title: Improved in vitro and in planta DNA repair by CPD photolyases.
title: Verbesserte in vitro und in planta DNA-Reparatur durch CPD-Photolyasen.
Creators: name: Kaiser, Gebhard Alexander
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: DNS-Reparatur
Biowissenschaften, Biologie
Antennen-Chromophor
Arabidopsis thaliana
Photolyase
Antenna chromophore
Thermus thermophilus
UV-Toleranz
Cyclobutanpyrimidindimer
Transgene Pflanzen
Cyclobutane pyrimidine dimmers
DNA repair

description: Ultraviolet-B (UV-B, 280–320 nm)
      radiation may have severe negative effects on plants
      including damage to their genetic information. UV protection
      and DNA repair mechanisms have evolved to either avoid or
      repair such damage. Since autotrophic plants are dependent on
      sunlight for their energy supply, an increase in the amount
      of UV-B reaching the earth’s surface may affect the integrity
      of their genetic information if DNA damage is not repaired
      efficiently and rapidly. Here we show that overexpression of
      cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) Photolyase (EC 4.1.99.3)
      in Arabidopsis thaliana (L.), which catalyses the reversion
      of the major UV-B photoproduct in DNA (CPDs), strongly
      enhances the repair of CPDs and results in a moderate
      increase of biomass production under elevated UV-B.
      Functional analysis of the class I DNA photolyase from
      Thermus thermophilus revealed the binding of flavin
      mononucleotide (FMN) as an antenna chromophore. The binding
      mode of FMN closely coincides with the binding of a
      deazaflavin-like chromophore in the related class I DNA
      Photolyase from Anacystis nidulans. Compared to the R46E
      mutant, which lacks a conserved arginine in the binding site
      for the antenna chromophore, the FMN-comprising
      holophotolyase exhibits an eightfold higher activity at 450
      nm. The facile incorporation of the flavin cofactors 8 into
      the binding site for the antenna Chromophore paves the way
      for wavelength-tuning of the activity spectra of DNA
      photolyases by using flavins.
description: CPD-Photolyasen sind Enzyme, die
      lichtabhängig Cyclobutanpyrimidindimer (CPD), eines der
      Hauptprodukte der UV-abhängigen DNA-Schädigung, reparieren.
      Sie können bei fast allen Lebewesen gefunden werden und
      spielen eine zentrale Rolle bei der UV-Resistenz dieser
      Organismen. Als monomeres, fehlerfrei und energieneutral
      arbeitendes Reparatursystem sind sie ein geeignetes Werkzeug
      für die biotechnologische Verbesserung der UV-Toleranz. So
      könnten sie helfen, den negativen Folgen der erhöhten
      UV-Belastung, die durch das Ozonloch entstehen, entgegen zu
      wirken. In Escherichia coli rekombinant überexprimiert bindet
      die CPD-Photolyase aus Thermus thermophilus FMN als zweiten
      Kofaktor. Im Gegensatz hierzu binden die meisten anderen
      diesbezüglich analysierten Photolyasen
      Methenyltetrahydrofofalt oder Deazaflavin als zweiten
      Kofaktor. In dieser Arbeit wird durch Absorptions- und
      Wirkungsspektroskopie gezeigt, dass FMN als
      Antennenchromophor fungiert und die absorbierte Lichtenergie
      auf den katalytisch aktiven FAD-Kofaktor überträgt. Hierdurch
      wird die Photoreduktion und Enzymaktivität der Thermus
      thermophilus Photolyase deutlich verbessert. Als sessile und
      photoautotrophe Organismen sind Pflanzen in besonderem Maße
      UV- und Lichtstress ausgesetzt. Sie besitzen hochkomplexe
      Signal- und Schutzmechanismen, um sich optimal an die an
      ihrem Standort vorherrschenden Lichtbedingungen anzupassen.
      Bei der UV-Toleranz von Pflanzen spielen CPD-Photolyasen eine
      zentrale Rolle. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die
      gezielte Verbesserung der Reparatur von CPD-Schäden durch die
      Überexpression der Arabidopsis CPD-Photolyase in Arabidopsis
      thaliana einen positiven Effekt auf die UV-Toleranz der
      Pflanzen hat. Hierfür wurde der kodierende Bereich des CPD-
      Photolyasegens (At-PHR1) mit dem starken und konstitutiven
      35S CaMV Promotor fusioniert und Arabidopsis stabil mit dem
      resultierenden Konstrukt transformiert. Die stabile
      Integration des Transgens in das Genom wurde durch Southern
      Blot überprüft und zudem die Anzahl der T-DNA-Insertionen
      bestimmt. Die Überexpression wurde dann auf
      transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene bestimmt.
      Es konnten deutlich erhöhte Transkript- und Proteinmengen von
      CPD-Photolyase in den transgenen Linien nachgewiesen werden.
      Um den Einfluss der At-PHR1-Überexpression auf die Reparatur
      von CPD-Schäden zu untersuchen, wurden Rosettenblätter mit
      UV-B und UV-A reichem Licht bestrahlt und die
      CPD-Akkumulationsrate bestimmt. Hierbei zeigte sich eine
      deutlich verringerte Akkumulation von CPDs in den transgenen
      Linien. Weiterhin wurde untersucht, wie sich die Reduktion
      der CPD-Akkumulation auf das Wachstum der Pflanzen auswirkt.
      Hierzu wurde das Frischgewicht und der Rosettendurchmesser
      der unter UV-Stress angezogen Pflanzen bestimmt. Hierbei
      zeigen die Photolyase-überexprimierenden Pflanzen im
      Vergleich zum Wildtyp eine deutlich geringere Sensitivität
      gegenüber UV-B. In der Literatur gibt es widersprüchliche
      Angaben zur zellulären Lokalisation von CPD-Photolyasen in
      Pflanzen. Durch Konfokale Laser Scanning Mikroskopie von
      Arabidopsis Protoplasten, die ein At-PHR1::GFP Fusionsprotein
      exprimierten, wird hier gezeigt, dass die zelluläre
      Lokalisation von At-PHR1 auf den Zellkern beschränkt
      ist.