title: Investigations on lin-Benzopurines With Respect to Dissociation Behavior, Pocket Cross-Talk, Targeting Resistance Mutants, Residual Mobility, and Scaffold Optimization
title: Untersuchungen an lin-Benzopurinen im Hinblick auf deren Dissoziationsverhalten, Kommunikation zwischen Bindetaschen, Adressieren von Resistenz-Mutanten, Seitenkettenbeweglichkeit und Grundgerüstoptimierung
Creators: name: Neeb, Manuel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Isothermale Titrationskalorimetrie
Enzyminhibition
Transferase
X-ray crystallography
drug design
Medizin, Gesundheit
transferase
isothermal titration calorimetry
Wirkstoffdesign
Proteinkristallographie
enzyme inhibition

description: The present thesis deals with the
      characterization and improvement of selective antibiotics
      targeting the enzyme tRNA–guanine transglycosylase. Recently,
      the lin-benzopurine scaffold was introduced as promising
      starting point for the structure-based design of TGT
      inhibitors. Two classes, namely the lin-benzoguanines and
      lin-benzohypoxanthines, were found to inhibit the target
      enzyme in the nanomolar range. However, the analyzed
      molecules did not show ideal drug metabolism and
      pharmacokinetic features since firstly they showed poor
      permeation through cell membranes and secondly their attached
      2-substituents were poorly defined in the difference electron
      density in crystal structures complicating the establishment
      of a structure–activity relationship. In a comprehensive
      study the protonation inventory of lin-benzopurines is
      addressed. Initial ITC measurements performed with
      lin-benzoguanine-type ligands suggested the uptake of one
      proton by the ligand. This protonation takes place at the
      basic guanidine moiety of the aminopyrimidinone structure of
      the scaffold. The lin-benzohypoxanthines do not show this
      behavior. pKa Calculations support the observations. While
      the lin-benzohypoxanthines bind to a TGT conformation closely
      similar to the apo enzyme interacting with only one aspartate
      within the G34 recognition site, addition of the exocyclic
      amino functional group in case of the lin-benzoguanines
      induces the rotation of a second aspartate towards the
      binding pocket. The negatively charged environment of both
      aspartates in short distance provokes a pKa shift in case of
      the lin-benzoguanines strong enough to induce the uptake of a
      proton. The hypothesis is proofed by studies using
      site-directed mutagenesis. Considering the binding affinities
      across the series of lin-benzopurines, a rather flat
      structure–activity relationship is observed. Therefore,
      additional insight into the driving forces of binding was
      gained by factorizing the free binding energy into
      enthalpy–entropy contribution. As expected, bindings of both
      series were found to be enthalpy-driven. Thereby, the
      lin-benzohypoxanthines exhibit a less pronounced enthalpic
      term due to their missing interaction to Asp102, which can be
      partly compensated by a crystallographically conserved water
      cluster located at the bottom of the G34 recognition site.
      While the thermodynamic profiles of the
      lin-benzohypoxanthines remain nearly unchanged, data for the
      lin-benzoguanines are found to be quite diverse. Obviously,
      the structural changes triggered by Asp102 in case of the
      lin-benzoguanines enable a cross-talk between U33 subpocket
      addressed by the 2-substituent and the G34 recognition site
      occupied by the parent scaffold. Based on elevated
      temperature factors, a high flexibility of the 2-substituent
      of the lin-benzoguanines was assumed. Therefore, we tested
      whether a binder with high residual mobility can avoid a loss
      in binding affinity in case of resistant mutations compared
      to a binder adopting one ordered binding mode. After
      identification of an appropriate mutation site, different
      mutants were expressed and crystallized. The derived binding
      affinities of various 2-amino-lin-benzoguanines could be
      related to the binding of the parent scaffold inducing
      disorder of the protein in proximal distance to the mutation
      site rather than to the different 2-substituents. Only
      marginal differences could be ascribed to the properties of
      the substitution pattern, most likely due to electrostatic
      attractions and repulsions, respectively. In further
      experiments MD-simulations were used to predict the binding
      modes of extended 2-amino-lin-benzoguanines. Subsequent
      crystal structure analyses unravelled novel aspects important
      for the further design and characterization of TGT
      inhibitors: Firstly, we were able to spot the 2-subsituent of
      the extended 2-amino-lin-benzoguanines, which bind to the
      ribose-32 subpocket that has never been occupied before.
      Secondly, the results emphasize the importance of the applied
      crystallization conditions. Poorly defined electron density
      does not always indicate ligands or substituents exhibiting
      high mobility in the protein-bound state. The applied
      crystallization protocol takes a major impact on the derived
      difference electron density and has to be considered in the
      discussion of the obtained structures. The class of
      5-azacytosines was investigated as a novel scaffold to
      inhibit TGT. Similarly as the lin-benzopurines, also the
      5-azacytosines are deduced from the natural substrate guanine
      and establish similar binding features, however, the key
      interaction to Asp102 that was proven to be of utmost
      importance for substrate recognition, ligand protonation, and
      pocket crosstalk is poorly established. Different from all
      known TGT inhibitors, they do not bind to the protein in a
      planar fashion. In consequence, the compared to
      lin-benzoguanines low pKa cannot be shifted into a window
      appropriate for ligand protonation and binding affinity
      drops.
description: Die vorliegende Arbeit behandelt
      die Charakterisierung und Optimierung selektiver Antibiotika
      gegen das Enzym tRNA-Guanin Transglykosylase. Kürzlich wurde
      das lin-Benzopurin-Grundgerüst als Ausgangspunkt für das
      strukturbasierte Wirkstoffdesign eingeführt. Zwei Klassen
      wurden als potente TGT-Inhibitoren identifiziert,
      lin-Benzoguanine und lin-Benzohypoxanthine. Allerdings zeigen
      diese Liganden keine idealen Eigenschaften in Bezug auf
      Metabolismus und Pharmakokinetik: Zum einen weisen sie eine
      geringe Permeation durch Zellmembranen auf. Zum anderen ist
      ihr 2-Substituent nur schwach durch Differenzelektronendichte
      in Kristallstrukturen definiert. Dies erschwert eine
      Struktur–Wirkungsbeziehung aufzustellen. In einer umfassenden
      Studie wurde der Protonierungszustand der lin-Benzopurine
      untersucht. Mit lin-Benzoguaninen durchgeführte ITC-Messungen
      suggerierten die Aufnahme eines Protons durch den Liganden.
      Diese Protonierung erfolgt am basischen Stickstoff der
      Guanidinstruktur im Aminopyrimidinonteil des Grundgerüstes.
      lin-Benzohypoxanthine weisen dieses Verhalten nicht auf.
      pKa-Berechnungen stützen diese Beobachtung. Während die
      lin-Benzohypoxanthine an eine dem Apo-Enzym ähnelnde
      Konformation der TGT binden, bei der die Liganden mit nur
      einem Aspartat in der G34-Tasche interagieren, induziert die
      zusätzliche Aminogruppe der lin-Benzoguanine die Rotation
      einer zweiten Aspartatseitenkette zur Bindetasche. Nur die
      negativ geladene Umgebung beider Aspartate in kurzer Distanz
      induziert eine pKa-Wertänderung der lin-Benzoguanine, die
      stark genug ist, um eine Protonenaufnahme zu begünstigen.
      Diese Hypothese konnte durch Mutationsstudien abgesichert
      werden. Unter Berücksichtigung der gemessenen
      Bindungsaffinitäten war eine flache
      Struktur–Wirkungsbeziehung der lin-Benzopurine zu beobachten.
      Daher wurden zusätzliche Einblicke in treibende Kräfte der
      Bindung über die Aufspaltung von ∆G in ∆H und -T∆S gewonnen.
      Wie erwartet, binden beide Ligandserien enthalpisch. Dabei
      weisen die lin-Benzohypoxanthine eine weniger ausgeprägte
      Enthalpie auf, da die Interaktion zum zweiten Aspartat in der
      G34-Tasche fehlt. Diese kann teilweise durch ein
      kristallographisch konserviertes Wassernetzwerk am Grunde der
      Tasche kompensiert werden. Während die thermodynamischen
      Profile der lin-Benzohypoxanthine fast unverändert bleiben,
      sind die Daten der lin-Benzoguanine divers. Offensichtlich
      ermöglichen strukturelle Änderungen induziert durch die
      Rotation des Aspartatrestes im Falle der lin-Benzoguanine
      eine Kommunikation zwischen U33-Tasche, die vom
      2-Substituenten adressiert wird, und G34-Tasche, die das
      Grundgerüst besetzt. Weiterhin wurde am Beispiel der
      2-Amino-lin-Benzoguanine getestet, ob ein Ligand mit hoher
      residualer Beweglichkeit einen Bindungsverlust im Falle einer
      Resistenzentwicklung eher vermeiden kann als ein Ligand mit
      geordnetem Bindungsmodus. Nach Identifizierung einer
      geeigneten Mutationsstelle folgten Expression und
      Kristallisation verschiedener TGT-Mutanten. Die für
      unterschiedliche 2-Amino-lin-Benzoguanine bestimmten
      Bindungsaffinitäten konnten eher in Zusammenhang mit dem
      Grundgerüst gebracht werden, das Unordnung seitens des
      Proteins in naher Umgebung zur Mutationsstelle verursacht,
      als mit den verschiedenen 2-Substituenten. Marginale
      Unterschiede konnten den Eigenschaften der Substituenten
      zugeschrieben werden, die auf elektrostatische Anziehungs-
      und Abstoßungskräfte zurückzuführen sind. Weitere Experimente
      nutzten MD-Simulationen, um den Bindungsmodus neuartiger
      2-Amino-lin-Benzoguanine vorauszusagen. Anschließend
      verfeinerte Datensätze deckten neuartige Aspekte für das
      weitere Design und die Charakterisierung von TGT-Inhibitoren
      auf: Erstens konnte den 2-Substituenten
      Differenzelektronendichte in der Ribose-32-Tasche zugeordnet
      werden, die zuvor noch nie durch Inhibitoren besetzt wurde.
      Zweitens unterstreichen die Ergebnisse die Wichtigkeit der
      verwendeten Kristallisationsbedingungen. Schlecht definierte
      Elektronendichte deutet nicht notwendigerweise auf Liganden
      oder Substituenten hin, die eine hohe Beweglichkeit im
      proteingebundenen Zustand besitzen. Das verwendete
      Kristallisationsprotokoll beeinflusst die erhaltene
      Differenzelektronendichte maßgeblich und muss in
      entsprechenden Diskussionen berücksichtigt werden. Die
      Substanzklasse der 5-Azacytosine wurde als neuartiges
      Grundgerüst für TGT-Inhibitoren untersucht. Ähnlich den
      lin-Benzopurinen sind auch diese vom natürlichen Substrat
      Guanin abgeleitet. Sie zeigen daher vergleichbare
      Bindungseigenschaften, jedoch ist die Interaktion zu Asp102
      schwach ausgebildet, die sich als äußerst wichtig für
      Substraterkennung, Ligandprotonierung und Kommunikation
      zwischen den Bindetaschen herausgestellt hat. Anders als alle
      bekannten TGT-Inhibitoren binden sie nicht planar an das
      Protein. In Folge wird der im Vergleich zu den
      lin-Benzoguaninen niedrigere pKa-Wert nicht in ein Fenster
      geeignet für die Ligandprotonierung verschoben und die
      Liganden brechen in der Affinität ein.