Produktion von Plattformchemikalien auf Zucker- und CO$_{2}$-Basis mit dem Knallgasbakterium Cupriavidus necator H16
Creators: name: Windhorst, Carina
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2019
Subjects: Cupriavidus necator
Ralstonia eutropha
Plattformchemikalien
Acetoin
2
3-Butandiol
Elektrolyse

description: Die Vorkommen der fossilen Energiereserven neigen sich dem Ende zu. Daher ist es notwendig, dass die Menschheit lernt alternative Energie- und Kohlenstoffquellen zu nutzen. Insbesondere die chemische Industrie muss unabhängig von fossilen Rohstoffen werden, in dem Plattformchemikalien verwendet werden. Diese Plattformchemikalien sollen aus Biomasse hergestellt werden und dienen als Vorläufer für viele weitere Endprodukte der chemischen Industrie. Unter anderem wurden Acetoin und 2,3-Butandiol als Plattformchemikalien identifiziert. Nicht nur das weite Anwendungsspektrum sondern auch der prognostizierte steigende Umsatz lenken das Interesse auf diese beiden Chemikalien. Für die Produktion von Acetoin und 2,3-Butandiol wurde das Knallgasbakterium Cupriavidus necator für diese Arbeit ausgewählt, da es sowohl als Modelorganismus für chemolithoautotrophes Wachstum gilt, als auch in der Industrie bereits als Produzent für Bioplastik (Polyhydroxybutyrat, PHB) eingesetzt wird. Nach der Deletion des acoABC-Operons, welches für den Acetoin-Metabolismus notwendig ist, wurden die Gene alsSD (Acetolactat-Synthase und Acetolactat-Decarboxylase) vom Plasmid aus exprimiert. Dafür wurden drei verschiedene Promotoren getestet: ein Arabinose-induzierbarer Promotor, ein Rhamnose-induzierbarer Promotor und ein konstitutiver Promotor, der nativ für die Produktion von PHB zuständig ist. Des Weiteren wurden die Gene für die beiden beschriebenen PHB-Synthasen PhaC1 und PhaC2 deletiert, um den Kohlenstofffluss in Richtung Acetoin-Produktion zu verschieben. Dabei hat sich herausgestellt, dass die zweite Synthase keinen direkten Einfluss auf die Produktion von PHB hatte. Die Acetoin-Produktion dieser zwölf verschiedenen Stämme wurde unter heterotrophen und autotrophen Bedingungen untersucht. Bei der Kultivierung in Minimal-Medium mit Fructose als einzige Kohlenstoffquelle weist der Stamm mit der Deletion von acoABC und dem Rhamnose-induzierten Plasmid die höchste Acetoin-Ausbeute mit 69% auf. Mit nur fünf Prozentpunkten weniger erreichten die Stämme mit dem konstitutiven Promotor und den zusätzlichen Deletionen von phaC2 und phaC1_phaC2 eine Ausbeute von 64%. Ausgehend von Fructose als Kohlenstoffquelle wurde das theoretische Maximum der Ausbeute von 100% (mol Acetoin/mol Fructose) ermittelt. Bei der Kultivierung mit CO2 hingegen liegt dieses Maximum der Ausbeute bei 25% (mol Acetoin/mol CO2). Das Maximum von 25% erreichten zwei Stämme bei der Kultivierung mit H2 (Elektronendonor), O2 (Elektronenakzeptor) und CO2 (Kohlenstoffquelle). Beide Stämme trugen die Deletion von acoABC und phaC1 sowie das Plasmid mit dem Rhamnose-induzierten oder mit dem konstitutiven Promotor. Dabei war phaC2 in dem Stamm mit dem konstitutiven Promotor zusätzlich deletiert. Der Stamm ohne diese zusätzliche Deletion von phaC2 erreichte eine Ausbeute von 19%. Neben der Acetoin-Produktion wurde ebenfalls die Produktion von 2,3-Butandiol getestet, dafür wurde in den Acetoin produzierenden Stämmen zusätzlich das Gen budC (2,3-Butandiol Dehydrogenase) exprimiert. In allen Versuchen wurden niedrigere Ausbeuten für die kombinierte Produktion gegenüber der reinen Acetoin-Produktion festgestellt. Die höchste 2,3-Butandiol-Ausbeute wurde unter heterotrophen Bedingungen (theoretisch maximale Ausbeute 100%) für den Stamm mit dem Rhamnose-induzierten Promotor am Ende des Versuches mit 48% berechnet, zu diesem Zeitpunkt wurden ebenfalls noch 10% Acetoin detektiert. Unter autotrophen Bedingungen (theoretisch maximale Ausbeute 25%) produzierte der Stamm mit dem konstitutiven Promotor 1% Acetoin und 7% 2,3-Butandiol. Für die chemolithoautotrophe Produktion von Plattformchemikalien sind drei Gase (H2, O2 und CO2) notwendig. Sowohl O2 als auch CO2 sind dafür in unserer Luft ausreichend vorhanden. Da die H2-Konzentration von etwa 0,5 ppm in der Luft nicht ausreichend für lithotrophes Wachstum ist, ist eine externe Zugabe notwendig. H2 kann über verschiedene Wege produziert werden. Um dabei die Freisetzung von CO und CO2 zu verhindern, kann eine elektrolytische Spaltung von Wasser in H2 und O2 durchgeführt werden. Um die zusätzlich benötigte Spannung hinzuzufügen, wurde ein Potentiostat an eine Elektrolyse-Zelle angebracht. In dieser Arbeit wurde eine Elektrolyse-Zelle aus überwiegend handelsüblichen Materialien aufgebaut, die in einem Versuch über 14 d mit einer angelegten Spannung von -1 V vs. Ag/AgCl im Durchschnitt 0,75 A verbrauchte. Für diese Zeitspanne wurde eine Produktivität von 3,55 cm3 H2/h berechnet.