title: Mutagenese der (R)-Benzylsuccinat-Synthase: Erweiterung des Substratspektrums und Verbesserung der Enzymaktivität
title: Mutagenesis of (R)-benzylsuccinate synthase: Expanding the substrate spectrum and improving enzyme activity
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Alhaj Zein, Ammar
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2024
Subjects: Aromatoleum evansii
(R)-Benzylsuccinat-Synthase
Mutagenese der (R)-Benzylsuccinat-Synthase
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Eisen-Schwe
BSS
Mutagenesis of (R)-benzylsuccinate synthase
Aromatoleum aromaticum
benzylsuccinate synthase
NMS
4Fe-4S
Thauera aromatica

description: Anaerober Toluolabbau folgt bei verschiedenen nicht verwandten Bakteriengruppen einem gemeinsamen Weg. Diese Bakterien bilden syntrophe Kokulturen, die den Toluolabbau mit der anaeroben Atmung oder Fermentation verknüpfen [1] [2]. Der Weg beginnt mit (R)-Benzylsuccinat-Synthase (BSS), einem Mitglied der Familie der Glycyl-Radikal-Enzyme. BSS enthält einen konservierte Glycinrest in der Nähe des C-Terminus, der durch ein aktivierendes Enzym in ein Glycyl-Radikal-Motiv umgewandelt wird [3]. Strukturell handelt es sich bei BSS um ein Heterohexamer mit einer Zusammensetzung von α2β2γ2. Es katalysiert die Addition der Methylgruppe von Toluol an die Doppelbindung eines Fumarat-Cosubstrats und bildet (R)-Benzylsuccinat als erstes Zwischenprodukt im Abbauweg [4] [5]. BSS fungiert als Prototyp-Enzym für unterschiedliche Fumarat-addierende Enzyme (FAE), die den anaeroben Abbau verschiedener Kohlenwasserstoffe wie Xylole, Kresole, Methylnaphthalin oder Alkane initiieren. 
In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass bereits eine einzige Mutation ausreicht, um eine Variante mit erweiterter Substratspektrum zu erzeugen. Diese Variante kann nun nicht nur die zuvor bekannten Substrate Toluol und die Kresolisomere umsetzen, sondern auch m-Xylol. Zudem ermöglicht eine Mutation des hochkonservierten Arginins zu Lysin die Umsetzung eines Fumarat Analogons – 3-Acetylacrylat, was vom BSS-Wildtyp nicht umgesetzt wird.
In unserer Arbeit wurde erstmals ein rekombinantes Produktionssystem für aktive BSS eingesetzt. Dabei wurden gezielte Mutationen im aktiven Zentrum der Alpha-Untereinheit des Enzyms erzeugt, um das Substratspektrum des Enzyms zu erweitern und seine Fähigkeit zur Aufnahme größerer Substrate zu verbessern.
Mutationen von Tyr197Ser oder Tyr197Phe bilden eine Variante mit einem erweiterten Substratspektrum, die neben den bereits etablierten Substraten Toluol und den Kresol-Isomeren auch sämtliche Xylolisomere umsetzt. Zudem konnten wir aufgrund der empfindlichen Analysemethode (LC ESI/MS), die in dieser Arbeit verwendet wurde, geringfügige Mengen der Umwandlung aller Xylol Isomere im rekombinanten BSS-Wt nachweisen.
Andererseits konnten wir durch den Austausch von Arginin508 durch die hydrophobe Aminosäure Phenylalanin (Phe) und die polar neutralen Seitenketten Glutamin (Gln) die Umwandlung der Fumarat Analoga 3-Acetylacrylat, Crotonsäure und Glutaconsäure in der Mutante Arg508Phe sowie die Umwandlung von Crotonsäure und Glutaconsäure in der Mutante Arg508Gln nachweisen, die vom BSS-Wildtyp nicht umgesetzt werden.

Darüber hinaus wird die Bedeutung der Fe-S-Cluster ebenfalls gründlich untersucht. 
Die Untereinheiten von Fe-S-Cluster mehrerer BSS-Orthologe aus verschiedenen Organismen sind bekannt dafür, Teil des aktiven Enzyms zu sein. Ihre Relevanz und Bedeutung wurden bisher jedoch nicht gezeigt. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit drei gezielte Punktmutationen im Eisen Schwefel-Cluster der β- und γ-Untereinheiten von BSS eingeführt. Eine Doppelmutante in der BSSγ-Untereinheit (Cys4Ala Cys7Ala), sowie eine Einzelmutante (Cys37Ala) und eine Doppelmutante (Cys19Ala Cys22Ala) in der BSSβ-Untereinheit wurden erstellt, um entweder die Bildung des Clusters zu verhindern oder seine Redox-Eigenschaften zu verändern.
Außerdem zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Doppelmutante in der BSSγ-Untereinheit (Cys4Ala Cys7Ala) zu einem signifikanten Rückgang der produzierten BSSα-Menge führte, während die anderen Mutanten (Cys37Ala) und (Cys19Ala Cys22Ala) in der BSSβ-Untereinheit keine Auswirkungen auf die BSSα-Produktion hatten. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass eine einzelne oder doppelte Cystein-Mutation im Eisen-Schwefel-Cluster der β- oder γ-Untereinheit von BSS die Aktivität von BSS eliminiert.