Biophysikalische Untersuchungen zur Ras-Membran-Wechselwirkung
Creators: name: Sperlich, Benjamin
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2016
Subjects: subject: Ras
subject: Rheb
subject: CLR01
subject: PLA2
subject: Lipide
subject: Membran
subject: SPR
subject: AFM
subject: Anisotropie
subject: Expression
subject: Protein
subject: 540

description: In dieser Dissertation wurde der Einfluss von verschiedenen biologischen Proteinen (Ras, Calmodulin, Rheb, Phospholipase A2) und Molekülen (Tweezer CLR01) auf Lipidmembranen untersucht. Im Detail wurde dabei die Interaktion zwischen Calmodulin und K-Ras4B in Gegenwart eines anionischen Membransystems (DOPC/DOPG/DPPC/DPPG/Chol 20:5:45:5:25 mol%) untersucht. Ein weiterer Teil dieser Arbeit hat sich mit dem Einfluss verschiedener DOPS-Konzentrationen auf die Lokalisation und das Phasenverhalten von Ras konzentriert. Für die Untersuchungen wurden verschiedene biophysikalische Methoden, wie die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie, die Fluoreszenzanisotropie und die Rasterkraftmikroskopie verwendet. Zusätzlich zu den biophysikalischen Methoden wurde auch die Proteinexpression, die säulenchromatografische Aufreinigung und die Farnesylierung des humanen Rheb-Proteins durchgeführt. Die Proteinexpression wurde rekombinant in E. coli mit dem humanen full-length Rheb-Plasmid durchgeführt. Die anschließende Proteinaufreinigung erfolgte über eine GSTrap- und Benzamidin-Säule. Für die Farnesylierung wurde die Möglichkeit der in vitro Farnesylierung gewählt, und mittels Triton X-114-Extraktion wurde das in vitro farnesylierte Protein abgetrennt. Das enzymatische Schneiden des GST-Tags erfolgte mit dem Enzym Thrombin bei Raumtemperatur auf der GSTrap-Säule. Zusätzlich wurde der Einfluss des molekularen Tweezers CLR01 und der Phospholipase A2 auf Membransysteme rasterkraftmikroskopisch untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Dissertation ermöglichen einen weiteren Einblick in die komplexen biologischen Prozesse einer Zelle. Nach einer früheren Studie [11] über die Interaktion von K-Ras4B mit PDEδ konnte für einen weiteren Interaktionspartner ein Zusammenspiel gezeigt werden. Sobald das Calcium-bindende Protein Calmodulin K-Ras4B gebunden hat und einen Komplex mit ihm eingeht, ist K-Ras4B nicht mehr in der Lage, an die anionische Lipidmembran zu binden. Dieser Aspekt dient vermutlich als Regulationsparameter, da somit K-Ras4B quasi inaktiv vorliegt und nicht mehr in die Signaltransduktionskaskade eingreifen kann. Der vorhergesagte Effekt der Membranzerstörung durch Phospholipase A2 konnte mit rasterkraftmikroskopischen Untersuchungen bestätigt werden. Innerhalb kürzester Zeit setzte die enzymatische Aktivität der Phospholipase ein und zerstörte die Topologie der anionischen Membran. Desweiteren konnte mit rasterkraftmikroskopischen Experimenten der Einfluss des molekularen Tweezers CLR01 auf verschiedene Membransysteme untersucht werden. Eine Membranzerstörung durch den Tweezer konnte in diesem Zusammenhang nur für Raft-ähnliche Membranen (DOPC/SM/Chol 45:25:30 mol%) und nicht für fluide Membransysteme (DOPC) beobachtet werden. Die rekombinante Rheb-Expression in E. coli, und die anschließende Proteinaufreinigung über ein Äktaprime-System war erfolgreich. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung über den GST-Tag an eine GSTrap Säule mit den gewählten Parametern für dieses Protein optimal ist. Die vorherigen Bedenken bezüglich der Größe des GST-Tags (der GST-Tag ist etwas größer als das Zielprotein Rheb (~25,5 kDa gegenüber ~20,5 kDa)) in Bezug auf eventuelle sterische Behinderungen wurden nicht bestätigt. Der GST-Tag konnte über eine enzymatische Thrombinschnittstelle entfernt werden. Einzig die in vitro Farnesylierung bzw. die Triton X-114-Extraktion ergaben ein Problem. Das Problem bestand unter anderem darin, dass es keinen direkten Nachweis für das Gelingen der in vitro Farnesylierung bzw. der Triton X-114-Extraktion gibt. Aufgrund der schwierigen in vitro Farnesylierung und der sehr geringen Proteinausbeute wurde vorgeschlagen, ein gekürztes Protein mit einem lipidierten Peptid zu koppeln. Eine weitere Möglichkeit für die Farneslyierung von Rheb ist die Ligation eines gekürzten Rheb-Proteins (Sequenz 1-173) mit einem farnesylierten Peptid. Diese Art der Kopplung ist für Ras eine etablierte und effizient handhabbare Methode. Über die Expressed Protein Ligation (EPL-Ligation) wird das gekürzte Protein mit einem synthetisierten Peptid über eine Thioester-Bindung lipidiert.[261, 353] Bei der MIC-Ligation (MIC = Maleimidocaproyl) wird das in E. coli exprimierte verkürztes Ras-Protein mit einem synthetisierten Maleinimidocaproyl-aktivierten Ras-Peptid gekoppelt.[47, 354] [11] K. Weise, S. Kapoor, A. Werkmüller, S. Möbitz, G. Zimmermann, G. Triola, H. Waldmann, R. Winter, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134(28), 11503–11510. [47] B. Popkirova, Dissertation, Ruhr-Universität Bochum, Bochum, 2004. [261] Y.-X. Chen, S. Koch, K. Uhlenbrock, K. Weise, D. Das, L. Gremer, L. Brunsveld, A. Wittinghofer, R. Winter, G. Triola, H. Waldmann, Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49(35), 6090–6095. [353] S. Chong, F. B. Mersha, D. G. Comb, M. E. Scott, D. Landry, L. M. Vence, F. B. Perler, J. Benner, R. B. Kucera, C. A. Hirvonen, J. J. Pelletier, H. Paulus, M. Q. Xu, Gene 1997, 192(2), 271–281. [354] B. Bader, K. Kuhn, D. J. Owen, H. Waldmann, A. Wittinghofer, J. Kuhlmann, Nature 2000, 403(6766), 223–226.