Trp operón

Tryptofánový operón, skrátene "trp" operón, je operón – skupina génov, ktoré sa využívajú alebo transkribujú naraz – ktorý kóduje jednotlivé zložky potrebné pre produkciu tryptofánu. Tryptofánový operón je prítomný u mnohých baktérií, ale prvýkrat bol opísaný u baktérie "Escherichia coli". Pokiaľ je tryptofán prítomný v okolí, neexprimujú sa gény tohto operónu potrebné pre jeho syntézu. Tento operón bol veľmi dôležitým experimentálnym systémom pri skúmaní génovej regulácie a bežne sa využíva na jej vysvetlenie.
Tryptofánový operón obsahuje päť štruktúrnych génov – trpE, trpD, trpC, trpB a trpA – ktoré kódujú enzýmy tejto metabolickej dráhy. Okrem toho obsahuje i represívny regulačný gén, trpR. Tento regulačný gén má promótor, kam sa viaže RNA polymeráza, ktorá syntetizuje mRNA pre regulačný proteín. Proteín sa následne viaže na operátor, čím znemožňuje transkripciu. V "trp" operóne sa tryptofán viaže na represorový proteín, čím sa blokuje transkripcia génov. Ide teda o represiu pomocou blokovania RNA polymerázy, ktorá nemôže prepisovať gény v operóne. Narozdiel od "lac" operónu má "trp" operón ešte vedúci proteín a atenuátor, ktoré umožňujú stupňovanú reguláciu.
Tryptofánový operón je príkladov reprimovateľnej negatívnej regulácie génovej expresie. Represorový proteín sa viaže na operátor v regulačnej sekvencii tohto operónu, ak je prítomný tryptofán, čím sa znemožní transkripcia. Represorový proteín sa naopak uvoľní, ak je tryptofán nedostupný, čím sa transkripcia povolí.
Gény operónu.
Tryptofánový operón obsahuje päť štruktúrnych génov:
Represia.
Operón využíva mechanizmus negatívnej reprimovateľnej spätnej väzby. Represor tohto operónu je produkovaný génom trpR, nachádzajúcim sa upstream od operónu (pred operónom), ktorý je stále produkovaný v malom množstve. Nasyntetizované trpR monoméry následne tvoria diméry. Keď je tryptofán prítomný, viaže sa na tieto diméry, čo spôsobuje zmenu konformácie represoru, na základe čoho sa represor môže viazať na operátor "trp" operónu. Týmto sa zabráni väzbe RNA polymerázy na operón a prepisu génov, takže sa tryptofán neprodukuje. V prítomnosti tryptofánu totiž nie je nutné produkovať ďalší tryptofán, takže jeho prítomnosť zastaví jeho syntézu. Ak tryptofán nie je prítomný, neaktívny represor sa nedokáže viazať na operátor, takže prepis génov nie je inhibovaný.
Represor trpR riadi expresiu minimálne štyroch ďalsích génov, ktoré sa týkajú syntézy tryptofánu – okrem "trp" operónu ("trpO") riadi i expresiu génov "trpR" (vznik seba samého), "aroH" a "aroL" (súčasť šikimátovej dráhy) a "mtr" (permeáza špecifická pre tryptofán)"."
Atenuácia.
Atenuácia (útlm, zoslabenie) je druhým mechanizmom negatívnej spätnej väzby prítomným v "trp" operóne. Zatiaľ čo represorový systém funguje na základe intracelulárnej koncentrácie tryptofánu, atenuácia je spojená s koncentráciou aktivovanej tRNAtrp. Represor teda znižuje expresiu génov na základe zmeny počiatku transkripcie, zatiaľ čo atenuácia ovplyvňuje proces transkripcie, ktorá už začala. Represor znižuje transkripciu až 70x a atenuácia ju môže znížiť ešte 10x, čo znamená celkové možné zníženie asi 700x. Atenuácia je možná vďaka tomu, že u prokaryotov (ktoré nemajú bunkové jadro) prebieha translácia mRNA už počas toho, ako RNA polymeráza transkribuje DNA sekvenciu operónu. Tento proces umožňuje translácii priamo ovplyvniť transkripciu operónu.
Na začiatku "trp" operónu existuje sekvencia aspoň 130 nukleotidov, ktorá sa nazýva vedúci transkript. Lee a Yanofsky v roku 1977 zistili, že účinnosť atenuácie súvisí so stabilitou sekundárnej štrukúry trpL. Tieto dve vlásenky, ktoré tvoria terminátorové štruktúry, boli neskôr objasnené Oxenderom "et al." v roku 1979. Vedúci transkript obsahuje štyri krátke sekvencie, označované postupne 1-4. Káždá z týchto sekvencií je vždy čiastočne komplementárna so sekvenciou, ktorá nasleduje po nej. Na základe toho teda dochádza k tvorbe troch rôznych sekundárnych štruktúr (vláseniek): 1–2, 2–3 alebo3–4. Hybridizácia sekvencií 1 a 2, ktorá vedie k tvorbe štruktúry 1–2, je vzácna, pretože RNA polymeráza čaká na naviazanie ribozómu, než pokračuje v transkripcii za sekvenciou 1. Ak sa však táto štruktúra vytvorí, znemožní tvorbu štruktúry 2–3 (ale nie 3–4). Tvorba vlásenky zo sekvencií 2 a 3 potom znemožňuje tvorbu ostatných vláseniek, teda 1–2 aj 3–4. Štruktúra 3–4 je takzvaná transkripčná terminačná sekvencia, ktorá obsahuje veľa G/C a hneď za nimi nasleduje niekoľko uracilových reziduí. Keď sa vytvorí táto štruktúra, RNA polymeráza disociuje z DNA a transkripcia štruktúrnych génov operónu je ukončená (pozri nižšie). Pri experimentoch s destabilizáciou G+C párovania druhej vlásenky, tvorenej sekvenciami 3 a 4, bola pozorovaná znížená frekvencia transkripčnej terminácie, čo preukazuje dôležitosť druhej vlásenky pre funkciu transkripčnej terminácie.
Časť vedúceho transkriptu kóduje krátky polypeptid tvorený 14 aminokyselinami, ktorý sa nazýva aj vedúci peptid. Tento peptid obsahuje dve po sebe idúce tryptofánové reziduá, čo je nezvyčajné, vzhľadom na to, že tryptofán je celkom neobvyklou aminokyselinou (bežný proteín z "E. coli" je tvorený tryptofánom z asi 1%). Sekvencia 1 v trpL zahŕňa región, ktorý postupne obsahuje reziduá Trp, Trp, Arg, Thr a Ser. Týchto päť reziduí je vysoko konzervovaných (zachovaných naprieč rôznymi druhmi baktérií), zatiaľ čo mutácie v oblasti pred touto sekvenciou (upstream) nevedú k zmene expresie operónu. Keď ribozóm príde k tejto časti sekvencie a koncentrácia tryptofánu je nízka, zastaví sa na niektorom z kodónov Trp. Keď zastaví, fyzicky bráni sekvencii 1 transkriptu viazať sa na sekvenciu 2, takže blokuje tvorbu štruktúry 1–2. Sekvencia 2 sa potom môže voľne viazať na sekvenciu 3 a tvoriť štruktúru 2–3, ktorá zase zabraňuje tvorbe štruktúry 3–4 (terminačnej vlásenky). Preto sa štruktúra 2–3 občas nazýva antiterminačnou vlásenkou. V prítomnosti štruktúry 2–3 môže RNA polymeráza naďalej pokračovať v transkripcii operónu. Štúdie a analýzy pomocou mutácií, ktoré využívali komplementárne oligonukleotidy, ukázali, že stabilita štruktúry 2–3 odpovedá úrovni expresie operónu. Ak je koncentrácia tryptofánu v bunke vysoká, ribozóm preloží celý vedúci peptid bez prerušenia a zastaví sa len pri terminácii translácii na stop kodóne. V tomto prípade ribozóm zaberá sekvencie 1 a 2, čo umožňuje tvorbu štruktúry 3–4, ktorá ukončí transkripciu. Táto terminačná štruktúra sa tvorí v prípade, že sa ribozóm nezastaví pri kodónoch Trp alebo Arg: buď sa nepreložil vedúci peptid, alebo translácia pokračuje bez problémov s dostatkom aktivovaných tRNAtrp. Ribozóm blokuje len asi 10 nukleotidov dopredu (downstream), takže ak sa ribozóm zastaví pri inom kodóne, evidentne neovplyvňuje tvorbu terminačnej vlásenky. Výsledkom je, že operón sa prepisuje len v prípade, že je tryptofán nedostupný pre ribozómy, zatiaľ čo trpL transkript sa stále exprimuje.
Tento atenuačný mechanizmus je experimentálne podložený niekoľkými štúdiami. Bolo priamo ukázané, že translácia vedúceho peptidu a zastavenie ribozómu sú nutné predpoklady pre inhibíciu transkripčnej terminácie. Mutačná analýza destabilizujúca alebo narúšajúca párovanie báz antiterminačnej vlásenky ukázala niekoľkonásobne zvýšenú frekvenciu terminácie – toto je konzistentné s atenuačným modelom, pretože táto mutácia spôsobuje nadmernú termináciu i v prípade neprítomnosti Trp. Naproti tomu oligonukleotidy komplementárne so sekvenciou 1 zvyšujú expresiu operónu, nakoľko podporujú tvorbu antiterminačnej vlásenky. U histidínového operónu bolo ukázané, že schopnosť párovania sekvencií 2 a 3 je dôležitejšia pri znížení atenuácie, než ich primárna sekvencia.
Poloha, v ktorej sa ribozóm zastaví, určuje, či sa vytvorí terminačná vlásenka alebo nie. Aby mohla polymeráza rozpoznať alternatívnu štruktúru, rýchlosť štruktúrnej modulácie musí byť porovnateľná s rýchlosťou transkripcie. Aby bolo zariadené, že sa ribozóm ihneď naviaže a začne prekladať vedúci tanskript hneď po jeho syntéze polymerázou, existuje v trpL špeciálna sekvencia, kde polymeráza zastaví. Až sa k nej RNA polymeráza dostane, zastaví sa a evidentne čaká na to, kým začne translácia. Tento mechanizmus umožňuje synchronizáciu transkripcie a translácie, čo je dôležité pre správnu funkciu atenuácie.
Podobný atenuačný mechanizmus reguluje i syntézu histidínu, fenylalanínu, treonínu či rozvetvených aminokyselín.
Regulácia "trp" operónu v "Bacillus subtilis".
Gény "trp" operónu "Bacillus subtilis" sú usporiadané rovnako, ako v prípade "E. coli". Regulácia "trp" operónu je v oboch organizmoch závislá na hladine tryptofánu v bunke. Narozdiel od "E. coli" je však u "B. subtilis" atenuácia hlavným spôsobom regulácie biosyntézy tryptofánu namiesto represie. U "B. subtilis" sa tryptofán viaže na atenuačný proteín, TRAP (RNA-viažuci atenuačný proteín aktivovaný tryptofánom), ktorý sa následne viaže na RNA. Tento proteín má 11 podjednotiek. Väzba tryptofánom aktivovaného TRAP na vedúcu sekvenciu RNA vedie k tvorbe terminačnej štruktúry, čo vedie k ukončeniu transkripcie.