Μελέτη του μορίου της LDL-χοληστερόλης με τη χρήση του Μικροσκοπίου Ατομικής Δύναμης (AFM):
Creators: name: Κανονίδου, Χριστίνα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2010
Subjects: Λιποπρωτεΐνες
AFM
Διεπιφάνειες
Lipoproteins
Interfaces

description: Η αξιοποίηση της μικροσκοπίας ατομικής δύναμης στη μελέτη κάποιων από τα πιο ενδιαφέροντα νανοσωματίδια που απαντώνται στον άνθρωπο, των λιποπρωτεϊνών, αποτελεί μία ερευνητική πρόκληση. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε με σκοπό: 1. να απεικονισθεί το σωματίδιο της LDL με το AFM χωρίς ειδική προετοιμασία του βιολογικού υλικού και 2. να μελετηθεί η αλληλεπίδρασή του με επιφάνειες υλικών. Στη μελέτη περιελήφθησαν τέσσερα υγιή νορμολιπιδαιμικά άτομα (μ.ό.ηλικίας 29,7±5,5 έτη). Το κλάσμα των LDL απομονώθηκε κατόπιν υπερφυγοκέντρησης του πλάσματος των συμμετεχόντων. Για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης με επιφάνειες εξετάστηκαν: 1. δύο διαφορετικά υποστρώματα με λείες, καθαρές επιφάνειες, διαφορετικής υδροφοβικότητας [HOPG, c-Si(100)], 2. διαφορετικές συγκεντρώσεις του διαλύματος των LDL (5, 15, 50 μg/ml), 3. διαφορετικοί χρόνοι εμβάπτισης (1h, 2h, 12h). Επομένως, έγινε έλεγχος τριών παραμέτρων και για να γίνουν κάθε φορά οι αναγκαίες συγκρίσεις οι δύο διατηρούνταν σταθερές. Οι εικόνες ελήφθησαν με την τεχνική της ταλαντούμενης ακίδας στον ατμοσφαιρικό αέρα. Χρησιμοποιήθηκε το Solver P47H Pro (NT-MDT). Με τη χρήση του HOPG κατέστη δυνατή η απεικόνιση των LDL και προσδιορίστηκαν οι διαστάσεις δομών που αποδόθηκαν σε μεμονωμένα LDL σωματίδια. Η διάμετρός τους μετρήθηκε περίπου 60-65 nm και το ύψος τους 10-12 nm. Διαπιστώθηκε επίσης η δημιουργία συσσωματωμάτων ορισμένα από τα οποία είχαν ιδιαίτερη μορφολογία (τετραμερή). Τα προσροφηθέντα σωματίδια κατέλειπαν μη επικαλυμμένες περιοχές πάνω στο υπόστρωμα και συσσωρεύονταν κυρίως στις θέσεις των steps. Το μέγεθος της προσρόφησης παρουσίασε θετική συσχέτιση με τη συγκέντρωση του διαλύματος που χρησιμοποιήθηκε, ενώ δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τους χρόνους που επιλέχθηκαν. Στο πυρίτιο διαπιστώνεται πλήρης κάλυψη του υποστρώματος μετά από 1h και 2h εμβάπτισης. Δημιουργούνται συσσωματώματα ποικίλου σχήματος και μεγέθους, που διασπείρονται σε όλη την επιφάνεια και δεν δείχνουν προτίμηση σχηματισμού σε κάποιες περιοχές. Με την αύξηση της συγκέντρωσης του διαλύματος αυξάνεται το μέγεθος των συσσωματωμάτων. Μετά από 12h εμβάπτισης παρατηρείται μείωση του μεγέθους των συσσωματωμάτων και ύπαρξη μικρών ακάλυπτων περιοχών. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να οφείλεται στην επεξεργασία που υφίστανται τα δείγματα πριν την απεικόνισή τους, με αποτέλεσμα η έκπλυση και η ξήρανσή τους να προκαλούν την κατακρήμνιση του στρώματος των λιποπρωτεϊνών που σχηματίζεται. Σε όλες της περιπτώσεις παρατηρήθηκε μετατόπιση των προσροφημένων σωματιδίων από την επίδραση της ακίδας κατά τη σάρωση, ένδειξη της ασθενούς αλληλεπίδρασης των LDL με τα μελετούμενα υποστρώματα. Με την τεχνική AFM, την επιλογή κατάλληλης συγκέντρωσης διαλύματος και υποστρώματος και μια απλή διαδικασία προετοιμασίας των δειγμάτων, είναι δυνατή η απεικόνιση των σωματιδίων της LDL. Τα μεγέθη των διαστάσεών τους φαίνεται να είναι υπερτιμημένα και το σχήμα τους αλλοιωμένο, πιθανότατα λόγω των δυνάμεων που ασκεί η ακίδα στα σωματίδια κατά τη σάρωση της επιφάνειας. Από τη μελέτη της αλληλεπίδρασης με επιφάνειες παρατηρείται διαφορετική συμπεριφορά σε υποστρώματα διαφορετικής υδροφοβικότητας. Σε όλες τις περιπτώσεις σχηματίζονται συσσωματώματα των LDL. Σημαντικό ρόλο στην προσρόφηση του βιολογικού υλικού φαίνεται να παίζουν η συγκέντρωση του διαλύματος και τα τοπογραφικά χαρακτηριστικά του υποστρώματος. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση του χρόνου εμβάπτισης, των συνθηκών σάρωσης (γεωμετρία ακίδας, ασκούμενη δύναμη, μετρήσεις σε υγρό μέσο ή ατμοσφαιρικό αέρα) και διαφόρων παθολογικών καταστάσεων στο σχήμα, το μέγεθος και τη συμπεριφορά των σωματιδίων της LDL.
description: The use of modern nanotechnology techniques and atomic force microscopy (AFM) in particular, in the study of some of the most interesting nanoparticles met in human, lipoproteins, remains a scientific challenge. The aim of the present study was: 1. to image LDL particle with the use of AFM without special sample preparation with fixation and 2. to investigate its interaction with material surfaces. Blood plasma was obtained from four healthy normolipidemic subjects (mean age 29,7±5,5 years). LDL fraction was isolated by ultracentrifugation. Experiments were performed: 1. on two different smooth and clean substrates of different hydrophobicity [HOPG and c-Si(100)], 2. with varying LDL concentrations (5, 15 and 50 μg/ml) and 3. at different incubation times (1h, 2h and 12h). Therefore, comparisons of results were made on three directions, each time keeping two of them constant. Measurements were performed with Solver P47H Pro (NT-MDT) using tapping mode in air. AFM images of LDL on HOPG were obtained and dimensions attributed to single LDL particles were determined. The lateral dimensions of these molecules were approximately 60-65 nm and their height 10-12 nm. Various LDL aggregates were discernible and some of them had a specific motif (tetramers). The particles demonstrated preferential accumulation at the HOPG steps and clean areas on the surface were observed. The adsorption increased with the increase of the solution concentration while no significant changes in the amount of LDL as a function of time was observed for the selected time periods. On the other hand, full c-Si surface coverage from the adsorbed LDL layer was observed after 1h and 2h of incubation. Lipoproteins formed clusters of different shape and size, without being aggregated on special morphology features. LDL solution concentration was positively correlated with grain size. After 12h of incubation the grain size seemed to be reduced and small uncovered areas were revealed. This may be due to the sample preparation before imaging which leads to the layer’s removal after being rinsed and dried. In all cases, the lipoproteins were displaced by the action of the tip which may be a manifestation of the weak LDL-substrate interactions. Using the AFM, the appropriate substrate and sample solution and a simple surface immobilization procedure, images allowing identification of LDL molecules can be obtained. Their dimensions are overestimated and their shape is changed due to the forces applied to them by the AFM tip. The adsorption seems to be dependent on the substrate wetting properties. It is also affected by LDL concentration and surface morphology. Further research is required in order to determine the effect of incubation time, AFM parameters (tip geometry, applied force, in ambient or liquid environment) and various pathological conditions on LDL shapes, sizes and biological behavior.