title: Amide-to-triazole substitution strategy for the stabilization of peptide-based radiotracers
Creators: name: Guarrochena, Xabier
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Peptide spielen in der Nuklearmedizin aufgrund ihrer Fähigkeit, radioaktive Frachten selektiv zu Tumoren zu transportieren, eine wichtige Rolle. Grund dafür ist ihre hohe Bindungsaffinität zu krebsrelevanten Biomarkern. Diese Aminosäuresequenzen, die mit Chelatbildnern konjugiert und mit diagnostischen Radiometallen (z. B. Gallium-68 ([68Ga]Ga), Indium-111 ([111In]In)) radioaktiv markiert sind, dienen zur Beurteilung des Krankheitsstadiums oder zur Beurteilung der Eignung eines Patienten für eine bestimmte Behandlung (Patientenstratifizierung). Darüber hinaus können Peptide in Kombination mit therapeutischen Radiometallen (z. B. Lutetium-177 ([177Lu]Lu)) eine zytotoxische Strahlendosis an nicht resektable Krebserkrankungen abgeben. Unter den vielen radioaktiv markierten Peptiden mit klinischem Potenzial haben die auf Somatostatin basierenden Radiotracer eine besondere Bedeutung in der Nuklearmedizin. Somatostatin-14 (SST-14) ist ein zyklisches Peptidhormon, das mehrere Körperfunktionen (unter anderem die Hemmung der Wachstumshormonfreisetzung (GH)) moduliert, indem es mit der Familie der Somatostatin-Rezeptoren (SSTR) interagiert. Diese Familie von G- Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR), bestehend aus fünf Rezeptorsubtypen (SST1- 5R), und wird ubiquitär in gesundem Gewebe und Organen exprimiert. Sie stellen jedoch auch ein vielversprechendes Ziel in der Onkologie dar, da sie bei mehreren Krebsarten überexprimiert werden. Auch wenn die meisten malignen Tumore mit einer SSTR- Expression hohe SST2R-Werte aufweisen (z. B. neuroendokrine Tumore (NETs)), exprimieren einige von ihnen gleichzeitig verschiedene Rezeptorsubtypen, während andere Tumore durch die Expression anderer Rezeptoren als SST2R gekennzeichnet sind. Daher wird die Synthese von Tracern, die mehrere SSTR-Subtypen ansprechen können, als äußerst relevant angesehen. Ein vielversprechendes radioaktiv markiertes Peptid, das diese Anforderung erfüllt, ist das 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10- tetraessigsäure (DOTA)-Konjugat AT2S (DOTA-Ala1-Gly2-Zyklus(c)(Cys3-Lys4-Asn5-Phe6- Phe7-D-Trp8-Lys9-Thr10-Phe11-Thr12-Ser13-Cys14-OH)). Dieses zyklische Peptid basiert auf dem Gerüst des nativen SST-14 und wurde mit dem Einzelphotonen- Emissionscomputertomographie-Radionuklid 111In markiert. [111In]In-AT2S behält eine hohe nanomolare Affinität für alle SSTR-Subtypen bei, wird jedoch im Blutkreislauf (Mäuse) schnell abgebaut. Daher kann AT2S nicht als geeigneter Shuttle für den Transport radioaktiver Frachten zu Tumoren angesehen werden. Die Verwendung metabolisch stabiler Bioisostere mit Amidbindungen stellt eine attraktive Lösung dar, um die biologische Funktion von Peptiden zu erhalten und gleichzeitig die metabolische Stabilität zu verbessern. Unter den vielen bekannten Beispielen für Bioisostere mit trans-Amidbindungen haben sich 1,4-disubstituierte 1,2,3-Triazole (1,4- Tz) als zuverlässige metabolisch resistente Surrogate für trans-Amidbindungen erwiesen. Um die schlechte proteolytische Stabilität von [111In]In-AT2S zu beheben, haben wir in dieser Doktorarbeit die Strategie der Amid-zu-Triazol-Substitution zur Stabilisierung dieses zyklischen Peptidkonjugats angewendet. Nach Auswahl der labilen trans- Amidbindungen von [111In]In-AT2S wurden diese einzeln durch ein 1,4-Tz ersetzt, was zur Synthese von fünf neuartigen Triazolo-Peptidomimetika führte, die mit 111In markiert waren. Von den fünf Radiokonjugaten wurde eines ([111In]In-XG1) aufgrund seiner beibehaltenen Affinität zu SST1,2,3,5R für weitere Untersuchungen ausgewählt. Das führende Triazolo-Peptidomimetikum [111In]In-XG1 zeigte auch eine mäßig verbesserte Stabilität in vivo (Mäuse) im Vergleich zur Referenzverbindung [111In]In-AT2S und seine tumorzielenden Eigenschaften wurden an Mäusen mit humanen (h)SST2R-positiven Xenotransplantaten untersucht. Trotz der rezeptorspezifischer Aufnahme übertraf [111In]In-XG1 [111In]In-AT2S nicht und führte zu einer erheblichen Ansammlung von Radioaktivität in den Nieren. Dieses Phänomen könnte mit dem charakteristischen Abbaumuster zusammenhängen, das für [111In]In-XG1 in Stoffwechselstudien im Blutkreislauf (Mäuse) beobachtet wurde. Wir gehen davon aus, dass die Einführung von 1,4-Tz zur Bildung kationischer Radiometaboliten führt, die durch Interaktion mit dem Megalin/Cubulin-Rezeptorkomplex zu einer Akkumulation in den Nieren neigen. Neben der Beurteilung der Eignung von 1,4-Tzs zur Verbesserung der metabolischen Stabilität von [111In]In-AT2S wurde der Forschungsumfang durch die Durchführung von zwei zusätzlichen Studien erweitert. - Die hohe renale Aufnahme von [111In]In-XG1 ist ein Nachteil, der für viele peptidische Radiopharmaka typisch ist. Diese Eigenschaft könnte ein Hindernis für die klare Abgrenzung von Tumoren sein, die in der anatomischen Nähe der Nieren auftreten. Die renale Clearance der Radioaktivität im Laufe der Zeit könnte die Aufnahme verbesserter Bilder mit höheren Tumor-zu-Nieren-Verhältnissen ermöglichen. Folglich kann die Verwendung langlebiger Radiometalle der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) eingesetzt werden, um Bilder zu einem späten Zeitpunkt zu erhalten, die Läsionen zuverlässig von den Nieren unterscheiden. Das PET-Radiometall Zirkonium-89 ([89Zr]Zr, t1/2 = 78,4 h) kann diesen Zweck erfüllen. Einer der vielversprechendsten Chelatoren, der die Freisetzung von 89Zr in vivo verhindert, ist der auf Deferoxamin basierende Chelator DFO*. Der beschriebene Ansatz zur Synthese dieses achtzähnigen Chelators bringt jedoch mehrere synthetische Schwierigkeiten mit sich. Daher haben wir uns entschieden, einen einfacheren synthetischen Ansatz zu entwickeln, der sich auf die Verwendung alternativer Schutzgruppen und innovativer Reinigungsstrategien konzentriert. Mit der erreichten verbesserten Verfügbarkeit von DFO* wird die Eignung der Verwendung von [89Zr]Zr-DFO* zur Verbesserung der Bildgebungseigenschaften des Triazolo-Peptidomimetikums XG1 in zukünftigen Studien untersucht. - Der Einsatz von 1,4-Tzs als Amid-Bindungs-Surrogate wurde bei der Synthese metabolisch stabilisierter Peptidomimetika umfangreich untersucht. Die gemeldeten Methoden zur Synthese von Triazolo-Peptidomimetika nutzen jedoch keine automatischen Peptid-Synthesizers, die eine schnelle und kostengünstige Synthese ermöglichen. Daher haben wir einen automatisierten Ansatz für die Synthese dieser Verbindungen mit einem automatisierten Peptid-Synthesizer (Biotage® Inititator+AlstraTM) entwickelt. Da die Kopplung von Aminosäuren in automatisierten Setups gut beschrieben ist, konzentrierten wir uns auf die Anpassung zweier Reaktionen, die für die Einführung der 1,4-Tzs im Peptid- Rückbogen unentbehrlich sind. Zunächst untersuchten wir die Kompatibilität der
description: Peptides fulfill an important role in nuclear medicine due to their ability to selectively transport radioactive cargoes to tumors on account of their high-binding affinity to cancer related biomarkers. These amino acid sequences, conjugated to chelators and radiolabeled with diagnostic radiometals (e.g., Gallium-68 ([68Ga]Ga), Indium-111 ([111In]In)), serve to evaluate the stage of a disease or to assess the eligibility of a patient to receive a given treatment (patient stratification). In addition, when paired with therapeutic radiometals (e.g., Lutetium-177 ([177Lu]Lu)), peptides can deliver a cytotoxic dose of radiation to unresectable cancers. Among the many radiolabeled peptides that have clinical potential, the somatostatin-based radiotracers hold notable importance in nuclear medicine. Somatostatin-14 (SST-14) is a cyclic peptide hormone that modulates multiple body functions (e.g., the inhibition of growth hormone (GH) release) by interacting with the family of somatostatin receptors (SSTR). This family of G-protein coupled receptors (GPCR), comprised of five receptor subtypes (SST1-5R), is ubiquitously expressed in healthy tissue and organs. However, they also represent a promising target in oncology due to their over-expression by multiple cancers. Even if most malignancies with a SSTR expression show high levels of SST2R (e.g., neuroendocrine tumors (NETs)), some of them concomitantly express various receptor subtypes, whereas other tumors are characterized by the expression of receptors other than SST2R. Consequently, the synthesis of tracers able to target multiple SSTR subtypes is considered highly relevant. A promising radiolabeled peptide that meets this requirement is the 1,4,7,10- tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic (DOTA)-conjugate AT2S (DOTA-Ala1-Gly2- cycle(c)(Cys3-Lys4-Asn5-Phe6-Phe7-D-Trp8-Lys9-Thr10-Phe11-Thr12-Ser13-Cys14-OH)). This cyclic peptide is based on the scaffold of the native SST-14 and has been labeled with the single-photon emission computed tomography (SPECT) radionuclide 111In. [111In]In-AT2S maintains high nanomolar affinity for all SSTR subtypes but it is rapidly degraded in blood circulation (mice). Hence, AT2S cannot be regarded as an appropriate shuttle for the transport of radioactive cargoes to tumors. The use of metabolically stable amide bond bioisosteres represents an attractive solution to preserve the biological function of peptides while rendering improved metabolic stability. Among the many reported examples of trans-amide bond bioisosteres, 1,4- disubstituted 1,2,3-triazoles (1,4-Tz) have shown to be reliable metabolism-resistant surrogates of trans-amide bonds. Thus, in order to tackle the poor proteolytic stability of [111In]In-AT2S, in this doctoral thesis we have applied the amide-to-triazole-substitution strategy to the stabilization of this cyclic peptide conjugate. Upon selection of the labile trans-amide bonds of [111In]In-AT2S, these were individually replaced with a 1,4-Tz leading to the synthesis of five novel triazolo-peptidomimetics that were labeled with 111In. Out of the five radioconjugates, one ([111In]In-XG1) was selected for further evaluation due to its retained affinity towards SST1,2,3,5R. The lead triazolo-peptidomimetic [111In]In-XG1 also displayed moderately improved stability in vivo (mice) as compared to the reference compound [111In]In-AT2S and its tumor targeting properties was evaluated in mice bearing human (h)SST2R-positive xenografts. Despite receptor-specific uptake, [111In]In-XG1 did not outperform [111In]In-AT2S and resulted in substantial accumulation of radioactivity in the kidneys. This phenomenon might be linked to the distinctive degradation pattern observed observed for [111In]In-XG1 in metabolic studies in blood circulation (mice). It is our assumption that the introduction of the 1,4-Tz lead to the formation of cationic radiometabolites that are prone to renal accumulation via interaction with the megalin/cubulin receptor complex. Besides assessing the suitability of 1,4-Tzs in the improvement of the metabolic stability of [111In]In-AT2S, the scope of the research was expanded by conducting two additional studies. - The high renal uptake displayed by [111In]In-XG1 is a drawback that is representative of many peptidic radiopharmaceuticals. This feature might be an impediment for the clear delineation of tumors occurring in the anatomic vicinity of the kidneys. The renal clearance of radioactivity over time might enable the acquisition of improved images with higher tumor-to-kidney ratios. Consequently, the use of long-lived positron emission tomography (PET) radiometals can be employed to obtain late-time-point images that reliably distinguish lesions from the kidneys. The PET radiometal Zirconium-89 ([89Zr]Zr, t1/2 = 78.4 h) can serve this purpose. One of the most promising chelators that prevents the in vivo release of 89Zr is the deferoxamine-based chelator DFO*. However, the reported approach to synthesize this octadentate chelator entails several synthetic difficulties. Consequently, we decided to develop a more facile synthetic approach focusing on the use of alternative protecting groups and innovative purification strategies. With the achieved improved availability of DFO*, the suitability of using the [89Zr]Zr-DFO* to improve the imaging properties of the triazolo-peptidomimetic XG1 will be evaluated in future studies. - The use of 1,4-Tzs as amide bond surrogates has been extensively studied in the synthesis of metabolically stabilized peptidomimetics. However, the reported methods to synthesize triazolo-peptidomimetics do not take advantage of automated peptide synthesizers, which would allow their fast and cost-effective synthesis. Consequently, we designed an automated approach for the synthesis of these compounds using an automated peptide-synthesizer (Biotage® Inititator+AlstraTM). Since the coupling of amino acids in automated setups is well described, we focused on adapting two reactions that are indispensable for the introduction of the 1,4-Tzs in the peptide backbone. First, we studied the compatibility of the diazotransfer reaction with the peptide synthesizer. This reaction is essential to introduce the azide functionality on the N-terminus of the peptide and can be accomplished using a suitable diazotransfer reagent (e.g., imidazole-1-sulfonyl azide hydrochloride (ISA·HCl)). We centered our attention on guaranteeing the long-term stability of the diazotransfer reagent in order to allow the introduction of the azide functionality at positions occurring far from the resin. Second, the copper-catalyzed azide-to-alkyne (CuAAC) reaction was optimized by exploring different conditions to preserve the catalytic activity of a Cu(I)-based catalyst over time. The optimized procedure was successfully applied to the synthesis of five model triazolo-peptidomimetics of different length and amino acid sequence with 1,4-Tzs in varying positions.