Imaging EphA3 receptor tyrosine kinase substrate interaction
Creators: name: Hou, Jian
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2012
Subjects: subject: Enzyme substrate interaction
subject: EphA3
subject: FLIM
subject: 540
subject: 570

description: Receptor tyrosine kinases (RTKs) function as key signaling molecules to influence several physiological processes such as cell growth, survival and migration. Crystal structure and biochemical evidence suggests that the kinase activity of some RTKs, like the Eph RTK family, is affected by the phosphorylation of several key tyrosine residues in the activation loop (AL) of the tyrosine kinase domain and in the conserved juxtamembrane segment (JMS). However, in living cells, little is known about this regulatory mechanism in which tyrosine phosphorylation affects the catalytic activity and substrate accessibility of RTKs in both space and time. In this thesis, we used the EphA3 RTK as an example to investigate the JMS auto- inhibition involved in the Eph RTK activity regulatory mechanism. To achieve this, a generic cellular EphA3 RTK substrate interaction-imaging assay was developed that is based on Förster Resonance Energy Transfer as measured by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FRET-FLIM). A high affinity EphA3 peptide substrate was applied to increase the probability of kinase-substrate complexes forming. Using this assay, it was possible to quantitatively investigate the formation of steady-state enzyme- substrate (ES) complexes between the purified EphA3 catalytic domain fused to mCitrine and the Cy3.5 labeled peptide substrate. A kinase/phosphatase reaction cycle could be reconstituted that gave rise to stable ES-intermediates as measured by FRET- FLIM. By using this ES imaging approach, EphA3 RTK (WT)-substrate interactions could be observed in EphA3-mCitrine expressing quiescent Cos-7 cells that had been microinjected with the Cy3.5-substrate. This suggests that a population of EphA3 receptors exists with a temporarily relieved JMS auto-repression in the absence of ephrin-A5 ligands. Stimulation with soluble ephrin-A5 ligands led to a detectable increase in ES-intermediates, that pointed to an autocatalytic phosphorylation mechanism of JMS auto-repression relieve. To further study the role of JMS tyrosine phosphorylation on active site accessibility, the ES imaging approach was applied to analyze the active site accessibility of JMS regulation deficient mutants (MTs). Different substrate accessibilities were observed for these JMS regulation-deficient mutants (MTs), which revealed a possible function of JMS tyrosine phosphorylation in the regulation of the EphA3 RTK active site accessibility in living cells. In this work, a generic living cell compatible FRET-FLIM approach has been developed that allows direct observation of kinase-substrate interactions and helps to elucidate conformational dynamics of EphA3 RTK in living cells. In principle, this assay could also be used to quantitatively address conformational dynamics of other RTKs in living cells.
description: Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) fungieren als Schlüsselmoleküle in der Signalübertragung und beeinflussen dadurch mehrere physiologische Prozesse der Zelle, wie beispielsweise Wachstum, Überleben und Migration. Kristallstrukturen wie auch biochemische Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Aktivität einiger RTKs – darunter auch die Eph-RTKs – durch die Phosphorylierung mehrerer Tyrosinreste innerhalb des activation loops (AL) der Tyrosinkinasedomäne als auch innerhalb des konservierten Juxtamembransegment (JMS) gesteuert wird. Wie der RTK- Regulationsmechanismus durch Phosphorylierung in lebenden Zellen abläuft ist bis heute jedoch noch kaum bekannt. Ebenso wenig wurde bis jetzt der Effekt von Tyrosinphosphorylierungsreaktionen auf die katalytische Aktivität und die Substratzugänglichkeit von RTKs räumlich oder zeitlich quantifiziert. In dieser Arbeit wurde am Beispiel der EphA3-RTK untersucht, welchen Einfluss die Autoinhibierung des JMS auf Aktivität und Regulation von Eph-RTKs hat. Dazu wurde ein allgemeiner Zell-Imaging Assay zur Messung der Interaktion der EphA3-Kinase mit ihrem Substrat entwickelt, welcher auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) beruht und mithilfe von Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) gemessen wurde. Um die Wahrscheinlichkeit der Bildung des Kinase-Substrat-Komplexes zu erhöhen, wurde ein hochaffines EphA3-Peptidsubtrat verwendet. Mithilfe dieses Assay war es möglich, quantitativ die Bildung des Fließgleichgewichts (steady-state) des Enzym-Substrat- Komplexes (ES) zwischen der aufgereinigten und mCitrine-markierten EphA3- Kinasedomäne und des Cy3.5-markiertem Substratpeptids zu erforschen. Auch unterschiedliche Phosphorylierungsstadien des Kinase/Phosphatase-Zyklus konnten mithilfe von FLIM-FRET beobachtet und ihr jeweiliger steady-state erforscht werden. Des Weiteren war es durch diesen ES-Assay möglich, steady-state-Interaktionen von EphA3-RTK (WT) in lebenden Zellen zu untersuchen, indem unstimulierte Cos7-Zellen sowohl transient mit EphA3-mCitrine transfiziert als auch mit dem Cy3.5-markiertem Substratpeptid mikroinjiziert wurden. Daraus erschloss sich, dass bereits eine Population des EphA3-Rezeptors existiert, welche in Abwesenheit ihres ephrinA5- Liganden eine zeitweilig aufgehobene JMS Autorepression aufweisen. Stimulation mit freiem ephrinA5 führte zu einer detektierbaren Erhöhung des ES-Komplexes, was auf einen autokatalytischen Phosphorylierungsmechanismus des JMS hindeutet, welcher die Autorepression steuert. Zur weiteren Untersuchung der JMS-Tyrosinphosphorylierung auf die Zugänglichkeit des aktiven Zentrums, wurde der ES-Assay mit einer JMS-regulationsdefizienten Mutante (MT) durchgeführt. Die dabei gemachten Beobachtungen unterstreichen die These einer Regulation von EphA3 RTK durch die Tyrosinphosphorylierung des JMS in lebenden Zellen. In dieser Arbeit wurde ein in vivo-kompatibler FLIM-FRET-Assay entwickelt, welcher die direkte Visualisierung von Kinase-Substrat-Interkationen ermöglicht und somit dazu beiträgt, das dynamische Verhalten von EphA3-RTKs in lebenden Zellen aufzuklären. Im Prinzip kann dieser Assay auch für die quantitative Analyse der Aktivitätsdynamiken anderer RTKs verwendet werden.