title: Structure based design and characterization of TGT inhibitors, a putative target for therapy of Shigellosis
title: Strukturbasierte Entwicklung und Charakterisierung von Inhibitoren der TGT,ein mögliches Ziel zur Therapie der Bakterienruhr
title: Strukturbasierte Entwicklung und Charakterisierung von Inhibitoren der TGT,ein mögliches Ziel zur Therapie der Bakterienruhr
Creators: name: Ehrmann, Frederik Rainer
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Homodimer
Proteine
Generalities
Allgemeines, Wissenschaft
Homodimer, Kristallisation
Inhibitor
Drug design, Shigellosis
Bakterienruhr
Arzneimitteldesign
TGT

description: Das Zielenzym TGT hat eine
      essentielle Bedeutung für die Pathogenese der entzündlichen
      Darmerkrankung Bakterienruhr, die durch Shigellen verursacht
      wird. Die TGT tauscht dazu die Purinbase Guanin in der Wobble
      Position-34 von verschiedenen tRNAs durch die modifizierte
      Base preQ1 aus. Die von den Purinbasen abgeleiteten
      lin-Benzoguanin Inhibitoren binden im aktiven Zentrum der
      Basenaustauschreaktion. Durch Anfügen von Substituenten
      können die benachbarten Ribose-33 und Ribose-34-Taschen
      adressiert werden. In zwei Studien wurden die Wassernetzwerke
      der genannten Seitentaschen ladungsneutral durch
      Monosaccharid-Substituenten der lin-Benzoguanin Inhibitoren
      adressiert und verdrängt. Dabei binden die
      Furanosyl-Substituenten räumlich gesehen in einer
      vergleichbaren Region wie die Phosphatgruppe-35 des
      natürlichen tRNA-Substrats. Dies lässt den Rückschluss zu,
      dass Furanoside als mögliche Surrogate für die Adressierung
      von Phosphatbindetaschen geeignet sind. Da die TGT nur als
      Homodimer das natürliche tRNA-Substrat modifiziert, kommen
      als Inhibitionsmechanismen sowohl die Blockierung des aktiven
      Zentrums, als auch die Störung der dimeren Quartärstruktur
      der TGT, in Frage. Die Kontaktfläche der zwei TGT Monomere
      liegt in unmittelbarer Nähe zu der Ribose-34-Tasche. Bei der
      Analyse der Kokristallstrukturen der Furanosyl-substituierten
      Inhibitoren fiel auf, dass durch Adressierung des hydrophoben
      Bereichs der Seitentasche ein angrenzendes Loop-Helix Motiv
      in seiner geometrischen Integrität gestört wird. Da dieses
      Motiv entscheidend zur Dimerstabilität beiträgt und die
      Umlagerungen nur in Kokristallstrukturen auftreten, wurden in
      einer vertieften Studie bereits charakterisierte Liganden
      kokristallisiert, von denen zuvor nur eine durch die
      Soaking-Methode erhaltene Kristallstruktur vorlag. Die
      Analyse dieser Kokristallstrukturen offenbarte zum einen
      andere Bindungsmodi als in den Soaking-Kristallstrukturen und
      bestätigte zum anderen weitere Liganden, die das Interface
      der TGT stören. Die Dimer-destabilisierende Wirkung dieser
      Liganden wurde durch native Massenspektroskopie bestätigt.
      Ein Ligand induziert durch seine Bindung eine neuartige
      Ausrichtung des TGT-Dimers (verdrehtes Dimer), welche
      offensichtlich aufgrund der verdrehten Neuausrichtung nicht
      mehr katalytisch aktiv sein kann. In einer Folgestudie
      konnten drei Inhibitoren charakterisiert werden, die
      ebenfalls die Dimerisierung der TGT stören. Zwei dieser
      Verbindungen kokristallisieren sowohl in dem konventionellen,
      als auch in dem verdrehten Dimer. Eine weitere Studie
      verfolgte den Prodrug-Ansatz. Da die
      lin-Benzoguanin-Inhibitoren nicht membrangängig sind, wurde
      das Grundgerüst mit unterschiedlichen Carbamat-Substituenten
      versehen. Infolge konnten PAMPA-Messungen zum ersten Mal
      membrangängige Liganden der TGT bestätigen. In einer Art
      retrospektiven Arbeit wurden die Bindungsbeiträge der
      Aminosäuren der Guanin 34/preQ1 Tasche auf die Affinitäten
      der untersuchten Liganden aufgeklärt. Anhand von
      Benzimidazol-Derivaten wurde eine zuvor durch eine
      MD-Simulation prognostizierte Taschenerweiterung erstmals in
      Kokristallstrukturen experimentell bestätigt. Sowohl
      Hydrazid-, als auch Guanidin-Substituenten des
      Benzimidazol-Grundkörpers, stabilisieren aufgrund ihres
      sterischen Drucks auf Asp156 und der Solvatisierung von
      Gln203 und Gly230 die transiente Taschenerweiterung. In
      zukünftigen Designzyklen könnten die Guanidin-Benzimidazole
      derivatisiert werden, um den neuen Hohlraum zu adressieren
      und so neue Affinitätspotentiale zu nutzen. Ein weiteres
      Projekt verfolgte die Charakterisierung eines
      Nukleosidderivats, welches als mögliches
      Übergangszustand-Analogon die Basenaustauschreaktion der TGT
      inhibiert. Der entwickelte Deazaguanin-basierte Inhibitor
      stellt eine neue Verbindungsklasse und mögliche Leitstruktur
      dar, die in Zukunft die etablierten lin-Benzoguanine ablösen
      könnte. In einem größer angelegten Projekt wurde von neun
      Kristallographen der AG Klebe die in-house Fragmentbibliothek
      durch Soaking-Kristallstrukturen an das Zielenzym
      Endothiapepsin röntgenkristallographisch durchgemustert. Von
      361 Soaking Kristallstrukturen wurden 71 Komplexstrukturen
      (Trefferquote 20%) erhalten. Im Zuge dieses Projektes wurde
      auch ein standardisiertes Verfeinerungsprotokoll entwickelt,
      welches die Identifizierung von Fragmenten in
      Kristallstrukturen optimiert und automatisiert. Aufgrund der
      strukturellen Information der Fragmente in den
      Kristallstrukturen konnten zum einen neue funktionelle
      Gruppen zur Adressierung der katalytischen Diade, als auch
      drei Hotspots abseits des aktiven Zentrums, identifiziert
      werden. Neben der Demaskierung eines falsch-positiven
      Treffers aus biophysikalischen Screening-Verfahren, wurde
      auch offensichtlich, dass die in der Praxis häufig
      verwendeten biophysikalischen Methoden zum Vor-Screening von
      Fragmentbibliotheken die Anzahl der Treffer und somit
      mögliche Röntgenkomplexstrukturen nicht unbedingt erhöht
      sondern gegebenenfalls reduziert.
description: The target enzyme TGT is essential
      for the molecular pathogenesis of the inflammatory disease
      Shigellosis, which is caused by Shigella spp. Incorporation
      of modified nucleobases into tRNA are required to develop
      pathogenicity of Shigella. Therefore, TGT replaces the purine
      base guanine in the wobble position-34 of
      tRNAsAsn,Asp,His,Tyr by the modified base preQ1. The
      lin-benzoguanine inhibitors derived from purine bases bind in
      the active site of the base exchange reaction. By attaching
      substituents, the adjacent specificity pockets ribose 33 and
      ribose 34 can be addressed, respectively. In two studies, the
      water clusters of the named pockets were addressed and
      displaced by charge neutral monosaccharide substituents of
      the lin-benzoguanine inhibitors. Thereby, the
      furanosyl-substituents bind in comparable region as the
      phosphate group-35 of the natural tRNA substrate. This
      implies that furanosides might be a surrogate to target
      phosphate binding sites. As TGT modifies the natural tRNA
      substrate only as a homodimer, both, blocking of the active
      site and disturbing the dimeric quaternary structure of the
      TGT can be considered as inhibition mechanisms. The contact
      surface of the two TGT monomers is in close proximity to the
      ribose-34 pocket. Upon analyses of the co-crystal structures
      of the furanosyl-substituted inhibitors it became obvious,
      that by addressing the hydrophobic region of the side pocket,
      an adjacent loop helix motif was disturbed and lost its
      geometric integrity. This disturbance is associated with
      rearrangements of up to 20 amino acids. As this motif
      decisively contributes to the dimeric stability and
      rearrangements are only visible in co crystal structures,
      previously characterized ligands have been newly
      co-crystallized in an elaborate study, as only crystal
      structures obtained by the soaking method were available. The
      analysis of these co crystal structures revealed on the one
      hand different binding poses compared to the soaking
      structures and on the other hand confirmed further ligands
      that interfere with TGT interface. The dimer-disturbing
      effect of these ligands has been confirmed by native mass
      spectroscopy. One ligand caused a complete rearrangement of
      TGT monomer units (twisted dimer), leading to an arrangement
      obviously no longer catalytical active with twisted subunit
      packing. In a follow-up study, three inhibitors could be
      characterized, which also interfere with the dimerization of
      TGT. Two of these compounds co crystallized in both, the
      conventional and the twisted dimer, respectively. Another
      study followed a prodrug approach. As the lin-benzoguanine
      inhibitors do not diffuse through membranes, the scaffold was
      modified with different carbamate substituents. As a result,
      PAMPA measurements confirmed ligands of TGT that are
      membrane-permeable for the first time. Furthermore, from two
      carbamate derivatives co-crystal structures could be
      obtained, which due to surprising orientation of the
      substituents address the ribose-34/phosphate-35 pocket. In a
      kind of retrospective work the impact of amino acids flanking
      the guanine-34/preQ1 site on binding affinity of the examined
      ligands were studied. Based on benzimidazole derivatives, a
      cavity expansion, previously predicted by a MD-simulation,
      has been experimentally confirmed by co crystal structures
      for the first time. Both, hydrazide and guanidine groups
      attached to the benzimidazole scaffold stabilize a transient
      cavity opening, due to steric impact on Asp156 and solvation
      of Gln203 and Gly230. In future design cycles,
      guanidine-benzimidazoles can be derivatized to address the
      new pocket and thus exploit new affinity options. Another
      project followed the characterization of a nucleoside
      derivative, which inhibits as a putative transition state
      analogue the base exchange reaction of TGT. The developed
      deazaguanine-type inhibitor represents a new class of
      compounds and suggests a possible lead structure that could
      replace the established lin-benzoguanines in the future. In a
      large-scale project, nine crystallographers from the group of
      Prof. Klebe scanned the in-house fragment library by soaking
      crystal structures of the target enzyme Endothiapepsin. From
      361 soaking crystal structures 71 complex structures (hit
      rate 20%) were obtained. Within the framework of this
      project, also a standardized refinement-protocol was
      developed, which optimizes and automatizes the identification
      of fragments in crystal structures. Based on the structural
      information of the fragments in the crystal structures new
      functional groups to address the catalytic dyad, as well as
      three hotspots remote from the active site were identified.
      In addition to unmasking false-positive hit from biophysical
      screening methods, it became obvious that biophysical methods
      frequently used to initially screen fragment libraries
      possibly reduces the number of accessible hits and thus the
      number of X-ray complex structures.