title: Untersuchungen zum Biosyntheseweg von Flavonolignanen in der Mariendistel Silybum marianum
Creators: name: Ditzler, Sandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Aufgrund ihrer Inhaltsstoffe ist die Mariendistel (Silybum marianum) besonders für die medizinische Therapie von Bedeutung (Valková 2020). Die Früchte und Extrakte dieser Pflanze werden bereits seit über 2000 Jahren für die Behandlung von Leber- und Gallenwegserkrankungen verwendet (Delmas et al. 2020). Darüber hinaus zeigt die Hauptwirksubstanz Silymarin eine natürliche antiinflammatorische Aktivität (Corchete 2008) sowie ein hemmendes Potential gegen verschiedene Krebsarten (Won et al. 2018). Silymarin ist ein Flavanonollignan-Gemisch aus mehreren Regioisomeren und Diastereomeren. Sie werden durch oxidative Kopplung einer Flavonoid- (Taxifolin) und einer Phenylpropanoid-Einheit (Coniferylalkohol) gebildet. Bei der Reaktion handelt es sich vermutlich um eine radikalische Kopplung (Bernards 2010), die zunächst eine Radikalbildung erfordert, welche möglicherweise durch eine Laccase oder eine Peroxidase (POD) katalysiert wird (Poppe und Petersen 2016, Bijak 2017). Danach könnten dirigierende Proteine (DIR) die regio- und stereospezifische Kopplung, die zur Bildung der einzelnen Regioisomere und Diastereomere führt, vermitteln (Pickel und Schaller 2013). Die Biosynthese beider Vorläufereinheiten erfolgt mit Hilfe mehrerer Enzyme des Phenolstoffwechsels. Die Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) ist hierbei das erste zentrale Schlüsselenzym bei der Biosynthese von Phenylpropanen und katalysiert eine nicht oxidative Desaminierung des Phenylalanins zu trans-Zimtsäure. Die Chalkonsynthase (CHS) ist ein wichtiges Enzym im Flavonoid-Biosyntheseweg und synthetisiert Naringenin-Chalkon, welches über weitere Reaktionsschritte zu Taxifolin umgewandelt wird. Die Cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) ist das erste Enzym welches Phenylpropanoid-Metabolite in den Monolignol-Weg leitet. Es katalysiert die Umwandlung von 4-Cumaroyl-, Feruloyl- und Sinapoyl-CoA mit Hilfe von NADPH zu 4-Cumaraldehyd, Coniferaldehyd und Sinapaldehyd. Im letzten Schritt des Monolignol-Biosyntheseweges bildet die Coniferylalkohol Dehydrogenase (CAD) in Abhängigkeit von NADPH aus Coniferaldehyd Coniferylalkohol. Diese Enzyme sowie der Kopplungsmechanismus selbst sind in der Mariendistel (Silybum marianum) bisher noch nicht untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die sekretorische Klasse III Peroxidase, sowie zwei dirigierende Proteine aus der Mariendistel heterolog exprimiert werden. Aufgrund der verstärkten Anwesenheit von Signalpeptiden und mehreren Glykosylierungsstellen, konnte trotz mehrfacher Methodenoptimierung keine erfolgreiche Expression der Gene verzeichnet werden. Im Gegensatz hierzu konnten jedoch PAL, CHS, CCR und CAD erfolgreich in Escherichia coli heterolog exprimiert werden. Die Mariendistel besitzt zwei PAL-Isoformen mit einer Molekülmasse zwischen 75 und 100 kDa. Proteinbiochemische Charakterisierungen ergaben Affinitäten zu L- und D Phenylalanin und L Tyrosin. Beide PALs besitzen ein Temperaturoptimum von 60 °C und ein pH-Optimum von 8,5 und 9,5. Für L Phenylalanin konnten Km-Werte von 12 und 35,2 µM, für D Phenylalanin von 146 und 236 µM und für L-Tyrosin von 2,4 und 2,6 mM ermittelt werden. Die CHS dagegen besitzt eine Proteinmasse zwischen 63 und 75 kDa. Das Enzym hat sein pH-Optimum bei pH 7,7. Das Temperaturoptimum konnte auf 40 °C bestimmt werden. Für 4 Cumaroyl-CoA konnte ein Km-Wert von 1,48 µM und für Malonyl-CoA ein Km-Wert von 12 µM bestimmt werden. Ein weiteres in dieser Arbeit charakterisiertes Enzym ist die CAD. Über die Gelelektrophorese konnte eine Proteinmasse von etwa 40 kDa ermittelt werden. Proteinbiochemische Charakterisierungen ergaben ein pH-Optimum bei pH 9,1. Das Temperaturoptimum konnte auf 55 °C bestimmt werden. Der Km-Wert für Coniferylalkohol beträgt 25 µM und für das Cosubstrat (NADP) 3,2 µM. Als letztes der charakterisierten Enzyme ist die CCR zu nennen. Dieses monomere Enzym besitzt ein Molekulargewicht zwischen 35 kDa und 48 kDa und akzeptiert mehrere Substrate: Feruloyl-CoA, gefolgt von Sinapoyl-CoA, 4 Cumaroyl-CoA und Caffeoyl-CoA. Das pH-Optimum konnte auf pH 6,5 und das Temperaturoptimum auf einen Bereich zwischen 29 °C und 34 °C festgelegt werden. Der Km-Wert für Feruloyl-CoA liegt bei 15 µM, für Sinapoyl-CoA bei 21,3 µM, für NADPH bei 23 µM und für NADH bei 68 µM. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mehrere Schlüsselenzyme aus dem Phenolstoffwechsel aus Silybum marianum identifiziert und heterolog exprimiert werden. Darüber hinaus konnten wichtige Parameter erhoben werden und so tiefere Einblicke und Erkenntnisse in die biochemischen Eigenschaften der ausgewählten Schlüsselenzyme gewonnen werden. Diese Ergebnisse bieten eine gute Grundlage für weitere Untersuchungen des pflanzlichen Phenylpropanoid-Biosynthesewegs in der Mariendistel.
description: Due to its active natural compounds, milk thistle (Silybum marianum) is particularly important for medicinal therapy (Valková 2020). Extracts of this plant are commonly used for the treatment of liver and gall bladder disorders for over 2000 years (Delmas et al. 2020). In addition, the main active ingredient silymarin shows natural anti-inflammatory activity (Corchete 2008), as well as potential inhibitory activities on various cancers (Won et al. 2018). Silymarin is a flavanonollignan mixture of several regioisomers and diastereomers. They are formed by oxidative coupling of a flavonoid (taxifolin) and a phenylpropanoid (coniferyl alcohol) moiety. The reaction putatively is a radical coupling (Bernards 2010), which requires radical formation first, possibly catalyzed by a laccase or a peroxidase (POD) (Poppe and Petersen 2016, Bijak 2017). Thereafter, dirigent proteins (DIR) presumably mediate the regiospecific and stereospecific coupling that leads to the formation of the individual regioisomers and diastereomers (Pickel and Schaller 2013). Biosynthesis of both precursor units takes place with the help of several enzymes of phenolic metabolism. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) is the first key enzyme in the biosynthesis of phenylpropanes, catalyzing a non-oxidative deamination of phenylalanine to trans-cinnamic acid. Chalcone synthase (CHS) is another important enzyme in the flavonoid biosynthetic pathway, synthesizing naringenin chalcone. Taxifolin is formed via further reaction steps. Cinnamoyl-CoA reductase (CCR) is the first enzyme that directs phenylpropanoid metabolites into the monolignol pathway. It catalyzes the conversion of 4 coumaroyl-, feruloyl and sinapoyl-CoA to 4-coumaraldehyde, coniferaldehyde, and sinapaldehyde with the help of NADPH. After that, coniferylalcohol dehydrogenase (CAD) forms coniferylalcohol using NADPH. These enzymes as well as the coupling mechanism itself have not been studied in milk thistle (Silybum marianum) yet. In this work, it was further more aimed at expressing the secretory class III peroxidase as well as two dirigent proteins from milk thistle. Due to the presence of signal peptides and several glycosylation sites, no successful expression of the genes could be recorded despite of several attempts of method optimization. However, PAL, CHS, CCR and CAD were successfully expressed heterologously in Escherichia coli. Milk thistle contains two PAL isoforms with a molecular mass between 75 and 100 kDa. Protein characterization revealed enzymatic affinities for L- and D-phenylalanine and L-tyrosine. Both PALs show a temperature optimum at 60 °C and a pH optimum at 8.5 and 9.5. Km-values for L-phenylalanine could be determined at 12 and 35.2 µM. D-phenylalanine had a Km at 146 µM and 236 µM and L-tyrosine at 2.4 and 2.6 mM. CHS possesses a protein mass between 63 and 75 kDa. The enzyme shows a pH-optimum at pH 7.7. The temperature optimum could be determined to be 40 °C. 4-Coumaroyl-CoA had a Km-value of 1.48 µM and malonyl-CoA a Km of 12 µM. Additionally, a CAD was characterized in this thesis. A protein mass of approximately 40 kDa could be determined via gel electrophoresis. Protein biochemical characterizations revealed an optimal enzyme reaction at a pH of 9.1 as well as a temperature optimum at 55 °C. Km-values were pointed out to be at 25 µM for coniferyl alcohol and 3.2 µM for the cofactor NADP. The last characterized enzyme was CCR. This monomeric enzyme has a molecular weight between 35 kDa and 48 kDa and shows substrate affinity to feruloyl-CoA, followed by sinapoyl-CoA, 4-coumaroyl-CoA and caffeoyl-CoA. The pH-optimum was found out to be at pH 6.5 and the temperature optimum ranged from 29 °C to 34 °C. The Km-value is 15 µM for feruloyl-CoA, 21.3 µM for sinapoyl-CoA, 23 µM for NADPH and 68 µM for NADH. In summary, several key enzymes from phenol metabolism were identified and expressed heterologously in this work. In addition, relevant parameters have been obtained, providing important insights and knowledge into the in vitro nature of selected key enzymes. These results provide a solid basis for further studies of the plant phenylpropanoid biosynthetic pathway in Silybum marianum.