title: Identifizierung von Antibiotika-produzierenden Endophyten aus Pflanzen von Naturwaldstandorten
Creators: name: Plesko, Maja
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Endophytische Actinobakterien werden als potentielle Quelle neuer Spezies und Produzenten neuer Naturstoffe mit möglichen Anwendungen in der Medizin, Agrikultur und Industrie angesehen. Ihre wachstums- und gesundheitsfördernden Wirkungen auf Wirtspflanzen, aber auch ihre antimikrobielle- und Antitumor-Wirkstoffe stehen im Mittelpunkt vieler Studien und Diskussionen. Die Zahl der multiresistenten Pathogenen steigt rasch und somit auch der Bedarf an neuen Antibiotika. Einer der Wege, um neue antimikrobielle Wirkstoffe zu entdecken führt über das Erforschen von besonderen ökologischen Nischen (gegeben durch unterschiedliche Nährstoffversorgung, mikrobielle Diversität in Böden und verschiedenen endophytisch besiedelten Pflanzen) und der Entwicklung neuer Isolations- und Kultivierungsmethoden für endophytische Bakterien. Die Ziele dieser Arbeit waren endophytischen Actinobakterien aus Pflanzen von Naturwaldreservaten – Merkenstein und Stampfltal - zu isolieren und zu identifizieren und ihre antimikrobielle Wirkung zu untersuchen. Für diese zwei Standorte war aus früheren Studien bekannt, dass es sich um Sonderstandorte mit extrazonaler Vegetation handelt in deren steinigen Böden und Actinobakterien als am stärksten vertretene bakterielle Gemeinschaft (49%) hervortreten. Als gutes Isolierungsmedium hat sich das nährstoffarme Gellan gum herausgestellt, da Actinobakterien aufgrund ihrer Eigenschaften Filamente zu bilden so einen selektiven Vorteil gegenüber anderen Endophyten erzielen konnten. So wurden aus 21 Pflanzen 98 endophytischen Bakterien isoliert. Mittels PCR-Amplifizierung von 16S-rRNA und RNA-Polymerase ß-Untereinheit (rpoB) Genen wurden 62 isolate als Streptomyces sp. und 36 Isolate als andere Bakterien, vorwiegend Bacillus sp. identifiziert. Die anschließende phylogenetische Analyse von Streptomyces-rpoB-Gen-Sequenzen suggeriert, dass es sich bei einer Gruppe von Isolaten möglicherweise um neue Stämme handelt; dies bleibt allerdingst noch zu klären. In einem Agardiffusionstest wurden Streptomyces-Isolate auf ihre antibiotische Wirkung gegen Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Erwinia carotovora odorifera, Fusarium oxysporum und Candida albicans getestet. In diesen Versuchen wurden zweierlei Nährstoffzusammensetzungen sowie drei Stimulationsstoffe miteinbezogen. Mehr als 50% der Streptomyces-Isolate zeigten eine antimikrobielle Wirkung gegen Gram-positive Bakterien, wobei die meisten gegen Bacillus subtilis aktiv sind. Es bestätigte sich ein klarer Zusammenhang zwischen Nahrungsknappheit und Sekundärmetaboliten-Produktion. Es wurde auch der Einfluss von Stimulationsstoffen auf die Aktivierung bzw. Inhibierung der Antibiotika-Produktion beobachtet. Ein Ko-Kultivierungversuch von Streptomyces-Isolaten mit anderen Bakterien (mit Streptomyceten-assozierte Isolate) verdeutlichte den Einfluss der biologischen Kompetition auf die Produktion von Signalmolekülen und die Fähigkeiten der bakteriellen Zelle auf diese Signale spezifisch zu antworten. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit bestätigt werden, dass Endophyten, insbesondere Streptomyceten, eine potenzielle Quelle neuer Antibiotika darstellen. Es ist aber weiterhin wichtig an den molekularen Mechanismen, die zur Expression von Sekundärmetaboliten Genclusters führen zu forschen, da durch Expression von „cryptic“ Genclusters neue metabolische Signaltransduktionswege entdeckt werden können.
description: Endophytic actinobacteria are possible sources of new species and potential producers of new natural products that could find their application in medicine, agriculture and industry. There are already many studies that discuss the positive effects of actinobacteria on growth and health of the plants, as well as the antimicrobial and antitumor activity of the active agents derived from these endophytes. The number of the multiresistant pathogens increases constantly and so does the demand for new antibiotics. One of the ways to find new antimicrobial agent is to explore specific ecological niche (defined through different nutrient supply, microbial diversity in the soil and several endophytes-colonized plants) and to develop new methods for the isolation and the cultivation of the endophytic bacteria. The aim of this study was to isolate and to identify endophytic actinobacteria from the plants collected at Merkenstein and Stampfltal, natural forest reserves in Austria and to test their antimicrobial activity. On these two locations, as previous studies have shown, the actinobacteria are the most abundant bacterial community (49%). Nutrient-poor Gellan gum has shown to be very good isolation media for actinobacteria due to their ability to form filaments, which worked for them as a selective advantage in compare to other endophytes. In this way 98 endophytic bacteria were isolated from 21 plants. PCR amplification of the 16S-rRNA and RNA-polymerase β-subunit (rpoB) genes identified 62 isolates as Streptomyces sp. and 36 isolates as other bacteria, predominantly Bacillus sp. Furthermore, phylogenetic analysis of the Streptomyces-rpoB-gen-sequence suggested that one group of isolates is presumably new species. However, this assumption remains to be further explored. Possible antibiotic activity of Streptomyces isolates against Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Erwinia carotovora odorifera, Fusarium oxysporum and Candida albicans was evaluated using agar diffusion test. In these experiments were used two different nutrient compositions as well as three stimulating substances. More than 50% of Streptomyces isolates have shown antimicrobial activity against gram-positive bacteria, the majority being active against Bacillus sp. The clear correlation was noticed between food shortage and secondary metabolite production as well as the effect of the stimulating substances on activation or inhibition of antibiotic production. Additional co-cultivation experiment of Streptomyces isolates with other bacteria (with Streptomyces- associated isolates) illustrated the influence of biological competition on the production of signal molecules and the ability of bacterial cells to create specific answer to these signals. In summary, in presented study we have demonstrated that endophytes, especially Streptomyces, are potential sources of new antibiotics. However, it is of great importance to research further and to understand molecular mechanisms that lead to expression of secondary metabolites genclusters, because through expression of “cryptic” genclusters new metabolic signal transduction pathways can be discovered.