Spectral response of individual molecules and nanoantennas with two-beam excitation
Authors:   , Gellings Esther 
Published: October 2023

At room temperature, individual molecules can be found in different conformations due to intrinsic and extrinsic factors which are reflected in spectral variability. When detecting single molecules, the ensemble average is lifted and the spectral variability no longer obscured by the inhomogeneously broadened ensemble spectrum. Yet, only about one in every 10^7 photons interacts with the molecule, so that detection necessarily relies on background-free fluorescence. Fluorescence emission spectra only contain information about the ground state of molecules. In this thesis two new detection techniques are introduced to overcome this limitation: fluorescence excitation spectroscopy and stimulated emission detection. Moreover, the latter method is adapted to probe individual plasmonic nanoantennas.

First, Fourier transform excitation spectroscopy is introduced as a sensitive and robust method to probe the excited state manifold of single molecules. Fluorescence excitation and emission spectra complement each other, the former probing the excited state, and the latter the ground state manifold. Both spectra are routinely measured at cryogenic temperatures, though excitation spectroscopy has only recently reached single molecule sensitivity at room temperature. Here, Fourier transform spectroscopy is adapted to measure excitation spectra of single molecules. The working of the technique is demonstrated on synthetic dye molecules, where a spectral variability of more than 100nm has been uncovered. It is then applied to photosynthetic light-harvesting complexes LH2 that exhibit near-unity energy transfer efficiencies despite large environmental differences. Excitation spectra were routinely measured alongside emission spectra and it was found that variations in the two absorption bands B800 and B850 are uncorrelated, while the Stokes shift between the B850 and emission band becomes larger for more red-shifted complexes. The single complex Stokes shift was found to be about 20% larger than the ensemble result.

Second, a stimulated emission pump-probe setup with single molecule sensitivity is developed, which does not rely on fluorescence detection and can directly probe excited state dynamics. The necessary steps to achieve shot noise limited sensitivity will be explained. Stimulated emission depletion measurements are performed to verify the alignment of the setup and to find the best experimental parameters. The stimulated emission measurements achieved sensitivities of up to 10^-8, which in principle is sufficient for single molecule detection.

Third, single molecule techniques are applied to study the scattering and absorption of single plasmonic nanoantennas in focused Gaussian beams using the stimulated emission setup. In photothermal microscopy, the contribution of the scattering component and focal position to the signal has been largely ignored. Here, a comprehensive model including all relevant parameters is developed and systematically probed on nanoantennas of various lengths, positions in the focus, and surrounding media. It will be shown that the interaction of an antenna with a single probe beam results in a dispersive interference signal that mainly depends on the antenna dimensions, and that flips sign when passing through the antenna resonance. Adding a modulated pump beam that heats the antenna's environment leads to a combination of the probe beam scattering off the refractive index gradient around the nanoantenna, and the antenna resonance shifting, which affects the interference between the incident and scattered light. It will be demonstrated that both effects are relevant for antennas with a significant scattering cross-section and that photothermal measurements strongly depend on the photothermal properties of the surrounding medium and the antenna dimensions, which lead to strong signal variations around antenna resonance.
A 300K, las moléculas únicas se pueden encontrar en distintas conformaciones debido a varios factores vistos en la variabilidad espectral. Cuando se detectan moléculas únicas, la variabilidad espectral no se ve oculta debido al espectro ensanchado del conjunto molecular. Sin embargo, solo uno de cada 10^7 fotones interactúa con la molécula, y la detección se basa en la fluorescencia que es libre del ruido de fondo. Los espectros de emisión de fluorescencia solo contienen información sobre el estado fundamental. En esta tesis se introducen dos nuevas técnicas de detección para superar esta limitación: espectroscopía de excitación de fluorescencia y detección de emisión estimulada.
El segundo método está adaptado para investigar nanoantenas plasmónicas únicas. Primero, se introduce la espectroscopía de excitación por transformada de Fourier como un método sensible y robusto para investigar el estado excitado de moléculas únicas. Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia se complementan entre sí. El primero prueba el estado excitado y el segundo el estado fundamental. Ambos espectros se miden a temperaturas bajas, pero la espectroscopía de excitación solo ha alcanzado la sensibilidad para medir moléculas únicas a temperatura ambiente hace poco. Aquí, la espectroscopía de transformada de Fourier está adaptada para medir los espectros de excitación de moléculas únicas. Con esta técnica se demuestra una variabilidad espectral de más de 100nm en moléculas sinteticas. Luego se aplica a complejos fotosintéticos de captación de luz LH2 que exhiben eficiencias de transferencia de energía cercanas a la unidad a pesar de grandes diferencias en su entorno. Los espectros de excitación se midieron conjuntamente con los espectros de emisión y se descubrió que las variaciones en las bandas de absorción B800 y B850 no están correlacionadas, pero que el cambio de Stokes entre el B850 y la banda de emisión se hace más grande para más complejos desplazados al rojo. Además, el cambio de Stokes en complejos individuales era aproximadamente 20% más grande que el resultado del conjunto. Segundo, se desarrolla una configuración de bombeo-prueba para medir con mayor sensibilidad la emisión estimulada de moléculas individuales que no utiliza fluorescencia y puede probar directamente la dinámica del estado excitado. Se explica como lograr una sensibilidad que solo es limitada por el ruido de disparo. Mediciones del decaimiento de emisión estimulada verifican la alineación del dispositivo experimental y para encontrar los mejores parámetros experimentales. Las mediciones de emisiones estimuladas lograron sensibilidades de hasta 10^-8, que en principio es suficiente para la detección de una sola molécula.
Tercero, el experimento para medir emisión estimulada está adaptado para estudiar la dispersión y absorción de nanoantenas plasmónicas únicas en haces gaussianos enfocados. En la microscopía fototérmica se ha ignorado mucho el rol de la dispersión y de la posición focal a la señal. Aquí, se desarrolla un modelo integral que incluye todos los parámetros relevantes y se prueba en antenas con diferentes longitudes, posiciones en el foco y medios circundantes.
Se demostrará que la interacción de una antena con un solo haz de prueba da como resultado una señal de interferencia dispersiva que depende principalmente de las dimensiones de la antena y, que cambia de signo cuando pasa a través de la resonancia de la antena. Agregar un haz de bombeo modulado que calienta el entorno de la antena provoca una combinación de dispersión del haz de prueba con el gradiente del índice de refracción alrededor de la nanoantena, y el desplazamiento de resonancia de la antena, que afecta la interferencia entre la luz incidente y la dispersa. Se demostrará que ambos efectos son relevantes para antenas con una sección eficaz de dispersión significativa y que las mediciones fototérmicas dependen en gran medida de las propiedades fototérmicas del medio circundante y las dimensiones de la antena, lo que resulta en fuertes variaciones de la señal alrededor de la resonancia de la antena.