Lipase-catalysed synthesis of glycolipids - utilization of innovative media, reactors and substrates -
Creators: name: Delavault, André
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2021
Subjects: heterogenous biocatalysis
lipase
deep eutectic systems
intensification
integrated process
biosurfactants
microwaves
downstream processing
single cell oil
bioactivity
biosensing

description: Glykolipide sind vielversprechende nichtionische Tenside mit einem breiten Anwendungsspektrum. Man begegnet ihnen täglich in Reinigungsmitteln, Pharmazeutika oder auch in Lebensmitteln. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit und Präsenz in Hygieneprodukten steigt die Nachfrage weltweit kontinuierlich an. Die etablierte chemische Synthese von Glykolipiden weist einige Nachteile wie mangelnde Spezifität und Selektivität auf. Im Gegensatz zu den traditionellen Tensiden fossilen Ursprungs weisen sie nicht nur hervorragende Tensid- und Emulgiereigenschaften auf, sondern sind auch biologisch abbaubar und nicht toxisch für die Umwelt. Glykolipide können durch mikrobielle Fermentation, durch chemische oder enzymatische Synthese unter Verwendung erneuerbarer Ressourcen hergestellt werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir unter Verwendung von Lipasen, dass die Esterbildung unter milden und nahezu wasserfreien Bedingungen erreicht werden kann, wobei letztere erforderlich sind, um die Kondensation anstelle der Hydrolysereaktion zu begünstigen. So wurde unter Verwendung von Lösungsmitteln mit geringer Wasseraktivität der enzymatisch synthetisierte Zuckeralkoholester, Sorbitollaurat, als Modellprodukt verwendet. Folglich hebt diese Dissertation die enzymatische Synthese als Methode der Wahl für die maßgeschneiderte Herstellung einer potenziell breiten Palette von neuartigen Tensiden hervor. Die Biokatalyse ermöglichte eine innovative Herangehensweise an dieses aktuelle Thema mit einem multidisziplinären Ansatz im Hinblick auf die aktuellen Bedenken zur Nachhaltigkeit. Die Löslichkeit von Polyolen wie Zuckern oder Zuckeralkoholen in organischen Lösungsmitteln ist eher gering. Die enzymatische Synthese dieser Verbindungen ist jedoch in nahezu wasserfreien Medien unter Verwendung kostengünstiger und nachwachsender Rohstoffe möglich. Mit Hilfe von Lipasen kann die Esterbildung unter milden Bedingungen erreicht werden. Wir schlagen zunächst ein "2-in-1"-System vor, das die Löslichkeitsprobleme überwindet, da ein Deep Eutectic System (DES) aus Sorbitol und Cholinchlorid entweder ein rein organisches oder wässriges Medium ersetzt. Erstmals wurden 16 kommerziell erhältliche Lipase-Formulierungen verglichen und Faktoren, die den Umsatz beeinflussen, untersucht, um diesen Prozess dank einer neu entwickelten HPLC-ELSD-Methode zur Quantifizierung zu optimieren. So konnte bei der optimierten Synthese von Sorbitollaurat (SL) unter Verwendung von 50 g/L der Lipaseformulierung Novozym 435® bei 50°C eine 28%ige molare Umsetzung von 0,5 M Vinyllaurat zu seinem Zuckeralkoholmonoester erreicht werden, wenn das DES 5 Gew.-% Wasser enthielt. Nach 48h wurde das de novo synthetisierte Glykolipid durch Flüssig-Flüssig-Extraktion vom Medium abgetrennt, durch Flash-Chromatographie gereinigt und durch ein- und zweidimensionale Kernspinresonanz (NMR)-Experimente und Massenspektrometrie (MS) charakterisiert. Abschließend erbringen wir einen ersten Nachweis der Skalierbarkeit für diesen Prozess. Die Verwendung eines 2,5-L-Rührkesselreaktors (STR) ermöglichte eine Batch-Produktion bis zu 25 g/L in einem hochviskosen Zweiphasensystem. Dennoch bleiben viele Herausforderungen bestehen und begrenzen die Erwartungen an eine industrielle Anwendung. Eine lange Produktionszeit und relativ niedrige Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten gehören zu den Barrieren, die es zu überwinden gilt. Wir konzentrierten uns in diesem Zusammenhang auf die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten bei der Herstellung von Sorbitollaurat durch eine mikrowellenunterstützte Methode, die wir jedoch mit einer konventionellen Heizmethode verglichen. Es wurden auch verschiedene Lösungsmittelsysteme miteinander konkurriert, wobei sich 2M2B als ein leistungsfähigeres Lösungsmittelsystem als das DES erwies. So erlaubte die Verwendung von 20 g/L immobilisierter Lipaseformulierung, 0,75 M Vinyllaurat, 0,25 M Sorbitol bei 50°C in 2M2B eine 92%ige Konversionsausbeute zu erreichen, was einer 168 g/L Titerproduktion entspricht. Der Einsatz der Mikrowellentechnologie ermöglichte danach eine 50-fache Steigerung der ursprünglichen Reaktionsgeschwindigkeit im organischen Lösungsmittel bei 75°C. Die Wiederverwendung des Biokatalysators wurde auch in 2M2B und DES untersucht, wobei bei letzterem eine größere Destabilisierung des Enzyms festgestellt wurde. Wir bringen somit eine Nuance in die intensive Entwicklung, die DESs derzeit in der Literatur als Medium für die Biokatalyse erfahren. Nichtsdestotrotz zeigen wir ermutigende Aussichten auf Verbesserungen, um DESs konkurrenzfähig zu Standardmedien für Biokonversionen zu machen. Abschließend untersuchten wir die Effizienz unseres Downstream-Prozesses, der die vollständige Rückgewinnung von Sorbitollaurat nach 4 Zyklen der Flüssig-Flüssig-Extraktion ermöglicht. Bestehende Berichte, die integrierte Prozesse zur Glykolipidproduktion aus nachwachsenden Rohstoffen beschreiben, verwenden viele Reaktionsschritte. Daher zielten wir darauf ab, das Verfahren zu vereinfachen. Durch die Verwendung von dielektrischer Mikrowellenerwärmung wurde die Herstellung von DESs zunächst erheblich beschleunigt. Unsere Vergleichsstudie ergab eine durchschnittlich 16-fach schnellere Vorbereitungszeit als die konventionelle Erhitzungsmethode in einem Inkubator. Darüber hinaus konnten Lipide aus robuster ölhaltiger Hefe-Biomasse erfolgreich bis zu 70% extrahiert werden, ohne die Vorbehandlungsmethode für den Zellaufschluss zu verwenden, wodurch der für einen solchen Prozess notwendigen Energieaufwand begrenzt. Angesäuerte DESs, die entweder aus Xylit oder Sorbit und Cholinchlorid bestanden, vermittelten den Eintopfprozess und ermöglichten die anschließende Umwandlung der Lipide in monoacylierte Palmitat-, Oleat-, Linoleat- und Stearat-Zuckeralkoholester. Somit zeigen wir, dass die Zugabe von immobilisierter Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®) in einer angesäuerten DES-Mischung eine vereinfachte und schnelle Glykolipidsynthese unter Verwendung direkt ölhaltiger Hefebiomasse ermöglicht. Schließlich stellen wir fest, dass der DES-ähnliche Manuka-Honig auch als Medium für die Glykolipidsynthese dienen kann. Diese übersättigte Zuckerlösung kann in Bezug auf die physikochemischen Eigenschaften mit den zuckerbasierten DESs verglichen werden. Da Honigprodukte für therapeutische Zwecke kommerziell verfügbar sind, erscheint es interessant, ihre Bioaktivität zu erhöhen. Im letzten Kapitel dieser Dissertation wird untersucht, ob die Anreicherung von medizinischem Honig mit in situ enzymatisch synthetisierten Glykolipiden die antimikrobielle Eigenschaft der Mischung verbessern kann. Die getesteten Mischungen bestehen aus Manuka-Honig, der mit Octanoat-, Decanoat-, Laurat- und Myristat-Zuckerestern angereichert ist, die jeweils als GOH, GDH, GLH und GMH bezeichnet werden. Um die Bioaktivität dieser Mischungen zu charakterisieren, wurde zunächst ein qualitatives Screening mittels Agar-Well-Diffusionstest mit Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli und Pseudomonas putida durchgeführt, das eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit dieser Mikroorganismen gegenüber den verschiedenen mit Glykolipiden angereicherten Honigmischungen bestätigte. Dann wurde ein entworfener Biosensor E. coli-Stamm verwendet, der ein Stressreportersystem aufweist, das aus drei stressspezifisch induzierbaren, rot, grün und blau fluoreszierenden Proteinen besteht, die jeweils physiologischen Stress, Genotoxizität und Zytotoxizität übersetzen. Letzteres ermöglichte die Charakterisierung der Bioaktivität und zeigte eine sechsfache Steigerung des physiologischen Stresses durch GOH im Vergleich zu regulärem Manuka-Honig bei einer Konzentration von 1,6% (v/v). Der antibakterielle Agar-Well-Diffusionstest mit E. coli wurde dann durchgeführt und zeigte ein verbessertes hemmendes Potential mit GOH bei 20% (v/v) Konzentration.