Καθήλωση βιομορίων με αντιγονικές ιδιότητες σε πολυμερικούς φορείς για την παραγωγή διαγνωστικού συστήματος και τον έλεγχο των ελληνικών βιοτύπων της Brucella Melitensis
Creators: name: Νούτσιος, Γεώργιος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Βρουκέλλωση
Μελιταίος πυρετός
Μέθοδος των δακτυλικών αποτυπωμάτων
Λιποπολυσακχαρίτες
Πολυκλωνικά αντισώματα
Πολυμορφισμός
Brucella melitensis
Rev-1
Brucellosis
Hoof-prints
LPS

description: Στην παρούσα μελέτη έγινε εφαρμογή των νεότερων μοριακών μεθόδων για τη διάγνωση της βρουκέλλωσης καθώς και εύρεση μοριακών δεικτών με την βοήθεια των οποίων είναι δυνατόν να επιτευχθεί διαφοροποίηση των φυσικών μολυσματικών στελεχών της Br. melitensis από το στέλεχος του εμβολίου Rev-1. Οι τεχνικές που εφαρμόστηκαν είναι η PCR, η PCR-RFLP, η μέθοδος των δακτυλικών αποτυπωμάτων HOOF-prints ή μέθοδος των υπερμεταβλητών οκταμερών ολιγονουκλεοτιδικών δακτυλικών αποτυπωμάτων, η τεχνική τυποποίησης με βάση την ανεύρεση της αλληλουχίας βάσεων συγκεκριμένων περιοχών γονιδίων-στόχων, η ηλεκτροφόρηση σε κλίση αποδιατακτικών ουσιών για την εύρεση πολυμορφισμών στο γένωμα του βακτηρίου, καθώς και η παραγωγή εξειδικευμένων αντισωμάτων έναντι των αντιγόνων της Br. melitensis. Εξετάστηκαν 44 φυσικά μολυσματικά στελέχη Br. melitensis (ολικό αίμα, υλικά βιοψιών, ορός) αποκλειστικά από κτηνοτροφικές μονάδες αιγοπροβάτων της ελληνικής περιφέρειας, τρία πρότυπα στελέχη Br. melitensis (βιοτύπων 1, 2 και 3) καθώς και το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 που παραχωρήθηκε από την κτηνιατρική υπηρεσία Θεσσαλονίκης. Όλοι τα δείγματα ταυτοποιήθηκαν με τις κλασικές διαγνωστικές μεθόδους και στην συνέχεια αναλύθηκαν με δέκα διαφορετικές PCR. Επιτεύχθηκε αναγνώριση και διαφοροποίηση του εξασθενημένου εμβολιακού στελέχους Rev-1 από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη της Br. melitensis. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των δακτυλικών αποτυπωμάτων για να γίνει γενοτύπιση των στελεχών της Br. melitensis και διαφοροποίηση του εμβολιακού στελέχους Rev-1. Η γενοτύπιση βασίστηκε στον προσδιορισμό του αριθμού των πλήρων επαναλήψεων της οκτανουκλεοτιδική ακολουθίας AGGGCAGT που βρέθηκε ότι υπάρχει σε οκτώ περιοχές του γονιδιώματος της Br. melitensis. Επιπρόσθετα, έγινε χρήση της τεχνικής PCR-RFLP για την περιοχή του γονιδίου omp2, όπου βρέθηκαν δύο ομόλογα αντίγραφα του γονίδιου με διαφορές στην θέση κοπής του ενζύμου περιορισμού PstI. Το γονίδιο omp2 αναλύθηκε και με την τεχνική της DGGE όποτε και αποδείχθηκε ότι στο συγκεκριμένο γονίδιο υπάρχει πολυμορφισμός που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την διαφοροποίηση του εμβόλιου Rev-1 από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη του βακτηρίου. Οι λιποπολυσακχαρίτες βρίσκονται στην εξωτερική μεμβράνη των κυττάρων της Brucella παρουσιάζουν ισχυρή αντιγονική δράση. Έγινε απομόνωση LPS από διάφορα φυσικά μολυσματικά στελέχη της Br. melitensis και από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1. Οι LPS απαρτίζονται από το λιπίδιο Α το οποίο περιλαμβάνει μια ολιγοσακχαριδική πυρηνική περιοχή που περιέχει δύο τύπους αμινογλυκοσίδης και χαρακτηριστικά λιπαρά οξέα, μια κεντρική περιοχή πολυσακχαρίτη η οποία περιέχει γλυκόζη, μαννόζη και κουινοβοζαμίνη και το Ο-αντιγόνο, το οποίο θεωρείτε ως η ανοσοεπικρατής περιοχής των LPS. Το λιπίδιο Α απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο κατακρήμνισης με χλωριούχο μαγνήσιο. Οι LPS ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου όποτε και προέκυψαν καποίες διαφορές στην σύσταση τους. Επιπλέον, έγινε χρήση της τεχνικής τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για την περεταίρω ανάλυση τους όποτε και βρέθηκαν πολλά σάκχαρα που ήταν κοινά για τους LPS όλων των στελεχών της μελέτης. Ωστόσο, βρέθηκαν ορισμένες χημικές ενώσεις που διαφοροποιούνταν μεταξύ των φυσικών μολυσματικών στελεχών και του εμβολιακού στελέχους Rev-1. Στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η τεχνικής της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης για την ανάλυση της σύσταση των συστατικών των LPS, λόγω του ότι η τεχνική CZE είναι μη παρασκευαστική και η διαχωριζόμενες ενώσεις δεν μπορούσαν να παραληφθούν. Η εφαρμογή της τεχνικής έδωσε περισσότερο ποσοτικές παρά ποιοτικές διαφορές όσον αφορά τα συστατικά των LPS. Οι LPS από επιλεγμένα μολυσματικά στελέχη και από το εμβολιακό στέλεχος Rev-1 ενέθηκαν σε αρσενικά κουνέλια για την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων. Μετά από αρκετές επαναλήψεις της ανοσοποίησης των πειραματόζωων έγινε ηλεκτρομεταφορά των LPS και κατόπιν διαπιστώθηκε η ύπαρξη αντισωμάτων έναντι των LPS της Br. melitensis στον ορό με ανοσοαποτύπωση. Μεγαλύτερη ευαισθησία και εξειδίκευση παρουσίασε ο ορός μετά την τρίτη ένεση. Συνολικά παράχθηκαν τέσσερα αντισώματα, τρία αντισώματα έναντι των LPS τριών μολυσματικών στελεχών και ένα έναντι των LPS του εμβολιακού στελέχους. Δοκιμές των παραγόμενων αντισωμάτων με LPS από άλλα βακτηριακά στελέχη που έχουν παρόμοια λιποπολυσακχαριδική δομή στην εξωτερική μεμβράνη των κυττάρων τους με αυτά της Br. melitensis, έδειξαν ότι τα παραγόμενα αντισώματα ήταν εξειδικευμένα έναντι των LPS των στελεχών της Br. melitensis. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι το αντίσωμα anti Rev-1 αναγνωρίζει τους LPS του εμβολιακού στελέχους, ενώ, στην περίπτωση των LPS των φυσικών μολυσματικών στελεχών δεν αναγνωρίζει κάποια τμήματα των αντιγόνων τους. Το αντίσωμα anti Rev-1 είναι πολλά υποσχόμενο τόσο για την άμεση και εύκολη διάγνωση της βρουκέλλωσης αλλά και για την διαφοροποίηση των εμβολιασμένων ζώων από αυτά μου έχουν μολυνθεί από τα φυσικά μολυσματικά στελέχη. Τα παραγόμενα πολυκλωνικά αντισώματα μπορούν να καθηλωθούν σε υλικά στατικών φάσεων, όπως πολυμερή, για την παραγωγή ενός συστήματος ενζυμικής ανοσοπροσροφητικής μεθόδου προσδιορισμού
description: The goals of this dissertation are the invention of new molecular methods and techniques for the diagnosis of brucellosis, the finding of new molecular markers that differentiate the contagious field strains from the vaccine strain Rev-1. The techniques that have been used were the PCR, PCR-RFLP, the Hypervariable Octrameric Oligonucleotide Finger print method, the DNA sequencing, the Denaturant Gradient Gel Electrophoresis analysis and production of antibodies against antigens of Br. melitensis. The samples of our study comprised of 44 field strains of Br. melitensis (whole blood, serum or tissue) originated exclusively from sheep and goats of Greek provinces, three reference strains of Br. melitensis (biovars 1, 2 and 3) and the vaccine strain Rev-1 that was kindly relinquished from the department of Greek veterinary services. All samples were tested with classical biochemical methods, were identified to be strains of Br. melitensis and were analyzed with ten different PCRs. We were able to identify and differentiate the attenuated vaccine strain Rev-1 from the contagious field strains. Fingerprinting method has been implemented for genotyping of Br. melitensis and differentiation of strain Rev-1. The genotyping was based on the assessment of the number of complete repetitions of the nucleotide sequence AGGGCAGT, that has been found in eight loci of the Br. melitensis genome. In addition, the PCR-RFLP technique was successfully been used for studying of the gene omp2, where there were found two homologous copies of the gene with different sites for the restriction enzyme PstI. The region of omp2 locus was also analyzed with DGGE. It was proved that the omp2 gene bares a polymorphism that can be used as an effective tool for the differentiation of vaccine strain Rev-1 from the natural contagious field strains of Br. melitensis. The above results were also validated with sequencing technique. It was confirmed that there is single site mutation of vaccine strain Rev-1. The major component of Brucella antigen is the lipopolysaccharides which are found in the surface of the extracellular membrane. There has been isolation of LPS from different contagious field strains of Br. melitensis and Rev-1 vaccine strain. LPS is comprised of lipid A which is an oligosaccharide region that contains two types of aminoglycosides and other characteristic fatty acids, core polysaccharide which contains glucose, mannose and quinovosamine and O-antigen. The last component of LPS, O-antigen, is considered to be the most immunogenic. There has been elimination of the lipid A part of the LPS by using the precipitation protocol of magnesium chloride in ethanol solution. LPS deprived of lipid A from all samples were then electrophoresed in polyacrylamide gels and some major differences in their components’ construction have been revealed. In addition, the capillary zone electrophoresis has been used to achieve an in-depth analysis of the composition of LPS. There were found many saccharides that were common in the LPS of all strains but there were also found a few chemical compounds that were present in contagious field strains and absent in Rev-1 strain. Due to the fact that CZE is not a preparative technique, HPLC has been recruited so as to analyse the composition of LPS. This technique yielded more quantitative differences than quality differences as far as the components of LPS are concerned. LPS from contagious field strains and from vaccine strain Rev-1 have been injected subcutaneously into rabbits so as to produce polyclonal antibodies. After a few boosts of antigen stimulus, there have been produced three different antibodies against the LPS of contagious field strains and an antibody against LPS of vaccine strain Rev-1. These antibodies were tested with the immunoblot technique against the antigens of contagious field strains. The produced antibodies were found to be specific for the LPS of Br. melitensis since they did not bind with antigens of other bacteria that also have similar structure of LPS in the outer membrane of their cells. In addition, it was shown that the anti Rev-1 antibody binds with the LPS of Rev-1, whereas in cases of field strains it does not bind with certain parts of antigen. It seems that the anti Rev-1 is very promising not only for direct and easy diagnosis of brucellosis but also for differentiating animals that are vaccinated with Rev-1 from the ones that are infected with natural field strains of Br. melitensis. The produced antibodies can be immobilized into non-motile surfaces, such as polymers, so as to produce an enzyme-linked immunosorbent assay