title: Immunhistochemische, zellbiologische und physiologische in vivo Untersuchungen zum Apelin/APJ-Systemin Hypothalamus und Hypophyse der Ratte
title: Immunohistochemical, cell biological and physiological in vivo analysis of the apelin/APJ system in rat hypothalamus and pituitary
Creators: name: Hatzelmann, Thomas
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Calcium-Imaging
G-Protein gekoppelte Rezeptoren
Apelin
Neuron
Biowissenschaften, Biologie
Hypophyse
Peptidhormon
Nucleus parave
Stickstoffmonoxid-Synthase
Physiologe
Nucleus paraventricularis
APJ
Nucleus praeopticus medialis
Immuncytochemie
Hypothalamus

description: The hypothalamus represents the
      most important component of the central nervous system (CNS)
      used for integrating afferent signaling information and
      regulating the homeostasis of body temperature, water and
      electrolyte balance of the extracellular space, circadian
      rhythm and energy metabolism. The most important hypothalamic
      structure (nucleus) for regulating the above mentioned
      physiological functions is the Nucleus paraventricularis
      (PVN) of the preoptic region, which is located closely to the
      third brain ventricle. The PVN consists of many
      neurosecretory cells and shows numerous efferent and afferent
      neuronal connections to other structural components of the
      brain. In addition to the PVN, the Nucleus praeopticus
      medianus (MnPO), which is located close to the Commisura
      anterior, displays a critical integrative function for
      regulating water and electrolyte balance, as well as
      regulating body temperature. Besides other peptides and
      classical neurotransmitters, the gaseous transmitter nitric
      oxide (NO), produced by the neuronal nitric oxide synthase
      (nNOS) amongst other substances, plays an essential
      neuromodulatory role in regulating water and electrolyte
      balance and body temperature. The apelinergic system,
      consisting of several active fragments of the preproapelin
      (apelin36, apelin17 and apelin13) and the G-protein coupled
      receptor, APJ, has been reported to also centrally modulate
      body temperature and water and electrolyte balance.
      Expression of apelin peptides and their receptors has been
      shown in peripheral organs and the CNS, in particular in the
      hypothalamus. Despite many expression studies having been
      undertaken, the detailed mapping of the APJ protein
      distribution in hypothalamus and thalamus remains to be
      determined. (1) The present thesis therefore includes, for
      the first time, a detailed semi-quantitative
      immunhistochemical mapping of the APJ protein on coronal
      hypothalamic rat brain slices and confirms published APJ mRNA
      expression in structures like the PVN and Nucleus
      supraopticus (SON). However, for many structures and/or
      nuclei like the MnPO or the medial devision of the bed
      nucleus of the stria terminalis, the N. praecommisuralis and
      the N. dorsomedialis, APJ protein has been described for the
      first time in single neurons or pseudopodia. (2) The
      expression of nNOS has been reported in both the PVN and MnPO
      previously. Additionally it has been postulated that
      apelinergic effects, for example on the cardiovascular
      system, could be mediated by NO. Therefore, the present work
      analyzed the possible immunhistochemical codistribution and
      colocalization of APJ and nNOS in the hypothalamus. In this
      study the MnPO, amongst other brain structures, showed
      distinct codistribution of nitrergic neurons and APJ
      immunopositive fiber structures. Quantitative analysis of the
      PVN and SON perikarya revealed about 40 % and, 50% cellular
      colocalization of both molecules. Due to this prominent
      colocalization and codistribution in the PVN and MnPO, NO
      could be involved as a downstream signaling molecule in
      mediating central apelinergic functions. (3) Because of the
      distinctive expression of APJ in the MnPO and PVN, specificly
      the primary neuroglial cultures of both nuclei and
      additionally primary intermediate lobe pituitary (HZL)
      cultures, with high native expression of APJ, these cultures
      were used to analyze apelin induced intracellular signal
      transduction in vitro. Changes of intracellular calcium
      concentrations ([Ca2+]i), which are important second or third
      messengers, were monitored in single cells by calcium binding
      fluorophors fura-2 (=calcium imaging). Neurons and astrocytes
      of the MnPO and PVN specific cultures exhibited 2-9 %
      specific microglial cells in the MnPO and 12% specific
      microglial cells in the PVN. Of the MnPO and PVN cell
      cultures, 12 % directly responded with changes in ([Ca2+]i )
      when stimulated with the pyroglutamate modified form of
      apelin13 (PyrAp13) (10 -6 mol/l). As described for other
      neuropeptides, PyrAp13 was able to positively and negatively
      modulate the influx of calcium caused by the classical
      neurotransmitter glutamate in mainly non-nitregic cells, but
      also nitregic cells. This modulatory function of PyrAp13
      could provide evidence for the cellular basis of apelin as a
      novel CNS neuromodulator. Besides analysis of [Ca2+]I as a
      downstream signal of the apelinergic system, some reports
      showed involvement of extracellular regulated kinase (ERK)1/2
      in apelinergic signaling in peripheral or transfected cell
      systems. In the present work no activation of ERK1/2 was
      detected in primary HZL cultures with highly native APJ
      expression, using Western Blot analysis. The lack of ERK1/2
      expression may be due to already high levels of
      phosphorylation before stimulation. (4) As a next important
      component of the present work, in vivo parameters were
      monitored in rats by radiotelemetry after
      intracerebroventricular (i.c.v.) micro application of PyrAp13
      (20 nmol). (A) Microinjection of PyrAp13 i.c.v. induced no
      significant changes in bacterial lipopolysaccharide
      (LPS)-induced sickness behavior, including anorexia, adipsia
      and lethargy. However, it significantly reduced LPS-induced
      fever 3-6 and 6-9 h after injection. Moreover, it also led to
      a significant reduction in plasma levels of tumor necrosis
      factor- α (TNF-α), a prominent proinflammatory cytokine, 2 h
      after injection. (B) Despite a high sequence of similarity
      between the APJ and the Angiotensin II (AngII) receptor and a
      proven interaction of both in vitro, i.c.v. microinjected
      PyrAp13 exhibited no influence on water intake in vivo or
      nuclear translocation of the transcription factor and
      neuronal activity marker c-Fos, induced by i.c.v. AngII. (C)
      Furthermore i.c.v. PyrAp13 showed no influence on
      telemetrically recorded parameters, such as body temperature,
      locomotor activity and food/water intake of animals.
description: Der Hypothalamus repräsentiert die
      wichtigste Komponente des Zentralnervensystems (ZNS) zur
      Integration afferenter Signalinformationen und zur Regulation
      der Homöostase von Körperkerntemperatur, Wasser- und
      Elektrolythaushalt des Extrazellularraumes, circadianer
      Rhythmik sowie Energiehaushalt. Das wichtigste Kerngebiet
      (Nucleus) des Hypothalamus zur Steuerung der genannten
      physiologischen Funktionen stellt der in der supraoptischen
      Region, in unmittelbarer Nähe zum dritten Hirnventrikel
      gelegene Nucleus paraventricularis (PVN) dar. Der PVN enthält
      zahlreiche neurosekretorische Zellen und weist darüber hinaus
      zahlreiche efferente und afferente neuronale Verknüpfungen zu
      anderen Struktureinheiten des Gehirns auf. Zusätzlich zum PVN
      kommt auch dem im Bereich der Commissura anterior gelegenen
      Nucleus praeopticus medianus (MnPO) eine bedeutende,
      integrative Funktion bei der Regulation des Wasser- und
      Elektrolythaushaltes sowie der Körperkerntemperatur zu. Bei
      der Regulation dieser Prozesse spielt neben klassischen und
      peptidergen Neurotransmittern auch das gasförmige
      Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO), produziert unter
      anderem von der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS),
      eine wesentliche neuromodulatorische Rolle. Auch für das
      apelinerge System, bestehend aus den verschiedenen, aktiven
      Fragmenten des Preproapelins (Apelin36, Apelin17 und
      Apelin13) und dem G-Protein gekoppelten Rezeptor APJ, wurde
      bereits ein zentral vermittelter Einfluss unter anderem auf
      die Temperaturregulation und auf die Kontrolle des Wasser-
      und Elektrolythaushaltes beschrieben. Eine Expression sowohl
      der Apelinpeptide als auch des Rezeptors konnte bisher in
      peripheren Organen sowie im ZNS, und dabei hauptsächlich im
      Hypothalamus, gezeigt werden. Trotz zahlreicher
      Expressionsstudien fehlte jedoch bisher eine detaillierte
      Kartierung der Verteilung des Rezeptorproteins in
      Hypothalamus und Thalamus. (1) Anhand der in der vorliegenden
      Arbeit durchgeführten immunhistochemischen Markierungen an
      coronalen Gehirnschnitten der Ratte wurde deshalb erstmalig
      eine detaillierte, semiquantitative Kartierung der Expression
      des APJ Proteins im Hypothalamus erstellt. Diese Untersuchung
      bestätigt einerseits die bereits auf mRNA-Ebene publizierte
      APJ-Expression in Strukturen wie PVN und Nucleus supraopticus
      (SON), konnte jedoch darüber hinaus in vielen Nuclei und/oder
      deren Substrukturen wie u.a. dem MnPO, dem medialen Teil des
      „Bed Nucleus“ der Stria terminalis, dem N. praecommissuralis
      und dem N. dorsomedialis eine APJ-Expression zum ersten Mal
      auf Proteinebene für einzelne Neurone bzw. deren Pseudopodia
      nachweisen. (2) Sowohl für den PVN als auch den MnPO wurde
      bereits eine Expression von nNOS in früheren Studien
      beschrieben. Zusätzlich dazu konnte in der Fachliteratur eine
      Vermittlung apelinerger Effekte über NO etwa anhand der
      Modulation kardiovaskulärer Parameter in der Peripherie
      postuliert werden. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit
      eine mögliche Co-Distribution und -Lokalisation von APJ und
      nNOS anhand immunhistochemischer Markierungen im Hypothalamus
      der Ratte untersucht. Dabei konnte u.a. im MnPO eine
      ausgeprägte Co-Distribution nitrerger Neurone und
      APJ-immunpositiver Faserstrukturen festgestellt werden. Bei
      der quantitativen Analyse der Expression von nNOS und APJ in
      Perikaryen des PVN und des SON hingegen war sogar mit mit ca.
      40 % bzw. ca. 50 % markante zelluläre Co-Expression der
      beiden Moleküle nachweisbar. Aufgrund der ausgeprägten
      Co-Lokalisation und Co-Distribution in PVN und MnPO könnte
      somit NO als nachgeschaltetes Signalmolekül auch an der
      Vermittlung zentraler, apelinerger Wirkmechanismen beteiligt
      sein. (3) Zur in vitro Untersuchung Apelin-induzierter,
      intrazellulärer Signaltransduktions-mechanismen wurden
      aufgrund der ausgeprägten APJ-Rezeptorexpression sowohl MnPO-
      und PVN-spezifische neurogliale Primärkulturen als auch eine
      primäre Hypophysenzwischen-lappenkultur (HZL) herangezogen.
      Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i)
      als wichtigen second oder third messenger konnten für
      einzelne Zellen durch den Einsatz calciumbindener Fluorophore
      wie Fura-2 kontinuierlich erfasst werden (=Calcium-Imaging).
      Sowohl für Neurone als auch Astrozyten der MnPO- und
      PVN-spezifischen Kulturen ergab sich bei 2-9 % der Zellen, in
      PVN-spezifischen Mikrogliazellen hingegen bei 12 % eine
      direkte Responsivität in Form einer transienten Erhöhung der
      [Ca2+]i nach Stimulation mit der pyroglutamylierten Form von
      Apelin13 (PyrAp13) (10-6 mol/l). Wie bereits für andere
      Neuropeptide beschrieben, vermochte PyrAp13 darüber hinaus
      den Calciumeinstrom des klassischen Neurotransmitters
      Glutamat in nitrergen und vor allem nicht-nitrergen Zellen
      sowohl positiv als auch negativ zu modulieren. Diese
      modulatorische Wirkung könnte somit möglicherweise die
      zelluläre Grundlage für physiologische Funktionen des
      apelinergen Systems als neuer Neuromodulator im ZNS
      darstellen. Neben der Analyse der [Ca2+]i als dem Apelin13
      nachgeschalteten Signal wurde in einigen Publikationen auch
      über die Involvierung der MAP-Kinasen extracellular regulated
      kinase 1/2 (ERK1/2) im apelinergen Signalweg in peripheren
      oder transfizierten Zellsystemen berichtet. In der
      Primärkultur des HZLs mit hoher nativer APJ-Expression konnte
      in der vorliegenden Arbeit nach apelinerger Stimulation
      anhand von Western Blot Analysen jedoch keine Aktivierung der
      ERK1/2 beobachtet werden, möglicherweise bedingt durch eine
      bereits hohe Phosphorylierung vor der peptidergen
      Stimulation. (4) Als weiterer wichtiger Aspekt der
      wissenschaftlichen Arbeit wurden in vivo physiologische
      Parameter nach intracerebroventrikulärer (i.c.v.) Applikation
      von PyrAp13 (20 nmol) in der Ratte anhand telemetrischer
      Datenaufzeichnung untersucht. (A) I.c.v. mikroappliziertes
      PyrAp13 zeigte dabei keinen signifikanten Einfluss auf durch
      bakterielles Lipopolysaccharid (LPS, 100 μg/kg Körpergewicht)
      induzierte Komponenten des sickness behavior wie Anorexie,
      Adipsie und Lethargie. Jedoch führte es zu einer
      signifikanten Reduktion des LPS-induzierten Fiebers 3-6 und
      6-9 Std. post injectionem und einem signifikanten
      erniedrigten Plasmaspiegel an Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)
      als prominenten proinflammatorischen Cytokin 2 Std. nach der
      Injektion. (B) Trotz der hohen Sequenzähnlichkeit von APJ und
      dem Angiotensin II (AngII)-Rezeptor und einer in vitro
      bereits gezeigten Interaktion mit diesem, zeigte i.c.v.
      mikroappliziertes PyrAp13 jedoch in vivo keinen Einfluss auf
      durch die zentrale AngII-Applikation induzierte
      Trinkwasseraufnahme bzw. nukleäre Translokation des
      neuronalen Aktivitätsmarkers und Transkriptionsfaktors c-Fos.
      (C) Weiterhin zeigte PyrAp13 i.c.v. selbst beim Vergleich der
      Injektion vor der Aktivitätsphase mit der Inaktivitätsphase
      der Versuchstiere keinen Einfluss auf die circadiane Rhythmik
      telemetrisch erfasster Parameter wie Körpertemperatur,
      lokomotorische Aktivität und Futter- bzw.
      Wasseraufnahme.