title: Mutational analysis and post-transcriptional modification of human telomerase RNA
Creators: name: Handl, Stefan
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Die humane telomerase ist ein Ribonukleoprotein-komplex, welcher aus einer RNA, der humanen telomerase RNA (hTR) und einem protein-teil, der humanen telomerase reversen Transkriptase (hTERT) besteht, sowie Anhangs Proteinen wie Dyskerin, Nop10, Nhp2, Tcab1 und Gar1. Die Hauptfunktion dieses Komplexes ist die Instandhaltung der Telomere durch de novo synthese von hexameren Sequenzen (5`-TTAGGG-3´) an das Ende von Chromosomen nach jedem Replikationszyklus um dem ‚End replication‘ Problem entgegen zu wirken. Somatische Zellen ist wird Telomerase nicht exprimiert und kann daher die Telomere nicht verlängern. Folglich werden die Telomere zu kurz was Zell Seneszenz und den Tod der Zelle zur Folge hat. In hoch-proliferativen Zellen, wie Stammzellen, ist die Telomerase Expression hoch reguliert und die Länge der Telomere kann beibehalten werden. In 90% aller Krebstypen ist die Telomerase hochreguliert. Diese Erkenntnis hat die biomedizinische Wissenschaft dahin gebracht neue Therapien in diese Richtung zu entwickeln. Ein nicht-funktionierendes Telomerase Enzym kann Krankheiten auslösen wie, dyskeratosis congenita, aplastische Anemie and idiopathische pulmonare Fibrose, welche alle in Verbindung zu kurzen Telomeren und Seneszenz in hoch-proliferativen Zellen steht. Mutationen in hTERT, hTR und Anhangs Proteinen können so einen Phänotyp auslösen. Punktmutationen in hTR wurden in Zusammenhang mit so einem Phänotyp und können die telomerase Aktivität reduzieren oder gar komplett vernichten. Trotz des Aufwands hoch auflösende Strukturdaten über die telomerase RNA zu erhalten gibt es nur wenige Informationen über die gesamte hTR. In dieser Arbeit wir analysierten die telomerase Aktivität von hTERT gebunden an mutierte hTR, von hoch konservierten Positionen oder strukturell interessanten Nukleotiden verändert wurden. Von diesen Mutanten die Mutante C123A hat die telomerase Aktivität am meisten beeinflusst. Tatsächlich ‚nucleotide addition procesivity‘ wurde auf unter 10 % reduziert, während die ‚repeat addition processivity‘ komplett beseitigte. Genauere Betrachtung der strukturellen Veränderungen dieser Punktmutation zeigte, dass die Auflösung des Basenpaares G91-C123 in P2a die Formierung des Pseudoknoten und der assoziierten dreifach Helix stört und dabei eine Missfaltung der Kern Domäne verursacht. In Kontrast, diese Mutation scheint die Bindung von hTERT in der CR4/CR5 Domäne nicht zu beeinträchtigen und beeinflusst somit nicht die Biogenese der Telomerase. Wir wissen, dass Pseudouridine eine wichtige Rolle im Stabilisieren und in der Faltung von nicht-kodierenden RNAs spielt, deshalb ist es von großem Interesse Pseudouridine in hTR zu identifizieren. Tatsächlich haben wir 29 Pseudouridine beobachtet und festgestellt dass diese in der Pseudoknoten/Template Domäne vermehrt auftreten. Im speziellen scheinen alle Us in der dreifach-Helix Pseudouridine zu sein. Deshalb ist anzunehmen, dass diese Pseudouridine wichtig sind für die Stabilität und Funktion dieses Elements.
description: The human telomerase is a ribonucleoprotein-complex (RNP) consisting of an RNA part, the human telomerase RNA (hTR), a protein part, the human telomerase reverse transcriptase (hTERT), and accessory proteins like Dyskerin Nop10, Nhp2, Tcab1 and Gar1. The main function of this complex is the maintenance of the telomeres by de novo synthesis of hexameric repeats (5’-TTAGGG-3’) onto the end of chromosomes after each replication cycle to counteract the end replication problem. In somatic cells telomerase is not expressed and cannot elongate telomeres, therefore after a certain number of cell divisions the short telomeres cause senescence and cell death. For highly proliferative cells, like stem cells, the telomerase expression is up-regulated and telomere length is maintained. Also in 90 % of all cancer types the telomerase is highly up-regulated. This has led biomedical research to focus on ways to use this fact in new therapies. A dysfunctional telomerase enzyme can cause diseases, like dyskeratosis congenita, aplastic anemia, idiopathic pulmonary fibrosis, which are all connected to shortened telomeres and the senescence of highly proliferative cell like stem cells. Mutations in hTERT, hTR and accessory proteins can cause such phenotypes. Single mutations in hTR have been identified to cause such phenotypes and reduce or abolish telomerase activity. These changes seem to influence folding and conformation of the human telomerase RNA. Despite the fact that there are great efforts to obtain high resolution data on telomerase RNA, the information on full length hTR is scarce. In this thesis we analyzed the telomerase activity of hTERT bound to mutant hTR in which highly conserved residues or structurally interesting nucleotides were altered. Of the analyzed mutants, C123A affected telomere function most severely. In fact, nucleotide addition processivity was reduced to &lt;10%, while repeat addition processivity was abolished. Exploring the structural consequences of this single point mutation revealed that disrupting the G91-C123 base pair in P2a perturbs formation of the pseudoknot and associated triple helix, thereby inducing misfolding of the core domain. In contrast, this mutation does not appear to affect binding of hTERT to the CR4/CR5 domain and to interfere with telomere biogenesis. As pseudouridines are known to play a role in stabilizing and folding of non-coding RNAs, it was of interest to identify potential pseudouridines within hTR. In fact, a total of 29 pseudouridines were observed clustering in the pseudoknot/template domain. Specifically, all Us within the triple helical scaffold appear to be pseudouridines, potentially involved in stabilizing this structural element essential for telomerase function.