title: Drosophila paulistorum trinity
Creators: name: Däuble, Wolfgang Georg Albert
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Drosophila paulistorum ist eine neotropische Fruchtfliegenart in statu nascendi, d.h., sie spaltet sich derzeit in mehrere neue Spezies auf. Bisher werden auf Grund von Kreuzungsinkompabilitäten sechs beschriebene Semispezies zu dem D. paulistorum Spezieskomplex gezählt. Deren Unterscheidung und phylogenetische Klassifizierung stellen eine große Herausforderung dar, da sie keine morphologischen Eigenheiten besitzen und bisher keine zuverlässigen molekularen Marker veröffentlicht wurden. Darüber hinaus weisen die publizierten mitochondrialen und nukleären Phylogenien Widersprüche auf. Jede der beschriebenen Semispezies besitzt einen eigenen Stamm an Wolbachia maternal vererbte, intrazelluläre Bakterien, die in mutualistischer Symbiose mit den Fliegen leben und reproduktive Phänotypen in ihren Wirten exprimieren. Diese führen zu sexueller Isolation sympatrischer Populationen unterschiedlicher Semispezies. Männliche Hybride, welche ausschliesslich unter Laborbedingungen durch Kreuzung verschiedener Semispezies erzeugt werden können, sind steril. Durch Behandlung der Fliegen mit Antibiotika können der Wolbachia Titer auf ein Minimum gesenkt und somit die reproduktiven Phänotypen teilweise umgangen werden. Unter solchen Bedingungen wurden in vorrangegangenen Studien stabile Hybridlinien von D. paulistorum Semispezies generiert, die Signaturen einer paternalen Vererbung der Wolbachien aufwiesen. Das erste Ziel dieser Arbeit war es, hochinformative nukleäre und mitochondriale Marker zu finden um die Phylogenie des D. paulistorum-Komplexes zu verbessern und die Widersprüche zwischen den publizierten mitochondrialen und nukleären Daten zu klären. Zu diesem Zweck wurden Gene für antimikrobielle Peptide (AMPs) als nukleäre Marker ausgesucht, da vorangegangene Studien gezeigt haben, dass diese Gene erhöhte Evolutionsraten in Drosophila-Spezies aufweisen. Als mitochondrieller Marker wurde das Gen für die NADH Dehydrogenase Untereinheit 4 ausgewählt. Das zweite Ziel dieser Arbeit war das Erstellen eines genetischen Typisierungssystems, um mit Hilfe der oben beschriebenen Markergene neu gesammelte oder unklassifizierte D. paulistorum Stämme in das System der sechs beschriebenen Semispezies genotypisch einzuordnen. Zudem sollte das Gen für Attacin D, ein AMP welches potentiell intrazellulär wirkt, auf Hinweise für eine Koevolution mit Wolbachien untersucht werden. Als letztes Ziel sollte die mitochondrielle Vererbung in den oben erwähnten stabilen Hybridlinien untersucht werden, da Wolbachien gemeinsam mit Mitochondrien vererbt werden, was eine paternale Übertragung der Mitochondrien in diesen Hybriden vermuten lässt. Die Sequenzanalyse der sechs AMP-Gene Attacin A, -C, -D, und Diptericin-B und Drosocin zeigte eine hohe Rate (2.4 - 7.9%) an unterschiedlichen Nukleotiden innerhalb der D. paulistorum Semispezies. Für drei dieser AMPs wurden mehrere Paraloge in manchen Semispezies entdeckt. Die unterschiedlichsten Nukleotidsequenzen und die meisten Paraloge fanden sich für Attacin D. Obwohl eine Analyse der Ka/Ks-Verhältnisse dieses Gens Hinweise auf negative Selektion hervorbrachte, kann die Aufrechterhaltung der hohen Nukleotiddiversität und der unterschiedlichen Paralogen als eine Adaption an Semispezies-spezifische Symbionten gedeutet werden. Die Sequenzierung und Restriktionsfragmentslängen-polymorphismus- (RFLP-) Analyse durch P32- markierte Southern-Blot-Hybridisierung des mitochondriellen ND4-Gens ergab, dass manche Semispezies mehrere mitochondrielle Haplotypen besitzen. Mit Hilfe der ND4-, Attacin C- und –D- Datensätze wurde ein molekulares Markersystem erstellt, welches die eindeutige Zuordnung dreier unklassifizierter Stämme in das System der sechs Semispezies erlaubte. Darüberhinaus konnten in dieser Studie phylogenetische Bäume mit höherer Auflösung erstellt werden als die der bisher veröffentlichten D. paulistorum Phylogenien. Es traten aber ebenfalls Widersprüche zwischen nukleären und mitochondriellen Daten auf. Die Entdeckung von mehreren Mitotypen und der in dieser Studie erbrachte Beweis der paternalen Vererbung von Mitochondrien in D. paulistorum-Hybriden kann als eine mögliche Erklärung für diese Widersprüche herangezogen werden.
description: Drosophila paulistorum is a neotropical fruit fly in statu nascendi, i.e. under on-going evolutionary segregation into multiple new species. Six described D. paulistorum semispecies are currently assigned to this species complex based on mating compatibilities. The distinction and the phylogenetic classification of these semispecies provide a big challenge, as they are morphologically indistinguishable and no reliable molecular marker system has been published yet. In addition, the existing phylogeny of D. paulistorum is conflicting at nuclear and mitochondrial level. All of the described semispecies harbour distinct strains of Wolbachia, maternally transmitted intracellular bacteria, living in mutualistic symbiosis and expressing reproductive phenotypes in their hosts. These phenotypes induce pre- and postmating isolation of sympatric populations of different semispecies. Male hybrids of the semispecies, hatching only under laboratory conditions, are completely sterile. Antibiotic treatment of the flies reduces the Wolbachia titer to a minimum and can partially rescue those reproductive phenotypes. Under those conditions, hybrid lines of D. paulistorum semispecies were generated in previous studies. Remarkably, such intersemispecies hybrids showed signatures of paternal Wolbachia transmission. The first aim of this thesis was to find and examine highly informative nuclear and mitochondrial genes to improve the phylogeny of the D. paulistorum species complex and to resolve the conflicts between the published nuclear and mitochondrial data. For this purpose, genes for antimicrobial peptides (AMPs) were chosen at nuclear level, as previous studies showed that their rate of evolution is elevated in Drosophila species. As a mitochondrial marker gene, NADH dehydrogenase subunit 4 (ND4) was selected. The second aim was to create with those sequences a genetic strain typing system in order to group newly collected and unclassified D. paulistorum strains in the system of described semispecies. Additionally, the gene for Attacin D, an AMP potentially acting intracellularly, was examined for signs of coevolution with Wolbachia. Finally, we wanted to investigate the mitochondrial transmission mode in hybrid lines mentioned above, as their paternally inherited Wolbachia are potentially hitchhiking with the paternal mitotype. Sequence analysis of the six AMP genes Attacin A, -C, -D, Diptericin, Diptericin-B and Drosocin revealed high levels (2.4% - 7.9%) of nucleotide diversity within the D. paulistorum semispecies. Three of those AMP genes showed multiple paralogues in some semispecies. The highest nucleotide divergence and paralogue abundance was found in Attacin D. Although Ka/Ks ratio analysis of this gene provided signs of negative selection, the maintenance of the divergent paralogues and the high level of nucleotide divergence of this gene were interpreted as an adaptation to a divergent set of symbionts. ND4 sequencing and Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis via P32-labelled Southern blot hybridization showed that some semispecies harbour multiple mitochondrial haplotypes. By using the ND4 data and the nuclear Attacin C, and - D sequences, a molecular marker system was established. It allowed the unambiguous integration of three unclassified strains into the system of described semispecies. Phylogenetic trees established in this study provide a higher resolution than the previously published D. paulistorum phylogenies. However, they are also inconsistent at nuclear and mitochondrial level. The finding of multiple mitotypes and the proof of paternal transmission of mitochondria in D. paulistorum hybrids, produced in this work, serve as a possible explanation for these incongruence.