Ανθεκτικότητα του Botrytis cinerea σε υδροξυανιλιδικά μυκητοκτόνα και ανάπτυξη μεθοδολογίας ανίχνευσης μεταλλάξεων της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος (sdh).
Creators: name: Σαμαράς, Αναστάσιος Μαργαρίτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Ανθεκτικότητα
Αφυδρογονάση
Υδροξυανιλίδια
Resistance
SDHIs
Botrytis cinerea

description: Η τεφρά σήψη που προκαλείται από το παθογόνο Botrytis, αποτελεί ένα μεγάλο πρόβλημα σε πολλές καλλιέργειες. Ο κυρίως τρόπος αντιμετώπισης της ασθένειες είναι η χημική καταπολέμηση, η χρήση της οποίας παρουσιάζει προβλήματα λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικών πληθυσμών των παθογόνων. Η χημική καταπολέμηση εφαρμόζεται με την χρήση μυκητοκτόνων πολλών χημικών ομάδων όπως SDHIs, QoIs, EBIsκ.α. Η εμφάνιση ανθεκτικότητας σε πληθυσμούς του Botrytiscinerea, είναι ένα φαινόμενο που απασχολείκαι την χώρα μας εδώ και αρκετά χρόνια. Η ανθεκτικότητα στους SDHIsσε στελέχη του Botrytiscinereaσυνδέεται με σημειακές μεταλλάξεις του sdhγονιδίου και κυρίως στην Β υπομονάδα όπου και έχουν ανιχνευθεί οι περισσότερες από αυτές. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη μιας μεθόδου η οποία θα μπορούσε να διαχωρίσει τα ανθεκτικά στελέχη ανάλογα με την μετάλλαξη που φέρουν. Ο διαχωρισμός των γενοτύπων με διαφορετική μετάλλαξη έγινε με την βοήθεια της ΗRM μεθόδου. Η HRMαποτελεί μια μέθοδο που το γενετικό προφίλ των δειγμάτων διαφοροποιείται ανάλογα με την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων. Κάθε γενότυπος παρουσιάζει ένα διαφορετικό προφίλ τήξης, δίνοντας τις ανάλογες καμπύλες τήξης ανάλογα με την μετάλλαξη. Για την ανάπτυξη της μεθόδου χρησιμοποιήθηκαν 7 ανθεκτικές απομονώσεις αγρού (P225F/L/H, H272L/R/Yκαι Ν230Ι και μια απομόνωση που έφερε εργαστηριακή μετάλλαξη (Ρ225Τ). Η HRMκατάφερε με την χρήση ενός μόνο ζεύγους εκκινητών να διαχωρίσει τα ανθεκτικά στελέχη, καθώς κάθε γενότυπος παρουσίασε διαφορετικό προφίλ τήξης. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε ελέγχθηκε ως προς την ικανότητα της να διαχωρίσει ανθεκτικά στελέχη του Botrytiscinereaπου συλλέχτηκαν από τον αγρό και η εξαγωγή τουDNAέγινε απευθείας από τον προσβεβλημένο ιστό. Και σε αυτή την περίπτωση εξασφαλίστηκε επιτυχής διαχωρισμός τόσο μεταξύ των ανθεκτικών στελεχών όσο και με τα ευαίσθητα στελέχη. Η αξιοπιστία των εκκινητων ελέγχθηκε και με άλλα παθογόνα που προκαλούν σήψεις σε καρπούς φράουλας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πρόκειται για μία οικονομική και αξιόπιστη μέθοδο ανίχνευσης των σημειακών μεταλλάξεων σε ανθεκτικά στους SDHIs στελέχη του Botrytiscinerea. Μια σχετικά νέα χημική ομάδα που χρησιμοποιείται για την καταπολέμηση του B. cinerea είναι τα υδροξυανιλίδια με κύριο εκπρόσωπο το fenhehamid το οποίο δρα ως αναστολέας της βιοσύνθεσης των στερολών, παρεμποδίζοντας την 3-κετορεδουκτάση (erg 27). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας έγινε διερεύνηση της ανθεκτικότητας πληθυσμών του μύκητα από θερμοκηπιακές καλλιέργειες φράουλας (Ν. Πιερίας), τομάτας (Ν. Πρέβεζας) και από φυτώριο παραγωγής υποκειμένων γιγαρτοκάρπων και πυρηνοκάρπων (Ν. Άρτας). Οι συχνότητες ανθεκτικότητας στο fenhexamid ήταν 3, 27,4 και 11,2% στις καλλιέργειες τομάτας, φράουλας και υποκειμένων, αντίστοιχα. Στην συνέχεια ακολούθησε μοριακός χαρακτηρισμός των ανθεκτικών φαινοτύπων με στόχο την ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα στο fenhexamid. Η ανίχνευση των μεταλλάξεων έγινε με δύο τεχνικές, την αλληλούχιση του γονιδίου erg27 και μετη χρήση εξειδικευμένων εκκινητών για την ανιχνευση μεταλλάξεων στο κωδικόνιο 412 (F412S/I/C). Συνολικά ανιχνεύθηκαν 14 σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο erg27, εκ των οποίων οι οχτώ αναφέρθηκαν για πρώτη φορά παγκοσμίως. Μετά την ανίχνευση των σημειακών μεταλλάξεων, τα στελέχη διαχωρίστηκαν ανάλογα με τον γενότυπο τους και συνολικά προέκυψαν 13 ανθεκτικοί γενότυποι. Κατόπιν μελετήθηκε η επίδραση των μεταλλάξεων στην ευαισθησία των απομονώσεων. Για τον λόγο αυτό πραγματοποιήθηκαν invitroπειράματα μέτρησης της μυκηλιακής αύξησης των στελεχών σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του fenhexamid. Τέλος πραγματοποιήθηκε καταγραφή της αποτελεσματικότητας του μυκητοκτόνου, εφαρμοζόμενο σε δόση αγρού, έναντι των ανθεκτικών γενοτύπων που βρέθηκαν.
description: Gray mold, caused by the fungus Botrytis cinerea, is among the most important diseases in many crops worldwide. Disease control can be achieved by chemical applications; however, resistance development has caused many problems for their use. Fungicides, used for the disease control, are categorized into several chemical classes . The allarming of resistance to specific classes of fungicides in Botrytis cinerea populations is a concerning phenomenon which appeared in Greece several years ago. Resistance in B. cinerea to SDHIs is associated with point mutations in the sdh gene, and more specifically in the subunit B, where most of the mutations have been detected. The overall purpose of the study is the development of a method which separates the resistant isolates, based on the mutation they possess. The identification of the genotypes was conducted by using the HRM method, where the genetic profile of each sample is differentiated based on the nucleotide sequence. Every genotype exhibits different melting profile, which corresponds to a different melting curve for each point mutation respectively. In this study, seven resistant field isolates, P225F/L/H, H272L/R/Y, Ν230Ι and one laboratory isolate P225T were used. A single pair of primers was able to separate all resistant isolates using the HRM method. Moreover, the method developed herein was assessed by its ability to identify resistant field isolates using DNA extracted directly from the infected tissue, resulting in successful identification among resistant and sensitive isolates as well. Efficacy of primers was assessed by using other pathogens that cause similar symptoms in strawberries. Results indicated that HRM is a low cost and reliable method for detecting point mutations between SDHIs resistant isolates of B. cinerea. Among the newest fungicides used to control B. cinerea is the chemical group of hydroxyanalides, with fenhexamid, being the main representative of this group. This systemic fungicide acts by inhibiting the 3-ketoreductase enzyme, which participates in the ergosterol biosynthesis pathway. In this study, screening was conducted in B. cinerea resistant isolates originating from strawberry and tomato crops as well as from stone and pomefruit rootstock seedlings. Frequencies of resistance were 3, 27,4 and 11,2% respectively. Subsequently, molecular characterization was conducted, in order to detect mutations associated with fenhexamid resistance. The two methods used for the detection were the sequencing of erg27 gene and an allele specific PCR in codon 412. Overall, 14 point mutations were detected in erg27, 8 of which are reported for the first time worldwide. The detection was followed by isolate grouping according to their genotype, where 13 resistant genotypes were found in total. In order to study the effect of these mutations in isolate sensitivity, colony growth tests were conducted under different concentrations of fenhexamid. Finally, control efficacy against every genotype was evaluated, when the fungicide was applied to the suggested by the manufacturer dose