title: Biochemische Untersuchungen zu bakteriellen und pilzlichen Dimethylallyltryptophan-Synthasen
title: Biochemical investigations on bacterial and fungal dimethylallyltryptophan synthases
title: Biochemical investigations on bacterial and fungal dimethylallyltryptophan synthases
Creators: name: Winkelblech, Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: regioselectivity, enantioselectivity
Enzymkinetik
DMAPP
dimethylallyltryptophan synthases
Prenylgruppe
Homology Modeling, Prenyltransferase
prenyltransferases
Stereoselektivität , Friedel-Crafts-Reaktion
DMATS
Streptomyces,Biokatalysator, Naturstoff
Biowissenschaften, Biologie
Life sciences
natural products
Regioselektivität

description: Prenyl transfer reactions occur
      ubiquitously in nature and play an important role in primary
      and secondary metabolism in all domains of life. Prenylated
      secondary metabolites including indole alkaloids usually
      demonstrate improved biological and pharmacological
      activities and thus makes them to promising candidates for
      drug discovery and development. Important producers of such
      bioactive compounds are fungi of ascomycetes and bacteria of
      actinomycetes. The transfer reactions of a prenyl moiety from
      prenyl diphosphate, primarily dimethylallyl diphosphate
      (DMAPP), onto indole derivatives including tryptophan are
      mainly catalyzed in nature by the members of the
      dimethylallyltryptophan synthase (DMATS) superfamily. In the
      last years, remarkable progress has been achieved in their
      biochemical, molecular biological, and structural
      characterization, especially for DMATS enzymes from fungi.
      The major challenge of this thesis is to provide a better
      understanding of the catalytic features of these enzymes from
      different origins. Cloning and expression of these genes as
      well as the subsequent biochemical investigations of the
      three novel tryptophan prenyltransferases provided several
      new intriguing features. Initially, two tryptophan
      C6-prenyltransferases were identified, i.e. 6-DMATSSa from
      Streptomyces ambofaciens and 6-DMATSSv from Streptomyces
      violaceusniger. Biochemical investigation on these enzymes
      revealed a remarkable broad substrate specificity. In
      addition to a number of indole derivatives also several
      hydroxynaphthalenes were accepted by 6-DMATSSa and 6-DMATSSv.
      Moreover, they represent the first examples of tryptophan
      prenyltransferases that accept both DMAPP and geranyl
      diphosphate (GPP) as prenyl donors and catalyze the same
      prenylation positions. Consequently, the studied 6-DMATSs
      were used for further investigations on the acceptance of
      unnatural alkyl or benzyl donors. Prior to this study,
      investigations on this issue are limited to fungal C4- and
      C5- prenyltransferases. The L-tyrosine prenyltransferase
      TyrPT with a tryptophan C7-prenyltransferase activity, the
      two mentioned 6-DMATSs as well as the bacterial 5-DMATSSc
      (SCO7467) were included in this project. In total, five C5-,
      C6- and C7-prenytransferases were investigated in the
      presence of the DMAPP analogs methylallyl (MAPP), 2-pentenyl
      (2-pentenyl-PP) and benzyl diphosphate (benzyl-PP). The
      unnatural donors were accepted by all tested enzymes with
      different relative activities and regioselectivities.
      C6-alkylated or benzylated derivatives were identified in all
      the reactions, as unique product of the two 6-DMATSs or as
      one of the main products of the other enzymes. These results
      demonstrated a clear preference of the five enzymes for
      alkylation/benzylation at C-6 of the indole ring in the
      presence of the unnatural DMAPP derivatives. Furthermore,
      homology modeling of the 5-DMATS and subsequent docking as
      well as molecular dynamics studies with DMAPP, MAPP and
      2-pentenyl-PP, led to a distance-based explanation of the
      observed reaction results. Later on, a third tryptophan
      C6-prenyltransferase 6-DMATSMo from Micromonospora
      olivasterospora was identified and characterized. The most
      notable feature of 6-DMATSMo is the high relative activity
      toward D-tryptophan. This result led to the comparative study
      on enantioselectivity of the seven DMATS enzymes from fungi
      and bacteria. The tested prenyltransferases displayed
      different substrate preferences as well as different
      regioselectivities toward the L- and D-enantiomers of
      tryptophan and their methylated derivatives. Interestingly,
      the bacterial 5-DMATSSc and 6-DMATSMo highly preferred the
      D-enantiomer of 5-methyltryptophan to the L-enantiomer,
      although that was the better substrate in all other
      reactions. In the presence of the racemate, the D-enantiomer
      reaction was strongly inhibited, which could be explained by
      the high affinity to the respective L-form as the main
      reason. Another interesting output of this project is the
      reduced or even completely changed regioselectivity for the
      reactions of FgaPT2, 5-DMATSSc, and 7-DMATS with the
      D-enantiomers of tryptophan or 5-methyltryptophan. Moreover,
      the observed diprenylation by 5-DMATSSc was the first report
      on a tryptophan prenyltransferase which catalyzes two
      successive prenylation steps. In conclusion, identification
      and characterization of the three new 6-DMATSs from
      actinomycetes expand our knowledge on bacterial tryptophan
      prenyltransferases. Furthermore, prenyltransferases including
      the three 6-DMATSs could serve as valuable biocatalysts in
      chemoenzymatic synthesis for alkylated compounds with
      potential biological activities.
description: Prenylierungsreaktionen sind in
      der Natur weit verbreitet und spielen eine wichtige Rolle in
      dem Primär- und Sekundärmetabolismus aller Lebensformen.
      Prenylierte Sekundärmetabolite einschließlich Indolalkaloide
      weisen häufig eine verstärkte biologische und
      pharmakologische Aktivität auf, wodurch sie vielversprechende
      Kandidaten für die Arzneistoff-Findung und Entwicklung
      darstellen. Wichtige Produzenten solcher bioaktiver
      Substanzen sind Pilze der Askomyzeten und Bakterien der
      Aktinomyzeten. Die Übertragung eines Prenylrestes meistens
      von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), auf Indolderivate
      mitunter Tryptophan werden in der Natur durch Enzyme der
      Dimethylallyltryptophan-Synthase (DMATS)-Superfamilie
      katalysiert. Bemerkenswerte Fortschritte wurden in den
      letzten Jahren in der biochemischen, molekularbiologischen
      und strukturellen Charakterisierung dieser Enzyme,
      insbesondere solcher aus Pilzen, erzielt. Die größte
      Herausforderung dieser Arbeit besteht darin, ein besseres
      Verständnis über die katalytischen Eigenschaften dieser
      Enzyme unterschiedlicher Herkunft zu erlangen. Die
      Klonierung, Expression und die anschließenden biochemischen
      Untersuchungen drei neuer Tryptophan-Prenyltransferasen
      offenbarten neue, interessante Eigenschaften. Zunächst wurden
      mit 6-DMATSSa aus Streptomyces ambofaciens und 6-DMATSSv aus
      Streptomyces violaceusniger zwei
      Tryptophan-C6-Prenyltransferasen identifiziert. Die
      biochemischen Untersuchungen dieser Enzyme ergaben eine
      breite Substratspezifität. Neben einer Vielzahl an
      Indolderivaten wurden auch mehrere Hydroxynaphthaline von
      6-DMATSSa und 6-DMATSSv akzeptiert. Zudem handelt es sich um
      die erstmalige Beschreibung für
      Tryptophan-Prenyltransferasen, die sowohl DMAPP als auch GPP
      als Prenyldonor akzeptieren und die Prenylierung an derselben
      Position katalysieren. Folglich stellen die untersuchten
      6-DMATS Enzyme interessante Kandidaten für weitere
      Untersuchungen bezüglich der Akzeptanz von unnatürlichen
      Alkyl- oder Benzyldonoren dar. Bisherige Studien zu diesem
      Thema beschränken sich auf die pilzlichen C4- und
      C5-Prenyltransferasen. Im Rahmen dieses Projektes wurden
      daher die L-Tyrosin-Prenyltransferase TyrPT mit
      Tryptophan-C7-Prenyltransferase Aktivität, zwei 6-DMATS sowie
      die bakterielle 5-DMATSSc (SCO7467) analysiert. Hierzu wurde
      das Verhalten der C5-, C6- und C7-Prenytransferasen in
      Gegenwart der unnatürlichen Prenyldonoren Methylallyl-
      (MAPP), 2-Pentenyl (2-Pentenyl-PP) oder Benzyldiphosphat
      (Benzyl-PP) untersucht. Diese DMAPP-Analoga wurden von allen
      getesteten Enzymen mit unterschiedlichen, relativen
      Aktivitäten und Regioselektivitäten akzeptiert.
      C6-alkylierte/benzylierte Derivate wurden in allen Reaktionen
      identifiziert, entweder als einzelnes Produkt der beiden
      6-DMATS oder als eines der Hauptprodukte der anderen Enzyme.
      Diese Ergebnisse weisen auf eine deutliche Präferenz der fünf
      Enzyme für die Alkylierung/Benzylierung an C-6 des Indolrings
      in Gegenwart der unnatürlichen DMAPP-Derivate hin. Des
      Weiteren führte das „homology modeling“ der 5-DMATS und
      anschließende „docking“- sowie „molecular dynamics“-Studien
      mit DMAPP, MAPP und 2-Pentenyl-PP zu einer distanzbasierten
      Erklärung für die beobachteten Reaktionsergebnisse. Später
      wurde mit 6-DMATSMo aus Micromonospora olivasterospora eine
      dritte Tryptophan-C6-Prenyltransferase identifiziert und
      charakterisiert. Das auffälligste Merkmal der 6-DMATSMo ist
      die hohe relative Aktivität gegenüber D-Tryptophan. Dieses
      Resultat führte zu der vergleichenden Studie über die
      Enantioselektivität von sieben DMATS-Enzymen aus Pilzen und
      Bakterien. Für die verschiedenen Prenyltransferasen wurden
      unterschiedliche Substratpräferenzen sowie eine
      unterschiedliche Regioselektivität bezüglich der L- und
      D-Enantiomere von Tryptophan und deren methylierten Derivaten
      festgestellt. Interessanterweise bevorzugten die bakteriellen
      5-DMATSSc und 6-DMATSMo das D-Enantiomer von
      5-Methyltryptophan gegenüber dem L-Enantiomer, was in allen
      anderen Reaktionen das bessere Substrat darstellte. In
      Gegenwart des Racemats, führt die hohe Affinität zur L-Form
      zur Hemmung der D-Enantiomer-Reaktion. Weiterhin konnte eine
      reduzierte oder sogar grundlegend veränderte
      Regioselektivität der Reaktion von FgaPT2, 5-DMATSSc und
      7-DMATS mit dem D-Enantiomer von Tryptophan und
      5-Methyltryptophan beobachtet werden. Außerdem konnte mit
      5-DMATSSc erstmals eine Tryptophan-Prenyltransferase
      beschrieben werden, die eine Diprenylierung in einem
      sukzessiven Reaktionsmechanismus katalysiert. Zusammenfassend
      lässt sich sagen, dass die Identifizierung und
      Charakterisierung drei neuer 6-DMATS aus Aktinomyzeten zu
      einem besseren Verständnis bakterieller
      Tryptophan-Prenyltransferasen führen. Auf Grund der
      besonderen Eigenschaften untersuchter Prenyltransferasen
      ergibt sich schließlich die Möglichkeit, mittels neuer
      Biokatalysatoren das Repertoire alkylierter, potenziell
      aktiver Substanzen zu erweitern.