Δημιουργία διαγονιδιακών φυτών καπνού (N.tabacum L.) που υπερεκφράζουν γονίδια GST απο το είδος Phaseolus vulgaris και μελέτη της αντοχής τους σε συνθήκες καταπόνησης:
Creators: name: Βούλγαρη, Γεωργία Σπυρίδωνος
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Τρανσφεράσες της γλουταθειόνης
Καταπόνηση
Γενετική τροποποίηση
Glutathione-s-transferase
Stress
Genetic transformation

description: Οι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) είναι πολυλειτουργικές πρωτεΐνες και συνιστούν κύριο στοιχείο, του κυτταρικού συστήματος αποτοξίνωσης ξενοβιοτικών ουσιών καθώς και του αντοξειδωτικού μηχανισμού άμυνας των φυτών. Τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 απομονώθηκαν απο τα φύλλα και την ρίζα του είδους Phaseolus vulgaris αντίστοιχα. Εμφανίζουν αντιοξειδωτική δράση, ενώ επιπρόσθετα το PvGSTU2-2 καταλύει την συμπλοκοποίηση της GSH με τα ζιζανιοκτόνα alachlor και metalachlor (χλωροακεταμιδία). Στην παρούσα μελέτη, προκειμένου να χαρακτηριστούν λειτουργικά in planta τα δύο ισοένζυμα, δημιουργήθηκαν δύο ανασυνδυασμένα πλασμίδια, το pART27-PvGSTU2-2 και pART27-PvGSTU3-3 και μέσω του A. Tumefaciencs, αναπτύχθηκαν Τ0 διαγονιδιακές σειρές καπνού (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi). Η εισαγωγή των διαγονιδίων στις Τ0 σειρές επιβεβαιώθηκε με την τεχνική RTPCR και η έκφραση του PvGSTU2-2 με q-RTPCR ανάλυση. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε πως οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούν τα διαγονίδια είναι ενεργές, μέσω του προσδιορισμού της ενζυμική δραστικότητας των GSTs στο υπόστρωμα NBD-CI, στις Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU2-2 ή και στο CDNB στις Τ0 σειρές με το γονίδιο PvGSTU3-3. Τρεις Τ0 διαγονιδιακές σειρές που υπερεκφράζουν το γονίδιο PvGSTU2-2 αξιολογήθηκαν ως προς την αντοχή τους στο ζιζανιοκτόνο dimethenamid (χλωροακεταμιδία). Κάτω απο in vivo συνθήκες, οι Τ0 διαγονιδιακές σειρές ήταν πιο ανθεκτικές στις συγκεντρώσεις των 0,5 και 1 mg/L dimethenamide, καθώς είχαν στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερο μήκος ρίζας και βλαστού σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά. Αντιθέτως, κάτω απο in vitro συνθήκες, παρα το γεγονός πως είχαν καλύτερη φαινοτυπική συμπεριφορά σε σχέση με τα μη γενετικά τροποποιημένα φυτά, δεν ήταν ανθεκτικές, πιθανόν λόγο της εξαιρετικά υψηλής συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου (10 και 20 mg/L). Προκειμένου να χαρακτηριστεί ο βιολογικός ρόλος του PvGSTU3-3, τρεις Τ0 διαγονιδιακές σειρές που υπερεκφράζουν το συγκεκριμένο γονίδιο αξιολογήθηκαν για την αντοχή τους στην αλατότητα (200mM) σε in vitro συνθήκες. Oι σειρές ήταν πιο ανθεκτικές, καθώς το ριζικό τους σύστημα αναπτύχθηκε περισσότερο σε σχέση με τα φυτά άγριου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν πως τα ισοένζυμα PvGSTU2-2 και PvGSTU3-3 συμμετέχουν σε φυσιολογικά μονοπάτια που σχετίζονται με την αύξηση της ανθεκτικότητας των φυτών σε συνθήκες καταπονήσεων.
description: Glutathione S-transferases (GSTs) are multifunctional proteins and forms major part, of plant cellular detoxification system and antioxidant enzyme network. PvGSTU2-2 and PvGSTU3-3 has been previously isolated from leaves and roots of Phaseolus vulgaris plants respectively. Both enzymes, shows high antioxidant catalytic function but only PvGSTU2-2 catalyses the conjugation with chloroacetamide herbicides alachlor and metalachlor. In the present thesis two constitutive plant expression vectors pART27-PvGSTU2-2 and pART27-PvGSTU3-3 was constructed and tobacco (Nicotiana tabacum L. cv Xanthi) plants overexpressing the two genes were raised via the method of A. tumefaciens, with the aim of studying in planta, the isoenzymes function. The introgression of the transgenes in the plant genome was confirmed by RTPCR and the expression of PvGSTU2-2 with q-RTPCR analysis. Furthermore, it was verified that transgenes codes functional proteins by measuring GST enzyme activity towards NBD-CI in PvGSTU2-2 T0 transgenics lines or CDNB and NBD-CI in PvGSTU3-3 lines. Three transgenic lines overexpressing PvGSTU2-2 were assayed for their tolerance towards the herbicide dimethenamid (chloroacetamide). Under in vivo conditions, all PvGSTU2-2 overexpressing lines exhibited increased tolerance at 0,5 and 1 mg/L dimethenamid, with significantly higher shoot and root elongation compared to wild type plants. In contrast, despite the better performance of transgenic lines, no increased tolerance was observed compared to wild type plants under in vitro conditions, possibly due to the extremely high concentration of the herbicide (10 and 20 mg/L). In order to characterize the biological function of PvGSTU3-3, three tobacco transgenic lines tested for their salt tolerance (200mM NaCl) under in vitro conditions. All lines were more tolerant compared to no transgenic plants, as demonstrated by the longer root length. These results suggest that PvGSTU2-2 and PvGSTU3-3 isoenzymes can mediate physiological pathways that enhance stress resistance in plants.