Μελέτη αναγωγής δισουλφιδικών δεσμών σε συνθήκες συνεχούς ροής με τη χρήση διαλυμένης και ακινητοποιημένης Τρις-(2-καρβοξυαιθυλο)φωσφίνης.:
Creators: name: Μητάνη, Κωνσταντίνα Βασιλείου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Δισουλφιδικοί δεσμοί
Τρις-(2-καρβοξυαιθυλο)φωσφίνη
SIA (Sequential Injection Analysis)
Disulfide bonds
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine

description: Στην εργασία αυτή μελετήθηκε – για πρώτη φορά – η δυνατότητα χρήσης της TCEP ως αντιδραστηρίου αναγωγής δεσμών S-S σε συνθήκες συνεχούς ροής σε σύστημα SIA. Το πειραματικό μέρος της εργασίας αποτελείται από τρία τμήματα:Στο πρώτο τμήμα (Κεφάλαιο 9) μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της μη αυτοματοποιημένης (off-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP. Ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε το ζεύγος κυστεΐνης (CYS) – κυστίνης (CSN). Το προϊόν της αναγωγής της CSN μετρούνταν φασματοφωτομετρικά σε σύστημα SIA μετά από αντίδραση της CYS με τον αίθυλο εστέρα του προπιολικού οξέος (ΕΡ) σε αλκαλικό περιβάλλον. Μελετήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το pH, η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος και του αναγωγικού αντιδραστηρίου και ο χρόνος αντίδρασης. Στο δεύτερο τμήμα (Κεφάλαιο 10) μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από την TCEP σε σύστημα SIA. Στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε αντιδραστήριο Ellman’s (5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB). Το προϊόν της αναγωγής (TNB) μετρούνταν απευθείας φασματοφωτομετρικά σε μέγιστο μήκος κύματος 412 nm.Μελετήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το pH, η συγκέντρωση του αναγωγικού αντιδραστηρίου, η θερμοκρασία, η παροχή όγκου του μεταφορέα. Η κινητική της αντίδρασης μελετήθηκε με πειράματα αναχαίτισης της ροής αντίδρασης.Στο τελευταίο τμήμα του πειραματικού μέρους (Κεφάλαιο 11) μελετήθηκε η δυνατότητα και αποτελεσματικότητα της εν-ροή (on-line) αναγωγής δισουλφιδίων από ακινητοποιημένη TCEP σε πηκτή αγαρόζης. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε αναγωγική μικρο-στήλη, η οποία ενσωματώθηκε στο σύστημα της SIA. Και στη μελέτη αυτή ως αντιπροσωπευτικό χημικό σύστημα επιλέχθηκε αντιδραστήριο Ellman’s (5,5-διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ), DTNB). Μελετήθηκαν διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την αντίδραση αναγωγής, όπως το pH, η παροχή όγκου του μεταφορέα, το μήκος της αναγωγικής στήλης και ελέγχθηκε η σταθερότητά της στο χρόνο.
description: In the present thesis we studied – for the first time – the behavior of TCEP as a reducing reagent for disulfide bonds under flow conditions using sequential injection analysis (SIA). The experimental section of this thesis is divided in three parts:In the first part (Chapter 9) we studied the reduction of disulfides by TCEP off-line. The pair cysteine (CYS) – cystine (CSN) was selected as representative model system. The product of the reduction reaction was determined spectrophotometrically after on-line reaction of cysteine with ethyl propiolate (EP) in a SIA manifold.Several parameters that affect the reduction of the disulfide bonds, such as the pH, the amount concentration of the buffer and TCEP and the reaction time were studied.In the second part (Chapter 10) we studied the on-line reduction of disulfide bonds by soluble TCEP in a SIA manifold. Ellman’s reagent (DTNB) was selected as a model disulfide, since the reaction product (TNB) can be monitored directly at 412 nm without any additional reactions. Several parameters that affect the reduction of the disulfide bonds, such as the pH, the amount concentration of TCEP, the temperature and the flow rate of the carrier stream were investigated. The reaction kinetics was studied using stopped-flow experiments.Finally, in the third part of the experimental section (Chapter 11) we investigated the usage of immobilized TCEP on agarose gel as a reducing reagent of disulfide bonds under flow conditions. For this purpose a suitable reducing mini-column was constructed and incorporated in the SIA setup. Ellman’s reagent (DTNB) was used as a model disulfide system as well. Several parameters that affect the reduction of the disulfide bonds, such as the pH, the flow rate of the carrier stream and the length of the reduction column were investigated. The columns were proved to be stable under continuous usage.