ANTI-TUMORAL EFFECTS OF MIR-3189-3P IN GLIOBLASTOMA
Creators: name: DE LUCA, MARIACRISTINA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2015

description: Introduzione: Il glioblastoma e? un tumore maligno del cervello, della categoria dei gliomi, caratterizzato da rapida crescita cellulare, elevata invasivita?, aggressivita? e resistenza alla radio e chemioterapia. I soggetti colpiti da questa forma tumorale, che costituisce circa il 50% delle neoplasie maligne cerebrali negli adulti, hanno in media un?aspettativa di vita di quindici mesi. Il trattamento di base prevede l?asportazione della massa tumorale in combinazione alla radioterapia, eventualmente seguite da chemioterapia con temozolomide. Data l?estrema necessita? di sviluppare nuove strategie terapeutiche per questo tumore fino ad ora praticamente incurabile, l?individuazione dei meccanismi molecolari che sono alla base della proliferazione e della sopravvivenza del glioblastoma e? di fondamentale importanza. Growth Differentiation Factor 15 (GDF15), conosciuto anche con il nome di Nonsteroidal Anti-Inflammatory drug-activated Gene-1 (NAG-1) o Macrophage Inhibitory Cytokine-1 (MIC-1) e? una proteina della famiglia del transforming growth factor-? (TGF-?). Il gene che codifica per GDF15 e? costituito da due esoni che generano un precursore composto da un pro-peptide di 167 amminoacidi e da un dominio corrispondente al peptide maturo di 112 amminoacidi. In seguito alla dimerizzazione, avviene il clivaggio del precursore con il successivo rilascio del peptide maturo di 112 amminoacidi nella matrice extracellulare, dove agisce come dimero biologicamente attivo. L?espressione di GDF15 nei tessuti e? notevolmente indotta in risposta a stimolazione con differenti farmaci anti-infiammatori, agenti citotossici, agonisti dei recettori della famiglia dei peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) e farmaci antitumorali. Il ruolo di GDF15 nella tumorigenesi non e? stato ancora del tutto chiarito. Evidenze sperimentali dimostrano che elevati livelli di trascritto sono presenti in pazienti durante la progressione dello stadio tumorale da astrocitoma a glioblastoma, ma altri studi hanno dimostrato come l?espressione di GDF15 sia indotta in risposta a trattamenti chemioterapici. Metodi: L?espressione di GDF15 mediante saggi di Real-time PCR, Western Blot ed Elisa e del miR-3189-3p mediante Real-time PCR e? stata valutata nella linea cellulare di glioblastoma LN-229 in seguito a stimolazione con Fenofibrato. Saggi di transfezione in vitro sono stati effettuati allo scopo di validare il targeting del miR-3189-3p sulla regione 3?UTR dei due geni SF3B2 e p63RhoGEF. Analisi di Real-time PCR, Western Blot, di proliferazione e migrazione cellulare in vitro e l?iniezione subcutanea ed intracranica in topi nudi di cellule di glioblastoma precedentemente transfettate con il miR-3189-3p, sono state eseguite al fine di studiare il ruolo funzionale del miR-3189-3p. Risultati: Risultati precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la stimolazione della linea cellulare LN-229 con il fenofibrato, un agonista di PPAR?, determina un aumento di espressione di GDF15. Nel presente studio, dall?analisi della sequenza genica di GDF15 e? risultata di particolare interesse la presenza di un microRNA, miR-3189, all?interno del suo unico introne, in posizione prossimale all?esone 1. Il pre-mir-3189 contiene due sequenze di microRNA mature all?interno dell sua struttura a forcina: miR-3189-3p e miR-3189-5p, rispettivamente di 21 e 25 nucleotidi. Ad oggi non ci sono studi che abbiano riportato la funzione biologica di tale microRNA, pertanto dato il ruolo che ricoprono i microRNA nella regolazione genica, scopo principale di questo lavoro e? stato innanzitutto quello di definire gli effetti dei due microRNA, miR-3189-3p e -5p, nella funzione biologica di GDF15 nei glioblastomi. Abbiamo scoperto che l?induzione del trascritto e della proteina in seguito a stimolazione con fenofibrato e? accompagnata da una elevata espressione del miR-3189-3p e precede gli eventi di apoptosi innescati dal fenofibrato. Nelle medesime condizioni sperimentali non e? stata osservata invece induzione del miR-3189-5p. Inoltre, mediante saggi di transfezione, abbiamo dimostrato che l?espressione ectopica del miR-3189-3p determina una inibizione della proliferazione e della migrazione cellulare mediante il silenziamento di due dei suoi mRNA bersaglio predetti, rispettivamente il fattore di splicing SF3B2 e il fattore di scambio del nucleotide guanina p63RhoGEF. Dall?analisi di espressione genica su campioni di glioblastoma e di tessuti normali abbiamo trovato che ad un aumento dei livelli di espressione di GDF15 nei glioblastomi corrisponde un decremento dei livelli di miR-3189-3p e, in aggiunta, queste differenze di espressione correlano con un incremento nei livelli di SF3B2 e una tendenza all?aumento in p63RhoGEF. Infine, esperimenti di iniezione subcutanea e intracranica di cellule di glioblastoma precedentemente transfettate con il miR-3189-3p, hanno mostrato una inibizione della crescita tumorale rispetto a cellule di controllo. Conclusioni: Tutte queste evidenze sperimentali supportano e validano il ruolo di miR-3189-3p come oncosoppressore nei glioblastomi mediante il controllo della crescita e della migrazione cellulare attraverso il silenziamento rispettivamente di SF3B2 e p63RhoGEF.