Toxigenic profile of fungi and multi mycotoxins analysis as supporting tools for a risk evaluation and mycotoxins minimization/degradation
Creators: name: CIMMARUSTI, MARIA TERESA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Foggia
Year: 2019

description: Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da alcuni funghi filamentosi, che possono contaminare piante coltivate o alimenti e mangimi immagazzinati; tra questi i pi� importanti funghi micotossigeni coinvolti nella contaminazione alimentare, appartengono a tre generi: Aspergillus, Fusarium e Penicillium. Pi� di 300 micotossine sono state identificate e questi metaboliti secondari possono essere dannosi per la salute umana ed animale quando ingeriti (Bennett and Klich, 2003). Le principali micotossine contaminati di alimenti e mangimi sono: aflatossine, ocratossina, fumonisine, tricoteceni e zearalenone. Le aflatossine rappresentano la classe pi� importante di micotossine, comunemente presenti nel mais e in altri cereali, i principali funghi responsabili della loro produzione sono Aspergillus flavus e A. parasiticus (Shepard, 2008). Invece i cereali, il caff�, il cacao, il vino, la birra e gli alimenti di origine animale sono spesso contaminati dall'ocratossina A, prodotta principalmente da A. ochraceus (Van der Merwe et al., 1965), A. carbonarius, Penicillium verrucosum e P. nordicum. Fusarium verticillioides e F. proliferatum producono fumonisine, che sono spesso rilevate nel mais e nei sottoprodotti (Dutton, 1996). I trichoteceni, che si trovano spesso nei cereali, in particolare nel frumento e nel mais, sono divisi in quattro gruppi, i due principali sono: il tipo A con le tossine T2 e HT-2, prodotte da F. langhsetiae e F. sporotrichioides (Van der Fels-Klerk e Stratakou, 2010); il tipo B con il deossinivalenolo (DON) e il nivalenolo (NIV) prodotti da F. graminearum e F. culmorum (Placinta et al., 1999; Turner, 2010). Inoltre, la contaminazione da DON si trova frequentemente in associazione con un'altra micotossina prodotta dagli stessi funghi, lo zearalenone (ZEA) (Logrieco et al., 2002a). Queste specie sono responsabili di infezioni che si verificano sia nel campo che durante la conservazione post-raccolta, in particolare quando i cereali sono immagazzinati in condizioni inadeguate (ad esempio alte temperature e alta umidit�). Una grande variet� di effetti tossici negli animali e nell'uomo � stata osservata a causa dell'ingestione di cibo contaminato da micotossine, quali: immunosoppressione, effetti cancerogeni, genotossici, teratogeni o mutageni (Peraica et al., 1999; Richard, 2007). La contaminazione da micotossine � diventata una preoccupazione per la salute pubblica con gravi implicazioni economiche ed etiche. Dal momento che non � completamente possibile impedire la produzione di micotossine, le autorit� nazionali e internazionali hanno adottato limiti regolatori e linee guida per monitorare i livelli di micotossine in vari prodotti alimentari e nei mangimi (EC 2006a e 2006b; Commision Recommendation 2013/165/UE). Diversi metodi fisici, chimici e biologici sono stati raccomandati per la detossificazione di alimenti e mangimi contaminati da micotossine. Tuttavia, solo alcuni di essi sono stati accettati per l'uso pratico. Molti specialisti pensano che l'approccio migliore per la decontaminazione da micotossine debba essere la degradazione biologica, dando la possibilit� di rimuovere micotossine in blande condizioni, senza usare sostanze chimiche dannose e senza perdite significative nel valore nutritivo e nell?appetibilit� di alimenti o mangimi detossificati. A seconda della loro modalit� di azione, questi additivi per mangimi possono agire legando micotossine alla loro superficie (adsorbimento) o degradandoli o trasformandoli in metaboliti meno tossici (biotrasformazione). L'efficacia del legante di queste sostanze si basa sulle propriet� sia del legante che della micotossina. La biotrasformazione pu� essere ottenuta da enzimi che degradano le micotossine o da microrganismi (funghi e batteri) che producono tali enzimi. Vari adsorbenti inorganici, alluminosilicati e carboni attivi, sono stati testati e utilizzati come leganti micotossine (MB). Un'alternativa interessante agli adsorbenti inorganici per la detossificazione delle micotossine � l'uso di leganti organici, come i componenti della parete cellulare del lievito, i batteri dell'acido lattico, i conidi degli Aspergilli. Questi MB sono utilizzati l?alimentazione animale al fine di ridurre l'assorbimento delle micotossine dal tratto gastrointestinale e la loro distribuzione al sangue e agli organi bersaglio, prevenendo o riducendo le micotossicosi nel bestiame. Recentemente, l'uso di tali sostanze come additivi per mangimi tecnologici � stato ufficialmente autorizzato dall'Unione europea (Commission Regulation 2015/786). Enzimi ligninolitici, come le laccasi, dai funghi del marciume bianco, come Pleurotus spp. che catalizzano l'ossidazione di un ampio spettro di composti fenolici e di ammine aromatiche utilizzando l?ossigeno molecolare come accettore di elettroni, che viene quindi ridotto ad acqua (Reinhammar e Malstrom, 1981). Aggiungendo alla reazione l?appropriato mediatore redox pu� estendere l'attivit� degli enzimi laccasi a substrati non fenolici, come le micotossine. Questa tesi di dottorato � organizzata in sei capitoli e un allegato, in cui sono descritte le seguenti attivit�. Nel Capitolo 1 sono stati raccolti centosettantacinque campioni di grano durante le stagioni agricole: 2013-2014, 2014-2015 e 2015-2016 in diverse regioni italiane. I tricoteceni (DON, NIV, tossine T2 e HT-2) e i livelli di ZEA sono stati monitorati attraverso l'uso di metodi analitici validati, per fornire una visione d?insieme della distribuzione italiana delle micotossine nel grano. Le specie di Fusarium isolate dai semi sono state identificate in base alle loro caratteristiche morfologiche. Nel Capitolo 2, lo sviluppo di una tecnologia innovativa per la bioremedation del mais contaminato dall'AfB1 e della sua bioconversione in mangime ad un alto apporto nutrizionale, � stato realizzato attraverso lo sfruttamento della capacit� degradativa del Pleurotus eryngii. A tale scopo, � stata studiata l'attivit� degradativa dei confronti dell?AfB1 da parte di un estratto enzimatico grezzo ottenuto da un substrato esausto e la capacit� del fungo commestibile P. eryngii di degradare l'AfB1 sia in vitro che in una coltivazione dei funghi su scala di laboratorio. Nel Capitolo 3, � stata valutata la capacit� del micelio non vitale del P. eryngii (ITEM 13681) di assorbire l?AfB1. Sono stati valutati l'influenza di diversi parametri, quali: pH (5, 7), concentrazioni dell?AfB1 (da 50 a 1000 ng/mL), tempo (da 30 a 120 min), temperatura (25, 37 � C), massa fungina (da 50 a 1000 mg), sulla capacit� di assorbimento del micelio di P. eryngii. La stabilit� del legame AfB1-bioassorbente e gli studi di desorbimento sono stati effettuati variando, rispettivamente, il pH a 7 e 3, per 24 ore di incubazione a temperatura ambiente e al buio. Nel capitolo 4, l'attivit� di degradazione di due laccasi ottenute da due funghi commestibili (P. eryngii e P. pulmonarius) nei confronti di AfB1, AfM1, FB1, ZEA e tossina T2, sono state valutate singolarmente, aggiungendo alla reazione mediatori naturali ed artificiali. L'effetto dei sistemi laccasi-mediatore (LMSs) � stato analizzato mediante cromatografia liquida ad elevata prestazione accoppiata ad uno specifico rivelatore, scelto in base alle caratteristiche chimiche di ciascuna tossina. Nel capitolo 5, l'obiettivo perseguito era quello di investigare l'azione dei sistemi laccase-mediatore (LMSS) verso pi� tossine, simultaneamente. A tal fine, sono stati eseguiti diversi test di degradazione, esaminando l'effetto dei diversi mediatori, come acetosyringone (AS), syringaldehyde (SA) e del mediatore sintetico 2,2,6,6-tetrametil-piperidinil-ossil (TEMPO), sull'attivit� della laccasi da Trametes versicolor (CE 1.10.3.2) verso l'acido fusarico (FA) e micotossine, come: DON, T2, FB1, AfB1, OTA e ZEA. Un metodo multi micotossina, � stato sviluppato per determinare simultaneamente queste sette tossine, mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS). Nel capitolo 6, l'attivit� di degradazione dell?enzima laccasi verso lo ZEA � stata ulteriormente investigata. I prodotti della biodegradazione sono stati monitorati mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa ad elevata risoluzione (LC-HRMS). I dati sono stati elaborati dal software MassHunter Workstation (Qualitative Analysis Navigator e Workflow di analisi qualitativa, versione B.08.00), Mass Profile Professional (versione 14.08) e MassHunter Molecular Structure Correlator (versione B.08.00)) di Agilent Technologies, per consentirne l'identificazione. Nell'Annesso A, la produzione di Enniatine (A, A1, B e B1) e Beauvericina da varie specie di Fusarium � stata valutata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con array di fotodiodi e spettrometro di massa a singolo quadrupolo (UPLC-PDA-QDa).