Characterization and pharmacological evaluation of naturally-secreted and artificially-produced exosomes: Towards nanovesicle-based drug delivery in cancer treatment
Creators: name: Σαΐτη, Αικατερίνη Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Εξωσώματα
Ιατρική ακριβείας
Φορείς μεταφοράς φαρμάκων
Exosomes
Pecision medicine
Drug delivery systems

description: Despite the complexity and significant heterogeneity of cancer, the advances and extensive research into novel approaches for cancer therapeutics have enabled better disease management. However, cancer treatment remains challenging in biomedical/molecular research, pharmacology, and drug delivery. Towards the development of more effective therapeutic approaches, nanotechnology in oncology has laid the foundation for the targeted delivery of chemotherapeutics. Indeed, multiple next-generation delivery systems, such as synthetic or cell-derived nanoparticles, have been introduced, providing solutions to several side effects resulting from conventional therapeutic methods. Extracellular vesicles (EVs), specifically exosomes, have gained tremendous attention due to their unique properties. As naturally secreted vesicles, exosomes can transport genetic and biochemical information intercellularly, playing a crucial role in cell-cell communication. Various biological molecules, such as DNA, mRNAs, miRNAs, and proteins, can be transferred via exosomes in neighbor or distant cells, ultimately affecting the normal functioning of recipient cells. From the initial conceptualization of exosome properties, an extensive study of exploiting them as drug delivery systems have been performed. Their size, morphology, biocompatibility, and loading capacity were just some of the characteristics that led many researchers to consider them “ideal” drug delivery systems. However, despite the advantageous properties of exosomes, their “translatability” is hindered by the batch-to-batch heterogeneity and the limitations of high-yield production they display. Thus, the development of artificial exosomes, also known as exosome mimetics (EMs), via cellular components has been introduced to overcome natural exosomes' limitations. Within these frames, in the present work, we have focused on: i) the development and physicochemical/molecular characterization of exosome-based delivery systems, ii) the pharmacological evaluation of exosomes as therapeutic nanocarriers in the context of cancer therapeutics, and iii) the production of artificial exosomes by cellular components and the morphological/physicochemical characterization of these nanovesicles. More specifically, natural exosomes were isolated from the culture medium of cells, and detailed morphological, physicochemical, and molecular characterization was performed, utilizing well-established physicochemical techniques, to clarify their unique features and molecular repertoire. Moreover, the pharmacological evaluation of these systems was performed according to a) the encapsulation efficiency of hydrophobic and hydrophilic drugs in exosomes, b) the qualitative and quantitative uptake assessment of drug-loaded exosomes by normal and cancer recipient cells, c) the in vitro cytotoxicity of exosome-based formulations and, finally d) the potentially enhanced cytotoxicity effect of dual-chemotherapeutic treatment via exosomes. Exosomes displayed desired morphological/physicochemical properties for their exploitation as next-generation delivery systems, efficient loading capacity, and selective accumulation into cancer cells, providing tumor-specific targeting. In addition, according to a custom protocol, artificial exosomes were generated via a 3D-printed microfluidic chip and characterized in terms of their morphological and physicochemical properties. The results confirmed the efficient development of exosomal vesicles and suggested their potential utility as innovative delivery platforms of chemotherapeutic agents. Notably, this methodology enables faster and high-yield production of nanovesicles exploitable in the context of nanotechnology. Summarizing, this project's objective was to develop well-established and fully-characterized functional exosome-based delivery platforms for therapeutic applications. The results render natural and artificial exosomes promising systems for targeted delivery within nanomedicine and precision medicine.
description: Παρά την πολυπλοκότητα και τη σημαντική ετερογένεια του καρκίνου, η πρόοδος και η εκτεταμένη έρευνα για τη θεραπεία του καρκίνου έχουν επιτρέψει την καλύτερη διαχείριση της νόσου. Ωστόσο, η θεραπεία του καρκίνου παραμένει πρόκληση στους τομείς της βιοϊατρικής/μοριακής έρευνα, της φαρμακολογίας και της χορήγησης φαρμάκων. Με σκοπό την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων, η νανοτεχνολογία στην ογκολογία έχει θέσει τα θεμέλια για τη στοχευμένη παροχή χημειοθεραπευτικών. Πράγματι, πολλαπλά συστήματα μεταφοράς φαρμάκων, όπως συνθετικά ή νανοσωματίδια που προέρχονται από κύτταρα, έχουν εισαχθεί, παρέχοντας λύσεις σε αρκετές παρενέργειες που προκύπτουν από τις συμβατικές θεραπευτικές προσεγγίσεις. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια (EVs), με κυριότερα τα εξωσώματα, έχουν κερδίσει σημαντικό ενδιαφέρον λόγω των μοναδικών ιδιοτήτων τους. Ως φυσικώς εκκρινόμενα κυστίδια, τα εξωσώματα μπορούν να μεταφέρουν γενετικές και βιοχημικές πληροφορίες διακυτταρικά, λειτουργώντας σαν δίαυλοι επικοινωνίας μεταξύ των κυττάρων. Διάφορα βιολογικά μόρια, όπως DNA, mRNA, miRNAs και πρωτεΐνες, μπορούν να μεταφερθούν μέσω των εξωσωμάτων σε γειτονικά ή απομακρυσμένα κύτταρα, επηρεάζοντας τελικά την κανονική λειτουργία των κυττάρων-δεκτών. Από την αρχική σύλληψη των ιδιοτήτων των εξωσωμάτων, έχει πραγματοποιηθεί μια εκτενής μελέτη για την αξιοποίησή τους ως συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Το μέγεθος, η μορφολογία, η βιοσυμβατότητα και η ικανότητα φόρτωσης ήταν μερικά μόνο από τα χαρακτηριστικά που οδήγησαν πολλούς ερευνητές να τα θεωρήσουν ως «ιδανικά» συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Ωστόσο, παρά τις πλεονεκτικές ιδιότητες των εξωσωμάτων, η «μεταφρασιμότητά» τους παρεμποδίζεται από την ετερογένεια από παρτίδα σε παρτίδα και τους περιορισμούς της παραγωγής υψηλής απόδοσης που εμφανίζουν. Έτσι, η ανάπτυξη τεχνητών εξωσωμάτων, γνωστών και ως μιμητικών εξωσωμάτων (exosome mimetics-EMs), μέσω κυτταρικών συστατικών έχει εισαχθεί για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί των φυσικών εξωσωμάτων. Στην παρούσα εργασία, εστιάσαμε: i) στην ανάπτυξη και στον φυσικοχημικό/μοριακό χαρακτηρισμό των εξωσωμάτων, ii) στη φαρμακολογική αξιολόγηση των εξωσωμάτων ως θεραπευτικών νανοφορέων στα πλαίσιο της θεραπείας του καρκίνου και iii) στην παραγωγή τεχνητών εξωσωμάτων από κυτταρικά συστατικά και τον μορφολογικό/φυσικοχημικό χαρακτηρισμό αυτών των νανοκυστιδίων. Πιο συγκεκριμένα, τα φυσικά εξωσώματα απομονώθηκαν από το θρεπτικό της καλλιέργειας των κυττάρων και πραγματοποιήθηκε λεπτομερής μορφολογικός, φυσικοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός, χρησιμοποιώντας καθιερωμένες φυσικοχημικές τεχνικές, για την αποσαφήνιση των μοναδικών χαρακτηριστικών και του μοριακού τους ρεπερτορίου. Επιπλέον, η φαρμακολογική αξιολόγηση αυτών των συστημάτων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με α) την αποτελεσματικότητα ενθυλάκωσης υδρόφοβων και υδρόφιλων φαρμάκων σε εξωσώματα, β) την ποιοτική και ποσοτική αξιολόγηση της πρόσληψης των φορτωμένων με φάρμακο εξωσωμάτων από φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα, γ) την in vitro κυτταροτοξικότητα των εξωσωμάτων φορτωμένων με φάρμακα, τέλος, δ) το δυνητικά ενισχυμένο αποτέλεσμα κυτταροτοξικότητας της διπλής χημειοθεραπευτικής προσέγγισης μέσω εξωσωμάτων. Τα εξωσώματα εμφάνισαν επιθυμητές μορφολογικές/φυσικοχημικές ιδιότητες, αποτελεσματική ικανότητα φόρτωσης και επιλεκτική συσσώρευση σε καρκινικά κύτταρα, παρέχοντας στόχευση στον όγκο. Επιπλέον, σύμφωνα με ένα προσαρμοσμένο πρωτόκολλο, δημιουργήθηκαν τεχνητά εξωσώματα μέσω μιας τρισδιάστατα εκτυπωμένης (3D-printed) πλακέτας μικρορευστομηχανικής (microfluidic chip) και χαρακτηρίστηκαν ως προς τις μορφολογικές και φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την αποτελεσματική και γρήγορη ανάπτυξη εξωσωματικών κυστιδίων σε μεγάλη κλίμακα και πρότειναν τη δυνητική τους χρησιμότητα ως καινοτόμες πλατφόρμες χορήγησης χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Συνοψίζοντας, ο στόχος αυτού του έργου ήταν η ανάπτυξη καθιερωμένων και πλήρως χαρακτηρισμένων συστημάτων χορήγησης βασισμένων στα εξωσώματα για τη θεραπεία του καρκίνου. Τα αποτελέσματα καθιστούν τα φυσικά και τεχνητά εξωσώματα ως πολλά υποσχόμενα συστήματα για στοχευμένη παροχή φαρμάκων στα πλαίσια της νανοϊατρικής και της ιατρικής ακριβείας.