Die to Survive - Functional Analysis of Grapevine Metacaspases Responsive to Effector - Triggered Immunity (ETI)-Related Cell Death
Creators: name: Gong, Peijie
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2017
Subjects: Metacaspase
programmed cell death
plant immunity
Vitis rupestris

description: Der programmierte Zelltod (programmed cell death, PCD) ist ein unverzichtbarer Vorgang, welcher sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren durch ein intrazelluläres Programm vermittelt wird. Vor allem im pflanzlichen Immunitätssystem ist er als letztes Mittel eine unentbehrliche Strategie, um im Rahmen einer sogenannten hypersensitiven Antwort (hypersensitive response, HR) die Ausbreitung von biotrophen Pathogenen zu unterbinden. Als fortgeschrittener Zelltodmechanismus erscheint die hypersensitive Antwort häufig als Gipfelpunkt des zweiten Immunitätsniveaus einer Pflanze, die als Effektor-vermittelte Immunität (effector-triggered immunity, ETI) bezeichnet wird und ein Zeichen höherer Resistenz darstellt. Unsere bisherige Arbeit hat bereits eine Cystein-abhängige Protease-Genfamilie in der Weinrebe identifiziert, eine so genannte Metacaspase (MC), die eine wesentliche Rolle bei Prozessen des programmierten Zelltods in der Entwicklung von Pflanzen spielt. Ziel dieser Doktorarbeit ist es, zentrale MC-Genkandidaten zu screenen, die auf den ETI-induzierten HR-Prozess reagieren und die zelluläre Funktion und den entsprechenden Regulationsmechanismus der Kandidaten zu verstehen. Die Doktorarbeit besteht wie folgt aus drei progressiven Teilen.

Wir verwendeten ein typisches biotrophes Pathogenisolat, Plasmopara viticola, als HR-Elicitor auf Blattscheibenbioassays, um die Unterschiede der nekrotischen Zone während der Infektion von neun Genotypen auf Weinrebenblätter zu beobachten. Zwei gegensätzliche Genotypen wurden untersucht: Das Kultivar "Müller Thurgau" steht für einen anfälligen Genotyp, wohingegen Vitis rupestris für einen HR-resistenten Genotyp steht. Eine weitere Genexpressionsanalyse zeigte, dass nach der Infektion nur VrMC2 und VrMC5 von V. rupestris zunehmend exprimiert wurden, was 24 h vor dem Auftreten der hypersensitive Antwort erfolgte. Daher wurden diese beiden Gene als Kandidaten ausgewählt.

In einer Suspensionszelllinie wurde Harpin als ein wirksamer, die hypersensitive Antwort auslösender Elicitor eingesetzt, der den Zelltod spezifisch für V. rupestris und “Pinot Noir”induzieren konnte. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass nach 24 h mit 18 µg / ml Harpinbehandlung VrMC2 und VrMC5 entsprechend hochreguliert wurden. Dieses Ergebnis entsprach unseren früheren Ergebnissen auf Blattscheiben. Bezüglich ihrer zellulären Funktionen wurden VrMC2 und VrMC5 durch heterologe Expression in BY-2 Tabakzellen charakterisiert. Die subzellulären Lokalisierungsstudien zeigten, dass sich VrMC2 am endoplasmatischen Retikulum (ER) um die Kern herum und VrMC5 im Zytoplasma und dem Kernbereich befand. Dies legt nahe, dass in der Weinrebe zwei verschiedene Typen von Metacaspasen wahrscheinlich die Rolle des programmierten Zelltods in verschiedenen subzellulären Orten in der Zelle übernehmen. Darüber hinaus zeigte ein Zellmortalitätsassay, dass beide VrMC2- und VrMC5-BY-2-Überexpressionslinien stark auf den durch Harpin-induzierten Zelltod reagierten. Darüber hinaus ist diese Mortalität signalabhängig, was durch die Zugabe von exogenem Methyljasmonat (MeJA), ein wichtiger Überträger der basalen Immunität, oder Diphenyleniodonium (DPI), einem Inhibitor von Nicotinamid-Adenin- Dinukleotid-Phosphat-Wasserstoff (NADPH) Oxidasen, welche apoplastisches Superoxid erzeugen, vermindert werden konnte.

Die 5'-Upstream-Sequenz-Promotoren von MC2 (pMC2) und MC5 (pMC5) wurden aus beiden Kultivaren, "Müller Thurgau" und V. rupestris, kloniert, um den durch Genexpression regulierten Mechanismus weiter zu untersuchen. Die Verteilung der auf die Abwehrreaktion bezogenen cis-Elemente von pMC2 und pMC5 wurde in den zwei Genotypen weiter analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass es fünf verschiedene Arten cis-Elementen gibt, die sowohl auf pMC2 als auch auf pMC5 verteilt sind, wie z. B. die W-Box, die TC-reiche Region und das GT-1-Motiv. Die Gesamtelementanzahl von pVrMC2 und pVrMC5 ist höher als die Anzahl von pVvMC2 und pVvMC5. Nicht zuletzt wurde mit Hilfe eines Dual-Luciferase-Systems zum Nachweis der Promotoraktivität von pVrMC2 und pVrMC5 gezeigt, dass nach der Harpinbehandlung sowohl die Aktivität von pVrMC2 als auch die von pVrMC5 zumeist verdoppelt wurden. Jedoch zeigte pVrMC2 keine Antwort auf MeJA. Außerdem verringerte sich sogar die pVrMC5-Aktivität durch Zugabe von MeJA. Diese Ergebnisse bestätigten, dass die VrMC2- und VrMC5-Genexpressionsmuster teilweise durch ihre entsprechenden Promotoraktivitäten reguliert wurden.