title: The role of SCAMP proteins during intracellular transport of potassium channel TASK-1
title: Die Rolle von SCAMP Proteinen beim intrazellulären Transport des Kaliumkanals TASK-1
Creators: name: Kling, Stefan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: endocytosis
K2P channels
Kaliumkanal
TASK-1
TASK-1 , K2P-Kanäle
SCAMP
Endocytose
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: TASK-1 (TWIK-related
      acid-sensitive K+ channel 1) is an acid-sensitive K+ channel.
      It belongs to the family of two-pore domain K+ (K2P)
      channels, which are involved in array of physiological and
      pathophysiological processes. TASK-1 is widely distributed,
      being particularly abundant in the pancreas and placenta, but
      it is also found in the brain, heart, lung and kidney. The
      intracellular traffic of TASK-1 has been studied in some
      detail but relatively little is known about the endocytosis
      of TASK-1. The channel expression at the cell surface is
      regulated by both forward trafficking and endocytosis
      mechanisms. We have tried here to elucidate the functional
      relevance of the interaction between the potassium channel
      and the SCAMPs. We performed a split-ubiquitin based yeast
      two-hybrid screen with a brain cDNA library using TASK-1 as
      bait and identified Secretory Carrier Membrane Protein 5
      (SCAMP5) as an interaction partner. Structurally, all SCAMPs
      contain a highly conserved four hydrophobic transmembrane
      domains (TMDs) with three inter-TMD-flanking sequences. The
      hydrophilic loop between transmembrane domain 2 and 3, known
      as the E-peptide, shows the highest degree of sequence
      conservation. The cytoplasmic N- and C-termini, flanking the
      SCAMP domain, have variable length and highest diversity. Of
      all SCAMP isoforms, SCAMP4 and SCAMP5 are the only isoforms
      that lack the N-terminal NPF-repeat domains. SCAMP5 is mainly
      expressed in neural tissues, whereas the other members of
      SCAMP family are ubiquitously expressed. Expression of TASK-1
      in Xenopus oocytes gave rise to an acid-sensitive outward
      current. The amplitude of this current was reduced to about
      50 % when TASK-1 was co-expressed with SCAMP5. A similar
      reduction of current amplitude was observed after
      co-expression of the channel with SCAMP1 and SCAMP2. Deletion
      of the (NPF) domains in the amino terminus of SCAMP1 and 2
      proteins abolished the effects of SCAMP1 and SCAMP2 on the
      endocytosis of TASK-1. When we co-expressed the C-terminal
      part of the adaptor protein AP180 (AP180C) the effect of
      SCAMPs on the amplitude of TASK-1 currents was abolished. A
      similar effect was also observed by Dynasore, a specific
      blocker for dynamin dependant endocytosis. An antibody uptake
      assay performed in COS7 cells (where only SCAMP1 and 2 are
      moderately expressed but SCAMP5 is not expressed) showed a
      substantially reduced surface expression of TASK-1 after
      co-expression of SCAMP5. Fluorescence microscopy showed a
      clear co-localisation of TASK-1 and SCAMP5 at the cell
      surface. Additional biochemical interaction studies like
      His-tag pull-down assay showed that SCAMP5 can form homo and
      heteromers with SCAMP1 and SCAMP2. Our data suggests that
      SCAMP1 and SCAMP2 can exert their effect on TASK-1 via
      SCAMP5, where SCAMP5 plays a role as an adaptor protein.
      Taken together, these results strongly indicate that the
      secretory carrier membrane proteins play a crucial role in
      clathrin mediated endocytosis of TASK-1 via NPF
      domains.
description: TASK-1 (TWIK-related Acid-Sensitive
      K+ channel 1) ist ein säuresensitiver K+ Kanal und gehört zu
      der Familie der K2P-Kanäle (Kaliumkanäle mit zwei
      Porendomänen). TASK-1 wird in Neuronen, Herzmuskelzellen,
      glatten Muskelzellen und zahlreichen anderen Zellen
      exprimiert. In diesen Zellen besitzt TASK-1 eine wichtige
      Rolle bei der Regulation ihrer Erregbarkeit. Sowohl die
      transkriptionelle als auch die posttranslationale Regulation
      von TASK-1 bestimmen die Anzahl der Kanäle auf der
      Zellmembran und damit direkt den durch TASK-1 vermittelten
      Strom. Die Regulation der Oberflächenexpression von TASK-1
      hat demnach direkten Einfluss auf die elektrophysiologischen
      Eigenschaften einer Zelle. Die Menge eines Membranproteins an
      der Zelloberfläche wird im Wesentlichen von zwei Faktoren
      bestimmt: (1) von dem Vorwärtstransport und (2) von der
      Endozytose der Zellmembran. Der Vorwärtstransport („forward
      trafficking“) bezeichnet den Transport von
      Transmembranproteinen vom rauen endoplasmatischen Retikulum
      (rER) zum Golgi-Komplex und weiter zur Zellmembran. Die
      Aufnahme von Proteinen aus der Zellmembran ins Zellinnere
      wird Endozytose genannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein
      Split-Ubiquitin basierter Hefe-Zwei-Hybrid-Screen mit einer
      cDNS-Bibliothek aus dem Gehirn durchgeführt, wobei TASK-1 als
      „Köder“-Protein verwendet wurde. Wir identifizierten
      Secretory Carrier Membrane Protein 5 (SCAMP5) als neuen
      Interaktionspartner („Beute“) für TASK-1. Dieses Protein,
      SCAMP5, gehört zur Familie der „Secretory Carrier Membrane
      Proteins“. Die strukturellen Gemeinsamkeiten der Proteine
      dieser Familie sind die vier Transmembran-Domänen (TMD), ein
      E-Peptid und eine Prolin reiche Sequenz im N Terminus. Die
      Mitglieder SCAMP1, SCAMP2 und SCAMP3 besitzen in ihrem N
      Terminus drei NPF-Domänen. Die NPF-Domänen bestehen aus den
      Aminosäuren Asparagin-Prolin-Phenylalanin und sind in der
      Lage an EH-Domänen (Epsin Homologe Domänen) zu binden,
      während SCAMP4 und SCAMP5 nur einen kurzen N-Terminus
      besitzen, der keine NPF-Domänen enthält. SCAMP5 wird
      vorwiegend im neuronalen Gewebe exprimiert, im Gegensatz dazu
      zeichnen sich die anderen Mitglieder der Familie durch eine
      ubiquitäre Expression aus. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe
      elektrophysiologischer Messungen gezeigt, dass bei
      Koexpression von TASK-1 mit SCAMP5, SCAMP1 oder SCAMP2 der
      durch TASK-1 Kanäle fließende Strom deutlich reduziert wird.
      Die Oberflächenexpression von TASK-1 wurde mittels eines auf
      der extrazellulären Seite zugänglichen Hämagglutinin-Motivs
      (HA-Tag) durch einen luminometrischen Oberflächenassay
      gemessen. Es zeigte sich, dass bei einer Koexpression der
      SCAMPs mit TASK 1 die Anzahl der Kanäle auf der Zellmembran
      deutlich reduziert wird. Die Entfernung der NPF-Domänen im
      N-Terminus von SCAMP1 und SCAMP2 führen zu einer deutlichen
      Erhöhung des TASK-1 induzierten Stroms sowie zu einer
      erhöhten Oberflächenexpression der Kanäle im Vergleich zur
      Koexpression mit den Wildtypen von SCAMP1 oder SCAMP2. Die
      Clathrin-vermittelte Endozytose wurde gezielt inhibiert um zu
      zeigen, dass die Verringerung der Oberflächenexpression auf
      eine erhöhte Endozytoserate zurückzuführen ist. Sowohl der
      chemische Blocker Dynasore als auch die Koexpression des
      dominant-negativen Adapterproteins AP180C konnten den Effekt
      der SCAMP Proteine auf den TASK-1 induzierten Strom in
      Oozyten aufheben. Interessanterweise konnte mit der
      Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine direkte Interaktion
      ausschließlich zwischen TASK-1 und SCAMP5, aber nicht
      zwischen TASK-1 und SCAMP1 und auch nicht zwischen TASK-1 und
      SCAMP2 nachgewiesen werden. In der Fluoreszenzmikroskopie
      zeigte sich, dass eine Kolokalisation an der Zellmembran nur
      zwischen TASK-1 und SCAMP5 stattfand. Die direkte
      Quantifizierung der Endozytoserate erfolgte mit dem
      Antikörper-Aufnahme-Assay. Nach 30 min wurde eine
      signifikante Internalisierung von TASK-1 bei Kotransfektion
      mit SCAMP5 beobachtet, jedoch nicht nach einer Kotransfektion
      mit SCAMP1 oder SCAMP2. Proteinbiochemische Analysen
      (Histidin Pull-Down Assay) zeigten, dass SCAMP5 sowohl
      Homomere (wahrscheinlich Homodimere) als auch Heteromere mit
      SCAMP1 oder SCAMP2 bilden kann. Aus diesen Ergebnissen lässt
      sich ableiten, dass SCAMP1 und SCAMP2 nur indirekt über das
      Adapterprotein SCAMP5 einen Effekt auf TASK-1 ausüben. Die
      vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Secretory Carrier
      Membrane Proteine eine entscheidende Rolle bei der
      Clathrinvermittelten Endozytose von TASK-1 spielen.