Απομόνωση, υψηλής καθαρότητας, της βιοτεχνολογικά παραγόμενης TAT-L-Sco2-HA πρωτεΐνης και μελέτη της βιοκατανομής σε πειραματόζωα
Creators: name: Καϊάφας, Γεώργιος Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Sco2 μιτοχονδριακή πρωτεΐνη
Ραδιοεπισήμανση
Βιοκατανομή
Sco2 mitochondrial protein
Radiolabeling
Biodistribution

description: Τα μιτοχόνδρια αποτελούν υποκυτταρικά ημιαυτόνομα οργανίδια που επιτελούν απαραίτητες για ζωή του κυττάρου λειτουργίες, όπως η παραγωγή ενέργειας (ATP) μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Μεταλλάξεις σε γονίδια που κωδικοποιούν μιτοχονδριακές πρωτεΐνες μπορούν να οδηγήσουν στην εμφάνιση μιτοχονδριακών ασθενειών. Οι μιτοχονδριακές ασθένειες αποτελούν μία πολύπλοκη κατηγορία ασθενειών, καθώς τα συμπτώματα, ο χρόνος εμφάνισης και η σοβαρότητα της ασθένειας μπορούν να ποικίλουν σε μεγάλο βαθμό. Αυτή η πολυπλοκότητα ευθύνεται κυρίως για την έλλειψη εξειδικευμένων και αποτελεσματικών θεραπειών. Η χρήση βιοτεχνολογικά παραγόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, στα πλαίσια της πρωτεϊνικής θεραπείας, επιτρέπει την αντιμετώπιση ασθενειών, μέσω της αντικατάστασης πρωτεϊνών και ενζύμων, που είτε είναι μεταλλαγμένα και μη λειτουργικά, είτε απουσιάζουν πλήρως. Βασικός περιορισμός στη χρήση θεραπευτικών πρωτεϊνών είναι η έλλειψη ικανότητας των πρωτεϊνών να εισέρχονται στο εσωτερικό των κυττάρων. Η τεχνολογία των πεπτιδίων κυτταρικής διείσδυσης (PTDs/CPPs) επιτρέπει σε πρωτεϊνικά μόρια να εισέρχονται στα κύτταρα διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης. Το πεπτίδιο ΤΑΤ είναι το πρώτο CPP που ανακαλύφθηκε και χρησιμοποιείται μέχρι σήμερα. Μεταλλάξεις στο γονίδιο SCO2, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη συγκρότησης Sco2 της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COX, τέταρτο σύμπλοκο της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης), οδηγούν σε θανατηφόρο βρεφική καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια. Με την τεχνολογία των πεπτιδίων κυτταρικής διείσδυσης παράχθηκε η ανασυνδυασμένη 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA πρωτεΐνη σύντηξης, η οποία έχει ήδη ελεγχθεί από μέλη του εργαστηρίου Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής (Α.Π.Θ.) για τη δυνατότητά της να αναστρέφει το φαινότυπο της μειωμένης δραστικότητας της COX σε κύτταρα ασθενών. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν: α) να αυξηθεί η καθαρότητα της παραγωγής της10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA, β) να επιτευχθεί η ραδιοεπισήμανσή της και γ) να μελετηθεί η βιοκατανομή της σε ποντίκια. Για την επίτευξη αυτών των στόχων: α) έγινε προσπάθεια απομόνωσης της πρωτεΐνης από το διαλυτό κλάσμα βακτηριακών κυττάρων, μετασχηματισμένων με τον πλασμιδιακό φορέα pET16b-TAT-L-SCO2-HA, με στήλες χρωματογραφίας ακινητοποιημένου μετάλλου, με μερική επιτυχία, καθώς η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο καθαρό κλάσμα ήταν χαμηλότερη από την απαιτούμενη για τα επακόλουθα πειράματα, β) έγινε διαλυτοποίηση βακτηριακών εγκλείστων, εμπλουτισμένων με την 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA πρωτεΐνη, με διάλυμα αλάτων, παρουσία ή όχι L-αργινίνης, γ) επιτεύχθηκε αρκετά καλή ραδιοεπισήμανση της πρωτεΐνης και δ) πραγματοποιήθηκαν πειράματα βιοκατανομής της πρωτεΐνης, μετά από ενδοφλέβια και ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση της ραδιοεπισημασμένης πρωτεΐνης σε πειραματόζωα. Από τα πειράματα βιοκατανομής, παρατηρήθηκε αυξημένη ποσότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια των ιστών που ελέγχθηκαν, ενώ οι μετρήσεις ραδιενέργειας στους ιστούς έδειξαν υψηλή κατανομή σε ήπαρ και νεφρούς, αλλά και μικρό ποσοστό σε καρδιά, μυ και στον εγκέφαλο, τα κύρια όργανα που επηρεάζονται σε ασθενείς με μεταλλάξεις στο γονίδιο SCO2, όπως στη βρεφική θανάσιμη καρδιοεγκεφαλομυοπάθεια και μειωμένη δραστικότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c.
description: The mitochondrion is a subcellular semi-autonomous organelle that performs vital cell functions, such as energy production through oxidative phosphorylation (OXPHOS). Mutations in genes encoding mitochondrial proteins can lead to mitochondrial diseases. Mitochondrial diseases are a complex category of diseases, as the symptoms, the time of occurrence and the severity can vary greatly. This complexity leads to the lack of specialized and effective therapies. The use of biotechnologically produced recombinant proteins, in the context of protein therapy, allows the treatment of diseases through the replacement of proteins and enzymes, either mutant and non-functional, or completely absent. A major limitation on the use of therapeutic proteins is the lack of ability of the proteins to enter the cells. The technology of cell penetrating peptides (PTDs/CPPs) allows proteins to enter cells through the cell membrane. The TAT peptide is the first CPP to be discovered and it is used until today. Mutations in the SCO2 gene, which encodes the Sco2 protein, a cytochrome c oxidase (COX, the 4th complex of OXPHOS) assembly protein, lead to fatal infantile cardioencephalomyopathy. By using the CPPs technology, the recombinant 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA fusion protein was produced and tested [by members of the Laboratory of Pharmacology, Department of Pharmacy (AUTH)] for its ability to reverse the phenotype of reduced COX activity in patient cells. The purpose of this postgraduate thesis was: (a) to increase the purity of the production of 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA; (b) to achieve its radiolabeling; and (c) to study its biodistribution in mice. To achieve these goals: (a) an attempt was made to isolate the protein from the soluble fraction of bacterial cells transformed with the plasmid vector pET16b-TAT-L-SCO2-HA by immobilized metal affinity chromatography, with partial success as the protein concentration was low for the subsequent experiments; (b) bacterial inclusion bodies, enriched with the 10xHis-XaSITE-TAT-L-Sco2-HA protein, were solubilized with a salt solution, in the presence or absence of L-arginine; (c) fairly good radiolabeling of the protein was achieved, and d) protein biodistribution experiments were performed after intravenous and intraperitoneal administration to experimental animals. From the biodistribution experiments, after Western blotting, an increased amount of the recombinant protein was observed in the mitochondria of the tissues tested, while radioactivity measurements of the tissues showed a high distribution in the liver and kidneys, but also a small percentage in the heart, muscle and brain, the main organs affected in patients with mutations in the SCO2 gene, as in the case of fatal infantile cardioencephalomyopathy and reduced COX activity.