title: Entwicklung, Optimierung, Validierung und Anwendung einer LC-MS Methode für die simultane Quantifizierung einer Vielzahl von oralen Antitumortherapeutika in Humanplasma als Basis für eine zukünftige, routinemäßige Expositionsabschätzung von Tumorpatienten
Creators: name: Kehl, Niklas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: Tumorerkrankungen sind für etwa 25 % aller Todesfälle in Deutschland verantwortlich und nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste Todesursache. Die Inzidenz von Tumorerkrankungen steigt stetig an, was u.a. durch eine immer älter werdende Bevölkerung begründet werden kann. Maligne Tumore sind durch invasives Wachstum und Metastasenbildung charakterisiert. Nach einer Diagnose, z.B. durch bildgebende Verfahren und Klassifikation des Tumors, sind verschiedene Behandlungsmöglichkeiten verfügbar. Neben den klassischen Therapieoptionen, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie, gab es in den letzten Jahrzehnten erhebliche Fortschritte bezüglich einer zielgerichteteren Behandlung vieler Tumorentitäten. Solche Therapieformen richten sich u.a. gegen Oberflächenrezeptoren oder Versorgungsprozesse des Tumors, um so ein übermäßiges Zellwachstum oder Überleben der Tumorzelle zu verhindern. Typische Vertreter dieser Therapieform sind beispielsweise monoklonale Antikörper, immunmodulierende Checkpoint-Inhibitoren oder Proteinkinase-Inhibitoren. Seit den 1960er Jahren wurde neben der parenteralen auch die orale Applikation von Tumortherapeutika etabliert. Anfänglich noch mit klassischen Zytostatika, wie Chlorambucil, hat sich das Portfolio deutlich erweitert. So wurden seit der Einführung des ersten Proteinkinase-Inhibitors Imatinib im Jahr 2001 mittlerweile mehr als 100 orale Antitumortherapeutika auf dem europäischen Markt zugelassen. Orale Antitumortherapeutika ermöglichen Patienten erheblich mehr Freiheiten im Laufe der medikamentösen Therapie im Vergleich zu klassischer intravenös applizierter Chemotherapie, was sich positiv auf die Patientenzufriedenheit auswirkt. Jedoch stellt die Therapieform der oralen Antitumortherapeutika auch Patienten und medizinisches Personal vor erhebliche Herausforderungen. So bekommt der Patient ein höheres Maß an Eigenverantwortung, das orale Antitumortherapeutikum nach bestimmten, teilweise sehr komplexen Behandlungsplänen einzunehmen. Zudem kommen noch Einnahmehinweise bezüglich Nahrungsaufnahme oder der gleichzeitigen Einnahme weiterer Arzneimittel, was die Exposition der oralen Antitumortherapeutika drastisch beeinflussen kann. Eine Nichteinhaltung kann zu einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit potenzieller Nebenwirkungen oder eine mangelnde Antitumorwirkung zur Folge haben. Zahlreiche orale Antitumortherapeutika zeigen erhebliche interindividuelle Schwankungen in den Plasmakonzentrationen, dennoch werden sie häufig in einer Standarddosis ohne Berücksichtigung von Patientencharakteristika verabreicht. Aufgrund von mangelnden klinischen Studien bezüglich geeigneter Zielwerte zur Bewertung der pharmakokinetischen Exposition, wie beispielsweise dem Talspiegel, ist diese Verabreichung von Normdosen derzeit klinische Routine. Eine Möglichkeit zur Verbesserung dieses wahrscheinlichen Nachteils von oraler Antitumortherapie ist Therapeutisches Drug Monitoring, welches in der klinischen Routine bei einer oralen Antitumortherapie nur in Ausnahmefällen etabliert ist. Dies liegt unter anderem daran, dass der potenzielle Nutzen eines Therapeutischen Drug Monitorings für die meisten oralen Antitumortherapeutika bislang nicht durch randomisierte, klinische Studien untersucht ist. Ein Grund hierfür ist u.a. ein Mangel an aktuell verfügbaren analytischen Multi-Methoden, welche das breite Spektrum der derzeit zugelassenen oralen Antitumortherapeutika abdecken. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer analytischen Multi-Methode für die gleichzeitige Quantifizierung einer sehr hohen Anzahl an oralen Antitumortherapeutika in Humanplasma, mit dem Ziel den analytischen Teil zukünftiger klinischer Studien hinsichtlich eines Therapeutischen Drug Monitorings bei oraler Antitumortherapie möglichst effizient gestalten zu können. Im ersten Teilprojekt dieser Dissertation konnte eine analytische Methode entwickelt werden, mit der es möglich ist, 57 orale Antitumortherapeutika in Humanplasma gleichzeitig zu quantifizieren. Die Detektion und Quantifizierung wurde mit einem Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographen (UHPLC) verbunden mit einem Orbitrap Massenspektrometer (MS) durchgeführt und benötigt 15 min für die Messung einer Probe. Ebenso wurde im Zuge dieses Projekts eine einfache und schnelle Probenaufarbeitung entwickelt. Über einen linearen Bereich von 10-200 % der minimalen Blutplasmakonzentration wurde diese Methode individuell für jedes orale Antitumortherapeutikum erfolgreich validiert und somit die Robustheit bestätigt. Es wurde gezeigt, dass die Genauigkeit und Präzision mit einem Durchschnittswert von 101,8 % und einem Variationskoeffizienten (VarK) von 1,9 % für alle Analyten gute Ergebnisse erzielt hat. Darüber hinaus wurden Kennzahlen wie der Korrelationskoeffizient ermittelt und die Stabilität der Proben in Kurz- und Langzeittests überprüft. Somit bietet diese Methode einen einfachen und robusten Weg für die Bestimmung der Exposition für eine große Vielfalt an oralen Antitumortherapeutika, wie sie an einem universitären Comprehensive Cancer Center (CCC) eingesetzt werden. Im Anschluss wurde die Anwendbarkeit dieser Methode in der klinischen Routine durch die Quantifizierung von 71 Patientenproben getestet. Es wurde in Übereinstimmung mit Daten aus der Literatur eine erhebliche interindividuelle Variabilität der Plasmakonzentrationen bestätigt. Im zweiten Teilprojekt wurde eine Weiterentwicklung der UHPLC-MS Methode des ersten Teilprojekts durchgeführt. Durch den Einsatz von maschinellem Lernen konnte sowohl das in der Methode enthaltene Analyt-Panel auf 73 orale Antitumortherapeutika und 5 aktive Metaboliten erweitert (56 aus Methode 1 und 22 neue Analyten) als auch die benötigte analytische Laufzeit für jeden Analyten verkürzt werden (von 15,79 s zu 13,78 s). Hierfür wurde ein regressionsbasiertes Skript mit Python erstellt, wodurch Retentionszeiten für alle Analyten zu unterschiedlichen analytischen Bedingungen vorhergesagt werden konnten. Dieser Vorgang bestand aus individuellen Trainings-, Evaluierungs-, Vergleichs- und Anwendungs-Schritten, welche zu einer Übereinstimmung zwischen vorhergesagten und gemessen Retentionszeiten führten. Der durchschnittliche Fehler für die Vorhersage verglichen mit den tatsächlich gemessenen Retentionszeiten betrug 1,78 % ±1,93 %. Dadurch konnte schlussendlich ein optimierter Gradient für die Separierung und Quantifizierung von insgesamt 78 Analyten mit einer Gesamtlaufzeit von 17,92 min gefunden werden. Die zugehörige Methode wurde analog zur ersten Methodenvalidierung nach FDA- und zudem nach EMA-Kriterien erfolgreich validiert. Eine zufriedenstellende Genauigkeit und Präzision von durchschnittlich 101,6 % mit einem VarK von 2,1 % wurde ebenfalls für alle Analyten ermittelt. Das Analyt-Panel der Methode des zweiten Teilprojekts enthält alle Analyten der Methode des ersten Teilprojekts, bis auf Panobinostat, da es durch veränderte chromatographische Bedingungen keine geeignete Detektion gegeben hat. Des Weiteren wurde eine Zusatzfunktion zum regressionsbasierten Skript hinzugefügt, wodurch die Anzahl der inkludierten Analyten auf individuelle klinische/wissenschaftliche Bedürfnisse angepasst werden kann. Dies wurde anhand einer Auswahl von 14 uro-onkologischen Wirkstoffen getestet, womit die Gesamtlaufzeit auf 9,29 min gesenkt werden kann. Zusammenfassend bieten diese Methoden eine effiziente Möglichkeit zur Konzentrationsbestimmung von bis zu 73 oralen Antitumortherapeutika und 5 aktiven Metaboliten in Humanplasma. Zukünftige klinische Studien, welche den Nutzen einer Konzentrationsbestimmung für ein breites Spektrum von oralen Antitumortherapeutika untersuchen möchten, können sich auf die entwickelten Methoden stützen. Ebenfalls beinhaltet die analytische Methodik die Möglichkeit, die Gesamtlaufzeit durch Fokussierung auf bekannte orale Antitumortherapeutika-Gruppen zu verkürzen und damit den Probendurchsatz zu verbessern, was eine für die orale Antitumortherapie, einzigartige Möglichkeit zur Anpassung an individuelle klinische/wissenschaftliche Bedürfnisse darstellt.