Μελέτη της επίδρασης παρακρινικών προϊόντων βλαστικών κυττάρων οδοντικού πολφού στην κυτταροτοξικότητα του ρητινώδους μονομερούς TEGDMA
Creators: name: Πασχαλίδης, Θεόδωρος Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Βλαστικά κύτταρα οδοντικού πολφού
TEGDMA
παρακρινικά προϊόντα
dental pulp stem cells
Conditioned medium

description: Σκοπός. Ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των παρακρινικών προϊόντων των βλαστικών κυττάρων του οδοντικού πολφού (Dental Pulp Stem Cells - DPSCs) - μέσω θρεπτικού υλικού στο οποίο έχουν αναπτύξει την παρακρινική τους δραστηριότητα (conditioned medium - CM) - στον πολλαπλασιασμό τους και στην επαγόμενη κυτταροτοξικότητα του ρητινώδους μονομερούς TEGDMA σε αυτά. Υλικά κα μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν DPSCs τα οποία ελήφθησαν από τρίτους γομφίους υγειών ασθενών και χαρακτηρίστηκαν με κυτταρομετρία ροής για μια σειρά δεικτών μεσεγχυματικών κυττάρων όπως STRO-1, CD146, CD34, CD45, CD117, CD81, CD49f, CD24, CD271/NGFR, Nanog, Oct3/4, TRA-1-60 and SSEA-3. Το CM συλλέχτηκε από καλλιέργεια DPSCs σε συνθήκες πλήρους αποστέρησης ορού και από καλλιέργεια DPSCs με 15% ορό. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδραση τριών συγκεντρώσεων του CM (25%, 50% και 75%) στην κυτταροτοξικότητα 4 συγκεντρώσεων του ΤEGDMA (0,25, 0,5, 1 και 2 mM) όσον αφορά στον πολλαπλασιασμό των DPSCs με τη δοκιμασία MTT και στη μεταναστευτική ικανότητα τους με δοκιμασία in vitro σχηματισμού τομών (in vitro scratch assay) καθώς και με δοκιμασία in vitro μετανάστευσης διαμέσου μεμβράνης (transwell migration assay). Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι το CM που συλλέχτηκε υπό συνθήκες πλήρους αποστέρησης ορού για 4 ημέρες προκάλεσε μία σημαντική αύξηση του πολλαπλασιασμού των DPSCs κατά 20-25% (p&lt;0,05) περιορίζοντας παράλληλα σημαντικά την κυτταροτοξική δράση του TEGDMA. To εντονότερο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε για τη συγκέντρωση 50% του CM. Αντίθετα, τo CM που συλλέχτηκε από καλλιέργεια DPSCs με 15% ορό δεν παρουσίασε κάποια θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Στη δοκιμασία in vitro σχηματισμού τομών παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση 50% του CM μπορεί να βελτιώσει το δυναμικό της μετανάστευσης των DPSCs που εκτέθηκαν σε TEGDMA, ενώ στη δοκιμασία in vitro μετανάστευσης διαμέσου μεμβράνης παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότητας των DPSCs που είχαν εκτεθεί στο CM. Συμπέρασμα: Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα παρακρινικά προϊόντα που εκκρίνονται από τα DPSCs σε συνθήκες στρες - αποστέρηση ορού - έχουν θετική επίδραση στον πολλαπλασιασμό και τη μεταναστευτική ικανότητα των DPSCs, ενώ είναι σε θέση να μειώσουν σημαντικά την κυτταροτοξικότητα του ρητινώδους μονομερούς TEGDMA. Επομένως, οι παρακρινικές επιδράσεις των DPSCs μπορούν να συνεισφέρουν σημαντικά στους μηχανισμούς ανάπλασης του οδοντικού πολφού μετά από την έκθεση σε ρητινώδη μονομερή που απελευθερώνονται κατά τις αποκαταστατικές διαδικασίες.
description: Objective: The aim of this study was to investigate the effect of Dental Pulp Stem Cell (DPSC)-conditioned medium (CM) on TEGDMA-induced cytotoxicity. Methods: DPSCs cultures were established from extracted third molars of healthy donors aged 15-25 years after informed consent. Cultures were analyzed for the stem cell markers STRO-1, CD146, CD34, CD45, CD117, CD81, CD49f, CD24, CD271/NGFR, Nanog, Oct3/4, TRA-1-60 and SSEA-3 using flow cytometry. CM was collected from DPSCs cultured under serum-free conditions (SFC) every 4d for 24d and under normal non-serum-free (15%) conditions (nSFC) every 2d for 12d. The influence of three concentrations (25, 50 and 75%) of CM on TEGDMA (0.25, 0.5, 1.0 and 2.0mM) cytotoxicity was estimated by MTT assay for DPSCs proliferation and by transwell migration assay and in vitro scratch assay for the migration potential. Results: Our results showed that DPSCs’ CM collected under SFC (especially after 4d of serum deprivation-SD) was able to increase cell proliferation by 20-25% and to reduce TEGDMA cytotoxicity (approx. 20%, p&lt;0.05 at all concentrations, except 2mM). The effects of CM-SFC were more robust at CM concentration of 50%, whereas the 25 and 75% concentrations had a lower impact on TEGDMA cytotoxicity. CM positive effects on cell proliferation and reduction of TEGDMA cytotoxicity were less obvious when collected at 8-24d after initiation of SD and for the CM collected under nSFC (15%). In vitro transwell migration assay showed increase of DPSCs migration after exposure to CM, whereas in vitro scratch assay showed an overall increase in migration rate in TEGDMA-treated cultures which exposed to 50% CM compared to cultures which were treated only with TEGDMA. Conclusion: These findings suggest that DPSCs paracrine effects expressed through their CM under stress conditions of SD is able to significantly increase cell proliferation and migration, and to reduce TEGDMA cytotoxicity. These data give evidence on the potential supportive role of DPSCs’ paracrine effects on pulp repair processes after exposure to resinous monomers.