title: Bio-synthesised LytC protein kills bacteria and the study of protein dynamics in B. subtilis
title: Lösliches LytC protein tötet Bakterien ab und Studie von Protein-Dynamiken in Bacillus subtilis
Creators: name: Cao, Mingle
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Einzelmolekülbewegung, Einzelmolekülverfolgung
MreB, Einzelmolekülbewegung
LytC
MreB
Chemistry and allied sciences
Chemie
Single Molecule Tracking
Einzelmolekülverfolgung
MreB, Dynamics

description: Eine Vielzahl von Antibiotika
      greifen in die Zellwandsynthese ein. Gegen fast alle gängigen
      Antibiotika existieren Resistenzen, die von einem Bakterium
      in das andere weitergegeben werden können. Daher wollten wir
      eine alternative Strategie verfolgen und
      Zellwand-degradierende Enzyme einsetzten, um Bakterien durch
      externe Zugabe zu lysieren. LytC iste in sogenanntes
      Autolysin von Bacillus subtilis, das in der Lage ist, Brüche
      in die Zellwand einzuführen, und ist ein Kandidat für unsere
      Strategie. Ich habe das lytC Gen kloniert und das Protein in
      E. coli Zellen überproduziert, und anschließend aufgereinigt.
      Um die Funktion der verschiedenen LytC Domänen zu
      untersuchen, haben wir unterschiedliche Konstrukte von LytC
      hergestellt. LytC besitzt eine “low complexity region” (LCR),
      vier Zellwand-Bindedomänen (CWB) und eine funktionale
      Hydrolase Domäne. Ich habe das Gram negative Bakterium E.
      coli und den Gram positiven Organismus B. subtilis verwendet,
      um zu untersuchen, ob extern zugegebenes LytC zur Zelllyse
      führen kann. Die Ergebnisse zeigten dass LytC effizient das
      Wachstum beider Organismen hemmen kann, wobei dieser Effekt
      nur in der exponentiellen Wachstumsphase zu beobachten war.
      Eine C-terminale Fusion von LytC mit einem Strepavidin-tag
      konnte effizient überproduziert und gereinigt werden, ein
      N-terminaler nicht. Die Überexpression von LytC führte zu
      einem schnellen Absinken der optischen Dichte, eine Stunde
      nach Induktion der Transkription. Das LytCF6 Konstrukt
      bestand nur aus der Hydrolase Domäne und konnte Zelllyse
      herbeiführen, was zeigt, dass die CWD und die LCR Domänen
      nicht essentiell für die Aktivität sind. Kontrollversuche mit
      BSA oder Elutionspuffer belegten, dass die Aktivität
      spezifisch für LytC ist. Eine Deletion von 22 Aminosäuren von
      C-Terminus der funktionalen Domäne führten zu einer starken
      Reduktion der lytischen Aktivität, was zusätzlich belegt,
      dass die wachstumshemmende Aktivität von LytCF2 stammt. Im
      zweiten Teil der Arbeit wurden die Lokalisation und die
      Einzelmolekülbewegungen von Proteinen MreB, MreC, MreD, Pbp1A
      und RodZ, die an der Zellmorphologie in vielen Bakterien
      beteiligt sind, und den Untereinheiten der
      Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) und der Phosphofruktokinase
      (PfkA) als zytosolische Proteine untersucht. Die
      Morphologie-Proteine sind entweder Membran-integral, oder
      Membran-assoziiert, was die Lokalisation der fluoreszierenden
      Fusionsproteine bestätigte. MreB aus B. subtilis und aus E.
      coli bildete, wie zuvor beschrieben, filamentöse Strukturen
      an der Zellmembran aus. Eine Reduktion des Expressionsniveaus
      von MreB führte zur Ausbildung kurzer Filamente und diffuser
      Aggregate. MreC und MreD interagieren mit MreB und
      lokalisierten in punktuellen Mutsren innerhalb der Membran.
      Die PDH Untereinheiten PdhB, PdhC und die PfkA wiesen
      homogene Lokalisation in der Zelle auf, im Einklang mit einer
      zytosolischen Enzym-Funktion. Interessanterweise lokalisierte
      PdhA an nur einem Zellpol in zwei Dritteln der Zellen, und
      PdhD wies zwei Lokalisationsmuster auf, ein homogen
      zytosolisches, und eines, dass mit der Lokalisation der
      Chromosomen im Nukleoid überein stimmte. Dem entsprechend
      haben zwei der vier Untereinheiten der PDH eine spezifische
      Lokalisation in B. subtilis Zellen. Durch
      Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter
      Molekülverfolgung konnte bestimmt werden, dass MreB Moleküle
      zwei Populationen ausbilden, eine eher immobile Population,
      die in den filamentösen Strukturen vorhanden ist, und eine
      bewegliche aus diffundierenden Molekülen. Die Mehrheit der
      MreB Moleküle ist immobil und damit in filamentöser Struktur.
      Auch MreC, MreD und RodZ, sowie Pbp1A und die PDH
      Untereinheiten wiesen eine statische und eine dynamische
      Population auf, nur PfkA zeigte zwei dynamische Populationen,
      die vermutlich aus einer Population langsamer und schnell
      diffundierender Proteine besteht. Die
      Diffusionsgeschwindigkeit der der dynamischen MreB Moleküle
      ist deutlich niedriger als die der PfkA Moleküle, was
      vermuten lässt, dass MreB hauptsächlich entlang der Membran
      diffundiert, was die Diffusion verringert. Die E2
      Untereinheit der PDH, PdhC, scheint die zentrale Untereinheit
      der PDH zu sein, da sie die geringste Diffusionskonstante der
      vier Untereinheiten aufwies, und daher die meisten PdhC
      Moleküle im Komplex gebunden sind, während die übrigen in
      höherem Masse zwischen freier und gebundener Form
      wechseln.
description: For many years, efforts for
      discovering new antibiotics were mainly focused on the
      inhibitors of the cell wall synthesis machinery. We tried to
      find other antibiotics that target the cell wall by making
      use of the cell wall degradation enzymes, which lyse the cell
      wall and therefore kill bacteria. LytC is an autolysin from
      B. subtilis, which is capable of degrading the bacterial cell
      wall and make it a potential candidate antibiotic. In this
      dissertation, I cloned B. subtilis lytC gene and
      over-expressed LytC protein in E. coli. In order to
      characterize the function of different LytC regions, we
      designed different constructs of lytC. I used the
      Gram-negative bacterium E. coli and Gram-positive B. subtilis
      to test if LytC can degrade the cell wall components when
      used as an external additive in cell medium. Different
      constructs of purified LytC protein were used, the results
      showed that LytC constructs can efficiently and greatly
      inhibit the growth of E. coli and B. subtilis, yet it is only
      effective for exponentially growing cells. The cell wall of
      stationary cells was more resistant to LytC and cell lysis
      was not observed. I proved that the C-terminal fusion of LytC
      with a strep-tag can be successfully over-expressed and
      purified while the N-terminal fusion cannot. Overexpression
      of LytC leads to a fast drop in OD600 after one hour
      induction with 0.5 mM IPTG. The construct of LytCF6 only
      contains the functional region and the purified protein can
      still function like full length protein, which means the four
      cell wall binding (CWB) and the „low complexity region“ (LCR)
      domains are not necessary for LytC activity. I used strep
      elution buffer with BSA (bovine serum albumin) as control to
      verify that it is the LytC protein that is responsible for
      cell growth inhibition. I deleted 22 amino acids from the
      C-terminus of the functional region, and protein activity of
      this partially deleted LytCF2R2 was compared with LytCF2
      (which has the full length of functional region). As a
      result, LytCF2R2 lost almost half of the protein activity in
      comparison to LytCF2. This further demonstrates that LytCF2
      contains the functional region and the deletion of it can
      result in loss of activity. We reviewed the localization and
      the single molecule trajectories of proteins (MreBCD, Pbp1A,
      RodZ and PDH complex) in exponentially grown B. subtilis
      cells. Phosphofructokinase (PfkA), which is a fast moving
      protein, was used as a control for MreB in the single
      molecule tracking study. In the protein localization study,
      we found that MreB, MreC, MreD, RodZ and Pbp1A are localized
      along the cell membrane and have a similar localization
      pattern. The results indicate that MreB, MreC, MreD, RodZ and
      Pbp1A are membrane proteins. We confirmed the phenomenon that
      MreB forms discontinuous filaments structure underneath the
      cell membrane, both in B. subtilis and in E. coli. Upon
      reduction in its expression level, MreB forms patchy and
      short filament structures in B. subtilis. MreC and MreD also
      form patchy spots structures besides the membrane staining
      pattern. From our calculation, two thirds cells have PdhA
      localized at one cell pole, one third of the cells does not
      contain PdhA spots. The localization studies of PdhB, PdhC
      and PfkA showed that they are all uniformly distributed
      within the cytoplasm of the cell, which indicates they are
      cytoplasmic proteins. PdhD has two localization patterns, one
      is the same as chromosome DNA staining, and the other one is
      uniformly distributed within the cytoplasm. We found single
      molecules of MreB are composed of two populations. One is the
      immobile population that forms the filamentous structures.
      The other one is the mobile population that freely diffuses
      within the cell. The same conclusions apply to the Pbp1A and
      PDH subunits proteins, as well as for the MreB colocalized
      proteins (MreC, MreD and RodZ). The single molecules of the
      PfkA compose two mobile populations. The fraction and
      movement speed of MreB mobile single molecules are lower than
      those of PfkA. We also deduced that MreB is a
      membrane-associated protein and that PdhC (E2 subunit) is the
      core of PDH complex from our data analysis, because the
      fraction and diffusion coefficient of mobile PdhC single
      molecules are the slowest of the four PDH subunits.