title: Click-Konjugation von siRNA an ein Designed Ankyrin Repeat Protein zur zielgerichteten Aufnahme in Tumorzellen
Creators: name: Streussnig, Sonja
Publisher: name: :none
Year: 2016

description: RNA-Interferenz (RNAi) ermöglicht es, die Expression von Genen posttranslational zu regulieren und somit genspezifische Therapien zu entwickeln. Small-interfering Ribonukleinsäure (siRNA) baut dabei die entsprechende komplementäre messenger Ribonukleinsäure (mRNA) ab, wodurch deren Genexpression inhibiert wird. Obwohl schon RNAi-basierte Medikamente entwickelt worden sind, stellt die Verabreichung der siRNA noch immer eine große Hürde dar. Vor allem der Transport zum Wirkort und die Aufnahme in die Zielzellen sind limitierende Faktoren und deshalb momentan Gegenstand vieler Forschungsprojekte. Es gibt mehrere Ansätze diese Hürden zu lösen. Dazu zählen die Struktur der siRNA zu optimieren und spezielle Transportsysteme wie Lipidpartikel, kationische Polymere oder auch Nanopartikel-Systeme. Eine weitere Möglichkeit ist die Herstellung von Oligonukleotid-Konjugaten besonders für eine rezeptor-spezifische Aufnahme, womit ich mich auch im Zuge meiner Diplomarbeit näher beschäftigt habe. Mittels Click-Chemie wurde ein Biokonjugat aus dem EpCAM-spezifischen DARPin N3-Ec1 und einem Oligonukleotid mithilfe eines bifunktionellen Dibenzocyclooctin-N-hydroxysuccinimidyl-Alkyllinkers (DBCO-NHSAlkyllinkers) hergestellt. Das Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) N3-Ec1 bindet spezifisch an das transmembranäre Glykoprotein Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), welches in einigen Krebsarten überexprimiert ist. Neben der Ermittlung und Optimierung der geeigneten Reaktionsbedingungen für die Herstellung des DBCO-Konjugates sowie der effizienten Aufreinigung des Endproduktes wurde mittels Durchflusszytometrie sowohl die Bindung des DBCO-Konjugates an sein Target EpCAM, als auch die Aufnahme in die Zielzellen untersucht. Die Zellkulturversuche haben gezeigt, dass es durch die Struktur des DBCOKonjugates zu einer deutlich stärken Bindung an EpCAM-positive Zellen kommt, als durch die entsprechende siRNA-Duplex allein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das DBCO-Konjugat in EpCAM-positive Zellen aufgenommen wird.
description: Post-transcriptional gene silencing through RNA interference (RNAi) by small interfering ribonucleic acids (siRNAs) enables gene-specific therapy. Some RNAi-based drugs have already been developed and are undergoing clinical testing. However, administering siRNAs is still a major problem. Especially limited transport to the target location and limited uptake into the target cells are barriers which have to be overcome and are therefore at the core of current research. There are different strategies to overcome these problems, including structural optimization of the siRNA and the use of delivery systems like lipid particles, cationic polymers or nanoparticles. Another possibility is the use of oligonucleotide conjugates for receptor-specific targeting. Using click chemistry, a conjugate of a siRNA oligonucleotide and a Designed Ankyrin Repeat Protein (DARPin) was produced. Dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester (DBCO-NHS-ester) was used as a linker between the oligonucleotide and the DARPin. The DARPin N3-Ec1 binds specifically to the transmembrane glycoprotein Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM), which is overexpressed on tumor cells of various carcinomas. The main focus of the work was the production of the DBCO-conjugate and its cell culture analysis. Procedures for efficient conjugation and purification of the final product were established. Specific binding of the conjugate to the target EpCAM and the uptake into target cells were tested using flow cytometrie. The results demonstrate significantly better binding to EpCAM through the DBCO-conjugate than through the siRNA itself. Furthermore, successful cellular uptake into EpCAM-positive cells was shown.