Ανάπτυξη και εφαρμογή προσδιορισμού του αντιβιοτικού τιγεκυκλίνη με Υγρή Χρωματογραφία-Φασματομετρία Μαζών (LC-MS/MS) σε ήπαρ και σπλήνα από επίμυες:
Creators: name: Κωνσταντίνου, Ελισσάβετ Γεωργίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2014
Subjects: Υγρή Χρωματογραφία-Φασματομετρία Μαζών
Τιγεκυκλίνη
Ήπαρ, σπλήνας
Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
Tigecycline
Liver, spleen

description: Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε η αναλυτική μέθοδος προσδιορισμού του αντιβιοτικού τιγεκυκλίνη σε ιστοτεμάχια ήπατος και σπληνός από επίμυες με τη μέθοδο Υγρής Χρωματογραφίας με συζευγμένη Φασματομετρία Μαζών (LC-MS/MS). Πραγματοποιήθηκαν εργαστηριακές μελέτες, που έδειξαν ότι η μέθοδος είναι γραμμική και για τα δύο τα υποστρώματα, με συντελεστές συσχέτισης, R2, 0,997 για το ήπαρ και 0,998 για το σπλήνα. Το όριο ποσοτικής αποτίμησης (Limit of Quantitation, LOQ) είναι 3,44μg/g για το ήπαρ και 4,75μg/g για το σπλήνα. Το όριο ανίχνευσης (Limit of Detection, LOD) είναι αντίστοιχα για το ήπαρ και το σπλήνα 1,15μg/g και 1,58μg/g. Το σχετικό σφάλμα ( ) και η σχετική τυπική απόκλιση (Relative Standard Deviation, RSD%) για το ήπαρ κυμαίνεται από 2,38% μέχρι 18,82% και από 1,11% μέχρι 15,92% αντίστοιχα, ενώ για το σπλήνα από 3,36% μέχρι 22,28% και από 5,18% μέχρι 21,30% αντίστοιχα. Η ανάκτηση βρέθηκε για το ήπαρ και το σπλήνα 141% και 132% αντίστοιχα. Η επίδραση του υποστρώματος είναι 111% για το ήπαρ και 138% για το σπλήνα. Τέλος, η σταθερότητα ήταν 91% για το ήπαρ και 87% για το σπλήνα. Στη συνέχεια, η μέθοδος εφαρμόστηκε για την κατασκευή φαρμακοκινητικής καμπύλης της τιγεκυκλίνης. Το σκεπτικό της μελέτης είναι η δημιουργία καμπυλών ιστικής φαρμακοκινητικής σε μοντέλα επαγόμενης ασθένειας σε πειραματόζωα. Μέχρι στιγμής οι μελέτες που διερευνούν τη φαρμακοκινητική και την ιστική κατανομή in vivo είναι σε υγιή πειραματόζωα. Έτσι, η Επιφάνεια κάτω από την Καμπύλη (Area under the Curve, AUC) από τη στιγμή της χορήγησης του αντιβιοτικού μέχρι τις πρώτες βρέθηκε ότι είναι για το ήπαρ και το σπλήνα αντίστοιχα 2073μg∙h/g και 704μg∙h/g.
description: Tigecycline is a first-in-class, broad spectrum antibiotic with activity against multiple resistant organisms. A rapid, sensitive and simple analytical method for the quantitation of tigecycline in tissue samples of liver and spleen from rats using Ultra Performance Liquid Chromatography – tandem Mass Spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed and validated. Chromatography was performed on a reversed-phase ACQUITY UPLC™ BEH C18 column (2.1mmx50mm, 1.7μm). The mobile phase consisted of A: water, 0.1% formic acid, B: acetonitrile, 0.1% formic acid and C: methanol, 0.1% formic acid at a flow rate of 0.400mL/min. Detection was performed using multiple-reaction monitoring mode (MRM) at m/z 586.3 &gt; 513.2 for tigecycline, operating in positive electrospray ionization mode. Sample pretreatment included homogenization of 26.3±4.4mg and 33.9±2.9mg of rat liver and spleen tissue respectively with 1mL acidified mixture of methanol-water (1:1), 10mM HCl with microsonicator, centrifugation and liquid-liquid extraction (LLE) with dichloromethane. An extra step, which was consisted of letting the homogenized sample in rotating plate stirrer for 30min, has been added at the pretreatment of spleen tissue, after the homogenization. 0.200mL were collected from the upper layer and injected into the system. Linearity was demonstrated over the concentration range from 3 to 279μg/g and from 5 to 385μg/g for liver and spleen samples respectively. Limit of Determination (LOD) and Limit of Quantitation (LOQ) were 1.2μg/g and 3.4μg/g respectively for liver and 1.6μg/g and 4.8μg/g for spleen samples. The relative standard deviation (RSD%) of three quality control samples for intra- and inter-day precision were less than 21.3% and the relative error (er%) of the intra- and inter- day accuracy were less than 22.3%. The stability of tigecycline was evaluated and shown to be 91% and 87% for liver and spleen samples respectively under the assay conditions. The application of the validated assay for the determination of tigecycline in induced diseased models of rats after a 7mg/kg bodyweight single intravenous (IV) dose of tigecycline was demonstrated. Pharmacokinetic parameter (Area Under the Curve, AUC0-24h) was evaluated and found to be 2073μg∙h/g and 704μg∙h/g for liver and spleen samples respectively. By now, the investigation of pharmacokinetic and tissue distribution in vivo has been reported only in healthy subjects.