title: Improved split-root system for the study of systemic sulfur allocation and incorporation into bacteroid proteins
Creators: name: Stamenovic, Dragoslava
Publisher: name: :none
Year: 2019

description: Die symbiotische Wechselwirkung zwischen Hülsenfrüchten und Rhizobium-Bakterien beinhaltet den Nährstoffaustausch zwischen den beiden Partnern und ermöglicht den Pflanzen, auf stickstoffarmen Böden zu wachsen. Dieser Stoffwechselaustausch findet in den neu gebildeten Wurzelorganen, den Knöllchen, statt, in denen Pflanzen Symbionten mit Zucker, Schwefel und Mikronährstoffen versorgen, während die Bakterien atmosphärischen Stickstoff (N) binden, um Aminosäuren zu bilden. Sulfat ist die Schwefelform, die für die Biosynthese des bakteriellen enzyms, Nitrogenase (für die N-Fixierung), entscheidend ist. Es wurde gezeigt, dass Sulfate direkt zum Symbionten transportiert wird. Es bleibt die Frage, ob das Sulfat auch systemisch über den Sproß oder indirekt durch Einbau in schwefelhaltige Aminosäuren zu den Rhizobien transportiert werden kann. Dafür habe ich ein robustes „Trennwurzelsystem“ (Split-Root-System) entwickelt und festgestellt, dass Sulfat höchstwahrscheinlich nur direkt und nicht über den Sproß, zu den Bakteroiden transportiert werden kann; Es gab keine Hinweise auf einen alternativen, systemischen Transportmechanismus. Die Entwicklung des Split-Root-Systems führte zu einem sehr detaillierten Protokoll und ermöglichte die Untersuchung des systemischen Nährstofftransports in der Modellhülsenfrucht Lotus japonicus. Dafür verwendete ich dieses Split-Root-System, wobei eine Wurzel symbiont inoculiert und ohne Sulfat und die andere nicht symbiotisch angezogen wurde, aber 34S-markiertes Sulfat über eine Nährlösung erhielt. Während frühere Experimente nachweisen konnten, dass markiertes Sulfat nach fünf Tagen zu 10% in die Nitrogenase eingebaut wird, konnte ich nun auch nach neun Tagen keine klaren Hinweise für einen Schwefeleinbau finden. Es wurde bei indirekter Sulfatapplikation über das Split-Root-System kein signifikanter Anstieg in der relativen Isotopenhäufigkeit festgestellt. Meine Ergebnisse zeigen, dass Sulfat die einzige Form von Schwefel ist, die zu den Mikrosymbionten transportiert werden kann. Es kann ferner vermutet werde, dass Sulfat nicht vom Sproß zu den Wurzeln transportiert wird, aber eventuel in anderen Formen, die jedoch nicht in der Lage sind, in den Symbiosom einzudringen. Das in dieser Studie entwickelte Split-Roots-System ist robuster als frühere Protokolle und kann leicht an andere Forschungsfragen angepasst werden, um z.B. die genaue Sulfatkonzentration zu bestimmen, die für die symbiotische N-Fixierung benötigt wird sowie für die weitere Forschung an der Autoregulierung der Knöllchenbildung, für die dieses System ursprünglich konzipiert wurde.
description: The symbiotic interaction between legumes and rhizobium bacteria involves the nutrient exchange between both partners and enables the plants to grow on nitrogen deficient soils. This metabolic exchange is located in the newly formed root organs, the nodules, where plants supply symbionts with sugar, sulfur and micronutrients while the bacteria fix atmospheric nitrogen (N) to build amino acids. Sulfate is the form of sulfur, crucial for the bacterial nitrogenase enzyme biosynthesis, responsible for N2-fixation, and has been shown to be the form that directly transported towards the symbiont. The question remains whether sulfate can also be systemically transported to the rhizobia via shoots or via incorporation into sulfur-containing amino acids. For this, I developed a robust split-root system and found that sulfate can most likely only be directly (locally) transported to the bacteroids; there were no indications for an alternative systemic transport mechanism. The development of the split-root system resulted in a very detailed protocol and allowed the study of systemic nutrient transport in the model legume, Lotus japonicus. For this, I used a split-root system, with one root being inoculated and kept without sulfate and the other not being inoculated but receiving 34S-labeled sulfate through a nutrient solution. While previous experiments could demonstrate that sulfate is incorporated into rhizobium nitrogenase, I could not find any clear indications for a sulfur incorporation even after nine days. No significantly difference was detected in the relative isotope abundance when applying sulfate indirectly through split-roots. My results indicate that sulfate is the sole form of sulfur that can be transported to the microsymbionts. It further suggests that sulfate is not transported from shoots to roots but may be transported in other forms, which are not able to enter the symbiosome. The split-roots system, developed during this study, is more robust than previous protocols and may be easily adapted to other research questions such as to determine the exact sulfate concentration needed for symbiotic N-fixation and nodule formation as well as for further research on autoregulation of nodulation for instance.