Entwicklung HPLC‐MS/MS‐basierter Methoden zur Multi‐Mykotoxinanalytik in Humanurin
Authors: Schmidt Jessica , Humpf Hans‐Ulrich , Esselen Melanie 
Published: June 2023

ZusammenfassungMykotoxine sind toxische Sekundärmetaboliten von Schimmelpilzen verschiedener Gattungen. Der Befall von landwirtschaftlichen Nutzpflanzen wie Getreide, Obst, Nüssen oder Gewürzen durch die Schimmelpilze sowie die Bildung von Mykotoxinen wird von klimatischen Faktoren beeinflusst. Da die vollständige Entfernung von Mykotoxinen bei der Lebensmittelverarbeitung in der Regel nicht möglich ist, sind diese als Kontaminanten in Lebens‐ und Futtermitteln vorhanden und werden über die Nahrung aufgenommen. Aufgrund der vielfältigen toxikologischen Wirkungen von Mykotoxinen ist die Abschätzung der menschlichen Exposition von entscheidender Bedeutung.Ein vielversprechender Ansatz zur Expositionsabschätzung gegenüber Mykotoxinen sind Methoden des humanen Biomonitorings (human biomonitoring, HBM). Durch den Nachweis von Biomarkern in physiologischen Proben können dabei Expositionsabschätzungen auf individueller Ebene erfolgen und verschiedene Expositionsquellen berücksichtigt werden. Aufgrund der nicht‐invasiven Probenahme ist Urin zur Analytik von Biomarkern in Form der Mykotoxine selbst und/oder Produkten des humanen Metabolismus häufig die biologische Matrix der Wahl. Neben niedrigen Analytkonzentrationen, der Komplexität der Urin‐matrix sowie der strukturellen Diversität der Mykotoxinbiomarker gehört vor allem die Analytik großer Probensets, die für eine aussagekräftige Expositionsabschätzung erforderlich ist, zu den größten Herausforderungen des analytischen Prozesses.Die Ziele dieser Arbeit waren daher die Entwicklung und Anwendung von leistungsstarken und zeiteffizienten Multi‐Analyt‐Methoden zur Quantifizierung von Mykotoxinen und Mykotoxinmetaboliten in Humanurin unter Verwendung von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) gekoppelt mit Tandem‐Massenspektrometrie (MS/MS).Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte zunächst eine bereits etablierte und auf dem dilute and shoot (DaS)‐Ansatz basierende Multi‐Methode zur Quantifizierung von 33 Mykotoxinbiomarkern um das Trichothecen Nivalenol (NIV) sowie Deepoxy‐Deoxynivalenol (DOM‐1) als Metaboliten von Deoxynivalenol (DON) erweitert werden. Aufgrund von Limitierungen hinsichtlich Chromatographie und Ionisierung dieser Analyten wurde jedoch stattdessen eine separate HPLC‐MS/MS‐Methode entwickelt. In diese Methode wurden zusätzlich zu NIV und DOM‐1 die ebenfalls zur Gruppe der Trichothecene gehörenden Mykotoxine und Mykotoxinmetaboliten DON, Deoxynivalenol‐3‐O‐ Glucuronid (DON‐3‐GlcA), T‐2‐Toxin (T‐2), HT‐2‐Toxin (HT‐2) sowie HT‐2‐Toxin‐3‐ und HT‐2‐Toxin‐4‐O‐Glucuronid (HT‐2‐3‐ und HT‐2‐4‐GlcA) integriert. Analog zur bereits etablierten DaS‐Multi‐ Methode wurde auch mit der DaS‐Trichothecen‐Methode eine schnelle chromatographische Trennung der Analyten innerhalb von 13 min erreicht. Die Nachweisgrenzen (limits of detection, LODs) wurden zwischen 0,20 ng/mL Urin (T‐2) und 15 ng/mL Urin (HT‐2) bestimmt. Für DON, DON‐ 3‐GlcA und T‐2 wurde mit der DaS‐Trichothecen‐Methode eine Steigerung der Sensitivität um Faktor 6 im Vergleich zur etablierten DaS‐Multi‐Methode erreicht, während für HT‐2 sowie HT‐2‐3‐ und HT‐ 2‐4‐GlcA ähnliche LODs erhalten wurden. Sowohl die DaS‐Multi‐Methode als auch die DaS‐ Trichothecen‐Methode wurden schließlich für die Untersuchung von Urinproben von Jugendlichen in Schweden (n=1102) verwendet. Zur Quantifizierung wurde das Verfahren der matrix‐matched‐Kalibrierung herangezogen. Von den mit beiden Methoden ins‐gesamt 35 zu erfassenden Analyten wurden fünf Mykotoxinbiomarker in den untersuchten Proben detektiert. Der Hauptanteil der positiven Befunde entfiel auf DON (5%) und DON‐GlcA (9%), wohingegen Dihydrocitrinon (DH‐CIT), HT‐2‐3‐GlcA und Ochratoxin A (OTA) nur sehr vereinzelt und unterhalb der Bestimmungsgrenzen (limits of quantitation, LOQs) detektiert wurden.Vor dem Hintergrund, eine im Vergleich zu DaS‐Methoden erhöhte Sensitivität bei möglichst gleichbleibend hohem Probendurchsatz zu ermöglichen, wurden nachfolgend Multi‐Analyt‐HPLC‐ MS/MS‐Methoden unter Verwendung der online Festphasenextraktion (online solid phase extraction, online SPE) als Probenvor‐bereitung entwickelt. Bei diesem automatisierten Verfahren werden die Analyten nach der Injektion der Probe auf einer online SPE‐Säule angereichert und störende Matrixbestandteile abgetrennt. Auf Basis der Ventil‐Schaltung erfolgt an‐schließend die HPLC‐Trennung und Detektion mittels MS/MS. Eine umfassende Methodenentwicklung zeigte zunächst, dass das injizierte Probenvolumen auf ein Maximum gesteigert werden kann, um eine maximale Sensitivität zu erreichen. Als kritischer Faktor hinsichtlich der Robustheit und Sensitivität der Methode erwies sich das Fließmittel zur Probenaufgabe, während die Flussrate und die VentilSchaltzeit keinen deutlichen Einfluss zeigten. Eine ausreichende Retention des polaren DON‐ Metaboliten DON‐3‐GlcA auf der verwendeten online SPE‐Säule wurde nicht erreicht, sodass der Injektion eine enzymatische Hydrolyse vorangestellt wurde, um Glucuronsäurekonjugate indirekt zu erfassen. Als Folge der direkten Injektion der Proben nach enzymatischer Hydrolyse und des damit einhergehenden neutralen pH‐Werts wurden inakzeptable Peakformen für die Analyten Citrinin (CIT), DH‐CIT und Ochratoxin α (OTa) beobachtet. Die Einstellung des pH‐Werts durch Säurezusatz oder Puffer‐Lösungen vor Injektion oder über das Fließmittel zur Probenaufgabe verbesserte die Robustheit erheblich, führte allerdings zu einer starken Reduktion der Signalintensitäten von Analyten im negativen Ionisierungsmodus. Mit dem gewählten Kompromiss zur Probenaufgabe in Form eines 0,25 mM Ammoniumacetat‐Puffers bei pH 4,5 wurde schließlich die Leistungs‐fähigkeit der Methode abgeschätzt. Aufgrund von starken chromatographischen Interferenzen, die durch die enzymatische Hydrolyse hervorgerufen wurden, musste DON aus der Methode ausgeschlossen werden. Die Bestimmung der LODs der übrigen Analyten zeigte, dass eine deutliche Steigerung der Sensitivi‐tät im Vergleich zum DaS‐Ansatz nur für einzelne Analyten erreicht wurde. Als Ursachen wurden geringe Wiederfindungsraten aufgrund von starken Matrixeffekten identifiziert.Das Analytspektrum der online SPE‐Methode wurde schließlich auf die elf Mykotoxine und Mykotoxinmetaboliten Aflatoxin M1 (AFM1), Altenuen (ALT), Alternariolmonomethylether (AME), Alternariol (AOH), CIT, DH‐CIT, Fumonisin B1 (FB1), OTA, Zearalenon (ZEN), α‐Zearalenol (α‐ZEL) und β‐Zearalenol (β‐ZEL) begrenzt. Auf die enzymatische Hydrolyse wurde verzichtet, um für diese Analyten eine optimierte Methode mit hoher Sensitivität zu entwickeln. Die Quantifizie‐rung und Validierung erfolgte aufgrund der im Vergleich zu DaS‐Methoden höheren Matrixlast unter Verwendung stabil‐isotopenmarkierter Standards; lediglich für ALT, AME und AOH wurden MatrixKalibrierungen eingesetzt. Für alle Analyten wurden niedrige LODs im Bereich zwischen 0,0036 ng/mL Urin (OTA) und 0,27 ng/mL Urin (ALT), hohe Wiederfindungsraten sowie eine hohe Richtigkeit und Präzision im Rahmen der Wiederholbarkeit bestimmt. Im Vergleich zur DaS‐Multi‐Methode wurden die LODs mit dem online SPE‐Ansatz um Faktor 3 bis > 200 verringert. Zudem zeichnet sich die finale online SPE‐HPLC‐MS/MS Methode durch eine kurze Gesamtlaufzeit von 13 min aus. Die Anwendbarkeit der online SPE‐Methode wurde durch die Untersuchung von Urinproben aus Simbabwe (n=50) demonstriert. Neben FB1, das in allen untersuchten Proben nachgewiesen und quantifiziert wurde, erfolgte die Detektion von sieben weiteren Mykotoxinbiomarkern (AFM1, AME, CiT, DH‐CIT, OTA, ZEN, α‐ZEL) in bis zu 38% der Proben. Nach vorangegangener Untersuchung des Probensets mit der DaS‐Multi‐Methode wurden im Vergleich zur online SPE‐Analytik deutlich weniger positive Befunde erhalten. Der Nachweis von AME, ZEN und α ZEL wurde nach Analytik mittels des DaS‐Ansatzes nicht erbracht und auch AFM1 und OTA wurden nur vereinzelt detektiert. Als alternative Strategie für die Probenahme in entlegeneren Gebieten wurde im weiteren Verlauf der Arbeit eine HPLC‐MS/MS‐Methode zur Multi‐Mykotoxinanalytik in Humanurin auf der Basis von getrockneten Urinproben (dried urine spots, DUS) entwickelt. Im Gegensatz zu flüssigen Urinproben, deren Transport für gewöhnlich gekühlt stattfinden muss und mit einem hohen logistischen Aufwand verbunden ist, können die getrockneten Urinproben in einfachen Verpackungen aus stabilem Papier transportiert, verschickt und gelagert werden. Im Rahmen der Probenvorbereitung ist außerdem die Abtrennung von störenden Matrixbestandteilen und die Konzentrierung der Probe möglich. Auf Grundlage des zu erwartenden Vorkommens in Urin, der Toxizität und der Verfügbarkeit stabil‐ isotopenmarkierter Standards wurden die 16 Mykotoxine und Mykotoxinmetaboliten CIT, DH‐CIT, DON, FB1, T‐2, HT 2, OTA, 2’R‐Ochratoxin A (2’R‐OTA), OTa, Ochratoxin B‐Glutathion (OTB‐GSH), Ochratoxin B‐N‐Acetyl‐L‐cystein (OTB‐NaC), Tenuazonsäure sowie dessen Epimer allo‐ Tenuazonsäure (TeA + allo‐TeA), Zearalanon (ZAN), ZEN, a‐ZEL und β‐ZEL in die Methode integriert. Eine enzymatische Hydrolyse, die dem Spotten des Urins auf das Filterpapier vorangestellt wurde, ermöglichte zudem die indirekte Erfassung von Glucuronsäurekonjugaten der genannten Verbindungen. Neben dem Spotten des hydrolysierten Urins auf Filterpapier bestand die Probenvorbereitung aus der Extraktion mit einem Gemisch aus Acetonitril, Methanol und Wasser (35/35/30; v/v/v), dem Einengen eines Aliquots sowie der Rekonstitution in einem wässrigen Lösungsmittel, gefolgt von der Analytik mittels HPLC‐MS/MS. Aufgrund der im Vergleich zu DaS‐ Methoden höheren Matrixlast wurden analog zur online SPE‐Methode stabil‐isotopenmarkierte Standards zur Quantifizierung und Validierung eingesetzt; lediglich für OTB‐GSH und OTB‐NAC wurden matrix‐matched‐Kalibrierungen verwendet. Im Rahmen der Methodenvalidierung wurden LODs zwischen 0,004 ng/mL Urin (OTA) und 1,4 ng/mL Urin (HT‐2) bestimmt. Der Ver‐gleich zur DaS‐Multi‐Methode zeigte dabei eine Steigerung der Sensitivität um Faktor 2 bis 42. Unter Berücksichtigung der internen Standards, die aufgrund der einfacheren Handhabung der Proben am Ort der Probenahme erst nach der Extraktion der DUS hinzugefügt wurden, wurden mit Ausnahme von CIT, ZEN, α‐ZEL und β‐ZEL hohe Wiederfindungsraten erzielt. Die anschließende Bestimmung der Wiederholbarkeit zeigte zum größten Teil eine hohe Richtigkeit und Präzision. Nur für einige Analyten wie ZEN, α‐ZEL und β‐ZEL konnten starke Schwankungen beobachtet werden. Bei Untersuchungen zur Stabilität der DUS wurde keine oder nur eine leichte Abnahme der Analytkonzentrationen bei Lagerung über einen Zeitraum von 28 Tagen und Raumtemperatur festgestellt. Die DUS‐Methode wur‐de schließlich für die Analytik von Urinproben von Jugendlichen aus Schweden (n=91), die zuvor bereits mit dem DaS‐Ansatz untersucht wurden, verwendet. Nach Analytik aus DUS wurden DH‐CIT, DON und dessen Glucuronsäurekonjugate, OTA und TeA + allo‐ TeA in 55% (DH‐CIT) bis 99% (TeA + allo‐TeA) der Proben detektiert. Die Analytik mittels DaS‐ Methoden zeigte vor allem für OTA und DH‐CIT deutlich weniger positive Befunde, während TeA + allo‐TeA nicht integriert waren.Aufgrund der gesteigerten Sensitivität im Vergleich zu etablierten DaS‐Ansätzen können sowohl die online SPE‐Methode als auch die DUS‐Methode einen wert‐vollen Beitrag zu einer akkurateren und verlässlicheren Abschätzung der humanen Exposition gegenüber Mykotoxinen leisten. Die online SPE‐Methode zeichnet sich insbesondere durch den geringen Bedarf an manueller Probenhandhabung und eine hohe Robustheit aus, während das DUS‐Verfahren die Proben‐ahme und den Transport von Urinproben in entlegeneren Gebieten erleichtert. Zusammen stellen die beiden neu entwickelten Methoden zwei unterschiedliche Instrumente dar, die je nach Schwerpunkt der Studien zum HBM optimale Bedingungen für Probenahme und Versand oder maximale Sensitivität und höchsten Probendurchsatz für flüssige Urinproben bieten.