title: The Cav- und KCa/SK- ion channel families in Locus Coeruleus neurons of the mouse - Functional characterization and implications for Parkinson’s disease
title: Die Cav- und KCa/SK- Ionenkanalfamilien in Locus Coeruleus Neuronen der Maus - Funktionelle Charakterisierung und Implikationen für die Parkinson-Erkrankung
title: Die Cav- und KCa/SK- Ionenkanalfamilien in Locus Coeruleus Neuronen der Maus - Funktionelle Charakterisierung und Implikationen für die Parkinson-Erkrankung
Creators: name: Matschke, Lina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Locus Coeruleus, Parkinson´s disease
Sciences
Naturwissenschaften
calciumaktivierter Kaliumkanal
Locus coeruleus , Parkinson-Krankheit
Kaliumkanal
calcium activated potassium channel
Calciumkanal
Patch Clamp
calcium channel

description: Der Locus Coeruleus (LC) ist ein
      noradrenerger Kern des Hirnstammes, der an der Regulation
      vielfältiger, physiologischer Prozesse beteiligt ist.
      Störungen des LC-Noradrenalin Systems sind in der Pathogenese
      verschiedener psychiatrischer und neurodegenerativer
      Erkrankungen beteiligt und sind ein frühes Kennzeichen der
      Parkinson-Krankheit (PD). Während die Degeneration von
      Neuronen der Substantia Nigra pars compacta (SNpc) den
      motorischen Leitsymptomen der PD unterliegt, wird der
      ausgeprägte Verlust noradrenerger Neurone des LC für einen
      Großteil der nichtmotorischen Dysfunktionen dieser Erkrankung
      verantwortlich gemacht. Die Ursachen für die selektive
      Vulnerabilität der LC Neurone in der Pathogenese der PD sind
      bislang jedoch weitestgehend unklar. Um eine tonische
      Noradrenalin-Ausschüttung zu gewährleisten, verfügen LC
      Neurone über einen intrinsischen Schrittmachermechanismus,
      welcher direkt an intrazelluläre Überlebenssignalwege
      gekoppelt ist. So führt aktivitätsabhängiger, durch L-Typ
      Ca2+ Kanäle vermittelter Ca2+ Influx, zu oxidativem Stress in
      LC Neuronen und anderen von der PD Pathogenese betroffenen
      Kerngebieten. Des Weiteren wird eine neuroprotektive Rolle
      Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle postuliert, welche den
      Schrittmachermechanismus dopaminerger SNpc Neurone
      modulieren. Die Identifikation von Ionenkanälen, die der
      elektrischen Aktivität unterliegen, kann somit zu einem
      besseren Verständnis der selektiven Vulnerabilität coerulärer
      Neurone führen. Innerhalb dieser Arbeit wurden daher mittels
      RT-PCR Expressionsanalysen und Patch-Clamp Messungen in
      akuten Hirnstammschnitten die molekulare Komposition und
      Funktion verschiedener Ionenkanalfamilien in LC Neuronen der
      Maus charakterisiert. Zunächst erstellte ich ein Profil
      bezüglich der elektrophysiologischen Charakteristika und der
      Expression kaliumselektiver Ionenkanäle coerulärer Neurone.
      Diese Analysen zeigten, dass der elektrophysiologische
      Phänotyp der LC Neurone durch regelmäßige, breite
      Aktionspotenziale mit einer ausgeprägten
      Nachhyperpolarisation, die um ein depolarisiertes
      Membranpotenzial fluktuieren, gekennzeichnet ist. Mittels der
      Expressionsanalyse konnte ich die molekulare Komposition
      spannungsabhängiger Kaliumkanäle aufklären, die
      wahrscheinlich den A-Typ K+ Strom und den persistierenden K+
      Strom der LC Neurone vermitteln. Als A-Typ Kaliumkanäle
      wurden unter anderem Kv4.3 sowie Kv1 in Kombination mit Kvβ1
      detektiert, welche durch das oxidative Potenzial der Zelle
      reguliert werden und deshalb unter pathologischen Bedingungen
      mit gestörter Funktion der Mitochondrien von Bedeutung sein
      könnten. Des Weiteren detektierte ich Amplifikate der GIRK
      Kanal Unterheinheiten GIRK-1 und GIRK-4 sowie verschiedene
      K2P Kanal-Untereinheiten, welche an der Aufrechterhaltung des
      Ruhemembranpotenzials zentraler Neurone beteiligt sind. Zur
      funktionellen Charakterisierung spannungsabhängiger Ca2+
      Kanäle führte ich RT-PCR Expressionsanalysen sowie
      Patch-Clamp Messungen in Kombination mit L- und T-Typ Ca2+
      Kanal Blockern durch. Diese Experimente zeigten, dass sowohl
      Ca2+ Kanäle der Unterfamilien Cav1 als auch Cav3 in LC
      Neuronen exprimiert sind und eine ausgeprägte „low voltage“
      aktivierte Ca2+ Leitfähigkeit vermitteln. Die Analyse der
      Aktionspotenzial-Folgen ergab, dass weder die Inhibition von
      L- noch von T-Typ Ca2+ Kanälen allein die Feurrate oder die
      Aktionspotenzial-Parameter der LC Neurone verändert. Die
      kombinierte Applikation der Kanal-Blocker führte jedoch zu
      einer signifikanten Reduktion der Nachhyperpolarisation und
      daraus resultierend zu einer Beschleunigung der Feuerrate.
      Diese Ergebnisse beschreiben erstmals die funktionelle
      Expression von T-Typ Ca2+ Kanälen in LC Neuronen und
      demonstrieren ihre Rolle bei der Modulation des
      Schrittmachermechanismus im Zusammenspiel mit L-Typ Ca2+
      Kanälen. T-Typ Ca2+ Kanäle sollten demnach neben den
      „low-voltage“ aktivierten L-Typ Ca2+ Kanälen als Kandidaten
      in Betracht gezogen werden, die aktivitätsabhängigen
      oxidativen Stress im Kontext pathologischer Bedingungen
      vermitteln könnten. Im Rahmen der funktionellen
      Charakterisierung Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle detektierte
      ich die Expression der SK Kanal Familienmitglieder SK1, SK2
      und SK3 in LC Neuronen. Mittels Patch-Clamp Messungen in
      Kombination mit dem selektiven SK Kanal Blocker Apamin und
      dem positiven SK Kanal Modulator NS309 konnte ich
      demonstrieren, dass SK Kanäle maßgeblich für die während der
      Nachhyperpolarisation fließenden K+ Auswärtsströme
      verantwortlich sind. Während Aufnahmen der
      Aktionspotenzialabfolgen bewirkte die Inhibition der SK
      Kanäle eine Reduktion der Nachhyperpolarisation und eine
      beschleunigte Feuerrate, während ihre Aktivierung zu einer
      Vergrößerung der Nachhyperpolarisation und einer
      verlangsamten Frequenz führte. SK Kanäle können demnach als
      wichtige Regulatoren der Schrittmacherfrequenz von LC
      Neuronen angesehen werden. Mittels Calcium Imaging
      Experimenten im in vitro Glutamat- und
      Rotenon-Toxizitätsmodell konnte ich darüber hinaus zeigen,
      dass die pharmakologische SK Kanal Aktivierung die
      Dysregulation der Ca2+ Homöostase unter toxischen Bedingungen
      verhindert. Mittels Patch-Clamp Messungen konnte ich erstmals
      demonstrieren, dass die akute Rotenon-Exposition eine
      Depolarisation und eine Steigerung der
      Aktionspotenzial-Frequenz in LC Neuronen induziert, welche
      durch die SK Kanal Aktivierung unterbunden werden konnte.
      Stereologische Analysen zeigten schließlich, dass die SK
      Kanal Aktivierung mit NS309 signifikant der Degeneration von
      LC Neuronen im in vitro Rotenon- Toxizitätsmodell
      entgegenwirkt. Die Aktivierung von SK Kanälen wird demnach
      als ein vielversprechender Ansatzpunkt zur Neuroprotektion
      des LC während früher Stadien der PD Pathogenese
      postuliert.
description: The Locus Coeruleus (LC) is a
      noradrenergic nucleus of the brainstem that plays a major
      role in the regulation of versatile physiological processes.
      Dysfunction of the LC noradrenergic system is involved in
      psychiatric and neurodegenerative diseases and is an early
      hallmark of Parkinson´s disease (PD). While degeneration of
      dopaminergic Substantia Nigra pars compacta (SNpc) neurons
      accounts for the motor symptoms observed in PD patients, the
      extensive loss of noradrenergic LC neurons is responsible for
      most of the non-motor symptoms that occur in early stages of
      the disease. However, the reasons why LC neurons are
      selectively vurnerable during the pathogenesis of PD are only
      poorly understood. To warrant a permanent release of
      Noradrenaline LC neurons possess an intrinsic pacemaking
      mechanism, which is ultimately coupled to cell survival
      signaling pathways. It is suggested that activity-dependent
      Ca2+ Influx, mediated by L-type Ca2+ channels, leads to
      mitochondrial oxidant stress in LC neurons and other
      PD-related brain regions. In addition, a neuroprotective
      function of Ca2+ activated potassium channels that modulate
      pacemaking of dopaminergic SNpc neurons, is proposed.
      Therefore, the analysis of ion channels underlying the
      autonomous electrical activity of LC neurons can lead to a
      better understanding of the vulnerability of these neurons.
      In the present study, I performed RT-PCR expression analysis
      and utilized patch-clamp recordings of in vitro brainstem
      slices to characterize the molecular composition and function
      of distinct ion channel families in mouse LC neurons. First,
      a profile regarding the electrophysiological characteristics
      and the expression of potassium selective ion channels in LC
      neurons was compiled. These analyses revealed an
      electrophysiological phenotype of LC neurons that was marked
      by regular, broad action potentials with pronounced
      afterhyperpolarizations fluctuating around a depolarized
      membrane potential. Utilizing RT-PCR expression analyses the
      molecular composition of voltage dependent potassium channels
      that most probably mediate the A-type K+ and the persistent
      K+ currents of LC neurons was elucidated. Among others, the
      A-type channels Kv4.3 and Kv1 in combination with Kvβ1 were
      detected. These channels are modulated by the oxidative
      potential of a cell and could therefore play a role during
      pathological conditions where mitochondrial function is
      impaired. In addition, expression of the GIRK channel
      subunits GIRK-1 and GIRK-4 as well as distinct K2P channel
      subunits, that are involved in setting the resting membrane
      potential of central neurons, was detected. In the course of
      the functional characterization of voltage dependent Ca2+
      channels I utilized RT-PCR expression analyses as well as
      slice patch clamp recordings in combination with L-type and
      T-type Ca2+ channel blockers. These experiments showed the
      expression of both Cav1 and Cav3 subtypes in LC neurons
      mediating a pronounced low-voltage activated Ca2+
      conductance. Analyzing action potential trains, I revealed
      that neither L-type nor T-type Ca2+ channel antagonism alone
      leads to a change in firing frequency or action potential
      properties. However, a combined application of antagonists
      significantly decreased the afterhyperpolarization, resulting
      in an increased firing frequency. Hence, I report for the
      first time the functional expression of T-type Ca2+ channels
      in LC neurons and demonstrate their role in modulating the
      pacemaking mechanism of LC neurons by working in concert with
      L-type Ca2+ channels. Next to L-type Ca2+ channels, T-type
      Ca2+ channels should therefore be taken into account as
      potential candidates in mediating activity-dependent oxidant
      stress under pathological conditions. In the course of the
      functional characterization of Ca2+ activated potassium
      channels in LC neurons the expression of the SK channel
      subtypes SK1, SK2 and SK3 was revealed. Using slice patch
      clamp recordings in combination with the selective SK channel
      antagonist Apamin and the positve SK channel modulator NS309
      I display that SK channels mediate K+ outward currents that
      flow during the afterhyperpolarization of LC neurons.
      Recordings of spike trains elucidated that inhibition of SK
      channels leads to decreased afterhyperpolarizations and an
      increased firing frequency whereas activation of these
      channels results in augmented afterhyperpolarizations and a
      decelerated firing frequency. Hence, SK channels can be
      considered as important regulators of LC neuron pacemaking.
      Using Calcium Imaging experiments in in vitro models of
      glutamate and rotenone toxicity I revealed that the
      pharmacological SK channel activation prevents a
      dysregulation of the intracellular Ca2+ homeostasis.
      Additionally, my patch clamp experiments demonstrated for the
      first time that acute rotenone exposure induces a significant
      depolarisation and an increase of firing frequency in LC
      neurons which could be prevented by SK channel activation.
      Eventually, stereological analyses showed that SK channel
      activation via NS309 significantly counteracts the
      degeneration of LC neurons induced by toxic concentrations of
      rotenone in vitro. Thus, the activation of SK channels is
      proposed as a promising target to protect LC neurons in early
      stages of the PD pathology.