title: Optimierung von DNA-Extraktionsmethoden für langzeit-konservierte Gewebspräparate
Creators: name: Zack, Nicole
Publisher: name: :none
Year: 2023

description: Der Otozephalie-Dysgnathia Komplex (ODC) ist eine tödliche Erkrankung humaner Föten, welche sich durch ausgeprägte Gesichtsdysmorphien auszeichnet. Da die Krankheit selten auftritt, weiß man über die genetischen Veränderungen, die ODC verursachen, noch relativ wenig. Im Wiener Narrenturm gibt es langzeit-konservierte Feuchtpräparate von Föten mit ODC als auch Föten, die nicht an ODC erkrankt waren. Um diese für genetische Untersuchungen heranziehen zu können, ist es notwendig, DNA in ausreichender Reinheit und Quantität isolieren zu können. Es ist bekannt, dass die DNA-Isolierung, insbesondere aus langzeit-Formalin eingelagerten Proben schwierig ist, da es aufgrund von stabilen Methylenbrücken zur Quervernetzung von Proteinen und der DNA kommt. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Optimierung der DNA-Extraktion aus langzeit-konservierten, fetalen Gewebsproben in Hinblick auf den Erhalt hoher Mengen, hoher Reinheit und hoher Ausbeuten an isolierter DNA, um nachfolgende genetische Analysen zu ermöglichen. Zur Studie wurden verschiedene Gewebstypen herangezogen, darunter Herz, Leber, Lunge, Milz, Magen, Muskeln, Nabelschnur, Großhirn und Kleinhirn. Die Konzentration und Reinheit der isolierten DNA wurde photometrisch und fluorometrisch bestimmt. Die DNA-Extrakte wurden einer Real time-PCR unterzogen. Die Identität der Amplikons wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese, hochauflösender Schmelzkurven (HRM)-Analyse und Pyrosequenzierung (PSQ) überprüft. Die Hot Alkali Extraktion eignete sich am besten zur Isolierung intakter DNA. Dadurch konnten sowohl die DNA-Extrakte von alkoholisch-fixierten als auch von FF, fetalen Geweben ohne ODC amplifiziert und viele PCR-Produkte sequenziert werden. Dennoch war eine reproduzierbare Amplifikation vieler DNA-Extrakte nicht möglich, wodurch es weiterer Modifizierungen bedarf. Von den an ODC-erkrankten Föten war durch den Erhalt geringer DNA-Ausbeuten und/oder aufgrund fragmentierter DNA keine PCR-Amplifikation möglich.
description: Otocephaly-dysgnathia complex (ODC) is a fatal disease of human foetuses characterised by marked facial dysmorphic disorders. Because the disease is rare, there is still a lack of knowledge about the genetic mutations that cause ODC. The Fool´s tower of Vienna contains long-term fixed wet preparations of foetuses with and without ODC. A prerequisite for using them for genetic studies is to isolate DNA in sufficient purity and quantity. However, it is known that DNA isolation, especially from long-term formalin stored samples, is difficult due to cross-linking of proteins and DNA caused by stable methylene bridges. The aim was to optimize extraction of DNA from long-term preserved fetuses with regard to achieve high amounts, high purity and high yields to allow downstream genetics analyses. The study involved different tissue types: heart, liver, lung, spleen, stomach, muscles, umbilical cord, cerebrum and cerebellum. Concentration and purity of the isolated DNA was determined photometrically and fluorometrically. DNA extracts were subjected to real time PCR, the identity of the amplicons was verified by agarose gel electrophoresis, high resolution melting (HRM) and pyrosequencing (PSQ). The hot alkali extraction was the most suitable method for isolating intact DNA. DNA extracts from both alcohol-fixed and FF fetal tissues without ODC could be successfully amplified and many PCR products could be sequenced. However, reproducible amplification of many extracts was not possible, which requires further modifications. PCR amplification of the foetuses with ODC failed due to very low DNA yields and/or due to fragmented DNA.