title: Etablierung und Untersuchung artifizieller Multi- Replikon Systeme im Alphaproteobakterium Sinorhizobium meliloti
title: Establishment and Analysis of Artificial Multi-Replicon Systems in the Alphaproteobacterium Sinorhizobium meliloti
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Wagner, Marcel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Biotechnologie
Genom-Editierung
Synthetische Biologie
Genome Editing
Synthetic Biology

description: Die vorliegende Arbeit beschreibt Studien zur pABC-Vektorfamilie sowie zu artifiziellen
Genomfusionen, aus denen sich zukünftige hybride Genomkonfigurationen im α-Proteobakterium
Sinorhizobium meliloti (Synonym: Ensifer meliloti) ableiten lassen. Diese dienen dem Verständnis von
genomischen Organisationsprinzipien und Replikationsmechanismen sowie der Weiterentwicklung der
Methoden zur Genomeditierung in S. meliloti und verwandten Organismen innerhalb der α-
Proteobakterien. Das neuartige pABC-Vektorsystem wurde in vorangegangenen Arbeiten für S. meliloti
entwickelt. Es zeigte sich, dass die pABC-Vektorfamilie als funktionelle Erweiterung des dreigeteilten
S. meliloti Genoms nutzbar ist. Im Kontext dieser Arbeit wurde die Stabilität dieses modularen
Replikonsystems unter metabolischer Belastung, durch die Expression des Lux-ähnlichen Regulators
ExpR untersucht. Ebenso wurde eine über S. meliloti hinausgehende Kompatibilität des pABCVektorprinzips
gezeigt, indem pABC-Derivate speziell für Methylorubrum extorquens AM1 entwickelt
wurden, der als Plattformorganismus für eine zukünftige C1-Bioökonomie relevant ist. Eine weitere
Optimierung des pABC-Replikonsystems wurde durch die Entfernung von Erkennungssequenzen von
Typ IIS Restriktionsendonukleasen in mehreren Vektormodulen erreicht, wodurch die Nutzung
effizienter modularer Klonierungsstrategien (MoClo) ermöglicht wird. Eine Ergänzung der Vektoren
mit zusätzlichen Funktionsmodulen zur ortsspezifischen Rekombination oder neuen
Assemblierungsmöglichkeiten erweiterte die Anwendungsmöglichkeiten des pABC-Systems zur
Genomeditierung. Abschließend konnte gezeigt werden, dass pABC-basierte genetische Schaltkreise in
S. meliloti eine leistungsfähige Alternative zu deren genomischer Integration darstellen können.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Konstruktion und Charakterisierung von
unterschiedlichen Fusionen des dreiteiligen S. meliloti Genoms. Physiologische Untersuchungen
zeigten, dass Morphologie, Wachstum und die Fähigkeit, eine funktionelle Symbiose mit Medicago
sativa einzugehen, in den Genomfusionsvarianten kaum beeinflusst wurden. Lediglich unter besonderen
Stressbedingungen oder bei ungünstiger Replichor-Komposition zeigten sich Unterschiede im Vergleich
zum Wildtyp-Stamm. Mit Hilfe eines speziell modifizierten Fluoreszenzmarkierungssystem wurde die
räumlich-zeitliche Organisation und Koordination der Segregation der Fusionsgenome während des
Zellzyklus charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Schlüsselelemente der Genompartitionierung
weitgehend erhalten blieben. In einem S. meliloti-Stamm, der ein Fusionsprodukt aus Chromosom,
pSymA und pSymB trug, wurde festgestellt, dass sowohl die Replikationsursprünge der sekundären
Replikons, als auch der Partitionierungsapparat von pSymB nicht mehr essenziell waren. Dieses Triple-
Fusionsderivat ohne die Replikationsursprünge der sekundären Replikone zeigte allerdings deutlich
unsymmetrische Replichor-Verhältnisse sowie abnormale Lokalisations- und Segregationsmuster des
chromosomalen Replikationsursprungs. Als Suppressoren der ungünstigen Replichorkomposition
konnte durch Sequenzierung der jeweiligen Genome eine Missense-Mutation im Gen für die
Histidinkinase CckA sowie eine partielle Inversion des fusionierten Replikons identifiziert werden.