Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός των γονιδίων δυο εστερασών (καρβοξυλεστεράση και φωσφολιπάση D) στο βακτήριο Thermus Thermophilus
Creators: name: Δικαίος, Ιωάννης Αλεξάνδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Υδρολάση
Εστεράση
Thermus Thermophilus
Hydrolase
Esterase

description: Η σύνθεση συγκεκριμένων προϊόντων από ένζυμα είναι μια από τις θεμελιώδεις πτυχές της σύγχρονης βιοτεχνολογίας. Μια από τις περισσότερο αξιοποιήσιμες και σημαντικές κατηγορίες βιοκαταλυτών είναι οι υδρολάσες καρβοξυλικών εστέρων (E.C. 3.1.1.x). Οι υδρολάσες καρβοξυλικών εστέρων είναι ένζυμα με χαρακτηριστική α/β δομή υδρολάσης, τα οποία έχουν βρεθεί σε διάφορους οργανισμούς. Παρουσία νερού, καταλύουν την υδρόλυση εστερικών δεσμών οδηγώντας στην δημιουργία μιας αλκοόλης και ενός καρβοξυλικού οξέος. Υπάρχουν δυο πολύ γνωστές κατηγορίες ενζύμων στην οικογένεια των υδρολασών καρβοξυλικών εστέρων: οι εστεράσες και οι λιπάσες. Οι εστεράσες διαφέρουν από τις λιπάσες στο γεγονός ότι δείχνουν εξειδίκευση σε εστέρες μικρού μήκους αλυσίδας. Οι υδρολάσες έχουν πολλές εφαρμογές ιατρική βιοτεχνολογία, στη βιομηχανία απορρυπαντικών, στην οργανική σύνθεση, στην παραγωγή biodiesel, στη σύνθεση τεχνητών αρωματικών ουσιών και σε άλλες διαδικασίες στη βιομηχανία τροφίμων. Οι περισσότερες υδρολάσες οι οποίες χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία προέρχονται από μεσόφιλα. Ο αριθμός των υδρολασών που έχουν απομονωθεί από θερμόφιλους οργανισμούς είναι αρκετά μικρότερος. Στην παρούσα εργασία σκοπός είναι η κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός δυο γονιδίων (TTHA1705 και ΤΤΗΑ1187) από το στέλεχος HB8 του θερμόφιλου οργανισμού Thermus Thermophilus, ως εστεράση / λιπάση και φωσφολιπάση D αντίστοιχα. Πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση του γενώματος του T. thermophilus ΗΒ8, για την εύρεση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με α/β δομή υδρολάσης. Επιλέχθηκαν δυο γονίδια: το ΤΤΗΑ1705 και το ΤΤΗΑ1187. Ακολούθησε κλωνοποίηση των γονιδίων, έλεγχος με ενδονουκλεάσες περιορισμού και αλληλούχιση των κλωνοποιημένων γονιδίων. Πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση του γονιδίου της εστεράσης/λιπάσης (TTHA1705) του T. thermophilus από κύτταρα E. coli με πολύ καλή απόδοση παραγόμενης πρωτεΐνης. Η υπερέκφραση της ανασυνδυασμένη εστεράσης/λιπάσης εξακριβώθηκε με ανοσοαποτύπωση με αντίσωμα His-probe. Ακολούθησε παραγωγή της πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα καθώς και καθαρισμός της με στήλη Ni-IDA, σε ένα στάδιο καθαρισμού, με ικανοποιητική απόδοση. Για τον χαρακτηρισμό του ενζύμου προσδιορίστηκε η Km έναντι των υποστρωμάτων pNPB, pNPΟ και pNPL. Εξακριβώθηκε ότι το παραγόμενο ένζυμο είναι καρβοξυλεστεράση καθώς η δραστικότητα του ενζύμου έναντι του pNPΟ είναι σημαντικά μεγαλύτερη σε σχέση με τις αντίστοιχες έναντι των pNPL και pNPB. Το ένζυμο έχει μεγαλύτερη συγγένεια ως προς τους εστέρες του οκτανοϊκού οξέος. Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της παραγόμενης καρβοξυλεστεράσης είναι οι 100οC και εμφανίζει μεγάλη θερμοσταθερότητα στους 75 οC (επώαση 6 ωρών, 89% δραστικότητα).
description: The synthesis of specific products by enzymes is a fundamental aspect of modern biotechnology. One of the industrially most exploited and important groups of biocatalysts are the carboxylic ester hydrolases (EC 3.1.1.X). Carboxylic ester hydrolases are ubiquitous enzymes with α/β-hydrolase fold, which have been identified in all domains of life. In the presence of water, they catalyze the hydrolysis of an ester-bond resulting in the formation of an alcohol and a carboxylic acid. There are two well-known groups within the family of carboxylic ester hydrolases: lipases and esterases. Esterases differ from lipases in that they show a preference for short chain acyl esters. Hydrolases have many applications in medical biotechnology, detergent production, organic synthesis, biodiesel (methyl-ester) production, flavor and aroma synthesis, and other food related processes. Most hydrolases used in industry are from mesophiles. Hydrolases have only been isolated from a small number of thermophiles. The aim of this thesis is the cloning and characterization of two genes (TTHA1705 και ΤΤΗΑ1187) from the HB8 strain of Thermus Thermophilus, as an esterase/lipase and phospholipase D. Bioinformatics analysis of the genome of T. thermophilus HB8 was performed in order to find genes encoding proteins with a / b hydrolase structure. Two genes were selected: TTHA1705 and TTHA1187. Cloning of genes, check with restriction endonucleases and sequencing of the cloned genes were performed. Overexpression of TTHA1705 gene from E. coli cells was performed with a very good yield in produced protein. Overexpression of recombinant esterase / lipase was verified by immunoblotting with antibody His-probe. Protein production on a large scale and its purification by Ni-IDA column, were performed in one purification step, with satisfactory performance. For the characterization of the enzyme Km was determined towards pNPB, pNPO and pNPL substrates. We confirmed that the enzyme is produced as a carboxylesterase since the enzyme activity versus pNPO is significantly greater than in the corresponding over pNPL and pNPB. The enzyme has a higher affinity for the esters of octanoic acid. The optimum action temperature of the produced carboxylesterase is 100°C, showing a high thermostability at 75°C (6-hour incubation, remaining activity 89%).