title: Bestimmung des Methylierungsgrades von Brustkrebs-relevanten Genen in MCF-7 Zellen und Biopsieproben mittels methylierungs-sensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Creators: name: Fackler, Viktoria
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Die DNA-Methylierung in der Promotorregion von Tumorsuppressor-Genen ist ein sehr frühes Ereignis in der Kanzerogenese. Diese Hypermethylierung der Promotorregion führt in den meisten Fällen zur Stilllegung des jeweiligen Gens. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde der Methylierungsgrad von Brustkrebs-relevanten Genen in MCF-7 Zellen, sowie in Biopsieproben von Brustkrebspatientinnen, mittels der methylierungs-sensitiven hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) bestimmt. Es wurden spezielle Primerpaare für die ausgewählten Brustkrebs-relevanten Tumorsuppressor-Gene CDH1 (Cadherin 1), HIN-1 (High in Normal 1), ERα (Östrogenrezeptor α), ERβ (Östrogenrezeptor β), sowie MGMT (O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase) entworfen und für den Einsatz in der MS-HRM Analyse optimiert. Für CDH1 und HIN-1 konnte kein geeignetes Primerpaar entworfen und für den Einsatz in der MS-HRM Analyse optimiert werden. Im Laufe dieser Diplomarbeit wurde die entwickelte Methode für das Gen MGMT als nicht robust eingestuft. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass lebensmittelrelevante Substanzen einen demethylierenden Effekt auf die DNA haben können. In dieser Diplomarbeit wurde untersucht, in wie weit ausgewählte Polyphenole ((-)-Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), (+)-Lariciresinol, (-)-Matairesinol und Quercetin), sowie Hydralazin, den Methylierungsgrad in Brustkrebszellen verringern können. Polyphenole erfahren eine Auto-Oxidation. Um diesem oxidativen Stress und der dadurch induzierten Apoptose der MCF-7 Zellen entgegenzuwirken, wurde bei den Inkubationsversuchen mit den entsprechenden Polyphenolen das Enzym Katalase zur Stabilisierung hinzugefügt. Weiters wurden Inkubationsversuche mit EGCG in Gegenwart des Enzyms Superoxiddismutase (SOD) und der Zugabe von MgCl2 durchgeführt. Die MCF-7 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen (1 – 100 μmol/l) der entsprechenden Substanzen 216 bzw. 96 Stunden lang inkubiert. Aus den MCF-7 Zellen wurde die DNA isoliert, Bisulfit-konvertiert und anschließend der Methylierungsgrad mittels MS-HRM Analyse ermittelt. Bei den Inkubationsversuchen mit EGCG, sowie mit Quercetin, wurde eine Wachstumshemmung beobachtet. Bei der Inkubation von EGCG und Quercetin erfolgte bei einer Substanzkonzentration von 100 μmol/l die Apoptose der Brustkrebszellen. Die Zugabe von SOD und Katalase während der Inkubation von MCF-7 Zellen mit EGCG hatte zur Folge, dass die Zellen nicht abstarben und auch bei einer EGCG-Konzentration von 100 μmol/l die DNA isoliert und ihr Methylierungsgrad bestimmt werden konnte. Der Methylierungsgrad der folgenden Gene wurde ermittelt: ERβ (Östrogenrezeptor β), MGMT (O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase), CDKN2A (Cyclin-dependent Kinase Inhibitor 2A), DAPK1 (Death-associated Protein Kinase 1) und RASSF1A (Ras-association Domain Family 1, Isoform A) untersucht. Die MS-HRM Methoden für die Gene CDKN2A, DAPK1 und RASSF1A wurden von B. Werner [132], E. Habla [133] und A. Raab [134] entwickelt. Die Promotorregion der untersuchten Gene war in MCF-7 Zellen durchgehend hoch methyliert (Methylierungsgrad über 75 %). Die stärkste demethylierende Wirkung auf die RASSF1A Promotormethylierung in den Brustkrebszellen wurde durch die Inkubation mit (+)-Lariciresinol (5 μmol/l) in Gegenwart von Katalase erzielt. Beim Gen RASSF1A konnte beim Inkubationsversuch mit EGCG, SOD und Katalase bei einer höheren Konzentration (Konzentration über 10 μmol/l) ebenfalls eine Abnahme der DNA-Methylierung festgestellt werden. Weiters wurde in dieser Diplomarbeit untersucht, in wie weit es bei Brustkrebspatientinnen einen Unterschied im Grad der Methylierung der Tumorgewebe-DNA, im Vergleich zu tumornahem bzw. tumorfernen Gewebe-DNA gibt. Es wurde der Methylierungsgrad der Gene CDKN2A, RASSF1A, DAPK1, APC, MGMT, ERβ und ERα auf eine mögliche DNA-Methylierung in der Promotorregion ermittelt. Der Methylierungsgrad in den Gewebeproben stellte sich als sehr genspezifisch heraus. Einige Gene wiesen in den Biopsieproben einen hohen Methylierungsgrad auf (ERβ und MGMT), andere Gene zeigten hingegen eine sehr geringe DNA-Methylierung (APC, RASSF1A und ERα). Weiters gab es auch zwischen den Patientinnen einen Unterschied in der DNA-Methylierung des jeweiligen Gens. Bei den Genen CDKN2A, RASSF1A und ERα konnte eine Abnahme der DNA-Methylierung zwischen Tumorgewebe und tumornahem bzw. tumorfernem Gewebe festgestellt werden.