Μελέτη της Δράσης Αντικαρκινικών Ουσιών επί της Βιοενεργητικής Καρκινικών Κυττάρων
Creators: name: Λύτα, Αρετή Αγγελάκη
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2020
Subjects: Ορθοκολικός καρκίνος
Ιματινίβη
Διχλωροξικό οξύ
Colorectal cancer
Imatinib (IM)
Dichloroacetate acid (DCA)

description: Ο καρκίνος είναι μια πολυπαραγοντική ασθένεια και αποτελεί τη δεύτερη κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως. Ανάμεσα στους παράγοντες που συμβάλλουν στην εμφάνιση του καρκίνου είναι και οι μεταλλάξεις που μπορούν να συμβούν σε διάφορα πρωτο-ογκογονίδια, όπως RAS, MYC και Abl ή ογκοκατασταλτικά γονίδια όπως BRCA1, BRCA2, PTEN και TP53. Σύμφωνα με τους ερευνητές Hanahan και Weinberg, τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων μπορούν να ταξινομηθούν σε δέκα ορόσημα, ένα από τα οποία είναι και ο επαναπρογραμματισμός του μεταβολισμού της ενέργειας (Hanahan and Weinberg 2011). Πριν από σχεδόν έναν αιώνα, ο Otto Warburg παρατήρησε ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να στηρίζονται στη γλυκόλυση ακόμη και αν υπάρχει επαρκές οξυγόνο για να υποστηρίξει την οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS). Αυτή η παρατήρηση ονομάστηκε ‘’Φαινόμενο Warburg’’ και είναι η κύρια κατάσταση που υιοθετούν τα καρκινικά κύτταρα προκειμένου και να παράγουν επαρκείς ποσότητες ATP, αλλά και γιατί μέσω της γλυκόλυσης τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν πρόσβαση και στην οδό των φωσφορικών πεντοζών και στη σύνθεση νουκλεοτιδίων και λιπιδίων, δημιουργώντας έτσι μεγάλες ποσότητες βιομορίων για να ανταπεξέλθουν στους υψηλούς ρυθμούς πολλαπλασιασμού (DeBerardinis and Chandel 2020). Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν επίσης να καταστρατηγήσουν αρκετά σηματοδοτικά μόρια, ενισχύοντας έτσι τις ενεργειακές τους απαιτήσεις. Αυτά τα μόρια μπορεί να εμπλέκονται σε σήματα υποξίας ή οξειδοαναγωγής όπως η HO-1, SCF και HIF-1α. Επίσης, ο HIF-1α ενεργοποιεί ένζυμα της γλυκόλυσης, όπως GAPDH, PKM και LDHA. Σημαντικό ρόλο στο φαινόμενο Warburg παίζει το γονίδιο TP53, το οποίο ανευρίσκεται μεταλλαγμένο στο ~60% των περιπτώσεων του καρκίνου. Η p53 πρωτεΐνη παίζει καθοριστικό ρόλο στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων, ενεργοποιώντας την πρωτεΐνη Sco2 και ρυθμίζοντας έτσι τη συναρμολόγηση του τέταρτου συμπλόκου (οξειδάση του κυτοχρώματος c, COX) της OXPHOS (Lin et al. 2020a). Επίσης έχει βρεθεί ότι η p53 πρωτεΐνη καταστέλλει την πρόσληψη γλυκόζης, αναστέλλοντας την οδό ΙΚΚ/NF-κB, μόριο-κλειδί στη ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων, επίσης υπεύθυνο και για την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου (Colorectal Cancer, CRC). Ο CRC είναι η τρίτη συνηθέστερη κακοήθεια που διαγιγνώσκεται παγκοσμίως και η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου που συνδέεται με τον καρκίνο παγκοσμίως και οφείλεται τουλάχιστον σε έναν καταρράκτη μεταλλάξεων που λαμβάνουν χώρα σε διάφορα γονίδια, όπως το APC, KRAS, TP53 και SMAD4. Η στόχευση του φαινομένου Warburg είναι ένα απαιτητικό πεδίο, επειδή η μεταβολική πλαστικότητα μεταξύ της γλυκόλυσης και της OXPHOS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι και το μικροπεριβάλλον του όγκου (TME) παίζει κρίσιμο ρόλο στην πρόγνωση και στην πρόοδο του καρκίνου, καθώς και στην αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας (Greten and Grivennikov 2019). Αρκετές δημοσιεύσεις υποδεικνύουν ότι η συγχορήγηση ‘’έξυπνων’’ φαρμάκων, όπως η μετφορμίνη, ένας αναστολέας της OXPHOS και ρυθμιστών της γλυκόλυσης [όπως το DCA (Dichloroacetate)] μπορούν να δράσουν συνεργιστικά και να καταστείλουν την ανάπτυξη του όγκου, διαταράσσοντας τη μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα και μειώνοντας τη σύνθεση ΑΤΡ σε ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (Chronic Lymphocytic Leukemia, CLL) (Voltan et al. 2016). Συγκεκριμένα, στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, για τη στόχευση των μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν το φαινόμενο Warburg στον CRC χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές HCT116 +/+p53 και HCT116 -/-p53, στις οποίες εξετάζεται η επίδραση δύο ενώσεων, της Ιματινίβης (IM) και του διχλωροξικού οξέος (DCA). Σημειώνεται ότι η κυτταρική σειρά HCT116 -/-p53 προκύπτει από την κυτταρική σειρά HCT116, ύστερα από εξάλειψη του εξωνίου 2, στο οποίο βρίσκεται η περιοχή “trans-ενεργοποίησης” που είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης p53 με τις πρωτεΐνες-στόχους της. Η Ιματινίβη [σύμφωνα με προηγούμενες δημοσιευμένες μελέτες του εργαστηρίου Φαρμακολογίας (Papadopoulou et al. 2014)] φαίνεται ότι παρεμβαίνει στη λειτουργία των μιτοχονδρίων (μειώνοντας τη δραστικότητα της οξειδάσης του κυτοχρώματος c αλλά και την έκφραση γονιδίων, που εμπλέκονται στη βιοσύνθεσή της) σε κυτταρικές σειρές Bcr-Abl(+), ενώ το DCA αποτελεί γνωστό αναστολέα της γλυκόλυσης. Έχοντας υπόψιν τις νέες φαρμακευτικές συνδυαστικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται για τη στόχευση του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων, στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή, διερευνάται: α) η βιωσιμότητα των HCT116 +/+p53 και HCT116 -/-p53 κυττάρων παρουσία της ΙΜ, του DCA αλλά και του συνδυασμού των δυο ουσιών IM/DCA, β) ο μοριακός μηχανισμός δράσης της ΙΜ, του DCA και του συνδυασμού των δύο ουσιών IM/DCA στην κυτταρική σειρά HCT116, μέσω μελέτης της έκφρασης πρωτεϊνών που σχετίζονται με τα μονοπάτια της γλυκόλυσης (p53, GAPDH, PKM2, LDHA), της OXPHOS [Sco2, Frataxin (FXN), που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση του συμπλόκου IV της OxPHOS] αλλά και μορίων που συμμετέχουν στην υποξία (SCF) και την οξειδοαναγωγή (HO-1, NF-κB) και γ) κατά πόσο η παρουσία ή η απουσία της πλήρους μήκους πρωτεΐνης p53 διαφοροποιεί την απόκριση των HCT116 +/+p53 και HCT116 -/-p53 κυττάρων, παρουσία της IM και του DCA. Σύμφωνα με τα πειραματικά δεδομένα αποδεικνύεται ότι: α) 2 μΜ ΙΜ αναστέλλουν τα μόρια που συμμετέχουν στη γλυκόλυση, στην OXPHOS, στην υποξία και στην οξειδοαναγωγή και στις δυο κυτταρικές σειρές HCT116, με εξαίρεση την πρωτεΐνη PKM2, όπου στα HCT116 +/+p53 παρατηρείται αύξηση. β) 4 mM DCA αυξάνουν τα μόρια που συμμετέχουν στην OXPHOS και στην οξειδοαναγωγή. Επίσης οδηγεί σε αύξηση της πρωτεΐνης p53, αλλά και την PKM2 που συμμετέχει στη γλυκόλυση. Παράλληλα το DCA αποδείχθηκε ότι μειώνει κύρια ένζυμα της γλυκόλυσης, όπως η GAPDH και η LDHA, αλλά και την πρωτεΐνη SCF. γ) η απουσία της πλήρους μεγέθους πρωτεΐνης p53 φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην απόκριση των HCT116 -/-p53 κυττάρων ως προς τη δράση της IM, του DCA αλλά και του συνδυασμού των δύο ουσιών, IM/DCA, μέσω των πρωτεϊνών Sco2, Fxn, GAPDH, PKM2, LDHA SCF, NF-κB και HO-1. και δ) Θα μπορούσε να μελετηθεί περαιτέρω η συγχορήγηση της IM (αναστολέας πρωτεϊνικών κινασών) με το DCA (αναστολέας γλυκόλυσης) ως μία εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση του ορθοκολικού καρκίνου.
description: Cancer is a multifactorial disease and the second leading cause of death worldwide. Among the factors that contribute to the appearance of cancer are mutations that can occur in various proto-oncogenes, such as RAS, MYC and Abl or tumor suppressor genes, like BRCA1, BRCA2, PTEN and TP53. According to researchers Hanahan and Weinberg, the characteristics of cancer cells can be classified into ten Hallmarks, one of them being the deregulation of cellular energetics (Hanahan and Weinberg 2011). Almost a century ago, Otto Warburg observed that cancer cells can utilize glycolysis even if there is adequate oxygen to support oxidative phosphorylation (OXPHOS). This observation named ‘’The Warburg effect’’ and is the main situation that cancer cells adopt in order to produce enough amounts of ATP, plus the fact that glycolysis can branch cancer cells into pentose phosphate pathway and nucleotide, amino acid and lipid synthesis, thus building large amounts of biomolecules to cope with their high proliferation rates (DeBerardinis and Chandel 2020). Cancer cells also outwit several signaling molecules, thus boosting their energy demands. These molecules may be involved in hypoxic-redox signaling, such as HO-1, SCF and HIF-1α. Moreover, HIF-1α activates glycolysis enzymes as GAPDH, PKM and LDHA. The TP53 gene plays a crucial role in the establishment of the Warburg effect as it is mutated in ~60% of cancer cases. p53 plays a key role in the electron transport chain, by transactivating Sco2 protein and thus regulating the assembly of complex IV of OXPHOS (COX) (Lin et al. 2020a). p53 also suppresses glucose uptake by inhibiting the IKK/NF-κB pathway. This key molecule, besides regulating cell metabolism, is also responsible for the development of Colorectal Cancer (CRC). CRC is the third most common malignancy diagnosed worldwide and the fourth leading cause of death associated with cancer worldwide and depends on mutations that occur in various genes, such as APC, KRAS, TP53 and SMAD4. Targeting the Warburg effect is a challenging field, because metabolic plasticity between glycolysis and OXPHOS can be utilized for cancer cells’s survival. Recently, it has been found that the tumor microenvironment (TME) plays a critical role in prognosis and progression of cancer, as well as chemotherapy efficiency (Greten and Grivennikov 2019). Several publications demonstrate that co-administration of "smart" drugs, such as Metformin, an inhibitor of OXPHOS and modulators of glycolysis [such as DCA (Dichloroacetate)] can act synergistically and suppress tumor growth by disrupting mitochondrial respiratory chain and decreasing ATP synthesis in patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) (Voltan et al. 2016). Specifically, in this master's thesis, in order to target the molecular mechanisms that regulate the Warburg effect in CRC, we used HCT116 +/+p53 and HCT116 -/-p53 cell lines, in which we examined the effect of two compounds, Imatinib (IM) and DCA. Note that the HCT116 -/-p53 cell line results from HCT116 cell line after deletion of exon 2, in which the trans-activation domain is located, and is responsible for the interaction of p53 protein with other proteins. Imatinib [according to previous published studies of our lab (Papadopoulou et al. 2014)] appears to interfere with mitochondrial function (by reducing cytochrome c oxidase activity and the expression of genes involved in its biosynthesis) in Bcr-Abl(+) cell lines, whereas DCA is a known inhibitor of glycolysis. Considering the new pharmaceutical approaches used to target cancer cell metabolism in this master's thesis, it was investigated: a) the viability of HCT116 +/+p53 and HCT116 -/-p53 cells in the presence of IM, DCA and the combination of the two compounds (IM/DCA), b) the mechanism of action of IM, DCA and the combination of the two compounds (IM/DCA) in these cell lines, through the study of protein levels’ expression associated with glycolysis (p53, GAPDH, PKM2, LDHA), OXPHOS [Sco2, Frataxin (FXN), which are involved in biosynthesis of complex IV of OxPHOS] and molecules involved in hypoxia (SCF) and redox (HO-1, NF-κB), and c) whether the presence or absence of the full length p53 protein differentiates the response of HCT116 +/+p53 and HCT116 -/-p53 cells in presence of IM and DCA. According to the experimental data that were obtained: a) 2 μM IM inhibits molecules involved in glycolysis, OXPHOS, hypoxia and redox in HCT116 cell lines, except for PKM2 protein, which is increased in HCT116 +/+p53, b) 4 mM DCA increases molecules involved in OXPHOS and redox. It also increases p53 protein and PKM2 involved in glycolysis. At the same time, DCA has been shown to reduce major glycolysis enzymes, such as GAPDH and LDHA as well as SCF protein, c) the absence of full length p53 protein appears to play an important role in the response of HCT116 cells to the action of IM, DCA and the combination of the two compounds (IM/DCA) in the following proteins: Sco2, Fxn, GAPDH, PKM2, LDHA, SCF, NF-κB and HO-1 and d) co-administration of IM (protein kinase inhibitor) with DCA (glycolysis inhibitor) could be further studied as an alternative treatment approach of CRC.