title: Identifizierung und Charakterisierung des zellulären Interaktoms des Lassavirus Matrixproteins Z
title: Identification and characterization of the cellular interactome of the Lassa virus matrix protein Z
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Ehlert, Birthe
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: virology
mTOR
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Virusreplikation
Zytoskelett
LAMTOR1
Matrixprotein
Lassa virus
Lassavirus
interactome
virus release
Cdc42EP1
BioID2
Interaktom
virus replication
matrix protein
Cytoskeleton
Virologie
Virusfreisetzung

description: Das hochpathogene Lassavirus (LASV) stellt eine große Gefahr für die öffentliche Gesundheit in Westafrika dar. Protein-Protein-Interaktionen (PPI) zwischen Virus- und Wirtsproteinen spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen Phasen des viralen Lebenszyklus, einschließlich dem Viruseintritt, der Virusreplikation und der Virusfreisetzung. Darüber hinaus können diese PPI auch eine Modulation von zellulären Signalwegen und biologischen Prozessen während einer Infektion induzieren. Das LASV- Matrixprotein Z hat wichtige strukturelle und funktionelle Aufgaben im viralen Lebenszyklus, wie z. B. die Regulierung der viralen RNA-Synthese, die Orchestrierung der viralen Assemblierung und Virusfreisetzung sowie die Hemmung der Interferon-vermittelten Immunantwort. Das Verständnis über die molekularen Mechanismen und Wirtsprotein-Interaktionen durch die das Z-Protein seine vielfältigen Funktionen ausübt, ist jedoch noch begrenzt. In dem vorliegenden Promotionsprojekt wurde die Proximity-abhängige Biotinidentifizierung 2 (BioID2) als Methode der Affinitätsaufreinigung in Verbindung mit massenspektrometrischen Analysen für den Nachweis und die Identifizierung des PPI-Netzwerks des LASV-Z-Proteins in lebenden Zellen eingesetzt. Eine stringente statistische Filterung ergab 584 potenzielle zelluläre Interaktionskandidaten des Z-Proteins. 
Einer der identifizierten Wirtsfaktoren war der Septinregulator Cdc42EP1, ein Effektorprotein der Rho-GTPase Cdc42. Die funktionelle Validierung mittels Ko-Immunpräzipitationsanalysen (Ko-IP) und konfokaler Mikroskopie bestätigte eine physische Interaktion und subzelluläre Ko-Lokalisation zwischen LASV Z und Cdc42EP1. Die weitere molekulare Charakterisierung ergab, dass die Interaktion zwischen dem Z-Protein und Cdc42EP1 von der CRIB (Cdc42 and Rag interactive binding)-Domäne von Cdc42EP1 abhängt, die normalerweise die Bindung an Cdc42 vermittelt. Interessanterweise reguliert die rekombinante Expression von Cdc42EP1 durch die Modulation von Septinfilamenten die Freisetzung von Z-induzierten Virus-ähnlichen Partikeln (virus-like particles, VLPs). Infektionsstudien zeigten ferner, dass LASV eine Umlagerung des zellulären Septinzytoskeletts induziert. Die pharmakologische Hemmung der Septinpolymerisation mit dem Wirkstoff Forchlorfenuron führte zu einem gestörten Plasmamembrantransport des Z-Proteins sowie einer reduzierten Freisetzung von VLPs und authentischem LASV. Dies unterstreicht die Bedeutung eines dynamischen Septinnetzwerks während einer LASV-Infektion. Septine regulieren das Mikrotubuli- als auch das Aktinzytoskelett, die ebenfalls eine wichtige Rolle im LASV-Replikationszyklus spielen. Wohingegen das Mikrotubulinetzwerk beim Plasmamembrantransport des Z-Proteins beteiligt ist, scheint ein dynamisches Aktinzytoskelett bei dem Viruseintritt und der Virusfreisetzung an der Plasmamembran notwendig zu sein. Insbesondere die Virusausbreitung von Zelle-zu-Zelle über Aktin-reiche Filopodien konnte in dieser Arbeit als weiterer Freisetzungsmechanismus von LASV aufgezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Cdc42EP1 als ein wichtiger Wirtsfaktor identifiziert werden konnte, der die Freisetzung von Z-induzierten VLPs und infektiösen LASV-Partikeln reguliert. 
Der zelluläre mTOR-Signalweg war einer der am stärksten angereicherten Signalwege im LASV Z-Interaktom. So wurde beispielsweise die Ragulatoruntereinheit LAMTOR1 als möglicher Interaktionspartner des Z-Proteins in den Interaktomanalysen identifiziert. Die wichtigste Funktion des Ragulatorkomplexes ist die lysosomale Gerüstfunktion für die Aminosäure-abhängige mTORC1-Rekrutierung und Aktivierung. Mittels Ko-IP-Analysen und Ko-Lokalisationsstudien konnte der Ragulatorkomplex als physischer Interaktionspartner des Z-Proteins bestätigt werden. Funktionelle Validierungen wiesen LAMTOR1 als antiviralen Faktor bei der Z-vermittelten VLP-Freisetzung aus. Der mögliche Mechanismus deutet auf die Rolle von LAMTOR1 bei der intrazellulären Positionierung von späten Endosomen und Lysosomen hin. Seine Funktion bei der mTORC1-Aktivierung scheint hingegen keine Rolle zu spielen. Das lassavirale Oberflächenglykoprotein GP, das Matrixprotein Z sowie das Nukleoprotein NP als Marker für Ribonukleoproteinkomplexe ko-lokalisierten mit späten Endosomen an der Plasmamembran in infizierten Zellen. Die Bedeutung der späten Endosomen und der Exosomenbiogenese für die Freisetzung von LASV konnte zusätzlich durch die elektronenmikroskopische Charakterisierung von LASV Z-positiven extrazellulären Vesikeln und LASV-infizierten Zellen bestätigt werden. Zusammenfassend konnten in diesem Promotionsprojekt bislang unbekannte Freisetzungsmechanismen des LASV aufgezeigt werden. Eine umfassendere Kenntnis der Virus-Wirt-Interaktionen könnte neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten gegen das hochpathogene LASV erschließen.