EQUINE AND BOVINE MICROVESICLES DERIVED FROM AMNIOTIC PROGENITOR CELLS IN REGENERATIVE AND REPRODUCTIVE TOPICS
Creators: name: PERRINI, CLAUDIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2017

description: Durante questo progetto di dottorato sono stati condotti studi per comprendere la capacit� delle cellule mesenchimali amniotiche (AMCs) di agire attraverso meccanismi paracrini. La prima fase del disegno sperimentale ha valutato l?efficacia delle AMCs sulla proliferazione delle cellule endometriali (EDCs) in assenza di un contatto cellula-cellula. Le EDCs sono state co-coltivate in un sistema trans-well con le AMCs o sono state coltivate in presenza del loro medium condizionato (CM). In entrambe le condizioni sperimentali � stato osservato un aumento del tasso di proliferazione delle EDCs definendo, cos�, il ruolo cruciale dei fattori secreti dalle AMCs come mediatori dell'azione delle cellule staminali. Il CM � composto da fattori solubili e non-solubili rappresentati da microvescicole (MVs). Per capire il ruolo delle MVs e del loro contenuto nell?azione paracrina, la seconda fase del disegno sperimentale � stata incentrata sull?individuazione del tipo di MVs secrete dalle AMCs e sulla loro efficacia in processi infiammatori in vitro su due importanti modelli sperimentali nella specie equina quali l?endometrio ed il tendine. La produzione di MVs � stata ottimizzata attraverso un?ultracentrifugazione del CM a 100.000 g per 1 ora. Attraverso lo strumento Nanosight � stato calcolato che la produzione di MVs da AMCs equine � di circa 2550�71 particelle/cellula, con una dimensione media di 258�55 nm. La microscopia elettronica a trasmissione ha confermato la presenza di vescicole cellulari che per dimensioni e modalit� di secrezione sono state classificate come shedding vesicles. Per capire se le cellule endometriali (EDCs) e tendinee (TNCs) fossero target delle MVs secrete dalle AMCs, � stata studiata l?incorporazione delle medesime dopo marcatura con un fluorocromo lipofilico quale il PKH-26. Dopo uno studio di una curva dose-risposta � stato osservato che la dose ottimale per l'incorporazione di MVs in EDCs � stata di 40x106 MVs/ml a 72 h e per le TNCs di 40x106 MVs/ml a 24-48h. Per esaminare l'abilit� delle MVs nel contrastare un processo infiammatorio, entrambe le linee cellulari sono state stressate in vitro con LPS e trattate con MVs. La vitalit� cellulare, l'espressione di alcuni geni pro-infiammatori ed il rilascio delle rispettive citochine sono stati i parametri impiegati per valutare l?efficacia delle MVs. Per entrambe le linee cellulari, il tasso di apoptosi � drammaticamente salito nelle cellule trattate con LPS, rispetto al controllo (CTR). LPS ha indotto un aumento significativo dell'espressione di TNF-?, IL-6 e IL-1? in EDCs e di MMP-1, MMP-9, MMP-13 e TNF-? in TNCs. Le MVs sono state in grado di contrastare l'effetto di LPS, diminuendo il tasso di apoptosi in entrambe le linee cellulari e riducendo il livello di espressione dei geni pro-infiammatori. Una conferma di questi dati � stata ottenuta attraverso l'analisi delle citochine pro-infiammatorie (TNF-? and IL-6) ed anti-infiammatorie (TGF-?) rilasciate dalle EDCs nel terreno di coltura, confermando l'abilit� delle MVs di trasportare molecole capaci di contrastare la risposta infiammatoria in cellule stressate con LPS. Data l'importanza del contenuto in miRNA delle MVs, sia nelle AMCs sia nelle loro MVs � stata studiata la presenza di tre miRNA (miR-335, miR-146a, and miR-26a-2) coinvolti nella regolazione dei processi infiammatori. Questi tre miRNA sono stati identificati sia nelle AMCs sia nelle MVs, di conseguenza, � possibile ipotizzare che l'espressione genica dopo infiammazione con LPS e trattamento con MVs possa essere stato modulato dal trasferimento di miRNAs dalle MVs alle cellule target. Successivamente a questi studi, si � tentato di capire quanto in un processo rigenerativo possa essere imputato alle MVs e quanto ai fattori solubili presenti nel CM e, a questo proposito, � stata valutata l?abilit� delle MVs di inibire la proliferazione delle cellule periferiche mononucleate del sangue (PBMC). La loro azione � stata comparata a quello del CM e del sovranatante (SN) ottenuto dal CM dopo scorporazione delle MVs. Il CM ed il SN hanno manifestato capacit� immunosoppressiva ma, anche dopo un trattamento di sonicazione al fine del rilascio del loro contenuto, le MVs non hanno dimostrato quest?abilit�. Questi risultati portano a dedurre che le MVs sono in grado di trasportare informazioni alle cellule target attraverso molecole capaci di contrastare l'effetto infiammatorio dovuto all'uso di LPS ma, tenendo in considerazione la mancanza di effetto immunomodulatorio, probabilmente in vivo la loro azione � integrata anche dalla presenza dei fattori solubili presenti nel CM. I meccanismi paracrini materno-fetali sono di vitale importanza ai fini dell?instaurarsi di una gravidanza, per cui si � ritenuto interessante studiare questi meccanismi durante la produzione in vitro di embrioni bovini. Le differenti componenti del secretoma (CM, SN e MVs) ottenute da AMCs ed EDCs bovine sono state aggiunte al terreno di coltura embrionale a differenti giorni di coltura. I risultati hanno dimostrato che il giorno 5 � il migliore momento per la supplementazione e che le MVs di AMCs portano a migliori risultati qualitativi. Questi dati sono stati confermati dalla valutazione di alcuni geni coinvolti nell'apoptosi e nella protezione contro specie reattive dell'ossigeno. I motivi per i quali le MVs di AMCs si siano dimostrate migliori di quelle secrete dalle EDCs non sono ancora conosciuti ma � probabile che le EDCs coltivate in monostrato in vitro vadano incontro a de-differenziamento che altera la qualit� del loro secreto. In conclusione, � possibile affermare che le AMCs sono una linea cellulare affascinante in quanto derivano da materiale di scarto biologico, e quindi a basso costo, e possono essere impiegate in medicina rigenerativa per la loro capacit� di trasportare informazioni alle cellule target. Le MVs possono offrire un nuovo strumento terapeutico privo di cellule nell?ambito della nanomedicina.