A Comparison of Three Techniques for Detecting Bovine Herpesvirus Type 1 (BHV‐1) in Naturally and Experimentally Contaminated Bovine Semen
Authors: Brunner D. , Engels Monika , Schwyzer M. , Wyler R. 
Published: October 2007

Contents: Immune electron microscopy, hybridization (Sandwich, Southern‐blot and dot‐blot hybridization) as well as two cell culture inoculation techniques to detect bovine herpesvirus 1 (BHV‐1) in naturally and artificially contamined bovine semen were compared. Immune electron microscopy was not a suitable method because of its low limit of detection. Dot‐blot hybridization, as the most sensitive hybridization technique, could detect 150 pg BHV‐1 DNA/semen straw (∼ 106TCID50/ 500 μl semen). Best results were obtained by using cell culture techniques. With the first technique embryonic bovine lung cells (EBLC) on microtiterplates were inoculated with an ultracentrifuged pellet of seminal plasma (pelleting method). The second procedure comprised a dilution of 250 μl (1/2 content of a straw) in 6,25 ml cell culture medium which were overlayed on a confluent layer of EBLC in a 25 cm2 flask. After an incubation of 4 hours at 37°C the medium was decanted and replaced by 6,5 ml fresh medium (dilution method). With both tissue culture methods as little as 5 TCID50 of BHV‐1 in 500 μl of artificially contaminated semen were detectable. However the dilution method was better suited than the pelleting method because toxic effects to cells were less pronounced. It was even possible to detect BHV‐1 in naturally contaminated semen samples where all other methods failed. The DNA of virus isolates from semen showed three different restriction patterns.Inhalt: Vergleich dreier Methoden zum Nachweis von bovinem Herpesvirus Typ 1 (BHV‐1) in natürlich und experimentell kontaminiertem Rindersamen Die Immunelektronenmikroskopie, die Hybridisation (Sandwich‐, Southern‐Blot‐ und die Dot‐Blot Hybridisation) sowie zwei Zellkultur‐Inokulationstechniken wurden zum Nachweis von bovinem Herpesvirus Typ‐1 (BHV‐1) in natürlich und künstlich kontaminiertem Stierensamen verglichen. Die Immunelektronenmikroskopie erwies sich dabei als zu wenig empfindliche Methode. Die Dot‐Blot Hybridisation war die beste der Hybridbationsmethoden. Es lieβen sich damit bis zu 150 pg BHV‐1 DNA/Paillette (∼ 106 TCID
50
/500 μl Samen) nachweisen. Am besten eigneten sich Zellkulturmethoden. Eine erste Methode bestand darin, embyonale bovine Lungenzellen in Microtiterplatten mit einem Ultrazentrifugensediment des Samenplasmas zu inokulieren (pelleting method). In einem zweiten Verfahren wurde 1/2 Inhalt einer Pailette (250 μl) in 6,25 ml Zellkulturmedium verdünnt und damit ein Zellrasen von embyonalen bovinen Lungenzellen überschichtet. Nach 4 h bei 37°C wurde das Medium abgegossen und durch 6,5 ml neues Medium ersetzt (Verdünnungsmethode). Mit beiden Methoden lieβen sich 5 TCID50 BHV‐1 in 500 μl Rünstlich kontaminiertem Samen nachweisen. Die Verdünnungsmethode war aber besser geeignet, weil der toxische Effekt auf die Zellen geringgradiger war. Mit der Verdünnungsmethode lieβ sich aus Ejakulaten BHV‐1 isolieren, auch in Fällen, in denen alle andern Methoden versagten. Die DNA's von Virusisolaten aus Rindersamen wiesen drei verschiedene Restriktionsmuster auf.