Optical holographic microscopy for bio- and nanoparticle characterization
Authors:   , Ortiz de Orruño Cuesta Unai 
Published: December 2023

(English) Nowadays, being able to precisely characterize nanoparticles is of key relevance in a wide range of scenarios. For instance, chemical and pharmaceutical industries often rely in particle-sizing for quality control. In a clinical context, in contrast, sensitive bioparticle characterization platforms can lead to the diagnosis of early-stage illnesses. However, the needs between each scenario vary, due to the differences in samples’ composition and the particle-property of interest. Hence, several nanoparticle characterization techniques have emerged, each one based on a different physical principle and best suited for particular usage scopes.

In this thesis, I improve the optical nanoparticle sizing techniques by using holography. I present different optical systems that image nanoparticles and record their scattering signal into holograms. I show how to reconstruct the scattered light’s wavefront using holographic processing tools and how to extract the particle size information from it. I prove the capabilities of the holographic imaging systems that I introduce by providing their technical characterization and by measuring relevant samples.

First, I introduce an imaging system with an extended the dynamic range compared to conventional darkfield microscopes. I demonstrate the nanoparticle sizing capabilities of such holographic platform using calibration samples. Moreover, I provide a proof-of-concept in the form of the characterization of a clinical sample, composed by extracellular vesicles, to demonstrate the feasibility of the platform for the development of point-of-care systems.

Afterwards, I show how nanoparticle tracking analysis (NTA), that is to size particles from their diffusion, can be improved by using holography. The use of holography not only increases the NTA’s precision, thanks to its ability to capture better the particles’ diffusion, but also provides the refractive index information of the sample. The latter is of especial interest when measuring samples of unknown compositions, such as clinical extractions. I present experimental evidence of the improvements in the NTA’s sizing precision and the simultaneous retrieval of the refractive index. Additionally, I measure the radial shift of the nanoparticles induced by the formation of protein-coronas, which I believe that proves the platform’s relevance for studying the particles’ behaviour in biological fluids.

Finally, I present a system that confines particles in the volume-of-view of a holographic imaging system for further improving the NTA’s sizing precision. Such platform’s design was motivated by the promising results obtained using holographic NTA and its potential usage on fundamental research of protein-corona formation. The idea behind the system is to obtain longer particle-diffusion trajectories for pushing the holographic NTA sensitivity down to what is necessary to detect the absorption of a single protein onto a nanoparticle. I demonstrate the capabilities of such platform by showing a thorough technical evaluation based on experimental evidence.

I foresee that the presented holographic platforms will find many applications of both fundamental and applied nature. In particular, considering the ability of such platforms to analyse polydisperse samples, I expect to contribute to advances in the fundamental research of extracellular vesicles.
(Català) Avui en dia, la correcta caracterització de les nanopartícules és clau en molts aspectes. Per exemple, las industries química i farmacèutica normalment confien en la mida de les partícules per a fer el control de qualitat. Per altra banda, en un context clínic la caracterització de certes biopartícules pot ajudar a diagnosticar diferents malalties en el seu inici. Tot i així, les necessitats en els diferents camps varia, degut a la diferència en la composició de les mostres i les propietats de les partícules d’interès. Per tant, s’han desenvolupat diferents tècniques per a caracteritzar nanopartícules, cadascuna basada en un principi físic diferent i adequades a àmbits d’ús específics.

En aquesta tesi, he millorat les tècniques òptiques per a mesurar la mida de nanopartícules fent servir holografia. Presento diferents sistemes òptics d’imatge que capten la llum que dispersen les nanopartícules i la graven en hologrames. Mostro com reconstruir el front d’ona de la llum dispersada fent servir eines de processament hologràfic i com extreure d’aquesta informació la mida de la partícula. Demostro la capacitat dels sistemes d’imatge per holografia que presento proporcionant una caracterització tècnica i mesurant mostres rellevants.

Primer, introdueixo un sistema d’imatge amb un rang dinàmic ampliat en comparació als microscopis de camp fosc convencionals. Demostro la capacitat de mesura de nanopartícules d’aquesta plataforma hologràfica fent servir mostres de calibratge. A més a més, aporto una prova de concepte caracteritzant una mostra clínica formada per vesícules extracel·lulars, per tal de demostrar la viabilitat de la plataforma per a desenvolupar sistemes de proves al punt de atenció.

Tot seguit, milloro el anàlisi de seguiment de nanopartícules (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA), fet servir per mesurar partícules a partir de la seva difusió, gracies a la holografia. L’ús d’holografia no només augmenta la precisió del NTA per la seva capacitat de capturar millor la difusió de les partícules, si no que també aporta l’índex de refracció de la mostra. Aquest és d’especial interès a mesurar mostres de composició desconeguda, com les extraccions clíniques. Presento proves experimentals de la millora de mesures de mida per NTA i de l’obtenció simultània de l’índex de refracció. Addicionalment, mesuro el canvi radial induït per la formació de corones de proteïnes, demostrant la rellevància de la plataforma per l’estudi del comportament de les partícules en fluids biològics.

Finalment, presento un sistema que confina partícules en el volum de visió d’un sistema d’imatge hologràfic per a millorar la precisió de les mesures per NTA. El disseny d’aquesta plataforma va ser motivat per els bons resultats fent servir el NTA hologràfic i el seu potencial ús en investigació bàsica en la formació de corones de proteïnes. La idea d’aquest sistema és obtenir trajectòries de la difusió de partícules més llargues, augmentant la sensibilitat del NTA hologràfic per tal de detectar l’absorció d’una única proteïna a una nanopartícula. Demostro les capacitats d’aquesta plataforma mitjançant una minuciosa avaluació tècnica basada en evidencies experimentals.

Preveig que les plataformes hologràfics presentades en aquesta tesi es podran utilitzar en varies aplicacions, tan en investigació bàsica com aplicada. En particular, considerant la capacitat d’aquestes plataformes per analitzar mostres polidisperses, espero contribuir a avançar la recerca bàsica de vesícules extracel·lulars.