title: Molecular characterization and identification of genes involved in maize female gametophyte development
Creators: name: Srilunchang, Kanok-orn
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Mais , Weiblicher Gametophyt , Entwicklung , Genexpression , Reproduktion , Eizelle , Mais , Biologie , Gametophyte , Genregulation , Sumo , reproduction , egg cell , maize , biology , gametophyte , gene regulation , Sumo
subject: 580 Pflanzen (Botanik)

description: Megagametophyte development involves many fundamental phenomena, such as nuclear migration and fusion, polarity, cell death, asymmetric cell division, and cell fate specification. So far, very little is known about genes or gene products that regulate these cellular processes during female gametophyte (FG) development. To identify genes expressed in the FG, several advanced molecular approaches have been used. However, the establishment of powerful forward and genetic methods combined with several molecular markers toolkit now allows to study the processes that control FG development also in more detail in maize. By using several molecular techniques, such as RNA interference (RNAi) I could correlate defective phenotypes of maize FG development with various gene activities. Moreover, I have established a histological method to monitor embryo sac development defects occurring at early and late FG stages of transgenic RNAi plants. Subcellular protein localization studies complemented these experiments to visualize the various pattern during development and during the cell cycle. Following FG development in maize which produces an eight-nucleate embryo sac, the functional megaspore first has to undergo three nuclear divisions. This suggests that the basic cell cycle machinery is required, and any mutation in these cell cycle genes would likely disrupt nuclear division. Chapter 4 and Chapter 5 describe the different stages of maize FG development comparing wild-type with mutant phenotypes. In one study, I could show that knock-down of the MATH-BTB domain containing ZmMAB1 gene (Chapter 4) is required for the first nuclear divisions since embryo sac are arrested at the two-nucleate stage in mab1 mutants. Besides, the two nuclei were not properly segregated to each pole. This suggests that ZmMAB1 is essential for the second nuclear division and proper nuclei positioning. The knock-down of the diSUMO-like ZmDSUL gene (Chapter 5) causes the embryo sac to arrest at the eight-nucleate stage (FG5) and the immature embryo sac degenerated afterwards, indicating that ZmDSUL is an essential gene for progression of FG development. More interesting, some dsul mutant embryo sacs show unequally nuclei size and a fault of nuclei segregation towards the two poles. This indicates that ZmDSUL plays important roles in nuclear division and segregation/position, a prerequisite for cell fate specification. Similar to my studies, mutants of FG mitotic division that occur during megagametognesis (from FG1 to early FG5) were characterized in Arabidopsis by an unusual number of nuclei, or an aberrant distribution of nuclei in the developing embryo sac. Therefore, MAB1 and DSUL may control multiple steps to make sure that different development events are spatially and temporally coordinated during embryo sac formation. A member of the Mini-Chromosome-Maintenance protein family (PROLIFERA/MCM7) has been shown to be essential for FG development in Arabidopsis. I have therefore studied the role of maize ZmMCM6 (Chapter 2) whose transcripts where first detected in egg cells and strongly induced shortly after fertilization (our data, chapter 2). The effects on female site are mutants with small ears and sterile anthers on the male side. These suggested that ZmMCM6 is essential for plant growth and development. Gametophytic FG mutants can however also affect post-fertilization development. A mutant phenotype of this kind that depends on the genotype of the FG, but is independent of the paternal contribution, is referred to as a gametophytic maternal effect mutation. The mechanistic basis of such maternal effects varies and can be caused by mutations in genes that are expressed during FG development, but whose products are required after fertilization for embryo and/or endosperm development and which are generally imprinted. The instance of such a maternal effect gene in plants is the maternally imprinted medea (mea) gene. Embryo and endosperm derived from a mea mutant embryo sac show abnormal cell proliferation without fertilization leading to the formation of diploid endosperm tissue. Here I reported the molecular analysis of the imprintied polycomb group Fie genes in maize (Chapter 3). Fie genes were supposed to be involved in gene imprinting being differentially expressed from maternal and paternal alleles. We showed that Fie1 and Fie2 seemed to have distinct expression pattern and distinct function in FG development before and after fertilization. The Fie1 transcript was not detected in the individual gametes, while Fie2 transcript was detected in individual female gametes but not in the male gametes. However, since mutants of Fie1 and Fie2 are not available in maize, a detailed phenotypic study was not feasible.
description: Bei der Entwicklung des weiblichen Gametophyten während der Megagametogenese bei Blütenpflanzen (Angiospermen) finden grundsätzliche zellbiologische Prozesse wie Kernwanderung und �fusion, Etablierung von Polarität, Zelltod, asymmetrische Zellteilung und die Spezifizierung von Zellschicksalen statt. Bisher ist sehr wenig über die diese Prozesse regulierenden Gene bzw. Genprodukte bekannt. Um Gene zu identifizieren, die Schlüsselrollen bei oben genannten Prozessen spielen, wurden in vorhergehenden Arbeiten die Zellen des weiblichen Gametophyten (Embryosack) bei der Modell- und Nutzpflanze Mais isoliert und Transkriptomprofile erstellt. Aus diesen Profilen habe ich mehrere Gene für die detaillierte Erstellung von Expressionsprofilen und für Funktionsstudien selektiert. Kapitel 2 beschreibt das Mitglied (ZmMCM6) der Mini chromosome maintenance Proteinfamilie MCM, welche als DNA-Replikations-/Lizenzfaktoren den Zellzyklus kontrollieren. Ich habe das Expressionsmuster von ZmMCM6 im Embryosack vor und nach Befruchtung aufgezeigt und konnte durch ommunhistochemische Analysen zeigen dass ZmMCM6 Zellzyklus-abhängig zwischen Kern und Zytoplama hin und her wandert. Die Funktionsanalyse von ZmMCM6 zeigte pleiotrope Effekte und sowohl eine Rolle bei reproduktiven Prozessen der Blütenorganentwicklung als auch bei generellen vegetativen Wachstumsprozessen. Zellspezifische Knock-outs und Co-Immunpräzipitatinsexperimente sind zukünftig notwendig, um die Funktion von ZmMCM6 genauer zu definieren. In Kapitel 3 wird die Charakterisierung von zwei Polycomb-Gruppen Proteinen (Fie1 und Fie 2) beschrieben, von denen gezeigt wurde, dass Fie1 im Embryosack von Mais dem sog. Imprinting unterliegt. Ich habe das Expressionsmuster von beiden Genen in den Gameten von Mais untersucht und darüber hinaus durch MSRE-PCR (methylation sensitive restriction enzyme digestion-PCR) das Methylierungmuster in einzelnen Zellen untersucht. In zukünftigen Arbeiten sollten beide Gene einzeln ausgeschaltet und die erhaltenen Phänotypen untersucht werden. Darüber hinaus gilt es die Interaktionspartner zu identifizieren. Posttranslationalle Proteinmodifikationen scheinen eine große Rolle bei der Entwicklung und Funktion des weiblichen Gametophyten zu spielen. Kapitel 4 und Kapitel 5 beschäftigen sich mit zwei Genen für ein di-SUMO-ähnliches Protein (ZmDSUL) bzw. eines Cullin3-Komplex-Proteins mit MATH und BTB-Domäne (ZmMAB1). Während zahlreiche Proteine durch SUMOylierung modifiziert und in ihrer Aktivität verändert werden, sind MATH/BTB-Proteine vermutlich für die Substarterkennung bei der Ubiquitinierung wichtig. Durch RNAi-Silencing habe ich beide Gene ausgeschaltet und einen Arrest in der Embryosack-Entwicklung zum Stadium FG2 (ZmMAB1) bzw. FG5/6 (ZmDSUL) erhalten. Die erhaltenen Phänotypen zeigen Fehler bei der Kernpositionierung und Identität der Zellen des weiblichen Gametophyten. Insbesondere ZmDSUL wurde intensiver bearbeitet und sowohl die C-terminale Prozessierung, subzellulare Lokalisierung und Expression während der Embryosack-Entwicklung untersucht. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit erstmalig bei Mais Gene funktionell untersucht, die Schlüsselrollen bei den mitotischen Kernteilungen, der Kernpositionierung und der posttranslationalen Proteinmodifikation bei der Megagametogenese spielen. Weitere Arbeiten insbesondere zur Identifizierung der ZmMAB1- und ZmDSUL-Zielproteine sowie des interagierenden Proteoms sind jetzt notwendig, um die erhaltenen Phänotypen besser interpretieren zu können.