title: Investigation of the signal transduction mechanisms of activin beta E and its function for malignant growth
Creators: name: Sahin, Emine
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Hintergrund: Aktivine gehören zur TGF-β Familie an Wachstumsfaktoren und spielen eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, in Entzündungsvorgängen, in Wachstum, Differenzierung und Zelltod um nur einige Funktionen zu erwähnen. Bis heute sind die Funktion und der Signaltransduktionsmechanismus von Aktivin βE, der als letztes entdeckten Untereinheit, welcher vor allem in der Leber exprimiert wird, unklar. Aktivin E ist herabreguliert im Leberzellkarzinom und überexprimiert in vielen Leukämie Zelllinien. Das Ziel dieser Studie war, den Signalmechanismus von Aktivin E in Hepatom und Leukämie Zelllinien zu untersuchen und herauszufinden, wie es zum malignen Wachstum beiträgt. Methoden: Für die Untersuchung der Funktionen von Aktivin E in malignen Zellen wurde ein Doppelansatz durchgeführt. Für die Etablierung von stabilen Klonen mit erhöhter Aktivin E Expression wurden Expressionsvektoren generiert und durch Lipofektion in Zellen mit niedrigem endogenem Aktivin E transfiziert. Gleichzeitig wurde Aktivin E mittels sh-Lentiviren in Zelllinien mit relativ hoher Aktivin E Expression hinabreguliert. Zusätzlich wurde ein Baculovirus Expressionssystem angewendet, um rekombinantes Aktivin E zu produzieren, welches bis heute noch nicht kommerziell erhältlich ist. Mittels unterschiedlicher in vitro Assays wurden stabile Klone mit Kontrollzellen verglichen und auf phänotypische Unterschiede bezüglich Proliferation, Viabilität, Adhäsions-unabhängiges Wachstum, Klonogenität und Zellzyklusphasenverteilung untersucht. Um potentielle Signalkaskaden zu detektieren, in die Aktivin E involviert ist, wurden Expressionsanalysen mit 4x44k Expressionsarrays durchgeführt. Ergebnisse: Überexpression oder verminderte Expression von Aktivin E zeigte in MTT- und Proliferationsuntersuchungen keine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf die Proliferation oder Viabilität der jeweiligen Zelllinien. Die Verteilung der Zellzyklusphasen war ebenfalls unverändert zwischen stabilen Klonen und Kontrollzellen. Im Gegensatz dazu reduzierte eine Überexpression von Aktivin E die Proliferation im Soft Agar Assay für Adhäsions-unabhägiges Wachstum, und die Gröβe der Klone im Clonogenic Assay. In Migrationsassays hatten Aktivin E überexprimierende Zellen eine reduzierte laterale Motilität, jedoch eine erhöhte Fähigkeit durch Poren von Membranen zu wandern. Histidin-epitopmarkierte Aktivine konnten dimerisieren, aber eine Bioaktivität konnte nicht nachgewiesen werden, da das produzierte rekombinante Aktivin A keine Smad2/3 Phosphorylierung auslösen konnte. Die Expressionsanalyse zeigte, dass einige in der Apoptose involvierte Gene durch Aktivin E hochreguliert wurden, während das verwandte Zytokin Aktivin A stark herab reguliert war. Diverse andere Gene, die in verschiedene Signalkaskaden involviert sind, waren zusätzlich stark reguliert und sollten weiter untersucht werden. Schlussfolgerung: Bei Langzeitversuchen mit Aktivin E überexprimierenden Zellen werden anti-proliferative Effekte beobachtet, vor allem in in vivo ähnlichen Experimenten. Aktivin E interagiert mit vielen Signalkaskaden ohne bisher einem bestimmten Rezeptor zugeordnet werden zu können.
description: Background: Activins belong to the extended transforming growth factor beta superfamily of cytokines which play key roles in e.g. embryonic development, inflammation, growth, differentiation and death of cells to mention just some of their functions. Until now the function and signaling mechanism of activin βE, the latest activin subunit to be discovered, which is prominently expressed in the liver, is unclear. Activin E was found downregulated in hepatocellular carcinoma and elevated in multiple leukemia cell lines. The aim of the present study was to investigate activin E signaling in hepatoma and leukemia cell models and how it could contribute to malignancies. Methods: A dual approach was conducted in order to investigate activin E functions in malignant cells. For establishment of stable clones with increased activin E level, expression vectors were generated and transfected via lipofection into cell lines with low endogenous activin E levels. At the same time a lentivirus-mediated knockdown of activin βE was performed in cell lines expressing high endogenous levels of activin E. Additionally a baculovirus expression system was used for the production of histidin-tagged activin E, because recombinant activin E is still not available commercially. Phenotypic differences between stable clones and their respective controls were examined by several in vitro assays measuring proliferation, viability, migration, anchorage independent growth, clonogenicity and cell cycle distribution. To find potential pathways activin E might be involved in, 4x44k expression arrays were carried out. Results: In MTT and proliferation assays no stimulation or inhibition of proliferation and viability were obtained when activin E levels were elevated or decreased. The cell cycle distribution did not differ between stable clones and control cells. In contrast, Activin βE reduced anchorage-indepent growth in three-dimensional soft agar assays and clone size in clonogenic assays. Migration assays revealed a slightly reduced motility in lateral migration and increased ability to pass through pores of transwell membranes when activin E levels were elevated. Baculovirus-produced Histidin-tagged activins were able to dimerize but bioactivity of the recombinant proteins could not be achieved, since the generated recombinant activin A could not activate Smad2/3 phosphorylation. The expression array revealed that several apoptosis-related genes were upregulated in activin E overexpessing cells, and the related cytokine activin A was strongly down-regulated in one of the hepatome cell lines. Several other genes involved in different signalling cascades were regulated and need further investigation. Conclusion: Long-term examination of activin E overexpressing cells reveals anti-proliferative effects, especially in in vivo like experiments. Activin E crosstalks with multiple signaling cascades but cannot be connected to a certain receptor, thus signaling mechanisms need further investigation.