Μοντεολοποίηση της αταξίας Φρίντριχ σε νευρομυϊκά οργανοειδή από πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου
Creators: name: Δαφνόπουλος, Γεώργιος Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Βλαστοκύτταρα
Αταξία Φρίντριχ
Οργανοειδή
Stem cells
Friedreich’s ataxia
Organoids

description: Η αταξία Φρίντριχ είναι μία νευροεκφυλιστική πάθηση η οποία προκαλεί κινητικά, καρδιακά και σκελετικά προβλήματα. Οι ασθενείς συχνά υποφέρουν και από υποκείμενα νοσήματα όπως ο διαβήτης. Σε κυτταρικό επίπεδο, ο αιτιολογικός παράγοντας εμφάνισης της νόσου είναι η μειωμένη παραγωγή της πρωτεΐνης φραταξίνης. Σε μοριακό επίπεδο, στις περισσότερες περιπτώσεις η ασθένεια προκαλείται από την ύπαρξη GAA νουκλεοτιδικών τριπλετών στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου της φραταξίνης FXN. Η φραταξίνη είναι μία μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ομοιόστασης του σιδήρου καθώς και σε κυτταρικούς μηχανισμούς καταπολέμησης του οξειδωτικού στρες. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχει θεραπεία για την αταξία Φρίντριχ, άλλα εξετάζονται αρκετοί φαρμακευτικοί παράγοντες για την αντιμετώπιση της νόσου. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η ανάπτυξη μιας ex-vivo πειραματικής πλατφόρμας, που βασίζεται στην in-vitro δημιουργία νευρομυϊκών οργανοειδών από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα ανθρώπου (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs), για τη μελέτη και εξατομικευμένο προκλινικό έλεγχο νέων πιθανών θεραπειών κατά της Αταξίας Φρίντριχ. Για το σκοπό αυτό, αρχικά τα HiPSCs διαφοροποιήθηκαν σε νευρομεσοδερμικούς προγεννήτορες (neuromesodermal progenitor cells – NMPs). Τα NMPs αποτελούν έναν διδύναμο κυτταρικό πληθυσμό, με δυνατότητα διαφοροποίησης προς κύτταρα του νευροεξωδέρματος και του μεσοδέρματος, τα οποία in vivo συμμετέχουν στην επιμήκυνση του νωτιαίου μυελού άλλα και του παρακείμενου παραξιακού μεσοδέρματος. Τα NMPs λόγω της αμφιδύναμης φύσης τους, επιλέχθηκαν ως αρχικός κυτταρικός πληθυσμός για την κατασκευή των νευρομυϊκών οργανοειδών (neuromuscular organoids – NMOs). Η καλλιέργεια των οργανοειδών πραγματοποιήθηκε σε τρισδιάστατες συνθήκες, με σκοπό την καλύτερη προσομοίωση της in vivo οργανογένεσης των παραπάνω ιστών. Μετά την επιτυχή κατασκευή NMPs και NMOs αγρίου τύπου, εφαρμόστηκαν τεχνικές γενετικής τροποποίησης, χρησιμοποιώντας την τεχνολογία CRISPR/Cas9 για την λειτουργική αποσιώπηση (Knock-out) και ενεργοποίηση (CRISPRa) του γονιδίου FXN. Τα μοντέλα που θα κατασκευαστούν θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για την διαλεύκανση του ρόλου της FXN, ο οποίος μέχρι στιγμής βρίσκεται υπό διερεύνηση, καθώς επίσης και ως πλατφόρμες δοκιμής νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων, υψηλότερης ευαισθησίας σε σχέση με τις υπάρχουσες διαθέσιμες, όπως τα 9 ζωικά μοντέλα, τα οποία λόγω διαφορετικής φυσιολογίας από αυτήν του ανθρώπου υπόκεινται σε αναντιστοιχίες ευρημάτων, άλλα και των δισδιάστατων κυτταρικών καλλιεργειών που αδυνατούν να προσομοιάσουν τις in vivo συνθήκες ενός ιστού.
description: Friedrich's ataxia is a neurodegenerative disorder that leads to progressive degeneration of sensory neurons and heart failure. Patients exhibit gait and limb ataxia and often develop an array of co-morbidities, including diabetes, dysarthria and gastrointestinal problems, before becoming wheelchair-dependent. The causative factor of the disease is the impaired expression of the FXN gene. In most cases the disease is caused by the presence of GAA nucleotide triplets in the first intron of the frataxin gene. Frataxin is a protein involved in iron-sulfur cluster biogenesis. Iron-sulfur clusters are essential co-factors for the assembly of more than 60 metalloproteins, many of which are Krebs cycle and electron-transport-chain enzymes There is currently no cure for Friedreich's ataxia, but several pharmaceutical agents are being investigated to treat the disease. The purpose of this thesis is the development of a cellular model of the disease. The model will simulate the in vivo conditions of the pathological disease state at the synapse of the peripheral nervous system with skeletal muscles. To achieve the above goal, the technology of organoids, which are three-dimensional cell cultures that simulate the respective tissues to be studied, will be utilized. The study of the tissues of the neuromuscular synapse will be carried out by the construction of neuromuscular organoids, which will be genetically modified using CRISPR/Cas9 technology to reduce the expression levels of frataxin. At the same time, organoids with increased expression of frataxin will be manufactured. The models that will be constructed could be exploited to elucidate the role of frataxin, which is still under investigation, as well as testing platforms for new therapeutic approaches, clearly better than those currently available, such as animal models, which due to of a different physiology from that of humans are subject to antagonisms of findings and of two-dimensional cell cultures that are unable to simulate the in vivo conditions of a tissue.