Ρόλος της επιμόλυνσης με scrapie στην γονιδιακή έκφραση κυτταρικής σειράς νευροβλαστώματος (Ν2α) και έλεγχος της επίδρασης του APOBEC1 KnockDown στην μετα-μεταγραφική διαδικασία του RNA Editing
Creators: name: Χαδιός, Γεώργιος Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Νευροεκφυλισμός
Στοιχειοθεσία RNA
APOBEC1
Neurodegeneration
RNA Editing

description: Οι ασθένειες Prion χαρακτηρίζονται ως θανατηφόρες νευροεκφυλιστικές ασθένειες και εντοπίζονται με τον όρο μεταδοτικών σπογγόμορφων εγκεφαλοπαθειών. Μέχρι σήμερα δεν έχει εντοπιστεί μια μέθοδος που να εγγυάται τόσο την έγκαιρη και έγκυρη διάγνωση όσο και την αποτελεσματική θεραπεία τους. To βασικό γεγονός στην παθολογία τέτοιων νοσημάτων είναι η μετατροπή της φυσιολογικής Prion πρωτεΐνης που καλείται PrPC στην παθολογική ισομορφή της πρωτεΐνης, την λεγόμενη PrPSC. Στην διάρκεια της συγκεκριμένης αναδίπλωσης το γεγονός που λαμβάνει χώρα είναι η μετατροπή μέρους της α-έλικας της πρωτεΐνης σε β-ελάσματα με ταυτόχρονη εμφάνιση αντίσταση της παθολογικής ισομορφής σε αποικοδόμηση από το σύστημα πρωτεασώματος. Η προκύπτουσα παθολογική ισομορφή PrPSC είναι πλέον σε θέση να συσσωματώνεται σε περιοχές του εγκεφάλου και ταυτόχρονα φαινόμενα απώλειας νευρώνων να αναπτύσσονται. Η παραπάνω μεταλλαγή της πρωτεΐνης PrPC ευθύνεται για ασθένειες prion που περιλαμβάνουν τη νόσο Scrapie στα αμνοερίφια, τη νόσο BSE στα βοοειδή και τη νόσο CJD στον άνθρωπο. Τα επιμολυσμένα με scrapie νευροβλαστικά κύτταρα (scN2a) χρησιμοποιούνται ευρέως στην έρευνα των prion ασθενειών ως vitro μέθοδος για τον έλεγχο πιθανών θεραπευτικών στόχων. Η ταυτόχρονη μελέτη μεταξύ επιμολυσμένων με scrapie (scN2a) και μη επιμολυσμένων νευροβλαστικών κυτταρικών σειρών (N2a) μπορεί να φανεί χρήσιμη ώστε να παρατηρηθούν αλλαγές στον κυτταρικό μεταβολισμό που θα αντανακλούν συνέπειες της prion παθογένειας καθώς και αντισταθμιστικούς κυτταρικούς μηχανισμούς που μπορεί να αναπτύσσονται έναντι αυτής. Οι αλλαγές αυτές μπορούν αρχικά να παρατηρηθούν σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης και για αυτό το σκοπό κατασκευάστηκε πρωτόκολλο υπολογιστικής προσέγγισης ώστε να εντοπίζονται οι αλλαγές στην μεταγραφωματική έκφραση έχοντας ως βάση δυο διαφορετικά πειραματικά μοντέλα με διακριτές παρατηρούμενες διαφορές. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν προφίλ διαφορικής μεταγραφωματικής έκφρασης των N2a/scN2a που διαφοροποιούν τα δείγματα νευροβλαστικών κυτταρικών σειρών με επιμόλυνση scrapie από τα μη επιμολυσμένα νευροβλαστικά κύτταρα. Ακολούθησε ο προσδιορισμός των μοριακών μονοπατιών και μηχανισμών που εμπλέκονται τα εκάστοτε προφίλ διαφορικής μεταγραφωματικής έκφρασης μέσω ανάλυσης εμπλουτισμού μονοπατιών KEGG με χρήση του δημόσια διαθέσιμου εργαλείου DAVID. Ολοένα και περισσότερες μελέτες δείχνουν τον τρόπο με τον οποίο νευροεκφυλιστικά νοσήματα επηρεάζονται από μια μετα-μεταγραφική ενζυματική τροποποίηση κατά την διάρκεια της οποίας ένα νουκλεοτίδιο αντικαθίσταται στην αλληλουχία του RNA και οδηγεί σε αλλαγή αμινοξέος στην προκύπτουσα τελική πρωτεΐνη. Η παραπάνω τροποποίηση αναφερόμενη και ως στοιχειοθεσία RNA ή αλλιώς RNA Editing εμφανίζεται κυρίως με δυο τύπους: ο πρώτος αφορά την μετατροπή της αδενοσίνης (Α) προς ινοσίνη (Ι) πάνω στο RNA, που καταλύεται από μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών ADARs και ο δεύτερος τύπος αντιπροσωπεύει την αλλαγή της κυτοσίνης (C) σε ουρακίλη (U) που καταλύεται από το ένζυμο Apobec1, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών AID/APOBECs. Μέχρι και σήμερα έχει υπάρξει επισταμένη μελέτη για την συσχέτιση των μελών των δυο αυτών οικογενειών με νευροεκφυλιστικά νοσήματα. Η στοχειοθεσία RNA φαίνεται να έχει άμεση συσχέτιση με την κωδικοποίηση των πρωτεϊνών, το εναλλακτικό μάτισμα καθώς και άλλες βιολογικές διεργασίες τονίζοντας έτσι την σημαντικότητά της στην παθογένεια και εξέλιξη των νευροεκφυλιστικών νοσημάτων. Τέλος προς την κατεύθυνση αυτήν κατασκευάστηκε πρωτόκολλο ανίχνευσης για τον εντοπισμό θέσεων RNA Editing και εντοπίστηκαν οι αλλαγές για τα εκάστοτε αντιπροσωπευτικά προφίλ μελέτης που δημιουργήθηκαν για τα δείγματα νευροβλαστικών κυτταρικών σειρών επιμολυσμένων και μη με scrapie.
description: Prion diseases are fatal neurodegenerative disorders and they can also been found on term of transmissible spongiform encephalopathies. Until now there is not any specific method which will be accurate enough to produce either an early diagnosis or an effective treatment. The key event that takes place in the pathogenesis of those diseases is the conversion of the normal prion protein also called as PrPC into the disease-related isoform, PrPSC. In this process a portion of the a-helix and random coil structure in PrPC is refolded into β-pleated sheet, during which conversion it becomes partially resistant to protease. This isoform is able to self aggregate into toxic aggregates, leading to neuronal loss. The conversion of the protein PrPC, as described above, is responsible for prion diseases such as, scrapie in sheep, BSE in cattle and CJD in human. Scrapie-infected neuroblastoma cells (scN2a cells) are increasingly used in prion disease research as infected cell line as an in vitro screen to test for potential therapeutic drugs. Simultaneous study between scrapie-infected and non-infected neuroblastoma cell lines may be useful to observe changes in cellular metabolism that reflect the effects of prion pathogenesis or compensatory cellular mechanisms against it. Scrapie infected neuroblastoma cell lines are also capable of producing the disease-related isoform, PrPSC so that we can observe the consequences of this conversion of the prion protein. Those changes can initially been observed in a gene expression level and for this reason a computational approach of finding gene expression alterations was built so that we will be able to find those changes by simply giving as input, data of the two different cell line states. In this direction, profiles of differential gene expression were constructed, differentiating the two states of scrapie infected and non-infected neuroblastoma cell lines. This process was followed by defining the molecular pathways and mechanisms where each profile of differentially expressed genes was involved by using KEGG pathway analysis. Nowadays, more and more studies have shown the way where neurodegenerative disorders are affected from a post-transcriptional enzyme based process during which we led to the conversion of one nucleotide on the RNA sequence, leading to a different amino acid and finally to a different protein. This alteration also known as RNA Editing leads into two different types of conversions: the first one refers to the conversion of adenosine (A) into inosine (I) and it is catalyzed by a member of the ADARs protein family, whereas the second one refers to the conversion of cytosine (C) into uracil (U) and it is catalyzed by a member of the AID/APOBEC protein family. RNA Editing seems to directly affect the protein coding process, alternative splicing but also other biological processes, pointing by that the significance of this procedure in the pathogenesis and evolution of neurodegenerative disorders. Finally, for that reason, an analysis protocol of finding RNA Editing Sites was re-built in order to find the changes for the respective study profiles that were created from both scrapie infected and not infected (scN2A/N2A) neuroblastoma cell lines.