Χρήση της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 για την δημιουργία σταθερών ηπατικών κυτταρικών σειρών μειωμένης έκφρασης του HNF4α
Creators: name: Νιαούρης, Αθανάσιος Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: μειωμένης έκφρασης
HNF4α
CRISPR/Cas9
stable knock out

description: Η συμμετοχή του ηπατοειδικού πυρηνικού παράγοντα HNF4α στην εμφάνιση και την εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος τον έχει καταστήσει αντικείμενο μελέτης πληθώρας ερευνητικών εργασιών. Η σημασία της περαιτέρω κατανόησης κάθε μηχανισμού που ενέχεται στην ανάπτυξη του ηπατοκαρκινώματος είναι μεγάλη καθώς το ηπατοκαρκίνωμα αποτελεί την 3η σε συχνότητα αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια μόνιμης αποσιώπησης του γονιδίου του HNF4α κάνοντας χρήση της τεχνολογίας CRISPR-Cas9 με τελικό στόχο την δημιουργία σταθερών ηπατικών κυτταρικών σειρών μειωμένης έκφρασης του HNF4α. Αρχικά, σχεδιάστηκαν 4 διαφορετικά guideRNAs έτσι ώστε να παρουσιάζουν συμπληρωματικότητα με τμήματα του γονιδίου του HNF4α και εν συνεχεία κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα lentiCRISPRv2. Ακολούθησε διαμόλυνση σε κύτταρα HEK293FT για την παραγωγή των τεσσάρων λεντιικών σωματίων που φέρουν τα 4 διαφορετικά guideRNAs (ο καθένας διαφορετικό ένθεμα ενός εκ των τεσσάρων διαφορετικών guideRNAs). Οι ιικοί πλασμιδιακοί φορείς χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμούς των 2 για την αποτελεσματικότερη στόχευση του γονιδίου ΗΝF4α μέσω επιμόλυνσης των ηπατικών καρκινικών κυττάρων σειρών HepG2 και Huh-7. Το επιδιωκόμενο αποτέλεσμα γονιδιωματικής τροποποίησης ελέγχθηκε με τη διενέργεια PCR, όπου έγινε προσπάθεια ενίσχυσης του στοχευόμενου από το CRISPR-Cas9 σύστημα, τμήματος DNA. Επίσης ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του HNF4α μέσα από ανάλυση κατά Western. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν τόσο από την PCR όσο και από την ανάλυση κατά Western, δεν κατέδειξαν γονιοδιωματική τροποποίηση. Προκειμένου να διερευνηθούν τα αίτια της μη επιτυχούς αυτής προσπάθειας είναι ανάγκη να ελεγχθούν οι παράμετροι σχεδιασμού των guideRNAs καθώς και η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας της επιμόλυνσης. Περιθώρια βελτιστοποίησης της μεθόδου υπάρχουν πολλά και επικεντρώνονται στη χρήση πιο εξελιγμένων λεντιικών φορέων και νέων τεχνητών μορφών νουκλεάσης Cas9, που θα πρόσφεραν πλεονεκτήματα αποδοτικότερης, πιο εξειδικευμένης και πιο εύκολα αναγνωρίσιμης στόχευσης.
description: The importance of Hepatocellular Nuclear Factor 4α (ΗNF4α) in the development of Hepatocellular carcinoma (HCC) is the leading cause of numerous scientific studies. Further understanding of the mechanisms involved in the development of HCC, is of great importance since HCC is the third most common cause of death, worldwide. The aim of this project was to optimize and utilize CRISPR-Cas9 technologies with the intension to develop HNF4α stable knock out liver cancer monoclonal cell lines. To this purpouse four different guideRNAs were designed and inserted into the latest lentiviral vector based plasmid vector available, lentiCRISPRv2. Next, we optimized the production of lentiviral particles each corresponsding to the four newly designed guideRNAs, utilising HEK293FT cells. Transduction experiments in two liver cancer cells lines, Huh7 and HepG2, were performed using different combinations of guideRNAs to achieve more efficient HNF4a gene editing. In parallel, transfection experiments were performed using the same guide RNA combinations. We designed several deletion detection protocols to assess HNF4a gene editing based on PCR amplification of the targeted DNA locus dependent on the guide RNA combinations used. Immunoblotting analysis was also used to assess HNF4a protein expression levels following editing experiments. The results produced did not identify successful HNF4a gene editing. We explored further optimization parameters among improvements on the guideRNA design protocols and the efficiency of lentiviral transduction. Optimised CRIPSR cas9 methodology can be achieved in the future by utilizing newly developed lentiviral vectors and Cas9 nucleases that would offer higher targeting efficiency and specificity, as well as better detection methods of successful gene editing events.