Structure determination and biochemical characterization of the protein ubiquitin ligases SCFFbw7 and APC
Creators: name: Schumann, Stephanie
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2007
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in dt. Sprache
subject: 572.79

description: Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich zum Einen mit Cyclin E und dem Tumorsuppressor Fbw7 und zum Anderen mit der APC-Ligase. Zuerst wurde die Wichtigkeit der phosphorylierten Cyclin E Aminosäuren Ser372, Thr380 und Ser384 bezüglich der Interaktion mit dem Tumorsuppressor Fbw7 mittels ITC Bindungsstudien untersucht. Dies liess schlussfolgern, dass Fbw7 WD40 Domäne zwei-Phosphat Bindungstaschen besitzt, zu welchen die phosphorylierten Cyclin E Aminosäuren Thr380 und Ser384 nicht aber Ser372 bindet. Diese Ergebnisse wurden auch durch das Lösen der Proteinkristallstruktur vom Fbw7-Skp1-CycE31pS372/pT380/pS384 Komplex bestätigt. Das daraus abgeleitete zwei-Phosphat Bindungstaschen Modell steht jedoch im Widerspruch zu früheren Ergebnissen am zu Fbw7 eng verwandten scCdc4, wonach scCdc4 nur eine Phosphat Bindungstasche besitzt, und zu welcher der S-Phase Inhibitor Sic1 nur binden kann, nachdem er an mindestens fünf bis sechs Aminosäuren phosphoryliert ist (Orlicky et al., 2003). Die Überlagerung der Strukturen der WD40 Domänen von Fbw7 und scCdc4 (Orlicky et al., 2003) zeigte jedoch, dass die WD40 Motive zwei bis fünf, welche die zwei-Phosphat Bindungstaschen enthalten, identisch sind. Ausserdem zeigten ITC-Bindungsstudien des scCdc4-Skp1 Komplex mit phosphorylierten Cyclin E Peptiden, dass scCdc4 wie Fbw7 zwei-Phosphat-Bindungstaschen besitzt. Desweiteren wurden drei zweifach phosphorylierte Sic1 Peptide identifiziert, welche im Vergleich zu den einfach phosphorylierten Sic1 Peptiden vier bis achtzehn mal stärker zu scCdc4 binden konnten. Dies zeigt das bestimmte zweifach phosphorylierte Sic1 Peptide zu zwei scCdc4 Phosphat-Bindungstaschen binden. Weiterhin zeigten Substratbindungs- und Substratdegrationsstudien mit Fbw7 und scCdc4 mutiert in der zweiten-Phosphat-Bindungstasche, dass diese Mutanten die zweifach phosphorylierten Substrate sehr viel schlechter binden bzw. umsetzen konnten. Es wurde auch gezeigt, dass Fbw7 und scCdc4 als Dimer existieren. Desweiteren legt die Proteinkristallstruktur vom Fbw7-Skp1 mit einem N-terminalen phosphorylierten CycE14pT62 Peptid nahe, dass die zwei phosphorylierten Regionen in Cyclin E und zwei der drei identifizierten phosphorylierten Regionen in Sic1 jeweils zu einer WD40 Domäne vom Fbw7/scCdc4 Dimer binden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Unterheiten der APC-Ligase charakterisiert und kristallisiert. Kristalle der scAPC4 Untereinheit zeigten eine Streufähigkeit von 6Å bis 8Å, welche jedoch nicht ausreicht um ein genaues Abbild von dem scAPC4 Protein zu modulieren.
description: The presented work deals on one hand with Cyclin E and the tumorsuppressor Fbw7 and on the other hand with the APC-ligase. At first, the importance of the phosphorylated Cyclin E residues Ser372, Thr380 and Ser384 were tested for the binding to the tumorsuppressor Fbw7 by ITC binding studies. This led to the conclusion that Fbw7 WD40 domain contains two-phosphate-binding pockets to which the phosphorylated Cyclin E residues Thr380 and Ser384 but not Ser372 bind to. Moreover, this result was confirmed by the crystal structure of the Fbw7-Skp1-CycE31pS372/pT380/pS384 complex. However the two-phosphate-binding pocket model stands in contradiction to earlier results on to Fbw7 closely related scCdc4. According to this, scCdc4 contains only one-phosphate-binding pocket, to which the S-phase inhibitor Sic1 can only bind to after its phosphorylation on at least five to six residues (Orlicky et al., 2003). Yet, the superimpostion of the WD40 domains of Fbw7 and scCdc4 (Orlicky et al., 2003) showed, that its WD40 motives two to five, which contain the two-phosphate-binding pockets, are identical. Furthermore, ITC binding studies of the scCdc4-Skp1 complex with the phosphorylated Cyclin E peptides have shown that scCdc4 like Fbw7 contains two-phosphate-binding pockets. In addition three doubly phosphorylated Sic1 peptides were identified, which bound compared to its singly phosphorylated Sic1 peptides four to eighteen times tighter to scCd4. This shows that specific doubly phosphorylated Sic1 peptides bind to two scCdc4 phosphate-binding pockets. Moreover substrate-binding and substrate-degradation studies with Fbw7 and scCdc4, mutated in the 2nd-phosphate-binding pocket, showed that they were less capable to bind to and to turnover its doubly phosphorylated substrates. It is also shown that Fbw7 and scCdc4 exist as a dimer. Furthermore, the crystal structure of Fbw7-Skp1 with a N-terminal phosphorylated CycE14pT62 peptide lets speculate that the two phosphorylated regions in Cyclin E and two of the three identified phosphorylated regions of Sic1 bind each to one WD40 domain of Fbw7/scCdc4 dimer. Secondly, subunits of the APC ligase were characterized and crystallized. Crystals of the scAPC4 subunit showed a limited diffraction of 6Å to 8Å, which is not sufficient to solve the structure.