Creation of DNA libraries for high-throughput genotyping of Karelian birch and analysis of their quality
Authors: Сафронычева Е.Д. , Лыткин К.Ф. , Каржаев Д.С. , Волков В.А. 
Published: February 2024

В статье рассматривается вопрос разработки рабочего лабораторного протокола создания ДНК-библиотек для высокопроизводительного генотипирования березы карельской и приводится анализ качества полученных библиотек. Древесина карельской березы (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti) всегда ценилась за свой необычный и ярко выраженный рисунок годичных колец. Этот материал высоко ценится в производстве и используется в изготовлении мебели, посуды, различных предметов интерьера и декоративных вставок. Из-за сложности определения типа древесины на ранних этапах роста дерева, приходится использовать плантации с большим числом особей. Процесс отбора «карельских» образцов по внешним характеристикам дерева затруднен, так как в значительной степени зависит от знаний и опыта специалиста-селекционера. Сделать отбор «карельских» форм более точным и быстрым можно с помощью генетических маркеров, которые будут объективно отражать изменения в геноме, ассоциированные с образованием узорчатой древесины. Выявление генетических локусов, определяющих признак узорчатоcть древесины у сеянцев на ранних стадиях развития, помогло бы в перспективе создавать «чистые» плантации карельской березы, без примеси деревьев с обычной древесиной. Генетические маркеры позволяют более точно отбирать «карельские» формы, исключая деревья с обычной древесиной. Для разработки таких молекулярных маркеров необходимо выявить мутации в генах карельской березы, которые отличают ее от березы повислой и сцеплены с наследованием «узорчатой» древесины. Для поиска мутаций может быть использована технология высокопроизводительного генотипирования на основе секвенирования (Genotyping By Sequencing, GBS). Одним из вариантов GBS является технология прочтения коротких последовательностей ДНК, прилежащих к определенным сайтам рестрикции (RADseq, Restriction site associated DNA sequencing). Разработка рабочего лабораторного протокола создания RADseq библиотек является ключевым этапом проектов по высокопроизводительному генотипированию. Целью настоящего исследования является описание протокола приготовления RADseq библиотеки на материале 12 образцов ДНК березы карельской, а также анализ качества полученных прочтений фрагментов ДНК по результатам секвенирования созданной библиотеки на приборе Illumina HiSeq2500. Результаты проведенного анализа показали, что использованный протокол позволяет получать из ДНК листьев березы библиотеки для секвенирования хорошего качества. Это позволяет переходить далее к следующим этапам анализа – выравнивания прочтений на референсную последовательность и поиск SNP-маркеров.
The article discusses the development of a practical laboratory protocol for creating DNA libraries for high-throughput genotyping of Karelian birch. Karelian birch wood (Betula pendula Roth var. carelica (Mercklin) Hämet-Ahti) has always been valued for its unique and distinctly patterned annual rings. This material is highly prized in manufacturing and is used in furniture, tableware, various interior items, and decorative inlays. Due to the complexity of identifying the type of wood at the early stages of tree growth, plantations with a large number of individuals have to be used. The process of selecting «Karelian» samples based on the external characteristics of the tree is challenging because it largely depends on the knowledge and experience of a breeding specialist. Making the selection of «Karelian» forms more precise and faster can be achieved with genetic markers that objectively reflect changes in the genome associated with the formation of patterned wood. Identifying the genetic loci that determine the «wood patterning» trait in seedlings at early stages of development would help in the future to create «pure» Karelian birch plantations without the presence of trees with regular wood. Genetic markers allow for a more precise selection of «Karelian» forms, excluding trees with regular wood. To develop such molecular markers, it is necessary to identify mutations in Karelian birch genes that distinguish it from pendulous birch and are linked to the inheritance of «patterned» wood. The technology of high-throughput genotyping based on sequencing (Genotyping By Sequencing, GBS) can be used to search for mutations. One of the GBS variants is the technology of reading short DNA sequences adjacent to specific restriction sites (RADseq, Restriction site-associated DNA sequencing). The development of a working laboratory protocol for creating RADseq libraries is a key step in high-throughput genotyping projects. The goal of this research is to describe the protocol for preparing a RADseq library using 12 Karelian birch DNA samples, as well as to analyze the quality of the obtained DNA fragment readings from the sequencing of the created library using the Illumina HiSeq2500 instrument. The results of the analysis showed that the protocol used allows for obtaining high-quality libraries from birch leaf DNA. This enables the progression to the next stages of analysis, including aligning reads to the reference sequence and searching for SNP markers.