Spektrofotometria

Spektrofotometria je analýza založená na meraní absorpcie žiarenia vlnovej dĺžky, ktorá sa pohybuje od 200 nm do 800 nm. Tiež je definovaná ako spektrálna analýza v oblasti elektrónových spektier, pretože pri absorpcii žiarenia skúmanou látkou sa elektróny v molekule prerozdeľujú (prechádzajú z jednej energetickej hladiny na druhú) čiže mení sa ich energia. Tieto elektrónové spektrá do určitej miery ovplyvňujú aj vibračné a rotačné zmeny molekúl.
Absorpciou žiarenia sa mení:
Energia molekuly je súčtom týchto troch energií: E= Ee+ Ev +Er
Najväčšie zmeny prislúchajú energii elektrónov, menšie vibračnej a najmenšie rotačnej energii. Skúmaným roztokom je zvyčajne zriedený vodný roztok molekúl skúmanej látky. V rozsahu vlnovej dĺžky 400-800 nm, čo zodpovedá viditeľnému svetlu sa mení farba svetla od fialovej cez modrú, zelenú, žltú až na červenú. Látka sa javí ľudskému oku ako farebná, ak absorbuje svetlo s určitou vlnovou dĺžkou. Pozorovaná farba je farbou doplnkovou ku tej farbe ktorú látka absorbuje. Absorpciu žiarenia v oblasti viditeľného spektra vykazujú najmä komplexné ióny prechodových kovov.
Použitie.
Pri meraní vo viditeľnej oblasti je potrebné, aby sledovaná látky bola buď farebná, prípadne aby dávala farebné reakcie, ktoré musia byť:
Pri samotnej farebnej reakcii musíme často ďalšie zložky buď separovať (extrahovať), alebo maskovať prímesi vhodnými skúmadlami.
Kvalitatívna analýza.
Uplatní sa pri skúmaní štruktúry organických látok a ich identifikácii. S meraním absorpčných spektier skúmaných látok získame absorpčnú krivku. Pre určité zoskupenie atómov prvkov ktoré nazývame "chromofor" je charakteristická vlnová dĺžka λ pri ktorej je hodnota absorbancie maximálna. Poloha chromoforu na osi vlnových dĺžok λ je ovplyvňovaná aj inými chromoformi, preto priame stanovenie nemožno realizovať. Pracuje sa pomocou tzv. modelových zlúčenín.
Pri absorpcii viditeľného žiarenia dochádza k excitácii valenčných elektrónov (väzbových). Elektróny vytvárajúce σ (jednoduché) väzby potrebujú na excitáciu väčšiu energiu než elektróny podieľajúce sa na π väzbách. Uhľovodíky s jednoduchými väzbami nie sú farebné. Zlúčeniny s π väzbami (násobnými) a to hlavne v aromatickom a konjugovanom stave sú schopné excitácie väzbových elektrónov a javia sa ako farebné. Atómy N, O, S, halogénov ktoré obsahujú nespárené voľné elektrónové páry sú tiež schopné excitácie. Systém konjugovaných dvojitých väzieb a skupiny s voľným elektrónovým párom, sa označujú ako "chromofóry" – nosiče farebnosti, napríklad NH2 , OH, Cl, NO2, SH.
So zvyšovaním počtu konjugovaných dvojitých väzieb a funkčných skupín s voľným elektrónovým párom sa posúva maximum absorpcie k väčším vlnovým dĺžkam, zlúčeniny absorbujú žiarenie vo viditeľnej oblasti a javia sa ako farebné. 
Kvantitatívna analýza.
Táto analýza je založená na Lambertovom- Beerovom zákone, podľa ktorého ak prechádza monochromatické žiarenie, ktorého žiarivý tok je Ф0, absorbujúcim prostredím hrúbky I zoslabí sa tento žiarivý tok na hodnotu Ф. Stanovovaná látka musí byť farebná alebo reakciou dáva farebný produkt. Reakcie ktoré dávajú farebný produkt môžu byť oxidačno-redukčné, komplexotvorné, diazotačné. 
Podiel týchto žiarivých tokov Ф/Ф0 = T sa nazýva transmitancia (priepustnosť) vyjadruje, aká časť dopadajúceho žiarenia prechádza cez skúmanú látku. Transmitancia nadobúda hodnoty od 0 po 1.
Ф= Ф0.T= Ф0. 10-a.1
Tento vzťah platí pre absorpčnú spektrofotometriu vo všetkých oblastiach elektromagnetického žiarenia. Koncentrácia látky vo vzorke sa zistí pomocou kalibračnej krivky vyjadrujúcej lineárnu závislosť medzi absorbanciou a koncentráciou látky v roztoku pri konštantnej hrúbke vrstvy a konštantnej vlnovej dĺžky λmax. Optimálnu vlnovú dĺžku možno určiť zo závislosti A= f(λ) ako maximum. 
Pre každú známu hodnotu koncentrácie štandardného roztoku sa odmeria príslušná hodnota absorbancie a zostrojí sa kalibračná krivka. Táto závislosť je priamková pre určenú rozsah koncentrácie. 
Pre stanovenie musí platiť:
Spektrometricky možno merať pH, určiť stechiometrické zloženie komplexov, sledovať procesov oxidačno-redukčnej reakcie.