Παραγωγή β-καροτένιου από συνθετικό υπόστρωμα με το μύκητα Blakeslea Trispora σε ζύμωση βυθού
Creators: name: Μαντζουρίδου, Φανή
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2003
Subjects: Blakeslea trispora
Κωνικές φιάλες
Ζυμωτήρας ανάδευσης
Synthetic medium
Stirred tank reactor

description: Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε η δυνατότητα βελτίωσης της απόδοσης και της παραγωγικότητας του β-καροτένιου από συνθετικό υπόστρωμα με το μύκητα Blakeslea trispora. Για το σκοπό αυτό, οι ζυμωτικές διεργασίες έγιναν σε ανακινούμενες φιάλες και σε ζυμωτήρα ανάδευσης με ασυνεχή ζύμωση βυθού και σε ζυμωτήρα ανάδευσης με ασυνεχή ζύμωση με συνεχή προσθήκη υποστρώματος. Στο αρχικό στάδιο της μελέτης αναπτύχθηκε μία βελτιωμένη μέθοδος ανάκτησης του β-καροτένιου από τα κύτταρα του B. trispora. Το υγρό της ζύμωσης θερμαίνονταν στους 121 0C για 15 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν σε 5.000g για 20 λεπτά. Ακολουθούσε έκπλυση του μυκηλίου με αποσταγμένο νερό και φυγοκέντρηση του υγρού σε 5.000g για 20 λεπτά. Η εκχύλιση του β-καροτένιου έγινε με προσθήκη 100 ml αλκοόλης/g ξηρού βάρους βιομάζας σε θερμοστατούμενο παλινδρομητή ανακίνησης, στα 300 rpm, σε θερμοκρασία 30 0C. Το β-καροτένιο απομακρύνονταν πλήρως από τα κύτταρα του μικροοργανισμού μετά από 3 διαδοχικές εκχυλίσεις. Το μεγαλύτερο ποσοστό του εκχυλισμένου β-καροτένιου παραλήφθηκε μετά το τέλος της πρώτης εκχύλισης (75,94%), ενώ η απόδοση της δεύτερης και τρίτης εκχύλισης ήταν σημαντικά μικρότερες (16,62% και 7,44%, αντίστοιχα). Κατά την παραγωγή β-καροτένιου σε επίπεδο κωνικών φιαλών μελετήθηκε η επίδραση του εμβολίου, της θερμοκρασίας, του pH, του φυσικού φωτός, της πηγής άνθρακα και αζώτου, των επιφανειοδραστικών ουσιών, των φυτικών ελαίων, των ακόρεστων λιπαρών οξέων, του αντιοξειδωτικού και διαφόρων πρόδρομων ουσιών και ενεργοποιητών στις κινητικές παραμέτρους της ζυμωτικής διεργασίας. Οι παράμετροι αυτοί ήταν η συγκέντρωση του β-καροτένιου, της βιομάζας, των υπολειμματικών σακχάρων και το pH του υγρού της ζύμωσης. Η μεγαλύτερη απόδοση της χρωστικής παρατηρήθηκε στο υπόστρωμα παραγωγής (pH 7,0) που εμβολιάστηκε με ένα κομμάτι άγαρ από κάθε ένα τρυβλίο καλλιέργειας των στελεχών αντίθετου φύλου του B. trispora, την 8η ημέρα της ζύμωσης στους 26 0C και παρουσία φυσικού φωτός σε όλη τη διάρκεια της ζυμωτικής διεργασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αντικατάσταση της γλυκόζης με σακχαρόζη, άμυλο και γλυκερόλη μείωσαν την παραγωγή του β-καροτένιου, ενώ ο εμπλουτισμός του υποστρώματος με καλαμποκάλευρο, υδρολυμένη πρωτείνη σόγιας ή στερεά υπολείμματα απόσταξης αλκοόλης οδήγησε σε μικρή αύξηση της χρωστικής. Αντίθετα, η προσθήκη γλυκόζης, εκχυλίσματος καλαμποκιού, Span 20, Tween 80, ελαιόλαδου, βαμβακέλαιου, σογιέλαιου, ελαϊκού και λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης και αντιοξειδωτικού (βουτυλιωμένο υδροξυτολουόλιο, BHT) αύξησαν σημαντικά την παραγωγή β-καροτένιου. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η μεταβολή της μορφολογίας του μικροοργανισμού μέσω ειδικού προγράμματος μορφομετρίας σε σχέση με τη σύσταση του υποστρώματος. Κατά τη διάρκεια του βιολογικού κύκλου του B. trispora ο θαλλός του μύκητα διαφοροποιείται σε βλαστικό και αναπαραγωγικό τμήμα. Το βλαστικό τμήμα βρίσκεται με τη μορφή άθικτων μυκηλιακών υφών, μυκηλιακών υφών με κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισμένων κυττάρων, ενώ επί του αναπαραγωγικού τμήματος εμφανίζονται τα γαμετάγεια που φέρουν τα όργανα αναπαραγωγής (γαμέτες), από τα οποία με συγχώνευση γενετικής ουσίας των πυρήνων τους προκύπτουν τα ζυγοσπόρια. Τα αποτελέσματα της μορφομετρικής ανάλυσης έδειξαν ότι στο άριστο υπόστρωμα παραγωγής του β-καροτένιου το μεγαλύτερο ποσοστό της ξηρής βιομάζας του μικροοργανισμού αντιστοιχούσε σε ζυγοσπόρια (79,84%), ενώ το ποσοστό των άθικτων μυκηλιακών υφών, των μυκηλιακών υφών με κενοτόπια, των κενών κυττάρων και των εκφυλισµένων κυττάρων ήταν πολύ χαμηλό. Η ολοκλήρωση της έρευνας για τη βελτιστοποίηση των παραμέτρων της ζυμωτικής διεργασίας σε επίπεδο κωνικών φιαλών, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση στατιστικού μοντέλου πρόβλεψης, το οποίο βασίζεται στη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης. Με το παραπάνω μοντέλο ερμηνεύτηκαν σε ικανοποιητικό βαθμό οι επιδράσεις του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης και του αντιοξειδωτικού στη συγκέντρωση του β-καροτένιου και καθορίστηκε ο συνδυασμός των τιμών της συγκέντρωσης του λινελαϊκού οξέος (17,15 g/l), της κηροζίνης (39,25 g/l) και του αντιοξειδωτικού (9,04 g/l) του υποστρώματος παραγωγής, ο οποίος επιτυγχάνει τη μέγιστη συγκέντρωση του β-καροτένιου (2,82g/l). Οι πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν από τις προαναφερθείσες πειραματικές δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για την πραγματοποίηση ζυώσεων στο επίπεδο του εργαστηριακού βιοαντιδραστήρα. Μελετήθηκε η επίδραση του λινελαϊκού οξέος, της κηροζίνης, του αντιοξειδωτικού και του ισομοριακού μίγματος ελαιόλαδου, σογιέλαιου και βαμβακέλαιου στην παραγωγή β-καροτένιου με το B. trispora και στη μορφολογία του μικροοργανισμού σε ασυνεχή ζύμωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη λινελαϊκού οξέος, κηροζίνης ή αντιοξειδωτικού δεν βελτίωσαν την απόδοση της χρωστικής, ενώ ευνόησαν το σχηματισμό μυκηλιακών υφών με κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισμένων κυττάρων. Επιπλέον, η συνεργιστική δράση του λινελαϊκού οξέος και του αντιοξειδωτικού επέφερε μικρή αύξηση στην παραγωγή του β-καροτένιου. Η μεγαλύτερη παραγωγή του β-καροτένιου (1,57 g/l) παρατηρήθηκε με τον εμπλουτισμό του υποστρώματος με 30,0 g/l ισομοριακό μίγμα ελαιόλαδου, σογιέλαιου, βαμβακέλαιου και 2,5 g/l αντιοξειδωτικό (BHT). Στο άριστο υπόστρωμα παραγωγής β-καροτένιου το ποσοστό των άθικτων μυκηλιακών υφών, των κενών κυττάρων, των εκφυλισμένων κυττάρων και των ζυγοσπορίων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιομάζας ήταν 16,0%, 13,52%,1,60% και 51,46%, αντίστοιχα. Η μελέτη για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της ασυνεχούς ζύμωσης σε ζυμωτήρα ανάδευσης συνεχίστηκε με τη διερεύνηση της επίδρασης της ταχύτητας ανάδευσης του υποστρώματος και της παροχής αέρα στο ζυμωτήρα στην παραγωγή του β-καροτένιου και στη μορφολογία του μικροοργανισμού. Βρέθηκε ότι οι παραπάνω παράγοντες επιδρούν σημαντικά στη συγκέντρωση και στην παραγωγικότητα του β-καροτένιου, στη βιομάζα και στον ογκομετρικό συντελεστή μεταφοράς μάζας. Με την προσαρμογή στατιστικού μοντέλου πρόβλεψης ερμηνεύτηκαν σε ικανοποιητικό βαθμό οι επιδράσεις της ταχύτητας ανάδευσης και της παροχής αέρα στις παραπάνω παραμέτρους της ζυμωτικής διεργασίας και καθορίστηκε ο συνδυασμός των άριστων τιμών τους, ο οποίος τις επιτυγχάνει. Η μέγιστη τιμή της συγκέντρωσης του β-καροτένιου (1,57 g/l) επιτεύχθηκε σε χαμηλές τιμές ταχύτητας ανάδευσης (150 rpm) και υψηλές τιμές παροχής αέρα (1,50 vvm), ενώ οι μέγιστες τιμές της παραγωγικότητας της χρωστικής (0,079 g/l.d) και της συγκέντρωσης της βιομάζας (24,7 g/l) παρατηρήθηκαν σε υψηλές τιμές ταχύτητας ανάδευσης και παροχής αέρα (500 rpm, 1,29 vvm και 500 rpm, 1,43 vvm, αντίστοιχα). Επιπλέον, η μέγιστη τιμή του ογκομετρικού συντελεστή μεταφοράς μάζας (0,33 s-1) παρατηρήθηκε σε ταχύτητα ανάδευσης 500 rpm και παροχή αέρα 1,47 vvm. Η μορφολογία του μικροοργανισμού επηρεάζονταν σημαντικά από την ταχύτητα ανάδευσης και την παροχή αέρα. Όταν η καλλιέργεια αναπτυσσόταν με υψηλή παροχή αέρα και χαμηλή ταχύτητα ανάδευσης ευνοούνταν ο σχηματισμός μεγάλου αριθμού ζυγοσπορίων με μέτριο μέγεθος, ενώ σε έντονες συνθήκες αερισμού και ανάδευσης του υποστρώματος ευνοούνταν ο σχηματισμός μικρού αριθμού ζυγοσπορίων με μεγάλο μέγεθος. Επίσης, η ανάπτυξη του μικροοργανισμού σε έντονες συνθήκες αερισμού και ανάδευσης ευνοούσε το σχηματισμό μυκηλιακών υφών με κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισμένων κυττάρων. Στο τελικό στάδιο της εργασίας διερευνήθηκε η δυνατότητα παραγωγής του β-καροτένιου με τη μέθοδο της ασυνεχούς ζύμωσης βυθού με συνεχή προσθήκη υποστρώματος. Μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου έναρξης, της μεθόδου και του ρυθμού τροφοδοσίας του ζυμωτήρα με νέο υπόστρωμα καθώς και της σύστασης των υποστρωμάτων ανάπτυξης και τροφοδοσίας στην παραγωγή β-καροτένιου. Η μέγιστη συγκέντρωση της χρωστικής (82,5 mg/l) επιτεύχθηκε όταν προστίθενταν συνεχώς στο ζυμωτήρα νέο υπόστρωμα από την αρχή της ζύμωσης, που περιείχε 30,0 g/l ισομοριακό μίγμα φυτικών ελαίων και χαμηλές συγκεντρώσεις αυξητικών παραγόντων (πρωτεϊνική πηγή αζώτου, βιταμίνες και ιχνοστοιχεία) με ρυθμό παροχής 4,2 ml/h. Η μορφομετρική ανάλυση των κυττάρων του μικροοργανισμού έδειξε ότι στο παραπάνω σύστημα ζύμωσης ευνοείται ο σχηματισμός υψηλών ποσοστών μυκηλιακών υφών με κενοτόπια, κενών κυττάρων και εκφυλισμένων κυττάρων στο συνολικό ξηρό βάρος της βιομάζας, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης του Η2O2 και της επαγωγής της δράσης των ελευθέρων ριζών στις παραπάνω συνθήκες που πιθανόν να προκαλούν αναστολή της δράσης ενός ή περισσοτέρων ενζύμων της βιοσύνθεσης του β-καροτένιου, καταστροφή της δομής του κυτταρικού DNA και άλλες κυτταροτοξικές δράσεις. Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι το σύστημα των ανακινούμενων φιαλών είναι το πλέον αποτελεσματικό σύστημα για την παραγωγή του β-καροτένιου από συνθετικό υπόστρωμα με το B. trispora. Το σύστημα της ασυνεχούς ζύµωσης έδωσε καλύτερα αποτελέσματα ως προς τις βασικές παραμέτρους της ζύμωσης, σε σχέση με το σύστημα της ασυνεχούς ζύμωσης με συνεχή προσθήκη υποστρώματος
description: In the present study the production of β-carotene from synthetic medium by mated cultures of B. trispora in submerged fermentation was investigated. For this purpose different fermentation systems were used such as shake flasks and stirred tank reactor (batch and fed-batch culture). At the beginning stage of this study an improved method for the extraction of β-carotene from B. trispora was developed. The fermentation broth was steamed at 121 0C for 20 min. β-Carotene was removed from the biomass by extraction with absolute ethanol at a ratio of 1:100 at 30 0C for 2 h in a rotary shaker incubator at 300 rpm. The carotenoid pigment was completely removed from the cells after three repeated extractions. The removal of β-carotene from B. trispora was higher during the first stage (75,94%), whereas in the second and third stage it was very low (16,62% και 7,44%, respectively). The effect of inoculum, temperature, pH, light, carbon and nitrogen source, nonionic surfactants, natural oils, fatty acids, inducers, precursors and antioxidant on β-carotene production by B. trispora in shake flask culture was investigated. The highest concentration of β-carotene was obtained in the medium (pH 7.0) inoculated with one loop of each culture after 8 days of fermentation, at 26 0C, in the presence of daylight. Sucrose, starch and glycerol did not improve the production of β-carotene, while corn meal, soy protein acid hydrolysate and distiller's solubles slightly increased the production of the pigment. On the other hand, glucose, corn steep liquor, Span 20, Tween 80, olive oil, soybean oil, cottonseed oil, oleic and linoleic acid, kerosene and antioxidant (butylated hydroxytoluene, BHT), significantly increased the production of β-carotene. Also, a semi-automated image analysis system was used to examine the relationship between morphological changes of the fungus and the composition of the production medium. B. trispora is a microfungus with a life-cycle involving hyphae (intact hyphae, vacuolated and evacuated cells and degenerated hyphae), zygophores and zygospores in submerged culture. As indicated from the results of the morphometric analysis, in the best production medium the growing mycelium was composed primarily of zygospores (79,84%), whereas the concentration of intact hyphae, vacuolated and evacuated cells and degenerated hyphae were very low. A central composite design was employed to determine the maximum β-carotene production at optimum values for the process variables (linoleic acid, kerosene and antioxidant). The fit of the model was found to be good. Linoleic acid, kerosene and antioxidant had a strong linear effect on β-carotene production. The concentration of β-carotene was significantly affected by linoleic acid-kerosene and linoleic acid-antioxidant interactions as well as by the negative quadratic effects of these variables. The interaction among keroseneantioxidant had no significant linear effect. The maximum β-carotene concentration (2.82 g/l) was obtained at concentrations of linoleic acid (17.15 g/l), kerosene (39.25 g/l) and antioxidant (9.04 g/l). The effect of linoleic acid, kerosene, antioxidant and a mixture of natural oils (olive oil, soybean oil, and cottonseed oil) on the production of β-carotene by B. trispora and the morphological characteristics of the fungus in a stirred tank reactor were investigated. The mixture of linoleic acid and antioxidant improved slightly the production of β-carotene, while the addition of linoleic acid, kerosene or antioxidant alone to the medium had an inhibiting effect on β-carotene production. The addition to the medium of a mixture of natural oils and antioxidant increased significantly the concentration of the pigment. B. trispora formed hyphae, zygophores and zygospores during β-carotene production. Morphology of the fungus was studied during growth in submerged culture in a stirred tank reactor under different compositions of the production medium using an image analysis system. Zygospores are the morphological forms, which are responsible for pigment production. Maximum β-carotene concentration (1,57 g/l) was obtained in culture grown in medium supplemented with 10,0 g/l each one of olive oil, soybean oil, cottonseed oil and 2,5 g/l of antioxidant. In this case, the morphological characteristics of B. trispora recorded showed intact hyphae, evacuated cells, degenerated hyphae and zygospores in percentages of about 16,0%, 13,52%, 1,60% και 51,46%, respectively, in the biomass dry weight. The effect of aeration rate and agitation speed on β-carotene production and morphology of B. trispora in a stirred tank reactor was investigated. Both aeration and agitation significantly affected β-carotene concentration, productivity, biomass and the volumetric mass transfer coefficient (KLa). The highest β-carotene concentration (1.57 g/l) was obtained at low impeller speed (150 rpm) and high aeration rate (1.5 vvm). Also, maximum productivity (0.079 g/ld) and biomass dry weight (24.7 g/l) were achieved at high agitation speed and aeration rate (500 rpm, 1.29 vvm and 500 rpm, 1,43 vvm, respectively). The highest value of KLa (0.33 s-1) was observed at high agitation speed (500 rpm) and high aeration rate (1.47 vvm). The experiments were arranged according to a central composite statistical design. Response surface methodology was used to describe the effect of impeller speed and aeration rate on the most important fermentation parameters. In all cases, the fit of the model was found to be good. All fermentation parameters (except biomass concentration) were strongly affected by the interactions among the operation variables. β-Carotene concentration and productivity were significantly influenced by the aeration, agitation, and by the positive or negative quadratic effect of the aeration rate. Biomass concentration was principally related to the aeration rate, agitation speed, and the positive or negative quadratic effect of the impeller speed and aeration rate, respectively. Finally, the volumetric mass transfer coefficient was characterized by the significant effect of the agitation speed, while the aeration rate had a small effect on KLa. Microscopic examination showed that at high aeration rate (1.5 vvm) and low agitation speed (150 rpm) was observed a great number of zygospores with long diameter, while at high aeration rate and agitation speed (1.5 vvm, 500 rpm) a small number of zygospores with extremely wide diameter were observed. At intermediate values of aeration rate and impeller speed (1.0 vvm, 325 rpm) was observed a common number of zygospores with average diameter. The maximum concentration of β-carotene (1.57 g/l) was observed at the same conditions where the highest percentage of zygospores in the biomass dry weight were observed. At the final stage of this study the potential of fed-batch culture as fermentation system for β-carotene production from a chemically defined medium by B. trispora was investigated. The effect of the feeding medium composition, time of addition of feeding medium, feeding rate and fermentation system on the production of β-carotene was studied. Also, a semi-automatic image analysis system was used to determine the morphology of the microorganism, and a correlation between morphology of the fungi and the concentration of the pigment was proposed. The maximum β-carotene concentration (82,5 mg/l) was obtained using the best batch medium found in previous experiments and the feeding medium containing natural oils at concentration 1% of each one and low concentration of growth factors (amino acids, vitamins and minerals) at feeding rate of 4,2 ml/h from the beginning of the fermentation. High percentages of vacuolated hyphae, evacuated cells and degenerated hyphae of the microorganism were observed during the fermentation. This was due to the formation of high amount of reactive oxygen species (e.g. superoxide, hydrogen peroxide, hydroxyl radical) under conditions of exogenous oxidative stress, by exposure of the microorganism to high dissolved oxygen concentration. These oxidants have a detrimental function in the microorganism mediating damage of cellular membranes and enzymes, DNA damage, mutagenesis and inhibition of membrane transport processes. The above results showed that shake flask culture was the best fermentation system for the production of β-carotene from synthetic medium by B. trispora. Further investigation should focus on the improvement of β-carotene production under batch and fed-batch conditions in a larger fermentation scale