Κλωνοποίηση και έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μέσω της PTD τεχνολογίας - έλεγχος της ενδοκυττάριας μεταγωγής τους σε κυτταροκαλλιέργειες
Creators: name: Μηλιώτου, Αντρούλα Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Πεπτίδια μεταγωγής
Κλωνοποίηση
Ανασυνδυασμένες θεραπευτικές πρωτεΐνες
Protein Transduction Domain Technology
Cloning
Recombinant therapeutic proteins

description: Η τεχνολογία μεταγωγής πρωτεϊνών μέσω των PTDs (Protein Transduction Domains) προσφέρει αρκετές δυνατότητες, για την παραγωγή νέων φαρμακολογικά δραστικών πρωτεϊνών, αποτελώντας ουσιαστικά μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση ανίατων ανθρώπινων ασθενειών. Αναφέρεται στη μεθοδολογία που χρησιμοποιεί μικρά πεπτίδια, τα οποία αποτελούνται από λιγότερα από 30 αμινοξέα και είναι ικανά να διαπεράσουν σχεδόν όλες τις βιολογικές μεμβράνες. Αυτά τα μικρά πεπτίδια αποκαλούνται PTDs ( Protein Transduction domains ) ή PTDs ( Cell Penetrating Peptides). Η α-θαλασσαιμία αποτελεί ένα κληρονομικό νόσημα και οφείλεται στη μη επαρκή ή ολική έλλειψη παραγωγής των α-αλυσίδων, με αποτέλεσμα τη μετατόπιση του ισοζυγίου σε σχέση με την παραγωγή β-αλυσίδων και στη συσσώρευσή τους. Το κλινικό φάσμα της α-θαλασσαιμίας εξαρτάται από τον αριθμό των α-γονιδίων, των οποίων έχει επηρεαστεί η λειτουργικότητα από τις διάφορες μεταλλάξεις και είναι ιδιαιτέρως ευρύ και κυμαίνεται από ασυμπτωματική έως βαρύτατη εκδοχή της νόσου, που είναι ασύμβατη με τη ζωή και προκαλεί ενδομήτριο θάνατο. Η ομάδα του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής ΑΠΘ, με τη βοήθεια της Τεχνολογίας της Πρωτεϊνικής Μεταγωγής, παρήγαγε την ανασυνδυασμένη β-σφαιρίνη, συντηγμένη με το πεπτίδιο ΤΑΤ και το επιτόπιο ΗΑ, σε βακτηριακό σύστημα έκφρασης, με σκοπό τη μελέτη της μεταγωγής της ανασυνδυασμένης αυτής πρωτεΐνης, ενδοκυττάρια σε καλλιέργειες β-θαλασσαιμικών κυττάρων. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία, βασισμένη στη μελέτη αυτή, είχε ως σκοπό την κλωνοποίηση και την έκφραση της ανασυνδυασμένης α σφαιρίνης, συντηγμένης με το πεπτίδιο ΤΑΤ και το επιτόπιο ΗΑ και της μελέτη της ενδοκυττάριας μεταγωγής της σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με απώτερο στόχο την ανάπτυξη μιας πιθανής θεραπευτικής προσέγγισης σε ασθενείς με σοβαρή α-θαλασσαιμία. Παράλληλα με την προσπάθεια ανάπτυξης θεραπευτικής προσέγγισης των θαλασσαιμικών συνδρόμων, έγινε και η προσπάθεια εφαρμογής της τεχνολογίας μεταγωγής μέσω των PTDs, για την αντιμετώπιση μιτοχονδριακών διαταραχών που σχετίζονται με μεταλλάξεις στο γονίδιο SCO2. Η ευκαρυωτική οξειδάση του κυτοχρώματος c (COX) είναι το τελικό ένζυμο της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας και σχηματίζεται από υπομονάδες που κωδικοποιούνται τόσο από το πυρηνικό όσο και από το μιτοχονδριακό DNA. Εκτός από τις δομικές υπομονάδες, απαιτούνται πολλοί βοηθητικοί παράγοντες για τη συγκρότηση του ολοενζύμου και οι μεταλλάξεις στα αντίστοιχα γονίδια, σχετίζονται άμεσα με παθολογικές καταστάσεις (Papadopoulou και συν, 1999). H ανθρώπινη Sco2 πρωτεϊνη είναι μία τέτοια πρωτεΐνη συγκρότησης, η οποία προσδένεται στη μιτοχονδριακή μεμβράνη και συμμετέχει στη μεταφορά του ιόντος χαλκού για τη συγκρότηση της COX, και η οποία πρωτεϊνη, όταν μεταλλάσσεται οδηγεί σε βρεφική θανάσιμη καρδιομυοεγκεφαλοπάθεια και μειωμένη δραστικότητα της COX (Papadopoulou και συν, 1999). Από προηγούμενες μελέτες μελών του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας, της Φαρμακευτικής του AΠΘ, αποδείχθηκε ότι η ανασυνδυασμένη L-Sco2 πλήρους μεγέθους, συντηγμένη με την νουκλεοτιδική αλληλουχία του πεπτιδίου μεταγωγής ΤΑΤ, το οποίο είναι ένα έντεκα-πεπτίδιο από την πρωτεΐνη ΤΑΤ του ιού HIV-1, και με την αλληλουχία του επιτόπιου ΗΑ, για σκοπούς ανοσοανίχνευσης, έχει την ικανότητα μεταγωγής σε ευκαρυωτικά κύτταρα και να αναστρέφει το φαινότυπο της μειωμένης δραστικότητας της COX. Ως συνέχεια της εργασίας αυτής, σκοπός και της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η κλωνοποίηση, η παραγωγή και η ενδοκυττάρια μεταγωγή της ανασυνδυασμένης ΤΑΤ-Sco2, χωρίς το επιτόπιο ΗΑ, αλλά και ο εντοπισμός της στα μιτοχόνδρια ευκαρυωτικών κυττάρων.
description: The aim of the study is the bacterial production of recombinant human fusion proteins, intended for intracellular delivery into human cells where the absence or reduce of production and expression of the specific protein, results in pathological situations. Macromolecules such as peptides, catalytic protein domains, complete proteins, and oligonucleotide offer great potential as therapeutic molecules, but they have poor penetration in tissues and inability to cross the cellular membrane. Protein transduction technology uses small peptides, called PTDs (Protein transduction Domains) or CPPs (Cell Penetrating Peptides), to penetrate almost all biological membranes, delivering also the therapeutic cargos, attached to them, intracellularly. TAT, the most common among these peptides, derived from the HIV-1 transactivator TAT protein, facilitates the intracellular delivery of therapeutic cargos possibly due to the mechanism of macropinocytosis. An emerging and highly promising therapeutic strategy against α-thalassemia is the protein therapy, which is based on the use of protein transduction technologies to directly deliver healing levels of wild-type α-globin fused to PTDs into the red blood cells of patients. The research aims to evaluate the efficiency at which α-globin chains fused to Tat peptide, enter K562 cells. The recombinant human fusion proteins TAT-a globin-HA and a globin-HA (as control) have been produced and tried to be transduced intracellularly into human K562 cells. In parallel to this work, there was the project to apply the Protein Transduction Domain Technology (PTD) to mitochondrial disorders. Defects of the OXPHOS system result in failure of energy metabolism and increased free radical mediated damage. Furthermore, one of the most frequent cause of mitochondrial disorders is Cytochrome c Oxidase (COX) deficiency. COX is the IV complex in mitochondrial electron chain reaction, embedded in the inner mitochondrial membrane and the holoenzyme consists of 13 subunits, being encoded by mtDNA. Primary mitochondrial disorders consist an heterogeneous group of rare genetic diseases (~1/5000), affecting mainly organs with high energy (ATP) demands, like brain, heart and muscles. One of the proteins involved in COX assembly is Sco2, encoded by the nuclear gene SCO2 and is involved in mitochondrial copper transfer, redox signaling and p53 regulatory pathway. Mutations in this gene lead to promoting or disturbing the copper binding capacity and result in impaired COX assembly, which leads to COX deficiency, lack of cell respiration and cell death. In 1999, Papadopoulou et al., identified mutations in the human SCO2 gene, in three unrelated infants with a newly recognized fatal cardioencephalomyopathy and COX deficiency. Considering the successful transduction of TAT-Sco2-HA (Foltopoulou et al., 2010) into eukaryotic cells, we produced the same recombinant protein without –HA (hemagglutinin), the present work was designed to apply the Protein Transduction Domain Technology (PTD) to produce the wild type Sco2 fused to TAT in genetically modified E.coli cells, resolved and refolded, and there was a try to transduce the TAT-Sco2 recombinant protein in eukaryotic cells, in an approach to counteract mitochondrial disorders due to pathogenic mutations detected in Sco2 gene.