Peptide variants of a SARS-CoV-2 neutralizing protein
Creators: name: Weißenborn, Lucas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023

description: The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic continues to be a topic of great interest in biomedical research. The infectious agent, which has caused almost 7 million deaths worldwide (as of July 2023), is the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) from the family of Coronaviridae. This virus primarily infects cells in the human respiratory system by attaching its Spike (S) Protein receptor-binding domain (RBD) to the angiotensin-converting enzyme type 2 (ACE2) that is expressed on the human cell surface. Although the successful development of vaccines during the year 2020 has significantly reduced mortality, continuously emerging virus variants are hampering vaccination efficacy, and especially immunocompromised patients or patients with concomitant diseases continue to die as a result of COVID-19, which underlines the need for additional therapeutic options in the prevention and treatment of severe clinical cases. Recently described de-novo designed proteins, such as LCB1, have been shown to neutralize a number of SARS-CoV-2 variants of concern (VOC) with high potency by binding the S protein and inhibiting ACE2-recruitment. However, the use of such therapeutic proteins is usually limited due to their lack of metabolic stability and potential immunogenicity. One potential solution to these limitations is to mimic the binding site of these proteins using peptides. Therefore, a panel of smaller, LCB1-derived peptides was designed, synthesized and evaluated, which alsoincorporates chemical modifications to increase activity and stability. Truncation of LCB1 by at least one third of its sequence proved to be possible without losing activity against LCB1-susceptible virus variants. An Alanine scan and a D-amino acid scan of one such truncated peptide was performed to dissect the role of each amino acid side chain and stereochemistry, respectively, in RBD binding, inhibition of the RBD-ACE2 interaction and secondary structure. Introducing an additional disulfide bridge to a truncated peptide resulted in LW25.13, a cyclic peptide with higher RBD-affinity and 10-fold improved neutralizing activity, compared to LCB1. Digestion experiments with different proteolytic enzymes also demonstrated a significantly increased stability of LW25.13 compared to linear peptide variants. Other modifications to the truncated peptides, for example the exchange of natural amino acids for non-canonical amino acids, or alkylation of the peptide backbone also lead to significantly increased proteolytic stability, but are usually also associated with a loss of biological activity. Incubation with human serum also indicated oxidation susceptibility as a possible instability. Subsequently, the effect of oxidation on the peptide variants was assessed and counteracted by replacing methionine residues with the non-canonical amino acid O-methyl homoserine. To identify which of the common mutations in VOC have an impact on the peptide activity, three mutations from non-LCB1-susceptible VOC were introduced into wild type Spike protein expressed by pseudoviruses, both individually and in combination. By analyzing the neutralization of these virus variants, we found that a combination of the K417N and N501Y mutations, present for example in the beta- and omicron VOCs, results in an almost complete loss of susceptibility to neutralization by the peptides and LCB1. We were already able to partially counteract this by structure-based exchange of amino acids in LW25.13. However, further optimization of the peptide for the purpose of broader neutralization is still necessary. In summary, we were able to generate a potent SARS-CoV-2 neutralizing, protease-stable peptide. We were able to demonstrate the benefit of chemical modifications for neutralization breadth and proteolytic stability, which is a major advantage of chemically synthesized peptides over biotechnologically produced proteins, highlighting the potential of peptides in COVID-19 treatment and antiviral therapy in general.
description: Die Coronavirus Disease 2019 (COVID-19)-Pandemie ist nach wie vor ein Thema von großem Interesse für die biomedizinische Forschung. Bei dem Krankheitserreger, der weltweit inzwischen fast 7 Millionen Todesfälle verursacht hat (Stand: Juli 2023), handelt es sich um das Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) aus der Familie der Coronaviridae. Dieses Virus infiziert hauptsächlich Zellen des menschlichen Atmungssystems, indem die rezeptorbindende Domäne (RBD) seines Spike-Proteins (S) an das Angiotensin-konvertierende Enzym Typ 2 (ACE2) bindet, welches auf der menschlichen Zelloberfläche exprimiert wird. Obwohl die erfolgreiche Entwicklung von Impfstoffen im Jahr 2020 die Sterblichkeit erheblich reduziert hat, beeinträchtigen kontinuierlich neu auftretende Virusvarianten die Wirksamkeit der Impfung, und insbesondere immungeschwächte Patienten oder Patienten mit Begleiterkrankungen sterben weiterhin an COVID-19. Dies unterstreicht die Notwendigkeit zusätzlicher therapeutischer Optionen zur Vorbeugung und Behandlung schwerer klinischer Fälle. Kürzlich beschriebene de-novo entworfene Proteine wie LCB1 sind in der Lage, mehrere SARS-CoV-2-Varianten (VOC) mit hoher Wirksamkeit neutralisieren, indem sie das S Protein binden und die ACE2-Rekrutierung hemmen. Der Einsatz solcher therapeutischen Proteine ist jedoch in der Regel aufgrund ihrer mangelnden metabolischen Stabilität und ihrer potenziellen Immunogenität begrenzt. Eine mögliche Lösung für diese Probleme besteht darin, die Bindungsstelle dieser Proteine durch Peptide zu imitieren. Daher wurden kleinere, von LCB1 abgeleiteter Peptide entworfen, synthetisiert und bewertet, die auch chemische Modifikationen zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität enthält. Die Verkürzung der Sequenz von LCB1 um mindestens ein Drittel erwies sich als möglich, ohne dass die Aktivität gegen LCB1-empfängliche Virusvarianten verloren ging. Ein Alanin-Scan und ein D-Aminosäure-Scan eines solchen verkürzten Peptids wurden durchgeführt, um die Rolle der Seitenketten bzw. der Stereochemie aller einzelnen Aminosäuren bei der RBD-Bindung, der Hemmung der RBD-ACE2-Interaktion und der Sekundärstruktur zu untersuchen. Die Einführung einer zusätzlichen Disulfidbrücke in ein verkürztes Peptid führte zu LW25.13, einem zyklischen Peptid mit höherer RBD-Affinität und 10-fach verbesserter Neutralisierungsaktivität im Vergleich zu LCB1. Verdauexperimente mit verschiedenen proteolytischen Enzymen zeigten auch eine deutlich erhöhte Stabilität von LW25.13 im Vergleich zu linearen Peptidvarianten. Andere Modifikationen der verkürzten Peptide, z. B. der Austausch natürlicher Aminosäuren gegen nicht-kanonische Aminosäuren oder die Alkylierung des Peptidrückgrats, führen ebenfalls zu einer deutlich erhöhten proteolytischen Stabilität, sind aber in der Regel auch mit einem Verlust an biologischer Aktivität verbunden. Die Inkubation mit Humanserum deutete auch auf eine Anfälligkeit für Oxidation als mögliche Instabilität hin. Daher wurde im Anschluss die Auswirkung von Oxidation auf die Peptidvarianten untersucht und ihr durch Austausch von Methionin durch die nicht-kanonische Aminosäure O-Methylhomoserin entgegengewirkt. Um herauszufinden, welche der häufigsten Mutationen in VOC einen Einfluss auf die Peptidaktivität haben, wurden drei Mutationen aus nicht durch LCB1-neutralisierbaren VOC sowohl einzeln als auch in Kombination in mit Wildtyp-Spike-Protein pseudotypisierte Lentiviren integriert. Bei der Analyse der Neutralisation dieser Varianten stellten wir fest, dass eine Kombination der Mutationen K417N und N501Y, die beispielsweise in den Beta- und Omikron-VOCs vorkommt, zu einem fast vollständigen Verlust der Neutralisation durch die Peptide und LCB1 führt. Wir konnten dies bereits teilweise durch den strukturbasierten Austausch von Aminosäuren in LW25.13 ausgleichen. Eine weitere Optimierung des Peptids zur Erzielung einer breiteren Neutralisation ist jedoch noch erforderlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es uns gelungen ist, ein wirksames SARS-CoV-2-neutralisierendes, proteasestabiles Peptid herzustellen. Wir konnten den Nutzen chemischer Modifikationen für die Neutralisierungsbreite und proteolytische Stabilität nachweisen, was ein großer Vorteil von chemisch synthetisierten Peptiden gegenüber biotechnologisch hergestellten Proteinen ist und das Potenzial von Peptiden für die COVID-19-Behandlung und die antivirale Therapie im Allgemeinen hervorhebt.