Μηχανισμοί αντοχής πολυανθεκτικών στελεχών Klebsiella Pneumoniae σε τριτοβάθμιο ελληνικό νοσοκομείο
Creators: name: Ζάρρας, Χαράλαμπος Κ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Καρβαπενέμη ανθεκτική Κλεμπσιέλλα της πνευμονίας
Αλληλούχιση ολόκληρου γονιδιώματος
Ανάλυση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών
Μοριακή επιδημιολογία
Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae
Whole genome sequencing
Single-nucleotide polymorphism analysis
Molecular epidemiology

description: Εισαγωγή: Η παρατηρούμενη εξάπλωση πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων, συμπεριλαμβανομένης της Klebsiella pneumoniae, αποτελεί παγκόσμια απειλή για τη Δημόσια Υγεία. Ο πιο συχνός μηχανισμός επίκτητης αντοχής στις καρβαπενέμες είναι μέσω της παραγωγής καρβαπεμενασών, ιδιαίτερα της καρβαπενεμάσης K. pneumoniae (KPC), της μεταλλο-β-λακταμάσης Νέου Δελχί (NDM), μεταλλο-β-λακταμάσης Verona Integron-Borne (VIM), ιμιπενεμάσης (IMP) και οξακιλλινάσης-48 (OXA-48). Η εφαρμογή της αλληλουχίας επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing-NGS) αποτελεί ένα ισχυρό εργαλείο για τη λήψη αλληλουχιών ολόκληρου γονιδιώματος (Whole-Genome Sequencing-WGS) των βακτηρίων, δίνοντας τη δυνατότητα για τον πλήρη γενετικό χαρακτηρισμό των στελεχών και την επιδημιολογική συσχέτιση μεταξύ των στελεχών. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο γενετικός χαρακτηρισμός πολυανθεκτικών στελεχών K. pneumoniae απομονωθέντων από ασθενείς των ΜΕΘ τριτοβάθμιου νοσοκομείου και η ταυτοποίηση των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στα αντιβιοτικά, και κυρίως στις καρβαπενέμες. Υλικό και μέθοδοι: Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 150 στελέχη CRKP που συλλέχθηκαν από ασθενείς που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ ενηλίκων (116 στελέχη, 77,4%), την παιδιατρική ΜΕΘ (17 στελέχη, 11,3%) και τις δύο ΜΕΘ νεογνών (17 στελέχη, 11,3%) του Ιπποκράτειου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης από τον Ιούνιο του 2018 έως τον Ιούλιο του 2021. Η διάμεση ηλικία των παιδιατρικών ασθενών ήταν 2 έτη (εύρος 14 ημερών–18 ετών) και εκείνη των ενηλίκων ασθενών 66 έτη (εύρος 19–92 ετών). Εκτός των φαινοτυπικών μεθόδων, εφαρμόστηκε μία πολυπλεκτική PCR για την ανίχνευση των γονιδίων αντοχής στις καρβαπενέμες blaKPC, blaNDM, blaIMP και τύπου blaOXA-48. Το πρωτόκολλο τροποποιήθηκε με την προσθήκη εκκινητών για την ανίχνευση του blaVIM-1. Πραγματοποιήθηκε περιγραφική και συμπερασματική στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο SPSS v. 22.0. Σε 24 αντιπροσωπευτικά στελέχη CRKP εφαρμόστηκε η μέθοδος NGS. Από αυτά, τα 18 επιλέχθηκαν από τα 150 στελέχη της συνολικής μελέτης, ώστε να περιλαμβάνονται στελέχη από όλα τα έτη και από όλους τους τύπους καρβαπενεμάσης, ενώ εξετάστηκαν 6 επιπλέον στελέχη που συλλέχτηκαν από τον Δεκέμβριο 2021 μέχρι τον Ιούνιο του 2022, διότι τα στελέχη αυτά απομονώθηκαν από ασθενείς με σηψαιμία και παρουσίαζαν κλινικό ενδιαφέρον. Η διάμεση ηλικία των ενηλίκων ασθενών ήταν 57,5 έτη (εύρος 30–88), ενώ η διάμεση ηλικία των παιδιών ήταν 6,2 έτη (εύρος 0,25–17). Οι τύποι αλληλουχίας (ST), τα πλασμίδια, τα γονίδια που σχετίζονται με τα ρυθμιστικά συστήματα και αντλιών εκροής καθώς και τα γονίδια μικροβιακής αντοχής ταυτοποιήθηκαν με διάφορα λογισμικά πακέτα. Για τη φυλογενετική ανάλυση του πυρήνα γονιδιώματος (core genome SNP, cgSNP), τον εντοποισμό των θέσεων σημειακών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) καθώς και για την κατασκευή φυλογενετικού δέντρου εφαρμόστηκαν ειδικά προγράμματα βιοπληροφορικής. Αποτελέσματα: Με την εφαρμογή της πολυπλεκτικής PCR βρέθηκε ότι οι συχνότερες καρβαπενεμάσες ήταν οι KPC και NDM (37,3 και 36,0%, αντίστοιχα) με αποτελέσματα ταυτόσημα με αυτά της ανοσοδοκιμασίας. Το γονίδιο blaNDM ανιχνεύθηκε κυρίως σε ενήλικες (54/116, 46,9%), ενώ σε νεογνά και παιδιά το πιο συχνό γονίδιο ήταν το blaKPC (24/34, 70,6%). Ο κύριος μηχανισμός αντοχής στις καρβαπενέμες κατά την περίοδο 2018-2019 ήταν η παραγωγή KPC μόνη της ή σε συνδυασμό με VIM, ενώ σημαντική επικράτηση της παραγωγής NDM παρατηρήθηκε κατά την περίοδο 2020-2021 (p &lt;0,001). Ο επιπολασμός των γονιδίων που προσδίδουν αντοχή στις β-λακτάμες ήταν 100%, στις αμινογλυκοσίδες 79,2%, στις κινολόνες 95,8%, στη φωσφομυκίνη και την τιγεκυκλίνη 33,3% και στην κοτριμοξαζόλη 87,5%. Το πιο διαδεδομένο πλασμίδιο ήταν το IncF, το οποίο σχετίζεται με την εξάπλωση αρκετών γονιδίων β-λακταμάσης εκτεταμένου φάσματος (ESBL) ή καρβαπενεμασών, και ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη CRKP. Επιπλέον πλασμίδια (όπως Col και IncC), βρέθηκαν σε δεκαπέντε στελέχη. Οι παράγοντες λοιμογόνου δράσης που ανιχνεύθηκαν περιλάμβαναν γονίδια για φίμπριες για σιδηροφόρα μόρια, καθώς και γονίδια για την yersiniabactin και γονίδια που κωδικοποιούν το σιδεροφόρο αεροβακτίνη. Γονίδια που κωδικοποιούν την αντλία εκροής AcrAB (acr, mar, sox, rob, ram, sdiA, fis και envR) ή την αντλία εκροής OqxAB (oqx και rar) υπήρχαν σε όλα τα στελέχη. Τα 24 στελέχη CRKP ανήκαν σε οκτώ διαφορετικούς τύπους αλληλουχιών (ST): ST11 (7, 29.1%), ST39 (7, 29.1%), ST323 (3, 12.5%), ST15 (7, 29.1%), ST307 (1, 4.2%), ST30 (1, 4.2%), ST512 (1, 4.2%) και ST35 (1, 4.2%). Δημιουργήθηκαν κυκλικοί χάρτες γονιδιώματος για τους τέσσερις πιο συχνούς τύπους ST (ST11, ST39, ST323 και ST15). Βρέθηκε ότι τα στελέχη που ανήκαν στον ίδιο ST μοιράζονταν πολλές ίδιες περιοχές με το στέλεχος αναφοράς. Κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση το cgSNP όλων των στελεχών, σε σχέση με το στέλεχος αναφοράς. Να σημειωθεί ότι με την εφαρμογή NGS αναγνωρίστηκε η πρώτη περίπτωση νεογνικής σήψης οφειλόμενης σε στέλεχος K. pneumoniae ανθεκτικού στο CAZ/AVI που παρήγαγε KPC-2 και VEB-25, που οδήγησε σε εφαρμογή προσαρμοσμένου προγράμματος ενεργούς επιτήρησης σε συνδυασμό με μέτρα ελέγχου λοιμώξεων. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη παρέχει πληροφορίες για τον γενετικό χαρακτηρισμό στελεχών CRKP που κυκλοφόρησαν στις ΜΕΘ ενός ελληνικού τριτοβάθμιου νοσοκομείου κατά τη διάρκεια της μελέτης, δίνοντας στοιχεία για τους μηχανισμούς αντοχής στα αντιβιοτικά. Η εφαρμογή της τεχνικής NGS σε νοσοκομειακό περιβάλλον είναι εξαιρετικά χρήσιμη, καθώς τα δεδομένα που λαμβάνονται σχετικά με τη χρονική και χωρική κλωνική κατανομή των στελεχών μπορούν να καθοδηγήσουν τον σχεδιασμό έγκαιρων και δραστικών μέτρων ελέγχου των λοιμώξεων.
description: Introduction: The observed spread of multidrug-resistant Gram-negative bacteria, including Klebsiella pneumoniae, is a global threat; the problem is higher in hospitalized patients, especially those in the intensive care units (ICUs). The most frequent mechanism of acquired carbapenem resistance is through the production of carbapenemases, especially K. pneumoniae carbapenemase (KPC), New Delhi metallo-blactamase (NDM), Verona Integron-Borne metallo-b-lactamase (VIM), imipenemase (IMP) and oxacillinase-48 (OXA-48). The application of Next-Generation Sequencing (NGS) is a powerful tool for whole-genome sequencing (WGS) of bacteria, enabling the full genetic characterization of strains and the epidemiological correlation between of executives. Aim of this PhD thesis was the genetic characterization of multidrug-resistant strains of K. pneumoniae isolated from ICU patients of a tertiary hospital and the identification of the genes that confer resistance to antibiotics, and mainly to carbapenems. Material and Methods: The study included 150 CRKP isolates collected from patients hospitalized in the adult ICU (116 isolates, 77.4%), the pediatric ICU (17 isolates, 11.3%) and the two neonatal ICUs (17 isolates, 11.3%) of Hippokration Hospital of Thessaloniki, Greece from June 2018 to July 2021. The median age of the pediatric patients was 2 years (range 14 days–18 years), and that of the adult patients 66 years (range 19–92 years). In addition to phenotypic methods, a multiplex PCR was applied to detect the carbapenem resistance genes blaKPC, blaNDM, blaIMP and blaOXA-48 type. The protocol was modified by adding primers to detect blaVIM-1. Descriptive and inferential statistical analysis was performed using the statistical package SPSS v. 22.0. The NGS method was applied to 24 representative CRKP strains to obtain the whole genome sequences of the strains and their complete genetic characterization. Of these, 18 were selected from the 150 strains of the overall study, to include strains from all years and from all types of carbapenemase, while 6 additional strains collected from December 2021 to June 2022 were examined, because these strains were isolated from patients with septicemia and were of clinical interest. The median age of adult patients was 57.5 years (range 30–88), while the median age of children was 6.2 years (range 0.25–17). Sequence types (STs), plasmids, genes associated with regulatory and efflux pump systems as well as antimicrobial resistance genes were identified with various software packages. Special bioinformatics programs were applied for the phylogenetic analysis of the core genome SNP (cgSNP), the identification of single nucleotide polymorphism (SNP) sites, as well as for the construction of a phylogenetic tree. Results: By applying multiplex PCR it was found that the most frequent carbapenemases were KPC and NDM (37.3 and 36.0%, respectively) with results identical to those of the immunoassay. The blaNDM gene was mainly detected in adults (54/116, 46.9%), while in neonates and children the most frequent gene was blaKPC (24/34, 70.6%). The main mechanism of carbapenem resistance in 2018-2019 was KPC production alone or in combination with VIM, while a significant prevalence of NDM production was observed in 2020-2021 (p &lt; 0.001). The prevalence of genes conferring resistance to β-lactams was 100%, to aminoglycosides 79.2%, to quinolones 95.8%, to fosfomycin and tigecycline 33.3%, and to cotrimoxazole 87.5%. The most prevalent plasmid was IncF, which is associated with the spread of several extended-spectrum β-lactamase (ESBL) or carbapenemases genes and was detected in all CRKP strains. Additional plasmids (such as Col and IncC) were found in fifteen strains. Virulence factors detected included genes for fibriae, for siderophores, as well as genes for yersiniabactin, genes encoding the siderophore aerobactin. Genes encoding the AcrAB efflux pump (acr, mar, sox, rob, ram, sdiA, fis and envR) or the OqxAB efflux pump (oqx and rar) were present in all strains. The 24 CRKP strains belonged to eight different sequence types (STs): ST11 (7, 29.1%), ST39 (7, 29.1%), ST323 (3, 12.5%), ST15 (7, 29.1%), ST307 (1, 4.2%), ST30 (1, 4.2%), ST512 (1, 4.2%) and ST35 (1, 4.2%). Circular genome maps were generated for the four most frequent ST types (ST11, ST39, ST323 and ST15). Strains belonging to the same ST were found to share many identical regions with the reference strain. A phylogenetic tree was constructed based on the cgSNP of all strains, relative to the reference strain. Of note, the first case of neonatal sepsis due to a CAZ/AVI-resistant K. pneumoniae strain producing KPC-2 and VEB-25 was identified with the application of NGS, leading to the implementation of an adapted program of active surveillance in combination with infection control measures. Conclusions: The present study provides information on the genetic characterization of CRKP strains released in the ICUs of a Greek tertiary hospital during the study, providing evidence for antibiotic resistance mechanisms. The application of NGS technique in a hospital setting is extremely useful, as the data obtained on the temporal and spatial clonal distribution of strains can guide the design of timely and effective infection control measures for fighting the spread of multi-resistant bacteria.