title: Rekombinante Spinnenseidenproteine und Biomineralisation für technische und biomedizinische Anwendungen
Creators: name: Neubauer, Vanessa J.
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2022
Subjects: subject: Spinnenseide
subject: Abseilfaden
subject: Rekombinante Proteinherstellung
subject: Biomineralisation
subject: Katalysatortechnik
subject: Biomedizin
subject: 3D Druck
subject: Gradient
subject: 500
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description: Die Übertragung von Prinzipien aus der Natur half dem Menschen in der Vergangenheit bei bahnbrechenden technischen und medizinischen Neuerungen, die nun unseren Alltag erleichtern. Eine genaue Studie der Vorgänge der Biomineralisation, wie sie in unser aller Knochen ablaufen, kann verschiedene Anwendungen enorm bereichern. Das Verständnis der zu Grunde liegenden Prozesse, wie die Interaktion von Zellen mit dem umliegenden mineralisierten Gewebe, die Steuerung der Kristallkeim- und Strukturbildung durch Proteintemplate oder der osmotischen Balance während der Mineralabscheidung aus übersättigter Lösung spielen dabei auch in ihrer Interaktion untereinander eine wichtige Rolle. Der Brückenschlag zwischen dem natürlichen Vorbild und der späteren Applikation findet dabei insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen statt: Im biomedizinischen Anwendungsbereich gelten derzeit nach wie vor Implantation oder Transplantation als Goldstandardlösungen für den Ersatz von mineralisierten Geweben. Dabei stellen sich vermehrt Probleme wie die Knappheit an Spenderorganen, eine nachteilige Interaktion von Implantaten mit dem umliegenden Ersatzgewebe oder die Übertragung von Krankheiten aus tierischen Produkten dar. Um diese Hindernisse zu überwinden, können artifizielle Gewebe, die einer Biomineralisation des Materials unterliegen, geeignete Lösungen im Sinne des Tissue Engineering darstellen. In diesem Fabrikationsansatz werden personalisierte Ersatzgerüste erstellt und in den Patienten eingebracht. In technischen Anwendungen ist in Zeiten der Energiewende die möglichst effiziente Nutzung und klimafreundliche Erzeugung von Energie ein wichtiges Argument. Um die erneuerbare Energieerzeugung zu unterstützen und effizienter zu gestalten, kommen häufig keramische Katalysatoren zum Einsatz. So kann im Zuge der Wasserstoffwirtschaft die katalytische Spaltung von Wasser als Grundlage für die Gewinnung des Energieträgers Wasserstoff dienen. In ausgefeilten Mineralisationsprozessen können gerichtet Materialien entstehen, die diese Reaktion katalysieren und großtechnisch umsetzbar machen. Um diese unterschiedlichen Ziele miteinander zu verbinden und basierend auf einer gemeinsamen Grundlage individuell zu lösen, wurden in der vorliegenden Dissertation nach dem Vorbild der natürlich ablaufenden Biomineralisation Lösungsansätze erstellt. Als gemeinsame Ausgangsmaterialien wurden dafür rekombinante Spinnenseidenproteine gewählt. Basierend auf funktionellen Peptidmotiven der repetitiven Kerndomäne des Abseilfadens der Gartenkreuzspinne Araneus diadematus lag bereits das rekombinante Spinnenseidenprotein eADF4(C16) vor, das biotechnologisch großtechnisch hergestellt werden kann. Es ermöglicht neben einer molekularbiologischen Modifikation des Ausgangsmaterials ein Maßschneidern von Morphologien für unterschiedliche Anwendungen. Anhand diesen flexiblen Materials als Grundlage wurden verschiedene Fragestellungen zum Themenkomplex Biomineralisation beleuchtet, im Speziellen darunter Ersatzmaterialien für den Sehnen-Knochen-Übergang, der Enthese. Der erste Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf das Verständnis mechanistischer Vorgänge während der bioinspirierten Mineralisation von Mangancarbonat unter kontrollierten Bedingungen in Gegenwart von verschiedenen Additiven. Darüber hinaus wurde der Ladungseinfluss von zwei Spinnenseidenvarianten untersucht, die mit unterschiedlichen Peptid-Funktionalisierungen ausgestattet waren und als klassisches Proteintemplat fungierten. Weiterhin wurde die ebenfalls geladene, synthetische Polyacrylsäure in die Reaktion als Struktur-dirigierendes Polymer eingebracht. Dabei wurde herausgefunden, dass neben einem Ladungseinfluss der Komponenten auch die kolloidale Stabilität der eingebrachten Spinnenseidenpartikel das Mineralisationsergebnis beeinflusst. Eine Abweichung der gebildeten Spezies äußerte sich in unterschiedlich starker Interaktion der Spinnenseidenpartikel mit den unter diesen Bedingungen typischerweise gebildeten Mangancarbonat-Würfeln. Außerdem konnte eine Polymer-induzierte Flüssigphase ähnlich bereits beschriebener Strukturen in Gegenwart von Polyacrylsäure generiert werden. Somit konnten aus diesen Erkenntnissen Aussagen über das Mineralisationsgeschehen mit Spinnenseidenproteinen getroffen werden und eine Einschätzung der gebildeten Materialien für eine Anwendung als Katalysatormaterial abgeleitet werden. Im zweiten Teil wurden Antworten zu Fragestellungen zu mineralisiertem Gewebeersatz erarbeitet. Da Spinnenseide ein biokompatibles Biomaterial darstellt, das nicht-toxisch und bioabbaubar ist und keine Immunreaktion auslöst, eignet es sich für derartige biomedizinische Anwendungen. Im Falle des teilmineralisierten Gewebes des Sehnen-Knochen-Übergangs sind neben einer graduellen Mineralisation hin zur Knochenseite weitere Designkriterien wichtig, die die Mechanik des Gewebes zur Kraftübertragung und Zellbesiedlung betreffen. Es wurde eine biomimetische Biomineralisation von rekombinanten Spinnenseidenvarianten untersucht, die Mineralisierungs- und Kollagenbindemotive aus der Mineralisation im Knochen zu Grunde liegenden SIBLING Proteinen trugen. Eine Materialstudie zeigte das Mineralisationsverhalten der Varianten und ihre Zellverträglichkeit. Durch eine Prozessierung in ein Gradientenmaterial wurde das unterschiedliche Zellverhalten von Osteoblasten mit einer Präferenz zu Gunsten des Kollagenbindemotivs sichtbar. Dies bestätigte eine Eignung für Materialanwendungen im graduellen Sehnenersatz an der Knochenseite. Ein weiterer Ansatz realisierte Spinnenseiden-Kompositmaterialien mit anorganischen Füllstoffen. Vorteil dieser Herangehensweise war das gerichtete Einbringen von Keramiken in ein Matrixmaterial, das dann zusätzlich mit Zellen angereichert wurde. Die Entwicklung eines neuartigen Verfahrens im 3D Druck erlaubte das einfache Verarbeiten dieser Biotinten in Gradientenmaterialien. Somit wurde erfolgreich nach Vorbild der Enthese ein rekombinantes Spinnenseidenhydrogel mit einem Gradienten, beladen an Zellen und Fluorapatit-Partikeln, gedruckt und eine Zellviabilität nach dem Prozess bestätigt. In einem dritten Teil wurde ein neuer Fabrikationsansatz für Spinnenseidengele entwickelt. Faltung und Selbstassemblierung von rekombinanten Spinnenseidenproteinen basierten in mischbaren, wässrig-organischen Zwischenphasen auf der Ausbildung von Wasserstoffbrücken und hydrophoben Effekten. Neben zu Grunde liegenden mechanistischen Betrachtungen wurde eine höhere Materialsteifigkeit der Spinnenseidengele in wässrig-organischen Mischphasen mit Dimethylsulfoxid erzielt. Sie eignen sich durch ihren organischen Lösungsmittelanteil als injizierbare oder druckbare Depots zur Formulierung von wasserunlöslichen Wirkstoffen.