title: In vivo Regulation of Channelrhodopsin1 in Chlamydomonas reinhardtii
title: Untersuchungen zur in vivo Regulation von Channelrhodopsin1 aus Chlamydomonas reinhardtii
Creators: name: Wolfram, Michaela
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 57 Biowissenschaften; Biologie :: 579 Mikroorganismen, Pilze, Algen

description: The channelrhodopsins ChR1 and ChR2 are the primary photoreceptors of phototactic and photophobic reactions in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Due to their role in optogenetic research, much is already known about their properties in ectopic expression systems. In contrast, only little is yet known about their in vivo regulation in C. reinhardtii. However, knowledge about these processes is essential for a better understanding of these movement responses and their integration and impact on the diverse light-dependent physiological responses of this alga. Adaptation of the phototactic sensitivity occurs through multiple mechanisms. Some of them are very fast, such as the change in photocurrents (pico- to millisecond range), while others, like e.g. the adaptation of eyespot size, are rather slow (days). In the medium-term, also protein degradation, phosphorylation, possible complex formation including homo- and hetero-oligomerization, and interactions with other photoreceptors are thought to play a role. The latter factors were investigated with respect to ChR1 in the present study. The degradation of ChR1 is controlled by both light intensity and quality. Spectral analyses revealed that the blue to violet region of the spectrum has the greatest stimulating effect on its degradation. The present work shows that an elevated UV-A and UV-B proportion in white light leads to an increased ChR1 degradation, even at a lower total light intensity. In contrast, the ChR1 stability in the dark is high. In the presence of cycloheximide only minor degradation occurred during the studied period (9 hours). Accordingly, light-induced conformational changes as solely cause of degradation can be excluded. Thus, light must lead to ChR1 degradation via other mechanisms. When comparing several parental strains with regard to their ChR1 content and degradation, significant differences were observed. For strain CW15, a comparatively low ChR1- and carotenoid content was detected. This can be explained by a relatively small eyespot. CW15 showed also a lower degradation rate compared to the other parental strains. Notably, in different mutants of known signaling components ChR1 content and degradation were also impaired. Deletions of the photoreceptors COP5 and pCRY, as well as overexpression of the kinase-domain of the blue-light receptor phototropin (PHOT) and a point mutation in the adaptor protein of an E3 ubiquitin ligase (LRS1) resulted in a reduced ChR1 content. In contrast, the absence of the UV photoreceptor UVR8 leads to an increased content. In the case of PHOT kinase-domain overexpression this is probably due to a reduced eyespot size. For the other mutants, the underlying mechanisms are unknown. In addition, the ChR1 degradation rate was affected by PHOT, pCRY and LRS1. Deletion of PHOT resulted in a reduced and slower degradation, whereas knock-out of pCRY or inactivation of LRS1 accelerated it. So far, the pathway(s) involved in ChR1 degradation are not known. Involvement of the proteasome can be excluded on the basis of pharmacological approaches. With PD150606 and PR-619, however, two inhibitors were identified that influence ChR1 degradation. PR-619 is an inhibitor of deubiquitinating enzymes (DUBs). Since many DUBs are cysteine proteases, it is suspected that the cysteine protease inhibitor PD150606 might also act, at least in part, by inhibiting DUBs. Both inhibitors lead already in the dark to accumulation of DTT-stable high molecular mass complexes (HMMCs) of ChR1. Inhibitor treatment in the light resulted in a parallel increase in ubiquitin content at the same position of these DTT-stable HMMCs. This is consistent with the observed impairment of ChR1 degradation in the LRS1 mutant, which has a point mutation of the substrate adaptor protein of an E3 ubiquitin ligase. Furthermore, experimental evidence for a role of extracellular vesicles (EVs) in ChR1 degradation was obtained here for the first time. In addition to a specific enrichment of ChR1 and an increased content of DTT-stable HMMCs, illumination affected the ChR1 content in purified EVs. It thus appears that both ubiquitinylation and the formation of DTT-stable HMMCs play a role in ChR1 degradation. However, the observed molecular weight shift of the ChR1 monomer (~7 kDa) in the EVs is not due to ubiquitinylation, which is why SUMO is suggested to be also involved. Based on these and recently published data on the SUMOylome of Chlamydomonas, a model for ChR1 secretion via the cilia using EVs as part of the degradation pathway is proposed here. It is known that the functional ChR1 is a homodimer. The in vivo reduction experiments and PEGylations with mPEG-MAL-5K carried out here confirmed the importance of disulfide bridges as well as involvement of three cysteines in the formation of the dimer. ChR2 is also suggested to be a dimer. However, in the here presented in vivo analyses under non-reducing conditions, ChR2 was detected at an apparent molecular mass of ~200 kDa. This corresponds to a trimer or the interaction of a dimer with an unknown interaction partner. Furthermore, both ChRs were shown to form additional high molecular weight complexes in vivo when analyzed under non-reducing conditions. Hetero-oligomerization of the two ChRs could be excluded. Thus, the ChRs exhibit probably higher levels of multimerization or interactions with other proteins in vivo. In this context, first analyses with isolated eyespot fractions point to a possible interaction of ChR1 with a yet unidentified protein with an apparent molecular mass of ~120 kDa. Since protein phosphorylation is important for activity regulation of a multitude of proteins, it was also investigated in more detail for ChR1. Exposure to light rapidly induces ChR1 phosphorylation in an intensity-dependent manner. Moreover, it is fully reversible in darkness and the ChR1 phosphorylation status adapts upon short- and long-term changes in the light intensity. Phosphorylation, however, is not strictly light dependent. Changes in the plasma membrane resting membrane potential or the free cytosolic Ca2+-concentration in the dark also affect the ChR1 phosphorylation status in a graded manner. Further, a link between ChR1 phosphorylation, redox balance of the cell, photosynthesis and phototactic behavior was confirmed. The fact that substances such as tempol and H2O2, which affect the cellular redox balance, lead also to increased intracellular Ca2+-concentration in other model systems confirms the long-suspected central role of Ca2+ as a key link in the various cellular processes that control the sign of phototactic orientation. The data suggest that an increased ChR1 phosphorylation leads to an adapted, less sensitive ChR1 form, whereas a lower phosphorylation level increases its sensitivity. In the photoreceptor mutants ∆COP5, ∆PHOT and ∆UVR8 a reduced ChR1 phosphorylation was detected already in the dark. Deletion of COP5 impairs additionally the sensitivity regulation upon prolonged light exposure, while that of UVR8 affects only the ground state of ChR1 phosphorylation. PHOT, on the other hand, has a positive effect on the speed of the phosphorylation reaction and also accelerates ChR1 degradation. In summary, the data obtained in this work provide evidence that parts of the phototactic behavior and ChR1 activity regulation in Chlamydomonas are controlled by a just emerging blue-light photoreceptor network.
description: Die beiden Channelrhodopsine ChR1 und ChR2 sind die primären Photorezeptoren der phototaktischen und photophobischen Reaktion in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Während über ihre Eigenschaften in ektopischen Expressionssystemen, aufgrund ihrer Rolle in der optogenetischen Forschung bereits vieles bekannt ist, ist nur wenig über ihre in vivo Regulierung in C. reinhardtii bekannt. Dies ist jedoch unerlässlich für ein besseres Verständnis ihrer Funktion bei der Phototaxis und ihrer Verknüpfung mit anderen zellulären Prozessen. Die Anpassung der phototaktischen Sensitivität erfolgt über vielfältige Mechanismen. Manche davon sind sehr schnell, wie die Änderung des Photostroms (Pico- bis Millisekunden-Bereich), andere wie z.B. die Anpassung der Augenfleckgröße eher langsam (Tage). Mittelfristig spielen auch Protein-Abbau, mögliche Komplexbildungen, Phosphorylierung und Interaktionen mit anderen Photorezeptoren eine Rolle. Letztere Faktoren wurden in Bezug auf ChR1 in der vorliegenden Arbeit untersucht. Der Abbau von ChR1 scheint durch Belichtung gesteuert zu werden. Dabei ist neben der Lichtintensität auch die -qualität wichtig. Den größten Einfluss auf den Abbau hat dabei blau-violettes Licht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch einen erhöhten UV-A und UV-B Anteil im Licht der ChR1-Abbau, selbst bei niedrigerer Gesamtbelichtungs-intensität, gesteigert wird. Die Stabilität von ChR1 im Dunkeln ist dagegen hoch. Im untersuchten Zeitraum (9 Stunden) erfolgte bei gehemmter Proteinbiosynthese nur ein geringfügiger Abbau. Eine lichtinduzierte Konformationsänderung als Ursache für den Abbau kann entsprechend ausgeschlossen werden. Licht muss daher über andere Mechanismen zum ChR1-Abbau führen. Beim Vergleich verschiedener Parentalstämme hinsichtlich ihres ChR1-Gehalts und -Abbaus konnten z.T. deutliche Unterschiede festgestellt werden. In CW15 wurde ein vergleichsweise geringer ChR1-Ausgangs- und Carotinoid-Gehalt nachgewiesen. Dies ist durch einen relativ kleinen Augenfleck zu erklären. Auch bezüglich des Abbauverhaltens zeigte CW15 eine geringere Abbaurate sowie einen geringeren Gesamtabbau im Vergleich zu den anderen Parentalstämmen. Auch für verschiedene (Photorezeptor)-Mutanten konnte eine Verknüpfung mit dem Gehalt und Abbau von ChR1 gezeigt werden. So führen die Deletionen der Photorezeptoren COP5 und pCRY, sowie die Überexpression der Kinase-Domäne des Blaulichtrezeptors Phototropin (PHOT) und eine Punktmutation in dem Adapterprotein der E3-Ubiquitin Ligase LRS1 zu einem reduzierten ChR1-Ausgangsgehalt. Das Fehlen des UV-Photorezeptors UVR8 führt dagegen zu einer Erhöhung. Im Falle der PHOT-Kinase-Domäne-Überexpressions-Mutante ist dies vermutlich die Folge einer reduzierten Augenfleckgröße. Für die anderen Mutanten sind die Wirkmechanismen unbekannt. Auf die ChR1-Abbaurate bzw. den Gesamtabbau wirkte sich neben den Photorezeptoren PHOT und pCRY erneut die Punktmutation von LRS1 aus. Eine Deletion von PHOT führte zu einem verlangsamten Abbau, wohingegen die Deletion von pCRY bzw. ein inaktives LRS1 zu einem beschleunigten Abbau führten. Bis jetzt ist nicht bekannt über welche Wege der ChR1-Abbau erfolgt. Eine Beteiligung des Proteasoms konnte ausgeschlossen werden. Mit PD150606 und PR-619 konnten zwei Inhibitoren identifiziert werden, die den ChR1-Abbau beeinflussen. Bei PR-619 handelt es sich um einen Inhibitor von deubiquitinierenden-Enzymen (DUBs). Da viele DUBs Cystein-Proteasen sind, wird vermutet, dass der Cystein-Protease-Inhibitor PD150606 ebenfalls zumindest z.T. über die Hemmung von DUBs wirkt. Beide Inhibitoren führen bereits im Dunkeln zu einer Akkumulierung von DTT-stabilen High Moleculare Mass Complexes (HMMCs) des ChR1. Auf gleicher Höhe mit diesen konnte im Western Blot parallel eine Zunahme des Ubiquitin-Gehalts nach Inkubation im Licht mit den Inhibitoren festgestellt werden. Dies deckt sich mit der beobachteten Beeinträchtigung des ChR1-Abbaus in der LRS1-Mutante (Punktmutation des Substrat-Adapter Proteins der E3-Ubiquitin Ligase). Ferner konnten erstmals experimentelle Hinweise für eine Rolle von extrazellulären Vesikeln (EVs) beim ChR1-Abbau gewonnen werden. Neben einer spezifischen Anreicherung von ChR1, konnte ebenfalls ein Einfluss von Belichtung auf dessen Gehalt gezeigt werden. Ebenso wurde ein erhöhter Anteil an DTT-stabilen HMMCs festgestellt. Die in den EVs nachgewiesene Molekulargewichtsverschiebung des ChR1-Monomers um ca. 7 kDa ist jedoch nicht auf Ubiquitin zurückzuführen, weshalb eine Beteiligung von SUMO vorgeschlagen wird. Zusammengenommen scheint es, dass sowohl Ubiquitinierung als auch die Bildung DTT-stabiler HMMCs eine Rolle beim ChR1-Abbau spielen. Auf Basis dieser und kürzlich publizierter Daten über das SUMOylom von Chlamydomonas wird hier ein Modell zur ChR1-Sekretion über die Zilien mittels EVs als Teil des Abbauwegs vorgeschlagen. Es ist bekannt, dass das funktionelle ChR1 ein Homo-Dimer ist. Die hier durchgeführten in vivo Reduktionsversuche und PEGylierungen mit mPEG-MAL-5K bestätigen die Bedeutung von Disulfid-Brücken für das Dimer, sowie die Beteiligung von drei Cysteine an der Ausbildung dessen. Auch bei ChR2 handelt es sich möglicherweise um ein Dimer. In dieser Arbeit konnte ChR2 dagegen bei in vivo Analysen unter nicht-reduzierenden Bedingungen erstmals bei einem apparentem Molekulargewicht von ~200 kDa nachgewiesen werden. Dies würde einem Trimer oder der Interaktion eines Dimers mit einem bisher unbekannten Interaktionspartner entsprechen. Ferner konnte unter nicht-reduzierenden Bedingungen für beide ChRs gezeigt werden, dass sie in vivo zusätzlich weitere hochmolekulare Komplexe ausbilden. Hetero-Oligomerisierung der beiden ChRs konnte ausgeschlossen werden. Es gibt also in vivo vermutlich höhere Multimerisierungsgrade bzw. Interaktionen mit anderen Proteinen. In diesem Zusammenhang wurden bei Analysen mit isolierten Augenfleck-Fraktionen Hinweise auf eine mögliche Interaktion von ChR1 mit einem Protein (apparentes Molekulargewicht ~120 kDa) gefunden, dessen molekulare Identifizierung noch aussteht. Da Protein-Phosphorylierung für Aktivitätsregulierungen vieler Proteine wichtig ist, wurde diese ebenfalls im Detail für ChR1 untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass Belichtung die ChR1-Phosphorylierung schnell und intensitätsabhängig induziert. Zudem ist sie nach Verdunkeln reversibel, sowie anpassungsfähig an kurz- und langfristige Änderung der Lichtintensität. Dabei ist die Phosphorylierung jedoch nicht strikt lichtabhängig. Auch Änderungen im Ruhemembranpotential der Plasmamembran und der freien cytosolischen Ca2+ Konzentration im Dunkeln zeigen einen Einfluss. Zusätzlich konnte hier eine Verknüpfung der ChR1-Phosphorylierung mit dem Redoxgleichgewicht der Zelle, der Photosynthese und der Phototaxis bestätigt werden. Der Fakt, dass Substanzen wie Tempol und H2O2, die das zelluläre Redoxgleichgewicht beeinflussen, in anderen Modellsystem zu einer erhöhten intrazellulären Ca2+-Konzentration führen, bestätigt die lange vermutete zentrale Rolle von Ca2+ als Bindeglied der unterschiedlichen zellulären Prozesse, die die phototaktische Orientierung steuern. Die Daten deuten darauf hin, dass eine höhere ChR1-Phosphorylierung zu einer adaptierten, weniger sensitiven ChR1-Form führt, während eine geringere Phosphorylierung die Sensitivität erhöht. In ∆COP5-, ∆PHOT- und ∆UVR8-Mutanten konnte bereits im Dunkeln eine reduzierte ChR1 Phosphorylierung nachgewiesen werden. Die Deletion von COP5 beeinträchtigt ferner die Sensitivitätsregulierung bei längerer Belichtung, während die von UVR8 nur den Grundzustand der ChR1-Phosphorylierung beeinflusst. PHOT hat dagegen einen positiven Einfluss auf die Geschwindigkeit der Phosphorylierungsreaktion und beschleunigt den ChR1-Abbau. In ihrer Summe belegen die in dieser Arbeit gewonnenen Daten, dass Teile der Phototaxis und der ChR1-Aktivitätsregulation in Chlamydomonas von einem Blaulicht-Photorezeptor-Netzwerk gesteuert werden, dessen Komponenten sich langsam abzuzeichnen beginnen.