title: Evaluating endosomal escape performance of mRNA and oligonucleotide carriers
Creators: name: Fasching, Helene
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Therapeutische Nukleinsäuren ermöglichen die Behandlung verschiedener Krankheiten, indem sie intrazelluläre Moleküle in Zellen von Patienten manipulieren. Polykationische Polymere, darunter lineares Polyethylenimin (LPEI), können als Trägermoleküle verwendet werden, um exogene Nukleinsäuren effizient an ihren intrazellulären Wirkungsort zu transportieren. In dieser Arbeit wurden 10-kDa-LPEI, 2,5-kDa-LPEI und deren Derivate LPEI 10-PEG-Cys und quervernetztes LPEI als Träger von Boten-RNA und splice-switching Oligonukleotiden (SSOs) bei in vitro Transfektionen untersucht. Dabei wurde eine gentechnisch veränderte HeLa-Zelllinie verwendet, die den Nachweis aufgebrochener Endosomen mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht, um die Fähigkeit der Polymere zu analysieren, nach ihrer Aufnahme durch Endozytose die Freisetzung von mRNA ins Zytoplasma zu erleichtern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass 10-kDa-LPEI und 2,5-kDa-LPEI den endosomalen Austritt von mRNA weniger effizient erleichtern als ihre Derivate. Dies legt den Schluss nahe, dass die PEGylierung beziehungsweise die Quervernetzung deren Leistung erhöhen. In einem weiteren Projekt wurden 2,5-kDa-LPEI und quervernetztes LPEI verwendet, um die Zellen mit Alexa-Fluor-750-markierten SSOs zu transfizieren und so deren Austritt aus den Endosomen und Eintritt in den Zellkern zu visualisieren und semi-quantitativ zu analysieren. Außerdem wurde die Wirkung der Transfektion mit SSOs – die Korrektur von fehlerhaftem Spleißen – an anderen HeLa-Zellen getestet. Diese Zellen sind gentechnisch so verändert, dass sie eine Luziferase produzieren, die aufgrund von fehlerhaftem Spleißen nicht funktionsfähig ist. Den Ergebnissen zufolge ist quervernetztes LPEI effizienter als 2,5-kDa-LPEI bei der Vermittlung des endosomalen Austritts und des Kerneintritts von Alexa-Fluor-750-markierten SSOs sowie bei der Spleißkorrektur.
description: Therapeutic nucleic acids allow treatment of various diseases by manipulating intracellular molecules inside patients´ cells. Polycationic polymers, including linear polyethyleneimine (LPEI), can be used as carriers to efficiently deliver exogenous nucleic acids to their intracellular site of action. In this thesis, 10 kDa LPEI, 2.5 kDa LPEI and their respective derivatives LPEI 10-PEG-Cys and crosslinked LPEI were evaluated as carriers of mRNA and splice switching oligonucleotides (SSOs) during in vitro transfections. A genetically engineered HeLa cell line, which allows the detection of ruptured endosomes via fluorescence microscopy, was used to visualise and quantify the capacity of the polymers to facilitate the release of mRNA into the cytoplasm after endocytosis. The results indicate that 10 kDa LPEI and 2.5 kDa LPEI are less efficient in facilitating the endosomal escape of mRNA than their derivatives, suggesting that PEGylation and crosslinking increase their performance. In another project, 2.5 kDa LPEI and crosslinked LPEI were used to transfect the cells with Alexa Fluor 750 labelled SSOs in order to detect and semi-quantitatively analyse their endosomal escape and nuclear entry. Furthermore, the effect of SSO transfection – to correct aberrant splicing – was tested using another HeLa cell line. These cells are genetically engineered to stably produce a luciferase which is nonfunctional due to a splice site mutation. According to the results, crosslinked LPEI is more efficient than 2.5 kDa LPEI in promoting endosomal escape and nuclear entry of Alexa Fluor 750 labelled SSOs as well as splice correction.