title: Investigations on the use of nanoparticular vector systems for the transfection of immun and alveolar cells with therapeutic DNAzymes
title: Untersuchungen zum Einsatz nanopartikulärer Trägersysteme zur Transfektion von Immun- und Alveolarzellen mit therapeutischen DNAzymen
title: Untersuchungen zum Einsatz nanopartikulärer Trägersysteme zur Transfektion von Immun- und Alveolarzellen mit therapeutischen DNAzymen
Creators: name: Paul, Christoph
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Zellkultur
Medizin, Gesundheit
Lung
Transfektion
DNAzym
Tran sfektion
Lunge
Allergisches Asthma
Asthma
DNAzyme
Immunsystem
Transfection

description: Asthma bronchiale gehört weltweit
      zu den häufigsten chronischen Lungenerkrankungen. Eine
      wichtige Rolle in der Pathogenese des allergischen Asthmas
      spielen T-Helferzellen (TH2) für deren Differenzierung und
      Aktivierung der Transkriptionsfaktor GATA-3 essentiell ist.
      Durch lokale Applikation eines GATA-3 mRNA spaltenden DNAzyms
      - ein DNA-Oligonukleotid mit katalytischer Aktivität - konnte
      im Tiermodell ein Asthma Phänotyp bereits erfolgreich
      therapiert werden. Die Aufnahme der DNAzym-Moleküle in ihre
      Zielzellen ist jedoch auf Grund ihrer Ladung und Größe
      herausfordernd, so dass in der vorliegenden Arbeit der Frage
      nachgegangen wurde, ob natürliches Surfactant oder künstliche
      Vektoren die Aufnahme und somit die Wirksamkeit von GATA-3
      spezifischen DNAzymen verbessern können. Zur Untersuchung in
      vitro setzten wir dafür ein fluoreszenzmarkiertes DNAzym ein,
      dessen Aufnahme in verschiedene Zelllinien unter Einfluss von
      Surfactant sowie Polyethylenimin (PEI) und
      Polyethylenimin-Polyethylenglycol (PEI-PEG) Polymeren
      durchflusszytometrisch analysiert wurde. Zwei verschiedene
      Surfactant-Präparationen (Alveofact®, Curosurf®) führten
      dabei in verschiedenen Versuchsaufbauten zu keiner
      Veränderung der Aufnahme - unsere Ergebnisse liefern somit
      keinen Hinweis auf die in der Literatur vertretene Hypothese,
      Surfactant verbessere die Aufnahme von DNA in vitro. Die
      eingesetzten PEI und PEI-PEG Moleküle hingegen führten zu
      einer effizienten Transfektion des DNAzyms. Alle PEI-PEG
      Polymere zeigten dabei eine deutlich geringere Zytoxizität
      als unmodifiziertes PEI. Das PEI(25kDa)-g-PEG(5kDa)4 Molekül
      mit vier 5 kDa PEG-Seitenketten zeigte unter den untersuchten
      PEI-PEG Molekülen die höchste Transfektionseffizienz, so dass
      dieses für einen initialen in vivo Versuch ausgewählt wurde.
      In diesem Experiment wurde Mäusen mit einem experimentell
      induzierten Asthma Phänotyp einmal täglich über vier Tage
      parallel zur lokalen Allergenprovokation ein Komplex aus
      GATA-3 spezifischem DNAzym und PEI-PEG Polymer intratrachael
      verabreicht. Dieses Protokoll führte jedoch zu einer
      schweren, bei einigen Tieren sogar letalen Entzündung der
      Lunge. Der Effekt war dabei abhängig von der Menge des
      verabreichten Polymers und am ausgeprägtesten in den Tieren,
      die unkomplexiertes PEI-PEG ohne DNAzym erhielten. Die von
      uns untersuchten DNAzym/PEI-PEG Komplexe erwiesen sich,
      ähnlich wie bereits beschriebene siRNA/PEI-PEG Komplexe, als
      effektive Vektoren in vitro. Die beobachteten Nebenwirkungen
      in vivo deuten jedoch auf eine nicht unerhebliche Toxizität
      dieser Komplexe hin. Da für den Einsatz in der chronischen
      Erkrankung Asthma bronchiale von längeren Therapiezeiträumen
      auszugehen ist, sind dafür jedoch besonders gut verträgliche
      therapeutische Systeme erforderlich. Daher muss die weitere
      Entwicklung von Vektorsystemen für die lokale Applikation
      nukleinsäure-basierter Therapeutika zum Ziel haben, die
      toxischen Eigenschaften dieser Komplexe bei gleichen oder gar
      noch weiter verbesserten in vivo Transfektionseffizienzen
      signifikant zu reduzieren.
description: Bronchial Asthma is one of the
      most common chronic pulmonary diseases worldwide. T-helper
      cells (TH2) have been shown to play a central role in the
      pathogenesis of allergic asthma. Differentiation and
      activation of TH2 cells necessarily depends on the
      transcription factor GATA-3. It has been shown that local
      administration of a GATA-3 mRNA cleaving DNAzyme – a
      DNA-oligonucloetide with inherent catalytic activity – may
      significantly improve an asthmatic phenotype in mice.
      However, effective administration of “naked” DNAzymes
      represent a challenge since their cellular uptake is hindered
      by size and anionic character of the molecules. Hence, it was
      the goal of the present work to investigate whether natural
      surfactant or artificial vectors could improve DNAzyme uptake
      and thereby the therapeutic efficacy of this type of novel
      drugs. In our in vitro experimental setup using different
      cell lines we analysed the uptake of a fluorochrome-labelled
      DNAzymes by flow cytometry under the influence of surfactant,
      Polyethylenimine (PEI) and Polyethylenimine-Polyethylene
      glycol (PEI-PEG) polymers. The two investigated surfactant
      preparations Alveofact® and Curosurf® did not influence
      DNAzyme uptake in our experiments. Consequently, our data do
      not support the hypothesis that surfactant could improve the
      uptake of DNA-based molecules in vitro. We did however
      observe an effective transfection of cells when PEI or
      PEI-PEG polymers were applied in the same experimental setup.
      All PEI-PEG polymers showed significantly less cytotoxicity
      compared to the unmodified PEI molecules. Among the PEI-PEG
      polymers PEI(25kDa)-g-PEG(5kDa)4 with four 5 kDa PEG side
      chains proved to be the most efficient vector, and was
      therefore selected for an initial in vivo experiment. Mice
      with an experimentally induced allergic asthma phenotype were
      treated intratracheally with a complex of GATA-3 specific
      DNAzyme and PEI-PEG polymer once daily over a period of 4
      days during the time of local allergen challenge.
      Unfortunately, this treatment regime led to severe, in
      several animals even fatal, lung inflammation. This effect
      depended on the administered polymer dose, and was most
      pronounced in animals treated with uncomplexed PEI-PEG
      without DNAzyme. Taken together, the investigated
      DNAzyme/PEI-PEG complexes – similar to effects already known
      for siRNA/PEI-PEG complexes - proved to be efficient
      transfection vectors in vitro. The observed adverse reactions
      in vivo however, suggest a significant toxic potential of
      these complexes. As the chronic disease condition bronchial
      asthma is expected to require long-term treatments,
      toxicologically safe systems are an absolute prerequisite for
      novel therapeutic options. Thus, future development of vector
      systems for an effective local application of nucleic
      acid-based drugs must aim at a significant reduction of toxic
      properties of such complexes paralleled by comparable or even
      improved transfection efficacies.