Παράγοντες που επηρεάζουν τη διάρκεια και το ύψος της ιαιμίας και την ικανότητα μετάδοσης του ιού του καταρροϊκού πυρετού στο πρόβατο:
Creators: name: Χατζηνάσιου, Ευαγγελία Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Καταρροϊκός πυρετός του προβάτου
Ανοσοκαταστολή
Ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης
Κυτταροκαλλιέργειες
Εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας
Bluetongue
Immunosuppression
Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction
Tissue cultures
Embryonated chicken eggs

description: Ο καταρροϊκός πυρετός είναι μία αρθροποδομεταδιδόμενη νόσος, που προσβάλλει το πρόβατο και άλλα κατοικίδια και άγρια μηρυκαστικά. Οφείλεται στον ιό Bluetongue (Bluetongue Virus, BTV), έναν dsRNA ιό (γένος Orbivirus, οικογένεια Reoviridae) που μεταδίδεται με έντομα του γένους Culicoides. Στο πρόβατο προκαλεί νόσο που χαρακτηρίζεται από πυρετό, αιμορραγία, οίδημα κεφαλής και τραχήλου, ποδοδερματίτιδα και ενδονυχίτιδα. H διάρκεια και η βαρύτητα της νόσου διαφέρουν ανάλογα με τη φυλή του προβάτου, τον ορότυπο/στέλεχος του ιού και την ανοσολογική αντίδραση του κάθε ζώου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσο η ανοσοκαταστολή ή η ανοσοενίσχυση επηρεάζουν την εξέλιξη της λοίμωξης και τη μετάδοση του ιού, αυξάνοντας τον τίτλο του λοιμογόνου ιού στο αίμα, την παραμονή του στο ζώο και τη μετάδοσή του με τους ξενιστές. Πριν το κυρίως πείραμα προηγήθηκαν τρεις προκαταρκτικές μελέτες. Η πρώτη είχε ως σκοπό τη διαμόρφωση του πειραματικού προτύπου μόλυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πρόβατα δύο ελληνικών φυλών, Καραγκούνικης και Χίου, που μολύνθηκαν με τον ορότυπο BTV–9 (GR 199/98RS). Παρατηρήθηκε ότι το πρόβατο της Καραγκούνικης φυλής ήταν πιο ευαίσθητο από εκείνο της Χίου κι έτσι επιλέχθηκε για τα επόμενα πειράματα. Η δεύτερη μελέτη αφορούσε στη διαμόρφωση της μεθόδου ανοσοκατατολής στο πρόβατο. Επιλέχθηκε η κυκλοφωσφαμίδη (37,5 mg/kg / ζώο, ενδοφλεβίως, εφάπαξ), γιατί προκάλεσε σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία για 10 ημέρες. Στην τρίτη μελέτη συγκρίθηκαν έξι μέθοδοι απομόνωσης ιικού γενώματος (dsRNA) του BTV, βελτιώθηκε το πρωτόκολλο αποδιάταξης του dsRNA του ιού και αξιολογήθηκε ο σχεδιασμός μιας ποσοτικής πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR), χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος πειραματικά μολυσμένων προβάτων. Αποδείχθηκε ότι ο τίτλος του ιού, εκφρασμένος σε EID50/ml, εμφάνισε υψηλό βαθμό συσχέτισης με τα dsRNA αντίγραφα του BTV που προσδιορίστηκαν με qRT-PCR μέχρι την 28η ημέρα μετά τη μόλυνση. Στο τελικό πείραμα έγινε ανοσοκαταστολή (κυκλοφωσφαμίδη, 37,5 mg/kg / ζώο, ενδοφλεβίως, εφάπαξ) ή ανοσοδιέγερση (πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund, 10 ml / ζώο, ενδομυικά, εφάπαξ) Καραγκούνικων προβάτων, που ακολούθως μολύνθηκαν με BTV–9. Παρατηρήθηκε ότι τα ανοσοκατεσταλμένα / μολυσμένα πρόβατα, σε σχέση με τους μάρτυρες μόλυνσης, εμφάνισαν νωρίτερα πυρετό και ιαιμία (ανίχνευση ιού από την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση έναντι της 4ης), με υψηλότερο τίτλο ιού (0,73±0,11 log10 ECEs/ml) από την 3η  7η ημέρα μετά τη μόλυνση. Χαρακτηριστικό είναι ότι ανοσοκαταστολή προκάλεσε και ο ιός, αφού τα μολυσμένα με BTV ζώα παρουσίασαν σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία από την 1η ημέρα μετά τη μόλυνση. Επίσης τα ανοσοκατεσταλμένα / μολυσμένα πρόβατα είχαν μεγαλύτερη μείωση των Β-λεμφοκυττάρων σε σχέση με τους μάρτυρες μόλυνσης, και γι’ αυτό εμφάνισαν καθυστέρηση, κατά μία ημέρα, της εμφάνισης αντισωμάτων. Εντούτοις, δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στους τίτλους των εξουδετερωτικών αντισωμάτων μεταξύ όλων των μολυσμένων ζώων. Επομένως, η κυκλοφωσφαμίδη στη δόση και στην οδό χορήγησης που χρησιμοποιήθηκε επηρέασε σε σχετικά μικρό βαθμό τη χυμική και την κυτταρική ανοσία του προβάτου, την ένταση της ιαιμίας και κατ’ επέκταση την ικανότητα μετάδοσης του ιού, αλλά μόνο για 10 ημέρες, επομένως ελάχιστα ή οριακά θα μπορούσε να συμβάλλει σε αυξημένη μετάδοση του ιού. Τέλος, στα ανοσοενισχυμένα / μολυσμένα ζώα δεν υπήρξαν ενδείξεις ανοσοενίσχυσης.
description: Bluetongue is an infectious but non-contagious, arthropod-borne viral disease affecting sheep and other domesticated and wild ruminants. The causative agent, bluetongue virus (BTV), is a dsRNA virus (genus Orbivirus, family Reoviridae) transmitted by Culicoides spp. BTV infection of sheep can cause a disease which is characterised by pyrexia, haemorrhage, oedema of the head and neck, coronitis and laminitis. The duration and severity of the disease varies considerably between different breeds of sheep, viral serotypes/strains and immune response of each animal to viral disease. The objective of this work was to investigate if immunosuppression or immunostimulation could play a role in the pathogenesis of infection, allowing for higher and/or longer viraemia, and greater potential for acquisition of virus by the arthropod vector. Before the main experiment, 3 preliminary experiments were done. The first was done in order to set up the experimental model. Sheep of two breeds were inoculated with BTV–9 (GR 199/98RS). Karagouniko sheep was found more sensitive than Chios and so it was selected for the following experiments. The second study was to develop pharmacological protocol for immunosuppression in sheep. Cyclophosphamide, used, in one dose of 37.5 mg/kg (intravenously) caused significant leukopaenia and lymphopaenia at least 8 days after administration of cyclophosphamide. The third study compared six methods for extraction of the viral genome (dsRNA) of BTV, improved protocol denaturation of dsRNA virus and evaluated the design of a quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR), using blood samples of experimentally infected sheep. From all experiments it was demonstrated that the titre of the virus expressed in EID50/ml, showed a high degree of correlation with copies of BTV dsRNA identified by qRT-PCR up to 28 days after infection. In the final experiment Karagouniko sheep were immunosuppressed or immunostimulated (Freund’s complete adjuvant, 10 ml / animal, intramuscularly, in one dose) and then sheep were inoculated with BTV–9. It was observed that immunosuppressed / infected sheep, compared to infected sheep, had earlier clinical signs and viraemia (virus detection by day 3 after infection compared to the 4th) with higher titre (0.73 ± 0.11 log10 ECEs / ml), from 3rd  7th days after infection. It is characteristic that virus itself caused also immunosuppression, since the BTV-infected animals showed significant leukopaenia and lymphopaenia from the first days after infection. However, immunosuppressed / infected sheep had a greater reduction in the number of B-lymphocytes than infected sheep, and this resulted in a delay by one day, the appearance of antibodies. However, no significant differences were found in the titre of neutralising antibodies between immunosuppressed and non-immunosuppressed sheep. Therefore, the use of cyclophosphamide in the dose and route of administration, affected mildly only the humoral and cell-mediated immunity of the experimental sheep, the intensity of viraemia and thus the ability of virus transmission, and only for 10 days, so there may contribute to increased transmission of BTV during this period. Finally, the use of Freund’s aduvant did not provide evidence of immunostimulation.