Molekulare Grundlagen der Rab-Manipulation der Proteine DrrA und LidA aus Legionella pneumophila
Creators: name: Schöbel, Stefan
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2012
Subjects: subject: DrrA
subject: GEF
subject: GTPase
subject: Legionella pneumophila
subject: LidA
subject: P4M
subject: Rab
subject: Rab-Effektor
subject: 540

description: Das intrazelluläre, pathogene Bakterium Legionella pneumophila manipuliert die von Rab-Proteinen regulierten Transportprozesse der eukaryotischen Wirtszelle, um ein replikations-permissives Kompartiment zu bilden. Die Mitglieder der Rab-Familie sind essentielle Regulatoren des intrazellulären vesikulären Transports und haben die Funktion von molekularen Schaltern: Rab-Proteine befinden sich entweder inaktiv im Zytosol im Komplex mit dem Protein GDI (engl.: GDP-dissociation inhibitor, GDI) oder sie werden an eine Membran lokalisiert, wo sie nach der Aktivierung durch einen GEF (engl.: guanine nucleotide exchange factor, GEF) zusammen mit Rab-Effektoren die Prozesse des vesikulären Transportes koordinieren.1 Die gezielte Manipulation von Rab1 durch die sekretierten Legionellenproteine DrrA und LidA führt zur Umleitung des Rab1-regulierten, frühen sekretorischen Transports an die bakterienenthaltende Vakuole (engl.: legionella containing vacuole, LCV). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der molekularen Grundlagen der Rab-Manipulation durch die Legionellenproteine DrrA und LidA. DrrA enthält eine bi-funktionale, zentrale GEF-Domäne, die eine Rekrutierung von Rab1 an die LCV und die anschließende Aktivierung von Rab ermöglicht. Die Strukturen der GEF-Domäne von DrrA und ihres Komplexes mit Rab1 wurden in dieser Arbeit bestimmt und zeigten eine noch nicht beobachtete Proteinfaltung der GEF-Domäne. Aus der Komplexstruktur konnte der DrrA-katalysierte Mechanismus der Rab1-Aktivierung abgeleitet werden. DrrA ist das erste bakterielle RabGEF, das charakterisiert wurde und es besitzt eine hohe katalytische Effizienz4. Basierend auf der Rab1:DrrA-Komplexstruktur konnten GEF-defiziente Aminosäure-substitutionen eingeführt werden, deren biochemische Analyse die Ableitung des enzymatischen Mechanismus ermöglichten. Diese Untersuchungen zeigten erstmals, dass die GEF-Aktivität von DrrA die Freisetzung von Rab1 aus dem Komplex mit GDI vermitteln kann. Der Ort der DrrA-vermittelten Rekrutierung von Rab1 wird durch die Bindung von DrrA an die LCV bestimmt. Die C-terminale P4M-Domäne (PI4P binding of SidM/DrrA) verankert DrrA durch die Bindung von Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI4P) auf der LCV. Die Bestimmung der Affinität der P4M-Domäne zu PI4P ergab, dass die P4M-Domäne eine ungewöhnlich hohe Affinität zu PI4P besitzt (KD = 18 nM) und DrrA somit stabil mit der LCV assoziiert ist. Die Struktur der P4M-Domäne zeigte eine bisher für PIP-bindende Proteine noch nicht beobachtete Faltung. Durch die Identifizierung der PI4P-Bindungstasche und dem Vergleich der P4M-Domäne mit anderen PIP-bindenden Proteinen gelang die Erstellung eines realistischen Modells der Orientierung von DrrA und der DrrA-katalysierten Aktivierung von Rab1 auf der LCV. Das Legionellenprotein LidA ist an der Rekrutierung von Vesikeln an die LCV beteiligt und zeichnet sich durch die für einen Rab-Effektor ungewöhnliche Eigenschaft aus, neben der aktiven Form auch die inaktive Form von Rab1 zu binden6. Auf der LCV interagiert LidA mit dem von DrrA rekrutiertem Rab1. LidA interagierte mit einer Vielzahl unterschiedlicher Rab-Proteine sowohl in der aktiven, als auch zum Großteil in der inaktiven Form, aber nicht mit anderen kleinen GTPasen. Die Affinitäten von LidA zu Rab-Proteinen sind außergewöhnlich hoch und besitzen KD-Werte im niedrigen nanomolaren bis femtomolaren Bereich. Die Strukturbestimmung des Komplexes aus aktiven Rab8a und LidA zeigte eine neuartige Proteinfaltung von LidA. Dieses Legionellenprotein unterscheidet sich zu humanen Rab-Effektoren durch eine wesentlich komplexere Art der Rab-Bindung und einer erstaunlich großen Kontaktfläche zum Rab, was mit der außergewöhnlichen hohen Affinität zu Rab-Proteinen korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit lieferten ein detailliertes Verständnis der molekularen Vorgänge der DrrA- und LidA-vermittelten Prozesse auf der LCV. Die Untersuchungen an DrrA zeigten erstmals, dass ein GEF in der Lage ist, die Dissoziation des Rab:GDI-Komplexes zu bewirken und führten zu der Hypothese, dass auch humane RabGEFs ähnliche Eigenschaften besitzen könnten. Die strukturellen und biochemischen Untersuchungen der P4M-Domäne belegen eine sehr stabile Assoziation von DrrA auf der LCV. Die Strukturbestimmung und biochemische Analyse der Rab-Bindungseigenschaften von LidA identifizierten dieses Protein als einen außergewöhnlichen Rab-Effektor mit außergewöhnlich hohen Affinitäten zu aktiven und inaktiven Rab-Proteinen. Diese besondere Eigenschaft impliziert die Rab-Effektor-untypischen Funktionen eines Rab- und/oder Vesikel-Rekrutierungsfaktors für LidA. Die detaillierte molekulare Analyse der auf Rab-Proteine spezialisierten, bakteriellen Proteine DrrA und LidA lieferte neue Blickwinkel auf die Kontrolle eukaryotischer, vesikulärer Transportprozesse.