title: Which hydroxycinnamoyltransferase can be detected in Coleus blumei and Glechoma hederacea and how sensitive is Melissa officinalis to low ozone concentrations?
title: Welche Hydroxycinnamoyltransferasen sind in Coleus blumei und in Glechoma hederacea nachweisbar und worin besteht der Einfluss von Ozon auf Melissa officinalis?
Creators: name: Döring, Anne Sarah
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Melissa officinalis
ozone
Biowissenschaften, Biologie
secondary metabolism
Coleus blumei
Sekundärstoffwechsel
Ozon
rosmarinic acid
Rosmarinsäure
Zitronenmelisse
Buntnessel

description: Hydroxyzimtsäureester und -amide,
      z.B. Hydroxycinnamoylchinat, Hydroxycinnamoylshikimat,
      Hydroxycinnamoyltyramin und Rosmarinsäure, sind im
      Pflanzenreich sehr weit verbreitet. Pflanzen synthetisieren
      diese Stoffe zur Abwehr gegen Bakterien oder Pilze, nutzen
      sie aber auch als UV-Schutz. Die Rosmarinsäuresynthase (RAS,
      Hydroxy-cinnamoylCoA:Hydroxyphenyllactat
      Hydroxycinnamoyltransferase) ist für die Biosynthese der
      Rosmarinsäure (RA), einem wichtigen phenolischen Inhaltsstoff
      der Buntnessel (Coleus blumei), essentiell. Zur
      Kristallisation und Strukturanalysen des RAS-Proteins wurde
      RAS-cDNA heterolog in E. coli exprimiert. Da das Protein
      hauptsächlich in inclusion bodies vorliegt, wurde eine
      Rückfaltung und Resolubilisierung durchgeführt. Auf Grund der
      geringen Aktivität wurde das RAS-Protein in SoluBL21TM E.
      coli-Zellen heterolog exprimiert. Nach Aufreinigung durch
      Gelpermeationschromatographie konnte aktives, sauberes
      Protein für Kristallisationsversuche verwendet werden. Es
      erfolgte jedoch kein Kristallwachstum. RAS, HST
      (Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat Hydroxycinnamoyltransferase),
      die zur Bildung von Lignanen und Monolignolen wichtig ist,
      und HQT (Hydroxycinnamoyl-CoA:Chinat
      Hydroxycinnamoyltransferase), ein Enzym der Chlorogensäure
      (CA)-Biosynthese, sind wichtige Vertreter der
      Hydroxycinnamoyltransferasen (HCTs). Ein Ziel dieser Arbeit
      war die Charakterisierung verschiedener HCTs in dem
      Efeublättrigen Gundermann (Glechoma hederacea). Die krautige,
      mehrjährige Pflanze ist in Europa, Asien und Amerika
      beheimatet und kann als interessantes Untersuchungsobjekt
      angesehen werden, da sie RA, CA und Kaffeesäure akkumuliert.
      Eine partielle cDNA-Sequenz, die möglicherweise für eine
      Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat/Chinat
      Hydroxycinnamoyltransferase kodiert, konnte aus Glechoma
      herderacea isoliert werden. Außerdem wurden die RA-, CA- und
      Kaffeesäuregehalte, sowie die Transkriptmenge der RAS, HST
      und einer unbekannten HCT in Blättern, Blüten, Stängeln und
      Wurzeln bestimmt. Die untersuchten Transkripte konnten in
      allen Organen, außer in Wurzeln, nachgewiesen werden. Die
      Blüten akkumulierten 12,5% RA, während der Gehalt in
      Blättern, Stängeln und Wurzeln bei etwa 1% lag. Darüber
      hinaus wurde die Akkumulation der CA, RA und Kaffeesäure und
      außerdem die spezifische Aktivitäten der RAS und der
      Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) in einer Suspensionskultur
      von Glechoma hederacea bestimmt. Während des
      Untersuchungszeitraums von 14 Tagen wurden Wachstums- und
      Mediumsparameter, sowie der Sekundärmetabolismus untersucht.
      Die maximale PAL-Aktivität konnte an Tag 5 und die maximale
      RAS-Aktivität an Tag 8 bestimmt werden. RA war im Vergleich
      mit den anderen Sekundärmetaboliten mit fast 26% an Tag 7 am
      stärksten vertreten. In einem anderen Projekt wurden die
      spezifische Aktivität und Substratspezifität von bereits
      konstruierten CbRAS/HST- und CbHST/RAS-Chimären analysiert.
      Die Kristallstrukturanalyse verschiedener HCTs zeigt, dass
      sie aus zwei ungefähr gleich großen Domänen aufgebaut sind.
      Durch den Austausch der beiden Domänen konnten die Chimären
      synthetisiert werden. Die Aktivitätstests zeigten geringe
      RAS-Aktvität bei beiden Chimären, wohingegen keinerlei
      HST-Aktivität gemessen werden konnte. Melissa officinalis
      gehört wie die beiden vorher erwähnten Pflanzen zur Familie
      der Lamiaceae (Unterfamilie Nepetoideae) und dient aufgrund
      des Gehalts an ätherischem Öl und Phenolcarbonsäuren als
      Arzneipflanze. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von
      geringen Ozonkonzentrationen auf den Primär- und
      Sekundärstoffwechsel untersucht. Die Melissenpflanzen wurden
      geringen Ozonkonzentrationen (80 ppb, 5 h) ausgesetzt, da
      verschiedene Studien gezeigt haben, dass erhöhte
      Hintergrundkonzentrationen genauso schädlich wie
      Ozonspitzenkonzentrationen sein können. Die Probenahme
      erfolgte 0, 3, 5, 12 und 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung.
      Es wurden Änderungen der photosynthetischen Funktionen
      bestimmt, außerdem wurden ökophysiologische, biochemische und
      strukturelle Parameter untersucht. Nach Ende der
      Begasungsperiode konnten makroskopisch keinerlei Schäden
      erkannt werden, doch auf mikroskopischer Ebene zeigten sich
      nekrotische Bereiche in den Blättern. Auch wurden die
      photosynthetischen Funktionen stark beeinflusst. Verschiedene
      Enzyme, z.B. PAL, Hydroxyzimtsäure:Coenzym A Ligase (4CL),
      Tyrosin Aminotransferase (TAT) und RAS, sind an der
      Biosynthese der RA beteiligt. Durch quantitative
      Real-time-PCR wurden die Transkriptionslevel dieser Gene in
      Melissa officinalis untersucht. Es erfolgte eine schnelle
      Hochregulierung aller Gene, aber 24 h nach Beginn der
      Ozon-Begasung waren nur noch RAS und PAL hochreguliert. Die
      spezifische Aktivität der RAS korrelierte mit einem Absinken
      des RA-Gehalts, wohingegen die PAL-Aktivität einen Anstieg um
      163% nach 12 h aufwies. In einem zweiten Begasungsexperiment
      unter den gleichen Bedingungen wurden antioxidative Effekte
      in der Zitronenmelisse untersucht. Die Probenahme erfolgte 0,
      3, 5, 12, 24 und 48 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es
      konnten ein signifikanter Anstieg an Ascorbat,
      Dehydroascorbat und Gesamtascorbat, sowie ein biphasischer
      Verlauf des Redoxstatus festgestellt werden. Ein hohes
      Radikalfängerpotential korrelierte mit einem hohen
      Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen und einem hohen
      Carotinoidgehalt. Außerdem stiegen der Gehalt an
      Wasserstoffperoxid und Prolin. Die Bestimmung der
      Katalaseaktivität zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem
      Anstieg nach 5 h und einem Abfall nach 48 h. Zusammenfassend
      verdeutlichen diese Ergebnisse den Einfluss von Ozonstress
      auf die Arzneipflanze Melissa officinalis.
description: Hydroxycinnamic esters and amides
      e.g. hydroxycinnamoylquinate, hydroxycinnamoyl-shikimate,
      hydroxycinnamoyltyramine and rosmarinate are quite abundant
      in the plant kingdom. Plants can use these compounds as
      defense strategies against herbivores, pathogens or
      UV-irradiation. Rosmarinic acid synthase (RAS,
      4-coumaroyl-CoA:hydroxyl-phenyllactic acid
      hydroxycinnamoyltransferase) is an important enzyme in the
      formation of rosmarinic acid (RA), the main phenolic compound
      in Coleus blumei. For structural analyses of RAS, the
      RAS-cDNA was heterologously expressed in Escherichia coli.
      The protein was mostly found as insoluble inclusion bodies.
      After solubilization and refolding of CbRAS, the protein was
      insufficiently active. So the expression was performed with
      SoluBL21TM E. coli and after purification by gel permeation
      chromatography, very active and pure protein could be used
      for crystallization. Unfortunately no crystals were growing.
      RAS, HST (hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate
      hydroxycinnamoyltransferase), which is important for the
      formation of monolignols, and HQT
      (hydroxycinnamoyl-CoA:quinate hydroxyl¬cinnamoyltransferase),
      a compound essential for the formation of chlorogenic acid
      (CA), are important members of the
      hydroxycinnamoyltransferases (HCTs). The cloning and
      characterization of these HCTs present in Glechoma hederacea
      was an objective of this study. Glechoma hederacea L.
      (Lamiaceae) is a perennial plant, which is distributed widely
      in Europe, Asia and America and an ideal candidate, because
      it produces RA, CA and caffeic acid. By several attempts a
      partial sequence putatively encoding a HSCQT was isolated
      from Glechoma hederacea. Additionally, the presence of
      caffeic acid, CA, RA and the transcript abundances of RAS,
      HST and an unknown HCT in flowers, leaves, stems and roots of
      naturally grown G. hederacea were determined. The RAS, HST
      and HCT genes were expressed in all organs apart from roots.
      Flowers accumulated astonishingly 12.5% RA in their dry mass
      and leaves, stems and roots around 1%. In another part of
      this project the accumulation of caffeic acid, CA and RA and
      the determination of RAS and phenylalanine ammonia-lyase
      (PAL) activities in a suspension culture of Glechoma
      hederacea was studied. Growth, medium and secondary
      metabolism parameters were assessed during a cultivation
      period of 14 days. The maximum PAL activity was observed on
      day 5, while the maximum of the RAS activity was accomplished
      on day 8. The main caffeic acid derivative definitely was RA,
      which reached 25.9% of the dry mass on day 7. This is among
      the highest level of a secondary metabolite in plant cells
      ever observed. The activity and substrate acceptance of
      already constructed chimeric proteins consisting of RAS and
      HST halves (CbRAS/HST, CbHST/RAS) were determined. The
      assumption is that hydroxycinnamoyltransferases are formed by
      two almost equally sized domains I and II. The chimeras were
      designed by exchanging the two main domains of RAS and HST,
      which is important for the formation of monolignols. RAS and
      HST activity assays revealed low RAS-activities in both
      chimeric proteins while HST activity could not be detected.
      Lemon balm (Melissa officinalis) is a commonly used medicinal
      plant, which belongs to the family Lamiaceae (subfamily
      Nepetoideae). The pharmaceutical properties are e.g.
      sedative, carminative, spasmolytic, antibacterial and
      antiviral mostly due to the content of essential oil (citral,
      citronellal) and phenolic acid esters. The influence of low
      ozone concentrations on primary and secondary metabolism of
      lemon balm was studied. Melissa plants were exposed to low
      ozone (O3) dosages (80 ppb for 5 h), because high background
      levels of O3 are considered to be as harmful as episodic O3
      peaks. Samples were taken 0, 3, 5, 12 and 24 h from beginning
      of exposure (FBE). The influence on different
      ecophysiological, biochemical and structural parameters were
      analyzed. At the end of the ozone exposure, no visible foliar
      symptoms were detectable, but at microscopic level a small
      number of dead cells were found. Nevertheless several
      photosynthetic reactions were significantly affected. Several
      enzymes are responsible for the biosynthesis of RA, among
      them PAL, 4-coumarate:coenzyme A ligase (4CL), tyrosine
      aminotransferase (TAT) and RAS. The transcript levels of
      these genes have been investigated by quantitative RT-PCR in
      lemon balm. All analyzed genes were quickly up-regulated at 3
      h of O3 exposure, but at 24 h from beginning of exposure
      (FBE) only RAS and PAL were up-regulated. The specific
      activity of RAS was closely correlated with a decrease in RA
      content, while the specific activity of PAL increased at 12 h
      FBE to 163% in comparison to control levels. In a second
      treatment with 80 ppb ozone for 5 h the antioxidant effects
      of Melissa officinalis were assessed. Sampling took place 0,
      3, 5, 12, 24 and 48 h FBE. A significant increase of
      ascorbate, dehydroascorbate, total ascorbate 48 h FBE and a
      biphasic redox status was measured. Strong scavenging
      capacities, measured with the DPPH assay, were correlating
      with a high content of total phenols and carotenoids.
      Furthermore the hydrogen peroxide and proline contents also
      increased significantly 48 h FBE. The catalase activtity
      showed a biphasic trend with an increase 5 h FBE and a
      decrease 48 h FBE. In conclusion these experiments provide
      insight into the effect of abiotic stress caused by ozone on
      the pharmaceutically important plant Melissa
      officinalis.