title: Isolierung und Charakterisierung von humanen Osteoblasten mittels Immunoblottechnik
Creators: name: Ahmed, Victoria
Publisher: name: :none
Year: 2015

description: Ziel dieser Diplomarbeit war es, primäre humane Osteoblasten mittels Gewebeexplantattechnik aus Knochenmaterial zu isolieren um sie in weiterer Folge zu charakterisieren. Die Gewebeproben stammten aus dem Oberschenkelknochen von 4 verschiedenen Spendern männlichen und weiblichen Geschlechts zwischen 58 und 75 Jahren, die sich einer Hüftoperation unterzogen haben. Die Charakterisierung der isolierten Zellen erfolgte durch den Nachweis alkalischer Phosphatase am Tag 7 und durch eine Alizarin Rot Färbung am Tag 14 und 21, welche abgelagertes Mineral sichtbar macht. Des Weiteren wurden Western Blots zur Untersuchung der Proteinexpression in vitro von alkalischer Phosphatase, Osteopontin, LRP6 und Phospho-LRP6 zu den Zeitpunkten „Tag 0, 7 und 14“ angefertigt. Die ALP-Färbung war bei den Zellpopulationen aller Patienten in allen untersuchten Gruppen positiv. Die ARS-Färbung der Calciumeinlagerungen ergab bei Patient 4 am Tag 14, als auch am Tag 21 eine signifikant (p &lt; 0,001) ausgeprägtere Färbung in der Mineralisationsgruppe „MM“ (mit β-Glycerophosphat) im Vergleich zur Kontrollgruppe „KM“ (ohne β-Glycerophosphat). Auch bei Patient 1 konnten mineralische Strukturen in der „MM“-Gruppe am Tag 14 und am Tag 21 mikroskopisch nachgewiesen werden, jedoch ergab die Quantifizierung des Farbstoffs keine signifikanten (p &gt; 0,05) Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Beurteilung der Western Blots hat ergeben, dass es in der Proteinexpression keinen Unteschied zwischen den Patienten zu den einzelnen Zeitpunkten gibt. Auch der Zusatz von β-Glycerophosphat zum Kulturmedium scheint keinen Einfluss auf die Expression der detektierten Proteine zu nehmen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Gewebexplantattechnik eine geeignete Methode zur Isolierung von primären humanen Osteoblasten darstellt und eine Erhaltung des Phänotyps von Osteoblasten zumindest bis zur Passage 2 garantiert werden kann. Der Nachweis der Mineralisationsfähigkeit war bei 2 von 4 Patienten positiv und scheint unabhängig von Alter und Geschlecht zu sein.
description: The aim of this thesis was the isolation and characterisation of primary human osteoblasts by installing explant cultures of trabecular bone from four different donors aged between 58 and 75 years. The bone material was received during hip surgery and was derived from the femoral neck. To characterise the isolated cells an alkaline phosphatase staining was performed on day 7 after confluence and an alizarin red staining on day 14 and 21 to determine the in vitro ability for matrix mineralisation. Furthermore, western blots were performed with cell lysates harvested on day 0, 7 and 14 to evaluate in vitro protein expression of alkaline phosphatase, osteopontin, LRP6 and phosphorylated LRP6. The ALP-staining on day 7 was positive for all observed cell populations. The potential to form mineralised structures, so called bone nodules, could be demonstrated for patient 1 and 4 on day 14 and 21 by an ARS-staining with a significantly (p &lt; 0,001) higher staining intensity in cell cultures from patient 4 in the mineralisation group “MM” (with β-glycerophosphate) compared to the control group (without β-glycerophosphate). Analysis of the western blots showed no significant (p &gt; 0,05) differences in the protein expression between all patients on each time point. Even the presence or absence of β-glycerophosphate in the media did not cause any differences. In conclusion, it can be stated that the explant technique is an appropriate method to gain functional primary human osteoblasts which are able to keep their phenotype at least until passage 2. The capability to form bone nodules varied amongst patients, but seems to be independent from sex or age.