title: Photoswitchable Peptides as Tools for Lightcontrolled Modulation of Epigenetic Protein Complexes
Creators: name: Albert, Lea
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2020
Subjects: Photoschalter
Epigenetics
Protein-Protein Interactions
MLL1
Chemistry &amp; allied sciences
Chemie
Protein-Protein Interaktion
Peptide
Photoswitches
Leukemia
Epigenetik
Leukämie
Peptides

description: This cumulative thesis consists of two published articles in Chemical Science and ChemBioChem, a submitted manuscript and a published review in Chemical Communications, which provides a detailed overview of photoswitchable peptides capable of modulating biological functions. General aspects as used photoswitches, incorporation techniques and structural precedents are discussed too. Besides the articles, the thesis includes a general overview of epigenetics, which is focused on the methyltransferase MLL1 complex and its inhibitors that target the protein-protein interaction (PPI) MLL1-WDR5. The cumulative part of the thesis is followed by an outlook and conclusions, drawn from the published/submitted manuscripts, and an additional section, which deals with further developments, which were not discussed in the publications. During the last years, we pursued the control of epigenetic states using photoswitchable molecules instead of genetically encoded photoreceptors. For this purpose, we focused on the histone methyltransferase Mixed-Lineage-Leukemia 1 (MLL1) also known as lysine [K]-specific Methyl Transferase 2A (KMT2A), which is a promising target in cancer therapy. Its activity depends on the formation of a protein-protein core complex (MLL1, WDR5, RbBP5, Ash2L, DPY30), where especially the WDR5-MLL1 interaction is of crucial importance. Such PPI is essential to facilitate the MLL1 binding to the RbBP5-Ash2L dimer, needed to maintain the catalytically active conformation of the SET1-domain of MLL1. Based on reported peptides, capable of binding to WDR5, we conceived photoswitchable PPI modulators for altering MLL1 activity. Thus, initially we hypothesized that the incorporation of the classical azobenzene 4-[(4’-aminomethyl)phenyl-azo]benzoic acid (AMPB) into the MLL1-derivative peptide: H2N-SARAEVHLRKS-CONH2 would cause a light-triggered conformational change, which may affect its WDR5 affinity and, thereby, MLL1 activity. Fluorescence polarization (FP)-based experiments revealed that the photoswitchable peptidomimetic H2N-SARA-AMPB-VHLRKS-CONH2 was the most promising candidate of our positional scanning library for the enzymatic activity studies. Hence, this compound displayed the highest affinity window between isomers: Ki (trans) = 1.25 ± 0.36 nM versus Ki (cis) = 6.50 ± 1.4 nM, as well as one order of magnitude tighter binding than the parental MLL1-derivative peptide. Our co-crystal structure (PDB: 5M23) could explain the latter result as a consequence of further stabilization due to an additional hydrogen bond between the first nitrogen of the diazenyl group to the Lys259 as well as van der Waals interactions between the second benzene ring of the AMPB and the Tyr260. Furthermore, our peptidomimetic did not only strongly bind to WDR5 but also inhibited the methylation activity of the MLL1 complex, according to radioactive histone methyltransferase (HMT) assays. Importantly, the difference between isomers was amplified (HMT activity IC50 (trans) = 0.531 ± 0.023 µM; IC50 (cis) = 8.23 ± 0.38 µM), demonstrating for the first time that photoswitchable peptidomimetics can control the activity of histone methyltransferases. The precise control of MLL1 engages a pivotal role in the transcriptional regulation of genes involved in hematopoiesis as H3K4 methylation is associated with transcriptionally active genes. Since MLL1-target genes, such as hox and deptor, are highly overexpressed in MLL-rearranged leukemias, we checked the effect of our peptide on leukemia cell viability. For this purpose, we prepared cell-penetrating versions of the best peptide candidate to explore the modulation of cell growth in leukemia mouse bone marrow cells (MLL-AF9 cells). Cell viability assays verified effective inhibition with a modest, yet clear, difference up to 1.52-fold in the cytotoxic behaviour of isomers (GI50 (trans) = 2.14 ± 0.10 µM, GI50 (cis) = 3.25 ± 0.23 µM). In addition, our most potent inhibitor was tested on its ability to downregulate the expression of deptor via reverse transcriptase real time quantitative PCR (RT-qPCR). These experiments verified that our probe is, indeed, an optoepigenetic inhibitor because it differently downregulated deptor expression levels depending on the photoisomer (relative expression levels of deptor: trans = 0.23 %; cis = 0.36 %, p = 0.008). This proof-of-concept study resulted in an article published in Chemical Science. Once that we demonstrated the potential of photopharmacological inhibition of MLL1 for external epigenetic control, we used this optimized biological system as a platform to improve the photoswitchable peptidomimetics. In particular, we strove for maximizing the difference in biological output between isomers and improving the photochemical properties. Thus, we established the synthesis of two visible-light responsive peptide backbone photoswitches: a Fmoc-protected cyclic azobenzene analogue of 5,6-dihydrodibenzol[c,g][1,2]diazocine (Fmoc-cAzoAA) and a Mtt-ethylenediamine protected tetra-ortho-fluoroazobenzene (Mtt-oF4AzoAA). Apart from avoiding UV irradiation, the oF4Azo switch displayed higher photoconversions than the AMPB derivative (95% cis; 86% trans). However, when they were introduced into the same MLL1-derivative peptide, they did not provide an increased difference in WDR5 binding compared to our former results (H2N-SARA-cAzo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 140 ± 35 nM, Ki (cis) = 207 ± 52nM; H2N-SARA-oF4Azo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 11.8 ± 1.4 nM, Ki (cis) = 30.8 ± 3.3 nM). Structure-activity relationships deduced from crystallization and theoretical calculations revealed substantial differences in the positioning of the azobenzene moieties. This project was published in ChemBioChem, and highlighted as a front cover. Finally, we combined the visible-light oF4Azo with a structurally-defined cyclic scaffold in an attempt to maximize the biological output. Thus, we designed and synthesized 14 photoswitchable cyclic peptide analogues based on the scaffold of the MLL1 inhibitor: MM-401 ((H3C)2CHCO-NH-c[D-Lys-Arg-Abu-D-Phg]#). Following the same workflow, FP-based assays revealed that the candidate (H3C)2CHCO-NH-c[D-Dab-Arg-Abu-D-Phe-oF4Azo]# displayed an increase of 50% in the WDR5 affinity window between isomers (Ki (trans) = 78.6 ± 3.4 nM, Ki (cis) = 7.99 ± 0.79 nM) compared with our linear AMPB peptide. This confirms that a cyclic constrain leads to greater modulation potential than the lineal arrangement. Unlike the linear AMPB peptide, the cis isomer exhibited both higher WDR5 affinity and MLL1 inhibition activity compared to the trans ones: IC50 (trans) = 6.68 ± 3.1 µM; IC50 (cis) = 0.649 ± 0.3 µM. Crystallization studies, molecular docking (MD) in combination with virtual docking (VD) studies, pull-down assays and hydrogen deuterium exchange (HDX) mass spectrometry (MS) corroborated the increased difference in WDR5 affinity, and its effect on the whole MLL1 complex topology. Via HDX-MS, we discovered that the observed activity loss upon cis-cycle addition was yielded by i.a. allosteric rearrangements of the WDR5-RbBP5 binding interface, leading to the inability of the RbBP5-Ash2L dimer to stabilize the open SET1 conformation, which is required for its activity. Importantly, our cyclic PPI modulators presented improved photochromic properties, behaving as a quasi bistable system. Indeed, the photostationary states were stable for at least five months in darkness. Furthermore, we examined whether the loss of MLL1-enzymatic activity could modulate viability of human leukemia cells. Cell permeabilization via a peptide carrier varied for different cell types, and preliminary tests using the same MLL-AF9 cells as in the Chemical Science, proved that such cells were not suitable. The best results were obtained in MOLM-13 cells, where viability differences of trans: 37 %, cis: 0 % at 200 µM and trans: 57 %, cis: 26 % at 100 µM between isomers were detected. To exclude that the observed toxicity arises from the oF4Azo-moiety itself, the enantiomer of our best oF4Azo-containing cyclic peptide, where the Arg was exchanged by a D-Lys (D-Lys variant), was tested upon its effects on cell viability. Besides, a washing step after cargo transfection was included into the experiment to ensure that the observed effects resulted solely from intracellular mechanisms. Such experiments, with the D-Lys variant as a control proved that the detected toxicity is not originated from the oF4Azo-moeity since low cytotoxicity was observed at 100 µM, being even lower with the active cis isomer (viability: trans: 70 %, cis: 91 %). Also, no interaction of the D-Lys variant with WDR5 was detected by FP-based assays. In contrast, the active cis isomer of our best Arg-containing photoswitchable cyclic candidate caused high toxicity under the same conditions, while the trans isomer retained the same effect (viability: cis: 24 %, trans: 66 %). Ultimately, we tested the in vivo effect of our compound on the modulation of hematopoiesis. We chose the zebrafish developmental model, because MLL1 is conserved in zebrafish, and its knock out represses hematopoiesis. This lack of blood flow is observable by o-dianisidine staining. Gratifyingly, we demonstrated that the cis isomer is capable to affect hematopoiesis in 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvea (o-dianisidine staining: 60% highly disrupted, 40% no staining), which displayed curved body axes, heart edema and a lack of response upon touch. In contrast, 100 % of trans incubated larvea, as well as water and DMSO controls, did not exhibit any of these defects at all. The possibility of visible-light isomerization of our novel cyclic peptide allowed us to study whether trans incubated larvae could be in situ activated. Such experiment proved that the high significant differences between isomers could, indeed, be achieved via in situ irradiation to the cis state (o-dianisidine staining: 3% intact, 30% disrupted, 67%: no staining). All these results together demonstrate the possibility of modulating MLL1-dependent hematopoiesis in vivo using cyclic constraint photoresponsive peptides. This project has recently been submitted.
description: Die vorliegende kumulative Dissertationsschrift besteht aus zwei publizierten Manuskripten in Chemical Science und ChemBioChem, einem eingereichten Manuskript und einem veröffentlichten Review in Chemical Communications, welches die optochemische Kontrolle über biologische Prozesse unter Anwendung fotoschaltbarer Peptide behandelt. Außerdem werden in dem Review grundlegende Prinzipen der eingesetzten Fotoschalter, die Techniken ihrer Inkorporierung in Peptide, sowie deren struktureller Eigenschaften diskutiert. Darüber hinaus beinhaltet diese Thesis eine allgemeine Übersicht der Epigenetik. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf dem Methyltransferase MLL1-Komplex und dessen Inhibitoren, welche die Protein-Protein Interaktion (PPI) zwischen MLL1 und WDR5 als Target adressieren. Dem kumulativen Teil folgt ein Fazit und ein Ausblick sowie ein weiterer Abschnitt über zusätzlich durchgeführte Experimente, welche nicht in den Manuskripten diskutiert wurden. Während der letzten Jahre verfolgten wir das Ziel, die Kontrolle über epigenetische Zustände mit Hilfe fotoschaltbarer Peptide zu erlangen. Hierbei lag unser Augenmerk auf der Histon Methyltransferase Mixed-Lineage-Leukemia 1 (MLL1), auch bekannt unter dem Namen Lysin [K]-spezifische Methyl Transferase 2A (KMT2A), einem vielversprechenden Target in der Krebstherapie. Die enzymatische Aktivität von MLL1 ist abhängig von der Formation eines Protein-Protein Komplexes (MLL1, WDR5, RbBP5, Ash2L, DPY30), wobei insbesondere die Interaktion zwischen MLL1 und WDR5 von essentieller Bedeutung ist. Diese PPI ist notwendig um die Bindung des RbBP5-Ash2L Dimers an MLL1 zu gewährleisten und somit die katalytisch aktive offene Konformation der SET1-Domäne von MLL1 zu stabilisieren. Basierend auf bekannten WDR5-bindenden Peptiden haben wir fotoschaltbare Analoga entwickelt, um somit die MLL1-WDR5 Interaktion reversibel zu inhibieren. Zunächst haben wir das klassische Azobenzol 4-[(4’-aminomethyl)phenyl-azo]benzoic acid (AMPB) in ein MLL1 Peptidderivat (H2N-SARAEVHLRKS-CONH2) eingebaut um somit eine lichtgesteuerte Konformationsänderung zwischen den beiden Isomeren zu erzeugen, was letztendlich zu einer kontrollierbaren Inhibierung der MLL1 Aktivität führen sollte. Fluoreszenz-Polarisations (FP) Assays zeigten, dass das Peptid: H2N-SARA-AMPB-VHLRKS-CONH2 den vielversprechendsten Kandidaten unserer Peptid-Bücherei darstellte, da es sowohl die höchste Differenz in Bindungsaffinität zwischen den Isomeren aufwies (Ki (trans) = 1.25 ± 0.36 nM versus Ki (cis) = 6.50 ± 1.4 nM), als auch um eine Größenordnung gesteigerte Affinität zum originalen MLL1 Peptid besaß. Mit Hilfe der Co-Kristallstruktur (PDB: 5M23) konnten wir diese gesteigerte Affinität erklären. So sorgte eine weitere Wasserstoffbrückenbindung des ersten Stickstoffs der N=N-Azo Doppelbindung zum Lys259, sowie van der Waals Interaktionen zwischen dem zweiten Benzolring des AMPBs zum Tyr260 für zusätzliche Stabilität. Weiterhin wies unser Peptid nicht nur eine hohe Bindungsaffinität zu WDR5 auf, sondern war außerdem in der Lage die MLL1 Aktivität zu inhibieren. Hervorzuheben ist, dass die Differenz zwischen den Isomeren auf das 15-fache erhöht werden konnte (HMT Aktivität IC50 (trans) = 0.531 ± 0.023 µM; IC50 (cis) = 8.23 ± 0.38 µM). Dies zeigt erstmalig die lichtgesteuerte Modulierung von Histonmethyltransferasen. Die präzise Kontrolle von MLL1 spielt eine entscheidende Rolle in der Regulierung der Transkription von Genen, welche in der Hämatopoese und Entwicklung involviert sind. So ist die Trimethylierung von Histon 3 Lysin 4 (H3K4) mit transkriptional aktiven Genen assoziiert. Da MLL1 adressierte Gene, wie hox und deptor, in diversen Leukämiearten stark überexprimiert vorliegen, haben wir den Effekt unseres Peptids auf die Viabilität von Leukämie Zellen (MLL-AF9 Maus Knochenmark Zellen) getestet. Hierfür verknüpften wir unsere Verbindung mit zellpenetrierenden Peptiden (Cell Penetrating Peptides, CPPs), um die Aufnahme in die Zelle zu gewährleisten. Die Zell-Viabilitäts Assays verifizierten die effektive Inhibierung des Zell-Wachstums mit einem deutlichen Unterschied zwischen den beiden Isomeren bis zu einem Faktor von 1.52 (GI50 (trans) = 2.14 ± 0.10 µM, GI50 (cis) = 3.25 ± 0.23 µM). Schließlich testeten wir, anhand von Reversibler Transkriptase Echtzeit quantitativer PCR (RT-qPCR), ob unser vielversprechendster Kandidat in der Lage ist, die Transkription des MLL1 assoziierten Gens deptor zu regulieren. Erfreulicherweise bewiesen diese Experimente, dass unser Peptid tatsächlich als optoepigenetischer Inhibitor dient, da er die Expression von deptor, abhängig vom Fotoisomer, herabreguliert (relative Expressionslevel von deptor: trans = 0.23%; cis = 0.36%, p = 0.008). Diese proof-of-concept Ergebnisse wurden in Chemical Science veröffentlicht. Nachdem das Potential der fotopharmakologischen Inhibierung von MLL1 etabliert war, wollten wir diese optimierte biologische Plattform nutzen, um unsere fotoschaltbaren Peptide weiter zu entwickeln. Spezifisch formuliert, sollte die Differenz des biologischen Outputs zwischen den Isomeren vervielfältigt, sowie die fotochromen Eigenschaften verbessert werden. Folglich haben wir die Synthese zweier neuartiger fotoschaltbarer Aminosäurebausteine entwickelt: ein Fmoc-geschütztes cyclisches Azobenzolanalogon von 5,6-dihydrodibenzol[c,g][1,2]diazocine (Fmoc-cAzoAA) sowie ein Mtt-ethylenediamin geschütztes tetra-ortho-fluoroazobenzol (Mtt-oF4AzoAA). Abgesehen von der Vermeidung von UV-Licht für die Isomerisierung, weist der oF4Azo Fotoschalter höhere Fotokonversionen auf als der vorige AMPB Schalter (95% cis; 86% trans). Inkorporierung in dasselbe MLL1 Peptid führte jedoch nicht zu einer erhöhten Differenz in WDR5-Bindungdaffinität zwischen den Isomeren (H2N-SARA-cAzo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 140 ± 35 nM, Ki (cis) = 207 ± 52nM; H2N-SARA-oF4Azo-VHLRKS-CONH2 Ki (trans) = 11.8 ± 1.4 nM, Ki (cis) = 30.8 ± 3.3 nM). Struktur-Aktivitäts Relationen (SARs), abgeleitet von Kristallisationsstudien, sowie theoretischen Berechnungen wiesen erhebliche Unterschiede in der Positionierung der Azobenzoleinheiten auf. Dieses Projekt wurde in ChemBioChem veröffentlicht und als Front Cover ausgezeichnet. Schließlich kombinierten wir den oF4Azo Fotoschalter mit einem strukturell definierten Grundgerüst, um somit die Differenz zwischen den Isomeren zu maximieren. Basierend auf dem Grundgerüst des MLL1 Inhibitors MM-401: ((H3C)2CHCO-NH-c[D-Lys-Arg-Abu-D-Phg]#) wurden insgesamt 14 cyclische Peptidderivate entworfen und synthetisiert. FP-basierte Assays zeigten, dass der Kandidat: (H3C)2CHCO-NH-c[D-Dab-Arg-Abu-D-Phe-oF4Azo]# eine Zunahme der WDR5-Affinitätsdifferenz zwischen Isomeren (Ki (trans) = 78.6 ± 3.4 nM, Ki (cis) = 7.99 ± 0.79 nM) um 50% im Vergleich zu unserem vorigen AMPB-Peptid aufwies. Dies bestätigte, dass cyclische Grundgerüste zu erhöhten Modulationspotentialen führen als lineare Analoga. Im Gegensatz zum linearen AMPB-Peptid zeigte das cis Isomer sowohl eine höhere WDR5-Affinität, als auch bessere MLL1-Inhibierungskapazitäten im Vergleich zum trans Isomer: IC50 (trans) = 6.68 ± 3.1 µM; IC50 (cis) = 0.649 ± 0.3 µM. Kristallisations-studien sowie molekulare Dynamik-Simulationen (MD) kombiniert mit virtuellen Dockingstudien (VD), Pull-Down Assays und Wasserstoff-Deuteriumaustausch (Hydorgen Deuterium Exchange, HDX) verifizierten die Verbesserung der WDR5-Affinitäts Differenz sowie dessen Auswirkung auf die gesamte MLL1-Komplex Topologie. Mit Hilfe von HDX-MS Experimenten konnten wir zeigen, dass der Aktivitätsverlust durch Zugabe unseres cis Inhibitors unter anderem durch allosterische Umlagerungen der WDR5-RbBP5 Bindungsstelle hervorgerufen wird. Dies hat möglicherweise zur Folge, dass das RbBP5-Ash2L-Dimer nicht weiter in der Lage ist, die katalytisch aktive Konformation der SET1-Domäne von MLL1 zu stabilisieren, was zu deren Aktivitätsverlust führt. Des Weiteren besitzen unsere cyclischen Peptidkandidaten verbesserte photochrome Eigenschaften und verhalten sich wie ein quasi-bistabiles System. In der Tat sind beide Isomere bis zu fünf Monate beständig. Darüber hinaus haben wir untersucht, ob der Verlust der enzymatischen Aktivität von MLL1, die Viabilität menschlicher Leukämiezellen modulieren kann. Die Aufnahme in die Zelle, mit Hilfe eines Carrier-Peptids, variierte für verschiedene Zelltypen. So erwies sich die MLL-AF9 Zelllinie, welche für die Experimente im Chemical Science verwendet wurde, als untauglich. Die besten Ergebnisse wurden hingegen mit MOLM-13 Zellen erzielt, bei welchen Viabilitätsunterschiede von: trans: 37%, cis: 0% bei 200 µM and trans: 57%, cis: 26% bei 100 µM festgestellt wurden. Um auszuschließen, dass die beobachtete Toxizität von der oF4Azo Einheit selbst herrührt, wurde das Enantiomer unseres besten cyclischen Peptids, bei dem zusätzlich das Arg mit einem D-Lys substituiert wurde (D-Lys Variante), für die Zell Experimente eingesetzt. Zusätzlich wurde ein extra Waschschritt der Zellen nach der Cargo-Transfektion eingebaut, um sicherzustellen, dass die erfassten Effekte ausschließlich von intrazellulären Mechanismen resultieren. Diese Experimente mit der D-Lys Variante, welche außerdem keine WDR5 Affinität aufweist, bewiesen, dass die Toxizität nicht von der oF4Azo Einheit herrührt, da bei 100 µM eine geringe Toxizität beobachtet wurde, welche noch geringer für das aktive cis Isomer ausfiel (Viabilität: trans: 70%, cis: 91%). Im Gegensatz dazu verursachte das aktive cis Isomer unseres besten Arg-beinhaltendem Kandidaten unter gleichen Bedingungen eine hohe Toxizität, während das trans Isomer gleichbleibende Effekte aufwies (Viabilität: trans: 66%, cis: 24%). Schließlich wollten wir den in vivo Effekt unseres fotoschaltbaren Inhibitors auf die Modulierung von Hämatopoese untersuchen. Aufgrund der Konservierung von MLL1 haben wir uns hierbei für das Zebrafisch Modell entschieden. Dort ist bekannt, dass MLL1 Knockout zur Unterdrückung der Hämatopoese führt, was anhand eines verminderten Blutflusses mit Hilfe von o-Dianisidine Färbung beobachtet werden kann. Unsere Experimente konnten bestätigen, dass das cis Isomer die Hämatopoese in 3 dpf (days post fertilization) Zebrafischen beeinflusst (o-Dianisidine Färbung: 60% stark gestört, 40% keine Färbung). Außerdem wiesen cis inkubierte Zebrafische gekrümmte Körperachsen, Herzödeme und mangelndes Reaktionsvermögen auf. Im Gegensatz dazu wiesen 100% der trans inkubierten, sowie DMSO- und Wasser Kontrollfische keine dieser Defekte auf. Die Isomerisierung unseres Peptids mit sichtbarem Licht ermöglichte uns, zu untersuchen ob trans inkubierte Zebrafische in situ aktiviert werden können. Mit Hilfe dieses Experiments konnten wir beweisen, dass die signifikanten Unterschiede zwischen den Isomeren tatsächlich durch in situ Bestrahlung zum aktiven cis Isomer erreicht werden können (o-Dianisidine Färbung: 3% intakt, 30% gestört, 67%: keine Färbung). Zusammengenommen präsentieren unsere Ergebnisse die Möglichkeit der in vivo Modulierung von MLL1-abhängiger Hämatopoese unter Verwendung cyclischer fotoschaltbarer Peptide. Dieses Projekt wurde kürzlich eingereicht.