Μοριακή και βιοτεχνολογική προσέγγιση για την αξιοποίηση του κρητικού λάδανου(Cistus creticus ssp. creticus)
Creators: name: Πατεράκη, Ειρήνη Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2007
Subjects: Cistus creticus
Τερπενία
Βιοσύνθεση
Δευτερογενής μεταβολισμός
Terpenoids
Biosynthesis
Secondary metabolism

description: Το φυτό Cistus creticus ssp. creticus είναι ενδημικό του Ελληνικού χώρου και αξιοποιείται εμπορικά στην Κρήτη, χάριν των αρωματικών ιδιοτήτων της ρητίνης του ("λάδανο") η οποία παράγεται και εκκρίνεται κυρίως από τις αδενικές τρίχες που βρίσκονται στην επιφάνεια των φύλλων. Το ενδιαφέρον στο είδος αυτό εντάθηκε μετά την ανακάλυψη ότι συγκεκριμένες ουσίες της ρητίνης οι οποίες ανήκουν στην κατηγορία των λαβδανικών διτερπενίων όπως η (13Ε)-λαβδα-13-εν-8α,15-διόλη, η σκλαρεόλη και πολλά παράγωγα του οξειδίου της μανοόλης, παρουσιάζουν ισχυρή αντιμικροβιακή, κυτταροστατική και κυρίως αντιλευχαιμική δράση in vitro. Με βάση τα παραπάνω κρίθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της βιοσύνθεσης των ουσιών αυτών στο συγκεκριμένο φυτό, μέσω της κλωνοποίησης και χαρακτηρισμού γονιδίων που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό τους μονοπάτι. Ο απώτερος στόχος ήταν από την μία η διεύρυνση των γνώσεων που έχουμε έως σήμερα πάνω στο μεταβολισμό των τερπενίων στα φυτά και από την άλλη η πιο αποδοτική εκμετάλλευση φυτών του είδους Cistus creticus ssp. creticus για τη δημιουργία νέων φαρμακευτικών και μη προϊόντων. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν γονίδια που βρίσκονται σε κομβικά σημεία στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των τερπενίων και θεωρείται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του μονοπατιού. Τα γονίδια αυτά ήταν η αναγωγάση του 3-ύδροξυ-3-μέθυλο-γλουταρυλ-CoA (HMGR), η συνθετάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXS), η αναγωγάση της 5-φωσφορικής-1-δεοξυ-D-ξυλουλόζης (DXR) και η συνθετάση του πυροφωσφορικού γερανυλγερανυλίου (GGPPS). Απομονώθηκαν ένα πλήρες cDNA που κωδικοποιούσε την CcDXR και δύο πλήρη cDNAs που αντιστοιχούσαν στην GGPPS του λάδανου (CcGGPPS1 και CcGGPPS2). Τα CcHMGR και CcDXS cDNAs προέκυψαν από την EST ανάλυση από cDNA βιβλιοθήκη κατασκευασμένη από ολικό RNA τριχών από φύλλα του C. creticus. Η λειτουργικότητα των GGPPS cDNAs επιβεβαιώθηκε μετά από την έκφραση τους σε κύτταρα ζύμης. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφραση των παραπάνω γονιδίων σε διάφορους ιστούς του φυτού και μετά από διάφορες μεταχειρίσεις. Από τις παραπάνω μελέτες προέκυψε ότι τα γονίδια αυτά παρουσιάζουν μεταξύ τους διαφορετικό πρότυπο έκφρασης και ακόμη ότι τα δύο CcGGPPS γονίδια εκφράζονται διαφορετικά κάτω από όλες σχεδόν τις συνθήκες που έχουν μελετηθεί στην παρούσα εργασία. Η έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων δεν μεταβάλλεται σημαντικά μέσα στην διάρκεια ενός έτους ή μίας ημέρας, ενώ φαίνεται να ελέγχεται αναπτυξιακά τουλάχιστον στα φύλλα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα επίπεδα των mRNAs τους ήταν σημαντικά υψηλότερα στις τρίχες που είχαν απομονωθεί από φύλλα του φυτού σε σχέση με τα ολικά φύλλα. Ακόμη παρατηρήθηκε παροδική αύξηση των mRNAs μετά από τις αβιοτικές καταπονήσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία όπως ήταν η ξηρασία, υψηλές θερμοκρασίες και μηχανικός τραυματισμός ενώ αύξηση παρατηρήθηκε και μετά από προσθήκη ιασμονικού οξέος. Η παρούσα εργασία είναι η πρώτη προσπάθεια μελέτης της βιοσύνθεσης των τερπενίων σε μοριακό επίπεδο στο συγκεκριμένο φυτό. Με την συνέχιση και επέκταση της έρευνας αυτής είναι πιθανό να καταστεί δυνατή η αύξηση της παραγωγής των διτερπενίων που μπορούν να παραχθούν από τους ιστούς του φυτού αυτού αλλά και η παραγωγή προϊόντων με ακόμη ισχυρότερη φαρμακολογική δράση
description: Cistus creticus ssp. creticus is an indigenous shrub of the Mediterranean basin. The resin produced by its leaves is renowned since ancient times for its aromatic and pharmaceutical properties. Specific compounds of the terpenoid fraction of the resin exhibited antibacterial and antifungal activity as well as growth inhibition of leukemian cell cultures. In the present thesis, the biosynthesis of the terpenoids was studied, at the molecular level. Selected genes[CcHMGR(3-hydroxy-3-methylglutary1-CoA reductase) of the cytosolic pathway, CcDXS(1-deoxy-D-xlulose-5-phosphate synthase). CcDXR(1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase) and CcGGPPS(geranylgeranyl diphosphate synthase) from the plastidial pathway] participating in the biosynthetic pathway of these compounds were studied. Two full-length cDNAs encoding GGPPS(CcGGPPS1 and CcGGPPS2) and one full-length cDNAs encoding DXR(CcDXR) were isolated from Cistus creticus using PCR techniques. Additionaly, two cDNAs encoding HMGR(CcHMGR) and DXS(CcDXS), respectively, were identified from an EST analysis of a trichome-specific cDNA library. CcGGPPSI and CcGGPPS2 were functional characterized by complementing GGPPS activity in yeast cells deficient in GGPP synthesis. The expression of the above genes was studied using RT-PCR techniques, in several tissues and environmental conditions. Different patterns of gene expression were observed among the genes examined, in all tissues and treatment used. The expression of the above genes seems to be developmentally regulated and affected from several abiotic stresses and exogenous application of jasmonic acid. The work reported here is the first attempt to study the terpenoid biosynthesis in Cistus creticus plant at the molecular level. This endeavour sets the foundation for further insight into Cistus secondary metabolism that might facilitate its biotechnological exploitation