Fumaráza

Fumaráza alebo fumaráthydratáza je enzým, ktorý katalyzuje reverzibilnú hydratáciu fumarátu na malát. Fumaráza existuje v dvoch formách: mitochondriálna a cytozolová. Mitochondriálna fumaráza sa účastní Krebsovho cyklu, zatiaľ čo cytozolová fumaráza sa účastní metabolizmu aminokyselín a fumarátu. Subcelulárna lokalizácia enzýmov je daná prítomnosťou signálnej sekvencie na N-konci mitochondriálnej formy, ktorá u cytozolovej formy chýba.
Tento enzým sa účastní dvoch metabolických dráh: citrátového cyklu a reverzného citrátového cyklu (fixácia CO2). Takisto je významný u rakoviny obličiek. Mutácie v tomto géne boli asociované s vývojom leiomyómov v koži a maternici v súvislosti s rakovinou obličiek.
Štruktúra.
Gén.
Fumarázu kóduje gén FH, ktorý sa u ľudí nachádza na chromozomálnej pozícii 1q42.3-q43. Tento gén obsahuje 10 exónov.
Proteín.
V kryštálovej štruktúre fumarázy C z "Escherichia coli" boli objavené dve väzbové miesta pre dikarboxylové kyseliny, ktoré sa nachádzajú blízko seba. Tieto väzbové miesta sa nazývajú aktívne miesto a B miesto a sú prepojené sériou vodíkových mostíkov. Prístup na ktorékoľvek z týchto miest je možný len cez otvor na povrchu enzýmu poblíž B miesta. Aktívne miesto sa skladá z troch domén. Väzbové vrecko vytvorené okolitými reziduami je dostatočné na naviazane molekuly vody i v prípade, že žiadny ligand nie je naviazaný na aktívne miesto. Kryštalografický výskum na B mieste ukázal pohyb His129 medzi voľným a obsadeným stavom. Toto takisto naznačuje, že premena imidazol-imidazólium ovláda prístup na alosterické B miesto.
Subtypy.
Existujú dve triedy fumaráz, trieda I a trieda II. Klasifikácia záleží na usporiadaní podjednotiek, prítomnosti kovového iónu a teplotnej stabilite. Fumarázy triedy I menia stav alebo sa stávajú neaktívnymi pri vystavení žiareniu alebo teplote, sú citlivé na superoxidový anión, obsahujú železnatý katión Fe2+ a sú to dimerické proteíny, ktorých podjedotky majú hmotnosť asi 120 kD. Fumarázy triedy II, ktoré sa nachádzajú v prokaryotoch i eukaryotoch, sú tetramérne enzýmy, ktorých podjednotky majú hmotnosť asi 200 kD. Skladajú sa z troch rozličných segmentov s výrazne konzervovanými aminokyselinami, neobsahujú železnatý katión a sú termálne stabilné. Prokaryoty obsahujú tri rôzne formy fumarázy: fumarázu A, fumarázu B a fumarázu C. Fumaráza A a fumaráza B z "Escherichia coli" sú fumarázy triedy I, zatiaľ čo fumaráza C je fumaráza triedy II.
Funkcia.
Mechanizmus.
Obrázok 1 ukazuje reakčný mechanizmus fumarázy. Dve reziduá (Asn a Lys) katalyzujú prenos protónu. Ionizačný stav týchto reziduí udáva dve podoby tohto enzýmu: E1 a E2. U E1 existujú v neutrálnej podobe AH/B:, zatiaľ čo v E2 existujú v zwitteriónovej podobe A-/BH+. E1 viaže fumarát a katalyzuje jeho premenu na malát a E2 viaže malát a katalyzuje jeho premenu na fumarát. Pri každom katalytickom cykle musia tieto formy izomerizovať z jednej na druhú.
Napriek biologickej dôležitosti tejto reakcie nie je mechanizmus úplne pochopený. Reakcia sa dá sledovať v oboch smeroch, ale presný postup tvorby fumarátu z malátu nie je presne známy kvôli vysokej hodnote pKa vodíka HR (obrázok 2), ktorý sa odstraňuje bez pomoci kofaktorov či koenzýmov. Reakcia z fumarátu na malát je jasnejšia a zahŕňa stereošpecifickú hydratáciu fumarátu za vzniku S-malátu pomocou trans-adície hydroxylovej skupiny a vodíkového atómu. Prvé výskumy tejto reakcie naznačovali, že tvorba fumarátu z malátu sa skladá z dehydratácie malátu a vzniku karbokatiónu, ktorý následne stráca alfa-protón za vzniku fumarátu. Na základe toho sa predpokladalo, že tvorba malátu z fumarátu prebieha opačne ako E1 eliminácia - cez protonáciu fumarátu, čím by vznikol karbokatión, a následnou adíciou hydroxylovej skupiny z vody. Novšie štúdie však ukázali, že mechanizmus v skutočnosti prebieha cez acidobázicky katalyzovanú elimináciu a karbanión, teda ako E1cB eliminácia (obrázok 1).
Biochemické dráhy.
V citrátovom cykle je funkciou fumarázy sprostredkovať medzikrok pre tvorbu energie v podobe NADH. V cytozole tento enzým metabolizuje fumarát, ktorý vzniká ako vedľajší produkt močovinového cyklu a katabolizmu aminokyselín. Štúdie ukázali, že aktívne miesto enzýmu sa skladá z reziduí aminokyselín pochádzajúcich z troch zo štyroch podjednotiek tetramérneho enzýmu.
Iné substráty.
Hlavnými substrátmi fumarázy sú fumarát a malát. Okrem toho je však tento enzým schopný katalyzovať i dehydratáciu -vínanu, pri ktorej vzniká enol-oxalacetát. Enol-oxalacetát potom izomerizuje na keto-oxalacetát. Fumaráza A i fumaráza B majú prakticky rovnakú kinetiku reverzibilnej premeny malátu na fumarát, ale fumaráza B má omnoho vyššiu katalytickú účinnosť premeny -vínanu na oxalacetát oproti fumaráze A. Vďaka tomu môžu baktérie ako "E. coli" využiť -vínan na rast. Rast mutantov, ktorí nemali funkčný gén "fumB" kódujúci fumarázu B bol však výrazne pomalší.
Klinický význam.
Nedostatok fumarázy je charakterizovaný polyhydramniom (nadbytkom plodovej vody) a abnormalitami mozgu plodu. U novorodencov sa vyskytujú vážne neurologické abnormality, slabé kŕmenie a slabé svaly. Zvýšená kyselina fumarová v moči naznačuje nedostatok fumarázy. Aktuálne už je možné nedostatok fumarázy testovať i geneticky.
Fumaráza je hojne prítomná v tkanive plodu i dospelého. Veľké percento enzýmu sa exprimuje v koži, prištítnom teliesku, lymfe a hrubom čreve.