title: Μελέτη της ενσωμάτωσης του γονιδιώματος κλινικών στελεχών HPV-16 στο κυτταρικό γονιδίωμα του ξενιστή. Αποτελεί η ενσωμάτωση κατάλληλο μοριακό δείκτη νεοπλασίας ;
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Τσακογιάννης, Δημήτρης
Publisher: name: University of Thessaly
Year: 2010
Subjects: subject: ΠΑΠΙΛΟΜΑΙΟΙ
subject: ΓΟΝΙΔΙΑ -- ΑΝΑΛΥΣΗ

description: Οι ιοί των θηλωμάτων (papillomaviruses) είναι μια ομάδα επιθηλιοτροπικών DNA ιών χωρίς εξωτερικό περίβλημα που προκαλούν αλλοιώσεις στο επιθήλιο του δέρματος (θηλώματα) και στο επιθήλιο του βλεννογόνου (κονδυλώματα). Μολύνουν μια ευρεία κλίμακα οργανισμών, η οποία εκτείνεται από τα πτηνά μέχρι τα θαλάσσια θηλαστικά. Ο ιός των θηλωμάτων απέκτησε μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον όταν διαπιστώθηκε ότι προκαλεί μια σειρά δερματικών αλλοιώσεων στον άνθρωπο. Ο ιός των Ανθρωπίνων Θηλωμάτων (HPV) μεταδίδεται μέσω δερματικής επαφής, έχει παγκόσμια κατανομή και προκαλεί ένα ευρύ φάσμα από καλοήθεις και κακοήθεις αλλοιώσεις στον άνθρωπο. Οι περισσότερες HPV λοιμώξεις είναι ασυμπτωματικές. Έχουν πλήρως αναγνωριστεί περισσότεροι από 130 τύποι του ιού, ορισμένοι από τους οποίους ευθύνονται για την πρόκληση δερματικών κονδυλωμάτων, κυρίως των παλαμών και των πελμάτων. Το ένα τρίτο των τύπων του ιού μεταδίδεται μέσω σεξουαλικής επαφής και αναπτύσσεται στη γεννητική περιοχή των ατόμων. Με βάση το γεγονός ότι προκαλούν μια σειρά αλλοιώσεων στον άνθρωπο και κυρίως στην ανάπτυξη καρκίνου έχει δοθεί ιδιαίτερη ιατρική σημασία και μια εκτεταμένη προσπάθεια ανάπτυξης εμβολίων. Επιδημιολογικές και πειραματικές μελέτες έχουν αποδείξει σαφώς ότι διάφοροι τύποι των HPV (HPV-υψηλού κινδύνου) αποτελούν βασική αιτία πρόκλησης καρκίνου στον τράχηλο της μήτρας, ενώ ορισμένοι άλλοι τύποι HPV (HPV- χαμηλού κινδύνου) προκαλούν κοινά κονδυλώματα του γενετικού συστήματος. Παρά το γεγονός ότι η εφαρμογή των προληπτικών κυτταρολογικών εξετάσεων (test pap) ελάττωσε την εμφάνιση της νόσου στις Δυτικές χώρες, τα ποσοστά παραμένουν αρκετά υψηλά. Πέρα από την δημιουργία κυτταρολογικών και μοριακών μεθόδων για την ανίχνευση HPV στελεχών που προσβάλουν το γενετικό σύστημα, αποτελεί μεγάλο ερευνητικό ενδιαφέρον η ανάπτυξη μεθόδων για τον εντοπισμού μοριακών δεικτών. Δείκτες οι οποίοι θα μπορούν να προβλέπουν σε πρώιμα στάδια της μόλυνσης, την εξέλιξη του βαθμού της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης και την μεταβολή της αλλοίωσης σε καρκίνο. Η ανίχνευση της ενσωμάτωσης HPV τύπων υψηλής επικυνδυνότητας στο κυτταρικό γονιδίωμα, καθώς επίσης και ο εντοπισμός της ακριβής θέσης ενσωμάτωσης του ιού στο κυτταρικό χρωμόσωμα μπορεί να αποτελέσει ένα ενδιαφέρον και αξιόπιστο μοριακό δείκτη με βασικό στόχο την πρόβλεψη της δημιουργίας τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας και κυρίως την ανέλιξη της δυσπλασίας σε καρκίνο. Για τον λόγο αυτό στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο προσδιορισμός της κατάστασης του γονιδίωματος κλινικών στελεχών HPV-16 (ενσωματωμένη, υπό την μορφή επισώματος ή και οι δυο μορφές ταυτόχρονα ). Σε πρώτο στάδιο μελετήθηκε η ακεραιότητα του γονιδίου Ε2 το οποίο αποτελεί την συνηθέστερη θέση ρήξης και ενσωμάτωσης του ιϊκού DNA. Η μελέτη του γονιδίου Ε2 πραγματοποιήθηκε με την χρήση εκκινητικών μορίων, οι οποίοι σχεδιάστηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Οι εκκινητές που κατασκευάστηκαν ενισχύουν ολόκληρο το γονίδιο καθώς επίσης και τα επιμέρους τμήματά του έτσι ώστε να εντοπιστεί η ακριβής θέση ρήξης εντός του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή ΑΡΟΤ assay, η οποία επιτρέπει την διάκριση των ιικών mRNAs, προερχόμενα από ενσωματωμένα ή επισωμικά ιικά μετάγραφα. Με την μέθοδο αυτή δίνεται η δυνατότητα να προσδιορίσουμε από ιικα μετάγραφα την μορφή του γονιδίωματος του ιού και από την αλληλουχία των μεταγράφων μπορούμε να προσδιορίσουμε πιο ιικό γονίδιο έχει υποστεί ρήξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι εκτός από το γονίδιο Ε2, έχει παρατηρηθεί και σε μικρότερο ποσοστό ρήξη στα γονίδια Ε1 και Ε4. Τέλος από τις κυτταρικές αλληλουχίες που συμπεριλαμβάνονται στα μετάγραφα είναι δυνατός ο εντοπισμός της ακριβής θέσης ενσωμάτωσης του ιού στο χρωμόσωμα.