Πειραματική μελέτη της μοριακής απάντησης νευρικών κυττάρων μετά από τοξικότητα εκ διεγέρσεως (διεγερσιμοτοξικότητα) από γλουταμινικό οξύ
Creators: name: Σταμούλα, Ελένη Γ.
Publisher: name: Aristotle University of Thessaloniki
Year: 2016
Subjects: Γλουταμινικό οξύ
Διεγερσιμοτοξικότητα
Αυτοφαγία
Μοριακές συνοδοί
Glutamate
Excitotoxicity
Autophagy
Molecular chaperones

description: Το γλουταμινικό συνιστά ένα σημαντικό νευροδιαβιβαστή που ρυθμίζει ποικίλους ομοιοστατικούς μηχανισμούς που αφορούν λειτουργίες όπως η μάθηση, η μνήμη, η ενίσχυση μετάδοσης νευρικών ώσεων και η συναπτική πλαστικότητα. Αυξημένη έκκριση του γλουταμινικού οξέος συνδέεται με την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου μέσω μιας διεργασίας γνωστής ως διεγερσιμοτοξικότητα. Η διεργασία αυτή είναι σημαντική γιατί καθορίζει φυσιολογικές αποκρίσεις των νευρώνων σε εξωτερικά ερεθίσματα που αφορούν για παράδειγμα την τοπική αναγέννηση των ιστών μετά από τραύμα καθώς και την ανάπτυξη του ιστού. Ταυτόχρονα, ωστόσο, υπέρμετρη συγκέντρωση γλουταμινικού οξέος σχετίζεται με την ανάπτυξη παθολογικών καταστάσεων γνωστών ως νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως οι νόσοι Alzheimer και Parkinson και η σκλήρυνση κατά πλάκας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το τοξικό δυναμικό του γλουταμινικού κατά τη χορήγηση του σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε κύτταρα ως επί το πλείστον φαιοχρωμοκυττώματος PC12. Σε αυτά τα κύτταρα χορηγήθηκε γλουταμινικό οξύ σε συγκεντρώσεις 10μM-10mM και για χρονικά διαστήματα από μισή μέχρι 24 ώρες. Η απόκριση των κυττάρων στο αμινοξύ παρατηρήθηκε σε κυτταρικό επίπεδο με τη βοήθεια χρώσης αιματοξυλίνης/ηωσίνης και οπτική μικροσκοπία καθώς και με ανάλυση της μορφολογίας με τη βοήθεια ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Παράλληλα, μετρήθηκαν τα επίπεδα βιωσιμότητας των κυττάρων με τη μέθοδο MTT. Σε μοριακό επίπεδο μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης ποικίλων πρωτεϊνών-μοριακών συνοδών που σχετίζονται με τον παρατηρούμενο φαινότυπο είτε σε επίπεδο πρωτεΐνης με στύπωμα κατά Western ή σε επίπεδο mRNA με τη βοήθεια της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο.Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υπογραμμίζουν ένα διακριτό ρόλο του γλουταμινικού στην μοίρα των νευρικών κυττάρων που σχετίζεται με τη συγκέντρωση του αμινοξέος. Αντίθετα με τη γενική πεποίθηση ότι το γλουταμινικό δρα αμιγώς ως κυτταροτοξικός παράγοντας, παρουσιάζουμε εδώ για πρώτη φορά αποτελέσματα που δείχνουν ότι όταν το αμινοξύ χορηγηθεί σε χαμηλές συγκεντρώσεις επάγει έναν προστατευτικό μηχανισμό που προωθεί την επιβίωση των νευρικών κυττάρων. Αυτό φαίνεται να οφείλεται στην ενεργοποίηση του αυτοφαγικού μηχανισμού όπως διαπιστώνεται από τα μικροσκοπικά μορφολογικά ευρήματα αλλά και την αύξηση των επιπέδων της αυτοφαγικής πρωτεΐνης LC3-II. Ο παρατηρούμενος φαινότυπος σχετίζεται εν συνεχεία με τη δράση ποικίλων πρωτεϊνών-μοριακών συνοδών όπως οι GRP75, GRP78, GRP94 και HSC70 καθώς και της GAPDH που σχετίζεται με τον κυτταρικό μεταβολισμό αφού η έκφρασή τους τόσο σε πρωτεϊνικό όσο και σε επίπεδο mRNA επηρεάζεται από τη δράση του γλουταμινικού.
description: Glutamate is a potent neurotransmitter that regulates various physiological functions such as learning, memory, long term potentiation and synaptic plasticity. Increasing amounts of glutamate are associated with advanced cell death through a phenomenon named excitotoxicity. Excitotoxicity is important for normal responses of the neurons to external stimuli that drive regeneration after injury or during development. At the same time, however, it is linked to a group of pathological entities known as neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease and multiple sclerosis. In the present thesis we investigated the toxic capacity of glutamate administered in low concentrations mainly on PC12 rat pheochromocytoma cells. Cells were treated with 10μM-10mM of the non-essential amino acid for 0.5-24 hours. The action of glutamate was monitored in a cellular lever with electron microscopy and hematoxylin-eosin staining as well as cell survival MTT assays. In a molecular level we also investigated the expression of various chaperones and GAPDH either with Western Blotting at the protein level or with qRT-PCR at the mRNA level in search of a putative mechanism related to the observed phenotype. The findings underline a discrete effect of glutamate on neuronal cell fate depending on its concentration. Contrary to the general belief that glutamate acts solely as a toxic agent, we show here for the first time that low concentration of this amino acid induces an autophagy-related prosurvival phenotype. This is evidenced through microscopy as well as LC3-II upregulation upon glutamate treatment. The observed phenotype is attributed to a certain degree to the activity of various chaperones such as GRP75, GRP78, GRP94 and HSC70 as well the metabolism-related molecule GAPDH whose protein and mRNA levels are affected by low dose glutamate administration.