REACTIVE OXYGEN SPECIES, OXIDATIVE DAMAGE, AND ANTIOXIDANT DEFENSE MECHANISMS: IN HUMANS AND IN VITRO ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE SPIN-TRAPPING STUDIES
Creators: name: MRAKIC - SPOSTA, SIMONA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2013

description: Scopo della ricerca sviluppata durante questi tre anni di Dottorato � quello di spiegare i meccanismi sottesi alla risposta allo stress ossidativo nell'uomo a livello integrativo e molecolare. Per questo fine, nel primo anno di Dottorato, si � innanzi tutto implementato un metodo quantitativo assoluto atto a valutare la produzione dei radicali liberi. Come � noto ci� che importa � l?equilibrio tra produzione di Specie Reattive dell?Ossigeno (ROS) e la disponibilit� di difese antiossidanti. Quando questo equilibrio viene meno, si parla di Stress Ossidativo, con conseguenze a carico degli acidi nucleici, dei lipidi e delle proteine, compromettendo il metabolismo e la vitalit� cellulare, fino a indurre apoptosi o necrosi. Questo � un fenomeno ricorrente in molte malattie acute e croniche oltre che nel fisiologico processo di invecchiamento. Allo scopo si � utilizzata la tecnica di Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) accoppiata a specifiche sonde molecolari (spin trapping) per sviluppare un metodo quantitativo ?in vivo? in grado di monitorare la produzione di ROS in campioni biologici quale il sangue e sue frazioni. Gli inizi del mio periodo di Dottorato sono fortunatamente coincisi con l?acquisizione da parte dell?Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare (IBFM) del CNR (Lita di Segrate), di uno strumento EPR che risponde alle esigenze di maneggevolezza e portabilit� (e-scan Bruker BioSpin, Germania), di recente immissione sul mercato, che opera in onda continua (CW), nella banda X delle �W, in grado di rilevare concentrazioni molto basse (nM) in piccoli campioni (50 �l), utilizzando una cavit� risonante le cui propriet� ottimizzano il fattore di riempimento, conferendo un?elevata sensibilit� allo strumento. L?attendibilit� dell'efficacia del metodo sviluppato � stata verificata con correlazioni tra metodi classici enzimatici e misure EPR in vari stati: fisiologici e parafisiologici. Trattandosi della messa a punto di un metodo di misura completamente innovativo e mancando pertanto dati di letteratura cui fare riferimento, si sono rese necessarie molte prove sperimentali da campioni ematici, in un vasto gruppo di soggetti, con tantissime acquisizioni modificando e ottimizzando di volta in volta i parametri e le condizioni (T, pO2) Questo procedimento � stato lento e laborioso; una volta superate le difficolt� tecniche, si � avuto a disposizione un piccolo catalogo di misurazioni che � servito ad ottenere i primi dati sperimentali che saranno illustrati nei primi paragrafi di questa tesi. Si � inoltre cercata una correlazione statistica tra la produzione di ROS determinata con tecnica EPR ed i marcatori dello stress ossidativo ottenuti dai vari test convenzionali enzimatici riportati in letteratura quali il dosaggio da sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) e carbonili proteici (PC) in grado di quantizzare il danno ?a posteriori? prodotto dai ROS su lipidi e proteine rispettivamente. Una correlazione sistematica tra i dati EPR e i dati enzimatici non era certa, in quanto questi ultimi rivelano un danno conclamato. Tuttavia, � stata trovata una significativa correlazione (ANOVA, p&lt;0.05) in soggetti a riposo, tra la produzione di ROS/TBARS e PC (rispettivamente: r2=0.74 e r2=0.60). Per rispondere allo scopo della ricerca, abbiamo assunto come modello l?ipossia studiata 1) come situazione che induce uno sbilanciamento tra Stress Ossidativo e capacit� antiossidante e 2) nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell?equilibrio. Dall'insieme dei dati raccolti, al di l� dei risultati specifici, possiamo evincere che anche se la misura quantitativa assoluta della produzione di ROS (umol . mim-1) non pu� essere un parametro generalizzato, perch� funzione di variabili fisico-chimiche (pO2, Temperatura, concentrazione della sonda), acquisizione ed elaborazione dei parametri vanno comunque prese in considerazione. Dal calcolo dei limiti di detenzione (LOD): 30 � 10-3 mM, e quantificazione (LOQ): 100 � 10-3 mM, lo strumento si � rilevato sensibile e affidabile. Allo stesso tempo, va tenuto presente che il dato ottenuto rappresenta la produzione di ROS non tamponati dal sistema antiossidante. Per questo, si � ritenuto che la misura su campione ematico fosse rappresentativa della risposta sistemica integrativa. In particolare, il sangue capillare, oltre alla sua elevata sensibilit� e riproducibilit� (0,5% di differenza tra misure ripetute), ci ha permesso di disegnare un protocollo agile mini-invasivo. Da quanto fin qui esposto, possiamo ricavare che, al di l� della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, � una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. Nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell?equilibrio dello stress ossidativo, gli esperimenti sono stati condotti su: A) soggetti sani, che come tali sono caratterizzati da una condizione di equilibrio tra ROS e difese antiossidanti, B) soggetti affetti da patologie neurodegenerative, per i quali era logico attendersi, come confermato dalla realt�, che fossero caratterizzati da una condizione di conclamato squilibrio, rivelabile da un significativo incremento di ROS prodotti in condizioni di riposo. In soggetti sani, si sono disegnati, messi a punto e applicati differenti protocolli sperimentali, per testare l?effetto: a) dell?esercizio fisico (stato ipossico transitorio) di breve (hockeisti e nuotatori) e lunga durata (atleti di triathlon); b) dell?allenamento (nuotatori); c) dell?ipossia normobarica e ipobarica acuta e prolungata (giovani soggetti sedentari); d) dell?assunzione di molecole antiossidanti sulla produzione di ROS. In patologie neurodegenerative (pazienti affetti da: Neuropatia Diabetica (tipo II DN), decadimento cognitivo lieve (MCI) e Sclerosi Laterale Amiotrofica sporadica (sSLA)) dopo aver rilevato uno squilibrio in condizioni basali, � stato studiato l?effetto dell?esercizio/allenamento (SLA) o dell?assunzione di antiossidanti (tipo II DN) sulla possibilit� di un potenziale ripristino a valori di equilibrio. Importanti risultati sono emersi dall?analisi dei dati registrati nelle varie condizioni sperimentali e sono illustrati in questa tesi. ll tema comune di tutti i test, oltre all?evidente studio sulla produzione dei ROS, � stato quello dell?ipossia. Infatti l?Ipossia, nelle sue varie espressioni (intese come deficienze parziali o totali di O2 nel nostro organismo), � stato elemento caratterizzante in tutti i protocolli che abbiamo testato. I protocolli di studio su pazienti sono tuttora in corso; pertanto i dati illustrati devono intendersi come preliminari. Nei soggetti patologici si � costatata una differente produzione di ROS in condizioni di riposo, mostrando un valore significativamente (p&lt;0,05) pi� alto nei pazienti affetti da SLA (+20%) rispetto ai soggetti sani. L?allenamento, in questi pazienti, sembra giocare un ruolo favorevole nel diminuire la produzione di ROS: un decremento del 7% � stato calcolato nei valori a riposo pre e post allenamento. Un sicuro effetto positivo dell?allenamento controllato, dopo otto settimane, � stato osservato nei nuotatori (-25%) sulla produzione di ROS (2.24 � 0.14 ?mol � min-1). Tutti questi esperimenti sono stati condotti e i risultati ottenuti durante il secondo e terzo anno della mia Scuola di Dottorato. A parte gli specifici risultati ottenuti dal set di dati raccolti, osservazioni generali possono essere riassunte come segue: 1) Non vi � alcun modo per ottenere dati per quantificare il volume totale di ROS prodotta da un soggetto in qualsiasi condizione. Il dato EPR ricavato dalle misurazioni rappresenta l?eccesso di ROS che il sistema ha prodotto (?mol � min-1) in una determinata condizione, ed � quindi un tasso di produzione di ROS Inoltre si � scelto di effettuare la misura da sangue invece che da campioni di tessuto in modo da ottenere dati il pi� possibile sistematici. In particolare, il sangue capillare (rispetto al sangue venoso o plasma) ha dato la possibilit� di sviluppare un metodo di misurazione affidabile, relativamente semplice e mini-invasivo. Tuttavia quando si passa da misurazioni di sangue capillare a venoso, bisogna prendere in considerazione la differente pO2. (la produzione di ROS in sangue venoso � stata trovata circa il 18% inferiore a quella nel sangue capillare: 1.79 � 0.12 vs 1.48 � 0.29 ?mol�min-1 rispettivamente). 2) I dati non possono essere presi come parametri generali, poich� dipendono strettamente da variabili fisico-chimiche (T, pO2) Da tutti questi punti, si pu� evincere che, al di l� della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, � una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. 3) Tuttavia si � consapevoli che il dato fornito da EPR deve essere integrato con dati sistemici quali: analisi ematochimiche di laboratorio (ematocrito, ferro, colesterolo, piastrine, neutrofili, linfociti, monociti), saturazione dell?ossigeno, cinetica degli scambi gassosi (VO2max). Si ritiene che il metodo possa trovare applicazione i) medicina dello sport offrendo un valido aiuto nei centri sportivi per monitorare l?efficacia dell?allenamento e gli eventuali effetti dello stress provocato ed eventualmente migliorare i protocolli; ii) alla medicina di montagna per lo studio delle patologie da alta quota, poich� l?ipossia � il primo e pi� delicato problema dell?altitudine sin dalla quota media (1800m); iii) ai centri clinici/diagnostici per monitorare gli effetti delle terapie/trattamenti sulla progressione di patologia. Seconda parte della mia attivit� di ricerca, � stato lo studio in vitro dell?ipossia da un punto di vista molecolare mediante misurazioni spettroscopiche EPR. Partendo da una visione molecolare, l?ipossia orchestra una moltitudine di processi e di pathway molecolari. Nel tradizionale meccanismo dell?ipossia si ha la presenza di una proteina eme in grado di rilevare il legame reversibile di O2 il quale causa un cambiamento allosterico nell?emo-proteina: da inattivo (forma ossigenata) ad attivo (forma de-ossigenata). Quindi l'attivit� di una proteina emo � determinata dalla presenza o assenza dell?ossigeno legato. Nella presente ricerca, la rilevanza di stati ipossici, dal punto di vista molecolare, atti ad essere rilevati sia in condizioni fisiologiche che patologiche � stato attribuito all?Ossido Nitrico (NO) e al ruolo della Mioglobina (Mb). E? noto, infatti, che l?NO � un radicale libero particolarmente espresso in condizioni ipossiche in quanto � in grado di regolare la vasodilatazione, quindi aumenta l?afflusso di sangue e al tempo stesso pu� essere per� dannoso andando ad inibire la catena respiratoria a livello del complesso IV. In letteratura sono riportate cinque isoforme di Mb umana (Mb I-V) presenti nel muscolo scheletrico in percentuali diverse (Mb I: 75%; Mb II: 20%; Mb III-V: 5%) le cui funzioni non sono ancora state chiarite. Prendendo a riferimento Mb II, queste proteine differiscono solo per un singolo residuo aminoacidico: E54K (Mb I), K133N(Mb III), R139Q (Mb IV) a R139W (Mb V). Inoltre popolazioni tibetane, native dell?alta quota, presentano come risposta all?ipossia alte capacit� antiossidanti, alto flusso ematico sistemico, metabolismo ed efficienza meccanica migliore, alti livelli di metaboliti circolanti biologicamente attivi all?NO e sono caratterizzate da un significativo aumento della concentrazione di Mb a livello muscolare con particolare riferimento all? isoforma 54E (Mb II). Il presente studio, grazie all?analisi combinata EPR e simulazioni di Dinamica Molecolare (MD), contribuisce ulteriormente a sottolineare il ruolo importante svolto dalla Mb in condizioni di ipossia; inoltre segna un primo passo verso l'identificazione dei diversi ruoli svolti dalle isoforme della Mb Importanti risultati funzionali si sono ottenuti dallo studio EPR: l?NO ha capacit� di legame significativamente maggiore con l?isoforma 54E rispetto all?isoforma 54K; questa � pi� circoscritta alla struttura dello stato de-ossigenato e la capacit� di legame diventa significativamente inferiore (p&lt;0.01) e quasi identica per le due proteine in presenza di O2 anche a differenti livelli di pO2 (40 e 100 mmHg). Concludendo, osservazioni e prospettive future possono essere condensate nella convinzione, che confidiamo saranno condivise e verificate anche dal lettore, della validit� del nuovo del metodo sviluppato e dei dati raccolti. Alcuni risultati, in particolar modo quelli concernenti gli stati patologici, sono da considerarsi preliminari; tuttavia la strada da percorrere � estremamente interessante e richiede ulteriori indagini.