title: Etablierung und Optimierung von in vivo- und in vitro-Systemen zur Erhöhung der Produktion sowie zur Stabilisierung der humanen Dopaminrezeptoren D2 und D3
Creators: name: Boritzki, Vanessa
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2020
Subjects: subject: G-Protein gekoppelte Rezeptoren
subject: Heterologe Expression
subject: E. coli
subject: Insektenzellen
subject: in-vitro Produktion
subject: Dopaminrezeptoren
subject: Radioligandenbindungstest
subject: FACS
subject: 500

description: Die humanen Dopaminrezeptoren D2 und D3 sind integrale Membranproteine und gehören zu den G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Beide Rezeptoren sind im zentralen Nervensystem lokalisiert und werden durch den endogenen Liganden Dopamin stimuliert. Veränderungen im dopaminergen System, wie beispielsweise ausbleibende Bildung des endogenen Liganden oder Mutationen in den Genen der Rezeptoren, können zu schwerwiegenden neurologischen Erkrankungen führen. Um die genauen molekularen Zusammenhänge zu verstehen und um Fehlregulationen ausgleichen zu können, ist es zwingend erforderlich, den Aktivierungsmechanismus der Rezeptoren aufzuklären und neue Medikamente zu entwickeln, die mit hoher Spezifität an die jeweiligen Rezeptor-Subtypen binden, um Nebenwirkungen auf ein Minimum zu reduzieren (Subtyp-Selektivität). Dafür werden strukturelle und biochemische Untersuchungen der beiden Dopaminrezeptoren in der aktiven Konformation benötigt. Die größte Herausforderung für die erforderlichen strukturbiologischen Analysen besteht darin, rekombinante Rezeptoren in ausreichenden Mengen (mg-Maßstab) herzustellen. Hierfür stehen verschiedene in vivo- und in vitro- Expressionssysteme zur Verfügung, welche im Rahmen dieser Arbeit für die beiden Dopaminrezeptoren D2 und D3 geprüft wurden. Der Fokus lag darauf, die Rezeptoren ohne Fusionsproteine, wie dem T4-Lysozym, in der dritten intrazellulären Schleife (third intracellular loop, ICL3) zu synthetisieren, da diese Fusionen die Kopplung mit dem G-Protein beeinträchtigen und die Rezeptoren im Zuge dessen die aktive Konformation nicht einnehmen können. Zu Beginn des Projekts war bereits bekannt, dass der wildtypische D3-Rezeptor in hohen Mengen in Insektenzellen synthetisiert werden kann, jedoch war unklar, ob er auch funktionell daraus gereinigt werden kann. Daher wurde versucht, den D3wt-Rezeptor aus Insektenzellen zu reinigen. Der Rezeptor wurde jedoch im Zuge der Reinigung proteolytisch abgebaut, wahrscheinlich durch einen Schnitt im ICL3, der ca. 25 % (~100 Aminosäuren) des Proteins ausmacht und vermutlich unstrukturiert ist. Darüber hinaus wurde die zellfreie Expression für den D3-Rezeptor getestet, da dieser im Gegensatz zum D2-Rezeptor noch nicht zellfrei hergestellt wurde. Basierend auf den Erfahrungen bezüglich der Reinigung aus Insektenzellen wurde der D3-Rezeptor modifiziert und unterschiedliche Rezeptorvarianten geprüft. Es wurden flexible Teile des D3-Rezeptors gekürzt (N-Terminus und ICL3), um ihn für strukturbiologische Untersuchungen wie Röntgenstrukturanalyse und Kernspinresonanzspektroskopie besser zugänglich zu machen und vor proteolytischem Abbau zu schützen. Außerdem wurden Cysteine gegen Alanin bzw. Serin ausgetauscht, um Fehlfaltung aufgrund unerwünschter Disulfid-Brücken zu reduzieren. Vor der zellfreien Expression wurden zunächst Nanodiscs hergestellt, um den Rezeptor in einer Lipidumgebung zu stabilisieren. Dafür wurde das membrane scaffold protein MSP1E3D1 in Escherichia coli (E. coli) produziert und gereinigt. Für die anschließende Assemblierung des MSP1E3D1 wurden unterschiedliche Phospholipide verwendet, wobei die Assemblierung mithilfe der Dialyse am erfolgreichsten war. Unter Zugabe der Nanodiscs gelang es, die hydrophoben D3-Rezeptorvarianten während der zellfreien Expression in Lösung zu bringen. Der Hauptteil der Arbeit beschäftigte sich damit, die Synthese des D2- und D3-Rezeptors in E. coli zu optimieren, um daraus Rezeptor im mg-Maßstab für strukturbiologische Untersuchungen reinigen zu können, der durch Agonisten und die Kopplung mit dem G-Protein aktiviert werden kann. Beide Rezeptoren wurden erfolgreich mit N- und C-terminalem Fusionsprotein hergestellt und waren im Radioligandenbindungstest in der Lage, den Liganden [3H]Spiperon zu binden. Aminosäuresubstitutionen führten beim D2-Rezeptor zu einer deutlich verbesserten Synthese, die es erlaubt, Rezeptor in hohen Mengen aus E. coli zu reinigen. Außerdem konnte für beide Rezeptoren gezeigt werden, dass eine Expression der Gene für 4h deutlich vielversprechender ist als die Expression über Nacht. Der erste Reinigungsschritt für die Rezeptoren, welcher die Isolation der Membranen aus E. coli beinhaltet, konnte ebenfalls erfolgreich durchgeführt werden. Abschließend wurde für die Dopaminrezeptoren D2 und D3 eine Strategie basierend auf gerichteter Evolution etabliert, mit welcher der Grundstein gelegt wurde, um die Synthese der rekombinanten Rezeptoren noch weiter zu steigern und um Rezeptorvarianten zu finden, die eine erhöhte Thermostabilität aufweisen.