen ihr Erbmaterial verdoppeln und dafür Sorge tragen, daß jede Tochterzelle einen kompletten Satz des Erbguts vor der Zellteilung erhält. In Bakterien müssen die Chromosomen organisiert und kompaktiert werden, während sie gleichzeitig dynamisch sein müssen, um laufende zelluläre Prozesse wie DNA Reparatur, Rekombination, Transktiption und Replikation zu ermöglichen. SMC (Structural Maintenance of Chromosome) Proteine bilden eine ubiquitäre Proteinfamilie, die eine zentrale Rolle in verschiedenen Chromosomendynamiken spielt. Das Hauptaugenmerk in dieser Arbeit ruht auf der Charakterisierung der SMC Proteine und ihrer Partner aus Bacillus subtilis. Genbanksuchen haben zu der Identifizierung zweier Interaktionspartner des SMC Proteins geführt. Diese Proteine, ScpA und ScpB, sind in Bakterien und Archaen konserviert. Die Deletion des scpA oder des scpB Gens führte zu einem der smc Deletionsmutante ähnlichen Phänotyp, d.h. temperatursensitivem langsamen Wachstum (unterhalb 23°C), dekondensierten Nukleoiden (zelluläre Struktur der Chromosomen) und einem ausgeprägten Segregationsdefekt. Die gleichzeitige Deletion der Gene erzeugte keinen veränderten Phänotyp, was zeigt, dass alle drei Proteine im gleichen Aspekt der Chromosomen-Kondensation und Segregation fungieren. Um ihre Funktion in vivo zu untersuchen, wurden die Proteine in Zellen mit Hilfe von voll funktionellen GFP Fusionen lokalisiert. Alle drei Proteine bildeten diskrete Foci in den Zellen, einem bis dato unbekannten Lokalisationsmuster, das sich dynamisch während des Zellzyklus veränderte: zu Beginn des Zellzyklus befanden sich die Foci in der Zellmitte, und nach der Verdopplung des Focus wanderten die beiden Foci rasch entgegengesetzt in Richtung der Zellpole. In diesen bipolaren Foci verblieben die drei Proteine für den Rest des Zellzyklus. Die Bildung des Proteinkomplexes konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) und durch Depletionsstudien belegt werden. So konnte die Bildung der Foci nur in Anwesenheit aller Proteine beobachtet werden, nicht jedoch in Abwesenheit eines der drei Proteine. Die spezifische Lokalisierung des SMC Komplex hing auch von fortlaufender DNA Replikation ab, von zellulärer Gyrase Aktivität (d.h. von der Struktur der DNA), sowie von der ATPase-Aktivität von SMC. Die Überproduktion von SMC führte zu einer Über-Kondensation der Nukleoide, wobei die Lokalisation des SMC Komplexes erhalten blieb, was darauf hin deutet, daß die beobachteten Foci aktive Kondensationszentren darstellen. Weiterhin zeigten die Proteine des SMC Komplex wachstumsabhängige Expression. SMC und ScpB waren nur in wachsenden Zellen vorhanden, und wurden rasch beim Übergang in die Statonärphase abgebaut. Die Analyse der RNA Mengen in verschiedenen Wachstumsphasen durch Primer Extensionsanalyse zeigte, daß das smc Transkript im Übergang zur Stationärphase nicht abnimmt. Diese Experimente zeigten einen bisher nicht identifizierten smc Promotor auf, und erbrachten den Nachweis, daß SMC posttranskriptionell reguliert wird. Die smc, scpA, und scpB Deletionsmutanten wiesen ebenfalls eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber Mitomycin C (MMC) auf, welches Doppelstrangbrüche (DSBs) in die DNA einführt. Demnach wird der SMC Komplex ebenfalls für die Reparatur von DSBs benötigt. Weiterhin wurde die Funktion des SMC Proteins YirY untersucht, welches homolog zum DNA Reparatur Protein SbcC aus Escherichia coli ist. Die yirY Deletion führte ebenfalls zu einer deutlichen Sensitivität zu MMC, was eine Rolle in der DSB Reparatur belegt. In MMC behandelten Zellen bildete YirY Foci auf der DNA, welche aktive DSB Reparaturzentren darstellen könnten. In Gegensatz dazu waren die anderen Proteine aus dem gleichen Operon, AddA, AddB, and SbcD überall in den Zellen vorhanden und bildeten keine speziellen Strukturen, was darauf hindeutet, daß SbcC und AddAB in verschiedenen Reparaturwegen fungieren. Die subzelluläre Lokalisation der Topoisomerase IV Untereinheiten ParC und ParE wurde ebenfalls in dieser Arbeit beleuchtet. ParC lokalisierte auf dem gesamten Nukleoid, ganz im Gegenteil zu einer früheren Studie, in der ParC ausschließlich in der Nähe der Zellpole vorhanden war, wonach ParC eine spezialisierte Rolle bei der Dekatenierung von Chromosomen zugesprochen wurde. Durch Überproduktion von ParC und ParE wurden die Nukeloide noch stärker kompaktiert, was zusammen mit der Lokalisierung eine generelle Rolle in der Chromosomenkompaktierung belegt. Insgesamt läßt sich schlußfolgern, daß die Lokalisation von Proteinen, die an der Chromosomensegregation, DNA Reparatur und Translation beteiligt sind, ein wesendlich definierteres Bild der räumlichen Funktion der Proteine in lebenden Bakterien erbrachte.
description: All cells need to duplicate and separate their genetic material faithfully into the future daughter cells before cell division takes place. In bacteria, the chromosome has to be organized and compacted whilst, at the same time, it needs to be dynamic to allow other ongoing cellular processes like repair, recombination, transcription, replication and segregation to take place. SMC (Structural Maintenance of Chromosome) protein belongs to a ubiquitous protein family that play crucial roles in chromosome dynamics. The main interest of this work is to characterize the function of the SMC protein in Bacillus subtilis. Data base searches have led to the identification of two interaction partners of SMC. These proteins, ScpA and ScpB are conserved among bacterial and archaeal species possessing SMC. The scpA or scpB deletions showed a similar phenotype to that of a smc disruption, namely temperature sensitive slow growth (below 23°C), decondensed nucleoids and a strong segregation defect. Their simultaneous deletion did not exacerbate the phenotype, suggesting that all the three proteins function in the same pathway in chromosome condensation. To investigate their in vivo function, the proteins where localized in the cells using functional GFP fusions. The subcellular localization showed bipolar foci, a unique pattern of localization that was dynamic and cell cycle dependent. The foci were present at mid-cell position in smaller cells and separated towards opposite cell poles within a few minutes. The formation of a complex between SMC, ScpA, and ScpB in vivo was confirmed using fluorescence resonance energy transfer (FRET) and depletion studies. Formation of foci was only seen in the presence of all three proteins, but not in the absence of any one of them. The specific localization pattern of these proteins also depended on ongoing DNA replication, on active gyrase and thus on DNA topology, as well as on SMC?s ATPase activity. Overproduction of SMC led to increased compaction of nucleoids but the localization was retained in the form of foci suggesting that the foci represent active chromosome condensation centers. The proteins of the SMC complex showed growth dependent protein expression. SMC and ScpB proteins were present in actively replicating exponential phase cells, but were rapidly depleted as the cells entered stationary phase. Analysis with total RNA extracts from various growth phases by primer extension studies showed a strong transcript for SMC that was present even in stationary phase. This experiment led to the identification of a new promoter for smc, and suggests that SMC is regulated at the protein level by a protease that is induced at the onset of stationary phase. Smc, scpA, and scpB deletion mutant cells were also sensitive to Mitomycin C (MMC) treatment, which induces double strand breaks (DSB) into DNA. This finding revealed a role of the SMC complex in DSB repair. I also investigated the role of YirY, a homolog of the DSB repair protein SbcC which is a proposed member of SMC family. Upon disruption of yirY/sbcC, the cells did not show any visible phenotype but the cells were sensitive to MMC, suggesting its role in repair. SbcC formed foci only in MMC treated cells, so the foci in the cell might represent a DNA repair centers. Other proteins located in the same operon as SbcC, AddA, AddB, and SbcD, did not show any specific pattern of localization, but were present throughout the cell and showed slight increase in their fluorescence intensity after MMC treatment, suggesting that SbcC and AddAB function in different in repair pathways. The localization of topoisomerase IV subunits ParC and ParE has also been investigated in this work. The fluorescent protein fusion of ParC localized throughout the nucleoid, contrarily to the previously published bipolar localization as foci, which had suggested a specialized function of topoisomerase IV in chromosome decatenation. Upon over expression of ParC and ParE, the cells contained more condensed nucleoids, revealing a general role of topoisomerase IV in global chromosome compaction. A further aspect of this work was the study of dynamic localization of ribosomes. The large subunit ribosome protein L1 showed specific localization in the cytoplasmic space surrounding the nucleoid in growing cells, and was seen diffused throughout the cell in the stationary phase. The same effect was observed upon inhibition of transcription, suggesting the dependence of specific ribosome localization on active transcription. In toto, localization of DNA segregation, DNA repair and the ribosomal proteins has provided a more defined view of the spatial organization of these cellular processes in live bacterial cells.