PAT and automation strategies for the process development of PEGylated proteins
Creators: name: Sanden, Adrian Simon Johannes Marius
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2020
Subjects: PEGylation
PAT
process development
downstream processing
FTIR

description: In der modernen Medizin werden vermehrt Medikamente eingesetzt die auf Molekülen mit hohem Molekulargewicht basieren die ihren Ursprung in biologischen Systemen haben. Diese biopharmazeutischen Medikamente werden unter anderem für verschiedene schwerwiegende und tödliche Erkrankungen eingesetzt. Darunter befinden sich verschiedene Formen von Krebs und chronische Erkrankungen wie Diabetes und Hämophilie die in der Regel lebenslange Medikation erfordern. Dies zeigt sich auch im Marktanteil dieser Medikamente. Acht der zehn meistverkauften Medikamente 2018 waren große biologische Moleküle wovon wiederum sechs monoklonale Antikörper (mAb) waren. Insgesamt erzielten diese zehn Medikamente einen Umsatz von mehr als 80 Milliarden USD. [1] Diese relativ großen Moleküle wie Antikörper, Gerinnungsfaktoren oder Insulin können nicht sinnvoll auf traditionelle Art chemisch synthetisiert werden. Um dieses Problem zu umgehen, werden stattdessen biologische Systeme zur Produktion verwendet, um die natürliche Synthese zu imitieren. Dazu werden gentechnisch veränderte Bakterien oder Säugerzellen in großen Fermentern produziert um die Zielprodukte zu exprimieren. Als Nebeneffekt der Produktion in komplexen biologischen Systemen wie lebenden Zellen entsteht allerdings ein sehr komplexes Profil an Verunreinigungen die im sogenannten Downstream Processing (DSP) aus der geklärten Zellkulturflüssigkeit (HCCF) entfernt werden müssen. In Kombination mit der unabhängig davon arbeitsintensiven Identifikation von Kandidatenmolekülen und langwierige klinischen Studien als Voraussetzung zur Zulassung durch die Behörden sind dadurch sehr große finanzielle Investitionen notwendig um derartige Medikamente zu erforschen, entwickeln und zu produzieren. Der DSP wird so entworfen, dass ungewünschte produktbezogene und prozessbezogene Verunreinigungen abgetrennt werden um eine konsistente Qualität, Wirksamkeit und geringe Nebenwirkungen des Produktes zu gewährleisten. Während einige potentielle Quellen für Prozessvarianz wie Temperatur, pH Wert und Pufferzusammensetzung relativ einfach zu kontrollieren sind, führt die Verwendung von lebenden Organismen in der Produktion immer zu variablen Ausgangsmaterialien im Aufreinigungsprozess. Der Aufreinigungsprozess besteht in der Regel aus einer Aneinanderreihung von Standardschritten wie Querstromfiltration (CFF), chemischen Reaktionen und Chromatographieschritten. Die Fähigkeit den Status des Prozesses zu bestimmen und den Prozess entsprechend zu steuern ist wichtig um die Variation im Ausgangsmaterial auffangen zu können. Regulierungsbehörden wie die Food and Drug Administration (FDA) und European Medicines Agency (EMA) bevorzugen solche wissensbasierten Ansätze für die Prozessentwicklung. Solche Prozesse folgen den Prinzipien von intrinsischer Produktqualität oder Quality by Design (QbD) und verwenden Prozessanalytische Technologien (PAT) um die kritischen Qualitätsattribute und kritischen Prozessparameter Critical Process Parameter (CPP) zu messen, um das Erreichen des gewünschten Produktprofils (QTPP) am Ende des Prozesses sicherzustellen. Dies trifft in besonderem Maße auf spezielle Formate von Proteinbasierten Medikamenten zu bei denen zusätzlich noch ein weiteres Molekül wie Polyethylenglykol (PEG) kovalent an das produzierte Protein gebunden wird nachdem es aufgereinigt wurde. Obwohl PEG selbst sich in biologischen Systemen relativ inert verhält kann es deutliche Vorteile haben ein therapeutisches Protein mit einem kovalent gebundenen PEG zu versehen. Der hydrodynamische Radius wird größer, die Ausscheidung durch die Niere wird verlangsamt und die Stabilität erhöht. Diese Vorteile stehen allerdings am Ende eines verkomplizierten Aufreinigungsprozesses. Nachdem das therapeutische Molekül produziert und aufgereinigt wurde wird die Konjugationsreaktion gefolgt von einer weiteren Reihe von Aufreinigungsschritten durchgeführt um das Protein mit der richtigen Anzahl konjugierter PEG Moleküle zu erhalten. Die Reaktion wird in der Regel in einem Rührkesselreaktor durchgeführt und es entstehen Proteine mit verschiedenen PEGylierungsgraden und Isoformen der jeweiligen Spezies. Die Zielsetzung dieser Arbeit war es Fourier-Transform Infrared (FTIR) Spektroskopie als Prozessanalytische Technologie (PAT) und Automatisierungsstrategien für die Prozessentwicklung von PEGylierten Proteinen zu implementieren. Um FTIR Spektroskopie als PAT Methode verwendbar zu machen wurde zunächst ein experimenteller Aufbau entwickelt um direkt am Säulenausgang einer Chromatographieanlage Spektraldaten in Beinahe-Echtzeit als in-line Messung aufzunehmen. Dazu wurde das Spektrometer mithilfe einer speziellen Durchflusszelle in den Flussweg integriert und Software entwickelt, um die Messungen automatisiert zu starten. Neben MATLAB und OPUS-Skript basierter software wurde dazu ein externes Kommunikationsgerät von National Instruments verwendet um den Informationsaustausch mit der Chromatographieanlage zu ermöglichen. Zusätzlich wurden Methoden zur Korrektur der Spektraldaten aus Ionentauschchromatographieexperimenten untersucht. Da Wasser in solchen Experimenten in großen Konzentrationen vorliegt hat das aufgeben eines Salzgradienten einen signifikanten Einfluss auf das Spektrum. Obwohl die Salzkonzentration deutlich geringer ist als die des Wassers ist sie mehrere Größenordnungen höher als die der Analyte in Lösung. Als erste Implementierung zur Hintergrundkorrektur wurden Spektraldaten eines Blindlaufs abgezogen um den Einfluss der sich ändernden Salzkonzentration auszugleichen. Der experimentelle Aufbau für die Automatisierung der Reaktionsexperimente basierte ebenfalls auf einer Chromatographieanlage. Dabei wurden der Fraktionierer und die Probenaufgabepumpe mit 3D-gedruckten Adaptern versehen um die Reaktionslösung zu zirkulieren und die automatisierte Probennahme im Mikrotitermaßstab zu ermöglichen. Nach der erfolgreichen Implementierung der FTIR Sepktroskopie als in-line Messung wurden mehrere Fallstudien durchgeführt. Die ersten beiden Studien basieren auf der Anwendung von Multivariater Datenanalyse (MVDA) in Kombination mit Spektraldaten. Lysozym und ein Monoklonaler Antikörper (mAb) wurden durch Gradientenelution auf einer Chromatographiesäule getrennt. Mithilfe der Spektraldaten und Offlineanalytik wurde ein PLS Regressionsmodell kalibriert um die Konzentration der beiden Spezies im Prozessstrom basierend auf den Spektraldaten abzuschätzen. Die zweite Fallstudie wurde nach demselben Prinzip durchgeführt. Lysozym wurde in einem Rührkesselreaktor mit PEG konjugiert und durch Ionentauschchromatographie aufgereinigt. Ebenfalls basierend auf einem PLS Regressionsmodell wurde die Konzentration der unterschiedlich PEGylierten Spezies am Säulenausgang abgeschätzt. In beiden Studien korrelierten die Modellantworten mit den Ergebnissen der Referenzanalytik und zeigten nur geringe Abweichungen. Die Grundidee hinter der ersten Fallstudie wurde schon in früheren Arbeiten umgesetzt wobei die zweite Studie speziell von FTIR profitiert, da PEG nicht UV-aktiv ist. Um die Vielseitigkeit von FTIR als PAT Methode zu zeigen wurde in einer weiteren Fallstudie die Konzentration einer Prozessbezogenen Verunreinigung in Form von Triton X-100 im Durchfluss während der Beladung einer Chromatographiesäule überwacht, indem eine lineare Regression auf die Spektraldaten angewendet wurde anstatt ein multivariates Regressionsmodell zu kalibrieren. In thematischer Fortführung der zweiten Fallstudie wurde die integrierte Festphasen-PEGylierung und Aufreinigung durch dieselbe Chromatographiesäule mit FTIR ohne die Verwendung multivariater Regressionsmethoden mithilfe der Absorptionsspektren überwacht. Das zu PEGylierende Protein wurde auf der Säule gebunden und dann im gebundenen Zustand mit dem Konjugationsreagenz in Kontakt gebracht. Der PEGylierungsgrad der eluierenden Spezies wurde dann auf Basis des Verhältnisses der Extinktionskoeffizenten des Proteins und des PEG-Reagenz abgeschätzt. Dieses Vorgehen ist erheblich weniger arbeitsintensiv als das Durchführen der Experimente um ein Regressionsmodell zu kalibrieren. Des Weiteren wurde in dieser Studie ein vielseitigerer Ansatz zur Hintergrundkorrektur basierend auf Extended Multiplicative Signal Correction (EMSC) verwendet. Im Vergleich mit der Referenzanalytik konnte gezeigt werden, dass der PEGylierungsgrad mit vergleichsweise geringem Vorwissen abgeschätzt werden konnte. Der Aufwand um die Extinktionskoeffizienten zu bestimmen war dabei deutlich niedriger, als der experimentelle Aufwand um Regressionsmodelle wie in den vorhergehenden Studien zu kalibrieren. Die PEGylierungsreaktion in Form eines Chargenprozesses wurde in einer weiteren Studie betrachtet. Die automatische Zirkulation der Prozesslösung durch das FTIR Spektrometer wurde in Kombination mit der automatisierten Probennahme in Mikrotiterplatten realisiert. Um dies zu erreichen wurde der Flusspfad einer Chromatographieanlage mit selbst entworfenen 3D-gedruckten Elementen verändert. Dabei wurde gezeigt, dass die mit verschiedenen Prozessbedingungen erzeugten Proben verwendet werden können um ein Kinetikmodell mit geringen Konfidenzintervallen zu kalibrieren. Des weiteren wurde untersucht inwieweit sich die Spektraldaten verwenden lassen um den Aktuellen Prozessfortschritt abzuschätzen.