Σύνθεση, Χαρακτηρισμός και Βιολογική Λειτουργοποίηση Νανοσωματιδίων Χρυσού για Μελλοντική Χρήση σε Βιοαισθητήρες με Σκοπό την Πρώιμη Ανίχνευση του Οξέος Εμφράγματος του Μυοκαρδίου
Creators: name: Αρβανίτη, Δέσποινα Χρήστου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Νανοσωματίδια χρυσού
Βιολογική λειτουργοποίηση
Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου
Gold nanoparticles
Biofunctionalization
Acute myocardial infraction

description: Το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου (ΟΕΜ) αποτελεί την πιο συχνή μορφή πάθησης της καρδιάς και την πρώτη αιτία νοσηρότητας και θνητότητας παγκοσμίως. Στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής περισσότερα από 1.000.000 άτομα ετησίως θα νοσήσουν από ΟΕΜ, ενώ στην Ελλάδα εκτιμάται ότι ο ετήσιος αριθμός εμφραγμάτων είναι περίπου 15.000. Παρόλο που γίνονται συνεχείς προσπάθειες και μελέτες για την καλύτερη φαρμακευτική και επεμβατική αντιμετώπιση του εμφράγματος, πρέπει να γίνει αντιληπτό ότι βασική προϋπόθεση για την επιτυχία όλων των θεραπειών παραμένει η έγκαιρη αναγνώριση των συμπτωμάτων του από τους ασθενείς, η άμεση μεταφορά τους στο νοσοκομείο και η ταχύτητα έναρξης της θεραπείας. Η πρώιμη ανίχνευση του ΟΕΜ λοιπόν, παίζει πολύ σημαντικό ρόλο, αφού και οι λίγες ώρες που θα κερδηθούν μπορεί να σώσουν ζωές. Ένα μέσον για την έγκαιρη ανίχνευση του ΟΕΜ και ακολούθως την άμεση έναρξη θεραπείας, είναι οι βιοαισθητήρες. Στις μέρες μας, γίνεται πολύ μεγάλη έρευνα σε αυτόν τον τομέα, καθώς οι διατάξεις αυτές έχουν πολλά πλεονεκτήματα, όπως πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης, γρήγορη και έγκαιρη διάγνωση και απαίτηση ελάχιστης ποσότητας αναλύτη. Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται στα νανοϋλικά, ιδίως όσοι περιλαμβάνουν λειτουργοποιημένα νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs) ως παράγοντα ανίχνευσης, προσφέρουν δυνητικά πολλά επιθυμητά χαρακτηριστικά που απαιτούνται για την ανίχνευση συγκεκριμένων παραγόντων. Η ευαισθησία των φυσικών ιδιοτήτων που έχουν τα AuNPs, π.χ. χρώμα, συντονισμός επιφανειακών πλασμονίων και ηλεκτρική αγωγιμότητα, ενισχύονται σημαντικά, όταν αυτά υποβάλλονται σε λειτουργοποίηση με μία κατάλληλη οργανική, μεταλλική ή βιομοριακή λειτουργική ομάδα. Αυτή η ευαίσθητη φύση των λειτουργοποιημένων AuNPs μπορεί δυνητικά να αξιοποιηθεί στο σχεδιασμό βιοαισθητήρων. Με την παρουσία ενός αναλύτη-στόχου, παρατηρείται μία αναλογική μεταβολή στη συγκέντρωση του, η οποία μπορεί να μετρηθεί με διάφορες μεθόδους. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός λειτουργικών AuNPs, τα οποία, λόγω των εξαιρετικών φυσικών ιδιοτήτων τους, όπως η ηλεκτρική αγωγιμότητα ή το χρώμα, και σε συνδυασμό με πεπτίδια μπορούν να βρουν εφαρμογή ως μεταγωγείς σήματος (ηλεκτρική διεπαφή και βιοϋποδοχέας αντίστοιχα) σε βιοαισθητήρες. Τα συστήματα που μελετήθηκαν, προορίζονται για χρήση ως μεταγωγείς σήματος για πρώιμη ανίχνευση του ΟΕΜ. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση και η σύγκριση των διαφόρων νανοσωματιδίων που συντέθηκαν, η βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης της χιτοζάνης και η βιολογική λειτουργοποίηση (biofunctionalization) τους με στόχο τη βέλτιστη ηλεκτρική απόκριση. Συγκεκριμένα, συντέθηκαν AuNPs με τη μέθοδο Turkevich και AuNPs που ανάχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας χιτοζάνη. Για τη σύνθεση αυτών των νανοσωματιδίων χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις χιτοζάνης, συγκεκριμένα 0.01% κ.β., 0.05% κ.β. και 0.1% κ.β., για την αναγωγή του τετραχλωροχρυσικού οξέος και επιλέχθηκαν τα νανοσωματίδια με τη βέλτιστη συγκέντρωση, ώστε να ακολουθήσει βιολογική λειτουργοποίηση τους. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, τη μορφολογία της επιφάνειας, το ζήτα δυναμικό (ζ-δυναμικό) και τη χημεία της επιφάνειας τους. Επιπλέον, εναποτέθηκαν πάνω σε υμένια poly(3,4-ethylenedioxythiophene) polystyrene sulfonate (PEDOT: PSS), προκειμένου να μετρηθεί η ηλεκτρική τους αγωγιμότητα. Τα μεγέθη τους, καθώς και το ζ-δυναμικό μετρήθηκαν με δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering - DLS), ενώ η μορφολογία και η τοπογραφία της επιφάνειας τους ερευνήθηκαν μέσω μικροσκοπίας ατομικών δυνάμεων (Atomic Force Microscopy - AFM). Για την πραγματοποίηση των ηλεκτρικών μετρήσεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Van der Pauw, ενώ η μελέτη της επιφανειακής χημείας έγινε με φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίων ακτίνων-Χ (X-Ray Photoelectron Spectroscopy - XPS). Ακόμη, έγινε επιφανειακή τροποποίηση των νανοσωματιδίων Turkevich με χιτοζάνη, αλλά και πρόσδεση στρεπταβιδίνης στην επιφάνεια τους, ώστε να μπορούν να συνδεθούν σ’ αυτά βιοτινυλιωμένα αντισώματα. Επίσης, τροποποιήθηκαν βιολογικά επιφάνειες PET/SiO2 με το σύστημα βιοτίνης-στρεπταβιδίνης, ώστε να μπορεί να ακολουθήσει ειδική πρόσδεση μορίων. Τέλος, έλαβε χώρα βιολογική λειτουργοποίηση των βέλτιστων επιλεγμένων νανοσωματιδίων επικαλυμμένων με χιτοζάνη με πεπτίδιο αντι-τροπονίνης, ώστε να μπορούν να αποτελέσουν μία πλατφόρμα για χρήση σε βιοαισθητήρες με σκοπό την έγκαιρη ανίχνευση του ΟΕΜ. Συνοψίζοντας, συντέθηκαν λειτουργικά AuNPs επικαλυμμένα με χιτοζάνη, αλλά και AuNPs με τη μέθοδο Turkevich, στα οποία πραγματοποιήθηκε επιφανειακή τροποποίηση με χιτοζάνη προκειμένου να καταστούν πιο βιοσυμβατά, αλλά και πρόσδεση στρεπταβιδίνης στην επιφάνεια τους. Με τη μέθοδο βιοτίνης-στρεπταβιδίνης τροποποιήθηκαν επίσης επιφάνειες, για ειδική πρόσδεση μορίων. Έγινε χαρακτηρισμός των νανοσωματιδίων και ακολούθησε βιολογική λειτουργοποίηση με αντι-τροπονίνη. Η καινοτομία της μελέτης βρίσκεται στο συνδυασμό υλικών και μεθόδων χαρακτηρισμού, δηλαδή αντι-τροπονίνης, PEDOT: PSS και ηλεκτρικών μετρήσεων. Συμπερασματικά, ο λόγος εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η σύνθεση, η βελτιστοποίηση, η βιολογική λειτουργοποίηση και η μελέτη λειτουργικών AuNPs και η εξαγωγή συμπερασμάτων που θα συμβάλλουν στη βελτίωση των ιδιοτήτων τους και στη δημιουργία πιο ευαίσθητων συστημάτων με καλή ηλεκτρική απόκριση για εφαρμογή ως μεταγωγείς σήματος σε βιοαισθητήρες.
description: Acute myocardial infarction (AMI) is the most common form of heart disease and the first cause of morbidity and mortality worldwide. In the United States more than one million people per year will suffer from AMIs, while in Greece it is estimated that the annual number of myocardial infarctions is about 15.000. Although there are constant efforts and studies for better pharmaceutical and interventional treatment of myocardial infarction, it should be understood that the early recognition of symptoms from the patients, their immediate transfer to the hospital and the instant beginning of therapy remain an essential condition for the success of all treatments. The early detection of AMI therefore, plays a very important role, since with early detection and proper treatment many lives can be saved. A mean for early detection of AMI and subsequently immediate commencement of therapy, is biosensors. Nowadays, much research takes place in this area, as these devices have many advantages, such as very low detection limits, fast and timely diagnosis and requirement of a minimum amount of analyte. Biosensors based on nanomaterials, especially those which include functionalized gold nanoparticles (AuNPs) as a detection agent, potentially offer many desirable characteristics required for the detection of specific factors. The sensitivity of physical properties of AuNPs, e.g. color, surface plasmon resonance and electrical conductivity are enhanced significantly when they undergo functionalization with a suitable organic, metallic or biomolecular functional group. This sensitive nature of functionalized AuNPs can potentially be used in biosensors’ design. In the presence of a target analyte, an analog change in concentration is observed, which can be measured by various methods. The purpose of the present study is synthesis, characterization and biofunctionalization of AuNPs, which due to their excellent physical properties such as electrical conductivity or color, and in combination with peptides can be used as signal transducers (electrical interface and bioreceptor respectively) in biosensors. The systems that were examined in the present work are intended for utilization as signal transducers for early detection of AMI. The objective of this study is to investigate and compare the different nanoparticles that were synthesized, to optimize the concentration of chitosan and to biofunctionalize them, always targeting to the optimal electrical response. Specifically, AuNPs were synthesized by the Turkevich method and by a modified method, where chitosan acts as reducing and stabilizing agent. Three different chitosan concentrations were used, i.e., 0.01% w/v, 0.05% w/v and 0.1% w/v, for the reduction of tetrachloroauric acid and the nanoparticles with optimum concentration were chosen for biofunctionalization. The nanoparticles were characterized according to their size, surface morphology, zeta potential and surface chemistry. In addition, they were deposited on poly (3,4-ethylenedioxythiophene) polystyrene sulfonate (PEDOT: PSS) films, in order to measure their electrical conductivity with Van der Pauw method. Their sizes and the zeta potential were measured via Dynamic Light Scattering (DLS), whereas morphology and topography of the surface were investigated via Atomic Force Microscopy (AFM). X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) was used for analyzing their surface chemistry. Moreover, surface modification of Turkevich nanoparticles with chitosan took place, and binding of streptavidin onto their surface, for binding of biotinylated antibodies. Also, PET/SiO2 surfaces were biologically modified with biotin-streptavidin chemistry, for further binding of biomolecules. Finally, biofunctionalization of the nanoparticles took place with anti-troponin peptide, so they can be used as a platform for biosensors to allow early detection of AMI. In summary, chitosan-capped AuNPs and Turkevich AuNPs were successfully synthesized. Surface modification of Turkevich nanoparticles with chitosan was performed and also binding of streptavidin onto their surface. PET/SiO2 surfaces were also modified with the biotin-streptavidin method for specific binding of biomolecules. Characterization and biofunctionalization of nanoparticles with anti-troponin followed. The novelty of this study lies in the combination of materials and characterization methods, i.e. anti-troponin, PEDOT: PSS and electrical characterization.Conclusively, the reason for elaborating this thesis is the synthesis, optimization, biofunctionalization and study of functionalized AuNPs and elicitation of conclusions that will help in the improvement of their properties and the creation of more sensitive systems with optimum electrical response for implementation as signal transduction in biosensors.