title: Quantifying bone extracellular matrix properties for improved clinical fracture risk prediction
Creators: name: Kochetkova, Tatiana
Publisher: name: Universität Bern
Year: 2023
Subjects: subject: 530 Physics
subject: 570 Life sciences; biology
subject: 610 Medicine &amp; health
subject: 620 Engineering

description: Metabolic bone diseases like osteoporosis lead to increased bone fragility and consequent implications for the patient lifestyle and health expenses. In the present aging society, fragility fractures pose significant health and economic burden. Current clinical methods to assess bone health status (dual-energy X-ray absorptiometry, FRAX, quantitative computed tomography variations) depend mostly on bone mineral density (BMD) measurements. However, BMD alone only accounts for about 70% of the variance in bone strength. It is therefore of high interest and potential societal impact to investigate bone quality, i.e. measures other than BMD influencing bone strength and toughness.
In the present thesis, novel laboratory methods were developed for high-throughput investigation of bone properties, with the ultimate goal to define combinations of measurements that can be used as a proxy for bone quality in a fracture risk analysis. Firstly, a novel method for quantifying mineralized collagen fibril orientation based on polarized Raman spectroscopy (qPRS) was calibrated and validated on a natural material (mineralized turkey leg tendon). This method enables the quantitative estimation of the local degree of mineralization and 3D collagen fibril orientation non-destructively at submicron resolution. It was then applied to the cortex of bovine bone samples in combination with micropillar compression, allowing to reliably determine structure-property relationships of bone at the microscale. Later, a multimodal framework for bone characterization was developed in another animal bone model (minipig jawbone). This included the development of a novel femtosecond laser ablation protocol for bone micropillar fabrication allowing high-throughput and site-matched testing without exposure to high vacuum.
The key part of the research was then carried out on a set of femoral neck samples collected from patients who underwent the hip arthroplasty due to osteoarthritis or fragility fracture. The femoral neck cortex from the inferomedial region was analyzed ex vivo in a site-matched manner using a combination of micromechanical testing (nanoindentation, micropillar compression) together with micro-computed tomography and quantitative polarized Raman spectroscopy for both morphological and compositional characterization. The output bone properties were correlated with the clinical information about age, gender, and primary diagnosis (coxarthrosis or hip fracture) of the participating patients.
Patient gender and diagnosis did not influence any of the investigated bone properties. Moreover, all mechanical properties as well as the tissue-level mineral density were nearly constant over all ages (45-89 y.o.). Only local tissue composition was found to change significantly with age: decline in mineral to matrix ratio and increase in collagen cross-link ratio. Site-matched microscale analysis confirmed that all investigated mechanical properties except yield strain demonstrate a positive correlation with the mineral fraction of bone. The large dataset of experimentally assessed microscale bone properties together with the available clinical information of the patients allowed the application of machine learning algorithms for fracture prediction in silico. Logistic regression classification suggests that indentation hardness, relative mineralization and micropillar yield stress are the most perspective parameters for bone fracture risk prediction.
As a result of this thesis, the output database of experimental measurements is the first to integrate microscale mechanical, chemical, morphological, and clinical information about the patients. In future, it can be used to compare existing methods of bone quality assessment. Moreover, the presented data and analysis approaches may be used to improve the prediction of fracture risk in the elderly.
description: Stoffwechselerkrankungen des Knochens wie Osteoporose führen zu einer erhöhten Knochenbrüchigkeit und haben Auswirkungen auf den Lebensstil und die Gesundheitskosten der Patienten. In der heutigen alternden Gesellschaft stellen Fragilitätsfrakturen eine erhebliche gesundheitliche und wirtschaftliche Belastung dar. Die derzeitigen klinischen Methoden zur Beurteilung des Gesundheitszustands der Knochen (Dual-Röntgen-Absorptiometrie, FRAX, Quantitative Computertomographie Variationen) hängen hauptsächlich von der Messung der Knochenmineraldichte (BMD) ab. Die BMD allein macht jedoch nur etwa 70 % der Varianz in der Knochenstärke aus. Es ist daher von grossem Interesse und potenzieller gesellschaftlicher Bedeutung, die Knochenqualität zu untersuchen, d. h. andere Parameter als die BMD zu finden, welche die Knochenfestigkeit und -zähigkeit beschreiben.
In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige Labormethoden für die Hochdurchsatzuntersuchung von Knocheneigenschaften mit dem Ziel entwickelt, neue Messkombinationen zu definieren, die als Parameter für die Knochenqualität in einer Frakturrisikoanalyse verwendet werden können. Zunächst wurde eine neuartige Methode zur Quantifizierung der Orientierung mineralisierter Kollagenfibrillen auf der Grundlage der polarisierten Raman-Spektroskopie (qPRS) kalibriert und an einem natürlichen Modellmaterial (mineralisierte Sehne des Putenbeins) validiert. Dieser Ansatz ermöglicht die quantitative Abschätzung des lokalen Mineralisierungsgrades und der 3D-Kollagenfibrillenorientierung zerstörungsfrei mit einer Auflösung im Submikrometerbereich. Die Methodik wurde, in Kombination mit der Kompression von Mikrosäulen, zur Untersuchung der Rinderknochenrinde angewandt. Dadurch konnte die Struktur-Eigenschafts-Beziehungen des Knochens auf der Mikroskala zuverlässig bestimmt werden. Anschliessend wurde ein multimodaler Rahmen für die Knochencharakterisierung in einem anderen Tierknochenmodell (Minischwein-Kieferknochen) entwickelt. Dazu gehörte auch die Entwicklung eines neuartigen Femtosekunden- Laserabtragungsprotokolls für die Herstellung von Knochenmikrosäulen, das einen hohen Durchsatz und lokal angepasste Tests ohne Hochvakuum ermöglicht.
Der wichtigste Teil der Forschung erfolgte an einer Reihe von Oberschenkelhalsproben, die Patienten mit Osteoarthritis und Fragilitätsfrakturen während der Implantation einer Hüfttotalendoprothese entnommen wurden. Die Schenkelhalskortikalis aus dem inferomedialen Bereich wurde ex vivo mittels einer Kombination aus mikromechanischen Tests (Nanoindentation, Mikrosäulenkompression), Mikro-Computertomographie und quantitativer polarisierter Raman-Spektroskopie zur morphologischen und kompositorischen Charakterisierung analysiert. Die ermittelten Knocheneigenschaften wurden mit den klinischen Informationen über Alter, Geschlecht und Primärdiagnose (Coxarthrose oder Hüftfraktur) der teilnehmenden Patienten korreliert. 
Geschlecht und Diagnose der Patienten hatten keinen Einfluss auf die untersuchten Knocheneigenschaften. Darüber hinaus waren alle mechanischen Eigenschaften sowie die Mineraldichte auf Probenebene über das Alter (45-89 Jahre) nahezu konstant. Lediglich die lokale Gewebezusammensetzung veränderte sich mit zunehmendem Alter signifikant, das Verhältnis von Mineralien zu Matrix nahm ab und das Verhältnis von Kollagenvernetzungen zu. Eine lokale Analyse auf der Mikroskala bestätigte, dass alle untersuchten mechanischen Eigenschaften mit Ausnahme der Dehngrenze eine positive Korrelation mit dem Mineralanteil des Knochens aufweisen. Der grosse Datensatz der experimentell bewerteten mikroskaligen Knocheneigenschaften ermöglichte, zusammen mit den verfügbaren klinischen Informationen der Patienten, die Anwendung von Algorithmen des maschinellen Lernens für die in silico-Frakturvorhersage. Die logistische Regressionsklassifikation legt nahe, dass die Eindruckhärte, relative Mineralisierung und das Fliessspannung der Mikrosäule die wichtigsten Parameter für die Vorhersage des Knochenbruchrisikos sind.
Das Ergebnis dieser Arbeit ist die erste Datenbank mit experimentellen Messungen, die mikroskalige mechanische, chemische, morphologische und klinische Informationen über die Patienten integriert. Sie kann in Zukunft für den Vergleich bestehender Methoden zur Bewertung der Knochenqualität verwendet werden. Darüber hinaus können die vorgestellten Daten und Analyseansätze in Zukunft verwendet werden, um die Vorhersage des Frakturrisikos bei älteren Menschen zu verbessern.