title: Biodegradable amphiphilic PEG-PCL-PEI triblock copolymers designed for the self-assembly of multifunctional gene carriers
title: Bioabbaubare amphiphile PEG-PCL-PEI Triblock-Copolymere zur Herstellung multifunktionaler Genvektoren
Creators: name: Endres, Thomas
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Quantum dot
Lyophilisation
siRNA-Formulierung
Gefriertrocknung
Naturwissenschaften
In vitro
In vivo
Quantenpunkt
Copolymer
RNS-Interferenz
Cationic triblock copolymer
Self assembly
Gentherapie
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
Micelle

description: The great promise that gene therapy
      holds is the opportunity of directly introducing genetic
      material into cells for a causal therapy of yet incurable
      diseases. One promising way to achieve that goal is the usage
      of non-viral delivery vehicles, constructed from amphiphilic
      block copolymers. This thesis presents the establishment of a
      multifunctional PEG-PCL-PEI block copolymer platform,
      designed for multifunctional gene delivery. Across the
      scientific disciplines of chemistry, chemical physics,
      pharmacy and biomedicine the underlying work covers all
      aspects of non-viral gene delivery: In a first step, block
      copolymers were synthesised and characterised. In a
      systematic approach a library of compounds with varying
      hydrophilic/hydrophobic ratio was established. Subsequently,
      polymers were assembled into gene carriers followed by a
      non-invasive structural characterisation. Most importantly it
      was noticed, that polymers hydrophilic in nature formed
      smaller micelle-like carriers, whereas hydrophobic polymers
      aggregated to larger particle-like assemblies. In that vein,
      carrier features such as colloidal stability and toxicity
      were found to depend on chemical composition. Second, the
      nucleic acid loading process was optimised. Herein it was the
      overall goal to manufacture compactly condensed carrier
      complexes by understanding the basic principles of the
      electrostatic loading procedure. It was hypothesised that a
      more homogeneous fusion of charges is supposed to lead to
      superior carrier complexes. In that line, a microfluidic
      mixing technique, bringing cationic polymer and nucleic acid
      together at a constant ratio during the entire mixing
      process, was found to be the most promising technique.
      Ultimately, gene delivery carriers with superior colloidal
      stability, RNA protection and transfection efficiency were
      manufactured and process parameters were optimised with the
      help of a central composite design. Third, as a prerequisite
      for effective in vivo usage, carriers were transferred into
      stable ready-to-use formulations by lyophilisation with the
      help of glucose as a lyoprotectant. Unloaded nano-suspensions
      could be restored after rehydration by addition of small
      amounts of glucose. Upon loading of those rehydrated
      carriers, no significant difference in complex size or
      transfection efficiency was observed as compared to
      freshly-prepared ones. Moreover, the stabilisation of
      pre-formed carrier/siRNA complexes is feasible at elevated
      N/P and higher glucose concentrations. Fourth, most promising
      carriers where tested for their in vitro and in vivo
      transfection efficiency. Vectors constructed from rather
      hydrophobic block copolymers showed superior transfection
      efficiency, whereas poor performance was found in case of
      predominantly hydrophilic ones in a good correlation in vitro
      and in vivo. FACS studies revealed that this might possibly
      be due to reduced cell uptake of carriers with thicker PEG
      shell preventing cell interaction. In that way a yet active
      vector with diminished toxicity as compared to PEI
      homopolymers was evaluated. Fluorescent microscopy images of
      murine lung tissue revealed emission predominantly in the
      alveolar region, rendering this carrier system as promising
      for local treatment of airway diseases. Finally, the
      feasibility of multifunctional carrier co-loading and
      FRET-monitored nucleic acid unpacking was approved.
      Double-labelled nano-carriers emitted light at the acceptor’s
      emission wavelength upon donor excitation, proving successful
      FRET-effect and hence, complex integrity. The ability of dual
      loading is especially useful for “theranostic” purposes or
      co-delivery of nucleic acids and drugs. FRET-switching
      functionality may be advantageous for monitoring complex
      stability and nucleic acid unpacking. In view of prospective
      experiments, to circumvent the observed
      charge-toxicity-relationship, carriers are supposed to be
      taken up by the target tissue in a selective way. This can be
      achieved, up to a certain degree, via targeting ligands.
      Rather hydrophilic carriers with thicker PEG shells,
      increased colloidal stability and reduced toxicity represent
      the ideal candidates for this modification. In the long term,
      required work is evident: the development of more effective
      non-viral vectors and conquering the yet severe toxicity
      effects of current delivery systems. By a deeper
      understanding in the mechanistic aspects of the gene delivery
      process plus a rational vector design we are on the right
      track to achieve that goal.
description: Im Gegensatz zu einer
      symptomatischen Behandlung schwerwiegender Erkrankungen
      ermöglicht die Gentherapie einen kausalen Therapieansatz
      durch direkte Manipulation genetischen Materials. Eines der
      vielversprechendsten Trägersysteme zur Realisierung dieser
      Zielsetzung setzt sich aus amphiphilen Blockcopolymeren
      zusammen. Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist die
      Etablierung eines multifunktionalen PEG-PCL-PEI
      Blockcopolymer-Trägersystems für die Gentherapie. Hierfür
      erforderte das an der Schnittstelle unterschiedlichster
      wissenschaftlicher Disziplinen angesiedelte Thema
      fächerübergreifendes Arbeiten, um den chemischen,
      physikochemischen, pharmazeutischen und biomedizinischen
      Aspekten der Aufgabenstellung in vollem Umfang gerecht zu
      werden: Der erste Schritt umfasste den Aufbau einer
      Vektorbibliothek aus PEG-PCL-PEI Blockcopolymeren. Das
      Verhältnis aus hydrophilen und hydrophoben Kettensegmenten
      wurde hierbei systematisch variiert. Anschließend wurden die
      Blockcopoylmere zu Trägern verarbeitet und deren Aufbau wurde
      mittels nicht-invasiver Methoden charakterisiert. Hierbei
      wurde beobachtet, dass sich überwiegend hydrophile Polymere
      zu kleineren, mizellartigen Trägern formierten, während eher
      hydrophobe Ketten zu größeren, partikelartigen Vektoren
      aggregierten. Die Erforschung eines Zusammenhangs zwischen
      Polymerzusammensetzung und den Eigenschaften der Träger
      (Kolloidstabilität und Toxizität) ermöglichte die selektive
      Auswahl repräsentativer Polymere einer jeden Vektorklasse.
      Zweitens: Der Prozess der Selbstorganisation von Polymeren zu
      Trägern und deren Beladung mit Nucleinsäuren wurde erforscht
      und optimiert. Im Rahmen dieser Arbeiten war das Ziel die
      Grundzüge des elektrostatischen Ladungsprozesses besser zu
      verstehen und mit Hilfe dieser Erkenntnisse kompakte
      Nanokomplexe zu generieren. Dieses Kapitel basiert auf der
      Hypothese, dass ein gleichmäßigerer Komplexierungsvorgang zu
      einer homogeneren Verteilung von Ladungen und folglich zu
      Trägerkomplexen mit verbesserten Eigenschaften führen sollte.
      Folglich kristallisierte sich eine microfluidale
      Herstellungstechnik, bei der Träger und RNA während des
      gesamten Herstellungsprozesses gleichmäßig zusammengeführt
      werden, als die am besten geeignete Beladungsmethode heraus.
      Durch diese Technik wurden Komplexe mit verbesserter
      Kolloidstabilität, RNA-Einbettung und letztendlich auch
      Transfektionseffizienz erzielt. Die Prozessparameter wurden
      anschließend im Rahmen eines statistischen Designs im Detail
      untersucht. Drittens: Die Überführung von Nanoträgern in eine
      lagerstabile, trockene Form, stellt eine der
      Grundvoraussetzungen für die effektive Nutzung in vivo dar.
      Im Zuge der Untersuchungen wurden frisch hergestellte
      Trägersuspensionen unter Zugabe des Lyoprotektors Glucose
      gefriergetrocknet. Bereits durch geringe
      Glucosekonzentrationen konnten die Eigenschaften unbeladener
      Träger nach Rehydrierung wiederhergestellt werden. Bei
      anschließender Beladung mit siRNA wurde im Vergleich zu
      frischen Trägern kein Unterschied bezüglich der Komplexgröße,
      der Größenverteilung oder der Transfektionseffizienz
      detektiert. Darüber hinaus gelingt die Trocknung bereits
      beladener Trägerkomplexe bei erhöhten N/P-Verhältnissen sowie
      höheren Glucosekonzentrationen. Viertens: Die
      vielversprechendsten Träger sollten nun auf ihre
      Transfektionsaktivität hin untersucht werden. In guter
      Übereinstimmung der Ergebnisse in vitro und in vivo wurde bei
      hydrophoben Trägern eine hohe Transfektionseffizienz
      ermittelt, wohingegen bei hydrophilen Vektoren kaum Aktivität
      detektiert wurde. Die Ergebnisse der FACS-Analyse zeigten,
      dass die geringe Aktivität hydrophiler Vektoren durch
      mangelnde zelluläre Wechselwirkung, höchstwahrscheinlich
      bedingt durch eine dickere PEG-Hülle, verursacht wird. Im
      Zuge dieser Arbeiten wurde folglich eine Verbindung
      ausgewählt, welche sich durch gute Transfektionseffizienz bei
      gleichzeitig geringerer Toxizität (im Vergleich zu
      PEI-Homopolymeren) auszeichnet. Fluoreszenzmikroskopische
      Aufnahmen des Lungengewebes untersuchter Mäuse zeigten
      vorrangig Emission im Alveolargewebe. Dieses Ergebnis
      prädestiniert das etablierte Trägersystem für eine zukünftige
      Anwendung zur lokalen Therapie von Lungenerkrankungen.
      Schließlich wurde die Möglichkeit einer doppelten
      Fluoreszenzmarkierung von Trägerkomplexen untersucht. Durch
      Beladung des hydrophoben PCL-Kerns mit Quantenpunkten gefolgt
      von der Komplexierung mit fluoreszenzmarkierter siRNA wurde
      ein FRET-Paar etabliert, welches sich hervorragend zur
      Detektion der Komplexintegrität eignet. Die auf diese Weise
      doppelt markierten Träger zeichneten sich durch Emission von
      Licht der Wellenlänge des Akzeptors bei Anregung des Donors
      aus. Sie lieferten damit den Beweis für den Energietransfer
      im intakten FRET-Komplex. Es wurde folglich ein
      multifunktionales und biologisch aktives Vektorsystem
      geschaffen, welches sich hervorragend für theragnostische
      Zwecke oder für eine simultane Verabreichung von
      Nucleinsäuren und Wirkstoffen eignet. Der FRET-induzierte
      Schalteffekt ermöglicht eine Echtzeituntersuchung von
      Komplexstabilität und Entladevorgang. Ein Durchbrechen des
      Zusammenhangs zwischen Ladung, Aktivität und Toxizität ist
      die wohl wichtigste Herausforderung zukünftiger Arbeiten.
      Dies könnte durch eine Erhöhung der Selektivität des
      Trägersystems im Zuge der Einführung von geeigneten
      Rezeptoren gelingen. Hydrophile Träger mit dicker PEG-Hülle,
      erhöhter Kolloidstabilität und geringer Toxizität wären die
      idealen Kandidaten für eine derartige Modifikation. Das
      Langzeitziel bei der Erforschung nicht-viraler Vektoren ist
      klar: Die Effektivität von Vektoren muss gesteigert, die
      Toxizität verringert werden. Durch rationales Vektordesign,
      welches wiederum systematische und intensive
      Grundlagenforschung bedingt, ist zu erhoffen, dass zukünftig
      sichere und effektive Trägersysteme zur kausalen Therapie
      gegenwärtig als unheilbar klassifizierter Krankheiten
      entwickelt werden können.