Αλληλεπιδράσεις της Δισφαινόλης – Α (BPA) με το μικροβίωμα εντέρου και κοπράνων της ιριδίζουσας πέστροφας (Oncorhynchus mykiss)
Creators: name: Κατσούλας, Αντώνιος Νικολάου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2019
Subjects: Δισφαινόλη – A (BPA)
Μικροβίωμα
Αλληλούχιση 16S rRNA
Bisphenol – A (BPA)
Microbiome
16S rRNA Sequencing

description: Η Δισφαινόλη – Α (bis-phenol A, BPA), είναι μια συνθετική οργανική ένωση με οιστρογονικές ιδιότητες που χρησιμοποιείται ευρύτατα για την παραγωγή πλαστικών και ρητινών. Αποτελεί έναν ενδοκρινικό διαταράκτη με δυσμενείς επιπτώσεις τόσο για τους υδρόβιους οργανισμούς όσο και για τον άνθρωπο και μπορεί να εισέλθει στην κυκλοφορία του αίματος μέσω δερματικής επαφής ή κατάποσης. Πιθανός, όμως, ενδιάμεσος μεσολαβητής αυτών των επιδράσεων αποτελεί το εντερικό μικροβίωμα των οργανισμών. Είναι επίσης γνωστό ότι υπάρχει πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ του μικροβιώματος του εντέρου και ξενοβιοτικών, με αποτέλεσμα τη ρύθμιση της τοξικότητάς τους, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες και διαφοροποιήσεις στο ορμονικό σύστημα. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν η in vitro διερεύνηση πρόκλησης αλλοιώσεων στη μικροβιακή σύνθεση εντέρου και κοπράνων της ιριδίζουσας πέστροφας (Oncorhynchus mykiss) παρουσία BPA. Οι βακτηριακές κοινότητες δοκιμάστηκαν για τη δυνητική τους ικανότητα να επιβιώνουν ή/και να μεταβολίζουν το ρύπο. Τα προϊόντα αποικοδόμησης ΒΡΑ που εξετάστηκαν ήταν, η 4-υδροξυ ακετοφαινόνη (HAP), το 4-υδροξυ βενζοϊκό οξύ (HBA), η υδροκινόνη (HQ) και η 4-ισο-προπενυλφαινόλη (PP). Κάθε δείγμα αναπτύχθηκε σε θρεπτικό μέσο ανόργανων αλάτων που περιείχε ΒΡΑ (50 μg/mL) με προσθήκη 0,1%(w/v) εκχυλίσματος ζύμης, σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες 13°C και 37°C. Δείγματα υπερκειμένου καλλιέργειας συλλέχθηκαν άσηπτα στις 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 και 96 ώρες, φυγοκεντρήθηκαν, διηθήθηκαν και αναλύθηκαν με HPLC, χρησιμοποιώντας την n-οκτυλφαινόλη ως εσωτερικό πρότυπο. Μετά το πέρας του πειράματος συλλέχθηκαν κύτταρα, ένα μέρος των οποίων υποβλήθηκε σε προσδιορισμό αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου και το άλλο σε ομογενοποίηση, SPE και HPLC ανάλυση. Αποικοδόμηση της ΒΡΑ ήταν εμφανής σε όλα τα δείγματα, με σημαντικές όμως διαφορές, να παρουσιάζονται τόσο μεταξύ θερμοκρασιών όσο και μεταξύ βιολογικών δειγμάτων (κόπρανα, έντερα). Ο μεταβολίτης PP ανιχνεύθηκε μόνο σε δείγματα εντέρου στους 37°C από 0 έως 24 ώρες, με τη συγκέντρωσή του να είναι χρόνο-εξαρτώμενη, ενώ η HAP ανιχνεύθηκε σε δείγματα εντέρου και σε δείγματα περιττωμάτων σε αμφότερες τις θερμοκρασίες από 0 έως 96 ώρες. Συνολικά, βρέθηκαν 417 μοναδικές βακτηριακές ταξινομικές λειτουργικές μονάδες (operational taxonomic units, OTUs) σε αυτή τη μελέτη, σε όλα τα δείγματα. Τα πιο άφθονα και κυρίαρχα φύλα βακτηρίων, τόσο στα δείγματα των αρχικών ομογενοποιημάτων, όσο και στα δείγματα που καλλιεργήθηκαν παρουσία BPA, ήταν τα Proteobacteria, Firmicutes και Actinobacteria, και η πιο άφθονη βακτηριακή οικογένεια ήταν τα Enterobacteriaceae. Τα βακτηριακά φύλα μπορεί να είναι ίδια, όμως η κυριαρχία και η αφθονία συγκεκριμένων OTUs διαφοροποιήθηκε παρουσία BPA. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν διαφορετικούς ρυθμούς αποικοδόμησης BPA μεταξύ των βακτηριακών κοινοτήτων, γεγονός που επιβεβαιώνεται από την BPA-εξαρτώμενη μεταβολή στη δομή των μικροβιακών κοινοτήτων
description: Bisphenol-A (BPA) is a synthetic organic compound with estrogenic properties, used extensively in the production of polycarbonates and epoxy resins. BPA is included among the endocrine disrupting compounds (EDCs) that exert adverse effects and bio-accumulate on aquatic organisms and humans. BPA can enter the bloodstream through dermal contact or ingestion, causing endocrine and neurodevelopmental dysfunctions that may be mediated by gut microbiota. It is also known that there is a complex interplay between gut microbes and ingested xenobiotics, resulting in regulation of their toxicity that may lead to disease or even modifications to the hormonal system. In this study, an in vitro evaluation of the efficacy of BPA leading to possible alterations in the composition of gut and feces microbial communities of the freshwater fish rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) was investigated. The bacterial communities were tested in regard to their potential ability to survive and/or metabolize this pollutant, when provided as the sole carbon source. The BPA degradation products, examined were 4-hydroxy acetophenone (HAP), 4-hydroxy benzoic acid (HBA), Hydroquinone (HQ) and 4-iso-propenylphenol (4-ISO). Each sample was grown on mineral salts medium containing BPA (50 μg/mL) with 0.1% (w/v) yeast extract. Cultures of gut and of feces bacteria were grown at 13oC and 37oC. Culture supernatant aliquots were aseptically collected at 0, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 and 96 hours, centrifuged, filtered and analyzed with HPLC, using n-Octylphenol as the internal standard. Cells were collected at the end of the experiment (96h) and part of the cell pellet was subjected to 16S rRNA amplicon sequencing and the remaining to homogenization, SPE and HPLC analysis. Although BPA degradation was evident, there were significant differences among experimental series conducted at different temperatures as well as between feces and gut bacterial samples. The metabolite 4-ISO was detected only in gut samples at 37oC from 0 to 24h with its concentration being time-dependent, while HAP was detected in gut samples at 13oC and in feces samples at both temperatures, from 0 to 96 hours. In total, 417 unique bacterial operational taxonomic units, OTUs were found in this study in all samples. The most abundant and dominant bacterial phylum, both in the samples of the original homogenates and in samples grown in the presence of BPA, were Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria and the most abundant bacterial family was Enterobacteriaceae. The bacterial phylum may be the same, but the dominance and abundance of specific OTUs changed in the presence of BPA. Our results demonstrate different BPA degradation rates among bacterial communities, which are confirmed by the BPA-dependent shift in the structure of microbial communities