title: RNAi-based anti-cancer strategies - targeting the proto-oncogene PIM1 and oncogenic miRNAs
title: RNAi-basierte Strategien gegen Krebs - Targeting des Protoonkogens PIM1 und onkogener miRNAs
Creators: name: Thomas, Maren
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: RNAi
transcriptional regulation
Naturwissenschaften
miRNA Inhibitoren , transkriptionelle Regulation
miRNA
miRNA cluster
miRNA , miRNA inhibitors
miRNA Cluster

description: Krebs ist eine chronische
      Erkrankung, bei der Körperzellen durch Mutationen entarten,
      unkontrolliert wachsen und unter bestimmten Voraussetzungen
      gesundes Gewebe infiltrieren. Heutzutage zählt Krebs als
      zweithäufigste Todesursache der westlichen Welt zu den
      wichtigsten epidemiologischen Krankheitsbildern unserer
      Gesellschaft. Neben klassischen Behandlungsmethoden wie
      Resektion des Tumorgewebes, Chemo oder auch Immuntherapie ist
      die Entwicklung neuer Therapieoptionen von großer Bedeutung.
      Eine mögliche neue therapeutische Alternative ist der Einsatz
      kleiner, nicht kodierender, regulatorischer RNAs wie z.B.
      miRNAs. MiRNAs sind an der Regulation wesentlicher
      biologischer Prozesse wie Entwicklung, Differenzierung oder
      Proliferation beteiligt, indem sie die Genexpression über den
      Mechanismus der RNA Interferenz beeinflussen. Seit ihrer
      Entdeckung bestätigte sich die Annahme, dass miRNAs sowohl
      tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen ausüben,
      weshalb sie sich nicht nur als diagnostische oder
      prognostische Biomarker des Krebsgewebes eignen, sondern auch
      als Therapeutika selbst eingesetzt werden könnten. In einer
      miRNA Substitutionstherapie wird der Verlust oder die
      Herunterregulierung einer miRNA mit tumorsuppressiver Wirkung
      durch externe Zugabe ausgeglichen. Eine Antisense Therapie
      vermittelt hingegen eine Inhibition onkogener miRNAs durch
      komplementäre Oligonukleotide. Eine sichere und effiziente
      Aufnahme der RNA Moleküle zum Wirkort muss in beiden Ansätzen
      sichergestellt werden. Zurzeit ist die Entwicklung
      effizienter Delivery Systeme der limitierende Faktor für
      miRNA basierte Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde
      zunächst das Proto Onkogen PIM1 bezüglich einer möglichen
      RNAi basierten Antikrebstherapie untersucht. Eine
      Überexpression der PIM1 Kinase wird in zahlreichen soliden
      Tumoren oder malignen Entartungen des hämatopoetischen
      Systems beobachtet und ist in der Regel mit einem
      schwerwiegenden Krankheitsverlauf assoziiert. In vitro
      Studien an humanen Leukämie und Kolonkarzinom Zelllinien
      konnten erstmalig zeigen, dass die zelluläre PIM1
      Proteinexpression durch eine miRNA mit tumorsuppressiver
      Wirkung, nämlich miR 33a, spezifisch herunterreguliert wird,
      woraus zusätzlich ein proliferationsinhibierender Effekt
      resultiert. Ein erfolgreiches Delivery von nanopartikulären
      Vesikeln aus miR 33a Oligonukleotiden und einem nicht
      toxischen, verzweigtkettigen Polyethylenimin (PEI F25 LMW)
      führte in Maus Tumor Modellen zu einem antitumorigenen
      Effekt, der durch eine Reduktion des Tumorvolumens gezeigt
      werden konnte. Diese in vitro und in vivo Studien weisen das
      Proto Onkogen PIM1 erstmalig als erfolgversprechendes
      Zielobjekt für eine miRNA vermittelte Substitutionstherapie
      aus. Der Fokus des zweiten Projektes lag auf der Entwicklung
      neuartiger LNA basierter miRNA Inhibitoren, im Weiteren LNA
      Antiseeds genannt, bestehend aus einzelsträngigen
      Oligonukleotiden mit sog. Locked Nucleic Acid (LNA)
      Modifikationen und einem natürlich vorkommenden
      Phosphodiester Nukleotidrückgrat. Im Allgemeinen erhöht ein
      LNA Design sowohl die Resistenz der Oligonukleotide gegenüber
      einem Abbau durch zelluläre Nukleasen als auch ihre Affinität
      zur Ziel miRNA, wobei durch komplementäre Bindung an onkogene
      miRNAs deren zelluläre Funktionen ausgeschaltet werden.
      Bereits die Verwendung geringer Konzentrationen an LNA
      Antiseeds zeigte in humanen Krebs Zelllinien eine nahezu
      vollständige Inhibition onkogener miRNAs der miR 106b
      Familie, die durch eine Steigerung der endogenen Derepression
      des Tumorsuppressors P21 gezeigt wurde. Eine erfolgreiche
      Verpackung der neuartigen LNA basierten miRNA Inhibitoren mit
      dem verzweigtkettigen Polyethylenimin PEI F25 LMW sowie die
      funktionelle Aufnahme der gebildeten Nanopartikel in humane
      Krebszelllinien konnte in weiteren in vitro Experimenten
      gezeigt werden. Der Einsatz von PEI F25 LMW komplexierten LNA
      Antiseed miRNA Inhibitoren könnte nun auch in Xenograft Tumor
      Modellen der Maus als ein erfolgversprechender Ansatz einer
      Antisense Therapie getestet werden. Im dritten Themenkomplex
      dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des
      onkogenen miRNA Clusters miR 17 92 untersucht. Eine
      Überexpression dieses Clusters ist mit gesteigerter
      Proliferation, Angiogenese und verminderter Apoptose
      assoziiert und wird in zahlreichen hämatopoetischen und
      soliden Tumoren beobachtet. Die Transkription von miR 17 92
      wird dabei maßgeblich durch das Onkogen MYC reguliert. In
      vitro Experimente in humanen Krebs Zelllinien zeigten, dass
      auch der miR 17 92 Cluster zu jenen 20 % aller MYC
      regulierten Gene gehört, dessen Transkription durch einen
      Synergismus zwischen MYC und PIM1 gesteuert wird. Weitere
      Untersuchungen hinsichtlich der transkriptionellen Regulation
      von miRNA Promotoren könnten zukünftig dazu beitragen, die
      Zusammenhänge zwischen miRNA-Expression und der Entstehung
      von Krebs näher zu charakterisieren.
description: Cancer is a chronic disease caused
      by a degeneration of somatic cells due to mutations. In
      general cells grow erratic and under certain conditions this
      leads to an infiltration of even healthy tissues. To date
      cancer is the second most common cause of death in the
      Western world and belongs to one of the most important
      epidemiological diseases of our society. Besides traditional
      methods in cancer treatment such as resection of tumor
      tissue, chemo or immunotherapy, the development of novel
      therapeutic strategies is of the highest importance. One
      therapeutic option would include the use of small non coding
      regulatory RNAs such as miRNAs. MiRNAs are involved in the
      regulation of crucial biological processes such as
      development, differentiation or proliferation due to the
      control of the cell’s gene expression via RNA interference.
      Since the discovery of miRNAs, evidence has emerged that they
      can exert either tumor suppressive or oncogenic functions.
      Thus miRNAs are not only applied as diagnostic or prognostic
      biomarkers of cancerous tissues, but can also function as
      therapeutics. In miRNA replacement therapy a loss or
      downregulation of a tumor suppressive miRNA is adjusted with
      addition of this single miRNA. On the contrary an antisense
      therapy approach mediates the inhibition of oncogenic miRNAs
      by antisense oligonucleotides. Safe and efficient delivery of
      the oligonucleotides has to be guaranteed for both
      approaches. Currently the development of such efficient
      delivery systems is the critical and limiting factor upon
      miRNA based therapy designs. In this thesis the proto
      oncogene PIM1 was considered regarding a putative RNA based
      anti cancer strategy. Overexpression of PIM1 kinase usually
      is associated with severe forms of cancers with bad prognosis
      in several solid tumors or malign degenerations of the
      hematopoietic system. In vitro studies revealed a specific
      reduction of PIM1 protein levels in human leukemia and colon
      carcinoma cell lines due to a miRNA with tumor suppressive
      potential, namely miR 33a. Additionally this decrease in PIM1
      resulted in an inhibition of proliferation. Successful
      delivery with nanoparticle complexes composed of miR 33a
      oligonucleotides and a non toxic branched polyethylenimine
      (PEI F25 LMW) showed an anti tumor effect in mouse colon
      carcinoma models that was obtained through a reduction in
      tumor size. These in vitro and in vivo studies provide
      evidence for the first time that the proto oncogene PIM1 is a
      promising target for miRNA replacement therapy. The second
      project dealt with the development of novel LNA based miRNA
      inhibitors, termed LNA antiseeds, composed of single stranded
      RNA oligonucleotides with locked nucleic acid (LNA)
      modifications and a natural phosphodiester backbone. In
      general an LNA design enhances the resistance of
      oligonucleotides against cellular degradation by nucleases.
      Furthermore affinity of the molecule to the miRNA of interest
      is increased. Cellular functions of the targeted oncogenic
      miRNAs are silenced due to complementary binding to the
      inhibitor. A use of minor amounts of LNA antiseeds already
      revealed an almost complete inhibition of miRNAs of the miR
      106b family in human cancer cell lines which was connected to
      an endogenous derepression of the tumor suppressor P21.
      Successful complex formation of the novel LNA antiseeds with
      the branched polyethylenimine PEI F25 LMW has been proven.
      Furthermore in vitro experiments confirmed a functional
      delivery of the resulting nanoparticles into human cancer
      cell lines. Application of PEI F25 LMW complexed LNA antiseed
      miRNA inhibitors could now be tested as a promising antisense
      therapy approach in xenograft tumor mouse models. The third
      topic addressed the transcriptional regulation of the
      oncogenic miRNA cluster miR 17 92. Overexpression of this
      miRNA cluster is associated with enhanced proliferation,
      sustained angiogenesis and reduced apoptosis in several
      hematopoietic malignancies and solid tumors. Transcription of
      human miR 17 92 is significantly regulated by the oncogene
      MYC. In vitro experiments in human cancer cell lines
      confirmed that miR 17 92 belongs to one of those 20 % of MYC
      regulated genes which transcription is controlled by a
      synergism of MYC and PIM1. Further investigations regarding
      transcriptional control of miRNA promoters could provide
      profound evidences for a better understanding of a connection
      between miRNA expression levels and the development of
      cancer.