title: Synthesis and physiological function of the chemical chaperones ectoine and hydroxyectoine
title: Synthese und physiologische Funktion der chemischen Chaperone Ectoin und Hydroxyectoin
Creators: name: Pittelkow, Marco
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Ectoin
osmolarity
Osmolaritaet
Biowissenschaften, Biologie
ectoin
compatible solutes
Kompatible Solute

description: A common strategy of bacteria to
      adapt to hypo osmotic environmental conditions is the uptake
      or synthesis of osmotic active substances, referred to as
      compatible solutes. This thesis deals mainly with aspects
      based on the synthesis of those compatible solutes. A
      commonly used compatible solute in bacteria is the
      tetrahydropyrimidine derivative ectoine, which can be
      converted enzymatically into the hydroxylated form
      hydroxyectoine by the ectoine hydroxylase EctD. In order to
      understand the hydroxylation reaction in more detail, x-ray
      structure analysis were used to analyze the crystal structure
      of the ectoine hydroxylase EctD from V. salexigens in
      cooperation with the working group of Prof. Dr. K. Reuter
      (University Marburg). With the intention to select amino
      acids for mutagenesis studies, three approaches were used: 1)
      the EctD crystal structure in complex with Fe3+, 2) a
      comparative analysis of the active site of the EctD structure
      with putative ectoine binding proteins from ectoine
      transporters and 3) bioinformatics comparison of putative
      EctD protein sequences. Results from those mutagenesis
      studies of highly conserved amino acid revealed important
      information about their function and the possible synthesis
      mechanism of EctD enzyme. As we were not able to crystallize
      EctD in a complex with its substrate ectoine or its
      co-substrate 2-oxoglutarate, putative ectoine hydroxylases
      from a variety of microorganisms were cloned and purified via
      affinity chromatography for further crystallization studies.
      All purified ectoine hydroxylases from the bacteria
      Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10,
      Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi,
      Acidiphilium cryptum and Halomonas elongata as well as from
      the crenarchaeon N. maritimus were enzymatically active. The
      activity of each enzyme and their biochemical parameters like
      Km, vmax and kcat were measured after optimization of the
      assay conditions regarding pH value, temperature and salt
      concentration. Additional bioinformatics of ect genes, which
      are mainly organized in gene clusters, showed interesting
      genes inside those gene clusters. Continually a ask gene
      encoding for an aspartokinase was identified. Aspartokinases
      synthesize the essential precursor for ectoine synthesis
      β-aspartate-semialdehyde from L-aspartate in cooperation with
      the Asd enzyme. The genome of Pseudomonas stutzeri A1501
      contains two genes encoding for putative aspartokinases.
      Whereas one of those genes is located in the ect gene
      cluster, the other gene is found at another position in the
      genome. Both genes were cloned, the proteins were
      heterologously produced in E. coli and characterized by
      enzymatic approaches. Those analyses show important
      difference in features between both aspartokinases. The
      physiological role of both competitive solutes ectoine and
      hydroxyectoine was investigated using growth studies with the
      actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Ectoine and
      hydroxyectoine protects S. coelicolor from the effects of
      high osmotic conditions and high temperatures. Thereby, the
      mixture of ectoine und hydroxyectoine in a 1:1 ratio leads to
      the most efficient protection. In order to investigate the
      initiation of the uptake of competitive solutes by S.
      coelicolor at a certain degree of salinity and temperature,
      transport studies with radioactive labeled [14C]-ectoine were
      used. The combination of both stress factors, high salt and
      high temperature, leads to the highest uptake of competitive
      solutes in the cell.
description: Eine unter Bakterien weit
      verbreitete Anpassungsstrategie an hyperosmotische
      Umgebungsbedingungen ist die Aufnahme oder die Synthese von
      osmotisch wirksamen Substanzen, die sogenannten kompatiblen
      Solute. In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Aspekte aus dem
      Bereich der Synthese von den sogenannten kompatiblen Soluten
      aufgeklärt. Ein häufig genutztes kompatibles Solut in
      Bakterien ist das Tetrahydropyrimidinderivat Ectoin. Dieses
      kompatible Solut kann in einem weiteren enzymatischen Schritt
      durch eine Ectoin-Hydroxylase EctD zu Hydroxyectoin
      hydroxyliert werden. Um diese Hydroxylierungsreaktion besser
      zu verstehen, wurde in dieser Arbeit durch
      Röntgenstrukturanalysen die Kristallstruktur der
      Ectoin-Hydroxylase EctD aus V. salexigens in Zusammenarbeit
      mit der AG von Prof. Dr. K. Reuter (Universität Marburg)
      aufgeklärt. Die Ergebnisse aus der Kristallstruktur von EctD
      mit gebundenem Eisen, ein Vergleich des aktiven Zentrums der
      EctD Struktur mit Ectoin bindenden Substratproteinen aus
      Ectoin Transportern sowie der bioinformatische Vergleich von
      putativen EctD Proteinsequenzen führten zu einer Auswahl an
      Aminosäuren, die für eine Mutagenesestudie herangezogen
      wurden. Die Ergebnisse der Mutagenesestudie von
      hoch-konservierten Aminosäuren lieferten wichtige
      Informationen über deren Funktion und über den möglichen
      Synthesemechanismus des EctD Enzyms. Da man jedoch keine EctD
      Struktur mit gebundenem Substrat Ectoin oder Co-Substrat
      2-Oxoglutarat erhalten konnte, wurden weitere potentielle
      Ectoin-Hydroxylasen aus verschiedenen Mikroorganismen
      kloniert und affinitätschromatographisch gereinigt. Alle
      gereinigten Ectoin-Hydroxylasen aus den Bakterien
      Sphingopyxis alaskensis, Geobacillus. sp. Y412MC10,
      Pseudomonas stutzeri A1501, Alkalilimnicola ehrlichi,
      Acidiphilium cryptum und Halomonas elongata sowie dem
      Crenarchaeon N. maritimus waren enzymatisch aktiv. Dazu
      wurden die genauen Essaybedingungen jeder Ectoin-Hydroxylase
      in Bezug auf pH-Wert, Temperatur, Salzkonzentration angepasst
      und optimiert. Danach erfolgte die enzymatische
      Charakterisierung und die Ermittlung der biochemischen
      Parameter wie Km, vmax und kcat. Durch weitere
      bioinformatische Analysen der ect Gene, die überwiegend als
      ein geschlossenes Gencluster in den Organismen organisiert
      sind, wurden weitere interessante Gene innerhalb des
      ect-Genclusters identifiziert. Dabei trat immer wieder ein
      für eine Aspartokinase kodierendes ask Gen auf. Die
      Aspartokinasen synthetisieren aus L-Aspartat den für die
      Ectoin Synthese wichtigen Vorläufer β-Aspartat-Semialdehyd im
      Zusammenschluss mit einem Asd Enzym. Im Genom des Bakteriums
      Pseudomonas stutzeri A1501 wurden zwei Gene für potentielle
      Aspartokinasen gefunden. Ein Gen befindet sich im
      ect-Gencluster und das zweite ask Gen ist an anderer Stelle
      im Genom lokalisiert. Die beiden Gene der Aspartokinasen
      wurden kloniert, die Proteine heterolog in E. coli produziert
      und durch enzymatische Tests charakterisiert. Diese
      Untersuchungen zeigten wichtige Unterschiede im Hinblick auf
      die Eigenschaften der beiden studierten Aspartokinasen in
      diesem Bakterium. In Wachstumsanalysen mit dem Actinomyceten
      Streptomyces coelicolor A3(2) wurde die physiologische
      Bedeutung der beiden kompatiblen Solute Ectoin und
      Hydroxyectoin untersucht. S. coelicolor wird durch Ectoin und
      Hydroxyectoin unter hohen osmotischen Bedingungen und hohen
      Temperaturen protektiert. Es konnte gezeigt werden, dass beim
      Einsatz eines 1:1 Gemischs von Ectoin und Hydroxyectoin diese
      Protektion am effektivsten ist. Des Weiteren wurde durch
      Transportstudien mit radioaktiv markiertem [14C]-Ectoin
      untersucht, bei welcher Salinität und bei welcher Temperatur
      die Aufnahme der kompatiblen Solute in S. coelicolor
      induziert wird. Durch die Kombination der beiden
      Stressfaktoren wie Hochsalz und hohe Temperatur, konnte
      gezeigt werden, dass in dieser Situation die Aufnahme am
      stärksten angeschaltet wird.