title: In vivo Dynamiken von DnaA und seinen Regulatoren
title: In vivo dynamics of DnaA and its regulators
Creators: name: Schenk, Katrin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: DnaA
Replikation
Zellzyklus
Replication
Chemistry and allied sciences
Cell cycle

description: An important step during the
      bacterial cell cycle is the duplication of the chromosome.
      This key process has to be tightly regulated to ensure that
      the number of chromosomes per cell remains constant.
      Chromosomal DNA replication is initiated at the origin of
      replication by the highly conserved initiator protein DnaA.
      DnaA binds to specific DNA sequences at the oriC region and
      initiates replication by forming a stable, helical
      right-handed nucleoprotein complex, which leads to local
      unwinding of the double-stranded DNA. To prevent untimely and
      overinitiation the initiation step is highly regulated. In B.
      subtilis, YabA and Soj (ParA) play major roles in regulating
      the initiation of replication. YabA functions as an
      anti-cooperativity factor of DnaA and furthermore tethers
      DnaA to the replication machinery. Soj, on the other hand,
      was shown to stimulate DNA replication in its dimeric form
      and to inhibit DnaA helix formation as a monomer. This study
      reveals that the localization of YabA with respect to the
      origin of replication and the replication machinery is
      similar to the pattern previously observed for DnaA,
      indicating that YabA can localize at the origin of
      replication but that it is primarily localized at the
      replisome. By using in vivo fluorescence microscopy after
      photobleaching (FRAP), I could show that the exchange rates
      of DnaA molecules bound to the origin of replication or at
      the replication machinery are similar and in the lower second
      range. Furthermore, a deletion of yabA or soj- spo0J
      significantly decreased the turnover of DnaA. In addition,
      YabA was shown to have similar recovery half-times as DnaA.
      As a second approach single molecule microscopy in live cells
      was applied. The study of DnaA at the single molecule level
      reveals that DnaA is indeed a highly mobile protein and does
      not rest for more than a few hundred milliseconds at its
      individual binding sites. Because DnaA also acts as
      transcription factor at several sites throughout the
      chromosome, these sites also include several promotor sites,
      and not only oriC or the replication forks. Furthermore, a
      deletion of soj-spo0J increased the residence time of DnaA
      molecules, which is in accordance with results obtained in
      FRAP experiments. On the contrary, a DnaA variant carrying a
      single amino acid substitution, which renders it impaired in
      ATPase activity and leads to an underinitiation of
      replication, displays an even shorter residence time than
      wild type DnaA. Therefore, even mild differences in residence
      time can lead to aberrant initiation frequencies. YabA
      molecules, on the other hand, tend to be significantly more
      static, indicating that DnaA and YabA are not scanning
      together over the chromosome. Strikingly, E. coli DnaA showed
      an oscillation of DnaA molecules between the two cell halves
      and a diffusion constant and residence time similar to B.
      subtilis DnaA, revealing that DnaA is highly dynamic in two
      different bacterial species. Subsequently, the observation
      that DnaA in E. coli oscillates might support the notion of a
      mechanism in which DnaA is chased by a slower regulatory
      protein that upon interaction induces the release of DnaA
      from its binding ixsite, thereby inducing the alternating
      pattern of DnaA. Fast turnover rates may be advantageous to
      integrate many regulatory inputs into the decision whether to
      initiate or not. In B. subtilis the two regulators YabA and
      Soj could act in part through a stimulation of DnaA turnover
      at oriC and the replication machinery, thereby regulating the
      initiation of replication.
description: Die Verdopplung des Chromosoms ist
      ein entscheidender Schritt des bakteriellen Zellzyklus. Um
      die Anzahl der Chromosomen pro Zelle konstant zu halten, muss
      dieser Prozess streng reguliert werden. Die Replikation wird
      am Replikationsursprung durch das hochkonservierte
      Initiationsprotein DnaA initiiert. Dazu bindet DnaA an
      spezifische DNA-Sequenzen in der Ursprungsregion und bildet
      einen helikalen Nukleo-Protein-Komplex, der die lokale
      Aufwindung des Doppelstrangs herbeiführt. Dies muss
      kontrolliert geschehen, um eine Initiation zu einem falschen
      Zeitpunkt zu vermeiden. Für Bacillus subtilis sind zwei
      Regulationsproteine bekannt, YabA und Soj (ParA). YabA
      erfüllt zwei Funktionen: Zum einen wirkt es als
      Anti-Kooperativitätsfaktor für DnaA und zum anderen
      rekrutiert es, vermittelt duch eine Interaktion mit DnaN,
      DnaA und die Replikationsmaschinerie. Das Protein Soj
      hingegen kann ATP-abhängig ein Dimer bilden und als solches
      fördernd auf die DnaA-Aktivität wirken, während es in seiner
      ADP- gebundenen Form als Monomer vorliegt und am Ursprung die
      Ausbildung der rechtsgängigen DnaA-Helix verhindert. Die
      vorliegende Arbeit zeigt, dass die Lokalisation von YabA im
      Bezug auf den Replikationsursprung und die
      Replikationsmaschinerie einem ähnlichen Muster folgt, wie es
      für DnaA bekannt ist. Dabei stellt sich heraus, dass YabA
      hauptsächlich am Replisom, aber auch am Ursprung lokalisieren
      kann. Unter Zuhifenahme von FRAP (fluorescence recovery after
      photobleaching) konnte ich in vivo zeigen, dass DnaA einen
      hohen Turnover am Ursprung und an der Replikationsmaschinerie
      hat, der im Bereich von nur wenigen Sekunden liegt. Des
      Weiteren verringert eine Deletion von yabA und soj-spo0J den
      Turnover von DnaA. YabA hingegen zeigt ein ähnliches
      Verhalten wie DnaA. In einem zweiten Ansatz wurde
      Einzel-Molekül-Mikroskopie an lebenden Zellen durchgeführt.
      Die Untersuchung von DnaA-Einzelmolekülen bestätigt, dass es
      sich bei DnaA um ein sehr dynamisches Protein handelt, das
      für nicht mehr als wenige Millisekunden an seinen
      Bindestellen verweilt. Da DnaA auch als Transkriptionsfaktor
      wirkt, beinhalten diese Bindestellen nicht nur den Ursprung
      und die Replikationsmaschinerie, sondern auch mehrere über
      das ganze Chromosom verteilte Promotoren. Des Weiteren führt
      eine Deletion von soj-spo0J zu verkürzten Verweildauern, was
      im Einklang mit den FRAP-Daten steht. Im Gegensatz dazu
      verweilt eine DnaA-Variante, die eine Aminosäuresubstitution
      trägt, welche die ATPase-Aktivität und die Initiationsrate
      beeinträchtigt, deutlich kürzer. Folglich führen selbst
      geringe Unterschiede in der Verweildauer zu untypischen
      Initiationsfrequenzen. YabA-Einzelmoleküle hingegen sind
      statischer, was darauf hindeutet, dass DnaA und YabA nicht
      gemeinsam, als Komplex, die DNA scannen. Erstaunlicherweise
      war für E. coli-DnaA eine Oszillation der DnaA-Moleküle
      zwischen den zwei Zellhälften zu beobachten. Die
      Diffusionskonstante und die Verweildauer ähnelten denen von
      B. subtilis-DnaA, was eine hohe Dynamik von DnaA Proteinen in
      zwei Bakterienspezies zeigt. viiDie Beobachtung, dass E.
      coli-DnaA oszilliert, lässt weiterhin einen Mechanismus
      vermuten, bei dem ein regulatorisches Protein DnaA verfolgt
      und es von seinen Bindestellen löst, was zu dem beobachteten
      Muster führen könnte. Hohe Änderungsraten können vorteilhaft
      sein um viele regulatorische Impulse in die Entscheidung über
      eine Initation zu integrieren. In B. subtilis könnten die
      zwei Regulatoren YabA und Soj teilweise durch eine
      Stimulation der zeitlichen Änderungsrate von DnaA am Ursprung
      und an der Replikationsmaschinerie agieren.