title: Einblicke in die Dynamik von Peroxisomen in Säugerzellen
title: Towards an understanding of peroxisome dynamics in mammalian cells
Creators: name: Bonekamp, Nina Anna Maria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Mitochondrium
Mitochondria
Pex11
Organelle dynamics
Fusion
Medizin, Gesundheit
Peroxisomen
Organelldynamik
Peroxisomes

description: Peroxisomen sind ubiquitäre
      Zellorganellen, die an einer Vielzahl wichtiger metabolischer
      Prozesse beteiligt sind. Viele dieser Funktionen werden in
      enger Kooperation mit Mitochondrien ausgeführt. Da
      Peroxisomen für die Gesundheit und Entwicklung des Menschen
      essentiell sind, führen peroxisomale Dysfunktionen zu
      schwerwiegenden Erkrankungen. Des Weiteren sind Peroxisomen
      sehr dynamische Zellorganellen, die ihre Proteinkomposition,
      Morphologie und Anzahl an die zellulären Anforderungen
      anpassen. Kürzlich wurde ein Patient mit einem letalen Defekt
      der mitochondrialen und peroxisomalen Teilung identifiziert;
      daraus wird ersichtlich, dass der korrekte Ablauf dynamischer
      peroxisomaler Prozesse eng mit der Funktion der Organelle
      verknüpft ist und somit ebenfalls essentiell für die
      menschliche Gesundheit ist. Die Dynamik der Peroxisomen als
      solche wird durch Wachstums- und Teilungsprozesse reguliert,
      jedoch können Peroxisomen unter bestimmten Bedingungen auch
      de novo aus dem ER gebildet werden. In Säugerzellen geht der
      peroxisomale Wachstums- und Teilungsprozess mit einer Reihe
      klarer morphologischer Veränderungen der Organelle einher:
      eine initiale Elongation der peroxisomalen Membran wird durch
      das peroxisomale Membranprotein Pex11pβ, während die
      Durchschnürung der peroxisomalen Tubuli in kleinere
      Organellen durch die Membranadaptoren Mff, Fis1 sowie die
      GTPase DLP1 erfolgt. Interessanterweise sind letztere
      Proteine auch an der Teilung von Mitochondrien beteiligt. Die
      Frage, ob ausgereifte Peroxisomen ähnlich wie Mitochondrien,
      miteinander fusionieren, blieb umstritten. Es wurden außerdem
      diverse externe Stimuli identifiziert, die die Dynamik der
      Peroxisomen verändern, jedoch sind die Mechanismen ihrer
      Rezeption und der Signaltransduktion auf die Ebene der
      Organelle weithin unbekannt. Die vorliegende Studie zielte
      daher darauf ab, Einblicke in Prozesse zu gewinnen, die an
      der Dynamik der Peroxisomen als solche beteiligt sind und zu
      ihrer Regulation beitragen. Diese Dissertation besteht aus
      drei Teilen: im ersten Teil wurde die Existenz einer Fusion
      ausgereifter Peroxisomen, analog zur mitochondrialen Fusion,
      untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die
      Regulation von Pex11pβ, des Schlüsselproteins der
      peroxisomalen Biogenese in Säugerzellen, durch
      post-translationale Mechanismen untersucht, um Einblicke in
      die Regulation der peroxisomalen Dynamik auf der Ebene der
      Organelle selbst zu gewinnen. Im dritten Teil dieser Studie
      wurden verschiedene Gruppen von Stimuli im Hinblick auf ihren
      Effekt auf das peroxisomale Kompartiment charakterisiert, um
      die Regulation der peroxisomalen Dynamik auf
      transkriptioneller Ebene in Säugerzellkulturmodellen zu
      untersuchen. Um die Fusion ausgereifter Peroxisomen in
      Säugerzellen zu untersuchen, wurde ein in vivo Fusionsassay
      in CHO-Säugerzellen etabliert. Dieser beruhte auf der
      Kokultivierung stabiler Zelllinien, die GFP- oder
      DsRed-basierte peroxisomale Matrix- oder Membranmarker
      exprimierten, und der anschließenden Generierung von
      Hybridomzellen durch Zellfusion. Eine Überlappung der
      unterschiedlichen peroxisomalen Marker wurde
      fluoreszenzmikroskopisch in nach verschiedenen Zeitpunkten
      fixierten Zellen festgestellt, was zunächst auf einen
      gewissen Grad peroxisomaler Fusionen hinwies. Weitere Studien
      in lebenden Zellen zeigten jedoch, dass kein Austausch
      peroxisomaler Marker stattfand. Allerdings wurde erstmals die
      Existenz transienter peroxisomaler Interaktionen
      charakterisiert. Interagierende Peroxisomen gingen dabei enge
      Kontakte ein, die für die beobachtete Überlappung von
      peroxisomalen Markern in fixierten Zellen verantwortlich
      waren. Computer-basiertes Modelling und mathematische Analyse
      ergab, dass transiente peroxisomale Interaktionen einem
      komplexen, nicht-zufälligen Verhaltensmuster folgten, welches
      potentiell zu einer Homogenisierung des peroxisomalen
      Kompartiments beitragen könnte. Vorstimulation der Zellen mit
      peroxisomalen Substraten wies darauf hin, dass Fettsäuren und
      H2O2 nicht ausgetauscht wurden, jedoch könnten transiente
      peroxisomale Interaktionen dem Austausch anderer
      peroxisomaler Metabolite dienen oder Teil eines Signalsystems
      z. B. zur Feststellung der Verteilung der
      Peroxisomenpopulation sein. Erstmals konnte außerdem erklärt
      werden, warum nur ein bestimmter Anteil von Peroxisomen (15
      %) Mikrotubuliabhängig bewegt wird. Zusätzlich wurde erstmals
      nachgewiesen, dass mitochondriale Fusionsproteine nicht
      peroxisomal lokalisiert sind, welches daraufhin weist, dass
      die Dynamik der Peroxisomen durch andere, charakteristische
      Prozesse reguliert wird. Um die Regulationsmechanismen der
      peroxisomalen Dynamik an der Organelle selbst zu untersuchen,
      wurde das zentrale Membranprotein Pex11pβ biochemisch
      charakterisiert. Differentielle Permeabilisierung und
      protease-protection assays ermöglichten in Kombination mit
      einem seit kurzem erhältlichen Antikörper die Lokalisation
      der ersten Transmembrandomäne von Pex11pβ zwischen den
      Aminosäurepositionen 90 und 110. Im Anschluss wurde die
      Bedeutung der N-terminalen Domäne von Pex11pβ für die
      Regulation der Proteinaktivität untersucht: die Deletion der
      ersten 40 Aminosäuren des Proteins inhibierte bereits die
      Pex11pβ-induzierte Elongation peroxisomaler Membranen, obwohl
      die für die Membrandeformation essentielle amphipathische
      Helix intakt blieb. Nach unterschiedlichen
      Expressionszeitpunkten wurde chemisches Cross-linking und
      eine Anreicherung von Pex11pβ durchgeführt, was darauf
      hinwies, dass eine Homodimerisierung für die Proteinaktivität
      vonnöten ist. Diese wiederum war abhängig von der
      N-terminalen Domäne von Pex11pβ. Im Gegensatz zum orthologen
      Protein in S. cerevisiae, wiesen In vivo phospho-labelling-
      Experimente nicht auf eine Phosphorylierung von Pex11pβ in
      Säugerzellen hin. Daher scheinen die Pex11 Proteine im
      Säuger- und Hefesystem gegensätzlich reguliert zu werden.
      Eine Überexpresssion von Pex11pβ in Peroxisomen-defizienten
      Patientenfibroblasten führte des weiteren zu einer
      Fehllokalisation des Proteins an Mitochondrien, wo es eine
      exzessive mitochondriale Fragmentierung verursachte. Diese
      Beobachtung unterstreicht, dass in Säugerzellen Mitochondrien
      anstatt des ER als alternatives Membrankompartiment für
      peroxisomale Proteine dienen, wenn keine peroxisomalen
      Membranen vorhanden sind. Daraus resultierende Effekte auf
      die Dynamik und Funktion der Mitochondrien könnten zum
      klinischen Phänotyp peroxisomaler Erkrankungen beitragen. Im
      letzten Teil dieser Arbeit wurden externe Stimuli
      charakterisiert, die die peroxisomale Dynamik beeinflussen,
      um ein eher physiologisches Säugerzellkulturmodel zu
      etablieren, welches Untersuchungen zur Regulation dynamischer
      peroxisomaler Prozesse ermöglicht. Die Behandlung von SH-S5Y5
      Neuroblastomzellen mit dem Neurotoxin 6-OHDA hatte keinen
      Einfluss auf die peroxisomale Dynamik, resultierte allerdings
      in einer prominenten DLP1-abhängigen Fragmentierung der
      Mitochondrien. Obwohl DLP1 von beiden Organellen geteilt
      wird, werden demnach mitochondriale und peroxisomale Dynamik
      unterschiedlich voneinander reguliert. Des weiteren wurde
      eine Reihe verschiedener Komponenten, die zytosolischen und
      mitochondrialen oxidativen Stress auslösen, appliziert, diese
      führten allerdings nicht zu einer Veränderung des
      peroxisomalen Kompartiments in Säugerzellen.
      KillerRed-basierte Induktion von oxidativem Stress in
      verschiedenen Kompartimenten führte zu ähnlichen Resultaten
      in lebenden Zellen. Dies weist darauf hin, dass andere
      Faktoren als oxidativer Stress allein, wie z. B. der extra-
      oder intrazelluläre Ursprung des Signals, eine Veränderung
      des zellulären Redox-Gleichgewichts oder andere, bisher
      unidentifizierte Signaltransduktionsmechanismen, dazu
      beitragen, eine Veränderung der peroxisomalen Dynamik, wie in
      früheren Studien beobachtet, auszulösen. Die Behandlung von
      AR42J Zellen, einer Rattenzelllinie pankreatischen Ursprungs,
      mit dem synthetischen Glukokortikoid Dexamethason führte zu
      einer prominenten, kontinuierlichen Elongation von
      Peroxisomen. Interessanterweise wurde die tubuläre
      Morphologie der Peroxisomen aufrechterhalten, selbst wenn der
      externe Stimulus entfernt wurde. Die kontinuierliche
      peroxisomale Tubulation könnte mit der Zelldifferenzierung
      verknüpft sein oder auf eine bestimmte metabolische Funktion
      hinweisen. Dexamethasonbehandlung führte außerdem zu einer
      transkriptionellen Induktion von Pex11β (and Pex11α) durch
      einen potentiell PPARα-unabhängigen Mechanismus. Daher hat
      das hier etablierte Modell der Dexamethason-induzierten
      peroxisomalen Elongation großes Potenzial, als eher
      physiologisches Säugerzellkulturmodell zur Untersuchung der
      Regulation von peroxisomaler Dynamik zu dienen. Weitere
      Studien wurden bereits initiiert, um Veränderungen des
      peroxisomalen Expressionsprofil nach Dexamethason-Stimulation
      zu untersuchen. Diese deinen dazu, neue Komponenten und/oder
      molekulare Mechanismen aufzuklären, die Dynamik von
      Peroxisomen regulieren.
description: Peroxisomes are ubiquitous
      subcellular organelles involved in a variety of important
      metabolic processes. Recently, it became obvious that many of
      those functions are carried out in co-operation with
      mitochondria. The essential role of peroxisomes for human
      health is exemplified by the severe phenotype of peroxisomal
      disorders. Furthermore, peroxisomes are highly dynamic,
      adjusting their protein content, morphology and number in
      response to cellular needs. In recent years, peroxisome
      dynamics and their proper regulation were closely linked to
      organelle function and thus, human well-being. In line with
      this, a patient with a lethal defect in mitochondrial and
      peroxisomal fission was identified. Peroxisome dynamics are
      regulated by growth and division of the organelle, however,
      peroxisomes can also arise de novo from the ER under special
      conditions. In mammalian cells, peroxisomal growth and
      division follows a well-defined sequence of morphological
      alterations. Initial membrane elongation is carried out by
      the key peroxisomal membrane protein Pex11pβ, while final
      scission into smaller organelles is achieved by the combined
      action of the membrane adaptors Mff and Fis1 as well as the
      large GTPase DLP1. Interestingly, the key components of the
      peroxisomal fission machinery are shared with mitochondria;
      however the occurrence of peroxisomal fusion analogous to
      mitochondria remains a matter of debate. Although several
      external stimuli were identified to alter peroxisome
      dynamics, detailed information on their reception and
      transduction onto the peroxisomal level is limited. Thus, the
      aim of this study was to gain a deeper understanding of the
      processes contributing to and regulating peroxisome dynamics
      in mammalian cells. This thesis contains three parts: in the
      first section, the contribution of peroxisomal fusion,
      analogous to mitochondria, to organelle dynamics was
      addressed. In the second part, the regulation of peroxisome
      dynamics at the organelle itself was investigated by
      characterizing post-translational mechanisms modulating the
      action of Pex11pβ, the key mediator of peroxisome
      elongation/proliferation in mammalian cells. In the final
      part, different groups of external stimuli were characterized
      in regard to their capacity to alter peroxisome dynamics in
      order to study the regulation of peroxisome dynamics on a
      transcriptional level in mammalian cell culture. To
      investigate fusion of mature peroxisomes in mammalian CHO
      cells, an in vivo fusion assay was established based on
      hybridoma formation by cell fusion using cell lines stably
      expressing GFP- or DsRed-derived peroxisomal matrix and
      membrane markers. Fluorescence microscopy in time course
      experiments of fixed cells revealed a merge of different
      peroxisomal markers in fused cells, pointing to a certain
      degree of peroxisomal fusion. Although subsequent live cell
      imaging indicated that peroxisomes did not exchange matrix or
      membrane markers, the existence of transient, vivid
      interactions between individual peroxisomes was characterized
      for the first time. Interacting peroxisomes were shown to be
      tightly associated, accounting for the marker overlay
      observed in fixed cells. Using computational modelling and
      mathematical analysis, transient peroxisome interactions were
      shown to follow a complex, non-random behaviour that has the
      potential to facilitate the homogenization of the
      heterogeneous peroxisomal compartment. Pre-treatment with
      peroxisomal substrates indicated that transient, peroxisomal
      interactions do not contribute to the exchange of fatty acids
      or H2O2, but might facilitate the exchange of other
      peroxisomal metabolites or be part of a signaling system to
      sense the state and/or distribution of the peroxisomal
      population in the cell. Furthermore, for the first time,
      computational analysis provided an explanation why only 15 %
      of the peroxisome population is engaged in long-range
      microtubule-dependent movement. Additionally, evidence was
      provided that mitochondrial fusion proteins do not localize
      to peroxisomes, indicating that peroxisome dynamics in
      mammalian cells are regulated in a distinct manner. To gain
      insight into the modulation of peroxisome dynamics at the
      organelle itself, Pex11pβ was characterized biochemically.
      Differential permeabilization and protease-protection assays
      in combination with a newly available commercial antibody
      localized the position of its first transmembrane domain to
      the amino acid positions 90 – 110. Subsequently, the
      contribution of the N-terminal domain to the regulation of
      human Pex11pβ activity was addressed. Deletion of the first
      40 amino acids abolished Pex11pβ-membrane elongation,
      although the essential amphipathic helix within the protein
      remained intact. Biochemical cross-linking and enrichment of
      Pex11pβ in time-course experiments linked its
      homo-dimerization to its activity which was diminished upon
      N-terminal deletion. In vivo phospho-labelling did not
      indicate phosphorylation of Pex11pβ in a manner similar to
      its S. cerevisiae orthologue. Thus, Pex11 proteins in yeast
      and mammals appear to be regulated in an opposite manner.
      Furthermore, overexpression of Pex11pβ in
      peroxisome-deficient patient fibroblasts resulted in its
      mistargeting to mitochondria where an excessive fragmentation
      was induced. This further emphasizes that mitochondria, but
      not the ER, serve a default membrane for peroxisomal membrane
      proteins in the absence of peroxisomes in mammals. Potential
      disturbances of mitochondrial function might thus contribute
      to the clinical severity of peroxisome disorders. In the
      final part of this thesis, external stimuli altering
      peroxisomal dynamics were characterized to establish a more
      physiological and amenable cell culture model to investigate
      the transcriptional regulation of peroxisome dynamics in
      mammalian cells. Application of the neurotoxin 6-OHDA in
      SH-S5Y5 neuroblastoma cells did not affect peroxisome
      dynamics, but led to a profound DLP1-dependent fragmentation
      of mitochondria. Though DLP1 is a shared component of both
      organelles, mitochondrial and peroxisomal dynamics further
      appear to be regulated in a distinct manner. Using a variety
      of compounds inducing cytosolic and mitochondrial oxidative
      stress, no morphological alterations of peroxisomes were
      observed. KillerRed-based induction of ROS in different
      compartments produced similar results in living cells. Thus,
      other factors besides the induction of oxidative stress, such
      as e.g. the intracellular or extracellular origin of the
      signal, alterations of cellular redox-state or yet
      unidentified signalling pathways might contribute to induce
      the alterations of peroxisome dynamics observed before.
      Addition of the glucocorticoid dexamethasone to rat
      pancreatic AR42J cells resulted in a profound, continuous
      elongation of peroxisomes. Notably, peroxisomes maintained
      their tubular morphology even after removal of the stimulus.
      Continuous peroxisome tubulation might be linked to cell
      differentiation or a metabolic function. Dexamethasone
      application induced Pex11β (and Pex11α) on a transcriptional
      level by a potentially PPARα-independent mechanism. Thus,
      dexamethasone-induced peroxisome elongation in AR42J cells
      has a high potential to serve as a more physiological model
      to study the regulation of peroxisome dynamics in mammalian
      cells. Future studies using expression profiling after
      dexamethasone stimulation in order to identify novel
      components and/or molecular mechanisms regulating peroxisome
      dynamics have been initiated.