Improvement of the electron transfer in S. oneidensis and production of glucose-based platform chemicals
Creators: name: Palma Delgado, Veronica
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2020
Subjects: Shewanella oneidensis
electron transfer
periplasmic cytochrome
genetic engineering
current density
bioelectrochemical system
glucose
itaconic acid

description: Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war es, die Elektronentransferrate des Mikroorganismus S. oneidensis MR-1 auf Anodenoberflächen zu verbessern und mit seiner Hilfe Itakonsäure ausgehend von Glukose als neuem Substrat zu produzieren. Aufgrund der Komplexität dieses Vorhabens wurde die Doktorarbeit in drei Teilprojekte aufgeteilt. Das erste Teilprojekt basierte auf der Hypothese, dass eine Reduktion der Komplexität des periplasmatischen Elektronentransfernetzwerks und eine anschließende Überexpression des wichtigen periplasmatischen Elektronen-Shuttle-Cytochroms STC zu einer Beschleunigung der Elektronentransferrate und somit des gesamten Metabolismus führen könnte. Genauer gesagt, wurden die periplasmatischen Cytochrome NrfA, CcpA, NapB und das Protein NapA mit STC ersetzt, was zu einer 3,6-fach erhöhten Expression des STC kodierenden Gens cctA und einem 2,5-fachen Anstieg der periplasmatischen Flavin-Konzentration führte. Die resultierende 4-fach Mutante zeigte in anoxischen Zellsuspensionsassays mit Eisencitrat als Elektronenakzeptor eine 1,7-fach erhöhte Elektronentransferrate im Vergleich zu S. oneidensis MR-1. Des Weiteren war die erreichte Gesamtstromproduktion in bioelektrochemischen Systemen mit einer Graphit-Fleece-Elektrode als Elektronenakzeptor unter anoxischen Bedingungen mit der entwickelten 4-fach Mutante 1,5-fach höher. Außerdem war es möglich zu zeigen, dass eine bisher vermutete Redundanz von STC und FccA im Elektronentransfer nicht komplett gegeben ist, da eine zusätzliche Substitution von FccA mit STC zu Elektronentransferraten auf Wildtyp-Niveau führte. Im zweiten Teilprojekt wurden verschiedene Strategien getestet, um Shewanella zu ermöglichen Glukose als Substrat zu nutzen. Dabei war das Einsetzen eines Plasmids mit den Genen für den Glukosetransporter GalP und die Kinase Glk aus E. coli die effizienteste Strategie. Die Kombination aus dieser Strategie und dem im ersten Teilprojekt entwickelten Chassis-Stamm erlaubten es Shewanella 50 mM Eisen(III)citrat innerhalb von 24 h komplett zu reduzieren. Im Vergleich von 4-fach Mutante mit Glukose-Modul und Wildtyp mit Glukose-Modul konnte ein 1,7-fach schnellerer Glukoseverbrauch festgestellt werden. Eine andere getestete Strategie – die Deletion des Repressors NagR – stellte sich unter anoxischen Bedingungen als wirkungslos heraus. Das dritte Teilprojekt zielte auf die Ermöglichung der Glukose-basierten Itakonsäure-Produktion ab, weshalb das zuvor getestete Glukose-Modul sowie das Enzym CadA von Aspergillus terreus in einem Plasmid in Shewanella eingefügt wurden. Zusätzlich wurden verschiedene Gene deletiert, um die metabolische Komplexität zu reduzieren und die Produktion von Nebenprodukten zu vermeiden. Genauer gesagt wurden die Gene sucCD, pykA, aceA, ptA und ackA aus dem Genom entfernt. Zellsuspensionsassays unter oxischen und anoxischen Bedingungen zeigten, dass die Produktion von kleinen Itakonsäure-Mengen nur unter oxischen Bedingungen möglich war. Wegen der geringen Mengen von Itakonsäure, die während dieser Experimente produziert werden konnten, wäre weitere Forschung an der Stammoptimierung notwendig. Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass die Integration von cadA die Itakonsäure-Produktion ermöglicht und somit das grundlegende Konzept valide ist.