Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για τον προσδιορισμό τετρακυκλινών σε διάφορα δείγματα τροφίμων ζωικής προέλευσης
Creators: name: Νικολαϊδου, Κωνσταντίνα Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Τετρακυκλίνες
Βόειος, χοίρειος μυϊκός ιστός
Tetracyclines
Bovine and porcine tissues

description: Οι τετρακυκλίνες αποτελούν μία από τις σημαντικότερες κατηγορίες αντιβιοτικών “ευρέος φάσματος”. Η υψηλή δραστικότητάς τους έναντι διαφόρων τύπων βακτηρίων, τόσο gram-θετικών, όσο και gram-αρνητικών, έχει ως αποτέλεσμα αυτές να χορηγούνται, τόσο στην ιατρική όσο και στην κτηνιατρική, για την αντιμετώπιση πληθώρας βακτηριακών και μη λοιμώξεων. Η χρήση τους όμως δεν περιορίζεται αποκλειστικά σε θεραπευτικούς σκοπούς, αλλά επεκτείνεται και στον τομέα της κτηνοτροφίας, όπου χορηγούνται για προληπτικούς σκοπούς και ως αυξητικά πρόσθετα στις ζωοτροφές. Η εκτεταμένη και αλόγιστη χορήγηση τους στην κτηνοτροφία τις τελευταίες δεκαετίες ενέχει τον κίνδυνο, ποσότητες αυτών να περνούν από τα ζώα στα προϊόντα τους και από εκεί στην διατροφική αλυσίδα, με αποτέλεσμα αφενός μεν την ανάπτυξη ανθεκτικών βακτηριακών στελεχών που εξουδετερώνουν τη δράση των συνταγογραφούμενων αντιβιοτικών στην ιατρική, αφετέρου την δημιουργία κινδύνων για τη δημόσια υγεία (αλλεργίες). Για την αντιμετώπιση του προβλήματος καθίσταται αναγκαίος ο έλεγχος της παρουσίας καταλοίπων τετρακυκλινών σε κάθε είδους κτηνοτροφικά προϊόντα, μεταξύ των οποίων και στο κρέας. Η παρούσα εργασία ασχολείται με την ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων για τον ταυτόχρονο διαχωρισμό και προσδιορισμό επτά αντιβιοτικών της κατηγορίας των τετρακυκλινών, της οξυτετρακυκλίνης (OTC), της τετρακυκλίνης (TC), της μινοκυκλίνης (MNC), της χλωροτετρακυκλίνης (CTC), της δοξυκυκλίνης (DC), της μετακυκλίνης (MTC) και της ντεμεκλοκυκλίνης (DMC) σε μία σειρά κτηνοτροφικών προϊόντων, στην οποία περιλαμβάνονται διάφοροι τύποι ζωικών ιστών (βόειοι και χοίρειοι μυϊκοί ιστοί, μυϊκοί ιστοί πουλερικών, ήπαρ και νεφρός), δείγματα γάλακτος και αυγών, με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC). Ο διαχωρισμός των επτά τετρακυκλινών επιτεύχθηκε με μία στήλη Kromasil 250 x 4 mm, C18, 5 μm χρησιμοποιώντας ως κινητή φάση το μίγμα: Α: υδατικό διάλυμα 0.01 M C2H2O4 (pH=2) και 10-4Μ Na2ΕDTA/Β: CH3CN με βαθμωτή έκλουση. Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των επτά TCs πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων (DAD). Στη συνέχεια για την εφαρμογή της αναπτυσσόμενης μεθόδου στον προσδιορισμό των επτά τετρακυκλινών στα κτηνοτροφικά προϊόντα που επιλέχθηκαν, μελετήθηκαν διεξοδικά διάφορα πρωτόκολλα προκατεργασίας των εμβολιασμένων δειγμάτων των προϊόντων. Το γενικό σχήμα της προκατεργασίας για κάθε υπόστρωμα περιλάμβανε μια σειρά από κοινά βήματα, παραλαβή των TCs από τα εμβολιασμένα δείγματα μέσω εκχυλίσεων με ρυθμιστικό διάλυμα και καθαρισμό του εκχυλίσματος με την τεχνική της SPE. Ως καταλληλότερο εκχυλιστικό σύστημα κρίνεται σε κάθε περίπτωση το ρυθμιστικό διάλυμα των οξαλικών (pH 4), ενώ στις περιπτώσεις των δειγμάτων γάλακτος, λεκίθου αυγού, ήπατος, νεφρών και πουλερικών προηγούνταν καταβύθιση των πρωτεϊνών με υδατικό διάλυμα TFA διαφόρων συγκεντρώσεων. Για τον καθαρισμό των εκχυλισμάτων που προκύπτουν μετά την εκχύλιση των τετρακυκλινών επιλέχθηκε η χρήση διαφορετικών για κάθε υπόστρωμα μικροστηλών (Nexus για τους βόειους και χοίρειους ιστούς και την λέκιθο των αυγών, Discovery για το γάλα και τα δείγματα ήπατος και Lichrolut για τους ιστούς πουλερικών και τα δείγματα νεφρών). Οι μέθοδοι προκατεργασίας που αναπτύχθηκαν χαρακτηρίζονται από σχετική απλότητα, συντομία, μικρή κατανάλωση οργανικών διαλυτών, υψηλά ποσοστά ανακτήσεων και επιτυχή απομάκρυνση τυχόν παρεμποδίσεων. Όλες οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν για τον προσδιορισμό των επτά TCs στα διάφορα υποστρώματα επικυρώθηκαν σύμφωνα με τα χαρακτηριστικά επίδοσης και τις απαιτήσεις που ορίζει η απόφαση 2002/657/EC ως προς τα κριτήρια της γραμμικότητας, της επαναληψιμότητας, της ενδιάμεσης επαναληπτικότητας, της ευαισθησίας, της εκλεκτικότητας, της σταθερότητας, του ορίου απόφασης και της ικανότητας ανίχνευσης. Τα όρια ποσοτικής αποτίμησης για όλες τις τετρακυκλίνες σε όλα τα υποστρώματα ήταν σαφώς χαμηλότερα από το ορισμένο από τη νομοθεσία κάθε φορά MRL. Τόσο οι ανακτήσεις που επιτεύχθηκαν, όσο και οι τιμές των συντελεστών CV που υπολογίστηκαν κατά τον έλεγχο τηςεπαναληψιμότητας και της ενδιάμεσης επαναληπτικότητας κρίνονται πολύ ικανοποιητικές κατά τη σύγκρισή τους με τα όρια που θέτει η απόφαση 2005/657/EC.
description: Tetracycline antibiotics (TCs) are broad-spectrum agents, exhibiting activity against infections caused by both Gram-positive and Gram-negative bacteria, as well as chlamydia, mycoplasmas, rickettsiae and protozoan parasites. TCs are the most widespread group of antibiotics used in veterinary medicine and animal husbandry, not only to prevent and treat certain diseases, but also to fraudulently promote growth. However the abundant and in some cases improper use of TCs may result in the presence of residues in edible animal tissues, which can be toxic and dangerous for human health and potentially cause allergic reactions. Moreover the long-term presence of TCs as residues even in low doses may generate the evolution of micro-organisms provoking resistance to antibiotics. In the present study high-performance liquid chromatographic methods were developed and validated for the determination of seven tetracyclines: minocycline (MNC), tetracycline (TC), oxytetracycline (OTC), chlortetracycline (CTC), doxycycline (DC), demeclocycline (DMC) and methacycline (MTC), in various food products of animal origin. The separation of the examined TCs was achieved on a Kromasil 250 x 4 mm, C18 5 μm analytical column, operated at ambient temperature, with the following elution system: C2H2O4 (0,01 M, pH=2)-10-4Μ Na2ΕDTA/CH3CN according to a gradient program, Detection and quantitation of the seven TCs was performed on a photodiode array detector at 355 nm. In order to apply the developed method to the determination of TCs in a number of selected food products of animal origin which were chosen (bovine, porcine and chicken tissues, milk, egg yolk, liver and kidney tissues), various protocols were tested for the preparation of the spiked samples of those products. Sample preparation of each matrix includes extraction of TCs from the samples with a buffer and cleaning-up the extracts with SPE. Oxalate buffer (pH 4) is considered as the most suitable buffer for the extraction of TCs from all kind of matrices. For milk, egg yolk, liver, kidney and chicken tissues, proteins were first precipitated. Three different cartridges (Nexus, Discovery, Lichrolut) were chosen to be used during the optimization of the SPE procedure for the purification of extracts taken from each matrix. Application of the most efficient for each sample-matrix preparation protocol, lead to the absence of unknown peaks due to endogenous compounds which co-elute with TCs preventing their detection or quantitation. The procedure for each sample-matrix was validated according to the European Union regulation 2002/657/EC determining selectivity, decision limit, detection capability, accuracy, precision and stability. Limits of quantitation of all seven TCs determined in each matrix were lower than from the Maximum Residue Level (MRL) enacted by E.U. in each case. Both mean recoveries of TCs from the matrices and CV values calculated during accuracy and precision tests are very satisfactory after comparison with the limits set by 2002/657/EC decision. Decision limits (CCα) and detection capability (CCβ) values were also calculated for each TC in every matrix at the MRL. Finally during stability study the examined TCs showed a uniform behaviour, since they were stable at all spiked samples for 4 weeks. Stability was also assessed after four freezing-defrosting cycles. TCs concentrations were stable for two cycles of freezing and de-frosting the tissue samples, while a mean decrease of 30% in concentration was observed after the third cycle. In conclusion it should be noticed that the characteristics of the developed method such as quantitation limits lower than MRL, good sensitivity, satisfactory recoveries, simple sample pretreatment method, relatively short analysis time, demonstrate that the method can be easily and reliably applied to the detection and determination of TC antibiotic residues in a number of food products of animal origin.