title: Spatiotemporal Regulation of Plant Plasma Membrane Proteins at the Nanoscale: Advancements in and Applications of sptPALM and FRET-FLIM Techniques for Integrated Analyses
Creators: name: Rohr, Leander Karl Wilhelm
Publisher: name: Universität Tübingen
Year: 2025
Subjects: subject: Mikroskopie , Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie , Plasmamembran , Zellwand , Ackerschmalwand , Nicotiana benthamiana
subject: 500
subject: 570
subject: 580
subject: Nanodomäne
subject: sptPALM
subject: nanodomain
subject: super-resolution microscopy
subject: Super-Resolution-Mikroskopie
subject: single-particle tracking
subject: FRET-FLIM
subject: FRET
subject: dual-color
subject: Einzelmolekülverfolgung
subject: PA-GFP
subject: PATagRFP
subject: mEos

description: Proteine in der pflanzlichen Plasmamembran (PM) sind nicht homogen verteilt, sondern vielmehr in verschiedenen Domänen im Nanomaßstab organisiert, welche molekulare Knotenpunkte bilden können. Während einige Aspekte dieser Komplexe, wie zum Beispiel Protein-Protein-Wechselwirkungen oder die Auswirkungen ihrer Signalkaskaden, häufig bereits bekannt sind, wurde ihrer räumlich-zeitlichen Regulierung bisher vergleichsweise wenig Aufmerksamkeit geschenkt. Allerdings legen Studien eine zentrale Rolle dieser Regulation in verschiedenen Signalkaskaden nahe, sodass es von besonderem Interesse ist, auch diese Prozesse im Detail zu untersuchen.Die Einzelpartikelverfolgung in Kombination mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (sptPALM) liefert räumlich-zeitliche Informationen über Proteine mit hoher Präzision. Während die Methode in nichtpflanzlichen Systemen bereits länger etabliert ist, hat sich die Technik in der Pflanzenforschung erst kürzlich verbreitet und befindet sich noch unter ständiger Verbesserung und Weiterentwicklung. Dabei haben wir zwei große Herausforderungen identifiziert: (i) Die Analyse der Daten wird durch mehrstufige Auswertungsprozesse erschwert, wofür spezifische Softwarelösungen verwendet werden müssen. (ii) Um physiologische Prozesse besser zu verstehen, ist die raum-zeitliche Untersuchung von mehr als einem Protein zeitgleich besonders wichtig; dies war jedoch bisher mit sptPALM in Pflanzen nicht möglich. Neben diesen technischen Aspekten waren wir auch daran interessiert, inwieweit verschiedene Komponenten der pflanzlichen Zelle, im Speziellen das Zytoskelett, die Organisation von PM-Proteinen beeinflussen.In dieser Arbeit stellen wir eine universelle Softwarelösung vor, welche intuitiv ist und den Anwender durch alle Analyseschritte führt. Wir haben ihre Funktionalität demonstriert, indem wir Proteine mit publizierten raum-zeitlichen Daten sowie weitere gut charakterisierte pflanzliche PM-Proteine analysiert haben, welche bisher nicht Gegenstand von sptPALM-Studien waren. Unsere Ergebnisse weisen zudem auf organspezifische Effekte und einen Einfluss des Entwicklungsstadiums der Pflanze auf den Diffusionskoeffizienten hin – Aspekte, die bisher in keinen anderen Untersuchungen berücksichtigt wurden.Darüber hinaus haben wir zum ersten Mal die generelle Verwendbarkeit von zwei fluoreszierenden Proteinen (FP) gezeigt –photoaktivierbares (PA)-GFP und PATagRFP – welche simultane zweifarbige sptPALM-Studien in Pflanzen ermöglichen könnten. Anschließend haben wir ihre tatsächliche Anwendung in einer Proof-of-Principle-Studie nachgewiesen, in der wir die Proteindynamik von zwei unterschiedlich markierten Proteinen gleichzeitig analysiert haben. Dies erweitert nicht nur das Portfolio verfügbarer FP, sondern ermöglicht es Forschern in Zukunft auch, beispielsweise die Wirkung externer Stimuli auf verschiedene Proteine gleichzeitig zu untersuchen.In Folge der Untersuchungen, wie das Zytoskelett die pflanzliche PM und die darin lokalisierten Proteine reguliert, konnten wir gegenläufige Effekte von Aktinfilamenten und Mikrotubuli zeigen. Die Störung von Aktinfilamenten führt in erster Linie zu verringerten Diffusionskoeffizienten, größeren Proteinclustern und eingeschränkteren Bewegungen, während die Manipulation von Mikrotubuli zu erhöhten Diffusionskoeffizienten, vermehrter ungehinderter Diffusion und verringerten Clustergrößen führt. Mit diesen Ergebnissen unterstreichen wir die potenziell spezifischen regulatorischen Funktionen dieser unterschiedlichen Zytoskelett-Komponenten. Infolgedessen schlagen wir einen veränderten Mechanismus für die Zytoskelett-vermittelte Kompartimentierung der PM im Vergleich zum picket fence model der tierischen Zellen vor.Außerdem habe ich Forscher bei Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen in Kombination mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Mikroskopie (FLIM; FRET-FLIM) unterstützt, um verschiedene Signalwege genauer zu verstehen. Erneut konnten wir demonstrieren, dass FRET-FLIM Experimente hervorragend geeignet sind, um Ergebnisse anderer Protein-Protein-Interaktionsmethoden zu unterstützen oder zu bestätigen sowie um aktuelle Arbeitsmodelle um neue Erkenntnisse zu erweitern. Zum Beispiel deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die SUCROSE-INDUCED RECEPTOR KINASE 1 (SIRK1), QIAN SHOU KINASE 1 (QSK1) und das PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN 2;4 (PIP2;4) in präformierten Proteinclustern vorhanden sein könnten; eine Hypothese, welche wir aktuell weiterverfolgen.Schließlich habe ich an zwei Projekten mitgewirkt, bei welchen wir eine FRET-FLIM-Methode zur Untersuchung von tripartiten Komplexen in lebenden Zellen vorgestellt haben und bei welchen wir klassische Laborexperimente mit computergestützten Modellierungen kombiniert haben, um das Verständnis des Brassinosteroid-Signalnetzwerks zu verbessern. Dadurch konnten wir beispielsweise CYCLIC NUCLEOTIDE GATED CHANNEL 10 (CNGC10) als eine neue Komponente dieses Signalwegs identifizieren.Zusammenfassend stellt diese Arbeit wesentliche methodische und technische Fortschritte sowie Anwendungen vor, die es Pflanzenwissenschaftlern erleichtern werden, die räumlich-zeitliche Organisation von PM-Proteinen effektiver zu erforschen.