title: Strukturaufklärung Ribosomaler Komplexe mittels Kryo-EM Mechanismus der Translokationsreaktion ribosomal verankerte ncRNAs
title: Structure Elucidation of Ribosomal Complexes via Cryo-EM- Mechanism of Translocation- ribosomal anchored ncRNAs
Creators: name: Ratje, Andreas Heinrich
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Translokation
Aufreinigung
Elongationszyklus
Naturwissenschaften
Ribosome
Expression
Translocation
23 S rRNA
tRNA
Elongation cycle
Purification
ncRNA
Ribosom

description: Die am Ribosom erfolgende
      Proteinbiosynthese unterteilt sich in die vier Schritte
      Initiation, Elongation, Termination und Recycling. Die
      Elongationsphase als zyklisch ablaufender Vorgang beinhaltet
      die Anlieferung aminoacylierter tRNAs in die A-Stelle des
      Ribosoms, die Bildung einer neuen Peptidbindung und die
      Translokation der tRNAs im Komplex mit der gebundenen mRNA.
      In Prokaryonten wird die Translokation vom Elongationsfaktor
      G (EF-G) katalysiert, dessen Aktivität von der Hydrolyse des
      Kofaktors GTP abhängt. Trotz der Vielzahl der in der
      Literatur beschriebenen EF-G-Ribosomen-Komplexe und
      biochemischer Studien ist der genaue Vorgang der
      Translokation noch unbekannt. Der Beitrag des
      Elongationsfaktors G, der tRNAs und der verschiedenen
      Konformationen des Ribosoms zur Translokation ist in
      molekularen Details noch nicht verstanden worden. Im Rahmen
      dieser Arbeit sollte ein Beitrag zum Verständnis dieses
      Vorgangs geleistet werden. Dazu wurde ein Komplex aus 70S
      Ribosomen von T. thermophilus mit EF-G und GTP in Gegenwart
      von Fusidinsäure gebildet und kryo-elektronenmikroskopisch
      untersucht. Fusidinsäure ermöglicht zwar die für die
      Translokation benötigte GTP-Hydrolyse, verhindert aber
      Konformationsänderungen im EF-G und so dessen Dissoziation
      vom Ribosom. Der kryo-elektronenmikroskopisch gesammelte
      Datensatz konnte mithilfe des multiparticle refinements in
      zwei bisher nicht gesehene Konformationen des Ribosoms mit
      7,8 °A Auflösung für die erste Subpopulation und 7,6 °A
      Auflösung für die zweite Subpopulation aufgetrennt werden.
      Beide Subpopulationen enthalten Elektronendichte für EF-G und
      eine tRNA, zeigen aber signifikante Unterschiede in ihrer
      Konformation. Die erste der beiden Subpopulationen zeigt eine
      Verdrehung (engl. ratcheting) der 30S Untereinheit gegen die
      große Untereinheit um 7° mit einer gleichzeitigen
      Drehbewegung des Kopfes (engl. swivelling) ungefähr senkrecht
      zum ratcheting um 5° relativ zur Körper/Plattform-Region der
      kleinen Untereinheit. Im Gegensatz dazu ist die 30S
      Untereinheit in der zweiten der beiden Subpopulationen nur um
      4° gegen die große Untereinheit verdreht, der Kopf jedoch um
      18° gegenüber der Körper/Plattform-Region gedreht. Die
      hochaufgelösten Strukturen ermöglichten die Visualisierung
      von Sekundärstrukturen und die Erzeugung molekularer Modelle
      mit dem neu entwickelten Algorithmus MDFIT, einem flexiblen
      Einpassen (engl. docking) von Kristallstrukturen unter
      Berücksichtigung molekularer Dynamiken. Dabei zeigte sich,
      dass die Konformation der ersten Subpopulation vergleichbar
      ist mit der in der Literatur beschriebenen Konformation des
      PRE-Zustands und dass sich die tRNA in der hybriden Bindung
      zwischen der P- und der E-Stelle befindet (P/E). Dies führt
      zu der Annahme, dass es sich bei der ersten Subpopulation um
      ein pre-translokationales Intermediat (TIPRE) handelt. Die
      zweite Subpopulation zeigt das Ribosom und die tRNA dagegen
      in einer neuen Konformation. Der Anticodon-Stem-Loop (ASL)
      der tRNA hat sich im Vergleich mit dem TIPRE um 8 - 10 °A in
      Richtung der E-Stelle bewegt, während gleichzeitig der
      Kontakt mit den P-Stellen-Komponenten des Kopfes der kleinen
      Untereinheit aufrechterhalten wird, indem die tRNA der
      starken Drehbewegung des Kopfes folgt. Diese gleichzeitige
      Interaktion mit P-Stellen-Komponenten des Kopfes und
      E-Stellen-Komponenten der Körper/Plattform-Region der kleinen
      Untereinheit kann als hybrides Intermediat innerhalb der 30S
      Untereinheit angesehen werden. Gleichzeitig bleibt der
      Kontakt mit der E-Stelle der 50S Untereinheit bestehen, so
      dass die übliche Nomenklatur zur Bezeichnung der
      tRNA-Position innerhalb des Ribosoms erweitert werden muss.
      Die neue hybride Bindung wird als pe/E bezeichnet (P-Stelle
      auf dem Kopf und E-Stelle auf der Plattform der 30S
      Untereinheit/E-Stelle auf der 50S Untereinheit). Gemeinsam
      mit dem gebundenen mRNA Codon kommt der ASL der Position
      einer komplett translozierten tRNA sehr nahe und diese
      Konformation einer partiell translozierten tRNA stellt ein
      post-translokationales Intermediat (TIPOST) auf dem Weg zur
      vollständigen Translokation dar. Im Gegensatz zu den
      verdrillten Konformationen der tRNA im TIPRE und TIPOST
      unterscheidet sich die Grundstruktur des Elongationsfaktors G
      in beiden Subpopulationen nur unwesentlich. Ein signifikanter
      Unterschied zeigt sich allerdings in Domäne IV des Faktors,
      die im TIPOST in Kontakt mit Helix 34 der 16S rRNA tritt.
      Dieser Kontakt wird ermöglicht, indem EF-G seine Position im
      Vergleich zum TIPRE leicht verändert hat und Helix 34 der
      starken Drehbewegung des Kopfes gefolgt ist. Dadurch ändert
      Helix 34 seine Position um 12 °A und kann nicht mehr mit der
      Region 530 der 16S rRNA interagieren. Als Folge davon wird
      der mRNA-Eingangskanal geöffnet und die Translokation des
      mRNA-tRNA2-Komplexes ermöglicht. Bis jetzt wurden
      intermediäre Zustände der Untereinheiten-Rotation als
      Intermediate auf dem Weg zur vollständigen Verdrehung
      betrachtet. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen jedoch, dass
      die Bewegung der tRNAs und letztendlich deren Translokation
      abhängig ist von einer Rückrotation der Untereinheiten und
      der Drehbewegung des Kopfes der kleinen Untereinheit. Dabei
      führt die schnelle GTP-Hydrolyse zu einer Destabilisierung
      der maximalen Untereinheiten-Rotation, da direkte und
      indirekte Kontakte der switchI-Region von EF-G mit der
      maximal rotierten 30S Untereinheit beeinflusst werden könnten
      und eine Rückrotation erleichtern. Im Kontext des Ribosoms,
      das als brown’sche molekulare Maschine beschrieben werden
      kann, wirkt EF-G wie eine Sperrklinke, die die Rückrotation
      der 30S Untereinheit von der Translokation entkoppelt und auf
      diese Weise die Translokation über mehrere intermediäre
      Zustände der tRNAs zwischen und innerhalb der Untereinheiten
      in die klassisch gebundenen Positionen (P/P und E/E) fördert
      und dirigiert. Die in den letzten Jahren vermehrt entdeckten
      ncRNAs erfüllen vielfältige biologische Aufgaben und die
      Kenntnis ihrer dreidimensionalen Struktur ist oftmals ein
      wichtiger Schritt zum Verständnis ihrer Funktionsweise. Da
      die meist kleinen ncRNAs nur schlecht den klassischen
      Strukturanalyseverfahren zugänglich sind, wurde im Rahmen
      dieser Arbeit eine andere Möglichkeit zur Aufklärung der
      Struktur gesucht. Die Verankerung kleiner RNA-Moleküle auf
      größeren Molekülen mit bekannter Struktur ermöglicht die
      Lokalisation der fixierten RNA. Die bei der
      Kryo-Elektronenmikroskopie eingesetzte Schockgefrierung
      konserviert zudem die RNA in einem quasi nativen Zustand und
      verhindert die Bildung von Artefakten, wie sie bei der
      Kristallbildung für die Röntgenkristallographie auftreten
      können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene ncRNAs
      (RNase P RNA von E. coli, B. subtilis und T. thermophilus,
      die 6S RNA von A. aeolicus und das Ribozym GIR1 von D.
      iridis) in unterschiedliche Helices (9, 25, 45 und 98) der
      23S rRNA von E. coli insertiert, um die Struktur der
      jeweiligen ncRNA mittels Kryo-Elektronenmikroskopie zu
      analysieren. Das 70S Ribosom von E. coli, dessen Struktur
      weitgehend bekannt ist, wurde dabei als Plattform benutzt.
      Die Expression mutierter Ribosomen erfolgte in einem
      hitzeinduzierbarem System mittels Temperaturwechsel auf 42° C
      in unterschiedlichen E. coli-Stämmen. Die gleichzeitige
      Expression nativer und mutierter 23S rRNA in diesem
      hitzeinduzierbaren System erforderte die Abtrennung der
      mutierten von den nativen Ribosomen. Dies war über den in
      Helix 98 der mutierten 23S rRNA insertierten MS2 tag möglich.
      Der über eine RT-PCR geführte Nachweis mutierter Ribosomen
      verlief im Fall der ncRNAs meist negativ, während sich der
      MS2 tag schon in cr70S, die eine Mischung nativer und
      mutierter Ribosomen darstellten, nachweisen ließ. So trugen
      aufgereinigte Ribosomen zu 100% den MS2 tag in Helix 98,
      während die zusätzlich insertierte ncRNA kaum oder gar nicht
      nachweisbar war. Ein deutlicher RT-PCR-Nachweis mutierter
      Ribosomen, die sowohl den MS2 tag als auch eine ncRNA trugen,
      gelang nur im Fall der Insertion des Ribozyms GIR1 in Helix
      9. Die Induktion durfte allerdings nur über einen Zeitraum
      von 30 min erfolgen und führte zu einer 10 - 20%igen
      Expression mutierter 23S rRNA. Die Aufreinigung der cr70S
      über den MS2 tag in Helix 98 ergab Ribosomen, die zu 100%
      diesen tag in Helix 98 trugen, aber nur zu 30% das Ribozym
      GIR1 in Helix 9. Die zusätzliche Insertion in Helix 9, die
      eventuell die Funktion des Ribosoms beeinträchtigt, wurde
      durch bisher nicht verstandene Mechanismen auf zellulärer
      Ebene aus dem Ribosom entfernt. Die
      kryo-elektronenmikroskopische Analyse der über den MS2 tag
      aufgereinigten Ribosomen ergab, dass bei etwa 45% der
      Partikel zusätzliche Elektronendichten sowohl in Helix 9 als
      auch Helix 98 vorhanden waren. Die Auflösung der erhaltenen
      Volumenrekonstruktion ist mit 18,4 °A allerdings viel zu
      niedrig, um eine präzise Interpretation der Struktur des
      Ribozyms vorzunehmen. Die Voraussetzungen für die Erstellung
      einer hochauflösenden Struktur, die im Rahmen dieser Arbeit
      nicht mehr realisiert werden konnte, sind allerdings
      erfüllt.
description: Protein biosynthesis is carried
      out by the ribosome and can be divided into four steps:
      initiation, elongation, termination and recycling. The
      elongation phase, a cyclic process, comprises the delivery of
      aminoacylated tRNAs to the A-site, peptide bond formation and
      translocation of tRNAs together with bound mRNA. In
      prokaryotes, translocation is catalysed by elongation factor
      G (EF-G) in a GTP-dependent manner. The exact mechanism of
      translocation is still unclear, although many biochemical
      studies have addressed this functional aspect of translation
      and high resolution structures of ribosomal complexes
      containing EF-G have become available. The intricate
      interplay of EF-G, tRNAs and different conformational states
      of the ribosome during translocation is far from being fully
      understood in mechanistic terms. As a result of this PhD
      work, novel insight into the mechanism of translation has
      been gained. Starting point was the formation and
      purification of ribosomal complexes consisting of 70S
      ribosomes from T. thermophilus bound to EF-G in its GDP form
      stalled with fusidic acid; the antibiotic allows GTP
      hydrolysis but inhibits conformational changes of EF-G and
      dissociation of EF-G from the ribosome. Such particles,
      further containing a deacylated tRNA, were analyzed by
      cryo-electron microscopy (cryo-EM). The collected cryo-EM
      data could be divided by multiparticle refinement into two,
      as yet undetected subpopulations within EF-G:ribosome
      complexes with 7.8 Å resolution for the first and 7.6 Å
      resolution for the second subpopulation. Both subpopulations
      show density for EF-G and one tRNA, but represent different
      conformational states. The first subpopulation showed a
      50S:30S ratcheting of 7 with a modest swiveling of the 30S
      head of 5. In contrast, a smaller ratcheting of only 4 is
      observed for the second subpopulation, but in this case the
      swivelling of the 30S head is increased to 18. The high
      resolution of the structures enabled the visualization of
      secondary structures and the generation of molecular models
      with the new developed algorithm MDFIT which allows for the
      flexible docking of crystal structures considering molecular
      flexibilities. It could be shown that the conformation of the
      first subpopulation is comparable to ribosomes in the
      PRE-state, with the tRNA in a hybrid position between P- and
      E-site (P/E) as described in the literature. Accordingly,
      this subpopulation has been proposed to represent a
      pre-translocational intermediate (TIPRE). The second
      subpopulation shows the ribosome and the tRNA in a new
      conformation. In comparison with the TIPRE state, the
      anticodon stem-loop (ASL) has moved about 8 10 °A towards the
      E-site while maintaining contact with P-site components of
      the 30S head, enabled by the tRNA following the movement of
      the head. The simultaneous interaction with P-site components
      of the 30S head and E-site components of the 30S
      body/platform is the hallmark of this newly identified
      intersubunit hybrid site within the small subunit. As the
      contact with the E-site of the 50S subunit is maintained, the
      previous nomenclature describing hybrid sites has to be
      extended. This new tRNA binding state is referred to as the
      pe/E hybrid position: the tRNA forms P-site contacts with the
      30S head and E-site contacts with the 30S platform, while
      being positioned at the E-site on the 50S side. The ASL
      together with the bound mRNA is very close to a fully
      translocated tRNA and the conformation of the partially
      translocated tRNA is considered to be a post-translocational
      intermediate (TIPOST). In contrast to the twisted
      conformations of the tRNA, EF-G shows only slight positional
      differences within both subpopulations. A significant
      difference is seen for domain IV of EF-G which gets in
      contact with helix 34 of 16S rRNA in the TIPOST state. This
      contact is made possible by a small shift of the position of
      EF-G and by helix 34 following the movement of the head. The
      position of helix 34 has changed by 12 °A while interaction
      with the 530 region of 16S rRNA is disrupted. As a result,
      the mRNA entry channel is opened and translocation of the
      mRNA-tRNA2-complex is enabled. So far, intermediate states of
      inter-subunit rotation were considered to be intermediates on
      the pathway to the fully rotated state. The present findings
      show that movement of tRNAs and translocation is dependent on
      back-ratcheting of the subunits and swiveling of the 30S
      head. We propose that fast GTP hydrolysis influences the
      interaction of the switch I region of EF-G with the 30S
      subunit, leading to a destabilization of the fully ratcheted
      state to enable back rotation. Based on the model of the
      ribosome acting as a Brownian ratchet machine during
      translocation, EFG is suggested to act as a dynamic pawl,
      decoupling the unratcheting motions of the ribosome from the
      transition of hybrid state tRNAs back into their classical
      states. Thereby, EF-G provides directionality and accelerates
      translocation of the tRNAs via several intermediate inter-
      and intra-subunit hybrid states into the classical P/P and
      E/E sites of the POST state. The numerous non-coding RNAs
      (ncRNAs) discovered in recent years exert a plethora of
      biological functions. The knowledge of their
      three-dimensional structure is important towards
      understanding their mode of function. However, many ncRNAs
      have turned out to be not amenable to X-ray crystallography.
      Here we pursued the approach to express ncRNAs as part of the
      23S rRNA in order to anchor and expose these ncRNAs on the
      structurally well-characterized ribosomal surface for
      structural analyses by cryo-electron microscopy. The use of
      cryo-electron microscopy combined with shockfreezing of the
      samples preserves the native state of the ncRNA and avoids
      generation of artefacts as they are possible in X-ray
      crystallography. Summary 101 Several different ncRNAs (RNase
      P RNA of E. coli, B. subtilis and T. thermophilus, 6S RNA of
      A. aeolicus and the ribozyme GIR1 of D. iridis) were
      covalently linked to distinct helices of 23S rRNA (helices 9,
      25, 45 and 98) of E. coli to elucidate the structure of the
      inserted RNA molecule using the 70S ribosome as a platform of
      known structure. Expression of mutated ribosomes was explored
      in different E. coli strains using a heat-inducible promoter
      system. This approach required to separate the simultaneously
      expressed native ribosomes from the mutant ones. This was
      possible by purification via an MS2 tag which was inserted
      into helix 98 of mutated ribosomes. Using RT-PCR, it was
      impossible in most cases to detect significant levels of 23S
      rRNA carrying the ncRNA insertion, while detection of the MS2
      tag was always possible in cr70S fractions representing a
      mixture of native and mutated ribosomes. Ribosomes purified
      via the MS2 tag were pure fractions of ribosomes carrying the
      MS2 tag, but the ncRNA insertions were hardly or not at all
      detectable. A distinct detection of mutant ribosomes carrying
      both the MS2 tag and the ncRNA was only feasible in the case
      of the ribozyme GIR1 inserted into helix 9 of 23S rRNA. The
      corresponding strain had to be induced for only 30 minutes,
      resulting in expression of mutated 23S rRNA to a level of 10
      20% of total cellular 23S rRNA. Affinity purification of
      corresponding cr70S preparations resulted in ribosomes all
      carrying the MS2 tag in helix 98, but only 30% also harboured
      the ribozyme GIR1 in helix 9. In general, the additional
      insertion in helix 9 seems to disturb the function of the
      ribosome, leading to excision of the inserted ncRNA and/or
      degradation of mutant 23S rRNA as part of as yet unknown
      cellular defense mechanisms. Cryo-EM analysis of
      affinity-purified ribosomes resulted in a volume with
      additional density for helix 9 (ribozyme GIR1) and helix 98
      (MS2 tag) in 45% of the particle images. The resolution of
      18.4 °A achieved so far is too low for a detailed structural
      interpretation, but provides the basis for the collection of
      a data set that is sufficient to to generate a high
      resolution structure.