Enzyme catalysis at high hydrostatic pressure
Creators: name: Schmalle, Marlene
Publisher: name: TUHH Universitätsbibliothek
Year: 2024
Subjects: subject: Biocatalysis
subject: High Pressure
subject: Enzymes
classificationCode: 6
subject: Technology::660: Chemistry; Chemical Engineering::660.6: Biotechnology

description: In the past, several methods have been developed to improve the application of the biocatalysts, such as immobilizing enzymes on support materials to ensure reusability, improve stability, and maintain their activity. Furthermore, the use of non-aqueous media and genetic engineering has been applied to further enhance the enzyme performance with respect to stability, activity and selectivity. However, the evaluation of additional or synergistic process parameters is still part of research with the aim of enabling the application of enzymes in chemical synthesis. Recently, the application and effect of high hydrostatic pressure (HHP) to enzymatic catalyzed reactions is becoming increasingly important. This thesis explored the synergistic potential of combining common and innovative methods to improve enzyme performance with superior stabilization and enzyme activity, thereby contributing to the development of more efficient biocatalysts. In order to investigate the effect of HHP on three different enzymes, a reactor concept was designed first. A continuously operated packed bed reactor (PBR) was selected to fulfill the requirement for continuous operation as part of process intensification and to enable quick and easy adjustment of process parameters. An appropriate immobilization method was developed for two selected lipases to ensure their application in a packed bed reactor (PBR) with the highest loading of the enzyme immobilizates possible. In particular, mechanical stability during continuous reactor operation under ambient and high hydrostatic pressure conditions and the leaching of enzymes from the carrier were investigated. After the establishment of the HHP reactor system, the influence of HHP on the enzyme performance including enzyme stability, activity, selectivity and kinetic parameters was investigated representing the core of the thesis. Three industrially relevant enzymes, Candida rugosa lipase (CRL) and Candida antarctica lipase B (CalB) from enzyme class 3 (EC 3), as well as Ruegeria pomeroyi polyphosphate kinase (PPK) of EC 2 were chosen to investigate the impact of HHP of up to 1200 bar. This investigation aims to determine the intra- and inter-enzyme-class-specific effects of HHP on the enzyme properties. Particularly, the lipase-catalyzed transesterification reaction was used for a detailed study of the effect of HHP, as it allowed the investigation of both stability and activity changes, as well as changes in selectivity. This was of great interest as regio- as well as enantioselectivity differentiates enzymes from chemical catalysts. Additionally, the investigation included the effect of HHP on the kinetic parameters and characteristics of CRL. The resulting kinetic parameters vmax, KM,vin, KM,PP and Ki,vin were adapted to the experimental data using Michaelis-Menten type kinetics at ambient and high pressure. HHP was investigated as a synergistic and possible process intensification parameter for the cofactor regeneration process catalyzed by the industrially relevant PPK. The applicability of the enzyme immobilizates and their performance in a continuously operated reactor system were studied and compared with results obtained in a discontinuously operated stirred tank reactor (STR). Therefore, the objective of this work was to conceptualize and investigate the operability of a continuously operated high pressure reactor system. The influence of HHP on different classes of enzymes was investigated as a complementary process parameter in the conceptualized reactor system.
description: Verschiedene Methoden zur Verbesserung von Biokatalysatoren, wie die Immobilisierung von Enzymen auf Trägermaterialien, wurden entwickelt, um die Wiederverwendbarkeit zu gewährleisten und die Stabilität sowie die Aktivität zu verbessern. Darüber hinaus werden nichtwässrige Medien und Gentechnik eingesetzt, um die Leistung von Enzymen in Bezug auf Stabilität, Aktivität und Selektivität zusätzlich zu verbessern. Heute gewinnt die Anwendung von hohem hydrostatischem Druck auf biologische Reaktionen als zusätzlicher Prozessparameter in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie zunehmend an Bedeutung. In dieser Arbeit wurde das synergetische Potenzial der Kombination dieser Methoden zur Verbesserung der Enzymleistung untersucht, um eine höhere Stabilität und Enzymaktivität zu erreichen und so zur Entwicklung effizienterer Biokatalysatoren beizutragen. Um den Einfluss des hydrostatischen Drucks auf drei ausgewählte Enzyme – zwei Lipasen und eine Kinase – untersuchen zu können, musste zunächst ein geeigneter Reaktortyp entwickelt werden. Um kontinuierlichen Betrieb zu gewährleisten wurde ein Festbettreaktor (engl. packed bed reactor; PBR) ausgewählt, der eine schnelle und einfache Anpassung der Prozessparameter ermöglicht. Anschließend wurden die ausgewählten Enzyme immobilisiert, um ihre Verwendung im PBR zu ermöglichen. Um eine möglichst hohe Beladung der Enzymimmobilisate zu erreichen, wurde eine geeignete Immobilisierungsmethode für die beiden ausgewählten Lipasen evaluiert. Um sicherzustellen, dass die Immobilisate für den Einsatz im kontinuierlichen Reaktor geeignet waren, mussten verschiedene Parameter und Effekte untersucht werden. Insbesondere galt es, die mechanische Stabilität der Immobilisate während des Reaktorbetriebs zu gewährleisten und ein Verlust der Enzyme vom Träger auszuschließen. Nach dem Aufbau des Hochdruckreaktorsystems, der Charakterisierung der Enzymimmobilisate und der Sicherstellung ihrer Verwendbarkeit wurde die zentrale Forschungsfrage dieser Arbeit umgesetzt: die Untersuchung des Einflusses des hohen hydrostatischen Drucks auf die enzymatische Leistungsfähigkeit. Dazu wurde der Einfluss des hohen hydrostatischen Drucks auf alle wichtigen Eigenschaften der Enzyme, wie Stabilität, Aktivität und Selektivität, untersucht und die kinetischen Parameter ermittelt. Drei Enzyme von industrieller Bedeutung wurden ausgewählt, um zu untersuchen, wie die Anwendung von HHP bis zu 1200 bar diese Eigenschaften innerhalb einer Enzymklasse und für verschiedene Enzymklassen beeinflusst: die Lipasen Candida rugosa Lipase (CRL) und Candida antarctica Lipase B (CalB) aus der Enzymklasse 3 sowie die Ruegeria pomeroyi Polyphosphat Kinase (PPK) aus der Enzymklasse 2. Die Lipase-katalysierte Umesterungsreaktion war für die detaillierte Untersuchung des Druckeinflusses von besonderem Interesse, da neben dem Einfluss auf Stabilität und Aktivität der Enzyme auch die Änderung der Selektivität untersucht werden konnte. Die Selektivität ist eine der herausragendsten Eigenschaften von Enzymen gegenüber chemischen Katalysatoren und muss daher besonders berücksichtigt werden. Der Einfluss des Drucks auf die kinetischen Parameter der CRL wurde zusätzlich untersucht, Die resultierenden kinetischen Parameter vmax, KM,vin, KM,PP und Ki,vin wurden mit Hilfe der Michaelis-Menten-Kinetik bei Umgebungsdruck und hohem Druck an die experimentellen Daten angepasst, um den Einfluss auf die kinetischen Eigenschaften von CRL zu bestimmen. Der hydrostatische Druck wurde darüber hinaus auch als möglicher Prozessintensivierungsparameter für die industriell relevante PPK und deren katalysierte Cofaktorregeneration untersucht. Die Eignung des Enzymimmobilisats und die Durchführbarkeit der Reaktion im kontinuierlich betriebenen Reaktorsystem wurden untersucht und mit den Ergebnissen aus dem diskontinuierlich betriebenen Satzreaktor verglichen. Das Ziel dieser Arbeit war es, ein kontinuierlich betriebenes Hochdruckreaktorsystem zu konzipieren und auf seine Funktionsfähigkeit hin zu untersuchen. Darüber hinaus wurde der Einfluss von HHP auf verschiedene Enzymklassen als ergänzender Prozessparameter für verschiedene Enzyme in dem konzipierten Reaktorsystem untersucht.