Επίδραση των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης στην έκφραση, διαλυτότητα και λειτουργικότητα της ανασυνδυασμένης λουσιφεράσης:
Creators: name: Χατσισβίλι, Αννα Τεϊμουράζ (Anna Chatsisvili)
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Πρωτεΐνες θερμικής καταπόνησης
Διαλυτότητα πρωτεϊνών
Αναδίπλωση πρωτεϊνών
Heat shock proteins
Protein solubility
Protein refolding

description: Ο ευρύτερα χρησιμοποιούμενος φορέας έκφρασης για την παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών για θεραπευτικούς, διαγνωστικούς και ερευνητικούς σκοπούς αποτελεί το βακτήριο Escherichia coli λόγω του χαμηλού κόστους και της αυξημένης του απόδοσης. Όμως, η δυσκολία ορθής αναδίπλωσης των υπερεκφραζόμενων πρωτεϊνών που οδηγεί στο σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων, γνωστών ως βακτηριακά έγκλειστα, αποτελεί το μεγαλύτερο πρόβλημα κατά τη χρήση του. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος αυτού έχουν χρησιμοποιηθεί τεχνικές βελτίωσης της αναδίπλωσης και αύξησης της διαλυτότητας, όπως η έκφραση των πρωτεϊνών σε χαμηλές θερμοκρασίες, η συνέκφραση μοριακών συνοδών πρωτεϊνών, καθώς και η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ως υβρίδιο είτε με πρωτεΐνη υψηλής διαλυτότητας (π.χ. πρωτεΐνη πρόσδεσης της μαλτόζης) είτε με πρωτεΐνη θερμικής καταπόνησης που δρα ως συνοδός πρωτεΐνη (π.χ. DnaK, GroEL). Αποτελεσματικότερη χαρακτηρίστηκε η τελευταία μέθοδος, ωστόσο στις προηγούμενες μελέτες δεν είχε προσδιοριστεί η λειτουργικότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης και έτσι δεν ήταν γνωστό αν η αύξηση της διαλυτότητάς της οφείλεται στην ορθή αναδίπλωσή της. Επομένως, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η παραγωγή υβριδίων της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με DnaK και GroEL και η μελέτη της έκφρασης, διαλυτότητας και λειτουργικότητάς τους σε in vivo και in vitro πειράματα. Ως πρωτεΐνη αναφοράς χρησιμοποιήθηκε η λουσιφεράση πυγολαμπίδας Photinus pyralis, η οποία παρουσιάζει εύκολα καταγραφόμενη ενζυμική δράση, συγκεντρώνεται στα έγκλειστα όταν υπερεκφράζεται στην Escherichia coli και η in vitro αναδίπλωσή της είναι ανεπαρκής. Η σύντηξη της λουσιφεράσης με DnaK και GroEL βρέθηκε ότι αυξάνει την in vivo διαλυτότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών DnaK-λουσιφεράση (80%) και GroEL-λουσιφεράση (14%), όταν η έκφραση πραγματοποιείται στους 37°C. Αντίθετα, η ελεύθερη λουσιφεράση είναι σχεδόν πλήρως αδιάλυτη. Η έκφραση σε χαμηλότερη θερμοκρασία (28°C) βελτιώνει την ποσότητα των παραγόμενων πρωτεϊνών (κατά 17% της λουσιφεράσης, 37,5% της DnaK-λουσιφεράσης και 15% της GroEL-λουσιφεράσης) και τη διαλυτότητα της λουσιφεράσης (7%) και της GroEL-λουσιφεράσης (40%), ενώ δεν έχει επίδραση στην ήδη υψηλή διαλυτότητα της DnaK-λουσιφεράσης (80%). Η συνέκφραση των συν-συνοδών πρωτεϊνών DnaJ/GrpE βελτιώνει περαιτέρω την in vivo διαλυτότητα της DnaK-λουσιφεράσης, ενώ η συνέκφραση της GroES δεν έχει επίδραση στη διαλυτότητα της GroEL-λουσιφεράσης. Οι μελέτες της in vitro αναδίπλωσης μετά από χημική μετουσίωση έδειξαν ότι τα υβρίδια DnaK-λουσιφεράση και GroEL-λουσιφεράση παραμένουν διαλυτά (97,5%) μετά την απομάκρυνση του μετουσιωτικού παράγοντα, σε αντίθεση με τη λουσιφεράση (5%). Η αυξημένη αυτή διαλυτότητα οφείλεται στην ορθή αναδίπλωση της λουσιφεράσης που βρίσκεται συντηγμένη με τις συνοδούς πρωτεΐνες, γεγονός που επιβεβαιώνεται από τα πειράματα μέτρησης της in vitro ενεργότητας λουσιφεράσης. Στα πειράματα αυτά, η DnaK-λουσιφεράση αναδιπλώνεται κατά 20%, ενώ παρουσία ATP και εξωγενούς DnaK αναδιπλώνεται βέλτιστα (90%). Η GroEL-λουσιφεράση αναδιπλώνεται κατά 30% και η μέγιστη αναδίπλωσή της καταγράφεται παρουσία DnaK/DnaJ και ATP (95%), ενώ η λουσιφεράση αναδιπλώνεται κατά 10-15% και απαιτεί DnaK/DnaJ/GrpE (45-90%) ή GroEL/GroES (30%) σε συνδυασμό με ATP για περαιτέρω αναδίπλωση. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η απόδοση, η διαλυτότητα και η αναδίπλωση της λουσιφεράσης μπορούν να βελτιωθούν παρουσία συντηγμένης συνοδού πρωτεΐνης, DnaK ή GroEL. Τα αποτελέσματα είναι θετικότερα παρουσία της DnaK, εφόσον η παραγωγή της λουσιφεράσης και η in vivo και in vitro διαλυτότητά της λόγω ορθότερης αναδίπλωσης είναι καλύτερες σε σχέση με εκείνες που παρατηρούνται στην περίπτωση χρήσης της GroEL.
description: The most extensively used organism for the production of proteins for therapeutic, diagnostic and research applications is the enteric bacterium Escherichia coli, since it offers several advantages, such as low cost and high-yield protein expression. However, overexpressed recombinant proteins often fail to fold properly. As a result, insoluble aggregates known as inclusion bodies are formed. In order to aid folding and solubility and to improve expression of active recombinant proteins, several methods have been used, e.g. expression at lower temperatures, co-expression of molecular chaperones or expression of proteins fused either with a solubility-enhancing tag (e.g. maltose binding protein) or a molecular chaperone (e.g. the heat shock proteins DnaK and GroEL). Although the latter method has been shown to produce superb results and overcome successfully the recombinant protein solubility problem, previous studies could not differentiate between protein solubility and correct protein folding (since protein activity had not been defined). Hence, the aim of the present work was to generate DnaK and GroEL with a reporter enzyme and study the effects of each fusion on expression, solubility and activity by conducting in vivo and in vitro experiments. Firefly luciferase was used as the reporter protein, since its enzymatic activity is easily assayed, forms inclusion bodies when overexpressed in E. coli and fails to refold in vitro. According to in vivo experiments, fusion proteins DnaK-luciferase (80%) and GroEL-luciferase (14%) are soluble when expressed at 37°C, in contrast to luciferase (approximately 0%). At lower temperature (28°C), the solubility of DnaK-luciferase remains the same (80%), but the solubility of luciferase (7%) and GroEL-luciferase (40%) is enhanced; moreover, the expression of all proteins is increased (37.5%, 17% and 15%, respectively). Co-expression of co-chaperones DnaJ/GrpE improves further the solubility of DnaK-luciferase, but co-expression of GroES does not affect the solubility of GroEL-luciferase. The study of in vitro refolding after chemical denaturation showed that fusion proteins DnaK-luciferase and GroEL-luciferase remain soluble (97.5%) after the removal of the denaturant, in contrast to luciferase (5%). This enhanced solubility is due to the correct folding of luciferase by fused chaperones, as it has been confirmed by measurements of in vitro luciferase activity. In particular, luciferase, DnaK-luciferase and GroEL-luciferase refold 10-15%, 20% and 30%, respectively, in the absence of ATP and exogenous chaperones. However, for maximum refolding, ATP and DnaK/DnaJ/GrpE (45-90%) or GroEL/GroES (30%) are required for luciferase, ATP and exogenous DnaK for DnaK-luciferase (90%) and ATP and DnaK/DnaJ for GroEL-luciferase (95%). In conclusion, expression, solubility and refolding of luciferase are enhanced when it is fused with chaperones DnaK or GroEL. However, fusion with DnaK is recommended, since the production and in vivo and in vitro solubility of luciferase are optimum in this case.