title: Analysis of the subcellular localization of the C-signal precursor p25 and identification of the PopC cleavage site in p25 in Myxococcus xanthus
title: Analyse der subzellulären Lokalisation des C-Signalvorläuferproteins p25 und die Identifikation der PopC-Spaltstelle in p25 in Myxococcus xanthus
Creators: name: Ammon, Meike
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Subtilase
Proteolyse
C-Signal
Biowissenschaften, Biologie
Myxococcus xanthus
Serinproteinasen
Development
Fruchtkörperbildung

description: Myxococcus xanthus ist ein
      Bakterium, das ein außergewöhnliches Verhalten bei
      Nährstoffmangel zeigt. Im Zuge eines Entwicklungszyklus
      bilden diese Bakterien Fruchtkörper, die mit Dauerformen, den
      sogenannten Myxosporen gefüllt sind, um die
      lebensbedrohlichen Umweltbedingungen zu überstehen. Sechs
      Stunden nach Eintritt des Hungerzustandes koordiniert und
      reguliert das C Signal die Aggregation der Zellen zur
      Fruchtkörperbildung, die Sporulation der Zellen zu Myxosporen
      und eine spezifische Genexpression. Beim C Signal handelt es
      sich um das 17 kDa große Protein p17, welches nach der
      Prozessierung des C Signalvorläuferproteins p25 durch die
      Subtilisin-ähnliche Serinprotease PopC entsteht. In dieser
      Arbeit sollte zum einen die Orientierung von p25 in der
      äußeren Membran untersucht und zum anderen die
      PopC-Spaltstelle in p25 identifiziert werden. Um die
      subzelluläre Lokalisation von p25 zu untersuchen, wurden
      intakte Zellen mit einer unspezifischen Protease behandelt.
      Anschließend wurde in Immunoblot Analysen geprüft, ob p25 im
      Vergleich zu Kontrollproteinen degradiert wird. p25 zeigte
      ein identisches Verhalten wie das Kontrollprotein PilQ, ein
      Protein der äußeren Membran, welches auf der Zelloberfläche
      exponiert ist. Als weitere Kontroll-proteine dienten Tgl, ein
      Protein der äußeren Membran, das ins Periplasma ragt, und
      PilC, ein Protein der inneren Membran. Tgl und PilC wurden im
      Gegensatz zu PilQ und p25 weniger stark degradiert. Daher
      deuten die Ergebnisse darauf hin, dass p25 auf der
      Zelloberfläche exponiert ist. Um die PopC-Spaltstelle zu
      identifizieren, wurden biochemische und genetische Strategien
      verfolgt. Synthetische Peptide wurden herangezogen, um die
      PopC-Spaltung zu analysieren. Der N-Terminus von p17 sollte
      mittels Massenspektrometrie bestimmt werden. Außerdem wurde
      die Spaltung von verkürzten MalE-p25 Deletionsderivaten und
      Alaninsubstitutionsmutanten durch gereinigtes PopC Protein in
      vitro untersucht. Damit wurde das Spaltmotiv in p25 auf die
      Aminosäuren 56LDV58 eingegrenzt. Die Untersuchungen von
      Alanin-substitutionen in vitro und in vivo lassen
      schlussfolgern, dass Aspartat 57 essentiell für die
      PopC-Spaltung in M. xanthus ist. Daher deuten die Daten
      darauf hin, dass PopC p25 im Spaltmotiv 56LDV58 nach Aspartat
      57 spaltet.
description: Myxococcus xanthus is a
      Gram-negative, rod-shaped δ-proteobacterium, which shows a
      complex developmental program. This program is initiated
      under starvation conditions and results in the formation of
      multicellular, spore-filled fruiting bodies. After six hours
      of starvation the C-signal coordinates and regulates the
      aggregation of cells into fruiting bodies, sporulation of
      cells into myxospores and a specific gene expression. The
      C-signal is a 17 kDa protein p17, which is generated by
      proteolytic cleavage of a 25 kDa precursor p25 by the
      subtilisin-like serine-protease PopC. The aim of this study
      was to investigate the subcellular localization of p25 in the
      outer membrane and to identify the PopC cleavage site in p25.
      To analyze the localization of p25, intact cells were treated
      with an unspecific protease. Immunoblot analysis with
      antibodies against p25 and against different control proteins
      were used to detect protein degradation. p25 was degraded
      like the outer membrane protein PilQ, which is exposed to the
      cell surface. Additionally, the outer membrane protein Tgl,
      which is exposed into the periplasmic space, and the inner
      membrane protein PilC were employed as controls. Tgl and PilC
      were degraded less drastically than PilQ and p25. These data
      suggest that p25 is exposed on the cell surface. To identify
      the PopC cleavage site, biochemical and genetic approaches
      were used. Synthetic peptides were explored to map the PopC
      cleavage site and the N-terminus of p17 was analyzed by
      mass-spectrometry. Truncated MalE-p25 derivatives as well as
      mutants containing alanine substitutions at certain amino
      acid positions were investigated after cleavage by purified
      PopC protein in vitro. With these experiments the PopC
      cleavage site was narrowed down to the amino acid motif
      56LDV58 in p25. Furthermore, analysis of different alanine
      substitution mutants in vitro and in vivo revealed that
      aspartate in the position 57 of p25 is essential for PopC
      cleavage in M. xanthus. These data strongly suggest that PopC
      cleaves p25 after aspartate 57 in the cleavage motif
      56LDV58.