Regulation of septin filament formation and cholesterol production by DHCR7
Creators: name: Yashar, Sadian
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2013
Subjects: subject: Cholesterol
subject: Electron microscopy
subject: Filament
subject: Septin
subject: 570

description: Elektronenmikroskopie (EM) ist eine hervorragende Methode um die Struktur von Proteinkomplexen in ihrer nativen Umgebung zu studieren. In dieser Arbeit verwendeten wir zum einen Einzelpartikelelektronenmikroskopie und Elektronenktomographie um die Struktur von Septinfilamenten und deren Interaktion mit anderen Proteinen zu untersuchen. Zum anderen züchteten wir zweidimensionale Kristalle der Dehydrocholesterinreduktase DHCR7, um in Zukunft deren Struktur elektronenkristallographisch bestimmen zu können. Septine gehören zur Familie der GTPasen und bilden große Polymere, deren Untereinheiten aus nichtpolaren Multimeren bestehen. Die Polymere wiederum bilden Filamente, die im Knospungshals von sprossenden Hefen zu finden sind. Die Rekrutierung der Septine zum Knospungshals ist abhängig von dem Signalprotein Cdc42p und zwei seiner Effektoren, Gic1 und Gic2. Die Septinfilamente lagern sich auf der Oberfläche von Membranen an und bilden dadurch zum einen ein Gerüst und zum anderen eine Diffusionsbarriere für Proteine. Obwohl man weiß, dass Gic-Proteine direkt mit Septinen interagieren, sind die strukturellen Gegebenheiten und die Signifikanz dieser Bindung bislang unbekannt. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Gic1 an der Bindungsfläche zwischen den Septinen Cdc10- Cdc10 bindet und dabei bis zu sechs Septin-Filamente zu einem flexiblen Septin-Gic-Komplex verbindet. Die Bindung von Cdc42p(GDP) an die ersten 29 Aminosäuren von Cdc10 induziert die Dissoziierung der Septinfilamente. Cdc42p(GppNHp) hingegen interagiert nicht mit Septinen, sondern bindet direkt an Gic1. Interessanterweise führen hohe Konzentrationen von Cdc42p(GppNHp) dabei zu einer Dissoziierung des Septin-Gic-Komplexes. Ebenso haben wir den Effekt von GTP auf die Filamente selbst untersucht. GTP ersetzt GDP in Cdc11 und verursacht eine Konformationsänderung an der Bindungsfläche von Cdc11-Cdc11 was zu einer Dissoziierung der Septinfilamente führt. Die vorliegende Studie liefert ein Modell für den durch Cdc42p, GTP und Gic1 gesteuerte Auf- und Abbaus von Septinringen während des Zellzyklus. Die Dehydrocholesterinreduktase DHCR7 reduziert im letzten Schritt der Cholesterin-Biosynthese die C7-C8-Doppelbindung von 7-Dehydrocholesterin unter Verbrauch von NADPH. Eine Fehlfunktion der DHCR7 führt beim Menschen zu dem Smith-Lemli-Opitz Syndrom (SLOS). Eine atomare Struktur der DHCR7, die es bislang nicht gibt, würde die mechanistischen Grundlagen der enzymatischen Funktion des Proteins erklären und Aufschlüsse über dessen Fehlsteuerung im Krankheitsfall geben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich deshalb mit der Isolierung, Aufreinigung und zweidimensionalen Kristallisation der menschlichen Dehydrochlosterinreduktase-7 und deren bakteriellen Homologe aus Coxiella burnettii und Plesiocystis pacifica. Für DHCR-7 aus Coxiella burnettii konnten kleine zweidimensionale gezüchtet werden, die allerdings in Zukunft verbessert werden müssen, um sie elektronenkristallographisch zu analysieren. Um die Funktion der Reduktase in vivo zu studieren, wurde die DHCR-7-katalysierte Umwandlung von Ergosterol zu Brassicasterol mit Hilfe von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS)quantifiziert. Des Weiteren zeigte eine Lokalisationsstudie in HEK293-Zellen, dass DHCR7 neben dem ER auch im Golgi-Apparat lokalisiert ist.