Funktionelle Charakterisierung des 19S regulatorischen Komplexes des 20S Proteasoms sowie Analyse der Biogenese des 20S Proteasoms
Creators: name: Braun, Beate
Publisher: name: Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
Year: 2001
Subjects: subject: Proteasom
subject: Chaperonaktivität
subject: 19S Regulator
subject: Proteasombiogenese
subject: Proteasome
subject: Chaperone-like activity
subject: 19S regulatory complex
subject: Proteasome biogenesis
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie
subject: 32 Biologie
subject: WD 5100

description: Das 20S Proteasom spielt zusammen mit seinem 19S Regulator als 26S Proteasomkomplex eine zentrale Rolle beim Abbau von Proteinen in eukaryotischen Zellen. Dem 19S Regulator wird dabei die Funktion der Substraterkennung und -entfaltung sowie die Beteiligung an der Translokation der entfalteten Substrate zum katalytischen Zentrum zugeordnet. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß der 19S Regulator chaperonähnliche Eigenschaften besitzt, dadurch also durchaus die Entfaltung der Proteinsubstrate bewirken kann. Durch den 19S Regulator war das 26S Proteasom in der Lage, einen Teil denaturierter Citratsynthase, eines Modellsubstrats für die Untersuchung von Chaperonaktivitäten, ATP-abhängig zum nativen Zustand zurückzufalten. Desweiteren führte die Anwesenheit des 19S Regulators bzw. des 26S Proteasoms in Abwesenheit von ATP zu einer Aggregationshemmung denaturierter Citratsynthase. Auch konnte die direkte Interaktion zwischen der Citratsynthase und dem 26S Proteasom bzw. dem 19S Regulator durch Glyceroldichtegradientenzentrifugation gezeigt werden. Diese chaperonähnlichen Eigenschaften des 19S Regulators konnten dem aus sechs ATPasen und zwei nicht-ATPasen bestehenden Base-Subkomplex zugeordnet werden. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem 19S Regulator und dem 20S Proteasom und damit möglicherweise verbundenen Konformationsänderungen in den Komplexen, wurde postuliert, daß der 19S Regulator auch auf die Biogenese, also die Assemblierung und Reifung des 20S Proteasoms einen Einfluß haben könnte. Es konnte gezeigt werden, daß Mutationen in den 19S ATPasen zu einer Anreicherung der unprozessierten proteasomalen 20S Untereinheit beta5 bei erhöhter Temperatur führen. Die Ursache dieses Anreicherungseffektes konnte nicht aufgeklärt werden. Der Effekt läßt sich nicht auf eine Hochregulation der m-RNA-Synthese der beta5-Untereinheit zurückführen. Die Beteiligung des 19S Regulators an frühen Assemblierungsstadien des 20S Proteasoms ist aufgrund der Analyse der mit dem Maturierungsfaktor Ump1 im Komplex vorliegenden Proteine ebenfalls unwahrscheinlich. Eine Beteiligung des 19S Regulators an einem der letzten Schritte der 20S Proteasomenbiogenese, beispielsweise an der Katalyse der Prozessierung der beta-Untereinheiten, ist eher vorstellbar, konnte aber nicht eindeutig gezeigt werden. Auf die Prozessierung der beta-Untereinheiten hat aber auch die katalytische Aktivität der beta-Untereinheiten einen nicht unwesentlichen Einfluß. So werden die katalytisch aktiven Untereinheiten durch Autokatalyse zu ihrer aktiven Form prozessiert und bewirken die Prozessierung der katalytisch inaktiven Untereinheiten beta6 und beta7. Dies konnte so auch durch Inaktivierung der beta2i-Untereinheit bestätigt werden. Die Expression der inaktiven Maus-beta1iT1A-Untereinheit in humanen T2-Zellinien verhinderte ihre eigene vollständige Prozessierung, hatte aber auch Einfluß auf die Prozessierung von beta7 und von inaktiv exprimierten beta1i (Maus-beta1iT1A).
description: In eukaryotic cells the protein degrading proteasome/ubiquitin system is involved in a wide variety of regulatory processes. The 26S proteasome is composed of two subcomplexes, a proteolytic core (20S) and a regulatory complex (19S). It is proposed that the proteins of the 19S regulatory complex can recognize and unfold the substrates. Furthermore the RC participates in translocation of the substrates into the proteasomes inner chamber were peptide bond hydrolysis occurs. This work shows that the proteasome exhibits an ATPdependent chaperon-like activity on citrate synthase, a model substrat for chaperones. Human and yeast proteasomes stimulated the recovery of the native structure of citrate synthase in an ATPdependent manner. Furthermore the 19S complex was able to supress the aggregation of denatured citrate synthase. Glycerol gradient analysis indicated that proteasome facilitates the refolding of citrate synthase through the formation of citrate synthase-proteasome complexes as expected for a chaperon-like mechanism. The chaperonlike activity was mapped to the base of the 19S regulatory complex. The RC could be able to unfold protein substrates in the 26S proteasome by this activity. The crystal structure of S. cerevisiae 20S proteasome shows a closed gate to the proteasome interiors. The 19S regulatory complex may induce conformational changes not only to open the protease cavity but also to assit in beta-subunit processing during 20S proteasome biogenesis. To test this hypothesis some yeast 19S ATPase mutant strains were analyzed for defective 20S proteasome maturation by following the processing of beta5-subunit. This work has shown that some mutations in these ATPases led to an accumulation of the unprocessed proteasomal beta5-subunit at restricted temperature. This effect was not due to the upregulation of beta5 mRNA transcription. It is not very likely that proteins of the RC participate in early steps of proteasome biogenesis, since they could not be found in precurser intermediates containing the maturation factor Ump1p. However, they might be important for later assembly steps. During biogenesis five prosequence containing beta subunits have to be processed. This proceeds via a two-step mechanism involving autocatalytic or transcatalytic processing by neighbouring subunits. The proposed mechanism could be confirmed by inactivation of the beta2i subunit via substitution of the active site Threonin1 against Alanin (beta2iT1A). The inactivation blocked the autocatalysis of beta2i and influenced the processing of beta7 and that of inactivated beta1i (beta1iT1A).