title: Konstruktion synthetischer sekundärer Chromosomen zur Charakterisierung von DNA-Reparatur und Segregation in Escherichia coli
title: Konstruktion synthetischer sekundärer Chromosomen zur Charakterisierung von DNA-Reparatur und Segregation in Escherichia coli
title: Construction of synthetic secondary chromosomes for characterization of DNA repair and segregation in Escherichia coli
Creators: name: Schindler, Daniel
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2016
Subjects: Vibrio cholerae
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie
Replikation
synthetic chromosomes
Escherichia coli , Vibrio cholerae
DNS-Reparatur
Escherichia coli
Synthetische Biologie
DNA repair
synthetic biology

description: Alle Funktionen einer jeden Zelle
      sind im Genom kodiert, dieses wird in jeder Zellteilung –
      egal ob ein oder mehrere Chromosomen – gleich auf die
      Tochterzellen verteilt. Die Integrität des Genoms ist für das
      Überleben eines jeden Organismus essentiell. Durch die
      Methoden der Synthetischen Biologie werden umfangreiche
      Veränderungen an Genomen durchgeführt bzw. ganze Chromosomen
      synthetisiert, wobei der Fokus meist auf den kodierenden
      Sequenzen liegt. Chromosomen sind aber mehr als eine
      Aneinanderreihung von Genen. Chromosomen benötigen Systeme
      zur Replikation, Segregation, Organisation und Reparatur, was
      häufig über Wechselwirkungen von Proteinen mit
      DNA-Sequenzmotiven geschieht. Die vorliegende Arbeit studiert
      solche, als Chromosome Maintenance System bezeichnete
      Prozesse anhand von synthetischen sekundären Chromosomen in
      E. coli. Können die resultierenden Ergebnisse zum Verständnis
      der DNA-Replikation in Bakterien beitragen? Das im Rahmen
      dieser Arbeit etablierte synthetische sekundäre Chromosom
      (synVicII) repliziert in E. coli wie das sekundäre Chromosom
      in V. cholerae, auf dem es basiert. Das Design wurde nach
      einer initialen Charakterisierung weiter optimiert. Ein
      entscheidender Schritt war die Herstellung einer
      Kompatibilität von synVicII mit dem hierarchischen
      DNA-Assemblierungssystem MoClo. Parallel wurde eine
      Vorgehensweise etabliert, um hochvariable, lange
      DNA-Sequenzen zu generieren, in denen benutzerdefinierte
      DNA-Sequenzen ausgeschlossen werden können. Die Insertion
      dieser DNA-Sequenzen in synVicII ermöglicht es, synthetische
      sekundäre Chromosomen mit einer Größe von 100 kb zu
      konstruieren. Dadurch konnte im Rahmen der vorliegenden
      Arbeit erstmals die Interaktion der DNA-Segregation und DNA
      mismatch Reparatur in vivo durch ein Set von drei
      synthetischen sekundären Chromosomen analysiert werden. Beide
      Prozesse sind auf das Vorhandensein hemi-methylierter
      GATC-Sequenzen angewiesen und die Arbeit zeigt, dass durch
      eine strukturierte GATC-Anordnung ein differenzielles Binden
      der beiden Proteine SeqA und MutH erreicht werden kann. Da
      die Funktionsweise von SeqA noch nicht vollständig verstanden
      ist, wurde außerdem das quantitative Verständnis von SeqA
      experimentell verbessert. Anhand der Daten wurde ein Modell
      der SeqA-Strukturen an den Replikationsgabeln generiert.
      Durch FRAP-Experimente konnte belegt werden, dass SeqA ein
      dynamisches Protein ist, welches zwischen zwei
      Bindeereignissen frei in der Zelle diffundiert. SeqA und Dam
      konkurrieren um die hemi-methylierten GATCs. Es konnte
      gezeigt werden, dass beide Proteine in einem konstanten
      Mengenverhältnis vorliegen. Dies könnte ein möglicher Aspekt
      zur Regulation der Re-methylierung der GATC-Sequenzen in E.
      coli sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen
      dadurch signifikant zum Verständnis der DNA-Replikation in
      Bakterien bei.
description: All functions of each cell are
      encoded in the genome, which is distributed equally to the
      daughter cells during each cell division. This applies to
      chromosomes, regardless the number of chromosomes. The
      integrity of the genome is essential for the survival of any
      organism. Using synthetic biology methods, extensive
      alterations of genomes or entire chromosomes can be
      synthesized, although the focus is mostly on the coding
      sequences. However, chromosomes are more than merely a
      sequential arrangement of genes. Chromosomes need systems for
      replication, segregation, organization, and repair, which is
      often done by interactions of proteins with DNA sequence
      motifs. The present study investigates such so-called
      chromosome maintenance systems using synthetic secondary
      chromosomes in E. coli. Can the results generate a better
      understanding of DNA replication in bacteria? The synthetic
      secondary chromosome (synVicII) established in this work
      replicates in E. coli similarly to the secondary chromosome
      in V. cholerae on which it is based. After an initial
      characterization, the design of synVicII was further
      optimized. A crucial step was to generate compatibility of
      synVicII with the hierarchical DNA assembly system MoClo. In
      parallel, an approach was established to generate highly
      variable, long DNA sequences in which user-defined DNA motifs
      can be excluded. The insertion of these DNA sequences into
      synVicII allowed the construction of synthetic secondary
      chromosomes with a size of 100 kb. These chromosomes make it
      feasible for the first time to analyze the interaction of DNA
      segregation and DNA mismatch repair in vivo by a set of three
      synthetic secondary chromosomes. Both processes are dependent
      on the presence of hemi-methylated GATC sequences in E. coli.
      This work shows that a differentiated binding of the two
      responsible proteins, for the above processes, SeqA and MutH,
      can be achieved by an ordered GATC arrangement to allow
      comparative analysis. Since the functionality of SeqA has not
      yet been fully understood, the quantitative understanding of
      SeqA was experimentally improved. Based on this data a model
      for SeqA structure variants at the replication fork was
      generated. It was demonstrated by FRAP experiments that SeqA
      is a dynamic protein that diffuses freely between two binding
      events within the cell. SeqA and Dam compete for the
      hemi-methylated GATCs. It was shown that both proteins are in
      a similar ratio to each other. This could be an aspect for
      how GATC re-methylation is regulated. The results of the
      present work contribute significantly to the understanding of
      DNA replication in bacteria.