title: Design and Synthesis of Allosteric Inhibitors against Dengue Virus Protease
Creators: name: Mark, Kerstin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2021
Subjects: Docking
Dengue Virus
Drug Design
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Wirkstoffentwicklung
Dengue Virus Protease

description: Obwohl Denguefieber mit etwa 390 Millionen Infektionen pro Jahr die weltweit häufigste durch Arthropoden übertragene Krankheit ist, gibt es bisher keine zugelassene spezifische therapeutische Behandlung. Daher befasste sich diese Arbeit mit dem Design und der Synthese neuartiger allosterischer DENV-Proteaseinhibitoren als potenzielle Wirkstoffe gegen das Denguefieber. Als Ausgangspunkt wurde ein in silico High Throughput Screening (HTS) durchgeführt, das die allosterische Tasche der geschlossenen Konformation der DENV3-Protease als Rezeptor und die ZINC15 Lead-Like Bibliothek als Input für das Docking verwendete. Dies führte zu einer Auswahl von 15 Verbindungen, die gekauft und in einem fluoreszenzbasierten Enzym-Assay in vitro getestet wurden. Die wirksamste Verbindung aus diesem Set zeigte einen vielversprechenden IC50-Wert von 136 +/- 16 mikromolar gegen die DENV3-Protease sowie einen nicht-kompetitiven Bindungsmodus und wurde erfolgreich auf ein Leitfragment reduziert, das ebenfalls eine signifikante Hemmung der DENV-Protease zeigte. Dieses Leitfragment diente als Ausgangspunkt für einen in silico Fragment growing-Ansatz, der nach Docking und Bewertung zu einer Auswahl von 17 Verbindungen führte, die synthetisiert und ebenfalls in vitro getestet wurden. Vier dieser Verbindungen zeigten eine signifikant erhöhte Aktivität gegenüber der DENV3-Protease im fluoreszenzbasierten Assay im Vergleich zum initialen Screening-Hit, wobei die effektivste Verbindung einen IC50-Wert von 28 +/- 7.9 mikromolar gegenüber der DENV3 Protease zeigte. Ein allgemeines strukturelles Motiv, das den wirksamsten Inhibitoren gemeinsam ist, wurde identifiziert und als Vorlage für eine umfassende Structure-Activity Relationship (SAR) Studie verwendet, die wichtige Merkmale der Protein-Ligand-Interaktionen aufdeckte. Die wirksamste Verbindung in der SAR-Studie (IC50(DENV3)=12.3 +/- 3.5 mikromolar) zeigte auch eine hohe Wirksamkeit gegenüber einem binären DENV4-Proteasekonstrukt und gegen die ZIKV-Protease, mit einem IC50-Wert gegen letztere im niedrigen mikromolaren Bereich. Der nicht-kompetitive Bindungsmodus wurde auch für die optimierten Ligandenstrukturen bestätigt, und es wurden erste Mutationsexperimente durchgeführt, um die tatsächliche Bindungsstelle in der Protease zu klären. Zellbasierte Experimente zeigten eine geringe Zytotoxizität der etablierten Ligandenserie bei Konzentrationen von bis zu 25 mikromolar und eine relative Hemmung der ZIKV-Replikation von mehr als 50% bei Konzentrationen von 5-10 mikromolar. Insgesamt bilden die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse eine gute Grundlage für die weitere Entwicklung potenter flaviviraler Proteaseinhibitoren.
description: Although dengue fever is the most common arthropod-borne disease worldwide, with approximately 390 million infections per year, no specific therapeutic treatment is available to date. Therefore, this thesis addressed the design and synthesis of novel allosteric DENV protease inhibitors as potential anti-dengue drugs. As a starting point, an in silico High Throughput Screening (HTS) was performed targeting the closed conformation allosteric pocket of DENV3 protease using the ZINC15 lead-like library as input for docking. This resulted in a selection of 15 compounds that were purchased and tested in a fluorescence-based enzyme assay in vitro. The most potent compound from this set showed a promising IC50 value of 136 +/- 16 micromolar against DENV3 protease as well as a non-competitive binding mode and was successfully simplified to a core fragment, which also showed significant inhibition of the DENV protease. This core fragment served as starting point for an in silico fragment growing approach, which after docking and evaluation resulted in a selection of 17 compounds to be synthesized and tested in vitro. Four of these compounds showed significantly increased activity toward DENV3 protease compared to the initial hit in the fluorescence-based assay, with an IC50 value of 28 +/- 7.9 micromolar against DENV3 protease for the most potent one. A general structural motif common to the most effective inhibitors was identified and used as a template for a comprehensive SAR study that revealed important features of the protein-ligand interactions. The most potent compound resulting from this study (IC50(DENV3)=12.3 +/- 3.5 micromolar) also showed high potency against a binary DENV4 protease construct and against ZIKV protease, with an IC50 value against the latter in the low micromolar range. The non-competitive binding mode was also confirmed for the optimized ligand structures, and preliminary mutation experiments were conducted to clarify the actual binding site in the protease. Cell-based experiments revealed low cytotoxicity of the established ligand series at concentrations up to 25 micromolar and relative inhibition of ZIKV replication of more than 50% at concentrations of 5-10 micromolar. Overall, the results obtained in this thesis provide a good basis for further development of potent flaviviral protease inhibitors.