Molekularbiologische und physiologische Analyse des Oligomerisierungsverhaltens von humanen Connexinen
Creators: name: Schadzek, Patrik Klaus
Publisher: name: Hannover : Institutionelles Repositorium der Leibniz Universität Hannover
Year: 2019
Subjects: subject: hemichannel docking
subject: concatenated connexins
subject: heteromeric connexons
subject: oligomerization
subject: channel stoichiometry
subject: Gap Junctions
subject: Halbkanal-Docking
subject: Connexin-Konkatemer
subject: heteromere Connexone
subject: Oligomerisierung
subject: Kanalstöchiometrie
subject: Dewey Decimal Classification::500 | Naturwissenschaften::570 | Biowissenschaften, Biologie

description: Für multizelluläre Organismen ist die Zell-Zellkommunikation lebensnotwendig, die durch Gap Junctions zwischen benachbarten Zellen innerhalb eines Gewebes vermittelt wird. Connexine, die die Untereinheit von Gap Junction-Kanälen bei Vertebraten bilden, sind somit maßgeblich für die Organfunktionalität verantwortlich, indem sie die einzelnen Zellen zu einer physiologischen Einheit vereinen. Die Funktionalität der Gap Junction-Kanäle ist von der Oligomerisierung der Connexin- Untereinheiten, wovon beim Menschen bisher 21 verschiedene Isoformen bekannt sind, abhängig. In dieser Arbeit wurde das Oligomerisierungsverhalten von Connexinen, sowohl in Hinblick auf das Hexamerisieren von sechs Connexinen zu einem Connexon (Halbkanal), als auch in Hinblick auf das Docking von zwei Connexonen zu einem Gap Junction-Kanal, analysiert. Ausgehend von der Mutation N188T des humanen Connexin46 (hCx46), welche mit einer Kataraktbildung assoziiert ist, wurden die strukturellen und funktionellen Konsequenzen dieses Aminosäureaustauschs untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die Mutation N188T das Docking der Connexone stört, da durch die Mutation die benötigte Stabilisierung des Gap Junction-Kanals über ausreichend viele Wasserstoffbrückenbindungen nicht mehr möglich ist. Die Aminosäure N188 stellt die Schlüssel- position beim Docking von hCx46 dar. Um auf molekularer Ebene zu untersuchen, wie die Patienten pathophysiologisch betroffen sind, die die Mutation zusammen mit dem Wildtyp hCx46 exprimieren (heterozygot), wäre es wünschenswert, die Anzahl und die stöchiometrische Zusammensetzung mutierter Connexine innerhalb eines Connexons determinieren zu können. Hierfür wurden Connexine konkatemerisiert. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass konkatemerisierte Connexine transportiert und in die Plasmamembran insertiert werden, wo sie funktionale Halbkanäle und Gap Junction-Kanäle bilden können. Durch das Bilden von Konkatemeren, bestehend aus hCx46N188T und dem Wildtyp, in Kombination mit Molekül-Dynamik-Simulationen konnte die postulierte dominant-negative Eigenschaft der Mutation auf das Docking strukturbiologisch bestätigt werden. hCx46N188T reduziert die Anzahl der zwischen den Zellen gebildeten hCx46-Gap Junction-Kanäle und erschwert dadurch die metabolische Homöostase der Linse, was die Katarakt-Bildung begünstigt. Durch diese innovative Herangehensweise der Connexin-Konkatemerisierung eröffnen sich neue Möglichkeiten für die Analyse heteromerer Connexone und heterotypischer Gap Junction- Kanäle mit einer definierten Stöchiometrie. Homodimere und heterodimere Konkatemere, bestehend aus hCx46 und hCx26, wurden im Vergleich zu den beiden Monomeren in Zellen exprimiert und auf ihre physiologischen Eigenschaften untersucht. Die heterodimeren Kanäle wiesen einzigartige Kanaleigenschaften auf, die von denen der homodimeren Kanäle abwichen, was weitere Hinweise auf die postulierte Spezifizierung von Connexonen durch Heterooligomerisierung gibt. Eine weitere Analyse stöchiometrisch spezifischer heteromerer Kanäle mit dieser Methode ist somit sehr vielversprechend.
description: For multicellular organisms the cell-to-cell communication is essential, mediated by gap junctions between neighboring cells within a tissue. Connexins are the subunits of vertebrate gap junction channels and are responsible for multiple organ functions by uniting individual cells to a physiological system. The functionality of the gap junctions channels depends on the oligomerization of the connexin subunits. In human 21 different connexin isoforms are known. In this dissertation, the oligomerization behavior of connexins was analyzed with regard to the hexamerization of six connexins to a connexon and to the docking of two connexons to form a gap junction channel. Based on the N188T mutation of human connexin46 (hCx46), which is associated with a congenital nuclear pulverulent cataract, the structural and functional consequences of this amino acid exchange were investigated. It could be shown for the first time that the N188T mutation disrupts the docking of the connexons by not allowing the required stabilization of the channel via a sufficient number of hydrogen bonds. The N188 residue is the key position for the docking of the hemichannels. In order to molecularly analyze how patients are pathophysiologically affected who express the mutation hCx46N188T together with the hCx46 wild type (heterozygous for the mutation hCx46N188T), it would be desirable to be able to determine the number of the mutant connexins and the stoichiometric composition within a connexon. Therefore, connexins were concatemerized. It was shown for the first time that concatenation of connexins is compatible with trafficking of the hemichannels to the membrane and the formation of functional hemichannels and gap junction channels. By constructing concatemers consisting of hCx46N188T and the wild type, in combination with molecular dynamics simulations, the postulated negative dominate property of the mutation for the hemichannel docking was structural biologically verified. hCx46N188T reduces the amount of gap junction channels between cells, making it more difficult to catabolize the metabolic homeostasis of the lens and thereby promoting the formation of cataract. This innovative approach of concatemerizing connexins opens up new possibilities to analyze heteromeric connexons and heterotypic gap junction channels with a defined stoichiometry. Homodimeric and heterodimeric concatemers, consisting of hCx46 and hCx26, were expressed in cells. Their physiological properties were analyzed in comparison to cells expressing the monomers. The heterodimeric channels showed unique channel properties that deviated from those of the homodimeric channels, giving further evidence regarding the postulated specification of the connexons by hetero-oligomerization. Future analysis of the stoichiometrically specified heteromeric channels by concatenating connexins is very promising.