Μελέτη του μικροβιώματος του ανωτέρου αναπνευστικού συστήματος σε υγιή πληθυσμό της Β. Ελλάδος και έλεγχος της μεταβολής αυτού σε αναπνευστικές λοιμώξεις
Creators: name: Σιάσιος, Παναγιώτης Δ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2021
Subjects: Ανθρώπινο μικροβίωμα
Μεταγονιδιωματική
Φαρυγγικό μικροβίωμα
Pharynx
Microbiome
Microbiota
Metagenomics
Human microbiome
Next generation sequencing
16S rRNA gene

description: Σκοπός της διατριβής ήταν η ανίχνευση και ο ταξινομικός χαρακτηρισμός του ανθρώπινου μικροβιώματος στο φάρυγγα με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η παραπέρα μελέτη της ποικιλίας του ανάλογα με τον πληθυσμό που εξετάζεται, το φύλο, την κατάσταση της υγείας, την ηλικία και το περιβάλλον. Απώτερος στόχος ήταν ο καθορισμός στο φάρυγγα ενός πυρήνα μικροβιώματος, δηλαδή των μικροοργανισμών που ανευρίσκονται σε όλα τα υγιή άτομα όπως επίσης και ο προσδιορισμός των παραγόντων που επηρεάζουν τη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος, του τρόπου με τον οποίο οι ανωτέρω παράγοντες αλληλοεπιδρούν μεταξύ τους και του ρόλου που διαδραματίζουν οι μεταβολές στη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος στην κατάσταση της υγείας του ανθρώπου. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 46 εθελοντές εκ των οποίων 29 άτομα ήταν υγιή. Η σχετική αφθονία των μικροβιακών κοινοτήτων αναγνωρίστηκε με αλληλούχιση νέας γενιάς του γονιδίου 16S rRNA. Συνολικά αναγνωρίστηκαν 14 φύλα, 138 οικογένειες, 160 γένη και 259 είδη. Τα πιο άφθονα φύλα ήταν τα Proteobacteria, Firmicutes και Bacteroidetes ακολουθούμενα από τα φύλα Actinbacteria και Fusobacteria. Σε επίπεδο γένους, τα πέντε πιο άφθονα γένη στους υγιείς ήταν τα Streptococcus, Prevotella, Gemella, Veillonella και Neisseria, ενώ στους πάσχοντες από λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος τα πιο άφθονα γένη ήταν τα Prevotella, Streptococcus, Achromobacter, Rhizobium και Veillonella. Στο τελευταίο ταξινομικό επίπεδο του είδους τα πέντε πιο άφθονα είδη στους υγιείς ήταν τα Gemella haemolysans, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Veillonella atypica και Prevotella salivae ενώ στους ασθενείς τα Achromobacter spanius, Prevotella pallens, Prevotella melaninogenica, Rothia mucilaginosa και Veillonella atypica. Η ανάλυση γραμμικής διάκρισης μεγέθους αποτελέσματος (LDA-LEfSe) κατέδειξε 93 μικροβιακά είδη που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στο διαχωρισμό του φαρυγγικού μικροβιώματος μεταξύ ασθενών και υγιών, 17 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να διακρίνουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε σχέση με το φύλο και 35 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να κατατάξουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε αυτό των καπνιστών ή των μη καπνιστών. Προσδιορίστηκε με το πακέτο λογισμικού Microbiome της γλώσσας R ένας πυρήνας φαρυγγικού μικροβιώματος για κάθε ομάδα των υποκείμενων της μελέτης, ενώ η δημιουργία δικτύου αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μικροβιακών ειδών που συνθέτουν το φαρυγγικό μικροβίωμα αποκάλυψε έναν κεντρικό κόμβο (hub) στο φαρυγγικό μικροβίωμα των ανδρών, την οικογένεια Lachnospiraceae. Από τη σύγκριση του φαρυγγικού μικροβιώματος ανδρών και γυναικών προέκυψε μεγαλύτερη ποικιλομορφία όσον αφορά τον μικροβιακό πλούτο στους άνδρες σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα από το φύλο έως το είδος. Το αντίθετο, δηλαδή ελάττωση του μικροβιακού διαπιστώθηκε στο φαρυγγικό μικροβίωμα των καπνιστών σε σχέση με τους μη καπνιστές. Αύξηση της μικροβιακής ποικιλομορφίας διαπιστώθηκε επίσης και με την πρόοδο της ηλικίας, με πιο πλούσια ηλικιακή ομάδα όσον αφορά των αριθμό των διαφορετικών μικροβιακών ειδών την ομάδα 41-49 ετών. Η μελέτη της α- ποικιλομορφίας κατέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ υγιών και ασθενών σε ταξινομικό επίπεδο φύλου και γένους, ενώ η μελέτη της β-ποικιλομορφίας στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα. Τέλος, με την ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCoA) ανευρέθηκαν 35 μικροβιακά είδη που συνέβαλλαν περισσότερο στο σχηματισμό των αξόνων της PCoA στην διάκριση υγιών και ασθενών.
description: The purpose of the present study was to detect and classify the human microbiome in the pharynx (pharyngeal microbiome) by sequencing the 16S rRNA gene and to study its variety according to the examined population, gender, state of health, age, and environment. Further goal was the definition of a core microbiome in the pharynx of healthy subjects as well as to determine the factors that affect the composition of the pharyngeal microbiome and the way these factors interact with each other and to specify the possible role of composition changes in the microbiota of the upper respiratory niche in human health. Forty-six volunteers were enrolled into the study and twenty-nine of them were healthy. The relative abundance of microbial communities was determined by Next Generation Sequencing of the 16S rRNA gene. A total of 14 phyla, 138 families, 160 genera and 259 species were identified. The most abundant phyla were Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes followed by Actinobacteria and Fusobacteria. At the genus level, the five most abundant genera in healthy volunteers were Streptococcus, Prevotella, Gemella, Veillonella and Neisseria, while in patients with respiratory infections the most abundant genera were Prevotella, Achromobacter, Streptococcus, Rhizobium and Veillonella. At the last taxonomic level of the species the five most abundant species in the healthy subjects were Gemella haemolysans, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Veillonella atypica and Prevotella salivae while in the patients Achromobacter spanius, Prevotella pallens, Rothia mucilaginosa and Prevotella melaninogenica. The linear discriminant analysis-linear effect size analysis (LDA-LEfSe) revealed 93 microbial species that could help differentiate pharyngeal microbiome between patients and healthy, 17 microbial species that could distinguish pharyngeal microbiome according to sex (male- female) and 35 microbial species that could classify the pharyngeal microbiome as that of smokers or non-smokers. A core microbiome in the pharynx was determined, using the R's Microbiome software package, for each group of subjects (men, women, controls and patients), and the construction of a network of interactions between the microbial taxa of the pharyngeal microbiome (package NetCoMi) revealed a hub in the microbiome of the male’s pharynx, the Lachnospiraceae family of phylum Firmicutes, which appears to play an important role in this anatomical region. The comparison of the pharyngeal microbiome between men and women revealed an increase of the microbial richness in men from phylum to species level. On the contrary, a reduction in the microbial richness observed in the pharyngeal microbiome of smokers compared to the pharyngeal microbiome of non-smokers. An increase in microbial diversity was also observed with age, and the 41-49 years age group had the richest pharyngeal microbiome. The study of a-diversity showed a statistically significant difference between healthy and patients at the taxonomic level of phylum and genus. The analysis of b-diversity revealed also statistically significant difference between the same groups of subjects for all the taxonomic levels. Finally, the analysis of principal components (PCoA) revealed 35 microbial species that contributed most to the formation of PCoA axes in the distinction between healthy subjects and patients.