The Hydantoinase Process - Toward β-Amino Acids and Cell-free Reaction Systems
Creators: name: Slomka, Christin
Publisher: name: Karlsruhe
Year: 2017
Subjects: amino acids
enzyme catalysis
hydrolases
enantioselectivity
hydantoinase process
protein purification
enzyme immobilization
magnetic beads
dihydrouracil

description: Nicht-kanonische α-Aminosäuren spielen unter anderem in der pharmazeutischen Industrie bei der Synthese von Antibiotika eine bedeutende Rolle. Als wichtiges Beispiel sind hierbei D-Phenylglycin oder substitutierte D-Phenylglycine zu nennen, welche Bestandteile von Penicillinen und Cephalosporinen sein können. β-Aminosäuren sind aufgrund ihrer besonderen strukturellen Eigenschaften ebenfalls von großer Bedeutung für pharmazeutische Produkte wie Peptidmimetika, Antibiotika oder biologisch aktive Sekundärmetabolite. Der Hydantoinase-Prozess dient der Herstellung enantiomerenreiner α-Aminosäuren mittels dynamisch kinetischer Resolution und wird bereits erfolgreich industriell angewendet. Basierend darauf wurde ein modifizierter Hydantoinase-Prozess zur Synthese optisch reiner β-Aminosäuren untersucht.
Im Hinblick auf die Synthese einer neuen β-Aminosäure mithilfe des modifizierten Hydantoinase-Prozesses wurde in dieser Arbeit ein neu synthetisiertes Substrat, 6-(4-nitrophenyl)dihydro-pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione (pNO2PheDU), untersucht. Es wurde eine achirale HPLC-Analytik zum qualitativen und quantitativen Nachweis des Substrates sowie der daraus resultierenden N-Carbamoyl-β-Aminosäure, NCarbpNO2βPhe, etabliert. Des Weiteren wurde eine chirale HPLC-Analytik zum Nachweis beider Entantiomere der N-Carbamoyl-β-Aminosäure entwickelt. So konnte mittels Ganzzellbiotransformationen neben der erfolgreichen enzymatischen Hydrolyse von pNO2PheDU durch die rekombinant exprimierte Hydantoinase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 auch ein (S)-selektiver Umsatz des neuen Substrates durch dieses Enzym nachgewiesen werden. Dies macht pNO2PheDU zu einem vielversprechenden Substrat für die Synthese der Aminosäure para-nitro-β-Phenylalanin. Bei der Analyse dieser Stoffe mittels Dünnschichtchromatographie konnte zum einen gezeigt werden, dass α-Aminosäurederivate durch Ninhydrin- und Ehrlichs-Reagenz unterschiedlich derivatisiert werden als β-Aminosäurederivate und zum anderen, dass die synthetisierten pNO2-Derivate wiederum anders derivatisiert werden als β-Aminosäuren ohne pNO2-Rest.
In industriellen Anwendungen des Hydantoinase-Prozesses zur Herstellung optisch reiner α-Aminosäuren finden bisher hauptsächlich Ganzzellkatalysatoren Einsatz. Da diese jedoch auch Nachteile wie intrazelluläre Abbaureaktionen, Transportlimitierungen und niedrige Substratlöslichkeit mit sich bringen, wurde der Prozess in dieser Arbeit bezüglich einer Einsetzbarkeit in zellfreien Reaktionssystemen untersucht. Hierfür wurde die Hydantoinase aus A. crystallopoietes DSM 20117 zunächst mit einem His-tag versehen und außerdem wurde eine Codon-optimierte Variante dieses Enzyms mit C-terminalen His-tag sowie einem N-terminalen SBP-tag zur Aufreinigung und Immobilisierung synthetisiert.
Um anschließend die Expression funktionaler Hydantoinase in löslicher Form zu verbessern, wurde zunächst die Kultivierung und Expression unter Hypoxie untersucht. Dies resultierte in deutlich erhöhten spezifischen Aktivitäten für die Hydantoinase aufgrund einer verbesserten Expression. Außerdem konnte eine erfolgreiche Codon-Optimierung nachgewiesen werden, da die nicht optimierte Hydantoinase in jedem Fall geringere spezifische Aktivitäten aufzeigte als die optimierte.
Zur weiteren Verbesserung der Expression der Hydantoinase wurden verschiedene Parameter zur Kultivierung und Induktion mittels High-Throughput Screening in einem Mikrobioreaktionssystem (BioLector®) untersucht. Hierbei wies die Codon-optimierte Hydantoinase ebenfalls für jede untersuchte Kultivierungsstrategie höhere spezifische Aktivitäten auf als das nicht optimierte Enzym, was auf höhere Expressionsraten zurückzuführen ist. Die Zugabe von 3 % Ethanol zum Kultivierungsmedium führte zu einer weiteren Verbesserung der Expression sowie Erhöhung der spezifischen Aktivität der Codon-optimierten Hydantoinase. Untersuchungen der Expression ohne Induktion während der Kultivierung zeigten eine sehr hohe Basalaktivität des T7-Promotors auf, die daraus resultierende spezifische Aktivität war jedoch niedriger als bei induzierten Kulturen. Eine Verringerung des pH-Wertes des Mediums ergab keine signifikante Verbesserung der Expression oder Aktivität der Hydantoinase. Aus dem High-Throughput Screening ging die Kultivierung bei pH 7 mit 3 % Ethanol und Induktion mit 1 mM IPTG als beste Variante zur Expression aktiver Hydantoinase hervor.
Zusätzlich wurde die Coexpression der codon-optimierten Hydantoinase mit fünf verschiedenen Sets von Chaperonen zur verbesserten Faltung des Zielproteins untersucht. Ein erneutes Screening zeigte, dass keines der Chaperon-Sets eine Verbesserung der Expression erzielen konnte, wodurch auch keine erhöhte spezifische Aktivität erreicht wurde. Somit wurde aufgezeigt, dass die Überexpression von Chaperonen nicht nur Vorteile, sondern eventuell auch Nachteile, wie zum Beispiel eine erhöhte Proteaseaktivität oder eine Inhibierung der Expression natürlich vorkommender Chaperone mit sich bringen kann.
Um ein zellfreies Reaktionssystem für den Hydantoinase-Prozess zu ermöglichen, wurden die Hydantoinase sowie die Carbamoylase aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 über den His-tag mittels Ni-Sepharose Beads aufgereinigt. Das Protokoll konnte optimiert und somit die Aufreinigung für beide Enzyme erfolgreich durchgeführt werden.
Zur Immobilisierung beider Enzyme wurden funktionalisierte Magnetbeads verwendet, die ebenfalls über Metallionenaffinität den His-tag des jeweiligen Enzyms binden können. Nach der Optimierung einiger Parameter, wie beispielsweise der Regenerierung der Magnetbeads, konnte die Immobilisierung für beide Enzyme erfolgreich durchgeführt werden. Es wurden deutlich höhere spezifische Aktivitäten für die immobilisierten Enzyme im Vergleich zu den isolierten Enzymen erzielt. Des Weiteren wurden die funktionalisierten Magnetbeads zur Aufreinigung der Carbamoylase sowie der Hydantoinase über deren His-tag verwendet. Diese Methode führte zu deutlich höheren spezifischen Aktivitäten im Vergleich zur Aufreinigung der Enzyme mittels Ni-Sepharose Beads. Somit konnte eine schnelle und einfach durchzuführende Methode zur direkten Aufreinigung und Immobilisierung der Enzyme aus dem Rohextrakt etabliert werden. Durch eine niedrige Anzahl an Prozessschritten können Verluste an Aktivität und Ausbeute der Enzyme verhindert werden.
Des Weiteren wurde für die immobilisierte Hydantoinase erfolgreich der Umsatz von Phenylhydantoin, Benzylhydantoin und Hydroxymethylhydantoin gezeigt. Mit der immobilisierten Carbamoylase konnten die Substrate N-Carbamoylphenylglycin, N-Carbamoylphenylalanin sowie N-Carbamoylserin ebenfalls erfolgreich zu den entsprechenden Aminosäuren umgesetzt werden. Somit wurden die
Voraussetzungen zur Synthese verschiedener α-Aminosäuren durch den Einsatz des Hydantoinase-Prozesses im zellfreien Reaktionssystem geschaffen.