2005年に登場して以来、10-300形・10-300r形は10-000形とともに本八幡-新宿-笹塚-桜上水-つつじヶ丘間の各駅停車や橋本・京王多摩センター発着の急行・快速・通勤快速に使用されてきたが、2006年9月1日の都営新宿線・京王電鉄ダイヤ改正で相模原線・京王線直通の急行・快速の大半が10両編成での運用に置き換えられたことにより、当時8両編成のみの都営車による運用は本八幡-笹塚(一部桜上水・つつじヶ丘)間と精算運転のために京王相模原線内の各駅停車とその出入庫回送を兼ねた早朝・夜間の相模原線直通運用が中心になった。