title: A novel model for quantification of tumor-induced angiogenesis and lymphangiogenesis in the chicken chorioallantoic membrane
Creators: name: Harter, Eva
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Melanome zählen zu den aggressivsten, therapieresistenten humanen Tumoren, die durch eine maligne Transformation der Melanocyten entstehen. Während des pathologischen Prozesses der Tumorgenese erhalten Tumorzellen proliferative Signale aufrecht, umgehen Wachstumssupression, vermeiden Mechanismen, die zum Zelltod führen und erlangen ein erhöhtes Replikationspotential. Angiogenese und Lymphangiogenese kann von Primärtumoren induziert werden. Diese erworbenen Fähigkeiten tragen zur Metastasierung bei. Speziell Melanomzellen können die Eigenschaften des Lymphsystems manipulieren und Metastasierung durch intra- und peritumorale Lymphangiogenese fördern. Verantwortlich dafür sind zwei Mitglieder der Familie der Endothelwachstumsfaktoren: VEGF-C und VEGF-D, die an die Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 binden. Im Rahmen des Projektes wurden humane Tumore auf der Chorioallantois Membran von Hühnerembryonen mit folgenden humanen Zelllinien induziert: A375 Melanomzellen mit basalen VEGF-C Expressionslevels, A375 Melanomzellen, die genetisch modifiziert wurden, sodass sie VEGF-C überexprimieren und HT1080 Fibrosarkomzellen, die äußerst hämatogene, maligne mesenchymale Tumore bilden, die von fibrösem Bindegewebe stammen. Die Induktion von peritumoraler Angiogenese und Lymphangiogenese wurde ebenfalls mittels RT-qPCR unter Verwendung von Primer für Prox1, einem Lymphgefäß-spezifischen Marker, und Primer für PLVAP, einem Blutgefäß-spezifischen Marker, ermittelt. Die PCR wurde mit cDNA aus isolierter RNA einer Xenotransplantat Probe an der Schnittstelle zwischen Tumor und Chorioallantois Membran durchgeführt. Damit konnte eine verlässliche Methode etabliert werden, mit der Tumor-assoziierte Lymphangiogenese schnell detektiert und quantifiziert werden kann. Um Interaktionen zwischen Tumorzellen und Blut- oder Lymphgefäßen oder etwaige Intravasationsprozesse zu observieren, wurden histologische Schnitte der Tumor Xenotransplantate angefertigt und mittels Immunhistochemie gefärbt. VEGF-C abhängige Lymphangiogenese wurde lokal inhibiert, indem löslicher VEGFR-3 appliziert wurde. Der Behandlungseffekt, ein Rückgang der Lymphangiogenese, konnte mittels RT-qPCR für Prox1 nachgewiesen und quantifiziert werden. Wir konnten erfolgreich ein neues hoch-durchsatz in vivo Modell entwickeln, das die verlässliche Quantifizierung von Tumor Lymphangiogenese durch RT-PCR mittels Hühner-spezifischen PROX1 Primern und Tumor Hemangiogenese durch Hühner-spezifische PLVAP Primer ermöglicht. Diese RT-PCR Messungen korrelieren mit Tumor sekretierten VEGF-C und VEGF-A Mengen und ebenso mit immunohistochemischen Auswertungen des Lymph- und Hemangiogenese Grades der jeweiligen Tumoren.
description: During the pathological process of tumorigenesis, tumor cells sustain proliferative signaling, resist cell death and evade growth suppression, enable replicative immortality and induce angiogenesis and lymphangiogenesis. Together, these features pave the way for metastatic spread. Especially in the case of melanoma, one of the most aggressive and treatment-resistant human cancers, tumor cells can manipulate the properties of the lymphatic system to promote metastasis by inducing intra- and peritumoral lymphangiogenesis. Lymphangiogenesis describes the formation of new lymphatic vessels from preexisting ones and is triggered by two members of the family of vascular endothelial growth factors: VEGF-C and VEGF-D that bind to their receptors, VEGFR-2 and VEGFR-3, while angiogenesis refers to the emergence of new blood vessels that is triggered by VEGF-A and VEGF-B that bind to their receptors, VEGFR-1 and VEGFR-2. The major aim was to establish a novel model that allows for quantification of tumor-associated lymphangiogenesis and revelation of more information on the metastatic process in melanoma using the chicken chorioallantoic membrane model, a well-established model for tumorigenesis and angiogenesis. This thesis project involved grafting human tumors on the chicken chorioallantoic membrane (CAM), for which the following cell lines were used: human A375 melanoma cells, showing normal expression levels of VEGF-C (A375), human A375 melanoma cells, modified to over-express VEGF-C (A375/VEGF-C) and human HT1080 fibrosarcoma cells, that form strongly angiogenesis-inducing and highly hematogenous, malignant mesenchymal tumors as examples for tumors that directly intravasate into blood vessels. Induction of peritumoral lymph- and hemangiogenesis was quantified by RT-qPCR with cDNA obtained from RNA of a piece of tumor-stroma interface, using primers for Prox1 (Prospero Homeobox Protein 1), a specific marker for the lymphatic vascular endothelium, and PLVAP (Plasmalemma Vesicle-Associated Protein), a specific marker for the blood vasculature, respectively. Using RT-qPCR, a novel model was established to quickly and easily quantify tumor-induced lymphangiogenesis in comparison to tumor-induced angiogenesis. To further evaluate these measurements, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and tumor cells were stained immunohistochemically and monitored using a laser scan microscope. Quantification results of lymphatic and blood vessels, but also local intravasation events were in line with the obtained RT-qPCR data. VEGF-C – mediated lymphangiogenesis was inhibited by topically treating the tumors with soluble VEGFR-3. A decrease of lymphangiogenesis could be observed by a reduction of Prox1 expression, quantified by RT-qPCR. To assess the effect of VEGF-C over-expression, concomitant lymphangiogenesis and therapeutic intervention with soluble VEGFR-3 on distant metastasis, human Alu DNA sequences were quantified in the distant CAM by qPCR. We succeeded to establish a high throughput in vivo model to quickly and reliably quantify tumor-associated lymphangiogenesis by using RT-PCR quantification of chicken specific Prox1 as well as tumor associated angiogenesis by primers directed against PLVAP. These measurements correlate with the amounts of the respective VEGF-C and VEGF-A levels secreted by different tumors and also with the levels of lymphangiogenesis and angiogenesis determined by immunohistochemistry.