TARGETING PROKINETICIN SYSTEM TO COUNTERACT EXPERIMENTAL CHEMOTHERAPY-INDUCED PERIPHERAL NEUROPATHY.
Creators: name: MOSCHETTI, GIORGIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2019

description: La neuropatia periferica indotta da chemioterapici (CIPN) rappresenta uno degli effetti collaterali dose-limitante di numerosi agenti antineoplastici comunemente utilizzati in clinica. Il trattamento della CIPN, con i comuni farmaci analgesici � spesso insoddisfacente, pertanto � necessario lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. La patofisiologia della CIPN � molto complessa e non � stata ancora completamente chiarita; � caratterizzata da meccanismi multipatogenici tra cui: danno mitocondriale, stress ossidativo, alterazioni di canali ionici e neuroinfiammazione (Boyette-Davis et al., 2015; Montague e Malcangio 2017). In particolare, � stato dimostrato che le citochine e chemochine pro- ed anti-infiammatorie prodotte da cellule immunitarie, nonch� da glia e microglia a livello dei nervi, dei gangli della radice dorsale (DRG) e del midollo spinale sono coinvolte nell?insorgenza e nel mantenimento del dolore neuropatico (Sacerdote et al., 2013). Tra le chemochine, la famiglia delle prochineticine, ha un ruolo importante nell'immunomodulazione, nell'infiammazione, nella nocicezione, nel dolore infiammatorio e in diversi modelli sperimentali di dolore neuropatico come quello indotto da lesione del nervo sciatico (Lattanzi et al., 2015; Guida et al., 2015) o da diabete (Castelli et al., 2016). Sia nell'uomo che nei roditori, la famiglia delle Prochineticine � composta da due proteine, la Prochineticina-1 (PK1) e la Prochineticina-2 (PK2) (Negri et al., 2007), che legano due recettori accoppiati a proteine G, PK-R1 e PK-R2 (Masuda et al., 2002). Le prochineticine ed i loro recettori sono ampiamente distribuiti nel cervello, nel midollo spinale, nei gangli della radice dorsale, nei granulociti, nei macrofagi e nei linfociti. � stato dimostrato che la PK2 � in grado di indurre un profilo pro-infiammatorio nei macrofagi (Martucci et al., 2006), che a sua volta pu� portare ad una riduzione delle soglie nocicettive in risposta sia a stimoli termici che meccanici (Negri et al., 2006; Giannini et al., 2009; Maftei et al., 2014). E? stata dimostrata una co-localizzazione dei recettori PK-Rs e TRPV in alcune regioni nervose associate al dolore, ed � stato inoltre evidenziato che se stimolati con la PK2 (in vitro) molti neuroni che esprimono i recettori PK sono in grado di rilasciare mediatori del dolore come CGRP e sostanza P (Vellani et al., 2006). Sulla base di queste considerazioni, il presente progetto ha lo scopo di studiare il ruolo del sistema delle prochineticine in un modello murino di CIPN indotto dalla somministrazione di due diversi agenti chemioterapici comunemente usati in oncologia e correlati allo sviluppo di CIPN: vincristina (VCR), il farmaco pi� neurotossico tra gli alcaloidi della Vinca e bortezomib (BTZ), il primo inibitore del proteasoma 26s. Questi farmaci, nonostante abbiano meccanismi d?azione diversi sulle cellule tumorali, inducono neurotossicit� e conseguente neuropatia attraverso meccanismi molto simili (Flatters et al., 2019; Boyette-Davis et al., 2015). Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando topi maschi del ceppo C57BL/6J di 9 settimane di et�. Sulla base dei protocolli pi� comunemente utilizzati in letteratura, la CIPN � stata indotta negli animali attraverso la somministrazione intraperitoneale (i.p.) di bortezomib 0,4 mg/kg, 3 volte a settimana per 4 settimane consecutive (Boehmerle et al., 2014); mentre la vincristina � stata somministrata quotidianamente per 14 giorni consecutivi alla dose di 0,1 mg/kg (i.p.) (Kiguchi et al., 2008). Gli animali controllo sono stati trattati con il veicolo. Poich� l'allodinia � uno dei sintomi pi� comunemente riscontrati sia nei pazienti che nei modelli sperimentali di CIPN, l'allodinia meccanica e termica sono state monitorate durante gli esperimenti, utilizzando rispettivamente il Von Frey test e il test dell?acetone. Inoltre, � stata monitorata l'iperalgesia termica mediante il plantar test. La somministrazione di bortezomib o di vincristina ha indotto negli animali una condizione neuropatica dolorosa caratterizzata dalla presenza di allodinia meccanica, termica e di iperalgesia termica. Per valutare il possibile effetto terapeutico di PC1, un antagonista non peptidico dei PK-Rs, gli animali trattati con BTZ o VCR, in un chiaro stato di ipersensibilit�, sono stati sottoposti al trattamento cronico con PC1 (150?g/kg, iniettato per via sottocutanea, due volte al giorno per 14 (BTZ) o 7 (VCR) giorni consecutivi). Indipendentemente dall'agente chemioterapico utilizzato per indurre la neuropatia, il trattamento cronico con PC1 � stato in grado di migliorare significativamente la sintomatologia dolorosa. Per valutare nel nostro modello (BTZ e VCR), il ruolo del sistema PK, le analisi biochimiche sono state eseguite a due diversi tempi sperimentali: prima dell?inizio del trattamento cronico con PC1 (rispettivamente 14 o 7 giorni dalla prima somministrazione di bortezomib e vincristina) e al termine del protocollo sperimentale (28 o 14 giorni dalla prima somministrazione con BTZ e VCR). Quattordici giorni dopo la prima somministrazione di BTZ, non sono state osservate alterazioni dell'espressione del sistema PK nelle principali stazioni coinvolte nella trasmissione del dolore (nervo sciatico, DRG e midollo spinale). Gli animali trattati con VCR invece, 7 giorni dopo la prima somministrazione di chemioterapico, mostravano, sia a livello del sistema nervoso periferico (DRG) che del sistema nervoso centrale (midollo spinale), un?up-regolazione di entrambi recettori del sistema PK. � noto dalla letteratura che il reclutamento e l'infiltrazione dei macrofagi a livello dei DRG svolge un ruolo chiave nello sviluppo e nel mantenimento della CIPN (Lees et al., 2017). Inoltre, � stato dimostrato che la PK2 � in grado di indurre i macrofagi a migrare e acquisire un fenotipo pro-infiammatorio, abbiamo quindi deciso di valutare l'espressione dei markers del macrofago/microglia (CD68 e CD11b) e del TLR4, la cui attivazione � correlata alla modulazione delle citochine pro-infiammatorie, nei tessuti nervosi dei nostri animali. A met� del protocollo chemioterapico (14 giorni BTZ e 7 giorni VCR), la sintomatologia dolorosa era correlata ad un aumento dell'espressione di CD68 e del TLR4. Inoltre, negli animali BTZ, le analisi di immunofluorescenza hanno confermato la presenza di macrofagi attivati sia a nel DRG che nel nervo sciatico. Allo stesso tempo (14 giorni BTZ e 7 giorni VCR), nei tessuti nervosi periferici di tutti gli animali sottoposti a trattamento con i chemioterapici, abbiamo osservato un profilo pro-infiammatorio caratterizzato da alti livelli delle citochine pro-infiammatorie IL-1? e IL-6 e bassi livelli dell? anti-infiammatoria IL-10. A questi tempi sperimentali, il sistema nervoso centrale non sembrava essere alterato dalla neurotossicit� della chemioterapia. Al termine del protocollo sperimentale (BTZ giorno 28 e VCR giorno 14), nel nervo sciatico e nei DRG degli animali BTZ, � stato rilevato un profilo neuroinfiammatorio pi� marcato; l'aumentata produzione di citochine potrebbe essere stata sostenuta dall'infiltrazione di macrofagi attivati. Infatti, negli animali con CIPN, a livello del nervo sciatico e dei DRG abbiamo osservato un up-regolazione del CD68, del CD11b e del TLR4 oltre che un aumento delle cellule CD68 positive nei topi BTZ. Queste cellule esprimevano anche PK2, suggerendo che i macrofagi infiltranti potrebbero rappresentare una fonte di PK2 nei tessuti nervosi periferici. Allo stesso tempo (BTZ giorno 28 e VCR giorno 14), anche il midollo spinale � stato influenzato dalla neurotossicit� correlata alla chemioterapia; era infatti evidente un?upregolazione di tutti i componenti del sistema PK, del CD68 e del TLR4 oltre ad un chiaro profilo pro-infiammatorio. Inoltre, � stata osservata una colocalizzazione tra PK2 e GFAP (marker astrocitario) a livello del midollo spinale degli animali BTZ, suggerendo che, in questa stazione nervosa, gli astrociti potrebbero essere tra i principali produttori di PK2. Anche negli animali VCR, a livello del sistema nervoso centrale, era presente un aumento dell?espressione del GFAP e del CD68. PC1 � stato in grado di contrastare l'attivazione immunitaria e l'amplificazione neuroinfiammatoria, il cui ruolo nel mantenimento dell'ipersensibilit� � noto. Infatti, il trattamento con l'antagonista ha portato ad una riduzione dell'espressione del CD68, del CD11b e del TLR4 e ha ristabilito un corretto equilibrio delle citochine sia a livello del sistema nervoso periferico che centrale. Poich� nella pratica clinica molti pazienti sono sottoposti a multipli cicli di chemioterapia (Starobova &amp; Vetter, 2017), gli animali precedentemente trattati con gli agenti chemioterapici sono stati sottoposti ad un secondo ciclo BTZ o VCR. Dopo l'interruzione del primo ciclo di chemioterapia, gli animali hanno progressivamente recuperato le loro soglie di risposta basali. In entrambi i protocolli (BTZ e VCR), il secondo ciclo di chemioterapia ha indotto nuovamente lo sviuluppo di ipersensibilit� negli animali precedentemente trattati con lo stesso agente chemioterapico. L'effetto allodinico indotto dai sia da BTZ che da VCR era meno evidente nei topi che erano stati precedentemente trattati anche con PC1 rispetto a quello osservato negli animali trattati in entrambi i cicli con il solo chemioterapico, indicando un possibile ruolo protettivo di PC1. Nella seconda parte del nostro studio, considerando la forte suscettibilit� del DRG alla tossicit� dei chemioterapici (Montague e Malcangio, 2017), abbiamo iniziato a studiare il coinvolgimento dei neuroni nella CIPN usando un modello in vitro rappresentato da neuroni sensitivi primari di DRG. In particolare, ci siamo concentrati sulla crescita dei neuriti, un fenotipo morfologico delle cellule neuronali correlato alla loro funzione ed al loro stato di salute (da Silva e Dotti, 2002). I neuroni prelevati da topi wildtype sono stati messi in coltura e sono state testate diverse concentrazioni di BTZ e VCR (Al� et al., 2015). Entrambi gli agenti hanno indotto una riduzione dose-dipendente della lunghezza totale dei neuriti rispetto alle cellule incubate con il solo veicolo. Basandoci sulla letteratura, abbiamo selezionato diverse concentrazioni di PC1 (Severini et al., 2015) che sono state utilizzate in associazione a BTZ e VCR. La dose pi� efficace di PC1 nel prevenire la tossicit� indotta dai chemioterapici si � dimostrata essere la 250 nM. Abbiamo quindi iniziato ad analizzare i parametri biochimici delle cellule trattate con vincristina da sola o in associazione con PC1. Le cellule VCR hanno mostrato un upregolazione di: PK2, PK-R1, TLR4, IL-1?, IL-6, IL-10 e ATF3; che non era rilevabile nelle cellule co-trattate con VCR e PC1. VCR non ha indotto alterazioni dei livelli di mRNA di PK-R2, GFAP e TNF-?. Quando somministrato in assenza di vincristina, PC1 250nM non ha indotto alterazioni n� nella morfologia cellulare n� nei livelli di espressione dei parametri sopra citati. Nel loro insieme i nostri risultati mostrano che il sistema PK � coinvolto nello sviluppo e nel mantenimento della CIPN e, considerando gli effetti positivi del PC1 nel contrastare sia la sintomatologia dolorosa che la neuroinfiammazione, l'antagonismo dei PK-Rs potrebbe rappresentare un nuovo approccio terapeutico per gestire questo tipo di neuropatia dolorosa.