Meccanismi molecolari che sottendono allo sviluppo dei neuroni dopaminergici mesencefalici: ruolo del recettore nucleare Nurr1
Creators: name: Volpicelli, Floriana
Publisher: name: Università degli Studi di Napoli Federico II
Year: 2006

description: Il progetto di ricerca alla base della tesi di dottorato è centrato sullo studio dei meccanismi molecolari coinvolti nell’acquisizione di uno specifico fenotipo neuronale, quello dei neuroni dopaminergici (DA) mesencefalici e sullo studio del recettore nucleare Nurr1, la cui funzione è indispensabile per il differenziamento DA nel mesencefalo. 
I circuiti formati dai neuroni DA costituiscono la via nigro-striatale e la via meso-cortico-limbica nel cervello dei mammiferi. Queste vie nervose sono fondamentali per l’omeostati dell’organismo poichè regolano il controllo motorio, i meccanismi di ricompensa (cioè meccanismi che mediano il comportamento associato al piacere) e la modulazione degli stati affettivi ed emotivi. Disfunzioni di questi due sistemi per alterazione del neurone presinaptico dopaminergico sono coinvolte in gravi malattie neurologiche e psichiatriche (Morbo di Parkinson, Schizofrenia, ADHD o deficit d’attenzione ed iperattività, Distonia Dopa-responsiva, ecc.). I neuroni mesDA sono in numero relativamente piccolo (poche decine o centinaia di migliaia nei roditori e nei primati, rispettivamente). Pertanto per lo studio dei meccanismi differenziativi condotto in gran parte in coltura e per le potenziali applicazioni in terapia rigenerativa volta alla sostituzione di neuroni DA degenenerati con neuroni neoformati, la generazione di un numero elevato di neuroni DA in vitro è stato un primo obiettivo perseguito in questo lavoro di tesi.
Utilizzando le conoscenze dei meccanismi molecolari che determinano il fenotipo DA in vivo durante lo sviluppo embrionale ho messo a punto un metodo per ottenere neuroni DA in vitro mediante l’azione di mitogeni e di specifiche molecole induttive, partendo da un numero esiguo di neuroblasti mesencefalici. La somministrazione di bFGF a cellule mes embrionali in mezzo privo di siero stimola la proliferazione dei neuroblasti e l’aggiunta di Sonic hedgehog (SHH) e di FGF8 incrementa di più di cinque volte il numero di neuroni dopaminergici, caratterizzati in base alla presenza di marcatori specifici sia mediante tecniche di biologia molecolare (PCR, immunoblots, etc) che mediante tecniche di immunoistochimica, utilizzando anticorpi contro l’enzima biosintetico chiave di tutte le catecolamine, la tirosina idrossilasi (TH). Gli effetti di SHH esogeno sono specifici infatti vengono aboliti da anticorpi anti-SHH aggiunti alle colture.
Queste colture, definite “espanse”, sono ricche in neuroni nestina-positivi (il filamento intermedio del citoscheletro dei neuroblasti ancora immaturi), ma presentano anche neuroni differenziati, in particolare sono ricche in neuroni TH+, mentre le cellule neurali non neuronali, glia, sono praticamente assenti. L’aggiunta di acido ascorbico (Vit.C) alle colture espanse determina un’ulteriore arricchimento in neuroni DA (da 5 a 7 volte). Nel corso del lavoro è stato utilizzato questo sistema sperimentale per analizzare l’espressione differenziale di geni con un ruolo chiave nell’induzione, maturazione e mantenimento del fenotipo DA.
Essenziali per il differenziamento di questi neuroni dopaminergici sono alcuni fattori di trascrizione, in particolare Pitx3, codificato da un omeogene, e Nurr1, un recettore nucleare della superfamiglia dei recettori steroidei-tiroidei.
Durante il lavoro di tesi ho dimostrato che l’espressione di Nurr1 è temporalmente regolata durante lo sviluppo embrionale del mesencefalo: i livelli del trascritto mostrano un picco corrispondente alla fase di differenziamento dei neuroni DA nel mesencefalo ventrale (E13-15 nel ratto). In colture primarie di mesencefalo di roditori, Nurr1 segue un profilo di espressione temporale comparabile a quello osservato in vivo.
Dopo aver stabilito queste condizioni di coltura e definito il profilo di espressione di Nurr1 il lavoro di tesi è stato incentrato allo studio di potenziali geni target di Nurr1. L’espressione di questo gene, e i livelli di proteina, aumentano considerevolmente, ed in maniera transiente, quando i neuroni DA vengono depolarizzati (mimando così l’attività elettrica del neurone).
Questo paradigma sperimentale è stato utilizzato per identificare, mediante un approccio “genome wide” geni target di Nurr1 che potessero essere implicati nel differenziamento dei neuroni mesDA e nel loro mantenimento dopo lo sviluppo.
A questo scopo è stato utilizzato il sistema affymetrix, che permette di analizzare l’espressione genica su tutto il trascrittoma e individuare variazioni di espressione di geni specifici mediante ibridazione su sonde oligonucleotidiche ad alta densità su microarrays. Sono stati condotti esperimenti con RNA estratti dalle colture primarie depolarizzate e non (controlli). Analisi bioinformatiche e stringenti analisi statistiche hanno permesso di focalizzare l’attenzione su un numero di geni d’interesse la cui espressione varia in seguito a depolarizzazione, e specificatamente alcuni fattori di trascrizione e neurotrofici, Egr1, Atf3, Tieg, RAR, Junb, Pten e Bdnf. Questi esperimenti hanno permesso di stabilire una gerarchia temporale delle variazioni geniche causate dalla depolarizzazione. Sono stati così individuati alcuni geni i cui prodotti attivano la trascrizione di Nurr1, e altri che vengono modulati in seguito all’attivazione di Nurr1. I dati dei microarrays sono stati validati mediante PCR (sia RT che real-time). Allo scopo di identificare il network genico a monte ed a valle dell’attivazione di Nurr1 sono stati condotti esperimenti di interferenza di vie di segnalazione intracellulare che regolano Nurr1. Questa strategia ha permesso di accertare che l’attivazione di Nurr1 in seguito a depolarizzazione è calcio, MAP-chinasi e PKA indipendente. Ciò ci ha permesso di individuare alcuni geni che sono sulla stessa via di segnalazione di Nurr1 MAP-chinasi indipendente, come Egr1 e BDNF. Questo studio quindi, mediante approcci sperimentali di colture cellulari, incremento di specifiche sottopopolazioni di neuroni dopaminergici, studi d’espressione genica, interferenza con i segnali intracellulari e spegnimento di geni d’interesse mediante RNA interference (in corso), fornisce importanti informazioni sui meccanismi che determinano il differenziamento e la sopravvivenza dei neuroni mesDA. Tali studi potranno avere importanti ricadute sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche, sia rigenerative che farmacologiche, per la cura delle malattie che coinvolgono il sistema dopaminergico.