title: Strukturbasierte Charakterisierung von Klasse II CPD Photolyasen
title: Structure-based characterization of class II CPD photolyases
Creators: name: Kiontke, Stephan
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Deoxyribodipyrimidin-Photolyase , DNS-Reparatur
Structural biology
Deazaflavine , Rekombinantes Protein
UV-induced DNA lesions, Antenna chromophore
UV-induzierte DNA-Schäden
Class II CPD photolyases
Protein crystallography
Klasse II CPD Photolyasen
Flavine
Methanosarcina mazei , Kristallstrukturanalyse
Proteinkristallographie
Antennenchromophor
Or
Strukturbiologie
Chemie

description: CPD-Photolyasen sind
      substratspezifische, lichtgetriebene DNA-Reparaturenzyme, die
      mit der Energie des Sonnenlichts (300 nm – 500 nm) den
      UV-induzierten Hauptschaden im Erbgut, das
      Cyclobutanpyrimidindimer (CPD), entfernen und somit die
      genomische Integrität sicherstellen. Diese monomeren Enzyme
      besitzen neben dem katalytisch essentiellen Kofaktor FAD in
      der Regel einen zusätzlichen Antennenchromophor zur
      Erweiterung ihres Aktionsspektrums. Die Klassifizierung der
      CPD-Photolyasen erfolgt anhand von Sequenzhomologien und
      spiegelt sich bemerkenswerterweise auch im differenzierten
      Auftreten innerhalb der Lebewesen wider. Während der
      umfangreich charakterisierte Klasse I Subtyp auf mikrobielle
      Organismen beschränkt ist, existiert der weitgehend
      unerforschte Klasse II Subtyp ubiquitär in Pflanzen, Tieren,
      Bakterien, Archaeen sowie in einigen Viren. In dieser Arbeit
      erfolgte die funktionelle als auch strukturelle
      Charakterisierung des Klasse II Subtyps am Beispiel der
      Photolyasen aus der archaealen Gattung Methanosarcina. Diese
      Enzyme stellen aufgrund der hohen Sequenzhomologien zu den
      pflanzlichen und tierischen Orthologen geeignete Modelle für
      die Untersuchung eukaryotischer, Klasse II-spezifischer
      Aspekte dar. Die in dieser Arbeit gelösten Kristallstrukturen
      der Methanosarcina mazei Photolyase (MmCPDII) allein und im
      Komplex mit doppelsträngiger, CPD-geschädigter DNA lieferten
      die ersten dreidimensionalen Informationen für diese
      phylogenetisch distinkte Gruppe. Dabei wurde deutlich, dass
      der durch Gelshift-Experimente ermittelte geringe
      Diskriminierungsgrad zwischen ungeschädigter und geschädigter
      DNA des Klasse II Subtyps auf einen unterschiedlichen DNA
      Bindungsmodus zurückzuführen ist. Katalytische Merkmale
      ähneln zwar dem Klasse I Subtyp funktionell, unterscheiden
      sich aber auf struktureller Ebene und deuten so auf deren
      konvergente Evolution hin. So findet der Elektronentransport
      während der Photoreduktion des Kofaktors FAD ebenfalls
      entlang konservierter Tryptophane statt, nimmt aber eine neue
      Route und besteht nicht aus einer Triade, sondern aus einer
      Dyade mit mehreren terminalen Verzweigungspunkten.
      Vergleichbar mit dem Klasse I Subtyp erfolgt die
      Stabilisierung des neutralen semichionoiden Zustands während
      der Photoreduktion und der DNA Reparatur über ein Asparagin,
      das sich allerdings im Klasse II Subtyp konserviert auf einem
      anderen Strukturelement befindet. Mit Hilfe ortsgerichteter
      Mutagenese und UV/Vis-spektroskopischer Methoden war es
      möglich, die Funktion und Relevanz dieser Klasse
      II-spezifischen Merkmale zu verifizieren. Die Etablierung
      eines artifiziellen Synthesewegs zur Bereitstellung des
      Deazaflavins 8-HDF im Expressionswirt Escherichia coli
      identifizierte in letzter Konsequenz den anfänglich
      unbekannten Antennenchromophor der MmCPDII. Die
      Kristallstruktur des MmCPDII/8-HDF Komplexes wiederum
      lieferte detaillierte Einblicke in die Antennenbindungstasche
      und ermöglichte Schlussfolgerungen bezüglich potentieller
      Antennen für den gesamten Klasse II Subtyp, insbesondere für
      die pflanzlichen Photolyasen. Diese Informationen können
      einen wichtigen Beitrag zur Entdeckung des bisher kryptischen
      Antennenchromophors in pflanzlichen Photolyasen
      leisten.
description: CPD photolyases are
      substrate-specific, light-driven DNA repair enzymes which use
      the energy of sunlight (300 nm – 500 nm) to remove the
      predominant UV-induced DNA lesion, the cyclobutane pyrimidine
      dimer (CPD), for ensuring genomic integrity. These monomeric
      enzymes possess usually two cofactors: the catalytic cofactor
      FAD crucial for repair activity and an additional antenna
      chromophore which broadens the photolyase’s action spectrum.
      Based on sequence identities, CPD photolyases are classified
      into subtypes with species-specific distributions. While the
      extensively characterized class I subtype is limited to
      microbial organisms, the class II subtype is ubiquitous in
      plants, animals, bacteria, archaea and in some viruses.
      However, our overall knowledge on the class II photolyases is
      lagging behind. In this work, functional and structural
      aspects of the class II subtype were addressed using the
      archaeal photolyases from the genus Methanosarcina. Due to
      their high sequence identities to plant and animal orthologs
      these photolyases are suitable model enzyms to enhance our
      understanding of class II-specific functionalities. The
      crystal structures of the Methanosarcina mazei photolyase
      (MmCPDII) alone and in complex with duplex, CPD-containing
      DNA provided the first three dimensional information for this
      phylogenetically distinct group. It became clear that the low
      discrimination ratio between undamaged and damaged DNA of the
      class II subtype, which was determined by gel shift
      experiments, is due to different DNA binding modes.
      Interestingly, while critical features are functionally
      similar between the class I and class II subtype, their
      differences on the structural level suggest that they
      convergently evolved. For example, during photoreduction of
      the cofactor FAD the electrons are also transferred along
      conserved tryptophans, but this pathway takes a different
      route and the triad of class I is replaced by a dyad with
      terminal branching points. Comparable to the class I subtype,
      the neutral semiquinoid species during photoreduction and DNA
      repair is stabilized by an asparagine. However, in the class
      II subtype, this conserved residues is located on a different
      structural element. Finally, use of site-directed mutagenesis
      and UV/Vis-spectroscopic approaches verified the functional
      role of these critical features in the class II subtyp.
      Establishment of an artificial metabolic pathway for
      providing the deazaflavin 8-HDF in the E. coli expression
      system finally enabled the identification of the previously
      unknown antenna chromophore of MmCPDII. The crystal structure
      of the MmCPDII/8-HDF complex provided detailed insights into
      the antenna binding pocket and made it possible to draw
      conclusions regarding potential antennas for the entire class
      II subtype, especially for the plant photolyases. This
      information will be a major contribution for the
      identification of currently cryptic antenna chromophors in
      plant photolyases.