title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen und NRPS-ähnlichen Enzymen aus Ascomyceten
title: Molecular biological and biochemical investigations on prenyltransferases and NRPS-like enzymes from ascomycetes
Creators: name: Tarcz, Sylwia Magdalena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Sekundärstoffwechsel
Peptidsynthetasen
Aspergillus fumigatus
Prenyltransferases
Indolalkaloide
Medical sciences, Medicine
Prenyltransferasen
O
Site Directed Mutagenesis
Aspergillus terreus
Secondary Metabolism
Indole Alkaloids
Chaetomium globosum

description: Um ihr eigenes Überleben zu sichern
      und sich Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt zu
      verschaffen, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt,
      bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese kann sich
      der Mensch als Antibiotika, Immunsuppressiva oder als
      Leitsubstanzen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe wie
      HIV-Proteaseinhibitoren oder Insulinmimetika ebenfalls zu
      Nutze machen. Damit stellen sie eine wichtige Quelle
      potentiell nutzbarer Wirkstoffe dar. Große Fortschritte
      wurden in den vergangenen Jahrzehnten auf dem Gebiet der
      Erforschung der für die Biosynthese dieser Metabolite
      notwendigen mikrobiellen Werkzeuge gemacht. Einerseits sind
      nichtribosomale Peptidsynthetasen und Polyketidsynthasen weit
      verbreitete Enzyme, die in viele Biosynthesen von
      Grundstrukturen involviert sind und aufgrund ihrer modularen
      Struktur viel Spielraum für Manipulationen durch die
      Synthetische Biologie bieten. Andererseits können
      Sekundärmetabolite durch Modifikationsenzyme (tailoring
      enzymes) wie z. B. Prenyltransferasen weiter verarbeitet
      werden, was ihre biologische Aktivität häufig erhöht. Um
      diese Enzyme gezielt einsetzen zu können, ist es von
      essentieller Bedeutung, ihre Struktur und Funktion zu
      untersuchen und zu verstehen. Zahlreiche prenylierte
      Bisindolylbenzochinone aus der Gruppe der prenylierten
      Indol-alkaloide konnten bereits aus Ascomyceten isoliert
      werden, biochemische Informationen waren bisher allerdings
      nur für die Biosynthese von Terrechinon A in Aspergillus
      nidulans verfügbar. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation
      konnten die putativen Prenyltransferasegene astPT und
      ATEG_00702 (EAU39348) aus Aspergillus terreus heterolog in
      Escherichia coli exprimiert und anschließend bis zur
      Homogenität aufgereinigt werden. Das rekombinante Protein
      AstPT katalysierte in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat
      (DMAPP) die N- und C-Prenylierung von Asterrichinon D (AQ D).
      Als enzymatische Produkte konnten zwei mono- und zwei
      diprenylierte Substanzen isoliert werden, deren Strukturen
      mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie aufgeklärt
      wurden. Wie andere Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie
      war AstPT in seiner Katalyse unabhängig von Metallionen und
      folgte der Michaelis-Menten-Kinetik mit einer
      Michaelis-Konstante von 463 µM und einer Wechselzahl von 0,16
      1/s für AQ D bzw. von 33,5 µM und 0,02 1/s für DMAPP.
      Besonderheiten von AstPT sind die Einführung von
      Prenyleinheiten an zwei verschiedenen Positionen des
      Substrates und zum anderen die hohe Spezifität für seine
      aromatischen Substrate. AstPT akzeptierte weder Aminosäuren
      noch cyclische Dipeptide, wie sonst typisch für
      Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie. Hingegen
      akzeptierte sie vier Hydroxyxanthonderivate als Substrate und
      katalysierte O-Prenylierungen in Anwesenheit von DMAPP,
      Geranyl- (GPP) und Farnesyldiphosphat (FPP), was bisher nur
      für ein Enzym der DMATS-Superfamilie beobachtet werden
      konnte. Die Michaelis-Konstante für das beste Xanthonderivat
      wurde mit 17,3 µM bestimmt, allerdings war die Wechselzahl
      für AQ D um das 160-fache höher als für das Xanthonderivat.
      EAU39348 konnte AQ D nicht umsetzen, mit
      Didemethylasterrichinon D (DDAQ D) als aromatisches Substrat
      war hingegen die Bildung von mehreren Produkten zu
      beobachten. Die langsame Umsetzung von AQ D durch AstPT und
      die alleinige Umsetzung von DDAQ D durch EAU39348 deuten auf
      eine bevorzugte Produktion von DDAQ D-Derivaten in
      Aspergillus terreus hin, die in deren höherer Bioaktivität
      begründet sein könnte. Ein drittes putatives
      Prenyltransferasegen, CHGG_03684, konnte aus Chaetomium
      globosum kloniert und in verschiedenen Expressionssystemen
      getestet werden. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein
      lösliches Protein erhalten werden. Nach Solubilisierung der
      Protein-Einschlusskörper mittels Harnstoff wurde eine
      Renaturierung durch Dialyse versucht. Mit dem erhaltenen
      Protein und AQ D konnte in Anwesenheit von DMAPP keine
      Umsetzung beobachtet werden. Des Weiteren wurden vier
      putative, NRPS-ähnliche Gene aus Aspergillus terreus bzw.
      Chaetomium globosum mittels PCR amplifiziert. ATEG_02004,
      ATEG_03563 und CHGG_03687 konnten in den Expressionsvektor
      pJW24 kloniert werden, der pyrG als Selektionsmarker für die
      anschließende Transformation trägt. Das Konstrukt mit
      ATEG_02004 konnte erfolgreich in Aspergillus niger AB 1.13
      eingebracht und die Integration in Genom mittels PCR
      nachgewiesen werden. Die Untersuchung der
      Sekundärmetabolit-produktion der Transformanten führte
      allerdings nicht zur Identifizierung der Funktion von
      ATEG_02004. In einem weiteren Projekt innerhalb dieser Arbeit
      wurde die Bedeutung verschiedener Aminosäuren in FtmPT1
      untersucht, um den auf der Enzymstruktur basierten
      Reaktions-mechanismus zu bestätigen. Durch zielgerichtete
      Mutagenese mittels PCR und anschließende Überproduktion und
      Aktivitätstests konnte die Beteiligung des Glutamatrests 102
      an der Stabilisierung des Indolstickstoffs über
      Wasserstoffbrückenbindungen und seine Rolle als
      Protonenakzeptor während der Katalyse gezeigt werden. Der
      Austausch von Glycin 115 führte zur Änderung der
      Prenylierungsposition von C 2 nach C 3 unter Entstehung eines
      Hexahydropyrroloindols. Dies konnte sowohl für das natürliche
      Substrat von FtmPT1, Brevianamid F, als auch für verschiedene
      cyclische Dipeptide nachgewiesen werden. Damit wurde die
      essentielle Rolle von G115 in der Prenylierung in FtmPT1
      aufgezeigt. Mutationen der entsprechenden Aminosäure in
      CdpC3PT, A115, senkten nur die Aktivität. Mit dem Austausch
      von Tyrosin 205 gegen Phenylalanin konnte die Akzeptanz von
      sechs Hydroxynaphthalinderivaten gegenüber dem Wildtypprotein
      verbessert werden.
description: Microorganisms developed the
      capability to produce bioactive secondary metabolites to
      ensure their own viability and get evolutionary advantages.
      These metabolites can be used as antibiotics or
      immunosuppressive drugs, but also as lead structures for the
      development of new drugs like HIV protease inhibitors or
      insulin mimetics. Therefore, microorganisms are an important
      source of potentially active pharmaceutical ingredients.
      Significant progress has been achieved in the past decades in
      the research on the biosynthesis of these compounds. On the
      one hand, nonribosomal peptide synthetases and polyketide
      synthases are common enzymes involved in the biosynthesis of
      the backbones of numerous metabolites and their module-based
      structure represents a target for manipulations with the
      means of synthetic biology. On the other hand, secondary
      metabolites can be further modified by tailoring enzymes like
      prenyltransferases which often leads to a higher biological
      activity. It is of particular importance to investigate these
      structures and to understand their functions in order to make
      use of those enzymes. Many prenylated bisindolylbenzoquinones
      belonging to prenylated indole alkaloids have been isolated
      from ascomycetes, but biochemical information has been
      available only for the biosynthesis of terrequinone A in
      Aspergillus nidulans prior to this thesis. In this thesis the
      putative prenyltransferase genes astPT and ATEG_00702
      (EAU39348) from Aspergillus terreus were expressed
      heterologously in Escherichia coli and subsequently purified
      to near homogeneity. The recombinant protein AstPT catalysed
      the N- and C-prenylation of asterriquinone D in the presence
      of dimethylallyldiphosphate (DMAPP). The enzyme products, two
      mono- and two diprenylated compounds, were isolated and their
      structure was elucidated by NMR spectroscopy and mass
      spectrometry. As other prenyltransferases from the
      DMATS-superfamily, AstPT was not dependent on the presence of
      metal ions for its catalytic activity. The reaction
      apparently followed Michaelis-Menten kinetics and the
      Michaelis constant was determined at 463 µM with a turnover
      number at 0.16 s-1 for AQ D and at 33.5 µM and 0.02 s 1 for
      DMAPP, respectively. Special features of AstPT were the
      introduction of prenyl moieties at two distinct sites of the
      substrate and its high specificity towards its aromatic
      substrate. It accepted neither amino acids nor cyclic
      dipeptides, which are typical substrates of
      prenyltransferases of the DMATS-superfamily. However, it
      accepted four hydroxyxanthone derivatives as substrates and
      catalysed O-prenylations in the presence of DMAPP but also
      from geranyl- (GPP) and farnesyldiphosphate (FPP). This
      phenomenon has only been observed for one enzyme from this
      group before. The best accepted xanthone derivative had a
      Michaelis constant at 17.3 µM, but the turnover number for AQ
      D was 160 times higher than for this hydroxyxanthone.
      EAU39348 was not able to convert AQ D. Using
      didemethylasterriquinone D (DDAQ D) as aromatic substrate,
      the formation of several products was observed. The slow
      conversion of AQ D by AstPT and the exclusive acceptance of
      DDAQ D by EAU39348 may indicate that the production of DDAQ D
      derivatives is preferred in Aspergillus terreus. The reason
      for this might be the stronger biological activities of DDAQ
      D derivatives in comparison to AQ D derivatives. A third
      putative prenyltransferase gene, CHGG_03684, was cloned from
      Chaetomium globosum and overproduction was tested in
      different expression systems. Unfortunately, no soluble
      protein was obtained under these conditions. An attempt of
      renaturation via dialysis was made after solubilisation of
      inclusion bodies with urea, but no activity was observable
      after incubation with AQ D and DMAPP. Furthermore, four
      putative NRPS-like genes from Aspergillus terreus and
      Chaetomium globosum were amplified via PCR. ATEG_02004,
      ATEG_03563 and CHGG_03687 were cloned into the expression
      vector pJW24 containing pyrG as a selection marker for
      subsequent transformations. The construct with ATEG_02004 was
      successfully trans-ferred into Aspergillus niger AB 1.13 and
      the genomic integration was confirmed via PCR. The function
      of ATEG_02004 could not be identified by investigation of the
      produced secondary metabolites. In addition, the importance
      of several amino acid residues in FtmPT1 was studied in this
      thesis to support the proposed reaction mechanism, which is
      based on the enzyme structure. The involvement of glutamate
      102 in the stabilization of the indole nitrogen and its role
      as proton acceptor during catalysis was shown in activity
      assays after site-directed mutagenesis and overproduction of
      the proteins. Exchange of glycine 115 for threonine led to a
      shift of the prenylation position from C 2 to C 3 and the
      introduction of a hexahydropyrroloindole. This was observed
      by using the natural substrate brevianamide F as well as
      different cyclic dipeptides. These results revealed the
      essential role of G115 in the prenylation of FtmPT1. Mutation
      of the corresponding amino acid in CdpC3PT did not have any
      effect on the prenylation position and simply decreased the
      activity. The exchange of tyrosine 205 for phenylalanine
      increased the acceptance of six hydroxynaphthaline
      derivatives.