title: A LysR-family transcriptional regulator is involved in the selenium-dependent transcriptional regpression of selenium-free hydrogenase gene groups in Methanococcus voltae
Creators: name: Sun, Junsong
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2003
Subjects: Hydrogenassen
Genexpression
Selen
Hydrogenasen
Transkriptionsregulation
Archaeon
transcriptional regulation
hydrogenases
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Genregulation
selenium

description: Methanococcus voltae contains two coenzyme F420 reducing and two coenzyme F420 non-reducing hydrogenases. Two of them, Fru and Vhu, are selenoproteins. One F420-reducing hydrogenase (Frc) and one F420-non-reducing hydrogenase (Vhc) do not contain selenocysteine. The gene groups encoding these two proteins share a common intergenic region. It was found that the transcription of the frc-vhc gene clusters is inhibited by the presence of selenium in the medium, although the presence of trace amounts of selenium is the precondition for obtaining a maximal growth rate under laboratory conditions. Site-directed mutagenesis performed on the IR has led to the identification of potential negative and positive regulatory protein binding sites. Furthermore, a putative positive regulator involved has been found. In the research presented here, the â-glucuronidase encoding reporter gene uidA was used to indirectly monitor the transcription level of the frc and vhc gene clusters of M. voltae mutants F3 or V1 in vivo. Insertion vectors were constructed to perform random insertional mutagenesis in M. voltae. No deregulated mutants were obtained by this approach. However, transfection of an integration vector carrying the frc-vhc intergenic region as promoter region for the selective marker led to derepression of a hydrogenase promoter with concomitant amplification of the vector in the chromosome. This was taken as a further indication for the specific binding of a negative regulator to the intergenic region. DNA affinity chromatography was applied in an attempt to purify (a) negative regulatory protein(s). With biotin-labelled DNA comprising the hypothetical negative regulatory binding site in the intergenic region, a protein was partially purified. This protein was then analyzed by N-terminal sequencing. BLAST analysis revealed that it belongs to the LysR family of prokaryotic regulatory proteins. After obtaining the complete nucleotide sequence, a knockout of this gene was performed in M. voltae strain V1. Disruption of this gene in the V1 strain restored the transcription of selenium-free hydrogenase gene groups as well as the expression of the reporter enzyme in the presence of selenium. This regulator is therefore designated as HrsM (selenium-dependent repressor of hydrogenases in Methanococcus voltae). HrsM is the first reported transcriptional regulator in Archaea that belongs to the bacterial LysR family.
description: Methanococcus voltae besitzt zwei Coenzym F420 reduzierende und zwei Coenzym 420 nicht reduzierende Hydrogenasen. Zwei davon, Fru und Vhu, sind Selenoproteine. Eine F420 reduzierende Hydrogenase (Frc) und eine F420 nicht reduzierende Hydrogenase (Vhc) enthalten kein Selenocystein. Die Gengruppen, die für diese Enzyme codieren, sind durch eine gemeinsame intergene Region verbunden. Es wurde beschrieben, dass die Transkription der vhc-frc-Cluster durch die Anwesenheit von Selen im Wachstumsmedium inhibiert wird, obwohl die Anwesenheit von Spuren von Selen die Voraussetzung dafür ist, dass unter Laborbedingungen maximale Wachstumsraten erreicht werden. Ortsspezifische Mutagenese in der intergenen Region führte zur Identifizierung von Bindungsstellen für positiv und negativ regulatorischen Proteine geführt. In den hier beschriebenen Untersuchungen wurde das Gen für ß-Glucuronidase (uidA) benutzt, um das Transkriptionsniveau der frc- und vhc-Gengruppen in M. voltae-Stämmen (F3 und V1) in vivo indirekt zu verfolgen. Insertionsvektoren wurden konstruiert, um Zufalls-insertionen zu erzeugen. Mit diesem Ansatz wurden keine deregulierten Mutanten gefunden. Jedoch führte die Transformation mit einem Integrationsvektor, der die frc-vhc-intergene Region als Promotorregion für den Selektionsmarker trug, zur Derepression eines Hydrogenasepromotors unter gleichzeitiger Amplifikation des Vektors im Chromosom. Dies wurde als weiterer Anhaltspunkt dafür angesehen, dass es eine Bindungsstelle für den negativen Regulator in der intergenen Region gibt. Daraufhin wurde DNA-Affinitiätschromatogrphie eingesetzt, um zu versuchen, (das) negative Regulatorprotein(e) zu reinigen. An biotinmarkierter DNA, die die hypothetische Bindungsstelle für den negativen Regulator in der intergenen Region enthielt, wurde ein Protein teilweise gereinigt. Die N-terminale Sequenz des Proteins wurde bestimmt. BLAST-Analysen ergaben, dass es zur LysR-Familie prokaryotischer Regulationsproteine gehört. Nach der Erstellung der kompletten Nukelotidsequenz, wurde ein Knockout des Gens im M. voltae-Stamm V1 durchgeführt. Die Zerstörung des Gens im Stamm V1 führte zur Transkription des Reportergens und auch der Hydrogenasegene in Gegenwart von Selen. Dieser Regulator erhielt daher den Namen HrsM (selenabhängiger Repressor von Hydrogenasen in Methanococcus voltae). HrsM ist der erste beschriebene zur bakteriellen LysR-Familie gehörige Regulator in Archaea.