title: Integrating ex vivo organotypic cultures and highthroughput sequencing to study gene expression dynamics in mammalian tissues
Creators: name: Del Giudice, Simone
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin
Year: 2025
Subjects: subject: Regulierung der Genexpression
subject: Ex vivo organotypische Kulturen (EVOC)
subject: SLAM-seq
subject: Nonsense-vermittelter mRNA-Zerfall (NMD)
subject: Gene expression regulation
subject: Ex vivo organotypic cultures (EVOC)
subject: SLAM-seq
subject: Nonsense-mediated mRNA decay (NMD)
subject: 570 Biologie

description: Die Regulierung der Genexpression umfasst verschiedene Wege, die Genotyp und Phänotyp miteinander verbinden. RNA spielt dabei eine zentrale Rolle, wobei ihre Synthese und ihr Zerfall die Funktion und Halbwertszeit von Transkripten dynamisch beeinflussen. Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung hat unser Verständnis der Zellphysiologie revolutioniert, doch herkömmliche zelluläre Modelle werden der Komplexität von Säugetiergeweben nicht gerecht. Organotypische Ex-vivo-Kulturen (EVOC) spiegeln die Gewebephysiologie besser wider, doch ihre Verwendung für Genexpressionsstudien bleibt begrenzt. In dieser Arbeit wird diese Lücke durch zwei Projekte geschlossen. Erstens haben wir ex vivo SLAM-seq entwickelt, das EVOC mit Hochdurchsatzsequenzierung verbindet, um naszierende RNAs in Gewebeschnitten zu quantifizieren. Wir konnten zeigen, dass erwachsene Mäusegehirnschnitte 4sU in neue RNA einbauen, was die Identifizierung von Genen zur neuronalen Aktivierung ermöglicht. Darüber hinaus haben wir diese Methode für die räumliche Transkriptomik (ST) angepasst, was die kombinierte Analyse von Expressionsdynamik und Gewebearchitektur erleichtert. Ex vivo SLAM-seq wurde auch bei primären kolorektalen Karzinomen und Mausembryonen angewendet. Das zweite Projekt untersuchte den Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall (NMD) im Mäusegehirn, einen wichtigen Regulationsmechanismus, für den es keine geeigneten Säugetiermodelle gibt. Mithilfe von EVOC hemmten wir NMD ex vivo und führten RNA-seq durch, um potenzielle NMD-Ziele und ihre mögliche Kopplung mit alternativem Spleißen zu identifizieren. ST von erwachsenen Hirnschnitten deutete auf eine regionsspezifische NMD-Regulierung hin, insbesondere im Hippocampus. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass EVOC eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung der Genexpressionsdynamik ist und neue Möglichkeiten zur Untersuchung der RNA-Regulation in komplexen Geweben bietet.
description: Gene expression regulation encompasses diverse pathways linking genotype and phenotype. RNA plays a central role, with its synthesis and decay dynamically shaping transcript function and half-life. High-throughput RNA-sequencing has revolutionized our understanding of cellular physiology, yet traditional cellular models fail to capture the complexity of mammalian tissues. Ex vivo organotypic cultures (EVOC) better reflect tissue physiology, but their use in gene expression studies remains limited. This thesis addresses this gap through two projects. First, we developed ex vivo SLAM-seq, integrating EVOC with high-throughput sequencing to quantify nascent RNAs in tissue slices. We demonstrated that adult mouse brain slices incorporate 4sU into new RNA, enabling the identification of neuronal activation genes. Additionally, we adapted this method for spatial transcriptomics (ST), facilitating the combined analysis of expression dynamics and tissue architecture. Ex vivo SLAM-seq was also applied to primary colorectal cancers and mouse embryos. The second project explored nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in the mouse brain, a key regulatory mechanism lacking suitable mammalian models. Using EVOC, we inhibited NMD ex vivo and performed RNA-seq, identifying potential NMD targets and its possible coupling with alternative splicing. ST of adult brain slices suggested region-specific NMD regulation, particularly in the hippocampus. In summary, this thesis highlights EVOC as a powerful platform for studying gene expression dynamics, providing novel opportunities to investigate RNA regulation in complex tissues.