title: About rings and crossbands - Characterization of proteins involved in cell division and compartmentalization in Caulobacter crescentus
title: Ringe und Querbalken - Charakterisierung von Proteinen, die an der Zellteilung und Kompartimentierung von Caulobacter crescentus beteiligt sind
Creators: name: Schlimpert, Susan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Kompartimentierung
Biowissenschaften, Biologie
Stalked cell, crossbands
Caulobacter crescentus , Zellteilung

description: In most prokaryotes, cell division
      is accomplished by a multiprotein complex, called the
      divisome. The scaffold for assembling the divisome is
      provided by the Z-ring, which is a ring-like structure that
      forms during polymerization of FtsZ molecules at midcell.
      Coordination of Z-ring formation as well as divisome assembly
      and stability are crucial for successful proliferation.
      Several factors that stabilize the division apparatus have
      been characterized. However, these factors appear to be
      phylogenetically unrelated and to fulfill a rather
      species-specific function during cell division. This raises
      the question of what additional factors are required to
      ensure efficient cell division in C. crescentus. Here, I
      report the identification of the novel cell division protein
      CedX (cell division protein X). CedX is a proline-rich inner
      membrane protein that localizes in an FtsZ- and FtsN-
      dependent manner to the cell division plane. Interestingly,
      it was found that overproduction of CedX blocks cell division
      and causes the formation of several non-contractile Z-rings.
      Functional analysis of CedX mutant derivatives demonstrated
      that CedX requires its membrane anchor and proline-rich
      region for proper localization and protein-protein
      interaction. In addition, coimmunoprecipation and bacterial
      two-hybrid analyses suggest that CedX not only interacts with
      FtsZ and FtsN but also with several other late cell division
      proteins. Colocalization experiments with fluorescently
      tagged derivatives of FtsZ, FtsA, FtsN and CedX further
      support the notion that CedX is a late recruit to the cell
      division apparatus. However, it remains to be elucidated
      under which conditions CedX becomes essential for proper cell
      division. Collectively, these findings suggest that CedX is
      an accessory divisome component that presumably supports the
      assembly process of late divisome components by means of its
      unstructured proline-rich C-terminal tail. Apart from cell
      division, the formation of a prostheca, also known as stalk,
      is another characteristic change in cell morphology, which is
      a widespread phenomenon among bacteria and also an obligatory
      developmental checkpoint in the C. crescentus life cycle. In
      C. crescentus, the stalk represents a thin extension of the
      cell envelope that is free of DNA, ribosomes and most
      cytoplasmic proteins. It is segmented at irregular intervals
      by so-called crossbands, disk-like structures that traverse
      the entire width of the stalk perpendicular to the long-axis
      of the cell. Crossbands are generally thought to have an
      architectural, stabilizing function. Despite the fact that
      researchers have been trying to reveal the mechanisms
      underlying stalk formation, including the synthesis of the
      enigmatic crossbands, the biogenesis and function of these
      structures is still poorly understood. In an attempt to
      identify factors involved in stalk biogenesis and
      morphogenesis, four novel stalk proteins, StpABCD, were
      identified in C. crescentus. Synthesis of StpABCD is
      initiated at the onset of stalk outgrowth. It was found that
      StpABCD are specifically targeted to the inner membrane and
      the periplasmic space of the stalk, with StpA acting as a
      recruitment factor for StpBCD. Additionally,
      coimmunoprecipitation analysis supports the idea that StpABCD
      interact in vivo to form a multiprotein complex. The four
      proteins colocalize in the stalk in distinct foci that
      display the same subcellular distribution as crossbands.
      Noteably, electron cryo-tomography revealed that cells
      deficient in StpAB consistently lack crossbands. To test for
      a potential role of crossbands in cellular
      compartmentalization, the mobility of fluorescently labeled
      proteins was examined in wild-type or StpAB-deficient cells
      using fluorescence-loss-in-photobleaching (FLIP) and
      pulse-labeling experiments. Interestingly, these analyses
      demonstrated that crossbands act as diffusion barriers for
      periplasmic, inner and outer membrane proteins. Based on
      these findings, it can be hypothesized that StpABCD
      constitute the crossband structures, which act as a protein
      diffusion barrier to compartmentalize the periplasmic space
      of the stalk, thereby physically separating it from the cell
      body.
description: In den meisten Prokaryoten erfolgt
      die Zellteilung mittels eines Multi-Proteinkomplexes, dem
      Divisom. Das Grundgerüst des Divisoms bildet der sogenannte
      Z-Ring, eine ringähnliche Struktur, die durch die
      Polymerisation von einzelnen FtsZ-Molekülen in der Zellmitte
      gebildet wird. Eine erfolgreiche Zellteilung hängt maßgeblich
      von der zeitlichen und räumlichen Regulation der Entstehung
      des Z-Rings sowie der Assemblierung und Stabilisierung des
      Divisoms ab. Es wurden bereits Faktoren, die zur positiven
      Regulation des Zellteilungsapparates beitragen wurden bereits
      identifiziert. Jedoch scheinen diese in den meisten Fällen
      eine speziesspezifische Funktion während der Zellteilung
      auszuführen. Es stellt sich daher die Frage, welche
      zusätzlichen Faktoren in C. crescentus für eine effiziente
      Zellteilung verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit
      konnte das neue Zellteilungsprotein CedX (cell divison
      protein X) identifiziert werden. CedX ist ein prolinreiches
      Membranprotein, welches in Abhängigkeit von FtsZ und FtsN zur
      Zellteilungsebene rekrutiert wird. Interessanterweise
      inhibierte eine Überproduktion von CedX die Zellteilung und
      führte gleichzeitig zur Entstehung von mehreren Z Ringen in
      den Zellfilamenten. Diese Z-Ringe waren jedoch nicht mehr in
      der Lage, eine Zellteilung einzuleiten. Eine funktionelle
      Analyse von verkürzten Proteinvarianten von CedX zeigte, dass
      sowohl die Membranverankerung als auch die prolinreiche
      Region für die räumliche Lokalisation und den beobachteten
      Überproduktionsphänotyp von CedX eine Rolle spielen. Mittels
      Co-Immunpräzipitation und einer bakteriellen
      Zwei-Hybrid-Analyse konnte nachgewiesen werden, dass CedX
      nicht nur mit den essentiellen Zellteilungsproteinen FtsZ und
      FtsN, sondern auch mit weiteren, späten Zellteilungsproteinen
      interagiert. Co-Lokalisationsversuche mit
      fluoreszenz-markierten Derivaten von FtsZ, FtsA, FtsN und
      CedX bestätigten, dass CedX zu den späten
      Zellteilungsproteinen zählt. Bis zum jetzigen Zeitpunkt
      konnten jedoch keine Bedingungen ermittelt werden, unter
      denen CedX essentiell für die Zellteilung in C. crescentus
      wird. Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass CedX ein
      akzessorisches Zellteilungsprotein ist, welches
      wahrscheinlich den Einbau von späteren
      Zellteilungskomponenten in den Zellteilungsapparat
      unterstützt. Dabei wird die stabilisierende Wirkung des
      Proteins wahrscheinlich über den unstrukturierten,
      prolinreichen Abschnitt im C-terminalen Bereich vermittelt.
      Neben der Zellenteilung ist die Ausbildung einer Prostheka,
      auch Stiel genannt, eine weitere charakteristische
      Morphologieänderung. Der Stiel von C. crescentus ist eine
      dünne Verlängerung des Zellkörpers, welche weder DNA noch
      Ribosomen enthält und weitestgehend frei von
      zytoplasmatischen Proteinen ist. Darüber hinaus wird der
      Stiel in unregelmäßigen Abständen von scheibenartigen
      Strukturen, sogenannten Querbalken, segmentiert. Es wird
      vermutet, dass Crossbands eine strukturelle oder
      stabilisierende Funktion im Stiel übernehmen. Obwohl schon
      mehrere Studien zur Aufklärung der physiologischen Bedeutung
      des Stiels durchgeführt wurden, ist bis jetzt nur wenig über
      die Bildung und Funktion der Prosthecae sowie der
      rätselhaften Querbalken bekannt. Auf der Suche nach Faktoren,
      die für die Biogenese und/oder Morphogenese des Stiels in C.
      crescentus verantwortlich sind, konnten im zweiten Teil
      dieser Arbeit die vier neuen Stielproteine StpABCD (stalk
      proteins ABCD) identifiziert werden. Es konnte gezeigt
      werden, dass die Synthese von StpABCD mit der Initiierung des
      Stielwachstums erfolgt. Im Zuge der Assemblierung der
      Querbalken im periplasmatischen Raum des Stiels übernimmt
      StpA eine entscheidende „Ankerfunktion“ für die korrekte
      Lokalisierung von StpBCD. Darüber hinaus wurde mithilfe von
      Co-Immunpräzipitation nachgewiesen, dass StpABCD in einem
      Proteinkomplex vorliegen. Mittels Fluoreszenzmikroskopie
      konnte gezeigt werden, dass StpABCD eine charakteristische
      subzelluläre Position einnehmen, die mit der natürlichen
      Verteilung der Querbalken in den Prosthecae korreliert.
      Wurden in Zellen die Gene für stpAB deletiert, konnten keine
      Querbalken mehr mittels Kryo-Elektronenmikroskopie
      nachgewiesen werden. Um festzustellen, ob Zellen mit bzw.
      ohne Querbalken intrazelluläre Kompartimentierung aufweisen,
      wurde die Mobilität von fluoreszenz-markierten Proteinen
      mithilfe von „FLIP“ und „pulse-labeling“ Experimenten
      getestet. Diese Versuche verdeutlichten, dass Crossbands in
      der Tat für die Kompartimentierung von inneren und äußeren
      Membranproteinen sowie periplasmatischen Proteinen
      verantwortlich sind. Aus diesen Ergebnissen lässt sich daher
      schließen, dass StpABCD für die Synthese der Querbalken im
      Stiel von C. crescentus verantwortlich sind. Diese Strukturen
      wirken dabei als Diffusionsbarrieren, welche den
      periplasmatischen Raum zwischen Stiel und Zellkörper
      separieren.