title: New inhibitors of bacterial hyaluronidase - synthesis and structure-activity relationships
Creators: name: Braun, Stephan
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Inhibitor , Hyaluronidasen , Struktur-Aktivitäts-Beziehung , Vitamin C-Derivate , Benzoxazol-2-thion , Inhibitor , hyaluronidase , Vitamin C derivatives , benzoxazole-2-thione
subject: 540 Chemie

description: Potent and selective inhibitors of hyaluronidases are not reported in the literature so far. Such compounds are required as pharmacological tools to investigate the physiological and pathophysiological role of the enzymes and their preferred substrate, hyaluronic acid. Moreover, such inhibitors might be of therapeutic value, e.g. in the treatment of arthrosis, as new anti-fertility agents or as an additivie antimicrobial treatment. The main goal of this thesis was the synthesis and identification of lead-like compounds and their structural optimization as inhibitors of bovine testicular hyaluronidase (BTH) and hyaluronate lyase from S. agalactiae (hylB4755). The inhibitory activities on both hyaluronidases were determined by means of a turbidimetric assay and the structure-activity relationships were elaborated. L-Ascorbic acid was found to weakly inhibit hyaluronate lyase from S. pneumoniae (hylSpn). X-ray analysis of the vitamin C-hylSpn complex revealed that vitamin C binds to the active site of the bacterial enzyme. Therefore, as a part of this doctoral project a series of L-ascorbic acid derivatives was synthesized and investigated for inhibitory activity against BTH and hylB4755. Four 6-O-acyl derivatives of L-ascorbic acid were identified as moderate to strong inhibitors of hyaluronidases with preference for the bacterial enzyme. At optimum pH (pH 5) the IC50 values for inhibition of hylB4755 range from 0.9 µM to 475 µM with highest activity for the esters of the long chain alkanoic acids. Among the studied vitamin C derivatives, L-ascorbic acid-6-octadecanoate proved to be the most potent inhibitor of hylB4755 and BTH with IC50 values of 0.9 µM and 39 µM at pH 5, respectively. The octadecanoate is up to 6500 times more potent than the parent compound vitamin C, and is the most potent inhibitor of bacterial and among the most potent inhibitors of bovine testicular hyaluronidase described to date. Additionally, the binding mode of L-ascorbic acid-6-hexadecanoate at hylSpn was determined by X-ray analysis. Starting from a de novo substrate-based inhibitor design 1,3-diacetylbenzimidazole-2-thione was identified as lead compound for hylB4755 (IC50 values of 5 µM and 160 µM at physiological pH and optimum pH, respectively). The investigation of structurally diverse benzimidazoles derived from the lead revealed that N-monoacylated and N,N�-diacylated benzimidazole-2-thiones inhibit the bacterial enzyme hylB4755 but not the BTH. For N-monoacylated derivatives IC50 values in the low µM range were determined at physiological pH, whereas the N,N�-diacylated compounds showed strong inhibition of hylB4755 both at the pH optimum and at physiological pH. Owing to their structural similarity with the aforementioned benzimidazoles corresponding benzoxazoles and indoles were taken into consideration. Based on the X-ray analysis of hylSpn co-crystallized with 1-decyl-2-(4-sulfamoyloxyphenyl)-1H-indol-6-yl-sulfamate the putative binding mode of benzoxazole-2-thiones was suggested. To support this model a series of benzoxazole derivatives was synthesized and investigated for hyaluronidase inhibition. All tested compounds were highly selective for hylB4755 vs. BTH. 3-Acylated benzoxazole-2-thiones inhibited hylB4755 with IC50 values in the µM range. Interestingly, the thiones were much more potent than the corresponding oxo analogues. Within the latter series, 3-phenyl-1-(2-thioxobenzo[d]oxazol-3(2H)-yl)propan-1-one was the strongest inhibitor of hylB4755 with an IC50 value of 15 µM at optimum pH. The 3-phenylpropanoyl group proved to be the optimal substituent at the benzoxazole-N. This is in good agreement with the suggestions from molecular modeling studies. Replacement of the alkanoyl side chain by a sulfonyl or an alkyl group or incorporation of a benzofurane instead of the benzoxazole moiety resulted in a marked decrease in inhibition of hylB4755. Based on the analysis of the binding mode of the aforementioned 2-phenylindole a set of additional indole derivatives was prepared and screened for activity on hylB4755 and BTH. Generally, the investigated indoles showed a preference for the bacterial hyaluronidase with highest activity residing in three N-alkylated 5-amino-2-methyl-indoles (inhibitory activities on hylB4755 in the micromolar range at optimum pH). Different functional groups such as nitro, amino, urea, sulfonamide, carboxylic acid and sulfonic acid were introduced in position 5 of the indole scaffold. As a result high inhibitory activity only resides in indoles substituted with amino or acidic groups. Surprisingly, the N-acylated 5-amino-2-methylindoles had only minor inhibitory activities. The synthesized 1,3-disubstituted 5-amino-2-methyl-indoles weakly inhibited hylB4755. Compared to the benzoxazole-2-thione the indole structure proved to be a less promising scaffold for the synthesis of hyaluronidase inhibitors.
description: Potente, selektive Inhibitoren von Hyaluronidasen sind bislang nicht in der Literatur bechrieben. Solche Substanzen werden als pharmakologische Werkzeuge benötigt, um die (patho)physiologische Rolle der Hyaluronidasen und ihres Substrats, der Hyaluronsäure, zu untersuchen. Darüber hinaus könnten Hyaluronidase-Inhibitoren als Arzneistoffe interessant sein, z.B. zur Behandlung von Arthrosen, als Kontrazeptiva oder zur Anwendung im Rahmen einer antimikrobiellen Therapie. Ziel dieser Doktorarbeit war die Synthese und Identifizierung sowie die Optimierung von Leitstrukturen zur Entwicklung von Inhibitoren der bovinen testikulären Hyaluronidase (BTH) und der Hyaluronatlyase aus S. agalactiae (hylB4755). Die inhibitorische Aktivität der synthetisierten Verbindungen auf beide Hyaluronidasen wurde in einem Trübungstest bestimmt und die Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden ausgearbeitet. L-Ascorbinsäure ist ein schwacher Inhibitor der Hyaluronatlyase aus S. pneumoniae (hylSpn). Die Röntgenkristallstrukturanalyse eines Vitamin C-hylSpn-Komplexes bestätigte, dass Vitamin C im aktiven Zentrum des bakteriellen Enzyms bindet. Deshalb wurde eine Serie von L-Ascorbinsäure-Derivaten synthetisiert und auf Hemmung der Enzyme BTH und hylB4755 überprüft. Vier 6-O-Acyl Derivate der L-Ascorbinsäure wurden als moderate bis starke Inhibitoren beider Hyaluronidasen identifiziert, wobei eine Selektivität für das bakterielle Enzym festzustellen war. Beim pH Optimum (pH 5) lagen die IC50 Werte für die Inhibition auf hylB4755 im Bereich von 0.9 µM bis 475 µM, wobei die Ester der langkettigen Alkansäuren die größte Wirkung zeigten. L-Ascorbinsäure-6-octadecanoat erwies sich als der potenteste Inhibitor von hylB4755 und BTH mit IC50 Werten von 0.9 µM bzw. 39 µM bei pH 5. Das Octadecanoat ist bis zu 6500fach stärker wirksam als die Muttersubstanz Vitamin C und ist bis dato der potenteste Inhibitor der bakteriellen Hyaluronidase und einer der stärksten bekannten Hemmstoffe des bovinen testikulären Enzyms. Durch Röntgenkristallstrukturanalyse wurde zusätzlich der Bindungsmodus von L-Ascorbinsäure-6-hexadecanoat an hylSpn bestimmt. Ausgehend von einem strukturbasierten de novo Design wurde 1,3-Diacetylbenzimidazol-2-thion als Leitstruktur für hylB4755 erkannt (IC50 Werte von 5 µM und 160 µM bei physiologischem pH bzw. pH-Optimum). Die Untersuchung diverser strukturverwandter Benzimidazole zeigte, dass N-monoacylierte und N,N�-diacylierte Benzimidazol-2-thione selektiv das bakterielle Enzym hemmen. Bei physiologischem pH-Wert weisen die N-monoacylierten Derivate IC50 Werte im niedrigen µM Bereich auf, während die N,N�-diacylierten Substanzen sowohl beim pH-Optimum als auch beim physiologischen pH-Wert starke Inhibitoren von hylB4755 darstellen. Infolge der strukturellen Ähnlichkeit zu den oben genannten Benzimidazolen wurden auch entsprechende Benzoxazole und Indole untersucht. Der mutmaßliche Bindungsmodus der Benzoxazol-2-thione wurde aus der Röntgenkristallstrukturnalyse von hylSpn, kokristallisiert mit 1-Decyl-2-(4-sulfamoyloxyphenyl)-1H-indol-6-yl-sulfamat, vorgeschlagen. Um dieses Modell zu belegen, wurde eine Reihe von Benzoxazol-Derivaten synthetisiert und auf ihre hemmende Wirkung überprüft. Alle getesteten Verbindungen waren hochselektiv für hylB4755 vs. BTH. 3-Acylierte Benzoxazol-2-thione inhibierten hylB4755 mit IC50 Werten im µM Bereich. Interessanterweise waren die Thione viel potenter als die entsprechenden Oxo-Analoga. Innerhalb dieser Serie war 3-Phenyl-1-(2-thioxobenzo[d]oxazol-3(2H)-yl)propan-1-on der stärkste Inhibitor von hylB4755 mit einem IC50 Wert von 15 µM beim pH-Optimum. In guter Übereinstimmung mit den Vorschlägen aus Molecular Modeling-Studien erwies sich 3-Phenylpropanoyl als der optimale Substituent am Benzoxazol-N. Der Austausch der Alkanoylseitenkette durch eine Sulfonyl- oder eine Alkylgruppe oder die Verwendung eines Benzofuranrings anstelle eines Benzoxazols resultierten in einer deutlichen Abnahme der Hemmung von hylB4755. Basierend auf der Analyse des Bindungsmodus des oben erwähnten 2-Phenylindols wurde eine Reihe von Indolderivaten synthetisiert und auf ihre Hemmung der Aktivität von hylB4755 und BTH getestet. Im Allgemeinen zeigten die untersuchten Indole eine Präferenz für hylB4755, wobei drei N-alkylierte 5-Amino-2-methylindole die stärkste Wirkung mit IC50 Werten im µM Bereich bei pH 5 aufwiesen. Verschiedene funktionelle Gruppen (Nitro-, Amino-, Ureido-, Sulfonamid-, Carbonsäure- und Sulfonsäuregruppe) wurden in Position 5 des Indolgerüsts eingeführt. Jedoch scheinen nur die Aminogruppe und die Säuregruppen am Indolring zu potenten Inhibitoren zu führen. Erstaunlicherweise besitzen die N-acylierten 5-Amino-2-methylindole nur geringe inhibitorische Aktivität. Die synthetisierten 1,3-disubstituierten 5-Amino-2-methyl-indole inhibieren hylB4755 schwach. Verglichen mit Benzoxazol-2-thion ist das Indolgerüst eine weniger aussichtsreiche Struktur für die Synthese von Hyaluronidase-Inhibitoren.