title: Rolle von ICSBP in der Genetik BCR-ABL-induzierter Transformation und bei der Resistenzentstehung von BCR-ABL-transformierten Zellen gegenüber Imatinib
title: Role of ICSBP in the genetic of BCR-ABL induced transformation and in the development of resistance of BCR-ABL transformed cells towards imatinib
Creators: name: Schmidt, Katharina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Chronisch-myeloische Leukaemie
Medizin, Gesundheit
CML

description: The reciprocal gene translocation
      t(9;22)(q34;q11) creates the Philadelphia chromosome (Ph+)
      carrying the BCR-ABL fusion gene. It is the causative genetic
      aberration of chronic myelogenous leukaemia (CML) and encodes
      a constitutively active protein tyrosine kinase. CML is
      characterized by three clinical stages including the chronic
      phase, the accelerated phase and the blast crisis. After a
      median of 3-4 years rather indolent chronic phase accelerates
      to blast crisis, an acute leukaemia. Although the underlying
      mechanisms are not fully understood, the appearance of
      additional genetic and/or epigenetic abnormalities in the
      blast phase strongly suggests that superimposed genetic
      alterations account for disease progression. There is
      mounting evidence that the family of interferon regulatory
      factors (IRFs), among them particularly IRF-8 (ICSBP) and
      IRF-4, is involved in the pathogenesis of CML. In the
      peripheral blood of CML patients in chronic phase the
      ICSBP-mRNA expression is very low or absent compared with
      blood from healthy donors. INF-α therapy leads to an increase
      of ICSBP transcripts in the treated patients. Furthermore
      there is a correlation between good response to INF-α and
      high ICSBP levels. These data suggest a role for ICSBP as a
      tumour suppressor and regulator of apoptosis in diseases of
      the myeloid system. In an attempt to address whether there is
      genetic evidence for the cooperation between BCR-ABL and the
      loss of ICSBP in the oncogenic transformation of
      haematopoiesis we performed a replating assay. This
      experiment was based on the observation that BCR ABL
      transduced mononuclear bone marrow cells from ICSBP-/- mice
      could be replated more often than the corresponding cells
      from ICSBP+/+ mice. Flow-sorted mononuclear bone marrow cells
      from ICSBP+/+ and ICSBP+/- mice were transduced with BCR-ABL.
      We then looked for their replating capacities in
      methylcellulose culture. The replating pattern did not differ
      significantly. Both cells from ICSBP+/+ and from ICSBP+/-
      mice did not form any CFUs beyond the first round of
      replating. These results indicate that the genetic selection
      pressure in the course of the replating assay is not
      sufficient to lead to LOH. Thus, genetic evidence for the
      cooperation between BCR-ABL and loss of ICSBP in
      transformation could not be found. In the second part of the
      thesis we investigated whether ICSBP has an impact on
      resistance to imatinib based on the observation that 32D/BA
      ICSBP cells are significantly more sensitive to apoptosis in
      the presence of imatinib than 32D/BA cells. These data
      suggest a role for ICSBP as a tumour suppressor and regulator
      of apoptosis. In an ENU based mutagenesis assay we compared
      the resistence pattern of 32D/BA and 32D/BA-ICSBP cells and
      found that ICSBP seems to increase the rate of resistance.
      Because ENU causes point mutations in multiple proteins, we
      hypothesized that in our assay, resistance to imatinib may be
      multifactorial. However in western blot it became obvious
      that the resistant clones had an active tyrosine kinase
      suggesting that point mutations in the kinase domain of
      BCR-ABL may be responsible for resistance to imatinib.
      Whether treatment with ENU has an impact on the increased
      resistance in 32D/BA ICSBP cells and by which mechanisms
      ICSBP leads to increased resistance to imatinib will be part
      of further investigation. Taken together, genetic evidence
      for the cooperation between BCR-ABL and ICSBP in the
      oncogenic transformation could not be found, and ICSBP
      increases the resistance rate in BCR ABL-transduced 32D cells
      in the presence of imatinib.
description: Die ursächliche Mutation in der CML
      ist die reziproke chromosomale Translokation
      t(9;22)(q34;q11), die für das Fusionsprotein BCR-ABL, eine
      konstitutiv aktive Tyrosinkinase, kodiert. Die CML ist durch
      drei Krankheitsphasen gekennzeichnet, dazu gehören die
      chronische Phase, die Akzelerationsphase und die
      Blastenkrise. Die eher indolente chronische Phase akzeleriert
      nach etwa 3-5 Jahren zur Blastenkrise, einer akuten Leukämie.
      Welche Faktoren mit BCR-ABL kooperieren und die Progression
      von der chronischen Phase zur Blastenkrise herbeiführen, ist
      bisher nur unzureichend verstanden. Zahlreiche Untersuchungen
      deuten darauf hin, dass die Gruppe der Interferon
      regulatorischen Faktoren (IRFs), darunter insbesondere ICSBP
      und IRF-4, in der Pathogenese der CML eine wichtige Rolle
      spielt. In peripherem Blut von Patienten mit CML in der
      chronischen Phase ist die ICSBP-Expression im Vergleich zu
      Normalblut signifikant vermindert. Eine Therapie mit INF-α
      vermag die ICSBP Expression der Patienten wieder anzuheben
      und zwischen gutem Ansprechen und hoher ICSBP-Expression
      besteht eine positive Korrelation (Schmidt et al., 1998).
      Diese Daten deuten auf eine antileukämische Wirkungsweise von
      ICSBP bei Erkrankungen des myeloischen Systems hin. In dieser
      Arbeit wurde versucht, mithilfe eines Replattierungsassays in
      Methylcellulose eine genetische Evidenz für die Kooperation
      von BCR-ABL mit dem Verlust von ICSBP in der onkogenen
      Transformation der Hämatopoese zu finden. Grundlage dieses
      Experimentes war die Beobachtung, dass sich
      BCR-ABL-transduzierte mononukleäre Knochenmarkzellen von
      ICSBP-/--Mäusen deutlich häufiger replattieren ließen als
      entsprechende Zellen von ICSBP+/+-Mäusen. In der vorliegenden
      Arbeit wurde das Replattierungsverhalten von
      BCR-ABL-transduzierten mononukleären Knochenmark-zellen von
      ICSBP+/+- und ICSBP+/--Mäusen untersucht. Für die Analyse des
      genomischen ICSBP-Status dieser Zellen wurde zu Beginn eine
      PCR standardisiert. Beide Zelltypen unterschieden sich jedoch
      nicht wesentlich in ihrem Replattierungsverhalten mit der
      Unfähigkeit, über die erste Replattierung hinaus CFUs zu
      bilden. Die Ergebnisse deuten an, dass der genetische
      Selektionsdruck durch Inaktivierung eines der beiden
      ICSBP-Allele während des Replattierungsassays nicht
      ausreicht, um einen Verlust der Heterozygotie herbeizuführen.
      Eine gentische Evidenz für die Kooperation von BCR-ABL mit
      dem Verlust von ICSBP in der onkogenen Transformation konnte
      daher nicht gefunden werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde
      der Beitrag von ICSBP zur Resistenzentstehung unter
      kontinuierlicher Anwesenheit von Imatinib untersucht.
      Ausgangspunkt dieses Experimentes war die Entdeckung, dass
      ICSBP die imatinibinduzierte Apoptoserate erhöht (Burchert et
      al., 2004). Diese Daten weisen auf eine Funktion von ICSBP
      als Tumorsuppressor und Regulator von Apoptose hin. In einem
      ENU-basierten Mutageneseassay wurde die Resistenzfrequenz von
      32D/BA- und 32D/BA ICSBP Zellen miteinander verglichen und es
      konnte überraschend gezeigt werden, dass ICSBP die
      Mutationsfrequenz zu erhöhen scheint. ENU erzeugt
      Punktmutationen in multiplen Genen, so dass die Genese der
      Resistenz multifaktoriell bedingt sein kann. Im Western Blot
      zeigte sich jedoch in den resistenten Zellklonen unter
      Imatinib-Behandlung eine aktive Tyrosinkinase. Dies lässt
      vermuten, dass Punktmutationen im Bereich der Kinase-Domäne
      von BCR-ABL für die Resistenz verantwortlich sind. Ob die
      Vorbehandlung der Zellen mit ENU Einfluss auf die erhöhte
      Resistenzbildung von 32D/BA ICSBP-Zellen hat und über welchen
      Mechanismus ICSBP zu einer erhöhten Resistenz gegenüber
      Imatinib führt, wird Teil weiterer Studien sein.
      Zusammenfassend lassen die erhobenen Daten folgende
      Schlussfolgerungen zu: Erstens konnte keine genetische
      Evidenz für die Kooperation von BCR-ABL mit ICSBP in der
      onkogenen Transformation gezeigt werden und zweitens fördert
      ICSBP die Resistenzentstehung BCR ABL transformierter
      32D-Zellen gegenüber Imatinib.