Διερεύνηση της πεπτικότητας διαλυμάτων πρωτεϊνών ορού γάλακτος με in vitro τεχνικές
Creators: name: Τεντζίδου Κωνσταντίνα Εμμανουήλ
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: πρωτεΐνες ορού
πεπτικότητα
in vitro τεχνικές
whey proteins
digestibility
in vitro techniques

description: Οι πρωτεΐνες ορού γάλακτος (Whey Proteins, WP), αν και παρουσιάζουν ιδιαίτερα διατροφικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, επιδεικνύουν σημαντική αντοχή στα φαινόμενα υδρόλυσης λόγω της σφαιρικής δομής τους. Μελέτες έχουν δείξει ότι, σε σύγκριση με την παραδοσιακή θερμική επεξεργασία, η αιθανόλη μπορεί μη αναστρέψιμα και πιο αποτελεσματικά να μετουσιώσει τις πρωτεΐνες και να αλλάξει τη δευτεροταγή δομή τους. Ωστόσο, μέχρι στιγμής, τα δεδομένα σχετικά με την επίδραση της αιθανόλης στην πεπτικότητα των WP είναι περιορισμένα. Στο πλαίσιο αυτό, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση της δυνητικής επίδρασης διαφόρων μετουσιωτικών παραγόντων (αιθανόλη και θέρμανση) στην πεπτικότητα των πρωτεϊνών ορού γάλακτος, κάτω από in vitro συνθήκες. Για την προσομοίωση της φυσιολογικής διαδικασίας πέψης [στοματική (OP: Oral phase), γαστρική (GP: Gastric phase) και εντερική φάση (IP: Intestine phase)], σε όλα τα υποστρώματα εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο στατικής in vitro πέψης INFOGEST. Για την, όσο το δυνατόν, αρτιότερη και πληρέστερη κατανόηση του φαινομένου της υδρόλυσης των πρωτεϊνών ορού εφαρμόστηκαν τόσο ηλεκτροφορητικές τεχνικές όσο και χημικές μέθοδοι. Συγκεκριμένα, όσον αφορά τις ηλεκτροφορητικές τεχνικές, εφαρμόστηκε η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE), όπως περιγράφεται από τον Andrews (1983), ενώ παράλληλα πραγματοποιήθηκε και ανάλυση των δειγμάτων με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλο θειικού νατρίου (Sodium Dodecyl Sulphate, SDS-PAGE) τόσο σύμφωνα με το πρωτόκολλο του Laemmli (1970) με ορισμένες τροποποιήσεις όσο και με εκείνο που προτάθηκε από τους Fling &amp; Gregerson (1986). Αντιστοίχως, ως προς τις χημικές μεθόδους εφαρμόστηκε η μέθοδος καδμίου-νινυδρίνης (Cd-ninhydrin, Cd-NIN) σύμφωνα με τους Folkertsma &amp; Fox (1992), καθώς και Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Αντίστροφης Φάσης (Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) κατά Krause et al., (1995) για τον προσδιορισμό των αμινοξέων στην IP. Κατά την οπτική αξιολόγηση των ηλεκτροφορημάτων, τα οποία προέκυψαν μετά την εφαρμογή της PAGE, στα δείγματα OP που αντιστοιχούσαν και στα 4 υποστρώματα, καταγράφηκαν ζώνες με παρόμοια ηλεκτροφορητική κινητικότητα (EM: Electrophoretic mobility) με τις ζώνες που αντιστοιχούν σε α-λακταλβουμίνη (α-la) και β-λακτογλοβουλίνη (β-lg). Στο τέλος της GP, η ζώνη με ΕΜ παρόμοια με την α-la δεν ήταν ορατή σε κανένα από τα 4 υποστρώματα, υποδεικνύοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη ήταν αρκετά ευαίσθητη σε πρωτεόλυση από την πεψίνη. Ωστόσο, σαφείς διαφορές μεταξύ των 4 υποστρωμάτων παρατηρήθηκαν ως προς την πρωτεόλυση της ζώνης με ΕΜ παρόμοια με τη β-lg. Συγκεκριμένα, η ένταση της πρωτεϊνικής ζώνης αυτής δεν μεταβλήθηκε στο N-WPI, δεδομένο το οποίο αναδεικνύει την αυξημένη ανθεκτικότητα της μη μετουσιωμένης β-lg στην πεψίνη, σε σύγκριση με τα E-10 WPI, E-50 WPI και H-WPI. Τα δεδομένα που συγκεντρώθηκαν, τόσο από την οπτική παρατήρηση των ηλεκτροφορημάτων, και τη σάρωση αυτών με τη χρήση κατάλληλου προγράμματος, όσο και την εφαρμογή των χημικών μεθόδων ανέδειξαν ότι η προκατεργασία με αιθανόλη (10% και 50%) βελτιώνει το βαθμό πεπτικότητας της β-lg στη γαστρική φάση. Ωστόσο, η επιλογή χαμηλών συγκεντρώσεων αιθανόλης, στην εντερική φάση διαφοροποιεί το προφίλ της υδρόλυσης, το οποίο χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός μεγάλου εύρους πεπτιδίων και την περιορισμένη απελευθέρωση αμινοξέων. Στο πλαίσιο αυτό, κρίνεται σκόπιμη η πραγματοποίηση περαιτέρω μελετών με στόχο την επιβεβαίωση των ευρημάτων αυτών και την ολιστικότερη μελέτη του όλου φαινομένου
description: Whey proteins (WP), although exhibiting high nutritional and functional characteristics, demonstrate significant resistance to hydrolysis phenomena due to their globular structure. Studies have indicated that, in comparison with the traditional heat treatment, ethanol can irreversibly and more effectively denature proteins and change their secondary structures. However, to the best of our knowledge, data regarding the effect of ethanol on WP digestibility is scarce. In this context, the aim of this thesis was to evaluate the potential effect of various denaturing factors (ethanol and heating) on the digestibility of whey proteins, under in vitro conditions. To simulate the physiological digestion process [oral (OP), gastric (GP), and intestinal phases (IP)], all substrates were subjected to the INFOGEST static in vitro digestion protocol. In an effort to provide a more holistic appraisal of the WP degradation, both electrophoretic and chemical methods were applied. Specifically, as far as the electrophoretic techniques are concerned, a polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was initially used on the samples obtained from the in vitro digestion (Andrews et al.,1983). Furthermore, a Sodium Dodecyl Sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) was carried out according to the protocol of Laemmli (1970) with some modifications and the protocol of Fling &amp; Gregerson (1986). During the application of the disc-PAGE, the OP samples gave, in all 4 substrates, bands with the same electrophoretic mobility (EM) as the bands corresponding to α-lactalbumin (α-la) and β-lactoglobulin (β-lg), ran on the same gel. At the end of the GP, the band with EM similar to α-la was not visible indicating that this band was quite susceptible to proteolysis by pepsin in all four matrices. However, clear differences in the gastric proteolysis of the band with EM similar to β-lg were observed among the four treatments. Namely, this protein band remained pronounced, i.e., more pepsin resistant throughout the whole gastric phase, in N-WPI compared to E-10 WPI, E-50 WPI, and H-WPI. The data collected, from both electrophoretic and chemical methods, showed that pretreatment with ethanol (10% and 50%) improves the degree of digestibility of β- lg in the gastric phase. However, the lower ethanol concentration differentiates the hydrolysis profile, which is characterized by the presence of a wide range of peptides and the rather limited release of amino acids. In this context, further investigations are required to confirm these findings and provide a more holistic appraisal of the whole phenomenon