title: Analyse der Auswirkung lebensmittelrelevanter Substanzen auf die DNA-Methylierung mittels hochauflösender Schmelzkurvenanalyse
Creators: name: Werner, Bettina Karin
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Die DNA-Methylierung ist ein wichtiger epigenetischer Faktor für die Kanzerogenese. Im Rahmen dieser Masterarbeit sollte der Methylierungsstatus in HT29 und MCF7 Zellen mittels methylierungssensitiver hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (MS-HRM) analysiert werden. Es wurden dafür spezielle Primerpaare entworfen, die eine Amplifikation eines Bereichs der Promotorregion von Tumorsuppressorgenen ermöglichen. Dafür wurden die Gene CDKN2A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A), HIC1 (Hypermethylated in cancer 1) und RASSF1 (Ras association domain-containing protein 1) ausgewählt. Nur für CDKN2A konnten geeignete Primer gefunden und die MS-HRM Methode optimiert werden. Die MS-HRM Methode sollte im Rahmen dieser Arbeit validiert werden, wozu die quantitative MethyLight Methode ausgewählt wurde. Diese wurde kommerziell erworben und in einem ersten Schritt mittels Kontroll-Standards überprüft. Die Amplifikation der Real-Time PCR zeigte eine schlechte Effizienz und daraus ergaben sich stark abweichende Werte vom tatsächlichen Methylierungsgrad. Die Genauigkeit der Methode war damit unzureichend für eine Überprüfung der mit der MS-HRM Analyse erhaltenen Ergebnisse. Trotzdem wurden einige Proben aus Inkubationsversuchen mit Zellen analysiert und mit den Werten aus der MS-HRM verglichen. Während bei einem niedrigen Methylierungsgrad höhere Ergebnisse mit der MS-HRM Methode erzielt wurden, war es bei einem höheren Methylierungsgrad umgekehrt. Der Methylierungsgrad der Poromotorregionen der einzelnen Gene wurde in vitro in HT29 und MCF7 Zellen untersucht. Es wurden zusätzlich Inkubationsversuche mit verschiedensten lebensmittelrelevanten Substanzen durchgeführt, um eine etwaige Veränderung des DNA-Methylierungsgrads durch diese Stoffe zu untersuchen. Zusätzlich wurde die DNA aus Zellen von früher in der Arbeitsgruppe durchgeführten Inkubationsversuchen analysiert. Bei den Substanzen handelte es sich um Lebensmittel-Inhaltsstoffe wie Lignane ((+)-Lariciresinol und (-)-Matairesinol), Isoflavone (Genistein und Daidzein), Flavonole (Quercetin) oder bei der Zubereitung von Fleischwaren entstehende heterocyclische aromatische Amine (MeIQx und PhIP). Zusätzlich wurde die Wirkung von Kontaminanten wie Bisphenol A (BPA) und Mykotoxinen (Desoxynivalenol und Zearalenon) untersucht. Es wurde außerdem der demethylierende Arzneistoff 5-Aza-2‘-Deoxycytidin (5-Aza-dC) als Positivkontrolle verwendet. Für jede Substanz wurde die Wirkung konzentrationsabhängig bestimmt. Untersucht wurde der Promotor einer Reihe von Genen, die Methoden dazu wurden von B. Druml und E. Habla entwickelt, abgesehen von jener für CDKN2A. Bei den zusätzlichen Tumorsuppressorgenen handelte es sich um APC, DAPK1, GATA-4, NTRK2 und OSMR. Die Promotorregionen von APC und DAPK1 waren in HT29 Zellen nicht methyliert, jene von OSMR lag in MCF7 Zellen unmethyliert vor. Da von den verwendeten Substanzen keine methylierende Wirkung erwartet wurde, wurde der Einfluss auf nicht methylierte Promotorregionen von Genen nicht untersucht. Für die Versuche mit der HT29 Zelllinie konnten keine Effekte beobachtet werden. Einzig 5-Aza-dC zeigte die erwartete Wirkung, mit einem konzentrationsabhängigen Effekt, der bei 1 µM am stärksten war und mit zunehmender Konzentration abnahm. Die MCF7 Zellen wurden mit Genistein, Quercetin, Daidzein, BPA und 5-Aza-dC inkubiert. Allerdings wurden zum Screening nur wenige Versuche durchgeführt. Unter den verwendeten Substanzen waren auch einige endokrin wirksame, von denen eine Wirkung auf die MCF7 Zellen erwartet wurde. Tatsächlich konnte nur eine Inhibition des Wachstums durch Genistein, Quercetin und BPA beobachtet werden, eine Veränderung des Methylierungsstatus des Promotors kann für CDKN2A als Folge der Behandlung mit Genistein vermutet werden. Zusätzlich wurde auch hier bei der Inkubation mit 5-Aza-dC der stärkste demethylierende Effekt bei einer Konzentration von 1 µM erhalten. Aus Zeitgründen wurden einige dieser Inkubationsversuche nur einmal durchgeführt. Für eine endgültige Aussage über eine signifikante Wirkung müssten noch weitere Inkubations-versuche gemacht werden. Die Zellen wurden jeweils für 96 Stunden mit der jeweiligen Substanz inkubiert, was für manche bioaktive Stoffe zu kurz sein könnte. Daher wäre es außerdem sinnvoll, einen etwaigen Einfluss bei längeren Inkubationsdauern zu untersuchen.
description: DNA-methylation is known to play an important factor in carcinogenesis, particularly through silencing of tumor suppressor genes. The aim of the present master thesis was to develop methylation-sensitive high-resolution melting (MS-HRM) methods allowing the determination of the methylation status in the promoter region of different tumor suppressor genes. The methods should then be applied to determine the methylation status in HT29 and MCF7 cells and to investigate any demethylating effects of food relevant substances. At the beginning primer pairs for the tumor suppressor genes CDKN2A, HIC1 and RASSF1 were designed. However, only for CDNK2A an appropriate primer pair was found and subsequently the MS-HRM method was optimized. A commercially available MethyLight method should be used to validate the MS-HRM method for CDNK2A. However, by analyzing DNA standards of known methylation status we observed that the commercial kit did not perform well and suffered from low amplification efficiency, in particular of unmethylated DNA. Due to this PCR bias, the methylation extent determined with the MethyLight kit differed significantly from the actual methylation status of the DNA standards. The MethyLight method was therefore not applicable to verify the accuracy of the MS-HRM method developed in the present master thesis. In addition to the MS-HRM method for CDNK2A, further MS-HRM methods (developed by former diploma students) were applied to investigate the methylation status of tumor suppressor genes (NTRK2, OSMR and GATA-4) in HT29 cells. Incubation experiments with different food related substances were carried out to investigate a potential effect on the DNA-methylation level. The substances (genistein, quercetin and the demethylating drug 5-aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC)) were incubated in a concentration range from 1 to 100 µM for 96 hours. In addition, incubation experiments with (+)-lariciresinol, (-)-matairesinol, daidzein, MeIQx, PhIP, desoxynivalenol, zearalenone and bisphenol A (BPA) were carried out by former diploma students. In untreated HT29 cells the promoter regions of CDKN2A, NTRK2, OSMR and GATA-4 were found to be highly methylated. 5-Aza-dC showed a demethylating effect on the promoter regions of all genes. The strongest effect was observed at 1 µM. None of the other test substances was found to show a demethylation effect. In screening experiments, the effect of genistein, quercetin, 5-Aza-dC, daidzein and BPA on the promoter region of CDKN2A, NTRK2, APC and DAPK1 in MCF7 cells was investigated. Again, 5-Aza-dC was found to show a demethylating effect. Incubation with genistein, quercetin and BPA resulted in inhibiting cell growth. However, an influence on the DNA methylation level was not observed.