title: Untersuchungen zur Interaktion des Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) mit p15 und Identifizierung eines potenten peptidischen Inhibitors
Creators: name: Hardebeck, Sarah
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2024
Subjects: subject: 540 Chemistry and allied sciences
subject: 610 Medicine and health

description: Die PCNA-p15-Interaktion ist ein vielversprechendes Target für die Krebstherapie. Zur Identifizierung peptidischer Inhibitoren dieser Interaktion wurde ein Peptidbibliotheksscreening durchgeführt. Dazu wurde eine Peptidbibliothek mit 12 randomisierten Aminosäuren mittels Autodisplay an der Oberfläche von E. coli Zellen präsentiert. Durch das Bibliotheksscreening wurde der peptidische Inhibitor P3 (TCPLRWITHDHP) identifiziert, der PCNA mit einer Dissoziationskonstanten von 0,62 µM bindet und die PCNA-p15(51-70)-Interaktion mit einem IC50-Wert von 16,2 µM inhibiert. 
Die PCNA-Variante C148S ist mit der Erkrankung ataxia-telangiectasia-like disorder type 2 (ATLD2) assoziiert. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der C148S-Mutation auf die Funktion von PCNA untersucht. Dabei wurde kein Effekt der C148S-Mutation auf die Interaktion von PCNA mit p15 festgestellt. Jedoch konnte ein negativer Effekt der C148S-Mutation auf die Stabilität von PCNA nachgewiesen werden.
description: Inhaltsverzeichnis ..... 1
Zusammenfassung ..... 1
Summary ..... 3
I. Einleitung ..... 4
1. Protein-Protein-Interaktionen als therapeutisches Target ..... 4
2. Screening von an der Oberfläche präsentierten Bibliotheken ..... 5
3. Autodisplay ..... 6
4. Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) ..... 9
4.1. Aufbau und Funktion ..... 9
4.2. Therapeutische Relevanz ..... 11
5. Die PCNA-p15-Interaktion ..... 14
6. Zielsetzung ..... 17
II. Material und Methoden ..... 18
1. Materialien ..... 18
1.1. Geräte ..... 18
1.2. Verbrauchsmaterialien ..... 19
1.3. Chemikalien ..... 20
1.4. Bakterienstämme ..... 22
1.5. Plasmide ..... 22
1.6. Oligonukleotide ..... 24
1.7. Proteine ..... 26
1.8. Peptide ..... 27
1.9. Nährmedien ..... 27
1.10. Puffer und Lösungen ..... 28
1.11. Reagenziensätze ..... 28
1.12. Software ..... 29
2. Methoden ..... 29
2.1. Molekularbiologische Methoden ..... 29
2.2. Arbeiten mit E. coli Zellen ..... 34
2.3. Arbeiten mit Proteinen ..... 37
2.4. In silico Methoden ..... 45
III. Ergebnisse ..... 48
1. Entwicklung eines FRET-basierten Verfahrens für die Analyse der
PCNA-p15-Interaktion ..... 48
1.1. Cytosolische Expression und Reinigung von p15-mNeonGreen und
mScarlet-I-PCNA ..... 48
1.2. Analyse der PCNA-p15-Interaktion ..... 50
1.3. Untersuchungen der Inhibition der PCNA-p15-Interaktion ..... 52
2. Testung der inhibitorischen Aktivität von niedermolekularen Substanzen auf die
PCNA-p15-Interaktion ..... 54
2.1. Substanzen aus der Hausdatenbank ..... 54
2.2. Substanzen aus einem in silico molecular docking-Experiment ..... 58
3. Autodisplay-basiertes Bibliotheksscreening zur Identifizierung peptidischer Inhibitoren
der PCNA-p15-Interaktion ..... 62
3.1. Erstellung der Peptidbibliothek und der Bindekontrollen ..... 64
3.2. Überprüfung der Präsentation der Peptidbibliothek und der Bindekontrollen an der
Oberfläche von E. coli Zellen ..... 66
3.3. Anreicherung PCNA-bindender Peptidvarianten ..... 68
3.4. Analyse der P3-Affinität und seiner inhibitorischen Aktivität ..... 74
4. Untersuchung der Auswirkung der C148S-Mutation auf die Interaktionen und die
Stabilität von PCNA ..... 77
4.1. Analyse der PCNAC148S-p15-Interaktion durch die FRET-Methode ..... 78
4.2. Analyse der PCNA-Interaktion mit p15 und p21 in einem Autodisplay-basierten
Verfahren ..... 80
4.3. Alchemical free energy calculations zur Analyse der PCNA-Stabilität und der
PCNA-p15-Interaktion ..... 88
4.4. Untersuchung der chemischen und thermischen Stabilität ..... 91
4.5. Analyse der Trimerisierung und des Aggregationsverhaltens ..... 97
4.6. Inkubationszeitabhängige Untersuchung der PCNA-p15-Interaktion ..... 101
IV. Diskussion ..... 103
1. Entwicklung eines Förster resonance energy transfer-basierten Verfahrens zur Analyse
der PCNA-p15-Interaktion ..... 103
2. Inhibitionsscreening mit niedermolekularen Substanzen ..... 105
3. Autodisplay-basiertes Verfahren zur Analyse von PCNA-Interaktionen ..... 106
4. Erstellung und Screening von Autodisplay-basierte Peptidbibliotheken ..... 108
4.1. Erstellung der Peptidbibliothek ..... 108
4.2. Durchflusszytometrische Anreicherung PCNA-bindender Varianten ..... 109
4.3. Charakterisierung der identifizierten Peptidvarianten ..... 112
5. Auswirkungen der PCNAC148S-Variante ..... 114
5.1. Die C148S-Mutation reduziert die Stabilität von PCNA ..... 114
5.2. Zelluläre Auswirkungen der reduzierten Stabilität von PCNAC148S ..... 116
5.3. PCNA-Stabilisatoren als therapeutischer Ansatz für ATLD2 ..... 117
V. Literaturverzeichnis ..... 118
VI. Anhang ..... 135
1. Abkürzungsverzeichnis ..... 135
2. Aminosäuresequenzen ..... 137
2.1. Aminosäuresequenzen von den in dieser Arbeit gereinigten Proteinen ..... 137
2.2. Aminosäuresequenz von sfGFP ..... 139
2.3. Aminosäuresequenzen der Passagierdomänen von MATE-Plasmiden ..... 139
3. Plasmidkarten ..... 140
4. Ergänzende Abbildungen ..... 144
5. Ergänzende Tabellen ..... 150
6. Veröffentlichungen ..... 152
6.1. Zeitschriftenbeiträge ..... 152
6.2. Poster ..... 152
7. Kooperationen ..... 152