title: Structural and functional characterization of epithelial adhesines of Candida glabrata
title: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der epithelialen Adhäsine aus Candida glabrata
Creators: name: Diderrich, Rike
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Adhesine
Candida glabrata
Biowissenschaften, Biologie
Adhäsine

description: Der humanpathogene Pilz Candida
      glabrata ist ein opportunistischer Erreger, der bevorzugt die
      Schleimhäute von Säugetieren besiedelt. C. glabrata ist für
      etwa 15 % der Blutstrominfektionen bei Menschen
      verantwortlich und verursacht besonders bei
      immunsupprimierten Patienten schwere Infektionsverläufe.
      Wichtige Virulenzfaktoren von C. glabrata sind die
      epithelialen Adhäsine (Epa-Proteine), von denen der Pilz je
      nach Stamm bis zu 23 verschiedene Mitglieder besitzt und die
      für die erfolgreiche Kolonisierung des Wirtes entscheidend
      sind. Die Epa-Proteine sind mit den Flokkulinen der
      Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae verwandt und gehören zu
      den Glycosylphosphatidylinositol-verankerten
      Zellwandproteinen (GPI-CWP). Sie besitzen eine typische,
      dreigeteilte Domänenstruktur, bei der die N-terminale
      A-Domäne für die Vermittlung der Adhäsion verantwortlich ist,
      die anschließende B-Domäne als Träger der A-Domäne fungiert
      und die C-terminale C-Domäne für die GPI-Verankerung in der
      Zellwand verantwortlich ist. Bisherige Untersuchungen an
      einigen Mitgliedern der Epa-Familie haben gezeigt, dass diese
      Adhäsine als Lektine fungieren und bestimmte Glykane auf der
      Oberfläche von Epithelzellen spezifisch erkennen und binden.
      Um die Struktur und Funktion der gesamten Epa-Protein-Familie
      im Detail zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit alle 17
      EpaA-Domänen des C. glabrata Stammes CBS138 heterolog
      hergestellt und aufgereinigt. Anschließend wurden
      Ligandenbindungsspezifitätsprofile aller 17 EpaA-Domänen über
      Glycan Array Screening ermittelt, wobei sich ergab, dass etwa
      2/3 der Epa-Proteine Galactoside bevorzugen. Weiterhin wurden
      die exakten Bindungsstärken bestimmter EpaA-Domänen zu
      ausgewählten Glykan-Liganden ermittelt, die im niedrigen
      mikromolaren Bereich liegen. Ebenso gelang auch die
      Strukturlösung von Epa6A und Epa9A mit verschiedenen
      Liganden. Dadurch konnten sowohl konservierte als auch
      variable Aminosäurereste identifiziert werden, die für die
      Affinität und Spezifität wichtig sind und die anschließend
      über gezielte Mutagenese genauer untersucht wurden.Um die
      Funktion der EpaA-Domänen auch systematisch in vivo zu
      untersuchen und mit den biochemische Ergebnissen zu
      vergleichen, wurden 15 der EpaA-Domänen in einem heterologen
      Expressionssystem einzeln an die Zelloberfläche von S.
      cerevisiae gebracht und deren Fähigkeit zur
      Adhäsionsvermittlung an menschliche Epithelzellen und
      abiotische Oberflächen bestimmt. Zusammenfassend gibt diese
      Arbeit einen detaillierten Einblick in die Struktur und
      Funktion einer kompletten Multiprotein-Familie, wobei die
      präzise Charakterisierung der Ligandenbindungsstellen von
      besonderem Interesse ist, da diese für die Pathogenität von
      C. glabrata entscheidend sind und als mögliche Ziele für die
      zukünftige Entwicklung dringend benötigter, neuer
      Antimykotika in Frage kommen.
description: The human pathogenic fungus
      Candida glabrata is an opportunistic pathogen that
      preferentially colonizes the mucosa of mammals. C. glabrata
      is responsible for about 15 % of blood stream infections in
      humans and causes particularly serious infections in
      immunocompromised patients. Important virulence factors of C.
      glabrata are the epithelial adhesins (Epa proteins) that are
      crucial for the successful colonization of the host.
      Depending on the strain background, certain fungal strains
      express up to 23 different members of this protein family.
      Epa proteins are related to the flocculins in the baker's
      yeast Saccharomyces cerevisiae and belong to the group of
      glycosylphosphatidylinositol-anchored cell wall proteins
      (GPI-CWP). They have a typical three-part domain structure in
      which the N-terminal A domain is responsible for mediating
      the adhesion, followed by the B domain, which acts as a
      carrier of the A domain and the C-terminal C domain, which
      cross-links the adhesin covalently to the cell wall. Previous
      studies on some members of the Epa family have shown that
      these adhesins are lectins that identify and specifically
      bind certain glycans on the surface of epithelial cells. To
      investigate the structure and function of the entire Epa
      protein family in detail, all 17 EpaA domains of C. glabrata
      strain CBS138 were heterologously produced and purified in
      this work. Subsequently, the ligand binding specificity
      patterns of all 17 EpaA domains were determined by glycan
      array screening, which revealed that about 2/3 of the Epa
      proteins prefer galactosides as binding partners. Moreover,
      the exact binding strengths of certain EpaA domains to
      selected glycan ligands were determined, which were in a
      micromolar range. Furthermore the protein structure of Epa6A
      and Epa9A with various ligands has been resolved. Thereby it
      was possible to identify both conserved and variable amino
      acid residues that are important for the binding affinity and
      specificity, and which were then investigated in more detail
      by means of targeted mutagenesis. In order to systematically
      investigate the function of the EpaA domains in vivo and to
      compare them with the biochemical results, 15 of the 17 EpaA
      domains were analyzed in a heterologous expression system, in
      which each one of the proteins were targeted to the cell
      surface of S. cerevisiae, so their ability to mediate
      adhesion to human epithelial cells and abiotic surfaces could
      be determined. In summary this work gives a detailed insight
      into the structure and function of a complete multi- protein
      family. Thereby the precise characterization of ligand
      binding sites is of particular interest, since these are
      critical for the pathogenicity of C. glabrata and are
      potential targets for future development of urgently needed,
      new antifungal agents.