title: Die Rolle der SPA Proteine auf den lichtregulierten Abbau von Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2
title: The role of the SPA proteins in the lightregulted degradation of Arabidopsis thaliana cryptochrome 2
Creators: name: Weidler, Guido
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: cryptochrom
Biowissenschaften, Biologie
Cryptochrom

description: Cryptochrome (CRY) sind
      UV-A/Blaulicht Photorezeptoren, die in allen
      Organismenreichen vorkommen und eine hohe strukturelle
      Ähnlichkeit zu DNA-Photolyasen haben. Sie tragen die gleichen
      Kofaktoren wie DNA-Photolyasen, zeigen aber mit Ausnahme der
      cryDASH-Familie keine DNA-Reparaturaktivität. Cryptochrome
      nutzen stattdessen das Lichtsignal, um um in Pflanzen deren
      Entwicklung zu steuern. Cryptochrom 1 (CRY1) und 2 (CRY2) aus
      Arabidopsis thaliana vermitteln nach Absorption des
      Lichtsignals über die in ihrer N-terminalen PHR (photolyase
      related) Domäne gebundenen Chromophore die
      Signalweiterleitung über ihre C-terminale Extension an
      downstream Interaktionspartner. Eine lichtabhängige
      Phosphorylierung sowie Dimerisierung scheint für beide
      Cryptochrome für die Signaltransduktion und ihre biologische
      Funktion essentiell zu sein. Während CRY1 lichtstabil ist,
      wird CRY2 nach Blaulichtbelichtung schnell abgebaut. Die
      vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung
      von Arabidopsis CRY2. Insbesondere die Prozesse der
      Dimerisierung, der Phosphorylierung und des lichtgesteuerten
      Abbaus wurden näher untersucht. Cryptochrom 2 interagiert
      über seinen C-Terminus (CCT2) mit der C-terminalen WD-40
      Domäne von COP1, einer E3-Ligase, die als Repressor der
      Photomorphogense in Pflanzen fungiert. Des Weiteren haben
      unter anderem Untersuchungen in unserer Arbeitsgruppe
      gezeigt, dass nur die dimere Form von CCT2 biologisch aktiv
      ist. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, CCT2 als Fusion
      mit dem Rapalog-induzierbaren FKBP(v)-Protein, sowie COP1 als
      Volllängen- oder verkürztes Protein, welches nur aus der
      C-terminalen Domäne besteht, in E. coli löslich zu
      exprimieren und anschließend mittels
      Affinitätschromatographie aufzureinigen. Mit Hilfe dieser
      Proteine sollte geklärt werden, ob nur die dimere Form von
      CCT2 mit COP1 interagiert. Hierfür waren
      Co-Immunopräzipitationsanalysen (Co-IP) geplant. Weiterhin
      sollten die gereinigten Proteine für
      Kokristallisationsexperimente eingesetzt werden. Die
      Ausbeuten an löslichem COP1, bzw. verkürzter COP1 Proteine
      waren gering und Versuche der Optimierung der Expression
      gelangen nicht. Des Weiteren zeigte sich, dass das
      CCT2-Fusionsprotein nach Expression in E. coli und
      nachfolgender Aufreinigung und Ankonzentrierung Oligomere
      bereits ohne Zugabe des chemischen Inducer bildet. Dennoch
      wurden Co-IPs durchgeführt, die aber keine Aussage darüber
      ermöglichten, ob CCT2 als Dimer für die Interaktion mit COP1
      vorliegen muss. Aufgrund der vorgenannten Probleme war eine
      Kokristallisation von CCT2 mit COP1 nicht möglich. Die
      blaulichtabhängige Phosphorylierung und der Abbau von CRY2 in
      vivo wurde durch immunologische Analysen untersucht.
      Inbesondere wurde hierbei der Frage nachgegangen, welchen
      Einfluss Mitglieder der SPA-Proteinfamilie auf die
      Phosphorylierung und den Abbau von CRY2 haben. Die vier in
      Arabidopsis vorhandenen SPA Proteine fungieren zusammen mit
      COP1 ebenfalls als Repressoren der Photomorphogenese. Zur
      Beantwortung der Frage, ob SPA-Proteine am Abbau von CRY2
      beteiligt sind, wurden CRY2 Gehalte in zahlreichen spa
      Mutanten untersucht. Weiterhin wurde eine mögliche
      Interaktion von SPA Proteinen mit CRY2 in vitro überprüft. Es
      konnte hierbei ein Einfluss der SPA Proteine auf die
      Stabilität von CRY2 im Blaulicht gezeigt werden, inbesondere
      unter niedrigen Fluenzraten. In Co-IP Analysen wurde eine
      direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und SPA4 gezeigt.
      Zusammengefasst zeigen die erzielten Ergebnisse, dass
      SPA-Proteine am Abbau von CRY2 beteiligt sind und hierfür
      vermutlich eine direkte Interaktion von CRY2 mit SPA1 und
      SPA4 erforderlich ist. Weitere Analysen von CRY2
      Proteinleveln in phyA Mutanten zeigten einen bis dahin
      unbekannten Einfluss von Phytochrom A auf die Stabilität von
      CRY2. Konsistent mit der Rolle der SPA-Proteine im Signalweg
      von phyA wiesen die phyA-Mutanten im niedrigen
      Fluenzratenbereich höhrere CRY2-Level als der Wildtyp auf.
      Dieser phyA Effekt wurde nur im Blaulicht, nicht aber unter
      Rot- und Dunkelrotlicht beobachtet. Somit kann davon
      ausgegangen werden, dass für den Abbau von CRY2 dessen
      vorherige Aktivierung durch Blaulicht zwingend erforderlich
      ist. Die Analyse einer phyB-Mutante zeigte hingegen keinen
      Unterschied zum Wildtyp. D
description: The UV-A/blue light photoreceptor
      cry2 plays a fundamental role in the transition from the
      vegetative to the reproductive phase in the facultative
      long-day plant Arabidopsis thaliana by stabilizing the
      photoperiodic pathway element CO and modulating FT expression
      under long-day conditions. The level of cry2 protein itself
      is regulated by light with a strong decrease upon transition
      of etiolated seedlings to blue light. Both, cry2 signaling
      and its degradation occur in the nucleus. Degradation of cry2
      is preceded by phosphorylation and polyubiquitination and
      mediated by the 26S proteasome. Although, the E3 ubiquitin
      ligase COP1 has been identified as one element involved in
      cry2 degradation, several cop1 mutants show only some
      reduction but no prevention of cry2 degradation. We thus
      reasoned that SPA proteins, which act in concert with COP1,
      could also have a role in cry2 degradation. To test this
      hypothesis we analyzed cry2 protein levels in spa single,
      triple and quadruple mutants. cry2 degradation under
      continuous blue light was alleviated in a fluence
      rate-dependent fashion in all spa mutants analyzed.
      Consistent with a role of SPA proteins in phyA signaling we
      found enhanced levels of cry2 in the phyA mutant in
      particular under low fluence rate blue light. Moreover, in
      vitro pull-down studies showed that photoactive cry2
      interacts directly with SPA1 and SPA4. Together our results
      suggest that cry2 is under control of SPA and phyA thus
      adding another piece of information on the molecular
      mechanisms of interaction between cryptochrome and
      phytochrome photoreceptors.