TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF THE B3GALT5 GENE
Creators: name: ZULUETA MORALES, AIDA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2014

description: RIASSUNTO
Introduzione. La ?1,3 galattosiltransferasi (B3GALT5) � responsabile della sintesi della catena oligosaccaridica di tipo 1, tra cui gli antigeni Lewis come il sialil-Lewis a, epitope del marcatore tumorale CA19.9 e ligando della E-selectina, potenzialmente coinvolto nella malignit� tumorale. La sua trascrizione � regolata da molteplici promotori. In alcuni epiteli essa � sotto il controllo di un promotore debole, chiamato nativo, modulato epigeneticamente e tramite il fattore nucleare NF-Y. In alcuni organi e cellule di origine gastrointestinale � attivo inoltre un altro promotore, pi� forte e chiamato LTR per la sua origine retrovirale, che secondo la letteratura dovrebbe essere regolato attraverso il fattore nucleare epatocitario HNF1?/? e quello analogo al Caudale di drosofila Cdx1/2. Tuttavia la B3GALT5 � repressa nel cancro del colon, il trascritto LTR non � rilevante nell?intestino tenue, e Cdx1/2 risultano assenti in una linea cellulare che esprime grandi quantit� di tale trascritto.
Scopi. Scoprire i meccanismi che controllano la trascrizione di B3GALT5 attraverso il suo promotore LTR, con l?obiettivo di spiegare la specificit� tissutale e la repressione negli adenocarcinomi del colon, nonch� di capire il processo di stabilizzazione evolutiva del trasposone in alcuni primati.
Metodi. A questo scopo abbiamo quantificato l?espressione di HNF1?/? e Cdx1/2, tramite Western Blot, e quella del trascritto B3GALT5 LTR, tramite RT-PCR competitiva, in tessuti tumorali e linee cellulari. Inoltre, abbiamo silenziato HNF1? o ? in diverse cellule, tramite shRNA, e li abbiamo espressi in un?altra, tramite trasfezione del cDNA. Abbiamo quindi trattato delle cellule con l'agente demetilante il DNA 5'-AZA-2'-desossicitidina, misurandone poi i livelli di trascritto LTR. Abbiamo infine valutato il promotore LTR in vitro, mediante saggi di EMSA e di luciferasi. Risultati. Cdx1/2 risultano immisurabili in cellule e tessuti che pur esprimono alti livelli di trascritto LTR, mentre HNF1?/? sono presenti anche in cellule e tumori che esprimono una quantit� bassa o nulla del trascritto. Nelle cellule che non esprimono HNF1?/? per� non c?� espressione alcuna del trascritto LTR. Tra queste, le MDA-MB-231, dopo transfezione con HNF1? o ?, esprimono il trascritto LTR, ma a bassi livelli, paragonabili a quelli dei tumori del colon. Il silenziamento di HNF1? in una linea cellulare che esprime entrambi i fattori HNF1? e ? non ha effetti nell?espressione del trascritto LTR, mentre quello di HNF1? in un?altra linea che esprime solo HNF1? produce forte riduzione del trascritto. Pure il trattamento con 5'-AZA-2'-desossicitidina riduce il trascritto in cellule che ne esprimono alti livelli, portandolo ai livelli dei tumori del colon, e senza effetto sulla quantit� di HNF1. Usando i saggi delle luciferasi, abbiamo visto che la luciferasi sotto il controllo del promotore LTR � pi� attiva in cellule e cloni che esprimono alte quantit� di HNF1, anche se non esprimono o esprimono poco trascritto LTR, che in quelle cellule che esprimono poco HNF1 ma magari una grande quantit� di trascritto. Usando la sequenza del promotore LTR in saggi di EMSA, abbiamo visto che forma dei complessi specifici con estratti di proteine nucleari di tutte le linee cellulari che esprimono HNF1, indipendentemente dei livelli di espressione del trascritto B3GALT5 LTR.
Conclusione. I nostri risultati suggeriscono che HNF1? e -? sono necessari ma non sufficienti a regolare l'espressione del promotore LTR, mentre Cdx1/2 non sono coinvolti. HNF1?/? svolgono un ruolo intercambiabile e non cumulativo, e non sono immediatamente responsabili della regolazione negativa che avviene nel cancro, che invece dipende da elementi regolatori distanti attivi solo se metilati. Il successo della inserzione e l'attivazione del promotore B3GALT5 LTR durante l'evoluzione dipendono quindi non solo dal suo sito di legame a HNF1, ma anche da questi elementi distanti attualmente sconosciuti.