Μελέτη της Eπιθηλιακής προς Mεσεγχυματική μετατροπής (ΕΜΤ), σε ηπατοκαρκινικά κυτταρικά μοντέλα με καταστολή του HNF4α
Creators: name: Ντίνα, Ολγα-Μαρία Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ)
HNF4α
Eπιθηλιακή προς Mεσεγχυματική μετατροπή
Ηepatocellular carcinoma (HCC)
Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT)

description: Ο ηπατοειδικός μεταγραφικός παράγοντας HNF4α αποτελεί έναν από τους κύριους ρυθμιστές της διαφοροποίησης των ηπατοκυττάρων κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη και οργανογένεση, ενώ ευθύνεται για το σχηματισμό του ηπατικού επιθηλίου και τη διατήρηση του ηπατικού φαινοτύπου, ρυθμίζοντας την έκφραση μορφογενετικών παραγόντων, όπως η E-καδερίνη. Πρόσφατα, η μειωμένη έκφραση του, μέσω ενεργοποίησης των miR-24 και miR-629 συσχετίσθηκε με την εμφάνιση του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HKK). Κύριο φαινόμενο κατά την καρκινογένεση αποτελεί η Επιθηλιακή προς Μεσεγχυματική μετατροπή (EMT), όπου μέσω απώλειας επιθηλιακού προτύπου έκφρασης και ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως το Notch, προάγεται η μετάσταση. Για τη διερεύνηση του ρόλου της καταστολής του HNF4α στο ΗΚΚ, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ΕΜΤ σε δύο in vitro συστήματα με μειωμένη έκφραση του HNF4α. Το μοντέλο δύο διαστάσεων περιλάμβανε τη δημιουργία σταθερών μονοκλωνικών κυτταρικών σειρών Huh-7, με μειωμένη έκφραση του HNF4α, μέσω μόλυνσης με λέντι-ιό. Η καταστολή του HNF4α επετεύχθη και σε τρισδιάστατα κυτταρικά μοντέλα Huh-7 παροδικής καταστολής του HNF4α, μέσω υπερέκφρασης του miR-24. Στα δύο παραπάνω κυτταρικά συστήματα, η εκτίμηση των επιπέδων του HNF4α έγινε με Real-Time qPCR και ανάλυση κατά Western, ενώ ελέγχθηκε η έκφραση επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δεικτών, μέσω Real-Time qPCR. Στα τρισδιάστατα κυτταρικά μοντέλα έγινε επαλήθευση των προτύπων έκφρασης και με ανοσοϊστοχημεία, ενώ μελετήθηκε επιπλέον η εμπλοκή του μονοπατιού Notch στην ΕΜΤ, με μικροσυστοιχίες Real-Time qPCR. Η ποσοτικοποίηση δεικτών ΕΜΤ στα τρισδιάστατα κυτταρικά μοντέλα Huh-7 έδειξε αναλογική σχέση της αυξημένης καταστολής του HNF4α μέσω του miR-24, με την επαγωγή ΕΜΤ, αποκαλύπτοντας έντονη απώλεια επιθηλιακών δεικτών (E-καδερίνη) και εμφάνιση μεσεγχυματικών (N-καδερίνη, βιμεντίνη), σε συνδυασμό με ενεργοποίηση του μονοπατιού Notch, με ανοδική έκφραση διαφόρων συστατικών του. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με αντίστοιχη μελέτη των επιπέδων έκφρασης των δεικτών ΕΜΤ στις σταθερές μονοκλωνικές κυτταρικές σειρές σημαντικής καταστολής του HNF4α, οι οποίες επέδειξαν εξίσου επαγωγή της ΕΜΤ, εμφανίζοντας παρόμοιο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης των δεικτών, συνυφασμένο με την καταστολή του HNF4α. Με βάση τα αποτελέσματα, υποδεικνύεται πως η μειωμένη έκφραση του HNF4α, μέσω ανατροφοδότησης από το miR-24, οδηγεί στην επαγωγή της EMT στα ηπατοκαρκινικά κύτταρα. Στη διαδικασία αυτή φαίνεται για πρώτη φορά πως συμμετέχει ενεργά το μονοπάτι Notch. Ωστόσο απαιτείται περαιτέρω μελέτη για την αποσαφήνιση του ρόλου καθενός από τα συστατικά του Notch στο παραπάνω μοριακό κύκλωμα, με σκοπό την εύρεση νέων πιθανών μοριακών στόχων και την επίτευξη στοχευμένης θεραπευτικής αντιμετώπισης στο ΗΚΚ.
description: The hepatocyte transcription factor HNF4α plays an important role in the differentiation of hepatocytes during physiological development and organogenesis, and is responsible for the development of hepatic epithelium and maintenance of the hepatocyte phenotype, by regulating the expression of morphogenetic factors such as E-cadherin. Recently, the correlation has been made of reduced expression of HNF4α with increased expression of miR-24 and miR-629, in hepatocellular carcinoma (HCC). Epithelial to Μesenchymal Τransition (EMT) represents an important phenotypic marker during carcinogenesis, where the loss of epithelial gene expression pattern and the activation of signaling pathways, such as the Notch, support the progression of metastasis. In order to elucidate the role of reduced expression of HNF4α in liver carcinogenesis, we aimed to study the process of EMT in two in vitro cell models with reduced expression of HNF4α. The 2 dimensional (2D) cell model included the establishment of stable monoclonal HNF4α knock down (KD) Huh-7 cells by lentiviral mediated transduction of silencing constructs. The suppressed expression of HNF4α was also achieved in 3 Dimensional (3D) Huh-7 cell models, with transient HNF4α knock down, by miR-24 overexpression. The assessment of HNF4α KD was performed by Real-Time qPCR and Western blot analysis, while gene expression profiles of epithelial and mesenchymal specific markers were analyzed by Real-Time qPCR, into both 2D and 3D HNF4α KD cell models. The analysis in 3D models was followed by validation of protein expression by immunohistochemistry and it was also investigated the involvement of Notch signaling pathway by Real Time qPCR Arrays. Quantification of EMT markers in 3D HNF4α KD cell models revealed a correlation in increased HNF4α KD by miR-24 overexpression, with reduced expression of epithelial markers (E-cadherin) and increased expression of mesenchymal (N-cadherin, vimentin). In addition the Notch pathway was activated following the up regulation of different Notch genes. The above indicating results were confirmed by examining the gene expression profiles of EMT markers to the stable monoclonal HNF4α KD Huh-7 cells. The results showed induction of EMT, with the same gene expression pattern. The EMT induction was also positively correlated to the HNF4α KD. These findings indicate that the reduced expression of HNF4α, by miR-24 feedback loop leads to induction of EMT in HCC cell models. Also, it was observed for the first time activation of the Notch pathway implying that in may be involved into this process. However, more research is required in order to clarify the exact role of each Notch component in the HN4α/miR-24 feedback loop. Finding new possible key genes will help creating novel targeted therapies in HCC.