title: Konstruktion synthetischer Stoffwechselwege zur Produktion von(R)-Benzylsuccinat und weiteren aromatischen Metaboliten
title: Construction of a synthetic metabolic pathway for the production of (R)-Benzylsuccinate and further aromatic compounds
Creators: name: Mock, Johanna
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: beta-Oxidation, anaerob
synthetic metabolic pathway
Synthetischer Stoffwechselweg
Enzymologie
anaerob
Biotechnologie
Biokatalyse
Benzylsuccinat
Biowissenschaften, Biologie
Biphenyl, Biotechnologie
beta-oxidation, anaerobe,enzymemology
Benzylsuccinat, Biphenyl
biotechnology
benzylsuccinate, biphenyl
Enzymologie, beta-Oxidation

description: The aim of this work was the
      generation of a synthetic bacterial production strain, which
      produces new fermentation products via modified anaerobic
      pathways. In a first step a synthetic module for the
      production of benzoyl-CoA as biosynthetic precursor was
      established in the host organism Escherichia coli. Therefore
      a benzoatetransporter (encoded in the benK gene from the
      benzoate degrading bacterium Aromatoleum aromaticum) and a
      bezoate-CoA ligase (encoded in the bclAgene from A.
      aromaticum) were linked. In this work this biosynthetic
      module for benzoyl-CoA formation was used for the
      developement of bacterial pathwaysfor (R)-benzylsuccinate
      synthesis or for the synthesis of biphenyls, which occour in
      nature as secondary plant metabolites. The usage of this
      benzoyl-CoA biosynthesis module can be more expanded by using
      it as a building block for further synthetic pathways, which
      are benzoyl-CoA depending. Hence, it can be used for the
      synthesis of many useful natural products, which are produced
      via a benzoyl-CoA intermediate. i) Benzylsuccinate, an
      aromatic dicarboxylic acid, formed as first intermediate
      during anaerobic toluene degradation, is of potential
      biotechnological interest e. g. for the formation of
      bio-polymers. For the biological production of
      benzylsuccinate a second biosynthetic module was generated.
      This module contains genes coding for seven enzymes from
      Geobacter metallireducens, which occur in anaerobic toluene
      degradation. Normally these enzymes catalyse the degradation
      of the first intermediate benzylsuccinate to benzoyl-CoA and
      succinate via a modified β-oxidation pathway. During
      co-expression of both biosynthetic modules in E. coliand
      feeding with benzoate indeed benzylsuccinate was formed by
      the reversed β-oxidation pathway in significant amounts. The
      yield was increased 1000-fold by switching from aerobic
      respiration to anaerobic mixed acid fermentation and fumarate
      respiration (from 3 nM up to 5 µM). This result verifies the
      idea of the project, to form synthetic anaerobic production
      strains. The production could be further increased by a
      factor of 3.5 by the addition of a gene coding for an
      unspecific mechanosensitive channel, which exports the formed
      metabolite into the medium. This system can now be further
      optimized by genetical modifications supported by
      mathematical modelling of the pathway and by optimization of
      the production conditions to increase the production upto a
      possible industrial application. ii) For the synthesis of the
      secondary plant metabolite3,5-dihydroxybiphenyl the
      biosynthetic module for benzoyl-CoA formation was combined
      with genes coding for a biphenyl synthase from the rowan
      berry (lat. Sorbus aucuparia) and a malonyl-CoA synthetase
      from Paracoccus denitrificans. These genes were coexpressed
      in the host organisms E. coliand Shimwellia blattae. The
      malonyl-CoA synthetase was added to ensure the supply of the
      second precursor malonyl-CoA. Although all enzymes necessary
      for this pathway were produced with sufficient activities, no
      biphenyl formation was detected so far. Instead the generated
      synthetic bacteria produced large amounts of indole, which is
      known as a stress metabolite in enterobacteria. In addition
      to indole some further yet unknown metabolites were
      detected.One of these metabolites is formed from malonate.
      Further investigations are necessary to identify this
      metabolite and to figure out how it is linked to the
      syntheticbiphenyl pathway.
description: In dieser Arbeit wurden
      „synthetische“ anaerobe Bakterien konstruiert, die über
      Veränderungen ihrer Gärungswege neuartige
      Fermentationsprodukte herstellen. In einem ersten Schritt
      wurde ein Synthese-Modul für die Produktion von Benzoyl-CoA
      als biosynthetisches Startermolekül in Escherichia
      colientwickelt, das aus einem Benzoattransporter (kodiert
      durch benKaus dem Benzoat-abbauenden Bakterium Aromatoleum
      aromaticum) und einer Benzoat-CoA Ligase (kodiert durch bclA
      aus A. aromaticum) besteht. In dieser Arbeit wurde dieses
      Synthese-Modul zur Entwicklung von Stoffwechselwegen zur
      (R)-Benzylsuccinat-Synthese oder zur Synthese pflanzlicher
      Biphenyle in Bakterien eingesetzt. Das Synthese-Modul kann
      darüber hinaus zur Biosynthese vieler weiterer interessanter
      Naturstoffe eingesetzt werden, bei denen Benzoyl-CoA als
      Baustein benötig wird. i) Die aromatische Dicarbonsäure
      Benzylsuccinat ist ein Intermediat des anaeroben Toluolabbaus
      mit potentiellen biotechnologischen Anwendungen, z.B. zur
      Synthese von Bio-Polymeren. Für die biologische Produktion
      von Benzylsuccinat wurde ein zweites biosynthetisches Modul
      generiert, das aus den Genenfür sieben Enzyme aus Geobacter
      metallireducensbesteht, die am anaeroben Toluol-Abbau
      beteiligt sind. Diese Enzyme katalysieren normalerweise den
      Abbau des ersten Intermediats Benzylsuccinat zu Benzoyl-CoA
      und Succinat über eine modifizierte β-Oxidation. Durch
      gleichzeitige Expression beider Biosynthese-Module in E.
      coliund durch Zufütterung von Benzoat war es tatsächlich
      möglich, durch das Umkehren der β-Oxidation Benzylsuccinat in
      signifikanten Mengen zu produzieren. Die Ausbeute wurde ca.
      1000-fach gesteigert durch anaerobe Anzucht unter Gärungs-
      und Fumaratatmungsbedingungen (von ca. 3 nM auf bisher max. 5
      µM). Dies belegt, dass die Projektidee zur Schaffung
      „synthetischer Anaerobier“ tatsächlich funktioniert. Außerdem
      wurde gezeigt, dass die zusätzliche Expression eines Gens für
      ein unspezifisches Exportkanal-Protein die Ausbeute an
      produziertem Benzylsuccinat um den Faktor 3,5 steigern kann.
      Dieses System kann nun über weitere genetische Veränderungen
      in Verbindung mit Modell-rechnungen auf gesteigerte
      Produktivität bis hin zueiner möglichen industriellen
      Anwendung optimiert werden. ii) Für die Synthese des
      pflanzlichen Sekundärmetaboliten 3,5-Dihydroxybiphenyl wurden
      zusätzlich zum „Benzoyl-CoA-Modul“ Gene für die entsprechende
      Biphenyl-Synthase aus der Vogelbeere (lat. Sorbus aucuparia)
      sowie für eine Malonyl-CoA Synthetase aus Paracoccus
      denitrificansin die Wirtsorganismen E. coliund Shimwellia
      blattae eingeführt. Die Malonyl-CoA Synthetase diente hierbei
      zur besseren Versorgung mit dem zweiten notwendigen
      Biosynthesebaustein Malonyl-CoA. Obwohl alle Enzyme in
      ausreichender Aktivität produziert wurden, wurde hier bisher
      noch keine Biphenyl-Produktion beobachtet. Stattdessen
      produzierten diekonstruierten Zellen große Mengen an Indol,
      das in Enterobakterien als Stress-Metabolit bekannt ist.
      Neben Indol wurden in den rekombinanten Zellen auch einige
      unbekannte Verbindungen detektiert. Eine dieser Verbindungen
      beinhaltet Malonat als Synthesebaustein. Weitere
      Untersuchungen sind daher nötig, um die Identität dieser
      Malonat-abhängigen Verbindung aufzuklären und um zu zeigen,
      in welchem Zusammenhang diese Substanz mit dem synthetischen
      Biphenyl-Stoffwechselweg steht.