title: Beteiligte Signalwege an der Entstehung der Urkeimzellen in Platynereis dumerilii (Annelida, Polychaeta)
title: Signaling pathways involved in the regulation of primordial germ cell development in Platynereis dumerilii (Annelida, Polychaeta)
Creators: name: Lidke, Anika
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: GSK3ß
Zoologie
Estradiol
Platynereis , Primordial Germ Cells
Tiere (Zoologie)
Platynereis , Urkeimzellen

description: Urkeimzellen haben innerhalb eines
      Organismus eine wichtige Aufgabe; ohne sie kann keine neue
      Generation entstehen. Ihre Entwicklung muss einer genauen
      Regulation unterliegen, da schon kleinste Fehler den Verlust
      der Fortpflanzungsfähigkeit bedeuten können. Über die an der
      Entwicklung der Urkeimzellen beteiligten Signalwege in
      Wirbellosen ist bisher nur wenig bekannt. Deshalb wurde
      hierzu Untersuchungen an dem marinen Polychaetne Platynereis
      dumerilii durchgefürht Da in Vertebraten die Entwicklung der
      Urkeimzellen durch das Steroidhormon Estradiol beeinflusst
      werden konnte (Ge et al., 2012; La Sala et al., 2010), wurde
      untersucht, ob in Platynereis ein ähnlicher Effekt vorliegt.
      Tatsächlich konnten nach Behandlungen von 2 bis 24 h mit
      Estradiol Larven mit mehr als vier Urkeimzellen gefunden
      werden (Lidke et al, in press). Ebenso wie Estradiol erhöhte
      auchdas Xenoestrogens Ethinylestradiol die Anzahl der
      Urkeimzellen Eine Behandlung mit Estradiol nach 24 h ergab
      keine Larven mit erhöhter Anzahl von Urkeimzellen. Das
      Zeitfenster für die Empfindlichkeit der Embryonen für
      Estradiol ließ sich auf 4 h bis 9 h eingrenzen, d.h.die
      Urkeimzellen ließen sich nur zum Zeitpunktihrer Entstehung
      durch Estradiol beeinflussen. Der Estradiolrezeptor Inhibitor
      ICI182 780 konnte den durch Estradiol erzeugten Effekt
      blockieren. Dies zeigt, dass der Estradiolrezeptor an der
      Erhöhung der Urkeimzellen-Anzahl beteiligt ist. Um zu zeigen,
      zu welchem Zeitpunkt der Estradiolrezeptor in Platynereis
      nachzuweisen ist, wurden Westernblots mit verschiedenen
      Antikörpern durchgeführt, die jedoch alle keine eindeutige
      Bande entsprechender Größe detektieren konnten. Im Gegensatz
      dazu war der Nachweis der Estradiolrezeptor mRNA in 6 h alten
      Embryonen durch In Situ Hybridisierung erfolgreich. Anhand
      des Proliferationsmarkers EdU konnte gezeigt werden, dass
      nach einer Behandlung mit Estradiol auch noch nach 8 h
      Urkeimzellen entstehen, anstatt wie normalerweise zwischen 6
      h und 8 h. Der Versuch, mögliche Zielgene des
      Estradiol-Signalweges mit Hilfe von RT PCR aufzuzeigen, war
      aufgrund der geringen Anzahl der Urkeimzellen im Embryo
      jedoch nicht möglich. Wurde zunächst noch davon ausgegangen,
      dass die überzähligen Urkeimzellen durch einen genomischen
      Signalweg des Estradiolrezeptors zustande kamen, so zeigte
      der Einsatz eines Proteinkinase B (AKT) Inhibitors, dass es
      sich höchstwahrscheinlich um sogenanntes ‚Rapid Signaling‘
      handelte (Moriarty et al., 2006). AKT Inhibitor alleine
      erzeugt Larven mit weniger als vier Urkeimzellen. Der AKT
      Signalweg scheint also an der Entstehung der Urkeimzellen
      beteiligt zu sein. Als mögliches Ziel von AKT kam die
      Glykogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) in Frage. Ihre
      Beteiligung an der Entwicklung der Urkeimzellen wurde mit
      Hilfe des GSK3β Inhibitors Azakenpaullon (Azp) untersucht.
      Eine Behandlung während der Entstehung des Mesoblasten 4d (4
      h bis 5 h) sorgte für eine verringerte Anzahl der
      Urkeimzellen, während eine spätere Behandlung von 5,5 h bis
      6,5 h zu einem Anstieg der Urkeimzellen Anzahl führte. Die
      GSK3β scheint neben AKT eine wichtige Rolle bei der
      Urkeimzellen-Entwicklung zu spielen. Da β-Catenin ein durch
      GSK3β reguliertes Protein ist, wurden mit verschiedenen
      Antikörpern versucht, in Embryonen eine Veränderung der GSK3β
      Aktivität nachzuweisen. In einzelnen Fällen gelang eine
      immunohistochemische Färbung des β-Catenin, jedoch aufgrund
      der nicht zuverlässigen Wirkung der Antikörper konnte eine
      Veränderung der β-Catenin Lokalisation nicht systematisch
      untersucht werden. Da der FGF Rezeptor unter anderem AKT
      aktivieren kann (Kalff und Spencer, 2012), sollte durch den
      Einsatz des FGFR Inhibitors SU5402 untersucht werden, ob der
      Rezeptor an der Entstehung der Urkeimzellen beteiligt ist.
      Der Inhibitor erzeugte Larven mit einer verringerten Anzahl
      der Urkeimzellen. Eine Verknüpfung von FGFR und AKT könnte in
      diesem Fall vorliegen. Weiter wurde eine Nanos Response
      Elements in der untranslatierten 3‘ Region der Sequenz des
      FGFR gefunden. Dies könnte bedeuten, dass der FGFR durch den
      Keimzellmarker Nanos in den Urkeimzellen normalerweise
      herunterreguliert wird. Sowohl für den MAP Kinase Signalweg,
      als auch für den Notch-Delta Signalweg konnten bereits
      Verbindungen zu FGFR oder GSK3β bei anderen Spezies
      aufgezeigt werden (Espinosa et al., 2003; Kalff und Spencer,
      2012; Kim und Snider, 2011). Die Beeinflussung beider
      Signalwege mit spezifischen Inhibitoren zeigte jedoch keine
      Änderungen in der Anzahl der Urkeimzellen bei Platynereis. In
      beiden Fällen wurde bisher jedoch nur eine Konzentration
      ausgetestet, wodurch sich eine Beteiligung der beiden
      Signalwege bisher nicht endgültig ausschließen lässt. Neben
      der Untersuchung der an der Urkeimzell-Entwicklung
      beteiligten Signalwege wurden noch weitere Ergebnisse
      erzielt. Die komplette Sequenz des PduVasa Inserts im Plasmid
      ‚Vasa Clon A‘ wurde ermittelt. Ebenfalls konnten Fragmente
      von Pdu-Aktin und Pdu-CyclinB1 kloniert und sequenziert
      werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sich die Färbung
      von α-Tubulin mit Hilfe eines entsprechenden Antikörpers dazu
      eignet, um als mögliche Gegenfärbung zu β-Catenin zu
      fungieren. Da sich der immunhistochemische Nachweis des Vasa
      Proteins bei Embryonen als schwierig erwies, wurde zudem
      versucht, die Urkeimzellen in Embryonen durch Kernfärbungen
      mit DAPI oder Propidium Jodid sichtbar zu machen. Da die
      Urkeimzellen jedoch nach kurzer Zeit in den Embryo
      einwandern, waren diese nur sehr schwierig im Embryo zu
      finden Im Rahmen dieser Arbeit konnte also gezeigt werden,
      dass Estradiol eine proliferative Wirkung auf die
      Urkeimzellen von Platynereis hat. Weiterhin konnte ein Modell
      aufgestellt werden, das eine mögliche Beteiligung und
      Verknüpfung von FGFR, AKT und GSK3β bei der Entwicklung der
      Urkeimzellen beinhaltet.
description: Primordial germ cells (PGCs) are
      important for the development of the next generation of an
      organism. Their development has to be controlled exactly;
      even minor defects may lead to a loss of fertility. Little is
      known about i the signaling pathways involved in the
      regulation of PGC development in invertebrates. Therefore,
      PGC development was investigated in the marine polychaete
      Platynereis dumerilii. Since PGC development is influenced by
      the steroid hormone 17βestradiol in vertebrates (Ge et al.,
      2012, La Sala et al., 2010), the effect of estradiol on PGC
      development in Platynereis was analysed. Upon exposure to
      estradiol from 2 to 24 h, larvae with supernumerary PGCs were
      found (Lidke et al., in press). Similiaryl, the xenoestrogen
      ethinylestradiol was found to increase PGC numbers.
      Incubation after 24 h with either estradiol and
      ethinylestradiol had no effect. In a next step, the sensitive
      phase for Estradiol could be narrowed down to 4 to 9 h,
      indicating thatthe PGCs can only be influenced with estradiol
      during their development. The estradiol antagonist ICI182 780
      abolishes the effect of Estradiol. This suggests that the
      proliferative effect of estradiol is mediated by the
      estradiol receptor. In order to find out, when the estradiol
      receptor is expressed in Platynereis, several antibodies were
      tested in Westernblots, but none of them could detect a
      protein of the expected size. However, the ER transcript was
      detected by in situ hybridization in 6 h old embryos in the
      micromeres. Using of the proliferation marker EdU it could
      furthermore be shown, that the phase of PGC development is
      prolongated following incubation with estradiol.In order tTo
      elucidate the target genes of estradiol signaling, RT-PCR for
      putative target genes such as cyclin E was performed on
      estradiol treated and control embryos , but due to the small
      number of PGCs no difference could be observed. While it was
      initially assumed that the supernumerary PGCs arise from
      classical ‘genomic’ estradiol signaling, the fact that a
      proteinkinase B (AKT) inhibitor abolishes the estradiol
      effect suggests, that so called ‘rapid signaling’ (Moriarty
      et al., 2006) might be involved in PGC development. As a
      putativetarget of AKT, the role of GSK3β during PGC
      development was studied. The GSK3 β inhibitor Azakenpaullone
      (Azp)reduces PGC numbers after treatment from 4 to 5 h, while
      supernumerary PGCs occur upon treatment from 5,5 to 6,5 h.
      GSK3β and AKT seem to be indispensable for the development of
      the correct number of PGCs. Since the protein β-catenin is
      regulated by GSK3β, it was assumed, that β-catenin levels are
      altered by estradiol or azakenpaullone treatment.
      Unfortunately, the antibodies at hand failed yield
      reproducible results. Since FGFR is a possible activator of
      AKT (Kalff and Spencer, 2012), the FGFR inhibitor SU5402 was
      tested on Platynereis embryos. Indeed it produced larvae with
      less than four PGCs, which suggests a connection between FGFR
      and AKT signalling might exist. In the 3’ UTR region of the
      FGFR a putative Nanos response element was detected. A
      down-regulation of FGFR via Nanos could be possible in
      Platynereis. Besides AKT, MAP Kinase and Notch/Delta
      signaling can be influenced by FGFR (Espinosa et al., 2003,
      Kalff and Spencer, 2012, Kim and Snider, 2011). Treatments
      with specific inhibitors lead to no differences in PGC
      numbers. However, since only a single concentration was
      tested with both inhibitors, the involvement of this pathways
      has to be investigated more intensely. Furthermore, te
      complete sequence of the PduVasa insert in the plasmid ‘Vasa
      ClonA’ was obtained. Additionally, fragments of the genes
      PduActin and PduCyclinB1 were cloned and sequenced. Antibody
      staining against α-Tubulin could be shown to be a good
      counter-staining for staining with β-Catenin antibody. As a
      possible and fast staining of the PGCs in Platynereis
      embryos, DNA staining with DAPI and Propidium Iodid was
      tested. This method however did not allow the vizualisation
      of PGC formation because of the difficulty of finding the
      PGCs in the embryo. In my thesis I was able to show, that the
      formation of supernumery PGCs in Platynereis can be induced
      by estradiol when applied during a sensitive phase. A model
      explaining the involvement of FGFR, AKT and GSK3β within the
      development of PGCs was developed.