Νέοι μονωτές χρωματίνης ανθρώπου για αποτελεσματικότερη και ασφαλέστρερη γονιδιακή θεραπεία
Creators: name: Μέλο, Πάμελα Κώστα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Βιολογία
Γονιδιακή Θεραπεία
Μονωτές χρωματίνης
Biology
Gene therapy
Chromatin insulators

description: Παρά την αλματώδη πρόοδο που έχει σημειωθείτα τελευταία χρόνια στη γονιδιακή θεραπεία των γενετικών νοσημάτων, παραμένει η ανάγκη βελτιστοποίησης της μεθόδου, τόσο ως προς την αποτελεσματικότητα, όσο και ως προς την ασφάλεια της εφαρμογής της. Η ενσωμάτωση του διαγονιδίου σε έκτοπη θέση στο γονιδίωμα κυττάρων-στόχων, μέσω ενσωματούμενων ιικών φορέων, συνδέεται με προβλήματα έκφρασης του διαγονιδίου, όπως η αποσιώπηση ή η ανομοιογένεια της έκφρασης, καθώς και με πρόκληση γενοτοξικότητας, όπως η εισχωρητική μεταλλαξιγένεση και η κλωνική έκπτυξη. Για την αντιμετώπιση αυτών των φαινομένων έχει προταθεί η χρήση μονωτών χρωματίνης με δράση τύπου διακόπτη-ενισχυτή (enhancer-blocking activity), προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν τα φαινόμενα της επαγόμενης από τον ιικό φορέα γενοτοξικότητας, ή μονωτών χρωματίνης με δράση τύπου φραγμού (barrier activity) για να περιοριστούν τα φαινόμενα ανομοιογένειας ή αποσιώπησης της γονιδιακής έκφρασης . Μέχρι πρόσφατα, ο πρότυπος, διπλής δράσης μονωτής χρωματίνης προερχόμενος από την όρνιθα, cHS4, έχει συσχετιστεί με περιορισμούς, όπως αρνητική επίδραση στον τίτλο των ιικών φορέων λόγω του μεγάλου μεγέθους του, καθώς και μερικώς αποτελεσματική προστασία. Πολύ πρόσφατα, στο συνεργαζόμενο εργαστήριο του Δρ. Γ. Σταματογιαννόπουλου (Seattle, WA), ανακαλύφθηκαν με τεχνικές υψηλής ανάλυσης στο γονιδίωμα του ανθρώπου, 27 νέοι μονωτές χρωματίνης τύπου διακόπτη-ενισχυτή. Στην παρούσα εργασία, αξιολογήθηκε η πιθανήδράση τύπου φραγμού σε δύο εκ των 27 (C1 και Β4) νέωνμονωτών χρωματίνης τύπου διακόπτη-ενισχυτή, προκειμένου να αναγνωριστούν μονωτές χρωματίνης με διπλή δράση και προφανή ευεργετικά αποτελέσματα. Για τον σκοπό αυτό, οι μονωτές χρωματίνης ενσωματώθηκαν σε αυτοαδρανοποιούμενους (SIN) λέντι-ιικούς φορείς αναφοράς (GFP), με τους οποίους διαμολύνθηκαν αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ανθρώπου (CD34+), στα οποία ελέγχθηκε η αποτελεσματικότητα της έκφρασης του διαγονιδίου (eGFP) σε καλλιέργειες μεθυλοκυτταρίνης. Αντίστοιχα, για την επιβεβαίωση της δράσης τους και ως διακόπτες ενισχυτών, διαμολύνθηκαν με τους ίδιους λεντι-ιικούς φορείς αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα ποντικού (Lineage-), στα οποία ελέγχθηκε η γενοτοξικότητα των λεντι-ιικών φορέων, μέσωτου ποσοστού κλωνογενούς έκπτυξής τους. Παρατηρήθηκε ότι οι δυο νέοι μονωτές χρωματίνης ανθρώπου C1 και B4, δεν επηρεάζουν αρνητικά τον τίτλο των ιικών φορέων και εμφανίζουν ισχυρή διπλή δράση τύπου φραγμού, διατηρώντας επί μακρόν υψηλά επίπεδα έκφρασης τουδιαγονιδίου, αλλά και τύπου διακόπτη ενισχυτή, μειώνοντας την ικανότητα κλωνογενούς έκπτυξης και φαινομένων γενοτοξικότητας επαγόμενης από τον ιικό φορέα. Μεταξύ των δύο αυτών μονωτών χρωματίνης, ο C1 κατέδειξε ισχυρότερη διπλή δράση σε σχέση με τον B4.Συμπερασματικά, οι νέοι μονωτές χρωματίνης B4 και C1, και ισχυρότερα ο C1, αποτελούν μονωτές διπλής δράσης, διακόπτη ενισχυτή αλλά και φραγμού, αποτρέποντας έτσι φαινόμενα γονιδιακής αποσιώπησης και γενοτόξικότητας. Η χρήση αυτών των νέων μονωτών ανθρώπου σε ιικούς φορείς μπορεί δυνητικά να βελτιώσει σημαντικά την έκβασή της γονιδιακής θεραπείας όσον αφορά την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια
description: Despite the remarkable progress that has been made in recent years in gene therapy of genetic diseases, a need remains towards improving the safety and the efficacy of the method. The semirandom integration of the transgene into the target cell genome, through integrated viral vectors, is associated with the limitations of position effects such as silencing or heterogeneity of expression or/and genotoxic effects, namely insertional mutagenesis and vector mediated genotoxicity. Chromatin insulators have been proposed as a means to minimize both genotoxicity and position effects through their enhancer-blocking or barrier activity, respectively. Until recently, the prototypic, dual functioning vertebrate chromatin insulator chicken HS4, has been associated with several limitations including suboptimal titers, due to its large size (1.2kb) and only partial insulation. Recently, in the affiliate laboratory of Dr. G. Stamatoyannopoulos 27 novel chromatin insulators (CIs) were identified as enhancer blockers by high thruput analysis techniques of the human genome. In the present thesis, we evaluated the possible barrier activity of 2/27 (C1 and B4) new enhancer-blocking chromatin insulators to identify a dual functioning CI. To this end, human hematopoietic stem cells (CD34+) were transduced with insulated and uninsulated SIN lentiviral, reporter (GFP) vectors, and their eGFP expression was assessed at clonal level. In order to confirm, the enhancer-blocking activity, the mouse hematopoietic stem cells (Lineage-) were transduced with the same lentiviral vectors, and the vector-mediated genotoxicity was assessed, by determining the percentage of clonal expansion. We demonstrate that two new human chromatin insulators, the C1 and B4, do not negatively affect vector titers while display strong dual function, both barrier and enhancer-blocking (with C1 being superior over B4), thus maintaining high levels of transgene expression and reducing clonal expansion and vector mediated genotoxicity. Τhe use of these new human isolators in gene therapy could significantly improve the outcome in terms of safety and efficacy and lead to a new generation of viral vectors