title: Development, Synthesis and Characterization of novel Furin Inhibitors
title: Entwicklung, Synthese und Charakterisierung neuartiger Furininhibitoren
Creators: name: Becker, Gero Lutz
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Peptidmimetika
Influenza
Furin
Inhibitor
Furin inhibitors
Solid phase peptide synthesis
Chemie
Festphasenpeptidsynthese
Furininhibitoren
Peptide mimetics
Vogelgrippe

description: In the present work, novel
      effective peptidomimetic Inhibitors for the proprotein
      convertase furin were synthesized and characterized. Several
      compounds were designed based on the structure of the
      irreversible inhibitor Decanoyl-RVKR-chloromethyl ketone,
      which contain in place of the P1 Arg-chloromethyl ketone
      moiety decarboxylated arginin- or lysin derivatives as well
      as some other basic groups. Initially, the decanoyl residue
      was replaced with an acetyl or phenylacetyl group and the
      lysin in P2-position was replaced with and arginin. Following
      the synthesis, the determination of the inhibitor constants
      showed that the compound
      Phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide (17) was a highly
      effective Inhibitor (0.81 nM). For optimization, different
      series of inhibitors were synthesized based on this lead
      structure 17. Therefore, natural and unnatural amino acids
      and amino acid derivatives were inserted successively in all
      other positions (P2-P5). It could be shown that the exchange
      of the P4-arginin as well as the elimination of the basic
      group in P2 position led to a drastic reduction of the
      inhibitory efficiency. The systematic incorporation of all
      proteinogenic amino acids in P3 position led to compounds
      which could inhibit furin comparable to inhibitor 17. Besides
      valin, isoleucin, phenylalanin or tyrosin are also well
      suited in this position. In contrast, the determination of
      the inhibitory constants of compounds with acidic amino acids
      in P3-position showed a reduced inhibitory potency, probably
      due to electrostatic repulsion from the negatively charged
      active site of furin. Different fatty acids were introduced
      in P5 position in course of the following synthesis. The
      determination of the inhibitory constants showed that up to a
      length of 10 carbon atoms the inhibitory activity was
      comparable to the lead structure. The further prolongation of
      the carbon chain led to a gradual loss of the inhibitory
      efficiency. The introduction of basic residues in P5 position
      yielded highly potent Inhibitors of which
      3-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide
      (38) inhibits Furin most efficient with a Ki-value of 5.6 pM.
      In further course of the work, the stability of some
      synthesized compounds was analyzed via HPLC. Under the
      applied conditions no degradation or decay of the chosen
      compounds could be observed. For example, inhibitor 17 was
      stable in aqueous solution over 10 days at room temperature.
      In collaboration with the Garten laboratory (Institute of
      Virology, University of Marburg) some compounds were tested
      in cell culture for cytotoxicity. The inhibitors with
      negligible cytotoxic effects were further used in virological
      assays for the determination of the inhibition of virus
      spread and proliferation of highly pathogenic avian influenza
      (H7N1). Among others, inhibitor 17 and
      4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamide
      (40) were able to reduce efficiently the virus proliferation.
      The quantitative determination of infectious viruses in cell
      cultures over a period of several days showed a significant
      reduction in virus spread. After 45 h, the virus titer
      reached a value of only 1.7 % in comparison to the control
      without inhibitor. To purify recombinant synthesized furin
      for utilization in crystallization experiments, some
      N-terminally biotinylated inhibitors based on the lead
      structure were synthesized for the application in affinity
      chromatography. These derivatives were used in collaboration
      with the workgroup of Mr. Than (Institute for Age Research,
      Fritz Lipmann-Institut, Jena) for the purification of mouse
      furin. Therefore, commercially available streptavidin columns
      were loaded with the biotinylated compounds. In comparison to
      the classical purification methods, these affinity columns
      were well suited for an effective purification of furin. The
      small molecular inhibitors synthesized during this work are
      the most efficient reversible furin inhibitors worldwide
      until today. Therefore, they are well suited for further
      tests in cell cultures or even in animal models.
description: In der vorliegenden Arbeit wurden
      neuartige, effektive, peptidomimetische Inhibitoren der
      Proproteinkonvertase Furin synthetisiert und charakterisiert.
      Ausgehend von der Struktur des irreversiblen
      Referenzinhibitors Decanoyl-RVKR-chlormethylketon wurden
      Verbindungen entwickelt, in die anstelle des P1
      Arg-chlormethylketon-Segmentes decarboxylierte Arginin- und
      Lysinmimetika sowie weitere zyklische basische Reste
      eingebaut wurden. Der Decanoyl-Rest wurde zunächst durch
      einen Phenylacetyl- oder Acetylrest sowie das Lysin in der
      P2-Position durch Arginin ersetzt. Die auf die Synthese
      folgende Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass als
      wirksamster Inhibitor Phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid
      (17) Furin mit einem Ki-Wert von 0,81 nM hemmt. Basierend auf
      dieser Leitstruktur wurden zur weiteren Optimierung
      verschiedene Inhibitorserien synthetisiert, bei denen
      nacheinander in allen Positionen der Struktur (P2-P5)
      verschiedene natürliche und unnatürliche Aminosäurereste oder
      Aminosäurederivate eingebaut wurden. So konnte gezeigt
      werden, dass der Austausch des P4-Arginins durch ein Lysin
      oder die Eliminierung der basischen Gruppe in der P2-Position
      zu einer drastischen Reduktion der inhibitorischen
      Effektivität führt. Der systematische Einbau aller
      proteinogenen Aminosäuren in die P3-Position zeigte, dass
      fast alle Derivate dieser Serie Furin effektiv hemmen, dabei
      waren neben Valin auch Isoleucin, Phenylalanin oder Tyrosin
      besonders geeignet. Der Einbau saurer Aminosäuren an dieser
      Stelle führte jedoch zu weniger wirksamen Inhibitoren,
      wahrscheinlich bedingt durch elektrostatische Abstoßung
      aufgrund des stark negativ geladenen, aktiven Zentrums des
      Furins. In der P5-Position wurden verschiedene Fettsäurereste
      eingebaut. Die Bestimmung der Inhibitorkonstanten ergab, dass
      sie bis zu einer Länge von 10 Kohlenstoffatomen annähernd im
      Bereich der Leitstruktur (17) liegt. Die weitere Verlängerung
      der Kohlenstoffkette führte allerdings zu einem sukzessiven
      Abfall der inhibitorischen Wirkung. Die Synthese von
      Inhibitoren mit basischen P5-Resten führte zu sehr potenten
      Wirkstoffen, von denen sich
      3-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid
      (38) mit einem Ki-Wert von 5,6 pM als der effektivste
      Inhibitor für Furin herausstellte. Untersuchungen zur
      Stabilität einiger Verbindungen mittels HPLC zeigten, dass
      unter den gewählten Bedingungen kein nennenswerter Zerfall
      oder Abbau nachzuweisen war. Als Beispiel dient Inhibitor 17,
      der in wässriger Lösung über 10 Tage bei Raumtemperatur
      stabil ist. In Zusammenarbeit mit der AG Garten (Institut für
      Virologie der Universität Marburg) wurden ausgesuchte
      Inhibitoren auf ihre Zytotoxizität in Zellkultur untersucht.
      Die wenig zytotoxisch wirkenden Verbindungen wurden
      anschließend in virologischen Untersuchungen zur Hemmung der
      Vermehrung und Ausbreitung hochpathogener Viren der
      klassischen Geflügelpest (H7N1) eingesetzt. Dabei wurde
      nachgewiesen, dass unter anderen die Inhibitoren 17 und
      4-(Guanidinomethyl)phenylacetyl-RVR-4-(amidino)benzylamid
      (40) die Virusvermehrung effektiv hemmen. Die quantitative
      Bestimmung infektiöser Viren in Zellkulturen über einen
      Zeitraum von mehreren Tagen zeigte, dass die Zugabe des
      Inhibitors 40 zu einer signifikanten Verlangsamung der
      Virusausbreitung führt. So betrug der Virustiter nach 45 h
      nur 1,7 % der Kontrollkultur ohne Inhibitor. Zur Optimierung
      der Reinigung von rekombinant hergestelltem Furin für
      Kristallisationsexperimente wurden basierend auf der
      Leitstruktur N-terminal biotinylierte Inhibitoren für die
      Affinitätschromatographie synthetisiert. Diese Verbindungen
      wurden in Zusammenarbeit mit der AG Than (Institut für
      Altersforschung, Fritz Lipmann-Institut, Jena) für die
      Reinigung von Maus-Furin eingesetzt, indem kommerziell
      erhältliche Streptavidinsäulen mit den biotinylierten
      Inhibitoren beladen wurden. Mit diesen Affinitätssäulen
      gelang eine effektive Reinigung des Furins im Vergleich zu
      den bisher verwendeten, klassischen Reinigungsmethoden. Die
      im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten, niedermolekularen
      Verbindungen sind die wirksamsten, reversibel bindenden
      Furinhemmstoffe, die bisher weltweit entwickelt wurden. Sie
      sind daher für weiterführende Untersuchungen in Zellkulturen
      oder gegebenenfalls sogar in Tiermodellen geeignet.