title: Cyclophilin A und Serinproteasen : Neuroprotektive Zielstrukturen oberhalb der Mitochondrienschädigung
title: Cyclophilin A and serine proteases : Targets of neuronal cell death upstream of mitochondrial demise
Creators: name: Reuther, Christina
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Oxidativer Stress
Naturwissenschaften
oxydated stress
Mitochondrium
mitochdria

description: Many neurological disorders and
      neurodegenerative diseases are associated with mitochondrial
      abnormalities. Mitochondria are essential organelles
      regulating the energy metabolism of the cell, thereby,
      determining essential cellular functions and viability. This
      accounts particularly for neurons which show a pronounced
      energy demand and where mitochondria play a pivotal role in
      balancing the Ca2+ homeostasis, controlling ROS formation and
      providing most of the energy for neurotransmitter metabolism
      and maintenance of the membrane potential. Further,
      mitochondria are essential organelles controlling the ‘point
      of no return’ in intrinsic pathways of programmed cell death
      where the decision between cellular life and death involves
      post-translational protein modifications determining
      mitochondrial dysfunction and release of detrimental proteins
      such as AIF. Therefore, major aims of the present thesis
      included the characterization of the key regulators of
      protein modifications that occur upstream of mitochondrial
      demise and AIF release. In this context, the role of two
      PPIases, CypA and Pin1, and the involvement of serine
      proteases in paradigms of PCD were investigated. Most
      experiments were performed in an immortalized neuronal cell
      line (HT22 cells) which depicts a well-established model to
      study caspase-independent cell death induced by glutamate.
      The most prominent feature in this model of cell death is the
      mitochondrial AIF release and the subsequent translocation to
      the nucleus where it induces chromatinolysis. To substantiate
      the importance of these results further experiments were
      performed in a model of glutamate-induced excitotoxicity in
      primary cortical neurons. The findings of the first part of
      this study revealed a prominent role for CypA in
      glutamate-induced mitochondrial AIF release and cell death.
      Glutamate toxicity resulted in the translocation of CypA to
      the nucleus where it built a pro-apoptotic complex with AIF,
      thereby inducing chromatinolysis. Silencing of CypA protected
      HT22 cells against glutamate toxicity. Moreover, the
      depletion of CypA preserved mitochondrial fission and the
      loss of MMP and also prevented the release of AIF from the
      mitochondria. Furthermore, lipid peroxidation arising from
      the mitochondria was attenuated which supported increased
      cell viability. Further experiments addressed the involvement
      of a second family member of PPIases, Pin1, in neuronal cell
      death pathways. The inhibition of Pin1 with Br57 resulted in
      decreased susceptibility of HT22 cells to glutamate toxicity.
      This increase in cell viability was attended by changes at
      the level of mitochondria. Pin1 inhibition led to enhanced
      mitochondrial fission, but further, complete mitochondrial
      fragmentation induced by glutamate was attenuated. This
      elevated mitochondrial fission rate was accompanied by a
      slight decrease in ATP levels in Br57-treated controls,
      however, the strong ATP depletion that occurred after the
      glutamate challenge was prevented and the impairment of MMP
      was abolished. In summary, these findings depict a pivotal
      role for CypA and Pin1 in glutamate-induced cell death in
      HT22 cells upstream of mitochondrial demise. Since this model
      exhibits common features of neurological disorders the
      results obtained here may give a platform to investigate new
      neuroprotective strategies. The second part of this thesis
      dealt with the impact of activated trypsin-like serine
      proteases on cell viability and mitochondrial function.
      Inhibition of serine proteases with TLCK resulted in
      increased cell viability in HT22 cells and in primary
      cortical neurons. Furthermore, this work revealed that
      activation of trypsin-like serine proteases occurred upstream
      of Bid activation and moreover, in a very initial phase of
      this PCD pathway in HT22 cells. Further, lipid peroxidation
      was blocked and mitochondrial morphology alterations were
      prevented. In addition, ATP depletion and the impairment of
      the MMP were preserved and the decrease in mitochondrial
      respiration after glutamate toxicity was abolished.
      Interestingly, the interaction of Drp1 and CypA was
      strengthened by TLCK. However, the release of Drp1 from the
      actin cytoskeleton and the following redistribution of Drp1
      from the cytoplasm to the mitochondria were not prevented. In
      conclusion, the second part of this thesis highlighted
      trypsin-like serine proteases as mediators of
      glutamate-induced cell death in HT22 cells. The initial
      activation in this PCD pathway is a promising target for
      therapeutic intervention strategies in neurological
      diseases.
description: Mitochondrien gelten als
      „Kraftwerke“ der Zelle, da sie in Form von ATP die Energie
      bereitstellen, die für nahezu alle zellulären Prozesse
      benötigt wird. Zudem sind Mitochondrien an einer Vielzahl von
      biochemischen Mechanismen und Signalkaskaden beteiligt, wie
      z.B. der Aufrechterhaltung der intrazellulären Ca2+
      Homöostase oder der kontrollierten Bildung reaktiver
      Sauerstoffspezies. Neben diesen Funktionen spielen
      Mitochondrien eine zentrale Rolle bei Alterungsprozessen von
      Zellen und bei intrinsischen Signalkaskaden des
      programmierten Zelltods. Mitochondrien stellen dabei
      hochdynamische Organellen dar, die morphologisch entweder
      lange miteinander verbundene Netzwerke ausbilden oder als
      kleine kugelförmige Organellen vorliegen. Es besteht ein
      hochreguliertes Gleichgewicht dieser morphologischen
      Zustände, das unter pathologischen Bedingungen gestört wird
      und so zur Dysfunktion der Organellen und zum Zelltod
      beitragen kann. Entsprechende mitochondriale Veränderungen
      sind beispielsweise in Neuronen bei altersbedingten
      neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer, Morbus
      Parkinson, sowie nach akuten Hirnschädigungen durch
      Schädel-Hirn-Trauma oder Schlaganfall nachgewiesen worden.
      Darüber hinaus wurden sie mit den strukturellen und
      funktionellen Schädigungen der Organellen und der betroffenen
      Neurone in Verbindung gebracht. Post-translationale
      Proteinmodifikationen, Isomerisierung von Proteinen oder
      Protein-Protein Interaktionen können u.a. der Grund für
      solche mitochondrialen Fehlfunktionen sein und zum
      Nervenzelltod beitragen. Aus einer Vielzahl von
      Forschungsarbeiten ist bekannt, dass Mitochondrien eine
      zentrale Rolle in den intrinsischen Signalwegen des
      programmierten Zelltods in Neuronen einnehmen, der vor allem
      durch die Zerstörung der mitochondrialen Membranintegrität
      gekennzeichnet ist. Hierbei ist der wesentliche Schritt die
      Freisetzung des pro-apoptotischen Proteins AIF aus dem
      mitochondrialen Intermembranraum. Daher waren die Hauptziele
      der vorliegenden Arbeit, neue Regulatoren der
      Mitochondrienschädigung und der Freisetzung von AIF in
      Modellen des programmierten Zelltods zu charakterisieren und
      diese als mögliche Ziele therapeutischer Angriffspunkte zu
      definieren. In diesem Zusammenhang wurde die Beteiligung von
      zwei Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerasen CypA und Pin1 sowie
      von Serinproteasen an mitochondrialen Schädigungsmechanismen
      untersucht. Die Mehrzahl der Experimente wurde in einer
      hippokampalen neuronalen Mauszelllinie (HT22 Zellen)
      durchgeführt. Dabei handelt es sich um ein gut
      charakterisiertes Modellsystem für oxidativen Stress in
      Neuronen, das insbesondere für Untersuchungen mitochondrialer
      Prozesse bei intrinsischen Signalkaskaden des programmierten
      Zelltods hervorragend geeignet ist. Das bedeutendste Merkmal
      dieser Form des Zelltods ist die Freisetzung von AIF aus den
      Mitochondrien und die anschließende Translokation in den
      Zellkern, in dem AIF eine Schädigung der DNA hervorruft. Die
      Ergebnisse aus den HT22 Zellen wurden zudem in weiteren
      Experimenten im Modell der Glutamat-induzierten
      Exzitotoxizität in primären Neuronen verifiziert. Der erste
      Teil dieser Arbeit zeigt, dass CypA in Neuronen eine wichtige
      Rolle im Glutamat-induzierten Zelltod und der mitochondrialen
      AIF Freisetzung spielt. Glutamattoxizität führt zu einer
      Translokation von CypA in den Zellkern, wo es mit AIF einen
      pro-apoptotischen Komplex bildet, der zur Schädigung der DNA
      führt. Die verminderte Expression von CypA schützt HT22
      Zellen gegen Glutamattoxizität und zudem waren infolge der
      verminderten CypA-Spiegel die Mitochondrien geschützt. Eine
      Hemmung der CypA Expression verhindert ferner den Verlust des
      Mitochondrienmembranpotentials und die Fragmentierung der
      Organellen als typische morphologische Veränderung der
      geschädigten Mitochondrien sowie die Freisetzung von AIF aus
      dem mitochondrialen Intermembranraum. Weiterhin wurde die
      Lipidperoxidation in den Zellen deutlich abgeschwächt, die in
      der Spätphase der Glutamatschädigung durch mitochondriale
      Schäden gesteigert wird und die Endphase des Zelltods
      kennzeichnet. Andere Untersuchungen dieser Arbeit zeigen,
      dass Pin1, eine weitere Peptidyl-prolyl cis-trans Isomerase,
      ebenfalls an neuronalen Zelltodmechanismen und
      mitochondrialen Veränderungen beteiligt ist. Der spezifische
      Pin1 Inhibitor Br57 führt zu einer verminderten
      Empfindlichkeit der HT22 Zellen gegenüber Glutamat. Die
      dadurch bedingte Zunahme der Zellviabilität ist mit
      mitochondrialen Veränderungen assoziiert. Die Applikation von
      Br57 alleine resultiert einerseits in einer zunehmenden
      Mitochondrienfragmentierung, kann andererseits allerdings die
      weitere Fragmentierung der Mitochondrien, die durch Glutamat
      hervorgerufen wird, verhindern. Die erhöhte
      Mitochondrienteilung war dabei mit einer leichten Reduktion
      der ATP Spiegel in Br57 behandelten Kontrollzellen verbunden.
      Jedoch wird der deutliche Abfall der ATP Spiegel, der
      normalerweise nach Glutamatschädigung auftritt, verhindert.
      Des Weiteren wird der Glutamat-induzierte Zusammenbruch des
      Mitochondrienmembranpotentials durch die Pin1 Inhibition
      günstig beeinflusst. Zusammenfassend zeigt der erste Teil
      dieser Arbeit, dass beide Peptidyl-prolyl cis-trans
      Isomerasen, CypA und Pin1, in den intrinsischen
      Signalkaskaden des neuronalen Zelltods eine besondere
      Funktion einnehmen. Dabei sind sie offenbar entscheidend an
      der Regulation der Mitochondrienintegrität und -funktion
      beteiligt, so dass diese PPIs vielversprechende
      Angriffspunkte für neue neuroprotektive Strategien
      darstellen. Der zweite Teil dieser Dissertation befasst sich
      mit dem Einfluss von aktivierten Serinproteasen auf
      mitochondriale Funktionen und dem daraus resultierenden
      Zelltod. Die Hemmung von Serinproteasen mit TLCK, einem
      Serinproteaseinhibitor, konnte den durch Glutamat-induzierten
      Zelltod sowohl in HT22 Zellen als auch in primären kortikalen
      Neuronen verhindern. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die
      Aktivierung von Serinproteasen zu einem sehr frühen Zeitpunkt
      in dieser Form des programmierten Zelltods in HT22 Zellen
      stattfindet, bereits bevor die Aktivierung des
      pro-apoptotischen Proteins Bid und die daraus folgende
      Schädigung der Mitochondrien einsetzen. Ferner vermindert der
      Serinproteaseinhibitor TLCK die Glutamat-induzierte
      Lipidperoxidation, pathologische und morphologische
      Veränderungen der Mitochondrien, ATP Depletion sowie die
      Verminderung des Mitochondrienmembranpotentials und den
      Abfall der mitochondrialen Atmung. Interessanterweise wird
      gleichzeitig durch TLCK die Interaktion zwischen Drp1 und
      CypA verstärkt. Allerdings werden die Freisetzung von Drp1
      aus dem Aktinzytoskelett und die darauffolgende Translokation
      von Drp1 aus dem Zytoplasma zu den Mitochondrien nicht
      verhindert. Zusammenfassend zeigt der zweite Teil dieser
      Arbeit, dass Serinproteasen vom Trypsintyp den
      Glutamat-induzierten oxidativen Zelltod in neuronalen HT22
      Zellen vermitteln. Die initiale Aktivierung von
      Serinproteasen in diesem Modell des programmierten Zelltods
      ist ein möglicher therapeutischer Ansatzpunkt bei
      neurologischen Erkrankungen und Alterungsprozessen, bei denen
      oxidativer Stress und daraus folgende mitochondriale
      Schädigungsmechanismen wesentlich zur Fortschreitung der
      pathologischen Veränderungen in den Nervenzellen
      beitragen.