title: An exploration of prime editing approaches in primary T cells to unravel the effects of immune disease associated variants
Creators: name: Gandhi, Vinika
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Diese Masterarbeit befasst sich mit Precision-Editing-Methoden für CD4-positive primäre T-Zellen, um in Zukunft gezielt Enhancer-Regionen zu editieren, die mit Immunkrankheiten in Verbindung stehen. Ziel ist es, dadurch Verständnis des genregulatorischen Netzwerks von CD4-positiven primären T-Zellen für die zukünftige Forschung zu erweitern. Es wurden verschiedene Editing-Methoden in Betracht gezogen, darunter Base-Editing, das CRISPR-Cas9-System und Prime-Editing (PE), wobei letztlich das PE aufgrund seiner Vielseitigkeit bei der Einführung von Edits und Mutationen ausgewählt wurde. PE-Konstrukte wurden mit Merkmalen zur Steigerung der Editing-Effizienz entwickelt, darunter All-in-One-Plasmide für die Transfektion in einem Schritt und ein detailliertes Design von engineerd prime editing guide RNAs epegRNAs, die für die Editing-Effizienz entscheidend sind. Die extrazelluläre Domäne von CD4-Glykoproteinen auf der Oberfläche von T-Zellen wurde als Editing-Ziel gewählt, wobei das AIO-M-Plasmid mit der MLH1dn-Sequenz aufgrund seiner Fähigkeit, die Effizienz des PE zu erhöhen, ausgewählt wurde. Als Transfektionsmethode wurde die Elektroporation gewählt, die eine erfolgreiche Transfektion von CD4-T-Zellen ermöglichte. Die GFP-Expression zeigte das Vorhandensein des Konstrukts an, wobei die mit AIO-M transfizierten Zellen eine Transfektionseffizienz von 0,7 % bis 15 % aufwiesen, und die sortierten GFP-positiven Zellen wurden einer Sequenzierung unterzogen. CRISPresso2 wurde für die bioinformatische Datenanalyse verwendet, wobei die wichtigsten Editierparameter für eine zuverlässige Quantifizierung der Edits genau festgelegt wurden. Erste Ergebnisse zeigten, dass 0,18 % Edits entdeckt wurden, was auf ein Potenzial für die Anwendung von Prime Editing hindeutet, aber es sind weitere Beweise und Versuche notwendig, um die Resultate zu bestärken. Weitere Experimente sind erforderlich, um den Nutzen des PE bei CD4-positiven primären T-Zellen zu bestätigen.
description: This master thesis focuses on precision editing methods for CD4-positive primary T cells, with the future aim of targeting enhancer regions associated with immune diseases. The objective is also to expand the understanding of the gene regulatory network of CD4 positive primary T cells using precision editing methods for future research. Various editing methods were considered, including base editing, the CRISPR-Cas9 system, and prime editing, ultimately selecting prime editing for its versatility in introducing edits and mutations. Prime editing constructs were designed with features to enhance editing efficiency, including all-in-one plasmids for single-step transfection and detailed design of engineerd prime editing guide RNAs (epegRNAs), crucial for editing efficiency. The extracellular domain of CD4 glycoproteins on T cell surfaces was chosen as the editing target, with the All-in-One AIO-M plasmid containing the MLH1dn sequence selected for its ability to enhance prime editing efficiency. Electroporation was chosen as the transfection method, enabling successful transfection of CD4 T cells. GFP expression indicated construct presence, with AIO-M transfected cells showing a transfection efficiency ranging from 0.7 % to 15 %, and sorted GFP-positive cells were subjected to sequencing. CRISPresso2 was utilized for bioinformatic data analysis, precisely specifying prime editing parameters for reliable edit quantification. Initial results showed 0.18 % edits detected, indicating potential for prime editing application, but further evidence is needed to strengthen the results. Further experiments are necessary to confirm the utility of prime editing in CD4-positive primary T cells.