Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικής μεθόδου HPLC-FLD για τον προσδιορισμό της ομοταυρίνης
Creators: name: Ντόρκου, Μαριάννα Αναστασίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ομοταυρίνη
HPLC
Παραγωγοποίηση
Homotaurine
Derivatization

description: Η ομοταυρίνη κυκλοφορεί στο εμπόριο με τη μορφή συμπληρωμάτων διατροφής ως ενισχυτικό της μνήμης και αποτελεί το φάρμακο του μέλλοντος για τη θεραπεία της νόσου Αλτσχάιμερ καθώς και άλλων νευροεκφυλιστικών νόσων. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία νέα αναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό της ομοταυρίνης με χρήση Χρωματογραφίας Υγρού Υψηλής Απόδοσης συζευγμένη με ανιχνευτή φθορισμού (λex=340 nm και λem.=455 nm). Κατόπιν διερεύνησης, η μέθοδος εφαρμόστηκε σε στήλη RP- C18 Supelco Discovery (250 mm x 4,6 mm, 5 μm,) ενώ ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε δυαδικό σύστημα υδατικού ρυθμιστικού διάλυματος φωσφορικών ιόντων (20mmol/L, pΗ=7), και μεθανόλης. Το πρόγραμμα έκλουσης της κινητής φάσης ήταν βαθμιδωτό με ταχύτητα ροής 1ml/min. Τα προς ανάλυση δείγματα υποβλήθηκαν σε κατάλληλη διαδικασία για την παραγωγοποίηση της ομοταυρίνης και της ιστιδίνης (εσωτερικό προτύπο) με όρθο-φθαλδεΰδη (ΟΡΑ). Για την αντίδραση παραγωγοποίησης αναμίχθηκαν ορισμένες ποσότητες ομοταυρίνης και εσωτερικού προτύπου με OPA (10 mmol/L), Ν-ακέτυλο-κυστεΐνης (10 mmol/L) και ρυθμιστικού διαλύματος βορικών ιόντων (50 mmol/L, pH=10,5). Τα δείγματα αναμίχθηκαν (vortex) για 10 δευτερόλεπτα, αφέθηκαν 10 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και εγχύθηκαν στο σύστημα HPLC. Λόγω της αστάθειας των παραγωγοποιημένων δραστικών, η οποία διαπιστώθηκε μετά από διερεύνηση της αντίδρασης, οι αναλύσεις έπρεπε να πραγματοποιούνται σε διάστημα 1,5 ώρας. Η χρωματογραφική μέθοδος επέδειξε εκλεκτικότητα (διαχωρισμός κορυφών λευκού δείγματος και δραστικών) και γραμμικότητα σε εύρος συγκεντρώσεων της ομοταυρίνης από 4,5 έως 450 ng/ml (R2=0.9999). Επίσης, σύμφωνα με το ICH, η αναλυτική διαδικασία ήταν επαναλήψιμη τόσο μέσα στην ίδια μέρα (%RSD&lt;3.22%) όσο και σε διάστημα 3 διαδοχικών ημερών (μέση τιμή % RSD =1.83%), για δείγματα που ετοιμάζονταν σε χρονικό διάστημα 1,5 ώρας. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης της ομοταυρίνης καθορίστηκαν στα 5,75 και 17,43 ng/ml αντίστοιχα, ενώ τα ποσοστά ανάκτησης πέντε δειγμάτων (διαφορετικής συγκέντρωσης) κυμαίνονταν από 99,75 έως 101,58%. Τέλος, η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς για την in vitro μελέτη διαπερατότητας της ομοταυρίνης από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό σε κελιά διάχυσης Franz.
description: Homotaurine is marketed in dietary supplements as a memory enhancer and is considered as the promising drug for the treatment of Alzheimer's Disease as well as other neurodegenerative diseases. In the present study, a new analytical method was developed and validated for the determination of homotaurine based on the employment of High Performance Liquid Chromatography coupled with a fluorescence detector (λex.=340 nm and λem.=455 nm). After investigation, the method was applied to a RP-C18 Supelco Discovery column (250 mm x 4.6 mm, 5 μm,), while a binary system of an aqueous solution of phosphate buffer (20 mmol/L, pH=7), and methanol was used as the mobile phase. The elution program of the mobile phase was gradient with a flow rate of 1ml/min. The samples were subjected to an appropriate procedure for the derivatization of homotaurine and histidine (internal standard) with ortho-phthalaldehyde (OPA). For the derivatization reaction, certain amounts of homotaurine and internal standard were mixed with OPA (10 mmol/L), N-acetyl-cysteine (10 mmol/L) and borate buffer (20 mmol/L, pH=10,5). Samples were vortexed for 10 seconds, allowed 10 minutes at ambient temperature and then injected into the HPLC system. Due to the instability of the derivatized reagents, which was found after investigation of the reaction, the analysis had to be performed within 1.5 hours. The proposed chromatographic method showed selectivity (separation of peaks in blank and spiked samples) and good linearity (R2=0.9999) in the range of 4.5 to 450 ng/ml for homotaurine. Moreover, according to the ICH, the analysis procedure showed good repeatability in both intraday (%RSD&lt;3.22%) and interday precision over 3 consecutive days (mean %RSD =1.83%), for samples prepared within 1.5 hours. The limits of detection and quantification for homotaurine were determined to be 5.75 and 17.43 ng/ml respectively, while the recovery values of five samples of different concentration ranged from 99.75 to 101.58%. Finally, the developed and validated method was successfully applied to the in vitro permeability study of homotaurine across the blood-brain barrier in Franz diffusion cells.