title: Biochemical Investigations on Microbial Prenyltransferases in the Presence of DMAPP Analogues
title: Biochemische Untersuchungen an mikrobiellen Prenyltransferasen in Anwesenheit von DMAPP-Analoga
Creators: name: Liebhold, Mike Patrick
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Enzymkatalyse
Prenyltransferases
Schlauchpilze
Chemical Synthesis
DMAPP Analogues
Dimethylallyl-Transferase
Medizin, Gesundheit
Streptomycetaceae

description: Plants, bacteria and fungi provide
      a plethora of diverse structures derived from the primary as
      well as the secondary metabolism. Representative substances
      from secondary metabolite pathways are flavonoids, coumarins,
      xanthones and indole alkaloids. Although not necessary for
      the growth and reproduction of the respective organisms,
      nevertheless these compounds give them an advantage over
      other organisms in the form of, e.g. attractants or
      protection agents against natural enemies as well as
      competitors. The attachment of isoprene units (n  C-5) such
      as dimethylallyl, geranyl or farnesyl moieties to aromatic
      secondary metabolites as backbones is a further step in the
      broad diversification of these compounds. Enzymes of the
      class of prenyltransferases accomplish this prenyl transfer
      reaction in nature. The prenylated natural products often
      exhibit strong pharmacological activities in contrast to
      their substrates. Therefore, prenylated compounds represent
      interesting targets for drug development. Investigations on
      alternative alkyl residues transferable via
      prenyltransferases, i.e. prenyl diphosphate analogues, could
      have the potential to play an important role in the
      understanding of the catalytic mechanism of these enzymes as
      well as in the finding process of new drugs. As the first
      project in this thesis, the acceptance of four chemically
      synthesized alkyl and allyl diphosphates in the presence of
      three L-tryptophan prenyltransferases (FgaPT2, 5 DMATS, 7
      DMATS) was elucidated. Retaining the double bond in β
      position and performing alterations on the methyl groups of
      the allyl residue led to regular alkylated products and
      thereby showed successful utilization of DMAPP analogues.
      However, depending on the DMAPP analogue, the
      regiospecificity of the applied prenyltransferases was
      shifted partially or completely. Furthermore, the enzymes did
      not catalyze the transfer reaction of alkyl diphosphates onto
      the L tryptophan scaffold, if no double bond was present or
      if it was relocated to  position compared to DMAPP.
      Subsequently, the behavior of cyclic dipeptide
      prenyltransferases (AnaPT, CdpNPT, CdpC3PT, FtmPT1, BrePT)
      towards the unnatural alkyl and allyl donors was examined.
      The cyclic dipeptide prenyltransferases also used the
      unsaturated DMAPP analogues resulting in the formation of
      multiple products. Regardless of the prenylation position and
      orientation for the prenyl attachment (C 2 or C 3; regular or
      reverse) in the presence of DMAPP, the enzymatic reactions
      with both DMAPP analogues, i.e. MAPP and 2-pentenyl-PP,
      yielded a mixture of C2 reverse as well as C3 reverse
      alkylated diastereomers in different ratios depending on the
      donor and used enzyme. After the successful alkylation of L
      tryptophan and tryptophan-containing cyclic dipeptides
      utilizing simple unnatural allyl DMAPP analogues, the
      acceptance of the structurally more complex DMAPP analogue
      benzyl diphosphate was tested. Preliminary investigations
      showed the successful usage of this benzyl donor by several L
      tryptophan and cyclic dipeptide prenyltransferases, whereas
      FgaPT2 showed the highest activity. FgaPT2 also displayed a
      remarkable promiscuity using tryptophan analogues as
      substrates and catalyzing a highly regiospecific C5
      benzylation. Consequently, the usage of benzyl diphosphate
      instead of dimethylallyl diphosphate results in a complete
      shift of the prenylation position from C 4 to C 5. To
      complete our findings regarding the acceptance of unnatural
      alkyl and benzyl analogues by prenyltransferases, several
      tryptophan C5-, C6- and C7-prenylating enzymes of fungal and
      bacterial origin have been assayed with the three analogues.
      Depending on the enzyme used, one to four products could be
      identified from the incubation mixtures. The predominant
      products were regular C6-alkylated or C6-benzylated
      derivatives in all cases. Therefore, for the tested
      tryptophan C5-, C6- and C7-prenylating enzymes, C-6 seemed to
      be the preferred position for attachment of the alkyl or
      benzyl moiety. The results obtained during this thesis show
      that allyl as well as benzyl analogues of DMAPP are potential
      alternatives for chemoenzymatic FriedelCrafts alkylations of
      simple indole derivatives and tryptophan-containing cyclic
      dipeptides and could be used for the production of alkylated
      compounds.
description: Pflanzen, Bakterien und Pilze
      weisen eine Fülle an unterschiedlichen Strukturen sowohl aus
      dem Primär- als auch aus dem Sekundärstoffwechsel auf.
      Vertreter, der aus dem Sekundärstoffwechsel stammenden
      Substanzen, sind unter anderem Flavonoide, Coumarine,
      Xanthone und Indol-Alkaloide. Wenngleich sie nicht essenziell
      für das Wachstum und die Reproduktion der entsprechenden
      Organismen sind, verschaffen diese Stoffe ihren Produzenten
      dennoch einen Vorteil gegenüber anderen Organismen, zum
      Beispiel in Form von Lockstoffen, als Fraßschutz sowie als
      Abwehrstoffe gegen Konkurrenten. Das Anbringen von Isopren
      Einheiten (n  C5) wie zum Beispiel Dimethylallyl-, Geranyl-
      oder Farnesyl Gruppen an diese Grundstrukturen aus dem
      Sekundärstoffwechsel ist ein weiterer Schritt zur breiten
      Differenzierung dieser Stoffe. In der Natur bewerkstelligen
      Prenyltransferasen diese Prenylierungsreaktion. Prenylierte
      Naturstoffe weisen, im Gegensatz zu ihren Substraten, oftmals
      starke pharmakologische Wirkungen auf. Daher stellen sie
      interessante Moleküle für die Entwicklung von Arzneistoffen
      dar. Untersuchungen an, mit Hilfe von Prenyltransferasen
      übertragbaren, alternativen Alkyl Resten, sogenannten
      Prenyl-Diphosphat Analogen, könnten eine wichtige Rolle beim
      Verstehen der katalytischen Mechanismen dieser Enzyme und
      ebenso bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe spielen. Zu
      Beginn dieser Dissertation wurde die Akzeptanz vier chemisch
      synthetisierter Alkyl- und Allyl Diphosphate durch drei
      L-Tryptophan-Prenyltransferasen (FgaPT2, 5 DMATS, 7 DMATS)
      aufgeklärt. Wurde die Doppelbindung an β Position beibehalten
      und nur die Methylgruppen verändert, so führte dies zur
      Bildung von regulär alkylierten Produkten und zeigten damit
      die erfolgreiche Anwendung von DMAPP-Analoga. Es wurde jedoch
      eine teilweise bzw. vollständige Verschiebung der
      Regiospezifität der verwendeten Prenyltransferasen
      beobachtet, abhängig vom eingesetzten DMAPP Analog. Die
      Enzyme katalysierten hingegen nicht die Übertragung von
      Alkyl-Diphosphaten mit fehlender oder bzw. nach  Position
      verschobener Doppelbindung. Weiterhin wurde das Verhalten
      zyklischer Dipeptid-Prenyltransferasen (AnaPT, CdpNPT,
      CdpC3PT, FtmPT1, BrePT) gegenüber unatürlichen Alkyl- und
      Allyl Donoren untersucht. Die zyklischen
      Dipeptid-Prenyltransferasen akzeptierten ebenfalls die
      ungesättigten DMAPP Analoga MAPP und 2-pentenyl-PP und
      führten zur Bildung mehrerer Produkte. Ungeachtet der
      Position und Ausrichtung des Prenyl-Restes (C-2 oder C 3) in
      Anwesenheit von DMAPP, brachten die Reaktionen dieser Enzyme
      eine Mischung von C2- sowie C3-revers alkylierten
      Diastereomeren in unterschiedlichen Verhältnissen hervor,
      abhängig vom gewählten Donor sowie Enzym. Nach der
      erfolgreichen Alkylierung von L Tryptophan sowie
      Tryptophan-haltigen zyklischen Dipeptiden mittels einfacher
      allylischer DMAPP-Analoga wurde die Akzeptanz eines
      strukturell komplexeren DMAPP-Analogons (Benzyl-Diphosphat)
      getestet. Vorangegangene Untersuchungen zeigten, dass mehrere
      L Tryptophan- sowie zyklische Dipeptid-Prenyltransferasen
      diesen Benzyl-Donor akzeptierten, wobei FgaPT2 den höchsten
      Umsatz verzeichnete. FgaPT2 wies außerdem eine breite
      Substratspezifität auf und nutzte sowohl L Tryptophan als
      auch verschiedene Derivate hiervon. In diesen Fällen
      katalysierte diese Prenyltransferase mit hoher
      Regiospezifität eine C5 Benzylierung, was eine vollständige
      Verschiebung der Prenylierungposition von Position C-4
      darstellt. Um die Untersuchungen bezüglich der Akzeptanz
      nicht natürlicher Alkyl- sowie Benzyl Analoga abzurunden,
      wurden verschiedene Enzyme, welche Tryptophan an den
      Positionen C 5, C-6 oder C-7 prenylieren, aus Pilzen wie auch
      aus Bakterien zusammen mit den drei DMAPP Analoga inkubiert.
      Je nach verwendetem Enzym konnten bis zu vier Produkte
      isoliert werden. In allen Enzymassays war C6-alkyliertes oder
      benzyliertes L-Tryptophan das Hauptprodukt. Position C-6 des
      Indolringes wurde somit für die C-5, C-6 oder C-7
      prenylierenden Enzyme zur bevorzugten Angriffspunkt für die
      Übertragung der Alkyl- oder des Benzyl-Restes. Die in dieser
      Dissertation genannten Ergebnisse zeigen, dass sowohl Allyl-
      als auch Benzyl Analoga von DMAPP als mögliche Alternativen
      für chemoenzymatische FriedelCrafts Alkylierungen zur
      Herstellung unnatürlich alkylierter Substanzen verwendet
      werden können.