title: Time-resolved quantitative assays and imaging of enzymes and enzyme substrates using a new europium fluorescent probe for hydrogen peroxide
Creators: name: Wu, Meng
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2005
Subjects: subject: Fluoreszenz , Europium , Bildgebendes Verfahren , Wasserstoffperoxid , Enzym , , fluorescence , time-resolved , imaging , europium , hydrogen peroxide
subject: 540 Chemie

description: The thesis describes the development of a novel reversible H2O2 fluorescent probe comprising the ternary complex of europium(III), tetracycline and hydrogen peroxide; and its application in the assays of H2O2, of H2O2 producing oxidases and their substrates, and of H2O2 consuming catalase and its inhibitors. The probe is applied in steady-state intensity-based, time-resolved �gated�, or lifetime-based detection modes both for microplate fluorescence measurement and imaging. The fluorescent probe�s advantages include the reversibility of the EuTc-HP system, the possibility of a kinetic real-time detection of the production and the consumption of H2O2, and the system works best at pH 6.9 - 7.0. It also exhibits the typical spectral characteristics of a ligand-to-europium energy transfer system which include a Stokes shift of ~210 nm, line-like emission, excitation at 380-420 nm (e.g. by the 405-nm blue diode laser), and a µs decay time (~60 µs) facilitating time-resolved fluorometry and imaging. For the probe study, Chapter 1 gives a overview of the state of art of the H2O2 measurements. In the following first part of Chapter 2 is presented the characterization of the fluorescent EuTc-HP probe for its absorbance, circular dichroism and fluorescence spectra, fluorescence lifetime and decay profile, optimal pH and stability, and the influence of temperature, buffers, quenchers and interferents. In the last part of Chapter 6, the peculiar molar ratio of the EuTc-HP probe is further investigated for its possible structure and a com-binatorial approach for discovery of new lanthanide probes is preliminarily proceeded as well. Different assays have been developed for H2O2, glucose, glucose oxidase and catalase, as examples for the detection of enzyme substrates and enzymes. Furthermore, different fluorometric schemes have been applied, such as the steady-state intensity-based detection (Chapter 5, catalase), the time-resolved gated detections (Chapter 3, glucose), the rapid lifetime determination method (Chapter 2, H2O2, novel on microplate) and the time-correlated single photon counting method of the lifetime-based detection (Chapter 2, H2O2), for both microplates and cuvettes, compatible with high-throughput screening. The µs range lifetime of the EuTc-HP probe has greatly facilitated fluorescence imaging, a means for visualization and mapping of the analyte with multiple chemical information. Four schemes of imaging, those are the conventional fluorescence intensity imaging (FII), the time-resolved ("gated") imaging (TRI), the phase delay ratioing imaging (PDI), and the rapid lifetime determination imaging (RLI), have been tested for the quantitative analysis. Hydrogen peroxide, glucose, and glucose oxidase have been determined by the fluorescent imaging system, with Chapter 4 highlighting the fluorescence imaging of glucose oxidase. There are possible further applications in perspective for the EuTc-HP probe. Chapter 6 summarizes the initial attempts, such as glucose oxidase based ELISA, the coupled catalase/glucose oxidase system as a platform for screening, and the construction of microplate arrays and sensors.
description: Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung einer neuen reversiblen Fluoreszenzsonde für H2O2, ein ternärer Komplex, bestehend aus Europium(III), Tetracyclin und Wasserstoffperoxid, und seine Anwendungen in Untersuchungen von H2O2, H2O2-produzierenden Oxidasen und ihren Substraten, von H2O2-verbrauchender Katalase und dessen Inhibitoren. Die Sonde wurde durch stationäre intensitätsbasierende, zeitfensterbasierende, oder fluoreszenzlebensdauerbasierende Nachweismethoden auf Mikrotiterplattenbasierenden Fluoreszenzmessungen und �bildgebungen angewandt. Die Vorteile der fluoreszenten Sonde beinhalten die Reversibilität des EuTc-HP Systems, die Möglichkeit eines kinetischen Echtzeitnachweises für die Erzeugung und den Verbrauch von H2O2, außerdem funktioniert die Methode am besten bei pH 6,9 bis 7,0. Auch zeigt es die typischen spektralen Eigenschaften eines Ligand-zu-Europium Energietransfersystems, inklusive einer Stokes Verschiebung von ca. 210 nm, linienartiger Emission, Anregung bei 380-420 nm (z.B. durch den blauen Diodenlaser bei 405 nm), und eine Abklingzeit im µs-Bereich (ca. 60 µs), welche zeitaufgelöste Fluorimetrie und Bildgebung erleichtert. Zur Untersuchung der Sonde gibt Kapitel 1 einen Überblick über den aktuellen Stand der Technik von H2O2 Mesungen. In dem folgenden ersten Teil von Kapitel 2 wird die Charakterisierung der fluoreszenten EuTc-HP Sonde durch Absorption, Circulardichroismus, Fluoreszenzspektren, Fluoreszenzlebensdauer und Abklingprofil, optimaler pH-Bereich und Stabilität, und der Einfluß von Temperatur, Puffern, Quenchern und Interferenzien präsentiert. Im letzten Teil von Kapitel 6 wurde das besondere molare Verhältnis der EuTc-HP Sonde auf ihre mögliche Struktur untersucht. Auch wurde ein kombinatorischer Ansatz zur Entdeckung neuer Lanthanidsensoren vorbereitet. Als Beispiele für Nachweise von Enzymen und Enzymsubstraten wurden verschiedene Untersuchungsmethoden für H2O2, Glucose, Glucose Oxidase und Katalase entwickelt. Außerdem wurden verschiedene fluorometrische Methoden angewandt, wie stationärer, intensitätsbasierender Nachweis (Kapitel 5, Katalase), zeitfensterbasierender Nachweis (Kapitel 3, Glucose), die Rapid Lifetime Determination Methode (Kapitel 2, H2O2, auf Mikrotiterplatten neu), und die Time-Correlated Single Photon Counting Methode des lebensdauerbasierenden Nachweises (Kapitel 2, H2O2), in Mikrotiterplatten und Küvetten, Hochdurchsatzscreeningkompatibel. Der µs-Bereich der Abklingzeit der EuTc-HP Sonde hat die fluoreszente Bildgebung stark erleichtert, und bietet ein Mittel zur Visualisierung und Abbildung von Analyten mit multipler chemischer Information. Vier Bildgebungsverfahren, die normale Fluoreszenzintensitätsabbildung (FII), die zeitfensterbasierende Abbildung (TRI), die Phasenverschiebungsverhältnisabbildung (PDI), und die Rapid Lifetime Determination Abbildung (RLI) wurden für die quantitative Analyse getested. Wasserstoffperoxid, Glucose und Glucose Oxidase wurden mit dem fluoreszenten Bildgebungssystem bestimmt, Kapitel 4 hebt die fluoreszente Abbildung von Glucose Oxidase heraus. Mögliche weitere Anwendungen für die EuTc-HP Sonde sind in Sicht. Kapitel 6 fasst anfängliche Bemühungen wie Glucose Oxidase-basierendes ELISA, das gekoppelte Katalase / Glucose Oxidase System als Screeningplattform, und die Erstellung von Mikrotiterplattenarrays und �sensoren zusammen.