Μελέτη των ιών του γένους Nepovirus που προσβάλλουν την καλλιέργεια της αμπέλου στην Ελλάδα
Creators: name: Πάλλα, Ελευθερία Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Άμπελος
Ιοί του γένους Nepovirus
Γενετική παραλλακτικότητα
Grapevine
Nepoviruses
Genetic variability

description: Η άμπελος προσβάλλεται από μεγάλο αριθμό ιών, μεταξύ των οποίων ο ιός του ριπιδωτού φύλλου της αμπέλου (grapevine fanleaf virus, GFLV), που ανήκει στο γένος Nepovirus της οικογένειας Secoviridae και είναι από τους πιο κοινούς διεθνώς. Στη χώρα μας, ο GFLV θεωρείται ότι έχει περιορισμένη εξάπλωση. Ωστόσο, αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε αδυναμία αξιόπιστης ανίχνευσής του λόγω υψηλής γενετική παραλλακτικότητας, που υπάρχει συχνά στους ιούς του γένους Nepovirus. Τα τελευταία χρόνια η ευρεία εφαρμογή της τεχνολογίας αλληλούχησης υψηλής απόδοσης (High-Throughput Sequencing, HTS) στην άμπελο οδήγησε στην ανίχνευση πολλών νέων γενοτύπων nepo-ιών. Πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής τέθηκε η διερεύνηση της γενετικής παραλλακτικότητας του GFLV στους ελληνικούς αμπελώνες με την βοήθεια της τεχνολογίας HTS. Για τον σκοπό αυτό, στο πλαίσιο επισκοπήσεων αμπελώνων της χώρας, οκτώ μεμονωμένα και τέσσερα σύνθετα δείγματα αυτόχθονων ποικιλιών συλλέχθηκαν από πέντε διαφορετικές αμπελουργικές περιοχές της κεντρικής, βόρειας και νότιας Ελλάδας και υποβλήθηκαν σε ανάλυση HTS. Η ανάλυση των δεδομένων αποκάλυψε την παρουσία αρκετών αλληλουχιών nepo-ιών (19 αλληλουχίες RNA1 και 22 αλληλουχίες RNA2), οι περισσότερες από τις οποίες είχαν μέτρια έως υψηλή ταυτότητα αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (ντ) με τον GFLV. Ακολούθησε φυλογενετική ανάλυση η οποία κατάταξε τις αλληλουχίες σε διαφορετικούς κλάδους, ιδιαίτερα στο δέντρο που κατασκευάστηκε βάσει του RNA1 αναδεικνύοντας την ύπαρξη υψηλής γενετικής παραλλακτικότητας μεταξύ των ελληνικών απομονώσεων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι εντοπίστηκε μια διαφοροποιημένη ομάδα απομονώσεων (με την προσωρινή ονομασία GDefV-like) που παρουσιάζουν υψηλή ταυτότητα τόσο με τον GFLV όσο και με τον ιό της παραμόρφωσης της αμπέλου (grapevine deformation virus, GDefV) στο RNA1. Επόμενος στόχος ήταν η ταξινόμηση αυτών των διαφοροποιημένων γενοτύπων και η επιβεβαίωση της αλληλουχίας ενός εξ αυτών με αλληλούχηση κατά Sanger. Σύμφωνα με τα κριτήρια οριοθέτησης ειδών του γένους Nepovirus, οι διαφοροποιημένοι γενότυποι ανήκουν στο είδος του GFLV. Τέλος, στόχο της μελέτης αποτέλεσε η βελτιστοποίηση της RT-PCR πραγματικού χρόνου που αναπτύχθηκε από τους Bruisson et al. (2017) για την ανίχνευση του GFLV. Η μέθοδος βελτιώθηκε με την τροποποίηση του ιχνηλάτη, ενσωματώνοντας τα νέα δεδομένα, ώστε να επιτευχθεί ευρεία και αξιόπιστη ανίχνευση του συνόλου των απομονώσεών του GFLV. Μετά τη βελτιστοποίηση η δοκιμή υποβλήθηκε σε αξιολόγηση της εξειδίκευσης και της ευαισθησίας της. Αφού τα αποτελέσματα κατέδειξαν υψηλή αποτελεσματικότητα και ευαισθησία, ακολούθησε συγκριτική αξιολόγηση της μεθόδου με μια δημοσιευμένη συμβατική μέθοδο RT-PCR σε ένα σύνολο 104 δειγμάτων από υπάρχουσες συλλογές του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας του ΑΠΘ. Από τον συγκριτικό έλεγχο η ανίχνευση του GFLV πραγματοποιήθηκε σε υψηλότερο ποσοστό με την πραγματικού χρόνου RT-PCR από ότι με την συμβατική. Η εξειδίκευση της νέας μεθόδου παρουσιάστηκε μειωμένη, διότι ανιχνεύθηκε μια απομόνωση ιού του μωσαϊκού της αραβίδας (Αrabis mosaic virus, ArMV), ενός συγγενικού nepo-ιού ο οποίος ωστόσο δεν απαντάται σε καλλιέργειες αμπέλου στη χώρα μας. Για το λόγο αυτό έγινε δοκιμή εναλλαγής της μεθόδου με την χρήση της χρωστικής SYBR Green και ανάλυσης των προϊόντων με καμπύλη αποδιάταξης, αντί του ιχνηλάτη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι είναι δυνατή η ταυτοποίηση του GFLV με αυτή την προσέγγιση ωστόσο απαιτείται περαιτέρω αξιολόγηση της μεθόδου με περισσότερες απομονώσεις των δυο ιών.  
description: Grapevine is infected by a high number of viruses, among which grapevine fanleaf virus (GFLV), which belongs to the genus Nepovirus, family Secoviridae, is one of the most common grapevine viruses worldwide. In Greece, GFLV is considered to have a limited spread. However, this could be due to a failure of virus detection as a result of the high genetic diversity that often exists in nepoviruses. Recently, the widespread application of high-throughput sequencing (HTS) technology has led to the detection of many new genotypes of nepoviruses. The first objective of this study was to investigate the genetic variability of GFLV in Greek vineyards using HTS technology. For this purpose, during a survey of commercial vineyards in Greece, eight individual and four pooled samples from indigenous varieties were collected from five different viticultural areas of central, northern and southern Greece and were analyzed by HTS. Data analysis revealed the presence of several nepoviral sequences (19 RNA1 and 22 RNA2 sequences), most of which had moderate to high nucleotide (nt) sequence identity with GFLV. Further phylogenetic analysis classified the sequences in different clusters, especially in the tree generated using RNA1, thus highlighting the high genetic variability existing among the Greek isolates. Interestingly, a divergent group of isolates (tentatively named GDefV-like) were identified, showing high identity in RNA1 both with GFLV and grapevine deformation virus (GDefV). Τhe next objective was to classify the divergent genotypes in a nepovirus species. According to the current species demarcation criteria for Nepoviruses, the group of the divergent isolates belongs to the species of GFLV. Subsequently, the sequence of one divergent isolate was confirmed by Sanger sequencing to avoid artifacts from de novo assembly. Furthermore, a real-time RT-PCR detection assay developed by Bruisson et al. (2017), was improved by modifying the probe, incorporating the new data, to achieve a broad and reliable detection of all GFLV isolates. Following optimization of the assay it was then subjected to further validation of its specificity and sensitivity. Since the results showed high efficiency and sensitivity, the method was followed by a comparative validation with a published conventional RT-PCR method on a total of 104 samples from existing collections of the Plant Pathology Laboratory of AUTh. From the comparative analysis, GFLV detection was performed at a higher rate with the real-time RT-PCR than with the conventional method. The specificity of the new method was shown to be decreased, since an isolate of Αrabis mosaic virus (ArMV) was detected that is a closely related nepovirus to GFLV, which however hasn’t been detected so far in Greek vineyards. Therefore, an alternative method was tested using SYBR Green dye followed by melting curve analysis of the amplicons instead of the probe. The results showed that it is possible to discriminate GFLV using this approach but further validation with more virus isolates is needed.