Wechselwirkungen zwischen Adenylierungs- und Peptidyl Carrier Protein-Domänen in nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen sowie biochemische und strukturelle Untersuchungen zu gespaltenen Inteinen
Creators: name: Zettler, Joachim
Publisher: name: Technische Universität Dortmund
Year: 2010
Subjects: subject: Domäneninteraktion
subject: NRPS
subject: Antibiotikaforschung
subject: A-Domäneninhibitoren
subject: ungefaltete proteine
subject: gespaltene Inteine
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description: Die aktuelle Antibiotikaforschung basiert trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der kombinatorischen, organischen Synthese immer noch zu einem großen Teil auf Naturstoffbibliotheken bakteriellen oder pilzlichen Ursprungs. Innerhalb dieser Naturstoffe sind nichtribosomale Peptide (NRPs) eine enorm wichtige bioaktive Substanzklasse. Neben antibiotischen Eigenschaften können sie weiterhin immunsuppressive, antifungale und tumorunterdrückende Aktivität entfalten. NRPs werden von Multi-Domänen Proteinen den so genannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) in einer Art Fließbandmechanismus aufgebaut. Zwar sind die individuellen NRPS-Domänen biochemisch und strukturell sehr gut untersucht, jedoch sind die für das detaillierte Verständnis der Naturstoffbiosynthese essentiellen Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Domänen sowohl strukturell, als auch mechanistisch noch kaum verstanden. In dieser Arbeit gelang der erste experimentelle Nachweis von Interaktionen zwischen einer Adenylierungs- mit einer in cis vorliegenden Peptidyl Carrier Protein-Domäne aus einem NRPS Initiationsmodul. Mit biochemischen Methoden, wie partiellen tryptischen Verdauen, Gelfiltrationschromatographie und chemischen Markierungsassays, wurde festgestellt, dass der 4’-Phosphopantetheinarm der PCP-Domäne sich in unterschiedlichen Positionen während des Katalysezyklus befindet und zwar abhängig vom Zustand der Adenylierungs-Domäne. Die produktive Wechselwirkung zwischen den beiden Domänen benötigt sowohl eine post-translational modifizierte holo-Peptidyl Carrier Protein-Domäne, als auch eine spezielle Konformation der Adenylierungs-Domäne, die Thioesterkonformation. Die hier durchgeführten Studien charakterisieren erstmalig die großen konformationellen Bewegungen in NRPS-Proteinen und sollten den Startpunkt für ein tiefgreifendes Verständnis des antibiotika-produzierenden Proteintemplats bilden. Für die Untersuchung von Proteinstrukturen und -dynamiken mit spektroskopischen Methoden, wie der NMR- oder der Fluoreszenzspektroskopie, ist die Modifikation des zu untersuchenden Proteins mit biophysikalischen Sonden oft unvermeidlich. Für den gezielten Einbau dieser Sonden in Proteine sind, unter anderem, gespaltene Inteine ein wichtiges Werkzeug der Chemischen Biologie. Die von gespaltenen Inteinen vermittelte Protein trans- Spleißreaktion verbindet die N- und C-terminal zu den individuellen Inteinhälften vorliegenden Polypeptidsequenzen, die N- und C-Exteine, über eine native Peptidbindung und erlaubt damit den definierten Aufbau eines Proteins aus mehreren Segmenten. Mit dem natürlich gespaltenen DnaE Intein aus Nostoc punctiforme (Npu) wurde in dieser Arbeit das bisher schnellste trans-spleißende Intein biochemisch mit gereinigten Proteinen charakterisiert. Neben der hohen monomolekularen Reaktionsrate von 1,1 ± 0,2 s-1 bei 37°C zeigte es mit verschiedenen Exteinsequenzen robuste Spleißausbeuten von 50 - 90% in dem Temperaturbereich von 6 bis 37°C. Als ein Grund für verminderte Spleißausbeuten konnte die Bildung von löslichen Aggregaten der individuellen Inteinhälften nachgewiesen werden. NMR-Untersuchungen ergaben, dass sowohl die natürlich gespaltenen individuellen Hälften des Npu DnaE Inteins, als auch die des künstlich gespaltenen Synechocystis species PCC6803 DnaB Inteins keine definierte Faltung ohne das Partnerprotein aufwiesen. Für erstere konnte bei Komplexbildung der Hälften und nach der Spleißreaktion der Übergang in eine gefaltete Konformation nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde mit dem SPLICEFINDER-System eine Methode entwickelt, die es schnell und unkompliziert erlaubt parallel mehrere Insertionspositionen von gespaltenen Inteinen in Zielproteinen auf ihre Spleißaktivität zu überprüfen. Für eine Anwendung dieses Systems, der segmentellen Isotopenmarkierung von Proteinen für NMR-Untersuchungen, konnte ein einfaches Verfahren zur Bestimmung der Markierungseffizienz etabliert werden. Es ist anzunehmen, dass die in dieser Arbeit durchgeführten Studien zu gespaltenen Inteinen deren Einsatzbreite für die selektive Modifikation von Proteinen signifikant erhöhen werden.