Ανάπτυξη Πολυδύναμης Αναλυτικής Μεθόδου Χρωματογραφίας Υδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων και Φασματομετρίας Μάζας για Μεταβολομική Ανάλυση.
Creators: name: Θεοδώρου, Ελένη Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Μεταβολομική
Χρωματογραφία Υδρόφιλων Αλληλεπιδράσεων
Φασματομετρία Μάζας
Metabolomics
Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography
Mass Spectrometry

description: Τα μελισσοκομικά προϊόντα, όπως το μέλι, είναι σημαντικά λειτουργικά τρόφιμα που έχουν πολλές ευεργετικές ιδιότητες στην υγεία. Το μέλι έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως σε εμπορικά ιατρικά προϊόντα, υγιεινά τρόφιμα και καλλυντικά σε πολλές χώρες. Η χημική σύνθεση του μελιού έχει μελετηθεί από διάφορους συγγραφείς, αλλά τα δεδομένα που διατίθενται στη βιβλιογραφία παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία, λόγω της εγγενούς μεταβλητότητας του προϊόντος αυτού και της χρήσης διαφορετικών αναλυτικών μεθόδων, δεδομένου ότι δεν υπάρχουν μέθοδοι αναφοράς που να έχουν καθοριστεί μέχρι σήμερα. Στην επιστήμη των τροφίμων, η μεταβολομική έχει αναδυθεί πρόσφατα ως εργαλείο για τον έλεγχο της ποιότητας, της επεξεργασίας και της ασφάλειας των πρώτων υλών και των τελικών προϊόντων. Μία μέθοδος HILIC-MS / MS αναπτύχθηκε για την αποτελεσματικό διαχωρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό μικρών πολικών μορίων, ως επί το πλείστον πρωτογενών ενδογενών μεταβολιτών. Η μέθοδος βασίστηκε σε ένα σύστημα διαχωρισμού υγρής χρωματογραφίας υπερ-υψηλής απόδοσης (UHPLC) σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας τριπλού τετραπόλου. Η πηγή ιονισμού ήταν θερμαινόμενος ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (HESI), σε λειτουργία θετικού και αρνητικού ιονισμού χρησιμοποιώντας εναλλαγή πολικότητας. Η λίστα των προσδιοριζόμενων μεταβολιτών προέκυψε από τη μελέτη της βιβλιογραφίας. Στόχος ήταν να αναπτυχθεί μια μέθοδος για τη εύρεση του μεταβολικού προφίλ του μελιού. Η λίστα περιλάμβανε αμινοξέα, σάκχαρα, οργανικά οξέα, πουρίνες και πυριμιδίνες, αμίνες, βιταμίνες και άλλα μόρια. Οι χρωματογραφικές συνθήκες βελτιστοποιήθηκαν για να επιτευχθεί ο διαχωρισμός των 86 επιλεγμένων μεταβολιτών σε χρονικό διάστημα 21 λεπτών. Επιλέχθηκε παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων (MRM) σε λειτουργία MS/MS για την ακριβή ποσοστικοποίηση των προσδιοριζόμενων ενώσεων. Η χρωματογραφική ανάλυση διεξήχθη σε αναλυτική στήλη Acquity ΒΕΗ amide με κινητή φάση με 15μΜ μυρμηκικό αμμώνιο σε νερό και ακετονιτρίλιο και ροή 0,4 mL. Η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα τα όρια ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ), την ακρίβεια την επαναληψιμότητα και την αναπαραγωγιμότητα.. Η μέθοδος βρήκε εφαρμογή στην ανάλυση δειγμάτων μελιού, με σκοπό να παράσχει πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με το περιεχόμενο των πολικών μεταβολιτών που βρίσκονται στο συγκεκριμένο υπόστρωμα. Έμφαση δόθηκε στην προκατεργασία των δειγμάτων η οποία είναι ζωτικής σημασίας για την ακριβή και αξιόπιστη ανάλυση. Λόγω της έλλειψης πληροφοριών στη βιβλιογραφία που σχετίζονται με την προκατεργασία του δείγματος για τέτοιου είδους ανάλυση, επιλέχθηκε μια απλή προσέγγιση συμβατή με την αναλυτική μέθοδο. Το δείγμα μελιού αραιώθηκε με ένα μείγμα από ακετονιτρίλιο, μεθανόλη και νερό, φυγοκεντρήθηκε και διηθήθηκε πριν από την ένεση. Λόγω της εξαιρετικά υψηλής περιεκτικότητας ορισμένων μεταβολιτών στο μέλι, όπως τα σάκχαρα, και προκειμένου να αποφευχθεί η επιμόλυνση του αναλυτικού οργάνου, ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε επίσης στην αραίωση των δειγμάτων. Τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της μεθόδου σε πραγματικά δείγματα ήταν ικανοποιητικά και προσδιορίστηκε ένας μεγάλος αριθμός μεταβολιτών. Η ανάλυση ενός τόσο μεγάλου αριθμού μεταβολιτών επιτρέπει την εφαρμογή της μεθόδου για την ανάλυση των δειγμάτων μελιού και την μπορεί να την κάνει σημαντικό συμπληρωματικό εργαλείο των μελισσοπαλυνολογικών αναλύσεων.
description: Bee products, such as honey, are important functional foods that possess several health promoting properties. Honey has been widely used in commercial medical products, healthy foods and cosmetics in many countries. The chemical composition of honey has been studied by several authors, but data available in the literature are highly variable due to the intrinsic variability of this product and the use of different analytical methods, since no reference methods have been established so far. In food science, metabolomics has recently risen as a tool for quality, processing and safety of raw materials and final products. A HILIC-MS/MS method was developed for the efficient separation and quantification of small polar molecules, mostly primary metabolites. The method was based on an ultrahigh performance liquid chromatography (UHPLC) separation system coupled with Heated Electrospray Ionization (HESI) mass spectrometry on a triple quadrupole mass spectrometer, operating in both positive and negative ionization mode using polarity switching. The list of target metabolites was comprised by studying the literature; the idea was to develop a method to cover the quantitative analysis of metabolites present in honey. The list included amino acids, sugars, organic acids, nucleo-bases, amines, vitamins and other molecules. Chromatography was optimized to achieve separation of 86 selected metabolites over a period of 21 min. Multiple Reaction Monitoring (MRM) MS/MS mode was selected for accurate quantification. Chromatography was performed on an ACQUITY BEH Amide analytical column with a mobile phase of 15mM ammonium formate in water and acetonitrile, at a flow rate of 0.4 mL. The method was validated by studying the detection (LOD) and quantification limits (LOQ), the linearity ranges and the intraday- and inter day-precision of the analysis. The method found application in the analysis of honey with the aim to provide additional information on this matrice primary metabolite content Focus was given to the sample pre-treatment which is crucial for accurate and reliable analysis. Due to lack of literature information related to sample preparation for both matrices, a simple treatment approach, compatible with the analytical method was tested. Honey samples were diluted with a mix of acetonitrile, methanol and water, centrifuged, and filtered before injection. Due to the extremely high content of some metabolites, such as sugars and in order to avoid instrument contamination, special attention was also given to the dilution of real samples. The results were satisfying and a large number of metabolites were detected. Analysis of such a large number of metabolites allows application of the method for the analysis of bee samples for their characterization: for honey samples with regard to different percentages of pollen.