title: Characterization of RhoA-mutations in cancer
Creators: name: Koch, Lisa Maria
Publisher: name: :none
Year: 2018

description: Der Fortschritt im Bereich des "Next-Generation Sequencing" über die letzten Jahre ermöglichte die Identifikation von genetischen Veränderungen, die mit der Entstehung von häufigen Krebsarten assoziiert sind. Obwohl 25% aller Krebserkrankungen von seltenen Krebstypen eingenommen werden, wurde die genetische Charakterisierung dieser Krebsarten weitgehend vernachlässigt und es ist wenig über deren Pathogenese bekannt. Durch Sequenzieren von Patientenproben von zwei seltenen Hauttumoren (mikrozystisches Adnexalkarzinom (MAK) und desmoplastisches Trichoepitheliom (DTE)) identifizierten wir eine häufige, heterozygote Punktmutation im Gen der GTPase Ras homolog gene family member A (RhoA). Die Herstellung von Modellsystemen in vitro erlaubte eine Charakterisierung der Phänotypen, die mit der Mutation assoziiert sind und das Identifizieren von den zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Wir zeigen, dass die RhoA-G17E-Mutation morphologische und funktionelle Eigenschaften von Zellen verändert und ihnen ein tumorerzeugendes Potential verleiht. Dieser Hypothese gehen wir gegenwärtig, mit der Generierung eines in vivo Mausmodels nach. Mittels Immunpräzipitation und Massenspektrometrie identifizieren wir eine starke Bindung zwischen RhoA-G17E und guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Damit assoziiert, fanden wir heraus, dass es sich bei RhoA-G17E um eine dominant negative Mutante handelt, indem es GEFs besetzt und diese an der Aktivierung des Wildtypprotein hindert. Des Weiteren konnten wir eine Verbindung zwischen RhoA und dem Tumorsuppressor CYLD herstellen, der eine Rolle in der Tumorgenese von Trichoepitheliomen spielt, welche histologische Ähnlichkeiten mit MAK und DTE aufweisen. Obwohl weitere Untersuchungen notwendig sind um diese Hypothese zu verstärken, kann dieser Link zu einem besseren Verständnis der zugrundeliegenden, molekularen Mechanismen dieser Tumorsubtypen betragen.
description: In recent years, extensive efforts have been undertaken to establish a catalog of genetic aberrations involved in the formation and progression of common cancer types. These endeavors improved our ability to diagnose cancer and treat patients with drugs specifically targeting mutations responsible for driving malignancy. Although rare cancers account up to 25% percent of all cancer diagnoses, their genomic landscapes remain poorly characterized. Targeted sequencing of patient samples from two rare skin cancer types, microcystic adnexal carcinoma (MAC) and desmoplastic trichoepithelioma (DTE), patient samples revealed a heterozygous hotspot mutation in the Ras homolog gene family member A (RhoA) gene with a prevalence of 65%, altering the amino acid sequence from glycine 17 to glutamic acid (G17E). RhoA acts as a molecular switch and is involved in a multitude of cellular processes, including cell division and migration. The aim of this thesis was to dissect phenotypic changes induced by this mutation, identify its role in tumor formation and unravel the underlying molecular mechanism. The generation of several cell line models including overexpression and CRISPR/Cas9-mediated site-directed mutagenesis at the endogenous locus allowed us to study the phenotypes induced by RhoA-G17E. We detected severe morphological perturbations of the cytoskeleton and RhoA-G17E-dependent enhancement of invasiveness in vitro. We are currently investigating the tumor-initiating capacity of RhoA-G17E in vivo, by introducing the mutation via lentiviral in utero injections, which allows for stable integration and propagation of RhoA-G17E by targeting undifferentiated embryonic epithelium. Using mass spectrometry, we detected that RhoA-G17E strongly binds to guanine nucleotide exchange factors (GEFs) required for GTP-binding and RhoA activation. We found that RhoA-G17E mutants act in a dominant-negative manner by sequestering GEFs within the cell, preventing RhoA-WT from binding GTP. Moreover, we uncovered a link between RhoA, a sequestered GEF and the tumor suppressor CYLD, which was previously implicated in trichoepithelioma (TE), histologically related to DTE and MAC. Although, further investigations are required, this link may provide new insights into the molecular mechanisms underlying these tumor types.