title: Charakterisierung der RNA-Bindungsaktivität von VP30 im Hinblick auf die virale Transkriptionsregulation des Ebolavirus
title: Characterization of the RNA binding activity of VP30 concerning the transcriptional regulation of the Ebola virus
Creators: name: Schlereth, Julia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: RNA binding
Ebola virus
Transkription, RNA-Bindung
Ebolavirus
VP30
transcription
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit

description: The Ebola virus is a human
      pathogenic RNA virus which can cause hemorrhagic fever with
      high case fatality rates up to 90%. Unpredictable and
      sporadic outbreaks occurring mainly in Africa are
      characteristic for this virus. Owing to the recent outbreak
      with over 28 000 infected people and about 11 000 deaths, the
      Ebola virus has attracted increasing public interest. The
      Ebola virus harbors a negative single strand RNA genome of 19
      kb with seven protein coding genes. For replication of the
      viral genome three of the viral proteins are necessary: the
      RNA-dependent RNA polymerase (L), the viral protein 35 (VP35)
      and the nucleoprotein(NP). In contrast, for transcription a
      fourth protein is required, namely the viral protein
      30(VP30). Phosphorylation of two serine clusters in the
      N-proximal region of VP30 regulates the protein´s ability to
      support viral transcription; in its dephosphorylated state it
      functions as a transcription factor and interacts with VP35;
      by phosphorylation VP30 becomes transcriptionally inactive
      and loses the contact to VP35 while gaining affinity for the
      nucleoprotein. This results in a switch of the RNA polymerase
      to the replicative mode. The strict VP30 dependency of
      transcription is mediated by a stable hairpin structure on
      the viral genome/antigenome (nt 56-78) and can be abolished
      by weakening the structural stability of this hairpin. VP30
      is known to bind RNA and to form a hexamer consisting of
      three dimers. Moreover, it possesses an unconventional zinc
      finger motif (Cys3His) and was shown to act as suppressor of
      RNA silencing in addition to VP35 and VP40. The central goal
      of this work was to investigate the RNA binding ability of
      VP30 with regard to its function as transcription factor.
      This gave rise to four part projects dealing with (i) the
      establishment of an appropriate in vitro assay to analyze
      RNA:VP30 complex formation,(ii) the characterization of the
      RNA binding properties of VP30, (iii) the possible
      correlation between transcriptional activation and RNA
      binding of VP30 and (iv) a comprehensive transcriptome
      analysis to deepen the understanding of the transcriptional
      regulation by VP30. The RNA:VP30 interaction studies were
      mainly based on an EMSA (Electrophoretic Mobility Shift
      Assay) procedure tailored to VP30, which enabled us to
      measure binding affinities (in terms of apparent Kd values)
      and to visualize different types of RNA:VP30 complexes under
      native conditions. The results suggested that the RNA:VP30
      interaction is strongly governed by electrostatic
      interactions. The preferential substrates were found to be
      single stranded RNAs with an optimal length of ~ 37 nt.
      Initially, we analyzed the 3´-terminal ~ 150 nt of the viral
      genome as well as the corresponding complementary antigenomic
      sequence for potential structures. A deletion analysis based
      on these two RNA substrates confirmed the preference of VP30
      for single stranded regions. In addition, an
      affinity-enhancing effect of the hairpin structure (nt 56-78)
      could be observed. The comparison of different
      5´-modifications(5´-Mono- or Triphosphate, 5´-Cap(0)) in an
      RNA substrate mimicking the 5´-terminal sequence of the NP
      mRNA revealed a strong negative influence on VP30 binding by
      the presence of a 5´-Cap modification. To explore the
      correlation between RNA binding and transcriptional
      activation of VP30, the transcriptionally inactive VP30
      variants VP30_DD (mimicking the phosphorylated state),
      VP30_5LA (hexamerization-defective) and VP30_C72S (mutated
      zinc finger motif) as well as the transcriptionally active
      wild type and VP30_AA (mimicking the unphosphorylated state)
      were produced recombinantly. These VP30 variants were tested
      for their ability to bind RNA using the newly established
      EMSA procedure. Variants VP30_5LA and VP30_C72S - in line
      with their transcriptional inactivity - were essentially
      unable to bind RNA. Similarly, the two counterparts VP30_AA
      and VP30_DD showed RNA binding affinities that correspond to
      their ability to support viral transcription: VP30_AA
      (transcriptionally active) was able to bind RNA with a
      4.3-fold lower Kd value than VP30_DD (transcriptionally
      inactive). The influence of the arginine cluster (overlapping
      with the two serine clusters) on RNA binding ability and
      transcriptional activation was investigated using three
      single mutants (VP30_R26A, _R28A,_R40A) as well as one triple
      mutant (VP30_3RA). All single mutants had little effect on
      RNA binding or transcriptional activation. Solely the triple
      mutant showed a twofold reduced RNA binding affinity, an
      altered RNA binding mode and a substantially impaired
      transcriptional activation. Additionally, we found that the
      complex formation between VP30 and VP35 strictly depends on
      the presence of RNA. In summary, we observed a strong
      correlation between RNA binding and transcriptional
      activation using different VP30 variants, thus pinpointing
      the physiological link between VP30´s RNA binding ability and
      its function as transcription factor. In the course of a
      transcriptome analysis using Next Generation Sequencing (NGS)
      we were able to detect short transcripts in the mRNA start
      regions whose 3´-end coincided with the predicted hairpin
      structures there. Furthermore a leader transcript and two
      additional short transcripts were assigned to the intergenic
      region between the VP30 and VP24 genes. The 3´-leader
      transcript preceding the NP gene was confirmed experimentally
      by Northern Blot and its ratio to the first mRNA (NP)
      determined using RT-qPCR (mRNA/leader transcript: ~8.7:1).
      This is the first experimental evidence for the existence of
      a 3´-leader transcript of Ebola virus, which may exert -
      analogous to leader transcripts found in other viruses - a
      key function in the regulatory switch between viral
      transcription and replication.
description: Das Ebolavirus ist ein
      humanpathogenes RNA-Virus, das bei Menschen und Primaten
      hämorrhagisches Fieber mit Letalitätsraten von bis zu 90%
      auslösen kann. Das Virus tritt in Form von unvorhersehbaren,
      sporadischen Ausbrüchen v.a. in Afrika auf und rückte
      aufgrund des bisher dramatischsten Ausbruches (seit
      2013/2014) mit bisher über 28 000 Fällen (davon ca. 11 000
      Todesfälle) stärker in das öffentliche Interesse.Das Virus
      besteht aus einem negativ orientierten Einzelstrang-RNA-Genom
      mit sieben proteinkodierenden Genen. Für die Replikation des
      viralen Genoms sind drei dieser Proteine notwendig: die
      RNA-abhängige RNA-Polymerase (L), das virale Protein 35
      (VP35) und das Nukleoprotein (NP). Für die Transkription wird
      zusätzlich das virale Protein 30 (VP30) benötigt. Über
      Phosphorylierung von zwei Serin-Clustern in der N-proximalen
      Region von VP30 wird dessen Aktivität als
      Transkriptionsfaktor maßgeblich reguliert; im
      dephosphorylierten Zustand fungiert es als
      Transkriptionsfaktor und geht eine Interaktion mit VP35 ein,
      während es im phosphorylierten Status als inaktiver
      Transkriptionsfaktor den Kontakt zu VP35 verliert und mit dem
      Nukleoprotein interagiert. Als Folge wechselt die
      RNA-Polymerase in den replikativen Modus. Die strikte
      VP30-Abhängigkeit der Transkription wird durch eine stabile
      Haarnadelstruktur auf dem Genom/Antigenom (nt 56-78)
      vermittelt und kann durch eine eingeführte strukturelle
      Schwächung aufgehoben werden. VP30 ist ein RNA-bindendes
      Protein, das als Hexamer, bestehend aus drei Dimeren,
      vorliegt und ein unkonventionelles Zinkfinger-Motiv (Cys3His)
      besitzt. Außerdem fungiert es neben VP35 und VP40 als
      suppressor of RNA silencing. Zentraler Ansatzpunkt dieser
      Arbeit war es die RNA-Bindungsfähigkeit von VP30 im Hinblick
      auf seine Funktion als Transkriptionsfaktor zu untersuchen.
      Daraus ergaben sich vier Teilprojekte: (i) die Etablierung
      eines in vitro Assays zu Analyse von RNA:VP30-Komplexen,(ii)
      die Charakterisierung der RNA-Bindungseigenschaften von VP30,
      (iii) der Nachweis eines möglichen Zusammenhangs zwischen
      Transkriptionsaktivierung und RNA-Bindung von VP30 und (iv)
      eine Transkriptomanalyse zum Verständnis der
      transkriptionellen Regulation durch VP30. Die Untersuchungen
      der RNA:VP30-Bindung basierten in erster Linie auf einer
      modifizierten Variante des EMSA (Electrophoretic Mobility
      Shift Assay), anhand derer unter nativen Bedingungen
      Affinitäten (in Form von apparenten Kd-Werten) und
      verschiedene Komplexpopulationen untersucht werden konnten.
      Die Ergebnisse der Untersuchungen zu den
      RNA-Bindungseigenschaften von VP30 ließen darauf schließen,
      dass die VP30:RNA-Wechselwirkung stark elektrostatisch
      geprägt ist und vornehmlich mit einzelsträngigen
      RNASubstraten stattfindet. Einen erheblichen Einfluss auf die
      Bindungsaffinitäten hatte die Länge der einzelsträngigen
      Bereiche, wobei ein Affinitätsoptimum bei ca. 37 Nukleotiden
      beobachtet wurde. Im viralen Kontext wurden die 3´-terminalen
      ca. 150 Nukleotide des Genoms sowie die entsprechend
      komplementäre Sequenz des Antigenoms zunächst auf potenzielle
      Strukturelemente hin untersucht und anschließend einer
      Deletionsanalyse unterzogen. Hierbei bestätigte sich die
      Präferenz für ungepaarte RNA-Bereiche, wobei der
      Haarnadelstruktur (nt 56-78) eine affinitätssteigernde
      Wirkung zugewiesen werden konnte. Zusätzlich wurde gezeigt,
      dass eine 5´-Kappe am viralen mRNA-Substrat die
      Bindungsaffinität deutlich im Vergleich zu 5´-Mono- und
      5´-Triphosphat-Enden verschlechterte. Um einen möglichen
      Zusammenhang zwischen RNA-Bindung und
      Transkriptionsaktivierung von VP30 nachzuweisen, wurden die
      transkriptionsinaktiven Varianten VP30_DD (imitiert
      phosphoryliertes VP30), VP30_5LA (Hexamerisierungs-defekt)
      und VP30_C72S (mutiertes Zinkfinger-Motiv) sowie die
      transkriptionsaktive Variante VP30_AA (imitiert
      dephosphoryliertes VP30) und der Wildtyp von VP30 rekombinant
      hergestellt und mittels EMSA auf ihre RNA-Bindungsfähigkeit
      getestet. Hierbei konnte für die Varianten VP30_5LA und
      VP30_C72S - im Einklang mit ihrer Transkriptionsinaktivität -
      nur noch eine basale RNA:VP30-Komplexbildung nachgewiesen
      werden. Auch die beiden Gegenstücke VP30_AA und VP30_DD
      zeigten RNA-Bindungsaffinitäten, die sich schlüssig zu ihren
      Transkriptionsdaten verhielten: VP30_AA (transkriptionsaktiv)
      bindet die RNA 4.3-fach affiner als VP30_DD
      (transkriptionsinaktiv). Das die beiden Serin-Cluster
      überlagernde Arginin-Cluster wurde anhand von drei
      Einzelmutanten (VP30_R26A, _R28A und _R40A) sowie einer
      Tripelmutante (VP30_3RA) bezüglich RNA-Bindungsfähigkeit und
      Transkriptionsaktivierung untersucht. Hierbei wurde
      beobachtet, dass die Einzelmutanten weder RNA-Bindung noch
      Transkriptionsaktivierung signifikant beeinflussten.
      Lediglich die Tripelmutante zeigte eine 2-fache
      Verschlechterung der RNA-Bindung, einen veränderten
      Bindungsmodus sowie eine erhebliche Beeinträchtigung der
      Transkriptionsfähigkeit. Zudem konnte gezeigt werden, dass
      die bereits nachgewiesene Interaktion zwischen VP30 und VP35
      RNA-abhängig ist. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser
      Arbeit eine starke Korrelation zwischen RNA-Bindung und
      Transkriptionsaktivierung gezeigt und damit erstmals die
      RNA-Bindungsfähigkeit von VP30 in einen physiologischen
      Kontext gestellt. Im Zuge einer Transkriptomanalyse mittels
      Next Generation Sequencing (NGS) konnten kurze
      Abbruchtranskripte im Bereich der mRNA-Starts der
      verschiedenen Gene detektiert werden, die genau mit den
      vorhergesagten Haarnadelstrukturen in diesen Regionen
      korrelierten. Zusätzlich konnte ein leader-Transkript und
      zwei Transkripte innerhalb der intergenischen Region zwischen
      VP30 und VP24 gefunden werden. Das leader-Transkript wurde
      anschließend experimentell durch Northern Blot bestätigt und
      sein Verhältnis zur mRNA (NP) durch RT-qPCR bestimmt
      (mRNA/leader-Transkript: ca. 8.7:1). Damit konnte erstmals
      die Existenz eines leader-Transkriptes für das Ebolavirus
      nachgewiesen werden, dessen potenzielle Funktion
      möglicherweise - analog zu leader-Transkripten anderer Viren
      - im Bereich der Regulation von Transkription vs. Replikation
      liegt.