Επίδραση των micrornas στον ηπατοειδικό πυρηνικό υποδοχέα 4 άλφα (HNA-4a):
Creators: name: Μασμανίδου, Ερμιόνη Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Ηπατοειδής πυρηνικός υποδοχέας 4 άλφα
Πυρηνικός υποδοχέας
Micrornas
Nsa-mir-24
HepG2
Caco-2
Hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF-4a)
Nuclear factor

description: Ο πυρηνικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων 4 (Hepatocyte Nuclear Factor 4, HNF-4, NR2A1 στο ενοποιημένο σύστημα ονοματολογίας) είναι ένα ορφανό μέλος της οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων, αφού δεν έχει αναγνωριστεί κάποιο μόριο συνδέτης για αυτόν. Ο HNF-4α έχει απομονωθεί από διάφορα είδη ζώων, τόσο από ασπόνδυλα (Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti), όσο και από σπονδυλωτά (άνθρωπος, μυς, βάτραχος) και παρουσιάζει ιδιαίτερα σημαντική συντηρητικότητα στην ακολουθία των αμινοξέων του. Αποτελεί εξελικτικά έναν από τους πιο συντηρημένους πυρηνικούς υποδοχείς. Ο HNF-4 παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταγραφική ενεργοποίηση από τα πρώτα εμβρυονικά στάδια μέχρι και την ενηλικίωση. Ρυθμίζει την έκφραση μια πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια. Παράλληλα, επάγει την έκφραση μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν τη μεταγραφή των ηπατοειδικών γονιδίων. Έτσι, κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ηπατοκυττάρων, ενώ ευθύνεται και για τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο ήπαρ, αλλά και για τη δημιουργία του ηπατικού επιθηλίου. Επιπλέον, είναι πολύ σημαντικός ο ρόλος του στη γαστριδιοποίηση, αφού σε ποντικούς στους οποίους τα αλληλόμορφα του γονιδίου του HNF-4 δεν κωδικοποιούν λειτουργικό υποδοχέα, η γαστριδιοποίηση ξεκινά, αλλά αποτυγχάνει να συνεχίσει περαιτέρω, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξής τους. Όσον αφορά τα microRNAs (miRNAs), αυτά είναι μικρά μόρια RNA που κωδικοποιούνται από το γονιδίωμα των φυτών, των ζώων και των ιών. Αυτά τα υψηλά συντηρημένα μόρια RNA με μήκος 21 νουκλεοτιδίων φαίνεται ότι ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά, μέσω της σύνδεσης στις 3’ αμετάφραστες περιοχές (3’ untranslated regions, 3’ UTR) ειδικών αγγελιοφόρων RNAs (messenger RNAs, mRNAs). Υπάρχουν πολλά δεδομένα ότι τα miRNAs ίσως δρουν σαν σημαντικοί ρυθμιστές σε πάρα πολλές διαδικασίες, όπως η πρώιμη ανάπτυξη, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και ο κυτταρικός θάνατος, η απόπτωση και ο μεταβολισμός των λιπιδίων, η διαφοροποίηση των κυττάρων, καθώς και η ανάπτυξη του εγκεφάλου. Σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της πιθανής επίδρασης ενός συγκεκριμένου μορίου miRNA στα επίπεδα έκφρασης του HNF-4α. Παράλληλα, ένας επιπρόσθετος στόχος ήταν και η ανεύρεση του μονοπατιού, με βάση το οποίο αυτό το miRNA επηρεάζει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα HNF-4α. Προκειμένου να επιτευχθούν οι στόχοι αυτοί, υπήρχαν δύο σειρές πειραμάτων, οι οποίες πραγματοποιούνταν παράλληλα. Στην πρώτη σειρά πειραμάτων, πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυτταρικών σειρών HepG2 και Caco-2, οι οποίες εκφράζουν ενδογενώς τον HNF-4α, με το μόριο hsa-miR-24. Έπειτα, με ανάλυση κατά Western, βρέθηκε ότι τα επίπεδα του HNF-4α μειώνονται μετά από επίδραση με το συγκεκριμένο μόριο miRNA. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η επίδραση αυτού του miRNA σε καθοδικούς στόχους του HNF-4α, στις απολιποπρωτεΐνες ApoCIII και ApoAI στις κυτταροκαλλιέργειες HepG2 και Caco-2, αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε μείωση και στα επίπεδα έκφρασης των απολιποπρωτεϊνών μετά την επίδραση με το miRNA. Προκειμένου να επιτευχθεί ο δεύτερος στόχος, κλωνοποιήθηκε η 3’ αμετάφραστη περιοχή του γονιδίου του HNF-4α καθοδικά πλασμιδίου έκφρασης της λουσιφεράσης, εφόσον προηγουμένως ενισχύθηκε η περιοχή αυτή, μέσω της αλυσιδωτούς αντίδρασης πολυμεράσης. Το ανασυνδυασμένο αυτό πλασμίδιο αυτό θα χρησιμοποιηθεί μελλοντικά, προκειμένου να διευκρινιστεί ο τρόπος δράσης του συγκεκριμένου miRNA, αλλά και για να επαληθευτούν τα μέχρι τώρα αποτελέσματα.
description: Hepatocyte Nuclear Factor 4α (Nuclear Receptor 2A1) is an orphan member of the nuclear receptor superfamily, as it has not been yet identified any ligand for this factor. HNF-4 has been identified in many animal species, both in invertebrates (Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Aedes aegypti) and in vertebrates (human, rats, frogs). This factor has a highly conserved novel in its amino acid sequence and it is one of the most highly conserved nuclear receptors. HNF-4 plays an important role in activation of transcription from the early embryonic development till majority. It regulates the expression of many genes involved in various metabolic pathways. Furthermore it induces the expression of transcription factors which regulate the transcription of hepatocyte specific genes. HNF-4α fulfills an essential role in differentiation of hepatocytes, while it is responsible for the concentration of glucose in the liver. It is also responsible for the generation of a hepatic epithelium. HNF-4α function has been implicated in early endodermal development. Mouse embryos lacking HNF-4α die before completing gastrulation due to visceral endoderm dysfunction. As far as microRNAs (miRNAs) are concerned, these are small RNA molecules that are transcripted from the genome of plants, animals and viruses. These highly conserved RNA molecules are about 21 nucleotides long and could silence target gene expression through base pairing to the complementary sequences in the 3’ untranslated regions (3’ UTRs) of targeted genes. They play an important regulatory role in early development, in cell proliferation and cell death, in apoptosis and in lipid metabolism, in cell differentiation and in brain development. This project intended to study the possible effect of a particular microRNA on the expression levels of HNF-4α. Furthermore another intention of this project was to study the regulatory pathway by which this microRNA controls the expression of HNF-4α. In order to find these answers there were two groups of experiments. At the first group, we transfected HepG2 and Caco-2 cells, which express endogenously HNF- 4α, with the hsa-miR-24. Then using the Western analysis it was found that there was a reduction in the expression levels of HNF-4α after the transfection with the specific microRNA. At the same time, we studied the effects of this microRNA on downstream target genes of HNF-4α, on the apolipoproteins ApoCIII and ApoAI in the cell cultures of HepG2 and Caco-2 respectively. It was found that there was a reduction in the expression levels of both apolipoproteins after the transfection with the microRNA. In order to find the regulatory pathway by which this microRNA controls the expression of HNF-4α, the 3’ UTR of the HNF-4α gene was cloned downstream the luciferase gene in a plasmid vector. Before that, the 3’ UTR was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). This recombinant plasmid will be used in the future to determine this regulatory pathway.