title: Anaerobic toluene-metabolism in Thauera aromatica: Biochemical and spektroscopic investigations of the (R)-Benzylsuccinat Synthase reaction
title: Anaerober Toluol-Stoffwechsel in Thauera aromatica: Biochemische und spektroskopische Untersuchungen zur Reaktion der (R)-Benzylsuccinat Synthase
Creators: name: Hilberg, Markus
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Benzylsuccinat Synthase
Benzylsuccinate synthase
Anaerober Stoffwechsel
Thauera aromatica
Biochemie
Naturwissenschaften
Elektronenspinresonanzspektroskopie

description: Anaerobic degradation of toluene
      in Thauera aromatica is initiated by stereospecific addition
      of the methyl group of toluene to the double bond of a
      fumarate cosubstrate to form the first intermediate
      (R)-benzylsuccinate. This reaction is catalyzed by the enzyme
      (R)-benzylsuccinate synthase (BSS), which is a member of the
      glycyl-radical family together with the well characterized
      anaerobic ribonucleotide reductase, pyruvate formate lyase,
      glycerol dehydratase and 4-hydroxyphenylacetate
      decarboxylase. In contrast to other glycyl-radical enzymes
      BSS consists of three different subunits (α2β2γ2-composition)
      and contains iron-sulfur cofactors with so far unknown
      function. All members of the glycyl-radical family can be
      identified on the basis of the characteristic glycyl-radical
      signal in EPR-spectroscopic analysis. For catalytic activity,
      glycyl-radical enzymes require a posttranslational activation
      by dedicated activating enzymes. All enzymes involved in the
      degradation of toluene to (R)-benzylsuccinate are encoded in
      the toluene-inducible bss-operon. I The FeS-cofactors of the
      recombinant non-activated BSS were characterized by UV/vis-,
      EPR- and Mössbauer-spectroscopy. With these methods at least
      two different types of magnetically coupled [4Fe4S]-clusters
      per holoenzyme were identified. The redox potential of the
      FeS-clusters seems to be lower than – 450 mV and the magnetic
      coupling suggests a close distance of the clusters relative
      to each other (&lt; 10 Å). Based on aminoacid sequence
      alignments of other fumarate adding enzymes, the clusters are
      predicted to be localized in the small β- and γ- subunits of
      BSS. Furthermore recombinant BSS was used for crystallization
      experiments yielding a resolution of 4 Å. The achieved
      resolution is not sufficient for solving the crystal
      structure in detail, but the cell content analysis confirmed
      the postulated α2β2γ2-composition of BSS. II We also
      investigate the reaction mechanism of (R)-benzylsuccinate
      synthase by biochemical and EPR-spectroscopic studies of
      native BSS. The significant reduction of the reaction rate in
      enzyme assays with [2H2]toluene implies, that the abstraction
      of the hydrogen atom from toluene is indeed the rate limiting
      step of the BSS-reaction, as expected from the theoretical
      prediction. Detailed kinetic studies were achieved with
      substrate- and product-related inhibitors. The received
      kinetic parameters support the postulated BSS reaction
      mechanism. Identification and characterization of radical
      intermediates in the BSS-reaction are extremely helpful to
      investigate the reaction mechanism. During the time-course of
      this work a first direct observation of an organic radical
      intermediate in a glycyl radical enzyme was accomplished by
      EPR-spectroscopy. The results support significantly the
      proposed reaction mechanism of BSS and in general the assumed
      mechanisms via radical intermediates of all glycyl radical
      enzymes. III The activating enzyme (BssD) was recombinantly
      produced in E. coli and purified by His-Tag
      affinity-chromatography under strict anaerobic conditions.
      The enzyme was characterized by UV-Vis spectroscopy, EPR
      spectroscopy and chemical analysis and contains redox-active
      [4Fe4S]-clusters as predicted from aminoacid sequence
      alignments. Based on these results, further studies on the
      activation reaction of BSS can be accomplished.
description: Der initiale Schritt des anaeroben
      Toluol-Abbaus in dem denitrifizierenden β-Proteobakterium
      Thauera aromatica wird durch eine stereospezifische Addition
      der Methylgruppe von Toluol an die Doppelbindung von Fumarat
      unter Bildung des Produkts (R)-Benzylsuccinat eingeleitet.
      Die Reaktion wird von der (R)-Benzylsuccinat Synthase (BSS)
      katalysiert, die ein Mitglied der Glycylradikal-Enzymfamilie
      ist, zu deren Vertretern auch die anaerobe Ribonukleotid
      Reduktase, die Pyruvat-Formiat-Lyase und die
      4-Hydroxyphenylacetat Decarboxylase zählen. Im Gegensatz zu
      den meisten anderen Glycyradikalenzymen ist die BSS aus
      mehreren Untereinheiten aufgebaut (α2β2γ2-Komposition) und
      besitzt zudem Eisen-Schwefel-Cluster als Kofaktoren mit
      bisher unbekannter Funktion. Alle Mitglieder der
      Glycylradikal-Enzymfamilie können eindeutig anhand ihrer
      Sequenzähnlichkeit und ihres charakteristischen
      Glycylradikalsignals in EPR-spektroskopischen Analysen
      identifiziert werden. Die katalytisch aktive Form aller
      Glycylradikal-Enzyme wird erst durch die posttranslationale
      Generierung des Glycylradikals mit Hilfe des jeweils
      spezifischen aktivierenden Enzyms erhalten. Das Gen für das
      aktivierende Enzym der (R)-Benzylsuccinat Synthase ist
      zusammen mit den Genen für die BSS-Untereinheiten in einem
      Operon kodiert (bss-Operon). I In der vorliegenden Arbeit
      wurden die Zusammensetzung und weitere Eigenschaften der
      FeS-Cluster in rekombinant produzierter BSS mit Hilfe von
      UV/Vis-, EPR- und Mössbauer-spektroskopischen Analysen
      untersucht. In rekombinanter, nicht-aktivierter BSS wurden
      mindestens zwei unterschiedliche Typen magnetisch gekoppelter
      [4Fe4S]-Cluster mit sehr niedrigen Redoxpotentialen (&lt;
      -450 mV) nachgewiesen, die eine sehr geringe Distanz (&lt; 10
      Å) relativ zueinander aufweisen. Eine Lokalisation der
      Eisen-Schwefel-Cluster wird basierend auf einem
      Aminosäure-Sequenzalignment mit anderen Fumarat-addierenden
      Enzymen für die kleinen β- und γ- Untereinheiten
      vorhergesagt. Rekombinant produzierte BSS wurde außerdem für
      Röntgenstrukturanalysen verwendet. Die erhaltenen Kristalle
      streuten mit einer Auflösung von 4 Å, was zwar noch keine
      vollständige Strukturaufklärung zulässt, jedoch die
      Zusammensetzung der BSS-Untereinheiten in α2β2γ2-Komposition
      mit Hilfe der „Cell-Content“-Analyse bestätigt. II Es wurden
      biochemische und spektroskopische Untersuchungen zum
      Reaktionsmechanismus der (R)-Benzylsuccinat Synthase mit
      aktivierter BSS in T. aromatica Rohextrakt durchgeführt.
      Aufgrund der signifikanten Reduktion der Enzymaktivität mit
      [2H2]Toluol, wurde die Abstrahierung des Wasserstoffatoms von
      der Methylgruppe von Toluol als geschwindigkeitsbestimmender
      Schritt der Enzymreaktion identifiziert. Weiterhin wurden
      Studien mit bereits bekannten und neuen Inhibitoren der
      (R)-Benzylsuccinat Synthase durchgeführt. Durch detaillierte
      inhibitionskinetische Studien mit Benzylalkohol und einer
      Mischung aus Benzylfumarat/Benzylmaleat wurden neue
      Erkenntnisse bezüglich des Reaktionsmechanismus der BSS
      gewonnen. Benzylalkhol wurde als gemischter Inhibititor und
      Benzylfumarat/Benzylmaleat als unkompetitiver identifiziert.
      Für die weitere Aufklärung des Reaktionsmechanismus ist die
      Identifizierung stabiler radikalischer Intermediate sehr
      wertvoll. Durch EPR-spektroskopische Analysen mit T.
      aromatica Rohextrakt wurde im Rahmen dieser Arbeit zum ersten
      Mal ein kohlenstoff-basiertes Radikalintermediat in einem
      Glycylradikalenzym nachgewiesen. Die Ergebnisse stützen
      signifikant den Reaktionsmechanismus der BSS und grundlegend
      den für alle Glycylradikalenzyme postulierten radikalischen
      Reaktionsmechanismus. III Die Produktion des aktivierenden
      Enzyms (BssD) der (R)-Benzylsuccinat Synthase wurde optimiert
      und das Enzym mittels Affinitätschromatographie unter strikt
      anaeroben Bedingungen gereinigt. Durch UV/Vis- und
      EPR-spektroskopischen Analysen wurden redoxaktive
      [4Fe4S]-Cluster identifiziert, entsprechend der Vorhersage
      des Aminosäure-Sequenzalignments. Basierend auf diesen
      Ergebnissen können in Zukunft weitere Studien zur
      Aktivierbarkeit der (R)-Benzylsuccinat Synthase durchgeführt
      werden.