title: Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von dL(3)mbt enthaltenden Komplexen in Drosophila melanogaster
title: Identification and functional characterisation of dL(3)mbt-containing complexes in Drosophila melanogaster
Creators: name: Meier, Karin
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2012
Subjects: Multi-protein complex
Repression
Genregulation
Multiproteinkomplex
Chromatin
Gene repression
Medizin, Gesundheit
Gene regulation

description: The Drosophila Lethal (3) malignant
      brain tumour (dL(3)mbt) protein is the founding member of the
      family of MBT domain proteins. The MBT domain is a ‘chromatin
      reader’, a module that specifically recognises mono- and
      di-methylated lysines within histone tails. In vitro studies
      suggest that these domains compact nucleosomes to form higher
      order chromatin structures. Importantly, MBT
      domain-containing proteins were previously shown to have
      critical functions in developmental processes, maintenance of
      transcriptional repression and tumour suppression.
      Accordingly, mutation of the gene that encodes the dL(3)mbt
      protein leads to the development of a malignant and invasive
      tumour in the brain of third instar larvae. Data from both
      Drosophila melanogaster and human implicate that MBT domain
      proteins cooperate with or are part of multi-subunit protein
      complexes. Therefore, the goal of this thesis was to identify
      novel interaction partners and protein complexes of dL(3)mbt.
      In the first part of this thesis, dL(3)mbt has been shown to
      associate with enzymatic histone deacetylase activity. dRpd3
      was identified as a histone deacetylase specifically
      associating with dL(3)mbt. Interestingly, the three MBT
      domains were sufficient to mediate interaction with dRpd3.
      This dL(3)mbt-dRpd3 complex has been linked to the maturation
      of newly synthesised chromatin. In the second part of this
      study, the multi-subunit complex LINT, consisting of
      dL(3)mbt, the co-repressor protein dCoREST and the novel
      protein dLint-1, was isolated by FLAG immunoaffinity
      purification and classical biochemical chromato-graphy. These
      factors interacted stably with each other in extracts from
      cell lines, embryos and larval brain. On polytene chromosomes
      the two LINT subunits dL(3)mbt and dLint-1 co-localised
      extensively at many binding sites. Subsequent microarray
      analysis led to the identification of hundreds of genes that
      were co-regulated by dL(3)mbt and dLint-1. Among these target
      genes was a subset of germline-specific genes that were
      stably repressed by all three LINT complex components.
      Strikingly, there is a significant overlap with genes that
      have been demonstrated to drive tumour growth in l(3)mbt
      mutant brains. Moreover, this study confirmed that the LINT
      complex bound directly to promoter regions of these target
      genes to repress transcription. A reporter gene assay
      revealed that the recruitment of dL(3)mbt and dLint-1 to the
      promoter of a luciferase gene was sufficient to repress its
      transcription and that maximal repression was dependent of
      the presence on all LINT subunits. The upregulation of LINT
      target genes was accompanied by changes in histone
      modifications, namely an increase in active and a loss of
      repressive histone modifications. However, since the LINT
      complex itself does not contain histone-modifying enzymes
      these changes are likely to occur co-transcriptionally.
      Collectively, the results of this thesis lead to a model, in
      which the LINT complex maintains transcriptional repression
      of germ cell-specific target genes by hindering access of RNA
      Polymerase II and other activating transcription factors to
      their promoters.
description: Das Drosophila Protein Lethal (3)
      malignant brain tumour (dL(3)mbt) war das Gründungsmitglied
      der Familie der MBT-Domänen Proteine. Die MBT-Domäne ist ein
      sogenannter “Chromatin-Leser“, ein Modul, das spezifisch an
      mono- und di-methylierte Lysine, die in Histon-Schwänzen
      lokalisiert sind, bindet. In vitro Studien legen nahe, dass
      diese Domänen Nukleosomen kompaktieren, um dichter gepacktes
      Chromatin zu erzeugen. Bedeutenderweise wurde im Vorfeld
      gezeigt, dass MBT-Domänen enthaltende Proteine entscheidende
      Funktionen in Entwicklungsprozessen, der Erhaltung von
      transkriptioneller Repression und Tumorsuppression
      übernehmen. Dementsprechend führt die Mutation des Gens, das
      für dL(3)mbt kodiert, zur Entwicklung eines malignen und
      invasiven Tumors im Larvengehirn des dritten Larvenstadiums.
      Daten sowohl aus Drosophila melanogaster als auch dem humanen
      System implizieren, dass MBT-Domänen Proteine im Allgemeinen
      Proteinkomplexen, die mehrere Unter-einheiten enthalten,
      angehören oder mit ihnen zusammenwirken. Daher war das Ziel
      dieser Arbeit neue Interaktionspartner und Proteinkomplexe
      von dL(3)mbt zu identifizieren. Im ersten Teil dieser Arbeit
      wurde gezeigt, dass dL(3)mbt mit enzymatischer
      Histon-deacetylaseaktivität assoziiert. dRpd3 wurde als eine
      Histondeacetylase identifiziert, die spezifisch mit dL(3)mbt
      interagiert. Interessanterweise waren die drei MBT-Domänen
      ausreichend, um die Bindung mit dRpd3 zu vermitteln. Die
      Funktion dieses dL(3)mbt-dRpd3-Komplexes wurde in
      Zusammenhang gebracht mit der „Reifung“ von neu
      synthetisiertem Chromatin. Im zweiten Teil dieser Studie
      wurde der Proteinkomplex LINT, der aus dL(3)mbt, dem
      Korepressor dCoREST und einem neu identifizierten Protein
      namens dLint-1 besteht, mittels
      FLAG-Immunoaffinitäts-Aufreinigung und klassischer
      Chromatographie isoliert. Diese Faktoren interagieren stabil
      miteinander in Extrakten, die von Zelllinien, Embryonen und
      larvalen Gehirnen gewonnen wurden. Auf Polytän-Chromosomen
      kolokalisierten die beiden LINT-Untereinheiten dL(3)mbt und
      dLint-1 in hohem Umfang an vielen Bindungsstellen.
      Anschließende Microarray-Analyse führte zur Identifizierung
      Hunderter Gene, die von dL(3)mbt und dLint-1 koreguliert
      wurden. Innerhalb dieser Zielgene war eine Untergruppe von
      Keimbahn-spezifischen Genen, die stabil von allen drei
      LINT-Komponenten reprimiert wurden. Auffallend ist, dass es
      einen signifikanten Überlapp mit Genen gibt, die das
      Tumorwachstum in l(3)mbt mutanten Gehirnen fördern.
      Weiterhin, bestätigte diese Arbeit, dass der LINT-Komplex
      direkt an die Promotoren dieser Zielgene bindet, um die
      Transkription zu unterbinden. Die Untersuchung eines
      Reportergen-Systems machte deutlich, dass die Rekrutierung
      von dL(3)mbt und dLint-1 an den Promotor eines Luciferasegens
      ausreicht, um dessen Transkription zu reprimieren und dass
      die maximale Repression abhängig ist von der Anwesenheit
      aller LINT-Untereinheiten. The Hochregulierung von
      LINT-Zielgenen wurde von Veränderungen von
      Histon-modifikationen begleitet, nämlich dem Anstieg von
      aktiven und dem Verlust von repressiven Histonmodifikationen.
      Allerdings ist es, da der LINT-Komplex keine
      Histon-modifizierenden Enzyme enthält, wahrscheinlich, dass
      diese Veränderungen kotranskriptionell auftreten.
      Zusammengefasst, führen die Resultate dieser Arbeit zu einem
      Modell, in welchem der LINT-Komplex die Repression von
      Keimzell-spezifischen Zielgenen aufrechterhält, indem er den
      Zugriff von RNA Polymerase II und anderen aktivierenden
      Trans-kriptionsfaktoren auf ihre Promotoren
      behindert.