title: Development and evaluation of enzymes loaded gold nanoparticles
Creators: name: Eder, Marcella
Publisher: name: :none
Year: 2013

description: Um die Sicherheit und Effizient in der pharmazeutischen Industrie zu Verbessern, gewinnt die Produktion enantiomerenreiner Medikamente immer größere Bedeutung. Eine Möglichkeit der enantioselektiven Synthese ist der Einsatz von Enzymen, die effektive Biokatalysatoren darstellen. Die Vorteile dieser chemo-enzymatischen Synthese sind nicht nur hohe Stereospezifität, Regioselektivität und Chemoselektivität, sondern auch milde Reaktionsbedingungen, welche die Bildung unerwünschter Nebenprodukte verringern können. Allerdings ist diese Art der Produktsynthese teuer und führt zu einem hohen Verbrauch an als Biokatalysator dienenden Enzymen. Darum ist die Immobilisierung der Enzyme auf Trägermaterialien wie etwa Goldnanopartikeln (GNPs), welche einfach durch Zentrifugieren aus den betreffenden Reaktionslösungen entfernt werden können, von großer Bedeutung. Das Ziel dieser Masterarbeit war die Entwicklung eines Assays um die Enantioselektivität immobilisierter Enzyme näher zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die Serinproteasen Trypsin und α-Chymotrypsin auf Goldnanopartikeln via Polyethylenglykol (PEG7) spacerimmobilisiert. Die hergestellten enzymimmobilisierten GNP wurden charakterisiert und die Herstellung auf Reproduzierbarkeit überprüft. Dabei konnte eine zufriedenstellende Übereinstimmung der Ergebnisse erzielt werden. Zur Bestimmung der Enzymaktivität sowie der Michaelis Menten Konstanten KM and Vmax, wurden Assays mit verschiedenen chiralen Substraten wie etwa D,L-BApNA, α-N-benzoyl-D,L-Lys-Gly-OH und N-benzoyl-D,L-Arg-Gly-OH getestet. Im Vergleich mit Trypsin in Lösung wurde etwas geringere Werte für die Michaelis Menten (M.M.) Konstante KM für immobilisiertes Trypsin erreicht. Weiters wurde die Enantioselektivität der Assays mittels HPLC unter Verwendung von chiralen Ionenaustauschersäulen, gekoppelt mit einem UV/Vis Detektor, bestimmt. Für D,L-BApNa zeigte sich eine Abhängigkeit der Enantioselektivität von der Substratkonzentration ebenso wie von der Dauer des Verdaus. Bei den Peptiden α-N-benzoyl-D,L-Lys-Gly-OH und N-benzoyl-D,L-Arg-Gly-OH konnte eine vollständige Enantioselektivität zu Gunsten des L-Enantiomers erkannt werden. Hierbei konnte weder eine Abhängigkeit von der Zeit noch von der Substratkonzentration erkannt werden. Der Einfluss einer Enzymmodifikation, im Besonderen einer Acetylierung, auf die Enzymaktivität ebenso wie auf die Enantioselektivität wurde untersucht. Während die Enzymaktivität des Trypsins in Lösung annähernd unverändert blieb, zeigte sich für das immobilisierte Trypsin eine geringe Zunahme für KM beziehungsweise eine Abnahme für Vmax. Zusätzlich wurde der Effekt verschiedener organischer Lösungsmittel auf die Enantioselektivität überprüft. Dabei wurde für keines der getesteten Lösungsmittel ein Einfluss auf die Spaltung von D,L-BApNA erkannt. Bei der Untersuchung der Wiederverwendungsmöglichkeiten der enzymimmobilisierten GNPs wurde zwar ein geringfügiger Verlust der Aktivität detektiert, eine Wiederverwendung ist aber auf jeden Fall denkbar. Eine Langzeitstudie des Lagerungsverhaltens der Partikel zeigte eine hohe Lagerbeständigkeit sowohl für die enzym- (GNP@trypsin) als auch für die PEG7-Liganden modifizierten GNPs (GNP-PEG7-COOH). Eine Lagerung von mehr als 5 Monaten ist somit möglich.