title: In-depth mass spectrometry-based proteome profiling of inflammation-related processes
Creators: name: Bileck, Andrea
Publisher: name: :none
Year: 2016

description: Entzündungsprozesse sind die Folge von physiologisch essentiellen Abwehrstrategien höherer Organismen gegen Pathogene. Diese Prozesse sind durch ein komplexes Zusammenspiel unterschiedlichster Zelltypen charakterisiert, dem ein Netzwerk verschränkter Signaltransduktionswege zugrunde liegt. Massenspektrometrie-basierende Proteomanalysen wurden zur Untersuchung der zellulären Prozesse während entzündlicher Stimulation und auch der zellulären Reaktion auf anti-entzündliche Wirkstoffe eingesetzt. Als biologisch relevantes in vitro Modell wurden primäre humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes herangezogen, welche mit Lipopolysaccharid und Phytohämagglutinin entzündlich stimuliert wurden. In weiterer Folge wurden die Effekte von Dexamethason und dem synthetischen Cannabinoid CP47,497-C8 auf die Entzündungsprozesse untersucht. Die Behandlung entzündlich stimulierter Zellen mit Dexamethason wurde durchgeführt um einerseits Einblicke in anti-entzündliche Mechanismen zu erhalten und andererseits die Fähigkeit des Medikamentes pro-entzündliche Zellaktivitäten zu unterbinden, zu evaluieren. Die Behandlung von ruhenden Zellen mit dem synthetischen Cannabinoid hingegen zeigte die besondere Eignung des Verfahrens, die Beeinflussung von Entzündungsprozessen auch aufgrund von nicht-klassischen Stimulantien genau untersuchen zu können. Die zellulären Proben wurden in zytoplasmatische Protein, Kernproteine und sezernierte Proteine aus dem Zellüberstand fraktioniert und enzymatisch verdaut. Umfassende Proteomprofile wurden mit Hilfe eines hochauflösenden QExactive Orbitrap Massenspektrometers und der MaxQuant-Software erstellt. Vergleichende Proteomanalysen von ruhenden und entzündlich stimulierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes ergaben die Identifikation von 85501 unterschiedlichen Peptiden, die zur Identifikation von 6886 Proteinen führte. Davon waren 469 Proteine durch die entzündliche Stimulation signifikant reguliert, unter anderem auch die klassischen entzündlichen Mediatoren IL-1β, IL-6, CXCL2 und GROα. Es konnte auch gezeigt werden, dass Dexamethason nicht in der Lage ist, alle durch entzündliche Stimulation hoch regulierten Proteine wieder hinunter zu regulieren. Basierend auf der hohen Datendichte konnte der gesamte c-JUN, ERK5 und NF-κB Signalweg semiquantitativ abgebildet werden. Des Weiteren konnten 2731 Phosphopeptide, welche von 991 Proteinen stammen, mit hoher Sicherheit erfasst werden. Aufgrund der effizienten subzellulären Fraktionierung war es auch möglich Entzündungs-assoziierte Translokations-Ereignisse in den Zellkern von beispielsweise Histon-modifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren zu verfolgen. Schließlich zeigt diese Arbeit nicht nur die Leistungsfähigkeit von Massenspektrometrie-basierenden Analysestrategien hinsichtlich der Identifikation von Proteinen, sondern auch bezüglich der Untersuchung von Proteinregulationen, post-translationalen Modifikationen und Kerntranslokation von Proteinen, welche zur detaillierten Charakterisierung von komplexen Mechanismen im Rahmen von Entzündungsprozessen erforderlich sind.
description: Inflammatory responses are indispensable physiological processes involved in the defense mechanism of an organism. These processes are characterized by a complex interplay of different types of immune cells with an underlying network of intersecting signaling pathways. Mass spectrometry-based proteomics analysis was applied in order to investigate cellular processes during inflammatory stimulation as well as in response to therapeutic interventions. As a highly relevant in vitro model system, primary human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were chosen, which were inflammatory stimulated using lipopolysaccharide and phytoheamagglutinin. Furthermore, cells were treated with dexamethasone and the synthetic cannabinoid CP47,497-C8, respectively. The treatment of inflammatory activated PBMCs with dexamethasone was performed to obtain insight into antiinflammatory mechanisms induced by drug treatment and to investigate its potency to suppress proinflammatory cellular activities. In contrast, the assessment of CP47,497-C8-treated quiescent PBMCs demonstrated the power of this analysis strategy to disclose inflammation-related processes independent of a classical inflammatory stimulus. Cellular samples were fractionated into supernatant, cytoplasmic and nuclear protein fractions and subsequently enzymatically digested. Comprehensive proteome profiles were then generated using a high resolution QExactive orbitrap mass spectrometer and label-free quantitative data analysis was performed using MaxQuant. Comparative proteome profiling of quiescent and inflammatory activated PBMCs revealed the identification of 85501 peptides compiled to 6886 proteins. Thereof, 469 proteins were significantly regulated upon inflammatory activation including the classical inflammatory mediators IL-1β, IL-6, CXCL2 and GROα. Furthermore, it was clearly demonstrated that dexamethasone is unable to counter-regulate all inflammation-induced proteins. Based on the high data density, the entire c-JUN, ERK5 and NF-κB signaling cascade was mapped in a semi-quantitative fashion. Furthermore, 2731 phosphopeptides derived from 991 proteins were identified in a highly confident fashion. Due to the efficient subcellular fractionation it was further possible to assess inflammation-related nuclear translocation of proteins, for example of histone-modifying proteins and transcription factors. In conclusion, this thesis demonstrates the power of mass spectrometry-based proteomics regarding not only the identification of proteins, but also the assessment of protein regulations, post-translational modifications and nuclear translocation events in order to comprehensively characterize the complex molecular processes during inflammation.