Βελτίωση των δυνατοτήτων αξιοποίησης του σπέρματος κριού μετά από τον εμπλουτισμό του σε ζωηρά κινούμενα σπερματοζωάρια
Creators: name: Πιπερέλης, Σάββας Γ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Σπέρμα
Φιλτράρισμα
Σφαιρίδια γυαλιού
Semen
Filtration
Glass beads

description: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διεύρυνση της δυνατότητας αξιοποίησης υποβαθμισμένων εκσπερματισμάτων κριών (με ζωτικότητα &lt;70%) που κατά κανόνα απορρίπτονται ως ακατάλληλα. Η βελτίωση της αναλογίας του εκσπερματίσματος σε ζωηρά κινούμενα σπερματοζωάρια (εμπλουτισμός) επιχειρείται με τη χρήση φίλτρου γυάλινων σφαιριδίων κατακράτησης των νεκρών σπερματοζωαρίων. Καθοριστικός παράγοντας για τη διαμόρφωση του φίλτρου θεωρείται η Συνολική Προσφερόμενη Επιφάνεια των Σφαιριδίων (Σ.Π.Ε.), ανεξάρτητα από το μέγεθός τους. Η πειραματική ομάδα συγκροτήθηκε από τους είκοσι επτά (27) σπερματοδότες κριούς φυλής Χίου του Ι.Α.Τ.Σ. Τα ζώα, ηλικίας 2-6 ετών στεγάζονταν και διατρέφονταν κάτω από τις ίδιες συνθήκες σε όλη της διάρκεια του πειραματισμού. Χρησιμοποιήθηκαν τα εκσπερματίσματα που απορρίπτονταν ως ακατάλληλα για περαιτέρω επεξεργασία από το Ι.Α.Τ.Σ. λόγω χαμηλής ζωτικότητας [&lt;70%, υποκειμενική εκτίμηση σε οπτικό μικροσκόπιο NIKON Eclipse E200 (100x)], αλλά με κινητικότητα &gt;3,5 [υποκειμενική εκτίμηση σε οπτικό μικροσκόπιο NIKON Eclipse E200 (100x)] και πυκνότητα &gt;2.600x106 σπερματοζωαρίων/ml (μέτρηση με την βοήθεια πυκνόμετρου DR LANGE LP1). Σε κάθε επιμέρους πειραματισμό τα επιλεχθέντα εκσπερματίσματα αναμιγνύονταν μεταξύ τους (pooling). Ακολουθούσε επαναξιολόγηση της ζωτικότητας, της κινητικότητας και της πυκνότητας του ενιαίου δείγματος. Στη συνέχεια, το δείγμα διαχωριζόταν σε ίσα μέρη όγκου 3 ml. Ακολουθούσε η διαδικασία ανάμιξης του κάθε δείγματος των 3 ml με προεπιλεγμένη ποσότητα γυάλινων σφαιριδίων (Worf Glasskugeln GmBh, Meinz Germany), διαμέτρου 1.500, 2.000 ή 3.000 μm, με συγκεκριμένη συνολική επιφάνεια. Στη διάρκεια όλων των χειρισμών τα εκσπερματίσματα/δείγματα διατηρούνταν σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37οC. Ο προσδιορισμός της Σ.Π.Ε. μιας δεδομένης ποσότητας σφαιριδίων συγκεκριμένης διαμέτρου (απαραίτητη για την διεξαγωγή των πειραματισμών) έγινε με τη χρήση της 'αρχής της ένωσης' του Αρχιμήδη. Στις 0, 24, 48 και 72 ώρες συντήρησης εκτιμήθηκαν παράμετροι σχετικές με την ικανότητα επιβίωσης, την ακεραιτότητα ακροσώματος,την ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης, τις παραγόμενες ROS καθώς και τα χαρακτηριστικά κίνησης των σπερματοζωαρίων. Από τους ελέγχους διαπιστώθηκαν τα ακόλουθα: * Το ποσοστό ζωτικότητας των σπερματοζωαρίων ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από το αντίστοιχο ποσοστό στα δείγματα του μάρτυρα. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ του μάρτυρα και των εμπλουτισμένων δειγμάτων καταγράφηκαν σε όλους τους χρόνους ελέγχου (Ρ&lt;0,05). * Το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με ακέραιο ακρόσωμα (του μάρτυρα αλλά και των εμπλουτισμένων δειγμάτων), δεν φαίνεται να επηρεάστηκε από την διαδικασία εμπλουτισμού, καθώς δεν καταγράφηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του μάρτυρα και των εμπλουτισμένων δειγμάτων σε κανέναν από τους χρόνους ελέγχου (Ρ&gt;0,05). * Σε όλους τους χρόνους ελέγχου το ποσοστό των ανθεκτικών σπερματοζωαρίων στη δοκιμή υποωσμωτικής ανθεκτικότητας ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στην ομάδα των εμπλουτισμένων δειγμάτων σε σχέση με την ομάδα του μάρτυρα (Ρ&lt;0,05). * Σημαντική διαφορά μεταξύ μάρτυρα και εμπλουτισμένων δειγμάτων καταγράφηκε στο ποσοστό των κινούμενων και ακίνητων σπερματοζωαρίων, όπως καταγράφονταν από το σύστημα αξιολόγησης εκσπερματισμάτων με τη βοήθεια Η/Υ (Computer Assisted Semen Analysis, CASA), σε όλους τους χρόνους ελέγχου (Ρ&lt;0,05). * Μεταξύ των ομάδων του μάρτυρα αλλά και των εμπλουτισμένων δειγμάτων δεν διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά στη ποσότητα παραγόμενων δραστικών ριζών οξυγόνου στις 0, 24 και 48 ώρες (Ρ&gt;0,05) αλλά μόνο στις 72 ώρες (Ρ&lt;0,05). Από την ανάλυση των πειραματισμών με βάση την εποχή σπερματοληψίας προκύπτει ότι η μακροβιότητα των σπερματοζωαρίων στα εμπλουτισμένα δείγματα δεν επηρεάζεται από την εποχή του έτους (Ρ&gt;0,05). Αντίθετα, η ανθεκτικότητα των σπερματοζωαρίων στην δόκιμη υποσμωτικής ανθεκτικότητας καθώς και η ανθεκτικότητα του ακροσώματός τους φαίνεται ότι βελτίωνονται κατά την ένοιστρη περίοδο (Ρ&lt;0,05). Κατά την αξιολόγηση της μεθόδου με το σύστημα έμμεσης αξιολόγησης "Sperm Recovering Efficiency" σημαντικές διαφορές καταγράφηκαν μεταξύ των εποχών του έτους για τους δείκτες S.R.I. καθώς και L/D Ratio (Ρ&lt;0,05). Από τη διερεύνηση της δυνατότητας αξιοποίησης των εμπλουτισμένων εκσπερματισμάτων με βάση το δείκτη F.S.F. (Functional Sperm Fraction) διαπιστώθηκε ότι τα εμπλουτισμένα εκσπερματίσματα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν έως και 24 ώρες μετά τον εμπλουτισμό τους κατά την ένοιστρη και την μεταβατική περίοδο της αναπαραγωγικής δραστηριότητας των κριών. Συμπερασματικά προκύπτει ότι η συγκεκριμένη μέθοδος εμπλουτισμού, με χρήση φίλτρου γυάλινων σφαιριδίων και υπολογισμό της Σ.Π.Ε., μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον εμπλουτισμό υποβαθμισμένων εκσπερματισμάτων κριού, διευρύνοντας έτσι τις δυνατότητες αξιοποίησης τους...
description: Ram semen processing laboratories are sometimes confronted with the need to use semen of high genetic merit rams with relatively low semen quality. Thus, any method that would increase sperm viability in low viability ejaculates could be useful. In this study the possibility of a glass beads filtration method by estimating the beads Total Surface Provided (TSP) for adhesion of spermatozoa, was evaluated. Initially, two different TSP (102cm2 and 154cm2) achieved by various sizes of beads (1500, 2000 και 3000 μm in diameter) were tested. No significant difference in sperm viability improvement was noticed for the same TSP by different beads (P&gt;0.05). Optimization tests were then performed in which three different funnels were used for filtration at a standard TSP (154 cm2). The pear shaped funnel was found to be the most appropriate for filtration, since semen volume recovery and sperm viability improvement were more pronounced (P&lt;0.05). Subsequently, filtration tests were performed with pear shaped funnels with different TSP (102cm2 and 154cm2) aliquots. TSP of 102 cm2 proved to be most appropriate for filtration, as shown by the significant improvement of sperm viability (P&lt;0.05) and the significantly higher filtrate semen volume (P&lt;0.05). The optimum TSP of 102 cm2 was then used for the filtration of rejected low viability ejaculates for 12 months. Ejaculate characteristics (viability, volume, sperm concentration) were recorded both before και after filtration. The filtration procedure recovered 88.25% of the live sperm population along with 48.3% of the dead sperm population. Viability of the filtrated samples was improved more than 23% of its initial value, volume recovery exceeded 65% και sperm concentration was not in any way affected by the filtration procedure. Filtration time was less than 3 minutes (151 seconds in average). Filtrated samples and untreated samples were diluted, packaged in 0.25 ml straws and stored (5o C) for 72 hours. Spermatozoal characteristics (viability, acrosomal status, HOS test, production of ROS, sperm kinematics) of both the filtrated and untreated samples were recorded every 24 hours within the storage period. Viability of the filtrated samples was significantly higher than the untreated samples in 0, 24, 48 and 72 hours (P&lt;0.05). The acrosomal status of the filtrated spermatozoa was no different than that of untreated spermatozoa in 0, 24, 48 and 72 hours (P&gt;0.05). Filtrated spermatozoa were more resistant to the HOS test than the untreated samples in 0, 24, 48 and 72 hours (P&lt;0.05). Significant difference between groups in ROS production was detected after 72 hours of storage (P&lt;0.05). Analysis of the results revealed that the efficiency of the filtration procedure is increased in the breeding season of rams