title: In vitro quantification and strain differentiation of heat resistant α-Synuclein seeds associated with Parkinson’s disease
Creators: name: Pinder, Phillip Mario
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: Parkinson-Krankheit
subject: Alpha-Synuklein
subject: Keimungsaktivität
subject: Dampfsterilisation
subject: Prion
subject: Stammdifferenzierung
subject: RT-QuIC
subject: FT-IR
subject: Parkinson’s disease
subject: Alpha-Synuclein
subject: Seeds
subject: Seeding activity
subject: Steam sterilization
subject: Prion
subject: Strain differentiation
subject: RT-QuIC
subject: FT-IR
subject: 570 Biologie

description: Die Parkinson-Krankheit (PA) ist durch Fehlfaltung und Aggregation von Alpha-Synuklein (a-Syn) charakterisiert. Dieses zeigt Ähnlichkeiten mit dem Verhalten von Prionen bei transmissiblen spongiformen Enzephalopathien. Pathologische a-Syn Aggregate propagieren, wie Prione, über selbsttempliertes Seeding (Keimung). Aufgrund von Studien, die eine Übertragbarkeit der a-Syn Seeding-Aktivität nachgewiesen haben, war das Ziel dieser Dissertation die Risikobewertung potenzieller Übertragungen von a-Syn Seeds zu verbessern. Die Menge an Seeding-aktiven a-Syn in Hirn- und Magengewebe von PA-Patienten wurde durch Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) Assays quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten in beiden Geweben hohe Seeding-Titer, was die Notwendigkeit für effektive Inaktivierungsprotokolle unterstreicht. Die Quantifizierung des Effekts der Dampfsterilisation bei 134 °C ergab eine unerwartet hohe, Prion-übersteigende, Resistenz von PA-assoziiertem a-Syn gegen Dampfsterilisation. Die Verlängerung der Sterilisationsdauer führte zu einem identischen Reduktionsfaktor des Seeding-Titers. Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR) Spektroskopie wurde genutzt, um eine Stammdifferenzierung zwischen a-Syn Aggregaten aus PA-assoziierten transgenen Mausmodellen mit den a-Syn-Mutationen A30P und A53T vorzunehmen, die für familiäre PA beim Menschen prädisponieren. Etablierte Protokolle zur Untersuchung von Prionstämmen (PS) wurden verfeinert um 5 hamsteradaptierte PS zu vergleichen: 263K, 22A-H, BSE-H, CWD-H, und ME7-H. Hier führte die Zugabe des Farbstoffs Kongo Rot zu spektralen Veränderungen in einigen PS und resultierte in der erfolgreichen Unterscheidung aller untersuchten PS. Mittels PMCA wurden die winzigen Mengen an a-Syn Aggregaten aus Maus-Hirngeweben für die anschließende FT-IR Spektroskopie vervielfältigt. Die Spektren der A30P und A53T a-Syn Aggregate wiesen allerdings keine Unterschiede auf, und der Zusatz von Kongo Rot hatte keinen Effekt auf die Spektren.
description: Parkinson’s Disease (PD) is characterized by misfolding and aggregation of Alpha-Synuclein (a-Syn), which shows similarities to the behavior of prions in transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). Pathological a-Syn aggregates, like prions, propagate by self-templated seeding. Due to reports of transmissible seeding activity of a-Syn, the goal of this thesis was to improve risk assessment of potential a-Syn seed transmissions. Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) assays were used to quantify seeding active a-Syn in brain and stomach tissue of PD patients. The results show high seeding titers in both tissues, highlighting the need for effective inactivation protocols. Quantification of the effects of steam sterilization at 134 °C on the seeding activity of cerebral PD-associated a-Syn revealed a surprisingly high, prion-exceeding, resistance to steam sterilization. Extended duration of steam sterilization has no further inactivation effect and led to an identical reduction factor of the seeding activity titer. Fourier-Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy was used to attempt strain differentiation between a-Syn aggregates from PD-associated transgenic mouse models with the a-Syn A30P and A53T mutations which predispose for familial forms of PD in humans. Established protocols for prion strain examination were refined to compare five hamster-adapted prion strains: 263K, 22A-H, BSE-H, CWD-H, and ME7-H. Here, the addition of a dye (Congo Red) led to spectral changes of some prion strains and resulted in the successful distinction of all investigated prion strains. To increase the tiny amounts of a-Syn aggregates in the brain tissues of mice, PMCA was used to multiply these aggregates for subsequent FT-IR spectroscopy. However, the spectra of the A30P and A53T a-Syn aggregates were undistinguishable, and the addition of CR had no significant effect on the spectra.