Απόπτωση Τ-λεμφοκυττάρων σε πειραματικό μοντέλο αλλεργικής εγκεφαλομυελίτιδας
Creators: name: Τεστέμπαση, Κυριακή Π.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2006
Subjects: Πολλαπλή σκλήρυνση
Πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα
T-λεμφοκύτταρα
Multiple sclerosis
Experimental autoimmune encephalomyelitis
T-lymphocytes

description: Φυσιολογικά, υπάρχουν ώριμα Τ-λεμφοκύτταρα που είναι ικανά να αντιδρούν με αυτοαντιγόνα και να δραστηριοποιούνται μετά από διασταυρούμενη αντίδραση με αντιγόνα του περιβάλλοντος. Ο μηχανισμός που συντηρεί την ανοσολογική ανοχή και υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν εμφανίζεται αυτοανοσία, δεν έχει ξεκαθαριστεί. Η πολλαπλή σκλήρυνση (ΠΣ) και το πειραματικό της μοντέλο, η πειραματική αλλεργική εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ), θεωρούνται ως αυτοάνοσοι νόσοι εξαιτίας της παρουσίας αυτοαντιδρώντων Τ-λεμφοκυττάρων τα οποία ενεργοποιούνται έναντι αντιγόνων της μυελίνης. Έχει εκφραστεί η υπόθεση ότι ένας από τους πιθανούς μηχανισμούς περιορισμού της αυτοάνοσης αντίδρασης είναι και η απόπτωση των αυτοαντιδρώντων Τ-λεμφοκυττάρων. Η απόπτωση επέρχεται μετά την επανενεργοποίηση των κυττάρων αυτών μέσα στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ). Πιο συγκεκριμένα, τα αυτοαντιδρώντα Τ-λεμφοκύτταρα μετά την είσοδό τους στο KΝΣ επανενεργοποιούνται από μη ειδικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και υφίστανται απόπτωση μέσω της έκφρασης της οδού που χρησιμοποιεί τον παράγοντα Fas (CD95). Η εξέλιξη αυτή οφείλεται στο γεγονός ότι τα μη-ειδικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα δεν παρέχουν επαρκές ερέθισμα ώστε να εκφραστεί ο αντι-αποπτωτικός παράγοντας Bcl-2, ο οποίος αναστέλλει τον αντίστοιχο αποπτωτικό Fas (CD95), γεγονός το οποίο με τη σειρά του θα επέτρεπε τη δράση του αυτοαντιδρώντος λεμφοκυττάρου. Ειδικά ωστόσο για την ΠΑΕ, δεν υπάρχουν πληροφορίες για το πότε λαμβάνουν χώρα οι διαδικασίες έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση ούτε και για την κινητική τους ανάλογα με την κλινική πορεία της νόσου. Στην παρούσα εργασία προκλήθηκε ΠΑΕ με εμβολιασμό των πειραματοζώων με PLP. Σε διάφορα χρονικά διαστήματα μετά την πρόκληση του μοντέλου, μελετήθηκε η έκφραση των σχετιζόμενων με την απόπτωση γονιδίων στο ΚΝΣ των πειραματοζώων με RT-PCR, ενώ με ανοσοϊστοχημεία διερευνήθηκε η κατανομή των αντίστοιχων παραγόντων απόπτωσης κατά τα αντίστοιχα χρονικά διαστήματα: α) ημέρα πρόκλησης της νόσου, β) 3-4 ημέρες μετά την πρόκληση ΠΑΕ , γ) 6-10 ημέρες μετά την πρόκληση ΠΑΕ, δ) στην οξεία φάση (12-15 ημέρες) και ε) στη χρόνια φάση. Εξετάσθηκαν παράλληλα και φυσιολογικά πειραματόζωα αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων φαίνεται ότι: Την ημέρα της επαγωγής της ΠΑΕ, εντοπίστηκε στον εγκέφαλο έκφραση του γονιδίου GADPH καθώς και χαμηλή έκφραση του γονιδίου bcl-2. Δεν εντοπίστηκε έκφραση κανενός αποπτωτικού γονιδίου στο RNA που απομονώθηκε από τον νωτιαίο μυελό του ίδιου πειραματοζώου. Κατά την τρίτη ημέρα μετά την επαγωγή της ΠΑΕ, στον εγκέφαλο παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου GADPH και LICE και μικρότερη έκφραση των γονιδίων bcl-xL, bcl-2 και bax, ενώ στον νωτιαίο μυελό παρατηρείται μόνο μειωμένη έκφραση του γονιδίου GADPH. Κατά την ημέρα 6 μετά την επαγωγή της νόσου, στον εγκέφαλο παρατηρήθηκε έκφραση των γονιδίων GADPH, bcl-xL, LICE, bcl-2 και μικρότερου ποσοστού έκφραση του γονιδίου bax. Στο υλικό που απομονώθηκε από τον νωτιαίο μυελό παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου GADPH και μικρότερης έκτασης έκφραση των γονιδίων LICE, bcl-xL και bcl-2. Την ημέρα 9 μετά την επαγωγή της νόσου παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου GADPH και χαμηλότερου ποσοστού έκφραση των γονιδίων LICE, bcl-xL, bcl-2 και bax, στον εγκέφαλο. Στο νωτιαίο μυελό βρέθηκε έκφραση του γονιδίου GADPH και χαμηλότερη έκφραση των γονιδίων LICE και bcl-2. Κατά την διάρκεια της 12ης ημέρας μετά την επαγωγή της νόσου στον εγκέφαλο καθώς και στον νωτιαίο μυελό, παρατηρήθηκε η έκφραση του γονιδίου GADPH και εξαιρετικά χαμηλή έκφραση των γονιδίων LICE και bcl-2. Κατά την 15η ημέρα μετά την επαγωγή της νόσου, παρατηρήθηκε στον εγκέφαλο έκφραση των γονιδίων GADPH, bcl-xL, LICE και bax, ενώ στο υλικό που απομονώθηκε από τον νωτιαίο μυελό GADPH και χαμηλή έκφραση των γονιδίων LICE και bax. Μελετήθηκαν τέσσερις φάσεις της χρόνιας ΠΑΕ: πρώιμη προνοσηρή φάση, όψιμη προνοσηρή φάση, οξεία φάση και χρόνια φάση. Σε κάθε φάση έγινε ανοσοϊστοχημεία για έναν αντιαποπτωτικό παράγοντα, τον Bcl-2, πέντε αποπτωτικούς παράγοντες, τους Bax, Fas, FasL, TRAIL και caspase-3, και ένα παράγοντα τελικής ανίχνευσης της απόπτωσης, την φρακτίνη, και επιχειρήθηκε ποιοτική ανάλυση των δεδομένων. Από την ανοσοκυτταροχημεία για τους αντίστοιχους προ- και αντι-αποπτωτικούς παράγοντες, φαίνεται ότι: Ο αντιαποπτωτικός παράγοντας Bcl-2 εκφράζεται ήδη από την 10η ημέρα της ΠΑΕ αλλά όχι σε κύτταρα φλεγμονής, τα οποία άλλωστε δεν υπάρχουν σε αυτή τη χρονική στιγμή, αλλά σε κύτταρα του ΚΝΣ ανήκοντα πιθανώς στην γλοία. Ο Bcl-2 εκφράζεται επίσης και σε φλεγμονώδη κύτταρα αλλά μόνο κατά την οξεία φλεγμονή (οξεία φάση) και όχι στην χρόνια. Αυτό πιθανότατα σημαίνει μία αναστολή των αντιααποπτωτικών μηχανισμών στην χρόνια φλεγμονή όπου και το ΚΝΣ προσπαθεί να «καθαρίσει» τα φλεγμονώδη κύτταρα από αυτό. Ο αποπτωτικός παράγοντας Bax εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Η αναλογία των φλεγμονωδών κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Bax από το σύνολο των διηθώντων το ΚΝΣ φλεγμονωδών κυττάρων είναι περίπου η ίδια στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ στις τομές Ν.Μ. Στην παρούσα μελέτη δεν εντοπίζεται Bax στις τομές εγκεφαλικού ιστού στη χρόνια φάση. Στο συγκεκριμένο πειραματικό μοντέλο η φλεγμονώδης διήθηση είναι πιο περιορισμένη στον εγκέφαλο σε σύγκριση με το νωτιαίο μυελό και πιθανόν γι’ αυτό δε διαπιστώνεται έκφραση του Bax στις τομές εγκεφαλικού ιστού στη χρόνια φάση της ΠΑΕ. Ο αποπτωτικός παράγοντας Fas εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Η αναλογία των φλεγμονωδών κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Fas από το σύνολο των διηθώντων το ΚΝΣ φλεγμονωδών κυττάρων είναι περίπου η ίδια στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Ο αποπτωτικός παράγοντας Caspase-3 εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Η αναλογία των φλεγμονωδών κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Caspase-3 από το σύνολο των διηθώντων το ΚΝΣ φλεγμονωδών κυττάρων είναι περίπου η ίδια στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ . Ο αποπτωτικός παράγοντας TRAIL εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Η αναλογία των φλεγμονωδών κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα TRAIL από το σύνολο των διηθώντων το ΚΝΣ φλεγμονωδών κυττάρων είναι περίπου η ίδια στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ . Ο αποπτωτικός παράγοντας Fractin εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ. Η αναλογία των φλεγμονωδών κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Fractin από το σύνολο των διηθώντων το ΚΝΣ φλεγμονωδών κυττάρων είναι περίπου η ίδια στην οξεία και χρόνια φάση της ΠΑΕ στις τομές Ν.Μ. Στην παρούσα μελέτη δεν εντοπίζεται Fractin στις τομές εγκεφαλικού ιστού στη χρόνια φάση. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας συνηγορούν υπέρ της άποψης ότι ήδη από την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιφέρεια ενεργοποιούνται παράγοντες σχετιζόμενοι με την απόπτωση. Η περαιτέρω ενεργοποίηση των παραγόντων αυτών μέσα στο ΚΝΣ καθορίζει την επιβίωση και επομένως τη δράση των αυτοαντιδρώντων φλεγμονωδών κυττάρων. Η μελέτη της κινητικής των αποπτωτικών παραγόντων στην ΠΣ μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για την επαγωγή των προ-αποπτωτικών παραγόντων και επομένως τη μείωση του αριθμού των ενεργοποιημένων Τ-λεμφοκυττάρων και άρα την ύφεση της νόσου
description: Normal individuals have mature T- lymphocytes that are capable of reacting to self-antigens and can be activated by cross-reacting environmental antigens. The mechanism that maintains immune tolerance and prevents these activated autoreactive T cells from causing autoimmune disease is unclear. Multiple Sclerosis (MS) and the animal model of the disease, the Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE) are considered to be autoimmune disorders due to the presence of autoreactive T-lymphocytes which are activated against myelin antigens. It has previously been hypothesized that activation-induced apoptosis of previously activated autoreactive T cells in the target organ is a major mechanism for maintaining tolerance. It is proposed that when activated autoreactive T cells enter the target organ, they are reactivated mainly by non-professional antigen-presenting cells (APC) and deleted by activation-induced apoptosis through the Fas (CD95) pathway before producing significant target organ damage. This apoptosis occurs because the reactivated T cells do not receive sufficient costimulation from the non-professional APC to up-regulate their expression of Bcl-2-related anti-apoptotic proteins, which inhibit the CD95 pro-apoptotic pathway. However, particularly in the case of EAE, there are no reports either about the time during which the apoptosis – related gene expression takes place or the kinetics of these factors in relation to the clinical course of the disease. In the present study, the EAE was induced with PLP inoculation. During several time-points following EAE induction, the gene expression of apoptosis related molecules was studied with RT-PCR, while immunohistochemistry revealed the distribution of these factors throughout the CNS in corresponding time – points, such as: a) On the day of induction, b)3-4 days following the induction, c) 6-10 days following the induction, d) during the acute phase and e) during the chronic phase. Naïve or CFA treated age- and gender- matched animals were used as controls. On the day of induction, GADPH and low bcl-2 gene expression was detected in the brain. No similar expression was detected in spinal cord. On day 3 post-induction, GADPH and LICE gene expression as well as low gene expression of bcl-xL, bcl-2 and bax, was induced in the brain, whereas no similar findings were detected. On day 6 post induction, the expression of GADPH, bcl-xL, LICE, bcl-2 and to a lesser extend the one of bax. was increased in the brain. In the spinal cord, GADPH gene expression and to a lesser extend those of LICE, bcl-xL και bcl-2, were detected. On day 9 post-induction, brain GADPH gene expression was high, contrary to the one related to LICE, bcl-xL, bcl-2 and bax. GADPH was also induced in spinal cord whereas lower LICE and bcl-2 gene expression, was noticed. On day 12 post-induction, both brain and spinal cord GADPH gene was constantly expressed whereas LICE and bcl-2 gene expression was extremely low. On day 15 post – induction, brain GADPH, bcl-xL, LICE and bax, gene expression, was also noticed. On the contrary, spinal cord LICE και bax gene expression was low. Four clinical phases of chronic EAE were studied with immunohistochemistry: early and late preclinical, acute and chronic clinical. In each phase, immunohistochemistry for one anti-apoptotic (Bcl-2) and 5 pro-apoptotic factors (Bax, Fas, FasL, TRAIL and caspase-3) as well as for fractin (the later product of apoptotic procedure). The data were analyzed qualitatively. In particular, Bcl-2 was already detected on day 10 among cells morphologically indicative for glia. In any case, there are still no inflammatory cells during this phase. The same anti-apoptotic factor is also expressed among the inflammatory cells during the acute phase and no loger later at chronic stages. This finding may indicate the inhibition of anti-apoptotic mechanisms during the chronic phase during which CNS is about to become «clear» from inflammatory cells. The pro-apoptotic factor Bax is expressed on the inflammatory cells both in acute and chronic phases. The fraction of inflammatory cells expressing Fas, TRAIL or caspase-3 is the same both on acute and chronic stages of the disease. Fractin is expressed in spinal cord both during acute and chronic stage of the disease, whereas no similar findings were detected in brain. Present data indicate that apoptotic – related genes are already expressed early following the activation of immune cells in the periphery. Further activation or re-activation of the apoptotic – related factors whithin CNS determines the survival and therefore the activity of autoimmune inflammatory cells. The kinetics of apoptotic factors in MS may be extremelly valuable for the introduction of therapeutic strategies which may induce the expression of pro-apoptotic factors and consequently, the reduction of activated T-cells which may lead to concomittant remission of the disease