Novel Single-unit Membrane Filtration System for Concentration and Buffer Exchange of Protein Solutions using Continuous Ultrafiltration/Diafiltration
Creators: name: Tan, Ruijie
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2021

description: Biopharmazeutische Produkte (wie rekombinante Proteine und Impfstoffe) spielen eine zentrale Rolle in der modernen Medizin. Der Herstellungsprozess solch großer Biomoleküle umfasst mehrere vor- und nachgelagerte Verarbeitungsschritte. Das Rohmaterial wird durch sogenannte Upstream-Prozesse in Zwischenprodukte umgewandelt und die Endprodukte werden durch mehrere sequenzielle Downstream-Prozessschritte, wie z. B. Isolierung und Konzentration der Ziel-Biomoleküle, gewonnen. Vor allem aufgrund ihrer einfachen Bedienung und Flexibilität sind membranbasierte Verfahren in diesen Downstream-Prozess-Schemata weit verbreitet. Trotz der im Grunde einfachen physikalischen Zusammenhänge stoßen membranbasierte Technologien jedoch auf eine Reihe von Herausforderungen und Hindernisse, wenn sie auf biologische Ausgangs-Lösungen angewendet werden. Im Falle der Ultrafiltration sind Konzentrationspolarisation (CP) und Fouling-Phänomene von akkumulierten Proteinen an der Membranoberfläche eine große Hürde für die Systemleistung. Eine gängige Methode, die Akkumulation von Proteinen zu reduzieren, ist die sogenannte Tangentialflussfiltration (TFF), bei der das Retentat mit hohen Geschwindigkeiten parallel zur Membranoberfläche gepumpt wird. Die daraus resultierenden kurzen Verweilzeiten innerhalb des Membranmoduls erfordern jedoch, dass das Retentat in einem Kreislauf geführt wird und Pumpe und Membran mehrfach passiert, was zu einem chargenweisen Prozess führt. Als Alternative zum traditionellen chargenweisen Betrieb finden Prozesse mit kontinuierlicher Betriebsweise aufgrund ihrer Vorteile, wie z. B. der Reduzierung der Anlagengröße und einer konstanten und verbesserten Produktqualität, n den letzten Jahren immer mehr Beachtung. Im Falle der Ultra- und Diafiltration wird eine kontinuierlicher Betriebsweise durch die sogenannte Single-Pass-Tangential-Flow-Filtration (SPTFF) und Single-Pass-Diafiltration (SPDF) erreicht. Aufgrund der begrenzten Konzentrationsfaktoren, die in konventionellen SPTFF-Einheiten erreicht werden, erfordert die Herstellung von hochkonzentrierten Proteinlösungen jedoch ein Kaskadensystem, das mehrere dieser Filtereinheiten sowie die entsprechenden Pumpen, Vorratstanks, Ventile und Schläuche umfasst. Aktuelle Systeme zur kontinuierlichen UF/DF sind daher durch erhöhte Komplexität, hohe Investitionskosten und den Bedarf an anspruchsvoller Mess- und Regeltechnik gekennzeichnet. In dieser Arbeit wird ein neuartiges Single-Unit-Membranfiltrationssystem für kontinuierliche UF/DF vorgestellt. Der 3D-gedruckte Prototyp des Filtrationsmoduls besteht aus zwei Seitenteilen und einem zentralen Mittelteil, wobei zwei kommerzielle UF-Membranen zwischen den seitlichen und dem zentralen Teil eingespannt sind. Alle drei Teile enthalten eine Hohlgitterstruktur, die Strömungskanäle schafft und die Membranen mechanisch stützt. Die Kombination aus drei Kanälen und zwei Membranen ermöglicht es, Permeat abzuziehen und gleichzeitig frischen Diafiltrationspuffer in den zentralen Retentatkanal zu liefern. Um die volle Kontrolle über die verschiedenen Zu- und Ablaufströme des Moduls zu erhalten, wird das System im mit konstanten Volumenströmen aber transienten Drücken betrieben. Dies wird durch die Verbindung des Moduls mit drei Hochleistungskolbenpumpen und Mehrwegeventilen erreicht, die von einem kommerziellen ÄKTA Explorer FPLC-System bereitgestellt werden. Obwohl diese Systeme ursprünglich für Anwendungen in der Chromatographie vorgesehen sind, ermöglichen sie auch eine komfortable Online-Überwachung von UV- und Leitfähigkeitssignalen bei Diafiltrationsversuchen. Darüber hinaus ermöglichen die integrierten Multiport-Ventile und die programmierbare Steuerungssoftware neue Betriebsmodi des Filtrationsmoduls, wie z.B. ein zyklischer Wechsel der Flussrichtung des Diafiltrationspuffers durch die Membranen. Zu Beginn wurde das Filtrationsmodul durch die Bestimmung des Wasserflusses durch die Membranen bei verschiedenen anliegenden Transmembrandrücken und durch die Dauer, die zum Erreichen eines quasistationären Betriebs für beide Aufgaben, Aufkonzentrierung eines Proteinlösung und Pufferaustausch, benötigt wird, charakterisiert. Im ersten, kleinen Prototyp mit einer Strömungspfadlänge von nur 47 mm konnten Konzentrationsfaktoren von fünf erreicht werden, die erzielte Pufferaustausch-Effizienz betrug jedoch nur 46%. Daher wurde ein zweites Prototypmodul mit vergrößerter Strömungspfadlänge und optimierter Hydrodynamik entworfen und hergestellt. In anschließenden Experimenten wurde die reine Diafiltration mit wechselnder Flussrichtung des Diafiltrationspuffers bei gleicher Flussrate des Feed- und Retentatstroms untersucht. Der Einfluss verschiedener Parameter, darunter die Dauer der Umschaltintervalle zwischen den DF-Strömungsrichtungen, der Strömungsmodus zwischen Feed-Lösung und DF-Puffer (Gleichstrom und Gegenstrom), die Anzahl der aufgegebenen Diavolumina und der Volumenstrom der Feed-Lösung, auf die Diafiltrationseffizienz wurde umfassend untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Diafiltrationseffizienz von anfänglichen 46% im kleinen Prototyp auf 99,3% bei 7,2 Diavolumina und einem Schaltintervall von 3 min gesteigert werden konnte. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Schaltvorgänge der Flussrichtung des DF-Puffers durch die Membranen wie eine zyklische inhärente Rückspülung wirken und die Konzentrationspolarisation und den entsprechenden Druckaufbau stark reduzieren. Um die komplexen Hydrodynamik- und Stofftransportphänomene in dem neuartigen Membranmodul zu verstehen, wurde ein 2D-Finite-Elemente-Modell (FEM) mit COMSOL Multiphysics entwickelt. Unter Berücksichtigung der porösen Gitterstruktur, die in jedem Strömungskanal des Moduls vorhanden ist, wurde eine dynamische Version der Brinkman-Gleichung für die Simulation der Hydrodynamik verwendet, einschließlich zeitlich variierender lokaler Drücke und Geschwindigkeiten. Die Modellierung des Transports der gelösten Spezies wurde durch übliche Massenbilanzen erreicht, die den konvektiven Fluss tangential und senkrecht zur Membran, die Rückdiffusion in die Bulk-Lösung und die durch die Strömung durch das grobe Gitter verursachte Dispersion beinhalten. Die simulierten Ergebnisse sind in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Auf der Suche nach optimalen Parametereinstellungen für höhere Diafiltrationseffizienzen wurden mit dem entwickelten Modell Schlüsselfaktoren wie Drücke, Geschwindigkeiten und lokale Konzentrationen von Protein und Salz innerhalb des Moduls vorhergesagt. In einer Parameterstudie zeigte sich, dass die unidirektionale Betriebsweise im Vergleich zur Methode mit einem Wechsel der Strömungsrichtung des DF-Puffers zu einer besseren Diafiltrationseffizienz führt. Allerdings ist in dieser Betriebsart nur eine vergleichsweise geringe, maximal zulässige Flächenbelastung (spezifischer Filtratfluss) zu erreichen, da der maximale Druck im Modul das Drucklimit des Systems nicht überschreiten darf. Wenn eine höhere Flächenbelastung erforderlich ist, kann die Methode der alternierenden Strömungsrichtung des DF-Puffers angewendet werden, um den Druckaufbau zu reduzieren. Dies geschieht allerdings zu dem Preis verstärkter Mischeffekte im Modul und einer entsprechend reduzierten Diafiltrationsleistung. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit eine gründliche experimentelle und theoretische Untersuchung eines neuartigen, kontinuierlich betriebenen, Tangentialfluss Filtrationssystems vorgestellt. Das entworfene Modul ist in der Lage eine Diafiltrationseffizienz von bis zu 99,9% (99,3% bei 7,2 Diavolumen) in einer einzigen Filtrationseinheit zu erreichen. Damit ist seine Leistung vergleichbar mit komplexeren dreistufigen Gegenstrom-SPTFF-Systemen, die bisher in der Literatur für die kontinuierliche Diafiltration beschrieben wurden.