Επιδημιολογική μελέτη και γενετική διερεύνηση της μικροβιακής αντοχής της Escherichia Coli στις κινολόνες
Creators: name: Βασιλάκη, Ολγα Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Κολοβακτηρίδιο
Κινολόνες
Μικροβιακή αντοχή
Μοριακή επιδημιολογία
Escherichia coli
Quinolones
Bacterial resistance
Molecular epidemiology

description: Ο έλεγχος των νοσοκομειακών λοιμώξεων που προκαλούνται από Gram αρνητικά βακτηρίδια απασχολεί τα τελευταία χρόνια όλες τις ανεπτυγμένες χώρες ιδιαίτερα μετά την εισαγωγή νέων, ευρέως φάσματος αντιβιοτικών. Από τα βακτήρια αυτά, η E. coli (κολοβακτηρίδιο), που αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου, πρωταγωνιστεί στις λοιμώξεις των νοσηλευόμενων στα νοσοκομεία όσο και σε ασθενείς της κοινότητας. Είναι ένα κοινό βακτηρίδιο που προκαλεί κυρίως λοιμώξεις του ουροποιητικού συστήματος, ωστόσο ευθύνεται και για πολλές άλλες νόσους από όλα τα συστήματα ακόμη και με βαρύτερη κλινική εικόνα ιδιαίτερα σε βρέφη και ηλικιωμένους ή εξασθενημένα άτομα. Οι κινολόνες είναι χημειοθεραπευτικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες ευρέως φάσματος με καλή φαρμακοκινητική και φαρμακοδυναμική. Πλεονεκτούν μεταξύ των αντιμικροβιακών παραγόντων σε κλινική χρήση, διότι αναστέλλουν ταχύτητα τη σύνθεση του μικροβιακού DNA, με αποτέλεσμα το θάνατο του βακτηριακού κυττάρου σε βραχύ χρόνο. Διατηρούν την καλή δραστικότητα έναντι των Gram αρνητικών και άτυπων βακτηρίων, αλλά το φάσμα τους διευρύνεται με κάλυψη και των Gram θετικών. Οι κινολόνες χορηγούνται πολύ συχνά για τη θεραπεία διαφόρων λοιμώξεων από E. coli. Η καλή δράση τους τόσο στην αντιμετώπιση ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων, όσο και σε λοιμώξεις σε ασθενείς της κοινότητας οδήγησε στην υπέρμετρη συνταγογράφηση και κατάχρηση. Αυτά τα υψηλά επίπεδα χρήσης, οδήγησαν στην ταχεία ανάπτυξη αντοχής στις κινολόνες, ακόμη και στην E. coli που θεωρείται ευαίσθητο βακτήριο. Ο πιο κοινός μηχανισμός αντοχής της E. coli στις κινολόνες είναι οι μεταλλάξεις στα γονίδια αντοχής gyrA και parC που κωδικοποιούν τη DNA γυράση και τη DNA τοποϊσομεράση IV αντίστοιχα. Ένας δεύτερος μηχανισμός είναι η ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων qnr που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη qnr, η οποία προστατεύει την DNA γυράση από τη δράση των κινολονών. Τέλος η μειωμένη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης του βακτηριακού κυττάρου και η απορύθμιση των αντλιών ενεργητικής εκροής είναι μηχανισμοί που ευθύνονται σπανιότερα. Η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό την ανεύρεση και καταγραφή ανθεκτικών στη σιπροφλοξασίνη στελεχών E. coli καθώς και τη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών αντοχής. Επιπλέον με την εφαρμογή των μοριακών μεθόδων τυποποίησης έγινε μοριακή επιδημιολογική ανάλυση των ανθεκτικών στελεχών, ώστε να προσδιοριστεί πιθανή κλωνική συγγένεια μεταξύ αυτών. Τέλος έγινε έλεγχος επίσης της παρουσίας ESBLs στα στελέχη της μελέτης λόγω της συχνής συνύπαρξης πλασμιδιακών γονιδίων αντοχής στις κινολόνες με εκτεταμένου φάσματος β-λακταμάσες (ESBLs). Για το λόγο αυτό εξετάσθηκαν 114 στελέχη E. coli τα οποία απομονώθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύθηκαν ή προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία σε τέσσερα ελληνικά Νοσοκομεία Βορείου και Κεντρικής Ελλάδας κατά τη χρονική διάρκεια περιόδου Απρίλιος 2005- Ιούλιος 2007. Από τον προσδιορισμού της ελάχιστης ανασταλτικής πυκνότητας (MIC) της σιπροφλοξασίνης σε όλα τα απομονωθέντα κλινικά στελέχη προέκυψε ότι τα 75 (65,7%) παρουσίασαν υψηλού βαθμού αντοχή στη σιπροφλοξασίνη με MIC ≥ 32 μg/ml. Τα 114 ανθεκτικά στη σιπροφλοξασίνη στελέχη της E. coli ελέχθηκαν επιπλέον για την αντοχή τους σε σειρά αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση των λοιμώξεων που οφείλονται στην E. coli. Ιδιαίτερα υψηλά ήταν τα ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη 90,3%, ενώ σημαντικά ήταν και τα ποσοστά αντοχής 47,3% στην αμοξυκιλλίνη/κλαβουλανικό και 38,5% στην κεφαμανδόλη. Επίσης ο φαινοτυπικός έλεγχος με E-test για την παραγωγή ESBL έδειξε ότι το 12,2% των στελεχών της μελέτης παράγει β-λακταμάσες. Με τη δοκιμασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) έγινε ανίχνευση και ταυτοποίηση τόσο των χρωμοσωμικών γονιδίων gyrA και parC, όσο και των πλασμιδιακών γονιδίων αντοχής qnr. Στη συνέχεια με την αλληλούχιση και σύγκριση των προϊόντων της PCR με πρότυπα στελέχη που είναι καταχωρημένα στην Τράπεζα Γονιδιακών Πληροφοριών, αποδείχθηκε ότι η αντοχή στη σιπροφλοξασίνη σε όλα τα στελέχη οφειλόταν σε μεταλλάξεις των γονιδίων αντοχής gyrA και parC. Επίσης με την αλληλούχιση των προιόντων PCR, αποδείχθηκε ότι η αντοχή στη σιπροφλοξασίνη, στα 11 από τα 114 στελέχη (9,64%) οφειλόταν στην ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων αντοχής qnrS1. Ο έλεγχος της δυνατότητας μεταβίβασης της αντοχής στη σιπροφλοξασίνη στα θετικά qnr στελέχη που έγινε με τη μέθοδο της σύζευξης, είχε ποσοστό επιτυχίας (45%). Μετά από φαινοτυπικό έλεγχο αναστολής της δράσης των αντλιών εκροής, η υπερέκφραση των αντλιών δε θεωρήθηκε υπεύθυνος μηχανισμός αντοχής στις κινολόνες. Η συγγένεια των ανθεκτικών στελεχών μελετήθηκε τόσο με την εφαρμογή της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ERIC2- PCR, αλλά και με τη δοκιμασία της ηλεκτροφόρησης σε παλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο. Η πολυκλωνικότητα των στελεχών που ενδημούν στα ελληνικά νοσοκομεία φάνηκε από τους τουλάχιστον 13 κλώνους που απομονώθηκαν από τις δύο γεωγραφικές περιοχές της μελέτης Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η παρατηρούμενη αντοχή στη σιπροφλοξασίνη οφείλεται κυρίως σε μεταλλάξεις των γονιδίων αντοχής gyrA και parC. Επιπλέον αποδεικνύεται η ύπαρξη των πλασμιδιακά φερόμενων γονιδίων αντοχής qnrS1 καθώς και η δυνατότητα μεταφοράς μέσω σύζευξης, γεγονός που πιθανώς εξηγεί τη διασπορά της αντοχής. Από τις δύο μεθόδους μοριακής επιδημιολογίας ERIC2- PCR και PFGE προκύπτει ότι τα ανθεκτικά στη σιπροφλοξασίνη στελέχη E. coli έχουν γίνει ενδημικά. Τα δεδομένα που προκύπτουν από την παρούσα εργασία μπορούν να συμβάλλουν στην αντιμετώπιση της διασποράς των ανθεκτικών στελεχών και την ορθολογική χορήγηση των κινολονών, ώστε να διατηρηθεί η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου.
description: Surveillance and control of hospital infections caused by Gram negative bacteria has been a major concern over the last few years for the developed countries, especially after the intorduction of wide-spectrum antibiotics. Among Gram negative genera, Escherichia coli part of normal flora of human, has the lead in infection of both hospitalized patients and patients of the community. It is a common bacteria which mainly causes urinary tract infections, but is also highly associated with other diseases especially in infants and elder people or immunocompromised. Quinolones are extended spectrum chemotherapeutic antibacterial agents with excellent pharmakodynamics and pharmakokinetics. Their advantage among other antimicrobial agents in clinical use is that they inhibit very fast the synthesis of bacterial DNA, leading to rapid cell death. They remain effective against Gram negative and atypical bacteria, and also broad their spectrum by being effective against Gram-positive microorganisms. Quinolones are often used as treatment in many infections caused by E. coli. Their good activity against both hospital and community infections led to overprescribing and overusage. The high level of usage evolved rapidly in bacterial resistance to quinolones even of E. coli which is considers as a sensitive bacterium. The most common mechanism of resistance of E. coli to quinolones are mutations of genes gyrA and parC that encode for DNA gyrase or topoisomerase IV. A second known mechanism are plasmid mediated qnr resistance genes that encode qnr protein that can bind to DNA gyrase, protecting it from the action of quinolones. Finally decreased penetration of the outer membrane of bacterial cell and some types of efflux pumps can act to quinolone concentration. The aim of this thesis was to identify the quinolones resistant isolates and to investigate the mechanisms of resistance that are responsible. By performing methods of molecular typing, epidemiologic analysis of the resistant isolates was succeeded due to provement of possible genetic relation between them. Finally presence of ESBL was tested because of the frequent co- existence of plasmid mediated resistance genes and ESBL. For this purpose, a total of 114 clinical isolates were collected from hospital patients and patients visited the outpatient clinic of four unrelated tertiary Hospitals of Nothern and Central Greece between April 2005- July 2007. Minimum inhibitory concentration (MIC) of ciprofloxacin were determined to all clinical isolates revealed that 75 (65.7%) have high level resistance to ciprofloxacin with MIC ≥ 32 μg/ml. The resistant strains were also tested for their resistance to other antimicrobial agents that are commonly used as treatment to infections caused by E. coli. Resistance to ampicillin was high (90,3%), whereas the resistance rates to amoxycillin/ clavunate were 47,3% and to cafamandole 38,5%. Also ESBL production was determined phenotypically by using the E-test strip and showed that 12,2% of the isolates of the study were producing beta lactamases. PCR was performed to detect and identify the chromosomal resistance genes gyrA and parC as well as plasmid mediated qnr resistance genes. PCR was followed by DNA sequencing in order to confirm PCR results and to compare the nucleotide sequences of our PCR products to known nucleotide sequences in the GenBank database. It was proved that quinolones resistance in all isolates was due to mutations of chromosomal resistance genes gyrA and parC. Also 11 out of 114 isolates (9,64%) were carrying plasmid mediated qnS1 resistance genes. The ability of the qnrS positive isolates to transfer resistance to E. coli recipients tested with conjugation experiments was found in 45%. After phenotypically testing of the isolates no presence of efflux pump was detected that could explain quinolone resistance. The genetic relation of E. coli quinolones resistance was performed both by ERIC 2- PCR and Pulsed field gel electrophoresis. The isolates belonged at least to 13 clones which is indicative of the multiclonality of the endemic isolates of E. coli two geographical areas in Greece. In conclusion the findings of this research indicate that the appearance of quinolone resistance has developed mainly due to mutations of chromosomal resistance genes. Moreover plasmid mediated resistance exists, as well as the transferability through conjugation, a fact which maybe explains the dissemination of quinolones resistance. Ciprofloxacin resistant E. coli isolates based on the results of the two methods of molecular epidemiology ERIC2- PCR and PFGE, show that isolates have become endemic. Data produced out of this thesis can significantly contribute to the formulation of politics in order to retain the efficacy of quinolones.