title: Genome mining of xylariolide D biosynthesis in Penicillium and engineering of cyclodipeptide derivatives in Streptomyces
title: Genome Mining der Xylariolid D Biosynthese in Penicillium und Konstruktion von Cyclodipeptid-Derivaten in Streptomyces
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Stierle, Sina Alice
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Natural sciences &amp; mathematics
Naturwissenschaften
Penicillium
cyclodipeptides
biosynthesis
genome mining
Streptomyces
genetic engineering
polyketides

description: Mikroorganismen, die lange vor den Menschen existierten und wohl noch lange danach existieren werden, haben seit jeher unser Leben geprägt und nachhaltig beeinflusst. Während ihres Lebenszyklus produzieren Mikroorganismen eine Vielzahl an Metaboliten, die häufig auch als Naturprodukte (NP) bezeichnet werden. Darunter fallen einerseits Primärmetabolite, die die Organismen zum Leben und zur Reproduktion benötigen und andererseits Sekundärmetabolite (SM), die ihnen z.B. im Überlebenskampf mit Konkurrenten Vorteile verschaffen. Letztere wurden häufig auf eine bestimmte pharmakologische Wirkung maßgeschneidert und stellen daher wichtige Ausgangspunkte für die Entdeckung und Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. Rund die Hälfte der von der FDA zugelassenen Arzneimittel sind entweder NP, die direkt angewendet werden oder sie stellen Derivate oder Mimetika derselben dar. Da in den letzten Jahren jedoch immer weniger neue Arzneistoffe aus NP stammen, ist es umso wichtiger, diesem Trend durch Forschung entgegenzuwirken.
Dies kann durch unterschiedliche Ansätze erreicht werden. Zum einen können bisher unerforschte Gene untersucht werden, die eventuell für die Produktion neuer Substanzen verantwortlich sind und zum anderen können bereits bekannte Strukturen durch ein genetisches „Mix and Match“ Prinzip gezielt modifiziert werden, so dass neue, „unnatürliche“ NP entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden beide Ansätze verfolgt.
Im ersten Projekt wurde die Funktion eines Genclusters aus dem marinen Schimmelpilz Penicillium crustosum PRB-2, das unter Laborbedingungen nicht aktiv ist, aufgeklärt. Dieses „stumme“ Gencluster, hier als xil Cluster bezeichnet, besteht aus drei Genen, die für die Polyketidsynthase (PKS) XilA, einen Transkriptionsfaktor (TF) XilB und ein Cytochrom P450 (P450) Enzym XilC kodieren. Zunächst konnte durch gezielte genetische Manipulation des Wirts XilB aktiviert werden und die Produktion von Xylariolide D sowie dessen Vorstufe, das nicht-hydroxylierte Prexylariolide D, in den rekombinanten Stämmen detektiert werden. Da letzteres allerdings nur in sehr geringer Menge produziert wurde, wurde anschließend die PKS selbst überexprimiert, so dass deutlich mehr Produkt akkumulierte und eine Strukturaufklärung mittels NMR möglich war.
Um die Biosynthese dieser beiden Polyketide aufzuklären, wurde die PKS zunächst heterolog in Aspergillus nidulans exprimiert. Auch in diesen Transformanten konnte die Produktion von Prexylariolide D beobachtet werden. Zusätzlich wurde mit Xylariolide G eine neue Substanz entdeckt, die sich in der Position der Hydroxygruppe von Xylariolide D unterscheidet und als Artefakt im heterologen Wirt angesehen werden kann. Um zu bestätigen, dass Prexylariolide D durch das P450 XilC in Xylariolide D umgewandelt wird, wurde xilC ebenfalls heterolog in Aspergillus nidulans exprimiert. Nach Zufütterung von Prexylariolide D konnte die Umsetzung zum Endprodukt des Clusters bewiesen werden. Da die verzweigte Struktur von Xylariolide D nicht, wie üblich, aus einer linearen Kohlenstoffkette stammen kann, wurde eine Kultur des rekombinanten Penicillium crustosum Stamms mit Überxpression der PKS mit 13C markiertem Acetat versetzt. So konnte bewiesen werden, dass die verzweigte Struktur komplett aus Acetateinheiten biosynthetisiert wird. Dementsprechend muss während der Biosynthese durch die PKS eine unübliche Verzweigung der sonst linearen Kohlenstoffkette erfolgen.
Das zweite Projekt, das in Kooperation mit Dr. Lauritz Harken durchgeführt wurde, basierte auf dem erst kürzlich entdeckten gtm Gencluster aus Streptomyces cinnamoneus. Das gtm Cluster besteht aus fünf Genen, die für vier Enzyme kodieren: einer Cyclodipeptidsynthase (CDPS) GtmA, einer Cyclodipeptidoxidase (CDO) GtmBC, einem P450 GtmD und einer FeII/2-Oxoglutarat abhängigen (FeII/2OG) Oxidase GtmE. Während GtmA cyclo-L-Tryptophan-L-Methionin synthetisiert, wird jeweils eine Doppelbindung von GtmBC und GtmE am 2,5-Diketopiperazinring eingeführt und GtmD überträgt ein Guanin auf den Tryptophanrest. Um eine größere strukturelle Vielfalt an Cyclodipeptiden (CDPs) mit einem 2,5-Diketopiperazin (DKP)-Grundgerüst zu erhalten, sollten verschiedene CDPSs nach einem „Mix and Match“-Prinzip mit den modifizierenden Enzymen des gtm Clusters kombiniert werden. Um mögliche Kandidaten ausfindig zu machen, wurden die modifizierenden Enzyme des gtm Clusters (GtmB – E) zunächst heterolog in Streptomyces albus J1074 (S. albus) exprimiert. Den Kulturen des rekombinanten Stammes wurden verschiedene CDPs zugefüttert und die Umsetzung der Substrate mittels LC-MS ausgewertet. Für die anschließende genetische Kombination wurden jene CDPSs ausgewählt, deren Produkt umgesetzt wurde. Dementsprechend wurden fünf CDPSs aus verschiedenen Streptomyces-Stämmen ausgewählt und die entsprechenden Gene wurden zusammen mit gtmB – E in S. albus exprimiert. Die LC-MS Analyse der Kulturen zeigte, dass acht der zuvor zehn detektierten Derivate erhalten werden konnten. Nach Kultivierung im größeren Maßstab wurden diese isoliert und deren Struktur mittels NMR und MS aufgeklärt. Somit konnte gezeigt werden, dass das rationale Kombinieren von Genen eine einfache und schnelle Methode zur gezielten in vivo Produktion von teils neuen und hoch modifizierten Derivaten darstellt.