title: The impact of nitrated allergens and of nitrated polytyrosin on the development of an acut allergic air-way reaction by using the mouse-model
title: Auswirkung der Nitrierung von Allergenen und von nitriertem Polytyrosin auf die Entwicklung einer akut allergischen Atemwegsreaktion am Mausmodell
Creators: name: Niemeyer, Dorothee
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: oxidativ stress
nitrosative stress
air-way disease
OVA
Allergisches Asthma
KLH
Medizin, Gesundheit
murines Modell
Nitrierung , Atemwegskrankheit
extrinsic asthma, nitration
Polytyrosin, nitrosativer Stress
mouse model
Oxidativer Stress

description: Summary Within the last decades a
      rapid increase of allergic diseases such as bronchial asthma
      was reported, especially concerning the industrialized
      countries. The acute response of this chronic inflammatory
      disease with its hyperreactivity of the bronchial tract is
      characterized by activation of immunocompetent cells and
      their release of proinflammatory mediators, triggered by IgE.
      This process induces the clinical hallmarks of allergic
      asthma, such as acute airway obstruction, due to swelling of
      the bronchial mucosa, excessive secretion of mucus into the
      airways and contraction of smooth muscles. The late-phase
      response (2-24 h after the original reaction) is caused by
      activation of migrated leucocytes, especially eosinophils and
      an anew surge of inflammatory and bronchoconstrictive
      mediators. Large numbers of risk factors are discussed, as
      asthma is a multifactorial disease. Geographic distinctions
      of its incidence lead up to the conclusion there must be a
      correlation between the genetic background of a population
      and its environmental conditions, called
      „Gene-environmental-Interactions“. The present thesis deals
      with negative impacts on pulmonary health caused by traffic
      exhausts (keyword: Environmental factors). Various
      epidemiological and experimental studies revealed the
      damaging influence due to oxidative and nitrosative stress,
      in relation to aggravation or triggering of an allergic
      respiratory reaction. During the last years the formation of
      nitrotyrosine residues attached to proteins aroused special
      scientific attention, as this process is associated with
      numerous organic diseases. Exposure to oxidative and
      nitrosative species can decreases the redox potential of the
      airways severely. Subsequently a high rate of nitration in
      proteins/enzymes can induce dysfunctions. Patients suffering
      from inflammatory airway diseases showed to have a constantly
      elevated level of nitrotyrosine residues in their respiratory
      tract. Moreover it was demonstrated that high concentrations
      of ozone and nitrogen dioxide in congested areas effectively
      generate nitrated proteins/allergens that are inhaled and may
      exacerbate or trigger extrinsic-asthmatic reactions of the
      airways. For this study C57BL6- (n=228) and BALB/c-mice
      (n=54) were treated with nitrated and unmodified allergens
      (Ovalbumin (OVA, resp. nOVA) and keyhole limpet hemocyanin
      (KLH, resp. nKLH)) in a model of acute asthma. Three central
      hypotheses were postulated: 1. Nitration of allergens
      enhances their acute-inflammatory impact on the respiratory
      tract. 2. After sensitization against one specific nitrated
      allergen, other nitrated allergens induce similar allergic
      reactions in an individual, so that cross-reactions occur. 3.
      Treatment of BALB/c-mice with the nitrated amino acid
      polytyrosine arouses an allergic inflammatory reaction. After
      having the mice sensitized and provoked according to
      schedules for four weeks, various tests were performed to
      examine those hypotheses (timeframe: 2008 – 2011).
      Examinations on the bronchoalveolar lavage fluid (cell count,
      cell populations and concentration of proteins) and the
      histology showed to be most instructive. In particular the
      tested groups nOVA/nOVA, nKLH/nKLH and nOVA/nKLH, carried out
      with C57BL6- and BALB/c-mice, displayed cellular and
      structural changes due to inflammatory allergic reactions.
      Furthermore, type-II-pneumocytes were isolated from the lungs
      to extract proteins and RNA. Consequently central enzymes of
      the glutathione-system (glutathion reductase, glutathion
      peroxidase 3 and 4) were detected by immune-histochemical
      methods and by western blots using type-II-cell protein
      samples. In contrast to the controls, most of the tested
      groups showed an imposing increase in enzyme activity,
      exemplified in representative pictures. RT-qPCR gave an
      insight into DNA-expression of the named enzymes. As compared
      to the controls many of the tested groups displayed a
      reactive down-regulation on this level. All findings taken
      together, an aggravation of the allergic potential through
      nitration (first Hypothesis) was confirmed and examined in
      vivo for the first time. Treatment with nitrated allergens
      induced an intensified allergic inflammation of the airways,
      compared to treatment with unmodified allergens. The second
      Hypothesis (regarding cross reactions) was supported to some
      extent, yet more aimed investigations are required in future
      works. The third Hypothesis, involving nitrated polytyrosine,
      could not be verified by these exemplary tests on
      BALB/c-mice, as no characteristic signs of an allergic
      inflammation were detected.
description: Zusammenfassung In den letzten
      Dekaden ist die Inzidenz allergischer Erkrankungen, wie dem
      Asthma bronchiale, vor allem in Industrienationen rapide
      angestiegen. Bei dieser chronischen Entzündung und
      Hyperreagibilität der Atemwege ist die Frühreaktion durch die
      IgE vermittelte Immunzellaktivierung und Freisetzung
      proinflammatorischer Mediatoren charakterisiert. Sie
      imponiert klinisch als akute Bronchialobstruktion, bedingt
      durch rapides Anschwellen der Schleimhaut mit
      Schleimabsonderung und Kontraktion der glatten Muskulatur.
      Die Spätreaktion (2-24 h nach Beginn) wird durch die
      Aktivierung migrierter Leukozyten, insbesondere eosinophiler
      Granulozyten und eine erneute Welle proinflammatorischer und
      bronchokonstriktorischer Mediatoren verursacht. Verschiedene
      Risiken werden bei der multifaktoriellen Genese des Asthmas
      diskutiert. Die dabei bestehenden geographischen
      Inzidenzdiskrepanzen lassen auf einen Zusammenhang zwischen
      genetischen Gesellschaftsmustern und Umweltfaktoren
      schließen, den „Gene-environmental-Interactions“. In der
      vorliegenden Arbeit wurden Auswirkungen verkehrsbedingter
      Abgasbelastung behandelt (Stichwort: Umwelthypothese). Der
      negative Einfluss oxidativen und nitrosativen Stresses auf
      die Aggravation oder Genese einer allergischen
      Atemwegs-erkrankung wurde bereits in zahlreichen
      epidemiologischen und tierexperimentellen Studien aufgezeigt.
      In den letzten Jahren erregte die Formation von
      Nitrotyrosin-Resten an Proteinen wissenschaftliches
      Interesse, da dieser Vorgang mit zahlreichen
      Organerkrankungen assoziiert wird. Sinkt das Redoxpotential
      der Atemwege im Verhältnis zur Belastung durch oxidative- und
      nitrosative Spezies, kann die hohe Rate der Nitrierungen zu
      Fehlfunktionen der Proteine/Enzyme führen. Bei Patienten mit
      entzündlichen Atemwegserkrankungen konnten ein konstant
      erhöhtes oxidatives Stresslevel sowie eine erhöhte Anzahl an
      Nitrotyrosin-Formationen im Respirationstrakt gemessen
      werden. Zudem kommt es in der Luft verkehrsreicher Gebiete
      bei hohen Ozon- und Stickstoffdioxidkonzentrationen zu
      effektiven Nitrierungen von Proteinen und Allergen, welche
      inhaliert werden und extrinsisch-asthmatische Reaktionen der
      Atemwege verschärfen oder hervorgerufen können. Das
      Versuchsschema sah vor, Tiere des C57BL6- (n=228) und
      BALB/c-Stammes (n=54) im akuten Asthmamodell mit nitrierten
      und nicht nitrierten Allergenen (Ovalbumin (OVA bzw. nOVA)
      und Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH bzw. nKLH)) zu behandeln.
      Drei zentrale Hypothesen wurden aufgestellt: Die Nitrierung
      von Allergenen potenziert ihre akut-entzündliche Wirkung auf
      die Atemwege. Nach Sensibilisierung auf ein bestimmtes
      nitriertes Allergen, reagieren Individuen auch gegen ein
      anderes nitriertes Allergen, sodass es zu Kreuzreaktionen
      kommt. Die Behandlung von BALB/c-Tieren mit der nitrierten
      Aminosäure Polytyrosin (nPT) führt zu einer
      allergisch-entzündlichen Reaktion. Zur Klärung der Hypothesen
      wurden den jeweils vierwöchigen Sensibilisierungs- und
      Provokationsschemata verschiedene Untersuchungen
      angeschlossen (Versuchs-zeitraum: 2008 - 2011). Besonders
      aufschlussreich verliefen hierbei die Untersuchung der
      bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (Zellzahl,
      Zellpopulation, Proteingehalt) sowie die Analysen der
      histologischen Lungenpräparate. Die strukturellen und
      zellu-lären Veränderungen ließen insbesondere bei den
      Versuchsgruppen nOVA/nOVA, nKLH/nKLH und auch bei
      nOVA/nKLH-Tieren des C57BL6- und BALB/c-Stammes
      allergisch-entzündliche Reaktionen erkennen. Weiterhin wurden
      Typ-II-Pneumozyten aus den Lungen gewonnen, um daraus
      Proteine und RNA zu isolieren. Zentrale Enzyme des
      antioxidativen Glutathionsystems (Glutathionreduktase,
      Glutathion-peroxidase 3 und 4) konnten daraufhin sowohl in
      der Immunhistologie als auch bei den Western-Blots mit
      Typ-II-Zell-Proteinen detektiert werden. Die Versuchsgruppen
      zeigten gegenüber den Kontrollen zumeist Steigerungen der
      Enzymaktivitäten, welche sich in repräsentativen Bildern
      veranschaulichen ließen. Die RT-qPCR ermöglichte einen
      Einblick in die Expression der Enzyme. Auf dieser Ebene
      beobachtete man bei vielfach eine reaktive Down-Regulation im
      Vergleich zu den Kontrollen. Anhand aller Ergebnisse konnte
      eine Verstärkung des allergischen Potentials durch Nitrierung
      (erste Hypothese) erstmals in vivo bestätigt werden. Nach
      Behandlung mit nitrierten Allergenen zeigten die
      Versuchstiere eine aggravierte allergisch-entzündliche
      pulmonale Reaktion, verglichen mit unveränderten Allergenen.
      Die zweite Hypothese (Kreuzreaktivität) konnte teilweise
      unterstützt werden, jedoch sind hierfür gezieltere
      Untersuchungen notwendig. Die dritte Hypothese konnte nicht
      gestützt werden: Bei den exemplarischen Versuchen mit nPT an
      BALB/c-Tieren ließen sich keine typisch allergischen
      Entzündungsreaktionen nachweisen.