title: Fluorescent multiple chemical sensing using time-domain fluorescence lifetime imaging
Creators: name: Nagl, Stefan
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: Verzögerte Fluoreszenz , Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer , Lebensdauer , Phosphoreszenz , Bildgebendes Verfahren , Chemischer Sensor , , fluorescence lifetime imaging , chemical sensor , fullerene C70 , nanoparticles , protein microarray
subject: 540 Chemie

description: This thesis describes applications of fluorescence lifetime imaging in multiple chemical sensing approaches. Using fluorescence lifetime as an analytical parameter allows extracting more information out of probes than fluorescence intensity measurements and it is therefore attractive in order to quantitate multiple species. It leads to better data quality as fluorescence lifetime measurements are not or less affected by many sources of noise in fluorescence signals such as straylight and other scattering phenomena, background fluorescence, inhomogeneous fluorophore concentration in the sensing layer, excitation light intensity, or filter transmissions, and photobleaching. It is also superior for FRET measurements as no errors due to background excitation of the acceptor molecule are monitored when observing lifetime decrease of the donor molecule. Chapter 2 introduced a novel oxygen probe, the fullerene compound C70, which displays the unusual phenomenon of thermally activated, delayed fluorescence (TADF) with a lifetime in the ms domain. Due to the long lifetime of this process, which involves repeated cycles of this molecule between the singlet and the triplet state, it is exceptionally sensitive to oxygen. We embedded C70 into highly oxygen permeable polymeric matrices, a phenyl-substituted organosilica, and an ethyl cellulose and observed ppb (v/v) sensitivities of the delayed fluorescence lifetime in the temperature range of 0 to 120 °C. These properties make the fullerene layers superior both in terms of oxygen sensitivities and usable temperature range compared to fluorescent oxygen probes known to date. Those materials were then used in chapter 3 along with the Ruthenium-tris-phenanthroline complex in a dual sensing layer that is able to measure both temperature and trace oxygen amounts simultaneously. In order to avoid interference of oxygen to the Ru-complex it was embedded into a poly(acrylonitrile) matrix. The oxygen permeable matrix containing C70 in organosilica or ethyl cellulose can be applied on top of the temperature sensitive layer containg the Ru-complex and both analytes can be monitored in the range of 0 - 50 ppm oxygen and 0 - 120 °C. The separation of the signals was achieved by spectral as well as luminescence lifetime discrimination, as the emission of the Ru-complex was monitored between 550 and 610 nm, and in the µs domain, and the fullerene was monitored between 650 and 710 nm and in the ms domain. In chapter 4, a method that allows for discrimination of two species purely based on luminescence lifetimes without spectral separation was introduced. It is based on a dual application of the Rapid Lifetime Determination (RLD) method, that records four time gates within the emission period whereby the last two are used for measuring the analyte sensed by the longer-lived probe and this information was used to decipher the second species from the first two windows that gives a mixed signal of both analytes. By appropriate choice of the experimental conditions both sensitivity and operating range could be adjusted as desired. The scheme was demonstrated in a dual oxygen and temperature sensor using a platinum porphyrin compound as the oxygen sensitive probe and a europium chelate as the temperature probe. In chapter 5 uses of luminescent nanoparticles in multiple sensing were pointed out. Novel poly(methacrylonitrile)-based copolymer nanobeads were presented with diameters down to less than 30 nm that can be used as biological labels as demonstrated on a homogeneous FRET-based protein assay using a platinum porphyrin inside biotinylated nanoparticles as donors and the red-emitting cyanine dye Cy5 coupled to streptavidin as FRET acceptors. When stained with a palladium benzoporphyrin compound those nanoparticles can be used as red-excitable, long lifetime, high brightness probes. Poly(methacrylonitrile)-based nanospheres stained with a europium compound were found to be efficient temperature-sensitive components. Syntheses, staining, and determination of oxygen sensitivities of metalloporphyrins in polystyrene beads were shown. The spheres do also possess a carboxylic acid group that allows further manipulation. In chapter 6 fluorescence lifetime imaging with sub-ns resolution on protein microarrays was presented in a model assay. Alexa 555-stained biotinylated BSA was immobilized on various surfaces and FRET to Alexa 647-dyed streptavidin was observed in a competitive assay approach using the fluorescence lifetime decrease in the donor channel. Excitation was carried out using a ps Ar+-laser operating at 514.5 nm at 80 kHz and the temporal characteristics of the emission were recorded using an intensified CCD camera. The maximum lifetime decrease on an epoxysilane-based surface was found to be almost 90 % meaning that the method has is able to monitor minute concentration changes.
description: Diese Arbeit beschreibt Anwendungen bildgebender Fluoreszenzlebenszeitmessungen in multiplen chemischen Sensoren. Die Verwendung der Fluoreszenzlebenszeit als analytischem Parameter erlaubt, mehr Informationen aus Indikatoren zu gewinnen, als dies bei Fluoreszenzintensitätsmessungen der Fall ist. Die Fluoreszenzlebenszeitmessung wird nicht oder weniger von vielen Rauschquellen der Fluoreszenzintensitätsmessung wie Streulicht und andere Streuphänomene, Hintergrundfluoreszenz, Inhomogenitäten der Fluorophorkonzentration der Sensorschicht, der Anregungslichtintensität oder der Filterdurchlässigkeit, und Photobleaching beeinflusst. Sie ist auch bei FRET-Messungen überlegen, da Fehler aufgrund der Hintergrundanregung des Akzeptormoleküls vermieden werden wenn die Verringerung der Lebenszeit des Donormoleküls beobachtet wird. In Kapitel zwei wurde ein neuartiger Sauerstoffindikator, die Fullerenverbindung C70, die das ungewöhnliche Phänomen der thermisch aktivierten verzögerten Fluoreszenz (TADF) mit einer Lebenszeit in der ms-Domäne zeigt, vorgestellt. Wegen der langen Lebenszeit dieses Prozesses ist dieser besonders sauerstofffsensitiv. Wir haben C70 in hoch sauerstoffpermeable Matrizen gebracht, ein Phenyl-substituiertes Organosilica und eine Ethylcellulose, und ppb (v/v) Sensitivitäten der Lebenszeit der verzögerten Fluoreszenz im Temperaturbereich zwischen 0 und 120 °C beobachtet. Diese Eigenschaften heben die Fullerenschichten sowohl im Bezug auf die Sauerstoffsensitivitäten wie auch bzgl. der verwendbaren Temperaturspanne im Vergleich zu bekannten fluoreszenten Indikatoren heraus. Diese Materialien wurden dann in Kapitel drei zusammen mit Ruthenium-tris-phenanthrolin benutzt um gleichzeitig Temperatur und Spurenmengen an O2 zu messen. Um Störungen durch O2 zu vermeiden wurde der Ru-Komplex in eine Poly(acrylonitril) Matrix eingebettet. Die sauerstoffdurchlässige Matrix, die C70 in Organosilica oder Ethylcellulose enthält, kann über der temperatursensitiven Schicht, die den Ru-Komplex enthält, aufgetragen werden und beide Analyten können im Bereich zwischen 0 und 50 ppm Sauerstoff und 0 und 120 °C kontinuierlich überwacht werden. Die Trennung der Signale wurde spektral wie auch über die Lumineszenzlebenszeit vorgenommen, da die Emission des Ru-Komplexes zwischen 550 und 610 nm und in der µs Domäne aufgenommen wurde, und das Fulleren zwischen 650 und 710 nm und in der ms Domäne aufgenommen wurde. In Kapitel vier wurde eine Methode, die die Unterscheidung zweier Spezies allein aufgrund der Lumineszenzlebenszeit ohne spektrale Trennung ermöglicht, erarbeitet. Sie basiert auf einer doppelten Anwendung der Rapid Lifetime Determination (RLD) Methode. Es werden vier Zeitfenster aufgenommen, wovon die letzten beiden benutzt werden um den von dem längerlebigen Indikator erfassten Analyten zu messen, und diese Information wurde benutzt um die andere Spezies aus ersten beiden Fenstern zu quantifizieren, die ein gemischtes Signal beider Analyten geben. Das Schemata wurde vorgeführt anhand eines dualen Sauerstoff- und Temperatursensors, der ein Platinporphyrin als sauerstoffsensitiven Indikator und ein Europiumchelat als temperatursensitiven Rezeptor verwendete. In Kapitel fünf wurde die Benutzung lumineszenter Nanopartikel in multiplen sensorischen Anwendungen aufgezeigt. Neuartige Copolymer Nanobeads mit Durchmessern bis unter 30 nm wurden vorgestellt, die als biologische Label benutzt werden können, wie anhand einer homogenen FRET-basierten Proteinbestimmung gezeigt wurde, die ein Platinporphyrin innerhalb biotinylierter Nanopartikel als Donor, und den an Streptavidin gekoppelten rot-emittierenden Farbstoff Cy5 als Akzeptor benutzt. Mit einem Pd-benzoporphyrin gefärbte Nanopartikel können als langlebige, im roten anregbare Indikatoren hoher Helligkeit verwendet werden. Mit einer Europiumverbindung gefärbte Poly(methacrylonitril) Nanopartikel können effiziente temperatursensitive Materialien sein. Synthesen, Färbeschritte und die Bestimmung der Sauerstoffsensitivitäten von Metalloporphyrinen in Polystyrol-Beads wurden außerdem gezeigt. Diese Nanokugeln besitzen auch eine Carboxylsäuregruppe, die weitere Oberflächenmanipulationen ermöglicht. In Kapitel sechs wurden bildgebende Floureszenzlebenszeitmessungen mit sub-ns Auflösung auf Protein Mikroarrays vorgestellt. Mit Alexa 555 gefärbtes biotinyliertes Rinderserumalbumin wurde auf verschiedenen Oberflächen immobilisiert und FRET zu mit Alexa 647 gefärbtem Streptavidin wurde in einer kompetitiven Bestimmung, die den Fluoreszenzlebenszeitabfall im Donorkanal benutzt, gemessen. Die Anregung wurde mit einem ps Ar+-Laser, der bei 514.5 nm und 80 MHz arbeitet, durchgeführt, und die temporalen Charakteristiken der Emission wurden mit einer intensivierten CCD Kamera aufgenommen. Die maximale Lebenszeitabnahme auf einer Epoxysilan-basierten Oberfläche war fast 90 % was bedeutet, dass die Methode in der Lage ist, sehr genau Konzentrationsunterschiede zu überwachen.