Upgrading the toolbox for fermentation of crude syngas: Process characterization for complete carbon usage, cyanide adaption and production of C4 components
Creators: name: Oswald, Florian
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2019
Subjects: Clostridium ljungdahlii
Syngas fermentation
Acetic acid
Cyanide
Process link-up
elevated pressure
mass transfer

description: Synthesegas (Syngas), Industrieabgase und andere C1-Moleküle haben sich in den letzten Jahren als interessante Substrate für die biotechnologische Produktion von Kraftstoffen und Plattformchemikalien herauskristallisiert. Syngas ist in diesem Zusammenhang eine Mischung aus Wasserstoff, Kohlenmonoxid und Kohlendioxid, welche über Vergasung von Biomasse und organischen Abfällen (z. B. Kommunalabfälle oder Klärschlamm) hergestellt wird. Organismen, die in der Syngas-Fermentation eingesetzt werden können, gehören zur Klasse der acetogenen Bakterien. Diese nutzen einen einzigartigen Stoffwechselweg zur Kohlenstofffixierung in dem zwei Moleküle CO oder CO2 über sequenzielle Reaktionen zu einem Molekül Acetyl-CoA kondensiert werden. Dieser wird reduktiver Acetyl-CoA Weg oder Wood-Ljungdahl-Stoffwechselweg (WLS) genannt. Natürliche Produkte die aus dem WLS abgeleitet werden können sind Essigsäure, Ethanol, Buttersäure, n-Butanol oder 
2,3‑Butanidol. Clostridium ljungdahlii ist einer der Modelorganismen für acetogene Bakterien. Bisher konzentrieren sich Forschungen der synthetischen Biologie, Gentechnik und Prozessentwicklung hauptsächlich darauf, die Produktion natürlicher C4-Moleküle eines Organismus zu erhöhen oder neue Stoffwechselwege für C4- und C6-Moleküle zu implementieren. Bioenergetische Limitierungen verhindern jedoch die Produktion dieser Zielprodukte mit hohen Ausbeuten. Dies liegt darin begründet, dass acetogene Bakterien bevorzugt Essigsäure oder Ethanol herstellen, da dies einen höheren Energiegewinn für die Zelle bedeutet, als die Produktion von C4- oder C6-Molekülen.
Die Limitierung des Massentransfers von Kohlenmonoxid und Wasserstoff von der Gasphase in die Flüssigphase ist einer der Punkte, die häufig im Zusammenhang mit Limitierungen der Syngas-Fermentation in der Literatur genannt werden. Möglichkeiten den Massentransfer zu verbessern sind zum einen die Vergrößerung der Phasengrenzfläche Gas-Flüssig durch erhöhte Rührerdrehzahl und/oder Begasungsrate und zum andern, die Erhöhung der Sättigungskonzentration von Kohlenmonoxid und Wasserstoff durch das Anheben des Partialdruckes. Sollen allerdings Produkte mit geringer Wertschöpfung produziert werden, so hat sich gezeigt, dass die Verbesserung des Massentransfers über Erhöhung der Rührerdrehzahl nicht wirtschaftlich ist. Während die Verbesserung des Massentransfers über die Steigerung der Begasungsrate den Umsatz beeinträchtigen kann, führen höhere Gelöstkonzentrationen von Wasserstoff und Kohlenmonoxid zu Stoffwechselinhibierungen und dadurch zu einer Reduktion der Effizienz des Prozesses.
Da Roh-Syngas neben den genannten Hauptkomponenten auch Verunreinigungen wie Stickoxide, Schwefelwasserstoff oder Blausäure enthält, arbeiten viele Forschergruppen mit gereinigten oder synthetischen Syngas-Mischungen. Jedoch ist die Reinigung von Gas ein kostenintensiver Schritt. Die Möglichkeit ungereinigtes oder nur Teilgereinigtes Syngas einsetzten zu können, würde die Wirtschaftlichkeit jedes Syngas-Fermentationsprozesses verbessern. Leider sind die meisten, der in Roh-Syngas enthaltenen Stoffe, bekannte Katalysatorgifte. Bakterien sind zwar generell robuster gegenüber Katalysatorgiften als chemische Katalysatoren, aber Studien mit Extrakten aus aufgeschlossenen Zellen oder gereinigten Enzymen zeigen, dass manche der Verunreinigungen die zentralen Enzyme des WLS inhibieren. Daten, die den Effekt von Syngas-Verunreinigungen auf ganze Zellen acetogener Bakterien zeigen, sind dagegen nur wenige in der Literatur zu finden.
Im Zuge dieser Doktorarbeit wurden die folgenden vier Themen untersucht:
• Der Einfluss erhöhten Massentransfers durch gesteigerte Begasungsrate
• Verbesserung des Massentransfers durch erhöhen des Systemdrucks und Partialdrucks der Substrate
• Der Einfluss von Cyanid auf Wachstum und Produktbildung von C. ljungdahlii
• Prozesskopplung über sequentielle Mischkultur zur Produktion von Äpfelsäure
Hinsichtlich der Massentransfereigenschaften wurden zwei Rührerandordnungen mit drei unterschiedlichen Begasungsraten getestet. Eine ermöglichte die Teilweise Rückführung von Gas aus dem Kopfraum des Reaktors. Es zeigte sich für alle Begasungsraten, dass das Maximum des volumenbezogenen Stoffübergangskoeffizienten (kla-Wert) bei einer Rührerdrehzahl von 800 min-1 liegt. Über Batch-Kultivierungen im 1,5 L Maßstab konnte gezeigt werden, dass trotz steigender kla-Werte mit steigender Begasungsrate, die Konversion von Substraten zu Produkten bei höheren Begasungsraten ineffizienter wird. Der Einfluss der Begasungsrate auf den kla-Wert ist klein, verglichen mit dem Einfluss der Begasungsrate. Zudem Verringern steigenden Begasungsraten die Verweilzeit der Gasblasen in der Flüssigkeit. Dadurch wird mit steigender Begasungsrate zunehmend ungenutztes Substrat aus dem Reaktor ausgetragen. In diesem Punkt zeigt sich die Rühreranordnung, die eine Teilrückführung von Gas aus dem Kopfraum des Reaktors gestattet, überlegen und erreicht bessere Konversionseffizienten obwohl der kla-Wert im Vergleich zur anderen Rühreranordnung kleiner ist.
Aufgrund der möglichen Nachteile, die mit einer Steigerung des Massentransfers durch Erhöhung der Begasungsrate verbunden sind, sollen Experimente mit erhöhtem Druck zeigen, ob dies eine Alternative darstellt, um den Massentransfer zu verbessern. Zu diesem Zweck wurden Experimente aus dem 1,5 L Maßstab in den 2,5 L Maßstab hochskaliert und Versuche bei absoluten Systemdrücken von 1 bar, 4 bar und 7 bar, bei ansonsten konstantem volumenbezogenen Massenfluss der Gase und konstanter Gaszusammensetzung, durchgeführt. Um mögliche Inhibierungen durch erhöhte Gelöstkonzentrationen von Kohlenmonoxid zu vermeiden wurde hierfür ein Gasgemisch aus CO2, H2 und N2 verwendet. Für dieses Gasgemisch konnte erstmals gezeigt werden, dass eine direkte Steigerung der Substratpartialdrücke keine Verbesserungen bei Wachstum und Produktbildung zur Folge hat. Im Gegenteil, das Wachstum ging mit steigendem Druck zurück und die Produktbildung stagnierte. Darüber hinaus änderte sich die Produktzusammensetzung von 2,4 % Ameisensäure, 86,5 % Essigsäure und 11,1 % Ethanol bei atmosphärischem Druck zu 82,7 % Ameisensäure, 15,6 % Essigsäure und 1,7 % Ethanol bei einem Systemdruck von 7 bar. Da aber der Massenfluss an Substraten über alle Druckstufen konstant gehalten wurde, war die Produktausbeute und Konversionseffizienz bei 7 bar um den Faktor 7,5 höher, als bisher in der Literatur beschrieben.
Die Literatur betrachtet Cyanid als die kritischste Komponente in Roh-Syngas, die erst aus dem Gasstrom entfernt werden muss, bevor das Gas für die Fermentation eingesetzt werden kann. Die Ergebnisse in dieser Doktorarbeit zeigen jedoch zum ersten mal, dass C. ljungdahlii unter heterotrophen Bedingungen an bis zu 1,0 mM Cyanid adaptiert werden kann. Unter autotrophen Bedingungen ist eine Adaptation bis zu 0,1 mM Cyanid möglich. Nachdem die Zellen an Cyanid adaptiert wurden, werden die maximale Wachstumsrate und Biomasse nichtmehr von Cyanid beeinflusst, bis die oben genannten Grenzwerte erreicht sind. Die Ausbeutekoeffizienten aus Versuchen unter heterotrophen Bedingungen zeigen, dass bei einer Cyanidkonzentration von 1,0 mM die Aktivität der Kohlenmonoxiddehydrogenase (CODH) vollständig inhibiert und der WLS inaktiv ist. Die Ergebnisse unter autotrophen Bedingungen bestätigen dies, hier konnte bei einer Cyanidkonzentration von 1,0 mM weder Wachstum noch Produktbildung beobachtet werden. Im Zusammenhang mit der Inhibierung der CODH konnte zudem erstmals beobachtet werden, dass die Produktzusammensetzung sich mit steigender Cyanidkonzentration ändert und mehr Ethanol gebildet wird. Bei 0 mM Cyanid bestehen die Produkte zu 97 % aus Essigsäure und 3 % aus Ethanol während bei 1,0 mM Cyanid die Produktzusammensetzung 20 % Essigsäure und 80 % Ethanol ist (heterotrophe Kulturen). Unter autotrophen Bedingungen (Wachstum auf Syngas) setzen sich die Produkte in Gegenwart von 0,1 mM Cyanid zu 80 % aus Essigsäure und zu 20 % aus Ethanol zusammen.
Um die Limitierungen bei der Produktion von gewünschten C4 oder C6 Molekülen zu umgehen, wurde zusammen mit Dr.-Ing. Stefan Dörsam ein Prozess zur Produktion von Äpfelsäure (2-Hydroxybernsteinsäure) mit syngas als initiale Kohlenstoffquelle entworfen (vgl. Kapitel vier der Doktorarbeit Evaluation of Renewable Resources as Carbon Sources for Organic Acid Production with Filamentous Fungi). Die Herstellung von Äpfelsäure mit filamentösen Pilzen, wie zum Beispiel Aspergillus oryzae, resultiert in hohen substratbezogenen Ausbeuten. Allerdings sind diese Verfahren bisher auf Zucker als Kohlenstoffquelle limitiert. In Kooperation mit Dr.-Ing. Stefan Dörsam wurde ein zweistufiger Prozess entworfen der es ermöglicht Äpfelsäure aus Syngas herzustellen. Bei dieser sequentiellen Mischkultur ist Essigsäure der Metabolit, der beide Prozessstufen miteinander verbindet. Da die A. oryzae-Stufe dieses Prozesses auf Stickstofflimitierung angewiesen ist, war es zunächst notwendig, die Konzentration an Ammoniumchlorid im Medium für die Syngasfermentation so weit zu reduzieren, dass am Ende der Syngas-Stufe kein Ammonium-Stickstoff mehr enthalten ist. Während der Syngasfermentation wurden Wasserstoff und Kohlenmonoxid zu Essigsäure (88,9 %) und Ethanol (11,1 %) umgewandelt. Die Ausbeute lag bei 0,86 g g-1. Aus dieser Mischung wurde während der A. oryzae-Stufe des Prozesses die Essigsäure in Äpfelsäure umgewandelt. Hierbei lag die Ausbeute bei 0,33 g g-1. Daraus ergab sich eine Gesamtausbeute von 0,28 Gramm Äpfelsäure pro Gramm eingesetztem Wasserstoff und Kohlenmonoxid. Damit konnte erstmalig gezeigt werden, dass über Verfahrenskopplung höhere Ausbeuten an hochwertigen C4-Molekülen erreicht werden können.