Ανάπτυξη μοριακής μεθόδου για τη διάκριση γάλακτος διαφορετικής ζωικής προέλευσης σε τυριά. Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός οξυγαλακτικών βακτηρίων
Creators: name: Τσιριγώτη, Ευανθία Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: Ζωική προέλευση
Τυριά
Οξυγαλακτικά
Animal origin
Cheeses
Lactic acid

description: Η δυνατότητα ταυτοποίησης της ζωικής προέλευσης του γάλακτος στα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι σημαντική, αφενός γιατί αυτά σχετίζονται με την προστασία του καταναλωτή, αφετέρου δε γιατί η διατήρηση της ονομασίας προέλευσης διέπεται από αυστηρούς διεθνείς κανόνες. Σημαντικό ακόμη ενδιαφέρον παρουσιάζει η περιεκτικότητα των προϊόντων αυτών σε οξυγαλακτικά βακτήρια (Lactic Acid Bacteria - LAB), λόγω της ενδεχόμενης χρησιμότητάς τους στην τεχνολογία τροφίμων και στον τομέα της υγείας. Στην παρούσα εργασία, παρουσιάζεται μία μεθοδολογία που περιλαμβάνει χρήση απλής και multiplex PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα το DNA σωματικών κυττάρων που απομονώθηκε από τα τυριά, για την ταυτοποίηση της προέλευσης του γάλακτος από το οποίο παρασκευάστηκαν (αγελαδινό, πρόβειο, αίγειο). Για την ανίχνευση του είδους προέλευσης του γάλακτος και συγκεκριμένα των ειδών Bos taurus, Ovis aries και Capra hircus χρησιμοποιήθηκαν τόσο εκκινητές από τη βιβλιογραφία, όσο και εκκινητές που σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε σύγκριση της μεθόδου αυτής με μια υπάρχουσα ορολογική δοκιμασία (χρήση kit). Εξετάστηκε σημαντικός αριθμός τυριών τοπικής προέλευσης (40 είδη, ορισμένα σε διαφορετικές παρτίδες). Επίσης πραγματοποιήθηκε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμό τεσσάρων αντιπροσωπευτικών γενών LAB (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc), εφαρμόζοντας multiplex PCR και Real-Time PCR, αντίστοιχα, με εκκινητές που σχεδιάστηκαν στο εργαστήριο, καθώς και με την πρότυπη μέθοδο των τρυβλίων. Στόχο αποτελούσε και η αναζήτηση πιθανής συσχέτισης του αριθμού και τύπου των LAB με τη ζωική προέλευση του γάλακτος, αλλά και τη γεωγραφική προέλευση του τυριού. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μεταγονιδιωματική ανάλυση σε τυριά οικοτεχνίας. Η PCR και η multiplex PCR είχαν ως αποτέλεσμα την ανίχνευση ξένων (μη αναγραφόμενων) προσμείξεων στα 15 από τα 40 τυριά. Μεταξύ των αποτελεσμάτων των μεθόδων PCR και της ορολογικής δοκιμασίας παρατηρήθηκε απόκλιση μόνο σε ένα δείγμα, όπου ανιχνεύθηκαν αγελαδινά αντισώματα IgG, πιθανόν λόγω της προσθήκης ορού από αγελαδινό γάλα. Συμπερασματικά, η παραπάνω μέθοδος αποτελεί ένα γρήγορο και αξιόπιστο εργαλείο για την ταυτοποίηση της ζωικής προέλευσης του γάλακτος στα τυριά. Ως εκ τούτου, δύναται να χρησιμοποιηθεί για την παροχή πιστοποίησης που θα διασφαλίζει την αξιοπιστία των προϊόντων στην εγχώρια και διεθνή αγορά. Όσον αφορά τον ποιοτικό προσδιορισμό των LAB, με τη multiplex PCR ανιχνεύθηκαν και τα τέσσερα γένη στα 38 από τα 40 τυριά. Ο ποσοτικός προσδιορισμός με την πρότυπη μέθοδο των τρυβλίων, ο οποίος πραγματοποιήθηκε σε 16 επιλεγμένα τυριά, έδωσε τιμές μεταξύ 2.1x106-2.5x108 για το Lactobacillus sp., 1.3x106-2.3x1010 για το Lactococcus sp. και 105-2.3x108 για το Streptococcus sp., με τα τρία τυριά οικοτεχνίας να εμφανίζουν τους μεγαλύτερους αριθμούς στα τρία γένη LAB, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν βακτήρια του Leuconostoc sp. σε κανένα από τα 16 τυριά τα οποία αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα της Real-Time PCR έδωσαν επίσης υψηλές τιμές LAB, και για τα τέσσερα γένη, με ορισμένες διαφοροποιήσεις σε σχέση με την πρότυπη μέθοδο των τρυβλίων. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της ζωικής προέλευσης του γάλακτος και της γεωγραφικής προέλευσης του τυριού με τη σύσταση των τυριών στα τέσσερα προαναφερθέντα γένη. Τέλος, η μεταγονιδιωματική ανάλυση στα τυριά οικοτεχνίας αποκάλυψε ότι το μεγαλύτερο ποσοστό των επικρατών ειδών δεν έχει ταυτοποιηθεί, ενώ τα γένη Lactobacillus και Streptococcus ήταν τα επικρατή. Συνεπώς, απαιτείται περαιτέρω μελέτη του μικροβιώματος των τυριών, ιδιαίτερα των τυριών οικοτεχνίας, με σκοπό την απομόνωση νέων χρήσιμων στελεχών.
description: The possibility of identifying the animal origin of milk in milk products is important, firstly because they are related to consumer protection and on the other hand because the maintenance of the designation of origin is governed by strict international rules. Of particular interest is the content of these products in Lactic Acid Bacteria (LAB), due to their potential utility in food technology and health. In the present study, a methodology is presented that involves application of standard and multiplex PCR using the somatic cells’ DNA isolated from cheeses as a matrix to identify the origin of the milk from which they were prepared (cow’s, sheep’s, goat’s). For the detection of the origin of the milk, and in particular the species Bos taurus, Ovis aries and Capra hircus, both primers from the literature and primers designed in our laboratory were used. In addition, this method was compared with a commercially available serological test (kit). A considerable number of local cheeses were tested (40 species, some in different batches). A qualitative and quantitative determination of four representative LAB strains (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc) was performed by applying multiplex PCR and Real-Time PCR, respectively, with primers designed in the laboratory as well as with standard plate method. The aim was to investigate any correlation between the number and type of LABs present in the cheese, with the animal origin of milk and the geographical origin of the cheese. In addition, metagenomic analysis was performed on artisanal cheese. PCR and multiplex PCR detected foreign impurities in 15 of the 40 cheeses. Among the PCR methods and the serological test, was detected only one deviation where cow's IgG antibodies were detected, possibly due to the addition of serum from cow's milk. In conclusion, the above method is a quick and reliable tool for identifying the animal origin of cheeses. Therefore, it can be used to provide certification to ensure product reliability on the domestic and international market. Regarding the qualitative determination of LABs, all four genera were detected in 38 out of the 40 cheeses were detected by multiplex PCR. Quantitation by standard plate method, performed in 16 selected different cheeses, yielded values between 2.1x106-2.5x108 for Lactobacillus sp., 1.3x106-2.3x1010 for Lactococcus sp. and 105-2.3x108 for Streptococcus sp., with three artisanal cheeses having the largest numbers in the three genera LAB. Leuconostoc sp. were not detected in any of the 16 analyzed cheeses. According to the results of Real-Time PCR also high LAB values, for all four genera, with some variations compared to the standard plate method, were detected. No correlation was found between the animal origin of the milk or the geographical origin of the cheese with the composition of the cheeses in concern to the four genera mentioned above. Finally, the metagenomic analysis in artisanal cheeses revealed that the majority of the predominant species could not be identified, whereas the genera Lactobacillus and Streptococcus were found to be predominant. Therefore, further study of the microbe profile of cheeses, especially artisanal cheeses, is required in order to isolate new useful strains.