Untersuchungen zur Struktur-Funktionsbeziehung an archaebakteriellen Proteinen der oxidativen Phosphorylierung und Signaltransduktion
Creators: name: Dörner, Astrid M.
Publisher: name: Universität Dortmund
Year: 2001
Subjects: subject: Cytochrom ba 3
subject: Elektronentransportkette
subject: Oxidative Phosphorylierung
subject: N. pharaonis
subject: SRI
subject: Sensorisches Rhodopsin
subject: Phototaxis
subject: Photozyklus
subject: ESR-Spektroskopie
subject: Ortsspezifische-Spinmarkierung
subject: H. salinarum
subject: Cytochrome ba 3
subject: electron transport chain
subject: oxidative phosphorylation
subject: sensory rhodopsin
subject: phototaxis
subject: photocycle
subject: EPR-spectroscopy
subject: site-directed spin labeling
subject: 540

description: Cytochrom ba3 ist die terminale Oxidase in der Elektronentransportkette des haloalkaliphilen Archaeon Natronobakterium pharaonis. Für eine detaillierte Charakterisierung der Reaktivität des Cytochrom ba3 sollte hier durch heterologe Expression in H. salinarum der Enzymkomplex in funktionaler Form isoliert werden. Die Entwicklung eines geeigneten Expressions- und Reinigungsverfahren sollte im weiteren das Studium von geeigneten Mutanten ermöglichen. Durch genomische Insertion über den homologen genomisch kodierten bop-Promotor konnten stabile Transformanden für alle Expressionvarianten des Cytochrom ba3 erhalten werden. Das Cytochrom ba3 konnte hier jedoch trotz Variation in der Untereinheitenzusammensetzung und der Fusion verschiedener Affinitäts-Tags nicht synthetisiert werden. Durch Western-Blot Analyse konnte weiterhin gezeigt werden, daß selbst für das Cytochrom ba3 in nativer Zusammensetzung der Untereinheiten ohne Affinitäts-Tag keine Proteinsynthese in H. salinarum stattfindet. In abschließenden RT-PCR-Experimenten konnten die Transkription der Sequenz des Cytochrom ba3 nachgewiesen werden. Unter den gewählten Expressionbedingungen wird somit eindeutig der bop-Promotor induziert. Für die fehlende Proteinsynthese bieten sich mehrere Erklärungsmodelle an. Das sensorische Rhodopsin I (SRI) vermittelt als Phototaxisrezeptor im Halobakterium salinarum sowohl die photophile Signalantwort auf orange-farbenes Licht als auch die photophobe Reaktion auf Blau/UV-Licht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Mechanismus des Signaltransfers im Verlauf der photophilen Reaktion vom SRI an seinen Transducer HtrI in ESR-Experimenten aufgeklärt und kinetisch analysiert werden. Für das Transducer-freie SRI konnten zusätzlich erstmals die einzelnen Photozyklen der verschiedenen Spezies des Grundzustandes getrennt voneinander kinetisch detailliert charakterisiert werden. Das SRI wurde in E. coli exprimiert und bis zur Homogenität über Affinitätschromatographie gereinigt. Durch eine Modifikation der Reinigungsbedingugen konnte hierbei die Stabilität des Proteins deutlich erhöht werden. Die Charakterisierung des SRIwt-His zeigte weiterhin, daß keine Unterschiede zu dem homolog in H. salinarum exprimierten Protein bestehen. In pH-Titrationsversuchen konnten die absoluten Absorptionsmaxima der drei Grundzustände des SRIwt-His mit 400 nm, 530 nm und 580 nm ermittelt werden und die pKa-Werte den Protonierungsgleichgewichten zugeordnet werden. Durch die Variation der Wellenlänge des Anregungslichtes in der Laserblitzlicht-Spektroskopie gelang hier erstmals eine Separierung der spezifischen Photozyklen des SRI587 und SRI530. Die Analyse des Aktionsspektrums des Transducer-freien SRI zeigte, daß die Bildung des M-Intermediates für das SRI530 bis zu 100mal schneller ist als die des SRI587. Das SRI400 konnte im Gegensatz dazu nicht angeregt werden. Es kann daher angenommen werden, daß diese Spezies keinen Photozyklus durchläuft. Zur Untersuchung der Wechselwirkung des SRI im Komplex mit HtrI wurde eine verkürzte Variante des Transducers mit dem SRI in E. coli koexprimiert. Die Synthese des SRI wurde jedoch hierbei stark inhibiert. Die Experimente in Hinsicht auf eine gemeinsame Reinigung bzw. Bildung des Komplexes nach Isolierung der einzelnen Proteine lassen vermuten, daß das SRI bereits in der Membran zumindest dimerisiert und so eine Komplexierung des Transducers inhibiert ist. Als Interaktionsfläche für das HtrI konnten in weiteren Experimenten die Helices F und G identifiziert werden. Die Expression des über einen Peptid-Linker fusionierten Rezeptor-Transducer-Komplexes war hingegen erfolgreich. Die Analyse bezüglich der Funktionalität des isolierten Fusionsproteins lieferten jedoch widersprüchliche Daten. Zur Identifizierung des Mechanismus der Signaltransduktion vom Rezeptor auf den Transducer wurden spinmarkierte Cysteinmutanten des SRI im Bereich der Helix F und G positionspezifisch mittels ESR-Spektroskopie untersucht. Die Charakterisierung der Orientierung der einzelnen Spinlabel der Mutanten und damit der ursprünglichen Aminosäuren bestätigten im zytoplasmatischen Bereich der Helix F das von Lin et al. (1997) berechnete Modell des SRI. Durch ESR-Differenzspektroskopie konnte im weiteren eine Auswärtsbewegung der Helix F im zytoplasmatischen Bereich identifiziert werden. Das photophile Signal wird somit im SRI durch eine Konformationsänderung an den Transducer weitergeleitet.