IDENTIFICATION OF THE ANTIGEN RECOGNIZED BY RHIGM22, A REMYELINATION-PROMOTING HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY
Creators: name: CABITTA, LIVIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2019

description: Tutte le cellule eucariotiche sono circondate da una membrana cellulare che funge da barriera tra i compartimenti subcellulari e tra la cellula e il suo ambiente. Oltre alle proteine, le membrane cellulari sono composte da tre diversi gruppi di lipidi: glicerolipidi, sfingolipidi e steroli. I glicerolipidi sono i principali componenti delle membrane cellulari e sono prodotti utilizzando acido fosfatidico (PtdOH) come precursore centrale. Invece, gli sfingolipidi (SL), i componenti cellulari minori, hanno la sfingosina come componente base; l?aggiunta di oligosaccaridi alla sfingosina da origine agli glicosfingolipidi (GSL). SL e GSL non si distribuiscono in modo omogeneo nella membrana plasmatica esterna. Formano domini piccoli, eterogenei, altamente dinamici, arricchiti con steroli e sfingolipidi, chiamati "zattere lipidiche"; in questi microdomini semiordinati, gli SL sono coinvolti i diversi processi, quali quelli di adesione, riconoscimento e trasduzione del segnale. L'organo con il pi� alto arricchimento di lipidi, come colesterolo e glicosfingolipidi, � il cervello. La mielina, la sostanza isolante che circonda l'assone delle cellule nervose, � caratterizzata da un elevato rapporto lipidi-proteine, in cui i lipidi rappresentano l'80% del suo peso secco. Questa membrana contiene un alto livello di due galattosfingolipidi in particolare, il galattosilceramide (GalCer) e il 3-O-sulfogalattosilceramide (solfatide), che rappresentano rispettivamente circa il 20 e il 5% dei lipidi mielinici. I ruoli specifici di GalCer e solfatide sembrano essere legati alla loro capacit� di formare e stabilizzare specifici domini laterali nella membrana mielinica, che regolano il corretto smistamento, traffico, co-clustering e distribuzione laterale delle principali proteine della mielina. Studi recenti hanno suggerito che alcuni lipidi specifici della mielina potrebbero essere i principali responsabili del meccanismo patogeno della sclerosi multipla (SM), la malattia demielinizzante pi� comune nel sistema nervoso centrale. Gli individui affetti da SM hanno un?alterata composizione lipidica della mielina e elevati livelli di anticorpi anti-solfatide, nei fluidi biologici, rispetto agli individui sani. D'altro canto, gli anticorpi anti-mielina potrebbero rappresentare un importante strumento immunologico per il trattamento di malattie neurologiche che coinvolgono lesioni mieliniche. In particolare, � stato dimostrato che gli anticorpi monoclonali umani che legano la mielina e gli oligodendrociti (OL), come rHIgM22, possono stimolare un meccanismo di rimielinizzazione nei modelli animali di demielinizzazione. Ad oggi, l'esatto meccanismo d'azione di rHIgM22 resta da chiarire, ma alcune prove suggeriscono che il meccanismo � correlato all'organizzazione delle zattere lipidiche presenti sulla superficie della mielina e degli OL. Lo scopo degli esperimenti descritti in questa tesi � quello di individuare i target molecolari dell'anticorpo e caratterizzare il microambiente di membrana in cui si trova, al fine di comprendere meglio l? attivit� rimielinizzante di rHIgM22. Il legame di rHIgM22 ai lipidi purificati e agli estratti lipidici da varie fonti � stato testato usando saggi di TLC Immunostaining e saggi SPR. I risultati ottenuti mostrano che rHIgM22 si lega al solfatide e, in misura minore, al lisosolfatide in vitro, mentre non si lega ad altri sfingolipidi della mielina. L'affinit� di legame sia per il solfatide che per il suo derivato deacilato � bassa, anche se il legame � specifico. In aggiunta, i nostri dati mostrano che l'affinit� di legame di rHIgM22 per solfatide pu� essere modulata dalla presenza di altri lipidi, suggerendo un possibile ruolo del microambiente di membrana nel riconoscimento dell'antigene da parte di rHIgM22. Inoltre, rHIgM22 reagisce anche con acido fosfatidico, fosfatidilinositolo (PI) e fosfatidilserina (PS). Per verificare la capacit� di rHIgM22 di legare sulfatide o altri lipidi, il legame di rHIgM22 � stato testato anche su estratti lipidici purificati da diversi campioni: cervelli di topo WT, ASM (- / -), CST (+/-) e CST (- / -), cellule gliali miste di topo (MGC), astrociti di topo, rHIgM22+ OLs di ratto, microglia di ratto e mielina di topo. Negli esperimenti di TLC Immunostaining per le fasi acquose di questi campioni, abbiamo osservato bande immunoreattive a rHIgM22 che co-migrano con lo standard di solfatide puro e, inaspettatamente, una seconda banda immunoreattiva a rHIgM22 co-migrante con lo standard fosfatidilinositolo e fosfatidilserina puro, confermando i dati di TLC Immunostaining sui lipidi purificati. L'identit� delle specie fosfolipidiche riconosciute da rHIgM22 � stata confermata tramite spettrometria di massa; gli spettri mostrano che la specie molecolare del fosfatidilinositolo � 18:0/20:4, mentre per la fosfatidilserina � 18:0/22:6 e 18:0/18:1. Inoltre, l'analisi tramite spettrometria di massa per le frazioni arricchite in solfatide, mostra che rHIgM22 pu� legare diverse specie solfatate, suggerendo che questo legame non � specifico alle diverse specie degli acidi grassi. Tutti questi dati suggeriscono che non solo il solfatide, ma anche altri lipidi di membrana possono avere un ruolo nel legame di rHIgM22 agli OL o ad altri tipi di cellule. Inoltre, l'antigene riconosciuto da rHIgM22 potrebbe essere associato a zattere lipidiche di membrana plasmatica e incluso in un complesso multimolecolare. L'identificazione dei target riconosciuti da rHIgM22 e la caratterizzazione del microambiente di membrana in cui si trovano, potrebbe contribuire notevolmente a chiarire i meccanismi di segnalazione coinvolti nell'attivit� di promozione della rimielinizzazione di questo anticorpo, ma anche di quelli coinvolti nell'eziologia della SM, permettendo di identificare nuove potenziali strategie terapeutiche.