title: Etablierung von Systemen zur biochemischen, zellbasierten und strukturellen Charakterisierung der NS2B/3 Protease des Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus sowie anderer viraler Proteasen
Creators: name: Kurz, Martina
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Das FSME Virus ist ein humanpathogenes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Vom einzel- und (+)strängigen RNA Genom wird ein Vorläuferpolyprotein synthetisiert, das co- und post-translational von der viralen NS2B/3 Protease in seine funktionellen Einzelproteine zerlegt wird. Wir konnten zeigen, dass infektiöse Virionen auch von einer FSME-Mutante produziert werden, die anstelle der Erkennungssequenz für die NS2B/3pro eine optimierte Spaltstelle für die 3C Protease (3Cpro) vom Maul- und Klauenseuchevirus besitzt, sofern die entsprechende Protease in cis oder trans exprimiert wird. Passagieren dieses Mutanten in der Abwesenheit der aktiven 3Cpro führte zum Entstehen von drei Revertanten, in denen die Schnittstelle der NS2B/3pro im Kapsidprotein wieder vorhanden war. Eine Analyse der Eigenschaften der Revertanten zeigte, dass eine hydrophobere Verlängerung des Kapsidproteins zu einer verspäteten und verringerten RNA Synthese führt. Effizientes Budding des Nukleokapsid ist nur möglich, wenn sich am C-terminalen Ende des Kapsidproteins positiv geladene Aminosäuren befinden. Diese Ergebnisse implizieren, dass das Kapsidprotein für eine Vielzahl viraler Prozesse von Bedeutung ist. Weiters wurde die Gensequenz der Proteasedomaine des NS3 Proteins mit jener der Kernregion des Cofaktors NS2B verbunden und in E.coli exprimiert. Dieses Protein wurde sowohl für Kristallisationsexperimente zur strukturellen Charakterisierung, als auch zur Etablierung eines in vitro Assays zur biochemischen Charakterisierung der Protease verwendet. Das Substrat, C-prM, wurde in vitro translatiert, die Reaktionsbedingungen für die Proteolyse wurden optimiert. Effizienz und Spezifität der NS2B/3 wurden durch pankreatische mikrosomale Membranen weiter erhöht, unerwünschte Prozessierung durch die Signalpeptidase I durch eine Verlängerung der h-region des Signalpeptids inhibiert. Eine C-prM Mutante, mit einer Erkennungssequenz für die HIV-1 Protease anstelle jener für die NS2B/3pro, wurde verwendet, um die biochemischen Eigenschaften der HIV-1 Protease zu untersuchen. Dieser Assay ermöglicht es, unterschiedliche Proteasen in einem sicheren System zu untersuchen.
description: The tick-borne encephalitis virus (TBEV) belongs to the family of Flaviviridae and comprises a single positive-strand RNA genome, which is translated into one single polyprotein. Mature capsid protein C is cleaved from the polyprotein precursor by the viral NS2B/3 protease. We showed that infectious virions can also be produced from a TBEV mutant bearing an optimised cleavage site for the foot-and-mouth disease virus 3C protease (3Cpro) through the expression of the 3Cpro either in cis or in trans. Passaging of these TBEV mutants in the absence of an active 3Cpro led to the appearance of revertants in which capsid cleavage by NS2B/3pro had been regained. A comparison of the revertants reveals that the more hydrophobic the extension of protein C, the lower the rate of early RNA synthesis in general and the later the onset of early RNA replication and/or unpackaging in particular. A modular protease consisting of the protease domain of NS3 and the core-domain of cofactor NS2B, was expressed in E. coli. This protease was used in crystallisation experiments for structural, and in a trans-cleavage assay for biochemical characterisation. In the latter, reaction conditions were optimised to allow proteolytic cleavage of in vitro translated C-prM structural precursor protein. Efficiency and specificity of the NS2B/3pro were enhanced by providing canine pancreatic microsomal membranes, unwanted signal peptidase I cleavage was prevented by lengthening the h-region of the signal peptide. A C-prM mutant bearing a cleavage site for the HIV-1protease was used to examine cleavage by the corresponding protease. This assay should enable future studies of proteolysis requirements of various proteases in a save system.