title: New central carbon metabolic pathways in Alphaproteobacteria: from natural to synthetic metabolism
title: Neue zentrale Kohlenstoff-Stoffwechselwege in Alphaproteobakterien: vom natürlichen zum synthetischen Stoffwechsel
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Severi, Francesca
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: synthetic metabolism
mariner Kohlenstoffzyklus
Beta-Hydroxyaspartat-Zyklus
beta-hydroxyaspartate cycle
Mikrobiologie
marine carbon cycle
Alphaproteobakterien
Glykolat-Assimilation
glycolate assimilation
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Natürlicher Stoffwechsel
synthetischer Stoffwech
Natural metabolism
Alphaproteobacteria
Biochemie
Methylorubrum

description: CO2 is one of the main greenhouse gases driving global warming, and plays a fundamental role in the global carbon cycle. The threat posed by climate change needs to be addressed during this century, if its worst effects are to be prevented or at least mitigated. While new (bio)technological solutions are essential to successfully face this herculean challenge, continuously improving the understanding of the sources, sinks and fluxes of the global carbon cycle is required as well, in order to accurately build models and predict the effects of human intervention on the climate. This thesis aims at contributing to both approaches, i. e. furthering knowledge of the global carbon cycle, and providing biotechnological tools to convert CO2 into value-added products. The first part of this thesis describes the β-hydroxyaspartate cycle, a glyoxylate assimilation pathway that was originally proposed nearly 60 years ago, but until now never fully elucidated. The gene cluster encoding the regulator and the four enzymes of the cycle was identified in Paracoccus denitrificans, and their biochemical properties were characterised. In the process, a rare primary imine reductase was discovered, structurally elucidated and assigned to a novel family within the ornithine cyclodeaminase/µ-crystalline superfamily. Additional phylogenetics analyses revealed that the β-hydroxyaspartate cycle is widespread among marine Alphaproteobacteria, especially in the Rhizobiales and Rhodobacterales orders, and is also ubiquitously present in oceanic metagenomes, suggesting that it fulfills a relevant ecological role in this habitat. Field studies supported this hypothesis and established that the β-hydroxyaspartate cycle is involved in assimilation of glycolate, an abundant phytoplankton exudate, by heterotrophic marine bacteria, therefore revealing a new dimension of the marine carbon cycle. The second part of this thesis focuses on re-engineering the central carbon metabolism of Methylorubrum extorquens AM1 for production of valuable compounds from methanol, which can be sustainably obtained from CO2 and hydrogen. In order to access acyl-CoAester intermediates from the ethylmalonyl-CoA pathway, which is essential for growth on C1 and C2 compounds, rewiring of the metabolic network of M. extorquens AM1 was undertaken. Heterologous implementation of the glyoxylate cycle, followed by adaptive laboratory evolution, yielded a strain which was able to growth on methanol without using the native ethylmalonyl-CoA pathway. Characterisation of the engineered and evolved strain by whole-genome resequencing, proteomics and targeted metabolomics revealed that two mutations in the isocitrate dehydrogenase putative promoter region and coding sequence were responsible for the overall rebalancing of the cellular carbon flux from the TCA cycle towards the glyoxylate cycle. Furthermore, proof-of-principle production of crotonic acid from methanol and acetate was demonstrated, and the key bottlenecks of the process, including undesired flux into polyhydroxybutyrate synthesis, were identified.
description: CO2 ist eines der wichtigsten Treibhausgase, die die globale Erwärmung verursachen, und spielt eine grundlegende Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. Die Bedrohung durch den Klimawandel muss noch in diesem Jahrhundert angegangen werden, wenn seine schlimmsten Auswirkungen verhindert oder zumindest gemildert werden sollen. Während neue (bio)technologische Lösungen für die erfolgreiche Bewältigung dieser gewaltigen Herausforderung unerlässlich sind, muss auch das Verständnis der Quellen, Senken und Flüsse des globalen Kohlenstoffkreislaufs ständig verbessert werden, um genaue Modelle zu erstellen und die Auswirkungen menschlicher Eingriffe auf das Klima vorherzusagen. Diese Arbeit zielt darauf ab, zu beiden Ansätzen beizutragen, d. h. das Wissen über den globalen Kohlenstoffkreislauf zu erweitern und biotechnologische Werkzeuge zur Umwandlung von CO2 in Mehrwertprodukte bereitzustellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird der β-Hydroxyaspartat-Zyklus beschrieben, ein Glyoxylat-Assimilationsweg, der ursprünglich vor fast 60 Jahren vorgeschlagen, aber bis heute nicht vollständig aufgeklärt wurde. Der Gencluster, der für den Regulator und die vier Enzyme des Zyklus kodiert, wurde in Paracoccus denitrificans identifiziert, und ihre biochemischen Eigenschaften wurden charakterisiert. Dabei wurde eine seltene primäre Iminreduktase entdeckt, strukturell aufgeklärt und einer neuen Familie innerhalb der Ornithin-Cyclodeaminase/µ-Kristallin-Superfamilie zugeordnet. Zusätzliche phylogenetische Analysen ergaben, dass der β-Hydroxyaspartat-Zyklus unter marinen Alphaproteobakterien weit verbreitet ist, insbesondere in den Ordnungen Rhizobiales und Rhodobacterales, und auch in ozeanischen Metagenomen ubiquitär vorhanden ist, was darauf schließen lässt, dass er in diesem Lebensraum eine wichtige ökologische Rolle spielt. Feldstudien untermauerten diese Hypothese und ergaben, dass der β-HydroxyaspartatZyklus an der Assimilation von Glykolat, einem reichlich vorhandenen Phytoplankton Exudat, durch heterotrophe Meeresbakterien beteiligt ist, wodurch eine neue Dimension des marinen Kohlenstoffkreislaufs aufgedeckt wurde. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Engineering des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels von Methylorubrum extorquens AM1 für die Produktion von wertvollen Stoffen aus Methanol, das nachhaltig aus CO2 und Wasserstoff gewonnen werden kann. Der Ethylmalonyl-CoA-Weg ist essentiell für das Wachstum auf C1- und C2-Stoffe und enthält viele Acyl-CoA-Thioester-Intermediate. Um Zugang zu diesen Intermediaten zu erhalten, wurde das metabolische Netzwerk von M. extorquens AM1 neu verdrahtet. Die heterologe Implementierung des Glyoxylatzyklus, gefolgt von einer adaptiven Laborevolution, führte zu einem Stamm, der in der Lage war, auf Methanol zu wachsen, ohne den nativen Ethylmalonyl-CoA-Weg zu nutzen. Die Charakterisierung des manipulierten und weiterentwickelten Stammes durch Resequenzierung des gesamten Genoms, Proteomik und gezielte Metabolomik ergab, dass zwei Mutationen in der mutmaßlichen Promotorregion und der kodierenden Sequenz der Isocitrat-Dehydrogenase für die allgemeineUmstellung des zellulären Kohlenstoffflusses vom TCA-Zyklus auf den Glyoxylatzyklus verantwortlich waren. Darüber hinaus wurde der Nachweis der prinzipiellen Herstellung von Crotonsäure aus Methanol und Acetat erbracht, und die wichtigsten Engpässe des Prozesses, einschließlich des unerwünschten Flusses in die Polyhydroxybutyratsynthese, wurden ermittelt.