title: Modulation proliferationsassoziierter Parameter der Bioaktivität eines Heidelbeerextrakts (Vaccinium myrtillus L.) mittels Fraktionierung bzw. Mikroformulierung
Creators: name: Kropat, Christopher
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Polyphenolen, insbesondere Anthocyanen, werden zahlreiche chemopräventive Wirkungen zugeschrieben. Neuere Entwicklungen in der Mikroverkapselung zielen darauf ab, solche Substanzen im Lebensmittel zu stabilisieren, deren unerwünschte sensorische Eigenschaften zu maskieren sowie eine kontrollierte Freisetzung im Gastrointestinaltrakt zu erreichen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss unterschiedlicher Verkapselungstechniken auf biologische Eigenschaften eines polyphenolreichen Heidelbeerextrakts in vitro und in vivo untersucht. Darüber hinaus wurden Substanzgruppen, die zur biologischen Wirksamkeit des Extrakts beitragen, identifiziert. Die biologische Wirksamkeit des Heidelbeerextrakts vor und nach Verkapselung wurde in vitro über Hemmung der Rezeptoraktivität des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und des Wachstums humaner Kolonkarzinomzellen betrachtet. Als möglicher anwendungslimitierender Faktor wurde darüber hinaus der Einfluss auf die Aktivität von Topoisomerasen untersucht. Der Einfluss von Verkapselungsmethoden wurde im Rahmen einer humanen Interventionsstudie untersucht. Als ausgewählter Parameter wurde hierzu die Transkription Nrf2/ARE-regulierter Gene in Blutzellen von gesunden Probanden und Ileostomiepatienten herangezogen. Im Zellkultursystem wurde eine Verringerung der EGFR-Hemmwirkung des HBE (45 – 180 min Inkubation) durch die Formulierung in protein-, pektin- und emulsionsbasierte Systeme beobachtet. Dabei spielen Matrixeffekte eine wesentliche Rolle sowie die langsame Freisetzung bioaktiver Inhaltsstoffe und deren partielle Verluste bei der Kapselherstellung. Durch ex vivo-Verdau der Kapseln mit Ileostomaausfluss konnte die EGFR-Hemmwirkung des Extrakts nicht wiederhergestellt werden. Nach Fraktionierung des Heidelbeerextrakts gelang es, die wesentliche EGFR-Hemmwirkung auf den anthocyanfreien Anteil des Extrakts, insbesondere die polymere Proanthocyanidine, zurückzuführen. Im Gegensatz zur hemmenden Wirkung auf den EGFR wurde die wachstumshemmenden Eigenschaften des Extrakts (72 h Inkubation) durch die Formulierung in die zuvor untersuchten Systeme nicht negativ beeinflusst. Das emulsionsbasierte System hatte zudem eine leichte Verstärkung der Wachstumshemmung zur Folge. Nach Fraktionierung des Heidelbeerextrakts erwiesen sich hinsichtlich der wachstumshemmenden Wirkung sowohl Anthocyane als auch polymere Proanthocyanidine als aktive Komponenten. Weder vor noch nach Formulierung des Extrakts in die untersuchten Systeme wurde eine Stabilisierung von DNA/Topoisomeraseintermediaten im ICE-Bioassay beobachtet, sodass die Formulierung hinsichtlich dieses Parameters keine Anwendungslimitierung darstellt. In vivo wurde durch Formulierung in protein- und citruspektinbasierte Systeme ebenfalls eine deutlich Verminderung der Bioaktivität des Extrakts im Beobachtungszeitraum festgestellt. Der Verzehr verkapselten Extrakts vermittelte eine deutlich schwächer ausgeprägte Wirkung auf die Transkription der Nrf2/ARE-regulierter Gene HO-1, NQO1 und Nrf2 als die Aufnahme unverkapselten Extrakts (1 – 8 h nach Verzehr). In Blutzellen der Ileostomiepatienten wurde lediglich die Transkription von Nrf2 moduliert. Diese Beobachtung deutet auf die Aufnahme von aktiven Extraktbestandteilen bzw. die Bildung wirksamer Metabolite im Kolon hin. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung konnte in vitro lediglich das intestinale Anthocyanabbauprodukt Phloroglucinolaldehyd, nicht jedoch der Heidelbeerextrakt, isolierte Anthocyane oder Phenolcarbonsäuren als Aktivatoren des Nrf2/ARE-Signalwegs identifiziert werden. Auf die Bioaktivität des Extrakts, zumindest im Hinblick auf die untersuchten biologischen Endpunkte, besitzen die untersuchten Formulierungssysteme im derzeitigen Entwicklungsstadium keine positiv modulierende Wirkung. Vielmehr zeigten sich in vitro und in vivo nach Verkapselung signifikante Verluste potentiell chemopräventiver Eigenschaften. In vitro konnten allerdings Effekte, die unter physiologischen Bedingungen zu einem Kapselaufschluss führen (mechanisch bzw. enzymatisch) nur unzureichend abgebildet werden. Für den unverkapselten Extrakt konnte in vivo letztendlich eine bemerkenswert schnelle Wirkung auf die Transkriptregulation Nrf2-regulierter Gene in Blutzellen gezeigt werden, die zudem einen aktiven Kolon vorauszusetzen scheint. Durch die Verkapselung wird diese Wirkung jedoch im untersuchten Zeitfenster vermindert. Diese Beobachtung müsste in einer Langzeitintervention verifiziert werden, in die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnene Erkenntnisse einfließen könnten.
description: Polyphenols, in particular anthocyanins, have been described as chemopreventive reagents. Microencapsulation provides a technique to stabilize these components in foodstuff, mask unpleasant characteristics such as taste or color and allow their controlled release throughout the gastrointestinal tract. Herein, the influence of formulation techniques on a bilberry extract’s bioactivity was investigated in vitro and in vivo. In addition, bioactive components, responsible for the observed effects, were identified. In vitro, bioactive properties of the bilberry extract were investigated before and after encapsulation, using the inhibition of (1) epidermal growth factor receptor (EGFR) activity and (2) growth of colon carcinoma cells as parameters. Transcription of Nrf2/ARE-regulated genes in peripheral mononuclear blood cells (PBMC) of healthy volunteers and ileostomy patients where used as in vivo parameters to determine effects on the extract’s bioactivity after encapsulation. Formulation in protein, pectin and emulsion based systems led to a significant loss on the inhibitory potential towards the EGFR (45 –180 min of incubation). Most probably, this observation was due to matrix interaction, slow release of active compounds or partial loss of these compounds during encapsulation. In an attempt to simulate physiologic conditions, capsules were digested ex vivo in ileostomy effluent prior to cell incubation. It revealed that this pretreatment leads to a significant loss of the extract’s inhibitory potential toward the EGFR (non-encapsulated as well as formulated). This effect may be attributed to vast interactions of bioactive constituents with the ileostomy effluent. Non-anthocyanins, particularly polymeric proanthocyanins, were found to substantially contribute for the extract’s inhibitory potential towards the receptor. Furthermore, amplifying as well as compensating effects among particular substances were identified. Growth inhibitory effects (72 h of incubation) were not negatively affected due to formulation. Yet, the emulsion-based system had an increasing effect on the growth inhibitory potential. Anthocyanins and polymeric proanthocyanins were identified to mediate growth inhibition. The influence on topoisomerase activity was assessed to determine adverse effects due to encapsulation. No stabilization of DNA/topoisomerase intermediates was found in the ICE bioassay after incubation with free extract as well as extract loaded systems. In vivo, formulation of the extract led to a significant loss of bioactivity. In contrast to free extract, consumption of extract in protein or citrus pectin based systems had a significantly lower modulatory effect on transcription of the Nrf2/ARE regulated genes HO-1, NQO1 and Nrf2 in PBMC of healthy volunteers. In PBMC of ileostomy patients, transcription of HO-1 and NQO1 was not affected by consumption of free extract. This observation could be ascribed on colonic resorption of active compounds or intestinal formation of effective metabolites. Additional results of in vitro studies on Nrf2 activation using a reporter gene approach and qRT-PCR indicated that the intact anthocyanins are not the activating constituents but their intestinal degradation product phloroglucinol aldehyde. The data show, that the investigated formulation systems (in their stage of development) do not positively modulate bilberry extract’s bioactivity. Rather significant losses of putatively chemopreventive properties in vitro and in vivo were found due to encapsulation. Digestive processes that would disrupt capsules under physiological conditions were not simulated properly in the in vitro assays. The assumed enhancement of component’s bioactivity after encapsulation, for instance due to locally increased concentrations or triggered release, could be excluded under the given conditions.