title: Charakterisierung der CRISPR-Cas Subtyp I-B Proteine Cas66 und Cas86 von Methanococcus maripaludis C5
title: Characterization of the CRISPR-Cas subtype I-B proteins Cas6b and Cas8b of Methanococcus maripaludis C5
Creators: name: Richter, Hagen Klaus Gunther
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Immunsystem
Prokaryoten
Immune System
Biowissenschaften, Biologie
Prokaryotes

description: Mit dem CRISPR-Cas System wurde
      ein adaptives Immunsystem identifiziert, mit dem sich sowohl
      Archaen also auch Bakterien gegen fremde Nukleinsäuren zur
      Wehr setzen können. Dabei wird die Komplementarität einer
      kleinen RNA (crRNA) zur eindringenden Nukleinsäure ausgenutzt
      um diese abzubauen. Namensgebend für dieses System ist der
      CRISPR-Array oder Lokus, welcher sich aus sich wiederholenden
      DNA-Sequenzen (Repeats) und einzigartigen Elementen zwischen
      den Repeats (Spacer) zusammensetzt. Diese Spacersequenzen
      können aus vorausgegangenen Infektionen von Viren stammen und
      vermitteln, als Teil der kleinen crRNA, die nötige
      Komplementarität im Falle einer Neuinfektion. Im Zuge der
      Co-Evolution von Prokaryoten und ihren Viren hat sich eine
      hohe Diversität von verschiedenen CRISPR-Cas Systemen
      entwickelt. Es wird zwischen drei Haupttypen unterschieden,
      welche in weitere Subtypen unterteilt werden können. Die
      vorliegende Arbeit zeigt die erste Charakterisierung eines
      Subtyp I-B CRISPR-Cas Systems. Die in vivo Aktivität dieses
      CRISPR-Cas Systems wurde mittels RNA Sequenzierung in
      Methanococcus maripaludis C5 bestätigt. Die in den RNA-Seq
      Daten identifizierten crRNAs bestehen jeweils aus einer
      kompletten Spacersequenz und einer konservierten 8 Nukleotid
      Sequenz am 5' Terminus sowie einer 2 Nukleotid Sequenz am 3'
      Terminus. Es wurden 8 cas Gene identifiziert. Von den
      Cas-Proteinen wurden mit Cas8b und einem zunächst nur mit
      hypothetischer Funktion annotierten Protein zwei subtypisch
      spezifische Vertreter genauer analysiert. Für das letzte
      Protein wurde eine Endoribonuclease-Aktivität identifiziert
      und das Protein als Cas6b bezeichnet. Cas6b ist ein
      “single-turnover” Enzym, welches die längeren Vorläufer
      crRNAs in kleine reife crRNAs prozessiert. Dabei wurde
      bewiesen, dass Cas6b für die 8 Nukleotid Repeatsequenz am 5'
      Terminus der reifen crRNAs verantwortlich ist. Trotz einer
      sehr geringen Sequenzidentität von nur 11%, zeigte eine
      Modellierung der Cas6b Struktur eine hohe Ähnlichkeit zur
      Kristallstruktur des in Pyrococcus furiosus identifizierten
      Cas6 Enzyms. Mit Hilfe von eingefügten Punktmutationen
      konnten vier Aminosäurereste des katalytischen Zentrums von
      Cas6b identifiziert werden: Lysin (K30), Histidin (H38),
      Histidin (H40) und Tyrosin (Y47). Analysen der
      RNA-Bindefähigkeit von Cas6b haben gezeigt, dass Cas6b nach
      erfolgter Substratbindung in der Lage ist Dimerstrukturen zu
      formen. Weitere Untersuchungen mittels „RNA-Crosslinking“
      gefolgt von massenspektrometrischen Analysen haben ein
      Methionrest (M185) identifiziert, welcher eng mit einem
      Uridin (U15) der Repeatsequenz koordiniert ist. Cas6b
      Aktivitäts-Assays mit Repeatvarianten von M. maripaludis
      sowie der Repeatsequenz von Clostridium thermocellum konnten
      belegen, dass die Prozessierung von Vorläufer crRNA durch
      Cas6b unabhängig von möglichen Sekundärstrukturen in der RNA
      stattfindet. Neben dem Vorhandensein von reifen crRNAs geht
      aus den RNA-Seq Daten auch eine hoche Variabilität der crRNA
      Häufigtkeit hervor. Um die identifizierten crRNA Mengen zu
      bewerten, wurde ein experimentaler Ablauf entworfen, mit
      welchem der Einfluss jeder einzelnen Spacersequenz auf a) die
      Prozessierung durch Cas6b und b) die Stabilität der crRNAs
      analysiert werden konnte. Mit Hilfe dieses globalen
      Analyseansatzes wurden geringe Einflüsse der Spacerlänge
      sowie Spacersequenz auf die in vitro Prozessierung und
      Stabilität beobachtet. In diesem Zusammenhang werden
      zukünftige Experimente auch den Einfluss des Cas-Protein
      Interferenzkomplexes (Cascade) sowie mögliche regulatorische
      Effekte auf die Häufigkeit der crRNAs betrachten. Die
      Charakterisierung des subtypspezifischen Cas8b ergab eine
      Spaltung des rekombinaten Proteins in zwei definierte
      Fragmente. Mittels Edman-Sequenzierung wurde die
      Schnittstelle innerhalb der Proteinsequenz identifiziert. In
      anderen CRISPR-Cas Subtypen sind zwei Proteine vorhanden,
      welche als große und kleine Untereinheit des
      Interferenzkomplexes Cascade beschrieben werden. Im Subtyp
      I-B hingegen ist Cas8b als einziges äquivalent zu den beiden
      Proteinen zu finden und es wurde postuliert das seine
      mögliche autokatalytische Spaltung die kleine und große
      Cascade-Untereinheit generiert. Die biochemische
      Charakterisierung von Cas8b und dessen mögliche Rolle
      innerhalb der Interferenzantwort ergab eine unspezifische
      Bindefähigkeit zu Nukleinsäuren und konnte keine
      nukleolytische Aktivität zeigen. Mögliche Funktionen von
      Cas8b werden diskutiert und in zukünftigen Studien sollen
      diese im Kontext des Interferenzkomplexes Cascade
      weiterführend untersucht werden.
description: The CRISPR-Cas system is an
      adaptive immune system found in archaea and bacteria to
      defend themselves against mobile genetic elements (e.g.
      phages). The system employs base complementarity of small RNA
      species (crRNAs) to target the foreign nucleic acids for
      degradation. The hallmark of the system is the CRISPR array
      or locus, which is composed of repetitive DNA sequences
      (repeats) that are interspersed by unique sequences
      (spacers). Spacer sequences can be derived from earlier
      encounters with viruses and, as part of the crRNAs, confer
      the base complementarity during a reoccurring attack. During
      the ongoing battle between prokaryotes and viruses diverse
      CRISPR-Cas systems evolved into three main types that are
      further subdivided. This thesis shows the first
      characterization of a subtype I-B CRISPR-Cas system. RNA-Seq
      data proved the in vivo activity of this CRISPR-Cas system in
      Methanococcus maripaludis C5. The data further revealed that
      the crRNAs are always composed of a complete spacer sequence
      flanked by an 8 nt 5' repeat tag and a 2 nt 3' repeat tag.
      Eigth cas genes were identified for M. maripaludis. Two Cas
      proteins, Cas8b and an annotated hypothetical protein were
      characterized in more detail. The hypothetical protein was
      shown to be the endoribonuclease responsible for the
      single-turnover catalysis of precursor crRNA into mature
      crRNA and was termed Cas6b. The reaction performed by Cas6b
      yields the 8 nt 5' terminal tag of the mature crRNAs. Despite
      sharing only low sequence identity of 11 %, the two Cas6
      proteins of M. maripaludis and Pyrococcus furiosus could be
      well aligned using a structural model of Cas6b and the
      crystal structure of P. furiosus Cas6. Cas6b mutant analysis
      was used to determine four amino acid residues (lysine 30,
      histidine 38, histidine 40 and tyrosine 47) that comprise the
      catalytic site of Cas6b. The RNA binding properties of Cas6b
      were determined and showed a dimerization upon binding to a
      non-cleavable substrate. Further analyses including RNA
      crosslinking experiments followed by mass spectrometry
      identified a methionine residue (M185) that tightly
      coordinated to a uridine (U15) of the repeat sequence. Cas6b
      activity assays employing differently structured repeat
      variants of M. maripaludis and a 37 nt repeat sequence of
      Clostridium thermocellum could show, that the processing
      reaction performed by Cas6b does not recognize a secondary
      structure of the substrate. In addition to the verification
      to the in vivo activity of the CRISPR-Cas system, the RNA-Seq
      data also revealed a varying abundance pattern of crRNAs. To
      assess the crRNA abundance a experimental procedure was
      designed, which was aimed to analyse the influence of spacer
      sequences on a) the processing by Cas6 and b) the stability
      of crRNAs. With the help of this global approach influences
      of the spacer length and spacer sequence on the crRNA
      maturation and in vitro stability were recognized. In this
      context, future experiments will also determine further
      possible influences on crRNA abundance including i) crRNA
      loading into the Cas protein interference complex (Cascade)
      and ii) possible regulatory effects in terms of crRNA
      utilization dependent regulation. The characterization of the
      subtype-specific protein Cas8b revealed a splitting of the
      recombinant protein into two defined fragments. The exact
      point of cleavage was determined by Edman sequencing and
      provides evidence for a proteolytic cleavage of the
      full-length protein (either autocatalytically or by a
      protease). Other CRISPR-Cas subtypes were reported to contain
      two proteins serving as small and big subunit of the
      interference complex Cascade. For subtype I-B on the other
      hand Cas8b was found to be the only equivalent to these two
      proteins and it was proposed that the identified cleavage
      generates the large and small Cascade subunit. A biochemical
      analysis of Cas8b with respect to its putative roles during
      CRISPR-Cas immunity showed an unspecific binding to nucleic
      acids while no nucleolytic cleavage was observed. Possible
      functions of Cas8b are discussed and future studies will
      focus on the analysis of the protein functions in the context
      of a complete Cascade.