Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ορμονών με αυξητική δράση σε βιολογικά δείγματα με υγρή χρωματογραφία-φασματογραφία μαζών
Creators: name: Κακλαμάνος, Γεώργιος Π.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Ορμόνες
Στερεοειδή αναβολικά
Προγεσταγόνα
Βιολογικά δείγματα
Επικύρωση
Υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία
Hormones
Anabolic steroids
Biological matrices
Validation
Liquid chromatography-mass spectrometry

description: Ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών στεροειδών αναβολικών έχει χρησιμοποιηθεί στην κτηνοτροφία ως μέσο αύξησης της μυϊκής μάζας των ζωών, τα οποία καταλήγουν σε διάφορα προϊόντα ζωικής προέλευσης, με αποτέλεσμα να τίθεται σε κίνδυνο η δημόσια υγεία. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων, με την απαιτούμενη ευαισθησία για την αναμφισβήτητη ανίχνευση και επιβεβαίωση των ουσιών αυτών. Στην ερευνητική αυτή εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 20 ορμονών από διάφορες ομάδες καταλοίπων σε μυϊκό ιστό με LC-MS/MS. H προκατεργασία περιλάμβανε υδρόλυση, εκχύλιση με TBME, απομάκρυνση λίπους και τελικό καθαρισμό με SPE με μικροστήλες Oasis και Αmino. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 0,5 ng/g. Επίσης, αναπτύχθηκε μέθοδος προσδιορισμού προγεσταγόνων σε λίπος με LC-MS/MS. H προκατεργασία περιλάμβανε αυτόματο καθαρισμό, για πρώτη φορά, με GPC για το διαχωρισμό των προγεσταγόνων από το λίπος. Αναπτύχθηκε επίσης μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 15 στεροειδών αναβολικών, οι οποίες έχουν ευρύ ενδιαφέρον σε προγράμματα ελέγχου προϊόντων ζωικής προέλευσης, σε ούρα βοοειδών με LC-MS/MS. H προκατεργασία περιλάμβανε ενζυμική υδρόλυση, εκχύλιση με TBME, καθαρισμό με εξάνιο και τελικό καθαρισμό με SPE με Oasis και Αmino. Η μέθοδος επικυρώθηκε στο όριο 1 και 2 ng/mL. Αναπτύχθηκε ακόμη μέθοδος ταυτόχρονου προσδιορισμού 12 στεροειδών αναβολικών σε ορό βοοειδών με LC-MS/MS. Το όριο επικύρωσης ήταν από 0,1 έως 0,4 ng/mL. H προκατεργασία περιλάμβανε καθαρισμό με SPE με Oasis και Αmino. Οι μέθοδοι κρίθηκαν, ως προς την απόδοσή τους, με συμμετοχή σε Διεργαστηριακές Δοκιμές που διοργάνωσε το CRL για τον προσδιορισμό ορμονών σε λίπος, ούρα και ορό. Τα αποτελέσματα κρίθηκαν ικανοποιητικά. Σε όλες τις μεθόδους οι ορμόνες αναλύθηκαν, με APCI με σχηματισμό θετικών και αρνητικών ιόντων σε τύπο MRM, παρακολουθώντας 2 θυγατρικά ιόντα για την αναμφίβολη επιβεβαίωσή τους. Οι μέθοδοι επικυρώθηκαν με βάση την Κοινοτική Απόφαση 2002/657/EC. Η εκλεκτικότητα, η ευαισθησία, η ακρίβεια και η πιστότητα των μεθόδων ήταν ικανοποιητικά. Επομένως, οι μέθοδοι είναι κατάλληλες για εργαστήρια που ασχολούνται με επίσημους ελέγχους καταλοίπων ορμονών προσφέροντας ένα ολοκληρωμένο σύστημα ελέγχου. Τέλος, έγινε δοκιμή ανάλυσης των ορμονών σε τρίχες βοοειδών. Η προκατεργασία περιλάμβανε ενζυμική υδρόλυση, εκχύλιση με TBME, LLE και SPE με Oasis. Τα πρώτα αποτελέσματα κρίνονται ικανοποιητικά και επιτρέπουν μελλοντικά τη βελτίωση, περαιτέρω ανάπτυξη και επικύρωση της μεθόδου
description: A wide range of different anabolic steroids have been used in the livestock farming for increasing the muscular mass of the animals, leading to various products of animal origin. Αs a result the health of consumers is placed in danger. Therefore, it is imperative to have analytical methods with adequate selectivity for the unambiguous detection and confirmation of these substances. Α multi residue method based on LC-MS/MS has been developed for the determination of 20 anabolic steroids from a wide range of chemical groups/families in muscle tissue. The procedure involved hydrolysis, extraction with ΤΒΜΕ, defattening and final clean-up with SPE on Oasis HLB and Amino cartridges. The validation level was 0.5 ng/g. A method based on LC-MS/MS has been developed for the determination of gestagens in kidney fat. The procedure involved a clean-up procedure with GPC. The validation level was 1.0 ng/g. A LC-MS/MS multi residue method has been developed for the determination of 15 anabolic steroids in bovine urine. The procedure involved enzymatic hydrolysis, extraction with TBME, a washing step with hexane and final clean-up with SPE using Oasis HLB and Amino cartridges. The validation level was 1 and 2 ng/mL. A LC-MS/MS multi residue method has been developed for the determination of 12 anabolic steroids in bovine serum. The analytes were purified by SPE with Oasis HLB and Amino cartridges. The validation level ranged from 0.1 to 0.4 ng/mL. The methods were tested by participation at proficiency tests organized by the CRL in hormones for the determination of hormones in fat, urine and serum. The results were satisfactory. In all methods the analytes were analyzed with APCI, in positive and negative multiple reaction monitoring (MRM) mode, acquiring two diagnostic product ions from each of the chosen precursor ions for the unambiguous confirmation of the hormones. The multi methods were validated according to the Commission Decision 2002/657/EC. The specificity, the sensitivity, the accuracy and the precision of the methods were satisfactory. As a result, the methods are suitable for laboratories that focus on official residue controls giving a complete control system. Finally, a method for the analysis of hormones in bovine hair was tested. It included enzymatic hydrolysis, extraction with TBME, LLE and cleaning with SPE using Oasis HLB. The first results were satisfactory, a fact that allows future improvement, development and validation of the method