title: Die Charakterisierung des immunogenen Potentials DM-sensitiver Antigene im Vergleich zu DM-resistenten Antigenen
Creators: name: Bernhardt, Anna Luise
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2025
Subjects: subject: Immuntherapie, T-Zelltherapie, adoptiver T-Zelltransfer, GvHD, GvL, CD4+ T-Zellen, Antigenprozessierung, Antigenpräsentation, HLA-DM, HLA-DO, H2-O, Immunogenität, DM-sensitiv, DM-resistent

description: Erst kürzlich wurde entdeckt, dass sich endogene MHC-II restringierte Antigene in ihrem Verhalten gegenüber HLA-DM unterscheiden und sich daher in zwei Gruppen einteilen lassen. Antigene, deren Erkennung von HLA-DM unabhängig ist, werden als DM-resistent bezeichnet. Hingegen werden Antigene als DM-sensitiv beschrieben, wenn deren Präsentation durch HLA-DM beeinträchtigt wird. Lediglich durch die Koexpression von HLA-DO, dem natürlichen Inhibitor von HLA-DM, kann die Präsentation von DM-sensitiven Antigenen wiederhergestellt werden. Dieser Vorgang im MHC-II Prozessierungsweg könnte sich bei der allogenen Stammzelltransplantation (SZT) zu Nutze gemacht werden. Auch mehr als ein halbes Jahrhundert nach der ersten erfolgreichen allogenen SZT haben noch immer keine Routinemethoden in die Klinik Einzug gehalten, die zur Maximierung des Graft- versus-Leukämie (GvL) Effekts führen ohne dabei die Auswirkungen der Graft-versus-Host (GvH) Erkrankung zu verschlimmern. Auch heute noch sind die GvH Erkrankung und der Rückfall die beiden häufigsten Todesursachen bei einer allogenen SZT. Studien zeigen jedoch, dass Zellen von CLL, ALL und AML HLA-DO exprimieren. Im Gegensatz dazu bleiben Zellen des nicht-hämatopoetischen Systems selbst unter inflammatorischen Bedingungen HLA-DO negativ. Entsprechend könnte eine Donor- lymphozyteninfusion von CD4+ T-Zellen, die gegen DM-sensitive Antigene gerichtet sind, den GvL- Effekt verstärken, ohne das Risiko einer GvH zu erhöhen. Da bisher nichts über die Effektivität von DM- sensitiven Antigenen als Targets für Immuntherapien bekannt ist, war das Ziel dieser Arbeit, das immunogene Potential DM-sensitiver Antigene im Vergleich zu DM-resistenten Antigenen zu untersuchen. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurden die beiden Modellantigene OVA (VHAAHAEINEAG) und DBY (NAGFNSNRANSSRS) gewählt und von diesen 30mere hergestellt. Mit Hilfe von murinen Zelllinien, die entweder H2-M oder H2-O (die murinen Analoga von HLA-DM oder HLA-DO) überexprimierten, wurde von OVA und DBY die Sensitivität gegenüber HLA-DM bestimmt. Durch den gezielten Austausch einzelner Ankeraminosäuren innerhalb des Epitops, wurden von den Modellantigenen Mutations- varianten generiert, um zwischen DM-sensitiv und DM-resistent wechseln zu können. Zur Charakterisierung der Immunogenität wurden Antigen-spezifische CD4+ T-Zellen in C57BL/6 Mäuse transferiert und die Tiere anschließend mit einem DM-sensitiven Peptid oder dem DM-resistenten Pendant vakziniert. Mit Hilfe der H2-M oder H2-O überexprimierenden Zelllinie konnte gezeigt werden, dass die effektive Präsentation des OVA Epitops von H2-O abhängig ist. Dem Peptid konnte damit DM-sensitiven Eigen- schaften zugeschrieben werden. Im Gegensatz dazu wurde das DBY Epitop auf der Oberfläche von HLA- DM überexprimierenden Zellen präsentiert und konnte somit der Gruppe der DM-resistenten Antigene zugeordnet werden. Durch den Austausch von ein bis drei Ankeraminosäuren innerhalb des Epitops wurde die Bindungsaffinität der Modellantigene zum MHC-II erhöht oder verringert, so dass für das OVA Antigen eine weitere DM-sensitive (OVA30_I334A) und zwei DM-resistente Varianten (OVA30_A329Y/I334A, OVA30_V327F/A329Y/I334A) generiert werden konnten. Für DBY konnte eine weitere DM-resistente (DBY30_F12W) und vier DM-sensitive Varianten (DBY30_A10F/F12A, DBY30_F12I, DBY30_F12M, DBY30_F12A) gefunden werden. Durch Immunisierungsversuche in Mäusen konnte gezeigt werden, dass durch DM-sensitive und DM-resistente Antigene eine vergleichbare Expansion und funktionelle Avidität der Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen induziert werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass von den Modellantigenen OVA und DBY erfolgreich DM- sensitive und DM-resistente Varianten generiert werden konnten, die sich in ihrem immunogenen Potential nicht unterschieden. Damit stellen DM-sensitive Antigene einen vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung von neuen Immuntherapien dar.
description: Only recently, it was discovered that endogenous MHC-II restricted antigens differ in their behavior towards HLA-DM and can therefore be divided into two groups. Antigens whose recognition is independent of HLA-DM are called DM-resistant. In contrast, the presentation of DM-sensitive antigens is impaired by HLA-DM and can only be restored by HLA-DO co-expression, the natural inhibitor of HLA-DM. This process in the MHC-II processing pathway could be exploited in allogeneic stem cell transplantation (SCT). Even more than half a century after the first successful allogeneic SCT, there is no established method in the clinic that can maximize the graft-versus-leukemia (GvL) effect without aggravating graft-versus-host disease (GvHD). Even today, GVHD and relapse remain the two leading causes of death in allogeneic SCT. However, studies show that cells of CLL, ALL and AML express HLA-DO. In contrast, cells of the non-hematopoietic system remain HLA-DO negative even under in- flammatory conditions. Accordingly, a donor lymphocytes infusion of allogeneic CD4+ T cells directed against DM-sensitive antigens could enhance the GvL effect without inducing the risk of GvHD. Since nothing is known so far about the effectiveness of DM-sensitive antigens as targets for immuno- therapies, the aim of this thesis was to investigate the immunogenic potential of DM-sensitive antigens in comparison to DM-resistant antigens. To address this question, 30mers were generated from the two model antigens OVA (VHAAHAEINEAG) and DBY (NAGFNSNRANSSRS). Using murine cell lines overexpressing either H2-M or H2-O (the murine analogues of HLA-DM or HLA-DO), the sensitivity of the peptides towards HLA-DM was determined. By targeted exchange of individual anchor amino acids within the epitope, mutated peptide variants were generated to switch between DM-sensitivity and DM-resistance. To characterize immunogenicity, antigen-specific CD4+ T cells were transferred into C57BL/6 mice followed by subsequent vaccination with a DM-sensitive peptide or the DM-resistant counterpart. Using the H2-M or H2-O overexpressing cell line, the presentation of the OVA wildtype 30mer was shown to be dependent on HLA-DO demonstrating DM-sensitivity of the epitope. In contrast, the DBY epitope was presented on the surface of HLA-DM overexpressing cells and could thus be assigned to the group of DM-resistant antigens. By exchanging one to three anchor amino acids within the epitope, the binding affinity of the model antigens to MHC-II was increased or decreased, so that for the OVA antigen another DM-sensitive (OVA30_I334A) and two DM-resistant variants (OVA30_A329Y/I334A, OVA30_V327F/A329Y/I334A) could be generated. For DBY, one more DM-resistant (DBY30_F12W) and four DM-sensitive variants (DBY30_A10F/F12A, DBY30_F12I, DBY30_F12M, DBY30_F12A) could be found. The immunization experiments demonstrated that DM-sensitive antigens could achieve comparable expansion and functional avidity of antigen-specific CD4+ T cells as the DM-resistant counterpart. Taken together, the data of this study show that DM-sensitive and DM-resistant antigens could be successfully generated from the model antigens OVA and DBY, which did not differ in their immunogenic potential. These data suggest that DM-sensitive antigens might be a promising target for the development of new immunotherapies.