title: Auswirkungen einer PACAP-Gendefizienz auf Purkinjezell- Degeneration und Atrophie des Kleinhirns im Superoxiddismutase-1 Mausmodell der Amyotrophen Lateralsklerose
Creators: name: Burrichter, Jannik
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: PACAP
Medical sciences Medicine
Medizin
Amyotrophe Lateralsklerose
ALS
SOD1

description: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease. The main symptom is a loss of voluntary motor skills, caused by the continuous death of motor nerve cells in the cortex, brain stem and spinal cord. It is assumed that the pathology of ALS is not only limited to motor neurons, but is a multisystem network disease with characteristic impaired connectivity. Based on a genetic mutation that occurs in 20% of all hereditary ALS cases, the establishment of the superoxide dismutase 1 (SOD1) transgenic mouse model by Gurney et al. in 1994 contributed significantly to the elucidation of possible underlying pathomechanisms. The neuropeptide Pituitary-adenylate-cyclase-activating-polypeptide (PACAP) was initially isolated from the hypothalamus and belongs to a gene family that also includes the vasoactive intestinal polypeptide (VIP), secretin, the growth hormone (GH), as well as glucagon. PACAP has various neuroprotective, but also neuroinflammatory functions and effects on the CNS and is involved in acute and chronic neurodegenerative diseases such as ALS. This dissertation thesis dealt with the effects of a PACAP deficiency in the SOD1 (G93A) mouse model of ALS with a focus on microscopic and macroscopic changes of the cerebellum. For this purpose, the examined mouse groups either harbored the genetic SOD1 mutation, or a PACAP knockout, or both factors, and effects at the two measurement times of the presymptomatic stage (p60/70) and end stage (p120) were evaluated. Histologically, the Purkinje cells were counted and a possible macroscopic atrophy of the cerebellum (based on the transverse diameter and length) assessed with MRI. Finally, histological microtome sections were compared with the MRT diagnosis based on an area calculation in the sagittal plane. In the Purkinje cell analysis, neither a monofactorial SOD1 mutation, nor the sole PACAP knockout resulted in Purkinje cell death at either point in time. A simultaneous occurrence of the SOD1 mutation with an existing PACAP knockout (WT/KO vs. SOD1/KO) in the early stage led to a reduced Purkinje cell count. For the group SOD1/WT vs. SOD1/KO, this effect could not be proven, both in the early stage and endstage. The transverse diameter of the cerebellum calculated in the MRI showed significant macroscopic atrophy for the pure SOD1 mutation (WT / WT vs. SOD1 / WT) at the p60/70 and endstage time. For the sole PACAP knockout, this effect was not observed. In the calculated length of the cerebellum, however, only the group with the sole PACAP knockout (WT/WT p60/70 vs. WT/KO p60/70) was found to be significantly atrophic. This atrophy could not be replicated in the cerebellar length for the SOD1 mutation at p60/70 or endstage (WT/WT p60/70 vs. SOD1/WT p60/70 or SOD1/WT p60/70 vs. SOD1/WT endstage). These MRI results indicated a possible tissue destruction in the case of deficiency or a neuroprotective effect in the case of normal function, possibly also to the cell genesis and cell death of the cerebellum. Translated into humans, this diagnostic method could also be useful in ALS cerebellar diagnostics in vivo and may be used more forcefully in future studies. In the last step of this thesis it was compared to what extent a macroscopic atrophy can be assessed equally by histology and radiology by calculating the area of the SOD1-mutated and PACAP-deficient cerebellum. Histologically, the usability of an area calculation could only be proven in the presymptomatic ALS mice (p60/70 time point). Here, PACAP knockout mice showed significant cerebellar atrophy. In the PACAP knockout end-stage group, but also for the monofactor of the SOD1 mutation, however, this significance could not be confirmed at either time point. In the MRT area calculation, a significant atrophy of the cerebellum was detectable for both the PACAP knockout and SOD1 mutated animals at the p60/70 time point. Only the comparison between SOD1/WT p60/70 vs. SOD1/WT End showed no progression in surface atrophy. In summary, with both diagnostic methods, histology and MRI, there is the possibility of a meaningful analysis of the cerebellar surface in the early stages of ALS. In contrast to histology, an effect of the SOD1 mutation could also be clearly demonstrated with MRI. In addition, the undisputed advantage of MRI lies in the possibility of in vivo diagnostics, which can also be used for humans. Thus, in comparison to histological sectioning, the use of a radiological evaluation of the cerebellum in the SOD1 mouse model of ALS seems beneficial and could play a greater role in future research.
description: Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung. Hauptsymptom ist ein Verlust der Willkürmotorik, bedingt durch ein kontinuierliches Absterben motorischer Nervenzellen in Cortex, Hirnstamm und Rückenmark. Aktuell wird davon ausgegangen, dass sich die Pathologie der ALS nicht nur auf Motoneurone beschränkt, sondern es sich um eine multisystemische Netzwerkerkrankung mit charakteristischer, gestörter Konnektivität handelt. Basierend auf einer genetischen Mutation, die in 20% aller vererbbaren ALS Fälle auftritt, hat die Etablierung des Superoxiddismutase 1 (SOD1) - transgenen Mausmodells im Jahr 1994 durch Gurney et al. wesentlich zur Aufklärung möglicher zugrunde liegender Pathomechanismen beigetragen. Das Neuropeptid Pituitary-adenylate-cyclase-activating-polypeptide (deutsch: Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivierendes-Protein; PACAP) wurde initial aus dem Hypothalamus isoliert und gehört zu einer Genfamilie, der auch das Vasoaktive Intestinale Polypeptid (VIP), Secretin, das Wachstumshormon (GH) sowie Glucagon angehören. PACAP besitzt verschiedene neuroprotektive, aber auch neuroinflammatorische Funktionen und Auswirkungen auf das ZNS und ist in akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen wie der ALS eingebunden. Diese Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen einer PACAP-Defizienz im SOD1 (G93A)-Mausmodell der ALS mit Fokus auf mikro- sowie makroskopische Veränderungen im Kleinhirn. Hierzu besaßen die untersuchten Mausgruppen die genetische SOD1-Mutation, einen PACAP-Knockout oder beide Faktoren und es wurden Auswirkungen zu den zwei Messzeitpunkten des präsymptomatischen Stadiums (p60/70) und Endstadium (p120) ausgewertet. Histologisch wurden für die eingebundenen Kleinhirngewebeproben die Purkinjezellen gezählt sowie eine mögliche makroskopische Atrophie des Kleinhirns (anhand Querdurchmesser und Länge) im MRT beurteilt. Abschließend wurde ein Vergleich zwischen der histologischen Schnittführung durch das Mikrotom und der MRT-Diagnostik anhand einer Flächenberechnung im Sagittalschnitt unternommen. In der Purkinjezellanalyse führte eine monofaktorielle SOD1-Mutation oder der alleinige PACAP-Knockout zu beiden Messzeitpunkten zu keinem Purkinjezelluntergang im Vergleich zum Wildtyp. Das Vorhandensein der SOD1-Mutation bei bestehendem PACAP-Knockout (WT/KO vs. SOD1/KO) im Frühstadium führte zu einer verringerten Purkinjezellzahl. Beim Vergleich der Gruppen SOD1/WT vs. SOD1/KO trat dieser Effekt weder im Früh- und Endstadium auf. Der im MRT berechnete Querdurchmesser des Kleinhirns zeigte für die reine SOD1-Mutation (WT/WT vs. SOD1/WT) zum p60/70- und Endstadium-Zeitpunkt eine signifikante makroskopische Atrophie. Für den alleinigen PACAP-Knockout war dies im Querdurchmesser nicht zu beobachten. In der berechneten Länge des Kleinhirns zeigte sich hingegen nur die Gruppe des alleinigen PACAP-Knockouts (WT/WT p60/70 vs. WT/KO p60/70) als signifikant atroph. Diese Atrophie konnte in der Kleinhirnlänge nicht für die SOD1-Mutation zum p60/70- oder Endstadium-Zeitpunkt (WT/WT p60/70 vs. SOD1/WT p60/70 oder SOD1/WT p60/70 vs. SOD1/WT Endstadium) repliziert werden. Diese MRT-Ergebnisse deuteten auf einen möglichen Gewebeuntergang bei Defizienz bzw. neuroprotektive Wirkung bei normaler Funktion, möglicherweise auch auf die Zellgenese sowie den Zelluntergang des Kleinhirns, hin. Diese Diagnostikmethode könnte zudem, übertragen auf den Menschen, in der ALS-Kleinhirndiagnostik in vivo sinnvoll sein und für zukünftige Studien forciert genutzt werden. Im letzten Schritt dieser Arbeit wurde verglichen, inwieweit eine makroskopische Atrophie durch Flächenberechnung des SOD1-mutierten sowie PACAP-defizienten Kleinhirns gleichwertig durch Histologie und Radiologie beurteilt werden kann. Histologisch konnte die Nutzbarkeit einer Flächenberechnung für die ALS ausschließlich im präsymptomatischen ALS-Verlauf (p60/70-Zeitpunkt) bewiesen werden. Alleinig PACAP-Knockout Mäuse im ALS-Frühstadium (WT/KO p60/70) zeigten signifikant atrophe Kleinhirne in der Fläche. In der PACAP-Knockout-Endstadium-Gruppe, aber auch für den Monofaktor der SOD1-Mutation konnte zu beiden Messzeitpunkten diese Signifikanz nicht bestätigt werden. In der MRT-Flächenberechnung war zum p60/70-Zeitpunkt sowohl für die alleinig PACAP-Knockout-, als auch die SOD1-mutierten Tiere eine signifikante Atrophie des Kleinhirns nachweisbar. Alleinig der Unterschied von SOD1/WT p60/70 vs. SOD1/WT Endstadium zeigte keine Progredienz in der Flächenatrophie. Zusammenfassend erscheint mit beiden Diagnostikmethoden im Frühstadium der ALS eine Analyse der Kleinhirnfläche sinnvoll. Im Unterschied zu der histologischen Schnittführung war jedoch im MRT auch eine Wirkung durch die SOD1-Mutation eindeutig nachzuweisen. Zudem liegt der unumstrittene Vorteil der MRT bei der Möglichkeit der in vivo Diagnostik, welche auch für den Menschen anwendbar ist. Somit scheint im Vergleich zum bewährten histologischen Schnitt, die Nutzung der radiologischen Bewertung des Kleinhirns im SOD1-Mausmodell der Amyotrophen Lateralsklerose sinnvoll und könnte zukünftig eine größere Rolle in der Forschungsdiagnostik spielen.