Ανάπτυξη και σύγκριση αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό ανθελμινθικών φαρμάκων σε σκευάσματα
Creators: name: Μαργαριτέλης, Νικόλαος Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Ανθελμινθικά Φάρμακα
Πειραματικός Σχεδιασμός
Ανάλυση
Anthelmintics
Experimental Design
Analysis

description: Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό ανθελμινθικών ουσιών σε φαρμακευτικά σκευάσματα με ταυτόχρονη συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων τους. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν οι δραστικές ουσίες μεβενδαζόλη, αλβενδαζόλη, θειαβενδαζόλη, ιβερμεκτίνη, τετραμισόλη, λεβαμισόλη, διαιθυλκαρβαμαζίνη, πιπεραζίνη, παμοϊκή πυραντέλη, παμοϊκό πυρβίνιο, πραζικουαντέλη και νικλοζαμίδη με εφαρμογή α) Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (ΥΧΥΑ), β) Φασματοφωτομετρίας παραγώγων υπεριώδους-ορατού και γ) Ανάλυσης μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS). Οι χρωματογραφικοί προσδιορισμοί που αναπτύχθηκαν ήταν α) Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των ουσιών λεβαμισόλη, θειαβενδαζόλη, μεβενδαζόλη, αλβενδαζόλη, πραζικουαντέλη και νικλοζαμίδη, β) Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των ουσιών τετραμισόλη και διαιθυλκαρβαμαζίνη και γ) Ο ποσοτικός προσδιορισμός της ιβερμεκτίνης. Η ανίχνευση των ουσιών πραγματοποιήθηκε με δύο ανιχνευτές, έναν ανιχνευτή UV παράταξης φωτοδιόδων και έναν ELSD ανιχνευτή. Στον ταυτόχρονο προσδιορισμό των έξι ανθελμινθικών ουσιών εφαρμόστηκε μια μεθοδολογία διεξαγωγής πειραμάτων, γνωστή ως πειραματικός σχεδιασμός, με σκοπό τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού τους. Με τον «D-optimal» αλγόριθμο μελετήθηκε η συμμετοχή τριών διαλυτών (MeOH – H2O – ACN) στην κινητή φάση, καθώς τα δυαδικά μίγματα παρουσίαζαν φτωχό χρωματογραφικό διαχωρισμό. Αυτή η πειραματική προσέγγιση παρείχε τη δυνατότητα να μελετηθεί ταυτόχρονα και μια ακόμη χρωματογραφική παράμετρος, το pH, η επίδραση του οποίου ήταν σημαντική για την επίτευξη των βέλτιστων συνθηκών. Τελικά, ως κινητή φάση επιλέχτηκε μίγμα αποτελούμενο από ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 0,05Μ σε pH 5,5, ακετονιτρίλιο και μεθανόλη (40:39:21 v/v/v), με ρυθμό ροής 1ml min-1. Το σύστημα παρείχε καλές για ποσοτικό προσδιορισμό κορυφές για όλες τις ουσίες με τους χρόνους κατακράτησης τους να κυμαίνονται από 3,5 ως 13 λεπτά. Όσον αφορά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό τετραμισόλης και διαιθυλκαρβαμαζίνης, ικανοποιητικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με κινητή φάση αποτελούμενη από μεθανόλη και 0,05Μ ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου σε αναλογία 30:70 v/v και pH 4,2 με τους χρόνους κατακράτησης των δύο ουσιών να είναι 5,7 και 7 λεπτά αντίστοιχα. Για τον προσδιορισμό της ιβερμεκτίνης χρησιμοποιήθηκε κινητή φάση αποτελούμενη από μίγμα ακετονιτριλίου και νερού σε αναλογία 95:5 v/v, με την ουσία να εκλούεται σε χρόνο 10 λεπτών περίπου. Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για τις καμπύλες αναφοράς όλων των ουσιών έδειξε καλή συσχέτιση, με συντελεστή προσδιορισμού R2 μεγαλύτερο από 0,999 για τον UV και 0,997 για τον ELSD ανιχνευτή. Τέλος, οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και την ακρίβεια με καλά αποτελέσματα. Η μελέτη με φασματοφωτομετρία παραγώγων αρχικά περιελάμβανε τον ποσοτικό προσδιορισμό όλων των ουσιών παρουσία κατάλληλου εκδόχου που παρεμβάλλει στην απορρόφηση τους, εφαρμόζοντας τη τεχνική «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων». Η ίδια μέθοδος εφαρμόστηκε και για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό δυαδικών μιγμάτων Λεβαμισόλης – Διαιθυλκαρβαμαζίνης, και Τετραμισόλης – Θειαβενταζόλης, ενώ για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μιγμάτων αυτών παρουσία εκδόχου που συναπορροφά, εφαρμόστηκε η συνδυαστική τεχνική «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων - Διόδου από το Μηδέν». Για όλες τις μεθόδους πραγματοποιήθηκε έλεγχος για την αξιοπιστία τους, με τις ανακτήσεις των ουσιών να παρουσιάζουν ικανοποιητικές τιμές.Τέλος, αναπτύχθηκε η χημειομετρική μέθοδος «Προβολές Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων σε Λανθάνουσες Δομές». Με τη μέθοδο της «Διασταυρούμενης Αξιολόγησης» καθορίστηκε ο αριθμός των συνιστωσών που δίνει την ελάχιστη τιμή PRESS για τη βέλτιστη πρόβλεψη του μοντέλου και υπολογίστηκαν οι τιμές r2, Q2, RMSEP και RMSEE, ώστε να προσδιοριστούν οι % τιμές ανάκτησης των δραστικών ουσιών.
description: In this study, analytical methods were developed for the determination of anthelmintics in pharmaceutical formulations, followed by a comparative study of their results. Specifically, the active ingredients mebendazole, albendazole, thiabendazole, ivermectin, tetramisole, levamisole, diethylcarbamazine, piperazine, pyrantel pamoate, pyrvinium pamoate, praziquantel and niclosamide with the application of a) High Performance Liquid Chromatography, b) UV- Vis Derivative Spectrophotometric Analysis and c) Partial Least Squares Regression Analysis (PLS). The chromatographic determinations we developed were: a) Simultaneous determination of levamisole, thiabendazole, mebendazole, albendazole, praziquantel and niclosamide, b) Simultaneous determination of tetramisole and diethylcarbamazine and c) Quantitative determination of ivermectin. Their detection was performed with both UV-Diode array and ELSD detector. “Experimental design” methodology was applied to optimize the chromatographic separation and quantitative determination of the six anthelmintics. Based on “D-Optimal” algorithm, the participation of three mixed solvents in the mobile phase (methanol, water and acetonitrile) was investigated, since binary systems presented low chromatographic resolution. This approach provided the opportunity using a crossover design to study the effect of another chromatographic parameter, such as pH, which was considered important for optimal results. The chosen mobile phase consisted of an aqueous ammonium acetate buffer (pH 5.5; 0.05 M), acetonitrile, methanol (40:39:21, v/v/v) with 1mL min-1flow rate. The system was found to produce sharp and well-resolved peaks for all analytes with their retention times ranging from 3.5 to 13.0 min. An adequate separation of tetramisole and diethylcarbamazine, was achieved with a mobile phase consisting of an aqueous ammonium acetate buffer (pH 4.2; 0.05 M) and methanol (30:70, v/v). The retention times were 5.7 and 7 minutes respectively. The determination of ivermectin was performed with a mobile phase consisting of acetronitrile and water (95:5, v/v). The substance was eluted in about 10 minutes. Linear regression analysis for the calibration curves showed a good relationship with regression coefficients higher than 0.999 for UV and 0.997 for ELSD detector respectively. The proposed methods were validated and were proven accurate, precise and reproducible. The UV study using derivatization techniques initially included the quantitative determination of all substances in the presence of convenient excipient that interferes with their spectrum, applying the “Derivative Ratio” technique. The same method was applied for the simultaneous determination of binary mixtures of Levamisole – Diethylcarbamazine and Tetramisole – Thiabendazole, whereas the quantitative determination of their mixtures in the presence of an excipient with an over-lapping absorption band was performed with the combinative technique “Derivative Ratio - Zero Crossing”. Finally, we developed the chemometric method “Partial Least Squares to Latent Structures”. By using the “Cross Validation” method, the number of the components providing the minimum PRESS and the values of r2, Q2, RMSEP and RMSEE were calculated, in order to determine the % recovery values.