title: Progenitors from the postnatal and adult mammalian retina-neurogenic competence and plasticity
Creators: name: Engelhardt, Maren
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2005
Subjects: subject: Netzhaut , Stammzelle , Zelldifferenzierung , Vorläuferzelle , Plastizität , , Retina , stem cell , differentiation , progenitor , plasticity
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: The mammalian retina develops from stem cells that are of neuroectodermal origin and derive from bilateral evaginations of the neuroepithelium, the optic vesicles. In rats, the differentiation of the six neuronal and the one glial cell types is terminated around postnatal day 12. The retina of adult mammals is a non-neurogenic region and the diseased retina is devoid of any spontaneous regeneration, while in poikilothermic vertebrates, cells at the ciliary margin of the eye proliferate throughout the life of the animals and generate new retinal cells that are integrated into functional retinal circuits. This knowledge initialized the search for such pools of stem and progenitor cells in the mammalian ciliary body (CB) from which neural stem cells (NSCs) have been isolated and characterized. These cells are capable to differentiate into glia and neurons, including retina-specific cell types like photoreceptors. In course of the present study, cell culture protocols for NSCs from the neurogenic regions subventricular zone (SVZ) and hippocampus (HC) of the adult CNS were optimized. Furthermore, optimal conditions for differentiation of SVZ and HC cells into the three major cell classes of the CNS, namely neurons, astroglia and oligodendroglia, were established. Artificial constitutive expression of Notch1 in adult SVZ and HC derived stem cells resulted in upregulation of glial differentiation and downregulation of neuronal differentiation, suggesting that adult CNS derived stem cells are subject to plasticity in terms of their fate determination. Therefore, these cells could provide a promising source for cellular replacement strategies in neurodegenerative models. The results of the NSC culture optimization were the basis for analyses of retinal progenitor cells. The presence and neurogenic potential of mammalian progenitors of the postnatal sensory retina were analyzed by immunocytochemistry and RT-PCR. The results demonstrate that postnatal rodent retina derived cells proliferate in vitro and display some characteristics of NSCs, such as the expression of specific progenitor markers or the ability to incorporate BrdU. On the other hand, self-renewal as determined by clonal assays was not observed, indicating that postnatal cells are restricted in their stem cell potential. Furthermore, postnatal retinal cells grown under the optimized differentiation condition only differentiated along two neural lineages, neurons and astroglia. Stem cell capacities have been demonstrated for pigmented cells of the adult mammalian CB. RPE based neuronal regeneration in adult mammals has not been reported so far. This is surprising, since RPE cells are of neuroectodermal origin. A comparative study of adult rodent CB and RPE cells revealed that both cell types share characteristics, which are reminiscent of NSCs. Growth as neurospheres, proliferation and self-renewal capacities were all comparable to NSCs. Furthermore, both cell types expressed a set of specific retinal stem and progenitor cell markers, such as the proneural homeobox transcription factor Pax6 or the bHLH transcription factor neuroD. Differentiation in the optimized media indicated that CB and RPE cells can differentiate along neuronal and glial lineages, but are devoid of oligodendroglial differentiation. Trans- or de-differentiation processes induce changes in phenotypes and expression profiles of CB and RPE cells. Therefore, one further focus of this study was the analysis of adult mammalian RPE cells with respect to de- and trans-differentiation under the optimized conditions. Differentiated RPE cells acquired neuronal and glial phenotypes in vitro, although the RPE is devoid of such phenotypes in vivo. Furthermore, detection of doublecortin, a transient marker for neuronal precursors, identified de-differentiating RPE cells that not only expressed beta III tubulin, but also acquired a neuronal morphology. Similar results were also obtained for human derived RPE cells. The presented results eventually aim at the comprehension of the basic biological mechanisms, which regulate the restrictions that stem or progenitor cells experience during cessation of development in the mammalian retina. An intriguing idea is to provide stimuli that alter the gene expression from a quiescent somatic cell in the adult retina towards a retinal stem cell and activate its developmental program to generate new neurons in a diseased or injured retina.
description: Die Säugerretina entwickelt sich aus Stammzellen neuroektodermalen Ursprungs und entsteht aus bilateralen Einstülpungen des Neuroepithels, den optischen Vesikeln. In der Ratte ist die Differenzierung der sechs neuronalen und der einen glialen Zellklasse der Retina nach dem Postnataltag 12 abgeschlossen. Die Retina adulter Säuger ist ein nicht-neurogenes Gewebe und die erkrankte Retina ist nicht in der Lage, spontan zu regenerieren. Im Gegensatz dazu proliferieren in poikilothermen Vertebraten Zellen des Ziliarkörpers über die gesamte Lebensdauer des Tieres. Retinale Zellen werden generiert und in das bereits bestehende Netzwerk integriert. Dieses Wissen hat dazu veranlasst, ähnliche Vorkommen proliferierender Stamm-oder Vorläuferzellen im Ziliarkörper von Säugern zu suchen. So wurden Stammzellen im Ziliarkörper der adulten Säugerretina gefunden, isoliert und charakterisiert. Dabei wurde deutlich, dass diese Zellen zu Neuronen und Gliazellen differenzieren können und auch retina-spezifische Zelltypen, wie z.B. Photorezeptoren, generieren können. Im Verlauf dieser Studie wurden Zellkulturbedingungen für neurale Stammzellen aus dem adulten ZNS (subventrikuläre Zone (SVZ) und Hippocampus (HC)) optimiert. Zusätzlich wurden optimale Differenzierungsbedingunen für SVZ und HC Stammzellen entwickelt, die eine Differenzierung der Zellen entlang der drei Hauptzellklassen des ZNS (Neurone, Astroglia und Oligodendroglia) ermöglichen. Die konstitutive Expression von Notch1 in SVZ und HC Zellen, vermittelt durch retrovirale Infektion des Zellen, führte zu einer vermehrten glialen Differenzierung bei gleichzeitigem Rückgang der neuronalen Differenzierung. Dies lässt darauf schliessen, dass adulte Stammzellen des ZNS plastischen Veränderung im Bezug auf ihre Phänotypspezifizierung unterliegen. Daher könnten diese modifizierten Zellen eine interessante Möglichkeit zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen sein. Die Ergebnisse der Zellkulturstudie waren der Ausgangspunkt für die Analyse der retinalen Vorläuferzellen. Das Vorkommen und neurogene Potential postnataler Vorläuferzellen aus der Säugerretina wurde mittels immunzytochemischer Färbungen und RT-PCR analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass postnatale retinale Zellen aus dem Nager in vitro proliferieren und einige Gemeinsamkeiten mit neuralen Stammzellen des ZNS haben, wie z.B. die Expression spezifischer Vorläufermarker oder der Fähigkeit, BrdU zu inkorporieren. Auf der anderen Seite sind postnatale Vorläuferzellen aber nicht in der Lage, klonal zu expandieren, was ein Anzeichen für limitiertes Stammzellpotential ist. Weiterhin können postnatale Vorläuferzellen unter Differenzierungsbedingungen nur in zwei der drei neuralen Zellklassen differenzieren (Neurone und Astroglia). Stammzell-Eigenschaften wurden für adulte Ziliarkörperzellen (CB) aus der Säugerretina nachgewiesen. RPE-basierte Regeneration in adulten Säugern ist bis heute noch nicht nachgewiesen worden. Dies Überrascht vor dem Hintergrund, daß RPE Zellen neuroektodermalen Ursprungs sind. Eine vergleichende Studie von adulten CB Zellen und RPE Zellen zeigte, dass beide Zelltypen Charakteristika mit neuralen Stammzellen teilen. So wurde für CB und RPE Wachstum in Neurospären, klonale Expansion sowie die Expression Vorläufer-spezifischer Marker wie dem Homeobox Gen Pax6 oder dem bHLH Transkriptionsfaktor NeuroD nachgewiesen. Unter Differenzierungsbedingunen konnten sowohl neuronale Marker als auch gliale Marker in CB und RPE Kulturen gefunden werden, jedoch keine oligodendrogliale Marker. Trans- bzw. De-differenzierungsprozesse verursachen phänotypische Veränderungen und alternieren das Expressionsprofil der Zellen. Aus diesem Grund war die Analyse von RPE Zellen vor diesem Hintergrund ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit. Differenzierte RPE Zellen exprimierten neuronale und gliale Marker in vitro obwohl das RPE in vivo keine dieser Marker exprimieren kann. Zudem konnte auch Doublecortin nachgewiesen werden, ein transient exprimierter Marker für neuronale Vorläufer. Die Expression ging einher mit einer morphologische Veränderung in den RPE Zellen. Ähnliche Resultate wurden ebenfalls für humane RPE Zellen gefunden. Ein Kernstück der vorliegenden Arbeit war demnach das Verständnis der biologischen Grundlagen retinaler Stamm- oder Vorläuferzellen der postnatalen Periode und des adulten Säugers. Die Analyse der molekularen Mechanismen, die während der Entwicklung die Stammzellkapazitäten von retinalen Zellen einschränken, ist von größtem Interesse. Eine interessante Idee ist die Bereitstellung entsprechender Stimuli, die eine ruhende Stammzelle der adulten Retina so beeinflusst, dass es zu einer Neuauflage des Entwicklungsprogramms dieser Zelle kommt und somit die Generierung neuer Neurone in einer erkrankten oder verletzten Retina möglich würde.