title: In vitro Aktivierung porkiner Ovarialfollikel im Gewebeverband mittels bpV (HOpic)
Creators: name: Klemm, Katrin
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025

description: Zusammenfassung 1. Hintergrund und Ziele Immer mehr Menschen überleben dank der modernen Medizin eine maligne Erkrankung und haben mit den Folgen der Therapie zu kämpfen. Gonadotoxische Therapien können zur ovariellen Insuffizienz und Sterilität führen. Es gibt verschiedene etablierte Methoden, um die Gonaden zu schützen und die Chancen zu erhöhen, einen späteren Kinderwunsch erfüllen zu können. Alle Verfahren haben jedoch Einschränkungen oder Nachteile, weshalb weiterhin Forschungsbedarf zum Fertilitätserhalt bei malignen Erkrankungen besteht. (Dittrich et al. 2018) Eine Idee ist die Follikelreifung in vitro, die bereits in verschiedenen Tiermodellen und inzwischen sogar in humanem Gewebe gelang. Es besteht weiterhin Verbesserungs- und Forschungsbedarf auf diesem Gebiet, um die Ergebnisse zu verbessern und weiterzuentwickeln. Um die Ergebnisse zu verbessern, könnte gegebenenfalls das Kultivierungsprotokoll angepasst und durch das Hinzufügen eines Aktivators zum Medium verbessert werden. Ein System zur Austestung verschiedener Aktivatorsubstanzen an porkinen Ovarien wurde von Dr. rer. biol. hum. Nathalie Bleisinger im Rahmen ihrer Promotion entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Aktivator bpV (HOpic) getestet, da seine Wirksamkeit auf humane Ovarialfollikel bereits gezeigt wurde (McLaughlin et al. 2014). (Bleisinger 2021) Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro Aktivierung von Follikeln im porkinen Ovarialgewebe mittels des Aktivators bpV (HOpic). 2. Methoden Für die Versuche wurden Ovarien vom Hausschwein verwendet. Diese wurden im Labor in einer an Telfer et al. (Telfer et al. 2008) und McLaughlin et al. (McLaughlin et al. 2014) angelehnten Weise aufbereitet. Von jedem Ovar wurde direkt nach der Aufarbeitung ein Rindenstück in 4 % Formalin fixiert, um eine Ausgangskontrolle zum Vergleich mit den kultivierten Gewebestücken zu erhalten. Für die Kultivierung wurde ein Medium verwendet, dessen Zusammensetzung an das serum-freie Medium von Telfer et al. (Telfer et al. 2008) angelehnt ist. Pro Ovar wurden zwei Rindenstücke in Medium ohne Aktivatorsubstanz als Kontrolle sowie zwei Rindenstücke in Medium mit bpV (HOpic) in einer, in Vorversuchen ausgetesteten, Konzentration von 10 µM für 48 h kultiviert. Die Gewebestücke wurden für weitere vier Tage in Medium ohne Aktivator kultiviert, wobei zwei Drittel des Mediums nach weiteren 48 h gewechselt wurde. Nach insgesamt sechs Tagen Kultur wurden die Rindenstücke in 4 % Formalin fixiert und für die histologische Auswertung vorbereitet. Die Schnitte wurden unter dem Lichtmikroskop untersucht und anhand eines von Dr. rer. biol. hum. Nathalie Bleisinger im Rahmen ihrer Promotion entwickelten Verfahrens histologisch ausgewertet. Die Follikel wurden in die von Telfer et al. 2008 verwendeten Entwicklungsstadien eingeteilt (Telfer et al. 2008). Zur Auswertung der Daten wurde das Programm „Statistical Package for the Social Sciences“ (SPSS, IBM ®) sowie Microsoft Excel verwendet. (Raffel et al. 2019) 3. Ergebnisse Die Ergebnisse der Vorversuche ergaben prozentual die höchste Aktivierung bei gleichzeitig geringster Anzahl an avitalen Follikeln bei einer Konzentration von 10 µM bpV (HOpic) und einer Kultivierungsdauer von 48 h, weshalb dies für die Hauptversuche verwendet wurde. In der „0 h Kontrolle“ fanden sich 90 % der Follikel im Primordialstadium. 10 % der Follikel zeigten erste Aktivierungszeichen in Form von Übergangs- und Primärstadium. In der Kontrollgruppe „D6 Medium Kontrolle“ fanden sich 31 % der Follikel ohne Aktivierungszeichen, während 69 % im Übergang, primär oder präantral vorlagen. In der Versuchsgruppe „D6 bpV (HOpic)“ wurden 19 % der Follikel als primordial klassifiziert, während 81 % Zeichen von Aktivierung aufwiesen. Mittels einfaktorieller Signifikanztestung (ANOVA) konnte ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der „0 h Kontrolle“ und den kultivierten Gewebestücken nachgewiesen werden. Zwischen den kultivierten Gruppen zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied. Die Mittelwerte der verglichenen Gruppen lassen jedoch einen Trend erkennen, dass durch die Kultivierung mit dem Aktivator bpV (HOpic) mehr Follikel aktiviert werden konnten, als in der Gruppe „D6 Medium Kontrolle“. Die Mittelwerte weisen eine hohe Standardabweichung auf. Die prozentuale Verteilung der vitalen und avitalen Follikel war in den drei untersuchten Gruppen annähernd gleich. Es konnte kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden. 4. Diskussion Zum ersten Mal wurde die Aktivatorsubstanz bpV (HOpic) an Schweineovarien erprobt und hierfür eine geeignete Konzentration und Kultivierungsdauer gefunden, die als unschädlich für die ovarielle Reserve angesehen werden kann. Andere Arbeitsgruppen zeigten erfolgsversprechende Ergebnisse in Geweben von Maus, Rind und sogar Mensch. (McLaughlin et al. 2018; McLaughlin et al. 2014; Li et al. 2010) Weitere Kultivierung und Wachstum der Follikel heran zu Follikeln mit reifen Eizellen sind noch ausstehend. Das verwendete Ovarialgewebe vom Schwein wies verschiedene Unbekannte, wie das Alter oder die eventuelle medikamentöse Vorbehandlung der Tiere auf, die in folgenden Versuchsreihen weiter eingeschränkt werden könnten. Sowohl histologisch als auch statistisch fiel eine ausgeprägte Heterogenität des untersuchten Gewebes in Bezug auf die Verteilung der Follikel auf. Um Verzerrungen durch die hohe Standardabweichung zu vermeiden, wurde in bereits veröffentlichten Vorergebnissen das Hauptaugenmerk auf das Verhältnis zueinander zwischen den drei Gruppen gelegt. (Raffel et al. 2019)