title: Die Einkapselung von Desmopressin in PLGA Nanopartikel und hydrophile Mikropartikel für die pulmonale Applikation
title: Encapsulation of desmopressin into hydrophobic nanoparticles and hydrophilic microparticles for pulmonary drug delivery
Creators: name: Primaveßy, Daniel Andreas Addi
Publisher: name: Philipps-Universität Marburg
Year: 2017
Subjects: Nanoparticles
Nanopartikel
Life sciences
Biowissenschaften, Biologie

description: Die Dissertation besteht aus drei
      Elementen: der Einkapselung des Peptidwirkstoffs Desmopressin
      acetat in PLGA Nanopartikel (3.1), die Entwicklung einer
      Methode zur Herstellung von Mikropartikeln aus hydrophilen
      Polymeren (3.2) und der Einkapselung der PLGA Nanopartikel in
      eben diese hydrophilen Mikropartikel (3.3). Die PLGA
      Nanopartikel werden mit einer leicht modifizierten „Double
      Emulsion Solvent Diffusion“-Methode hergestellt. Die zentrale
      Änderung zu gängigen Ansätzen ist, dass vor der Emulgierung
      mit einer Ultraschall Sonde keine Durchmischung der beiden
      Phasen vorgenommen wurde und das organische Lösungsmittel
      nach der Herstellung durch Abzentrifugation der Partikel und
      Verwerfen des Überstands und nicht durch Verdampfen entfernt
      wurde (2.2.2). Die derart hergestellten Nanopartikel waren im
      Größenbereich zwischen 106 und 131 nm (hydrodynamischer
      Durchmesser) mit PDI &lt; 0,1. Zetapotential und pH-Werte
      wurden ermittelt zwischen -38 und -44 mV und pH 5,5 und 5,9
      (3.1.1). Die Beladung der Partikel wurde durch eine
      Doppelemulsion im ersten Schritt realisiert. Hierbei wurden
      unterschiedliche Stabilisatoren in der Primäremulsion
      getestet, um feststellen zu können, ob diese einen Einfluss
      auf die Einkapselung haben. Verglichen wurden alle Ergebnisse
      statistisch mit einer Kontrolle, in der lediglich die
      Oberfläche beschichtet war (keine Doppelemulsion). Es konnte
      hierbei gezeigt werden, dass es einen signifikanten
      Unterschied zwischen der Einkapselung unter Zuhilfenahme des
      Stabilisators Pluronic F-68 und dem Beschichtungsansatz gab.
      Des Weiteren war auch der Unterschied zwischen Pluronic F-68
      und einer Kontrolle ohne Stabilisatoren (Doppelemulsion, aber
      Einkapselung ohne Stabilisator) signifikant unterschiedlich.
      Die beiden Kontrollen jedoch zeigten untereinander keinen
      signifikanten Unterschied in der Beladung, was den Schluss
      zulässt, dass für eine Einkapselung in die Partikel ein
      Stabilisator nötig ist. Die Beladungseffizienz war im besten
      Experiment (Pluronic F-68) hoch genug, um mit kommerziell
      erhältlichen Formulierungen mitzuhalten, die
      Einkapselungseffizienz allerdings war mit 6 bis 9% zu niedrig
      für eine sinnvolle Anwendung (3.1.3). Neben der quantitativen
      Analyse des Peptids mittels HPLC wurde auch mittels LC-MS
      geprüft, ob das Peptid durch die Einkapselung Schäden
      davonträgt, was verneint werden konnte (3.1.4). In einem
      weiteren Experiment wurden die PLGA Nanopartikel mit
      hLF-Peptid, einem Penetrationsverstärker, durch Inkubation
      beschichtet. Nach der Inkubation konnte gezeigt werden, dass
      das Peptid für mindestens 7 Tage stabil in wässriger
      Dispersion auf den Partikeln verbleibt. Neben der Beladung
      war auch eine Funktionalisierung der Partikel möglich
      (3.1.5). Im zweiten Teil wurde ein Transportsystem, primär
      für pulmonale Applikation entwickelt. Hierbei wurde
      besonderer Wert darauf gelegt, das System so flexibel wie
      möglich zu halten, um es über diese Dissertation hinaus auch
      für andere Anwendungen einsetzen zu können. Das erarbeitete
      System ist eine Abwandlung der „Emulsion Diffusion“-Methoden,
      anhand derer auch die PLGA Nanopartikel hergestellt wurden.
      Da sich die Phasen der Emulsion, die für die PLGA
      Nanopartikel eingesetzt wurden, aber nicht einfach
      vertauschen ließen, musste ein Zwischenschritt eingefügt
      werden, in dem die Emulsion in einem anderen Lösungsmittel
      als dem Präzipitationsmittel hergestellt wird (3.2). Das
      daraus entstehende Dreiphasensystem ist in der Lage, Partikel
      aus unterschiedlichen hydrophilen Polymeren (z.B.: Dextran,
      Chitosan, Alginat, Gelatine, Glucomannan und Lignin)
      herzustellen (3.2.3). Die Größen der Partikel, die mit dieser
      Methode hergestellt werden, lassen sich über die Größe der
      Emulsionstropfen steuern. Um möglichst homogene Emulsionen
      herzustellen, wurde eine Membranemulgierung eingesetzt, bei
      der die zu dispergierende Phase mehrfach eine Membran
      passierte und damit entsprechend der Porengröße der Membran
      in kleine Tropfen dispergiert wurde. Hierbei konnten Partikel
      aus Chitosan im Größenbereich um 500-600 nm hergestellt
      werden (3.2.1). Zur Vereinfachung und um schneller arbeiten
      zu können, wurde für einige Experimente die Emulsion mit
      einem Hochdruckhomogenisator hergestellt, oder es wurde bei
      der Membranemulgierung auf multiple Membranpassagen
      verzichtet. Neben der Herstellung wurde auch eine
      Trocknungsmethode entwickelt. Hierfür wurden die Partikel
      zunächst mit organischem Lösungsmittel von überschüssigem
      Stabilisator befreit und dann mit flüssigem Stickstoff in
      organischem Lösungsmittel eingefroren und daraus
      gefriergetrocknet (2.2.3). Derart getrocknete Partikel wiesen
      eine Lagerstabilität (in mit Luft gefüllten abgeschlossenen
      Gefäßen) von mindestens 11 Monaten auf. Einzig die Dextran
      Partikel wiesen nach 11 Monaten eine glattere Oberfläche auf,
      was auf ein Anlösen der Oberfläche in der Luftfeuchtigkeit
      hindeutet (3.2.3). Auch die direkte Einkapselung von
      Desmopressin in Dextranpartikel mittels dieser Methoden wurde
      getestet und führte zu deutlich höheren
      Einkapselungseffizienzen als bei PLGA Nanopartikeln (3.2.4).
      In einem weiteren Experiment wurde die Dextranlösung vor der
      Emulgierung mit Pluronic F-127 gemischt. Diese Mischung
      führte zu einer Phasentrennung zweier wässriger Phasen.
      Dieser Effekt konnte genutzt werden, um poröse Partikel
      herzustellen, indem beide Phasen vor der Emulgierung gut
      durchmischt wurden und dann gemeinsam emulgiert und
      präzipitiert wurden. Die daraus entstehenden Partikel
      bestanden aus zwei festen Phasen, von denen eine durch ein
      organisches Lösungsmittel ausgewaschen werden konnte. Die
      resultierenden Partikel hatten Löcher und waren porös
      (3.2.2). Im dritten Teil wurden dann erneut PLGA Nanopartikel
      hergestellt aus einem Fluoresceinamin-gelabelten PLGA. Diese
      Nanopartikel wurden in Dextranpartikel eingekapselt und
      mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Auf diese Weise
      konnte gezeigt werden, dass sich PLGA Nanopartikel in
      Dextranpartikel einkapseln lassen (3.3). Ein flexibles
      hydrophiles Trägersystem zum Transport beladener und
      funktionalisierter hydrophober Nanopartikel konnte
      erfolgreich hergestellt werden.
description: Within this thesis, it was possible
      to set up a method of preparation that exhibits many of the
      desired characteristics. Up to the current point, the system
      includes the following possibilities: - preparation of
      hydrophilic microparticles of different polymers - no use of
      toxic substances is necessary - suitable cleaning and drying
      process for hydrophilic microparticles - particle stability
      at room temperature under air conditions for at least 11
      months, depending on the formulation - encapsulation of
      hydrophilic compounds into hydrophobic nanoparticles -
      encapsulation of hydrophobic nanoparticles into hydrophilic
      microparticles - encapsulation of hydrophilic compounds into
      hydrophilic microparticles - surface modification of
      hydrophobic nanoparticles for targeting - preparation of
      porous dextran microparticles All used substances are not
      classified as ‘toxic’; however, at certain concentrations
      they are toxic to the human body. The lungs are a very
      sensitive organ and might react to some of these substances,
      even at low concentrations. Currently, there are no polymers
      approved for pulmonary drug delivery by EMA or FDA, but it is
      likely that especially biopolymers such as dextran do not
      show a severe impact on the lungs, if used. The organic
      solvents and stabilizers are more problematic. For a final
      formulation, they have to be minimized. For pentane, this
      should not be much of a problem, as it is very volatile and
      will not mix with the hydrophilic particles. Ethyl acetate
      also would not mix with the particles and should be possibly
      removed by freeze drying. Also, ethyl acetate is contained
      in, for example, wine, fruits and some kinds of nail polish.
      An ingestion and inhalation of smaller amounts is obviously
      without risk for a healthy person. Acetonitrile is more toxic
      than ethyl acetate, but not essential for the drying process.
      It has been used in this thesis, because its freezing point
      is at -45 °C, and it was therefore suitable for freeze drying
      from an organic solvent on a laboratory scale. For an
      industrial application, an exchange to ethanol and subsequent
      freeze drying would be more suitable and less toxic. The
      stabilizers, on the other hand, could be a major problem for
      pulmonary application, as they cannot be removed by freeze
      drying. Since they are very hydrophobic, it is not clear
      whether they dissolve in the alveolar lining fluid or not,
      but if they do, they have the potential to change its
      properties and affect the breathing ability. Some features of
      the system are only assumed and could not be proven within
      this thesis: - particle sizes prepared with multiple membrane
      cycles are suitable for lung deposition - particle sizes
      prepared with multiple membrane cycles are suitable for
      entering hair follicles These features require future work to
      prove or disprove them.