Πειραματική αξιολόγηση ενός μεταβολικού μοντέλου βασισμένο στο γονιδίωμα του βακτηρίου Pseudomonas putida KT2440: in silico σχεδίαση στελεχών
Creators: name: Μπατιάνης Χρίστος Κοσμά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Μεταβολική μοντελοποίηση
Γενετική μηχανική
Μικροβιακή Βιοτεχνολογία
Metabolic modeling
Genetic engineering
Microbial biotechnology

description: Υπόβαθρο: Η επιτυχής προώθηση του πεδίου της μεταβολικής μηχανικής απαιτεί ολοκληρωμένες στρατηγικές μεταβολικής μοντελοποίησης που βασίζονται σε in silico αναλύσεις. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε πειραματικά ένα μεταβολικό μοντέλο βασισμένο στο γονιδιώμα του βακτηρίου Pseudomonas putida KT2440, σχεδιάζοντας ένα στέλεχος ικανό να υπερπαράγει πυροσταφυλικό οξύ. Η ανάλυση των μεταβολικών χαρακτηριστικών του in silico στελέχους έγινε με τους αλγόριθμους Flux Balance analysis (FBA) και Flux variability analysis (FVA), και οι προβλέψεις συγκρίθηκαν με πειραματικά δεδομένα. Αποτελέσματα: Καθοδηγούμενοι από τον αλγόριθμο βελτιστοποίησης στελεχών RobustKnock, διαγράψαμε επιτυχώς το γονίδιο gnd και το οπερόνιο aceEF καταλήγοντας στον προτεινόμενο γονότυπο, P. putida KT2440 Δgnd-ΔaceEF. Μέσω αυτής της διπλής διαγραφής η παραγωγή του πυροσταφυλικού αυξήθηκε σημαντικά, ωστόσο, ο μεταλλάκτης παρουσίασε αυξοτροφία στο οξικό οξύ. Χρησιμοποιώντας το πλαίσιο του αλγορίθμου FVA, παρατηρήσαμε πως το οξυγόνο παίζει καίριο ρόλο στην in silico παραγωγή του πυροσταφυλικού. Για να διασαφηνιστεί η παραπάνω παρατήρηση, ο μεταλλάκτης καλλιεργήθηκε σε ένα σύστημα αυτοματοποιημένων βιοαντιδραστήρων κάτω από διαφορετικές συγκεντρώσεις παρεχόμενου οξυγόνου και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τους in silico υπολογισμούς. Φάνηκε πως σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις οξυγόνου, το στέλεχος είχε την δυνατότητα να παράγει μεγαλύτερες ποσότητες πυροσταφυλικού, επικυρώνοντας έτσι τις αρχικές προβλέψεις του FVA. Συμπεράσματα: Με γνώμονα το μοντέλο σχεδιάσαμε και κατασκευάσαμε επιτυχώς ένα στέλεχος P. putida KT2440 ικανό να υπερπαράγει πυροστοφυλικό. Η εφαρμογή αυτή επιβεβαιώνει την υπολογιστική ικανότητα τόσο του μοντέλου iJP926 όσο και του αλγόριθμου RobustKnock στον σχεδιασμό νέων στελεχών
description: Background: Integrated approaches utilizing in silico analyses are necessary to successfully advance the field of metabolic engineering. In this study, we experimentally evaluated a genome-scale metabolic model of Pseudomonas putida KT2440 by designing a pyruvate overproducer mutant. The metabolic characteristics were analyzed using flux balance analysis (FBA) and flux variability analysis (FVA), and the predictions were validated using data from culture flask and automated fermentation experiments. Results: Guided by the strain optimization algorithm RobustKnock, we successfully deleted the gene gnd and the operon aceEF resulting in the proposed genotype, P. putida KT2440 ∆gnd-∆aceEF. This double deletion significantly increased the pyruvate production, however, the double knockout mutant was auxotrophic in acetate. Using the framework of FVA, we observed a critical effect of oxygen uptake rate on pyruvate production rate. To elucidate this observation, we cultivated the mutant under different amounts of dissolved oxygen in a fed batch fermentation system. The results revealed that the mutant was able to produce higher amounts of pyruvate under lower amounts of oxygen indicating in the confirmation of the FVA calculations. Conclusion: Based on a model-driven strain design strategy we successfully designed and constructed a P. putida KT2440 knockout mutant able to overproduce pyruvate. This application confirms the computational capacity of both the model iJP926 and the algorithm RobustKnock to design novel knockout strains