title: Immunorecognition of endogenous RNA ligands
title: Immunerkennung endogener RNA-Liganden
Creators: name: Jung, Stephanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: ITS2
modification
Medizin, Gesundheit
Modifikationen
RNase L
RIG I
45S rRNA
RNase A
TLR8

description: Innate immunity has evolved
      different pattern recognition receptors to detect pathogen
      associated molecular patterns (PAMPs) and to elicit an immune
      response. Whereas double stranded RNA in the cytoplasm is
      detected by RIG I and MDA5, double- and single stranded RNA
      in the endosome is recognized by Toll like Receptors (TLRs)
      3, 7 and 8. Under physiological conditions, these receptors
      discriminate between foreign and self RNA based on certain
      structures and modification patters. Under pathological
      conditons, these receptors can also recognize self RNA. The
      major part of this thesis deals with the detection of self
      RNA as a potential danger signal in the cytoplasm. In the
      case of viral infection, in addition to the activation of RIG
      I and MDA5, double stranded RNA also leads to the activation
      of RNase L. Subsequently, cellular RNA is digested and
      fragments bound to pattern recognition receptors, which
      results in an amplification of the danger signal. In this
      thesis, it could be shown that the fragments of self-RNA are
      exclusively recognized by RIG I. It was proven that this RIG
      I activation is not a common effect of digested RNA but
      caused by specific RNA structures. The sequences of these
      molecules were obtained by Next Generation Sequencing. The
      endogenous RIG I ligands are derived from expansion segments
      in the 28S rRNA and from ITS2, a processing product of the
      45S rRNA. Their specific RIG I activating effect could be
      shown in different immunostimulation experiments. Unlike the
      common model of an ultimate RIG I ligand, they do not bear a
      5’ triphosphate but a 3’ monophosphate and are not rich in
      uridine but in guanosine and cytosine. Instead, the
      endogenous RIG I ligands seem to be detected due to their
      double-strandness and a certain loop structure. Involvement
      of ITS2 indicates a further link not only between antiviral
      response and RNase L but also between RNase L, rRNA
      biogenesis and cancer development. Generation of
      immunostimulatory RNA species is not only limited to virus
      induced RNase L but can also be obtained by artificial
      transfection of RNase A into a cell. Consequently, RNase A
      might be established as a novel species of adjuvant. In the
      second part of this thesis, the impact of modifications on
      the TLR7 and 8 mediated recognition of 18S rRNA derived RNA63
      was analysed. Unmodified RNA63 and RNA63 bearing a 2’-O-deoxy
      or 2’-O-fluor modification all activate TLR7 and TLR8 while
      2’-O-methylation inhibits TLR7 depended signaling and is
      solely detected by TLR8. This is why TLR8 activation is more
      resistent to RNA-modifications than TLR7activation.
      Consequently, 2’-O-methylated RNA63 is a specific TLR8
      ligand.
description: Das angeborene Immunsystem verfügt
      über eine Vielzahl keimbahnkodierter Rezeptoren, die
      pathogenspezifische Muster erkennen und so eine Immunantwort
      auslösen können. Verantwortlich für die Detektion
      doppelsträngiger RNA im Zytoplasma ist die Familie der RIG I
      ähnlichen Rezeptoren, zu der u.a. RIG I und MDA5 gehören; im
      Endosomen wird doppel- und einzelsträngige RNA durch die
      Toll-ähnlichen Rezeptoren („Toll like receptors“, TLRs) 3, 7
      und 8 erkannt. Diese Rezeptoren können unter physiologischen
      Bedingungen anhand von Struktur und Modifikationen zwischen
      zelleigener und zellfremder RNA unterscheiden, unter
      pathologischen Bedingungen kann es aber auch zu einer
      Erkennung körpereigener RNA kommen. Der Hauptteil dieser
      Arbeit beschäftigt sich mit der Erkennung zelleigener RNA im
      Zytoplasma. Während einer Virusinfektion kann doppelsträngige
      virale RNA nicht nur direkt durch die RIG I ähnlichen
      Rezeptoren erkannt werden, sondern auch indirekt über 2‘5‘
      Oligoadenylat-aktivierte RNase L aktivieren. Dies führt zum
      Schneiden zelleigener RNA, wobei die gebildeten Fragmente
      wiederum von keimbahn-kodierten Rezeptoren erkannt werden.
      Diese Verstärkung des Gefahrensignals nimmt eine grundlegende
      Rolle in der Virusabwehr ein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte
      gezeigt werden, dass die Erkennung zelleigener
      RNase-generierter RNA-Fragmente ausschließlich über RIG I
      verläuft. Die Existenz spezifischer endogener RIG I Liganden
      wurde belegt und die Sequenzen der betreffenden Fragmente
      wurden mittels Next Generation Sequencing ermittelt. Hierbei
      handelt es sich um Strukturen aus der 28S rRNA und der ITS2,
      einem Prozessierungsprodukt der 45S rRNA. Der spezifische RIG
      I aktivierende Effekt dieser Sequenzen konnte in
      verschiedenen Stimulationsexperimenten nachgewiesen werden.
      Interessanterweise tragen die endogenen stimulatorischen
      RNA-Spezies im Gegensatz zum Prototyp eines RIG I Liganden
      kein 5' Triphosphat, sondern ein 3' Monophosphat, auch weisen
      sie keine typische Basenzusammensetzung mit hohem
      Uridingehalt auf. Stattdessen werden die außergewöhnlich
      GC-reichen Sequenzen vermutlich aufgrund ihrer
      Doppelsträngigkeit und einer Ringstruktur nahe der
      Schnittstelle von RIG I erkannt. Die besondere Bedeutung
      dieser Sequenzen wird durch die evolutionäre Konservierung
      dieser Strukturen belegt, auch könnten sie nicht nur eine
      Funktion in der Virusabwehr, sondern auch als Tumorsupressor
      haben. Die intrazelluläre Generierung immunstimulatorischer
      RNA-Spezies erfolgt nicht nur über die virusinduzierte RNase
      L, sondern auch über eine artifiziell in die Zelle
      transfizierte RNase A. Dies eröffnet die Möglichkeit zur
      Etablierung von RNase A als neue Adjuvansspezies. Im zweiten
      Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss
      verschiedene Modifikationen des 18S rRNA Abkömmlings RNA63
      auf dessen Erkennung durch die endosomalen TLRs 7 und 8
      haben. Eine nichtmodifizierte RNA63 und solche mit einer
      2'-O-Deoxy- oder Fluorgruppe werden sowohl durch TLR7 als
      auch durch TLR8 erkannt. Durch eine 2'-O-Methylierung
      allerdings lässt sich die Erkennung der RNA63 durch TLR7
      hemmen, nicht aber die Erkennung durch TLR8. Somit handelt es
      sich bei 2'-methylierter RNA63 um einen spezifischen
      TLR8-aktivierenden Liganden.