title: Establishment of functional cannabinoid receptor test systems and evaluation of ligands derived from Echinacea pallida
Creators: name: Nickl, Kathrin
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Cannabinoide , Rezeptor , Ligand , Pharmakologie , Blassfarbener Igelkopf , GTPase-Assay , GTPgammaS-Assay , Kopplung , G-Protein , Testsystem , GPCR , Cannabinoidrezeptor , Echinacea , Alkamide , THC , GTPase assay , GTPgammaS assay , coupling , G-protein
subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik

description: Cannabinoid receptors (CBRs) have been of high interest since their discovery in the early 1990s. Until now, two different subtypes, the human cannabinoid receptor 1 (hCB1R) and the human cannabinoid receptor 2 (hCB2R) are known. Both regulate important body functions, such as appetite, motor coordination, inflammation and host defence. Identifying new ligands at CBRs is of high importance for treating diseases such as multiple sclerosis, obesity, pain or immune deficiencies. To evaluate the efficacies and pharmacological profiles of CBR ligands sensitive and functional test systems analyzing compounds at a proximal level of the signal cascade are needed. Also, few years ago, alkamides of E. purpurea have been proposed to be ligands at CB2R. However, alkamides have only been characterized as ligands in competition binding assays. Additionally, Echinacea preparations that are efficient treating common cold do not always contain E. purpurea, but also E. pallida. The latter possesses ketoalkenes and ketoalkynes, which have neither been discussed as possible ligands nor been tested for CBR affinity at all. Hence, the aim of this thesis was to establish several functional and highly sensitive test systems to study cannabinoid receptors and their ligands at a proximal point of the signal cascade and to analyse different G-alpha-subunits, RGS-proteins and solvents. Also, differences in the coupling and activation of CBR via G-alpha-proteins should be investigated. Furthermore, isolated natural and synthesized ligands derived from Echinacea species should be analysed by functional test systems. Several test systems for cannabinoid receptors using the Sf9 cell/baculovirus transfection system were established ([3H]CP 55,940 competition binding assay, [32P]GTPase assay, [35S]GTPgammaS assay). This thesis shows for the first time that a final DMSO assay concentration of 3% (v/v) is necessary for stable solutions of CBR ligands and that BSA as a solvent has no advantage over DMSO regarding the pharmacological properties of compounds. [3H]CP 55,940 competition binding assays were set up to identify new ligands at CBRs. Furthermore, the establishment of functional GTPase assays and GTPgammaS binding assays allows now for the detection of agonists, partial agonists, inverse agonists and antagonists at a very proximal point of the signal cascade of CBRs. The coexpression of CBR, G-alpha-i2, G-beta-1-gamma-2 and RGS4 yielded the most effective system in the GTPase assay. To evaluate differences between CBRs their coupling to G-alpha-i2-proteins was evaluated by immunoblotting, [3H]CP 55,940 competition and saturation binding assays, [32P]GTPase assays and [35S]GTPgammaS binding assays. The expression levels of CB1R were approximately two-fold higher than those of CB2R as determined by immunoblotting. However, [3H]CP 55,940 saturation binding assays revealed even higher Bmax values for the CB1R and lower Bmax values for the CB2R. Further experiments showed that CB1R possesses G-protein independent agonist binding and that a part of the CB2R protein was not functional. GTPgammaS time course binding studies revealed a much faster activation of the CB1R after ligand binding. Compared to CB2R, CB1R possessed a higher constitutive activity, as assessed in GTPgammaS saturation binding and in GTPase assays in the presence of NaCl. For the agonist CP 55,940, an agonist / inverse agonist switch at CB1R was observed and described for the first time. Although alkamides from E. purpurea were described as CB2R agonists and endogenous ligands possess a very similar structure compared to alkamides present in E. purpurea, the findings in this thesis do not support the findings in the literature. Furthermore, isolated and synthesized compounds as well as a n-hexane extract derived from E. pallida were analysed for affinity at CBRs. The investigated plant extract of E. pallida and the natural compounds are not ligands at CBRs. However, two synthesized plant-derived ligands and a compound derived from the endogenous agonists showed affinity and efficacy at CBRs. The results of this thesis represent a promising step towards the understanding of CBR signaling, the development of new ligands for CBRs and their pharmacological characterization.
description: Seit ihrer Entdeckung in den frühen 1990er Jahren war das wissenschaftliche Interesse an Cannabinoid-Rezeptoren (CBR) groß. Zur Zeit sind zwei verschiedene Subtypen, der humane Cannabinoid-Rezeptor 1 (hCB1R) und der humane Cannabinoid-Rezeptor 2 (hCB2R) bekannt. Beide Rezeptoren regulieren wichtige Körperfunktionen, z. B. Appetit, Motorik, Entzündungen und Immunabwehr. CBR-Liganden sind als neuartige Therapieansätze für Krankheiten wie Multiple Sklerose, Übergewicht, Schmerz oder Immunschwäche von großem Interesse. Funktionelle und empfindliche Testsysteme, die die Effizienz und die pharmakologischen Eigenschaften von CBR-Liganden an einem proximalen Punkt des CBR-Signalwegs untersuchen, sind daher notwendig. Vor einigen Jahren wurde in der Literatur für die Substanzklasse der Alkamide aus E. purpurea ein CB2R-Agonismus beschrieben. Diese Charakterisierung der Alkamide als CBR-Liganden wurde jedoch lediglich anhand von Kompetitionsbindungs-Assays vorgenommen. Außerdem enthalten Echinacea-Handelspräparate, die erfolgreich zur Abwehr viraler Infekte eingesetzt werden, nicht nur E. purpurea, sondern auch E. pallida. Die Spezies E. pallida besitzt Ketoalkene und Ketoalkine, eine bisher auf ihre potentielle Affinität an CBR nicht untersuchte Substanzgruppe. Das Ziel dieser Doktorarbeit war daher, funktionelle und hochempfindliche Testsysteme zu etablieren, um CBR und Liganden an einem proximalen Punkt der Signalkaskade zu untersuchen. Weiterhin sollten der Einfluss von verschiedenen G-Protein-alpha-Untereinheiten, RGS-Proteinen und Lösungsmitteln analysiert werden. Die Kopplung von CBR an und deren Aktivierung durch G-Proteine sollte untersucht werden. Außerdem sollten isolierte natürliche und synthetisierte Liganden aus Echinacea-Spezies durch die etablierten funktionellen Testsysteme analysiert werden. Mehrere Testsysteme für CBR wurden mit Hilfe des Sf9 Zell/Baculovirus-Expressionssystems etabliert ([3H]CP 55,940 Kompetitionsbindungs-Assay, [32P]GTPase-Assay, [35S]GTPgammaS-Bindungsassay). In dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine finale DMSO Konzentration von 3% (v/v) in den Assays notwendig ist um die Stabilität von CBR-Verdünnungen zu gewährleisten. Außerdem wird beschrieben, dass BSA als Lösungsmittel für CBR Liganden keinen Vorteil gegenüber DMSO besitzt. [3H]CP 55,940 Kompetitionsbindungs-Assays wurden aufgebaut, um neue Liganden an CBR zu identifizieren. Durch die Etablierung von funktionellen GTPase- und GTPgammaS-Bindungsassays kann eine pharmakologische Charakterisierung von CBR-Liganden in volle und partielle Agonisten, volle und partielle inverse Agonisten und Antagonisten an einem proximalen Punkt des GPCR Signalweges erfolgen. Die Ko-Expression von CBR, G-alpha-i2, G-beta-1-gamma-2 und RGS4 ergab das effizienteste Testsystem (GTPase-Assay). Potentielle Unterschiede der Kopplung von CBR an G-alpha-i2-Proteine wurden durch Immunoblots, [3H]CP 55,940 Kompetitionsbindungs- und Sättigungsbindungs-Assays, [32P]GTPase-Assays und [35S]GTPgammaS-Bindungsassays bestimmt. Die Expressionslevel des CB1R waren circa 2mal höher als die des CB2R. [3H]CP 55,940 Sättigungsbindungs-Assays zeigten jedoch weitaus höhere Bmax-Werte für den CB1R und niedrigere Bmax-Werte für den CB2R. Weitere Experimente zeigten, dass am CB1R hochaffine Agonistbindung auch ohne G-Protein möglich ist und dass ein Teil des exprimierten CB2R-Proteins nicht funktionsfähig war. GTPgammaS-Bindungsassays zeigten eine deutlich schnellere Aktivierung der G-Proteine durch CB1R nach Ligandbindung. Der CB1R besaß außerdem eine deutlich höhere konstitutive Aktivität als der CB2R. Ein Switch von CP 55,940 vom Agonisten zum inversen Agonisten wird hier erstmals beschrieben. Obwohl Alkamide aus E. purpurea als CB2R Agonisten beschrieben worden sind und endogene CBR Liganden eine ähnliche Struktur aufweisen, konnte diese Hypothese in der vorliegenden Doktorarbeit nicht bestätigt werden. Außerdem wird gezeigt, dass weder der Gesamtextrakt aus E. pallida noch daraus isolierte Substanzen CBR-Liganden sind. Jedoch zeigten zwei synthetisierte, von den natürlichen Substanzen abgeleitete Verbindungen und eine weitere Verbindung, abgeleitet von den endogenen Liganden, Affinität und Effizienz an CBR. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit stellen einen wichtigen Schritt in Richtung Verständnis des CBR-Signalwegs, Entwicklung von neuen CBR-Liganden, sowie deren pharmakologischer Charakterisierung dar.