Chemical tools for protein analysis: development of an MS-cleavable cross-linker and a new approach for glycopeptide enrichment
Creators: name: Caixeta, Vanessa
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2018
Subjects: subject: Cross-linking
subject: Glycoproteomics
subject: Enrichment
subject: 570
subject: 540
subject: Proteomik
subject: Glycoproteine

description: The technological development in analytical methods, especially in chromatography and mass spectrometry, has allowed a deeper understanding of biological systems at a molecular level. Characterization and quantification of biomolecules and its modifications are crucial for comprehension of the entire biological machinery. However, additional bioanalytical methods are needed to gain more detailed information about protein structure, dynamic protein complexes and low abundant protein modifications. Herein chemical tools are used in addition to well-established shotgun proteomic approaches in order to enhance the knowledge of protein structure and information about glycosylation as a protein modification. Cross-linkers are used as molecular rulers or molecular bridges to connect two amino acid residues at a specific distance via covalent bonds. These tools assist in the characterization of the three-dimensional structure of a protein or of protein complexes. In the first part of this work a new MS-cleavable phosphonate cross-linker was proposed, with the aim to perform a neutral elimination reaction during the tandem MS fragmentation. The new phosphonate cross-linker PXL 14 was synthesized in 3 steps from commercial sources. This linker was evaluated using synthetic peptides. The linkage reaction was optimized by adjusting the buffer system and pH value in order to avoid in-situ chemical cleavage. Distinct fragmentation techniques were applied to observe the linker fragmentation in tandem mass spectrometric experiments. Low-energy HCD fragmentation showed favorable cleavage of the cross-linker bonds instead of the peptide backbone fragmentation. The acryloyl fragment of the Ac-IEAEKGR peptide is the second most intense ion in HCD with 18% NCE. Bovine serum albumin was used as model protein to evaluate PXL in a more complex system. The cross-linker reaction with BSA was monitored using SDS-PAGE. After optimization of conditions for cross-linker reaction and proteolytic digestion, cross-linked peptides were analyzed using LC-MS/MS methods. Manual data analysis allowed the identification of 7 intra-linked peptides, including 2 non-previously reported; 3 loop linked peptides and 8 peptides derived from chemical cleavage. Chemical tools were also developed in this work to improve glycopeptide enrichment in studies of glycan protein modifications. Glycosylation is one of the most common post-translational protein modifications and one of the most complex modifications due to the diversity in the monosaccharides building blocks, the linkage types among those monosaccharides and their extension. Besides micro- and macroheterogeneity, the low abundance of modified peptides after proteolytic protein degradation is a major obstacle for analysis of glycopeptides using the standard proteomic workflows. Therefore, an efficient glycopeptide enrichment strategy is required prior to LC-MS/MS analysis. In this work an improved enrichment methodology is proposed based on the chemical properties of glycopeptides/glycoproteins. A smart cleavable disulfide linker containing hydroxylamine groups was attached on the surface of beads. The linker 40 was synthesized in 6 steps from commercial source prior to the bead surface modification. The hydroxylamine group reacts with aldehydes leading to a covalent oxime bond. Reactive aldehyde groups were introduced on terminal glycan residues, e.g. via selective oxidation of sialic acid using sodium periodate or via enzymatic oxidation of terminal galactose by galactose oxidase. In this approach both, neutral and negatively charged, synthetic glycopeptides were enriched and released under reductive conditions by disulfide bond cleavage. This strategy allowed glycopeptide release independently of glycan nature and peptide backbone. The released glycopeptides presented only a minor modification of the chemical structure in the terminal glycan residue. Moreover, we demonstrated that this approach is compatible with tandem mass tag labeling, which would enable quantification with current available TMT methodologies. Amino acid analysis demonstrated that the enrichment of synthetic sialylated glycopeptide had a yield of 32% and a yield of 40% for a synthetic galactosylated peptide. The enrichment method was also evaluated using model proteins. In this case, fetuin and asialofetuin were applied using different oxidation methods: sodium periodate and GOase oxidation, respectively. For the fetuin sample, a total of 28 unique glycopeptides were identified. Among them, 7 were unique O-glycopeptides and 21 were unique N-glycopeptides. These peptides covered 2 O- and 2 N-glycosylation sites from fetuin A, and 2 O-glycosylation sites from fetuin B. On the other hand, 98 unique glycopeptides were identified for asialofetuin. Herein, 11 unique O-glycopeptides covered 1 fetuin A glycosylation site and 2 fetuin B glycosylation sites. For the N-glycopeptides 87 unique peptides were covered on 2 glycosylation sites from each fetuin A and B. Serum and CSF were used to expand the sample complexity scope of the improved enrichment methodology. In serum a total of 34 proteins and 162 unique sialylated glycopeptides were identified by our methodology. In a CSF sample 32 proteins and 129 unique sialylated glycopeptides were further identified. The N-glycopeptide enrichment method using hydrazine beads is typically used for determination of N-glycosylation sites after removal of the glycans during enzymatic bead release. Clinical CSF samples were here also used for the comparison of N-glycopeptide enrichment, by using this method employing hydrazine beads and enzymatic release with PNGase F and the new method containing a cleavable linker on hydroxylamine beads with chemical and/or enzymatic PNGase F release. A total of 2 963 peptides were identified by samples enriched with hydrazine and hydroxylamine beads together and enzymatic peptide release. While 350 unique glycopeptides were identified from 80 different proteins in the samples enriched by hydroxylamine beads and mild chemical cleavage. Among these identifications, 251 were O-glycopeptide structures and 222 were N-glycopeptide structures. As a conclusion, the new enrichment method allows parallel analysis of O- and N-glycopeptides from both galactosylated and sialylated peptide classes under mild chemical bead release conditions. Besides leaving the glycan structure intact, the method enables labeling with a TMT for quantitative MS detection and is also suitable to be explored in further large scale glycoproteomic studies.
description: Die technische Entwicklung analytischer Methoden, speziell der Chromatographie und Massenspektrometrie erlaubt ein tieferes Verständnis biologischer Systeme auf molekularer Ebene. Charakterisierung und Quantifizierung von Biomolekülen und ihrer Modifikationen sind entscheidend für das Verständnis biologischer Mechanismen. Zusätzliche bioanalytische Methoden sind notwendig um detaillierte Informationen über Proteinstrukturen, dynamische Proteinkomplexe oder Proteinmodifikationen mit geringer Häufigkeit zu erhalten. Hierfür werden chemische Werkzeuge zusammen mit bereits etablierten Shotgun-Ansätzen genutzt, um Erkenntnisse über Proteinstrukturen und Glykosylierungen zu erweitern. Cross-Linker dienen als molekulare Lineale, die zwei Aminosäureseitenketten in einem definierten Abstand kovalent miteinander verknüpfen. Sie sind hilfreich bei der Charakterisierung dreidimensionaler Protein- bzw. Proteinkomplex-Strukturen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein MS-spaltbarer Phosphonat-Cross-Linker (PXL) vorgestellt, der eine neutrale Eliminierung während der Tandem-MS-Fragmentierung ermöglichen soll. Der neue Phosphonat-Cross-Linker PXL 14 konnte ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten in drei Stufen dargestellt werden. Die Evaluierung wurde an synthetischen Peptiden vorgenommen. Die Optimierung der Reaktionsbedingungen der Verknüpfung erfolgte hinsichtlich des Puffer-Systems und pH-Werts, um eine in-situ-Freisetzung des Cross-Linkers zu vermeiden. Verschiedene Fragmentierungstechniken wurden zur Erforschung der Linker-Fragmentierung in Tandem-Massenspektrometrieexperimenten untersucht. Die gewünschte Abspaltung des Linkers konnte mittels Low-energy-HCD-Fragmentierung realisiert werden ohne dabei das Peptidrückgrat zu beschädigen. Das Acryloyl-Fragment des Ac-IEAEKGR-Peptids ist das zweitintensivste Ion nach HCD-Fragmentierung bei 18% NCE. Als Modellprotein zur Evaluierung der PXL in komplexeren Systemen fungierte Bovines Serumalbumin (BSA). Die Verknüpfung des Cross-Linkers mit BSA wurde mittels SDS-PAGE verfolgt. Nach Optimierung der Bedingungen der Cross-Linker-Kupplung und der proteolytischen Verdauung dienten LC-MS/MS-Methoden zur Analyse der cross-linker-verknüpften Peptide. Die manuelle Datenanalyse erlaubte die Identifizierung von sieben intramolekular verknüpften Peptiden, inklusive zweier bisher nicht dokumentierten; drei schleifen-verknüpften Peptiden und acht Peptiden als Resultat einer chemischen Spaltung. Des Weiteren wurden chemische Methoden zur Verbesserung der Anreicherung von Glykopeptiden zur Untersuchung von Glykosylierungsmodifikationen entwickelt. Die Glykosylierung stellt eine der am häufigsten vorkommenden und auf Grund der hohen Diversität an Monosacchariden und an Möglichkeiten derer Verknüpfung auch komplexesten posttranslationalen Modifikationen von Peptiden dar. Neben der Mikro- und Makroheterogenität stellt einem vor allem die geringe Menge an modifizierten Peptiden nach erfolgtem proteolytischen Abbau in der Analytik von Glykopeptiden mit Hilfe von Standard-Proteomic-Verfahren vor Herausforderungen. Aus diesem Grund ist eine effiziente Strategie zur Anreicherung von Glykopeptiden für LC-MS/MS-Analysen erforderlich. In dieser Arbeit wird eine verbesserte Anreicherungsmethode basierend auf den chemischen Eigenschaften von Glykopeptiden/-proteinen vorgestellt. Ein abspaltbarer Disulfid-Linker mit Hydroxylamin-Funktionen wurde auf der Oberfläche von Beads angebracht. Linker 40 konnte in sechs Stufen ausgehend von kommerziell erhältlichen Edukten dargestellt werden. Über die Hydroxylamin-Gruppen des Linkers können kovalente Verknüpfungen mit den Aldehyd-Funktionen der terminalen Monosacchariden der Glykosylierungsmodifikation unter Ausbildung von Oxim-Bindungen geschlossen werden. Die Einführung dieser Aldehyd-Funktionen kann z.B. mittels selektiver Oxidation von Sialinsäuren mit Natriumperiodat oder enzymatischer Oxidation von terminaler Galactose mit Galactose-Oxidase erreicht werden. Bei diesem Ansatz werden sowohl neutrale als auch negativ geladene, synthetische Glykopeptide angereichert und über die Spaltung der Disulfid-Bindung unter reduktiven Bedingungen freigesetzt. Diese Art der Freisetzung ist unabhängig von der Natur der Glykanstruktur und des Peptidrückgrates. Die freigesetzten Glykopeptide weisen dabei nur eine geringfügige chemische Modifikation in terminaler Position auf. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dieser Ansatz für Tandem Mass Tag (TMT) Labeling geeignet ist. Dies würde eine Quantifizierung mit derzeitigen TMT-Methoden ermöglichen. Aminosäureuntersuchungen konnten aufzeigen, dass die Ausbeute der Anreicherung von synthetischen sialylierten Glykopeptiden bei 32% und von synthetischen galactosylierten Glykopeptiden bei 40% liegt. Die Anreicherungsmethode wurde ebenso mit Hilfe von Fetuin und Asialofetuin als Model-Proteinen evaluiert. Für die Oxidation wurde entsprechend Natriumperiodat bzw. Galactose-Oxidase eingesetzt. In der Fetuin-Probe konnten 28 einzigartige Glykopeptide identifiziert werden; darunter sieben O-Glykopeptide und 21 N-Glykopeptide. Diese korrespondieren mit zwei O- und zwei N-Glykosylierungsseiten des Fetuin A und zwei O-Glykosylierungsseiten des Fetuin B. In der Asialofetuin-Probe wurden 98 einzigartige Glykopeptide identifiziert. Die elf O-Glykopeptide korrespondieren mit einer O-Glykosylierungsposition des Fetuin A und zwei O-Glykosylierungsseiten des Fetuin B. Die 87 N-Glykopeptide korrespondieren jeweils mit zwei N-Glykosylierungspositionen des Fetuin A bzw. Fetuin B. Um die Anreicherungsmethode für die Anwendung auf komplexere Systeme untersuchen zu können, wurden Blutserum und CSF als Proben gewählt. Unsere Methode ermöglichte im Blutserum 34 Proteine und 162 einzigartige sialylierte Glykopeptide zu identifizieren. In der CSF-Probe wurden 32 Proteine und 129 einzigartige sialylierte Glykopeptide identifiziert. Die Methode zur Anreicherung von N-Glykopeptiden mittels Hydrazin-Beads wird typischerweise zur Bestimmung von N-Glykosylierungsseiten nach enzymatischer Freisetzung der Oligosaccharide genutzt. Klinische CSF Proben wurden zum Vergleich der N-Glykopeptid-Anreicherung herangezogen; wobei Hydrazin-Beads für enzymatische Freisetzung mittels PNGase F unserer Methode mit abspaltbarem Linker auf Hydroxylamin-Beads für chemische oder enzymatische Abspaltung mit PNGase F gegenübergestellt werden sollten. 2 963 Peptide wurden mit Hilfe der Anreicherung sowohl von Hydrazin- als auch Hydroxylamin-Beads mit enzymatischer Freisetzung identifiziert. Bei Verwendung der Hydroxylamin-Beads in Kombination mit milder, chemischer Freisetzung war eine Identifikation von 350 einzigartigen Glykopeptiden der 80 verschiedenen Proteinen möglich. Unter diesen waren 251 O-Glykopeptidstrukturen und 222 N-Glykopeptidstrukturen zu beobachten. Zusammenfassend ermöglicht die neue Methode, basierend auf der chemischen Freisetzung der Beads unter milden Bedingungen, eine parallele Untersuchung von galactosylierten und/oder sialylierten O- und N-Glykopeptiden. Da die chemische Glykanstruktur nahezu unverändert bleibt, sind TMT Markierungen für quantitative Massenspektrometrie und weiterführende Studien auf dem Gebiet der Glykoproteomics im größeren Maßstab möglich.