A Quantitative in vitro Evaluation of the Combined Action of Benzylpenicillin and Dihydrostreptomycin on Staphylococci Isolated from the Bovine Udder with Special Regard to Synergistic Activities
Authors: Rosselet A. , Schluep J. , Knüsel F. 
Published: August 2010

Summary206 strains of Staph, aureus isolated from bovine mastitic milks were analysed for their susceptibility to benzylpenicillin (PEN) and dihydrostreptomycin (DHSM). On the base of MIC‐determinations 43% of the strains turned out to be PEN‐resistant and 33% DHSM‐resistant. 97% of the PEN‐resistant strains were penicillinase producers. The influence of the inoculum size on the PEN‐susceptibility of the PEN‐resistant group was very pronounced. On the other hand, the response of the strains to DHSM was hardly influenced by the inoculum size. The comparison of cumulative percentages of inhibition of the antibiotics used singly and combined and the analysis of the fractional inhibitory concentrations led to the conclusion of a significant synergistic effect of the combination. A synergistic effect of the combination was established also with the group of staphylococci resistant to both PEN and DHSM. The induction of penicillinase by PEN was examined on two PEN‐resistant strains. The beta‐lactamase production was reduced to one tenth by the concomitant influence of DHSM (PEN 100 I. U./ml, DHSM 100 mcg/ml). In an agar‐diffusion assay, one tenth MIC of DHSM increased the activity of PEN 9–14 fold while PEN potentiated the efficacy of DHSM by a factor 3–7. These data are discussed with respect to the number of staphylococci that are likely to occur in the bovine udder in cases of chronic mastitis, and with regard to the concentrations of the drugs present in the mammary glands of cows treated at drying‐off. The results give substantial evidence to explain the excellent therapeutic effect obtained against staphylococcal mastitis by combinations of PEN and DHSM at high dosage rates.ZusammenfassungQuantitative Erfassung der kombinierten in‐vitro Aktivitäten von Benzylpenicillin und Dihydrostreptomycin auf bovine Euter‐Staphylokokken unter besonderer Berücksichtigung von synergistischen Wirkungen206 aus Milchproben isolierte Staph. aureus‐Stämme wurden auf ihre Empfindlichkeit gegen Benzylpenicillin (PEN) und Dihydrostreptomycin (DHSM) untersucht. Bei einer angenommenen Grenzkonzentration von 4.1 I. E./ml resp. 37 mcg/ml wurden 43% der Stämme als PEN‐resistent und 33% als DHSM‐resistent klassiert. 97% der PEN‐resistenten Stämme produzierten Penicillinase. Die PEN‐Empfindlichkeit der PEN‐resistenten Staphylokokken war stark inokulumabhängig. In viel geringerem Ausmaß wurde die DHSM‐Empfindlichkeit der DHSM‐resistenten Stämme durch die Größe des Inokulums beeinflußt.Aus dem Vergleich der kumulativen Prozentsätze der Wachstumshemmung durch die Antibiotika allein und in Kombination sowie aus einer Analyse der fraktionierten Hemmkonzentrationen (FIC) ergaben sich eindeutige Anhaltspunkte für eine signifikante synergistische Wirkung der Kombination PEN/DHSM. Diese synergistische Wirkung kam auch bei PEN‐ und DHSM‐resistenten Stämmen zum Ausdruck.An zwei Stämmen wurde die Penicillinase‐Induktion durch PEN überprüft. Es zeigte sich, daß die Beta‐Laktamase‐Produktion durch den Einfluß von DHSM auf einen Zehntel der durch PEN allein induzierten vermindert wurde.In einem Agar‐Diffusionstest potenzierte eine subinhibitorische Konzentration von DHSM (ein Zehntel der minimalen Hemmkonzentration) die Wirkung von PEN um das 9 bis 14fache. Im selben Sinne (Faktor 3–7) verbesserte PEN die DHSM‐Wirkung.Bei der Besprechung der genannten Versuchsresultate wird insbesondere Bezug genommen auf die Zahl der bei chronischer Mastitis im Euter zu erwartenden Staphylokokken und auf die Wirkstoffkonzentrationen nach Trockenstellbehandlung. Die Versuchsergebnisse bieten eine Erklärung für die gute Wirkung, die eine hochdosierte PEN/DHSM‐Behandlung selbst gegen durch resistente Stpahylokokken verursachte Mastitiden entfaltet.RésuméEstimation quantitative de l'action combinée de benzylpénicilline et dihydrostreptomycine contre des staphylocoques isolés de mamelles de vaches avec considération particulière d'activités synergistiques206 souches de Staph, aureus isolées de laits provenant de mammites bovines furent analysées quant à leur susceptibilité à la benzylpénicilline (PEN) et la dihydrostreptomycine (DHSM). Le 43% des souches fut classé résistant à PEN et 33% à DHSM sur la base de limites de concentration de 4,1 U. I./ml et 37 mcg/ml. 97% des souches résistantes à PEN produisirent de la pénicillinase. La susceptibilité à PEN des staphylocoques résistants à PEN fut fortement influencée par la quantité des germes inoculés. En revanche, l'activité de la DHSM fut à peine influencée par l'ampleur de l'inoculum. La comparaison des pourcentages cumulatifs de l'inhibition exercée par les antibiotiques seuls et combinés et l'analyse des fractions de concentrations inhibitrices montrèrent l'existence d'une synergie significative résultant de l'emploi combiné des deux antibiotiques. Cette activité synergistique fut même confirmée sur le groupe de staphylocoques à double résistance. L'induction de la pénicillinase par PEN a été examinée sur deux souches résistantes à PEN. La production de béta‐lactamase resta réduite à un dixième sous l'influence simul‐tanée de DHSM (PEN 100 U. I./ml, DHSM 100 mcg/ml). Dans un essai de diffusion en gélose, un dixiéme de concentration minimale inhibitrice de DHSM augmenta l'activité de PEN 9 à 14 fois, alors que l'efficacité de DHSM fut multipliée d'un facteur de 3 à 7 par PEN. Ces résultats ont été discutés en tenant compte du nombre probable de staphylocoques se trouvant dans la mamelle bovine lors de mastite chronique et en prenant en considération les concentrations d'antibiotiques présentes dans les glandes mammaires de vaches traitées au tarissement. Les résultats obtenus expliquent l'excellent effet thérapeutique de combinaisons de PEN et DHSM à hauts dosages contre les mastites à staphylocoques.ResumenEvaluación cuantitativa in vitro de la actividad de la combinación Benzilpenicilina y Dihidroestreptomicina sobre estafilococos aislados en cuarterones de vacas y sobre las actividades sinergísticas en particular206 cepas Staph, aureus aisladas en muestras de leche fueron analizadas en cuanto a su sensibilidad frente a Benzilpenicilina (PEN) y Dihidroestreptomicina (DHSM). Ante una supuesta concentración mínima de inhibición de 4.1 resp. 37 ppm, el 43% de las cepas bacterianas eran PEN‐resistentes y el 33% DHSM‐resistentes. El 97% de las cepas que eran PEN‐resistentes producían penicilinasa. El tamaño del inoculum tuvo un influjo importante sobre la sensibilidad frente al PEN de los estafilococos que eran PEN‐resistentes. El influjo del tamaño del inoculum sobre la sensibilidad frente al DHSM de las cepas que eran DHSM‐resistentes era insignificante.La comparación entre los porcentajes cumulativos de inhibición de los antibióticos utilizados solos o en combinación, y los análisis de las concentraciones de inhibición fraccionadas (Fractional Inhibitory Concentrations) mostró indicios unívocos de un efecto sinergístico significante por la combinación PEN/DHSM. Este efecto sinergístico se expresó también en las cepas PEN‐ y DHSM‐resistentes.Se contrastó la inducción de penicilinasa por PEN con ayuda de dos cepas PEN‐resistentes. Resultó que la producción de beta‐lactamasa era disminuída a un déimo (1/10) por el simultáneo influjo del DHSM (PEN 100 unidades/ml, DHSM 100 ppm). En un ensayo de agardifusión un décimo de la concentración mínima de inhibición de DHSM aumentó la actividad de PEN de 9–14 veces, mientras que PEN elevó la eficacia de DHSM a la potencia 3–7. Los datos de estos estudios se refieren al número esperado de estafilococos en los cuarterones de vacas en casos de mamitis crónicas y a las concentraciones de agentes químicos después del tratamiento. Los resultados ofrecen una explicación por el buen efecto obtenido con tratamientos con alta dosis de PEN/DHSM; y también por los casos de mamitis provocadas por estafilococos resistentes.