title: Zwischen Zellzyklus-Arrest und Apoptose – p53-Kooperativitätsmutanten in vivo
Creators: name: Schäfer, Jonas Aaron
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: H1-Helix
TP53
Kooperativität
Medical sciences Medicine
Medizin
p53

description: Das p53-Protein übt seine Eigenschaften als Tumorsuppressor aus, indem es über das Schicksal einer Zelle bestimmt. Die Integration intrinsischer und extrinsischer zellulärer Stresssignale erlaubt p53 als tetramerem, sequenz-spezifischem Transkriptionsfaktor entscheidende Zielgene zu regulieren, die entweder einen Zellzyklusarrest, Seneszenz oder Apoptose befördern. Wie diese differentielle Expression reguliert wird, ist nach wie vor Gegenstand in-tensiver Forschung. Unlängst wurde in der Arbeitsgruppe Stiewe gezeigt, dass eine intrinsische Eigenschaft von p53 – die kooperative DNA-Bindung – die-sen Prozess moduliert. Durch Mutagenese zweier geladener Aminosäurereste der H1-Helix (E180 und R181), die über ionische Wechselwirkungen eine Stabilisierung zwischen je zwei p53-Monomeren im Tetramer vermitteln, konn-ten Mutanten mit unterschiedlich ausgeprägter DNA-Bindungskooperativität generiert werden. Während p53-Mutanten mit verminderter Kooperativität wei-terhin einen Zellzyklusarrest induzieren können, so sind sie in der Apoptos-einduktion defizient. Mutationen mit erhöhter Kooperativität zeigen demge-genüber sogar erhöhte Apoptoseraten im Vergleich zu Wildtyp-p53. Ziel dieser Arbeit war es, die Effekte dieser p53-Kooperativitätsmutanten in Bezug auf das Tumorwachstum sowie auf das Ansprechen auf eine chemotherapeutische Behandlung mit Hilfe eines Xenotransplantations-Mausmodells zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine p53-defiziente klonogene Reporter-Zelllinie mit Expression einer Luciferase generiert und mit den p53-Mutanten superinfiziert. Nach subcutaner Injektion dieser Zellen in immunkompromittierte Mäuse, konnte die Tumorlast im Zeitverlauf wiederholt an kleinvolumigen Blutproben durch Aktivitätsmessung der sezernierten Gaussia-Luciferase gemessen werden. Die methodischen Aspekte dieser Ar-beit betreffend konnte gezeigt werden, dass i) die Reporterzelllinie ein geeig-netes Instrument zur Untersuchung der p53-Antwort ist mit einem zu den pa-rentalen HCT 116-Zellen identischem Verhalten und ii) dass mit Hilfe dieser Reporterzelllinie die Aktivitätsmessungen der Gaussia-Luciferase ein einfa-ches, robustes und vor allem präzises und sensitives Werkzeug zur Quantifi-zierung der Tumorlast darstellen. In der Anwendung dieses Messsystems ergab sich kein nachweisbarer Ein-fluss auf den Spontanverlauf des Tumorwachstums in Abhängigkeit der Ko-operativität. Problem dieser Untersuchung war jedoch ein rascher Abfall der p53-Expression in den Krebszellen, der interessanterweise mit steigender Kooperativität zunehmend ausgeprägt war. Dieser negative Selektionseffekt erlaubt einen indirekten Rückschluss auf die mit der Kooperativität der p53-Mutanten korrelierende Effektstärke (verstärkte Tumorsuppression). Unter chemotherapeutischer Behandlung, die zu einer Stabilisierung von p53 führte, konnte trotz dieses Selektionseffekts ein vermindertes Ansprechen einer Mu-tante mit niedriger Kooperativität gezeigt werden. Genomumspannende Gen-expressionsuntersuchungen an Tumorproben bestätigen für dieses Modell bisherige in vitro gemachte Beobachtungen, nämlich dass eine niedrige Ko-operativität zwar hinreichend zur Induktion von Zellzyklusarrest-Genen ist, zur Apoptose-Induktion jedoch eine höhere Kooperativität erforderlich ist, die mit einem erhöhten Spektrum an transaktivierten Zielgenen einhergeht. In weiteren Arbeiten konnten Kollegen zeigen, dass die Kooperativität von p53 durch Phosphorylierung von Serin 183/185 negativ beeinflusst werden kann. Phosphorylierungen dieser Aminosäuren erfolgen möglicherweise durch die Aurorakinase B. Mehrere Inhibitoren dieser Kinase, die bei zahlreichen Krebserkrankungen überexprimiert ist, befinden sich zum Teil bereits in fort-geschrittener klinischer Erprobung.
description: The p53 protein exerts its tumour suppressive function by determining a cell's fate. The integration of intrinsic and extrinsic cellular stress signals allows p53 as a tetrameric, sequence-specific transcription factor to regulate key target genes that either promote cell cycle arrest, senescence or apoptosis. How this differential expression is regulated is still a subject of intensive research. Re-cently, it has been shown in the Stiewe group that an intrinsic trait of p53 – DNA binding cooperativity – modulates this process. Two charged amino acid residues of the H1-helix (E180 and R181) facilitate cooperative DNA binding. By mutagenesis of these amino acids the ionic interaction between two mon-omers each in the tetramer could be modulated resulting in mutants with dis-tinct cooperative traits. While cooperativity impaired p53 mutants still triggered cell cycle arrest, they failed to induce apoptosis. However, mutations with a higher cooperativity showed an increased rate of apoptosis in comparison to wildtype p53. The objective of this project was to check the effect of these p53 cooperativity mutants on tumour growth and the response to a chemotherapeutic agent in a xenograft tumour mouse model. For this purpose, a p53 deficient clonogenic reporter cell line stably expressing a luciferase was generated and superin-fected with the p53 mutants. After subcutaneous injection of these cells in im-munocompromised mice tumour burden could be quantified repeatedly over time by measuring the activity of the secreted Gaussia luciferase in small blood samples. Concerning the technical aspect of this work it could be shown that i) the reporter cell line is an appropriate tool for studying the p53 response behaving identical to parental HCT 116-cells and ii) that by use of this reporter cell line measurement of Gaussia luciferase activity is an easy, robust and par-ticularly precise and sensitive tool to quantify tumour burden. Utilizing this as-say system, no discernible difference of the spontaneous tumour growth de-pendent on cooperativity could be shown. The issue of this analysis was a rap-id decline in p53’s expression levels in cancer cells. Interestingly, a negative selection dependent on the strength of the cooperativity could be observed that suggests an effect of increasing tumour-suppressive potential with in-creasing DNA binding cooperativity. Despite of this negative selection the re-sponse to a chemotherapeutic agent that facilitates stabilisation of p53 was compromised in a low cooperativity mutant. Genome wide gene expression analysis performed on tumour samples confirm former in vitro data with this model: namely that a low cooperativity is sufficient to induce cell cycle arrest genes, induction of apoptosis, however, is dependent on higher cooperativity that leads to an increased spectrum of transactivated target genes. In further work colleagues were able to show that cooperativity of p53 is nega-tively regulated by phosphorylation of serine 183/185. Phosphorylation of these amino acid residues is potentially conducted by aurora kinase B. Sever-al inhibitors of this kinase, that is overexpressed in various cancers, are partly in advanced stages of clinical trials.