Μελέτη ηλεκτρικής σηματοδότησης των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση οπτικών καταγραφών
Creators: name: Μωυσίδου Τσιόρβα, Πολυξένη Σωτηρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Δυναμικό Μεμβράνης
Οπτικές Καταγραφές
Τασεο-ευαίσθητες φθορίζουσες χρωστικές
Membrane Potential
Optical Recordings
Voltage Sensitive Dyes

description: Τα καρκινικά κύτταρα της πλειοψηφίας των όγκων χαρακτηρίζονται από υπερέκφραση ιοντικών διαύλων στην πλασματική τους μεμβράνη. Οι ιοντικοί δίαυλοι συμμετέχουν στη δημιουργία του μεμβρανικού δυναμικού (Vm) οι μεταβολές του οποίου είναι άμεσα συνδεδεμένες με τη ρύθμιση κυτταρικών διεργασιών, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Έχει επίσης παρατηρηθεί πως το Vm μεταβάλλεται κατά την ενεργοποίηση υποδοχέων από μιτογόνα ερεθίσματα. Σκοπός της παρούσας εργασίας, είναι η μελέτη της μεταβολής του ηλεκτρικού δυναμικού της πλασματικής, της ενδοπλασματικής και της εξωτερικής πυρηνικής μεμβράνης, σε άθικτα κύτταρα καρκινικής σειράς με τεχνικές οπτικών καταγραφών. Ειδικότερα, για την καταγραφή των ηλεκτρικών φαινομένων διενεργήθηκαν πειράματα με τη χρήση της τασεο-ευαίσθητης χρωστικής (Voltage Sensitive Dye, VSD) di-8-ANEPPS και ακολούθησε διέγερση πεδίου με τετραγωνικό παλμό πλάτους 40mV και διάρκειας 100ms. Aκολούθησαν φαρμακολογικοί χειρισμοί με τη χρήση Καρβενοξολόνης (Carbenoxolone, CBX) και 4-αμινοπυριδινης (4-Aminopyridine, 4-AP) και στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Πραγματοποιήθηκε καταγραφή οπτικών σημάτων και μέτρηση του λόγου της μεταβολής του φθορισμού προς τον φθορισμό υποβάθρου %ΔF/F. Οι πληθυσμοί των κυττάρων διαχωρίσθηκαν σε εκπολωμένα και υπερπολωμένα κύτταρα, γεγονός που φαίνεται να επηρεάζεται από τη θέση των ηλεκτροδίων στη διάταξη διέγερσης πεδίου. Η επώαση με 4-ΑΡ φαίνεται να καταστέλλει την παραγωγή ηλεκτρικής δραστηριότητας, πιθανώς λόγω αναστολής των τασεο-ευαίσθητων καναλιών καλίου. Αντίστοιχα, η προσθήκη CBX οδηγεί σε μείωση του οπτικού σήματος γεγονός που υποδηλώνει πως οι χασμοσύνδεσμοι επιδρούν σημαντικά στη διακυτταρική μεταβίβαση ενός βιοηλεκτρικού σήματος.
description: Cancer cells generally exhibit a depolarized phenotype and are characterized by overexpression of ion channels on their plasma membrane. Ion channels and pumps are finely tuned to regulate the voltage gradient across the plasma membrane and therefore determine the membrane potential (Vm). Numerous studies have provided evidence for a regulatory role of the Vm changes in cellular processes such as proliferation. It has also been observed that activation of receptors by mitogenic stimuli leads to Vm changes. The focus of this study is to investigate membrane potential dynamics of cancer cells using optical recordings. Optical recordings provide the means to record changes in cell-type specific populations with great spatiotemporal resolution. In particular, experiments on HEK 293T were performed using the voltage-sensitive dye di-8-ANEPPS (di8A) to optically record voltage changes in response to field stimulation. Square pulses of 40mV and 100ms duration were used. Optical signals were recorded, and the fluorescence change %ΔF/F was measured. Pharmacological manipulations using Carbenoxolone and 4-Aminopyridine followed to investigate electrical signal propagation and explore role of gap junctions. The results of the current study indicated that cell populations of HEK293T segregated into depolarizing and hyperpolarizing groups in a spatiotemporal manner, due to the position of electrodes in RC-21BRFS chamber. Moreover, pre-treatment with 4-AP seems to abolish electrical signal generation due to inhibition of Kv channels and CBX reduced %ΔF/F fluorescence intensity of di8A and therefore resulted in signal attenuation in HEK293T.