Παραγωγή πολυμερών από μικροοργαμισμούς με τη χρήση υποστρωμάτων παραπροϊόντων βιομηχανικών τροφίμων
Creators: name: Κόνσουλα, Ζωή Α.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2005
Subjects: α-Αμυλάση
Ξανθάνη
Βιομηχανία τροφίμων
α-Amylase
Xanthan gum
Food industry

description: Το άμυλο αποτελεί, μετά την κυτταρίνη, έναν από τους πιο άφθονους πολυσακχαρίτες, που παράγεται από τα φυτά και αποτελείται από την αμυλόζη (18-33%) και την αμυλοπηκτίνη (67-82%). Η αμυλόζη είναι ένα γραμμικό μόριο αποτελούμενο από μόρια γλυκόζης ενωμένα με α-1,4-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Η αμυλοπηκτίνη πέρα από τους α-1,4-γλυκοζιτικούς δεσμούς φέρει και α-1,6-γλυκοζιτικές διακλαδώσεις. Η κυριότερη εφαρμογή του αμύλου είναι η υδρόλυσή του για την παραγωγή γλυκόζης, η οποία χρησιμοποιείται στη συνέχεια για την παραγωγή κρυσταλλικής γλυκόζης καθώς και αμυλοσιροπίων γλυκόζης και φρουκτόζης υψηλής περιεκτικότητας. Εναλλακτικά η γλυκόζη μπορεί να ζυμωθεί για την παραγωγή άλλων προϊόντων όπως είναι η αιθανόλη, τα αμινοξέα και τα οργανικά οξέα. Ωστόσο, λόγω της πολύπλοκης δομής του αμύλου η υδρόλυσή του απαιτεί τη συνδυασμένη δράση αρκετών αμυλολυτικών ενζύμων όπως είναι η α-αμυλάση, η β-αμυλάση, η γλυκοαμυλάση, η α-γλυκοσιδάση και τα ένζυμα αποπολυμερισμού διακλαδισμένου πολυμερούς (debranching enzymes). Οι ενδο-υδρολάσες, όπως είναι η α-αμυλάση, υδρολύουν τυχαία τους δεσμούς στο εσωτερικό του μορίου του πολυμερούς, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό γραμμικών και διακλαδισμένων ολιγοσακχαριτών. Οι α-αμυλάσες συγκαταλέγονται ανάμεσα στα σημαντικότερα ένζυμα και βρίσκουν μεγάλη εφαρμογή στη σύγχρονη βιοτεχνολογία. Παρόλο που αυτά τα ένζυμα παράγονται από διάφορους ζωικούς και φυτικούς ιστούς καθώς και μικροοργανισμούς, οι βακτηριακές α-αμυλάσες πληρούν συνήθως τις απαιτήσεις της βιομηχανίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η παραγωγή μιας θερμοφιλικής α-αμυλάσης από το μικροοργανισμό Bacillus subtilis, ο οποίος απομονώθηκε από νωπό πρόβειο γάλα. Συγκεκριμένα διερευνήθηκε η επίδραση διαφόρων φυσικοχημικών παραγόντων στην παραγωγή του ενζύμου από τον παραπάνω μικροοργανισμό. Οι σημαντικότεροι από τους παράγοντες αυτούς ήταν το αρχικό pH και η σύσταση του θρεπτικού μέσου, το είδος και η συγκέντρωση της πηγής άνθρακα, αζώτου και φωσφόρου, η παρουσία επιφανειοδραστικών ουσιών, η συγκέντρωση του ενοφθαλμίσματος καθώς και η θερμοκρασία στην οποία πραγματοποιήθηκε η καλλιέργεια. Επιπλέον για την παραγωγή της α-αμυλάσης αναπτύχθηκε ένα χαμηλού κόστους θρεπτικό μέσο, το οποίο αποτελούνταν από παραπροϊόντα της βιομηχανίας τροφίμων, όπως το εκχύλισμα του καλαμποκιού και το τυρόγαλα. Η βελτιστοποίηση της σύστασης του θρεπτικού μέσου επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τα παραπάνω παραπροϊόντα και τις σύνθετες πηγές οργανικού αζώτου, τρυπτόνη και εκχύλισμα ζύμης, σε διάφορες αναλογίες. Σε μια προσπάθεια περαιτέρω αύξησης της παραγωγής της α-αμυλάσης διερευνήθηκε η δυνατότητα εφαρμογής, πέρα από τη ζύμωση βυθού, άλλων εναλλακτικών μεθόδων καλλιέργειας του βακτηρίου, όπως είναι η εκχυλιστική καλλιέργεια και η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε εκχυλιστική καλλιέργεια σε υδατικά διφασικά συστήματα αποτελούμενα από πολυαιθυλενογλυκόλη και δεξτράνη και μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των συστατικών του συστήματος στην κατανομή του ενζύμου μεταξύ των δυο φάσεων καθώς και στη συνολική του παραγωγή. Επιπλέον αναπτύχθηκε μια ημι-συνεχής διεργασία παραγωγής της α-αμυλάσης, η οποία βασίστηκε στην επαναχρησιμοποίηση των κυττάρων που περιέχονταν στην πλούσια σε δεξτράνη κατώτερη φάση καθώς και στην ανάκτηση του μεγαλύτερου μέρους της πολυαιθυλενογλυκόλης, μετά φυσικά από την εκχύλιση του ενζύμου από αυτή. Υψηλή παραγωγικότητα α-αμυλάσης διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια 12 διαδοχικών κύκλων καλλιέργειας, αυξάνοντας τη συνολική παραγωγή του ενζύμου στις 600.000 U, ενώ παράλληλα η ειδική δραστικότητα της α-αμυλάσης που παράχθηκε σε αυτή την ημι-συνεχή διεργασία εμφανίστηκε 9 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με το ομογενές σύστημα καλλιέργειας. Η ακινητοποίηση των κυττάρων του βακτηρίου Bacillus subtilis σε μικροκάψουλες πηκτής αλγινικού ασβεστίου οδήγησε σε 2-3 φορές υψηλότερη παραγωγή α-αμυλάσης σε σύγκριση με την καλλιέργεια των ελευθέρων κυττάρων. Η απόδοση σε α-αμυλάση καθώς και η λειτουργική σταθερότητα του ακινητοποιημένου συστήματος αυξήθηκαν μεταβάλλοντας τα χαρακτηριστικά των μικροκαψουλών. Επιπλέον η ακινητοποίηση των κυττάρων παρείχε τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των βιοκαταλυτών σε μια ημι-συνεχή διεργασία παραγωγής αυξάνοντας παράλληλα τη συνολική παραγωγή της α-αμυλάσης στις 2.990.000 U μετά από 15 διαδοχικούς κύκλους καλλιέργειας. Ενδιαφέρον παρουσίασε επίσης το γεγονός ότι η απόδοση των παραπάνω ημι-συνεχών διεργασιών ενισχύθηκε από την παρουσία εκχυλίσματος καλαμποκιού και τυρογάλακτος στο θρεπτικό μέσο. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε επίσης στη μελέτη των βιοχημικών ιδιοτήτων της α-αμυλάσης που παράγεται από το βακτήριο Bacillus subtilis καθώς και στον προσδιορισμό των παραγόντων που επηρεάζουν τη δραστικότητά της. Παρόλο που τα βασικά χαρακτηριστικά των εξωκυττάριων α-αμυλασών αντικατοπτρίζουν συνήθως το pH και τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος παραγωγής τους, η α-αμυλάση που παράγεται από το βακτήριο B. subtilis ήταν ιδιαίτερα θερμοφιλική και εμφάνισε τη μέγιστη δραστικότητά της στους 135oC. Επιπλέον το ένζυμο παρουσίασε σημαντική θερμική σταθερότητα, η οποία ενισχύθηκε ακόμη περισσότερο από την παρουσία ιόντων ασβεστίου. Η α-αμυλάση χρησιμοποιήθηκε επίσης για την υδρόλυση διαφόρων αμυλούχων υποστρωμάτων τόσο σε ομογενή όσο και σε υδατικά διφασικά συστήματα. Μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης και της ζελατινοποίησης του υποστρώματος, της θερμοκρασίας υδρόλυσης και της καθαρότητας του ενζύμου στο βαθμό αποικοδόμησης του αμύλου. Ενδιαφέρον παρουσίασε η παραγωγή σημαντικών ποσοτήτων αναγόντων σακχάρων κατά την υδρόλυση του ακατέργαστου αμύλου με τη δράση αυτής της α-αμυλάσης. Επίσης η α-αμυλάση που παράγεται από το βακτήριο Bacillus subtilis ακινητοποιήθηκε σε μικροκάψουλες πηκτής αλγινικού ασβεστίου προκειμένου να προσδιοριστούν οι παράγοντες που επηρεάζουν τις καταλυτικές ιδιότητες του ενζύμου και καθιστούν δυνατή την εφαρμογή του σε μια ημι-συνεχή διεργασία υδρόλυσης του αμύλου. Ο σχηματισμός των μικροκαψουλών αλγινικού / SiO2 επέτρεψαν την επέκταση της ημι-συνεχούς διεργασίας στους 20 διαδοχικούς κύκλους υδρόλυσης. Τέλος, σε μια προσπάθεια παραγωγής α-αμυλάσης υψηλότερης θερμικής σταθερότητας μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου της α-αμυλάσης του αρχαιοβακτηρίου Pyrococcus woesei που είχε κλωνοποιηθεί στο βακτήριο Xanthomonas campestris, το οποίο είναι γνωστό ως σήμερα για την παραγωγή ξανθάνης. Επίσης δεδομένου ότι η ξανθάνη είναι ένας ετεροπολυσακχαρίτης, ο οποίος βρίσκει πλήθος βιομηχανικών εφαρμογών εξαιτίας των εξαιρετικών ρεολογικών του ιδιοτήτων, διερευνήθηκε η δυνατότητα συμπαραγωγής δυο αξιοποιήσιμων προϊόντων μεγάλης βιομηχανικής αξίας, όπως της α-αμυλάσης και της ξανθάνης, χρησιμοποιώντας το παραπάνω μετασχηματισμένο βακτήριο
description: Starch is, after cellulose, one of the most abundant polysaccharides produced by plants and is composed of amylose (18-33%) and amylopectin (67-82%). Amylose is a linear molecule consisting of α-1,4-linked glucopyranose residues. Amylopectin is a branched polymer containing α-1,6 glycosidic linkages in addition to the α-1,4 bonds. The major use of the polysaccharide is its processing for the production of glucose, which is subsequently used to produce crystalline dextrose, dextrose syrups or high fructose corn syrups. Alternatively, glucose may be fermented to produce other products, such as ethanol, aminoacids and organic acids. However, owing to the complex structure of starch, its hydrolysis requires the coordinate action of several enzymes, such as α-amylase, β-amylase, glucoamylase, α-glucosidase and several debranching enzymes. Endo-acting enzymes, such as α-amylase, hydrolyze linkages in the interior of the starch polymer in a random fashion, which leads to the formation of linear and branched oligosaccharides. α-Amylases are among the most important enzymes and find application in the present-day biotechnology. Although they can be derived from several sources, such as plant or animal tissues and microorganisms, the bacterial α-amylases usually meet the industrial demands. In the present thesis the production of a thermophilic α-amylase from Bacillus subtilis, isolated from fresh sheep's milk, was studied. More specifically, the effect of various physicochemical factors on the productivity of the amylase was investigated thoroughly. Most notable among these parameters were the initial pH and composition of the growth medium, the type and the concentration of carbon, nitrogen as well as phosphate, the presence of surfactants, concentration of inoculum and the culture temperature. Furthermore, a low cost fermentation medium, containing by-products of the food industry, such as corn steep liquor and cheese whey, was developed for the production of α-amylase. Optimization of the growth medium's composition was achieved by using the above mentioned by-products and other complex organic nitrogen sources, such as tryptone and yeast extract, in different ratios. In an attempt to improve further the α-amylase production alternative methods, other than submerged fermentation, were investigated, such as the extractive cultivation and the use of immobilized cells. More specifically, extractive cultivation was carried out in aqueous two phase systems, composed of polyethylene glycol (PEG) and dextran and the effect of the concentration of the phase-forming polymers on the distribution of α-amylase between the two phases as well as its overall production was studied. Furthermore, a semi-continuous operation, based on the re-circulation of living cells contained in the dextran-rich bottom phase as well as the PEG-rich upper phase, after of course the extraction of α-amylase from this phase, was developed. High amylase productivity was sustained after 12 successive fermentation batches, raising the cumulative α-amylase production to 600,000 U, while the specific activity of α-amylase produced in this semi-continuous operation was 9 fold higher in comparison to that of the homogeneous system. Immobilization of growing Bacillus subtilis cells in calcium alginate gel capsules resulted in 2-3 fold higher α-amylase productivity in comparison to the free cell cultures. The α-amylase yield and the operational stability of the immobilized system were increased by tailoring the capsules' characteristics. Furthermore, cell immobilization offered the advantage of using the biocatalysts in a semi-continuous fermentation process and concomitantly raising the cumulative α-amylase production to 2,990,000 U after 15 successive batches. Interestingly, α-amylase production in the above mentioned semi-continuous fermentation processes was enhanced by the presence of corn steep liquor and cheese whey in the growth medium. Special attention has been also paid in studying the biochemical properties of α-amylase produced from Bacillus subtilis and determining the factors affecting its activity. Although the fundamental characteristics of extracellular α-amylases are expected to reflect the pH and temperature of the environment in which they are produced, the α-amylase produced from B. subtilis appeared to be extremely thermophilic displaying a temperature optimum at 135oC. Furthermore, the enzyme exhibited significant thermostability, which was further enhanced by the presence of calcium. α-Amylase was also applied in the hydrolysis of various starches in homogeneous as well as in aqueous two phase systems. The effect of substrate concentration and gelatinization, processing temperature and enzyme purity on the extent of starch degradation was studied. Interestingly, considerable amounts of reducing sugars were liberated from raw starch by the action of this enzyme. Moreover, α-amylase produced from Bacillus subtilis was immobilized in calcium alginate gel capsules in order to determine the factors affecting the characteristic hydrolytic properties of the enzyme and enable its use in repeated batch starch hydrolysis processes. The formation of alginate / silica capsules enabled the extension of the semi-continuous operation to 20 successive batches. Finally, in an attempt to produce an even more thermostable enzyme the expression of Pyrococcus woesei α-amylase gene, which had been cloned in Xanthomonas campestris, a bacterium previously used for the production of xanthan gum, was studied. Furthermore, after taking into account that xanthan gum is a heteropolysaccharide used in a great number of industrial applications due to its exquisite rheological properties, the possibility of co-producing two industrially interesting products, such as α-amylase and xanthan gum, in one culture, using the transformants was investigated as well