Μελέτη της ικανότητας συμπλεγμάτων βιοκεραμικών ικριωμάτων/ βλαστικών κυττάρων οδοντικού πολφού για αναγέννηση οδοντίνης σε πειραματικές κοιλότητες φυσικών δοντιών
Creators: name: Χατζηχρίστου, Χριστίνα Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Ιστοτεχνολογία
κοιλότητες επεξεργασμένης οδοντίνης
οδοντογενής διαφοροποίηση
Tissue engineering
human treated dentin matrices
odontogenic differentiation

description: Σκοπός της διπλωματικής αυτής εργασίας ήταν η πειραματική διερεύνηση της ικανότητας βλαστικών κυττάρων του οδοντικού πολφού μέσα σε βιοκεραμικά ικριώματα, τοποθετημένα σε κοιλότητες φυσικών δοντιών να επαχθούν για οδοντογενή διαφοροποίηση και εν’ συνεχεία να εναποθέσουν ενασβεστιωμένους ιστούς που να προσομοιάζουν τη φυσική επανορθωτική οδοντίνη. Η μεθοδολογία υλοποίησης περιέλαβε απομόνωση και χαρακτηρισμό βλαστικών κυττάρων από τους πολφούς τρίτων γομφίων (ύστερα από έγγραφη συγκατάθεση τους). Οι μύλες από τα δόντια, μετά τη δημιουργία κοιλοτήτων σε αυτά, καθαρισμό σε λουτρό υπερήχων και σταδιακή επεξεργασία με κατιούσες συγκεντρώσεις αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέως (EDTA), υποδέχθηκαν βιοκεραμικά ικριώματα (Scaffolds-SCs). Στα συμπλέγματα αυτά τοποθετήθηκαν βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού (Dental Pulp Stem Cells-DPSCs) και καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς επιπρόσθετη εφάπαξ έκθεση σε ανθρώπινη ανασυνδυασμένη φωσφωρυλιωμένη πρωτεΐνη της οδοντίνης (hrDMP-1) ή ανθρώπινη ανασυνδυασμένη οστική μορφογενετική πρωτεΐνη hrBMP-2) για χρονικό διάστημα 14-28 ημερών ανάλογα με τη μελετώμενη βιολογική διεργασία. Ελήφθησαν δείγματα σε διάφορες χρονικές στιγμές και μελετήθηκαν με τις ακόλουθες μεθόδους: ανοσοπροσροφητική ανάλυση στερεάς φάσης με σύνδεση ενζύμου (Enzyme Linked Immunoabsormbernt Assay: ELISA, για την εύρεση των αυξητικών/μορφογενετικών παραγόντων που απελευθερώνουν οι κοιλότητες οδοντίνης, ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM) για τη μελέτη της προσκόλλησης των κυττάρων στα ικριώματα που ήταν τοποθετημένα σε κοιλότητες οδοντίνης, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (real time PCR) για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων σχετιζόμενων με την οδοντογενή διαφοροποίηση των κυττάρων στα συμπλέγματα, και τέλος SEM σε συνδυασμό με στοιχειομετρική ανάλυση ενεργειακής διασποράς (EDS), καθώς και με περιθλασιμετρία ακτίνων Χ (XRD) για τη μελέτη της μορφολογίας και σύστασης του ενασβεστιωμένου ιστού που αναγεννήθηκε από τα DPSCs εντός των συμπλεγμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα συμπλέγματα hTDM/SC υποστήριξαν την προσκόλληση, πολλαπλασιασμό, διατήρηση της ζωτικότητας και οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs. Σε αυτό συνέβαλλε η απελευθέρωση αυξητικών/μορφογενετικών παραγόντων από την επεξεργασμένη οδοντίνη των κοιλοτήτων, όπως των TGF-β1 (Transforming Growth Factor b1), BMP-2 και DMP-1. Τα κύτταρα έδειξαν αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την οστεο/οδοντινογένεση, όπως σιαλοφωσφοπρωτεΐνη της οδοντίνης (DSPP), BMP-2, οστεοκαλσίνη (BGLAP) και ο μεταγραφικός παράγοντας Osterix και μείωση με την πάροδο του χρόνου της έκφρασης γονιδίων, όπως η αλκαλική φωσφατάση (ALP) και ο μεταγραφικός παράγοντας Runx2. Ο παραγόμενος βιοεναλατωμένος ιστός έφερε τα χαρακτηριστικά οδοντίνης με χαρακτηριστική φάση βιολογικού απατίτη, όπως φάνηκε στα διαγράμματα περιθλασιμετρίας ακτίνων Χ. Συμπερασματικά, τα ικριώματα ήταν ικανά να υποστηρίξουν την οδοντογενή διαφοροποίηση των DPSCs, ενώ οι παράγοντες που απελευθερώθηκαν από τις κοιλότητες οδοντίνης προήγαγαν περαιτέρω την οδοντογενή διαφοροποίηση των κυττάρων καθώς και τη βιοεναλάτωση. Επιπλέον, οι αναγεννηθέντες ιστοί που προέκυψαν μετά από επώαση των DPSCs εντός των συμπλεγμάτων hTDMs/SCs για 28 μέρες είχαν τα χαρακτηριστικά βιοεναλατωμένων ιστών που προσομοιάζουν την επανορθωτική οδοντίνη με ανάπτυξη χαρακτηριστικής φάσης υδροξυαπατίτη. Τα αποτελέσματα αυτά είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντικά σε ότι αφορά τη χρήση των συμπλεγμάτων αυτών σε διαδικασίες ιστικής αναγέννησης οδοντίνης και χρήζουν περαιτέρω μελέτης σε in vivo βιολογικά συστήματα.
description: The aim of this research study was to evaluate then ability of Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) in bioceramic/bioactive Scaffolds (SC) embedded in human Treated Dentin Matrices (hTDM) to induce odontogenic differentiation and in vitro biomineralization of tissues resembling natural reparative dentin. The methodology used for the implementation of the experimental part included the isolation and characterization of DPSCs from human dental pulps (upon their written informed consent). A cavity was formed in the coronal half of each molar and these human matrices where then treated by ultrasonic cleansing and stepwise immersions in descending concentrations of EthyleneDiamineTetraacetic Acid (EDTA) thus resulting in the hTDM. Bioceramic bioactive SCs were inserted in the cavities. Following the assembly of hTDM and SC, DPSCs were spotted on the centre of each scaffold followed by culture in culture medium with or without the exogenous addition of human recombinant Dentin Matrix Protein (hrDMP-1) or human recombinant Bone Morphogenetic Protein (hrBMP-2). hTDM/SC/DPSCs (± hrDMP-1 or hrBMP-2) were cultured up to 28 d and samples were retrieved from cultures at various time points to be examined for different biological endpoints. These included: Enzyme Linked Immunoabsormbernt Assay (ELISA), for the quantification of growth/ morphogenetic factors released by hTDM, Scanning Electron Microscopy (SEM) for the investigation of the ability of DPSCs to adhere to the SC inside the hTDM, real time Polymerase Chain Reaction (real time PCR) for the evaluation of the expression of odontogenesis-related genes by DPSCs, SEM-EDS (Scanning Electron Microscopy combined with Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy and Χ-Ray Diffraction analysis (XRD) for the evaluation of the structural characteristics and composition/nature of the regenerated mineralized tissues respectively. The results obtained showed that hTDM/SC complexes supported adherence and proliferation, maintained vitality and induced odontogenic differentiation of DPSCs. The release of growth/morphogenetic factors from the hTDM such as TGF-β1 (Transforming Growth Factor b1), BMP-2 and DMP-1 contributed towards this effect. Cells showed increased expression of genes correlated to osteo/odontogenesis namely dentin sialophosphoprotein (DSPP), BMP-2, osteocalcin (BGLAP) and the transcription factor Osterix and also a time dependent decrease of the genes alkaline phosphatase (ALP) and Runt-related transcription factor 2 (Runx2). The aforementioned effects were further amplified by the exogenous addition of hrDMP-1 or hrBMP-2. The tissue obtained after 28 d of culture presented characteristics of mineralized tissue resembling natural reparative dentin. In conclusion, the proposed hTDM/SC complexes were potent to support odontogenic differentiation and in vitro biomineralization of tissues resembling natural reparative dentin to a higher extent as compared with SC/DPSCs alone. The latter was attributed to the release of several growth/ morphogenetic factors form treated matrices. In addition, exogenous addition of hrBMP-2 and hr-DMP-1 further enhanced odontogenic differentiation and biomineralization phenomena, validating them as potential candidate molecules for application in tissue engineering of mineralized dental tissues. Overall, these results are promising for the regeneration of lost hard dental tissues.