title: Fibrin for tissue engineering of cartilage
Creators: name: Eyrich, Daniela
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2006
Subjects: subject: Fibrin , Knorpel , Tissue Engineering , Insulin , Polyurethane , Zellkultur , Plastische Chirurgie , In-vitro-Kultur , In vivo , in vitro , bovin , human , fibrin , cartilage , tissue engineering , insulin , reconstructive surgery
subject: 540 Chemie

description: Since the beginning of the 1990s a plethora of research approaches towards cartilage engineering for plastic and reconstructive surgery have been undertaken. However, a general standard method for generation of cartilage tissue equivalent is still lacking. The goal of this thesis is based on the project �Bavarian Research Cooperation for Tissue Engineering and Rapid Prototyping� (ForTEPro) for development of individually customized implants for facial and reconstructive surgery. The main objective of this thesis was utilization of fibrin for tissue engineering of cartilage. Fibrin is a well-investigated medical device and has been used for over 20 years in clinical practice and surgery. Disintegration and solubility over time are taken as advantageous specific properties of fibrin glue when used as a sealant or for delivery of molecules, but for many tissue engineering based applications they represent a major problem. Therefore, specific fibrin parameters influencing gel appearance and stability were determined and a fibrin gel was developed that has a transparent appearance and is stable in size and shape under common cell culture conditions. These optimised fibrin gels showed a predominantly linear viscoelastic behaviour and withstood high mechanical loadings investigated by rheological measurements. The general suitability of the optimised fibrin gel for the use in cartilage engineering was demonstrated using primary bovine chondrocytes. Cells cultured within the gel remained round and vital, proliferated well and produced high amounts of extracellular matrix components. A minimum initial cell density was found that was required for the formation of a coherent matrix within 5 weeks. Furthermore, the optimised fibrin gels were evaluated for the suitability as surface material for culture of cells and were found to have a considerable advantageous effect on expansion of differentiated chondrocytes. The method of culturing bovine chondrocytes within the optimised fibrin gels could be successfully transferred to the use of human chondrocytes. However, generation of human cartilaginous tissue still represents a major challenge due to limited available cell number and development of smaller amounts of matrix components. Nevertheless, anabolic insulin was found to have tremendous enhancing effects on the development of extracellular matrix. In addition, combination of long-term stable fibrin gels and polymeric scaffolds was also investigated. Injection of a cell-fibrin suspension into newly developed polycaprolactone-based polyurethane scaffolds resulted in formation of adequate cartilaginous tissue, at the same time providing an added stability for the delicate process of implantation and for mechanical loading in vivo. Finally, a polycaprolactone-based scaffold in the shape of the cartilage part of an adult human ear was successfully seeded with chondrocytes suspended in fibrin gel. Though previous studies reported problems with construct shrinkage and deformation, in this experiment, construct size and shape was highly preserved within the culture period. In a further study, the potential of the composite constructs was investigated in detailed in vivo experiments. Small constructs implanted into the back of nude mice for up to 6 months showed formation of adequate new cartilaginous tissue. Remarkably, in vitro pre-culture of these constructs was demonstrated to have strong enhancing effects on further in vivo tissue development. Interestingly, a short in vitro pre-culture period of 1 week elicited the same results as a longer period of four weeks. This observation may have advantageous implications for future applications in clinical practise. In conclusion, within this thesis, a long-term stable fibrin gel was developed. The potential of this fibrin gel for application in cartilage engineering was demonstrated, using either bovine or delicate human chondrocytes. In combination with a solid polycaprolactone-based scaffold, a prototype of an individually customized cartilaginous construct in the shape of the external part of a human ear was generated in vitro. Disc-shaped composite constructs showed satisfying long-term development and maintenance of engineered cartilage after subcutaneous implantation in nude mice. In future, this system may result in fully functional individually shaped implants for cartilage regeneration.
description: Seit den 90er Jahren sind eine Fülle von vielversprechenden Strategien zum Tissue Engineering von Knorpel für die plastische und rekonstruktive Chirurgie aufgezeigt worden. Allerdings gibt es nach wie vor keine Standardmethode für die Generierung von knorpeligen Geweben. Die Ziele dieser Arbeit basieren auf dem Bayrischen Forschungsverbund für Tissue Engineering und Rapid Prototyping (ForTEPro) zur Entwicklung von patienten-individuellen Implantaten für die Rekonstruktionschirurgie. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Verwendung von Fibrin für das Tissue Engineering von Knorpel. Fibrin ist ein seit 20 Jahren in der Medizin weit verbreitetes Material. Während die typische Schrumpfung und Auflösung des Fibrins ein Vorteil für die Verwendung als Kleber oder für die Freisetzung von Molekülen ist, stellt es ein großes Problem für viele Anwendungen im Tissue Engineering dar. Aus diesem Grund wurden spezifische Parameter des Fibrins, die das Aussehen und die Stabilität des Gels beeinflussen, ermittelt. So wurde ein transparentes Gel entwickelt, das unter den gängigen Zellkulturbedingungen stabil ist. Dieses optimierte Fibringel besitzt ein überwiegend viskoelastisches Verhalten und hält hohen mechanischen Belastungen stand, was durch rheologische Messungen nachgewiesen wurde. Mit Hilfe von bovinen Knorpelzellen konnte die Eignung dieses optimierten Fibringels für die Anwendung im Tissue Engineering von Knorpel gezeigt werden. Im Gel suspendierte und kultivierte Zellen sind während des Kulturzeitraums rund und vital geblieben, proliferierten und produzierten große Mengen an Extrazellulärmatrixbestandteilen. Es wurde eine minimale Zelldichte ermittelt, die zur Bildung einer kohärenten Matrix innerhalb von 5 Wochen führte. Weiterhin zeigte das optimierte Fibringel als Oberflächenmaterial einen positiven Einfluss für die Vermehrung von differenzierten Knorpelzellen. Im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung konnte diese Kultivierungsmethode im optimierten Fibringel erfolgreich auf die Verwendung von humanen Knorpelzellen übertragen werden. Allerdings stellt die Generierung von humanen Knorpelgeweben durch die limitierte Menge an verfügbaren Zellen und die Bildung von geringeren Mengen an Extrazellulärmatrix eine deutlich größere Herausforderung dar. Es konnte aber gezeigt werden, dass anaboles Insulin die Produktion von humanen Matrixbestandteilen deutlich steigert. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Kombination des langzeitstabilen Fibringels mit einem Polymer-Zellträger untersucht. Die Injektion einer Suspension von Zellen in Fibrin in neu entwickelte Polycaprolacton-basierte Zellträger führte erfolgreich zur Bildung von Knorpelgewebe und besitzt gleichzeitig eine zusätzliche Stabilität für den Prozess der Implantation und die mechanischen Belastungen nach der Implantation. Weiterhin ist es mit dieser Methode gelungen, einen Polycaprolacton-basierten Zellträger in der Form des knorpeligen Anteils der humanen Ohrmuschel mit Knorpelzellen zu besiedeln. Anders als bei bisherigen Studien ist in dieser Untersuchung die Größe und schwierige Form des Ohrs exakt erhalten geblieben. Kleine Komposite zeigten auch nach bis zu 6 Monaten in der Nacktmaus die Bildung von zufriedenstellendem Knorpelgewebe. Bemerkenswerterweise förderte eine kurze in vitro Vorkultivierung deutlich die weitere in vivo Knorpelentwicklung. Allerdings führte eine Vorkultivierung von nur einer Woche zum gleichen Ergebnis im Vergleich zu 4 Wochen in vitro. Dies würde eine spätere klinische Anwendung deutlich vereinfachen. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass ein langzeitstabiles Fibringel entwickelt worden ist, das sich als geeignet für die Verwendung im Tissue Engineering von Knorpel herausgestellt hat, sowohl mit bovinen als auch mit humanen Knorpelzellen. In der Kombination mit einem soliden Zellträger ist es gelungen ein individuelles Knorpelkonstrukt in der Form der humanen Ohrmuschel in vitro zu generieren. Kleine Komposite zeigten eine zufriedenstellende Entwicklung und Langzeiterhaltung nach subkutaner Implantation in die Nacktmaus. Mit dieser Methode könnte es in Zukunft möglich sein, voll funktionsfähige individuell geformte Implantate für die Regenerierung von Knorpelgeweben herzustellen.