title: Secretome analysis of activated platelets
Creators: name: Böhm, Marie Lisa
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Thrombozyten sind kernlose Blutzellen, die an der Blutgerinnung und Wundheilung beteiligt sind und bei vielen hochrelevanten Krankheiten wie Krebs, COVID und Fettleibigkeit eine Rolle zu spielen scheinen. Nach ihrer Aktivierung können Thrombozyten eine Vielzahl von Molekülen mit hoher biologischer Wirksamkeit bilden und freisetzen, die auch an verschiedenen Krankheitsprozessen beteiligt sein können. Frühere Daten deuteten darauf hin, dass Thrombozyten aktiv Proteine synthetisieren können, obwohl sie keinen Zellkern besitzen. Ziel dieser Arbeit war es, bioaktive Moleküle zu identifizieren, die von aktivierten Blutplättchen freigesetzt werden, und weiter zu untersuchen, ob eine Neusynthese von Proteinen tatsächlich möglich ist. Eine Neusynthese von Proteinen würde das vielfältige funktionelle Repertoire von Plättchen gut erklären können. Darüber hinaus wurde das Proteom-Profiling durch ein Eicosanoid-Profiling ergänzt, da Eicosanoide ebenfalls potente Biomoleküle sind, die in extrem geringen Konzentrationen effektiv an einer Vielzahl von Wirkungen beteiligt sind. Da Thrombozyten sehr empfindlich auf jede Störung in ihrer Umgebung reagieren, war es notwendig, eine Methode zur schonenden Isolierung von Thrombozyten zu entwickeln, die eine vorzeitige Aktivierung verhindert. Dies ermöglicht die Herstellung geeigneter Kontrollproben im Vergleich zu den aktivierten Proben. Blutproben von vier gesunden Spendern wurden schonend, ohne Vakuumröhrchen durch freien Blutfluss aus der Vene in ein entsprechendes Probengefäß entnommen und die Thrombozyten durch Differenzialzentrifugations-Schritte konzentriert. Ein Aliquot pro Probe wurde nach einer Stunde Ruhezeit verarbeitet. Die beiden anderen Aliquote pro Probe wurden mit dem Ionophor Ionomycin aktiviert und 15 Minuten bzw. drei Stunden nach der Aktivierung weiterverarbeitet. Die Proteinproben wurden nach einem etablierten Protokoll verdaut und verarbeitet. Die Lipide wurden durch Festphasenextraktion extrahiert. Zur Kontrolle der Qualität der Identifizierung und Quantifizierung wurden interne Standards verwendet. Die Analyse wurde in dreifacher technischer Ausführung mit einem hochauflösenden Orbitrap-Massenspektrometer durchgeführt, der mit entsprechenden Hochleistungs-Chromatographie-Systemen gekoppelt waren. Die Auswertung der Proteomikdaten wurde durch bioinformatische Tools unterstützt. Die Auswertung der Lipidomics-Daten erforderte viele manuelle Auswertungsschritte. Die Ergebnisse zeigten erneut, dass Thrombozyten in der Lage sind, Proteine zu synthetisieren, und positive und negative regulatorische Ereignisse von Proteinen als Reaktion auf die Aktivierung aufweisen. Tatsächlich konnten viele Wachstumsfaktoren wie etwa PDGFA, PDGFB und VEGFC und EGF neben zahlreichen weiteren regulatorisch aktiven Proteinen im Sekretom nachgewiesen werden. Die herunterregulierenden Proteine scheinen die Aufgabe zu haben eine Eskalation der Blutgerinnung verhindern um unerwünschte thrombotische Ereignisse unterbinden. Die Suche nach Signallipiden ergab 26 Eicosanoide von denen 22 durch Aktivierung im Überstand signifikant hochreguliert wurden und die sowohl koagulationsfördernden als auch koagulationsinhibierenden Effekten zugeordnet werden konnten. Für die Bildung dieser Eicosanoide waren hautsächlich Cycloxygenasen und Lipoxygenasen verantwortlich, und die wichtigsten Enzymsubstrate waren Arachidonsäure, Eicosapentaensäure und Linolsäure. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Ziel, eine vorzeitige Aktivierung während der Thrombozytenisolation zu verhindern, erfolgreich erreicht wurde. Folglich konnte eine große Anzahl bioaktiver Moleküle identifiziert werden, die von Thrombozyten bei der Aktivierung freigesetzt werden und sowohl Proteine als auch Eicosanoide umfassen. Bemerkenswerterweise sind mehrere der identifizierten Moleküle dafür bekannt, dass sie überlebensfördernde Funktionen haben. Somit ist es plausibel, eine auch tumorpromovierende Funktion anzunehmen, die auch mit der biologischen Aufgabe der Wundheilung kompatibel ist. Die funktionelle Bedeutung von Blutplättchen bei so wichtigen Krankheiten wie etwa Krebs kann daher kaum überschätzt werden.
description: Platelets are anuclear blood cells, which are involved in hemostasis and wound healing and seem to be involved in a lot of highly relevant diseases, including cancer, COVID and obesity. Upon activation, platelets may form and release a lot of potent molecules involved in various disease processes. Previous data indicated that platelets might actively synthesize proteins although their lack of a cell nucleus. This work aimed to identify bioactive molecules released from activated platelets and further investigated whether new synthesis of proteins was indeed possible. In addition, proteome profiling was complemented with eicosanoid profiling, as eicosanoids are also potent biomolecules involved in a large range of effects. As platelets react highly sensitive to any disturbance in their environment it was necessary to develop a method for the gentle isolation of platelets avoiding premature activation. This allows the generation of suitable control samples in comparison to the activated ones. Blood samples of four healthy donors were collected and the platelets concentrated by differential centrifugation. One aliquot per sample was processed after one hour at rest. The other two aliquots per sample were activated with the ionophor ionomycin and collected 15 minutes and three hours after activation, respectively. The protein samples were digested and processed according to an established protocol. The lipids were extracted by solid phase extraction. To control the quality of the preparation and quantification, internal standards were used. The analysis was performed in technical triplicates, with a high resolution Orbitrap mass spectrometer. The evaluation of proteomics data was supported by bioinformatical tools. The lipidomics data evaluation required many more manual evaluation steps. The results again demonstrated that platelets are capable of synthesizing proteins and displayed positive and negative regulatory events of proteins in response to activation. The down-regulatory events may prevent an escalation of blood coagulation prohibiting unwanted thrombotic events. The search for signal lipids yielded 26 eicosanoids, 22 of which were found significantly upregulated and which could be assigned to different pathways. The molecules show pro- and anticoagulating properties. The results clearly indicated that the aim of preventing premature activation during platelet isolation was successfully achieved. Consequently, a large number of bioactive molecules released by platelets upon activation, comprising both proteins and eicosanoids, was successfully identified. Remarkably, several of the identified molecules are known to have pro-survival functions. Thus, the functional implications of platelets in various diseases might have been rather under-estimated.