title: Heterogeneous MYCN amplification in neuroblastoma
Creators: name: Bogen, Dominik
Publisher: name: :none
Year: 2010

description: Unter den 110 MYCN amplifizierten (MNA) Neuroblastomen, die in den letzten 10 Jahren am CCRI analysiert wurden, befanden sich 26 Tumore mit variierender Anzahl von Tumorzellen oder Arealen ohne MNA. In Übereinstimmung mit den Richtlinien der INRG Biologie Gruppe wurden diese Tumore als „heterogen MYCN- amplifiziert (hetMNA)“ eingestuft. Da der genomische Hintergrund von hetMNA- Tumoren bis jetzt noch nicht beschrieben wurde, versuchten wir Gemeinsamkeiten in segmentalen und/oder nummerischen Aberrationen (SCA und/oder NCA) zu finden. Von bis zu vier Tumorstücken vom selben hetMNA Tumor von fünf Patienten wurden Kryoschnitte angefertigt. Insgesamt wurden 13 Stücke mit Interphase FISH (I-FISH) analysiert und ihre DNA zur Aufklärung des genomischen Hintergrunds in hetMNA Tumoren mit MLPA und SNP Arrays untersucht. MYCN-Heterogenität wurde mit I-FISH detektiert und in Kombination mit der DDX1-Sonde angewendet um die Amplikonzusammensetzung festzustellen. γH2AX- Färbung mit anschließende MYCN FISH wurde durchgeführt um das Auftreten von DNA-Doppelstrangbrüchen mit MNA zu korrelieren. Die Quantifizierung der Signale auf den Schnitten wurde mit einem automatischen Aufnahmesystem durchgeführt. Alle analysierten hetMNA-Tumore zeigten NCAs, wobei zwei Proben von je zwei Patienten nur NCAs zeigten, sechs Stücke von vier Tumoren zweier weiteren Patienten wiesen zusätzlich unterschiedliche SCAs auf. Drei von vier Stücken von einem Patienten zeigten ebenfalls nur NCAs, das vierte eine SCA. Zahlreiche Chromosomen waren überrepräsentiert. MNA wurde in je einem Tumorstück von vier Patienten mit MLPA und/oder SNP Arrays bestätigt, während der fünfte MNA nur mit MYCN-FISH zeigte. In einem Tumor wurde Heterogenität in der Amplikonzusammensetzung bewiesen und ein anderer zeigte zwei unterschiedliche 1p-Bruchstellen in vier Stücken. Das Muster der γH2AX-Färbung korrelierte bedingt mit MNA-Tumorzellen. Unsere Daten belegten die Existenz von mehreren Tumorzellklonen und zum Teil unterschiedlichen Amplikons im gleichen Tumor. Mit der angewendeten Auflösung konnte jedoch keine SCA-Gemeinsamkeit gefunden werden, welche MNA bedingen könnte. Es konnten keine eindeutigen Rückschlüsse gezogen werden, dass genomische Instabilität MNA auslöst. Wir können die Notwendigkeit einer detaillierten Tumoraufarbeitung mit I-FISH und DNA-basierenden Techniken, wie sie von der International Neuroblastoma Research Group (INRG) Biology Group vorgeschlagen wird, nur bestätigen, um Heterogenität festzustellen.
description: Among 110 MYCN amplified neuroblastomas analyzed at the CCRI in the last decade, 26 tumors contained a varying number of tumor cells/areas without MNA, defined as heterogeneous MYCN amplification (hetMNA) according to INRG biology guidelines. Since the genomic background of hetMNA tumors has not yet been described, we looked for common segmental and/or numerical chromosome aberrations and genetic instability as initiators for amplicon formation. Up to four tumor pieces of the same hetMNA tumor from five patients were cryosectioned. In total, thirteen pieces were analyzed by I-FISH and their DNA was analyzed by MLPA and 250k SNP arrays to investigate the genomic background of hetMNA tumors. MYCN I-FISH was performed to detect MYCN heterogeneity and combined with DDX1 probes to assess the amplicon composition. γH2AX staining and subsequent MYCN FISH was performed to correlate DNA double strand breaks occurrence with MNA. Quantification of signals on the sections was done with an automatic device. All analyzed hetMNA tumors showed NCAs, two samples from two patients each showed only NCAs; six pieces from four tumors from two patients displayed a variety of inconsistent, additional SCAs. Three of four pieces from one tumor had only NCAs, the fourth one SCA. Numerous chromosomes were unitarily found overrepresented. MNA was confirmed in four tumor pieces of four patients by MLPA/SNP arrays, the fifth showed MNA only in its MYCN FISH results. One tumor revealed different amplicon compositions in the same piece and another showed two 1p-breakpoints in four pieces. γH2AX staining pattern only partially correlated with MNA cells. Our data indicates the existence of multiple tumor cell clones and different amplicons in single hetMNA NBs. At the applied resolution, no common SCA is found to be underlying MNA not excluding subtle genomic changes and mutations. A conclusion on genetic instability as a cause for MNA is premature. Our data strongly supports a detailed tumor work up and the application of both I-FISH and DNA-based techniques as recommended by the INRG.