title: Laktoferrininduzierte Signaltransduktion und Genexpression in THP-1 Monozyten
Creators: name: Wetzel, Ellen Maria
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Das eisenbindende Glykoprotein Laktoferrin sowie das pleiotrope Zytokin TGF-β1 sind in immunmodulatorische Prozesse involviert und an der Regulation zahlreicher physiologischer Prozesse beteiligt. In den letzten Jahren konnte unsere Arbeitsgruppe teilweise vergleichbare Effekte der beiden multifunktionellen Proteine auf die Aktivierung von Signalwegen und auf die Expression ausgewählter Gene anhand verschiedener Zelllinien nachweisen. Der exakte Mechanismus, über welche Signalwege die laktoferrininduzierte Aktivierung von Zielgenen reguliert wird, blieb dabei weitgehend unerforscht. Aus diesen Arbeiten entstand die Annahme, dass Laktoferrin und TGF-β1 in THP-1 Monozyten die PAI-1 mRNA Expression über den p38 oder ERK1/2 MAPK Pathway, smadunabhängig, stimulieren. Unter Anwendung spezifischer Inhibitoren der genannten Signalwege wurde es in dieser Arbeit möglich, die Kenntnis der Spezifität und der physiologischen Bedeutung zu erhellen. Laktoferrin und TGF-β1 sind an der Regulation der Immunantwort beteiligt und interagieren mit Zellen des Immunsystems, was die physiologische Relevanz der monozytären humanen leukämischen Zelllinie THP-1 als Zellmodell aufzeigt. TGF-β1 induzierte sowohl die Aktivierung von p38 als auch von ERK1/2, während in Antwort auf Laktoferrin lediglich die Aktivierung von p38 erfolgte. Die Relevanz der Aktivierung von p38 konnte nicht bestimmt werden, da die Aktivität der downstream Kinase MAPKAP2 nicht detektierbar war. Die erhöhte Expression der PAI-1 mRNA, nach Stimulierung mit Laktoferrin und TGF-β1, konnte durch Einsatz der MAPK Inhibitoren nicht verhindert werden. Somit ist es unwahrscheinlich, dass PAI-1 in monozytären THP-1 Zellen in Antwort auf Laktoferrin und TGF-β1 über den MAPK Signalweg stimuliert wird. Durch anschließende Untersuchungen zur Akkumulation von Smad2 im Zellkern konnte gezeigt werden, dass die Laktoferrin und TGF-β1 induzierte PAI-1 Expression durch SB-431542, als spezifischer Inhibitor von TβR-I, vollständig rückgängig gemacht wird. Aufgrund dieser Ergebnisse kann darauf geschlossen werden, dass sowohl Laktoferrin als auch TGF-β1 die PAI-1 mRNA Expression in THP-1 Monozyten über den Smad2 Pathway stimulieren. Bei Untersuchungen des Einflusses der beiden Stimuli auf das Wachstum der THP-1 Zellen, schienen Laktoferrin und TGF-β1 zunächst das Wachstum der monozytären THP-1 Zellen zu hemmen. Jedoch wurde mikroskopisch eine Veränderung der Morphologie und die Induktion der Adhärenz beobachtet. TGF-β1 zeigte eine vergleichbare Induktion der Adhärenz mit PMA, dem Standard-differenzierungsmittel, während die mit Laktoferrin behandelten Zellen in sehr viel geringerem Ausmaß adhärierten. Anhand eines Zellproliferationsassays, zur Bestimmung der Gesamtanzahl von viablen, suspendierten und adhärenten THP-1 Zellen konnten keine wachstumshemmenden Effekte von Laktoferrin und TGF-β1 beobachtet werden. Die Aktivität von Differenzierungsmarkern wie MMP-2 und MMP-9 wurde weder von Laktoferrin noch von TGF-β1 beeinflusst, während Zellen die durch Stimulierung mit PMA differenzierten im Zymogramm eine erhöhte Aktivität von pro-MMP-9 zeigten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Laktoferrin und TGF-β1 zwar die Adhärenz der Zellen fördern, nicht aber die vollständige Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen induzieren. Dazu wäre von Interesse, weitere Differenzierungsmarker zu analysieren um die Details der Steuerung der Differenzierung zu erhellen.
description: Lactoferrin, an iron-binding glycoprotein, as well as the pleiotropic cytokine TGF-β1 is involved in the regulation of multitudinous physiological processes. In the recent years our laboratory could detect partially super imposable effects of the two multifunctional proteins on the activation of signaling pathways and the expression of selected target genes in different cell lines. The exact mechanism how lactoferrin induces gene expression largely rested unexplored. This work ties up a previous one where the assumption arised that lactoferrin and TGF-β1 stimulate the PAI-1 mRNA expression in THP-1 monocytes, Smad-independent, via the p38 or ERK1/2 MAPK signaling pathway. To confirm this, western blot and PCR analysis presented in this work were carried out utilising specific inhibitors of these signaling pathways. Of physiological relevance is the human monocytic leukemic cell line THP-1 as cell model as Lactoferrin and TGF-β1 are involved in the regulation of immune responses and interact with immune cells. TGF-β1 induced both, the activation of p38 and ERK1/2, whereas the activation of p38 only could be detected in response to lactoferrin. The relevance of the activation of p38 could not be determined, because the activity of the downstream kinase MAPKAP2 was not detectable. Increased expression of PAI-1 mRNA, after stimulation with TGF-β1 and lactoferrin, could not be prevented by MAPK inhibitor treatment. Hence it is unlikely that in THP-1 monocytes, PAI-1 is stimulated in response to lactoferrin and TGF-β1 via the MAPK signaling pathway. Subsequent analysis determining the accumulation of Smad2 in the nucleus showed that the lactoferrin and TGF-β1 induced PAI-1 mRNA Expression was reversed completely with SB-431542, a specific inhibitor of TβR-I. Based on these results it can be concluded that in THP-1 monocytes both, lactoferrin and TGF-β1, stimulate PAI-1 expression via the Smad2 pathway. Examination of the influence of lactoferrin and TGF-β1 on the growth of monocytic THP-1 cells initially led to the assumption that they induced an inhibitory effect on cell growth. However morphology changes and induction of adherence was observed microscopically, this was confirmed by subsequent experiments. TGF-β1 showed a similar induction of adhesion with PMA, whereas lactoferrin-treated cells adhered in a much lower extent. A cell proliferation assay, determining the number of viable suspension and adherent THP-1 cells, showed no growth-inhibitory effects of lactoferrin and TGF-β1. Activity of MMP-2 and MMP-9 was neither affected by lactoferrin nor by TGF-β1. Since differentiated cells treated with PMA featured increased activity of pro-MMP-9, it can be suggested that lactoferrin and TGF-β1 promote adherence of THP-1 cells but do not induce the entire differentiation of monocytes into macrophages. The details of regulatory mechanisms of this partial differentiation have yet to be elucidated by further analysis of alternative differentiation markers.