Αξιολόγηση της επίδρασης αναστολέων της γλυκόλυσης στη δράση κυτταροτοξικών ουσιών σε ευκαρυωτικά κύτταρα
Creators: name: Ταμπάκη, Βασιλική Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Φαρμακευτική ΑΠΘ
Γλυκόλυση
Ταμπάκη Βασιλική
Pharmaceuticals Auth
Glycolysis
Tampaki Vasiliki

description: Ο κλάδος της Βιοενεργητικής, ασχολείται με τη μελέτη των μεταβολικών ενεργειακών μετασχηματισμών, ορίζοντας την καταβολική διαδικασία της κυτταρικής αναπνοής (γλυκόλυση, κύκλος του κιτρικού οξέος και οξειδωτική φωσφορυλίωση), απαραίτητη για τη συνεχή παροχή ενέργειας και επιβίωση των φυσιολογικών κυττάρων. Ωστόσο, το 2011 οι Hanahan και Weinberg, ανακάλυψαν πώς ένα από τα δέκα ορόσημα του καρκίνου είναι ο επαναπρογραμματισμός του μεταβολισμού της ενέργειας. Το 1926, ο Otto Warburg παρατήρησε, πως τα καρκινικά κύτταρα έδειξαν αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και υπερβολικό σχηματισμό γαλακτικού οξέος ακόμη και υπό πλήρως αερόβιες συνθήκες. Η υψηλή πρόσληψη γλυκόζης/απελευθέρωση γαλακτικού οξέος παραμένει χαρακτηριστικό του καρκίνου, φαινόμενο από ονομάστηκε Warburg effect και αποτελεί την βάση για έρευνα και ανάπτυξη καινοτόμων αντικαρκινικών φαρμάκων, που κυρίως επεμβαίνουν και αναστέλλουν το μονοπάτι της γλυκόλυσης στα καρκινικά κύτταρα με στόχο την διακοπή παραγωγής ενέργειας και θανάτωσή τους. Στην παρούσα εργασία, θα χρησιμοποιηθεί η ερυθρολευχαιμική σειρά Κ-562, η οποία απομονώθηκε από ασθενή με Χρόνια Μυελογενή Λευχαιμία, αποτέλεσμα της αμοιβαίας μετατόπισης μεταξύ των χρωμοσωμάτων 9 και 22 σε αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSCs). Στην κυτταρική σειρά Κ-562 θα εξετασθεί η επίδραση : α) της Δοξορουβικίνης, DOX, πρότυπης ένωσης της κατηγορίας των ανθρακυκλινών - αντινεοπλασματικών φαρμάκων, ως αναστολέα της τοποΐσομεράσης II, που παρεμβάλλεται στο DNA, διαταράσσει τη λειτουργία των μιτοχονδρίων και ενισχύει τη δημιουργία ελεύθερων ριζών και την οξειδωτική βλάβη, του β) του Διχλωροοξικού οξέος, DCA, ως αναστολέα της γλυκόλυσης, ο οποίος ενεργοποιεί το σύμπλοκο της δεϋδρογονάσης του πυροσταφυλικού (PDH) μέσω αναστολής της κινάσης της δεϋδρογονάσης του πυροσταφυλικού (PDK), γ) της 2-Δεοξυ-γλυκόζης, 2-DG, αναλόγου της γλυκόζης, ως αναστολέα της δράσης της εξοκινάσης (HK) καθώς και της ισομεράσης της φωσφορικής γλυκόζης (PGI), περιορίζοντας την πρόσληψη γλυκόζης και προκαλώντας κυτταρικό θάνατο, καθώς και δ) της συγχορήγησης των παραπάνω ουσιών. Θα πραγματοποιηθεί έλεγχος τόσο σε επίπεδα κυτταρικής βιωσιμότητας και κυτταρικού θανάτου καθώς και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η συγκέντρωση των παραπάνω ουσιών, εκ της οποίας επιτυγχάνεται η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των Κ-562 κατα 50%, υπολογίστηκε ως 4mΜ για την DCA, 4mΜ για την 2-DG και 2x10-8 μΜ για την DOX. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν πως στα Κ-562 κύτταρα, η DOX εμφανίζει υψηλή κυτταροτοξικότητα (υψηλό ποσοστό νεκρών κυττάρων), καθώς προκαλεί οξειδωτική βλάβη στα κύτταρα ενεργοποιώντας και τον μηχανισμό της απόπτωσης. Η χορήγηση DCA στα κύτταρα Κ-562, παρουσιάζει κυτταροτοξικότητα, ωστόσο μικρότερη της DOX κυτταροτοξικότητας. Η χορήγηση 2-DG στα Κ-562 έχει ως αποτέλεσμα την μικρότερη κυτταροτοξικότητα εκ των 3 ουσιών. Η συγχορήγηση των φαρμάκων με τους εξής συνδυασμούς DOX/DCA, DOX/2-DG και DOX/DCA/2-DG εμφανίζει εξίσου υψηλή κυτταροτοξικότητα, ακολουθώντας το προφίλ χορήγησης της DOX, αποδεικνύοντας, πως η δράση της DOX δεν επηρεάζεται από το συνδυασμό των φαρμακευτικών ουσιών. Σε πρωτεϊνικό επίπεδο, οι φαρμακευτικές ουσίες επηρεάζουν την έκφραση των πρωτεϊνών, προκαλώντας αλλαγή του μεταβολισμού των κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, οι φαρμακευτικές ουσίες αναστέλλουν ή επάγουν τα μονοπάτια της γλυκόλυσης, της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της υποξίας ή οξειδωτικού στρες, σημειώνοντας αντίστοιχα αποτελέσματα έκφρασης της κάθε πρωτεΐνης.
description: Bioenergetics deals with the study of metabolic energy transformations, defining the catabolic process of cellular respiration (glycolysis, citric acid cycle and oxidative phosphorylation), necessary for the continuous supply of energy and the survival of normal cells. However, in 2011 Hanahan and Weinberg discovered that one of the ten hallmarks of cancer is the reprogramming of energy metabolism. In 1926, Otto Warburg observed that cancer cells showed increased glucose uptake and excessive lactate formation even under fully aerobic conditions. The high intake of glucose/release of lactic acid remains a characteristic of cancer, a phenomenon called the Warburg effect and is the basis for research and development of innovative anticancer drugs, which interferes and inhibits the glycolysis pathway in cancer cells with the aim of interrupting energy production and killing them. In the present study, we will use the erythroleukemic K-562 cell line, which was isolated from a patient with Chronic Myelogenous Leukemia, as a result of the reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22 in hematopoietic stem cells (HSCs). In the K-562 cell line, we have examined the effect of a) Doxorubicin, DOX, as an inhibitor of topoisomerase II, which interferes with DNA, disrupts the function of mitochondria and enhances the generation of ROS and oxidative damage, of b) Dichloroacetic acid, DCA, as an inhibitor of glycolysis, which activates pyruvate dehydrogenase (PDH) complex by inhibiting pyruvate dehydrogenase kinase (PDK), of c) 2-Deoxy-glucose, 2-DG, as an inhibitor of the action of hexokinase (HK), as well as of the action of phosphate glucose isomerase (PGI), limiting glucose uptake and causing cell death, as well as d) co-administration of the above drugs. A control will be conducted and both cellular viability and cell death as well as the expression levels of certain proteins will be assessed. The concentration of the above drugs, from which the inhibition of K-562 cell growth by 50% is achieved, was calculated as 4mM for DCA, 4mM for 2-DG and 2x10-8 µM for DOX, at 72 hrs. The results demonstrate that in K-562 cells, DOX shows high cytotoxicity (high percentage of dead cells), as it causes oxidative damage to the cells, activating also the mechanism of apoptosis. The administration of DCA to K-562 cells, also shows cytotoxicity, however, less than DOX cytotoxicity. The administration of 2-DG to K-562 cells results in the least cytotoxicity of the three drugs. The co-administration of the drugs with the following combinations DOX/DCA, DOX/2-DG and DOX/DCA/2-DG shows equally high cytotoxicity, following the administration profile of DOX, proving that the action of DOX is not affected by the combination of the drugs. Concerning protein levels, drugs affect the expression of certain proteins, causing a change in cell metabolism. More specifically, the drugs inhibit or induce the pathways of glycolysis, oxidative phosphorylation and hypoxia or oxidative stress, noting corresponding effects on the expression of each protein examined.