title: Role of the cytosolic monothiol glutaredoxins in iron metabolism of eukaryotes
title: Rolle der cytosolischen Glutaredoxine im zellulären Eisenmetabolismus in Eukaryoten
Creators: name: Hoffmann, Bastian
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2013
Subjects: Eisen
Ironmetabolism, Ironhomöostasis
Saccharomyces cerevisiaem
Eisenmetabolismus, Eisenhomöostase
Biowissenschaften, Biologie
Monothiol Glutaredoxine
Metabolismus, Stoffwechsel
monothiol glutaredoxins. Saccharomyces cerevisiae

description: Glutaredoxins are found in all
      phylogenetic kingdoms of life. This protein family includes
      dithiol-glutaredoxins that contain a CPYC active site and are
      involved in oxidative stress protection. Single domain
      glutaredoxins with a CGFS active site play crucial roles in
      the maturation of cellular iron-sulfur (Fe/S) proteins and
      are usually localized in mitochondria or chloroplasts.
      Multidomain monothiol glutaredoxins are fusion proteins that
      consist of an N-terminal thioredoxin domain and one or more
      C-terminal glutaredoxin domain(s). This subgroup of
      glutaredoxins is found in the cytosol and nucleus of nearly
      all higher eukaryotes. In baker’s yeast S. cerevisiae, the
      multidomain glutaredoxins Grx3 and Grx4 bind Fe/S cofactors
      and play a crucial role in the maturation of all classes of
      iron-containing proteins and the regulation of cellular iron
      homeostasis. The aim of this work was a refined functional
      characterization of the multidomain monothiol glutaredoxins
      and was centered on two major questions. (1) Which structural
      differences enable the otherwise similar glutaredoxins to
      each perform a specific function? (2) Is the described
      function of the S. cerevisiae multidomain glutaredoxins in
      the iron metabolism conserved in higher eukaryotes? The first
      question was followed by the analysis of the effects of
      site-directed mutations on the functionality of Grx4 in S.
      cerevisiae. The analysis showed that a dithiol, instead of
      the monthiol active site in Grx4 causes a strong decrease in
      iron binding and a moderate loss of function in vivo. In
      contrast to the single domain glutaredoxins, a prolin in the
      active site of Grx4 is fully compatible with the binding of a
      Fe/S cluster. Furthermore, the thioredoxin domain is
      essential for function. Most likely, this domain serves as a
      binding platform for other proteins. Yeast Grx3 and Grx4
      interact with the iron-responsive transcription factor Aft1
      and inactivate Aft1 under iron sufficiency. Here it could be
      shown that the regulation of Aft1 is incompatible with a
      dithiol active site of Grx4 and that the C terminus of Grx4
      serves as the binding site for Aft1. Complex formation
      between Grx4 and Aft1 is not iron-dependent and increased
      when no Fe/S cluster is bound to Grx4. Hence, only the
      inactivation of Aft1, not the binding to Grx4 depends on the
      Fe/S cluster on Grx4.Collectively, this work identified
      structural requirements for the function of the multidomain
      monthiol glutaredoxins in the cellular iron metabolism of S.
      cerevisiae. To answer the second question, the effects of
      siRNA-mediated depletion of Grx3 in HeLa cells were analysed.
      Similar to yeast cells, Grx3-depleted HeLa cells showed
      defects in the assembly of cytosolic and nuclear Fe/S
      proteins. A defect in the maturation of the “Iron Regulatory
      Protein 1” (IRP1) caused the degradation of the apo-form of
      this protein and the subsequent effects on the cellular iron
      metabolism in Grx3-depleted HeLa cells. In contrast to yeast
      cells, Grx3 depletion in HeLa cells showed no effects on the
      assembly of mitochondrial Fe/S Cluster- or heme-depending
      enzymes. Furthermore, despite an altered iron metabolism, the
      transcriptome of Grx3-depleted HeLa cells showed no
      alterations in the regulation of typical iron-responsive
      genes that have a function in mitochondria or under hypoxic
      conditions. This observation and the missing effects on the
      mitochondrial iron-depending enzymes are conspicuous
      differences to yeast. Collectively, this work confirms a
      conserved function of Grx3 regarding the biogenesis of
      cytosolic Fe/S proteins, but not for mitochondrial
      iron-depending proteins in higher eukaryotes.
description: Glutaredoxine kommen in allen
      phylogenetischen Reichen der Lebewesen vor. Zu dieser
      Proteinfamilie gehören Dithiol-Glutaredoxine, die ein CPYC
      Motiv im aktiven Zentrum aufweisen und eine wichtige Rolle
      bei der Aufrechterhaltung des zellulären Redoxpotentials
      spielen. Einzeldomänen Monothiol-Glutaredoxine mit einem CGFS
      Motiv im aktiven Zentrum spielen eine zentrale Funktion bei
      der Maturierung zellulärer Eisen-Schwefel (Fe/S) Proteine und
      sind üblicherweise in den Mitochondrien und Chloroplasten
      lokalisiert. Multidomänen Monothiol-Glutaredoxine sind
      Fusionsproteine, die aus einer N-terminalen Thioredoxindomäne
      und einer oder mehreren C-terminalen Monothiol
      Glutaredoxindomäne(n) bestehen. Diese Unterfamilie der
      Glutaredoxine kommt im Cytosol und Nukleus fast aller
      Eukaryoten vor. In der Bäckerhefe S. cerevisiae binden die
      Multidomänen-Glutaredoxine Grx3 und Grx4 einen Fe/S-Kofaktor
      und spielen eine essenzielle Rolle bei der Maturierung aller
      Klassen Eisen-haltiger Proteine und der Regulation der
      zellulären Eisenhomöostase. Zentrales Ziel der Arbeit war die
      bessere funktionelle Charakterisierung der Multidomänen
      Monothiol-Glutaredoxine. Zwei zentrale Fragen standen hierbei
      im Vordergrund: (1) Welche strukturellen Unterschiede
      befähigen die ansonsten sehr ähnlichen Glutaredoxine dazu,
      jeweils spezifische Funktionen zu übernehmen? (2) In wie weit
      ist die für S. cerevisiae beschriebene Funktion der
      Multidomänen Glutaredoxine im Eisenmetabolismus höherer
      Eukaryoten konserviert? Der ersten Frage wurde durch
      Untersuchungen der Auswirkungen gezielter Mutationen auf die
      Funktionalität von Grx4 in S. cerevisiae nachgegangen. Diese
      Analyse zeigte, dass ein Dithiol-Motiv anstelle des Monothiol
      Motivs im aktiven Zentrum von Grx4 zu einer stark reduzierten
      Fe/S Clusterbindung und einem moderaten Funktionsverlust
      dieses Proteins in vivo führt. Hingegen ist ein Prolin im
      aktiven Zentrum von Grx4 im Gegensatz zu den Einzeldomänen
      Glutaredoxinen vollkommen kompatibel mit der Bindung eines
      Fe/S Clusters. Darüber hinaus ist die Thioredoxindomäne von
      Grx4 absolut essenziell für die Funktion. Wahrscheinlich
      fungiert diese Domäne als Bindestelle für andere Proteine.
      Grx3 und Grx4 interagieren direkt mit dem Eisen-regulierten
      Transkriptionsfaktor Aft1 und inaktivieren Aft1 bei
      ausreichend verfügbarem Eisen. Es konnte gezeigt werden, dass
      die Regulation von Aft1 inkompatibel mit einem Dithiol-Motiv
      im aktiven Zentrum von Grx4 ist und dass Aft1 mit dem C
      Terminus von Grx4 interagiert. Diese Interaktion ist nicht
      Eisen-abhängig und ist erhöht, wenn Grx4 keinen Fe/S Cluster
      gebunden hat. Somit ist nur die Inaktivierung von Aft1 direkt
      vom Fe/S Cluster von Grx4 abhängig. Insgesamt zeigte diese
      Arbeit wichtige strukturelle Voraussetzungen für die Funktion
      der Multidomänen Glutaredoxine im Eisenmetabolismus von S.
      cerevisiae auf. Zur Beantwortung der zweiten Frage wurden die
      Auswirkungen der siRNA-vermittelten Depletion von Grx3 in
      HeLa Zellen untersucht. Grx3-depletierte HeLa Zellen zeigten
      vergleichbar mit Hefe-Zellen Defekte in der Assemblierung von
      Fe/S Proteinen des Cytosols und des Zellkerns. Ein Defekt in
      der Reifung des „Iron Regulatory Protein 1“ (IRP1) führte zum
      Abbau der Apo-Form dieses Proteins und entsprechenden
      Auswirkungen auf den Eisenmetabolismus. Im Gegensatz zu
      Hefe-Zellen zeigten Grx3-depletierte HeLa Zellen keinen
      Effekt auf die Maturierung mitochondrialer Fe/S Cluster- oder
      Häm-haltiger Proteine. Trotz des geänderten Eisenmetabolismus
      wies das Transkriptom von Grx3-depletierten HeLa Zellen keine
      geänderte Regulation typischer Eisen-regulierter Gene auf.
      Dazu gehören z.B. Gene, die eine Funktion in den
      Mitochondrien sowie unter hypoxischen Bedingungen ausüben.
      Dies und die fehlenden Effekte auf die mitochondrialen
      Eisen-abhängigen Proteine sind auffällige Unterschiede zu der
      Hefe. Zusammenfassend konnte eine in allen Eukaryoten
      konservierte Funktion von Grx3 hinsichtlich der Biogenese von
      cytosolischen, nicht aber mitochondrialen Fe/S Proteinen
      nachgewiesen werden.