title: Identification and characterization of new components involved in cytosolic Fe-S protein biogenesis
title: Identifizierung und Charakterisierung neuer Faktoren der zytosolischen Fe-S Proteinbiogenese
Creators: name: Paul, Viktoria Désirée
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Yae1
Protein-Protein Interaktion
Saccharomyces cerevisiae
Rli1
Eisen-Schwefel-Cluster Biogenese
CIA machinery
Tandem Affinity Purification
Biowissenschaften, Biologie
Lto1

description: Iron sulfur (Fe-S) clusters are
      important cofactors of numerous proteins and are present in
      all known forms of life. Fe-S proteins have various functions
      in electron transport, enzyme catalysis and gene regulation.
      Moreover, recently Fe-S cluster-containing proteins with a
      function in essential cellular processes such as DNA
      replication, DNA repair, transcription and ribosome function
      were detected. The synthesis of the Fe-S clusters and their
      subsequent insertion into apoproteins require three complex
      proteinaceous machineries in eukaryotes that are localized in
      the mitochondria and the cytosol. The maturation of cytosolic
      and nuclear Fe-S proteins is accomplished by the cooperation
      of the mitochondrial iron sulfur cluster (ISC) assembly
      machinery, the ISC export machinery and the cytosolic iron
      sulfur protein assembly (CIA) machinery. The CIA machinery
      consists of eight known proteins but their interactions with
      each other are not fully understood. Moreover it is likely
      that even more CIA proteins are involved in this complex
      biosynthetic process. In the first part of my thesis the
      interactions of previously known CIA proteins were analyzed
      in the model organism Saccharomyces cerevisiae. By performing
      a systematic CIA protein interaction analysis it was shown
      that the individual CIA factors do not assemble a
      supercomplex. They rather can be divided into three
      functional subcomplexes that assist different stages in
      biogenesis of cytosolic and nuclear Fe-S proteins. The
      scaffold protein complex consisting of Cfd1-Nbp35 is required
      for the assembly of a [4Fe-4S] cluster in the early phase of
      biogenesis. Electrons required for this reaction are provided
      by the CIA subcomplex Dre2-Tah18. In the late phase of
      cytosolic Fe-S protein biogenesis the newly assembled Fe-S
      cluster is transferred from the scaffold protein complex onto
      apoproteins. This step is performed by the so-called "CIA
      targeting complex" consisting of Cia1, Cia2 and Met18. The
      CIA factor Nar1 fulfills an intermediary, so far not
      well-defined function and interacts with both the early and
      the late parts of the CIA machinery. In the second part of my
      thesis the essential proteins Yae1 and Lto1 were discovered
      and characterized as new components of the CIA machinery.
      These two proteins are highly conserved and form a complex
      that is specifically required under aerobic conditions. In a
      proteome-wide interaction analysis Yae1 and Lto1 were
      identified as binding partners of the CIA targeting complex.
      Moreover, a previous systematic interaction analysis has
      shown an association of Yae1-Lto1 with the Fe-S protein Rli1.
      However, a functional connection of these proteins to the CIA
      machinery has not been reported until now. It was shown in
      this work that the depletion of Yae1 or Lto1 results in a
      maturation defect of the essential Fe-S protein Rli1 but
      surprisingly no other cytosolic or nuclear target proteins
      were affected. Additionally, by setting up a new technology I
      showed that the cofactors were stably associated with Rli1
      when Yae1 was rapidly degraded, confirming that this protein
      is not a stabilization factor of the two Fe-S clusters. These
      findings suggest that Yae1 and Lto1 are highly specific
      maturation factors for Rli1. The Yae1-Lto1 complex is
      conserved in eukaryotes and can be functionally replaced by
      the human YAE1D1-ORAOV1 complex in yeast. This work shows
      that certain cytosolic Fe-S proteins such as Rli1 obviously
      do not only depend on the general CIA machinery for the
      maturation of their Fe-S clusters, but also on the function
      of other more specialized CIA components. A comparable
      substrate specificity as observed for these two new CIA
      factors was described recently for the human CIA factor
      CIA2A, which is solely responsible for the maturation of the
      cytosolic Fe-S protein IRP1. It has to be clarified whether
      additional CIA factors exist that support the dedicated
      maturation of eukaryotic Fe-S proteins. Furthermore, future
      studies will have to address the molecular mechanism by which
      such highly specific factors conduct the insertion of the
      Fe-S clusters into target proteins.
description: Eisen-Schwefel (Fe-S) Cluster sind
      wichtige Kofaktoren zahlreicher Proteine und kommen in allen
      bekannten Lebensformen vor. Fe-S Proteine haben vielfältige
      Funktionen, u.a. beim Elektronentransport, in Enzymkatalysen
      und in der Genregulation. In neuester Zeit wurden überdies
      Fe-S Cluster-haltige Proteine mit einer Funktion in
      essentiellen zellulären Prozessen wie der DNA-Replikation,
      DNA-Reparatur, Transkription und Ribosomenassemblierung
      entdeckt. Die Synthese der Fe-S Cluster und der anschließende
      Einbau in Apoproteine erfordern in Eukaryoten drei komplexe
      Synthesemaschinerien, die in den Mitochondrien und im Zytosol
      lokalisiert sind. Die Reifung zytosolischer und nukleärer
      Fe-S Proteine wird durch das Zusammenwirken der
      mitochondrialen Eisen-Schwefel Cluster
      (ISC)-Assemblierungsmaschinerie, der ISC-Exportmaschinerie
      und der zytosolischen Eisen-Schwefel Protein Assemblierungs
      (CIA)-Maschinerie ermöglicht. Die CIA-Maschinerie besteht
      bisher aus acht Proteinen, jedoch sind deren Interaktionen
      nicht umfassend beschrieben. Darüber hinaus ist
      wahrscheinlich, dass weitere CIA-Proteine an diesem komplexen
      Prozess beteiligt sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden
      die Interaktionen der bisher bekannten CIA-Proteine im
      Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae analysiert. Dabei
      konnte in einer systematischen CIA-Protein
      Interaktionsanalyse gezeigt werden, dass die einzelnen
      CIA-Faktoren keinen Superkomplex bilden, sondern in drei
      funktionelle Subkomplexe unterteilt werden können, die
      unterschiedlichen Phasen der Biogenese zytosolischer und
      nukleärer Fe-S Proteine zuzuordnen sind. Auf dem
      Gerüstproteinkomplex bestehend aus Cfd1-Nbp35 wird in der
      frühen Phase ein [4Fe-4S] Cluster assembliert. Die für diese
      Reaktion nötigen Elektronen werden durch den CIA-Subkomplex
      Dre2-Tah18 bereitgestellt. In der späten Phase der
      zytosolischen Fe-S Proteinbiogenese wird der neu assemblierte
      Fe-S Cluster vom Gerüstproteinkomplex auf Apoproteine
      übertragen. Dieser Schritt erfolgt mithilfe des sog.
      „CIA-Targetingkomplexes“ bestehend aus Cia1, Cia2 und Met18.
      Der CIA-Faktor Nar1 nimmt dabei eine intermediäre, noch nicht
      genau definierte Funktion ein und interagiert sowohl mit den
      frühen als auch mit den späten Teilen der CIA-Maschinerie. Im
      zweiten Teil dieser Arbeit wurden die essentiellen Faktoren
      Yae1 und Lto1 als neue Bestandteile der CIA-Maschinerie
      entdeckt und charakterisiert. Diese beiden Proteine zeichnen
      sich durch eine hohe Konservierung aus und bilden einen
      Komplex, der unter aeroben Bedingungen von besonderer
      Bedeutung ist. Yae1 und Lto1 wurden durch Auswertung der
      proteomweiten Interaktionsanalyse als Bindepartner der
      Komponenten des CIA-Targetingkomplexes identifiziert. Eine
      frühere systematische Interaktionsstudie hat außerdem
      gezeigt, dass Yae1 und Lto1 mit dem Fe-S Protein Rli1
      interagieren. Die Verbindung zur CIA-Maschinerie war jedoch
      bis dato nicht bekannt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt
      werden, dass die Depletion von Yae1 oder Lto1 einen
      Reifungsdefekt des essentiellen Fe-S Proteins Rli1, nicht
      aber anderer zytosolischer oder nukleärer Zielproteine zur
      Folge hat. Darüber hinaus wurde unter Verwendung einer neu
      etablierten Methode gezeigt, dass Rli1 seine Fe-S Cluster
      auch nach raschem Abbau von Yae1 stabil gebunden hält, was
      gegen eine Rolle des Yae1 als Stabilisator der beiden Fe-S
      Cluster spricht. Diese Befunde legen nahe, dass den beiden
      Proteinen Yae1 und Lto1 eine Funktion als hoch spezifische
      Reifungsfaktoren für Rli1 zukommt. Der Komplex aus Yae1 und
      Lto1 ist in Eukaryoten konserviert und kann durch den humanen
      YAE1D1-ORAOV1 Komplex funktionell in der Hefe ersetzt werden.
      Diese Arbeit zeigt, dass bestimmte zytosolische Fe-S Proteine
      wie Rli1 offensichtlich nicht nur die generelle
      CIA-Maschinerie, sondern auch die Funktion weiterer
      spezifischer CIA-Komponenten für die Reifung ihrer Fe-S
      Cluster benötigen. Eine vergleichbar hohe Substratspezifität
      wie bei diesen neu entdeckten CIA-Faktoren wurde kürzlich
      auch für den humanen CIA-Faktor CIA2A beschrieben, der
      ausschließlich für die Maturierung des zytosolischen Fe-S
      Proteins IRP1 verantwortlich ist. Zukünftige Untersuchungen
      müssen deshalb die interessante Frage angehen, ob nicht
      weitere CIA-Faktoren existieren, die auf bisher unbekannte
      Weise die Reifung eukaryotischer Fe-S Proteine unterstützen.
      Ein weiteres Ziel wird die Klärung der Frage sein, nach
      welchem molekularen Mechanismus solch hoch spezifische
      Faktoren den Fe-S Cluster-Einbau in Zielproteine
      gewährleisten.