title: Exploring cell-free synthesis for oligomeric membrane proteins: a promising platform technology
Creators: name: Ullrich, Jessica
Publisher: name: Technische Universität Berlin
Year: 2024
Subjects: subject: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::615 Pharmakologie, Therapeutik
subject: 500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
subject: cell-free protein synthesis
subject: membrane proteins
subject: ion channels
subject: G-protein coupled receptors
subject: membranes

description: Membrane proteins (MPs) play a central physiological role in nature and represent the primary class of molecular targets for pharmaceutical intervention. Accordingly, the understanding and effective biotechnological utilization of this protein class are of crucial importance for advancing progress in science and medicine. However, recombinant cell-based expression and downstream processing of MPs face several challenges, including cytotoxic side effects, protein aggregation, and limited functionality. To address these challenges, this thesis investigates the applicability of eu-karyotic cell-free protein synthesis (CFPS) as a transformative platform technology for producing oligomeric MPs with pharmacological relevance. This approach utilizes translationally active lysates derived from the insect cell line Spodoptera frugiperda 21, harboring endogenous endoplasmic reticulum-derived membrane structures. This thesis is structured into three distinct sections, aiming to evaluate the applicability of the CFPS platform for complex MPs, with a particular emphasis on ion channels and G protein-coupled re-ceptors (GPCRs): Firstly, the capacity of the CFPS platform for synthesizing post-translationally modified and ho-modimeric MPs within the microsomal environment is assessed, with a focus on the potassium channels TREK-2 and TWIK-1. Therefore, the applicability of CFPS for conducting pharmacological and functional screenings targeting oligomeric interfaces is demonstrated, leveraging its open and modular character. This reveals the successful heteromeric, coposttranslational assembly of TREK-2 with TWIK-1. In conclusion, this study not only assesses the functional integrity of the synthesized proteins, but also reveals a novel interaction, demonstrating the utility of the platform for in-depth studies of protein oligomerization mechanisms without cellular boundaries. In the second section, an innovative approach is presented in which, for the first time, styrene-maleic acid (SMA) copolymers are integrated into the CFPS system to solubilize oligomerized MPs. This method successfully solubilizes TWIK-1, showcasing the efficiency of SMAs in preserving the oligomerization and functionality of MPs within the native-like membrane context. The final section of the thesis showcases the CFPS platform's applicability in synthesizing non-covalent dimeric GPCRs, exemplified by the heterodimeric γ-aminobutyric acid receptor B (GABAB). Using a series of biochemical and biophysical assays, the research confirms the assembly and func-tionality of this complex, oligomeric MP, highlighting the platform's potential for pharmacological studies targeting heteromeric GPCRs. In conclusion, this thesis confirms CFPS as a versatile and powerful tool for the production and characterization of oligomeric, pharmacologically relevant MPs. By demonstrating its ability to facil-itate detailed studies of protein-protein interactions and maintain the physiological properties of the synthesized MPs, this work paves the way for scientific investigations and development.
description: Membranproteine (MPs) haben eine zentrale physiologische Funktion in der Natur und stellen eine der wichtigsten Klassen molekularer Ziele für pharmazeutische Interventionen dar. Dementsprechend ist das Verständnis und die biotechnologische Nutzung dieser Proteinklasse von entscheidender Bedeutung für den wissenschaftlichen Fortschritt. Die rekombinante zellbasierte Expression und die nachgeschaltete Verarbeitung dieser MPs sind aufgrund der zytotoxischen Nebenwirkungen, Proteinaggregation und eingeschränkter Funktionalität häufig limitiert. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, wird in dieser Arbeit die Anwendung der eukaryotischen zellfreien Proteinsynthese (CFPS) als transformative Plattformtechnologie für die Herstellung oligomerer MPs mit pharmakologischer Relevanz validiert. Bei diesem Ansatz werden translationsaktive Lysate basierend auf der Insektenzelllinie Spodoptera frugiperda 21 verwendet, die endogene, vom endoplasmatischen Retikulum stammende Membranstrukturen enthalten. Die vorliegende Arbeit ist in drei Abschnitte gegliedert, die darauf abzielen, die Anwendbarkeit von CFPS als Plattformtechnologie für komplexe MPs zu bewerten, wobei der besondere Schwerpunkt auf Ionenkanälen und G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) liegt: Zunächst wird die Fähigkeit der CFPS-Plattform zur Synthese von posttranslational modifizierten und homodimeren MPs in der mikrosomalen Umgebung bewertet, wobei der Schwerpunkt auf den Kaliumkanälen TREK-2 und TWIK-1 liegt. Anschließend wird die Anwendbarkeit von CFPS für die Durchführung pharmakologischer und funktioneller Screenings von Oligomeren unter Nutzung des offenen und modularen Charakter ohne zelluläre Grenzen demonstriert. Dabei wird erstmals die heteromere, post-translationale Assemblierung von TREK-2 mit TWIK-1 beschrieben. Zusammenfassend untersucht diese Studie nicht nur die funktionelle Integrität der synthetisierten Proteine, sondern deckt auch neu-artige Wechselwirkungen zwischen ihnen auf und demonstriert damit den Nutzen der Plattform für eingehende Studien von Protein-Oligomerisierungsmechanismen. Im zweiten Abschnitt wird ein innovativer Ansatz vorgestellt, bei dem zum ersten Mal Styrol-Malein-säure-Copolymere (SMA) in der CFPS-Plattform benutzt werden um oligomerisierte MPs zu solubilisieren und gleichzeitig ihre nativ-ähnliche Umgebung zu erhalten. Mit dieser Methode wurde assemblier-tes TWIK-1 erfolgreich solubilisiert, was die Effizienz von SMAs bei der Erhaltung der Oligomerisierung und der Funktionalität von MPs in einem zellfreien Kontext und dem entscheidenden Lipidkontext un-ter Beweis stellt. Der dritte Abschnitt zeigt die Anwendbarkeit der CFPS-Plattform für die Synthese eines nicht-kovalenten GPCRs am Beispiel des heterodimeren γ-Aminobuttersäure-Rezeptors B (GABAB). Mithilfe einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Tests werden die Assemblierung und die Funktionalität dieses komplexen, oligomeren Proteins bestätigt, was das Potenzial der Plattform für pharmakologische Studien an GPCRs unterstreicht. Zusammenfassend qualifiziert diese Arbeit die CFPS-Plattform als ein vielseitiges und leistungsstarkes Werkzeug für die Herstellung und Charakterisierung oligomerer, pharmakologisch relevanter MPs. Durch den Nachweis seiner Fähigkeit, detaillierte Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu ermöglichen unter Beibehaltung der physiologischen Eigenschaften, ebnet diese Arbeit den Weg für nachfolgende wissenschaftliche Untersuchungen und Entwicklungen.