In vitro μελέτη του μεταβολισμού βουπιβακαΐνης με ανασυνδυασμένα κυτοχρώματα P-450 (CYPs):
Creators: name: Κρητιώτου, Ιωάννα Παναγιώτη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Χρωματογραφία (GC/MS)
Μεταβολισμός
Βουπιβακαΐνη
Chromatography (GC/MS)
Metabolism
Bupivacaine

description: Η γνώση των κυτοχρωμάτων που ευθύνονται για το μεταβολισμό των φαρμάκων είναι απαραίτητη καθώς μπορεί να προκύψουν φαινόμενα επαγωγής ή αναστολής του μεταβολισμού, τα οποία ενδέχεται να οδηγήσουν σε ανεπιθύμητα αποτελέσματα. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μία αναλυτική μέθοδος αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (SIM GC/MS) για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της βουπιβακαΐνης και των τριών από τους μεταβολίτες της 3-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη, 4-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη και πιπεκολοξυλιδίνη. Η μέθοδος ήταν απλή, εκλεκτική, ευαίσθητη, ακριβής, επαναλήψιμη και γενικά αξιόπιστη και μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διεξαγωγή πειραματισμού σχετικά με τον in vitro μεταβολισμό της βουπιβακαΐνης. Ακολούθως διεξήχθησαν πειράματα με τη χρήση των ανασυνδυασμένων κυτοχρωμάτων Ρ450 (CYP) για να επιβεβαιωθεί ότι είναι υπεύθυνα για το μεταβολισμό της βουπιβακαΐνης. Έπειτα, χρησιμοποιώντας αναστολείς της δράσης των κυτοχρωμάτων, εξακριβώθηκε ποιο κυτόχρωμα ευθύνεται για το σχηματισμό των μεταβολιτών της βουπιβακαΐνης 3-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη, 4-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη και πιπεκολοξυλιδίνη. Αποδείχτηκε ότι για το μεταβολισμό της βουπιβακαΐνης σε πιπεκολοξυλιδίνη και 4-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη είναι υπεύθυνο το κυτόχρωμα CYP3A4, ενώ το κυτόχρωμα CYP1A2 ευθύνεται για το μεταβολισμό της σε 3-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μελέτη της κινητικής του μεταβολισμού της βουπιβακαΐνης, για να γίνει ο υπολογισμός της σταθεράς Michaelis –Menten (Km) και της μέγιστης ταχύτητας της αντίδρασης (Vmax), για το σχηματισμό κάθε μεταβολίτη. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις βουπιβακαΐνης και των αναστολέων των κυτοχρωμάτων CYP3A4 και CYP1A2. Ο αναστολέας του CYP3A4 ήταν η κετοκοναζόλη και του CYP1A2 η α-ναφθοφλαβόνη. Για την πιπεκολοξυλιδίνη η τιμή της Km ήταν 122,9 mM και η Vmax 6,833 nmol/min/mg. Για την 3-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη η τιμή της Km ήταν 36,6 mM και η Vmax 0,093 nmol/min/mg. Για την 4-υδρόξυ-βουπιβακαΐνη η τιμή της Km ήταν 288,2 mM και η Vmax 0,347 nmol/min/mg.
description: It is important to know the CYPs that are responsible for the metabolism of a drug. This knowledge is essential because there could be phenomena of induction or inhibition that could lead to adverse drug reactions. In the present study, an analytical method was developed and validated for the simultaneous quantitative determination of the anesthetic drug bupivacaine and three of its metabolites; 3-hydroxy-bupivacaine, 4-hydroxy-bupivacaine and pipecoloxylidine, using gas chromatography - mass spectrometry (GS-MS). The method was simple, selective, sensitive, accurate, precise and reliable for the conduct of bupivacaine in vitro metabolism studies. Experiments were conducted to show that the CYPs are responsible for the metabolism of bupivacaine. After this, CYPs inhibitors were used to identify which specific CYP is responsible for each of the three metabolites. It was shown that the CYP3A4 was responsible for the metabolism of bupivacaine to pipecoloxylidine and 4-hydroxy-bupivacaine. The CYP1A2 was responsible for the metabolism of bupivacaine to 3-hydroxy-bupivacaine. To determine the Michaelis-Menten constant (Km) and the maximal velocity (Vmax), multiple bupivacaine concentrations and the appropriate inhibitors were used. Ketoconazole and a-naphthoflavone were used as inhibitors for CYP3A4 and CYP1A2, respectively. For pipecoloxylidine Km was 122,9 mM and Vmax was 6,833 nmol/min/mg. For 3-hydroxy-bupivacaine Km was 36,6 mM and Vmax was 0,093 nmol/min/mg. For 4-hydroxy-bupivacaine Km was 288,2 mM and Vmax was 0,347 nmol/min/mg.