title: Decipering the subunit interaction in the crenarchaeal archaellum
title: Dechiffrierung von Wechselwirkungen der Untereinheiten des Archaellum von Crenarchaeota
Creators: name: Neiner, Tomasz Paweł
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: crenarchaeal archaellum
Crenarchaeota
Life sciences
Archaellum

description: Die archaeale
      Fortbewegungstruktur, das Archaellum ist ein faszinierendes
      Hybrid, welches die Funktion einer bakteriellen Flagelle aber
      die Architektur eines Type IV Pilus (T4P) in sich vereint.
      Aufgrund seiner rotierenden Eigenschaft ist dieser T4P ein
      erstaunliches Beispiel der evolutionären Anpassung und stellt
      eine neue bisher unbekannte Art sich zu bewegen dar. Trotz
      dem Wissen über die Beweglichkeit einzelner Archaeen von über
      20 Jahren, konnte durch das Fehlen genetischer Methoden in
      Archaeen die genaue Struktur dieser Fortbewegungseinheit
      sowie die zugehörigen Gene nicht identifiziert werden.. Alle
      bisher durchgeführten Studien zur physiologischen und
      genetischen Analyse des Archaellums sind auf wenigen
      Euryarchaeota Arten beschränkt. In dieser Studie präsentieren
      wir eine detaillierte, systematische sowie strukturelle
      Analyse des crenarchaealen Archaellums aus dem
      thermoacidophilen Sulfolobus acidocaldarius. Das Archaellum
      von S. acidocaldarius besteht aus nur sieben elementaren
      Untereinheiten und repräsentiert damit das minimalistischste
      der bekannten Archaella Systeme. Deletionsanalysen ergaben,
      dass alle der sieben fla-Gene essentiell für die
      ordnungsgemäße Assemblierung des Archaellums sind. Ferner
      waren alle diese fla-Mutanten unbeweglich, wodurch die
      Funktion der Fla- Proteine für die Motilität bewiesen wurde.
      Darüber hinaus konnte mit Immunoblot Analyse gezeigt werden,
      dass die Biosynthese des Archaellum unter
      nährstofflimitierten Bedingungen induziert wird. Obwohl sich
      alle sieben fla-Gene hintereinander in einem genomischen
      Locus befinden, konnte gezeigt werden, dass zwei
      verschiedenen Transkriptionseinheiten exprimiert werden. So
      werden das Archaellin FlaB und die restlichen Komponenten
      FlaBXHGFHIJ separat synthetisiert. Der Schwerpunkt dieser
      Arbeit fokussierte sich auf die strukturelle Analyse des
      Archaellums von S. acidocaldarius. So wurden detaillierte
      biochemische und strukturelle Charakterisierungen der beiden
      cytoplasmatischen Komponenten des Archaellums, die RecA
      Proteine FlaH und der ATPase FlaI durchgeführt. Durch die
      Aufklärung des Interaktionsnetzwerks von FlaH, FlaXund FlaI,
      konnten wir diese Proteine als strukturelle Komponenten des
      basalen Körper zusammen mit FlaJ identifizieren. Aufgrund
      dieser biochemischen Analysen konnte ein Model der Archaellum
      Assemblierung entwickelt werden, in dem das
      Transmembranprotein FlaJ als Montageplattform dient, welches
      die ATPase FlaI zur Membran rekrutiert. Dieser FlaI/FalJ
      Komplex wird von FlaX in Form einer riesigen Ringstrukturen
      umgeben, welche direkt mit FlaI interagiert. Aufgrund von
      Affinitätsstudien von FlaH mit FlaX und FlaI konnte die
      Bindung zu den beiden Strukturproteinen nachgewiesen werden..
      Aufgereinigte ATPase FlaI konnte erfolgreich kristallisiert
      werden, wodurch seine hexamere Struktur mit einer Auflösung
      von 2,0 Å aufgeklärt werden konnte. Die Hexamere von FlaI
      bilden eine kronenartige Struktur, dessen Untereinheiten sich
      in drei verschiedenen Konformationen befinden können und in
      einer seltenen Queruntereinheit Interactions Weise
      zusammengebaut sind. Durch Deletionsstudien konnte weiter
      gezeigt werden, dass FlaI die erzeugte Energie sowohl für die
      Assemblierung des Archaellums so wie auch für dessen Rotation
      bereitstellt. Durch die Deletion der ersten 29 Aminosäuren
      des N-Terminus von FlaI konnte das Filament noch
      zusammengebaut, allerdings nicht mehr rotiert werden. In vivo
      und in vitro Analyse von FlaH zeigten, dass FlaH ein gut
      konserviertes Walker A allerdings nur ein unvollständiges
      Walker-B-Motiv hat, beide Motive sind wichtig für die
      ATP-Bindung und Hydrolyse. Da keine ATPase-Aktivität
      festgestellt werden konnte, wurde FlaH als ein ATP-bindendes
      Protein gekennzeichnet Die Kristallstruktur von FlaH konnte
      mit 2,3 Å auflöst werden. Diese Kristallstruktur enthielt ein
      gebundenes ATP-Molekül, wodurch zusätzlich bestätigt wurde,
      dass FlaH ATP nicht hydrolysieren kann. Strukturelle
      Ähnlichkeiten mit der CII-Domäne von KaiC suggerierten, dass
      FlaH ein Phosphorylierung abhängiger Regulator für die
      Assemblierung und Funktion des Archaellums sein kann. Dieser
      Verdacht wird weiter durch die Auto-Phosphorylierungs
      Aktivität von FlaH verstärkt. Zusammenfassend, geben die in
      dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse neue Einblicke in die
      genomische Organisation und einzigartige molekulare
      Architektur des Archaellums von S. acidocaldarius. Außerdem
      konnten durch die hier dargestellte Strukturanalysen,
      Unterschiede zwischen den Motorproteinen des Archaellums und
      des bakteriellen Flagellums, aufgezeigt werden.
description: The archaeal motility structure,
      the archaellum is an intriguing hybrid of the function and
      architecture of two distinct motility organelles, the
      bacterial flagellum and the T4P, respectively. This rotating
      T4P is an astonishing example of evolutionary adaptation and
      represents indeed a unique, third way to move. This microbial
      structure was however for long time ignored and while many
      bacterial structures have been already well characterized,
      the knowledge about the archaellum remains still scare. The
      so far performed studies were restricted to motility in
      Euryarchaeota and included physiological and genetic analyses
      of few species. Here we present a detailed systematic and
      structural analysis of the crenarchaeal archaellum using the
      thermoacidophile Sulfolobus acidocaldarius as model organism.
      S. acidocaldarius has the most minimalistic known archaellum
      system, composed of only seven Fla proteins. In-frame
      deletion strain analysis revealed all seven fla genes to be
      essential for proper archaellum assembly. All these mutants
      were non-motile, conclusively linking the archaellum of
      Crenarchaeota with their swimming motility. Moreover, using
      immunoblot analysis we found the archaella biosynthesis to be
      induced under nutrient depleting conditions. We could also
      demonstrate that despite that all the seven fla genes are
      clustered in one genomic locus, they are expressed in two
      different transcriptional units. Thus the archaellin FlaB and
      the remaining structural components FlaXHGFHIJ encoding genes
      are expressed separately. The main focus of this work was
      however the structural aspect of the S. acidocaldarius
      archaellum. Thus we are presenting here a detailed
      biochemical and structural characterization of the two
      cytosolic components of the archaellum: the RecA family
      protein FlaH and the ATPase FlaI. By elucidating the
      interaction network of FlaH and FlaI within the archaellum,
      we could place them together with FlaX and FlaJ as structural
      components of the basal body The ATPase FlaI was successfully
      crystallized in hexameric form and we could solve this
      structure at 2.0 Å resolution. FlaI hexamer forms a
      crown-like structure with subunits at three different
      conformational states, assembled together in a rare
      cross-subunit interacting fashion. Further analysis revealed
      also that the enzymatic activity and system specificity of
      FlaI are structurally separated, since the ATPase is
      restricted to the C-terminal domain, while the functional
      part is represented by the N-terminal domain. We demonstrated
      moreover that FlaI has a dual role and is involved in
      generating the energy necessary for both, the archaellum
      assembly and its rotation. The functions of FlaI could be
      uncoupled by deleting the first 29 amino acids of the
      N-terminus, resulting in archaellated, but not motile
      phenotype. FlaH was characterized as an ATP-binding protein,
      since no ATPase activity could be detected. It has a well
      conserved Walker A, but an incomplete Walker B motif and as
      we could show with in vivo and in vitro analysis both motifs
      are important for ATP binding and also were essential for
      archaella assembly and motility. The structure of FlaH was
      solved at 2.3 Å resolution, revealing the presence of a bound
      ATP molecule, supporting the hypothesis that FlaH does not
      hydrolyze ATP. Structural similarities to the CII domain of
      KaiC and a proved auto-phosphorylation activity, suggest that
      FlaH plays a regulatory role and controls the archaellum
      assembly/function in a phosphorylation dependent manner.
      Taking together, all the presented here data provide insights
      into the role of the archaellum of S. acidocaldarius, its
      genomic organization and unique molecular architecture.
      Furthermore our structural analysis revealed differences
      between the motor proteins within the archaellum and the
      related bacterial systems, elucidating the phenomenon of the
      rotating type IV pilus. However, many questions regarding the
      archaellum remain still open and present a challenge for
      further motility studies in Archaea.