title: Investigation of antibiotically active compounds produced by newly isolated endophytic fungi Aspergillus westerdijkiae, Akanthomyces muscarius and Alternaria sp.
Creators: name: Isikoglu, Havva
Publisher: name: :none
Year: 2019

description: Durch die Zunahme der Antibiotikaresistenzen wird es immer schwieriger, wirksame Antibiotika gegen Infektionskrankheiten bereitzustellen. Daher werden dringend neue Quellen für Antibiotika gesucht, um den Bedarf an neuen Wirksubstanzen decken zu können. In dieser Hinsicht sind Endophyten eine vielversprechende neue Quelle. Endophyten sind kommunikative Mikroorganismen, die im Inneren von Pflanzen leben und daher ein hohes Potential für interaktive Substanzen besitzen. Sie produzieren zahlreiche sekundäre Metabolite, unter anderem auch antimikrobielle Substanzen. Aus diesen Gründen wurden in dieser Diplomarbeit Pilzendophyten aus der Medizinalpflanze Edelweiß (Leontopodium nivale subsp. alpinum) auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen verschiedene Testorganismen, wie z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Sacharomyces cerevisiae, Fusarium graminearum und Aspergillus niger, untersucht. Kulturmedien wurden mit Endophytenreinkulturen beimpft und inkubiert. Die Ansätze wurden mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und mit Hilfe von Agardiffusionstests auf ihre antibiotische Wirkung getestet. Aktive Extrakte wurden mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) analysiert und anschließend mithilfe von semi-präparativer HPLC aufgetrennt und fraktioniert, um Reinsubstanzen zu erhalten. Schließlich wurden aktive Substanzen mittels hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) identifiziert. Fünf aus Edelweiß isolierte Pilzendophyten wurden untersucht, wobei zwei Isolate antibiotische Aktivitäten zeigten. Das Isolat LN733 wurde als Aspergillus westerdijkiae und LN303 als Akanthomyces muscarius identifiziert. Das Gesamtextrakt von A. westerdijkiae zeigte antibiotische Aktivitäten gegen die Testorganismen B. subtilis, E. coli und S. cerevisiae. Bioassays der Fraktionen wiesen die antibiotische Aktivität gegen S. cerevisiae den Fraktionen 9 und 10 zu, während die Fraktionen 12 und 13 Aktivitäten gegen E. coli und B. subtilis zeigten. Des Weiteren wies Fraktion 16 eine antibiotische Aktivität gegen B. subtilis auf. Massenspektrometriesche Untersuchen zeigten, dass in den aktiven Fraktionen v.a. ungesättigte und gesättigte langkettige Fettsäuren enthalten waren. Untersuchungen der Fraktion 12 mittels HRMS und NMR ergaben, dass Linolsäure für die antibiotische Aktivität gegen B. subtilis verantwortlich war. Das Gesamtextrakt von A. muscarius war aktiv gegen E. coli, S. cerevisiae, F. graminearum und A. niger. Mithilfe semi-präparativer HPLC konnte durch Fraktionierung und anschließender Subfraktionierung der aktiven Fraktion eine Reinsubstanz gewonnen werden. NMR Analysen zufolge handelt es sich hierbei um die Substanz Emestrin A. Agardiffusionstest der Reinsubstanz zeigten eine komplette Inhibition bei den Testorganismen E. coli und S. cerevisiae, während bei den filamentösen Pilzen F. graminearum und A. niger nur eine partielle Inhibition beobachtet wurde.
description: The increase of antibacterial resistance makes it difficult to provide effective antibiotics against infectious diseases. Therefore, new sources for antibiotics are being searched to meet the need for new drugs. In this regard, endophytes are a promising source for the discovery of new antibiotics. Endophytes are communicative microorganisms, which are living inside plants and have therefore a high potential for interactive substances. They produce numerous secondary metabolites, including antimicrobial compounds. In this Diploma Thesis, fungal endophytes from the medicinal plant Leontopodium nivale subsp. alpinum (Edelweiss) were tested for their antimicrobial activity against various test organisms such e.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis, Sachharomyces cerevisiae, Fusarium graminearum and Aspergillus niger. Media were inoculated and incubated with pure cultures of the endophytes. The cultures were extracted with appropriate solvents and tested for their antibiotic activity by diffusion disc assays. Active extracts were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and then fractionated with semi-preparative HPLC to obtain pure substances. Finally, active substances were identified by high-resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Five isolated endophytes were investigated, whereby two showed an antibiotic activity. The fungus LN733 was identified as Aspergillus westerdijkiae and LN303 as Akanthomyces muscarius. The total extract of A. westerdijkiae showed antibiotic activity against the test organisms B. subtilis, E. coli and S. cerevisiae. Bioassays of the fractions showed antibiotic activity against S. cerevisiae for fractions 9 and 10, while fractions 12 and 13 showed activity against E. coli and B. subtilis. Furthermore, fraction 16 had antibiotic activity against B. subtilis. Mass spectrometry revealed that in the active fractions unsaturated and saturated long-chain fatty acids were prominent. Analyses of fraction 12 with HRMS and NMR spectroscopy revealed that linoleic acid was responsible for the antibiotic activity against B. subtilis. The total extract of A. muscarius was active against E. coli, S. cerevisiae, F. graminearum and A. niger. According to NMR analyzes, the active substance was emestrin A. Diffusion disc assays of the pure substance showed complete inhibition against the test organisms E. coli and S. cerevisiae, whereas partial inhibition was observed testing against the filamentous fungi F. graminearum and A. niger.