Estudis estructurals de complexos de les proteïnes HMG amb DNA
Authors:   , Sánchez Giraldo Raquel 
Published: September 2023

High Mobility Group proteins (HMG) are architectural factors involved in modulating chromatin structure and influencing a myriad of cellular processes such as transcription, replication and DNA repair. Altered levels of expression and mislocalization of these proteins have several pathological outcomes such as cancer and inflammatory processes.
Understanding how the different HMG proteins recognize DNA and which changes can induce in it is still a challenge, and will be of great importance to interpret their activities in vivo. For this purpose, the aim of this work is to obtain the atomic structure of HMG proteins in complex with DNA using X-ray crystallography.
In this work, we have studied two HMG families: HMGA and HMGB. Both bind to the minor groove of the DNA but are distinguished by their binding motifs: AT-hook motif (HMGA) and HMG-box motif (HMGB). AT-hooks are short positively charged flexible segments that bind preferentially to AT rich regions whereas HMG-box domains contain ~75 amino acids and have a characteristic L-shaped fold consisting of three a-helices and bind to DNA with limited or no sequence specificity.
We have expressed and purified the HMGA1a protein, the fragment HMGA1b(1-79), the fragments Box A, Box B and Box A+B of the HMGB1 and the NHP6A (yeast HMGB). We have performed crystallographic assays of the complexes of AT rich oligonucleotides with these proteins (as well as with synthetic peptides corresponding to the AT-hook motif). We have studied the packing of some of the obtained crystals.
As a major contribution of this thesis, we report the crystal structure of the HMGB1 Box A domain bound to the oligonucleotide ATATCGATAT at a resolution of 2 Å. It demonstrates a new mode of DNA recognition for HMG-box proteins. Two Box A domains act together kinking the DNA by 85º. In this unusual configuration the Phe37 of both domains stack together and intercalate the same CG base step. This duplex shows the greater distortion in just a base pair step that we have evidence for complexes with HMG-box domains.
Les proteïnes HMG (High Mobility Group) són considerades com a factors arquitectònics del DNA que modifiquen l'estructura de la cromatina afectant així diversos processos cel·lulars com la transcripció, la replicació i la reparació del DNA. L'alteració en els nivells d'expressió normals d'aquestes proteïnes i la seva deslocalització estan relacionades amb nombrosos processos patològics com ara el càncer o la inflamació. Per a poder interpretar l'activitat de les proteïnes HMG in vivo és molt important entendre els mecanismes de reconeixement en la unió al DNA que presenten les diferents famílies d'HMG així com els canvis que poden provocar en aquest, fet que representa encara un repte. Amb aquesta finalitat, en aquest treball ens hem proposat obtenir l'estructura atòmica dels complexos de diverses proteïnes HMG amb DNA mitjançant cristal·lografia de raigs X. Hem treballat amb dues famílies de proteïnes HMG: les HMGA i les HMGB. Ambdues s'uneixen al solc menor del DNA però es diferencien pels seus motius d'unió: motiu AT-hook (les HMGA) i motiu HMG-box (les HMGB). Els AT-hooks són cadenes curtes bàsiques i flexibles que s'uneixen preferentment a regions riques en ATs, mentre que els dominis HMG-box, compostos per uns 75 aminoàcids, presenten una forma d'L constituïda per tres hèlixs alfa i una especificitat de seqüència d'unió al DNA reduïda o inexistent. Durant el transcurs d'aquest treball s'han expressat i purificat la proteïna HMGA1a, el fragment HMGA1b(1-79), els fragments corresponents al Box A, Box B i Box A+B de l'HMGB1 i la proteïna NHP6A (HMGB de llevat) i s'han dut a terme assajos cristal·logràfics dels complexos d'oligonucleòtids rics en ATs amb aquestes proteïnes (així com amb pèptids sintètics corresponents als motius AT-hook). S'ha pogut estudiar l'empaquetament d'alguns dels cristalls obtinguts d'aquests complexos. L'aportació més important d'aquesta tesi és la resolució de l'estructura tridimensional d'un complex del domini Box A de l'HMGB1 amb l'oligonucleòtid ATATCGATAT a una resolució de 2 Å. Aquesta demostra un nou mode de reconeixement de DNA lineal per part dels dominis HMG-box. En l'estructura, dos dominis Box A s'uneixen a un mateix dúplex de DNA provocant un doblegament d'aquest de 85º. En aquest mode d'unió inusual, les Phe37 d'ambdós dominis s'intercalen en el mateix pas CG. Aquesta estructura presenta un dúplex amb la major distorsió en un únic pas de la que tenim constància per un complex del domini HMG-box.