Κλωνοποίηση και μελέτη ενζύμων της βιοσυνθετικής οδού των πολύ-υδροξυαλκανοϊκών οξέων (PHAs) του βακτηρίου Thermus thermophilus HB8
Creators: name: Σαμαρίδου, Ελένη Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2012
Subjects: πολυ- υδροξυαλκανοϊκά οξέα
PHA πολυμεράση
phaG τρανσακυλάση
PHA
PHA polymerase
phaG transalylase

description: Τα πολυυδροξυαλκανοϊκά (ΡΗΑs), είναι μια κατηγορία βιοπολυμερών τα οποία συντίθενται από πολλά βακτήρια υπό μορφή ενδοκυτταρικών έγκλειστων κόκκων ως ανταπόκριση σε μεταβολικό στρες, όταν δηλαδή παρατηρείται έλλειψη ενός απαραίτητου συστατικού για την ανάπτυξη του κυττάρου, ενώ παράλληλα είναι διαθέσιμη σε περίσσεια κάποια πηγή άνθρακα. Tα PHAs είναι πολύ καλοί υποψήφιοι για την αντικατάσταση των κοινών πλαστικών λόγω του ότι έχουν ιδιότητες θερμοπλαστικών ή ελαστομερών και επιπρόσθετα εμφανίζουν παρόμοια συμπεριφορά με τα πολυπροπυλενικά πολυμερή. Λόγω της μικροβιακής τους προέλευσης, τα ΡΗΑs μπορούν να αποικοδομηθούν από εξειδικευμένα ένζυμα. Το στέλεχος του θερμόφιλου βακτηρίου Thermus thermophilus HB8 έχει την ιδιότητα να συσσωρεύει πολυϋδροξυαλκανοϊκά (PHAs) στο εσωτερικό του. Η βελτίωση των ιδιοτήτων των PHAs και η μείωση του οικονομικού κόστους σε επίπεδο βιομηχανικής παραγωγής, αναμένεται να οδηγήσει μελλοντικά σε έναν ολοένα αυξανόμενο αριθμό εφαρμογών. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος του θερμόφιλου βακτηρίου Thermus thermophilus HB8. Πρόκειται για ένα κατά Gram αρνητικό βακτήριο που έχει την ιδιότητα να συσσωρεύει στο εσωτερικό του πολϋυδροξυαλκανοϊκά (PHAs) ως ενδοκυττάρια αποθηκευτική πηγή άνθρακα και ενέργειας, όταν το βακτήριο βρίσκεται σε κατάσταση “τροφικού stress”, όταν δηλαδή υφίσταται έλλειψη κάποιου από τα κύρια θρεπτικά συστατικά του μέσου ανάπτυξης καθώς και διαφοροποίηση της κύριας πηγής άνθρακα. Πρωταρχικός στόχος της εργασίας, ήταν η κλωνοποίηση του γονιδίου της τρανσακυλάσης PhaG του Τ. thermophilus, δηλαδή του γονιδίου ΤΤΗΑ1738, το οποίο σύμφωνα με πρόσφατη έρευνα είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίησή της, καθώς και η κλωνοποίηση του γονιδίου της PHA συνθάσης του Τ. thermophilus, για το οποίο υπήρχαν ενδείξεις από παλιότερη έρευνα ότι είναι το γονίδιο ΤΤΗΑ0759 και η μελέτη του ενζύμου. Η PhaG καταλύει τη μεταφορά του (R)-3-υδροξυδεκανοϋλ τμήματος από το ACP θειοεστέρα στο CoA. Με αυτό τον τρόπο, συνδέει άμεσα τη de novo βιοσύνθεση λιπαρών οξέων και τη PHA βιοσύνθεση. Η έκφραση του phaG οδηγεί σε υψηλή συσσώρευση PHAMCL από μη εξειδικευμένες πηγές άνθρακα. Έτσι η λειτουργική έκφραση μόνο του phaG γονιδίου σε βακτήρια που δεν παράγουν ΡΗΑ από μη εξειδικευμένα υποστρώματα δίνει τη δυνατότητα ύπαρξης μιας νέας μεταβολικής οδού σύνθεσης PHA. Ενώ, η PHA πολυμεράση (συνθάση) είναι το ένζυμο, που υπεύθυνο για την βιοσύνθεση των PHAs, η οποία καταλύει τη στερεοεκλεκτική μετατροπή των (R)-3-υδροξυάκυλο-CoA υποστρωμάτων. Τελικά επιτεύχθηκε η κλωνοποίηση των γονιδίων ΤΤΗΑ1738 και ΤΤΗΑ0759, ενώ το ΤΤΗΑ0759 μεταφέρθηκε σε κατάλληλο φορέα υπερέκφρασης για την παραγωγή του ενζύμου σε μεγάλη ποσότητα και τον καθαρισμό του. Έγινε καθαρισμός με στήλη Ni 142 φορές με αποδόση 10,6%. Μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του ενζύμου στην ενζυμική δραστικότητα, και όπως ήταν αναμενόμενο βρέθηκε αύξηση της με αύξηση της συγκέντρωσης του ενζύμου, καθώς και η επίδραση του pH στην ενζυμική δραστικότητα, με αποτέλεσμα να βρεθεί το βέλτιστο pH του ενζύμου 8.5. Τέλος, βρέθηκε ότι παρουσίαζει μεγάλη αγχιστεία με το PHB (εμπορίου). Η πρόσφατη αποκωδικοποίηση του γονιδιώματος του στελέχους Thermus thermophilus ΗΒ8, θα επιτρέψει μέσω μεθόδων γενετικής και μοριακής βιολογίας, να γίνουν περισσότερα γνωστά, και με άλλα ένζυμα του βακτηρίου αυτού, τα οποία λόγω της θερμοσταθερότητας τους θα είναι χρήσιμα σε διάφορες βιοτεχνολογικές εφαρμογές.
description: In recent years the large environmental impact because of the huge accumulation of plastics has alarmed the scientific community. The plastics are the main raw material for manufacturing various products and devices used every day, because of their properties such are flexibility, stability and low production costs. Their only drawback is that they do not degrade. For this reason, lately, many kinds of biodegradable polymers have been prepared by hydrolysis. The polydroxyalkanoates (PHAs) are a class of biopolymers that are synthesized by many bacteria form intracellular granules embedded in response to metabolic stress, when they lack an essential ingredient for the development of the cell, such as nitrogen, phosphorus, sulfur, oxygen or magnesium while a carbon source is available in some excess. The PHAs are very good candidates for the replacement of common plastics because of their thermoplastic and/or elastomeric properties and additionally exhibit similar behavior with polypropylene polymers. Because of their microbial origin, PHAs can be degraded by specialized enzymes. The strain, of thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8 has the ability to accumulate polydroxyalkanoates (PHAs). Improved properties of PHAs and the reduction of economic cost in terms of industrial production is expected to ultimately lead to a growing number of applications in various fields such as environment, health, etc. In this study, we used the strain Thermus thermophilus HB8. This is a Gramnegative bacterium that has the ability to accumulate polydroxyalkanoates (PHAs) as an intracellular storage of carbon and energy source when the bacteria are in "trophic stress", i.e. when there is a lack of major nutrients for growth and differentiation of the main carbon source. The primary aim of this work was the cloning of the gene phaG of T. thermophilus, namely the TTHA1738 gene, which according to recent research is responsible for encoding the PhaG transakylase and the cloning of the PHA synthase gene of T. thermophilus, for which there were indications from previous research that it is the gene TTHA0759 and the study of this enzyme. The PhaG catalyzes the conversion of (R)-3-ydroxyacetyl-ACP in (R)-3- ydroxyacetyl-CoA. In this way, a direct link between de novo fatty acid biosynthesis and PHA biosynthesis is created. The expression of phaG leads to high accumulation of non-specialized PHAMCL carbon sources. Thus, the functional expression alone phaG gene in bacteria, that do not produce PHA from non-specific substrates, allows the existence of a new PHA synthesis pathway. While the PHA polymerase (synthase) is the enzyme that is responsible for the biosynthesis of PHAs, which catalyzes the selective conversion of (R)-3-ydroxyakylo-CoA substrates. Finally, we achieved the cloning of genes and TTHA1738 TTHA0759, while TTHA0759 was transferred to a suitable overexpression vector to produce the enzyme in large quantities and to achieve its cleaning. Because the gene structure of TTHA0759 is undoubtedly a / b hydrolase found in all synthases, its activity was studied further. So, TTHA0759 synthase protein exhibits synthase activity. PHA polymerase was cleaned with two Ni columns for 142 times with a yield of 10.6%. The effect of the enzyme concentration on the enzymatic activity was studied, and as expected found increased with increasing concentration of the enzyme. The effect of pH on enzymatic activity also was studied, thus finding the optimum pH of the enzyme 8.5. Finally, we found that shows great affinity to PHB. The recent decoding of the genome of Thermus thermophilus strain HB8 will allow methods through genetics and molecular biology, to become more known, and other enzymes of this bacterium, which because of stability will be useful in different biotechnological applications.