title: Die Ustilago maydis MAP-Kinase-Kaskade: Identifikation der MAP-Kinase-Ziele durch phosphpo-Peptid-Anreicherung
title: The Ustilago maydis MAP kinase signaling pathway: Identification of MAP kinase targets by phosphpo-peptide enrichment
Creators: name: Naik, Vikram
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: phosphoproteomics
plant pathogen
Life sciences
MAP-Kinase
Ustilago

description: Ustilago maydis ist der Erreger
      des Maisbeulenbrands und dient als Modellorganismus um
      Interaktionen zwischen Pilz und Pflanze zu untersuchen.
      Pilzliche Paarung, invasives Wachstum in Maispflanzen und
      Virulenz werden in U. maydis über eine MAP-Kinase(MAPK)
      Kaskade reguliert. Zentrale Faktoren für Pathogenität sind
      die konservierten MAP-Kinasen (MAPKs) Kpp2 und Kpp6. Die
      MAP-Kinase Kpp2 ist in den Prozess der Appressorienbildung
      involviert, wohingegen Kpp6 eine Rolle während der
      Penetration pflanzlicher Epidermiszellen spielt. Weder für
      Kpp2 noch für Kpp6 wurden bisher die Substratproteine
      identifiziert welcher direkt phosphoryliert werden. Ziel
      dieser Arbeit war es wichtige Virulenzfaktoren zu
      identifizieren, welche in der MAP-Kinase Kaskade direkt
      unterhalb von Kpp2 und Kpp6 agieren. Zur artifiziellen
      Induktion der MAP-Kinase Kaskade wurde der Stamm FB1fuz7DD
      genutzt, welcher ein konstitutiv aktives allel der
      MAP-Kinase-Kinase Fuz7 (Fuz7DD) unter Kontrolle eines
      Arabinose induzierbaren Promotors exprimiert. Mittels eines
      phosphoproteomischen Ansatzes konnten nach Induktion der
      MAP-Kinase Kaskade phosphorylierte Proteine in Anwesenheit
      und Abwesenheit von kpp2 und kpp6 detektiert werden.
      Anreicherung phosphorylierter Proteine erfolgte in einem
      zweistufigen chromatographischen Prozess, bei welchem
      zunächst mittels einer Al(OH)3 Metalloxid
      Affinitätschromatographie (MOAC) Phosphoproteine angereichert
      wurden, um nach tryptischer Hydrolyse, mittels TiO2 MOAC
      Phosphopeptide zu isolieren. LC-MS/MS Analyse der
      Phosphopeptid Fraktion ergab 111 potentielle MAP-Kinase
      Substrate, welche in den Stämmen FB1fuz7DD und
      FB1Δkpp6Δkpp2fuz7DD differenziell phosphoryliert vorlagen.
      Fünfzehn dieser differenziell phosphorylierten Proteine,
      welche möglicherweise direkte Substrate von Kpp2 und Kpp6
      sind, wurden nach umfassender bioinformatischer Analyse
      ausgewählt und weiter untersucht. Um zu prüfen ob diese Gene
      möglicherweise zu pilzlicher Paarung oder Virulenz beitragen
      wurden die entsprechenden Gene in einem solopathogenen Stamm,
      z.T auch in kompatiblen wiltyp Stämmen, deletiert. Analyse
      der entsprechenden Deletionsstämme zeigte, dass um12335 für
      Virulenz benötigt wird. Weiterführende Untersuchungen
      ergaben, dass es III sich bei Um12235 möglicherweise um ein
      Mikrotubuli-assoziiertes Protein handelt, welches ein
      direktes Substrat der MAP-Kinasen Kpp2 und/ oder Kpp6
      ist.
description: The plant pathogen Ustilago maydis
      is the causative agent of maize smut disease and serves as a
      model system to study plant-fungal interactions. In this
      pathogen, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascade
      controls mating, invasive growth and virulence on maize
      plants. The key players for infection-related processes and
      pathogenicity are the conserved mitogen-activated protein
      kinases (MAPKs) Kpp2 and Kpp6. Specifically, the MAP kinase
      Kpp2 is involved in appressorium development while Kpp6 is
      required for penetration of plant epidermal cells. Neither
      for Kpp2 nor for Kpp6 have the immediate downstream
      phosphorylation targets been identified. The aim of this work
      was to identify crucial virulence factors which act
      downstream of the MAP kinases Kpp2 and Kpp6. To artificially
      induce MAP kinase signaling we used the strain FB1fuz7DD in
      which a constitutive active allele of the MAP kinase-kinase
      Fuz7 (Fuz7DD) is expressed under the control of an arabinose
      inducible promoter. Using a phospho-proteomic approach we
      detected phosphorylated proteins upon induction of the MAP
      kinase cascade in the presence and absence of kpp2 and kpp6.
      Enrichment of phosphorylated proteins involved a two-step
      chromatographic procedure, using Al(OH)3-based metal oxide
      affinity chromatography (MOAC), tryptic digestion of enriched
      phospho-proteins, and TiO2-based MOAC for phospho-peptide
      enrichment. LC-MS/MS analysis of the phospho-peptide fraction
      yielded 111 potential MAP kinase substrates that were
      differentially phosphorylated in strains FB1fuz7DD and
      FB1Δkpp6Δkpp2fuz7DD. Fifteen of these differentially
      phosphorylated proteins, that could possibly be targets of
      Kpp2 and Kpp6, were selected for further studies based on
      extensive bioinformatic analysis. To assess a possible
      contribution of the selected genes to mating and virulence,
      the respective genes were deleted in a solopathogenic strain
      and for some of the genes also in compatible haploid strains.
      Analysis of the respective deletions strains showed that,
      um12335 was required for virulence. Subsequent studies
      suggest that Um12235 is a microtubule-associated protein that
      is a direct substrate of the MAP kinase Kpp2 and/or
      Kpp6.