title: Charakterisierung der Hypoxie-induzierten Transkriptionsfaktoren AtLBD41 und AtERF#111/ABR1 aus Arabidopsis thaliana
Creators: name: Bäumler, Judith
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2020
Subjects: subject: Hypoxie
subject: Überflutung
subject: Verwundung
subject: Arabidopsis thaliana
subject: Arg/N-degron pathway
subject: Transkriptionsfaktoren
subject: Mikroarray
subject: ERF#111/ABR1
subject: LBD41
subject: 500
subject: 570
subject: 580

description: Wie alle aerobe Organismen sind auch Pflanzen auf die Verfügbarkeit von Sauerstoff angewiesen, um mittels oxidativer Phosphorylierung Energie zu generieren. Überflutung ist eine häufige Ursache von Sauerstoffmangel, da Sauerstoff in Wasser im Vergleich zur Luft eine sehr niedrige Diffusionsgeschwindigkeit aufweist. Um hypoxischen Bedingungen entgegenzuwirken, indem sowohl metabolische als auch morphologische Adaptationen induziert werden, ist eine effiziente sowie transiente Re-Programmierung der Genexpression für die Pflanze essentiell. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die beiden Hypoxie-responsiven Transkriptionsfaktoren aus Arabidopsis thaliana AtERF#111/ ABSCISIC ACID REPRESSOR 1 (ABR1) und LOB DOMAIN CONTAINING PROTEIN 41 (AtLBD41) vor allem in Bezug auf Sauerstoffmangel zu charakterisieren. AtERF#111/ABR1 gehört zu der Gruppe X der ERF/AP2 Familie (GXERFs) und wird Spross-spezifisch durch Überflutung und Hypoxie induziert. Ein Funktionsverlust von AtERF#111 in erf#111-2 Mutanten sowie eine stabile Überexpression (OE) in ERF#111-OE Linien hatten keinen Einfluss auf die Überlebensrate der Pflanzen nach Überflutung. Da der N-Terminus von AtERF#111 mit den Aminosäuren Methionin und Cystein initiiert, wurde das Protein als mögliches Substrat des Arg/N-degron pathways untersucht. Bei der Analyse der Proteinstabilität von (MA)AtERF#111, bei welchem der hoch konservierte N-terminale Cystein-Rest durch Alanin ersetzt wurde, konnten keine Unterschiede zur nativen Version MC(AtERF#111) festgestellt werden. Folglich wird AtERF#111 unabhängig von seinem N-Terminus und damit nicht durch den Arg/N-degron pathway abgebaut. Eine Inhibierung des Proteasoms resultierte in einer deutlichen Akkumulation von AtERF#111. Demnach wird AtERF#111 dennoch durch das Ubiquitin/Proteasom System degradiert. AtERF#111 wurde zuvor als ein Repressor der Abscisinsäure (ABA)-Antwort beschrieben, wobei erf#111 Mutanten eine hypersensitive ABA-Antwort im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen. Bei den in der Arbeit dargestellten Wiederholungen der Experimente konnte kein Zusammenhang zwischen AtERF#111 und der ABA-Signalgebung aufgezeigt werden. Zudem wurde festgestellt, dass das Transkript von AtERF#111 nicht durch exogen zugeführtes ABA oder Trockenstress, sondern sehr stark durch mechanischen Stress induziert wird. Eine Überexpression von AtERF#111 führte in Pflanzen zu einer veränderten Wurzel- und Sprossentwicklung. Mittels Mikroarrayanalyse wurde ein Genexpressionsprofil von zwei ERF#111-OE Linien erstellt, wobei eine signifikant große Anzahl der durch ERF#111-OE induzierten Gene auch durch die Stressantworten auf Verwundung, Hypoxie oder Überflutung induziert wurden. Es wurden direkte Zielgene von AtERF#111 identifiziert, welche ebenfalls eine Verbindung zur Verwundungsantwort belegten. Die Mutante erf#111-2 zeigte im Vergleich zum Wildtyp keine veränderte Expression der Zielgene nach Verwundung auf. Es ist jedoch denkbar, dass weitere Mitglieder der GXERFs einen Funktionsverlust von AtERF#111 kompensieren könnten. AtLBD41 zählt zu der Klasse II der pflanzenspezifischen LATERAL ORGAN BOUNDARIES (LOB) DOMAIN (LBD) Familie von Transkriptionsfaktoren und ist sehr nah mit AtLBD40 und AtLBD42 verwandt. Als eines von 49 core Hypoxie-responsiven Genen wird AtLBD41 bei Sauerstoffmangel in allen Zelltypen von A. thaliana sehr stark induziert. Da AtLBD41 eine C-terminale ERF-associated amphiphilic repression (EAR)-Domäne aufweist und eine Interaktion mit Co-Repressoren gezeigt wurde, besteht die Annahme, dass AtLBD41 als Repressor der Transkription fungiert. Zur Charakterisierung des Transkriptionsfaktors wurde die EAR-Domäne durch die virale Transaktivierungsdomäne VP16 ersetzt, um den Repressor der Genexpression in einen möglichen Aktivator umzufunktionieren. Anschließend wurde der Effekt einer Überexpression von AtLBD41 und AtLBD41ΔEAR:VP16 in Protoplasten mittels Mikroarray auf das Transkriptom analysiert. Dabei wurde eine Gruppe möglicher Zielgene von AtLBD41 identifiziert, deren Funktion in Bezug auf Hypoxie noch weitestgehend unbekannt ist. Klar ist hingegen, dass diese bei Hypoxie reprimiert und bei Wiederbelüftung induziert werden. Da sich das Expressionsmuster der Zielgene vice versa zur Expression von AtLBD41 verhält, stützt das die These der Funktion von AtLBD41 als transkriptionellen Repressor bei Sauerstoffmangel. AtLBD41 agiert wahrscheinlich redundant mit AtLBD40 und AtLBD42. Ein Funktionsverlust von AtLBD41 führte zu keiner modifizierten Expression der Zielgene bei Hypoxie. Darüber hinaus wurde die Expression von AtLBD40 in der Mutante lbd41 im Vergleich zum Wildtyp bei Hypoxie verstärkt induziert. Die Effektoren AtLBD40ΔEAR:VP16, AtLBD41ΔEAR:VP16 und AtLBD42ΔEAR:VP16 waren alle in der Lage, die Promotoren der Zielgene im Rahmen von Transaktivierungsassays in Protoplasten zu aktivieren. Es konnten orthologe Zielgene von AtLBD41 in Reis identifiziert werden, die ebenfalls durch die Effektoren aus A. thaliana reguliert werden konnten und damit eine hohe interspezifische Konservierung der Funktion von LBD41 vermuten lassen. Mittels CRISPR/Cas9 wurde die Dreifachmutante lbd40/lbd41/lbd42 generiert, für welche im Keimlingsstadium eine signifikant schlechtere Überlebens-rate bei Hypoxie im Vergleich zum Wildtyp demonstriert wurde. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass AtLBD41 posttranslational durch SUMOylierung modifiziert wird.