Κλωνοποίηση και έκφραση των γονιδίων Ε6 και Ε7 των θηλωματοϊών HPV16 και HPV18 σε ευκαρυωτικά κύτταρα:
Creators: name: Καλιώρα, Αγορίτσα Φωτίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Κλωνοποίηση
Εκφραση
Πρωτεϊνες Ε6, Ε7
Θηλωματοϊοιί HPV16, HPV18
Ευκαρυωτικά κύτταρα
Cloning
Expression
Proteins E6, E7
Papillomaviruses HPV16, HPV18
Eucaryotic cells

description: Οι πρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των θηλωματοϊών υψηλού κινδύνου HPV16 και HPV18 παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον και έχουν μελετηθεί ευρέως χάρη στην ικανότητά τους να προκαλούν μετασχηματισμό και αθανατοποίηση ευκαρυωτικών κυττάρων. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν και στην παρούσα εργασία, που σκοπό είχε την κλωνοποίηση και έκφρασή τους σε ευκαρυωτικά κύτταρα και κατ’ επέκταση τη δημιουργία αθάνατων κυτταρικών σειρών. Αρχικά ενισχύθηκαν οι κωδικοποιούσες περιοχές των Ε6 και Ε7 γονιδίων και των δύο τύπων του ιού, τόσο το καθένα χωριστά, όσο και σαν ενιαίο αναγνωστικό πλαίσιο (HPV16E6, HPV16E7, HPV16E6E7, HPV18E6, HPV18E7 και HPV18E6E7) και εισάχθηκαν στο πλασμίδιο pGM3910, που περιέχει το επιτόπιο FLAG. Με τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια που προέκυψαν (pGM3910/HPV16E6, pGM3910/HPV16E7, pGM3910/HPV16E6E7, pGM3910/HPV18E6, pGM3910/HPV18E7 και pGM3910/HPV18E6E7) πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση κυττάρων HEK 293FT για να ελεγχθεί η έκφραση των πρωτεϊνών. Μετά τη διαμόλυνση τα κύτταρα αυτά λύθηκαν, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών, ηλεκτρομεταφορά σε μεμβράνη PVDF και ανοσοανίχνευση τύπου Western Blot με αντίσωμα ειδικό για το επιτόπιο FLAG με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας, η οποία αποδείχθηκε ιδιαίτερα δύσκολη, καθώς γίνεται σε πολύ χαμηλά και πολλές φορές μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Η έκφραση των πρωτεϊνών επιβεβαιώθηκε, ιδιαίτερα μετά από επιλογή των διαμολυσμένων κυττάρων με G418. Στο δεύτερο σκέλος της παρούσας εργασίας έγινε προσπάθεια απομόνωσης και καλλιέργειας μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από αίμα ομφάλιου λώρου. Δοκιμάσθηκαν διάφορα θρεπτικά μέσα και συνθήκες καλλιέργειας και βρέθηκε ότι το καταλληλότερο θρεπτικό μέσο είναι το MSC, που περιέχει 5% Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements, 20% (v/v) FBS και 0,1% (v/v) αντιβιοτικά (streptomycin-penicillin), σε συνδυασμό με ίση ποσότητα υπερκείμενου κυττάρων Vero, που αποτελείται από DMEM, 5% FBS και 0,1% αντιβιοτικά (streptomycin-penicillin). Για την αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια της φλάσκας βρέθηκε ότι καταλληλότερη ήταν η επεξεργασία με κολλαγενάση IV. Τέλος επιτεύχθηκε η διαμόλυνση των κυττάρων αυτών με το γονίδιο της φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP, που είχε όμως σαν αποτέλεσμα πολλές μορφολογικές αλλοιώσεις και θάνατο σημαντικού αριθμού κυττάρων.
description: Proteins Ε6 and Ε7 of high risk human papillomaviruses HPV16 and HPV18 are of great interest and have been widely studied due to their special ability to cause transformation and immortalization of eukaryotic cells. That’s why they have been used in the present study, which intended to clone and express them in eukaryotic cells and finally create immortalised cell lines. Firstly, the open reading frames of Ε6 and Ε7 genes of both types of HPV were amplified, each one separately, as well as an integral open reading frame (HPV16E6, HPV16E7, HPV16E6E7, HPV18E6, HPV18E7 and HPV18E6E7) and were cloned in the pGM3910 plasmid, which contains the FLAG epitope. The recombinant plasmids (pGM3910/HPV16E6, pGM3910/HPV16E7, pGM3910/HPV16E6E7, pGM3910/HPV18E6, pGM3910/HPV18E7 and pGM3910/HPV18E6E7) were used for the transfection of HEK 293FT cells in order to check the protein expression. The solution of those transfected cells was followed by protein electrophoresis, electrotransfer on PVDF membrane, immunodetection through Western Blot analysis with an antibody specific for FLAG epitope and film development of the expressed proteins, which turned out to be particularly difficult, since it occurs in very low and sometimes untraceable levels. The protein expression was confirmed, especially after selection of the transfected cells with G418. In the second part of this study, the aim was to isolate and culture mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Different culture media and condition were tried and it has been proved that the most suitable culture medium for these cells is MSC, which contains 5% Mesenchymal Stem Cell Stimulatory Supplements, 20% (v/v) FBS and 0,1% (v/v) antibiotics (streptomycin-penicillin), in addition with the same quantity of supernatant medium from Vero cells, that is DMEM, 5% FBS and 0,1% antibiotics (streptomycin-penicillin). For the detachment of the cells from the flask surface, it has been shown that the most suitable treatment is with collagenase IV. Finally, mesenchymal stem cells were transfected with the gene of the fluorescent protein GFP, which resulted in many morphological alterations and death of significant number of cells.