Ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων καθαρισμού (HILIC) με φασματοσκοπία μαζών (MALDI-TOF &amp; LEMS/MS) για το χαρακτηρισμό γλυκοπρωτεϊνών και εφαρμογή σε θεραπευτικά μονόκλωνα αντισώματα (rMabs):
Creators: name: Πουσίνης, Πέτρος Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2009
Subjects: Φασματοσκοπία μαζών
HILIC
Γλυκοπρωτεϊνες
Αντισώματα
MALDI-TOF
LC-MS/MS
Mass spectrometry
Glycoproteins
Antibodies

description: Ο σκοπός αυτής της μεταπτυχιακής εργασίας είναι η ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων καθαρισμού (HILIC) για την ανάλυση των γλυκοπρωτεϊνών, χρησιμοποιώντας χρωματογραφικές (LC) και Φασματοσκοπίας Μαζών (MALDI-TOF, LC-MS/MS) μεθόδους, και την εφαρμογή τους στη μελέτη του προφίλ γλυκοσυλίωσης του IGg1 αντισώματος, που είναι ιδιαίτερα γλυκοσυλιωμένα. Επειδή τα γλυκοπεπτίδια υπάρχουν σε πολύ μικρή αφθονία και είναι δύσκολος ο ιονισμός τους, και επομένως η MS ανάλυσή τους είναι προβληματική, η απομόνωσή τους με κυρίως χρωματογραφικές μεθόδους κρίνεται απαραίτητη. Παρόλα αυτά, δύο (2) προσεγγίσεις ανάλυσης γλυκοπρωτεινών ακολουθήθηκαν: απευθείας ανάλυση γλυκοπρωτεϊνών με LC-MS/MS &amp; MALDI-TOF (χωρίς καθαρισμό), καθώς επίσης μια μέθοδος καθαρισμού που χρησιμοποιεί μια HILIC στήλη για την απομόνωση των γλυκοπεπτιδίων, ενώ η αποτελεσματικότητά τους συγκρίθηκε. Επομένως, ο στόχος στην εργασία αυτή ήταν ο πλήρης χαρακτηρισμός του προφίλ γλυκοσυλίωσης μιας γλυκοπρωτεΐνης, δηλαδή: 1) ο προσδιορισμός της αλληλουχίας της πρωτεΐνης,, 2) η θέση και 3) ο χαρακτηρισμός της δομής των γλυκάνων που συνδέονται με την πεπτιδική αλυσίδα. Μια από τις μεθόδους που εφαρμόστηκε εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην ανάλυση μιας από τις πιο συχνές μετά-μεταφραστικές τροποποιήσεις (PTMs) των πρωτεϊνών. Εφόσον η γλυκοσυλίωση στα θεραπευτικά μονόκλωνα αντισώματα είναι γνωστό ότι καθορίζει την ικανότητα τους ως φαρμακευτικά μόρια, η ανάπτυξη και εφαρμογή αναλυτικών μεθόδων (MS) με μεγάλη ακρίβεια, ευαισθησία και επαναληψιμότητα είναι απαραίτητη στον έλεγχο ποιότητας των θεραπευτικών αυτών αντισωμάτων σε όλα τα στάδια παραγωγής τους.
description: The aim of this postgraduate thesis is the development of a purification chromatographic method (HILIC) for the analysis of glycoproteins, using chromatographic (LC) and Mass Spectrometry (MALDI-TOF, LC-MS/MS) methods, and their application in the study of glycosylation profile in IgG1 antibodies, that are known to be glycosylated. Because glycopeptides (of a particular glycoprotein digest) exist in very small abundance, are difficult to ionize and consequently their MS analysis becomes problematic, their isolation with mainly chromatographic methods is often deemed necessary. Nevertheless, two (2) approaches of glycoprotein analysis were followed: direct analysis of glycoprotein digests with LC/MS/MS &amp; MALDI-TOF (no purification), as well as a purification approach that employs a HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) column for capturing the glycopeptides part of the digest, and their efficiency was compared. Consequently, the object in this work was the complete characterization of the glycosylation profile of a glycoprotein, that is 1) the identification of the glycoprotein sequence, 2) the site of, and 3) the characterization of the glycan structure that is connected to the amino acid polypeptide backbone. One of the methods that was used here (isolation with a purification step (HILIC and their later analysis with MALDI-TOF-TOF can be applied in the analysis of one of the more frequent post-translational modifications (PTMs) of proteins. Since the in therapeutic recombinant monoclonal antibodies (reMabs), that is glycoproteins of 150kDa MW, is known to highly regulate their efficiency as pharmaceutical molecules, the development and application of analytic methods (MS) with great precision, accuracy and reproducibility is necessary in the quality control of this therapeutic class of medicines (antibodies), throughout all their stages of production.