title: Etablierung des stickstofffixierenden Alphaproteobakteriums Sinorhizobium meliloti als Chassis-Organismus in der Synthetischen Mikrobiologie
title: Etablierung des stickstofffixierenden Alphaproteobakteriums Sinorhizobium meliloti als Chassis-Organismus in der Synthetischen Mikrobiologie
title: Establishment of the nitrogen-fixing alphaproteobacterium Sinorhizobium meliloti as chassis for synthetic microbiology
Creators: name: Döhlemann, Johannes
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: subject: Biotechnology
subject: Genetics
subject: FOS: Biological sciences
subject: Synthetische Biologie
subject: Genetik , Biotechnologie
subject: Synthetic Biology

description: Synthetic biology requires
      strategies, which facilitate efficient genetic engineering.
      DNA editing in the range of single nucleotides up to whole
      genomes requires appropriate molecular methods. While
      powerful tools are available for prokaryotic model organisms,
      the repertoire for genetic engineering of rhizobia of the
      class alphaproteobacteria is still limited. The α-rhizobium
      Sinorhizobium meliloti is able to fix atmospheric nitrogen in
      symbiotic relationships with legumes. Therefore it is of high
      agricultural value. Due to its remarkable genome
      architecture, which besides a main chromosome exhibits a
      chromid (pSymB) and a megaplasmid (pSymA), S. meliloti
      emerged as model organism for studying multipartite genomes
      in bacteria. pSymA and pSymB carry ~45% of the genomic
      content and are based on repABC-type replication origins,
      which integrate these extra-chromosomal replicons into the
      cell cycle. The repABC region of pSymA was further identified
      to confer the chromosome-like features as single copy
      replication and stable inheritance to artificial DNA
      constructs. In this work, heterologous repABC cassettes
      derived from different rhizobial species were used to
      establish a novel shuttle-vector system for S. meliloti. This
      highly modular and standardized assembly system facilitates
      in-vitro construction of artificial mini replicons. Resulting
      pABC vectors serve as E. coli-compatible cloning vehicels and
      enable establishment of complex, single-copy expression
      systems. Furthermore, a cloning-free genome editing method
      and an optimized Cre/lox recombination system were developed
      and expand the genetic toolbox of S. meliloti. Respective
      engineering approaches were demonstrated by substantial
      genome rearrangements and large scale deletion and inversion
      systems. Cre/lox recombination strategies and an inducible
      repABC-type replication origin further facilitated in-vivo
      cloning, which enables new experimental approaches both in
      genome biology, as well as for synthetic applications. The
      robust function of Cre/lox and the wide distribution of
      repABC-based replicons among the alphaproteobacteria likely
      allow an application of the established methods in additional
      organisms to exploit their genetic resources for agricultural
      and biotechnological purposes.
description: Die Synthetische Biologie benötigt
      Strategien, die effizientes Genetic Engineering erlauben.
      Eine grundlegende Voraussetzung hierzu ist die Etablierung
      von Techniken zur spezifischen DNA-Modifikation im Umfang
      einzelner Nukleotide bis hin zu ganzen Chromosomen. Während
      für Modellorganismen der Synthetischen Mikrobiologie ein
      großes Repertoire leistungsfähiger Werkzeuge zur Verfügung
      steht, war das Methodenspektrum zur genetischen Veränderung
      von Rhizobien aus der Klasse der Alphaproteobakterien lange
      Zeit eingeschränkt. In symbiotischen Lebensgemeinschaften mit
      Leguminosen besitzt Sinorhizobium meliloti die Fähigkeit,
      atmosphärischen Stickstoff zu biogenen Stickstoffverbindungen
      zu assimilieren, wodurch dem α-Rhizobium insbesondere
      landwirtschaftliche Relevanz zukommt. Aufgrund seiner
      besonderen Genomarchitektur, die neben einem Chromosom ein
      weiteres Chromid (pSymB) und Megaplasmid (pSymA) aufweist,
      ist S. meliloti außerdem ein Modellorganismus zur Erforschung
      mehrteiliger Genome in Bakterien. pSymA und pSymB, die ~45%
      der genomischen DNA tragen, besitzen repABC-basierte
      Replikationsursprünge, welche die Integration dieser
      extra-chromosomalen Replikons in den Zellzyklus vermitteln.
      Die repABC-Region wurde in dieser Arbeit als funktionelle
      Einheit identifiziert, die Chromosomen-ähnliche Eigenschaften
      wie eine stabile Vererbung und einfache Kopienzahl
      vermittelt. Auf Basis heterologer repABC-Kassetten
      verschiedener α-Rhizobien konnte außerdem ein
      Shuttle-Vektorsystem etabliert werden. Ein modulares und
      standardisiertes Assemblierungssystem ermöglichte hierbei die
      in-vitro Herstellung artifizieller Mini-Replikons. Diese
      können sowohl als klassische Klonierungsvektoren in E. coli,
      aber auch zur Etablierung mehrteiliger Expressionssysteme in
      S. meliloti eingesetzt werden. Eine neue Genome
      Editing-Methode sowie verbesserte Cre/lox-basierte
      Rekombinationsstrategien wurden entwickelt und erweitern das
      Repertoire genetischer Werkzeuge für S. meliloti. Ihre
      Anwendung konnte mittels Deletion und Inversion umfangreicher
      Genomabschnitte, sowie substantieller
      Genom-Umstrukturierungen demonstriert werden.
      Cre/lox-Anwendungen und eine Methode zur in-vivo Klonierung
      großer DNA-Fragmente ermöglichen neue experimentelle Ansätze,
      die bei der mechanistischen Aufklärung des mehrteiligen
      Genoms sowie in synthetischen Anwendungen von großem Nutzen
      sind. Die robuste Funktion des Cre/lox-Systems und die weite
      Verbreitung repABC-basierter Replikons innerhalb der
      α-Rhizobien bergen zudem das Potential, die in dieser Arbeit
      etablierten Methoden auf weitere Vertreter dieser
      landwirschaftlich und biotechnologisch relevanten Organismen
      zu übertragen.