Replikácia DNA

Replikácia DNA alebo reduplikácia – zdvojenie DNA je proces, pri ktorom sa z materskej molekuly DNA (deoxyribonukleovej kyseliny) vytvoria dve rovnaké dcérske molekuly DNA. Genetická informácia sa replikáciou prenáša z jednej molekuly DNA (templát, matrica) do inej rovnakej molekuly (tzv. replika).
Celý proces je semikonzervatívny, tzn. každá novo vytvorená molekula DNA má jeden reťazec z pôvodnej molekuly a jeden nový, syntetizovaný.Pri replikácii dochádza pomocou zložitého enzymatického procesu k radeniu deoxyribonukleotidov (základných stavebných častíc DNA) jeden za druhým, a to podľa vzorovej pôvodnej molekuly DNA. Výsledkom tohto radenia nukleotidov je nakoniec kompletná DNA daného organizmu, v podstate identická kópia pôvodnej DNA. Replikácia DNA je nevyhnutným predpokladom pre delenie bunky a množenie jej semiautonómnych organel.
Do tajomstva tohto procesu začali vedci bližšie prenikať až v 60. a 70. rokoch minulého storočia a dodnes boli odhalené do pomerne veľkých podrobností molekulárne pochody, ktoré sa pri replikácii odohrávajú. Je napríklad známe, že u baktérií prebieha replikácia mierne odlišne, ako u eukaryotických organizmov, ako je napríklad človek, rastliny či huby. Praktický význam majú výskumné metódy odvodené od procesu replikácie, ako je PCR a sekvenovanie.
Chybovosť a rýchlosť.
U baktérií sa chybovosť pri replikácii odhaduje na jednu chybu za 109–1010 nukleotidov (po prebehnutom proofreadingu a korekcii párovania báz, tzv. "mismatch repair"). Oprava DNA je zrejme dôvod, prečo pracuje DNA polymeráza len v jednom smere (tzv. 5'—&gt;3'), v opačnom smeru by nemohlo dosť dobre dochádzať k opravným mechanizmom.
Rýchlosť replikácie genómu je u baktérie druhu "Escherichia coli" asi 50 000 báz za minútu, zatiaľ čo u eukaryotov je omnoho nižšia. U pivnej kvasinky je to 3 600 báz za minútu, u myši len 2 200 báz za minútu. Hoci eukaryoty majú viacero začiatok miest replikácie (kvasinka 400, myš okolo 2 500), napriek tomu je tempo replikácie ich genómu pomalšie. Keby bol u eukaryotov k dispozícii iba jeden replikačný začiatok, trvalo by neúnosne dlho, kým by sa celý genóm replikoval: u človeka totiž rýchlosť DNA polymerázy činí iba 50 nukleotidov za sekundu.
Všeobecný priebeh.
Pri replikácii DNA vznikajú v typickom prípade z jednej dvojzávitnice DNA dve dvojzávitnice. Pôvodná DNA sa označuje ako "matrica" či "templát", novo vytvorená DNA je niekedy označovaná ako "replika".
Replikácia je tzv. semikonzervatívna, čo znamená, že každý nový DNA reťazec sa skladá z jedného starého vlákna a jedného nového vlákna. Do celého procesu je zapojených množstvo enzýmov, predovšetkým DNA polymeráza, ďalej napr. DNA ligáza, helikáza či topoizomeráza. Každé z vlákien pôvodnej dvojzávitnice sa replikuje odlišným spôsobom z toho dôvodu, že molekula DNA je tzv. antiparalelná. Zjednodušene povedané, skladá sa z dvoch vlákien, každé však „beží“ opačným smerom. DNA polymeráza však dokáže pracovať len v jednom smere, čo je v bunke vyriešené elegantným spôsobom. V každom prípade však dochádza k tomu, že je podľa vzoru (pôvodná DNA) vytváraná nová DNA, ktorá je k pôvodnému reťazcu komplementárna. To znamená, že keď je v pôvodnej DNA detegovaná báza adenín, na novú DNA sa pridá nukleotid obsahujúci tymín (a naopak). Pokiaľ bol na vzorovej DNA nájdený napríklad guanín, je na nový reťazec pripojený podľa pravidiel komplementarity cytozínový nukleotid.
Replikácia je v základných rysoch rovnaká u všetkých organizmov a všeobecne je možné jej priebeh rozdeliť do troch základných krokov:
Iniciácia.
Replikácia sa nezačína na náhodnom mieste genómu, ale na presne určenom mieste, ktoré sa označuje ako replikačný začiatok. Niektoré organizmy týchto začiatkov majú niekoľko tisíc (a tak vedľa seba pri replikácii prebieha niekoľko nezávislých polymerizácií), jednoduchším organizmom s menším genómom stačí niekedy len jeden replikačný začiatok.
Na replikáciu je na začiatku potrebná krátka molekula RNA s dĺžkou 10 – 200 nukleotidov, tzv. primer (čítaj prajmer). Túto sekvenciu vytvára špeciálny RNA-polymerizačný enzým označovaný ako primáza. Primer sa síce neskôr odstráni a nahradí DNA, ale hrá významnú úlohu v iniciácii replikácie. Celý replikačný proces totiž začína nukleofilným atakom 3'-hydroxylovej skupiny tohto primeru na fosfátovú skupinu prvého deoxyribonukleotidu. Ďalej sa už deoxyribonukleotidy viažu na 3' uhlík predchádzajúceho deoxyribonukleotidu a nie na primer; ten má teda iba jednorazovú úlohu (to sa však netýka tzv. oneskorujúceho sa reťazca, pozri kapitolu Elongácia).
Vzniku replikačnej vidlice sa zúčastňujú hexamérické enzýmy helikázy, schopné oddialiť obe molekuly dvojzávitnice a vytvoriť charakteristickú štruktúru v tvare písmena Y, aby medzi nimi vznikol priestor pre syntézu DNA. Udržať vlákna od seba oddelené pomáhajú proteíny SSB proteíny. Helikázy však síce oddialia obe vlákna, ale dvojzávitnica sa na konci replikačnej vidlice čím ďalej tým viac uťahuje a vzniká tam príliš veľký tlak. Tento problém riešia topoizomerázy, ktoré sú schopné prestrihnúť jedno z vlákien, uvoľniť tlak a potom ho opäť zlepiť.
Elongácia.
Potom, čo je pôvodná dvojzávitnica DNA rozvinutá a na jej vlákna prisadnú DNA polymerázy, je možné začať samotnú replikáciu. Aby v priebehu tejto činnosti DNA polymeráza pevne držala na svojom mieste, pomáhajú jej k tomu tzv. svorkové proteíny ("DNA clamps").
Dôležitý je fakt, že každé z vlákien pôvodnej templátovej DNA sa replikuje odlišným spôsobom. Dôvodom je skutočnost, že každá známa DNA polymeráza je schopná pracovať len v smere 5'—&gt;3', teda od piateho uhlíka deoxyribózy. Tento enzým totiž vie pripojiť nové nukleotidy iba na 3' uhlík deoxyribózy. Toto obmedzenie dosť komplikuje celý proces, pretože DNA je antiparalelná, teda jeden jej reťazec smeruje 5'—&gt;3' smerom, ale druhý 3'—&gt;5' smerom. Bunky tento problém riešia tak, že po jenom reťazci (tzv. vedúcom reťazci, angl. "leading strand") postupuje DNA polymeráza celkom bežným spôsobom. Druhý reťazec, ktorý je orientovaný v smere 3'—&gt;5', sa označuje ako oneskorujúci sa reťazec (angl. "lagging strand"). Tento reťazec sa však musí zreplikovať tiež v 5'—&gt;3' smere, a tak DNA polymeráza replikuje tento reťazec po malých častiach, tzv. Okazakiho fragmentoch s dĺžkou asi 100 – 200 nukleotidov (ale u prokaryotov sú tieto fragmenty asi 10-krát dlhšie). Na začiatku každého Okazakiho fragmentu sa musí zakaždým vytvoriť nový RNA primer, ktorý sa neskôr po splnení svojej funkcie vystrihne a enzým DNA ligáza zlepí Okazakiho fragmenty do súvislého vlákna, ktorý je na nerozoznanie od vedúceho ("leading") reťazca.
Terminácia.
Replikácia končí vtedy, keď je zhotovená kópia celej DNA. U baktérií sa v tomto okamihu zídu obe replikačné vidlice a splynú spolu, u eukaryotov splývajú replikačné vidlice vtedy, keď dosyntetizujú „svoju“ časť genómu. Pretože eukaryotické chromozómy sú lineárne, DNA polymerázy nie sú schopné replikovať ich koncové časti, tzv. teloméry, a tak je ich replikovaná DNA nepatrne kratšia, než pôvodná. Po určitom počte bunkových delení (Hayflickov limit) by to začalo vadiť; v praxi to však nepredstavuje problém, pretože v priebehu meiózy sa veľkosť telomér obnovuje pomocou enzýmov telomeráz.
Rozdiely v priebehu replikácie.
U prokaryotov.
Replikácia u prokaryotov je relatívne dobre preskúmaná, pretože baktérie (a ich menší genóm) predstavujú jednoduchší model než komplexné eukaryotické organizmy. Dôležitá je skutočnosť, že prokaryoty obvykle majú kruhovú molekulu DNA, tzv. nukleoid.
Baktéria "Escherichia coli" má jediný replikačný začiatok, a to v génovom lokuse zvanom OriC. Z tohto miesta sa pohybujú oboma smermi replikačné vidlice, v ktorých dochádza k syntéze DNA podľa vzoru. Hlavnou polymerázou baktérií je DNA polymeráza III obsahujúca veľké množstvo rôznych podjednotiek. Polymerázy I a II majú len menej významné úlohy.
Pretože z lokusu OriC boli vyslané dve replikačné vidlice po kruhovej molekule DNA, tieto vidlice sa logicky stretnú približne „na polceste“ dookola. Asi 100 kB od tohto stredu sa nachádzajú terminačné (ukončovacie) oblasti o dĺžke 23 párov báz. Tieto terminačné sekvencie existujú celkove štyri (dve na každom z vlákien dvojzávitnice) a označujú sa TerA, TerB, TerC a TerD. Tieto sekvencie rozoznáva proteín tus, schopný ukončiť replikáciu v momente, keď sa replikačná vidlica dostane k terminačným sekvenciám.
Replikácia mitochondriálnej DNA a plastidovej DNA sa veľmi podobá na replikáciu DNa u prokaryotov. Zato archebaktérie ("Archaea"), ktoré sú zaradené medzi prokaryota, vykazujú pomerne značné rozdiely v porovnaní s replikáciou baktérií. Zatiaľ čo u baktérií replikácia prebieha len z jedného replikačného začiatku, u archeí je týchto miest spravidla viac (podobne ako u eukaryotov). Taktiež príslušné DNA polymerázy sú podobné skôr eukaryotickým DNA polymerázám.
U eukaryotov.
Eukaryotické genómy sú vo všeobecnosti väčšie než prokaryotické, čomu musí byť prispôsobený celý proces replikácie. Na rozdiel od baktérií, ktoré majú iba jeden replikačný začiatok (miesto, v ktorom začína replikácia), eukaryoty majú viac replikačných začiatkov. U kvasinky "Saccharomyces cerevisiae" sa tieto replikačné začiatky označujú ARS a je ich okolo 400 (u obojživelníkov však ich je až 15 000). Z týchto replikačných začiatkov smerujú oboma smermi replikačné vidlice v tvare písmena Y. Keď sa stretnú dve protiidúce replikačné vidlice, jednoducho dôjde k ich splynutiu.
V replikácii eukaryotického genómu zrejme hrá úlohu väčšie množstvo rôznych proteínov. Príkladom je situácia u SSB proteínov: u baktérií sú tieto „stabilizátory jednovláknovej DNA“ zložené z jedinej podjednotky, u eukaryotov sa skladajú z troch podjednotiek. Situácia je zložitejšia aj čo sa týka počtu DNA polymeráz. U eukaryotov ich bolo nájdených najmenej 15. DNA polymeráza α obsahuje podjednotku, ktorá funguje ako primáza, a je schopná vytvoriť na začiatku každého Okazakiho fragmentu RNA primer, pričom k nemu pridá niekoľko DNA nukleotidov. Potom zrejme uvoľní miesto na 3' konci predlžujúceho sa reťazca DNA polymeráze δ. Vedúci reťazec je zrejme tiež načatý DNA polymerázou α, ale na rozdiel od oneskorujúceho sa reťazca sa tu zrejme odovzdáva vlákno DNA polymeráze ε (ale stále sa o tom vedú diskusie).
U vírusov.
Vírusy, ktoré stoja na hranici živého a neživého, majú pomerne špecifický typ replikácie DNA, odvíjajúci sa od ich parazitického spôsobu života. Toto sa netýka tzv. RNA vírusov, v ktorých rozmnožovacom cykle DNA molekuly vôbec nefigurujú. DNA replikácia sa teda týká výhradne DNA vírusov. Niektoré DNA vírusy obsahujú jednovláknovú DNA, a tak po infekcii musí najprv dôjsť k syntéze komplementárneho vlákna, aby vznikla klasická dvojzávitnica. U vírusov sa vyskytuje pomerne veľké množstvo ďalších odchýliek od bežnej schémy DNA replikácie. Čo sa týka "Polyomavírusu", ktorý infikuje eukaryotické bunky, jeho DNA je replikovaná takmer rovnako ako vlastný eukaryotický genóm. Dôvod je jednoduchý: vírusy zneužívajú hostiteľské DNA polymerázy a celý ich enzymatický aparát. Jediný rozdiel spočíva v tom, že u "Polyomavírusu" musí dôjsť k naviazaniu tzv. veľkého T antigénu ("large T-antigen") na replikačný začiatok.