title: Einfluss von Wirtsfaktoren auf die Nipahvirus-Infektion humaner und porciner Bronchial-Epithelzellen
title: Influence of host factors on Nipahvirus infection of human and porcine bronchial epithelial cells
Creators: name: Sauerhering, Lucie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: Nipahvirus
Ephrine
Viren
Epithelzelle
Infektion
nipahvirus
ephrin
Life sciences
BSL4

description: Summary Nipah virus (NiV) is a
      biosafety level 4 (BSL-4) classified paramyxovirus that is
      highly pathogenic for humans, pigs and other mammals. During
      the first outbreak in Malaysia, pigs developed a prominent
      bronchial infection with harsh cough and virus transmission
      via airway secretions was frequent. In contrast, human
      infections were generally characterised by severe
      encephalitis without major involvement of the respiratory
      tract. In this study we wanted to analyse the molecular basis
      of the differences in NiV replication in respiratory
      epithelial cells of pigs and humans. To study the
      NiV-infection of the respiratory tract of humans and pigs, we
      isolated primary bronchial epithelial cells (PBEpC) from pig
      lungs and used commercially available human bronchial
      epithelial cells (HBEpC). Infection studies of PBEpC and
      HBEpC showed that both cell types are infectable with NiV.
      However, human cells were more permissive to NiV infection.
      Furthermore, NiV is able to upregulate its own receptor
      (Ephrin B2) in infected cells which can facilitate the virus
      spread. Since it is known that there are 100 % amino acid
      identity between pig and human NiV isolates (AbuBakar, 2003),
      it can be hypothesized that host factors are responsible for
      the differences in airway infections. To analyse this, we
      studied different host factors which are important during the
      replication cycle of NiV. First the proteolytic activation of
      the fusionprotein was analysed. This is an important
      prerequisite for fusion of the viral membran with the host
      membran and thus, for entering of the target cell. It is
      known that the two proteases cathepsin L and/or cathepsin B
      are nessessary for activation of the fusionprotein (Pager et
      al., 2006 und Diederich et al., 2012). In the first part
      analysis of protease activity inhibitor studies lead to the
      result that cathepsin B is the predominant host cell protease
      in both, porcine and human bronchial epithelial cells.
      Another important host factor is the expression of the viral
      receptor (ephrin B2 and ephrin B3) which is essential for
      viral entry and spread of infection by cell-to-cell fusion
      (synyctia formation). So in the second part we compare ephrin
      B2 and ephrin B3-mRNA-levels in PBEpC and HBEpC. Both,
      porcine and human bronchial epithelial cells express
      ephrinB2. Interestingly, ephrin-B3 is only expressed in human
      cells. It is not only the additional ephrin-B3 expression
      that distinguishes the two cell types. Quantitative
      real-time-PCR analysis furthermore showed that HBEpC express
      much higher levels of ephrin-B2 than the porcine cells.
      Additional expression of human ephrinB2 causes a more
      efficient cell-cell-fusion in PBEpC and more NiV-N-mRNA is
      found in the supernatant of infected cells. So far, the data
      suggest that the receptor expression (more ephrinB2 and
      additional ephrinB3) supports a more efficient NiV
      replication in respiratory epithelial cells in the human
      lung, compared to replication in the airways of pigs. In 30 %
      of infected humans some respiratory clinical signs were
      found. So in the third part of this PhD thesis we compare the
      ephrin B2-level of different human donors to find out the
      variability of ephrin B2 expression in different individuals.
      We found that ephrin B2-levels differ in HBEpC of different
      donors and that less ephrin B2 leads to a slower
      NiV-infection. So the ephrin B2 levels are essential for an
      efficient NiV infection and may explain the different
      clinical outcomes in human infections.
description: Zusammenfassung Das hochpathogene,
      BSL-4 klassifizierte Nipahvirus (NiV) ist in der Lage,
      unterschiedliche Säugerspezies zu infizieren, darunter auch
      das Schwein und den Menschen. In Schweinen kommt es nach der
      NiV-Infektion zur Ausbildung einer akuten, respiratorischen
      Erkrankung und das Virus kann über Aerosole auf andere
      Säugerspezies übertragen werden. Beim Menschen kommt es nur
      selten zu respiratorischen Symptomen. Das klinische Merkmal
      einer NiV-Infektion im Menschen ist vornehmlich eine schwere,
      fiebrige Enzephalitis und die Mortalitätsrate ist im
      Unterschied zum Schwein sehr hoch. In dieser Promotionsarbeit
      wurden vergleichenden Untersuchungen zur NiV-Vermehrung und
      -Ausbreitung in primären, respiratorischen Epithelzellen von
      Schweinen und Menschen durchgeführt, um den molekularen
      Mechanismus des unterschiedlichen klinischen Krankheitsbildes
      aufzuklären. Für die Analysen im Respirationstrakt des
      Schweines wurden bronchiale Epithelzellen aus Schweinelungen
      (PBEpC) isoliert und charakterisiert. Für
      Vergleichsuntersuchungen im humanen Atemwegsepithel wurden
      kommerziell erhältliche primäre humane
      Bronchial-Epithelzellen (HBEpC) verwendet. Es wurden
      vergleichende Infektionsstudien durchgeführt, die den
      Eintritt und auch die Freisetzung der Viren aus
      respiratorischen Epithelzellen näher charakterisieren
      sollten. Es zeigte sich bei diesen Untersuchungen, dass
      humane Bronchial-Epithelzellen besser und schneller
      infizierbar waren als porcine Bronchial-Epithelzellen.
      Weiterhin konnte gefunden werden, das die NiV-Infektion zu
      einer Erhöhung des viralen Rezeptors (Ephrin B2) führt, was
      sich begünstigend auf den weiterer Verlauf der Infektion
      auswirken könnte. Das unterschiedliche Krankheitsbild kann
      nicht auf Adaptation der Viren beim Übergang vom Schwein auf
      den Menschen zurückgeführt werden, da die NiV-Isolate, welche
      von infizierten Schweinen und Menschen isoliert wurden, in
      ihrer Sequenz identisch sind (AbuBakar, 2003). Deshalb wurden
      im zweiten Teil dieser Arbeit verschiedene Wirtsfaktoren
      untersucht, welche für eine effiziente NiV-Vermehrung und
      -Ausbreitung notwendig sind. Zunächst wurde untersucht,
      welche Wirtsprotease das Fusionsprotein proteolytisch
      aktiviert, was eine wichtige Voraussetzung darstellt, damit
      die virale Membran mit der Wirtszellmembran fusionieren kann
      und NiV in die Zielzelle gelangt. Zwei Proteasen können für
      die Prozessierung des Fusionsproteins verantwortlich sein,
      Cathepsin L und/oder Cathepsin B (Pager et al., 2006 und
      Diederich et al., 2012). Untersuchungen zur Aktivität der
      Proteasen in den Bronchial-Epithelzellen und Inhibitorstudien
      verdeutlichten, dass Cathepsin B bei humanen und porcinen
      Bronchial-Epithelzellen für die Aktivierung des
      NiV-Fusionsproteins verantwortlich ist. Als zweiten wichtigen
      Wirtsfaktor wurde die Expression des viralen Rezeptors
      (Ephrin B2 und Ephrin B3) untersucht, welche unerlässlich für
      den Eintritt der Viren und für die Formation von mehrkernigen
      Riesenzellen (Synzytien) ist. Es zeigte sich, dass im
      Unterschied zu den porcinen Zellen, die humanen
      Bronchial-Epithelzellen mehr Ephrin B2- und zusätzlich noch
      Ephrin B3-mRNA besitzen. Wurde humanes Ephrin B2 in den
      porcinen Zellen überexprimiert, so resultierte dies in einer
      Erhöhung der Synzytien-Anzahl und mehr NiV-N-mRNA konnte im
      Überstand von infizierten porcinen Bronchial-Epithelzellen
      nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass eine
      höhere Rezeptorexpression die NiV-Infektion begünstigt. In
      nur 30 % der Patienten kam es zu einer respiratorischen
      Symptomatik, deshalb wurde im dritten Teil der Arbeit
      untersucht, wie variabel die Ephrin B2-Expression in
      unterschiedlichen humanen Spendern ist. Dabei zeigte sich,
      dass sich die Ephrin B2-Level in verschiedenen humanen
      Bronchial-Epithelzellen unterscheidet und dass in humanen
      Bronchial-Epithelzellen, welche weniger Ephrin B2 exprimieren
      auch eine schlechtere NiV-Infektion zu sehen ist.
      Zusammenfassend lässt sich somit sagen, dass die Ephrin
      B2-Level maßgeblich für eine effiziente NiV-Infektion
      verantwortlich sind.