NK cell regulation
Creators: name: Fasbender, Frank Oliver
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2016
Subjects: subject: NK cells
subject: Src familiy kinases
subject: SYK
subject: ZAP70
subject: Synthetic biology
subject: 610

description: Zur Untersuchung der Regulation von NK-Zellen wurden in der vorliegenden Arbeit Signalkaskaden in Schneiderzellen nachgebaut. Dafür wurden bekannte Komponenten von Signalkaskaden aus NK-Zellen transient in Schneiderzellen co-transfiziert und die Phosphorylierung von kritischen Signalmolekülen untersucht. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten wir in Schneiderzellen eine Signalkaskade mit 3 essentiellen Komponenten nachbilden. Ein Adaptermolekül das ein ITAM-Motiv enthält war ausreichend SYK zu aktivieren und somit SLP-76 zu phosphorylieren. Durch Mutationsexperimente konnten wir zeigen, dass diese Aktivierung abhängig von Tyrosinen im ITAM-Motiv und den SH-2 Domänen von SYK ist. Die SYK-Kinase ZAP70 hingegen benötigte die Co-Expression einer Src-Kinase um aktiviert zu werden. Mit Hilfe von Inhibitorexperimenten konnte diese Abhängigkeit weiter demonstriert werden. Die Aktivierung von Src-Kinasen konnte in diesem Zusammenhang durch Co-Expression von Csk und CD45 reziprok reguliert werden. In primären NK Zellen konnten wie zeigen, dass SLP-76 nach Kreuzvernetzung von ITAMassoziierten Rezeptoren - wie von unserem synthetischen Ansatz vorhergesagt – phosphoryliert wird. NK Zellen exprimieren die SYK Kinasen SYK und ZAP70, B Zellen nur SYK und T Zellen nur ZAP70. Um die Unterschiede der Aktivierung durch Src-Kinasen weiter zu untersuchen wurden alle 3 Zelltypen in Anwesenheit von Src oder SYK Inhibitoren stimuliert. So konnten wir zeigen, dass die Aktivierung von ZAP70 durch Inhibition von Src- Kinasen in T Zellen unterdrückt wird, während NK und B Zellen nur teilweise inhibiert werden.
description: Here we employ a combination of synthetic biology in Schneider cells and verification of these results with pharmacological inhibitors in primary human immune cells to investigate immune cell regulation. Taking advantage of the high transient co-transfection rate in Schneider cells, we were able to create a minimal signaling pathway containing an ITAMmotif, SYK kinase and its target SLP-76. The co-expression of all ITAM-containing adapters investigated resulted in strong activation of SYK kinase as observed by SLP-76 phosphorylation. Mutation experiments showed that this was dependent on both functional tyrosines within the ITAM motif as well as the SH2 domains of SYK kinase. Additionally, we observed a requirement for co-expression of Src kinases for ZAP70 mediated phosphorylation of SLP-76, whereas SYK was activated just by the presence of ITAMs without the need for Src kinases. Inhibitor experiments further underlined this requirement. Src-dependent SYK/ZAP70 activation and subsequent phosphorylation of SLP-76 could be controlled by coexpression of Csk or CD45, providing a molecular basis for this pathway in vivo. In primary NK cells, we could demonstrate that SLP-76 is phosphorylated after cross-linking of ITAM-associated receptors as predicted by the synthetic approach. NK cells express both SYK kinases SYK and ZAP70, whereas B cells only express SYK and T cells only express ZAP70. To further investigate the differences in the activation of SYK kinases, we stimulated all 3 cell types in the presence of Src or SYK kinase inhibitors. We could show that ZAP70 activation in T cells could be effectively inhibited by Src kinase inhibitors while NK cells and B cells were only partially inhibited at the same concentration thus validating our reconstructed pathway in Schneider cells.