title: Targeting von p53 und seinen Domänen zur Krebsgentherapie
title: Targeting p53 and its domains for cancer gene therapy
Creators: name: Matissek, Karina Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Bcl-XL
Bak
mitochondria
Mitochondrium
Krebs
cancer
Protein p53
Biowissenschaften, Biologie

description: Der Tumorsuppressor p53 ist eines
      der am häufigsten mutierten Proteine in humanen Krebsarten
      und wird daher umfassend für seinen Nutzen in der
      Krebstherapie erforscht. Dies führte in China zur
      Markteinführung von Wildtyp-p53 zur Therapie von
      Kopf-Hals-Karzinomen. p53 fungiert in der Zelle hauptsächlich
      als Transkriptionsfaktor und stimuliert eine Vielzahl von
      Genen, die im intrinsischen und extrinsischen
      Apoptosemechanismus involviert sind. In Krebszellen treten
      Mutationen normalerweise in der DNA-Bindungsdomäne von p53
      auf, wohingegen die Tetramerizationsdomäne (TD) des
      Tumorsuppressors intakt bleibt. Dies führt intrazellular zur
      Bildung von Heterotetrameren von Wildtyp-p53 und seiner
      mutierten Form, was die Transkriptionsaktivität erheblich
      beeinträchtigt und einen dominant negativen Effekt ergibt.
      Während transkriptionell aktives p53 als Gentherapeutikum
      genutzt wird, ist das therapeutische Potential für den
      Einsatz von mitochondrialem p53 noch nicht vollständig
      ermittelt. Wenn p53 zum Mitochondrium getargeted wird,
      interagiert es mit pro- und anti-apoptotischen Proteinen, die
      sich in der mitochondrialen Auβenmembran befinden. Für diese
      Interaktion reicht die monomere Form von p53 aus, was
      bedeutet, dass es nicht durch mutiertes p53 inaktiviert
      werden kann. In dieser Arbeit wurde die Funktion von
      mitochondrialem p53 charakterisiert, indem es zu
      verschiedenen mitochondrialen Kompartimenten getargeted
      wurde: der mitochondrialen Auβenmembran, der Innenmembran und
      der Matrix. Es konnte nachgewiesen werden, dass
      mitochondriale Targeting Sequenzen (MTS) in der
      mitochondrialen Auβenmembran optimal für eine p53-spezifische
      Aktivierung geeignet sind. Auch konnte gezeigt werden, dass
      als minimalste Domäne von p53 die DNA-Bindungsdomäne (DBD)
      ausreicht, um Apoptose zu induzieren. Weitere Untersuchungen
      haben ergeben, dass das Vereinigen von p53 oder nur seiner
      DBD mit der MTS von Bcl-XL, eine Bcl-XL spezifische Apoptose
      hervorruft, während eine Vereinigung der Segmente mit Bak auf
      p53/Bak spezifische Apoptose zurückzuführen ist. Dies hebt
      hervor, dass mitochondriales Targeting von p53 stark von der
      benutzten MTS abhängig ist. Auβerdem haben in vitro-Studien
      gezeigt, dass die Bindung von p53 oder DBD an die MTS von
      Bcl-XL eine dominant negative Inhibition überwinden kann,
      aber auβerstande ist dominant negative MDA-MB-468 Tumore in
      einem orthotopischen Maus-Tumor-Model für das gewählte
      Dosisschema zu reduzieren. Die Thematik dieser Dissertation
      war die Entwicklung Apoptose-induzierender Proteine basierend
      auf p53 und seinen Bindungsdomänen, um eine modifizierte
      Version von p53 zu generieren. Der Schwerpunkt lag sowohl auf
      der Optimierung eines mitochondrial getargeten p53 für
      mögliche Krebstherapien als auch in der Neugestaltung der TD
      von p53, um den dominant negativen Effekt der
      Transkriptionsaktivität zu überwinden. Dafür wurde die
      Oligomerizationsdomäne von p53 mit der Coiled-Coil (CC)
      Domäne von BCR ersetzt, damit der dominant negative Effekt
      von mutiertem p53 ausgeschaltet wird. Experimente zeigen,
      dass das chimäre p53 (p53-CC) in den Nukleus transloziert,
      Gene transaktiviert und Apoptose in ähnlicher Form wie
      Wildtyp-p53 auslöst. In vitro- und in vivo-Studien haben
      gezeigt, dass im Gegensatz zu Wildtyp-p53, das neu generierte
      p53-CC nicht mit endogen mutiertem p53 interagiert und seine
      apoptotische Aktivität in Krebszellen, die dominant negatives
      mutiertes p53 enthalten, beibehält. Zusammenfassend liegt der
      Forschungsschwerpunkt dieser Dissertation in der Entwicklung
      neuartiger p53-Gentherapeutika, die das Potential haben
      derzeitige Einschränkungen einer Wildtyp-p53 Therapie zu
      überwinden.
description: The tumor suppressor p53 is one of
      the most frequently mutated proteins in human cancer and has
      been extensively targeted for cancer therapy. This resulted
      in wild type p53 gene therapeutic approval for the treatment
      of head and neck cancer in China. p53 mainly functions as a
      transcription factor and stimulates a variety of genes
      involved in the intrinsic and extrinsic apoptotic pathway by
      binding to p53 responsive elements as a tetramer. In cancer
      cells, mutations in p53 typically occur in its DNA binding
      domain (DBD), while its tetramerization domain remains
      intact. Therefore, mutant p53 can heterotetramerize with wt
      p53 and abolish its transcriptional activity (dominant
      negative effect). While transcriptionally active wt p53 is
      used for gene therapy, mitochondrial p53 has not been fully
      exploited yet. Targeting p53 to the mitochondria causes a
      direct rapid apoptotic response by directly interacting with
      pro-and anti- apoptotic proteins at the mitochondrial outer
      membrane. Because the monomeric from is sufficient to
      interact with pro-and anti-apoptotic proteins, mitochondrial
      p53 is not affected by the dominant negative inactivation. To
      ensure mitochondrial targeting of p53, we targeted p53 to
      different mitochondrial compartments; mitochondrial outer
      membrane, inner membrane and matrix. We have demonstrated
      that MTSs from the mitochondrial outer membrane are optimal
      for p53-specific activation. In addition, we discovered the
      minimal domain of p53, its DNA binding domain (DBD), which is
      needed for apoptosis induction. Further studies have shown
      that fusing p53 or DBD to MTS from Bcl-XL causes p53/Bcl-XL
      specific apoptosis while fusing them to Bak results in
      p53/Bak specific apoptosis, emphasizing that mitochondrial
      targeting of p53 is highly dependent on the MTS used.
      Further, we have shown that DBD fused to the MTS from Bcl-XL
      can overcome dominant negative inhibition in vitro, but it
      was unable to shrink dominant negative MDA-MB-468 tumors in
      an orthotopic mouse model at one dosing regimen attempted.
      The main theme of this thesis was to design apoptotic
      proteins based on p53 domains to create modified versions of
      p53. We focused mainly on optimizing mitochondrial targeting
      of p53 for cancer therapy but also redesigned the TD of p53
      to overcome the dominant negative effect. We substituted the
      oligomerization domain of p53 with the coiled-coil (CC)
      domain from BCR to bypass dominant negative inhibition of
      mutant p53. Our chimeric p53 (p53-CC) can translocate into
      the nucleus, transactivate genes and cause apoptosis in a
      similar manner as wt p53. Unlike wt p53, p53-CC does not
      interact with endogenous mutant p53 and retains apoptotic
      activity in cancer cells harboring dominant negative mutant
      p53 in vitro and in vivo. In summary this dissertation
      focuses on new p53 gene therapeutics, with the potential to
      overcome current limitations with wt p53 therapy.