Development of Aspergillus-specific aptamers
Creators: name: Ιωάννου, Αλεξάνδρα Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ασπέργιλλος niger
Απταμερή
Ασπεργίλλωση
Aspergillus niger
Aptamers
Aspergillosis

description: Aspergillosis represents a highly lethal fungal infection with global prevalence, often characterized by significant underdiagnosis. Given the considerable mortality associated with this disease, there is a need to develop a novel diagnostic modality that surpasses the efficiency and the potential of the existing diagnostic methodologies. This master thesis study focuses on the development of DNA aptamers for the recognition and binding of cells of the ubiquitous fungus Aspergillus niger, which is in many cases responsible for the disease. Aptamers are DNA or RNA oligonucleotides and those specific to A. niger have the potential to be employed in diagnostic applications for aspergillosis. The selection of the aptamers was performed using a cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) process that includes multiple individual steps. The protocol is based on the publication of Claudia Kolm that has efficiently generated aptamers that bind to the bacterium E. faecalis (Enterococcus faecalis) (Kolm et al., 2020) and was modified to be adapted for a fungal application. This whole-SELEX protocol was effectively executed for nine rounds, concurrently conducted for two samples in parallel. Over the course of each iteration, the single-stranded DNA (ssDNA), starting with the initial ssDNA library in round 1, comprising aptamers, engaged in binding interactions with the conidia of A. niger. Thereafter, this binding complex underwent amplification and was subsequently reverted to its single-stranded DNA state, rendering it amenable for deployment in the subsequent selection round. The identification of the aptamers could be further explored using the next generation sequencing.
description: Η ασπεργίλλωση αντιπροσωπεύει μια εξαιρετικά θανατηφόρα μυκητιασική λοίμωξη με παγκόσμιο επιπολασμό, που συχνά χαρακτηρίζεται από σημαντική υποδιάγνωση. Δεδομένης της σημαντικής θνησιμότητας που σχετίζεται με αυτήν την ασθένεια, υπάρχει ανάγκη να αναπτυχθεί μια νέα διαγνωστική μέθοδος που να ξεπερνά την αποτελεσματικότητα και τις δυνατότητες των υπαρχουσών διαγνωστικών μεθοδολογιών. Αυτή η διπλωματική εργασία επικεντρώνεται στην ανάπτυξη απταμερών DNA για την αναγνώριση και τη δέσμευση των κυττάρων του πανταχού παρόντος μύκητα Aspergillus niger, ο οποίος σε πολλές περιπτώσεις ευθύνεται για τη νόσο. Τα απταμερή είναι ολιγονουκλεοτίδια DNA ή RNA και αυτά που είναι ειδικά για το A. niger έχουν τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν σε διαγνωστικές εφαρμογές για την ασπεργίλλωση. Η επιλογή των απταμερών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια διαδικασία cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) που περιλαμβάνει πολλαπλά μεμονωμένα στάδια. Το πρωτόκολλο βασίζεται στη δημοσίευση της Claudia Kolm που έχει δημιουργήσει αποτελεσματικά απταμερή που συνδέονται με το βακτήριο E. faecalis (Enterococcus faecalis) (Kolm et al., 2020) και τροποποιήθηκε για να προσαρμοστεί για εφαρμογή σε μύκητες. Αυτό το ολόκληρο πρωτόκολλο SELEX εκτελέστηκε αποτελεσματικά για εννέα γύρους, που διεξήχθησαν ταυτόχρονα για δύο δείγματα παράλληλα. Κατά τη διάρκεια κάθε επανάληψης, το μονόκλωνο DNA (ssDNA), ξεκινώντας με την αρχική βιβλιοθήκη ssDNA στον κύκλο 1, που περιλαμβάνει απταμερή, εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις δέσμευσης με τα κονίδια του A. niger. Στη συνέχεια, αυτό το σύμπλοκο δέσμευσης υποβλήθηκε σε ενίσχυση και στη συνέχεια επανήλθε στην κατάσταση του μονόκλωνου DNA του, καθιστώντας το επιδεκτικό για ανάπτυξη στον επόμενο γύρο επιλογής. Η ταυτοποίηση των απταμερών θα μπορούσε να διερευνηθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας την αλληλουχία επόμενης γενιάς.