title: Mechanistische Charakterisierung der späten Schritte der mitochondrialen Eisen-Schwefel Protein Maturierung.
title: Mechanistic characterization of the late steps of mitochondrial iron-sulfur cluster protein maturation.
Creators: name: Uzarska, Marta Agata
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Eisen
Saccharomyces cerevisiae
mitochondria,
Iron-sulfur clusters
Eisen, Mitochondrien
Naturwissenschaften

description: Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster
      gehören zu den ältesten Co-Faktoren und sind unabdingbar für
      die Funktion vieler Proteine. Die Synthese von Fe/S Clustern
      und deren Insertion in Apoproteine sind komplexe biochemische
      Vorgänge. In Mitochondrien wird die Biogenese von Fe/S
      Proteinen durch die ISC Assemblierungsmaschinerie
      (Iron-Sulfur Cluster Assembly) in drei Stufen durchgeführt.
      Im ersten Schritt wird ein Fe/S Cluster de novo aus
      Eisenionen und Sulfid, das durch eine Cysteindesulfurase
      bereitgestellt wird, auf dem Gerüstprotein Isu1 assembliert.
      In einem zweiten Schritt wird der Isu1-gebundene Fe/S Cluster
      mittels eines spezifischen Chaperonsystems dissoziiert, um
      dann schließlich durch spezielle Reifungsfaktoren auf die
      verschiedenen Zielproteine übertragen zu werden. Obwohl
      bereits einige Faktoren identifiziert wurden, die am Transfer
      von Fe/S Clustern auf Zielproteine beteiligt sind, ist über
      deren Zusammenspiel und ihre jeweilige spezifische Funktion
      wenig bekannt. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Rolle
      des Monothiol Glutaredoxin Grx5, der BolA-ähnlichen Proteine
      Aim1 und Yal044W sowie des Nfu1 in den späten Phasen der Fe/S
      Proteinbiogenese. Mutationen im humanen GLRX5 wurden mit
      mikrozytischer Anämie in Verbindung gebracht und eine
      Deletion im Zebrafisch ist embryonisch letal. In der Hefe S.
      cerevisiae ist Grx5 nicht essentiell, jedoch zeigen Zellen
      ohne Grx5 niedrige Enzymaktivitäten von Fe/S Proteinen, eine
      Akkumulation von mitochondrialem Eisen und oxidativen Stress.
      Es wurde bereits gezeigt, dass die Depletion von Grx5 eine
      Akkumulation von Fe/S Clustern auf Isu1 hervorruft, und diese
      nicht auf Zielproteine übertragen werden können. In dieser
      Arbeit konnte gezeigt werden, dass Grx5 einen Fe/S Cluster in
      vivo bindet, der für die Reifung aller zellulärer Fe/S
      Proteine benötigt wird, unabhängig vom Typ des gebundenen
      Fe/S Co-Faktors und deren subzellulärer Lokalisation. Grx5
      und Isu1 interagieren gleichzeitig mit dem Hsp70 Chaperon
      Ssq1 an unterschiedlichen Bindungsstellen. Grx5 stimuliert
      dabei nicht die ATPase Aktivität von Ssq1 und bindet
      bevorzugt an die ADP-Form von Ssq1. Die räumliche Nähe von
      Isu1 und Grx5 am Chaperon erleichtert den schnellen Fe/S
      Cluster Transfer von Isu1 auf Grx5. Somit verbindet Grx5 den
      Prozess der de novo Fe/S Clusterbiosynthese auf Isu1 mit dem
      Transfer des fertigen Fe/S Clusters auf entsprechende
      Zielproteine. BolA-ähnliche Proteine sind mit den Monothiol
      Glutaredoxinen über bioinformatische und experimentelle
      Ansätze in Zusammenhang gebracht worden. Um die Funktion der
      mitochondrialen BolA-ähnlichen Proteine zu studieren, wurden
      Hefezellen untersucht, in denen die Gene für Aim1 und Yal044W
      deletiert wurden. Während die Rolle der Yal044W in der Fe/S
      Proteinbiogenese unklar blieb, zeigten aim1Δ Zellen eine
      50%-ige Abnahme der Enzym-Aktivitäten der
      Succinatdehydrogenase und der Lipoat-abhängigen Enzyme
      Pyruvat- und α-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Die Aktivitäten
      der letzteren Enzyme sind abhängig von der Lipoat-Synthase
      Lip5, einem Fe/S Protein. Aim1 scheint für die katalytische
      Aktivierung, aber nicht für die de novo Insertion von Fe/S
      Clustern in Lip5 benötigt zu werden. Der Phänotyp von aim1Δ
      Zellen in Hefe ist kompatibel mit dem humaner Zellen aus
      Patienten mit fataler infantiler Enzephalopathie und/oder
      pulmonaler Hypertonie. Diese Erkrankung wird u.a. durch
      Mutationen im humanen Aim1 Homolog BOLA3 verursacht.
      Offensichtlich ist die Rolle der Aim1 Proteine als
      spezialisierte ISC Überträger-Proteine, die bei der Reifung
      einer Unterklasse mitochondrialer [4Fe-4S]-Proteine benötigt
      werden, in Eukaryoten konserviert. Mutationen im humanen NFU1
      wurden ebenfalls mit fataler infantiler Enzephalopathie und/
      oder pulmonaler Hypertonie in Verbindung gebracht. NFU1 wird
      für die Reifung der Fe/S Cluster der Atmungskettenkomplexe I
      und II und der Lipoat-Synthase in humanen Zellen benötigt.
      Nfu1-ähnliche Proteine binden Fe/S Cluster in vitro, woraus
      geschlossen wurde, dass Nfu1 ein Gerüstprotein ist, dass
      parallel zu Isu1 arbeitet. In dieser Arbeit wurde gezeigt,
      dass die Deletion von NFU1 in Hefe eine bis zu 5-fache
      Abnahme der Aktivitäten der Succinat-dehydrogenase und
      Lipoat-abhängiger Enzyme hervorruft. Dies stimmt mit den
      Befunden an NFU1 Patientenzellen überein. Hefe Nfu1, das eine
      Patienten-analoge Mutation trägt (Gly194Cys), bindet einen
      Fe/S Cluster wesentlich stabiler als das Wildtyp-Protein, und
      erlaubte somit erstmals den Nachweis einer Fe/S Cluster
      Bindung auf Nfu1 in vivo. Die Fe/S Cluster Bindung auf Nfu1
      war abhängig von der ISC Assemblierungsmaschinerie
      einschließlich Isu1, was ausschließt, dass Nfu1 ein zu Isu1
      alternatives Gerüstprotein ist. Aufgrund der verminderten
      Labilität des gebundenen Fe/S Clusters in Nfu1-Gly194Cys
      konnte dieses die Defekte der nfu1∆-Zellen in Hefe nur
      unvollständig retten, womit ein Einblick in die
      Krankheitsentstehung in menschlichen Patienten gegeben wurde.
      Die vorliegende Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis
      bei, wie Fe/S Cluster nach ihrer de novo Synthese auf dem
      Gerüstprotein Isu1 in den Mitochondrien weiter transferiert
      werden. Die hier gezeigte gleichzeitige Interaktion von Isu1
      und Grx5 auf dem spezialisierten Hsp70 Chaperon Ssq1
      ermöglicht einen effizienten Transfer der Fe/S Cluster von
      Isu1 zu Grx5, das wiederum als wichtiger ISC Faktor für die
      Reifung aller zellulärer Fe/S Proteine charakterisiert werden
      konnte. Weiterhin konnte eine unterstützende Funktion der
      Hefeproteine Nfu1 und Aim1 als spezialisierte
      Reifungsfaktoren nachgewiesen werden. Diese Erkenntnisse
      erlauben einen besseren Einblick in das mechanistische
      Zusammenspiel der späten Komponenten der mitochondrialen ISC
      Assemblierungsmaschinerie.
description: Iron-sulfur (Fe/S) clusters are
      among the oldest protein cofactors and are essential for the
      function of many proteins. Fe/S cluster synthesis and
      insertion into apo-proteins is a complex process. In
      mitochondria, Fe/S protein biogenesis is performed by the ISC
      (iron sulfur cluster) assembly machinery and can be divided
      into three major steps. First, the Fe/S cluster is assembled
      de novo on the scaffold protein Isu1 from iron and sulfide
      which is provided by a cysteine desulfurase. In a second
      step, the Isu1-bound Fe/S cluster is labilized with the help
      of a specialized chaperone system, and third, it is
      transferred to target apo-proteins by specific maturation
      factors. Although several factors involved in Fe/S cluster
      transfer to target proteins have been identified, their
      interplay and exact functions are not resolved. This work
      focusses on the role of the monothiol glutaredoxin Grx5, the
      BolA-like proteins Aim1 and Yal044W, and Nfu1 in the late
      phases of Fe/S protein biogenesis. Mutations in human Grx5
      have been associated with microcytic anemia, and its deletion
      in zebrafish is embryonically lethal. In yeast Grx5 is not
      essential, yet cells lacking Grx5 display low activities of
      Fe/S proteins, iron accumulation in mitochondria and
      oxidative stress. It was shown previously that upon depletion
      of Grx5, Fe/S clusters accumulate on Isu1 and cannot be
      properly transferred to the target proteins. Here it was
      shown that Grx5 binds a Fe/S cluster in vivo and is required
      for maturation of all cellular Fe/S proteins, regardless of
      the type of bound Fe/S cofactor and subcellular localization.
      Grx5 and Isu1 simultaneously interact with the dedicated
      Hsp70 chaperone Ssq1 at non-overlapping binding sites. Grx5
      does not stimulate the ATPase activity of Ssq1 and most
      tightly binds to the ADP form of Ssq1. The vicinity of Isu1
      and Grx5 on the chaperone facilitates rapid Fe/S cluster
      transfer from Isu1 to Grx5. Hence, Grx5 functions as a
      late-acting component of the core ISC assembly machinery
      linking Fe/S cluster synthesis on Isu1 with Fe/S cluster
      targeting to dedicated apo-proteins. BolA-like proteins have
      been linked to the monothiol Grxs by both bioinformatics and
      experimental approaches. To examine the function of
      mitochondrial BolA-like proteins yeast cells deleted for Aim1
      and Yal044W proteins were investigated. While the role of
      Yal044W in Fe/S biogenesis remains unclear, aim1Δ cells
      displayed a 50 % decrease in the activities of succinate
      dehydrogenase and lipoate-dependent enzymes (pyruvate and
      α-ketoglutarate dehydrogenases). Activities of latter enzymes
      depend on activity of Fe/S protein lipoate synthase Lip5.
      Aim1 seems to be needed for catalytic activation but not for
      de novo Fe insertion into Lip5. The phenotype of aim1Δ yeast
      cells is consistent with with the one observed in human
      patient cells where mutations in human Aim1 homolog BOLA3
      were associated with fatal infantile encephalopathy and/ or
      pulmonary hypertension. Hence, the role of Aim1 protein as an
      auxiliary ISC assembly protein facilitating the maturation of
      a subset of mitochondrial [4Fe-4S] proteins is conserved
      throughout eukaryotes. The human NFU1 has been associated
      with fatal infantile encephalopathy and/ or pulmonary
      hypertension, and is needed for the maturation of Fe/S
      clusters of respiratory complexes I and II and lipoate
      synthase. Previously, Nfu-like proteins were shown to bind
      Fe/S clusters in vitro and hence, a role was suggested in
      which Nfu1 functions as a scaffold protein alternatively to
      Isu1. Here, it is shown that nfu1Δ yeast cells display up to
      5-fold decreased activities of succinate dehydrogenase and
      lipoate-dependent enzymes, similarly as in NFU1 patient
      cells. Yeast Nfu1 carrying the mutation (Gly194Cys)
      corresponding to the one found in patients bound Fe/S cluster
      in a more stable fashion, and thus allowed for the first time
      the detection of Fe/S cluster association in vivo. Formation
      of the Nfu1-bound Fe/S cluster was dependent on the core ISC
      assembly machinery, including Isu1, ruling out the
      possibility of Nfu1 acting as an alternative scaffold
      protein. Due to the increased stability of the bound Fe/S
      cluster, Gly194Cys Nfu1 was not able to fully rescue the
      defects of nfu1Δ cells, giving an insight into disease
      development in the human patients. Taken together, this study
      contributed to a better understanding of how Fe/S clusters
      are handled in mitochondria after de novo synthesis on the
      scaffold Isu1. First, the joint interaction of Isu1 and Grx5
      on the specialized Hsp70 chaperone Ssq1 is important for
      efficient Fe/S cluster transfer from Isu1 to Grx5. Second,
      Grx5 is a crucial factor for maturation of all cellular Fe/S
      proteins. Third, an auxiliary role of yeast Nfu1 and Aim1 as
      dedicated maturation factors was established. These findings
      provide a better insight into how late-acting components of
      the mitochondrial ISC assembly machinery cooperate to
      efficiently mature Fe/S target proteins.