INVESTIGATION ON THE BLUE PHENOTYPE IN PSEUDOMONAS SPECIES INVOLVED IN BLUE DISCOLORATION DEFECT OF FRESH CHEESE
Creators: name: CHIERICI, MARGHERITA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2016

description: La presenza di macchie di colore blu su Mozzarella � una problematica attuale per le industrie produttrici di questa tipologia di formaggio fresco. In particolare dal 2010 sono stati segnalati diversi casi in Italia con grande risalto nei notiziari nazionali ed europei, causando anche una segnalazione da parte del sistema di allerta RASFF. La causa della formazione del colore blu � stata identificata nella contaminazione di ceppi appartenenti al genere Pseudomonas. Per questo lavoro di tesi di dottorato � stata costituita una collezione di 69 isolati appartenenti al genere Pseudomonas (elencati nel capito Appendix 1): di questi, 59 sono stati isolati da campioni di Mozzarella con difetto blu e identificati mediante sequenziamento della regione 16S rRNA. La produzione del pigmento blu � stata confermata incubando gli isolati nel liquido di governo di Mozzarella, precedentemente centrifugato e sterilizzato per filtrazione 0.22 �m (PF), a 4�C. Trenta campioni diventarono blu dopo 7 giorni (33.7% degli isolati). Su tutti gli 89 ceppi � stata fatta la restrizione del genoma usando l?enzima SpeI seguita dalla corsa elettroforetica in campo pulsato (PFGE) per valutare un?eventuale correlazione genetica tra gli isolati produttori del pigmento blu. Dai profili ottenuti i 30 isolati presentati il fenotipo blu sono stati raggruppati in 12 genotipi. Per ogni genotipo � stato scelto un ceppo rappresentativo su cui � stata fatta una tipizzazione attraverso il sequenziamento di 7 loci conservati (MultiLocus Sequence Typing) per confermare l?esistenza di una relazione filogenetica comune ai ceppi produttori del blu. Per 3 ceppi produttori del blu (200188/6, UMB247, UMB248) � stato sequenziato l?intero genoma. Le sequenze dei genomi ottenuti sono state confrontate con quelle di altri 2 ceppi produttori del blu (PS77 e PS22) e di 5 ceppi non presentanti la formazione del pigmento blu (PS40, PS20, Pf01, A506, SBW25). Da questa analisi di comparazione dei genomi � stata individuata una regione di circa 10 kbp presente unicamente nei genomi dei ceppi produttori del blu, composta da 13 CDS, la maggior parte delle quali (53.7%) codificante per proteine costitutive di batteriofagi. Per indagare la relazione tra la presenza di profagi integrati nel genoma dei ceppi produttori del blu e lo sviluppo di questo particolare fenotipo, i 30 isolati produttori del blu sono stati sottoposti a induzione con due diversi antibiotici (norfloxacina e ciprofloxacina). La presenza di batteriofagi indotti dal trattamento con gli antibiotici � stata verificata misurando un?eventuale attivit� inibente sulla crescita di ceppi produttori del blu di Pseudomonas spp., seguita dalla conferma mediante spot test e isolamento con la formazione di placche di lisi in doppio strato di agar. Alcuni campioni che hanno causato una zona di lisi negli spot test sono stati fotografati con microscopio elettronico a trasmissione. Attraverso le immagini sono state individuate due tipologie di particelle virali esclusivamente nei campioni indotti con ciporfloxacina. Non � stato per� possibile procedere all?isolamento dei batteriofagi in quanto non sono state ottenute singole placche di lisi. L?altra tematica affrontata durante questo progetto di dottorato � stata l?identificazione della/e molecola/e blu e del suo ruolo nell?ambiente. Per determinare i requisiti necessari per la produzione del pigmento blu sono state allestite delle prove fenotipiche in liquido di governo a tre diverse temperature (4�C, 14�C e 30�C) e in terreno minimo M9 a diversi pH (5.7, 6.3, 7.2) addizionato con (a) differenti fonti di carbonio (lattosio, glucosio, galattosio, acido lattico e acido succinico), (b) diversi metalli (Mo, Cu, Zn, Ca, Mg, Bo, Co, Mn, Fe) e (c) 18 diversi amminoacidi. La produzione del pigmento blu � stata osservata solo quando i campioni sono stati incubati a temperature di refrigerazione (al di sotto dei 14�C) in liquido di governo o nel terreno minimo a pH 5.7. La presenza di Cobalto e di alcuni amminoacidi, ad esempio la lisina, hanno avuto un effetto inibente sulla produzione del pigmento blu, mentre l?aggiunta di prolina ne ha aumentato l?intensit�. L?analisi UPLC/MS dei campioni 200188/6, UMB247 e UMB248 in liquido di governo e dei campioni in M9 + prolina non ha portato all?identificazione univoca della/e molecola/e che danno la colorazione blu. Per comprendere la funzione del pigmento blu sono state verificate una possibile correlazione con i segnali di quorum sensing e un possibile ruolo come batteriocina. I segnali di quorum sensing non sono risultati legati alla produzione del blu, mentre per quanto riguarda l?attivit� batteriostatica � risultato che, al contrario delle aspettative, il pigmento blu possiede un effetto positivo sulla crescita dei ceppi blu di Pseudomonas spp..