Κλωνοποίηση της β-σφαιρίνης ποντικού σε σύντηξη με το ΤΑΤ πεπτίδιο
Creators: name: Κωνσταντινίδου, Μαρία Μιλτιάδη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Κλωνοποίηση
β-σφαιρίνη μυός
Τεχνολογία πρωτεϊνικής μεταγωγής
Cloning
Murine beta-globin
Protein transduction domain

description: Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο την κλωνοποίηση της κωδικοποιούσας αλληλουχίας της ποντικίσιας β-σφαιρίνης σε σύντηξη με το πεπτίδιο TAT με σκοπό την παραγωγή της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης 10 × His-XaSITE-TAT-murine β-globin με την δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταφοράς της, στην κυτταρική σειρά MEL. Η κωδικοποιούσα αλληλουχία της β-σφαιρίνης ποντικού ενισχύθηκε με PCR και κλωνοποιήθηκε διαδοχικά στους φορείς pCR2.1 TOPO και pET-16b (που περιέχει ετικέτα ιστιδίνης), σε σύντηξη με το πεπτίδιο TAT, το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο πεπτίδιο μεταγωγής (PTD) για αποτελεσματική μεταγωγή της παραγώμενης πρωτεΐνης. Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μετασχηματίστηκε σε κύτταρα Escherichia coli C43 και ακολούθησε επαγωγή με IPTG για έκφραση της αντίστοιχης πρωτεΐνης. Η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που παράχθηκε ελέγχθηκε για την διαλυτότητά της, καθαρίστηκε από το διαλυτό κλάσμα χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αγχιστείας στήλης Νικελίου και αναλύθηκε με SDS-PAGE και «ανοσοαποτύπωση κατά Western». Επίσης απομονώθηκαν τα βακτηριακά έγκλειστα (IBs) εμπλουτισμένα στην ανασυνδιασμένη πρωτεΐνη και διαλυτοποιήθηκαν σε διάλυμα 1M L-Arg, αυτά, μετά την ανάλυση τους, επωάστηκαν με MEL κύτταρα για 4 ώρες. Απομόνωση του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος και έλεγχος με ανοσοαποτύπωση κατά Western επιβεβαίωσε την ενδοκυττάρια μεταφορά της ανασυνδιασμένης β-σφαιρίνης ποντικού η οποία συντήχθηκε με το πεπτίδιο μεταγωγής TAT, σε αντίθεση με την ίδια πρωτεΐνη (πρωτεινη control) χωρίς το TAT πεπτίδιο. Η μελέτη καταδεικνύει την επιτυχή κλωνοποίηση και έκφραση της κωδικής αλληλουχίας της β-σφαιρίνης ποντικού σε συνδυασμό με το πεπτίδιο ΤΑΤ και η ακόλουθη ενδοκυττάρια μεταφορά της, κατ΄ αντιστοιχία με την μελέτη της ανθρώπινης β-σφαιρίνης που προηγήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακολογίας του τμήματος Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. Η πρωτεΐνη αυτή μπορεί να χορηγηθεί μελλοντικά σε ποντίκια, για τον έλεγχο της βιοκατανομής της και στη συνέχεια σε θαλασσαιμικά ποντίκια για έλεγχο της πιθανότητας αναστροφής του θαλασσαιμικού φαινότυπου.
description: The present study aimed to clone the coding sequence of the murine β-globin in fusion with the TAT peptide in order to produce the recombined protein 10× His-XaSITE-TATmurine β-globin with the possibility of its endocell transfer, in the MEL cell line. The coding sequence of the murine β-globin was amplified by PCR and cloned sequentially into the vectors pCR2.1 TOPO and pET-16b (which contains a histidine tag), fused with the TAT peptide, the most commonly used transduction peptide (PTD) for efficient transduction of the produced protein. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli C43 cells, followed by induction with IPTG for the expression of the corresponding protein. The recombinant protein produced was checked for its solubility, was purified from the soluble fraction, using “flash Nickel column chromatography” and analyzed by SDS-PAGE and Western blotting. Additionally, bacterial inclusions (IBs), enriched in the recombinant protein, were isolated and solubilized in 1M L-Arg solution, these, after their analysis, were incubated with MEL cells for 4 hours. Isolation of the protein extract and verification by Western blotting confirmed the intracellular transport of the recombinant murine β-globin which was fused with the TAT transduction peptide, in contrast to the same protein (protein control) without the TAT peptide. The study demonstrates the successful cloning and expression of the coding sequence of the murine β-globin in combination with TAT peptide and its following intracellular transfer, in correspondence with the study of human β-globin that was preceded by the Pharmacology laboratory of the Pharmacy department of A.U.Th. This protein can be administered to mice, in the future, to control its biodistribution and subsequently in thalassemic mice to check the possibility for thalassemia phenotype reversal.