title: Immunohistochemical evaluation of NK cells in tumor tissue
Creators: name: Schilcher, Katharina
Publisher: name: :none
Year: 2019

description: CD47 ist ein Oberflächenprotein, welches häufig auf Tumorzellen überexprimiert ist. Es sendet ein „Friss mich nicht“-Signal an Makrophagen über eine Interaktion mit dem SIRPα Rezeptor an Makrophagen. Dies bewirkt deren Inaktivierung und verhindert die Phagozytose der Tumorzellen. Die Blockade dieser Interaktion stellt eine vielverspre-chende neue Behandlungsmethode für Tumore dar. In bisherigen Arbeiten wurde ein gen-therapeutischer Ansatz entwickelt, in Zuge dessen ein Fusionsprotein bestehend aus einer CD47-blockierenden Domäne und dem funktionellen Fc Teil von Immunglobulin G ge-zielt in Tumorzellen exprimiert wird. Nach Bindung des Fusionsproteins an die Zellober-fläche kann der Fc Teil auch zu antikörperabhängiger zellvermittelter Zytotoxizität (ADCC) durch Natural Killer (NK) Zellen führen, da der Fc Rezeptor auf NK Zellen ex-primiert wird. Diese Diplomarbeit fokussiert sich auf die histologische Auswertung eines in vivo Expe-riments, in dem triple negative Brustkrebs Xenotransplantate in der SCID Maus mit Gen-transferpartikeln behandelt wurden, die ein für das Fusionsprotein codierende Plasmid beinhalten. Das exprimierte Transgenprodukt sollte somit CD47 blockieren, die Interakti-on mit SIRPα auf Makrophagen inhibieren und über den Fc-Teil auch zum Abtöten der Tumorzellen durch ADCC führen. Zuerst wurde ein Protokoll für ein NK Zell Färbung mit zwei verschiedenen Antikörpern erstellt. Die Färbung dient zur Evaluierung der Einwanderung von NK Zellen in die Tu-more. Des Weiteren wurde ein Protokoll für die Färbung von Makrophagen entwickelt, welches nicht weiterverwendet wurde, da keine eindeutige Färbung erzielt werden konn-te. Die Tumore des in vivo Experiments wurden auf CD47, NK Zellen und Luciferase unter-sucht. Es konnte jedoch keine spezifische Färbung erreicht werden. Die möglichen Ursa-chen dafür werden in der vorliegenden Arbeit diskutiert. In mit Hämatoxylin und Eosin gefärbten Präparaten konnten jedoch die Immunzellinfiltration in Polyplex behandelten Tumoren klar gezeigt werden.
description: CD47 is a surface protein frequently overexpressed on tumor cells. It sends a “don’t eat me” signal to macrophages when interacting with the surface receptor SIRPα expressed in macrophages. This signal leads to an inactivation of the macrophages and protects the CD47-expressing tumor cells from phagocytosis. Blocking this interaction could be a promising tool in cancer therapy. In previous work, a gene therapy approach was devel-oped, which enables the tumor-restricted expression of a fusion protein consisting of a CD47 blocking domain and a functional Fc domain derived from IgG. After binding of the fusion protein to CD47, the Fc part can also lead to antibody dependent-cell-mediated cytotoxicity (ADCC) via an interaction with Fc receptors, mostly expressed on the surface of Natural Killer cells, macrophages and dendritic cells. This thesis focuses on the immunohistological evaluation of an in vivo experiment, in which triple negative breast cancer xenografts in SCID mice were treated with gene trans-fer particles containing the plasmid encoding for this fusion protein. The expressed transgene product should block CD47 and inhibit the interaction with SIRPα in macro-phages. Furthermore, the Fc part on that protein should lead to the apoptosis of the tumor cells via ADCC. First, a staining protocol for NK cells using two different antibodies was established to evaluate the infiltration of NK cells in the tumors. In the second step it was tried to estab-lish a staining protocol for macrophages, which was not used in the evaluation of the in vivo experiment since no specific staining could be achieved. The in vivo experiment was evaluated for CD47, Luciferase and NK marker expression. Albeit cellular staining was achieved, the intensity on unspecific staining was too high to draw conclusions about the expression of the antigens. Potential reasons for this are dis-cussed. Nevertheless, in tumors samples stained with Haematoxylin and Eosin, a clear immune cell infiltration would be observed in samples treated with polyplexes.