title: Adapting the SARSeq method for quantification of DNA-methylation
Creators: name: Paunovic, Boris
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Hintergrund: Jedes Jahr sterben über eine Million Menschen an Lungenkrebs. Ein Grund dafür ist die späte Diagnose und das Auftreten von Symptomen in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium, in dem möglicherweise bereits Metastasen gebildet wurden. Bei Lungenkrebs zeigen Tumorsuppressorgene sehr häufig ein Muster von methylierten Cytosinen in ihren CpG-reichen Promotorregionen, den so genannten CpG-Inseln. Diese Veränderungen können im frühen Stadium des Lungenkrebses gefunden werden, weshalb es sehr wichtig ist, über eine sensitive und spezifische Methode zur Detektion solcher DNA-Mutationen zu verfügen. Ziel ist die Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung der DNA-Methylierung unter Verwendung der SARSeq-Methode. Methoden: Um eine Anreicherung der Ziel-DNA zu erreichen, wird ein Hybridisierungsprotokoll eingesetzt, bei dem magnetische Beads, die eine zuvor immobilisierte Sonde mit Oligonukleotiden tragen, eingeführt werden. Diese Oligos sind so konzipiert, dass sie einen bestimmten DNA-Strang einfangen, der das Methylierungsmuster aufweisen könnte, von dem bekannt ist, dass es in lungenkrebsspezifischen Regionen existiert. Die Hybridisierungseffizienz wird unter Verwendung von qPCR als Ausleseverfahren getestet. Ziel ist es, eine Alternative zur Bisulfit-Sequenzierung einzuführen, die sogenannte TET-unterstützte Pyridin-Boran-Sequenzierungsmethode (TAPS), bei der methylierte Cytosine in CpG-Regionen direkt positiv umgewandelt werden, was das Auslesen einfacher und zugänglicher macht. Ziel ist es, diese beiden Methoden zu kombinieren und Hybridization Capture durchzuführen, gefolgt von einem TAPS-Protokoll auf den Beads und schließlich Next-Generation Sequencing für die Analyse zu verwenden. Ergebnisse: Wir haben das Hybridisierungsprotokoll unter Verwendung des lungenkrebsspezifischen Locus ZFP42 für verschiedene Capturing-Experimente optimiert. Die Optimierung führte zu wichtigen Erkenntnissen in Bezug auf die DNA-Reinheit, die Hybridisierungsbedingungen, das Waschen der Beads und die Einführung einer robusten Elutionsstrategie, die alle zu einer höheren Hybridisierungseffizienz führten. Darüber hinaus haben wir eine neue Art der Hybridisierungssonde vorgestellt, bei der sowohl das 5'-Ende als auch das 3'-Ende eines Einzelstrangs auf effizientere Weise eingefangen wird, anstatt den Zielstrang nur an einem Ende zu fangen, was wir als Bridge-Capturing bezeichnen. Das Hinzufügen eines Vordenaturierungsschritts mit DMSO und Betain vor Beginn der Hybridisierung hatte einen vielversprechenden Einfluss auf die Einfangergebnisse. Wir haben das Multiplexing der Hybridisierung erfolgreich gemeistert und verschiedene Loci in einer einzigen Reaktion eingefangen, ein bedeutender Erfolg, der uns dem Ziel der Kombination mit der TAPS-Methode näherbrachte. Die Effizienz des TET-Enzyms wurde durch die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA) zur Oxidationsreaktion verbessert, wobei die Hälfte der TET-Konzentration in Kombination mit BSA für die gleichen Ergebnisse ausreichte wie die doppelte Enzymmenge ohne den Zusatzstoff, was zu einer Umwandlung von methylierten und gut zugänglichen CGs von 100 % führte. Wir haben es geschafft, das TAPS-Protokoll mit den Beads durchzuführen, und es ist uns sogar gelungen, dies mit Multiplex-Beads zu tun und erfolgreiche CpG-Umwandlungen in lungenkrebsspezifischen Regionen ZFP42, HOXa9, HOXa7, Kras und TAC1 zu erhalten. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse und die Integration von TAPS in das vorangegangene Hybridisierungsprotokoll lassen vermuten, dass die Methode in Zukunft möglicherweise zur Früherkennung von Lungenkrebs als medizinische Diagnose eingesetzt werden könnte.
description: Background: Over one million people are dying of lung cancer, every year. A reason is the late diagnosis and, in many cases, only occurring symptoms in an advanced state of disease where metastasis has potentially already taken place. In lung cancer tumor suppressor genes are showing very often a pattern of methylated cytosines in their promoter CpG-rich regions, called CpG islands. These changes can be found in early stages of lung cancer and therefore it is very important to have a sensitive and specific technique for mapping such DNA mutations. Ultimately, the aim is to develop a high throughput method using the Saliva analysis by RNA sequencing technique (SARSeq) for quantification of DNA methylation. Methods: In order to have an enrichment of target DNA, a Hybridization Capturing protocol, where magnetic beads that carry a pre-immobilized probe using oligonucleotides, is introduced. These oligos are designed to capture a specific DNA strand which could have the methylation pattern known to exist in lung cancer specific regions. Hybridization efficiency is tested while using qPCR as a readout. The aim is to introduce an alternative to bisulfite sequencing, called the TET-assisted pyridine borane sequencing method (TAPS), where methylated cytosines found in CpG-regions get a direct positive conversion, what makes the readout easier and more approachable. In the end, combining those two methods and performing Hybridization Capture, followed by a TAPS protocol on the beads and finally using Next-Generation Sequencing for analysis is the aim. Results: We optimized the hybridization protocol using the lung cancer specific locus ZFP42 for various capturing experiments. The optimization led to key findings, in terms of DNA purity, hybridization condition, beads washing and introducing a robust elution strategy, all leading to a higher hybridization efficiency. In addition, we presented a new type of hybridization probe, where the 5’-end as well as the 3’-end of a single strand get captured in a more efficient way, instead of catching the target strand only on one end, which we call bridge-capturing. The addition of a pre-denaturation step using DMSO and Betaine before starting hybridization had a promising impact on the capturing results. We successfully mastered the multiplexing of hybridization and captured various loci in a single reaction, a significant achievement which brought us closer to the goal of combining it with the TAPS method. The TET enzyme efficiency was improved by adding Bovine Serum Albumin (BSA) to the oxidation reaction, where half of the TET concentration in combination with BSA was sufficient for same results as twice the amount of enzyme without the additive, leading to a conversion of methylated and well accessible CGs of 100%. We crafted to perform the TAPS protocol on the beads, even succeeding in doing so on multiplexed beads and receiving successful CpG conversions in lung cancer specific regions ZP42, HOXa9, HOXa7, Kras, TAC1. Conclusion: Our findings and integration of TAPS to the preceding hybridization capture suggest that the method could potentially be used in the future for an early detection of lung cancer as a medical diagnosis.