title: Untersuchung von genetischer Instabilität bei kommerziellen GVO-Linien
Creators: name: Madi, Zita
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Gemäß EU-Richtlinie 2001/18 sollen bei der Haltung und Vermehrung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) keine genetischen Veränderungen auftreten. Durch Verordnungen der EFSA wird vorgeschrieben, GVO Saatgut nach fünf Generationen mit Southern Blots zu untersuchen. Bei diesen Kontrollen sollten keine Abweichungen der DNA Sequenz auftreten. Ein genauer Nachweis von SNP (single nucleotide polymorphism) ist entsprechend der Publikation von Neumann et al. (2011) mittels real-time PCR mit Scorpion Primern möglich. Diese Methode wurde in der hier vorliegenden Diplomarbeit durch die Verwendung von HRM Analysen erweitert und verbessert. Zusätzlich wurde bei der Scorpion PCR ein Syto-Farbstoff zur Kontrolle der DNA Qualität eingesetzt. Syto kann durch Messungen bei einer Wellenlänge von 510 nm von Scorpion Primern unterschieden werden, die bei 660nm detektiert werden. Durch die Möglichkeit bei verschiedenen Wellenlängen zu messen, können Syto und Scorpion Primer in derselben PCR eingesetzt werden. Für eine Darstellung der Charakteristika von Scorpion PCR und HRM wurde GVO DNA von Soja (Roundup Ready) und Mais (MON810) in Plasmide kloniert. Die Unterschiede der DNA Sequenz der Plasmide wurde durch Sanger Sequenzierung bestätigt. Scorpion Primer sowie HRM wurden verwendet, um Einfach-, und Doppel- Deletionen sowie Mutationen bei den Plasmiden nachzuweisen. Anschließend wurden Scorpion PCR und HRM eingesetzt, um Roundup Ready bei transgenem Soja Saatgut sowie MON810 bei transgenem Maissaatgut hinsichtlich genetischer Abweichungen zu screenen. Bei diesem Screening wurden zwar potentielle Unterschiede gefunden, bei einer Sequenzierung oder Subklonierung dieser Unterschiede zeigte sich jedoch, dass sowohl bei transgenem Mais (MON810), wie auch bei transgenem Soja (Roundup Ready) keine DNA Änderungen vorhanden sind. Zusätzlich zur Untersuchung von genetischen Unterschieden bei genomischen Proben und bei Plasmiden wurde untersucht, inwieweit Scorpion PCR und HRM geeignet sind, zwischen zwei verschiedenen Allelen des Adh1 Gens zu unterscheiden. Adh1 wurde bei 2 Single-Events (Bt11 und MON810) und 2 stacked-Events (4421VT3 und 6831RHXT) mittels Scorpion PCR und HRM charakterisiert. Die Ergebnisse wurden wiederum durch Sanger Sequenzierung kontrolliert. Eine eindeutige Unterscheidung zwischen homo-, bzw. den heterozygoten Allelen ist jedoch nur durch eine Subklonierung der genomischen DNA in Plasmide und eine Untersuchung von mehreren Subklonen möglich. Allgemein zeigen die Experimente dieser Arbeit, dass eine Kombination von Scorpion PCR und HRM eine gute Möglichkeit ist, SNPs mit Unterschieden von nur wenigen Nukleotiden bei einem Screening von genomischen Proben zu finden, und heterozygote Mutationen bei transgenen Linien eindeutig zu charakterisieren.
description: According to the EU directive 2001/18 no genetic changes should appear with the position and increase of genetically modified organisms (GMO). By orders of the EFSA it is settled that GMO seeds have to be examined after five generations with Southern Blots. With these controls no rearrangements of the DNA sequence may appear. Neumann et al. (2011) described, how an exact analysis of SNP (single nucleotide polymorphism) is possible by using real time PCR and scorpion primer. In this dissertation this method is extended and improved by using HRM analysis. In addition to the Scorpion PCR the Syto dye was used for the examination of DNA quality.Syto could be distinguished by measurements of another wavelength (510 nm) of real time PCR with scorpion primern (660 nm). By using different wavelengths for the measurements Syto and scorpion primer could be used in the same PCR. For the characterization of Scorpion PCR and HRM GMO DNA of soy (Roundup Ready) and maize (MON810) was cloned into plasmids. The difference in the DNA of the plasmids was confirmed by the Sanger sequencing. Scorpion primer and HRM were used for the detection of single and double deletions and mutation in the plasmids.Afterwards scorpion PCR and HRM were used to screen after genetically rearrangements in Roundup Ready transgene soy seeds and in MON810 maize seeds of the stacked-event 4421VT3. Although some potential differences could be found no genetic instabilities neither in the sequence nor with subcloning in MON810 transgene maize and transgene Roundup Ready soy could be detected. In addition to the investigation of genetic aberrations in genomic samples and plasmids it was examined to what extent scorpion PCR and HRM are suitable to distinguish between two different alleles from the ADH1. Adh1 was characterized with 2 single events (Bt11 and MON810) and 2 stacked-events (4421VT3 and 6831RHXT) with scorpion PCR and HRM. In addition, a Sanger sequencing wasalso carried out. Nevertheless, a distinct differentiation between homo- and the heterozygous type is only possible by cloning of the genomic DNA sample in plasmids and the examination of several subclones. In general the experiments of this work showed that a combination of scorpion PCR and HRM was a good possibility to find SNPs with differences of one to only few nucleotides with a screening of genomic samples and also to characterize heterozygous mutations in transgene lines.