title: Ultra sensitive mass photometry via interferometric scattering microscopy (iSCAT)
Creators: name: Dahmardeh, Mahyar
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: subject: Nano-optics
subject: Interferometry
subject: Self-supervised machine learning
subject: Protein detection

description: Our understanding of the composition of living systems, which includes a broad range of macromolecules, remains far from complete. Therefore, scientists continue to devise new analytical methods to advance our knowledge. One of the recent and successful advances in the field is based on the use of interferometric scattering (iSCAT) microscopy for label-free detection of nanoscale objects down to single proteins and for measuring their molecular masses.In an ideal scenario, an iSCAT experiment is only limited by the shot noise of the laser light source. This implies that one can unravel infinitesimal fluctuations associated with small nanoparticles, by increasing the number of collected pho tons. However, because the nanoscale inhomogeneities of the coverglass substrate also scatter light, the iSCAT signal is accompanied by a speckle-like background. Moreover, in a typical iSCAT measurement there are sources of noise other than the quantum fluctuations of the light source, which have prevented iSCAT from detecting biomolecules smaller than approximately 40 kDa.In this dissertation, we analyze the iSCAT setup and different noise sources which have previously imposed the aforementioned detection limit. We then introduce novel techniques which eliminate the noise through instrumental considerations and the utilization of unsupervised machine learning algorithms, such as anomaly detection (iForest) and video denoising (FastDVDNet). On our optical set-up we have been able to detect point spread functions (PSFs) with signal to noise ratios of 1.4, which correspond to proteins as small as 9 kDa. To benchmark our methodology,we have carried out correlative fluorescence imaging in total internal reflection mode, and devised a routine to vary the signal to noise ratio of high contrast PSFs synthetically by changing the integration time to verify the reliability and accuracyof our findings. We have then employed our technique to study intramolecular protein interaction of samples as small as 11 kDa. For the first time we have also shown the fibrillation dynamic of this protein sample in real time.In addition, we lay out viable strategies to increase the signal to noise ratio in iSCAT measurements. These include eliminating the aforementioned complex speckled background through co-illumination of the coverglass sample at different wavelengths with different amplitudes. Another approach involves engineering the refractive index of the ambient solution, which enhances the iSCAT signal of the protein sample.Our work paves the way for non-invasive and label-free detection of extremely small biomolecules such as alpha-synuclein, interleukins, and other cytokines and chemokines, which are paramount to early stage diagnostics of neurodegenerative diseases and cancer.
description: Unser Wissen über die Zusammensetzung lebender Systeme, die eine breite Palette von Makromolekülen umfasst, ist noch lange nicht vollständig. Daher entwickeln die Wissenschaftler ständig neue Analysemethoden, um unser Wissen zu erweit ern. Einer der jüngsten und erfolgreichsten Fortschritte auf diesem Gebiet ist der Einsatz der interferometrischen Streuungsmikroskopie (iSCAT) zum markierungs freien Nachweis von Objekten im Nanometerbereich bis hin zu einzelnen Proteinen und zur Messung ihrer Molekülmassen.In einem idealen Szenario ist ein iSCAT-Experiment nur durch das Schrotrauschen der Laserlichtquelle begrenzt. Dies bedeutet, dass man winzige Fluktuationen, die mit kleinen Nanopartikeln verbunden sind, aufdecken kann, indem man die Anzahl der gesammelten Photonen erhöht. Da jedoch die nanoskaligen Inhomogenitäten an der Oberfläche des Deckglases ebenfalls Licht streuen, wird das iSCAT-Signal von einem speckleartigen Hintergrund begleitet. Darüber hinaus gibt es bei einer typischen iSCAT-Messung neben den Quantenfluktuationen der Lichtquelle noch andere Rauschquellen, die bisher verhinderten, dass mit iSCAT Biomoleküle mit einer Größe von weniger als etwa 40 kDa nachgewiesen werden konten.In dieser Dissertation analysieren und optimieren wir einen iSCAT-Aufbau und die verschiedenen Rauschquellen, die bisher die oben erwähnte Nachweisgrenze verur sacht haben. Anschließend stellen wir neuartige Techniken vor, die das Rauschen durch instrumentelle Überlegungen und den Einsatz von Algorithmen des unsu pervised machine learning, wie z. B. die Anomalieerkennung (iForest) und die Videoentrauschung (FastDVDNet), minimieren. Mit unserem optischen System konnten wir Punktspreizfunktionen (PSFs) mit einem Signal-Rausch-Verhältnis von 1,4 erkennen, die Proteinen mit einer Größe von 9 kDa entsprechen. Um unsere Methode zu testen, haben wir korrelative Fluoreszenzbildgebung im Modus der internen Totalreflexion durchgeführt und ein Verfahren entwickelt, um das Signal Rausch-Verhältnis von PSFs mit hohem Kontrast synthetisch durch Änderung der Integrationszeit zu variieren. Damit wurde die Zuverlässigkeit und Genauigkeitunserer Ergebnisse überprüft. Anschließend haben wir diese Technik zur Unter suchung der intramolekularen Proteininteraktion von Proben mit einer Größe von bis zu 11 kDa eingesetzt. Zum ersten Mal haben wir damit die Fibrillationsdynamik einer Proteinprobe in Echtzeit gezeigt.Darüber hinaus stellen wir praktikable Strategien zur Erhöhung des Signal-Rausch Verhältnisses bei iSCAT-Messungen vor. Dazu gehört die Beseitigung des oben erwähnten komplexen gesprenkelten Hintergrunds durch die gleichzeitige Beleuch tung der eckglasprobe bei verschiedenen Wellenlängen mit unterschiedlichen Am plituden. Ein weiterer Ansatz besteht darin, den Brechungsindex der Umgebungslösung zu verändern, wodurch das iSCAT-Signal der Proteinprobe verstärkt wird.Unsere Arbeit ebnet den Weg für den nicht-invasiven und markierungsfreien Nach weis extrem kleiner Biomoleküle wie z.B. Alpha-Synuclein, Interleukine und an dere Zytokine und Chemokine, die für die Frühdiagnostik von neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs von entscheidender Bedeutung sind.