Επίδραση νεότερων αντιμικροβιακών παραγόντων και των φαγοκυττάρων στην ανάπτυξη και επιβίωση μεικτών βιοϋμενίων από Pseudomonas spp. και Candida spp
Creators: name: Χατζημόσχου, Αθανάσιος Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Βιοϋμένια
Pseudomonas
Candida
Φαγοκύτταρα
Biofilms
Phagocytes

description: Εισαγωγή: Στη φύση, οι μικροοργανισμοί ζουν κυρίως σε σύνθετες λειτουργικές κοινότητες, οι οποίες αποτελούνται από ένα ή περισσότερα είδη μικροβίων. Παραδείγματα τέτοιων μικτών κοινοτήτων είναι εκείνες που σχηματίζονται από μικροοργανισμούς του είδους Candida spp. και Pseudomonas spp. Τα βιοϋμένια(ΒΥ) σχετίζονται με τη χρήση επεμβατικών ιατρικών εργαλείων. Σκοπός: Η διερεύνηση της δράσης 5 αντιβακτηριακών παραγόντων (αμικασίνη(ΑΜΚ), σιπροφλοξασίνη(CIP), κεφταζιδίμη(CEF), κολιμυκίνη(CST) και κλαριθρομυκίνη(CLAR) τόσο έναντι ΠΛΚ όσο και έναντι ΒΥ από PA και η μελέτη της δράσης των ανθρώπινων πολυμορφοπυρήνων (PMN) έναντι της PA. Επίσης, μελετήθηκε ο συνδυασμός αντιμικροβιακών παραγόντων έναντι μικτών βιοϋμενίων(MBY) από C.albicans(CA) και PA. Μελετήθηκε η συνδυαστική δράση της ΑΜΚ με τη βορικοναζόλη(VRC) ή τη ανιδουλαφουγκίνη(ΑΝID) και η φαγοκυτταρική ικανότητα των PMN έναντι MBY. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων BGL2, SUN41 και ECE1 σε στέλεχος CA σε συνδυασμό με την δράση αντιμυκητιακών φαρμάκων. Υλικό-Μέθοδος: Για τα ΒΥ, αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 106 μικροοργανισμοί/mL, ενώ για τα MBY που σχετίζονταν και με CA και με PA, αρχικά χρησιμοποιήθηκαν 106 μικροοργανισμοί/ml, σε RPMI-1640, μέσα σε πλάκες κυτταροκαλλιεργειών 96-πηγαδιών στους 37°C,48h,5%CO2, με συνεχή ανακίνηση. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα κυμάνθηκαν για όλα τα αντιβακτηριακά από 4-512mg/L και για όλα τα αντιμυκητιακά από 0,06-512 mg/L(n=8). Η δράση των αντιμικροβιακών φαρμάκων εκτιμήθηκε με ΧΤΤ. Τα PMNs χρησιμοποιήθηκαν σε αναλογία 1:1 και 5:1 για την Candida και σε αναλογία 1:20 και 1:10 για την Pseudomonas και συνδυάστηκαν με C1, C2, και C3 mg/L (n=4). Τρία ανεξάρτητα πειράματα με PCR πραγματοποιήθηκαν σε κάθε περίπτωση. Μεταβολή της έκφρασης κατά 2-φορές θεωρήθηκε σημαντική. Αποτελέσματα: Τα πρώτα δύο στελέχη ήταν το ένα ανθεκτικό(ΑΜΚr) και το άλλο ευαίσθητο(ΑΜΚs) στην αμικασίνη. Το ΑΜΚr εμφάνισε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην αμικασίνη σε σχέση με το ΑΜΚs τόσο στα PLK όσο και στα ΒΥ. Παρόμοια συμπεράσματα μπόρεσαν να εξαχθούν και για τα άλλα δύο ζευγάρια στελεχών (CEFr vs CEFs και CΙΡr vs CΙΡs). Στη ταυτόχρονη προσθήκη, όταν προστέθηκε στην CA, CAS(0,008-0,25mg/L) και PSC(32-128mg/L) παρατηρήθηκαν συνεργικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης, όλοι οι συνδυασμοί που μελετήθηκαν, CAS/PSC ή VRC/AND με PSC ή VRC, παρουσίασαν αδιάφορα αποτελέσματα στα ΒΥ. Σημαντική καταστροφή παρατηρήθηκε επίσης όταν συνδυάστηκε AND με VRC. Μετά την επώαση των διαφόρων μορφών των ΒΥ με VRC(128 και 512 mg/L) ή ANID(0,25 και 1 mg/L) για 12-24 h, το συνολικό RNA που απομονώθηκε από τα ΒΥ αναλύθηκε με RT-PCR. Η ANID προκάλεσε στατιστικά σημαντική υπερέκφραση των γονιδίων SUN41(3.7-9.3) και BGL2(2.2-2.8) στα ενδιάμεσα ΒΥ, ενώ η VRC προκάλεσε υπερέκφραση των αντίστοιχων γονιδίων στα ώριμα ΒΥ (SUN41:2.3, BGL2:2.1). Η έκφραση των γονιδίων μειώθηκε από την δράση της VRC στα ενδιάμεσα ΒΥ. Και τα δύο αντιμυκητιακά προκάλεσαν υποέκφραση του γονιδίου ECE1 στα ενδιάμεσα ΒΥ. Συμπεράσματα: Ακόμα και σε μεγάλες συγκεντρώσεις αντιψευδομοναδικών παραγόντων δεν κατέστη δυνατή η πλήρης εκρίζωση στελεχών των ΒΥ. Επίσης, πρέπει να τονίσουμε ότι τα ΒΥ όλων των στελεχών έχουν σαφώς υψηλότερες MIC σε σχέση με τα PLK. Τα αποτελέσματα των συνδυαστικών μελετών έδειξαν ότι όλοι οι συνδυασμοί της ΑΜΚ+ΡΜΝs είχαν συνεργικά ή προσθετικά αποτελέσματα. Επίσης, όλοι οι συνδυασμοί της ΑΜΚ+PMNs οδήγησε σε συνεργικά ή προσθετικά αποτελέσματα της PA. Η CEF ακολουθεί σε αποτελεσματικότητα ενώ η CIP επιδρά ανταγωνιστικά όταν συνδυάζεται με ΡΜΝ.
description: Introduction: In nature, microorganisms live mainly in complex functional communities of one or more species of microbes. Examples of such mixed communities are those formed by Pseudomonas species and Candida species. Biofilms, especially mixed ones, are often formed on indwelling medical devices. Biofilms not only exhibit increased resistance to antimicrobial agents but it seems that they are also resistant to innate immune response. Aim: The aim of the research was to study the activities of 5 antimicrobial agents; amikacin(AMK), ciprofloxacin(CIP), ceftazidime(CEF), colistin(CST) and claritromycin(CLAR) alone/in combination and the activity of PMN alone/in combination with drugs against PABF/PLK. Also, the combined activities of amikacin(AMK) and voriconazole(VRC) or anidulafungin(AND) against mixed BF of CA/PA and to compare them with PLK was studied. Finally, we investigated the biofilm-associated gene expression in CA exposed to VRC/ ANID and identify new molecular targets. Methods and Materials: Six CF-isolates of PA, either resistant or susceptible were used. BFs were then incubated with no drug or with two-fold dilutions of drugs for 24h. CA-M61 was grown in RPMI at 106 blastoconidia/mL in 96-well plates at 37°C,48h in order to produce BF. Voriconazole(VRC), posaconazole(PSC), caspofungin(CAS) or anidulafungin(ANID) alone, PMN(E:T 1:1/5:1) alone, or combinations of PMN+drugs were incubated with BF and PL at 37ºC/5%CO2,22h. Fungal damage was assessed by XTT. BF were then incubated for 12h, 18h, and 48h with VRC/AND. Differential expression of biofilm-associated genes at indicated time points was performed by RT-PCR. Three genes were investigated: BGL2, ECE1 and SUN41. A greater than 2-fold change was considered significant. Results: BF MICs of resistant isolates were similar to those of PL MICs, whereas in the case of susceptible isolates BF MICs were relatively higher than those of PL MICs. Eradication of PA BFs was not achieved even at the highest concentrations of antibiotics used. Overall, the activity of PMNs against PA isolates was limited. Taken together, statistically significant antagonism leading to bacterial growth was shown for selective combinations of CEF and CIP with PMNs but not for AMK. The results of the combined studies showed that all combinations of AMK with PMNs produced either synergism or additivity in damaging BF/PLK of the corresponding isolates. A high level of resistance was exhibited by BF/PLK of AMKr and CEFr isolates to corresponding antibiotics(128mg/l), followed by the CIPr isolate to CIP(32+64mg/l). Against PL, a synergistic interaction was observed when AMK:8-64mg/l were combined with VRC:0,125-4 mg/l in the absence/presence of PMN at E:T 1:1. In comparison, we found significant increases in biofilm damage to CA when CAS+PSC was combined. Significant biofilm damage was also noted with the combinations of AND+VRC. After incubation with VRC, BGL2 was significantly down-regulated. Conclusions: Variable differences were found between MICs of PA BFs and PLK for susceptible and resistant isolates for all three antipseudomonal agents. Even very high concentrations do not achieve eradication of PA, suggesting possible mechanism of PA persistence in CF patients. All combinations of AMK with PMNs resulted in synergistic or additive effects against both BF/PLK of PA. BF are generally resistant to antimicrobial agents.