title: Structural features of TNF-alpha lectin-like domain derived peptides for activation of amiloride-sensitive sodium current
Creators: name: Hazemi, Gavasaraei Parastoo
Publisher: name: :none
Year: 2011

description: Lungenödem ist eine schwerwiegende Komplikation im Rahmen einer Lungenverletzung, schwerer Pneumonie und akutem Lungenversagen. Neue Therapiemöglichkeiten wie Aktivierung des Natriumtransports und dadurch bedingten Wassertransports aus der alveolären Flüssigkeit könnte die Prognose eines Permeabilitätsödems verbessern. Insbesondere der Transport über den Amilorid-sensitiven epithelialen Natriumkanal (ENaC) ist einer der Hauptwege für Na+ über alveoläre und distale Epithelzellen. ENaC spielt eine wichtige Rolle beim Natriumtransport aus der Alveolarflüssigkeit und ist eine wesentliche Komponente in der alveolären Clearance in gesunden und kranken Lungen. Die Lectin-Domäne von TNF-α kann die Amilorid-sensitive Natriumaufnahme in Typ II alveolären Epithelzellen aktivieren. Ziel war daher die Wirkung von synthetischen Peptiden, die die Lectin-Domäne von TNF-α (TIP) nachbauen, auf ENaC in A549 Zellen mit Hilfe der Patch Clamp Technik zu untersuchen. Austausch von C101 durch Glycin (G2) und Hinzufügen von N-terminalen (C1) und C-terminalen Cystein (C17) Resten, verbunden durch eine Disulfidbrücke, ergab das cyclische Peptid AP301. Die Disulfidbrücke in AP301 kann nachteilig sein und daher sollten neue AP301-Analoge getestet und eine Struktur-Wirkungsbeziehung aufgestellt werden. Die Daten zeigen, dass TIP Peptide, die einen ENaC-aktivierenden Effekt in A549 Zellen haben, einerseits die Triade von Gruppen besitzen, die äquivalent mit T105, E107 und E110 des humanen TNF-α sind, und andererseits auch die angrenzende Gruppe der hydrophoben Reste besitzen, die äquivalent mit P113, W114 und Y115 vom humanen TNF-α sind. Weiters ist eine freie positiv geladene N-terminale Aminogruppe an Rest 1 und/oder eine freie negativ geladene Carboxylgruppe an Rest 17 der TIP Peptide essentiell für die ENaC-aktivierende Wirkung. Peptide ohne eine oder mehrere dieser Eigenschaften hatten keine Wirkung. Alle aktiven TIP Peptide waren hoch selektiv für ENaC mit einer Tendenz zu geringerer Selektivität in Molekülen ohne eine freie positiv geladene N-terminale Aminogruppe. Eine AP301-Lösung, die vernebelt und kondensiert wurde, behielt ihre ENaC-aktivierende Wirkung. Deshalb ist die Anwendung in Ärosol-Form zur Inhalation für Patienten geeignet, ohne Verlust der pharmakologischen Wirksamkeit. Die Wirkungen auf den makroskopischen Na+ Strom wurden durch die Einzelkanalstrom-messungen bestätigt. Die Öffnungswahrscheinlichkeit, mittlere Öffnungszeit sowie Anzahl und Dauer der Bursts wurden durch TNF-α und auch AP301 und AP318 signifikant erhöht, wohingegen die Einzelkanalleitfähigkeit durch die Testsubstanzen nicht verändert wurde. Patch Clamp Experimente weisen auf eine extrazelluläre Bindungsstelle für TIP Peptide hin. Eine spezifische Bindung der TNF-TIP Domäne an N,N-Diacetylchitobiose, ein in vielen Glykanstrukturen von Glykoproteinen vorkommendes Dissaccharid, ist bekannt. Deglycosylierung der A549 Zellmembran mit PNGase F bewirkte keine Veränderung der Kanalleitfähigkeit, jedoch ging die ENaC-aktivierende Wirkung in deglykosylierten Zellen verloren. Infektionen mit Listeria und Staphylococcus aureus können zu möglichen letalen pulmonalen Komplikationen mit ausgeprägtem Permeabilitätsödem führen. Das bakterielle Toxin Listeriolysin O (LLO) gehört zur Gruppe der Cholesterol-abhängigen Cytotoxine, das Hyperpermeabilität in Einzelschichten humaner pulmonaler mikrovaskulärer Endothelial-zellen in vitro induzieren kann. Es wird angenommen, dass über Porenbildung und Signalwege der von LLO und anderen porenbildenden Toxinen induzierte Zelltod erfolgt. Vorbehandlung von Makrophagen mit IFN-β verstärkte die LLO-induzierte Porenbildung und den Zelltod drastisch. Da die Bindung und Porenbildung durch LLO vom Membranaufbau abhängig ist, wäre eine IFN-β bedingte erhöhte Porenbildung denkbar. Panton-Valentine Leukocidin (PVL) ist ein β-barrel porenbildendes Toxin, das aus zwei Komponenten besteht, LukF-PV und LukS-PV. PVL sezernierende Staphylococcus aureus Stämme traten in den letzten Jahren vermehrt auf und wurden mit schweren Lungen- und Hautinfektionen in Zusammenhang gebracht. Die Ergebnisse deuten auf eine hoch spezifische inflammatorische transkriptionale Reaktion in alveolären Makrophagen hin, die unabhängig von der porenbildenden Eigenschaft von PVL ist. Die zwei Toxin-Komponenten müssen gemeinsam der Badlösung zugesetzt warden. Eine sukzessive Applikation führt nicht zur Porenbildung. Die Bildung von Na+, K+ und Ca2+ leitenden Poren wurde sowohl nach extra- als auch intrazellulärer Applikation festgestellt. Da ein Zusammenhang zwischen Amilorid-sensitivem Na+ Transport und Regulation der Permeabilität in Endothelzellen besteht, könnten die TIP Peptide ein interessanter Ansatzpunkt in der Therapie von infektionsassoziierten Permeabilitätsödemen sein. Es konnte bereits gezeigt werden, dass ein humanes TNF-TIP Peptid eine LLO-induzierte Hyperpermeabilität in vitro abschwächen kann.
description: Pulmonary oedema is a major complication of acute lung injury, severe pneumonia, and acute respiratory distress syndrome. Ventilation strategies apart, no standard treatment exists for pulmonary permeability oedema. Therefore, novel therapies activating sodium uptake from the alveolar fluid could improve clinical outcome. The involvement of Na+ transporters in alveolar fluid clearance in the mammalian lung has been well established in recent years. Transport via amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC) in particular is one of the major pathways for Na+ entry across alveolar and distal epithelial cells. ENaC plays a prominent role in sodium uptake from alveolar fluid and is the major component in alveolar fluid clearance in normal and diseased lungs. The lectin-like domain of TNF-α has been shown to activate amiloride-sensitive sodium uptake in type II alveolar epithelial cells. Therefore, several synthetic peptides that mimic the lectin-like domain of TNF-α (TIP) were synthesized and their ability to enhance sodium current through ENaC was studied in A549 cells with the patch clamp technique. Replacement of C101 by a glycine residue (G2) and addition of N-terminal (C1) and C-terminal cysteine (C17) residues, linked by a disulphide bridge, resulted in the 17-residue cyclic peptide, AP301. The disulphide bond in analogue AP301 may be susceptible to reduction and scission leading to complications in medical use. Therefore, the focus of the new peptide design described in the thesis was replacement of the disulphide bridge of the original TIP analogue, AP301, with other molecular arrangements. The data from structure-activity relationship studies suggest that TIP peptides which have an activating effect on amiloride-sensitive ENaC in A549 cells possess the triad of residues equivalent to T105, E107 and E110 of human TNF-α, and the group of adjacent hydrophobic residues equivalent to P113, W114 and Y115 of human TNF-α. Furthermore, a free positively charged N-terminal amino group on residue 1 and/or a free negatively charged carboxyl group on residue 17 of the TIP peptide is essential for the ENaC-activating effect. Peptides which lack one or more of these features do not exert such an effect. All active TIP peptides were highly selective for ENaC with a tendency towards less selectivity in molecules without a free positively-charged N-terminal amino group. A solution of AP301, which has been nebulized, retains the ENaC activating effect of AP301. Therefore, delivery of AP301 as an aerosol by inhalation to the patient will have no detrimental effect on the pharmacological activity of AP301. Effects on macroscopic Na+ current were confirmed by single channel current measurements. Open probability, mean open times, number of bursts, and duration of bursts were increased by TNF-α as well as AP301 and AP318, whereas single channel conductivity was not changed by the test compounds. Patch clamp experiments gave evidence for an extracellularly located binding site for TIP peptides. The specific binding of the TNF-TIP domain to N,N-diacetylchitobiose, a disaccharide present in many glycan structures of glycoproteins, was demonstrated previously. After deglycosylation of the A549 cell membrane with PNGase F, no effect on channel conductivity was found, however, the ENaC-activating effect got lost in deglycosylated cells. Infections with Listeria and Staphylococcus aureus can lead to potentially lethal pulmonary complications, characterized by extensive permeability oedema. The bacterial toxin Listeriolysin O (LLO) is a cholesterol-dependent cytotoxin, which induces hyperpermeability in monolayers of human lung microvascular endothelial cells in vitro. It is reported that pore-formation and signaling events are linked to cell death induced by LLO and some other pore-forming toxins. When macrophages were pretreated with IFN-β the extent of pore formation by LLO as well as the rate of cell death critically increased. Given that binding and pore formation by LLO is dependent on membrane composition, it is conceivable that IFN-β causes changes in this such that the extent of pore formation is increased. Panton-Valentine Leukocidin (PVL) is a β-barrel pore-forming toxin comprised of two subunits termed LukF-PV and LukS-PV. PVL secreting Staphylococcus aureus strains emerged worldwide in the last years and were found associated with serious lung and skin infections in humans, indicating the potential threat of serious infections. Data indicate a highly specific inflammatory transcriptional response in alveolar macrophages which is independent of PVL’s pore forming ability. The two components had to be added to the bathing solution concomitantly but not consecutively in order to allow pore-forming activity of PVL. This effect was observed independently of the site of application as Na+, K+ and Ca2+ conducting PVL pores were induced after extra- as well as intracellular application. TIP peptides showed no effect on PVL-induced pore formation. As a link between amiloride-sensitive Na+ uptake and regulation of permeability in endothelial cells is reported, the TIP peptides might represent an interesting candidate for the treatment of infection-associated permeability oedema. Indeed, it could already be demonstrated that the TNF-derived human TIP peptide is able to blunt LLO-induced hyperpermeability in vitro.