Συμβολή στην παθολογοανατομική μελέτη της Δονακίωσης του λαβρακιού (Dicentrarchus labrax):
Creators: name: Τελιούσης, Κωνσταντίνος Χ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Δονακίωση
Λαβράκι
V. anguillarum
Ιστοπαθολογία
Vibriosis
Seabass
Histopathology

description: Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκαν τρεις πειραματικές μολύνσεις ιχθυδίων λαβρακιού και χρησιμοποιήθηκαν δύο βακτηριδιακά στελέχη του V. anguillarum, το Van1 και το Van731. Το σύνολο των πειραματικών μολύνσεων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο της εμβάπτισης. Το Van1 είναι φυσικό στέλεχος V. anguillarum που διαπιστώσαμε ότι διέθετε ένα πλασμίδιο μεγέθους 67Kb, το οποίο ονομάσαμε pKTP. Το pKTP είναι πλασμίδιο όμοιο με το pJM1 και υπεύθυνο για την παραγωγή σιδηροφόρου μορίου από το στέλεχος. Tο Van731 είναι γενετικά τροποποιημένο στέλεχος που δημιουργήσαμε από το Van1 με θερμική καταπόνηση. To Van731 δεν διαθέτει το pKTP πλασμίδιο. Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο της PCR, με τη χρήση του γονιδίου amiB. Η επιτυχής αφαίρεση του πλασμιδίου και η αδυναμία σύνθεσης σιδηροφόρου μορίου από το Van731 ελέγχθηκε σε CAS agar και επιβεβαιώθηκε με PCR με τη χρήση των γονιδίων angR και angH. H δυνατότητα παραγωγής ισταμίνης από τα στελέχη επιβεβαιώθηκε με HPLC. Η πρώτη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της κινητικής του Van1. Ο έλεγχος της παρουσίας του βακτηριδίου στους ιστούς έγινε με χρώση κατά Gram και επιβεβαιώθηκε με FISH. Για τον υβριδισμό χρησιμοποιήθηκαν οι ιχνηθέτες Vav3 (ειδικός για το V. anguillarum) και Eub338 κοινός για πολλά βακτηριδιακά γένη. Από τα αποτελέσματα της πρώτης πειραματικής μόλυνσης προκύπτει, ότι πύλη εισόδου του βακτηριδίου στον οργανισμό του ψαριού, με τη μέθοδο που εφαρμόστηκε, αποτελεί το δέρμα. Το βακτηρίδιο εντοπίστηκε σε μικρά αθροίσματα στο χόριο του δέρματος στις 20 ώρες μετά τη μόλυνση και σχεδόν ταυτόχρονα στο σπλήνα και στο περιτόναιο. Στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση το βακτηρίδιο διαπιστώθηκε στο παρέγχυμα και τα αγγεία του συνόλου των οργάνων που εξετάστηκαν. Η δεύτερη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για να ελεγχθεί η προκαλούμενη από τα στελέχη Van1 και Van731 θνησιμότητα. Η μέση θνησιμότητα που προκλήθηκε από τα δύο στελέχη υπολογίστηκε στο 87,5% και 2,5% αντίστοιχα. Δεδομένου ότι τα δύο στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν διαφέρουν μόνο στην παρουσία του πλασμιδίου pKTP στο Van1, αποδεικνύεται ότι η προκαλούμενη από το βακτηρίδιο θνησιμότητα οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στο πλασμίδιο που το βακτηρίδιο διαθέτει και στο σύστημα δέσμευσης σιδήρου, που κωδικοποιείται από το πλασμίδιο. Η τρίτη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για να περιγραφούν οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις της Δονακίωσης από V. anguillarum στο λαβράκι και να διερευνηθεί σε επίπεδο αλλοιώσεων ο ρόλος του συστήματος δέσμευσης σιδήρου που διαθέτει το βακτηρίδιο. Σημαντικότερες αλλοιώσεις από τη μόλυνση με το Van1 προκλήθηκαν στο δέρμα, το σπλήνα και την καρδιά, ηπιότερες στο ήπαρ, τον κεφαλικό και σωματικό νεφρό, τα βράγχια, το οπίσθιο έντερο και τη νηκτική κύστη, ενώ ελάχιστες ήταν οι αλλοιώσεις στα υπόλοιπα όργανα. Κυκλοφορικές διαταραχές που συμπεριλάμβαναν οιδήματα, διάταση και συμφόρηση αγγείων και αιμορραγίες, νεκρώσεις και ήπια φλεγμονώδη αντίδραση χαρακτήρισαν την ιστοπαθολογική εικόνα της νόσου στα διάφορα όργανα. Οι αλλοιώσεις αφορούσαν τα ίδια όργανα, αλλά ήταν σημαντικά ηπιότερες στα ιχθύδια που μολύνθηκαν με το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος Van731. Το σύστημα δέσμευσης σιδήρου, που διαθέτει το βακτηρίδιο αποδεικνύεται σημαντικό για την εκδήλωση της παθογένειας της νόσου. Εντούτοις στην παθογένεια πιθανώς εμπλέκονται και άλλοι παθογενετικοί μηχανισμοί του βακτηριδίου, οι οποίοι πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω.
description: In this study, juvenile seabass fish were infected with two bacterial strains of V. anguillarum, (Van1 and Van731) in three different experiments. Juvenile fish were experimentally infected by immersion in sea water containing 5x107 bacteria/mL. Van1, is a naturally occurring strain of V. anguillarum. We found that Van1 harbours a 67kb pJM1-like plasmid, which we named pKTP. pKTP encodes the iron-sequestering system of this strain. Using the heat shock method we have also created the genetically modified plasmidless- derivative strain of Van1 designated as Van731. Both strains identified as V. anguillarum by PCR detection of the amiB gene. The successful curing of the plasmid evident by the incapability of Van731 to uptake iron was determined in CAS agar cultures and confirmed with angR and angH gene-specific PCR. The ability of the strain to produce histamine was tested by HPLC. The first experimental infection aimed to study the Van1 kinetics. The presence of the bacteria in fish tissues was examined histologically with the Gram stain and confirmed with 16rRNA fluorescent in situ hybridization (FISH). For FISH the V.anguillarum- specific probe Vav3 and the universal eubacterial probe EUB 338 were used. Histological and FISH analyses showed that skin was the most probable route of V.anguillarum invasion. The bacteria were found in small aggregates in dermis, as early as 20 hours post infection. At the same time point small numbers of bacteria were seen in the spleen and peritoneum. 72 hours post infection the bacteria were found in the parenchyma and the vessels of all the fish organs examined. The second experimental infection was carried out in order to assess the mortality of fish infected with the strains Van1 and Van 731. The mortality of vibriosis was significantly lower in fish infected with the plasmidless V.anguillarum strain. This result indicates that the presence of the iron acquisition system-related pKTP plasmid is particularly important for Van1 pathogenicity. The third experimental infection aimed to investigate the effect of the iron-binding bacterial system on the V.anguillarum ability to induce histopathological lesions in seabass fish. The skin, the spleen and the heart were the organ mostly affected. Less severe lesions were seen in the liver, the head and body kidney, the gills, the posterior intestine and the swim bladder, whereas the lesions were scarce and mild in the remaining organs. The histopathological lesions that were consistently found in the organs of fish infected with both strains of V.anguillarum included oedema, vessel dilatation, congestion, haemorrhage, necrosis and mild inflammatory cell infiltration. Several histopathological parameters were scored and analyzed statistically. The qualitative and quantitative analysis of V.anguillarum-induced lesions showed that the genetically modified strain Van731 caused significantly less pathology in fish. Taken together the results of this study suggest that iron binding system of the Van1 strain of V.anguillarum is important but not essential for the pathogenesis of vibriosis of the seabass. Other pathogenetic factors of this bacterium, although less important than the iron-binding system, contribute in the pathogenesis of vibriosis.