Λειτουργική ανάλυση μοριακών στόχων σε δείγματα ασθενών με χρόνια HCV
Creators: name: Μπαντοτάκη, Ευδοξία Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2017
Subjects: Hπατοκυτταρικό καρκίνωμα
Μοριακοί δείκτες
miRNAs/εξωσώματα
Ηepatocellular Carcinoma
Biomarkers
miRNAs/exosomes

description: Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) αποτελεί την τρίτη σε συχνότητα αιτία θανάτου από κακοήθειες, με σύνολο 600,000 θανάτων ετησίως. Κύριοι περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη, τη διατήρηση και την εξέλιξη του ΗΚΚ αναφέρονται οι ιικοί παράγοντες, όπως ο ιός της ηπατίτιδας Β και C, ο χρόνιος αλκοολισμός, τα αυτοάνοσα νοσήματα, το κάπνισμα, η παχυσαρκία, το μεταβολικό σύνδρομο, η μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) και η μόλυνση από αφλατοξίνες. Τα τελευταία χρόνια έχουν πραγματοποιηθεί προσπάθειες για τον προσδιορισμό της μοριακής βάσης της έναρξης και εξέλιξης της ασθένειας. Το ΗΚΚ χαρακτηρίζεται από μια ετερογενή, πολύπλοκη και πολυσταδιακή διαδικασία εξέλιξης αποτελούμενη από τα στάδια : ίνωση Ι,ΙΙ (F0-F2, F3-F4), κίρρωση και ΗΚΚ. Η εξέλιξη αυτή είναι αποτέλεσμα της απορρύθμισης λειτουργίας ογκοκατασταλτικών/ ογκογονικών γονιδίων και επιγενετικών δράσεων miRNAs που οδηγούν στη διαφορική έκφραση γονιδίων. Έχουν αναφερθεί τόσο ογκοκατασταλτικές όσο και οι ογκογονικές ιδιότητες των miRNAs. Διαφορικά εκφραζόμενα miRNAs και γονίδια θα μπορούσαν να αποτελούν πιθανούς ισχυρούς βιοδείκτες τόσο για τη διάγνωση του ΗΚΚ όσο και για την πρόβλεψη της εξέλιξης του HCV- σχετιζόμενου HΚΚ. Στη συγκεκριμένη μελέτη πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση του πρωτοκόλου απομόνωσης RNA από φρέσκο και καταψυγμένο πλάσμα για καθοδική ανάλυση. Για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών γεγονότων, ο συνδυασμός έκφρασης miRNA και mRNA μελετήθηκε σε σχέση με τη σταδιοποίηση του καρκίνου. Χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα αλληλούχησης miRNA και RNA από τη βάση δεδομένων “The Cancer Genome Atlas (TCGA)”. Από μετέπειτα βιβλιογραφική ανάλυση καταλήξαμε σε 3 στατιστικά σημαντικά miRNAs στόχους, τα miR103a, miR18a και miR532p που έχουν ως στόχους τα γονίδια ACER2 και SGSM2 μέλη του μονοπατιού μεταβολισμού των σφιγγολιπιδίων. Το πρότυπο έκφρασή τους μελετήθηκε πραγματοποιώντας real time qPCR σε δείγματα σε n=16, ίνωση (F0-F2),(F3-F4), n=11, κίρρωση, n=3, HΚΚ και n=2 control group. Απομένουν μελέτες στα υπόλοιπα δείγματα. Το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων στόχων αναμένεται να πραγματοποιηθεί σε μελλοντικές μελέτες. Πραγματοποιήθηκε επίσης απομόνωση των εξωσωμάτων με υπερφυγοκέντρηση. Παρατηρήθηκε υποέκφραση των miRNAs υπό μελέτη στο ΗΚΚ σε σχέση με το φυσιολογικό σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της βιοπληροφορικής ανάλυσης στον ιστό όπου τα miRNAs εμφανίζονται υπερεκφραζόμενα. Με την Η.Μ παρατηρήθηκε πως με τη μέθοδο της υπερφυγοκέντρησης απομονώθηκαν σωματίδια που εμπίπτουν στο εύρος μεγέθους των εξωσωμάτων με σφαιρική, μεμβρανική και άθικτη δομή από κυτταροκαλλιέργειες και πλάσμα φυσιολογικών ατόμων. Απομένει η απομόνωση από ασθενείς με ΗΚΚ και η εύρεση ενός τρόπου αύξησης της καθαρότητας του δείγματος. Σήμερα η χειρουργική εκτομή αποτελεί τη βασική θεραπεία του ΗΚΚ συνήθως παράλληλα με την χημειοθεραπεία. Η πρόγνωση είναι άσχημη λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης, της αντίστασης στη χημειοθεραπεία στα προχωρημένα στάδια και της ανάπτυξης απομακρυσμένων μεταστάσεων. Η επιβίωση σχετίζεται με το στάδιο τη στιγμή της διάγνωσης, προτείνοντας πως η έγκαιρη διάγνωση της υποβόσκουσας ασθένειας έχει εξαιρετική σημασία. Λόγω του ότι οι παρούσες μέθοδοι ελέγχου είναι ιδιαίτερα παρεμβατικές η ανακάλυψη ενός συστήματός σταδιοποίησης βασιζόμενου σε μοριακούς παράγοντες θεωρείται σημαντική. Η εφαρμογή μοριακών δεικτών θα μπορούσε να έχει προγνωστική σημασία και να θέσει τα θεμέλια γα την στοχευμένη, εξατομικευμένη θεραπεία
description: Hepatocellular carcinoma (HCC) represents the third most common cancer in mortality worldwide, leading to 600,000 deaths per year. Main risk factors for the initiation and progression of HCC are: chronic hepatitis (HCV/HBV), chronic alcohol consumption, autoimmune diseases, smoking, obesity, metabolic syndrome, non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and aflatoxins. Over the past years many efforts have been made to elucidate the molecular basis of the initiation and progression of the disease. HCC is characterized by a heterogenous, complicated and multistage process of development comprised by the stages: Fibrosis (F0-F2, F3-F4), Cirrhosis and HCC. This development is a result of the deregulation of the function of oncosuppressor genes and the epigenetic function of miRNAs that leads to differential expression of genes. There is evidence that suggests the oncosuppressor and ongogenic properties of miRNAs. Due to this fact differentially expressed miRNAs and genes could constitute possible powerful biomarkers for the diagnosis of HCC and the prognosis of the development of the HCV-related HCC. Ιn this study we performed optimzation of the protocol of RNA extraction from frozen and fresh plasma for downstream analysis. To gain insight into the molecular driver events, the combined effect of miRNA and mRNA expression was investigated in relation to cancer staging. We utilized the raw data of miRNA- and RNA-sequencing datasets from “The Cancer Genome Atlas (TCGA)”. We will study the expression profiles of three target miRNAs, miR103a-3p, miR18a-5p and miR532-5p which where found to be most statisically important in the in silico analysis by performing real time PCR and Real-time qPCR arrays in n=16, Fibrosis (F0-F2, F3-F4), n=11, Cirrhosis, n=3, HCC and n=2, control group. The selected miRNAs target the genes ACER2 and SGSM2, parts of the sphingolipid metabolism pathway. Downregulation of the three miRNAs was observed in fibrosis, cirrhosis and HCC in comparison to the control group. Those findings are on the contrary to the in silico analysis which was performed in the tissue where the miRNA targets appeared upregulated. Analysis remains to be completed in all samples. Expression analysis of the gene targets remains to be complete in future studies. Isolation of exosomes was performed following the ultracentrifugation method. By T.E.M we observed intact, circular, membranic vesicles within the spectrum of exosomes size from cell cultures and normal controls' plasma. Remains the isolation of exosomes from patients' plasma and finding a method for increasing the clarity of the sample under observation. Nowadays, curative resection is the major treatment option often in parallel with chemotherapy. The prognosis is bad due to delayed diagnosis, resistance to chemotherapy at late stages and development of distant metastases. Overall survival is associated with the disease stage at the time of diagnosis, suggesting that early detection of disseminated disease may be of great significance. Due to the fact that current screening methods are highly invasive the discovery of a staging system based on molecular factors is considered to be critical. The application of molecular markers could have a prognostic and predictive significance and set the foundation of individualized therapy