title: Molecular biological and biochemical investigation of 2-oxoglutarate dependent dioxygenases in Equisetum arvense L. and Petroselinum crispum (Mill.) Nyman &amp; A.W. Hill
title: Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu 2-Oxoglutarat abhängigen Dioxygenasen in Equisetum arvense L. und Petroselinum crispum (Mill.) Nyman &amp; A.W. Hill
Creators: name: Bredebach, Miriam
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: dioxygenases, flavonoids
Flavonoide , Flavonoidstoffwechsel
Schachtelhalm , Ackerschachtelhalm
FHT
Dioxygenasen
Petersilie
Naturwissenschaften
parsley
FNS, FLS
horsetail

description: 2-oxoglutarate-dependent
      dioxygenases (2-ODDs) involved in flavonoid biosynthesis (FNS
      I, FHT, FLS and ANS) were investigated in Equisetum arvense
      (horsetail) and Petroselinum crispum (parsley). E. arvense is
      a phylogenetically ancient genus with a large and well
      described diversity of flavonoids (Saleh et al., 1971; Veit
      et al., 1995). To date however, the flavonoid biosynthesis
      pathway in horsetail is still unknown. In the present study,
      activities of different 2-ODDs were detected in crude plant
      enzyme extracts. In addition to FHT- and FLS activities, a
      FNS I-type activity could be detected. This finding
      represents the first evidence of a FNS I-type-activity
      outside of the family of Apiaceae. The isolation of the
      corresponding enzyme via classical protein purification
      techniques failed due to the instability of the enzyme. The
      rapidly decreasing activity present in the crude extract
      could also not be enriched by affinity chromatography on
      2-oxoglutarate bounded sepharose or metal-chelate affinity
      chromatography. Using a molecular biological approach, two
      2-ODD sequences were successfully cloned by RT-PCR and
      cDNA-based approaches. They were expressed in heterologous
      recombinant systems. However, no enzyme activity could be
      detected with the tested flavonoid intermediate substrates,
      evolutionary analysis within the flavonoid biosynthesis
      pathway was not possible. As the overall identity of the
      cloned sequences was only 30% to other known ODDs, no
      hypothesis regarding the putative enzymatic function could be
      generated. Whereas the cloned sequences clearly code for
      2-ODDs, no evidence could be obtained for their functional
      role in flavoinoid biosynthesis in E. arvense. Secondly, the
      flavonoid biosynthesis was studied in P. crispum. Upon
      drought stress, red pigments accumulate in stems of parley
      plants. These pigments were identified as anthocyanins. They
      were only detected in stressed plant tissues and were
      identified as glycosides of cyanidin and peonidin,
      respectively. The cDNA of the corresponding enzyme (ANS,
      anthocyanidin synthase) was successfully cloned via RT-PCR
      and RACE methods. Subsequent expression in yeast and bacteria
      allowed the detection of the well-described ANS side activity
      (conversion of dihydroflavonols to flavonols, Welford et al.,
      2001; Turnbull et al., 2004) by bioconversions in cultures of
      transformed bacteria. However the main ANS reaction,
      converting leucoanthocyanidins to anthocyanidins, could be
      detected neither in in vitro assays nor in bioconversions. To
      delineate ANS sequences from FLS sequences the cloned cDNA
      sequence was analyzed by sequence alignments and the
      corresponding polypeptide sequence was compared with
      different known polypeptide sequences of FLS and ANS other
      plants. Alignments of PcFLS and AtANS, combined with
      phylogenetic analysis as well as the analysis of intron
      positions in 2-ODDs confirmed the identity of the cloned cDNA
      as an ANS. Furthermore, semi-quantitative PCR verified that
      some genes (PAL, 4-CL, CHS, FHT, FNS I, FLS) expressed in
      unstressed plants were transcribed less or not at all in
      drought stressed parsley stems and leaves. The ANS transcript
      was detected equally in unstressed and stressed, while the
      transcript of the DFR gene was only detectable in drought
      stress. These results corroborated at expression level the de
      novo synthesis of anthocyanins in drought stressed parsley as
      detected by metabolite analysis.
description: In der vorgelegten Arbeit wurden
      2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen aus dem
      Flavonoidstoffwechsel - unter besonderer Berücksichtigung der
      FNS I, FLS und ANS - von Equisetum arvense und Petroselinum
      crispum untersucht. E. arvense ist einer phylogenetisch sehr
      alten Gattung zuzuordnen und enthält eine große Zahl
      unterschiedlicher Flavonoide, die bereits gut erforscht sind
      (Saleh et al., 1971, Veit et al., 1995). Der
      Flavonoidstoffwechselweg in der Pflanze ist jedoch noch
      ungeklärt. In der hier vorgelegten Arbeit konnten im
      Enzymrohextrakt verschiedene 2-ODD-Aktivitäten nachgewiesen
      werden. Neben einer FHT- und FLS-Reaktion wurde zweifelsfrei
      auch eine FNS I-Aktivität bestimmt und konnte in Ansätzen
      charakterisiert werden. Dies ist ein erster Beweis, dass die
      Bildung von Flavonen mittels 2-ODD nicht allein auf die
      Familie der Apiaceae beschränkt ist. Der Versuch allerdings,
      die verantwortlichen Enzyme durch Proteinreinigung zu
      isolieren und funktionell zu charakterisieren, scheiterte
      aber an der Instabilität der Proteine. Ebenso konnte die
      schnell abnehmende katalytische Aktivität auch mit
      spezifischer Affinitätschromatographie nicht angereichert
      werden. Dahingegen konnten zwei 2-ODDn-cDNA-Sequenzen
      erfolgreich kloniert und exprimiert werden. Hierbei wurden
      Klonierungen mittels RT-PCR und cDNA-Bank-Screening
      durchgeführt. Da die exprimierten Proteine funktionell nicht
      mit den angebotenen Substraten identifiziert werden konnten,
      konnten diese evolutionär nicht verglichen werden. Auch mit
      Hilfe der phylogenetischen Analyse und aufgrund einer
      niedrigen Identität von 30 % zu anderen 2-ODDn konnte keine
      Aussage über die enzymatische Funktion getroffen werden. Die
      strukturelle Analyse der Polypeptid-Sequenzen und der
      genomischen Strukturen weist widersprüchliche Ergebnisse auf.
      Auf diese Weise kann nicht eindeutig geklärt werden, ob es
      sich bei den exprimierten cDNA-Sequenzen um 2-ODDn aus dem
      Flavonoidstoffwechsels handelt. Es ist dennoch
      wahrscheinlich, dass die klonierten Sequenzen für 2-ODDn
      kodieren. Der zweite Untersuchungsgegenstand war die
      Flavonoidbiosynthese der Petersilie, bei der durch
      Trockenstress die Bildung roter Farbstoffe im Stängel
      erreicht werden konnte. Diese konnten als Anthocyane
      identifiziert werden, die ausschließlich in gestressten
      Pflanzen zu finden waren und als Glykoside der Aglyka
      Cyanidin und Peonidin identifiziert werden konnten. Als
      verantwortliches Enzym der Anthocyanidin-Synthese, konnte die
      ANS aus P. crispum mittels RT-PCR und RACE-Technik
      erfolgreich kloniert und exprimiert werden. In
      Biotransformationen mit Bakterienkulturen konnte die für ANS
      bereits mehrfach nachgewiesene Nebenreaktion von
      Dihydroflavonolen zu Flavonolen (Welford et al., 2001;
      Turnbull et al., 2004) bestätigt werden. Die Hauptreaktion
      von Leukoanthocyanidinen zu Anthocyanidinen konnte jedoch
      weder in in vitro Enzymtests noch in Biotransformationen
      nachgewiesen werden. Zur Abgrenzung von ANS-Sequenzen
      gegenüber FLS-Sequenzen wurde auf molekulargenetischer Ebene
      die genetische Information weiter untersucht und es wurden
      verschiedene Polypeptid-Strukturanalysen durchgeführt. Sowohl
      Alignments der Polypeptid-Sequenzen von PcFLS und AtANS, die
      Phylogenie-Analyse als auch die Untersuchung des genomischen
      Klons und Analyse der Intronlage bestätigten das Vorliegen
      einer ANS. Weiter konnte mit Hilfe der semiquantitativen PCR
      gezeigt werden, dass Transkripte, die zunächst in ungestresst
      kultivierter Petersilie nachweisbar waren, in Petersilie, die
      unter Trockenstress kultiviert worden war, abnahmen oder
      sogar nicht mehr detektiert werden konnten. Lediglich das für
      die ANS kodierende Transkript konnte gleichbleibend
      detektiert werden, während das Transkript des DFR-Gens erst
      unter Trockenstress nachweisbar wurde. Dies bestätigte die de
      novo Synthese der Anthocyane auf Expressionsebene, die
      bereits durch die Inhaltsstoffanalytik angenommen worden
      war.