title: Characterisation of the E3 ligase HectH9 and its influence on cMyc and TopBP1
title: Charakterisierung der E3 Ligase HectH9 und deren Einfluss auf cMyc und TopBP1
Creators: name: Hock, Andreas Kurt
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: ubiquitin
DNA damage
Naturwissenschaften
p300
Ubiquitin
Miz1
TopBP1
HectH9
cMyc
DNA Schaden

description: The proto-oncogene c-myc encodes
      for the transcription factor cMyc, which acti- vates
      expression of target genes in a heterodimer with Max, and
      acts as a repressor in a ternary complex with Max and Miz1.
      In this work I show that the E3 ligase HectH9 interacts with
      both Miz1 and cMyc. Unlike cMyc, Miz1 is not ubiquitina- ted
      by HectH9 but acts as an inhibitor of cMyc ubiquitination by
      HectH9. This polyubiquitination is inter-linked via Lysine 63
      and does not lead to increased degradation of cMyc, but
      alters its biological properties: Depletion of HectH9 by
      shRNA leads to reduced induction of cMyc target genes, while
      repression of cMyc target genes is unaltered. These
      experiments are supported by experiments with Myc KR6, a cMyc
      mutant which can not be ubiquitinated by HectH9: Myc KR6
      fails to induce cell cycle progression and apoptosis in
      comparison to wild type cMyc in starved 3T3 fibroblasts. One
      cause for this lies in the inability of Myc KR6 to interact
      with the histone acetyltransferase p300: While both, wild
      type cMyc and Myc KR6 bind similarly to Myc target promoters,
      only wild type cMyc is capable of recruiting p300 which is
      needed for efficient binding of general transcription
      factors. TopBP1 is an essential activator of ATR after DNA
      damage induction by UV-B exposition. Cells that over-express
      Miz1 show signs of DNA damage and have increased half life
      times of TopBP1 and ATR. I could show that over-expression of
      HectH9 reduces the half life of TopBP1 after DNA damage in
      comparison to control cells and that HectH9 polyubiquitinates
      TopBP1 via lysine 48 interlinked chains. This reaction is
      inhibited by over-expression of Miz1. A TopBP1 mutant, which
      does not bind to Miz1 anymore, is ubiquitinated stronger by
      HectH9 than wild type TopBP1. Taken together these results
      show that HectH9 is an important cell cycle inducer by
      ubiquitinating and activating cMyc and thereby promoting cell
      cycle entry and in addition to that reducing DNA damage
      dependent cell cycle arrest by ubiquitinating and degrading
      TopBP1. These oncogenic properties are apparent in colon
      carcinomas: Although in normal colon tissue HectH9 is only
      detectable in 10% of all samples at a low level, it is highly
      transcribed in 80% of all analyzed colon carcinoma
      samples.
description: Das Protoonkogen c-myc kodiert für
      den Transkriptionsfaktor cMyc, der als Heterodimer mit Max
      die Transkription von Zielgenen aktiviert und als ternärer
      Komplex mit Max und Miz1 die Transkription einer zweiten
      Klasse von Zielgenen reprimiert. In dieser Arbeit wird
      gezeigt, dass HectH9, eine Ubiquitin E3 Ligase, endogen
      sowohl an cMyc als auch an Miz1 bindet. Miz1 wird im
      Gegensatz cMyc nicht von HectH9 modifiziert, kann aber die
      Ubiquitiniung von cMyc durch HectH9 inhibieren. Die
      Ubiquitinketten die HectH9 auf cMyc synthetisiert, sind über
      Lysin 63 verknüpft. Diese Modifikation führt nicht zu
      beschleunigtem Abbau von cMyc, sondern verändert dessen
      biologische Eigenschaften. Die Depletion von HectH9 durch
      shRNA reduziert die Fähigkeit von cMyc, Zielgene zu
      aktivieren. Die Repression von cMyc Zielgenen bleibt jedoch
      unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen sich in Experimenten
      mit Myc KR6, einer cMyc Mu- tante die nicht mehr von HectH9
      ubiquitiniert werden kann, bestätigen. Die
      Aktivierungsdefizienz von Myc KR6 zeigt sich in einer
      FACS-Analyse durch fehlende Induktion von Zellteilung und
      Apoptose. Während wildtyp cMyc bei gehungerten 3T3 Zellen
      Zellzyklusprogression und Zelltot induziert, verhalten sich
      Myc KR6 infizierte Zellen vergleichbar zu Kontrollzellen. Die
      Ursache hier für liegt in der Notwendigkeit der
      Ubiquitinierung von cMyc für die Rekrutierung von p300 an
      cMyc aktivierte Promotoren. Obwohl wildtyp cMyc und Myc KR6
      gleich effizient an Zielpromotoren assoziieren, kann
      lediglich wildtyp cMyc die Histonacetyltransferase p300
      binden, welche notwendig für Rekrutierung von generellen
      Transkriptionsfaktoren ist. TopBP1 ist Bestandteil der DNA
      Schadenssignalkaskade und essentieller Aktiva- tor von ATR
      nach DNA Schadensinduktion durch UV-B Strahlung. Zellen, die
      Miz1 überexprimieren zeigen Anzeichen von DNA Schaden und
      weisen verlän- gerte Halbwertszeiten von TopBP1 und ATR auf.
      In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die
      Überexpression von HectH9 die Halbwertszeit von TopBP1 nach
      UV-B Strahlung im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert und
      TopBP1 von HectH9 mit über Lysin 48 verknüpfte
      Polyubiquitinketten markiert wird. Diese Polyubiquitinierung
      wird von Miz1 gehemmt. Eine TopBP1 Mutante, die Miz1 nicht
      mehr binden kann, wird gegenüber wildtyp TopBP1 stärker
      ubiquitiniert und schneller abgebaut. Zusammenfassend wird
      deutlich, dass die E3 Ligase HectH9 entscheidend
      denZellzyklus vorantreibt, in dem sie durch Ubiquitinierung
      über Lysin 63 cMyc aktiviert und so die Zellzyklusprogression
      fördert und zusätzlich über Abbau von TopBP1 die Induktion
      von Zellzyklusarest reduziert. Diese onkogenen Ei-
      genschaften werden besonders im Kolonkarzinom deutlich.
      Während in normalen Darmgewebe HectH9 mRNA in nur 10% aller
      untersuchten Proben schwach nachzuweisen ist, ist in 80%
      aller untersuchten Adenokarzinome die HectH9 Transkription
      erhöht.