Προσδιορισμός της καθολικής μεθυλίωσης του DNA με HPLC-DAD σε αίμα εθελοντών κατά τη μετάβαση τους από το συμβατικό στο ηλεκτρονικό τσιγάρο
Creators: name: Πακκίδη, Ελένη Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: Μεθυλίωση DNA
Κάπνισμα
Ηλεκτρονικό τσιγάρο
DNA methylation
Smoking
E-cigarette

description: Η μεθυλίωση του DNA είναι μία επιγενετική τροποποίηση, που συμβαίνει στον άνθρακα 5 μίας κυτοσίνης, όταν αυτή συνδέεται με φωσφορικό δεσμό με μία γουανίνη στην αλληλουχία του DNA και ο βιολογικός ρόλος της είναι η ρύθμιση, ταυτόχρονα με άλλους μηχανισμούς, της γονιδιακής έκφρασης. Το κάπνισμα είναι γνωστό πως επηρεάζει τη μεθυλίωση του DNA, μεταβάλλοντάς την και προκαλώντας αρνητικές επιπτώσεις στον οργανισμό, όπως είναι η εμφάνιση διαφόρων ασθενειών. Από την άλλη πλευρά, το ηλεκτρονικό τσιγάρο έχει προταθεί ως μία εναλλακτική και πιο ασφαλής μέθοδος καπνίσματος, συγκριτικά με το συμβατικό κάπνισμα, αλλά δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία που να το υποστηρίζουν, ενώ υπάρχουν ελάχιστες αναφορές που να μελετούν την επίδραση του στη μεθυλίωση του DNA. Σκοπός της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της μεταβολής της καθολικής μεθυλίωσης του DNA σε ολικό αίμα εθελοντών, σε διάστημα 21 ημερών, κατά τη μετάβασή τους από το συμβατικό στο ηλεκτρονικό τσιγάρο. Συγκεκριμένα, η καθολική μεθυλίωση προσδιορίστηκε την 1η ημέρα διακοπής του συμβατικού τσιγάρου και της χρήσης του ηλεκτρονικού τσιγάρου, την 3η, την 7η και την 21η, μετά από απομόνωση, ποσοτικοποίηση και υδρόλυση του DNA με μία τεχνική Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης (HPLC) και με ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (DAD) στα 277 nm, εκφραζόμενη ως το ποσοστό της 5΄-μέθυλο-2΄-δεοξυκυτιδίνη έναντι της συνολικής 2΄-δεοξυκυτιδίνης. Ο διαχωρισμός των δεοξυριβονουκλεοτιδίων έγινε σε στήλη C18 (4 μm, 250 × 2,0 mm), μέσα σε 45 min και η έκλουση ήταν βαθμωτή, χρησιμοποιώντας μεθανόλη και ρυθμιστικό διάλυμα μυρμηκικού αμμωνίου 50 mM (pH=5,4). Η μέθοδος είχε καλή ακρίβεια, επαναληψιμότητα, γραμμικότητα και χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού. Τα όρια ανίχνευσης ήταν 0,0014 mM και 0,0016 mM και τα όρια ποσοτικού προσδιορισμού 0,0042 mM και 0,0048 mM, για την 2΄-δεοξυκυτιδίνη και την 5΄-μεθυλο-2΄-δεοξυκυτιδίνη, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική μεταβολή στην καθολική μεθυλίωση του DNA. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε αντιστάθμιση υπομεθυλίωσης/υπερμεθυλίωσης είτε σε μη ανίχνευση αυτής άμεσα στο αίμα ή σε τόσο σύντομο χρονικό διάστημα. Ακόμα, το ηλεκτρονικό τσιγάρο πιθανόν να επηρεάζει με παρόμοιο τρόπο την καθολική μεθυλίωση του DNA, παρατήρηση που αποτελεί πρόταση για μελέτη, καθώς απαιτείται παραπάνω διερεύνηση για την πλήρη κατανόηση της επίδρασης του ηλεκτρονικού τσιγάρου στην καθολική μεθυλίωση του DNA
description: DNA methylation is an epigenetic modification which refers to the addition of a methyl-group to the base cytosine where it is linked by a phosphate bond to the base guanine in the DNA sequence. It plays an important role in regulation of gene expression. Smoking is known to affect DNA methylation, causing alterations which lead to various diseases. On the other hand, the e-cigarette has been suggested as a safer alternative, although there is not enough evidence to support this. Moreover, there are very few reports on the effect of e-cigarette on DNA methylation. The aim of this study was the determination of changes in global DNA methylation, during a period of 21 days, in which smokers quit tobacco smoking and began using the e-cigarette. Global DNA methylation was determined on the 1st, 3rd, 7th and 21st day after smoking cessation with a HPLC-DAD method at 277 nm, following DNA isolation from peripheral blood, quantification and hydrolysis. Global DNA methylation was expressed as the percentage of 5’-methyl-2’-deoxycytidine over the overall content of 2’-deoxycytidine. The separation was performed on a C18 column (4 μm, 250 × 2,0 mm) within 45 min, with gradient elution of methanol and ammonium formate buffer 50mM (pH=5,4). The method used, had good linearity, high accuracy and repeatability and low detection and quantification limits. The limits of detection were 0,0014 mM and 0,0016 mM, while the limits of quantification were 0,0042 mM and 0,0048 mM, for 2’-deoxycytidine and 5’-methyl-2’-deoxycytidine, respectively. The results revealed that there are no significant alternations in global DNA methylation during these 21 days. This fact could be possibly attributed to the hypomethylation of some DNA regions and hypermethylation in other regions. It is also possible that 21 days was a period too short to detect such changes in blood. In addition, the e-cigarette may affect global DNA methylation in the same way as the conventional cigarette. In the view of the above, more research is needed to fully understand the effect of e-cigarette on global DNA methylation.