Φαρμακολογική αξιολόγηση αναστολέων των μεθυλοτρανσφερασών στοχευμένης δράσης στη διαφοροποίηση ερυθρολευχαιμικών κυττάρων MEL
Creators: name: Θεοδωρούλα, Νικολέτα Φωτίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Επιγενετική
Αναστολείς μεθυλοτρανσφερασών πρωτεϊνών
Ερυθροδιαφοροποίηση
Methylation inhibitors
Epigenetics
Erythroid differentiation

description: Η κατανόηση των επιγενετικών μηχανισμών της γονιδιακής ρύθμισης σε μοριακό επίπεδο επέτρεψε το σχεδιασμό μικρών μορίων-αναστολέων ως υποψηφίων φαρμάκων. Στον άνθρωπο, τα ένζυμα αυτά περιλαμβάνουν μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs), αποακετυλάσες ιστονών (HDACs), μεθυλοτρανσφεράσες πρωτεϊνών (ΡΜΤs), απομεθυλάσες πρωτεϊνών, ακετυλoτρανσφεράσες ιστονών, λιγάσες ουϊβικιτίνης και ειδικές κινάσες. Επομένως η δυνατότητα για φαρμακολογικό έλεγχο της μεταγραφής των γονιδίων που ρυθμίζεται επιγενετικά αποκτά ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Πράγματι, ο ρόλος αυτών των ενζύμων σε ανθρώπινες ασθένειες τονίζεται από την έγκριση τριών φαρμάκων από το FDA που δρουν ως εκλεκτικά μικρά μόρια-αναστολείς για HDACs και DNMTs, στη θεραπεία συγκεκριμένων ανθρώπινων καρκίνων. Συγκεκριμένα, η 5-αζακυτιδίνη (5-azacitidine, Vidaza) και η 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη (Decitabine, Dacogen), που αποτελούν δύο από τους πιο μελετημένους αναστολείς των DNMTs, εγκρίθηκε η κυκλοφορία τους για τη θεραπεία των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων το 2004 και 2006, αντίστοιχα. Επίσης, η βορινοστάτη (Zolinza), ένα παράγωγο του υδροξαμικού οξέος και που αποτελεί χαρακτηριστικό αναστολέα των HDACs,πήρε επίσης έγκριση για τη θεραπεία του Τ-λεμφοκυτταρικού λεμφώματος σε ασθενείς με εξελισσόμενη, επίμονη ή υποτροπιάζουσα μορφή της ασθένειας. Η στόχευση, επομένως, της δράσης των ειδικών μεθυλοτρανσφερασών έχει καταστεί αντικείμενο πολλών ερευνών στον τομέα ιδιαίτερα της ογκολογίας, ως μια σημαντική προσέγγιση προς την εξατομικευμένη θεραπεία του καρκίνου. Στην παρούσα λοιπόν πειραματική εργασία, αξιολογήθηκαν φαρμακολογικά δώδεκα χημικές ενώσεις, εξειδικευμένοι αναστολείς συγκεκριμένων PMTs, ως προς την ικανότητά τους να επηρεάζουν την ικανότητα πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε καλλιέργειες MEL καιK-562 κυττάρων, που αποτελούν δύο από τα κυριότερα κυτταρικά μοντέλα μελέτης ερυθροδιαφορποίησης in vitro, στο ποντίκι και στον άνθρωπο, αντίστοιχα. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των ενώσεων και πραγματοποιήθηκε: α) έλεγχος του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και του θανάτου των κυττάρων στην καλλιέργεια για την εύρεση της συγκέντρωσης IC50 των ενώσεων. β) Μορφολογική αξιολόγηση και κινητική ανάλυση της κυτταρικής ανάπτυξης μετά την επώαση των κυττάρων στις συγκεντρώσεις IC50. γ)Μελέτη της επαγωγικής ικανότητας των ενώσεων για την πρόκληση ερυθροδιαφοροποίησης in vitro. δ) έλεγχος πιθανής συνεργιστικής δράσης των ενώσεων με τον γνωστό χημικό επαγωγέα διαφοροποίησης HMBA. ε) κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση του ποσοστού κατανομής των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μετά την επίδραση των ενώσεων είτε μόνες τους, είτε με την παρουσία του HMBA.Τέλος, ζ) ανάλυση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε κρίσιμα μόρια που εμπλέκονται στην ικανότητα των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων να λαμβάνουν αποφάσεις για πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, και/ή απόπτωση. Τα αποτελέσματα που πάρθηκαν έδειξαν ότι υπάρχει ετερογένεια και πλειοτροπική δράση των δώδεκα ενώσεων, τόσο στο επίπεδο της κυτταρικής ανάπτυξης, όσο και στο επίπεδο της διαφοροποίησης. Επίσης, καταγράφονται σημαντικές μορφολογικές διαφορές των κυττάρων που αφορούν την κυτταροτοξικότητα και τη δέσμευση των κυττάρων για ερυθροδιαφοροποίηση. Οι συγκεκριμένες μεταβολές συνοδεύονται με τροποποιήσεις της γονιδιακής έκφρασης, ενώ καταγράφονται και αλλαγές στα ποσοστά κατανομής των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Η όλη συμπεριφορά των ενώσεων αναλύεται και συζητείται στη βάση των στόχων των ενώσεων στο μοριακό επίπεδο σε συσχέτιση με το πρόγραμμα ερυθροδιαφοροποίησης των ερυθρολευχαιμικών κυττάρων. Συμπερασματικά, η παρούσα πειραματική μεταπτυχιακή εργασία προσθέτει νέα στοιχεία για το ρόλο συγκεκριμένων επιγενετικών ενζύμων σε αναπτυξιακές διαδικασίες του αιμοποιητικού συστήματος, ενώ συνεισφέρει στη φαρμακολογική ανάπτυξη νέων καινοτόμων επιγενετικών φαρμάκων
description: Epigenetic mechanisms play a crucial role in the regulation of gene expression in a way that their deregulation contributes to disease pathogenesis and progression. Several drugs have entered the market that target epigenetic enzymes, whereas more chemical entities are under development and clinical trials. Such epigenetic therapeutics include the two DNMTs inhibitors azacitidine (Vidaza) and decitabine, (Dacogen), as well as the HDAC inhibitor vorinostat (Zolinza). The first two drugs have been approved for the treatment of myelodysplastic syndromes, whereas the third for the therapy of cutaneous T-cell lymphoma. Moreover, recent research efforts in cancer therapy focus on developing new innovative small-molecule inhibitors targeting protein methyltransferases (PMTs). In the present MSc Thesis, the main aim was to assess the effect of twelve selective inhibitors targeting various PMTs on the in vitro erythroidmaturationcell model systems of murine MEL and human K-562. This work follows a previous attempt in the Laboratory of Pharmacology, School of Pharmacy at Aristotle University of Thessaloniki, to evaluate pharmacologically the behavior of methylation inhibitors in the MEL cell differentiation program. To this end, the MEL cells were treated separately with each one of the twelve PMTs inhibitors to estimate: a) the dose-dependent cytotoxicity profileof the compounds and their IC50 valueby measuring cell growth and death in the cultures; b) the potential to induce differentiation of MEL cells to erythroid maturation; c) the ability to work synergistically with the known chemical inducer HMBA by assessing the commitment of cells to erythroid maturation; d) the morphological changes of cells in culture; and e) the ability of cells to enter the various phases of cell cycle to grow and differentiate in culture. Based on the data obtained, three of PMTs inhibitors targeting G9a were selected for further investigation in the K-562 cell model system. In this regard, the treated with the three G9a inhibitors K-562 were then assessed for: a) the dose-and time-dependent estimation of the cellular growth capacity, thus allowing the IC50 value measurement for each compound; b) any cellular phenotype changes in culture; c) flow cytometry analysis to estimate cell cycle phase distribution; and d) gene expression profiling in a panel of molecules involved in crucial cell decisions for proliferation, differentiation and/or apoptosis. The data obtained thus far indicate that the twelve PMTs inhibitors under investigation: a) present heterogeneity in their MEL cell cytotoxicity profile; b) cause cellular phenotype alterations coinciding with their cytotoxicity behavior; c) alter the cell cycle phase distribution profile; d) show variability in their synergistic capacity to modulate HMBA-induced MEL erythroid maturation; e) the three G9a inhibitors exhibit different cytotoxicity effects and morphological changes in K-562 cells with an interesting potential to affect cell cycle phase distribution and modulate gene expression profiling in culture. Overall, the results obtained in this experimental work give new insights on how the small-molecule specific inhibitors targeting various PMTs can affect cellular decisions in erythroleukemia cells. The latter, is of crucial importance for hematopoiesis malignancies and the pharmacological development of new innovative anticancer therapeutics