title: Species-selective interactions of histamine H2 receptors with guanidine-type agonists: molecular modelling, site-directed mutagenesis and pharmacological analysis
Creators: name: Preuß, Hendrik
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Histamin , Wirkstoff-Rezeptor-Bindung , Molekulardynamik , Molekulardesign , Punktmutation , Histamin-H2-Rezeptor , Spezies-Selektivität , G-Protein-gekoppelter Rezeptor , Fusionsprotein , Sf9-Insektenzellen , histamine H2 receptor , species-selectivity , G protein coupled receptor , site-directed mutagenesis , molecular dynamics
subject: 540 Chemie
subject: 87.15.By
subject: 87.14.Ee
subject: 87.15.He
subject: 87.15.Aa

description: The histamine H2 receptor (H2R) is a biogenic amine receptor that belongs to the class 1 of G protein coupled receptors (GPCR). N-[3-(1H-imidazol-4-yl)propyl]guanidines such as arpromidine are the most potent H2R agonists known so far. Such compounds might be useful as positive inotropic drugs. Recently, less basic N-acylated derivatives with improved pharmacokinetic properties, i.e. oral bioavailability and the capability of penetrating across the blood-brain barrier, have been developed. Guanidines and N-acylguanidines are more potent and efficacious agonists at the guinea pig (gp) than at the human (h) H2R. The aim of this thesis was to investigate molecular mechanisms underlying distinct functions of H2R species isoforms. Structural models of the hH2R and the gpH2R were expected to provide insight into the binding mode of guanidine-type agonists and to explore the molecular basis for the species-selectivity of these agonists. Predictions emerging from molecular modelling provided a working hypothesis for subsequent experimental molecular pharmacological studies. Three-dimensional homology models of the hH2R and the gpH2R were generated using the crystal structure of bovine rhodopsin as template (chapter 4). With these models, conserved intramolecular interactions were reproduced according to present concepts of GPCR structure. Analysis of the binding site predicted amino acids within the transmembrane (TM) spanning domains TM2, TM3, TM5, TM6, and TM7, as well as Lys-173 and Lys-175 of the second extracellular loop (e2) for interactions with guanidine-type agonists. An interaction between the non-conserved Tyr-17 in TM1 and Asp-271 in TM7 exclusively occurring in the gpH2R model was proposed to determine the species-selectivity of the compounds which has been confirmed experimentally by site-directed mutagenesis (chapter 8). A virtual screening approach with the program LUDI resulted in the development of alkyl-branched N-(phenylalkanoyl)guanidines with enhanced potencies at the hH2R. The hH2R model was subjected to molecular dynamics simulations both in its ligand-free form and in complex with arpromidine (chapter 5). A hydrated 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine bilayer was added to the model to realistically simulate the membrane environment of the receptor. The selective formation and deletion of interactions dependent on the presence or absence of arpromidine in the binding pocket was proposed to represent perturbations that are necessary for the transition from an inactive towards an active receptor state. The results from the simulations helped on further refining dynamic models of the binding mode of guanidine-type agonists. In the experimental part H2R species isoforms of human, guinea pig, rat, and canine were pharmacologically characterized (chapter 7). Fusion proteins of the H2R and the short splice variant of Gs-alpha (GsaS) were recombinantly expressed in Sf9 insect cells. In a steady-state GTPase activity assay only the canine H2R exhibited an increased level of constitutive activity compared to the hH2R. Moreover, in membranes expressing fused and non-fused receptors the highest basal and GTP-dependent increases in adenylyl cyclase activity were observed with the canine H2R. From H2R modelling, the increased constitutive activity of the canine H2R was suggested to be due to a lack of a putative intramolecular interaction with the non-conserved Arg-228 stabilizing an inactive receptor state. To investigate a potential impact of e2 on the species-selectivity of guanidine-type agonists, an hH2R-GsaS fusion protein with the four amino acids in e2 differing in human and guinea pig mutated into the gpH2R sequence, and a gpH2R-GsaS protein with the corresponding point mutations into the hH2R sequence, were generated (chapter 9). Efficacies and potencies of agonists were similar at mutant and wild-type receptors indicating that e2 does not contribute to the species-selectivity. With two additional mutant hH2R-GsaS proteins bearing single point mutations of Lys-173 to Ala and Lys-175 to Ala, respectively, agonist activities remained unchanged, suggesting that both amino acids do not participate in direct ligand-receptor interactions. Taken together, the complementary application of three-dimensional structural models and molecular pharmacological studies provided striking insight into specific functions of H2R species isoforms and their selective interactions with guanidine-type agonists and will facilitate a further development of more potent and selective agonists for the human H2R. Moreover, results from these studies are not restricted to the H2R subclass but should also apply to other members of the G protein coupled receptor family.
description: Der Histamin-H2-Rezeptor (H2R) gehört zur Klasse 1 G-Protein-gekoppelter Rezeptoren. Arpromidin und strukturverwandte N-[3-(1H-imidazol-4-yl)propyl]guanidine sind die potentesten beschriebenen H2R-Agonisten. Solche Substanzen könnten als positiv inotrope Arzneistoffe therapeutischen Einsatz finden. Die vom Arpromidin abgeleiteten N-Acylguanidine weisen eine deutlich herabgesetzte Basizität auf und verfügen somit über verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften hinsichtlich oraler Bioverfügbarkeit und Hirngängigkeit. Guanidine und N-Acylguanidine sind potentere und effektivere Agonisten am Meerschweinchen- (gp) gegenüber dem humanen (h) H2R. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der strukturellen und funktionellen Charakterisierung verschiedener H2R-Speziesisoformen sowie der molekularen Analyse Spezies-selektiver Agonist-Rezeptor-Wechselwirkungen, um die Basis für ein rationales Design neuer Agonisten mit hoher Aktivität am humanen H2R zu schaffen und vertiefte Erkenntnisse über die Funktionsmechanismen G-Protein-gekoppelter Rezeptoren zu erarbeiten. Der Einsatz computerbasierter Methoden wurde durch molekularpharmakologische Untersuchungen ergänzt. Anhand der Röntgenkristallstruktur des bovinen Rhodopsins wurden dreidimensionale Strukturmodelle des hH2R und des gpH2R generiert (Kapitel 4). Die in diesen Modellen ausgebildeten konservierten intramolekularen Wechselwirkungen stimmten mit aktuellen Erkenntnissen über die Struktur G-Protein-gekoppelter Rezeptoren überein. Eine Analyse der Bindetasche erbrachte Aminosäuren innerhalb der transmembranären (TM) Domänen TM2, TM3, TM5, TM6 und TM7 sowie Lys-173 und Lys-175 in der zweiten Extrazellulärschleife (e2) als potentielle Wechselwirkungspartner der Agonisten vom Guanidin-Typ. Eine selektiv im Modell des gpH2R ausgebildete Interaktion zwischen den nicht-konservierten Aminosäuren Tyr-17 in TM1 und Asp-271 in TM7 wurde als kritischer Parameter für die Spezies-Selektivität der Substanzen vorhergesagt und mittels Punktmutagenese experimentell bestätigt (Kapitel 8). Ein virtuelles Screening mit Hilfe des Programms LUDI resultierte in der Entwicklung alkyl-verzweigter N-(phenylalkanoyl)guanidine mit erhöhter Potenz am humanen H2R. Moleküldynamiksimulationen des hH2R in Ligand-freier Form und im Komplex mit Arpromidin wurden angefertigt (Kapitel 5). Zur Simulation einer realistischen Membranumgebung des Rezeptorproteins wurde das Modell in eine solvatisierte 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin-Doppelschicht eingebettet. Die Besetzung der Bindetasche mit Arpromidin rief Konformationsänderungen im Rezeptorprotein hervor, die für einen Übergang des inaktiven in einen aktivierten Zustand notwendig sein könnten. Zusätzlich wurde ein dynamisches Modell der Agonistbindung an den hH2R erarbeitet. Im experimentellen Teil wurden die H2R-Speziesisoformen von Mensch, Meerschweinchen, Ratte und Hund pharmakologisch charakterisiert (Kapitel 7). Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine bestehend aus dem H2R und der kurzen Splice-Variante des G-Proteins Gs-alpha (GsaS) rekombinant in Sf9-Insektenzellen exprimiert. Im GTPase-Aktivitäts-Assay zeigte allein der Hunde-H2R eine erhöhte konstitutive Aktivität gegenüber dem humanen Rezeptor. Fusionierter und nicht-fusionierter Hunde-H2R wiesen darüber hinaus die höchsten basalen Adenylylzyklaseaktivitäten und die höchsten GTP-stimulierten Signalanstiege an Adenylylzyklaseaktivität auf. Als molekulare Ursache für die erhöhte konstitutive Aktivität des Hunde-H2R wurde das Fehlen einer möglicherweise den Grundzustand stabilisierenden intramolekularen Wechselwirkung mit der nicht-konservierten Aminosäure Arg-228 diskutiert. Zur Überprüfung einer funktionellen Rolle der e2 für die Speziesselektivität der Agonisten wurden ein mutiertes hH2R-GsaS Fusionsprotein mit der e2-Aminosäuresequenz des gpH2R und ein analoges gpH2R-GsaS Fusionsprotein mit der e2-Aminosäuresequenz des hH2R konstruiert (Kapitel 9). Eine potentielle Interaktion der Agonisten mit Lys-173 und Lys 175 wurde anhand zweier weiterer mutierter hH2R-GsaS Fusionsproteine untersucht, bei denen jeweils eine der beiden Aminosäuren gegen Ala ausgetauscht wurde. Keines der mutierten Rezeptorproteine verursachte signifikante Änderungen in den Agonistaktivitäten gegenüber den Wildtyp-Rezeptoren, was auf eine Nichtbeteiligung der untersuchten Aminosäuren an direkten Wechselwirkungen schließen ließ. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass durch den kombinierten Einsatz dreidimensionaler H2R-Strukturmodelle und molekularpharmakologischer Untersuchungen neue Erkenntnisse über die spezifischen Funktionen verschiedener H2R-Speziessubtypen und deren selektive Interaktionen mit Agonisten vom Guanidin-Typ gewonnen werden konnten, die einer weiteren Entwicklung potenter und selektiver Agonisten am humanen H2R dienlich sind und darüber hinaus wichtige Informationen über die molekularen Mechanismen G-Protein-gekoppelter Rezeptoren liefern.