Proteintemplat-katalysierte Reaktionen von Peptidliganden
Creators: name: Brauckhoff, Nicolas
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2015
Subjects: subject: Templat-vermittelte Reaktionen
subject: Peptidfestphasensynthese
subject: Proteinsemisynthese
subject: Transferreaktionen
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description: Molekulare Template erlauben die Vororientierung gewünschter Reaktanten und erhöhen deren effektive Konzentration, wodurch die Bildung korrespondierender Produkte beschleunigt wird. Innerhalb der heutigen Forschung spielen Templat-unterstützte Reaktionen eine wichtige Rolle und kommen bei der Bearbeitung diverser biochemischer Fragestellungen zum Einsatz. Insbesondere handelt es sich dabei um Nukleinsäure-vermittelte Reaktionen, wohingegen enzymatisch inaktive Proteindomänen bisher kaum verwendet wurden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur selektiven Verknüpfung zweier Peptidliganden (A und B) unter Verwendung eines Proteintemplats T erstellt. Dabei binden A und B kooperativ an T und bilden einen trimären Komplex (A∙T∙B). Beide Peptide wurden N-terminal mit reaktiven Gruppen ausgestattet, die bei korrekter Orientierung eine Nachbarschafts-induzierte Umsetzung zum Verknüpfungsprodukt ermöglichen. Die untersuchten Reaktionen zeigten hohe Templat-bedingte Beschleunigungen (a &gt; 140), wobei ein Maleimid-modifiziertes Peptid (a = 6200) sämtliche bekannten Reaktionsbeschleunigungen Templat-basierter Peptidverknüpfungen übertraf (a = 81 - 1800). Aufgrund der hohen Reaktionsraten und -spezifitäten wurde das Modelsystem bereits erfolgreich zur selektiven Markierung eines Zielproteins innerhalb zellulären Lysats eingesetzt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Austauschrate der Produkte und Edukte am Templat erhöht, indem eine Transferreaktion statt einer Verknüpfung eingesetzt wurde. Mit dem Wissen um die hohe Chemoselektivität und Effizienz der nativen chemischen Ligation konnte das Modellsystem derart modifiziert werden, dass ein Templat-vermittelter Transfer einer Reportergruppe (F) von einem Donor- D auf den Akzeptorligand A möglich war. Unter Verwendung eines am Akzeptor befindlichen Fluoreszenzlöschers konnte der Transfer von F in Echtzeit verfolgt werden. Dies erlaubt eine katalytische Reaktionsführung mit bis zu 5 Umsetzungen pro Templatmolekül. Final wurde das Konzept erfolgreich zur spezifischen Markierung eines Zielproteins verwendet.
description: Molecular templates are often used for the specific pre-orientation of reactants to increase their effective concentrations and thereby accelerate the desired reaction. Today, the concept of templated reactions has already been applied to a multitude of chemical problems including self-replicating peptides and nucleic acids and the generation of DNA-based or dynamic combinatorial compound libraries. So far applications of templated reactions for a use within biological environments and the selective labeling of entire proteins are not known. In the first part of this doctoral thesis a protein-templated peptide ligation has been designed involving the selective coupling of two peptides (A and B) by the use of a protein template T. The two peptide ligands A and B cooperatively bind to T resulting in the formation of the trimeric complex A∙T∙B. Both peptides were modified with appropriate reactive groups allowing proximity-induced ligations. The reactions exhibit magnificent rate accelerations (a &gt; 140) with a maleimide-derivatized peptide (a = 6200) overtop accelerations of known ligations that use foldamers, peptides or nucleic acids as matrices (a = 81 - 1800). The protein-templated peptide ligation model shows high reaction rates and template specificity and has proven useful for the selective labeling of a protein in crude cell lysate. In the second part this dissertation product inhibition caused by the ligation reaction has been reduced by the utilization of a transfer reaction. Taking advantage of the selectivity and efficiency of the native chemical ligation a donor peptide D and an acceptor peptide A were composed. For measuring the template-mediated transfer reaction in real time, a convenient fluorescent label F has been designed which was transferred from D to a quencher molecule (Q) containing variant of A. By measuring the florescence decay caused by the transfer of F to the vicinity of Q, the protein-templated transfer system A∙T∙D generates up to five catalytic turn over. Finally the templated transfer reaction has been successfully applied for the specific labeling of a desired protein.