Κατασκευή γενετικών εργαλείων για την μελέτη της μεταγραφικής δραστηριότητας των υποκινητών p1 και p2 του γονιδίου TP53
Creators: name: Νικολόπουλος, Θεόδωρος Θωμάς Δημητρίου
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2023
Subjects: Ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53
Υποκινητής p1 του γονιδίου TP53
Ανασυνδυασμένος πλασμιδιακός φορέας pcDNA3.1 (+) p1 – IRES GFP
Tumor suppressor protein p53
p1 promoter of the TP53 gene
Recombinant vector pcDNA3.1 (+) p1 – IRES GFP

description: Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 αποτελεί έναν κομβικό ρυθμιστή των μονοπατιών κυτταρικής σηματοδότησης που καθορίζουν την μοίρα του κυττάρου καθώς ρυθμίζει την μεταγραφή γονιδίων που συμμετέχουν στην απόπτωση, στην παύση του κυτταρικού κύκλου και στην κυτταρική γήρανση. Η p53 δρα ως τετραμερές και ενεργοποιείται ως απόκριση σε κυτταρικό στρες και κυρίως σε βλάβη του DNA. Στον άνθρωπο, η p53 απαντάται σε 12 ισομορφές, οι μισές εκ των οποίων μεταγράφονται από τον μείζων υποκινητή, ενώ οι υπόλοιπες (Δ133,Δ160) μεταγράφονται από έναν εσωτερικό υποκινητή p2. Ο κρίσιμος ρόλος των ισομορφών στην ρύθμιση της σηματοδότησης μέσω p53 διαφαίνεται μέσω της διαφοράς στα επίπεδα έκφρασης κάθε ισομορφής σε διάφορες μορφές καρκίνου. Εικάζεται ότι η μεταγραφική ενεργότητα των υποκινητών p1 και p2 του γονιδίου TP53 διαφέρει ανάλογα με την κυτταρική κατάσταση και αυτό αντανακλάται στην έκφραση των ισομορφών. Σκοπός της εργασίας είναι η δημιουργία ενός γενετικού εργαλείου που να αναδεικνύει την μεταγραφική ενεργότητα του υποκινητή p1 του γονιδίου TP53 σε διαφορετικές κυτταρικές συνθήκες, μέσω της έκφρασης μίας πρωτεΐνης αναφοράς. Η περιοχή του υποκινητή p1 κλωνοποιήθηκε στο φορέα έκφρασης pcDNA3.1 (+) IRES-GFP, ανοδικά του γονιδίου αναφοράς GFP. Η λειτουργικότητα του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου ελέγχθηκε μέσω διαμόλυνσης των ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών A549 και MRC5. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι το κλωνοποιημένο τμήμα που περιέχει τον υποκινητή p1 είναι ενεργό και παρουσιάζει ισχυρότερη μεταγραφική ενεργότητα στην κυτταρική φυσιολογική σειρά MRC5 σε σύγκριση με την καρκινική σειρά A549. Το γενετικό αυτό εργαλείο μπορεί να αξιοποιηθεί για τον ποιοτικό χαρακτηρισμό της ενεργότητας του υποκινητή p1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και συνθήκες
description: Tumor suppressor protein 53 (p53) is a pivotal regulator of cell signaling transduction pathways that determine cell fate by regulating the transcription of genes involved in apoptosis, cell cycle arrest, and cellular senescence. p53 acts as a tetramer it’s activity is induced upon cellular stress and DNA damage. In humans, p53 occurs in 12 isoforms, half of which are transcribed from the major external promoter (p1), while the remainder (Δ133,Δ160) are transcribed from an internal (p2) promoter. The critical role of isoforms in regulating p53 signaling is demonstrated by the difference in expression levels of each isoform in different cancers. It is hypothesized that the transcriptional activity of the p1 and p2 promoters of the TP53 gene differs depending on the cellular state with this being reflected in the expression of the isoforms. The aim of this project is to engineer a genetic tool that highlights the p1 promoter’s transcriptional activity of the TP53 gene in a variety of cellular conditions through the expression of a reporter gene. The p1 promoter region was cloned into the pcDNA3.1 (+) IRES-GFP expression vector, upstream of the GFP reporter gene. Efficacy of the recombinant plasmid was tested by transfection of the eukaryotic cell lines A549 and MRC5. The results of the study showed that the cloned fragment containing the p1 promoter is active and exhibits stronger transcriptional activity in the normal MRC5 cell line compared to the A549 cancer line. This genetic tool can be exploited to qualitatively characterize p1 promoter activity in different cell lines and conditions