title: Die DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur nach Exposition niedriger Dosen Röntgenstrahlung
Creators: name: Ribbert, Ann-Charlotte
Publisher: name: UNSPECIFIED
Year: 2025

description: Niedrige Dosen ionisierender Strahlung im Bereich von wenigen mGy bzw. mSv sind im Leben eines jeden Menschen allgegenwärtig. Im Schnitt ist ein Mensch in Deutschland jährlich einer Dosis von etwa 4 mSv ausgesetzt, welche sich aus der natürlichen Strahlenexposition, z.B. durch das Vorkommen von Radionukliden in Böden oder manchen Lebensmitteln, und der Strahlenexposition durch u.a. CT-Aufnahmen im Rahmen von medizinischen Untersuchungen oder anderen technischen Anwendungen von ionisierender Strahlung zusammensetzt. Selbst solche niedrigen Dosen können die Zelle schädigen. Dabei sind insbesondere DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) kritisch, da sie die genetische Integrität der Zellen gefährden können, was die Entstehung von Krebs begünstigen kann. Zellen haben daher eine Vielzahl an Mechanismen entwickelt, um auftretende DSBs zu reparieren. Dennoch werden DSBs, die durch niedrige, alltäglich relevante Dosen ionisierender Strahlung verursacht werden, in normalen humanen Fibroblasten überraschenderweise nur ineffizient repariert. Im Gegensatz dazu werden DSBs, die durch hohe Strahlendosen verursacht werden, deutlich effizienter repariert. Wie die Zellen dosisabhängig die Reparatur von DSBs regulieren, ist bislang kaum bekannt und Gegenstand der Untersuchungen dieser Arbeit. 

Um die ineffiziente Reparatur nach niedrigen Dosen und den zugrundeliegenden Mechanismus zu charakterisieren, wurde in dieser Arbeit zunächst in experimentellen Studien in kultivierten, humanen Fibroblasten und Epithelzellen bestätigt, was aus früheren Untersuchungen mit Fibroblasten (Rothkamm &amp; Löbrich, 2003 und Grudzenski et al., 2010) bekannt war. So wurde in dieser Arbeit erneut gezeigt, dass Zellen in der G0/G1-Phase entstandene DSBs nach einer Bestrahlung mit hohen Dosen Röntgenstrahlung (z.B. 1 Gy) effizient reparieren, während sie DSBs nach Bestrahlung mit niedrigen Dosen (z.B. 10 mGy) ineffizient reparieren, sodass selbst nach 24 h Reparaturzeit die meisten DSBs unrepariert verbleiben. Werden die Zellen zusätzlich zur Bestrahlung mit niedrigen Dosen mit geringen Mengen Wasserstoffperoxid behandelt, kann die Reparatureffizienz deutlich gesteigert werden. Das Wasserstoffperoxid erzeugt in der verwendeten Konzentration Radikale in der Zelle, ohne selbst DSBs zu verursachen. Darauf aufbauende neue Untersuchungen mit einer molekularen Sonde, deren Fluoreszenzintensität vom Radikallevel der Zelle abhängt, bestätigen, dass bei niedrigen Dosen Röntgenstrahlen tatsächlich kaum Radikale entstehen, während bei hohen Dosen bzw. der Kombination aus Wasserstoffperoxid-Behandlung und Bestrahlung mit niedrigen Dosen vergleichbare, deutlich höhere Radikallevel entstehen. Dieser Unterschied im Radikallevel könnte den Unterschied der Reparatureffizienz bei verschiedenen Dosen erklären. Die Relevanz von intrazellulären Radikalen bei der Regulation der DSB-Reparatureffizienz wurde in vergleichenden Studien der DSB-Reparatureffizienz nach Bestrahlung mit Röntgenstrahlen sowie Anwendung des Radiomimetikums Neocarzinostatin (NCS) bestätigt, das im Gegensatz zur Strahlung weniger und räumlich begrenzt Radikale generiert. DSBs, die durch NCS erzeugt wurden, wurden etwas schlechter repariert als DSBs, die durch eine vergleichbare Strahlendosis erzeugt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass es ein kritisches Level von intrazellulären Radikalen gibt, welche für die Aktivierung der DSB-Reparatur nötig ist, was eine effiziente Reparatur der Brüche erlaubt. 

Darauf aufbauend stellte sich die zentrale Frage dieser Arbeit, welche der involvierten DSB-Reparaturproteine radikalabhängig reguliert werden. Die DNA-abhängige Proteinkinase - catalytic subunit (DNA-PKcs) wurde als möglicher Kandidat identifiziert. Zum einen spielt DNA-PKcs eine zentrale Rolle in der DSB-Reparatur in Zellen der G0/G1-Phase, spezifisch im DSB-Reparaturweg Non-homologous end joining (NHEJ), sodass es plausibel erscheint, dass ein inaktives NHEJ für eine eingeschränkte DSB-Reparatur verantwortlich ist. Tatsächlich gab es im Rahmen dieser Arbeit experimentelle Hinweise darauf, dass NHEJ nach niedrigen Strahlendosen nicht aktiv sein könnte, aber durch Wasserstoffperoxid stimuliert wird. Zum anderen ist für die mit DNA-PKcs eng verwandte Kinase Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) eine radikalvermittelte Aktivierung beschrieben (Guo et al., 2010). Um zu analysieren, wie hoch die jeweilige Aktivität von DNA-PKcs und ATM bei verschiedenen Strahlendosen ist, wurde ihre Fähigkeit, die Histonvariante H2AX schadensspezifisch zu phosphorylieren, ausgenutzt. So wurde gezeigt, dass DNA-PKcs durch eine niedrige Strahlendosis – im Gegensatz zu einer hohen Dosis – nicht aktiviert wird, ATM dagegen dosisunabhängig aktiviert wird. Damit liefert diese Arbeit erste Hinweise auf einen radikalvermittelten Aktivierungsweg von DNA-PKcs, der bei niedrigen Radikalleveln nicht ausreichend stimuliert wird. 
 
Daraufhin wurde die radikalvermittelte Aktivierung von DNA-PKcs näher untersucht. Es wurde die Hypothese untersucht, dass die Aktivität von DNA-PKcs durch Proteine gesteuert wird, die wiederum selbst auf das zelluläre Radikallevel reagieren. Peroxiredoxine wurden in den letzten Jahren als redoxabhängige Regulatoren der zellulären Schadensantwort beschrieben und wurden daher auch in dieser Arbeit hinsichtlich ihrer Rolle in der DSB-Reparatur untersucht. Durch den Inhibitor Adenanthin, welcher thiolhaltige Proteine und hier insbesondere die Peroxiredoxine PRDX2 und PRDX1 inhibiert, sowie durch die Depletion von PRDX2 und PRDX1 mittels siRNA, wird die Reparatureffizienz und DNA-PKcs-Aktivität bei niedrigen Dosen gesteigert, ohne dass das Radikallevel erhöht wird. Dies deutet auf eine kritische Rolle von Peroxiredoxinen in der Regulation der DNA-PKcs-Aktivität und damit der DSB-Reparatureffizienz hin. Co-Immunopräzipitationsstudien mit Flag-getaggtem PRDX2 in HEK293T-Zellen legen nahe, dass DNA-PKcs und PRDX2 bzw. möglicherweise auch andere Peroxiredoxine, wie PRDX1, bei niedrigen Dosen miteinander interagieren, bei höheren Dosen bzw. Radikalleveln dagegen nicht. Somit konnten in dieser Arbeit erste Hinweise erlangt werden, dass es eine radikalabhängige Interaktion zwischen PRDX2 bzw. PRDX1 und dem NHEJ-Faktor DNA-PKcs gibt. Diese Ergebnisse geben Anlass zur Vermutung, dass durch diese Interaktion die Aktivität von DNA-PKcs bei niedrigen Dosen gehemmt wird, was für die verminderte DNA-PKcs-Aktivität und die ineffiziente Reparatur nach niedrigen Dosen mitverantwortlich ist. 

Diese Arbeit trägt dazu bei, die ablaufenden zellulären Prozesse nach einer Exposition mit niedrigen, alltäglichen Strahlendosen mechanistisch besser zu charakterisieren. So konnte einerseits eine neuartige radikalabhängige Aktivierung von DNA-PKcs, sowie andererseits die Rolle der Peroxiredoxine in der DSB-Reparatur nach niedrigen Strahlendosen identifiziert werden. Dies hilft beim Verständnis, wie in Zellen radikal- bzw. dosisabhängig die Effizienz von DSB-Reparaturprozessen gesteuert werden. Diese Erkenntnisse zu den molekularen Mechanismen, die nach der Exposition mit niedrigen, alltäglichen Strahlendosen ablaufen, können langfristig helfen, die Wirkung und assoziieren Risiken solcher Expositionen zukünftig besser abschätzen zu können.