title: Untersuchungen zu Proteininteraktionen des renalen Risikofaktors APOL1
Creators: name: Jayasingam, Jarooshen
Publisher: name: University of Muenster, Institutional Repository MIAMI
Year: 2022
Subjects: subject: 610 Medicine and health

description: Zwei genetische Varianten des Apolipoprotein L1 Gens (APOL1 G1/G2) sind bei homozygoten Betroffenen mit einem erhöhten Risiko für nicht-diabetische Nephropathien assoziiert. Der Pathomechanismus ist nicht abschließend geklärt. In dieser Arbeit wurden mögliche intrazelluläre Proteininteraktionen von APOL1 mit BAG6, DNAJC14 und VAMP8 untersucht. Yeast Two Hybrid co-transformation assays, GFP Trap Experimente und Co-Lokalisationsanalysen zeigten eine starke Interaktion zwischen APOL1 und BAG6 sowie DNAJC14. APOL2 ist evolutionsbiologisch älter als APOL1, weist jedoch in seiner Aminosäuresequenz große Homologien zu APOL1 auf. Es konnte eine Interaktion von APOL2 mit BAG6, nicht aber mit DNAJC14, gezeigt werden. Es gibt starke Hinweise darauf, dass BAG6 und DNAJC14 in Podozyten mit APOL1 interagieren. DNAJC14 ist vermutlich ein neuer Interaktionspartner innerhalb der APOL-Familie, der am ER mit APOL1 co-lokalisiert. Eine Interaktion mit VAMP8 zeigte sich nicht.
description: TABELLENVERZEICHNIS ..... 1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..... 2 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..... 3 1 EINLEITUNG ..... 4 1.1 DIE ANATOMIE UND PHYSIOLOGIE DER GLOMERULÄREN FILTRATIONSBARRIERE (GFB) ..... 4 1.2 PODOZYTOPATHIEN ..... 7 1.3 DIE SONDERSTELLUNG VON APOL1 IN DER GENFAMILIE ..... 7 1.4 APOL1 RISIKOVARIANTEN ..... 8 1.5 PROTEIN INTERAKTIONSPARTNER VON APOL1 ..... 10 1.6 DIE FRAGESTELLUNG DIESER ARBEIT..... 12 2 MATERIALTEIL ..... 13 2.1 GERÄTE UND SOFTWARE ..... 13 2.2 CHEMIKALIEN..... 16 2.3 ALLGEMEINE VERBRAUCHSMATERIALIEN..... 18 2.4 PUFFER, LÖSUNGEN UND MEDIEN ..... 20 2.5 ENZYME ..... 24 2.6 ANTIKÖRPER..... 25 2.7 OLIGONUKLEOTIDE..... 26 2.8 PLASMIDE..... 27 2.9 ORGANISMENSTÄMME..... 29 2.10 EUKARYOTISCHE ZELLKULTUREN ..... 30 2.11 KITS..... 31 2.12 DYES ..... 32 3 METHODENTEIL ..... 33 3.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN ..... 33 3.1.1 Kultivierung von E. coli ..... 33 3.1.2 Transformation von E. coli ..... 33 3.1.3 Plasmid Präparation ..... 33 3.1.4 Kultivierung von Hefe ..... 33 3.1.5 Yeast Two Hybrid Co-Transformation Assay ..... 33 3.1.6 Herstellung kompetenter Hefe ..... 34 3.1.7 Transformation von Hefe ..... 34 3.1.8 β-Galaktosidase Assay ..... 35 3.2 MOLEKULARBIOLOGIE..... 35 3.2.1 Polymerase Kettenreaktion (PCR) ..... 35 3.2.2 Restriktionsverdau ..... 36 3.2.3 Agarose-Gelelektrophorese ..... 363.2.4 Gel Elution ..... 36 3.2.5 Dephosphorylierung der 5´-Vektorenden ..... 36 3.2.6 Ligation ..... 37 3.2.7 Sequenzierung ..... 37 3.2.8 LR Clonase Reaktion ..... 37 3.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN..... 38 3.3.1 Kultivierung humaner Zelllinien ..... 38 3.3.2 Transiente Transfektion mittels der Kalziumphosphat-Methode (CaPO4 Methode) ..... 38 3.3.3 Transiente Transfektion mit LipofectaminTM 2000 ..... 38 3.3.4 CRISPR/Cas9 ..... 38 3.4 BIOCHEMISCHE METHODEN..... 40 3.4.1 Herstellung von Zelllysaten ..... 40 3.4.2 GFP Trap ..... 40 3.4.3 SDS-PAGE ..... 40 3.4.4 Western Blot ..... 41 3.4.5 Strippen von PVDF Membranen ..... 41 3.5 FLUORESZENZ MIKROSKOPIE ..... 42 3.5.1 Immunfluoreszenz Färbung ..... 42 3.5.2 Live Cell Imaging ..... 42 3.6 STATISTISCHE AUSWERTUNG ..... 42 4 ERGEBNISSE ..... 43 4.1 UNTERSUCHUNGEN ZU PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN IM YEAST TWO HYBRID SYSTEM ..... 43 4.2 BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN ZU PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN MIT GFP TRAP EXPERIMENTEN ..... 47 4.2.1 Genexpression in stabilen HEK293T-APOL1-Zelllinien..... 47 4.2.2 BAG6 und DNAJC14 interagieren mit Wildtyp APOL1 G0. ..... 48 4.2.3 Interaktionen mit den Risikofaktoren APOL1 G1 und G2 ..... 51 4.3 KO-LOKALISATIONSANALYSEN ZU PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN..... 52 4.4 INTERAKTIONEN MIT APOL2 ..... 55 4.5 GENERATION FUNKTIONELLER HEK293T APOL1-KO-ZELLEN MIT CRISPR/CAS9 TECHNOLOGIE ..... 57 5 DISKUSSION ..... 58 5.1 DIE INTERAKTION VON APOL1 MIT BAG6 ..... 58 5.2 DIE INTERAKTION VON APOL1 MIT DNAJC14 ..... 60 5.3 DIE APOL1-VAMP8 INTERAKTION ALS POSITIVKONTROLLE ..... 62 5.4 UNTERSCHIEDE IN DEN INTERAKTIONEN MIT DEN RRV ..... 62 5.5 INTERAKTIONEN VON BAG6 UND DNAJC14 MIT DEM STRUKTURHOMOLOGEN APOL2 ..... 63 5.6 DIE GENERIERUNG VON KNOCKOUT ZELLLINIEN ..... 64 6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ..... 657 LITERATURVERZEICHNIS ..... 67 8 LEBENSLAUF ..... 73 9 DANKSAGUNG ..... 74