Artemisininderivate und ihre Interaktionen mit dem hepatischen Transportprotein OATP1B1
Creators: name: Kohlmeyer, Moritz
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: 1. Hintergrund und Ziele Transportproteine sind an der Aufnahme, Verteilung und Eliminierung vieler endogener und exogener Substanzen beteiligt. Der leberspezifische SLC Transporter OATP1B1, welcher u. a. die hepatozelluläre Aufnahme vieler Arzneistoffe vermittelt, war Gegenstand dieser Arbeit. Eine Inhibition des OATP1B1-vermittelten Transports durch konkurrierende Substrate oder das Vorliegen von Polymorphismen im Gen des Transportproteins können Arzneimittelinteraktionen oder Veränderungen der Pharmakokinetik von Arzneimitteln hervorrufen. Daher ist es bei der Entwicklung neuer Arzneimittel von Interesse, ob sie Substrat und/oder Inhibitor von OATP1B1 oder anderen Transportern sind. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Substanzen AC11 und AC98 sind Hybridmoleküle aus Artemisinin- und Cumarinderivaten mit fluoreszierenden Eigenschaften. Artemisininderivate werden zur Behandlung der Malaria eingesetzt und sind außerdem Gegenstand der Forschung zur Therapie anderer Erkrankungen (z. B. HCMV-Infektion oder Tumorerkrankungen). Fluoreszierende Stoffe werden zur Untersuchung von Transportproteinen verwendet, da durch Fluoreszenzphotometrie eine Bestimmung der transportierten Stoffmenge möglich ist und sie im Vergleich zur Flüssigkeitsszintillation ohne radioaktiv-markierte Substanzen auskommt. Zum jetzigen Zeitpunkt ist nicht bekannt, ob Artemisininderivate Substrate und/oder Inhibitoren von OATP1B1 sind. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit Aufnahme und Inhibitionsversuche zum OATP1B1-vermittelten Transport von AC11 und AC98 durchgeführt. Um diese Untersuchungen mit fluoreszenzphotometrischer Messung durchzuführen, wurde das bekannte fluoreszierende OATP1B1-Substrat Natriumfluorescein (NaFluo) als Kontrollsubstanz verwendet. 2. Material und Methoden Zur Untersuchung des OATP1B1-vermittelten Transports wurden Aufnahme- und Inhibitionsversuche mit bereits etablierten, stabil-transfizierten HEK293-Zellen, die eine Überexpression des OATP1B1-Proteins (HEK-OATP1B1) aufweisen, und einer Kontrollzelllinie (HEK-VK/418) durchgeführt. Dabei wurde die zelluläre Akkumulation des Substrats in beiden Zelllinien verglichen. Die Konzentrationsbestimmung der fluoreszierenden Substrate AC11, AC98 und NaFluo erfolgte fluoreszenzphotometrisch. Zur Untersuchung der Inhibition des OATP1B1-vermittelten Transports durch die Artemisininderivate wurde das radioaktiv-markierte Substrat [3H]Bromsulfophthalein verwendet. Zur Untersuchung der Inhibition des möglichen OATP1B1-vermittelten Transports der Artemisininderivate wurden die bekannten Inhibitoren Bromsulfophthalein (BSP) und Cyclosporin A (CsA) verwendet. Außerdem erfolgten Untersuchungen zur Temperaturabhängigkeit der zellulären Aufnahme bei 4 °C. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Die Aufnahme von NaFluo fiel in HEK-OATP1B1-Zellen um 280 % höher aus als in HEK-VK/418-Zellen (p &lt; 0,001). Die maximale Transportgeschwindigkeit (Vmax) des Netto-Transports betrug dabei 35,6 ± 3,7 pmol*mg-1*min-1 und der Km-Wert 9,8 ± 2,1 µM. Der OATP1B1-vermittelte Transport von NaFluo konnte durch BSP und Pravastatin mit IC50-Werten von 0,09 ± 0,09 bzw. 24,60 ± 0,06 µM inhibiert werden. Die Artemisininderivate AC11 und AC98 inhibierten den OATP1B1-vermittelten Transport von [3H]Bromsulfophthalein (p &lt; 0,001). Für diese Transportinhibition betrugen die IC50-Werte für AC11 und AC98 20,5 ± 0,2 bzw. 48,9 ± 0,4 µM. Die Bestimmung der für fluoreszenzphotometrische Messungen erforderlichen Emissionsmaxima ergab mit dem hier verwendeten Fluoreszenzphotometer nur für AC98 einen eindeutigen Wert von 470 nm. Die Aufnahme von AC98 fiel in HEK OATP1B1-Zellen bei verschiedenen Substratkonzentrationen um 13 % (p &lt; 0,05) bis 25 % (p &lt; 0,001) geringer aus als in HEK-VK/418-Zellen. Die zelluläre Akkumulation von AC98 in HEK-OATP1B1-Zellen konnte durch die Anwesenheit der Transportinhibitoren BSP und CsA um bis zu 27 % (p &lt; 0,05) bzw. 37 % (p &lt; 0,05) gesenkt werden. CsA inhibierte außerdem die Aufnahme von AC98 in HEK-VK/418-Zellen um bis zu 25 % (p &lt; 0,01). Die zelluläre Akkumulation von AC98 fiel bei einer Inkubationstemperatur von 4 °C gegenüber 37 °C in HEK-VK/418-Zellen um bis zu 40 % (p &lt; 0,001) und in HEK-OATP1B1-Zellen bis zu 18 % (p &lt; 0,01) geringer aus. 4. Schlussfolgerungen Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Eigenschaften von NaFluo als Substrat von OATP1B1 bestätigt und ähnliche, zu denen in der Literatur beschriebenen, kinetische Parameter ermittelt werden. Die Artemisininderivate AC11 und AC98 wurden als Inhibitoren des OATP1B1-vermittelten Transports identifiziert. Aufgrund des Fehlens eines eindeutigen Emissionsmaximums von AC11 mit dem hier verwendeten Fluoreszenzphotometer konnten nur für AC98 die Eigenschaften als mögliches Substrat von OATP1B1 untersucht werden. Aus Aufnahme- und Inhibitionsversuchen geht AC98 nicht als sicheres Substrat von OATP1B1 hervor, jedoch scheint ein bidirektionaler Transport möglich. Die zelluläre Aufnahme von AC98 in HEK293- Zellen erfolgt außerdem über andere, endogen exprimierte Transporter sowie durch transporterunabhängige Mechanismen. Ob AC98 tatsächlich ein Substrat von OATP1B1 ist und welche Transportproteine außerdem an der zellulären Aufnahme beteiligt sind, muss in weiteren Untersuchungen geklärt werden