Die Rolle des Fettsäuresynthase Acyl-Carrier-Proteins (FAS-ACP) in der Chinoxalinantibiotika-Biosynthese
Creators: name: Schmoock, Gernot
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2005
Subjects: subject: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
subject: Acyl-Carrier-Protein
subject: Adenylierende Enzyme
subject: Chinoxalinantibiotika
subject: Fettsäuresynthase-ACP
subject: Nichtribosomale Peptidsynthese
subject: NRPS
subject: ACP
subject: FAS-ACP

description: Chinoxalinantibiotika sind cyclische Octadepsipeptide, die aus zwei antiparallel angeordneten und über Esterbindungen miteinander verknüpften Chinoxalinoyl-tetrapeptidketten bestehen. Die Peptidketten sind an ihren Aminotermini mit Chinoxalin-2-carbonsäure (2QA) acyliert. Diese planaren, heteroaromatischen Seitengruppen sind für den Mechanismus der bifunktionellen Interkalation der Chinoxalinantibiotika in DNA verantwortlich. Als Inhibitoren der Transkription und der Replikation besitzen die Chinoxalin-antibiotika antimikrobielle und cytostatische Aktivität. Chinoxalinantibiotika werden von verschiedenen Streptomyces Arten, zu denen auch Streptomyces triostinicus und Streptomyces echinatus gehören, produziert. Der Aufbau der Peptidketten erfolgt in einem nichtribosomalen Mechanismus durch die Triostin Synthetasen I, II, III und IV (TrsI, II, III und IV). Die Triostin Synthetase I (TrsI) ist eine allein stehende Adenylierungs-Domäne (A-Domäne) und aktiviert die 2QA als Adenylat ohne 2QA-Bindungseigenschaft, während die Triostin Synthetasen II, III und IV typische nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) mit insgesamt vier kompletten Modulen sind, die jeweils eine Aminosäure des 2QA-Tetrapeptids durch Adenylierung aktivieren und als Thioester kovalent binden können. Die Peptidsynthetasen TrsII, III und IV sind somit höchstwahrscheinlich für den Aufbau der Tetrapeptidketten verantwortlich. Auf der Suche nach der 2QA-bindenden Proteinkomponente des Chinoxalinantibiotika-NRPS-Komplexes wurde aus Streptomyces echinatus ein ca. 9 kDa großes 2QA-bindendes Protein isoliert, welches durch die TrsI mit 2QA in ATP-abhängiger Weise acyliert wird. Die Reinigung und aminoterminale Sequenzierung des als AcpPSE bezeichneten 2QA-bindenden Proteins sowie die anschließende Klonierung seines Gens (acpPSE) ergab, dass es sich bei diesem Protein um das Acyl-Carrier-Protein (ACP) aus der Fettsäuresynthase (FAS) von S. echinatus handelt. Die heterologe Expression von acpPSE in E. coli lieferte das rekombinante AcpPSE in seiner holo-Form. Die eingehende Charakterisierung des ACPs ergab, dass es von ähnlichen allein stehenden A-Domänen (ACMSI und MKMSI aus der Actinomycin- bzw. Etamycin-Biosynthese) verwandter Chromopeptid-Biosynthesesysteme aus Streptomyceten nicht acyliert wird und ausschließlich ein Substrat für die TrsI darstellt. Aus diesen Daten konnte geschlossen werden, dass es sich bei der TrsI und des AcpPSEs höchstwahrscheinlich um das Initiationsmodul der Chinoxalinantibiotika-Biosynthese handelt, welches Chinoxalin-2-carbonsäure für die Synthese des 2QA-Tetrapeptids bereitstellt. Die Bestimmung der kinetischen Parameter KM und kcat der Acylierungsreaktion für das putative Initiationsmodul TrsI/AcpPSE und der Vergleich mit Initiationsmodulen anderer Chromopeptid-Biosynthese-systeme (Actinomycin-, Enterobactin- und Vibriobactin-Biosynthese) zeigten, dass TrsI/AcpPSE eine typische Acylierungs-Kinetik für diesen Modul-Typ aufweist. Die Umsetzung des Proteinpaares TrsI/AcpPSE mit der Triostin Synthetase II, welche die Module 2 (Serin) und 3 (Alanin) für den Aufbau der Tetrapeptidketten enthält, zeigte, dass AcpPSE spezifisch 2QA auf das an TrsII kovalent gebundene Serin unter Bildung von 2QA-Serin überträgt. Zudem war die TrsII offensichtlich in der Lage, das 2QA-L-Serine in 2QA-D-Serine durch Epimerisierung umzuwandeln. Diese Daten zeigen, dass AcpPSE eine hochspezifische Bindungsdomäne für 2QA in der Initiationsreaktion der 2QA-Peptidsynthese darstellt und hiermit zum ersten Mal die Mitwirkung eines Acyl-Carrier-Proteins der bakteriellen Fettsäuresynthase an einer nichtribosomalen Peptidsynthese gezeigt wird.