title: Molecular analysis of mammalian adenylyl cyclases and bacterial adenylyl cyclase toxins
Creators: name: Göttle, Martin
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Cyclonucleotide , Sekundärer Bote , Säugetiere , Adenylatcyclase , Bakterien , Toxin , Adenylylcyclase , Bakterielle Adenylylcyclase-Toxine , adenylyl cyclase , bacterial adenylyl cyclase toxins
subject: 540 Chemie

description: The cAMP signaling pathway is crucial for many physiological processes and many disease states like neurodegenerative diseases, mood disorders, pain, drug dependency or heart failure. As mammalian AC isoforms are expressed in a tissue-specific manner, isoform-selective AC activation or inhibition may be a promising novel therapeutic strategy. Therefore, the aim of this doctoral thesis was to develop analytical methods for the investigation and characterization of AC enzyme activity in specific mammalian tissues. As the cAMP signaling pathway is essential for cardiac contractility, and as heart failure is one of the most important causes for morbidity and mortality in elderly patients, the heart - hence AC from cardiac tissue - was considered primarily. Thus, this work provides the basis for exploring AC as target for the treatment of heart failure. As one major achievement of this thesis, a biochemical method was developed to prepare membranous AC from cardiac tissue, yielding the components of the cAMP signaling cascade, i.e. GPCRs, G proteins and AC in intact form. Using forskolin analogs for stimulating AC activity and MANT-substituted nucleotides as inhibitors, and by investigating Michaelis-Menten enzyme kinetics, we found AC from heart tissue to correlate to some extent with recombinant AC5, compatible with the notion that AC5 is the major AC isoform in the heart. However, AC isoforms other than AC5 appear to contribute to total AC activity in mouse heart membranes, too. These findings were corroborated by results obtained by applying further techniques, i.e. real-time PCR and immunoblot analysis. In summary, by the use of several techniques, we provide a pharmacological profile of cardiac AC and an excellent starting point for the design of potent and selective inhibitors. When conventional treatment of heart failure is limited, e.g. due to ineffective beta-adrenoceptor antagonist therapy, as a promising novel therapeutic strategy, future clinical treatment strategies may be complemented by nucleotide prodrugs accomplishing beneficial effects on the heart and increased survival of the patient. The bacterial AC toxins CyaA and EF are key virulence factors impairing host immune responses and worsening the infections by Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, and Bacillus anthracis, causing anthrax disease. The second aim of this doctoral thesis was to investigate the detailed modes of action of EF and CyaA and to provide the basis for the development of AC toxin inhibitors. Using radiochemical methods, we investigated the structure/activity relationships of substituted NTPs as CyaA inhibitors, revealing hypoxanthine nucleotides to be superior to other purine and pyrimidine nucleotides. One major achievement of this thesis is the development of fluorescence-based approaches allowing monitoring the binding of potential inhibitor molecules to CyaA. Selective CyaA inhibitors may be used to prevent dampening of the immune response upon Bordetella pertussis infection and to reduce mortality in severe courses of disease. The fluorescence-based approaches developed in this thesis are available for future high-throughput screening to support the development of highly potent and selective CyaA inhibitors. Cyclic cytidine 3´:5´-monophosphate (cCMP) was identified unambiguously in various mammalian tissues, protein kinase activity responsive to cCMP was observed and phosphodiesterase activity accounting for the selective degradation of cCMP was discovered. Therefore, cCMP may be a novel second messenger with potential importance in many physiological processes, including regulation of immune responses. However, so far, the precise identity of the cCMP-forming enzyme is unknown. For the first time, we provide evidence for cytidylyl cyclase (CC) activity of purified bacterial exotoxins, resulting in the conversion of CTP to cCMP. As a major achievement of this thesis, various nucleotidyl cyclase activities of bacterial AC toxins were investigated and monitored by the use of several techniques. First, the isotopic nucleotidyl cyclase assay based upon detection of radioactively labeled cNMPs showed that EF and CyaA possess CC activity, and additionally, we also observed the conversion of UTP to cUMP. We performed substrate saturation experiments to determine the kinetic properties of CC and UC activities. Second, the non-isotopic nucleotidyl cyclase assay basing upon an advanced sample preparation process and detection of cNMPs by HPLC was developed and used to monitor NTP consumption and cNMP formation by both AC toxins. Using this approach, in addition to the formation of cAMP, cCMP and cUMP, we also observed the formation of cIMP, cGMP and cTMP. The rank order of substrate preference was ATP &gt; CTP &gt; UTP &gt; ITP &gt; GTP &gt; TTP, for both EF and CyaA. Third, mass spectrometry was used to unambiguously identify the corresponding cNMPs obtained from enzymatic reactions. Based on the fact that cCMP-analogs inhibit immune responses, we hypothesize that cCMP may be a novel endogenous second messenger and that the multiple nucleotidyl cyclase activities of bacterial AC toxins described in this thesis for the first time contribute to weakening of the immune defense by bacterial exotoxins, resulting in increased infection severity. Regarding future research, the endogenous CC enzyme remains to be discovered. The physiological role and the molecular targets of cCMP remain to be determined. What is the impact of multiple nucleotidyl cyclase activities of bacterial AC toxins on cyclic nucleotide metabolism in host cells? And finally, - regarding the occurrence of bacterial strains resistant to antibiotic treatment - can our findings lead to advancements in the prevention and therapy of bacterial infections?
description: Die Bildung des �Second Messengers� cAMP durch Adenylylcyclasen (AC) ist von essentieller Bedeutung in Zusammenhang mit vielen physiologischen Prozessen und Krankheitszuständen wie zum Beispiel neurodegenerativen Erkrankungen, Depression, Schmerz, Drogenabhängigkeit und Herzinsuffizienz. Da die AC-Isoformen gewebsspezisch exprimiert werden, stellt Isoform-selektive Stimulation oder Hemmung der AC eine potentielle neue therapeutische Strategie dar. Somit war das Ziel dieser Doktorarbeit, analytische Methoden zur Erforschung und Charakterisierung der Enzymaktivität der AC in spezifischen Geweben zu entwickeln. Da der cAMP-Signaltransduktionsweg essentiell für die Kontraktilität des Herzens ist, und da Herzinsuffizienz eine der wichtigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität unter älteren Patienten ist, wurde speziell die AC des Herzens untersucht. Diese Arbeit bereitet somit die Grundlage zur Erforschung kardialer AC als neue therapeutische Zielstruktur in der Behandlung von Herzinsuffizienz. Eine biochemische Methode zur Präparation von intakter, membranärer AC aus murinem Herzgewebe wurde entwickelt und ermöglichte die Charakterisierung der Enzymaktivität durch den Einsatz pharmakologischer Methoden. Durch Stimulation mit Forskolin-Analoga und Inhibition mit MANT-substituierten Nukleotiden, sowie durch Michaelis-Menten Enzymkinetik-Versuche konnte gezeigt werden, dass die Enzymaktivität kardialer AC in gewissem Umfang mit AC5 korreliert. Jedoch schienen auch andere AC Isoformen als AC5 zur gesamten AC-Aktivität beizutragen. Diese Ergebnisse wurden durch den Einsatz weiterer Methoden (Real-time PCR und Immunoblotting) untermauert. MANT-substituierte Hypoxanthin-Nukleotide wurden als potente AC-Inhibitoren identifiziert. Diese Arbeit liefert somit eine pharmakologische Charakterisierung kardialer AC und einen guten Ausgangspunkt zur Entwicklung potenter und selektiver AC-Inhibitoren, die zukünftig die Therapie der Herzinsuffizienz ergänzen könnten. Die bakteriellen Adenylylcyclase-Toxine CyaA und EF sind bedeutende Virulenz-Faktoren von Bordetella pertussis, dem Erreger des Keuchhustens, und Bacillus anthracis, dem Erreger von Milzbrand, die eine Störung der Funktionen des Immunsystems bewirken und somit den Krankheitsverlauf verschlimmern. Das zweite Ziel dieser Doktorarbeit war, die detaillierte molekulare Funktionsweise von CyaA und EF zu erforschen und die Grundlage zur Entwicklung von Inhibitoren für CyaA und EF zu schaffen. Mit radiochemischen Methoden wurden Struktur-Wirkungbeziehungen substituierter Nukleosidtriphosphate als CyaA-Inhibitoren untersucht. Fluoreszenz-basierte Methoden wurden entwickelt, die es ermöglichen, die Bindung von potentiellen Inhibitoren an CyaA zu verfolgen. Eine Methode basierend auf Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und eine Methode basierend auf direkter Inhibitor-Fluoreszenz wurden eingesetzt, um die Wechselwirkungen von CyaA mit ANT-, MANT-, und TNP-substituierten Nukleotiden zu untersuchen und um die Potenzen der Inhibitoren zu bestimmen. Beide Fluoreszenzmethoden ermöglichen die Suche nach CyaA-Inhibitoren in Hochdurchsatzverfahren und könnten in Zukunft zur Entwicklung selektiver und potenter Inhibitoren beitragen. Zyklisches Cytosin-3´,5´-monophosphat (cCMP) konnte in früheren Arbeiten zweifelsfrei aus verschiedenen Organen nachgewiesen werden. cCMP könnte somit ein neuer �Second Messenger� mit großer Bedeutung in vielen physiologischen Prozessen sein. Bisher konnte die genaue Identität des cCMP-bildenden Enzyms jedoch nicht aufgeklärt werden. In der vorliegenden Doktorarbeit zeigen wir erstmalig Cytidylylcyclase-Aktivität von CyaA und EF. Wir haben multiple Nukleotidylcyclase-Aktivitäten bakterieller Adenylylcyclasen unter Verwendung verschiedener Techniken untersucht. In unserem isotopischen Nukleotidylcyclase-Assay basierend auf der Detektion radioaktiv markierter zyklischer Nukleotide zeigen wir, dass sowohl EF als auch CyaA Cytidylylcyclase-Aktivität und Uridylylcyclase-Aktivität besitzen. Wir haben beide Enzymaktivitäten nach Michaelis-Menten charakterisiert und Inhibitionsexperimente mit Substratanaloga durchgeführt. In unserem nicht-isotopischen Nukleotidylcyclase-Assay basierend auf HPLC zeigen wir die Bildung von cCMP, cUMP, cIMP, cGMP und cTMP durch EF und CyaA. Die zweifelsfreie Identifikation der entstandenen zyklischen Nukleotide erfolgte mittels Massenspektrometrie. Für die Zukunft bleiben die Fragen offen, welche physiologische Bedeutung den oben genannten seltenen zyklischen Nukleotiden zukommt, welches die molekularen Zielstrukturen sind und ob es im Menschen endogene Enzyme gibt, die cCMP bilden.