Μελέτη της επίδρασης της Nutlin-3a επαγόμενης ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού p53 στο μιτοχονδριακό πρωτεΐνωμα σε κυτταρικό μοντέλο ανθρώπινου λεμφώματος του μανδύα
Creators: name: Σύλλας, Αλέξανδρος Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Λέμφωμα κυττάρων μανδύα
Μιτοχόνδρια
p53
Nutlin-3a
Απόπτωση
Proteomics
Mantle cell lymphoma
Mitochondria
Apoptosis

description: Το λέμφωμα κυττάρων του μανδύα είναι ένα μη-Hodgkin λέμφωμα, Β-κυτταρικής προέλευσης που παρουσιάζει ανεξέλεγκτη ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων στη ζώνη μανδύα των λεμφαδένων. Η παρουσία γενετικών μεταλλάξεων οδηγεί στην απορρύθμιση πολλαπλών μονοπατιών σηματοδότησης, ωστόσο, έχει διαπιστωθεί ότι γεγονότα μεταλλάξεων στο γονίδιο TP53 συμβαίνουν με χαμηλή συχνότητα κυρίως στις πιο επιθετικές μορφές της νόσου, δίνοντας έτσι τη δυνατότητα εφαρμογής εν δυνάμει θεραπευτικών μορίων, όπως ο ανταγωνιστής Nutlin-3a, που στοχεύουν στην ενεργοποίηση του p53 σηματοδοτικού μονοπατιού με στόχο τη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, στα καρκινικά κύτταρα παρατηρούνται αλλαγές στη λειτουργία των μιτοχονδρίων, τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του μεταβολισμού και στις διαδικασίες προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Λαμβάνοντας υπόψη τον σημαντικό ρόλο των μιτοχονδρίων στα λεμφώματα, η παρούσα εργασία στοχεύει στη μελέτη της επίδρασης του ανταγωνιστή Nutlin-3a στην καταστροφή των καρκινικών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού p53, με επίκεντρο την ανάλυση των αλλαγών στον εμπλουτισμό του μιτοχονδριακού πρωτεϊνώματος σε κυτταρικό μοντέλο ανθρώπινου λεμφώματος του μανδύα. Επιπλέον, δίνεται η δυνατότητα να μελετηθούν τόσο η τοπολογία των πρωτεϊνών στα υποκυτταρικά διαμερίσματα όσο και οι αλλαγές στα επίπεδα της σχετικής αφθονίας τους. Για την προσομοίωση του παθολογικού φαινοτύπου χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά-μοντέλο λεμφώματος του μανδύα JMP-1. Ο εμπλουτισμός του μιτοχονδριακού εκχυλίσματος βασίστηκε σε σχήμα διαδοχικών φυγοκεντρήσεων, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της ερευνητικής ομάδας Liao et al. 2020, ενώ ταυτόχρονα έγινε προσπάθεια βελτίωσης του πρωτοκόλλου για αποτελεσματικότερο εμπλουτισμό, σύμφωνα με τις οδηγίες της επιστημονικής ομάδας Wieckowski et al. 2009. Η σύγκριση μεταξύ του συνολικού και μιτοχονδριακού πρωτεϊνώματος πραγματοποιήθηκε με φασματομετρία μάζας μέσω bottom-up label free σχετικής ποσοτικοποίησης. Παράλληλα, με ανοσοαποτύπωση κατά Western μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων πρωτεϊνών ενδιαφέροντος που σχετίζονται με τη δράση της p53. Τα συγκριτικά αποτελέσματα φανερώνουν την επιτυχία εμπλουτισμού μιτοχονδριακών πρωτεϊνών σε όλα τα εκχυλίσματα υποκυτταρικών διαμερισμάτων. Η ανάλυση των πρωτεϊνικών δειγμάτων με φασματομετρία μάζας και η ακόλουθη βιοπληροφορική και λειτουργική ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε πως λειτουργίες του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, όπως είναι η απόπτωση, η νεκρόπτωση και η μιτοφαγία, επηρεάζονται περισσότερο από την ενεργοποίηση του p53 σηματοδοτικού μονοπατιού με τη χορήγηση της Nutlin-3a. Ταυτόχρονα, η συγκριτική πρωτεϊνωματική ανάλυση, η οποία εστιάζει στη σχετική αφθονία πρωτεϊνών μεταξύ συνολικού πρωτεϊνώματος και των πρωτεϊνών στο μιτοχονδριακό εκχύλισμα, φανερώνει σημαντικό εμπλουτισμό στη διαδικασία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και στο σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/AKT. Τέλος, με την ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών αποδεικνύεται η συσσώρευση της πρωτεΐνης p53 στα μιτοχόνδρια, ενώ επιβεβαιώνεται ο ήδη γνωστός ρόλος της ως μεταγραφικού παράγοντα, ενεργοποιώντας την p21 και προαποπτωτικές πρωτεΐνες, όπως η BAX, που σχετίζονται με τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή της απόπτωσης, αντίστοιχα. Συμπερασματικά, το πρωτόκολλο της επιστημονικής ομάδας Liao et al. 2020 συμβάλλει στον επιτυχή εμπλουτισμό των μιτοχονδρίων στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά λεμφώματος. Παράλληλα, το μόριο Nutlin-3a, με την ενεργοποίηση του p53 σηματοδοτικού μονοπατιού, επιφέρει αλλαγές της σχετικής αφθονίας σε πρωτεΐνες που επηρεάζουν περισσότερο τις διαδικασίες προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, την αναστολή του κυτταρικού κύκλου, της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3K/AKT στο μιτοχονδριακό εκχύλισμα.
description: Mantle cell lymphoma is a non-Hodgkin lymphoma of B-cell origin that shows uncontrolled growth of lymphocytes in the mantle zone of the lymph nodes. The presence of genetic mutations leads to the dysregulation of multiple signaling pathways, however, mutations in the TP53 gene have been found to occur with low frequency, mainly in the most aggressive forms of the disease, thus, enabling the application of potentially therapeutic molecules, such as the Nutlin-3a antagonist, which aim to activate the p53 signaling pathway to elucidate cancer cells. In addition, functional changes in mitochondria, which play an important role in the regulation of metabolism and the processes of programmed cell death, are observed in cancer cells. Considering the important role of mitochondria in lymphomas, the present thesis aims to shed light on the effect of Nutlin-3a on the destruction of cancer cells through activation of the p53 signaling pathway, focusing on the analysis of changes in mitochondrial proteome enrichment in a human cell model of mantle cell lymphoma. Moreover, it is possible to investigate both the topology of the proteins in subcellular compartments and the changes in their relative abundance levels. The MCL cell line model JMP-1 was used to simulate the pathological phenotype. The enrichment of the mitochondrial extract was based on a sequential centrifugation scheme, according to the protocol of the research group Liao et al. 2020. Simultaneously, an attempt was made to improve the protocol for more efficient enrichment, according to the instructions of the scientific group Wieckowski et al. 2009. Comparison between total and mitochondrial proteome was performed by mass spectrometry via bottom-up label free relative quantification, while the expression levels of specific proteins of interest related to p53 activity were studied by Western immunoblotting. The comparative results unveil the success of enrichment of mitochondrial proteins in all extracts of subcellular compartments. Analysis of protein samples by mass spectrometry and subsequent bioinformatic and functional analysis of the results reveals that functions of programmed cell death, such as apoptosis, necroptosis and mitophagy, are most affected by the activation of the p53 signaling pathway by the administration of Nutlin -3a. At the same time, the comparative proteomic analysis, which focuses on the relative abundance of proteins between the total proteome and the proteins in the mitochondrial extract, indicates a significant enrichment in the process of oxidative phosphorylation and in the PI3K/AKT signaling pathway. Finally, protein immunoblotting demonstrates the accumulation of the p53 protein in mitochondria, while it confirms its already known role as a transcription factor, activating p21 and pro-apoptotic proteins, such as BAX, associated with cell cycle arrest and apoptosis induction, respectively. In conclusion, the protocol of the scientific group Liao et al. 2020 contributes to the successful enrichment of mitochondria in this particular lymphoma cell line. All in all, by activating p53 signaling pathway, Nutlin-3a brings about changes of relative abundance in proteins that most affect the processes of programmed cell death, cell cycle inhibition, oxidative phosphorylation and the PI3K/AKT signaling pathway in the mitochondria extract.