title: Importance of the senescence-associated secretory phenotype (SASP) for the radio-resistance of HNSCC cell lines after particle irradiation
title: Untersuchung der strahleninduzierten Seneszenz und des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) in HNSCCs-Zelllinien nach Bestrahlung mit Kohlenstoffionen
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Tiwari, Dinesh Kumar
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Medical sciences Medicine
Medizin

description: Die Strahlentherapie mit Photonen ist die wichtigste Behandlungsoption für lokal fortgeschrittene HPV-negative Plattenepithelkarzinome des Kopfes und Halses (HNSCC). Diese Behandlung kann als präzises und effizientes Instrument zur Abtötung von Tumorzellen eingesetzt werden. Jedoch kommt es trotz der Anwendung hoher Dosen über 70 Gy häufig zu einem Therapieversagen, was auf die inhärente und erworbene Radioresistenz der Tumorzellen zurückzuführen ist. Es wird davon ausgegangen, dass diese Radioresistenz stark mit der durch ionisierende Strahlung induzierten Seneszenz zusammenhängt. Seneszente Zellen sind in der Lage SASP-Faktoren (senescence-associated secretory phenotype) zu sezernieren, welche die zelluläre Radioresistenz verstärken könnten und damit die Wirkung der Strahlung, Tumorzellen abzutöten, verringern würden. Ziel dieses Projekts war es, die zellulären und molekularen Mechanismen dieser Seneszenz-induzierten Strahlenresistenz in HPV-neg. HNSCC-Zellen besser zu verstehen. Die Experimente wurden mit fünf verschiedenen HPV-neg. Zelllinien (Cal27, Cal33, UPCISCC040, UPCISCC099, UPCISCC131) durchgeführt, um ein breites Spektrum an Radiosensitivität abzudecken, welches ein typisches Charakteristikum dieser Entität ist. Die Mechanismen wurden für Röntgenstrahlen und zum ersten Mal auch für 12C-Ionen untersucht, welche eine weitere hochpräzise Strahlentherapie darstellt, die am Marburger Ionenstrahl-Therapiezentrum (MIT) durchgeführt werden kann. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 1. Die mittels Koloniebildungstest ermittelte zelluläre Radiosensitivität mit 12C-Ionen war im Vergleich zu Röntgenstrahlen mit einer RBW10 von ~ 2-3 deutlich höher, was auch frühere Ergebnisse bestätigt. 2. Eine aktive DSB-Reparatur, die durch immunfluoreszierende Visualisierung von γH2AX/53BP1-Foci untersucht wurde, wurde in allen Zelllinien und auch nach Röntgen- und 12C-Bestrahlung beobachtet. Die Reparaturkapazität war jedoch nach 12C-Bestrahlung deutlich geringer. 3. Die Seneszenz wurde mit einer auf einem Durchflusszytometer basierenden Methode zum Nachweis der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase-Aktivität nach Röntgenbestrahlung und zum ersten Mal auch nach 12C-Bestrahlung untersucht. Nach beiden Bestrahlungsarten nimmt die Seneszenz mit der Zeit und der Dosis zu. Jedoch wurde nach 12C-Bestrahlung ein stärkeres Endlevel erreicht. Dieser Grad der Seneszenz korrelierte gut mit der jeweiligen zellulären Strahlenresistenz, allerdings war dieser Zusammenhang bei 12C-Bestrahlung viel steiler. Bei Röntgenbestrahlung korreliert ein mäßiger Anstieg der Seneszenz mit einem starken Anstieg der Strahlenresistenz, während im Gegenteil bei 12C-Bestrahlung ein starker Anstieg der Seneszenz mit einem geringen Anstieg der Strahlenresistenz assoziiert ist. Dieses Ergebnis zeigt zum ersten Mal, dass der Einfluss der Seneszenz auf die zelluläre Strahlenresistenz bei 12C-Ionen im Vergleich zu Röntgenstrahlen geringer zu sein scheint. 4. Das Genexpressionsprofil der SASP-Faktoren wurde sowohl mittels qRT-PCR als auch mittels RNA-seq gemessen. Nach beiden Bestrahlungsarten wurde eine starke Induktion von SASP-Faktoren mit sehr ähnlicher Dynamik beobachtet. Mit Hilfe einer Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde eine klare Unterscheidung zwischen den fünf verwendeten Zelllinien festgestellt. Jede Zelle ist durch ein spezifisches Profil von SASP-Faktoren gekennzeichnet. Ebenso zeigte sich eine starke Induktion der SASP-Faktoren nach Bestrahlung. 5. Für IL1α und IL1β wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine starke Assoziation zwischen der Genexpression und der Radioresistenz sowie Seneszenz sowohl nach X- als auch nach 12C-Bestrahlung besteht. Die mittels ELISA gemessene Sekretion von IL1β im Überstand der Zellkulturen nimmt im Verlauf der Zeit nach der Bestrahlung zu und war nachweislich nach 12C-Bestrahlung stärker. Diese Sekretion war bei radioresistenten Zelllinien deutlich erhöht. 6. Eine mechanistische Studie wurde für IL1α und β durchgeführt, in welcher ein Knockdown durch eine siRNA-Transfektion herbeigeführt wurde. Überraschenderweise wirkte sich dieser Knockdown weder auf die zelluläre Radiosensitivität noch auf die DSB-Reparatur oder die Seneszenz aus. Dies galt sowohl für X- als auch für 12C-Bestrahlung und nicht nur für einen einzelnen, sondern auch für einen kombinierten Knockdown dieser beiden Faktoren. 7. Diese Daten demonstrieren zum ersten Mal, dass die beiden wichtigen SASP-Faktoren IL1α und β, obwohl sie stark mit der zellulärer Strahlenresistenz, DSB-Reparatur und Seneszenz assoziiert sind, an keinem dieser Prozesse funktionell beteiligt sind. Nach aktuellem Kenntnisstand ist dies die erste Studie, die den Einfluss der spezifischen SASP-Faktoren IL1α und β im Zusammenhang mit Seneszenz nach X- sowie nach 12C-Bestrahlung in HNSCC-Zelllinien untersucht. Aufgrund der gewonnenen Daten können IL1α/β nun als Faktoren ausgeschlossen werden, die hauptverantwortlich die Seneszenz und damit die zelluläre Radioresistenz kontrollieren. Zukünftige Forschungen müssen sich auf andere Faktoren konzentrieren, die für diese biologischen Endpunkte relevant sein können.
description: Photon-based radiotherapy is the major treatment option for locally advanced HPV-neg. head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). This treatment can be used as a precise and efficient tool to achieve tumor cell killing. However, despite the application of high doses above 70 Gy, therapeutic failure is common, which is attributed to the inherent and acquired radioresistance of tumor cells. This radioresistance is considered to be strongly associated with the senescence induced by ionizing irradiation. Senescent cells are able to secrete SASP (senescence-associated secretory phenotype) factors, which might enhance the cellular radioresistance and thereby diminish the effect of radiation on cell killing. The aim of this project was to better understand the cellular and molecular mechanisms of this senescence-induced radioresistance in HPV-neg. HNSCC cells. The experiments were performed with five different HPV-neg. cell lines (Cal27, Cal33, UPCISCC040, UPCISCC099, UPCISCC131) in order to cover a broad range of radiosensitivity, which is a typical characteristic of this entity. The mechanisms were studied for X-rays and for the first time also for 12C-ions, which is another high precision radiotherapy available at the Marburger Ionenstrahl-Therapiezentrum (MIT). This method uses particle irradiation to achieve efficient tumor cell killing. The following results were obtained: 1. Cellular radiosensitivity towards 12C-ions as determined via colony formation assay was clearly higher when compared with X-rays with an RBE10 of ~ 2-3, also confirming previous results. 2. An active DSB repair as examined by immunofluorescent visualization of γH2AX/53BP1-foci was seen in all cell lines and also after both, X- and 12C-irradiation. However, repair capacity was clearly less after 12C-irradiation. 3. Senescence was studied using a flow-cytometer based method to detect senescence-associated β-galactosidase activity after X-irradiation and for the first time also after 12C-irradiation. After both types of irradiation, senescence increases over time and dose. However, the final level approached was much stronger after 12C-irradiation. This level of senescence was well correlated with the respective cellular radioresistance. But this association was much steeper for 12C-irradiation showing that for X-irradiation, a moderate increase in senescence was associated with a strong increase in radioresistance, while for 12C-irradiation the opposite was seen with a strong increase of senescence being associated with a low increase in radioresistance. This finding shows for the first time, that impact of senescence on cellular radioresistance appeared to be less for 12C-ions when compared to X-rays. 4. Gene expression profile of SASP factors were measured via both, qRT-PCR and RNA-seq. A strong induction of SASP factors were seen after both radiation types with very similar dynamics. Using a principal component analysis (PCA) a clear discrimination was achieved for the five cell lines used, demonstrating that each cell is characterized by a specific profile of SASP factors. The data sets unveiled also a strong irradiation-induced induction of these factors. 5. For IL1α and IL1β it is shown for the first time that there is strong association with radioresistance as well as senescence after both X- and 12C-irradiation. The secretion of IL1β as measured in the supernatant of cell cultures using ELISA increases with time after irradiation and was shown to be stronger after 12C-irradiation. This secretion was clearly high in radioresistant cell lines. 6. A mechanistic study was performed for IL1α and β by using siRNA mediated knockdown. Most surprisingly this knockdown was found to have no effect on cellular radiosensitivity, DSB repair and senescence. And this was seen for both X- and 12C-irradiation and not only for a single but also for a combined knockdown of these two factors. 7. These data demonstrate for the first time that the two important SASP factors IL1α and β, although strongly associated with cellular radioresistance, DSB repair and senescence, are not functionally involved in any of these processes. Due to best knowledge, this is the first study examining the impact of the specific SASP factors IL1α and β associated with senescence after X- as well as after 12C-irradiation in HNSCC cell lines. Due to the data obtained, IL1α/β can now be excluded as exclusive drivers of irradiation-induced senescence and with that cellular radioresistance. Future research has to concentrate on other factors probably relevant for these biological end points.