Cell-secreted exosomes and exosome-mimetic nanovesicles as drug delivery systems for cancer therapeutics: development, characterization and pharmacological assessment
Creators: name: Γιαννόπουλος-Δημητρίου, Αλέξανδρος του Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Εξωσώματα
Φορείς μεταφοράς φαρμάκων
Αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα
Exosomes
Drug delivery systems
Lung adenocarcinoma

description: Cell-secreted exosomes are naturally derived “bio-shuttles” of bioactive molecules and exhibit favorable biopharmaceutical properties that render them dominant bioinspired nanocarriers for advanced drug delivery. Due to the unique lipid and protein species presented in their outer surface, exosomes exhibit an “intrinsic” capacity for targeting specific cancer cells increasing their selectivity while minimizing off-target toxicity. In addition, recent advances in nanomedicine led to the manufacturing of microfluidics devices for the “bottom-up” development of “self-assembled” lipid-based exosome-mimetic nanovesicles. These “artificial” exosomes can be easily generated, characterized and scaled up for mass production facilitating their translational process “from bench to bedside” towards clinical application. In this study, different exosome isolation methods were evaluated to collect exosomes from the cell culture conditioned medium derived from human lung normal fibroblast MRC-5 and human lung adenocarcinoma A549 cells. Furthermore, the physicochemical properties as well as the morphological characteristics of the isolated exosomes were evaluated using Dynamic Light Scattering (DLS) and cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM) respectively. The exosomal protein cargo was assessed using Western blot, bead-based flow cytometry for exosomes immunocapture and detection, and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Exosome-mimetic nanovesicles were also developed via microfluidics using the total lipids extracted from the A549 cells, and characterized in terms of their physicochemical properties. Additionally, the bradykinin curvature-sensing peptide was synthesized via solid phase peptide synthesis (SPPS) for future exploitation as an “anchor” towards functionalizing exosomes with fluorophores or tumor-targeting peptides for exosomes monitoring and cancer targeting respectively. Considering the favorable properties of MRC-5 cell-derived exosomes since they are isolated from non-tumorigenic well-characterized in vitro cellular models already approved from regulatory bodies for human vaccine production, a comprehensive characterization of their pharmacological profile was assessed to evaluate their potential application as natural drug delivery “shuttles” for lung adenocarcinoma targeting. Specifically, the cellular internalization efficiency of the MRC-5 cell-derived exosomes upon labeling with fluorescent lipid and incubation with the MRC-5 normal and A549 cancer cells was evaluated using Confocal laser Scanning Microscopy (CLSM) and flow cytometry analysis. Furthermore, the hydrophilic anticancer compound doxorubicin hydrochloride (DOX HCl) and the lipophilic polyphenolic compound curcumin (CUR) was loaded in MRC-5 cell-derived exosomes following different methodologies such as simple incubation, sonication or a lyophilization-based approach, and the loading efficiencies were evaluated using fluorescence spectroscopy. The delivery profile of the drug-loaded exosomes in MRC-5 and A549 cells was investigated via CLSM, and the in vitro cytotoxicity of the CUR-loaded and DOX-loaded exosomes upon incubation with the target cells was also assessed. The obtained characterization data of the MRC-5 and A549-cell derived exosomes enrich the existing knowledge regarding the physicochemical properties and the molecular cargo of the studied exosomes. Furthermore, as demonstrated in this study, exosome-mimetic nanovesicles can be generated via microfluidics devices using the total lipid content derived from the A549 cells. The data obtained thus far indicate that the MRC-5 cell-derived exosomes display an intrinsic targeting capacity against the A549 tumor cells and an interesting pharmacological profile that could be exploited for the development of exosome-based next-generation nanocarriers for lung adenocarcinoma targeting.
description: Τα εξωσώματα, ως φυσικοί «μεταφορείς» βιοδραστικών μορίων εκκρινόμενα από κύτταρα, παρουσιάζουν ευνοϊκά βιο-φαρμακευτικά χαρακτηριστικά που μπορούν να αξιοποιηθούν για την ανάπτυξη καινοτόμων, βασισμένων σε εξωσώματα, συστημάτων μεταφοράς θεραπευτικών για την εκλεκτική στόχευση νεοπλασματικών κυττάρων. Παράλληλα, οι επιστημονικές εξελίξεις στο πεδίο της Νανοτεχνολογίας συνετέλεσαν προς την ανάπτυξη συσκευών μικρορευστομηχανικής (microfluidics devices) που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την «αυτό-συναρμολόγηση» μιμητικών εξωσωμάτων διευκολύνοντας τη μεγάλης κλίμακας παραγωγή τους και ταυτόχρονα τη «μεταφραστική τους πορεία» προς την κλινική εφαρμογή. Στα πλαίσια της μεταπτυχιακής ερευνητικής εργασίας αξιοποιήθηκαν διαφορετικές μεθοδολογίες απομόνωσης εξωσωμάτων από το υπερκείμενο υγρό της in vitro καλλιέργειας των ανθρώπινων φυσιολογικών ινοβλαστικών κυττάρων του πνεύμονα MRC-5 και των ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα A549. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των απομονωθέντων εξωσωμάτων καθώς και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τις τεχνικές Δυναμική Σκέδαση Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) και Κρυο-Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (cryogenic Transmission Electron Microscopy, cryo-TEM) αντίστοιχα. Το πρωτεϊνικό φορτίο των εξωσωμάτων διερευνήθηκε αξιοποιώντας τις τεχνικές Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών, Κυτταρομετρία Ροής βασιζόμενη σε ειδικά σφαιρίδια, και Υγρή Χρωματογραφία διασυνδεδεμένη με Φασματομετρία Μάζας (Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS). Επιπρόσθετα, αξιοποιώντας το λιπιδικό περιεχόμενο των κυττάρων A549 αναπτύχθηκαν κυστίδια-μιμητικά των εξωσωμάτων μέσω κατάλληλων συσκευών μικρορευστομηχανικής, και, ακολούθως, χαρακτηρίστηκαν ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Επίσης, με την βοήθεια της τεχνικής ημι-αυτοματοποιημένη Σύνθεση Πεπτιδίων σε Στερεά Φάση (Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis) συντέθηκε το πεπτίδιο της Βραδυκινίνης με σκοπό να αξιοποιηθεί ως «άγκυρα» για την δέσμευση στην επιφάνεια των εξωσωμάτων φθοριζόντων μορίων ή πεπτιδίων στόχευσης καρκινικών κυττάρων. Επιπρόσθετα, αξιολογήθηκε το φαρμακολογικό προφίλ των εξωσωμάτων που απομονώθηκαν από τα κύτταρα MRC-5 με σκοπό να αποσαφηνιστεί η δυνατότητα αξιοποίησης τους ως «βιο-εμπνευσμένοι» φορείς μεταφοράς θεραπευτικών για την στόχευση των A549 κυττάρων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, τα εξωσώματα σημάνθηκαν και επωάστηκαν με τα φυσιολογικά MRC-5 και τα καρκινικά A549 κύτταρα και ακολούθως διερευνήθηκε η ικανότητα εισόδου τους στα κύτταρα-στόχο αξιοποιώντας την απεικονιστική τεχνική Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης με Ακτίνες Λέιζερ (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) και την μέθοδο ποσοτικής ανάλυσης Κυτταρομετρία Ροής. Επιπρόσθετα, η λιπόφιλη ένωση Κουρκουμίνη καθώς και το αντικαρκινικό υδρόφιλο φάρμακο Υδροχλωρική Δοξορουβικίνη ενσωματώθηκαν στα εξωσώματα αξιοποιώντας διαφορετικές μεθοδολογίες, ενώ, παράλληλα αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα των μεθόδων να προωθούν την ενσωμάτωση των φαρμάκων στα εξωσώματα μέσω της τεχνικής Φασματοσκοπία Φθορισμού (Fluorescence Spectroscopy). Μετά από επώαση της εξωσωμικής Κουρκουμίνης και εξωσωμικής Δοξορουβικίνης με τα φυσιολογικά MRC-5 και τα καρκινικά A549 κύτταρα διερευνήθηκε επίσης το προφίλ ενδοκυττάριας μεταφοράς και η κυτταροτοξικότητα των εξωσωμικών φαρμάκων στα κύτταρα-στόχο. Τα δεδομένα χαρακτηρισμού που αποκτήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας εμπλουτίζουν την υπάρχουσα γνώση σχετικά με τις φυσικοχημικές ιδιότητες και το μοριακό φορτίο των εξωσωμάτων που μελετήθηκαν. Επιπλέον, όπως καταδεικνύεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, νανοκυστίδια που προσομοιάζουν τις ιδιότητες των φυσικά εκκρινόμενων εξωσωμάτων μπορούν να αναπτυχθούν από το συνολικό λιπιδικό περιεχόμενο των κυττάρων A549 αξιοποιώντας κατάλληλες συσκευές μικρορευστομηχανικής. Τα δεδομένα που ελήφθησαν μέχρι στιγμής αποδεικνύουν ότι τα εξωσώματα που προέρχονται από κύτταρα MRC-5 εμφανίζουν μια «ενδογενή» ικανότητα στόχευσης των καρκινικών κυττάρων A549, καθώς και ένα ενδιαφέρον φαρμακολογικό προφίλ που θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για την ανάπτυξη εξωσωμικών φορέων μεταφοράς θεραπευτικών με εφαρμογή στην θεραπεία του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.