Προσδιορισμός ιστιδίνης σε δείγματα ούρων με χρήση dried urine spots και χρωματογραφίας υγρού σε συνδυασμό με εν ροή παραγωγοποίηση μετά τη στήλη
Creators: name: Γκουντουβά, Φρειδερίκη-Ιωάννα Θωμά
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2024
Subjects: Ιστιδίνη
Ξηρή κηλίδα ούρων
Υγρή χρωματογραφία
Histidine
Dried urine spots
Liquid chromatography

description: Στη παρούσα μελέτη αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος DUS για τον προσδιορισμό της ιστιδίνης στα ανθρώπινα ούρα. Η ανάπτυξη της τεχνικής περιλάμβανε την επιλογή του κατάλληλου τύπου χαρτιού, του διαλύματος εκχύλισης και τον καθορισμό του βέλτιστου χρόνου εκχύλισης. Μια κρίσιμη πτυχή της μεθόδου DUS ήταν ο εντοπισμός του ιδανικού μεγέθους και σχήματος από τα χαρτιά. Για την DUS χρησιμοποιήθηκε χαρτί χρωματογραφίας Whatman κομμένο σε λωρίδες, σε διαστάσεις 2×3 cm. Δείγματα ούρων 20 μL τοποθετήθηκαν στο χαρτί, ξηράνθηκαν και η ιστιδίνη εκχυλίστηκε στη συνέχεια με 2000 μL διαλύματος κινητής φάσης: ακετονιτριλίου 90:10. Η ανάλυση της ιστιδίνης έγινε μέσω υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC), σε συνδυασμό με εν-ροή παραγωγοποίηση μετά τη χρωματογραφική στήλη. Η παραγωγοποίηση πραγματοποιήθηκε με το αντιδραστήριο o-φθαλαδιαλδεΰδη (OPA), και η ανίχνευση έγινε με φθορισμομετρία. Η μέθοδος επικυρώθηκε ως προς τη γραμμικότητα, το όριο ανίχνευσης, το όριο ποσοτικού προσδιορισμού, την πιστότητα, την επίδραση του υποστρώματος, την ακρίβεια και τη σταθερότητα. Η γραμμικότητα αξιολογήθηκε σε εύρος 1,0-20,0 μmol L-1, με όριο ανίχνευσης 0,3 μmol L-1 και όριο ποσοτικού προσδιορισμού 1 μmol L-1. Οι ανακτήσεις ήταν ικανοποιητικές, κυμαινόμενες μεταξύ 87-115%. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διασταυρούμενη επικύρωση με υγρά δείγματα και τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων βρέθηκαν συγκρίσιμα. Η μέθοδος DUS αποδείχθηκε εξαιρετικά αξιόπιστη, με την ιστιδίνη να παραμένει σταθερή στο χαρτί για τουλάχιστον 7 ημέρες.
description: In this study, a novel Dried Urine Spot (DUS) method was developed for the determination of histidine in human urine. The development process involved selecting the appropriate type of paper, the extraction solution, and determining the optimal extraction time. A crucial aspect of the DUS method was identifying the ideal size and shape of the spots. The in-house DUS utilized Whatman chromatography paper cut into 2×3 cm strips. Urine samples of 20 µL were placed on the paper, and histidine was then extracted with 2000 µL of a 90:10 mobile phase: acetonitrile solution. Histidine analysis was performed using high-performance liquid chromatography, combined with in-line derivatization after the chromatographic column. The derivatization was carried out with o-phthaldialdehyde reagent, and detection was achieved through fluorometry. The method was validated for linearity, limit of detection, limit of quantification, intraday and interday precision, matrix effect, accuracy, and stability. Linearity was evaluated in the range of 1.0-20.0 μmol L-1, with a limit of detection of 0.3 μmol L-1 and a limit of quantification of 1 μmol L-1. The recoveries were satisfactory, ranging between 87-115%. Additionally, cross-validation with liquid approach demonstrated that the results of the two methods were in agreement. The DUS method proved to be highly reliable, with histidine remaining stable on the paper for at least 7 days.