title: Untersuchung (ultra-)dünner Filme und Beschichtungen aus dem rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(C16) für die biomedizinische Anwendung
Creators: name: Borkner, Christian Bruno
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2020
Subjects: subject: spider silk
subject: protein structure
subject: self-assembly
subject: spin-coating
subject: ultrathin films
subject: microphase separation
subject: biomaterial coating
subject: cell adhesion
subject: biodegradation
subject: 500

description: Obwohl Biomaterialien schon seit langer Zeit genutzt werden, ist die systematische Biomaterialwissenschaft ein noch recht junger Wissenschaftsbereich mit einer 60- bis 70jährigen Geschichte. Seide wird seit Jahrtausenden für Textilien verwendet und insbesondere Spinnenseide wurde schon vor Jahrhunderten von Polynesiern bei der Fischerei sowie in der Antike als Wundauflage und als Nahtmaterial verwendet. Aus heutiger Sicht ist die Biomaterialwissenschaft ein Zusammenwirken verschiedener Fachbereiche und das Verständnis der physikalischen und chemischen Wechselwirkungen zwischen komplexen biologischen Systemen und synthetischen oder modifizierten natürlichen Materialien nimmt einen hohen Stellenwert ein. Die Biokompatibilität spielt hierbei eine große Rolle. Doch es bedarf einer genauen Betrachtung, die abhängig vom jeweiligen Anwendungsgebiet (z.B. Hartgewebe, Weichgewebe, Herz-Kreislauf-System) des Biomaterials ist. Biokompatibilität kann in zwei Bereiche – die Strukturkompatibilität und die Oberflächenkompatibilität – gegliedert werden. Bei der Strukturkompatibilität wird z.B. die Struktur, Form und Mechanik eines Implantats an das Verhalten des Gewebes im Wirtsorganismus betrachtet. Werden die chemischen, physikalischen, biologischen und morphologischen Oberflächeneigenschaften eines Materials an das Wirtsgewebe angepasst, spricht man von Oberflächenkompatibilität. Die Oberflächeneigenschaften eines Biomaterials sind somit entscheidend für seine Biokompatibilität und Wechselwirkung mit dem Wirtssystem. Durch seine gute Verfügbarkeit und gute Biokompatibilität ist das rekombinante Spinnenseidenprotein eADF4(C16) ein interessantes Material zur Steuerung und Modifizierung der Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien. Spinnenseide ist nicht hämolytisch oder zytotoxisch und auch die beim Abbau der Seidenproteine entstehenden Produkte (Peptide und Aminosäuren) sind nicht toxisch und können vom Körper resorbiert werden. Es tritt keine Immunantwort auf und Zellen zeigen nur eine geringe Interaktion mit glatten eADF4(C16)-Filmen und ihren Oberflächen. eADF4(C16) ist daher gut als Beschichtungsmaterial für Implantate (z.B. Silikonbrustimplantate) oder auch Katheter geeignet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Prozess entwickelt, um glatte Polymeroberflächen, wie z.B. von Kathetern (aus Silikon, Polyurethan (PU) und Polytetrafluoroethylen (PTFE)), mit eADF4(C16) zu beschichten. Die Beschichtungen, die sich durch ihre Schichtdicke von &lt; 100 nm von bisher untersuchten Silikonimplantatbeschichtungen aus Spinnenseide mit einer Schichtdicke im Mikrometerbereich unterscheiden, wurden hinsichtlich ihrer Stabilität, Biokompatibilität und ihrer Zelladhäsionseigenschaften untersucht. Die in dieser Arbeit verwendeten polymeren Biomaterialien (PTFE, PU und Silikon) haben hydrophobe Oberflächen und wurden vor dem Tauchbeschichtungsprozess im Sauerstoffplasma hydrophilisiert. Um die Haftung der eADF4(C16)-Beschichtung auf der plasmabehandelten Oberfläche zur erhöhen, wurde eine Vermittlerschicht aus dem polykationischen Polymer Polyethylenimin (PEI) bzw. dem positiv geladenen rekombinanten Spinnenseidenprotein eADF4(k16) auf die hydrophilisierte Polymeroberflächen aufgebracht. Die Beschichtungen zeigen keine Delamination bei Biegebelastung und die Oberflächenkontaktwinkel liegen für diese Beschichtungen deutlich unter dem für gegossene eADF4(C16)-Filme mit einer Dicke von 1 bis 2 µm. Sinkt die Schichtdicke eines Films oder einer Beschichtung, so steigt auch die spezifische Oberfläche je Volumen. Erreicht ein Material Abmessungen von &lt; 100 nm in mindestens einer Dimension, so spricht man von Nanomaterialien, die im Vergleich zum bulkMaterial verschiedene Eigenschaften aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Oberflächeneigenschaften (hier: Oberflächenkontaktwinkel) abhängig von der Schichtdicke ändern. Zusätzlich wurden die strukturellen Eigenschaften (beta-Faltblattanteil) schichtdickenabhängig untersucht. Betrachtet man die Aminosäuresequenz von eADF4(C16), so lässt sich das Protein als eine sich wiederholende Abfolge eines alaninreichen hydrophoben und eines glycinreichen hydrophilen Blockes beschreiben und kann aus polymerwissenschaftlicher Sicht als AB-Multiblockcopolymer beschrieben werden. Auf Basis der gesammelten Daten über die Schichtdickenabhängigkeit des beta-Faltblattanteils und der Oberflächeneigenschaften zusammen mit den bereits beschriebenen Multiblockcopolymereigenschaften des Proteins wurde ein schichtdickenabhängiges Assemblierungs- und Phasenseparationsmodell von der nur einige Nanometer dicken Proteinlage bis zum bulkMaterial vorgeschlagen. Zusätzlich wurde die Bioabbaubarkeit dünner eADF4(C16)-Beschichtungen untersucht. Die eADF4(k16)/eADF4(C16)-Beschichtungen auf Silikonkathetern zeigten eine sehr gute Stabilität in Puffer und wiesen in Wundheilungsumgebung eine langsame Bioabbaubarkeit sowie eine gute Stabilität der Beschichtungen gegenüber mechanischer Belastung auf. Neben der Beschichtungsstabilität spielt auch die Zellinteraktion mit den Beschichtungsoberflächen eine bedeutende Rolle für die Biokompatibilität des Materials und seine spezifische Anwendung. Auf mit eADF4(C16) beschichteten Katheteroberflächen war eine geringe Zelladhäsion von BALB/3T3 Fibroblasten, B50 neuronalen Zellen, HaCaT Keratinocyten sowie C2C12 Myoblasten zu beobachten. Dünne eADF4(C16) Beschichtungen bieten somit für biomedizinische Anwendungen, in denen keine Wirtsreaktion auftreten soll und Zellen nicht mit der Oberfläche interagieren sollen, eine gute Möglichkeit zur Einstellung der Oberflächeneigenschaften bei gleichzeitig geringem Materialeinsatz. Zusätzlich wurden mit eADF4(C2) funktionalisierte bakterielle Nanopartikeln (MamC-C2 Magnetosomen) untersucht. Magnetosomen werden von magnetotaktischen Bakterien zur Orientierung entlang der Feldlinien des Erdmagnetfeldes gebildet. Im Modellorganismus Magnetospirillum gryphiswaldense bestehen sie aus einem Magnetitkern und einer Phospholipid-Doppelschicht (Magnetosomen-Membran). Im Fall von MamC-C2 Magnetosomen ist eine zweifache Wiederholung des C-Moduls des Spinnenseidenproteins eADF4(C16) über das Ankerprotein MamC in der Biomembran verankert und bildet mit dieser zusammen eine den Partikel kolloidal stabilisierende Hülle. QCM-D Experimente haben gezeigt, dass eine intermolekulare Wechselwirkung zwischen MamC-C2 Magnetosomen und eADF4(C16) besteht und MamC-C2 Magnetosomen als Nukleationskeime für die Assemblierung von eADF4(C16)-Fibrillen dienen können.