Επίδραση εξωγενούς και παραγόμενου από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα PD-L1 σε λεμφοκύτταρα του αίματος του ανθρώπου
Creators: name: Κακαβούλια Μαρία-Ανθή  Ευριπίδη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Λεμφοκύτταρα
Συνδέτης προγραμματισμένου θανάτου 1
Μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα
Lymphocytes
Programmed death ligand 1
Mesenchymal stem cells

description: Η Programmed death-ligand 1 (PD-L1) (40kDa) είναι διαμεμβρανική πρωτεΐνη τύπου 1, η οποία πιθανόν να έχει σημαντικό ρόλο στην καταστολή του ανοσοποιητικού συστήματος. Στην παρούσα μελέτη εξετάζουμε in vitro την επίδραση, εξωγενώς προστιθέμενης PD-L1 σε καλλιέργειες λεμφοκυττάρων, στην αναστολή πολλαπλασιασμού και στην απόπτωση ενεργοποιημένων λεμφοκυττάρων και την συγκρίνουμε με την επίδραση της PD-L1, που εκφράζεται και εκκρίνεται από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, σε ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό, λεμφοκύτταρα του αίματος εξήχθησαν από φίλτρα λευκαφαίρεσης και απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση διαβάθμισης πυκνότητας σε φικόλη. Η ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων πραγματοποιήθηκε με εμβρυϊκό βόειο ορό τόσο στις καλλιέργειες λεμφοκυττάρων όσο και στις συγκαλλιέργειες με μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον ομφάλιο λώρο. Η μεταβολική ενεργότητα των λεμφοκυττάρων ελέγχθηκε με την χρωματομετρική μέθοδο MTT, ο πολλαπλασιασμός με την χρωματομετρική μέθοδο BrdU-Elisa και τέλος η απόπτωση και νέκρωση των κυττάρων μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής με 7-Αμινο-Ακτινομυκίνη/Ανεξίνη V, μετά το πέρας 48 και 96 ωρών. Το ΜΤΤ έδειξε ότι, μετά την προθήκη PD-L1 σε ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα η μεταβολική τους ενεργότητα μειώθηκε κατά 28 % μετά από 48 ώρες και κατά 27 % μετά από 96 ώρες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με το BrdU, όπου στις 48 ώρες τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα μειώθηκαν κατά 26% και στις 96 ώρες κατά 22%. Η κυτταρομετρία ροής με 7-Αμινο-Ακτινομυκίνη/Ανεξίνη V κατέδειξε 30% αποπτωτικά και νεκρά λεμφοκύτταρα μετά από 48 ώρες και 32% μετά από 96 ώρες. Η εκτέλεση των παραπάνω δοκιμασιών στις συγκαλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων με λεμφοκύτταρα, έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα. Η από μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα παραγόμενη και η εξωγενώς χορηγούμενη PD-L1 προκαλεί αναστολή πολλαπλασιασμού ικανοποιητικού αριθμού λεμφοκυττάρων και οδηγεί στην απόπτωσή τους, ύστερα από ασθενές σήμα ενεργοποίησης και πολλαπλασιασμού των λεμφοκυττάρων. Μελλοντικές έρευνες, με ισχυρότερα σήματα ενεργοποίησης, θα διαλευκάνουν την επίδραση της PD-L1 στα λεμφοκύτταρα.
description: Programmed death-ligand 1 (PD-L1) (40kDa) is a type 1 transmembrane protein, which is likely to have an important role in suppressing the immune system. In this study we examine the in vitro effect of exogenously added PD-L1 on lymphocyte cultures, on proliferation, inhibition and apoptosis of activated lymphocytes and compare it with the effect of expressed and secreted by mesenchymal stem cells PD-L1, on activated lymphocytes. Towards this goal, blood lymphocytes were extracted from leukapheresis filters and isolated by ficol density gradient centrifugation. Lymphocyte activation was performed with fetal bovine serum in both lymphocyte cultures and co-cultures with mesenchymal stem cells derived from the umbilical cord. The metabolic activity of the lymphocytes was examined by the MTT colorimetric method, the proliferation by the colorimetric method BrdU-Elisa and finally the apoptosis and necrosis of the cells was evaluated by Flow Cytometry with 7-amino-actinomycin / annexin V, after 48 and 96 hours. MTT showed that after the addition of PD-L1 in activated lymphocytes, their metabolic activity decreased by 28 % after 48 hours and by 27 % after 96 hours. Similar results were obtained from the BrdU assay, since at 48 hours the number of proliferating cells decreased by 26% and by 22%at 96 hours. Flow cytometry with 7-amino-actinomycin/annexin V demonstrated that 30% of the lymphocytes apoptosed and ultimately died after 48 hours and 32% after 96 hours. Repetition of the above assays in the co-cultures of mesenchymal stem cells with lymphocytes, gave similar results. Both the exogenous and the mesenchymal stem cells produced PD-L1 caused inhibition of proliferation of a sufficient number of lymphocytes and led to apoptosis, after a weak signal of activation and proliferation of lymphocytes. Future research, with more robust activation signals, will elucidate the effect of PD-L1 on lymphocytes.
description: Σε συνεργασία με: Ιατρικής (Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης)