title: Molecular biological and biochemical investigations of the biosynthesis of mycotoxins in ascomycota
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Mykotoxinen aus Ascomyceten
Creators: name: Matuschek, Marco
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Gencluster
Mutterkornpilz
Schlauchpilze
Penicillium commune
Sekundärmetabolite
Secondary metabolites
Medizin, Gesundheit
Penicillium
Aspergillus fumigatus
Ergotalkaloide

description: Fungi are rich sources of
      secondary metabolites. Among these secondary metabolites, the
      ergot alkaloids are both pharmaceutically useful and toxic.
      Ergot alkaloids are indole derivatives produced by fungi of
      the genera Claviceps, Aspergillus and Penicillium with
      Claviceps purpurea (C. purpurea) as the most important
      producer for medical use. C. purpurea produces ergotamine and
      ergocryptine as main ergot alkaloids. The clavine-type
      alkaloids, e.g. festuclavine, pyroclavine and fumigaclavines
      A, B and C are mainly produced by the fungi Aspergillus
      fumigatus (A. fumigatus) and Penicillium commune (P.
      commune). Chanoclavine-I-aldehyde is a branch point of ergot
      alkaloid biosynthesis for ergotamine in C. purpurea and
      fumigaclavines C and A, respectively in A. fumigatus and P.
      commune. Ergotamine is characterized by a peptide moiety
      which is absent in the fumigaclavines. Instead, the
      fumigaclavines contain additional substituents, e.g. alcohol
      or acetoxy group at C-9 and a reverse prenyl moiety at C-2.
      Furthermore, the C-8 stereochemistry of fumigaclavine C from
      A. fumigatus and fumigaclavine A from P. commune differs. In
      this study, the presence of genes for ergot alkaloid
      biosynthesis in ascomycetous fungi was investigated. For this
      purpose, 138 available genomes of 53 fungi families of the
      NCBI database were screened with the sequences of the seven
      orthologous genes from C. purpurea and A. fumigatus. 23
      ascomycetous fungi belonging to the families Trichocomaceae,
      Clavicipitaceae and Arthrodermataceae were identified to
      contain putative ergot alkaloid gene clusters. The family
      Clavicipitaceae is assigned to the class of Sordariomycetes,
      whereas the families Trichocomaceae and Arthrodermataceae are
      members of the class of Eurotiomycetes. The two identified
      fungi of the genus Metarhizium belong to the family
      Clavicipitaceae. Until now, no ergot alkaloids have been
      isolated from fungi neither of the genus Metarhizium nor of
      fungi of the family Arthrodermataceae. To prove functions,
      the gene fgaOx1 from A. fumigatus and its orthologue easE
      from C. purpurea were cloned into expression vectors for
      Escherichia coli (E. coli). In case of fgaOx1 Saccharomyces
      cerevisiae (S. cerevisiae) was also tested as expression
      strain. Unfortunately, no overexpression was detectable under
      different conditions. Additional protein sequence analysis
      indicated that FgaOx1 contains two membrane domains.
      Furthermore, analysis of genes of ergot alkaloid biosynthesis
      in ascomycetous fungi revealed that the intron-exon structure
      for easE from C. purpurea is incorrect in the NCBI database.
      The investigations of key enzymes from C. purpurea, A.
      fumigatus and P. commune in this study provided new insights
      in the differentiation of ergot alkaloid biosynthesis. The
      expression of the genes easA and easG from C. purpurea and
      the purification and biochemical characterization of the
      recombinant proteins showed that EasG alone catalyses, via a
      non-enzymatic adduct with reduced glutathione, the conversion
      of chanoclavine-I aldehyde to agroclavine. The overproduced
      EasA seems inactive and may lose its function during
      evolution. A reaction mechanism was proposed for the
      conversion of chanoclavine-I aldehyde to agroclavine, whereas
      one isomerisation and one reduction step was necessary. It
      was demonstrated that EasG was responsible for the reduction
      step and a non-enzymatic adduct with reduced glutathione
      (GSH) for the isomerisation. NADPH was required as cofactor
      for the EasG reaction. The structure of agroclavine was
      unequivocally elucidated by NMR and MS analyses. By using a
      combination of FgaOx3 from A. fumigatus and EasG from C.
      purpurea it was demonstrated that both enzymes catalyse the
      reaction from chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and
      pyroclavine. It had been shown previously, that FgaOx3 and
      FgaFS from A. fumigatus together produce only festuclavine.
      For detailed investigations on the conversion of
      chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and pyroclavine the
      orthologues of fgaOx3 and fgaFS from P. commune NRRL2033,
      fgaOx3pc and fgaFSpc, were amplified and expressed. The
      combinations of all orthologues from C. purpurea, A.
      fumigatus and P. commune revealed that in A. fumigatus and P.
      commune, in contrast to the reaction mechanism in C.
      purpurea, two reduction steps are required for the conversion
      of chanoclavine-I aldehyde to festuclavine and pyroclavine.
      It was shown that FgaOx3 or FgaOx3pc catalysed the first
      reduction step and the imine reductases FgaFS, FgaFSpc or
      EasG the second. More importantly, the ratio of pyroclavine
      to festuclavine was controlled by the reduction of an imine
      intermediate catalysed by FgaFS, FgaFSpc or EasG, and not by
      the reduction step catalysed by the old yellow enzymes FgaOx3
      or FgaOx3pc.
description: Die Sekundärmetabolit-Produktion
      der Pilze stellt eine wichtige Quelle von biologisch aktiven
      Stoffen dar. Innerhalb der Sekundärmetabolite besitzen die
      Ergotalkaloide sowohl pharmazeutisch-nützliche als auch
      toxische Eigenschaften. Die Ergotalkaloide gehören zu den
      Indolalkaloiden. Momentan ist Claviceps purpurea (C.
      purpurea) einer der wichtigsten Stämme für die industrielle
      Ergotalkaloidproduktion. C. purpurea produziert hauptsächlich
      die Ergotalkaloide Ergotamin, Ergocryptin und verwandte
      Ergopeptine. Im Gegensatz dazu wurden aus Aspergillus
      fumigatus (A. fumigatus) und Penicillium commune (P. commune)
      die Clavinalkaloide, darunter Festuclavin, Pyroclavin und die
      Fumigaclavine A, B und C, isoliert. Ein gemeinsames
      strukturelles Merkmal dieser Substanzen ist das
      tetrazyklische Ergolinringsystem. Im Verlauf der
      Ergotalkaloidbiosynthese stellt Chanoclavin-I-Aldehyd einen
      Verzweigungspunkt dar. In C. purpurea wird Ergotamin und in
      A. fumigatus bzw. P. commune Fumigaclavin C bzw. A gebildet.
      Das Ergotamin enthält einen Tripeptidrest, während die
      Fumigaclavine andere Substituenten enthalten, z.B. eine
      Acetoxy-Gruppe an C-9. Zusätzlich unterscheiden sich
      Fumigaclavin C aus A. fumigatus bzw. Fumigaclavin A aus P.
      commune stereochemisch an der Position C-8 des Ergolinrings.
      In dieser Arbeit wurde das Vorkommen von
      Ergotalkaloidgenclustern innerhalb der Ascomyceten
      untersucht. Dabei wurden aus 53 verschiedenen Pilzfamilien
      138 in der NCBI-Datenbank verfügbare Pilzgenome auf
      Sequenzhomologien zu den sieben orthologen Genen von A.
      fumigatus und C. purpurea analysiert. Es wurden insgesamt 23
      Pilze identifiziert, die putative Ergotalkaloidgencluster
      enthielten. Diese 23 Pilze verteilen sich innerhalb der
      Ascomyceten auf die drei Familien Clavicipitaceae,
      Trichocomaceae und Arthrodermataceae. Zum funktionellen
      Nachweis wurde das Gen fgaOx1 aus A. fumigatus und sein
      Homolog easE aus C. purpurea untersucht. Beide Gene wurden in
      Expressionsvektoren kloniert und Expressionsbedingungen in
      Escherichia coli (E. coli) bzw. in Saccharomyces cerevisiae
      getestet. Leider blieben die Expressionsversuche der beiden
      Gene erfolglos. Weitere Proteinsequenzanalysen von FgaOx1
      ergaben, dass wahrscheinlich zwei Membrandomänen vorhanden
      sind. Im Falle des Gens easE ergaben sich während der
      Untersuchungen der Pilzgenome der Ascomyceten neue
      Ergebnisse. Wahrscheinlich ist die Intron-Exon-Struktur
      innerhalb der NCBI-Datenbank fehlerhaft. Die
      Verzweigungspunkte der Ergotalkaloidbiosynthesen in C.
      purpurea, A. fumigatus und P. commune wurde durch diese
      Arbeit weiter aufgeklärt. Durch die Expression der Gene easA
      und easG aus C. purpurea und deren Aufreinigung sowie der
      biochemischen Charakterisierung der kodierten Proteine konnte
      gezeigt werden, dass Chanoclavin-I-Aldehyd in Gegenwart von
      reduziertem Glutathion durch EasG allein zu Agroclavin
      umgesetzt wird. Für diesen Schritt war keine Beteiligung von
      EasA nötig, vielmehr scheint das Protein EasA seine Funktion
      evolutionär verloren zu haben. In dem postulierten
      Reaktionsmechanismus von Chanoclavin-I-Aldehyd zu Agroclavin
      werden ein Isomerisierungs- und ein Reduktionsschritt
      benötigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung
      durch ein nicht-enzymatisches Intermediat von
      Chanoclavin-I-Aldehyd mit Glutathion (GSH) vollzogen wird.
      Die Reduktion hingegen erfolgt enzymatisch durch das Protein
      EasG, das als Iminreduktase fungiert. Für die Katalyse
      benötigt EasG den Kofaktor NADPH. Die Struktur des
      Agroclavins wurde eindeutig durch NMR- und MS-Analysen
      identifiziert. Durch die Kombination von FgaOx3 aus A.
      fumigatus mit EasG aus C. purpurea konnte gezeigt werden,
      dass beide Proteine zusammen die Reaktion von
      Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und seinem Stereoisomer
      Pyroclavin katalysieren. Zuvor war nur bekannt, dass FgaOx3
      und FgaFS aus A. fumigatus zusammen Festuclavin bilden. Im
      Zusammenhang mit diesen Ergebnissen erfolgte die
      Amplifikation und anschließende Expression der orthologen
      Gene fgaOx3pc und fgaFSpc aus P. commune NRRL2033 und die
      Aufreinigung beider Proteine. Die Kombination aller
      Orthologen lieferte neue Erkenntnisse über den
      Reaktionsmechanismus und damit auch über den
      Verzweigungspunkt der Ergotalkaloidbiosynthese in A.
      fumigatus und P. commune. Im Unterschied zum
      Reaktionsmechanismus in C. purpurea werden in A. fumigatus
      und P. commune zwei Reduktionsschritte für die Umsetzung von
      Chanoclavin-I-Aldehyd zu Festuclavin und Pyroclavin benötigt.
      Dabei katalysieren FgaOx3 bzw. FgaOx3pc den ersten und die
      Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc den zweiten
      Reduktionsschritt. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten
      Hypothesen einer anderen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden,
      dass die Iminreduktasen FgaFS bzw. FgaFSpc die Stereochemie
      der Gesamtreaktion festlegen und nicht die auch als old
      yellow enzymes bekannten Reduktasen FgaOx3 bzw. FgaOx3pc.
      Zudem wird durch die jeweilige Iminreduktase das
      Produktverhältnis zwischen Festuclavin und Pyroclavin
      festgelegt.