Recombinant expression and functional characterization of cannabinoid producing enzymes in komagataella phaffii
Creators: name: Zirpel, Bastian
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2018
Subjects: subject: Cannabioids
subject: Cannabis sativa
subject: Komagataella phaffii
subject: Pichia pastoris
subject: THC
subject: THCAS
subject: CBDAS
subject: 660
subject: Cannabis
subject: THC

description: Cannabinoids are secondary natural products predominantly found in the oil compartments of trichomes of the plant Cannabis sativa L. Up to now more than 100 cannabinoids have been isolated, the most prominent being the psychoactive Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD). As THC-derived products are already available for medical use and CBD is currently investigated for its application in several disease treatments, the demand of cannabinoid-based products is expected to further rise in the future. A biotechnological production presents a promising alternative to meet the demand, while also offering environmentally friendly, highly controllable and reproducible, GMP compliant processes as well as the reduction of agricultural area. In this regard, the cannabinoid producing enzymes from C. sativa, Δ9-tetrahydrocannabinolic acid synthase (THCAS) and cannabidiolic acid synthase (CBDAS), were recombinantly produced in the yeast Komagataella phaffii. The expression of thcas was enhanced in K. phaffii by optimization of cultivation conditions as well as identification and co-expression of helper protein genes. Insights were gained into structure-function relationships of the THCAS and CBDAS. The influence on the enzyme activities of glycosylation sites, of amino acid residues in the berberine-bridge-domain as well as in the active site were investigated. Important amino acid residues for enzyme activity were identified yielding enzyme variants with improved catalytic and stability properties. Additionally, a first approach to establish the late cannabinoid biosynthesis pathway in yeasts is presented. Production of the soluble prenyltransferase NphB from Streptomyces sp. strain CL190, which enables the replacement of the native transmembrane prenyltransferase cannabigerolic acid synthase from C. sativa, was simultaneously produced with THCAS, thereby enabling a production of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid from precursors olivetolic acid and geranyl diphosphate. The studies presented here contribute to increased fundamental and industrially relevant knowledge and will help promoting a biotechnological cannabinoid production in yeasts.
description: Cannabinoide sind sekundäre Naturstoffe, die vorrangig in den Öl-Kompartimenten von Trichomen der Pflanze Cannabis sativa L. vorkommen. Bis heute wurden mehr als 100 Cannabinoide isoliert, wobei die bekanntesten von ihnen die psychoaktiven Stoffe Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD) sind. THC-haltige Produkte finden bereits medizinische Anwendung und CBD wird momentan für mögliche Anwendungen in der Behandlung von diversen Krankheiten untersucht, weswegen in der Zukunft mit einem Anstieg der Nachfrage von cannabinoidhaltigen Produkten gerechnet wird. Eine biotechnologische Produktion stellt eine vielversprechende Alternative dar, um diesen Bedarf zu decken. Zusätzlich bietet sie eine Aussicht auf ökologische, kontrollierbare und reproduzierbare, GMP-konforme Prozesse, ohne den Bedarf an landwirtschaftlicher Nutzfläche zu steigern. Die Cannabinoid-produzierenden Enzyme aus C. sativa, Δ9-Tetrahydrocannabinolsäure Synthase (THCAS) and Cannabidiolsäure Synthase (CBDAS), wurden recombinant in der Hefe Komagataella phaffii produziert. Die thcas Expression wurde in K. phaffii erhöht, indem Kultivierungsbedingungen optimiert und Helferproteine identifiziert und co-produziert wurden. Neue Erkenntnisse bezüglich der Struktur-Funktion-Beziehungen der THCAS und CBDAS wurden gewonnen. Die Einflüsse der Glykosylierungsstellen, von Aminosäurereste in der Berberine-Bridge-Enzyme Domäne, sowie von Aminosäureresten in der aktiven Tasche auf die Enzymaktivitäten wurden untersucht. Dabei wurden wichtige Aminosäurereste für die Enzymaktivität identifiert und Enzymvarianten mit verbesserten katalytischen und Stabilitätseigenschaften erstellt. Weiterhin wurde ein erster Versuch unternommen, die letzten beiden Schritte der Cannabinoid Biosynthese in Hefen zu integrieren. Die simultane Produktion der löslichen Prenyltransferase NphB aus Streptomyces sp. Stamm CL190, welche die native transmembrane Prenyltransferase Cannabigerolsäure Synthase aus C. sativa ersetzt, mit der THCAS wurde etabliert. Dadurch wurde die Produktion von THC aus den Vorstufen Olivetolsäure und Geranyldiphosphat ermöglicht. Die hier präsentierten Studien tragen zu einem grundlegenden und speziell industriell relevanten Verständnis bei, um eine Entwicklung zur biotechnologischen Produktion von Cannabinoiden in Hefen voranzutreiben.