Φαρμακολογική Ανάπτυξη Καινοτόμων Ενώσεων Καρβορανίου για τη BNCT Θεραπεία του Καρκίνου
Creators: name: Τσελίγκα, Ειρήνη Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2015
Subjects: Αντικαρκινική θεραπεία
Καινοτόμες ενώσεις καρβορανίου
Φαρμακολογική ανάπτυξη
BNCT-Boron Neutron Capture Therapy
Νovel carborane compounds
Pharmacological development

description: Η καινοτόμος αντικαρκινική θεραπεία BNCT αποτελεί μια πειραματική μορφή ακτινοθεραπείας με βιοχημική υπόσταση που χρησιμοποιείται κυρίως στη θεραπεία των γλοιωμάτων υψηλού βαθμού, όπως το πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM). Η θεραπευτική αποτελεσματικότητα της BNCT βασίζεται σε δύο καίρια σημεία: • την εκλεκτική συσσώρευση του μη ραδιενεργού ισοτόπου του βορίου, 10B • και την εξωτερική ενεργοποίησή του από μια δέσμη θερμικών νετρονίων χαμηλής ενέργειας που οδηγούν στο σχηματισμό των σωματιδίων μεταγωγής υψηλής γραμμικής ενέργειας που μετακινούνται μόνο σε αποστάσεις εφάμιλλες με τη διάμετρο του κυττάρου ιονίζοντας τα πάντα στο πέρασμά τους και καταστρέφοντας μόνο τα «φορτωμένα» με 10B κύτταρα. Σκοπό της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας αποτέλεσε η φαρμακολογική ανάπτυξη των καινοτόμων, δι-λειτουρικών ενώσεων καρβορανίου, που θα μπορούσαν δυνητικά να προσπεράσουν το σημαντικότερο μειονέκτημα της μεθόδου που δεν είναι άλλο από την έλλειψη φορέων 10Β με ικανότητα εκλεκτικής απόδοσης στα καρκινικά κύτταρα. Η μεταπτυχιακή εργασία προέκυψε μέσα από τη στενή συνεργασία των εργαστηρίων Φαρμακολογίας και Φαρμακευτικής Τεχνολογίας της Φαρμακευτικής Σχολής του ΑΠΘ, της Φαρμακευτικής Σχολής και της Σχολής των Βιοϊατρικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Portsmouth και της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Kingston της Αγγλίας. Η φαρμακολογική αξιολόγηση επικεντρώθηκε σε πέντε χιμαιρικές ενώσεις του καρβορανίου, παραγώγων των DLCs (Delocalized Lipophilic Cations). Το τμήμα του καρβορανίου αποτελεί ένα από τα πιο ελκυστικά συστήματα απόδοσης βορίου (BDS), ενώ τα λιπόφιλα χαρακτηριστικά των DLCs ευνοούν τη μεταφορά και την εκλεκτική συσσώρευση των ενώσεων εντός των καρκινικών κυττάρων. Το πρώτο μέρος των πειραμάτων περιελάμβανε in vitro μελέτες κυτταροτοξικότητας σε επιλεγμένες φυσιολογικές και καρκινικές κυτταρικές σειρές με σκοπό τον υπολογισμό των συγκεντρώσεων IC50. Οι φυσιολογικές κυτταρικές σειρές αποδείχθηκαν έως και 100 φορές λιγότερο ευαίσθητες σε σχέση με τις καρκινικές σειρές και εμφάνισαν σημαντικές μορφολογικές αλλαγές κατά την επώαση τους με δύο συγκεκριμένες ενώσεις (MRC-5 κύτταρα). Τα καρκινικά κύτταρα κατά τη διάρκεια των «wash out» πειραμάτων, παρέμειναν μη αντιστρεπτά εγκλωβισμένα στη φάση του κυτταρικού κύκλου που βρίσκονταν, ακόμη και μετά την απομάκρυνση των ενώσεων από την καλλιέργεια και την προσθήκη νέου θρεπτικού, γεγονός που έρχεται σε πλήρη αντίθεση με την απόκριση των φυσιολογικών κυττάρων κατά την προεπώασή τους. Το μοριακό προφίλ των παραπάνω εξαιρετικά σημαντικών αποτελεσμάτων μελετήθηκε μέσω της qPCR ανάλυσης με ιδιαίτερη έμφαση στα γονίδια του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Η σημαντική αύξηση της γονιδιακής έκφρασης του άξονα p53/p21 στα καρκινικά κύτταρα πρότεινε την αναστολή τους στη φάση G0/G1 του κυτταρικού κύκλου, σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Τέλος η φαρμακολογική αξιολόγηση των ενώσεων καρβορανίου στο in vitro μοντέλο που προσεγγίζει περισσότερο το GBM, επιτεύχθηκε μέσω της υποτροφίας μου-Short Term Scientific Mission στο ερευνητικό ινστιτούτο San Raffaele του Μιλάνου με τη συνεργασία της Dr. Rosella Galli. Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης IC50 των παραπάνω ενώσεων σε δύο αρχέγονες καρκινικές σειρές (EGFR-pos/neg) που απομονώθηκαν από ασθενείς με GBM και η ποιοτική και ποσοτική ανοσοκυτταροχημική ανάλυση του αντιγονικού δείκτη ki67 και της ενεργής κασπάσης-3 στα EGFRneg κύτταρα, απέδειξαν τη μεγάλη εκλεκτικότητα των ενώσεων ανάμεσα στα hCSCs, καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα και έδειξαν σε πρωτεϊνικό επίπεδο την αναστολή της κυτταρικής διαίρεσης, χωρίς να επηρεάζεται ο θάνατός τους. Συμπερασματικά, οι σημαντικές φαρμακολογικές ιδιότητες των καινοτόμων χιμαιρικών ενώσεων του καρβορανίου χρίζουν μεγαλύτερης διερεύνησης προκειμένου να εκτιμηθεί η ενδεχόμενη χορήγησή τους στην κλινική εφαρμογή της BNCT.
description: Boron Neutron Capture Therapy-BNCT, constitutes an experimental form of a biochemically rather than a physically targeted type of radiotherapy and is mostly used in the treatment of high grade gliomas, such as GBM (Glioblastoma Multiforme). BNCT therapeutic effectiveness is based on two crucial steps: • the selective accumulation of 10B, a nonradioactive chemical constituent of natural element boron • and its external activation by a beam of low energy thermal neutrons 10B activation leads to the formation of high linear energy transfer (LET) particles that spread only within a cell diameter space and ionize everything in their path by damaging only the 10B loaded cells. The present M.Sc. thesis deals with the pharmacological development of novel carborane compounds and targets to the overcoming of BNCT major drawbacks, the lack of tumor selective targeting boron agents. The project arose as a joint collaboration between the Departments of Pharmacology and Pharmaceutical Technology of the School of Pharmacy at Aristotle University of Thessaloniki, the School of Pharmacy and Biomedical Sciences at Portsmouth University and the Department of Pharmacy at Kingston University. This MSc thesis was assigned to pharmacologically evaluate five chimaeric carborane derivatives of delocalized lipophilic cations (DLCs). The carborane part constitutes a polyhedral boron cluster and represents one of the most attractive third generation Boron Delivery System (BDS), whereas the lipophilic characteristics of DLCs act as selective carriers towards cancer cells. The first part of experiments included the pharmacological assessment of the aforementioned compounds by executing in vitro studies upon exposure of selected normal and cancerous cell lines at various concentrations in order to calculate their specific IC50 values. Surprisingly, normal cells resulted to be even 100 folds less sensitive than cancer cell lines and significant morphological changes were noticed upon their exposure with two specific compounds (MRC-5). Moreover, cancer cells stayed irreversibly cell cycle arrested, even when the compounds were removed and fresh medium was added in the cell culture during the wash-out experiments, as opposed to normal cell's pretreatment. The molecular profile of these outstanding results has been portrayed through qPCR analysis where we focused on the analysis of cell cycle and apoptosis related genes. The tremendous augmentation of the expression level of p53/p21 axis in cancer cells suggested G0/G1 phase arrest, as opposed to normal cells. Finally, the pharmacological evaluation of the carborane compounds to the in vitro model that mostly resembles GBM behavior was achieved during my Short Term Scientific Mission at the San Raffaele Scientific Institute, in Milan with the collaboration of Dr. Rosella Galli. The pharmacological analysis of two human primary cancer stem cell lines (EGFR-pos/neg) that originated from GBM patients focused on the evaluation of the IC50 values and on the quantitative and qualitative evaluation of the levels of ki67 and Caspase-3 through the immunocytochemistry assay (ICC) carried out in EGFRneg cells. The results obtained showed once again the tremendous selectivity of the compounds against hCSCs, cancer and normal cells and confirmed the data carried out so far. Overall, the interesting pharmacological properties of the innovative chimaeric compounds need to be further exploited in order to elucidate their potential development as anticancer drugs within the therapeutic approach of BNCΤ in Clinical practice.