Ενίσχυση της εμφύτευσης, αιμοποιητικών κυττάρων διαμολυσμένων με λεντι-ιικούς φορείς αναφοράς, με ex vivo προεργασία με τον αναστολέα της διπεπτιδάσης CD26, Diprotin A:
Creators: name: Σγουραμάλη, Ελένη Γρηγορίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Γενετικά τροποποιημένα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα
Εμφύτευση
Διπεπτιδυλοπεπτιδάση ΙV, CD26
Genetically modified hematopoietic stem cells
Engraftment
Dipeptidylpeptidase IV, CD26

description: Η γονιδιακή θεραπεία ορίζεται ως η παρέμβαση στο γενετικό υλικό ενός οργανισμού με τη μεταφορά εξωγενούς DNA που αποσκοπεί στην επιδιόρθωση του φαινοτύπου. Τα τελευταία χρόνια, τα αποτελέσματα από κλινικές έρευνες γονιδιακής θεραπείας είναι ενθαρρυντικά, με τη γονιδιακή θεραπεία να θεωρείται ως μια πιθανή θεραπευτική επιλογή σε γενετικές ασθένειες, παρ’ όλα αυτά υπάρχουν ακόμη εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν για επίτευξη επιτυχούς γονιδιακής θεραπείας. Απαραίτητη προϋπόθεση της γενετικής τροποποίησης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων με λεντι-ιικούς φορείς είναι η ex vivo ενεργοποίησή τους σε καλλιέργεια παρουσία διαφόρων κυτοκινών. Η ενεργοποίηση αυτή επιφέρει αλλοιώσεις σε διάφορα μόρια προσκόλλησης (CAMs), θέτει τα κύτταρα σε κυτταρικό κύκλο και αυξάνει την τάση των κυττάρων για απόπτωση, με αποτέλεσμα να παρατηρείται μειωμένη ικανότητα εγκατάστασης και κατ’ επέκταση εμφύτευσης στο δέκτη, έπειτα από μεταμόσχευση. Το τριπεπτίδιο Diprotin A αποτελεί έναν ειδικό αναστολέα της διπεπτιδάσης CD26, η οποία είναι γνωστό πως φέρει ικανότητα διάσπασης του χημειοτακτικού παράγοντα SDF-1, ρυθμίζοντας κατά αυτό τον τρόπο την παλιννόστηση των κυττάρων στο μυελό των οστών. Έχει ήδη αποδειχθεί πως προεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα Diprotin A μπορεί να οδηγήσει στην ενίσχυση της εμφύτευσης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων μετά από μεταμόσχευση Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η δράση του αναστολέα στην ενίσχυση της εμφύτευσης διαμολυσμένων με λεντι-ιικούς φορείς, HSCs και τον έλεγχο τους στην έκφραση του επιθυμητού διαγονιδίου (φθορίζουσα πρωτεΐνη GFP). Παρατηρήθηκε λοιπόν, πως κύτταρα τα οποία είχαν προεργαστεί με τον αναστολέα οδηγήθηκαν σε σημαντικά αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα, σε πειράματα που διενεργήθηκαν in vitro με συστήματα transwell. Στα in vivo πειράματα που διενεργήθηκαν οδήγησαν στο συμπέρασμα πως ο αναστολέας οδηγεί σε άμεση και σημαντική αύξηση της εμφύτευσης διατηρώντας τις υψηλές τιμές που παρατηρήθηκαν καθ’ όλη τη διάρκεια της έρευνας. Η αυξημένη μεταναστευτική ικανότητα αλλά και η ικανότητα εμφύτευσης που παρατηρήθηκε οφείλεται πιθανόν σε σημαντική αύξηση της περιεκτικότητας του μυελού των οστών σε προγονικά κύτταρα (LKs) μετά από in vivo χορήγηση του αναστολέα καθώς επίσης και σε αυξημένη ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων. Υποστηρίζοντας την άποψη πως ο αναστολέας ενισχύει την επιβίωση και την αυτό-ανανεωτική ικανότητα των HSCs και προγονικών κυττάρων. Η αυξημένη ικανότητα έκφρασης του διαγονιδίου GFP μετά από επίδραση του αναστολέα πιθανόν οφείλεται στην αυξημένη περιεκτικότητα (διαμολυσμένων) στελεχιαίων και προγονικών κύτταρων μετά την επίδραση του Diprotin-A , λόγω της ενίσχυσης της επιβίωσης και αυτοανεωτικής ικανότητάς τους παρά σε άμεση ενισχυτική δράση του αναστολέα στη διαδικασία της διαμόλυνσης Ο αναστολέας Diprotin A αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για την ενίσχυση ενός μικρού αριθμού διαμολυσμένων κυττάρων (με αυξημένη περιεκτικότητα σε προγονικά κύτταρα), ικανά να επανα-αποικίσουν το μυελό των οστών μετά από κατάλληλο χημειοθεραπευτικό σχήμα, και να οδηγήσουν σε αυξημένη έκφραση του επιθυμητού διαγονιδίου.
description: Genetic modification of autologous HSCs has the potential to be used for the treatment of several inborn errors and for manipulation of immune responses without the need for allogeneic bone marrow transplantation which can cause immunoincompetence and graft versus host disease. Inefficient gene transfer typically results in transplantation of a small number of genetically modified HSCs which have to compete with a greater number of unmodified HSCs for bone marrow niches in order to undergo engraftment. Efforts to improve engraftment could provide a means to increase the ability of modified HSCs to engraft, leading to development of a greater frequency of cells expressing transduced genes of interest. Enhancing engraftment of genetically modified HSCs is therefore an important part of improving HSC gene therapy. CD26 (DPPIV/dipeptidylpeptidase IV) is a membrane associated dipeptidase expressed on the surface of a variety of cells including HSCs. CD26 cleaves dipeptides from the N-terminus of proteins, including the chemoattractant CXCL12 (SDF-1a). Signaling through CXCR4 following CXCL12 binding is critically involved in controlling trafficking and homing of HSCs to their bone marrow niches. CD26 plays a critical role in homing of HSCs to their bone marrow niche. We investigate the inhibition of CD26 activity on lenti-viral transduced bone marrow HSCs, using the tri-peptide Diprotin A (Ile-Pro- Ile), a specific inhibitor of CD26. We show that treatment of lenti-viral transduced bone marrow cells with Diprotin A, enhance the capacity of migration in vitro. Treatment of lenti-viral transduced bone marrow cells with Diprotin A prior to transplantation significantly improved the efficiency at which limiting numbers of bone marrow cells expressing a lenti-viral transduced GFP gene engrafted in recipients The increase of migration capacity and the engraftment that was observed was caused by a significant increase of the content of progenitor cells (LKs) into the bone marrow as well as the increase of the capacity for differentiation of the cells, after in vivo administration of the inhibitor. Supporting that the inhibitor enhances survival and self -renewing capacity of HSCs and progenitor cells. We also show that Treatment of lenti-viral transduced bone marrow cells with Diprotin A increase the capacity of GFP transgene expression probably due to the increased content (transfected) stem and progenitor cells, despite their ability to direct effect of the inhibitor at the process of transfection. The inhibitor Diprotin A is an important tool to support a small number of transfected cells (with increased content of progenitor cells ) able to re - colonize the bone marrow after appropriate chemotherapy, and lead to increased expression of the transgene.