title: Structural investigations of the Id helix-loop-helix dimerization domain
Creators: name: Kiewitz, Sebastian Donatus
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Zirkulardichroismus , Fluoreszenzspektroskopie , Peptidsynthese , Helix-loop-Helix , Magnetische Kernresonanz , NMR-Spektroskopie , Id Proteine , Festphasenpeptidsynthese , Peptidanaloga , circular dichroism , fluorescence spectroscopy , solid-phase peptide synthesis , Id proteins
subject: 540 Chemie

description: The Id proteins take part in many fundamental physiological processes during development and tumor-related events. A characteristic of these rather small proteins (119 up to 161 amino acids long) is a highly conserved dimerization domain, the helix-loop-helix (HLH) motif, which allows them to homo- or heterodimerize and makes them a subfamily of the large HLH protein family. Their preferred binding partners are transcription factors from the same family, whose homo- or heterodimers are able to bind to DNA by basic residues adjacent to the N-terminal end of the HLH fold. As the Id proteins lack such a basic region, dimers formed under their participation lose their ability to bind to DNA and, thus, transcriptional activation is blocked. By using this mechanism of inhibition of DNA binding, the Id family members regulate cellular processes like proliferation and differentiation. Structural information on the Id proteins is scarce and was so far deduced by sequence alignment and homology studies based on known HLH structures, disregarding their unique position within the HLH protein family. A first approach was based on the design of Id1 HLH analogs displaying modified loop regions and/or the retro sequence of the first helix. As shown by CD experiments, the synthesized peptides possessed a broad diversity in terms of secondary structure elements composition, proving the importance not only of the interhelical side-chain packing, but also of the helix dipole arrangement for the HLH fold stabilization. Further, by using tyrosine/phenylalanine replacement Id1 HLH analogs were obtained which showed a superior helicity compared to the native sequence, thus underlining the fact that these positions are involved in the formation and stabilization of the hydrophobic core of the protein fold. Moreover, also the presence of cation-pi interactions can explain the positive effect of the substitutions, as phenylalanine stabilizes such contacts better than tyrosine. In another approach, covalently linked Id1 HLH homodimers were formed by cysteine oxidation. The oxidation proceeded fast and almost to completion, as monitored by mass spectrometry and analytical HPLC, indicating that a parallel orientation of the first and second helices, respectively, should be favored in the HLH dimer. This was confirmed by a thiol exchange assay, which did not produce the heterodimer, in which the helix-1 and the helix-2 of the corresponding monomer would adopt an anti-parallel conformation. To further characterize the structural properties of the Id HLH fold, the HLH domain of the Id2 protein was investigated by NMR spectroscopy. Due to its pronounced aggregation tendency, the fluorinated alcohol TFE had to be added to improve the peptide solubility to a level, at which reasonable NMR spectra could be recorded. Indeed, the quality of the obtained NMR spectra proved to be sufficient to achieve the sequential assignment of the peptide. The chemical shift index (CSI) and the NOE patterns suggest the presence of a poorly defined N-terminal helix and of a stable C-terminal alpha-helix, connected by a short flexible region. These results are in accordance with NMR spectroscopic investigations on the related HLH domains of E47 and Max. Finally, the ability of a ditopic receptor to bind to the Id HLH motifs was investigated by fluorescence spectroscopy. The receptor consists of a fluorescent crown ether unit linked to a CuII-IDA complex by an alkyl chain. Only upon simultaneous binding to both moieties a fluorescence response is triggered. The receptor was shown to bind to peptides representing the four Id HLH domains with K0.5 values ranging from 1.5 µM to 2.5 µM. Further binding experiments on shorter Id peptide fragments allowed the identification of the tetrapeptide CxxR/K as strong binding motif located in the first helix of the Id HLH domains. The receptor showed also moderate selectivity towards the Id HLH motifs compared to the ones of the related HLH proteins MyoD and Max, which showed K0.5 values of 6.0 µM and 5.2 µM, respectively. A similar receptor, containing a CuII-NTA in place of the CuII-IDA unit and a modified linker between the crown ether and the metal complex, did not succeed to bind the CxxR motif. In conclusion, the presented work has provided additional information on the structural properties of the Id proteins. The oxidized Id1 HLH dimer is likely to prefer a parallel helix arrangement. Previous reports on the increased flexibility of helix-1 compared to helix-2 could be supported by the NMR data obtained for the Id2 HLH domain. By using a fluorescent artificial receptor, a unique tetrapeptide motif within the helix-1 could be identified, which might represent a starting point for the development of Id specific markers and small molecules able to interfere with the Id cellular pathways.
description: Die Id Proteine sind an wichtigen physiologischen Prozessen, sowohl der normalen Entwicklung als auch der Tumorentstehung und -ausbreitung beteiligt. Ein Merkmal dieser eher kleinen Proteine (119 bis 161 Aminosäuren lang) ist ihre hoch konservierte Dimerisierungsdomäne, das Helix-Loop-Helix (HLH) Motiv, welches die Id Proteine zu der Familie der HLH Proteine zählen lässt und es ihnen ermöglicht Homo- oder Heterodimere zu formen. Die bevorzugten Bindungspartner sind dabei Transkriptionsfaktoren derselben Familie, deren Homo- oder Heterodimere durch basische Aminosäuren die N-terminal am HLH Motiv anschließen, an die DNS binden können. Da den Id Proteinen eine solche basische Region fehlt, können die von ihnen gebildeten Dimere nicht mehr an die DNS binden und die Aktivierung der Transkription wird unterbunden. Mit Hilfe dieses Mechanismus nehmen die Id Proteine an der Regulierung zellulärer Prozesse wie Proliferation und Differenzierung teil. Über die Struktur der Id Proteine ist bis dato wenig bekannt, und die wenigen vorhandenen Informationen basieren auf Sequenzvergleich und Homologiestudien mit bekannten HLH Strukturen, die jedoch der herausstechenden Position der Id Proteine innerhalb der HLH Proteinfamilie keine Rechnung tragen. Ziel der vorgelegten Arbeit war es die Kenntnisse zugrunde liegender Strukturprinzipien der Id HLH Domäne zu erweitern. In einer ersten Versuchsreihe wurden dazu sowohl die natürliche Sequenz des Id1 HLH Motiv als auch HLH Peptidanaloga hergestellt, die neben einer modifizierten Loop-Region entweder die native oder die Retrosequenz der ersten Helix enthielten. Die CD Messungen der synthetisierten Peptide zeigten unterschiedliche Anteile an Sekundärstrukturelementen, die den Einfluss nicht nur einer interhelikalen Stabilisierung, sondern auch der Anordnung der Helixdipole zueinander unterstreichen. In weiteren Peptiden wurden zwei innerhalb der HLH Domäne befindliche Tyrosin-Reste durch Phenylalanin ersetzt. Diese Substitutionen führten zu einer Vergrößerung des helikalen Strukturanteils gegenüber der nativen Sequenz, was sich mit einem Beitrag dieser Position zur Stabilisierung des hydrophoben Kerns des gefalteten Peptids erklären lässt. Weiterhin könnten auch Kation-Pi-Wechselwirkungen den positiven Effekt dieser Substitutionen erklären, da Phenylalanin solche Kontakte besser als Tyrosin zu stabilisieren vermag. Ein weiterer Ansatz basierte auf der Herstellung disulfidverbrückter Id1 HLH Homodimere. Die Leichtigkeit der Oxidation ließ dabei die Präferenz für eine parallele Orientierung der beiden Helices im HLH Motiv vermuten. Dies wurde durch ein weiteres Experiment bestätigt, in dem keine Bildung eines Dimers mit einer antiparallelen Anordnung der Helices beobachtet werden konnte. Zur näheren strukturellen Charakterisierung der Id Dimerisierungsdomäne wurde das HLH Motiv von Id2 NMR spektroskopisch untersucht. Aufgrund seiner ausgeprägten Neigung zur Aggregation, musste dem Peptid der fluorinierte Alkohol TFE zugesetzt werden, um die Löslichkeit bei einer für die NMR Messungen ausreichenden Konzentration zu gewährleisten. Die Qualität der durchgeführten NMR Experimente erwies sich als ausreichend, um die sequentielle Zuordnung des Peptids erfolgreich durchführen zu können. Im Einklang mit NMR spektroskopischen Untersuchungen an den verwandten HLH Motiven von E47 und Max lassen die berechneten Chemical Shift Index (CSI) Werte und die beobachtete NOE Verteilung auf eine schlecht definierte N-terminalen neben einer stabilen C-terminalen alpha-Helix schließen. Ebenso wurde die Fähigkeit eines ditopischen Rezeptors zur Bindung an die Id HLH Motive fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Der Rezeptor bestand aus einem durch eine Alkylkette mit einem Kupfer-IDA Komplex verbundenen fluoreszierenden Kronenether. Nur die gleichzeitige Bindung beider Teile resultiert dabei in einem Fluoreszenzsignal. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor mit K0.5-Werten zwischen 1,5 µM und 2,5 µM an die vier HLH Motive binden kann. Durch weitere Bindungsexperimente an verkürzten Id Peptidfragmenten ließ sich die CxxR/K Sequenz in der unstrukturierteren ersten Helix der HLH Domäne als verantwortlich für die Bindung identifizieren. Darüber hinaus wurde mit den K0.5-Werten von 5,2 µM und 6,0 µM für die HLH Motive der verwandten Proteine MyoD und Max eine moderate Selektivität des Rezeptors gegenüber den Id HLH Motiven bewiesen. Ein ähnlicher Rezeptor, der an Stelle der Kupfer-IDA Einheit einen Kupfer-NTA Komplex sowie einen veränderten Linker aufwies, erwies sich als nicht in der Lage an die getesteten Peptide zu binden. Zusammenfassend wurden durch die vorgelegte Arbeit neue Kenntnisse über die strukturellen Eigenschaften des Id Dimerisierungsmotivs gewonnen, die Anhaltspunkte für die Entwicklung von Inhibitoren der Id Proteine bieten könnten.