Synthesis of the RNA CrcZ during anaerobiosis and impact of the CrcZ levels on anoxic biofilm formation and antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa
Creators: name: Chriki, Rim
Publisher: name: (:none)
Year: 2020

description: In Pseudomonas aeruginosa as well as in several Pseudomonas spp., the two-component system (TCS) CbrA/CbrB controls a variety of metabolic and behavioral traits needed for adaptation to changing environmental conditions. The histidine kinase CbrA and the response regulator CbrB constitute a TCS that, together with the Crc system, controls carbon metabolic flow in Pseudomonas species, allowing the utilization of preferred carbon sources and establishing a carbon/nitrogen balance. In P. aeruginosa, CbrB activates the transcription of the CrcZ RNA. CrcZ is a regulatory RNA involved in carbon catabolite repression (CCR) and acts as a decoy for the Hfq RNA chaperone, and thus antagonizes the function of Hfq/Crc repressive complexes on catabolic genes. The CbrA/CbrB system has several functions besides the control of catabolic pathways. It is also involved in the regulation of swarming, biofilm formation, cytotoxicity and antibiotic resistance. In this study, the effect of CbrB on crcZ gene expression was assessed by Northern-blot analyses using a cbrB deletion mutant. In addition, the regulation of crcZ expression during anaerobiosis was studied using transcriptional reporter fusions. In addition, the possibility of harnessing CrcZ synthesis to increase antibiotic susceptibility of P. aeruginosa early stage biofilms was assessed. Two antibiotics, ciprofloxacin (CIP) cefepime (CEF), were tested in SCFManox medium in combination with preferred (succinate) and non-preferred (mannitol or lactamide) carbon sources. Our results verified the predicted CbrB, IHF, Anr, and σN consensus binding sites present in the crcZ promoter and showed that the corresponding transcription factors are necessary for transcriptional activation of CrcZ during anaerobiosis. Sub-inhibitory concentrations of CIP and CEF, when combined with lactamide, reduced biofilm formation under anoxic conditions. The minimal biofilm eradication concentration (MBEC) for CIP in SCFManox medium without addition of any C-source was 4 µg/ml; while the MBEC for CEF could not be determined.
description: In Pseudomonas aeruginosa sowie in anderen Pseudomonas spp. kontrolliert das Zwei-Komponenten System (TCS) CbrA/CbrB eine Reihe von metabolischen und verhaltensbezogenen Merkmalen, die für die Anpassung an wechselnde Umweltbedingungen benötigt werden. Die Histidinkinase CbrA und der Response Regulator CbrB bilden ein TCS, das gemeinsam mit dem Crc System den metabolischen Kohlenstofffluss in Pseudomonas spp. reguliert, wodurch die Verwendung bevorzugter Kohlenstoffquellen ermöglicht wird und eine Kohlenstoff/Stickstoff Balance etabliert wird. In P. aeruginosa aktiviert CbrB die Transkription der CrcZ RNA. CrcZ ist eine regulatorische RNA, die in die Kohlenstoff Katabolit Repression (CCR) involviert ist und dabei als Anagonist für das RNA Chaperon Hfq fungiert. Dadurch inhibiert CrcZ die Funktion des Hfq/Crc Komplexes als translatorischem Repressor von katabolischen Genen. Neben der Katabolitregulation hat das CbrA/CbrB System noch andere Funktionen, z.B. ist das CbrA/CbrB System beteiligt an der Regulation des Schwärmens, der Biofilm Bildung, Zytotoxizität und der Antibiotikaresistenz. In dieser Studie wurde der Effekt von CbrB auf die crcZ Expression durch Northernblots mittels cbrB Deletionsmutanten analysiert. Darüber hinaus wurde die Regulation der crcZ Expression während der Anaerobiose durch den Einsatz verschiedener Mutanten mit einem Reportergen untersucht. Weiters wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, die CrcZ Synthese auszunutzen um die Antibiotikasensitivität von P. aeruginosa in frühen Stadien der Biofilmbildung zu erhöhen. Die beiden Antibiotika Ciprofloxacin (CIP) und Cefepime (CEF) wurden in SCFManox Medium in Kombination mit bevorzugten (Succinat) und nicht-bevorzugten (Mannit oder Lactamid) Kohlenstoffquellen getestet. Unsere Ergebnisse verifizieren die vorhergesagten CbrB, IHF, Anr und σN Konsensus Bindestellen in der crcZ Promotorregion und zeigen, dass diese Faktoren essentiell sind für die transkriptionale Aktivierung von crcZ während der Anaerobiose. Sub-inhibitorische Konzentrationen von CIP und CEF in Verbindung mit Lactamid reduzierten die Biofilm Bildung unter anoxischen Bedingungen. Die minimale Eradikationskonzentration (MBEC) für CIP in SCFManox Medium ohne Zugabe von Kohlenstoffquellen ist 4 µg/ml, während die MBEC für CEF nicht bestimmt werden konnte.