Μελέτη της καρβοξυτελικής περιοχής του TGF-β3 παράγοντα στη διαφοροποίηση κυττάρων προς χονδρογένεση
Creators: name: Αποστολίδου, Χρυσάνθη Πηνελόπη Αποστόλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Καρβοξυτελική περιοχή TGF-β3
Κλωνοποίηση
Χονδρογένεση
Carboxyl terminal TGF-β3
Cloning
Chondrogenesis

description: Σκοπός της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν ο έλεγχος της δραστικότητας της καρβοξυτελικής επικράτειας του παράγοντα TGF-β3 στη διαφορoποίηση κυττάρων προς χονδρογένεση, καθώς και της υποκυτταρικής κατανομής του σε καρκινικά κύτταρα τραχήλου HeLa. Για τη μελέτη της υποκυτταρικής εντόπιση τους μέσα στο κύτταρο. πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση της αλληλουχίας του TGF-β3 και του καρβοξυτελικού δραστικού του άκρου στον πλασμιδιακό φορέα pEGFP-C1 Με μικροσκοπία συνεστίασης παρατηρήθηκε ότι στις 48 ώρες η καρβοξυτελική επικράτεια του TGF-β3 εντοπίζεται στην κυτταροπλασματική περιοχή του κυττάρου, ενώ στις 24 ώρες ο παράγοντας εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα. Η κλωνοποίηση ολόκληρης της αλληλουχίας του TGF-β3 βρίσκεται σε εξέλιξη και η υποκυτταρική της εντόπιση μένει να ελεγχθεί, προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα για την κατανομή της ολόκληρης και της καρβοξυτελικής περιοχής του TGF-β3.Ακόμη, η καρβοξυτελική επικράτεια του TGF-β3 κλωνοποιήθηκε και ακολούθησε απομόνωση της πρωτεΐνης και καθαρισμός αυτής, ώστε να μελετηθεί η διαφοροποιητική ικανότητα της σε μεσεγχυματικά κύτταρα οδοντικής προελεύσεως με τη χρώση alcian blue. Η κλωνοποίηση της ολόκληρης αλληλουχίας και η επαγωγή της πρωτεϊνικής της έκφρασης βρίσκεται σε εξέλιξη. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η διαφοροποίηση των κυττάρων σε χονδροκύτταρα είναι μεγαλύτερη με τη δράση της καρβοξυτελικής επικράτειας του παράγοντα TGF-β3 απ’ ότι με ολόκληρη πρωτεΐνη TGF-β1,ενώ η διαφοροποίηση αυξάνεται με τo οκταπεπτιδίου (YYVGRKPK), το οποίο αποτελεί τμήμα της καρβοξυτελικής περιοχής του TGF-β1. Επιπλέον, η χονδρογένεση των κυττάρων παραμένει σχετικά ίδια στις χαμηλές συγκεντρώσεις του TGF-β3 και εμφανίζεται μειωμένη στην υψηλότερη συγκέντρωση που χορηγήθηκε. Τέλος, η μελέτη αυτή αποτελεί ένα βήμα προς την κατανόηση της δραστικότητας του παράγοντα TGF-β3, ώστε να είναι δυνατή η χρήση του περαιτέρω για θεραπευτική αγωγή.
description: The aim of the present thesis to test the activity of c terminal TGF-β3 activity in cell differentiation to chondrogenesis, as well as to control subcellular distribution in HeLa cervical cancer cells. To study their subcellularly localization in our experiments, we use confocal microscopy, showed that at 48 hours the carboxyl terminal domain of TGF-β3 is located in the cytoplasm of the cell, while at 24 hours the agent is located in the cytoplasm and the nucleus. Cloning of the entire TGF-β3 coding sequence is in progress and its subcellular localization remains to be tested to draw conclusions for the distribution of the entire and C-terminal region of TGF-β3. Furthermore, the C-terminal domain of TGF-β3 was cloned, followed by isolation and purification of the protein to study its differentiation capacity in dental mesenchymal cells using the alcian blue staining. Cloning of the entire sequence and induction of its protein expression is underway. Our results indicate that the differentiation of dental mesenchymal cells in chondrocytes is greater in the presence of the C-terminal domain of TGF-β3 than with TGF-β1 protein,whereas differentiation is increased using the octapeptide (YYVGRKPK), which is part of the carboxyl-terminal region of TGF-β1. In addition, the chondrogenicity of the cells remains relatively similar at low concentrations of TGF-β3 and appears reduced in the highest concentration administered. Finally, this study is a step towards understanding the activity of TGF-β3, so that it can further used for treatment.