title: Charakterisierung der großen GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1) im intrazellulären Proteintransport
title: Characterization of the large GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1) in intracellular protein transport
Creators: name: Hoff, Florian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Epithelzelle
Proteintransport , Polarität
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
epithelia
Vesikel
trafficking
vesicle
Cytologie
protein
Dynamin
GTPase
Proteintransport , GTPase

description: The intracellular protein
      transport in polarized epithelial cells is based, in view of
      the transported cargo molecules, on a complex code of sorting
      signals, protein modifications and an association with
      specific lipid compositions. On the other side exists a
      highly specialized cellular transport machinery, consisting
      of a diverse set of various proteins and cytoskeletal
      components, which is able to decrypt this code and transports
      the cargo molecules to their particular destination. In
      search of yet unknown factors in protein transport, the large
      GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1) was discovered on
      vesicles of the biosynthetic lipid raft independent pathway
      in polarized epithelial cells. Mx1 is generally known as an
      interferon induced protein, which is synthesized after viral
      infections and which provides an antiviral immune response.
      The precise mechanism behind this antiviral activity is so
      far unknown. Different publications reveal that Mx1 is able
      to mislocalize viral components within the cell, which makes
      them unavailable for viral replication. Thus a possible
      function of Mx1 in the intracellular transport system is
      conceivable and the research focus of this dissertation. Mx1
      is constitutively expressed in polarized canine kidney
      epithelial cells (MDCK cells) without interferon induction.
      In this cell line, the large GTPase was associated with
      post-Golgi vesicular membranes, which were positive for the
      neurotrophin receptor p75NTR and lipid raft independently
      transported towards the apical domain. The reduction of Mx1
      synthesis via RNA interference demonstrated that Mx1 was not
      simply associated with these vesicles, but it also performed
      a role in their transport. Mx1 depletion led to significantly
      less p75NTR at the apical plasma membrane. Furthermore the
      secretion of the two soluble peptides galectin-3 and gp80 was
      also significantly reduced. The Mx1 knockdown did not result
      in an altered appearance of these three proteins at the
      basolateral membrane, but rather in a decreased efficiency of
      apical transport. With the help of immunofluorescence and the
      Proximity Ligation Assay (PLA), Mx1 was localized to
      membranes of endosomal origin. There, the large GTPase
      colocalized with galectin-3, a lectin which is essential for
      the correct sorting of lipid raft independent proteins. In
      addition Mx1 interacted directly with the tubulin- and actin
      cytoskeleton and the PLA showed a close proximity to tubulin
      dependent motor proteins. The precise function of Mx1 in
      intracellular transport is not yet understood. Because of its
      affiliation to the dynamin superfamily and structural
      homologies to classical dynamins, a function in fission of
      transport vesicles at the post- Golgi endosomal system is
      possible. The analysis of Mx1 expression revealed that it is
      not only constitutively synthesized in MDCK cells, but also
      present in other cell lines without interferon induction.
      This work demonstrates for the first time a role of Mx1 in
      biosynthetic protein transport. The presented observations
      indicate that Mx1 is not only an antiviral factor, but rather
      generally involved in intracellular transport
      mechanisms.
description: Der intrazelluläre Proteintransport
      in polaren Epithelzellen basiert zunächst auf der Seite der
      zu transportierenden Moleküle aus einem komplexen Code von
      Sortiersignalen, Proteinmodifikationen und einer Assoziation
      mit spezifischen Lipidkompositionen. Dem gegenüber steht auf
      der anderen Seite eine hochspezialisierte zelluläre
      Transportmaschinerie, bestehend aus einem breiten Spektrum
      verschiedener Protein- und Zytoskelettkomponenten, die diesen
      Code zu entschlüsseln vermag und das Transportgut zur
      jeweiligen Destination befördert. Auf der Suche nach bislang
      unbekannten Faktoren im Proteintransport wurde bei einer
      Analyse von Vesikeln des biosynthetischen lipid
      raft-unabhängigen Transportwegs in polaren Epithelzellen die
      große GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1) entdeckt.
      Mx1 gilt allgemein als streng Interferon-induziertes Protein,
      das im Zuge viraler Infektionen synthetisiert wird und eine
      antivirale Immunantwort vermittelt. Der genaue Mechanismus
      hinter dieser antiviralen Aktivität ist bislang weitgehend
      unverstanden. Verschiedene Studien lassen vermuten, dass Mx1
      in der Lage ist Viruskomponenten innerhalb der Zelle
      fehlzuleiten, sodass sie nicht mehr für eine virale
      Replikation zur Verfügung stehen. Eine mögliche Funktion von
      Mx1 im intrazellulären Transportsystem ist daher vorstellbar
      und sollte in dieser Arbeit näher untersucht werden. Mx1 wird
      in polaren Epithelzellen der caninen Niere (MDCK-Zellen)
      konstitutiv, ohne Interferoninduktion, exprimiert. In dieser
      Zelllinie zeigte diese große GTPase eine Assoziation mit
      post- Golgi vesikulären Membranen, die positiv für den
      Neurotrophinrezeptor p75NTR waren und lipid raft- unabhängig
      zur apikalen Domäne transportiert wurden. Eine Reduktion der
      Mx1-Synthese mittels RNA- Interferenz bewies, dass die große
      GTPase nicht nur mit diesen Vesikeln assoziiert war, sondern
      auch eine Rolle in ihrem Transport ausübte. Die Mx1-Depletion
      führte zu signifikant weniger p75NTR an der apikalen
      Plasmamembran. Darüber hinaus wurde die Sekretion der zwei
      löslichen Peptide Galectin-3 und gp80 ebenso signifikant
      reduziert. Der Mx1-knockdown resultierte nicht in einer
      veränderten Beförderung dieser drei Proteine an die
      basolaterale Membran, sondern zu einer verminderten Effizienz
      des apikalen Transports. Mit Hilfe von
      Immunfluoreszenzstudien und des Proximity Ligation Assays
      (PLA) konnten Mx1-positive Membranen dem endosomalen System
      zugeordnet werden. Dort lag die große GTPase zusammen mit
      Galectin-3 vor, ein Lektin, welches für die korrekte
      Sortierung lipid raft- unabhängiger Proteine essentiell ist.
      Des Weiteren interagierte Mx1 direkt mit dem Tubulin- und
      Aktinzytoskelett und zeigte im PLA eine unmittelbare Nähe zu
      Tubulin-abhängigen Motorproteinen. Welche genaue Aufgabe Mx1
      im intrazellulären Transport ausübt, ist noch nicht
      verstanden. Durch die Zugehörigkeit zur Dynamin-Superfamilie
      und Strukturähnlichkeiten zu den klassischen Dynaminen, ist
      eine Funktion in der Fission von Transportvesikeln im
      post-Golgi endosomalen Netzwerk möglich. Eine
      Expressionsstudie zeigte, dass Mx1 nicht nur in MDCK-Zellen
      konstitutiv hergestellt wurde, sondern auch in weiteren
      Zelllinien ohne Interferonbehandlung detektiert werden
      konnte. Nun wurde erstmals mit dieser Arbeit eine Funktion
      von Mx1 im biosynthetischen Proteintransport aufgezeigt.
      Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Mx1 nicht nur als
      antiviraler Faktor fungiert, sondern generell in
      intrazellulären Transportmechanismen involviert ist.