title: Charakterisierung von Modulationsmechanismen der Kv1-Ionenkanalfamilie: Lipidsensitivität, RNA Editierung und Inaktivierungspartikel
title: Characterization of modulatory mechanisms of the Kv1 ion channel family: lipid sensitivity, RNA editing and inactivation particles
Creators: name: Streit, Anne-Kathrin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Epilepsie
Inaktivierung
RNA editing
Naturwissenschaften
Blockade
Channel transport
Lipide
Kaliumkanal
Epilepsy
Elektrophysiologie
Modifikation
Pharmakologie
Kanaltransport
RNA Editierung
Pharmacology

description: Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle
      (Kv-Kanäle) sind an der Regulation neuronaler und kardialer
      Aktivität beteiligt. Sie öffnen bei Depolarisation der Zelle
      und leiten unter physiologischen Bedingungen
      Kaliumauswärtsströme, wodurch sie zur Repolarisation
      beitragen. Kv-Kanäle modulieren die Dauer von
      Aktionspotentialen und die Erregbarkeit der Zellen.
      Verschiedene Regulationsmechanismen können die Kanalfunktion
      beeinflussen. Zu den physiologischen Regulationsmechanismen
      gehören unter anderem die durch endogene mehrfach
      ungesättigte Lipide induzierte Inaktivierung von Kv-Kanälen,
      die RNA Editierung des Kv1.1-Kanals, welche zu einem
      Austausch von Isoleucin gegen Valin innerhalb der zentralen
      Pore führt sowie die Inaktivierung durch akzessorische
      Untereinheiten. Sowohl der zugrunde liegende Mechanismus der
      durch Lipide induzierten Inaktivierung als auch die Folgen
      der Kv1.1 RNA Editierung sind bisher nur ansatzweise bekannt
      und wurden in der hier vorliegenden Arbeit genauer
      untersucht. Zudem wurde die Konformation des
      Inaktivierungspartikels der akzessorischen
      Kvβ1.3-Untereinheit und die Regulation der durch sie
      eingeführten A-Typ Inaktivierung analysiert. Zunächst wurde
      der Mechanismus der Inaktivierung durch endogene Lipide wie
      Arachidonsäure, Docosahexaensäure und Anandamid anhand
      verschiedener Methoden untersucht. Die Charakteristika der
      Inaktivierung wie Kinetik, Kompetition mit dem Porenblocker
      TEA und Beeinflussung durch Mutationen in der zentralen Pore
      sowie die in silico Modelle zeigen, dass eine physikalische
      Blockade der offenen Kanalpore den wahrscheinlichsten
      Mechanismus der Inhibition durch Lipide darstellt.
      Untersuchungen der funktionellen Folgen der Kv1.1 RNA
      Editierung ergaben, dass editierte Kanäle eine verminderte
      Sensitivität gegenüber Porenblockern aufweisen. Dazu zählen
      sowohl die Substanzen 4-Aminopyridin (4-AP) und Psoralen-4,
      welche experimentell und klinisch genutzt werden, als auch
      die in dieser Studie neu als Porenblocker identifizierten
      Lipide und deren verwandte Substanzen. Zudem konnte gezeigt
      werden, dass editierte Kv1.1-Untereinheiten durch
      Heteromerisierung die Pharmakologie und Lipidsensitivität
      aller Kv1-Kanäle modulieren können. Im Rahmen der
      funktionellen Charakterisierung von editierten Kv1.1-Kanälen
      wurde in verschiedenen Expressionssystemen eine Verringerung
      der Stromgröße als Folge der Editierung beobachtet. Daraufhin
      wurde die molekulare Grundlage dieser Stromverringerung
      untersucht. Messungen auf Einzelkanal- und Ganzzellebene
      sowie Quantifizierung der Proteinmenge ergaben, dass die
      Editierung weder Veränderungen im Öffnungs- und
      Schließverhalten noch in der Gesamtmenge der Kanalproteine
      zur Folge hat. Es konnte jedoch eine signifikant verminderte
      Oberflächenexpression der editierten
      Kv1.1-Kanaluntereinheiten nachgewiesen werden, die
      wahrscheinlich für den geringeren Gesamtstrom verantwortlich
      ist. Diese Ergebnisse beschreiben erstmals eine Modulation
      des intrazellulären Transportes der Kv1.1-Kanaluntereinheiten
      durch RNA Editierung. Eine pathophysiologische Relevanz der
      RNA Editierung des Kv1.1-Kanals wird in Zusammenhang mit dem
      Krankheitsbild der Epilepsie vermutet. Eine Quantifizierung
      der Kv1.1 Editierungsrate im entorhinalen Cortex chronisch
      epileptischer Ratten des Kainat-induzierten Tiermodells
      zeigte eine erhöhte Editierungsrate im Vergleich zu gesunden
      Kontrolltieren. Die epileptischen Tiere zeichnen sich durch
      eine Resistenz gegenüber 100 µM des iktogenen
      Kv-Kanalblockers 4-AP aus, einer Konzentration, die in
      gesunden Kontrolltieren epileptiforme Potentiale auslöst. In
      der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der erhöhten
      Editierungsrate auf diese Konzentration an 4-AP anhand
      elektrophysiologischer Versuche im Expressionssystem
      untersucht. Während eine Beeinflussung des Zeitverlaufes oder
      der Spannungsabhängigkeit des 4-AP Blocks durch die
      beobachtete Erhöhung der Editierungsrate ausgeschlossen
      werden konnte, wurde eine signifikante Verminderung der 4-AP
      Sensitivität festgestellt. Diese, auf der erhöhten
      Editierungsrate beruhende, verminderte 4-AP Sensitivität von
      Kv1-Kanälen liegt vermutlich der veränderten 4-AP
      Sensitivität der epileptischen Tiere zugrunde. Neben der RNA
      Editierung wurden im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit
      Aspekte der Inaktivierung von Kv1-Kanälen untersucht.
      Kvβ1-Untereinheiten können nach Assoziation mit Kv1-Kanälen
      eine schnelle A-Typ Inaktivierung hervorrufen. Anhand
      elektrophysiologischer Versuche und Molecular Modelling wurde
      die Konformation bzw. der Bindungsmodus des
      Inaktivierungspartikels der Kvβ1.3-Untereinheit analysiert.
      Die Ergebnisse zeigen, dass der Kvβ1.3-Inaktivierungspartikel
      während der Bindung innerhalb der zentralen Pore des
      Kv1.5-Kanals am wahrscheinlichsten in einer
      Haarnadelkonformation vorliegt und die Inaktivierung durch
      Phosphoinositide reguliert werden kann.
description: Voltage-gated potassium channels
      (Kv-channels) participate in the regulation of neuronal and
      cardiac activity. They open upon depolarization of the cell
      and conduct potassium outward currents under physiological
      conditions, thus contributing to repolarization. Kv-channels
      modulate action potential duration and cell excitability.
      Different regulatory mechanisms can influence channel
      function. Amongst others, the physiological regulatory
      mechanisms include inactivation of Kv-channels induced by
      endogenous lipids, the RNA editing of the Kv1.1-channel,
      which leads to an exchange of isoleucine for valine within
      the central pore, as well as inactivation induced by
      accessory subunits. The underlying mechanism for
      lipid-induced inactivation and the consequences of Kv1.1 RNA
      editing are only partly understood and were examined in more
      detail in the present study. Furthermore, the structure of
      the inactivation particle of the accessory Kvβ1.3-subunit and
      the regulation of inactivation by this subunit were analyzed.
      First, the mechanism of channel inhibition by endogenous
      lipids like arachidonic acid, docosahexaenoic acid and
      anandamide was analyzed with the help of different methods.
      The characteristics of the inactivation such as kinetics,
      competition with the pore blocker TEA and influence by
      mutations in the central pore as well as the in silico models
      suggest that a physical occlusion of the open channel pore is
      the most likely mechanism for channel inhibition by lipids.
      Examination of the functional consequences of Kv1.1 RNA
      editing showed that edited channels exhibit a reduced
      sensitivity to pore blockers. This applies to the substances
      4-Aminopyridine (4-AP) and Psoralen-4, which are used for
      experimental and clinical purposes, as well as to the lipids
      and related substances that have been newly identified as
      pore blockers in this study. Furthermore, it could be
      demonstrated that edited Kv1.1 subunits can modulate the
      pharmacology and lipid sensitivity of all Kv1-channels
      through heteromerization with other Kv1 channel subunits. In
      the course of the functional characterization of edited
      Kv1.1-channels a reduced current amplitude due to the editing
      was observed in different expression systems. Thereupon, the
      molecular correlates of this current reduction were
      investigated. Recordings on single-channel and whole-cell
      level and quantification of protein amount revealed that the
      editing does not cause changes neither in gating nor in the
      total amount of channel protein. However, a significantly
      diminished surface expression of edited Kv1.1-channel
      subunits could be detected, which is likely to be responsible
      for the reduced total current. These results describe for the
      first time a modulation of intracellular transport of
      Kv1.1-channel subunits by RNA editing. A pathophysiological
      relevance of Kv1.1 RNA editing is assumed in the context of
      epilepsy. A quantification of the extent of Kv1.1 editing in
      the entorhinal cortex of chronic epileptic rats from the
      kainic acid induced animal model showed an increased editing
      ratio in comparison to healthy control animals.
      Characteristic of epileptic animals is a resistance to 100 µM
      of the ictogenic Kv-channel blocker 4-AP, a concentration
      that induces epileptiform potentials in healthy control
      animals. In the present work, the effects of the increased
      editing ratio on this 4-AP concentration were examined in
      electrophysiological experiments in an expression system.
      While any influence of the observed increase in editing ratio
      on the time course or voltage-dependence of 4-AP block could
      be ruled out, a significant reduction of 4-AP sensitivity was
      detected. This reduced 4-AP sensitivity of Kv1-channels which
      is caused by the elevated editing ratio is presumably the
      basis of the altered 4-AP sensitivity of epileptic animals.
      Furthermore, aspects of the inactivation of Kv1-channels were
      examined in the course of this study. Kvβ1-subunits can
      induce fast A-type inactivation when attached to
      Kv1-channels. The conformation (or rather the binding mode)
      of the inactivation particle of the Kvβ1.3-subunit was
      analyzed by means of electrophysiological experiments and
      molecular modelling. The results suggest that the Kvβ1.3
      inactivation particle most probably adopts a hairpin
      conformation when bound within the central pore of the
      Kv1.5-channel. Moreover, I could show that the Kvβ1.3-induced
      inactivation can be regulated by phosphoinositides.