title: Therapie von Harnwegsinfekten
Creators: name: Semmler, Johanna Christina
Publisher: name: :none
Year: 2021

description: Aufgrund der hohen Prävalenz von Harnwegsinfekten, den steigenden Antibiotikaresistenzen und der unzureichenden Effektivität gängiger Therapien von Harnwegsinfekten ist die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden nötig. Die intravesikale Instillation des Wirkstoffs bietet viele Vorteile, allerdings sind dieser Methode durch konstante Verdünnungsvorgänge und dem Auswaschen des Arzneistoffs Grenzen gesetzt. Vor allem die Eradikation von intrazellulär persistierenden Erregern, die zu häufigen Rezidiven führen, stellt aus klinischer und therapeutischer Sicht ein großes Problem dar. Der Einsatz von nanopartikulären Trägersystemen, die an die Zellen des Urothels adhärieren, bietet Möglichkeiten, die instillative Behandlung von Harnwegsinfekten für den Patienten zu verbessern. Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurden dazu Verfahren entwickelt und Prozessschritte optimiert, Trimethoprim-beladene, BodiPy-markierte Nanopartikel mit einer Matrix aus PLGA herzustellen, zu charakterisieren und deren Oberfläche mit Weizenkeimlektin zu modifizieren, um schließlich die Adhäsion an gesunde Blasenzellen im SV-HUC-Zellmodell ex-vivo zu analysieren. Die Herstellung der Nanopartikel erfolgte nach dem solvent-evaporation-Verfahren unter Bildung einer O/W-Emulsion. Ein optimiertes Reinigungsprotokoll, das einen Kompromiss zwischen Ausbeute und Resuspendierbarkeit darstellt, ergab Nanopartikel mit einem Durchmesser von 230 nm in einer Gauß’schen Verteilung. Die im Rahmen der Lagerung bei 4°C durch Ostwald Reifung entstanden Agglomerate konnten einfachsten durch Filtration abgetrennt werden. Die Analyse des Zeta-Potentials der Nanopartikel mittels Laser-Doppler-Mikro-Elektrophorese zeigte ein hohes negatives Potential von durchschnittlich - 57,25 mV, sodass die Dispersionen eine hohe elektrostatische Stabilität aufweisen. Eine Oberflächenmodifikation mit Weizenlektin bewirkt im Mittel eine maximale Abnahme um 1,8 mV und kann als qualitativer Beweis der Funktionalisierung gewertet werden. Als Voraussetzung für Bindungsstudien an Monolayern von gesunden Blasenzellen im SV-HUC-Zellmodell konnte der stabile Einbau von Markermolekülen in die Nanopartikelmatrix für mindestens acht Tage bei 37°C nachgewiesen werden. Die Bindungsstudien zeigten eine hohe unspezifische Bindung der Nanopartikel an Blasenepithelzellen unabhängig von der Acidität des Kunsturins. Unter sauren Bedingungen zeigten Partikel mit einer größeren Menge an immobilisiertem WGA eine gesteigerte Adhäsion, sodass nach vier Waschschritten, die die laufende Verdünnung durch die kontinuierliche Produktion von Harn sowie die Miktion imitieren sollten, um 40% und nach sechs Waschschritten um 29% mehr Partikel an das Urothel gebunden waren, sofern die Oberfläche mit Weizenlektin funktionalisiert war. Bei einer Inkubation in Kunstharn pH 5 und anschließendem Waschen mit Kunstharn pH 7 konnte eine Verbesserung der Adhäsion durch gesteigerte WGA-Immobilisierung nachgewiesen werden, jedoch in geringerem Ausmaß von maximal 34%. Die PLGA-Nanopartikel blieben allerdings unabhängig vom pH-Wert des Kunstharns auch ohne Lektin zu einem Anteil von bis zu 20% am Zellmonolayer haften. Insgesamt konnten in dieser Diplomarbeit einige Parameter geklärt werden, die im Rahmen einer präklinischen Entwicklung einer Arzneiform von Bedeutung sind. Besonders die Zellbindungsstudien können als Teil eines „proof of concept“ gewertet werden, die in Zukunft eine effizientere und Patienten-freundliche Therapie von schweren Harnwegserkrankungen erwarten lassen.
description: Due to the urgent demand for more potent therapy regimens for urinary tract infections, especially in preventing recurrences, the development of new treatment strategies is needed. Intravesical instillation of antibiotics offers many benefits, but this method is still limited by constant dilution and washout of the drug by miction. Furthermore, the low permeability of the urothelial layer counteracts eradication of intracellular persistent pathogens, which leads to frequent recurrences. A new approach to circumvent these issues is the usage of nanoparticular carrier-systems and biorecognitive targeting concepts. For this purpose, key parameters were optimized for preparation and purification of trimethoprim- and BodiPy-loaded PLGA-nanoparticles, as well as their surface modification with bioadhesive wheat germ agglutinin. Centrifugation at 23000 x g for 15 minutes at 4°C proofed to be adequate for preparation of a dispersion containing 233 nm particles in a Gaussian distribution. Optionally, aggregated particles can be easily removed by using a 1 µm filter. Analysis of the zeta potential of the nanoparticles as a function of WGA loading revealed that a zeta potential of -57.7 mV in case of parent nanoparticles but decreased to -55.9 mV in case of WGA-functionalization. Most important for reliable binding studies, the dye leakage from the nanoparticles was as low as studies can be performed up to eight days without any doubt. Binding studies were performed ex-vivo on artificial healthy urothelium represented by SV-HUC-monolayers. Independent from the pH of artificial urine, the non-specific adhesion of the PLGA nanoparticles was unexpectedly high. Nevertheless, in acidic artificial urine the binding rate of nanoparticles with WGA-functionalized surface was 40% after four or after six washing steps 29% higher than that of plain particles. The washing steps imitated the effect of dilution by continuously produced urine and miction on bioadhesion. All in all, this diploma work contributed to elucidation of parameters important for preclinical development of a new formulation. Especially the cell adhesion studies are considered as a part of a “proof of concept” that is expected to contribute to a more efficient and more patient-friendly therapy of severe urinary tract infections.