title: Diagnostical fusion- and linkerproteins for developement of innovative immunoassays.
title: Diagnostische Fusions- und Linkerproteine zur Entwicklung neuartiger Immunoassays
Creators: name: Dassinger, Nina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Immunoassay
immunoassay
fusionsproteins , biosensors
Fusionsproteine , Biosensorik
Sciences
Naturwissenschaften
Enzyme-linked immunosorbent assay , Klonierung

description: In dieser Arbeit wurden
      Linker-/Fusionsproteine rekombinant hergestellt und getestet.
      Sie dienten der Entwicklung neuartiger Analyseverfahren,
      sowie der Verbesserung bereits bestehender
      antikörperbasierter Analyseverfahren. Hierbei wurde vor allem
      die Eigenschaft des Concanavalin A Proteins genutzt, um die
      Proteine auf Oberflächen zu immobilisieren, die vorher mit
      einer Zuckerverbindung beschichtet wurden. Das universale,
      bifunktionale Linkerprotein ConA-SAv sollte der Entwicklung
      eines Anreicherungsmoduls, für die Aufreinigung eines
      Analyten aus komplexen Matrizes dienen. Hierzu wurde das Gen
      der Concanavalin A Bindedomäne C-terminal, mittels Alanin
      Linker, an das Gen der Streptavidin Bindedomäne fusioniert,
      um die Anbindung biotinylierter Antikörper zu ermöglichen.
      Die Expression wurde in E. coli durchgeführt und die
      Funktionalität des Proteins mit mehreren Methoden untersucht.
      Das Ergebnis der Co-IP bewies die volle Funktionsfähigkeit
      des Linkerproteins ConA-SAv; beide funktionalen Domänen sind
      bindungsaktiv. Die Regenerierbarkeit von der Dextran-Matrix
      in Form von Sephadex® G-25 Beads konnte ebenfalls
      nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der RIfS Messungen sind
      ebenfalls positiv zu werten. Das Linkerprotein allein konnte
      problemlos von einer mit Dextran funktionalisierten
      Chipoberfläche, durch einen konkurrierenden Zucker abgelöst
      werden. Allerdings war die Regeneration des Linkerproteins,
      bei Anbindung des biotinylierten Antikörpers, eingeschränkt.
      Zur weiteren Untersuchung wurden SPR Messungen durchgeführt.
      Diese bestätigten die Beobachtungen, die bereits an der RIfS
      gemacht wurden. Das Linkerprotein war bei Anbindung eines
      biotinylierten Antikörpers nicht mehr von der Oberfläche zu
      lösen. Im weiteren Verlauf wurden Fusionsproteine für die
      Borreliosediagnostik entwickelt. Hierzu wurden spezielle
      Oberflächen-Antigene ausgewählt, gegen welche das
      Immunsystem, insbesondere in der Frühphase der Infektion,
      während der IgM Antwort, Antikörper bildet. Nach
      Literaturrecherche stellten sich das Oberflächen Protein C
      (OspC) sowie ein Epitop (C6) des VlsE Antigens als gute Wahl
      heraus. Beide cDNA Sequenzen der Epitope wurden jeweils
      C-terminal, durch eine kurze Linkersequenz, an die cDNA
      Sequenz des ConA gekoppelt und anschließend in E. coli
      rekombinant hergestellt. Nach Expression wurden die
      Fusionsproteine mittels SPR und RIfS auf ihre Funktionalität
      untersucht. Die Ergebnisse der SPR Messungen zeigten die
      Funktionalität beider Fusionsproteine. Die Fusionsproteine
      banden auf die mit Mannan funktionalisierten Goldoberflächen
      und detektieren spezifisch die Antikörper aus den Testseren.
      Die Messungen mittels RIfS konnten diese Beobachtungen nur
      bestätigen. Allerdings erwies sich insbesondere das ConA-OspC
      Protein als wenig stabil. Daher wurde in Hinblick auf einen
      Einsatz in kommerziell erhältlichen Produkten die
      Lagerbeständigkeit, bei Lyophilisierung der beiden Proteine
      untersucht. Diese Untersuchungen wurden mittels
      ELISA-Messreihen durchgeführt. In den ELISA-Messungen zeigten
      beide Proteine eine sehr hohe Signifikanz in der Detektion
      der Borreliose-Antikörper aus dem Blutserum. Sie behielten
      auch nach der Lyophilisierung ihre Funktionsfähigkeit,
      allerdings bestätigten sich auch hier wieder die Ergebnisse
      aus den SPR Messungen. ConA-OspC war im Gegensatz zu ConA-C6
      wesentlich instabiler und verlor stark an Signalstärke.
      Jedoch konnte durch die Anwendung spezieller stabilisierender
      Reagenzien die Signalstärke und die Lagerbeständigkeit
      verbessert werden. Zuletzt wurde ein zweites, universelles
      Linkerprotein entwickelt, welches es ermöglichte, eine
      Vielzahl unmarkierter IgG-Antikörper auf mit Zucker
      funktionalisierten Oberflächen zu binden. Hierzu wurde die
      cDNA einer Bindedomäne des Protein A C-terminal, durch eine
      kurze Linkersequenz, an die cDNA Sequenz des ConA gekoppelt
      und anschließend in E. coli rekombinant hergestellt. Die
      Funktionstestung erfolgte mittels SPR, zuerst unter Anwendung
      eines Modell-Assays, der anschließend erfolgreich auf eine
      Diagnostik im Veterinärbereich übertragen wurde. Die
      Detektion einer akuten Pankreatitis sowie einer
      Pankreas-Insuffizienz bei Katzen, erfolgte über die Messung
      des fTLI Spiegels im Blutserum. Mittels SPR gelang die
      Erstellung einer Kalibriergeraden aus Proben mit bekannter
      fTLI Konzentration, zur weiteren Ermittlung von unbekannten
      fTLI Konzentrationen in Realproben. Um eine Point-of-Care
      Diagnostik darzustellen, wurden 3D-Polymersinterkörper mit
      einer Zuckerverbindung funktionalisiert und die
      Analysenmethode wurde von der 2D- auf die 3D-Oberfläche
      übertragen. Auch hier gelang die Erstellung einer
      Kalibriergeraden anhand bekannter Probenkonzentration. Auf
      dieser Grundlage konnte erfolgreich eine weiterführende
      Konzentrationsbestimmung durchgeführt werden.
description: n this work different linker /
      fusion proteins were produced recombinantly and tested .
      These served the development of new analysis methods , as
      well as the improvement of existing antibody-based methods of
      analysis . In this case, especially the property of the
      protein Concanavalin A was used to immobilize proteins on
      surfaces which have been previously coated with a sugar
      compound . The second domain of the proteins was adjusted
      depending on the use .The universal, bifunctional linker
      protein ConA SAv should serve the development of an
      enrichment module for purification of analytes from complex
      matrices. For this purpose the gene was the concanavalin A
      binding domain C-terminal fused by alanine linker to the gene
      of streptavidin binding domain, to allow the connection of
      biotinylated antibody. The expression was performed in E.
      coli and assayed the functionality of the protein using
      several methods. The result of the co-immunoprecipitation
      demonstrated the full functionality of the linker protein
      ConA SAv; both functional domains are binding-active. The
      recoverability of the dextran matrix in the form of Sephadex®
      G-25 beads could also be detected. The results of the
      measurements are to be regarded RIfS also positive. The
      linker protein alone could easily of a functionalized dextran
      chip surface, to be replaced by a competing sugar. However,
      it was the regeneration of the linker protein, wherein
      binding of the biotinylated antibody limited. To further
      investigate SPR measurements were conducted. This confirmed
      the observations that have been made at the RIfS. The linker
      protein was no longer to be solved in connection of a
      biotinylated antibody from the surface. One approach was to
      generate various mutants. For this purpose, the binding
      pocket of ConA was modified at the genetic way. The mutants
      D90N and R110L were also tested, and it was found that the
      binding activity was either questionable or no longer
      exists.In the further course fusion proteins were developed
      for the disease diagnosis. For this special surface antigens
      were selected, against which the immune system, especially in
      the early phase of infection, while the IgM response,
      antibody forms. After literature review, the surface protein
      C (OspC) and an epitope (C6) of VlsE antigen as a good choice
      turned out. Both cDNA sequences of the epitopes were
      respectively C-terminal, coupled through a short linker
      sequence to the cDNA sequence of the ConA and subsequently
      produced in E. coli recombinant. After expression, the fusion
      proteins by SPR and RIfS were tested for their functionality.
      The results of the SPR measurements showed the functionality
      of both fusion proteins. The fusion proteins bound to the
      functionalized gold surfaces with mannan and specifically
      detect the antibodies from the test sera. The measurements by
      RIfS could only confirm these observations. However,
      particularly the ConA-OspC protein proved to be very stable.
      Therefore, in regard to the use in commercially available
      products, the storage stability, evaluated in lyophilization
      of the two proteins. These studies were performed by ELISA
      measurement series. In the ELISA measurements both proteins
      showed a very high significance in the detection of Lyme
      disease-antibodies from the blood serum. They also retained
      after lyophilisation their ability to function, however,
      confirmed also here again the results of the SPR
      measurements. ConA-OspC was unlike ConA-C6 considerably less
      stable and lost heavily on signal strength. However, the
      signal strength and the storage stability could be improved
      by the use of special stabilizing reagents.Recently a second
      universal linker protein has been developed, which made it
      possible to bind a variety of unlabeled IgG antibody with
      sugar on functionalized surfaces. For this purpose, the cDNA
      of a binding domain of protein A C-terminal, coupled through
      a short linker sequence to the cDNA sequence of the ConA and
      subsequently produced in E. coli recombinant. The function
      testing was carried out by SPR, first using a model assay,
      which was then successfully transferred to a diagnosis in the
      veterinary field. The detection of acute pancreatitis and
      pancreatic insufficiency in cats was performed by measuring
      the fTLI level in blood serum. Using SPR succeeded in
      creating a calibration of samples of known concentration
      fTLI, for further investigation of unknown fTLI
      concentrations in real samples. To illustrate a point-of-care
      diagnostics, 3D polymer sintered body were functionalized
      with a sugar compound and the method of analysis has been
      transferred from the 2D to the 3D surface. Again, succeeded
      in creating a calibration using known sample concentration.
      On this basis, a further concentration determination could
      successfully be carried out in real samples of unknown
      concentration fTLI.