Παρασκευή βιολειτουργικών ικριωμάτων από βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή για ιστική αναγέννηση και εκτίμηση της λειτουργικότητας τους
Creators: name: Κοτζιάπαση, Θεοδώρα Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2013
Subjects: Ικρίωμα
Ιστική αναγέννηση
Χιτοζάνη
Scaffold
Tissue engineering
Chitosan

description: Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματεύεται την ανάπτυξη νανοϊνωδών ικριωμάτων από βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή με τη μέθοδο Electrospray Deposition και λεπτών υμενίων με τη μέθοδο Περιστροφικής Εναπόθεσης (Spin Coating) στα πλαίσια του πεδίου της Αναγεννητικής Ιατρικής (Regenerative Medicine) και συγκεκριμένα για εφαρμογές Ιστομηχανικής (Tissue Engineering). Απώτερος σκοπός ήταν η δημιουργία ενός βιομιμητικού νανοϊνώδους περιβάλλοντος που να προσομοιάζει την Εξωκυττάρια Θεμέλια Ουσία (ECM) του αρθρικού χόνδρου κι επομένως να προάγει την πρόσφυση και πολλαπλασιασμό των χονδροκυττάρων. Τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι η Πολύ-καπρολακτόνη (Poly-caprolactone, PCL), ένα συνθετικό πολυμερές, η Χιτοζάνη (Chi), ένα φυσικό πολυμερές καθώς και το συμπολυμερές Chi/PCL σε διάφορες αναλογίες (80:20, 65:35, 50:50). Για την παρασκευή των ικριωμάτων δοκιμάστηκαν πολυμερικά διαλύματα σε διάφορες συγκεντρώσεις και με διάφορους διαλύτες, ώστε να εξευρεθεί ο βέλτιστος για κάθε πολυμερές. Διαπιστώθηκε πως απαραίτητη προϋπόθεση για τη δημιουργία του συμπολυμερούς είναι η χρήση κοινού διαλύτη (Trifluoroacetic acid/Dichloromethane TFA/DCM 80:20), στις βέλτιστες συγκεντρώσεις των επιμέρους πολυμερών (8% w/v Chi, 30% w/v PCL) και σαν βέλτιστη αναλογία το 50:50. Για την παρασκευή των λεπτών υμενίων χρησιμοποιήθηκε ένας κοινός διαλύτης για όλα τα πολυμερή, ώστε να είναι συγκρίσιμα μεταξύ τους. Ο δομικός/μορφολογικός/τοπογραφικός χαρακτηρισμός τόσο των ικριωμάτων όσο και των λεπτών υμενίων έγινε με την Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και την Σαρωτική Μικροσκοπία Ατομικών Δυνάμεων (AFM) και η αξιολόγηση της διαβροχής (wettability) τους με τη μέτρηση γωνίας διαβροχής (Contact Angle, CA). Δείγματα PCL γενικά παρουσίασαν υδρόφοβη συμπεριφορά, ιδιαίτερα τα ικριώματα, ενώ η χιτοζάνη υδρόφιλη. Η εκτίμηση της χημικής φύσης των λεπτών υμενίων, έγινε με τη Φασματοσκοπία Raman. Το φάσμα Raman του συμπολυμερούς, προκύπτει από τη συνεισφορά των επιμέρους φασμάτων των δύο πολυμερών, γεγονός που εξακριβώνει την παρουσία των δύο πολυμερών στο συμπολυμερές, παρότι υπήρξε διαχωρισμός φάσης στα διαλύματα. Τα ικριώματα και τα λεπτά υμένια μελετήθηκαν, επίσης, ως προς την βιολογική απόκριση τους σε κυτταρικές σειρές, ειδικότερα την L929s και μία ανθρώπινη σειρά χονδροκυττάρων. για τρία χρονικά διαστήματα (24hrs, 3 μέρες, 7 μέρες), κι έγινε ποσοτική εκτίμηση των κυττάρων που αναπτύχθηκαν με την εφαρμογή του ΜΤΤ πρωτόκολλου. Για την ολοκλήρωση της κυτταρικής μελέτης ελήφθησαν εικόνες με την Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και με το οπτικό μικροσκόπιο μετά από χρώση με κυανό του μεθυλενίου. Στις ομάδες των δειγμάτων, τη μεγαλύτερη κυτταρική βιωσιμότητα στα λεπτά υμένια παρουσίασε το PCL, ενώ στα ικριώματα η χιτοζάνη. Το PCL σε μορφή ικριώματος σημείωσε τη μικρότερη βιωσιμότητα, ενώ το συμπολυμερές είχε μια ενδιάμεση κυτταρική συμπεριφορά. Στα πολυμερικά νανοϊνώδη ικριώματα, φυσικά πολυμερή, όπως η χιτοζάνη επιδεικνύουν μεγαλύτερη βιοσυμβατότητα, καθότι αποτελούνται από δομικά στοιχεία που αναγνωρίζονται από τα κύτταρα. Δηλ, φαίνεται πως ο κύριος μηχανισμός κυτταρικής πρόσφυσης περιλαμβάνει τις απευθείας αλληλεπιδράσεις ινών-κυττάρων, λόγω της τραχύτητας και της αυξημένης διαθέσιμης περιοχής (αναλογία επιφάνειας/όγκου). Συμπεραίνεται πως η χημική σύνθεση, η τραχύτητα, η διαβροχή και η τοπογραφία των επιφανειών είναι καθοριστικοί παράγοντες για τη βιοσυμβατότητα ενός πολυμερικού υλικού καθότι καθορίζουν to μηχανισμό της κυτταρικής πρόσφυσης, κι επηρεάζουν την κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό και μετανάστευση.
description: The present diploma thesis deals with the development of biodegradable polymer nanofibrous scaffolds with Electrospray Deposition Method and the fabrication of thin films with Spin Coating Method within the framework of Regenerative Medicine and especially Tissue Engineering Applications. The ultimate goal was to create a biomimetic nanofibrous environment that simulates the extracellular matrix (ECM) of articular cartilage and thus promotes the adhesion and proliferation of chondrocytes. Poly-caprolactone (PCL), a synthetic polymer and Chitosan, a natural polymer were chosen for this study. Also, Chi/PCL copolymers in different ratios (80:20, 65:35, 50:50) were prepared. Various polymer solutions in different concentrations and solvents were tested in order to find the optimal solution for the fabrication of each polymer scaffold. It was found that a necessary condition for the creation of copolymer scaffolds is the use of a common solvent (Trifluoroacetic acid/Dichloromethane TFA/DCM 80:20) within the optimal concentrations of individual polymers and optimal ratio was found to be 50:50. On the contrary, a common solvent was used for thin films so as to be comparable between them. The structural/morphological/topographic characterization of scaffolds and thin films was conducted with Scanning Electron Microscope (SEM) and Atomic Force Microscopy (AFM) and Contact angle (CA) measurements were performed for wettability tests. PCL samples had a hydrophobic behavior, especially scaffolds, whereas, Chitosan was hydrophilic. The chemical nature of the thin films was evaluated by Raman spectroscopy. Τhe Raman spectrum of the copolymer resulted from the contribution of the individual spectra of the two polymers, which verifies the presence of the two polymers in the copolymer, although there was phase separation in the solutions. The scaffolds and thin films were also studied for their biocompatibility with cell lines, particularly, L929s cells and human chondrocytes for three intervals (24hrs, 3 days, 7 days). MTT assay was performed for the quantitative assessment of the cell-seeded scaffolds and thin films. To complete the cell studies, images were obtained by Scanning Electron Microscopy (SEM) and optical microscopy after staining with methylene blue. PCL in the group of thin films showed the highest cell viability, whereas, PCL nanofibrous scaffold the lowest. Chitosan in the group of nanofibrous scaffolds was the most favorable to cell proliferation. Chitosan/PCL co-polymer exhibited an intermediated cellular behavior. In nanofibrous polymeric scaffolds, natural polymers such as chitosan, show greater biocompatibility, since they are consisted of cell-recognized components. It seems that the main mechanism of cell adhesion includes direct fiber - cells interactions because of the roughness and increased available area (ratio of surface area / volume). It was concluded that surface chemical composition, roughness, wettability and topography are crucial factors, by determining biocompatibility of a polymeric material, since they govern the mechanism of cellular adhesion and impact cellular growth, proliferation, immigration.