title: Genetische und biochemische Analysen zur Regulation der Arp2/3-Komplex vermittelten F-Aktin-Plaque Bildung und Auflösung während der Myoblastenfusion von Drosophila melanogaster
title: Genitical and biochemical analyses to regulation of Arp2/3-complex dependent F-actin plaque formation and dissolution during myoblast fusion
Creators: name: Trinkewitz, Tatjana
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Myoblastenfusion , Arp2/3-Komplex
Zellkontakt
Drosophila
Depolymerisation
actin plaque formation
plaque dissolution
Scar-Komplex
Muskulatur
Biowissenschaften, Biologie
Scar-complex
myoblast fusion , Arp2/3-complex
Aktin-Plaque
Actin , Polymerisation

description: Myoblast fusion is a fundamental
      process during muscle formation of multicellular organisms.
      In Drosophila melanogaster the formation of somatic
      musculature occurs by the fusion of Founder Cells (FCs) and
      Fusion Competent Myoblasts (FCMs). After cell recognition and
      adhesion an adhesion ring is formed at the contact membranes,
      in which center an actin-rich core is arranged (Kesper et
      al., 2007). Life-imaging studies demonstrated the dynamic of
      these actin plaques. These are formed within 2 minutes and
      are dissolved shortly afterward. Mutant analyses show, that
      the Arp2/3-complex dependent actin polymerization is
      essential for myoblast fusion. Moreover based on the dynamic
      of actin plaques the depolymerization should also play an
      essential role. To study these F-actin based processes
      several approaches have been done. The Arp2/3 dependent
      plaque formation is regulated by the NPFs Scar/Wave and WASP
      in both cell types. Mutations in Scar/Wave as well as in the
      WASP dependent Arp2/3 activation lead to reduction of actin
      plaques, but not to losing of plaques formation (this thesis
      and Sens et al., 2010). Therefore additional components
      should be involved in this process, such as the
      actinmonomere- binding protein Profilin/Chicadee (Chic). The
      performed dosage experiments and protein interaction studies
      in this work indicate Chic as a component of both Scar/Wave
      and WASP dependent actin polymerization. Additionally an
      Arp2/3 regulator Ena/Vasp was identified to play a role
      during the myoblast fusion as well as during the muscle
      attachment to the epidermis. Another part of my work deals
      with the activation of Scar/Wave complex during myoblast
      fusion. These occurs merely trough the small GTPase Rac or
      results from a cooperation of Rac with components of the
      pentameric Scar/Wave complex. Drosophila genome harbors tree
      rac GTPases, while rac1 and rac2 play a redundant role during
      myoblast fusion. Expression of constitutive- active and
      dominant- negative constructs of Rac1 results in a strong
      fusion phenotype. Additionally double mutants of rac1 and
      rac2 show unfused myoblasts. Nevertheless in all mutants I
      could observe the formation of actin plaques. Moreover
      genetic and biochemical interaction studies in this thesis
      indicate an interaction of Rac with Chic, Scar/Wave, Sra1 and
      Kette. In order to detect activators and/or inactivators of
      both Rac GTPases, Yeast-Two-Hybrid screens were done with an
      activated form of Rac1 and Rac2. In this approach the Csk
      kinase and the actin binding protein WupA could be identified
      as potential interaction partners for Rac1. The last part of
      this work deals with the investigation of
      actin-depolymerizing components, which are involved in the
      membrane breakdown during the fusion. For this reason
      mutations of depolymerizing factor Cofilin/Twinstar (Tsr)
      were analyzed. Neither the homozygous tsr mutants nor the
      expression of activated/ inactivated Tsr cause fusion
      defects. Therefore I analyzed an additional cofactor,
      Aip1/Flare (Flr), in respect of its mRNA expression and
      perform double mutants with tsr. The localization of flr
      transcript could be detected in embryonic somatic musculature
      as well as in ovaries, in testis and in imaginal discs.
      However flr single mutants show no muscle defects. In tsr;
      flr double mutants a weak muscle phenotype could be observed;
      that indicates a potential collaboration of both proteins
      during muscle formation. To sum up the results it can be
      postulated that Tsr acts in redundancy with additional
      depolymerizing proteins.
description: Die Fusion der Myoblasten ist ein
      fundamentaler Prozess bei der Muskelbildung multizellulärer
      Organismen. Ein hierfür gut untersuchter Modellorganismus ist
      Drosophila melanogaster, bei welchem die Bildung der
      somatischen Muskulatur durch die Fusion von Founderzellen
      (FCs) und fusionskompetenten Myoblasten (FCMs) vollzogen
      wird. Das eigentliche Fusionsereignis wird durch das
      spezifische Erkennen und die Adhäsion der beiden
      Zellpopulationen mit Hilfe der Transmembranproteine
      eingeleitet. Anschließend wird das Signal intrazellulär an
      das Aktin-Zytoskelett weitergeleitet, was die Bildung der
      Fusionsporen und die Verschmelzung der Membranen zur Folge
      hat. Dabei wird an der Kontaktstelle der fusionierenden
      Myoblasten ein Adhäsionsring gebildet, in dessen Mitte sich
      ein Aktin-reiches Zentrum befindet (Kesper et al., 2007).
      Lebend-Untersuchungen haben gezeigt, dass sich dieser
      Aktin-Plaque sehr dynamisch verhält und innerhalb von zwei
      Minuten seine maximale Größe erreicht. Die Auflösung der
      Plaques dauert nur eine Minute. Mutantenanalysen zeigen, dass
      die Arp2/3-abhängige Aktin-Polymerisation essentiell für die
      Myoblastenfusion ist. Die Dynamik der Aktin-Plaques lässt
      zudem vermuten, dass die Depolymerisation ebenfalls eine
      entscheidende Rolle spielt. Um diese F-Aktin-basierten
      Prozesse genauer zu analysieren, wurden in dieser Arbeit
      mehrere Ansätze verfolgt. Die Arp2/3-abhängige Aktin-Plaque
      Bildung wird durch die NPFs Scar/Wave und WASP in FCs und
      FCMs reguliert. Mutationen in der Scar/Wave- als auch der
      WASP-abhängigen Arp2/3-Aktivierung resultieren in einer
      Reduktion der Aktin-Plaques, aber nicht in einem Verlust der
      Aktin-Plaque Bildung (diese Arbeit, Sens et al., 2010). Es
      wurde daher in dieser Arbeit nach weiteren Komponenten
      gesucht, die an der Aktin-Plaque Bildung beteiligt sind, wie
      z.B. das Aktinmonomer-bindende Protein Profilin/Chic (Chic).
      Die hier durchgeführten Dosisexperimente und
      Protein-Interaktionsstudien deuten daraufhin, dass Chic
      sowohl eine Komponente der Scar/Wave- als auch der
      WASP-abhängigen Aktin-Polymerisation ist. Des Weiteren konnte
      in diesem Zusammenhang der Arp2/3-Regulator Ena/VASP als eine
      mögliche neue Komponente der Arp2/3-vermittelten
      Aktin-Polymerisation während der Myoblastenfusion und der
      Muskelanheftung identifiziert werden. Ein weiterer Teil
      meiner Arbeit befasst sich mit der Aktivierung des
      Scar-Komplexes während der Myoblastenfusion. Dieser erfolgt
      durch die kleine Rho GTPase Rac bzw. durch ein Zusammenwirken
      von Rac mit den Komponenten des pentameren Scar-Komplexes. In
      Drosophila gibt es drei Rac GTPasen, von denen Rac1 und Rac2
      während der Myoblastenfusion redundant wirken. Die Expression
      der konstitutiv-aktiven und dominant-negativen Konstrukte von
      Rac1 resultiert in einem starken Fusionsphänotyp. Auch die
      Doppelmutanten für rac1- und rac2 zeigen unfusionierte
      Myoblasten. In allen Mutanten konnte ich noch die Bildung von
      Aktin-Plaques beobachten. Zudem zeigen die in dieser Arbeit
      durchgeführten biochemischen und genetischen
      Interaktionsstudien eine Interaktion von Rac mit Chic,
      Scar/Wave, Sra-1 und Kette. Um Aktivatoren bzw. Inaktivatoren
      für die beiden Rac GTPasen aufzudecken, wurde unter
      Verwendung der aktivierten Form von Rac1 und Rac2 ein
      globaler Hefe-2-Hybrid Screen durchgeführt. Unter den
      potentiellen Interaktionspartnern für Rac1 während der
      Myoblastenfusion konnten die Csk-Kinase und das
      Aktin-bindende Protein WupA identifiziert werden. Der letzte
      Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Suche nach
      Aktin-depolymerisierenden Komponenten, die am
      Membranzusammenbruch während der Fusion beteiligt sind. Dabei
      wurden Mutationen im Depolymerisierungsfaktor
      Cofilin/Twinstar (Tsr) auf Fusionsstörungen untersucht. Weder
      homozygote tsr-Mutanten zeigten Defekte in der Fusion der
      Myoblasten, noch die Expression von aktivierten bzw.
      inaktiviertem Tsr in Myoblasten. Daraufhin wurde ein weiterer
      Kofaktor, Aip1/Flare (Flr), bezüglich seiner mRNA-Expression
      analysiert und Doppelmutantenanalysen mit tsr durchgeführt.
      Die Lokalisation des flr Transkripts konnte dabei in der
      embryonalen somatischen Muskulatur nachgewiesen werden, sowie
      auch in den Ovarien, im Testis und in den Imaginalscheiben.
      Allerdings zeigen flr-Einzelmutanten keine Muskeldefekte. In
      tsr;flr-Doppelmutanten konnten jedoch schwache
      Muskelstörungen beobachtet werden, was auf ein potentielles
      Zusammenwirken der beiden Proteine während der Muskelbildung
      hindeutet. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Ergebnissen
      postulieren, dass Tsr in funktioneller Redundanz mit weiteren
      depolymerisierenden Proteinen wirkt.