title: Functional characterization of glycoproteins of a newly identified african henipavirus
title: Funktionelle Charakterisierung der Glykoproteine eines neu entdeckten afrikanischen Henipavirus
Creators: name: Weis, Michael
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2015
Subjects: fusion protein
Spaltung
Pathogenese
nipah
Viren
Flughund
Proteine
Fusion
hendra
Afrika
Henipavirus
Hendra
Nipah
Medizin, Gesundheit
fusion
glycoproteins

description: Henipaviruses are
      highly-pathogenic paramyxoviruses with today only two known
      representatives, that can cause infections in humans and
      livestock. Hendra virus occurs in australia and causes mainly
      respiratory infections in horses. Nipah virus derives from
      south-east-asia, where it regularly causes smaller outbreaks
      of severe encephalitis in humans. In general henipavirus
      infections are zoonotic infections with fruitbats of the
      species Pteropus as natural reservoir. Since some years it
      was belived that the distribution of the viruses is hampered
      to south-east-asia and australia. In 2009 the isolation of
      henipavirus-like rna-sequences out of a bat of the order
      Eidolon helvum from africa succeeded. One of this newly
      discovered african henipaviruses, GH-M74a, could be fully
      sequenced and cloned. Due to the lack of isolation of
      replicative viruses out of bats, the evoluation of the
      zoonotic potential is based on functional analyses of
      individual proteins in comparison to the proteins of
      humanpathogenic henipaviruses. Because of their importance
      for a sucsessfull infection of a new host cell and virus
      spread from cell to cell the two glycoproteins, the
      receptor-binding G and the fusion causing F protein of the
      newly identified GH-M74a (M74) should be functionally
      characterized in this work. Therefor the M74 glycoproteins
      where cloned into the expression vector pCAGGS. To facilitate
      their detection they were marked with an HA- or Flag-tag.
      With the help of indirect immunofluorescence analyses it was
      first proven that all cloned constructs are expressed. The
      ability of the two M74-glycoproteins to cause
      cell-to-cell-fusion when coexpressed was limited to very
      little cell lines. A fusion assay with heterotypic NiV-G or
      F-protein revealed that the main reason for the little fusion
      activity lays within the F-protein. Following western blot
      analyses showed a comparable total expression to NiV-F but a
      much more inefficient proteolytic activation and the fusion
      active form was hardly detectable on the cell surface.
      Coimmunoflourescence with NiV-F showed clear differences in
      the intracellular distribution of the two proteins. In
      addition tot hat, inhibitor studies indicate the
      endocytosis-dependend cleavage of the M74-F but revealed that
      M74-F is not cleaved by the NiV-F activating proteases
      cathepsin B or L. This is a clear sign for a different
      intracellular transport. To clarify if this modified
      transport and the reduced surface expression results from
      disrinct protein domains, M74-F chimeric, deletion and point
      mutants where generated in the second part of my work. The
      fact that no introduced minor or mayor mutation could restore
      the function leads to the guess that in contrast tot he other
      human pathogenic henipaviruses the reduced surface expression
      and fusion activity of the M74-F protein is a conserved
      intrinsic feature. Such a reduced bioactivity of a fusion
      protein could be a benefit for a bat-henipavirus. It could
      limit the spread in the reservoir host what causes persistant
      infection and the „survival“ of the virus. Such a reduced
      activity could in addition highly limit the zoonotic
      potential.
description: Henipaviren sind hochpathogene
      Paramyxoviren, von denen zurzeit nur zwei Vertreter
      bekanntermaßen Infektionen im Menschen oder Nutztieren
      verursachen können. Das Hendra-Virus kommt in Australien vor
      und verursacht vor allem respiratorische Infektionen in
      Pferden. Das Nipahvirus (NiV) stammt aus Südostasien, wo es
      regelmäßig kleinere Ausbrüche schwerer Enzephalitiden im
      Menschen verursacht. Generell sind Henipavirus-Infektionen
      zoonotische Infektionen, wobei fruchtfressende Flughunde der
      Gattung Pteropus das natürliche Reservoir darstellen. Bis vor
      wenigen Jahren ging man davon aus, dass die Verbreitung der
      Viren auf Südostasien und Australien beschränkt ist. Im Jahr
      2009 gelang es jedoch in Afrika aus Flughunden der Gattung
      Eidolon helvum neue Henipavirus-ähnliche RNA-Sequenzen
      isolieren. Eines dieser neu entdeckten afrikanischen
      Henipaviren, GH-M74a (M74), konnte vollständig sequenziert
      und kloniert werden. Da es bis heute nicht möglich war,
      vermehrungsfähige Viren aus Flughunden zu isolieren, basiert
      die Einschätzung ihres zoonotischen Potentials zurzeit auf
      Funktionsanalysen einzelner viraler Proteine im Vergleich zu
      den homologen Proteinen humanpathogener Henipaviren. Aufgrund
      ihrer wichtigen funktionellen Bedeutung für eine erfolgreiche
      Infektion neuer Wirtszellen und die Virusausbreitung von
      Zelle zu Zelle sollten in dieser Arbeit die beiden
      Oberflächen-Glykoproteine, das Rezeptor-bindende G und das
      Fusions-vermittelnde F-Protein, des neu entdeckten
      M74-Isolats funktionell charakterisiert werden. Hierfür
      wurden die M74-Glykoproteine zunächst in den
      Expressionsvektor pCAGGS kloniert. Um ihre Detektion zu
      ermöglichen wurden sie mit einem HA- bzw. FLAG-tag versehen.
      Mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz-Analysen wurde dann
      erst einmal nachgewiesen, dass alle klonierten Konstrukte
      exprimiert werden. Die Fähigkeit der beiden M74-Glykoproteine
      bei Koexpression Zell-Zell-Fusion zu vermitteln war
      allerdings gering und auf sehr wenige Zelllinien beschränkt.
      Ein Fusionsassay mit den heterotypischen NiV-G bzw.
      F-Proteinen ergab, dass der Hauptgrund für die geringe
      Fusionsaktivität im M74-F-Protein liegt. Anschließende
      Western Blot Analysen zeigten zwar eine mit dem NiV-F
      vergleichbar gute Gesamtexpression, M74-F wurde jedoch
      deutlich ineffektiver proteolytisch aktiviert und war kaum in
      fusionsaktiver Form auf der Zelloberfläche nachweisbar.
      Koimmunfluoreszenzen mit dem NiV-F zeigten außerdem deutliche
      Unterschiede in der intrazellulären Verteilung der beiden
      Proteine. Darüber hinaus wiesen Inhibitionsstudien zwar auf
      eine Endozytose-abhängige Spaltung des M74-F hin, zeigten
      aber, dass das M74-F nicht durch die NiV-F aktivierenden
      endosomalen Proteasen Cathepsin B und L gespalten wird. Dies
      spricht eindeutig für unterschiedliche intrazelluläre
      Transportwege. Um zu klären, ob dieser veränderte Transport
      und die geringe Oberflächenexpression auf bestimmte
      Protein-Bereiche zurückzuführen sind, wurden im zweiten Teil
      der Arbeit verschiedene M74-F Chimären sowie Deletions- und
      Punktmutanten untersucht. Die Tatsache, dass mit keiner der
      eingebrachten größeren und kleineren Mutationen, die
      Funktionalität verbessert werden konnte, lässt vermuten, dass
      die im Vergleich zu anderen humanpathogenen Henipaviren
      geringere Oberflächenexpression und Fusionsaktivität des
      M74-F-Proteins, eine konservierte intrinsische Eigenschaft
      ist. Eine solch reduzierte Bioaktivität eines Fusionsproteins
      könnte durchaus einen Vorteil für ein Flughund-Henipavirus
      darstellen. So könnte eine zu starke Ausbreitung im
      Reservoir-Wirt vermieden werden, was eine langfristige
      Infektion und somit das „Überleben“ der Viren ermöglichen
      könnte. Eine solch reduzierte Aktivität würde darüber hinaus
      auch das zoonotische Potential eines afrikanischen
      Henipavirus stark einschränken.