title: Amino acid analysis in biological fluids by GC-MS
Creators: name: Kaspar, Hannelore
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Metabolom , Aminosäuren , Massenspektrometrie , Harn , Chlorameisensäurederivate , Quantitative Analyse, GC-MS , , metabolomics , amino acids , gas chromatography mass spectrometry , urine , alkyl chloroformate
subject: 540 Chemie

description: Amino acids are intermediates in cellular metabolism and their quantitative analysis plays an important role in disease diagnostics. A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) based method was developed for the quantitative analysis of free amino acids as their propyl chloroformate derivatives in biological fluids. Derivatization with propyl chloroformate could be carried out directly in the biological samples without prior protein precipitation or solid-phase extraction of the amino acids, thereby allowing for automation of the entire procedure, including addition of reagents, extraction and injection into the GC-MS. The total analysis time was 30 minutes, including sample preparation and 31 amino acids could be reliably quantified using 19 stable isotope-labeled amino acids as internal standards. Limits of detection (LOD) and lower limits of quantification (LLOQ) were in the range of 0.03 - 12 µM and 0.3 - 30 µM, respectively. The method was validated using certified amino acid standard and reference plasma, and its applicability to different biological fluids was shown. Intraday precision for the analysis of human urine, blood plasma, and cell culture medium was 2.0 - 8.8%, 0.9 - 8.3%, and 2.0% - 14.3%, respectively, while the inter-day precision for human urine was 1.5 - 14.1%. Using two blinded sets of urine specimens containing replicates, the GC-MS method was further validated and the results were compared with those obtained for iTRAQ® derivatization HPLC-tandem mass spectrometry and ion exchange chromatography with postcolumn ninhydrin detection of amino acids. The technical error (TE), as determined by repeated aliquot measurements of various urine specimens was calculated to prove that the method was suitable for the quantitative analysis of amino acids in large clinical and epidemiological studies. The quantitative results obtained by the three methods were compared by regression analysis and Bland-Altman plotting. The method was further expanded to fatty acids. Due to the carboxy function fatty acids can be derivatized with propyl chloroformate and included in the develpoped GC-MS method. To resolve isobaric fatty acids the GC program had to be expanded and the analysis time increased to 50 min for one GC run. LODs for the fatty acids ranged from 0.08 µM to 39 µM. To that end, the method was adapted to allow the combined analysis of the total fatty acid content of 17 fatty acids and 25 free amino acids in a single gas chromatographic run. The number of amino acids amenable to GC analysis is limited and therefore, the potential of derivatization with propyl chloroformates, followed by LC-MS/MS analysis for amino acid determination was investigated. The method was expanded to tryptophan metabolites and polyamines that are of great interest in several biological projects. The intention to use an in-house synthesized internal standard for each analyte failed as experiments showed that the created standard is not suitable for quantification purposes. Therefore, isotopes labeled analytes have to act as internal standards. Using 23 stable-isotope labeled compounds as internal standards, the method aims the quantification of 41 analytes comprising amino acids, tryptophan metabolites and polyamines. It was not possible to detect tryptophan metabolites above the LLOQ in biological samples. Preliminary experiments were performed to improve the method by evaluating choice of the extraction solvent.
description: Aminosäuren sind Zwischenprodukte im zellulären Stoffwechsel und ihre quantitative Analyse ist speziell bei der Diagnose von Krankheiten von enormer Bedeutung. Zur Bestimmung von Aminosäuren in unterschiedlichen biologischen Proben wurde eine gaschromatographische mit Massspektrometer gekoppelte Methode entwickelt, welche auf der Derivatisierung von Aminosäuren mit Chlorameisensäurepropylester beruht. Diese Art der Derivatisierung kann ohne vorgeschaltete Proteinfällung oder Festphasenextraktion direkt in biologischen Proben durchgeführt werden, wodurch eine Automatisierung des gesamten Prozesses - Zugabe der Reagenzien, Extraktion und Injektion ins GC-MS - ermöglicht wird. Die Gesamtanalysenzeit inklusive Probenvorbereitung beträgt 30 min, wobei durch die Verwendung von 19 stabile isotopenmarkierten Aminosäuren als interner Standard 31 Aminosäuren und Dipeptide quantifiziert werden konnten. Die Nachweisgrenzen (LOD) lagen zwischen 0,03 und 12 µM und die unterste Quantifizierungsgrenze (LLOQ) zwischen 0,3 und 30 µM. Die Methode wurde durch die Analyse eines zerifizierten Standards und Referenzplasma validiert und die Anwendbarkeit für verschiedene biologische Proben getestet. Die relative Standardabweichung für eine Zehnfachbestimmung am selben Tag lag zwischen 2,0 und 8,8% für menschlichen Harn, zwischen 0,9 und 8,3% für menschliches Plasma und zwischen 1,3 und 9,1% für Mäuseharn, während die Standardabweichung für eine Zehnfachbestimmung für menschlichen Harn über mehrere Tage verteilt zwischen 1,5 und 14,1% lag. Die GC-MS Methode wurde weiterhin durch die Analyse von zwei verdeckten Probensets validiert, welche Splitproben enthielten. Dieselben Proben wurden zusätzlich mit der iTRAQ® Derivatisierung gefolgt von HPLC -Tandemmassen-spektometrie und einer Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrin mittels eines Aminosäurenanalysator gemessen. Um die Eignung der Methode für einen hohen Probendurchsatz zu zeigen, wurde der technische Fehler für die Splitproben berechnet. Die quantitativen Ergnisse aller drei Methoden wurden durch Regressionsanalyse und Bland-Altman Auftragungen miteinander verglichen. Die Methode wurde zusätzlich für die Analyse von Fettsäuren erweitert, welche aufgrund ihrer Carboxylgruppe mit Chlorameisensäurepropylester derivatisiert werden können. Um isobare Fettsäuren trennen zu können mußte die GC-trennung auf von 11 auf 50 min erweitert werden. Der Bereich der Nachweisgrenzen (LOD) lag zwischen 0.08 und 39 µM. Mit der erweiterten Methode ist es möglich eine vereinte Analyse von Aminosäurenkonzentration und totalen Fettsäurenkonzentration für 17 Fettsäuren und 25 Aminosäuren durchzuführen. Da die Anzahl der Aminosäuren die mittels GC bestimmt werden können limitiert ist, wurde zusätzlich die Möglichkeit zur Aminosäurenanlytik mittels LC-MS/MS Chlorameisensäurepropylesterderivate getestet. Tryptophanmetabolite und Polyamine sind in mehreren biologischen Projekten von großem Interesse und wurden deshalb in die Methode integriert. Da der eigens synthetisierte Standard nicht zu Quantifizierungszwecken eingesetzt werden konnte wurden erneut isotopenmarkierten Aminosäuren als interner Standard verwendet. Insgesamt wurden 23 isotopenmarkierte Verbindungen für die Quantifizierung 41 Analyten (Aminosäuren, Tryptophanderivate und Polyamine) verwendet. Mit dieser Methode war es nicht möglich Konzentrationen für Tryptophanmetabolite oberhalb der unteren Quantifizierungsgrenze in biologischen Proben zu bestimmen. Zur Verbesserung der Nachweisgrenzen wurden erste Experimente durchgeführt, die eine bessere Extraktion der Analyten ermöglichen.