title: Characterisation of bovine testicular hyaluronidase and a hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae. Investigations on the effect of pH on hyaluronan degradation and preclinical studies on the adjuvant administration of the enzymes in cancer chemotherapy
Creators: name: Hoechstetter, Julia
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2005
Subjects: subject: Hyaluronidasen , Enzymologie , pH-Profile , spreading factor , Hyaluronsäure-Analytik , hyaluronidases , enzymology , pH profiles , spreading factor , hyaluronan analytics
subject: 540 Chemie

description: Pharmaceutical preparations of bovine testicular hyaluronidase (BTH) have been therapeutically applied in several medical fields for many years. In the context with the risk of BSE, companies stopped the production of BTH preparations resulting in a shortage of this drug, which is the only highly effective antidote in the treatment of extravasations of vinca alkaloids. To find a substitute for the poorly characterised BTH preparations, two BTH preparations (Neopermease®; Hylase® �Dessau�) and a hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae (HyL) were compared with respect to purity (composition) and enzyme activity. The BTH preparations were complex mixtures of proteins (SDS-PAGE, gel filtration) with enzymatic activity in different fractions. Using the Morgan-Elson assay (colorimetric assay, CA) in the case of Neopermease® the highest specific activity was found in the 58 kDa fraction (optimum at pH 3.6), whereas the 77 kDa and 33 kDa fractions showed markedly lower specific activities at an optimal pH of 6.2. Both BTH preparations were characterised by almost identical though complex pH profiles showing activity over a broad range (pH 3 � 8; maximum at pH 3.6). Maximum specific activity of the bacterial enzyme (approx. 1000 µmol*min-1*mg-1) was found at pH 5.0, being 410 times and 5100 times higher compared to Neopermease® and Hylase® �Dessau�, respectively. The HyL preparation was separated into two main proteins (100 kDa (pI = 8.9) and 85 kDa (pI = 9.2)) which were enzymatically active in SDS substrate-PAGE. In preclinical in vitro and in vivo studies it was investigated if HyL may serve as a substitute for BTH as activity enhancer in cancer chemotherapy. In contrast to BTH, HyL did neither enhance the efficacy of regional chemotherapy of human malignant melanoma, implanted in nude mice, nor improve the intratumoral accumulation of peritumorally injected chemotherapeutics, although HyL was administered at concentrations yielding in the CA 150 to 300 times higher activity compared to the activity applied in the corresponding experiments with Neopermease®. The apparent discrepancy between the activities in the CA, which detects the release of N-acetylglucosamine (NAG) end groups, and the observed spreading effect (viscosity reduction of the extracellular matrix), may be explained by the different mechanisms of HA degradation by HyL and BTH: while in case of BTH (endolytic action) every cleavage step may be conducive to viscosity reduction, the processive release of disaccharides catalysed by HyL may reduce the viscosity rather ineffectively. To test this hypothesis, Neopermease® and HyL were compared with respect to their activity in a turbidimetric assay (TA) and a viscosimetric assay (VA). Indeed, in the TA and the VA the activity of HyL was relatively low compared to its high activity in the CA, which may partly explain the observation that the HyL did not show the desired spreading effect. The turbidimetrically determined pH activity profile of HyL was in good agreement with the results of the CA (maximum at pH 5.0). By contrast, in case of BTH the pH profile obtained in the TA, showing maximum activity at pH 6.0, was almost inverted compared to the pH profile obtained in the CA (maximum at pH 3.6). Comparison of the isolated enzymatically active proteins contained in Neopermease® with respect to their activity in both assays revealed that the main 58 kDa fraction showed the highest specific activity in both assays and gave the inverse profiles typical for the whole preparation. The turbidimetrically obtained pH profile of Neopermease® was confirmed by viscosimetry. Anion exchange HPLC analysis of the oligosaccharide mixtures produced by HA digestion with Neopermease® at various pH values suggests that the pH optima of BTH in the different assays may be explained as follows: after an incubation time of 1 h (incubation time used for the determination of the pH activity profiles) HA degradation at pH 3.6 yielded a considerably higher amount of short oligosaccharides than incubation at pH 6.0, which explains the pH profile of the CA. Although at pH 6.0 the formation of short oligosaccharides was relatively low after 1 h of incubation, HA was degraded to HA fragments, which are not precipitated in the TA. Assuming that at pH 3.6 oligosaccharides are preferentially generated in the presence of high molecular mass HA, whereas at pH 6.0 all types of molecules of the polydisperse substrate are processed to the same extent, the higher activity detected in the TA and the VA at pH 6.0 can be explained regardless of the higher rate of NAG formation detected in the CA at pH 3.6. Investigations on HA degradation by HyL with respect to the effect of pH on the kinetic parameters Vmax and Km suggest that the enzyme shows lower affinity to the substrate at pH 7.4 than at pH 5.0. This may explain the higher activity observed for a number of inhibitors of the enzyme at pH 7.4 compared to pH 5.0.
description: Arzneimittel mit boviner testikulärer Hyaluronidase (BTH) als wirksamer Bestandteil wurden therapeutisch erfolgreich eingesetzt. Wegen der TSE-Problematik wurde die Produktion dieser Medikamente eingestellt, so dass es, trotz großer Nachfrage, insbesondere als hochwirksames Antidot bei Paravasaten (Vincaalkaloide), zu einem Engpass an BTH-Präparaten kam. Obwohl BTH-Präparate in der Klinik lange verwendet werden, sind sie bezüglich Zusammensetzung und enzymatischer Eigenschaften wenig charakterisiert. Deshalb wurden zwei BTH-Präparate (Neopermease®; Hylase® �Dessau�) und als Alternative eine Hyaluronat-Lyase aus Streptococcus agalactiae (HyL) verglichen. Die BTH-Präparate erwiesen sich als komplexe Proteingemische (SDS-PAGE, Gelfiltration) mit Enzymaktivität in verschiedenen Fraktionen. Im Morgan-Elson Assay (kolorimetrischer Assay, KA) wurde für Neopermease® die höchste spezifische Aktivität in der 58 kDa-Fraktion (Optimum bei pH 3.6) gefunden, während die 77 kDa- und die 33 kDa-Fraktion deutlich niedrigere spezifische Aktivitäten (Optimum bei pH 6.2) aufwiesen. Beide BTH-Präparate sind durch nahezu identische, komplexe pH-Profile mit Aktivität über einen breiten pH-Bereich charakterisiert (pH 3 - 8; Maximum bei pH 3.6). Die HyL zeigte maximale spezifische Aktivität (ca. 1000 µmol*min-1*mg-1) bei pH 5.0 und erwies sich als 410- bzw. 5100-fach aktiver im Vergleich zu Neopermease® und Hylase® �Dessau�. Das HyL-Präparat wurde in 2 Hauptkomponenten (100 kDa (pI = 8.9) und 85 kDa (pI = 9.2)) aufgetrennt, und deren Enzymaktivität mittels Zymographie detektiert. In präklinischen In-vitro- und In-vivo-Studien wurde untersucht, ob HyL einen möglichen Ersatz für BTH als �activity enhancer� in der regionalen Krebschemotherapie darstellt. Obwohl die applizierten HyL-Konzentrationen, verglichen mit den in analogen Experimenten eingesetzten Neopermease®-Konzentrationen, im KA eine 150- bis 300-fach höhere Aktivität aufwiesen, erhöhte HyL im Gegensatz zu BTH weder die Wirksamkeit der Chemotherapie humaner maligner Melanome, welche in Nacktmäuse implantiert worden waren, noch die intratumorale Anreicherung der peritumoral injizierten Zytostatika. Die Diskrepanz zwischen der Aktivität im KA (Detektion der Freisetzung von N-Acetylglucosamin (NAG) - Endgruppen), und dem beobachteten �spreading effect� (Viskositätsminderung der extrazellulären Matrix), resultiert möglicherweise aus den unterschiedlichen Mechanismen des HA-Abbaus durch HyL und BTH: während im Fall von BTH (endolytischer Angriff) jeder Spaltschritt zu einer Viskositätserniedrigung beiträgt, reduziert die von HyL katalysierte prozessive Abspaltung von Disacchariden die Viskosität u. U. weniger effektiv. Zur Prüfung dieser Hypothese wurden die Aktivitäten von Neopermease® und HyL in einem turbidimetrischen (TA) und einem viskosimetrischen Assay (VA) verglichen. Tatsächlich erwies sich die Aktivität der HyL im TA und im VA als relativ gering im Vergleich zu ihrer hohen Aktivität im KA, was das Ausbleiben des erwünschten �spreading effect� durch HyL teilweise erklärt. Das turbidimetrisch bestimmte pH-Profil von HyL entspricht dem im KA ermittelten pH-Profil (Maximum bei pH 5.0). Dagegen weist im Fall von BTH das pH-Profil des TA (Maximum bei pH 6.0) eine nahezu spiegelbildliche Form zum pH-Profil des KA (Maximum bei pH 3.6) auf. Ein Vergleich der Aktivitäten der isolierten enzymatisch aktiven Proteine aus Neopermease® ergab, dass die 58 kDa-Hauptfraktion in beiden Assays die höchste spezifische Aktivität aufwies und die für das Gesamtpräparat typischen inversen pH-Profile zeigte. Das im TA ermittelte pH-Profil von Neopermease® wurde mittels Viskosimetrie bestätigt. Die Analyse der nach HA-Verdau mit Neopermease® bei verschiedenen pH-Werten gebildeten Oligosaccharid-Mischungen mittels Anionenaustausch-HPLC legt folgende Erklärung für die pH-Optima von BTH in den verschiedenen Assays nahe: nach einer Inkubationszeit von 1 h (Inkubationszeit zur Bestimmung der pH-Profile) ergab der HA-Verdau bei pH 3.6 eine wesentlich größere Menge an Oligosacchariden als der Verdau bei pH 6.0, was das pH-Profil im KA erklärt. Obwohl bei pH 6.0 nach 1 h Inkubation die Bildung von Oligosacchariden relativ gering war, wurde HA zu Fragmenten abgebaut, die im TA nicht ausgefällt werden. Unter der Annahme, dass bei pH 3.6 bevorzugt niedermolekulare HA in Anwesenheit von hochmolekularer HA zu Oligosacchariden abgebaut wird, während bei pH 6.0 alle Moleküle des polydispersen Substrats in gleichem Ausmaß verdaut werden, kann die höhere Aktivität bei pH 6.0 im TA und im VA erklärt werden - trotz der im KA detektierten schnelleren Freisetzung von NAG bei pH 3.6. Untersuchungen zum HA-Abbau durch HyL bzgl. des Einflusses des pH-Werts auf die kinetischen Parameter Vmax und Km ergaben, dass das Enzym bei pH 7.4 eine niedrigere Substrataffinität aufweist als bei pH 5.0. Dies erklärt die für eine Reihe von Inhibitoren des Enzyms beobachtete höhere Hemmwirkung bei pH 7.4 im Vergleich zu pH 5.0.