title: Cellular role of the putative Ca2+-dependent Cl- channel bestrophin
Creators: name: Barro Soria, René
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Best-Krankheit , Chloridkanal , Calcium , Membranproteine, Genexpression , Bestrophin , Vmd2 , Cl(-)-Leitfähigkeit , bestrophin , Vmd2 , Cl- conductance
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: Ca2+-activated Cl- channels (CaCCs) participate in a variety of important physiological processes such as transepithelial transport, olfactory and taste transduction, neuronal and cardiac excitability, fototransduction and fertility. These Cl- channels also play a key role in diseases such as cystic fibrosis, and polycystic kidney disease. Although epithelial CaCCs have been studied for more than two decades, their molecular identity and physiological role remain uncertain. Whereas most candidate molecules have failed to fulfill CaCC requisites, proteins of the bestrophin family have been demonstrated to induce a Ca2+-acitivated Cl- conductance in expression systems. The properties of this conductance resembled those of Ca2+-activated Cl- currents (IClCa) in native tissues. Bestrophin 1 (best1), the gene product of the vitelliform macular dystrophy type 2 (VMD2), is expressed in the retinal pigment epithelium (RPE) where it is thought to underlie the Cl- conductance that controls retinal homeostasis. Mutations in best1 gene cause the so-called Best disease, a genetic form of retinal macular dystrophy. There is not yet a consensus as to whether Best disease is caused by Cl- channel dysfunction, partly because mbest1 knockout mice (best1-/-) have no ocular pathology and normal Cl- currents can be recorded from the RPE. It has also been shown that best1 regulates voltage-gated Ca2+ channels in the RPE. The precise cellular role of bestrophins therefore remains an unresolved question. Most importantly, bestrophins remain to be demonstrated to generate IClCa in tissues other than the RPE. The present work demonstrates that best1 is also expressed in other epithelial tissues, such as airways, kidney and colon where it enables Ca2+-activated Cl- secretion. Endogenous IClCa coincide with endogenous expression of best1 in murine and human epithelial cells, whereas IClCa is absent in epithelial tissues lacking best1 expression. Furthermore, IClCa is shown to be activated by ATP in HEK293 cells overexpressing hbest1. Ussing chamber recordings showed that low concentrations of the purinergic agonist ATP (0.1-1M) evoked larger short circuit currents (Isc) in tracheas of wild type (best1+/+) mice, when compared to tracheas of best1 knockout (best1-/-) mice. Patch clamp analysis revealed that ATP-induced whole cell currents in primary epithelial cells from best1-/- tracheas were half as the size of those recorded from best1+/+ cells. Cells patch clamped in the presence of different Ca2+-free intracellular solutions, also showed larger Ca2+-activated Cl- currents in best1+/+ than in best1-/- mice. These and other results suggest that bestrophin 1 and 2 are necessary components of the Ca2+-activated Cl- secretion in mouse trachea. The quaternary structure of bestrophins as well as their cellular localization is of fundamental importance for the understanding of their physiological role. Here, we show a molecular and functional interaction and a colocalization of hbest1 with hbest2 and hbest1 with hbest4, when overexpressed heterologously in HEK293 cells, or for airway epithelial cells expressing endogenous bestrophins. This indicates that bestrophin paralogs interact with each other and form heterooligomers. It is known that ion channels play important roles in cell proliferation. In contrast to K+ channels, for which vast amounts of information exist regarding their participation in tumorigenesis, and which have even been documented as potential drug targets, involvement of Ca2+-activated Cl- channels in cell proliferation has been scarcely tackled. A high baseline Cl- conductance coincides with high endogenous expression of hbest1 in fast-growing colonic carcinoma (T84) cells, whereas low baseline Cl- conductance and low endogenous hbest1 expression are present in slow-growing T84 cells. siRNA for hbest1 inhibits proliferation of fast-growing T84 cells, while in slow-growing T84 cells siRNA has no effect on proliferation. In contrast, overexpression of hbest1 in slow-growing cells induces fast proliferation. In summary, the present study examines the physiological role of the putative Ca2+-activated Cl- channel bestrophin. Our results demonstrate that bestrophins enable Ca2+-activated Cl- secretion in different epithelia. Although we present clear evidence that bestrophins induce IClCa, our work does not directly address the question whether these proteins form the CaCC pore themselves or are accessory regulatory proteins. We also present evidence for functional and molecular interaction of bestrophin paralogs, presumably acting as heterooligomers. Finally, we settle a direct correlation between best1 expression and Cl- currents and cell proliferation, which may be useful to understand of the role of Ca2+ and volume regulated Cl- channels in cell proliferation.
description: Ca2+-aktivierbare Cl--Kanäle (CaCCs) sind an einer Vielzahl wichtiger physiologischer Prozesse beteiligt, wie z.B. transepithelialem Transport, Weiterleitung von Geruchs- und Geschmacksreizen, neuronaler und kardialer Erregbarkeit und Fototransduktion. Diese Cl- Kanäle spielen ebenso eine Rolle bei Krankheiten wie der Mukoviszidose und der polyzystischen Nierenerkrankung. Obwohl epitheliale CaCCs seit mehr als zwei Jahrzehnten untersucht werden, ist über ihre molekularen Eigenschaften und ihre physiologische Rolle noch sehr wenig bekannt. Bisher vermutete Kandidatenproteine erfüllten nicht die nötigen Anforderungen, um sie als CaCCs in Betracht zu ziehen. Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass Proteine der Bestrophinfamilie eine Ca2+-aktivierte Cl- Leitfähigkeit in Expressionssystemen induzieren. Die Eigenschaften dieser Leitfähigkeit sind denen der Ca2+-aktivierten Cl- Leitfähigkeit in nativen Geweben sehr ähnlich. Bestrophin 1 (best1), das Genprodukt der �vitelliform macular dystrophy type 2� (VMD2), ist im Pigmentepithel der Retina (RPE) exprimiert, wo es vermutlich die Cl- Leitfähigkeit und damit die Homöostase der Retina reguliert. Mutationen des Bestrophin 1-Gens führen zur so genannten Bestschen Maculadystrophie. Allerdings herrscht noch Unklarheit darüber, ob die Ursache für die Bestsche Erkrankung tatsächlich eine Cl- Kanal-Dysfunktion ist, unter anderem deshalb, weil mbest1 Knockoutmäuse (best1-/-) keinen pathologischen ophthalmologischen Phänotyp aufweisen und normale Cl- Ströme im RPE zeigen. Andererseits wurde vermutet, dass die Aktivität von spannungsabhängigen Ca2+ Kanälen im RPE durch Bestrophin reguliert wird. Es ist somit ein wichtiges Anliegen, die exakte zelluläre Rolle der Bestrophine zu klären und zu untersuchen, ob Bestrophine auch zur Funktion der Ca2+-aktivierten Cl--Kanäle in anderen Geweben beitragen könnten. Diese Fragen wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht. Wir konnten zeigen, dass Bestrophin 1 neben dem Pigmentepithel auch in anderen epithelialen Geweben, wie den Luftwegen, der Niere und im Colon exprimiert wird, wo es zur Ca2+-aktivierbaren Cl- Sekretion beiträgt. Die endogene Expression von best1 in humanen und murinen Epithelzellen ging mit endogenen Ca2+-aktivierbaren Cl- Strömen (IClCa) einher, wohingegen in epithelialen Geweben ohne best1-Expression kein IClCa messbar war. Darüber hinaus ließ sich IClCa in HEK293 Zellen, welche hbest1 überexprimierten, durch ATP aktivieren. In sogenannten Ussing-Kammer Experimenten wurde beobachtet, dass geringe Konzentrationen des purinergen Rezeptoragonists ATP größere Kurzschlussströme (Isc) im Trachealepithel von Wildtypmäusen (best1+/+) erzeugte als in Geweben von Knockoutmäusen (best1-/-). Zusammenfassend sprechen diese Daten dafür, dass Bestrophin 1 und Bestrophin 2 notwendige Komponenten der Ca2+-aktivierbaren Cl- Sekretion in der Mäusetrachea darstellen. Die Quartärstruktur der Bestrophine sowie deren subzelluläre Lokalisation werden derzeit kontrovers diskutiert. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen eine molekulare und funktionelle Interaktion und Kolokalisation der Bestrophine 1, 2 und 4 in überexprimierenden HEK293-Zellen und in Epithelzellen der Luftwege, welche Bestrophine endogen exprimieren. Diese Daten zeigen, dass Bestrophin Paraloge miteinander interagieren und dabei heterooligomere Komplexe ausbilden. Ionenkanäle spielen eine Rolle bei der Zellproliferation. Während der Einfluss von K+ Kanälen auf die Tumorgenese gut untersucht ist, gibt es nur wenige Daten zur Beteiligung von CaCCs an der Zellproliferation. Wir untersuchten daher die Rolle von Bestrophinen für die Zellproliferation. Diese Beobachtungen sprechen dafür, dass hbest1 zur Entstehung einer Cl- Leitfähigkeit in T84-Zellen beiträgt, die vermutlich das Proliferationsverhalten der Zellen beeinflusst. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Ergebnisse, dass Bestrophine zur Entstehung der Ca2+-aktivierten Cl--Leitfähigkeit in Expressionssystemen und nativen Epithelien beitragen. Allerdings erlauben die Daten noch keine sicheren Rückschlüsse, ob diese Proteine selbst porenbildend sind oder als Regulatoren oder Adapterproteine funktionieren. Die verschiedenen Mitglieder der Bestrophinfamilie interagieren miteinander und bilden vermutlich heteromere Proteinkomplexe. Eine eindeutige physiologische Funktion konnte den Bestrophinen bisher noch nicht zugeschrieben werden. Unsere Untersuchungen an T84-Kolonkarzinomzellen sprechen dafür, dass Bestrophine nicht nur einen Einfluss auf die Cl- Leitfähigkeit haben sondern ihre Expression auch das Proliferationsverhalten der Zellen modifizieren kann.