N6-Metyladenozín

"N"6-Metyladenozín (m6A) je modifikovaný nukleozid, ktorý bol pôvodne identifikovaný a čiastočne charakterizovaný v 70. rokoch 20. storočia. Je to bežná modifikácia mRNA a DNA. Je prítomná u niektorých vírusov a u väčšiny eukaryotov vrátane cicavcov, hmyzu, rastlín a kvasiniek. Takisto je prítomná v tRNA, rRNA, malej nukleárnej RNA (snRNA) a i v niekoľkých dlhých nekódujúcich RNA, napríklad "Xist".
Biosyntéza a funkcia.
Metylácia adenozínu je riadená veľkým komplexom m6A metyltransferázy, ktorý obsahuje METTL3 ako podjednotku, ktorá viaže SAM. "In vitro" tento komplex preferenčne metyluje RNA oligonukleotidy, ktoré obsahujú sekvenciu GGACU a podobná preferencia bola identifikovaná "in vivo" na značených m6A miestach v genómovej RNA vírusu Rousovho sarkómu a v mRNA hovädzieho prolaktínu. Nedávnejšie štúdie charakterizovali ostatné kľúčové zložky m6A metyltransferázového komplexu u cicavcov, vrátane METTL14, proteín asociovaný s Wilmsovým tumorom 1 (WTAP), KIAA1429 a METTL5. V roku 2010 sa uvažovalo o tom, že prítomnosť m6A v mRNA je dynamická a reverzibilná, čo bolo neskôr potvrdené objavom prvej m6A demetylázy, proteín asociovaný s tukovou hmotou a obezitou (FTO), v roku 2011. To takisto obnovilo záujem v štúdiu m6A. Neskôr bola objavená druhá m6A demetyláza, homológ enzýmu alkB (nazývaný ALKBH5).
Biologické funkcie m6A sú sprostredkované pomocou proteínov, ktoré sa viažu na RNA, ktoré špecificky rozoznávajú metylovaný adenozín. Tieto bielkoviny sa nazývajú „čítačky“ m6A. Rodina enzýmov s doménami homológnymi s T521-B (YTH), ktorá obsahuje proteíny YTHDF1, YTHDF2, YTHDF3 a YTHDC1, boli charakterizované ako priamo „čítačky“ m6A a majú konzervované miesto na viazanie m6A. Inzulínu podobne rastové faktory-2 mRNA viažuce proteíny 1, 2 a 3 (IGF2BP1-3) boli takisto popísané ako nová trieda „čítačiek“ m6A. IGF2BP používajú K homológne domény na selektívne rozpoznávanie RNA, ktoré obsahujú m6A, a podporujú jej transláciu a zvyšujú stabilitu. Tieto "čítačky" m6A, spolu s m6A metyltransferázami ("zapisovačmi") a demetylázami ("vymazávačmi"), tvoria komplexný mechanizmus regulácie m6A, v ktorom "zapisovače" a "vymazávače" rozhodujú o rozložení a prítomnosti m6A v RNA a "čítačky" sprostredkovávajú funkcie závislé na m6A. Okrem toho bolo ukázané, že m6A sprostredkováva i štrukturálny switch, nazvaný m6A switch.
Výskyt.
Kvasinky.
U kvasiniek "Saccharomyces cerevisiae" je homológ podjednotky METTL3, IME4, indukovaný v diploidných bunkách v rámci odpovede na neprítomnosť dusíka a fermentovateľného zdroja uhlíka. Je vyžadovaný na metyláciu mRNA a začiatok správnej meiózy a sporulácie. mRNA IME1 a IM2, kľúčových regulátorov meiózy, sú známe ciele pre metyláciu a to isté platí aj o transkripte IME4.
Rastliny.
U rastlín je väčšina m6A prítomná v posledných 150 nukleotidoch pred poly(A) koncom mRNA.
Mutácie enzýmu MTA, čo je homológ podjednotky METTL3 u "Arabidopsis thaliana", majú za následok zastavenie rastu embrya v globulárnom štádiu. Zníženie m6A o 90 % u dospelých rastlín vedie k dramatickým zmenám rastu a homeotickým abnormalitám kvetov (kvety sa nevyvíjajú správne).
Cicavce.
Značenie m6A v ľudskej a myšej RNA viedlo k identifikácii viac ako 18 000 miest v transkriptoch, kde sa vyskytuje m6A, a viac ako 7 000 ľudských génov, ktoré obsahujú sekvenciu [G/A/U][G&gt;A]m6AC[U&gt;A/C] (tzv. konsenzuálna sekvencia), čo odpovedá predtým odhaleným motívom, kde býva m6A prítomný (GGACU, viď vyššie). Lokalizácia jednotlivých miest, kde sa nachádza m6A, je v mnohých mRNA u ľudí a myší veľmi podobná a transkriptómová analýza ukázala, že m6A sa nachádza v oblastiach, ktoré sú evolučne zachovávané. m6A sa nachádza v dlhých vnútorných exónoch a je obzvlášť bežný v 3' UTR a poblíž stop kodónov. m6A v 3' UTR je takisto asociovaný s prítomnosťou miest, ktoré môžu viazať mciroRNA - asi 2/3 mRNA, ktoré obsahujú m6A v 3' UTR oblasti, majú aspoň jedno väzbové miesto pre microRNA. Integráciou všetkých sekvencií s m6A bola vytvorená nová databáza, nazývaná RMBase, ktorá identifikovala a ukázala ~200 000 miesto v ľudskom a myšom genóme, ktoré odpovedajú prítomnosti m6A v RNA.
Presné značenie m6A pomocou m6A-CLIP/IP (skrátene m6A-CLIP) ukázala, že väčšina m6A sa nachádza v poslednom exóne mRNA v rôznych tkanivách/kultúrach ľudských a myších buniek a že obohatenie m6A pri stop kodónoch je vlastne náhoda, pretože mnohé stop kodóny sa nachádzajú na začiatku posledných exónov, kde je skutočne vyšší výskyt m6A. Vysoký výskyt m6A v poslednom exóne (≥ 70 %) umožňuje potenciálnu reguláciu 3' UTR, vrátane alternatívnej polyadenylácie. Štúdia kombinujúca m6A-CLIP s rigoróznou frakcionáciou buniek ukázala, že m6A modifikácie mRNA vznikajú v nascentnej pre-mRNA a nie sú vyžadované na zostrih, ale rozhodujú o cytoplazmatickej dĺžke života mRNA.
m6A je náchylný na dynamickú reguláciu počas vývoja i v rámci odpovedí na bunkové stimuly. Analýza m6A v RNA z myšieho mozgu ukázala, že hladina m6A je nízka počas vývoja embrya a dramaticky sa zvýši pred dovŕšením dospelosti. Okrem toho platí, že umlčanie m6A metyltransferázy výrazne ovplyvňuje expresiu génov a alternatívnych zostrihov RNA, čo vedie k modulácii signálnej dráhy p53 (známeho i ako TP53) a apoptóze.
m6A sa nachádza i na RNA v rámci R-slučiek (rozdelenej dvojzávitnici DNA, na ktorú je pripojená RNA, čím vzniká triplet DNA, DNA, RNA) v ľuďských bunkách, kde sa účastní regulácie stability hybridov RNA:DNA.
Nedávno bol ukázaný význam m6A metylácie pre fyziologické procesy. Inhibícia m6A metylácie pomocou farmakologickej inhibície bunkovej metylácie alebo konkrétnejšie umlčaním m6A metylázy METTL3 pomocou siRNA viedlo k predĺženiu periódy circadiánneho rytmu. Naopak, zvýšená expresia METTL3 viedla ku kratšej perióde. Cicavčie cirkadiánne hodiny, ktoré sú zložené zo spätnoväzbovej transkripčnej slučky, ktorá ja prísne regulovaná, aby oscilovala s periódou približne 24 hodín, je teda extrémne senzitívna na zmeny v m6A-dependentnom spracovaní RNA, pravdepodobne kvôli prítomnosti m6A v transkriptoch potrebných génov. Účinku globálnej inhibície metylácie na periódu cirkadiánneho rytmu u myších buniek sa dá predísť pomocou ektopickej (na nezvyčajnom mieste) expresie enzýmu z metabolizmu bakteriálnej metylácie. Myšie bunky exprimujúce tento bakteriálny proteín boli odolné voči farmakologickej inhibícii metylačného metabolizmu a navykazovali zníženie m6A metylácie mRNA alebo metylácie proteínov.
Klinický význam.
Vzhľadom na verzatilitu m6A v mnohých fyziologických procesoch nie je prekvapivé, že existuje spojenie medzi m6A a mnohými ľudskými chorobami. Mnohé z nich existujú kvôli mutáciám alebo ako jednonukleotidové polymorfizmy. Spojenie medzi m6A a mnohými druhmi rakoviny bolo naznačené vo výskumoch a zahŕňa rakovinu žalúda, prostaty, prsníka, pankreasu, obličiek, mezotelióm, sarkóm a leukémiu. Čím viac dát je dostupných, tým viac vyzerá, že m6A pôsobí na delenie rakovinových buniek. Je známe, že vyčerpanie METTL3 vedie k apoptóze rakovinových buniek znižuje ich invazívnosť, zatiaľ čo aktivácia ALKBH5 kvôli hypoxii spôsobuje rozvoj rakovinových kmeňových buniek. Bolo naznačené i to, že m6A sa účastní regulácie energetickej homeostázy a obezity, keďže FTO je hlavný regulačný gén na energetický metabolizmus a obezitu. Bolo ukázané, že jednonukleotidové polymorfizmy FTO sú asociované s indexom telesnej hmotnosti (BMI) v ľudskej populácii a výskytom obezity a diabetu. Takisto bol navrhnutý možný vplyv FRO na pre-adipocytovú diferenciáciu. Takisto bolo skúmané spojenie medzi m6A a neurónovými poruchami. Napríklad neurodegeneratívne poruchy môžu byť ovplyvnene m6A, pretože dopamínová signalizácia je závisla na FTO a správnej metylácii m6A kľúčových signalizačných transkriptov. Je známe, že mutácie HNRNPA2B1, potenciálnej „čítačky“ m6A, vedú k neurodegenercii. IGF2BP1–3, nový druh m6A „čítačiek“, má onkogénnu funkciu. Zníženie či zastavenie expresie IGF2BP1–3 vedie k zníženiu expresie proteínu MYC, proliferácii buniek a tvorby kolónií ľudských rakovinových buniek. Pri znížení expresiu ZC3H13, zložky m6A metyltransferázového komplexu, bola pozorovaná značná inhibícia rastu kolorektálnnych rakovinových buniek.
Okrem toho bolo ovplyvňuje m6A i virálne infekcie. Mnohé RNA vírusy, vrátane SC40, adenovírusu, vírusu herpesu, vírusu Rousovho sarkómu a vírusu chrípky, obsahujú m6A metylácie na vírusovej genómovej RNA. Ďalšie nedávne štúdie preukázali, že regulátory m6A ovládajú úspešnosť infekcie a replikácie RNA vírusov, ako je vírus HIV, vírus hepatitídy C a Zika vírusu. Tieto výsledky naznačujú, že m6A a príbuzné faktory hrajú dôležitú úlohu v regulácii životného cyklu vírusu a interakcií vírusu s hostiteľom.