title: Peroxisomale Biogenese in Säugerzellen: Charakterisierung der Pex11-Proteine und deren Rolle in Wachstum und Teilung von Peroxisomen
title: Biogenesis of peroxisomes in mammalian cells: Characterization of the Pex11 proteins and their role in peroxisomal growth and division
Creators: name: Delille, Hannah Katharina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Peroxisomal biogenesis
Pex11-Proteine
Peroxisome
Pex19
Biogenese
Fis1
Medizin, Gesundheit
Pex11 proteins
Peroxisom

description: Peroxisomes are multifunctional
      organelles involved in various metabolic processes.
      Peroxisomal malfunctions lead to numerous mostly severe
      disorders, rendering perox-isomes essential for human health
      and development. Peroxisomal abundance can be adjusted to the
      cellular needs, since peroxisomes have the capacity to
      proliferate or to be degraded. Peroxisomes multiply by growth
      and division, but can also form de novo via the endoplasmic
      reticulum. Peroxisomal growth and division is a multistep
      process involving peroxisome elongation, constriction and
      final fission. The molecular components and mechanisms
      mediating the formation, growth, division and dynamics of
      peroxisomes are far from being understood. Pex11pβ, DPL1 and
      hFis1 were previously identified as the first molecular
      components involved in proliferation and division of
      peroxisomes in mammals. Pex11pβ mediates peroxisome
      elongation, while hFis1 serves as membrane adaptor for DLP1
      responsible for division of the organelles. Surprisingly,
      DLP1 and hFis1 are involved in both mitochondrial and
      peroxisomal division. Aim of this study was to further reveal
      the molecular mechanisms of peroxisomal proliferation and
      division. First, the dual targeting of hFis1, a tail-anchored
      protein, was studied. It was demon-strated for the first time
      that peroxisomal but not mitochondrial targeting of hFis1
      de-pends on Pex19p, a peroxisomal import factor. An essential
      binding region for Pex19p was located within the last 26
      C-terminal amino acids of hFis1. The basic amino acids in the
      very C-terminus are not essential for Pex19p binding and
      peroxisomal targeting but are instead required for
      mitochondrial targeting. Since overexpression of Pex19p alone
      was not sufficient to shift the targeting of hFis1 to
      peroxisomes, further regulative mechanisms are likely to be
      involved. The findings indicate that targeting of hFis1 to
      peroxisomes and mitochondria are independent events and
      support a direct, Pex19p-dependent targeting of peroxisomal
      tail-anchored proteins. Furthermore, Pex11pβ and its isoforms
      Pex11pα and Pex11pγ have been studied. Pex11 proteins are the
      only proteins known to induce peroxisome elongation and
      proliferation in mammals, and it is assumed that they are key
      components in the regulation of peroxisome abundance. In this
      study, a comparative characterization of the Pex11p isoforms
      was performed for the first time. Differently tagged and
      truncated versions were generated and alterations of
      peroxisome formation and division were monitored.
      Interestingly, it was shown that the Pex11 proteins have
      (only) partially overlapping functions. Pex11pβ expression is
      known to induce formation of tubular peroxisomes, followed by
      segmentation of the tubules before they are divided by the
      division machinery. It was demonstrated here that Pex11pγ
      promotes tubulation of peroxisomes similar to Pex11pβ, but
      does not induce subsequent segmentation of the peroxisomal
      tubules. Pex11pα, on the other hand, induces only a
      segregation of peroxisomal proteins. Thus, Pex11pα and
      Pex11pγ appear to fulfil different functions, which are
      combined in Pex11pβ. Furthermore, the Pex11 proteins show
      different sensitivities to the detergent Triton-X 100, which
      is likely to be related with different lipid binding
      properties, which might in turn explain their capacities to
      deform membranes. Several signals inducing peroxisome
      elongation (e.g. microtubule depolymerisation) were examined,
      and it was demonstrated that multiple simultaneous stimuli
      result in hypertubulation of peroxisomes. The hypertubulation
      was not mediated by transcriptional upregulation of the Pex11
      proteins. This additive effect indicates that complex
      regulation and activation mechanisms of the Pex11 proteins
      exist (e.g. post-translational modifications), and/or that
      other effectors than Pex11pβ are able to mediate elongation
      of peroxisomal membranes. Moreover, it was discovered that a
      Pex11pβ-YFP fusion protein can be used as a specific tool to
      further dissect the growth and division process at early time
      points. Pex11pβ-YFP inhibits peroxisomal segmentation and
      division, but instead results in formation of pre-peroxisomal
      membrane structures composed out of globular domains and
      tubular extensions. These structures were characterized in
      detail. Interestingly, peroxisomal matrix and membrane
      proteins were targeted to distinct regions of the peroxisomal
      structures. Performing time-course and import assays, it was
      shown that Pex11pβ-mediated membrane formation was initiated
      at the pre-existing peroxisome. This indicates that growth
      and division of peroxisomes follows a multistep maturation
      pathway and that formation of mammalian peroxisomes is more
      complex than simple division of a pre-existing organelle. In
      this study, the early steps of the peroxisomal growth and
      division process have been characterized in detail for the
      first time. The findings give new insights into the general
      processes of peroxisome formation by growth and division, and
      indicate the involvement of new, not yet characterized
      processes (e.g. in protein sorting) at the peroxisomal
      membrane.
description: Peroxisomen sind multifunktionale
      Zellorganellen, die in eine Vielzahl von metaboli-schen
      Prozessen involviert sind. Peroxisomale Dysfunktionen führen
      zu verschiedensten zum Teil schwerwiegenden Erkrankungen.
      Peroxisomen sind für die Entwicklung und Gesundheit des
      Menschen essentiell. Die Anzahl der Peroxisomen kann den
      jeweiligen Anforderungen durch Proliferation oder Degradation
      der Organellen angepasst werden. Peroxisomen vermehren sich
      durch Wachstum und Teilung, sie können aber auch de novo aus
      dem Endoplasmatischen Retikulum gebildet werden. Der
      Wachstums- und Teilungsprozess besteht aus mehreren
      Schritten: Elongation, Segmentierung und anschließende
      Durchschnürung der peroxisomalen Tubuli. Die genauen
      Mechanismen und molekularen Komponenten der Wachstums- und
      Teilungsmaschinerie sind noch weitestgehend unbekannt. Die
      ersten identifizierten Säugerproteine sind Pex11pβ, hFis1 und
      DLP1. Pex11pβ vermittelt die peroxisomale Elongation, während
      hFis1 der Membranandapter für DLP1 ist, welches wiederum die
      Organellen teilt. Interessanterweise sind hFis1 und DLP1
      gleichermaßen an der Teilung der Mitochondrien beteiligt.
      Ziel dieser Arbeit war es nun die molekularen Mechanismen der
      peroxisomalen Proliferation und Teilung weiter aufzuklären.
      Zunächst wurde das duale Targeting von hFis1, einem
      C-terminal verankerten Protein, untersucht. Es konnte gezeigt
      werden, dass Pex19p, ein peroxisomaler Importfaktor, an hFis1
      bindet und das peroxisomale Targeting von hFis1 vermittelt.
      Pex19p wird hinge-gen nicht für den mitochondrialen Import
      benötigt. Die Binderegion von Pex19p konnte auf die
      C-terminalen 26 Aminosäuren eingegrenzt werden. Des Weiteren
      wurde gezeigt, dass basische Aminosäuren im C-Terminus von
      hFis1 zwar für den mitochondrialen Import von Nöten sind, der
      peroxisomale Import und die Bindung von Pex19p erforderte
      diese Aminosäuren hingegen nicht. Weitere
      Regulations-mechanismen scheinen zu existieren, da das
      peroxisomale Targeting von hFis1 nicht mittels Überexpression
      von Pex19p gesteigert werden konnte. Die erzielten Ergebnisse
      lassen den Schluss zu, dass das Targeting von hFis1 zu
      Peroxisomen und Mitochondrien zwei unabhängige Prozesse sind.
      Zudem scheinen C-terminal verankerte Proteine direkt und
      Pex19p-abhängig in die peroxisomale Membran inseriert zu
      werden. Des Weiteren wurde Pex11pβ sowie dessen beide
      Isoformen Pex11pα und Pex11pγ untersucht. Pex11-Proteine sind
      die einzig bekannten Proteine, die im Säuger die Elongation
      und Proliferation von Peroxisomen induzieren; sie erfüllen
      daher (vermutlich) eine Schlüsselfunktion in der Regulation
      der Peroxisomenanzahl. Hier wurde zum ersten Mal eine
      vergleichende Charakterisierung der Pex11p-Isoformen
      durchgeführt. Unterschiedlich getaggte und trunkierte
      Konstrukte wurden generiert und deren Auswirkungen auf die
      Bildung und Teilung der Peroxisomen untersucht. Bemerkenswert
      ist, dass die drei Pex11-Proteine (nur) teilweise
      überlappende Funktionen haben. Durch Pex11pβ induzierte
      peroxisomale Tubuli segmentieren (bevor sie geteilt werden).
      Pex11pγ bewirkt ebenfalls die Ausbildung von Tubuli, diese
      werden allerdings nicht segmentiert. Die Expression von
      Pex11pα führt hingegen ausschließlich zu einer Segregation
      der peroxisomalen Proteine. Die beiden unterschiedlichen
      Funktionen von Pex11pα und Pex11pγ scheinen daher in Pex11pβ
      vereint zu sein. Zusätzlich zeigen die Pex11-Proteine
      unterschiedlich starke Sensitivität für das Detergens
      Triton-X 100, was mit unterschiedlichen
      Lipid¬binde¬eigen¬schaften zusammenhängen könnte, die
      wiederum die membran¬deformierenden Fähigkeiten erklären
      würden. Es wurden zudem unterschiedliche Signale, die zu
      Elongation von Peroxisomen führen (wie z.B.
      Mikrotubulidepolymerisation), untersucht und es konnte
      gezeigt werden, dass multiple Stimuli zu einer
      Hypertubulation der Peroxisomen führen. Diese wird allerdings
      nicht durch transkriptionelle Hochregulation der
      Pex11-Proteine vermittelt. Dies weist darauf hin, dass
      weitere Proteine eine Elongation von Peroxisomen induzieren
      können und/oder dass andere regulatorische Prozesse wie z.B.
      posttranslationale Modifikationen an der Tubulation der
      Peroxisomen beteiligt sind. Ferner wurde entdeckt, dass das
      Fusionsprotein Pex11pβ-YFP als spezifisches Werkzeug für die
      Entschlüsselung früher Ereignisse im Wachstums- und
      Teilungsprozess der Peroxisomen genutzt werden kann.
      Pex11pβ-YFP inhibiert die Segmentierung und Teilung der
      Peroxisomen. Es führt zur Bildung von pre-peroxisomalen
      Strukturen, die aus globulären Domänen und tubulären
      Membranfortsätzen aufgebaut sind. Diese Strukturen wurden
      detailliert charakterisiert. Interessanterweise sind die
      peroxisomalen Matrix- und Membranproteine in definierten
      Regionen lokalisiert. Es konnte mit Hilfe von time-course und
      Importstudien gezeigt werden, dass die von Pex11pβ
      induzierten Membranfortsätze von schon vorhandenen
      Peroxisomen ausgehen. Dies zeigt, dass der Wachstums- und
      Teilungsprozess der Peroxisomen ein mehrschrittiger
      Reifungsvorgang ist. Die Bildung von Peroxisomen im Säuger
      ist somit komplexer als die simple Durchschnürung einer
      existenten Organelle. In dieser Arbeit wurden insbesondere
      die frühen Schritte des peroxisomalen Wachstums- und
      Teilungsprozesses erstmals detailliert charakterisiert. Die
      erzielten Befunde werfen ein neues Licht auf den generellen
      Prozess der Bildung von Peroxisomen durch Wachstum und
      Teilung und weisen auf neue, noch nicht charakterisierte
      Vorgänge (z.B. bei der Proteinsortierung) an der
      peroxisomalen Membran hin.