Κλωνοποίηση της κωδικοποιούσας αλληλουχίας της ποντικίσιας β-σφαιρίνης, in vitro μεταγραφή (IVT), και σύζευξη του IVT-mRNA με το πεπτίδιο μεταγωγής PTD με απώτερο σκοπό την ενδοκυττάρια μεταφορά του PTD-IVT-mRNA της β-σφαιρίνης
Creators: name: Κανελάκη, Αικατερίνη Σπυρίδωνα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: In vitro μεταγραφόμενο mRNA (αγγελιαφόρο RNA)
β-σφαιρίνη ποντικού
Τεχνολογία Πεπτιδίων Μεταγωγής
In vitro transcribed mRNA (messenger RNA)
murine β-globin
Protein Transduction Domain Technology

description: Η β-θαλασσαιμία αποτελεί μία μονογονιδιακή κληρονομική νόσο που οφείλεται σε ένα ευρύ φάσμα μεταλλάξεων, οι οποίες οδηγούν σε μείωση ή πλήρη απουσία σύνθεσης της β-σφαιρίνης. Το έλλειμα αυτό διαταράσσει την ισορροπία α- και β- αλυσίδων με αποτέλεσμα τη μειωμένη σύνθεση της αιμοσφαιρίνης ενηλίκων HbA, οδηγώντας στην εμφάνιση ενός εύρους κλινικών φαινοτύπων που κυμαίνονται από σοβαρή αναιμία έως πλήρη απουσία συμπτωμάτων. Η συμβατική θεραπευτική προσέγγιση που ακολουθείται συνήθως είναι: α) οι μεταγγίσεις αίματος σε συνδυασμό με τεχνικές αποσιδήρωσης, β) η σπληνεκτομή, γ) η φαρμακολογική αγωγή της γ-σφαιρίνης και δ) η μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών από συμβατό δότη. Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια, η γονιδιακή θεραπεία παρουσιάζει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα, με πολύ μεγάλο κόστος, αλλά εγείροντας παράλληλα ζητήματα σχετικά με την ασφάλειά της. Μια εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση, που εντάσσεται στο πεδίο της πρωτεϊνικής θεραπείας αντικατάστασης, είναι η χρήση του In Vitro Μεταγραφόμενου (IVT) - mRNA, ενός συνθετικού μορίου που προσομοιάζει το φυσιολογικό mRNA. Μια σημαντική πρόκληση της εν λόγω τεχνολογίας ήταν η εύρεση και αξιοποίηση ενός αποτελεσματικού συστήματος ενδοκυττάριας μεταφοράς μορίων ΙVT-mRNA, με τα λιπονανοσωματίδια (LNPs) να κατέχουν την πρώτη θέση μέχρι στιγμής. Στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΑΠΘ εφαρμόζεται από χρόνια η τεχνολογία των πεπτιδίων μεταγωγής [Protein Transduction Domain (PTD) Technology] στα πλαίσια της πρωτεϊνικής θεραπείας αντικατάστασης γενετικών -μεταβολικών ασθενειών. Η ερευνητική ομάδα της καθηγήτριας Παπαδοπούλου Λευκοθέας ανέπτυξε και κατοχύρωσε ως εθνική πατέντα [«Μέθοδος για την ανάπτυξη μιας πλατφόρμας για την παραγωγή, δυνάμενων για μεταφορά μέσω πεπτιδίου μεταγωγής (PTD), in vitro μεταγραφόμενων (IVT) mRNA θεραπευτικών», No: 1010063], μία καινοτόμο πλατφόρμα σύζευξης των IVT-mRNAs με ένα επιλεγμένο πεπτίδιο (PTD). Η μέθοδος αυτή διευκολύνει την ενδοκυττάρια μεταφορά και έκφραση μορίων IVT-mRNA και παραγωγή της επιθυμητής πρωτεΐνης αξιοποιώντας τον ενδογενή μεταφραστικό μηχανισμό, που επιτελείται στα ριβοσώματα των κυττάρων-στόχων. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας τέθηκε ως στόχος και πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η κλωνοποίηση της κωδικοποιούσας αλληλουχίας (CDS) της β-σφαιρίνης μυός σε επιλεγμένο πλασμιδιακό φορέα που έφερε ενσωματωμένη την 3′ αμετάφραστη περιοχή της ανθρώπινης β-σφαιρίνης και τον Τ7 υποκινητή, που συνέβαλε στην επακόλουθη In Vitro Μεταγραφή του CDS του γονιδίου. Ακολούθως, επιτεύχθηκε η σύνθεση του IVT-mRNA της β-σφαιρίνης, με τις απαραίτητες δομικές τροποποιήσεις που εξασφαλίζουν επιθυμητή σταθερότητα, περιορισμένη ανοσογονικότητα και μεταφραστική ικανότητα του μορίου [ARCAs, βελτιστοποιημένες 3′ και 5′ αμετάφραστες περιοχές, πολύ(Α) ουρά]. Μοριακές αναλύσεις επιβεβαίωσαν την δομική ορθότητα και ακεραιότητα της αλληλουχίας του IVT--mRNA, εξασφαλίζοντας την παραγωγή της αντίστοιχης πρωτεΐνης-στόχου ( β-major αλυσίδας σφαιρίνης). Τέλος, ακολούθησε η σύζευξη του IVT-mRNA που παράχθηκε με το επιλεγμένο πεπτίδιο μεταγωγής για την ενδοκυττάρια μεταφορά και έκφραση του. Τα αποτελέσματα της πειραματικής διαδικασίας υποδεικνύουν ότι η σύζευξη του IVT-mRNA της ποντικίσιας β-σφαιρίνης και του επιλεγμένου πεπτιδίου μεταγωγής ήταν επιτυχής. Απώτερος στόχος της εργασίας αποτελεί η ενδοκυττάρια μεταφορά του παραγόμενου PTD-IVT mRNA της ποντικίσιας β-σφαιρίνης σε κυτταρικές καλλιέργειες όπως επίσης και σε θαλασσαιμικά ποντίκια στα πλαίσια της πρωτεϊνικής θεραπείας αντικατάστασης της β-θαλασσαιμίας.
description: Beta- thalassemia is a monogenetic, hereditary disease caused by a wide range of mutations that lead to reduction or complete absence of β-globin synthesis. This deficit disturbs the equilibrium between alpha- and β-chains resulting to reduced synthesis of adult hemoglobin HbA, leading to the emergence of a range of clinical phenotypes that fluctuate from severe anemia to complete absence of symptoms. Conventional therapeutic methods, usually applied are: a) blood transfusions combined with iron chelation techniques, b) splenectomy, c) pharmacological induction of γ-globin and d) transplantation of bone marrow derived hematopoietic cells from compatible donor. Moreover, recently, gene therapy demonstrates promising results, with high cost, while also raising safety issues. An alternative therapeutic approach, that are included in the field of protein replacement therapies, is the use of In Vitro Transcribed (IVT)-mRNA, a synthetic molecule that simulates normal mRNA. One of the main challenges accompanying this technology is the selection and utilization of an effective delivery system, with lipid nanoparticles (LNPs) being the most common so far. In Pharmacology laboratory (Department of Pharmacy, AUTΗ) Protein Transduction Domain (PTD) Technology has been applied in the context of Protein Replacement Therapy, for several years. The research team under the supervision of Professor Mrs. Papadopoulou developed and registered as national patent [[«Method for the development of a delivery platform to produce deliverable PTD-IVT-mRNA therapeutics», Greek patent Number: 1010063 with international publication number WO2021/094792A1 (20-5-2021)], a novel platform of conjugation of IVT-mRNA with a selected peptide (PTD). This method facilitates intracellular delivery and expression of IVT-mRNA molecules as well as the production of the desired protein through utilization of endogenous translational machinery, which is carried out by the ribosomes of the targeted cells. The goal set for the conduction of the present work which was successfully achieved was the cloning of the coding sequence (CDS) of murine β-globin into a selected plasmid vector which contained 3′ untranslated region of human β-globin and T7 promoter, that contributed to the following In Vitro Transcription of the CDS of the aforementioned gene. Subsequently, we achieved the synthesis of IVT-mRNA of β-globin, with the necessary structural modifications that ensure desired stability, limited immunogenicity and translational capacity of the molecule [ARCAs, optimized 3′ and 5′ untranslated regions, poly(A) tail]. Molecular analyses confirmed structural accuracy and integrity of IVT-mRNA sequence, ensuring the production of the corresponding protein of interest (β- major globin chain). Finally, the produced IVT-mRNA was conjugated with the selected peptide for its intracellular transduction and expression. Experimental results indicate that the conjugation of IVT-mRNA of murine β-globin with the selected PTD was carried out successfully. The ultimate aim of this current study is the transduction of PTD-IVT-mRNA of β-globin to cell cultures and finally beta-thalassemic mice.