title: The Role of PHF13 in Spermatogenesis
title: Die Rolle von PHF13 in der Spermatogenese
Creators: name: Bosch, Elisabeth
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: PHF13
subject: spermatogenesis
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 570 Biowissenschaften; Biologie

description: The production of male gametes through meiosis is an essential process guarded by different check points to ensure proper distribution of genetic material to the haploid sperm cells, enable genetic diversity through recombination and minimise danger to genomic integrity by tight control of transposable elements. This study aimed to elucidate the specific roles of the PHD finger protein PHF13, an epigenetic reader for H3K4me2/3, in spermatogenesis. The protein has diverse functions in different cellular mechanisms, such as DNA damage repair, chromosome segregation and transposon regulation, influencing a variety of biological processes, including but not limited to embryonic development, stem cell maintenance and tumorigenesis. In the first part of this work I investigated the testicular single cell transcriptome of a knockout mouse model of PHF13. All cell types are present and cluster together with wildtype cells. By analysing differentially expressed genes and gene regulatory pathways, I could show that while some general transcriptional changes are evident, no cell-type specific pathways are affected. By analysing gene expression over pseudotime as well as through RNA-FISH and RNA-polymerase analysis, I found no general upregulation of gonosomal transcripts during pachytene in the knockout, rebutting the previous working hypothesis of partial MSCI failure. Nevertheless, I was able to demonstrate that some proteins downregulated by Phf13 knockout localise to the XY-body during the pachytene and diplotene stages of meiotic prophase I. Moreover, single cell RNA sequencing revealed previously undetected RNA expression of Phf13 not only in spermatogonia, but also spermatocytes. Through 5’ RACE and qPCR analyses I determined the presence of a second, truncated PHF13 isoform specifically in testis. Detailed immunocytologcial analysis of meiocyte populations revealed that both protein isoforms are present at low levels in spermatocytes, localising to the XY body. The shorter protein, termed miniPHF13, was detected in a punctum close to the XY body in spermatocytes and at the base of elongating spermatids, reminiscent of the dense body, an enigmatic meiotic structure. Using CoIP of transfected HeLa cells, I confirmed interaction of PHF13 with SIN3A and YBX1, previously identified in ES cells, and demonstrated a colocalisation in testis tissue. While proof of interaction in testis is still outstanding, this finding nevertheless points towards concerted action of PHF13 and SIN3A in the maintenance of the spermatogonial stem cell pool. To take a completely different approach to evaluate PHF13 function, in the final part I heterologously expressed human PHF13 and deletion variants lacking either the N- or C-terminus in Drosophila melanogaster, which does not possess a Phf13 homologue. Using various driver genes I evaluated the effect of transgene expression in somatic, mitotic and early meiotic testicular cell populations. While I did not find an effect of ectopic PHF13 on fertility in the flies, expression of full-length PHF13 under ptc-control, active in testicular cyst cells, but also during spacial patterning and neuronal development, lead to a decline in viability and caused neuronal locomotor defects. In conclusion, the essential function of PHF13 in spermatogenesis is the maintenance of the stem cell pool, most likely through interaction with the histone remodeling complexes SIN3A/HDAC1 and PRC2. Although localising to the XY body, it is not essential for meiotic sex chromosome inactivation. A newly identified truncated isoform is present in the dense body of pachytene spermatocytes. Additionally, results obtained by heterlogous expression of PHF13 in flies point towards a role for PHF13 in brain development and memory formation, an area that has not been extensively studied so far.
description: Die Produktion männlicher Keimzellen durch Meiose ist ein für die Fortpflanzung grundlegender Prozess, dessen korrekter Ablauf an verschiedenen Fixpunkten kontrolliert wird. Dadurch wird die richtige Verteilung von genetischem Material an die haploiden Spermien sichergestellt, genetische Vielfalt durch Rekombination ermöglicht und durch strikte Regulation von transposablen Elementen genomische Integrität gewahrt. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die spezifische Rolle des PHD-Finger Proteins PHF13, einem epigenetischen ”Reader” von H3K4me2/3, in der Spermatogenese aufzuklären. Das Protein erfüllt verschiedene Funktionen in unterschiedlichen zellulären Mechanismen, z.B. DNA-Reparatur, Chromosomenverteilung und Transposon-Kontrolle, wodurch es Einfluss auf verschiedene biologische Prozesse nimmt. Dazu gehören unter Anderem Embryonalentwicklung, Stammzellerhalt und Tumorgenese. Im ersten Teil dieser Arbeit untersuchte ich das testikuläre Transkriptom eines Phf13-knockout Mausmodells auf Einzelzellebene. Es zeigte sich, dass alle Zelltypen vorhanden sind und zusammen mit den Wildtyp-Zellen Cluster bilden. Durch Analyse von differentiell exprimierten Genen und regulatorischen Signalwegen konnte ich zeigen, dass zwar einige generelle transkriptionelle Veränderungen vorhanden sind, aber keine Zelltyp-spezifischen Signalwege betroffen sind. Bei Analyse der Genexpression über Pseudozeit, RNA-FISH und der Untersuchung der Verteilung von differentiell phosphotylierten RNA-Polymerase II-Varianten am XY-Körperchen fand ich keine generelle vermehrte Expression gonosomaler Transkripte während des Pachytäns im Knockout. Dies widerlegt die vorhergehende Arbeitshypothese, dass die meiotische Geschlechtschromosomeninaktivierung teilweise fehlschlägt. Dennoch war ich in der Lage zu zeigen, dass einige Proteine, die durch den knockout von Phf13 herunterreguliert werden, während des Pachytän- und Diplotänstadiums der meiotischen Prophase I im XY-Körperchen lokalisiert sind. Des Weiteren enthüllte Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine zuvor unentdeckte RNA-Expression von Phf13 nicht nur in Spermatogonien, sondern auch in Spermatozyten. Durch 5’ RACE und qPCR-Analysen konnte ich die Präsenz einer zweiten, verkürzten PHF13 Isoform speziell im Hoden zeigen. Detaillierte immunzytologische Analyse von Meiozyten-Populationen ergab, dass beide Proteinformen in niedriger Konzentration in Spermatozyten vorhanden sind, wo sie im XY-Körperchen lokalisiert sind. Das kürzere Protein, das miniPHF13 genannt wurde, wurde in einer punktförmigen Struktur nahe beim XY-Körperchen in Spermatozyten und an der Basis des ”Kopfes” von elongierenden Spermatiden detektiert. Dieses Signal-Muster deckt sich mit dem des sogenannten ”dense body”, einer enigmatischen meiotischen Struktur. Durch CoIP-Experimente mit transfizierten HeLa-Zellen bestätigte ich die Interaktion von PHF13 mit SIN3A und YBX1, die zuvor in ES Zellen identifiziert worden waren, und konnte eine Colokalisation in Hodengewebe zeigen. Während diese Interaktion im Hoden noch bestätigt werden muss, deutet dieser Befund dennoch auf eine gemeinschaftliche Funktion von PHF13 und SIN3A beim Erhalt des spermatogonalen Stammzellreservoirs hin. Um einen völlig anderen Ansatz zur Untersuchung der Funktion von PHF13 zu verwenden, exprimierte ich im letzten Teil dieser Arbeit humanes PHF13 und Deletionsmutanten, denen entweder N- oder C-Terminus fehlte, in Drosophila melanogaster, einem Organismus, der selbst kein Phf13-Homolog besitzt. Mittels verschiedener Treiber-Gene untersuchte ich den Effekt der Expression von PHF13 in somatischen, mitotischen und frühen meiotischen testikulären Zellpopulationen. Während ich keinen Effekt von ektopem PHF13 auf die Fertilität der Fliegen nachweisen konnte, führte Expression des kompletten PHF13-Proteins unter der Kontrolle von ptc, einem Protein das nicht nur in testikulären Zyst-Zellen, sondern sowohl während der Bestimmung der Segmentpolarität als auch während der neuronalen Entwicklung aktiv ist, zu einer Reduktion der Lebensfähigkeit und verursachte Locomotor-Defizite. Abschließend ist die Hauptfunktion von PHF13 während der Spermatogenese der Erhalt des Stammzellreservoirs, sehr wahrscheinlich durch Interaktion mit den Histon-Remodellierungskomplexen SIN3A/HDAC1 und PRC2. Obwohl das Protein im XY-Körperchen präsent ist, ist es nicht notwendig für die meiotische Geschlechtschromosomeninaktivierung. Eine zum ersten Mal identifizierte verkürzte Isoform von PHF13 ist im ”dense body” von Pachytän-Spermatozyten vorhanden. Des Weiteren deuten Ergebnisse, die durch die heterologe Expression von PHF13 in Taufliegen erlangt wurden, darauf hin, dass PHF13 eine Rolle in der Gehirnentwicklung und Gedächtnisbildung spielt, die bisher noch nicht weiter untersucht wurde.