Μελέτη της μοριακής δομής των παθογόνων παραγόντων που προκαλούν σπογγόμορφες εγκεφαλοπάθειες ανθρώπων και ζώων
Creators: name: Πετράκης, Σπύρος Ι.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: Παθογένεση
Σπαγγόμορφες εγκεφαλοπάθειες
Pathogenesis
Spongiform encephalopathia

description: Η παρούσα διατριβή έχει δύο σκέλη. Το κύριο σκέλος υπήρξε η απομόνωση και ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τη φυσιολογική ή τη παθολογική PrP. Στόχος ήταν η κατανόηση αφ' ενός του μηχανισμού μετατροπής στη μολυσματική ισομορφή, αφ' ετέρου του φυσιολογικού ρόλου της prion πρωτεΐνης. Παρ' όλο που διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις που έχουν πραγματοποιηθεί μέχρι σήμερα έχουν οδηγήσει στο χαρακτηρισμό αρκετών τέτοιων μακρομορίων, τόσο η διαδικασία σχηματισμού των prions όσο και η βιολογία της PrPC παραμένουν αδιευκρίνιστες. Γι' αυτό το λόγο, διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση της PrPC με πρωτεΐνες του εγκεφαλικού ιστού. Πιο συγκεκριμένα, εκτελέστηκαν πειράματα διπλής ανοσοκατακρήμνισης, παρουσία ή απουσία χημικών συνδετών, καθώς και χρωματογραφίας αγχιστείας ομογενοποιημάτων εγκεφάλου σε στήλες ακινητοποιημένης και αναδιπλωμένης PrP. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φυσιολογική prion πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με τη β4 υπομονάδα του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nAChR) καθώς και με πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης και του κυτταροσκελετού που σχετίζονται με τη δομή και λειτουργία των nAChR. Η συσχέτιση μεταξύ της PrPC και της β4 υπομονάδας nAChR μελετήθηκε περαιτέρω, με πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού, τα οποία έδειξαν ότι οι δύο πρωτεΐνες συνεκφράζονται στον εγκέφαλο και στο γαστρεντερικό σύστημα. Τέλος η πιθανή συμμετοχή της β4 υπομονάδας nAChR στην παθογένεση των ασθενειών prion μελετήθηκε με πειράματα βιοδοκιμασιών σε διαγονιδιακά ποντίκια που δεν εκφράζουν τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι τα διαγονιδιακά πειραματόζωα εμφανίζουν ελαφρά αυξημένους χρόνους επώασης της νόσου μετά από μόλυνση με prions και πιθανόν να σημαίνουν ότι οι nAChR παίζουν ρόλο στην πρόσληψη του παθογόνου παράγοντα κατά τα αρχικά στάδια της νόσου. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε η πρωτεϊνική σύσταση παθολογικών παρασκευασμάτων, εμπλουτισμένα στην PrPSc ισομορφή, προκειμένου να ταυτοποιηθούν πρωτεΐνες που συγκαθαρίζουν με τη μολυσματική PrP. Οι πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν, οδήγησαν στον χαρακτηρισμό αρκετών πρωτεϊνών της εξωκυτταρικής μήτρας που φαίνεται να σχετίζονται με την PrPSc. Στο δεύτερο σκέλος μελετήθηκε η πρωτεολυτική δράση του ιστοειδικού ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (tPA) σε φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστο Το πλασμινογόνο θεωρήθηκε το μόριο, το οποίο αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με την PrPSc και είναι ένας από τους πιθανούς μεταφορείς του μολυσματικού παράγοντα. Οι πειραματικές δοκιμασίες έδειξαν ότι το σύμπλοκο tPA/πλασμινογόνου μπορεί να πέψει τη φυσιολογική PrPC αλλά όχι την παθολογική PrPSc. Αυτά τα δεδομένα, σε συνδυασμό με πειράματα μόλυνσης σε μοντέλα διαγονιδιακών πειραματόζωων, δείχνουν ότι το σύμπλοκο tPA/πλασμινογόνου πιθανόν να έχει νευροπροστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη των ασθενειών prion Το πλασμινογόνο θεωρήθηκε το μόριο, το οποίο αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με την PrPSc και είναι ένας από τους πιθανούς μεταφορείς του μολυσματικού παράγοντα. Οι πειραματικές δοκιμασίες έδειξαν ότι το σύμπλοκο tPA/πλασμινογόνου μπορεί να πέψει τη φυσιολογική PrPC αλλά όχι την παθολογική PrPSc. Αυτά τα δεδομένα, σε συνδυασμό με πειράματα μόλυνσης σε μοντέλα διαγονιδιακών πειραματόζωων, δείχνουν ότι το σύμπλοκο tPA/πλασμινογόνου πιθανόν να έχει νευροπροστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη των ασθενειών prion
description: Introduction: Prion diseases are a group of neurodegenerative diseases including scrapie, BSE in animals and CJD in humans. The main event in these disorders is the conversion of the physiological prion protein, PrPC, to an abnormal isoform, denoted PrPSc. PrPSc polymerizes in extracellular aggregates that are detected as amyloid plaques, followed by the formation of vacuoles in brain. PrPC is expressed in most tissues, including brain, gastrointestinal tract and muscles but has still no apparent physiological role. The conversion mechanism to the pathological isoform also remains unknown but it is believed to be mediated by a host-encoded unknown macromolecule, termed protein X. The identification of proteins interacting with prion protein is of dual importance, in order to understand the biological role of PrPC and the conversion mechanism to PrPSc. Such molecules may be used in novel therapeutic approaches that would target on the inhibition of prion propagation or the reconstitution of PrP function during TSE pathogenesis. Aim of the study: The main aim of the study was the isolation and identification of proteins interacting with either PrPC or PrPSc in brain. We also studied the effect of a previously described PrP-related complex, the tPA/plasminogen system, in the metabolism of prion protein. Materials and methods: A proteomics approach was followed in order to characterize PrP-associated molecules. PrPC was immunoprecipitated from normal brain tissue, in the presence or absence of chemical cross-linkers. Cross-linkers were used to stabilize transient or permanent protein-protein interactions. The molecules co-precipitating with PrP were identified with either western blotting or lc/ms/ms analysis. In some cases, the association between the identified protein and PrPC was verified with double-label immunofluorescence in brain tissue and gastrointestinal tract. Additionally, recombinant PrP was expressed in E.coli with the insertion of a His-tag at the N-terminus. His-tagged PrP was immobilized on Ni-NTA agarose beads and on-column refolded. Brain homogenates were pre-cleared and passed through columns with immobilized PrP. Proteins with affinity for PrP were eluted from the column, analyzed in SDS-PAGE and stained non-specifically with Aurodye. The unknown molecules were identified using lc/ms/ms analysis. In order to characterize proteins co-purifying with the pathological isoform, PrPSc enriched samples from scrapie-infected brain tissue were prepared. The samples were treated with or without PK and analyzed in 2D electrophoresis. Proteins were detected with silver staining and identified with lc/ms/ms analysis. The effect of the tPA/plasminogen system on PrP metabolism was studied in in vitro experiments. Immunoprecipitated PrPC or PrPSc enriched samples were treated with exogenous tPA/plasminogen. The products of treatment were analyzed in SDS-PAGE and prion protein was detected with western blotting. The participation of some PrP-associated proteins in TSE pathogenesis was studied in bioassays. Knockout animals were challenged with prion agents and mice were monitored till the onset of the symptoms. The animals were sacrificed at terminal stages of the disease. PrPSc presence in brain of the animals was verified by immunohistochemistry or western blotting. Results: PrPC was immunoprecipitated from normal human brain homogenate. Homogenates were prepared in buffers containing non-ionic detergents in order not to disrupt the Detergent Resistant Microdomains (DRM) of the cellular membrane, where PrP is mainly located. The products were probed for the presence of several candidate proteins that had been previously identified from preliminary phage display experiments. The blots showed that β4 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) co-precipitates with PrPC. These results were verified with converse experiments which showed that PrPC is detected in β4 or α3 nAChR subunit immunoprecipitations. α3 along with β4 nAChR subunit form the α3β4 receptor that is expressed in the brain and the periphery. The association between PrPC and β4 nAChR subunit was further studied by double-label immunofluorescence. These experiments showed that both proteins co-localize in the brain and the epithelial cells of large bowel. A second set of experiments included PrPC immunoprecipitations with the use of chemical cross-linkers and affinity chromatography of normal brain homogenates on columns with immobilized and refolded recombinant PrP. Proteins forming complexes with PrP in the presence of cross-linkers and molecules binding to PrP/Ni-NTA columns were isolated and identified with lc/ms/ms analysis. The results showed that several membrane and cytoskeletal proteins, such as Na+, K+ ATPase α3 subunit, BASP1, CNPase, 14-3-3, creatine kinase, α-spectrin and β-actin display affinity for prion protein. The presence of some of them in the previous preparations was verified with western blotting. In order to characterize novel molecules co-purifying with the pathological isoform, PrPSc enriched samples were prepared and treated with or without PK. The samples were analyzed in 2D electrophoresis and either probed with antibodies against prion protein or stained with silver, to detect molecules associated with PrPSc. Several proteins were detected and some of them displayed resistance to PK treatment, as PrPSc Using the same techniques, we studied the effect of a proposed PrP-related complex, tPA/plasminogen in the metabolism of PrPC and PrPSc. Exogenous tPA/plasminogen digested PrPC at approximately position 110, resulting in the detection of an N-terminal and three C-terminal fragments by western blotting. On the other hand, tPA/plasminogen had no effect on PrPSc, as the pathological isoform was not digested. The final part of this thesis concerned the participation of tPA, plasminogen and β4 nAChR subunit in TSE pathogenesis. tPA, plasminogen or β4 nAChR deficient mice were inoculated with prion strains. tPA and plasminogen knockout mice displayed reduced incubation times, suggesting that these molecules have a neuroprotective effect during TSE pathogenesis. On the other hand, β4-/- mice showed slightly extended incubation time after intraperitoneal inoculation of RML prions. These results mean that α3β4 nAChR may play a role in the uptake of the infectious agent at the early stages of prion propagation. Conclusions: The results presented in this thesis suggest that PrPC participates in signal transduction, as it interacts with receptor subunits, transmembrane and cytoskeletal proteins. Prion protein may facilitate the formation of nAChRs in the central and peripheral nervous system. Interacting with proteins involved in signal transduction, it may regulate the function of these receptors. PrPSc co-purifies with proteins of the extracellular matrix. The presence of these proteins in infectious preparations suggests that they may play a role in the conversion mechanism of the physiological to the pathological isoform. The possible role of proteins associated with both PrPC and PrPSc in TSE pathogenesis, remains to be examined in bioassays with cell lines or transgenic animals