title: Sweets for my sweet - Kohlenhydrattransport und dessen Regulierung in Sulfolobus acidocaldarius
title: Sweets for my sweet - carbohydrate transport and its regulation in Sulfolobus acidocaldarius
Creators: name: Wagner, Michaela
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Kohlenhydrattransport, Regulation
regulation
archaea , carbohydrate transport
Archaeen

description: Kohlenhydrate sind
      energieliefernde Nährstoffe, die von Organismen in allen
      Domänen des Lebens genutzt werden. Der Transport dieser
      Kohlenhydrate in die Zelle ist die entscheidende Grundlage
      für die Verwertung dieser Nährstoffe, weil Zuckermolekule
      nicht durch die Membran diffundieren können. Das
      hyperthermophile Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius kann
      verschiedenste Zucker wie L-Arabinose, Dextrin, D-Glcuose,
      Maltose, Saccharaose, Stärke oder D-Xylose verwerten (Grogan,
      1989; Brouns et al., 2006). Aber bisher wurde in S.
      acidocaldarius nur der Maltose/Maltodextrintransporter
      aufgrund von Sequenzhomologien zu dem identifizierten
      Maltosetransporter in S. solfataricus gefunden. In dem nahe
      verwandten S. solfataricus wurden bereits viele verschiedene
      ABC Zuckertransportsysteme für unterschiedliche Kohlenhydrate
      identifiziert. In S. acidocaldarius sind allerdings keine
      weiteren Homologen zu diesen Transportern gefunden worden und
      der Mechanismus des Zuckertransports war bis dahin ein
      Rätsel. Um die Mechanismen des Zuckertransports und dessen
      Regulierung in S. acidocaldarius untersuchen zu können, habe
      ich ein genetischen System für diesen Organismus entwickelt.
      Das hier beschriebene genetische System basiert auf den
      uracilauxtrophen Stamm MW001, der vom Wildtyp S.
      acidocaldarius DSM639 generiert wurde. Sowohl einfache als
      auch mehrfache Gendeletionen, Genommarkierungen, die
      Insertion von Fremd-DNA, Komplementierungen in cis und in
      trans als auch induzierbare homologe Expressionen können in
      MW001 angewandt werden. Dadurch wird sowohl
      Grundlagenforschung als auch die industrielle Nutzung von S.
      acidocaldarius ermöglicht. Mit Hilfe dieses genetischen
      Systems wurde zunächst die Regulation des Maltosetransporters
      in S. acidocaldarius untersucht. Die Transkription des
      Maltosegenclusters war in der Anwesenheit von
      Maltose/Maltodextrin verstärkt, was auf einen regulatorischen
      Mechanismus hinweist. Der Transkriptionsregulator MalR wurde
      innerhalb des Genclusters identifiziert. Die
      Charakterisierung der Deletionsmutanten ΔmalR bestätigte die
      regulatorische Funktion dieses Proteins, das als Aktivator
      der Transkription der mal Gene fungiert. MalR war der erste
      identifizierte archaeale Aktivator, der in Zuckertransport
      involviert ist. Punktmutationen in MalR deuteten darauf hin,
      dass sowohl Zuckerbindung als auch die Phosphorylierung von
      MalR dessen Aktivität beeinflussen. Aber der gesamte
      regulatorische Mechanismus dieses Systems muss immer noch
      aufgeklärt werden. Die Transportmechanismen für andere
      Kohlenhydrate blieb lange Zeit unbekannt, da keine Homologien
      zu anderen bereits identifizierten archaealen
      Zuckertransportern gefunden wurden. Trotzdem konnten wir den
      D-Xylose and L-Arabinose ABC-Transporter identifizieren. Die
      Transkription dieses Transporteroperons wurde durch die
      Anwesenheit von Xylose oder Arabinose induziert.
      Deletionsmutanten einzelner Transportereinheiten bestätigten
      die Funktion als Transporter, der im Besonderen bei geringen
      Zuckerkonzentrationen von Bedeutung war. Das Wachstum dieser
      Transportermutanten in Anwesenheit von hohen
      Zuckerkonzentrationen lässt allerdings auf ein zweites bisher
      unbekanntes Zuckertransportsystem schließen. D-Xylose und
      L-Arabinose aktivieren nicht nur die Transkription des ABC
      Transporters sondern auch die von zwei andere Genen. Diese
      beiden Gene kodieren die Enzyme
      α-Ketoglutaratesemialdehyddehydrogenase (KGSADH) und
      2-keto-3-deoxyarabinoate/xylonatedehydratase (KDXD/KDAD),
      welche im aldolaseunabhängigen Pentoseabbauweg involviert
      sind. Die Deletionen dieser beiden Enzyme deuten darauf hin,
      dass S. acidocaldarius ausschließlich den
      aldolaseunabhängigen Pentoseabbauweg benutzt. Die hier
      präsentierte Arbeit gibt erste und vor allen Dingen neue
      Einblicke in den Kohlenhydrattransport und dessen Regulierung
      in S. acidocaldarius. Das gewonnene Wissen über den
      Zuckertransport und den Metabolimus zusammen mit der
      Entwicklung eines genetischen Systems eröffnen die
      Möglichkeit S. acidodaldarius metabolisch zu verändern und
      für industrielle Zwecke zu nutzen.
description: Carbohydrates are energy-providing
      nutrients which are utilized by organisms in all three
      domains of life. Sugar transport into the cell is crucial for
      the metabolism of these nutrient as they cannot cross the
      membrane by simple diffusion. The hyperthermophilic
      crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius can utilize different
      carbohydrates including L-arabinose, dextrin, D-glucose,
      maltose, sucrose, starch or D-xylose (Grogan, 1989; Brouns et
      al., 2006). However, only the ABC transporter system for
      maltose and maltodextrin was elucidated in S. acidocaldarius
      by sequence homology to the maltose transporter system of S.
      solfataricus. In the closely related S. solfataricus several
      ABC transporter systems for different carbohydrates. However,
      no homologues of these transporter systems are present in S.
      acidocaldarius and the mode of sugar transport in this
      organism was a mystery. In order to study the principle of
      sugar transport and its regulation in S. acidocaldarius, I
      developed a genetic tool box for this organism. The genetic
      system, described in this thesis, is based on the uracil
      auxotrophic strain MW001 constructed from the S.
      acidocaldarius DSM639 wild type strain. Multiple markerless
      gene deletions, in genome tagging, ectopic integrations,
      complementations in cis and in trans as well as inducible
      homologues expression can be done by this system in MW001.
      This enables fundamental research as well as metabolic
      engineering of S. acidocaldarius. Using that system, the
      regulation of the maltose transporter in S. acidocaldarius
      was analysed first. Transcription of the maltose gene cluster
      was upregulated in the presence of maltose or maltodextrin
      indicating a regulatory mechanism. The transcriptional
      regulator MalR was identified among the maltose gene cluster.
      Characterization of the deletion mutant ΔmalR confirmed the
      regulatory function of this protein which acts as an
      activator for transcription of the mal regulon. MalR was the
      first identified positive regulator involved in sugar
      transport in the domain of Archaea. Point mutations in MalR
      indicated that sugar binding to MalR as well as the
      phosphorylation state of MalR influences its activity, but
      however, the elucidation of the complete regulatory mechanism
      in that system is still in progress. Because of the absence
      of other sugar related archaeal ABC transporters in S.
      acidocaldarius, transport mechanism for other carbohydrates
      were not known for long time. However, we could identify an
      ABC transporter system responsible for D-xylose and
      L-arabinose uptake. Transcription of the transporter operon
      was induced in the presence xylose or arabinose. Deletion
      mutants of the arabinose/xylose sugar transporter units
      confirmed the function of the transporter which is relevant
      if only low carbohydrate concentrations are present. However,
      evidence for a second D-xylose/L-arabinose transporter is
      provided by growth of the mutants in the presence of higher
      sugar concentrations. D-xylose and L-arabinose activated not
      only transcription of the ABC transporter operon, but also
      induced transcription of two genes involved in the aldolase
      independent pentose degradation. Deletion of these
      metabolizing enzymes α-ketoglutarate semialdehyde
      dehydrogenase (KGSADH) and 2-keto-3-deoxyarabinoate/xylonate
      dehydratase (KDXD/KDAD) indicated the probable absence of the
      aldolase dependent pentose degradation pathway from S.
      acidocaldarius. Taken together, the work presented in this
      thesis give first and new insights into carbohydrate
      transport and it regulation in S. acidocaldarius. The
      knowledge about the sugar transport and metabolism together
      with the developed genetic tool box enables the utilization
      S. acidocaldarius as chassis for metabolic engineering and
      industrial usage.