The effect of immune checkpoint inhibitors on platelet activation and aggregation in the context of therapy-related thromboembolic events
Creators: name: Schlüter, Julian
Publisher: name: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)
Year: 2024
Subjects: Immune checkpoint inhibitors
Platelets

description: Background and Objectives Immune checkpoint inhibitors (ICI) have become established in the treatment of various cancer entities due to their ability to block cancer cell strategies to bypass the immune system and to reactivate the endogenous antitumor immunity. By blocking cellular checkpoint receptors on immune or cancer cells, ICIs prevent early immune system shutdown and subsequent lymphocyte destruction. Despite the benefits of immunological activation, ICI therapy has several side effects. Physicians report treatment related thrombosis, which is a serious side effect due to the associated decreased life expectancy. In recent years, the view of the role of platelets has shifted from blood coagulation and hemostasis to a broader range of functions to include immune response initiation and leukocyte-platelet crosstalk. Given the advances in understanding platelet function, the role of platelets with respect to ICI associated thrombosis remains unknown. The aim of this study is to improve the understanding of the pathogenesis of ICI associated thrombosis and to investigate the role of platelets in this development. Methods The effect of ICI addition on platelet activation and function is investigated in three sections. To analyze the effect of ICI addition on platelet aggregation and coagulation, two independent aggregation assays were performed. For this purpose, thrombus formation time was measured under high shear stress with the Platelet Function Analyzer as well as platelet aggregation after ICI addition by aggregometry. In a second part, the effect of ICI addition on platelet surface marker expression was analyzed both in whole blood and platelet concentrates. The experiments were extended by the addition of Toll-like receptor (TLR) ligands and platelet agonists. The last part addresses the secondary effects of ICI therapy on platelets by enhancing leukocyte stimulation. Supernatants of PBMCs stimulated with staphylococcal enterotoxin B were analyzed for various pro thrombogenic factors and tested for differences in their respective platelet activation by flow cytometry. Results No effect of ICI addition on platelet aggregation and its function in primary hemostasis was detected in the performed experiments. Furthermore, ICI addition did not alter the expression of platelet surface markers in platelet concentrates and whole blood, either under unstimulated conditions or under stimulated conditions in the presence of adenosine diphosphate (ADP), thrombin receptor-activating peptide - 6 (TRAP-6) or toll-like receptor (TLR) ligands. With regard to the generated PBMC supernatants, ICI addition showed an enhancement of T cell stimulation with increased IL-2 concentration in the supernatant. In addition, the generated supernatants after ICI addition showed significant changes in the pro-thrombogenic factors studied with respect to tPA and sCD40L. Despite evidence of altered supernatant composition after ICI addition, an indirect effect of ICI on platelet activation status could not be demonstrated. Conclusion and Discussion The acquired in vitro data suggest a lack of connection between platelets and ICI therapy in the pathogenesis of ICI treatment-associated thrombosis. A direct effect of ICI on platelet aggregation and platelet activation, as well as secondary effects via enhanced T-cell activation, could not be detected. A strength of the study design is the use of blood from healthy blood donors to exclude possible tumor effects on platelets and to better demonstrate the ICI effect. However, tumor cells affect platelets and the platelet proteome, so the effect of ICI might be enhanced in these tumor-affected platelets. Despite the lack of evidence that ICI affects platelets, there are other possible pathogenesis pathways that should be investigated in subsequent studies. Briefly, ICIs could promote the development of a pro thrombogenic endothelial phenotype or activate platelets via the formation of immune complexes. Furthermore, it would be possible that ICIs contribute to platelet activation via increased deposition of complement factor C3 or occur at the site of platelet activation via intracellular uptake and release by platelets at higher concentrations than the measured cmax levels. Nevertheless, this is the first study to address the effects of ICI on platelet functionality, contributing to the understanding of the pathogenesis of ICI-associated thrombosis and the role of platelets in immune response and regulation.
description: Hintergrund und Ziele Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICI) sind zu einem wichtigen Bestandteil der Behandlung verschiedener Tumorentitäten geworden. Sie verfügen über die Fähigkeit, die Umgehung des Immunsystems durch Krebszellen zu blockieren und das körpereigene Immunsystem zu reaktivieren. Indem ICIs zelluläre Checkpoint-Rezeptoren auf Immun- oder Krebszellen blockieren, verhindern sie eine frühzeitige Abschaltung des Immunsystems und die damit verbundene Zerstörung von Lymphozyten. Neben den Vorteilen einer gesteigerten immunologischen Aktivierung hat die ICI Therapie auch einige Nebenwirkungen. Behandelnde Ärzte berichteten über therapieassoziierte Thrombosen, die aufgrund einer assoziierten Verringerung der Lebenserwartung schwerwiegende Nebenwirkungen darstellen. In den letzten Jahren hat sich das Verständnis der Thrombozytenfunktion von ihrer ausschließlichen Beteiligung an der Blutgerinnung und Hämostase auf weitere wichtige Funktionen einschließlich der Auslösung einer Immunantwort und der Interaktionen mit Leukozyten erweitert. Trotz der Fortschritte im Verständnis der Thrombozytenfunktion ist ihre Rolle in Bezug auf die ICI-assoziierten Thrombosen immer noch unbekannt. Ziel dieser Studie ist es, die Pathogenese ICI-assoziierter Thrombosen besser zu verstehen und die Rolle der Thrombozyten in diesem Prozess eingehender zu untersuchen. Methoden Die Untersuchung der Auswirkungen der ICI Zugabe auf die Thrombozytenfunktion und -aktivierung ist in drei Abschnitte unterteilt. Um den Effekt der ICI Zugabe auf die Gerinnung und Thrombozytenaggregation zu analysieren, wurden zwei unabhängige Aggregationstests durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde die Bildungszeit eines Thrombus unter hoher Scherbelastung mit Hilfe eines Platelet Function Analyzers gemessen. Zusätzlich erfolgte die Messung der Thrombozytenaggregation nach ICI Zugabe einer Aggregationsmessung im zeitlichen Verlauf. Im zweiten Abschnitt wurde der Effekt der ICI Zugabe auf die Expression von Thrombozyten-Oberflächenmarkern in Vollblut und Thrombozytenkonzentraten untersucht. Die Experimente wurden durch die Zugabe von Toll-like Rezeptor (TLR) Liganden und Thrombozytenagonisten erweitert. Der letzte Abschnitt befasste sich mit den sekundären Effekten der ICI Therapie auf Thrombozyten, die durch eine erhöhte Leukozytenstimulation ausgelöst werden. Die Überstände von Staphylococcus Enterotoxin B stimulierten PBMCs wurden auf verschiedene prothrombogene Faktoren untersucht und mittels Durchflusszytometrie auf ihre Unterschiede in Bezug auf die Thrombozytenaktivierung getestet. Ergebnisse und Beobachtungen In den durchgeführten Untersuchungen, konnten keine Auswirkungen der ICI Zugabe auf die Thrombozytenaggregation und ihre Funktion in der primären Hämostase nachgewiesen werden. Weiterhin veränderte die Zugabe von ICI zu Vollblut oder Thrombozytenkonzentraten nicht die Expression der untersuchten Thrombozytenoberflächenmarker, weder unter unstimulierten Bedingungen noch nach Stimulation mit ADP, TRAP-6 oder TLR-Liganden. Im Hinblick auf die generierten PBMC Überstände zeigte die ICI Zugabe eine Verstärkung der T-Zell-Stimulation durch eine Erhöhung der IL-2-Konzentration im Überstand. Zusätzlich wiesen die Überstände nach ICI Zugabe signifikante Veränderungen in der Konzentration der prothrombogenen Faktoren tPA und sCD40L auf. Entgegen dem Nachweis einer veränderten Zusammensetzung des Überstandes nach ICI Zugabe konnte ein indirekter Effekt der ICI auf die Thrombozytenaktivierung nicht beobachtet werden. Schlussfolgerungen und Diskussion Die generierten in vitro Daten lassen keinen Zusammenhang zwischen Thrombozyten und ICI-Therapie in der Pathogenese der ICI-assoziierten Thrombosen erkennen. Ein direkter Einfluss von ICI auf die Thrombozytenaggregation und -aktivierung sowie sekundäre Effekte durch eine gesteigerte T-Zell Aktivierung konnten weiterhin nicht nachgewiesen werden. Einerseits ist die Verwendung von Blut gesunder Blutspender eine Stärke des Studiendesigns, um mögliche Tumoreffekte auf Thrombozyten auszuschließen. Andererseits beeinflussen Tumorzellen die Thrombozyten und das Thrombozytenproteom, so dass die ICI-Wirkung in diesen betroffenen Thrombozyten verstärkt sein könnte. Ungeachtet des fehlenden Nachweises einer Thrombozytenaffektion durch ICI Zugabe, gibt es weitere mögliche Entstehungswege der behandlungsassoziierten Thrombose die weiter untersucht werden sollten. Zusammenfassend könnten ICI die Entwicklung eines prothrombogenen endothelialen Phänotyps begünstigen oder Thrombozyten über die Bildung von Immunkomplexen aktivieren. Weiterhin wäre es möglich, dass ICI zu einer Thrombozytenaktivierung durch gesteigerte Ablagerung des Komplementfaktors C3 beitragen oder am Ort der Thrombozytenaktivierung durch intrazelluläre Aufnahme und Freisetzung durch Thrombozyten in höheren Konzentrationen als den gemessenen cmax Werten auftreten. Gleichwohl ist dies die erste Studie, die sich mit den Auswirkungen von ICI auf die Thrombozytenfunktionalität befasst. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Pathogenese der ICI-assoziierten Thrombose und der Rolle der Thrombozyten in der Immunantwort und -regulation bei.