title: Apoptosis induction and cell cycle arrest after exposure to photons or carbon ions
title: Apoptoseinduktion und Zellzyklusarretierung nach Bestrahlung mit Photonen oder Kohlenstoffionen
Creators: name: Bonifer, Elisabeth Theresa
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: particle therapy , carbon ions
Partikeltherapie , Kohlenstoffionen
Zellzyklus
Apoptosis
Bronchialkrebs
Strahlentherapie
Medizin, Gesundheit
Strahlenbiologie

description: In der vorliegenden Arbeit wurde
      die biologische Wirkung von Kohlenstoffionen im Vergleich zu
      Photonen in der Bronchialkarzinomzelllinie A549 untersucht.
      Dabei ging es in erster Linie um die Untersuchung von
      Apoptoseinduktion und Zellzyklusarrest nach Bestrahlung mit
      den verschiedenen Strahlenqualitäten. Zur Ermittlung der
      relativen biologischen Wirksamkeit (RBW) von Kohlenstoffionen
      gegenüber Photonen wurde ein Koloniebildungstest durch unsere
      Arbeitsgruppe durchgeführt. Die relative Genexpression der
      Apoptose- und Zellzyklus-relevanten Gene BAX, BCL2 und BIRC5
      bzw. CDKN1A und GADD45A wurde mittels quantitativer Real-Time
      RT-PCR in Monolayerzellen (Photonen max. 7,5 Gy, 12C max. 4,5
      Gy) und in einem Xenograftmodell (Photonen 6 Gy, 12C 2 Gy)
      untersucht. Zudem wurde über die durchflusszytometrische
      Messung des DNA-Gehalts die Zellzyklusverteilung nach
      Bestrahlung untersucht, sowie über ein Annexin V/ PI-Assay
      die strahleninduzierte Induktion von Apoptose detektiert.
      Zusammenfassend wurden folgende Ergebnisse ermittelt: · Die
      relative biologische Wirksamkeit von Kohlenstoffionen (9,8
      MeV/u, LET 170keV/μm) im Vergleich zu Photonenstrahlung (6
      MV) betrug in Bezug auf das klonogene Überleben in
      A549-Monolayerzellen im Bereich von 10% Überleben 2,88. · Das
      pro-apoptotische Gen BAX wurde im Monolayer nach geringeren
      Dosen Kohlenstoffionenexposition länger und deutlicher
      heraufreguliert als nach Photonenbestrahlung. · Das
      anti-apoptotische Gen BIRC5 wurde nach
      Kohlenstoffionenbestrahlung im Monolayer wesentlich
      deutlicher herabreguliert (0,18-fach, Photonen:
      unterschwellig). · Nach Kohlenstoffionenbestrahlung bis 4 Gy
      war ein höherer Prozentsatz (max. 12%) an strahleninduziert
      toten Zellen in der Tumorzelllinie A549 zu detektieren als
      nach Photonenbestrahlung bis 10 Gy (max. 6,7%). · Der am
      G1/S-Übergang beteiligte Zellzyklusinhibitor CDKN1A wurde im
      Monolayer nach Photonenexposition bis knapp 4-fach und unter
      Kohlenstoffionenexposition bis 18-fach hochreguliert. · Das
      am G2/M-Arrest beteiligte Gen GADD45A wurde im Monolayer nach
      Photonenexposition kaum induziert, wohingegen nach
      Kohlenstoffionenbestrahlung eine fast 12-fache
      Heraufregulierung beobachtet werden konnte. · Exponentiell
      wachsende Zellen zeigten nach Photonenbestrahlung einen
      Arrest in der G2/M- und in der G1-Phase. Nach
      Kohlenstoffionenbestrahlung war dieser Arrest schon bei
      Bestrahlung mit geringeren physikalischen Dosen deutlich
      stärker und länger ausgeprägt. · Die Ergebnisse der
      Genexpressionsanalysen im Xenograftmodell unterschieden sich
      von den Ergebnissen in Monolayerzellen. Die Expression war
      nach gleicher physikalischer Dosis Photonenstrahlung im
      Xenograftmodell teilweise höher als in den Monolayerzellen.
      Umgekehrt zeigte sich nach Kohlenstoffionenexposition im
      Xenograftmodell zum Teil eine geringere Expression als in den
      Monolayerzellen. Es konnte gezeigt werden, dass durch
      Kohlenstoffionenbestrahlung bei äquivalenter physikalischer
      Dosis fast dreimal mehr Zellen ihre Teilungsfähigkeit
      verloren als nach Photonenexposition. Die stärkere Induktion
      bzw. Suppression Apoptose-relevanter Gene zeigt die stärkere
      Aktivierung des Apoptosesignalwegs nach
      Kohlenstoffionenexposition. Auch die über Annexin V
      morphologisch nachgewiesene Induktion von Apoptose in
      A549-Zellen war nach Kohlenstoffionenexposition höher als
      nach Photonen, jedoch insgesamt gering. Somit kann die in
      dieser Arbeit ermittelte höhere RBW für das zelluläre
      Überleben nach Kohlenstoffionenbestrahlung nur zu einem
      kleinen Teil auf der Induktion von Apoptose beruhen. Der
      stärker und länger ausgeprägte Zellzyklusarrest und die
      deutlichere Induktion der Zellzyklusinhibitoren nach
      Kohlenstoffionenexposition lassen sich vermutlich auf die
      komplexeren Schäden durch Hoch-LET-Strahlung zurückführen, da
      die Zellen mehr Zeit für deren Reparatur benötigen. Dass die
      Reparaturkapazität der A549-Zellen nach
      Kohlenstoffionenexposition häufiger überstiegen wurde, zeigen
      die Ergebnisse der Apoptosedetektion. Die abweichenden
      Genexpressionsergebnisse im Xenograftmodell veranschaulichen
      die wichtige Rolle des Tumormikromilieus für die Reaktionen
      auf Bestrahlung in vivo. Welche Einflüsse in welcher Form auf
      die Strahlenantwort nach Hoch-LET-Strahlung in vivo wirken,
      bleibt in nachfolgenden Arbeiten zu klären. Als
      weiterführende Untersuchungen wäre außerdem die Analyse von
      anderen an Apoptose und Zellzyklusprogression beteiligten
      Genen bzw. deren Expression auf Proteinebene nach
      Kohlenstoffionenbestrahlung von Interesse.
description: In this study the biological
      impact of carbon ions in comparison to photons was analyzed
      in the human lung cancer cell line A549. Apoptosis induction
      and cell cycle arrest were examined after exposure to the two
      radiation types. In order to detect the relative biological
      effectiveness (RBE) of carbon ions compared to photons, a
      colony forming assay was employed by our research group. The
      relative expression of genes involved in cell cycle
      progression and apoptosis was measured by quantitative
      Real-Time-PCR in a monolayer cell culture (photons max. 7.5
      Gy, 12C max. 4.5 Gy) as well as in a xenograft model (photons
      6 Gy, 12C 2 Gy). Furthermore, cell cycle distribution after
      radiation was detected by flow cytometric measurement of DNA
      content. Additionally, radiation-induced apoptosis was
      monitored using an Annexin V/ PI assay. The following results
      were obtained: · The RBE of carbon ions (9.8 MeV/u, LET 170
      keV/μm) compared to photons (6 MV) for 10% survival was 2.88.
      · After exposure to carbon ions expression of the
      pro-apoptotic gene BAX lasted longer and was up-regulated at
      lower doses in the monolayer cell culture as compared to
      photon irradiated cells. · The anti-apoptotic gene BIRC5 was
      down-regulated to a greater extent after carbon ion exposure
      (0.18-fold, photons: below threshold) in the monolayer cell
      culture. · There was a higher percentage (max. 12%) of
      radiation-induced cell death in the cancer cell line A549
      after exposure to carbon ions (up to 4 Gy) than after
      exposure to photon beams up to 10 Gy (max. 6.7%). · The gene
      CDKN1A, which is involved in the G1/S checkpoint, was
      up-regulated up to 4-fold and up to 18-fold following photon
      and carbon ion irradiation in the monolayer cell culture,
      respectively. · GADD45A, which is involved in G2/M arrest,
      was barely up-regulated after exposure to photons, whereas it
      was up-regulated 12-fold after carbon ion exposure in the
      monolayer cell culture. · Exponentially growing cells were
      arrested in G2/M and in G1 phases after exposure to photons.
      After carbon ion irradiation the arrest was more pronounced
      and longer-lasting, even in response to smaller physical
      doses. · Gene expression data in the xenograft model differed
      from that of the monolayer cell culture model. After
      equivalent physical doses of photons, gene expression in the
      xenografts was partly higher than in the monolayer cells.
      Contrarily, gene expression was, to some extent, lower after
      carbon ion exposure in the xenografts compared to in
      monolayer cells. This study demonstrates that three times
      more cells lost their ability to divide after exposure to
      carbon ions than after an equivalent physical dose of
      photons. The considerabe respective induction and suppression
      of apoptosis-related genes emphasizes the more distinct
      activation of the apoptosis pathway after carbon ion
      irradiation. Additionally, apoptosis induction detected by
      the Annexin V assay was higher in carbon ion-exposed cells,
      despite being low for both treatments. The higher RBE for
      cell survival following carbon ion irradiation can be partly
      explained by differences in apoptosis induction. The marked
      and longer lasting cell cycle arrest and the more distinct
      induction of cell cycle inhibitors after exposure to carbon
      ions are most likely due to the more complex damage after
      High-LET radiation, as the cells need more time for repair.
      Apoptosis detection revealed that the repair capacity of the
      cells was exceeded more often after carbon ion irradiation.
      The different gene expression results in the xenograft model
      support the important role of the tumor microenvironment for
      the response to radiation in vivo. Further studies are needed
      to explore the types of influences that operate during the
      response to High-LET radiation in vivo. For future studies,
      it would be interesting to analyze other genes that are
      involved in apoptosis and cell cycle arrest pathways after
      carbon ion irradiation and, accordingly protein expression
      changes.