title: Structural and functional analysis of non-canonical tandem-thioesterases
Creators: name: Biermeier, Maximilian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Tandem-Thioesterase
NRPS
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Kristallstruktur
Tandem-Te
tandem-TE
inhibitor-assay
terminationmodul
crystal structure
tandem-Te
nonribosomal peptidsynthetase
termination domain
Terminationsdomäne
Inhibitor-Assay
Nichtribosomale Peptidsynthetasen
Terminationsmodul

description: Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind dafür bekannt eine vielfältige Palette an bioaktiven Naturstoffen zu produzieren, deren Wirkungsbereiche häufig im Einsatz als Antibiotikum, Immunsuppressivum oder Zytostatika sind. Diese pharmakologisch bedeutsamen Eigenschaften haben verstärkt wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen, um zum einen die Entdeckung neuer Naturstoffe voran zu treiben. Zum anderen erhofft man sich, über die mechanistische Aufklärung dieser komplexen Synthesestraßen, die katalytischen Eigenschaften für zielgerichtetes Medikamentendesign nutzen zu können. Im Hinblick auf die mechanistische Aufklärung ist die Forschung besonders auf die strukturelle Aufklärung einzelner Domänen und Module angewiesen um für die Funktion essentielle Interaktionen aufzuzeigen, Substratspezifitäten zu erklären und die gezielte Modifikation bestimmter Funktionseinheiten zu erleichtern. Ein besonderes Interesse gilt hier der Funktionsanalyse von Terminationseinheiten, wie der Thioesterase (Te), die für die Produktfreisetzung aus dem NRPS erforderlich ist. Innerhalb der letzten Jahre wuchs das Interesse insbesondere für die Erforschung der ungewöhnlichen Tandem-Te, die bislang überwiegend in NRPS Systemen beschrieben wurde, deren Biosynthese überwiegend makrozyklische Naturprodukte zu vertreten scheint. In dieser Arbeit ist die strukturelle und funktionelle Analyse von ungewöhnlichen Tandem-Te auf Basis des Modellorganismus Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 beschrieben. In voran gehenden Arbeiten von BODE et al. konnte bereits gezeigt werden, dass das biosynthetische Gencluster von Xenoamicin, einem Naturstoff aus der Gruppe der zyklischen Depsipeptide, diese Didomäne beherbergt. Eine im Fokus stehende Fragestellung dieser Arbeit befasst sich mit der kristallographischen Strukturaufklärung dieser Tandem-XncTe, die bei einer Auflösung von 3.4 Å hier genauer beschrieben wird. Zudem zeigt eine C-terminale Teilstruktur, bei einer Auflösung von 1.9 Å, Eigenschaften der isolierten Subdomänen auf. Die strukturellen Informationen werden zudem mit dynamischen Eigenschaften in Lösung verknüpft, die unter anderem über Wasserstoff / Deuterium-Austausch massenspektrometrisch eingeordnet werden. Hierbei steht insbesondere die Subdomänen-Anordnung, sowie Te-bekannte Lid-Merkmale im Vordergrund. In einem weiterführenden bioinformatischen Ansatz wird zudem das natürliche Vorkommen der Tandem-Te hervorgehoben und anhand von gesammelten Sequenzinformationen tiefgehender beleuchtet. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wird zudem die proteinbiochemische Charakterisierung der orthologen 2-F4 NRPS Tandem-Te unbekannten Ursprungs beschrieben. Das Ortholog, welches Ähnlichkeit mit der Syringomycin-Synthetase aus Pseudomonas syringae aufweist, wird erstmals erfolgreich rekombinant überproduziert und gereinigt. Hierauf aufbauend wird die gelöste C-terminale Teilstruktur präsentiert, die eine stark konservierte Struktur zur Tandem-Xnc-Te aufweist. Auch konnten hier erste dynamische Untersuchungen durchgeführt werden.
description: Nonribosomal peptide synthetases (NRPS) are known to produce a diverse range of bioactive natural products, like antibiotics, immunosuppressants or cytostatics. These pharmacologically important properties have attracted increased scientific interest, on the one hand to advance the discovery of new natural products from nature. On the other hand, the mechanistic elucidation of these complex synthetic pathways enables the catalytic properties of individual domains to be used for targeted drug design. Regarding mechanistic elucidation, research is particularly dependent on the structural elucidation of individual domains and modules in order to reveal functionally essential interactions, to investigate substrate specificities and facilitate the targeted modification of certain functional units. A particular interest here is the functional analysis of termination units, such as thioesterase (Te), which is indispensable for product release from the NRPS. In recent years, the interest has grown in particular in the study of the unusual tandem Te, which has been described predominantly in NRPS systems whose biosynthesis seem to represent predominantly macrocyclic natural products. In this work, the structural and functional analysis of unusual tandem Te based on the model organism Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 is described. Previous work by BODE et al. has already shown that the biosynthetic gene cluster of xenoamicin, a member of the cyclic depsipeptide group, harbors this didomain. One of the focal questions of this work deals with the structure elucidation of this tandem-XncTe, which is described in more detail here at a resolution of 3.4 Å. In addition, a C-terminal subdomain is revealed at a resolution of 1.9 Å, reveals properties of the isolated subdomains. The structural information is also linked to dynamic properties in solution, which are also spectrometrically classified via hydrogen/deuterium exchange. Here, the focus relies on the subdomain arrangement in particular, as well as Te-known lid features. In a further bioinformatic approach, the natural occurrence of tandem-Te is also highlighted and illuminated in greater depth using collected sequence information. A further part of this paper, the protein biochemical characterization of the orthologous 2-F4 NRPS tandem Te of unknown origin is also described. The ortholog, which shares similarity to the syringomycin synthetase from P. syringae, is successfully recombinantly overproduced and purified for the first time. Based on this, the solubilized C-terminal partial structure is presented, which shows a strongly conserved structure to tandem Xnc-Te. The first dynamic investigations could also be carried out here.