Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus
Creators: name: Drabner, Birgit
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Year: 2000
Subjects: subject: Chitinase
subject: Filarien
subject: T-Zell-Epitope
subject: Adjuvantien
subject: chitinase
subject: filariae
subject: T-cell epitopes
subject: adjuvans
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie
subject: 32 Biologie
subject: YD 9800

description: Da Filarieninfektionen noch immer chemotherapeutisch schwer bekämpfbar sind, ist die Aufklärung von potentiell protektiven Molekülen, die zur Impfstoffentwicklung von Nutzen sein könnten, von Bedeutung. Ein vielversprechendes Antigen stellt in diesem Zusammenhang die Chitinase von infektiösen Drittlarven von Onchocerca volvulus dar. In dieser Arbeit sollte deshalb dieses Protein immunologisch charakterisiert und immundominante Bereiche identifiziert werden. Dazu wurde die cDNA des gesamten Proteins (OvL3-Chitinase) und die cDNA der Domäne, die für die Chitin-Bindung verantwortlich ist (OvL3-CBD), in einen Expressionsvektor kloniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die aufgereinigte OvL3-Chitinase zeigte enzymatische Aktivität. Die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD wurden in Immunisierungsstudien im Tiermodel der Nagetierfilarie A. viteae und M. unguiculatus eingesetzt. Während die Immunisierung mit OvL3-CBD mit dem Adjuvans Alum zu keiner Reduzierung der Adultwurmlast führte, war nach Gabe der OvL3-Chitinase die Anzahl der Adultwürmer um 40 % bzw. um 17,7% reduziert. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase allein und in Kombination mit zwei verschiedenen Adjuvantien (STP und Alum) in Immunisierungsstudien von BALB/c-Mäusen eingesetzt, deren Immunantworten anschließend charakterisiert wurden. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, daß die Chitinase ohne zusätzliche Gabe eines Adjuvans unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Dies wurde durch die Anwesenheit von Antikörpern der Subklasse IgG1 deutlich. Außerdem waren Milzzellen dieser Mäuse nicht in der Lage, nach Restimulation mit Chitinase mit Proliferation zu reagieren. Durch den Einsatz der Adjuvantien STP und Alum konnte eine Polarisation der Immunantworten erfolgen. Während die Immunisierung mit Chitinase und Alum zur deutlichen Bildung von IgG1-Antikörpern und zu einer leichten Erhöhung der Antikörper IgG2a und IgG2b führte, konnte nach Immunisierung mit Chitinase und STP neben Antikörpern der Subklasse IgG1 deutliche erhöhte OD-Werte von IgG2a und IgG2b gemessen werden. In beiden Gruppen reagierten Milzzellen nach Restimulation mit Chitinase, wobei die Proliferationswerte der STP/Chitinase-Gruppe über denen der Alum/Chitinase-Gruppe lagen. Durch den Einsatz von Salmonellen, die Chitinase exprimierten, konnten die T-Zell-Antworten verstärkt werden. Es konnten jedoch keine antigen-spezifischen Antikörper gefunden werden. Mit Hilfe von drei verschiedenen T-Zell-Algorithmen (Algorithmus nach Rothbard und Taylor, nach Humphreys und die MHC-II-Bindungs-Motive nach Rammensee) wurden T-Zell-Epitope innerhalb der OvL3-Chitinase identifiziert. Alle vorhergesagten Epitope wurden als synthetische Peptide hergestellt und in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Hierzu wurden Milzzellen von Mäusen verwendet, die dreimal mit rekombinanter Chitinase und dem Adjuvans STP immunisiert worden waren. Um möglichst viele T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase zu ermitteln, wurden überlappende Peptide (Pepscan), die die Gesamtheit der Chitinase umfaßten, in T-Zell-Tests eingesetzt. Die verwendeten Algorithmen wurde auf ihre Sensitivität und Spezifität überprüft, indem die vorhergesagten Epitope mit den ermittelten T-Zell-Epitopen des Pepscans verglichen wurden. Dabei konnte der Algorithmus von Rammensee den besten Index an Sensitivität (0,47) und Spezifität (0,7) erzielen. Eine Kombination der Algorithmen ergab, daß die Verknüpfung des Algorithmus nach Rothbard und Taylor mit den MHC-Bindungs-Motiven nach Rammensee die Sensitivität auf 0,67 erhöhen konnte, doch die Spezifität sank durch die hohe Anzahl der vorhergesagten Epitope auf 0,33. Die Anwendung der Algorithmen auf die Sequenz der OvL3-Chitinase führte zu der Identifizierung von fünf Bereichen, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden, und von denen vier in T-Zell-Proliferationstests deutliche Proliferationswerte erzielten. Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD in Kamerun hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, PBMC von Onchozerkose-Patienten zu restimulieren, die aus einem hyperendemischen Onchozerkose-Gebiet stammten. Diese Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse aus den Immunisierungsstudien mit BALB/c-Mäusen, in denen Chitinase eine TH2-Immunantwort hervorrief. Die PBMC der Onchozerkose-Patienten zeigten nur eine sehr geringe Proliferation nach Stimulation mit OvL3-Chitinase und OvL3-CBD. Begleitet wurde diese Proliferation von Ausschüttung typischer TH2-Zytokine wie IL-10 (Chitinase) bzw. IL-4, IL-5 und IL-10 (CBD). Die Untersuchung der Antikörperantworten der Onchozerkose-Patienten zeigte, daß bei 77% der untersuchten Patienten IgG4-Antikörper gegen die Chitinase und bei 20% gegen die OvL3-CBD im Serum nachgewiesen werden konnten.
description: Chemotherapeutic treatment of filarial infections has rendered difficult and still insufficient. Therefore, the identification of potentially protective molecules which can be used for vaccine development is desirable. The chitinase of larvae stage three of Onchocerca volvulus constitutes a promising antigen. Immunological characterization of this protein and the identification of immunodominat regions was performed in this study. The complete sequence (OvL3-chitinase) and the C-terminal end responsible for the binding of chitin (OvL3-CBD) were cloned in an expression vector, overexpressed in E. coli and subsequently purified. Recombinant chitinase was enzymatically active. The OvL3-chitinase and the OvL3-CBD were used for immunization studies using the rodent filaria A. viteae in the animal model M. unguiculatus. No decreased number of adult worms was observed after immunization with OvL3-CBD in the present of Alum as adjuvans, while chitinase together with STP resulted in the reduction the worm burden to 40 % (first trial) and to 17,7 % (second trial). Additional immunization studies using BALB/c-mice were performed with OvL3-chitinase in the absence or the presence of two different adjuvans. Spleen cells isolated from mice immunized with chitinase in the absence of adjuvans were devoid of proliferative capacity after in vitro antigenic restimulation. Antigen-specific IgG1 antibodies were the only subtype detectable in sera from mice. These results suggested that a Th2 response was induced after immunization with chitinase under these conditions. Including STP or Alum in the immunization protocol a polarization of the obtained immune response was found. Immunization with chitinase together with Alum elicited strong IgG1 response followed by slightly increase of IgG2a and IgG2b. Co-administration of chitinase and STP evoked increased IgG2a and IgG2b antibodies in addition to the observed IgG1 response. Good proliferative responses were observed for spleen cells from mice immunized with chitinase in the present of both adjuvans after in vitro restimulation with chitinase. Furthermore stronger T-cell reactivity was found in the group immunized with chitinase/STP. Also chitinase was expressed in Salmonella and oral immunization of mice with this construct enforced the T-cell reactivity, however antigen specific antibodies were undetectable. To further characterize T cell reactivity against OvL3-chitinase T cell epitopes using the Rothbard and Taylor algorithm (1988), Humphreys prediction and the MHC-II-binding motifs from Rammmensee (1995) were identified. All predicted epitopes were synthesized and tested in T-cell proliferation assays. Additional synthetic L3-chitinase-derived overlapping peptides were also used in T-cell proliferation assays. The sensitivity and specificity of the algorithms was evaluated by comparing the predicted epitopes with the epitopes determined by overlapping peptides. Using this approach, prediction based on MHC-II-binding motifs showed the highest sensitivity (0,47) and specificity (0,7). A further increase of the predictive power was obtained by a combining MHC-II-binding motifs and Rothbard and Taylor algorithm, resulting in increased sensitivity (0,67) but lower specificity (0,33). Five immunodominant regions were identified by all algorithm and four of them were confirmed as T-cell epitopes in T-cell assays. PBMCs isolated from patients affected with Onchocerca volvulus from Cameroon were also tested for their reactivity against OvL3-chitinase and the OvL3 CBD in T-cell proliferation assays. After in vitro restimulation with OvL3-chitinase and CBD only marginal T-cell response was observed accompanied by release of Th2-like cytokines such as IL-10 when stimulated with chitinase and IL-4, IL-5 and IL-10 when stimulated with CBD. Strong antibody responses of the IgG4 isotype were detected in the serum of 77% of the patients against chitinase and only in 20% of the patients against CBD.