Untersuchungen zur Intein-vermittelten Semisynthese modifizierter Proteine
Creators: name: Pöhlmann, Angela
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2006
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 547.2
subject: 572.6

description: Bis heute ist trotz einer Vielzahl beschriebener Methoden zur Synthese modifizierter Proteine keine universell anwendbar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, eine neue Strategie unter dem Einsatz manipulierter Proteasen in Kombination mit dem Substratmimetika-Konzept zu entwickeln. Schwerpunkt der Dissertationsschrift war die hierfür notwendige Darstellung N-terminaler Fragmente in Form von Substratmimetika bzw. Substratmimetika-Vorläufermolekülen mittels Intein-Strategie. Im Mittelpunkt der Untersuchungen zur synthetischen Relevanz langkettiger rekombinanter Substratmimetika in Peptidligase-katalysierten Reaktionen stand die Synthese der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase Parvulin 10 (Par10) aus E. coli. Im speziellen galt es, einen Fluoreszenzmarker im chemisch zu synthetisierenden Cterminalen Fragment einzuführen, was generell Untersuchungen zur Bindung von Par10 an dessen Substrate ermöglichen könnte. Durch Spaltung der Intein-Fusionsproteine mit unterschiedlichen Thiolen wurden Substratmimetika sowie deren Vorläufer für die Peptidligasen Trypsin D189K/K60E und V8-Protease direkt hergestellt. Ebenso gelang die indirekte Synthese der Substratmimetika durch Umesterung der Ausgangsester. Durchgeführte Ligationsreaktionen mit V8-Protease führten zu dem Ergebnis, daß der Biokatalysator proteolytische Fremdaktivität aufweist. Die mit dem N-terminalen Fragment durchgeführte Modellreaktion unter Katalyse von Trypsin D189K/K60E ergab eine marginale Produktausbeute, da der Thioester spontanen Kondensationsreaktionen unterlag. Kinetische Stabilitätsuntersuchungen legten eine initiale Beteiligung von Cys40 an den Kondensationsreaktionen der Thioester nahe. Diese Vermutung konnte durch die temporäre Blockierung des Restes mit 2-Nitro-5-thiobenzoesäure bestätigt werden. Die Synthese von fluoreszenzmarkiertem Par10 unter Katalyse von Trypsin D189K/K60E erfolgte aufgrund der beobachteten Kondensationsreaktionen des Thioesters mittels zweier Strategien: (i) unter kinetischer Kontrolle der Kondensationsreaktionen und (ii) unter temporärem Schutz der Cystein-Thiol-Funktion. Trotz einer vorgenommenen kinetisch kontrollierten Reaktionsführung wurde das Syntheseprodukt nur in einer synthetisch nicht relevanten Ausbeute erhalten. Durch Anwendung der entwickelten Schutzgruppen-Strategie konnte die Ausbeute an fluoreszenzmarkiertem Parvulin 10 signifikant gesteigert werden.
description: Despite a great number of established methods for the synthesis of modified proteins there is so far no universal applicable. Thus, the aim of this work was to develop a new strategy that combines manipulated proteases with the substrate mimetic concept. The main focus of the thesis was the intein-mediated synthesis of Nterminal fragments as substrate mimetics and substrate mimetics precursors, respectively. The synthetic relevance of long-chain recombinant substrate mimetics in peptide ligase catalyzed reactions was investigated by the synthesis of the peptidyl-prolyl-cis/trans-isomerase parvulin 10 (Par10) from E. coli. In addition, a fluorescence label was introduced into the C-terminal synthetic fragment to enable substrate binding investigations. The cleavage of intein fusion proteins by different thiols yielded in the direct synthesis of substrate mimetics and their precursors for peptide ligases trypsin D189K/K60E and V8-protease. Similarly, substrate mimetics were synthesized indirectly via transthioesterification of universal precursors. Ligation reactions with V8-protease showed that this biocatalyst exhibits extrinsic proteolytic activity. The trypsin D189K/K60E-cataylzed model reaction with the N-terminal fragment resulted in a marginal product yield because of spontaneous condensation reactions of the thioester. From kinetic stability investigations it was concluded that Cys40 initiates condensation reactions. This assumption was confirmed by temporary protecting the Cys40 side chain with 2-nitro-5-thiobencoic acid. Due to the observed condensation reactions of the thioesters fluorescence labelled Par10 was synthesized via two strategies: (i) under kinetic control of the condensation reactions and (ii) under temporary protection of the cysteine thiol function. Despite applying kinetic optimized conditions it could only obtained a low product yield. Contrary, using the new described protecting group strategy the yield of fluorescence tagged parvulin 10 could be significantly increased.