title: Single-molecule Dynamics and Localization of mRNAs, ribosomal Protein L1 and the membrane remodeling protein DynA in Bacillus subtilis
title: Einzelmoleküldynamiken und Lokalisierung von mRNAs, ribosomalem Protein L1 und dem Membranumgestaltungsprotein DynA in Bacillus subtilis
titleType: AlternativeTitle
Creators: name: Sattler, Laura
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2022
Subjects: mRNA Einzelmolekülverfolgung Chemie Bacillus ribosomales Protein L1 DynA MS2-System Transkription und Translation Ribosom
single-molecule tracking mRNA mRNA dynamics mRNA localization mRNA labeling ribosomal assembly ribosome dynamics DynA dynamics membrane remod
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Fluoreszenzmikroskopie mRNA-Dynamiken mRNA-Lokalisation Ribosom Dynamik DynA Dynamik DynA Lokalisation Membranstress

description: In dieser Arbeit ist das Verfahren der Einzelmolekül-Verfolgung, in Kombination mit der SMTracker Software, die wichtigste Mikroskopiemethode, um Daten zu generieren und zu analysieren. Damit können verschiedenen Prozesse im Millisekundenbereich mit einer hohen optischen Auflösung in lebenden Zellen/Bakterien untersucht werden. Durch neue Erkenntnisse, u.a. durch verbesserte Methoden, müssen verschiedene, bis dahin als etabliert betrachtete Theorien, überdacht werden. So auch die Proteinbiosynthese in Bakterien. Eine zeitliche und räumliche Trennung von Transkription und Translation dieser beiden Prozesse in verschiedenen Bakterienspezies wird immer wahrscheinlicher. In welchem Ausmaß dies geschieht, ist jedoch noch unklar. Dafür existieren zwei generelle Modelle, die zu erklären versuchen, wo die mRNA-Translation stattfindet und ob dies ein von der Transkription getrennter oder damit gekoppelter Vorgang ist: 1.) Die mRNA verbleibt in der Nähe ihres Transkriptionsortes, wobei das bakterielle Chromosom als Vorlage fungiert – bei dem sowohl eine Kopplung von Transkription und Translation als auch eine Trennung möglich ist -, oder 2.) mRNAs lokalisieren sich dort, wo das zu kodierende Protein später benötigt wird. Transkription und Translation sind damit eher räumlich und zeitlich voneinander getrennt. Wichtig ist, diese Modelle können für verschiedene Bakterienspezies unterschiedlich zutreffend sein. Diese Arbeit beschäftigt sich im Wesentlichen mit der Frage, wo die Translation verschiedener mRNAs in dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis stattfindet und welche Dynamiken sie aufweisen. Für diese Arbeit wurde die bereits vielfacht genutzte RNA-Markierungsmethode, das MS2-System, verwendet, das vorab ein wenig abgeändert werden musste, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Ergebnisse zeigen, dass bereits ein und zwei Wiederholungen der MS2-Bindesequenz ausreichend sind, um mRNAs mit dem MS2-System zu detektieren. In diesem Zusammenhang konnte aufgezeigt werden, dass eine unspezifische Bindung des MS2-Bindeproteins auftritt und das Wachstum von Zellen, die dies exprimieren, unabhängig von der Koexpression der dazugehörigen Bindestelle, beeinflusst. Trotzdem ist der Nachweis von mRNAs damit möglich. Um der Frage nachzugehen, wo die Translation in B. subtilis stattfindet, wurden mRNAs, die für lösliche, membranständige und extrazelluläre Proteine kodieren, verwendet. Die Lokalisierung dieser mRNAs gibt einen Einblick, wo die Translation stattfinden könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit passen dabei weder ausschließlich zu Modell 1) noch zu Modell 2), besitzen jedoch Merkmale beider Modelle. Sämtliche getesteten mRNAs weisen eine Lokalisation an den Polen und der Umgebung des Nukleoids auf, wobei mRNAs, die für Membranproteine kodieren, eine Tendenz zur Membran aufzeigen. Die Koexpression und Ko-lokalisation einer mRNA, ypbR-ypzF, und eines der daraus kodierten Proteine, DynA, unterstützt die Annahme, dass eine mRNA und ihr Proteinprodukt kolokalisieren könnten. Diese Untersuchung umfasst ferner die Dynamiken von mRNAs, die in bisherigen Studien hauptsächlich auf indirekte oder theoretische Weise ermittelt wurde. Die Erkenntnis, wie sich mRNAs in der Zelle bewegen, lässt sich am besten durch die Annahme von mindestens zwei, möglicherweise drei Populationen erklären, wobei eine statische Population wahrscheinlich die Translation der mRNA abbildet, ein möglicher Übergangskomplex mit den ribosomalen Untereinheiten vorhanden ist, sowie eine frei diffuse Population existiert, wenn von drei Populationen ausgegangen wird. Die quadratische Verschiebungsanalyse (square displacement analysis) zeigt zudem, dass die Diffusionskonstanten und damit die Geschwindigkeit der mRNAs größenunabhängig zu seinen scheint und sich mRNAs innerhalb weniger Sekunden überall in der Zelle hinbewegen können, wobei sie deutlich langsamer sind als zytosolische Proteine. Auch der Zusammenbau des Ribosoms spielt hierbei eine wichtige Rolle und wird wahrscheinlich bereits indirekt durch die mRNA Untersuchung wiedergegeben. Die generierten Daten des ribosomalen Proteins der 50S Untereinheit, L1, mittels Einzelmolekül-Verfolgung unterstützt dies zusätzlich. Neben dessen Lokalisation wurde erstmals in einem Gram positiven Bakterium, dessen Dynamik untersucht. Hier kann von mehr als drei Populationen ausgegangen werden, wobei die statische Population, die eine mögliche Translation darstellt, der statischen Population der untersuchten mRNAs entspricht. Daneben kann eine schnelle, frei diffuse Population beobachtet werden, sowie die Bildung eines Übergangskomplexes mit mehreren Zwischenprodukten, was für den dynamischen, komplexen Aufbau des Ribosoms spricht und mit den mRNA Daten übereinstimmt. Des Weiteren passen die Lokalisationsdaten zu den gewonnenen Ergebnissen der mRNAs und untermauert diese. Das bakterielle Dynamin-ähnliche Protein, DynA von B. subtilis, wurde nicht nur für Kolokalisationsanalysen mit seinem mRNA-Transkript verwendet, sondern auch weitergehend charakterisiert. Dieses Protein ist an der Zellteilung beteiligt und spielt dort eine wichtige Rolle bei der Membranfusion der sich frisch geteilten Zelle. Darüber hinaus sind Zellen, denen DynA fehlt, weniger resistent gegenüber Phagenbefall und Membranstress, der durch chemische Reagenzien induziert wird. Welche Art von Membranstress für die Rekrutierung von DynA verantwortlich ist, ist jedoch nicht vollständig geklärt. Mit Hilfe von Epifluoreszenzmikroskopie und Einzelmolekül-Verfolgung konnte ich zeigen, dass DynA nur auf spezielle Stressfaktoren reagiert, wahrscheinlich induzierte Poren in der Membran, die durch das Angreifen von Komponenten des Lipid II entstehen. Außerdem konnte bei der Untersuchung der Dynamik von DynA drei unterschiedliche Populationen der Mobilität gefunden werden. Eine statische Population, die an der Membranfusion beteiligt ist, u. a. während der Zellteilung und bei der Behebung von Membranschäden– ein Vorgang, der verhältnismäßig schnell vonstattengeht -, eine langsam mobile Population, die nach möglichen Membranschädigungen sucht, sowie eine Population für wahrscheinlich frei diffundierende DynA-Moleküle, die eine bisher nicht bekannte zytoplasmatische Lokalisation aufweist. Wichtig dabei ist, dass bereits eine geringfügige Änderung in der Anzahl der DynA-Moleküle ausreichend ist, um die durch die Antibiotika verursachten Schäden zu beheben.
description: In this work, single-molecule tracking, in combination with SMTracker software, is the main microscopy method to generate and analyze data. This allows various processes to be studied in a millisecond time range with a high optical resolution in living cells/bacteria. Due to new findings, including improved methods, a number of theories that were previously considered established have to be reconsidered. This also applies to protein biosynthesis in bacteria. A temporal and spatial separation of transcription and translation of these two processes is becoming increasingly likely at least in some bacteria. However, the extent to which this occurs is still unclear. Two general models exist for this, which attempt to explain where mRNA translation takes place and whether this is a process separate from transcription or coupled to it: 1.) The mRNA remains close to its transcription site, with the bacterial chromosome acting as a template - where both, coupling of transcription and translation and separation, are possible - or 2.) mRNAs localize where the protein to be encoded is later required. Transcription and translation are thus rather spatially and temporally separated from each other. Importantly, these models may apply differently to different bacterial species. This work focuses mainly on the question of where translation of different mRNAs takes place in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis and what dynamics they exhibit. For this work, the already often used RNA labelling method, the MS2-system, was used, which had to be modified a little in advance in order to achieve optimal results. The results show that already one and two repeats of the MS2-binding sequence are sufficient to detect mRNAs with the MS2-system. In this context, it could be shown that unspecific binding of the MS2-binding protein occurs and affects the growth of cells expressing it, regardless of the co-expression of the associated binding site. Nevertheless, detection of mRNAs is still possible. To address the question of where translation occurs in B. subtilis, mRNAs encoding soluble, membrane and extracellular proteins were used. The localization of these mRNAs provides insight into where translation might take place. The results of this work do not fit exclusively to either model 1) or model 2), but have features of both models. All tested mRNAs show a localization at the poles and the surrounding of the nucleoid, whereas mRNAs encoding membrane proteins show a tendency towards the membrane. The co-expression and co-localization of a mRNA, ypbR-ypzF, and one of the proteins encoded from it, DynA, supports the assumption that a mRNA and its protein product could colocalize. This investigation further includes the dynamics of mRNAs, which previous studies have mainly determined in an indirect or theoretical way. The understanding of how mRNAs move in the cell is best explained by assuming at least two, possibly three populations, with a static population likely representing the translation of mRNA, a possible transition complex with the ribosomal subunits, as well as a freely diffusing population existing if three populations are assumed. The square displacement analysis also shows that the diffusion constants and thus the speed of the mRNAs appear to be size-independent and that mRNAs can move anywhere in the cell within a few seconds, although they are noticeably slower than cytosolic proteins. The assembly of the ribosome also plays an important role here and is probably already indirectly reflected by the mRNA study. The data generated of the ribosomal protein of the 50S subunit, by using single-molecule tracking further supports this. In addition to its localization, for the first time in a Gram-positive bacterium, its dynamics were investigated. Here, more than three populations can be assumed, whereby the static population, which represents a possible translation, corresponds to the static population of the investigated mRNAs. In addition, a fast, freely diffuse population can be observed, as well as the formation of a transition complex with several intermediates, which argues for the dynamic, complex structure of the ribosome and agrees with the mRNA data. Furthermore, the localization data match and support the results obtained from the mRNAs. The bacterial dynamin-like protein, DynA from B. subtilis, was not only used for co-localization analyses with its mRNA transcript, but was also further characterized. This protein is involved in cell division, where it plays an important role in membrane fusion of the newly divided cells. In addition, cells lacking DynA are less resistant to phage attack and membrane stress induced by chemical reagents. However, the type of membrane stress responsible for DynA recruitment is not fully understood. Using epifluorescence microscopy and single-molecule tracking, I was able to show that DynA only responds to specific stresses, probably induced pores in the membrane caused by attacking components of lipid II. Furthermore, by studying the dynamics of DynA, three different populations of mobility could be found. A static population that is involved in membrane fusion, including during cell division and repair of membrane damage - a process that occurs relatively quickly -, a slow mobile population that searches for possible membrane damage, and a population for probably freely diffusing DynA molecules that has a cytoplasmic localization not known so far. Importantly, even a slight change in the number of DynA molecules is enough to repair the damage caused by the antibiotics.