title: Recombinant expression, purification and characterization of human hyaluronidases
Creators: name: Hofinger, Edith
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Hyaluronidasen , Hyaluronsäure , Rekombinantes Protein , Einschlusskörper , Kapillarelektrophorese , Proteinfaltung , Isolierung , Drosophila Schneider-2 Zellen , Proteinreinigung , Glykosylierung , hyaluronidase , hyaluronic acid , recombinant protein , protein purification
subject: 540 Chemie
subject: 87.15.Tt
subject: 87.15.Cc
subject: 87.14.Ee

description: Hyaluronidases and their substrate, hyaluronic acid, are known to play a role in signal transduction events directly correlated with tumor growth and cell migration. Yet correlations with disease progression are controversial due to scarce information on enzymatic properties and the lack of specific inhibitors as pharmacological tools. Therefore, the aim of this thesis was the establishment of recombinant expression systems for the human hyaluronidase subtypes, purification of the enzymes and their characterization with respect to biochemical and catalytic properties. In a first approach the human hyaluronidase subtypes PH-20, Hyal-1, Hyal-2 and Hyal-4 were efficiently expressed in E. coli. All human hyaluronidases formed inclusion bodies in the cytoplasm of E. coli due to the presence of disulfide bridges in the native proteins. Only Hyal-1 could be re-folded in vitro into an enzymatically active protein with the folding yields strongly depending on the kind of denaturing agent used, the disulfide shuffling system and the presence of arginine in the folding buffer. However, both the yield of active protein and the specific enzymatic activity of Hyal-1, purified by Ni-IMAC under denaturing conditions, were extremely low. As in vitro folding of the human hyaluronidases posed major problems, the human hyaluronidases Hyal-1, PH-20 and Hyal-2 were alternatively expressed into the culture medium of Drosophila Schneider-2 cells (DS-2 cells) enabling the correct formation of disulfide bonds and mammalian-like glycosylation. Native Hyal-1 was expressed by DS-2 cells and purified by ammonium sulfate precipitation, cation exchange chromatography and Ni-IMAC. During purification the use of detergents was required because of the extraordinarily high adsorption of the protein to surfaces. Highly pure, homogeneous Hyal-1 (54 kDa with 4 kDa comprising glycosidic residues) with a specific enzymatic activity comparable to human plasma hyaluronidase was isolated in quantities sufficient for biophysical characterization studies. Although characteristic features such as the pH profile showed a similar catalytic behavior of Hyal-1, expressed in the prokaryotic and the eukaryotic system, the glycosylation of Hyal-1 was shown to improve the catalytic efficiency of the enzyme in solution. A truncation of Hyal-1 by the C-terminal domain failed to yield enzymatically active protein in both expression systems. Human PH-20 (56 kDa) was stably expressed by DS-2 cells and purified by chelating-IMAC. As determined previously for bovine testicular hyaluronidase (BTH), a commercially available hyaluronidase preparation, human PH-20 exhibited the typical assay-dependent shift in the pH activity optimum. Furthermore, recombinant Hyal-1 and PH-20 recognized chondroitin sulfate A and C as alternative substrates with pH-dependent activities similar to the preferred substrate, hyaluronic acid. In contrast to PH-20 and Hyal-1, no catalytic activity was detected with recombinant human Hyal-2 (54 kDa), expressed by DS-2 cells. Since the hydrolytic activity of human Hyal-2 is discussed controversially in the literature, a variety of hyaluronidase activity assays, including electrophoretic and viscosimetric techniques, was explored. However, none of the methods proved any hyaluronidase or chondroitinase activity of recombinant Hyal-2 under acid, neutral or basic pH conditions. To gain more detailed insight into the catalytic mechanism of the recombinant human hyaluronidases Hyal-1 and PH-20 in comparison to BTH a capillary zone electrophoresis method was established for the qualitative and quantitative detection of degradation products of hyaluronic acid. BTH and, less significantly, recombinant human PH-20 produced different degradation products of hyaluronic acid at acidic and nearly neutral pH, explaining the assay-dependent shift of the pH activity profiles. Human Hyal-1 was found to degrade high molecular weight hyaluronic acid consecutively into di- to hexasaccharides as final products. The quantitative analysis of the conversion of hyaluronan hexa- and octasaccharides revealed specific properties of the hyaluronidase subtypes: the minimum substrate of BTH, the hexasaccharide, was not accepted as a substrate by Hyal-1 and PH-20, albeit the octasaccharide; transglycosylation, which was catalyzed to a significant extent by BTH and PH-20, occurred with Hyal-1 only in the presence of a great excess of substrate. The calculation of enzymatic parameters by Michaelis-Menten kinetics revealed additional features of the hyaluronidase subtypes. A model of an array of disaccharide unit binding sites framing the active site was employed to explain the pH- and subtype-specific properties of the hyaluronidases. Taken together, the recombinant production of human hyaluronidases provides the basis for enzymological studies, crystallization and the structure-based development of specific inhibitors, which can be used, for example, as pharmacological tools.
description: Hyaluronsäure und Hyaluronidasen spielen bei Signaltransduktionsprozessen eine Rolle, die mit der Zellmigration und dem Wachstum von Tumoren korrelieren. Allerdings liegen nur unzureichende Informationen über die enzymatischen Eigenschaften der Hyaluronidasen vor und es existieren keine geeigneten Inhibitoren als pharmakologische Werkzeuge. Daher war das Ziel dieser Arbeit die rekombinante Expression der humanen Hyaluronidasen, ihre Reinigung und Charakterisierung hinsichtlich der biochemischen und katalytischen Eigenschaften. Zunächst wurden die humanen Hyaluronidasen PH-20, Hyal-1, Hyal-2 und Hyal-4 in E. coli exprimiert. Aufgrund der Anwesenheit von Disulfidbrücken im nativen Protein bildeten die Hyaluronidasen Inclusion Bodies im Cytoplasma von E. coli. Nur Hyal-1 konnte in vitro in die enzymatisch aktive Form rückgefaltet werden, wobei die Faltungsausbeuten von der Wahl des Denaturierungsmittels, dem Disulfid-Shuffling System und der Anwesenheit von Arginin abhängig waren. Sowohl die Ausbeute an aktivem Protein als auch die spezifische Enzymaktivität von Hyal-1 nach Reinigung über Ni-IMAC unter denaturierenden Bedingungen waren extrem niedrig. Da sich die In-vitro-Faltung der humanen Hyaluronidasen als problematisch erwies, wurden Hyal-1, PH-20 und Hyal-2 alternativ in das Zellkulturmedium von Drosophila Schneider-2 (DS-2) Zellen exprimiert. Dadurch wurde sowohl die korrekte Ausbildung von Disulfidbrücken als auch eine Säugetier-ähnliche Glykosylierung ermöglicht. Natives Hyal-1 aus DS-2 Zellen wurde mittels Ammoniumsulfat-Präzipitation, Kationaustauscher- und Ni-Affinitätschromatographie gereinigt. Wegen der ungewöhnlich hohen Adsorption des Proteins an Oberflächen war der Zusatz von Detergentien notwendig. Hochreines, homogenes Hyal-1 (54 kDa mit 4 kDa Kohlenhydratanteil) wurde mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität isoliert, die vergleichbar mit der von humaner Hyaluronidase aus Plasma ist. Beide Hyal-1 Varianten sind bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften wie dem pH-Profil sehr ähnlich, allerdings verbessert die Glykosylierung die spezifische Aktivität des Enzyms in Lösung. Eine Verkürzung von Hyal-1 um die C-terminale Domäne lieferte in beiden Expressionssystemen inaktives Protein. Humanes PH-20 (56 kDa) aus DS-2 Zellen wurde über Chelat-IMAC gereinigt. Ähnlich wie bovine testikuläre Hyaluronidase (BTH) zeigte auch humanes PH-20 eine typische, Assay-abhängige Verschiebung des pH-Optimums der Aktivität. Desweiteren wurde gezeigt, dass rekombinantes Hyal-1 und PH-20 Chondroitinsulfat A und C als alternative Substrate akzeptieren. Im Gegensatz zu PH-20 und Hyal-1 war Hyal-2 (54 kDa) aus DS-2 Zellen inaktiv. Da die hydrolytische Aktivität des humanen Hyal-2 in der Literatur kontrovers diskutiert wird, wurden verschiedene Hyaluronidase-Testsysteme herangezogen, u. a. elektrophoretische und viskosimetrische Techniken. Dennoch wurde für Hyal-2 keinerlei Hyaluronidase oder Chondroitinase Aktivität nachgewiesen, weder unter sauren, neutralen noch basischen pH-Bedingungen. Um einen Einblick in den katalytischen Mechanismus von Hyal-1 und PH-20 im Vergleich zu BTH zu erhalten, wurde eine kapillarzonenelektrophoretische Methode zur qualitativen und quantitativen Detektion der Abbauprodukte der Hyaluronsäure entwickelt. BTH und, in geringerem Maße PH-20, liefern bei saurem und neutralem pH unterschiedliche Abbauprodukte, womit sich die Assay-abhängigen Unterschiede in den pH-Profilen erklären lassen. Hyal-1 baute die hochmolekulare Hyaluronsäure kontinuierlich zu Di- bis Oktasacchariden ab. Die quantitative Analyse der Umwandlung von Hyaluronsäure Hexa- und Oktasacchariden ermöglichte Aussagen über spezifische Eigenschaften der Hyaluronidase Subtypen: im Gegensatz zum Oktasaccharid wurde das Minimalsubstrat von BTH, das Hexasaccharid, von Hyal-1 und PH-20 nicht als Substrat akzeptiert; Transglykosylierung, die von BTH und PH-20 in beträchtlichem Ausmaß katalysiert wurde, trat mit Hyal-1 nur bei großem Substratüberschuss auf. Die Berechnung von enzymatischen Parametern nach der Michaelis-Menten Kinetik lieferte zusätzliche Information über die Isoenzyme. Um die pH- und Isoenzym-spezifischen Eigenschaften zu erklären, wurde ein Modell aus einer Anordnung von Disaccharid-Bindungsstellen vorgeschlagen. Insgesamt betrachtet ist die rekombinante Herstellung und Charakterisierung der humanen Hyaluronidasen die Grundlage für weiterführende enzymatische Untersuchungen, Kristallisationsexperimente und das Struktur-basierte Design von spezifischen Inhibitoren, die beispielsweise als pharmakologische Werkzeuge eingesetzt werden können.