Μοριακή διερεύνυση της ανθεκτικότητας οκτώ (8) πληθυσμών ήρας λεπτής (Lolium rigidum) σε ζιζανιοκτόνα:
Creators: name: Νταλιάνη, Ευγενία Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Ανθεκτικότητα
΄Ηρα λεπτή
Ζιζανιοκτόνα
Resistance
Lolium rigidum
Herbicides

description: Σε πειράματα διερεύνησης του μηχανισμού ανθεκτικότητας του ζιζανίου ήρα λεπτή (Lolium rigidum Gaudin.) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron, αξιολογήθηκαν επτά (7) ανθεκτικοί πληθυσμοί και ένας (1) ευαίσθητος πληθυσμός του ζιζανίου ως προς την ύπαρξη υπεύθυνων για την ανθεκτικότητα μεταλλάξεων στο ALS γονίδιο (αλληλούχηση του ALS γονιδίου) καθώς και τη δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS. Η αλληλούχηση του ALS γονιδίου έδειξε μεταλλάξεις υπεύθυνες για ανθεκτικότητα και συγκεκριμένα στο κωδικόνιο του αμινοξέος προλίνη 197 (Pro197) (CCG) [αρίθμηση με βάση το γένωμα του φυτικού είδους Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]. Ειδικότερα, μεταλλάξεις διαπιστώθηκαν στην πρώτη, δεύτερη και δεύτερη και τρίτη βάση του κωδικονίου. Επίσης, οι μεταλλάξεις διαπιστώθηκαν στο ένα μόνο αλληλόμορφο (R/S ετεροζυγωτία) ή και στα δύο αλληλόμορφα γονίδια (R/R ομοζυγωτία, R1/R2 ετεροζυγωτία). Οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις είχαν ως συνέπεια την αντικατάσταση της Pro197 με ένα από πέντε διαφορετικά αμινοξέα. Συγκεκριμένα, σε εννέα άτομα (φυτά) πέντε πληθυσμών διαπιστώθηκε αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από αλανίνη (Ala), ενώ σε δύο άτομα ενός πληθυσμού διαπιστώθηκε αντικατάσταση της Pro197 από λευκίνη (Leu) και σε δύο άτομα ενός άλλου πληθυσμού αντικατάστασή της από αργινίνη (Arg). Σε ένα άτομο διαπιστώθηκε αντικατάσταση του ίδιου αμινιξέος από γλουταμίνη (Gln), ενώ σε δύο άτομα ενός πληθυσμού του ζιζανίου παρατηρήθηκε ταυτόχρονη παρουσία δύο μεταλλάξεων, η οποία δεν επέτρεψε τον ακριβή προσδιορισμό του αμινοξέος αντικατάστασης. Στις περιπτώσεις αυτές, η αντικατάσταση της Pro197 από την ιστιδίνη (His) ήταν πιθανή. Η καταλυτική δράση (ενεργότητα) του ενζύμου ALS επτά ανθεκτικών πληθυσμών και ενός ευαίσθητου πληθυσμού ήρας αξιολογήθηκε παρουσία έξι (6) συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων chlorsulfuron, mesosulfuron και imazamox. Για το σκοπό αυτό, εκχυλίστηκαν οι πρωτεΐνες από φυτά των προαναφερθέντων πληθυσμών. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε φασµατοφωτοµετρικά µε μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 520 nm (A520nm), ενώ όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ακολούθως ως ποσοστό της απορρόφησης του μάρτυρα (αντίδραση απουσία ζιζανιοκτόνου). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με σκοπό την εξεύρεση της εξίσωσης που περιγράφει καλύτερα τη σχέση μεταξύ συγκέντρωσης του ζιζανιοκτόνου και δράσης του ενζύμου ALS, ενώ στη συνέχεια υπολογίστηκε, για κάθε πληθυσμό, η συγκέντρωση κάθε ζιζανιοκτόνου που προκαλεί μείωση της δράσης του ενζύμου ALS κατά 50% (τιμή I50). Ακολούθως, υπολογίστηκε η ένταση ανθεκτικότητας (R/S) ως το κλάσμα της I50 τιμής των ανθεκτικών πληθυσμών ως προς την αντίστοιχη I50 τιμή του ευαίσθητου πληθυσμού. H μεγαλύτερη ένταση ανθεκτικότητας (R/S) των πληθυσμών διαπιστώθηκε για το ζιζανιοκτόνο chlorsulfuron (R/S = 4,2 – &gt;320), ενώ μικρότερες τιμές υπολογίσθηκαν για το mesosulfuron (R/S = 4 – 49,9) και imazamox (R/S = 0,5 – 1). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 από Ala, Leu, Gln, Arg, ή His είχε ως αποτέλεσμα τη μειωμένη ευαισθησία του ενζύμου ALS (σταυρανθεκτικότητα) στα ζιζανιοκτόνα chlorsulfuron και mesosulfuron, ενώ οι ίδιες αντικαταστάσεις δεν επηρέασαν την ευαισθησία του ALS ενζύμου στο ζιζανιοκτόνο imazamox. Αυτό σημαίνει ότι η αντικατάσταση του αμινοξέος Pro197 οδήγησε σε μειωμένη ευαισθησία των πληθυσμών της ήρας στις σουλφονυλουρίες (chlorsulfuron και mesosulfuron) αλλά όχι στις ιμιδαζολινόνες (imazamox).
description: Experiments were conducted to investigate one (1) sensitive and seven (7) resistant rigid ryegrass (Lolium rigidum Gaudin.) populations for possible existence of mutations in their ALS gene (DNA sequencing), which are responsible for ALS resistance to herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron. The ALS sequencing showed mutations on the codon 197 (Pro197) (CCG) [numbering based on Arabidopsis thaliana (L.) Heynh sequence]. In particular, mutations were found at the first, second, and second and third base of this codon, whereas these mutations were found either in one allele (R/S heterozygosity) or in both alleles (R/R homozygosity, R1/R2 heterozygosity). These mutations resulted in the substitution of Pro by five different amino acids. More specifically, nine plants of five resistant populations had substitution of the Pro197 by alanine (Ala), whereas two plants of one population had substitution at the same amino by leucine (Leu) and two plants of another population by arginine (Arg). However, one plant had substitution by glutamine (Gln) and two plants of another population had two mutations simultaneously. Regarding the later, it was impossible to determine accurately the amino acid substitution but it is possible that Pro197 was substituted by histidine (His). ALS in vitro experiments were also conducted to study the activity of the ALS enzyme (protein fraction showing ALS activity) extracted from one sensitive and seven resistant rigid ryegrass populations in the presence of six (6) concentrations of chlorsulfuron, mesosulfuron and imazamox. The extracted protein fraction with ALS activity was used to catalyze the condensation of two pyruvate molecules to form acetolactate. The data obtained from the conducted tests (absorption at Α520 nm) were expressed as percentage (%) of the absorption recorded in the control samples (reaction absence herbicide). Also, the concentration of herbicide that causes 50% reduction of ALS activity (I50 value) was estimated for every population. The estimated I50 values were used to calculate the resistance factor (R/S) as the I50 value of the resistant population divided by the respective I50 value of the sensitive population. The highest resistance factor was estimated for the herbicide chlorsulfuron (R/S = 4,2 – &gt;320), the moderate for mesosulfuron (R/S = 4 – 49,9) and the lowest was estimated for imazamox (R/S = 0,5 – 1). These data indicated that the Pro197 substitution by Ala, Leu, Gln, Arg or His resulted in reduced ALS sensitivity to the herbicides chlorsulfuron and mesosulfuron, whereas the Pro197 substitution did not affect the ALS sensitivity to herbicide imazamox. Therefore, these results clearly suggest that amino acid substitution at the codon 197 (Pro197) was related with high ALS resistance to sulfonylureas (chlorsulfuron and mesosulfuron) but not to imidazolinones (imazamox).