title: Candidate genes for stress response in silver fir (Abies alba Mill.)
title: Kandidatengene für die Stressantwort in der Weisstanne (Abies alba Mill.)
Creators: name: Behringer, David
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: FIR-Mikroskopie , Genexpression
Botanical sciences
Pflanzen (Botanik)
drough stress
Random Forest , Dentro chronology
Terahertz
SNP

description: The aim of this thesis was the
      identification and analysis of candidate genes for stress
      response in silver fir (Abies alba Mill.). This ecologically
      and economically important forest tree species is native to
      many mountainous regions of Europe but little is known about
      its ecological characteristics. Silver fir populations were
      heavily transformed by human activity, which results in a
      mismatch between past and current distribution. Recent
      studies suggest that silver fir can occupy warmer and dryer
      climates than it currently does. However, the species also
      suffered considerably during the 1970s and 1980s, including
      foliar damage, radial growth depression and local diebacks in
      Germany. This is attributed mainly to the peak in air
      pollution during this period, especially sulfur dioxide
      (SO2), which seems to heavily increase drought sensitivity in
      silver fir. The combination of both stressors, SO2 and
      drought events, negatively affected silver fir even in
      regions where drought is usually not a problem. In the
      context of anthropogenic global climate change that will very
      likely lead to an increase in temperature in Europe and to
      more extreme events such as severe drought periods, the
      question arises, how silver fir will cope with these
      environmental changes. Given the speed of the predicted
      changes and the increasing landscape fragmentation, silver
      fir might not be able to evade it via seed dispersal. As a
      sessile organism, the only other option is adaptation, which
      will likely draw from standing genetic variation. To
      successfully predict the fate of silver fir, especially in
      the face of global climate change, and to potentially manage
      populations based on such predictions, the genetic
      architecture of silver fir in the context of such important
      stressors as drought and air pollution has to be understood.
      There exist, however, little genomic resources for silver fir
      and conifers in general. This is due to their large and
      complex genomes and the long generational cycle, which makes
      conifers typical nonmodel species. As such, methods for the
      identification of the genetic basis of stress response are
      effectively limited to a candidate gene approach. The
      candidate gene approach includes the identification of
      functional candidate genes by measuring differential gene
      expression between a stressed and a control group. In the
      context of this thesis, the water content of silver fir
      seedlings was monitored in a laboratory using a novel
      terahertz spectroscopy setup. One group of seedlings was
      regularly irrigated while the other group was drought
      stressed. Continually measuring the water content allowed to
      harvest needles from both groups at a time when the water
      status was comparable between the individuals within each
      group. A differential expression analysis between the needles
      from both groups then revealed 296 genes that were
      significantly up- or down-regulated in response to drought
      stress. Of those genes, approximately 45% have not been
      previously described in any organism and are potentially
      unique to silver fir or conifers in general. However, since
      only needles of seedlings were analyzed at a specific level
      of drought stress, the results are limited in scope to the
      source material and stress intensity and cannot be directly
      applied to silver fir or drought stress in general. Also,
      this approach implies a cause-effect relationship between
      gene expression and a specific level of drought stress. Thus,
      it is very important that confounding factors are excluded
      from the experiment. Chlorophyll content in the needles, for
      example, might change over the course of the monitoring
      period due to the drought treatment. To test if the
      chlorophyll content could potentially influence the terahertz
      signal, chlorophyll was extracted from silver fir needles, in
      the course of this thesis, and different concentrations were
      measured using terahertz spectroscopy, showing that
      chlorophyll content does not influence terahertz monitoring.
      Another aspect of the candidate gene approach involves the
      variation within a polymorphic gene and its potential
      association with the variation in a phenotypic trait. Since
      the growth depression period of silver fir in the 1970s and
      1980s was mostly influenced by the combination of air
      pollution and drought, in the context of this thesis, genetic
      variation, in the form of single nucleotide polymorphims
      (SNPs) in pre-selected genes, was associated with tree-ring
      derived phenotypes for individual trees in the Bavarian
      Forest National Park. These so called ’dendrophenotypes’ were
      measures for resistance, resilience and recovery during the
      depression period, as well as the drought year 1976. Using
      general linear models and feature selection techniques based
      on the machine learning algorithm random forest, 15 out of
      103 polymorphic candidate genes for trait variation could be
      identified. Since the associated dendrophenotyes are
      potentially adaptively relevant, the variation in this
      candidate genes could influence the stress coping capability
      of individual trees. However, this approach is of an
      observational nature and thus, cause-effect relationships
      cannot be derived from this type of experiment. The
      identified SNPs might be the causal variant or physically
      close to the true causal variant or it might just be a
      spurious correlation. Further, reliance on advanced
      statistical techniques can be troublesome, as could be
      demonstrated in the course of this thesis for a random forest
      based feature selection technique, developed for genetic
      association studies in conifers. Replicating this study and
      evaluating the algorithm, non-uniqueness of the results could
      be demonstrated, which not only hinders biological
      interpretation but can severely negatively influence
      downstream analyses, such as tests for interaction between
      SNPs. In conclusion, this thesis presents new techniques to
      add to the current methodology for candidate gene selection
      and analysis in the stress response of the non-model organism
      silver fir and other conifer species. Both approaches should
      be combined, for example by drawing polymorphic candidate
      genes for trait variation from the pool of functional
      candidate genes to ensure the involvement of the studied
      genes in the variation of the trait of interest. Further, the
      results of this thesis add to the growing molecular resources
      in silver fir and thereby, hopefully, contribute to the
      successful prediction and management of this important forest
      tree species in the face of rapidly changing environmental
      conditions.
description: Das Ziel dieser Dissertation war
      die Identifizierung und Analyse von Kandidatengenen f¨ur
      Stressreaktion in der Weißtanne (Abies alba Mill.). Diese
      ¨okologisch und ¨okonomisch wichtige Waldbaumart ist
      nat¨urlich beheimatet in bergigen Regionen Europas aber es
      ist wenig bekannt ¨uber ihre ¨okologische Charakterisierung.
      Weißtannenpopulationen wurden durch menschlichen Einfluss
      deutlich transformiert, was zu einer Diskrepanz zwischen dem
      fr¨uheren und dem heutigen Verbreitungsgebiet gef¨uhrt hat.
      Aktuelle Studien legen nahe, dass die Weißtanne in w¨armeren
      und trockeneren Klimaten ans¨assig sein kann, als sie es
      derzeit ist. Die Art hat jedoch in den 1970ern und 1980ern
      deutlich gelitten und zeigte in Deutschland Blattsch¨aden,
      eine Abnahme im Dickenwachstum und ¨ortliches Waldsterben.
      Als Grund hierf¨ur wird meist der H¨ochststand der
      Luftverschmutzung w¨ahrend dieses Zeitraums genannt,
      insbesondere von Schwefeldioxid (SO2), das offenbar die
      Empfindlichkeit der Weißtanne gegen¨uber Trockenstress
      deutlich erh¨oht. Die Kombination dieser beiden Stressoren,
      SO2 und Trockenperioden, hat die Weißtanne sogar in Regionen
      in denen Trockenstress ¨ublicherweise kein Problem ist
      negativ beeinflusst. Im Kontext des anthropogenen globalen
      Klimawandels, der sehr wahrscheinlich zu einem Ansteigen der
      Temperatur in Europa und zu mehr Extremereignissen, wie
      heftigen Trockenperioden, f¨uhren wird, stellt sich die
      Frage, wie die Weißtanne mit diesen Umweltver¨anderungen
      umgehen wird. Bedenkt man die Geschwindigkeit der
      vorhergesagten Ver¨anderungen und die zunehmende
      Fragmentierung der Landschaft, besteht die M¨oglichkeit, dass
      die Weißtanne diesem nicht durch Samenausbreitung entgehen
      kann. Als sessiler Organismus bleibt als die einzig andere
      Option nur Adaptation, die sich wahrscheinlich aus der
      stehenden genetischen Variation speisen wird. Um das
      Schicksal der Weißtanne, insbesondere im Kontext des globalen
      Klimawandels, erfolgreich abzusch¨atzen und Populationen
      m¨oglicherweise aufgrund solcher Vorhersagen zu managen,
      bedarf es der Kenntnis der genetischen Architektur im Kontext
      solcher bedeutender Stressoren wie Trockenperioden und
      Luftverschmutzung. Es gibt jedoch sehr wenige genomische
      Ressourcen f¨ur die Weißtanne und Koniferen im Allgemeinen.
      Das liegt maßgeblich an der Gr¨oße und Komplexit¨at der
      Genome und am langen Generationszyklus, was Koniferen zu
      typischen nicht-Modell Organismen macht. Aus diesem Grund
      sind Methoden zur Identifizierung der genetischen Basis von
      Stressantwort effektiv auf einen Kandidatengenansatz
      beschr¨ankt. Der Kandidatengenansatz beinhaltet die
      Identifikation von funktionellen Kandidatengenen, indem die
      differentielle Genexpression zwischen einer gestressten und
      einer Kontrollgruppe gemessen wird. Im Kontext dieser
      Dissertation wurde der Wassergehalt von Weißtannens¨amlingen
      mit einem neuartigen Terahertz-Spektroskopie-Aufbau in einem
      Labor ¨uberwacht. Eine Gruppe von S¨amlingen wurde
      regelm¨aßig gegossen, w¨ahrend eine andere Gruppe
      Trockenstress ausgesetzt war. Durch die kontinuierliche
      Messung des Wassergehalts konnten Nadeln der S¨amlingen aus
      beiden Gruppen zu einem Zeitpunkt geerntet werden, zu dem der
      Wassergehalt zwischen den Individuen einer Gruppe jeweils
      vergleichbar war. Eine differentielle Expressionsanalyse
      zwischen den Nadeln der beiden Gruppen resultierte dann in
      296 Genen die als Reaktion auf Trockenstress signifikant
      hochoder herunter-reguliert waren. Ungef¨ahr 45% dieser Gene
      sind zuvor noch nicht in anderen Organismen beschrieben
      worden und sind potentiell spezifisch f¨ur die Weißtanne oder
      Koniferen im Allgemeinen. Da jedoch nur Nadeln von S¨amlingen
      bei einem bestimmten Trockenstressniveau analysiert wurden,
      sind die Ergebnisse in ihrem Umfang auf das Ausgangsmaterial
      und das spez-ifische Stresslevel reduziert und k¨onnen nicht
      direkt auf die Weißtanne oder Trockenstress allgemein
      ¨ubertragen werden. Weiterhin impliziert dieser Ansatz einen
      Kausalzusammenhang zwischen Genexpression und einem
      spezifischen Maß an Trockenstress. Daher ist es sehr wichtig
      st¨orende Faktoren vom Experiment auszuschließen. So kann der
      Chlorophyllgehalt der Nadeln sich beispielsweise w¨ahrend des
      Messzeitraumes in Folge der Trockenstressbehandlung
      ver¨andern. Um zu testen ob der Chlorophyllgehalt
      m¨oglicherweise einen Einfluss auf das Terahertz-Signal hat,
      wurde im Rahmen dieser Dissertation Chlorophyll aus
      Weißtannennadeln extrahiert und unterschiedliche
      Konzentrationen mittels Terahertz-Spektroskopie gemessen.
      Dabei konnte gezeigt werden, dass der Chlorophyllgehalt
      keinen Einfluss auf das Terahertz-Monitoring hat. Ein anderer
      Aspekt des Kandidatengenansatzes beinhaltet die Variation
      innerhalb eines polymorphen Gens und die m¨ogliche
      Assoziation mit der Variation in einem ph¨anotypischen
      Merkmal. Da die Periode der Wachstumsdepression von
      Weißtannen in den 1970ern und 1980ern maßgeblich durch eine
      Kombination von Luftverschmutzung und Trockenperioden
      verursacht war, wurde im Rahmen dieser Dissertation
      genetische Variation, in Form von
      Einzelnukleotid-Polymorphismen (engl. single nucleotide
      polymorphisms (SNPs)) in vorausgew¨ahlten Genen, mit
      Ph¨anotypen assoziiert, die aus Jahresringen f¨ur
      individuelle B¨aume im Nationalpark Bayerischer Wald
      abgeleitet wurden. Diese so genannten ’Dendroph¨anotypen’
      waren Maße f¨ur die Resistenz, Resilienz und Erholung in der
      Depressionsperiode und dem Trockenjahr 1976. Basierend auf
      allgemeinen linearen Modellen und Feature Selection
      Techniken, die auf dem maschinellen Lernalgorithmus Random
      Forest beruhen, konnten 15 aus insgesamt 103 polymorphen
      Kandidatengenen f¨ur Merkmalsvariationen identifiziert
      werden. Da die assoziierten Dendroph¨anotypen potentiell
      adaptiv relevant sind, k¨onnte die Variation in diesen
      Kandidatengenen die F¨ahigkeit der Stressbew¨altigung
      individueller B¨aume beeinflussen. Dieser Ansatz ist jedoch
      grunds¨atzlich beobachtender Natur und diese Art von
      Experiment erlaubt daher keine Ableitung von
      Kausalzusammenh¨angen. Die identifizierten SNPs k¨onnen die
      urs¨achliche Variation sein, sie k¨onnen aber auch
      physikalisch nah an der tats¨achlich urs¨achlichen Variation
      sein oder es kann sich lediglich um einen Scheinzusammenhang
      handeln. Weiterhin kann das Vertrauen in fortgeschrittene
      statistische Verfahren problematisch sein, was im Rahmen
      dieser Dissertation f¨ur eine auf Random Forest basierende
      Feature Selection Methode gezeigt werden konnte, die f¨ur
      genetische Assoziationsanalysen in Koniferen entwickelt
      wurde. Durch die Replikation dieser Studie und die
      Evaluierung des Algorithmus konnte die Multiplizit¨at der
      Ergebnisse demonstriert werden, die nicht nur die biologische
      Interpretation behindert, sondern auch nachgelagerte
      Analysen, wie Tests auf Interaktion zwischen SNPs, negativ
      beeinflusst. Schlussfolgernd beschreibt diese Dissertation
      neue Techniken der Auswahl und Analyse von Kandidatengenen
      f¨ur die Stressreaktion im nicht-Modell-Organismus Weißtanne
      und anderen Koniferenarten die der g¨angigen Methodik
      hinzuzuf¨ugen sind. Beide Ans¨atze sollten kombiniert werden,
      beispielsweise indem polymorphe Kandidatengene f¨ur
      Merkmalsvariation aus dem Pool von funktionellen
      Kandidatengenen gezogen werden um die Beteiligung der
      untersuchten Gene an der Variation des zu untersuchenden
      Merkmals sicher zu stellen. Weiterhin tragen die Ergebnisse
      dieser Dissertation zu den wachsenden molekularen Ressourcen
      f¨ur die Weißtanne bei und haben dadurch, hoffentlich, einen
      Anteil an der erfolgreichen Vorhersage und am Management
      dieser wichtigen Baumart im Kontext rasanter
      Umweltver¨anderungen.