Τεστ πλευρικής ροής με νανοσωματίδια νιτριδίου του τιτανίου στη διάγνωση οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας
Creators: name: Βασιλείου, Ελένη Βασιλείου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Τεστ πλευρικής ροής
Νανοσωματίδια νιτριδίου του τιτανίου
Οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία
Παιδιά
Lateral flow assay
Titanium nitride nanoparticles (TiN NPs)
Acute lymphoblastic leukemia
Children

description: Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) αποτελεί τη συχνότερη κακοήθεια της παιδικής ηλικίας. Συνήθως εκδηλώνεται με πυρετό, καταβολή, οστικά άλγη, διόγκωση των λεμφαδένων και πετέχειες. Η κλινική προβολή της νόσου συχνά αποτελεί διαφοροδιαγνωστικό πρόβλημα για τον γιατρό της πρωτοβάθμιας φροντίδας που εξετάζει αρχικά το παιδί. Άλλες παθήσεις του αιμοποιητικού συστήματος αλλά και ιογενείς λοιμώξεις μπορούν να εκδηλωθούν με παρόμοια κλινική εικόνα. Ο αρχικός εργαστηριακός έλεγχος περιλαμβάνει τη γενική εξέταση αίματος, η οποία μπορεί να φανερώσει λευκοκυττάρωση, αναιμία και θρομβοπενία. Σε υποψία λευχαιμίας απαιτείται περαιτέρω έλεγχος και μελέτη του μυελού των οστών (μυελόγραμμα). Η διάγνωση της ΟΛΛ θα τεθεί με κυτταρομετρία ροής μετά από επεξεργασία του δείγματος μυελού των οστών με ειδικά αντισώματα έναντι των αντιγόνων που εκφράζουν τα λευχαιμικά κύτταρα. Ο κυτταρομετρητής ροής είναι ένα σύνθετο μηχάνημα και απαιτούνται ειδικές γνώσεις για το χειρισμό του. Επίσης, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων απαιτεί εξειδικευμένες γνώσεις και εμπειρία. Συνήθως γίνεται από έμπειρο μικροβιολόγο, βιολόγο, αιματολόγο, ανοσολόγο ή παθολογοανατόμο. Στα πλαίσια αυτής της διπλωματικής εργασίας κατασκευάστηκε ένα πρωτότυπο και καινοτόμο τεστ πλευρικής ροής (lateral flow assay, LFA) για την ανίχνευση λευχαιμικών κυττάρων. Η εξέταση του δείγματος με LFA είναι απλή και το αποτέλεσμα μπορεί να διαβαστεί άμεσα (εντός μισής ώρας). Το δείγμα μπορεί να είναι είτε περιφερικό αίμα είτε μυελός των οστών. Ένα τέτοιο τεστ μπορεί να βρει εφαρμογή σε μη εξειδικευμένα εργαστήρια, όπως σε επαρχιακά νοσοκομεία και ιδιωτικά εργαστήρια, όπου εξετάζονται οι ασθενείς με ύποπτα συμπτώματα πριν παραπεμφθούν σε τριτοβάθμια νοσοκομεία, αλλά και σε παιδογκολογικές κλινικές, όταν απαιτούνται γρήγορα αποτελέσματα πριν την ολοκλήρωση της εξέτασης με κυτταρομετρία ροής. Επειδή δύο είναι οι πιο συχνοί τύποι ΟΛΛ (Β και Τ) επιλέχθηκαν δύο διαφορετικά αντισώματα για τη γραμμή εξέτασης και κατασκευάστηκαν δύο LFA. Οι ταινίες με anti-CD19 αντισώματα στη γραμμή εξέτασης χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση Β-ΟΛΛ και οι ταινίες με anti-CD7 χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση Τ-ΟΛΛ. Επιπλέον, δεν χρησιμοποιήθηκε υπόθεμα σύζευξης, αλλά τα χρωμοφόρα επωάστηκαν με το δείγμα και στη συνέχεια το διάλυμα δείγματος-χρωμοφόρων μεταφέρθηκε στην ταινία LFA. Σε αντίθεση με τη συνήθη πρακτική, αντί για νανοσωματίδια χρυσού χρησιμοποιήθηκαν νανοσωματίδια νιτριδίου του τιτανίου (TiN NPs) ως χρωμοφόρα. Τα TiN NPs έχουν χαμηλότερο κόστος από τα νανοσωματίδια χρυσού, ενώ έχουν παρόμοιες οπτικές ιδιότητες με αυτά. Για να μπορέσουν να αλληλεπιδράσουν με τα κύτταρα, τα οποία βρίσκονται σε περιβάλλον νερού, τροποποιήθηκε η επιφάνεια των TiN NPs. Αρχικά επικαλύφθηκαν με γλυκολική χιτοζάνη, ώστε να γίνουν υδρόφιλα, και στη συνέχεια καθηλώθηκαν τα αντισώματα με τη βοήθεια του συστήματος βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Χρησιμοποιήθηκαν δύο είδη αντισωμάτων για τη βιολειτουργικοποίηση των TiN NPs (anti-CD34 για την ανίχνευση B-ΟΛΛ και anti-CD45 για την ανίχνευση Β- και Τ-ΟΛΛ). Τέλος, μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν από μυελό των οστών ασθενούς με Τ-οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία. Το δείγμα αυτό εξετάστηκε με το τεστ πλευρικής ροής και ανιχνεύθηκαν τα λευχαιμικά κύτταρα. Αυτό το θετικό αποτέλεσμα αποτελεί απόδειξη της ορθότητας της ιδέας (proof of concept).
description: The aim of this thesis is the development of a novel lateral flow assay (LFA) for the detection of leukemic cells. LFAs are simple to use and test results can be read within 30 minutes. The proposed LFA can be useful in primary care settings or even in oncology departments, when fast results are needed. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood malignancy. Patients usually present with fever, weakness, bone pain, swollen lymph nodes and petechiae. The primary health physician, who is not always familiar with ALL, could be confused by its unclear clinical manifestations. Differential diagnosis of ALL includes other hematological diseases as well as viral diseases. The initial laboratory workup might reveal leukocytosis, anemia and thrombocytopenia. When leukemia is suspected, further tests should include flow cytometry immunophenotyping of a bone marrow sample since the diagnosis of ALL is made with flow cytometry. The flow cytometer is a complex machine and only well-trained personnel can operate it. Moreover, the interpretation of the results requires specialized knowledge and adequate experience. Two types of LFA strips are developed in order to detect both B- and T-leukemic cells. Anti-CD19 (B-cell detection) and anti-CD7 (T-cell detection) antibodies were immobilized on the test lines. Instead of using a conjugate pad, sample and labelled conjugates (detector reagents) were premixed and then applied on the LFA sample pad. Although gold nanoparticles are the most commonly used labels in LFAs, titanium nitride nanoparticles (TiN NPs) were selected, as they have similar optical properties at a reduced price. In addition, the surface of TiN NPs was functionalized. Initially, they were coated with glycol chitosan to become water-soluble and then antibodies were fixed on them using the biotin-streptavidin system. Two antibodies were also used for the functionalization of TiN NPs (anti-CD34 for B-cell and anti-CD45 for both T- and B-cell detection). Finally, mononuclear cells were isolated from a bone marrow sample of a patient with T-ALL. These cells were examined using the developed LFA and leukemic cells were detected. This positive result provides a proof of concept for the detection of leukemic cells using a lateral flow assay.