title: Examination abeout developing a Real-time-PCR Assay for quick screening on Clostridium difficile in Patient- and environmental samples
title: Untersuchung zur Etablierung einer Real-time-PCR zum schnellen Screening auf Clostridium difficile aus Patienten- und Umgebungsproben
Creators: name: Albrecht, Ulla Maria
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2011
Subjects: Real-time-PCR
Spore
Spore Contamination
Sporenbildner
Medizin, Gesundheit
Real time quantitative PCR
Clostridium difficile Infection
Stuhlproben
Clostridium difficile
Umgebungsproben
Clostridium-difficile-Infektion
Patientenproben

description: Clostridium difficile is the
      leading cause of antibiotic associated diarrhoe. Over the
      last years clostridium difficile became more important
      because of the occurence of new more toxigenic and hyper
      virulent strains. Clostridium difficile is a gram positive,
      anaerobe, rod-shaped and spore-forming bacteria. In case of
      an antibiotic therapy the normal flora of the intestine is
      deranged and Clostridium difficile colonize the intestine.
      The main transmission of Clostridium difficile is
      faecal-oral. The bacteria formes three different toxines,
      toxin A, toxine B and the binary toxine. The binary toxine is
      often present in the new more toxigenic and hypervirulent
      strains, for example in the strain Nap1/027. Infected
      patients excret a lot of spores that persist for months in a
      clinical environment if they are not eliminated by
      spore-effective desinfection. The spores can be the origin of
      the infection of other patients. For this reason, a quick and
      sensitive diagnostic tool to detect Clostridium difficile is
      necessary in order to take measures against the spreading of
      spores. In this study at first a Real-time PCR Assay for
      detecting the 16S rRNA of Clostridium difficile was
      established. After that, 242 faecal samples from two
      patient-groups were tested by the Real-time PCR Assay
      detecting the 16SrRNA of Clostridium difficile. The first
      group contains faecal samples, which were tested positive in
      an toxinimmunoassay, detecting toxine A and B. The second
      group contains faecal samples which were tested negative in
      an ELISA test detecting toxine A and B. The Real-time PCR
      Assay reached high levels of sensitivity and specificity and
      it was shown that the Real-time PCR Assay was a quick and
      reliable method to detect the 16 SrRNA of Clostridium
      difficile in faecal samples. All samples were also tested by
      a conventional PCR Assay detecting toxine A, B and the binary
      toxine. In most cases the result of the conventional PCR
      Assay detecting toxine A and B confirms the result of the
      toxinimmunoassay. In ten samples the binary toxine was
      detected which shows that there are new strains of
      Clostridium difficile also at the university clinic of
      Marburg. In a second study 531 hospital environmental samples
      werte examined by the Real-time PCR assay detecting the 16 S
      rRNA of Clostridium difficile. A first group contains samples
      from the environment of patients infected by Clostridium
      difficile, a second group contains patients not infected with
      Clostridium difficile but present at the same ward as the
      infected patient. A third group contains samples from wards
      without the detection of Clostridium difficile within the
      last six months. The study revealed that not only the direct
      surrounding of an infected patient is contaminated by the
      spores of Clostridium difficile but the entire ward. In a
      correlation-analysis it became evident that the hands of the
      staff are the predominant way of transmission of spores of
      Clostridium difficile. Thus it is evident that the most
      important way to prevent the transmission of Clostridium
      difficile are hand-hygiene and desinfection
      activities.
description: Clostridium difficile ist der
      häufigste Erreger von Antibiotika-assoziierten Diarrhoen und
      hat in den letzten Jahren als nosokomialer Problemkeim stark
      an Bedeutung gewonnen. Das Bakterium ist grampositiv,
      stäbchenförmig, obligat anaerob und bildet Sporen aus. Bei
      einer Antibiotikatherapie wird die natürliche Darmflora
      gestört und Clostridium difficile kann sich leichter
      ansiedeln. Die Übertragung des Bakteriums erfolgt dabei in
      der Regel fäkal-oral über die Aufnahme von Sporen.
      Clostridium difficile kann drei bekannte Toxine ausbilden,
      Toxin A, Toxin B und das Binary-Toxin. Die Toxine verursachen
      schwere Diarrhoen bis hin zur pseudomembranösen Enterokolitis
      mit möglichem letalen Ausgang. Das Binary-Toxin wird nicht
      von allen pathogenen Stämmen gebildet, ist aber mit einer
      erhöhten Toxizität und Virulenz assoziiert. In den letzten
      Jahren sind weltweit gehäuft schwere Ausbrüche von
      Clostridium difficile assoziierten Diarrhoen dokumentiert
      worden, die mit dem neu aufgetretenen, Binary-Toxin bildenden
      Stamm Nap1/027 in Verbindung gebracht werden. Außerdem wurden
      vermehrt Clostridium difficile assoziierte Diarrhoen
      außerhalb von Kliniken in der Normalbevölkerung beschrieben.
      Da infizierte Patienten eine große Zahl von Sporen
      ausscheiden, die resistent gegen herkömmliche alkoholische
      Desinfektionsmittel sind, können sie in klinischen
      Einrichtungen lange überdauern und stellen eine gefährliche
      Infektionsquelle für andere Patienten und Mitarbeiter dar.
      Aus diesem Grund müssen strikte Hygieneregeln eingehalten
      werden, sobald ein Patient an Clostridium difficile
      assoziierter Diarrhoe erkrankt ist. Gleichzeitig kommt einer
      möglichst schnellen Diagnostik große Bedeutung zu damit zügig
      entsprechende Maßnahmen eingeleitet werden können. In dieser
      Arbeit wurde ein Real-time-PCR Assay zum Nachweis und zur
      Quantifizierung der 16S rRNA von Clostridium difficile
      weiteretabliert, wobei das Real-time-PCR Assay eine hohe
      Sensitivität und Spezifität erreichte. Mit Hilfe der
      Real-time-PCR wurde extrahierte DNA aus 242 Stuhlproben von
      zwei Patientengrupen des Klinikums Marburg untersucht. Die
      erste Patientengruppe umfasste Patienten deren Stuhlprobe
      zuvor im Toxinimmunoassay auf Toxin A und B von Clostridium
      difficile positiv getestet worden war. In der zweiten
      Patientengruppe waren Patienten eingeschlossen, die zwar an
      Diarrhoe erkrankt waren, deren Stuhlprobe aber im
      Toxinimmunoassay negativ getestet worden war. Es konnte
      gezeigt werden, dass das verwendete Real-time-PCR Assay eine
      schnelle, sensitive und spezifische Methode darstellt, um
      Clostridium difficile in extrahierter DNA aus Stuhlproben zu
      detektieren. Alle Stuhlproben wurden zur Kontrolle zusätzlich
      mit einer konventionellen PCR auf Toxin A, Toxin B und das
      Binary-Toxin untersucht. Bis auf wenige Ausnahmen bestätigte
      sich im Test auf Toxin A und B das Ergebnis des
      Toxinimmunoassays. Bei 10 Proben konnte zudem das Binarytoxin
      nachgewiesen werden, was dafür spricht, dass auch im Klinikum
      Marburg bereits neuere Stämme von Clostridium difficile
      Einzug gehalten haben. In verschiedenen Studien konnte belegt
      werden, dass die Umgebung von mit Clostridium difficile
      infizierten Patienten stark mit Sporen kontaminiert ist. Um
      besonders kontaminierte Bereiche aufzuzeigen und die
      Verbreitung der Sporen zu dokumentieren, wurde DNA aus 531
      Abstrichen der Patientenumgebung extrahiert und mit dem
      weiteretablierten Real-time-PCR Assay untersucht. Dabei
      wurden Proben aus der Umgebung infizierter Patienten mit
      Proben der Umgebung nicht infizierter Patienten, die aber mit
      infizierten Patienten auf einer Station lagen und Proben von
      Stationen, auf denen seit 6 Monaten kein Fall von Clostridium
      difficile mehr aufgetreten war, verglichen. Es wurde
      deutlich, dass nicht nur die direkte Umgebung von mit
      Clostridium difficile infizierten Patienten stark
      kontaminiert ist, sondern auch der ganze Stationsbereich.
      Auch in den Abstrichproben der Stationen, auf denen seit 6
      Monaten kein infizierter Patient mehr gelegen hatte, konnte
      Clostridium difficile nachgewiesen werden. In einer
      Korrelationsanalyse wurde zudem deutlich, dass vor allem die
      Hände des Personals eine Hauptinfektionsquelle darstellen.
      Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die
      erforderlichen Hygienemaßnahmen auf den untersuchten
      Stationen gar nicht oder nur unzureichend eingehalten werden.
      Um zu vermeiden, dass sich Stämme wie der neu aufgetretene,
      hypervirulente Stamm Nap1/027 weiter ausbreiten, ist es daher
      nötig, dass sowohl den Patienten als auch dem Personal
      deutlich gemacht wird, dass strikt eingehaltene
      Hygienemaßnahmen die einzige effektive Möglichkeit darstellen
      weitere Infektionen zu verhindern. Aufgrund der Resistenz der
      Sporen gegen alkoholische Desinfektionsmittel kommt hier dem
      Händewaschen neben der normalen alkoholischen Desinfektion
      eine besondere Bedeutung zu