title: Wirkmechanismen des MAP-Kinase Inhibitors CNI-1493 auf mikrogliale BV-2 Zellen und primäre Mikroglia
title: Mechanisms of action of the MAP-kinase inhibitor CNI-1493 with respect to BV-2 cells and primary microglia
Creators: name: Mengel, David
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Microglia
Medizin, Gesundheit
Alzheimer-Disease
Alzheimer-Krankheit
Mikroglia

description: Ein zentrales Merkmal der Demenz
      vom Alzheimertyp (AD) ist die Akkumulation von
      β-Amyloid-Oligomeren sowie die Ausbildung einer
      β-Amyloid-induzierten Entzündungsreaktion im Gehirn.
      β-Amyloid entsteht aus einem Vorläuferprotein, dem APP,
      welches durch Sekretasen prozessiert wird. Die Bildung und
      der Abbau dieser Oligomere stellen einen zentralen Ansatz in
      der Entwicklung neuer Medikamente für AD dar. Insbesondere
      wird versucht, die Sekretasenaktivität zu beeinflussen, den
      Abbau von β-Amyloid zu fördern, die Aggregation von β-Amyloid
      zu hemmen sowie die durch die Oligomere bedingte Toxizität zu
      beeinflussen. Darüber hinaus steht die Modulation der
      β-Amyloid-induzierten Inflammation, bei der es zu einer
      starken Aktivierung mikroglialer Zellen kommt, im Focus des
      Interesses. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden,
      dass der entzündungshemmende p38 MAPK Hemmstoff CNI-1493 in
      einem transgenen Mausmodel der Demenz vom Alzheimertyp zu
      einer deutlichen Reduktion der intrazerebralen
      β-Amyloid-Konzentration und gleichzeitig zu einer
      Verbesserung der Kognition dieser Tiere geführt hat.
      Allerdings sind die Wirk-mechanismen dieser Substanz nicht
      vollständig geklärt. Auch die besondere Wirkung auf die
      Mikroglia, einer zentralen Zelle bei der Erkrankung, ist noch
      unklar. Daher war das Ziel der vorliegenden Arbeit, zum einem
      die Interaktion zwischen CNI-1493 und β-Amyloid zu
      charakterisieren. Weiterhin wurde in vitro an primären
      Mikrogliazellen der Einfluss von CNI-1493 auf die
      Zytokinsekretion, die Aktivität der Sekretasen, die Toxizität
      von β-Amyloid und die Phagozytosefähigkeit untersucht.
      Primäre Mikroglia wurden aus Mesokortizes von Mausembryonen
      isoliert. Zusätzlich erfolgten die ersten Experimente an
      einer Zellkulturlinie. Zur Untersuchung der Zytotoxizität
      wurden MTT-Assays durchgeführt. Die Sekretion von Zytokinen
      und Amyloid-β wurde mit Hilfe von ELISAs untersucht. Die
      Fähigkeit der Zellen zur Phagozytose wurde durch
      FACS-Analysen überprüft. Die Interaktion zwischen CNI-1493
      und β-Amyloid-Oligomeren wurde anhand von Westernblot bzw.
      Dot-Blot-Verfahren getestet. Die Aktivität der Sekretasen
      wurde indirekt durch RT-PCR dargestellt, während deren
      Funktion mit Hilfe von fluoro-metrischen Assays bestimmt
      wurde. Wir konnten zeigen, dass CNI-1493 in der Lage ist, die
      Bildung von toxischen Aggregations-formen des β-Amyloids zu
      hemmen. Dadurch ließ sich die β-Amyloid-induzierte Schädigung
      mikroglialer Zellen reduzieren. Auch die Sekretion von
      proinflammatorischen Zytokinen konnte durch CNI-1493
      vermindert werden. Darüber hinaus ließ sich durch die
      Inkubation mit CNI-1493 die Phagozytose von β-Amyloid
      verbessern. Wir konnten auch zeigen, dass CNI-1493 die
      Funktion der α-Sekretase moduliert und dadurch die Induktion
      des nicht-amyloidogenen Weges der APP-Prozessierung
      induziert. In der vorliegenden Studie konnten wir relevante
      Wirkmechanismen von CNI-1493 in der mikroglialen Zellkultur
      aufklären. Unsere Daten zeigen, dass es nicht nur zu einem
      direkten Effekt von CNI-1493 auf Bildung toxischer
      β-Amyloid-Oligomere kommt, sondern über eine Inhibition des
      p38 MAPK Signalweges auch zur Modulation immunologischer
      Funktionen von mikroglialen Zellen. Über eine Aktivierung der
      α-Sekretase durch CNI-1493 ließ sich zudem eine Reduktion der
      β-Amyloid-Sekretion mikroglialer Zellen induzieren. In der
      Zusammen-schau dieser Ergebnisse scheint diese Substanz
      gerade aufgrund der unterschiedlichen Wirk-mechanismen für
      eine Therapie der AD geeignet. Berücksichtigt man die
      Tatsache, dass CNI-1493 bereits erfolgreich in einer
      klinischen Studie bei M. Crohn getestet wurde, wäre der
      Einsatz in einer klinischen Studie bei Patienten mit AD
      möglich.
description: Introduction: Intracerebral
      accumulation of β-Amyloid oligomers and the induction of a
      β-Amyloid induced inflammatory response are crucial factors
      in the development of Alzhei-mer´s disease. β-Amyloid
      peptides are generated from the amyloid precursor protein
      (APP) by a stepwise processing of the secretases. Generation
      as well as break-down of oligomeric β-Amyloid are key
      mechanisms for the development of drugs for Alzheimer´s
      disease. Thera-peutical targets are the modulation of
      secretase activity, induction of the degradation of
      β-Amyloid, inhibition of the aggregation of β-Amyloid as well
      as the reduction of β-Amyloid induced cell toxicity.
      Furthermore, attention is being paid to the modulation of
      β-Amyloid induced inflammatory mechanisms which are
      accompanied by the activation of microglial cells. In this
      context, it has been shown that the anti-inflammatory p38
      MAPK inhibitor CNI-1493 is able to inhibit the intracerebral
      accumulation of β-Amyloid as well as the cognitive
      de-terioration in an APP transgenic mouse model of
      Alzheimer´s disease. Even though, the mechanism of action is
      far from being understood so far, current evidence points
      towards a regulatory effect on microglial activation.
      Therefore, a central aim of this study was to analyze the
      interaction of CNI-1493 and β-Amyloid. In addition, the
      influence of CNI-1493 on the secretion of cytokines,
      secretase activity, β-Amyloid toxicity and phagocytosis was
      investigated. Primary microglial cells were isolated from
      embryonic mice cortices. Additionally, experi-ments were
      performed with a microglial cell line. Cell viability was
      assessed with MTT assays. We used ELISAs to analyze secretion
      of cytokines and β-Amyloid. Phagocytosis was investi-gated
      with FACS scans. Western-blot/ dot-blot techniques were used
      to show the interaction of CNI-1493 with β-Amyloid oligomers.
      RT-PCR was performed to analyze secretase ex-pression, and
      secretes activity was determined using fluometric assays. We
      were able to show an inhibition of the generation of toxic
      β-Amyloid oligomers by CNI-1493. As a result CNI-1493 is able
      to reduce β-Amyloid oligomer-induced toxicity in microglial
      cells. Additionally, CNI-1493 reduced the secretion of
      pro-inflammatory cytokines. Further phagocytosis of β-Amyloid
      was enhanced following incubation with CNI-1493. We could
      also show that CNI-1493 modulates α-secretase activity and
      hence induces the non-amyloidogenic pathway of APP
      processing. In this study, we further characterized the
      important in vitro and in vivo mechanisms of action by
      CNI-1493. Our data show a direct effect of CNI-1493 on the
      generation of toxic β-Amyloid oligomers as well as a
      modulation of immunological functions of microglial cells by
      the inhibition of the p38 MAPK pathway. Induction of the
      α-secretase resulted in a reduced secretion of β-Amyloid by
      microglial cells. Given the various ways of actions, CNI-1493
      seems to be an appropriate drug for the treatment of
      Alzheimer’s disease. Since CNI-1493 has already been
      successfully used in chronic inflammatory diseases, it will
      be intriguing and informative to determine its effect in a
      clinical trial in patients suffering from Alzheimer’s
      disease.