title: Impact of the food matrix on allergenic properties of purified hazelnut allergens
Creators: name: Spiller, Alexandra
Publisher: name: :none
Year: 2014

description: Einleitung: Bisher weiß man wenig über die Interaktionen zwischen Proteinen und anderen Lebensmittelbestandteilen wie diese die Immunantwort beeinflussen können. Es wird vermutet, dass bestimmte Lebensmittelbestandteile, wie beispielsweise Lipopolysaccharide, Kohlenhydrate und Lipide zur allergenen Wirkung von Proteinen beitragen können. Basierend auf dieser Hypothese wurde der Einfluss von Lipiden der Haselnuss auf die Allergenizität von gereinigten Haselnussallergenen untersucht. Methoden: In einer ersten Reihe von Experimenten wurden zwei Hauptallergene der Haselnuss (Corylus avellana), welche zur Familie der Prolamine gezählt werden, dem 2S Albumin, Cor a 14, und dem nsLTP, Cor a 8, mittels eines mehrstufigen chromatographischen Verfahrens gereinigt. Anschließend wurden die erhaltenen Fraktionen, von Cor a 14 und Cor a 8 durch physikalisch-chemische und immunologische Methoden, einschließlich SDS-PAGE, 2D-SDS-PAGE, Zirkulardichroismus Spektroskopie, MALDI-TOF Massenspektrometrie, N-terminale Sequenzierung, IgE-ELISA, Western blotting untersucht. Weiters wurden zelluläre Histaminfreisetzungsssays und Proteinaufnahme Experimente mit dendritischen Zellen (MODCs) durchgeführt. Ergebnisse: Der Prozentanteil der Prolamin Fraktion aus dem gesamten Haselnussproteinextrakt betrug 7%, wovon 5% auf Cor a 14 und 2% auf Cor a 8 entfielen. Es konnten fünf unterschiedliche Protein- Isoformen von Cor a 14 mit voneinander abweichenden molekularen Massen und isoelektrischen Punkten isoliert werden. Die detaillierte Analyse einer der Isoformen, Cor a 14.2, mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie und 2D-SDS-PAGE zeigte, dass das reife Protein ein Molekulargewicht von 12 kDa aufwies und aus zwei durch Disulfidbrücken verbundene Untereinheiten mit Molekulargewichten von 8 kDa and 4 kDa zusammengesetzt war. Anhand von Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte die korrekte Faltung der Proteine Cor a 14.1, Cor a 14.2, Cor a 14.4 und Cor a 14.5 mit einer Sekundärstruktur, die hauptsächlich aus für 2S Albumine typischen α-Helices bestand bestätigt werden. Von Cor a 8 konnte eine Isoform mit einem Molekulargewicht von 9.4 kDa isoliert werden, deren Identität durch N-terminale Sequenzierung verifiziert wurde. Die Bindung von IgE-Antikörpern konnte für alle getesteten Proben von Cor a 14 und Cor a 8 durch Inkubation mit Seren von haselnussallergischen Patienten mittels ELISA nachgewiesen werden. Basierend auf Ergebnissen von IgE-ELISA und Western blotting kann angenommen werden, dass beide Allergene sowohl lineare als auch konformationelle Epitope beinhalten. Histaminfreisetzungs-Assays mit passiv sensibilisierten Basophilen der Ratte zeigten in vitro, dass die gereinigten Proteine Cor a 14.1, Cor a 14.5 und Cor a 8 eine dosisabhängige Degranulation herbeiführten. Mit Haselnussöl, im Gegensatz zu Cor a 14, konnte für Cor a 8 eine um 10-20% erhöhte Histaminfreisetzung gemessen werden. Die durchgeführten Experimente mit MODCs erwiesen eine verstärkte Aufnahme von Cor a 8, wenn Haselnussöl hinzugefügt wurde. Schlussfolgerung: Es wurden Reinigungsprotokolle für zwei wichtige Haselnussallergene etabliert. In vorläufigen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass Haselnusslipide einen Einfluss auf die Allergenizität von Cor a 8, aber nicht auf Cor a 14 zeigten. Es bleibt abzuklären, wie diese Allergene mit Haselnusslipiden interagieren und wie Lipide die Sensibilisierungsphase und Effektorphase der IgEvermittelten Haselnussallergie beeinflussen.
description: Introduction: So far, little is known about food matrix-protein interactions and how they modulate immune responses. It has been hypothesized that food compounds, such as lipopolysaccharides, carbohydrates and lipids, may contribute to the allergenicity of certain proteins. Based on these considerations, we studied the impact of hazelnut derived lipids on the allergenic activity of two purified hazelnut allergens. Methods: In the first set of experiments two important hazelnut (Corylus avellana) allergens belonging to the prolamin superfamily, the 2S albumin, Cor a 14 and nsLTP, Cor a 8, were purified by a multi-step chromatographic procedure. Subsequently, final protein batches, containing different isoforms of Cor a 14 and one isoforms of Cor a 8 were characterized by physicochemical and immunological methods, including SDS-PAGE, 2D-SDS-PAGE, CD spectroscopy, MALDI-TOF mass spectrometry, N-terminal sequencing, IgE-ELISA, Western blotting, histamine release assays based on rat basophilic leukemia cells (RBL assays) and protein uptake experiments using monocyte-derived dendritic cells (MODCs). Results: The percentage of prolamin fraction was 7% of total hazelnut extract and contained about 5% of Cor a 14 and 2% of Cor a 8. We isolated five different batches of Cor a 14, which varied in their molecular weight and isoelectric point. MALDI-TOF MS and 2D-SDS-PAGE analysis of one of these isoforms, Cor a 14.2, showed that the mature protein had a molecular weight of 12 kDa and consisted of two subunits with molecular weights of 8 kDa and 4 kDa, linked by disulfide bonds. CD spectroscopy verified that Cor a 14.1, Cor a 14.2, Cor a 14.4 and Cor a 14.5 were correctly folded, containing α-helices as predominant secondary structure, which is typical for 2S albumins. For Cor a 8 we identified one isoform with a molecular weight of 9.4 kDa, which was also confirmed by N-terminal sequencing. All tested samples of Cor a 14 and Cor a 8 displayed IgE-binding capacity in IgE-ELISA by using sera of hazelnut allergic patients. Both allergens possessed conformational as well as linear epitopes as have been estimated by IgE-ELISA and Western blotting using native and denatured proteins. Histamine release assays performed with Cor a 14.1, Cor a 14.5 and Cor a 8, demonstrated that all purified proteins induced dose-dependent degranulation of passively sensitized RBL cells in vitro. In contrast to Cor a 14, in presence of hazelnut lipids Cor a 8 showed a 10-20% increased level of histamine release. Uptake experiments with immature monocyte-derived dendritic cells (MODCs) showed enhanced uptake of Cor a 8, when the protein was associated with hazelnut oil. Conclusion: We established purification protocols for two important hazelnut allergens. Our preliminary experiments pointed out that hazelnut lipids play a role in the allergenic activity of Cor a 8, but not of Cor a 14. It remains to be investigated, how these allergens interact with hazelnut lipids and how lipids influence the sensitization and effector phase of IgE-mediated hazelnut allergy.