Διερεύνηση του ρόλου της αποουβικουιτινάσης CYLD στη μεταμεταγραφική ρύθμιση του αγγελιοφόρου RNA της IL-6
Creators: name: Σαχινίδης, Αθανάσιος Παύλου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Aποουβικουιτινάση
Iντερλευκίνη 6
Kυλινδρωμάτωση
Deubiquitinase
IL-6
CYLD

description: Η CYLD αποτελεί μία ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη με δράση αποουβικουιτινάσης, που ειδικεύεται στην υδρόλυση αλυσίδων πολυουβικουιτίνης που συνδέονται κυρίως μέσω λυσίνης 63 ή μεθειονίνης 1. Λόγω της δράσης της αυτής, η CYLD ρυθμίζει αρνητικά μία σειρά από σηματοδοτικά μονοπάτια όπως αυτό του NF-κB και της JNK και ουσιαστικά διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε βιολογικές διεργασίες υψίστης σημαντικότητας για το κύτταρο, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η ανάπτυξη και ενεργοποίηση των T-κυττάρων, η φλεγμονή, η απόπτωση/νεκρόπτωση κ.α. Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας και με βάση τα ευρήματα των Tenekeci et al. 2016 [31] που αναφέρονται στο ρόλο της ουβικουιτίνωσης και της E3 λιγάσης TRAF6 στη μεταμεταγραφική ρύθμιση αγγελιοφόρων RNA που σχετίζονται με τη φλεγμονή, έγινε μία προσπάθεια διερεύνησης του ρόλου της CYLD στην αποικοδόμηση του mRNA της IL-6 και κατ’επέκταση στη ρύθμιση σε μεταμεταγραφικό επίπεδο των mRNAs που σχετίζονται με τη φλεγμονή. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα της σειράς MCF-7 που εξέφραζαν φυσιολογικά τη CYLD και αντίστοιχα που υπέστησαν RNA παρεμβολή (RNAi) για την καταστολή της έκφρασης της. Και στις δύο περιπτώσεις, στα κύτταρα έγινε επίδραση με λιποπολυσακχαρίτη (LPS) ώστε να επαχθούν τα επίπεδα του mRNA της IL-6 και εν συνεχεία έγινε επίδραση με ακτινομυκίνη D (actD) για διαφορετικής χρονικής διάρκειας διαστήματα (time points) ώστε να ανασταλεί η διαδικασία της μεταγραφής και να καταστεί εφικτός ο προσδιορισμός του χρόνου ημιζωής του mRNA. Η ποσοτικοποίηση του mRNA που απομονώθηκε από τα κύτταρα έγινε με RT-qPCR. Οι καμπύλες αποικοδόμησης που προέκυψαν και ο χρόνος ημιζωής που υπολογίστηκε δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, υποδηλώνοντας ότι η αποουβικουιτινάση CYLD δεν ασκεί κάποιο μεταμεταγραφικό ρυθμιστικό ρόλο στο mRNA της IL-6. Περεταίρω έρευνα γύρω από το θέμα αυτό κρίνεται απαραίτητη.
description: The tumor suppressor CYLD is a deubiquitinase that specifically hydrolyzes poly-ubiquitin chains linked via lysine 63 or methionine 1. CYLD is a negative regulator of signaling pathways such as NF-κB and JNK activation pathways and actually plays a critical role for physiological cell processes, including cell cycle regulation, development and activation of the T-cells, inflammation, apoptosis/necroptosis etc. The present study was initiated because to Tenekeci et al. 2016 [31], who demonstarated that ubiquitylation and E3 ligase TRAF6 play an important role in post transcriptional regulation of inflammatory mRNAs. The goal of the present study is the elucidation of CYLD’s role in IL-6 mRNA degradation. The MCF-7 cell line was used for the experimental procedure and CYLD silencing, when needed, was mediated by RNAi interference. In order to induce IL-6 mRNA levels, wild type- and CYLD-deficient cells were treated with LPS and then with actinomycin D for different time point periods to block transcription and finally determine the mRNA half-life. RNA isolated from the cells was quantified by RT-qPCR. The obtained decay curves and the estimated mRNA half-life showed no statistically significant difference between the two MCF-7 cell groups, indicating that CYLD is not involved in the post transcriptional regulation of the IL-6 mRNA. Further investigation of this subject is required to assess the role of CYLD in post-trancriptional regulation of inflammatory mRNAs.