title: X-ray Crystallography of Proteins with Fragments: Experimental Active Site Mapping as a Starting Point in Fragment-based Lead Discovery and 3D-Structure Determination via SAD-Phasing
title: Kristallstrukturen mit kleinen Sondenmolekülen: Ausleuchten von Bindetaschen, Startpunkt für ein Fragment-basiertes Wirkstoffdesign und Erhalten von Phaseninformationen zur Strukturlösung
Creators: name: Behnen, Jürgen
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Naturwissenschaften
X-ray crystallography
FBLD
Xenon
IspD
Proteinkristallographie
SAD-Phasing
Fragmentbasierte Leitstrukturentwicklung

description: This thesis addresses a variety of
      different approaches in which structure based drug design
      plays an important role. Starting with de novo structure
      determination of macromolecules, followed by fragment
      screening via X-ray crystallography and finally the structure
      based lead discovery against malaria and tuberculosis. The
      emphasis of this thesis was to find small, soluble molecules
      which mark not only the position of functional groups but
      also the putative scaffold position, i.e. an aromatic ring
      system, to create a protein-based pharmacophore. Furthermore,
      the active sites mapped by this experimental approach can be
      used as a reference to develop and validate in silico methods
      to calculate hotspots of binding, such as implemented in the
      program DrugScore. In this study a selection of different
      small and highly soluble molecules with a molecular weight of
      67 – 297 g/mol were either soaked or co-crystallized in
      varied concentrations into crystals of different protein
      targets and subsequently screened by X-ray crystallography.
      Complexes of TLN, PKA, DXI and IspD with phenol, aniline,
      urea, N-methylurea and 1,2-propanediol could be determined.
      Furthermore, it could be evidenced that the positions of the
      functional groups and ring systems of these molecules were
      well in agreement with most in silico hotspot predictions
      calculated by the program DrugScore. The relevance of the
      observed probe molecule poses for drug binding could be
      confirmed by superimposing much larger ligands for which
      complex crystal structures have been determined. It was
      possible to match not only the position of the functional
      groups by the found molecular probes but also parts of the
      scaffold of the larger ligands. The fact that small molecular
      probes can still be discovered as kind of original seeds from
      which an entire inhibitor can be grown, opens a very
      promising and prospective option using the binding of such
      small probes as a starting point of a fragment-like de novo
      design. Furthermore, molecular probes such as phenol,
      aniline, urea, N-methylurea and 1,2-propanediol seemed to be
      suitable to be applied rather general to many proteins to
      perform an experimental binding site mapping. Particularly,
      if they are used in parallel and are further supported by
      computer tools such as DrugScore to fully map the binding
      pocket for a subsequent inhibitor design. In collaboration
      with the group of Prof. Joel L. Sussman in Rehovot, Israel it
      was possible to incorporate xenon under pressure into
      crystals of TLN and TcAChE and perform successfully phase
      determinations via SAD, with in-house data. In addition,
      further enzymes as EP, TGT and Sap2 were also derivatize with
      xenon. Unfortunately, only the 3D-structure of EP could be
      determined additionally to TLN and TcAChE by the SAD method
      with in-house data. Nevertheless, with the help of TLN, EP
      and TcAChE as model systems it could be demonstrated on one
      hand that single (TLN &amp; EP) or double (TcAChE) bound
      xenon atom is sufficient to produce interpretable density
      maps, using various programs and program combinations for
      processing, scaling, phasing and model building and on the
      other that xenon SAD phasing, using data collected on a home
      source, may provide an effective, efficient and low-cost
      alternative to MAD phasing at synchrotron sources. The last
      topic of this thesis was to discover a new lead structure
      against malaria and tuberculosis by inhibiting IspD, an
      enzyme of the non-mevalonat pathway. On the basis of the
      X-ray structure of IspD in complex with 1,2-propanediol it
      was attempt to create a new lead by linking this core
      fragment with an other substrate analogous fragment.
      Therefore a thermofluoro assay and X-ray crystallography was
      used for screening purposes. Even the 3D-structure of IspD
      was known new crystallographic conditions needed to be found,
      which allow exhaustingly screening via soaking. In the
      development of new reproducible crystallization conditions
      and by performing the thermofluoro assay a high amount of
      soluble protein was required. Therefore the existing
      purification protocol was been amended and the yield rate
      could be enhanced from 134 mg up to 203 mg soluble protein
      out of 4 l bacteria culture. By finding new crystallization
      terms over 1000 different conditions have been tested.
      Finally, the diffraction pattern of IspD crystals could be
      improved from a starting resolution of 4 Å up to 2.34 Å using
      an in house X-ray source. Although six different fragments
      were found in the thermofluoro assay, but up to now it was
      not possible to detect one of these potential fragments in
      the binding site of IspD. Nevertheless, it was possible to
      deposit the crystal structure of IspD in complex with
      1,2-propanediol in the PDB. This crystal structure is the
      first non substrate analogous complex structure of IspD in
      the PBD.
description: Im Zuge dieser Doktorarbeit wurden
      unterschiedliche Bereiche behandelt, in denen die
      Proteinkristallographie wichtige Beiträge liefert. Angefangen
      bei der de novo Strukturaufklärung von Makromolekülen über
      Fragmentscreening mittels Röntgenstrukturanalyse bis hin zur
      strukturbasierten Entwicklung neuer Leitstrukturen im Kampf
      gegen Malaria und Tuberkulose. Der Schwerpunkt dieser Arbeit
      befasste sich mit der Suche nach Sondenmolekülen, die sich
      eignen, um Bindetaschen verschiedne Proteinsysteme
      experimentell über Röntgenstrukturanalyse auszuleuchten.
      Diese experimentell charakterisierten Bindungsstellen in
      Proteinbindetaschen werden auch als HotSpots bezeichnet. Sie
      stellen die Grundlage dar, um einen proteinbasierten
      Pharmakophore abzuleiten. Über Soaking und Co-Kristallisation
      wurde versucht, sehr kleine, hydrophile Moleküle in die
      Bindetasche der Zielproteine hinein diffundieren zu lassen.
      Bis zum heutigen Zeitpunkt sind 25 Fragmente und Gase
      unterschiedlicher Größe und Eigenschaften an dem
      Proteinsystem TLN mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse vorab
      durchgemustert worden. Es konnten das Bindungsverhalten von
      Anilin, 3-Bromphenol, 2-Bromessigsäure, 1,2-Propandiol,
      Harnstoff, N-Methylharnstoff und N2O im aktiven Zentrum von
      TLN charakterisiert werden. Diese an TLN erfolgreich
      etablierten Sondenmoleküle wurden auf andere Proteinsysteme
      übertragen. Im aktiven Zentrum von PKA konnten jeweils zwei
      Moleküle Phenol und N-Methylharnstoff sowie in der
      Bindetasche von DXI und IspD jeweils ein
      1,2-Propandiolmolekül charakterisiert werden. Diese
      experimentell ermittelten HotSpots wurden im Anschluss mit
      theoretisch berechneten HotSpots unter Verwendung des
      Programms DrugScoreHotSpot verglichen. Es konnte in diesem
      Ansatz gezeigt werden, dass die theoretisch berechneten
      Vorhersagen von HotSpots in Proteinbindetaschen gut mit den
      experimentell gewonnenen Erkenntnissen übereinstimmten.
      Dadurch stellt die Kombination beider Ansätze eine
      hervorragende Möglichkeit dar, proteinbasierte Pharmakophore
      zu erstellen und mit Hilfe dieser neue Arzneistoffe zu
      entwickeln. In Kooperation mit dem Arbeitskreis von Prof.
      Joel L. Sussman in Rehovot, Israel, gelang es, durch
      Inkorporation von Xenon in Proteinkristallen von Thermolysin
      und TcAcetylcholinesterase die 3D-Struktur der jeweiligen
      Xenonproteinkomplexe über SAD (Single Anomalous Dispersion)
      an einer hauseigenen Röntgenquelle zu bestimmen. Zusätzlich
      wurden auch noch die Enzyme Endothiapepsin, TGT und Sap2 mit
      Xenon derivatisiert. Allerdings war es dabei nur möglich, die
      Struktur von Endothiapepsin über SAD mit in house gesammelten
      Daten zu bestimmten. Nichts desto trotz konnte an Hand der
      Modellsystemen Thermolysin, TcAcetylcholinesterase und
      Endothiapepsin gezeigt werden, daß die Strukturbestimmung von
      Proteinen unterschiedlicher Enzymklassen, Größe und Symmetrie
      mit Hilfe des Edelgases Xenon als Schweratomderivat durch die
      SAD-Methode anhand von in house gesammelten Daten eine
      einfache, toxikologisch unbedenkliche und leicht
      durchzuführende Alternative zu herkömmlichen Methoden, wie
      z.B. Quecksilber- oder Selenmethioninderivaten, darstellt.
      Als drittes und letztes Thema der Arbeit wurde am Beispiel
      des Enzyms
      4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-4-phosphat-synthase
      (IspD) versucht, eine neue Leitstruktur gegen Malaria und
      Tuberkulose zu entwickeln. Basis war hier eine
      Kristallstruktur mit dem Fragment 1,2-Propandiol in der
      Bindetasche. Über einen Thermofluoro-Assay und mit Hilfe der
      Röntgenstrukturanalyse wurde versucht, ein zum Cytidin
      basenanaloges Molekül zu finden, welches in die Basentasche
      von IspD binden sollte. Das Ziel dabei war es, beide
      Fragmente passend miteinander zu verbinden, um so eine neue
      hochpotente Leitstruktur gegen Malaria und Tuberkulose zu
      erhalten. Obwohl die Apo-Struktur von IspD bekannt ist, war
      es nötig neue, reproduzierbaren und für
      Diffraktionsexperimente tauglichen IspD-Kristallen zu finden.
      Hierfür wurden weit mehr als 1000 verschieden
      Kristallisationsbedingungen getestet. In einer Feinabstimmung
      der anfänglich gefunden Bedingungen ließen sich
      reproduzierbare und ausreichend streuende Kristalle erhalten.
      Das Streuverhalten von in house vermessenen IspD-Kristallen
      konnte von einer anfänglichen Auflösung von 4,0 Å bis hin zu
      2,34 Å verbessert werden. Zusätzlich wurde das bestehende
      Expressions- und Reinigungsprotokoll bezüglich der Ausbeute
      an IspD weiter verbessert. Die Ausbeute an IspD konnte von
      135 mg auf 208 mg IspD pro 4 l Ansatz gesteigert werden.
      Durch einen Thermofluoro-Assay wurden bisher 24 entweder
      gekaufte oder auch hauseigene Substanzen durchgemustert, um
      eine Vorauswahl an Fragmenten für die Röntgenstrukturanalyse
      zu finden. Bei diesen Messungen kristallisierten sich die 6
      Liganden mit einer Schmelzpunktverschiebung von 2° – 7,5° C
      als sehr vielversprechend heraus. Es ist außerdem gelungen
      die erste substratunabhängige IspD-Komplexstruktur in der PDB
      zu deponieren.