title: Characterization and detection of β-lactamases
Creators: name: Barisic, Ivan
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema der Antibiotikaresistenzen in klinisch relevanten Bakterien intensiv behandelt. Aufgrund der hohen Anzahl an unterschiedlichen Resistenzmechanismen wurde der Fokus auf eine der wichtigsten Klassen von Resistenzgenen gelegt, die β-Laktamasen. Es handelt sich hierbei um eine Proteinkategorie, die über ihre enzymatische Aktivität definiert wird. Die Enzyme sind in der Lage β-Laktam Antibiotika zu spalten und damit zu deaktivieren. Die β-Laktame sind die wichtigsten Bakterizide gegen die meisten humanen Pathogene. Die Wirkung der β-Laktame basiert auf einer strukturellen Ähnlichkeit mit einem Bestandteil der bakteriellen Zellwand, dem D-Alanyl-D-Alanin, welches in Kombination mit einer Peptidase für die molekulare Vernetzung des bakteriellen Mureins verantwortlich ist. β-Laktame binden irreversibel an die Peptidase, wodurch nach einer Kaskade von weiteren Reaktionen das Bakterium sich schließlich selbst lysiert. Über 950 unterschiedliche, natürlich vorkommende β-Laktamasen sind bereits bekannt und werden in vier Klassen (A-D) eingeteilt, die zwar ähnliche enzymatische Aktivität, aber unterschiedliche katalytische Zentren und Proteinsequenzen haben. Ein Ziel dieser Arbeit war es einen detaillierten Überblick über die Verbreitung der β-Laktamasen in Österreichs größten Ballungszentren Wien und Graz zu erlangen. Zu diesem Zweck wurden klinische, phänotypisch β-Laktam resistente Stämme genetisch untersucht. Nach dem Erstellen einer β-Laktamase DNA Sequenzdatenbank wurden 25 Primerpaare entworfen mit denen die 25 wichtigsten β-Laktamasegene identifiziert werden konnten. Zur Doppelkontrolle wurden auch 24 bereits publizierte Primerpaare verwendet. Dreiunddreißig klinische Isolate aus Graz und 108 aus Wien wurden jeweils zweimal mit diesen 49 Primerpaaren analysiert. Die mittels PCR amplifizierten Gene wurden sequenziert und für statistische Auswertungen verwendet. Die Rarefaction Curve, Chao1 und ACE Algorithmen wurden genutzt um die Anzahl von β-Laktamasegenen in den untersuchten Spitälern abschätzen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde eine große Anzahl von Genen zum ersten Mal in Österreich bzw. Europa beschrieben. Darunter befinden sich Gene aus allen vier Klassen der β-Laktamasen. Die statistischen Auswertungen ergaben, dass der Großteil der β-Laktamasegene in den klinischen Isolaten der Enterobacteriaceae in den untersuchten Spitälern identifiziert wurde. Die genaue Anzahl an unterschiedlichen β-Laktamase Genotypen konnte aufgrund der hohen Diversität nicht bestimmt werden. Das zweite Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer Methode mit der viele unterschiedliche Gene in einer Reaktion detektiert werden können. Die Immobilisierung der PCR auf einem Objektträger war eine naheliegende Herangehensweise bei der Primerpaare mit einem Microarrayspotter an eine unpolare Oberfläche kovalent gebunden wurden. Unterschiedliche Parameter wie Reaktionsgemisch, Annealing Temperatur, Primersequenz, Produktlänge, etc. wurde getestet. Die DNA konnte zwar in der On-Chip-PCR auf der Oberfläche vervielfältigt werden, aber es gelang nicht spezifische Reaktionsbedingungen zu bestimmen. Darauf aufbauend wurde eine Multiplex-Ligationsreaktion mit immobilisierten Sonden getestet. Ein neu entwickelter Typ von Sonde (looplock probe) und diverse Parameter wurden systematisch untersucht. Die Ligationsreaktion konnte mit den neuen Sonden auf der Objektträgeroberfläche zwar etabliert werden, aber eine weitere Optimierung der Spezifität ist notwendig. Neben oberflächenbasierenden Methoden wurde auch ein Multiplex-Detektionsverfahren in Lösung entwickelt. Dabei wurden Padlock Sonden verwendet, die bei Vorhandensein eines Zielgenes zu zirkularen DNA Molekülen ligiert werden. Die ligierten Padlock Sonden werden in zwei aufeinanderfolgenden Rolling-Circle-Amplication-Reaktionen vervielfältigt und anschließend in einer linearen PCR fluoreszenzmarkiert. Die Detektion der markierten DNA erfolgte mit einem Microarray. Mit dieser Methode konnten knapp 100 verschiedene Zielsequenzen parallel bestimmt werden. Der Assay kann alle wichtigen β-Laktamasegene in einer Reaktion identifizieren und wurde mit klinischen Isolaten erfolgreich evaluiert. Er zeichnet sich durch eine hervorragende Spezifität und Sensitivität aus. Im Vergleich zu bestehenden Produkten am Markt kann er drei bis vier Mal mehr Gene parallel detektieren und hat ein sehr hohes Entwicklungspotential, da eine Erweiterung des Assays um eine Vielzahl von zusätzlichen Zielgenen möglich ist.
description: In the present study, the issue of antibiotic resistance in clinically relevant bacteria has been discussed intensively. Due to the large number of different resistance mechanisms, the focus was on one of the most important classes of resistance genes, the β-lactamases. It is a protein category, which is defined by its enzymatic activity. These enzymes cleave β-lactam antibiotics, and thus, deactivate them. β-Lactams are the most important bactericides against human pathogens which mainly belong to the Enterobacteriaceae. β-Lactams share a structural similarity with D-alanyl-D-alanine, which is a component of the bacterial cell wall. It is involved in the molecular cross-linking of the bacterial murein by a peptidase. β-Lactams bind irreversibly to the peptidase, which provokes after a cascade of further reactions, bacterial cell lyses. More than 950 different naturally occurring β-lactamases are already known and divided into four phylogenetically different classes (A-D). Although they have a similar enzymatic activity, the catalytic sites and protein sequences differ strongly between these classes. One goal of this work was to obtain an overview of the distribution of β-lactamase genes in Austria's largest urban areas Vienna and Graz. For this purpose, clinical isolates taken from patients and phenotypically determined as β-lactamase-positive were analysed genetically. The first step was the creation of a β-lactamase DNA sequence database. Based on this data, 25 primer pairs were designed targeting the clinically most important β-lactamase genes. To double check, also 24 already published primer pairs were used in the analysis. All 33 clinical isolates from Graz and 108 from Vienna were analysed with these 49 primer pairs by PCR twice. The detected genes were amplified, sequenced and used for further statistical analyses. The Chao1, ACE and Rarefaction curve algorithms, which are widely used in ecology, have been applied in a clinical study for the first time. They were used to estimate the number of β-lactamase genes in the investigated hospitals. In the present study, a large number of genes have been described in Austria and Europe for the first time. Members of all four classes of β-lactamases were among the detected genes. The statistical analyses showed that the majority of β-lactamase genes in clinical isolates of Enterobacteriaceae were identified in the surveyed hospitals. The number of different β-lactamase genotypes could not be determined due to the high diversity among the genotypes. The second objective of this work was the development of a multiplex detection method. The immobilization of the PCR on a glass slide was an obvious approach for this purpose. A primer pair was covalently bound with a microarray spotter to a nonpolar surface. Based on this reaction environment, many different parameters such as reaction mixture, annealing temperature, primer sequence, product length, etc. were evaluated. The DNA was amplified on a glass surface successfully during the on-chip PCR, but it was not possible to determine parameters for specific amplification. Based on the experience obtained from on-chip PCR experiments, a multiplex ligation reaction with immobilized probes was developed. A newly developed type of probes (looplock probes) was compared with linear probes. Parameters that were essential for the specificity of the on-chip ligation reaction were studied systematically. The proof-of-principle with the new probes and the on-chip ligation reaction could be shown, but for routine use, further optimization of specificity is required. In addition to the tested surface-based methods, also a liquid phase multiplex detection method was developed based on padlock probes. These padlock probes were ligated in the presence of a target sequence resulting in single-stranded, circular DNA molecules. The ligated padlock probes were amplified in two successive rolling circle amplification reactions and then fluorescently labelled in a linear PCR. The labelled amplification products were detected with a microarray. With this method, nearly 100 different target sequences could be determined in parallel. An assay detecting all clinically important β-lactamase genes in a single reaction was developed. The assay was successfully evaluated with clinical isolates and produces results with excellent sensitivity and specificity. Compared to existing products on the market, the developed assay can detect three to four times more genes in parallel. In addition, it has a very high development potential because the detection of all antibiotic resistance genes in a single assay is possible with this method.