Analyse der Restriktion des Humanen Endogenen Retrovirus-K(HML-2) durch das Protein IFI-16
Creators: name: Friedrich, Josephine
Publisher: name: Robert Koch-Institut
Year: 2021
Subjects: subject: 610 Medizin und Gesundheit

description: Ein Immunsensor für intrazelluläre DNA und viraler Restriktionsfaktor ist das IFI16-Protein. Zu Beginn dieser Arbeit erfolgte der Nachweis der 13-fachen Hemmung der Viruspartikelproduktion von HERV-K(HML-2) durch IFI16. Verwendet wurde dabei der Molekularklon eines rekonstruierten HERV-K113-Provirus, welcher ein vollständiges Provirus-Genom mit offenem Leserahmen für alle viralen Gene und intakte LTR-Sequenzen besitzt. Als Indikator für die virale Partikelproduktion diente die Aktivität der Reversen Transkriptase, die mithilfe des PERT-Assays bestimmt werden konnte. Der Austausch der U3-Region der 5‘LTR mit einem CMV-Promotor resultierte in Außerkraftsetzen der Restriktion. Aufgrund dieser Tatsache wurden im Laufe dieser Arbeit verschiedene Konstrukte generiert, die ermöglichten, die Rolle der LTRs bei der Hemmung von HERV-K113 durch IFI16 zu analysieren. Zu Beginn erfolgte hierfür das Klonieren diverser Luciferase-Konstrukte, die sowohl die Möglichkeit boten, den Effekt von IFI16 auf die alleinstehende 5’LTR und 3’LTR als auch die vollständige LTR von HERV-K113 zu untersuchen. Die Verwendung dieser Luciferase-Konstrukte resultierte jedoch nicht in der Beantwortung der Frage nach der Rolle der LTRs bei der Hemmung von HERV-K113, da keine signifikanten Unterschiede zwischen der entsprechenden Kontrolle und dem IFI16-Expressionsplamid detektiert werden konnten und des Weiteren IFI16 in einigen Zelllinien trotz hoher Transfektionsrate nicht erfolgreich exprimiert wurde. Daher wurden zur Identifikation des funktionellen Bereichs des viralen Genoms, an dem IFI16 seine hemmende Wirkung entfaltet, ergänzende HERV-K(HML-2)-Konstrukte kloniert, die ermöglichen, sukzessiv den Bereich der 5‘ LTR oder der 3’LTR einzugrenzen. Die gewonnenen Daten stützen die Annahme, dass für die Restriktion von HERV-K113 die LTR eine essenzielle Rolle spielt, waren jedoch nicht in der Lage, den dabei funktionellen Bereich des Genoms näher einzugrenzen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Masterarbeit humane Zelllinien bezüglich ihrer Transfektionseffizienz und hinsichtlich ihrer Volllängen- oder Teil-IFI16-Expression untersucht. Hierbei sind besonders die überzeugenden Daten der Hek293-T und HeLa-Zellen zu erwähnen. Zudem wurde nachgewiesen, dass der Bereich des IFI16-Proteins, welcher lediglich die Pyrindomäne plus Linkerbereich umfasst, zur HERV-K(HML-2) Hemmung ausreicht. Dieser Bereich wurde abschließend in einen bicistronischen lentiviralen Vektor kloniert, damit Reporterviren generiert und die Transduktionseffizienz verschiedener humanen Zelllinien bestimmt.
description: An immune sensor for intracellular DNA and viral restriction factor is the interferon-inducible protein 16 (IFI16). At the beginning of this work, the 13-fold inhibition of the viral particle production of HERV-K(HML-2) by IFI16 was demonstrated using the molecular clone of a reconstituted HERV-K113 provirus, which has a complete provirus genome with open reading frame for all viral genes and intact LTR sequences. Within this master thesis, the activity of reverse transcriptase served as an indicator of viral particle production, which could be determined by using a PERT assay. The exchange of the U3-region of the 5’LTR with a CMV-promoter resulted in the annulment of the restriction. Based on this fact, different constructs were generated during this thesis, which made it possible to analyze the role of the LTR in the inhibition of HERV-K113 by IFI16. Initially, this was done by cloning various luciferase constructs that offered the possibility to study the effect of IFI16 on the stand-alone 5'LTR and 3'LTR as well as on the complete LTR of HERV-K113. However, the use of these luciferase constructs did not result in answering the question of the role of the LTRs in inhibiting HERV-K113, as no significant differences could be detected between the corresponding control and the IFI16 expression plasmid and, further, IFI16 was not successfully expressed in some cell lines despite a high transfection rate. Therefore, to identify the functional region of the viral genome at which IFI16 displays its inhibitory effect, complementary HERV-K(HML-2)-constructs were cloned that allowed successively narrowing down the region of the 5' LTR or the 3'LTR. The obtained data verified the assumption that for the restriction of HERV-K113 by IFI16 the LTR plays an essential role but was not able to further identify the functional region of the genome in more detail. In addition, human cell lines were analyzed in this master thesis regarding their transfection efficiency and their full-length or partial IFI16 expression. Here, the convincing data of Hek293T and HeLa cells are particularly worth mentioning. In addition, the region of IFI16 protein containing only the pyrin domain plus linker region was shown to be sufficient for HERV-K(HML-2) inhibition. This region was finally cloned into a bicistronic lentiviral vector to generate reporter viruses and to determine the transduction efficiency of various human cell lines.