title: Interaction dynamics between heterotrimeric G-proteins and type V adenylyl cyclase determine sensitivity of effector regulation
title: Die Dynamik der Interaktion heterotrimerer G-Proteine mit der Typ V Adenylylzyklase bestimmt die Sensitivität der Effektorregulation
Creators: name: Milde, Markus
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
interaction
Dynamik
Medizin, Gesundheit
G-Protein , Adenylylzyklase
cAMP
Interaktion
G-protein , adenylyl cyclase
FRET

description: The signalling pathway from
      G-protein-coupled receptors to the second messenger cAMP is
      present in virtually all cells and of major physiological and
      pathophysiological importance. The membrane-spanning
      receptors can easily be targeted by pharmaceutical compounds
      and therapies to treat diseases like hypertension, asthma or
      pain affect cellular cAMP-levels. Biochemical studies have
      revealed a lot of important information about the interaction
      of the proteins participating in this signalling cascade,
      namely the receptors, the G-proteins and adenylyl cyclases.
      The development of new microscopic methods allowed to
      dynamically investigate protein/protein-interactions. While
      these techniques have already been widely used to investigate
      in vivo signalling dynamics of the receptors, G-proteins and
      second messengers, research on adenylyl cyclases (ACs) mainly
      relied on in vitro methods or steady-state interaction
      studies. An assay, based on Förster Resonance Energy Transfer
      (FRET), was developed within this study, to investigate the
      dynamic interaction between G-proteins and ACs in living
      cells, thereby providing a platform for biochemical analysis
      in vivo. Furthermore, a protocol was established to resolve
      Gi protein-mediated regulation of cAMP in single living cells
      by means of FRET. For the assays, a fluorescently labelled
      AC5 was cloned. Bioluminescence-based cAMP measurements
      proved the constructs wild-type-like functionality with
      respect to stimulation through forskolin and Gs-proteins. The
      new protocol for FRET-based cAMP measurements verified Gs-
      and Gi-protein signalling competence of the labelled AC5. The
      new assay was used to analyse agonist-dependent interaction
      between AC5 and Gαs-, Gαi1- and Gβ1γ2-subunits, respectively.
      Although no basal interaction between the G-protein subunits
      and AC5 was observed, all subunits showed an increase in FRET
      upon agonist-stimulation of the according receptors.
      Interestingly, the different combinations of AC5 and
      G-protein subunits showed distinct FRET-signals. The
      agonist-dependent Gβ1γ2/AC5-FRET increase and decrease
      followed an exponential course, closely resembling other
      FRET-signals observed for G-proteins. FRET between Gαs and
      AC5 was characterised by a transient peak in the onset of the
      signal. Contrastingly, Gαi1 and AC5 showed an additional
      transient increase in their FRET-signal upon agonist
      withdrawal. The signal-phenotypes observed between
      Gα-subunits and AC5 possibly indicate additional
      conformational changes within the G-protein/AC5 complex. The
      onset-kinetics of the interaction between AC5 and
      G-protein-subunits were fast and in the same range as
      previously observed G-protein activation-kinetics. The
      interaction between Gαi1 and AC5 was found to be especially
      sensitive and proved to be left-shifted in comparison to the
      activation of the Gi1-protein itself. Downstream events of
      Gi-dependent regulation of AC5 and Gi-protein activity
      further verified this difference on a functional level.
      Gi-dependent inhibition of AC5-regulated cAMP levels was
      determined with the newly established protocol for the
      FRET-based cAMP sensor Epac1-camps. In comparison to GIRK
      currents, which reflect Gi1 protein activity, the
      receptor-induced Gi-protein-mediated inhibition of stimulated
      AC5 activity was shifted by two orders of magnitude. This was
      in line with previous reports on higher sensitivity of
      cAMP-involving over Gi-protein activity-dependent pathways.
      After appropriate controls ruled out confounding mechanisms
      that could shift the apparent sensitivity of the assay, the
      interaction kinetics between AC5 and Gαi1 remained as a major
      contributing cause. Indeed the interaction of Gαi1-subunits
      with AC5 was prolonged in comparison to the deactivation of
      the Gi1-protein and could not be accelerated by RGS4. This
      indicates a slow dissociation of AC5 and Gαi1, which prevents
      the deactivation and reassembly of the Gi1 protein, thereby
      affecting the dynamics of the G-protein cycle. Presumably,
      the balance in the G protein cycle between inactive and
      active G-proteins is shifted towards a higher amount of
      AC5-bound active G-proteins, providing the putative molecular
      mechanism for the high sensitivity observed in the
      interaction studies.
description: Praktisch alle Zellen des
      menschlichen Körpers verfügen über den Signalweg vom
      G-Protein-gekoppelten Rezeptor zum sog. „second messenger“
      (zweiter Botenstoff) cAMP. Diese Signalkaskade ist von großer
      physiologischer und pathophysiologischer Bedeutung. Die in
      die Zellmembran eingelassenen Rezeptoren sind leicht
      zugänglich für pharmakologische Wirkstoffe. Daher
      beeinflussen verschiedene Krankheitstherapien, z.B. die
      Behandlungen von Bluthochdruck, Asthma und Schmerzen, direkt
      oder indirekt die zellulären cAMP-Spiegel. Biochemische
      Studien konnten bereits wichtige Informationen liefern über
      die Interaktion der an diesem Signalweg beteiligten Proteine.
      Dazu gehören die Rezeptoren selbst, die G-Proteine und die
      Adenylylzyklasen. Durch die Entwicklung neuartiger
      mikroskopischer Methoden konnten diese Interaktionen auch
      dynamisch untersucht werden. Derartige Techniken wurden
      bereits vielfach verwendet, um die Dynamik der
      Rezeptoraktivierung, des G-Proteins und des second messengers
      cAMP in vivo zu untersuchen. Die Erforschung der
      Adenylylzyklasen (AC) stützte sich bisher aber hauptsächlich
      auf in vitro Methoden oder Untersuchungen des
      Gleichgewichtszustandes der Interaktion der AC mit anderen
      Proteinen. Während dieser Arbeit wurde, basierend auf dem
      Förster Resonanzenergietransfer (FRET), eine neue
      Untersuchungsmethode entwickelt. Mit ihr ist es möglich, die
      dynamische Interaktion zwischen G-Proteinen und ACs zu
      erforschen und biochemische Studien in lebenden Zellen
      durchzuführen. Darüber hinaus wurde ein Protokoll für
      FRET-Messungen in lebenden Zellen etabliert, mit dessen Hilfe
      die Regulation von cAMP durch inhibitorische Gi-Proteine
      verfolgt werden kann. Um diese Versuche zu ermöglichen, wurde
      eine fluoreszenzmarkierte Typ V AC (AC5) kloniert. Dieses
      Konstrukt zeigte eine Wildtyp-ähnliche Funktionalität in
      Biolumineszenz-basierten cAMP-Untersuchungen, in denen
      Forskolin und stimulatorische G-Protein-Signalwege eingesetzt
      wurden. Mittels des neu entwickelten Protokolls für
      FRET-basierte cAMP-Untersuchungen konnte darüber hinaus
      nachgewiesen werden, dass die markierte AC5 auch durch
      Gi-Proteine reguliert wird. Auch hier unterschied sie sich
      nicht von unmarkierter AC5. Der neue Assay wurde verwendet,
      um die agonistabhängige Interaktion zwischen der AC5 und den
      verschiedenen G-Proteinuntereinheiten (Gαs, Gαi und Gβ1γ2) zu
      untersuchen. Nach der Stimulation zugehöriger Rezeptoren
      wurde für alle Paarungen die Entwicklung eines FRET-Signals
      beobachtet, obwohl nicht festgestellt werden konnte, dass die
      Proteine unter nicht-stimulierten Bedingungen miteinander
      interagieren. Bemerkenswerterweise waren diese Signale für
      alle Paarungen unterschiedlich ausgeprägt. Der
      agonistabhängige Anstieg im FRET zwischen
      Gβ1γ2-Untereinheiten und AC5 folgte einem monoexponentiellem
      Verlauf, ähnlich dem, der aus anderen G-Protein-Versuchen
      bekannt war. Der FRET-Anstieg zwischen der Gαs-Untereinheit
      und AC5 war durch ein Maximum vor dem Signalplateau
      charakterisiert. Im Gegensatz zu diesen Kurvenverläufen
      zeigte das FRET-Signal zwischen der Gαi1-Untereinheit und AC5
      einen zusätzlichen vorübergehenden Anstieg, sobald der
      Agonist ausgewaschen wurde. Die verschiedenen Signalformen,
      die zwischen AC5 und den Gα-Untereinheiten beobachtet wurden,
      werden vermutlich durch zusätzliche Konformationsänderungen
      im G-Protein/AC-Komplex hervorgerufen. Für alle untersuchten
      G-Protein-Untereinheiten konnte festgestellt werden, dass
      sich die FRET-Signale mit der AC5 schnell entwickelten und im
      gleichen zeitlichen Rahmen abliefen, wie die schon bekannte
      Aktivierung der G-Proteine an sich. Die Interaktion zwischen
      Gαi1-Untereinheit und AC5 stellte sich als besonders sensitiv
      heraus. Weitere Untersuchungen konnten belegen, dass die
      Empfindlichkeit dieser Wechselwirkung tatsächlich
      linksverschoben war gegenüber der Aktivierung des
      Gi1-Proteins an sich. Diese Verschiebung konnte durch die
      Untersuchung nachfolgender Signalschritte auch auf
      funktioneller Ebene bestätigt werden. Hierzu wurde die
      Gi-Protein-abhängige Inhibierung der AC5 mittels des neu
      etablierten Protokolls zur FRET-basierten cAMP-Messung durch
      den Epac1-camps-Sensor gemessen. Im Vergleich zur Aktivität
      des GIRK-Kanals, der klassischerweise zur Bestimmung der
      Aktivität des Gi-Proteins verwendet wird, zeigte sich, dass
      die Rezeptor-abhängige, Gi-Protein-vermittelte Regulation der
      AC5 um zwei Zehnerpotenzen sensitiver war. Dieses Ergebnis
      bestätigt frühere Berichte, die ebenfalls eine deutlich
      höhere Sensitivität von cAMP-Signalwegen, im Vergleich zu
      Gi-Protein-Aktivitäts-basierten Signalen, gefunden hatten.
      Durch geeignete Kontrollen konnte ausgeschlossen werden, dass
      die Verschiebung der Sensitivität durch experimentelle
      Bedingungen hervorgerufen wurde. Somit blieb die
      Interaktionskinetik als wichtiger Einfluss übrig. Tatsächlich
      wurde entdeckt, dass die Interaktion der Gαi1-Untereinheit
      und AC5 länger andauerte, als durch die Deaktivierung des
      Gi1-Proteins zu vermuten war. RGS4 konnte diese lange
      Interaktion auch nicht signifikant verkürzen. Dieses Ergebnis
      deutet auf eine langsame Dissoziation von Gαi1 und AC5 hin,
      welche die Deaktivierung des Gi1-Proteins und nachfolgend die
      Formierung der inaktiven Konformation verzögert. Dadurch wird
      die Dynamik des G-Protein-Zyklus beeinflusst und vermutlich
      das Gleichgewicht zwischen inaktiven und aktiven G-Proteinen
      derart verschoben, dass mehr aktive, AC5-gebundene G-Proteine
      vorhanden sind. Dieser molekulare Mechanismus könnte die
      mutmaßliche Erklärung für die beobachtete hohe Sensitivität
      in den Interaktionsstudien liefern.