title: Analyses of the archaeal transcription cycle reveal a mosaic of eukaryotic RNA polymerase II and III-like features
Creators: name: Spitalny, Patrizia
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Biochemie , Molekularbiologie , RNS-Polymerase II , RNS-Polymerase III , Archaebakterien , Transkription , Pyrococcus furiosus , , biochemistry , molecular biology , RNA polymerase II , RNA polymerase III , archaea
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: Novel mechanistic properties of the archaeal transcription system that reveal similarities especially to the eukaryotic RNA polymerase II and III systems were presented in thesis. The in vitro transcription system from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus provided the basis for the studies of the archaeal transcription cycle in the present work. To obtain a detailed view on the dimensional parameters of the archaeal RNA polymerase during the transition from initiation to elongation, transcription complexes were paused in several registers from +5 to +20 by the use of C-minus cassettes. Exonuclease III footprinting analyses showed the RNA polymerase in close contact to the transcription factors TBP and TFB until a first structural transition in registers +6/+7 leads to a detectable upstream end of the RNAP. A second structural transition, observed in registers +10/+11, is characterized by bubble reclosure in the upstream part of the initially melted region and the first movement of the RNA polymerase downstream edge. RNA synthesis proceedes synchronously in early elongation between registers +11 and +20. The size of the transcription bubble in early elongation complexes is around 16 nucleotides and the RNA-DNA hybrid is about 9 bp in length. The RNA polymerase covers 26-29 bp of DNA and the distance of the catalytic center to the front edge of the RNA polymerase is approximately 12 bp. Based on structural data on the eukaryotic RNA polymerase II, a structure-function analysis of Pyrococcus furiosus RNA polymerase mutants was performed. It elucidated the influence of structural polymerase elements on different stages of the transcription cycle. Recombinant archaeal RNA polymerases each carrying a deletion of one of four prominent cleft loops, named lid, rudder, fork1 and fork2, and three other RNAPs with point mutations were analysed. The delta rudder enzyme was demonstrated to be defective in open complex formation indicating an important role of the rudder loop in strand separation and/or maintainence of the transcription bubble. Experiments with templates containing a mismatch bubble resulted in predominant transcripts of 11 and 12 nucleotides. It could be demonstrated that a minimal length of 27 nt downstream of the bubble is required for promoter escape and transcription past the barrier. The complete archaeal histone gene from Pyrococcus furiosus with its adjacent four consecutive oligo-dT streches was used as a model system to address the question of termination mechanisms in hyperthermophilic Archaea. At 90°C the archaeal RNA polymerase terminated with high efficiency at the first oligo-dT sequence when it contains at least 5 T residues. Possible hairpin formation has no influence on termination efficency. Template competition experiments revealed the existence of a pol III-like terminationdependent reinitiation mechanism in the archaeal transcription system. Mutations of the sequences immediately downstream of the first termination signal dramatically affect the reinitiation mechanism.
description: Die vorliegende Arbeit führt zu neuen Einblicken in den Mechanismus des archaeellen Transkriptionssystems und offenbart Ähnlichkeiten insbesondere zu den eukaryotischen RNA Polymerase II und III Systemen. Das in vitro Transkriptionssystem des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus bildete die Grundlage für die Untersuchung des archaeellen Transkriptionszyklus in dieser Arbeit. Um ein detailiertes Bild von den strukturellen Eckdaten einer archaeellen RNA Polymerase während des Übergangs von der Initiation zur Elongation zu erhalten, wurden Transkripitonskomplexe in verschieden Registern zwischen +5 und +20 mit Hilfe von Cminus Kassetten pausiert. Die Analyse der pausierten Komplexe mit Exonuklease III zeigte, dass die RNA Polymerase in engem Kontakt zu den Transkriptionsfaktoren TBP und TFB steht, bis ein erster struktureller Übergang in den Registern +6/+7 ein Ablösen der RNAP von den Faktoren erkennen lässt. Das Schließen der Transkriptionsblase im stromaufwärts gelegenen Bereich der initial geöffneten Region und eine erste Vorwärtsbewegung des vorderen Endes der RNA Polymerase charakterisieren einen zweiten strukturellen Übergang in den Registern +10/+11. Zwischen den Registern +11 und +20 der frühen Elongationsphase läuft die RNA Synthese synchron. Im frühen Elongationskomplex hat die Transkriptionsblase eine Ausdehnung von etwa 16 Nukleotiden und das RNA-DNA Hybrid ist ungefähr 9 bp lang. Die RNA Polymerase Bindestelle umfasst 26-29 bp der DNA und der Abstand vom aktiven Zentrum zum stromabwärts gelegenen Ende der RNA Polymerase beträgt etwa 12 bp. Eine auf Strukturdaten der eukaryotischen Polymerase II beruhende Struktur-Funktions- Analyse von Pyrococcus furiosus RNA Polymerase Mutanten beleuchtete den Einfluß struktureller Elemente der RNA Polymerase auf verschiedene Phasen im Transkriptionszyklus. Rekombinante archaeelle RNA Polymerasen, von denen jede eine Deletion einer der vier aus der RNA Polymerase Spalte hervorstehende Schleifen, lid, rudder, fork1 und fork2, trug sowie drei andere RNA Polymerasen mit Punktmutationen wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das delta rudder Enzym keinen offenen Komplex ausbilden konnte, was auf eine wichtige Rolle dieser Struktur in Strangtrennung und/oder Erhaltung der Transkriptionsblase hindeutet. Experimente mit einer Matrize, die einen vorgeöffneten Promotor enthält, brachten hauptsächlich vorzeitig abbrechende Transkripte von 11 und 12 Nukleotiden Länge hervor. Es konnte gezeigt werden, dass eine minimale Länge von 27 bp der DNA stromabwärts des Heteroduplexbereichs benötigt wird, damit die RNA Polymerase diese Barriere überwinden und Transkripte mit voller Länge synthetisieren kann. Das komplette archaeelle Histon-Gen hpyA1 von Pyrococcus furiosus, mit seinen nachfolgenden vier oligo-dT Sequenzen direkt stromabwärts des Gens, wurde als Modellsystem verwendet, um den Mechanismus der transkriptionellen Termination bei hyperthermophilen Archaeen zu untersuchen. Bei 90°C terminiert die archaeelle RNA Polymerase mit hoher Effizienz an der ersten oligo-dT-Sequenz wenn sie mindestens 5 T Reste enthält. Die mögliche Ausbildung einer Haarnadelstruktur hat keinen Einfluß auf die Terminationseffizienz. Die Existenz eines RNA polymerase III-ähnlichen terminationsabhängigen Reinitiations-mechanismus im archaeellen Transkriptionssystem konnte durch Kompetitionsexperimente mit pausierten Komplexen aufgedeckt werden. Mutationen der Sequenzen direkt stromabwärts der Terminationssignale haben einen entscheidenden Einfluß auf den postulierten Reinitiationsmechanismus.