Προσδιορισμός ενδογενών μεταβολιτών στο βασιλικό πολτό με την τεχνική UPLC (HILIC) – MS/MS
Creators: name: Πίνα, Αθανασία-Χρυσοπηγή Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Βασιλικός πολτός
Μεταβολίτες
Φασματομετρία μαζών
Royal Jelly
Metabolites
Mass Spectrometry

description: Ο βασιλικός πολτός αποτελεί ένα υψηλής αξίας μελισσοκομικό προϊόν με αναγνωρισμένες διατροφικές και φαρμακολογικές ιδιότητες. Ο βασιλικός πολτός χρησιμοποιείται ευρέως σε ιατρικά προϊόντα και διατροφικά σκευάσματα. Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί σχετικά με τις βιολογικές δράσεις και τη χημική σύστασή του, αλλά οι πληροφορίες είναι αρκετά συγκεχυμένες, λόγω της εγγενούς μεταβλητότητάς του αλλά και λόγω των διαφορετικών αναλυτικών μεθόδων που εφαρμόζονται. Στην ανάλυση τροφίμων, η μεταβολομική ανάλυση έχει αναδειχθεί προσφάτως ως ένα εργαλείο για την αξιολόγηση της ποιότητας, της επεξεργασίας και της ασφάλειας των τροφίμων. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μια πολυδύναμη αναλυτική μέθοδος HILIC-MS/MS για τον αποτελεσματικό διαχωρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό, μικρών υδρόφιλων μορίων, ως επί το πλείστον, πρωτογενών ενώσεων. Η μέθοδος βασίστηκε στη συνδυαστική τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας Υπέρ Υψηλής Απόδοσης και διαδοχικής Φασματομετρίας Μαζών (UHPLC-MS/MS). Χρησιμοποιήθηκε ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό σε ένα τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας, που λειτουργούσε τόσο σε θετικό όσο και σε αρνητικό ιοντισμό, με εναλλαγή της πολικότητας. Η μέθοδος καλύπτει ταυτόχρονα όλες τις μεγάλες κατηγορίες βιοδραστικών ενώσεων, όπως αμινοξέα, σάκχαρα, μικρού μήκους οργανικά οξέα, νουκλεοσίδια, αμίνες και βιταμίνες. Η χρωματογραφία βελτιστοποιήθηκε ώστε να επιτευχθεί ο διαχωρισμός 88 ενώσεων σε χρονικό διάστημα 21 λεπτών. Η τεχνική σάρωσης που επιλέχθηκε ήταν η παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων θραυσματοποίησης ιόντων (MRM-MS/MS) για την ακριβή ποσοτικοποίηση των ενώσεων. Η χρωματογραφική στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ACQUITY BEH Amide ενώ οι κινητές φάσεις αποτελούνταν από μυρμηκικό αμμώνιο σε νερό και ακετονιτρίλιο με ρυθμό ροής 0,4 mL/min. Η μέθοδος επικυρώθηκε μελετώντας τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης, τα εύρη γραμμικότητας, την ακρίβεια και την πιστότητα. Η μέθοδος εφαρμόσθηκε για την ανάλυση δειγμάτων φρέσκου βασιλικού πολτού. Τα δείγματα του βασιλικού πολτού εκχυλίστηκαν με ένα μίγμα μεθανόλης-νερού, φυγοκεντρήθηκαν, αραιώθηκαν με ακετονιτρίλιο και διηθηθήκαν πριν την έγχυση. Συνολικά 125 δείγματα βασιλικού πολτού αναλύθηκαν με την αναπτυχθείσα μέθοδο HILIC-MS/MS. Τα δείγματα ταξινομήθηκαν ανάλογα με τα πειράματα τροφοδοσίας με σάκχαρα ή πρωτεΐνες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ενδογενών ενώσεων στα δείγματα βασιλικού πολτού, παρασκευάστηκε αντιπροσωπευτικό δείγμα, καθώς και κλάσματα αυτού, τα οποία εμβολιάστηκαν με πρότυπα διαλύματα των προσδιοριζόμενων ενώσεων και αναλύθηκαν με την αναπτυχθείσα HILIC-MS/MS μέθοδο, με τη χρήση της μεθόδου της σταθερής προσθήκης προτύπου. Για την αξιολόγηση της επίδρασης του υποστρώματος, έγινε σύγκριση των κλίσεων των ευθειών παλινδρόμησης, των καμπυλών αναφοράς με διαλύτη και των καμπυλών αναφοράς του υποστρώματος, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Student’s test. Ταξινόμηση των δειγμάτων του βασιλικού πολτού, σύμφωνα με τα πειράματα τροφοδοσίας, διεξήχθη χρησιμοποιώντας πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση, με βάση τη μεταβλητότητα των εμβαδών των κορυφών των υπό μελέτη ενώσεων, με σκοπό τη διερεύνηση των διαφορών στα μεταβολικά προφίλ των δειγμάτων.
description: Royal Jelly represents a high value food commodity with recognized nutraceutical and pharmacological properties. Royal Jelly has been widely used in commercial medical products and healthy foods. The chemical composition of royal jelly has been studied by several authors, but data available in the literature are highly variable due to the intrinsic variability of this bee product and the use of different analytical methods. In food science metabolomics have recently risen as a tool for quality of raw materials and final products. A HILIC-MS/MS method was developed for the efficient separation and quantification of small polar molecules, mostly primary metabolites. The method was based on an Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) separation system coupled with Electrospray Ionization (ESI) mass spectrometry on a triple quadrupole mass spectrometer, operation in both positive and negative ionization mode using polarity switching. The compound list included amino acids, sugars, organic acids, nucleosides, amines and vitamins. Chromatography was optimized to achieve separation of 88 selected metabolites over a period of 21 minutes. Multiple Reaction Monitoring (MRM) MS/MS mode was selected for accurate quantification. Chromatography was performed on an ACQUITY BEH Amide analytical column with a mobile phase of ammonium formate in water and acetonitrile, at a flow rate of 0,4 mL. The development process of this multi-analyte method included the selection of an appropriate mobile phase pH, the optimization of various parameters such as analyte retention time window, gradient program and MRM dwell time. The method was validated by studying the detection (LOD) and quantification limits (LOQ), the linearity ranges, the precision and accuracy of the analysis. The method found application in the analysis of crude royal jelly samples with the aim to provide additional information on this matrix primary metabolite content. Crude royal jelly samples were diluted with a mix of methanol and water, centrifuged, further diluted with acetonitrile and filtered before injection. A total of 125 crude royal jelly samples were analyzed with the developed HILIC-MS/MS method. The samples were divided in groups depending on sugar or protein feeding experiments. Standard addition approach was used in order to quantify the determined metabolites in royal jelly samples. To evaluate the matrix effect, a comparison of the slopes of the standard regression curves with those of the matrix-matched calibration curves, using the Student’s t-test was carried out. Classification of royal jelly samples according to the feeding experiments was carried out using multivariate statistical analysis (PCA, PLS-DA, OPLS-DA), based on the peak area variation of the metabolites studied, with the aim of investigating the differences in metabolic profiles.