Charakterisierung der N-terminal verlängerten Isoform des humanen TRPV6-Ionenkanals in einem Überexpressionsmodell
Creators: name: Pomowski, Anett
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2020
Subjects: TRPV6
ACG-Startcodon
Calcium Imaging
NFAT
Migration
Invasion
Vesikeltransport

description: Die Superfamilie der Transient Receptor Potential (TRP)-Ionenkanäle ist eine große Gruppe von Kationenkanälen, die in einer Vielzahl fundamentaler physiologischer Prozesse involviert sind. Innerhalb der TRP-Familie weist der TRPV6- (Transient Receptor Potential Vanilloid Subfamily Member 6), neben dem TRPV5-Ionenkanal, die größte Selektivität für Ca2+ auf (PCa/PNa&gt;100). Der TRPV6-Ionenkanal ist in apikalen Membranen von Ca2+-transportierenden Epithelien verschiedener Gewebe unterschiedlich stark exprimiert und spielt in der Aufnahme von Calcium-Ionen eine wichtige Rolle. Eine veränderte TRPV6-Expression ist mit einer Reihe verschiedener Erkrankungen, einschließlich zahlreicher Tumorarten, assoziiert. Die Translation des humanen TRPV6-Proteins wird an einem nicht-kanonischen ACG-Startcodon initiiert, das 120 Nukleotide stromaufwärts, im gleichen Leseraster des ersten kanonischen AUG-Startcodons liegt. Das resultierende humane full-length TRPV6-Protein besteht aus 765 Aminosäuren (NM_018646). Das zunächst annotierte Protein mit 725 Aminosäuren stellt somit eine N-terminale Deletionsvariante dar. Die Sequenz der zusätzlichen 40 Aminosäuren weist keine Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinsequenzen auf. Die heterologe Expression des full-length TRPV6-Proteins als auch der Deletionsvariante führte in Säugetier-Zelllinien zu funktionellen Ionenkanälen. Mit der vorliegenden Dissertation wurde das Ziel verfolgt, die Ionenkanal-Eigenschaften des humanen full-length TRPV6-Proteins und der TRPV6-Deletionsvariante in lebenden Zellen vergleichend zu analysieren und dadurch Hinweise auf mögliche Funktionen der zusätzlichen 40 N-terminalen Aminosäuren zu erhalten. Dazu wurden TetOn-regulierbare, stabile Zelllinien entwickelt, die das humane full-length TRPV6-Protein bzw. die TRPV6-Deletionsvariante als Fusionsprotein mit einem C-terminalen mCherry-Fluoreszenztag exprimierten. Durch die stabile, regulierbare Expression in CHO-K1-Zellen konnte eine bessere Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Das TRPV6-mCherry-Fusionsprotein erlaubte die Quantifizierung der hTRPV6-Überexpression parallel zum Calcium-Imaging als auch subzelluläre Lokalisationsstudien. Bei gleicher Doxyzyklin-Induktion war die Deletionsvariante 3-fach höher exprimiert als das full-length TRPV6-Protein. Beide Varianten der TRPV6-Ionenkanäle waren in den Überexpressionsmodellen funktionell aktiv. Die Bestimmung der Aktivität der in den stabilen Zelllinien exprimierten humanen TRPV6-Ionenkanäle bzw. der deletierten Ionenkanalvariante erfolgte durch nicht-ratiometrische Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i). Für die Analysen wurde ein Flusskammermodell etabliert. Die Messungen der [Ca2+]i wurde in den Zellmodellen in Abhängigkeit von der durch Doxyzyklin-induzierten TRPV6-Expressionshöhe und einer Thapsigargin-Behandlung zur Entleerung der intrazellulären Ca2+-Speicher sowie abhängig von der extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]e), des extrazellulären pH-Wertes (pHe) und von TRPV6-Antagonisten durchgeführt. Die resultierenden, durch TRPV6-vermittelten Änderungen der [Ca2+]i konnten durch Calcium-Imaging sehr gut aufgelöst und verglichen werden. Durch die internen Kontrollen war es möglich, Ca2+-Einströme, die nicht durch TRPV6-Ionenkanäle vermittelt wurden, zu quantifizieren. Aus den vergleichenden Analysen der [Ca2+]i konnte abgeleitet werden, dass die humanen full-length TRPV6-Ionenkanäle nach Erhöhung der [Ca2+]i, [Ca2+]e und pHe schneller und stärker inhibiert werden als die TRPV6-Deletionsvariante. Bei der pharmakologischen Testung der Zellen mit den Antagonisten Ruthenium Red, La3+, 2-APB und SOR-C13 waren die IC50-Werte für den TRPV6-spezifischen Peptid-Inhibitor SOR-C13 auffallend unterschiedlich: in den Zellen mit Expression der TRPV6-Deletionsvariante war der IC50-Wert 71-fach niedriger als in Zellen mit Expression der full-length TRPV6-Ionenkanäle. Zusätzlich wurde der Einfluss der Überexpression der TRPV6-Ionenkanäle auf Ca2+-abhängige zellphysiologische, einschließlich pathophysiologischer Prozesse, wie Vesikeltransport, Proliferation, Migration, Invasion und Aktivierung des NFAT-Signalwegs untersucht. Bei der Analyse des Vesikeltransportes ergaben sich erste Hinweise auf eine unterschiedliche Regulation der beiden TRPV6-Varianten. Die TRPV6-Deletionsvariante war stärker mit Rab7 kolokalisiert, während das full-length TRPV6-Protein eine stärkere Kolokalisation mit Rab11 aufwies. Die Analyse einer TRPV6-vermittelten Aktivierung des NFAT-Signalweges erfolgte auf der Basis eines Luciferase-Assays. Beide TRPV6-Varianten aktivierten den NFAT-Signalweg, allerdings war die NFAT-Aktivierung durch die Deletionsvariante im Vergleich zum full-length TRPV6 2-fach höher. Die Überexpression der beiden TRPV6-Varianten führte weiterhin zu einer 1,4-fach erhöhten Migrationsgeschwindigkeit der Zellen. In Zusammenfassung aller gezeigten Resultate konnten signifikante, funktionelle Unterschiede zwischen der TRPV6 Deletionsvariante und dem full-length TRPV6-Ionenkanal ermittelt werden, die anzeigen, dass die zusätzlichen 40 Aminosäuren der verlängerten N-terminalen Region einen Einfluss auf die Ca2+-abhängige Inaktivierung des Ionenkanals sowie auf die NFAT-Aktivierung haben. Darüber hinaus weisen die IC50-Werte für den SOR-C13 Inhibitor darauf hin, dass der full-length TRPV6-Ionenkanal im Vergleich zur Deletionsvariante möglicherweise eine unterschiedliche Konformation einnimmt, die die Bindung des Peptid-Inhibitors erschwert.