The ADAP/SKAP55-module regulates F-actin cytoskeleton reorganization through the interaction with Ena/VASP proteins
Creators: name: Degen, Janine
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2020
Subjects: subject: Zellbiologie
subject: 571.6

description: The integrin leukocyte function associated antigen (LFA-1) mediates chemokine C-C motif ligand 21 (CCL21)-induced adhesion and migration of T cells on entry into secondary lymphoid organs (SLOs). Within the SLOs, LFA-1 mediates the interaction of T cells with antigen-presenting cells (APCs). These processes are essential for the participation of T cells in the adaptive immune response. T-cell receptor (TCR) and chemokine triggering lead to the activation of signaling pathways termed ‘inside-out’ signaling, which induce changes in the conformation of integrins. This enables LFA-1 to bind its respective ligand, the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) (affinity regulation). The activation of LFA-1 leads to the formation of integrin clusters (avidity regulation), which are probably regulated by the actin cytoskeleton. The ADAP/SKAP55-module plays a key role in LFA-1 activation, T-cell adhesion, and migration in response to chemokine and TCR stimuli ex vivo. In the first part of my thesis, I analyzed whether the ADAP/SKAP55-module is required for T-cell adhesion and migration in vivo. The results obtained show that the ADAP/SKAP55- module is crucial for T-cell homing and the stable interaction of T cells with the endothelium of blood venules. The analysis of ADAP-/- T cells on primary endothelial cells under shear flow ex vivo revealed an attenuated detachment and crawling on the endothelium. Moreover, ADAP-/- T cells are less polarized, which correlates with a reduced F-actin polymerization and enhanced F-actin depolymerization during chemokine stimulation, indicating that this module regulates F-actin cytoskeleton remodeling. These defects may explain the reduced homing capacity of ADAP-/- T cells to SLOs. The molecular basis of how the ADAP/SKAP55-module modulates the F-actin cytoskeleton is not fully understood, and this question is addressed in the second part of my thesis. T cells express two of the three members of the Ena/VASP proteins, Evl-I and VASP, which are both regulators of the actin cytoskeleton. These Ena/VASP proteins are known to interact with ADAP and RIAM, the interaction partners of SKAP55. Immunoprecipitation studies confirmed that ADAP and RIAM are linked to Ena/VASP proteins. To analyze the functional relevance of Evl-I and VASP, I established a shRNA-mediated knockdown in Jurkat T cells. Here, I found that both Evl-I and VASP are responsible for TCR-mediated F-actin polymerization and lamellipodia formation. The absence of Ena/VASP proteins led to increase LFA-1-mediated adhesion upon TCR stimulation, although the interaction of T-cell/APC was diminished, indicating an integrin-independent but more actin cytoskeleton-dependent function of these proteins for T-cell conjugation with APCs. In contrast to the TCR-mediated function, chemokine-mediated F-actin remodeling was reduced, while chemokine-mediated adhesion and migration were not impaired. This suggests different functional properties of Ena/VASP proteins in TCR- and chemokine-mediated signaling processes.
description: Für die Teilnahme von T-Zellen an der adaptiven Immunantwort reguliert das Integrin leukocyte function associated antigen (LFA-1) die über das Chemokin C-C motif ligand 21 (CCL21)-vermittelte Adhäsion und Migration von Lymphozyten. Dies ermöglicht ihnen die Einwanderung in die sekundären lymphatischen Organe wie der Milz oder den Lymphknoten. In der Milz und im Lymphknoten reguliert LFA-1 die Interaktion von T-Zellen mit antigenpräsentierenden Zellen (APZ). Die Stimulation von T-Zellen über den T-Zell-Rezeptor (TZR) und Chemokinrezeptor bewirkt die Aktivierung von Signalwegen, die eine Veränderung der Integrinkonformation hervorrufen (inside-out signaling). Dadurch kann LFA-1 an seinem Liganden das intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) binden (Affinitätsregulierung). Nach der Aktivierung kommt es zur Bildung von Integrinclustern (Aviditätsregulierung), welche vermutlich über das Aktinzytoskelett reguliert werden. Nach Stimulation des TZRs sowie des Chemokinrezeptors CCR7 spielt das ADAP/SKAP55-Modul eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von LFA-1 und ist an Adhäsions- und Migrationsprozessen in T-Zellen ex vivo beteiligt. Im ersten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die funktionelle Relevanz des ADAP/SKAP55-Moduls bei der Adhäsion und Migration von T-Zellen in vivo. ADAP-/- T-Zellen zeigten eine verminderte Wanderung in die sekundären lymphatischen Organe. Mit Hilfe der 2-Photon-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass das ADAP/SKAP55-Modul für die stabile Interaktion der T-Zelle mit dem Blutgefäßendothel verantwortlich ist. In ex vivo Experimenten zeigten ADAP-/- T-Zellen ein vermehrtes Ablösen und ein gestörtes Laufverhalten auf primären murinen Endothelzellen unter Durchflussbedingungen. Ferner wurde beobachtet, dass ADAP-/- T-Zellen weniger polarisiert sind, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass das ADAP/SKAP55-Modul das Aktinzytoskelett beeinflusst. Weitere Untersuchungen ergaben, dass der Verlust von ADAP nach Chemokinstimulation zu einer verminderten F-Aktin-Polymerisierung bzw. zu einer verstärkten Depolymerisierung führte. Diese Defekte sind vermutlich dafür verantwortlich, dass ADAP-/- T-Zellen mit einer zeitlichen Verzögerung in Milz und Lymphknoten einwandern. Die molekularen Mechanismen wie das ADAP/SKAP55-Modul das F-Aktinzytoskelett moduliert sind unklar und wurden im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht. In T-Zellen werden zwei der drei Mitglieder der Ena/VASP-Familie exprimiert, Evl-I und VASP. Ena/VASP-Proteine sind dafür bekannt, dass sie das Aktinzytoskelett modulieren. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass Evl-I und VASP mit ADAP und RIAM, dem Interaktionspartner von SKAP55, interagieren. In Immunpräzipitationsstudien konnte die Bindung von ADAP und RIAM an Evl-I und VASP verifiziert werden. Um die funktionellen Konsequenzen von Evl-I und VASP in Jurkat T-Zellen zu analysieren, etablierte ich eine shRNA-vermittelte Reduktion der Expression dieser Proteine. Mit Hilfe dieses shRNA basierten knockdowns von Evl-I und VASP konnte ich zeigen, dass diese Proteine an der TZR-vermittelte F-Aktin-Polymerisierung und Lamellipodiaformation beteiligt sind. Darüber hinaus führte die Reduktion der Expression von Ena/VASP-Proteinen zu einer gesteigerten LFA-1-vermittelten Adhäsion nach TZR Stimulation. Im Gegensatz zur erhöhten TZR-vermittelten Adhäsion war die Interaktion der Ena/VASP-defizienten Jurkat T-Zellen mit Superantigen-beladenen Raji B-Zellen stark vermindert, was auf eine Integrin-unabhängige, aber Aktin-regulierende Funktion dieser Proteine bei der Interaktion von T-Zellen mit B Zellen hindeutet. Ebenso konnte eine verminderte F-Aktin-Polymerisierung nach Chemokinstimulation nachgewiesen werden, wohingegen die Chemokin-vermittelte Adhäsion und Migration nicht beeinflusst war. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Ena/VASP-Proteine verschiedene Funktionen bei Signalwegen der TZR- und Chemokin-vermittelten Adhäsion und Migration ausüben.