Ruolo di neuropeptidi nella spermatogenesi di vertebrati non mammiferi
Creators: name: Agnese, Marisa
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2010

description: Il testicolo è un organo complesso che svolge due funzioni fondamentali, la spermatogenesi e la steroidogenesi. Tali processi si realizzano sotto il controllo delle gonadotropine ipofisarie, FSH e LH, il cui rilascio è stimolato dal GnRH, e di numerosi fattori paracrini e autocrini (Matsumoto et al., 1986). Recenti studi hanno dimostrato la presenza di molti neuropeptidi e dei loro recettori nel testicolo, suggerendo che questi possano agire come regolatori locali della spermatogenesi e della steroidogenesi. Tra i neuropeptidi identificati nel testicolo rientrano il GHRH, il PACAP, il VIP, la secretina, l’ossitocina e la somatostatina. Il ruolo di questi neuropeptidi nella fisiologia del testicolo è in gran parte sconosciuto, anche se l’avvento di nuove tecniche ha permesso di iniziare a comprenderne le funzioni come fattori regolatori di spermatogenesi e steroidogenesi (Li e Arimura, 2003). Tra i neuropeptidi coinvolti nella regolazione delle funzioni testicolari, la mia attenzione si è rivolta principalmente a due neuropeptidi della superfamiglia della secretina, che include nove ormoni accomunati dalla struttura, dalla distribuzione, dalla funzione e dai recettori: ho studiato in primo luogo il PACAP, dal momento che la sua concentrazione nel testicolo supera quella di qualsiasi altro peptide testicolare noto, e in secondo luogo il VIP, dal momento che questo peptide ha il 68% di identità con il PACAP e dal momento che questi due neuropeptidi svolgono le proprie funzioni interagendo con alcuni recettori comuni (Sherwood et al., 2000).  
Il PACAP (Pituitary Adenylate Cylcase-Activating Polypeptide) è il membro della superfamiglia descritto più di recente in base alla sua capacità di stimolare la formazione di cAMP nelle cellule dell’ipofisi anteriore di ratto; è un peptide che esiste in due diverse forme di 27 e 38 aminoacidi, il PACAP27 e il PACAP38, rispettivamente. Il VIP (Vasoactive Intestinal Peptide) è un peptide di 28 aminoacidi; è uno dei membri della superfamiglia isolato più precocemente dall’ileo di maiale e deve il suo nome all’azione vasodilatatoria che induce dopo somministrazione sistemica. La sequenza di entrambi i peptidi si è conservata nel corso dell’evoluzione (Vaudry et al., 2000). Il PACAP e il VIP interagiscono con alcuni recettori comuni; infatti entrambi si legano con la stessa affinità ai recettori VPAC1 e VPAC2; in aggiunta, il PACAP si lega anche al recettore PAC1, che è il recettore a sette segmenti transmembrana di cui si conosce il maggior numero di isoforme, la maggior parte delle quali deriva dallo splicing alternativo di alcune cassette (hip/hop) nel terzo loop intracellulare (Dickson e Finlayson, 2009). 
Il PACAP e il VIP sono peptidi pleiotropici, che intervengono nella gametogenesi, e in particolare nella spermatogenesi. Tuttavia il loro ruolo nell’ambito di questo processo non è stato ancora del tutto chiarito e, se da una parte non mancano studi condotti nel testicolo dei mammiferi (Li e Arimura, 2003), dall’altra i dati circa il coinvolgimento del PACAP e del VIP nella spermatogenesi dei vertebrati non mammiferi sono a tutt’oggi molto scarsi (Gobbetti e Zerani, 2002; Huang et al., 2009; Agnese et al., 2010). È per questa ragione che lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di caratterizzare il PACAP, il VIP e i loro recettori nel testicolo di due vertebrati non mammiferi: il pesce cartilagineo Torpedo marmorata e il rettile squamato Podarcis sicula, confrontando, attraverso questi modelli sperimentali, un’organizzazione testicolare di tipo cistica (Torpedo marmorata) (Stanley, 1966; Prisco et al., 2002) con una di tipo tubulare (Podarcis sicula) (Galgano e D’Amore, 1953; Lofts, 1987).  
Lo studio è stato condotto lungo tre linee di ricerca: la prima è stata tesa essenzialmente allo studio del PACAP, del quale sono state caratterizzate la sequenza codificante in Torpedo e la distribuzione del messaggero e della proteina nelle sue due forme 27 e 38 in Torpedo e in Podarcis, e del VIP, del quale sono state caratterizzate la sequenza in Podarcis (verificando anche se lo stesso gene che codifica il VIP codifica anche il PHI) e la localizzazione del messaggero e della proteina in entrambi i modelli sperimentali; la seconda ha riguardato la localizzazione dei recettori del PACAP e del VIP, con una particolare attenzione al recettore PAC1, sul quale è stata condotta anche un’analisi di tipo biomolecolare per caratterizzare parte della sequenza codificante questo recettore sia in Torpedo sia in Podarcis; la terza linea di ricerca è stata prettamente funzionale e ha previsto l’allestimento di colture d’organo per comprendere l’effetto di PACAP e VIP sulla steroidogenesi nel testicolo di Podarcis sicula. I dati ottenuti nel corso di questi tre anni hanno innanzitutto dimostrato che le sequenze del PACAP di Torpedo, del VIP di Podarcis e del recettore PAC1 di Torpedo e di Podarcis hanno un’elevata identità con quelle degli altri vertebrati; in particolare, per quanto riguarda il VIP, è stato dimostrato che lo stesso gene che codifica il VIP codifica anche il PHI; per quanto riguarda invece il PAC1R, le analisi biomolecolari hanno evidenziato che nel testicolo di Torpedo marmorata sono presenti le isoforme null e hop2, nel testicolo di Podarcis sicula la null e la hop1. Sono stati quindi individuati i siti di sintesi endotesticolare del PACAP, del VIP e del recettore PAC1. È emerso inoltre che questi neuropeptidi e i loro recettori sono ampiamente distribuiti nel testicolo di entrambi i modelli sperimentali e la loro localizzazione suggerisce fortemente che PACAP e VIP intervengono nella regolazione della spermatogenesi e della steroidogenesi sia di Torpedo sia di Podarcis agendo come fattori paracrini e autocrini; il coinvolgimento di questi peptidi nella steroidogenesi di Podarcis sicula è stato poi dimostrato più direttamente dalle colture d’organo. I risultati ottenuti hanno dunque dimostrato che il PACAP e il VIP possono essere annoverati tra quei neuropeptidi prodotti localmente a livello testicolare, che partecipano alla fine regolazione della spermatogenesi e della steroidogenesi anche in Torpedo marmorata e in Podarcis sicula. Dall’insieme dei dati da me ottenuti (vedi anche Agnese et al., 2010) e da quelli ottenuti nei mammiferi emerge chiaramente che nei vertebrati non mammiferi il ruolo di tali neuropeptidi nel controllo della spermatogenesi sembra molto più significativo dal momento che il PACAP, il VIP e i rispettivi recettori sono ampiamente rappresentati nei diversi momenti della spermatogenesi, mentre nei mammiferi la loro distribuzione è particolarmente circoscritta, nel caso del PACAP, o del tutto assente, almeno come molecola, nel caso del VIP. A questo proposito sarebbe particolarmente interessante estendere le osservazioni ad altri rettili e agli uccelli per avere una visione più completa della distribuzione di tali peptidi nei diversi taxa di vertebrati e quindi pervenire ad una comprensione dei processi che nel corso della storia evolutiva dei vertebrati hanno accompagnato i cambiamenti nella localizzazione di tali neuropeptidi.