title: Posttranslationale Modifikation und subzelluläre Verteilung von Plakophilin 3 in normalen und Tumorzellen
title: Posttranslational modification and subcellular distribution of plakophilin 3 in normal and tumor cells
Creators: name: Neuber, Steffen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Zelladhäsion , Kinasen
Biowissenschaften, Biologie
Kinase
Phosphorylierung
Adhesion, Desmosome
Hydrogen peroxide
Phosphatasen
Prostatakrebs , Wasserstoffperoxid
Plakophilin 3

description: Die zelluläre Adhäsion stellt einen
      Eckpunkt für den evolutionären Erfolg mehrzelliger Organismen
      dar. Die Spezialisierung einzelner Zellen und das Entstehen
      komplexer funktioneller Einheiten manifestiert sich in
      verschiedensten Zell- und Gewebstypen. Desmosomen und
      Adhärenzverbindungen sind für die Bildung und
      Aufrechterhaltung dieser Gewebsstrukturen unerlässlich und
      ermöglichen auch deren funktionelle Dynamik. Eine wichtige
      strukturelle Komponente dieser Zell-Zell-Verbindungen sind
      Armadillo-Proteine. Diese fungieren allerdings nicht
      ausschließlich als Zelladhäsionsmoleküle, sondern übernehmen
      auch weitere zelluläre Aufgaben. Die verschiedenen
      funktionellen Eigenschaften der Armadillo-Proteine werden
      meist durch spezifische posttranslationale Modifikationen
      reguliert. Für einige Mitglieder der Proteinfamilie
      existieren bereits umfangreiche Studien, die sich mit der
      Dynamik der Moleküle infolge spezifischer Phosphorylierungen
      auseinandergesetzt haben. Regelmäßig wurden bei diesen
      Analysen Kinasen der Src-Familie und der epidermale
      Wachstumsfaktorrezeptor als katalysierende Proteine
      identifiziert. Im Zuge dieser Arbeit wurde das desmosomale
      Armadillo-Protein Plakophilin 3 auf das Vorhandensein von
      Proteinmodifikationen in normalen und Tumorzellen hin
      analysiert. Mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (IEF)
      wurde gezeigt, dass Plakophilin 3 Ziel post-translationaler
      Modifikationen ist, die sich zumindest teilweise auf
      Tyrosin-Phosphorylierungen zurückführen ließen. Aus einer
      entsprechenden Datenbank von Phospho-Proteinen wurden für
      Plakophilin 3 fünf Tyrosin-Reste und ein Serin-Rest, die
      einerseits häufig in Phosphoanalysen nachgewiesen wurden und
      andererseits von Relevanz für die Funktion des Proteins sein
      könnten, ausgewählt. Diese sechs Aminosäure-Reste wurden in
      Mutagenese-Experimenten substituiert und zur Konstruktion von
      PKP3-Einzelmutanten und PKP3-Kombinationsmutanten verwendet.
      Epitheliale Zellen wurden mit diesen unterschiedlichen
      PKP3-Konstrukten stabil transfiziert und mittels
      Immunofluoreszenz-Färbung und differentieller Extraktion
      untersucht. Eine funktionelle Bedeutung hinsichtlich der
      PKP3-Eigenschaften einzelner Modifikationen konnte hierbei
      bislang nicht nachgewiesen werden. Des weiteren wurden gegen
      die phosphorylierten Plakophilin 3-Sequenzen polyklonale
      Antiseren hergestellt. Aus einem der Seren konnten
      ausreichend sauber Phospho-spezifische Antikörper gegen den
      Tyrosin-Rest Y195 aufgereinigt werden. Mit Hilfe dieses
      Antikörpers wurde die Phosphorylierung von Plakophilin 3 an
      Y195 in in-vivo und in-vitro Experimenten untersucht.
      Plakophilin 3 wurde dabei durch Einsatz spezifischer
      Kinase-Inhibitoren und in einem in-vitro Kinase-Assay als
      neues Substrat der c-Src-Kinase identifiziert. Hierbei wurde
      festgestellt, dass die Phosphorylierung dieses Tyrosin-Restes
      streng reguliert wird und erst durch den Einsatz des
      Tyrosin-Phosphatase-Inhibitors Pervanadat detektiert werden
      kann. Wachstumsfaktoren wie EGF, IGF-1 oder HGF führten
      erstaunlicherweise zu keiner Phosphorylierung des
      spezifischen Tyrosin-Restes. Allerdings konnte die
      Tyrosin-Phosphorylierung durch Stimulation der Zellen mit
      Wasserstoff-Peroxid induziert werden. Dies legt nahe, dass
      PKP3 ein Zielmolekül des Src-vermittelten Signalwegs
      darstellt, welches in Abhängigkeit von reaktiven
      Sauerstoff-Spezies und oxidativem Stress an Y195
      phosphoryliert wird. Immunfluoreszenz-Färbungen an
      c-Src-überexprimierenden Zellen zeigten, dass
      Y195-phosphoryliertes PKP3 an der desmosomalen Struktur
      lokalisiert. An dieser Stelle sind allerdings weitere
      funktionelle Untersuchungen notwendig, da die
      Tyrosin-Phosphorylierung von Plakophilin 3 in einigen
      Versuchen mit einem veränderten zellulären
      Löslichkeitsverhalten in Verbindung zu stehen schien, wobei
      diese Beobachtung bisher nicht mit einer einzelnen,
      spezifischen Phosphorylierung korreliert werden konnte. Somit
      hat die vorliegende Studie erstmals für das desmosomale
      Protein Plakophilin 3 die Existenz einer spezifischen
      Tyrosin-Phosphorylierung und einen damit assoziierten
      Signalweg aufgezeigt, deren zellbiologische Relevanz in
      weiterführenden Experimenten zu klären ist. Hinsichtlich
      maligner Tumoren konnte in früheren Arbeiten an
      Prostatakarzinomen ein höherer Malignitätsgrad sowohl mit
      einer erhöhten c-Src-Kinaseaktivität als auch mit einer
      gesteigerten Expression von Plakophilin 3 korreliert werden.
      Unter Berücksichtigung unserer experimentellen Daten wurden
      daraufhin Adenokarzinome der Prostata hinsichtlich des
      Auftretens der spezifischen Phosphorylierung von Plakophilin
      3 immunhistochemisch untersucht. Hier wurde
      Y195-phosphoryliertes PKP3 in bestimmten Tumorarealen einiger
      schlecht differenzierter Adenokarzinome entlang von
      Zellgrenzen gefunden. Ob die untersuchte Modifikation unter
      Umständen eine diagnostische Relevanz hat, muss in
      weiterführenden Untersuchungen bestimmt werden.
description: Cellular adhesion is one hallmark
      accountable for the evolutionary success of multicellular
      organisms. Cellular specialization and the development of
      sophisticated functional units are reflected by the multiple
      kinds of cells and tissues. Desmosomes and adherens junctions
      are essential for the assembly and integrity of these tissues
      and facilitate - inter alia - their functional dynamics.
      Integral parts of both types of cell junctions are proteins
      of the armadillo family. Next to cellular adhesion, these
      proteins implement further cellular functions, which are
      mostly regulated by specific post-translational
      modifications. Detailed analyses of some of these proteins
      describe specific phosphorylation events related to the
      molecular dynamics. Several studies identified kinases of the
      Src-family and the epidermal growth factor receptor as
      responsible enzymes catalyzing reversible phosphorylation of
      armadillo proteins. In this thesis the desmosomal armadillo
      protein plakophilin 3 (PKP3) was analyzed for protein
      modifications occurring in normal and tumor cells. Utilizing
      two-dimensional gel electrophoresis, it was shown that PKP3
      is a target of post-translational modification events, and
      some of them could be attributed to phosphorylation of
      tyrosine residues. By screening a phosphotomic database we
      selected five tyrosine residues and one serine residue that
      were frequently detected in phosphorylation studies and that
      may be relevant for functional properties of PKP3. The
      selected amino acid residues were replaced by mutagenesis
      experiments and several PKP3 mutants were generated covering
      single or multiple mutations. Epithelial cells were stably
      transfected with these PKP3 constructs and analyzed by
      immunofluorescence staining and differential extraction. So
      far, the individual modifications studied did not result in a
      detectable change in PKP3 function or cellular behavior.
      Furthermore, we generated polyclonal antisera against these
      phosphorylated PKP3 sequences. Purification of one of these
      sera revealed that it was suitable for further analyses.
      Using these antibodies, the phosphorylation of the tyrosine
      residue Y195 of PKP3 was analyzed by in-vivo and in-vitro
      experiments. By the application of specific kinase-inhibitors
      and in-vitro kinase assays we identified PKP3 as a new
      substrate of c-Src kinase. We found that phosphorylation of
      this tyrosine residue is tightly regulated and is only
      detectable after inhibition of cellular tyrosine phosphatases
      by pervanadate. Incubation of cells with common growth
      factors like EGF, IGF-1 or HGF surprisingly did not result in
      a detectable phosphorylation of this specific residue.
      Interstingly, phosphorylation of Y195 was induced by hydrogen
      peroxide treatment of cells. This suggests that this
      modification of PKP3 is at least part of a Src-mediated
      signalling pathway which is dependent on reactive oxygen
      species and oxidative stress. Immunofluorescence staining of
      c-Src over-expressing cells detected Y195-phosphorylated PKP3
      at the desmosomal structure. At this particular point further
      investigations seem to be necessary since tyrosine
      phosphorylation of PKP3 was associated with altered protein
      solubility in several experiments, and so far, these findings
      did not correlate with a specific phosphorylation of PKP3. In
      conclusion, the present study shows for the first time the
      existence of a specific tyrosine phosphorylation and an
      associated signaling pathway for the desmosomal protein PKP3,
      whose cell biological relevance has to be addressed in future
      experiments. With regard to malignant tumors, the grade of
      malignancy of prostate carcinomas was previously correlated
      with an elevated activity of c-Src kinase and increased PKP3
      expression. According to the results obtained in this thesis,
      adenocarcinomas of prostate were immunohistochemically
      analyzed for the presence of Y195-phosphorylated PKP3. The
      specific phosphorylation was found in some poorly
      differentiated adenocarcinomas at distinct tumour areas along
      cell borders. Further studies have to elucidate the
      functional relevance and if the specific PKP3 modification
      may achieve diagnostic significance.