Einfluß der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin auf Wachstum und Differenzierung der hippocampalen Zellkultur
Creators: name: Gorsleben, Martin
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité
Year: 1999
Subjects: subject: Synaptophysin
subject: Synaptobrevin
subject: hippocampale Zellkultur
subject: Tetanustoxin
subject: synaptophysin
subject: synaptobrevin
subject: hippocampal cell culture
subject: tetanustoxin
subject: 610 Medizin
subject: 33 Medizin
subject: WW 2480

description: Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin bei Wachstum und Differenzierung der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur 17 Tage alter Mäuseembryonen zu untersuchen. Besonderes Interesse galt dabei dem Fortsatzwachstum und der Synaptogenese. Durch Beobachtung von Zellmorphologie und Zellwachstum wurde gezeigt, daß die Ausbildung charakteristischer Zelltypen ein intrinsischer Prozeß der hippocampalen Neurone ist. Die Synaptogenese wurde durch die Darstellung der entwicklungsabhängigen Verteilung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin mittels Immunfluoreszenzmarkierung dokumentiert. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde die Differenzierung subzellulärer Strukturen der hippocampalen Zellkultur charakterisiert und die Verteilung von Synaptophysin und Synaptobrevin entwicklungsabhängig dargestellt. Synaptophysin fand sich nicht nur in axonalen Präsynapsen, sondern auch in Dendriten. Synaptobrevin war im Gegensatz zu Synaptophysin nicht in allen synaptischen Vesikeln der Axonterminalen darstellbar. Um die Wirkungen von Synaptophysin und Synaptobrevin auf hippocampale Neurone in der Kultur genauer zu untersuchen, standen zwei Versuchsmodelle zur Verfügung: 1. die Synaptophysin-defiziente Maus und 2. das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeNT), das Synaptobrevin spezifisch spaltet. Anhand der Depletion von Synaptophysin wurde untersucht, ob in vitro das Fehlen des Proteins Konsequenzen in Bezug auf Synapsenbildung und morphologisches Erscheinungsbild der Neurone hat. Es konnten lichtmikroskopisch und auch im elektronenmikroskopischen Bild keine Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Durch morphometrische Messungen zeigte sich, daß in der Kultur der Synaptophysin-depletierten Maus nach 2 DIV mit hoher Signifikanz die Dendriten länger als in Kontrollkulturen waren. Dies spricht für regulatorische Funktionen des Proteins bei Exo- und Endozytosevorgängen während des dendritischen Wachstums. Nach Zugabe von Tetanustoxin zur pränatalen Zellkultur konnte gezeigt werden, daß die Inaktivierung von Synaptobrevin durch TeNT in vitro keine Konsequenzen in Bezug auf das morphologische Erscheinungsbild der Neurone, die Synapsenbildung und das Wachstumsverhalten hat. Mit morphometrischen Messungen konnten für TeTx-behandelte Neurone keine hochsignifikanten Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Synaptobrevin scheint also sowohl beim Axon- als auch beim Dendritenwachstum keine essentielle Rolle zu spielen.
description: Goal of this work was to investigate the role of the synaptic vesicle proteins synaptophysin and synaptobrevin during development and differentiation of mouse fetal hippocampal neurons in primary culture. The outgrowth of dendritic and axonal fibers and the mechanisms of synaptogenesis were of special interest. Observation of morphology and development showed that generation of characteristic cell types is an intrinsic process of hippocampal neurons. Differentiation of cellular and subcellular structures in hippocampal cell culture, characteristics of synaptogenesis and the stage-dependent distribution of synaptophysin and synaptobrevin were demonstrated by immunofluorescence and electron microscopy. Synaptophysin was localized in presynaptic axon terminals but also in dendrites. In contrast with synaptophysin immunoreaction for synaptobrevin could not be found in all synaptic vesicles of the presynaptic axon terminal. To investigate the influence of synaptophysin and synaptobrevin on hippocampal neurons in culture two experimental models were used, first a synaptophysin-knock-out-mouse and second the clostridial neurotoxin tetanustoxin (TeNT) which selectively cleaves synaptobrevin. With the depletion of synaptophysin we investigated if there are consequences in development of synapses and morphological features of the neurons in vitro. In both, light and electron microscopy, there was no difference to control cultures. In morphometric measurements there was a significant difference in the lenght of developing dendrites after 2 DIV with longer dendrites in the synaptophysin-knock-out-mouse. Therefore synaptophysin may have a regulatory function for exo-/ endocytosis during dendritic growth. Specific inactivation of synaptobrevin by tetanustoxin had no consequences in morphological features, synaptogenesis and growing of the hippoacampal neurons in vitro. Morphometric measurements showed no significant differences between TeNT and control. Therefore we conclude that synaptobrevin has no essential function during axon growth or dendrite elongation.