Ruolo dei fibroblasti cardiaci nella cardiotossicit� da doxorubicina
Creators: name: RUGGERI, CLARISSA
Publisher: name: Universit� degli studi di Genova
Year: 2020

description: Le terapie antitumorali sono note cause di complicazioni cardiache irreversibili nei pazienti trattati. Numerosi sono gli studi che hanno definito i meccanismi con cui i trattamenti chemioterapici portano a danni cardiaci. In modo intrinseco, le antracicline influenzano l?integrit� dei cardiomiociti, provocando in combinazione stress ossidativo, disfunzione mitocondriale, danni nella struttura del DNA ed alterazioni nel metabolismo energetico. Negli ultimi anni sono state numerose le intuizioni circa i meccanismi alla base della patogenesi dei cardiomiociti, indotta dalla Doxorubicina (DOX): un antibiotico antraciclinico, ad azione antineoplastica, che possiede un ampio spettro antitumorale. Ben poco, invece, � stato scoperto sull?effetto di questi farmaci sui fibroblasti cardiaci: l?attivazione di queste cellule e la fibrosi miocardica, che ne deriva, sono gli aspetti che caratterizzano la cardiomiopatia da DOX. L?insieme di questi eventi, tuttavia, sono considerati secondari alla lesione dei cardiomiociti, e si ritiene che abbiano un esordio tardivo nel corso della cardiotossicit�, e quindi un impatto biologico minore. La componente cardiomiocitica, in un cuore adulto, rappresenta circa il 25-35% della popolazione cellulare; la restante parte � occupata da cellule di natura non cardiomiocitica (endoteliali, leucociti, cellule muscolari lisce, periciti e fibroblasti): un sistema equilibrato e sinergico, che garantisce la stabilit� organica, solo se ogni componente � in grado di mantenere la sua omeostasi. Per tale ragione abbiamo ipotizzato che la DOX potesse esercitare effetti diretti e biologicamente rilevanti sui fibroblasti. Per verificare la nostra ipotesi, abbiamo, in un primo momento, studiato il comportamento dei fibroblasti cardiaci primari (HCF, Human Cardiac Fibroblast), isolati dalle appendici atriali destre, di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca elettiva, con circolazione extracorporea. Successivamente ci siamo avvalsi di colture primarie di cardiomiociti e fibroblasti cardiaci, ottenuti dai cuori di topi neonatali, per comprendere se i fibroblasti trattati con la DOX fossero in grado di influenzare le cellule contigue del miocardio.
Per i nostri esperimenti, HCF, ottenuti per digestione enzimatica, sono stati trattati con DOX 0,3 �M, una concentrazione subapoptotica; � stata studiato, in queste condizioni, lo stato di senescenza cellulare (SA ?-Gal ed immunofluorescenza per p16INK4), lo stato di proliferazione (saggio citofluorimetrico per CFSE), l?apoptosi (immunofluorescenza per caspasi 3 clivata), l?attivazione fibroblastica (immunofluorescenza per ?-SMA e colorazione con Picro-Sirius red) ed il coinvolgimento di p53 (western blot). Esperimenti di tipo funzionale sono stati condotti per meglio comprendere il coinvolgimento dei pathway di p53 e TGF-? nella disfunzione cardiaca da DOX: le cellule sono state, per tanto, trattate con pifitrina-? (PFT, inibitore di p53) e GW788388 (GW, inibitore del recettore di TGF-?). La DOX, nella concentrazione testata, induce la senescenza nei HCF trattati, i quali appaiono morfologicamente pi� estesi ed appiattiti, con aumentata espressione di SA ?-Gal e p16INK4a, rispetto alle cellule di controllo, guidata da un aumento nell?espressione di p53, e con un?attivit� proliferativa contenuta. La DOX induce anche la deposizione di collagene e ?-SMA nei miofibroblasti. I pretrattamenti con PFT e GW si sono rivelati essenziali per prevenire lo switch fenotipico dei HCF in miofibroblasti. Questi effetti sono altres� evidenti nel caso dell?effetto autocrino di HCF, trattati con il mezzo di coltura condizionato di altri HCF (precedentemente trattati con DOX 0,3 �M per 3 ore e mantenuti in coltura per 2 ore in condizioni serum free, per ottenere il mezzo di coltura condizionato). Per meglio comprendere la presenza di un cross-talk tra le cellule che compongono il cuore, cardiomiociti (nMCM, neonatal Mouse Cardiomyocyte) e fibroblasti (nMCF, neonatal Mouse Cardiac Fibroblast) murini neonatali sono stati ottenuti per digestione enzimatica, da cuori di topi di 1-2 giorni (C57BL/6), e cresciuti nel loro specifico terreno di crescita. nMCF sono stati trattati con DOX 0,5 �M per tre ore e mantenuti in coltura per le due ore successive in terreno serum free; il mezzo condizionato (CM, Conditioned Medium), contenente il secretoma dei miofibroblasti � stato utilizzato per trattare i nMCM e studiarne l?effetto paracrino. L?analisi del CM di nMCF ci ha permesso di escludere la presenza di DOX o suoi metaboliti, ma il secretoma dei nMCF � sufficiente ad indurre la senescenza nei nMCM, che mostrano un?incrementata attivit� SA ?-Gal, senza intaccare l?integrit� mitocondriale.
I fibroblasti, diversamente da quanto noto fino ad oggi, sono profondamente danneggiati dalla DOX, ed influenzano in maniera paracrina i cardiomiociti contigui, provocando lesioni, per mezzo del loro secretoma, e non per effetto dei metaboliti della DOX. Ulteriori studi saranno necessari per caratterizzare i fattori secreti dai fibroblasti, implicati nella patogenesi della cardiotossicit�.