Interaction of alpha-synuclein and microtubule organization is linked to impaired neuritogenesis in Parkinson‘s patient-derived neurons with SNCA duplication
Die Interaktion von Alpha-Synuclein mit der Organisation von Mikrotubuli und ihr Einfluss auf die Neuritogenese in humanen Neuronen mit einer SNCA-Duplikation
Creators: name: Seebauer, Lukas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: Parkonson's disease
alpha-synuclein
neuritogenesis
microtubule
SNCA
duplication
induced pluripotent stem cells

description: Parkinson's disease (PD) is neuropathologically characterized by the loss of dopaminergic neurons and the deposition of aggregated alpha synuclein (aSyn). Mounting evidence suggests that neuritic degeneration precedes neuronal loss in PD. A possible underlying mechanism could be the interference of aSyn with microtubule organization in the neuritic development, as implied by several studies using cell-free model systems. In this study, we investigate the impact of aSyn on microtubule organization in aSyn overexpressing H4 neuroglioma cells and midbrain dopaminergic neuronal cells (mDANs) generated from PD patient-derived human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) carrying an aSyn gene duplication (SNCADupl). An unbiased mass spectrometric analysis reveals a preferential binding of aggregated aSyn conformers to a number of microtubule elements. We confirm the interaction of aSyn with beta tubulin III in H4 and hiPSC-derived mDAN cell model systems, and demonstrate a remarkable redistribution of tubulin isoforms from the soluble to insoluble fraction, accompanied by a significantly increased insoluble aSyn level. Concordantly, SNCADupl mDANs show impaired neuritic phenotypes characterized by perturbations in neurite initiation and outgrowth. In summary, our findings suggest a mechanistic pathway, through which aSyn aggregation interferes with microtubule organization and induces neurite impairments.
description: 1.1 Hintergrund und Ziele Das Parkinson-Syndrom (PS) ist die häufigste Bewegungsstörung und zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Neuropathologisch ist die Erkrankung durch den Verlust dopaminerger Neurone im Mittelhirn und die Ablagerung aggregierten alpha-Synucleins (aSyn) gekennzeichnet. Neben der großen Mehrheit an sporadischen Fällen gibt es genetische Formen des PS, die durch Punktmutationen im, oder Multiplikationen des für aSyn codierenden Genes (SNCA) verursacht werden. Bei Vorliegen einer Duplikation des SNCA Genes (SNCADupl) ist die Erkrankung durch einen frühen Symptombeginn und eine rasche Krankheitsprogredienz gekennzeichnet. Inzwischen gibt es vermehrt Hinweise, dass dem Verlust ganzer Neurone die Degeneration ihrer Neuriten vorangeht. Einige Studien in zellfreien Modellen lassen vermuten, dass die Ursache hierfür in der Interaktion von aSyn mit Tubulin-Strukturproteinen, den essenziellen Bausteinen der Mikrotubuli (MT), und ihrer Auswirkung auf die Neuritogenese liegen könnte. Unklar ist jedoch, ob diese Interaktion tatsächlich auch in Nervenzellen von Patienten mit PS präsent und wie ausgeprägt ihr Einfluss auf die Neuritogenese ist. Mit der Entwicklung von humanen, induzierten, pluripotenten Stammzellen (hiPSZ) durch Reprogrammierung zum Beispiel von Fibroblasten aus einer Hautbiopsie, besteht die Möglichkeit zur Differenzierung spezifischer Zelltypen aller drei Keimblätter unter Beibehaltung der genetischen Ausstattung der Spenderperson. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung des Einflusses von aSyn Überexpression auf aSyn Aggregation und aSyn-MT-Interaktion in humanen Zellmodellen, sowie der Auswirkungen der Interaktion auf die Neuritogenese bei Neuronen des Mittelhirns. 1.2 Methoden Hierfür differenzierte ich aus hiPSZ einer SNCADupl Patientin neuronale Vorläuferzellen (NVZ) und dopaminerge Neurone des Mittelhirns (mDAN) und verglich sie mit NVZ und mDAN gesunder Kontroll-Personen. Zur Bestätigung unserer Beobachtungen in hiPSZ-basierten Zellen und zur Aufklärung des spezifischen Effekts von aSyn untersuchte ich zusätzlich humane H4 Neurogliom- Zelllinen, die sich in ihrem aSyn-Gehalt unterscheiden: wildtyp aSynüberexprimierende H4 Zellen (H4-aSyn) und naive aSyn-arme H4 Zellen (H4 naive). Fragestellungen zur Umverteilung und Expression spezifischer Proteine abhängig von der Interaktion mit aSyn, sowie zur Kontrolle der Zelldifferenzierung, wie dem Nachweis essenzieller Marker dopaminerger Zellen nutzte ich nebst Western Blot- Analyse auch Immunozytochemie. Zum Nachweis der Interaktion von aSyn mit MTElementen in Zellen kamen Co-Immunoprezipitation und anschließend Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung zum Einsatz. Um die konkreten Auswirkungen der Interaktion zu untersuchen, erfolgte außerdem die Separation der löslichen und unlöslichen, MT-assoziierten Zellbestandteile zur Analyse der Verteilungsmuster von Proteinen des Zytoskeletts und aSyn. Zur Untersuchung weitergehender Auswirkungen bis auf zellmorphologische Ebene diente die Sholl-Analyse an aus hiPSZ differenzierten SNCADupl- und KontrollmDAN der Quantifizierung morphologischer Aberrationen der Neuritogenese. 1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Ich konnte beobachten, dass in beiden Zellmodellen (H4-aSyn und aus hiPSZ differenzierte SNCADupl-mDAN) erhöhte aSyn-Level mit einem erhöhten Vorkommen unlöslichlicher aSyn Aggregate einhergehen. Außerdem wurde gezeigt, dass aSyn mit Klasse-III-β-Tubulin, einem neuronenspezifischen Tubulin interagiert und bevorzugt aggregierte aSyn-Konformere an MT-Elemente binden. Die Separation der Zellbestandteile offenbarte eine deutliche Umverteilung von Tubulin-Isoformen in die unlösliche Fraktion, begleitet von einem signifikanten Anstieg unlöslicher aSyn-Anteile sowohl in H4-aSyn-Zellen als auch in SNCADupl mDAN im Vergleich zu aSyn armen H4 naive-Zellen und Kontroll-mDAN. Zu den Veränderungen, der für MT relevanten Tubuline passend, trat bei iPSZ-basierten SNCADupl mDAN gegenüber Kontroll-mDAN ein veränderter Phänotyp im Sinne einer signifikant höheren Anzahl von primären (direkt dem Zellsoma entspringenden), gleichzeitig aber dünneren und kürzeren Neuriten auf. 1.4 Schlussfolgerungen und Diskussion In unserer Studie konnte erstmals, die mehrfach in zellfreien Modellen vorbeschriebene Interaktion von aSyn mit Elementen der MT wie insbesondere den an wichtigen dynamischen Transport- und Bewegungsprozessen beteiligten Tubulin-Bausteinen, in zwei aSyn-überexprimierenden humanen, neuralen Zellmodellen nachgewiesen werden. Die Umverteilung der Tubulin-Isoformen und die synchrone Alteration des neuronalen Phänotyps weisen darauf hin, dass aSyn- Aggregate eine Desorganisation der Tubuline bewirken. Unsere Daten deuten darüber auf einen mechanistischen Zusammenhang von der Bildung von aSyn- Aggregaten über eine veränderte Dynamik und Verteilung von MT zu neuritischen Schäden in Patienten-basierten Neuronen hin. Das legt nahe, dass dieser Mechanismus wichtiger Mitverursacher früher neurodegenerativer Veränderungen in Mittelhirn-Neuronen von Parkinson Patienten sein könnte. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse unserer Studie die Bedeutung der Interaktion von aSyn (Aggregaten) mit MT und deren Einfluss auf die Neuritogenese als früher pathogener Faktor in der Entwicklung des PS - nach in vitro Versuchen nun eben gerade auch in humanen neuronalen Zellkulturen, die allein durch ihren genetisch bedingten, hohen aSyn Spiegel am PS leiden. Dadurch könnte diese Interaktion als Ziel zukünftiger Therapieansätze dienen, die zudem direkt an von Patienten abstammenden Zellen getestet und bewertet werden könnten.