title: Microbial communities of the Eastern Mediterranean and their hydrocarbon degradation capability
title: Μικροβιακές κοινότητες της Ανατολικής Μεσογείου και η δυνατότητα τους στην αποδόμηση υδρογονανθράκων
Creators: name: Χαραλαμπους Γεωργια
Publisher: name: Technical University of Crete
Year: 2024

description: The Eastern Mediterranean Sea (EMS) is a semi-enclosed basin, usually referred to as a “miniature ocean” because of the complex oceanic activities that take place there. Increased bottom sea temperatures, salinity levels and ultraoligotrophic conditions are some of its unique characteristics that shape microbial communities. This sub-basin of the Mediterranean Sea has become a hotspot for oil and gas activities in the recent decades. Large reservoirs have already been discovered and exploited in depths reaching ~1500m while several others, including ultra-deep marine areas, have been committed and are currently under exploration (South-Southwest Crete). In the aftermath of Deepwater Horizon (DWH) blowout in 2010, deep-sea oil biodegradation studies flourished providing the scientific community with valuable information about the fate of hydrocarbons (HC) in the deep sea, microbial succession patterns and key oil-degrading taxa. One of the major lessons learned from the DWH accident was the importance of conducting site-specific research under in situ conditions to provide policy makers with realistic data for the construction of efficient bioremediation protocols. The ongoing activities, which are progressing in deeper and more challenging waters, increase the risk for a potential oil spill accident in the deep EMS with many environmental and financial consequences for the surrounding countries. 
This PhD thesis attempts to evaluate the microbial response and self-healing capability (natural attenuation) in the event of an accidental hydrocarbon release scenario in the deep EMS. For this purpose, seawater was retrieved from the EMS water column, down to 1000 m below sea level, in stations south of Crete (Cretan Passage) using Niskin bottles (decompressed) and a high-pressure sampling apparatus (in situ pressure). Hydrocarbon-biodegradation experiments were conducted in Erlenmeyer flasks and in high-pressure bottles or high-pressure bioreactor for incubations at 0.1MPa and 10MPa respectively, using Iranian light crude oil as carbon source. Data on microbial community analysis and hydrocarbon-degradation rates were produced via high throughput sequencing and GC-MS analysis. 
Prior to any hydrocarbon exposure experiments, the synthesis of the pristine microbial community along with interspecies associations were analysed across the water column in this understudied marine region and background levels of known hydrocarbon degraders were recorded. Interestingly, even though natural seepages were not present near the sampling stations, notable abundances of taxa involved in oil bioremediation were found, especially in the deep-water layers. The known hydrocarbonoclastic genus, Alcanivorax, was included in the significant nodes of the deep network.
Comparison of a timeseries hydrocarbon-degradation experiment at in situ temperature conditions between surface and deep EMS-collected microbial communities indicated that the latter (deep community) responded faster to oil contamination than the surface one despite the incubation at lower in situ temperature of 14 ºC. Furthermore, incubation of the deep consortium at a higher temperature of 25 ºC (for direct comparison with the surface community) did not affect oil biodegradation levels suggesting a microbial community that is acclimatized for HC biodegradation at the lower in situ temperature. Monitoring of microbial succession patterns resulted in different key hydrocarbon-degrading taxa in each treatment. The deep consortium at 14 ºC, was dominated primarily by the generalist Vibrio and substituted later on by the slow-growing specialist Alcanivorax whereas incubation at 25 ºC led to the dominance of Pseudomonas and Pseudoalteromonas in the deep community. On the other hand, the surface consortium was enriched in Thalassospira, Halomonas, Alteromonas and Idiomarina genera.
The efficacy of the deep EMS consortia in hydrocarbon bioremediation, was further tested under in situ high-pressure conditions. In particular, the impact of decompression was evaluated during deep-sea sampling and in enrichment incubations for the isolation of oil degraders. Decompression upon sampling resulted in a drastic decrease in deep microbial diversity. In addition, subjection of HC-degrading consortia for enrichment in ONR7 medium caused further decrease in biodiversity and taxa correlated with HC removal were outcompeted by Pseudoalteromonas, Halomonas, Thalassomonas and Alcanivorax which were favored under all treatments tested. Dispersant application had no significant effect in microbial community composition at any stage of the experimental process. Biodiversity loss impacted the community functionality in terms of biodegradation of the more recalcitrant oil compounds (PAHs, Heavy Alkanes). A strains of Alcanivorax venustensis (recently emended as Alloalcanivorax venustensis) that dominated the communities was isolated. 
Furthermore, a deep EMS hydrocarbon plume emulation experiment was conducted under in situ EMS conditions to address primary microbial responders and succession patterns in the absence and presence of dispersant. Genera belonging to Gammaproteobacteria (Oleispira, Thalassomonas, Thalassotalea, Ralstonia) were among the first responders to oil-only contamination similarly to studies in the aftermath of the DWH accident. Those were then succeeded by Alcanivorax and Methylophaga, followed by Marinobacter and Thalassospira in the late phases of exposure to crude oil. The presence of dispersant favored members of Bacteroidota along with Hyphomonas and Alcanivorax, with the latter dominating the community. 
In conclusion, marine areas of interest for oil and gas exploration and exploitation (off-Crete) present a microbial “seed bank” of species related to hydrocarbon removal especially in deep-water layers. This could explain why the deep EMS community responds faster to oil contamination even though at lower temperature conditions than the surface consortium. Moreover, the results of this dissertation suggest an important role for Alcanivorax in hydrocarbon bioremediation in the deep EMS along with other known obligate oil degraders such as Oleispira and Marinobacter. Overall, this PhD thesis underlines the importance of maintaining in situ pressure and temperature conditions during sampling and experimentation when conducting experiments with deep-seawater microbial communities.

description: Η Ανατολική Μεσόγειος (ΑΜ) παρουσιάζει πολύπλοες ωκεάνιες διεργασίες. Η αυξημένη θερμοκρασία στα βαθιά της νερά, τα υψηλά επίπεδα αλατότητας και οι υπερολιγοτροφικές συνθήκες είναι μερικά από τα μοναδικά χαρακτηριστικά της τα οποία επηρεάζουν την σύνθεση και τις μεταβολικές διεργασίες των μικροβιακων κοινοτήτων. Τις τελευταίες δεκαετίες, έχει αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω των ερευνών-εξορύξεων πετρελαίου και φυσικού αερίου. Μεγάλα υποθαλάσσια κοιτάσματα βρίσκονται ήδη υπό εκμετάλλευση σε βάθη ~1500 μέτρων από την επιφάνεια της θάλασσας, ενώ άλλες περιοχές, σε ακόμα μεγαλύτερα βάθη, έχουν δεσμευτεί και βρίσκονται ήδη υπό εξερεύνηση (Νότια-Νοτιοδυτικά της Κρήτης). Στον απόηχο του ατυχήματος του Deepwater Horizon (DWH) το 2010, πραγματοποιήθηκαν πολλές μελέτες βιοαποδόμησης πετρελαίου στα βαθιά νερά παρέχοντας πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την τύχη των υδρογονανθράκων (Υ/Α), τα μοτίβα μικροβιακής διαδοχής και ανέδειξαν σημαντικά είδη ως προς την αποικοδόμηση πετρελαίου. Ένα από τα σημαντικότερα διδάγματα του ατυχήματος DWH είναι η ανάγκη διεξαγωγής πειραμάτων αποδόμησης Υ/Α στις περιβαλλοντικές συνθήκες της περιοχής ενδιαφέροντος προκειμένου να καταγράφονται ρεαλιστικά δεδομένα που να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την δημιουργία αποτελεσματικών πρωτοκόλλων βιοαποκατάστασης. Οι συνεχιζόμενες δραστηριότητες στην ΑΜ, οι οποίες προχωρούν σε βαθύτερα και πιο απαιτητικά ύδατα, αυξάνουν τον κίνδυνο για ένα ατύχημα έκλυσης υδρογονανθράκων με πολλές περιβαλλοντικές και οικονομικές συνέπειες για τις γύρω χώρες.
Αυτή η διδακτορική διατριβή επιχειρεί να αξιολογήσει την μικροβιακή απόκριση και την ικανότητα αυτό-θεραπείας μέσω φυσικής εξασθένησης σε ένα ενδεχόμενο ατύχημα απελευθέρωσης υδρογονανθράκων στα βαθιά νερά της ΑΜ. Για το σκοπό αυτό, ανακτήθηκε θαλασσινό νερό από τη στήλη νερού της ΑΜ, μέχρι τα 1000 m, σε σταθμούς νότια της Κρήτης (Κρητικό Πέρασμα) με τη χρήση φιαλών Niskin (αποσυμπιεσμένο) και με συσκευής δειγματοληψίας υψηλής πίεσης (διατήρηση in situ πίεσης). Πειράματα βιοαποδόμησης υδρογονανθράκων διεξήχθησαν σε φλάσκες Erlenmeyer και σε δοχεία ή σε βιοαντιδραστήρα υψηλής πίεσης για επωάσεις στα 0,1 MPa και 10 MPa αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ελαφρύ Ιρανικό αργό πετρέλαιο ως πηγή άνθρακα. Δεδομένα σχετικά με την ανάλυση μικροβιακής κοινότητας και τους ρυθμούς αποδόμησης υδρογονανθράκων παρήχθησαν μέσω αλληλούχισης υψηλής απόδοσης και ανάλυσης αέριας χρωματογραφίας (GC-MS).
Πριν από οποιαδήποτε πειράματα έκθεσης σε υδρογονάνθρακες, η σύνθεση της φυσικής μικροβιακής κοινότητας και οι συσχετίσεις μεταξύ των ειδών αναλύθηκαν σε όλη τη στήλη του νερού σε αυτήν την θαλάσσια περιοχή που δεν έχει μελετηθεί σχεδόν καθόλου ενώ καταγράφηκαν και τα υπόβαθρα επίπεδα γνωστών αποδομητών Υ/Α. Ενδιαφέρον αποτελεί το γεγονός πως, παρόλο που δεν υπάρχουν φυσικές πηγές διαρροής Υ/Α κοντά στους σταθμούς δειγματοληψίας, εντοπίστηκαν αξιοσημείωτες αφθονίες μικροοργανισμών που εμπλέκονται στη βιοαποδόμηση του πετρελαίου ειδικά στα βαθύτερα ύδατα. Ενώ, το είδος Alcanivorax εντοπίστηκε ανάμεσα στους σημαντικούς κόμβους του δικτύου συσχετίσεων στα βαθιά νερά της ΑΜ.
Η σύγκριση ενός πειράματος αποδόμησης Υ/Α σε συνθήκες in situ θερμοκρασίας μεταξύ επιφανειακών και βαθιών μικροβιακών κοινοτήτων της ΑΜ έδειξε ότι η βαθιά κοινότητα αποκρίθηκε ταχύτερα από την επιφανειακή στη μόλυνση του πετρελαίου παρά την επώαση της σε χαμηλότερη θερμοκρασία (14 ºC). Επιπλέον, η επώαση της βαθιάς μικροβιακής κοινότητας στους 25 ºC (για άμεση σύγκριση με την επιφανειακή) δεν επηρέασε τα επίπεδα βιοαποδόμησης πετρελαίου υποδηλώνοντας μια εγκλιματισμένη κοινότητα με ικανότητα βιοαποδόμησης Υ/Α στη χαμηλότερη in situ θερμοκρασία. Η ανάλυση των μοτίβων μικροβιακής διαδοχής ανέδειξε διαφορετικά είδη σε κάθε πειραματική επεξεργασία. Στη βαθιά κοινότητα που επωάστηκε στους 14 ºC, κυριάρχησε αρχικά το είδος Vibrio που αντικαταστάθηκε αργότερα από το Alcanivorax, ενώ η επώαση στους 25 ºC οδήγησε στην κυριαρχία των Pseudomonas και Pseudoalteromonas στη βαθιά κοινότητα. Από την άλλη, η επιφανειακή κοινότητα εμπλουτίστηκε στα γένη Thalassospira, Halomonas, Alteromonas και Idiomarina.
Η αποτελεσματικότητα της βαθιάς μικροβιακής κοινότητας της ΑΜ στη βιοεξυγίανση υδρογονανθράκων, ελέγχθηκε περαιτέρω σε in situ συνθήκες υψηλής πίεσης. Ειδικότερα, αξιολογήθηκε ο αντίκτυπος της αποσυμπίεσης κατά τη δειγματοληψία από τα βαθιά ύδατα όπως και σε πειράματα εμπλουτισμού για την απομόνωση αποικοδομητών πετρελαίου. Η αποσυμπίεση κατά τη δειγματοληψία οδήγησε σε δραστική μείωση της βαθιάς μικροβιακής ποικιλότητας. Επιπλέον, η υποβολή των εγκλιματισμένων κοινοτήτων στο μέσο ONR7 για τον εμπλουτισμό και την απομόνωση αποικοδομητών Υ/Α προκάλεσε περαιτέρω μείωση της ποικιλομορφίας της κοινότητας και την κυριαρχία των Pseudoalteromonas, Halomonas, Thalassomonas και Alcanivorax σε όλες τις πειραματικές επεξεργασίες. Η εφαρμογή του διασκορπιστικού μέσου δεν είχε σημαντική επίδραση στη μικροβιακή σύνθεση της κοινότητας σε οποιοδήποτε στάδιο της πειραματικής διαδικασίας. Η απώλεια βιοποικιλότητας επηρέασε την ικανότητα της κοινότητας ως προς την αποδόμηση των πιο ανθεκτικών ενώσεων του πετρελαίου Το είδος Alcanivorax venustensis (πρόσφατα τροποποιήθηκε σε Alloalcanivorax venustensis) που κυριαρχούσε στις κοινότητες απομονώθηκε στο τέλος του πειράματος.
Επιπλέον, διεξήχθη ένα πείραμα εξομοίωσης πλουμίου υδρογονανθράκων στη βαθιά θάλασσα σε in situ συνθήκες της ΑΜ για την διερεύνηση των μικροβιακων ειδών που αποκρίνονται πρώτα στην παρουσία πετρελαίου στη βαθιά θάλασσα καθώς και των μοτίβων διαδοχής απουσία και παρουσία διασκορπιστικού μέσου. Τα γένη που ανήκουν στα γ-πρωτεοβακτήρια (Oleispira, Thalassomonas, Thalassotalea, Ralstonia) ήταν μεταξύ των πρώτων που αποκρίθηκαν στη μόλυνση, αντίστοιχα με τις μελέτες που πραγματοποιήθηκαν  στον απόηχο του DWH. Στη συνέχεια, η κοινότητα εμπλουτίστηκε στα είδη Alcanivorax και Methylophaga, ενώ έπειτα ακολούθησε η ενίσχυση στα γένη Marinobacter και Thalassospira στις όψιμες φάσεις της έκθεσης στο αργό πετρέλαιο. Ενώ, η παρουσία του διασκορπιστικού μέσου ευνόησε μικροοργανισμούς που ανήκουν στο φύλο Bacteroidota μαζί με τα γένη Hyphomonas και Alcanivorax, με το τελευταίο να κυριαρχεί στην κοινότητα.
Συμπερασματικά, οι θαλάσσιες περιοχές ενδιαφέροντος για εξερεύνηση και εκμετάλλευση πετρελαίου και φυσικού αερίου (νότια της Κρήτης) παρουσιάζουν μια φυσική παρουσία μικροβιακών ειδών που σχετίζονται με την απομάκρυνση υδρογονανθράκων ειδικά στα βαθιά νερά. Αυτό θα μπορούσε να ερμηνεύσει και το γεγονός πως η βαθιά μικροβιακή κοινότητα αποκρίνεται ταχύτερα στη ρύπανση πετρελαίου ακόμα και σε συνθήκες χαμηλότερης θερμοκρασίας από την αντίστοιχη επιφανειακή κοινότητα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν τον σημαντικό ρόλο του είδους Alcanivorax στη βιοξυγίανση υδρογονανθράκων στη βαθιά θάλασσα της Ανατολικής Μεσογείου μαζί με τα Oleispira και Marinobacter. Συνολικά, αυτή η διατριβή υπογραμμίζει τη σημασία της διατήρησης των περιβαλλοντικών συνθηκών πίεσης και θερμοκρασίας τόσο κατά τη δειγματοληψία όσο και κατά την διεξαγωγή πειραμάτων με μικροβιακές κοινότητες από τα βαθιά νερά.