title: Immunohistochemical evaluation of CD47 surface protein in a xenograft triple-negative breast cancer (TNBC) mouse model
Creators: name: Pichler, Julia
Publisher: name: :none
Year: 2019

description: CD47 ist ein Glykoprotein, das von vielen Tumorentitäten als Transmembranprotein an der Zelloberfläche überexprimiert wird. Damit ist es möglich, der Eliminierung durch das Immunsystem zu entgehen, indem ein sog. “Friss mich nicht” - Signal an Makrophagen ausgesendet wird. Dies erfolgt nachdem CD47 an das Membran-Glykoprotein SIRPα, welches an der Oberfläche der Makrophagen exprimiert ist, gebunden hat. Dementsprechend ist die Blockade von CD47 mit einer SIRPα-Variante ein potenziell vielversprechender Ansatz in der Krebsforschung, um das Tumorwachstum durch die dann verstärkte Phagozytose zu stoppen oder Tumore sogar zu eliminieren. Diese Diplomarbeit fokussierte sich auf die histologische Auswertung von drei in vivo Experimenten, die an SCID Mäusen durchgeführt wurden, um die Wirkung des Fusionsproteins SIRPα-Fc an einem Xenograft triple-negative breast cancer (TNBC) Mausmodell zu testen. Eine zentrale Aufgabe dieser Diplomarbeit war der immunhistochemische Nachweis von CD47. Dabei wurde das Färbeprotokoll für FFPE (formalin fixed paraffin embedded) Gewebe optimiert. Ein weiteres Ziel der Arbeit war der immunhistochemische Nachweis von Luciferase, ein Reportergen und Enzym, welches ebenfalls vom Tumor exprimiert wird, da die Krebszelllinie in vitro mit dem Luc-Gen transduziert wurde. Der abschließende Teil befasste sich mit dem Nachweis des Fc-Teils des Fusionsproteins, um feststellen zu können, ob SIRPα-Fc zu bestimmten Zeiten nach Therapiebeginn tatsächlich im Gewebe aufzufinden ist, indem es an CD47 gebunden hat und dieses blockiert. Die Ergebnisse zeigten, dass CD47 von der getesteten humanen TNBC Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 LM2-4 überexprimiert wird. Ebenso konnte das Luciferase Protein erfolgreich in den Luc-transduzierten Tumorzellen immunhistochemisch nachgewiesen werden. Weiterhin konnte histologisch gezeigt werden, dass das Fusionsprotein 24 Stunden nach einer intratumoralen Behandlung mit einem Plasmid, das für SIRPα-Fc kodiert, noch teilweise an CD47 gebunden war und das Protein somit blockiert war.
description: The CD47 glycoprotein, overexpressed on the cell surface of tumor cells, is a very important target in cancer immunotherapy. Several tumor cells overexpress this protein to evade the immune system sending out a “don’t eat me signal” to the macrophages by the interaction of CD47 with SIRPα, a membrane glycoprotein expressed on macrophages. Accordingly, the blocking of CD47, e.g. with a SIRPα analogue/variant, is a vital option in the development of anti-cancer drugs to enhance tumor eradication by phagocytosis. This work focused on the histological evaluation of human triple-negative breast cancer (TNBC) xenografts implanted in immune compromised SCID mice. The effect of SIRPα-Fc fusion protein expression of ex vivo or in vivo transduced tumors on tumor morphology and CD47 receptor accessibility was studied by means of histological methods. First, a staining protocol for immunohistochemical detection of CD47 surface protein was developed. Secondly, tumor cells genetically marked with firefly luciferase were identified by immunohistochemistry using anti-luciferase antibodies. The third aim was the immunohistochemical evaluation of tumors expressing the SIRPα-Fc fusion protein through the detection of the Fc-part in the tumor tissue. The results demonstrated that CD47 is overexpressed on the TNBC breast cancer cell line MDA-MB-231 LM2-4. Furthermore, a partial blockade of CD47 was observed in a tissue sample 24 hours after the intratumoral treatment with a plasmid encoding for SIRPα-Fc.