Ανάπτυξη θεραγνωστικών παραγόντων με δομή ανθρακινόνης και εφαρμογή του ραδιοδιαγνωστικού νουκλιδίου τεχνήτιο – 99m (99mTc)
Creators: name: Μίγκος, Θεοφάνης – Ματθαίος – Άλντο Λάμπρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Θεραγνωστικά ραδιοφάρμακα
Σύμπλοκα τεχνητίου – 99m
Ανθρακινόνη
Theranostic radiopharmaceuticals
Technetium – 99m complexes
Anthraquinone

description: Οι ανθρακινόνες είναι βιολογικά ενεργές ενώσεις οι οποίες, λόγω της επιπεδότητάς τους, παρεμβάλλονται στη διπλή έλικα του DNA, ενώ επιπλέον δύναται να παρεμποδίζουν τη δράση του ενζύμου DNA τοποϊσομεράση ΙΙ. Αποτέλεσμα αυτού είναι να εμφανίζουν κυτταροτοξική δράση και συνεπώς να χρησιμοποιούνται ως δομικοί λίθοι για την ανάπτυξη αντινεοπλασματικών παραγόντων. Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας είναι η σύνθεση τριών νέων θεραγνωστικών ραδιοϊχνηθετών τεχνητίου – 99m (99mTc), βασιζόμενοι στη δομή της ανθρακινόνης, και η αξιολόγησή τους ως διαγνωστικά μέσα για τον καρκίνο (εκπομπή γ-ακτινοβολίας/SPECT). Επιπλέον, οι ενώσεις αυτές θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν και ως ραδιοθεραπευτικά μέσα κάνοντας χρήση της εκπομπής ηλεκτρονίων εσωτερικής μετατροπής του τεχνητίου – 99m (99mTc). Δεδομένης της ευέλικτης χημικής του συμπεριφοράς, το τεχνήτιο – 99m (99mTc) διαθέτει διάφορες οξειδωτικές βαθμίδες με αποτέλεσμα να σχηματίζει σύμπλοκα με διαφορετικές γεωμετρίες αλληλεπιδρώντας με διάφορα άτομα (Ν, Ο) ή μόρια (CO). Έτσι, αναπτύχθηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα επισήμανσης με σκοπό την αξιοποίηση του ραδιονουκλιδίου με τη μορφή τόσο του μονο – οξοτεχνητικού(V), [99mTc][Tc=O]3+, όσο και του fac – τρικαρβονυλοτεχνητικού(I) πυρήνα, fac – [99mTc][Tc(CO)3]+. Επιπλέον, ως γνωστόν, λόγω της λανθανιδικής συστολής, το ρήνιο και το τεχνήτιο παρουσιάζουν όμοιες ιδιότητες με αποτέλεσμα να σχηματίζουν και ίδιας δομής σύμπλοκα. Κατά επέκταση, σχηματίστηκαν και τα ανάλογα μη – ραδιενεργά σύμπλοκα ρηνίου, ώστε να χαρακτηριστεί η δομή τους και να αποτελέσουν ενώσεις αναφοράς για την ταυτοποίηση και της δομής των ραδιοϊχνηθετών, μέσω συγκριτικής RP – HPLC χρωματογραφικής ανάλυσης. Συντέθηκαν αρχικά δύο νέοι χηλικοί συναρμοτές, L1 και L2, μέσω της μεθόδου του διλειτουργικού συναρμοτή. Η 1,8 – διυδροξυ – ανθρακινόνη αντέδρασε με το 1,3 – διβρωμοπροπάνιο και το μονοϋποκατεστημένο προϊόν (4) απομονώθηκε. Το ενδιάμεσο αυτό προϊόν αντέδρασε με την μονοαμιδο – μονοαμινο – διθειόλη (ΜΑΜΑ) για την παραγωγή του L1, ή την 2 – πικολυλαμίνη (picol) για τον L2. Έπειτα, ύστερα από μελέτη των συνθηκών σύνθεσης των προτύπων συμπλόκων Re(O)MAMA και fac – [Re(CO)3(picol)(im)]+ (όπου im το ιμιδαζόλιο) συντέθηκαν και τα σύμπλοκα Re(O)(L1), fac – Re(CO)3(L2)Br/fac – [Re(CO)3(L2)(MeOH)]+ έχοντας ως πρόδρομες ενώσεις το Re(O) – γλυκολικό και το Re(CO)5Br/fac – [Re(CO)3(MeOH)3]+ αντίστοιχα. Στην περίπτωση των μονο – οξορηνικών συμπλόκων, η σφαίρα συναρμογής του μετάλλου συμπληρώνεται από τα δύο άτομα θείου και το αμιδικό άζωτο, τα οποία δρουν ως μονοανιονικοί δότες, καθώς και από το αμινικό άζωτο του ΜΑΜΑ, που δρα ως ουδέτερος δότης, με αποτέλεσμα να προκύπτουν ουδέτερα σύμπλοκα. Από την άλλη, στην περίπτωση των τρικαρβονυλικών, η 2 – πικολυλαμίνη δρα ως (Ν,Ν) διδραστικός συναρμοτής μέσω των αζώτων της πυριδίνης και της αλειφατικής αμίνης, αφήνοντας μια θέση συναρμογής κενή, η οποία καταλαμβάνεται είτε από ένα ιόν βρωμίου (ουδέτερο σύμπλοκο) είτε από ένα μόριο μεθανόλης (θετικά φορτισμένο σύμπλοκο). Έτσι, εισήχθη και ένα μόριο ιμιδαζολίου (μονοδραστικός (Ν) συναρμοτής) στην εν λόγω 6η θέση συναρμογής, για τον σχηματισμό και του «2+1 συμπλόκου» fac – [Re(CO)3(L2)(im)]+. Τόσο οι συναρμοτές, όσο και τα σύμπλοκα του ρηνίου, χαρακτηρίστηκαν με αναλυτικές μεθόδους (NMR, RP – HPLC, FT – IR, HR – MS). Ομοίως λοιπόν, ξεκινώντας από τα πρόδρομα [99mTc]Tc(O) – γλυκονικό και fac – [99mTc][Tc(CO)3(H2O)3]+ συντέθηκαν οι ραδιοϊχνηθέτες [99mTc][Tc(O)MAMA], [99mTc][Tc(O)(L1)] και fac – [99mTc][Tc(CO)3(picol)(im)]+, fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+, fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ αντίστοιχα. Οι ραδιοχημικές αποδόσεις όλων των αντιδράσεων επισήμανσης ήταν ικανοποιητικές (56-78% και 31-68% για τον L1 και τον L2 συναρμοτή, αντίστοιχα), εντούτοις, στην περίπτωση του [99mTc][Tc(O)(L1)], η κατεργασία του αντιδρώντος μίγματος (φυγοκέντριση, διήθηση και απομόνωση του επιθυμητού κλάσματος με RP – HPLC) οδήγησε σε απώλεια σημαντικής ποσότητας ραδιενέργειας. Έπειτα, υπολογίστηκε η λιποφιλικότητα των L2 ραδιοϊχνηθετών, βασική φυσικοχημική ιδιότητα των φαρμακομορίων που καθορίζει την διαλυτότητα αυτών, την ικανότητά τους διέλευσης διαμέσου των βιολογικών μεμβρανών και κατά επέκταση προσέγγισης του επιθυμητού στόχου. Παρουσίασαν τιμές logD7.4 = 2.55  0.25 για το fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ και logD7.4 = 2.59  0.19 για το fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+, οι οποίες βρίσκονται εντός του επιθυμητού εύρους [1, 3]. Και οι τρεις ραδιοϊχνηθέτες που φέρουν το μόριο της ανθρακινόνης παρουσίασαν υψηλή σταθερότητα, ≥90% στις 4 h, όταν επωάστηκαν σε διαλύματα 1 mM L – ιστιδίνης ή L – κυστεΐνης καθώς και σε πλάσμα αρουραίου. Μάλιστα, συγκρίνοντας τα ποσοστά των συμπλόκων fac – [99mTc][Tc(CO)3(picol)(im)]+ και fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ που παραμένουν σταθερά μετά από 24 h (57% και 92% αντίστοιχα σε διάλυμα L – ιστιδίνης) συμπεραίνεται πως η ογκώδης ομάδα της ανθρακινόνης εμποδίζει στερεοχημικά την αλληλεπίδραση του συμπλόκου με τα παραπάνω αμινοξέα. Επιπλέον, οι ραδιοϊχνηθέτες παρουσίασαν σχετικά χαμηλά ποσοστά δέσμευσης στις πρωτεΐνες του αίματος (12% για το [99mTc][Tc(O)(L1)] στις 4 h), επιθυμητό χαρακτηριστικό για τους ραδιοϊχνηθέτες καθώς αυξάνει την ευκρίνεια της απεικόνισης. Εξαίρεση αποτέλεσε το fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ που παρουσίασε ποσοστά δέσμευσης έως και 54% στις 24 h, γεγονός που αποδίδεται στο ευκίνητο μόριο νερού που μπορεί να εκτοπιστεί εύκολα από τα άτομα δότες των βιομορίων. Από την in vitro μελέτη της πρόσληψης των ραδιοϊχνηθετών από κύτταρα αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου μυός CT26 βρέθηκε πως το fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ παρουσιάζει ποσοστό πρόσληψης 4.31 ± 1.13% μετά από 4 h επώασης, ενώ το fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ 0.37 ± 0.04%. Η διαφορά αυτή εξηγείται από την παρουσία του ευκίνητου μορίου νερού, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Η μελέτη της in vivo βιοκατανομής των ραδιοϊχνηθετών σε BALB/c ποντίκια πραγματοποιήθηκε αρχικά σε υγιή ποντίκια για την ένωση [99mTc][Tc(O)(L1)], όπου παρατηρήθηκε ταχεία αιματική κάθαρση και ηπατοχολική απέκκριση. Από την άλλη, οι τρικαρβονυλικές ενώσεις του τεχνητίου μελετήθηκαν σε BALB/c φέροντα όγκο από συγγενικά καρκινικά κύτταρα CT26. Όμοια, και αυτές οι ενώσεις παρουσίασαν ταχεία αιματική κάθαρση και ηπατοχολική απέκκριση. Όσον αφορά την πρόσληψη από τους όγκους, το διδραστικό fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ παρουσίασε υψηλότερο ποσοστό πρόσληψης σε σχέση με το «2+1 σύμπλοκο» fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ (1.83  0.18% ID/g και 0.90  0.05% ID/g στα 30 min, αντίστοιχα), σε συμφωνία και με τα αποτελέσματα των in vitro πειραμάτων. Από την άλλη όμως, το «2+1 σύμπλοκο» εμφάνισε υψηλότερους λόγους κατανομής στον όγκο έναντι του αίματος (0.99  0.09 vs 0.33  0.05 στα 30 min) και έναντι του μυός (2.49  0.21 vs 1.48  0.31 στα 30 min), το οποίο εξασφαλίζει μια υψηλότερης ευκρίνειας απεικόνιση.
description: Anthraquinones are bioactive molecules which, due to their planar structure, intercalate between the base pairs of the double – stranded DNA, while also they could inhibit the DNA topoisomerase II enzyme. As a result they exhibit cytotoxic activity and have been used as scaffolds for the development of antineoplastic agents. Thus, the aim of this thesis is the synthesis of three new theranostic technetium – 99m (99mTc) radiotracers, based on the anthraquinone molecule, and their evaluation as potential tumor imaging agents (γ-emitter/SPECT). In addition, they could be used as radiotherapeutic agents based on the emission of internal conversion electrons of this radionuclide. Given its versatile chemical behavior, technetium – 99m (99mTc) can be found in different oxidation states leading to the formation of various structures with different geometries by interacting with common donor atoms (N, O) or molecules (CO). Therefore, two different radiolabeling protocols were applied for the utilization of the radionuclide in both the mono – oxotechnetium(V), [99mTc][Tc=O]3+, and the fac – tricarbonyltechnetium(I), fac – [99mTc][Tc(CO)3]+, form. Moreover, due to the lanthanide contraction, rhenium and technetium display similar properties leading to the formation of complexes with identical structures. Consequently, the respective non – radioactive rhenium analogs were produced, to characterize their structure and to be used as reference compounds for the identification of the radiotracers structures too, by comparative RP – HPLC chromatographic analysis. Initially, two new ligands were synthesized, L1 and L2, through the bifunctional approach. 1,8 – dihydroxy – antraquinone reacted with 1,3 – dibromopropane and the monosubstituted product (4) was collected. This intermediate product then was conjugated on monoamide – monoamine – dithiol (MAMA) for L1 formation, or 2 – picolylamine (picol) for L2. Then, after studying the reaction conditions for the synthesis of the model complexes Re(O)MAMA and fac – [Re(CO)3(picol)(im)]+ (where im is imidazole) the Re(O)(L1) and fac – Re(CO)3(L2)Br/fac – [Re(CO)3(L2)(MeOH)]+ complexes were also synthesized utilizing Re(O) – glycolate and Re(CO)5Br/fac – [Re(CO)3(MeOH)3]+, respectively, as precursors. As for the mono – oxorhenium complexes, the remaining coordination sites are occupied by the two sulfur atoms and the nitrogen of the amide, that act as monoanionic donors, as well as by the nitrogen of the amine present in the MAMA chelator, that acts as neutral donor, leading to the production of neutral complexes. On the other hand, in the case of the tricarbonyl – complexes, the 2 – picolylamine moiety acts as a (N,N) bidentate chelator through the nitrogen atoms of pyridine and the aliphatic amine, leaving one available coordination site, which can be occupied by either a bromide ion (neutral complex) or a methanol molecule (positively charged complex). Subsequently, an imidazole molecule (monodentate (N) ligand) was incorporated in the above mentioned 6th coordination site, for the production of the mixed «2+1 complex» fac – [Re(CO)3(L2)(im)]+. The ligands, as well as the rhenium complexes, were characterized by analytical methods (NMR, RP – HPLC, FT – IR, HR – MS). Similarly, starting from the [99mTc]Tc(O) – gluconate and fac – [99mTc][Tc(CO)3(H2O)3]+ precursors, the radiotracers [99mTc][Tc(O)MAMA], [99mTc][Tc(O)(L1)] and fac – [99mTc][Tc(CO)3(picol)(im)]+, fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+, fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ were synthesized respectively. Despite the fact that all radiolabeling reactions displayed satisfactory radiochemical yields (56-78% and 31-68% for the complexation of L1 and L2 respectively), in the case of [99mTc][Tc(O)(L1)], the purification process (centrifugation, filtration and RP – HPLC isolation of the desired fraction) resulted in significant loss of radioactivity. Afterwards, the lipophilicity of the L2 radiotracers was quantified, a fundamental physicochemical property of drugs that determines their solubility, membrane permeability and thus their ability to finally reach the desired target. They displayed logD7.4 values of 2.55 ± 0.25 for the fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ and 2.59 ± 0.19 for the fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+, which are within the desired range of [1, 3]. All three radiotracers bearing the anthraquinone moiety displayed high stability, ≥90% at 4 h, after their incubation in both 1 mM solutions of L – cysteine/L – histidine or rat plasma. By comparing the percentages of the complexes fac – [99mTc][Tc(CO)3(picol)(im)]+ and fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ that remain intact after 24 h incubation in L – histidine solution (57% and 92% respectively), it can be assumed that the large anthraquinone moiety inhibits sterically the interaction between the complex and the above mentioned amino acids. Moreover, the radiotracers showed relatively low percentages of binding to blood proteins (12% for [99mTc][Tc(O)(L1)] at 4 h), a desired feature for radiotracers given that enhances the scan quality. Fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ was the only exception, since it displayed binding percentages as high as 54% at 24 h, that can be attributed to the water molecule present in the complex coordination sphere, which can be easily displaced by the donor atoms of other biomolecules. In the in vitro tests the cellular uptake of the complexes was determined using the colon adenocarcinoma CT26 cell line, where the fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ displayed 4.31 ± 1.13% cell uptake after 4 h of incubation, in comparison with the mere 0.37 ± 0.04% of the fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+. This difference can be attributed to the presence of labile water molecule, as mentioned above. Finally, the in vivo biodistribution studies of the radiotracers in BALB/c mice were conducted initially in healthy mice for the [99mTc][Tc(O)(L1)], where fast blood clearance as well as hepatobiliary excretion were noticed. On the contrary, the tricarbonyltechnetium complexes were tested in BALB/c mice bearing tumors from syngeneic cancer cells CT26. Likewise, these complexes displayed fast blood clearance and hepatobiliary excretion. Regarding the tumor uptake, the bidentate complex fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(H2O)]+ presented higher uptake compared to the «2+1 complex» fac – [99mTc][Tc(CO)3(L2)(im)]+ (1.83 ± 0.18% ID/g and 0.90 ± 0.05% ID/g at 30 min, respectively), in accordance with the results of the in vitro tests. On the other hand though, the mixed «2+1 complex» displayed higher tumor to blood (0.99 ± 0.09 vs 0.33 ± 0.05 at 30 min) and tumor to muscle (2.49 ± 0.21 vs 1.48 ± 0.31 ratios 30 min) ratios, which improves the scan quality.