Παραγωγή των φυκοερυθρινών από το βακτήριο T. thermophilus HB8 κάτω από έλλειψη σιδήρου και καθαρισμός τους.:
Creators: name: Τσιακίρη, Ελένη Παναγιώτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Φυκοερυθρίνη
Φυκομπιλλινοπρωτεΐνη
Φυκομπιλλινόσωμα
Phycoerythrin
Phycobillinoprotein
Phycobillinosome

description: Tο βακτήριο T. thermophilus HB8 όταν αναπτυχτεί σε συνθήκες έλλειψης σιδήρου και μέσα ανάπτυξης που περιέχουν πηγή άνθρακα το ηλεκτρικό η το κιτρικό νάτριο, παράγει σιδηροφορείς, και μια σιδηρο-θειούχο πρωτεΐνη, τη φυκοερυθρίνη, η οποία συμμετέχει σε ένα αποτελεσματικό μηχανισμό δέσμευσης της ηλιακής ακτινοβολίας, το φικομπιλλινόσωμα. Στα φωτοσυνθετικά βακτήρια Synechostis και Synechococcus, το φικομπιλλινόσωμα αποικοδομείται σε συνθήκες έλλειψης σιδήρου και επάγεται η σύνθεση μιας πρωτεΐνης, της IsiA, η οποία δεσμεύει χλωροφύλλη Α και συσχετίζεται με τη βιοσύνθεση των σιδηροφορέων . Το εξωκυττάριο υγρό καλλιεργειών T. thermophilus HB8, που πραγματοποιήθηκαν στις αντίστοιχες πηγές άνθρακα, καθαρίστηκε κατάλληλα και εκχυλίστηκαν οι σιδεροφορείς. Η ύπαρξη των σιδηροφορέων πυοβερντίνη και πυοχελίνη πιστοποιήθηκε, με χρωματομετρικές μεθόδους (αποχρωματισμός διαλύματος CAS, μέθοδοι Atkins και Arnow), και με φασματοσκοπία εκπομπής φθορισμού. Η ύπαρξη της φυκοερυθρίνης ένας από τους κύριους επίσης μεταβολίτες στο εξωκυττάριο υγρού πιστοποιήθηκε από την έντονη κορυφή στα 580 nm σε φάσματα εκπομπής φθορισμού. Από το εξωκυττάριο υγρό με ηλεκτροφόρηση κάτω από μη αποδιατακτικές συνθήκες (native electrophoresis) απομονώθηκε πρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες αναλύθηκε στη φυκοερυθρίνη εφόσον οι πρωτεϊνικές ζώνες στα 10 kDa και 6 kDa αφορούν τις υπομονάδες των φυκοερυθρινών, που φέρουν τη χρωμοφόρο ομάδα (φυκομπιλλίνες), ενώ η ζώνες στα 63 kDa, 35 kDa, 28 kDa ανήκουν σε πρωτεΐνες συνδέσμους που βοηθούν στη συγκρότηση του φικομπιλλινοσώματος. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε καθαρισμός των φυκοερυθρινών από το εξωκυττάριο υγρό καλλιέργειας και το ενδοκυττάριο εκχύλισμα κυττάρων Τ. thermophilus που αναπτύχθηκαν με πηγή άνθρακα το ηλεκτρικό νάτριο. Ο καθαρισμός σε κάθε στάδιο ελέγχονταν με το λόγο Α562/Α280 και Α542/Α280, εφόσον οι φυκοερυθρίνες παρουσιάζουν έντονη απορρόφηση στα 562 nm, στο φάσμα υπεριώδους-ορατού, αλλά σε παλαιές καλλιέργειες η απορρόφηση τους πέφτει στα 542 nm. Μετά από ηλεκτροφόρηση κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) της καθαρισμένων φυκοερυθρινών πραγματοποιήθηκε χρώση της πηκτής με οξικό ψευδάργυρο, ειδική βαφή για τη χρωμοφόρο ομάδα των φυκοερυθρινών που υπό το φως λυχνίας υπεριώδους εμφανίζει πορτοκαλί φθορισμό. Παρατηρήθηκαν δύο πορτοκαλί φθορίζουσες ζώνες στα 6 και στα 10 kDa που αντιστοιχούν στη α υπομονάδα των φυκοερυθρινών. Παράλληλα η χρώση των πρωτεϊνών της πηκτής με Coomassie Brilliant Blue εμφάνισε πλην των χαρακτηριστικών ζωνών στα 6 και 10 kDa και μία ζώνη στα 30 kDa, που συνήθως αντιστοιχεί σε πεπτίδιο σύνδεσμο του φυκομπιλλινοσώματος.
description: The thermophilic bacterium T. thermophilus HB8 when grown in growth media containing as carbon source sodium succinate or sodium citrate, under conditions of iron deficiency, produce siderophores and an iron-sulfur protein, phycoerythrin. Phycoerythrin constitutes part of a protein complex called phycobillinosome and participates in an effective binding mechanism of solar radiation. In photosynthetic bacteria Synechocystis and Synechococcus, the phycobillinosome is degraded under iron deficiency conditions and induced the synthesis of a protein of IsiA, which binds chlorophyll A, and is associated with the biosynthesis of siderophores. The extracellular fluid of T. thermophilus HB8 cultures, grown in the respective carbon sources, was removed and extracted properly for siderophore recovery. The presence of siderophores pyoverdine and pyochelin was identified by colorimetric methods, and fluorescence emission spectroscopy. The existence of phycoerythrin, one of the main metabolites, was confirmed by the strong peak at 580 nm in fluorescence emission spectra. A protein complex was also isolated from the extracellular fluid, by electrophoresis under non-denaturing conditions. Under denaturing conditions, the protein complex was analyzed in two protein bands at 10 kDa and 6 kDa related to phycoerythrin subunits, bearing the chromophore group (phycobillines), while the protein bands at 63, 35, and 28 kDa belong possibly to protein-linkers involved in the formation of phycobillinosome. Phycoerythrins were isolated from the extracellular medium and the intracellular cell extract of T. thermophilus, grown in sodium succinate. Purification steps of phycoerythrin were controlled by the ratio of A562/A280 and A542/A280, since phycoerythrin show strong absorption at 562 nm, in the UV-visible spectrum. In old cultures the absorption drops to 542 nm. After electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE) of purified phycoerythrin, the gel was stained with zinc acetate; a special dye for the chromophore group of phycoerythrin, which displays orange fluorescence. Two orange fluorescent bands at 6 and 10 kDa were observed under UV light due to the presence of chromophore, corresponding to the subunits of phycoerythrin. Similarly, the protein staining of the gel with Coomassie Brilliant Blue showed the characteristic subunits of phycoerythrin at 6 and 10 kDa and a band at 32 kDa, which usually corresponds to a peptide link of phycobillinosome.