title: Charakterisierung von humanen monoklonalen Antikörpern gegen humanes CD38
Creators: name: Schulz, Bastian
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2023
Subjects: subject: CD38
subject: Antikörper
subject: DDC Classification::6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften :: 61 Medizin und Gesundheit :: 610 Medizin und Gesundheit

description: Background and Aims: CD38 is a surface protein expressed on lymphoid and myeloid cells as well as on some non-hematopoietic cells. Due to its properties and its important role in tumor microenvironment, it has shaped up as a promising target structure for therapy of various diseases. Daratumumab, an antibody directed against CD38, is already successfully in clinical use for the treatment of multiple myeloma. The relevance of CD38 to a variety of other diseases and the potential use of corresponding therapeutics is subject of current research. The goal of this project was the characterization of new monoclonal antibodies against human CD38 already established in the Jäck group. These were established using the TEMMA (Trianni-Erlangen Mighty Mouse Antibody) platform, which is based on a genetically modified mouse in which all gene segments for the variable regions of the antibodies were exchanged for human sequences. Here specificity and affinity of the antibodies as well as induction of internalization and antibody-dependent cell-mediated phagocytosis were to be analyzed in comparison to clinically established Daratumumab. Finally, the sequences of the heavy and light chains of the respective monoclonal antibodies should be determined by sequencing the corresponding DNA regions. Material and Methods: The already established anti-CD38-producing hybridomas were expanded and the antibodies were purified by affinity chromatography (IgG) or ammonium sulfate precipitation (IgA). Concentration and purity were tested by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Coomassie staining. Subsequently flow cytometric analyses of specificity, affinity as well as induction of internalization and cellular phagocytosis were performed. As CD38-positive cells the human Burkitt-lymphoma-line Daudi, as CD38-negative control the human myeloma-line U266 were used. For some experiments antibodies were labelled directly with the fluorescent dye Alexa 647. To sequence the gene region of the antibody chains, RNA was isolated from the hybridomas and transcribed to cDNA. This was amplified by PCR and, after cloning in E. coli, sequenced. Results: CD38-specificity was confirmed for all eight monoclonal antibodies tested (7 IgG, 1 IgA). Three clones were labelled with Alexa 647 for further analysis and showed high affinity for CD38, with a dissociation constant which corresponds in magnitude to that of Daratumumab. These clones also, after antigen binding, caused internalization of CD38 to different extent, partly more strongly than Daratumumab. Furthermore, it was shown that all tested IgG clones induced cellular phagocytosis by murine macrophages after binding to Daudi cells. The sequencing of the variable heavy and light chains of six antibodies confirmed that they have different but fully human V-regions. Conclusions: The antibodies characterized in this project contain complete human V- and complete murine C-regions and bind specifically to CD38 with affinity constants similar to those of clinically used Daratumumab. Because of their structure with murine constant regions, they are especially suitable for further research in cell culture or mouse models. Potential further development for clinical use requires in vivo - analyses in animal models and the exchange of murine constant regions by human sequences. Overall, this work contributes to further investigation of molecular processes and consequently to the development of new therapies for a variety of CD38-associated disease entities.
description: Hintergrund und Ziele: CD38 ist ein Oberflächenprotein, welches auf lymphoiden und myeloiden Zellen sowie auf einigen nicht-hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. Aufgrund seiner Eigenschaften und seiner Bedeutung im Tumormikromilieu hat es sich als vielversprechende Zielstruktur für die Therapie verschiedener Erkrankungen herausgestellt. Mit Daratumumab befindet sich bereits ein gegen CD38 gerichteter Antikörper erfolgreich im klinischen Einsatz zur Therapie des Multiplen Myeloms. Die Bedeutung von CD38 bei einer Vielzahl anderer Erkrankungen und der potenzielle Einsatz entsprechender Therapeutika ist Gegenstand aktueller Forschung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung neuer, in der Arbeitsgruppe Jäck bereits etablierter, monoklonaler Antikörper gegen humanes CD38. Diese wurden mittels der TEMMA (Trianni-Erlangen Mighty Mouse Antikörper)-Plattform generiert, welche auf einer genetisch modifizierten Maus basiert, in der alle Gensegmente für die variablen Regionen der Antikörper durch menschliche Sequenzen ersetzt wurden. Es sollten hierbei, im Vergleich mit dem klinisch etablierten Daratumumab, die Spezifität und Affinität der Antikörper sowie die Induktion von Internalisierung und antikörpervermittelter Phagozytose analysiert werden. Abschließend sollten die Sequenzen der schweren und leichten Ketten der jeweiligen monoklonalen Antikörper über Sequenzierung der entsprechenden DNA-Bereiche bestimmt werden. Material und Methoden: Die bereits etablierten anti-CD38-produzierenden Hybridome wurden expandiert und die Antikörper mittels Affinitätschromatographie (IgG) bzw. Ammoniumsulfatfällung (IgA) aufgereinigt. Konzentration und Reinheit wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung überprüft. Es folgten die durchflusszytometrischen Analysen von Spezifität, Affinität sowie der Induktion von Internalisierung und zellulärer Phagozytose. Als CD38-positive Zellen dienten die humane Burkitt-Lymphom-Linie Daudi, als CD38-negative Kontrolle die humane Myelom-Linie U266. Für einige Versuche wurden Antikörper direkt mit dem Fluoreszenzfarbstoff Alexa 647 markiert. Zur Sequenzierung der Genregion der Antikörperketten wurde RNA aus den Hybridomen isoliert und in cDNA transkribiert. Diese wurde mittels PCR amplifiziert und nach Klonierung in E. coli sequenziert. Ergebnisse: Für alle acht getesteten monoklonalen Antikörper (7 IgG, 1 IgA) wurde die CD38-Spezifität bestätigt. Drei Klone wurden für weitere Untersuchungen mit Alexa 647 markiert und zeigten sich hochaffin für CD38 mit einer Dissoziationskonstanten, welche größenordnungsmäßig der von Daratumumab entspricht. Diese Klone bewirkten außerdem nach Antigenbindung eine Internalisierung von CD38, welche teilweise stärker ausgeprägt war als bei Daratumumab. Weiterhin wurde gezeigt, dass alle getesteten IgG Klone nach Bindung an Daudi-Zellen zellvermittelte Phagozytose durch Maus-Makrophagen induzieren. Die Sequenzierung der variablen schweren und leichten Ketten von sechs Antikörpern bestätigte, dass diese verschiedene, aber komplett menschliche V-Regionen besitzen. Schlussfolgerungen: Die in dieser Arbeit charakterisierten Antikörper enthalten vollständig menschliche V- und vollständig murine C-Regionen und binden spezifisch an CD38 mit Affinitätskonstanten ähnlich der des im klinischen Einsatz befindlichen Daratumumab. Aufgrund ihres Aufbaus mit murinen konstanten Regionen eignen sie sich insbesondere unmittelbar für weitere Untersuchungen in der Zellkultur oder im Mausmodell. Für eine potenzielle Weiterentwicklung zum klinischen Einsatz bedarf es der in vivo - Testung im Tiermodell und dem Austausch der murinen konstanten Regionen durch menschliche Sequenzen. Insgesamt leistet die vorliegende Arbeit damit einen Beitrag zur weiteren Erforschung molekularer Vorgänge und letztlich zur Entwicklung neuer Therapien für eine Vielzahl von CD38-assoziierten Krankheitsentitäten.