title: The role of Stat1 serine phosphorylation in Stat1 transcriptional activity
Creators: name: Pfaffenwimmer, Thaddäus
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Interferone regulieren Immunantworten nach viralen und bakteriellen Infektionen indem sie die sogenannten JAK/Stat Signaltransduktionswege aktivieren. Im Laufe dieser Signalübertragung werden signal transducers and activators of transcription (Stats) Tyrosin-phosphoryliert, sie translozieren in den Nukleus, binden dort an spezielle DNA Sequenzen und aktivieren schließlich die Transkription spezieller Zielgenen. Neben der zwingend erforderlichen Tyrosin-Phosphorylierung der Stat-Proteine wurde eine zweite Phosphorylierungsstelle, ein hoch konserviertes Serin innerhalb der Transaktivierungsdomäne der Stats, identifiziert. Für Stat1 konnte gezeigt werden, dass diese Serin-Phosphorylierung für eine maximale Aktivierung der Interferon gamma abhängigen Immunantwort in Mäusen notwendig ist. Ergebnisse aus unserem Labor zeigten, dass Stat1 Tyrosin-phosphoryliert und in einem nuklären Transkriptionskomplex integriert sein muss, um an dem besagten Serin phosphoryliert werden zu können. Die genauen Auswirkungen der modulierenden Serin-Phosphorylierung auf die Expression individueller Stat1 Zielgene als auch die Kinase, die diese Phosphorylierung vermittelt, sind nicht bekannt. Im ersten Teil meiner Diplomarbeit zeigten Kinetikstudien, welche an embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) durchgeführt wurden, dass die Abhängigkeit der Aktivierung individueller Stat1 Zielgene von der Stat1 Serin727-Phosphorylierung in Interferon Antworten unterschiedlicher Natur ist. Interessanterweise konnte in Chromatinimmunopräzipitationen gezeigt werden, dass das Erscheinen von Stat1 an den Promotoren der untersuchten Zielgene dem Aufkommen von phoshoserin-Stat1 zeitlich vorhergeht. Dies ist im Einklang mit Studien die postulieren, dass Stat1 nur Serin-phosphoryliert werden kann wenn es an Chromatin gebunden vorliegt. Zukünftige Arbeiten werden das Ziel haben, die Unterschiede in den Promotern einzelner Zielgene zu analysieren um herauszufinden, was diese Differenzen für die Serinabhängigkeit der Expression dieser Gene aussagen. Der zweite Teil meiner Arbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung der Kinase, welche die Stat1 Serin-Phosphorylierung vermittelt, und der Fragen, ob andere Mitglieder der Stat-Familie von den gleichen Kinasen wie Stat1 Serin-phosphoryliert werden. Inhibitorstudien in humanen Zellen und Mauszellen konnten zeigen, dass Flavopiridol, ein Cyclin-abhängiger Kinase (CDK) Inhibitor der eine erhöhte Wirksamkeit gegen nukleäre CDKs aufweist, die Serin-Phosphorylierung von Stat1 und Stat3 in Gamma-Interferon und IL-6 Antworten verhindern konnte, ohne die vorangehende Tyrosin-Phosphorylierung zu beeinflussen. Aufgrund der hohen Konservierung des phosphorylierbaren Serins innerhalb der einzelnen Mitglieder der Stat-Familie implizieren die erhaltenen Resultate, dass mehrere Stat-Proteine von derselben Gruppe an Kinasen Serin-phosphoryliert werden.
description: Interferons (IFNs) regulate immune responses upon viral and bacterial infections by triggering the JAK/Stat signaling pathway. In these signaling responses, signal transducers and activators of transcription (Stats) become tyrosine phosphorylated, translocate into the nucleus, bind to DNA and activate transcription of individual target genes. Besides the mandatory tyrosine phosphorylation of Stat proteins, a second phosphorylation at a serine residue, located in a conserved consensus sequence inside their transactivation domain, was discovered. It was shown that for Stat1 this serine phosphorylation is required for full fledged IFN-γ dependent innate immunity in mice. The results from the work done in our lab revealed that Stat1 has to be tyrosine phosphorylated and assembled into transcriptional complexes to become S727 phosphorylated. However, the effect of this modulating serine phosphorylation on the expression of individual Stat1 targets genes and the kinase responsible for this modification have not been characterized yet. In the first project of my diploma thesis time course studies in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) revealed that individual Stat1 target genes vary in their dependence on Stat1 S727 phosphorylation for full transcriptional activation in interferon gamma responses. Furthermore, chromatin immunoprecipitation assays in MEFs showed that Stat1 binding to its target promoters precedes the appearance of serine phosphorylated Stat1. This is being consistent with publications stating that Stat1 gets serine phosphorylated once it is bound to chromatin. Future studies will have to clarify how the promoters of individual Stat1 target genes differ and how these differences affect the dependence on Stat serine phosphorylation for full transcriptional activation. The second objective of this thesis was to identify the kinase mediating Stat1 S727 phosphorylation and to clarify whether other Stat members than Stat1 are also serine phosphorylated by the same subset of enzymes. Inhibitor studies in human and murine cells using Flavopiridol, a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor with increased specificity for nuclear CDKs, revealed that Stat1 and Stat3 serine phosphorylation was abolished by Flavopiridol in interferon gamma and IL-6 responses, respectively. However, the precedent tyrosine phosphorylation was not affected. Due to the highly conserved serine phosphorylation site inside the transactivation domain across all the Stat members, these findings implicate that more Stat proteins than Stat1 and Stat3 are phosphorylated by the same subset of kinases.