Study of DNA damage repair mechanisms and epigenetics in the maintenance of genome integrity: a role for histone de-ubiquitinase complexes
Creators: name: Φανουργάκη, Σμαράγδα Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Μεταγραφή
Μηχανισμοί επιδιόρθωσης DNA
Ιστόνη H2B
Απο-ουβικουιτίνωση
Transcription
DNA damage repair
Histone H2B ubiquitination
Nucleotide excision repair

description: Ο συνολικός σκοπός αυτής της μελέτης είναι να επεκτείνει την κατανόησή μας για τους μοριακούς μηχανισμούς της κυτταρικής απόκρισης που ενεργοποιούνται σε αντίδραση σε γενοτοξικό στρες, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες. Ειδικότερα, θέλουμε να διερευνήσουμε τις επιγενετικές πτυχές της κυτταρικής απόκρισης στο γενοτοξικό στρες και να αποκτήσουμε εις βάθος κατανόηση του πώς αυτές αλληλοεπιδρούν με την επιδιόρθωση του DNA και τη μεταγραφή για τη διατήρηση της γενωμικής ακεραιότητας. Οι συγκεκριμένοι στόχοι της μελέτης είναι δύο. Πρώτον, στοχεύσαμε στην αποσαφήνιση του ρόλου της δυναμικής της χρωματίνης και των υποκείμενων τροποποιήσεων των ιστονών που πραγματοποιούνται για να διευκολύνουν τη λειτουργία της επιδιόρθωσης και του μηχανισμού μεταγραφής τοπικά στα σημεία των βλαβών που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Δεύτερον, στοχεύσαμε στην εξέταση του ρόλου των ίδιων παραγόντων στην αναδιοργάνωση της μεταγραφής που προκαλείται σε απόκριση σε UV. Ο μηχανισμός εκτομής νουκλεοτιδίων (NER), και ιδιαίτερα το υπομονοπάτι που συνδέεται με τη μεταγραφή (TC-NER), είναι υπεύθυνο για την επιδιόρθωση βλαβών του DNA που εμποδίζουν την πρόοδο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (RNAPII) επιμήκυνσης στη μεταγραφόμενη αλυσίδα των ενεργών γονιδίων, εξασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτόν την πιστή μεταγραφή. Η σημασία αυτού του μηχανισμού επιδιόρθωσης αποδεικνύεται από τα σοβαρά συμπτώματα της σπάνιας προγεροειδούς νόσου Σύνδρομο Cockayne, που συνδέεται με ελαττωματικό TC-NER. Πρόσφατα ευρήματα στο εργαστήριό μας δείχνουν ότι η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί μια σημαντική μεταγραφική απόκριση που συμπεριλαμβάνει μια de novo συγχρονισμένη απελευθέρωση κυμάτων επιμήκυνσης, ενισχύοντας την ανίχνευση και την επιδιόρθωση των βλαβών του DNA σε ολόκληρο το μεταγραφόμενο γονιδίωμα (Lavigne et al., 2017). Ωστόσο, οι αλλαγές στο επίπεδο της χρωματίνης που καθορίζουν ή που προκαλούνται από αυτήν την εκτενή απελευθέρωση RNAPII παραμένουν ασαφείς. Τα δεδομένα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι μια ιστονική τροποποίηση που ενδεχομένως να έχει ρόλο στον μηχανισμό αυτόν είναι η μονο-ουβικουιτινίωση της ιστόνης H2B στην λυσίνη 120 (H2Bub), η οποία ρυθμίζεται από την συνεργατική δράση της ουμπικουτινάσης RNF20/40 και της δράσης από-ουβικουιτινίωσης (DUB) της υπομονάδας DUB του συμπλέγματος SAGA (Spt-ADA-GCN5-Acetyltransferase) κατά τη μεταγραφική επιμήκυνση. Το H2Bub μειώνεται δυναμικά ως απάντηση στην υπεριώδη ακτινοβολία, και η ρύθμιση αυτής της απόκρισης δείχνεται ότι σχετίζεται στενά με τη μεταγραφική αναδιάρθρωση που πραγματοποιείται ταυτόχρονα. Με ανάλυση της κατανομής της H2Bub σε κύτταρα με ανενεργή ATXN7L3 DUB σε συνθήκες έκθεσης σε υπεριώδη ακτινοβολία και αναστολής της μεταγραφής, δείχνεται ότι η κατανομή της H2Bub εξαρτάται από χαρακτηριστικά των γονιδίων, όπως η δομή των ιντρονίων και των εξονίων, και αποκαλύπτεται ότι η ολική μείωση της H2Bub που παρατηρείται, πρόκειται στην πραγματικότητα για μια αναδιανομή η οποία αντανακλά τη δυναμική της RNAPII. Τα παρατηρούμενα αποτελέσματα οφείλονται σε μια άμεση αλληλεξάρτηση του H2Bub στα επίπεδα και την ταχύτητα της RNAPII τοπικά, ενώ η μειωμένη δραστηριότητα της DUB ATXN7L3 οδηγεί σε αυξημένη ταχύτητα επιμήκυνσης υπό κανονικές συνθήκες και συνθήκες ακτινοβόλησης. Αυτά τα δεδομένα αποκαλύπτουν ότι η εικόνα της κατανομής του H2Bub ακολουθεί εκείνη της RNAPII, εξασφαλίζοντας την πιστή ταχύτητα επιμήκυνσης στο πλαίσιο της απόκρισης του DNA που οδηγείται από τη μεταγραφή.
description: The overall purpose of this study is to expand our understanding of the molecular mechanisms of the cellular response that are activated in response to genotoxic stress, both under normal and pathological conditions. In particular, we want to explore the epigenetic aspects of the cellular response to genotoxic stress and gain an in-depth understanding of how these interact with DNA repair and transcription to maintain genomic integrity. The specific objectives of the study are twofold. First, we aimed to elucidate the role of chromatin dynamics and the underlying histone modifications that occur to facilitate the function of the repair and transcription machinery locally at the sites of ultraviolet (UV)-induced damage. Second, we aimed to examine the role of the same factors in transcriptional reorganization induced in response to UV. The nucleotide excision machinery (NER), and in particular the transcription-coupled pathway (TC-NER), is responsible for the repair of DNA lesions that prevent the progress of RNA polymerase II (RNAPII) elongation on the transcribed strand of active genes, thereby ensuring faithful transcription. The importance of this repair mechanism is demonstrated by the severe symptoms of the rare progeroid disease Cockayne Syndrome, which is associated with defective TC-NER. Recent findings in our laboratory show that UV radiation induces an important transcriptional response that includes a de novo synchronized release of elongation waves, enhancing the detection and repair of DNA damage throughout the transcribed genome (Lavigne et al., 2017). However, the changes at the chromatin level that determine or are induced by this extensive RNAPII release remain unclear. The data of the present thesis show that a histone modification that may have a role in this mechanism is the mono-ubiquitination of histone H2B at lysine 120 (H2Bub), which is regulated by the cooperative action of the ubiquitinase RNF20/40 and the action of ubiquitination (DUB) of the DUB subunit of the SAGA complex (Spt-ADA-GCN5-Acetyltransferase) during transcriptional elongation. H2Bub is dynamically reduced in response to UV radiation, and the regulation of this response is shown to be closely related to the transcriptional remodeling that occurs simultaneously. By analyzing the distribution of H2Bub in ATXN7L3 DUB-inactivated cells under conditions of UV exposure and transcription inhibition, we show that the distribution of H2Bub depends on gene features, such as intron and exon structure, and reveal that the overall reduction of H2Bub observed is actually a redistribution that reflects the dynamics of RNAPII. The observed effects are due to a direct interdependence of H2Bub on RNAPII levels and velocity locally, whereas decreased activity of the DUB ATXN7L3 results in increased elongation velocity under normal and irradiated conditions. These data reveal that the distribution pattern of H2Bub follows that of RNAPII, ensuring faithful elongation speed in the context of the transcription-driven DNA response.