title: Assessing the adaptability of the live-FISH method to soil Acidobacteriota
Creators: name: Špaček, Peter
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Die Untersuchung von Acidobacteriota, einem weit verbreiteten und ökologisch bedeutsamen Bakterienstamm im Boden, ist aufgrund der spezifischen Kultivierungsanforderungen seiner Mitglieder und der eingeschränkten Widerstandsfähigkeit unter Standard-Laborbedingungen nach wie vor schwierig. Herkömmliche Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierungsverfahren (FISH) sind zwar für die Identifizierung von Mikroorganismen wertvoll, erfordern jedoch in der Regel eine Zellfixierung, was ihren Nutzen bei der Kultivierung und weiteren Analyse lebender Zellen einschränkt. Ziel dieser Studie war es, ein modifiziertes Live-FISH-Protokoll zu evaluieren, das neu entwickelte, für das Phylum der Acidobacteriota spezifische Sonden enthält, um die Fluoreszenzmarkierung lebensfähiger Zellen innerhalb dieses Phylums zu ermöglichen.In dieser Arbeit wurden doppelt markierte DOPE-Sonden für die Unterabteilung 1 von Acidobacteriota entwickelt und getestet. Unter diesen zeigte die Acid303 eine optimale Leistung mit starker Spezifität und Signalintensität bei niedrigen Formamid-Konzentrationen. Erste Lebensfähigkeitstests mit gram-positiven und gram-negativen Modellbakterien ergaben ein unterschiedliches Überleben unter Live-FISH-Bedingungen; gram-positive Bacillus-Stämme zeigten eine höhere Widerstandsfähigkeit im Vergleich zu gram-negativen Bakterien. Trotz umfangreicher Optimierungsmaßnahmen konnten jedoch keine lebensfähigen Acidobacteriota-Zellen gefunden werden, was wahrscheinlich auf ihre Empfindlichkeit gegenüber den hohen Temperaturen und dem Puffer-pH-Wert zurückzuführen ist, die im Hybridisierungsprozess verwendet werden. Bei weiteren Versuchen mit Bodenanreicherung und Filtrat traten Probleme mit Autofluoreszenz und Zellaggregation auf, so dass Raum für die weitere Entwicklung des Protokolls blieb. Obwohl das Live-FISH-Protokoll keine lebensfähigen Acidobacteriota-Zellen ergab, die für die Kultivierung geeignet waren, hat diese Studie die Acid303 als zuverlässige Sonde für herkömmliche FISH-Anwendungen validiert. Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit einer weiteren Verfeinerung von Live-FISH-Methoden, die auf empfindliche mikrobielle Taxa wie Acidobacteriota zugeschnitten sind, und weisen auf mögliche Richtungen für die zukünftige Forschung hin, einschließlich der Erforschung alternativer Hybridisierungsumgebungen.
description: Acidobacteriota, a widespread and ecologically significant bacterial phylum in soil environments, remains challenging to study due to its members’ specific cultivation requirements and resilience limitations under standard laboratory conditions. Traditional Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) techniques, while valuable for microbial identification, generally require cell fixation, limiting their utility in cultivating and further analyzing live cells. This study aimed to evaluate a modified live-FISH protocol, incorporating newly developed Acidobacteriota phylum-specific probes, to enable fluorescent labeling of viable cells within this phylum. In this work, double-labeled DOPE probes targeting Acidobacteriota subdivision 1 were developed and tested. Among these, the Acid303 exhibited optimal performance, with strong specificity and signal intensity at low formamide concentrations. Initial viability tests on model gram-positive and gram-negative bacteria revealed variable survival under live-FISH conditions; gram-positive Bacillus strains demonstrated higher resilience compared to gram-negative bacteria. However, despite extensive optimization, viable Acidobacteriota cells remained elusive, likely due to their sensitivity to the high temperatures and buffer pH used in the hybridization process. Further trials with soil enrichment and filtrate imposed challenges with autofluorescence and cell aggregation, leaving room for further protocol development. Although the live-FISH protocol did not yield viable Acidobacteriota cells suitable for cultivation, this study validated the Acid303 as a reliable probe for traditional FISH applications. These findings emphasize the need for further refinement of live-FISH methodologies tailored for sensitive microbial taxa, such as Acidobacteriota and suggest potential directions for future research, including the exploration of alternative hybridization environments.