Molekulárna biológia

Molekulárna biológia je vedný odbor zaoberajúci sa biológiou na úrovni molekúl. Skúma zmeny v molekulárnej stavbe zložiek organizmu a ich účinky na životné procesy. Jej pole pôsobnosti sa prekrýva s inými oblasťami biológie a chémie, konkrétne najmä s genetikou a biochémiou. Molekulárna biológia sa zaoberá predovšetkým porozumením vzťahov medzi rôznymi bunkovými systémami, zahŕňajúc napríklad vzájomné vzťahy medzi DNA, RNA, proteosyntézou (tvorbou bielkovín), biosyntézou enzýmov, porozumeniu ako sú tieto interakcie regulované a skúma aj zákonitosti genetickej regulácie a genetický kód.
W.T. Astbury v odbornom časopise "Nature" opísal molekulárnu biológiu ako:
"...nie až tak technika ako koncepcia, koncepcia z hľadiska takzvaných jednoduchých vied s hlavnou ideou nájsť pod rozsiahlymi manifestáciami klasickej biológie zodpovedajúci molekulový plán. Zaoberá sa najmä formou biologických molekúl a... je prevažne trojrozmerná a štruktúrna- čo však neznamená, že je iba rafináciou morfológie- musí tiež v rovnakú dobu skúmať aj vznik a funkciu."
Príbuznosť s ostatnými „molekulárnymi“ vednými odbormi biológie.
Výskumníci v molekulárnej biológií využívajú techniky typické pre molekulárnu biológiu (pozri "Techniky" ďalej v článku), no v čoraz väčšej miere ich kombinujú s technikami a myšlienkami používanými a obsiahnutými v genetike, biochémii a biofyzike. V súčasnosti už neexistuje pevná hranica medzi týmito disciplínami ako kedysi. Nasledujúci obrázok znázorňuje jeden z možných pohľadov na vzťahy medzi biologickými odbormi:
Množstvo práce v molekulárnej biológií je rozsiahle, a najmä v poslednej dobe je veľa z nej spracovávané v spojení s počítačovými vedami ako sú bioinformatika a výpočtová biológia.
V čoraz väčšom počte sa na molekuly sústreďujú aj iné oblasti biológie a to buď priamo, štúdiom vzťahov molekúl v nimi skúmaných javoch, ako napríklad cytológia alebo vývojová biológia, alebo nepriamo, využívajúc techniky molekulárnej biológie napríklad v oblastiach evolučnej biológie ako sú populačná genetika a fylogenetika na odvodenie charakteristických znakov populácií alebo druhov. Dlhú tradíciu štúdia biomolekúl má aj biofyzika.
Techniky v molekulárnej biológií.
Od konca 1950-tych a 1960-tych rokov sa molekuloví biológovia naučili ako charakterizovať, izolovať a manipulovať s molekulárnymi súčasťami buniek a organizmov. Tieto súčasti zahŕňajú DNA, zdroj genetickej informácie; RNA, blízka príbuzná DNA, ktorej funkcie siahajú od pôsobenia ako dočasná pracovná kópia DNA, až po štruktúrne a enzymatické funkcie ako aj pôsobenia ako funkčná a štruktúrna časť translačného aparátu; a proteíny, hlavné štruktúrne a enzymatické molekulové typy v bunkách.
Expresné klonovanie.
Jednou z najzákladnejších techník molekulárnej biológie, využívanej na štúdium funkcie proteínov je expresné klonovanie. Pri tejto technike je DNA kód pre daný proteín naklonovaný (použitím PCR a/alebo reštrikčných enzýmov) dovnútra plazmidu (nazývaného tiež funkčný vektor). Súčasťou plazmidu môžu byť aj špeciálne promotéy na urýchlenie produkcie želaného proteínu.
Plazmid môže byť vložený ako dovnútra bakteriálnej, tak aj dovnútra živočíšnej bunky. Vkladanie DNA do bakteriálnej bunky sa nazýva transformácia a môže byť uskutočnené využitím niekoľkých metód vrátane elektroprorácie, mikroinjekcií a taktiež chemickou cestou. Vkladanie DNA do bunky eukaryotickej, ako napríklad do živočíšnej bunky, sa nazýva transfekcia. V súčasnosti je dostupných niekoľko rôznych transfekčných techník, napríklad transfekcia fosforečnanom vápenatým, lipozómová transfekcia alebo transfekcia s využitím špeciálnych transfekčných reagentov, akým je napríklad Fugene. DNA môže byť tiež vložená do buniek využitím vírusu ako nosiča. V takomto prípade sa technika volá virálna transdekácia a bunky sa nazývajú transdukované.
V obidvoch prípadoch, po tom, čo je DNA kód daného proteínu vložený do bunky, môže nastať jeho expresia (prejavenie sa protínu v bunke). Dostupných je mnoho systémov, napríklad niektoré promotéry a špecifické bunkovo-signálne faktory, ktoré pomáhajú expresii želaných proteínov na vysokej úrovni. Vďaka tomu môžu byť extrahované pomerne veľké množstvá proteínov z bakteriálnych alebo eukaryotických buniek. Enzematická aktivita proteínov môže byť testovaná v rôznych situáciách, proteín môže byť skryštalyzovaný, čo umožní štúdium jeho terciárnej štruktúry, alebo, vo farmaceutickom priemysle, môže byť skúmaná aktivita nových drog voči proteínom.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR- polymeraze chain reaction).
Polymerázová reťazová reakcia je mimoriadne všestranná technika používaná na kopírovanie DNA. V skratke, PCR umožňuje kopírovať jedinú sekvenciu DNA milióny ráz, alebo ju meniť v predom určenom smere. PCR môže byť napríklad použité na vkladanie reštrikčných enzýmov, alebo na mutáciu (zmenu) jednotlivých DNA báz. PCR tiež môže byť využité pri rozhodovaní, či sa príslušný fragment DNA nachádza v cDNA knižnici.
Gélová elektroforéza.
Gélová elektroforéza je jednou z hlavných nástrojov molekulárnej biológie. Jej základným princípom je, že DNA, RNA a proteíny môžu byť oddelené s využitím elektrického poľa. Pri agarózovej gélovej elektroforéze sú DNA a RNA oddeľované na základe veľkosti, ako prechádzajú cez agarózový gél. Proteíny sú oddeľované taktiež na základe veľkosti väčšinou s použitím SDS-PAGE gélu. Proteíny však môžu byť separované na základe ich elektrického náboja s využitím isoelektrického gélu.
Northern Blotting.
Northernov prenos je využívaný na zisťovanie prítomnosti, neprítomnosti, relatívneho množstva špecifických RNA molekúl (slúži aj na ich relatívne porovnávanie v sade rôznych RNA vzoriek). Je to v podstate kombinácia denaturačnej RNA gélovej elektroferázy a blotu. V tomto procese prebieha separácia RNA na základe veľkosti a následne sú gély RNA prenesené na nitrocelulózový papier, kde je ich dvojitý reťazec prerobený na jednoduchý reťazec a označené sondy. Po následnom opláchnutí a osušení je každá RNA so sekvenciu komplementárnou k sekvencii sondy naviazaná na nitrocelulózový papier. Výsledky môžu byť vizualizované množstvom spôsobov závisiacich napríklad od druhu označenia, no väčšina výsledkov odhaľuje pásy, reprezentujúce zoradenie objavených RNA vo vzorke. Intenzita pásov závisí od množstva cieľovej RNA v analyzovanej vzorke. Celá procedúra je bežne využívaná na štúdium kedy a ku koľkým génovým expresiám v konkrétnom type tkaniva došlo cez meranie množstva RNA nachádzajúcej sa v rôznych vzorkách. Je to jeden zo základných nástrojov na určovanie kedy presne došlo ku génovým expresiám v živých tkanivách.
Western blotting a imunochémia.
Mnoho proteínových protilátok sa dá vytvoriť vpichovaním malých množstiev proteínov do tela zvierat ako sú myši, zajace, ovce alebo somáre. Tieto protilátky môžu byť následne použité na rozmanité analytické a prípravné techniky.
Pri tomto procese sú proteíny najpv oddelené podľa veľkosti v tenkom géle vloženom medzi dvomi sklenými platňami. Táto technika sa volá SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis). Proteíny v géle sú transferované do PVDF, nitrocelulózy, nylonu alebo inej podpornej membrány, ktorá môže byť neskôr vyšetrená roztokmi protilátok. Tie z protilátok, ktoré sa špecificky naviažu na daný proteín sa môžu zviditeľniť pomocou rôznych techník, napríklad chemoluminescenciou alebo rádioaktivitou.
Protilátky môžu byť tiež využité na vyčistenie proteínov. Protilátky ku proteínom sú vytvárané a často zoskupované do „kvapiek“. Po tom, čo sa protilátka naviaže na želaný proteín, je možné od ostatných proteínov oddeliť komplexy protilátka-proteín cez centrifugáciu. Počas tohto procesu, kvapky do ktorých sa protilátky zoskupili nesú so sebou želané proteíny zanechávajúc ostatné proteíny v roztoku. Protilátky zoskupené do priestorovej opornej živnej látky môžu eventuálne byť použité na odstránenie želaného proteínu z komplexného roztoku. Po omytí neviazaných a nešpecificky viazaných materiálov z „kvapiek“, je daný proteín vymytí zo živnej látky zvyčajne pridaním roztoku s vysokou koncentráciou soli, alebo s rôznimi hodnotami pH živnej látky.
História.
Molekulárna biológia bola založená v 30. rokoch 20. storočia, ale termín bol po prvýkrát vytvorený Warrenom Weaverom v roku 1938. Warren bol v tom čase riaditeľom Prírodných vied v Rockefellerovej nadácií a veril, že biológia má prejsť obdobím významných zmien s prispením nedávnych pokrokov v odboroch ako röntgenová kryštalografia. Preto venoval množstvo peňazí (z Rockefellerovho Inštitútu) na podporu biologických odborov.