Συγκριτική μελέτη μεθόδων Υγρής Χρωματογραφίας - Φασματομετρίας Μαζών για την ανάλυση νευροδιαβιβαστών
Creators: name: Παπακωνσταντίνου, Βασιλική Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Νευροδιαβιβαστές
Υγρή Χρωματογραφία
Φασματομετρία Μαζών
Neurotransmitters
Liquid Chromatography - HPLC
Mass Spectrometry - MS

description: Στην παρούσα μελέτη, αναπτύχθηκαν ποικίλες χρωματογραφικές μέθοδοι, τόσο κανονικής φάσης όσο και αντίστροφης φάσης, σε σύζευξη με φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC-MS/MS), με στόχο την ταυτόχρονη ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό έξι νευροδιαβιβαστών, συγκεκριμένα της ντοπαμίνης, της επινεφρίνης, της νορεπινεφρίνης, της σεροτονίνης, της ακετυλοχολίνης και του γ-αμινοβουτυρικού οξέος, σε ανθρώπινο ορό/πλάσμα αίματος. Δοκιμάστηκαν στήλες που διέφεραν ως προς το υλικό πλήρωσης, διάφορα συστήματα και αναλογίες διαλυτών κινητών φάσεων, όπως επίσης και προγράμματα έκλουσης. Αποτελεσματικότερη για τον σκοπό αυτό αναδείχθηκε μια ευαίσθητη μέθοδος υγρής χρωματογραφίας υδρόφιλων αλληλεπιδράσεων συζευγμένη με φασματομετρία μαζών σε σειρά (HILIC-MS/MS), η οποία αναπτύχθηκε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας και στη συνέχεια βελτιστοποιήθηκε. Ο βέλτιστος χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε στήλη ACQUITY UPLC BEH AMIDE με σύστημα κινητής φάσης Α: 83,3:16,7(v/v) νερό: ακετονιτρίλιο, 10 mM NH2HCO3 και οξίνιση με μυρμηκικό οξύ 0,1% (pH=3,75) και Β: 95:5(v/v) ακετονιτρίλιο:νερό, 10 mM NH2HCO3 και οξίνιση με μυρμηκικό οξύ 0,15% (pH=6,3), με ροή 0,350 mL/min. Δοκιμάστηκαν διάφορα προγράμματα έκλουσης, από τα οποία βέλτιστο αναδείχθηκε το εξής βαθμωτό πρόγραμμα, με συνολική διάρκεια ανάλυσης 7,5 λεπτά: 0-2 min 100→40% B, 2-2.5 min 40→30% B, 2.5-3.5 min 30%B, 3.50-3.51 min 30→100%Β, 3.51-7.50 min 100%Β, με την θερμοκρασία πηγής στους 450.0 οC για αύξηση της ευαισθησίας. Η εφαρμογή της προαναφερθείσας βελτιστοποιημένης χρωματογραφικής μεθόδου σε συνδυασμό με το φασματομετρικό σύστημα μάζας QTRAP 6500+, παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία, καθώς επιτυγχάνονται χαμηλά όρια ανίχνευσης (LOD: 12, 15, 75, 1.2, 0.1, 2.7 ng/mL για DA, E, NE, 5-HT, ACh, GABA, αντίστοιχα) και ποσοτικοποίησης (LOQ: 40, 50, 250, 4, 0.4, 9 ng/mL για DA, E, NE, 5-HT, ACh, GABA, αντίστοιχα) καθιστώντας συνεπώς την μέθοδο δυνατή για ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των ενώσεων της σεροτονίνης, της ακετυλοχολίνης, του γ-αμμινοβουτυρικού οξέος, και οριακά της ντοπαμίνης, σε πραγματικά δείγματα ανθρωπίνου αίματος, ενώ με χρήση του αναλυτή QTRAP 3200 είναι δυνατή μόνο η ανίχνευση και η ποσοτικοποίηση των ενώσεων της σεροτονίνης και της ακετυλοχολίνης.
description: In the present study, a variety of chromatographic methods, both normal phase and reversed phase, coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were developed for the simultaneously detection and quantification of six neurotransmitters, specifically dopamine, epinephrine, norepinephrine, serotonin, acetylcholine and γ-aminobutyric acid, in human serum/blood plasma. Different columns varying in packing material, various soluble systems and proportions of mobile phases, as well as many elution programs were tested. Most efficient method for this purpose proved to be a sensitive method of hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS), which has been developed in this study and subsequently has been optimized. The optimal chromatographic separation was performed on an ACQUITY UPLC BEH AMIDE column and the elution system was consisted of mobile phase A: 83.3:16.7 (v/v) water:acetonitrile, 10 mM NH2HCO3, formic acid 0.1% (pH=3.75) and mobile phase B: 95:5 (v/v) acetonitrile:water, 10 mM NH2HCO3, 0.15% formic acid (pH=6.3), with a flow of 0.350 mL /min. Various elution programs were tested, of which the following gradient program emerged as the most optimal, with a total analysis time of 7.5 minutes: 0-2 min 100→40% B, 2-2.5 min 40→30% B, 2.5-3.5 min 30% B, 3.50-3.51 min 30→100%B, 3.51-7.50 min 100%B, and source temperature set at 450.0 °C in order to increase sensitivity. The application of the aforementioned optimized chromatographic method coupled with QTRAP 6500+ mass analyzer, shows high sensitivity, as low detection limits (LOD: 12, 15, 75, 1.2, 0.1, 2.7 ng/mL for DA, E, NE, 5-HT, ACh, GABA, respectively) and low quantification limits (LOQ: 40, 50, 250, 4, 0.4, 9 ng/mL for DA, E, NE, 5-HT, ACh, GABA, respectively) are achieved, thus making the method possible to detect and quantify the compounds of serotonin, acetylcholine, γ-aminobutyric acid, and marginally dopamine, in real human blood samples, while using the QTRAP 3200 mass analyzer it is possible to detect and quantify only the compounds of serotonin and acetylcholine.