title: Hairy roots of Peucedanum ostruthium (L.) Koch
Creators: name: Gössnitzer, Florian
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Peucedanum ostruthium (L.) Koch (Meisterwurz) findet in Form von alkoholischen Auszügen oder Teezubereitungen verbreitete Anwendung in der österreichischen Volksmedizin. Die Rhizome der Pflanze enthalten pharmazeutisch relevante Cumarine, deren antibakterielle, antivirale, entzündungshemmende, antimykotische, antioxidative und antitumorielle Wirkeigenschaften durch entsprechende Studien belegt sind. In der vorliegenden Arbeit wurden an Peucedanum ostruthium transformierte „hairy roots“ gebildet. Dazu wurden zunächst ausgehend von in vitro gekeimten Samen Sprosskulturen angelegt. Die Samenkeimung konnte durch eine vierwöchige Kältevorbehandlung bei 5°C, und noch mehr durch eine Vorbehandlung mit Gibberellinsäure, gegenüber der Keimung bei Raumtemperatur deutlich verbessert werden. Es wurden Explantate aus in vitro-Kulturen und Freilandpflanzen präpariert und diese dann mit drei Wildstämmen von Agrobacterium rhizogenes infiziert. Dieses Bakterium ist Auslöser der „hairy roots“-Krankheit, wobei der Grad der Infektion, gemessen an der Transformationsrate, abhängig vom Explantattyp und von der Infektionstechnik ist: Explantate aus in vitro-Kultur reagierten gegenüber jenen aus Freilandpflanzen mit gesteigerter Wurzelbildung, weiters hat sich im Allgemeinen das Anritzen des Explantats mit einer in Bakteriensuspension getauchten Skalpellklinge als bestgeeignete Infektionsmethode erwiesen. Die Kultivierung im Licht brachte bemerkenswerterweise für die Bildung von „hairy roots“ keine Erfolge. Die erhaltenen „hairy roots“-Klone zeigten in Abhängigkeit von Bakterienstamm und Nährmedium unterschiedliches Wachstum: Klone von Explantaten, welche mit dem Agrobacterium-Stamm TR 105 infiziert worden waren, wiesen das beste Wachstum auf, außerdem führte der Einsatz des Nährmediums B5 zum höchsten Zuwachs an Biomasse. Erste HPLC-Analysen einiger „hairy roots“-Klone zeigten, dass unter den gegebenen Kulturbedingungen deutlich weniger Cumarine gebildet wurden als in natürlich gewachsenen, nichttransformierten Wurzeln. Keiner der acht untersuchten Klone wies das für die Meisterwurz typische Cumarinmuster auf, und auch das Nährmedium schien Einfluss auf die Cumarinbildung zu haben. In einem Klon konnte keines der sieben Hauptcumarine der Meisterwurz detektiert werden, in den restlichen Klonen waren ein bis vier Cumarine (Imperatorin, Isoimperatorin, Ostruthin und Oxypeucedanin) nachweisbar. In weiterführenden Studien sollte der Einfluss anderer Nährmedien auf das Wachstum und vor allem auf die Cumarinbildung untersucht werden. Außerdem könnte auch der Einsatz von Elizitoren quantitative und qualitative Auswirkungen auf die Cumarinbiosynthese haben.
description: Peucedanum ostruthium (L.) Koch (masterwort) is a widely used plant in traditional Austrian medicine, e.g. in forms of liquor or tea. Coumarins in masterwort rhizomes are of pharmaceutical relevance, as a number of studies have shown antibacterial, antiviral, anti-inflammatory, antifungal, antioxidant and antitumoral activities. The present thesis deals with the establishment of transformed hairy roots in Peucedanum ostruthium under controlled regimes. Multiple shoot cultures were established from aseptically germinated seeds. At this, germination frequency could be improved through a four-week pretreatment of the seeds at 5°C. A second way to increase germination rates is the use of gibberellic acid. Explants prepared from in vitro-cultures as well as from in vivo-growing plants were infected in vitro with three wildtype strains of Agrobacterium rhizogenes, the causative bacterium of the hairy-root disease. Both the type of starting material and the infection technique proved to be significant for a successful transformation. The use of explants from in vitro-cultures resulted in good hairy-root formation rates while explants from in vivo-growing plants did barely respond to the bacterial infection. Scratching the explants with a scalpel blade dipped in the bacterial suspension proved to be the most suitable technique. Interestingly, no hairy roots were formed under light conditions. The obtained hairy-root clones differed in their growth rate, depending on the bacterial strain used for infection and the nutrient medium for subsequent cultivation. Clones established with Agrobacterium strain TR 105 showed the fastest growth, and for most hairy-root clones B5 medium was best suited in terms of biomass increase. HPLC-DAD analyses of a number of hairy-root clones revealed that under the given culture conditions definitively less coumarins were formed when compared to non-transformed naturally-grown roots. Also, the coumarin pattern typical for natural roots was not found in any of the eight investigated clones, and the nutrient medium also seemed to influence coumarin formation. In one sample, none of the seven main coumarins of masterwort could be detected. In the other clones from one to four known compounds (imperatorin, isoimperatorin, ostruthin and oxypeucedanin) were identified. For future studies it might be considered to investigate the influence of further nutrient media on growth and especially on coumarin formation. In addition, the use of elicitors could possibly also influence coumarin biosynthesis in both quantitative and qualitative ways.