title: The role of activins and their antagonists in human melanoma cell lines
Creators: name: Öztürk, Deniz
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: EINLEITUNG: Activine sind sezernierte dimere Polypeptide, die zur TGF β Familie der Wachstums- und Differenzierungsfaktoren gehören. Activine regulieren Zellwachstum, Differenzierung, Migration und Angiogenese in verschiedenen Geweben und Organen. Die Funktion von Activinen wird seinerseits durch extrazelluläre Antagonisten (Follistatin und FLRG) und antagonistische Co-Rezeptoren an der Zellmembran (Cripto) limitiert. Deregulierung von Activin Signalen wurde in mehreren Tumorarten gefunden und in direkten Zusammenhang mit dem malignen Wachstum von Tumorzellen gebracht. ZIELE: Das Ziel dieser Studie war es, (1) die Expression von Aktivinen und Aktivinantagonisten in Melanomzellen zu untersuchen, (2.) den Einfluss von Follistatinüberexpression auf Melanomzellen zu testen und (3.) mögliche Signaltransdutionsmechanismen der Aktivin Beta E Untereinheit zu analysieren. METHODEN: Die Expression aller vier Aktivin Untereinheiten und antagonistischer Faktoren wurden in einer Reihe von humanen Melanomzellen durch quantitative RT-PCR untersucht. 3 Melanomzelllinien wurden stabil mit Follistatin transfiziert und die Überexpression wurde mittels ELISA bestätigt. Diese Zellen wurden dann in-vitro-in Migrations- und Proliferations-Assays getestet. Für Follistatin überexprimierende VM21 Zellen wurden auch Xenotransplantationsexperimente in SCID-Mäusen durchgeführt. Die Auswirkungen von Activin E, Activin A und Follistatin auf den Smad Signalweg wurde mittels Western-Blot Analyse untersucht. ERGEBNISSE: Das Expressionsniveau von Activin C war in Melanomzelllinien erhöht (83%) im Vergleich zu primären Melanozyten. Die Expressionniveaus von Activin beta B (75%) und Activin beta E (92%) dagegen reduziert, während Activin beta A unterschiedliche Regulation in Abhängigkeit von der Zelllinie zeigte. Expression von Follistatin (75%) und Cripto (100%) war erhöht. Die Expression der anderen dem Follistatin verwandten Proteinen, FLRG und Follistatin-like-1 war je nach Zelllinie erhöht oder reduziert. Nur eine der beiden Isoformen von Follistatin (Fst-315) wurde in nahezu allen Melanomzellen und in primäre Melanozyten gefunden. Überstände von stabil transfizierten Zellen enthielten mehr als 10-fach soviel Follistatin wie die Kontrollzellen. Überstände Follistatin exprimierender Zellen waren auch in der Lage Smad-Phosphorylierung durch zugegebenes Aktivin A zu neutralisieren. In-vitro, zeigten die Follistatin überexprimierenden Zellen eine Tendenz zu verminderter Proliferations, aber teils erhöhter Klonogenizität. Die Migrationsfähigkeit der Melanomzellen wurde um 20%-80% reduziert, wenn Follistatin überexprimiert wurde. Die Rolle der Follistatin vermittelten Hemmung des Activins wurde auch durch Xenotransplantation Experimente von VM21 Zellen in SCID-Mäusen getestet. Allerdings war hier kein Unterschied im Tumorwachstum verglichen mit GFP-Kontrollen zu erkennen. Bezüglich möglicher Signalwege von Activin E wurde nachgewiesen, dass durch Aktivin E konditionierte Medien im Gegensatz zu Aktivin A konditionierte Medien keine Smad2 Phosphorylierung aktiviert wird. Auswirkungen der Konditionierung von Medien mit unterschiedlichen Kombination von Activin E, Aktivin A und Follistatin liessen auch weder eine Blockierung noch eine Verstärkung von Aktivin A induzierten Signalen durch Aktivin beta E - wie etwa durch Ausbildung von AE Heterodimeren oder Konkurrenz um Aktivinrezeptoren oder Follistatinbindung - erkennen.
description: BACKGROUND: Activins are secreted dimeric polypeptides belonging to the TGF-β family of growth and differentiation factors. They have been shown to regulate cell growth, differentiation, migration and angiogenesis in multiple tissues and organs. Activins interact with various binding proteins which include antagonists in the extracellular space (follistatin and FLRG) and antagonistic co-receptors at the cell membrane (cripto). Deregulation of activin signals has been found in several tumor types and linked to the malignant growth of tumor cells. OBJECTIVES: The purpose of this study was to (1.) analyze the expression of activins and activin antagonists in melanoma cell lines, (2.) functionally characterize melanoma cell lines overexpressing follistatin and (3) investigate potential signaling mechanisms of activin beta E. METHODS: The expression levels of all four human activin subunits and antagonistic factors were investigated in a panel of human melanoma cell lines by quantitative RT-PCR. Three melanoma cell lines were transfected with follistatin and clones stably overexpressing follistatin (confirmed using enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) were analyzed with in vitro migration and proliferation assays. The effect of follistatin-mediated inhibition of activin activity on tumour growth was also investigated by xenotransplantation experiments in SCID mice. The impact of activin E, activin A and follistatin on smad signaling was assessed by immunoblotting. RESULTS: Elevated expression levels of activin beta C (83%) were found in malignant melanoma cell lines compared to primary melanocytes. The expression of activin beta B (75%) and activin beta E (92%) in contrast, was downregulated, whereas activin beta A showed up- or down-regulation depending on the cell line. Expression levels of follistatin (75%) and cripto (100%) showed upregulation. The other follistatin related proteins, FLRG and follistatin-like-1 were up- or down-regulated, depending on the cell line. Only one of the two isoforms of follistatin (Fst-315), encoding a 27 amino acid extension at the C-terminus, was found in nearly all melanoma cells, including primary melanocytes. Supernatants of follistatin overexpressing VM21 and VM1 cells contained more than 10-fold elevated levels of follistatin and were also confirmed to inhibit smad phosphorylation induced by treatment with recombinant activin A. In vitro characterization of follistatin overexpressing cells revealed a tendency towards reduced proliferation but partly increased clonogenicity. Migration of melanoma cells was reduced ranging from 20% to 80% by overexpression of follistatin. Follistatin overexpressing VM21 cells were also tested by a xenotransplantation experiment in SCID mice, but did not show a difference in tumor growth when compared to mock controls. Experiments with conditioned media showed that activin E, in contrast to activin A, does not lead to phosphorylation of smad2. Also no evidence was found that expression of activin beta E together with activin beta A could inhibit or enhance activin A-induced signals either by heterodimerization or by competition for activin receptors or follistatin.