Γενετική τροποποίηση υβριδίων τομάτας (S. lycopersicum L.) με το γονίδιο gmgstu4 της σόγιας (G. max) και μελέτη της ανθεκτικότητας των διαγονιδιακών φυτών σε συνθήκες αυξημένης αλατότητας και ξηρασίας:
Creators: name: Σταυρίδου, Ευαγγελία Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Glutathione S-Transferases
Τομάτα
Αβιοτικές καταπονήσεις
Tomato
Abiotic stresses

description: Η τομάτα (S. lycopersicum) καλλιεργείται σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών συνθηκών αντιμετωπίζοντας πλήθος περιβαλλοντικών καταπονήσεων. Η ανθεκτικότητα που παρουσιάζει σχετίζεται με τους προστατευτικούς μηχανισμούς που έχει αναπτύξει κατά την εξέλιξή της στις διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης. Οι S- μεταφοράσες της γλουταθειόνης (Glutathione S Transferases, GSTs), ενισχύουν την άμυνα των φυτών συμμετέχοντας στον αντιοξειδωτικό μηχανισμό ως υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GPx) και προστατεύουν τα φυτά από τις δυσμενείς επιδράσεις των αβιοτικών καταπονήσεων. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν ο σχηματισμός και η ταυτοποίηση των διαγονιδιακών φυτών τομάτας του υβριδίου Don Jose που υπερεκφράζουν το γονίδιο gmgstu4 της σόγιας (G. max), μέσω της μεθόδου του Agrobacterium tumefaciens, ο προσδιορισμός της έκφρασης και της ενζυμικής δράσης των διαγονιδιακών σειρών των υβριδίων Don Jose, CLX3711και CLX3731, καθώς και η μελέτη της ανθεκτικότητας αυτών σε συνθήκες αυξημένης αλατότητας και ξηρασίας. Για τη γενετική τροποποίηση χρησιμοποιήθηκαν έκφυτα κοτυληδόνων 15 ημερών του υβριδίου Don Jose, τα οποία τοποθετήθηκαν σε υπόστρωμα αναγέννησης MSR συμπληρωμένο με 0,1 mg/l ΙΑΑ, 0,5 mg/l Ζ, 250 mg/l σεφοταξίμη (Cf) και 100 mg/l καναμυκίνη (Km) και, εν συνεχεία, έγινε επιλογή και ταυτοποίηση με την τεχνική της PCR. Παράλληλα μελετήθηκε η αναγεννητική ικανότητα και ο ρυθμός μικροπολλαπλασιασμού των διαγονιδιακών σειρών συγκριτικά με τα φυτά αγρίου τύπου. Έγινε προσδιορισμός της έκφρασης και της ενζυμικής δράσης του gmgstu4 γονιδίου στις έξι διαγονιδιακές σειρές (Α1, Α5, Β3, Β7, C16, C26) των τριών υβριδίων και για τις δύο καταπονήσεις. Μελετήθηκε η ανθεκτικότητα των διαγονιδιακών φυτών μετά από 30 και 28 ημέρες ανάπτυξης σε in vitro συνθήκες αυξημένης αλατότητας (200 mΜ NaCl) και ξηρασίας (240 mΜ mannitol), αντίστοιχα, συγκριτικά με τα φυτά αγρίου τύπου. Και στις δύο καταπονήσεις έγινε μέτρηση των μορφολογικών παραμέτρων αύξησης, όπως: το μήκος βλαστού και ρίζας, το νωπό βάρος βλαστού και ρίζας, και προσδιορισμός της περιεκτικότητας των φυτών σε χλωροφύλλη. Οι διαγονιδιακές σειρές εμφάνισαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυτά αγρίου τύπου και στις δύο καταπονήσεις. Επιπλέον ήταν πιο ανθεκτικές στην καταπόνηση ξηρασίας από ότι στην καταπόνηση αλατότητας, ως προς το βάρος βλαστού (1,67 έναντι 1,13 φορές), βάρος ρίζας (1,67 έναντι 1,19 φορές) και την περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη (1,13 έναντι 0,94 φορές). Η υπερέκφραση του γονιδίου gmgstu4 προσέδωσε μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις αβιοτικές καταπονήσεις αλατότητας και ξηρασίας, υπό in vitro συνθήκες, με κατά μέσο όρο 2,18 και 2,7 φορές, αντίστοιχα, μεγαλύτερη δράση υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Η υπερέκφραση του γονιδίου gmgstu4 στα διαγονιδιακά φυτά τομάτας των τριών υβριδίων συνέβαλε στην ανθεκτικότητα αυτών ως προς τις δύο αβιοτικές καταπονήσεις, εκφραζόμενη ως καλύτερη αντιμετώπιση των δυσμενών επιδράσεων της οξειδωτικής καταπόνησης και της τοξικότητας των ιόντων.
description: Tomato (S. lycopersicum) is being cultivated on a wide range of enviromental conditions confronting various environmental stresses. Plant tolerance correlates with the protective mechanisms developed through the evolution of this species at different growth conditions. Glutathione S- Transferases (GSTs), enhance plant tolerence by participating in the antioxidant mechanism as glutathione peroxidases (GPx) and protect the plants from the adverse effects of abiotic stresses. The purpose of this study was to evaluate in planta: 1) the generation via Agrobacterium mediated transformation and verification of transgenic tomato plants of the Don Jose hybrid, overexpressing the soybean (G. max) gmgstu4 gene, 2) the determination of the gene expression and the peroxidase activity of the transgenic lines (A1, A5, B3, B7, C16, C26) of tomato hybrids (Don Jose, CLX3711 and CLX3731), and the transgenic plant tolerance to salt and drought stresses. For the genetic transformation, 15 days old cotyledon explants, of the Don Jose hybrid were placed in the regeneration medium MSR supplemented with 0,1 mg / l IAA, 0,5 mg / l Zeatine (Z), 250 mg / l Cefotaxime (Cf) and 100 mg / l Kanamycin (Km). Regenerated shoots after selection were verified via PCR. Moreover, the regeneration ability and micropropagation rate of the transgenic and wild type plants of the Don Jose hybrid were studied. In addition, expression and peroxidase activity of the transgene were determined. The tolerance of the transgenic lines was studied after 28 and 25 days as in vitro growth in increased salinity (200 mM NaCl) and drought (240 mM mannitol) conditions, compared with the wild type plants. The morphological growth parameters (shoot and root length, shoot and root fresh weight) and chlorophyll content were determined. All transgenic lines exhibited higher tolerance comparred to the corresponding wild type plants in both stresses. Moreover, drought tolerance was higher than salt tolerance, as for shoot weight (1,67 to 1,13 times), root weight (1,67 to 1,19 times) and chlorophyll content (1,13 to 0,94 times). Overexpression of the GmGSTU4 isozyme enchanced higher salt and drought tolerance, under in vitro conditions, with an average of 2,18 and 2,7 times glutathione peroxidase activity, respectively compared to the wild type plants. Overexpresion of the GmGSTU4 isoenzyme in transgenic plants contributed to salt and drought tolerance, showing better response to oxidative stress and ion toxicity adverse effects.