Charakterisierung von zwei Na + -Phosphat-Kotransportern des Typs NaPi-IIb aus dem Zebrafisch (Brachydanio rerio) und die Regulation durch Antisense-Transkripte
Creators: name: Nalbant, Perihan
Publisher: name: Universität Dortmund
Year: 2000
Subjects: subject: NaPi-IIb
subject: Zebrafisch
subject: Niere
subject: Darm
subject: Phosphat
subject: Kotransporter
subject: Antisense
subject: Regulation
subject: 540

description: Die Proteinfamilie NaPi-II ist in Vertebraten für den natriumabhängigen Phosphattransport der Epithelzellen in Niere und Darm verantwortlich. Durch Regulation dieses Proteins wird der Phosphattransport kontrolliert und dadurch die Phosphathomöostase aufrechterhalten. Physiologische Unterschiede zwischen Säugern und Fischen fokussierten das Interesse in meiner Diplomarbeit auf den Na+/Phosphat-Kotransporter des Zebrafisches (Brachydanio rerio). Interessanterweise wurden aus Darm und Niere dieses Süßwasserfisches zwei Transkripte isoliert, die für zwei unterschiedliche Na+/Phosphat-Kotransporter der Proteinfamilie NaPi-II kodieren. Die Isoform aus dem Darm wurde vollständig kloniert und kodiert für ein Protein mit 634 Aminosäuren. Die Analyse der Aminosäuresequenz von diesem Klon zeigte, daß sich das Protein in die NaPi-IIb Untergruppe der Transporterfamilie einordnen läßt. Die Nieren-Isoform konnte nur teilweise isoliert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, beide NaPi-II Isoformen des Zebrafisches auf molekularer Ebene und funktionell zu charakterisieren und so die physiologische Relevanz dieser Transkripte einzugrenzen. Die 5’-RACE Untersuchungen im Falle der Nieren-Isoform erbrachten lediglich Produkte ohne ein sinnvolles Start-Methionin im NaPi-II Leserahmen. Der homologe Abschnitt des gesamten Transkripts umfaßt 2010 bp und kodiert im NaPi-II Leserahmen für ein Protein mit 633 Aminosäuren. Die erhaltenen Sequenzdaten erlaubten weitere Untersuchungen auf Nukleotid und Proteinebene. Auch die Nieren-Isoform wird demnach der Untergruppe NaPi-IIb zugeordnet. Die Isoformen wurden im Folgenden NaPi-IIb1 (ursprünglich: Darm) und NaPi-IIb2 (ursprünglich: Niere) genannt. Die Gewebeverteilung der mRNA beider Isoformen wurde mit RT-PCR untersucht. Die Darm-Isoform wurde wie erwartet im Darm, in den Augen und in der Niere nachgewiesen. Dagegen konnte die Nieren-Isoform in nahezu allen untersuchten Organen detektiert werden. Mit Antikörpern aus dem 3’-Bereich beider NaPi-IIb Proteine wurden immunhistochemische Untersuchungen an Gewebeschnitten durchgeführt. Beide Proteine werden exprimiert und sind in Epithelzellen des Darms, in Nieren-Tubuli und in Gallengängen (Leber) apikal lokalisiert. Der Nachweis der Expression trotz der RACE-Ergebnisse bei NaPi-IIb2 zeigt, daß möglicherweise eine alternative Spleißvariante des isolierten Transkripts mit einem offenen Leserahmen existiert. In elektrophysiologischen Untersuchungen zeigte die klonierte Isoform NaPi-IIb1 ähnliche Transporteigenschaften wie andere NaPi-II Proteine. Während bei Säugern ein deutlicher Unterschied zwischen typischen NaPi-IIa und NaPi-IIb Transportcharakteristika existiert, zeigt der Transport durch Zebrafisch-NaPi-IIb überlappende funktionellen Eigenschaften mit den Typ IIa Transportern. Es wurden zwei natürliche Antisense-mRNAs des NaPi-IIb1 Transkripts entdeckt und kloniert. Aufgrund des gemeinsamen genomischen Locus besitzen beide Transkripte komplementäre Bereiche zu NaPi-IIb1 mRNA. Die Koinjektion von NaPi-IIb1 mit jeweils einem der Antisense-Transkripte hemmte den Phosphattransport erheblich. Durch Northern-Analysen und Immunhistochemie an Oozyten konnte gezeigt werden, daß diese Beobachtung nicht auf den Abbau der injizierten NaPi-IIb1 cRNA zurückzuführen ist, sondern durch die Hemmung der Proteintranslation hervorgerufen wird. In vivo ergaben RT-PCR Untersuchungen, daß die Gewebeexpression von NaPi-IIb1 mRNA mit dem Vorhandensein seiner Antisense-Transkripte verknüpft ist. In Organen, in welchen Antisense-mRNA detektiert werden konnte, konnte keine NaPi-IIb1 mRNA nachgewiesen werden. Dieser Befund weist auf eine mögliche regulatorische Rolle der Antisense-Transkripte im Zebrafisch hin.