Molekulare und genetische Charakterisierung eines Cyclophilin B-Homologen aus Drosophila melanogaster
Creators: name: Reißmann, Jana
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2001
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Zsfassung in engl. Sprache

description: PPIasen katalysieren die cis/trans Isomerisierung von Xaa-Pro-Peptidbindungen. Es gibt verschiedene Vertreter dieser Enzymklasse, die entsprechend ihrer Bindung an immunsuppressive Inhibitoren eingeteilt werden. Diese ubiquitär vorkommenden Enzyme sind in der Lage, die sehr langsam verlaufende Reaktion mit hoher Effizienz zu beschleunigen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die genetische und molekulare Charkterisierung eines bisher unbekannten Vertreters dieser Enzymklasse, dem Cyclophilin B-Homologen aus Drosophila melanogaster. Um Cyclophiline während der Entwicklung von D. melanogaster zu charakterisieren, wurde eine CsA-Affinitäts-Säule präpariert mit der drei CsA Bindungspartner isoliert werden konnten. Mittels MALDI-TOF-Massenspektroskopie konnte das Cyclophilin mit einer Masse von 20.3 kDa als Cyclophilin B Homologes aus D. melanogaster identifiziert werden. Das Gen, welches für dieses Cyclophilin codiert, ist auf dem 2. Chromosom in Region 2R58F2-3 lokalisiert und besteht aus drei Exonen und zwei Intronen. Zur Charakterisierung der biologischen Relevanz des Cyclophilins wurde eine EP-Element Insertion genutzt. Der Insertionsort des EP-Elementes befindet sich im Promotorbereich des Cyclophilin-Gens genau 66 Basenpaare vom Translationsstart des Cyclophilins entfernt. Durch diese Insertion wird eine hypomorphe Mutation ausgelöst, die zu einer Verringerung des CypB Transkriptes als auch zu einer Verringerung des CypB Genproduktes führt. Im Verlauf eines Reversionsexperimentes wurden 700.000 Fliegen auf Verlust des EP-Elementes untersucht. Dieses Experiment führte zur Herstellung einer Nullmutante für das Cyclophilin-Gen. Infolge der Remobilisierung des EP-Elementes entstand eine Deletion, die mit einer Länge von 287 bp das erste Exon und erste Intron des Cyclophilin-Gens betrifft. Die Deletion führt in Drosophila melanogaster zu rezessiver Letalität. Die Expression des untersuchten Cyclophilin B Homologen unterliegt einer starken mütterlichen Kontrolle. Damit gelang eine wichtige Aussage zur Funktion dieser cis/trans Isomerase in vivo. Diese essentielle Funktion wurde für ein Cyclophilin erstmals beschrieben.
description: PPIases are able to catalyze the cis/trans Isomerization of Xaa-Pro-peptidebonds. There are several families of PPIases, which are devided in order to their binding to immunsuppressive inhibitors. In vitro, these enzymes accelerate the rate-limiting cis/trans PPIase steps in the folding pathway of peptide and protein substrates. In this work the genetic and molecular characterization of an unknown PPIase, a Cyclophiline B-homologue from Drosophila melanogaster is described. To characterize Cyclophilins during the development of D. melanogaster a CsA-affinity column was prepared. Three Cyclophilins were detected in embryonic homogenates. Using MALDI-mass spectroscopy one enzyme was characterized as Cyp 20.3. The Cyp 20.3 belongs to the Cyp B subfamily. The gene coding for that Cyclophiline is localized on the second chromosome in region 2R58F2-3 and consists of three exons and two introns. To characterize the in vivo function of the Cyclophiline an EP-element-insertion was used. The element is localized in the promotor-region of the Cyclophiline gene, 66 bp from the translational start. This insertion leads to a hypomorphic mutation, so that the amount of CypB transcript and CypB geneproduct is strongly decreased. To create a null-mutant in the Cyclophiline B gene reversion of this insertion was used. For about 700.000 flies were screened for the lost of the EP-Element. After molecular characterization a 287 bp Deletion was isolated leading to rezessive lethality. The expression of the Cyclophiline B homologue has a strong maternal component. The essential function of this PPIase in vivo was firstly described.