title: Der Einfluss der Neuwelt-Arenaviren Junín und Tacaribe auf die Apoptose der Wirtszelle
title: The Influence of Newworld-Arenaviruses on Host Cell Apoptosis
Creators: name: Wolff, Svenja
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2014
Subjects: Apoptose
Arenavirus
Apoptosis
Medizin, Gesundheit

description: Arenaviren gehören zu den
      segmentierten negativsträngigen RNA-Viren und werden in die
      zwei Serogruppen der Alt- und Neuwelt-Arenaviren unterteilt.
      Die in dieser Arbeit untersuchten Virusspezies Junín (JUNV)
      und Tacaribe (TCRV) werden den Neuwelt-Arenaviren zugeordnet
      und stellen die Prototypen für hämorrhagische
      Fieber-verursachende bzw. apathogene Neuwelt-Arenaviren dar.
      Das in Argentinien endemische JUNV löst im Menschen
      hämorrhagisches Fieber aus und ist mit einer Mortalitätsrate
      von 30% ein hochpathogenes Arenavirus, wohingegen das eng
      verwandte TCRV nicht humanpathogen ist. Den Hauptbestandteil
      der Virionen stellt das Nukleoprotein NP dar. NP spielt eine
      entscheidende Rolle für die virale Replikation/Transkription
      sowie für die Unterdrückung der Immunantwort. Die ersten
      Analysen dieser Arbeit zur JUNV und TCRV NP-Charakterisierung
      zeigten interessanterweise, trotz einer 78%igen
      Übereinstimmung in der NP-Aminosäuresequenz, einen deutlichen
      Unterschied bei der Expression von JUNV und TCRV NP. Für JUNV
      NP konnten sowohl bei rekombinanter NP-Expression als auch in
      der Infektion NP-spezifische Spaltprodukte mit einer Größe
      von etwa 62, 53, 47 und 40 kDa beobachtet werden, die im
      Falle von TCRV NP nicht auftraten. Die Analyse der JUNV
      NP-Aminosäuresequenz wies potentielle Caspase-Spaltmotive
      auf. Mittels Punktmutationen, die zu einer Veränderung im
      JUNV NP-Expressionsmuster und dem Ausbleiben bestimmter
      Spaltprodukte führten, wurden die Motive DVKD und QEHD als
      die Spaltstellen identifiziert, die für die Generierung der
      47 kDa und 40 kDa Spaltprodukte genutzt werden. Es konnte
      ferner beobachtet werden, dass die Intensität der JUNV
      NP-Spaltung direkt mit der Caspase-Aktivität zusammenhängt,
      da eine Steigerung der Caspase-Aktivität zu einer verstärkten
      NP-Spaltung, die Inhibition der Caspase hingegen zu einer
      verringerten NP-Spaltung führte. Basierend auf diesen
      Ergebnissen konnte JUNV NP als ein spezifisches Substrat
      zellulärer Caspasen identifiziert werden. Interessanterweise
      zeigte sich, dass JUNV NP, nicht jedoch TCRV NP, in
      Abwesenheit weiterer viraler Proteine in der Lage ist, die
      Caspase 3-Spaltung in apoptotischen Zellen zu unterdrücken
      und dass diese anti-apoptotische Eigenschaft durch den
      Spaltungsprozess von JUNV NP vermittelt wird. Zusammengefasst
      zeigt sich, dass JUNV NP, im Gegensatz zu TCRV NP, ein
      Substrat von Caspasen darstellt und durch die
      Caspase-vermittelte JUNV NP-Spaltung eine anti-apoptotische
      Eigenschaft besitzt. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde
      die Bedeutung der fehlenden NP-Spaltung und
      anti-apoptotischen Funktion für TCRV untersucht. Es konnte
      gezeigt werden, dass TCRV deutlich Apoptose in der
      infizierten Zelle induziert. In TCRV-infizierten Zellen
      wurden Apoptosemerkmale wie Caspase 3- und PARP-Spaltung,
      Chromatinkondensation sowie die Bildung von apoptotic bodies
      detektiert. Eine genauere Charakterisierung der
      TCRV-induzierten Apoptose ergab, dass die Induktion zu einem
      späten Zeitpunkt der Infektion erfolgt und Zelltyp-abhängig
      ist. Ferner wurde mittels UV-inaktiviertem TCRV demonstriert,
      dass die Apoptose vermutlich durch virale
      Replikation/Transkription und Akkumulation viraler Proteine
      im Zytoplasma und nicht durch die Bindung und den Eintritt in
      die Zelle ausgelöst wird. Die Spaltung von Caspase 8 und 9 in
      TCRV-infizierten Zellen deutete zudem daraufhin, dass die
      TCRV-induzierte Apoptose unter Beteiligung des extrinsischen
      und des intrinsischen Signalwegs vermittelt wird.
      Interessanterweise zeigten TCRV-Wachstumskinetiken, dass die
      Inhibition der Caspasen zu verminderten Virustitern, die
      Aktivierung von Caspasen hingegen zu erhöhten Virustitern
      führt. TCRV hat somit durch die fehlende NP-Spaltung als
      anti-apoptotischen Mechanismus keinen Nachteil während der
      Infektion, sondern benötigt im Gegenteil die apoptotischen
      Prozesse für eine effiziente Virusproduktion und
      -freisetzung. Mit der vorliegenden Arbeit konnte erstmals für
      Arenaviren eine anti-apoptotische Funktion identifiziert
      werden, die über die NP-Spaltung durch zelluläre Caspasen
      vermittelt wird. Zusätzlich zeigen die aufgeführten Daten zum
      ersten Mal, dass JUNV und TCRV, trotz enger phylogenetischer
      Verwandtschaft, unterschiedliche Mechanismen besitzen, um
      Apoptose in der Wirtszelle zu modulieren. Während JUNV
      mittels NP-Spaltung Apoptose in der infizierten Wirtszelle
      gezielt unterdrückt, benötigt TCRV apoptotische Prozesse, um
      zu vergleichbaren Titern wie JUNV heranzuwachsen. Durch die
      vergleichenden Analysen von JUNV und TCRV NP konnten in
      dieser Arbeit Funktionen und Unterschiede zwischen den beiden
      Spezies identifiziert werden, die eine entscheidende
      Auswirkung auf die Virus-Wirtszell-Interaktion haben und in
      Zukunft helfen könnten, die signifikanten
      Pathogenitätsunterschiede der Viren zu erklären.
description: Arenaviruses belong to the
      segmented negative-strand RNA-viruses and are divided into
      the two serogroups known as the Old World and New World
      arenaviruses. In this study the New World arenavirus species
      Junín (JUNV) and Tacaribe (TCRV), which can be considered
      prototypes for hemorrhagic fever-causing and non-pathogenic
      New World arenviruses, respectively, were investigated. JUNV
      is a human pathogen endemic to Argentina that causes
      hemorrhagic fever with a high case fatality rate, while its
      close relative TCRV is not known to be a significant human
      pathogen. The nucleoprotein NP is the most abundant
      structural component of the viral particle. It plays an
      essential role for viral replication/transcription as well as
      overcoming the interferon response in the host cell. JUNV and
      TCRV NP show 78% identity between their NP amino acid
      sequences, nevertheless the characterisation of JUNV and TCRV
      NP at the beginning of this work revealed significant
      differences in the expression pattern of JUNV and TCRV NP. In
      the case of JUNV NP, NP-specific cleavage products with a
      size of 62, 53, 47, 40 kDa were observed during recombinant
      expression as well as during JUNV infection. TCRV NP,
      however, did not show a comparable specific degradation
      pattern. Examination of the JUNV NP sequence revealed several
      putative caspase cleavage motifs. Point mutations of these
      motifs led to alterations in the observed degradation pattern
      and the loss of certain cleavage events. The DVKD and QEHD
      motives in JUNV NP were identified as the responsible
      cleavage sites for the generation of the 47 kDa and 40 kDa
      cleavage products, respectively. Further it could be shown
      that the intensity of JUNV NP cleavage directly depended on
      caspase activity, with increased caspase activity resulting
      in increased cleavage of NP, while inhibition of caspases
      decreased cleavage of NP. Based on these data JUNV NP was
      identified as a substrate of caspases. Interestingly it was
      further shown that expression of JUNV NP alone, but not of
      TCRV NP, suppresses the induction of apoptosis in cells
      treated with an apoptosis activator and that this
      anti-apoptotic effect also depends on cleavage of JUNV NP.
      Taken together, these data reveal that JUNV NP, in contrast
      to TCRV NP, serves as a target for caspase cleavage and is,
      therefore, able to prevent the induction of apoptosis in JUNV
      infected cells, possibly by serving as a decoy substrate. To
      better understand the role of caspase activation in
      arenavirus infection, the biological relevance of
      non-cleavage of TCRV NP was also analysed. TCRV, having no
      anti-apoptotic function mediated by NP, showed significant
      hallmarks of apoptosis during infection. In the case of TCRV,
      but not JUNV, a strong cleavage of caspase 3 and PARP, as
      well as chromatin condensation and the formation of apoptotic
      bodies, could be detected during infection. Further,
      characterisation of TCRV-induced apoptosis revealed an
      induction of apoptosis at late stages of infection and was
      dependent on cell type. Studies with UV-inactivated TCRV
      further demonstrated that apoptosis-induction is mediated not
      by binding or entry of the virus into the cell, but by
      down-stream steps in virus replication (e.g. viral
      replication/transcription and/or the accumulation of viral
      proteins in the cytoplasm). Cleavage of caspases 8 and 9
      however, indicated that both, the extrinsic as well as the
      intrinsic apoptosis pathways are involved in signal
      transduction during the induction of apoptosis.
      Interestingly, caspase inhibition during TCRV infection
      results in a reduced virus titre, while caspase activation
      increased the virus titre. Therefore, the absence of
      NP-cleavage and its corresponding anti-apoptotic effect is
      unlikely to present a disadvantage for TCRV during infection.
      In contrast, TCRV seems to rely on apoptotic processes to
      yield efficient virus replication and release. The data
      presented in this work show for the first time that, in some
      species, the arenavirus nucleoprotein exerts a novel
      anti-apoptotic function related to its cleavage by caspases.
      In addition, this work has shown that JUNV and TCRV, despite
      their close phylogenetic relationship, are using different
      mechanisms to modulate apoptosis in the infected host cell to
      achieve efficient virus production and spread. While JUNV
      inhibits apoptosis by using NP as a decoy substrate for
      caspases, TCRV depends on apoptotic processes in the infected
      cell to replicate efficiently and reach virus titres
      equivalent to those achieved by JUNV. Based on the
      comparative analysis used in this study, differences between
      JUNV and TCRV NP that have a crucial effect on virus-host
      cell-interaction were identified and may help in future to
      explain the fact that JUNV and TCRV differ dramatically in
      their pathogenicity, as well as to predict the virulence of
      newly emerging arenavirus species.