title: Small RNA-guided processes in the hyperthermophilic methanogen Methanopyrus kandleri
title: Von kleinen RNAs geleitete Prozesse im hyperthermophilen Methanogen Mathanopyrus kandleri
Creators: name: Su, Andreas A. H.
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Biowissenschaften, Biologie
kleine RNAs
CRISPR-Cas

description: In this thesis, a combination of
      RNAseq, computational and biochemical methods was applied to
      analyze processes that use small RNAs (sRNAs) as guide
      molecules at extreme temperatures. Here, the
      hyperthermophilic archaeon Methanopyrus kandleri, which grows
      at temperatures of up to 110°C, was used as a model organism.
      The genome of M. kandleri harbors two CRISPR-Cas systems that
      use CRISPR RNA (crRNA) as guide molecules to target foreign
      nucleic acids. RNAseq analysis revealed a high abundance and
      processing of crRNAs in M. kandleri that indicated that
      CRISPR-Cas systems are highly active at extreme temperatures.
      Furthermore, the crystal structure of the CRISPR-associated
      protein Csm3 was solved in collaboration with Prof. Dr. Elena
      Conti (MPI Martinsried). Csm3 was found to bind crRNAs and
      was shown to function as the crRNA-binding backbone protein
      in type III-A CRISPR-Cas interference complexes. A recently
      discovered nucleic acid-guided mechanism uses prokaryotic
      Argonaute (pAgo) proteins. In M. kandleri, a pAgo protein was
      found to be encoded within a potential operon of
      CRISPR-associated genes and the analysis of recombinant pAgo
      protein production revealed a high toxicity in Escherichia
      coli that might correlate with its potential defense function
      against plasmid DNA. Methylation of rRNA is regulated by a
      different sRNA-guided mechanism that utilizes C/D box sRNAs
      to target a ribonucleoprotein complex to the rRNA methylation
      site. In M. kandleri, a record number of 126 C/D box sRNAs
      were detected by RNAseq analysis and indicate an increased
      potential for rRNA methylation reactions. Furthermore, most
      of the C/D box sRNAs were detected as circular molecules.
      Taken together, the circularization of C/D box sRNAs and the
      high requirement for rRNA methylation are suggested to be
      adaptations to the hyperthermophilic lifestyle of M.
      kandleri. Finally, RNAseq analyses were used to identify tRNA
      precursors in M. kandleri that feature a unique C-to-U
      editing reaction of base 8. The occurrence of this editing
      event was used to deduce the order of tRNA processing steps
      in a non-compartmentalized cell, indicating that termini
      truncation precedes intron removal and editing.
description: In der vorliegenden Arbeit wurden
      RNAseq, sowie bioinformatische und biochemische Methoden
      angewandt um zelluläre Prozesse zu analysieren die von
      kleinen RNAs (sRNA) gesteuert werden. Um zu untersuchen, wie
      diese Prozesse bei extremen Temperaturen funktionieren, wurde
      das hyperthermophile Archaeon Methanopyrus kandleri, welches
      bei Temperaturen von bis zu 110°C lebt, als Modellorganismus
      verwendet. Das Genom von M. kandleri enthält zwei CRISPR-Cas
      Systeme, welche crRNAs (CRISPR RNAs) als
      Zielerkennungsmoleküle verwenden, um sich gegen Viren zur
      Wehr zu setzen. Durch RNAseq Analysen wurden große Mengen an
      prozessierten crRNAs detektiert. Dies deutet darauf hin, dass
      CRISPR-Cas Systeme bei extremer Temperatur sehr aktiv sind.
      Zudem wurde die Kristallstruktur des CRISPR-assoziierten
      Proteins Csm3 in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Elena Conti
      (MPI Martinsried) aufgeklärt. Anhand von RNA Bindestudien
      wurde Csm3 als crRNA-bindendes Protein identifiziert, welches
      als Gerüstprotein des Typ III-A CRISPR-Cas
      Interferenzkomplexes fungiert. Erst kürzlich konnte gezeigt
      werden, dass pAgo (prokaryotic Argonaute) Proteine kurze
      Nukleinsäuresequenzen verwenden, um Zielmoleküle zu erkennen.
      In M. kandleri, ist ein solches pAgo Protein in einem
      potentiellen Operon zusammen mit Proteinen des CRISPR-Cas
      Systems kodiert. Versuche pAgo rekombinant herzustellen
      wiesen auf eine hohe Toxizität des Proteins in Escherichia
      coli hin, was mit einer möglichen Abwehrfunktion gegen
      Plasmid DNA in Zusammenhang stehen könnte. Die Methylierung
      von RNA Molekülen wird durch einen anderen Prozess gesteuert,
      welcher C/D Box sRNAs als Zielerkennungssequenzen verwendet,
      um Ribonukleoproteinkomplexe an Methylierungsstellen
      ribosomaler RNAs zu führen. In M. kandleri wurde eine
      Rekordzahl von 126 C/D Box sRNAs durch RNAseq Analysen
      detektiert, welche auf eine erhöhte Methylierung von rRNAs
      hinweist. Zudem wurde ein Großteil der C/D box sRNAs als
      zirkuläre Moleküle detektiert. Zusammenfassend können die
      Zirkularisierung von C/D Box sRNAs und der erhöhte Bedarf an
      RNA Methylierungen als Adaptionen an die hyperthermophile
      Lebensweise von M. kandleri angesehen werden. Abschließend
      wurden durch RNAseq Analysen tRNA-Vorläufer Moleküle
      identifiziert, welche die nur in M. kandleri vorkommende
      C-zu-U Modifikation der Base 8 aufwiesen. Das Auftreten
      dieser Modifikation wurde genutzt, um daraus Rückschlüsse auf
      die Reihenfolge von tRNA Prozessierungsschritten in nicht
      kompartimentierten Zellen zu schließen. Unsere Analysen
      ergaben, dass das Beschneiden der Enden dem Entfernen von
      Introns, sowie der Editierungsreaktion vorrausgeht.