Ποιότητα αβγών και γονιδιακή ρύθμιση στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια της τσιπούρας Sparus aurata Linnaeus, 1758:
Creators: name: Ρουφίδου, Χρυσούλα Αχιλλέα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Γονιδιακή ρύθμιση
Ποιότητα αβγών
Τσιπούρα
Gene regulation
Egg quality
Gilthead sea bream

description: Οι πληθυσμοί των ψαριών εξαρτώνται από την παραγωγή καλής ποιότητας αβγών. Στις μονάδες ιχθυοκαλλιέργειας η ευμετάβλητη ποιότητα των αβγών αποτελεί ένα σύνηθες πρόβλημα. Καλής ποιότητας αβγά παρουσιάζουν συνήθως υψηλά ποσοστά επιβίωσης των γόνων, ενώ κακή ποιότητα αβγών οδηγεί σε σοβαρά προβλήματα, ήδη από τα πρώτα στάδια παραγωγής. Πολλοί παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα των αβγών, όπως η διαχείριση των γεννητόρων, οι φυσικοχημικές συνθήκες και το γενετικό υπόβαθρο των ψαριών. Μετά τη γονιμοποίηση, η εμβρυϊκή ανάπτυξη ελέγχεται πρωταρχικά από μητρικώς παρεχόμενα mRNAs και πρωτεΐνες και αργότερα, από το ζυγωτικό γονιδίωμα. Τα μητρικά προϊόντα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις πρώιμες διαδικασίες, καθοριστικής σημασίας για τη διαμόρφωση του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Από γενετική άποψη, μέχρι σήμερα είναι διαθέσιμες ελάχιστες μόνον πληροφορίες σχετικά με τη γονιδιακή ρύθμιση που συνδέεται με την ποιότητα των αβγών στα εκτρεφόμενα ψάρια. Ο κύριος σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν η διερεύνηση των προτύπων έκφρασης βιβλιογραφικά γνωστών και μη μελετημένων γονιδίων μητρικής προέλευσης και πρωτεϊνών στα πρώιμα εμβρυϊκά αναπτυξιακά στάδια της τσιπούρας (Sparus aurata L.) και η συσχέτιση αυτών με τη ρύθμιση της πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης και την ποιότητα των αβγών. Ως εκ τούτου, μελετήθηκε η έκφραση 16 γονιδίων (GAPDH 1 και 2, Cathepsin D, L, S* και Z*, ERK1*, JNK1*, p38α* και p38δ*, PPARα, β και γ, Tubulin β*, Ferritin M*, Cyclin A2*, με αστερίσκο τα νέα γονίδια που μελετώνται) διαφορετικών λειτουργικών κατηγοριών με χρήση συμβατικής RT-PCR, καθώς και το πρότυπο έκφρασης 12 εξ αυτών σε 7 αναπτυξιακά στάδια της τσιπούρας (από το στάδιο των 2,4 κυττάρων μέχρι και το στάδιο της ½ επιβολής), με χρήση ποσοτικής Real-Time PCR (qRT-PCR). Η αναγνώριση της πιθανής τμηματικής νουκλεοτιδικής ακολουθίας για 9 από τα προαναφερόμενα γονίδια, τα οποία για πρώτη φορά περιγράφονται στην τσιπούρα, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ευρέως φάσματος εργαλείων βιοπληροφορικής. Επιπλέον, έγινε η ανάλυση της έκφρασης 5 πρωτεϊνών (JNK, ERK, p38 MAPK, HSP 70 και HSP 90) στα 7 πρώιμα αναπτυξιακά στάδια της τσιπούρας, καθώς και σε δύο προκαταρκτικά δείγματα αβγών τσιπούρας χαμηλής ποιότητας διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων, με τη τεχνική της ανοσοαποτύπωσης (Western blotting). Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι τα γονίδια GAPDH 2, Cathepsin S, PPARα και γ δεν παρουσίασαν έκφραση στην πρώιμη ανάπτυξη της τσιπούρας. Από την άλλη, η ανάλυση των υπολοίπων γονιδίων με qRT-PCR έδειξε ότι 11 από αυτά παρουσίασαν χαρακτηριστική απότομη καταστολή της έκφρασης τους στο στάδιο του υψηλού βλαστιδίου, γεγονός που πιθανώς συνδέεται με τη λειτουργία τους ως γονίδια μητρικής επίδρασης και συνεπώς ενδέχεται να χρησιμεύουν ως δείκτες ποιότητας των αβγών. Παράλληλα, η μελέτη της έκφρασης των 5 πρωτεϊνών, τόσο στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια της τσιπούρας, όσο και στα δύο προκαταρκτικά δείγματα αβγών χαμηλής ποιότητας, έδειξε διαφοροποιημένα χρονικά πρότυπα έκφρασης τους τα οποία άλλοτε συμβαδίζουν με τα πρότυπα των αντίστοιχων γονιδίων και άλλοτε όχι. Ως εκ τούτου, θεωρείται απαραίτητη η περαιτέρω μελέτη του θέματος τόσο σε επίπεδο πρωτεϊνών, όσο και σε επίπεδο γονιδίων για τη βελτίωση της κατανόησης των λειτουργιών τους στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς και για την αναγνώριση και χαρακτηρισμό πρώιμων βιοδεικτών, οι οποίοι θα μπορούν να είναι χρήσιμοι στα εκτρεφόμενα είδη ιχθύων, ώστε να μειωθεί το οικονομικό αντίκτυπο της αύξησης χαμηλής ποιότητας αβγών και προνυμφών στις ιχθυοκαλλιέργειες.
description: Fish populations are dependent on the production of good egg quality. However, in commercial fish farming, variable egg quality is a common issue. Good quality eggs usually exhibit high survival rates of offspring, while poor quality eggs lead to major problems during the early production stages. Many parameters can affect egg quality, such as broodstock management, physicochemical conditions and genetic influences. After fertilization, the embryonic development is initially regulated by maternally provided mRNAs and proteins and later by the zygotic genome. Maternal mRNAs have an important role in initiating processes crucial to patterning the developing fish embryo. From the genetic point of view, only scarce information is available to date for farmed fish regarding gene regulation of egg quality. The main purpose of this master thesis was to investigate the expression patterns of maternal effect genes (new and others known from literature) and of some proteins in early embryonic developmental stages of gilthead sea bream (Sparus aurata L.), and their correlation with the control of early embryonic development and egg quality. Therefore, the expression of 16 genes (GAPDH 1 and 2, Cathepsin D, L, S* and Z*, ERK1*, JNK1*, p38α* and p38δ*, PPARα, β and γ, Tubulin β*, Ferritin M*, Cyclin A2*, newly studied genes are marked with asterisk) of different functions was studied with standard RT-PCR, as well the expression pattern of 12 of the above genes in 7 developmental stages of gilthead seabream (from 2,4 cells to ½ epibolie stage), using quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Identification of putative partial nucleotide sequence for 9 of the above mentioned genes, which are described for the first time in gilthead sea bream, was performed using a broad range of bioinformatic tools. Furthermore, the analysis of expression of 5 proteins (JNK, ERK, p38 MAPK, HSP 70 και HSP 90) in 7 early developmental stages of gilthead sea bream, as well in two preliminary samples of low quality gilthead sea bream eggs of various developmental stages was performed using Western blotting technique. The results of the present study indicated that the genes GAPDH 2, Cathepsin S, PPARα and γ showed no expression in early development of gilthead sea bream. On the other hand, the analysis of the remaining genes by qRT-PCR showed that 11 of them exhibited a significant and abrupt suppression of their expression in high blastula stage, a typical expression pattern that indicates their possible function as maternal effect genes and thus a probable role as indicators of egg quality. At the same time, the study of the expression of 5 proteins, both in the early developmental stages of gilthead sea bream and in the two preliminary samples of low quality eggs, showed differential temporal expression patterns, which sometimes follow with the standards of the respective genes and sometimes not. Consequently, further study is considered necessary at both protein and gene level to improve the understanding of their functions in embryonic development as well as to identify early biomarkers, which could be useful in farmed fish, in order to reduce the economic impact of increasing low quality eggs and larvae in aquaculture.