title: Regulation der Autophagie durch Miz1 in Brustdrüsenzellen und embryonalen Fibroblasten
title: Regulation of autophagy by Miz1 in mammary cells and embryonic fibroblasts
Creators: name: Paul, Tanja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Miz1 , Brustdrüsenzellen
Transkriptionsfaktor , Fibroblast
Autophagie
autophagy , mammary cells
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: Die Autophagie beschreibt einen
      katabolischen Prozess, bei dem für den Abbau bestimmtes
      Zellmaterial in Autophagosomen eingeschlossen und durch deren
      Verschmelzung mit Lysosomen zersetzt wird. Durch diesen
      Selbstreinigungs-Vorgang trägt sie zur Aufrechterhaltung der
      zellulären Homöostase bei und hilft durch Bereitstellung von
      Energielieferanten bei der Anpassung an nährstoffarme
      Bedingungen. Neben diesen Hauptaufgaben erfüllt die
      Autophagie außerdem wichtige Funktionen im Rahmen der
      Zellreifung, Differenzierung und bei der Immunabwehr. Ein
      gestörter Ablauf des autophagischen Prozesses hingegen ist
      mit verschiedenen Krankheitsbildern assoziiert. Für eine
      fehlerfrei ablaufende Autophagie ist das Zusammenspiel
      zahlreicherer Autophagie-assoziierter Proteine notwendig, die
      durch verschiedene übergeordnete Systeme reguliert werden. In
      früheren Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass der
      Transkriptionsfaktor Miz 1 in die Regulation der Autophagie
      involviert ist. Sowohl auf morphologischer als auch auf
      Genexpressionsebene wurden Unterschiede zwischen Zellen mit
      funktionierendem Miz 1 und solchen mit trunkiertem Miz 1
      beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die gefundenen
      Unterschiede in einem verbesserten Zellmodell reproduziert
      und außerdem der Einfluss der Interaktion zwischen Miz 1 und
      Myc auf den autophagischen Prozess untersucht werden. Hierfür
      wurde zunächst die murine Brustdrüsenzellline HC11 verwendet.
      Nach Induktion von Autophagie durch Inkubation der Zellen mit
      nährstoffarmem Medium wurde zuerst der zeitliche Verlauf der
      Expression von Miz 1 und verschiedener anderer Gene mittels
      quantitativer Real Time PCR untersucht. Dabei wurde nach
      einer anfänglichen Hochregulierung der Expression von CDKN1a
      eine zeitlich versetzte Induktion von Miz 1 und Myc, zusammen
      mit einer Herunterregulierung von CDKN1a beobachtet. Im
      weiteren Verlauf der Arbeit wurden HC11 Zellen mit
      verschiedenen Konstrukten infiziert, um eine Überexpression
      von Miz 1, Myc bzw. der Myc-Mutante V394D zu erreichen. In
      dieser Mutante ist eine Interaktion der beiden
      Transkriptionsfaktoren nicht möglich. Diese infizierten
      Zellen wurden dann für 6 Stunden mit EBSS behandelt und
      anschließend immunozytochemisch analysiert. Zur Beurteilung
      der autophagischen Aktivität wurden LC 3-Färbungen
      quantifiziert. In Zellen, die Miz 1 überexprimierten, konnte
      in diesem Experiment eine leicht erhöhte autophagische
      Aktivität im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle
      beobachtet werden. Während die Myc-überexprimierenden Zellen
      durch einen verstärkten Ablauf des autophagischen Prozesses
      auffielen, unterschieden sich Zellen die das mutierte Myc-Gen
      trugen kaum von den entsprechenden Kontrollzellen. Diese
      zuletzt genannten Ergebnisse konnten mittels
      Elektronenmikroskopie reproduziert werden und sprechen dafür,
      dass die Interaktion zwischen den beiden
      Transkriptionsfaktoren für die Regulierung der Autophagie
      eine Rolle spielt. Auch auf Genexpressionsebene konnten
      Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien nach Induktion
      der Autophagie gezeigt werden. Zellen, die MycV394D
      überexprimierten, zeichneten sich im Vergleich zu Zellen, die
      mit dem regulären, nicht mutiertem Myc-Vektor infiziert
      waren, durch eine signifikant erhöhte Expression von Atg 5,
      Atg 12 und Spast aus. Auch einige andere Gene zeigten
      unterschiedliche Expressionstendenzen nach Stimulierung der
      Autophagie in Abhängigkeit von den beiden Konstrukten. Der
      Versuch einer Herunterregulierung von Miz 1 mittels sh-RNA
      Interferenz war leider nicht erfolgreich. Aus diesem Grund
      wurde ein weiteres Zellmodell etabliert, in dem ein
      POZ-Domäne-Knockout des Miz 1-Gens mit Hilfe des
      Östrogen-Rezeptor-Modulators Tamoxifen induziert werden kann.
      In diesen modifizierten embryonalen Mausfibroblasten wurde im
      Einklang mit Ergebnissen aus früheren Arbeiten beobachtet,
      dass ein Fehlen von Miz 1 die Anpassung an nährstoffarme
      Bedingungen erschwert. Im Unterschied zu den früheren
      Experimenten, wurden in diesen Zellen jedoch keine
      Genexpressionsunterschiede für Atg 4c, Atg 5 und Atg 7 in
      Abhängigkeit von Miz 1 gemessen. Zusätzlich wurde im Rahmen
      dieser Arbeit eine Zelllinie entwickelt, die GFP-markiertes
      LC 3 bzw. einen entsprechenden Kontrollvektor überexprimieren
      und zukünftig zum Beispiel für Echtzeituntersuchungen der
      Autophagie in Abhängigkeit von Miz 1 verwendet werden können.
      Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit nicht nur der
      Einfluss von Miz 1 auf die Autophagie bestätigt werden,
      sondern zusätzlich die Relevanz einer funktionierenden
      Interaktion zwischen den Transkriptionsfaktoren Miz 1 und Myc
      für diesen essentiellen Prozess aufgezeigt werden.
description: Autophagy is a catabolic process
      in which cellular content determined for degradation is
      engulfed by autophagosomes and finally degraded by their
      fusion with lysosomes. With this self-cleaning mechanism it
      contributes to the maintainence of the cellular homeostasis
      and helps with the adaptation to nutrient-poor conditions by
      obtaining energy from intracellular resources. In addition to
      these main functions, autophagy fulfills important functions
      in the context of cell maturation, differentiation and for
      the immune system. Aside from that, an impaired autophagic
      process is associated with different disorders. The correct
      functioning of autophagy requires interaction of numerous
      autophagy-associated proteins which are tightly regulated. In
      previous works, it was already shown that the transcription
      factor Miz 1 is involved in the regulation of autophagy. Both
      morphological and gene expression level differences were
      observed between cells with wildtype Miz 1 and cells with
      truncated Miz 1. The aim of this thesis was to reproduce
      these previously found differences in an improved cell
      culture model and furthermore to analyze the influence of the
      interaction between Miz 1 and Myc on the autophagic process.
      For that purpose, the murine mammary cell line HC11 was used.
      Firstly, the change of gene expression levels from Miz 1 and
      other genes were analyzed over time when cells were incubated
      with nutrient-low medium. After an initial upregulation of
      CDKN1a expression, Miz 1 and Myc levels increased as CDKN1a
      went down again. In the further course of this work, HC11
      cells were infected with different constructs aiming to
      overexpress Miz 1, Myc and the Myc-mutant V394D. This
      mutation makes Myc interaction with Miz1 not possible. These
      infected cells were treated with EBSS for 6 hours and
      subsequently immunocytochemically analyzed. Cells
      overexpressing Miz 1 showed a slightly increased autophagic
      activity, as quantified by LC 3 immunofluorescence, compared
      to the corresponding control. While cells overexpressing Myc
      showed a boosted autophagy, cells with the mutated
      Myc-sequence did not differ from control cells. The latter
      results could be reproduced with electron microscopy and are
      indicative for a role of the interaction between Miz 1 and
      Myc in the regulation of the autophagic process. Also,
      differences in gene expression levels between the two cell
      lines could be assessed after induction of autophagy. Cells
      that overexpressed MycV394D were characterized by a
      significantly induced mRNA expression of Atg 5, Atg 12 and
      Spast compared to cells overexpressing the non mutated Myc
      gene. Some additional genes showed different expression
      tendencies between the two constructs. A knockdown of Miz 1
      via interference shRNA was unfortunately not successful. For
      that reason, another cell model was established in which the
      exons that code for the POZ-domain of Miz 1 are excised by
      the Cre-ER recombinase after tamoxifen induction. In
      accordance with previous results, deletion of Miz 1 led to a
      decreased adaptation ability to a nutrient-low environment in
      these modified mouse embryonic fibroblasts. In contrast to
      previous experiments, no Miz 1-dependent expression
      differences in Atg 4c, Atg 5 and Atg 7 were observed.
      Furthermore, other cell lines overexpressing GFP-labeled LC 3
      and a corresponding control vector, were developed. These can
      be used for real time investigation of the autophagic
      process. Summarizing, this work not only confirmed previous
      results on the influence of Miz 1 on autophagy but
      additionally demonstrated the relevance of the interaction
      between Miz 1 and Myc in this essential process.