In vitro μελέτη της πιθανής προστατευτικής δράσης νέων 5,7,8-τριμεθυλο-3,4-διυδρο-2Η-1,4-βενζοξαζινών έναντι των μεταδιδόμενων σπογγόμορφων εγκεφαλοπαθειών:
Creators: name: Κούκουλη, Φανή Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: Μεταδιδόμενες Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες
Prion πρωτεΐνη
Βενζοξαζίνες
Transmissible Spongiform Encephalopathies
Prion protein
Benzoxazines

description: Οι ασθένειες Prion, ή αλλιώς Μεταδιδόμενες Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες, αποτελούν νόσους μολυσματικής, κληρονομικής ή σποραδικής φύσης, των οποίων το κύριο χαρακτηριστικό είναι η νευροεκφύλιση . Κλινικά συμπτώματα των ασθενειών prion είναι η απότομη έκπτωση των διανοητικών λειτουργιών, η αταξία και οι μυοκλονίες. Η πλειοψηφία των ασθενειών prion σχετίζεται με τη συσσώρευση μίας μη φυσιολογικής, μερικώς ανθεκτικής στην πρωτεόλυση, ισομορφής της φυσιολογικής πρωτεΐνης PrPC . Η PrP είναι μία σιαλογλυκοπρωτεΐνη , ιδιαίτερα συντηρημένη στα θηλαστικά, της οποίας ο φυσιολογικός ρόλος δεν έχει αποσαφηνιστεί πλήρως. Σε μοριακό επίπεδο, τα θεραπευτικά μέσα για την αντιμετώπιση αυτών των νόσων θα μπορούσαν να έχουν ως στόχο την PrPC, την παθολογική ισομορφή PrPSc, ή τη διαδικασία μετατροπής της PrPC σε PrPSc. Παρά την έρευνα που διεξάγεται τα τελευταία τριάντα χρόνια στο πεδίο αυτό, δεν έχει ακόμα προκύψει ικανοποιητική θεραπευτική αντιμετώπιση για τις νόσους αυτές και οι προσπάθειες που έγιναν για πειραματική αγωγή ασθενών που είχαν προσβληθεί από κάποια μορφή σπογγώδους εγκεφαλοπάθειας ήταν αποτυχημένες. Οι βενζοξαζίνες αποτελούν δικυκλικές ετεροκυκλικές ουσίες που παράγονται με την αντίδραση Mannich μεταξύ φορμαλδεΰδης, φαινόλης και μιας αμίνης. Βενζοξαζινικά παράγωγα έχουν μελετηθεί εκτεταμένα και χρησιμοποιούνται σαν αντιδιαβητικοί, νευροπροστατευτικοί παράγοντες, παράγοντες κατά του άγχους και της κατάθλιψης καθώς και για τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με τη μη σωστή διαμόρφωση πρωτεϊνών. Σε μια προσπάθεια να ταυτοποιήσουμε νέους αναστολείς της μολυσματικότητας prion, μελετήσαμε, in vitro, την επίδραση μίας σειράς παραγώγων 5,7,8-τριμεθυλο-3,4-διυδρο-2H-1,4-βενζοξαζινών στα επίπεδα έκφρασης της φυσιολογικής PrPC , καθώς και την αναστολή μετατροπής της στην παθολογική ισομορφή PrPSc. Όπως διαπιστώθηκε, οι ουσίες TC121 και TC158 είχαν ως αποτέλεσμα τη μείωση της συσσώρευσης της PrPSc σε ποσοστό 90% και 50%, αντίστοιχα. Τα υπόλοιπα παράγωγα που εξετάστηκαν δεν επέφεραν κάποια μείωση στα επίπεδα της παθολογικής ισομορφής. Παράλληλα με τις μελέτες σε επίπεδο πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκαν μελέτες σε επίπεδο mRNA με σκοπό την εκτίμηση της επίδρασης των νέων παραγώγων βενζοξαζινών στα επίπεδα του Prnp γονιδίου. Όπως διαπιστώθηκε, η πλειοψηφία των υπό μελέτη παραγώγων δεν δρουν στην έκφραση του Prnp γονιδίου, ωστόσο οι ουσίες TC121 και TC145 προκαλούν σημαντική αύξηση σε μεταγραφικό επίπεδο. Ενώ η ουσία TC121 προκαλεί μείωση της PrPSc κατά 90%, σε μεταγραφικό επίπεδο προκαλεί αύξηση στην έκφραση του Prnp γονιδίου κατά ένα παράγοντα της τάξης του 3.9, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ομοίως, η ουσία TC145 αυξάνει τα επίπεδα mRNA της PrP, ωστόσο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα κατά western, δεν εκτιμήθηκε κάποια επίδραση στην PrP πρωτεΐνη. Επιπλέον μελέτες κρίνονται απαραίτητες για την εξακρίβωση του μηχανισμού δράσης των εν λόγω ουσιών σε μοριακό επίπεδο. Ωστόσο, η σημαντική μείωση των επιπέδων της PrPSc που προκαλείται από τις ουσίες TC121 και TC158, καθιστά απαραίτητη την in vivo μελέτη τους.
description: Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), commonly known as prion diseases are fatal neurodegenerative disorders affecting a wide range of species, varying from humans to rodents. The most notorious representatives include Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle, scrapie in sheep and goats and Creutzfeldt Jakob disease (CJD) in humans. Prion diseases are invariably fatal, involving the structural conversion of a normal, endogenous protein, called PrPC into its conformational, proteinase K (PK) - resistant, possibly pathogenic isoform, termed PrPSc. Although substantial research has been performed during the last 30 years, in order to better comprehend prion pathogenesis, principal issues, including PrPC physiological role, prion pathogenic mechanism and transmissibility, still remain elusive. Currently, there are no effective therapies for TSEs. Therefore, it is of crucial importance to identify compounds with therapeutic or prophylactic activity against these diseases. On an attempt to identify novel neuroprotective compounds, a series of new 2,3-dihydro-2H-1,4-benzoxazine derivatives modified at positions 2-, 3-, 4- and 6-, was examined regarding their putative protective effect on the levels of both PrPC and PrPSc in vitro. Our research activities have focused on bioactive compounds possessing the 5,7,8-trimethyl-1,4-benzoxazine core which can be considered as a classical bioisostere of the 5,7,8-trimethylbenzopyran nucleus of the well known chain breaking antioxidant vitamin E. Our data indicate that certain 5,7,8-trimethyl-1,4-benzoxazine derivatives exert a diminishing effect on the levels of PrPSc. More specifically, treatment of the cells with TC121 and TC158 reduces PrPSc accumulation by about 90% and 50% respectively, as evaluated by Western blot analysis. However, compound TC145 had no obvious effect on the levels of the pathological prion isoform. Based on qPCR studies, TC 121 has been shown to be active at the transcriptional level as welll, increasing the relative expression of the Prnp gene by a factor of 3.9 as compared to untreated cells. This result seems to be conflicting to its effect on the PrPSc levels. In this respect, the results of the Western blot analysis are helpful as they show that there is no difference on the signal of PrPC between control samples and TC 121 treated samples. Similarly, TC 145 increases the mRNA levels of PrP, while the signal detected by Western blot was the same as compared to control, untreated samples. An explanation for these observations could be the degradation of mRNA, which is widely accepted. Our results indicate that TC 121 affects the PrP molecule by both major pathways, at a transcriptional and the protein processing level. Further studies concerning the mechanism of action of this derivative could focus on these two levels. The ability of the derivatives of the present study to cross the blood-brain barrier has not been determined as yet, however they may be employed as prophylactic factors against peripheral infections. Compound TC121, 2-(4-methoxyphenyl)-5,7,8-trimethyl-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazine represents a lead structure requiring further optimisation to obtain meaningful structure-activity relations, as well as, in vivo experiments in mice to further analyze the anti-prion properties of this class of compounds and to evaluate the therapeutic potential of these 5,7,8-trimethyl-1,4-benzoxazine derivatives.