title: Epistatic effects of DNase- and Siglec-deficiencies in SLE development, and the nanoscale organization of Siglec-G on the plasma membrane of B cells
Creators: name: Steffensen, Marie
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: SLE, Siglec-G, DNase1, DNase1l3, B1a cells, B cell receptor signalling

description: Systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist eine schwere Autoimmunerkrankung, die weltweit verbreitet ist und vorzugsweise Frauen im gebärfähigen Alter betrifft. SLE ist eine sehr heterogene Krankheit, und auch die Entstehung scheint multifaktoriell zu sein. Die meisten der Gene, die in genom-weiten Assoziationsstudien mit SLE identifiziert wurden, lassen sich drei biologischen Prozessen zuordnen: Abbau von Immunkomplexen, TLR-Funktion mit Produktion von Typ-I-Interferon und Signaltransduktion in Lymphozyten. Derzeit wird versucht, epistatische Effekte von Genen zu identifizieren, die an den genannten biologischen Prozessen beteiligt sind. Daher werden in dieser Arbeit potenzielle epistatische Effekte von Genen untersucht, die am Abbau von DNA (DNase1 und DNase1l3), der Lymphozyten-Signaltransduktion (Siglecg) und der Produktion von Typ-I-Interferon (Siglech) beteiligt sind. DNase1 und DNase1l3 sind Endonukleasen, die DNA abbauen. Es wurde gezeigt, dass sie sowohl im Menschen als auch in der Maus an der Entwicklung von SLE beteiligt sind. Siglec-G ist ein hemmender Rezeptor für die B Zell Rezeptor (BZR)-Signalübertragung in B1a-Zellen. Es wurde gezeigt, dass Siglecg-/- Mäuse SLE-ähnliche Symptome entwickeln, jedoch wurde bisher kein Zusammenhang mit genetischen Polymorphismen oder Mutationen des menschlichen Paralogs SIGLEC10 festgestellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Siglec-H die Produktion von Typ-I-Interferonen durch plasmazytoide dendritische Zellen nach TLR-9-Stimulation in vitro oder nach einer in vivo Infektion mit mCMV hemmt. Bei Siglec-H-defizienten Mäusen wurden leichte SLE-ähnliche Symptome beobachtet. Um die epistatischen Effekte dieser Gene zu untersuchen, wurden doppelt defiziente DNase1-/- x Siglecg-/-, DNase1l3-/- x Siglecg-/- und DNase1l3-/- x Siglech-/- Mäuse durch Kreuzung erzeugt. Bei DNase1-/- x Siglecg-/- Mäusen manifestieren sich die epistatischen Effekte hauptsächlich auf zellulärer Ebene mit einer vermehrten Bildung spontaner Keimzentren. Im Gegensatz dazu zeigen DNase1l3-/- x Siglecg-/- Mäuse erhöhte ANA-Werte und Anti-dsDNA-Antikörper-Titer. Sowohl DNase1-/- x Siglecg-/- als auch DNase1l3-/- x Siglecg-/- Mäuse weisen einen erhöhten Glomerulosklerose-Score auf, der bei Letzteren deutlich höher ist. Des Weiteren sind die meisten Veränderungen bei DNase1l3-/- x Siglech-/- Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen nur tendenziell, aber nicht statistisch signifikant. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination einer DNase-Defizienz mit einer Siglec-G-Defizienz, aber wahrscheinlich nicht mit einer Siglec-H-Defizienz, epistatische Effekte verursacht, die die Entwicklung des SLE beeinflussen. Neben der Analyse epistatischer Effekte wird in dieser Arbeit untersucht, ob zwei SNPs im SIGLEC10-Gen, die bei SLE-Patienten gefunden wurden, zur Entwicklung von SLE beitragen können. Eine vom Labor von C. Vinuesa durchgeführte Ganzgenomsequenzierung von SLE-Patienten ergab jedoch, dass SIGLEC10 häufig von seltenen Mutationen betroffen ist. Daher werden zwei SNPs in SIGLEC10 auf ihren möglichen Einfluss auf die Hemmung der BZR-Signalübertragung untersucht. Zu diesem Zweck wurde die menschliche B-Zelllinie RAMOS mit lentiviralen Konstrukten transduziert, die entweder wt- oder mutierte SIGLEC10-Inserts enthalten. Die BZR-Signalübertragung in den transduzierten RAMOS-Zellen wurde dann anhand des Einstroms von Calcium in die Zelle untersucht. Es ist jedoch kein Einfluss der SIGLEC10-SNPs nachweisbar. Der zweite Teil dieser Arbeit zielt darauf ab, ein besseres Verständnis der Siglec-G-Regulation zu erhalten. Analysen von Siglec-G-defizienten Mäusen zeigten eine B1-Zell-spezifische Funktion von Siglec-G, da Siglecg-/- Mäuse eine erhöhte Anzahl von B1-Zellen in der Milz, eine starke Vermehrung von B1a-Zellen im Peritoneum und eine erhöhte Kalziummobilisierung in B1a-Zellen nach BZR-Stimulation zeigten. Im Gegensatz dazu waren andere B-Zell-Untergruppen nicht beeinträchtigt. Der Mechanismus, der hinter dieser Spezifität für B1a-Zellen steht, bleibt jedoch unklar. In dieser Arbeit wird analysiert, ob eine Siglec-G-Spezifität für B1a-Zellen aus einer unterschiedlichen Organisation und Assoziation mit Immundomänen von Siglec-G auf der Plasmamembran von B-Zellen resultiert. Zu diesem Zweck wurden mögliche Veränderungen in der Verteilung und Organisation von Siglec-G und IgM sowie deren Assoziation mit den beiden „Super-Resolution“-Mikroskopietechniken TIRF &amp; SRRF-Mikroskopie und dSTORM-Mikroskopie untersucht. Die TIRF- und SRRF-Mikroskopie zeigt, dass Siglec-G und IgM bereits auf ruhenden B1a-Zellen stärker kolokalisieren als auf B2-Zellen. Darüber hinaus nimmt die Kolokalisierung auf B1a-Zellen signifikant zu, bleibt aber auf B2-Zellen nach BZR-Stimulation konstant. Darüber hinaus zeigt die TIRF- und SRRF-Mikroskopie eine verminderte Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen, aber nicht auf B2-Zellen der Ligandenbindungsmutante Siglec-G-R120E. Daher könnte die Ligandenbindung von Siglec-G wichtig für die Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen, aber nicht auf B2-Zellen sein. Ruhende B-Zellen von wt- und Siglec-G-R120E-Mäusen wurden ebenfalls mittels dSTORM-Mikroskopie analysiert. Ein erstes Experiment bestätigte die verstärkte Assoziation von Siglec-G und IgM auf ruhenden B1a-Zellen im Vergleich zu B2-Zellen. Die Auswertung weiterer dSTORM-Mikroskopie-Experimente ist jedoch noch nicht abgeschlossen. Daher kann noch keine endgültige Schlussfolgerung gezogen werden. Zusammenfassend bestätigen die „Super Resolution“-Mikroskopie-Experimente eine erhöhte Assoziation von Siglec-G und IgM auf B1a-Zellen und weisen auf eine erhöhte Abhängigkeit der Siglec-G-Ligandenbindung für die Assoziation mit IgM auf B1a-Zellen hin.
description: Systemic lupus erythematosus (SLE) is a severe autoimmune disease with a worldwide distribution preferably affecting women in childbearing age. SLE is a very heterogenous disease and its origin appears to be multifactorial as well. Most of the genes identified in genome-wide association studies with SLE can be assigned to three biological processes: processing of immune complexes, Toll-like receptors (TLRs) function with production of type I interferon (IFN) and signal transduction in lymphocytes. Current efforts are determined to identify epistatic effects of genes involved in the mentioned biological processes. Therefore, this work investigates potential epistatic effects of genes involved in DNA clearance (DNase1 and DNase1l3), lymphocyte signal transduction (Siglecg) and production of type I IFN (Siglech). DNase1 and DNase1l3 are endonucleases degrading DNA. They have been shown to be involved in SLE development in both humans and mice. Siglec-G is an inhibitory receptor of B cell receptor (BCR) signalling in B1a cells. Siglecg-/- mice have been shown to develop SLE-like symptoms, however, no association of genetic polymorphisms or mutations of the human paralogue SIGLEC10 has been detected so far. Siglec-H was shown to negatively regulate the production of type I IFNs by plasmacytoid dendritic cells after TLR-9 stimulation in vitro, or after an in vivo infection with murine cytomegalovirus. A development of mild SLE-like symptoms could be found in Siglec-H-deficient mice. To investigate epistatic effects of these genes, double-deficient DNase1-/- x Siglecg-/-, DNase1l3-/- x Siglecg-/- and DNase1l3-/- x Siglech-/- mice were generated by crossing. In DNase1-/- x Siglecg-/- mice, epistatic effects mainly manifest on a cellular level with increased formation of spontaneous germinal centers. In contrast, DNase1l3-/- x Siglecg-/- mice show increased ANA levels and anti-dsDNA antibody titers. Both DNase1-/- x Siglecg-/- and DNase1l3-/- x Siglecg-/- mice reveal an enhanced glomerulosclerosis score, considerably higher in the latter. Furthermore, most changes in DNase1l3-/- x Siglech-/- mice are only non-significant tendencies. In summary, the combination of a DNase-deficiency with a Siglec-G-deficiency, but probably not a Siglec-H-deficiency, causes epistatic effects that influence SLE development. Beside the analysis of epistatic effects, it is investigated in this thesis, whether two SNPs in SIGLEC10 found in SLE patients may contribute to SLE development. Whole-genome sequencing of SLE patients performed by the laboratory of C. Vinuesa revealed SIGLEC10 to be frequently affected by rare mutations. Therefore, two SNPs in SIGLEC10 are analysed for their potential influence on BCR signalling inhibition. For this purpose, the human B cell line RAMOS was transduced with lentiviral constructs containing either wt or mutated SIGLEC10 inserts. BCR signalling in transduced RAMOS cells has then been investigated by a calcium mobilisation assay. However, no influence of the SIGLEC10 SNPs is detectable. The second part of this theses aims to gain further understanding of Siglec-G regulation. Analyses of Siglec-G-deficient mice revealed a B1 cell-specific function of Siglec-G, as Siglecg-/- mice showed increased numbers of splenic B1 cells, a large expansion of B1a cells in the peritoneal cavity and increased calcium mobilization into B1a cells after BCR stimulation. In contrast, other B cells subsets were unaffected. However, the mechanism behind this specificity for B1a cells remains unclear. This thesis analyses, whether a Siglec-G specificity for B1a cells results from a different nanoscale organization and association with immunodomains of Siglec-G on the plasma membrane of B cells. For this purpose, potential alterations in the distribution and organization of Siglec-G and IgM as well as their association was investigated by the two super-resolution microscopy techniques TIRF &amp; SRRF microscopy and dSTORM microscopy. TIRF &amp; SRRF microscopy reveals that Siglec-G and IgM show increased colocalization on resting B1a cells than B2 cells. Moreover, the colocalization increases significantly on peritoneal B1a cells but remains constant on splenic B2 cells after BCR stimulation. In addition, TIRF &amp; SRRF microscopy shows a decreased association of Siglec-G and IgM on B1a cells, but not B2 cells of the ligand binding mutant Siglec-G-R120E. Therefore, Siglec-G ligand binding might be important for the association of Siglec-G and IgM on B1a cells, but not B2 cells. Resting B cells from wt and Siglec-G-R120E mice were also analysed via dSTORM microscopy. A first experiment confirmed the increased association of Siglec-G and IgM on resting B1a cells compared to B2 cells. However, the analysis of further dSTORM microscopy experiments is still in progress. Therefore, no final conclusion can be drawn yet. In summary, the super-resolution microscopy experiments confirm an elevated association of Siglec-G and IgM on B1a cells and indicate an increased dependency of Siglec-G ligand binding for its association with IgM on B1a cells.