title: ATP-dependent chromatin remodelers - Analysis of expression patterns and impact on gene regulation
title: ATP-abhängige Chromatin Remodeler - Analyse von Expressionsmustern und Einfluß auf Genregulation
Creators: name: Neuendorff, Nina Rosa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: CHD5
CHD4, BRG1
Entzündung, Chromatin
Tumorsuppressorgen
Transkription
Medizin, Gesundheit

description: ATP-dependent chromatin remodelers
      are enzymes which use the energy from ATP hydrolysis to alter
      the chromatin structure. Thus, they play a key role in the
      transcriptional control of many important cellular processes
      such as proliferation,senescence and differentiation.The
      first part of this study focused on CHD5, a novel chromatin
      remodeling enzyme. To gain further insight into its
      expression profile and biological function, polyclonal
      peptide antisera were, together with a commercially available
      antiserum, successfully established for use in western blot,
      immunoprecipitation and immunofluorescence staining.
      ATP-dependent chromatin remodelers are expressed by very
      different patterns ranging from ubiquitous expression to an
      expression restricted to specific cell populations. So far,
      CHD5 expression was thought to be restricted to
      neural-related tissues. Here, it was shown for the first time
      that CHD5 expression is not restricted to neural tissues but
      additionally expressed in rodent testes. Furthermore, several
      cell lines were tested for CHD5 expression on transcript and
      protein level. CHD5 expression was not detected in any of the
      tested neuroblastoma and glioblastoma cell lines. In
      neuroblastoma cell lines this was expected due to the
      suggested function as tumor suppressor. Furthermore, a
      primary astrocyte culture was established. No CHD5 could be
      detected in protein lysates from astrocytes but was found in
      those from murine neural stem cells. This suggests that CHD5
      expression in brain is restricted to neural stem cells and
      probably also to neurons. In the second part of this thesis,
      the impact of the chromatin remodelers CHD4 and BRG1 on a
      TNFα-induced inflammatory response was investigated. BRG1 and
      CHD4 expression was disrupted by a siRNA-mediated knockdown
      in HEK293 cells. After stimulations with TNFα for one to four
      hours, gene induction of typical inflammatory NF-κB target
      genes was determined by RT-qPCR. BRG1 and CHD4 were both
      required for the efficient induction of all tested target
      genes exclusively after one hour but not after four hours of
      TNFα treatment. Expression of the housekeeping gene ß-actin
      was unaffected. Surprisingly, although CHD4 is mainly known
      to be involved in transcriptional repression, a requirement
      for CHD4 in active transcription during this inflammatory
      response was revealed. To gain further insight into the
      mechanism of involvement, co-immunoprecipitations of the
      NF-κB subunit p65 with BRG1 and CHD4,respectively, were
      performed upon TNFα stimulation. No robust interactions
      between these proteins could be observed. Furthermore, ChIP
      experiments with the NF-κB subunit p50, histone H3 and CHD4
      were carried out on the model target gene CXCL2. p50 was
      recruited to the promoter of CXCL2 rapidly after TNFα was
      added. Histone H3 binding to the promoter and the open
      reading frame of the gene strongly decreased within the first
      hour of TNFα stimulation, indicating that chromatin
      remodeling took place during the early period of gene
      induction. Recruitment of CHD4 was nonconclusive. Thus, the
      mechanism of how BRG1 and CHD4 act during TNFα response needs
      to be investigated further. In summary, a major influence of
      the chromatin remodelers BRG1 and CHD4 on the TNFα-induced
      gene activation during its early phase in HEK293 cells was
      demonstrated.
description: ATP-abhängige Chromatin Remodeler
      sind eine Gruppe von Enzymen, welche die Energie aus der
      ATP-Hydrolyse nutzen, um die Chromatinstruktur zu verändern.
      Damit spielen sie eine bedeutende Rolle für die
      Transkriptionskontrolle wichtiger zellulärer Prozesse, wie
      beispielsweise Proliferation, Seneszenz und Differenzierung.
      Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf CHD5, ein
      neu identifiziertes Mitglied der ATP-abhängigen Chromatin
      Remodeler. Um wichtige biologische Funktionen dieses Proteins
      studieren zu können, wurden polyklonale Peptid-Antiseren,
      zusammen mit einem später kommerziell erhältlichen
      Antikörper, für den Gebrauch in Western Blot,
      Immunpräzipitation und Immunfluoreszenzfärbungen etabliert.
      ATP-abhängige Chromatin Remodeler zeigen vollkommen
      unterschiedliche Expressionsmuster. Diese reichen von einer
      ubiquitären Präsenz bis hin zu einer auf spezielle
      Zellpopulationen beschränkten Expression. Bislang ging man
      davon aus, dass CHD5 nur in neuronalen Geweben exprimiert
      wird. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass
      dies nicht zutrifft, da das CHD5 Protein in Hoden-Lysaten von
      Nagetieren detektiert werden konnte. Weiterhin wurden RNA-
      und Proteinextrakte diverser Zelllinien auf ihre
      CHD5-Expression hin untersucht. Keine der untersuchten
      Neuroblastom- und Glioblastom-Zelllinien zeigte eine
      signifikante CHD5-Expression. Zumindest in den
      Neuroblastom-Zelllinien steht dies in Einklang mit der
      vermuteten Rolle als Tumorsuppressor in dieser Tumorentität.
      Außerdem konnte eine primäre Astrozytenkultur etabliert
      werden. Proteinlysate dieser Kultur waren negativ in Bezug
      auf eine CHD5-Expression, jedoch konnte das Protein in
      Extrakten muriner neuronaler Stammzellen nachgewiesen werden.
      Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass eine
      CHD5-Expression im Hirn auf bestimmte Zellpopulationen
      beschränkt ist, nämlich auf neuronale Stammzellen und
      vermutlich zusätzlich auf Neurone, jedoch nicht in Astrozyten
      exprimiert wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der
      Einfluss der Chromatin Remodeler BRG1 und CHD4 auf die
      TNFα-vermittelte Induktion von NF-κB Targetgenen untersucht.
      Die Expression von BRG1 bzw. CHD4 wurde mit Hilfe von
      spezifischen siRNAs in HEK293 Zellen herunter reguliert.
      Anschließend wurden die Zellen für ein bis vier Stunden mit
      TNFα stimuliert. Die Induktion von typischen NF-κB
      Targetgenen wurde mit Hilfe einer RT-qPCR untersucht. Dabei
      ergab sich, dass beide Proteine für die Induktion aller
      untersuchter Targetgene nach einer Stunde benötigt werden.
      Die Expression der Targetgene nach vier Stunden war nicht
      beeinträchtigt, ebenso unverändert war die des Haushaltsgens
      ß-Actin. Dies war überraschend, denn CHD4 ist hauptsächlich
      als Repressor bekannt. Hier konnte jedoch ein Stellenwert
      innerhalb der aktiven Transkription gezeigt werden. Um einen
      Einblick zu erhalten, in welcher Form CHD4 und BRG1 an der
      untersuchten Targetgen-Induktion beteiligt sind, wurden
      Ko-Immunpräzipitationen der NF-κB Untereinheit RelA mit CHD4
      bzw. BRG1 nach einer Inkubation mit TNFα durchgeführt. Es
      konnten keine robusten Interaktionen der Proteine gezeigt
      werden. Weiterhin wurden ChIP-Experimente mit der NF-κB
      Untereinheit p50, Histon H3 und CHD4 am Beispiel des
      Targetgens CXCL2 nach einer TNFα-Induktion durchgeführt. Nach
      einer kurzen Inkubationszeit mit TNFα wurde p50 zum
      CXCL2-Promoter rekrutiert. Die Dichte von Histone H3 im
      Bereich des Promoters und, weniger ausgeprägt, auch des
      Open-Reading-Frame sank ebenfalls innerhalb der ersten
      Stunde. Dies symbolisiert eine stattgehabte Aktion von
      Chromatin Remodelern. Eine Rekrutierung von CHD4 blieb jedoch
      unklar aufgrund technischer Details. Daher bleibt der
      Mechanismus der beobachteten Effekte während dieser
      Transkriptionsaktivierung unbekannt. Zusammengefasst wurde
      eine wichtige aktivierende Funktion der beiden Chromatin
      Remodeler BRG1 und CHD4 während der frühen Phase der
      TNFα-Antwort gezeigt.