title: Transepitheliale impedanzspektroskopische 4-Punkt- Messung von Caco-2-Zellen und -Geweben mittels Chipdevices
Creators: name: Peter, Christian
Publisher: name: :none
Year: 2012

description: Pharmazeutische Wirkstoffe werden häufig oral eingenommen und über die Darmwand weiter in den Körper verteilt. Die Darmwand stellt somit eine entscheidende Barriere dar, die eine Arznei überwinden muss, um gezielt wirken zu können. Caco-2-Zellen haben sich in der pharmazeutischen Technik als in vitro Ersatz für in vivo Transportstudien, von über die Darmwand resorbierten Arzneien, bewährt. Dabei wird der Transport der Arznei durch (trans-epithelial) ein konfluentes Caco-2-Zellgewebe beobachtet. Ein konfluentes Caco-2- Gewebe ist dadurch charakterisiert, dass eine lückenlose Barriere zwischen den Gewebeseiten entsteht. Die Impedanzspektroskopie (IS) ist eine elektrische Messmethode, die sich als zielführend erwiesen hat, um die Konfluenz eines Caco-2-Zellgewebes zu prüfen. Die vorliegende Arbeit befasst sich im ersten Teil mit der Herstellung und Charakterisierung eines Mikroelektrodensystems für transepitheliale impedanzspektroskopische (IS) in vitro Untersuchungen an Caco-2-Zellgeweben mit 4-Punkt-Elektrodenmesstechnik. Im zweiten Teil werden Caco-2-Zellen in mit Elektroden ausgestatteten Zellkulturkammern kultiviert und während deren Vermehrung zu einem konfluenten Zellschicht kontinuierlich transepitheliale IS-Messungen durchgeführt. Bei der Messung stehen zwei Mikroelektroden einer Chipoberfläche einem oberhalb über den Chipelektroden befindlichen Elektrodenpaar gegenüber. Das gesamte Messsystem stellt 8 solche Elektrodenanordnungen bereit, die jeweils eine Zellkulturkammer mit elektrischen Sensoren ausstatten und eine jeweils voneinander unabhängige Messumgebung bilden. Der Messablauf wird durch eine LabVIEWProgrammierung, einen Multiplexer (MUX) und ein Fluidik-System soweit automatisiert, sodass ISMessungen (1Hz-100kHz) an biologischen Zellen bzw. Geweben kontinuierlich (jede h oder alle 2h) über mehrere Tage (7-24) ohne menschliches Eingreifen durchgeführt werden können. Zu Beginn werden vereinzelte Caco-2-Zellen in einer elektrolytischen RPMI-Nährlösungssuspension in die Zellkulturkammern ausgesät. Im Zuge der Vermehrung der Zellen überwachsen sie zunehmend die Chip- Elektroden. Die zunehmende Konfluenz des Caco-2-Zellmonolayers auf den Chipelektroden erhöht - so die dem Experiment zugrundeliegende Hypothese - die transepitheliale Impedanz bei charakteristischen Frequenzen. Neben der elektrischen Messung wird mit Hilfe von mikroskopischer Aufnahmen auf die Konfluenz des Caco-2-Zellmonolayers geschlossen. Der Vergleich des elektrischen mit dem optischen Ergebnis, zeigt eine Korrelation zwischen Zellbedeckung der Elektroden in Form eines Anstiegs der transepithelialen Impedanz. Abschließend wurden chemische Substanzen, sogenannte Permeation Enhancer (PE), eingesetzt um den parazellulären Ionenstrom durch Caco-2-Zellgewebe zu beeinflussen. Dieses letzte Experiment brachte die Gewissheit, dass der Anstieg, der im transepithelialen Impedanzspektrum zu beobachten ist, ausschließlich auf die Zellbedeckung der Elektroden zurückgeführt werden kann. All diese Untersuchungen stellen eine Grundlage für die weiterführende Beschreibung von Transportmechanismen durch die Darmwand durch ein elektrisches Modell dar.