Die Methodik des Chemilumineszenz‐Enzym‐Immunoverfahrens zum Nachweis geringer Bakterienmengen demonstriert am Beispiel von Pseudomoms aeruginosa
Authors: Zschöck M. , Böhm R. 
Published: August 2010

ZusammenfassungAm Modell Ps. aeruginosa wird eine Chemilumineszenz‐Enzym‐Immunologische Methode (CEIA) beschrieben, die eine spezifische Erregerdiagnose ermöglicht. Zur Optimierung der Untersuchungsrnethodik werden 5 verschiedene Chernilumineszenz‐Reagenzien auf ihre Eignung im CEIA gepruft. Die besten Ergebnisse werden dabei mit Purpurogallin erzielt. Weiterhin werden 5 verschiedene Proteinlösungen auf die Absättigung freier Valenzen im Teströhrchen aus Polystyrol getestet. Eine 10%ige Lösung von BSA in PBS‐Tween 20 wirkt am besten. Zur Optirnierung der äußeren Bedingungen der Immunreaktion wird der zeitliche Verlauf der serologischen Reaktion bei 3 verschiedenen Temperaturen sowie der Waschvorgang zur Entfernung ungebundenen Konjugats untersucht. Die Immunreaktion ist bei 37°C nach 3 h nahezu abgeschlossen. 5 Waschschritte mit dazwischenliegender 5 minütiger Zentrifugation reichen aus um das ungebundene Konjugat vollständig zu entfernen. Irn eigentlichen CEIA werden neben 2 verschiedenen Antigenpräparationen auch verschiedene direkte und indirekte Konjugatpräparationen hinsichtlich ihrer Sensitivität zurn Bakteriennachweis überprüft. Als endgültiges Verfahren wird eine indirekte Methode mit frei suspendierten Bakterien, reinem spezifischen IgG und HRP‐Protein A ausgewählt. Dieses wird anhand von 5 verschiedenen heterologen Pseudornonadenarten erfolgreich auf seine Spezifität untersucht.SummaryA chemiluminescent enzyme immunoassay for the detection of small numbers of bacteria demonstrated with Pseudomonas aeruginosaA chemiluminescent enzyme imrnunoassay (CEIA) for the detection of bacteria using Ps. aeruginosa as a model is described. 5 different chemiluminescent substrates were tested for their suitability in the CEIA. Purpurogallin is the best one. For saturation of free binding sites, 5 different protein solutions were also tested. The treatment of the polystyrol tubes with a 10 % solution of BSA in PBS‐Tween 20 is the most effective. Different conditions, like incubation‐time and 3 temperatures for the immune reaction were investigated. The antigen‐antibody reaction is nearly finished after 3 h at 37°C. The number and length of washing steps to remove unbound conjugate was also investigated; 5 washing steps with 5 min centrifugation between are enough for this purpose. Two different antigen preparations were investigated in the CEIA. Different direct and indirect conjugate preparations were used to improve the sensitivity of the immunoassay. As final procedure an indirect method was chosen, which uses free suspended bacteria, pure specific IgG and HRP labelled protein A. It was successfully tested for specifity with 5 different Pseudomonas species.RésuméLa méthode immunologique de chemiluminescence‐enzyme pour la mise en évidence de très petites quantités de bactéries dé montrée par l'exemple de Pseudomonas aeruginosaUne méthode immunologique de cherniluminescence‐enzyme (CEIA) qui rend possible un diagnostic spécifique d'agent est décrite à l'aide d'un modèle de Ps. aeruginosa. Cinq réactifs différents de chemiluminescence ont été testés pour leur capacité en CEIA afin d'optimiser la méthode de recherche. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec purpurogalline. Cinq solutions différentes de protéines ont été testées sur la saturation des valences libres dans des tubes à essai en polystyrol. Une solution à 10 % de BSA dans PBS‐Tween 20 a été la meilleure. La durée de la réaction sérologique a été examinée par trois températures différentes et le procédé de lavage pour l'élimination du conjugué non lié a été testé pour l'optimisation des conditions externes de la réaction immunologique. La réaction immunologique est pratiquement terminée après 3 h à 37°C. Cinq lavages avec une centrifugation de 5 minutes entre deux suffisent pour éliminer complètement le conjugué non lié. Dans le CEIA proprement dit et en dehors de deux préparations différentes d'antigène, on a également testé différentes préparations directes et indirectes de conjugué du point de vue de leur sensibilité pour la mise en évidence de bactéries. La marche à suivre finale choisie est une méthode indirecte avec des bactéries libres en suspension, avec une IgG pure spécifique et une HRP‐protéine A. Cette méthode a été utilisée avec succès pour sa spécificité en utilisant 5 espèces différentes hétérologues de Pseudomonas.ResumenLa técnica del procedimiento inmunitario quimioluminiscencia‐enzima para la puesta en evidencia de cantidades escasas de bacterias, demostrada en el ejemplo de Pseudomonas aeruginosaEn el modelo Ps. aeruginosa se describe un método inmunológico de quimioluminiscencia‐enzima (CEIA), el cual hace posible un diagnóstico específico del agente etiológico. Para optimar la técnica de investigación se examinaron 5 reactivos diferentes de quimioluminiscencia en cuanto a su idoneidad en el CEIA. Aquí se logran los mejores resultados con purpurogalina. Además se ensayaron 5 soluciones proteicas diferentes en cuanto a la saturación de valencias libres en tubitos de polistirol. La que mejor actuó fue una solución al 10 % de BSA en PBS‐Tween 20. Para optimar las condiciones exteriores de la reacción inmunitaria se examinó el curso temporal de la reacción serológica a tres teperaturas diferentes así como el procedimiento de lavado para eliminar el conjugado no fijado. La reacción inmunitaria está casi ultimada a 37 °C al cabo de 3 h. 5 pasajes de lavados con centrifugación intermedia durante 5 minutos resultan suficientes para eliminar por completo el conjugado no fijado. En el CEIA propiamente dicho se verificaron al lado de 2 preparaciones diferentes de antígenos diversas preparaciones conjugadas directas e indirectas con respecto a su sensitividad para con la puesta en evidencia de bacterias. Como procedimiento definitivo se eligió un método indirecto con bacterias suspendidas libremente, IgG específica pura y proteína A‐HRP. Esta última fue examinada con éxito en cuanto a su especificidad con ayuda de 5 especies heterólogas diferentes de pseudomonas.