title: Oberflächenanalyse humaner dendritischer Zellen zur Identifikation potentieller Subpopulationen
Creators: name: Schütz, Fabian
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: Dendritische Zellen
subject: BDC
subject: DC
subject: Conventional and plasmacytoid dendritic cells
subject: Immunphänotypisierung von dendritischen Zellen
subject: DC Subsets

description: Objectives: Blood dendritic cells (DC) have a major regulatory function in innate and ad- aptive immunity and can be classified into: plasmacytoid DC (pDC), conventional (mye- loid) cDC1 and cDC2. Detailed immunophenotyping of the dendritic surface is essential for research and diagnosis. In particular, CD141+cDC1 has been difficult to discriminate from cDC2 and pDC. For the pDC subset, subpopulations based on distinct immunophenotypes have been re- peatedly reported. In addition to CD2+CD5+ and AXL+Siglec6+pDC like AS DC5 subpo- pulations, functional studies have revealed a dichotomy of pDCs in their ability to produce interferon. The second part of this thesis aims to investigate whether immunophenotyping and subsequent functional stimulation provide evidence for further pDC subpopulations. Design &amp; Methods: Polychromatic flow cytometry was combined with DC surface ex- pression analysis of 332 antigens in human blood samples enriched for DCs by magne- tic activated cell sorting. Candidate subset markers were then tested from unenriched PBMC bulk samples and evaluated for their specificity, sensitivity, and ability to induce monocyte-derived DC. Based on the screening results, out of six potential pDC subpopulation, CD7, CD10 and CD226high and low populations were sorted with FACS. Cytokine production after TLR7 and TLR9 agonist stimulation were determined with cytometric bead array (CBA) in the- se subpopulations. The cytokine-rich supernatants of the sorted pDCs were also used in CMV-specific T cell expansion cell culture experiments. Observations &amp; Results: Detailed expression analysis of surface antigens revealed no- vel DC subset markers. Out of eight markers, CD26, CD85a, CD109, CD172a, CD200, CD200R, CD275 and CD301, only CD26, CD85a and CD275 could be confirmed for pro- perly identifying cDC subsets. The search for pDC subpopulations yielded contradictory results, with the greatest dif- ferences for a CD226-high vs. CD226-low pDC being seen in cytokine production and T-cell expansion. Conclusions: CD26 (DPP-4), CD85a (LILRB3, ILT5) and CD275 (ICOSL) withstand tho- rough confirmation. CD26 and CD275 are novel cDC1 markers and help distinguish con- ventional cDCs. cDC2 specifically express CD85a. CD226 is found on cDC1 and partially expressed on pDCs. A CD226high ICOSLhigh pDC subpopulation could be discriminated from a CD226neg ICOSLlow more secretory pDC, which could be an immune checkpoint.
description: Hintergrund und Ziele: Humane dendritische Zellen (DC) übernehmen regulatorische Schlüsselfunktionen der angeborenen und adaptiven Immunität und lassen sich in plas- mazytoide DC (pDC), konventionelle (myeloide) cDC1 und cDC2 einteilen. Eine detail- lierte Immunphänotypisierung der dendritischen Oberfläche ist für Forschung, Diagnose und zellbasierte Immuntherapie unerlässlich. Insbesondere die seltene CD141+cDC1 ist schwer von cDC2 und pDC abzugrenzen. Für die pDC sind Subpopulationen für CD2+CD5+ und AXL+SIGLEC6+pDC-like AS DC5 beschrieben. Die hohe funktionelle Plastizität der pDC legt jedoch die Existenz weiterer funktionell distinkter Subpopulationen nahe. Der zweite Teil dieser Arbeit bezieht sich auf die funktionelle Untersuchung von sechs pDC Immunphänotypen hinsichtlich einer pDC Subpopulation. Methoden: Für die Immunphänotypisierung der magnetisch angereicherten DC Zellpo- pulation aus mononukleären Blutzellen kombinierten wir eine polychromatische FACS Analyse mit einer systematischen Expressionsanalyse von 332 Oberflächenantigenen. Anhand dichotomer Expressionsmuster der pDC dienten CD7, CD10 und CD226 als po- tentielle Subpopulationsmarker, deren Populationen mittels FACS Cell Sorting getrennt auf sekretorische Zytokinmuster und CMV antigenspezifische T-Zell-Interaktionen analy- siert wurden. Ergebnisse und Beobachtungen: Die Expressionsanalyse der Oberflächenantigene ergab acht neue DC-Subsetmarker. Von CD26, CD85a, CD109, CD172a, CD200, CD275,CD200R, und CD301 konnten nur CD26, CD85a und CD275 für die korrekte Identifizie- rung von cDC-Subsets bestätigt werden. Die Suche nach pDC-Subpopulationen führte zu widersprüchlichen Ergebnissen, wobei sich die größten gruppeninternen Unterschiede für CD226 (DNAM1) pDC bei der Zyto- kinproduktion und der CMV-spez. T-Zell-Expansion fanden. Schlussfolgerungen und Diskussion: Drei neue DC-Subsetmarker, CD26 (Dipeptidyl- peptidase IV), CD85a (Leukozyten-Immunoglobulin-ähnlicher Rezeptor B3) und CD275 (induzierbarer Costimulator-Ligand), konnten bestätigt werden. CD26 und CD275 sind neuartige cDC1-Marker und eignen sich beide zur sicheren Identifikation. CD85a ist spe- zifisch auf cDC2 exprimiert. CD226 wird von cDC1 vollständig und auf der pDC teils exprimiert. CD226+ ICOSL+ pDC lässt sich als potentielle Subpopulation oder "DC Stateäbgrenzen, die eine Immun- checkpointfunktion von CD226 auf pDC nahelegen.