title: Vergleichende qualitative und quantitative Auswertung vo Knochenregeneraten aus beta-Tricalciumphosphaten mittels Histomorphometrie und dreidimensionaler nicht-invasiver Synchrotrontomographie
title: A comparative quantitative and qualitative analysis of bone tissue regeneration employing beta-tricalcium phosphate by three-dimensional non-invasive synchrotron micro-tomography and histomorphometry
Creators: name: Stiller, Felix Siegfried
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Synchrotron , Knochenersatz
synchrotron
histomorphometry
Knochenregenerate, Tricalciumphosphate
Dimension 3 , Kieferhöhle
bone
Histomorphologie
Knochen
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: Das Ziel der Studie war die
      vergleichende Untersuchung der Knochenneubildung nach
      Sinusbodenelevation mittels konventioneller Histomorphometrie
      und Synchrotron-Tomographie. Standardverfahren zur
      Beurteilung derartiger Prozesse sind die histomorphometrische
      oder immunhistologische Analyse von Schnitten, oder als
      dreidimensionales röntgenologisches Verfahren, das
      Mikro-Computertomogramm. In der vorliegenden Studie wurde
      Synchrotronstrahlung zur Auswertung der Proben verwendet, die
      eine deutlich höhere Strahlenintensität bzw. Photonendichte
      und damit verbunden höhere Auflösung, als ein Mikro-CT
      besitzt. Vergleichend wurden dazu histologische Schnittbilder
      herangezogen, um die jeweiligen verfahrenstechnischen
      Unterschiede aufzuzeigen und diese hinsichtlich der
      diagnostischen Relevanz zu bewerten. Um Implantationen in
      immer schwierigeren anatomischen Situationen vornehmen zu
      können, wurde verschiedene Vorgehensweisen zur Schaffung
      eines sicheren und funktionsstabilen Knochenlagers
      entwickelt. Die Verwendung von β-Trikalziumphosphaten wurde
      in zahlreichen Studien hinlänglich untersucht und
      beschrieben. Eine Untersuchung mittels Synchrotronstrahlung
      an einer größeren Probenzahl wurde bislang in der Literatur
      nicht beschrieben. Diese ermöglicht eine völlig neue
      Dimension der dreidimensionalen Darstellung des Knochens und
      des KEM. Synchrot-ronstrahlung wird in einem
      Teilchenbeschleuniger erzeugt. Aufgrund der Größe der
      technischen Anlage können um ein vielfaches höhere
      Photonenflussdichten als beim konventionellen Röntgen
      erreicht werden, die ein Hauptkriterium für die Qualität der
      tomographischen Bilder darstellen. Außerdem wird durch den
      Abstand von bis zu 140 m (im ESRF in Grenoble) zwischen
      Untersuchungsobjekt und Strahlungsquelle ein nahezu
      paralleler Strahlenverlauf ermöglicht, was eine, im Vergleich
      zum Mikro-CT, verzerrungsfreie Wiedergabe ermöglicht. Die
      Proben wurden zunächst mittels Synchrotron-Tomograph (Sy-CT)
      untersucht und danach in Schnitte zersägt. Die der Histologie
      äquivalente Ebene wurde in dem dreidimensionalen Datensatz
      aufwendig manuell bestimmt, um einen direkten Vergleich
      zwischen den beiden Verfahren zu ermöglichen. Die Bioptate
      wurden je nach Intaktheit der Knochensäule, Qualität der
      tomographischen Untersuchung und Übereinstimmung der zwei
      äquivalenten Ebenen in drei Klassen eingeteilt. Die erste
      Klasse enthält die besten Proben, die eine komplette
      Integrität und eine sehr gute Übereinstimmung der
      äquivalenten Ebenen aufweisen. Die Proben der zweiten Klasse
      weisen einige Mängel auf, z.B. eine leicht deformierte
      Knochensäule oder einige Unterschiede der äquivalenten
      Ebenen. Die Proben der dritten Klasse weisen erheblichere
      Mängel auf, die äquivalenten Ebenen sind aber in wesentlichen
      Details zuzuordnen. Die Sy-CT Bilder, die alle Details des
      Untersuchungsobjektes abhängig von der Dichte in
      Grauabstufungen wiedergeben, müssen zur Erfassung der
      Knochenmasse in Bool´sche Bilder (reine Schwarz-Weiß-Bilder)
      umgewandelt werden. Ein Knochenfenster im Histogramm legt
      fest, welche der Grauwerte als Knochen zu identifizieren sind
      und stellt diese anschließend weiß dar. Alle anderen
      Dichtewerte werden schwarz dargestellt. In diesen Datensätzen
      lässt sich durch Summation der weißen Pixel die Knochenmenge
      bestimmen. Für jede Probe wurde dreimal die gebildete
      Knochenmenge bestimmt. Zum ersten in der Histologie durch
      manuelles Vermessen und zum zweiten in der äquivalenten Ebene
      des dreidimensionales Datensatzes. Zum dritten wurde die
      Knochenmenge über die gesamte Biopsiesäule bestimmt, um diese
      besondere Möglichkeit des Sy-CT für die Einschätzung der
      klinschen Wertigkeit des ß-TCP auszunutzen. Der 2D-Wert
      spiegelt das Ausmaß der Knochenneubildung in der zufällig
      gewählten histologischen Ebene im Sy-CT-Datensatz wider und
      der 3D-Wert gibt die real gebildete Knochenmenge im gesamten
      Biopsiezylinder wieder. Die Differenz dieser zeigt an, wie
      groß der mögliche Fehler in der Angabe der Menge der
      Knochenneubildung für einen räumlichen Bereich ist, wenn nur
      ein histologischer Schnitt als Grundlage verwendet wird. Der
      Mittelwert der Abweichung beträgt über alle Proben ±4,48%.
      Die Abweichungen betrugen jedoch bis zu 18%. In der
      vorliegenden Studie bestand für die jeweilige Schnittebene
      eine hohe Übereinstimmung zwischen dem konventionellen
      histologischen Schnittbild und dem korrespondierenden
      Synchrotron-Bild. Bei der Synchrotonuntersuchung bleiben die
      Proben intakt und können gegebenenfalls ein weiteres mal oder
      durch an¬dere Verfahren untersucht werden, wie in dieser
      Studie geschehen. Inhaltlich bietet die Sy-CT ebenfalls neue
      Möglichkeiten. Dargestellt werden nun-mehr nicht nur einzelne
      Schichten einer Probe, sondern eine gesamte Knochen-probe mit
      ihrer komplexen Struktur, in einer Qualität, die bisher kein
      anderes Untersuchungsverfahren erreicht hat. Die Entwicklung
      des Knochens lässt sich durch die Mineralisierungsgrade, die
      sich aus den Grau-Werten der Bilder ablesen lassen, noch
      weiter beurteilen. So ist zu erkennen, zu welchem Zeitpunkt
      einzelne Bereiche in der Entwicklung des Knochens
      mineralisiert wurden. Auf zellulärer Ebene sind der
      Synchrotron-Tomographie noch Grenzen gesetzt. Die
      Immunhistologie hat in diesem Bereich klare Vorteile. Hier
      ist es möglich, mittels verschiedener Antikörper-Färbungen
      einzelne Zelltypen hervorzuheben und deren Aktivität in
      unterschiedlichen Knochenbildungsphasen zu beurteilen. Die
      Auflösung des Sy-CT wird stetig durch bessere Optiken und
      höhere Photonenflussraten verbessert, sodass mittlerweile
      auch zelluläre Strukturen dargestellt werden können, doch
      deren Qualität der Darstellung liegt noch unter der Qualität
      der Histologie. Bei allen Verbesserungen der
      Strahlenuntersuchungen sollte man nicht ignorieren, dass
      biologische Materialien nicht jede Dosis vertragen und es
      dadurch zu Veränderungen kommen kann. In der vorliegenden
      Studie konnten wir zeigen, dass auch die Untersuchung von
      Proben geringerer Qualität (Klasse 3) mit
      Synchrotronstrahlung valide Ergebnisse ermöglicht und
      Knochenneubildungsraten, wenn auch approximierend, ermittelt
      werden können. Diese Proben sind mittels Histologie
      schwieriger oder gar nicht auszuwerten, da die Proben zum
      Beispiel aufgrund der mechanischen Verformung kleinere und
      unregelmäßigere Untersuchungsfelder besitzen und damit schwer
      zu vermessen sind. Die verwendeten β-TCP haben sich auch in
      der vorliegenden Studie als im oralchirurgischen Bereich gut
      verwendbare KEM erwiesen. In allen Proben zeigten sich auch
      im Sy-CT ausgeprägte Formationen von neugebildetem
      Geflechtknochen. Zusammenfassend gelang durch die vorliegende
      synchrotrontomographische Studie erstmalig der Nachweis, dass
      konventionelle histomorphometrische Unter-suchungsverfahren
      für kleine homogene Bioptate als Standard ausreichend gute
      Ergebnisse liefern, für kleine anisotrope Bioptate eine
      dreidimensionale Analyse mittels Sy-CT jedoch eine wesentlich
      exaktere Darstellung der Knochenstruktur ermöglicht
      wird.
description: The aim of this study was to
      evaluate the validity of two dimensional histo-morphometric
      measurement of bone biopsy specimen after sinus floor
      evaluation by means of high contrast, high resolution,
      three-dimensional and non-destructive synchrotron
      micro-tomography (SCT). Histomorphometry and immune-histology
      or three-dimensional x-ray method micro computer tomography
      is still the gold standard for evaluating bone specimen. In
      this study evaluation was done by high contrast, high
      resolution, three-dimensional and non-destructive synchrotron
      micro-tomography (SCT) and compared to standard histology in
      order to demonstrate the potential of this new approach for
      the evaluation of bone biopsy samples. First, the bone biopsy
      specimen were analysed in SCT and then cut into slices from
      histologic sections. The histologic sections were searched
      manually in the three-dimensional data of SCT to have a
      direct comparison between these different procedures. The
      bone samples were classified into groups from one to three
      depending on the integerity of their bone pillar, the quality
      of tomography analysis and the analogy between the
      two-dimensional SCT section and the histology. The first
      group contained samples of best quality bone specimen and the
      third group samples of lowest quality specimen. The SCT
      images picture all details of the samples on a grey scale,
      depending of their mass density. In order to calculate the
      bone mass, SCT images needed to be converted into
      black-and-white boolean data sets. All grey-scales expected
      to be bone were pictured white and all those that were
      expected not to be bone, such as unmineralized osteoid or
      blood, were pictured black. The bone mass was determined by
      adding of all white pixel. For every sample the bone mass was
      calculated three times. First, the histologic section was
      measured manually, second the equivalent section of
      three-dimensional SCT data set. Third, the bone mass was
      measured on the whole three-dimensional (3D) pillar which is
      the new opportunity of SCT analysation. The 2D data represent
      the bone mass in a randomly chosen histologic section in
      contrast to the 3D data which represent the real bone mass of
      the whole bone pillar. The deviation between these two
      results shows the possible error of measurement while using
      2D analysis instead of 3D for complex situations. In total
      the deviation is ±4,48% but up to 18%. The SCT data reveals
      new quality of bone images. Not just two or three sections of
      a sample can be analysed, but the whole specimen with all
      kinds of complex structures. The development of the bone can
      be read off the mineralisation lines which are represented by
      different grey scales in the bone. On cellular level there
      are still set boundaries for SCT. Immune-histology has the
      advantage of different antibody staining methods to
      distinguish between cell types and their activity. But due to
      better optics and higher photon flux the resolution of SCT is
      getting higher, meaning that it is already possible to
      picture cellulare structures. In this reagard one should not
      forget that biological materials can be altered by too high a
      dose of photon flux. This study showed that even samples of
      lower quality bone specimen (group 3) can be analysed by SCT
      giving valid results for bone mass. Samples of lower quality
      are hard to evaluate by histologic sectioning because of
      mechanical instability and smaller areas to measure. The
      beta-tricalcium phosphate used in all samples showed distinct
      formations of newly built woven bone. An application in oral
      surgery can be recommended. To summarise, histological
      analysation can remain standard for big homogeneous samples
      but for smaller and heterogeneous samples three-dimensional
      analysation with SCT is more accurate and offers a better
      representation of bone structures.