title: Synthese von Glycoformen des humanen Erythropoietins
Creators: name: Seeleithner, Simone
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2019
Subjects: subject: EPO
subject: glycoproteins
subject: glycopeptides
subject: N-glycans
subject: peptide synthesis
subject: bioorganic synthesis
subject: 540

description: Glycoproteine spielen eine wichtige Rolle bei vielen biologischen Prozessen.[13] Da natürlich vorkommende Glycoproteine stets eine Mikroheterogenität aufweisen, aber zur Erforschung von Struktur-Wirkungsbeziehungen homogene Glycoformen vonnöten sind, müssen letztere durch chemische und enzymatische Synthese dargestellt werden.[20,24]
Das Immunoglobulin G1 weist in der Fc-Region ein N-Glycan auf.[171] Das Fc 287-320 Glycopeptidhydrazid 1 wurde durch Fmoc-SPPS und Pseudoprolin-vermittelte Lansbury-Aspartylierung dargestellt. Zur Vermeidung einer Cyclisierung des C-terminalen Lysins wurde eine TFAc-Schutzgruppe eingesetzt, deren Eignung für Ligationen bestätigt wurde.
Erythropoietin regelt durch Stimulation der Erythropoese die Sauerstoffhomöostase im menschlichen Körper.[125] Humanes Erythropoietin besitzt drei N-Glycane, deren Struktur die in vivo-Aktivität maßgeblich beeinflusst.[12,152] Um monoglycosyliertes EPO A durch Semisynthese zu gewinnen, wurde das EPO 1-28 (Nona) Hydrazid 23 durch konvergente Glycopeptidsynthese dargestellt und der Zucker enzymatisch sialyliert. Nach Thioveresterung und anschließender NCL mit dem rekombinanten EPO 29-166 Peptidfragment C lieferte die oxidative Rückfaltung EPO (Undeca) A mit einem α-2,6-sialylierten komplexen N-Glycan an Asn-24 in 33 % Ausbeute.
Die Totalsynthesestrategie für dreifach glycosyliertes EPO D sah die sequentielle NCL der fünf Fragmente B2-H2 mit Entschwefelung von drei Cysteinen vor. Hierfür wurden verschiedene Schutzgruppenstrategien untersucht.
Bei der Trt/Nvoc-Strategie erfolgte der Schutz der nativen Cysteine-29, 33 und 161 durch eine säurelabile Tritylgruppe, die an den entschützten Peptiden nachträglich eingeführt wurde. Das C terminale Lys-97 wurde durch eine Nvoc-Gruppe in der Seitenkette geschützt. Das EPO 29-67 (2xSTrt, Nona) Hydrazid 29 ergab aufgrund der hydrophoben Tritylschutzgruppen niedrige Ausbeuten bei der Retritylierung. Die Synthese des Peptidfragments EPO 98-166 (STrt) 33 erfolgte durch NCL. Das schwer lösliche doppelt glycosylierte EPO 29-97 (2xSTrt, Nvoc) Hydrazid 34 wurde nach Thioveresterung mit 33 verknüpft, wobei die Tritylgruppen die Isolierung von EPO 29-166 (3xSTrt, 2xNona, Nvoc) 36 erschwerten.
Aufgrund der Schwierigkeiten wurde die Acm/TFAc-Strategie zur Darstellung von EPO mit drei komplexen N-Glycanen D angewandt. Das Glycopeptidhydrazid EPO 29-67 40 wurde mit einer Acm-Schutzgruppe an Cys-29 und 33 synthetisiert. Die Labilität der Acm Gruppe bei der palladiumkatalysierten Entschützung der Glycosylierungsstelle wurde durch die Verwendung einer PhiPr-Schutzgruppe umgangen. EPO 68-97 (Nona) F2 wurde mit einem TFAc-geschützten Lys-97 dargestellt. Die α-2,6-Sialylierung der biantennären N Glycane an den Glycopeptidhydraziden 40 und F2 gelang. Nach Umsetzung von 40 zum Thioester E2 erfolgte die Ligation mit F2 zum doppelt glycosylierten EPO 29-97 (2xSAcm, TFAc) 47 und dessen Thioveresterung. An dem Peptid EPO 98-166 (Thz,  SPhacm) 51 wurde die Entfernung beider Cys-Schutzgruppen mit PdCl2 getestet. Hierbei wurde eine höhere Labilität von Phacm im Vergleich zu Thz festgestellt. An dem Ligationsprodukt EPO 29 166 (3xSAcm, 2xNona, TFAc) 55 wurden die nicht-nativen Cysteine-68, 98 und 128 zu nativen Alaninen entschwefelt. Die Abspaltung der Acm-Gruppen an den drei verbliebenen Cysteinen mit PdCl2 ergab EPO 29-166 (3xSH, 2xNona, TFAc) 58. Die basische Entfernung der TFAc Gruppe tendiert zu Nebenreaktionen, gelang jedoch schließlich an 58. Der EPO 1 28 (Nona) Thioester B2 und EPO 29-166 (3xSH, 2xNona) 59 wurden zum Volllängenglycoprotein Dred ligiert und zu EPO (3xNona) D oxidativ rückgefaltet.
Da die Abspaltung der TFAc-Schutzgruppe mit zahlreichen Problemen verbunden war, wurde die Synthese von dreifach glycosyliertem EPO D nach der Acm-Strategie weiterverfolgt. Es wurde zunächst die TFAc-Gruppe an Lys-97 des EPO 68-97 (TFAc) Glycopeptidhydrazids F2 entfernt, was sich an dieser Stelle als unproblematisch erwies. Durch Thioveresterung und sequentielle NCL wurde EPO 29-166 (3xSAcm, 2xNona) 62 erhalten. Eine ε-Caprolactam-bildung an Lys-97 trat nicht auf. Nach Entschwefelung und Abspaltung der Acm-Gruppen führten die NCL mit dem EPO 1 28 (Nona) Thioester B2 und die folgende oxidative Rückfaltung zu dem gewünschten dreifach N-glycosylierten EPO D. Die Ausbeute betrug 11 %. Mit der Acm-Strategie wurde somit eine gangbare Vorgehensweise zur Totalsynthese von homogenem dreifach N-glycosylierten EPO etabliert.