title: Quantitative analysis and live imaging of Polycomb group proteins in Drosophila melanogaster
Creators: name: Gänger, Cornelia
Publisher: name: :none
Year: 2010

description: Proteine der Polycomb- (PcG) und Trithorax- (TxG) Gruppen bewahren das epigenetische Transkriptionsgedächtis von hunderten Genen, die für die Entwicklung wichtig sind. Sie binden an cis-regulatorische DNA-elemente die man Polycomb/Trithorax Response Elements (PRE/TREs) nennt. Obwohl der Transkriptionsstatus eines durch Proteine der PcG und TrxG regulierten Gens stabil von einer Zellgeneration zur nächsten weitervererbt wird, ist der Mechanismus dynamisch und es herrscht ein ständiger Austausch zwischen freiem Protein und Protein, welches an Chromatin gebunden ist. Um dieses System verstehen zu können ist es wichtig, funktionstüchtige Proteinkomplexe, welche an die DNA binden, die Gentranskription unterdrücken (PcG) oder aktivieren (TxG), in lebenden Organismen studieren zu können. Proteine, die mit kleinen fluoreszierenden Proteinen verbunden sind, können mittels mikroskopischer in vivo Methoden sichtbar, verfolgbar und quantifizierbar gemacht werden. Ich habe wichtige und representative Proteine verschiedender Komplexe ausgewählt (E(Z), PHO, DSP1), um sie mit einem grün fluoreszierenden Protein zu fusionieren. Ich habe den Expressionslevel dieser Proteine und deren Funktionalität in den jeweiligen transgenen Fliegen quantitativ analysiert und ihre Verteilung in verschiedenen Geweben observiert. Das hat zur Identifikation der Expressionsstrategien geführt, die mutante Phenotypen von E(Z) und PHO ersetzen können und ausreichend Fusionsprotein erzeugen, um mit Live Imaging Methoden studiert werden zu können. Das ermöglicht zukünftige kinetische Studien dieser Proteine, um die Stabilität und Lebensdauer von funktionstüchtigen Proteinen zu erforschen. Zudem habe ich auch transgene Fliegen geschaffen, die ein sichtbar markiertes PRE/TRE in ihrem Genom tragen, um kinetische Studien der grün fluoreszierenden Fusionsproteine an einem konkreten DNA-element vergleichend studieren zu können. Somit habe ich ein System etabliert, das die spezifische Bindung der Proteine der PcG und TrxG im lebenden Gewebe verfolgen lässt.
description: The Polycomb (PcG) and Trithorax (TrxG) proteins ensure epigenetic memory of transcription for several hundred developmentally important genes by binding to cis regulatory elements called Polycomb/Trihorax response elements (PRE/TREs). Paradoxically, although the PcG and TrxG proteins pass the transcriptional state very stably from one cell generation to the next, this is a dynamic system in constant flux between chromatin bound and free protein pools. For a complete understanding of this mechanism it is crucial to be able to study functional PcG repression complexes, TrxG activation complexes and complexes of DNA binding factors, which recruit other PcG/TrxG proteins, in living organisms. Advanced microscopy in combination with fluorscent protein tagging with GFP or its variants have been established as a minimally invasive tool to visualize, track and quantify proteins of interest in vivo. In this thesis work I have selected important members of different complexes involved in the PRE-mediated regulatory mechanism (E(Z), PHO, DSP1), and tagged them fluorescently with GFP. I quantitatively analyzed the expression level and functionality of the fusion proteins in the respective transgenic flies and their distribution in different tissues at different developmental stages. This resulted in the identification of expression strategies that gave full rescue of mutant phenotypes for PHO and E(Z), and also sufficient levels of protein to be visualised by live imaging, thus providing a set of tools for future photobleaching studies of these proteins to investigate the behavior, stability and lifetime of functional complexes in vivo. In addition, I have generated transgenic flies carrying a visually tagged transgene PRE to study GFP fusion protein kinetics at a single locus. I have established a system to follow PcG/TrxG protein binding and locus-specific behavior in the living organism.