title: Investigating membrane diffusion and endocytosis at the subcellular level with a microfluidic paintbrush
Creators: name: Holler, Cornelia
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024

description: In the life sciences, the focus in recent years has increasingly shifted towards single-cell-based research to investigate basic cellular functions as well as pathogenic processes. This shift has enabled the detection of profound heterogeneities at the cellular level, manifesting as differences in gene expression, molecular composition and function. Additionally, significant variations in the constituents and properties of the plasma membrane, the outermost structure of every living cell, have been observed both across an individual cell and between cells. These heterogeneities remain obscured in ensemble measurements, which examine entire cell cultures simultaneously, thereby affecting the interpretation of functional studies of crucial cellular processes, such as endocytosis. One particular example is the uptake mechanism of the Transferrin Receptor and the role the cytoskeleton plays in this process. Despite extensive research on this system, the organization and dynamic interactions between receptor molecules and proteins of the endocytic machinery remain active areas of investigation. Various techniques have emerged to detect cellular heterogeneities, including methodologies for sequencing the genome or transcriptome of single cells. However, technologies enabling the precise delivery of experimental reagents, such as chemicals or optical labels, to the surfaces and the extracellular space of individual cells are still underdeveloped. Traditional ensemble experiments, where reagents are added to the culture medium and distributed by diffusion, lack the control over where, when and how much reagents an individual cell is exposed to. This control is necessary, for example, to study how virus particles spread from cell to cell, starting from a single infected cell. Existing technologies for controlled reagent delivery to individual cells and sub-regions suffer from several drawbacks, including complex sample preparation procedures or lacking compatibility with a wide range of experimental materials, limiting their use in biology-oriented laboratories. To address this technological gap, I have developed a microfluidic tool called the Picoperfuser, which is capable of delivering various reagents, chemicals and bioparticles to the immediate vicinity of a cell, termed the `near-field', in a contact-free manner. Due to the gentle nature of this interaction with the cell, the reagent transfer is referred to as `Microkiss' (short µkiss). Utilizing two glass micropipettes, the tool exploits the concept of hydrodynamic flow confinement, and enables reagent delivery with microscopic spatial and millisecond temporal resolution. After a critical characterization of the Picoperfuser's performance, I applied µkiss reagent delivery to investigate fundamental cellular processes at the single-cell and subcellular levels, focusing on membrane-located processes. This included studying the diffusive behavior and spatial organization of selected membrane components, such as the Transferrin receptor, as well as the process of clathrin-mediated endocytosis. Finally, the dynamics of intracellular structures, such as the cytoskeleton, were examined to gain deeper insights into the interplay of these fundamental cellular components.
description: In den Biowissenschaften hat sich der Schwerpunkt in den letzten Jahren zunehmend auf die Erforschung einzelner Zellen verlagert, um grundlegende zelluläre Funktionen sowie pathogene Prozesse zu untersuchen. Diese Verlagerung hat es ermöglicht, signifikante zelluläre Heterogenitäten in Bezug auf Genexpression, molekulare Komposition und Funktion zu entschlüsseln. Darüber hinaus wurden erhebliche Unterschiede in den Komponenten und Eigenschaften der Plasmamembran, der äußersten Struktur jeder lebenden Zelle, sowohl innerhalb einer einzelnen Zelle als auch zwischen verschiedenen Zellen festgestellt. Diese Heterogenitäten bleiben in Ensemble-Messungen, bei denen ganze Zellkulturen simultan untersucht werden, oft unentdeckt und erschweren so die Interpretation von Studien wichtiger zellulärer Prozesse wie der Endozytose. Ein besonderes Beispiel ist der Aufnahmemechanismus des Transferrin-Rezeptors und die Rolle des Zytoskeletts in diesem Prozess. Trotz umfangreicher Forschungsarbeiten zu diesem System sind die räumliche Organisation und die dynamischen Interaktionen zwischen Rezeptormolekülen und Proteinen der endozytotischen Maschinerie noch immer Gegenstand aktiver Untersuchungen. Während verschiedene Techniken zum Nachweis zellulärer Heterogenität, einschließlich Methoden zur Sequenzierung des Genoms oder Transkriptoms einzelner Zellen, bereits entwickelt wurden, sind Technologien, die eine präzise Applikation von experimentellen Reagenzien wie Chemikalien oder optischen Markern auf die Oberfläche einzelner Zellen ermöglichen, noch unterentwickelt. Bei herkömmlichen Ensemble-Experimenten, in welchen die zu untersuchenden Reagenzien durch Diffusion im Kulturmedium verteilt werden, fehlt die Kontrolle darüber, wo, wann und welcher Menge an Reagenzien eine einzelne Zelle ausgesetzt wird. Studien, wie sich beispielsweise Viruspartikel während einer Infektion von Zelle zu Zelle ausbreiten, mit einer einzigen infizierten Zelle als Ausgangspunkt, sind mit diesem Versuchsansatz nicht möglich. Bestehende Technologien für den kontrollierten Transfer von Reagenzien auf einzelne Zellen und mikrometergroße Subregionen haben verschiedene Nachteile, darunter aufwändige Probenvorbereitungen oder eine mangelnde Kompatibilität mit einer Vielzahl von Versuchsmaterialien, was ihren Einsatz in biologisch orientierten Laboren bislang einschränkt. Um diese technologische Lücke zu schließen, habe ich ein auf Mikrofluidik basierendes Instrument, den Picoperfuser, entwickelt, mit welchem verschiedene Reagenzien, Chemikalien und Biopartikel berührungslos in die unmittelbare Umgebung einer Zelle, das sogenannte ``Nahfeld'', gebracht werden können. Aufgrund der schonenden Art dieser Interaktion mit der Zelle wird der Reagenztransfer als ``Microkiss'' (kurz µkiss) bezeichnet. Mit Hilfe von zwei Glasmikropipetten wird das Konzept der hydrodynamischen Strömungsbegrenzung realisiert und ermöglicht den Reagenzientransfer mit mikroskopischer räumlicher und zeitlicher Auflösung im Millisekundenbereich. Nach umfangreicher Charakterisierung des Picoperfusers habe ich µkiss zur Untersuchung grundlegender zellulärer Prozesse auf Einzelzell- und subzellulärer Ebene mit Schwerpunkt auf membranständigen Prozessen angewandt. Dazu gehörte die Untersuchung des Diffusionsverhaltens und der räumlichen Organisation ausgewählter Membrankomponenten, wie z.B. des Transferrin-Rezeptors, sowie des Prozesses der Clathrin-vermittelten Endozytose. Schließlich wurde auch die Dynamik intrazellulärer Strukturen wie des Zytoskeletts untersucht, um tiefere Einblicke in das Zusammenspiel dieser grundlegenden zellulären Komponenten zu gewinnen.