Identification potential of the variable locus of the P5CS gene in barley for assessing the haplotype affiliation of the main raw material for brewing
Authors: Михайлова Ирина Юрьевна , Вафин Рамиль Ришадович , Агейкина Ирина Игоревна 
Published: August 2022

Широкое сортовое многообразие ячменя, в том числе пивоваренного направления, - результат многовековой селекции данной зерновой культуры, одомашненной человеком практически первой. Для оценки его генетического разнообразия применяют различные типы молекулярных маркеров, подбираемых в зависимости от поставленных задач и технологической оснащенности лаборатории. Из уровня техники известен способ идентификации 13 гаплотипов гена P5CS Hordeum Vulgare L. интерпретацией детектируемых полиморфных позиций, насчитывающих 16 SNPs и 25 INDELs в анализируемом локусе длиной 1066 нуклеотидов. Будучи оптимальной мишенью для тестирования зерна и солода на предмет их гаплотипической принадлежности, указанная протяженная область может и вовсе не амплифицироваться из образцов ДНК ячменя, подвергшихся фрагментации уже на начальных этапах пивоварения. Поэтому основной целью исследования являлась оценка идентификационного потенциала вариабельного локуса гена P5CS Hordeum Vulgare L. небольшого размера, ограниченного сконструированным набором праймеров, инициирующих амплификацию ПЦР-продукта длиной 323 bp. Экстракцию ДНК ячменя из зерна и солода проводили коммерческим набором «innuPREP Plant DNA Kit». Постановку ПЦР выполняли коммерческим набором «Encyclo Plus PCR Kit» с последующей гель-электрофорезной детекцией амплификата, визуализированного в УФ-трансиллюминаторе. Выравнивание анализируемых нуклеотидных последовательностей и подбор идентификационно значимых эндонуклеаз рестрикций проводили с использованием онлайн-программ CLUSTALW и NEBcutter V2.0 соответственно. В результате проведенного исследования оценен идентификационный потенциал вариабельного локуса гена P5CS Hordeum Vulgare L. ограниченной длины. При этом установлено, что разрешающая способность секвенируемого ампликона сводится к идентификации 8 уникальных гаплотипов и 2 групп-гаплотипов, тогда как ПЦР-ПДРФ-анализ с пятью подобранными рестриктазами способен идентифицировать 5 уникальных гаплотипов и 3 групп-гаплотипов. Таким образом, анализируемая область гена, фланкируемая сконструированными праймерами P5CS-F1 и P5CS-R1, может служить диагностической мишенью для установления гаплотипической принадлежности ячменного сырья и прослеживаемости начальных этапов производства пива.
A wide varietal diversity of barley, including the brewing direction, is the result of centuries-old selection of this grain crop, domesticated by man almost for the first time. To assess its genetic diversity, various types of molecular markers are used, selected depending on the tasks and technological equipment of the laboratory. The prior art method of identifying 13 haplotypes of the Hordeum Vulgare L. P5CS gene by interpreting the detected polymorphic positions, numbering 16 SNPs and 25 INDELs in the analyzed locus of 1066 nucleotides in length. Being an optimal target for testing grain and malt for their haplotype, this extended region may not be amplified at all from barley DNA samples that have undergone fragmentation already at the initial stages of brewing. Therefore, the main goal of the study was to assess the identification potential of the variable locus of the Hordeum Vulgare L. P5CS gene of small size, limited by the designed set of primers initiating amplification of the PCR product with a length of 323 bp. Extraction of barley DNA from grain and malt was carried out using the commercial «innuPREP Plant DNA Kit». PCR was performed using a commercial «Encyclo Plus PCR Kit» followed by gel electrophoresis detection of the amplificate visualized in a UV transilluminator. The alignment of the analyzed nucleotide sequences and the selection of identificationally significant restriction endonucleases were performed using the online programs CLUSTALW and NEBcutter V2.0, respectively. As a result of the study, the identification potential of the variable locus of the Hordeum Vulgare L. P5CS gene of limited length was evaluated. It was found that the resolution of the sequenced amplicon is reduced to the identification of 8 unique haplotypes and 2 haplotype groups, while PCR-RFLP analysis with five selected restrictases is able to identify 5 unique haplotypes and 3 haplotype groups. Thus, the analyzed region of the gene, flanked by the designed primers P5CS-F1 and P5CS-R1, can serve as a diagnostic target for establishing the haplotype identity of raw barley and traceability of the initial stages of beer production.