title: Strukturelle und funktionelle Analyse von SynCph2(1-2), einem nicht-kanonischen Phytochrom aus Synechocystis sp. PCC 6803
title: Structural and functional analysis of SynCph2(1-2), a non-canonical phytochrome from Synechocystis sp. PCC 6803
Creators: name: Anders, Katrin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Chemie
Phytochrom
Synechocystis
Cph2
Photorezeptor
photoreceptor
phytochrome

description: Phytochromes are photoreceptors
      that incorporate a bilin chromophore and undergo a
      photoconversion between a red light (Pr) and a far red light
      (Pfr) absorbing state. SynCph2 from Synechocystis sp. PCC
      6803 comprises the domain architecture
      GAF1-GAF2-GGDEF1*-EAL-GAF3-GGDEF2, which indicates that it is
      a hybrid of a GAF-GAF bidomain phytochrome and a
      cyanobacteriochrome, represented by the GAF3 domain. This
      work provides a detailed analysis of the N-terminal GAF1-GAF2
      module. SynCph2(1-2) retains the red/far red photochemistry
      of canonical phytochromes, therefore, the GAF2 domain is able
      to substitute for the PHY domain in the latter. The PCB
      chromophore is covalently attached to Cys-129 in the GAF1
      domain. In cooperation with the group of P. Hildebrandt we
      showed that all four pyrrole nitrogens are protonated in both
      Pr and Pfr states that comprise a ZZZssa and ZZEssa
      conformation, respectively. Far UV CD data reveal an increase
      of the α-helical content of at least 3% in the Pr → Pfr
      transition which goes along with an increased hydrodynamic
      diameter of Pfr. We solved the crystal structure of
      SynCph2(1-2) in the Pr conformation at a resolution of 2.6 Å.
      The protein crystallizes as an antiparallel dimer, whereby
      the GAF1 domain connects to GAF2 via a long α-helical linker.
      The GAF2 domain mimics the overall organization of the PHY
      domain in protruding a tongue-like extension that covers the
      chromophore binding pocket of GAF1. The PCB chromophore in
      the ZZZssa conformation is non-planar and exhibits a high
      tilt between the B- and C- as well as C- and D-rings. Based
      on the structural data we performed a mutagenesis study
      involving the D-ring environment, the propionate interactions
      of the chromophore and the tongue region. We showed that the
      B-ring propionate interactions differ in SynCph2(1-2)
      compared to canonical phytochromes and seem to vary depending
      on the type of effector domain. Based on the data for the
      amino acids in the conserved tongue motifs, we suggested a
      model for the structural changes during photoconversion.
      Here, a conformational switching of the tongue region is
      supposed via swap of the tryptophans from the W(G/A)G and WxE
      motifs that act as anchors in the Pfr structure. Upon
      photoconversion the Asp-Arg salt bridge between GAF1 and the
      tongue is broken, the PRxSF motif is reoriented and maybe
      structurally reorganized to an α-helical structure
      establishing a new Asp-Ser interaction. We analyzed the
      photocycle of SynCph2(1-2) that comprises four and three
      intermediates in the Pr → Pfr and Pfr → Pr photoconversion,
      respectively. Ser-385 of the PRxSF and Trp-389 of the WxE
      motif in the tongue region are ~13 Å and ~15 Å distant from
      the chromophore’s D-ring, respectively, but they affect the
      formation of the Pfr state as S385A and W389A variants
      comprise an altered spectrum after red light illumination.
      The S385A mutation affects the last intermediate of the Pr →
      Pfr photoconversion and the first of the back reaction. The
      W389A mutation already affects the third intermediate that
      directly decays to a degenerated red light adapted state. The
      three intermediates of the back reaction to Pr all differ
      from SynCph2(1-2). In contrast, a phenylalanine substitution
      of Trp-389 results in wild type behavior. Based on these
      results we concluded that during the Pr → Pfr photoconversion
      only the chromophore and its nearest surroundings are altered
      in the first two intermediates. During formation of
      intermediate R2 conformational changes occur in the tongue
      region, involving the tryptophan-switch. Formation of the
      last intermediate triggers the movement of Ser-385 and the
      formation of the hydrogen bond network involving the
      aspartate of GAF1 and Ser-385. In a work performed with P.
      Savakis, S. De Causmaecker and V. Angerer and in cooperation
      with the group of A. Wilde we illuminated the role of the
      C-terminal GAF3-GGDEF2 module. SynCph2(5-6) comprises a
      photoconversion between a blue (Pb) and green light absorbing
      (Pg) state. It covalently attaches PCB to Cys-1022 and to
      Cys-994 and is able to isomerize the chromophore to PVB. The
      module can produce c-di-GMP in the GGDEF2 domain in a light
      dependent manner with Pg as the signaling state. In vivo
      studies in Synechocystis sp. confirmed these observations.
      Under blue light conditions the c-di-GMP production of
      SynCph2(5-6) leads to an inhibition of phototaxis.
      Nevertheless, only a coproduction of SynCph2(5-6) with
      SynCph2(1-4) can restore the wild type phenotype under white
      light thus proving the enzymatic activity of SynCph2(1-4)
      that is mediated by the EAL domain in degrading c-di-GMP.
      Overall, the here presented studies on SynCph2 show the
      interplay between the photochemical and structural properties
      in the Pr / Pfr and Pb / Pg interconverting modules as well
      as their implications in vivo. Future studies will benefit
      from the enhanced knowledge about intramolecular signaling in
      phytochromes including the tryptophan switch
      hypothesis.
description: Phytochrome sind Bilin-bindende
      Photorezeptoren, die zwischen einer Rotlicht- (Pr) und einer
      Dunkelrotlicht-absorbierenden Form (Pfr) photokonvertieren
      können. SynCph2 aus Synechocystis sp. PCC 6803 weist einen
      GAF1-GAF2-GGDEF1*-EAL-GAF3-GGDEF2 Domänenaufbau auf, was
      darauf hindeutet, dass es sich um ein Hybrid aus einem
      GAF-GAF-Bidomänen-Phytochrom und einem Cyanobakteriochrom
      (GAF3) handelt. Diese Arbeit enthält eine detaillierte
      Analyse des N-terminalen GAF1-GAF2 Moduls. SynCph2(1-2) weist
      eine rot/dunkelrote Photochemie auf; somit ist die GAF2
      Domäne in der Lage, die kanonische PHY Domäne zu ersetzen.
      Der Chromophor PCB ist kovalent an Cys-129 in der GAF1 Domäne
      gebunden. In Kooperation mit der Gruppe von P. Hildebrandt
      konnten wir zeigen, dass alle vier Pyrrolstickstoffe sowohl
      in Pr (ZZZssa) als auch in Pfr (ZZEssa) protoniert sind. In
      der Fern-UV CD Spektroskopie konnte ein 3%iger Anstieg des
      α-Helix Gehaltes in der Pr → Pfr Phototransformation
      festgestellt werden. Desweiteren erhöht sich in Pfr der
      hydrodynamische Durchmesser von SynCph2(1-2). Die
      Kristallstruktur von SynCph2(1-2) in der Pr Konformation
      konnte bei einer Auflösung von 2,6 Å gelöst werden. Das
      Protein kristallisiert als antiparalleles Dimer, wobei die
      GAF1 und GAF2 Domänen durch einen α-helikalen Linker
      verbunden sind. Die GAF2 Domäne ahmt den strukturellen Aufbau
      der kanonischen PHY Domäne nach, indem sie mit einem
      Zungen-ähnlichen Vorsprung die Chromophorbindungstasche in
      GAF2 abdeckt. Der Chromophor PCB in seiner ZZZssa
      Konformation ist nicht planar, sondern zeigt eine Verkippung
      der B-/C- sowie der C-/D-Ringe gegeneinander. Basierend auf
      der Kristallstruktur führten wir eine Mutagenesestudie durch,
      die die D-Ringumgebung und Propionatinteraktionen des
      Chromophors sowie die Zungenregion umfasste. Dabei
      unterscheiden sich die B-Ringpropionatinteraktionen von
      kanonischen Phytochromen und scheinen vom Typ der
      Effektordomäne abzuhängen. Die Analyse konservierter Motive
      in der Zungenregion führte zu einem Modell, das die
      strukturellen Änderungen während der Photokonversion
      beschreibt. Dabei wird die Zungenregion durch einen
      Trp-Positionstausch in den W(G/A)G und WxE Motiven verdreht,
      die als Anker die Pfr Struktur stabilisieren. Desweiteren
      bricht die Asp-Arg Salzbrücke, das PRxSF Motiv wird
      reorientiert und wahrscheinlich α-helikal, wodurch sich die
      neue Asp-Ser Interaktion ausbilden kann. Eine nähere
      Untersuchung des Photozyklus’ von SynCph2(1-2) ergab vier
      Intermediate in der Pr → Pfr und drei in der Pfr → Pr
      Photokonversion. Trotz ihrer Distanz von ~13 Å und ~15 Å zum
      D-Ring des Chromophors, beeinflussen Ser-385 aus dem PRxSF
      und Trp-389 aus dem WxE Motiv die Bildung des Pfr Zustandes.
      Die S385A Mutation wirkt sich auf das letzte Intermediat der
      Pr → Pfr Photokonversion und das erste der Rückreaktion aus.
      Die W389A Mutation beeinflusst schon das dritte Intermediat,
      das direkt in einen degenerierten Rotlicht-adaptierten
      Zustand zerfällt. Die drei PDeg → Pr Intermediate
      unterscheiden sich alle von SynCph2(1-2). Ein Austausch von
      Trp-389 mit Phenylalanin stellt das Wildtyp-ähnliche
      Verhalten wieder her. Wir schlussfolgern, dass in den ersten
      zwei Intermediaten nur der Chromophor und seine nächste
      Umgebung von Veränderungen betroffen sind. Während der
      Bildung von Intermediat R2 treten die strukturellen
      Änderungen in der Zungenregion auf, die den oben postulierten
      Tryptophanwechsel beinhalten. Die Bildung des letzten
      Intermediates leitet die Reorientierung von Ser-385 und die
      Ausbildung des Wasserstoffbrückennetzwerkes ein, das das
      Aspartat der GAF1 Domäne sowie Ser-385 einschließt. Im Rahmen
      einer Arbeit, die mit P. Savakis, S. De Causmaecker und V.
      Angerer in Kooperation mit der Gruppe von A. Wilde ausgeführt
      wurde, konnten wir die Rolle des C-terminalen GAF3-GGDEF2
      Moduls beleuchten. SynCph2(5-6) photokonvertiert zwischen
      einer Blau- (Pb) und Grünlicht-absorbierenden (Pg) Form. PCB
      ist kovalent an Cys-1022 und Cys-994 gebunden und wird zu PVB
      autoisomerisiert. Das Modul ist in der Lage, lichtabhängig
      c-di-GMP in der GGDEF2 Domäne herzustellen, wobei der
      Signalzustand Pg auch in in vivo Studien in Synechocystis sp.
      bestätigt wurde. Unter Blaulichtbedingungen führt die
      c-di-GMP Herstellung von SynCph2(5-6) zu einer Inhibierung
      der Phototaxis. Durch Koproduktion von SynCph2(5-6) und
      SynCph2(1-4) konnte der Wildtypphenotyp unter Weisslicht
      wiederhergestellt werden, was zeigt, dass SynCph2(1-4) eine
      enzymatische Aktivität aufweist, die durch die
      c-di-GMP-abbauende EAL Domäne verursacht wird. Die hier
      dargelegten Studien von SynCph2 zeigen das Zusammenspiel von
      photochemischen und strukturellen Eigenschaften in den Pr /
      Pfr und Pb / Pg interkonvertierenden Modulen sowie ihre
      Bedeutung in vivo. Zukünftige Studien profitieren von den
      Einblicken in die Signaltransduktion in Phytochromen und
      insbesondere von der Trp-Schalterhypothese.