title: Das DegS-DegU Zwei-Komponenten System und dessen Rolle bei der Regulation des osmotisch induzierbaren yqiHIK Operons aus Bacillus subtilis
title: The DegS-DegU two-component system and its role in regulation of the osmotically inducible yqiHIK Operon of Bacillus subtilis
Creators: name: Löbach, Stephanie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Zellwand , Osmoregulation
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Bacillus subtilis
Mikrobiologie
cell wall hydrolases
two component systems

description: Die Verfügbarkeit von Wasser ist
      essentiell für die Entwicklung von lebenden Zellen. In den
      obersten Bodenschichten, dem natürlichen Lebensraum des
      Gram-positiven Bodenbakteriums Bacillus subtilis, ist dieser
      diversen Stressfaktoren ausgesetzt, die die Verfügbarkeit von
      Wasser beeinflussen. Trockenperioden führen zu einem
      hyperosmotischen Stress für die Zelle, der letztendlich die
      Plasmolyse der Zelle zur Folge haben könnte. Um diesen
      Wasserverlust zu vermeiden, ist B. subtilis in der Lage durch
      Synthese oder Transport kompatible Solute zu akkumulieren und
      sich dadurch vor den negativen Auswirkungen hoher
      Osmolarität/Salinität zu schützen. In Hinblick auf die
      zelluläre Osmoadaptation konnte aber bisher noch nicht
      geklärt werden wie B. subtilis Osmostress wahrnimmt. Die
      Stresswahrnehmung in Bakterien erfolgt oftmals über
      Zwei-Komponenten Systeme (TCS). In Transkriptomanalysen
      hyperosmotisch gestresster B. subtilis Kulturen wurde das
      DegS-DegU TCS als einziges salzinduzierbares System
      identifiziert (299). Dieses System kontrolliert eine Vielzahl
      von Prozessen die charakteristisch für die Übergangsphase von
      der exponentiellen zur stationären Phase und während
      zellulärer Differenzierungswege sind. Das DegS-DegU TCS
      konnte zwar schon als salzinduziert identifiziert werden,
      aber wie genau es auf osmotischen Stress reagiert konnte
      nicht geklärt werden. Im Verlauf meiner Promotion konnte ich
      mittels Reportergenanalysen die Salzinduktion des degSU
      Genclusters nachweisen. Weiterhin konnte ein positiver
      Feedback Loop von DegU~P auf den eigenen Promotor (degUP3)
      erstmals unter Salzstress nachgewiesen werden. Außerdem
      zeigte sich, dass die Expression des degUP3 Promotors nur bei
      hohen Salzkonzentrationen (≥ 0,8 M NaCl) erfolgt. Das
      DegS-DegU TCS wird durch zwei Proteine (RapG und PhrG)
      reguliert (236), die in dieser Studie durch
      Reportergenanalysen ebenfalls als salzinduziert identifiziert
      wurden. Die phänotypische Charakterisierung zeigte, dass die
      Deletion des DegS-DegU TCS unter hyperosmotischen Bedingungen
      zu einer geringen Verlängerung der Lag-Phase von B. subtilis
      Kulturen führt. Interessanterweise führte die
      Hyperphosphorylierung von DegU zu einem stark verbesserten
      Wachstum, sowohl unter isoosmotischen als auch unter
      hyperosmotischen Bedingungen. Dieser Phänotyp konnte nicht
      auf die Akkumulation des de novo synthetisierten kompatiblen
      Soluts Prolin zurückgeführt werden. Um eine mögliche
      Beteiligung von DegS-DegU in der Adaptation an hochsaline
      Bedingungen zu studieren, wurden die Gene, die DegU~P
      reguliert, in Hinblick auf ihre Salzinduktion
      charakterisiert. Dabei kristallisierte sich heraus, dass die
      Hälfte des DegU~P Regulons (197) salzinduzierbar ist, jedoch
      die Salzinduktion unabhängig von DegS-DegU ist. Dies zeigte
      sich durch Reportergenstudien der Gene aus dem Überlapp des
      DegU~P Regulons und des Salz-Modulons, die trotz einer
      Deletion des DegS-DegU TCS immer noch salzinduzierbar waren.
      In diesem Zusammenhang wurde das vor kurzem identifizierte
      Typ VII Sekretionssystem (T7SS, yukE-yueD) detaillierter
      analysiert. Die Deletion des T7SS führte unter
      hyperosmotischen Bedingungen im B. subtilis 168 Laborstamm zu
      keinem Phänotyp. Es zeigte sich aber, dass dessen Expression
      salzinduzierbar ist und durch das DegS-DegU TCS reguliert
      wird. Reportergenanalysen deckten auf, dass DegU~P unter
      pyhsiologischen Bedingungen als Aktivator und unter
      hyperosmotischen Bedingungen möglicherweise als Repressor
      agiert. Weiterhin wurde eine Beteiligung der
      Biofilmregulatoren SinR, ein Repressor, und RemA, ein
      Aktivator, nachgewiesen. Der Schwerpunkt meiner Arbeit
      fokussierte sich auf die Analyse der Regulation des osmotisch
      induzierbaren yqiHIK Operons und dessen Regulation durch das
      DegS-DegU Zwei-Komponenten System. Das yqiHIK Operon, welches
      in verschiedenen Transkriptomstudien (172, 230, 299) als
      stark salzinduzierbar identifiziert wurde, steht ebenfalls
      unter der Kontrolle des DegS-DegU TCS (86).
      Reportergenanalysen und ein Northern Blot zeigten, dass das
      Operon als eine Einheit transkribiert wird und diese
      salzinduzierbar ist. Weiterhin wiesen diese Analysen darauf
      hin, dass DegU~P in diesem Fall als Aktivator fungiert. Durch
      Verkürzungen einer stromaufwärts gelegenen AT-reichen Region
      und der gerichteten Mutagenese putativer DegU~P Bindestellen,
      konnte eine Bindestelle von DegU~P in einem Abstand von 203
      bp zum Transkriptionsstart identifiziert werden. Durch
      Western Blot Analysen konnte die N-Acetylmuramyl–L-Alanin
      Amidase YqiI im extrazellulären Bereich lokalisiert werden
      und die Glycerophosphodiester Phosphodiesterase YqiK im
      Zytoplasma. Dies erlaubte eine neue Beschreibung der
      physiologischen Funktion der von yqiHIK kodierten Proteine.
      Die Eigenschaften des yqiHIK Promotors wurden außerdem als
      Hilfsmittel genutzt um die Rolle von DegS-DegU während der
      Osmoadaptation näher zu charakterisieren. Durch Mutationen im
      SigA-abhängigen Promotor von yqiHIK, die das
      Expressionsniveau verbessern, konnte dieser trotzdem durch
      Salzstress induziert werden, obwohl das DegS-DegU TCS
      deletiert wurde. Eine synthetisch hergestellte
      membrangebundene Kinase (KinC-DegS) führte ebenfalls zu einer
      Salzinduktion von yqiHIK, obwohl diese Hybridkinase nicht auf
      ein osmotisches Signal reagiert (193). Entgegen eines zuvor
      gemachten Vorschlags (279) konnte also in dieser Dissertation
      gezeigt werden, dass DegS nicht der global-agierende
      Salzsensor in B. subtilis ist. Das DegS-DegU System trägt
      aber zur Transkriptionskontrolle einer Vielzahl von
      Salzstress-regulierten Genen von B. subtilis bei.
description: Water availability is essential
      for the development of living cells. In the upper layers of
      soil, the natural habitat of the gram-positive soil bacterium
      B. subtilis, it is faced to various stresses that have an
      influence on the availability of water. Long dry periods lead
      to a hyperosmotic stress that finally could cause
      plasmolysis. To avoid this loss of water, B. subtilis is able
      to accumulate compatible solutes by either transporting them
      or synthesizing them and to protect itself from the negative
      impacts of high osmolality/salinity. In terms of the
      osmoadaptation the big question is how B. subtilis is able to
      sense osmotic stress. Two component systems (TCS) play a
      crucial role in sensing environmental stresses.
      Transcriptomic data of osmotically stressed B. subtilis cells
      revealed that only the DegS-DegU TCS is salt inducible (299).
      This system controls different processes which are
      characteristic for the transition from the exponential to the
      stationary phase and for cellular differentiation procedures.
      The DegS-DegU TCS was identified to be salt inducible,
      however the exact mechanism how it reacts to osmotic stress
      remained unclear (299). In the course of my study reporter
      gene studies confirmed the salt induction of the degSU
      operon. For the first time the positive feedback loop of
      DegU~P on its own promotor (degUP3) under salt stress
      conditions was shown. The expression of degUP3 is only
      activated upon high salt concentrations (≥ 0.8 M NaCl).
      Reporter gene studies of two proteins (RapG and PhrG) that
      regulate the TCS (236), were shown to be salt inducible.
      Phenotypic characterisations highlighted the role of the
      DegS-DegU TCS during the growth of B. subtilis. The deletion
      of the DegS-DegU TCS lead to a slightly longer lag phase
      under hyperosmotic conditions. Interestingly the
      hyperphosphorylation of DegU leads to a strong enhancement of
      growth under physiological and hyperosmotic conditions. This
      phenotype is not due to the de novo synthesis of the
      compatible solute proline. To analyse a putative role of
      DegS-DegU in the adaptation to high salinity, genes which are
      regulated by DegU~P were analysed in terms of their salt
      induction. Here I could show that half of the DegU~P regulon
      (197) is salt inducible, but this induction is independent of
      the DegS-DegU TCS. This was schown by reporter gene analysis
      of genes which belong both to the DegU~P regulon as well as
      to the salt modulon. These genes were still salt inducible,
      although the DegS-DegU TCS was deleted. In conjunction with
      this, the recently identified type VII secretion system
      (T7SS, yukE-yueD) was analysed in detail. Deletion of the
      T7SS revealed no phenotype under hyperosmotic conditions in
      B. subtilis 168 laboratory strain. Reporter gene analysis
      showed that the T7SS is salt inducible and regulated by the
      DegS-DegU TCS. Under physiological conditions DegU~P acts a
      transcriptional activator, but under hyperosmotic conditions
      DegU~P seems to be a repressor. Furthermore, the involvement
      of the biofilm regulators SinR, a repressor, and RemA, an
      activator, was proven. The main focus of my studies was the
      analysis of the regulation of the osmotically inducible
      yqiHIK operon and its regulation by the DegS-DegU two
      component system. The yqiHIK operon, which was shown to be
      highly salt inducible in different transcriptomic data (172,
      230, 299), is additionally regulated by the DegS-DegU TCS
      (86). Reporter gene and Northern blot analysis showed that
      yqiHIK is transcribed in one operon, which is salt inducible.
      Furthermore, the analysis highlighted the role of DegU~P as a
      transcriptional activator. Truncations of a far upstream
      AT-rich region and site directed mutagenesis of putative
      DegU~P binding sites, highlighted a DegU~P binding site at a
      distance of 203 bp from the transcriptional start site. The
      N-acetylmuramoyl–L-alanine amidase YqiI was localized by
      Western blot analysis in the extracellular space and the
      glycerophosphodiester phosphodiesterase YqiK in the
      cytoplasm. This results enables me to suggest a physiological
      function for the yqiHIK encoded proteins. The characteristics
      of the yqiHIK operon were further used as a device to analyse
      the role of the DegS-DegU TCS during the osmoadaptation. The
      promoter activity of the SigA-type promoter of yqiHIK was
      increased by site directed mutagenesis and showed a salt
      induction which is independent of the TCS DegS-DegU.
      Additionally the yqiHIK operon was still salt inducible,
      although the putative osmosensor was membrane bound instead
      of cytoplasmically localized by a synthetically produced
      chimeric enzyme (KinC-DegS). This chimeric enzyme does not
      respond to osmotic stresses (193). Contrary to a prior
      hypothesis (279), I could show that DegS is not the
      globally-acting salt sensor in B. subtilis. The DegS-DegU TCS
      however contributes to the transcriptional control of a
      multitude of salt stress regulated genes in B.
      subtilis.