Protilátka

Protilátka (iné názvy: antilátka, imunoglobulín; skratky: "Ig", "Ab", z angl. antibody) je veľký proteín tvaru Y produkovaný efektorovými B-lymfocytmi ako humorálna súčasť imunitného systému. Ich funkciou je identifikácia, opsonizácia (označenie) a neutralizácia cudzích elementov v tele (vírusy, baktérie, transplantáty) a aktivácia komplementu.
Štruktúra protilátok.
Protilátky sú tvorené dvoma ťažkými (H) a dvoma ľahkými (L) reťazcami, ktoré sú navzájom spojené disulfidickou väzbou . Zatiaľ čo ťažké reťazce sú tvorené štyrmi až piatimi doménami a ich molekulová hmotnosť je v rozmedzí 50 – 75 kDa, ľahké reťazce sú tvorené vždy dvoma doménami a ich približná molekulová hmotnosť je 25 kDa. Domény na N-konci všetkých reťazcov sú tzv. variabilné (označované VH a VL) a ich štruktúra je iná pre každý klon B-lymfocytov. Ostatné domény sú tzv. konštantné (CL a CH1 – 4, číslované od N-konca), sú teda rovnaké pre protilátky toho istého typu. Variabilné domény tvoria tzv. idiotop, čo je časť protilátky, ktorá dokáže rozoznať určitú konkrétnu časť antigénu (tzv. epitop).
Proteolyticky je možné molekulu imunoglobulínu rozštiepiť na definované fragmenty: pôsobením papaínu vznikajú dva rovnaké fragmenty Fab (každý s jedným ľahkým a ťažkým reťazcom) a fragment Fc. Na fragment Fc sa viažu svojimi Fc receptormi fagocyty, NK bunky a iné bunky imunitného systému. Podľa typu ťažkého reťazca, ktorý tvorí inmunoglobulín ich rozdeľujeme na 5 základných typov – nazývaných izotypy: IgA, IgD, IgG, IgE, IgM. Typ ich ťažkého reťazca, najmä štruktúrna väzba kryštalizujúceho fragmentu, ktorým sa viažu na bunkové receptory, ovplyvňuje ich interakciu s bielymi krvinkami aj proteínmi – ako je systém komplementu. Protilátky, ktoré vytvára jedna plazmatická bunka sa môžu líšiť typom ťažkého reťazca, aj ich môže byť viac typov, všetky sú ale zamerané na ten istý antigén-majú rovnakú variabilnú oblasť. Aby sa organizmus dokázal brániť veľa rôznym antigénom, musí aj tvoriť veľké množstvo protilátok, rádovo milióny. Ak by variabilné oblasti protilátok boli presne kódované génmi, ich počet by bol obrovský, nestačil by ani celý ľudský – súčasný genóm! Preto B-lymfocyt používa smerovanú evolúciu na vygenerovanie potrebných oblastí ľahkých i ťažkých reťazcov. Za tento objav dostal Susumu Tonegava v 1987 Nobelovu cenu v lekárstve.
Funkcia.
Protilátky sa svoju variabilnou časťou viažu na antigén a zabraňujú tak patogénu vstupovať do buniek organizmu a poškodzovať ich (tzv. neutralizácia). Po naviazaní na antigén tiež môžu aktivovať komplement a opsonizáciou aktivovať deštrukčné mechanizmy efektorových buniek, predovšetkým fagocytov.
Aktivácia komplementu.
Po naviazaní protilátky na patogén sa zmení jej konformácia tak, že na Fc časti odkryje väzbové miesto pre zložku komplementu C1, ktorá následne spúšťa kaskádu reakcií vedúcu ku chemotaxii ostatných zložiek imunitného systému, ďalšej opsonizácii patogénu a prípadne ku osmotickej lýze cieľovej bunky.
Opsonizácia.
Väzbou na mikroorganizmy a antigénne častice protilátky zlepšujú alebo umožňujú reakciu ďalších efektorových buniek, ktoré sa svojimi Fc receptormi viažu na Fc časti protilátok na povrchu patogénu. Fc receptory sa nachádzajú predovšetkým na povrchu fagocytov, ale aj na povrchu NK buniek (CD16), bazofilov a mastocytov.
Izotypy.
Génové úseky, ktoré kódujú rôzne časti izotypov ťažkých reťazcov, sú za sebou usporiadané tandemovo (u človeka na 14. chromozóme). Ťažké reťazce, ktoré tieto úseky kódujú, sa nazývajú μ, δ, γ, α a ε, pričom u človeka existujú 4 významne odlišné subtypy γ1-γ4 a 2 významne odlišné subtypy α1-α2. Imunoglobulíny tvorené týmito izotypmi ťažkých reťazcov sa nazývajú IgM, IgD, IgG1-4, IgA1-2 a IgE. V jednej molekule imunoglobulínu sú vždy totožné ľahké a ťažké reťazce.
IgM.
Protilátka IgM sa môže nachádzať na povrchu B-lymfocytu v monomérnej forme a tvoriť tak jeho receptor (BCR). Sekretovaný IgM existuje vo forme pentamérov, v ktorých sú jednotlivé monoméry spojené do kruhu cystínovými mostíkmi – molekula IgM má teda 10 väzbových miest pre antigén. IgM je prvým typom protilátky, ktorý sa vytvorí po stretnutí s antigénom. Tiež dobre viaže komplementový proteín C1 a aktivuje tak klasickú dráhu komplementu.
IgD.
IgD sa v monomérnej forme tiež nachádza na povrchu B-lymfocytov ako ich receptor ešte pred ich stretnutí s antigénom. Aktivuje bazofily a mastocyty, ktoré následne produkujú antimikrobiálne faktory.
IgG.
IgG je hlavný sérový izotyp (hlavne IgG1) a jeho jednotlivé subtypy sa odlišujú schopnosťou viazať komplementový proteín C1. Väčšinou sa dobre viažu na Fc receptory fagocytov a na tzv. proteín A, ktorý sa nachádza na povrchu niektorých kmeňov stafylokokov.
IgA.
IgA sa vyskytuje v slizničnej a v sérovej forme. Slizičný IgA sa skladá z dvoch monomérov spojených tzv. J reťazcom a zo sekrečnej komponenty. Ich veľké množstvo na povrchu slizníc tvorí významnú časť ochrany pred mikroorganizmami. Sérový IgA neaktivuje komplement, ale viaže svojou Fc časťou špecifické Fcα receptory na fagocytoch.
IgE.
IgE sa vyskytuje v zdravých jedincoch len v malých koncentráciách a uplatňuje sa predovšetkým pri obranných reakciách proti mnohobunkovým parazitom na slizniciach. Je hlavnou príčinou alergických reakcií. Vysokoafinitné receptory pre IgE sa nachádzajú na povrchu mastocytov a bazofilov.
Protilátková diverzita.
Na to, aby protilátky boli schopné rozpoznať ľubovoľný patogén, je potrebný ich široký repertoár s rôznymi variabilnými časťami. Bolo preukázané, že ľudia produkujú okolo 10 miliónov rôznych protilátok – počet konkrétnych protilátok u jedinca je odlišný v závislosti od jeho génovej variability.
Usporiadanie génov imunoglobulínových reťazcov.
Gény kódujúce reťazce imunoglobulínov sú zložené z veľkého počtu niekoľkých druhov úsekov (tzv. génových segmentov). Gény pre ľudské H-reťazce sú usporiadané v génovom komplexe na 14. chromozóme. Tento komplex obsahuje (od 5' konca) niekoľko stoviek sekvenčne podobných úsekov V (variabilita), ďalej skupinu asi 50 krátkych úsekov D (diverzita) a skupinu deviatich krátkych úsekov J (z angl. joining). Ďalej sú tandemovo usporiadané úseky C (constant) – gény kódujúce konštantnú časť H-reťazca. Na koncoch jednotlivých V, D a J úsekov sú sekvencie, ktoré sú rozoznávané enzýmami zodpovednými za splicing, po stranách úsekov C sú tzv. prešmykové (switch) sekvencie, ktoré sú rozoznávané enzýmami zodpovedými za tzv. izotypový prešmyk. Gény ľudských L-reťazcov sú usporiadané podobne, nemajú však úseky D a majú menší počet úsekov V a J.
Proces rekombinácie.
Pri diferenciácii B-lymfocytov dochádza v ich progenitoroch (pro-B-lymfocyt) najprv ku vyštiepeniu časti génu medzi náhodne vybraným D a J segmentom (D-J preskupenie). Toto preskupenie môže prebiehať opakovane a prebieha paralelne na oboch chromozómoch. Ďalej nasleduje vyštiepenie náhodnej časti génu medzi V a D segmentom (V-D preskupenie). Ak je výsledok preskupenia na jednom chromozóme produktívny, čiže ak prepisom vzniknutá mediátorová RNA (mRNA) dáva vznik kompletnému peptidu, je proces preskupovania na druhom chromozóme zastavený. Tento proces sa nazýva alelická exklúzia. Primárny transkript tohto génu je alternatívnym splicingom upravený tak, že sú vyštiepené zvyšné úseky J a vzniká tažký reťazec (IgH) s konštantou časťou korešpondujúcou imunoglobulínu typu M alebo typu D. V tejto fáze sa bunka nazýva pre-B-lymfocyt. IgH asociuje s náhradnými L-reťazcami a vystavuje sa na povrchu bunky podobne ako BCR.
Gény pre L-reťazec kódujú dva jeho typy označujú ako reťazce κ a λ. Najprv prebieha V-J preskupenie na génoch pre κ reťazec oboch chromozómov, až kým produkt jedného z nich nie je schopný asociovať s už vytvoreným IgH. Ak je preskupenie na jednom chromozóme úspešné, na druhom chromozóme sa zastaví. Ak nie je úspešné na ani jednom, iniciuje sa preskupovanie na génoch pre λ reťazec. Ak nie je ani to úspešné, bunka hynie. Po úspešnom preskupovaní bunka produkuje povrvchový IgM a stáva sa tak nezrelým B-lymfocytom. V ďalšom štádiu sú produkované alternatívnym splicingom súčasne IgM a IgD a bunka sa stáva zrelým B-lymfocytom.
Variabilita imunoglobulínov je teda daná rôznymi kombináciami V, D a J úsekov. Tieto úseky navyše nie sú spájané presne definovaným spôsobom, čiže na rovnakých miestach. Okrem toho môžu byť odstrihnuté konce V, D a J segmentov predĺžené o náhodné tzv. N-sekvencie pôsobením enzýmu terminálna transferáza, čo ešte viac zvyšuje variabilitu imunoglobulínov.
Tieto protilátky sa vyznačujú pomerne nízkou afinitou k antigénu a sprostredkujú tzv. protilátkovú reakciu vyvolanú antigénmi nezávislými od T-lymfocytov.
Afinitná maturácia.
Afinita protilátok voči antigénom môže byť niekoľkonásobne zvýšená za asistencie pomocných T-lymfocytov (Th lymfocytov) a folikulárnych dendritických buniek (FDC) v primárnych lymfoidných folikuloch. FDC a špecializovaná línia makrofágov vystavujú na svojich Fc receptoroch a komplementových receptoroch opsonizované antigény, ktoré rozoznávajú zrelé B-lymfocyty svojimi BCR receptormi, zatiaľ čo ich MHC glykoproteíny II s vystavenými peptidmi z pohltených patogénov môžu byť rozoznané TCR receptorom Th lymfocytov. Takto stimulované B-lymfocyty vstupujú do germinálnej reakcie, počas ktorej dochádza k ich deleniu a k opätovnému preskupovaniu V, D a J segmentov. Pod selekčným tlakom hynie väčšina B-lymfocytov a prežijú iba tie, ktorých imunoglobulíny majú zvýšenú afinitu. Výsledkom germinálnej reakcie je tzv. afinitná maturácia vznikajúcich protilátok, keďže ich afinita ku antigénom je o 4 – 6 rádov vyššia. B-lymfocyty, ktoré prešli afinitnou maturáciou, sa nazývajú plazmatické bunky .Zlepšenie rozoznávania nepriateľských látok T-lymfocytami je názorným príkladom mikroevolúcie. Po prvom úspešnom zachytení cudzej látky sa kontaktné segmenty na jeho ľahkých a aj ťažkých reťazcoch zmutujú a to niekoľkonásobne a následne sa vyskúša“ ich schopnosť detegovať cudziu látku. Používajú sa potom tie, ktoré boli najúčinnejšie. Takýmto spôsobom sa výrazne zlepší ich rozpoznávaia schopnosť na akonkrétneho „nepriateľa“. Táto „smerovaná mikroevolúcia“ prináša úsporu miesta v DNA bunky a zároveň vylepší obranu organizmu. Tento jav sa nazýva aj somatická hypermutácia. Pre organizmy prináša zlepšenie rozpoznávacej schopnosti protilátok na príslušný antigén. Prebieha naprogramovaný proces mutácií hypervariabilných oblastí genetickej základne antigénu. Netýka sa však buniek pohlavných – na potomstvo nie je prenášané. Po rozpoznaní antigénu sa B-lymfocyt začne masívne množiť. Pritom sa gény, čo vytvárajú receptory zmenia – mutujú stotisíc až miliónkrát častejšie než bežne! Najviac sa zamieňajú nukleotidy iným typom – tým sa menia gény, iné spôsoby – vloženie alebo mazanie nukleotidov sa robí len vzácne. Zo vzniknutých ntigénov sa potom selekčným mechanizmom vyberajú tie, ktoré najlepšie rozpoznávajú antigén. Toto rozpoznávanie sa už mierne líši pre antigény, lebo aj receptory sú málo odlišné. Postupným mutovaním a selekciou najlepších receptorov antigénov sa ich rozpoznávacia schopnosť už potom zlepší až rádovo! Táto najúčinnejšia B-bunka potom zostane a sa masívne a rýchlo rozmnoží, aby jej protilátky sa využili pri obrane voči antigénu. Zároveň sa „uloží do pamäte“, aby pre budúcu infekciu bola už pripravená. Pri somatickej hypermutácii zároveň protilátky sú upravené, aby neútočili na bunky vlastného tela, aby neprišlo zároveň na vznik autoimunitného ochorenia-zápalu, ale nevieme momentálne princíp tejto úpravy.
Izotypový prešmyk.
Pri germinálnej reakcii dochádza navyše k izotypovému prešmyku, čiže k zámene konštantnej časti produkovaných imunoglobulínov. To, aké izotypy vznikajú, je dané pôsobením cytokínov (IL-4, TGF-ß, IL-10, IFN-γ a iné).
Imunitné reakcie založené na protilátkach.
Tento druh imunitných reakcií je založený na rozpoznaní antigénu povrchovým antigénne špecifickým receptorom B-lymfocytov (BCR). Takto stimulované B-lymfocyty sa môžu pomnožiť a diferencovať na plazmatické bunky sekretujúce veľké množstvo protilátok. Väčšina antigénov je schopná vyvolať protilátkovú odpoveď založenú len na spolupráci B-lymfocytov s Th-lymfocytmi, niektoré (hlavne polysacharidy) sú však od T-lymfocytov nezávislé.
Konštitutívne protilátky.
Niektoré protilátky sú niektorými B-lymfocytmi produkované spontánne a konštitutívne. Tieto protilátky tvoria s antigénmi imunokomplexy a zohrávajú rolu v primárnej fáze protilátkovej reakcie (pozri nižšie).
Reakcia vyvolaná antigénmi nezávislými na T-lymfocytoch.
Táto reakcia závisí hlavne na tvorbe nízkoafinitných protilátok triedy IgM. Je vyvolaná rozpoznaním typických povrchových štruktúr patogénov (lipopolysacharid, flagelin, polysacharidy tvoriace puzdrá a bunkovú stenu baktérií, polyproteíny tvoriace obálku vírusov) receptormi B-lymfocytov (hlavne tzv. TLR, z angl. toll-like receptor). Nezávislosť od T-lymfocytov však nie je úplná – B-lymfocyty potrebujú pre aktiváciu niektoré cytokíny (IL-2, IL-3, IFN-γ), ktoré sú produkované aj T-lymfocytmi.
Reakcia vyvolaná antigénmi závislými na T-lymfocytoch.
B-lymfocyt môže po rozoznaní antigénu daný patogén pohltiť a jeho peptidické štepy vystaviť na MHC gp II. Tie môžu byť rozoznané receptormi Th-lymfocytov (TCR), ktoré boli stimulované MHC gp II antigén prezentujúcich buniek, ktoré predtým pohltili rovnakého patogéna. Ide teda o špecifickú aktiváciu B-lymfocytov, pre ktorú je potrebná súhra antigén prezentujúcich buniek, Th-lymfocytov a B-lymfocytov. V prípade, že bol B-lymfocyt stimulovaný patogénom ako cez BCR, tak aj cez iný receptor (napr. TLR), je možná jeho aktivácia v rámci tzv. minimálneho modelu, v ktorom antigén prezentujúce bunky nie sú potrebné. Reakcia vyvolaná antigénmi závislými na T-lymfocytoch prebieha vo dvoch fázach.
Primárna fáza protilátkovej reakcie.
V tejto fáze vytvárajú prirodzené protilátky imunokomplexy, ktoré sú spolu s opsonizovanými antigénmi transportované lymfou (v prípade sleziny krvou) do sekundárnych lymfatických orgánov. Tieto antigény a imunokomplexy sú zachytávané špecializovanou populáciou makrofágov a folikulárnych dendritických buniek (FDC), na ktorých povrchu sú uchovávané v natívnom stave. Rovnaké antigény sú zároveň do sekundárnych lymfatických orgánov prenesené dendritickými bunkami, ktoré ich rozštiepené na peptidy prezentujú na svojich MHC gp II T-lymfocytom. Tak dochádza v tzv. T-bunkovej zóne ku stimulácii Th-lymfocytov. Rozpoznanie antigénu na povrchu FDC B-lymfocytmi spôsobí putovanie B-lymfocytov ku Th-lymfocytom, kde dochádza k proliferácii B-lymfocytov, a ich diferenciáciu na plasmatické bunky. Časť B-lymfocytov sa premieňa na tzv. pamäťové bunky a ďalšia časť vstupuje do sekundárnej fázy protilátkovej reakcie.
Sekundárna fáza protilátkovej reakcie.
V tejto fáze B-lymfocyty nie sú diferencované na plazmatické bunky, ale vracajú sa naspäť do lymfoidného folikulu, kde prebieha germinálna reakcia. B-lymfocyty sú na jej konci diferencované na plazmatické bunky s rádovo vyššou afinitou voči antigénu.
Monoklonálne protilátky.
Protilátková odpoveď aj proti jednoduchým antigénom je skoro vždy polyklonálna, čiže výsledkom je množstvo individuálne odlišných molekúl imunoglobulínov. Monoklonálne protilátky sú produktom jedného klonu plazmatických buniek, sú špecifické pre totožný epitop a sú rovnakého izotypu. Môžu prevládať v prípade nádoru plazmatických buniek (tzv. plazmocytom).
Príprava monoklonálnych protilátok.
Monoklonálne protilátky je možné pripraviť "in vitro", problémom je však krátka doba života B-lymfocytov. Tento problém sa rieši fúziou B-lymfocytu s vhodnou myelómovou bunkovou líniou, čím vzniká tzv. hybridóm. Monoklonálne protilátky majú veľké využitie ako pre diagnostické a lekárske účely, tak pre výskum.
Monoklonálne protilátky vo výskume.
Monoklonálne protilátky sú hojne využívané predovšetkým v oblasti biochémie a molekulárnej biológie. Sú na nich založené techniky izolácie proteínov (afinitná chromatografia, imunoprecipitácia) a ich detekcie (western blot, enzýmová imunosorbentová analýza, imunofluorescenčné metódy). Reakcia protilátky a antigénu je základ praktick všetkých sérologických metód v ľudskej aj veterinárnej medicíne. Metódy sa líšia najmä vizualizáciou antigénu viažúceho protilátky. Toto nám prináša spôsob na určenie veľa infekčných aj autoimunitných postihnutí či onemocnení.
Princípy zvýraznenia väzby vytváranej obrannými látkami z B-lymfocytov:
Monoklonálne protilátky v medicíne.
Monoklonálne protilátky sa môžu používať ako liek proti jedom (typicky uštipnutie hada). Najnovším využitím sú rekombinantné proteíny, ktoré zvyšujú afinitu imunitných buniek k ich cieľovým bunkám a zvyšujú tak ich efektivitu, napr. s cieľom liečiť rakovinu.
Počiatky imunity.
Samotný imunitný systém je podstatnou časťou organizmu. To ako vznikol nám môže umožniť lepšie ho pochopiť alebo aj zlepšiť. Táto otázka, stále, však zostáva v rovine skúmania aj sporov. Hoci boli navrhnuté viaceré scenáre jeho evolučného vývoja, neboli zatiaľ všeobecne prijaté, sú príliš povrchné. Vážnym impulzov pre súčasný výskum najmä v posledných rokoch, to boli zástancovia hnutia inteligentného dizajnu, ktorý ho označujú za prípad mechanizmu tzv. nezjednodušiteľnej zložitosti a preto tvrdia, že nie je možné, aby bol vytvorený nikým neriadenými, čisto materialistickými evolučnými procesmi. Má niekoľko častí, ktoré navzájom závisia a vytvárajú jeho obrannú funkciu, ale samostatne! takúto funkciu nemajú – receptory, väzba von na B-bunku, B-bunka, naprogramovaný proces hypermutácií a selektovania – riadená mikroevolúcia, pamätanie použitých protilátok. Navyše sú vzájomne zosúladené, aby spolupracovali. Vysvetlenia prevzaté na zverejnenie v literatúre, registroch sú nepresné a povrchné. Zvyčajne len popisujú kľúčové časti a hoci správne zdôrazňujú ich vzájomnú prepojenosť, nevysvetľujú jej vznik – len opisujú potrebnosť jej „objavenia sa“ v správnom čase a na správnom mieste pre fungovanie celého systému imunity. Experimenty, ktoré by nám prezentovali vývoj imunity alebo overovanie navrhnutých scenárov sú prakticky iba maličké krôčky (časti) procesov, ale nie realistické a vystavené plne náročnosti vzniku v reálnych podmienkach prírody. Otázka zostáva stále otvorená a snaha o vylepšenie našej imunity, môže nám umožniť pochopiť aj jej počiatky.