Ετερογένεια στην κινητική συμπεριφορά ανάπτυξης μεμονωμένων κυττάρων Escherichia coli
Creators: name: Στασινού, Κωνσταντίνα Θεόδωρου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2022
Subjects: Ετερογένεια
Μεμονωμένα κύτταρα
Escherichia coli
Heterogeneity
Single cells

description: Η πλειονότητα των πειραματικών ερευνών για τη μελέτη της βακτηριακής ανάπτυξης δεν λαμβάνουν υπόψη τη συμπεριφορά μεμονωμένων κύτταρων και εστιάζουν στους μικροβιακούς πληθυσμούς σαν σύνολο. Ωστόσο, τα μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να παρουσιάσουν αξιοσημείωτη ετερογένεια. Σκοπός λοιπόν της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της συμπεριφοράς μεμονωμένων κυττάρων Escherichia coli με τη βοήθεια της μικροσκοπίας πραγματικού χρόνου – αντίθετης φάσης. Παρατηρήθηκε μία αξιοσημείωτη ετερογενής συμπεριφορά μεταξύ των μεμονωμένων κυττάρων, καθώς ένα ποσοστό των κυττάρων διαιρέθηκε ενώ ένα άλλο όχι. Παράλληλα, κάποια μη διαιρούμενα κύτταρα οδηγήθηκαν σε σχηματισμό νηματίων ή και λύσης. Τα κύτταρα τα οποία κατάφεραν να διαιρεθούν και να σχηματίσουν αποικίες χαρακτηρίστηκαν από υψηλή παραλλακτικότητα της κινητικής ανάπτυξής τους. Η υψηλή ευκρίνεια των εικόνων επέτρεψε την καταμέτρηση των κυττάρων με τον χρόνο και κατά συνέπεια τον υπολογισμό των πέντε πρώτων χρόνων κυτταρικής διαίρεσης. Ο υπολογισμός αυτός έδειξε ότι οι μέσοι χρόνοι κυτταρικής διαίρεσης μειώνονται με την αύξηση των γενεών, με τον πρώτο χρόνο κυτταρικής διαίρεσης να αποτελεί τον μεγαλύτερο καθώς περιλαμβάνει τη φάση προσαρμογής. Επιπρόσθετα μέσω της ανάλυσης των εικόνων κατέστη εφικτή η εκτίμηση των κινητικών παραμέτρων μέγιστος ειδικός ρυθμός ανάπτυξης (μmax) και φάση προσαρμογής (λ) για κάθε μικροαποικία η οποία προέρχεται από ένα μεμονωμένο κύτταρο. Για τη σωστή ερμηνεία των παρατηρήσεων χρησιμοποιήθηκαν κατάλληλες κατανομές για τον χαρακτηρισμό της παραλλακτικότητας των κινητικών παραμέτρων μmax (Logistic) και λ (Log Logistic). Στόχος του δεύτερου μέρους της παρούσας διατριβής ήταν η ποσοτική περιγραφή της στοχαστικότητας που διέπει την ανάπτυξη των μεμονωμένων κυττάρων E. coli. Για τον σκοπό αυτό, οι κατανομές των κινητικών παραμέτρων εισήχθησαν σε ένα εκθετικό μοντέλο με φάση προσαρμογής. Η ανάπτυξη του στοχαστικού μοντέλου σε συνδυασμό με την τεχνική προσομοίωσης Monte Carlo συνέβαλαν στη μελέτη της ετερογένειας μεταξύ των μεμονωμένων κυττάρων, παρέχοντας στοχαστικές καμπύλες βακτηριακής ανάπτυξης. Έτσι με βάση την πρόβλεψη του στοχαστικού μοντέλου, για κάθε χρονική στιγμή ο πληθυσμός υπολογίστηκε ως κατανομή πιθανοτήτων. Επιπλέον το στοχαστικό μοντέλο έδωσε τη δυνατότητα να ποσοτικοποιηθεί η παραλλακτικότητα στη μικροβιακή ανάπτυξη όπως αυτή εξαρτάται από τον αρχικό πληθυσμό αλλά και τον χρόνο ανάπτυξης. Πιο συγκεκριμένα, η αύξηση του αρχικού πληθυσμού είχε ως αποτέλεσμα η φαινομενική μεταβλητότητα να μειωθεί αισθητά. Ως απόρροια, το φαινόμενο της παραλλακτικότητας τείνει να καλυφθεί με την αύξηση του αρχικού αριθμού των κυττάρων με αποτέλεσμα το σύστημα να συμπεριφέρεται ντετερμινιστικά. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τη μελέτη της συμπεριφοράς σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων Ε. coli, καθώς επιτρέπουν την ποσοτικοποίηση της ετερογένειας μεταξύ των κυττάρων αυτών και τη μαθηματική περιγραφή της επίδρασή της στη δυναμική της ανάπτυξης πληθυσμών. Δεδομένου ότι ένα τρόφιμο μπορεί να μολυνθεί από ένα κύτταρο ή μικρό αριθμό κυττάρων οι παραπάνω πληροφορίες μπορούν να συμβάλουν στην καλύτερη διαχείριση της ασφάλειας και ποιότητας των τροφίμων μέσω της λήψης αποφάσεων με βάση την επικινδυνότητα.
description: Most experimental bacterial growth studies are based on deterministic approaches without considering single cells, but only the microbial population as a whole. However, single cells can exhibit remarkable heterogeneity. In the first part of this study, the behaviour of Escherichia coli single cells with the use of time lapse microscopy was studied. A remarkable heterogenous behaviour was observed between single cells as one part of the cells divided while the other did not. At the same time, some cells unable to divide exhibited the phenomena of filamentation and lysis. Cells that were able to grow and form microcolonies were characterized by high variability in growth dynamics. The high quality of the images allowed counting of the cells over time and thus calculation of the first five division times. This calculation showed that division times decreased with generations, with the first division time being the longest as it includes the lag phase. In addition, due to the analysis of the images obtained, the kinetic parameters maximum specific growth rate (μmax) and lag phase (λ) of each microcolony originating from a single cell were estimated. For the correct interpretation of the observations, appropriate distributions were fitted to the data in order to characterize the variability of the kinetic parameters μmax (Logistic) and λ (Log Logistic). The aim of the second part of this study was the quantitative description of the stochasticity that governs the growth of E. coli single cells. For this purpose, the kinetic parameter distributions were introduced into an exponential model, with lag phase. The development of the stochastic model combined with the Monte Carlo simulation technique contributed to the study of heterogeneity between single cells, providing stochastic bacterial growth curves. Thus, based on the prediction of the stochastic model, for each time point the population was calculated as a probability distribution. In addition, through the stochastic model the variability in microbial growth, as it depends on the initial population and the time of growth, was quantified. More specifically, due to the increase in the initial population the apparent variability was significantly reduced. As a result, the phenomenon of variability tends to be masked with the increase in the initial number of cells and the system tends to behave determinatively. The results of the present study provide useful information for the study of the behaviour of E. coli single cells by quantifying heterogeneity. Since contamination of foods with microorganisms usually occurs with very low numbers, information about variability can improve food safety management with a risk-based decision-making.