Συσχέτιση της γονιδιακής έκφρασης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPS5 με την in vitro διαφοροποίηση των κυττάρων MEL και η πιθανή κλινική σημασία της στα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα:
Creators: name: Ανδρεάδης, Παναγιώτης Αλέξανδρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2011
Subjects: RPS5
MEL
Ριβοσωμοπάθειες
Ribosomopathies

description: Over the last few years, there has been a tremendous research interest in the extra-ribosomal functions of Ribosomal Proteins (RPs). It seems that some of these proteins play an important role in normal heamatopoiesis and especially at various stages of erythropoiesis. In particular, after the discovery that certain RP genes, are correlated with pathophysiologic disorders or impairment-failure of erythropoiesis, the term Ribosomopathies arose to describe such illnesses. Among theses, Diamond Blackfan Anemia (DBA) is considered as a study model, since more than 50% of DBA patients, exhibit mutations in at least one gene that encodes RPs (RPS19, RP24, RPS17, RPL35A, RPL5, RPL11). Moreover, del5q syndrome, a type of Myelodysplastic Syndrome (MDS), is thought to be the result of the loss of one out the two alleles of the gene that encodes RPS14. Previous work from our laboratory has shown that ribosomal protein S5 (RPS5) is implicated in the in vitro differentiation of murine erythroleukemia cells (MEL). The present Thesis aimed for: a) The correlation of the gene expression profiling of RPS5 with the ability of MELs to differentiate and commit to erythroid maturation upon their exposure to chemical inducers in culture and b) the assessment of the potential clinical relevance and impact of the gene expression of RPS5 in patients suffering from erythropoiesis disorders. Particularly, we studied the ability of MEL cells to differentiate in vitro in conditions where the RPS5 gene, has been modulated experimentally. The study has shown: (1) MEL-C14 cells (that overexpress RPS5) have exhibited a delay in the onset of differentiation after being incubated with a chemical inducer. This finding is in accordance with previously published results from our laboratory. (2) MEL-SiRPS5 cells (where expression of RPS5 has been knockdown with the use of RNA interference) have shown inability to differentiate to erythroid maturation upon exposure to chemical inducers in vitro. MEL-SiRPS5 cells, also presented with different morphological and phenotypical attributes (larger diameter, cell degradation) as compared to control cells.(3) The expression levels of the oncogene c-myc, were considerably higher in MEL-C14 cells, compared to parental cultures.Interestingly, such levels were maintained relatively high even 96 hr after the treatment with HMBA.(4) Last but not least, RT-PCR analysis of RNA samples isolated from the peripheral blood of two patients with Myelodysplastic/Myeloproliferative syndrome (MDS/MPS) has indicated low expression levels of RPS5 and c-myc genes compared to patients with MDS or DBA. Overall, differential expression of RPS5, seems to abrogate decision of MEL cells leading to a delay and an inability to initiate their erythroid maturation program, when exposed in culture to a chemical inducer of differentiation. It has also been observed, that changes in the expression level of RPS5, can lead to a modulation in the gene expression of c-myc oncogene and also to traceable distinct cellular morphological alterations. The potential importance of these changes in the pathophysiology of ribosomopathies, strengthens the need of further investigation of RPS5 role in erythropoiesis and by uncovering the molecular mechanisms of its extra-ribosomal functions.
description: Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον για τη μελέτη των εξω-ριβοσωμικών λειτουργιών των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPs). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι ορισμένες από αυτές τις πρωτεΐνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη φυσιολογική αιμοποίηση και πιο ειδικά κατά τα στάδια της ερυθροποίησης. Πράγματι, μετά την ανακάλυψη ότι συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε γονίδια RPs, συσχετίζονται με παθοφυσιολογικές διαταραχές ή ακόμη και με ανεπάρκεια της ερυθροποίησης, προέκυψε ο όρος Ριβοσωμοπάθειες για να χαρακτηρίσουν αυτή την ομάδα των ασθενειών. Ιδιαίτερα, η αναιμία Diamond Blackfan (DBA), αποτέλεσε εξαρχής το μοντέλο για τις ασθένειες αυτές καθώς το 50% των ασθενών, εμφανίζει μεταλλάξεις σε τουλάχιστον ένα γονίδιο που κωδικοποιεί ριβοσωμικές πρωτεΐνες (RPS19, RPL35A, RPL5, RPL11). Επιπρόσθετα, και το σύνδρομο del5q, ένας τύπος Μυελοδυσπλαστικού Συνδρόμου (ΜΔΣ), φαίνεται να οφείλεται στην απώλεια του ενός εκ των δύο αλληλίων του γονιδίου που κωδικοποιεί την RPS14. Σε προηγούμενη δουλειά που είχε γίνει στο εργαστήριό μας, έχει δειχθεί πως η ριβοσωμική πρωτεΐνη S5 (RPS5), εμπλέκεται στην εκτέλεση του προγράμματος διαφοροποίησης των MEL κυττάρων μετά την επώασή τους με χημικούς επαγωγείς. Η συγκεκριμένη Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία αποτελεί συνέχεια αυτής της προσπάθειας και είχε ως στόχο: α) τη συσχέτιση της γονιδιακής έκφρασης της RPS5, με την in vitro διαφοροποίηση των κυττάρων MEL και την ικανότητά να παίρνουν αποφάσεις για τη δέσμευση τους για ωρίμανση στα τελικά στάδια ερυθροδιαφορποίησης και β) τη διερεύνηση της πιθανής κλινικής σημασίας του επιπέδου γονιδιακής έκφρασης της RPS5 σε κλινικά δείγματα ασθενών με διαταραχές της ερυθροδιαφοροποίησης. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η ικανότητα των MEL κυττάρων να διαφοροποιούνται σε συνθήκες ελαττωμένης ή αυξημένης έκφρασης του γονιδίου της RPS5 σε σχέση με τα αρχικά (parental) κύτταρα. H χρήση των διαφόρων κυτταρικών σειρών που προέκυψαν με τη γενετική τροποποίηση των parental κυττάρων MEL για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης της RPS5, καθώς και η RT-PCR ανάλυση δειγμάτων RNA που απομονώθηκαν από ασθενείς, έδειξε ότι: (1) Τα κύτταρα MEL C14 (που υπερεκφράζουν την RPS5), καθυστερούν την έναρξη διαφοροποίησης μετά την επώασή τους στην καλλιέργεια με το χημικό επαγωγέα HMBA. (2) Τα κύτταρα MEL-SiRPS5 (όπου το μεταγράφημα της RPS5 έχει κατασταλεί με τη χρήση της τεχνικής RNA interference) αδυνατούν να διαφοροποιηθούν και εμφανίζουν μορφολογικές και φαινοτυπικές διαφορές (μεγαλύτερη διάμετρο, εικόνα κατακερματισμού) σε σύγκριση με καλλιέργειες αναφοράς. (3) Τα επίπεδα του ογκογονιδίου c-myc είναι υψηλότερα στα κύτταρα MEL-C14 συγκρινόμενα με τα αντίστοιχα των parental κυττάρων. (4) Τέλος, στην RT-PCR ανάλυση δειγμάτων RNA που απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα 2 ασθενών με Μυελοδυσπλαστικό/ Μυελοϋπερπλαστικό σύνδρομο (ΜΔΣ/ΜΥΣ) παρατηρήθηκε μειωμένη έκφραση των γονιδίων RPS5 και c-myc σε σύγκριση με ασθενείς με ΜΔΣ ή DBA.Συμπερασματικά, δείχθηκε ότι η μεταβολή της έκφραση της RPS5, οδηγεί σε καθυστέρηση ή αδυναμία λήψης απόφασης για διαφοροποίηση των κυττάρων MEL in vitro. Παρατηρήθηκε επίσης ότι οι μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης της RPS5, οδηγούν και σε μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης του ογκογονιδίου c-myc στα MEL κύτταρα αλλά και σε ανιχνεύσιμες μορφολογικές διαφορές των κυττάρων. Η πιθανή σημασία αυτών των μεταβολών στην παθοφυσιολογία διαταραχών της αιμοποίησης σχετιζόμενες με ριβοσωμοπάθειες, ενισχύει την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της RPS5 στην ερυθροδιαφοροποίηση και την αποκάλυψη των μοριακών μηχανισμών της εξω-ριβοσωμικής λειτουργίας της.