Μελέτη της αποπτωτικής δράσης βακτηριοσινών προβιοτικών βακτηρίων σε καρκινικές σειρές κυττάρων παχέος εντέρου
Creators: name: Θώδα, Χριστίνα Ευαγγέλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Βακτηριοσίνες
Προβιοτικά
Καρκίνος παχέος εντέρου
Bacteriocins
Probiotics
Colorectal cancer

description: Ο καρκίνος παχέος εντέρου (Colorectal Cancer, CRC) είναι η τρίτη συνηθέστερη μορφή καρκίνου παγκοσμίως και αποτελεί μια ιδιαίτερα πολυπαραγοντική και ετερογενή νόσο. Ο κύριος τρόπος αντιμετώπισης της νόσου είναι η χημειοθεραπεία. Ωστόσο, παρά τις εξελιγμένες χημειοθεραπευτικές προσεγγίσεις, περιορισμοί όπως η αδυναμία επιλεκτικής στόχευσης των καρκινικών κυττάρων, η ανάπτυξη ανθεκτικότητας σε φάρμακα και η πρόκληση παρενεργειών στον οργανισμό, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη εύρεσης εναλλακτικών θεραπειών. Μεταξύ πληθώρας πρωτεϊνικών μορίων με πιθανή αντικαρκινική δράση ξεχωρίζουν οι βακτηριοσίνες, τα κατιονικά κυρίως ριβοσωμικά συντιθέμενα πεπτίδια του εκκριτώματος προβιοτικών βακτηρίων, οι οποίες θεωρούνται υπεύθυνες για την τοξικότητα υπερκειμένων βακτηριακών καλλιεργειών σε καρκινικά κύτταρα. Οι έρευνες περιορίζονται στην κυτταροτοξική επίδραση της μόνης εμπορικά διαθέσιμης βακτηριοσίνης, της νισίνης του Lactococcus lactis, ενώ δεν έχει μελετηθεί η συνέργεια βακτηριοσινών στην επιβίωση καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η επίδραση απομονωμένων βακτηριοσινών των βακτηρίων L. lactis και Bacillus subtilis στη βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου (Caco-2) και φυσιολογικών μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων ομφάλιου λώρου (WJ-MSCs) με τις μεθόδους MTT και Crystal Violet. Για την απομόνωση των βακτηριοσινών, τα υπερκείμενα άνευ βακτηριακών κυττάρων υποβλήθηκαν σε πρωτόκολλο καθαρισμού που περιλάμβανε καθίζηση με θειικό αμμώνιο και εκχύλιση με οργανικό διαλύτη, και ακολούθως ιοντική χρωματογραφία και εκχύλιση στερεής φάσης (SPE) προς την παραλαβή δύο ξεχωριστών κλασμάτων (S1 και S2). Έπειτα από μεμονωμένη χορήγηση κάθε κλάσματος διαπιστώθηκε μεγάλη μείωση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων με δοσο- και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά ελάχιστη κυτταροτοξικότητα ενάντια στα φυσιολογικά κύτταρα με εξαίρεση το κλάσμα S2 του B. subtilis. Η μελέτη του μηχανισμού απόπτωσης έγινε με κυτταρομετρία ροής μέσω χρώσης των κυττάρων με αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο. Μετά από 48ωρη επίδραση στην τιμή IC50, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων στα Caco-2 βρέθηκε στο 60,38 και 90,46% και 82,7 και 83,47 % για τα κλάσματα S1 και S2 του Β. subtilis και L. lactis, αντιστοίχως. Αντίθετα, παρατηρήθηκε πως μόνο το κλάσμα S2 του Β. subtilis επάγει την απόπτωση στα WJ-MSCs σε ποσοστό 55%, πιθανώς λόγω της παρουσίας του λιποπεπτιδίου surfactin. Συμπερασματικά οι βακτηριοσίνες ως εκλεκτικοί κυτταροτοξικοί παράγοντες αποτελούν παράγοντες που χρήζουν μελέτης και σε άλλους τύπους καρκίνου ώστε ενδεχομένως να αξιοποιηθούν μελλοντικά ως αντικαρκινική θεραπεία μεμονωμένα ή σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά.
description: Colorectal cancer (CRC) is the third most common form of cancer worldwide and is a multifactorial and heterogeneous disease. Chemotherapy is the main route of treatment for CRC. However, despite advanced chemotherapeutic approaches, limitations such as inability to selectively target cancer cells, development of drug resistance, and induction of adverse side effects to the human body render the need for alternative treatments imperative. Bacteriocins, the cationic mainly ribosomally synthesized peptides secreted by probiotic bacteria stand out among several proteinaceous molecules with potential anticancer activity and are considered responsible for the toxicity of bacterial culture supernatants to cancer cells. Research is only limited to the cytotoxic effect of the commercially available bacteriocin nisin derived from Lactococcus lactis, while the synergy of bacteriocins on cancer cell survival has not been evaluated yet. In the present study, the effect of isolated bacteriocins from L. lactis and Bacillus subtilis bacteria on the viability of colon cancer cells (Caco-2) and normal Wharton's jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) was investigated by the MTT and Crystal Violet assays. For bacteriocins isolation, cell-free supernatants were subjected to a purification protocol including precipitation with ammonium sulfate and organic solvent extraction, followed by the application of various chromatography techniques to obtain two separate fractions (S1 and S2). After administration of each fraction individually a great reduction in CRC cell viability in a dose- and time-dependent manner was observed, while little cytotoxicity against normal cells, except for the S2 fraction of B. subtilis, was found. Study of apoptosis was performed by flow cytometry using annexin V-FITC and propidium iodide staining. Following 48h treatment to concentrations corresponding to the IC50 values, the percentage of apoptotic cells for Caco-2 was found to be 60.38 and 90.46% and 82.7 and 83.47% for fractions S1 and S2 of B. subtilis and L. lactis, respectively. However, only the S2 fraction of B. subtilis was observed to induce apoptosis in WJ-MSCs at a rate of 55%, possibly due to the presence of the lipopeptide surfactin. In conclusion, bacteriocins as selective cytotoxic agents require further investigation to determine their action in other cancer types which, in the future, may render them exploitable as anticancer therapy.