title: Synthesis, analysis, and purification of a targeted DARPin-PAMAM delivery system for siRNA
Creators: name: Ahmed, Ahmed
Publisher: name: :none
Year: 2016

description: Seit der Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi), stellt diese eine vielversprechende Methode dar, um eine hocheffiziente Downregulierung der Genexpression durch spezifischen Eingriff in die Translation der Zielproteine zu erreichen. Verbindungen, die auf dem Prinzip der Small interfering RNA (doppelsträngige RNA aus 21-23 Basenpaaren) basieren, konnten erfolgreich den therapeutischen Effekt der RNAi-Maschinerie beweisen. Allerdings muss eine Vielzahl von zusätzlichen Konjugationen und chemischen Modifikationen durchgeführt werden, um die gezielte Lieferung siRNA an das erkrankte Gewebe zu ermöglichen bzw., um die Stabilität des Wirkstoffes zu erhöhen und die zelluläre Aufnahme zu steuern. Zu diesem Zweck wurde das Dendrimer PAMAM G4 an das DARPin AhaEc1, welches selektiv an EpCAM bindet, konjugiert mit dem Ziel, ein siRNA-Trägersystem zu erzeugen, das von EpCAM-exprimierenden Tumorzellen spezifisch erkannt und aufgenommen werden kann. Um die beiden Komponenten zu verbinden, wurde ein DBCO-NHS Linker verwendet. Für die Analyse der optimierten Konjugationsreaktionen wurden mehrere Gelelektrophoresen durchgeführt, welche sowohl Banden von PAMAM-EC1-Konjugaten als auch von ungebundenen Edukten (freiem Protein und Linkermolekülen) zeigten. Die Reaktionsbedingungen wurden angepasst, um die effektivste Kopplung und die höchst mögliche Ausbeute zu erreichen. Außerdem wurden Verfahren zur Abtrennung der Reaktionsprodukte von weiteren ungebundenen Komponenten getestet. Das am besten geeignete Verfahren zur Isolierung der Konjugate war die FPLC Reinigung unter Verwendung eines ÄKTA Systems. Komplexe aus den Konjugaten und der siRNA wurden durch Mischungen der negativ geladenen Nukleinsäure und des Dendrimers mit positiv geladenen Aminen erzeugt. Die Komplexbildung war abhängig vom Ladungsverhältnis, wobei die höchste Kapazität von 61,7% durch das Verhältnis N/P 2 erzielt wurde. Die Bindungskapazität fluoreszierender siRNA zu EpCAM-positiven MDA-MB-468-Zellen und -negativen HeLa-Zellen wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie getestet und mit Komplexen aus siRNA und dem Dendrimer, ohne Verwendung des DARPins verglichen. Die Bindung von Ec1 enthaltenden Konjugaten war im Gegensatz zu PAMAM-siRNA Komplexen deutlich höher in Antigen-positiven Tumorzellen, was die selektive DARPin vermittelte Zell-Erkennung beweist.
description: Since its discovery, RNA interference (RNAi) has represented a promising pathway to achieve highly efficient downregulation of gene expression by specific interference with the translation of targeted proteins. Small interfering RNA (21-23 base pairs, double-stranded RNA) -based compounds have successfully demonstrated the therapeutic use of the RNAi machinery. However, a variety of additional conjugations and chemical modifications have to be carried out in order to enable targeted siRNA delivery to the diseased tissue, to improve the drug's stability, and to enhance and control the cellular uptake. For this purpose, the dendrimer PAMAM G4 was conjugated to the DARPin AhaEc1, which binds selectively to EpCAM, to generate a siRNA delivery system that can be specifically recognized by EpCAM expressing tumor cells. To connect the two elements, a DBCO-NHS linker was used. For analysis of the optimized conjugation reactions, several gel electrophoreses were performed, showing bands of PAMAM-Ec1 conjugates and unbound educts (free protein and linker molecules). Reaction conditions were optimized for effective coupling and adequate yields. Methods for separating reaction products from unreacted components were developed. The best suited method for isolating the conjugates was FPLC purification on an ÄKTA system. Complexes of the conjugates and siRNA were generated by mixing the negatively charged nucleic acid to the dendrimer with its positively charged surface amines. The complexation was not was dependent on charge ratio with the highest loading capacity of 61.7 % reached with N/P 2. The binding capacity of fluorescent siRNA to EpCAM-positive MDA-MB-468 cells and -negative HeLa cells was tested by flow cytometry and was compared to complexes of the dendrimer and siRNA without the DARPin. The binding of Ec1 containing conjugates was significantly higher in antigen positive tumour cells compared to unconjugated dendrimers, proving selective DARPin mediated cell recognition.