EXOME SEQUENCING APPROACH TO IDENTIFY CAUSATIVE GENES FOR AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
Creators: name: TILOCA, CINZIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2015

description: Introduzione: La Sclerosi laterale amiotrofica (SLA) � una malattia neurodegenerativa progressiva e fatale caratterizzata dalla perdita selettiva dei motoneuroni nella corteccia cerebrale, nel tronco cerebrale e midollo spinale. La maggior parte dei casi � costituita da forme sporadiche, mentre solo il 5-10% dei casi � rappresentato da forme familiari, causate da geni con modalit� di trasmissione mendeliana, generalmente autosomica dominante. Sono stati identificati pi� di 20 geni causativi delle forme familiari, che hanno contribuito a comprendere meglio i meccanismi patogenetici coinvolti e sottolineano la grande eterogeneit� genetica della malattia. Nonostante i numerosi progressi raggiunti, in circa il 40% dei casi familiari la causa genetica non � stata ancora identificata, mentre la componente genetica delle forme sporadiche � in gran parte sconosciuta. L? applicazione delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione ed in particolare il sequenziamento della porzione codificante del genoma o esoma rappresenta un approccio innovativo e promettente per gli studi genetici sulla SLA. Lo scopo del presente progetto di ricerca di Dottorato � stato quello di identificare nuovi geni associati alle forme familiari e sporadiche di SLA mediante sequenziamento dell?esoma come metodo alternativo per superare i limiti delle tecniche genetiche tradizionali. Metodi: Sono state utilizzate tre diverse strategie per l?identificazione di geni causativi: I) sequenziamento dell?esoma in combinazione con analisi di linkage in due grandi famiglie SLA a trasmissione dominante; II) analisi per varianti rare degli esomi di 363 casi familiari singoli; III) sequenziamento dell?esoma in 32 casi di SLA sporadica e dei loro genitori non affetti (approccio dei trios). Risultati: I) Attraverso l?approccio combinato di sequenziamento dell?esoma ed analisi di linkage, abbiamo identificato il gene PFN1 (profilina-1), codificante per una proteina implicata nella regolazione dell?actina, come nuovo gene causativo di SLA. Mutazioni a carico del gene PFN1 sono state osservate nel 2,6% dei pazienti SLA familiari e gli studi funzionali condotti sui mutanti hanno dimostrato una maggiore tendenza all?aggregazione, una riduzione del legame all?actina ed un effetto inibitorio sulla crescita assonale. II) L?analisi delle varianti rare tra casi e controlli, applicata su un totale di 12.495 geni, ha portato all?identificazione di TUBA4A (codificante per lalfa-tubulina 4a) come gene candidato caratterizzato da un eccesso significativo di varianti rare potenzialmente dannose nei 363 casi familiari analizzati. L?analisi funzionale ha dimostrato per i mutanti di TUBA4A una capacit� ridotta di dimerizzazione con la beta-tubulina in vitro ed un?alterata incorporazione nei microtubuli in vivo. Inoltre, il mutante tronco TUBA4A p.W407X ha mostrato una maggiore tendenza all?aggregazione. III) Infine, analizzando l?esoma di 32 pazienti con SLA sporadica e dei loro genitori non affetti, abbiamo identificato 25 mutazioni de novo in 16 dei 32 trios analizzati, con un tasso di mutazioni de novo pari a 0,78. Non sono stati identificati geni con molteplici mutazioni de novo nei trios sequenziati, ma le analisi bioinformatiche hanno mostrato possibili connessioni tra i geni candidati e la classificazione funzionale ha rilevato che le mutazioni de novo sono principalmente a carico di geni codificanti per trasportatori o per proteine con attivit� regolatoria sulle GTPasi. Conclusioni: I risultati ottenuti hanno dimostrato che il sequenziamento dell?esoma, applicato con specifiche strategie di studio e di analisi, � un approccio efficace per l?identificazione di nuovi geni causativi nella SLA. La scoperta dei due geni PFN1 e TUBA4A, codificanti per proteine coinvolte nel processo di polimerizzazione dell?actina e dei microtubuli, fornisce ulteriori evidenze a supporto del coinvolgimento del citoscheletro nella patogenesi della SLA.