Μεταφραστική μελέτη αναγέννησης οδοντίνης με βιομιμητικά ικριώματα χιτοζάνης-ζελατίνης-υδροξυαπατίτη και βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού: Δομική και χημική ανάλυση
Creators: name: Βαγροπούλου, Γεωργία Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Ιστοτεχνολογία
Βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού
Ικριώματα χιτοζάνης/ζελατίνης/νανουδροξυαπατίτη
Αναγέννηση οδοντίνης
Βιοεναλάτωση
Βιοεναλατωμένος ιστός
Tissue engineering
Dentin regeneration
Dental pulp stem cells
Chitosan/gelatin/nanohydroxyapatite scaffolds
Natural polymer-based scaffolds
Mineralized tissue

description: Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η διερεύνηση της δυνατότητας βλαστικών κυττάρων οδοντικού πολφού (DPSCs), τοποθετημένων σε βιομιμητικά ικριώματα χιτοζάνης/ζελατίνης/νανο-υδροξυαπατίτη (CS/Gel/nHA) να αναγεννήσουν in vitro ενασβεστιωμένο ιστό που να που να φέρει τα δομικά και χημικά χαρακτηριστικά της επανορθωτικής οδοντίνης. Αρχικά πραγματοποιήθηκε απομόνωση βλαστικών κυττάρων από τους πολφούς τρίτων γομφίων και χαρακτηρισμός τους για δείκτες βλαστικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Βιομιμητικά ικριώματα χιτοζάνης/ζελατίνης/νανο-υδροξυαπατίτη κατασκευάστηκαν με την τεχνική της λυοφιλοποίησης με αναλογία 40%:60% CS/Gel διασταυρούμενα με 0,1% γλουταραλδεύδη (GTA). Στη συνέχεια έγινε ανάμειξη με διάλυμα νανοϋδροξυαπατίτη σε αναλογία 55% ως προς το αρχικό μίγμα CS/Gel. Στα ικριώματα τοποθετήθηκαν 2x106 DPSCs και καλλιεργήθηκαν σε μέσο καλλιεργειών με ή χωρίς προσθήκη επιπλέον εξωτερικών πηγών φωσφορικών για χρονικό διάστημα 0-48 ημερών, ανάλογα με τη μελετώμενη βιολογική διαδικασία. Στη συνέχεια, ακολούθησαν οι δοκιμασίες ελέγχου βιοσυμβατότητας: η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) και η σήμανση ζωντανών/ νεκρών κυττάρων με τις φθορίζουσες χρωστικές καλσεΐνη ΑΜ (calcein AM) και αιθιδίο ομοδιμερές (ethidium homodimer (EthD-1)) και ποσοτική ανάλυση με συνεστιακή μικροσκοπία (confocal microscopy). Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμασίες μελέτης της βιοεναλάτωσης των ικριωμάτων: η ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης - στοιχειομετρική ανάλυση ενεργειακής διασποράς (Scanning Electron Microscopy- Energy Dispersive Analysis, SEM-EDS) και η περιθλασιμετρία Ακτίνων -Χ (X-Ray Diffraction analysis- XRD). Τα ικριώματα CS/Gel/nHA υποστήριξαν την πρόσφυση, τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των DPSCs ως και τη δέκατη τέταρτη ημέρα καλλιέργειας, όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του SEM, τα οποία επιβεβαιώνονται και με τη σήμανση ζωντανών/ νεκρών κυττάρων όπου διατηρείται υψηλό επίπεδο βιωσιμότητας &gt;95% καθόλη την περίοδο παρατήρησης. Το SEM-EDX έδειξε την παραγωγή νανοκρυσταλλικής ασβεστοφωσφορικής (CaP) μήτρας πλούσιας σε υδροξυαπατίτη με νανοκρυστάλλους περίπου 15 nm σε διάμετρο, και λόγο Ca:P = 1,75, ο οποίος είναι κοντά στον βιολογικό απατίτη. Η ανάλυση XRD επιβεβαίωσε αφενός την επιτυχή ενσωμάτωση του nΗΑ στα ικριώματα, από την ύπαρξη της χαρακτηριστικής κορυφής 32° (2θ), και τη νανοκρυσταλλική φύση του παραγόμενου βιολογικού απατίτη, με καθορισμένου μεγέθους κρυσταλλίτες (D = 50 nm). Τα ικριώματα CS/Gel/nHA αποτέλεσαν ένα ευνοϊκό περιβάλλον για την πρόσφυση και τον πολλαπλασιασμό των DPSCs. Ο ιστός που προέκυψε μετά από επώαση των DPSCs εντός των ικριωμάτων ήταν ένας πλούσιος σε CaP νανοκρυσταλλικός ιστός που εμφάνισε μορφολογικά και χημικά χαρακτηριστικά που προσομοιάζουν με τη φυσική επανορθωτική οδοντίνη. Τα αποτελέσματα είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά σε ότι αφορά τη χρήση των συμπλεγμάτων ικριωμάτων/DPSCs στην ιστοτεχνολογική αναγέννηση ενασβεστιωμένων οδοντικών ιστών, γεγονός που χρήζει περαιτέρω μελέτης σε in vivo βιολογικά συστήματα.
description: Hybrid chitosan/gelatin (CS/Gel) scaffolds, combined with nanohydroxyapatite (nHA), have attracted considerable interest in tissue engineering (TE) of mineralized tissues. The present study aimed to investigate the potential of CS/Gel/nHA scaffolds loaded with dental pulp stem cells (DPSCs) to support their attachment and viability and nanocrystalline biological apatite-like tissue formation. CS/Gel/nHA scaffolds synthesized by freeze-drying were seeded with DPSCs, characterized with flow cytometry. Scanning Electron Microscopy (SEM), live/dead fluorescence staining, were used to evaluate cell morphology and viability; SEM coupled with Energy Dispersive Analysis (SEM-EDS), and X-ray Diffraction analysis (XRD) were used for structural and chemical characterization of the regenerated tissues, respectively. CS/Gel/nHA scaffolds supported viability and proliferation of DPSCs over 14 days in culture. SEM-EDX showed the production of abundant nanocrystalline, hydroxyapatite-rich mineralized matrix inside the constructs, with net-like nanocrystals (appr. 15 nm in diameter), and a Ca:P ratio of 1.75, which is close to that of biological apatite. XRD analysis of the determined crystallite size (D=50 nm) confirmed the nanocrystalline nature of HA. This is the first study validating the potential of CS/Gel/nHA scaffolds seeded with DPSCs to favor formation of abundant nanocrystalline biological apatite-rich mineralized tissue. These results reveal a promising strategy for employment in TE of mineralized dental tissues.