title: Entwicklung und Charakterisierung eines Photosensitizer-Polyethylenimin Konjugates
Creators: name: Gruber, Michaela Johanna
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Die Therapie mit Photosensitizern stellt eine nebenwirkungsarme Alternative zu den herkömmlichen Behandlungen von vielen Hauterkrankungen und oberflächlichen Tumoren dar. Jedoch ist die Anwendung wegen der für die praktische Handhabung nachteiligen Eigenschaften wie geringer Löslichkeit der Wirkstoffe limitiert. Um diese lipophilen Photosensitizer in Zukunft in der Praxis einsetzen zu können, bestand das Ziel dieser Diplomarbeit darin, eine Methode zu entwickeln, die Hydrophilie hochpotenter Porphyrine ohne Wirkungsverlust zu erhöhen. Als hydrophiles Trägermolekül für den lipophilen Photosensitizer 5-(4-Carboxyphenyl)-10,15,20-triphenyl-21, 23H-porphyrin (TPP) wurde Polyethylenimin (PEI) eingesetzt, das durch seine Vielzahl an primären, aber auch sekundären Aminogruppen hohe Wasserlöslichkeit besitzt. Zur Synthese eines Konjugates sollte die Carboxylgruppe von TPP mit Hilfe von Carbodiimid mit primären Aminogruppen von PEI unter Ausbildung einer stabilen Amidbindung kovalent verknüpft werden. Eine effiziente Aktivierung von TPP mit N,N´-Dicyclohexylcarbodiimid war nur in organischen Lösungsmitteln möglich, was durch dünnschichtchromatographischen Nachweis des TPP-Aktivesters bestätigt wurde. Ein Katalysator war, wie in der Literatur beschrieben, dazu nicht nötig. Die Optimierung der Kopplungsmethode als auch die Reinigung des Konjugates wurde durch Dünnschichtchromatographie dokumentiert. Das wasserlösliche TPP-PEI Konjugat konnte in fester Form durch Ausschütteln der organischen Phase mit Wasser Aqua dest. erschöpfende Dialyse und anschließender Lyophilisation dargestellt werden. Die Variation der molaren Ansatzverhältnisse von TPP und PEI ergab, dass ein Konjugat mit höchstem Substitutionsgrad bei gleichzeitigem Erhalt der Wasserlöslichkeit bei einem Ansatzverhältnis von 1:6 (PEI:TPP) entsteht und durch eine Belegungsrate von 1,8 Mol TPP/Mol PEI charakterisiert ist. Qualitative Hinweise auf eine kovalente Bindung von TPP an PEI ergab die FTIR-Spektroskopie durch die Detektion von Amidschwingungen im Konjugat. Da neben der kovalenten Bindung auch eine ionische Bindung zwischen dem Carboxylat-hältigen Photosensitizer und dem Amin-hältigen makromolekularen Träger möglich sein sollte, wurde im gleichen molaren Ansatzverhältnis ein ionischer Komplex ohne Aktivesterbildung hergestellt, der als Polyelektrolytkomplex (PEK) bezeichnet wird. Durch vergleichende Untersuchungen sollte der Einfluss ionischer TPP-Bindung im kovalenten Konjugat evaluiert werden. Um die Stabilität beider Produkte, Konjugat und PEK, zu untersuchen wurden einerseits Löslichkeitsversuche durchgeführt. Diese Verdünnungsversuche zeigten deutlich, dass die ionischen Wechselwirkungen des PEK durch Elektrolyt-Zusatz aufgehoben werden und der PEK wieder in seine Einzelkomponenten zerfällt. Das Konjugat hingegen war in allen untersuchten artifiziellen physiologischen Flüssigkeiten stabil. Andererseits bewirkte Harnstoff als Chaotrop, demgegenüber nur kovalente Bindungen stabil sind, auch beim Konjugat eine deutliche Abnahme des PEI-gebundenen TPP-Anteiles. Während die Bestimmung der biologischen Aktivität durch den Singulett Oxygen Sensor Green-Test widersprüchliche Ergebnisse ergab, vorwiegend bedingt durch die scheinbar hohe Reaktivität des Reagens mit den eingesetzten Lösungsmitteln, ermöglichte die Evaluierung der Konjugat-Zellinteraktion durch (Fluoreszenz)-Mikroskopie qualitative Schlüsse. Dazu wurden Caco-2 Monolayer als humanes artifizielles Dünndarmepithel eingesetzt. Sowohl Konjugat als auch TPP assoziieren mit den Geweben, wobei die Interaktion mit dem Konjugat etwa doppelt so hoch ist. Ebenso ist die Zytotoxizität des Konjugates nach Aktivierung durch Licht doppelt so hoch wie jene des Wirkstoffes. Hinsichtlich der biologischen Aktivität, insbesondere im Hinblick auf einen möglichen unspezifischen additiven toxischen Effekt des Trägermoleküls sind jedoch weitere Untersuchungen für eine klare Beurteilung notwendig. Insgesamt konnte in dieser Arbeit erstmals ein wasserlösliches, biologisch aktives Photosensitizer-Polyethylenimin Konjugat synthetisiert, gereinigt und in fester Form dargestellt werden. Verdünnungsversuche bestätigten die Stabilität des Konjugates in physiologischen Flüssigkeiten und in-vitro Interaktionsstudien mit humanen Dünndarmepithelien ergaben erste fundierte Hinweise auf die zytotoxische Aktivität des TPP-PEI - Konjugates.