Συμβολή στην προσπάθεια αξιόπιστης και έγκαιρης διάγνωσης της ασθένειας της προϊούσας πνευμονίας σε μικρά μηρυκαστικά
Creators: name: Ρόγκα, Χριστίνα Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Προϊούσα Πνευμονία Προβάτων (Ιός Maedi – Visna)
Αντισώματα
Ανοσοαποτύπωση
Ovine Progressive Pneumonia (Maedi – Visna Virus)
Antibodies
Western Blot

description: Η παρούσα διπλωματική εργασία έγινε με στόχο τη διευκρίνιση της ασάφειας μεταξύ των αποτελεσμάτων που προκύπτουν αναφορικά με τη διάγνωση της ασθένειας της προϊούσας πνευμονίας των προβάτων. Για να επιτευχθεί αυτό, πρώτο βήμα ήταν ο εντοπισμός ενός ιστού που να είναι μολυσμένος και θετικός στην παρουσία του ιού προερχόμενος από κάποιο ζώο με κλινικά συμπτώματα. Η παρουσία του προϊού σε απομονωμένο από τον ιστό γενωμικό DNA ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο Nested – PCR, χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά πρωτόκολλα (τα δύο προέκυψαν από τη βιβλιογραφία ενώ για το τρίτο, ένα ζεύγος εκκινητών σχεδιάστηκε στο εργαστήριο του Ινστιτούτου Κτηνιατρικών Ερευνών του Ε.Λ.Γ.Ο. ΔΗΜΗΤΡΑ). Τα θετικά αποτελέσματα που προέκυψαν για το δείγμα του ιστού, επιβεβαιώθηκαν επιτυχώς με αλληλούχιση (μέθοδος Sanger), επιβεβαιώνοντας ταυτόχρονα την παρουσία του προϊού στο γονιδίωμα του οργανισμού – στόχου. Σε απομονωμένο ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα αλλοιωμένου τμήματος του ιστού, με χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος CAEP5A1 (MAb Ascites CAEV-63, CAEV-Co, VV, OPPV IgG1 Isotype, Vmrd, Αγγλία) και εφαρμογή των μεθόδων Dot Blot και Western Blot (ανοσοαποτύπωσης), επιβεβαιώθηκε η παρουσία της ιικής πρωτεΐνης p28. Για την ύπαρξη αντισωμάτων έναντι του ιού, με τη δοκιμή ELISA ελέγχθηκαν συνολικά 55 οροί προβάτων και το ποσοστό οροθετικότητας ήταν 51%. Κατόπιν επιλέχθηκαν 19 εξ αυτών, (10/19 οροί ήταν θετικοί κατά ELISA), για τους οποίους είχε παράλληλα συλλεγεί και αίμα παρουσία αντιπηκτικού οπότε υπήρχε η δυνατότητα απομόνωσης και λευκών αιμοσφαιρίων περιφερικού αίματος. Με εφαρμογή της ανοσοαποτύπωσης (W.b.) χρησιμοποιώντας το ομογενοποίημα του επιβεβαιωμένου θετικού στον ιο πνεύμονα, και τους ορούς αυτού σε αραίωση 1/50, και το πολυκλωνικό anti–sheep IgG (αραίωση 1/2.500), επιβεβαιώθηκε ότι 18/19 ορούς είχαν αντισώματα έναντι της ιικής p28 και 5/19 έναντι και της p15. Συνεπώς, με τη μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης προσαρμοσμένης στα δεδομένα του εργαστηρίου, ανιχνεύθηκε η παρουσία αντισωμάτων και σε θετικά αλλά και αρνητικά κατά ELISA δείγματα ορού προβάτων, φέρνοντας τα αποτελέσματα αυτά σε μερική αντίθεση με τα αντίστοιχα της δοκιμής ELISA εφόσον 2 οροί είχαν διαγνωστεί αρνητικοί με τη δοκιμή ELISA. Προχωρήσαμε σε προσπάθεια ανίχνευσης, της παρουσίας ιικών πρωτεϊνών σε ομογενοποίημα λευκών αιμοσφαιρίων περιφερικού αίματος από πρόβατα που προηγουμένως είχαν ελεγχθεί με τη μέθοδο PCR για την παρουσία προϊού. Ελέγξαμε εάν ο ορός των προβάτων αυτών μπορεί να ανιχνεύσει ιικές πρωτεΐνες στο ομογενοποίημα των λευκών αιμοσφαιρίων. Τα λευκά αιμοσφαίρια απομονώθηκαν με φυγοκέντρηση σε βαθμιδωτή συγκέντρωση φικόλης (Lymphoprep). Επιλέχθηκαν να διερευνηθούν συνολικά 11 πρωτεϊνικά εκχυλίσματα λευκών αιμοσφαιρίων και τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά, καθώς παρατηρήθηκε αναγνώριση ιικών πρωτεϊνών (θετικές ζώνες κατά την δοκιμασία με W.b. ιδιαίτερα στις περιοχές που αντιστοιχούν στα μοριακά βάρη της περιοχής των 28.000 και 15.000 d όπου εντοπίζονται οι περισσότερο αντιγονικές ιικές πρωτεΐνες) σε πρόβατα που είναι μολυσμένα με MVV (που δηλαδή η παρουσία του προ-ιού είχε επιβεβαιωθεί με αλληλούχιση), ενώ δεν ανιχνεύθηκε καμία αντίδραση όταν χρησιμοποιήθηκε πρωτεϊνικό εκχύλισμα λευκών αιμοσφαιρίων από μη μολυσμένα πρόβατα, δείχνοντας την αποτελεσματικότητα της μεθόδου της ανοσοαποτύπωσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα επέτρεψαν τη σύγκριση των μεθόδων PCR, ELISA και Western Blot. Συμφωνία και των τριών μεθόδων σημειώθηκε σε ποσοστό 36,4%. Το μεγαλύτερο ποσοστό συμφωνίας (90,1%) παρατηρήθηκε ανάμεσα στις μεθόδους PCR και W.b., ενώ τα αποτελέσματα ELISA και PCR ήταν σύμφωνα σε ποσοστό 63,2%. Αυτό που προκύπτει από την παρούσα εργασία είναι ότι: 1) Τα μολυσμένα ζώα μπορούν να διαγνωστούν με συνδυασμό μεθόδων, κυρίως με χρήση PCR και στη συνέχεια αλληλούχιση αλλά και με δοκιμασία D.b. ή W.b. μέσω μονοκλωνικού αντισώματος, όταν αυτό είναι εφικτό, 2) Ο ορός αίματος από μολυσμένα ζώα μπορεί να αναγνωρίσει ιικές πρωτεΐνες σε ομογενοποίημα μολυσμένου ιστού (πνεύμονα), όπου παρατηρείται αλλοίωση (εστία μόλυνσης), 3) Ο ορός από μολυσμένα πρόβατα μπορεί επίσης να αναγνωρίσει πρωτεΐνες του ιού σε ομογενοποίημα περιφερικού αίματος που προέρχεται από ζώα που είτε έχουν μολυνθεί και φέρουν προϊό είτε φέρουν ενεργή μόλυνση και 4) Παρατηρείται μερική σύγκλιση αποτελεσμάτων μεταξύ των κύριων μεθόδων ανίχνευσης ELISA, PCR, W.b, η οποία παρουσιάζει προβλήματα και κενά που κατά την προσωπική μας άποψη μπορούν να εξηγηθούν μόνο με την παραδοχή ότι η μόλυνση στα πρόβατα οφείλεται σε περισσότερους του ενός γενετικούς τύπους ιού κάτι που σύμφωνα με την διεθνή βιβλιογραφία έχει αναφερθεί να συμβαίνει και σε άλλες χώρες.
description: The present postgraduate thesis was aimed at clarifying the ambiguity of the results obtained regarding the diagnosis of ovine progressive pneumonia (O.P.P.). To achieve this, the first step was to identify a tissue that is completely positive to the presence of the virus and comes from an animal with clinical symptoms that indicate the presence of the specific disease. The presence of the provirus in tissue-isolated genomic DNA was detected by Nested - PCR, using three different protocols (two protocols were derived from the literature while for the third, one primer pair was designed in the laboratory). The positive results obtained for the tissue sample were successfully confirmed by sequencing (Sanger method), indicating the integration of the genetic material of the virus in the genome of the target organism. After isolating the total protein extract from part of the infected tissue, Dot Blot and Western Blot were applied, where using the monoclonal antibody CAEP5A1 (MAb Ascites CAEV-63, CAEV-Co, VV, OPPV IgG1 Isotype, Vmrd, England) the presence of viral protein p28 was confirmed. For the presence of antibodies against the virus, 55 sheep sera were tested by ELISA and the seroprevalence was 51%. 19 of them were selected (10/19 seropositive), for which blood was also collected using anticoagulant and so it was possible to isolate peripheral blood mononuclear cell (PBMC). By applying immunoblotting (W.b.) using protein extract of the confirmed positive tissue, sera at a dilution of 1/50, and the polyclonal anti-sheep IgG (dilution 1 / 2,500), it was confirmed that 18/19 sera had antibodies against viral p28 and 5/19 against p15. Therefore, using the immunoassay method, which was previously adapted to the laboratory data, the presence of antibodies was detected in both positive and negative ELISA sheep serum samples, bringing these results in partial contrast to those of the ELISA test, since 2 of those sera were diagnosed negative by ELISA test. Then, we tried to detect the presence of viral proteins in PBMC’ protein extracts from sheep, which were previously tested by PCR for the presence DNA-provirus and in addition whether sheep serum can detect viral proteins in their protein extract. White blood cells were isolated by centrifugation at a gradient folate concentration (Lymphoprep). Eleven white blood cell protein extracts were selected to be further investigated and the results were encouraging, as the presence of viral proteins was observed in sheep infected with MVV (i.e. the presence of the provirus was confirmed by sequencing), but no reaction was detected when used PBMC’s protein extract from uninfected sheep. These results allowed the comparison of PCR, ELISA and Western Blot. Agreement of all three methods was recorded at a rate of 36.4%. The highest percentage of agreement (90.1%) was observed between the results of PCR and W.b., while ELISA and PCR results agreed at 63.2%.The conclusions drawn from the present work are the following: 1) There are infected animals in farms and this can be confirmed by a combination of methods, mainly using PCR (following by sequencing), but also by Dot Blot or Western Blot via monoclonal antibody, 2) Blood serum from infected animals can recognize viral proteins in a homogenate of infected tissue (lung), where lesion is observed (source of infection), 3) Serum from infected sheep may also recognize viral proteins in PBMC’s protein extracts from animals that are either infected and carry the provirus or are actively infected and 4) There is a partial convergence of results between the main methods ELISA, PCR, W.b, which presents problems and gaps that in our personal opinion can only be explained by the assumption that the infection in sheep is due to more than one genetic type of virus, something which according to the international literature has been reported to occur in other countries.