title: Wolframabhängige Aldehydoxidoreduktase - Neue Einblicke in Katalyse, Struktur und Kofaktor-Maturation
title: Tungsten Dependent Aldehyde Oxidoreductase - New Insights into Catalysis, Structure and Cofactor Maturation
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Hege, Dominik Alexander
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: AOR Wolframenzym Wolfram-Kofaktor Aldehydoxidation Molybdän-Kofaktor WCo MoCo
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Tungsten Enzyme Tungsten Cofactor Aldehyde Oxidation Molybdenum Cofactor WCo MoCo

description: Die Aldehydoxidoreduktase aus Aromatoleum aromaticum ist eine bakterielle AOR, die aus drei Untereinheiten in der Zusammensetzung α2β2γ besteht und die Oxidation verschiedener Aldehyde zu den entsprechenden Carbonsäuren katalysiert. Die β-Untereinheit enthält dabei einen Wolfram-bis-Pterin-Kofaktor (WCo) im aktiven Zentrum. Über ein [4Fe-4S]- Cluster in der β-Untereinheit und vier weitere [4Fe-4S]-Cluster in der α-Untereinheit können die Elektronen auf ein FAD in der γ-Einheit übertragen werden. In vitro kann die Aktivität sowohl mit Benzylviologen als auch mit NAD+ gemessen werden, als physiologischer Elektronenakzeptor kommt daher neben NAD+ mutmaßlich auch Ferredoxin in Frage. Unter Verwendung passender Reduktionsmittel wie Ti(III) oder Eu(II) kann auch die Reduktion von Carbonsäuren zu den entsprechenden Aldehyden beobachtet werden. Das Enzym besitzt außerdem eine Hydrogenaseaktivität, die elementaren Wasserstoff zur Reduktion von Benzylviologen, NAD+ oder Carbonsäuren nutzt. Das aor-Operon enthält neben den drei Strukturgenen aorA-C außerdem zwei weitere Gene aorD und aorE, die für putative Maturationsfaktoren kodieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde basierend auf Aromatoleum evansii KB740 ein Expressionssystem für die AOR erstellt, das es ermöglicht, das Enzym rekombinant zu produzieren und mittels Affinitätschromatographie aufzureinigen. Dabei wurden die Bedingungen so weit optimiert, dass die Aktivität der rekombinanten AOR die des nativ gereinigten Enzyms deutlich übersteigt. Neben der Aktivität wurden außerdem unter anderem der Gehalt an Wolfram und Eisen sowie FAD bestimmt. Außerdem wurden Experimente zur Hydrogenaseaktivität des Enzyms durchgeführt. Neben dem Enzym selbst und potentiellen biotechnologischen Anwendungen ist auch der Wolframkofaktor und dessen Maturation von besonderem Interesse. In weiten Teilen entspricht die Biosynthese des WCo der des Molybdän-Kofaktors (MoCo). Trotz der chemischen Ähnlichkeit von Wolframat und Molybdat erfolgt der Einbau des WCo in die AOR dennoch sehr spezifisch. Als möglicher Ansatzpunkt für diese Diskriminierung von Molybdän und Wolfram wurden in der Literatur die beiden Paraloge der Molybdopterin- Molybdotransferase MoeA1 und MoeA2 diskutiert. Um die Rolle dieser beiden Proteine in vivo zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit ΔmoeA-Deletionsmutanten von A. evansii generiert. Mithilfe dieser Stämme konnte gezeigt werden, dass MoeA2 für die Synthese des WCo zwingend notwendig ist, die Synthese des MoCo hingegen mit beiden MoeA-Paralogen abläuft. Zusammen mit der Beobachtung, dass die beiden Maturationsfaktoren AorD und/oder AorE ebenfalls eine wichtige Rolle für die Aktivität der AOR spielen, lässt sich ein Mechanismus für die Maturation des WCo postulieren, mit dem sich der selektive Einbau von Wolfram erklären lässt.