Ανάπτυξη CRISPR/Cas9 εργαλείου για την αδρανοποίηση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών σε Τ-λεμφοκύτταρα και την ευρύτερη εφαρμογή της ανοσοθεραπείας με αντιγονο-ειδικά Τ-λεμφοκύτταρα
Creators: name: Πανταζή, Χρυσούλα Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Υιοθετούμενη Ανοσοθεραπεία
Κορτικοστεροειδή
Λοιμώξεις
Adoptive immunotherapy
Corticosteroids
Infections

description: Οι ιογενείς και μυκητιασικές λοιμώξεις συγκαταλέγονται στις θανατηφόρες επιπλοκές μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιματοποιητικών κυττάρων (άλλο-ΜΑΚ), ενώ η συμβατική φαρμακοθεραπεία συχνά αποτυγχάνει ή σχετίζεται με τοξικότητα. Mία υποσχόμενη εναλλακτική προσέγγιση αποτελεί η υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία (YA) με παθογονο-ειδικά Τ-λεμφοκύτταρα (pathogen Specific T-cells, pSTs) μέσω της οποίας γίνεται με παθητική μεταφορά μία «έτοιμη» ανοσία στον ανοσοκατεσταλμένο ασθενή. Ωστόσο, τα Τ-λεμφοκύτταρα υπολειτουργούν παρουσία στεροειδών, τα οποία αποτελούν θεραπεία πρώτης γραμμής των ανοσολογικών επιπλοκών της μεταμόσχευσης. Δημιουργείται, λοιπόν, το προφανές παράδοξο: οι πιο ευάλωτοι σε λοιμώξεις ασθενείς, δηλαδή οι ισχυρά ανοσοκατεσταλμένοι υπό υψηλές δόσεις στεροειδών, να στερούνται τα πιθανά οφέλη της ΥΑ με pSTs. Στόχοι της παρούσας εργασίας είναι i) η αξιολόγηση της επίδρασης της δεξαμεθαζόνης (Dex), σε πρωτογενή, ενεργοποιημένα, Τ-λεμφοκύτταρα ανθρώπου και ii) η ανάπτυξη ενός συστήματος CRISPR/Cas9 για τη γενετική αδρανοποίηση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (Glucocorticoid Receptor, GR) σε Τ-λεμφοκύτταρα, με απώτερο στόχο την ανάπτυξη pSTs ανθεκτικών στα στεροειδή. Αρχικά, αξιολογήθηκε ο πολλαπλασιασμός, η απόπτωση και ο ανοσοφαινότυπος των Τ-λεμφοκυττάρων του ανθρώπου μετά από CD3/CD80-διέγερση και καλλιέργεια παρουσία και απουσία Dex. Η τριήμερη έκθεση σε Dex ανέστειλε την έκπτυξη και προκάλεσε την απόπτωση των CD3/CD80-διεγερμένων Τ-κυττάρων και ανοσοφαινοτυπικά επέφερε αύξηση των επιπέδων των Τ-ρυθμιστικών κυττάρων και των κύριων δεικτών εξουθένωσης των Τ-κυττάρων PD-1 και CTLA-4, έναντι της συνθήκης απουσίας Dex. Για την αδρανοποίηση του γονιδίου του GR σχεδιάστηκαν 10 RNA-οδηγοί (gRNAs), που στοχεύουν διαφορετικές περιοχές του γονιδίου (μια θέση έναρξης της μεταγραφής και τα εξώνια 2, 3, 4 και 5) και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδια που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη Cas9. Έπειτα, παρήχθησαν λεντι-ιικοί φορείς που έφεραν αρχικά 2 συνδυασμούς με 7 και 3 gRNAs αντίστοιχα, και κατόπιν κάθε gRNA ξεχωριστά, οι οποίοι και χρησιμοποιήθηκαν για τη διαμόλυνση της κυτταρικής σειράς λεμφοκυττάρων Τ2. Μετά από επιλογή παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, τα διαμολυσμένα Τ2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία Dex και αξιολογήθηκε η έκπτυξή τους και η «εντός-στόχου» διάσπαση του GR σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο. Ως αρνητική ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν Τ2 κύτταρα διαμολυσμένα με λεντι-ιικό φορέα που εξέφραζε την Cas9, αλλά όχι κάποιο gRNA (κενός φορέας). Η Dex ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των διαμολυσμένων με τον κενό-φορέα Τ2 κυττάρων, δεν επηρέασε ωστόσο την έκπτυξη των διαμολυσμένων με τους 2 συνδυασμούς gRNAs Τ2 κυττάρων, υποδηλώνοντας ότι και οι δύο συνδυασμοί περιείχαν λειτουργικά gRNAs που αδρανοποίησαν τον GR. Για να προσδιοριστεί εάν η ανθεκτικότητα στα στεροειδή προήλθε από ένα gRNA ή ήταν απόρροια προσθετικής/συνεργικής δράσης των συνδυασμών gRNAs, Τ2 κύτταρα διαμολύνθηκαν με λεντι-ιικούς φορείς που εξέφραζαν ξεχωριστά κάθε gRNA. Τ2 κύτταρα διαμολυσμένα με 7/10 υπό μελέτη gRNAs παρουσίασαν παρόμοια έκπτυξη παρουσία και απουσία Dex, υποδηλώνοντας ανθεκτικότητα στη Dex. Η αδρανοποίηση του GR επιβεβαιώθηκε με αποτύπωμα Western και τη δοκιμασία Τ7. Συνολικά, επιβεβαιώθηκε η ανασταλτική επίδραση της Dex σε πρωτογενή Τ-λεμφοκύτταρα και προτείνεται μια σειρά gRNAs ικανών να προκαλέσουν γενετική αδρανοποίηση του GR και να προσδώσουν ανθεκτικότητα στα στεροειδή. Με αυτήν την προσέγγιση, επιδιώκεται η δημιουργία pSTS με ανθεκτικότητα στα στεροειδή, έτσι ώστε και οι πιο ευάλωτοι σε λοιμώξεις ασθενείς όπως εκείνοι που λαμβάνουν υψηλές δόσεις στεροειδών μετά από άλλο-ΜΑΚ, να μπορούν να ωφεληθούν από την ΥΑ.
description: Viral and fungal infections are among the most fatal complications in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). While pharmacotherapy often fails or is associated with toxicity, adoptive immunotherapy (AI) with pathogen-specific T-cells (pSTs) represents an attractive alternative. However, T cells perform suboptimally under immunosuppression, mainly steroids like Dexamethasone, which represent the first-line treatment of transplant-associated immunological complications. The latter generates the obvious paradox of depriving the most susceptible to infections patients of the potential benefits of AI. In this study we aimed to i) evaluate the impact of Dexamethasone (Dex) on primary, activated, human T cells and ii) develop a CRISPR/Cas9 system to genetically disrupt the glucocorticoid receptor (GR) in lymphocytes, ultimately aiming to generate steroid-resistant pSTs. Initially, proliferation, apoptosis and immunophenotype of human T cells were evaluated upon stimulation with CD3/CD80 and culture in the presence or absence of Dex. A 3-day exposure to Dex impaired the proliferation of CD3/CD80-pulsed primary T cells and induced early apoptosis over the “no Dex” condition (p=0.001 and p=0.0067, respectively). Immunophenotypically, Dex also increased T-regulatory cells (CD4+/CD25high, p=0.0002) and upregulated the major T-cell exhaustion markers PD-1 and CTLA-4, over the “no Dex” condition (p&lt;0.05). To inactivate the GR gene, we designed 10 guide RNAs (gRNAs) to target different genomic sequences corresponding to various domains of the GR (a transcription start site, and exons 2, 3, 4 and 5) and cloned them in plasmids with the Cas9 genes. Subsequently we generated lenti-viral vectors encoding at the beginning 2 different pooled libraries of gRNAs and later each gRNA separately and used them to transduce T2 lymphocytic cell line. After selection in culture supplemented with the appropriate antibiotic, transduced T2 cells were incubated in the presence or absence of Dex and their proliferation and GR disruption were evaluated by trypan blue exclusion assay and western blot and T7 assay, respectively. Cells transduced with a viral vector expressing Cas9 but no gRNA (empty vector) were used as negative control. T2 cells edited with either gRNA pool, presented normal proliferation ±Dex as contrasted to the empty-transduced cells, suggesting that both pools contained gRNAs which functionally disrupted GR. To clarify whether Dex-resistance was a single-gRNA effect or an additive/synergistic action of the pooled gRNAs, T2 cells were transduced by viral vectors expressing each single gRNA. In the presence of Dex, T2 cells edited by 7/10 tested gRNAs presented similar proliferation rates in the presence or absence of Dex, suggesting functional resistance to Dex. The GR disruption was confirmed by western blotting and T7 assay. Among these functional gRNAs, an optimal gRNA will be selected based on higher GR disruption efficiency and lower off-target effects for further studies. Overall, we confirm the inhibitory effect of Dex on primary T cells and provide a series of gRNAs to CRISPR/Cas9-disrupt the GR and confer resistance of T-cells to steroids. By this approach, we endeavor to ultimately offer the benefits of AI to the patients most vulnerable to infections, as those who receive high-dose steroids post allo-HSCT, by generating steroid-resistant, pSTs.