title: Untersuchungen zur Dynamik von Cytoskelettelementen und Endoplasmatischem Retikulum in Arabidopsis thaliana
Creators: name: Blum, David
Publisher: name: :none
Year: 2017

description: Plasmamembran und Zellwand sind bei Pflanzenzellen über bestimmte Kontaktstellen miteinander verbunden. Mehrere Zellorganellen spielen dabei innerhalb dieser Verbindungsstellen eine Rolle, wie zum Beispiel das Cytoskelett und das Endoplasmatische Retikulum (ER) – die genaue Beschaffenheit ist jedoch noch nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit soll weiteren Aufschluss über jene Kontaktstellen geben. Eine gute Möglichkeit die Anheftungsstellen in vivo zu untersuchen und sichtbar zu machen, ist die Plasmolyse. Mit Hilfe einer osmotisch wirksamen Lösung, verliert der Protoplast an Größe und löst sich dabei von der Zellwand. Dabei bleiben Plasmastränge zwischen Zellwand und Plasmamembran erhalten, welche diese beiden Strukturen weiterhin miteinander verbinden. Diese Stränge werden als Hechtsche Fäden, wenn von der Zellwand zur Plasmamembran eine direkte Verbindung durch den Plasmolysevorraum besteht, oder als Hechtsches Retikulum, wenn sie an der Zellwand verbleiben, bezeichnet. In den von Hecht (1912) entdeckten Strukturen, die hauptsächlich aus einer Ummantelung aus Plasmamembran bestehen, finden sich unter anderem sowohl Mikrotubuli wie auch Aktinmikrofilamente und ER (Lang-Pauluzzi &amp; Gunning, 2000). In der vorliegenden Arbeit wird unter anderem das Verhalten der Hechtschen Fäden und des Hechtschen Retikulums bei fehlendem Cytoskelett untersucht. Dabei wurden mittels Konfokaler Laser-Rastermikroskopie Mikrotubuli, Aktinmikrofilamente und ER während der Plasmolyse durch Mannitol, wie auch durch den Einsatz von Cytoskelett depolymerisierenden Substanzen, wie Latrunculin-B (Lat-B) und Oryzalin, analysiert. Den Hauptteil der Arbeit bildet somit die Analyse der Interaktion zwischen jenen drei Strukturen, zum einen im Zellkortex, zum anderen in den Hechtschen Fäden und dem Hechtschen Retikulum. Es wurden fünf verschiedene transgene Linien von Arabidopsis thaliana in Kombination mit einem Konfokalen Laser-Rastermikroskopie Mikroskop verwendet. GFP-FABD erlaubte die Visualisierung der Aktinmikrofilamente, während Mikrotubuli mit GFP-MAP4 und GFP-TUA6 markiert wurden. Mittels YFP-RTN konnte das feine kortikale ER-Netzwerk untersucht werden, während GFP- CXN die Visualisierung des gesamten ERs erlaubte. Weder Mikrotubuli, noch Aktinmikrofilamente sind für das Entstehen der Hechtschen Fäden und des Hechtschen Retikulums essentiell. Allerdings kam bei YFP-RTN, wie auch bei GFP-TUA6 Zelllinien mit fehlenden Aktinmikrofilamenten das Hechtsche Retikulum seltener, Hechtsche Fäden dafür häufiger vor. Es ist denkbar, dass das Hechtsche Retikulum an manchen Verbindungsstellen Aktinmikrofilamente zur festen Verankerung an der Zellwand benötigt. Bei fehlendem Gerüst löst es sich stellenweise von der Wand und bildet sich teilweise zu Hechtschen Fäden um, welche weiterhin an Aktin unabhängigen Verbindungsstellen mit der Zellwand in Verbindung bleiben. Reticulons und Aktinmikrofilamente scheinen somit essentiell für bestimmte Anheftungsstellen des Hechtschen Retikulums an der Zellwand zu sein. Auch die Form des kortikalen ERs ist stark vom Cytoskelett abhängig, in erster Linie vom Aktingerüst. Die Größe der Polygone des ER-Netzwerks der YFP-RTN Linie stieg bei Anwendung von Lat-B stark an. Die Fläche des ERs bei GFP-CXN Zelllinien stieg hingegen während der Plasmolyse an und bildete größere zusammenhängende Flächen.
description: The plasma membrane and the cell wall of plant cells are connected through some special attachment sites. Different cell organelles, such as the cytoskeleton or the endoplasmic reticulum (ER), play major roles in connecting those two structures. One way how we can observe possible attachment sites is during plasmolysis. The protoplast retracts from the cell wall in response to hyperosmotic shock. During the shrinking of the protoplast, one can observe a tubular network between the cell wall and the protoplast, the Hechtian reticulum (Hecht, 1912). The Hechtian reticulum shows similarity to the cortical ER and is firmly attached to the cell wall. Some fine strands, called the Hechtian strands, connect the Hechtian reticulum directly through the periplasmatic space to the protoplast. They also connect the protoplast directly to the cell wall. The strands are coated with a plasma membrane sleeve and they can contain ER, actin microfilaments and microtubules (Lang-Pauluzzi &amp; Gunning, 2000). In this study, the behaviour of the Hechtian strands and the Hechtian reticulum in absence of cytoskeleton elements were investigated. Under the use of cytoskeletal drugs as latrunculin-B and oryzalin, microtubules, actin microfilaments and ER have been analysed in vivo, using a confocal laser-scanning microscope in combination of GFP- and YFP-tagged transgenic Arabidopsis thaliana seedlings. The interaction of those three structures in the cortex, in the Hechtian strands and in the Hechtian reticulum were the main focus of this work. Five different transgenic Arabidopsis thaliana lines were used to investigate those structures. GFP-FABD was used to visualize actin microfilaments, GFP-MAP4 and GFP-TUA6 for the visualization of microtubules. YFP-RTN, visualizing the fine tubules of the cortical ER and GFP-CXN, visualizing the whole ER, were used for its examination. After the depolymerization of microtubules, Hechtian strands and Hechtian reticulum still existed. But in the abscence of actin microfilaments in the YFP-RTN line, Hechtian reticulum was rarer and Hechtian strands more frequent visible. It seems possible that the connection between the Hechtian reticulum and the cell wall is at some points dependant of actin microfilaments as well as Reticulons. The shape of the cortical ER changed in absence of actin microfilaments. The polygons of the cortical ER meshwork increased dramatically. Plasmolysis had mainly an influence on cells from the GFP-CXN line. The surface area of the ER increased and formed more coherent areas in plasmolysed hypocotyl cells.