title: Characterization of the domesticated mammalian transposon protein L1TD1
Creators: name: Podhornik, Alexandra
Publisher: name: :none
Year: 2023

description: Repetitive Sequenzen wie Transposons machen mehr als 40% des menschlichen Genoms aus. DNA-Transposons vermehren sich innerhalb des Genoms mittels eines cut-and-past Mechanismus, während Retrotransposons einen copy-and-paste Mechanismus für ihre Vermehrung und Integration in das Wirtsgenom verwenden. Aufgrund dieser Prozesse stellen Transposons eine Gefahr für die Integrität und Funktion des Wirtsgenoms dar. Gleichzeitig kann die Aktivität von Transposons zu einem evolutionären Vorteil führen und die Ursache für die Bildung von neuen Genfunktionen darstellen. Weiters können Wirtszellen Transposons domestizieren und so ihre Funktion für ihre eigene Zwecke zu nutzen. LINE-1 Transposase containing Domain 1 (L1TD1) ist ein domestiziertes Transposonprotein, dessen kodierende Sequenz praktisch komplett von einem LINE-1 Retrotransposon abgeleitet ist. Transposons sind unter der repressiven Kontrolle von zellulären epigenetischen Mechanismen wie der DNA- Methylierung. Eine vorangegangene Studie hat gezeigt, dass die Expression von L1TD1 ebenfalls durch DNA-Methylierung reguliert wird. Dementsprechend konnten wir zeigen, dass der Knockout der Maintenance DNA Methyltransferase DNMT1 in der menschlichen Krebszelllinie HAP-1 zur Induktion der L1TD1-Expression, die normalerweise auf wenige Gewebe und undifferenzierte Zellen limitiert ist, führt. L1TD1 hat eine wichtige Funktion für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz in menschlichen embryonalen Stammzellen, aber die mechanistische Funktion des Proteins ist noch nicht geklärt. Diese Masterarbeit beschäftigt sich mit der potenziellen Rolle von L1TD1 in den menschlichen Krebszelllinien OV-90 (Eierstockkrebszellen) und HAP-1 (Zellen, die von chronischer myeloischer Leukämie Zellen abgeleitet sind). Das Ziel dieser Masterarbeit war es, die potentielle regulatorische Rolle von L1TD1 als RNA- bindendes Protein ist in menschlichen Krebszellen zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden mittels CRISPR/Cas9 Technologie HAP-1 Zellen, die V5-getaggtes L1TD1 exprimieren zusätzlich zu DNMT1-KO und DNMT1/L1TD1-dKO HAP-1 Zellen hergestellt. Da das L1TD1- Protein das RNA Recognition Motiv von seinem Vorgängerprotein LINE-1 ORF1p behalten hat, haben wir seine Funktion als RNA-binding Protein mittels RNA-Immunopräzipitationsexperimenten getestet. Indirekte Immunfluoreszenzexperimente zeigten, dass L1TD1 hauptsächlich im Zytosol lokalisiert ist, wo es mit P-Bodies kolokalisiert, was auf eine mögliche Rolle im RNA-Abbau hinweist. Weiters haben wir L1TD1 als potentiellen Interaktionspartner von LINE-1 ORF1p identifiziert. Diese Interaktion konnte durch Ko-Immunopräzipitationexperimente and Immunofluoreszenzanalyse nachgewiesen werden. Massenspektrometrieanalyse von HAP-1 Zellen zeigte, dass der Knockout von L1TD1 zu einer Änderung des Proteoms führt. Des Weiteren zeigte eine RNA-seq Analyse eine Deregulation des Transkriptoms in Abwesenheit von L1TD1. Um ein ähnliches experimentelles System in OV-90 Zellen herzustellen, haben wir versucht, L1TD1 in dieser Zelllinie mittels Knockout/Knockdown auszuschalten. Diese CRISPR-Cas9 und siRNA Experimente zeigten nicht den erwünschten Erfolg, was möglicherweise auf eine potentielle Abhängigkeit dieser Zellen von L1TD1 zurückzuführen ist. Zusammengefasst zeigen unsere Resultate, dass L1TD1 neben seinem eigenen Transkript ein Set von weiteren RNAs bindet. Knockout von L1TD1 resultiert in einer Veränderung des Proteoms and Transkriptoms in HAP-1 Zellen. Schließlich zeigen wir mittels Immunofluoreszenz und Ko-Immunopräzipitations-experimenten eine Interaktion von L1TD1 mit seinem Vorgängerprotein LINE-1 ORF1p in HAP-1 und OV-90 Zellen. Dies weist auf eine regulatorische Rolle von L1TD1 für die Funktion von LINE-1 Retrotransposons hin.
description: Transposable elements (TE) make up more than 40% of the human genome. DNA transposons propagate themselves by a cut-and-past mechanism, while retrotransposons use a copy-and-paste mechanism called retrotransposition for their propagation and integration in the hostgenome. Due to these processes TEs endanger the integrity and function of the host genome. At the same time, TE activities can lead to evolutionary advantages and act as a resource for the formation of novel genes. Furthermore, host cells can domesticate TEs to use them for their own purposes. LINE-1 Transposase containing Domain 1 (L1TD1) is a domesticated TE protein, whose coding sequence is nearly entirely derived from the LINE-1 retrotransposon. Transposons are under the repressive control of cellular epigenetic mechanisms including DNA methylation. A previous study on L1TD1 has shown that its expression is also regulated by DNA methylation. Accordingly, we found that knockout of the maintenance DNA methyltransferase DNMT1 in the human cancer cell line HAP-1 led to derepression of L1TD1 expression, which is usually limited to a few tissues and undifferentiated cells. L1TD1 has been shown to have an important function in the maintenance of pluripotency of human embryonic stem cells but its mechanistic function in cancer cells is still unclear. This Master thesis focuses on the potential role of L1TD1 in the human cancer cell lines, OV-90 (ovarian cancer cells) and HAP-1 (cells derived from chronic myeloid leukemia cells). The aim of this Master thesis was to investigate the potential regulatory role of L1TD1 as an RNA-binding protein in human cancer cells. In order to address this, HAP-1 cells expressing V5- tagged L1TD1 were generated using the CRISPR/Cas9 gene editing system in addition to DNMT1 KO and DNMT1/L1TD1 dKO HAP-1 cells. Since the L1TD1 protein has retained the RNA recognition motif from its ancestor gene LINE-1 ORF1p, we investigated its ability to act as an RNA-binding protein via RNA-immunoprecipitation experiments. Indirect immunofluorescence experiments demonstrated that L1TD1 is mainly localized to the cytosol where it partially co-localized with P-bodies, which indicates its potential role in RNA turnover. Moreover, we found out that L1TD1 might be a potential interaction partner of LINE-1 ORF1p. This interaction was demonstrated by co-immunoprecipitation experiments and immunofluorescence analysis. Massspectrometry analysis of HAP-1 cells indicated that the loss of L1TD1 leads to a differential proteome in HAP-1 cells. Furthermore, an RNA-seq analysis showed a deregulated subset of genes in the absence of L1TD1. In order to generate a similar system in OV-90 cells, an attempt was made to knockout/knockdown L1TD1 in this cell line. However, the attempts to knock-down and knockout L1TD1 in ovarian cancer cells failed probably due to its essential role in OV-90 cells. Our results overall show that L1TD1 binds to its own transcript and to other RNA targets. Its deletion results in a differential proteome and transcriptome in HAP-1 cells. Finally, we report an interaction of L1TD1 with its ancestor protein, LINE-1 ORF1p in the cytosol in both HAP-1 and OV-90 via immunofluorescence and co-immunoprecipitation experiments suggesting a regulatory role of L1TD1 on the function of LINE-1 retrotransposons.