title: lin-Benzopurine als Inhibitoren der tRNA-Guanin Transglycosylase: Störung der Homodimer Formation, Import von Wassernetzwerken und Determinanten kristallographischer Unordnung
title: lin-Benzopurines as Inhibitors of tRNA-Guanine Transglycosylase: Perturbance of Homodimer Formation, Import of Water Clusters and Determinants of Crystallographical Disorder
title: lin-Benzopurines as Inhibitors of tRNA-Guanine Transglycosylase: Perturbance of Homodimer Formation, Import of Water Clusters and Determinants of Crystallographical Disorder
Creators: name: Immekus, Florian Peter Philip
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Queuin-tRNS-Ribosyltransferase
inhibitor design
protein protein interaction
Naturwissenschaften
Enzyminhibitor
water cluster analysis
Proteinkristallographie
Protein Protein Interaktion
Inhibitordesign
Wassernetzwerkanalyse

description: In this thesis different methods of
      structure-based drug design have been applied to develop TGT
      inhibitors suiting the manifold purposes of the tackled
      projects. TGT is not only a putative target for the treatment
      of Shigellosis, but additionally represents a well-accessible
      model system to study more general aspects of drug design.
      The presented results are mostly received from X-ray
      crystallography and binding affinity measurements. For the
      latter determinations, a new method - microscale
      thermophoresis - has been introduced. To characterize binding
      of TGT ligands, the newly established protocol largely
      replaces the expensive and time-consuming kinetic assay based
      on radioactive labeled guanine. The experimental perspective
      has been further expanded by a point mutation study, methods
      of computational chemistry and non-covalent nanoESI mass
      spectrometry. The latter technique provided crucial
      information about the dimer stability of TGT in solution and
      upon the impact of ligands, designed to perturb the
      anticipated hot spot interactions of the dimer interface
      (section 2). For the first time, a dimer destabilization in
      solution has been verified induced by needle-type decorated
      ligands which spike into the interface region. However, these
      ligands were not able to fully disrupt the dimer which
      questions the importance of the targeted substructures for
      dimer stability. A detailed crystal structure analysis of
      three TGT-ligand complexes complemented with collected
      affinity data could unravel the role of the targeted
      helix-loop-substructure, assumed to be crucial for dimer
      stability due to preceding mutation studies. Despite the
      involvement of this substructure in several,
      crystallographically conserved directed interactions between
      the monomer mates this helix-loop-motif is most likely
      flexible in solution and just conveyed into a well-ordered
      arrangement upon crystallization. Supported by molecular
      modeling and MD-simulations it was possible to provide an
      explanation for the discrepancy between the discovered minor
      importance of these helix-loop associated directed
      interactions and the observed ligand-induced dimer
      destabilization in solution. In section 3 two series of TGT
      inhibitors have been developed - each corresponding to
      another variation of the lin-benzoguanine scaffold. The
      lin-benzohypoxanthines - lacking the exocyclic amino function
      at C(6) - and the C(6)-N-alkylated lin-benzoguanines have
      been analyzed with respect to their membrane permeability,
      pKa-profile, binding mode in crystal structures and binding
      affinity. Finally these characteristics have been compared to
      the parental lin-benzoguanines studied in previous works. For
      the pyrimidine portion of lin-benzohypoxanthines a shift of
      ca. two pKa units to increased acidity could be achieved
      compared to the analog lin-benzoguanines. However, despite
      the reduced tendency to be charged, lin-benzohypoxanthines
      showed no improved membrane permeability. The
      lin-benzohypoxanthines exhibit strongly reduced binding
      affinities in the micromolar range which could be reasoned by
      the loss of two H-bonds formed between the exocyclic amino
      function of parental lin-benzoguanines and two aspartates of
      the binding pocket. A water cluster was identified as a
      crystallographically conserved arrangement being picked up
      upon binding of lin-benzohypoxanthines. This cluster
      experiences several favorable interactions to the protein and
      to the ligand and was partially found also in the apo
      structure. Despite this water cluster cannot compensate the
      loss in affinity for lin-benzohypoxanthines, the potential
      large impact of favorable water-protein interactions on the
      ligand´s binding affinity could be demonstrated by crystal
      structure analysis of two C(6)-N-alkylated lin-benzoguanines.
      In section 4, a series of disubstituted lin-benzoguanines and
      lin-benzohypoxanthines has been characterized in terms of
      their binding mode and affinity. The combination of
      substituents simultaneously targeting the ribose33- and
      ribose34-pocket yielded the first TGT inhibitor exhibiting
      picomolar binding affinity. However, the comparison of
      disubstituted compounds with their monosubstituted analogs
      revealed that the overall binding affinity is not necessarily
      improved by sidechain combination to result in additivity of
      affinity contributions. The results presented in section 2
      concerning the flexibility of a dimer interface-associated
      helix-loop substructure also affect the interpretation of
      crystal structures in section 4. In section 4, a more rigid,
      crystallographically defined binding mode within the
      ribose33-pocket could be obtained for the C(2)-substituents
      of three compounds of the analyzed series. In section 5, a
      mutationally introduced asparagine within the TGT recognition
      pocket can be used as a model for a permanently protonated
      aspartate, which is involved in ligand binding and
      catalysis.
description: Im Rahmen dieser Dissertation
      wurden Inhibitoren der TGT unter verschiedenen
      Gesichtspunkten entwickelt und untersucht. Hierbei kamen
      zahlreiche Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesign zum
      Einsatz. Die TGT-Dimerstabilität in Lösung und deren
      Beeinflussbarkeit durch Liganden wurde untersucht (Kapitel
      2). Erstmals konnte eine ligandinduzierte Destabilisierung
      des Homodimers in Lösung nachgewiesen werden, welche auf die
      nadelartig in die interface-Region reichenden
      Ligandseitenketten zurückgeführt werden konnte. Die
      detaillierte Analyse von drei TGT-Ligand-Komplexstrukturen,
      komplementiert mit entsprechenden Affinitätsdaten, konnte den
      Einfluss der angesteuerten Helix-loop-Substruktur auf die
      Dimerstabilität offenlegen. War diese aufgrund
      vorausgegangener Mutationsstudien noch als entscheidend für
      den Zusammenhalt der assemblierten TGT-Monomere eingeschätzt
      worden, ist das Strukturelement, trotz seiner Beteiligung an
      zahlreichen kristallographisch konservierten Wechselwirkungen
      zum korrespondierenden Monomer, von nur geringer Bedeutung
      für die Dimerstabilität. Die sich ergebende
      Widersprüchlichkeit zwischen der ligandinduzierten
      Dimerdestabilisierung in Lösung und der offensichtlich
      geringen Bedeutung der Helix-loop-assoziierten gerichteten
      Wechselwirkungen konnte durch molecular modelling und
      Molekulardynamik-Simulationen aufgeklärt werden. Die
      kristallstrukturbasierten Simulationen zeigten, dass die
      beschriebene loop-Struktur - auch in Gegenwart eines
      gebundenen, nadelartig dekorierten Liganden - einer
      hydrophoben Kontaktfläche zwischen beiden Monomeren
      deckelartig aufliegt. Eine hydrophobe Triade bestehend aus
      drei aromatischen Resten ist an der Bildung dieser
      Kontaktfläche beteiligt und konnte aufgrund ihrer
      Konservierung in allen untersuchten Ligandkomplexen als
      wahrscheinliche hot spot-Interaktion des Dimer interface
      ausgemacht werden. In Kapitel 3 wurden zwei Serien von TGT
      Inhibitoren entwickelt und untersucht. Jede Serie basiert auf
      einer Variation des in vorangegangenen Arbeiten entwickelten
      lin-Benzoguanin-Grundgerüsts. Die lin-Benzohypoxanthine, bei
      denen die exozyklische Aminofunktion an C(6) des Trizyklus
      entfernt wurde, und die C(6)-N-alkylierten lin-Benzoguanine
      wurden hinsichtlich Membranpermeabilität, pKa-Profil,
      Bindungsmodus in Kristallstrukturen und Bindungsaffinität
      charakterisiert. Die festgestellten Eigenschaften wurden mit
      den analogen lin-Benzoguaninen verglichen. Für die
      Pyrimidin-Partialstruktur der lin-Benzohypoxanthine konnte
      eine Verschiebung von zwei pKa-Einheiten zu erhöhter Azidität
      gegenüber den analogen lin-Benzoguaninen erzielt werden.
      Trotz verminderter Protonierbarkeit der lin-Benzohypoxanthine
      konnte aber keine verbesserte Membranpermeabilität erreicht
      werden. Sehr wahrscheinlich wird ein günstigeres
      biopharmazeutisches Profil durch die in allen untersuchten
      Verbindungen erhaltene, leicht protonierbare
      2-Aminoimidazol-Partialstruktur verhindert. Ein
      Wassernetzwerk konnte als ein mit der Bindung von
      lin-Benzohypoxanthinen assoziiertes, kristallographisch
      konserviertes Arrangement dargestellt werden. Das teilweise
      auch in der apo-Struktur sichtbare Netzwerk bildet günstige
      Wechselwirkungen sowohl zu gebundenen lin-Benzohypoxanthinen
      als auch zu Resten der Bindetasche aus. Obgleich das Netzwerk
      den Affinitätsverlust gegenüber den lin-Benzoguaninen nicht
      kompensieren kann, konnte anhand der Komplexstrukturen zweier
      C(6)-N-alkylierter lin-Benzoguanine der potentiell große
      Einfluss günstiger Protein-Wasser- und
      Ligand-Wasser-Interaktionen auf die Bindungs-affinität
      gezeigt werden. In Kapitel 4 wurde eine Serie
      disubstituierter lin-Benzoguanine und lin-Benzohypoxanthine
      im Hinblick auf den kristallographischen Bindungsmodus und
      die Bindungsaffinität charakterisiert. Die Kombination zweier
      Substituenten am trizyklischen Grundgerüst ermöglicht die
      zeitgleiche Bindung der Liganden in der Ribose33- und
      Ribose34-Tasche. Hierdurch konnte erstmals eine pikomolare
      Bindungsaffinität für einen TGT-Inhibitor erreicht werden.
      Der Vergleich der beschriebenen disubstituierten Verbindungen
      mit ihren monosubstituierten Analoga machte jedoch deutlich,
      dass sich die Beiträge der einzelnen Substituenten zur
      Bindungsaffinität nicht zwingend additiv verhalten. Weiterhin
      konnte in Kapitel 4 erstmals ein kristallographisch
      geordneter Bindungsmodus für die C(2)-Seitenketten dreier
      Liganden in der Ribose33-Tasche festgestellt werden.
      Auffällig ist hierbei die Ummantelung der apolaren
      Seitenketten durch kristallographisch definierte
      Wassernetzwerke, welche die geordneten Konformationen
      vermutlich stabilisieren. Ein signifikanter Einfluss des
      geordneteren Bindungsmodus auf die Bindungsaffinität der
      entsprechenden Liganden ist hingegen nicht festzustellen.
      Kapitel 5 beschreibt eine TGT-Variante, in deren Bindetasche
      ein Aspartat mittels positionsgerichteter Mutagenese durch
      ein Asparagin ersetzt wurde.