title: Bestimmung des Methylierungsgrads von GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4 in Rattus norvegicus mittels methylierungssensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) und Pyrosequenzierung (PSQ)
Creators: name: Klingler, Maximilian
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Bei der Gedächtnisbildung und beim Lernen spielt die Langzeit-Potenzierung (LTP) von Synapsen und Nervenzellen im Hippocampus eine bedeutende Rolle. Für die Entstehung dieser LTP ist unter anderem der ionotrope Glutamatrezeptor AMPA (α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionsäure-Rezeptor) von Bedeutung. In Säugetieren kommt dieser trans-membrane Ionenkanal als tetramerer Komplex, welcher aus unterschiedlichen Kombinationen der folgenden 4 Untereinheiten gebildet wird, vor: GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4. Die Anzahl und Art der Untereinheiten, aus denen der Rezeptor aufgebaut ist, bestimmen die physiologischen Eigenschaften wie Kinetik, Leitfähigkeit und Durchlässigkeit für Ionen und damit auch die post-synaptische Antwort des Rezeptors. Daher ist die Regulation der Expression dieser Rezeptoruntereinheiten von besonderem Interesse. In dieser Masterarbeit wurde untersucht, ob sich durch das Trainieren im Morris Wasserlabyrinth (engl.: Morris Water Maze, MWM) einem weit verbreiteten Paradigma, um räumliches Lernen und die Gedächtnisbildung zu beurteilen, der Methylierungsgrad der DNA von Ratten in den Genen GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4 ändert. Dazu wurden Ratten von Ajinkya Sase, einem Mitarbeiter unseres Kooperationspartners Univ.-Prof. Dr. Gert Lubec, im MWM trainiert und anschließend deren Hippocampi entnommen. Im Zuge dieser Arbeit wurde die DNA aus diesen Hippocampi extrahiert und gemeinsam mit DNA-Standards bisulfit-konvertiert. Um eine anschließende Analyse des Methylierungsgrads mittels methylierungssensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) und Pyrosequenzierung (PSQ) durchführen zu können, wurden die Proben und Standards mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Hierfür wurden genspezifische Primer entworfen. Die entwickelten PCR-Methoden wurden getestet und die Primer- und Magnesium-Konzentration sowie die Annealing-Temperatur optimiert. Die Promotorregionen der untersuchten Gene GluR1-GluR4 wiesen sowohl in den Hippocampi von untrainierten als auch von trainierten Ratten einen geringen Methylierungsgrad, welcher oft sogar unter der Nachweisgrenze der entwickelten Methoden lag, auf. Für keine der untersuchten Genregionen konnte ein Zusammenhang zwischen dem Methylierungsgrad und dem Training im Morris Wasserlabyrinth festgestellt werden. Daher wird davon ausgegangen, dass die Expression dieser Gene nicht über den Methylierungsgrad der Promotorregion reguliert wird.
description: Memory formation and learning are linked to long-term potentiation (LTP) of synapses in the hippocampus. Ionotropic glutamate receptors including the AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor) are known to play an important role in LTP formation. In mammals, this transmembrane ion channel is a tetrameric complex expressed in different combinations of four subunits: GluR1, GluR2, GluR3 and GluR4. Number and type of the subunits assembling determine the physiological properties of the receptor, i.e. kinetics, conductance and permeability, and thus size and shape of the postsynaptic response of the receptor. So far, it is unknown how expression of the genes coding these receptor subunits is regulated. In this Master thesis I aimed at investigating if the DNA methylation status of the promoter region of GluR1-GluR4 in the hippocampi of rats is related to the training in the Morris Water Maze (MWM), a widely used paradigm to assess spatial learning and memory formation. Rats were trained in the MWM by Ajinkya Sase, a co-worker of our co-operation partner Univ.-Prof. Dr. Gert Lubec. In the course of this work, the DNA of hippocampi from trained (and untrained rats as control) was extracted and, together with DNA standards, bisulfite-converted. In order to be able to determine the methylation level by methylation sensitive high resolution melting analysis (MS-HRM) and pyrosequencing (PSQ), the samples and standards were amplified by polymerase chain reaction (PCR). For this purpose, gene-specific primers were designed. The PCR methods were optimized with regard to primer concentration, magnesium concentration and annealing temperature. The methylation status of GluR1-GluR4 in the hippocampi of trained and untrained rats was very low, most frequently even below the limit of detection of the developed methods. For none of the gene regions we found a correlation between the methylation status and the training in the Morris water maze. Therefore, we assume that the expression of GluR1-GluR4 is not regulated by methylation of the promoter region.