title: Biochemische und strukturelle Charakterisierung der Regulation von Sirtuinen durch AROS und Kleinmoleküle
Creators: name: Weiß, Sandra
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2021
Subjects: subject: Sirtuin
subject: AROS
subject: Deacetylierung
subject: 500
subject: 570

description: Sirtuine sind eine evolutionär hoch konservierte Familie der Histon-Deacetylasen. Sie katalysieren die Deacylierung von Acyllysinresten in Substratproteinen durch einen einzigartigen Mechanismus, der NAD+ als Cosubstrat benötigt. Dies macht Sirtuine zu metabolischen Sensoren. Diese Enzyme regulieren Stressreaktionen und Alterungsprozesse. Da sie in altersbedingten und metabolischen Erkrankungen involviert sind, ist die Regulation von Sirtuinen von medizinischem Interesse und besitzt therapeutisches Potenzial. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur endogenen Regulation von Sirtuinen durch das Protein AROS und zur Sirtuinmodulation durch Kleinmoleküle gewonnen. Das Pflanzenflavonoid Quercetin hat im Gegensatz zur Sirt6-spezifischen Aktvierung eine inhibitorische Wirkung auf die anderen Sirtuinisoformen. Die molekularen Grundlagen der Quercetin-vermittelten Inhibition konnte mit Hilfe einer Kristallstruktur des Sirt2/Quercetin-Komplexes aufgeklärt werden. So inhibiert der Naturstoff die Sirtuinaktivität durch Bindung am Eingang des aktiven Zentrums und daraus resultierender Kompetition mit dem acylierten Substrat. In Sirt6 wird diese Bindungsstelle durch den N-Terminus des Proteins besetzt. Die Sirt2-Quercetinbindungsstelle ist in Sirt6 nicht zugänglich. Quercetin bindet stattdessen in einer Sirt6-spezifischen Bindungstasche. Die Sirt2/Quercetin-Struktur trägt dazu bei, den Sirt6-spezifische Aktivierungseffekt von Quercetin zu erklären und liefert somit Informationen zur Weiterentwicklung von Sirt6-spezifischen, potenten Modulatoren. Die Erkenntnisse der Quercetin-Bindung in Sirt2 könnten zudem zur Entwicklung neuer Quercetin-basierender Inhibitoren beitragen. Neben der Regulation von Sirt6 und Sirt2 steht auch die Aktivierung von Sirt3 im Fokus. Als einziges Sirtuin mit robuster Deacetylaseaktivität im Mitochondrium gilt es als vielversprechendes Ziel zur pharmakologischen Modulation durch Aktivatoren. Aufgrund des Mangels an Sirt3-Aktivatoren wurde durch kristallografisches Screening einer Fragment-Bibliothek nach neuen Modulatoren für Sirt3 gesucht. Auf diese Weise konnten zwei neue Liganden sowie drei bisher unbekannte Liganden-Bindungsstellen für Sirt3 gefunden werden. Aufbauend auf diesen Fragmentgerüsten könnten Kleinmoleküle entwickelt werden, die Potential zur Modulation der Sirt3-Aktivität besitzen. Das Protein AROS wurde zunächst als bisher einziger endogener Aktivator von Sirt1 beschrieben. Dem widersprechend wurde von anderen Autoren eine inhibierende Wirkung von AROS auf die Sirt1-Deacetylaseaktivität festgestellt. Das Verständnis des Regulationsmechanismus von Sirt1 durch AROS könnte zur Entwicklung pharmakologischer Modulatoren beitragen. In dieser Arbeit konnte das Protein AROS zum ersten Mal charakterisiert werden. AROS akkumuliert exprimiert in E. coli in Einschlusskörpern. Daher wurde ein Renaturierungsprotokoll etabliert, welches in löslichem, reinem Protein resultierte. AROS konnte als ein flexibles Protein ohne stabile Tertiärstruktur aber mit Sekundärstrukturelementen wie α Helices charakterisiert werden. Zudem scheint das Protein unter stabilisierenden Bedingungen eine deutlich strukturiertere Konformation einzunehmen. Der Sirt1/AROS-Komplex musste zunächst durch Optimierung des Puffersystems stabilisiert werden. Anschließende Aktivitätstest von Sirt1 und AROS resultierten in einer Inhibition der Sirt1-Deacetylaseaktivität. Für die Isoformen 2,3 und 5 konnte ebenso eine AROS-vermittelte Inhibition gezeigt werden. Diese ist im Vergleich zu Sirt1 jedoch geringer. Als Interaktionsbereich im Sirtuin konnte der generische, katalytische Sirtuinkern identifiziert werden. Zudem lässt sich die höhere inhibitorische Wirkung von AROS auf Sirt1 durch zusätzliche Interaktionen mit der regulatorischen, N-terminalen Domäne von Sirt1 erklären. Für AROS konnte gezeigt werden, dass der mittlere Bereich des Proteins für die Inhibition verantwortlich ist. N- und C-terminale Abschnitte in AROS scheinen die Affinität zum Sirtuin durch zusätzliche Bindungsstellen zu erhöhen bzw. wichtige Bereiche für die Inhibition zu stabilisieren. Titrationen der beiden Sirt1-Substrate resultierten in einer Verringerung der Affinität des acetylierten Peptid-Substrates in Anwesenheit von AROS und liesen daher auf einen Inhibitons-Mechanismus, der auf Kompetiton mit dem acetylierten Peptid-Substrat beruht, schließen. Eine Kristallstruktur von Sirt3 konnte in Komplex mit einem AROS-Peptid gelöst werden. Im aktiven Zentrum des Sirtuins in der Bindungsstelle des acetylierten Lysins befindet sich das Lysin 65 von AROS, was den Kompetitionsmechanismus bestätigt. Unter Verwendung der strukturellen und mechanistischen Daten wurde ein Modell für den Sirt1/AROS-Komplex postuliert, in dem AROS die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes durch Interaktion mit dem N-Terminus und der katalytischen Domäne von Sirt1 verhindert.