Development of a method for determining the relative share of malted and unmalted raw rarley in crushed grain products by RT-PCR. Part 1
Authors: Вафин Рамиль Ришадович , Михайлова Ирина Юрьевна , Агейкина Ирина Игоревна , Семипятный Владислав Константинович 
Published: August 2022

Ячменный солод, полученный из пивоваренных сортов ячменя, является традиционным сырьем для производства пива. Наряду с инновационным методом инфракрасной спектроскопии и классическими физико-химическими методами определения качественных показателей солода видится целесообразным и применение ДНК-технологий, обладающих диагностическим потенциалом оценки степени пророщенности зерна в процессе солодоращения и установления доли солода в дробленых зернопродуктах. Целью настоящей работы являлась разработка молекулярно-генетического способа определения относительной доли соложеного и несоложеного сырья-ячменя в дробленых зернопродуктах методом обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Объектами исследования послужили цельное зерно ячменя и приготовленный из него сухой ячменный солод, подвергнутые процедуре измельчения для получения дробленых зернопродуктов с различной относительной долей соложеного и несоложеного сырья. Экстракция нуклеиновых кислот из пробоподготовленного материала проведена коммерческим набором innuPREP Plant DNA Kit, а для постановки ОТ-ПЦР использован коммерческий набор OneTube RT-PCRmix. Программный анализ амплифицированных нуклеиновых кислот выполнен с применением приложений CLIQS и Adobe Photoshop. В результате проведенного исследования визуально и программно прослежена динамика увеличения яркости свечения амплифицированных ОТ-ПЦР-продуктов по мере повышения в исследуемых образцах дробленых зернопродуктов доли соложеного сырья-ячменя (солода), что составило теоретическую основу разработки способа. При этом показатель ∑ Band 1/∑ Band 2 максимального значения серого в Adobe Photoshop был более сглажен и наиболее приближен к визуальному восприятию электрофоретической картины в сравнении с инструментами измерения CLIQS. Разработанный способ предусматривает гель-электрофорезную детекцию ОТ-ПЦР-продуктов, амплифицированных из образцов экстрагированных нуклеиновых кислот ячменя, а также программный относительный количественный анализ с последующим выстраиванием процентной шкалы относительной доли солода в дробленых зернопродуктах Выявленная погрешность измерений в определенной степени характерна для электрофоретического метода детекции в агарозном геле, адаптируемого для относительной количественной оценки анализируемых образцов ДНК.
Barley malt, obtained from brewing barley varieties, is a traditional raw material for the production of beer. Along with the innovative method of infrared spectroscopy and classical physicochemical methods for determining the quality indicators of malt, it seems appropriate to use DNA technologies that have a diagnostic potential for assessing the degree of grain germination in the process of malting and establishing the proportion of malt in crushed grain products. The aim of this work was to develop a molecular genetic method for determining the relative proportion of malted and unmalted barley raw materials in crushed grain products by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The objects of the study were whole grain of barley and dry barley malt prepared from it, subjected to a grinding procedure to obtain crushed grain products with different relative proportions of malted and unmalted raw materials. The extraction of nucleic acids from the sample prepared material was carried out using the commercial kit innuPREP Plant DNA Kit, and the commercial kit OneTube RT-PCRmix was used for RT-PCR. Software analysis of amplified nucleic acids was performed using CLIQS and Adobe Photoshop applications. As a result of the study, the dynamics of increasing the brightness of the luminescence of amplified RT-PCR products was visually and programmatically traced as the proportion of malted barley (malt) in the studied samples of crushed grain products increased, which formed the theoretical basis for the development of the method. At the same time, the ∑ Band 1/∑ Band 2 indicator of the maximum gray value in Adobe Photoshop was smoother and closest to the visual perception of the electrophoretic pattern in comparison with the CLIQS measurement tools. The developed method provides for gel electrophoresis detection of RT-PCR products amplified from samples of extracted barley nucleic acids, as well as software relative quantitative analysis with subsequent alignment of the percentage scale of the relative proportion of malt in crushed grain products. The revealed measurement error is, to a certain extent, characteristic of the electrophoretic method of detection in agarose gel, which is adapted for the relative quantitative assessment of the analyzed DNA samples.