Κλωνοποίηση και έκφραση HEAT επικρατειών του παράγοντα ματίσματος SF3B1 που εμπλέκονται στη ΧΛΛ
Creators: name: Κυριζάκη, Παρασκευή Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Παράγοντας ματίσματος 3b υπομονάδα 1
Μάτισμα
Χρόνια Λεμφοκυτταρική λευχαιμία
SF3B1
Splicing
Chronic lymphocytic leukemia

description: Η πρωτεΐνη SF3B1 αποτελεί κύριο συστατικό του U2 snRNP και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη στρατολόγηση, καθώς επίσης και τη δέσμευση του U2 snRNP στη θέση διακλάδωσης, κατά το μάτισμα. Αποτελείται από 2 δομικές περιοχές: τη Ν-τελική περιοχή, η οποία συμμετέχει στην αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες του ματίσματος και τη C-τελική περιοχή, η οποία αποτελείται από 22 μη πανομοιότυπες, διαδοχικές επαναλήψεις του μοτίβου HEAT. Οι μεταλλάξεις που εντοπίζονται στον παράγοντα SF3B1 είναι κυρίως παρανοηματικές μεταλλάξεις, οι οποίες χαρτογραφούνται σε συγκεκριμένα σημεία που βρίσκονται μεταξύ της 4ης και 8ης επανάληψης των συντηρημένων HEAT επαναλήψεων. Η μετάλλαξη που φέρει τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης σε διάφορες μορφές καρκίνου και ιδιαίτερα στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία, προκαλεί μια αλλαγή ενός κωδικονίου λυσίνης σε κωδικόνιο γλουταμινικού οξέος στη θέση 700 (Lys700Glu – K700E). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας συγκεκριμένες επικράτειες του γονιδίου SF3B1, που αποτελούνται από τις HEAT επαναλήψεις 1-6, 3-6, 4-6, 5-6, 4-7, κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα έκφρασης και εκφράστηκαν σε ικανοποιητικά επίπεδα σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η πιθανότητα αλληλεπίδρασης μεταξύ των πρωτεϊνών SF3B1 και DDX46, που όμως δεν επιβεβαιώθηκε. Η διερεύνηση αυτή έγινε λόγω της αλληλεπίδρασης των αντίστοιχων ομόλογων πρωτεϊνών της ζύμης, με τρόπο που εξαρτάται από τις επαναλήψεις HEAT. Τέλος, πραγματοποιήθηκε περαιτέρω διερεύνηση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων για τις επικράτειες SF3B1 3-6 και SF3B1 3-6 K700E, μέσω πειραμάτων συγκατακρήμνισης και χρώσης με νιτρικό άργυρο. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ύπαρξη μιας πρωτεΐνης στα περίπου 200 kDa και μιας στα 70 kDa, για τις οποίες απαιτείται περαιτέρω μελέτη. Η παρούσα εργασία οδήγησε στη δημιουργία χρήσιμων μορίων για την διερεύνηση της λειτουργικής σημασίας των μεταλλάξεων του SF3B1 που σχετίζονται με νεοπλασίες.
description: SF3B1 is a highly conserved protein found in both the major and minor spliceosomes. It is part of the SF3b complex that, along with SF3a and the 12S snRNP, forms the functional 17S U2 snRNP. SF3B1 plays an important role in the recruitment, as well as the stabilization of the U2 snRNP at the branch site. It is composed of two regions: the N-terminal domain and the C-terminal domain. The N-terminal domain is less conserved and contains the binding sites for other splicing associated factors, whereas, the C-terminal region is highly conserved and consists of 22 nonidentical HEAT repeats. Cancer-associated mutations in SF3B1 are missense mutations with major hotspots targeting the 4-8 HEAT repeats. A mutation creating a Lys700Glu substitution is the most frequent mutation that is associated with chronic lymphocytic leukemia. In this particular study, specific domains of SF3B1 gene, consisting of HEAT repeats 1-6, 3-6, 4-6, 5-6, 4-7 were cloned into a plasmid vector and expressed at satisfactory levels in eukaryotic cells. Subsequently, the probability of interaction between the SF3B1 protein and the DDX46 protein was investigated because of the recently demonstrated interaction of he corresponding homologous molecules in yeast in a manner that depend on the integrity of the HEAT repeats. Our experiments could not demonstrate an intreraction between SF3B1 and DDX46. Further investigation for proteins that interact with SF3B1 3-6 and SF3B1 3-6 K700E was performed by co-precipitation and silver staining experiments. The results revealed an interaction with a protein about 200 kDa and one at about 70 kDa, though further experiments are required in order to identify these proteins. This study generated useful tools for the investigation of the functional significance of SF3B1 mutations that are associated with human malignancies.