Mechanismus des GrpE-induzierten Nukleotidaustausches des molekularen Chaperons DnaK aus Escherichia coli
Creators: name: Packschies, Lars
Publisher: name: Universität Dortmund
Year: 2000
Subjects: subject: FB 03
subject: ATPase-Reaktion
subject: Chaperon
subject: DnaK
subject: Elektronenspinresonanz
subject: Escherichia coli
subject: Fluoreszenzspektroskopie
subject: Gleichgewichtsanalyse
subject: GrpE
subject: Hitzeschockprotein
subject: Hsp70
subject: Kinetik
subject: Mechanismus
subject: Nukleotidaustausch
subject: Peptidbindung
subject: Peptide
subject: Spinmarkierung
subject: 540

description: DnaK aus E.coli gehört zur hochkonservierten Familie der "Hsp70"-Hitzeschockproteine. Hsp70 sind peptidsubstratbindende ATPasen mit einer Masse von etwa 70 kD, die in nahezu allen Organismen vorkommen und deren Funktionen in der Zelle vielfältig sind. So sind sie an der Stabilisierung naszierender Polypeptidketten oder denaturierter Proteine beteiligt, unterstützen den Proteintransport durch die Zelle und durch Membranen und führen Polypeptide dem proteolytischen Abbau zu. All diese Funktionen basieren auf der Fähigkeit, Peptidketten mit bestimmten, vornehmlich hydrophoben "Erkennungs"-sequenzen zu erkennen und zu binden. Derartige Motive sind üblicherweise im Zentrum von nativen Proteinen verborgen und werden nur in Folge von (streßbedingten) Entfaltungen oder während der Proteinbiosynthese präsentiert. Die Affinität zu diesen Substraten ist vom Nukleotidzustand (ADP vs. ATP) abhängig. DnaK·ATP bindet diese mit niedriger, DnaK·ADP mit hoher Affinität. Das E.coli-DnaK-System besteht aus drei Proteinen. Dem Hsp70 selbst (DnaK) sowie zwei sogenannten Cochaperonen, GrpE und DnaJ. DnaJ beschleunigt die ansonsten sehr langsame ATPase-Reaktion von DnaK mindestens 200-fach, während GrpE den Nukleotidaustausch (ADP gegen ATP) unterstützt. Beide Cochaperone greifen dadurch regulierend in den ATPase-Zyklus von DnaK ein. Ziele der vorliegenden Arbeit waren die mechanistische Charakterisierung des GrpE-induzierten Nukleotidaustausches (ADP vs. ATP) des molekularen Chaperons DnaK aus E.coli sowie die Aufklärung der Funktion der ATP-Hydrolyse durch DnaK. Detaillierte kinetische Untersuchungen des ATP-Bindungsmechanismus ergaben, daß DnaK wahrscheinlich in zwei Formen (einem Monomer und einem Dimer) vorliegt. Die Einstellung dieses Monomer-/Dimer-Gleichgewichtes erfolgt über mehrere Stunden. ATP wird durch beide Formen in mindestens zwei Schritten gebunden, allerdings unterscheiden sich die kinetischen Konstanten für das Monomer und das Dimer. Die mutmaßlich dimere Form bindet ATP ähnlich wie ein DnaK·Substratkomplex, wonach eine besondere Eigenschaft des Dimers zu sein scheint, daß zwei DnaK-Moleküle sich gegenseitig als Substrat zu binden vermögen. Nachfolgend wurde der molekulare Mechanismus des GrpE-induzierten Nukleotidaustausches untersucht. Als spektrale Sonde diente hierzu das fluoreszierende ADP-Analog MABA-ADP. Es zeigte sich, daß GrpE eine offene Form von DnaK stabilisiert, wodurch die Affinität von MABA-ADP 200-fach erniedrigt wird. Geschwindigkeitsbestimmend für den stimulierten Nukleotidaustausch ist eine Konformationsänderung von DnaK, welche als Öffnung der nukleotidbindenden Tasche nach Bindung von GrpE an den DnaK·MABA-ADP-Komplex interpretiert wurde. Die Existenz eines ternären Komplexes aus DnaK, MABA-ADP und GrpE konnte anhand von Fluoreszenztitrationen nachgewiesen werden. Durch die GrpE-induzierte Öffnung der DnaK-Nukleotidbindungstasche erfahren gebundene Nukleotide wahrscheinlich eine Zugkraft. Anschließend löst sich das Nukleotid zunächst an der schwächer gebundenen Seite ab (Phosphatreste vs. Nukleosid). Dieser Mechanismus wurde aufgrund des Vergleiches verschiedener Nukleotide (MgADP vs. MgATP, Mg2'dATP vs. MgATP, Mg2'dATP sowie MgADP vs. ADP) auf Basis der Analyse nach "unterscheidenden und nichtunterscheidenden Wechselwirkungen" postuliert. Es konnte eindeutig gezeigt werden, daß das Magnesiumion die DnaK-Nukleotidinteraktion stabilisiert, jedoch nicht essentiell für die Funktion des Nukleotidaustauschfaktors ist. Weiterhin wurde die Funktion der ATP-Hydrolyse durch DnaK untersucht. Im einfachsten Fall wird die ATPase-Reaktion von DnaK genutzt, um DnaK zwischen zwei Zuständen unterschiedlicher Substrataffinität umzuschalten. Andererseits ist jedoch auch die Möglichkeit denkbar, daß die chemische Energie von ATP zur Verrichtung von Arbeit am gebundenen Substrat in Form einer Strukturänderung genutzt wird. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der ESR-Spektroskopie verschiedene, zweifach spinmarkierte Peptide daraufhin untersucht, ob eine Abstandsbestimmung (Bestimmung des Interspinabstands) im DnaK-gebundenen Zustand möglich ist. Drei der untersuchten DnaK-Substrate erlauben dies. Durch die Identifizierung geeigneter, zweifach spinmarkierter DnaK-Substrate wurde die notwendige Grundlage entwickelt, um diese Fragestellungen mit Hilfe zeitauflösender ESR-Techniken zu untersuchen. Wenn DnaK an den gebundenen Substraten Strukturarbeit leistet, könnten die resultierenden Abstandsänderungen der Spinsonden vor, während oder nach der ATP-Hydrolyse durch DnaK zeitaufgelöst detektiert werden.