title: The pyrimidine nucleotide transporter Mrs12p mediates iron uptake into yeast mitochondria
Creators: name: Hassler, Melanie Rosalia
Publisher: name: :none
Year: 2008

description: Für Mitochondrien ist die Aufnahme von Eisen für die Eisen-Schwefel Cluster Biogenese, für die Haem-Synthese und für die Funktion vieler mitochondrialer Proteine von entscheidender Bedeutung. In S. cerevisiae hatte man bereits zwei mitochondriale Carrier Proteine, Mrs3p und Mrs4p, identifiziert, welche für den Eisentransport unter Eisenmangelzustand verantwortlich sind. Einige Beobachtungen weisen jedoch darauf hin, dass diese Proteine nicht das einzige System zur Eisenaufnahme ausmachen. Interessanterweise ist der mitochondriale Pyrimidin-Nukleotid Transporter Mrs12p in der Lage, als Multi-Copy Suppressor des mrs3/4D Phenotyps zu wirken und stellt daher einen Kandidaten für Eisenaufnahme bei normalen Eisenkonzentrationen in der Zelle dar. In dieser Arbeit soll die Beteiligung von Mrs12p an der mitochondrialen Eisenaufnahme und die Rolle, die der Pyrimidintransport bei der Suppression des mrs3/4D Phenotyps spielt, untersucht werden. Die Expression von FET3 einer mrs3/4/12D und einer mrs3/4D Mutante wurde mittels GFP-Expression beobachtet und Microarray Daten, welche die Induktion von Genen des Eisen-Regulons einer mrs3/4/12D Mutante aufzeigen, wurden dargestellt und mit der Genexpression einer mrs12D Mutante verglichen. FET3-Expression und Expression Profiling weisen auf eine Rolle von Mrs12p beim mitochondrialen Eisen-Erwerb hin. Um die Rolle des Pyrimidin-Transports zu untersuchen, wurde eine Mutante im Kontaktpunkt II von Mrs12p hergestellt. Überexpression des mutierten Gens führte zu keiner Suppression der mrs12D Mutante und keine Pyrimidin-Aufnahme konnte in Mitochondrien, welche das mutierte Protein besaßen, beobachtet werden. In Wachstumstests wurde keine Suppression des mrs3/4D Phenotyps gesehen und Eisen-Aufnahme in submitochondriale Partikel (SMPs) war im Vergleich zu Wild-Typ SMPs oder mrs3/4D SMPs, die MRS12 überexprimierten, deutlich reduziert. Vor dieser Arbeit war bereits bekannt, dass Überexpression von MRS12, außer zur Suppression des mrs3/4D Phenotyps, auch zur Suppression des mrs2D Phenotyps führt. Dieser Phenotyp kommt durch das Fehlen des mitochondrialen Mg2+ Transporters Mrs2p zustande. Das führte uns zu der Annahme, dass Mrs12p nicht nur eine Funktion als Eisentransporter, sondern als Transporter mit geringer Affinität zu verschiedenen divalenten Metallen haben könnte. Daher untersuchten wir die mitochondriale Mg2+-Aufnahme im Detail mittels Transportstudien an Mitochondrien mit dem fluoreszierenden Mg2+-Chelator mag-fura 2. Diese zeigten, dass Überexpression von MRS12 den Mg2+ Transport fördert, bei Expression der Mutante wurde jedoch keine Zunahme gesehen. Überexpression des mutierten Gens führte auch zu keiner Suppression des mrs2D Phenotyps. Diese Beobachtungen zeigen, dass Fe2+ und Mg2+ gemeinsam mit Pyrimidin-Nukleotiden von Mrs12p in die Mitochondrien transportiert werden. Abschließend wird die Bedeutung dieser Ergebnisse für die Aufnahme divalenter Kationen in die Mitochondrien der Hefe diskutiert.
description: Iron uptake into mitochondria is of key importance for iron-sulfur cluster biogenesis, for heme synthesis and for the function of many mitochondrial proteins. In S. cerevisiae, the mitochondrial carrier proteins Mrs3p and Mrs4p had previously been identified to be the main iron transporters under iron limiting conditions. However, several indications point to the possibility that these proteins do not represent the sole system of mitochondrial iron import. Interestingly, the mitochondrial pyrimidine nucleotide transporter Mrs12p had recently been found to function as multi-copy suppressor of the mrs3/4D phenotype and therefore is a possible candidate for low-affinity mitochondrial iron uptake. In this work, Mrs12p's involvement in mitochondrial iron uptake and the role of pyridimine transport in the proteins's ability to suppress the mrs3/4D phenotype were studied. FET3-expression in mrs3/4/12D and mrs3/4D mutants was monitored by GFP-expression and microarray data showing induction of genes belonging to the iron-regulon of a mrs3/4/12D mutant were compared to mrs12D gene expression. Both FET3-expression and genome wide expression profiling pointed to a role of Mrs12p in mitochondrial iron acquisition. For studying the role of pyrimidine transport, a mutant in contact site II of Mrs12p was created. Overexpression of the mutated gene did not complement the mrs12D phenotype and no pyrimidine transport into mitochondria carrying the mutated protein was observed. Suppression of the mrs3/4D phenotype in growth tests was not seen and iron uptake into submitochondrial particles (SMPs) was significantly reduced when compared to wild-type SMPs or mrs3/4D SMPs overexpressing MRS12. Besides suppression of the mrs3/4D phenotype, it had already been reported that overexpression of MRS12 also suppresses the mrs2D phenotype, which is due to lack of mitochondrial Mg2+ uptake. Considering this, we assumed a function of Mrs12p in not only iron, but low-affinity divalent metal transport and therefore looked at mitochondrial Mg2+ uptake in more detail. Transport studies into mitochondria using the fluorescent Mg2+-chelator mag-fura 2 showed that overexpression of MRS12 enhances Mg2+ transport into mrs2D mitochondria, but no increase in Mg2+ transport was seen in the case of the mutant. Also, overexpression of the mutated gene did not suppress the mrs2D phenotype. These observations imply that Mrs12p transports Fe2+ and Mg2+ into mitochondria together with pyrimidine nucleotides. The relevance of these results for divalent cation uptake into yeast mitochondria will be discussed in the last part of this work.