title: Characterization of the Hcg proteins involved in [Fe]-hydropgenase cofactor biosynthesis
title: Charakterisierung der an der Biosynthese des Cofaktors der [Fe]-Hydrogenase Hmd beteiligten Hcg-Proteine
Creators: name: Bai, Liping
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Hydrogenase
Cofacor, Biosynthese
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Die [Fe]-Hydrogenase Hmd
      katalysiert die Reduktion von Methenyl-H4MPT+ zu
      Methylen-H4MPT unter Nutzung von H2 als Elektrondonor in der
      hydrogenotrophen Methanogenese. Die Produktion der Hmd war
      erhöht, wenn die Zellen unter Ni-limitierten Bedingungen
      kultiviert wurden. Hmd ist ein homodimeres Enzym, in dem die
      aktiven Zentren in einer Spalte zwischen den N-terminalen
      Domänen und den zentralen Domänen lokalisiert sind. Die
      N-terminale Domäne bindet einen Eisen-Guanylylpyridinol-
      (FeGP-) Cofaktor als prosthetische Gruppe. Der FeGP-Cofaktor
      besteht aus einem low-spin FeII, ligandiert durch zwei CO,
      einem Acyl-C und eine Pyridinol-N. Zusätzlich ist das
      Eisenzentrum durch ein Cys-S und ein Wassermolekül im Enzym
      koordiniert. Der Pyridinol-Ring ist mit einem GMP-Rest und
      zwei Methylgruppen substituiert. Genom-Analysen deuteten auf
      einen Cluster aus sieben konservierten Genen hin, der sowohl
      die hcgAG Gene als auch das hmd-Gen umfasst. Aufgrund dessen
      wurde angenommen, dass die hcg-Gene für die Biosynthese des
      FeGP-Cofaktors verantwortlich sind. Von den Gensequenzen
      selbst konnten jedoch keine Funktionen für die entsprechenden
      Proteine abgeleitet werden. Sowohl eine
      „Struktur-zu-Funktion“-Strategie, als auch biochemische
      Charakterisierungen wurden genutzt, um die Funktionen einiger
      Hcg-Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Studie wird die
      Funktion von HcgC, anhand seiner Kristallstruktur und
      biochemischer Analysen beschrieben. Isotopenmarkierungen
      wiesen darauf hin, dass die C3-Methylgruppe des
      Pyridinol-Rings aus Methionin stammt und wahrscheinlich in
      einer S-Adenosylmethionin- (SAM-) abhängigen Reaktion
      übertragen wird. Strukturvergleiche zwischen HcgC und anderen
      verwandten Proteinen deuteten auf Ähnlichkeiten zu
      SAM-abhängigen Methyltransferasen hin. Co-Kristallisation von
      HcgC und SAM zeigte, dass SAM tatsächlich im aktiven Zentrum
      von HcgC bindet. Docking-Simulationen mit einem möglichen
      Methylakzeptor-Pyridinol zeigten eine wahrscheinliche
      Bindestelle für das Pyridinol auf. Das vorhergesagte
      Substrat-Pyridinolderivat wurde chemisch synthetisiert und
      die Enzymaktivität der HcgC wurde bestimmt. Die Struktur des
      Reaktionsproduktes der HcgC wurde mit NMR aufgeklärt und es
      wurde bestätigt, dass die Methylgruppe tatsächlich von SAM
      auf das C3 des Pyridinols übertragen wurde. Um den
      Katalysemechanismus näher zu untersuchen, wurde HcgC mit
      Pyridinol und SAM oder S-Adenosylhomocystein (SAH)
      co-kristallisiert. Es zeigte sich, dass sieben Wassermoleküle
      an der Bindung des Pyridinols im aktiven Zentrum beteiligt
      waren. Die einzige direkte Interaktion des Pyridinols und
      einer Aminosäureseitenkette war mit der Hydroxylgruppe von
      Thr179. Das C3 des Pyridinols lag in Nähe zum
      SAH-Schwefelatom. Die Kristallstruktur wies auf keine
      Aminosäure hin, die als generelle Base in der Reaktion hätte
      dienen können. Es wird vorgeschlagen, dass die
      koordinierenden Wassermoleküle die deprotonierte Form des
      Pyridinols über einen Resonanzeffekt stabilisieren, welcher
      die Nucleophilie des C3 erhöht. Mutationsstudien konnten die
      essentielle Rolle der Wassermoleküle in der Reaktion
      untermauern.
description: [Fe]-hydrogenase (Hmd) catalyzes
      the reduction of methenyl-H4MPT+ to methylene-H4MPT using H2
      as electron donor in the hydrogenotrophic methanogenic
      pathway. The production of Hmd was upregulated when the cell
      was grown under Ni-limiting environment. Hmd is composed of
      homodimer; the active sites are located at the cleft formed
      by the N-terminal domain and central domain. The N-terminal
      domain binds an iron-guanylylpyridinol (FeGP) cofactor, which
      is prosthetic group of this enzyme. The FeGP cofactor is
      composed of a low spin FeII ligated with two CO, an acyl-C
      and pyridinol-N; in addition, Cys-S and a solvent are bound
      to the iron site in the enzyme. The pyridinol ring is
      substituted with GMP moiety and two methyl groups. Genome
      analysis indicated that there are seven conserved genes which
      is named hcg gene cluster containing hcgAG and hmd genes.
      Therefore, it was predicted that the hcg cluster is
      responsible for biosynthesis of the FeGP cofactor. From the
      hcg genes sequences, we could not deduce the function of the
      proteins. However, using the “structure to function” strategy
      and biochemical assays, we could identify the function of
      some Hcg proteins. In this thesis, I describe the function of
      HcgC based on crystal structure and biochemical analyses. The
      isotope-labeling experiment indicated that the C3 methyl
      group comes from methionine, probably via
      S-adenosylmethionine (SAM). Structure comparisons of HcgC
      with other proteins suggested similarity of HcgC to
      SAM-dependent methyltransferases. Co-crystallization of HcgC
      and SAM revealed that SAM binds to the active site of HcgC.
      Docking simulation with a possible methyl-acceptor pyridinol
      suggested that the binding site of the pyridinol. The
      predicted substrate pyridinol was chemically synthesized and
      the enzyme activity was determined. The structure of the
      HcgC-reaction product was determined by NMR, which confirmed
      that HcgC transfer the methyl group from SAM to C3 of
      pyridinol. In order to analyze the catalytic mechanism of
      HcgC, co-crystallizaiton of HcgC, pyridinol, SAM or SAH was
      performed. The substrate binding site structure showed that
      seven water molecules connected pyridinol to protein. The
      only interaction of pyridinol with amino acid side chain was
      Thr179-OH. The C3 of pyridinol was close to the sulfur of
      SAH. In the crystal structure, there was no amino acid, which
      functions as general base of the typical methyl-transfer
      reaction. We proposed that the water molecules stabilize the
      deprotonated form of pyridinol by resonance effect, which
      increases the nucleophilicity of C3. Mutation analysis
      supported the essential contribution of the water
      molecules.