title: Analysis of ADAM8 in the tumor microenvironment of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
title: Analyse von ADAM8 in der Tumormikroumgebung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Cook, Lena
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: Regulation
ADAM8
Makrophagen
Lipocalin 2
Serum Biomarker
PDAC
Tumormikroumgebung
Neutrophile
MMP-9
miRNA
Extrazelluläre Vesikel
Kommunikat
Medical sciences Medicine
Medizin

description: Die Expression des membrangebundenen Proteins ADAM8 wird mit verschiedenen Krankheiten wie Atemwegserkrankungen, Leberschäden, Entzündung des Nervengewebes und Krebserkrankungen in Verbindung gebracht. Trotz seiner geringen Expression in bestimmten Zelltypen kann ADAM8 durch spezifische Stimuli auf ein beträchtliches Maß hochreguliert werden. Im Gegensatz zu entzündlichen Prozessen ist ADAM8 bei Krebserkrankungen konstitutiv überexprimiert, wie es für Gehirn-, Brust-, Lungen- und Bauchspeicheldrüsenkrebs beschrieben wurde und korreliert fast ausschließlich mit einem schlechten Überleben. Vor allem konnte beim PDAC nachgewiesen werden, dass ADAM8 für die Migration, Invasion und Metastasierung von Tumorzellen in vitro und in vivo eine wichtige Rolle spielt. Die Behandlung des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wird durch seine hohe Metastasierungsfähigkeit und das Fehlen spezifischer Symptome erschwert, was zu einer späten Erkennung der Tumorerkrankung und einer hohen Sterblichkeit führt. Daher ist es dringend notwendig, sowohl Biomarker für die frühe Erkennung als auch spezifische therapeutische Ziele zu finden. Das erste Ziel dieser Arbeit war der Nachweis von ADAM8 in den Tumorgewebeschnitten der Marburger PDAC-Patientenkohorte. Die DAB-Färbung aller Patienten ergab einen positiven Nachweis von ADAM8 in allen Schnitten, was auf eine wesentliche Rolle von ADAM8 bei der Progression des Tumors und Entwicklung der Erkrankung hindeutet. Dennoch korrelierte die ADAM8-Expression nicht mit dem Überleben der Patienten. Die Expression von ADAM8 wurde auch in tumorassoziierten Makrophagen, NK-Zellen und Neutrophilen nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass ADAM8 an der Rekrutierung von Immunzellen in die Tumormikroumgebung beteiligt ist, und somit die Tumorprogression fördern könnte. Die Quantifizierung und anschließende Analyse der Neutrophilen-Dichte in den postkapillären Venolen innerhalb des Tumors ergab jedoch eine signifikante negative Korrelation der ADAM8-positiven Neutrophilen mit dem Gesamtüberleben, was das Potenzial von ADAM8 für die Diagnose und Prognose von PDAC unterstreicht. Im zweiten Teil dieser Studie wurde ADAM8 mit Hilfe einer „Bead“-gekoppelten FACS-Analyse als aktive Protease in Exosomen aus Seren von PDAC-Patienten nachgewiesen. Ein erhöhter ADAM8-Spiegel in Exosomen korrelierte mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die zwei miRNAs miR-451 und miR-720, von denen berichtet wird, dass sie tumorfördernde Funktionen ausüben, in Exosomen von PDAC-Patienten im Vergleich zu gesunden Personen dysreguliert sind. Die Validierung dieser beiden miRNAs in Exosomen, die von den Pankreaskrebs-Zelllinien Panc89 Kontrolle und Panc89 ADAM8 Knockout sekretiert wurden, zeigte die ADAM8-abhängige Hochregulierung von miR-720 und die Herunterregulierung von miR-451. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse könnte der Nachweis von ADAM8, miR-451 und miR-720 in Exosomen die Diagnosestellung erleichtern, da durch dieses Regulationsprofil die Unterscheidung zwischen verschiedenen Stadien der PDAC-Erkrankung ermöglicht. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die regulatorische Funktion von ADAM8 in der Mikroumgebung von Tumoren untersucht. Als eine Protease, die an der Invasion und Metastasierung von Tumorzellen beteiligt ist, wird MMP-9 nachweislich von ADAM8 über MAPK/CREB-Signale reguliert. Auf dieser Grundlage wurde die Expression von MMP-9 in Panc89 Kontroll- und ADAM8-Knockout-Zellen validiert. Es zeigte sich jedoch, dass ADAM8 zwar die Aktivität, aber nicht die Expression von MMP-9 reguliert. Eine weitere Analyse anderer regulatorischer Proteine zeigte die ADAM8-abhängige Herabregulierung von LCN2, einem Protein, das die PDAC-Progression fördert und die MMP-9 Aktivität bestimmen kann. Darüber hinaus wurde die beschriebene regulierende Wirkung von ADAM8 auf LCN2 und MMP-9 durch die Co-Kultur von Panc89-Zellen mit THP-1-Makrophagen verstärkt, was die wesentliche Rolle von ADAM8 in der Tumormikroumgebung von PDAC zeigt und damit das Potential als therapeutisches Ziel unterstreicht. Die funktionelle Analyse von Exosomen, die aus Panc89 Kontroll- und ADAM8-Knockout Zellen isoliert wurden, zeigte die ADAM8-abhängige Freisetzung von LCN2 und dass ADAM8 als aktives Enzym in Exosomen sekretiert wird. Das Vorhandensein von ADAM8 in extrazellulären Vesikeln und die Fähigkeit, spezifische regulatorische Funktionen in der Mikroumgebung des Tumors auszuüben, wie zum Beispiel die proteolytische Spaltung von essenziellen Proteinen oder die Regulierung bestimmter tumorfördernder Gene, bietet die Möglichkeit, fortschrittliche Behandlungsstrategien zu entwickelnd und die Früherkennung von PDAC zu verbessern.
description: The expression of the membrane-bound protein ADAM8 is associated with various diseases such as respiratory diseases, liver injury, neuroinflammation, and cancer. Despite its low expression level in distinct cell types, ADAM8 can be upregulated to significant levels upon specific stimuli. Unlike inflammatory processes, ADAM8 is constitutively overexpressed in cancer diseases as it has been described for brain, breast, lung, and pancreatic cancer, and correlates almost exclusively with poor survival. Most importantly, PDAC demonstrated that ADAM8 plays an essential role in tumor cell migration, invasion, and metastasis in vitro and in vivo. The treatment of PDAC is impeded by its high metastatic ability and the lack of specific symptoms leading to late detection of the tumor disease and a high mortality rate. Therefore, there is a high urgency to identify biomarkers for early detection as well as specific therapeutic targets. The first aim of this thesis was to detect ADAM8 in tumor tissue sections of the Marburg PDAC patient cohort. DAB staining of all patients revealed a positive detection of ADAM8 in all sections, suggesting an essential role for ADAM8 in PDAC tumor and disease progression. Nevertheless, ADAM8 expression did not correlate with patient overall survival. ADAM8 expression was also detected in tumor-associated macrophages, NK cells, and neutrophils, indicating that ADAM8 is involved in the recruitment of immune cells to the tumor microenvironment and thus might promote tumor progression. However, the quantification and subsequent analysis of the neutrophil density in post-capillary venules within the tumor areas disclosed the significant negative correlation of neutrophils positive for ADAM8 with overall survival, emphasizing the potential of ADAM8 for diagnosis and prognosis of PDAC. In the second part of this study, ADAM8 was identified as an active protease in exosomes derived from sera of PDAC patients by applying a bead-coupled FACS analysis. Elevated ADAM8 levels in exosomes correlated with disease progression. In addition, two miRNAs, miR-451 and miR-720, that are reported to exert tumor-promoting functions, were dysregulated in exosomes derived from PDAC patients compared to healthy individuals. The validation of these two miRNAs in exosomes from pancreatic cancer cell lines Panc89 control and Panc89 ADAM8 knockout cells revealed the ADAM8-dependent upregulation of miR-720 and downregulation of miR-451. Based on these results, the detection of ADAM8, miR-451, and miR-720 in exosomes may facilitate diagnosis, as this regulatory profile allows the differentiation between different stages of PDAC disease. The final part of this work investigates the regulatory function of ADAM8 in the tumor microenvironment. As a protease involved in tumor cell invasion and metastasis, MMP-9 was previously described to be regulated by ADAM8 via MAPK/CREB signaling. Based on this finding, MMP-9 expression was validated in Panc89 control and ADAM8 knockout cells. However, ADAM8 was shown to regulate MMP-9 activity but not MMP-9 expression. Further analysis of other regulatory proteins revealed the ADAM8-dependent downregulation of LCN2, a protein that promotes PDAC progression and is involved in the regulation of MMP-9 activity. These data suggest that ADAM8 regulates LCN2 expression levels to control MMP-9 activity, promoting invasion and metastasis in PDAC. In addition, the described regulatory effect of ADAM8 on LCN2 and MMP-9 was enhanced by the co-culture of Panc89 cell with THP-1 derived macrophages demonstrating the essential role of ADAM8 in the PDAC tumor microenvironment and thus underlining the potential as a therapeutic target. The functional analysis of exosomes derived from Panc89 control and ADAM8 knockout cells demonstrated an ADAM8-dependent release of LCN2 and revealed that ADAM8 is sorted as a proteolytically active enzyme in exosomes. The presence of the ADAM8 in extracellular vesicles and the ability to exert specific regulatory functions in the tumor microenvironment by either cleavage of essential proteins or regulating particular genes involved in tumor progression offers the possibility to develop advanced treatment strategies and to improve the early detection of PDAC disease.