Improving Single Cell ‘Omics Methods for Investigating Microbial Dark Matter
Creators: name: Sobol, Morgan S.
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2023

description: Die überwiegende Mehrheit des mikrobiellen Lebens ist unentdeckt und wenig erforscht, da sie bisher noch nicht erfolgreich kultiviert werden konnten. Wir bezeichnen sie daher als mikrobielle dunkle Materie (microbial dark matter, MDM). MDM hat hohes biotechnologisches Potential, z.B. für die Nutzung nachhaltiger Energiequellen, zur biologischen Sanierung kontaminierter Böden, oder für medizinische Anwendungen. Der Einsatz kulturunabhängiger Methoden zur Untersuchung von Mikroorganismen in der Natur, die Metagenomik und Metatranskriptomik, hat unser Verständnis von MDM erheblich verbessert. Allerdings ist es mit diesen Methoden immer noch schwierig, einzelne Spezies bioinformatisch zu analysieren, insbesondere von Organismen mit geringer Häufigkeit in komplexen Habitaten. Stammvariationen, die falsche Zuordnung von Sequenzen, insbesondere mobiler genetische Elemente sowie sich stark wiederholende Sequenzregionen sind nur einige der Probleme, mit denen z.B. die Metagenomik konfrontiert ist. Auch bei der Metatranskriptomik führen die phänotypische Heterogenität der Zellen und die Diversität der mikrobiellen Gemeinschaften zu komplexen Transkriptionsprofilen, die nicht vollständig zugeordnet werden können. Daher wurden die Einzelzellgenomik (single cell genomics, SCG) und die Einzelzelltranskriptomik (single cell transcriptomics, SCT), die zusammen als Einzelzell-'omics (SC 'omics) bezeichnet werden, entwickelt, um die Nachteile der Metagenomik und Metatranskriptomik zu überwinden. Die Anwendung von SCG hat sich zu einem wichtigen Instrument für die Erweiterung unseres Wissens über MDM entwickelt, beispielsweise durch die jüngste Entdeckung mehrerer neuer Phyla, von denen es derzeit nur sogenannte single amplified genomes (SAGs) gibt. Vollständige SAGs von vielen Mikroorganismen, insbesondere von solchen mit geringer Abundanz, sind jedoch aufgrund der vielen technischen Herausforderungen und der hohen Kosten selten. Auch die SCT ist mit den vielen Herausforderungen der Arbeit mit RNA konfrontiert, wie z. B. der kurzen Halbwertszeit von mRNA und geringen Genexpression, weshalb sie in der Mikrobiologie noch nicht häufig angewendet wird. Daher haben sich die hohen Erwartungen an mikrobielle SC 'omics noch nicht vollständig erfüllen können. In einem typischen SCG-Arbeitsablauf können die Zellen nach der Probenentnahme vor der Einzelzellisolierung mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Nach der Isolierung werden die Zellen lysiert und das Genom anschließend amplifiziert, gefolgt von der Sequenzierung und bioinformatischen Datenanalyse. In dieser Arbeit wurden die Schritte der Zellmarkierung, Isolierung, Lyse und Ganzgenom-Amplifikation (whole genome amplifikation, WGA) verbessert, um die Methodik zu verbessern. Zunächst wurde ein Ansatz zur gezielten Zellmarkierung entwickelt, der die Anreicherung von Mikroorganismen mit geringer Häufigkeit aus Umweltproben ermöglichte. Dieser Ansatz half bei der Entdeckung neuer Phylogenien und Stoffwechseln von Mikroorganismen die in geringer Abundanz vorkommen und die andernfalls durch konventionelle Metagenomik übersehen worden wären. Darüber hinaus trägt dieser Ansatz dazu bei, die Kosten für SCG zu senken, da nun nicht mehr Zehntausende von Einzelzellen sequenziert werden müssen, um seltene Mikroorganismen zu analysieren. Als nächstes wurden die Schritte der Zellisolierung und Zelllyse verbessert, um sowohl physische Zellschäden als auch den DNA-Abbau zu minimieren, was den Erfolg des nachgeschalteten Genom-Amplifikationsschritts erhöht. Für den WGA-Schritt wurde ein Ansatz zur Volumenreduzierung systematisch getestet und etabliert, um die Homogenität und Vollständigkeit der Genomabdeckung deutlich zu verbessern. Dies Ergebnisse der Versuche zeigen, dass eine weitere Volumenreduzierung in den nL oder pL Bereich nicht erforderlich. Die Kosten der WGA konnten um 97,5 % gesenkt werden konnten, was den Durchsatz von SCG erhöhen und die Verwendung dieses Ansatzes in weiteren Forschungsgruppen positiv beeinflussen dürfte. Da SCG allein nur Informationen über die Phylogenie, genetische Struktur und das Stoffwechselpotenzial, nicht aber über die tatsächliche Aktivität einer Zelle liefert, wurde in dieser Arbeit eine mikrobielle SCT-Pipeline entwickelt, um die individuellen Funktionen der Zelle in einer Gemeinschaft besser zu verstehen. Derzeit gibt es nur sehr wenige Methoden für mikrobielle SCT, und die, die es gibt, bleiben aufgrund ihrer schwierigen Anwendung und geringen Zugänglichkeit außerhalb ihrer jeweiligen Arbeitsgruppen weitgehend ungenutzt. Daher wurden in dieser Studie Änderungen und Verbesserungen an einer eukaryotischen Einzelzell-RNA-Sequenzierungsmethode (RNA-seq) vorgenommen, um ihre Anwendung bei Prokaryoten zu ermöglichen. Es wurde festgestellt, dass der Zusatz von Dithiothreitol (DTT) im Lysepuffer wahrscheinlich die DNase I hemmt, was zu einer DNA Kontamination führt. Die hier vorgestellten Einzelzell-RNA-seq-Ergebnisse zeigten zuverlässige Transkriptionsprofile im Vergleich zu RNA-seq-Ergebnissen aus der gesamten Probe. Dies wurde auch durch ein Proof-of-Principle-Experiment bestätigt, bei dem hitzeschockbehandelte und unbehandelte Escherichia coli Zellen verglichen wurden. Darüber hinaus wurden in den Einzelzelldaten im Vergleich zur Populations-Analyse Hinweise auf einzigartige Reaktionen bei der Synthese von Sekundärmetaboliten und der CRISPR-Cas-Editierung gefunden, was die Bedeutung der Untersuchung der Heterogenität seltener funktioneller Subpopulationen auf Einzelzellebene unterstreicht. Insgesamt wird erwartet, dass die verbesserten SCG- und SCT-Methoden, die in dieser Arbeit etabliert wurden, eine breitere Anwendung für ein besseres Verständnis der MDM-Diversität und -Funktion in der Umwelt ermöglichen.