title: ER-Stress in primären murinen Neuronen- und Mikroglia-Kulturen induziert durch in vitro Parkinson- und Alzheimer-Schädigungsmodelle
Creators: name: Plaschka, Charlotte Sophie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Alzheimer
Parkinson
ER-Stress
Caspase3
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
CHOP
ATF6
Neurodegeneration
GRP78
Neuronen
Mikroglia
6-Hydroxydopamin

description: Background: Alzheimer´s and Parkinson´s disease are the two great neurodegenerative diseases of our time. Both diseases share an accumulation of misfolded proteins, the oligomers of which have a toxic effect and may cause neuronal cell death. Furthermore, both diseases are characterized by neuro-inflammatory processes caused by activated microglia. ER stress is one of the mechanisms in neurodegeneration. Caused inter alia by an accumulation of misfolded proteins, ER stress activates different signalling cascades needed to restore cell homeostasis. Failure of these regulatory mechanisms induces apoptosis. Objective: This thesis explores the effects of ER stress induced by amyloid-beta 1 42 (Aβ1 42) oligomers and 6 hydroxydopamine (6 OHDA) on murine neuronal and microglial cell culture models of Alzheimer´s and Parkinson´s disease. Furthermore, the microglial activation was measured to gain deeper insight into the relationship between ER stress and neuroinflammation. Methodology: Embryonic primary murine cortical neurons and mesencephalic microglia were treated with toxic concentrations of Aβ1 42 oligomers and 6 OHDA, the effectivity of which was identified by means of MTT assay and double staining. Furthermore, ELISA and Griess assay were used to determine the inflammatory activity of microglial cells by measuring TNF α, IL 6 and nitrite level. Subsequently, changes in the concentration of Activating Transcription Factor 6 (ATF6), Glucose Regulated Protein 78 (GRP78), C/EBP Homologous Protein (CHOP) and Caspase 3 were identified using Western blot analysis. Results: 6 OHDA treatment leads to the induction of Caspase 3 and ATF6 in neuronal cells. There is no evidence that Aβ1 42 treatment induces a change in neuronal protein concentration. Both treatments result in a decrease in the protein concentration of GRP78, CHOP expression could not be detected in microglial cells. Furthermore, 6 OHDA and Aβ1 42 treatment fails to induce activation of microglia. Discussion: The results show the partial induction of ER stress activating signalling cascades in neuronal cells unter 6 OHDA treatment. Aβ1 42 treatment could not induce ER stress in microglial or neuronal cells. The established cell culture models are rather not suited for further investigation of ER stress regulation in neurodegenerative diseases. The results, however, indicate that the state of development of the cell might have an influence on the regulatory mechanisms activated by ER stress.
description: Hintergrund: Die Alzheimer- (AD) und die Parkinson-Krankheit (PD) sind die zwei großen neurodegenerativen Erkrankungen unserer Zeit. Beide Erkrankungen verbindet das Auftreten fehlgefalteter und akkumulierter Proteine, deren Oligomere toxisch wirken und neuronalen Zelltod bewirken können. Weiterhin sind beide Erkrankungen gekennzeichnet durch neuroinflammatorische Prozesse, denen aktivierte Mikroglia zugrunde liegen. ER Stress ist ein Mechanismus, der an Neurodegeneration beteiligt ist. Unter anderem wird er durch Akkumulation fehlgefalteter Proteine aktiviert und führt durch Induktion verschiedener Signalkaskaden zur Wiederherstellung der Zellhomöostase. Versagen diese Gegenregulationsmechanismen, setzen Mechanismen ein, die zum programmierten Zelltod führen. Zielsetzung: In dieser Arbeit wurde die Induktion von ER-Stress durch Amy-loid-beta 1 42 (Aβ1 42) Oligomere und 6 Hydroxydopamin (6 OHDA) in murinen neuronalen und mikroglialen Alzheimer- und Parkinson-Zellkulturmodellen untersucht. Zudem wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen ER-Stress-Induktion und inflammatorischer Aktivität der mikroglialen Zellen besteht. Methodik: Verwendet wurden embryonale primäre murine kortikale Neurone und mesenzephale Mikroglia, gewonnen an Entwicklungstag 13-14, welche mit toxischen Konzentrationen von Aβ1 42 Oligomeren und 6 OHDA behandelt wurden. Diese wurden zuvor mittels MTT-Assay und Doppelfärbung ermittelt. Unter Zuhilfenahme von Zyokin-ELISA und Griess-Assay wurde zudem die inflammatorische Aktivität der mikroglialen Zellen gemessen durch Bestimmung der proinflammatorischen Enzyme Tumornekrosefaktor α (TNF α) und Inter¬leu-kin 6 (IL 6) sowie von Nitrit. Anschließend erfolgte die Messung von Konzentrationsänderungen zuvor definierter Proteine der Signalkaskaden ATF6 [eng¬lisch: Activating Transcription Factor 6], GRP78 [englisch: Glucose Regulated Protein 78], CHOP [englisch: C/EBP Homologous Protein] und Caspase 3 mittels Western Blot. Ergebnis: Die Behandlung mit 6 OHDA führte in neuronalen Zellen zur Induktion von Caspase 3 und ATF6. Eine veränderte Proteinexpression im neuronalen Aβ1 42 Schädigungsmodell konnte trotz suffizient induzierter Schädigung nicht nachgewiesen werden. In Mikroglia konnte sowohl durch 6 OHDA als auch Aβ1 42 eine verringerte Expression von GRP78 nachgewiesen werden. Der Nachweis von CHOP in mikroglialen Zellen war in beiden Schädigungsmodellen nicht möglich. Darüber hinaus war eine Aktivierung der Mikroglia durch beide Substanzen nicht möglich. Diskussion: Die gewonnenen Ergebnisse lassen auf eine teilweise Aktivierung einiger ER-Stresskaskaden durch 6 OHDA in neuronalen Zellen schließen. Die Induktion von ER-Stress in mikroglialen Zellen sowie im neuronalen Aβ1 42 Schädigungsmodell gelang nicht. Die etablierten Schädigungsmodelle sind damit für die weitere Erforschung von ER-Stress in neurodegenerativen Erkrankungen eher ungeeignet. Jedoch lassen die gewonnenen Ergebnisse einen möglichen Rückschluss auf einen Einfluss des Entwicklungsstandes der Zelle auf ER-Stress-Regulationsprozesse zu.