title: Chromosome arrangement and dynamics in the budding bacterium Hyphomonas neptunium
Creators: name: Jung, Alexandra
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: ParABS
Hyphomonas neptunium
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Prokaryoten
replisome
chromosome segregation

description: Faithful chromosome replication and segregation are essential for every living cell and must be tightly coordinated with other cell cycle events such as cell division. Our knowledge about prokaryotic chromosome dynamics is based on studies of only a few model organisms that divide by binary fission and are mostly characterized by a rod-like morphology. To broaden our insight into bacterial chromosome segregation, our lab has recently started to analyze chromosome dynamics in the marine alphaproteobacterium Hyphomonas neptunium, which divides by budding at the tip of the stalk and uses its stalk as a reproductive structure. This mode of reproduction distinguishes H. neptunium from so far studied model organisms and renders it an exciting candidate for the study of chromosome dynamics, since the duplicated chromosome must transit the stalk to reach the newly generated daughter cell. Recent work has revealed that the H. neptunium chromosome is segregated in a unique two-step process. At first, one of the duplicated origins is segregated within the mother cell, possibly in a ParABS-dependent manner, and remains at the stalked mother cell pole until a visible bud has formed at the tip of the stalk. In a second step, it is then segregated through the stalk into the bud. Several lines of evidence suggest that the transport through the stalk is mediated by a novel, yet unidentified, segregation mechanism. Commonly, chromosome replication and segregation occur concomitantly in bacteria. However, this two-step segregation mechanism implies a temporal uncoupling of chromosome replication and segregation through the stalk, reminiscent of eukaryotic mitosis.  In this work, we analyzed the role of the ParABS system in chromosome segregation of H. neptunium. The ParABS system was shown to be essential for cell viability and chromosome segregation. Impairment of ParA functioning leads to morphological alterations and incomplete origin segregation within the mother cell and, consequently, hampers chromosome segregation through the stalk. This shows that the ParABS system mediates origin segregation within the mother cell. It also implies that chromosome segregation within the mother cell and through the stalk are sequential processes. Furthermore, we analyzed the role of PopZ and SMC in H. neptunium, since these proteins were shown to be involved in chromosome segregation in other bacteria. PopZ localizes to the pole opposite the stalk in the newly generated bud and appears to play only a minor role in the positioning of the ParABS partitioning machinery. SMC seems to be essential in H. neptunium and shows a similar localization pattern as ParB. Determination of the location of seven genomic loci in new-born cells revealed that the chromosome shows a longitudinal arrangement with the origin located at the flagellated pole and the terminus at the opposite cell pole. The other loci are arranged between both cell poles in a linear order that correlates with their position on the genomic map. Moreover, analysis of chromosome dynamics indicates that the ParB/parS complex is the region to be segregated first within the mother cell and also through the stalk, emphasizing its central role in the segregation process. As mentioned above, the observed two-step chromosome segregation mechanism suggested a temporal uncoupling of chromosome replication and its segregation through the stalk. To investigate the coordination between these two processes in more detail, we followed replisome dynamics by fluorescence labeling of different replisome components. The replication machinery shows a dynamic localization within the mother cell: in cells that are most likely at the swarmer-to-stalked cell transition as well as in stalked cells, it assembles at the pole opposite the (future) stalk and moves, via midcell, close to the stalked cell pole, where it disassembles again. This localization pattern is consistent with the observed location of the origin and terminus region. Furthermore, the replisomes appear to track independently along the two chromosome arms. Co-localization of ParB (origin) and DnaN (replisome) revealed that a large part of the chromosome is replicated before its segregation through the stalk commences, indicating that these processes are partially temporally uncoupled. Collectively, these observations expand our insight into chromosome dynamics in H. neptunium and suggest that it combines previously described segregation mechanisms, such as the ParABS system, with a novel segregation mechanism that awaits discovery.
description: Korrekte Chromosomenreplikation und die akkurate Segregation des Chromosoms sind essentiell für alle  lebenden Zellen und müssen gut mit anderen Prozessen des Zellzyklus, wie z.B. der Zellteilung, abgestimmt  sein. Unser bisheriges Wissen über prokaryotische Chromosomendynamik basiert auf Studien  einiger weniger Modellorganismen, welche sich durch binäre Teilung fortpflanzen und meist eine stäbchenförmige  Morphologie besitzen. Um unser Wissen über bakterielle Chromosomensegregation zu erweitern,  wurde vor kurzem in unserem Labor begonnen, die Chromosomendynamik im marinen Alphaproteobakterium  Hyphomonas neptunium zu untersuchen. H. neptunium teilt sich durch Knospung an der  Stielspitze und verwendet seinen Stiel als reproduktive Struktur. Diese Art der Teilung unterscheidet  H. neptunium von den bisher untersuchten Modellorganismen und macht es zu einem interessanten Kandidaten  für die Analyse der Chromosomendynamik in Bakterien, da das duplizierte Chromosom zunächst  den Stiel durchqueren muss, um die neu gebildete Tochterzelle zu erreichen. Neueste Studien zeigen, dass  die Chromosomensegregation in einem einzigartigen, zweistufigen Mechanismus abzulaufen scheint. Zunächst  wird die duplizierte centromer-ähnliche Region innerhalb der Mutterzelle, möglicherweise durch  einen ParABS-abhängigen Mechanismus, an deren gestielten Pol segregiert und verweilt dort, bis sich eine  sichtbare Knospe an der Stielspitze gebildet hat. Anschließend wird die centromer-ähnliche Region in  einem zweiten Schritt durch den Stiel in die Knospe transportiert. Verschiedene Anhaltspunkte deuten  darauf hin, dass dieser zweite Segregationsschritt durch einen neuen, bisher unbekannten Mechanismus  vermittelt wird. Chromosomenreplikation und -segregation finden in Bakterien gewöhnlich gleichzeitig  statt. Der zweiteilige Segregationsmechanismus lässt allerdings darauf schließen, dass die Chromosomenreplikation  und die Segregation durch den Stiel, ähnlich wie bei der eukaryotischen Mitose, zeitlich entkoppelt  sind.  In dieser Arbeit wurde die Rolle des ParABS-Systems in der Chromosomensegregation in H. neptunium  genauer analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ParABS-System essentiell für die Lebensfähigkeit  der Zelle sowie für die Chromosomensegregation ist. Die Beeinträchtigung der Funktionalität von ParA  führte zu einer Veränderung der Zellmorphologie sowie zu einer unvollständigen Segregation der centromer-  ähnlichen Region innerhalb der Mutterzelle, was dazu führte, dass auch die Segregation durch den  Stiel nicht mehr stattfand. Dies zeigt, dass das ParABS-System die Segregation der centromer-ähnlichen  Region in der Mutterzelle vermittelt und dass es sich bei der Segregation innerhalb der Mutterzelle und  durch den Stiel um sequenzielle Prozesse handelt. Weiterhin wurde die Rolle von PopZ und SMC in  H. neptunium untersucht, da diese Proteine in anderen Bakterien eine zum Teil wichtige Rolle in der Chromosomensegregation  spielen. PopZ lokalisiert in der entstehenden Knospe am Pol gegenüber des Stiels  und es konnte gezeigt werden, dass es eine untergeordnete Rolle in der Positionierung der ParABSSegregationsmaschinerie  spielt. SMC scheint essentiell in H. neptunium zu sein und zeigt ein ähnliches Lokalisationsmuster  wie ParB (centromer-ähnliche Region).  Die Analyse sieben verschiedener genomischer Loci in neugeborenen Zellen zeigte, dass das Chromosom  entlang der Längsachse der Zelle ausgerichtet ist, wobei die centromer-ähnliche Region am flagellierten  und die Terminusregion am gegenüberliegen Zellpol liegt. Die anderen Loci zeigen eine lineare Anordnung  zwischen den Zellpolen, welche mit ihrer Position in der chromosomalen Sequenz korreliert. Weiterhin  wurde gezeigt, dass der ParB/parS-Komplex als erstes innerhalb der Mutterzelle und anschließend  durch den Stiel segregiert wird, was die zentrale Rolle des Komplexes im Segregationsprozess verdeutlicht.  Wie bereits erwähnt, deutet der zweiteilige Segregationsmechanismus auf eine zeitliche Entkopplung von  Chromosomenreplikation und -segregation durch den Stiel hin. Um die Koordination dieser Prozesse  genauer zu untersuchen, wurden Fluoreszenzfusionen verschiedener Replisomkomponenten generiert und  deren Lokalisationsmuster analysiert. Die Replikationsmaschinerie zeigte eine dynamische Lokalisation  innerhalb der Mutterzelle: in Zellen, die sich sehr wahrscheinlich am Übergang vom Schwärmer- zum Stielzellstadium befinden, sowie in gestielten Zellen wird das Replisom am Pol gegenüber des (zukünftigen)  Stiels assembliert und bewegt sich über die Zellmitte in die Nähe des gestielten Pols, wo es anschließend  wieder deassembliert wird. Dieses Lokalisationsmuster korreliert mit der Lage der Ursprungs- und  Terminusregion innerhalb der Zelle. Die beiden Replisomen scheinen unabhängig voneinander entlang der  beiden Chromosomenarme zu wandern. Die Kolokalisation von ParB (centromer-ähnliche Region) und  DnaN (Replisom) zeigte, dass häufig ein Großteil des Chromosoms bereits repliziert ist, bevor dessen  Segregation durch den Stiel erfolgt. Dies bedeutet, dass die Replikation zum Teil zeitlich von der Segregation  durch den Stiel entkoppelt ist.  Zusammenfassend erweitern diese Beobachtungen unseren Einblick in die Chromosomendynamik in  H. neptunium und deuten darauf hin, dass dieser Organismus bereits beschriebene Segregationsmechanismen,  wie das ParABS-System, mit einem neuartigen Mechanismus kombiniert, den es aufzuklären gilt.