title: Establishing a NSCLC model to investigate the role of p53 DNA binding cooperativity for cell fate decicions in vitro and in vivo
title: Etablierung eines NSCLC-Modells zur Untersuchung der Rolle der p53 DNA Bindungskooperativität für Zellschicksalsentscheidungen in vitro und in vivo
Creators: name: Kahnis, Robert Walter
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Gen-Targeting
Zellzyklus
Protein p53
Zellschicksal
Krebs
tumor supression
Protein p53 , targeted integration
cell fate decicions
Medizin, Gesundheit
DNA Bindungskooperativität
dna binding cooperativity

description: Der Tumorsuppressor p53 fungiert
      als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von
      Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge
      Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert
      p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet
      durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor als Antwort auf
      zelluläre Stressoren über das Zellschicksal. Abhängig von Art
      und Ausmaß des Schadens, kann die Antwort von transientem
      Zellzyklusarrest mit Einleitung von DNA-Reparaturprogrammen
      über einen irreversiblen Zellzyklusstopp durch Seneszenz oder
      Differenzierung bis hin zur Entfernung der Zelle aus dem
      Organismus durch p53-vermittelte Apoptose reichen. Für die
      Auswahl von Zielgenen und damit das p53-abhängige
      Zellschicksal spielt die p53 DNA Bindungskooperativität eine
      entscheidende Rolle. p53 bindet als Tetramer kooperativ an
      die DNA. Die strukturelle Basis hierfür stellen
      intermolekulare Interaktionen zwischen den beiden
      gegensätzlich geladenen Aminosäureresten Glutamat 180 und
      Arginin 181 an der Helix H1 der DNA Bindungsdomänen von
      jeweils zwei p53 Monomeren dar. Mutationen an dieser Stelle
      können die Kooperativität und damit Bindungsaffinität von p53
      an die DNA verringern bzw. erhöhen. Dies beeinflusst die
      Zielgenselektion, denn hohe Kooperativität erweitert das
      Zielgenspektrum auch auf Gene mit von der
      p53-Konsensussequenz abweichenden p53-responsiven Elementen.
      Während Zielgene, die in der Auslösung von Zellzyklusarrest
      involviert sind, meist kanonische p53 RE aufweisen und daher
      sowohl von niedrig- als auch hoch-kooperativem p53
      transaktiviert werden können, finden sich in den Promotoren
      von Apoptose-fördernden Zielgenen weniger perfekte,
      niedrig-affine p53 Bindungsstellen, für deren Bindung daher
      hohe Kooperativität erforderlich ist. Der Einfluss der
      Bindungskooperativität auf das langfristige
      Proliferationsverhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo
      konnte dabei bislang noch nicht vergleichend untersucht
      werden. Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es daher,
      Zelllinien mit stabiler Expression von
      p53-Kooperativitätsmutanten zu etablieren, welche den
      Einfluss von Kooperativität auf das Zellschicksal abbilden
      und untersuchbar machen. Hierzu wurde ein induzierbares
      p53-Expressionssystem mit den verschiedenen
      Kooperativitätsmutanten kloniert, die das ganze Spektrum der
      H1-Helix-Interaktionsstärken – von aufgehoben bis über dem
      physiologischen Niveau liegend – abdecken. Das System wurde
      weiterhin mit einem Reporter versehen, um die p53 Expression
      überwachbar zu machen. Die entstehenden Fusionsproteine
      wurden korrekt exprimiert und übten erst nach Aktivierung
      p53-spezifische Effekte aus. Um eine optimale
      Vergleichbarkeit des Einflusses von Kooperativität auf das
      Zellschicksal herzustellen, wurde der Versuch unternommen,
      die p53 Konstrukte Endonuklease-vermittelt zielgerichtet in
      den Rag1 Genlokus p53-negativer H1299 Zellen zu integrieren.
      Dabei wird der zelluläre Reparaturmechanismus der homologen
      Rekombination ausgenutzt, um isogene Zelllinen zu generieren.
      Es zeigte sich eine sehr geringe Rekombinationsrate; zudem
      wiesen die positiv getesteten Klone unterschiedlich hohe
      p53-Proteinlevel und weiterhin keine induzierbare und
      effektive Aktivität von p53 auf. Daher eigneten sie sich
      nicht zur weiteren Untersuchung der Bindungskooperativität.
      Es lässt sich diskutieren, dass aufgrund verschiedener
      möglicher Gründe – z.B. dem epigenetischen Status des
      Rag1-Lokus oder Mutationen im DNA-Reparatursystem –
      Meganuklease-vermittelte zielgerichtete Integration in H1299
      Zellen nur mit sehr geringer Effizienz möglich ist. Daraufhin
      wurden durch konventionelle Transfektion und Selektion
      Zelllinien mit stabiler Expression der p53-Fusionsproteine
      generiert. Diese zeigten eine gute Expression der Konstrukte
      und nach Aktivierung von p53 starke, p53- und
      kooperativitätsabhängige Effekte. So zeigte sich bei der
      Untersuchung der langfristigen Auswirkung der Kooperativität
      auf die Proliferation eine mit steigender Kooperativität
      reduzierte Proliferationskinetik. Da die Zellen nicht isogen
      zueinander waren, zeigte sich in manchen der verwendeten
      Klone ein Einfluss der unterschiedlichen Proteinlevel auf das
      Zellschicksal, welche teilweise den Einfluss der
      Bindungskooperativität maskierte. Andererseits konnte aber
      auch verdeutlicht werden, dass dieses Modell bei sorgsamer
      Auswahl der Klone den Einfluss der p53 DNA
      Bindungskooperativität sehr gut abbilden kann. Daher eignet
      es sich sehr für weitere Experimente. Die Mechanismen
      p53-vermittelter Zellschicksalsentscheidungen zu verstehen,
      ist von großer Bedeutung, weshalb die weitere Erforschung der
      Bindungskooperativität – als ein Modulator dieser
      Entscheidungen – vorangetrieben werden sollte. Als eine der
      Möglichkeiten für weitere Untersuchungen mit diesem Modell
      bieten sich Xenograft-Studien an.
description: The tumor suppressor p53 acts as a
      cellular hub which processes a multitude of stress signals.
      By ensuring a tight control of the cell cycle and the state
      of the genome it acts as a safeguard of genomic integrity of
      a cell and - as an answer to cellular stresses - decides the
      cell’s fate mainly through its function as a transcription
      factor. Depending on the type and extent of the damage, the
      answer can reach from transient cell cycle arrest with
      concurrent start of DNA-repair programs to an irreversible
      cell cycle arrest by senescence or differentiation up to –
      ultimately – the removal of the cell from the organism via
      p53-mediated apoptosis. p53 DNA binding cooperativity plays
      an important role for target gene selection and thus for
      p53-dependent cell fate. p53 binds DNA as a tetramer in a
      cooperative manner. The structural basis for cooperativity is
      constituted by intermolecular interactions between the two
      oppositely charged amino acid residues glutamate 180 and
      arginine 181 in the helix H1 of the DNA binding domains of
      two p53 monomers. Mutations of these residues can lower or
      raise cooperativity and therefore DNA binding affinity of
      p53. This influences target gene selection, because high
      cooperativity expands the target gene spectrum to genes with
      p53 response elements deviating from the p53 consensus
      sequence. While target genes involved in cell cycle arrest
      mostly display canonical response elements and can therefore
      be transactivated by both low- and high-cooperative p53,
      promoters of apoptosis-promoting target genes often show
      imperfect, low-affinity p53 binding sites which can only be
      bound by high-cooperative p53. The influence of binding
      cooperativity on long-term proliferation behavior of tumor
      cells in vitro and in vivo has not been assessed
      comparatively yet. A primary objective of this work was
      therefore to establish cell lines with stable expression of
      p53-cooperativity mutants by means of which the entire
      spectrum of H1-Helix interactions strength and the associated
      impact on cell fate can be investigated. For this purpose an
      inducible p53 expression system with the different
      cooperativity mutants, which spanned the entire spectrum of
      cooperativity – from abrogated up to higher than
      physiological – was cloned. Furthermore, the system was
      labeled with a reporter, in order to monitor p53 expression.
      The created fusion proteins were expressed correctly and
      exerted p53-specific effects only after activation. For an
      optimal comparability of the influence of cooperativity on
      cell fate, it was attempted to integrate the p53 construct
      into a given locus in p53-null H1299 cells by means of gene
      targeting; this means endonuclease-mediated targeted
      integration into the Rag1 locus via homologous recombination
      to generate isogenic cell lines. The recombination rate was
      very low; furthermore the positively tested clones exhibited
      different p53-protein levels and did not show inducible and
      effective activity of p53. Thus, they were not suitable for
      further investigation of binding cooperativity. It can be
      presumed that because of a variety of reasons – e.g. the
      epigenetic status of the Rag1 locus or mutations in the DNA
      repair system – Meganuclease-mediated targeted integration in
      H1299 cells is only possible with very low efficiency.
      Thereupon additional cell lines with a stable expression of
      p53 fusion constructs were generated through conventional
      transfection and selection. They exhibited good expression of
      the constructs and strong p53- and cooperativity dependent
      effects on the cell fate upon p53 activation. For instance,
      cells showed reduced proliferation kinetics with increasing
      cooperativity. However, due to the fact that cells were not
      strictly isogenic, it could be observed that in some of the
      used clones different protein levels showed an effect on the
      cellular outcome upon p53 activation which in part masked
      influence of binding cooperativity. On the other hand, it
      could also be clarified that by means of careful selection of
      clones this model can display the influence of p53 DNA
      binding cooperativity very well. Hence, it is very suitable
      for additional experiments. Understanding the mechanisms of
      p53-mediated cell fate decisions is of great importance, thus
      further research on binding cooperativity as one modulator of
      these decisions should be conducted. There is a variety of
      possibilities for further investigations with this model, of
      which I suggest xenograft studies.