Biochemische und biophysikalische Charakterisierung der Regulation und Aktinpolymerisation des humanen Formins FHOD1
Creators: name: Schönichen, André
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2006
Subjects: subject: FHOD1
subject: Aktin
subject: Aktinpolymerisation
subject: ITC
subject: NMR
subject: Hexim1
subject: Transkription
subject: 610

description: Formine nehmen eine bedeutende Rolle bei dem Auf- und Abbau des Aktinzytoskelettes ein. Dabei binden sie über ihre Formin-Homologie 2- (FH2-) Domäne direkt an Aktin und katalysieren die Aktinfilamentbildung am stumpfen Ende. Diaphanous-autoregulierte Formine sind Effektoren der Rho-GTPasen und werden so durch äußere Signale zur Nukleierung der Aktinpolymerisation aktiviert. Ein Mitglied dieser Proteinfamilie ist das humane FHOD1-Protein, dessen genaue Funktion und Aufgabe bei der Formierung des Aktinzytoskeletts noch weitgehend unerforscht ist. Zum Verständnis der molekularen Eigenschaften dieses ubiquitär exprimierten Formins sind die autoregulatorischen Motive und der Mechanismus der Aufhebung des autoinhibierten Zustandes sowie der Mechanismus der Nukleierung der Aktinpolymerisation von großem Interesse. Diese Studie fokussierte auf die Charakterisierung der biochemischen Aspekte bei FHOD1. Für die Analyse in vitro gelang es zunächst, verschiedene Fragmente von FHOD1 rekombinant aus E.coli herzustellen. Mit Hilfe eines GST-Pulldown-Experiments und Westernblot-Analysen mit fünf unterschiedlich langen C-terminalen FHOD1-Fragmenten wurde zunächst gefunden, dass die C-terminalen 61 Aminosäuren (1104-1164) für die Interaktion mit der N-terminalen FH3-Domäne (1-377) und damit der Autoinhibition ausreichend sind. In einem nächsten Schritt wurden die drei DAD-Konsensusmotive mutiert und der Effekt in vivo durch Betrachten des Phänotyps und der Transkriptionstransaktivierung mittels eines Luziferase-Experiments analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass das erste hydrophobe Konsensusmotiv, das sich direkt C-terminal von der FH2-Domäne an Position 1053 befindet, auf die Autoinhibition keinen Einfluss hat. Vielmehr zeigte die Mutation des zweiten hydrophoben (Position 1108) sowie des basischen Motivs (Position 1126) innerhalb der letzten 61 Aminosäuren die Bildung von Aktinstressfasern. Besonders deutlich war dieses Ergebnis bei gleichzeitiger Mutation beider Motive. Die Stimulation der Transkription vom SRE hingegen war weniger deutlich, was auf einen möglichen schrittweisen Aktivierungsmechanismus hindeutet. Bei der Untersuchung der Bindung an FHOD1-(1-377) und DAD-Fragmenten mit der Wildtypsequenz und den Mutationen mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) kam heraus, dass die letzten 61 Aminosäuren mit einer Dissoziationskonstanten von 1,4 µM bindet und sowohl das hydrophobe als auch das basische Motiv allein noch den FHOD1-N-Terminus (1-377) im unteren mikromolaren Bereich bindet. Nur eine Doppelmutante mit der Mutation beider Motive zeigte keine Interaktion mit dem N-Terminus. Mittels analytischer Gelfiltration wurde die molekulare Dispersion der FHOD1-FH3-Domäne (1-377) und des Komplexes aus der FH3-Domäne mit dem DAD-Fragment (1104-1164) untersucht. Ein erstes Ergebnis war hier, dass die FH3-Domäne in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht vorliegt, das sich durch reduzierende Bedingungen der monomere Anteil erhöhen lässt, so dass vermutet wird, dass die Dimerisierung über Disulfidbrückenbildung erfolgt. Ferner vergrößert die Interaktion mit der DAD das Volumen der FH3-DAD-Domäne nur geringfügig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die DAD als unstrukturiertes Peptid auf der FH3-Domäne bindet, bzw. in eine konkave Bindungsoberfläche hineinfaltet. Untersuchungen mit zweidimensionaler, heteronuklearer NMR-Spektroskopie zeigten schließlich, dass die DAD ein zum größten Teil unstruktiertes Polypeptid ist, mit einem geringen -helikalen Anteil. Durch Titration der FH3-Domäne zu der 15N-markierten DAD konnte die Bindungsregion weiter eingegrenzt werden, da bei Bindung nicht alle Resonanzsignale verschwanden. Diese Studie zeigte, dass sich die interagierende Region der DAD von Position 1106 bis 1144 erstreckt und damit das hydrophobe sowie das basische Konsensusmotiv enthält. Zur Untersuchung der Aktivierung von FHOD1 durch eine kleine GTPase in vitro wurde die Bindung von Rac1 in der Triphosphatform mit den FHOD1-Fragmenten (1-377) oder (411-573) zunächst mittels isothermaler Titrationskalorimetrie untersucht. Dabei konnte für keines dieser Fragmente eine eindeutige Interaktion gemessen werden. Eine weitere Untersuchung durch analytischer Gelfiltration bei der C-terminal verkürztes Rac1 (1-184) sowohl in der Di- als auch in der Triphosphatform verwendet wurde, ergab, dass es nicht an das FHOD1-Fragment (411-573) bindet, jedoch mit dem N-Terminus (1-377) Oligomere bildet, was auf eine potentielle Interaktion hindeutet. In einem Aktinpolymerisationsexperiment wurde rekombinant aus E.coli gereinigte FH2-Domäne (614-1096) sowie aus dem eukaryotischen Bacoluexpressionssystem gereinigtes natives FHOD1-Volllängenprotein untersucht. Dabei konnte beobachtet werden, dass die FH2-Domäne und das Volllängenprotein die Aktinpolymerisation nicht nukleieren, sondern vielmehr inhibieren und sich ähnlich wie capping-Proteine verhalten. Damit wurde gezeigt, dass das FHOD1-Fragment (614-1096) und autoinhibiertes FHOD1 Aktin binden können. In letzteren Fall konnte auch bei Zugabe der drei GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 bzw. eines DAD-Peptids keine Aufhebung der Polymerisationsinhibierung erreicht werden. Dieser Befund deutet auf die Notwendigkeit eines weiteren Kofaktors zur Nukleierung der Aktinpolymerisation hin. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit dem Transkriptionsinhibitor Hexim1, der die Transkriptionselongation durch den P-TEFb-Komplex (bestehend aus der Kinase Cdk9 und dem Zyklinprotein CyclinT1) hemmt. Es konnte hier die C-terminale CyclinT1-bindende Domäne von Hexim1 (255-359) rekombiant dargestellt und uniform heteronuklear mit stabilen Isotopen markiert werden. In Kooperation mit Dr. Sonja Dames vom Biozentrum wurde die Struktur dieser Domäne aufgeklärt, die eine dimere zweigeteilte coiled-coil-Struktur besitzt. Dabei ist das C-terminale zweite coiled-coil-Segment 319-348 ein nahezu ideales, stabiles coiled-coil, während das erste Segment (284-313) Abweichungen von der idealen Konsensussequenz eines parallelen coiled-coils aufweist und flexibler ist. Die beiden Segmente sind durch einen sieben Aminosäure-langen Linker unterbrochen. N-terminal des ersten coiled-coil-Segments befindet sich eine weitere Helix (276-281), die durch drei Aminosäuren mit dem ersten coiled-coil-Segment verbunden ist. Durch NMR-Titrationexperimente von 15N-markiertem Hexim1 mit unmarkiertem CyclinT1 (1-292)-Molekül konnte die Bindungsregion für CyclinT1 bestimmt werden. Diese befindet sich auf dem ersten coiled-coil-Segment sowie auf der vorausgehenden Helix und stimmt gut mit dem Bereich höchster Konservierung überein. ITC-Bindungsstudien, analytische Gelfiltration und Fluoreszenzexperimente mit verschiedenen Hexim1-Fragmenten und CyclinT1 (1-272) zeigten, dass ein CyclinT1 (1-272) ein Hexim1-Dimer bindet.