title: Advancing the conversion of human induced pluripotent stem cells into functional microglia-like cells
Creators: name: Lanfer, Jonas
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: microglia
subject: stem cells
subject: Mikroglia
subject: Stammzellen

description: Mikroglia stellen die parenchymalen gewebsspezifischen Makrophagen im zentralen Nervensystem (ZNS) dar. Sie erfüllen wichtige Funktionen in der Entwicklung des Zentralnervensystems und initiieren darüber hinaus Entzündungsreaktionen im ZNS im Rahmen von Infektionen oder anderen neurologischen Erkrankungen. Die funktionelle Erforschung von Mikroglia ermöglicht daher sowohl wegweisende Erkenntnisse über Schlüsselmechanismen der ZNS-Entwicklung als auch über die Pathogenese zahlreicher ZNS-Erkrankungen und kann so Ausgangspunkte für therapeutische Strategien eröffnen. Über einen langen Zeitraum hing die funktionelle Erforschung von Mikroglia zu einem großen Teil von Nagersystemen, immortalisierten Zelllinien oder schwer zugänglichem humanem Hirngewebe ab. Da Humane- und Nagermikroglia jedoch sehr große Unterschiede hinsichtlich ihrer transkriptionellen Identität aufweisen, ist die Entwicklung einfach zugänglicher und möglichst physiologischer Quellen für humane Mikroglia unabdingbar für deren zukunftsfähige Erforschung. Mit der Möglichkeit zur Isolierung humaner Stammzellen (SZ) sowie der Generierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSZ) aus somatischen Zellen haben sich zahlreiche neue Möglichkeiten zur Generierung reifer humaner Zellen eröffnet. In den letzten Jahren wurden in diesem Zusammenhang zahlreiche Protokolle zur Generierung humaner Mikroglia-ähnlicher Zellen aus SZ oder iPSZ entwickelt. Diese Protokolle bringen jedoch allesamt hohe technische, experimentelle und infrastrukturelle Hürden mit sich und ermöglichen so nur eine limitierte Verfügbarkeit humaner Mikroglia-ähnlicher Zellen. Unser Ziel war es, ein optimiertes und einfach zugängliches Protokoll zur Generierung humaner Mikroglia-ähnlicher Zellen aus iPSZ zu entwickeln. In einem ersten Schritt überprüften wir dazu die Möglichkeit zur Erhöhung der Ausbeute von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) als Vorläufer der Mikrogliazellen. Um auch die zeitliche Flexibilität des Protokolls weiter zu erhöhen, prüften wir in zudem die Möglichkeit der Kryokonservierung der so entstandenen HSZ. Wir validierten diese Optimierungsschritte durch durchflusszytometrische sowie Fluoreszenzmikroskopie-basierte Analysen der Expression der Marker CD43 und CD45 für HSZ sowie IBA1 und TREM2 für Mikroglia. Darüber hinaus führten wir eine funktionelle Validierung der so generierten Mikroglia-ähnlichen Zellen durch, indem wir diese mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelten und nachfolgend deren inflammatorische Antwort mittels RNA-Sequenzierung analysierten. Wir verglichen dabei die inflammatorische Antwort unserer Mikroglia-ähnlichen Zellen mit bereits publizierten Daten von vergleichbaren Experimenten. In einem letzten Schritt charakterisierten wir den Einfluss unterschiedlicher Zellkulturuntergründe auf den Ertrag adhärenter Mikroglia-ähnlicher Zellen. Dabei nutzten wir die durchflusszytometrische Analyse der IBA1-Expression zur Beurteilung der Reinheit der erhaltenen Mikrogliazellkultur. Zur funktionellen Analyse nutzten wir die Phagozytose fluoreszierender bakterieller Partikel mittels Fluoreszenzmikroskopie. Darüber hinaus behandelten wir die Mikroglia-ähnlichen Zellen erneut mit LPS und quantifizierten die Expression der pro-inflammatorischen Gene Interleukin 1-β und Interleukin-6 über quantitative Polymerasekettenreaktion. Durch die aufgeführten Optimierungsschritte ist es uns gelungen, die Zahl der generierten HSZ deutlich zu erhöhen, ohne dabei die Reinheit der nachfolgend differenzierten Mikroglia-ähnlichen Zellen negativ zu beeinflussen. Mittels RNA-Sequenzierungsanalyse konnten wir bestätigen, dass die durch unser optimiertes Protokoll hergestellten Mikroglia-ähnlichen Zellen adäquat auf LPS als proinflammatorischen Stimulus reagieren. Die so charakterisierte inflammatorische Antwort war vergleichbar mit denen anderer publizierter Protokolle. Zusätzlich konnten wir belegen, dass die Ausreifung der HSZ zu Mikroglia-ähnlichen Zellen auf einem Glasuntergrund zu einer signifikant erhöhten Anzahl adhärenter Mikroglia-ähnlicher Zellen führt. Dabei hatte der Glasuntergrund keinen signifikanten Einfluss auf die Reinheit oder funktionelle Parameter der differenzierten Mikroglia-ähnlichen Zellen. Zusammenfassend wurde in der vorgelegten Arbeit ein optimiertes, skalierbares und zeitlich flexibles Protokoll zur Generierung Mikroglia-ähnlicher Zellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen entwickelt. Dieses Protokoll vereinfacht die Generierung humaner Mikroglia-ähnlicher Zellen deutlich und erhöht so die Zugänglichkeit dieser Zellen als in vitro Modell zur funktionellen Analyse humaner Mikroglia. Dadurch ergeben sich neue Möglichkeiten zur Charakterisierung humaner Mikroglia-spezifischer Funktionen im Rahmen der ZNS-Entwicklung oder zahlreicher Erkrankungen des ZNS.