Untersuchungen zur Pro-Sequenz-vermittelten Faltung von rekombinantem, humanen Nervenwachstumsfaktor
Creators: name: Rattenholl, Anke
Publisher: name: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
Year: 2001
Subjects: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Zsfassung in engl. Sprache

description: Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein neurotropher Faktor, der für Wachstum, Differenzierung und überleben von Neuronen notwendig ist. Nativer, reifer NGF liegt als Homodimer vor. Jedes Monomer besitzt sechs Cysteine, die einen Cystin-Knoten ausbilden. Dabei formen zwei Disulfidbrücken einen Ring, durch den die dritte Brücke hindurchfädelt. Die beiden Monomere sind über eine hydrophobe Kontaktfläche fest miteinander assoziiert. Die Pro-Sequenz von NGF ist fast so groß wie der reife Teil. Sie besitzt keine Cysteine. NGF stellt ein mögliches Therapeutikum zur Behandlung von Neuropathien des peripheren und zentralen Nervensystems dar. Das Protein ist jedoch nur in äußerst geringen Konzentrationen im Gewebe vorhanden. Für die Verwendung von NGF als Therapeutikum oder für diagnostische Zwecke kommt daher nur die rekombinante Herstellung in Betracht. Die Produktion in prokaryontischen Systemen ist relativ kostengünstig, und es können große Mengen an rekombinantem Protein gewonnen werden. Der bakterielle Organismus ist jedoch nicht in der Lage, NGF in nativer Form im Cytosol zu bilden. Das rekombinante Protein fällt in Form von Einschlusskörpern, so genannten Inclusion Bodies, in der Zelle an. Diese müssen solubilisiert, reduziert und anschließend in vitro renaturiert werden. In einem optimierten Verfahren der Firma Roche ließ sich nativer, reifer NGF bei einer Proteinkonzentration von 2 µg/ml und einer Faltungsdauer von mehr als 100 h in Ausbeuten von lediglich maximal 10 % erhalten. In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob sich die Renaturierungsausbeute verbessern lässt, wenn man statt des reifen NGF dessen Pro-Form verwendet. Tatsächlich ließen sich unter optimierten Bedingungen bei einer Proteinkonzentration von 50 µg/ml Ausbeuten von 35 % erzielen. Renaturierung des reifen NGF in Gegenwart des isolierten Pro-Peptids ergab jedoch keine Erhöhung der Faltungsausbeute (sog. "Faltung in trans"). Unterschiedlich disulfidverbrückte Intermediate von Pro-NGF und reifem NGF wurden mittels Massenspektrometrie untersucht. Bereits 15 min nach Beginn der Faltung ließ sich nativer Pro-NGF nachweisen. Die Renaturierung war nach 2 h fast abgeschlossen. Im Gegensatz dazu ließen sich bei der Faltung des reifen NGF viele nicht-native Disulfidbrücken nachweisen; nativer NGF ließ sich erst nach 24 h detektieren. In vitro ließ sich die Pro-Sequenz des renaturierten Pro-NGF mit Trypsin abspalten. Dabei entstand reifer, biologisch aktiver NGF. In vivo erfolgt die Prozessierung durch Pro-Hormon-Convertasen. Im Bioassay zeigten auch unprozessierter Pro-NGF und das isolierte Pro-Peptid Aktivität. Letzteres ist nur wenig strukturiert und wird leicht durch Proteasen degradiert. Nicht nur NGF, sondern auch andere Neurotrophine könnten in Zukunft als wichtige Diagnostika oder Therapeutika dienen. Da sie untereinander eine hohe Sequenzhomologie aufweisen, sollten sie sich ebenfalls leicht und mit hohen Ausbeuten aus rekombinantem Inclusion Body-Material in ihren jeweiligen Pro-Formen renaturieren lassen.
description: Nerve growth factor (NGF) is a neurotrophic factor that promotes growth, differentiation and survival of neurons. Native, mature NGF exists as a homodimer. Each monomer contains six cysteines that form a cystine knot: two disulfide bridges build a ring through which the third disulfide bond passes. Both monomers are tightly associated by hydrophobic interactions. The pro-sequence of NGF is almost as large as the mature part. It does not contain any cysteines. NGF is a possible therapeutic for the treatment of neuropathies of the peripheral and central nervous system. However, natural sources contain only minute amounts of the protein. Therefore, NGF needed for therapeutic or diagnostic purposes has to be produced recombinantly. Production in procaryotic systems is relatively cheap and large amounts of protein can be obtained. However, the recombinant protein is not able to fold into its native structure in the reducing bacterial cytosol. It forms intracellular aggregates (inclusion bodies). These have to be solubilized, reduced and afterwards refolded in vitro. In an optimized procedure of the company Roche, renaturation of mature NGF yielded only 10 % native protein using a protein concentration of 2 µg/ml and a folding period of more than 100 h. Therefore the question arose whether folding yields could be enhanced when NGF was renatured in its pro-form. Indeed, folding yields of 35 % were obtained at a protein concentration of 50 µg/ml under optimized conditions. However, the isolated pro-peptide was not able to further enhance refolding yields of the mature protein ("refolding in trans"). Disulfide bridged intermediates of both pro-NGF and mature NGF were analyzed by mass spectrometry. Only 15 min after initiation of refolding, native pro-NGF could be detected. Renaturation was nearly complete after 2 h. In contrast, folding of the mature protein showed many non-native disulfide bonds and native NGF could be detected only after 24 h. The pro-sequence of refolded pro-NGF could be cleaved in vitro by trypsin. Mature, biologically active NGF was formed. In vivo, processing of the pro-protein is achieved by pro-hormone convertases. Both unprocessed pro-NGF and the pro-peptide showed biological activity in a bioassay. The pro-peptide has only little structure and is very easily degraded by proteases. Not only NGF but also other neurotrophins could act as important diagnostics or therapeutics. Since they show a large sequence homology, their distinctive pro-forms should also be able to refold easily and in high yields from inclusion body material.