Synthese und Analytik von TmHU, dem Histon-ähnlichen Protein aus Thermotoga maritima, und dessen Einsatz als proteinogenes Gentransfersystem
Creators: name: Immisch, Claudia
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2006
Subjects: subject: Elektronische Publikation
subject: Hochschulschrift
subject: Online-Publikation
subject: Zsfassung in engl. Sprache
subject: 616.04

description: Das Histon-ähnliche Protein aus dem marinen hyperthermophilen Eubakterium Thermotoga maritima gehört zur Familie der HU-Proteine. Die Hauptfunktion der HU-Proteine ist die Kondensation oder Verpackung von DNA. Der Schmelzpunkt des TmHU-Homodimers liegt bei 95 °C. Auf Grund seines hohen Anteils basischer Aminosäuren ist TmHU in der Lage, mit DNA zu interagieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit TmHU für den Transfer von Nukleinsäuren, wie Plasmid-DNA oder siRNA, in humane Zellen geeignet ist. Neben der Interaktion mit RNA, ist TmHU in der Lage, in das Innere von Zellen zu gelangen, wobei es zytoplasmatisch und im Zellkern nachweisbar ist. Mittels Western-Blot kann das Protein bis zu 96 Stunden im Lysat humaner Zellen detektiert werden. Des Weiteren ist TmHU in der Lage, den Transfer von siRNA in humane Zellen zu vermitteln. Durch den Einsatz des Endozytoseinhibitors Cytochalasin D wurde der Aufnahmemechanismus der Komplexe aus TmHU und siRNA aufgeklärt. Die Präzipitate, die bei der Interaktion von siRNA und TmHU entstehen, werden endozytotisch aufgenommen. Anschließend erfolgt ein Abbau der TmHU-siRNA-Komplexe. Durch den Zusatz von Chloroquin in die Transfektion wird die Endosomolyse in den Zellen ausgelöst. Rund 30 % der Zellen exprimierten EGFP nach der Transfektion eines EGFP-Plasmids mit TmHU. Auf Grund der Zytotoxizität von Chloroquin wurde nach einer Alternative für das Aufbrechen der Endosomen gesucht. Dazu wurde die Variante E5 des fusogenen Peptids von Hämagglutinin HA-2 des Influenza-Virus kovalent an TmHU gekoppelt. Nach der Transfektion des EGFP-Plasmids mit dem Kopplungsprodukt TmHU-E5 konnte in bis zu 31 % der untersuchten Zellen eine EGFP-Expression detektiert werden. In Kombination mit Chloroquin lagen diese Transfektionsraten sogar weit über 60 %. Auf Grund der außergewöhnlichen Eigenschaften von TmHU wurde in vitro ein effizientes Gentransfersystem für DNA und RNA in humane Zellen entwickelt. Wegen seiner hohen Stabilität und seiner guten biotechnologischen Verfügbarkeit ist eine Anwendung von TmHU im Bereich der Gentherapie denkbar.
description: The histone-like protein of the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima is a member of the family of HU proteins. The main function of HU proteins is the condensation or packaging of DNA. The melting point of the TmHU homodimer was determined at 95 °C. Because of its high content of basic amino acids, TmHU is able to interact with DNA. In the context of this work, the suitability of TmHU for gene therapeutic approaches was examined. It was investigated, if TmHU is able to transfer nucleic acids, like plasmid DNA or siRNA, into human cells. In addition to the ability to interact with RNA, TmHU is able to reach the inside of cells, where it is located in the cytoplasm and the nucleus. By western blot analysis, the protein is detectable up to 96 hours in the lysate of human cells. Furthermore, it mediates the transfer of siRNA into human cells. By using the endocytosis inhibitor cytochalasin D, the uptake mechanism of the complexes of TmHU and siRNA was elucidated. The precipitate, which forms during the interaction of siRNA and TmHU, is taken up by endocytosis, followed by a degradation of the complexes of TmHU and siRNA. By addition of chloroquine into the transfection approach, endosomolysis in the investigated cells was caused. About 30 % of the cells expressed EGFP after the transfection of an EGFP plasmid with TmHU. Because of the toxicity of chloroquine, an alternative to destabilise the endosomoes was proven. Thereto, the variant E5 of the fusogenic peptide of hemagglutinin HA-2 of the influenza virus was coupled covalently to TmHU. After transfection of cells with an EGFP plasmid and the product of the coupling reaction TmHU-E5, up to 31 % of the investigated cells expressed EGFP. In combination with chloroquine the transfection rates were even far in excess of 60 %. Because of the remarkable properties of TmHU, an efficient gene transfer system for DNA and RNA into human cells was developed in vitro. Due to its thermostability and its high biotechnological availability, an application of TmHU in the field of gene therapy is conceivable.