title: Development of Small-Molecule Ligands Targeting β-Adrenergic Receptors and the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
title: Entwicklung Niedermolekularer Liganden für β-Adrenerge Rezeptoren und des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
Creators: name: Tiedt, Stephanie
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: GPCR
subject: β-Adrenergic Receptors
subject: Drug Development
subject: Small-Molecule Ligands
subject: Allosteric Modulators
subject: DDC Classification::5 Naturwissenschaften und Mathematik :: 54 Chemie :: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften

description: In this thesis, a variety of ligands targeting β-adrenergic receptors and the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator are presented: Based on the lead structure SX22, a NAM on norepinephrine (NE)-stimulated β-arrestin (β-ARR) recruitment that was developed in the course of my Master’s thesis114, we designed, synthesized and biologically investigated a novel series of analogs aiming to address an extracellular allosteric binding pocket at the β2AR. All synthesized ligands behave as NAMs in a NE-stimulated β ARR recruitment assay. Interestingly, β2-subtype selectivity over its congener β1AR increases for ligands with enlarged 3 halogen substituents on the benzyl ether moiety: Br ≈ CF3 &gt; Cl &gt; F. Recently, it has been shown that the formal insertion of an antagonist-like oxypropylene spacer into the catecholamine agonist motif resulted in functionally biased orthosteric ligands for β-ARs. Specifically, the resulting hybrid ligands, e.g. the isoproterenol-derived analog ST74, were found to be nonselective partial agonists preferentially activating G protein-mediated signaling over β-arrestin recruitment.83 We expanded this series of small hybrid β adrenoceptor ligands by synthesizing an epinephrine-based methyl analog (SX144) as well as a salbutamol-derived tert butyl hybrid ligand (SX145). Enlargement of the N-substituent from Me to iPr or tBu resulted in substantially increased binding affinities at both receptor subtypes. Moreover, a series of novel bitopic ligands was designed and synthesized to gain profound insights in pharmacological signaling of the β2AR when concomitantly addressing the orthosteric site and an allosteric binding pocket located in the extracellular vestibule. Hence, we connected partial agonist- (ST74, saligenin ethanolamine), antagonist- (carazolol) and agonist- (norepinephrine) derived pharmacophores to allosteric aryloxyalkyl appendages based on either salmeterol or the developed SX22 NAM motif. In general, a convergent synthesis approach was applied for the preparation of the novel ligands. Therefore, the respective orthosteric pharmacophores were synthesized in an enantiomerically pure manner applying either enantioselective synthesis approaches or asymmetric synthesis routes. Subsequently, the orthosteric head groups were coupled to C5- and/or C6-spacer allosteric appendages prepared in parallel, based on the proposed chemical space in the receptor binding pocket. Biological investigations revealed that the attachment of the allosteric appendages to agonist- and partial agonist-derived pharmacophores, respectively, resulted in high affinity β2AR bitopic ligands possessing high selectivity over the closely related β1-subtype (SX119, SX133, (RR)/(RS)-SX186, SX217, (RR)/(RS)-SX243). In contrast, the high impact of the aryloxyalkyl appendages on β2AR binding affinity and selectivity was not observed for the antagonistic carazolol-derived bitopic ligands SX164, SX166, SX180 and SX211. Another approach for potentially increasing receptor subtype selectivity is the development of bitopic ligands concomitantly addressing the orthosteric site and a metastable binding pocket where ligands were found to pause upon entering the receptor.115, 155 We investigated a dimeric β-AR antagonist consisting of two identical carazolol pharmacophores that might potentially probe a metastable binding pocket. Interestingly, the overall binding and the 3-fold β2AR selectivity of (S)-SX99 and rac. carazolol were not enhanced by the attachment of the second carazolol pharmacophore. We successfully demonstrated that ligands addressing spatially distinct sites from the classic orthosteric site represent powerful tools in fine-tuning β2AR affinity, selectivity as well as intracellular signaling profiles. Conclusively, the derivatives developed in this work give profound insights on β2AR regulation and provide an excellent basis for future studies. In a project initiated by the groups of Prof. Brian Shoichet, University of California, San Francisco, USA, Prof. Jue Chen, The Rockefeller University, New York, USA and our group, a novel racemic CFTR potentiator (‘853) targeting the ivacaftor and GLPG1837 binding site located in the transmembrane interface of the CFTR96 was identified in a high-throughput in silico screening followed by experimental testing and evaluation of the binding site by cryo-EM structure determination. As the absolute configuration of the racemic lead structure ‘853 could not be unambiguously deduced in the obtained cryo-EM complex, we synthesized both enantiomers of the chiral lead structure ‘853 in parallel, applying a three step linear enantiopure synthesis route [(R)/(S)-SX226]. Moreover, a series of various enantiomerically pure analogs bearing modifications on the phenolic moiety as well as on the indazole scaffold in positions 3 and 6 was prepared in order to increase CFTR potentiation and to generate a structure-activity relationship (SAR) profile. Electrophysiology experiments performed in the laboratory of Prof. Jue Chen, The Rockefeller University, New York, USA revealed that the potentiation ability of the lead structure ‘853 resides in the (S)-enantiomer [(S)-SX226], while modulator (R)-SX226 was found to be a competitive inhibitor indicating the penetration of the same binding site by both CFTR modulators. The structural analogs showed a range of very diverse effects. CFTR potentiation was majorly observed for (S)-isomers, while respective (R)-isomers showed either inhibitory effects or did not alter ion conductance. Interestingly, the (S)-enantiomers of the modulators SX244 and SX245 bearing ortho- and meta-substituents on the phenolic moiety were found to be inhibitors. Taken together, our results demonstrate the complexity of allosteric protein regulation and the high impact of stereochemistry on the biological outcome. Thus, the CFTR represents an excellent target for the structure-based development of both potentiators as well as inhibitors serving as promising tools to further study CFTR function.
description: In dieser Arbeit wird eine Reihe von Liganden vorgestellt, die β-adrenerge Rezeptoren und den Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator adressieren: Basierend auf der im Rahmen meiner Masterarbeit114 entwickelten Leitstruktur SX22, einem NAM in Hinblick auf Norepinephrin (NE)-stimulierte β Arrestin (β-ARR)-Rekrutierung, haben wir eine neuartige Analogareihe entworfen, synthetisiert und biologisch untersucht, mit dem Ziel eine extrazelluläre, allosterische Bindungstasche am β2AR zu adressieren. Alle synthetisierten Liganden verhalten sich als NAMs in einem NE-stimulierten β ARR-Rekrutierungs-Assay. Interessanterweise steigt die β2-Subtypselektivität gegenüber dem eng verwandten β1AR für Liganden mit vergrößerten 3-Halogen-Substituenten an der Benzylether-Gruppe: Br ≈ CF3 &gt; Cl &gt; F. Kürzlich wurde gezeigt, dass die formale Insertion eines antagonistenähnlichen Oxypropylen-Spacers in das Katecholamin-Agonistenmotiv zu funktionell selektiven β-AR orthosterischen Liganden führt. Die daraus resultierenden Hybridliganden, z.B. das von Isoprenalin abgeleitete Derivat ST74, erwiesen sich als unselektive Partialagonisten, die bevorzugt die G-Protein-vermittelte Signalübertragung gegenüber der β-Arrestin-Rekrutierung aktivieren.83 Wir erweiterten diese Reihe kleiner β-Adrenozeptor-Hybridliganden durch die Synthese eines Adrenalin-basierten Methylanalogons (SX144) sowie eines Salbutamol-abgeleiteten tert-Butyl-Hybridliganden (SX145). Die Vergrößerung des N-Substituenten von Me zu iPr oder tBu führte zu deutlich erhöhten Bindungsaffinitäten an beiden Rezeptorsubtypen. Weiterhin wurde ein Reihe neuartiger bitopischer Liganden entwickelt und synthetisiert, um umfangreiche Einblicke, bei gleichzeitiger Bindung an die orthosterische Stelle und eine allosterische Bindetasche im extrazellulären Vestibül, in die pharmakologische Signalgebung des β2AR zu erlangen. Dazu haben wir partialagonistische (ST74, Saligenin-Ethanolamin), antagonistische (Carazolol) und agonistische (Noradrenalin) Pharmakophore mit allosterischen Aryloxyalkylresten („appendages“) verbunden, welche entweder auf Salmeterol oder dem entwickelten SX22 NAM-Motiv basieren. Im Allgemeinen wurde für die Herstellung der neuen Liganden ein konvergenter Syntheseansatz angewandt. Hierfür wurden die jeweiligen orthosterischen Pharmakophore enantiomerenrein synthetisiert, wobei entweder enantioselektive Synthesewege oder asymmetrische Syntheserouten etabliert wurden. Zusätzlich wurde das racemische Saligenin-Ethanolamin-Pharmakophor, welches als Vorläufer für die Herstellung von SX217 diente, als Referenz für biologische Vergleiche mit dem bronchienerweiternden Wirkstoff Salmeterol herangezogen, der üblicherweise als racemisches Gemisch verwendet wird. Anschließend wurden die orthosterischen Kopfgruppen an allosterische C5- und/oder C6-Spacer-Motive gekoppelt, die auf der Grundlage des vorgeschlagenen chemischen Raums in der Rezeptorbindestasche parallel hergestellt wurden. Biologische Untersuchungen ergaben, dass die Anknüpfung der allosterischen „appendages“ an Agonist- bzw. Partialagonist-abgeleitete Pharmakophore zu hochaffinen bitopischen β2AR-Liganden führte, die zudem eine hohe Selektivität gegenüber dem eng verwandten β1-Subtyp aufweisen (SX119, SX133, (RR)/(RS)-SX186, SX217, (RR)/(RS)-SX243). Im Gegensatz dazu konnte bei den antagonistischen, von Carazolol abgeleiteten bitopischen Liganden SX164, SX166, SX180 und SX211 der starke Einfluss der Aryloxyalkylreste auf die β2AR-Bindungsaffinität und -selektivität nicht beobachtet werden. Ein weiterer Ansatz zur potenziellen Erhöhung der Rezeptorsubtypselektivität ist die Entwicklung bitopischer Liganden, die gleichzeitig die orthosterische Stelle und eine metastabile Bindungstasche adressieren, in der Liganden beim Rezeptoreintritt verweilen.115, 155 Wir untersuchten einen aus zwei identischen Carazolol-Pharmakophoren bestehenden, dimeren β-AR-Antagonisten, der möglicherweise eine solche metastabile Bindungstasche ansprechen könnte. Interessanterweise wurden weder die Gesamtbindung noch die 3-fache β2AR-Selektivität von (S)-SX99 und (rac.) Carazolol durch die Anlagerung des zweiten Carazolol-Pharmakophores erhöht. Wir haben erfolgreich gezeigt, dass Liganden, die räumlich unterschiedliche Stellen im Vergleich zum klassischen orthosterischen Zentrum adressieren, leistungsstarke Werkzeuge für die Feinabstimmung der β2AR-Affinität, -Selektivität sowie intrazellulärer Signalprofile darstellen. Abschließend lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit entwickelten Derivate umfangreiche Einblicke in die β2AR-Regulierung geben und eine hervorragende Grundlage für zukünftige Studien darstellen. In einem von den Gruppen von Prof. Brian Shoichet, University of California, San Francisco, USA, Prof. Jue Chen, The Rockefeller University, New York, USA, und unserer Gruppe initiierten Projekt, wurde ein neuartiger racemischer CFTR-Potentiator ('853), der die Ivacaftor- und GLPG1837-Bindestelle an der Transmembranschnittstelle des CFTR96 adressiert, in einem in silico-Hochdurchsatz-Screening identifiziert. Dieser Potentiator wurde anschließend experimentell getestet und die Bindestelle durch Kryo-EM-Strukturbestimmung verifiziert. Da die absolute Konfiguration der racemischen Leitstruktur '853 im erhaltenen Kryo-EM-Komplex nicht eindeutig abgeleitet werden konnte, synthetisierten wir beide Enantiomere der chiralen Leitstruktur '853 [(R)/(S)-SX226] parallel. Hierfür wurde eine dreistufige lineare, enantiomerenreine Syntheseroute angewandt. Darüber hinaus wurde eine Reihe verschiedener, optisch reiner Analoga mit Modifikationen an der phenolischen Einheit sowie am Indazolgerüst in den Positionen 3 und 6 hergestellt, um die CFTR-Potenzierung zu erhöhen und ein Struktur-Aktivitäts-Beziehungsprofil (SAR) zu erstellen. Elektrophysiologische Experimente, die im Labor von Prof. Jue Chen, The Rockefeller University, New York, USA, durchgeführt wurden, ergaben, dass die CFTR-Potenzierung der Leitstruktur '853 durch das (S)-Enantiomer [(S)-SX226] hervorgerufen wird. Im Gegensatz dazu erwies sich der Modulator (R)-SX226 als kompetitiver Inhibitor. Dies deutet darauf hin, dass beide CFTR-Modulatoren dieselbe Bindungsstelle ansprechen. Die Strukturanaloga zeigten sehr unterschiedliche Effekte. Eine CFTR-Potenzierung wurde vor allem bei den (S)-Isomeren beobachtet, wohingegen die entsprechenden (R)-Isomere entweder hemmende Wirkungen zeigten oder die Ionenleitfähigkeit nicht veränderten. Interessanterweise erwiesen sich die (S)-Enantiomere der Modulatoren SX244 und SX245, die ortho- und meta-Substituenten an der phenolischen Einheit tragen, als Inhibitoren. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse die Komplexität der allosterischen Proteinregulierung und den erheblichen Einfluss der Stereochemie auf das biologische Ergebnis. Der CFTR stellt ein hervorragendes Zielprotein für die strukturbasierte Entwicklung von Potentiatoren und Inhibitoren dar, die als vielversprechende Werkzeuge zur weiteren Untersuchung der CFTR-Funktion dienen.