title: Molecular biological and biochemical investigations on the biosynthetic enzymes of prenylated indole alkaloids from fungi
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Enzymen in der Biosynthese von prenylierten Indolalkaloiden aus Pilzen
Creators: name: Yu, Xia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: enzyme catalysis
Indolalkaloide , Katalyse
prenylated derivative
Biowissenschaften, Biologie
indole prenyltransferase
biosynthesis
Dimethylallyl-Transferase

description: Prenylierte Indolalkaloide sind
      ubiquitär in Pflanzen, Bakterien und Pilzen verbreitet, vor
      allem in den Familien Clavicipitaceae und Trichocomaceae der
      Ascomyceten. Gemeinsam weisen sie interessante biologische
      und pharmazeutische Aktivitäten auf. Bei der Biosynthese von
      Indolalkaloiden ist die Prenylierung durch Prenyltransferasen
      maßgeblich für die hohe Strukturvielfalt dieser Substanzen in
      der Natur verantwortlich. Biochemische Untersuchungen zu
      Indolprenyltransferasen können helfen, die Entstehung von
      prenylierten Indolalkaloiden in der Natur zu verstehen.
      Außerdem können Indolderivate und anderen Substanzen durch
      Prenyltransferasen modifiziert werden. Drei
      Indolprenyltransferasen der Dimethylallyltryptophan Synthase
      (DMATS) Superfamilie wurden biochemisch identifiziert und in
      vitro charakterisiert, diese beinhalteten CdpC3PT aus
      Neosartorya fischeri (N. fischeri), BrePT aus Aspergillus
      versicolor (A. versicolor) und 5-DMATS aus Aspergillus
      clavatus (A. clavatus). Die verantwortlichen Gene cdpC3PT und
      brePT wurden jeweils in einen Expressionsvektor kloniert und
      heterolog in Escherichia coli (E. coli) exprimiert. Diese
      Arbeiten wurden von Dr. Wen-Bing Yin, Suqin Yin und Qing Wang
      durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurde
      herausgefunden, dass CdpC3PT die Entstehung von
      C3-prenylierten Produkten mit einem charakteristischen
      6/5/5/6-tetrazyklischen Ringsystem aus tryptophan-haltigen
      zyklischen Dipeptiden in einem Reaktionsschritt katalysiert.
      Das NotF-Homolog BrePT zeigte eine sehr viel höhere
      Flexibilität gegenüber seinen aromatischen Substraten im
      Vergleich zu NotF. Dabei konnte eine hohe Regiospezifität
      einer reversen Prenylierung an Position C-2 des Indolrings
      nachgewiesen werden. Bei der Charakterisierung von 5-DMATS
      wurde die Klonierung von Yan Liu durchgeführt. Im weiteren
      Verlauf dieser Arbeit erfolgte meinerseits die Aufklärung der
      Genfunktion durch heterologe Expression in E. coli und die
      anschließende Strukturaufklärung der Enzymprodukte mit Hilfe
      von Massenspektrometrie (MS) und Kernresonanzspektroskopie
      (NMR). 5-DMATS katalysiert eine regiospezifische Prenylierung
      von Indolderivaten an Position C-5. Aufgrund der enormen
      Bedeutung der Prenylierung an der Strukturvielfalt und damit
      der biologischen Aktivität, wurden CdpC3PT, BrePT, 5-DMATS
      und andere bekannte Prenyltransferasen der DMATS-Superfamile
      zur chemoenzymatischen Synthese von prenylierten Substanzen
      verwendet. Durch Einsatz von AnaPT, CdpC3PT und CdpNPT,
      konnten jeweils acht und sechs Stereoisomere von
      cis-konfigurierten prenylierten
      Pyrroloindolin-Diketopiperazinen von cyclo-Trp-Ala und
      cyclo-Trp-Pro Isomeren produziert werden. Die
      Stereospezifität von AnaPT und CdpC3PT hängt dabei
      hauptsächlich von der Konfiguration der Tryptophaneinheit in
      cyclo-Trp-Ala und cyclo-Trp-Pro Isomeren ab. Im Vergleich
      dazu, zeigte CdpNPT eine geringere Stereoselektivität, aber
      eine höhere Umsetzungsrate gegenüber den getesteten
      Substraten. Weiterführend wurden 5-DMATS und FgaPT2 für die
      chemoenzymatische Synthese von prenylierten Indolcarbazolen
      eingesetzt. Die Rekonstruktion der Enzymaktivität von 5-DMATS
      und FgaPT2 in vitro zeigte, dass sie in der Lage sind, die
      regiospezifische Prenylierung von Indolcarbazolen an der
      para-Position des N-Atoms zu katalysieren. Dies ist der erste
      Bericht über derartige prenylierte Indolcarbazole.
      Desweiteren konnte auch die Akzeptanz einiger
      Hydroxynaphthalene und Flavonoide durch
      Indolprenyltransferasen der DMATS Superfamilie nachgewiesen
      werden, wobei diese eigentlich Substrate der Enzyme der
      CloQ/NphB-Gruppe, oder der UbiA-Superfamilie darstellen. Neun
      prenylierte Flavonoide und zwanzig prenylierte
      Hydroxynaphthalene wurden isoliert und deren Strukturen
      anschließend durch MS- und NMR-Analysen aufgeklärt. Dabei
      konnte festgestellt werden, dass für ein akzeptiertes
      Hydroxynaphthalen, unterschiedliche Enzyme das gleiche
      prenylierte Hauptprodukt produzieren, natürlich mit einer
      regulären C-Prenylierung an para- oder ortho-Position zu
      einer Hydroxygruppe. Bei Flavonoiden, welche von 7-DMATS
      akzeptiert wurden, war Position C-6 zwischen zwei
      Hydroxygruppen die bevorzugte Prenylierungsstelle. Die
      erhaltenen Michaelis-Menten Konstanten (KM) und die
      Wechselzahlen (kcat) einiger Prenyltransferasen für
      ausgewählte Hydroxynaphthalene waren vergleichbar mit denen
      von Indolderivaten. Ergänzend zu Prenyltransferasen wurden
      noch weitere Gene aus einem putativen Biosynthesecluster für
      ein prenyliertes Indolalkaloid, das Hexadehydroastechrom
      (HAS) untersucht. Ein putatives O-Methyltransferasegen hasC
      und ein putatives Cytochrome P450-Gen hasH, welche in dessen
      Biosynthese in Aspergillus fumigatus (A. fumigatus)
      involviert sind. Sie wurden jeweils in die
      Expressionsvektoren pQE60 und pESC-URA kloniert. Das lösliche
      His6-HasC wurde erfolgreich in E.coli SG13009 überexprimiert
      und über Ni-NTA aufgereinigt. Konstrukte für die
      Co-Expression mit dem Reduktasegen NFIA_083630 aus N.
      fischeri in pESC-URA und für die Expression als
      His6-getaggtes Protein in pESC-URA wurden auch für das
      putative Cytochrome P450-Gen hasH angefertigt.
description: Prenylated indole alkaloids are
      widely distributed in plants, fungi and bacteria, especially
      in the family of Clavicipitaceae and Trichocomaceae of
      Ascomycota, and commonly exhibit interesting biological and
      pharmaceutical activities. In the biosynthetic pathway of
      prenylated indole alkaloids, prenylation catalyzed by
      prenyltransferases contributes significantly to the large
      structure diversity of these compounds in nature.
      Investigation on indole prenyltransferases would help to
      understand the construction of prenylated indole alkaloids in
      nature and also be useful for structural modification of
      indole derivatives and other substances to produce analogues
      of prenylated derivatives. Three indole prenyltransferases
      belonging to the dimethylallyltryptophan synthase (DMATS)
      superfamily were biochemically identified and characterized
      in vitro, including CdpC3PT from Neosartorya fischeri (N.
      fischeri), BrePT from Aspergillus versicolor (A. versicolor)
      and 5-DMATS from Aspergillus clavatus (A. clavatus). The
      responsible genes cdpC3PT and brePT were cloned into
      expression vector and heterologously expressed in Escherichia
      coli (E. coli). These works were carried out by Dr. Wen-Bing
      Yin, Suqin Yin and Qing Wang, respectively. In this thesis,
      CdpC3PT was confirmed to catalyze the formation of
      C3-prenylated products with a characteristic 6/5/5/6-fused
      tetracyclic ring system from tryptophan-containing cyclic
      dipeptides in one-step reaction. The NotF homologue BrePT
      showed much higher flexibility towards its aromatic
      substrates than NotF, and was proven to catalyze the highly
      regiospecific reverse prenylation at C-2 of the indole
      nucleus. The cloning of 5-dmats was carried out by Yan Liu.
      Functional proof of this gene was provided within this thesis
      by heterologous expression in E. coli and subsequent
      structure elucidation of enzyme products by mass spectrometry
      (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) analyses. 5-DMATS
      established high regiospecific activity to catalyze
      C5-prenylation on indole derivatives. Given the importance of
      prenylation in structure diversity and bioactivity
      enhancement, CdpC3PT, BrePT, 5-DMATS and other known
      prenyltransferases of the DMATS superfamily were applied for
      the chemoenzymatic synthesis of prenylated compounds. By
      using AnaPT, CdpC3PT and CdpNPT, eight and six stereoisomers
      of cis-configured prenylated pyrroloindoline
      diketopiperazines from cyclo-Trp-Ala and cyclo-Trp-Pro
      isomers were produced, respectively. The stereospecificity of
      AnaPT and CdpC3PT depended mainly on the configuration of
      tryptophanyl moiety in cyclo-Trp-Ala and cyclo-Trp-Pro
      isomers, while CdpNPT showed lower stereoselectivity, but
      higher conversion ability towards most tested substrates.
      5-DMATS and FgaPT2 from Aspergillus were used for
      chemoenzymatic synthesis of prenylated indolocarbazoles.
      Reconstitution of enzyme activity of 5-DMATS and FgaPT2 in
      vitro revealed that they catalyzed regiospecific prenylation
      of indolocarbazoles at the para-position of the indole
      N-atom. This is the first report for prenylated
      indolocarbazoles. Subsequently, some indole
      prenyltransferases of the DMATS superfamily were found to
      accept also hydroxynaphthalenes and flavonoids, which were
      substrates for enzymes from the CloQ/NphB group and the UbiA
      superfamily, respectively. Nine prenylated flavonoids and
      twenty prenylated hydroxynaphthalenes have been isolated, and
      their structures were elucidated by MS and NMR analyses. It
      has been shown that, for an accepted hydroxynaphthalene,
      different enzymes produced usually the same major prenylated
      product, i.e. with a regular C-prenyl moiety at para- or
      ortho-position to a hydroxyl group. For flavonoids accepted
      by 7-DMATS, C-6 between two hydroxyl groups was the favorable
      prenylation position. The Michaelis-Menten constants (KM) and
      turnover numbers (kcat) of some prenyltransferases towards
      selected hydroxynaphthalenes are comparable to those obtained
      by using indole derivatives. In addition to indole
      prenyltransferases, other genes in the biosynthetic cluster
      of prenylated indole alkaloids were also investigated. A
      putative O-methyltransferase gene hasC and a putative
      cytochrome P450 gene hasH involved in the biosynthesis of
      hexadehydroastechrome (HAS) in Aspergillus fumigatus (A.
      fumigatus) were cloned into pQE60 and pESC-URA, respectively.
      Soluble His6-HasC was successfully overproduced in E. coli
      SG13009 and purified to near homogeneity by Ni-NTA.
      Constructs for co-expression with the reductase gene
      NFIA_083630 from N. fischeri in pESC-URA and for expression
      as His6-tagged protein in pESC-URA were also prepared for the
      putative cytochrome P450 gene hasH.