Ανάπτυξη μεθόδων μεταφοράς βιομορίων με τη χρήση νανοσωματιδίων
Creators: name: Κατσικάρη, Αθανασία Θ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Νανοσωματίδια PLGA
Κυτταροτοξικότητα
Πρόσληψη
Μεταφορά DNA
PLGA nanoparticles
Cytotoxicity
Uptake
DNA delivery

description: Πολυάριθμα προβλήματα που σχετίζονται με τα ελεύθερα φάρμακα και τα εμβόλια έχουν οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων συστημάτων μεταφοράς φαρμάκων. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων νανοσωματιδίων (NPs) πολυ(γαλακτικού-γλυκολικού)οξέος (PLGA) για αποτελεσματική μεταφορά πρωτεϊνών και DNA, σε κύτταρα και ιστούς. Τα νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος και εξάτμισης του διαλύτη και προσδιορίστηκε η επίδραση ποικίλλων παραγόντων στις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Αξιολόγηση της πιθανής τοξικότητας των νανοσωματιδίων in vitro έδειξε ότι η βιωσιμότητα των κυττάρων μειώνεται μόνο σε συγκεντρώσεις νανοσωματιδίων ανώτερες των 1 mg/ml. Επιπρόσθετα, διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν την in vitro πρόσληψη των νανοσωματιδίων αποκάλυψε ότι πρόκειται για μία ενεργητική διαδικασία που παρουσιάζει δοσο- και χρονο- εξαρτώμενο χαρακτήρα και ότι είναι πιθανό να στηρίζεται σε κάποιο μηχανισμό ενδοκύτωσης. Χρησιμοποιώντας το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα ακολούθησε ο αξιόπιστος και ταχύς χαρακτηρισμός της ανοσοτροποποιητικής δράσης των νανοσωματιδίων που προκαλούν ενεργοποίηση των μηχανισμών της έμφυτης ανοσίας. Ιδιαιτέρως ικανοποιητικά ήταν τα αποτελέσματα της in vivo πρόσληψης των νανοσωματιδίων και της αποτελεσματικής μεταφοράς του φορτίου τους, μέσω δύο διαφορετικών οδών χορήγησης. Ενδομυϊκή χορήγηση pMAX-GFP NPs είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση της πρωτεΐνης GFP στους τετρακέφαλους μύες των ποντικών. Από την άλλη, 30 μόλις λεπτά μετά τη στοματική χορήγηση νανοσωματιδίων φορτωμένων με FITC σε ποντίκια της φυλής Balb/c, τα νανοσωματίδια εντοπίστηκαν στο έντερο. Ανιχνεύτηκαν επίσης σημαντικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης όταν τα ποντίκια ταΐστηκαν με PLGA NPs που περιείχαν το πλασμίδιο pMAX-GFP, τη στιγμή που κάτι τέτοιο κατέστη αδύνατο με γυμνό πλασμιδιακό DNA. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής θέσης υπογραμμίζουν τη δυνατότητα χρησιμοποίησης των PLGA NPs που παρασκευάστηκαν, ως αποτελεσματικών φορέων μεταφοράς πρωτεϊνών και DNA.
description: Several problems associated with free drugs and vaccines had led to developing novel drug delivery systems. The aim of the present thesis was the production of biodegradable poly(D, L-lactide-co-glycolide)acid (PLGA)–based nanoparticles (NPs) for efficient protein and DNA delivery to cells and tissues. Nanoparticles were produced by the double emulsion and solvent evaporation technique, after the determination of several process parameters affecting their physicochemical properties. The evaluation of potential NP toxicity showed that cell viability is reduced only at nanoparticles concentrations greater than 1 mg/ml. Moreover, the in vitro uptake studies demonstrated that cellular uptake of nanoparticles is a concentration-, time- and energy-dependent endocytic process. Using the dorsal air pouch model, it was clearly established that PLGA NPs possess in vivo immunomodulatory activity since they attract polymorphonuclear cells (PMNs). Furthermore, intramuscular injection of pMAX-GFP NPs resulted in enhanced GFP expression in quadriceps muscle in Balb/c mice. Finally, it was demonstrated that after oral administration of FITC loaded PLGA NPs in Balb/c mice, nanoparticles can be detected in the intestine within 30 minutes after feeding. Significant levels of gene expression it was also detected when mice were fed with PLGA NPs containing pMAX-GFP plasmid, 12 days after the first immunization. Consequently, the results of the present doctoral thesis underline the potential of PLGA NPs, produced by double emulsion, as effective carriers for protein and DNA delivery.