title: ABCA transporters and associated genes in lipid metabolism
Creators: name: Sigrüner, Alexander
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2007
Subjects: subject: ABC-Transporter , Lipidstoffwechsel , ABCA1 , AOX1 , ABCA7 , ABCA1 , AOX1 , ABCA7
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: The ATP-binding cassette transporters A1 (ABCA1) and A7 (ABCA7) are inversely regulated under loading and deloading conditions and we were interested in protein/protein interactions of these transporters. The main topic was to identify, verify and characterize these interactions. In case of ABCA7, the yeast two-hybrid approach led to false positive results, and therefore we focused on the expression and regulation of the two published isoforms. Albeit having similar tissue distribution, the two isoforms show different regulation by stimulation, indicating the use of alternative promoters. This caused us to analyze the promoter of the long isoform in more detail and we were able to map the core promoter region. Analyzes of the putative alternative promoter might enable us to understand the regulatory differences between both isoforms. Due to our initial experiments and data from the literature, we would suggest different functions for the two isoforms of ABCA7. Isoform I localizes to the plasma membrane and is upregulated during monocyte to macrophage differentiation, indicating involvment in phagocytic processes. In contrast, isoform II localizes to intracellular membranes and is upregulated together with phosphatase and tensin homolog in HL-60 cells and during terminal keratinocyte differentiation, pointing to a function in the autophagic pathway. Further experiments are necessary to confirm this hypothesis. ABCA1 regulates plasma high-density lipoprotein levels and its cellular function is mediated through various protein interactions. One aim was to identify and confirm new ABCA1 C-terminus interacting PDZ proteins. By different methods seven new PDZ candidates were identified, and four of them, namely GAIP C-terminus-interacting protein1 (GIPC1), Tax1 (human T-cell leukemia virus type I) binding protein 3 (TAX1BP3), Scribble, and Membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 3 (MAGI3) were confirmed to bind to ABCA1 by different methods. Together with the known ABCA1 interacting PDZ proteins and their different tissue expression this may indicate that PDZ proteins are able to regulate ABCA1 trafficking and/or function in a tissue or even cell compartment specific manner. The cytosolic molybdo-flavoenzyme aldehyde oxidase 1 (AOX1), known as xenobiotic metabolizing enzyme, was previously suggested as an ABCA1 interacting protein. In this work it was shown that knock-down of AOX1 by siRNA significantly reduced ABCA1-dependent lipid-efflux and enhanced phagocytic uptake in HepG2 cells. ABCA1 and AOX1 were found coexpressed in certain human cell types, namely hepatocytes, kidney proximal tubular epithelial cells, Leydig cells and cells of the adrenal cortex. Deregulation of ABCA1 and AOX1 in hepatocellular- and renal cell-carcinomas was observed, suggesting that AOX1, perhaps in context with ABCA1, might be used as tumor marker. The involvement of AOX1 in metabolism of ethanol and xenobiotics is of particular interest, as it might link ABCA1 to detoxification, a process in which many ABC-transporters are involved. Finally, as ABCA1 through its interaction with Fas-associated via death domain (FADD) might influence apoptosis, we searched for apoptotic genes regulated by modified lipoproteins in a similar manner as ABCA1. Uptake of modified lipoproteins by macrophages causes foam cell formation and promotes the development of atherosclerotic lesions. Atherogenic lipoproteins exert cytotoxic effects and induce necrosis or apoptosis under certain conditions but may also enhance macrophage survival. GeneChip experiments were performed to identify genes that are regulated in macrophages treated with enzymatically modified low-density lipoprotein (E-LDL). Expression of TOSO, protecting cells against CD95- or tumor necrosis factor-mediated apoptosis, was found induced by E-LDL. Concomitantly, reduced apoptosis was detected in E-LDL loaded macrophages compared to oxidized LDL incubated cells or controls. Abundance of the caspase inhibitor FLICE-like inhibitory protein long form (FLIPL) was suggested to mediate the antiapoptotic properties of TOSO; however, FLIPL expression is induced neither in E-LDL laden macrophages nor in COS-7 cells overexpressing TOSO. E-LDL represents coreless liposome like particles and may be taken up by Fc- and complement-receptor dependent phagocytosis. Internalization of phagobeads by monocytes and macrophages upregulates TOSO but phagocytosis was not altered by TOSO in COS-7 cells. These data indicate that E-LDL-generated foam cells are protected from cell death most likely through the expression of TOSO by a mechanism independent of FLIPL. ABCA1 and ABCA7 may be related but exert distinct functions in the lipid-efflux/apoptosis/autophagy complex. While the function of ABCA1 is highly modulated by protein interactions, ABCA7 might be more affected by transcriptional regulation.
description: Die ABC Transporter A1 (ABCA1) und A7 (ABCA7) werden durch Be- und Entladung entgegengesetzt reguliert und unser Interesse galt ihren Protein/Protein Interaktionen. Im Fokus meiner Dissertation war die Identifikation, Bestätigung und Charakterisierung dieser Interaktionen. Im Falle von ABCA7 führte der Hefe Two-Hybrid Ansatz zu falsch positiven Ergebnissen die nicht weiter verfolgt wurden. Deshalb konzentrierte ich mich auf die Expression und Regulation der zwei publizierten ABCA7 Isoformen. Obwohl diese eine ähnliche Gewebsexpression aufweisen, reagieren sie unterschiedlich auf Stimulationen, was ein Hinweis auf alternative Promotoren ist. Daher habe ich den Promotor der langen Isoform genauer untersucht und die Kernregion des Promotors identifiziert. Die genauere Analyse des putativ alternativen Promotors könnte es ermöglichen die regulatorischen Unterschiede zwischen den beiden Isoformen zu verstehen. Ergebnissen erster Experimente zu Folge und anhand von Daten aus der Literatur können abweichende Funktionen für die beiden Isoformen von ABCA7 angenommen werden. Isoform I scheint an phagozytären Prozessen beteiligt zu sein, während Isoform II eine Rolle in der Autophagie spielen könnte. Weitere Versuche sind notwendig um diese Hypothese zu bestätigen. ABCA1 reguliert den HDL-Spiegel im Plasma und seine zelluläre Funktion wird durch Proteininteraktionen vermittelt. Ein Ziel der Arbeit war die Identifizierung und Bestätigung neuer PDZ Proteine, die an den ABCA1 C-Terminus binden. Über verschiedene Methoden wurden sieben Kandidaten gefunden. Die Interaktion von ABCA1 mit GIPC1, TAX1BP3, Scribble, und MAGI3 konnten auf unterschiedlichen Wegen bestätigt werden. Aufgrund der unterschiedlichen Gewebsexpression ABCA1 bindender PDZ Proteinen könnte man annehmen, dass PDZ Proteine den Transport bzw. die Funktion von ABCA1 in einer Gewebe- oder Zellkompartiment-spezifischen Weise regulieren. Das für seinen Xenobiotoka Umsatz bekannte Molybdo-Flavoenzym Aldehyd Oxidase 1 (AOX1) wurde bereits als möglicher ABCA1 Interaktionspartner beschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die siRNA vermittelte Verminderung von AOX1 zu einer signifikanten Reduktion des ABCA1-abhängigen Lipid-Efflux und zu einer erhöhten phagozytischen Aufnahme in HepG2 Zellen führt. ABCA1 und AOX1 wurden in bestimmten menschlichen Zelltypen, im einzelnen Hepatozyten, proximalen Tubulusepithelzellen der Niere, Leydig Zellen und Zellen der Nebennierenrinde, koexprimiert gefunden. Die in Leber- und Nieren-Karzinomen beobachtete Deregulierung von ABCA1 und AOX1 weist AOX1, eventuell im Zusammenspiel mit ABCA1, eine Rolle als mögliches Tumorkennzeichen zu. Die Einbindung von AOX1 in den Metabolismus von Ethanol und Xenobiotika ist besonders Interessant, da sie eine mögliche Verbindung zwischen ABCA1 und der Entgiftung darstellt, ein Prozess an dem viele ABC Transporter beteiligt sind. Da ABCA1 durch seine Bindung an FADD Einfluss auf die Apoptose nehmen könnte, haben wir als letzten Punkt nach Apoptose-beteiligten Genen gesucht, die durch modifizierte Lipoproteine in ähnlicher Weise wie ABCA1 reguliert werden. Die Aufnahme dieser Lipoproteine durch Makrophagen führt zur Schaumzellbildung und fördert die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen. Atherogene Lipoproteine üben zytotoxische Effekte aus und können zu Nekrose und Apoptose führen, könnten aber auch die Überlebensrate von Makrophagen erhöhen. Mittels GeneChip Versuchen wurden Makrophagen-Gene identifiziert, die durch enzymatisch modifiziertes LDL (E-LDL) reguliert werden. Die Expression von TOSO, das Zellen vor CD95- oder TNF-vermittelter Apoptose schützt, wurde durch E-LDL erhöht. Damit einhergehend wurde, im Vergleich zu mit oxidiertem LDL beladenen Zellen oder Kontrollen, erniedrigte Apoptose in E-LDL beladenen Makrophagen beobachtet. Es wurde angenommen, dass die Menge des Caspase Inhibitors FLIPL die antiapoptotische Wirkung von TOSO vermittelt, aber die Expression von FLIPL war weder in E-LDL beladenen Makrophagen, noch in TOSO überexprimierenden COS-7 Zellen erhöht. Bei E-LDL handelt es sich um kernlose, Liposomen-artige Partikel die über Fc- und Komplement-Rezeptor abhängige Phagozytose aufgenommen werden könnten. Die Aufnahmen von Phagobeads durch Monozyten und Makrophagen führt zu einer Hochregulation von TOSO, aber die Phagozytose von COS-7 Zellen wurde durch TOSO nicht verändert. Diese Daten deuten an, dass E-LDL generierte Schaumzellen vermutlich durch TOSO über einen FLIPL unabhängigen Mechanismus vor Zelltod geschützt sind. ABCA1 und ABCA7 sind verwandt, haben aber verschiedene Funktionen im Lipid-Efflux/Apoptose/Autophagie-Komplex. Während die Funktion von ABCA1 stark durch Proteininteraktionen moduliert wird, könnte ABCA7 mehr auf transkriptioneller Ebene reguliert werden.