title: Anaerobic reductive dehalogenation of organohalides in enrichment cultures from marine sediments of Venice lagoon.
title: Διεργασίες αναερόβιας αναγωγικής αφαλογόνωσης σε καλλιέργειες εμπλουτισμού από θαλάσσια ιζήματα της λιμνοθάλασσας της Βενετίας
Creators: name: Ροδοπουλου Ιωαννα-Ανδριαννα
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2018

description: Particular attention in recent years has been given to organohalide pollution of subsurface environments in industrialized areas. Microbial reductive dehalogenation plays an important role in decontamination of soil and sediments as strictly anaerobic microorganisms have evolved using naturally occurring halogenated organics as their terminal electron acceptor. To investigate the activity of these unusual organisms, an indigenous microbial community of a PCB-impacted sediment from Brentella Canal (Venice lagoon, Italy) was enriched in defined mineral media through subculturing from TCE- amended slurry microcosms. Reductive dechlorination process was tested initially in the presence of lactate and pyruvate, two organic acids with the ability to serve as substrates during  cometabolic  anaerobic reduction. Bacteria's activity was stimulated as they completely bioconverted TCE simultaneously to cis- and trans-DCE within 6 weeks with no lag phase. The cis-isomer was the major intermediate product at the beginning of chemical monitoring but after a few weeks the trans-isomer took the lead role in TCE dechlorination. This change could be ascribed as the action of a non-Dehalococcoides phylotype of the class Dehalococcoidia, namely phylotype VLD-1, which was considered as the main phylotype for the dehalogenation activity. For further test and enrichment, subculturing of lactate-fed microcosms was performed using the same defined mineral medium but amended with antibiotics. The presence of ampicillin, vancomycin and 2-bromoethanesulfonate did not inhibit TCE dechlorination activity since the dechlorinating VLD-1, which turned out to be tolerant to the antibiotics, was enriched.  Finally, another set of microcosms from cultures with lactate was prepared to test dehalogenation in the presence of different electron acceptors including TCE in the defined mineral medium. In contrast with the positive results cultures showed before subculturing while in sediment-slurry medium, in the defined medium none of the cultures exhibited dehalogenation activity except for the ones amended with TCE.  This finding suggested that due to subculturing and enrichment certain synergistic bacteria were lost whose presence was significant for the production of enzymes catalyzing dehalogenation on several organohalides.
description: Ιδιαίτερη προσοχή τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί στη ρύπανση από οργανοαλογονίδια στο υπέδαφος σε βιομηχανικές περιοχές. Η μικροβιακή αναγωγική αφαλογόνωση  διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην απορρύπανση του ανοξικού εδάφους και των ιζημάτων καθώς αυστηρώς αναερόβιοι μικροοργανισμοί έχουν εξελιχθεί χρησιμοποιώντας φυσικώς παραγώμενα αλογονωμένα οργανικά ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων. Για να διερευνηθεί η δραστηριότητα αυτών των ασυνήθιστων οργανισμών, μια ενδογενής μικροβιακή κοινότητα ενός ρυπασμένου ιζήματος με πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCB) από το κανάλι Brentella  (λιμνοθάλασσα της Βενετίας, Ιταλία) εμπλουτίστηκε σε καθαρό μεταλλικό μέσο διαμέσου υποκαλλιεργειών από μικρόκοσμους αποτελούμενους από ίζημα και θαλασσινό νερό της περιοχής ενδιαφέροντος στους οποίους προστέθηκε τριχλωροαιθένιο (TCE).

    διεργασία της αναγωγικής αποχλωρίωσης εξετάστηκε αρχικά υπό την παρουσία γαλακτικού και πυροσταφυλικού άλατος, δύο οργανικές ενώσεις οι οποίες χρησιμοποιούνται ως υποστρώματα κατά τη διάρκεια συμμεταβολικής αναερόβιας αναγωγής. Η δραστηριότητα των βακτηριδίων διεγέρθηκε καθώς βιομετέτρεψαν πλήρως το TCE σε cis- και trans-DCE εντός 6 εβδομάδων χωρίς τη μεσολάβηση διαστήματος προσαρμογής. Στους μικρόκοσμους με πυροσταφυλικό άλας ο  μέγιστος ρυθμός αποχλωρίωσης του TCE ήταν 19.4±2.9 μmol/L/d ενώ ο λόγος παραγωγής cis-DCE προς trans-DCE ήταν 4.0±0.6. Αντίστοιχα, οι μικρόκοσμοι με γαλακτικό άλας επέδειξαν μέγιστο ρυθμό αποχλωρίωσης 21.2±1.4 μmol/L/d με λόγο παραγωγής cis- προς trans-DCE 4.2±0.2. Σε καμία από τις καλλιέργειες δεν παρατηρήθηκε συσσώρευση 1,1-DCE. Τριχλωροαιθένιο προστέθηκε αρκετές φορές κατά τη διάρκεια της επώασης των μικρόκοσμων. Έπειτα από την βιομετατροπή του σε cis- και trans-DCE, τα τελευταία μαζί με το υπολειπόμενο TCE απογυμνώνονταν από τις καλλιέργειες με χρήση ροής αζώτου. Παρατηρήθηκε ότι οι ρυθμοί βιοαποδόμησης στους μικρόκοσμους γίνονταν μέγιστοι 5 με 8 ημέρες έπειτα από την προσθήκη τριχλωροαιθενίου. Κατά την 15η εβδομάδα επώασης των μικρόκοσμων παρουσιάστηκε μέγιστη ανάπτυξη των μικροοργανισμών με μέγιστο ρυθμό αποχλωρίωσης 55.0±7.5 μmol/L/d για τους μικρόκοσμους με το γαλακτικό και 36.1±15.8 μmol/L/d για εκείνους με το πυροσταφυλικό άλας. Παρ'όλα αυτά, μέτα από την πλήρη βιομετατροπή των οργανικών ενώσεων, οι ρυθμοί αποχλωρίωσης του TCE ελαττώθηκαν κατά την  18η εβδομάδα επώασης (12.0±0.3 μmol/L/d για τις καλλιέργειες που περιείχαν το γαλακτικό άλας και 5.2±3.3 μmol/L/d για  εκείνες με το πυροσταφυλικό άλας). Ασυνήθιστη μεταβολή παρουσιάστηκε στην παραγωγή των DCE ισομερών. Ενώ τις πρώτες εβδομάδες το cis-DCE ήταν το κυρίαρχο προϊόν της αποχλωρίωσης του TCE, οι ρόλοι εντέλει αντιστράφηκαν καθώς μεγαλύτερες ποσότητες του trans- ισομερούς παρήχθησαν πρώτα στους μικρόκοσμους με το πυροσταφυλικό άλας και έπειτα σε αυτούς με το γαλακτικό. Υπεύθυνο θεωρήθηκε ένα είδος βακτηρίων του γένους non-Dehalococcoides, ονόματι VLD-1, το οποίο έχει 98.8% γενετική ομοιότητα με το Dehalobium chlorocoercia DF-1 το οποίο παράγει περισσότερα trans- από cis-DCE κατά την αφαλογόνωση του TCE.
    τους μικρόκοσμους με το γαλακτικό άλας δημιουργήθηκαν δύο σετ υποκαλλιεργειών. Στο ένα εκ των δύο προστέθηκαν αντιβιοτικά για τον εμπλουτισμό των μικροοργανισμών του γένους non-Dehalococcoides, οι οποίοι αποτελούσαν το 17% της συνολικής βακτηριακής κοινότητας στις προηγούμενες καλλιέργειες εμπλουτισμού, και δύναται να παρουσιάσουν ανθεκτικότητα σε αυτά. Οι μισοί μικρόκοσμοι περιείχαν αμπικιλλίνη, βανκομυκίνη και 2-βρωμοαιθάνιο-σουλφονικό (BES) και οι υπόλοιποι μόνο BES. Κατά τις πρώτες εβδομάδες επώασης έπειτα από προσθήκη TCE διαμεσολάβησε περίοδος προσαρμογής των μικροοργανισμών στα αντιβιοτικά. τη δεύτερη φορά και έπειτα τα βακτήρια εκτέλεσαν αναγωγική αποχλωρίωση του TCE με μέσο λόγο παραγωγής cis- προς trans-DCE 4.2±0.8 στους μικρόκοσμους με τα τρία αντιβιοτικά και 4.0±0.4 στους μικρόκοσμους με το BES. Μοριακή ανάλυση της μικροβιακής κοινότητας πραγματοποιήθηκε στους μικρόκοσμους με τα τρία αντιβιοτικά. Το VLD-1 ήταν το βακτήριο που παρουσίασε ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και εμπλουτίστηκε αποτελώντας το 69% της συνολικής μικροβιακής κοινότητας.

Το δεύτερο σετ υποκαλλιεργειών που δημιουργήθηκε αποτελείται από μικρόκοσμους στον καθένα εκ των οποίων προστέθηκε ξεχωριστά εξαχλωροβενζόλιο (HCBe), μίγμα πολυχλωριωμένων διαφαινυλίων (PCB, Aroclor 1254), 1,2,3,4-τετραχλωροδιβενζοπαραδιοξίνη (1,2,3,4-TeCDD), TCE και πενταχλωροφαινόλη (PCP). Υπό την παρουσία ιζήματος και νερού από την περιοχή ενδιαφέροντος στις καλλιέργειες εμπλουτισμού οι μικροοργανισμοί μπορούσαν να εκτελέσουν αναγωγική αφαλογόνωση σε όλους τους υπό εξέταση ρύπους. Αντίθετα, στο καθαρό μεταλλικό μέσο, αφαλογόνωση εκτελέστηκε μόνο στους μικρόκοσμους με το τριχλωροαιθένιο. Αυτό συνέβει είτε γιατί κατά το διαδοχικό σχηματισμό υποκαλλιεργειών τα βακτήρια έχασαν την ικανότητα παραγωγής ενζύμων που καταλύουν αποχλωρίωση των υπόλοιπων ρύπων είτε γιατί δίχως την παρουσία ιζήματος τα βακτήρια δε μπορούσαν να προστατευτούν από πιθανές υψηλές συγκεντρώσεις των ουσιών καθώς η μετέπειτα προσθήκη TCE στους μικρόκοσμους με τους αρωματικούς ρύπους έδειξε ότι τα υπεύθυνα για την αποχλωρίωση βακτήρια  δε ζούσαν.

Συμπερασματικά, σχηματίστηκε καθαρό μεταλλικό μέσο το οποίο υποστήριξε την αναγωγική αφαλογόνωση τριχλωροαιθενίου, η οποία διεγέρθηκε με την προσθήκη γαλακτικού και πυροσταφυλικού άλατος. Ο φυλότυπος VLD-1, κυρίαρχος της διεργασίας αποχλωρίωσης, αποδείχθηκε ανθεκτικός υπό την παρουσία των αντιβιοτικών αμπικιλλίνη, βανκομυκίνη και BES και εμπλουτίστηκε σημαντικά. Στους μικρόκοσμους με χλωριωμένους αρωματικούς ρύπους δεν παρατηρήθηκε αναγωγική αποχλωρίωση. Χρειάζεται να διεξαχθούν επιπλέον πειραματισμοί με αρωματικούς και αλειφατικούς οργανικούς ρύπους στο ίδιο ή και σε διαφορετικό μεταλλικό μέσο εμπλουτισμού καθώς και έρευνες των ενζύμων που εκφράζονται κατά τη διεργασία της αναγωγικής αφαλογόνωσης για την κατανόηση της δράσης των βακτηρίων υπό διαφορετικές συνθήκες ώστε να χρησιμοποιηθούν σωστά σε εφαρμογές βιοεξυγίανσης περιβάλλοντος.