SYMBIONTS TODAY, PROBIOTICS TOMORROW: MICROBE-BASED STRATEGY FOR IMPROVING HONEYBEE HEALTH
Creators: name: SANSONNO, LUIGI
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2014

description: Il pi� importante tra gli insetti impollinatori � l?ape, Apis mellifera, il quale svolge un ruolo fondamentale in molti raccolti orto-frutticoli ma anche contribuisce al mantenimento della biodiversit� delle colture selvatiche. Nelle ultime decadi � stata registrata una grossa moria di alveari in tutto il pianeta. Le cause di questo fenomeno non sono ancora state del tutto chiarite e sembra esserci alla base una interazione di fattori biotici e abiotici, come il largo uso di agrofarmaci (es. neonicotinoidi), patogeni, parassiti e i cambiamenti climatici che stressano la salute dell?animale. Negli ultimi anni le ricerche hanno dimostrato che i batteri simbionti sembrano essere determinanti nel proteggere la salute animale ma purtroppo il loro ruolo non � ancora stato studiato in modo approfondito. I simbionti sono dei microrganismi che stabiliscono delle forti interazioni con il loro animale ?ospite?, e tra questi anche gli insetti (compresa l?ape). Tali sono coinvolti in molti aspetti della fisiologia dell?ospite, come la nutrizione, la riproduzione, l?omeostasi delle difese immunitarie, svolgendo un ruolo fondamentale nell?evoluzione dell?ospite stesso. La manipolazione e l?utilizzo del microbiota batterico pu� essere utile per lo sviluppo di strategie per la gestione di problemi legati agli insetti. Infatti, questo approccio, generalmente definito come ?Microbial Resource Management? (MRM), � stato descritto anche come ?Symbiont Resource Management? (SMR), quando applicato ai simbionti. L?importanza dei commensali microbici dell?ape per il mantenimento e il miglioramento della salute dell?ape � il tema principale di questa tesi di dottorato. In particolare, questo studio ha come obiettivo, inizialmente, di approfondire la diversit� microbica associata all?apparato digerente delle api dell?area Mediterranea, la sua interazione con l?ospite e con un modello patogeno e, infine, sviluppare una strategia di biocontrollo basata sull?uso dei simbionti microbici cos� da migliorare la salute dell?ospite e non permettere lo sviluppo della malattia. Usando il patogeno Paenibacillus larvae, agente eziologico della Peste Americana (AFB), � stata determinata la capacit� di diversi batteri simbionti dell?ape in modo da verificare se possano co-esistere differenti attivit� sinergiche tra le varie classi batteriche nel preservare la salute dell?ape. L?AFB � una delle malattie pi� virulenti della larva dell?ape. E? stata identificata in numerose aree, provocando enormi perdite economiche, ma purtroppo sono ancora poche informazioni sulla diversit� del fattore eziologico. Settantacinque isolati di P. larvae ottenuti da larve sintomatiche e collezionate in differenti siti della Tunisia sono stati analizzati tramite test biochimici e sequenziamento del gene ribosomiale 16s. Tramite la metodologia della BOX-PCR, sono stati definiti dei profili specifici di P. larvae (comparandoli a quelli di altre specie di Paenibacillus) e che possono essere utili per la loro identificazione. Alcune bande, specifiche di P.larvae, possono rappresentare dei nuovi modelli molecolari per la identificazione delle specie. Il pattern ottenuto dalla BOX-PCR ha identificato una certa diversit� intraspecifica. Ciononostante, le analisi di virulenza effettuate in-vivo di tre genotipi di P.larvae selezionati non hanno differito fortemente tra di loro, suggerendo che la patogenicit� non � l?unico effetto connesso alla diversit� genotipica e fenotipica. Il microbiota associato all?intestino di api di diversa et� sia sane che affette dal patogeno � stato studiato tramite l?analisi del gene 16s ribosomiale tramite la tecnica della elettroforesi con gradiente denaturante (DGGE). I taxa pi� rappresentativi identificati sono ?-, ?-, ?- Proteobatteri e Firmicutes sia nelle api adulte che nelle larve. Inoltre, � stato osservato un crescente sbilanciamento del microbioma all?avanzare della malattia. Uno studio pi� approfondito della diversit� microbica delle larve del quinto stadio di crescita � stata fatta con l?analisi del gene ribosomiale 16s tramite la metodologia del pirosequenziamento. I dati hanno confermanto i risultati ottenuti dalle DGGE: le larve sintomatiche creano un unico cluster, separatamente dalle larve sane, mostrando anche una dominanza di sequenze dell?ordine dei Firmicutes, dalla quale fa parte P.larvae. Contrariamente, nelle larve sane ?-, ?- Proteobatteri e Firmicutes sono gli ordini dominanti. I metodi cultura-dipendenti hanno permesso di isolare differenti gruppi batterici, tra i quali batteri acetici (AAB), batteri lattici (LAB) e batteri sporigeni (SFB). Quindi, allo scopo di valutare se questi isolati potessero inibire la crescita del patogeno, � stato effettuato un test di inibizione in vitro contro due ceppi di P.larvae; in particolare P.larvae 20it e P.larvae BMG93. Gli esperimenti hanno dimostrato che numerosi ceppi tra gli AAB, LAB e SFB sono stati capaci di inibire fortemente lo sviluppo del patogeno. Successivamente alcuni di questi ceppi sono stati saggiati in-vivo: la capacit� dei simbionti selezionati nel proteggere le giovani larve (prima fase larvale) dall?infezione patogena � stata determinata confrontando la mortalit� degli insetti con il patogeno a cui � stato somministrato il simbionte attraverso la dieta. E? stata dimostrata la capacit� dei due SFB di fermare l?invasione di P.larvae, abbassando la mortalit� fino alla mortalit� basale (cio� la mortalit� delle larve alimentate con la sola dieta sterile). L?effetto di protezione sembra essere addirittura maggiore quando i due SFB erano somministrati alle larve contemporaneamente. Alla base della protezione mediata dai batteri simbionti esistono diversi meccanismi, come sostiene Hamdi et al. (2011), tra i quali: 1) inibizione diretta del patogeno con il rilascio di molecole antimicrobiche; 2) induzione del sistema immunitario; 3) esclusione competitiva. In modo da sviluppare una strategia di biocontrollo efficace e praticabile, questa ricerca ha focalizzato l?attenzione sullo studio di tali meccanismi svolti dai simbionti. In primis, l?abilit� dei simbionti di inibire la crescita del patogeno � stata dimostrata con un test di inibizione in vitro usando come surnatante competente al patogeno P.larvae, intestini omogeneizzati ottenuti da larve alimentate con i probiotici. I risultati hanno confermato che esiste un effetto diretto dei surnatanti intestinali nei confronti del patogeno. Quindi, per valutare la capacit� di aumentare l?espressione del sistema immunitario dell?ape, larve alimentate con diete arricchite con i probiotici sono state analizzate per l?espressione del sistema immunitario innato, tramite l?uso della tecnica della RT-Real Time-PCR quantitativa. Il trascritto mRNA di alcuni dei peptidi antimicrobici (AMPs) espressi dal sistema immunitario dell?ape; imenoptaecina, abaecina e defensina, hanno mostrato un aumento della trascrizione quando le larve erano alimentate in presenza del mix BT e BL, confermando un?attivit� probiotica sinergica dei due simbionti. Al contrario, il trascritto del gene lisozima ha mostrato di essere sotto espresso in tutti i trattamenti, rispetto alle larve alimentate con la sola dieta sterile. Infine, � stata valutata la capacit� dei due probiotici di spiazzare il patogeno tramite competizione esclusiva. E? stato difatti dimostrato che i due probiotici sono capaci di colonizzare l?intestino dell?ape. Questo � stato dimostrato tramite l?uso di tecniche molecolari come la BOX-PCR, che ha evidenziato come BT e BL erano presenti dopo 6 giorni dalla somministrazione. La colonizzazione dei probiotici � stata quindi confermata tramite la tecnica della ibridazione fluorescente in situ (FISH). BT e BL sembrano colonizzare l?intestino della larva, rallentando lo sviluppo della malattia quando co-somministrati in presenza del patogeno PL. Inoltre, ulteriori esperimenti sono stati effettuati per dimostrare l?efficacia dei trattamenti probiotici nello prevenire l?attacco patogeno anche ?in campo?. E? stata quindi definita una modalit� di somministrazione del prodotto probiotico direttamente sugli alveari, ed � stato effettuato anche un test di mortalit� affiancato a ciascuna applicazione in campo. I risultati hanno confermato che i trattamenti con il mix BT/BL diminuivano fortemente la mortalit� larvale, indicando che questo rappresenta un metodo efficace per prevenire lo sviluppo della malattia. Inoltre, tramite l?uso della RT-Real time PCR quantitativa, sono stati analizzati i livelli dei trascritti di AMPs (abaecina ed imenoptaecina) di larve trattate in campo confrontate con quelle non trattate con il prodotto probiotico e sottoposti al patogeno. Una risposta immunitaria preventiva � evidente, misurando gli aumenti dei trascritti dei geni abaecina ed imenoptaecina quando le larve erano in presenza del prodotto probiotico. Quando le larve trattate erano invece in presenza del ceppo patogeno, una diminuzione dei livelli di trascritto di abaecina e di imenoptaecina rispetto alle larve non trattate avviene dopo il quinto trattamento, nonostante un forte abbassamento della mortalit� larvale mostrato dagli esperimenti di mortalit�. Questa diminuzione dei trascritti dei due geni erano invece non pi� osservati dopo il settimo trattamento con i ceppi probiotici, coerentemente con quanto mostrato dall?esperimento di mortalit�. Questo indica che l?influenza dei due ceppi probiotici nella espressione degli AMP, quando la larva era trattata con i due ceppi per lungo tempo, sembra prevalere sull?influenza guidata dal patogeno e che inoltre i due probiotici favoriscono l?omeostasi immunitaria quando in presenza del patogeno. Concludendo, la ricerca enfatizza l?importanza dei batteri simbionti intestinali dell?ape con un effetto probiotico nella prevenzione di una patologia e soprattutto suggerisce che i probiotici possono migliorare lo stato di salute dell?ospite implementando la protezione contro i diversi tipi di stress a cui l?ospite � sottoposto.