Ανάπτυξη δοκιμών real-time PCR για την ανίχνευση των παθογόνων PDV, PNRSV, PPV, PLMVd και ESFY:
Creators: name: Φωτίου, Ιωάννα Σταύρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: real- time PCR
PLMVd
PPV
ESFY
PDV
PNRSV

description: Ο ιός του νανισμού των πυρηνοκάρπων (Prune dwarf virus, PDV), ο ιός της νεκρωτικής δακτυλιοειδούς κηλίδωσης των πυρηνοκάρπων (Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV), ο ιός της ευλογιάς των πυρηνοκάρπων (Plum pox virus, PPV), το ιοειδές του λανθάνοντος μωσαϊκού της ροδακινιάς (Peach latent mosaic viroid, PLMVd) και το φυτόπλασμα του Ευρωπαϊκού ίκτερου των πυρηνόκαρπων (European stone fruit yellows, ESFY) θεωρούνται εκ των σημαντικότερων παθογόνων τα οποία πλήττουν την καλλιεργεια των πυρηνοκάρπων προκαλλώντες σοβαρές απώλειες. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής αναπτύχθηκαν πέντε μοριακές δοκιμές, πραγματικού χρόνου PCR, ικανές να ανιχνεύουν τα παραπάνω παθογόνα με ταχύτητα, υψηλή ευαισθησία και με ταυτόχρονη δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού του μολυσματικού φορτιού. Έτσι αναπτύχθηκαν για την ανίχνευση των PDV, PNRSV και PPV τρείς ποσοτικές, πραγματικού χρόνου RT-PCR (quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR) καθώς και μία πραγματικού χρόνου, ποσοτική PCR (quantitative real-time PCR, qPCR) για την ανίχνευση του ESFY στηριζόμενοι στην χημεία υδρόλυσης TaqMan. Η αποδοτικότητα αυτών αξιολογήθηκε ίση με 93%, 99,8%, 95,7%, και 93,5% αντίστοιχα ενώ το δυναμικό εύρος της ποσοτικής ανίχνευσης ήταν τα 40 έως 4x108, 10 έως 108, 20 έως 4x108 και 20 έως 2x108 συνθετικά αντίγραφα RNA και DNA, αντίστοιχα για κάθε παθογόνο. Ομοίως, για την ανίχνευση του ιοειδούς αναπτύχθηκε μια ποσοτική πραγματικού χρόνου RT -PCR (quantitative real-time RT -PCR, qRT-PCR) με χρήση του παρεμβολέα EvaGreen της οποίας η αποδοτικότητα αξιολογήθηκε 94,8% και το δυναμικό εύρος της ποσοτικής ανίχνευσης ήταν τα 20 έως 4x108 συνθετικά αντίγραφα RNA. Τέλος, αξιολογήθηκε ένα πρωτόκολλο εκχύλισης ολικού DNA βάση της ποσοτικής δοκιμής PCR (quantitative real-time PCR, qPCR) που αναπτύχθηκε για την ανίχνευση του ESFY με στόχο να μελετηθεί η ανάκτηση του μολυσματικού φορτιού καθώς και η επίδραση των συνεκχυλισθέντων ουσιών στην απόδοση της αντίδρασης. Για την μελέτη χρησιμοποιήθηκε υγιής ιστός υποκειμένου GF 305 και αξιολογήθηκαν δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις (Α και Β) συνθετικών αντίγραφων DNA. Η επίδρασης της παρουσίας συνεκχυλισθέντων αναστολέων στην απόδοση της δοκιμής φαίνεται να μην επηρεάζεται από την συγκέντρωση των αντιγράφων ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών Ct (ο κύκλος κατά τον οποίο οι τιμές φθορισμού της PCR υπερβαίνουν την ουδό ανίχνευσης του προϊόντος) των ανακτώμενων αντιγράφων του μάρτυρα και των φυτικών εκχυλισμάτων. Η ανάκτηση των συνθετικών αντιγράφων DNA υπολογίσθηκε ίση με 75,78±06,25 % και θεωρείται ικανοποιητική.
description: Prune dwarf virus (PDV), Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), Plum pox virus, (PPV), Peach latent mosaic viroid (PLMVd) and European stone fruit yellows (ESFY) are considered among the most detrimental and important pathogens of stone fruit trees which cause serious economic and agronomic losses . In this study five real-time PCR was developed to detect those pathogens and quantify the titer from Prunus tissue with speed, accuracy and high sensitivity. Thus in more detail, it was developed three separate TaqMan real-time qRT-PCR and one TaqMan real-time qPCR able to detect RNA and DNA targets from PDV, PNRSV, PPV and ESFY with efficiency up to 93%, 99,8%, 95,7%, and 93,5% respectively and in quantities that ranged from 40 to 4x108, 10 to 108, 20 to 4x108 and 20 to 2x108 control transcripts. Also a quantitive EvaGreen Real-time RT-PCR developed for the detection of PLMVd. The assay performed efficiency up to 94,8% and it’s quantitation ranged from 20 up to 4×108 RNA viral transcripts. Finally, a total DNA extraction protocol was evaluated over the qPCR developed for the ESFY detection in order to study the recovery rate of the synthetic transcripts and the effect of the presence of co-extracted inhibitors in the efficiency of the assay. For the evaluation, synthetic ESFY DNA transcripts of two known concentrations (A and B) were added in selected tissue from healthy GF 305 seedlings. The effect of the presence of co extracted inhibitors in the performance of the assay seems to be unaffected by the concentration of the synthetic transcripts while no significant difference revealed between Ct values (cycle at which the fluorescence of PCR values exceed the detection threshold of the product) of the recovered copies of control and the plant extract samples. The recovery rate of the synthetic DNA copies was estimated to 75,78 ± 06,25% and it is considered sufficient.