title: Investigations on release mechanisms of circulating tumor DNA and metabolism in Ewing sarcoma
title: Untersuchungen zu Freisetzungsmechanismen von zirkulierender Tumor-DNA und Metabolismus im Ewing-Sarkom
Creators: name: Eiblwieser, Johanna
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 0
Subjects: subject: Ewing sarcoma
subject: circulating tumor DNA
subject: Ser/Gly metabolism
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 50 Naturwissenschaften :: 500 Naturwissenschaften und Mathematik

description: Ewing Sarcoma (EwS) is one of the most common bone tumors among children and adolescents with an often fatal course of disease. It is usually treated using an aggressive, combinatorial approach consisting of multi-agent chemotherapy, radiotherapy (RT), and surgical resection. No further therapy modalities are currently available which would allow a personalized, targeted treatment and thereby improve survival rates while reducing side effects and resistance to therapy. The development of new therapeutic approaches overcoming therapy resistance remains challenging, since the cellular origin, the interaction of different genomic events and pathways promoting tumor growth in EwS remain poorly understood. In this work, we focused on the one hand on the evaluation of the specific tumor metabolism and on the other hand on immunological properties as new therapeutic targets in EwS, complementing established standard treatments. Until now, EwS tumor growth, progression and therapy response are primarily monitored using standard imaging techniques such as MRI and (PET-)CT. Thus, innovative therapeutic approaches consider an improved tumor surveillance using specific tumor markers which are detectable in the plasma of patients as liquid biopsy. In EwS, the characteristic genomic EWSR1-FLI1 fusion sequence has been identified and quantified in circulating tumor DNA (ctDNA) in the plasma of patients and its levels could be correlated to tumor volume in patients. An implementation of this biomarker into clinical routine would allow a better monitoring of disease in EwS patients and enables an optimized and personalized therapy. Using a therapeutic, orthotopic EwS xenograft mouse model, we aimed to evaluate cellular mechanisms and tumor characteristics which determine the dynamics of ctDNA release from EwS tissue under treatment conditions. With this approach we aimed to contribute to a better interpretation of ctDNA plasma levels. In this work the EwS-specific metabolism under RT could be characterized. Our data points out a possible association of mitochondria-mediated ROS-compensation with RT resistance, yet no significant influence of irradiation on fatty acid metabolism could be demonstrated. We could show the crucial role of the two amino acids Ser and Gly as essential exogenous nutrients for survival of EwS cells in vitro and in vivo. Interestingly, we proved that some cells seem to be able to dynamically switch between their endogenous and exogenous Ser/Gly sources in order to survive. Furthermore, an additive effect of RT and Ser/Gly depletion on cell death and reduction of tumor volume was observed. Concerning the influence of RT on EwS tumor immunology, we could demonstrate an increased expression of CD70, ICOS-L and PD-L1 in vitro after RT. Regarding CD70, our findings could be further confirmed in vivo. These results illustrate new possibilities for research on therapeutic innovations in EwS therapy. We further introduced an orthotopic xenograft mouse model which contributed to new findings regarding dynamics of ctDNA release from EwS tumor tissue. Our data indicates a correlation between the number of apoptotic cells and the extent of ctDNA copy numbers in the plasma of mice. Additionally, an influence of tumor volume and degree of vascularization on ctDNA release was be demonstrated. However, no certain statement could be made on an impact of mitotic cells and necrotic tissue proportions. We could not confirm a correlation of the extent and localization of metastases on ctDNA levels, either. From our findings we conclude that there is probably not only a single mechanism determining ctDNA release, but numerous circumstances might add to total ctDNA plasma levels which need to be carefully unravelled further in the future.
description: Das Ewing-Sarkom (EwS) ist einer der häufigsten Knochentumore bei Kindern und Jugendlichen, mit einem oft tödlichen Verlauf der Erkrankung. Die Behandlung des Tumors erfolgt meist mittels einer aggressiven, multimodalen Kombinationstherapie, die eine Chemotherapie, Radiotherapie (RT) und/oder einen chirurgischen Eingriff beinhaltet. Bisher sind keine weiteren Behandlungsansätze verfügbar, die eine personalisiertere und gezieltere Therapie des EwS ermöglichen, um die Überlebensraten zu verbessern und unerwünschte Nebenwirkungen und Therapieresistenzen zu reduzieren. Dadurch dass der zelluläre Ursprung des EwS, die genomische Eigenschaften und Signalwege, welche das Tumorwachstum bedingen, bisher kaum bekannt sind, stellt die Entwicklung neuartiger Therapieansätze eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, einerseits den charakteristischen Tumormetabolismus, andererseits die immunologischen Eigenschaften des EwS zu untersuchen, um neue therapeutische Ansätze ergänzend zu den gängigen Standardtherapien zu evaluieren. Bisher wird das Tumorwachstum, die Tumorprogression und das Therapieansprechen des EwS hauptsächlich mit standardisierten bildgebenden Verfahren wie beispielsweise MRT und (PET-)CT erhoben. Innovative Behandlungsansätze basieren jedoch auf einer verbesserten Überwachung der Tumorerkrankung, indem bestimmte Tumormarker betrachtet werden, die im Blutplasma der Patienten als Flüssigbiopsie detektierbar sind. Im Plasma von EwS-Patienten konnte eine charakteristische genomische EWSR1-FLI1-Fusionssequenz in zirkulierender Tumor-DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) identifiziert und quantifiziert werden, deren Konzentrationen mit dem Tumorvolumen dieser Patienten korreliert werden konnten. Der Einsatz dieses Biomarkers in der klinischen Routine könnte ein besseres Monitoring der Tumorerkrankung in EwS-Patienten ermöglichen und dabei eine optimierte und personalisierte Therapie begünstigen. Mithilfe eines therapeutischen, orthotopen EwS-Xenograft-Mausmodells untersuchten wir zelluläre Mechanismen und bestimmte Tumoreigenschaften, die die Dynamik der Freisetzung von ctDNA unter therapeutischen Bedingungen beeinflussen. Ziel des Vorhabens war es, die ctDNA-Plasma-Levels besser interpretieren zu können. In dieser Arbeit konnte der EwS-spezifische Metabolismus nach RT charakterisiert werden. Unsere Daten weisen auf eine Mitochondrien-abhängige Kompensation der reaktiven Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) bei RT-Resistenz hin, jedoch konnte kein signifikanter Einfluss von Bestrahlung auf den Fettsäure-Stoffwechsel beobachtet werden. Darüber hinaus betonen unsere Ergebnisse die wichtige Rolle der beiden Aminosäuren Ser und Gly als exogene Nährstoffe, die essenziell für das Überleben von EwS-Tumorzellen in vivo und in vitro sind. Besonders hervorzuheben ist dabei, dass wir zeigen konnten, dass manche Zellen im Stande sind dynamisch zwischen ihren endogenen und exogenen Ser/Gly-Quellen zu wechseln, um ihr Überleben zu sichern. Zusätzlich wurde ein additiver Effekt von RT und exogenem Entzug von Ser/Gly im Hinblick auf den Zelltod und die Reduktion von Tumorvolumen gezeigt. Was den Einfluss der RT auf die Immunologie von EwS-Tumoren betrifft, so wiesen wir in vitro nach RT eine erhöhte Expression von CD70, ICOS-L und PD-L1 nach. In Bezug auf CD70 konnten unsere Ergebnisse in vivo weiter bestätigt werden. Diese Ergebnisse beschreiben neue Ansatzpunkte bei der Erforschung innovativer therapeutischer Interventionen in der Therapie von EwS. Darüber hinaus führten wir ein orthotopes Xenograft-Mausmodell ein, das zu neuen Erkenntnissen über die Dynamik der Freisetzung von ctDNA aus EwS-Tumorgewebe beitrug. Unsere Daten deuten auf eine Korrelation zwischen der Anzahl apoptotischer Zellen und der ctDNA-Kopienzahl im Plasma der Mäuse hin. Außerdem konnte ein Einfluss des Tumorvolumens und des Grades der Vaskularisierung auf die ctDNA-Freisetzung nachgewiesen werden. Über einen Einfluss von mitotischen Zellen und nekrotischen Gewebeanteilen konnte jedoch keine sichere Aussage getroffen werden. Auch eine Korrelation zwischen dem Ausmaß oder der Lokalisation der Metastasen mit den ctDNA-Werten konnten wir nicht bestätigen. Aus unseren Ergebnissen schließen wir, dass es wahrscheinlich nicht nur einen einzigen Mechanismus gibt, der die Freisetzung von ctDNA bestimmt, sondern dass zahlreiche Umstände zu den gesamten ctDNA-Plasmaspiegeln beitragen können, die in Zukunft sorgfältig weiter erforscht werden müssen.