Απομόνωση σιδηροφορέα και του υποδοχέα του από το Βακτήριο Thermus thermophilus HB8 και μελέτη των ιδιοτήτων τους:
Creators: name: Βελαλή, Αικατερίνη Ηλία
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Σιδηροφορέας
Θερμόφιλο Βακτήριο Thermus thermophilus HB8
Υποδοχέας του σιδηροφορέα
Siderophore
Receptor of siderophore
Bacterium Thermus thermophilus HB8

description: Αρχικά απομονώθηκε το εξωκυττάριο εκχύλισμα από την καλλιέργεια με πηγή άνθρακα το αλγινικό νάτριο 0.2 % w/v του βακτηρίου Thermus thermophilus HB8. Αφού συμπυκνώθηκε στο 50 %, ακολούθησε ανίχνευση σιδηροφορέα με το εξειδικευμένο διάλυμα chromoazurol (CAS solution) και ο σιδηροφορέας ή το μίγμα σιδηροφορέων απομονώθηκε με τη μέθοδο της φαινόλης. Στη συνέχεια ο σιδηροφορέας πέρασε από στήλη μοριακής διήθησης G-10, όπου και καθαρίστηκε. Κατόπιν με διάφορες φασματοσκοπικές και άλλες μεθόδους, μελετήθηκαν οι ιδιότητες του σιδηροφορέα. Σύμφωνα με τα διάφορα φάσματα UV-Vis, τα φάσματα φθορισμού αλλά και τις εξειδικευμένες μεθόδους Arnow και Atkins πρόκειται πιθανόν για σιδηροφορέα υδροξαμικού τύπου. Επίσης με την τιτλοδότηση σιδήρου στο διάλυμα σιδηροφορέα και την καταγραφή των φασμάτων φθορισμού, αποδείχτηκε η εκλεκτικότητα του σιδηροφορέα ως προς το ιόν του Fe (III) και όχι για κάποια άλλα μεταλλικά κατιόντα. Προκειμένου να διαπιστωθεί η φύση και η διαδρομή του σιδηροφορέα σε διάφορα υποκυτταρικά τμήματα, απομονώθηκε το περίπλασμα και η εξωτερική μεμβράνη. Βρέθηκε ότι σ΄ αυτά τα τμήματα υπάρχει ο ίδιος σιδηροφορέας/εις και μάλιστα βρίσκεται στην μεγαλύτερη περιεκτικότητα στο περίπλασμα. Μελετήθηκε επίσης σ’ αυτά τα τμήματα η ύπαρξη πρωτεϊνών που πιθανόν εμπλέκονται στη μεταφορά του σιδηροφορέα μέσα στο κύτταρο. Χρησιμοποιώντας ηλεκτροφορήσεις με μη μετουσιωτικές συνθήκες και βαφή για ανίχνευση σιδηροπρωτεϊνών, απομονώθηκε μία πρωτεΐνη που είναι συμπλοκοποιημένη με σίδηρο και τον σιδηροφορέα και πιθανόν να είναι ο υποδοχέας του σιδηροφορέα. Δυστυχώς δεν ήταν εφικτό να βρεθεί ποιος είναι αυτός ο σιδηροφορέας και ποιος ο υποδοχέας αφού για την ταυτοποίησή τους χρειαζόταν φασματοσκοπία μαζών και ανάλυση αμινοξικής αλληλουχίας αντίστοιχα. Τελικά καταγράφηκε φάσμα μαζών του καθαρισμένου σιδηροφορέα και η αποτίμηση των αποτελεσμάτων βρίσκεται σε εξέλιξη.
description: Firstly, the bacterial strain Τhermus thermophilus HB8 was grown in a medium containing as the sole carbon source sodium alginate 0.2 % w/v and the extracellular medium was isolated. Then the extracellular medium was lyophilized to a final volume of 20 ml and siderophores were determined using the specific CAS solution (chromoazurol). Siderophore was extracted from the supernatant by centrifugation (10000 x g for 30 min), satured with NaCl and treated with 2 volumes chroroform-phenol (1/1 v/v) and then with 2 volumes ether. In addition, siderophore was purified by eluting in a column of Sephadex G-10 and both fluorescence and UV-Vis spectroscopy were employed to detect chromatographic peak of siderophore. According to the specific methods Arnow and Atkins siderophore that was isolated, may belong to hydroxamate type. The selectivity of the siderophore was evaluated against a range of physiologically relevant metal ions present as their chloride salts. Specifically, 400 μM solutions of Na(I), K(I), Mg(II), Cr(III). Mn(II), Fe(III), Co(II), Ni(II), Cu(II) and Zn(II) were each added to a 25 μM solution of the siderophore and changes in the fluorescence spectra were recorded. Upon addition of 400 μM Fe(III), the intensity of emission band at λmax = 464 nm decreased significantly (~55%) accompanied by a slight blue-shift of 1.5 nm (to 462.5 nm) of this band. None of the other metal ions tested provoked quenching of the original fluorescent intensity indicating the selective recognition of Fe(III) by the siderophore. Because of the research of the nature and the way that uses the siderophore to insert into the cell, periplasm and outer membrane were isolated. The same siderophore was found both in the periplasm and the outer membrane. The major amount of siderophore was found in the periplasm. Then, native electrophoresis was used to test if any proteins may be part of the complex of siderophore-Fe. Gels were also dried with K3Fe(CN)6 to detect iron-dependent proteins, that give characteristic blue bands. A protein whose molecular mass was approximately 78 kDa, may be the receptor of the siderophore but we cannot be sure because it needs further research using mass spectroscopy to indentify the siderophore and sequencing to indentify the receptor respectively.