Μελέτη της επίδρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Cyld στον επαναπρογραμματισμό εμβρυικών ινοβλαστών ποντικού
Creators: name: Μπέκας, Νικόλαος Στυλιανού
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Βλαστοκύτταρα
Επαναπρογραμματισμός
cyld
iPSC
Reprogramming

description: Το cyld είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο που κωδικοποιεί μια πρωτείνη με δράση αποουβικιτινάσης, το οποίο παίζει καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση πολλών βιολογικών διεργασιών και σηματοδοτικών μονοπατιών. Παρ’όλο που πολλές από τις δράσεις της πρωτεϊνης αυτής έχουνςε μελετηθεί εκτενώς, όπως για παράδειγμα η ρύθμιση του μονοπατιού του NF-kB και ο ρόλος της στην καρκινογένεση, η επίδρασή της στον επαναπρογραμματισμό αλλά και τη συντήριση του αδιαφοροποίητου χαρακτήρα των βλαστοκυττάρων παραμένει άγνωστος. Ο στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του πιθανού ρόλου που παίζει η cyld στις διεργασίες που προαναφέρθηκαν και ,επιπλέον, η ανάπτυξη και ο μοριακός χαρακτηρισμός σταθερών κυτταρικών σειρών επαγώμενων βλαστοκυττάρων (iPSCs). Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε απομόνωση εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού (MEFs), τόσο αγρίου τύπου (WT) όσο και ΚΟ, τα οποία κωδικοποιούν μια καταλυτικά ανενεργή πρωτεϊνη. Κάθε ζεύγος WT/KO κυττάρων της ίδιας γενεάς επαναπρογραμματίστηκε προς επαγώμενα βλαστοκύτταρα έπειτα από επιμόλυνση με ρετροϊούς που φέρουν τα γονίδια τα οποία επάγων αυτή τη διαδικασία (κασέτα επαναπρογραμματισμού). Στη συνέχεια ακολούθησε προσδιορισμός της απόδοσης του επαναπρογραμματισμού με τη βοήθεια της χρώσης αλκαλικής φωσφατάσης. Η ιοί που χρησιμοποιήθηκαν παρήχθησαν έπειτα από διαμόλυνση HEK293T κυττάρων. Ακολούθησε απομόνωση των iPSC αποικιών με τα καλύτερα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και η επιτυχής εγκαθίδρυση σταθερών κυτταρικών σειρών. Εν συνεχεία έγινε ο μοριακός χαρακτηρισμός αυτών των σειρών με τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της ενδογενούς έκφρασης γονιδίων-δεικτών του αδιαφοροποίητου χαρακτήρα με τη βοήθεια διαφόρων μεθόδων. Μελλοντικά πειράματα περιλαμβάνουν την αλληλούχηση του μεταγραφώματος των WT και KO iPSCs, που συλλέγησαν από σημεία κλειδιά της πορεία του επαναπρογραμματισμού, ώστε να διαλευκανθεί η επίδραση της cyld στην συνολική γονιδιακή έκφραση και η μελέτη της αποδιαφοροποίησης των βλαστοκυττάρων που παρήχθησαν, με στόχο να μελετηθούν πιθανές διαφορές κατά την πορεία αυτή μεταξύ των δυο κυτταρικών τύπων. Η επίδραση της cyld στο RNA editing και τη μεθηλίωση του DNA στα βλαστοκύτταρα είναι άλλος ένας ανεξερεύνητος τομέας που σκοπεύουμε να διερευνήσουμε
description: Cyld is a tumour suppressor gene which encodes a deubiquitinating enzyme that plays a pivotal role in the regulation of many biological processes and signal transduction pathways. While many of its functions have been studied extensively, the effect of cyld in the reprogramming process and maintenance of stem cells remain unknown. The aim of the present thesis was to investigate the potential effect of cyld on that process and to produce stable, fully characterized iPSC cell lines. For that purpose, we isolated MEFs from both wild type and cyld knockout mice, in which a catalytically inactive protein is encoded. Every pair of WT/KO MEFs that originate from the same litter (litter mates) was subsequently reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) via a retroviral method, by utilizing viruses that carry the genes which initiate the reprogramming process when activated (reprogramming cassette) and the reprogramming efficiency was calculated. The viruses we used were produced after the successful transfection of HEK293T cells. From each experiment, we isolated iPSC colonies with the best phenotypic properties and thus we managed to establish stable cell lines. Subsequently, we characterized the produced cell lines by identifying and measuring the endogenous expression of pluripotency markers with a variety of methods. Our future plans include RNA sequencing experiments of cells that were harvested during crucial time points of the reprogramming process above in order to understand how the absence of cyld affects the total gene transcription, by analyzing the transcriptome, and study the potentially unique de-differentiation pathways the two cell types follow. Additionally, the way cyld affects the methylation pattern and RNA editing during the said process is another completely unexplored field we intend to thoroughly scrutiny