Die Bedeutung der zellulären Volumenregulation bei der Kryo-Arretierung biologischer Systeme
Creators: name: Christmann, Jens
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2014
Subjects: subject: Volumenregulation
subject: RVI und HICC-Aktivierung
subject: Kryo-Arretierung
subject: Aktivierungsenergien
subject: Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
subject: Patch-Clamp
subject: 570

description: Während der Kryo-Konservierung von Zellen, die klassischerweise mit einem langsamen Einfrieren verbunden ist, verlieren Zellen massiv an Wasser. Teilweise sind bei tiefen Temperaturen nur noch 5% des osmotisch aktiven Volumens vorhanden. Dieses Verfahren stellt somit eine deutlich Dysbalance für den Wasserhaushalt von Zellen dar. Volumenregulation ist für Zellen eine essentielle Funktion, um sich an Änderungen der intra-oder extrazellulären Osmolarität anzupassen. Sie dient der Regulation des Wasserhaushaltes und ist kritischer Bestandteil von Prozessen wie der Proliferation oder auch der Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Volumenregulation von HeLa-Zellen eingehend charakterisiert. Dazu wurden mittels FCS-Messungen die Geschwindigkeiten, des Zell-Schrumpfens und Schwellen, sowie des RVI bestimmt. Neben den generellen Prozessen der Volumenregulation wurden noch zwei Hauptvermittler des RVI in HeLa-Zellen, der HICC und NHE1, ebenfalls in einer temperaturabhängigen Weise untersucht. Darüber hinaus wurde, in einer Kooperation, das molekulare Korrelat des HICCs in HeLa Zellen identifiziert und ein Aktivierungsmechanismus untersucht. Der Vergleich, insbesondere der Aktivierungsenergien zwischen ungefrorenen und gefrorenen Zellen brachte neue Erkenntnisse über die Notwendigkeit von Volumenregulation für eine erfolgreiche Kryo-Konservierung. Es stellte sich heraus, dass der RVI und die HICC-Aktivierung nach dem Frieren von Zellen eine deutlich niedrigere Aktivierungsenergie aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten auf eine Beteiligung des HICCs bei der Volumenregulation von Zellen nach deren Frieren hin. Die Volumenregulation nach dem Frieren ist ein integraler Bestandteil einer Adaptation an den vorhergegangenen Wasserverlust. Darüber hinaus konnte ein Verfahren für die Kryo-Konservierung von adhärenten Zellen etabliert werden. Als Konsequenz dieser Erkenntnisse wurde Vasopressin, ein Stimulanz von HICC-Kanälen, als neue Form der Kryo-Protektion etabliert. Eine Behandlung von Zellen vor dem Frieren mit diesem Hormon, führte zu höheren Überlebensraten und besserem Wachstum der Zellen nach dem Frieren. Dieser Effekt wurde durch eine Stimulation des RVI, insbesondere durch eine Stimulation des HICCs, vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass Viskosität scheinbar ein wichtiger Parameter in der Wahrnehmung von Volumenänderungen der Zelle sein kann. Durch die artifizielle Änderungen der Viskosität kam es zu einer Aktivierung des HICCs in HeLa Zellen. Ebenso zeigte sich nach dem Frieren von Zellen eine Hysterese in deren Viskosität, mit einer zweifachen Erhöhung nach der Rückkehr zu 35°C. Es kann angenommen werden, dass diese erhöhte Viskosität wenigstens ein Signal für die gesteigerte Volumenregulation nach dem Frieren ist. Die erhaltenen Ergebnisse und Konzepte zum Frieren von Zellen führten zu der Entwicklung und Etablierung von zwei neuen Verfahren zur Fixierung von Zellen für die Mikroskopie. So wurde ein langsames Gefrierprotokoll für das adaptive Frieren von Zellen zur anschließenden superresolutions-Mikroskopie entwickelt, welches einen reversiblen Arrest und ein zweite Mikroskopie nach Behandlung der Zellen erlaubte. Ein vom Fraunhofer Institut in St. Ingbert entwickeltes Gerät zum Schock-Frieren von Zellen wurde erfolgreich zur ultraschnellen Arretierung von Zellen mit anschließender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass diese Variante des Frierens weder die molekulare Interaktion noch die räumliche Lokalisation des EGF-Rezeptors beeinträchtigt.