Ανάπτυξη μεθόδου προσδιορισμού τις διμεθυλαμίνης και διαιθυλαμίνης σε φαρμακευτικά σκευάσματα
Creators: name: Lotca, Georgiana-Roxana Mircea
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Διμεθυλαμίνη
Διαιθυλαμίνη
Παραγωγοποιήση
Dimethylamine
Diethylamine
Derivatization

description: Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διπλωματικής διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό της διμεθυλαμίνης (DMA) και διαιθυλαμίνης (DEA) σε καθαρές δραστικές ουσίες όπως: μετφορμίνη, λιδοκαΐνη, εφεδρίνη, αμοξυκιλλίνη και θεοφυλλίνη και στα αντίστοιχα φαρμακευτικά σκευάσματα: Glucophage®, Xylozan®, Uniphyllin® (δισκία), εφεδρίνη (αμπούλα) και αμοξυκιλλίνη (ενέσιμο).Για τον σκοπό αυτόν χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (HPLC) σε συνδυασμό με ανιχνευτή φθορισμού (FLD). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε μία στήλη C18 με κινητή φάση ένα μείγμα μεθανόλης/ ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (pH=2.8, 20mM) σε αναλογία 50:50 v/v, και ισοκρατική έκλουση.Η παραγωγοποίηση των αναλυόμενων ουσιών πραγματοποιήθηκε πριν από την στήλη (pre-colum derivatization) με αντιδραστήριο NBD-Cl σε αλκαλικό περιβάλλον (ρυθμιστικό βορικoύ άλατος pH=10,5) και ακολούθως αναλύθηκαν με HPLC-FLD (λem 470nm και λex 540nm). Για τον καθορισμό των βέλτιστων συνθηκών της αντίδρασης μελετήθηκε μια σειρά παραγόντων που την επηρεάζουν τόσο σε προκαταρτικά πειράματα (αναλογία όγκων διαλυμάτων μεθανόλης και DMA/DEA σε NaHCO3, συγκέντρωση του NBD-Cl, θερμοκρασία), όσο και με τη βοήθεια του πειραματικού σχεδιασμού και αξιολογήθηκαν. Κατά την εφαρμογή του Πειραματικού Σχεδιασμού χρησιμοποιήθηκε η τεχνική Mixture Component Crossed D -Optimal, (CDO) όπου η αναλογία των συστατικών του NBD-Cl (1,2 mg/mL) και του H2Ο συνδυάστηκε και μελετήθηκε υπό την επίδραση δύο παραγόντων (VmL NaHCO3 0,5M και το, χρόνο αντίδρασης). Η αντίδραση της παραγωγοποίησης βάσει των αποτελεσμάτων του πειραματικού σχεδιασμού και των προκαταρκτικών πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν ήταν η εξής: Φιαλίδιο (vial), με τελικό όγκο 550μL, που περιέχει: 100μL ΜΙΧ (DMA+DEA) σε διάλυμα NaHCO3, συγκέντρωσης 5μg/mL DEA και 1μg/mL DMA, 100 μL MeOH, 50μL ρυθμιστικό διάλυμα βορικού συγκέντρωσης 10mM, 150 μL ΝBD-CL (τελικής συγκέντρωσης 320 ppm) τοποθετείται στον φούρνο με καπάκι για 30 min στους 70°C. Μετά το πέρας της αντίδρασης, απομακρύνεται από τον φούρνο και τοποθετείται στην κατάψυξη για 1 min ώστε να σταματήσει η αντίδραση και στη συνέχεια προστίθενται 150 μL νερό. Ακολούθησε ο καθορισμός των χρωματογραφικών συνθηκών ανάλυσης και η διαδικασία επικύρωσης της μεθόδου. Τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά και εντός προδιαγραφών ICH ως προς τη γραμμικότητα (R^2&gt;0.9994 για την DMA και R^2&gt;0.9993 για την DEA), το όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης (LODDMA=0.67 ng/ML, LODDEA=3,38 ng/mL και LOQDMA = 2,02 ng/ML, LOQ DEA =10,23 ng/mL), την επαναληψιμότητα και ενδιάμεση επαναληπτικότητα, (%RSD&lt;5), την ανθεκτικότητα (%RSD&lt;5) και την ακρίβεια (%Ανάκτηση στο όριο ποσοτικοποίησης των αμινινών ήταν 63.51% για την DMA και 80% για την DEA). Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των δύο αμινών σε δραστικές καθαρές ουσίες (ΑΡΙ) και σε φαρμακευτικά σκευάσματα. Προηγήθηκε το στάδιο επεξεργασίας και καθαρισμού των δειγμάτων με εκχύλιση στερεού/υγρού ή υγρού/υγρού με διχλωρομεθάνιο (εκτός από την λιδοκαΐνη όπου χρησιμοποιήθηκε ο διαιθυλαιθέρας). Ακολούθησε διαλυτοποίηση με υπέρηχους, φυγοκέντριση παραλαβή του υπερκείμενου, διήθηση, εξάτμιση με Ν_2, παραγωγοποίηση και ανάλυση με ΗPLC.Η μέθοδος ήταν επιτυχής αφού οι ανακτήσεις των DMA, DEA μετά την εκχύλιση ήταν αρκετά ικανοποιητικές και κυμαίνονταν για την DEA 85-94% και την DΜA από 85-95%. Σε όλα τα υποστρώματα ανιχνεύτηκε επιμόλυνση των δυο αμινών.
description: The subject of the present study was the development of an analytical method for the determination of dimethylamine (DMA) and diethylamine (DEA) in active pharmaceutical ingredients (API) such as metformin, lidocaine, ephedrine, amoxycillin and theophyliine, and the respective pharmaceutical formulations: Glucophage®, Xylozan®, Uniphyllin® (tablets), ephedrine (ampule) and amoxycillin (injection).For this purpose we used High Performance Liquid Chromatography (HPLC) conjugated with a fluorosence detector (FLD). The column used for the analysis was an octadesyl (C18) and the mobile phase consisted of a mixture of methanol/phosphate buffer solution (pH=2.8, 20mM) 50:50 v/v. The analyses were run in isocratic mode. The derivatization of the analytes was performed prior their injection in the column (pre-colum derivatization) with NBD-Cl reagent in alkaline solution (with a borate buffer pH=10.5) and then analyses were run in HPLC-FLD (λem 470nm and λex 540nm). In order to determine optimum conditions, we studied a series of factors that affected the reaction with preliminary experiments (volume ratio of methanol and DMA/DEA in NaHCO3, concentration of NBD-Cl reagent, temperature), and the results were evaluated applying experimental design. In the context of the application of experimental design, we used the Mixture Component Crossed D -Optimal technique, (CDO) were the ratio of the components of NBD-Cl (1,2 mg/mL) and water (H2Ο) was combined and the effect of two parameters was studied (VmL NaHCO3 0.5M and the time of reaction). The derivatization reaction, based on the results derived from experimental design and from the preliminary experiments was the following: Vial of final volume of 550μL, containing: 100μL ΜΙΧ (DMA+DEA) in NaHCO3 solution, concentration 5μg/mL DEA and 1μg/mL DMA, 100 μL MeOH, 50μL borate buffer with concentration 10mM, 150 μL ΝBD-CL (final concentration 320 ppm) which is placed (covered) in the oven for 30 min at 70°C. With the completion of the reaction, it was removed from the oven and transferred in the refrigerator (below 0°C) for 1 min, so as to terminate the reaction and then 150 μL of water was added.The next step was to determine the conditions of chromatographic analysis and method validation. The results were satisfactory and within ICH specification limits in terms of linearity (R^2&gt;0.9994 for DMA, and R^2&gt;0.9993 for DEA). The limits of detection and quantification were LODDMA=0.67 ng/ML, LODDEA=3.38 ng/mL and LOQDMA = 2.02 ng/ML, LOQ DEA =10.23 ng/mL, repeatability and inter-day reproducibility (%RSD&lt;5), robustness (%RSD&lt;5), and the accuracy (% recovery within the quantification of the amines was 63.51% for DMA and 80% for DEA). The method was also applied for the quantification of the two amines in active pharmaceutical ingredients (API) and in pharmaceutical formulations. Prior to this step, the samples were processed using solid/liquid or liquid/liquid extraction using dichloromethane in all cases except from the sample containing lidocaine where diethylether was used. Then the samples were subjected to dissolution using sonicator, then centrifugation and the supernatant liquid was received. Then the sample underwent volatilization using Ν_2, derivatization and HPLC analysis. The method was proven successful as the recovery of DMA and DEA after the extraction was satisfactory within the range of 85-94% for DEA and 85-95% for DMA. Contamination with the two amines was detected in all substrates.