Development of Calibration Standards for Minimal Residual Disease Monitoring by Quantitative Reverse Transcription-PCR in AML with t(10;11)(p12.31;q14.2)/ PICALM::MLLT10
Authors: Зеркаленкова Е.А. , Борковская А.Н. 
Published: January 2024

Хромосомная транслокация t(10;11)(p12.31;q14.2) с образованием химерного гена PICALM::MLLT10 является редкой рекуррентной перестройкой при некоторых типах острых лейкозов, включая острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Она ассоциирована с неблагоприятным прогнозом и в настоящее время включена в риск-стратификацию ОМЛ у детей, получающих терапию по протоколу ОМЛ-MRD-2018, в качестве маркера высокого риска. Экспрессия PICALM::MLLT10 может использоваться в качестве мишени для мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Однако в силу редкости и гетерогенности данной перестройки для нее отсутствуют коммерчески доступные калибровочные стандарты. Целью данной работы явилось создание калибровочных стандартов для оценки экспрессии химерного гена PICALM::MLLT10 методом клонирования в плазмидный вектор. Были заклонированы 4 фрагмента PICALM::MLLT10 с различными локализациями точек разрыва в гене MLLT10 (интроны 4, 6, 9 и 10) и локализацией точки разрыва в гене PICALM в интроне 19. Для каждого калибровочного стандарта было показано наличие корректной вставки методом секвенирования по Сэнгеру и отсутствие мутаций в сайтах посадки праймеров и проб для количественной ПЦР. Чувствительность примененных в настоящей работе систем детекции составила 10 копий в реакции в ПЦР с плазмидными стандартами и 1/10 000 в 10-кратных лимитирующих разведениях. Значение углового коэффициента для калибровочных стандартов составило 3,4±0,05, свободного коэффициента – 34,7±1,24, значение R2 превышало 0,95 во всех случаях, коэффициент вариации для образцов с минимальным содержанием молекул-мишеней составил 1,12±0,43%, что соответствует международным рекомендациям для систем детекции и количественных стандартов, применяемых в мониторинге МОБ методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
The chromosomal translocation t(10;11)(p12.31;q14.2) leading to PICALM::MLLT10 fusion gene formation is a rare recurrent rearrangement in some types of acute leukemia, including acute myeloid leukemia (AML). It is associated with a poor prognosis and is currently included in the risk stratification of AML in children receiving therapy according to the AML-MRD-2018 protocol as a high-risk marker. PICALM::MLLT10 expression can be used as a target for minimal residual disease (MRD) monitoring by quantitative reverse transcription-PCR. However, due to the rarity and heterogeneity of this rearrangement, there are no commercially available calibration standards for it. The goal of this work was to create calibration standards for assessing the expression of the chimeric gene PICALM::MLLT10 by cloning into a plasmid vector. Four fragments of PICALM::MLLT10 were cloned with different localizations of breakpoints in the MLLT10 gene (introns 4, 6, 9 and 10) and localization of the breakpoint in the PICALM gene in intron 19. For each calibration standard, the presence of a correct insert was demonstrated by Sanger sequencing and the absence of mutations in the primer binding sites and probes for quantitative PCR. The sensitivity of the detection systems used in this work was 10 copies in a PCR reaction with plasmid standards and 1/10000 in 10-fold limiting dilutions. The slope coefficient for calibration standards was 3.4±0.05, y-intercept was 34.7±1.24, the R2 value exceeded 0.95 in all cases, the coefficient of variation for samples with a minimum content of target molecules was 1.12±0.43%, which corresponds to international recommendations for systems detection and quantitative standards used in real-time RT-PCR monitoring of MRD.