title: Mitochondriale Calcium-Regulation in isolierten Kardiomyozyten unter normalen und pathologischen Bedingungen
title: Mitochondrial calcium regulation in isolated cardiomyocytes under normal and pathological conditions
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Hammer, Victoria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2023
Subjects: Cacna1c
Cacna1c,
Mitochondriale Calcium-Regulation
Mitochondrial calcium regulation
SR-stress
heart
SR-Stress
Herz Mitochondria
WKY
Pharmacology &amp; therapeutics, prescription drugs
Pharmakologie, Therapeutik
Kardiomyozyten
Calcium
Mitochondrien
calcium
SHR
cardiomyocytes

description: Die für die Herzkontraktion benötigte Energie (ATP) wird zu einem Großteil (&gt; 90 %) aus der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien gewonnen. Mitochondrien sind auch an der Regulation des intrazellulären Calciums (Ca) beteiligt und können aufgrund spezialisierter Transportproteine Ca in ihre Matrix aufnehmen und wieder ausschleusen. Mitochondriales Ca (mitoCa) kann den Zellstoffwechsel sowie den Zelltod steuern und ist ein entscheidender Faktor für die Abstimmung von Energieangebot und -nachfrage im Herzen. Daher könnte die (gestörte) mitoCa-Regulation an der Entwicklung von Herzerkrankungen beteiligt sein. Ein besseres Verständnis der mitoCa-Regulation erscheint deswegen aus physiologischer und pathologischer Sicht dringend geboten. 
In der vorliegenden Arbeit wurde die mitoCa-Regulation in isolierten Kardiomyozyten aus adulten Ratten charakterisiert. Die Untersuchungen fanden an einem physiologischen Modell statt (Kardiomyozyten aus gesunden WKY-Ratten), sowie an drei pathologischen Modellen: Kardiomyozyten aus spontan-hypertensiven Ratten (SHR), Kardiomyozyten aus haploinsuffizienten Cacna1c+/--Ratten und an Kardiomyozyten, die mit dem ER/SR-Stress-Induktor Tunicamycin behandelt wurden. Zuerst wurde ein Protokoll zur verlässlichen Messung der mitoCa-Transienten (mitoCaT) etabliert. Dazu wurden die isolierten Myozyten mit einem Ca-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff beladen (X-Rhod-1) und die cytosolische Fluoreszenzkomponente wurde mittels CoCl2-Quenching eliminiert. Die mitochondriale Lokalisation von X-Rhod-1 wurde mit Hilfe eines spezifischen mitochondrialen Farbstoffes, MitoTracker Green, bestätigt. Die Kardiomyozyten wurden elektrisch-stimuliert und die resultierenden mitoCaT wurden am Konfokalmikroskop im Linescan-Modus gemessen, analysiert und mit cytosolischen Ca-Transienten (cytoCaT) verglichen (gemessen mit Fluo-4). Durch Unterdrückung der Kontraktion der Kardiomyozyten mittels Cytochalasin D (10 M) konnte ausgeschlossen werden, dass es sich bei den gemessenen mitoCaT um Bewegungsartefakte handelte. 
In dieser Arbeit konnten schnelle oszillierende mitoCaT in Vorhofmyozyten aus WKY-Ratten gemessen werden, die bei basaler Stimulation (0,5 Hz) eine Amplitude von etwa  0,15 – 0,25 (F/Frest), eine Anstiegszeit von etwa  40 – 70 ms und eine Abfallzeitkonstante von etwa  60 – 100 ms aufwiesen. Bei Erhöhung der Frequenz kam es zu einem Anstieg des diastolischen Ca, zu einer Abnahme der Amplitude und zu einer Beschleunigung des Abfalls der mitoCaT. Zudem konnten deutliche subzelluläre Unterschiede in den mitoCaT von Vorhofmyozyten gefunden werden. So zeigten die subsarkolemmalen mitoCaT erheblich größere Amplituden als zentral gemessene mitoCaT. Durch den Vergleich mit den cytoCaT konnte dargestellt werden, dass die (subzellulären) mitoCaT dem Verhalten der (subzellulären) cytoCaT ähnelten, aber hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter deutliche Unterschiede zeigten. 
Die zu einem frühen Zeitpunkt der hypertensiven Herzerkrankung (3 Monate) gemessenen mitoCaT in Vorhofmyozyten aus SHR zeigten (noch) keine Veränderungen und lagen sowohl global als auch subzellulär bei ähnlichen Werten wie die mitoCaT der Vorhofmyozyten gesunder WKY-Ratten. Jedoch zeigten sich in der Expression wichtiger mitoCa-regulierender Proteine (um  50 % erhöhte NCLX- und LETM1-Expression) im Vorhofmyokard der SHR bereits deutliche Unterschiede, die auf ein beginnendes Remodeling der Mitochondrien in den SHR hindeuten. 
In Ventrikelmyozyten des Cacna1c+/--Rattenmodells konnte mit Hilfe des -adrenergen Agonisten Isoprenalin (30 nM) gezeigt werden, dass die mitoCaT auf eine sympathische Stimulation reagierten. Es kam zu einem Anstieg des diastolischen Ca (um  20 %) und der Amplitude (um  70 %) und zu einer Beschleunigung des Abfalls der mitoCaT (von  105 ms auf  75 ms). Trotz einer bereits beschriebenen veränderten cytoCa-Regulation konnten keine wesentlichen Unterschiede in den mitoCaT der Ventrikelmyozyten zwischen den beiden Genotypen gefunden werden (WT vs. Cacna1c+/-). Auch die Expression wichtiger mitoCa-regulierender Proteine (MCU, NCLX, LETM1) im Ventrikelmyokard zeigte keine Unterschiede zwischen WT und Cacna1c+/--Ratten. 
Schließlich wurde der Einfluss eines ER/SR-Stress-Induktors (Tunicamycin) auf die mitoCa- und cytoCa-Regulation in Ventrikelmyozyten von WKY-Ratten untersucht. Tunicamycin (10 M) führte innerhalb von 10 – 12 Minuten zu weitreichenden Störungen der mitoCa- und cytoCa-Regulation: Es kam in beiden Fällen zu einem ausgeprägten Anstieg des diastolischen Ca verbunden mit einem vermehrten Auftreten von arrhythmogenen Ca-Wellen. Zusätzlich konnte (subzellulärer) Ca-Alternans nachgewiesen werden. 
Zusammenfassend konnten in isolierten adulten Kardiomyozyten der Ratten schnelle oszillierende mitoCaT gemessen werden, die frequenzabhängig reguliert werden. Dabei konnte in Vorhofmyozyten ein deutlicher Unterschied in der subzellulären mitoCa-Regulation zwischen subsarkolemmalen und zentralen Mitochondrien aufgedeckt werden. Die beiden Pathologiemodelle (SHR und Cacna1c+/-) zeigten mitoCaT, die denen der gesunden Kontrollgruppen ähnelten. Isoprenalin führte in Ventrikelmyozyten zu größeren und schnelleren mitoCaT, wie dies auch für cytoCaT bekannt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Tunicamycin als ER/SR-Stress-Induktor bei akuter Gabe zu tiefgreifenden Störungen der cytoCa- und mitoCa-Regulation führt, die letztendlich das Auftreten von Ca-Alternans und Arrhythmien bedingen.