title: Synthesis and characterization of subtype-selective estrogen receptor ligands and their application as pharmacological tools - Cross-talk between estrogen and NPY Y1 receptors in human breast cancer cells
Creators: name: Memminger, Martin
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2009
Subjects: subject: Neuropeptid Y , Brustkrebs , Östrogene , Antiöstrogene , Östrogenrezeptor , Struktur-Aktivitäts-Beziehung , Krebszelle , Estrogen Rezeptor , Neuropeptid Y Y1 Rezeptor , Brustkrebszellen , Estrogen Rezeptor Subtyp , estrogen receptor , neuropeptide Y Y1 receptor , breast cancer cells , estrogen receptor subtype
subject: 540 Chemie

description: The estrogen receptor (ER), a member of the nuclear receptor family, is the classical target of hormonal treatment of breast cancer. Recently, also individual membrane bound receptors have gained interest in both, diagnosis and possibe treatment of mammary carcinoma. Especially neuropeptide Y (NPY) receptors, belonging to the superfamily of G-protein coupled receptors, have become a topic in breast cancer research, as the Y1 receptor (Y1R) subtype was found to be expressed by the majority (85 %) of human mammary carcinomas. This thesis aimed at the investigation of the functional expression and cross-talk between ERs and Y1Rs in human breast cancer cells. Selective �pure antagonists� of the ER alpha (ERa) and beta (ERb) subtypes are considered useful pharmacological tools for the characterization of ER subtype specific cellular and physiological effects. 2-Phenylbenzofurans, in particular those bearing substituents in position 7 of the benzofuran core, are known as ERb subtype selective agonists. Aiming at ERb-selective �pure antagonists�, functionalized aliphatic side chains were introduced into position C7 of the benzofuran core within the scope of this thesis. A benzofuran, bearing a small 1-propenyl substituent in the C7 position, revealed high affinity to ERb (RBA = 34) and &gt;30-fold selectivity over ERa. This compound was shown to be an ER agonist in the luciferase gene reporter assay. Benzofurans, substituted with long functionalized aliphatic side chains revealed strongly decreased receptor affinities and selectivities. In the luciferase assay, these compounds were either weak antagonists or inactive. To obtain ERa-selective antagonists, a library of 2-aryl-tetrahydroisoquinolin-6-ols (THIQs), substituted with different functionalized aliphatic side chains in position C1, was synthesized. ER affinities of synthesized THIQs strongly depended on the nature of the side chain, whereas a 3�-hydroxy function at the N-phenyl ring was favourable for ERa-subtype selectivity. THIQs, containing side chains bearing a tertiary amine group, revealed binding affinities to the ER in the same order of magnitude (RBA ≈ 10) as determined for the potent antiestrogens fulvestrant (ICI 182.780) and 4-hydroxytamoxifen, respectively. ERa-selectivities of 13- and 17-fold over ERb were observed for compounds with an amine and thioether containing chain or a side chain bearing a sulfoxy function in combination with a 3�-hydroxy group. Both compounds exerted full antagonism in the luciferase assay with IC50 values in the sub-micromolar range, becoming appropriate pharmacological tools for blocking ERa-subtype specific cellular effects. Furthermore, the THIQ containing a sulfoxide side chain, was a potent inhibitor of the proliferation of estrogen responsive MCF-7 breast cancer cells, suggesting further investigation of its value with respect to the hormonal therapy of breast cancer. ER and Y1R protein expression by different subclones of MCF-7 breast cancer cells showing differential sensitivities against antiestrogen treatment were quantified by radioligand binding assays. For this purpose, Y1Rs were labeled with the selective, high-affinity radioligand [3H]-UR-MK114, recently developed in our work group. Basal expression of Y1Rs by MCF-7 cells varied between 40,000 and 100,000 receptors per cell, and inversely correlated with ER expression in vitro. In agreement with published results at the mRNA level, the Y1R protein was up-regulated by 100 % after treatment of the cells with estradiol at physiological concentrations (EC50 = 20 pM). The potent, highly ERa-selective agonist 1,3,5-tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl-1H-pyrazole up-regulated the Y1R by 100 % with an EC50 value of 0.25 nM, indicating a predominant role of ERa in Y1R induction. The �pure ER antagonist� fulvestrant abrogated estradiol-induced Y1R expression in a concentration-dependent manner (IC50 = 5 nM) to 25 % of the basal level. Two THIQ-based moderately ERa-selective antagonists, synthesized within the scope of this thesis, down-regulated the Y1R expression to the same extent as fulvestrant. Functional coupling of the Y1R to both, mobilization of intracellular calcium and inhibition of adenylyl cyclase activity, was demonstrated in MCF-7 cells by triggering intracellular calcium transients and suppression of forskolin-stimulated cAMP synthesis with NPY, respectively. However, there was neither an effect of NPY treatment on the proliferation of MCF-7 cells nor on ER-mediated transcriptional activity. According to the results of this thesis, the Y1R-mediated signaling cascade does not regulate downstream processes involved in tumor growth, which might be addressed in the therapy of breast cancer. Nonetheless, the Y1R is a useful endogenous gene reporter for the quantification of ER alpha specific (anti)estrogenic effects in whole-cell radioligand binding assays and a potential target for diagnostic imaging of breast cancer metastases.
description: Der Estrogen Rezeptor (ER), ein Mitglied der Superfamilie der nukleären Rezeptoren, ist das klassische Target für Hormone/Antihormone bei der Behandlung des Mammakarzinoms. Neuerdings rückten auch Vertreter der Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, insbesondere Neuropeptid Y (NPY) Rezeptoren, in das Interesse der Brustkrebsforschung, nachdem die Expression des Y1 Rezeptor (Y1R) Subtyps in einer Mehrzahl (85%) der Mammakarzinome nachgewiesen wurde. Diese Arbeit hatte daher die Zielsetzung, die funktionelle Expression von Y1R und ER und einen möglichen Cross-Talk zwischen beiden Rezeptoren in humanen Brustkrebszellen zu untersuchen. Selektive �reine Antagonisten� der ER alpha (ERa) und beta (ERb) Subtypen sind nützliche pharmakologische Werkzeuge zur Charakterisierung von ER Suptyp-spezifischen zellulären und physiologischen Effekten. 2-Phenylbenzofurane sind als ERb-selektive Agonisten bekannt, wobei in früheren Arbeiten gezeigt wurde, dass Substituenten in Position 7 des Benzofuran-Grundkörpers die ERb-Selektivität begünstigen. Auf ERb-selektive �reine Antagonisten� abzielend, wurden im synthetischen Teil dieser Arbeit funktionalisierte Seitenketten in Position 7 des Benzofuranmoleküls eingeführt. Ein Benzofuran mit einem kleinen 1-Propenyl Substituenten in Position C7 erwies sich als eine Verbindung mit hoher Affinität am ERb (RBA = 34) und 30-facher Selektivität gegenüber ERa. Im Luciferase Genreporter Assay zeigte die Substanz eine agonistische Wirkung am ER. Lange funktionalisierte Seitenketten, anstelle des kleinen Alkenyl-Substituenten in Position 7, bewirkten eine Absenkung der Rezeptoraffinität und �selektivität. Im Luciferase Assay waren diese Verbindungen entweder schwache Antagonisten oder inaktiv. Mit dem Ziel, ERa-selektieve Antagonisten zu erhalten, wurde eine Bibliothek von 2-Aryl-tetrahydroisochinolin-6-olen (THIQs) synthetisiert, die mit funktionalisierten Seitenketten in Position C1 versehen waren. Affinitäten der synthetisierten THIQs zum ER hingen stark von der Beschaffenheit der Seitenkette ab, wobei eine 3�-Hydroxyfunktion am N-Phenylring entscheidend für die ERa Selektivität war. THIQs, welche Seitenketten mit tertiärer Aminogruppe enthielten, zeigten vergleichbare Bindungsaffinitäten wie die potenten ER Antagonisten Fulvestrant (ICI 182.780) und 4-Hydroxytamoxifen. 13- und 17-fache ERa-Selektivitäten wurden für Verbindungen mit �bifunktioneller� Amino- und Thioether-Seitenkette, oder einer Seitenkette mit Sulfoxy-Funktion, jeweils in Kombination mit einer 3�-Hydroxygruppe bestimmt. Beide Verbindungen waren im Luciferase Assay voll antagonistisch wirksam, weswegen sie als pharmakologische Werkzeuge zur selektiven Blockade des ERa einsetzbar sind. Besonders Verbindungen mit Sulfoxy-Seitenkette zeigten außerdem eine deutliche, konzentrationsabhängige Hemmung der Proliferation Estrogen-sensitiver MCF-7 Brustkrebszellen. In Radioligand-Bindungsassays wurde die Expression der ER und Y1R Proteine durch verschiedene Subklone von MCF-7 Brustkrebszellen, die sich stark in ihrer Sensivität gegenüber dem Antiestrogen 4-Hydroxytamoxifen unterschieden, quantifiziert. Der Y1R wurde zu diesem Zweck mit dem selektiven, hochaffinen Radioliganden [3H]-UR-MK-114, der vor kurzem in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde, markiert. Die Basalexpression des Y1R in MCF-7 Zellen variierte zwischen 40000 und 100000 Rezeptoren pro Zelle und korrelierte invers mit der ER Expression in vitro. Behandlung der Zellen mit physiologischen Estradiol-Konzentrationen (EC50 = 20 pM) bewirkte eine Stimulation der Y1R-Synthese um 100 %, ein Phänomen, das bisher lediglich auf mRNA-Ebene gezeigt werden konnte. Mit ER-Subtyp-selektiven Liganden, wie dem sehr potenten ERa-selektiven Agonisten 1,3,5-Tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl-1H-pyrazol und mit im Rahmen der Arbeit synthetisierten Antagonisten vom THIQ-Typ gelang der Nachweis, dass die Regulation der Y1R Expression überwiegend ERa-vermittelt ist. Der �reine ER Antagonist� Fulvestrant unterdrückte die Estradiol-induzierte Y1R Expression konzentrationsabhängig (IC50 = 5 nM). Dass NPY Y1 Rezeptoren in menschlichen Brustkrebszellen funktionell aktiv sind, konnte durch Bestimmung von Second Messengern (intrazelluläres Calcium, cAMP) nachgewiesen werden. Eine Behandlung von MCF-7 Zellen mit NPY bzw. Y1R Antagonisten hatte jedoch keinerlei Einfluss auf die Zellproliferation, so dass NPY der Y1R als Target für eine Brustkrebstherapie nicht in Frage kommt. Nichtsdestotrotz erwies sich der NPY Y1 Rezeptor als nützlicher natürlicher Gen-Reporter zur Untersuchung von Estrogenen/Antiestrogenen. Darüber hinaus ist der Y1R möglicherweise ein Tumormarker, dessen Nachweis mit selektiven markierten Liganden durch bildgebende Verfahren wie z.B. PET für die Diagnostik Brustkrebsmetastasen genutzt werden kann.