title: Wirkstofftransport an der urothelialen Oberfläche
Creators: name: Spijker, Sylvia
Publisher: name: :none
Year: 2016

description: In dieser Arbeit wurden die Bindung, die Aufnahme in die Zelle und die Freisetzung von mikroverkapseltem 4-(N)-Stearoyl-Gemcitabin-Prodrug (Gem-C18) untersucht. Zur Herstellung dieses Derivats wurde ein Protokoll von Immordino et al [34] verwendet. Das für Gem-C18 erstellte NMR-Spektrum wies zunächst noch Verunreinigungen auf, sodass das Protokoll optimiert werden musste. Gem-C18 wurde anschließend mittels Solvent Evaporation in PLGA mikroverkapselt [32]. An die Oberflächen der dadurch entstandenen Partikel wurden Lektine (WGA) bzw. humanes Serum Albumin (HSA) gekoppelt [33]. Zum Vergleich wurden zusätzlich nicht-modifizierte Partikel (Plain) verwendet. Es konnte eine signifikant höhere Bindung der WGA-modifizierten Mikropartikeln an die immortalisierten Blasenzellen (SV-HUC), sowie an die malignen Blasenzellen 2. Grades (RT112, 647V, 5637, T24) und 3. Grades (HT1376) nachgewiesen werden. Selbst nach mehrfachem Waschen blieb ein Großteil der PLGA-Partikeln an den Zellen haften. Die Spezifität der Bindung konnte durch Co-Inkubation mit N,N,N-Triacetylchitotriose bestätigt werden. Dieser Zucker bindet, genauso wie die an der Zelloberfläche vorhandenen Zucker (N-Acetylglucosamin und N-Acetylneuraminsäure) an WGA-Lektine [30]. In einer weiteren Analyse wurde festgestellt, dass leichte Strömungen keinen Einfluss auf die Partikelbindung haben. Für die Freisetzungsuntersuchungen und jene für die Aufnahme in die Zellen wurde zusätzlich ein Fluoreszenzfarbstoff (5-N-(Oktadecanoyl)aminofluorescein, Fluo-C18) mit ähnlicher Struktur wie Gem-C18 verwendet und eingebaut. Durch Inkubation der Zellen mit mikroverkapseltem Fluo-C18 konnte die Aufnahme in die Zellen bildlich festgehalten werden. Dabei wurde bestätigt, dass nur durch direkten Kontakt der Mikropartikel mit den Blasenzellen und die anschließende Freisetzung des Farbstoffs ein ausreichender passiver Transport von Fluo-C18 in die Zelle möglich ist. Mikroskopisch konnte deutlich die Verteilung des Farbstoffes in der Zelle über die Zeit (15 min, 1 std, 2 std) bei 4 °C (sehr wenig Resorption) und bei 37 °C (sehr gute Resorption) dargestellt werden. Ohne Wirkstofffreigabe aus den Partikeln kann keine effektive Therapie stattfinden. Dazu wurden Untersuchungen hinsichtlich der Freisetzung des lipophilen Gem-C18 und des lipophilen Fluo-C18 in ein hydrophiles Medium durchgeführt. Die Freisetzung beider Substanzen aus den PLGA-Partikeln konnte mittels HPLC (Agilent Technologies 1100) bestätigt werden. Diese Arbeit liefert gute Ansätze für die Optimierung der bereits vorhandenen Zytostatikatherapie bei Blasenkarzinomen. Durch die Bindung der Partikel und die erhöhte Aufnahme des Wirkstoffes in die Zelle können die Dosis des Zytostatikums und die Nebenwirkungen reduziert werden. Ein weiterer Schritt in der Entwicklung einer verbesserten intravesikalen Therapie wäre eine Modifikation der Partikel, die gezielt ausschließlich Tumorzellen erreicht.
description: In this work, the binding and the uptake of 4-(N)-Stearoyl-Gemcitabine-Prodrug (Gem-C18) into bladder cells and the release of encapsulated Gem-C18 were investigated. The derivatization of Gemcitabine to lipophilic Gem-C18 was carried out according to the protocol of Immordino et al. The NMR spectra of Gem-C18 indicated impurities, and thus, the protocols of the synthesis had to be improved. Subsequently, the Prodrug was encapsulated into PLGA microparticles by solvent evaporation and a surface modification of the prepared PLGA-particles with lectins (wheat germ agglutinin, WGA) or human serum albumin (HSA) were implemented and compared to plain particles. The binding capacity of WGA-modified microparticles to the immortalized bladder cells, as well as to malignant bladder cancer cells (RT112, 647V, 5637, T24, HT1376) were significantly higher than for HSA-modified or plain particles. Even after repeated washing, most of the particles remained attached to the cell surfaces, which was confirmed by co-incubation of N,N,N-Triacetylchitotriose. The carbohydrate epitopes on the surface of the bladder cells interact with WGA in the same way as the carbohydrates, N-acetylglucosamine and N-acetylneuramininic acid. In a further assay, it was determined that there was no influence of gentle flow on the binding. For the analysis of the release and the uptake into the bladder cells, a fluorescent marker, (5-N-(octadecanoyl)aminofluorescein, Fluo-C18) was additionally used, which has a configuration similar to that of Gem-C18. Incubating the bladder cells with Fluo-C18 microparticles, the uptake could be analysed visually with a microscope. Thereby, it could be confirmed that only the direct contact of the microparticles with the cells and the following release of the drug enable the transport of Fluo-C18 into the cell. The distribution of the Fluo-C18 inside the cancer cells was displayed with the microscope over a time period of 15 min, one hour, and two hours, at temperatures of 4 °C (low resorption) and 37 °C (high resorption). The release of active substances is a prerequisite for effective therapy. Thus, the release of lipophilic Gem-C18 and lipophilic Fluo-C18 in a hydrophilic medium was examined. The present results of this work provide strategies for an improvement of the current cytostatic therapy of bladder cancer. Binding of the particles may lead to an increased uptake of the drug into the cancer cells. That way, both the therapeutic dose and adverse effects could be reduced. A further step in the development of targeted therapy might be a modification of these particles that is specific for urothelial tumour cells.