title: Immunmonitoring während Transarterieller Chemoembolisation beim hepatozellulären Karzinom und Korrelation mit dem klinischen Therapieerfolg
title: Immunomonitoring during transarterial chemoembolization of hepactocellular carcinoma and correlation with clinical outcome
Creators: name: Schmid, Jonas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Objectives Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common carcinomas worldwide and one of the leading causes of cancer death. Overall, despite new therapeutic options, there is still a poor prognosis with a wide individual variation in response to different forms of therapy. Causes of the varying response to therapy in individual patients remain unclear. Immunological changes that are influenced by therapy and are conducive to successful treatment could be contributing factors. Interventional therapies should be emphasized in this context, as they induce rapid tumor cell death, which leads to a strong acute phase reaction with associated release of inflammatory mediators. These can trigger further immunological processes that presumably stimulate or even initiate tumor-specific defense mechanisms. For this reason, we performed immune monitoring periinterventionally to transarterial chemoembolization (TACE). The aim of this study was to analyze different immune parameters in relation to the response to therapy and to draw conclusions about the importance of individual cell groups and the associated signaling pathways in regard to the tumor-specific immune response. Furthermore, new prognostic markers should be identified. Design and Methods Twenty-one HCC-patients treated with TACE at University Hospital Erlangen were included. Plasma, serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained immediately before TACE and on the two subsequent days. Clinical data were collected pseudonymized from the electronic medical record. This included parameters such as etiology, tumor diameter, tumor focus number and clinical scores. In addition relevant laboratory values such as transaminases, cholestasis levels and alpha-1-fetoprotein (AFP) were collected. The obtained patient samples were analyzed by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The percentage of different lymphocyte subpopulations with their activation and proliferation levels and corresponding cytokines were determined. For evaluation, patients were divided into two groups according to progression-free survival (PFS). We looked for relevant correlations among the recorded and determined parameters with each other and with progression-free survival by using Mann-Whitney U test, Wilcoxon signed-rank test and Kaplan-Meier estimator. Observations and Results The 21 included subjects were on average 74.1 (±10.0) years old, 15 (71.4%) were male. Liver cirrhosis was present in a majority (17 subjects, 81.0%), of which the Child-Pugh score was A in 12 patients (66.7%), B in 5 (27.8%) and C in one (5.6%). The Model for End-Stage Liver Disease (MELD)-score averaged 11.7 (±4.8). The etiology of liver cirrhosis was ethyltoxic in 7 patients (33.3%), hepatitis C in 3 (14.3%), ethyltoxic in combination with hepatitis C and ethyltoxic in combination with nonalcoholic steatohepatitis (NASH) one each (4.8%) and primary biliary cholangitis (PBC) in 2 (9.5%). In seven subjects (33.3%) etiology was unclear. Six subjects had Barcelona Clinic Liver Cancer Staging System (BCLC) A (28,6%), 14 had BCLC B (66,7%) and one had BCLC D (4,8%). The median tumor diameter was 42.3 mm (±17.6 mm) and the median AFP level was 421.7 ng/ml (±657.1 ng/ml). Median PFS amounted 83 days and median overall survival was 207 days. A good response to therapy was considered a progression-free survival of more than 180 days, which was present in 16 subjects (76.2%). Significant changes at day one and two after TACE compared to baseline levels were seen in several parameters. There was a significant decrease in total lymphocyte count (baseline: 51.57 ±13.95%, day 2: 37.11 ±15.47%, z = 3.148, p = 0.002), CD4+ T-cells (baseline: 58.76 ±18.14%, day 2: 55.17 ±18.75%, z = 2.107, p = 0.035), Ki67+ CD8+ T-cells (baseline: 2.80 ±1.94%, day 2: 2.25 ±1.83%, z = 2.675, p = 0.008) and AFP (baseline: 421.71 ±657.12 ng/mL, day 2: 413.76 ±644.51 ng/mL, z = 2.417, p = 0.016). A significant increase was observed in total leukocyte count (baseline: 4.92 ±1.80 thousand/µL, day 1: 6.43 ±2.48 thousand/µL, z = -2.556, p = 0.011; day 2:7.74 ±3.74 thousand/µL, z = -2.589, p = 0.001), glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) (baseline: 63.19 ±29.00 U/L, day 1: 154.95 ±134.47 U/L, z = -3.659, p &lt; 0.001; day 2: 357.90 ±413.64 U/L, z = -3.464, p = 0.001), glutamate pyruvate transaminase (GPT) (baseline: 40.38 ±23.34 U/L, day 1: 67.15 ±48.55 U/L, z = -3.698, p &lt; 0.001; day 2: 142.25 ±155.36 U/L, z = -3.517, p &lt; 0.001), interleukin (IL)-6 (baseline: 8.60 ±11.48 pg/mL, day 1: 26.96 ±26.18 pg/mL, z = -3.678, p &lt; 0.001; day 2: 151.29 ±186.08 pg/mL, z = -3.516, p &lt; 0.001), C-reactive protein (CRP) (baseline: 12.97 ±21.08 mg/L, day 2: 42.81 ±49.79 mg/L, z = -2.192, p = 0.028) and CD8+ terminal differentiated T effector memory cell (Temra) (baseline:47.77 ±22.70%, day 2: 51.01 ±24.16%, z = -2.059, p = 0.040) were observed. However, the extent of change did not correlate with treatment response. There were no significant changes at day 1 or 2 after TACE compared with baseline levels in IL-1β, IL-8, IL-17A, transforming growth factor β 1 (TGF-β1), lactate dehydrogenase (LDH), gamma-glutamyl transferase (γ-GT), alkaline phosphatase (AP), T- cells, HLA-DR+ T-cells, Ki67+ T-cells, CD4+ T-cells, HLA-DR+ CD4+ T-cells, Ki67+ CD4+ T-cells, CD4+ central memory T cell (Tcm), CD4+ effector memory T-cell (Tem), CD4+ Temra, CD4+ naive T-cell (Tnaive), CD8+ T-cells, HLA-DR+ CD8+ T-cells, CD8+ Tcm, CD8+ Tem, CD8+ Tnaive, B-cells, Ki67+ B-cells, natural killer cells (NK-cells), Ki67+ NK-cells, regulatory T-cells (Treg) and Ki67+ Treg. Significantly longer PFS was correlated with lower baseline levels of TGF-β1 (PFS &gt;180 days: 2023.08 ±1173.88 pg/mL, PFS ≤180 days: 5030.15 ±2458.92 pg/mL, logrank p = 0.019) and higher levels of HLA-DR+ CD8+ T-cells (PFS &gt;180 days: 3.83 ±2.51%, PFS ≤180 days: 3.25 ±1.86%, logrank p = 0.027) and CD8+ Temra (PFS &gt;180 days: 49.68 ±19.25%, PFS ≤180 days: 47.18 ±24.23%, logrank p = 0.031). A lower baseline level of TGF-β1 (PFS &gt;180 days: 2023.08 ±1173.88 pg/mL, PFS ≤180 days: 5030.15 ±2458.92 pg/mL, p = 0.023) and a higher number of Ki67+ NK-cells (PFS &gt;180 days: 9.12 ±4.77%, PFS ≤180 days: 5.40 ±2.36%, p = 0.048) correlated with a better treatment response. Baseline levels of the following parameters did not correlate with PFS: IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17A, albumin, creatinine, bilirubin, INR, AFP, LDH, GOT, GPT, γ-GT, AP, leukocytes, CRP, MELD, lymphocytes, T-cells, HLA-DR+ T-cells, Ki67+ T-cells, CD4+ T-cells, HLA-DR+ CD4+ T-cells, Ki67+ CD4+ T-cells, CD4+ Tcm, CD4+ Tem, CD4+ Temra, CD4+ Tnaive, CD8+ T-cells, Ki67+ CD8+ T-cells, HLA-DR+ CD8+ T-cells, CD8+ Tcm, CD8+ Tem, CD8+ Tnaive, CD8+ Temra, B cells, Ki67+ B-cells, NK-cells, Ki67+ NK-cells, Treg and Ki67+ Treg. In addition, significantly higher baseline TGF-β1 levels existed in less favorable grading (G1: 3561.41 ±1920.77 pg/mL, G2/G3: 6243.24 ±1333.18 pg/mL, p = 0.050), more advanced BCLC-score (BCLC A: 2761.91 ±1409.21 pg/mL, BCLC B/C/D 5143.09 ±2631.47 pg/mL, p = 0.040) and incomplete devascularization (complete: 3170.62 ±1989.05 pg/mL, incomplete: 5966.44 ±2385.08 pg/mL, p = 0.011). There was no significant correlation of baseline TGF-β1 levels with the other clinical classifications Child-Pugh, etiology, tumor size, and MELD. Furthermore, no correlation of the baseline level of the other determined parameters with these clinical parameters was observed. Conclusions An important previously identified mechanism for inadequate treatment response in HCC is depletion of CD8+ T-cells, decreased NK-cell function and increased activity of Treg. In this study, the correlation of an increased baseline level before TACE of HLA-DR+ CD8+ T-cells and of Ki67+ NK-cells with a longer PFS confirmed this finding. TGF-β1 is thought to play a key role in the development of immune cell exhaustion and activation of Treg. The higher baseline level of TGF-β1 correlating with shorter PFS, less favorable grading, advanced BCLC score and incomplete devascularization confirmed this assumption. These observations could be used in clinical practice as easily available prognostic markers or as target for immunomodulatory therapy.
description: Hintergrund und Ziele Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist eines der weltweit häufigsten Karzinome und eine der häufigsten Krebstodesursachen. Insgesamt besteht trotz neuer Therapieoptionen noch immer eine insgesamt schlechte Prognose, wobei das Ansprechen auf die verschiedenen Therapieformen individuell sehr unterschiedlich ausfällt. Die Ursachen des unterschiedlichen Therapieansprechens einzelner Patienten sind weiterhin ungeklärt. Es könnten immunologische Veränderungen beitragen, die durch die Therapie beeinflusst werden und somit einer erfolgreichen Behandlung förderlich sind. Hervorzuheben sind bei dieser Fragestellung interventionelle Therapien, da hier ein rascher Tumorzelltod ausgelöst wird, der zu einer starken Akute-Phase-Reaktion mit zugehöriger Ausschüttung von Entzündungsmediatoren führt. Diese lösen weitere immunologische Vorgänge aus, die vermutlich tumorspezifische Abwehrmechanismen anregen bzw. initiieren. Aus diesem Grund führten wir ein Immunmonitoring periinterventionell zur Transarteriellen Chemoembolisation (TACE) durch. Das Ziel dieser Studie war verschiedene Immunparameter in Bezug auf das Therapieansprechen zu analysieren und Rückschlüsse auf die Bedeutung einzelner Zellgruppen und den zugehörigen Signalwegen bzgl. der tumorspezifischen Immunantwort zu ziehen. Ferner sollten neue Prognosemarker identifiziert werden. Material und Methoden Eingeschlossen wurden 21 Personen, die in der Universitätsklinik Erlangen bei HCC mit einer TACE behandelt wurden. Plasma, Serum und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden direkt vor TACE und an den beiden darauffolgenden Tagen gewonnen. Eine Erfassung der klinischen Daten erfolgte pseudonymisiert aus der elektronischen Patientenakte. Hierzu gehörten sowohl Parameter wie Ätiologie, Tumordurchmesser, Herdanzahl und klinische Scores, als auch relevante Laborwerte wie Transaminasen, Cholestasewerte und Alpha-1-Fetoprotein (AFP). Die gewonnenen Patientenproben wurden mittels Durchflusszytometrie und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysiert. Bestimmt wurden so der Anteil verschiedener Lymphozytensubpopulationen mit deren Aktivierungs- und Proliferationsgrad und korrespondierende Zytokine. Zur Auswertung wurden die Patienten nach dem progressionsfreien Überleben in zwei Gruppen eingeteilt. Unter Verwendung des Mann-Whitney-U-, des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests und Kaplan-Meier-Schätzers wurde nach relevanten Korrelationen unter den erfassten und bestimmten Parametern untereinander und mit dem progressionsfreien Überleben (engl. progression free survival, PFS) gesucht. Ergebnisse Die 21 eingeschlossenen Personen waren durchschnittlich 74,1 (±10,0) Jahre alt, 15 (71,4%) waren männlich. Bei einem Großteil (17 Personen, 81,0%) lag eine Leberzirrhose vor, hiervon lag der Child-Pugh-Score bei 12 Personen bei A (66,7%), 5 bei B (27,8%) und einer bei C (5,6%). Der Model for End-Stage Liver Disease (MELD) -Score betrug durchschnittlich 11,7 (±4,8). Die Ätiologie der Leberzirrhose war bei 7 Patienten (33,3%) ethyltoxisch, bei 3 eine Hepatitis C (14,3%), jeweils einmal (je 4,8%) ethyltoxisch in Kombination mit Hepatitis C bzw. ethyltoxisch in Kombination mit nicht-alkoholischer Steatohepatitis (NASH) und bei 2 eine primär biliäre Cholangitis (PBC) (9,5%). Bei 7 Personen (33,3%) war die Genese unklar. Bei 6 Personen bestand Barcelona Clinic Liver Cancer Staging System (BCLC) A (28,6%), bei 14 BCLC B (66,7%) und bei einer BCLC D (4,8%). Der durchschnittliche Tumordurchmesser lag bei 42,3 mm (±17,6 mm) und der durchschnittliche AFP-Wert bei 421,7 ng/ml (±657,1 ng/ml). Das mediane PFS betrug 83 Tage, das mediane Gesamtüberleben 207 Tage. Ein gutes Therapieansprechen wurde als PFS von über 180 Tagen gewertet, was bei 16 Personen (76,2%) vorlag. Signifikante Änderungen an Tag eins und zwei nach TACE im Vergleich zum Ausgangsniveau konnten bei mehreren Parametern festgestellt werden. Es kam zu einer signifikanten Abnahme der Gesamtlymphozytenzahl (Ausgangswert: 51,57 ±13,95%, Tag 2: 37,11 ±15,47%, z = 3,148, p = 0,002), CD4+ T-Zellen (Ausgangswert: 58,76 ±18,14%, Tag 2: 55,17 ±18,75%, z = 2,107, p = 0,035), Ki67+ CD8+ T-Zellen (Ausgangswert: 2,80 ±1,94%, Tag 2: 2,25 ±1,83%, z = 2,675, p = 0,008) und des AFP (Ausgangswert: 421,71 ±657,12 ng/mL, Tag 2: 413,76 ±644,51 ng/mL, z = 2,417, p = 0,016). Ein signifikanter Anstieg konnte bei der Gesamtleukozytenzahl (Ausgangswert: 4,92 ±1,80 Tsd/µL, Tag 1: 6,43 ±2,48 Tsd/µL, z = -2,556, p = 0,011; Tag 2:7,74 ±3,74 Tsd/µL, z = -2,589, p = 0,001), Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) (Ausgangswert: 63,19 ±29,00 U/L, Tag 1: 154,95 ±134,47 U/L, z = -3,659, p &lt; 0,001; Tag 2: 357,90 ±413,64 U/L, z = -3,464, p = 0,001), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) (Ausgangswert: 40,38 ±23,34 U/L, Tag 1: 67,15 ±48,55 U/L, z = -3,698, p &lt; 0,001; Tag 2: 142,25 ±155,36 U/L, z = -3,517, p &lt; 0,001), Interleukin (IL)-6 (Ausgangswert: 8,60 ±11,48 pg/mL, Tag 1: 26,96 ±26,18 pg/mL, z = -3,678, p &lt; 0,001; Tag 2: 151,29 ±186,08 pg/mL, z = -3,516, p &lt; 0,001), C-reaktives Protein (CRP) (Ausgangswert: 12,97 ±21,08 mg/L, Tag 2: 42,81 ±49,79 mg/L, z = -2,192, p = 0,028) und CD8+ terminal differenzierte T-Effektorgedächtniszelle (Temra) (Ausgangswert:47,77 ±22,70%, Tag 2: 51,01 ±24,16%, z = -2,059, p = 0,040) beobachtet werden. Allerdings korrelierte die Stärke der Veränderung nicht mit dem Therapieansprechen. Es bestanden keine signifikanten Veränderungen an Tag 1 oder 2 nach TACE im Vergleich zum Ausgangsniveau bei IL-1β, IL-8, IL-17A, transforming growth factor β 1 (TGF-β1), Lactatdehydrogenase (LDH), Gamma-glutamyltransferase (γ-GT), Alkalische Phosphatase (AP), T- Zellen, HLA-DR+ T-Zellen, Ki67+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, HLA-DR+ CD4+ T-Zellen, Ki67+ CD4+ T-Zellen, CD4+ zentrale T-Gedächtniszelle (Tcm), CD4+ T-Effektorgedächtniszelle (Tem), CD4+ Temra, CD4+ naive T-Zelle (Tnaive), CD8+ T-Zellen, HLA-DR+ CD8+ T-Zellen, CD8+ Tcm, CD8+ Tem, CD8+ Tnaive, B-Zellen, Ki67+ B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK-Zellen), Ki67+ NK-Zellen, regulatorische T-Zellen (Treg) und Ki67+ Treg. Mit einem signifikant längeren PFS korrelierte ein geringeres Ausgangsniveau von TGF-β1 (PFS &gt;180 Tage: 2023,08 ±1173,88 pg/mL, PFS ≤180 Tage: 5030,15 ±2458,92 pg/mL, logrank p = 0,019) und eine höhere Anzahl an HLA-DR+ CD8+ T- (PFS &gt;180 Tage: 3,83 ±2,51%, PFS ≤180 Tage: 3,25 ±1,86%, logrank p = 0,027) und CD8+ Temra (PFS &gt;180 Tage: 49,68 ±19,25%, PFS ≤180 Tage: 47,18 ±24,23%, logrank p = 0,031). Mit einem besseren Therapieansprechen korrelierte ein geringeres Ausgangsniveau von TGF-β1 (PFS &gt;180 Tage: 2023,08 ±1173,88 pg/mL, PFS ≤180 Tage: 5030,15 ±2458,92 pg/mL, p = 0,023) und eine höhere Anzahl an Ki67+ NK-Zellen (PFS &gt;180 Tage: 9,12 ±4,77%, PFS ≤180 Tage: 5,40 ±2,36%, p = 0,048). Die Ausgangswerte der folgenden Parameter korrelierten nicht mit dem PFS: IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17A, Albumin, Kreatinin, Bilirubin, INR, AFP, LDH, GOT, GPT, γ-GT, AP, Leukozyten, CRP, MELD, Lymphozyten, T-Zellen, HLA-DR+ T- Zellen, Ki67+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, HLA-DR+ CD4+ T-Zellen, Ki67+ CD4+ T-Zellen, CD4+ Tcm, CD4+ Tem, CD4+ Temra, CD4+ Tnaive, CD8+ T-Zellen, Ki67+ CD8+ T-Zellen, HLA-DR+ CD8+ T-Zellen, CD8+ Tcm, CD8+ Tem, CD8+ Tnaive, CD8+ Temra, B-Zellen, Ki67+ B-Zellen, NK-Zellen, Ki67+ NK-Zellen, Treg und Ki67+ Treg. Zudem wurde festgestellt, dass bei ungünstigerem Grading (G1: 3561,41 ±1920,77 pg/mL, G2/G3: 6243,24 ±1333,18 pg/mL, p = 0,050), fortgeschrittenerem BCLC-Score (BCLC A: 2761,91 ±1409,21 pg/mL, BCLC B/C/D 5143,09 ±2631,47 pg/mL, p = 0,040) und unvollständiger Devaskularisation (vollständig: 3170,62 ±1989,05 pg/mL, unvollständig: 5966,44 ±2385,08 pg/mL, p = 0,011) signifikant höhere TGF-β1 Ausgangswerte bestanden. Eine signifikante Korrelation des TGF-β1 Ausgangswertes mit den anderen klinischen Einteilungen Child-Pugh, Ätiologie, Tumorgröße und MELD bestand nicht. Zudem wurde keine Korrelation des Ausgangsniveaus der anderen bestimmten Parameter mit diesen klinischen Parametern festgestellt. Schlussfolgerung Ein wichtiger bereits identifizierter Mechanismus für ein unzureichendes Therapieansprechen beim HCC ist die Erschöpfung von CD8+ T-Zellen, eine verminderte NK-Zellfunktion und eine erhöhte Aktivität regulatorischer T-Zellen. In dieser Studie bestätigte die Korrelation eines erhöhten Ausgangsniveaus vor TACE von HLA-DR+ CD8+ T-Zellen und von Ki67+ NK-Zellen mit einem längeren PFS diese Erkenntnis. Für TGF-β1 wird eine zentrale Rolle in der Entwicklung dieser Immunzellerschöpfung und Aktivierung von regulatorischen T-Zellen angenommen. Das höhere Ausgangsniveau von TGF-β1 bei kürzerem PFS, ungünstigerem Grading, fortgeschrittenem BCLC-Score und unvollständiger Devaskularisation bestätigte diese Annahme. Diese Beobachtungen könnten im klinischen Alltag beispielsweise als einfach verfügbarer Prognosemarker oder als Ziel einer immunmodulatorischen Therapie genutzt werden.