Μελέτη της επίδρασης της εξωκυττάριας DJ1-GFP στη μετάβαση ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά
Creators: name: Μπουτζέτη, Αννα Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή
Καρκινικά κύτταρα μαστού MCF7
DJ-1
Epithelial mesenchymal transition (EMT)
MCF7 breast cancer cells

description: Η απογλυκάση πρωτεΐνης/νουκλεϊνικού οξέος DJ-1 (RS/PARK7/CAP1) αποτελεί μια εξαιρετικά συντηρημένη, μικρή πρωτεΐνη, μεγέθους 20 kDa, που είναι μέλος της υπεροικογένειας πρωτεϊνών DJ-1/ThiJ/Pfp. Ο ακριβής ρόλος της πρωτεΐνης DJ-1 δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός, όμως οι επιστήμονες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι αποτελεί μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη με διάφορες λειτουργίες στο κύτταρο και εμπλέκεται σε πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια. Η DJ-1 εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και σε μικρές ποσότητες στον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια. Η πρωτεΐνη διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στις νευροεκφυλιστικές διαταραχές, ωστόσο είναι κύριος ρυθμιστής του νεοπλασματικού μετασχηματισμού και αποτελεί μια ογκοπρωτεΐνη που εμπλέκεται στο μονοπάτι σηματοδότησης Ras. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της εκκρινόμενης DJ-1-GFP πρωτεΐνης σύντηξης στην μετατροπή των επιθηλιακών MCF-7 κυττάρων του μαστού σε μεσεγχυματικού τύπου κύτταρα και ο εντοπισμός της μορφής εξωκυτταρικών κυστιδίων μέσω των οποίων εκκρίνεται η υπερεκφρασμένη DJ-1 από τα επιμολυσμένα κύτταρα. Επομένως, πραγματοποιήθηκε παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HeLa με πλασμιδιακούς φορείς pEGF-N1 και pEGF-N1-DJ1, απομόνωση εξωκυτταρικών κυστιδίων από τα επιμολυσμένα κύτταρα και βρέθηκε ότι η υπερεκφρασμένη GFP-DJ1 εκκρίνεται από τα επιμολυσμένα κύτταρα κυρίως μέσω των αποπτωτικών σωμάτων και λιγότερο μέσω μικροκυστιδίων και εξωσωμάτων. Για την μελέτη της εμπλοκής της DJ-1 στην επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή, το υπερκείμενο της επιμόλυνσης των HeLa μεταγγίστηκε σε MCF7 κύτταρα, ελέγχθηκε το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων e-Cadherin, Snail και Slug σε cDNAs από MCF7 και πραγματοποιήθηκαν Western blot των εκχυλισμάτων MCF7 ως προς e-Cadherin και β-Catenin. Η μελέτη στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των εκτεθειμένων MCF7 σε υπερκείμενο από επιμολυσμένα με πλασμιδιακό φορέα pEGF-N1-DJ1 HeLa έδειξε ότι η καθηλωμένη e-Cadherin μειώνεται με το πέρας των ημερών έκθεσης ενώ η καθηλωμένη β-Catenin αυξάνεται. Μέσω του ελέγχου της μεταγραφής των e-Cadherin, Snail, Slug και Actin των cDNAs ενίσχυσης των γονιδίων αυτών, είδαμε ότι η μεταγραφή της e-Cadherin μειώνεται με το πέρας των ημερών έκθεσης, του Slug από την άλλη αυξάνεται ενώ των Snail και Actin παραμένει περίπου στον ίδιο βαθμό όλες τις μέρες έκθεσης
description: DJ-1 protein/nucleic acid apoglycase (RS/PARK7/CAP1) is a highly conserved, small, 20 kDa protein that is a member of the DJ-1/ThiJ/Pfp protein superfamily. The exact role of the DJ-1 protein is not yet fully understood, but scientists have come to the conclusion that it is a multifunctional protein with various functions in the cell and is involved in many signaling pathways. DJ-1 is mainly localized in the cytoplasm and in small amounts in the nucleus and mitochondria. The protein plays a critical role in neurodegenerative disorders, yet is a master regulator of neoplastic transformation and is an oncoprotein involved in the Ras signaling pathway. The purpose of this master's thesis is to study the effect of the secreted DJ-1-GFP fusion protein on the transformation of breast epithelial MCF-7 cells into mesenchymal-type cells and to identify the form of extracellular vesicles through which the overexpressed DJ-1 is secreted from the infected cells. Therefore, transient transfection of HeLa cells with pEGF-N1 and pEGF-N1-DJ1 plasmid vectors was performed, extracellular vesicles were isolated from transfected cells, and overexpressed GFP-DJ1 was found to be secreted from transfected cells mainly via apoptotic bodies and less via microvesicles. and exosomes. To study the involvement of DJ-1 in epithelial-mesenchymal transition, HeLa transfection supernatant was transfected into MCF7 cells, the expression level of e-Cadherin, Snail and Slug genes in cDNAs from MCF7 was checked and Western blots of MCF7 extracts were performed in terms of e-Cadherin and β-Catenin. The study of protein extracts of exposed MCF7 in supernatant from transfected HeLa with the plasmid vector pEGF-N1-DJ1 showed that e-Cadherin decreases with the end of days of exposure while β-Catenin increases. By controlling the transcription of e-Cadherin, Snail, Slug and Actin of the amplification cDNAs of these genes, we saw that the transcription of e-Cadherin decreases with the end of the exposure days, Slug on the other hand increases while Snail and Actin remain approximately to the same extent on all exposure days