title: Esterified oxylipin analysis in human cancer cell lines
Creators: name: Kaltenböck, Konstantin
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Oxylipine, die Oxidationsprodukte mehrfach ungesättigter Fettsäuren, sind eine Gruppe bioaktiver Fettsäurederivate. Während bereits große Anstrengungen zur Charakterisierung von ungebundenen Oxylipinen unternommen wurden, ist die Zusammensetzung ihrer membrangebundenen Fraktion noch wenig erforscht. In dieser Arbeit wurde eine auf Verseifung basierende Extraktionsmethode für die ungezielte LC-MS-Analyse von membrangebundenen Oxylipinen in menschlichen Krebszelllinien erfolgreich eingesetzt und optimiert. Eine Zelldichte von 105 Zellen pro Probe und eine Verseifungszeit von 30 Minuten wurden als optimale Bedingungen für diese Methode ermittelt, um die Analyt- und Standardvariationen zu minimieren. Die Methode wurde zunächst zur Charakterisierung der Fettsäure- und Oxylipinprofile der promyelozytären Zelllinie HL-60 nach Behandlung mit all-trans-Retinsäure (ATRA) und Dimethylsulfoxid (DMSO) unter Stimulation durch den transformierenden Wachstumsfaktor beta 1 (TGF-β1) eingesetzt. In HL-60-Zellen unter ATRA-Behandlung verursachte die TGF-β1-Stimulation eine Hochregulierung von 18-HETE. Die DMSO-Behandlung führte zu einem Gesamtrückgang fast aller Analyten, was möglicherweise auf eine Membranausdünnung zurückzuführen ist. Des Weiteren wurden die Auswirkungen des regulierten Zelltods in der Eierstockkrebs-Zelllinie A2780 auf das Fettsäure- und Oxylipinprofil in zellulären und mitochondrialen Fraktionen untersucht. Im Einzelnen wurden die Cisplatin-induzierte Apoptose und die RSL3-induzierte Ferroptose untersucht. In ferroptotischen A2780 Zelllysaten wurde festgestellt, dass 14,15-DiHETrE, 11,12-DiHETrE und 14-HEPE signifikant hochreguliert und 20-HEPE herunterreguliert waren. In mitochondrialen Lysaten wurde eine Hochregulierung von 14(15)-DiHETE festgestellt. Weiters wurde ein Synergismus-Test zwischen RSL3 und NDGA durchgeführt, der starke antagonistische Effekte des 5-LOX-Inhibitors NDGA auf die Wirkung von RSL3 ergab. Die Untersuchung des membrangebundenen Oxylipin- und Fettsäureprofils unter diesem antagonistischen Zustand ergab außerdem einen signifikanten Rückgang der 18-HEPE- und 5(6)-EET-Niveaus im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen und Zellen, die nur mit RSL3 behandelt wurden. Die in dieser Arbeit beschriebene, auf Verseifung basierende Extraktion von membrangebundenen Fettsäuren und Oxylipinen bietet eine zuverlässige Methode für deren Charakterisierung und, die für zukünftige molekulare Charakterisierungen biologischer Membranen hilfreich sein kann.
description: Oxylipins are a group of bioactive fatty acid derivates and products of the oxidation of poly-unsaturated fatty acids. While great effort has already been put into the characterization of oxylipins, the characterization of the composition of their membrane bound fraction remains under-investigated. In this thesis a saponification-based extraction method for untargeted LC-MS analysis of membrane-bound oxylipins in human cancer cell lines was successfully adopted and optimized. A cell density of 105 cells per sample and a saponification time of 30 min was identified as optimal conditions for this method to minimize analyte and standard variation. The method was firstly implemented to characterize fatty acid and oxylipin profiles of the promyelocytic cell line HL-60 upon treatment with all-trans retinoic acid (ATRA) and dimethyl sulfoxide (DMSO) under stimulation with transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). In HL-60 cells under ATRA treatment, TGF-β1 stimulation caused an upregulation of 18-HETE. DMSO treatment led to an overall decrease of almost every analyte which is potentially caused by membrane thinning. Further, the impact of regulated cell death in the ovarian cancer cell line A2780 on the fatty acid and oxylipin profile in cellular and mitochondrial fractions was studied. In detail, Cisplatin-induced apoptosis, and RSL3-induced ferroptosis were investigated. The former is expected to be executed by caspases with a minor effect on lipids, while the latter is driven by lipid peroxidation. In ferroptotic A2780 whole cell lysates 14,15-DiHETrE, 11,12-DiHETrE and 14-HEPE were found to be significantly upregulated and 20-HEPE was down-regulated. In mitochondrial lysates, 14(15)-DiHETE was found to be upregulated. Lastly, a synergism assay between RSL3 and NDGA was performed which revealed strong antagonistic effects of the 5-LOX inhibitor NDGA on RSL3. The investigation of the membrane bound oxylipin and fatty acid profile under this antagonistic state further revealed a significant decrease of 18-HEPE and 5(6)-EET levels in comparison to both untreated control cells and cells treated with RSL3 only. The saponification-based extraction of membrane-bound fatty acids and oxylipins described in this thesis provides a reliable method for their characterization and will be helpful for future molecular characterizations of biological membranes.