title: Structural and biochemical analysis of the RicAFT complex
Creators: name: Hoffmann, Gregor
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Bacillus subtilis RicA RicF RicT Massenphotometrie Strukturanalyse HDX CoIPs
Bacillus subtilis RicA RicF RicT Mass photometry X-ray crystallography HDX CoIPs

description: The regulation of protein amounts in the cell is of utmost importance, as imbalance can lead to cell death. Hence, the protein levels are meticulously balanced by a vast network of regulation. This network penetrates all levels of regulation, from transcription to translation and post-translational modification. Messenger RNA (mRNA) maturation is a regulatory process at the post-transcriptional level and enables the cell to adapt to environmental changes quickly and resourcefully. In Bacillus subtilis, a soil-dwelling model organism, a large margin of mRNA maturation is carried out by the endoribonuclease RNase Y. However, the precise regulation of the maturation is still not well understood and only some factors involved in the regulation of RNase Y are known, such as the RicAFT complex. This complex is associated with the RNase Y in vivo and controls the maturation and degradation of a plethora of different mRNAs. Additionally, the complex is vital for the switch between lifestyles, as a dysfunctional complex leads to various phenotypes: flat and unstructured biofilms, dysfunctional sporulation, and loss of genetic competence. Additionally, the RicAFT complex could be involved in a regulatory cascade of proteins that activates all these processes, essentially regulating the same processes possibly in two different pathways. The switching between these lifestyles is vital for bacteria to survive in an everchanging environment. Hence, the RicAFT complex is a prime target for research, as it is conserved in Bacilli and many aspects of its role and function are unknown. Therefore, a biochemical and structural analysis of the complex is essential for understanding its function, which this work strives to achieve. Henceforth, various biochemical methods are employed to unravel its structure and its interaction sites. The complex is comprised of three proteins: RicA, RicF and RicT. These are not encoded in one operon yet form a stable complex. Their mechanism of interaction is unknown, as is the structure of the whole complex. However, it is known that the complex coordinates two [4Fe-4S] cluster and binds FADH, their role is yet to be determined. In this work, a comprehensive overview and biochemical analysis of the complex and its interactions is given.
description: Die Regulation von Proteinmengen ist von höchster Wichtigkeit in Zellen, denn ein Ungleichgewicht könnte zum Zelltod führen. Daher werden Proteinmengen durch ein großes Netzwerk mit vielen Kontrollinstanzen sehr genau reguliert. Dieses Netzwerk reicht durch alle Ebenen der Regulation, von der Transkription über Translation, hin zu posttranslationalen Modifikationen. Die Maturierung der Boten-RNA (mRNA) ist ein posttranskriptionaler Prozess und ermöglicht der Zelle eine schnelle und ressourcenschonende Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen. In Bacillus subtilis, ein im Boden vorkommendes Modelbakterium, wird ein großer Teil der mRNA Maturierung durch die RNase Y durchgeführt. Jedoch ist die genaue Regulation dieser Maturierung unbekannt. Trotzdem sind Faktoren bekannt, die diese zum Teil bewirken, wie der RicAFT Komplex. In vivo ist er mit der RNase Y assoziiert und reguliert die Reifung vieler unterschiedlicher mRNAs. Zudem ist er essenziell für den Wechsel zwischen verschiedenen Lebensarten des Bakteriums. Wenn er nicht vollständig ist, führt dies zu zahlreichen Phänotypen: flache und unstrukturierte Biofilme, keine funktionierende Sporulation und ein Verlust der genetischen Kompetenz. Weiterhin ist der RicAFT Komplex direkt involviert in einer Kaskade von Proteinen, die den Wechsel zu diesen Lebensstilen veranlassen. Somit reguliert der Komplex diese Wechsel auf zwei unterschiedlichen regulatorischen Ebenen und diese Veränderung der Lebensstile ist absolut lebensnotwendig in einer sich ständig wechselnden Umwelt. Daher ist der RicAFT Komplex ein hervorragendes Ziel zur Forschung, da viele Aspekte seiner Rolle und Funktion noch unverstanden sind und der Komplex in den Bacilli konserviert ist. Vor allem eine biochemische und strukturelle Beschreibung des Komplexes ist unabdingbar zum Verständnis seiner Funktion, was in diese Arbeit versucht wird zu erreichen. Daher wurden verschiedene biochemische Methoden angewandt, um mehr von seiner Struktur und dessen Interaktionen zu erfahren. Der Komplex setzt sich aus drei einzelnen Proteinen zusammen: RicA, RicF und RicT. Diese sind nicht in einem Operon konserviert, bilden jedoch einen stabilen Komplex. Wie sie interagieren ist aber unbekannt, wie auch die Struktur des kompletten Komplexes. Es ist nur bekannt, dass zwei [4Fe-4S] Komplexe durch diesen koordiniert werden, sowie dass der Proteinkomplex FADH bindet, ihre Funktionen sind jedoch unbekannt. Daher wird diese Arbeit versuchen einen verständlichen Überblick mit einer biochemischen Analyse des Komplexes und seiner Interaktionen zu geben.