Healing potential of cells isolated from the soft tissue wall of remaining periodontal pockets: in vitro study
Creators: name: Γουσοπούλου, Ευαγγελία Σταύρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: ανάλυση γονιοδιακού προφίλ
βιοψίες ουλικών ιστών
επούλωση ιστών
gene expression profiling
gingival tissue biopsies
wound healing

description: Σκοπός της διατριβής ήταν ο προσδιορισμός του δυναμικού επούλωσης του μαλακού τοιχώματος από το εσωτερικό υπολειμματικών περιοδοντικών θυλάκων έναντι του μαλακού τοιχώματος της ουλοδοντικής σχισμής σε δείγματα που λήφθηκαν από τους ίδιους ασθενείς. Οι βιοψίες ουλικού ιστού από τρεις ασθενείς υποβλήθηκαν σε ανάλυση RT2 profiler PCR Array, εξειδικευμένη στην επούλωση ιστών, ακολουθούμενη από ανάλυση γονιδιακών δικτύων των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Η έκφραση γονιδίων σχετιζόμενων με λεμφαγγειογένεση εξετάστηκε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Οι καλλιέργειες G-MSC και GT-MSC καθιερώθηκαν με μέθοδο ενζυματικής διάσπασης από βιοψίες ουλικού ιστού τριών ασθενών. Η μεταναστευτική ικανότητα G-MSC και GT-MSC αξιολογήθηκε με τις δοκιμασίες Scratch Migration Assay και Transwell Migration Assay. Διεξήχθη ολική ανάλυση κολλαγόνου για την αξιολόγηση της συνολικής παραγωγής κολλαγόνου από ομογενοποιημένα δείγματα G-MSC και GT-MSC. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Prism 8.0 σε δύο επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας. Η ανάλυση GO term σε γονίδια που η έκφρασή τους αυξήθηκε σημαντικά (cut-value P = 10e-2, and FC cutoff = 1.2) σε κατάσταση ασθένειας (COL5A3, EGFR, TGFA, TGFB1, MIF και ITGA3) αποκάλυψε ότι στον διηθημένο ιστό πολλές διαδικασίες σχετικές με την αναδιαμόρφωση του ικριώματος, την παραγωγή κολλαγόνου και τη σηματοδότηση ιντεγκρίνης εμπλουτίστηκαν. Αντίθετα, τα κορυφαία 20 γονίδια που έδειξαν αξιοσημείωτη μείωση στην έκφρασή τους στον διηθημένο ιστό περιλαμβάνουν γονίδια που εμπλέκονται στον καταρράκτη ενεργοποίησης του πλασμινογόνου και την πήξη του αίματος, ωστόσο η μείωση έκφρασης αυτών των γονιδίων δεν έδειξε στατιστική σημαντικότητα. Επιπλέον, όλα τα γονίδια που σχετίζονται με λεμφαγγειογένεση εκφράστηκαν τόσο σε υγιείς όσο και σε φλεγμαίνοντες ιστούς, ωστόσο οι φλεγμαίνοντες ιστοί παρουσίασαν στατιστικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης για το γονίδιο PROX-1 σε σύγκριση με τους υγιείς ιστούς. Όσον αφορά την ικανότητα μετανάστευσης κυττάρων, η δοκιμασία Scratch Migration Assay υπό φυσιολογικές συνθήκες κυτταροκαλλιεργειών έδειξε μικρές διαφορές μεταξύ των G-MSCs και GT-MSCs, αλλά μετά από στέρηση ορού η ανάλυση έδειξε υψηλότερη ικανότητα μετανάστευσης για τα G-MSCs σε σύγκριση με τα GT-MSCs. Επιπρόσθετα, ο προσδιορισμός Transwell Migration Assay επιβεβαίωσε το μεγαλύτερο ποσοστό μετανάστευσης των G-MSCs σε σύγκριση με τα GT-MSCs. Τέλος, ο προσδιορισμός της συνολικής σύνθεσης κολλαγόνου παρουσίασε υψηλότερη παραγωγή κολλαγόνου για τα GT-MSCs σε σύγκριση με τα G-MSCs. Η τρέχουσα μελέτη είναι το πρώτο ερευνητικό έργο με συγκριτικά δείγματα από ίδιους δότες, που χρησιμοποιεί μοριακούς μηχανισμούς και λειτουργικές δοκιμασίες στην προσπάθεια κατανόησης σε βάθος της περιοδοντικής επούλωσης. Προσδιορίστηκαν γονίδια με διαφορετική έκφραση στους υγιείς σε σύγκριση με τους διηθημένους ιστούς, παρέχοντας νέες πληροφορίες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς της επούλωσης, υποδεικνύοντας μια προσπάθεια του διηθημένου ιστού να ελέγξει τη φλεγμονή και να αναδιαμορφώσει την περιοχή. Οι λειτουργικές ιδιότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων που απομονώθηκαν από βιοψίες υγιών και διηθημένων ουλικών ιστών ίδιων ασθενών, έδειξαν ότι τα κύτταρα που απομονώθηκαν από φλεγμαίνοντες ιστούς, παρά το χαμηλότερο δυναμικό τους για μετανάστευση, συμβάλλουν στην επούλωση με παραγωγή περισσότερου κολλαγόνου, ενισχύοντας κατ’ αυτόν τον τρόπο το εξωκυττάριο ικρίωμα. Τα δεδομένα καταλήγουν ότι ενδεχομένως να υπήρχε κλινικό όφελος από τη διατήρηση κοκκιώδους ιστού κατά τη χειρουργική περιοδοντική θεραπεία
description: This study aimed to determine the wound healing potential of the soft tissue wall lining remaining periodontal pockets versus healthy gingival crevices in the same individuals. Gingival tissue biopsies from three systematically healthy patients were subjected to RT2 profiler PCR Array for wound healing-related markers, followed by network analysis of the differentially expressed genes. Lymphangiogenesis-related gene expression (VEGF-C, PROX-1, LYVE-1, PDPN, CCL21) was examined by quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR/Real time PCR). G-MSC and GT-MSC cultures were established by the enzymatic dissociation method from gingival tissue biopsies of three systematically healthy patients. G-MSC and GT-MSC migratory potential was evaluated by the Scratch Migration Assay in five different time-points (12h, 24 h, 30h, 36 h, and 48 h) in two different experimental conditions: a. under normal condition (CCM), and b. under 18-hour serum deprivation condition. MSC and GT-MSC migratory potential was further evaluated by the Transwell Migration Assay in two different time-points (24 h and 30 h). Total Collagen Assay was performed to evaluate total collagen protein content in G-MSC and GT-MSC homogenates. Statistical analysis was performed with Prism 8.0 Software in two levels of statistical significance (p&lt;0.05 and p&lt;0.01). GO term analysis on significantly (P-value cutoff = 10e-2, and FC cutoff = 1.2) upregulated genes on the diseased condition (COL5A3, EGFR, TGFA, TGFB1, MIF and ITGA3) revealed that in the diseased tissue many processes related to matrix remodelling, collagen deposition and integrin signaling were enriched. In contrast, top 20 downregulated genes on the diseased epithelium include markers involved in plasminogen activating cascade and blood coagulation; however, these genes’ downregulation failed to reach statistical significance. In addition, all lymphangiogenesis-related genes were expressed both in healthy and diseased tissues; however diseased tissues demonstrated statistically higher expression levels for PROX1 compared to controls. Regarding cell migration potential, the Scratch Migration Assay under normal conditions demonstrated minor differences between the two cell cultures types (healthy vs. diseased). Nevertheless, after serum deprivation, the assay indicated higher migration potential for G-MSCs compared to GT-MSCs. In line with this, the Transwell Migration assay confirmed the higher migration rate of G-MSCs compared to GT-MSCs. Finally, Total Collagen Assay demonstrated higher collagen protein production for GT-MSCs compared to G-MSCs. Current study is the first pair matched research project recruiting molecular mechanisms and functional assays in an attempt to obtain a better understanding to the periodontal wound healing. We identified some genes differentially expressed in healthy compared to diseased tissue, providing novel insights into the molecular mechanisms of wound healing, indicating an attempt of the diseased tissue to control the inflammation and remodel the site. The function properties of MSCs-like cells isolated from pair-matched healthy and diseased gingival tissue biopsies demonstrated that the cells isolated from inflamed tissue biopsies, despite their lower potential for migration, contribute to wound healing by greater collagen production, enriching ECM. All current findings corroborate for the fact that there are might be merit in granulation tissue preservation during periodontal surgery