Dvojfotónová excitačná mikroskopia

Dvojfotónová excitačná mikroskopia je fluorescenčná zobrazovacia metóda, ktorá umožňuje zobrazovanie živého tkaniva až do hĺbky jedného milimetra. Od tradičnej fluorescenčnej mikroskopie sa odlišuje hlavne kratšou vlnovou dĺžkou excitujúceho svetla. Hlavnými výhodami dvojfotónovej mikroskopie je hĺbka zobrazenia, účinná detekcia svetla a menšia miera blednutia výsledného obrazu. 
Princíp.
Dvojfotónová excitácia využíva dvojfotónovú absorpciu, ktorú po prvýkrát popísala Maria Goeppert-Mayerová (1906-1972) vo svojej doktorandskej dizertačnej práci v roku 1931. Tento jav ako prvý pozoroval Wolfgang Kaiser v roku 1961. Jednalo sa o kryštál CaF2: Eu2+ a bola použitá excitácia laserom. Isaac Abella v roku 1962 dokázal (v atmosfére céziových výparov), že dvojfotónové vybudenie jednotlivých atómov je možné.
Dvojfotónová excitačná mikroskopia je podobná konfokálnej laserovej skenovacej mikroskopii. Obidva postupy používajú zamerané laserové lúče naskenované v rastrovom vzore na generovanie snímok a oba majú optický "rezný efekt". Optické rezy, ktoré produkujú multifotónové mikroskopy, sú výsledkom funkcie bodového rozloženia: funkcia rozšírenia viacerých bodov je zvyčajne činná (dlhšia v rovine x-y) v porovnaní s funkciou konfokálnych mikroskopov v tvare lopty na americký futbal s guľovitým bodom.
Budenie vedie k následnej emisii fluorescenčného fotónu, typicky pri vyššej energii ako ktorýkoľvek z dvoch excitačných fotónov. Pravdepodobnosť takmer simultánnej absorpcie dvoch fotónov je extrémne nízka. Preto je potrebný vysoký tok excitačných fotónov, zvyčajne z femtosekundového lasera. Vlnová dĺžka tohto lasera je kratšia ako pri jednofotónovej excitácii. To zaručuje menšie poškodenie pozorovanej vzorky, takže vzorky (napríklad bunky živého tkaniva) môžu byť pozorované dlhšie.
Najbežnejšie používané fluorofóry majú excitačné spektrá v rozmedzí 400-500 nm, zatiaľ čo laser používaný na excitáciu dvojfotónovej fluorescencie leží v rozmedzí ~ 700-1000 nm (infračervené žiarenie). Ak fluorofor absorbuje súčasne dva infračervené fotóny, dostáva dostatok energie, aby prešiel do excitovaného stavu. Fluorofór potom emituje jediný fotón s vlnovou dĺžkou, ktorá závisí od typu použitého fluorofóru (zvyčajne vo viditeľnom spektre). Pravdepodobnosť fluorescenčnej emisie sa zvyšuje kvadraticky s intenzitou excitácie, pretože počas excitácie sú absorbované dva fluorofóry. Tým pádom je dvojfotónová fluorescencia efektívnejšia, keď je laserový lúč presne zaostrený. Excitácia je preto efektívne obmedzená na malý ohniskový objem (~ 1 femtoliter), čiže objekty mimo ohniska sa kvalitne nezobrazujú. Lokalizácia excitácie je najväčšou výhodou oproti jednofotónovej excitácii, ktorá potrebuje ďalšie prvky (napríklad tzv. pinholes) na obmedzenie fluorescencie mimo ohniska. Fluorescenciu následne zaznamenáva detektor s vysokou citlivosťou, napríklad fotonásobovacia trubica. Toto pozorovanie sa stáva jedným pixelom v konečnom zobrazovaní, ohniskový bod sa skenuje v celej oblasti vzorky, aby sa zaznamenali všetky body obrazu. Skenovacia hlava sa zvyčajne skladá z dvoch zrkadiel, ktorých uhly sa môžu rýchlo meniť pomocou galvanometra.
Využitie.
Dvojfotónová mikroskopia sa používa v rozličných oblastiach vedy, napríklad psychológii, neurológii, tkanivovom inžinierstve, alebo embryológii. Vďaka vysokej rýchlosti a relatívnej neinvazívnosti postupu je dvojfotónová mikroskopia efektívnou a využiteľnou metódou sledovania živého tkaniva.