Κλωνοποίηση, παραγωγή του αναπτυξιακού παράγοντα SCF (Stem Cell Factor) και αξιολόγηση της βιολογικής δράσης του:
Creators: name: Γαβριηλίδης Γιώργος Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Ανθρώπινος βλαστοκυτταρικός παράγοντας
Φαρμακευτική βιοτεχνολογία
Διαλυτοποίηση βακτηριακών εγκλείστων
Stem cell factor
Pharmaceutical Biotechnology
Solubilization of inclusion bodies

description: O ανθρώπινος βλαστοκυτταρικός παράγοντας SCF (Stem Cell Factor) είναι προφλεγμονώδη κυτοκίνη καθώς και αναπτυξιακός παράγοντας που συμμετέχει σε πολλά βιολογικά συστήματα, συμπεριλαμβανομένου και του αιμοποιητικού συστήματος. Ο SCF απαντάται τόσο σε διαμεμβρανική (mSCF) όσο και σε διαλυτή (sSCF) μορφή. Ο SCF σχηματίζει διμερή και συναρμόζεται με το διαμεμβρανικό υποδοχέα του, που ονομάζεται ΚΙΤ (c-Kit) και έχει ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. O ανθρώπινος ανασυνδυασμένος sSCF χρησιμοποιείται τόσο στην έρευνα όσο και στη θεραπευτική. Στη παρούσα διπλωματική εργασία, με τη βοήθεια κατάλληλων πλασμιδιακών φορέων, κλωνοποιήθηκε η CDS αλληλουχία του ανθρώπινου SCF και ακολούθησε η παραγωγή του ανθρώπινου ανασυνδυασμένου sSCF από βακτηριακό σύστημα (E.Coli). Η CDS περιοχή του ανθρώπινου αναπτυξιακού παράγοντα SCF (Stem Cell Factor) απομονώθηκε από, πλακουντιακής προέλευσης, ολικό ώριμο mRNA και κλωνοποίηθηκε στον πλασμιδιακό φορέα pCR2.1. Η CDS περιοχή του ανθρώπινου sSCF απομονώθηκε από το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pCR2.1-SCF και επανακλωνοποίηθηκε στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pET-16b. Ανακτήθηκαν δύο ανασυνδυασμένα πλασμίδια: ένα πλασμίδιο που περιελάμβανε την CDS περιοχή του sSCF με μια σημειακή μετάλλαξη που οδηγεί σε αλλαγή του 5ου αμινοξέος (στη θέση της γλουταμίνης να φέρει ιστιδίνη) και ένα πλασμίδιο που περιελάμβανε 100% ακέραια την CDS περιοχή του sSCF. Βακτήρια E.Coli C43 (DE3) μετασχηματίστηκαν με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο, το οποίο δεν έφερε μετάλλαξη και παρήγαγαν τον ανασυνδυασμένο sSCF (sSCFrec). Η πρωτεΐνη ενδιαφέροντος διαλυτοποιήθηκε από τα βακτηριακά έγκλειστα και επαναδιπλώθηκε σε διάλυμα L-Αργινίνης 1Μ. Η βιοπληροφορική πρόβλεψη της πιθανής συμπλοκοποίησης του sSCFrec με τον ΚΙΤ ήταν «θετική». Ακολούθως αξιολογήθηκε η βιολογική δράση της παραγόμενης ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ενδιαφέροντος. Ο sSCFrec εμφάνισε βιολογική δραστικότητα σε c-Kit+ K562 ερυθρολευχαιμικά κύτταρα προκαλώντας αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης, μείωση του κυτταρικού θανάτου και αύξηση του ρυθμού βιοσύνθεσης του DNA.
description: Αγγλική Περίληψη Human Stem Cell Factor (SCF) is a proinflammatory cytokine and a growth factor for various biological systems, including the hematopoietic system. SCF can be found either in a transmembrane (mSCF) or in a soluble form (sSCF). SCF forms dimmers and activates its transmembrane RTK (Receptor Tyrosine Kinase) receptor, KIT (c-Kit). Recombinant human soluble SCF is important not only as a research tool but also as a biotherapeutic. In the present thesis, the CDS region of human SCF was cloned and human recombinant sSCF was expressed from bacteria cells (E.Coli), through the use of fusion plasmid vectors. The CDS region of the human SCF was isolated from total mRNA of placental origin and was cloned into the fusion plasmid vector pCR2.1. The CDS region of the human sSCF was isolated from the recombinant plasmid pCR2.1-SCF and was cloned in the fusion plasmid expression vector pET-16b. Two different recombinant plasmids were obtained: a recombinant plasmid that had the sSCF CDS region with a point mutation which leads to the substitution of the 5th amino acid (instead of glutamine, histidine) and a recombinant plasmid that had the sSCF CDS region with no mutations. C43 (DE3) E.Coli, transformed with the recombinant plasmid that had no mutations (pET-16b-sSCF), expressed the recombinant human sSCF (sSCFrec). sSCFrec was solubilized from the inclusion bodies using L-Arginine 1Μ. It is believed that L-Arginine also properly refolded the protein of interest. The bioinformatic prediction of the possible ligation between sSCFrec and KIT was positive. sSCFrec was added in c-Kit+ K562 cell suspension culture and found to be biologically active, by augmenting cell growth, diminishing cell death and increasing the rate of DNA synthesis.