Η πρωτεΐνη Wap65-2 στην τσιπούρα (Sparus aurata): in silico ανάλυση και διερεύνηση της γονιδιακής έκφρασης σε θερμοκρασιακές, μεταβολικές και ανοσολογικές προκλήσεις
Creators: name: Παντελή, Νικόλας Κώστα
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Γονιδιακή έκφραση
Wap65
Sparus aurata
Gene expression

description: Η "πρωτεΐνη 65-kDa σχετιζόμενη με το θερμικό εγκλιματισμό" (warm temperature acclimation associated 65-kDa protein, Wap65) είναι μια γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος των ιχθύων που εμπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές και ανοσοβιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων του εγκλιματισμού των ιχθύων σε υψηλές θερμοκρασίες νερού και της ανοσοαπόκρισης. Σε διάφορα είδη τελεόστεων έχουν αναγνωριστεί δύο πρωτεΐνες Wap65, η Wap65-1 και η Wap65-2, οι οποίες δρουν ως πολυλειτουργικοί παράγοντες. Η παρουσία των δύο πρωτεϊνών Wap65s πιθανολογείται ότι προέκυψε από ένα συμβάν διπλασιασμού ολόκληρου γονιδιώματος που συνέβη στη εξελικτική γραμμή των ακτινοπτερύγιων. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε η αναγνώριση της τμηματικής ακολουθίας του γονιδίου Wap65-2 στην τσιπούρα Sparus aurata και μελετήθηκε η έκφραση τόσο του Wap65-2 όσο και του Wap65-1 στο ήπαρ υπό την επίδραση θερμοκρασιών, μεταβολικών και ανοσολογικών προκλήσεων. Το μέγεθος του Wap65-2 cDNA είναι 1.565 ζεύγη βάσεων (bp), ενώ το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο (ORF) αποτελείται από 1.260 bp που κωδικοποιούν ένα πρωτεϊνικό μόριο 419 αμινοξέων. Η πολλαπλή ευθυγράμμιση ακολουθιών υπέδειξε ότι η πρωτεΐνη Wap65-2 στο S. aurata παρουσιάζει σημαντικά ποσοστά ομολογίας με τις αντίστοιχες ορθόλογές της σε άλλα είδη τελεόστεων και μέτρια ποσοστά με την αιμοπηξίνη, την ορθόλογή της στον άνθρωπο. Η Wap65-2 διαθέτει συντηρημένα χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων ουσιωδών αμινοξικών καταλοίπων, τα οποία είναι σημαντικά για την πρωτεϊνική δομή της αιμοπηξίνης. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε το σαφή εξελικτικό διαχωρισμό των πρωτεϊνών Wap65-1 και Wap65-2, ενώ οι πρωτεΐνες Wap65s στο S. aurata εμφανίζουν μεγαλύτερη φυλογενετική σύνδεση με τις ορθόλογές τους στα υπόλοιπα είδη της τάξης Perciformes. Η σχετική έκφραση mRNA των Wap65-1 και Wap65-2 προσδιορίστηκε με τη μέθοδο της ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Η μεταγραφή των δύο γονιδίων μεταβάλλεται διαφορικά από διάφορα ερεθίσματα όπως η αύξηση της θερμοκρασίας του νερού και οι ανοσοποιητικές (έγχυση λιποπολυσακχαρίτη) και μεταβολικές (χορήγηση ινσουλίνης) προκλήσεις. Στην παρούσα έρευνα βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη Wap65-2 διαδραματίζει σημαντικότερο ρόλο στο θερμικό εγκλιματισμό του S. aurata συγκριτικά με τη Wap65-1 (η έκφραση του Wap65-2 αυξήθηκε σημαντικά έπειτα από αύξηση της θερμοκρασίας). Αντίθετα, η έκφραση του Wap65-1 φαίνεται να επάγεται σε περιπτώσεις αύξησης της θερμοκρασίας πέραν του ανώτατου ορίου ανοχής. Επιπρόσθετα, η επαγωγή της έκφρασης του Wap65-2 έδειξε χρονοεξαρτώμενο πρότυπο υποδεικνύοντας πιθανή εμπλοκή του σε οξείες και μακροπρόθεσμες αποκρίσεις. Τόσο το Wap65-1 όσο και το Wap65-2 δεν επέδειξαν σημαντική ανοσοαπόκριση έπειτα από έγχυση LPS, παρόλο που η έκφραση του Wap65-2 σημείωσε μια μικρή τάση αύξησης. Τέλος, η χορήγηση ινσουλίνης μείωσε σημαντικά τα επίπεδα έκφρασης των δύο γονιδίων. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας καταδεικνύουν τη συμμετοχή της πρωτεΐνης Wap65-1 στο θερμικό εγκλιματισμό και τον πολύπλευρο ρόλο της πρωτεΐνης Wap65-2 σε καταστάσεις καταπόνησης όπως οι θερμοκρασιακές μεταβολές και οι ανοσοπροκλήσεις.
description: The "Warm temperature acclimation associated 65-kDa protein" (Wap65) is a fish-specific plasma glycoprotein that is involved in various physiological and pathological processes, including acclimation to high temperatures and immune response. In some teleost species, two Wap65 proteins, Wap65-1 and Wap65-2 are found, both acting as a multifunctional agent. The presence of two Wap65 proteins probably resulted from a whole genome duplication event that occurred in the lineage of Actinopterygii. In the present study, we identified the partial sequence of Wap65-2 in gilthead seabream Sparus aurata and studied the hepatic expression of both Wap65-1 and Wap65-2 in response to temperature, metabolic and immunological challenges. The full-length Wap65-2 cDNA sequence is 1.565 bp, containing an open reading frame of 1.260 bp encoding for 419 amino acid residues. Multiple sequence alignment showed that Wap65-2 protein of S. aurata shares significant levels of homology with the corresponding orthologues from other teleost species and moderate levels with the hemopexin, a human corresponding ortholog. Wap65-2 protein displays conserved features including essential residues that are important for the protein structure of hemopexin. Phylogenetic analysis revealed the distinct evolutionary separation of Wap65-1 and Wap65-2 proteins, while Wap65s proteins in S. aurata are most closely related to their corresponding orthologous from other species of the order Perciformes. The relative mRNA expression of Wap65-1 and Wap65-2 was determined by Real-Time quantitative PCR (qRT-PCR). The transcription of the Wap65-1 and Wap65-2 genes is differentially modulated by various stimuli, including elevated water temperature, immune (lipopolysaccharide injection) and metabolic (insulin administration) challenges. In the present study we found that Wap65-2 protein seems to play an important role in the thermal acclimation of S. aurata compared to Wap65-1 protein (the expression of Wap65-2 increased significantly after temperature increase). In contrast, the expression of Wap65-1 was induced when temperature increased beyond the upper tolerance limit. Additionally, the induction of Wap65-2 expression showed a time-dependent pattern indicating a role in both acute and long term adaptation responses. Both Wap65-1 and Wap65-2 showed no significant immune response after LPS injection, although an increasing tendency was noted in the expression of Wap65-2. Furthermore, insulin administration resulted in significant reduction in the expression levels of both genes. In conclusion, the results of this study demonstrate the involvement of Wap65-1 protein in thermal acclimation and the multifunctional role of Wap65-2 protein in stress-related situations like temperature changes and immune challenges.