title: In vivo and in vitro characterization of gp44, a putative toxin of φCh1
Creators: name: Athanasiou, Alexandros Vaios
Publisher: name: :none
Year: 2020

description: Toxin-Antitoxin-Systeme bestehen aus einem stabil exprimierten Toxin und dem konjugierten Antitoxin. Die DNA-Sequenzanalyse von ORF43/44 hat eine Homologie zum VapBC Typ II TA-System ergeben. ORF44 existiert als Operon mit dem Antitoxin kodierenden ORF43, was zu einer Transkriptions- und Translationskopplung führt. Frühere Studien haben die Funktion von ORF44 als eine scheinbare Ribonuklease-Endonuklease nahelegt, die einzelsträngige RNA sequenzabhängig spaltet. Dies wurde durch die Identifizierung einer PIN-Domäne in gp44 mittels einer Pfam Analyse verstärkt. Zusätzliche Befunde weisen auf eine Repressoraktivität von gp44 hin und somit eine mögliche Rolle von ORF43/44 bei der Regulierung der Transkription viraler Gene und des Fortschreitens des Lysezyklus des φCh1 Myovirus, das das haloalkaliphile Archäon Natrialba magadii infiziert. Genetische Analysen von Haloviren werden selten berichtet und die in vivo Rollen und Funktionen ihrer Proteine bleiben unbekannt. In dieser Studie werden die möglichen Rollen von ORF43 und ORF44 sowie ihre Auswirkungen auf die Infektiosität von φCh1 untersucht. Zu diesem Zweck wurden phänotypische Analysen, Virustiter-Ansätze und Proteinanalysen mittels Western Blot durchgeführt. Die ORF44-Deletionsmutante wurde mittels homologer Rekombination durch das Einsetzen der Novobiozin-Resistenzkassette konstruiert. Passagierungs-Experimente haben eine vollständige Aufhebung des Lysezyklus und eine starke Abnahme der Produktion des Hauptkapsidproteins E gezeigt. Eine Erhöhung der Salzkonzentration im Medium hat zur Wiederherstellung des normalen Lyseverhaltens und zu einer gleichmäßigen Expression von Protein E geführt. Im Vergleich zum Wildtyp-Stamm hat der L11-Δ44 Stamm weiterhin eine 24 Stunden-frühere Lyse und eine erhöhte Produktion von Viruspartikeln angezeigt. Die Western-Blot-Analyse hat eine Verkürzung von gp34 beim Vorhandensein von ORF44 nachgewiesen. Die konstitutive Expression von ORF43 und ORF44 im Virus-freien Stamm N. magadii L13 Stamm hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Plattierungseffizienz von φCh1. Die induzierte Überexpression von ORF44 unter der Kontrolle des Tryptophan Promotors tnaN hat die Expression von Protein E und der Methyltransferase beeinflusst. Die Überexpression von ORF43 auf einer Gendosis- abhängigen Weise hat ähnliche Ergebnisse geliefert. In beiden Fällen wurde kein Effekt auf das Schwanzfaserprotein gp34 beobachtet. ORF43 und ORF44 wurden zusammen mit dem Schwanzfaserprotein gp34 in den Schlüsselmodellorganismus Haloferax volcanii transformiert, der zur Verbesserung des Verständnisses der archaealen Genomik dient, um die mutmaßliche Funktion von gp44 als Repressor oder Endoribonuklease weiter zu untersuchen. In Gegenwart von ORF44 wurde eine starke Wachstumsverzögerung sowie eine starke Unterregulierung von gp34 beobachtet, während ORF43 einen verstärkenden Effekt aufgewiesen hat. Schließlich wurde versucht, das gp44 Protein unter nativen Bedingungen zu reinigen. Die Isolierung hat aufgrund des Mangels an Informationen und der extremen Bedingungen, unter denen diese Proteine exprimiert werden, als schwierig erwiesen und war somit erfolglos.