title: Charakterisierung eines Typ I-B CRISPR-Cas Systems in Clostridium thermocellum
title: Characterization of a type I-B CRISPR-Cas system of Clostridium thermocellum
Creators: name: Zöphel, Judith
Publisher: name: Philipps-Universität
      Marburg
Year: 2016
Subjects: CRISPR-Cas
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Immune system , bacteria
RNA
Immunsystem
Bakterien , RNS

description: CRISPR-Cas Systeme stellen
      adaptive Abwehrsysteme dar, die in Bakterien und Archaeen
      gefunden werden und vererbbare Resistenz gegen mobile
      genetische Elemente wie z.B. Viren und Plasmide vermitteln.
      CRISPR-Cas Systeme bestehen aus einem oder mehreren
      CRISPR-Loci und assoziierten cas Genen. CRISPR-Loci enthalten
      virale DNA-Sequenzen (Spacer) die durch identische,
      repetitive Sequenzen (Repeats) getrennt werden. Cas-Proteine
      bilden Ribonukleoproteinkomplexe (RNP-Komplexe) mit kleinen
      CRISPR RNAs (crRNAs), die als Zielerkennungsmoleküle
      Nukleinsäuren detektieren und zum Verdau markieren. Die
      Einführung einer Nomenklatur zur Klassifizierung der
      Cas-Proteine verdeutlicht die Diversität von CRISPR-Cas
      Systemen, die durch die Co-Evolution von Phage und Wirt
      angetrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Typ
      I-B CRISPR-Cas System des thermophilen Bakteriums Clostridium
      thermocellum untersucht. CRISPR-Loci werden in
      Precursor-crRNAs transkribiert und anschließend von Cas6
      Endonukleasen zu individuellen crRNAs prozessiert. C.
      thermocellum enthält zwei Cas6 Proteine, die als rekombinante
      Enzyme in vitro ausschließlich die ihnen zugehörigen
      Precursor-Transkripte schneiden. RNA-Seq-Analysen bestätigten
      die Produktion von crRNAs und belegten variable
      Transkriptmengen individueller crRNAs in vivo. Es konnten
      Promotoren innerhalb von CRISPR-Loci beobachtet werden. Des
      Weiteren wurden entgegengesetzte crRNA-Transkripte
      (Anti-crRNAs) identifiziert, die ein deutliches
      Prozessierungsmuster aufweisen. Die Transkriptmenge der
      komplementären crRNAs ist häufig reduziert. Aktivitätsassays
      mit doppelsträngigen crRNA/Anti-crRNA-Hybriden zeigten, dass
      RNase III imstande ist, Anti-crRNAs zu schneiden. Diese
      Aktivität wird durch Erkennungsmotive in der Sequenz von
      Repeat-RNA-Hybriden vermittelt. Typ I-B CRISPR Interferenz
      wird durch crRNP-Komplexe vermittelt, die doppelsträngige
      Fremd-DNA erkennen und als Cascade-Komplexe bezeichnet
      werden. Diese Cascade-Komplexe setzten sich aus den
      Cas-Proteinen Cas3, Cas5, Cas6, Cas7 und der
      Subtyp-spezifischen Untereinheit Cas8b zusammen. Alle fünf
      rekombinanten Cascade-Untereinheiten wurden in Escherichia
      coli hergestellt. In vitro-Studien zur Assemblierung von
      rekombinanten Cascade-Komplexen zeigten, dass Cas5, Cas7,
      Cas8b und crRNA stabile Untereinheiten sind. Cas3 ist kein
      fester Bestandteil des Komplexes und Cas6 interagiert nur
      zeitweise mit anderen Cas-Komponenten. Massenspektrometrische
      Analysen belegten die Interaktion zwischen Cas5, Cas7 und
      Cas8b, und ermittelten eine ungerade Komplexstöchiometrie von
      1:1:6:2,5 für Cas5:Cas6:Cas7:Cas8b. Die große Untereinheit
      Cas8b weist ein zusätzliches C-terminales Proteinfragment
      auf, welches im Zellextrakt von C. thermocellum nachgewiesen
      wurde und ebenfalls mit dem Cascade-Komplex assembliert. Die
      Ergebnisse dieser Studie ermöglichen einen Einblick in die
      Assemblierung der einzelnen Cas-Proteine zu einem Typ I-B
      Cascade in vitro. Des Weiteren verdeutlichen RNA-Seq Analysen
      der CRISPR-Arrays den Einfluss von individuellen
      Spacer-und-Repeat-Sequenzen auf die Funktionalität von
      CRISPR-Cas Systemen.
description: CRISPR-Cas systems are adaptive
      immune systems, found in bacteria and archaea that provide
      inheritable resistance against mobile genetic elements, e.g.
      viruses and plasmids. CRISPR-Cas systems comprise one or more
      CRISPR loci that contain virus-derived DNA sequences
      (spacers) that are interspaced by identical repeat sequences
      (repeats), and a set of cas genes. The degradation of nucleic
      acid targets is mediated by ribonucleoprotein (RNP)
      complexes, formed by Cas proteins, that are guided by small
      CRISPR RNA molecules (crRNAs). A Cas protein classification
      has been established which reflects the diversification of
      CRISPR systems during the co-evolution of phages and their
      respective hosts. In this study, the type I-B CRISPR-Cas
      system of the thermophilic bacterium Clostridium thermocellum
      was investigated. CRISPR loci are transcribed into
      precursor-crRNAs and individual crRNAs are produced by Cas6
      endonucleases. C. thermocellum contains two Cas6 proteins and
      the recombinant enzymes exclusively process their respective
      precursor transcripts in vitro. RNA-Seq analyses confirmed
      crRNA maturation and highlighted crRNA abundance differences
      in vivo. These analyses identified internal promotion of
      precursor-crRNA transcription and reverse crRNA transcripts
      (anti-crRNAs). Anti-crRNAs display a distinct processing
      pattern and the abundance of the complementary crRNA is often
      reduced in vivo. Cleavage assays with crRNAs and
      double-stranded crRNA/anti-crRNA hybrids identified RNase III
      to be capable of anti-crRNA processing. RNase III cleavage is
      mediated by recognition motifs within the repeat RNA
      duplexes. In type I-B systems, CRISPR interference is
      mediated by a dsDNA targeting crRNP complex, termed Cascade,
      which consists of the Cas proteins Cas3, Cas5, Cas6, Cas7 and
      the subtype-specific Cas8b subunit. All five recombinant
      Cascade subunits were produced in Escherichia coli. Cascade
      assembly studies revealed that a stable core-complex is
      formed by Cas5, Cas7, Cas8b and crRNA in vitro. Cas3 does not
      assemble with the complex. Cas6 is a temporarily associated
      subunit. Mass-spectrometric analyses confirmed protein
      interactions between Cas5, Cas7 and Cas8b and determined an
      uneven complex stoichiometry of 1:1:6:2.5 for
      Cas5:Cas6:Cas7:Cas8b. The large subunit Cas8b forms an
      additional small C-terminal protein fragment that is also
      observed in C. thermocellum cell extracts and assembles with
      the complex. This thesis provides details for the in vitro
      assembly of individual Cas proteins into type I-B Cascade.
      Furthermore, RNA-Seq analyses of the CRISPR arrays highlight
      the impact of individual spacer and repeat sequences on the
      functionality of CRISPR-Cas systems.