Σχεδιασμός και σύνθεση πεπτιδίων με πιθανή αντιθρομβωτική δράση
Creators: name: Πατσιαλάς, Κωνσταντίνος Ε.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Συνθετικά πεπτίδια
Αντιθρομβωτική δράση
Παράγοντας VIII
Εγκλεισμός σε πολυμερή
Synthetic peotides
Anticoagulant activity
Factor VIII
Encapsulation

description: Αντικείμενο μελέτης της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο σχεδιασμός και σύνθεση πεπτιδίων με πιθανή αντιθρομβωτική δράση. Επιλέχθηκε η σύνθεση αναλόγων πεπτιδίων της περιοχής του FVIIIa που έχει προσδιοριστεί ως περιοχή αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα IXa με σκοπό τη διερεύνηση της δράσης τους ως ανασταλτικά της θρόμβωσης. Η επιλογή των αναλόγων πεπτιδίων που συντέθηκαν έγινε με σκοπό τη διερεύνηση της επίδρασης παραγόντων που επηρεάζουν τη διαμόρφωση του πεπτιδίου στο χώρο καθώς και της επίδρασης των πλευρικών ομάδων αμινοξέων του πεπτιδίου στη βιολογική δράση των πεπτιδίων. Οι συνθέσεις των πεπτιδίων έγιναν σε στερεή φάση, με την Fmoc/tBu μεθοδολογία προστασίας των λειτουργικών ομάδων και με τη μέθοδο των καρβοδιιμιδίων (DIC/HOBt) για τις συζεύξεις των αμινοξέων. Ο έλεγχος της πορείας και της απόδοσης των αντιδράσεων σύζευξης έγινε με τη χρησιμοποίηση του αντιδραστηρίου Kaiser, καθώς και με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Τα προϊόντα καθαρίστηκαν με RP-HPLC χρωματογραφία και ταυτοποιήθηκαν με RP-HPLC και (ESI-MS). Αρχικά πραγματοποιήθηκε σύνθεση της αλληλουχίας 1811-1818. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε αντικατάσταση του Glu1811 από Asp. Συντέθηκαν παράγωγα οξέων καθώς και παράγωγα αμιδίων σε στερεά φάση με προστατευμένη ή όχι την Ν-τελική αμινομάδα με την ακετυλομάδα. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αντικατάσταση της Tyr1815 από Ile καθώς και της Phe1816 πάλι από Ile για την διερεύνηση του ρόλου των αρωματικών αμινοξέων στη βιολογική δράση των πεπτιδίων. Συντέθηκαν παράγωγα αμιδίων σε στερεά φάση με προστατευμένη ή όχι την Ν-τελική αμινομάδα με την ακετυλομάδα. Τα βιολογικά πειράματα που διενεργήθηκαν για την αξιολόγηση των αναλόγων περιελάμβαναν μέτρηση του ενεργοποιημένου χρόνου μερικής θρομβοπλαστίνης (ΑΡΤΤ) και του χρόνου προθρομβίνης (ΡΤ), πειράματα προσδιορισμού της αναστολής της ενεργοποίησης του παράγοντα VIII και πειράματα μέτρησης της συσσωμάτωσης (συγκολλητικότητας) των αιμοπεταλίων. Η μέτρηση του (ΑΡΤΤ) χρησιμοποιείται γενικά για την εκτίμηση του ενδογενούς δρόμου πήξης και η παράταση του χρόνου από το φυσιολογικό αποτελεί ένδειξη της αναστολής του. Όλα τα ανάλογα έχουν την τάση παράτασης του χρόνου προθρομβίνης, αλλά πιο σημαντική δράση παρουσιάζει το ανάλογο Ac-Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys-NH2 (ΡΑ6) (παράταση 6,10 sec). Τα πειράματα με τον χρόνο προθρομβίνης δεν έδειξαν σημαντική παράταση του, για κανένα από τα ανάλογα, δείχνοντας ότι η δράση τους εντοπίζεται κυρίως στην αναστολή σχηματισμού του συμπλόκου της δεκάσης του ενδογενούς δρόμου, αλλά όχι της δεκάσης του εξωγενούς δρόμου. Επιπρόσθετα, ενισχύει την πιθανή δράση των αναλόγων στην αντιμετώπιση της θρομβοφιλίας χωρίς την πρόκληση αιμορραγικών προβλημάτων, αφού η αναστολή είναι εκλεκτική και δεν αφορά όλους τους μηχανισμούς της αιμόστασης. Όσον αφορά στη μέτρηση της αναστολής της ενεργοποίησης του παράγοντα VIII τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική δράση (41%) του αναλόγου ΡΑ6 εν αντιθέσει με τα υπόλοιπα που έδειξαν μια μικρή τάση αναστολής (3-13%). Η μέτρηση της αναστολής είναι χαρακτηριστική για την επίδραση των πεπτιδίων στον VIIIa και στην πιθανή συμμετοχή τους στην αναστολή της συμπλοκοποίησης του VIIIa στη δεκάση του ενδογενούς δρόμου. Τα παραπάνω αποτελέσματα συμφωνούν και με αυτά που προέκυψαν από την μέτρηση του ΑΡΤΤ. Επίσης, έγιναν πειράματα in vitro όπου μελετήθηκε η επίδραση των πεπτιδίων που συντέθηκαν στη συσσωμάτωση. Όταν χρησιμοποιήθηκε ως αγωνιστής το κολλαγόνο τα ανάλογα δεν παρουσίασαν καμία αντιαιμοπεταλιακή δράση, ενώ για την περίπτωση του ADP, αν και προκαλούν μια μικρή αναστολή της συσσώρευσης δεν χαρακτηρίζεται ως ιδιαίτερα σημαντική. Στη συνέχεια έγιναν πειράματα εγκλεισμού του αναλόγου ΡΑ6 σε σωματίδια υδροπηκτής. Το ανάλογο αυτό επιλέχθηκε καθώς παρουσίασε την πιο αξιόλογη βιολογική δράση από αυτά που εξετάστηκαν. Δοκιμάστηκε ο εγκλεισμός του αναλόγου (ΡΑ6) σε υδροπηκτή διακλαδισμένης πολυ(βινυλαλκοόλης), για την προκαταρκτική μελέτη της παρασκευής σωματιδίων κατάλληλων για χορήγηση ως φαρμακευτικών ουσιών. Η PVA επιλέχθηκε ως το πολυμερές εγκλεισμού λόγω της μη τοξικότητας της, τον γρήγορο σχηματισμό σφαιριδίων και τις ιδιότητες αυτών. Ως παράγοντες διακλάδωσης χρησιμοποιήθηκαν το βορικό οξύ και η γλουταραλδεΰδη. Υπολογίστηκε η πρόσληψη νερού από τα σφαιρίδια υδροπηκτής καθώς και η απόδοση του εγκλεισμού του PA6 στις υδροπηκτές που παρασκευάστηκαν. Στην συνέχεια έγιναν πειράματα αποδέσμευσης του πεπτιδίου από τα σφαιρίδια σε υδατικό σύστημα και υπολογίστηκαν, ο χρόνος αποδέσμευσης, και ο συντελεστής διάχυσης. Οι χρόνοι αποδέσμευσης κυμάνθηκαν μεταξύ 50 και 80 min για την περίπτωση πολυμερών με βορικό, ενώ για την περίπτωση της γλουταραλδεΰδης ήταν 120 min, που ήταν και η μεγαλύτερη τιμή που παρατηρήθηκε. Υπολογίστηκε ο συντελεστής διάχυσης που χαρακτηρίζει την κινητική της αποδέσμευσης του οκταπεπτιδίου στο νερό καθώς τα μόρια του διαχέονται μέσα από το στερεό υπόστρωμα του πολυμερούς. Βρέθηκε ότι οι τιμές κυμαίνονται σε στενό εύρος, γεγονός που δείχνει ότι το πορώδες των σφαιριδίων διαφέρει ελάχιστα για όλες τις περιπτώσεις που διερευνήθηκαν. Τα αποτελέσματα του εγκλεισμού ήταν ικανοποιητικά καθώς παρασκευάστηκαν σωματίδια ανθεκτικά και ελαστικά που εμφανίζουν συγκεκριμένη κινητική απελευθέρωσης του οκταπεπτιδίου, γεγονός που δείχνει ότι τα σφαιρίδια αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ελεγχόμενη αποδέσμευση του βιολογικά δραστικού πεπτιδίου.
description: The aim of the present study is design and synthesis of peptides with possible antithrombotic action. It has been chosen to synthesize peptide analogues of the FVIIIa region, which has been determined as the interaction region with factor IXa, in order to study their function as inhibitors of thrombosis. The selection of peptide analogues that were synthesized, was made in order to study the influence of factors that affect the conformation of the molecules as well as the effect of the side chains of the amino acids in the biological activity of the peptides. The peptides were synthesized by the solid phase technique. For the protection of the functional groups the Fmoc/tBu method was used, while the carbodiimides method was used for the coupling of amino acids. Completion of the coupling reactions was determined by the Kaiser test and thin layer chromatography (TLC). The reaction products were purified by reverse phase HPLC and identified by RP-HPLC and Electron Spray Mass Spectrometry (ESI-MS). Initially, we synthesized the sequence 1811-1818. Following, we replaced Glu1811 with Asp. There were synthesized peptide analogues with N-terminal aminο group either free or protected with acetyl-group. Then, we replaced Tyr1815 with Ile as well as Phe1816 with Ile to investigate the role of aromatic amino acids in the biologic functionality of the peptides. There were synthesized peptide amides with N-terminal aminο group either free or protected with acetyl-group. Experiments that were conducted to evaluate the biological activity of the analogues included the activated partial thromboplastin time (APTT) and the prothrombin time (PT) clotting assays, inhibition of blood coagulation factor VIII assay and platelet aggregation assay. The measurement of APTT is generally used as a screening procedure for the evaluation of the intrinsic coagulation pathway. The prolongation of it against the normal values indicates inhibition of the coagulation process. All peptides presented a tendency to prolongate of APTT, with peptide Ac-Glu-Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Trp-Lys-NH2 (ΡΑ6) presenting the most important activity (prolongation 6,10sec). Experiments concerning PT did not show any significant prolongation, providing evidence that their function is mainly localized on inhibiting the formation of the intrinsic tenase complex and not on the extrinsic tenase complex. Additionally, this fact enhances the possible functionality of the analogues in treatment of thrombophilia without causing side effects like bleeding, since the inhibition is selective and does not affect all the coagulation mechanisms. As far as the inhibition of blood coagulation factor VIII assay is concerned, the results showed significant activity (41%) of analogue PA6 opposite to the rest of the analogues that showed a low inhibition tendency (3-13%). This assay is indicative of the influence of the peptides in the FVIIIa and more specifically in the possible inhibition of the formation of the intrinsic tenase complex. This finding is in agreement with the results of the APTT measurement. Furthermore, experiments took place in vitro where the effect of the analogues on platelet aggregation was studied. When collagen was used as an agonist, the analogues did not present any antiplatelet activity, while the ADP is concerned, even though the analogues cause a small inhibition of aggregation, this does not considered important enough. Afterwards, encapsulation experiments of PA6 analogue in hydrogel took place. This analogue was chosen because it showed the most significant biological action among those that were tested. The encapsulation of PA6 in hydrogel of cross linked PVA was attempted for the preliminary study of bead production suitable for drug release. PVA was chosen as the encapsulation polymer due to its non-toxicity, fast bead formation and their attributes. As cross linking agents, boric acid and glutaraldehyde were used. The water hydrogel uptake and entrapment efficiency of PA6 in hydrogel beads were determined. Also, studies of the peptide release from the beads in water, were conducted and the release times as well as the diffusion coefficient were estimated. The release times varied between 50 and 80 min in case of boric acid polymers, while in case of glutaraldehyde the release time was 120 min, which was the highest value that was observed. The diffusion coefficient that characterizes the release kinetics of the peptide in water was determined. The conclusion was that the values vary in a narrow window, which shows that the bead porosity is slightly different in all the cases that were studied. The encapsulation results were satisfactory since durable and elastic beads were produced that show specific peptide release kinetics, which indicates that these beads can be used for controlled release of the biologically active peptide.