title: Characterization of mouse polycystic kidney disease and receptor for egg jelly gene and protein in heterologous and native system
Creators: name: Butscheid, Yulia
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2006
Subjects: Primary cilium
Cilie
Spermatogenese
Medical sciences, Medicine
Medizin, Gesundheit
Sperm
Membranproteine
Spermium
Signaltransduktion
Signal transduction
Spermatogenesis
Membrane protein

description: The mammalian polycystic kidney disease (PKD) gene family comprises eight members whose role in cell physiology is still poorly understood. Two of the founding members of the family, PKD1 and PKD2, are responsible for the majority of cases of autosomal dominant polycystic kidney disease. While PKD1 is considered to be a cell-surface receptor, PKD2 functions as a cation channel and has been described both at the plasma membrane and intracellularly. The present study focuses on PKDREJ – polycystic kidney disease and receptor for egg jelly, a protein that contains both a large receptor-like extracellular part and a putative ion channel region. PKDREJ homology to suREJ proteins, which seem to play a role in the induction of the sperm acrosome reaction in sea urchin, gives a reason to propose the same scenario for PKDREJ in mammals. Although the PKDREJ gene was identified in 1999, its features and protein characteristics remained elusive up to now. The present study investigates mouse PKDREJ gene and protein and provides the first data about its structure, expression and localization. It demonstrates that PKDREJ is highly expressed in testicular tissue and its expression there is restricted to germ cells and spermatozoa. Upon heterologous expression in HEK 293, COS7, GC-1, GC-2 cells and Xenopus laevis oocytes PKDREJ is retained intracellularly in endoplasmatic compartments. Since many known receptors and ion channels can not be properly trafficked without special partner or adaptor proteins, while expressed in a heterologous system, co-expression experiments with mouse HspA2, PKD2L2 and human PKD1 and PKD2 were done. In all cases PKDREJ localization remained intracellular irrespective of whether it was co-expressed with other proteins or not. The presence of the GPS domain in the PKDREJ amino acid structure gave a reason to speculate about the proteolytical cleavage within this site. The present work provides not only the biochemical characterisation of the PKDREJ protein, but also the first evidence about lack of the GPS processing. It shows that PKDREJ unlike PKD1 or suREJ3 does not undergo cleavage within G-protein-coupled receptor proteolytic site while being expressed in HEK293 cells or Xenopus laevis oocytes. Moreover, the explanation of this phenomenon, based on the structure of the GPS domain in PKDREJ and the autocatalytic mechanism of the cleavage, is proposed. To investigate the PKDREJ protein in native system PKDREJ-specific polyclonal antibodies were developed and characterised. By means of indirect immunofluorescence it was possible to demonstrate PKDREJ localization in the acrosomal region and on the inner aspect of the falciform-shaped mouse sperm head. Additional immunoelectron microscopy with mouse sperm revealed the plasma membrane localization of the PKDREJ protein and confirmed the predicted protein topology with the N-terminus located extracellularly. To examine the functional relevance of PKDREJ in terms of the induction of the sperm acrosome reaction capacitated mouse sperm was incubated with antibodies directed against the PKDREJ N-terminus. We have not observed antibody-induced Ca2+ influx or a significant increase in the fraction of acrosome-reacted sperm. Also, anti-PKDREJ antibodies failed to block ZP-induced acrosome reaction. These observations do not completely exclude a role of PKDREJ for the induction of the acrosome reaction, since the antibodies may neither be able to stabilize an active protein conformation required for transmembrane signaling nor to block relevant epitopes needed for ZP signaling. However, it may be also the first hint for another role of PKDREJ in sperm physiology. Although all other PKD family members are widely expressed, PKDREJ expression was considered to be testis-specific. Investigating non-testicular tissue distribution of PKDREJ we were able to detect the protein in cardiomyocytes and smooth muscles of pulmonary blood vessels; the staining pattern of PKDREJ subcellular localization in both cell types corresponded to transverse tubules (t-tubules). Another site of non-testicular expression was discovered in epithelial cells of kidney and epididymis. In kidney epithelium PKDREJ was co-localized with acetylated -tubulin, a marker of primary cilia. These results open a new direction for the further investigation of PKDREJ that will provide deeper insight into its function and physiological relevance.
description: Die polycystic kidney disease (PKD)-Genfamilie besteht aus acht Genen, deren Rolle in der Zellphysiologie weiterhin zum größten Teil unklar ist. Die zwei zuerst entdeckten Mitglieder dieser Familie, PKD1 und PKD2, sind für die meisten Fälle der autosomal dominanten polyzystischen Nierenerkrankung verantwortlich. Während PKD1 ein zellmembranständiger Rezeptor zu sein scheint, handelt es sich bei PKD2 um einen Kationenkanal, welcher sowohl in der Zellmembran als auch intrazellulär beschrieben wurde. Die vorliegende Studie fokussiert auf polycystic kidney disease and receptor for egg jelly (PKDREJ), ein Protein welches sowohl einen großen rezeptorähnlichen extrazellulären Teil als auch einen mutmaßlichen Ionenkanal beinhaltet. Die Homologie von PKDREJ zu sea urchin receptor for egg jelly (suREJ)- Proteinen, welche wahrscheinlich eine Rolle in der Induktion der akrosomalen Reaktion von Spermatozoen bei Seeigeln spielen, gibt Anlass zu der Spekulation, dass PKDREJ die gleiche Funktion bei Säugetieren erfüllt. Obwohl das PKDREJ-Gen schon 1999 entdeckt wurde, sind seine Eigenschaften und Proteinmerkmale bislang weitestgehend unklar. Diese Studie untersucht das murine PKDREJ-Gen und -Protein und beschreibt erstmalig dessen Struktur, Expression und Lokalisation. Es wird gezeigt, dass PKDREJ stark in testikulärem Gewebe exprimiert wird und diese Expression auf Keimzellen und Spermatozoen beschränkt ist. Nach heterologer Expression in HEK 293-, COS7-, GC-1- und GC-2-Zellen sowie in Xenopus laevis-Eizellen verbleibt PKDREJ intrazellulär in endoplasmatischen Kompartimenten. Da viele bekannte Rezeptoren und Ionenkanäle, ohne spezielle Partner- oder „Adaptor“-Proteine nicht bestimmungsgemäß transportiert werden, wenn man sie in heterologen Systemen exprimiert, wurden Koexpressions-Experimente mit murinem HspA2, einem testisspezifischen Chaperon, PKD2L2, einem PKD2 eng verwandten Ionenkanal, und menschlichem PKD1 und PKD2 durchgeführt. In allen Fällen verblieb PKDREJ intrazellulär, unabhängig davon, ob mit oder ohne Koexpression anderer Proteine. Das Vorhandensein einer GPS-Domäne in der PKDREJ-Aminosäuresequenz gab Anlass, die proteolytische Spaltung in dieser Region zu untersuchen. Dabei charakterisiert diese Arbeit nicht nur biochemische Eigenschaften des PKDREJ-Proteins, sondern gibt auch erste Hinweise auf eine fehlende proteolytische Abspaltung der N-terminalen Proteindomäne. In HEK293-Zellen oder Xenopus laevis-Oozyten exprimiertes PKDREJ wird im Gegensatz zu PKD1 oder suREJ3 nicht in seiner GPS-Domäne gespalten. Außerdem wird eine Erklärung dieses Phänomens, basierend auf der Struktur der GPS-Domäne von PKDREJ und dem autokatalytischem Mechanismus der Spaltung, vorgeschlagen. Um das PKDREJ-Protein in einem nativen System zu untersuchen, wurden PKDREJ-spezifische polyklonale Antikörper entwickelt und charakterisiert. Durch indirekte Immunofluoreszenz war es möglich, PKDREJ in der akrosomalen Region und am inneren Anteil des sichelförmigen murinen Spermienkopfes zu lokalisieren. Zusätzliche Immun-Elektronenmikroskopie mit murinen Spermien zeigte die Lokalisation des PKDREJ-Proteins in der Plasmamembran und sicherte die vorausgesagte Protein-Topologie mit einem extrazellulär liegenden N-Terminus. Um die funktionelle Relevanz von PKDREJ in Hinblick auf die Induktion der akrosomalen Reaktion zu zeigen wurden kapazitierte murine Spermien mit Antikörpern gegen das N-terminale Ende von PKDREJ-Protein inkubiert. Wir konnten keinen antikörperinduzierten Ca2+-Einstrom oder eine signifikante Steigerung des Anteils akrosomreagierter Spermien beobachten. Des weiteren blockierten anti-PKDREJ Antikörper die Zona pellucida (ZP)-induzierte akrosomale Reaktion nicht. Diese Beobachtungen schließen eine Rolle von PKDREJ in der Akrosomreaktion nicht vollständig aus, da die Antikörper eventuell nicht in der Lage sind, eine aktive Proteinkonformation, eine Voraussetzung für die transmembranäre Signalkette, zu stabilisieren oder die relevanten Epitope, die für ZP-Signaltransduktion benötigt werden, zu blockieren. Dennoch könnte diese Arbeit der erste Hinweis einer anderen, noch unbekannten Funktion von PKDREJ in der Physiologie von Spermien sein. Obwohl die Mitglieder der PKD-Familie vielerorts exprimiert werden, galt PKDREJ bislang als hodenspezifisch. Wir konnten auf Proteinebene PKDREJ allerdings in Herzmuskelzellen und Lungenblutgefäßen nachweisen, wobei das Färbemuster von PKDREJ in beiden Zelltypen auf eine Lokalisation an den transversen Tubuli schließen lässt. Weitere nicht-testikuläre Expression wurde in Nierenepithelzellen und im Epididymis entdeckt. Im Nierenepithel war PKDREJ mit acetyliertem α-Tubilin kolokalisiert, einem Marker von primären Zilien. Diese Resultate bilden die Grundlage für weiterführende Untersuchungen zur Funktion und physiologischen Relevanz von PKDREJ.