Επίδραση της αιθανόλης στη μετουσίωση των πρωτεϊνών ορού γάλακτος και στο σχηματισμό πηκτών
Creators: name: Ανδρεάδης, Μάριος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Μετουσίωση
Πρωτεΐνες ορού γάλακτος
Αιθανόλη
Denaturation
Whey proteins
Alcohol

description: Ελληνική Περίληψη Επίδραση της αιθανόλης στη μετουσίωση των πρωτεϊνών ορού γάλακτος και στο σχηματισμό πηκτών Τα τελευταία χρόνια η παραγωγή τυριών τυρογάλακτος έχει αυξηθεί ραγδαία. Οι πρωτεΐνες του ορού έχουν ιδιαίτερα υψηλή βιολογική αξία διότι παρέχουν στον οργανισμό διάφορα απαραίτητα αμινοξέα τα οποία ο οργανισμός δεν μπορεί να τα συνθέσει, ενώ παράλληλα αποτελούν εξαιρετική πηγή θειούχων αμινοξέων, όπως είναι η μεθειονίνη και η κυστεΐνη. Τέλος, είναι πηγές αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας (ΒCAAs), όπως είναι η λευκίνη, η βαλίνη και η ισολευκίνη. Σε ροφήματα για αθλητές, μπάρες δημητριακών και αναψυκτικά ενισχύουν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των προϊόντων αυτών, αλλά και τη θρεπτική τους αξία. Σε προϊόντα κρέατος και αρτοποιίας χρησιμοποιούνται για την αντικατάσταση της πρωτεΐνης του αυγού, ως γαλακτωματοποιητές, αλλά και λόγω της ικανότητάς τους να σχηματίζουν πηκτές. Στο παρελθόν, κατά τη μελέτη της διεθνούς βιβλιογραφίας, δεν έχει αναφερθεί ποτέ σχηματισμός πηκτών από μίγμα πρωτεϊνών ορού γάλακτος με τη χρήση αλκοόλης. Αν και οι μελέτες πάνω στη μετουσίωση των πρωτεϊνών ορού γάλακτος με χρήση αλκοολών είναι πολυάριθμες, όλες αφορούν μεμονωμένες πρωτεΐνες του ορού του γάλακτος, όπως η αλβουμίνη και η β– λακτογλοβουλίνη. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων της παρούσας διατριβής έγινε προσπάθεια να σχηματιστούν πηκτές χρησιμοποιώντας την αιθανόλη ως παράγοντα μετουσίωσης. Ο μηχανισμός της μετουσιωτικής δράσης της αιθανόλης αποτελεί αντικείμενο συνεχούς έρευνας και έχουν διατυπωθεί διάφορες προτάσεις, όπως για παράδειγμα η επίδρασή της στη διηλεκτρική σταθερά του μέσου ή η απευθείας επίδραση στο μόριο των πρωτεϊνών. Ανεξάρτητα της ασάφειας που υπάρχει ακόμα και σήμερα σχετικά με το μηχανισμό δράσης των αλκοολών στις πρωτεΐνες, αυτό που έχει επιβεβαιωθεί από πολυάριθμες μελέτες, είναι ότι σε συγκεντρώσεις αιθανόλης μεταξύ 20 και 50% w/w παρατηρείται, σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής, αύξηση των α– ελίκων. Όταν οι συνθήκες είναι κατάλληλες για συσσωμάτωση, αυτή συνοδεύεται αντίθετα από αύξηση της β– πτυχωτής δομής. Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν απομονωμένες καθαρές πρωτεΐνες ορού γάλακτος (WPI) σε συγκέντρωση 5% w/w. Η ρύθμιση του pH των διαλυμάτων έγινε με την προσθήκη γλυκονο– δ– λακτόνης (GDL) και η επίδραση της αιθανόλης μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις 10 – 70% w/w. Η αιθανόλη προστέθηκε μετά την προσθήκη GDL έτσι ώστε να αποφευχθεί η εξάτμιση αλλά και για να αναμιχθεί καλύτερα το GDL στο διάλυμα. Οι πηκτές που σχηματίστηκαν μελετήθηκαν ως προς τις μηχανικές του ιδιότητες με τη βοήθεια ρεομέτρου σε συνθήκες μικρής ταλάντωσης (Physica MCR 300), ενώ ο τυχόν διαχωρισμός φάσης παρακολουθήθηκε με οπτική παρατήρηση σε σωληνάκια (διάλυμα 4ml) που παρέμεναν ακίνητα στο ράφι. Τέλος πραγματοποιήθηκε έλεγχος της μικροδομής των πηκτών με τη βοήθεια συνεστιακού μικροσκοπίου (CLSM). Από την μακροσκοπική μελέτη των πηκτών παρατηρήθηκε ότι ο διαχωρισμός φάσεων εξαρτάται τόσο από τη συγκέντρωση της αιθανόλης όσο και από τη συγκέντρωση του GDL. Για συγκεντρώσεις αιθανόλης κάτω από 50% w/w, υψηλότερες συγκεντρώσεις GDL (1– 1,8 % w/w GDL) ευνοούν το διαχωρισμό. Αντίθετα, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (50– 70% w/w) αιθανόλης, εμφανίστηκε διαχωρισμός σε μικρές συγκεντρώσεις GDL. Οι μηχανικές ιδιότητες και η σταθερότητα των πηκτών εξαρτώνται από το pH στο οποίο σχηματίζεται η πηκτή, αλλά και από το ρυθμό μείωσής του προς το ισοηλεκτρικό σημείο. Η επικράτηση της β– πτυχωτής δομής σε επίπεδο δευτεροταγούς δομής κατά τη συσσωμάτωση εξηγεί πιθανόν τη μικροδομή των πηκτών που σχηματίστηκαν. Σε συγκεντρώσεις αιθανόλης κάτω από 30% w/w, παρατηρήθηκε αυξημένο πορώδες και δίκτυα που είχαν ρηγματώσεις. Αντίθετα, η μικροδομή των πηκτών που σχηματίστηκαν σε συγκέντρωση αιθανόλης 50% w/w δεν είχε εμφανές πορώδες, γεγονός που αποδεικνύει ότι τα μόρια των πρωτεϊνών συσσωματώθηκαν επαρκώς, χωρίς να αφήνουν μεγάλους κενούς χώρους. Αντίθετα, η δομή πηκτών που σχηματίστηκαν με 70% w/w αιθανόλη, εμφάνισε από την αρχή μεγάλα συσσωματώματα. Αυτό που έγινε αντιληπτό από τις ρεολογικές μετρήσεις ήταν ότι η συγκέντρωση τoυ GDL δεν επηρέασε άμεσα τη σκληρότητα των σχηματιζόμενων πηκτών, ενώ οι πιο σκληρές πηκτές ελήφθησαν σε συγκέντρωση αιθανόλης 40 – 60% w/w. Αυτό συνέβη, διότι σε συγκέντρωση αιθανόλης 40 – 60% w/w, η επίδραση της αιθανόλης στη μετουσίωση των πρωτεϊνών ορού γάλακτος βρίσκεται στο μέγιστο. Επίσης, η σκληρότητα των πηκτών σε ποσοστά αιθανόλης 40 – 60% w/w ήταν 2 – 3 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με πηκτές που σχηματίστηκαν με χρήση θέρμανσης (μάρτυρας), γεγονός που υποδεικνύει, ότι στις πηκτές με αιθανόλη συμμετέχουν περισσότεροι δισουλφιδικοί δεσμοί (S – S). Πέρα από το ρόλο της αιθανόλης να μετουσιώνει τις πρωτεΐνες, χρησιμοποιείται και ως ένας επιπλέον αντιμικροβιακός παράγοντας προσδίδοντας σε ένα νέο προϊόν επιπλέον αντιμικροβιακές ιδιότητες. Εν κατακλείδι, βασιζόμενοι στις μελέτες της συγκεκριμένης διατριβής, υπάρχει η δυνατότητα σχηματισμού ενός καινοτόμου προϊόντος όπως για παράδειγμα, κάποιου καινοτόμου τυριού τυρογάλακτος (π.χ. μυζήθρας) με διαφορετικές μηχανικές και οργανοληπτικές ιδιότητες καθώς επίσης και με υψηλές αποδόσεις.
description: Effect of ethanol on whey protein denaturation and gelation During the last few years, whey cheese production has increased markedly. Whey proteins have a very high biological value, since they are a major source of essential amino acids that our body cannot synthetize. Also, they are an important source of sulfur containing amino acids, such as methionine and cysteine. Finally, they contain branched– chain amino acids (BCAAs), such as leucine, valine and isoleucine. In drinks for athletes, cereal bars and refreshments, whey proteins are used to enhance the sensory attributes of these products, as well as their nutritional value. In meat and bakery products they are used to replace egg protein, as emulsifying agents and for their ability to form gels. Based on the relevant literature, to this day, no gel formation has been reported using a mixture of whey proteins and an alcohol. Although the studies on alcohol– induced denaturation of proteins are numerous, they all have been conducted with individual whey proteins, especially β– Lactoglobulin and BSA. During the experimental work for the present research, gels were formed using ethanol as the denaturing agent. The mechanism through which ethanol denatures proteins is the subject of continuous research and different views have been formulated; for example, that ethanol has an indirect effect by reducing the dielectric constant of the solvent or that it acts directly on the protein molecule. Despite the uncertainty regarding the exact mechanism by which alcohols act on proteins, what has been established by several researchers, is that different alcohols, at concentrations between 20 and 50% w/w, induce an increase of the α– helical content, on the level of the proteins’ secondary structure. On the other hand, aggregation has been found to be accompanied by an increase in β– sheet structure. For the purposes of the present research, a whey protein isolate (WPI) at a concentration of 5% w/w was used. The pH of the protein solutions was adjusted with glucono– δ– lactone (GDL), while the effect of ethanol was studied for alcohol concentrations in the range 10 – 70% w/w. Ethanol was added following GDL, to minimize its vaporization and because it mixed more efficiently with GDL. The mechanical properties of the gels formed were studied using a rheometer (Physica MCR 300), while any phase separation was monitored macroscopically. Finally, the microstructure of the gels was studied using confocal microscopy (CLSM). The macroscopic observation revealed that phase separation depended both on ethanol and GDL concentration. For ethanol concentrations below 50% w/w (1 – 1,8% w/w GDL), higher GDL concentrations favored separation. In contrast, when ethanol concentration was between 50 and 70% w/w, phase separation took place at lower GDL concentrations. The mechanical properties and stability of the gels depend on the pH upon gel formation, as well as on the rate of pH decrease towards the proteins’ isoelectric point. The proliferation of β– sheet structure during aggregation was verified by the microscopic study of the gels. At ethanol concentrations below 30% w/w, porosity was increased, and the relevant networks had fractures. In contrast, the microstructure of gels formed in 50% w/w ethanol showed no apparent porosity, indicating that the protein molecules were efficiently aggregated, leaving no significant void spaces among them. Large aggregates were observed already from the initial stages of gelation in 70% w/w ethanol. From the rheological measurements, it was concluded that the concentration of GDL does not affect directly the hardness of the formed gels and that the hardest gels are obtained in ethanol concentrations between 40 and 60% w/w. This is explained on the basis that at such concentrations, ethanol– induced denaturation of whey proteins is at its maximum. Also, the hardness of the gels obtained in 40 – 60% w/w ethanol concentration, is 2 – 3 times higher compared to heat– induced gels (reference gels). This is an indication that during ethanol gelation, the contribution of disulfide bonds (S – S bonds) is higher. Ethanol, besides its denaturing action, can be considered as an additional antimicrobial agent in different food products. In conclusion, based on the results of the present research work, the use of ethanol may offer the interesting possibility to develop new food products, e.g. novel whey cheeses (myzithra) with different mechanical and organoleptic properties, as well as with higher yields.