Prozessstrategien zur Beeinflussung der makromolekularen Zellzusammensetzung photoautotropher Mikroorganismen bei Kultivierungen im Labor- und Pilotmaßstab
Creators: name: Trautmann, Andreas Martin
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2018

description: Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit Hilfe verschiedener Prozessstrategien die makromolekulare Zellzusammensetzung photoautotropher Mikroorganismen während der Kultivierung erfolgreich manipuliert werden. Im Zentrum der Untersuchungen stand dabei, wie sich unterschiedliche Kultivierungsparameter, mit Hauptaugenmerk auf die Photonenflussdichte und die Substratkonzentration, im Labor- und Pilotmaßstab auswirken. Als Modellorganismus diente die Mikroalge Chlorella vulgaris. An diesem Stamm wurde der Einfluss der Licht-, Kohlenstoffdioxid- und Stickstoffverfügbarkeit auf das Wachstum und die Zellzusammensetzung unter idealisierten Wachstumsbedingungen in einem Rührkesselreaktor näher untersucht. Es gelang, nicht nur die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit von Chlorella vulgaris in Abhängigkeit von einem limitierenden Substrat, sondern zusätzlich die Auswirkung des Substrates auf die stöchiometrische Grundzusammensetzung zu bestimmen. Im Bereich niedriger Biotrockenmassekonzentrationen von cX = 0,3 g L-1 sind für eine optimale Prozessführung mit einer Wachstumsrate µ ≥ 2 d-1 eine minimale Photonenflussdichte von PFD0 = 200 µmol m-2 s-1, ein CO2-Partialdruck von 0,5 kPa - bzw. ein CO2-Anteil des eintretenden Luftstroms von 0,5 % (v/v) - und eine Ammoniumkonzentration von mindestens c(NH4+)Zulauf = 20 mg L-1 nötig. Für diesen Betriebspunkt ergibt sich eine Zellzusammensetzung mit einem Gesamtproteingehalt zwischen qP = 0,4 und 0,5 g g-1, einem Kohlenhydratgehalt zwischen qKh = 0,2 und 0,3 g g-1 sowie einem Lipidgehalt zwischen qL = 0,1 und 0,2 g g-1. Ist eine höhere Proteinausbeute erwünscht, sollte die beschriebene Strategie einer substratgesättigten Kultivierung bei gleichzeitiger Lichtlimitierung angewendet werden. Wird eine höhere Kohlenhydrat- oder Lipidausbeute verlangt, ist die ausgeführte Strategie einer stickstofflimitierten Kultivierung zielführend. Der eigens zur Untersuchung von stickstoffgesättigtem und -limitiertem Wachstum etablierte kontinuierliche Luminostat-Prozess für Chlorella vulgaris konnte erfolgreich auf die Mikroalge Nannochloropsis limnetica, die Kieselalge Phaeodactylum tricornutum sowie das Cyanobakterium Synechocystis sp. übertragen werden. Bei allen Stämmen führte, übereinstimmend mit publizierten Ergebnissen, ein Stickstoffmangel zu einer Speicherstoffakkumulation und eine ausreichende Stickstoffversorgung zu einer Proteinakkumulation. Die Übertragbarkeit des entwickelten Prozesses kann daher als bestätigt gelten. 
Die Ergebnisse der Wachstumskinetik in Abhängigkeit von der Photonenflussdichte und der Stickstoffverfügbarkeit für den Stamm Chlorella vulgaris sowie das metabolische Netzwerk wurden zur Erstellung eines strukturierten Modells genutzt, um pho-toautotrophes Wachstum zu simulieren. Das generierte Modell ist in der Lage, zellinterne Verän-derungen der Zellzusammensetzung in einem Chargenprozess nach Eintritt einer Stickstofflimi-tierung mit Hilfe spezifischer Raten zu beschreiben. Insgesamt wurden 16 spezifische Raten zur Darstellung der anabolen und katabolen Stoffwechselwege berechnet. Die bei den Simulationen erhaltenen Wachstumsverläufe stimmen sehr gut mit experimentell gewonnenen Daten überein. Im Mittel liegt die relative Streuung der geschätzten Parameterwerte unterhalb der unteren Schranke von 15 %. Das postulierte Zellmodell wird durch das Simu-lationsergebnis und die gemessenen Wachstumskinetiken sowie durch die Er-gebnisse der Luminostat-Versuche unterstützt. Die makromolekulare Zellzu-sammensetzung wird maßgeblich von der Photonenflussdichte, der CO2-Verfügbarkeit und der Stickstoffverfügbarkeit beeinflusst.
Die oben erwähnte Zunahme des Proteinanteils unter lichtlimitierten Wachstumsbedingungen konnte auf einen Anstieg der Anteile der Proteinkomplexe der Photosysteme zurückgeführt wer-den. Von 18 untersuchten Aminosäuren stimmen 12 Aminosäuren in ihrer prozentualen Zunahme zu über 80 % mit deren jeweiligen Anteil in den Proteinkomplexen der Photosysteme I und II überein. Die Erkenntnisse bestätigen Literaturangaben, nach welchen lichtlimitiertes Wachstum zu einer erhöhten Expression von Lichtsammelkomplexen führt. Als Reaktorsystem wurde ein 8 L Plattenreaktor im kontinuierlichen Luminostat-Betrieb eingesetzt. Ergänzend konnte, mit Hilfe von statistischer Versuchsplanung und -auswertung, ein Zu-sammenhang von Protein- und Chlorophyll-Zellquota nachgewiesen werden. Da die Pigmente der Lichtsammelkomplexe ebenfalls unter lichtlimitierten Bedingungen verstärkt exprimiert werden, ist die Aussage nachvollziehbar, dass unter lichtlimitierten Bedingungen der Proteingehalt der Zelle ansteigt. Die Medienkomponenten Ammoniumchlorid, Magnesi-umsulfat und Eisensulfat zeigten einen signifikanten Einfluss auf den Protein- und Pigmentgehalt. Unter den hier verwendeten Versuchsbedingungen wurde für Chlorella vulgaris als Maxi-mum ein Proteinanteil von qP = 0,65 g g-1 erreicht.
Zur genaueren Charakterisierung des Cyanobakteriums Synechocystis sp. wurde die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Licht- und Phosphatverfügbarkeit unter idealisierten Wachstumsbedingungen untersucht. Es zeigte sich, dass eine minimale Photonenflussdichte von PFD0 = 46 µmol m-2 s-1 und eine Phosphatkonzentration von mindestens c(PO43-)Zulauf = 4,16 mg L-1 eingestellt werden sollten, um unter den gegebenen Ver-suchsbedingungen eine hohe Wachstumsrate von µ ≥ 1,3 d-1 zu garantieren. Eine quantitative Charakterisierung der Bedingungen, welche eine Akkumulation des Biopolymers Cyanophycin von bis zu qCP = 0,4 g g-1 begünstigen, wurde mit Hilfe von Chargenprozessen in Plattenreakto-ren verwirklicht. Vorausgehende Arbeiten konnten - wenn auch nur qualitativ - zeigen, dass Sy-nechocystis sp. zur Anreicherung dieses Biopolymers unter Phosphatlimitierung fähig ist. Neben dem spezifischen Phosphoranteil von qP,X &lt; 4 mg g-1, welcher eine erhöhte Cyanophycin-synthese induzierte, konnte der minimal notwendige Phosphoranteil von qP,X &lt; 1 mg g-1 be-stimmt werden, bei welchem das stöchiometrische Limit erreicht wird und die Zellen das Wachs-tum einstellen. Da die Zellen trotz phosphatlimitierten Wachstums bis qP,X &gt; 1 mg g-1 eine gleichbleibende PCE erreichten, kann außerdem davon ausgegangen werden, dass phosphatlimi-tiertes Wachstum keinen Stresszustand für Synechocystis sp. darstellt.
Um die Erkenntnisse aus dem Labormaßstab in den Pilotmaßstab zu übertragen, wurde eine Kultivierung in einem 230 L Freiland-Plattenreaktor durchgeführt. Als Prozessvariante wurde ein im Vergleich zu kontinuierlichen Prozessen ökonomisch sinnvollerer repetitiver Chargenprozess gewählt. Die wechselnden Bedingungen der Tag- und Nachtphasen und die damit verbundenen photosynthetischen und respiratorischen Zellaktivitäten stellen bei Freilandkultivierungen eine besondere Herausforderung dar. Die eintretenden pH Änderungen erforderten die Regelung des CO2-Eintrags durch einen PI-Regler. Wie in vorausgegangenen Arbeiten wurde durch die Kombination eines PI-Reglers mit einer Ammoniaklösung als pH Stellmittel außerdem eine Stickstofflimitierung erfolgreich vermieden. Mit dieser Strategie wurde bei Chlorella vulgaris ein Proteinanteil von bis zu qP = 0,63 g g-1 im Labormaßstab bzw. qP = 0,65 g g-1 im Pilotmaßstab erzielt. Über die Prozesszeit konnte ein zyklischer Verlauf der Zell-zusammensetzung - bedingt durch die Tag- und Nachtphasen - beobachtet werden. In den Nachtphasen sank die Biotrockenmassekonzentration cX um bis zu 10,0 %  aufgrund respiratori-scher Prozesse zur Energiebereitstellung.
Zusammengenommen wurden verschiedene Strategien entwickelt und verifiziert, die eine Mani-pulation der Synthese biologischer Makromoleküle durch photoautotrophe Mikroorganismen ermöglichen. Die Produktausbeute kann aktiv beeinflusst werden. Der Anteil essentieller Ami-nosäuren oder gesättigter Fettsäuren kann im Bereich stöchiometrischer Minima und Maxima verschoben werden; dies kommt den Wünschen der Futter- und Nahrungsmittelindustrie bezüg-lich einer gezielten Produktion physiologisch wertvoller Stoffgruppen entgegen. Kostengünstig wirkt sich die Möglichkeit einer Freilandkultivierung aus. Eine präzise Bestimmung von Wachs-tumskinetiken in Abhängigkeit von limitierenden Substraten kann einen essentiellen Beitrag für die Prozessentwicklung liefern, sofern produktrelevante zellinterne Regelkreise entsprechend berücksichtigt werden. Mess- und regelungstechnische Verfahren ermöglichen außerdem eine Automatisierung von Prozessen. Die quantitative Verfügbarkeit von Nährstoffen und Energielie-feranten bestimmt sämtliche metabolischen Vorgänge in der Zelle und wirkt sich direkt auf die Wachstumsrate aus. Eine gezielte Prozessauslegung erfordert daher eine allumfassende quantita-tive Betrachtung der Abläufe in- und außerhalb einer Zelle.