Μελέτη του ρόλου της CYLD στον επαναπρογραμματισμό επαγόμενων βλαστικών κυττάρων και τη στοχευμένη διαφοροποίηση
Creators: name: Μπέκας, Νικόλαος Στ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: CYLD
Επαναπρογραμματισμός
Αποδιαφοροποίηση
Επιθηλιακή-προς-Μεσενχγυματική Μετατροπή (ΕΜΤ)
Reprogramming
Dedifferentiation
Epithelial-to-Mesenchymal transition (EMT)

description: Ο επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων είναι μια διαδικασία μέσω της οποίας οποιοσδήποτε τύπος κυττάρου μπορεί να μετατραπεί σε επαγόμενο ολοδύναμο βλαστικό κύτταρο. Η πιο καλά μελετημένη μεθοδολογία περιλαμβάνει την υπερέκφραση τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων (OCT4, SOX2, KLF4, c-myc), γνωστών ως παραγόντων Yamanaka. Παρόλο που έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος στην κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τον επαναπρογραμματισμό, πολλά ρυθμιστικά στοιχεία παραμένουν ακόμη άγνωστα. Η CYLD είναι μια πρωτεΐνη που λειτουργεί κυρίως ως ένζυμο αποουβικουιτινάσης (DUB), στοχεύοντας κυρίως τις αλυσίδες ουβικουιτίνης Κ63 και Μ1, παίζοντας έτσι σημαντικό ρόλο ως ρυθμιστής της κυτταρικής σηματοδότησης. Πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια και διεργασίες που ρυθμίζονται από την CYLD εμπλέκονται στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων, ωστόσο ο πιθανός ρόλος της CYLD σε αυτή τη διαδικασία δεν έχει ακόμη μελετηθεί. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση του πιθανού ρόλου της CYLD στον επαναπρογραμματισμό, στη διατήρηση της ολοδυναμίας των παραγόμενων iPSCs και στη δυνατότητα αυθόρμητης διαφοροποίησής τους. Για το σκοπό αυτό, εμβρυωνικοί ινοβλάστες μυών (MEFs) που εκφράζουν είτε το άγριου τύπου CYLD (CYLD WT/WT) είτε το καταλυτικά ανενεργό αλληλόμορφο Δ9 (CYLD Δ9/Δ9) επαναπρογραμματίστηκαν μέσω έκτοπης υπερέκφρασης των παραγόντων Yamanaka. Οι MEFs που φέρουν το αλληλόμορφο CYLD Δ9 παρουσίασαν 75% μείωση της απόδοσης του επαναπρογραμματισμού σε σύγκριση με τους WT MEFs. Η έκφραση δεικτών αντιπροσωπευτικών των φάσεων του επαναπρογραμματισμού (ημέρα 5 για τον πρώιμο, ημέρα 10 για τον ενδιάμεσο και ημέρα 16 για τον όψιμο επαναπρογραμματισμό) προσδιόρισε την πρώτη φάση (γνωστή και ως φάση έναρξης) ως την κυρίως επηρεαζόμενη από την ανεπάρκεια της CYLD. Μέσω μεταγραφωματικής και πρωτεωμικής ανάλυσης, αποκαλύφθηκε ότι η ανεπάρκεια CYLD προάγει την έκφραση γονιδίων σχετιζόμενων με την ταυτότητα των σωματικών κυττάρων, την εξωκυτταρική μήτρα (ECM) και την Επιθηλιακή-προς-Μεσεγχυματική μετατροπή (EMT), παρεμποδίζοντας την αντίθετη διαδικασία (Μεσεγχυματική-προς-Επιθηλιακή μετατροπή/MET), ένα σημαντικό ορόσημο του πρώιμου επαναπρογραμματισμού. Ως αποτέλεσμα, εμποδίζεται η ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με τον επιτυχή επαναπρογραμματισμό (όπως τα επιθηλιακά και τα γονίδια πρώιμης πολυδυναμίας) και τα κύτταρα με ανεπάρκεια CYLD χαρακτηρίζονται από βραδύτερη κινητική του πρώιμου επαναπρογραμματισμού.Τα Δ9 MEF σχημάτισαν σταθερές κυτταρικές σειρές iPSC που παρουσίασαν παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά με εκείνα των WT iPSC. Η έκφραση των δεικτών ολοδυναμίας ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των Δ9 και των WT iPSCs. Από την άλλη πλευρά, και οι δύο σειρές εξέφραζαν χαμηλά επίπεδα ινοβλαστικών και μεσεγχυματικών δεικτών, που είναι ένδειξη πλήρους ολοδυναμίας. Η δυνατότητα διαφοροποίησης και των δύο σειρών iPSC αξιολογήθηκε μέσω in vitro αυθόρμητης διαφοροποίησης. Και οι 2 κυταρικές σειρές διαφοροποιήθηκαν με επιτυχία σε κύτταρα προερχόμενα από τις 3 βλαστικές στιβάδες (ενδόδερμα, μεσόδερμα, εξώδερμα). Επιπλέον, η κινητική της διαφοροποίησης, όπως μετρήθηκε μέσω της έκφρασης δεικτών γενεαλογικών γραμμών κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, δεν παρουσίασε καμία διαφορά μεταξύ των WT και Δ9 iPSCs. Συνεπώς, η CYLD δεν είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ολοδυναμίας και την αυθόρμητη διαφοροποίησης των iPSC. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αποκάλυψαν για πρώτη φορά τον σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο του CYLD στον επαναπρογραμματισμό σωματικών κυττάρων και, ταυτόχρονα, παρείχαν περαιτέρω στοιχεία σχετικά με τη σύνδεση της καταλυτικής ανεπάρκειας της CYLD με την προώθηση της EMT. Η συσχέτιση του CYLD με την εξωκυτταρική μήτρα αποτελεί μια άλλη σημαντική ανακάλυψη της παρούσας μελέτης.
description: Somatic cell reprogramming is a process through which any cell type can be transformed into an induced pluripotent stem cell. The most well studied methodology involves the overexpression of four transcription factors (OCT4, SOX2, KLF4, c-myc), commonly known as the Yamanaka factors. Even though great progress has been made in understanding the mechanisms governing reprogramming, many regulatory elements still remain elusive. CYLD is a protein which primarily functions as a deubiquitinating enzyme (DUB) that targets mostly K63 and M1 ubiquitin chains, thus playing an important role as a modulator of cell signaling. Many signaling pathways and processes regulated by CYLD are involved in somatic cell reprogramming, however the potential role of CYLD in this process has not been studied yet. The aim of the current thesis is to investigate the potential role of CYLD in somatic cell reprogramming, pluripotency maintenance of produced iPSCs and their spontaneous differentiation potential. For that purpose, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) capable of expressing wild type (CYLD WT/WT) or DUB-deficient (CYLD Δ9/Δ9) CYLD were reprogrammed through ectopic overexpression of the Yamanaka factors. MEFs expressing the Δ9 CYLD allele presented a 75% reduction in reprogramming efficiency compared to WT MEFs. Expression of markers representative of the phases of reprogramming (day 5 for early, day 10 for intermediate and day 16 for late reprogramming) identified the first phase (also known as initiation phase) as being mostly affected by CYLD DUB deficiency. Through gene expression and whole proteomic analysis, it was revealed that CYLD DUB deficiency promotes the expression of genes related to somatic cell identity, extracellular matrix (ECM) and Epithelial-to-Mesenchymal transition (EMT), therefore inhibiting the opposing process known as Mesenchymal-to-Epithelial transition (MET) an important milestone of early reprogramming. As a result, the activation and subsequent upregulation of genes related to successful reprogramming (such as epithelial and early pluripotency genes) is blocked and CYLD-DUB-deficient cells are characterized by slower kinetics of early reprogramming progression.Δ9 MEFs produced stable iPSC cell lines that presented similar phenotypic characteristics to those of WT iPSCs. Importantly, the expression of pluripotency markers was comparable between Δ9 and WT iPSCs. On the other hand, both expressed low levels of fibroblast and differentiation-associated markers, which are indicative of full pluripotency. The differentiation potential of both iPSC lines was assessed through an in vitro spontaneous differentiation protocol. Interestingly, they were able to produce cells derived from all 3 embryonic germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm). Moreover, the kinetics of differentiation, as measured through the expression of lineage markers during the course of the process, presented no difference between WT and Δ9 iPSCs. Based on these results, it was concluded that CYLD is dispensable for pluripotency maintenance and doesn’t affect the spontaneous differentiation potential of iPSCs. The results of this thesis revealed for the first time the important regulatory role of CYLD in somatic cell reprogramming and, at the same time, provided further evidence concerning the connection of CYLD DUB deficiency to EMT promotion. The association of CYLD with the extracellular matrix is another significant discovery of this study.