title: Effect of stress on cellular properties of probiotic microorganisms
Creators: name: Rabenreither, Marie-Christin
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Verschiedenste Präparate enthalten heutzutage probiotische Mikroorganismen. Eine Herausforderung bleibt dabei noch immer die möglichst schonende Verarbeitung. Die klassischen Methoden, auf die oft zurückgegriffen wird, sind Lyophilisation und Sprühtrocknung. Beide Varianten verursachen Stress für die Bakterien, sichtbar anhand koloniebildender Einheiten und zellulärer Eigenschaften. Das Wirbelschichtverfahren bietet eine moderate Methode für Granulierung und Trocknung. Anhand Enterococcus faecium M-74 sollte in dieser Arbeit festgestellt werden, ob das Wirbelschichtverfahren für die Trocknung von Bakterien geeignet ist. Für diesen Zweck wurde E. faecium M-74 in einer Wirbelschichtanlage auf kristalline Mikrozellulose-Pellets aufgesprüht. Der Zustand der Bakterien wurde einerseits durch die Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf Agarplatten überprüft, andererseits wurden verschiedene fluoreszierende Farbstoffe verwendet. Der Grad der Zerstörung der Zellmembran wurde mit Propidiumiodid detektiert, mit Dihydrorhodamin 123 wurde die Wasserstoffperoxidproduktion nachgewiesen. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Microplate Reader durchgeführt. Verschiedene Substanzen wie Saccharose, „Skim milk“ (Magermilchpulver), Glukose und Dextrin wurden in unterschiedlichen Konzentrationen (10%, 50% und 100% bezogen auf die Feuchtmasse an Bakterien) hinzugefügt, um die Mikroorganismen vor allzu großer Zerstörung und Stress zu schützen. Bei dieser Versuchsreihe stellte sich heraus, dass 100% Saccharose bezogen auf die Bakterien-Feuchtmasse die besten Ergebnisse bezüglich der Lebensfähigkeit, des Zustands der Zellmembranen und der Wasserstoffperoxidproduktion zeigten. 100% Saccharose wurde auch ausgewählt, um Enterococcus faecium M-74 in der folgenden Versuchsanordnung zu schützen. Der Einfluss der einzustellenden Parameter auf die Mikroorganismen - Prozesstemperatur, Prozesszeit resultierend aus der Sprührate und der verwendete Sprühdruck während des Wirbelschichtprozesses - wurde ebenfalls überprüft. Die Temperatur schwankte zwischen 40 und 60°C, die Prozesszeiten variierten zwischen 7 und 45 Minuten, der verwendete Sprühdruck zwischen 1 und 3 bar. Die gleichen Methoden wie oben erwähnt wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit, Zustand der Zellmembran und die Wasserstoffperoxidproduktion zu eruieren. Die Prozesstemperatur zeigte den größten Effekt auf die Viabilität der Bakterien. Zusammenfassend lässt sich zu dieser Versuchsreihe sagen, dass mit 40 °C, 15 Minuten und 1.5 bar die besten Ergebnisse bezogen auf die Lebensfähigkeit, den Zustand der Zellmembran und die Wasserstoffperoxidproduktion während des Wirbelschichtprozesses für Enterococcus faecium M-74 erreicht wurden. Das Wirbelschichtverfahren bietet eine gute Möglichkeit, E. faecium M-74 unter Zuhilfenahme geeigneter Protektantien und Prozesseinstellungen zu stabilisieren. Neben den Auswirkungen des Wirbelschichtverfahrens auf die Mikroorganismen wurde auch der Effekt von Kältestress untersucht. In einer neuen Versuchsanordnung wurden die Effekte von -20 °C, -80 °C und -200 °C in flüssigem Stickstoff auf E. faecium M-74 ermittelt. Bei -80 °C wurden auch verschiedene Arten des Einfrierens untersucht. Einerseits wurden die Bakterien schonungslos im Tiefkühler bei -80 °C gekühlt, andererseits wurden sie langsam auf diese Temperatur mit einer Rate von -1 °C pro Minute gebracht. Bei diesem Teil der Arbeit sind weitere fluoreszierende Farbstoffe zum Einsatz gekommen. Neben den schon erwähnten wurden der Hyperpolarisationsgrad der Membran mit Dihexyl-oxacarbocyaniniodid und der intrazelluläre pH-Wert mit Carboxyfluorescindiacetatsuccinimidylester mit dem Microplate Reader und dem Durchflusszytometer gemessen. Bei -200 °C zeigten die Bakterien das geringste Maß an Schaden, sie bildeten die meisten kolonieformenden Einheiten aus. Das stufenweise Einfrieren auf -80 °C brachte ebenfalls gute Ergebnisse, als schlechteste Methode entpuppte sich das Einfrieren auf -20 °C. In einem weiteren Versuch wurde die Eignung von Saccharose und Glucose mit 50% und 100% bezogen auf die Feuchtmasse an Bakterien als Protektantien während des Einfrierens getestet. Die Bakterien wurden in flüssigem Stickstoff und bei -80 °C eingefroren. In diesem Fall zeigten interessanterweise sowohl 50% Saccharose als auch 50% Glucose die besseren Ergebnisse.