Μελέτη βλαστοκυττάρων από λίπος κουνελιού (New Zealand) με δυνατότητα αντιστροφής
Creators: name: Σιμερίδης, Ευστάθιος Παναγιώτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Βλαστοκύτταρα
Ηλικιακή αντιστροφή κυττάρων
Κυτταρική γήρανση
Stem cells
Cell age reversal
Cellular aging

description: Σκοπός αυτής της διπλωματικής εργασίας είναι, αρχικά, να περιγράψει την ιδέα πάνω στην οποία βασιστήκαμε προκειμένου να κάνουμε την διπλωματική εργασία με θέμα την δυνατότητα των βλαστοκυττάρων να αντιστραφούν ηλικιακά. Επιπλέον, τον τρόπο με τον οποίο θέλουμε να εργαστούμε πάνω στο θέμα της ηλικιακής αντιστροφής των κυττάρων με χρήση των παραγόντων yamanaka ή ακόμη και με χρήση χημικών μορίων ανάλογων των παραγόντων yamanaka και στην συνέχεια να μελετηθούν η πιθανές δυνατότητες αυτών των κυττάρων, όπως η επουλωτική τους δυναμική, η αναγεννητική τους ικανότητα, αλλά και πως αυτά μπορούν να εφαρμοστούν στην αντιγήρανση. Για τον σκοπό αυτό, αρχικά, πήραμε λίπος από κουνέλι New zeland, ηλικίας 5 μηνών, αρσενικό και βάρους 5,23 Kgr. Από το λίπος αυτό απομονώσαμε μεσεγχυματικά βλαστοκύτταρα. Στην συνέχεια χρησιμοποιείται το πλασμίδιο lenti (TET – OSKM) για tet – επαγώμενη έκφραση των Oct4 / Sox2 / Klf4 / Myc, το οποίο θα επιμολυνθεί μαζί με τα πλασμίδια PsPax2 και pMD2.G σε HEK293T κύτταρα προκειμένου να δημιουργηθούν λεντι-ιικά σωμάτια. Τα λεντιϊκά σωμάτια θα χρησιμοποιηθούν για να μολυνθούν τα κύτταρα που μας ενδιαφέρουν ώστε να εκφραστούν τα Oct4/Sox2/Klf4/Myc. Από το εργαστήριο του Κου Χατζηστέργου μας δόθηκαν βακτήρια Stabl3 για το κάθε πλασμίδιο ξεχωριστά, για την έκφραση των παραγόντων yamanaka παρουσία τετρακυκλίνης. Στη συνέχεια, τα βακτήρια θα πρέπει αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια παρουσία αμπικιλλίνης, απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA από το κάθε ένα εκ των 3 πλασμιδίων και επιμολύνθηκαν τα HEK293T. Τα κύτταρα HEK 293T επιμολύνονται για την δημιουργία lent – ιικών σωματίων για έκφραση των Oct4 / Sox2 / Klf4 / Myc. Με τον τρόπο αυτό φτάνουμε να έχουμε βλαστικά κύτταρα που έχουν την δυνατότητα ηλικιακής αντιστροφής. Η δυνατότητα που έχουμε να επαναπρογραμματίσουμε κύτταρα από ενήλικα άτομα πηγαίνοντάς τα πίσω στην κατάσταση της πολυδυναμίας, αποτελεί μία πρόκληση και ένα σημαντικό εργαλείο στην θεραπεία. Αυτή η δυνατότητα, πέραν από την μοντελοποίηση διαφόρων ασθενειών που σχετίζονται με το γήρας, δίνει επίσης και την δυνατότητα να μελετήσουμε την κυτταρική γήρανση σε πραγματικό χρόνο και άρα και την δυνατή αναζωογόνηση των κυττάρων. Οι παραπάνω δυνατότητες μας θέτουν ερωτήματα προς μελέτη. Μπορούμε να επαναπρογραμματίσουμε κύτταρα πηγαίνοντας τα πίσω στον χρόνο; Δηλαδή να επαναπρογραμματίσουμε την κυτταρική ηλικία. Μπορούμε να έχουμε για παράδειγμα καρδιακά κύτταρα 50 ετών που να τα πάμε πίσω στον χρόνο και να τα κάνουμε 30 ετών ; Ή αντίστοιχα άλλων οργάνων, εγκεφάλου, πάγκρεας, νευρώνες κ.α. Στο πλαίσιο του μεταπτυχιακού δεν εξαντλήσαμε όλη την αρχική ιδέα αλλά φτάσαμε σε εργαστηριακό επίπεδο μέχρι την απομόνωση των βλαστοκυττάρων με δυνατότητα αντιστροφής της ηλικίας, ενώ το υπόλοιπο κομμάτι προσεγγίστηκε βιβλιογραφικά.
description: The purpose of this thesis is, initially, to describe the idea on which we were based in order to do the thesis on the possibility of stem cells to reverse age. In addition, the way we want to work on the topic of cell age reversal using yamanaka factors or even using chemical molecules similar to yamanaka factors and then to study the possible potential of these cells, such as their healing dynamics, their regenerative capacity, but also how these can be applied to antiaging. For this purpose, initially, we took fat from a New Zealand rabbit, aged 5 months, male and weighing 5.23 Kgr. From this fat we isolated mesenchymal stem cells. The lenti plasmid (TET – OSKM) is then used for tet - induced expression of Oct4 / Sox2 / Klf4 / Myc, which will be co-transfected with the PsPax2 and pMD2.G plasmids into HEK293T cells in order to generate lentiviral bodies. Lentils will be used to infect cells of interest to express Oct4/Sox2/Klf4/Myc. From the prof. Hadjistergos laboratory, we were given Stabl3 bacteria for each plasmid separately, for the expression of the yamanaka factors in the presence of tetracycline. Bacteria were then grown in liquid culture in the presence of ampicillin, plasmid DNA was isolated from each of the 3 plasmids, and HEK293Ts were transfected. HEK 293T cells are transfected to generate lentiviral particles for expression of Oct4 / Sox2 / Klf4 / Myc. In this way we end up with stem cells that have the possibility of age reversal. The possibility that we have to reprogram cells from adult individuals, taking them back to the state of pluripotency, is a challenge and an important tool in therapy. This capability, in addition to modeling various age-related diseases, also gives the possibility to study cellular aging in real time and therefore the possible rejuvenation of cells. The above possibilities pose questions for us to study. Can we reprogram cells by going back in time? That is, to reprogram the cellular age. Can we have, for example, 50-year-old heart cells that we can go back in time and make them 30 years old? Or correspondingly of other organs, brain, pancreas, neurons etc. In the context of the master's degree, we did not exhaust the entire original idea, but reached a laboratory level until the isolation of age-reversible stem cells, while the remaining part was approached from the literature.