title: Adenylylcyclase 5/6 zugrunde liegende PIP3-abhängigen Regulation
title: Adenylyl cyclase 5/6 underlie PIP3 dependent regulation
Creators: name: Gopireddy, Raghavender Reddy
Publisher: name: Philipps-Universität
      Marburg
Year: 2016
Subjects: Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
PI3K
FRET
Adenylyl cyclase 5 and 6
G-protein
cAMP
Cyclo-AMP

description: A wide variety of signaling
      substances such as hormones, neurotransmitters, odorants and
      chemokines control intracellular signaling by regulating the
      production of the second messenger cAMP. By activating Epac,
      PKA and cyclic nucleotide-gated ion channels, the production
      of cAMP alters a wide range of biological processes including
      cell division and metabolism. A number of GPCRs controls
      intracellular cAMP levels via stimulatory or inhibitory G
      proteins via adenylyl cyclases. The function of the broadly
      expressed AC5 and AC6 is enhanced by stimulatory (Gαs) or
      attenuated by inhibitory (Gαi) G proteins. Mechanistically
      both inhibition and stimulation is mediated via a direct
      protein-protein interaction. In addition to this direct
      regulation, several previous studies reported a cAMP rebound
      stimulation after withdrawal of Gi stimulation in cardiac
      myocytes for which the mechanism is debated (Hartzell, 1988;
      Wang &amp; Lipsius, 1995). A similar cAMP rebound response
      was observed previously in our lab after termination of
      α2A-AR adrenergic receptor activation in HEK293T cells
      (Markus et al., 2013). The present study was aimed at
      investigating mechanisms underlying Gi-induced cAMP rebound
      effects. Many genetically encoded biosensors have been
      developed based on fluorescence resonance energy transfer
      (FRET) to visualize the spatiotemporal dynamics of various
      intracellular signals including second messengers. FRET-based
      cAMP biosensor (Epac1-camps) as well as heterologous
      overexpression system was used to investigate the mechanisms
      underlying Gi-mediated cAMP rebound stimulation in cardiac
      myocytes and also in heterologous expression system. When
      studying the mechanism of the long-known phenomenon of cAMP
      rebound stimulation after withdrawal of Gi stimulation in
      cardiac myocytes, we observed a PTX-sensitive/Gi-mediated/
      adenylyl cyclase (type 5/6)/ cAMP-dependent pathway for this
      cAMP rebound stimulation. In addition, we observed that
      inhibition of Gβγ by gallein led to an attenuation of the
      AC5- mediated cAMP rebound response, although, overexpression
      of AC4 did not produce additional cAMP stimulation. This
      implies that different Gβγ-mediated signaling pathways may
      exist. Interestingly, we observed that PI3K inhibitor
      attenuates AC5/6-dependent cAMP rebound effects. This
      indicated that Gi-mediated cAMP rebound response was mediated
      via the PI3K-dependent pathway. Indeed, overexpression of
      PIP3-specific phosphatase PTEN confirmed that PIP3 itself
      either directly or indirectly mediated Gi-dependent cAMP
      rebound responses. Additionally, inhibition of PIP2-specific
      phosphatase SHIP and downstream events of PIP3-dependent
      regulation of Akt further confirm the influence of PIP3 on
      cAMP rebound levels. Indeed, surpassing Gi-mediated PI3K
      activation through PDGF-receptor stimulation strengthens this
      pathway. In addition, we confirmed that inhibition of PI3K
      also prevented cAMP rebound response after withdrawal of ACh
      in atrial myocytes. We suppose that the novel PIP3 dependent
      regulation of AC5/6 might represent a missing mechanism that
      explains physiological phenomena such as post vagal
      tachycardia.
description: Eine große Bandbreite von
      Signalmolekülen _ darunter Hormone, Neurotransmitter,
      Geruchsstoffe und Chemokine _ kontrollieren intrazelluläre
      Signale durch die Regulation des sog. zweiten Botenstoffs
      cAMP. Die Produktion von cAMP beeinflusst verschiedenste
      biologische Prozesse wie die Zellteilung und Stoffwechsel.
      Dies geschieht unter anderem durch die Aktivierung von Epac,
      PKA und cyclisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle. Eine Reihe
      von GPCR kontrolliert das intrazelluläre cAMP-Niveau mittels
      des Einflusses von stimulatorischen oder inhibitorischen
      G-Proteinen auf die Adenylylcyclasen. Die Aktivität der weit
      verbreiteten AC5 und AC6 wird durch stimulatorische
      G-Proteine (Gαs) erhöht, während sie durch inhibitorische
      G-Proteine (Gαi) verringert wird. Mechanistisch werden
      Inhibition und Stimulation durch direkte
      Protein/Protein-Interaktionen vermittelt. Zusätzlich zu
      dieser direkten Regulation wurde in anderen vorangegangenen
      Studien eine cAMPRebound-Stimulation beschrieben. Diese trat
      in Kardiomyocyten auf, sobald die Aktivierung von
      Gi-Proteinen beendet wurde. Der zugrundeliegende Mechanismus
      ist umstritten (Hartzell, 1988; Wang et al., 1995). Ein
      ähnliches cAMP-Rebound-Verhalten wurde auch bereits in
      unserem Labor in HEK293T-Zellen beobachtet, nachdem die
      Stimulation α2Aadrenerger Rezeptoren beendet wurde (Milde et
      al., 2013). Daher zielte die vorliegende Arbeit auf die
      Untersuchung des zugrundeliegenden Mechanismus dieses
      Gi-Proteininduzierten cAMP-Rebound-Effekts. Es wurden viele
      genetisch kodierte Biosensoren entwickelt, die auf dem
      Förster/Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) beruhen
      und mit denen die zeitliche und räumliche Dynamik von
      verschiedenen intrazellulären Signalen, einschließlich denen
      der zweiten Botenstoffe, sichtbar gemacht werden konnte. Der
      FRET-basierte cAMP-Biosensor Epac1-camps wurde zusammen mit
      heterologen Überexpressionsmodellen benutzt, um den
      Mechanismus der Gi-Protein-vermittelten
      cAMP-Rebound-Stimulation in Kardiomyocyten und anderen
      lebenden Zellen zu untersuchen. Während der Untersuchung
      dieses wohlbekannten cAMP-Rebound Phänomens beobachteten wir
      einen PTX-empfindlichen, Gi-Protein-vermittelten
      Typ5/6-Adenylylcyclase/cAMP-abhängigen Signalweg. Zusätzlich
      dazu stellten wir fest, dass die Inhibition von
      Gβγ-Untereinheiten durch Gallein zu einer Verringerung der
      AC5-vermittelten cAMP-Rebound-Antwort führte, während die
      Überexpression von AC4 keine zusätzliche Stimulation von cAMP
      bewirkte. Dies legt nahe,dass verschiedene Gβγ-vermittelte
      Signalwege existieren. Bemerkenswerterweise beobachteten wir
      auch, dass, PI3K den AC5/6-abhängigen cAMP-Rebound-Effekt
      abschwächte. Dies deutete darauf hin, dass die Gi-vermittelte
      cAMP-Rebound-Antwort einem PI3K-abhängigen Signalweg
      unterliegt. Tatsächlich bestätigte die Überexpression der
      PIP3-spezifischen Phosphatase PTEN, dass PIP3 selbst,
      entweder direkt oder indirekt, die Gi-abhängige
      cAMP-Rebound-Antwort vermittelt. Der Einfluss von PIP3 auf
      die cAMP Rebound-Niveaus wurde zusätzlich durch die
      Inhibition der PIP2-spezifischen Phosphatase SHIP und
      weiterer Vorgänge unterhalb der PIP3-abhängigen Regulation
      von Akt bestätigt. Außerdem konnte der Signalweg verstärkt
      werden, wenn die Gi-abhängige PI3K-Aktivierung durch die
      Stimulation des PDGF-Rezeptors umgangen wurde. Zusätzlich
      dazu konnten wir bestätigen, dass auch in atrialen Myocyten
      die Inhibierung der PI3K die Ausbildung der
      cAMP-Rebound-Antwort verhinderte, nachdem Acetylcholin
      entfernt wurde. Wir vermuten, dass diese neu beschriebene
      PIP3-abhängige Regulation der AC5/6 jenen unbekannten
      Mechanismus darstellt, der physiologischen Phänomenen wie der
      post-vagalen Tachikardie zu Grunde liegt.