Pyridoxalfosfát

Pyridoxalfosfát (PLP) je aktívna forma vitamínu B6. Je to koenzým rôznych enzýmových reakcií. Medzinárodná únia pre biochémiu a molekulárnu biológiu zaznamenala do roku 2003 viac ako 140 PLP-dependentných enzýmových aktivít, čo odpovedá asi 4 % zaznamenaných aktivít. Verzatilita PLP vychádza z jeho schopnosti kovalentne viazať substrát a potom vystupovať ako elektrofilný katalyzátor, ktorý je schopný stabilizovať rôzne druhy karbaniónových reačných intermediátov.
Úloha ako koenzým.
PLP je koenzým všetkých transaminačných reakcií a takisto niektorých dekarboxylácií, deaminácií a racemizačných reakcií aminokyselín a ďalších enzýmov. Aldehydová skupina PLP tvorí väzbu v podobe Schiffovej bázy (interný aldimín) s ε-aminoskupinou konkrétnych lyzínových reziduí v aminotransferázach. α-Aminoskupina aminokyseliny, ktorá vystupuje ako substrát, potom nahrádza ε-aminoskupinu lyzíu v aktívnom mieste. Tento proces je známy ako transaldiminácia. Výsledný externý aldimín môže odštiepiť protón, oxid uhličitý alebo aminokyselinový bočný reťazec, čím z neho vzniká chinoidový intermediát, ktorý potom môže fungovať ako nukleofil v niekoľkých reakčných dráhach. 
V transaminácii po deprotonácii chinoidového intermediátu dochádza k prijatiu protónu na rôznych pozíciách, čím vzniká ketimín. Výsledný ketimín hydrolyzuje tak, že aminoskupina ostáva naviazaná na komplex. Okrem toho je PLP využívaný aminotransferázami (transaminázami), ktoré prijímajú ako substrát nezvyčajné sacharidy, napríklad perozamín a dezozamín. V týchto reakciách reaguje PLP s glutamátom, ktorý presúva svoju α-aminoskupinu na PLP, čím vzniká pyridoxamínfosfát (PMP). PMP potom presúva túto aminoskupinu na sacharidy, čím vznikajú aminosacharidy.
PLP sa takisto účastní rôznych β-eliminácií, napríklad reakcií katalyzovaných seríndehydratázou a GDP-4-keto-6-deoxymanóza-3-dehydratázou (ColD).
PLP takisto vystupuje v kondenzačnej reakcii v syntéze hemu počas syntézy kyseliny δ-aminolevulovej.
Okrem toho má PLP dôležitú úlohu pri premeno levodopy na dopamín, sprostredkováva premeni excitačného neurotransmiteru glutamátu na inhibičný neurotransmiter GABA a umožňuje dekarboxyláciu SAM za vzniku propylamínu, ktorý vystupuje ako prekurzor v syntéze polyamínov.
Úloha v ľudskom tele.
Pyridoxalfosfát má v ľudskom tele rôznorodé využitie. Medzi ne patria napríklad:
Ďalšie príklady PLP.
PLP sa takisto nachádza v glykogénfosforyláze v pečeni, kde pomáha pri štiepení glykogénu v glykogenolýze na základe signálu od glukagónu alebo epinefrínu. Tento enzým však nevyužíva jeho reaktívnu aldehydovú skupinu a namiesto toho na katalýzu využíva fosfátovú skupinu PLP.
Aj keď drtivá väčšina PLP-dependentných enzýmov tvorí interný aldimín s PLP pomocou lyzínového rezidua v aktívnom mieste, niektoré PLP-dependentné enzýmy toto lyzínové reziduum nemajú a namiesto neho majú na aktívnom mieste histidín. V takom prípade histidín nemôže vytvoriť interný aldimín a kvôli tomu sa tento kofaktor neviaže na enzým kovalentne. Príkladom takého enzýmu je GDP-4-keto-6-deoxymanóza-3-dehydratáza (ColD). Ľudská serínhydroxymetyltransferáza 2 reguluje prenos jednouhlíkovej skupiny, ktorá je vyžadovaná na syntézu aminokyselín a metabolizmus nukleotidov, existuje v podobe diméru a tetraméru. Dimérny variant SHMT2 je potentný inhibítor BRISC deubikvitylázového enzýmového komplexu, ktorý reguluje bunkovú signalizáciu. Nedávne štúdie ukázali, že tetramerizácia SHMT2 je indukovaná PLP. Tým sa zabráni interakcii s BRISC deubikvitylázovým komplexom, čo potenciálne prepája hladinu vitamínu B6 s metabolizmom zápalov.
Katalytický mechanizmus.
Enzýmy využívajúce PLP (PLP enzýmy) katalyzujú mnoho rôznorodých reakcií. Aj keď rozsah týchto reakcií vyzerá byť veľmi široký, stojí za nimi tvorba interného aldimínu s lyzínom polypeptidového reťazca. Keď substrát s aminoskupinou interaguje s aktívnym miestom, dochádza k vytvoreniu Schiffovej báze, ktorá sa označuje ako externý aldimín. Po tomto kroku je mechanizmus každej reakcie odlišný.
Špecificita.
Špecificita je daná tým, ktorá väzba sa rozštiepi. Zo štyroch väzieb vychádzajúcich z α-uhlíku aminokyselinového aldimínu sa rozštiepi väzba kolmá na pyridínový kruh (Dunathanova stereoelektronická hypotéza). Špecificita je teda daná tým, ako enzýmy viažu svoje substráty. Okrem toho hrá v špecificite úlohu i jednoduchosť protonácie pyridínového dusíka.
PLP enzýmy.
PLP sa drží v aktívnom mieste nielen vďaka lyzínu, ale i vďaka interakciám fosfátovej skupiny a fosfátového väzbového vrecka a do menšej miery vďaka skladaniu báz (pyridínového kruhu a aromatických reziduí, zvyčajne tyrozínu, ktorý sa niekedy účastní i acidobázickej katalýzy, poblíž). Napriek tomuto malému počtu požiadavok patria PLP enzýmy len do piatich rôznych rodín. Tieto rodiny nie vždy odpovedajú konkrétnemu typu reakcie (v rámci jednej rodiny sa teda môže vyskytovať viac rôznych reakcií a jeden typ reakcie môže byť vo viacerých rodinách). Týchto päť rodín sa značí rímskymi číslicami podľa skladby proteínu:
Evolúcia.
PLP-dependentné enzýmy majú niekoľko evolučných pôvodov. Pôvodne sa sa PLP enzýmy delili do štyroch nezávislých evolučných línií:
Tieto rodiny však odpovedajú vyššie uvedeným typom, ku ktorým bol pridaný Typ V (ktorý, na rozdiel od ostatných, využíva fosfátovú skupinu PLP, nie aldimínový intermediát). Príklad evolučnej podobnosti je však vidieť napríklad v β rodine. Všetky enzýmy, ktoré do nej patria, sú lyázy, ktoré katalyzujú reakcie, ktorých sa účastnia Cα a Cβ. Vo väčšine reakcií (okrem zmieneného typu V) sa PLP viaže kovalentou imínovou väzbou na aminoskupinu v aktívnom mieste.
Biosyntéza.
Z vitamérov.
Zvieratá sú auxotrofné organizmy voči tomuto kofaktoru, takže potrebujú v potrave prijímať priamo vitamín alebo intermediát v jeho syntéze, preto je PLP zaradený medzi vitamíny (ako vitamín B6), na rozdiel od napríklad MoCo alebo CoQ10. PLP sa syntetizuje z pyridoxalu pôsobením pyridoxalkinázy, ktorá v procese spotrebováva jednu molekulu ATP. PLP sa metabolizuje v pečeni.
Prototrofia.
Existujú dve prírodné dráhy syntézy PLP: jedna vyžaduje deoxyxylulóza-5-fosfát (DXP) a druhá nie, takže sú známe ako DXP-dependentná a DXP-independentná. Tieto dráhy boli skúmané do detailov v "E. coli" (DPX-dependentná) a "B. subtilis" (DXP-independentná). Napriek rozdielnosti počiatočných zlúčenín a rôznemu počtu krokov majú tieto dráhy mnoho spoločného.
DXP-dependentná biosyntéza.
DXP-dependentná biosyntéza vyžaduje niekoľko krokov a predstavuje spojenie dvoch vetiev. V jednej vetve vzniká 3-hydroxy-1-aminoacetónfosfát z erytróza-4-fosfátu a v druhej vzniká (pôsobením jediného enzýmu) deoxyxylulóza-5-fosfát (DXP) z glyceraldehyd-3-fosfátu (GAP) a pyruvátu. Kondenzáciou 3-hydroxy-1-aminoacetónfosfátu a deoxyxylulóza-5-fosfát vzniká pyridoxín-5-fosfát. Túto kondenzáciu katalyzuje PNP syntáza, kódovaná génom "pdxJ". Posledným enzýmom tejto dráhy je PNP oxidáza (gén "pdxH"), ktorá katalyzuje oxidáciu 4' hydroxylovej skupiny na aldehyd pomocou dikyslíku. V procese vzniká peroxid vodíka.
Prvá vetva je v "E. coli" syntetizovaná enzýmami "epd", "pdxB", "serC" a "pdxA". Tieto enzýmy sa podobajú trom enzýmom vystupujúcim v biosyntéze serínu ("serA" (homológ "pdxB"), "serC", "serB", ale "epd" je homológ "gap"), z mechanistického hľadiska ( majú podobné mechanizmy) i zo štruktúrneho hľadiska (sú k nim homologické), čo poukazuje na zdieľaný evolučný pôvod týchto dráh. V niekoľkých druhoch existujú dva homológy génu "serC" z "E. coli", zvyčajne jeden v "ser" operóne ("serC") a jeden v "pdx" operóne (kde sa nazýva "pdxF").
Okrem toho bola náhodou objavená dráha, ktorá umožňuje potlačiť auxotrofiu, ktorá vzniká deléciou génu "pdxB" (ktorý kóduje erytronát-4-fosfátdehydrogenázu) v "E. coli". Táto dráha je veľmi neefektívna, ale funguje vďaka promiskuitnej aktivite rôznych enzýmov. Začína 3-fosfohydroxypyruvátom (3PHP; produktom enzýmu kódovaným génom "serA" z biosyntézy serínu) a nevyžaduje erytronát-4-fosfát. 3PHP sa defosforyluje, čím vzniká nestabilný intermediát, ktorý sa spontánne dekarboxyluje (preto je v biosyntéze serínu prítomná fosfátová skupina) na glykolaldehyd. Glykaldehyd potom kondenzuje s glycínom a produkt sa fosforyluje za vzniku 4-fosfohydroxytreonínu (4-PHT), čo je kanonický substrát pre 4-PHT dehydrogenázu ("pdxA"). Ak je v rastovom médiu prítomný 4-hydroxytreonín, nadexpresia enzýmu homoserínkinázy (kódovaná "ThrB") môže takisto obnoviť syntézu PLP v mutantoch, ktorí nemajú "pdxB".
DXP-independentná biosyntéza.
DXP-independentná biosyntéza PLP pozostáva z kroku, ktorý katalyzuje PLP syntáza, čo je enzým zložený z dvoch podjednotiek. Produkt "pdxS" katalyzuj kondenzáciu ribulóza-5-fosfátu, glyceraldehyd-3-fosfátu a amoniaku. Amoniak je produkovaný pomocou produktu "pdxT" z glutamínu. "PdxS" je (β/α)8 barel (známy i ako TIM barel), ktorá tvorí dodekamér.
Abiotická syntéza.
Široké využitie PLP v centrálnom metabolizme, hlavne v biosyntéze aminokyselín, a jeho aktivita v neprítomnosti enzýmov naznačujú, že PLP môže byť „prebiotická“ zlúčenina – teda že je to zlúčenina, ktorá je staršia než život sám (nezamieňať s prebiotikami, teda látkami, ktoré sa využívajú ako potrava pre baktérie s pozitívnym účinkom na ľudské zdravie). Zahrievanie amoniaku a glykolaldehydu spontánne tvorí celú radu pyridínov vrátane pyridoxalu. Za istých podmienok vzniká PLP z kyanoacetylénu, diacetylénu, oxidu uhoľnatého, vodíka, vody a kyseliny fosforečnej.
Inhibítory.
Je známych niekoľko inhibítorov PLP enzýmov.
Jeden druh inhibítorov nevratne reaguje s PLP za vzniku aduktu, ktorý je viazaný na na lyzínové reziduum v aktívnom mieste. Príkladom takýchto inhibítorov sú acetylénové zlúčeniny (napríklad propargylglycín) a vinylové zlúčeniny (napríklad vinylglycín). Ďalším druhom inhibítorov sú α-metyl a amino-oxy analógy substrátov (napríklad α-metylglutamát), ktoré reagujú za vzniku nereaktívnych aldimínov. Ďalším príkladom inhibítorov sú látky, ktoré majú dobrú odstupujúcu skupinu, ktoré potom nukleofilne atakujú PLP, medzi ktoré patrí napríklad β-chloroalanín. Okrem toho existujú ďalšie druhy inhibítorov.
Medzi príklady inhibítorov patria: