Προσκόλληση ενεργοποιημένων ουδετεροφίλων - μετά από επώαση με την Helicobacter Pypori Neutrophil Activating Protein (HPNAP) και των τμημάτων της – σε ενδοθηλιακά κύτταρα και επίδραση των αραβινογαλακτανών (ΑGP) πρωτεϊνών της μαστίχας της Χίου
Creators: name: Μπεφάνη, Χριστίνα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2008
Subjects: Helicobacter pylori
Ουδετερόφιλα
Προσκόλληση
Ενδοτοξίνες
Neutrophil
Adhesion
Endotoxin

description: Το Helicobacter pylori, ένα αρνητικό κατά Gram βακτήριο το οποίο ζει στο βλεννογόνο του στομάχου των θηλαστκών, θεωρείται η βασική αιτία της χρόνιας γαστρίτιδας και του έλκους του στομάχου και έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η σχέση δομής λειτουργίας μιας πρωτεΐνης του ελικοβακτηρίου του πυλωρού, της ΗΡΝΑΡ (Helicobacter pylori Neutrophil Activating Protein), η οποία ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα πυροδοτώντας μια σειρά αντιδράσεων που έχουν ως τελικό αποτέλεσμα την συγκρότηση της NADPH οξειδάσης και την παραγωγή ελευθέρων ριζών που είναι καταστρεπτικές για τα κύτταρα. Εκτός από την HPNAP άγριου τύπου (HPNAPwt), στην εργασία χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα η αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης (HPNAP1-57), η καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης (HPNAP58-144) καθώς και η μεταλλαγμένη μορφή της (HPNAPmut) στην οποία είχε γίνει αντικατάσταση των Ηis25, Ηis37, Asp52 και Lys134 με αλανίνη. Τα αμινοξέα αυτά βρίσκονται στο ενεργό κέντρο και είναι υπεύθυνα τόσο για τον σχηματισμό των διμερών όσο και για την σταθεροποίησή τους σε υδατικά διαλύματα προκειμένου να συγκροτηθεί η πρωτεΐνη στην δωδεκαμερή της μορφή. Αρχικά όλες οι παραπάνω πρωτεΐνες υπερεκφράστηκαν, καθαρίστηκαν και απομονώθηκαν από στελέχη των βακτηρίων E.coli. Στην συνέχεια, οι πρωτεΐνες καθαρίστηκαν από τους λιποπολυσακχαρίτες (LPS) των βακτηρίων E.coli, οι οποίοι είναι ενδοτοξίνες και ισχυροί παράγοντες ενεργοποίησης των ουδετεροφίλων. Τα πειράματα που ακολούθησαν επικεντρώθηκαν στην μελέτη της ιδιότητας των ενεργοποιημένων ουδετεροφίλων να προσκολλώνται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, ο βαθμός προσκόλλησης των ουδεροφίλων στα ενδοθηλιακά κύτταρα αυξήθηκε σημαντικά μετά από επώαση με την HPNAP άγριου τύπου, την HPNAPmut και την HPNAP58-144 ξεχωριστά, ενώ η HPNAP1-57 δεν είχε καμμία επίδραση στην προσκόλληση. Το προκύπτον αποτέλεσμα έδειξε ότι η περιοχή 58-144 που περιέχει τις έλικες Η3 (L69-L75) και H4 (K89-E114) είναι υπεύθυνη για την προσκόλληση των ουδετερόφιλων στο ενδοθήλιο του τοιχώματος των αγγείων. Τέλος, στην συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε και η δράση του εκχυλίσματος της Μαστίχας της Χίου κατά του ελικοβακτηρίου όσον αφορά την ιδιότητα της προσκόλλησης. Η σχέση των AGP πρωτεϊνών της μαστίχας με την ΗΡΝΑΡ διερευνήθηκε με την ταυτόχρονη επώαση των ουδετεροφίλων με εκχύλισμα μαστίχας και των πρωτεϊνών HPNAP άγριου τύπου, HPNAPmut, καθώς και της HPNAP58-144 και στην συνέχεια μετρήθηκε ο βαθμός προσκόλλησης των ουδετεροφίλων σε υπόστρωμα ενδοθηλιακών κυττάρων. Η επίδραση του εκχυλίσματος της μαστίχας είχε ως αποτέλεσμα όχι μόνο την μείωση αλλά την πλήρη παρεμπόδιση των ουδετεροφίλων να προσκολληθούν στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Αυτό δείχνει ότι τα υδατοδιαλυτά συστατικά της μαστίχας παρεμποδίζουν την εξέλιξη της φλεγμονής του ελικοβακτηρίου του πυλωρού.
description: Helicobacter pylori, a Gram-negative bacterium which colonises the gastric mucosa of humans is now recognised as the major aetiological agent of chronic gastritis and peptic ulcer disease and has been linked with the development of gastric carcinoma. The present study is dealing with the structure-function relationship of the HPNAP (Helicobacter pylori Neutrophil Activating Protein) protein of H.pylori that crosses the epithelial lining and recruits neutrophils and monocytes which extravasate and cause tissue damage by releasing reactive oxygen intermediates (ROIs). In this study the HPNAP wild type, the N-terminal and the C-terminal region of the HPNAP as well as the HPNAP mutant where the residues Ηis25, Ηis37, Asp52, Glu56 and Lys134 were replaced by Ala were used. These residues are localized within the ferroxidase center of the protein and they are responsible for the formation and stability of the protein dimmers, which is the first step in the process of dodecamer formation. The expression and the purification of all the above proteins were followed by the removal of the lipolysaccherides (LPS) which are endotoxins and potent activators of neutrophils. Then, the HPNAP-induced neutrophil adhesion to endothelial cells was studied. The HPNAP wild type, the HPNAP mutant and the C-terminal region of the HPNAP enhanced neutrophil adhesion to endothelial cells whereas, the N-terminal region displayed a remarkable lack of this ability. This result showed that the C-terminal region of the HPNAP which contains the helices H3 (L69-L75) and H4 (K89-L114) is responsible for the neutrophil adhesion to the endothelium. Finally, in this study activity of the water extract of mastic gum against the H.pylori was investigated. Human neutrophils were incubated with either HPNAP wild type or HPNAP mutant or the C-terminal region of HPNAP both in the presence and in the absence of water extract of mastic gum and the attachment of thus treated neutrophils to endothelial cells was measured. The water extract of mastic gum not only decreased but also blocked the neutrophil attachment to endothelial cells caused by the HPNAP and its C-terminal region.This shows that the mastic gum inhibits the development of inflammation caused by H.pulori.