Εξαγωγή και μελέτη ποσοτικών σχέσεων δομής-δράσης(QSAR) ενώσεων με δράση κατά των σερινοπρωτεασών: σύνθεση και φαρμακοχημική μελέτη κουματινικών παραγώγων με πιθανή βιολογική δράση κατά των σερινοπρωτεασών και της φλεγμονής
Creators: name: Κοντογιώργης, Χρήστος Α.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2004
Subjects: Αναστολείς Σερινοπρωτεασών
Serine Proteases Inhibitors

description: Η φλεγμονή είναι μία σύνθετη διαδικασία στην οποία εμπλέκονται διάφοροι παράγοντες και αποτελεί ένα βασικό πρόβλημα για την υγεία πολλών ασθενών. Μερικοί από τους εμπλεκόμενους παράγοντες είναι διάφορα ένζυμα όπως η λιποξυγονάση και η κυκλοξυγονάση, που εμπλέκονται στη διαδικασία μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος, η β-γλυκουρονιδιάση αλλά και οι ελέυθερες ρίζες. Τελευταία έχι βρεθεί ότι ανάμεσα στους διάφορους παράγοντες που εμπλέκονται στον κύκλο της φλεγμονής είναι και οι σερινοπρωτεάσες. Οι σερινοπρωτεάσες είναι μια κατηγορία πρωτεϊνών, οι οποίες έχουν το αμινοξύ σερίνη στο ενεργό τους κέντρο και συμμετέχουν σε πολλές βιοχημικές οδούς, όπως είναι η πέψη των τροφών, η πήξη του αίματος και άλλες. Τα πιο γνωστά μέλη από αυτές είναι η τρυψίνη, η χυμοτρυψίνη, η θρομβίνη, ο Παράγοντας Χα και οι ελαστάσες. Ετσι θεωρήθηκε ενδιαφέρον να συντεθούν νέα κουμαρινικά παράγωγα για ν μελετηθούν τόσο για την αντιφλεγμονώδη και την αντιοξειδωτική τους δράση όσο και για τη δυνατότητά τους να αναστέλλουν τις σεριπρωτεάσες. Σε προηγούμενες εργασίες έχει ήδη παρουσιασθεί η σημαντική δράση που εμφανίζουν διάφορα κουμαρινικά παράγωγα ως αντιφλεγμονώδεις παράγοντες. Ακόμα έχει δειχθεί ότι μπορούν να δράσουν και ως σαρωτές ελεύθερων ριζών αλλά και ως αναστολείς ενζύμων. Πρόσφατα μελετήθηκε η δράση διαφόρων κουμαρινικών παραγώγων επί γνωστών για τη βιολογική τους δράση σερινοπρωτεασών. Εχει αποδειχθεί μάλιστα και κρυσταλλογραφικά η πολύ καλή σύνδεση της 7-υδροξυ-κουμαρίνης με το ενεργό κέντρο της χυμοτρυψίνης. Σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν δύο κατηγορίες νέων κουμαρινικών παραγώγων επί γνωστών για τη βιολογική τους δράση σερινοπρωτεασών. Εχει αποδειχθεί μάλιστα και κρυσταλλογραφικά η πολύ καλή σύνδεση της 7-υδροξυ-κουμαρίνης με ενεργό κέντρο της χυμοτρυψίνης. Σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν δύο κατηγορίες νέων κουμαρινικών παραγώγων. Η πρώτη περιλαμβάνει βάσεις Mannich και χωρίζεται σε δύο υποομάδες. Η πρώτη ομάδα περιλαμβάνει την ένωση 2[9-μεθυλο-9, 10-διϋδρο-2Η, 8Η-χρωμενο[8,7-e][1,3]-οξαζιν-2όνης] και τις ενώσεις 3-15 με γενικό τύπο 8-μεθυλεν-αμινο-7-υδροξυ-υποκατεστημένες κουμαρίνες. Η δεύτερη κατηγορία ενώσεων περιλαμβάνει τις ενώσεις 17-24, που περιέχουν τον αζωμεθινικό δεσμό στον υποκαταστάτη στη θέση 7 του κουμαρινικού δακτυλίου. Ολες οι νέες ενώσεις ταυτοποιούνται φασματοσκοπικά και με τη βοήθεια των στοιχειακών αναλύσεών τους. Υπολογίστηκε πειραματικά η λιποφιλικότητα των νέων ενώσεων με τις τιμές R^(M) αλλά και με υπολογιστικές μεθόδους(Clog P, logP^(GC)). Ακόμη με διάφορα υπολογιστικά προγράμματα εκτιμήθηκαν διάφορες φυσικοχημικές ιδιότητες των νέων κουμαρινικών παραγώγων. Στη συνέχεια οι ενώσεις μελετούνται φαρμακοχημικά για την αλληλεπίδραση τους με την ελεύθερη σταθερή ρίζα του DPPH και για τον ανταγωνισμό τους με το DMSO για τη δέσμευση των ελεύθερων ριζών υδροξυλίου. Οι ενώσεις χαρακτηρίστηκαν από καλή δράση. Μελετάται η επίδραση των νέων κουμαρινικών παραγώγων στην αναστολή διαφόρων ενζύμων που εμπλέκονται στον κύκλο της φλεγμονής, όπως η λιποξυγονάση, η κυκλοοξυγονάση και η β-γλυκουρονιδάση. Το σύνολο σχεδόν των ενώσεων προκάλεσε ισχυρή ανασταλτική δράση επί των ενζύμων. Ενδιαφέροντα είναι τα αποτελέσματα της μελέτης της ανασταλτικής δράσης των κουμαρινικών παραγώγων επί των διαφόρων σερινοπρωτεασών. Για τη τρυψίνη και τη χυμοτρυψίνη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα που μελετούν τις δύο διαφορετικές δράσεις των ενζύμων, την πρωτεολυική τους δράση και τη δράση τους ως εστερασών. Ακόμη μελετάται και η επίδραση των ενώσεων επι της θρομβίνης με δύο διαφορετικά πειραματικά πρωτόκολλα. Οι περισσότερες ενώσεις έδειξαν πολύ καλά αποτελέσματα επί της τρυψίνης και της χυμοτρυψίνης, ενώ ορισμένες από αυτές εμφάνισαν και ισχυρή δράση κατά της θρομβίνης. Παράλληλα μελετάται η ικανότητα των ενώσεων με αζωμεθινικό δεσμό στο μόριο τους να δρουν ως δότες ΝΟ(Μονοξειδίου του Αζώτου) με την παρουσία δύο διαφορετικών θειολικών παραγόντων, της L-κυστεϊνης και της θειοφαινόλης. οι ενώσεις μελετήθηκαν για την in vivo αντιφλεγμονώδη δράση τους με το πρότυπο της καρραγενίνης. οι περισσότερες ενώσεις έδωσαν ικανοποιητική δράση. Ακόμη μελετήθηκε η vivo και η δυνατότητα τους να αναστέλλουν την προκαλούμενη από το ανοσοενισχυτικό του Freud πειραματική αρθρίτιδα. Οι ενώσεις που δοκιμάσθηκαν έδειξαν να μειώνουν σημαντικά τις επιπτώσεις από τις εκδηλώσεις της πειραματικής αρθρίτιδας. Γενικά τα αποτελέσματα από τις in vino και in vitro φαρμακοχημικές δοκιμασίες επιβεβαιώνουν την ύπαρξη της προβλεφθείσας βιολογικής δράσης. Προσπαθήσαμε να συσχετίσουμε ποσοτικά τα αποτελέσματα από τις φαρμακοχημικές δοκιμασίες επιβεβαιώνουν την ύπαρξη της προβλεφθείσας βιολογικής δράσης. Προσπαθήσαμε να συσχετίσουμε ποσοτικά τα αποτελέσματα από τις φαρμακοχημικές και τις in vivo δοκιμασίες με τη δομή των ενώσεων με σκοπό την εξαγωγή προτύπων σχέσεων που θα βοηθήσουν την ανεύρεση και τη διευκρίνιση του μηχανισμού δράσης τους. Παράλληλα γίνεται μια εκτενής προσπάθεια εξαγωγής προτύπων σχέσεων που να συσχετίζουν τη δομή με τη δράση νέων ενώσεων, γνωστών από τη βιβλιογραφία, που έχουν δοκιμασθεί για τη δράση τους ως αναστολείς των σερινοπρωτεασών, της τρυψίνης, της θρομβίνης και του Παράγοντα Χα. Τα τελευταία χρόνια έχει πραγματοποιηθεί μεγάλη πρόοδος στην ανάπτυξη ενώσεων-αναστολέων. Επείδή οι αναστολείς τόσο της θρομβίνης όσο και του Παράγοντα Χα βρίσκουν μεγάλη θεραπευτική εφαρμογή, τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη αυτή θα βοηθήσουν το σχεδιασμό και τη σύνθεση αλλά και τη διευκρίνηση με ακρίβεια του μηχανισμού δράσης αναστολέων των σερινοπρωτεασών.
description: Inflammation is a complex phenomenon involving interrelationships between humoral and cellular reactions through a number of inflammatory mediators. It is an usual symptom covering different pathologies and there are still many questions to be answered in order to understand the inflammatory process, as well as a need for better-tolerated and more efficient anti-inflammatory drugs. Recently it has been clarified that serine proteases are implicated in various inflammatory disorders. Some of the most well known members of serine proteases are trypsin, chymotrypsin, thrombin and Factor Xa. Coumarin derivatives are mostly active compounds. Many of them have been isolated from natural sources and especially from plants. In previous studies many coumarin derivatives have shown significant anti-inflammatory activity as well as antioxidant. Coumarins were found to highly inhibit various enzymes implicated in inflammation. Among them lipoxygenase and serine proteases, especially chymotrypsin and thrombin. In this study a number of new synthesized coumarin Mannich bases is presented. Among them: compound 2 [9-methyl-9,10-dihydro-2H,8H-hromen[8,7-e][1,3]-oxazin-2-one] and compounds 3-15 with the general structure of 7-hydroxy-8-methylene-amine-substituted coumarins. Another group of new coumarin derivatives has also been synthesized. These compounds contain an azomethine group at position 7 of the coumarin ring. The structure of all the new compounds (bases, salts, azomethine derivatives) are confirmed spectrophotometrically and elemental analysis have been performed. Lipophilicity of the compounds was determined experimentally as RM values by RPTLC and theoretically by computational methods (C-QSAR for Clog P and McSpartan). The compounds are novel and in relation to their pharmacological properties are of high interest, since they present major differences to the classical anti-inflammatory agents. All the compounds have been conducted to a preliminary in vitro and in vivo study. The new compounds were studied for their interaction with the stable free radical DPPH and most of them shown high ability to scavenge free radicals. Moreover many of them were found to have a good competition with DMSO for scavenging free hydroxy radicals, which were found to be involved in inflammatory process. A number of enzymes is well known that they are implicated in inflammation. Some of them are lipoxygenase, cyclooxygenase and _-glucuronidase. Most of the new tested coumarin derivatives have shown high inhibitory activity on these enzymes in two different concentrations (0.01 mM and 0.1 mM). Compounds were tested in vitro against various serine proteases. In the case of trypsin and chymotrypsin two different experiments were performed examining their proteolytic activity and their ability to function as esterases. Almost all the compounds presented high inhibitory activity against both enzymic activities Two different experiments were performed to delineate the inhibitory activity of the tested coumarins against thrombin. Some of the compounds presented significant inhibition. All the azomethine - derivatives were studied in vitro for the nitric oxide release in the presence of thiol cofactors. It was found that __2 - release was dependent on the nature of thiol. Some of them were found to highly release __2 For the anti-inflammatory activity of all the new compounds the carraggenin induced rat paw edema has been used. All the tested compounds highly inhibit the carrageen induced rat paw edema at 0.01 mmol/ kg b.w. For some of the synthesized compounds the adjuvant induced arthritis (AID) model has been used. AID is considered to be one of the best experimental models for investigation of anti-inflammatory drugs and quite close to the human rheumatoid arthritis. The examined compounds suppressed very effectively the AID manifestations (inflammation - arthritic score - cachexia impairment of the in vivo drug metabolism). In continuation, we tried to linearly correlate the different biological responses in order to delineate the mechanism of action of these derivatives: in vivo anti-inflammatory and in vitro antioxidant activity, free radical scavenging activity and inhibitory activity of enzymes induced by the tested compounds. The relationships between structure, physicochemical properties and biological activities for several classes of serine proteases (trypsin, thrombin and Factor Xa) inhibitors reported in literature, have been evaluated. An attempt has been also made to correlate all the biological data of this research with the physicochemical properties of the corresponding compounds. The QSAR analysis presented here is an attempt to organize the knowledge available from the compounds able to inhibit trypsin, thrombin and Factor Xa. The C-QSAR methodology of Biobyte can greatly help in this effort being focused on the physicochemical and statistical bases as to extract useful results that can be used in the further design of serine proteases inhibitors.