title: Recruitment of G-protein-coupled receptor kinase 2 to the M3-ACh-receptor – Identification of the influence of Gαq and generation of a kinetic modelling
title: Rekrutierung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase 2 zum M3-ACh-Rezeptor – Identifizierung des Einflusses von Gαq und Erstellung eines kinetischen Modells
Creators: name: Wolters, Valerie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Naturwissenschaften
Rezeptor
muskarinerger Acetylcholinrezeptor
G-protein-coupled receptor kinase
G-Protein
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2

description: G-protein-coupled receptor kinase
      type 2 (GRK2) belongs to the family of
      serine/threonine-kinases and plays an important role in the
      desensitisation of G-protein-coupled receptors (GPCR). Its
      agonist-dependent recruitment to activated GPCRs through
      interaction with free Gβγ-subunits and negatively charged
      phospholipids of the plasma membrane has been studied in
      detail (Pitcher et al., 1992; Touhara et al., 1995). In
      addition, Gαq was identified to be an interaction partner of
      GRK2 (Carman et al., 1999b). Thus, GRK2 can be considered to
      be a G protein effector that sequesters active Gq-protein
      subunits and thereby desensitises GPCRs in a
      phosphorylation-independent manner. It remained unclear,
      whether – and if so which – additional effects on the signal
      transduction of Gq-protein-coupled receptors might result
      from the interaction between Gαq and GRK2. Furthermore, there
      was no detailed description of the kinetics of the
      agonist-mediated recruitment of GRK2 to Gq-protein-coupled
      receptors. Neither were any kinetics data available for the
      dissociation of receptor and GRK2 after agonist withdrawal.
      The aim of this study was to uncover the dynamics of the
      interaction of GRK2 with Gq protein-coupled receptors and
      other proteins involved in the GRK2-recruitment. The M3
      acetylcholine (ACh) receptor was chosen as a model receptor.
      In this respect, the influence of Gαq binding to GRK2 was
      investigated. Therefore, experiments based on Fluorescence
      Resonance Energy Transfer (FRET) were established. This
      technique allowed the visualisation and investigation of the
      interaction between GRK2 and M3-ACh receptors, Gαq, and
      Gβγ-subunits, respectively, in single living HEK293T-cells
      with high spatio-temporal resolution. Stimulation of M3-ACh
      receptors with acetylcholine resulted in distinct
      FRET-changes that reflected the interaction of the labelled
      partner. GRK2-Mutants with reduced affinity to Gαq or Gβγ
      were used to analyse the influence of Gq-protein binding to
      GRK2. So far, the role of Gβγ in membrane translocation of
      GRK2 had only been studied using end-point experiments. This
      study could confirm the published results using the newly
      established FRET-assays and other fluorescence-imaging
      techniques, while also providing for the first time kinetic
      details. It was further observed that the agonist-dependent
      membrane targeting of GRK2 is not only mediated by Gβγ, but
      also by Gαq, thereby uncovering a new aspect of GRK2 membrane
      translocation. Furthermore, Gαq increases extent and
      stability of the interaction of GRK2 and the M3-ACh receptor.
      This fact was revealed by comparison of the absolute
      FRET-amplitudes of different GRK2-mutants. Investigation of
      the kinase activity of GRK2 showed that binding of Gβγ is
      indeed a necessary prerequisite for receptor phosphorylation,
      but efficient receptor phosphorylation is only achieved
      through simultaneous binding of Gβγ and Gαq to GRK2. These
      results further confirmed the importance of Gαq for the
      recruitment of GRK2 to activated M3-ACh receptors, although
      Gβγ has a larger effect in this respect. However, GRK2 shows
      higher affinity towards Gαq than Gβγ, which is indicated by
      the fact that the interaction between GRK2 and Gαq is more
      sensitive than the GRK2-Gβγ-interaction. Accordingly, Gαq is
      presumably more important for the GRK2-recruitment at lower
      agonist concentrations. No effect of activated Gq-protein
      subunits was observed on the GRK2-recruitment towards
      Gi-protein-coupled receptors during these studies. Therefore,
      the observed influence of Gαq is probably limited to
      Gq-protein-coupled receptors. The FRET-based experiments
      allowed for the first time the detailed description of the
      kinetics of GRK2-recruitment to the M3-ACh receptor,
      beginning with the interaction between activated receptor and
      inactive Gq-proteins and ending at the complex formation of
      GRK2 with Gαq, Gβγ and the receptor. It became evident that
      the binding between GRK2 and Gβγ occurred about 3-times as
      fast as the respective interaction of GRK2 with Gαq. The
      membrane translocation of GRK2, mediated through binding to
      Gq-proteins, is the rate-limiting step for the interaction of
      GRK2 with the receptor. The interaction between GRK2 and
      M3-ACh receptors was prolonged by Gαq. This hints at an
      inhibition of receptor signalling straight after GRK2 binding
      and not just after recruitment of arrestin, as assumed
      previously. Taken together, this work shows for the first
      time the importance of Gαq in the translocation of GRK2
      towards M3-ACh receptors, thereby exerting critical influence
      on signal transduction and desensitisation of
      Gq-protein-coupled receptors. Furthermore, this study also
      provides the first detailed description of the kinetics of
      all steps involved in this physiologically important
      pathway.
description: Die G-Protein-gekoppelte
      Rezeptorkinase 2 (GRK2) ist eine Serin/Threonin-Kinase mit
      bedeutender Funktion bei der Desensibilisierung
      G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Die agonistabhängige
      Rekrutierung der GRK2 zu aktivierten G-Protein-gekoppelten
      Rezeptoren durch Interaktion mit freien Gβγ-Untereinheiten
      und negativ geladenen Phospholipiden der Membran wurde
      bereits detailliert erforscht (Pitcher et al., 1992; Touhara
      et al., 1995). Auch Gαq war als Interaktionspartner der GRK2
      bekannt (Carman et al., 1999b). Die GRK2 kann damit auch als
      Effektor der G-Proteine angesehen werden, der eine
      phosphorylierungs-unabhängige Desensibilisierung der
      Rezeptoren durch Sequestrierung aktiver
      Gq-Protein-Untereinheiten bewirkt. Bisher war allerdings
      wenig darüber bekannt, ob und welche weiteren Funktionen die
      Interaktion von Gαq und GRK2 in Bezug auf die
      Signalweiterleitung Gq Protein-gekoppelter Rezeptoren
      besitzt. Darüber hinaus fehlte die detaillierte kinetische
      Beschreibung der agonistabhängigen Rekrutierung der GRK2 zu
      aktivierten Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren, sowie der
      Dissoziation des Komplexes nach Auswaschen des Agonisten.
      Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Dynamik der
      Interaktion der GRK2 mit Gq Protein-gekoppelten Rezeptoren
      und anderer an der Rekrutierung der GRK2 beteiligter
      Interaktionen am Beispiel des M3-Acetylcholin (ACh) Rezeptors
      aufzuklären. Außerdem wurde in diesem Zusammenhang der
      Einfluss der Gαq-Bindung an die GRK2 untersucht. Dazu wurden
      neue Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET)-basierte
      Experimente etabliert, mit deren Hilfe die Interaktion der
      GRK2 mit M3-ACh-Rezeptoren sowie mit Gαq und Gβγ mit hoher
      zeitlicher Auflösung in einzelnen lebenden HEK293T-Zellen
      sichtbar gemacht werden konnte. Die Stimulation der
      M3-ACh-Rezeptoren mit Acetylcholin führte zu deutlichen
      FRET-Änderungen, welche die Interaktion der jeweiligen
      Partner widerspiegelten. Zur Untersuchung des Einflusses der
      Bindung der Gq-Protein-Untereinheiten an die GRK2 wurden
      GRK2-Mutanten eingesetzt, die eine reduzierte Bindeaffinität
      zu Gαq oder Gβγ aufweisen. Die Funktion von Gβγ bei der
      Membrantranslokation der GRK2, die bisher nur über
      Endpunktmessungen beschrieben wurde, konnte in dieser Arbeit
      durch den Einsatz der FRET-Mikroskopie und anderer
      fluoreszenzmikroskopischer Methoden bestätigt und darüber
      hinaus erstmals dynamisch vermessen werden. Zusätzlich
      ergaben die Experimente, dass nicht nur Gβγ, sondern auch Gαq
      in der Lage ist, die GRK2 agonistabhängig an die Membran zu
      rekrutieren. Dies stellt einen neuen Aspekt in der
      Membrantranslokation der GRK2 dar. Ein Vergleich der
      absoluten FRET-Amplituden der unterschiedlichen GRK2-Mutanten
      zeigte, dass Gαq zudem das Ausmaß und die Stabilität der
      Interaktion zwischen GRK2 und dem M3 ACh-Rezeptor erhöht.
      Funktionelle Untersuchungen zur Kinaseaktivität der GRK2
      konnten außerdem nachweisen, dass die Bindung von Gβγ an GRK2
      zwar notwendige Bedingung für die Phosphorylierung des
      Rezeptors ist, eine effiziente Rezeptor-phosphorylierung aber
      nur bei gleichzeitiger Bindung von Gβγ und Gαq an die GRK2
      möglich ist. Diese Ergebnisse belegten die wichtige Funktion
      von Gαq bei der Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor,
      auch wenn Gβγ bei der Rekrutierung der GRK2 die größere Rolle
      spielt. Allerdings bewies die höhere Sensitivität der
      GRK2-Gαq-Interaktion gegenüber der Interaktion zwischen GRK2
      und Gβγ, dass die GRK2 eine höhere Bindeaffinität zu Gαq als
      zu Gβγ besitzt. Die Bedeutung von Gαq bei der Rekrutierung
      der GRK2 zum Rezeptor wird deshalb bei niedrigen
      Agonist-Konzentrationen vermutlich verhältnismäßig wichtiger
      sein. Ein Effekt aktivierter Gαq-Untereinheiten auf die
      Rekrutierung von GRK2 zu Gi-Protein-gekoppelten Rezeptoren
      konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht beobachtet werden, so
      dass der Einfluss von Gαq sehr wahrscheinlich auf Gq
      Protein-gekoppelte Rezeptoren beschränkt ist. Die
      durchgeführten FRET-Experimente ermöglichten erstmals die
      detaillierte kinetische Beschreibung der Rekrutierung der
      GRK2 zum Rezeptor, beginnend bei der Interaktion inaktiver
      G-Proteine mit aktiven M3-ACh-Rezeptoren bis hin zur Bildung
      eines Komplexes aus GRK2, Gαq, Gβγ und Rezeptor. Es zeigte
      sich, dass die Interaktion der GRK2 mit Gβγ etwa 3-mal
      schneller war als die Gαq Bindung. Die Membrantranslokation
      der GRK2 durch die Gq-Protein-Bindung ist dabei der
      geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Interaktion der
      GRK2 mit dem Rezeptor. Die, in Anwesenheit von Gαq, lang
      anhaltende Interaktion der GRK2 mit dem M3-ACh-Rezeptor
      lieferte einen Hinweis darauf, dass die Signalweiterleitung
      des Rezeptors bereits durch die Bindung der GRK2 gehemmt
      wird, und nicht erst durch die Rekrutierung von Arrestin, wie
      bisher vermutet. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser
      Arbeit zum ersten Mal die wichtige Rolle von Gαq bei der
      Rekrutierung der GRK2 zum M3 ACh-Rezeptor beschrieben werden,
      die entscheidenden Einfluss auf die Signalweiterleitung und
      Desensibilisierung Gq-Protein-gekoppelter Rezeptoren ausübt.
      Darüber hinaus konnte die kinetische Beschreibung der
      beteiligten Vorgänge erstmals den zeitlichen Ablauf dieses
      physiologisch wichtigen Signalwegs entschlüsseln.