title: The role of TRPC1 in CA1 hippocampal neurons of the mouse
title: Die Rolle von TRPC1 in CA1-Neuronen des murinen Hippocampus
Creators: name: Kepura, Frauke
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: TRPC1
Patch-Clamp
Patch-clamp
Golgi
Naturwissenschaften
Mouse
Maus
Hippocampus
qRT-PCR

description: Die klassischen (classical)
      "transient receptor potential"-Kanäle (TRPC1-TRPC7) bilden
      eine Familie von nichtselektiven Kationenkanälen, die
      Phospholipase C-abhängig aktiviert werden und in
      verschiedensten Geweben exprimiert werden.(z.B. Chung et al.,
      2006). Funktionelle Kanäle bestehen aus vier Untereinheiten
      und die Bildung von homo- bzw. heteromultimeren Kanälen führt
      zu unterschiedlichen Regulations- und
      Permeationseigenschaften. Im heterologen System,
      heteromultimerisiert TRPC1 mit und modifiziert dadurch die
      Eigenschaften von TRPC4 und TRPC5 (Strübing et al., 2001). In
      CA1 hippocampalen Neuronen werden TRPC1, TRPC4 und TRPC5
      koexprimiert und in diesen Neuronen induziert die Aktivierung
      von Gq-koppelnden Rezeptoren einen Ca2+-abhängigen
      nichtselektiven Kationenstrom (ICAN; Congar et al., 1997). Es
      wird vermutet, dass TRPC-Kanäle an der Vermittlung des ICAN
      beteiligt sind, der Nachweis hierfür fehlt jedoch bis heute.
      Das Ziel dieser Arbeit war deshalb, zum einen die
      Charakteristika des Stroms zu beschreiben, der durch die
      Stimulation von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRI)
      mittels (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) in CA1-Neuronen
      des Hippocampus aktiviert wird. Zum anderen sollte die Rolle
      von TRPC1 bei der Vermittlung dieses Stromes analysiert
      werden, indem die Antworten zwischen Wildtyp- (WT) und
      homozygoter TRPC1-Knockoutmaus (TRPC1-/-) verglichen werden.
      TRPC1-/- Mäuse weisen keinen offensichtlichen Phänotyp auf
      (Dietrich et al., 2007) und die grobe Morphologie der
      hippocampalen Formation ist unverändert. Auf mikroskopischer
      Ebene zeigten CA1-Neurone der TRPC1-/- Maus, die mittels
      Golgi-Färbung markiert wurden, eine kleine jedoch
      signifikante Zunahme der Anzahl an Primärdendriten. Bei der
      Durchführung von Whole-Cell Voltage-Clamp Experimenten führte
      die Stimulation von mGluRI zur Generierung eines Stromes
      sowohl im WT als auch in der TRPC1-/- Maus. Die
      Strom-Spannungsbeziehung des DHPG-sensitiven Stroms war
      S-förmig (Min: -50 mV, Max: +40 mV, Umkehrpotential: -10 mV).
      Der Einwärtsstrom wurde durch extrazelluläre Kationen (Na+,
      Ca2+) getragen und durch die intrazelluläre Ca2+- und
      extrazelluläre Mg2+-Konzentration moduliert. Eine
      Besonderheit des ICAN war seine Spannungsabhängigkeit, da er
      ohne eine vorherige Depolarisation der Membran nicht
      induziert werden konnte und somit als Integrator von
      Rezeptoraktivierung und Membrandepolarisation fungierte
      (Koinzidenz). Der Hauptunterschied zwischen WT- und TRPC1-/-
      Maus war die signifikante Zunahme des Einwärtsstroms in
      Neuronen der TRPC1-/- Maus. Des Weiteren ergaben die
      durchgeführten Versuche, dass es erst zwei Wochen postnatal
      zu der beobachteten Zunahme des Stroms in der Knockoutmaus
      kam. Der Stromzuwachs resultierte nicht aus einer
      kompensatorischen Veränderung der Expression anderer
      TRPC-Isoformen in Neuronen der TRPC1-/- Maus. Die Analyse der
      Expressionslevel einzelner TRPC-Isoformen mithilfe der
      Isolation von mRNA aus hippocampalem Gewebe und qRT-PCR
      zeigte, dass das Vorkommen der Isoformen - mit Ausnahme von
      TRPC1 - vergleichbar war zwischen WT- und TRPC1-/- Maus. Um
      die physiologische Konsequenz des gesteigerten
      DHPG-sensitiven Einwärtsstroms in der TRPC1-/- Maus zu
      untersuchen, wurden Whole-Cell Current-Clamp Experimente
      durchgeführt. CA1-Neurone im WT und in der TRPC1-/- Maus
      wiesen ein vergleichbares Ruhemembranpotential auf. Die
      Stimulation von mGluRI im WT rief hauptsächlich eine schwache
      Zelldepolarisation und die Ausbildung bzw. Steigerung von
      Spikeaktivität hervor. Im Gegensatz dazu zeigten Neurone in
      der TRPC1-/- Maus induziert durch die Stimulation mit DHPG
      eine stärker ausgeprägte Depolarisation und eine größere
      Anzahl der Zellen, die sogenannte epilepsieartige Aktivität
      mit der Ausbildung von Plateaupotentialen (PP) aufwiesen.
      Eine schwache Strominjektion in der Anwesenheit des
      mGluRI-Agonisten erzeugte in Neuronen des WT entweder eine
      langsame Nachdepolarisation oder eine starke Depolarisation,
      die mit der Ausbildung von PP mit einer Dauer von bis zu 55 s
      nach Beendigung der Strominjektion einherging. Zusätzlich zu
      diesen Antworten zeigten Neurone in der TRPC1-/- Maus
      häufiger PP vergleichbar zum WT, jedoch signifikant kürzer in
      ihrer Dauer. Die dargestellten Ergebnisse legen die Vermutung
      nahe, dass TRPC1 eine negativ-regulatorische Funktion in CA1
      hippocampalen Neuronen übernimmt. Hierbei reduziert TRPC1,
      vermutlich durch die Bildung von heteromultimeren Kanälen mit
      TRPC4 und TRPC5, den nichtselektiven Kationeneinstrom, der
      durch die Stimulation von mGluRI aktiviert wird. Die Deletion
      von TRPC1 führt zu einer gesteigerten Anzahl der Neurone, die
      in Antwort auf eine Membrandepolarisation bei gleichzeitiger
      Aktivierung von mGluRI mit der Entwicklung von PP reagieren.
      Da PP in die Ausbildung epilepsieartiger Aktivität involviert
      sind, scheint die physiologische Rolle von TRPC1 eine
      Modulation der Zellerregbarkeit in CA1 hippocampalen Neuronen
      zu sein.
description: The classical or canonical
      &amp;amp;quot;transient receptor
      potential&amp;amp;quot; channels (TRPC1 - TRPC7) are a
      family of nonselective cation channels, that are activated in
      a phospholipase C-dependent manner and are expressed in many
      tissues, e. g. the brain (cortex, hippocampus, etc.; e. g.
      Chung et al., 2006). TRPC channels are thought to be
      tetrameric, and the assembly of different TRPC subunits into
      homo- and heteromultimers creates channels with different
      regulatory and physiological properties. In heterologous
      expression systems, TRPC1 heteromultimerizes with and
      modifies the properties of TRPC4 and TRPC5 (Strübing et al.,
      2001). In CA1 hippocampal neurons TRPC1, TRPC4 and TRPC5 are
      coexpressed and in these neurons, the activation of
      Gq-coupled receptors induces a Ca2+-activated nonselective
      cation current (ICAN; Congar et al., 1997). TRPC channels
      have been suggested to be involved in the generation of this
      current, but there is little hard evidence to support this.
      Therefore, the aim of this thesis was to characterize the
      properties of the cation current activated by stimulation of
      metabotropic glutamate receptors of type I (mGluRI) by
      (RS)-3,5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) in CA1 neurons of the
      murine hippocampus and to study the role of TRPC1 in the
      generation of this current by comparing the responses from
      wild type (TRPC1+/+) and homozygous TRPC1 knockout mice
      (TRPC1-/-). TRPC1-/-mice show no obvious phenotype (Dietrich
      et al., 2007), and the morphology of the hippocampus is
      largely unchanged. At the microscopical level, Golgi-stained
      CA1 neurons showed a small but significant increase in the
      number of primary branches. In whole-cell voltage-clamp
      recordings, the stimulation of mGluRI led to the development
      of a current in WT as well as in TRPC1-/- mice. The
      current-voltage relationship of the DHPG-sensitive current
      was S-shaped with a minimum at around -50 mV, a maximum at
      +40 mV and a reversal potential near -10 mV. The inward
      current was carried by extracellular cations like Na+ and
      Ca2+ and was modulated by the intracellular Ca2+ as well as
      the extracellular Mg2+ concentration. Interestingly, the ICAN
      in CA1 neurons was voltage-dependent. Therefore, the
      nonselective cation channel required activation of mGluRI and
      membrane depolarization to be activated, acting as a
      coincidence detector. The major difference between TRPC1+/+
      and TRPC1-/- neurons was a significant increase of the inward
      current in TRPC1-/- mice. Another finding was that the
      increase of the inward current in TRPC1-/- mice was
      detectable two weeks after birth. The larger current in
      TRPC1-/- mice is unlikely to result from a change in the
      expression patterns of TRPC isoforms. Expression levels of
      TRPC mRNAs in the whole hippocampus measured using
      quantitative real-time PCR were, with the exception of TRPC1,
      similar in WT and TRPC1-/- mice. To investigate the
      physiological consequences of the increased DHPG-sensitive
      inward current in TRPC1-/- mice, whole-cell current-clamp
      recordings were performed. CA1 neurons from WT and TRPC1-/-
      mice showed a comparable resting membrane potential. In most
      experiments, the stimulation of mGluRI in WT induced membrane
      depolarization leading to the generation of, or an increase
      in spike activity. In contrast, in TRPC1-/- mice, stimulation
      by DHPG led to stronger membrane depolarizations and to an
      increased tendency of these neurons to show so-called
      epileptiform activity associated with the generation of
      plateau potentials. In response to small current injections
      in the presence of the mGluRI agonist, TRPC1+/+ neurons
      showed a weak slow afterdepolarization or a stronger
      depolarization to a plateau potential which persisted up to
      55 s following the current injection. In addition to these
      patterns, neurons in TRPC1-/- mice mainly showed plateau
      potentials similar to that in TRPC1+/+ mice, but with a
      significantly shorter duration. In conclusion, this study
      showed that TRPC1 has a negative regulatory role in CA1
      hippocampal neurons where it reduces the inward nonselective
      cation current generated in response to mGluRI stimulation.
      This probably occurs as an effect of the formation of
      heteromultimeric channels with TRPC4 and TRPC5. Deletion of
      TRPC1 results in an increase of the number of neurons
      developing a plateau potential in response to simultaneous
      membrane depolarization and mGluRI activation. Since plateau
      potentials may be involved in the generation of epileptiform
      activity, the physiological role of TRPC1 may be the
      modulation of cell excitability in CA1 hippocampal
      neurons.