DNA barcoding ταυτοποίηση ειδών ιχθύων των εσωτερικών υδάτων της Ελλάδας
Creators: name: Τσούπας, Αλέξανδρος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: DNA barcoding
Ιχθύες εσωτερικών υδάτων
Γενετική ταυτοποίηση
Freshwater fishes
Genetic identification

description: Η κατάταξη των οργανισμών σε είδη, έχει αποτελέσει θέμα εκτενών συζητήσεων, ιδιαίτερα κατά τον 20ο αιώνα και για πολλά χρόνια βασιζόταν σε μορφολογικούς, ανατομικούς, ηθολογικούς και γεωγραφικούς χαρακτήρες. Τις τελευταίες δεκαετίες, με τη ραγδαία ανάπτυξη της μοριακής βιολογίας χρησιμοποιούνται και μοριακοί χαρακτήρες, με τη χρήση γενετικών χαρακτήρων να κερδίζει σταθερά έδαφος. Η προσέγγιση του DNA barcoding προτείνει την ταυτοποίηση των οργανισμών μέσω της αλληλουχίας μίας συγκεκριμένης περιοχής του γονιδιώματός τους, η οποία για τα ζώα είναι το μιτοχονδριακό γονίδιο της υπομονάδας 1 της οξειδάσης του κυτοχρώματος c (COI). Παράλληλα οι αλληλουχίες που προκύπτουν από την εφαρμογή του DNA barcoding επιτρέπουν φυλογενετικές αναλύσεις, οι οποίες συχνά οδηγούν στην επιβεβαίωση ή αμφισβήτηση της ισχύουσας κατάστασης στη συστηματική κατάταξη των οργανισμών. Μέχρι στιγμής η μέθοδος έχει εφαρμοστεί σε πλήθος ερευνών, τα αποτελέσματα των οποίων φαίνεται να επιβεβαιώνουν την αποτελεσματικότητα του DNA barcoding, οδηγώντας παράλληλα σε μία διαπίστωση: ότι για να είναι αποτελεσματική η μέθοδος απαιτεί όσο το δυνατόν περισσότερες αλληλουχίες από ολόκληρο το εύρος εξάπλωσης του κάθε οργανισμού. Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη ειδών ιχθύων εσωτερικών υδάτων του Ελλαδικού χώρου, με σκοπό τη δημιουργία DNA barcodes, συμβάλλοντας στον εμπλουτισμό των βάσεων δεδομένων και στη βελτίωση της αποτελεσματικότητας του DNA barcoding, αλλά και στη μελέτη της βιοποικιλότητας των εσωτερικών υδάτων της Ελλάδας, ελπίζοντας πως τα δεδομένα αυτά θα φανούν χρήσιμα στη διατήρηση και διαχείριση των πληθυσμών τους. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, απομονώθηκε DNA από 406 άτομα ιχθύων εσωτερικών υδάτων που ανήκαν συνολικά σε 39 είδη και 24 γένη. Από αυτά αλληλουχήθηκε ένα τμήμα 624 βάσεων από το 5’ άκρο του γονιδίου COI. Οι αλληλουχίες αυτές χρησιμοποιήθηκαν μαζί με 599 ήδη υπάρχουσες αλληλουχίες που ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων BOLD, για την κατασκευή φυλογενετικών δέντρων για το κάθε γένος και τον υπολογισμό των γενετικών αποστάσεων μεταξύ των ατόμων. Μέσω αυτών εκτιμήθηκε κατά πόσο μπορούν τα είδη αυτά να διαχωριστούν μέσω DNA barcoding και έγιναν προτάσεις για την περαιτέρω μελέτη ειδών που παρουσίαζαν ενδιαφέρον. Εν γένει, η μέθοδος κρίθηκε αποτελεσματική για το μεγαλύτερο μέρος των υπό μελέτη ειδών, παρατηρήθηκαν μάλιστα πέντε περιπτώσεις, όπου ομάδες ατόμων που ανήκαν στο ίδιο είδος, παρουσίαζαν μεταξύ τους μεγάλη γενετική απόσταση που θα δικαιολογούσε το διαχωρισμό τους σε διαφορετικά είδη. Επίσης βρέθηκαν είκοσι δύο περιπτώσεις που τα άτομα ενός είδους σε μία συγκεκριμένη περιοχή παρουσίαζαν μόνο απλοτύπους μοναδικούς για αυτήν την περιοχή, επιτρέποντας έτσι την ένταξη ενός ατόμου που φέρει τον απλότυπο αυτό όχι μόνο σε ένα είδος, αλλά και σε ένα συγκεκριμένο πληθυσμό. Παρατηρήθηκαν όμως και επτά περιπτώσεις στενά συγγενικών ειδών τα οποία ήταν πιο δύσκολο να διαφοροποιηθούν μέσω των αλληλουχιών του γονιδίου COI. Για τα είδη αυτά προτάθηκε η περαιτέρω μελέτη τους, τόσο σε γενετικό όσο και σε μορφολογικό επίπεδο, για τη διαλεύκανση των μεταξύ τους σχέσεων, αν δηλαδή πρόκειται πράγματι για ξεχωριστά είδη ή αν είναι συνώνυμα είδη
description: The classification of organisms into species has been the subject of extensive discussions, especially during the 20th century. This classification was based, for many years, on morphological, anatomical, ethological and geographic markers. In the last decades, with the rapid growth of molecular biology, molecular markers are also used, with genetic markers steadily gaining ground. The DNA barcoding approach suggests the identification of organisms through the sequence of a specific region of their genome, which for the animals is the cytochrome c oxidase subunit I (COI) mitochondrial gene. At the same time, the sequences resulting from the application of DNA barcoding allow phylogenetic analyzes, which often lead to the confirmation or questioning of the current status in the systematic classification of organisms. So far, the method has been applied to a number of studies, the results of which seem to confirm the effectiveness of DNA barcoding, while leading to the conclusion that, in order to be effective, the method requires as many sequences as possible from across the dispersion range of each organism. The aim of the present study was to study the fish species of inland waters in Greece in order to create DNA barcodes for them, contributing to the enrichment of the databases and the improvement of the efficiency of DNA barcoding, as well as to study the fish biodiversity of internal waters in Greece, hoping that these data will be useful for species conservation and management. In the context of this study, DNA was extracted from 406 freshwater fish species that consisted of 39 species and 24 genera. From these, a 624 base fragment from the 5’ end of the COI gene was sequenced. These sequences were used together with 599 already existing sequences recovered from the BOLD database, for the construction of phylogenetic trees for each genus, and the calculation of the genetic distances between individuals. Through them, it was assessed whether these species could be separated by DNA barcoding and suggestions were made to further study species of interest. In general, the method was found to be effective for most of the studied species, and five cases were observed, where groups of individuals belonging to the same species showed a large genetic distance between them that would justify their separation into different species. Also, twenty two cases were found that individuals of a species in a particular region showed only haplotypes unique to this region, thus allowing an individual who carries this haplotype to be placed not only in a species but also in a particular population. However, seven cases of closely related species that were more difficult to differentiate through the sequences of the COI gene were observed. For these species, further study was proposed, both on genetic and morphological level, to elucidate the relationships between them, whether they are indeed separate but closely related species or if they are synonym species