Katalysemechanismus und in vivo-Funktion der Poly(A)-spezifischen Ribonuklease (PARN)
Creators: name: Reuter, Michael
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2006
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 572.788

description: Der mRNA-Abbau wird durch die exonukleolytische Verkürzung des Poly(A)-Schwanzes eingeleitet. Die poly(A)-spezifische Exoribonuklease PARN gehört der DEDD-Superfamilie an. Die Enzyme dieser Gruppe sind durch vier stark konservierte Aminosäuren (DEDD) charakterisiert. Diese bilden das Aktive Zentrum und binden insgesamt zwei, für die Katalyse essentielle, divalente Kationen. PARN interagiert mit der Cap-Struktur. Die Bindung in cis stimuliert die katalytische Aktivität und bewirkt eine Umwandlung des distributiven in einen prozessiven Abbaumodus. Ein Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung wesentlicher struktureller Voraussetzungen für charakteristische enzymatische Eigenschaften von PARN, wie die Poly(A)-Spezifität, den Katalysemechanismus bzw. die Prozessivität. Die Analysen basierten dabei auf der Kristallstruktur einer C-terminal verkürzten Variante (PARNn) sowie auf der funktionellen Analyse verschiedener Punkt- und Deletionsmutanten des vollständigen Proteins. Ein weiteres wesentliches Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der in vivo-Funktion von PARN in somatischen Zellen. Der knock down des Proteins durch RNAi diente in diesem Zusammenhang als experimenteller Ansatz. Dabei wurde untersucht, ob die PARN-Depletion eine Änderung der Poly(A)-Längenverteilung, eine Verringerung der Deadenylierungsrate bzw. eine Zunahme der Stabilität verschiedener transient exprimierter oder endogener Transkripte bewirkte. Auf Grund der Akkumulation von PARN in den Nukleoli, was anhand einer GFP-Fusion sowie von Immunfluoreszenzanalysen demonstriert wurde, erfolgte eine weitergehende Untersuchung, inwieweit der knock down von PARN mit quantitativen oder quantitativen Effekten hinsichtlich verschiedener nucleär bzw. nucleolär lokalisierte RNA-Spezies, wie snRNAs, snoRNAs, rRNAs oder pri-miRNAs, korrelierte.
description: The decay of an mRNA starts with the exonucleolytic decay of their poly(A) tail. The poly(A)-specific exo-ribonuclease PARN belongs to the DEDD-superfamily of nucleases which is characterised by four highly conserved residues (DEDD). They constitute the active site and coordinativelly bind two divalent metal ions. PARN interacts with the Cap. Binding in cis activates the enzyme and changes the catalytic mode from distributive to processive. This thesis represents investigations concerning the structural prerequisites for characteristic enzymatic properties of PARN, such as poly(A) specificity, the catalytic mechanism and the processivity. The analysis based on the crystal structure of a C-terminal truncated variant of the protein (PARNn) and were performed by functional analysis of different point and deletion mutant proteins. Another aspect of this thesis was the characterisation of the in vivo function of PARN in somatic cells. The knock down of the protein in HeLa cells by RNAi served as an experimental base of these investigation It was analysed whether the depletion of PARN correlates with changes in the poly(A) tail length distribution, a reduced deadenylation rate or an increased stability of different transiently expressed or endogenous transcripts, respectively. Because of the nucleolar accumulation of PARN, which was shown by a GFP-fusion and immunofluorescence analysis, the investigations were expanded to qualitative or quantitative effects concerning different nuclear or nucleolar localised RNA species including snRNA, snoRNA, rRNA and pri-miRNA.