title: Characterization of the monocyte to macrophage differentiation (MMD) protein and its homologue MMD2
Creators: name: El Chartouni, Carol
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Monozyten-Makrophagen-System , Knockout , Immuncytochemie , Zelldifferenzierung , Proteine , Genexpression , ES Zellkultur , ES cell culture , Whole mount ISH
subject: 610 Medizin

description: During the course of this work the monocyte to macrophage differentiation factor (MMD) and its homologue MMD2 were characterized. Both genes encodes for orphan proteins with a predicted seven transmembrane domain very well conserved between species. MMD mRNA expression could be shown to be upregulated in macrophages and to be ubiquitously distributed in mouse and human. In contrast, MMD2 mRNA was only detected in brain and testis and in none of the tested cell lines. This differential expression pattern indicates differences in gene regulation although MMD and MMD2 share about 68% sequence identity at the protein level. Furthermore, mouse MMD (mMMD) regulation on the mRNA level was investigated in bone marrow macrophages and found to be rapidly induced by LPS, associating MMD function with processes that occur during the first stage of the macrophage innate activation. At the protein level, mMMD cellular localization and topology were determined. For this purpose various tagged versions of the protein were generated, and used to determine its subcellular localization. Additionally, a retroviral transfection system was established in our lab, and used to generate two cell lines stably expressing two tagged versions of MMD. By performing immunocytochemistry, tagged MMD proteins were localized in perinuclear compartments with an N(cytosol) and C(lumen) orientation. The second and main aim of this project was to investigate the effect of a MMD null-mutation in mice in an attempt to elucidate its function. For this purpose ES cell culture was established, MMD targeting constructs were generated and transfected into ES cells with the aim to generate an ES knock-out cell line and to establish an MMD knock-out mouse line by blastocyst injection. As an alternative to gene targeting, an siRNA sequence was determined that can be used for further analysis of MMD function.
description: Im Rahmen dieser Arbeit wurde der �Monocyte to Macrophage Differentiation� (MMD) Faktor und dessen Homologes MMD2 charakterisiert. Beide Gene kodieren für ein unbekanntes Sieben-Transmembran-Protein, das zwischen verschiedenen Spezies sehr stark konserviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass die MMD-mRNA ubiquitär in Mensch und Maus exprimiert wird und in Makrophagen hochreguliert ist. Im Gegensatz dazu wurde die MMD2-mRNA nur im Gehirn und in den Testes, sowie in keiner der getesteten Zellen detektiert. Diese unterschiedlichen Expressionprofile deuten auf eine unterschiedliche Regulation der beiden Gene trotz einer hohen Konservierung der Proteinsequenz hin. In den Knochenmarks-Makrophagen der Maus war eine Induktion der MMD-mRNA nach einer LPS Stimulierung zu sehen. Dieses Ergebnis ist ein Hinweis darauf, dass MMD an Aktivierungsprozessen der Makrophage beteiligt ist. Auf der Proteinebene wurde die subzellulare Lokalisierung und Orientierung des mMMD bestimmt. Für diesen Zweck wurden verschiedene Versionen des Epitop-markierten Proteins generiert. Zusätzlich wurde ein retrovirales Transduktionssystem in unserem Labor etabliert, um zwei Zelllinien zu generieren, die jeweils zwei Versionen des Epitop-markierten mMMDs stabil exprimieren. Anhand von Immunzytochemie-Analysen konnte eine perinukleare Lokalisierung und eine N(Zytosol) und C(Lumen) Orientierung des Proteins festgestellt werden. Um Aufschluß über die Funktion des MMD-Gens zu bekommen, stellte die Generierung einer ES-Knockout Zelllinie den zweite Hauptteil der Arbeit dar. Für diesen Zweck wurde die ES-Zellkultur etabliert und verschiedene MMD-Targeting Konstrukte hergestellt, die in die ES-Zellen elektroporiert wurden. ES-Knockout Zelllinien sollten zur Herstellung einer MMD-Knockout-Maus verwendet werden. Als alternatives Werkzeug für die Inaktivierung des MMD-Gens wurde im Rahmen dieser Arbeit eine MMD-siRNA Sequenz definiert, die in weiteren Untersuchungen eingesetzt werden kann.