Ανάλυση του προτύπου έκφρασης γονιδίων σε κυτταρικά μοντέλα και βιοψίες ηπατοκυτταρικού καρκινώματος
Creators: name: Λιούλια, Ελισάβετ Απόστολου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα
Κυτταρικά μοντέλα
Βιοψίες Ηπατοκυτταρικού Καρκινώματος
Hepatocellular carcinoma
Models
Biopsies of Hepatocellular Carcinoma

description: Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) αποτελεί την 3η σε συχνότητα αιτία θανάτου από κακοήθειες, με σύνολο 600,000 θανάτων ετησίως. Κύριοι περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και την εξέλιξη του ΗΚΚ αναφέρονται οι ιικοί παράγοντες, όπως ο ιός της ηπατίτιδας Β και C, ο χρόνιος αλκοολισμός, τα αυτοάνοσα νοσήματα, το κάπνισμα, η παχυσαρκία, το μεταβολικό σύνδρομο, η μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) και η μόλυνση από αφλατοξίνες. Η συνήθης πορεία προς το ΗΚΚ είναι η εξής: χρόνια φλεγμονή, δημιουργία ινώδους ιστού, κίρρωση και ΗΚΚ. Η απορρύθμιση του μοριακού δικτύου HNF4α-miR24, παρουσία φλεγμονής, διαδραματίζει σημαίνοντα ρόλο στο μηχανισμό της ηπατοκαρκινογένεσης. Ο πυρηνικός υποδοχέας HNF4α είναι ο πιο άφθονος μεταγραφικός παράγοντας του ήπατος, κατέχοντας καίριο ρόλο στον έλεγχο του λιπιδιακού μεταβολισμού. Ο λιπιδιακός μεταβολισμός και η ισορροπία, μεταξύ λιπογένεσης και λιπόλυσης αποτελεί ένα κρίσιμο σημείο στην εξέλιξη της καρκινογένεσης. Καίριο ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων διαδραματίζει, η πρωτεΐνη PLIN1, η οποία ανήκει στην οικογένεια των perilipin, LD συνδεόμενων πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, η PLIN1 είτε επάγει, είτε εμποδίζει τη διαδικασία της λιπόλυσης. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του προτύπου έκφρασης των γονιδίων HNF4α και PLIN1, σε HepG2 σταθερές μονοκλωνικές κυτταρικές σειρές μόνιμης καταστολής του HNF4α, οι οποίες δημιουργήθηκαν με τη μέθοδο της λεντιικής μόλυνσης, καθώς και σε δείγματα βιοψιών ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (υγιείς-κιρρωτικοί-ΗΚΚ ιστοί). Τα αποτελέσματα στις HepG2 μονοκλωνικές κυτταρικές σειρές (2D και 3D) μόνιμης καταστολής του HNF4α έδειξαν την αναλογική συσχέτιση της αύξησης του ογκογονικού φαινοτύπου (Alamar Blue Assay, Scratch Assay, Soft Agar Assay και Invasion Assay), με τη μείωση των επιπέδων έκφρασης του HΝF4α. Ως προς το πειραματικό σκέλος των βιοψιών, δεν παρατηρήθηκε διαφορική πρωτεϊνική έκφραση, τόσο του HNF4α, όσο και της κυτταροπλασματικής PLIN1, στην ΗΚΚ περιοχή, συγκριτικά με την περιοχή, δίχως νεοπλασματική πάθηση, στο σύνολο των δειγμάτων. Ιδιαίτερης σημασίας εύρημα, αποτελεί η πυρηνική παρουσία της PLIN1, στην πλειοψηφία των δειγμάτων, τα οποία αναλύθηκαν. Συγκεκριμένα, επιβεβαιώθηκε η ειδικότητα της χρώσης και η παρουσία της PLIN1 στον πυρήνα, με παράλληλη ανάλυση των mRNA επιπέδων της PLIN1, στον ΗΚΚ ιστό, συγκριτικά με το φυσιολογικό παρακείμενο ιστό. Για την πλήρη διερεύνηση του προτύπου έκφρασης των HNF4α και PLIN1 μπορούν να πραγματοποιηθούν περαιτέρω πειράματα, τόσο σε in vitro (2D και 3D), όσο και σε in vivo μοντέλα, στα οποία και θα μελετηθούν οι συνθήκες των διαφόρων σταδίων της εξέλιξης του ΗΚΚ. Σημαντικό ρόλο θα διαδραματίσει και η μελέτη αυτών, σε δείγματα βιοψιών ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, με ασθενείς από διάφορα στάδια εξέλιξης του ΗΚΚ, και συγχρόνως, διαφορετικής αιτιολογίας (μόλυνση με τον ιό της ηπατίτιδας Β και C, μεταβολικό σύνδρομο, αλκοολισμός). Θα μπορούσε να ανιχνευθεί η ενδεχόμενη σχέση της έκφρασης των δύο γονιδίων, με τη διαδικασία της στεάτωσης, αλλά και το τι ακριβώς λαμβάνει χώρα, κατά τη μετάβαση των κυττάρων από μια διαφοροποιημένη, σε μια λιγότερο διαφοροποιημένη κατάσταση. Σίγουρα, η μελέτη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος αποτελεί ένα δύσκολο μονοπάτι έρευνας, αλλά με πολύπλευρη προσέγγιση μπορούν να αναδυθούν νέες ελπιδοφόρες θεραπευτικές μέθοδοι, που να το στοχεύουν εκλεκτικά.
description: Hepatocellular carcinoma (HCC) represents the third most common cancer in mortality worldwide, leading to 600,000 deaths per year. Main risk factors for the initiation and progression of HCC are: chronic hepatitis (HCV/HBV), chronic alcohol consumption, autoimmune diseases, smoking, obesity, metabolic syndrome, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and aflatoxins. The common process for HCC is: chronic injury, fibrosis, cirrhosis and HCC. The deregulation of the molecular signaling network of HNF4α-miR24 plays an important role in the mechanism of hepatocarcinogenesis. Hepatocyte nuclear factor 4α (HNF4α) represents the most abundant transcription factor of the liver, with a specific key-role in lipid metabolism. The balance between lipogenesis and lipolysis, in lipid metabolism, is a crucial step in carcinogenesis. PLIN1 is a member of lipid droplet (LD) associated protein family and simultaneously acts as a master regulator of lipid metabolism. Specifically, PLIN1 regulates either the induction or the suppression of lipolysis. This project intended to study the expression pattern (mRNA, protein levels) of HNF4α and PLIN1 in stable monoclonal HepG2 cell lines, in which HNF4α has been silenced (HNF4α knock-down, KD), through lentiviral infection. Furthermore, this study aimed to investigate, the expression profile, in patient biopsies of human hepatocellular carcinoma (normal-cirrhotic-HCC tissue samples). In HepG2_HNF4α_KD stable monoclonal cell lines, the oncogenic phenotype was assessed, in 2D and 3D cell culture systems, with the following assays: Alamar Blue, Scratch, Soft Agar and Invasion Assay. The results in HepG2_HNF4α_ΚD stable monoclonal cell lines have shown a correlation between the induction of oncogenic phenotype and the reduction of HNF4α expression levels respectively. We did not observe a differential pattern of expression of HNF4α and cytoplasmic PLIN1 staining, between HCC, and the normal adjacent tissue, in all patient samples examined. The most intriguing result was the nuclear localization of PLIN1 in the majority of samples. Notably, the specificity of staining and the nuclear localization of PLIN1 were confirmed with parallel analysis of PLIN1 mRNA levels in HCC tissue relative to normal adjacent tissue. For further elucidation of HNF4α and PLIN1 expression patterns, more in vitro (2D and 3D), as well as, in vivo experiments, need to be performed in order to delineate the mechanisms of HCC development. Moreover, additional patient samples of different stages of HCC of varying etiology (hepatitis C, B infection, metabolic syndrome, alcohol consumption) will be required for better understanding of the expression profiles of HNF4α and PLIN1 in relation with HCC development. A possible correlation between the expression pattern of the two genes and steatosis, as well as the exact regulatory mechanisms, which are involved in cellular differentiation, could be clarified. Hepatocellular carcinoma is a complex and multifactorial disease, where an intensive approach could identify novel molecular targets with therapeutic potential.