PROGRESSI NELLA TECNOLOGIA DEL VETTORE POXVIRALE MVA: 1. PRODUZIONE DI RICOMBINANTI ESPRIMENTI DUE TRANSGENI 2. TRANSATTIVAZIONE DI GENI CELLULARI
Creators: name: BARBIERI, ANDREA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2015

description: Il virus Modified Vaccinia Ankara (MVA) � un ceppo fortemente attenuato di Vaccinia Virus ed � da tempo utilizzato in qualit� di vettore vaccinale nell?uomo. La totale incapacit� di replicare in cellule di mammifero unita agli alti livelli di espressione dei transgeni (TG) veicolati costituiscono i punti di forza di MVA e ne fanno un vettore estremamente sicuro e potente, in grado di indurre una forte risposta immunitaria nei soggetti vaccinati. Uno dei metodi pi� impiegati per la costruzione di virus MVA ricombinanti (rMVA) sfrutta la ricombinazione omologa tra specifiche regioni del genoma virale e un plasmide donatore, contenente due sequenze di omologia che indirizzano la ricombinazione. La selezione dei cloni ricombinanti viene generalmente effettuata introducendo marker che determinano alterazioni nel fenotipo delle cellule infettate (ad esempio, resistenza ad antibiotici o proteine fluorescenti) e grazie ai quali � possibile aumentare notevolmente l?efficienza. L?interesse suscitato in ambito scientifico e medico da parte di MVA ha fornito una notevole spinta all?ideazione di nuove strategie volte alla sua manipolazione ed ingegnerizzazione, come dimostrato dai notevoli progressi compiuti nell?ultimo ventennio. Il lavoro svolto in questa tesi, suddivisa in due parti, si inserisce in questo ambito e ha come scopo lo sviluppo di nuovi metodi nel tentativo di rendere MVA un vettore sempre pi� duttile, potente e versatile nell?ambito della ricerca sia di base sia clinica. Cos� come i vaccini pi� tradizionali possono essere costituiti da diversi antigeni, anche i virus rMVA possono essere ingegnerizzati per esprimere due o pi� TG (mrMVA). Strategie per la generazione di mrMVA sono gi� descritte in letteratura, ma non si sono dimostrate completamente soddisfacenti, soprattutto per quanto riguarda l?indipendenza trascrizionale e traduzionale dei TG. Questo � un prerequisito molto importante qualora i TG, ad esempio, dovessero assemblarsi secondo precisi rapporti stechiometrici a formare una proteina multimerica. Nella prima parte di questo lavoro di tesi viene descritta una nuova strategia di costruzione di mrMVA basata sul Red-to-Green gene swapping (Di Lullo et al., 2010) che permette l?inserimento dei TG in punti diversi del genoma, in particolare all?interno delle regioni ?III e ?VI, assicurandone pertanto la totale indipendenza. Il primo virus mrMVA presentato, MVA HLAC(?III)ENV(?VI), � stato costruito a partire da un rMVA gi� contenente il gene ENV nella regione ?VI e inserendo HLAC nella regione ?III applicando direttamente il metodo del Red-to-Green gene swapping. Il secondo virus, MVA HA(?III)NP(?VI), � stato invece costruito in maniera del tutto speculare, partendo da un rMVA contenente HA nella regione ?III e inserendo NP nella regione ?VI. La strategia di ingegnerizzazione impiegata per quest?ultimo ha richiesto la costruzione di due nuovi plasmidi di trasferimento, contenenti le sequenze di omologia per la regione ?VI, rispettivamente p675 (plasmide donatore della proteina rossa HcRED) e p604 (plasmide di trasferimento contenente un MCS e la proteina verde EGFP). Entrambi i virus sono stati poi saggiati per valutare l?espressione dei TG contenuti e confrontati con i virus rMVA singoli: non essendo state individuate differenze, � stato concluso che la strategia presentata � adatta alla generazione di mrMVA recanti TG in regioni diverse. Nonostante l?importanza che MVA ricopre nel panorama scientifico e medico, la piena potenzialit� di questo virus non � ancora stata raggiunta: il suo impiego, infatti, � stato finora limitato a quello di carrier di TG contro i quali indurre una risposta immunitaria, bench� esistano altre strategie che non coinvolgano la diretta presentazione dei TG al sistema immunitario. Una di queste � la possibilit� di promuovere l?espressione di geni cellulari sfruttando fattori di trascrizione, induttori o transattivatori opportunamente inseriti all?interno del vettore MVA. Per approfondire questo campo d?indagine, � stato selezionato CIITA, gene fisiologicamente espresso nelle cellule presentanti l?antigene (APC) e responsabile dell?espressione di MHC Classe-II. Nella seconda parte di questo lavoro � stato pertanto costruito, attraverso la tecnica del Red-to-Green gene swapping, il virus MVA fCIITA(?III), contenente il gene CIITA fuso al tag M2 all?interno della regione ?III. Come confermato a mezzo di western blot, saggi citometrici e immunofluorescenza, MVA fCIITA(?III) si � rivelato in grado di indurre un fenotipo Classe-II+ in cellule umane e murine, dimostrando che l?infezione virale non interferisce con l?attivit� transattivatoria di CIITA. Considerato che l?overespressione della Classe-II sulle cellule tumorali ha prodotto interessanti, bench� eterogenei, risultati nel campo dell?immunoterapia e che i metodi di gene delivery finora impiegati risultano poco efficienti o dispendiosi in termini di tempo, � stata presa in considerazione la possibilit� di veicolare CIITA all?interno di cellule tumorali sfruttando il virus costruito. In via preliminare, � stata saggiata in vivo la capacit� di MVA fCIITA(?III) di stimolare il ramo T-helper mediante due immunizzazioni intramuscolari consecutive. Al termine dell?immunizzazione sono state valutate sia la risposta anti-vettore attraverso un saggio ELISA sia la distribuzione delle popolazioni linfocitarie CD4+ mediante citometria su cellule estratte da linfonodi. I risultati, tuttavia, non hanno messo in mostra differenze significative rispetto al controllo: l?assenza dell?effetto biologico, ossia l?aumento di anticorpi anti-vettore, � risultata infatti in linea con la mancata over-stimolazione dei linfociti T-helper. Data la possibilit� che la risposta anti-vettore fosse gi� completamente satura, impedendo di fatto l?ulteriore stimolazione del ramo umorale, sono in corso ulteriori saggi in vivo per la valutazione funzionale del virus costruito inerente ad una possibile stimolazione del ramo cellulare dell?immunit� acquisita. Qualora la capacit� immunostimolatoria e/o immunomodulante di MVA fCIITA(?III), eventualmente in associazione con adiuvanti, venisse confermata, si avr� a disposizione un ottimo strumento per valutare in maniera rapida e sicura in quali tumori l?overespressione della Classe-II svolge un ruolo efficace nell?induzione di una risposta immunitaria antitumorale.