title: Der methylotrophe Bacillus methanolicus als eine synthetische Zellfabrik für die L-Prolin-Produktion
title: The methylotrophic Bacillus methanolicus as a synthetic cell factory for the L-proline production
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Frank, Christine
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Bacillus methanolicus
Zellfabrik
L-Glutamat
osmotischer Stress
L-Prolin
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Physiologie

description: Der thermotolerante methylotrophe Bacillus methanolicus MGA3 wurde ursprünglich aus Süßwassersumpfböden isoliert und seine optimale Wachstumstemperatur liegt bei 50 °C. Dieser Organismus ist in der Lage die C1-Verbindung Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle zu verwerten. Auf Grund der Fähigkeiten Methanol als Substrat zu konsumieren und unter hohen Temperaturen zu wachsen, gewinnt der Organismus in der industriellen Biotechnologie immer mehr an Relevanz. Während Fed-Batch Fermentationsprozessen führt die kontinuierliche Exkretion der Metabolite zu einer drastischen Erhöhung der externen Osmolaritäten, die die Produktivität der Zellfabrik negativ beeinflusst. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die physiologische Anpassungsstrategie von B. methanolicus MGA3 unter hyperosmolaren Bedingungen untersucht. In Übereinstimmung mit den ökophysiologischen Bedingungen seines natürlichen Habitats (Süßwassersumpfböden), besitzt der Organismus nur beschränkte Fähigkeiten, sich an Hochsalzbedingungen anzupassen. Keine der getesteten kompatiblen Solute und der prolinhaltigen Peptide begünstigt das Wachstum von B. methanolicus unter hohen Salinitäten. Unter hyperosmolaren Bedingungen, produziert B. methanolicus ausschließlich L-Glutamat als Osmoprotektivum. Ein erheblicher Teil des neu synthetisierten L-Glutamats wurde in das Medium ausgeschieden. Die Expression der Gene der L-Glutamat-Synthasen (gltAB, gltA2) und des regulatorischen Gens gltC unterliegen einer osmotischen Kontrolle. Solch ein Transkriptionsmuster der L-Glutamatsynthese-Gene wurde bisher noch nicht beobachtet. Da B. methanolicus diverse Vorteile in Hinblick fermentativer Prozesse liefert, stellt die Entwicklung eines L-Prolin-Produktionsstamms ein weiteres Themenfeld der vorliegenden Arbeit dar. Die proteinogene Aminosäure wird für anabole Zwecke und als osmotische Schutzsubstanz diverser Bacillus Spezies synthetisiert. Für die Entwicklung eines Methanol-basierenden L-Prolin-Produktionsstamms, wurden die osmoadaptiven L-Prolinsynthese-Enzyme aus B. licheniformis (ProJ-ProA-ProH) in B. methanolicus MGA3 heterolog exprimiert. Entgegen den Erwartungen führte die Überexpression dieser Enzyme zu einer Akkumulierung von Citrullin. Dieser Befund deutet darauf hin, dass das ∆1 Pyrrolin-5-carboxylat ProH Enzym möglicherweise der limitierende Faktor ist und dieses thermolabil ist. Für die Entwicklung eines temperaturstabilen L-Prolinsynthesewegs, wurden die anabole Enzyme aus B. methanolicus MGA3 (ProB-ProA-ProI) herangezogen. Diese Route ist auf transkriptioneller- und post-transkriptioneller Ebene strikt reguliert. Die Expression des proBA-Operons und proI-Gens wird durch die Anpassung der intrazelluläre L-Prolin-Konzentration über eine T-Box abhängige Transkriptionskontrolle reguliert. Auf Proteinebene unterliegt die Glutamat-5 Kinase ProB einer allosterischen Feedback-Regulierung durch sein Endprodukt L-Prolin. Durch bioinformatische Analysen wurde eine Schlüsselaminosäure (E142) der Feedback-Inhibierung identifiziert. Diese ist in einer flexiblen Schleife lokalisiert, die für die Modulierung des aktiven Zentrums zuständig ist. Durch Austausch des charakteristischen, negativ geladenen L-Glutamats durch ein positiv geladenes L-Arginin (E142/R), wird die allosterische Regulierung signifikant reduziert. Durch Überexpression der synthetischen anabolen Prolinsynthese-Enzyme (proB*AI) wurde erfolgreich eine L-Prolin-Produktion in B. methanolicus MGA3 erzielt. In Fed-Batch Fermentationsprozessen wurde eine Konzentration von 263 mg L-1 erreicht. Diese Studie repräsentiert die erste mikrobielle Synthese von L-Prolin aus Methanol. Ein weiteres Gebiet der vorliegenden Arbeit stellt die Analyse des Restriktionsmodifikationsystems dar. Dieses ist auf das native Plasmid pBM69 lokalisiert. In vivo Studien haben gezeigt, dass ein Verlust des natürlichen Plasmids zu einer 10-fachen Erhöhung der Transformation-Effizient führt.