title: Heterologous production and maturation of an oxygen-tolerant [NiFe]-hydrogenase from Cupriavidus necator in Escherichia coli
title: Heterologe Produktion und Reifung einer löslichen sauerstofftoleranten [NiFe]-Hydrogenase aus Cupriavidus necator in Escherichia coli
Creators: name: Schiffels, Johannes
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Kultivierung
Recombinant , Multigene-expression
[NiFe]-hydrogenase , oxygen-tolerant
Knallgas
Kombinatorik , Genexpr
Eisen
[NiFe]-Hydrogenase , Sauerstofftoleranz
Rekombinant , Multigen-Expression
Nickel , Alcaligenes eutrophus
Escherichia coli
Biowissenschaften, Biologie
Hydrogenasen
Wasserstoff , Sauerstoff
high-yield
Hochausbeute

description: Ziel dieser Arbeit war die
      Produktion und Reifung einer O2-toleranten
      [NiFe]-Hydrogenase, der SH aus Cupriavidus necator (Cn), in
      Escherichia coli (Ec). Zu diesem Zweck wurde zunächst ein
      verfügbares Basis-Klonierungssystem (StarGate®, IBA)
      erweitert, um den Anforderungen einer Multigen- und
      Hochausbeute-Expressionsplattform für den Modellorganismus
      Escherichia coli zu entsprechen. Die erste Erweiterung
      beinhaltete das Design neuer Fusionsvektoren, die jedes Gen
      unter Kontrolle individueller T7-Promotoren und –Terminatoren
      stellen und die Verknüpfung jedes Genprodukts mit N- oder
      C-terminalen StrepII-Tags ermöglichen. Unter Einsatz des
      neuen Systems wurden insgesamt 21 Hydrogenase-assoziierte
      Cn-Gene, darunter die fünf SH-Stukturgene sowie zwei
      vollständige Sätze putativer Reifungsgene, systematisch zu
      funktionalen Multigen-Einheiten (Modulen) assembliert. Die
      Koexpression von bis zu 10 Genen innerhalb von SH- oder
      Reifungsmodulen auf einem Plasmid konnte erfolgreich
      demonstriert werden. Um eine Kombination der SH-Gene mit den
      Reifungsmodulen in einer Zelle zu ermöglichen, erfolgte
      anschließend die Entwicklung kompatibler Akzeptorvektoren.
      Daraufhin konnten Expressionsstämme mit unterschiedlichen
      Vektor- und Modul-Kombinationen generiert, und damit sowohl
      SH-Produktions- als auch kombinatorische Studien zum
      SH-Reifungsprozess ermöglicht werden. SH-Produktionsversuche
      mit rekombinanten Ec-Stämmen deuteten darauf hin, dass die
      maximale Löslichkeit und Funktionalität der Reifungsproteine
      nicht nur von der Gendosis und Expressionsrate, sondern auch
      maßgeblich von einem transienten, wachstumsabhängigen
      zellulären Milieu abhängig ist. Aus diesem Grund wurde eine
      spezielle Kultivierungsstrategie zur SH-Produktion
      erarbeitet, welche auf einem bekannten
      Laktose-Autoinduktionssystem basiert. Im Zuge umfangreicher
      Optimierungsstudien wurden aerobe Langzeit-Kultivierungen mit
      sequentieller Modifikation der physikalischen
      Wachstumsparameter und der Medienzusammensetzung vorgenommen.
      Die Strategie wurde auf die rekombinanten Stämme angewendet
      und ergab eine einheitliche maximale SH-Aktivität innerhalb
      der mittstationären Phase 36–40 Stunden nach Inokulation.
      Maximale spezifische Aktivitäten in Extrakten lagen mit 7,2
      U•mg-1 in der Größenordnung der Werte, welche bei optimierten
      Kultivierungen zur Produktion nativer SH in Cn erreicht
      wurden. Die Kombination der vorgestellten
      Expressionsplattform mit dem erarbeiteten
      Kultivierungsprozess stellt somit die erste
      Hochausbeute-Produktionsplattform für eine rekombinante
      [NiFe]-Hydrogenase dar. StrepII-getaggte SH-Varianten konnten
      homogen aus Zellen rekombinanter Stämme isoliert werden. Mit
      bis zu 227 U•mg-1 wurde hierbei die höchste bisher für die SH
      dokumentierte spezifische Aktivität erreicht. In diesen
      hochreinen Präparationen war die Enzymausbeute verringert,
      lag jedoch stets im Milligramm-Bereich pro Liter Kultur.
      Sowohl hinsichtlich der oligomeren Enzymstruktur als auch der
      katalytischen Eigenschaften entsprachen die rekombinanten
      Varianten der aus Cn-Zellen isolierten Wildtyp-SH. Durch
      Entwicklung der kombinatorischen Expressionsplattform wurden
      innovative Strategien zur Untersuchung des Reifungsprozesses
      von [NiFe]-Hydrogenasen ermöglicht. Dies wurde anhand der SH
      als Modellenzym demonstriert. Einzelne Proteine sowie
      essentielle Reifungs-Intermediate (Komplexe) zweier
      unabhängiger Reifungsmodule aus Cn wurden rekombinant
      produziert und gereinigt. Dies lieferte Hinweise darauf, dass
      die Stabilität der einzelnen Reifungsproteine in vivo stark
      von der Ausbildung oligomerer Formen und stöchiometrischer
      Reifungs-Komplexe abhängt. Durch Reinigung der
      SH-spezifischen Endopeptidase HoxW konnten darüber hinaus
      Hinweise auf ein redoxaktives [4Fe-4S]-Cluster mit bislang
      unbekannten Eigenschaften geliefert werden.
      In-vivo-Deletions- und Substitutionsstudien mit analogen
      Reifungsproteinen (Hyp) verschiedener Module aus Cn und Ec
      lieferten darüber hinaus Erkenntnisse über Spezifitäten und
      damit die Möglichkeit partieller Komplementation. Durch
      Entwicklung eines zellfreien in-vitro-Reifungssystems für die
      SH konnten die in-vivo-Experimente anschließend entscheidend
      ergänzt werden. Essentielle Komponenten und limitierende
      Faktoren des Reifungsprozesses wurden ermittelt. Erste
      „Pulldown“-Experimente lieferten Hinweise darauf, dass
      bislang unbekannte Reifungsintermediate durch das
      in-vitro-System identifiziert werden könnten. Dadurch erweist
      sich die vorgestellte Methodik als potentes
      grundlagenorientiertes Werkzeug zur Untersuchung des
      Reifungsprozesses.
description: The aim of this thesis was the
      production and maturation of an O2-tolerant
      [NiFe]-hydrogenase, the SH from Cupriavidus necator (Cn), in
      Escherichia coli (Ec). For this purpose, an available cloning
      system (StarGate®, IBA) was initially subjected to an upgrade
      in order meet the requirements for a multigene and high-yield
      Escherichia coli expression platform. The first development
      consisted of the design of new fusion vectors, which place
      each gene under control of individual T7-promoters and
      –terminators in the course of gene assembly and enable the
      fusion of each gene product with an N- or C-terminal
      StrepII-tag. Using the novel fusion system, a total number of
      21 hydrogenase-associated Cn genes, including five
      SH-structural genes and two independent sets of auxiliary
      genes, were systematically assembled yielding functional
      multigene units (modules). Co-expression of up to 10 genes
      assembled as SH- or maturation-related modules from one
      plasmid was successfully demonstrated. In order to combine
      SH- and accessory modules in one cell, a set of compatible
      plasmids was designed. Thereby, generation of expression
      strains harboring different combinations of vectors and
      modules was enabled. SH-production as well as maturation
      studies were thus made possible in a systematic and
      integrative way. SH-production studies using recombinant
      Ec-strains indicated that the activity of maturation-related
      proteins was not only dependent on gene doses and the rate of
      expression, but also on specific cellular environments
      transiently present during growth. Therefore, a cultivation
      strategy based on a previously presented
      lactose-autoinduction system was applied for SH-production.
      In the course of optimization studies, aerobic long-term
      cultivations with sequential modification of both physical
      growth parameters and the medium composition were carried
      out. The strategy was subsequently applied to recombinant
      SH-production strains and consistently yielded maximal
      SH-activities between 36–40 hours after inoculation. The
      highest specific activity in cell-free extracts amounted to
      7.2 U•mg-1, which is in range of the values achieved with an
      optimized SH-production process in Cn. Hence, combination of
      the expression platform presented herein with the developed
      cultivation strategy represents the first high-yield
      production system for a recombinant [NiFe]-hydrogenase to
      date. StrepII-tagged SH-variants were homogeneously isolated
      from recombinant Ec strains. The specific activity of
      purified recombinant SH reached 227 U•mg-1, which represents
      the highest activity for the enzyme reported to date. In case
      of these ultrapure preparations, yields were reduced but
      still in the mg•(Liter culture)-1 range. The oligomeric
      enzyme structures and catalytic properties obtained for the
      recombinant variants nicely matched the data available for
      the wildtype-SH isolated from Cn cells. Development of the
      combinatorial expression platform further enabled innovative
      strategies to investigate the maturation process of
      [NiFe]-hydrogenases. This was demonstrated for the SH as a
      model enzyme in this study. Individual maturation-related
      proteins as well as complex intermediates of two independent
      Cn maturation sets were recombinantly produced and isolated
      by StrepTactin affinity chromatography. These results
      indicated that the in-vivo-stability of the maturation
      factors was largely dependent on the formation of oligomeric
      conformations as well as stoichiometric complexes with other
      parts of the maturation machinery. Purification of the
      SH-specific endopeptidase HoxW revealed the existence of a
      redox-active [4Fe-4S]-cluster with hitherto unknown
      properties. This is the first documented isolation of a
      HoxW-analog and the first indication for an
      electron-transferring co-factor in a maturation-related
      specific endopeptidase to date. In-vivo-deletion and
      substitution studies with analogous Hyp-proteins from
      different Cn and Ec maturation-related sets provided further
      insights into specificities and thus, complementation
      capabilities. An in-vitro-maturation system was developed,
      which allowed the dissection of the maturation process in a
      cell-free environment. Essential components and limiting
      factors of the SH maturation process were determined using
      this system. Initial pull-down experiments with in vitro
      matured SH suggested that the cell-free system might be used
      as an efficient technique to identify previously unknown
      maturation complex-intermediates and to study the general
      maturation process in detail.