Παροδική έκφραση συνθετασών των σεσκιτερπενίων από το Cistus creticus subsp. creticus (L.) στο φυτό Nicotiana benthamiana.
Creators: name: Γιβανούδη, Στέλλα Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Σεσκιτερπένια
Ετερόλογη έκφραση(
Cistus creticus subsp. creticus
Sesquiterpenes
Heterologous expression

description: Το Cistus creticus ssp. creticus είναι ένα θαμνώδες αρωματικό φυτό το οποίο ενδημεί στην Κρήτη. Το φυτό αυτό καλύπτεται στα φύλλα, στα σέπαλα και στο βλαστό από αδενικά τριχώματα τα οποία παράγουν κατά την διαρκεια του καλοκαιριού μια αρωματική ρητίνη, το λεγόμενο λάδανο. Το λάδανο χρησιμοποιούνταν από πολύ παλιά στη λαική θεραπευτική τόσο για τις φαρμακολογικές του δράσεις όσο και για την ευχάριστη μυρωδιά του. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, μελέτες σε κυτταρικές σειρές έχουν δείξει την αντικαρκινική και αντιμικροβιακή δράση των εκχυλισμάτων αλλά και απομονωμένων ενώσεων από το φυτό αυτό. Το έκκριμα των αδενικών τριχωμάτων αποτελείται από δευτερογενείς μεταβολίτες, κυρίως τερπένια. Τα τερπένια είναι μια τεράστια ετερογενή ομάδα οργανικών ενώσεων τα οποία παράγονται από βακτήρια, μύκητες, φυτά και ζώα και τα οποία συμμετέχουν σε πλήθος βιολογικών διεργασιών (επικονιασμός, φερομόνες, προστασία από εχθρικά είδη και επικοινωνία μεταξύ των ατόμων ενός είδους), ενώ παράλληλα αποτελούν τις πρόδρομες ενώσεις από τις οποίες παράγονται γνωστές ουσίες, όπως τα καροτενοειδη, οι γιββερελλίνες, οι στερόλες, η βιταμίνη Α κ.α. Κυρίαρχες τερπενικές ενώσεις στα αδενικά τριχώματα του Cistus creticus ssp. creticus είναι τα διτερπένια, με υψηλά ποσοστά λαβδανικών διτερπενίων και τα σεσκιτερπένια (Falara et al., 2008). Στα πλαίσια της μελέτης των βιοσυνθετικών μονοπατιών παραγωγής τερπενίων στο φυτό αυτό είχαν απομονωθεί από το εργαστήριο «Βιοτεχνολογίας Φαρμακευτικών Φυτών» τρεις συνθάσες σεσκιτερπενίων: η συνθάση του β-καρυοφυλλενίου, η συνθάση του β-φαρνεσενίου και η συνθάση του γερμακρενίου Β. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των συνθασών σεσκιτερπενίων έγινε in vitro με ενζυμικές αντιδράσεις και ανάλυση των προϊόντων με αέριο χρωματογραφία-φασματοσκοπία μαζών. Ο στόχος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι ο χαρακτηρισμός των συνθασών σεσκιτερπενίων in vivo μέσω της έκφρασης τους σε ένα ετερόλογο σύστημα έκφρασης φυτικής προέλευσης, την Nicotiana benthamiana. Παράλληλα, έγιναν προσπάθειες απομονωσης και κλωνοποίησης νέων συνθασών διτερπενίων από το ίδιο φυτό. Σαν αποτέλεσμα απομονώθηκε και κλωνοποιήθηκε μια συνθάση διτερπενίων τύπου ΙΙ με αγνωστη μέχρι στιγμής λειτουργία.
description: Cistus creticus ssp. creticus is a bushy herb which is endemic to the Greek island, Crete. The plant is covered in the leaves, sepals and stems with glandular trichomes that produce during summer an aromatic resin, called Ladano. This resin is used in folk medicine for both its pharmacological effects and pleasant smell. Over the past two decades, studies have shown antitumor and antibacterial activity of extracts and compounds isolated from this plant. The secretion of the glandular trichomes consists of secondary metabolites, mainly terpenes. Terpenes are a vast heterogeneous group of organic compounds produced by bacteria, fungi, plants and animals and participate in numerous biological processes (pollination, pheromones, protection from enemies and communication between individuals of a species), while forming the precursors of carotenoids, gibberellins, sterols, vitamin A and others. Major terpene compounds isolated from the glandular trichomes of Cistus creticus ssp. creticus are diterpenes, mainly consisting of high levels of labdane diterpenes and sesquiterpenes (Falara et al., 2008). In the laboratory of «Biotechnology of Pharmaceutical Plants", three sesquiterpene synthases (beta-caryophyllene synthase, beta-farnesene synthase and germacrene B synthase) had been isolated from Cistus creticus ssp. creticus. Those sesquiterpene synthases were functionally characterized with in vitro enzymatic reactions and product analysis by gas chromatography-mass spectrometry. The objective of the present master thesis is the functional characterization of the sesquiterpene synthases in vivo through their expression in a heterologous expression system of plant origin, Nicotiana benthamiana. Furthermore, efforts have been made to isolate and clone new diterpene synthases from the same plant. As a result a type II diterpene synthase with an unknown function was isolated and cloned.