Μελέτη του ρόλου της καταλάσης στις ρίζες ψυχανθών, κατά τον αποικισμό με συμβιωτικά βακτήρια και σε συνθήκες καταπόνησης:
Creators: name: Αναγνωστόπουλος, Νικόλαος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: Αντιοξειδωτικά γονίδια
Καταλάση
Φυμάτια
Antioxidant genes
Catalase
Root nodules

description: Στην εγκαθίδρυση της συμβιωτικής αζωτοδέσμευσης, μεταξύ φυτού-βακτηρίου, σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι ενεργές μορφές οξυγόνου (ROS). Ο έλεγχος των επιπέδων των ROS στα κύτταρα των ριζικών τριχιδίων γίνεται από διάφορα αντιοξειδωτικά ένζυμα και μόρια τόσο του φυτού όσο και του βακτηρίου, μεταξύ των οποίων ιδιαίτερο ρόλο παίζει η καταλάση. Ενώ ο ρόλος της βακτηριακής καταλάσης έχει μελετηθεί εκτεταμένα, δεν συμβαίνει το ίδιο για την καταλάση του φυτού. Σκοπός της παρούσης διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου της καταλάσης του φυτού-μοντέλου των ψυχανθών Medicago truncatula, στην εγκαθίδρυση της συμβιωτικής σχέσης με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Sinorhizobium meliloti. Για το σκοπό αυτό έγινε σίγηση του γονιδίου Cat1 της M.truncatula με την εφαρμογή τεχνικών παρεμβατικού RNA, και μελέτη της επίδρασης της σίγησης στην αποίκηση των γενετικά τροποποιημένων ριζών με το αζωτοδεσμευτικό βακτήριο S. meliloti, τόσο σε κανονικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης. Για τη διεξαγωγή του πειράματος αρχικά πολλαπλασιάστηκε με PCR τμήμα αλληλουχίας του cDNΑ της καταλάσης Cat1 της M. truncatula. Στη συνέχεια έγινε εισαγωγή της αλληλουχίας τόσο με κωδικό όσο και με αντικωδικό προσανατολισμό και σχηματισμός κασσέτας έκφρασης στον ενδιάμεσο φορέα pHANNIBAL, ώστε η έκφραση του ενσωματωμένου τμήματος να οδηγήσει στην παραγωγή δίκλωνου RNA. Η κασσέτα κλωνοποιήθηκε στον δυαδικό φορέα pART27, με αποτέλεσμα την κατασκευή φορέα έκφρασης, με τον οποίον πραγματοποιήθηκε μεταμόρφωση βακτηρίων Agrobacterium rhizogenes και γενετική τροποποίηση φυτικών κυττάρων. Η μεταμόρφωση των φυτών έγινε με εμβάπτιση ριζών σε εναιώρημα τροποποιημένων βακτηρίων Agrobacterium rhizogenes ώστε να είναι παροδική και περιορισμένη στη ρίζα. Έγιναν μετρήσεις της δραστικότητας της καταλάσης σε γενετικά τροποποιημένα φυτά και φυτά-μάρτυρες μετά από ωσμωτική καταπόνηση με μαννιτόλη, και μετρήσεις του αριθμού των σχηματισθέντων φυματίων, μετά από ενοφθαλμισμό των ριζών με S.meliloti. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δραστικότητα της καταλάσης παρουσίασε μια τάση μείωσης μετά από εφαρμογή ωσμωτικής καταπόνησης με μαννιτόλη στα διαγονιδιακά φυτά, που ερμηνεύθηκε σαν αποτέλεσμα πιο αποτελεσματικής σίγησης του γονιδίου της καταλάσης στις συνθήκες αυτές, ενώ στις ίδιες ομάδες διαγονιδιακών φυτών ο αριθμός των φυματίων ήταν στατιστικά σημαντικά μικρότερος, σε σχέση με τους μάρτυρες. Συμπερασματικά, η μείωση της έκφρασης του γονιδίου της καταλάσης επηρέασε την αποίκηση των ριζοβίων. Ο ρόλος της φυτικής καταλάσης στην εγκαθίδρυση επιτυχούς συμβίωσης φαίνεται ότι είναι σημαντικός, και επηρεάζεται από αβιοτικές καταπονήσεις όπως η ωσμωτική καταπόνηση. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι πιθανόν η φυτική καταλάση να παίζει σημαντικό ρόλο στην επιτυχία αποικισμού των ριζών των ψυχανθών με ριζόβια και μπορεί να αποτελέσει στόχο βελτίωσης ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που είναι δύσκολη η εγκατάσταση των αζωτοδεσμευτικών βακτηρίων στις καλλιεργούμενες ποικιλίες ψυχανθών φυτών.
description: Reactive oxygen species (ROS) play a crucial role for the establishment of legume-rhizobium nitrogen-fixing symbiosis. Several antioxidant genes and especially catalase, from both the plant and the rhizobia, play a desicive role in order to control concentration levels of ROS in root hair cells. While the function of bacterial catalase has been studied thoroughly, the role of plant catalase during symbiosis remains unclear. The aim of this study was to examine the role of catalase of the model-legume Medicago truncatula, for the establishment of nitrogen-fixing relationship between the plant and its microbial partner Sinorhizobium meliloti. For this purpose, the Cat1 gene of M. truncatula was silenced, by using RNA interference (RNAi) techniques. The effects of silencing on the mechanisms engaged in the establishment of symbiosis were measured under normal conditions and under osmotic stress. For the conduction of the experiment, a specific cDNA sequence of Cat1 M. truncatula was designed and reproduced by PCR techniques. The sequence was then introduced into an intermediate pHANNIBAL vector, in both sense and antisense orientation, in order to create a cassette, able to encode for a dsRNA molecule. The cassette was cloned into the binary vector pART27, resulting in the construction of an expression vector, able to transform bacteria of the Agrobacterium rhizogenes species and genetically modify plant cells. Gene silencing of catalase was achieved by using the RNAi technique, conducting hairy root transformation with Α.rhizogenes, aiming to transform exclusively and transiently root cells. The number of nodules in transiently transgenic and wild type plants, used as controls, was measured. Catalase specific activity, under mannitol-caused osmotic stress, was also measured. The results of this study showed that catalase activity was in lower levels, after treatment of transiently transgenic plants with mannitol. The levels of catalase activity could be explained, as a result of a more efficient silencing of catalase gene, under the given conditions of osmotic stress, while in the same transgenic plants, the number of nodules was significantly lower, in comparison with the negative and the wild type controls. In conclusion, the results show that the role of plant catalase for the establishment of a successful nitrogen-fixing relationship seems to be of major importance and could be used as a breeding goal, especially when there is difficulty in inoculating rhizobia to cultivated legumes.