title: Examining Uptake of Nanomaterials by Eukaryotic Cells with Digital Image Cytometry
title: Digital Image Cytometry zur Untersuchung der Aufnahme von Nanomaterialien durch eukaryotische Zellen
Creators: name: Hartmann, Raimo
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Endocytose
Nanomaterials
Nanopartikel
Mikropartikel
Nanoparticle
Steifigkeit
Physics
Stiffness
Microcapsules
Cytometrie
Endocytosis

description: Due to their small size and related
      interesting properties, artificial nanoma-terials are
      utilized for a great number of biological and medical
      applications. Cell entry routes, intracellular trafficking
      and processing of nanoparticles, which determine their fate,
      efficiency, and toxicity, are depending on various parameters
      of the specific nanomaterial, such as size, surface charge,
      surface chemistry and elasticity. Nanoparticle-cell
      interactions are typically elucidated by means of
      fluorescence microscopy. Cell functions can be observed by a
      multiplicity of commercially available probes. For the
      quantification of cell features from images (image
      cytometry), computer-based algorithms are favoured to avoid
      bias introduced by the subjective perception of the observer.
      By applying high throughput microscopy in combination with
      digital image cytometry the screening of high numbers of
      cells is made possible. With the large quantity of obtained
      data, cell populations can be identified and, in general,
      results that are statistically meaningful are obtained. In
      the first part of this work this method is applied in order
      to examine the cellular responses upon exposure to plasmonic
      poly(methacrylic acid)-coated gold nanoparticles (Au NPs)
      with respect to morphology and viability of human endothelial
      and epithelial cells (HUVECs and HeLa cells). Au NPs of 4-5
      nm size were chosen which had been thoroughly characterized
      in terms of their physico-chemical parameters. These
      particles bear interesting properties for biomedical
      applications and, for several years, have been in the focus
      of research. In this work significant impacts on
      mitochondrial and lysosomal morphology upon exposure to the
      Au NPs are reported. The alteration of the structure of the
      cytoskeleton and a dramatically reduced proliferation are
      described. Interestingly, the smallest dose inducing the
      described cellular responses was of one or two magnitudes
      lower than those, where acute cytotoxicity and an increase in
      the production of reactive oxygen species (ROS) were
      observed. In the second part the process of endocytosis of
      polymer capsules is examined. These systems are seen as a
      promising tool for intracellular cargo delivery and release.
      After lipid raft-mediated phagocytosis, the capsules are
      transferred from the neutral extracellular medium to
      increasingly acidic intracellular vesicles. By embedding a
      pH-sensitive fluorescent dye into the cavity of the capsule
      the uptake process and the associated acidification can be
      monitored time-dependently. It is demonstrated that the
      kinetic of the acidification process strongly depends on the
      stiffness of the capsules. Soft particles with minor
      stiffness are transported faster into lysosomal structures
      than stiffer ones. Additionally, these sensor particles are
      used to confirm the importance of the V1G1-subunit of the
      vacuolar ATPase being responsible for vesicle
      acidification.
description: Künstliche Nanomaterialien eignen
      sich aufgrund ihrer winzigen Größe und der damit verbundenen
      interessanten Eigenschaften für zahlreiche biologische und
      medizinische Anwendungen. Die Wechselwirkungen auf zellulärer
      Ebene hängen von einer Vielzahl unterschiedlicher Faktoren
      ab. Um die Wirksamkeit und Toxizität von Nanopartikeln
      einschätzen zu können, ist es notwendig, ihre zelluläre
      Aufnahme, ihren intrazellulären Transport und letztendlichen
      intrazel-lulären Verbleib sowie die durch sie ausgelöste
      Zellantwort zu verstehen. Die genannten Faktoren werden
      ihrerseits von den physikalisch-chemischen Parame-tern des
      eingesetzten Nanomaterials wie z.B. Größe, Oberflächenchemie,
      Ober-flächenladung und Elastizität beeinflusst. Durch
      Fluoreszenzmikroskopie lassen sich mit einer Vielzahl
      kommerziell er-hältlicher, fluoreszierender
      Reporterfarbstoffe viele zelluläre Funktionen abbilden und
      auswerten. Zur bildbasierten Quantifizierung von
      Zellmerkmalen (engl. Image Cytometry) eignen sich
      Computer-basierte Algorithmen sehr gut, da Ver-fälschungen
      durch die subjektive Wahrnehmung und Beobachtungsperspektive
      des Experimentators vermieden werden können. Diese im
      folgenden als Digital Image Cytometry bezeichnete Methode
      profitiert von automatisierter Mikroskopie, da eine große
      Anzahl von Zellen abgebildet werden muss, um in der Lage zu
      sein, einzelne Populationen zu identifizieren und statistisch
      aussagekräftige Resultate zu erzielen. Diese Methode wurde in
      der vorliegenden Arbeit zur Untersuchung der Auswirkung von
      plasmonischen Gold-Nanopartikeln (Au NP) auf die Morpholo-gie
      und die Lebensfähigkeit von menschlichen Endothel- und
      Epithelzellen (HUVEC- und HeLa-Zellen) angewandt. Die
      verwendeten 4 5 nm großen Au NP sind mit Polymethacrylsäure
      umhüllt und ihre physikalisch-chemischen Eigen-schaften sind
      nahezu vollständig beschrieben. Mehr oder weniger identische
      Gold-Nanopartikel sind bereits in mehreren zuvor
      durchgeführten und entsprechend dokumentierten Studien
      eingesetzt worden und bieten interessante
      An-wendungsmöglichkeiten im biomedizinischen Bereich. Die
      verwendeten Gold-Nanopartikel werden nach der Aufnahme in
      intrazellulären lysosomalen Struk-turen angereichert. Als
      Ergebnis des ersten Teils der Arbeit lässt sich eine
      signi-fikante Auswirkung der eingesetzten Nanopartikel auf
      die Morphologie von Mi-tochondrien und Lysosomen sowie auf
      die Struktur des Aktinzytoskeletts und insbesondere auf die
      Teilungsfähigkeit der Zellen (Proliferationsfähigkeit)
      be-obachten. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die dafür
      ausreichende Dosis um ein bis zwei Größenordnungen geringer
      ist als diejenige, bei der akute Zyto-toxizität und erhöhte
      Werte von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) gemessen werden.
      Der zweite Teil dieser Arbeit beruht auf Untersuchungen des
      Endozytose-Vorgangs von Polymer-Mikrokapseln. Diese stellen
      ein interessantes Trägersystem dar, um Wirkstoffe in das
      Zellinnere zu transportieren und dort freizusetzen. Nach der
      Aufnahme durch Lipid Raft-vermittelte Phagozytose durchlaufen
      die Kapseln eine intrazelluläre Kaskade von immer azidischer
      werdenden Vesikeln. Durch das Einbringen eines pH-sensitiven
      Fluoreszenzfarbstoffs in die Kapseln kann ihr Aufnahmevorgang
      mittels der damit assoziierten Ansäuerung zeitaufgelöst
      abgebildet werden. Die Kinetik des Ansäuerungs-prozesses
      hängt dabei maßgeblich von der Elastizität der Kapseln ab.
      Weiche Partikel mit hoher Elastizität werden schneller in
      Lysosomen transportiert als weniger elastische. Außerdem wird
      mit diesem Sensorpartikelsystem die Relevanz der
      V1G1-Untereinheit der an der Ansäuerung lysosomaler Vesikel
      beteiligten vakuolären ATPase verifiziert.