title: Methods to monitor and improve cell viability and behaviour during and after bioprinting
title: Methoden zur Visualisierung und Verbesserung des Zellüberlebens und -verhaltens während und nach dem Biodrucken
Creators: name: Fischer, Lena
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: The ultimate goal of biofabrication is to create biologically functional constructs that mimic human tissues and organs in structure and complexity. To achieve this, living cells immersed in biomaterials are printed into three-dimensional (3-D) tissue-constructs using methods such as laser-assisted, inkjet or extrusion-based bioprinting. Due to many advantages, extrusion-based bioprinting is the most commonly used method. However, it inevitably subjects cells to shear stress due to the application of hydrostatic pressure to pass cells through a thin printing needle. This shear stress can cause damage to the cellular plasma membrane and possibly intracellular organelles, which can impair cell survival or functional performance. Despite this inherent problem of extrusion bioprinting, methods to monitor shear stress-induced plasma membrane damages, and to decrease the vulnerability of cells to shear stress are not well established. In this work, a fluorescence-based assay using the styryl dye FM 1-43 was developed to visualize and quantify bioprinting-induced plasma membrane damages. FM 1-43 is incorporated into the outer lipid layer of the plasma membrane without crossing it and becomes fluorescent upon insertion. Following plasma membrane damage, e.g. through shear stress, the dye enters the cell and additionally stains intracellular membrane systems (e.g. mitochondria), resulting in an increased fluorescence intensity. Using FM 1-43 in confocal microscopy and microfluidic setups, it could be confirmed that the fluorescence intensity increases with applied shear stress and resulting cell deformation. Moreover, it could be shown in this work that bioprinting at high pneumatic pressure (6 bar) leads to cellular plasma membrane damages and impaired cell survival. Calcium ions play a fundamental and well-described role in the immediate repair of plasma membrane lesions. Based on this, it was shown in this work that supplementing the bioink with 1.9 mM CaCl2 improved cell survival during bioprinting in all tested bioinks (alginate, GelMA) and cell types (NIH/3T3, A125, MDA-MB-231, hiPSC, HUVEC/Tert2). Importantly, stiffer cells (hiPSC, HUVEC/Tert2) underwent less cell deformation than softer cells (NIH/3T3, A125, MDA-MB-231) at similar shear stress, resulting in less plasma membrane damage and cell death. This result strongly suggests that it is the shear stress-induced cell deformation, rather than the shear stress itself, that results in cell damage and death. In addition to providing tools for visualizing and improving the immediate effects of bioprinting on cell survival, methods for long-term monitoring of cell behavior were developed in this work. Lentiviral genetic reporter constructs for different cellular processes (proliferation, morphology and apoptosis) were generated and stably integrated into different cell types. Notably, bioprinting experiments using NIH/3T3-FUCCI proliferation reporter cells revealed that the application of high shear stress (6 bar) did not impair the proliferation of surviving cells. Moreover, NIH/3T3-tdTomato-Farnesyl morphology reporter cells exhibited increased spreading and elongation in biomaterials containing adhesion motifs (collagen) compared to non-adhesive bioinks (alginate), emphasizing the relevance of efÏcient adhesive functionalization of bioinks. As demonstrated by those experiments, genetically encoded reporter for cell behaviour can be used for the optimization of printing processes as well as the characterization of bioinks, and for live monitoring of the same cells over a longer period of time.
description: Das Ziel von Biofabrikation ist die Generierung von biologisch funktionellen Strukturen, die hinsichtlich Aufbau und Komplexität menschlichen Geweben ähneln. Hierfür werden lebende Zellen zunächst in Biomaterialien gemischt und anschließend mittels additiver Fertigungsverfahren (zum Beispiel Laser-, Tintenstrahl- oder Extrusionsbasiertes Biodrucken) zu einem dreidimensionalen (3-D) Konstrukt räumlich angeordnet. Aufgrund vieler Vorteile ist das extrusionsbasierte Biodrucken die am häufigsten verwendete Methode. Dabei wird die Biotinte mit Hilfe von Druck durch eine dünne Druckernadel extrudiert, was unweigerlich eine Scherbelastung der lebenden Zellen zur Folge hat. Dieser Scherstress kann zu Schäden an der zellulären Plasmamembran führen und somit das Überleben und die Funktionsfähigkeit der Zellen im Biofabrikat beeinträchtigen. Obwohl dies eine der größten Herausforderungen im Bereich der Biofabrikation darstellt, gibt es kaum Methoden für die Visualisierung und Quantifizierung von Plasmamembranschäden oder für die Stärkung zellulärer Abwehrmechanismen gegen Scherstress-induzierte Schäden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Fluoreszenz-basierte Methode entwickelt, um Plasmamembranschäden während des Biodruckens sichtbar und quantifizierbar zu machen. Hierfür wurde der Styryl-Farbstoff FM 1-43 verwendet, der sich in die äußere Schicht der zellulären Plasmamembran einlagert und diese grün fluoreszierend anfärbt. Da der Farbstoff die Membran nicht durchdringen kann, wird bei gesunden Zellen somit ausschließlich diese angefärbt. Kommt es jedoch zu einer Schädigung der Membran, z. B. durch Scherstress, kann der Farbstoff in die Zelle eindringen und somit zusätzlich intrazelluläre Membransysteme (z. B. von Mitochondrien) anfärben. Die geschädigten Zellen sind dann durch eine erhöhte Fluoreszenz-intensität erkennbar. Diese Hypothese wurde in verschiedenen experimentellen Aufbauten überprüft. Dabei zeigte sich, dass die Intensität von FM 1-43 in der Tat mit zunehmendem Scherstress und der daraus resultierenden Zellverformung korrelierte. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Biodrucken bei hohem pneumatischem Druck (6 bar) zu Schäden an der Plasmamembran von NIH/3T3 Zellen führte und das Überleben der Zellen, nicht jedoch die Proliferation von überlebenden Zellen beeinträchtigte. Als Reaktion auf Plasmamembranschäden haben Zellen schnelle Reparaturmechanismen entwickelt, bei deren Initiierung der Einstrom von Kalziumionen eine grundlegende Rolle spielt. Darauf basierend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Zugabe von einer physiologischen Konzentration von CaCl2 zur Biotinte das Überleben der Zellen in Folge der Biodruck-bedingten Scherbelastung verbessert. Dieser Effekt konnte in allen getesteten Biotinten (Alginat, GelMA) und Zelltypen (NIH/3T3, A125, MDA-MB-231, hiPSC, HUVEC/Tert2) nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass steifere Zellen (hiPSC, HUVEC/Tert2) bei gleicher Scherbelastung weniger verformt werden als weichere Zellen (NIH/3T3, A125, MDA-MB-231), was wiederum zu weniger Schäden an der Plasmamembran und verbessertem Zellüberleben führte. Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass nicht der Scherstress selbst, sondern die dadurch bedingte Zellverformung zu Zellschäden und Zelltod führt. Neben der Entwicklung von Methoden zur Visualisierung und Verbesserung der unmittelbaren Auswirkungen des Biodruckens auf das Zellüberleben, wurden in dieser Arbeit auch Methoden zur langfristigen Beobachtung und Auswertung des Zellverhaltens etabliert. Hierfür wurden lentivirale genetische Reporterkonstrukte für verschiedene zelluläre Prozesse (Proliferation, Morphologie und Apoptose) generiert und stabil in verschiedene Zelltypen eingebracht. Mit Hilfe dieser Zellen konnte in Biodruck-Experimenten gezeigt werden, dass jene Zellen, die das Druckverfahren bei 6 bar überlebten, nicht in ihrer Proliferation beeinträchtigt waren. Darüber hinaus zeigte die Verwendung von Morphologiereporterzellen, dass Zellen in Biomaterialien mit Adhäsionsmotiven (Kollagen) einen elongierten Phänotyp aufwiesen, im Gegensatz zu nicht-adhäsiven Biotinten (Alginat). Die Experimente zeigen eindrücklich, dass Reporterzellen sowohl für die Optimierung von Druckverfahren als auch für die Charakterisierung von Biotinten und die Beobachtung von Zellverhalten über einen längeren Zeitraum eingesetzt werden können.