title: Condensin I in Meiose : Charakterisierung einer essentiellen Rolle für die männliche Keimzellbildung von D. melanogaster
Creators: name: Seel, Kristina
Publisher: name: University of Bayreuth
Year: 2018
Subjects: subject: Condensin
subject: Meiose
subject: Drosophila
subject: 500
subject: 570

description: Die fehlerfreie Verteilung des genetischen Materials während der Zellteilung ist eine fundamentale Voraussetzung, um die Genomstabilität aufrechtzuerhalten. Die ordnungsgemäße Trennung und Segregation der replizierten Chromosomen erfordert eine drastische Umorganisation des Chromatins in eine robuste Transportform. Während dieses, als Chromosomenkondensation bezeichneten Prozesses, wird das gesamte Genom einer Zelle um das 200 bis 20000-fache komprimiert und zu robusten, stäbchenförmigen Strukturen, den lichtmikroskopisch sichtbaren Chromosomen, verpackt. Die evolutionär hoch konservierten, heteropentameren Proteinkomplexe, Condensin I und Condensin II, spielen eine entscheidende Rolle bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der Chromosomenstruktur. Die beiden Structural Maintenance of Chromosomes (SMC)-Untereinheiten bilden zusammen mit einer Untereinheit aus der Familie der Kleisine eine dreigliedrige Ringstruktur aus, welche DNA-Stränge topologisch umschließen und dadurch intrachromosomale Verknüpfungen und Schlaufen stabilisieren kann. Die funktionelle Relevanz beider Condensin-Komplexe für die mitotische sowie meiotische Chromosomensegregation konnte in allen wichtigen Modellorganismen, darunter D. melanogaster, beschrieben werden. Lediglich die Rolle von Condensin I für die Spermatogenese in Drosophila melanogaster ist nach wie vor unklar. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse und Charakterisierung potentieller Funktionen des kanonischen Condensin I-Komplexes während der männlichen Keimzellbildung in D. melanogaster. Um die Lokalisation spezifischer Condensin- Untereinheiten eruieren zu können, stellen Fusionen mit fluoreszierenden Proteinen ein wertvolles Instrument dar. Zu diesem Zweck wurde das kürzlich entwickelte CRISPR/Cas-System eingesetzt, um, durch präzise knockins an deren endogenen Genloci, EGFP-markierte Condensin-Allele zu erzeugen. Mit Hilfe des CRISPR/Cas-Systems werden Doppelstrangbrüche ortsspezifisch im Genom erzeugt und auf Basis einer DNA-Matrize durch homologe Rekombination wieder repariert. Es wurde eine zuvor etablierte Screeningstrategie validiert und dahingehend optimiert, positive Rekombinationsereignisse eindeutig und verlässlich identifizieren zu können. Durch die Integration exogener DNA-Sequenzen einschließlich konditionaler, visualisierbarer Marker wurde eine transiente, gewebespezifische Expression von EGFP in den Augen adulter Fliegen induziert. Unter Verwendung dieser Methode wurden transgene Fliegenlinien etabliert, welche die Fluoreszenz-markierte Condensin I-spezifische Kleisin-Untereinheit Barren, sowie die assoziierte nicht-SMC-Untereinheit CapG exprimieren. Durch in vivo Mikroskopie primärer Spermatozyten wurde das räumlich-zeitliche Lokalisationsprofil dieser und weiterer EGFP-fusionierter Condensin-Untereinheiten in Meiose verfolgt. Die einzelnen Untereinheiten offenbaren eine transiente Assoziation mit dem meiotischen Chromatin von Prometaphase bis Anaphase. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)-Experimente deuten daraufhin, dass lediglich eine Subfraktion der Condensin-Komplexe stabil mit dem Chromatin assoziiert, während ein maßgeblicher Anteil dynamisch mit der löslichen Proteinfraktion ausgetauscht wird. Anders als in Mitose, scheint die Chromatinassoziation von Condensin I in Meiose nicht oder nur teilweise durch Aurora B Kinase-abhängige Phosphorylierung reguliert zu werden. Zur funktionellen Analyse des Condensin I-Komplexes wurde dieser konditional in der männlichen Keimbahn inaktiviert. Die RNAi-vermittelte Depletion der Condensin I-Untereinheiten SMC2, Barren und CapG führt zu einer signifikanten Reduktion der männlichen Fertilität. Der Fertilitätsverlust konnte auf eine verminderte Produktion reifer Spermien in Folge einer gestörten Keimzellbildung zurückgeführt werden. Im Verlauf beider meiotischer Teilungen treten schwerwiegende Defekte während der Chromosomensegregation auf, welche sich primär in Form von Chromatinbrücken äußern und zu Aneuploidie der betreffenden Keimzellen führen. Durch klassische, genetische Nondisjunction-Analysen konnte eine erhöhte Frequenz autosomaler und gonosomaler Fehlsegregationsereignisse sowohl in Meiose I als auch Meiose II nachgewiesen werden. Konsistent damit sind Befunde, die zeigen, dass Spermienkerne nach Suppression von Condensin vermehrt durch eine abnormale Kernmorphologie und numerische Chromosomenaberrationen gekennzeichnet sind. Eine abweichende Chromosomenanzahl konnte sowohl durch Quantifizierung centromerischer Cid/CenH3-Signale als auch durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) mit einer gegen X-chromosomale Sequenzen gerichteten DNA-Sonde demonstriert werden. Die reduzierte männliche Fertilität nach Depletion von Condensin I wurde auch durch induzierte proteolytische Spaltung und induzierte proteasomale Degradation von Barren bestätigt. Zusammenfassend deuten diese Daten erstmals daraufhin, dass der kanonische Condensin I-Komplex eine wichtige Rolle für die Chromosomensegregation in der männlichen Meiose von D. melanogaster spielt.