Ανάλυση επιγενετικών διεργασιών στη διαφοροποίηση ερυθρολευχαιμικών κυττάρων in vitro
Creators: name: Δακή, Ελισάβετ Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα (K562)
Ριβοσωμικές πρωτεΐνες
microRNAs (miRs)
Human erythroleukemia cell (K562)
Ribosomal proteins

description: Για τις ανάγκες των πειραμάτων αξιοποιήθηκε η ερυθρολευχαιμική κυτταρική σειρά των Κ562 ως πρότυπο μοντέλο. Διεξήχθησαν χρονοεξαρτώμενα πειράματα με διαφορετικούς επαγωγείς διαφοροποίησης και συγκεκριμένα HMBA, αιμίνη και βουτυρικό νάτριο σε κατάλληλες συγκεντρώσεις για επαγωγή της διαφοροποίησης. Αφού αξιολογήθηκε η δράση των ενώσεων-χημικών επαγωγέων ως προς την κυτταρική ανάπτυξη, το θάνατο και τη διαφοροποίηση, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA και σύνθεση cDNA προκειμένου να χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια σε ανάλυση qPCR για ποσοτικοποίηση της έκφρασης για miRs, αλλά και για συγκεκριμένα γονίδια ενδιαφέροντος. Τα αποτελέσματα που πάρθηκαν δείχνουν πως το ΗΜΒΑ ωθεί τα Κ562 κύτταρα στο μονοπάτι της μεγακαρυοποίησης, καθώς τα επίπεδα έκφρασης των σφαιρινών α και γ μειώνονται δραματικά στις 72 ώρες επώασης, εν αντιθέσει με την αιμίνη ή το βουτυρικό νάτριο όπου αυξάνονται. Τα miR-129-5p και miR-663a μειώνονται εξ αρχής στο 50% της έκφρασής τους. Το miR-1207-5p εμφανίζει επίσης μειωμένη έκφραση, σε υψηλότερα όμως επίπεδα. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες RPS19, RPS14, RPL35a, RPL5 και RPL10 εμφανίζουν ένα ιδιαίτερο μοτίβο αρχικής αύξησης της έκφρασής τους που ακολουθείται από μείωση των επιπέδων μετά από 72 ώρες. Κύρια γονίδια του κυτταρικού κύκλου όπως το CMYC και p53 μειώνονται, ανεξάρτητα μάλιστα από το p21, το οποίο αυξάνεται δραματικά και το ακολουθούν τα γονίδια των κασπασών 3 και 8. Η επώαση με αιμίνη στρέφει τα κύτταρα όπως είναι γνωστό προς ερυθροποίηση. Η έκφραση των miRs επηρεάζεται αφού παρατηρείται μείωση, ενώ η μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης καταγράφεται για το miR-129-5p και miR-1207-5p, παρουσία του επαγωγέα αιμίνη. Οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες ακολουθούν το ίδιο μοτίβο αυξομείωσης όπως και παρουσία του HMBA, με εξαίρεση τις RPL5 και RPL10 της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος, οι οποίες συνεχίζουν να υπερεκφράζονται και μετά τις 72ώρες. Αντίστοιχα, η έκφραση των γονιδίων p53 και p21 αυξάνονται με χρονοεξαρτώμενο τρόπο, όπως επίσης και η κασπάση 8. Αντίθετα, τα γονίδια CMYC και CDK2,4,6 εμφανίζουν μείωση της έκφρασής τους που είναι μεγαλύτερη μετά τις 72 ώρες. Τέλος, η επώαση με βουτυρικό νάτριο έδειξε να επηρεάζει αρκετά διαφορετικά τα προφίλ έκφρασης, με εντονότερη την αυξημένη έκφραση των σφαιρινών α και γ. Όλα τα μελετώμενα miRs αυξάνονται δραματικά στις 72 ώρες, με εντονότερο το miR-663-a. Επίσης, η έκφραση όλων των ριβοσωμικών πρωτεϊνών αυξάνεται, ιδίως των RPL5 και RPL10, ενώ των κασπασών 3,8 και 9 μειώνεται. Η έκφραση των γονιδίων των p21, p53 και CDK2,4,6 παρουσία βουτυρικού ομοιάζει με την έκφρασή τους παρουσία αιμίνης, ενώ το CMYC συμπεριφέρεται όπως και παρουσία του HMBA
description: In this MSc thesis, the erythroleukemia K562 cell line was used as a model. Time-dependent experiments were performed with three differentchemical inducers of differentiation, i.e. HMBA, hemin and sodium butyrate at appropriate concentrations to induce differentiation. After assessing the effect of these inducers on cell growth, death and differentiation, total RNA was isolated to proceed through cDNA synthesis into qPCR analysis of expression of specific miRs and genes of interest. The results obtained have shown that HMBA induces differentiation of cells in the pathway of megakaryopoiesis, as the expression levels of α and γ globins are dramatically reduced at 72 hours of incubation, as opposed of those achieved after treatment with either hemin or sodium butyrate. miR-129-5p and miR-663a are initially reduced to 50% of their expression, whereas decreased expression was also observed for miR-1207-5p but at higher level. The ribosomal proteins RPS19, RPS14, RPL35a, RPL5 and RPL10 have shown a biphasic expression pattern with an initial increase of their expression, followed by a decrease after 72 hours of incubation. Cell cycle-related genes, such as CMYC and p53, are reduced, irrespective of p21, whose expression levels dramatically increased at the same period. Similar reduction in the gene expression levels of caspases 3 and 8 were observed during the incubation by HMBA. Exposure of K562 cells to hemin has induced erythroid differentiation, as it is expected. The expression of miRs has been shown to down-regulated, but a greater decrease in expression is recorded for miR-129-5p and miR-1207-5p, in the presence of hemin. The ribosomal protein gene expression exhibited the same fluctuation pattern as upon the presence of HMBA, except that RPL5 and RPL10, two ribosomal proteins of the large subunit of the ribosome, that have shown to be overexpressed even after 72hours of incubation. Amongst the genes tested by qPCR, the analysis of p21 expression has shown the more dramatic increase upon hemin exposure in a time-dependent manner. Similar by significantly lower increase in their expression have been indicated for CASP8, CCND1, CASP3 and p53. On contrary, the gene expression of CMYC and CDK2,4,6 as well as BCL2 have shown a time-dependent decrease in their levels. Finally, incubation with sodium butyrate indicated to affect K562 cells quite differently gene by considering the expression profiles under investigation with a more pronounced increased mRNA level of the α and γ globins after 72 hours. Also, in K-562 cells all the miRs studied were increased dramatically after 72 hours exposure to sodium butyrate, with the miR-663-ato exhibit the greater alteration. Also, the expression of RPL5 and RPL10 has shown a substantial increase whereas the levels of RPS19, RPS14 and RPL35a, slightly increased after 72 hours of incubation. Moreover, the expression profile of p21 has shown an initial increase at 24 hours that lowers afterwards but still is much higher than that observed for untreated K562 cells after 72 hours. The expression level of CCND1 greatly increases after 72 hours whereas the level of CASP3,8,9, p53 and CDK2,4,6 decreases at the same exposure period