Ανάπτυξη συνθετικού συστήματος μεταγραφής και αξιοποίηση φυτικού φορητού μοτίβου ενεργοποίησης στο σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae
Creators: name: Τζιατζιά, Λύδια Παύλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Βιοτεχνολογία
Σακχαρομύκητας
Συνθετική βιολογία
Biotechnology
Saccharomyces cerevisiae
Synthetic biology

description: Τα τελευταία χρόνια αναδεικνύεται ολοένα και περισσότερο ο ρόλος της βιοτεχνολογίας για τη δημιουργία προϊόντων προς όφελος του ανθρώπου και την παράλληλη μείωση του περιβαλλοντικού αποτυπώματος στον πλανήτη. Η αξιοποίηση των μικροοργανισμών ως εργοστασίων παραγωγής προϊόντων μπορεί να προσφέρει πολλά οφέλη. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία, αξιοποιήθηκε ο μικροοργανισμός Saccharomyces cerevisiae, μία ζύμη ιδιαίτερα διαδεδομένη και καλά μελετημένη στην κοινότητα της βιοτεχνολογίας. Ο σακχαρομύκητας αξιοποιήθηκε για την κατασκευή του συστήματος των δύο υβριδίων με τεχνικές μοριακής βιολογίας και γενετικής με σκοπό την σταθεροποίηση ενός επαγώγιμου συστήματος υψηλής έκφρασης προϊόντων βιοτεχνολογίας. Αρχικά, κατασκευάστηκε ο συνθετικός υποκινητής βασισμένος στο σύστημα των δύο υβριδίων με περιοχή πρόσδεσης οκτώ επαναλήψεις του βακτηριακού χειριστή LexA καθοδικά των οποίων βρίσκεται ο υποκινητής «minimal promoter» και με περιοχή ενεργοποίησης της μεταγραφής, την συνθετική περιοχή B42AD. Ως γονίδια αναφοράς για τη μελέτη της επαγωγής της έκφρασης και τη σταθερότητα αυτής από το σύστημα χρησιμοποιήθηκαν: το mCherry που κωδικοποιεί μια κόκκινη φθορίζουσα χρωστική πρωτεΐνη, το LacZ που κωδικοποιεί τη β-γαλακτοσιδάση και το γονίδιο σύντηξης TS655-GS(5)-ERG20 που κωδικοποιεί τη συνθετάση του σεσκιτερπενίου βαλενσένιο. Επιπλέον, έγινε διερεύνηση της δράσης του μοτίβου EDLL, στην ενίσχυση της μεταγραφικής ενεργότητας του συστήματος. Η διερεύνηση της δράσης του συστήματος μέσω της επαγωγής της έκφρασης των γονιδίων αναφοράς έγινε με τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού, κυτταρομετρίας ροής, ενζυματικών δοκιμών και αέρια χρωματογραφίαφασματοσκοπία μάζας. Από τα αποτελέσματα, διαπιστώθηκε η επιτυχής λειτουργία του συστήματος που κατασκευάστηκε μέσω της σταθερότητας στην έκφραση και των τριών διαφορετικών γονιδίων αναφοράς στις διαφορετικές περιπτώσεις ελέγχου. Επίσης, για πρώτη φορά διαπιστώθηκε η σημαντική δράση του μοτίβου EDLL που προέρχεται από τα φυτά, στην αύξηση της έκφρασης των γονιδίων σε έναν νέο οργανισμό τον S. cerevisiae και τα αποτελέσματα αναδεικνύουν τον ρόλο του ως ένα μοτίβο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσμάτικα στην ενίσχυση της μεταγραφικής ενεργότητας γονιδίων. Το συνθετικό σύστημα των δύο υβριδίων μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά ως βάση ανάπτυξης ορθογώνιων συστημάτων υψηλής μεταγραφής και να διερευνηθεί περαιτέρω για την παραγωγή προϊόντων κατά βούληση.
description: In recent years, the role of biotechnology for the creation of products for the benefit of human and the parallel reduction of the environmental footprint on the planet is becoming more and more prominent. Utilizing microorganisms as product factories has many benefits to offer in the modern world. In the present Master thesis, the microorganism Saccharomyces cerevisiae was utilized, a yeast that is very widespread and well studied in the biotechnology community. Initially, the twohybrid system was built with a LexA operator eight-fold binding domain downstream of which the minimal promoter is located and a B42AD activation domain. The following genes were used as reference genes for the study of expression induction and its stability by the system: mCherry encoding a red fluorescent protein, LacZ encoding β-galactosidase and the fusion gene TS655- GS(5)- ERG20 encoding the sesquiterpene valencene. The strains of S. cerevisiae used for the integration and study of the system are EGY48 and AM276. In addition, the effect of the EDLL pattern in enhancing the transcriptional activity of the system was investigated. The investigation of the activity of the system through the induction of the expression of the reference genes was done by techniques of fluorescence microscopy, flow cytometry, enzyme tests and gas chromatography-mass spectroscopy. The results showed the successful operation of the system constructed through expression stability of all three different reference genes in different control cases. Also, for the first time, the significant effect of the plant-derived EDLL motif is noted in the increase of the expression of genes in a new organism, S. cerevisiae, and the results highlight its role as a motif that can be used effectively to enhance gene transcriptional activity. The two-hybrid system can be used effectively and further explored to produce products at will.