title: Determination of DNA via Resonance Light Scattering technique using new probes derived from ruthenium ligands complexes and investigation of their binding mode
Creators: name: Burger, Doris Marianne
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Rutheniumkomplexe , DNS-Bindung , DNS , Konzentration , Lichtstreuung , Fluoreszenzspektroskopie , Resonance Light Scattering , Resonance Light Scattering
subject: 540 Chemie

description: This thesis describes the synthesis of DNA probes derived from ruthenium ligand complexes (RLCs). The biding mode of those RLCs to DNA was investigated and the concentration of nucleic acid determined via the Resonance Light Scattering (RLS) technique. Chapter 1 gives a short overview of the use on ruthenium complexes and their advantages over organic dyes. There, the luminescence emission mechanism of ruthenium ligand complexes is explained in detail. The three possible binding modes to DNA are described. Chapter 2 describes the mainstream theory of the RLS technique by Pasternack et al.. Since the introduction and its proof as valuable tool in analytical chemistry was made, there were a large number of further developments. The development of various techniques including the total internal reflected resonance light scattering (TIR-RLS) and backscattering light (BSL), surface enhanced light scattering (SELS), resonance light scattering imaging (RLSI), flow injection resonance light scattering (FI-RLS) and wavelength ratiometric RLS technique (WRRLS) as well as the RLS particles are discussed. In Chapter 3 the binding modes of the RLC derived probes to DNA was investigated. Absorption and fluorescence spectra as well as polarization and melting studies of the probes were performed in absence and presence of DNA resulting in the conclusion that all probes bind to DNA in an intercalative mode. Viscosity measurements, the most critical binding test, especially support this conclusion. Chapter 4 presents the determination of DNA via RLS technique using the newly designed RLCs. The optimal conditions for the assay were determined. The probe 2b proved to be best because the assay could be performed at neutral pH. The optimal pH using probe 1 and 2a was pH 3. The pH optimum lies in the basic range for the other dinuclear RLCs. The LOD of 2b was calculated to be 1.6 ng mL-1 for ct-DNA and 2.7 ng mL-1 for fs-DNA with a wide linear range of 30 - 1800 ng mL-1 under optimum conditions. The method presented here does not require surfactants and can be performed under neutral pH conditions. The low LODs of this assay are obtained in a very simple way and are definitely comparable to other RLS based methods, but also to well established fluorometric methods. Hence, the RLS assay represents a valuable tool for DNA determination. Chapter 5 describes a description of the synthetic pathways and purification of the ruthenium complexes with yields in the range of 20- 30 % used in chapter 3 and 4. The proof of structure and purity was provided by 1H NMR data.
description: Diese Arbeit beschreibt die Synthese von DNA Sonden, die sich von Rutheniumligandenkomplexen (RLC) ableiten. Die Bindungseigenschaften dieser RLCs wurden untersucht und Konzentration an DNA mittels der Resonanzlichtstreuung (RLS) bestimmt. Kapitel 1 beschreibt den Mechanismus auf dem die Lumineszenz der RLCs beruht, sowie deren Vorteile gegenüber organischen Farbstoffen bezogen auf ihre chemischen und photochemischen Eigenschaften. Des weiteren werden die drei möglichen kovalenten Bindungen zu DNA gezeigt und ein Überblick über die vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten von RLCs gegeben. Kapitel 2 beschreibt die am weitesten verbreitete Theorie der RLS Technik nach Pasternack et al. Seit der Einführung der RLS Technik 1993, hat sie sich als ein wertvolles Werkzeug in der analytischen Chemie erwiesen. Eine große Anzahl von Weiterentwicklungen folgten in den nächsten Jahren, unter anderem die Total Internal Reflected Resonance Light Scattering Technik (TIR-RLS), die Backscattering Light Technik (BSL), die Surface Enhanced Light Scattering Technik(SELS), die Resonance Light Scattering Imaging Technik (RLSI), die Flow Injection Resonance Light Scattering Technik (FIA-RLS) und die Wavelength Ratiometric RLS Technik (WR-RLS) sowie die Entwicklung von RLS Partikeln Die genannten Techniken werden im Einzelnen beschrieben. In Kapitel 3 werden die Bindungseigenschaften der in dieser Arbeit synthetisierten RLCs (siehe Kapitel 5) mit DNA untersucht. Dafür wurden Absorptions- und Fluoreszenzspektren aufgenommen, sowie Polarisationsmessungen und Schmelzkurven in An- und Abwesenheit von DNA durchgeführt. Die Ergebnisse der Messungen lassen darauf schließen, daß sich die Sonden in die DNA einlagern. Besonders die Viskositätsmessungen, der kritischste Test, unterstreichen diese Schlußfolgerung. Kapitel 4 zeigt die Bestimmung von DNA Konzentrationen via Resonanzlichtstreuung mittels RLCs deren Synthese in Kapitel 5 beschriebenen wird. Die optimalen Bedingungen des Assays wurden ermittelt, wobei sich die Sonde 2b als die am besten geeignete herausstellte. In diesem Falle konnte der Assay unter neutralen Bedingungen durchgeführt werden. Dagegen liegt bei den Proben 1 und 2a der optimale pH im sauren; der der Sonden 2c - e im basischen Bereich. Unter optimalen Bedingungen, d.h. pH 7 und einer Konzentration von 2b von 1 µM, konnte eine Nachweisgrenze für ct-DNA von 1.6 ng mL-1 und von 2.7 ng mL-1 für fs-DNA bestimmt werden. Der lineare Bereich erstreckt sich von 30 bis 1800 ng mL-1. Die hier präsentierte Methode benötigt keine Zusätze ( in der Regel Tenside wie CTMAB) und kann unter neutralen pH durchgeführt werden. Mit dieser einfachen Methode können niedrige Nachweisgrenzen erreicht werden, die mit anderen auf RLS Technik basierenden, aber auch mit bereits gut etablierten fluorimetrischen Methoden vergleichbar sind. Deswegen stellt dieser RLS Assay ein wertvolles Werkzeug zur Bestimmung von DNA. Kapitel 5 beschreibt die Synthese und Reinigung der in Kapitel 3 und 4 verwendeten RLC. Die Ausbeuten liegen zwischen 20 und 30 %. Die Struktur wurde durch 1H NMR Spektroskopie belegt.