Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός του παθογόνου αιτίου της ασθένειας των χλωρωτικών σχεδίων του μαρουλιού
Creators: name: Καραπέτση, Λευκοθέα Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2018
Subjects: Ιός της κίτρινης ακτυλιοειδούς κηλίδωσης της αγκινάρας
Μαρούλι
Ταυτοποίηση και χαρακτηρισμός
Artichoke yellow ringspot virus - AYRSV
Lettuce
Identification and characterization

description: Στην περιοχή της βορειοανατολικής Πελοποννήσου, το 2015 και το 2016, παρατηρήθηκαν σε καλλιέργεια μαρουλιού, φυτά που έφεραν κίτρινες δακτυλιοειδείς κηλίδες και γραμμικά σχέδια. Τα συμπτώματα ήταν παρόμοια με αυτά που προκαλούν οι ιοί του γένους Nepovirus και συγκεκριμένα του ιού της κίτρινης δακτυλιοειδούς κηλίδωσης της αγκινάρας (Artichoke yellow ringspot virus-AYRSV), που προσβάλει την αγκινάρα και το κρεμμύδι στη συγκεκριμένη περιοχή. O σκοπός της εργασίας, ήταν η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός του παθογόνου αιτίου της νέας ασθένειας του μαρουλιού. Για την ταυτοποίηση του παθογόνου αιτίου πραγματοποιήθηκαν μηχανικές μολύνσεις σε N. benthamiana, έλεγχος με RT-PCR καθώς και αλληλούχηση νέας γενιάς (NGS). Τα αποτελέσματα από κάθε μέθοδο, επιβεβαίωσαν τη παρουσία του AYRSV. Επίσης, με τη μέθοδο της NGS ανακτήθηκε η αλληλουχία του ιού από ένα δείγμα μαρουλιού με έντονα συμπτώματα της ασθένειας. Μεγάλα τμήματα και των δυο RNA του ιού ανακτήθηκαν, ενώ η σύγκριση των αλληλουχιών του γονιδίου της RNA πολυμεράσης έδειξε 98% ομοιότητα με την απομόνωση του AYRSV από το κρεμμύδι. Για τον βιολογικό χαρακτηρισμό της απομόνωσης του AYRSV από το μαρούλι, ακολούθησαν μηχανικές μολύνσεις με εκχύλισμα φυτικού ιστού με συμπτώματα, σε ποικιλία φυτοδεικτών. Επίσης, ελέγχθησαν φυτά αγκινάρας και κρεμμυδιού, καθώς και αρκετά είδη ζιζανίων από τους αγρούς που εντοπίστηκε ο AYRSV ή/και γειτονικούς αυτών. Η παρουσία του ιού επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, τόσο στους φυτοδείκτες που έφεραν χαρακτηριστικά συμπτώματα, όσο και σε ένα μεγάλο αριθμό δειγμάτων από γειτονικές καλλιέργειες αγκινάρας, κρεμμυδιού και ζιζανίων, με συμπτώματα. Επίσης, πραγματοποιήθηκε μελέτη μετάδοσης με τον σπόρο του μαρουλιού και άλλων 4 φυτικών ειδών (N. benthamiana, N. glutinosa, S. nigrum, N. tabacum). Ο AYRSV ανιχνεύθηκε στον σπόρο που προήλθε από προσβεβλημένα φυτά μαρουλιού από τον αγρό, καθώς και στα φυτά που προέκυψαν από τη βλάστηση των σπόρων αυτών. Η μη ανίχνευση νηματωδών στα ριζίδια των φυτών μαρουλιού, ενισχύει την επιδημιολογική σημασία της μετάδοσης με τον σπόρο του AYRSV, καθώς και την πιθανή ύπαρξη κάποιου άλλου φορέα. Πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση κατά Sanger, σε 29 απομονώσεις του AYRSV, από δείγματα μαρουλιού, αγκινάρας, κρεμμυδιού και αυτοφυών φυτών, στην περιοχή της RdRp. Η φυλογενετική ανάλυση των απομονώσεων του AYRSV, μας υποδεικνύει την ισορροπία που υπάρχει μεταξύ της διατήρησης της γενετικής σταθερότητας, της ταχείας εξέλιξης και προσαρμογής σε νέους ξενιστές, χαρακτηριστικά των ιών του γένους Nepovirus. Για πρώτη φορά, μία απομόνωση του AYRSV συσχετίζεται με μία ασθένεια στο μαρούλι, αυξάνοντας παράλληλα το εύρος φυσικών ξενιστών του ιού. Συμπερασματικά, τα στοιχεία μας αποδεικνύουν ότι ο ιός είναι ενδημικός σε αυτή την περιοχή. Ο ευρύς κύκλος ξενιστών, υποδεικνύει τη συμμετοχή ενός φορέα, η ταυτότητα του οποίου πρέπει να ερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες.
description: In 2015 and 2016, lettuce plants showing yellow ringspots and line patterns were observed in Northeastern Peloponnese. The symptoms resembled those caused by nepoviruses and especially by Artichoke yellow ringspot virus (AYRSV) that is known to infect artichoke and onion crops, in this area. The aim of this work was to identify and characterize the viral agent associated with the observed disease. In order to identify the pathogen, mechanical inoculations were performed in N. benthamiana plants, as well as, testing by a specific RT-PCR and next generation sequencing (NGS). Results from each method confirmed the presence of AYRSV, only. Also, the full sequence of AYRSV from a symptomatic lettuce was recovered by NGS. Large portions of both RNAs were recovered, while the comparison of the RdRp gene sequences showed 98% similarity to the onion isolate of AYRSV. For the biological characterization of the lettuce isolate of AYRSV, mechanical inoculations were carried out, in a variety of experimental plants. Artichoke and onion plants, as well as, several species of native plants, were tested from the fields or nearby crops where AYRSV was found. The presence of the virus was confirmed by RT-PCR, both in the experimental plants, that had characteristic symptoms, and in a large number of symptomatic specimens from nearby crops of artichoke and onion and native plant species. Seed from lettuce and 4 other plant species (N. benthamiana, N. glutinosa, S. nigrum, N. tabacum), was used to carry out a transmission study. AYRSV was detected in seed coming from infected lettuce plants from the field, as well as in the seedlings resulting from the germination of the seeds. Non-detection of nematodes in the roots of lettuce plants enhances the epidemiological significance of seed transmission of AYRSV, and also the possibility that another vector is involved in the transmission of AYRSV. Sanger sequencing was performed in 29 isolates of AYRSV, from samples of lettuce, artichoke, onion and native plants, in the RdRp region. The phylogenetic analysis of AYRSV isolates suggests the balance between maintaining genetic stability, rapid progression and adaptation to new hosts, vital characteristics of Nepovirus viruses. In this study a new isolate of AYRSV was associated for the first time with a lettuce disease, thus increasing the known natural host range of the virus. Additionally, our findings indicate that AYRSV has become endemic in this area. AYRSV presence in a number of cultivated and wild plant species strongly indicates the involvement of a vector, a question demanding future research.