title: Characterizing the role of STAT5 proteins in JAK2 V617F-positive myeloproliferative neoplasms
Creators: name: Kavaja, Nikoleta
Publisher: name: :none
Year: 2024

description: Myeloproliferative Neoplasien (MPN) sind maligne Bluterkrankungen, die sich aufgrund der übermäßigen Vermehrung mutierter hämatopoetischer Stammzellen (HSC) im Knochenmark entwickeln, gefolgt von der anschließenden bösartigen Ausbreitung reifer Zellen der myeloiden Linie. Die drei klassischen MPN-Subtypen sind Polycythaemia vera (PV), essentielle Thrombozythämie (ET) und primäre Myelofibrose (PMF), die alle häufig durch dieselbe Mutation im JAK2-Gen verursacht werden. Diese Mutation, die JAK2V617F-Mutation, führt zu einer konstitutiv aktiven JAK2-Kinase und damit zu einer erhöhten Aktivierung der Proliferations- und Überlebensgene, die vom nachgeschalteten Transkriptionsfaktor STAT5 angesteuert werden. STAT5 besteht aus zwei verschiedenen Genprodukten, STAT5A und STAT5B, deren unterschiedliche Rollen bei menschlichen Erkrankungen noch untersucht werden. Frühere Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass MPN-Zelllinien (HEL, SET-2), die positiv für die JAK2V617F-Mutation sind, bei erhöhten STAT5B-Genexpression einen proliferativen Vorteil gegenüber solchen mit erhöhten STAT5A-Genexpression haben. Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass STAT5B der wichtigste nachgeschalteter Effektor von JAK2V617F sein könnte, und führt uns zu der Hypothese, dass STAT5B in diesem Zusammenhang das stärker onkogene Geschwister sein könnte. Ziel dieses Projekts war es, unser Verständnis der Funktionen der STAT5-Varianten in MPNs zu erweitern und zu untersuchen, ob und wie die beiden Varianten unterschiedliche Rollen auf die Krankheitsentwicklung spielen. Dazu haben wir sowohl menschliche MPN- als auch murine hämatopoetische Zelllinien verwendet. Wir untersuchten zuerst die Proliferation einer humanen MPN-Zelllinie (HEL), die homozygot für die JAK2V617F-Mutation ist, nach Knock-out oder Knock-down von entweder STAT5A oder STAT5B Variante mithilfe eines MTS-Assays. Wir stellten die Hypothese auf, dass reduzierte STAT5B die Proliferation von HEL-Zellen stärker reduzieren würde als die Reduzierung des STAT5A Proteins. Wir beobachteten eine gewisse Variabilität zwischen den Wiederholungen unserer Experimente. In den ersten beiden Assays verringerte die Abwesenheit von STAT5B die Zellproliferation stärker als die Abwesenheit von STAT5A. Dieser Effekt war über die Zeit nicht konsistent. Dann haben wir verschiedene Methoden zur Messung der Zellproliferation verwendet und unterschiedliche Testbedingungen optimiert. Aufgrund weiterer Dateninkonsistenzen zwischen den Wiederholungen der Experimente konnten wir keine Schlussfolgerungen auf die Auswirkungen des Mangels an STAT5A oder an STAT5B auf die Proliferation von HEL-Zellen ziehen. Wir untersuchten auch die Auswirkungen des Fehlens einer der beiden STAT5-Varianten auf die Expressions- und Aktivierungsniveaus zweier anderer Transkriptionsfaktoren der STATFamilie, STAT1 und STAT3. Es ist bekannt, dass diese zusätzlich zu STAT5, in hämatopoetischen Zellen durch JAK2V617F aktiviert werden und als Kompensationsmechanismen bei STAT5A/B-Verlust dienen könnten. Wir beobachteten keine Auswirkung des Fehlens einer der beiden STAT5-Varianten auf die Expressions- und Aktivierungsniveaus von STAT1 und STAT3. Darüber hinaus waren wir daran interessiert, die Wirkung von STAT5A oder STAT5B auf die Apoptose zu untersuchen. Dazu verwendeten wir HEL-Zellen mit erhöhten STAT5A- oder STAT5B-Genexpression und induzierten Apoptose mit Interferon-Alpha (IFNα). Leider wurde selbst nach einer gewissen Optimierung des Assays nur eine sehr schwache Wirkung von IFNα auf die Zelllebensfähigkeit beobachtet. Wir beobachteten jedoch einen Trend, dass STAT5Büberexprimierende Zellen im Vergleich zu STAT5A-überexprimierenden Zellen oder der leeren Vektorkontrolle geringere Apoptosewerte aufwiesen. Dieser Effekt war jedoch gering und muss durch weitere Experimente und Optimierung des Assays bestätigt werden. Frühere Daten zeigten auch, dass JAK2V617F-positive MPN-Patienten ein erhöhtes Maß an STAT5B-mRNA-Expression aufweisen (Rampal et al., 2014). Um zu untersuchen, ob dies eine direkte Folge der JAK2V617FMutation selbst ist, verwendeten wir eine murine hämatopoetische Vorläuferzelllinie (HPC-7), die die JAK2V617F-Mutation transgen exprimiert, und bestimmten ihre STAT5A- und STAT5BExpressionswerte. Überraschenderweise beobachteten wir in Zellen mit JAK2V617F im Vergleich zu Wildtyp-Zellen einen Rückgang von STAT5A und STAT5B sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das Ausschalten von STAT5B in einer für die JAK2V617F-Mutation positiven menschlichen MPN-Zelllinie die Zellproliferation verringern kann und eine Überexpression von STAT5B die Zellapoptose verringern kann. Unsere Ergebnisse waren jedoch unterschiedlich und weitere Experimente und Optimierungen sind für die klare Schlussfolgerungen erforderlich. Das Fehlen einer der STAT5-Varianten hatte keinen Einfluss auf die Proteinebene oder die Aktivierungsebene von STAT1 und STAT3. Schließlich zeigten unsere Experimente einen unerwarteten Rückgang der STAT5A/BmRNA-und Proteinebene in einer Maus-Vorläuferzelllinie, die die JAK2V617F-Mutation transgen exprimierte. Um die Pathogenese von MPNs besser zu verstehen, bleibt die Untersuchung der unterschiedlichen Rollen von STAT5A/B-Proteinen unten des JAK2V617F bei diesen Krankheiten ein interessantes Thema und dient als wichtiger Schritt zur Entwicklung neuer und Verbesserung der derzeit verfügbaren zielgerichteten Therapien.
description: Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are blood malignancies that develop due to the over proliferation of mutated hematopoietic stem cells (HSC) in the bone marrow, followed by the subsequent malignant expansion of mature cells of the myeloid lineage. The three classical MPN subtypes are polycythemia vera (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF), all of which are frequently driven by a mutation in the JAK2 gene. This mutation, JAK2V617F, results in a constitutively active JAK2 kinase and therefore increased activation of the proliferation and survival genes targeted by the downstream transcription factor STAT5. STAT5 comprises two different gene products, STAT5A and STAT5B, whose differential roles in human disease remain under investigation. Previous work in our lab has shown the proliferative advantage of MPN cell lines (HEL, SET-2) positive for the JAK2V617F mutation upon increased levels of STAT5B over those with increased levels of STAT5A. This suggests that STAT5B may be the main downstream effector of JAK2V617F and leads us to hypothesize that STAT5B is the more oncogenic sibling in this context. The aim of this project was to expand our understanding of the functions of the STAT5 variants in MPNs by investigating whether the two variants have different roles in the disease. For this we used both human MPN and murine hematopoietic cell lines. We first assessed the proliferation of a human MPN cell line (HEL), homozygous for the JAK2V617F mutation, upon knock-out or knock-down of either STAT5A or STAT5B, using an MTS assay. We hypothesized that reduced STAT5B levels would reduce HEL cell proliferation to a higher extent than the reduction of STAT5A protein. We observed some degree of variability between the repeats of our experiments. In the first two assays the absence of STAT5B did decrease the proliferation of cells to a higher degree, compared to the absence of STAT5A. However, this effect was not consistent over time. We proceeded to optimize different methods of measuring cell proliferation and different assay conditions, however due to further inconsistency of the results, we were not able to conclude on the effect of a lack of STAT5A or STAT5B on the proliferation of HEL cells. We also studied the effect of the absence of either STAT5 variant on the expression and activation levels of two other transcription factors of the STAT family, STAT1 and STAT3. These are, in addition to STAT5, known to be activated by JAK2V617F in hematopoietic cells and could serve as compensation mechanisms upon STAT5A/B loss. We observed no effect of the absence of either STAT5 variant on STAT1 and STAT3 expression and activation levels. Additionally, we were interested in investigating the effect of STAT5A or STAT5B on apoptosis. For this we used HEL cells with increased STAT5A or STAT5B levels and induced apoptosis with interferon-alpha (IFNα). Unfortunately, only a very weak effect of IFNα on cell viability was observed even after some optimization of the assay. We did however observe a trend that STAT5B over-expressing cells had decreased levels of apoptosis compared to STAT5A overexpressing cells or the empty vector control. This effect however was small and needs to be confirmed by further experiments and optimization of the assay. Previous data also showed that JAK2V617F positive MPN patients have increased levels of STAT5B mRNA expression (Rampal et al., 2014). To investigate whether this is a direct consequence of the JAK2V617F mutation itself, we used a murine hematopoietic precursor cell line (HPC-7) which transgenically expresses the JAK2V617F mutant and examined the STAT5A and STAT5B levels. Surprisingly, we observed decreased STAT5A and STAT5B both at the mRNA and protein level in cells with JAK2V617F compared to wildtype cells. To summarize, our results indicate that knocking out STAT5B in a human MPN cell line positive for the JAK2V617F mutation may decrease cell proliferation, and STAT5B over-expression may reduce cell apoptosis, but our results were variable and further experiments and optimization are required to make clear conclusions. The absence of either STAT5 variant had no effect on the protein levels nor the activation levels of STAT1 and STAT3. Lastly, our experiments showed an unexpected decrease in STAT5A/B mRNA and protein levels in a mouse progenitor cell line transgenically expressing the JAK2V617F mutation. In conclusion, to better understand the pathogenesis of MPNs, studying the differential roles of STAT5A/B proteins downstream of the JAK2V617F in these diseases remains a topic of interest and serves as an important step towards development of novel and improvement of currently available targeted therapies.