title: Rekombinante Produktion, Aufreinigung und Kristallisation der Shigella PathogenitätsfaktorenSpa15, IpgC und OspD1
title: Rekombinante Produktion, Aufreinigung und Kristallisation der Shigella PathogenitätsfaktorenSpa15, IpgC und OspD1
title: Recombinant production, purification and crystallization of the Shigellapathogenic factors Spa15, IpgC and OspD1
Creators: name: Jüngel, Jessica
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: protein crystallography
Sciences
Naturwissenschaften
Strukturbiochemie, Proteinkristallographie
Pathogenitätsfaktoren
Biochemie
Proteine
Struktur
structure biochemistry, shigella
Pathogenität
Kristallisation , Aufreinigung
Shigella
Molekularbiologie
pathogenic factors

description: Many gram-negative bacteria,
      including Shigella flexneri, use a type III secretion
      apparatus (T3SA) serving the secretion of bacterial proteins
      into eukaryotic cells. These proteins enable bacteria to
      infect eukaryotic cells. About 20 structural proteins and
      chaperones encoded by the mxi-spa-operon are needed to form
      the T3SA. The so-called "early genes" of the Shigella
      virulence plasmid obtain information for the synthesis of the
      structural proteins of the T3SA and invasins. They are
      regulated by VirF. The "later read-off genes" of the plasmid
      ensure that the host cell remains alive and are
      transcriptionally regulated by MxiE. Their transcriptional
      activation is achieved by activating the T3SA. The main focus
      of this thesis lies on the pathogenicity factor OspD1. The
      interaction of OspD1 with the chaperone Spa 15 and the
      transcriptional regulator MxiE was investigated biochemically
      and by X-ray crystallography. Within this thesis, an improved
      expression system was established which enables the
      purification via the maltose-binding protein-tag and finally
      results in pure OspD1 protein. After extensive attempts
      crystallization conditions (at 4 °C) were found which enable
      crystal growth of OspD1. The following improvement of the
      crystallization condition leads to a native data set of 2.34
      Å. Unfortunately, the structure of OspD1 could not be solved
      within the scope of this thesis. Attempts to solve the
      structure by molecular replacement were not successful due to
      the absence of a suitable structural model with sufficient
      homology. Subsequent extensive efforts using heavy metal
      derivatives resulted in several datasets, which however,
      could not be evaluated. The constructed selenomethionine
      derivative, which in general enables structure elucidation
      using multi-wavelength anomalous diffraction (MAD), was
      expressed successfully but could not be purified. In order to
      crystallographically characterize the interaction of Spa15
      with OspD1, co-crystallization experiments of the complex as
      well as crystallisation attempts of Spa15 with synthesized
      OspD1peptides of different length were conducted. The
      quantitative studies of protein interactions between Spa15
      and OspD1 were performed by microscale thermophoresis. This
      relatively new method is based on the directed movement of
      molecules along a temperature gradient, which is influenced
      in a measurable and concentration-dependent manner by the
      binding of a ligand. For interaction of Spa15 with OspD1 a KD
      of about 40 nM was determined. Thereafter, various OspD1
      peptides were measured with Spa15 to investigate the binding
      of individual peptides and determine the loss of the binding
      strength compared to the full-length protein. Furthermore,
      this method was used to investigate the binding of the MxiE
      peptides. In addition, the binding of MxiE and IpaC peptides
      to the chaperone IpgC was tested by microscale thermophoresis
      and co-crystallization experiments were conducted with the
      most potent peptides. Within this thesis, it was possible to
      find and improve crystallization conditions which results in
      a dataset with a resolution of 2.6 Å measured at BESSY in
      Berlin. However, no peptide was found in the refined crystal
      structure. For the biochemical characterisation of IpgC, the
      fragment library of the AG Klebe, consisting of over 320
      fragments, was screened against IpgC utilizing the thermal
      shift assay. Within this project, it was investigated whether
      individual fragments have the potential to bind to
      IpgC.
description: Viele gramnegative Bakterien, so
      auch Shigella flexneri, benutzen einen Typ-III
      Sekretionsapparat (T3SA), welcher der Sekretion bakterieller
      Proteine in eukaryotische Zellen dient. Diese Proteine
      ermöglichen es den Bakterien, die eukaryotischen Zellen zu
      infizieren. Etwa 20 strukturelle Proteine sowie Chaperone aus
      dem mxi-spa-Operon sind nötig, um den T3SA zu bilden. Die
      sogenannten „frühen Gene“ des Shigella-Virulenzplasmids
      erhalten Informationen für die Synthese der strukturellen
      Proteine und Invasine. Sie werden von VirF reguliert. Die
      „später abgelesenen Gene“ des Plasmids stellen sicher, dass
      die Wirtszelle möglichst lange am Leben bleibt und werden vom
      Transkriptionsaktivator MxiE reguliert. Ihre Regulation auf
      Transkriptionsebene erfolgt durch die Aktivierung des Typ-III
      Translokons. In dieser Arbeit steht der Pathogenitätsfaktor
      OspD1 im Vordergrund, dessen Wechselwirkung mit dem Chaperon
      Spa15 sowie mit dem Transkriptionsregulator MxiE biochemisch
      und kristallographisch untersucht wurde. Im Rahmen dieser
      Arbeit wurde ein verbessertes Expressionssystem für OspD1 mit
      einem MaltoseBindeprotein-Fusionsanteil etabliert, um das
      Protein rein darzustellen. Kristallisationsversuche zeigten
      Bedingungen, unter denen es möglich war, OspD1- Kristalle bei
      4 °C wachsen zu lassen. Nach einigen Verbesserungen konnte
      ein nativer Datensatz mit einer Auflösung von 2,34 Å
      gesammelt werden. Jedoch war es trotz intensiver Bemühungen
      im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich die Struktur
      aufzuklären. Versuche, den gesammelten Datensatz mittels
      Molecular Replacement zu lösen, waren aufgrund des Fehlens
      eines geeigneten Strukturmodells mit ausreichend Homologie
      nicht erfolgreich. Bei zahlreichen darauffolgenden Versuchen,
      die Struktur mit Hilfe von Schwermetallderivaten aufzuklären,
      konnten Datensätze gesammelt werden, welche allerdings nicht
      auswertbar waren. Ein Selenomethioninderivat, welches die
      Strukturaufklärung mittels eines MADExperiments ermöglichen
      sollte, wurde erfolgreich exprimiert, konnte aber final
      aufgereinigt werden. Um die Wechselwirkung von Spa15 mit
      OspD1 dennoch kristallographisch zu charakterisieren, wurden
      zum einen Kristallisationsversuche des Komplexes unternommen
      und zum anderen Peptide unterschiedlicher Länge von OspD1
      synthetisiert, deren Sequenz in dem Bereich der Interaktion
      mit Spa15 liegt. Die quantitative Untersuchung von
      Proteinwechselwirkungen zwischen Spa15 und OspD1 erfolgte
      durch die Microscale Thermophorese. Diese relativ neu
      entwickelte Methode beruht auf der gerichteten Bewegung von
      Molekülen entlang eines Temperaturgradienten, welche durch
      das Binden eines Liganden messbar und konzentrationsabhängig
      beeinflusst wird. Hier gelang es, die Wechselwirkung von
      Spa15 und OspD1 auf einen KD von etwa 40 nM zu determinieren.
      Danach wurden die verschiedenen OspD1-Peptide mit Spa15
      vermessen, um zu ermitteln, wie gut die einzelnen Peptide
      binden und wie hoch der Verlust der Bindungsstärke im
      Vergleich zum obengenannten KD Volllängenprotein war.
      Desweiteren war es mit dieser Methode möglich, die im Rahmen
      von Christian Hasewinkels Dissertation angefertigten
      MxiE-Peptide mit OspD1 zu vermessen und dabei eine Bindung
      bei einem KD von 100 nM und 500 nM für zwei MxiE Peptide zu
      detektieren. Ebenso wurde die Bindung von MxiE- und
      IpaCPeptiden an das Chaperon IpgC untersucht. Im Rahmen
      dieser Arbeit wurden ebenfalls Kristallisationsversuche mit
      jeweils den beiden bindungsstärksten Peptiden unternommen.
      Nach Optimierung der dabei gefundenen
      Kristallisationsbedingungen wurde ein Datensatz mit einer
      Auflösung von 2,6 Å erhalten. Nach Lösung der Struktur konnte
      allerdings kein Peptid in der Kristallstruktur gefunden
      werden. Zur weiteren biochemischen Charakterisierung von IpgC
      wurde die Fragmentbibliothek der AG Klebe (über 360
      Fragmente) mit Hilfe des Thermal Shift Assays vermessen.
      Hierbei konnte kein Fragment ermittelt werden, welches zu
      einer signifikanten thermischen Stabilisierung von IpgC
      führte.