title: Mechanistic analysis of sperm-egg interaction in vertebrates
Creators: name: Blaha, Andreas Leo Constantin
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Bei der Befruchtung binden Spermium und Ei aneinander und verschmelzen schließlich. Trotz ihrer grundlegenden Bedeutung sind wichtige Fragen zur Befruchtung bei Wirbeltieren noch unbeantwortet: Welche Proteine werden benötigt und wie steuern sie zusammen die Interaktion zwischen Ei und Spermium? In dieser Dissertation präsentiere ich meine Arbeit zur Identifizierung und Analyse von Befruchtungsfaktoren in den Spermien von Zebrafischen und Mäusen. In Deneke*, Blaha* et al. (2024) entdeckten wir durch einen AlphaFold2-Multimer-Screen einen Trimer auf dem Spermium aus den bekannten Befruchtungsfaktoren Izumo1, Spaca6 und dem bisher nicht charakterisierten Tmem81. Wir zeigten, dass Tmem81 für die männliche Fruchtbarkeit bei Zebrafischen und Mäusen essenziell ist und dass sowohl menschliches IZUMO1, SPACA6 und TMEM81 als auch deren Orthologe vom Zebrafisch biochemisch interagieren. Wir legten dar, dass die Izumo1-Spaca6-Interaktion beim Fisch die Bindungsstelle für das Eiprotein Bouncer bildet. Das steht im Gegensatz zu IZUMO1 bei Säugern, das bekannt war, das nicht verwandte JUNO auf dem Ei zu binden. Damit haben wir einen konservierten Proteinkomplex auf dem Spermium entdeckt, der die Brücke zwischen Wirbeltierkeimzellen schlägt, indem er verschiedene Liganden auf dem Ei bindet. In Noda, Blaha et al. (2023) charakterisierten wir die Spermienproteine DCST1 und 2 in Zebrafischen und Mäusen. Wir zeigten, dass Zebrafisch- und Mausmännchen mit Dcst1- oder Dcst2-Knock-out stark subfertil bzw. steril sind, und legten nahe, dass DCST1/2 direkt interagieren. Bei Zebrafischen ist DCST2 für die Bindung zwischen Spermien und Eiern notwendig, während DCST2 bei der Maus für die Verschmelzung erforderlich ist. Da für die DCST1/2-Homologe in C. elegans und D. melanogaster ebenfalls gezeigt wurde, dass sie für die männliche Fruchtbarkeit notwendig sind, beschreiben wir damit die ersten Befruchtungsfaktoren, die bei Wirbeltieren und Wirbellosen konserviert sind. In Fujihara*, Herberg*, Blaha et al. (2021) untersuchten wir die Rolle von SPACA4 auf Säugetierspermien. Das Ortholog von SPACA4 in Fischen, Bouncer, wurde zuvor als notwendig für die Gametenbindung auf der Eizelle nachgewiesen. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass SPACA4 bei Mäusen für die volle männliche Fruchtbarkeit notwendig ist, indem es den Spermien die Durchquerung der Zona pellucida ermöglicht. Schließlich untersuchte ich die Izumo1-Spaca6-Bouncer-Interaktion im Zusammenhang mit artenübergreifender Befruchtung. Zuvor wurde beschrieben, dass der Austausch von Zebrafisch-Bouncer durch sein Medakaortholog genügt, um ein Zebrafischei mit Medakaspermien zu befruchten. Ich vermutete, dass der Austausch der Spaca6-Izumo1-Orthologe, den Spermien die gleiche Fähigkeit verleiht. Im Kontext der Zebrafisch-befruchtung, fand ich keine Anzeichen dafür, dass Transgene mit spaca6 und izumo1 von Medaka ausreichen, um mit Medaka-Bouncer zu interagieren, selbst wenn sie zusammen exprimiert wurden. Stattdessen stellte ich unerwarteterweise fest, dass Medaka-Spaca6 endogenes Zebrafisch-Spaca6 vollständig ersetzen kann. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Artenbarriere von Seiten des Spermiums komplexer ist. Insgesamt hat meine Arbeit dazu beigetragen, vier der sechs bekannten essenziellen Befruchtungsfaktoren im Zebrafisch zu charakterisieren, einen konservierten Spermienkomplexes in Wirbeltierspermien zu entdecken und diesen Komplex als den Bouncer-Rezeptor zu identifizieren. Mit diesen Erkenntnissen beginnen wir, das Puzzle der genetisch essenziellen, aber mechanistisch wenig verstandenen Befruchtungs-faktoren zusammenzusetzen. Daher ist diese Dissertation ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der molekularen Mechanismen, die bei Wirbeltieren die Verschmelzung von Spermium und Ei steuern.
description: During fertilization, sperm and egg bind to each other and eventually fuse. Despite its fundamental importance, key questions about vertebrate fertilization remain unanswered: What are the required proteins and how do they work together to promote sperm-egg interaction? In this dissertation, I present my work identifying and analyzing fertilization factors on the sperm of zebrafish and mice. In Deneke*, Blaha* et al. (2024), we performed an AlphaFold2-Multimer screen that predicted a trimer of the sperm fertilization factors Izumo1, Spaca6, and the previously uncharacterized Tmem81. We showed that Tmem81 is essential for male fertility in zebrafish and mice and that both human IZUMO1, SPACA6 and TMEM81 and the zebrafish orthologs interact biochemically. The interaction of fish Izumo1-Spaca6 forms the binding site for Bouncer on the egg, in contrast to mammalian IZUMO1, which had been shown to bind the unrelated egg protein JUNO. Thus, we discovered a conserved sperm complex that bridges vertebrate sperm and egg by binding divergent egg ligands. In Noda, Blaha et al. (2023), we characterized the sperm proteins DCST1 and DCST2 in zebrafish and mice. We demonstrated that mouse and zebrafish knock-out males of Dcst1 and Dcst2 are severely subfertile and sterile, respectively, and suggested that DCST1/2 interact. In zebrafish, dcst2 is necessary for sperm-egg binding, whereas mouse DCST2 is required for gamete fusion. Since the DCST1/2 homologs in C. elegans and D. melanogaster had been shown to be essential for male fertility as well, we identified the first fertilization factors known to be conserved in invertebrates and vertebrates. In Fujihara*, Herberg*, Blaha et al. (2021), we investigated the role of SPACA4 on mammalian sperm. SPACA4’s ortholog in fish, Bouncer, was previously shown to be required on the egg for gamete binding. In contrast, we found that murine SPACA4 is necessary for full male fertility by facilitating the sperm’s traversal of the zona pellucida. Finally, I investigated the Izumo1-Spaca6-Bouncer interaction in the context of cross-species fertilization. Replacing zebrafish Bouncer with its medaka ortholog was found to allow medaka sperm to fertilize a zebrafish egg. I hypothesized that exchanging the Spaca6-Izumo1 orthologs on the sperm would confer the same capability. I found no evidence for the sufficiency of medaka spaca6 and izumo1 to interact with medaka Bouncer in the zebrafish context, even when expressed together. Instead, I unexpectedly found that medaka Spaca6 could fully rescue endogenous zebrafish Spaca6. These results suggest that the species barrier on the side of the sperm is more complex. Taken together, my work contributed to the characterization of four of the six known essential fertilization factors in zebrafish, the discovery of a conserved sperm complex in vertebrate sperm, and the finding that this complex is the Bouncer receptor on sperm. With these findings, we are beginning to piece together the puzzle of genetically essential but mechanistically understudied fertilization factors. Therefore, this dissertation represents an important step forward in elucidating the molecular mechanisms that govern how vertebrate sperm and egg fuse.