Μicrobial recovery after exposure to chlorhexidine: A methodological study
Creators: name: Γιαβρούτα, Νεκταρία- Μήνα Ιωάννη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2025
Subjects: Μικροβιακή ανάκαμψη
Χλωρεξιδίνη
Ρεσαζουρίνη
Χρώση ζωτικότητας
Μicrobial recovery
Chlorhexidine
Resazurin assay
Viability stain

description: Στόχοι: Διάφορες αντιμικροβιακές ενώσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για τον χημικό έλεγχο του βιοϋμενίου, με την χλωρεξιδίνη να αποτελεί την πρώτη επιλογή. Οι μικροοργανισμοί ενός βιοϋμενίου μπορεί να επιβιώσουν από την αντιμικροβιακή δράση και να επιδιορθώσουν τις κυτταρικές βλάβες που προκαλούνται. Υπάρχουν περιορισμένες γνώσεις σχετικά με τη δυναμική ανάκαμψη των μικροοργανισμών της στοματικής κοιλότητας μετά από την αντιμικροβιακή δράση. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο τη σύγκριση διαφόρων μεθόδων ανίχνευσης της κυτταρικής ζωτικότητας και την ανάπτυξη ενός πειραματικού πρωτοκόλλου για την εξέταση της αντιμικροβιακής ανάκαμψης της στοματικής μικροβιακής χλωρίδας. Υλικά &amp; Μέθοδοι: Φρέσκες καλλιέργειες σε άγαρ από τα γένη Streptococcus και Candida χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ευαισθησίας στη χλωρεξιδίνη με τη μέθοδο της μικροαραίωσης και για την παρασκευή κυτταρικών εναιωρημάτων με σκοπό τον έλεγχο της μικροβιακής ανάκαμψης. Μετά την έκθεση στη χλωρεξιδίνη, η ζωτικότητα των μικροοργανισμών εξετάστηκε με τρεις διαφορετικές δοκιμασίες: την καταμέτρηση αποικιών, την μέθοδο της ρεσαζουρίνης και τη χρώση ζωτικότητας. Διεξήχθησαν πειράματα για τον προσδιορισμό της μικροβιοκτόνου κινητικής καθώς και της επίδρασης της μικροβιακής ασιτίας και των θρεπτικών ουσιών κατά τη φάση ανάκαμψης. Η μικροβιακή ανάκαμψη παρατηρήθηκε ακόμη, in vivo μετά από στοματόπλυση με διάλυμα χλωρεξιδίνης. Η καταμέτρηση αποικιών εκτίμησε τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων από τον αριθμό των αποικιών που αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υλικό μετά από καλλιέργεια του δείγματος. Η δοκιμασία αναγωγής της ρεσαζουρίνης, που αποτελεί ένδειξη μεταβολικής δραστηριότητας, μετρήθηκε οπτικά με φασματοφωτόμετρο και φθοριοφω-τόμετρο. Για τη δοκιμασία ζωτικότητας με χρώση χρησιμοποιήθηκε το εμπορικό κιτ (Live/Dead). Αποτελέσματα: Οι ελάχιστες συγκεντρώσεις για αναστολή της ανάπτυξης κυμάνθηκαν από 0,00015 – 0,00031% για τους στρεπτόκοκκους και από 0,001 – 0,005% για τους ζυμομύκητες. Η αντιμικροβιακή δράση επηρεάζονταν από τη συγκέντρωση και το χρόνο δράσης, ενώ η μείωση των ζωντανών κυττάρων που ανιχνεύθηκε μέσω της καταμέτρησης αποικιών ακολούθησε κινητική μικροβιοκτονίας. Υπήρχε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης της χλωρεξιδίνης και του αριθμού των ζωντανών κυττάρων στη χρώση Live/Dead. Η δοκιμασία ρεσαζουρίνης έδειξε με σαφή τρόπο τον βαθμό ζωτικότητας του εναιωρήματος, ειδικά όταν η μέτρηση γινόταν με φθοριοφωτόμετρο, η οποία αποδείχθηκε ταχύτερη και πιο ευαίσθητη από τη χρωματομετρική μέθοδο. Η παρουσία γλυκόζης επιτάχυνε την αναγωγή της ρεσαζουρίνης, ενώ η ασιτία σε διαφορετικές θερμοκρασίες (37°C και 4°C) δεν έδειξε σημαντική διαφορά. Μετά την έκθεση στη χλωρεξιδίνη, οι μικροοργανισμοί αναπτύχθηκαν σε μεγαλύτερο αριθμό όταν επωάστηκαν σε θρεπτικό ζωμό σε σύγκριση με το σάλιο ή το ρυθμιστικό διάλυμα. Ο χαμηλότερος αριθμός ζωντανών μικροβίων βρέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα. Το ίδιο πρότυπο επιβεβαιώθηκε και από τη δοκιμασία της ρεσαζουρίνης. In vivo, το μικροβιακό φορτίο του σάλιου εμφάνισε μείωση &lt;1-log 30 λεπτά μετά τη στοματόπλυση με 0,2% χλωρεξιδίνης. Στις 2 ώρες, ο αριθμός του μικροβιακού φορτίου επανήλθε στα επίπεδα πριν από την πλύση. Παρόμοιο μοτίβο παρατηρήθηκε με τη δοκιμασία ρεσαζουρίνης. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη χρώση ζωτικότητας δεν συμβάδιζαν με τις υπόλοιπες μεθόδους. Συμπεράσματα: Και οι τρεις μέθοδοι μπορούν να υποδείξουν τη ζωτικότητα των μικροοργανι-σμών. Υπάρχει καλή συμφωνία μεταξύ των μεθόδων όταν χρησιμοποιούνται in vitro με καθαρές καλλιέργειες και χλωρεξιδίνη. Η μέθοδος χρώσης ζωτικότητας χρειάζεται περαιτέρω επεξεργασία και προσαρμογή για χρήση σε δείγματα σάλιου.
description: Οbjectives: Several antimicrobial compounds are used for chemical biofilm control, chlorhexidine (CHX) being the gold standard. The microbes in a biofilm may survive the antimicrobial exposure and repair cell damages caused by the antiseptic compound. Limited knowledge exists on the dynamic recovery of oral microbes after antimicrobial attack. The present study aimed to compare various methods detecting cell viability and to develop an experimental protocol for examining the antimicrobial recovery of the oral microbiota. Material &amp; methods: Fresh agar cultures of oral isolates from the genera Streptococcus and Candida were used to test the susceptibility to CHX by a microdilution method and to prepare cell suspensions for testing the microbial recovery. After exposure to CHX, the viability of the microbes was examined with three different assays, the plate counting (PCA), the resazurin reduction (RA), and the viable staining (VSA). Experiments were carried out to determine the microbicidal kinetics and the effect of cell starvation and of the nutrients during the recovery phase. The microbial recovery was also followed in vivo after a mouth rinse with CHX solution. The PCA estimated the number of viable cells from the number of colonies grown on agar media upon sample culturing. The resazurin reduction, indicative of metabolic activity, was optically measured in a spectro-photometer and fluorescence photometer. For the viability staining assay, a commercial kit (Live/Dead) was used. Results: The minimum inhibitory concentration were in the range 0.00015 – 0.00031% for strepto-cocci and 0.001 – 0.0025% for the yeasts. The antimicrobial activity of CHX solutions was time and concentration dependent and the reduction in viable cells detected by PCA followed true kinetics of a killing procedure. A strong correlation also existed between the CHX concentration and the number of viable cells in Liv/Dead staining. PA indicated the degree of viability of the suspension in a clear manner as well, especially, when the fluorescence was measured. The fluorescence method was quicker and more sensitive than the colorimetric one. Presence of glucose accelerated the reduction, while starvation at different temperatures of 37 OC and 4 OC showed no considerable difference. After CHX exposure, the microbes grew in higher number when incubated in culture broth compared to saliva or buffer. The lowest viable numbers were found in the latter medium. This pattern was also confirmed by RA. In vivo, the microbial load of saliva showed &lt;1-log reduction 30 min post-rinse with 0.2% CHX. At 2 h, the numbers of microbial load returned to the pre-rinse levels. A similar pattern was observed with RA. The results obtained with VSA (Live/Dead) were inconsistent. Conclusions: All three methods can indicate microbial viability. A good agreement exists between the methods when used in vitro with pure cultures and CHX. VSA needs further adjustment for use with saliva samples.