The next generation of anti-cytomegalovirus strategies: synergistic combinations of host-directed and direct-acting drugs
Anti-cytomegalovirale Strategien der nächsten Generation: synergistische Kombinationen von wirtsgerichteten und direkt-agierenden Wirkstoffen
Creators: name: Wild, Markus
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023

description: Human cytomegalovirus (HCMV) represents the number one infectious risk for unborn children, as well as a serious threat to immunocompromised patients. Current antiviral therapy faces challenges such as frequent side effects, lack of treatment during pregnancy, and the emergence of drug resistant virus mutants. To address these problems, a broad panel of host-directed antivirals inhibiting cyclin-dependent kinases (CDKs) were investigated, which showed suppression of HCMV replication in vitro. The CDK4/6 inhibitor abemaciclib was found to inhibit HCMV and murine cytomegalovirus (MCMV) in vitro and demonstrated antiviral activity in vivo in an MCMV mouse model. For comprehensive analysis of drug-drug interactions, a dual approach of Bliss independence checkerboard and Loewe additivity fixed-dose assay was established in primary human fibroblasts. A strong and consistent synergism was detected for combination treatment with CDK7 inhibitor LDC4297 and maribavir (MBV), a recently approved inhibitor of the viral CDK ortholog pUL97. This synergistic interaction could be confirmed in mouse, guinea pig and rhesus macaque CMV infection settings. Importantly, the hit combination MBV + LDC4297 was investigated in vivo, using a recombinant MCMV-UL97 to infect Balb/c mice. Read-outs of several organs yielded an initial proof-of-concept for the synergistic interaction of MBV + LDC4297 in vivo. Moreover, resistance formation analysis in long-term HCMV-infected fibroblasts showed no resistance-conferring mutations in LDC4297- or in combination-treated samples, in contrast to ganciclovir (resistance mutation UL97-L595F). The mechanistic basis of synergistic combinations was also investigated; all analyzed pUL97-CDK7 targeting combinations exhibited clear synergistic interaction, proving the independence of the synergism from inhibitor chemistry. Experiments employing an ORF-UL97 deleted HCMV strain confirmed the MBV + LDC4297 synergism to be pUL97-dependent and unconnected to secondary targets. Utilizing confocal imaging, the nucleocytoplasmic shuttling of HCMV protein pUL69 was shown not to be influenced by treatment with MBV, LDC4297 or their combination. Furthermore, the quantity of pUL97 and CDK7 was assessed on an infected single-cell level, revealing a significant decline of CDK7 levels as a result of synergistic drug treatment. A click reaction-based fluorescent labeling demonstrated a significant decrease of viral genomes in LDC4297-treated, but an increase in MBV-treated samples. Altogether, MBV + LDC4297 exhibited the most pronounced synergism within the analyzed combinations, which was confirmed in several cell systems in vitro, and in an MCMV mouse model in vivo. In summary, this thesis investigated CDK inhibitors as next-generation anti-HCMV drug candidates, with a special focus on combination treatments, which may have relevance for future drug development.
description: Das humane Cytomegalovirus (HCMV) stellt das häufigste infektionsbasierte Risiko für ungeborene Kinder, sowie eine ernsthafte Bedrohung für immunsupprimierte Patienten dar. Probleme wie häufige Nebenwirkungen, fehlende Behandlungsmöglichkeiten in der Schwangerschaft und das Auftreten von resistenten Virusmutanten erschweren die derzeitige antivirale Therapie. Um diese Probleme zu beheben, wurden wirtsgerichtete Substanzen gegen Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) untersucht, welche die HCMV-Replikation in vitro inhibierten. Der CDK4/6-Inhibitor Abemaciclib hemmte HCMV und das murine CMV (MCMV) in vitro und zeigte antivirale Aktivität in vivo in einem MCMV-Mausmodell. Für eine umfassende Untersuchung von Substanz-Wechselwirkungen wurde eine duale Herangehensweise aus den Bliss Checkerboard- und Loewe additivity-Assays in primären humanen Fibroblasten etabliert. Für die Kombination aus dem CDK7-Inhibitor LDC4297 und Maribavir (MBV), einem zugelassenen Inhibitor des viralen CDK-Orthologs pUL97, wurde ein statistisch signifikanter Synergismus nachgewiesen. Diese synergistische Wirkung wurde in Infektionen mit drei tierpathogenen CMVs bestätigt. Zusätzlich wurde die Hit-Kombination MBV + LDC4297 in vivo mit einem rekombinanten MCMV-UL97 untersucht. Analysen in verschiedenen Organen ergaben eine initiale Bestätigung der synergistischen Wirkung von MBV + LDC4297 in vivo. Eine Langzeit-Resistenz-Analyse in HCMV-infizierten Fibroblasten blieb für LDC4297 oder MBV + LDC4297 negativ, im Gegensatz zu Ganciclovir (Resistenzmutation UL97-L595F). Eine mechanistische Untersuchung synergistischer Kombinationen zeigte für alle analysierten Kombinationen aus pUL97- und CDK7-Inhibitoren eine Unabhängigkeit des Synergismus von chemischen Eigenschaften der Substanzen. Durch Experimente mit einem ORF-UL97-deletierten HCMV konnte aufgezeigt werden, dass der Synergismus abhängig von pUL97 und losgelöst von sekundären Targets ist. Das nucleo-cytoplasmatische Shuttling des HCMV-Proteins pUL69 wurde nicht durch MBV, LDC4297 oder deren Kombination beeinflusst, wie mithilfe Immunfluoreszenz-Mikroskopie herausgefunden wurde. Eine weitere konfokal-mikroskopische Analyse demonstrierte eine signifikante Abnahme an CDK7 als Ergebnis synergistischer Wirkstoff-Kombination in infizierten Zellen. Ein Fluoreszenz-markierungsansatz viraler Genome mittels Click-Reaktion offenbarte für neu synthetisierte DNA eine signifikante Abnahme in LDC4297-behandelten, jedoch eine Zunahme in MBV-behandelten Proben. Insgesamt wies die Kombination MBV + LDC4297 den ausgeprägtesten Synergismus auf, der in mehreren Zellsystemen in vitro und in einem MCMV-Mausmodell in vivo bestätigt werden konnte. Zusammenfassend charakterisierte diese Arbeit CDK-Inhibitoren als Anti-HCMV-Wirkstoffkandidaten der nächsten Generation mit einem speziellen Fokus auf Kombinationswirkung und potenzieller Relevanz für die Medikamentenentwicklung.