title: Site-specific phosphorylation of yeast RNA polymerase I
Creators: name: Gerber, Jochen
Publisher: name: Universität Regensburg
Year: 2008
Subjects: subject: RNS-Polymerase I , Saccharomyces cerevisiae , Phosphorylierung , MALDI-MS , Ortspezifische Mutagenese , , RNA polymerase I , yeast , phosphorylation , MALDI-MS , site-directed mutagenesis
subject: 570 Biowissenschaften, Biologie

description: A tight control of ribosome biogenesis in dependence of the growth conditions is crucial for the economics of a cell. Signal transduction cascades forward the status of environmental factors to several key regulatory steps via reversible phosphorylation. As one of the first steps of ribosome biogenesis, the transcription of the 35S rRNA precursor by RNA polymerase I (Pol I) is also one of the main targets for regulation. In logarithmically growing Saccharomyces cerevisiae cells, five of the fourteen Pol I subunits were found to be phosphorylated in vivo (A190, A43, A34.5, ABC23 and AC19) to a total content of about 15 ± 3 phosphate groups per enzyme. Further in vivo and in vitro studies showed that the activity of Pol I is linked to its phosphorylation status. However, little is known about the positions and functions of the single Pol I phosphorylation sites. In this study the site-specific phosphorylation of yeast Pol I was analyzed using a combination of chemical derivatization and LC-MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Prerequisite was the development of a rapid method to purify Pol I while maintaining its phosphorylation status. The resulting enzyme preparations were active in promoter-independent transcription assays and the purity was suitable for structural analyses by the cooperating research group of Patrick Cramer. A total of 13 phosphoserines and �threonines were identified on the in vivo modified subunits. Five of these were confirmed by independent proteome-wide phosphorylation analyses which employed alternative methods and additionally provided four other sites. A Pol I homology model facilitated the three-dimensional localization of seven phosphorylation sites in the new cryo-EM structure. The single phosphoresidues were systematically mutated to alanine or aspartate to mimic constitutively dephosphorylated or phosphorylated states, respectively, and the resulting yeast strains were analyzed using in vivo assays. Surprisingly all Pol I phosphorylations analyzed were found to be non-essential posttranslational modifications. None of the mutants showed a detectable growth phenotype with one exception: mutation of A190 S685 to aspartate resulted in a lowered sensitivity to the NTP-depleting drug 6-azauracil (6AU) compared to the isogenic wild-type or the analogous mutation to alanine. This drug is commonly used to investigate defects associated to the elongation phase of RNA transcription. Strikingly, in a related study by Alarich Reiter the same mutation of phosphorylation site A190 S685 to aspartate but not to alanine was found to be synthetic lethal with the non-essential TFIIS-like Pol I subunit A12.2 which was described to function in transcription elongation, 3� RNA cleavage and transcription termination. The data suggest a role of the reversible phosphorylation at A190 S685 in modulating one these functions. Furthermore a mutation of the TFIIS-like domain of A12.2 was created to analyze its role in the intrinsic Pol I RNA cleavage activity. Unexpectedly this mutation of the non-essential A12.2 was found to result in a lethal phenotype, possibly due to a dead end situation. Under the control of an inducible promoter, this mutant should provide a useful tool for the elucidation of the RNA cleavage process.
description: Eine strikte Kontrolle der Ribosomen Biogenese in Abhängigkeit der Wachstumsbedingungen ist entscheidend für den Energiehaushalt einer Zelle. Signal-Transduktions-Kaskaden übermitteln die Umweltbedingungen an mehrere Schlüsselstellen mittels reversibler Phosphorylierung. Die Transkription der 35S Vorläufer rRNA durch die RNA Polymerase I (Pol I) ist, als einer der ersten Schritte der Ribosomen Biogenese, auch einer der Hauptangriffspunkte zur Regulation. In logarithmisch wachsenden Zellen der Hefe Saccharomyces cerevisiae werden fünf der vierzehn Pol I-Untereinheiten in vivo phosphoryliert (A190, A43, A34.5, ACB23 und A34.5). Insgesamt gibt es etwa 15 ± 3 Phosphatgruppen pro Enzym. In vivo und in vitro Studien zeigten, dass die Aktivität der Pol I mit ihrem Phosphorylierungsstatus verknüpft ist, jedoch gibt es nur wenige Informationen über die Positionen und die Funktionen der einzelnen Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde die orts-spezifische Phosphorylierung der Pol I durch eine Kombination von chemischer Derivatisierung und LC-MALDI-TOF/TOF Massen-spektrometrie untersucht. Vorraussetzung hierfür war die Entwicklung einer Methode zur schnellen Reinigung der Pol I, welche den Phosphorylierungsstatus erhält. Die Enzympräparationen waren aktiv in Promoter-unabhängigen Transkriptions-Tests und der Reinheitsgrad war geeignet für Strukturanalysen, die in Zusammenarbeit mit der Forschungsgruppe von Patrick Cramer durchgeführt wurden. Insgesamt wurden 13 Phosphoserine und �threonine in den fünf in vivo modifizierten Untereinheiten identifiziert. Fünf davon wurden durch unabhängige proteomweite Phosphorylierungsanalysen bestätigt, welche alternative Methoden verwendeten und zusätzlich vier weitere Stellen identifizierten. Ein Pol I Homologie-Modell ermöglichte die dreidimensionale Lokalisierung von sieben Phosphorylierungsstellen innerhalb der neuen Cryo-EM Struktur. Die einzelnen Phosphoaminosäuren wurden systematisch zu Alanin oder Aspartat mutiert um konstitutiv dephosphorylierte bzw. phosphorylierte Stadien zu imitieren, und die daraus hervorgehenden Hefestämme wurden mittels in vivo Analysen untersucht. Überraschenderweise sind alle untersuchten Pol I Phosphorylierungen nicht-essentielle post-translationale Modifikationen. Keine der Mutanten zeigte einen erkennbaren Wachstums-Phänotyp, mit einer Ausnahme: Verglichen mit einem isogenen Wildtyp Stamm oder einer analogen Mutation zu Alanin, resultierte die Mutation von A190 S685 zu Aspartat in einer geringeren Sensitivität gegenüber 6-Azaurazil (6AU), welches den zellulären NTP-Vorrat abreichert. Diese Chemikalie wird häufig verwendet um Defekte in der Elongationsphase der Transkription zu untersuchen. Auffallenderweise wurde in einer begleitenden Studie von Alarich Reiter die synthetische Letalität zwischen der gleiche Mutation der Phosphorylierungsstelle A190 S685 zu Aspartat und der nicht-essentiellen Pol I Untereinheit A12.2 festgestellt, welche Funktionen in Transkriptions Elongation, 3� RNA Spaltung und Transkriptions Termination hat. Die Daten lassen eine Beteiligung der reversiblen Phosphorylierung von A190 S685 an einer dieser Funktionen vermuten. Des Weiteren wurde eine Mutation in der TFIIS-ähnlichen Domäne von A12.2 generiert um deren Rolle in der intrinsischen 3� RNA-Spaltaktivität der Pol I zu untersuchen. Unerwarteterweise resultiert diese Mutation der nicht-essentiellen Untereinheit A12.2 in einem letalen Phänotyp. Unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters könnte diese Mutante ein wertvolles Werkzeug für weitere Untersuchungen des Mechanismus der Pol I RNA-Spaltaktivität darstellen.