title: The Sulfolobus solfataricus CRISPR-Cas system
Creators: name: Manica, Andrea
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Das Vorkommen von Viren in allen Habitaten der Erde und ihre Koevolution mit Mikroorganismen führt zu einem hohen Selektionsdruck auf die Wirte. Dies führte zu der Entwickung einer großen Bandbreite von Resistenzmechanismen in Archaeen und Bakterien um viralen Infektionen vorzubeugen oder sie zu reduzieren. Erst kürzlich wurde ein neuer Mechanismus entdeckt, der mikrobielle Zellen vor Viren und anderen eindringenden genetischen Elementen schützt: das CRISPR-Cas System. Seine Aktivität beruht auf kleinen RNAs (crRNAs), die in einen Proteinkomplex (Cas Proteine) inkorporiert werden, welche die fremden DNA- oder RNA-Sequenzen, bei gegebener Komplementarität zwischen der crRNA und der Zielsequenz, degradiert. Während meiner Doktorarbeit habe ich das CRIPSR-Cas System in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus untersucht. Dieser Organismus besitzt ein umfangreiches CRISPR-Cas Set mit sechs CRISPR-Loci und fünf Cas-interferierenden Komplexen, die zusammen beinahe 10% des Genoms ausmachen. Ein rekombinanter Shuttle-Vektor basierend auf dem Sulfolobus Virus 1 (SSV1) wurde verwendet um das CRISPR-Cas System von Sulfolobus herauszufordern und dessen Aktivität über die Anzahl der bei der Infektion entstehenden Virus-Plaques zu quantifizieren. Mit diesem Ansatz wurde gezeigt, dass Virussequenzen mit Komplementarität zu den CRISPR- Spacer Sequenzen (sogenannte Protospacer) die Fähigkeit des Viruses die Wirtszelle zu infizieren beeinträchtigen. Bei einer perfekten Komplementarität zwischen der Protospacer-Sequenz und einem bestimmten CRISPR-Locus war der Virus nicht mehr in der Lage seinen Wirt zu infizieren. Die verschiedenen CRISPR-Loci variierten in ihrer Effizienz, was wiederum mit der Transkription des entsprechenden Locus korrelierte. Der offene Leserahmen der die Protospacer-Sequenz auf dem Virusgenom kodiert war nicht essentiell für die Virusinfektion und beinhaltete keinen Transkriptionspromotor, was daraufhin weist, dass eher die DNA als die RNA als Zielsequenz für das CRISPR-Cas System in diesem Assay dient. Der gleiche Assay wurde benutzt, um die Fähigkeit des Systems zu quantifizieren Protospacer mit geringerer Sequenzähnlichkeit als Zielsequenz zu erkennen. Die Anzahl der Mutationen die zwischen crRNA und Protospacer toleriert werden können, ist abhängig von der Position der Mutation innerhalb der Protospacer-Region. Die Mutationen, die die Hybridisierung mit der 5´seitigen Hälfte des Spacers beeinflussen, hatten einen starken Effekt auf die Zielerkennung, wobei sechs Fehlpaarungen innerhalb der ersten acht Nukleotide die DNA Interferenz-Aktivität beinahe vollständig verhinderten. Trotzdem war das System noch in der Lage den viralen Vektor effizient zu erkennen und zu degradieren, selbst wenn 14 Mutationen in die andere Hälfte der Hybridisierungsregion eingeführt wurden. Eine Mutation auf beiden Seiten des crRNA-Protospacer-Hybrids wirkten synergetisch und führten zu einer Abschwächung der DNA-Interferenz-Aktivität. Wir untersuchten ebenfalls den potentiellen Einfluss von Sequenzen außerhalb der Protospacer-Region auf die CRISPR-Aktivität. Es wurde berichtet das diese, dem Protospacer-benachbarten Motive (protospacer adjacent motifs, PAM), neben der Funktion des Erwerbs neuer Spacer auch einen Einfluss auf die Interferenz-Aktivität in einigen bakteriellen Systemen haben. Es konnte jedoch kein Hinweis für diese Rolle der Sequenzen im Sulfolobus-Assay gefunden werden. Nukleotide, die am 3´Ende des Protospacers lokalisiert waren, verhinderten eine CRISPR-Aktivität, sofern sie komplementär zum 8 nt-Anhang der crRNA waren. Die drei Positionen -3, -4 und -5 auf dem crRNA-Protospacer-Hybrid verhinderten eine Interferenz. Damit sind sie für das System wichtig zur Unterscheidung zwischen eigener und fremder DNA, ähnlich wie es bereits in bakteriellen Systemen nachgewiesen wurde. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein archaeales CRISPR-Cas System detalliert im hyperthermophilen S. solfataricus untersucht. Das System weist einige Gemeinsamkeiten aber auch klare Unterschiede zu den bereits beschriebenen bakteriellen Systemen auf. Im Besonderen weist die Toleranz gegenüber einer großen Anzahl von Mutationen in der Zielerkennung darauf hin, dass die CRISPR-vermittelte Virusverteidigung nicht nur als Verteidigung der ersten Stufe angesehen werden sollte, sondern als allgemeiner Mechanismus, der den Wirtszellen ermöglicht die Virenzahl längerfristig niedrig zu halten. Diese Resultate bezüglich der Erkennung der DNA als Fremd oder Eigen ebnen den Weg für zukünftige Studien an RNA-Interferenz in Archaea, da sie einen Mechanismus demonstrieren mit dem DNA-Interferenz in einem Organismus verhindert werden kann.
description: The persistence of viruses in all environments on Earth and their co-evolution with microorganisms imposes high selective pressures on the hosts. This has led to the development of a portfolio of resistance mechanisms in Archaea and Bacteria to prevent or reduce viral infections. Recently, a new mechanism was discovered which protects microbial cells from viruses and other invading genetic elements: the CRISPR-Cas system. Its activity is based on small RNAs (crRNAs) that are incorporated into a protein complex (Cas proteins) which degrades foreign DNA or RNA sequences, respectively, when complementarity between the crRNA and the target is given. During my PhD thesis I studied the CRISPR-Cas system in the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus. This organism possesses an extensive CRISPR-Cas set, with six CRISPR loci and five Cas “interference complexes” which together occupy almost 10% of the chromosome. Using a recombinant shuttle vector based on the Sulfolobus virus SSV1, the CRISPR-Cas system of Sulfolobus was challenged and its activity was quantified by counting virus plaques upon transfection. With this approach it was demonstrated that viral sequences with complementarity to CRISPR spacer sequences (so-called protospacers) affect the ability of the virus to infect the host cell. When perfect complementarity between protospacer sequence and spacers of certain CRISPR loci was given, the virus completely lost its ability to infect the host. The different CRISPR loci varied in their efficiency which correlated with the transcription of the respective locus. The open reading frame carrying the protospacer sequence on the virus genome was not essential for virus infection and did not carry a transcriptional promoter, both indicating that DNA rather than RNA was a target of the CRISPR-Cas system in this assay. The same genetic tool was used to quantify the ability of the system in targeting less similar protospacers. The amount of mutations tolerated between crRNA and protospacer varied depending on the location of the mutations along the protospacer region. Mutations influencing the hybrid formation with the 5´half of the spacer had a strong effect on target recognition, with six mismatches within the first 8 nucleotides almost completely abolishing the DNA interference activity. But the system was still able to efficiently recognize and degrade the viral vector even when 14 mutations were introduced in the other half of the hybridization region. A synergistic effect of mutations occurring simultaneously at both sides of the crRNA-protospacer hybrid was observed in attenuating the DNA interference activity. We also investigated the potential role of sequences located outside the protospacer region on CRISPR activity. Protospacer adjacent motifs (PAM), besides having a function in spacer recruitment, had been reported to influence interference activity in some bacterial systems. However, no indication of a role of this sequence was found in the Sulfolobus assay. However, nucleotides located 3’ to the protospacer abolished the CRISPR activity when they were complementary to the 8nt-tag of the crRNA. The three positions -3, -4 and -5 of the crRNA-protospacer hybrid abolished interference. They were thus important for the system to discriminate self from non-self DNA in a similar way as found earlier in bacterial system. In conclusion, an archaeal CRISPR-Cas system was studied in detail in the hyperthermophile S. solfataricus. It exhibits some commonalities but also clear differences to the currently described bacterial systems. In particular, the tolerance of a large number of mismatches in target recognition indicates that CRISPR-mediated virus defense should not only be considered a “first-barrier-defense-system” but may be seen as a broader mechanism that allows host cells to cope with viruses keeping them at reduced levels. The results on self/non-self recognition pave the way for future studies on RNA interference in Archaea, because they demonstrate a mechanism how DNA interference can be circumvented in the organism.