title: Investigating human TLX-LBD homodimerization and phenotypic consequences of TLX agonism in vitro employing a chemically diverse set of TLX modulators
Creators: name: Meijer, Isabelle Sophie
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Der Tailless homologe Rezeptor (TLX), ist ein orphan nukleärer Rezeptor, welcher eine Schlüssel-rolle bei der Regulierung von Neurogenese, Zellproliferation und der Aufrechterhaltung neuronaler Stamm- und Vorläuferzellen spielt. Eine Dysregulation von TLX wurde mit Glioblastomen in Verbindung gebracht, bei denen eine Überexpression von TLX Tumorwachstum und -entwicklung fördert und in Tierversuchen die Überlebenszeit in Mäusen deutlich reduziert. Im Gegensatz dazu wurden niedrige Level von TLX mit kognitiven und psychiatrischen Störungen assoziiert. Trotz seiner Bedeutung sind die Mechanismen und die biologische Funktion von TLX nur unzureichend verstanden, und bislang wurden nur wenige TLX-Agonisten und inverse Agonisten beschrieben. Die Entwicklung potenter und spezifischer chemischer Wirkstoffe bietet nicht nur vielversprechendes therapeutisches Potential, sondern trägt auch dazu bei, das Verständnis der Rolle von TLX in Gesundheit und Krankheit zu erweitern. In dieser Studie verwenden wir ein Set von 12 validierten TLX-Modulatoren, um die Auswirkungen auf TLX-Homodimerisierung sowie auf nachfolgende molekulare und phänotypische Effekte zu untersuchen. Dazu wird ein homogener Zeitaufgelöster FRET (HTRF) Versuch durchgeführt, um die Dynamik der TLX Homodimerisierung in einem zellfreien Kontext zu analysieren. Aufgereinigtes TLX-LBD wird, als FRET Donor Molekül verwendet, während das sGFP-TLX-LBD Fusionsprotein als FRET-Akzeptor dient. Die Dimerisierung wird sowohl unter apo Bedingungen als auch unter Anwesenheit der TLX-Liganden untersucht. Darüber hinaus untersuchen wir die nachgelagerten Effekte anhand von TLX-Modulation durch qPCR-Experimente. Veränderungen der mRNA-Expression von TLX und ausgewählten TLX-Zielgenen (PTEN, SIRT1 und TET3) werden in verschiedenen TLX exprimierenden Zelllinien, nämlich T98G Glioblastoma Zellen, retinale Pigmentepithel Zellen (ARPE19) und HEK293T Zellen, untersucht. Für die Phänotypisierung werden Zellwachstum und Viabilität in den Zelllinien ARPE19 und HEK293T orthogonal bewertet und mit der Lungenkrebs Zelllinie A549, die wenig bis kein TLX exprimiert, verglichen. Zusätzlich wird in T98G Zellen ein „Scratch-Wound“ Versuch durchgeführt, um das Migrationsverhalten der Zellen zu bewerten, wenn sie mit dem Set an TLX-Modulatoren behandelt werden. Wir identifizierten Verbindung 7 als stabilisierend für die TLX-LBD-Homodimerisierung, und zwar als siebenfach im Vergleich zur apo Kontrolle ohne Liganden. Im Gegensatz dazu zeigten die übrigen Verbindungen keine signifikanten Effekte auf die Dimerisierung. Trotz der Stabilisierung wies Verbindung 7 in umfassenden in vitro Bewertungen keine herausragenden Unterschiede im Vergleich zu den anderen TLX-Modulatoren auf. Die Analyse der Zielgenexpression über mehrere Zelllinien hinweg offenbarte einen dosisabhängigen Effekt bei Behandlung der Zellen mit Verbindung 8 (1 und 10 µM), insbesondere auf die TLX-Expression selbst. Jedoch stimmten die Gesamtergebnisse nicht mit früher veröffentlichten Resultaten überein. Bei der Bewertung der Konfluenz und Zell Viabilität beobachteten wir einen deutlichen Unterschied zwischen den zwei Hauptchemotypen: Verbindungen 4 bis 8, charakterisiert durch ein Chlorphenyl-(trifluoromethyl)phenyl)acetamid, und die Verbindungen 9 bis 12, die ein Dimethoxy-dihydro-isochinolin Gerüst aufweisen. Insgesamt waren die Verbindungen 4 bis 8 bis zu 10 µM gut verträglich, während die Verbindungen 9 bis 12 bereits bei deutlich niedrigeren Konzentrationen von 1 µM und darunter zytotoxische Effekte zeig-ten. Obwohl TLX-spezifische phänotypische Veränderungen in dieser Studie nicht bestätigt wer-den konnten, liefern diese Ergebnisse wertvolle Einblicke in die unterschiedlichen biologischen Effekte der beiden vertretenen Chemotypen. Diese Erkenntnisse könnten als Grundlage für zukünftige Struktur-/ Wirkung Beziehungsstudien (SAR) dienen und die zukünftig die gezielte Entwicklung von effektiven TLX-Modulatoren unterstützen.
description: Tailless homologue receptor (TLX), is an orphan nuclear receptor and a key regulator during neu-rogenesis, proliferation, and maintenance of neuronal stem and progenitor cells. Dysregulation of TLX has been implicated in glioblastoma, where its overexpression drives tumor growth and progression, reducing survival in mouse models. Conversely, reduced TLX expression levels have been associated with behavioral changes as well as cognitive and psychiatric disorders. Despite its importance, the mechanisms and TLX’s biological function remain poorly understood and to date only a few TLX modulators have been described. Developing potent and specific small molecules not only offers promising therapeutic potential but also advances our understanding of TLX’s biological roles in health as well as disease. In this study, we use a set of 12 validated TLX modulators to investigate the effects on TLX homodimerization and its downstream molecular and phenotypic effects. Therefore, a homogenous time-resolved FRET (HTRF) assay is performed to investigate TLX homodimerization dynamics in a cell-free context. Purified TLX-LBD is utilized as the FRET-donor while an sGFP-TLX-LBD fusion protein serves as the FRET-acceptor. Dimerization is analyzed under both apo conditions and in presence of the TLX modulators. Furthermore, we investigate downstream effects of TLX modula-tion by qPCR experiments. Changes in mRNA expression of TLX as well as selected TLX target genes (PTEN, SIRT1, and TET3) were assessed in multiple TLX expressing cell lines, namely T98G glioblastoma cells, retinal epithelial pigment (ARPE19) cells and HEK293T cells. For phenotypisation, cell confluence and viability are orthogonally assessed in ARPE19 and HEK293T cell lines compared to low to none TLX expressing lung cancer cell line A549. In addition, a scratch-wound assay is performed to assess cell migration in T98G upon treatment with the set of TLX modulators. Here, we identified compound 7 to stabilize TLX-LBD homodimer formation by seven-fold compared to the apo control lacking ligands. In comparison, the remaining compounds exhibited no significant effects on dimerization. However, compound 7 displayed no unique behavior during broader in vitro assessment compared to other TLX modulators. Target gene expression analysis across multiple cell lines revealed a dose-dependent effect upon treatment with compound 8 (1 and 10 µM), particularly on TLX expression itself. However, the overall results did not align with previously published results. When assessing confluence and cell viability, we observed a distinct difference between the two main chemotypes: compounds 4 to 8, characterized by a chloro-phenyl-(trifluoromethyl) phenyl) acetamide, and the compounds 9 to 12, which feature a di-methoxy-dihydro isoquinoline core. Overall, compounds 4 to 8 were well tolerated up to 10 µM, whereas compounds 9 to 12 exhibited cytotoxic effects at much lower concentrations as of 1 µM and below. While TLX specific phenotypic changes could not be confirmed in this study, these findings provided valuable insights into the differential biological effects of the two chemotypes. Such insights could inform further structure-activity relationship (SAR) studies and guide future efforts in the development of TLX modulators.