title: Biochemical and molecular analyses of the biosynthesis pathway of the indole derivatives in Piriformospora indica
title: Biochemical and molecular analyses of the biosynthesis pathway of the indole derivatives in Piriformospora indica
title: Biochemische und molekulare Analysen des Biosynthesepfads von Indolderivaten bei Piriformospora indica
Creators: name: Hilbert, Magdalena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: plant-fungi interaction
root endophyte Piriformospora indica
Biowissenschaften, Biologie

description: Der mutualistische Wurzelendophyt
      Piriformospora indica besitzt die Fähigkeit eine Vielzahl
      unterschiedlicher Pflanzen, einschließlich der monokotylen
      Gerste (Hordeum vulgare) und der dikotylen Modelpflanze
      Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana), zu besiedeln. Die
      Besiedelung sowohl von Ackerschmalwand als auch von Gerste
      ist durch eine Besiedlungsstrategie charakterisiert, welche
      sich in zwei Phasen unterteilt: einer initialen, biotrophen
      Interaktion und einer, sich daran anschließenden, Zelltot-
      assoziierten Phase. Im Verlauf beider Phasen können
      Pilzhyphen inter- und intrazellulär beobachtet werden. Das
      Pilzwachstum beschränkt sich hierbei jedoch auf die
      Cortexzellen der Wurzel, eine Besiedelung von Endodermis oder
      Zentralzylinder konnte nie beobachtet werden. Die Besiedlung
      der Wurzelzellen durch P. indica ist dabei oft mit
      vorteilhaften Effekten für den Wirt assoziiert, wie zum
      Beispiel Wachstumsförderung und Änderungen der
      Wurzelmorphologie. Das breite Wirtsspektrum und die positiven
      Effekte für den Wirt lassen auf eine generelle
      Interaktionsstrategie schließen, bei der Proteine des Pilzes
      mit pflanzlichen Signalwegen interagieren, die in vielen
      verschiedenen Pflanzenarten vorkommen. Ein solcher
      Mechanismus könnte der Eingriff von P. indica in die
      Phytohormonbiosynthese sein. Hierzu konnte kürzlich gezeigt
      werden, dass Phytohormone neben ihrer Rolle als Regulatoren
      von Entwicklungsprozessen in Pflanzen auch an der
      Pflanzenabwehr beteiligt sind. Des weiteren wurde bereits die
      Sekretion von Indol-3-Essigsäure (IAA) in das Wachstumsmedium
      durch P. indica beschrieben. In der vorliegenden Doktorarbeit
      wurde die Produktion von IAA aus Tryptophan in P. indica
      durch eine Reihe biochemischer und molekularer Methoden
      charakterisiert. Die Hauptziele lagen dabei auf einer
      funktionellen Untersuchungen der IAA Biosynthese in P. indica
      und welche Auswirkung diese auf die Kompatibilität während
      der biotrophen Interaktion von P. indica mit Gerstenwurzeln
      haben. Hierfür wurden geeignete molekulare Methoden für den
      Gebrauch in P. indica etabliert und optimiert. Zu diesen
      gehören eine PEG-vermittelte genetische Transformation, sowie
      ein GFP-Reporter- und ein RNA-Interferenz (RNAi) System.
      Mittels zeitabhängiger Analyse der Transkriptionsrate nach
      Zugabe von Tryptophan, konnte das Tryptophan-Aminotransferase
      Gen piTam1 als Kandidat für die Beteiligung an der
      IAA-Produktion in P. indica identifiziert werden. Die
      Untersuchung des piTam1 Promoters durch ein GFP-Reporter
      System sowie transkriptionelle Analysen des Genes in
      besiedelten Gerstenwurzeln, verifizierten die Aktivierung der
      piTam1 Expression während der biotrophen Phase. Durch
      Suppression dieser Expression mittels RNA-Interferenz (RNAi)
      wurde piTam1 als Schlüsselgen in der Umwandlung von
      Tryptophan in Indol-3-Pyruvat (IPA) identifiziert, welches
      den ersten Schritt in der Produktion von Auxin aus Tryptophan
      darstellt. RNAi Transformanden, deren Auxin-Produktion
      gehemmt war, zeigten ein weniger kompaktes Koloniewachstum
      und unterschieden sich in ihrer Fähigkeit Indol-3-Acetaldehyd
      (IAD) umzusetzen. Zusätzlich führte die gehemmte
      IAA-Biosynthese zu einer verminderten Besiedlung von
      Gerstenwurzeln durch P. indica während der ersten drei Tage
      der Interaktion, wobei jedoch die wachstumsfördernden Effekte
      nicht beeinflusst wurden. Konsequent, ein erhöhter Gehalt an
      freiem IAA und Indol-3-Lactat (ILA) einem Nebenprodukt der
      IAA Biosynthese in P. indica, konnten in besiedelten Wurzeln
      im Vergleich zu Kontrollwurzeln beobachtet werden. Obwohl 3
      Tage nach Inokulation mit P. indica eine erhöhte IAA
      Konzentration in planta gemessen wurde, ist es
      unwahrscheinlich, dass die beobachteten Unterschiede
      lediglich durch pilzliches IAA verursacht wurden. Dies lässt
      eine Akkumulation von pilzlichen und pflanzlichen IAA
      vermuten und stimmt mit den Änderungen der IAA
      Signalübertragung und der Biosynthese im Gerste-Transkriptom
      zu diesem Zeitpunkt überein.
description: The mutualistic root endophyte
      Piriformospora indica has the ability to colonize a wide
      range of plants including the monocot barley (Hordeum
      vulgare) and the dicot model plant Arabidopsis thaliana. The
      colonization of both, Arabidopsis and barley is characterized
      by a biphasic colonization strategy with an initial
      biotrophic interaction followed by a cell death associated
      phase. During both phases fungal inter- and intracellular
      growth is restricted to the root cortex cells and can never
      be observed in the endodermis or the central cylinder. The
      colonization of root cells by P. indica is often associated
      with beneficial effects to the host, such as growth promotion
      and changes in root morphology. The broad host range and the
      widely conferred benefits to the hosts suggest that the
      beneficial outcome could be based on general mechanisms and
      signaling pathways common to many different plant species.
      One such mechanism could be the recruitment of phytohormone
      pathways by P. indica. Beside their function in plant
      developmental processes, phytohormones were recently
      described to be involved in plant defence responses.
      Secretion of indole-3-acetic acid (IAA) by P. indica into the
      growth medium has already been reported. In this PhD study a
      tryptophan dependent IAA production pathway was identified in
      P. indica using biochemical and molecular methods. The main
      goals were focused on the functional analyses of the P.
      indica tryptophan dependent IAA pathway and how this may
      affect compatibility during the biotrophic interaction
      between P. indica and barley roots. For this, suitable
      molecular tools such as a PEG-mediated genetic
      transformation, a GFP reporter and an RNAi-mediated silencing
      system were established or optimized for use in P. indica.
      Time course transcriptional analyses after exposure to
      tryptophan designated the tryptophan aminotransferase piTam1
      gene as the top candidate gene involved in the production of
      IAA in P. indica. A green fluorescence protein (GFP) reporter
      study and transcriptional analysis of colonized barley roots
      showed that piTam1 is induced during the biotrophic phase.
      Via an RNAi-mediated gene silencing piTam1 was identified as
      a key gene involved in the first step of auxin biosynthesis.
      RNAi transformants impaired in auxin production were
      characterized by a less compact colony growth phenotype and
      differences in their ability to utilize indole-3-acetaldehyde
      (IAD). Additionally, silencing of the piTam1 gene resulted in
      a reduced P. indica colonization of barley roots at 3 days
      after inoculation (dai) but the elicitation of growth
      promotion was not affected compared with barley colonized by
      the P. indica wild-type strain. Consistently an increased
      amount of free IAA and free indole-3-lactate (ILA), a
      byproduct of P. indica IAA biosynthesis pathway, could be
      detected in P. indica colonized barley roots compared to non
      colonized control plants at this time point Given the large
      amount of IAA detected in planta at 3 dai and the amount of
      IAA produced by P. indica in culture after tryptophan
      induction, it is unlikely that the differences in free IAA
      levels observed in planta are merely derived from fungal IAA.
      This suggests a local accumulation of both fungal and plant
      IAA during the initial biotrophic phase and is consistent
      with changes in IAA signaling and biosynthesis observed in
      barley transcriptome at this time point.