title: Functional Characterization and Comparative Effectiveness of Differently Modified Variants of a DNAzyme Directed Against the Transcription Factor GATA-3
title: Funktionelle Charakterisierung und Wirksamkeitsvergleich unterschiedlicher Varianten eines DNAzyms gegen den Transkriptionsfaktor GATA-3
Creators: name: Behrje, Johanna
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: GATA-3
Transkriptionsfaktor
DNAzyme, Modification
Immunsystem
Allergisches Asthma , Antisense-Oligonucleotide
DNAzym, Modifikation
Medizin, Gesundheit

description: Allergic asthma is a chronic
      inflammatory disease of the airways that is characterized by
      reversible bronchial obstruction, bronchial
      hyperresponsiveness, mucosal edema and increased mucus
      secretion. The transcription factor GATA-3 has been shown to
      play a central role in the immune pathogenesis of allergic
      inflammatory responses due to its function in differentiation
      and activation of Th2 cells and its expression in
      eosinophils, mast cells and natural killer T cells. Thus,
      GATA-3 is considered an interesting therapeutic target for
      the treatment of allergic disorders including allergic
      asthma. Antisense technologies represent a novel class of
      therapeutic strategies that offer the possibility of early
      therapeutic intervention since, they directly interact with
      the mRNA of target proteins and subsequently cause specific
      inhibition of gene expression. A major class of antisense
      molecules is so-called DNAzymes, which are single-stranded
      RNA-cleaving deoxyoligonucleotides. Such molecules may be
      chemically modified in different ways which opens interesting
      possibilities for the optimization of this kind of antisense
      technology. In the present work, the basic structure of the
      GATA-3-specific DNAzyme hgd40 was modified by insertion of an
      inverted thymidine at the 3'-end, phosphothioate and
      2'-O-methyl-group base modifications as well as
      implementation of so-called locked nucleic acids. The
      original DNAzyme and the developed variants were functionally
      characterized. In particular, the influence of the
      modifications on the accessibility of the target sequence and
      the catalytic efficacy were examined. Furthermore, dependency
      of catalytic activities of the DNAzyme variants on magnesium
      concentrations was analysed and finally, the GATA-3-DNAzyme
      variants were evaluated with regard to potential off-target
      effects in an in vitro system. Analysis of cleavage activity
      revealed, that all developed variants could cleave the
      GATA-3-cRNA except the DNAzyme with a 2'-O-methyl-group
      modification hgd40-OMe3 and the LNAzyme hgd40-L2. The DNAzyme
      variant hgd40-3M modified with an inverse thymidine at the
      3'-end and the version hgd40-L3 showed similarly high or even
      slightly enhanced cleavage efficacies compared to the
      unmodified DNAzyme hgd40. With regard to magnesium
      dependency, all DNAzymes demonstrated high activities also at
      physiological magnesium concentrations suggesting that all
      variants might be active also in vivo. In terms of possible
      off-target effects it could be demonstrated in cell culture
      experiments, that none of the DNAzyme variants did
      significantly activate innate immune mechanisms, particularly
      through interaction with the toll-like receptor 9 (TLR-9). In
      conclusion, future use of modified versions of the
      GATA-3-specific DNAzyme hgd40 as a novel therapeutic strategy
      for the treatment of allergic asthma seems to be auspicious.
      This concept should be verified in further in vivo
      studies.
description: Das allergische Asthma bronchiale
      ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Atemwege,
      welche durch eine reversible Bronchoobstruktion, bronchiale
      Hyperreagibilität, Schleimhautödem und erhöhte
      Mukusproduktion gekennzeichnet ist. Innerhalb der
      Immunpathogenese einer allergischen Entzündungsreaktion
      spielt der Transkriptionsfaktor GATA-3 aufgrund seiner
      Funktion bei der Differenzierung und Aktivierung von
      Th2-Zellen und der Expression in Eosinophilen, Mastzellen und
      natürlichen Killer-T-Zellen eine zentrale Rolle und stellt
      aufgrund dessen ein interessantes therapeutisches
      Angriffsziel dar. Eine neue Therapiestrategie sind
      Antisense-Technologien. Sie bieten die Möglichkeit einer
      frühen therapeutischen Intervention, da sie direkt mit der
      mRNA der Zielmoleküle interagieren und so die spezifische
      Inhibierung der Expression eines Gens bewirken können. Zu den
      wichtigsten Antisense-Strategien gehören unter anderem
      DNAzyme, RNA-spaltende einzelsträngige Desoxyoligonukleotide.
      Durch die Möglichkeit, DNAzyme auf unterschiedliche Art zu
      modifizieren, ergeben sich zusätzlich interessante
      Möglichkeiten zur Optimierung dieser Antisense-Technologie.
      In dieser Arbeit wurde das GATA-3-spezifische DNAzym hgd40
      mit den Modifizierungen eines inversen Thymidins am 3´-Ende,
      Phosphothioatverbindungen, 2´-O-Methylgruppen und Locked
      nucleic acids versehen. Das DNAzym und die entwickelten
      Varianten wurden funktionell charakterisiert, insbesondere
      wurde der Einfluss der vorgenommenen Modifikationen auf die
      Zugänglichkeit gegenüber der Zielsequenz sowie auf die
      katalytische Effizienz untersucht. Weiterhin wurden die
      Aktivität in Abhängigkeit des Magnesiummilieus analysiert und
      die GATA-3-DNAzyme in einem in vitro System hinsichtlich
      einer Auslösung möglicher Nebenwirkungen überprüft. Analysen
      zur Spaltungsaktivität ergaben, dass alle entwickelten
      Varianten außer das mit 2’-O-Methylgruppen versehene
      hgd40-OMe3 sowie das mit LNA versehene hgd40-L2 die
      GATA-3-cRNA spalten konnten. Die mit inversem Thymidin am
      3´-Ende modifizierte Variante hgd40-3M und die mit LNA
      versehene Variante hgd40-L3 wiesen eine ähnlich hohe bzw.
      leicht verbesserte Spaltungseffizienz im Vergleich mit dem
      unmodifizierten hgd40-DNAzym auf. Hinsichtlich des
      Magnesiummilieus zeigte sich für alle verwendeten DNAzyme
      eine hohe Aktivität auch bei physiologischen
      Magnesiumkonzentrationen, welches auf eine hohe Aktivität in
      vivo hoffen lässt. Im Hinblick auf mögliche
      Off-Target-Effekte konnte in Zellkultur-Experimenten
      ausgeschlossen werden, dass die DNAzym-Varianten eine
      Aktivierung angeborener Immunmechanismen, insbesondere durch
      Interaktion mit dem Toll-like-Rezeptor 9, bewirken.
      Abschließend kann festgestellt werden, dass ein zukünftiger
      Einsatz eines modifizierten GATA-3-spezifischen hgd40-DNAzyms
      als neue Therapiestrategie bei Asthma bronchiale
      vielversprechend erscheint. Dies sollte in weiterführenden
      Untersuchungen in vivo überprüft werden.