Μελέτη του μοριακού διαλόγου συστημάτων δύο συστατικών στο θερμόφιλο βακτήριο Thermus thermophilus HB8:
Creators: name: Βασιλικός, Λάζαρος Βασιλείου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Μεταγωγή σήματος
Συστήματα δύο συστατικών
Signal transduction
Two-component systems
Thermus thermophilus HB8

description: Οι περισσότεροι ζωντανοί οργανισμοί δρουν σε ένα διαρκώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον, οπού είναι απαραίτητο να αντιλαμβάνονται αυτές τις περιβαλλοντικές αλλαγές για να μπορέσουν να επιβιώσουν. Όσον αφορά στα βακτήρια, οι κυριότεροι αισθητήριοι μηχανισμοί αντίληψης των εξωτερικών ερεθισμάτων περιλαμβάνουν τα συστήματα δύο συστατικών. Η παρούσα εργασία αποτελεί μέρος μιας προσπάθειας ολιστικής κατανόησης του τρόπου με τον οποίο αντιλαμβάνεται και αποκρίνεται το βακτηριακό στέλεχος T. thermophilus HB8 στο εξωτερικό περιβάλλον. Πρωταρχικός μας στόχος ήταν η ταυτοποίηση του συνόλου των συστημάτων δύο συστατικών που απαντούν στο συγκεκριμένο στέλεχος. Αναγνωρίστηκαν συνολικά 11 κινάσες ιστιδίνης και 14 ρυθμιστές απόκρισης σύμφωνα με τη συγκριτική μελέτη αρκετών βάσεων δεδομένων που περιλαμβάνουν τον σχολιασμό γονιδιωμάτων και οικογενειών πρωτεϊνικών περιοχών. Εκτός από ένα συγγενές ζεύγος κινάσης-ρυθμιστή που βρέθηκε στο pTT27 μεγαπλασμίδιο, τα υπόλοιπα γονίδια των συστημάτων του τοποθετούνται στο χρωμοσωμικό DNA. Περαιτέρω έρευνα σε διάφορες βάσεις δεδομένων οδήγησε στην κατασκευή ενός υπολογιστικά υποθετικού μοντέλου δικτύων αλληλεπίδρασης μεταξύ συγγενών, μη-συγγενών και ορφανών συστατικών των συστημάτων δύο συστατικών του. Με βάση το συγκεκριμένο μοντέλο, η συνέχεια της εργασίας επικεντρώθηκε στον in vitro χαρακτηρισμό τριών κινασών ιστιδίνης και οχτώ ρυθμιστών απόκρισης που θα μπορούσαν δυνητικά να συμμετέχουν σε δίκτυα πολλαπλών αλληλεπιδράσεων. Για τον σκοπό αυτό, κλωνοποιήθηκε η ολική αλληλουχία κωδικοποίησης των ρυθμιστών απόκρισης ΤΤΗΑ0020, ΤΤΗΑ0814, ΤΤΗΑ1002, ΤΤΗΑ1142, ΤΤΗΑ1362, ΤΤΗΑ1502, ΤΤΗΑ1593 και ΤΤΗΑ1722, όπως και των κινασών ιστιδίνης TTHA1363, TTHA1503 και ΤΤΗΑ1723, καθώς και η περικομμένη μορφή των τριών κινασών με την αφαίρεση του τμήματος αλληλουχίας που οδηγεί στη σύνθεση του αμινοτελικού διαμεμβρανικού τους τμήματος. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επαγωγή πρωτεϊνικής έκφρασης, με σκοπό την απομόνωση των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Από τη μεριά των κινασών, οι πλήρεις μορφές τους δεν παρουσίασαν καθόλου έκφραση με βάση τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ από τις περικομμένες μόνο η TTHA1503 απομονώθηκε σε μεγάλη ποσότητα και αρκετά καθαρή μορφή. Όσον αφορά στους ρυθμιστές απόκρισης, ο ΤΤΗΑ1142 δεν εκφράστηκε καθόλου, ενώ οι υπόλοιποι απομονώθηκαν σε σημαντική ποσότητα και σχετικά καθαροί, εκτός από τον ΤΤΗΑ1002. Δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης με ραδιενεργό 32P-ATP αποκάλυψαν την επικοινωνία μεταξύ του συγγενούς ζεύγους ΤΤΗΑ1502-ΤΤΗΑ1503, ταυτοποιώντας το ως πραγματικό σύστημα δύο συστατικών. Επιπλέον, παρουσιάστηκε η ικανότητα αλληλεπίδρασης της κινάσης ΤΤΗΑ1503 με τον μη-συγγενή ρυθμιστή ΤΤΗΑ1593, εγείροντας την πιθανότητα διασταυρωτής συνομιλίας μεταξύ συστημάτων δύο συστατικών του T. thermophilus HB8. Ωστόσο, οι περικομμένες κινάσες ΤΤΗΑ1363 και ΤΤΗΑ1723 δεν οδήγησαν σε συγκεκριμένο πρότυπο επικοινωνίας, αν και εκδηλώθηκε η ικανότητα αυτοφωσφορυλίωσης τους. Τελικά, η πλήρης γνώση του τρόπου απόκρισης του συγκεκριμένου στελέχους στα εξωτερικά ερεθίσματα μπορεί να οδηγήσει μέσω χρήσης μεταβολικής μηχανικής στην περαιτέρω βελτίωσή του ως οργανισμό μοντέλο για βιοτεχνολογικούς σκοπούς.
description: The majority of living organisms act in a constantly changing environment, where they have to sense these changes in order to survive. As far as bacteria are concerned, the major sensing mechanisms of external stimuli comprise the two component systems (TCSs). This work constitutes part of an effort for the holistic comprehension of the way the bacterial strain T. thermophilus HB8 perceives and responds to the external environment. Our primary aim was the identification of all TCSs systems which occur in this strain. In total, 11 histidine kinases and 14 response regulators were recognized according to the comparative study of several databases that include genome and protein family domain annotations. Except for a kinase-regulator cognate pair that was found on the pTT27 megaplasmid, the rest genes of its systems are located on the chromosomal DNA. Further research into various databases led to the construction of a computationally putative model of interaction networks among cognate, non-cognate and orphan components of its TCSs. Based on this model, the continuity of the work focused on the in vitro characterization of three histidine kinases and eight response regulators which could potentially be involved in networks of multiple interactions. For this purpose, we cloned the full-length coding sequence of response regulators TTHA0020, TTHA0814, TTHA1002, TTHA1142, TTHA1362, TTHA1502, TTHA1593 and TTHA1722, as well as the sequence of histidine kinases TTHA1363, TTHA1503 and TTHA1723, and the truncated form of the three kinases removing their sequence segment that leads to the composition of their N-terminal transmembrane domain. Thereafter, induction of protein expression was performed for isolation of the corresponding proteins. The full-length form of histidine kinases displayed no expression under the conditions used, whereas only the truncated TTHA1503 was isolated in large quantity and sufficiently pure form. As far as the response regulators are concerned, TTHA1142 was not expressed, while the others were isolated in significant quantity and relatively pure, except for TTHA1002. In vitro phosphorylation assays with radioactive 32P-ATP revealed the communication of the cognate pair TTHA1502-TTHA1503, identifying it as a real TCS. Additionally, it was presented that TTHA1503 kinase has the ability to interact with the non-cognate TTHA1593 regulator, raising the possibility of cross-talk events among TCSs of T. thermophilus HB8. However, truncated TTHA1363 and TTHA1723 did not lead to a specific communication pattern, even though they manifested autophosphorylation activity. Eventually, thorough knowledge of how the specific strain responds to external stimuli may result in its further improvement as model organism for biotechnological purposes by using metabolic engineering.