APPROCCI MOLECOLARI E BIOINFORMATICI INNOVATIVI PER STUDI DI EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE DEL MORBILLO NELL'AMBITO DEL WHO EUROPEAN REGION MEASLES STRATEGIC PLAN 2010-2020
Creators: name: CICERI, GIULIA
Publisher: name: Universit� degli Studi di Milano
Year: 2020

description: INTRODUZIONE. Il morbillo � una malattia esantematica estremamente contagiosa trasmissibile per via aerea causata da un virus della famiglia Paramyxoviridae, genere Morbillivirus. L?infezione spesso � causa di complicanze severe e decessi, � prevenibile con la vaccinazione e presenta i requisiti per l?eliminazione. L?Italia fa parte dei 12 paesi europei dove la trasmissione del morbillo � ancora endemica. Il Global Measles and Rubella Strategic Plan 2012 ? 2020 ha fissato il goal di eliminazione del morbillo endemico nella Regione Europea dell?OMS. Per raggiungere tale obiettivo � necessario ottenere e mantenere coperture vaccinali elevate (&gt;95%) e disporre di un sistema di sorveglianza sensibile e di qualit�. La sorveglianza molecolare del morbillo � una componente chiave della verifica dell'eliminazione del morbillo endemico ed � uno strumento cruciale sia per stabilire eventuali link epidemiologici tra casi che si verificano nello stesso periodo in una determinata area geografica sia per identificare le possibili fonti di importazione. Con il progredire del programma di eliminazione, la diversit� genetica dei ceppi di morbillo circolanti diminuisce. I continui viaggi aerei e la facilit� di scambi tra i paesi favoriscono le importazioni in una determinata area geografica di varianti virali appartenenti allo stesso genotipo. In questo contesto, i tradizionali metodi di laboratorio non consentono di distinguere la trasmissione endemica da eventi di importazione delle stesse varianti virali. Con il progredire del programma di vaccinazione, inoltre, una quota sempre pi� alta di casi di morbillo si verifica in soggetti vaccinati. Le nuove e avanzate tecnologie devono quindi permette di ampliare le conoscenze su questi aspetti e consentire di identificare ceppi potenzialmente in grado di eludere la risposta immunitaria. SCOPO. Scopo del presente progetto di dottorato � quello di studiare e sorvegliare nel tempo l?epidemiologia molecolare del morbillo in vista dell?obiettivo di eliminazione, attraverso lo sviluppo e l?utilizzo di metodologie innovative molecolari e bioinformatiche. La ricerca pertanto si propone di combinare il metodo epidemiologico tradizionale con le tecniche molecolari e bioinformatiche che la nuova era offre. Un ulteriore obiettivo � stato quello di studiare casi confermati di morbillo in soggetti precedentemente vaccinati, al fine di valutare il fallimento vaccinale e identificare eventuali mutanti escape a livello del gene H. MATERIALI E METODI. Sono stati analizzati i campioni biologici provenienti da pazienti con diagnosi sospetta di morbillo raccolti nell?ambito della Sistema di Sorveglianza Integrata Morbillo e Rosolia della Regione Lombardia (rete MoRoNET), da marzo 2017 a luglio 2019. I campioni sono stati sottoposti a estrazione dell'RNA e a test di Real Time RT-PCR per l?identificazione del genoma del virus del morbillo. Tutti i campioni risultati positivi sono stati sottoposti a retrotrascrizione e a successiva amplificazione genica della regione N-450 del virus del morbillo mediante nested RT-PCR per la caratterizzazione genotipica. Campioni di interesse (N=50) sono stati sottoposti ad amplificazione del gene virale H mediante due emi-nested PCR e ad amplificazione dell?intero genoma attraverso l?utilizzo di specifiche coppie di primer per l?amplificazione di 10 frammenti parzialmente sovrapposti. Gli amplificati sono stati sequenziati e sono state analizzate filogeneticamente le sequenze N-450, N-450/H e l?intero genoma attraverso diversi programmi bioinformatici (ClustalX2, BioEdit, MEGA7) per le valutazioni filogenetiche. Lo studio dei casi vaccinati � stato condotto attraverso l?analisi dei dati sierologici ottenuti dal database del laboratorio di riferimento regionale; in aggiunta, � stata analizzata la sequenza amminoacidica (ottenuta tramite la conversione delle sequenze nucleotidiche grazie al programma BioEdit) della proteina H di 7 casi vaccinati e di 80 casi non vaccinati come gruppo controllo. I dati anagrafici, clinici ed epidemiologici relativi ai casi di morbillo analizzati nel presente lavoro sono stati ottenuti dal database della Regione Lombardia per le malattie infettive MAINF. RISULTATI. Complessivamente, tra marzo 2017 e luglio 2019 sono stati indagati 885 casi sospetti di morbillo segnalati a Milano e nelle aree limitrofe. Il 74.2% dei casi indagati � stato confermato in laboratorio. Il maggior numero di casi � stato confermato nel 2017 (50.4%). Le fasce d?et� pi� colpite sono state quelle dei giovani tra i 15 e i 39 anni (63.0%) e degli adulti over-39 anni (21.5%), dato che si � confermato per tutti e tre gli anni esaminati. Il 92.1% dei casi confermati di morbillo non era vaccinato. La consultazione del database regionale MAINF ha permesso di classificare i casi confermati come sporadici (57.4%) o appartenenti a focolai (42.7%). Il 9.7% dei casi confermati dal nostro laboratorio si trovava fuori dal territorio in esame durante il periodo di incubazione della malattia. In questo modo � stato possibile definire l?importazione dell?infezione, sia dall?estero (44.3% dei casi importati) che da altre regioni italiane (55.7% dei casi importati). La caratterizzazione genotipica mediante sequenziamento della regione N-450 di Morbillivirus � stata completata con successo per il 95.3% dei casi. � stato possibile evidenziare la costante co-circolazione di due genotipi, il D8 (72.9%) e il B3 (26.1%). L?analisi intra-genotipica ha permesso di identificare complessivamente 16 varianti virali, di cui 8 gi� classificate dall?OMS e definite WHO named strain. In particolare, sono state identificate 5 WHO named strain D8 (Mv/Osaka.JPN/29.15, Mvs/London.GBR/21.16/2, MVi/Hulu-Langat.MYS/26.11, MVs/Gir-Somnath.IND/42.16, Mvs/Victoria.AUS/6.18) e 3 WHO named strain B3 (MV/Dublin.IRL/8.16, MVs/Saint-Denis.FRA/36.17, Mvs/Ljubljana.SVN.27.17). La D8-Osaka � stata la variante predominante nel 2017, la B3-Dublino nel 2018 e la D8-Gir Somnath nel 2019. Sono state inoltre identificate 69 sequenze non ancora classificate dall?OMS e momentaneamente denominate ?no named strain?. Venti erano di genotipo D8 e 49 di genotipo B3. Alcune di queste sequenze hanno dato origine a eventi di trasmissione continua, altre a casi sporadici o a piccoli focolai familiari non propagandosi ulteriormente nella popolazione. � stata approfondita l?analisi molecolare di ceppi correlati a importanti eventi epidemici (focolai nosocomiali e familiari) e a casi notificati come sporadici avvenuti a breve distanza geografica e temporale dai focolai. � stato quindi sviluppato il sequenziamento e l?analisi filogenetica di una regione di pi� di 2000 nucleotidi, comprendente l?N-450 e tutto il gene H (N-450/H). Ci� ha reso possibile valutare la variabilit� genetica (intra-variante) di ceppi 100% identici in N-450. L?analisi filogenetica di questa regione ha permesso di osservare che sequenze tra loro identiche nella sola regione N-450 formavano dei cluster e altre invece risultavano non strettamente correlate. In un secondo momento, gli stessi ceppi sono stati sottoposti a sequenziamento dell?intero genoma, la cui analisi filogenetica ha confermato i dati ottenuti in N-450/H, ma raggiungendo un maggior match con l?indagine epidemiologica e risultando pi� sensibile nel delineare le singole catene di trasmissione. � stato studiato il profilo sierologico di 33 casi confermati di morbillo con storia di vaccinazione documentata nel database regionale MAINF. Nel 18.2% dei casi, il riscontro di negativit� in IgG in fase acuta (7-10 giorni dall?esordio del rash) ha suggerito una mancata risposta al vaccino (non-responder) e quindi un fallimento primario della vaccinazione. La gran parte dei casi vaccinati (81.8%) ha mostrato una risposta in IgG in fase acuta e pertanto inquadrabile come fallimento verosimilmente secondario. La capacit� di trasmettere l?infezione da parte di soggetti con fallimento vaccinale � stata dimostrata nel 12% dei casi. Infine, i soggetti con fallimento primario avevano un?et� mediana all?epoca dell?ultima dose pi� elevata rispetto a quelli con fallimento secondario (12 anni e 6 anni rispettivamente). Un ulteriore obiettivo del presente progetto � stato quello di analizzare 87 sequenze amminoacidiche della proteina H (target principale degli anticorpi neutralizzanti) identificate in soggetti vaccinati e non vaccinati. Di queste, 30, di cui 7 appartenenti a ceppi di casi vaccinati, presentavano sostituzioni in siti immunoepitopici. Le sostituzioni riscontrate sono state L247S, P247S, A400V, A192T e Q575K. Non sono invece state riscontrate mutazioni in siti funzionali della proteina, come per esempio residui di cisteina importanti per il mantenimento della struttura terziaria, o in siti di legame col recettore, responsabili del riconoscimento e dell?ingresso nella cellula ospite. CONCLUSIONI. L?andamento epidemiologico e genotipico dei casi di morbillo identificato nei 3 anni di studio a Milano e nelle aree limitrofe rispecchia quello riscontrato sul territorio nazionale. L?analisi intra-genotipica condotta ha permesso di identificare complessivamente 16 varianti virali, di cui 4 predominanti e un?elevata variabilit� per entrambi i genotipi individuati (D8 e B3). Ci� conferma il pattern tipico nelle aree caratterizzate da un abbassamento delle coperture vaccinali e un aumento dei soggetti suscettibili alla malattia. Per dimostrare l?interruzione della circolazione all?interno del proprio territorio, i paesi devono essere in grado di distinguere le trasmissioni endemiche dai casi importati, in quanto la malattia pu� essere considerata eliminata solo in assenza di focolai endemici. La circolazione a livello mondiale di un ristretto numero di varianti virali limita l?informazione data dall?analisi filogenetica della regione N-450 e rende pi� complessa la ricostruzione delle rotte di trasmissione e la caratterizzazione dei focolai epidemici. Inoltre, non consente di ricostruire le catene di trasmissione e identificare i casi di importazione da fonti diverse. � pertanto importante mettere in atto nuove strategie metodologiche per ampliare la ?finestra di sequenziamento?. L?analisi dell?intero genoma � risultata sensibile e in grado di ricostruire le catene di trasmissione e identificare i casi di importazione. Questa tecnica risulta tuttavia estremamente laboriosa e costosa e, nell?attuale contesto epidemiologico, non applicabile come metodica di routine. Potrebbe risultare invece la strategia ottimale per i paesi measles-free o che si stanno avvicinando all'eliminazione del morbillo, dove � necessario verificare l?introduzione solo di pochi ceppi virali. I risultati ottenuti nel corso dei 3 anni di dottorato sui ceppi coinvolti in importanti eventi epidemici a Milano e nelle aree limitrofe suggeriscono che l?analisi della regione N-450/H possa essere considerata una valida strategia di implementazione della sorveglianza molecolare in questa fase del programma di eliminazione. Per quanto riguarda lo studio dei casi confermati di morbillo in soggetti vaccinati, i risultati hanno dimostrato che la maggior parte dei fallimenti vaccinali non sono dovuti a una mancata risposta immunitaria (non-responder), ma piuttosto ad una perdita nel tempo della risposta immunologica vaccino-indotta. Tuttavia, la valutazione del titolo anticorpale � stata fatta durante la fase acuta della malattia e non si � potuto valutare quanti soggetti presentavano titoli anticorpali protettivi prima dell?infezione. Questa valutazione avrebbe contribuito a identificare i booster delle IgG in fase acuta causati dall?incontro col virus selvaggio. Il riscontro di una percentuale non trascurabile di casi di morbillo tra soggetti vaccinati che ha dato origine a focolai evidenzia la necessit� di mantenere alta l?attenzione nel mettere in atto le misure di contenimento e diffusione della malattia anche in presenza di casi vaccinati. Ulteriori studi multidisciplinari devono essere condotti per confermare i risultati ottenuti e delineare opportuni piani risolutivi. L?analisi amminoacidica della proteina H ha permesso di identificare mutazioni in siti critici della proteina non osservate da studi precedenti. I dati ottenuti sono da un lato rassicuranti in quanto non mostrano la circolazione di mutanti escape, dall?altro documentano una variabilit� della proteina H che impone la necessit� di un monitoraggio costante. In conclusione, nel presente progetto di dottorato, sono state sviluppate e applicate metodologie innovative risultate utili per la corretta valutazione dello scenario epidemiologico attuale, caratterizzato dalla circolazione di ceppi endemici, dalla continua introduzione di varianti virali e da una quota non trascurabile di fallimenti vaccinali.