title: Erforschung der biosynthetischen Pfade von Glutamat und Benzoat bei Syntrophus aciditrophicus
title: Exploring the biosynthetic pathways of glutamate and benzoate in Syntrophus aciditrophicus
Creators: name: Kim, Marie
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Syntrophus aciditrophicus
Biosynthese
Glutamat
biosynthesis
benzoate
Benzoat
Biowissenschaften, Biologie
glutamate
Pfad
pathway

description: Syntrophus aciditrophicus thrives
      syntrophically on benzoate and axenically on crotonate, which
      is oxidized to acetate and reduced to cyclohexane carboxylate
      and some benzoate. Genomic, proteomic, and metabolic analyses
      suggested that degradation and synthesis of benzoate use the
      same pathway, whereby glutaconyl-CoA serves as central
      intermediate. In strictly anaerobic bacteria, glutamate is
      usually synthesized from two acetyl-CoA via pyruvate,
      oxaloacetate, citrate, and 2-oxoglutarate. As no gene for
      Si-citrate synthase has been detected in the genome of S.
      aciditrophicus, we speculated that glutaconyl-CoA via
      2-hydroxyglutarate could be the precursor of 2-oxoglutarate
      for glutamate biosynthesis. Recently, the gene rcs, which is
      annotated as isopropylmalate/citratemalate/homocitrate
      synthase in S. aciditrophicus, has been shown to exhibit 49%
      sequence identity with that coding for Re-citrate from
      Clostridium kluyveri. We cloned rcs and overproduced the
      recombinant protein in Escherichia coli. The enzyme was
      purified aerobically and characterized biochemically as
      Re-citrate synthase. The highest achieved specific activity
      was 1.6 U/mg using oxaloacetate and acetyl-CoA as substrates
      in the presence of Co2+. Pyruvate, 2-oxoglutarate and
      2-oxoisovalerate could not replace oxaloacetate; with
      propionyl-CoA also no activity was observed. No metal was
      detected in the recombinant protein. Besides Co2+ also Mn2+
      stimulates the activity and stabilizes the enzyme. Sulfhydryl
      reagents partially inactivate the enzyme, but a cysteine
      residue seems not to be involved in the catalytic site. With
      [2H3]acetyl-CoA a low intermolecular deuterium isotope effect
      (kH/kD = 1.4) was measured. Preliminary native PAGE data
      indicate a homodimeric structure of the enzyme. Labeled
      glutamate and aspartate were extracted from S. aciditrophicus
      cells grown on unlabeled crotonate with [1-14C]acetate or
      13CO2 and analyzed by oxidative decarboxylation and its
      radioactivity or by 13C-NMR, respectively. Together with
      GC-MS data from the universities of Oklahoma and Washington
      using [1-13C]acetate, the present results support the idea
      that Re-citrate synthase participates in glutamate
      biosynthesis, although an incomplete equilibration between
      labeled acetate and unlabeled crotonate must be considered.
      Unfortunately, the labeling pattern of glutamate derived from
      acetate via pyruvate, oxaloacetate and citrate cannot solely
      be distinguished from that via glutaconyl-CoA and
      2-hydroxyglutarate. To study the proposed reversibility of
      the energy conserving glutaconyl-CoA decarboxylase (Gcd),
      especially whether the carboxylation of crotonyl-CoA is
      driven by an electrochemical Na+ gradient, we cloned the
      genes gcdA, gcdB, and gcdC detected in the genome of S.
      aciditrophicus. The deduced amino acid sequences show 52%,
      51%, 46% and 42% identity to GcdA, B, C1 and C2 from
      Clostridium symbiosum, respectively, though the (A+P) rich
      domain of GcdC is missing and a gene for GcdD could not be
      detected. The S. aciditrophicus genes were expressed
      individually and in the combinations of gcdAC and gcdABC in
      E. coli, whereby only the productions of GcdA, GcdC, and
      GcdAC were successful. GcdA was characterized as
      carboxytranserase (2 mU/mg with 5 mM D-biotin as artificial
      acceptor). Purification of the decarboxylase complex by
      avidin affinity chromatography from S. aciditrophicus cells,
      grown in a fermenter in Leipzig, was not successful. To
      uncover the mechanism of transferring Na+ and CO2 in Gcd, a
      systematic approach of membrane protein overproduction and
      crystallization should be attempted. Perhaps the lack of the
      aggregate-forming (A+P) rich domain of GcdC facilitates
      crystallization.
description: In syntrophischer Lebensweise
      oxidiert Syntrophus aciditrophicus Benzoat zu Acetat und CO2,
      während axenische Kulturen Crotonat zu Acetat und
      Cyclohexancarboxylat mit etwas Benzoat fermentieren.
      Genomische, proteomische und metabolische Analysen lassen
      vermuten, dass Abbau und Synthese von Benzoat mit
      Glutaconyl-CoA als zentralem Intermediat den gleichen Weg
      benutzen. In strikt anaeroben Bakterien wird Glutamat
      üblicherweise aus zwei Acetyl-CoA über Pyruvat, Oxalacetat,
      Citrat und 2-Oxoglutarat synthetisiert. Da im Genom von S.
      aciditrophicus kein Gen für Si-Citrat-Synthase gefunden
      wurde, vermuteten wir, dass Glutaconyl-CoA über
      2-Hydroxyglutarat der Vorläufer von Glutamat sein könnte.
      Kürzlich wurde gezeigt, dass das rcs-Gen, das als
      Isopropylmalat/ Citramalat/ Homocitrat-Synthase annotiert
      ist, 49% Sequenzidentitäten mit dem Re-Citrat-Synthase-Gen
      aus Clostridium kluyveri aufweist. Wir haben deshalb das
      rcs-Gen kloniert und das rekombinante und mit einem
      C-terminalen Strep-tag versehene Protein in Escherichia coli
      überproduziert. Das Enzym wurde zur Homogenität gereinigt und
      mittels 14C-Markierung als Re-Citrat-Synthase
      charakterisiert. Die höchste spezifische Aktivität wurde mit
      Oxalacetat und Acetyl-CoA in Gegenwart von Co2+ erzielt.
      Pyruvat, 2-Oxoglutarat und 2-Oxoisovalerat konnten Oxalacetat
      nicht ersetzen; mit Propionyl-CoA war das Enzym ebenfalls
      inaktiv. Das reine Protein enthielt keine Metallionen; Co2+
      oder auch Mn2+ waren nicht nur für die Aktivität notwendig
      sondern erhöhten auch die Stabilität. Obwohl Thiolreagenzien
      das Enzym partiell inaktivierten, scheint ein Cysteinrest
      nicht an der Katalyse beteiligt zu sein. Mit [2H3]Acetyl-CoA
      wurde ein geringer intermolekularer Isotopeneffekt (kH/kD =
      1.4) gemessen. Vorläufige Versuche mit nativer
      Gelelektrophorese zeigen, dass das Enzym eine homodimere
      Struktur besitzt. Isotop-markierte Glutamate und Aspartate
      wurden aus S. aciditrophicus-Zellen isoliert, die axenisch
      auf unmarkiertem Crotonat mit [1-14C]Acetat oder 13CO2
      gewachsen waren. Die Aminosäuren wurden entweder oxidativ
      decarboxyliert und über ihre Radioaktivität oder mittels
      13C-NMR analysiert. Zusammen mit GC-MS-Daten der
      Universitäten Oklahoma und Washington, die [1-13C]Acetat
      benutzten, unterstützen unsere Ergebnisse eine Beteiligung
      der Re-Citrat-Synthase, obwohl eine unvollständige
      Äquilibrierung zwischen markiertem Acetat und ummarkiertem
      Crotonat in Betracht gezogen werden muss. Leider können die
      Wege über Re-Citrat-Synthase und Glutaconyl-CoA nicht allein
      durch Isotopenmarkierung unterschieden werden. Um die
      postulierte Reversibilität der Energie-konservierenden
      Glutaconyl-CoA-Decarboxylase (Gcd) zu untersuchen,
      insbesondere ob die Carboxylierung von Crotonyl-CoA durch
      einen elektrochemischen Na+-Gradienten getrieben wird,
      klonierten wir die im Genom von S. aciditrophicus vorhanden
      Gene gcdA, gcdB und gcdC. Die abgeleiteten
      Aminosäuresequenzen zeigen 52%, 51%, 46% und 42% Identitäten
      zu GcdA, B, C1 und C2 von Clostridium symbiosum, obwohl die
      (A+P) reiche Domäne von GcdC und gcdD fehlen. Die S.
      aciditrophicus-Gene wurden einzeln oder in den Kombinationen
      gcdAC und gcdABC in E. coli exprimiert. Nur GcdA, GcdC, und
      GcdAC konnten erfolgreich produziert werden. GcdA wurde als
      Carboxytransferase charakterisiert (2 mU/mg mit 5 mM Biotin
      als artifiziellem Akzeptor). Die Reinigung des
      Decarboxylase-Komplexes mittels
      Avidin-Affinitätschromatographie aus S.
      aciditrophicus-Zellen, die von einem Fermenter aus Leipzig
      stammten, war nicht erfolgreich. Zur Untersuchung der
      Mechanismus des durch Decarboxylierung getriebenen
      Na+-Transports, wären systematische Expressionsstudien von
      gcdB und eine Kristallisation des Komplexes erforderlich.
      Möglicherweise erleichtert das Fehlen der Aggregate
      verursachenden (A+P)-reichen Domäne von GcdC diese
      Aufgabe.