title: Determinierung funktioneller Unterschiede der Interaktion von G-Proteinen mit den Mitgliedern der RH-RhoGEF-Familie
title: Determination of functional differences in the interaction of G proteins with members of the RH-RhoGEF family
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Redlin, Fabian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Ga13
point mutation
Chimäre
PDZ-RhoGEF
chimera
RhoA
FRET
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik
G13
PDZ
RH-RhoGEF
LARG
RhoGEF
Thromboxan-Rezeptor
p115
Interaktionskinetik
p115-RhoGEF
Punktmutation
interaction kinetics
Thromboxane receptor

description: G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Gruppe von Transmembranrezeptoren im menschlichen Körper und erfüllen unzählige physiologische Aufgaben. Die drei RH-RhoGEFs (GEF=GTP-Austauschfaktor) p115-RhoGEF, LARG (leukemia-associated RhoGEF) und PDZ (postsynaptic density 95, disc large, zona occludens-1)-RhoGEF verbinden GPCRs mit der RhoA Signalkaskade über ihre Aktivierung durch die Gα12/13-Unterfamilie der G-Proteine. Da über die RhoA Signalkaskade die Form von Zellen, Zelldifferenzierung und Zellwachstum reguliert werden, bieten RH-RhoGEFs einen Weg für GPCRs diese physiologischen Prozesse zu steuern. Während die drei RH-RhoGEFs unterschiedlich stark in verschiedenen Organen und Geweben exprimiert werden, ist nicht bekannt ob sie auch funktionelle Unterschiede bezüglich ihrer Aktivierung durch GPCRs zeigen. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Interaktion der einzelnen RH-RhoGEFs mit Gα13 hinsichtlich der Interaktionskinetiken und der Agonistsensitivität untersucht. In einem zweiten Projekt dieser Arbeit wurden die drei RH-RhoGEFs auch in Bezug auf eine mögliche Interaktion mit Gβγ-Untereinheiten untersucht. Um diese wissenschaftlichen Fragen zu adressieren, wurde ein auf FRET basierender Einzelzell-Assay verwendet, welcher die Beobachtung der G-Protein–RH-RhoGEF Interaktion, nach Stimulation des Thromboxan-Rezeptors, in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erlaubte. Zusätzlich wurden unterschiedliche Klonierungsstrategien verwendet, um eine Vielzahl von Mutanten und Chimären zu erschaffen, welche Aufschlüsse über funktionelle und strukturelle Zusammenhänge gaben. Konfokale Bildgebung, BRET und das Dual-Luciferase Reporter Assay-System wurden als unterstützende Methoden verwendet. Es war möglich, spezifische Interaktionen zwischen den RH-RhoGEFs und Gα13-Untereinheiten aufzuzeigen. Hierbei wies p115-RhoGEF eine signifikant kürzere Interaktion mit Gα13 auf als LARG und PDZ-RhoGEF. Die Interaktionen zeigten außerdem einen kausalen Zusammenhang zwischen Interaktionskinetik und Agonistsensitivität. Durch Mutanten und Chimären war es möglich die strukturelle Ursache für die Unterschiede zwischen den RH-RhoGEFs auf eine einzige Aminosäure in der rgRGS-Domäne von p115-RhoGEF einzugrenzen. Die Mutation dieser Aminosäure führte zu einer erhöhten Interaktionszeit mit Gα13, welche mit LARG und PDZ-RhoGEF vergleichbar war und gleichzeitig die Agonistsensitivität erhöhte. Diese Aminosäure in der rgRGS-Domäne von p115-RhoGEF bildet eine polare Interaktion mit einer Aminosäure in der alphahelikalen Domäne von Gα13. Die Mutation dieser Aminosäure zeigte dieselbe veränderte Gα13-RH-RhoGEF Interaktionsdynamik. FRET Messungen der Gβγ-RH-RhoGEF Interaktion zeigte robuste Signale, deren Kinetik der Gα13-RH-RhoGEF Interaktionen glichen. Keine FRET-Änderung konnte beobachtet werden, wenn andere Gα-Untereinheiten außer Gα13 co-transfiziert wurden. Obwohl die rgRGS Domänen von p115-RhoGEF, LARG (Suzuki et al., 2009) und einer PDZ-RhoGEF Chimäre (Chen et al., 2008) in vitro GAP (GTPase-activating protein)-Aktivität gegenüber Gα13 zeigten, suggerierten die Ergebnisse unserer Herangehensweise in intakten Zellen, dass nur p115-RhoGEF in vivo GAP-Aktivität gegenüber Gα13 zeigt, da die GAP-Aktivität die Länge der Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen bestimmt. Im Gegensatz dazu verlangsamte LARG die Neubildung von Gα13-Heterotrimeren (Bodmann et al., 2017), was einen wichtigen funktionellen Unterscheid zwischen den PDZ-Domäne beinhaltenden RH-RhoGEFs und p115-RhoGEF nahelegt, welcher sich in p115-RhoGEFs GAP-Aktivität in lebenden Zellen wiederspiegelt. Die Ergebnisse der Gβγ-RH-RhoGEF weisen darauf hin, dass sich Gα13 und Gβγ-Untereinheiten bei der Aktivierung nicht vollständig trennen und zusammen an die Effektoren von Gα13 binden. Angesichts der Vielfallt von Krankheiten, welche mit der Gα13-RhoGEF-RhoA Signalkaskade in Verbindung stehen, wäre es wichtig, die funktionelle Rolle der verschiedenen RH-RhoGEFs in vivo zu verstehen. Die Punktmutanten von p115-RhoGEF und Gα13 und die viele Chimären bieten dabei nützliche Werkzeuge um die physiologischen Konsequenzen der in dieser Arbeit aufgedeckten funktionellen Unterschiede der Interaktionen von RH-RhoGEFs mit Gα13 zu untersuchen.