Differentiation and Cultivation of Retinal Cells in a Defined 3D Environment = Differenzierung und Kultivierung von retinalen Zellen in einer definierten 3D-Umgebung
Creators: name: Keppler, Stephan
Publisher: name: Karlsruher Institut für Technologie (KIT)
Year: 2021
Subjects: Organoid
Retina
Stem Cells
mESCs
3D Scaffolds
2PP
Direct Laser Writing
DLW
3D Cell Culture

description: Unter den fünf Sinnesempfindungen nimmt das Sehen für die meisten Säugetiere die zentralste Rolle ein. Das Sehvermögen wird durch die Retina bewerkstelligt, einem geschichteten neurosensorischen Gewebe das den Augapfel auskleidet. Die Retina besteht aus Müller Gliazellen und sechs neuronalen Zelltypen und ist in das retinale Pigmentepithel eingebettet. Licht wird durch die Photorezeptoren detektiert, von Interneuronen verarbeitet und über die Ganglienzellen an das Gehirn weitergeleitet. Seit Jahrzehnten werden für die Wissenschaft Tiermodelle verwendet, allerdings können diese nicht alle Aspekte der Entwicklung und Erscheinungsbilder von Erkrankungen widerspiegeln. Vor kurzem wurde ein in vitro Kultivierungssystem eingeführt, das als Organoide bezeichnet wird. Pluripotente Mausstammzellen wurden aggregiert und in der Gegenwart von Extrazellulärer Matrix weiter kultiviert. Dies führt zur Differenzierung von freischwimmendem Gewebe, das einer Retina ähnelt. Während Organoide unzählige Möglichkeiten für die Wissenschaft bieten, gehen sie auch mit einigen Beschränkungen einher: sie weisen nicht das retinale Pigmentepithel auf, sind von der Entwicklung auf frühe postnatale Stadien limitiert und ihre Kultivierungszeit ist auf ca. 30 Tage beschränkt. In dieser Arbeit wurden Anstrengungen vorgenommen, die Beschränkungen des Organoid-Systems auszugleichen und zu verbessern. Dies sollte durch die Kombination mit mikro-3D gedruckten Substraten bewerkstelligt werden, um so ein komplexeres in vitro Kultivierungssystem zu erlangen. Zur Herstellung der Strukturen wurde die etablierte Methode des Direkten Laserschreibens verwendet. Diese Methode eignet sich hervorragend, um großflächige Substrate mit einer Genauigkeit jenseits der Mikrometer-Grenze, herzustellen. Die Differenzierung und Kultivierung von retinalen Organoiden wurde etabliert und durch Modifikationen des ursprünglich publizierten Protokolls verbessert. Dadurch konnte die retinale Induktion in Organoiden signifikant verbessert werden. Die dreidimensionalen Substrate bestehen aus Säulenfeldern mit einer Höhe von 70 μm, einem Radius von 3.5 μm und einem Kanten-zu-Kanten Abstand von jeweils 20 μm. Ferner können diese Strukturen durch Proteinbeschichtungen weiter modifiziert werden, wodurch Zellen eine angemessene Wachstumsumgebung geboten wird. In einem weiteren Schritt wurden retinale Organoide enzymatisch und mechanisch zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert und auf Laminin-beschichteten 3D Substraten ausgesät. Von Organoiden abstammendes Gewebe in 3D Substraten wurde auf die Viabilität, die Zusammensetzung der Zelltypen und die Organisation der Zellen überprüft. Die 3D Substrate zeigten keinen negativen Einfluss auf die Viabilität der Zellen und alle Hauptklassen an retinalen Zellen waren vorhanden. In einigen Fällen konnte eine bevorzugte Orientierung in axialer Richtung beobachtet werden. Photorezeptor-ähnliche Zellen lokalisierten bevorzugt in den oberen Bereichen der Substrate. Außerdem konnte die Kultivierungszeit innerhalb der Strukturen auf bis zu 50 Tage ausgeweitet werden. In dieser Dissertation wurde ein in vitro Kultivierungssystem erfolgreich eingeführt. Zur Verbesserung der Langzeitkultivierung wurden durch Direktes Laserschreiben hergestellte 3D Substrate mit von retinalen Organoiden abstammende Zellen kombiniert. In nachfolgenden Arbeiten kann das System weiter analysiert und Modifikationen vorgenommen werden.