title: Chemical modification of OmpG and VDAC as targets for ion channel engineering
title: Chemische Modifikation von OmpG und VDAC zur Herstellung von Hybridionenkanälen
Creators: name: Hirsch, Boris
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Peptide
OmpG
Bipyridine
Native chemical ligation
Terphenyle
Chemistry and allied sciences
Native Chemische Ligation
Kronenether
Ionenkanal
Membranproteine
Voltage-Dependent Anion Channels
Porin

description: Membrane proteins like passive
      channels and pores, active transporters and receptors are
      essential for the communication between cells as well as for
      the transport of matter across the permeability barrier
      formed by cell membranes. Due to this properties, membrane
      proteins are of interest as targets for the pharmaceutical
      industry. The performance of ion channels can be modulated
      with the help of chemical as well as biological
      functionalization methods, through which insight can be
      gained into the functionality of these pores. This
      information could be further used as basis for the design of
      complex biohybrid systems, for the detection of new targets
      of drug action and for the understanding of complex
      biochemical cascades. In this work, chemical modulators for
      the functionalization of the porins OmpG and VDAC were
      prepared. The integral membrane protein OmpG, which can be
      found in the outer membrane of the Gram-negative bacterium
      Escherichia coli, shows a β-barrel fold formed by 14 β stands
      with an inner lumen of 12 ∙ 15 Å. VDAC occurs mostly in the
      outer membrane of mitochondria and forms a β-barrel
      consisting of 19 β-stands. An α-helix, which is essential for
      the gating behavior, is located inside the pore and restricts
      the inner lumen to 15 ∙ 26 Å diameter The modification of
      OmpG should be accomplished by a twofold S-alkylation of
      cysteines in the inner conductive pathway by haloacteamides.
      Therefore, two different pathways approaches were used: One
      method employed, monofunctionalized bipyridine-linkers were
      produced, which, after introducing into the pore, could form
      a stable complex with heavy metal ions like copper and hence,
      block the pore. In a more straight forward way,
      bishaloacetamides with different backbones were synthesized,
      which should form directly a molecular bar through the middle
      of the conductive pathway und reduce the conductivity. Of the
      synthesized bipyridine-linkers, one could be successfully
      reacted with OmpG and an X-ray structure of this biohybrid
      was obtained showing both bipyridine-linker covalently bound
      to the inside of the pore. ICP measurements of the copper
      proportion in the dialyzed biohydrid revealed its ability to
      bind copper while it was below the calculated copper
      saturation. However, BLM measurements for the identification
      of conductivity showed no change after the addition of
      copper(II)sulfat. For the bishaloacetamid route, the focus
      lay on terphenyl and azacrownether backbones. A water-soluble
      terphenyl and an azacrown with glycine spacers could both be
      transformed to bishaloacetamides which were reacted with
      OmpG. Both reactions showed ambiguous results towards the two
      point functionalization. The grown protein crystals of the
      complex could not be processed. For the modification of a
      VDAC mutant with a partly missing α-helix, a chemical
      modified peptide should be introduced to the protein by
      native chemical ligation (NCL). An appropriate peptide
      thioester consisting of ten amino acids was synthesized by
      SPPS and by fragment condensation. Only the peptide made by
      fragment condensation gave the desired C-terminal deprotected
      peptide in high purity. Reactions to convert this peptide
      into the ethylthioester needed for the NCL gave a mixture
      consisting of ethylthioester and methylester, which could not
      be separated. It was not possible to get a pure thioester to
      be reacted with VDAC via NCL.
description: Membranproteine wie passive Kanäle
      und Poren, aktive Transporter und Rezeptoren sind essentiell
      für die Kommunikation zwischen Zellen, als auch für den Fluss
      von Substanzen über die von der Zellmembran geformten
      Permeabilitäts-Barrieren. Aufgrund dieser Eigenschaften
      stehen Memebranproteine als Angriffsziel für Wirkstoffe im
      Interesse der pharmazeutischen Industrie. Durch chemische,
      sowie biologische Methoden zur Funktionalisierung kann das
      Verhalten von Ionenkanälen verändert werden, wodurch
      Einblicke in die Funktionsweise dieser Kanäle gewonnen wird.
      Diese Informationen können anschließend verwendet werden als
      Basis zur Gestaltung komplexer Biohybrid-Systemen, sowie um
      neue Angriffsziele für Wirkstoffe zu detektieren und um
      komplexere biochemische Kaskaden zu Verstehen. In der
      vorliegenden Arbeit wurden chemische Modulatoren zur
      Funktionalisierung der Porine OmpG und VDAC hergestellt. Das
      integrale Membranprotein OmpG, welches in der äußeren Membran
      des Gram-negativen Bakteriums Escherichia coli vorkommt,
      bildet ein β-barrel aus 14 β-Faltblättern mit einem
      Innendurchmesser von 12 ∙ 15 Å. VDAC kommt vorwiegend in der
      äußeren Membran von Mitochondrien vor und bildet ein β-barrel
      aus 19 β-Strängen. Der Innendurchmesser wird durch eine in
      die Pore reichende α-Helix, welche essentiell für das
      Schaltverhalten ist, auf 15 ∙ 26 Å begrenzt. Die
      Modifizierung von OmpG sollte über doppelte S-Alkylierung von
      Cysteinen im Porenin-nenraum mit Haloacetamiden erfolgen.
      Hierzu wurden zwei unterschiedliche Herangehens-weisen
      benutzt: Zum Einen wurden monofunktionalisierte
      Bipyridin-Linker hergestellt, welche nach Einbringen in die
      Pore mit Schwermetallen wie Kupfer einen stabilen Komplex
      bilden sollen, der die Pore blockiert. Zum Anderen wurden
      Bishaloacetamide mit unterschiedlichen Kernen synthetisiert,
      welche direkt bei der Reaktion mit OmpG eine Querverstrebung
      durch die Pore bilden und damit die Leitfähigkeit der Pore
      reduzieren sollten. Von den hergestellten Bipyridin-Linkern
      zeigte eine Verbindung erfolgreichen Umsatz mit OmpG und es
      gelang von diesem Biohybrid eine Röntgenkristallstruktur zu
      erhalten, welche zwei Bipyridin-Linker kovalent in der Pore
      gebunden zeigt. ICP-Messungen des Kupferanteils in dem
      dialysierten Biohybrid zeigten, dass dieser in der Lage ist
      Kupfer zu binden, dabei allerdings keine vollständige
      Sättigung erreicht wurde. BLM-Messungen zur Bestimmung der
      Leitfähigkeit zeigten hingegen keine Änderung nach Zugabe von
      Kupfer(II)sulfat. Bei den Bishaloacetamiden wurde der Fokus
      auf Terphenyl- und Azakronenether-Rückräder gelegt. Es gelang
      Bishaloacetamide von einem ein wasserlöslichen Terphenyl,
      sowie von einer Azakrone mit Glycinspacern herzustellen und
      mit OmpG umzusetzen. Beide Umsetzungen zeigten uneindeutige
      Ergebnisse bezüglich der Querverknüpfung, allerdings gelang
      es Proteinkristall zu erhalten, welche allerdings nicht
      prozessiert werden konnten. Zur Modifikation einer
      VDAC-Deletionsmutante sollte ein chemisch modifiziertes
      Peptid über native chemical ligation (NCL) in VDAC
      eingebracht werden. Ein entsprechender Peptidthioester aus
      zehn Aminosäuren wurde mittels SPPS sowie mittels
      Fragmentsynthese hergestellt. Nur die Fragmentsynthese
      erbrachte das gewünschte C-Terminal entschützte Peptid in
      hoher Reinheit. Reaktionen, um dieses Peptid in den
      benötigten Ethylthioester für die NCL zu überführen, führten
      zu einer Mischung aus Ethylthio- und Methylester, welche
      nicht getrennt werden konnte. Es konnte kein sauberer
      Thioester für die NCL hergestellt werden.