title: Characterization of the toolbox for selective biotinylation of Neurexin1α
Creators: name: Schulze Wehninck, Madita
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2025
Subjects: subject: 610 Medicine and health
subject: 570 Biology

description: Neurexine erfüllen wichtige synaptische Funktionen und sind aufgrund von Genmutationen relevant für Betroffene von ASD oder Schizophrenie. Die Forschung wird erschwert durch wenige Moleküle pro Zelle und den Mangel an spezifischen Antikörpern, weshalb wir eine Streptavidin-basierte Methode testeten. Eine Biotinligase-exprimierende Mauslinie soll mit einer Linie gekreuzt werden, die Nrxn1a mit fusioniertem Avi-Tag exprimiert. Die Ligase biotinyliert das Avi-Tag, woran Fluorophor-gekoppeltes Streptavidin bindet. Zwei Ligase-Mauslinien - transgen und Knock-in - wurden charakterisiert, zeigten jedoch unerwartet astrozytäre statt neuronale Expression und sind so zum Kreuzen ungeeignet, könnten jedoch der Erforschung astrozytärer Nrxns dienen. Die Anwendung der Markierungsmethode auf Kulturneuronen ergab einen Erfolg bzgl. transfiziertem Nrxn1a-Avi. Auf endogenem Level fand keine Detektion statt, was vermutlich auf geringe Expression und hohe Hintergrundfluoreszenz zurückzuführen ist.
description: 1 Introduction ..... 1
1.1 Synapses - how the main site of information exchange works ..... 1
1.2 The origins of Neurexins ..... 3
1.3 Disorders associated with Neurexins ..... 3
1.4 Neurexins ..... 5
1.5 Functions of neurexins ..... 7
1.6 Neurexins - a work in progress ..... 9
1.7 Labeling strategy ..... 12
1.8 Aim of the study ..... 15
2 Material &amp; Methods ..... 16
2.1 Material ..... 16
2.1.1 Equipment ..... 16
2.1.2 Chemicals ..... 17
2.1.3 Media and supplements ..... 18
2.1.4 Antibodies ..... 19
2.1.5 Apparatus ..... 20
2.1.6 Computer Software ..... 20
2.1.7 Mouse lines ..... 20
2.2 Methods ..... 21
2.2.1 Preparation and processing of tissue sections ..... 21
2.2.2 Culturing and processing of primary hippocampal neurons ..... 25
2.2.3 Preparation of neuronal cultures for electron microscopy ..... 29
3 Results ..... 32
3.1 Characterization of BirAer expression in the BirAer-HA(Tg)-mouse ..... 32
3.1.1 Nissl staining shows normal brain structure ..... 32
3.1.2 Synapsin staining shows normal distribution of synapses ..... 34
3.1.3 BirAer is expressed in astrocytes ..... 35
3.1.4 Biotin ligase-expressing cells also express GFAP and S100 ..... 36
3.2 Characterization of BirAer expression in the BirAer-HA(KI)-mouse ..... 40
3.3 Avi-Tag detection of biotinylated Nrxn1α-Avi in cultured neurons in fluorescence
microscopy ..... 42
3.3.1 Characterization of BirAer expression in cultured hippocampal neurons ..... 43
3.3.2 Labeling of Nrxn1α-Avi in cultured neurons transfected or transduced with BirAer ..... 47
3.3.3 Streptavidin labeling of additionally transfected Nrxn1α-Avi in cultured neurons ..... 49
3.3.4 Streptavidin surface labeling of Nrxn1α-Avi in cultured neurons ..... 58
4 Discussion ..... 61
4.1 Expression of BirAer in genetically modified mouse models ..... 62
4.1.1 BirAer-HA(Tg) mouse expresses BirAer in astrocytes - unspecific promoter? ..... 62
4.1.2 Expression of BirAer in knock-in mouse is unclear ..... 63
4.2 Labeling of Nrxn1α-Avi in neuronal cultures ..... 64
4.3 "Endogenous" Nrxn1α-Avi ..... 67
4.4 Efficiency of BirAer and the role of Biotin ..... 69
5 Summary ..... 72
6 Bibliography and references ..... 73
7 List of figures and tables ..... 87
8 List of abbreviations ..... 89
9 Acknowledgements ..... 92
10 Curriculum vitae ..... 93
11 Appendix ..... I