title: Analyse der Expression der co-inhibitorischen Immun-Checkpoints BTLA und LAG-3 in Blut- und Gewebeproben von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
Creators: name: Hahn, Alina
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 61 Medizin und Gesundheit :: 617 Chirurgie und verwandte medizinische Fachrichtungen

description: 1. Hintergrund und Ziele: Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle ist mit mehr als 90 % der häufigste Tumor der Mundhöhle. Die Überlebensrate von Erkrankten liegt nur bei ungefähr 50 %. Da das PECM ein stark immunogener Tumor ist, kann eine immuntolerante Umgebung beobachtet werden. Einer der Gründe dafür ist das Auftreten von Immun-Checkpoints, welche die Immunantwort durch Steigerung oder Schwächung modulieren können. Das PECM ist in der Lage, diesen Mechanismus zu dysregulieren und dadurch eine Immunresistenz zu erlangen. Ein Immun-Checkpoint, der in der Arbeit untersucht wird, ist BTLA. Er wirkt als co- inhibitorischer Rezeptor und bindet an Herpesvirus-Entry-Mediator, seinen Liganden. Er wird in vielen Tumoren hochreguliert und korreliert negativ mit der Prognose und Progression des Tumors. Daher gilt er als ein wichtiges potenzielles Ziel für die Krebs- Immuntherapie. Im Jahr 2018 konnte bereits ein erster monoklonaler Antikörper gegen BTLA für klinische Studien zugelassen werden. Ein weiterer in dieser Arbeit zu untersuchender Immun-Checkpoint ist LAG-3. Er bindet an seinen Liganden den Haupthistokompatibilitätskomplex-II und ist ein co- inhibitorischer Rezeptor. Auch hier konnte bereits bei einigen Tumoren eine erhöhte Progression festgestellt werden, wenn LAG-3 in den Tumorzellen verstärkt exprimiert wurde. Allerdings konnte im Gegensatz dazu bei Brustkrebspatienten und Patienten mit Oesophagealadenokarzinom eine positive Auswirkung einer erhöhten LAG-3- Konzentration beobachtet werden. Ziel dieses Promotionsprojekts ist es, die Expressionsmuster des immunsuppressiv fungierenden Immun-Checkpoints BTLA in Tumor- und gesundem Mundschleimhautgewebe und LAG-3 in Vollblut von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle und gesunden Probanden mittels RT-qPCR zu analysieren und diese zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. So soll deren Relevanz für die Progression des PECM und ihre Tauglichkeit als mögliche prognostische Parameter geklärt werden. 2. Material und Methoden: Insgesamt wurden 207 Proben in die Studie eingeschlossen, die in 2 Gruppen aufgeteilt wurden. Die Testgruppe umfasst Gewebe- und periphere Blutproben von 102 Patienten mit einer Erstdiagnose eines Plattenepithelkarzinoms der Mundhöhle. Als Vergleichsgruppe dienen Mundschleimhaut- und Blutgewebe von 105 gesunden Probanden. Die Expression der Immun-Checkpoints BTLA und LAG-3 wurde mittels RT-qPCR bestimmt. Dazu wurde das Gewebe mit Hilfe von Precellys® (Bertin Instruments in Frankreich) aufgeschlossen und die Gesamt-RNA mit dem miRNeasy mini kit der Firma Qiagen (Qiagen in Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert. Die Blutproben wurden mit Hilfe des „PAXgene Blood miRNA Kit“ von PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH in Hombrechtikon, Schweiz) nach Herstellerangaben isoliert. Die anschließend mit Hilfe des „High Capacity Kit“ von Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific in Massachusetts, USA) aus mRNA transkribierte cDNA wurde dann in eine semiquantitative RT-qPCR eingesetzt, um die Expression von BTLA und LAG-3 zu bestimmen. Zu diesem Zweck werden genspezifische Primer und der „Power SYBRTMGreen PCR Master Mix“ von Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific in Massachusetts, USA) verwendet. Die erhobenen Daten wurden, wie vom Hersteller für das ABI Prism 7300 (Applied Biosystems) angegeben, erhoben und die Zyklusschwelle (CT-Wert) bestimmt. Die relativen Expressionsunterschiede des BTLA/LAG-3-Gens zwischen den Gruppen wurden mit der ∆∆CT-Methode bestimmt. Für die statistische Auswertung wurde das Programm IBM SPSS Statistics 22 (IBM Inc., New York, USA) verwendet. 3. Ergebnisse: BTLA wird in Gewebe von Patienten mit Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle, im Vergleich zu normaler oraler Mukosa, signifikant erhöht exprimiert. Dies wurde durch unsere Expressionsanalyse untermauert, wo wir mit Hilfe des COP eine Überexpression über dem Schwellenwert feststellen konnten. LAG-3 wiederum wurde im Blut von PECM-Patienten im Vergleich zu Blut von gesunden Probanden nicht signifikant hochreguliert. Weder bei BTLA noch bei LAG-3 konnte eine Assoziation zwischen der Höhe der Expression und den T-Stadien (T1/T2 mit T3/T4), dem Lymphknotenbefall (kein Befall der Lymphknoten mit einem Lymphknotenbefall), der Entstehung eines Rezidivs (keine Rezidiventwicklung mit einer Rezidiventwicklung) und dem Grading (G1, G2, G3) festgestellt werden. 4. Schlussfolgerungen: BTLA scheint ein lokaler relevanter Immun-Checkpoint für die Entstehung des PECM zu sein und könnte als ein möglicher Ansatz für Immuntherapien gegen das PECM genutzt werden. Für LAG-3 müssen wir wiederum annehmen, dass er keine oder nur eine untergeordnete Rolle bei der PECM-Entstehung spielt und somit kein geeigneter Ansatz für eine Immuntherapie ist. Wir konnten des Weiteren keine Relevanz für eine Nutzung von BTLA als prognostischen Marker im Gewebe und LAG-3 als prognostischen Marker im Blut für die Tumorgröße, den Lymphknotenbefall, die Entstehung eines Rezidivs und das Grading feststellen.