title: Reconstitution of a PolII-like RNA polymerase and contribution of subunit E� and structural elements in the active center to RNA polymerase functions
Creators: name: Naji, Souad
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: Archaeabakterien , Transkription , RNS-Polymerase II , Untereinheit , Struktur-Aktivitäts-Beziehung , Pyrococcus furiosus , , Archaea , transcription , RNA polymerase , subunit E� , active center
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: The main focus of the present work was the functional and structural characterization of Pyrococcus furiosus RNAP. A protocol was developed for the purification of the endogenous RNAP to homogeneity and in a large scale. Transmission electron microscope images of this purified denzyme show that the archaeal Pfu RNAP can adopt different forms and it is slightly elongated in shape with a diameter of about 13-15 nm. This is in agreement with data obtained by x-ray crystallography from the eukaryotic RNAPII and the bacterial RNAP. It was unclear whether E� protein, which is highly conserved in archaea, was a subunit of RNAP. E� was detected in cell extract of Pfu but it was not detected as a subunit of endogenous Pfu RNAP. In addition, E� did not bind to the E�/F sub-complex. Autophosphorylation experiments of the purified endogenous RNAP show that a 100 kDa protein was phosphorylated, this protein could be the subunit A�. It has been also shown in this work that Pfu RNAP does not require hydrolysis of the gamma bond of ATP or GTP for its transcriptional activity at 70°C. The PolII-like RNAP from the hyperthemophilic archaeon Pfu was reconstituted in vitro from 11 recombinant subunits. The reconstituted Pfu RNAP could perform most of the steps required for in vitro transcription, from RNAP promoter recruitment via TBP and TFB to promoter escape and elongation. The specific activity of the reconstituted RNAP in promoter-dependent in vitro transcription assays had about 50% of the specific activity of the endogenous enzyme purified from Pfu cells. The availability of the RNAP reconstitution system allowed the analysis of the contributions of various subunits to Pfu RNAP activity, structure and stability. K, E� and F subunits were not required, whereas, N, P and H subunits were necessary for the transcriptional activity of the enzyme at 70°C. Subunit N is important for the stability of the enzyme at high temperatures. At 60°C, the activity of the reconstituted core enzyme (assembled in the absence of E´ and F) was sevenfold stimulated by addition of subunit E´, which was shown to catalyze open complex formation during transcription initiation at low temperatures. Gel filtration chromatography showed that E� and F were not present in stoichiometric amounts in the reconstituted RNAP and that E� and F co-eluted as a separate heterodimer complex. This explain that Pfu RNAP can exist as a 12-subunit holoenzyme complex or as a 10-subunit core with a dissociable E�/F sub-complex. F subunit was shown to interact strongly with the transcription factor TFE, and it might be involved in recruitment of this factor to the core enzyme. A sub-complex of RNAP consisting of subunits B, D, L, N and P was also reconstituted in vitro. The BDLNP sub-complex was shown to be able to form a stable complex with promoter bound transcription factors TBP and TFB. The availability of in vitro reconstituted Pfu RNAP system offers an opportunity for mutational studies of structural elements identified in the high resolution structure of RNAPII. The functions of Pfu RNAP structural elements homologous to RNAPII lid, rudder, fork1 and fork2 were investigated. Recombinant Pfu RNAP variants, harbouring the mutated subunits, were produced by in vitro assembly and were assayed to evaluate the contribution of these loops to the transcriptional activity of the enzyme. The RNAP structural elements Lid, Rudder, Fork2 loops are necessary for the transcriptional activity of RNAP. The deletion of Fork1 loop has only a mild effect on the transcription. As suggested from structural studies, these prominent loops participate indeed in the transcriptional activity of RNAP. The DeltaLid enzyme showed increased abortive initiation comparable to the wild-type when a complete pre-opened bubble (-10 to +3) was used as a template. However, the DeltaLid activity in producing abortive products decreased strongly when the downstream short bubble (-3 to +1) was used as a template in transcription assays. These results show that the DeltaLid enzyme is catalytically proficient in the presence of the entire transcription bubble and the A� lid loop might be involved in DNA melting downstream of the transcription bubble.
description: Das Hauptthema meiner Doktorarbeit war eine Analyse von Struktur-Funktionsbeziehungen innerhalb der Pyrococcus furiosus (Pfu) RNA Polymerase (RNAP). Ein Verfahren für die Reinigung der endogenen RNAP im großen Maßstab wurde etabliert. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen des Enzyms wiesen nach, dass die Pfu RNAP verschiedene Formen haben kann, die einen Durchmesser von etwa 13-15 nm besitzen. Das stimmt mit den Daten zur Kristallstruktur der eukaryotischen RNAPII und der bakteriellen RNAP überein. Es war nicht sicher, ob das E� Protein eine Untereinheit der RNAP ist. Das Protein ist in Archaea hochkonserviert, und wurde in Pfu Zellextrakten, aber nicht in der gereinigten RNAP nachgewiesen. E� konnte nicht an den E�/F Komplex binden. Die Untersuchungen zur Autophosphorylierung der endogenen Pfu RNAP haben das Ergebnis erbracht, dass ein 100 kDa-Protein in der gereinigten Polymerase phosphoryliert war. Das Protein ist wahrscheinlich die A� Untereinheit. In dieser Arbeit wurde auch nachgewiesen, dass die Pfu RNAP für die Transkription bei 70°C keine Hydrolyse der gamma Bindung von ATP oder GTP benötigt. Die Pfu RNAP wurde aus ihren 11 rekombinanten Untereinheiten in vitro rekonstituiert. Die rekombinante Pfu RNAP konnte die meisten Schritte der in vitro Transkription durchführen. Dies sind Promotor Erkennung mittels TBP und TFB, �Promoter escape� und Elongation. Die spezifische Aktivität der rekonstituierten RNAP beträgt bei der spezifischen in vitro Transkription 50% der spezifischen Aktivität des endogenen Enzyms. Mit dem RNAP Rekonstitutionssystem konnte der Beitrag der verschiedenen Untereinheiten der RNAP zur Aktivität, Struktur und Stabilität untersucht werden. Die Untereinheiten K, E� and F waren zur Synthese eines spezifischen Transkripts nicht unbedingt notwendig. N, H und P waren für die Aktivität des Enzyms bei 70°C erforderlich. Die N Untereinheit ist für die Stabilität des Enzyms bei hohen Temperaturen wichtig. Die Aktivität des rekonstituierten Core Enzyms (ohne E� und F) war bei 60°C nach der Zugabe von E� siebenmal höher. E� katalysiert bei 60°C die Bildung des �open complex� während der Initiation der Transkription. Die F Untereinheit interagiert mit dem Transkriptionsfaktor TFE und rekrutiert zusammen mit E� diesen Faktor für das Kernenzym. Gelfiltrationsexperimente haben nachgewiesen, dass E� und F substöchiometrisch in der rekonstituerten RNAP vorlagen. Außerdem koeluieren E� und F als separater Komplex. Deswegen kann die Pfu RNAP sowohl in Form eines 12-Untereinheiten Enzyms als auch in Form eines Kernenzyms aus 10-Untereinheiten mit dissoziierten E�/F Komplex existieren. Ein Subkomplex der RNAP aus den Untereinheiten BDLNP Komplex wurde in vitro rekonstituiert. Dieser Komplex bindet überraschenderweise stabil an den Promotor-TBP-TFB Komplex. Das Vorliegen der in vitro rekonstituierten Pfu RNAP bietet die Möglichkeit, Mutationsanalysen an spezifischen Strukturen und Aminosäuren der RNAPII durchzuführen, die in der Kristallstruktur der PolII ermittelt wurden. Die Funktionen der Pfu RNAP-Strukturlemente Lid, Rudder, Fork1 und Fork2 wurden untersucht. Die Pfu RNAP Mutanten wurden in vitro mit mutierten Untereinheiten rekonstituiert, und durch in vitro Transkriptionsversuche getestet. Die RNAP strukturellen Elementen Lid, Rudder und Fork2 sind für die Aktivität der RNAP essentiell. Die Beseitigung der Fork1 loop hat nur einen schwachen Effekt auf die Transkription. Wie aufgrund struktureller Studien postuliert, sind diese Elemente in der Tat für die Aktivität der RNAP wichtig. Im Vergleich zum Wildtyp Enzym zeigt die deletierte Lid (DeltaLid) erhöhte Synthese abortive Produkte, wenn eine durch Fehlparuung erzeugte künstliche Transkriptionsblase (-10 bis +3) als Matrizen-DNA benutzt wurde. Allerdings, nimmt die abortive Transkription von DeltaLid sehr stark ab, wenn eine kurze Transkriptionsblase (-3 bis +1) als Matrize in Transkriptionsversuchen eingesetzt wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass DeltaLid in Anwesenheit der kompletten Blase aktiv ist und die A� Lid Schleife beim Schmelzen der DNA stromabwärts von der offenen Blase involviert sein könnte.