Εφαρμογή και αρχική αξιολόγηση μοριακής μεθόδου διάγνωσης στις ονυχομυκητιάσεις
Creators: name: Λούκα, Αλεξάνδρα Κωνσταντίνου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Ονυχομυκητίαση
Πολυπλεκτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Candida και δερματόφυτα
Onychomycosis
Multiplex PCR
Candida and dermatophytes

description: Εισαγωγή: Η ονυχομυκητίαση είναι η πιο συχνή πάθηση των νυχιών με συχνότητα που αγγίζει το 10% στο γενικό πληθυσμό και φτάνει ως το 40% στους ηλικιωμένους. Τα υπεύθυνα αίτια περιλαμβάνουν τους δερματοφυτικούς μύκητες και ακολουθούν τα είδη Candida και οι μη-δερματοφυτικοί νηματοειδείς μύκητες. Οι κλασσικές μέθοδοι ταυτοποίησης περιλαμβάνουν την άμεση μικροσκόπηση και καλλιέργεια του νυχιού, αλλά είναι χρονοβόρες και απαιτούν καλά εκπαιδευμένο προσωπικό με ειδικές γνώσεις μυκητολογίας. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι ένα χρήσιμο εναλλακτικό διαγνωστικό εργαλείο που μπορεί να ταυτοποιεί ταχύτατα και έγκυρα τους υπεύθυνους μύκητες. Σκοπός: Σκοπός αυτής της μελέτης είναι ο σχεδιασμός μιας πολυπλεκτικής PCR που θα ανιχνεύει την ύπαρξη στα νύχια των δύο συχνότερων αιτιών των ονυχομυκητιάσεων, των δερματοφύτων και της Candida, σε μία μόνο αντίδραση. Υλικά και μέθοδοι: Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν όνυχες και οι καλλιέργειές τους από ασθενείς με εικόνα συμβατή ονυχομυκητίασης καθώς και στελέχη που κρατήθηκαν στα πλαίσια εξωτερικού ποιοτικού ελέγχου. Η εκχύλιση έγινε με την κατοχυρωμένη μεθοδολογία (διεθνής πατέντα) της Μονάδας Μυκητολογίας και Παρασιτολογίας του Ινστιτούτου Statens Κοπεγχάγης. Εφαρμόσθηκαν τρία πρωτόκολλα PCR, ένα για την ανίχνευση των ζυμομυκήτων, ένα για την ανίχνευση των δερματοφύτων και ένα τρίτο πολυπλεκτικό των δύο προηγούμενων. Αποτελέσματα: Όλα τα εκχυλίσματα των καλλιεργειών και των ονύχων με Candida έδωσαν προϊόν στις μεμονωμένες και στην πολυπλεκτική PCR. Δυσκολίες υπήρξαν μόνο στα εκχυλίσματα των ονύχων που έπασχαν από δερματόφυτα καθώς σε μερικά από αυτά εμφανίσθηκαν αχνά προϊόντα ή/και μη ειδικές ανεπιθύμητες ζώνες. Η ευαισθησία της μεθόδου έφτασε ως 0,025 ng/μl/ανά αντίδραση για την Candida albicans και 2,5 ng/μl για το T. rubrum. Συμπεράσματα: Αναπτύχθηκε μία νέα αντίδραση πολυμεράσης που μπορεί ταχύτατα να ανιχνεύσει την ύπαρξη δερματόφυτου ή/και Candida στους όνυχες, καθιστώντας την πολύτιμο εργαλείο στην διάγνωση του ασθενούς και στην άμεση έναρξη τεκμηριωμένης θεραπευτικής αγωγής.
description: Introduction: Onychomycosis is the most common nail disorder and its prevalence varies from 10% in the general population reaching up to 40% among the elderly. The dermatophytes are the most common causative agents followed by Candida sp. and non-dermatophyte moulds. The diagnosis of onychomycosis is conventially made by direct microscopy and fungal culture but these techniques are time-consuming and require experienced investigators with good knowledge of mycology. Polymerase chain reaction is a useful alternative diagnostic tool that identifies accurately and rapidly the pathogenic fungi. Objective: The purpose of this study is to design a new single multiplex PCR which will detect the presence of the two most common causative agents, dermatophytes or/and Candida sp., in clinically diseased nails. Materials and methods: The materials of this study include nail samples and their cultures from patients with clinically suspected onychomycosis and some clinical isolates from the external quality control scheme. DNA extraction was performed using the methodology, proposed by the Statens Serum Institute of Copenhagen (Denmark patent-WO/2006/133701). Three PCR protocols were tested, one for the detection of dermatophytes, one for Candida sp., and one for the multiplex format. Results: PCR products were visible from all DNA extractions originated from fungal cultures and nails with Candida, in both separate PCRs and multiplex format. Some difficulties were only faced with dermatophyte nail extractions as some of them gave faint PCR amplification products and non-specific bands. The analytical sensitivity of the method was found to be 0.025 ng/μl/per reaction for the detection of Candida albicans and 2.5 ng/μl/per reaction for T. rubrum. Conclusion: A new single multiplex PCR for the detection of dermatophyte and Candida nail infections was developed. The technique facilitates the rapid and accurate diagnosis of onychomycosis and allows the early and pre-emptive antifungal treatment.