Etudes sur la culture in vitro du virus aphteux selon Frenkel
Authors: Ubertini B. , Nardelli L. , Barei S. , Santero G. 
Published: September 2010

RésuméAprès avoir passé en revue la littérature sur la culture in vitro du virus aphteux jusqu'à en 1947, on souligne la discordance des résultats des différents auteurs sur la période optimale d'incubation de ces cultures.Ces recherches faites avec des techniques et des tissus divers, qui d'habitude sont des tissus épithéliaux embryonnaires, ont le mérite d'avoir mis en évidence des faits intéressants comme la crise d'adaptation des premiers passages in vitro, la multiplication du virus plus lente à 30° qu'à 37°, la possibilité de variation de certaines propriétés du virus après un certain nombre de passages, la multiplication du virus tout d'abord dans le tissu et son passage ultérieur dans le liquide cultural.En 1950 et au cours des années suivantes Frenkel a, d'une façon géniale, adapté sa méthode de culture sur les épithéliums linguaux de bovins à des cultures à l'échelle industrielle. Actuellement le virus cultivé selon la méthode de Frenkel est utilisé dans une mesure toujours plus grande par les laboratoires pour la production de vaccin.Il faut dire que jusqu'à présent rares sont les recherches systématiques sur le développement du pouvoir immunisant aux différentes heures d'incubation. Cela est dû, à notre avis, à ce que beaucoup d'auteurs ont accépté l'hypothèse que le développement maximum du pouvoir antigène immunisant correspond au titre maximum de virulence. C'est pourquoi les recherches ont été vouées presque exclusivement à l'étude du développement du pouvoir infectant.Les recherches récentes de Fogedby et Johnson, de Henderson, attirent l'attention sur l'absence d'une stricte corrélation entre le titre infectant et l'activité vaccinante d'un virus donné en culture in vitro.La grande importance pratique de la culture in vitro du virus aphteux est due principalement à ce qu'elle met à disposition de grandes quantités de virus aphteux, matériel jusqu'à présent insuffisant aux besoins durant les épizooties. La possibilité de pouvoir utiliser les épithéliums linguaux de tous les bovins des grands abattoirs, où qu'ils soient, laisse espérer des développements futurs de la vaccination, rendus jusqu'à présent impossibles à cause de la rareté et du coût du matériel antigène.Un autre avantage est de pouvoir préparer le matériel infecté en laboratoire seulement.Toutes ces considérations démontrent la nécessité d'entreprendre une série de recherches non seulement sur le pouvoir infectant, mais surtout sur le pouvoir immunisant et d'autre part de se procurer une méthode plus simple de titrage préventif d'une culture in vitro de virus, pour qu'on puisse évaluer d'une façon assez sûre son pouvoir antigène immunisant.Les recherches que nous avons effectuées et les résultats que nous avons obtenus peuvent se diviser en trois groupes:

Etude du développement en culture in vitro du pouvoir infectant, déviant et immunisant du virus O2/139.a) Les résultats les plus importants sont résumés dans le tableau n° 8 et dans le graphique n° 5. Il faut noter surtout que le pouvoir infectant de l'épithélium atteint son titre maximum 6 heures au moins avant les pouvoirs déviant et immunisant. A la 6ème heure d'incubation le pouvoir infectant est déjà présent en quantité notable, alors que le pouvoir déviant et immunisant ne sont pas démontrables. L'élévation de la courbe du pouvoir déviant est parallèle à celle du pouvoir immunisant. Pour tous deux le titre maximum est atteint à la 24ème heure d'incubation. A partir de la 24ème heure les trois courbes s'abaissent d'une façon continue pour le pouvoir infectant et déviant, tandis que celle du pouvoir immunisant subi à la 60–66ème heure une élévation significative qui la détache de celle du pouvoir déviant. Il ne faut pas oublier que tous les titrages reportés ici ont été faits sur l'épithélium sans liquide cultural.b) Le tableaux n° 2, 3, 4, 5 et les graphiques 1 et 2 montrent que le pouvoir infectant et déviant du virus se développent d'abord sur l'épithélium puis dans le liquide cultural. A partir et après la 60ème heure le titre infectant est plus élevé dans le liquide. Il en est de même, bien que plus tardivement, pour le pouvoir déviant.
Etude du développement en culture in vitro du pouvoir infectant, déviant et immunisant du virus A/165.Pour le groupe de recherches effectuées sur l'épithélium seul, les résultats les plus importants sont résumés dans le tableau n° 16 et dans le graphique n° 10. Il faut relever que dans ce cas le pouvoir infectant de l'épithélium atteint son titre maximum environ 12 heures avant le pouvoir déviant et immunisant.Jusqu'à 48 heures d'incubation on note un bon parallélisme dans le tracé des courbes du pouvoir déviant et immunisant. Toutes deux présentent le plus haut titre à la 24ème heure d'incubation. Après 48 heures, le pouvoir déviant et immunisant se comportent d'une façon indépendante quand ce dernier est mesuré selon l'indice de neutralisation, tandis que persiste un certain parallélisme si cette mesure est basée sur la dose protectrice 50 des vaccins.Les tableaux 10 et 11 et le graphique n° 6 en ce qui concerne le pouvoir infectant, les tableaux 12 et 13 et le graphique n° 7 pour le pouvoir déviant, montrent les mêmes phénomènes que ont été rapportés pour le virus O2/139 au paragraphe b).
Etude du développement en culture in vitro et in vivo du pouvoir infectant, déviant et immunisant du virus A/165.

En ce qui concerne le développement in vitro, les résultats les plus intéressants, résumés dans le tableau n° 23 et dans le graphique n° 14, confirment dans les grandes lignes les résultats des groupes d'expériences précédents.Dans le tableau n°24 sont résumés les résultats obtenus avec le virus cultivé in vivo, qui montrent qu'également in vivo le pouvoir infectant est la propriété du virus qui se développe le plus rapidement. Six heures après l'infection un bon pouvoir infectant est déjà présent, alors que le pouvoir déviant n'est pas encore décelable et que le pouvoir immunisant est très faible.Ceci démontre clairement, au moins en ce qui concerne les virus étudiés dans nos conditions expérimentales, que le seul titrage de la virulence d'un virus‐culture ne peut pas constituer l'élément indicateur de l'activité des vaccins qui en dérivent. Dans nos expériences nous avons noté un bon parallélisme entre le pouvoir déviant et le pouvoir immunisant.Avant de généraliser il est nécessaire d'entreprendre de nombreuses recherches pour confirmer ces résultats avec d'autres virus et de standardiser la technique de titrage de l'antigène déviant pour pouvoir comparer les résultats des divers laboratoires. Il serait opportun à cet égard d'avoir à disposition pour chaque virus un antigène standard international contenant un nombre donné d'unités antigènes déviantes.On pourrait peut‐ètre ainsi proposer de remplacer, dans la préparation des vaccins de culture, le titrage préalable du pouvoir infectant par celui du pouvoir déviant. En effet nous pensons que la propriété déviante, sans ètre l'expression directe de l'activité immunisante d'un virus aphteux, est la plus voisine, la moins coûteuse et la plus facile à déterminer.ZusammenfassungUntersuchungen über “in vitro” Kultur des M. K. S.‐Virus nach Frenkel

Teil: Entwicklung des Infektions‐, Komplementablenkungs‐ und Immunisierungsvermögens während 72stündiger Inkubation.

Die Verfasser heben die Meinungsverschiedenheiten der ersten Forscher über die Bebrütungszeit bei der Kultur des M. K. S.‐Virus hervor.Mit unterschiedlichen Verfahren und Geweben durchgeführte Untersuchungen mit M. K. S.‐Kulturen lehrten, daßwährend der ersten Passagen in Vitro ein unregelmäßiges Wachstum stattfindetdie Virusvermehrung bei 30° langsamer geschieht als bei 37°sich einige Viruseigentümlichkeiten nach einer bestimmten Anzahl von Passagen änderndie Vermehrung des Virus zuerst im Gewebe stattfindet und dann in die Flüssigkeit (Bouillon) übergeht.Frenkel (1950) erzielte die M. K. S.‐Viruszüchtung in Massen‐Virus‐Kulturen. Bisher liegen jedoch wenige systematische Untersuchungen über die Immunisierungsfähigkeit nach verschiedenen Bebrütungszeiten vor. Dies ist wohl darin begründet, daß viele Forscher glaubten, Virulenz und größte Immunisierungsfähigkeit wären voneinander abhängig. Daher beschränkten sich die Versuche auf das Studium der Virulenz. Nach der neuen Arbeit von Fogedby, Johnson und Henderson besteht aber keine Beziehung zwischen Infektionstiter und Vaccinationsfähigkeit einer Viruskultur “in vitro”.Die große praktische Bedeutung einer “in vitro”‐Kultur ist davon abhängig, daß eine große Menge von M. K. S.‐Virus zur Verfügung steht. Die Möglichkeit, das bovine Zungenepithel sämtlicher in öffentlichen Schlachthäusern geschlachteten Rinder verwenden zu können, eröffnet für die Vaccination neue Perspektiven. Ein weiterer Vorteil ist die Behandlung des infektiösen Materiales nur im Laboratorium.Um mit ausreichender Sicherheit die antigene Immunisierungsfähigkeit vorausbestimmen zu können, ergab sich die Notwendigkeit, ausgedehnte Versuche über das Immunisierungsvermögen und die Erarbeitung einer einfach zu handhabenden orientierenden Titrationsmethode der Viruskultur “in vitro” aufzunehmen.Die Versuche über die Entwicklung des Infektionsgrades sowie der Kom‐plementbindungs‐ und Immunisierungsfähigkeit der “in vitro”‐Kultur zeitigten folgende Ergebnisse:Virus O/139Wie aus Tabelle 8 und der graphischen Darstellung 5 hervorgeht, ist eine Infektionsfähigkeit der Kultur schon nach 6stündiger Bebrütung vorhanden, während das Komplementbindungs‐ und das Immunisierungsvermögen noch nicht nachzuweisen sind. Die ansteigende Kurve der Komplementbindungsfähigkeit geht dem Immunisierungsvermögen parallel. Bei beiden liegt der Gipfel bei 24stündiger Bebrütung. Von 24 Stunden an ist ein Abfallen der 3 Wachstumskurven zu erkennen; dieses ist für die Infektiosität und Komplementbindungsfähigkeit gleich. Dagegen ist für die Immunisierungsfähigkeit wieder ein deutlicher Anstieg nach 60 und 66 Stunden zu erkennen, so daß sich diese Kurve von der der Komplementbindungsfähigkeit trennt.Die Tabellen 2, 3, 4, 5 und die graphischen Darstellungen 1 und 2 zeigen, daß Infektiosität und Komplementbindungsfähigkeit zuerst im Epithel zunehmen und erst dann in die Flüssigkeit übergehen. Das Gleichgewicht des Infektionstiters tritt in diesen beiden Kulturkomponenten nach 42stündiger Bebrütung ein. Nach 60 Stunden ist ein größerer Infektionstiter in der Flüssigkeit nachweisbar. Das gleiche trifft für die Komplementbindungsfähigkeit, jedoch mit größerer Verzögerung, zu.Virus A/145Wie aus Tabelle 16 und der graphischen Darstellung 10 ersichtlich ist, erreicht die Infektiosität des Epithels ihren höchsten Grad um 12 Stunden früher als das Komplementbindungsvermögen und die Immunisierungsfähigkeit. Die ansteigenden Kurven der Komplementbindungs‐ und Immunisierungsfähigkeit laufen bis zur 48. Bebrütungsstunde parallel zueinander. Beide erreichen den Gipfel nach 24stündiger Bebrütung. Nach 48 Stunden zeigen Komplementbindungs‐ und Immunisierungsvermögen ein unterschiedliches Verhalten.Die Versuche über die Entwicklung der Infektiosität, der Komplementbindungs‐ und Immunisierungsfähigkeit der “in vitro”‐ und “in vivo”‐Kultur ergaben folgendes:Virus A/165Die “in vitro”‐ Versuche (Tabelle 23 und graphische Darstellung 14) bestätigen die erhaltenen Ergebnisse der vorhergehenden Versuchsgruppen. Mit der Virus‐Kultur “in vivo” (Tabelle 24) ist die Infektionskraft viel stärker. 6 Stunden nach der Infektion ist bereits ein gutes Infektionsvermögen vorhanden, während die Komplementbindungsfähigkeit nicht und die Immunisierungsfähigkeit nur schwach nachweisbar sind.Demnach scheint die Virulenztitration kein zuverlässiges Mittel für die Aktivität der Vaccine zu sein. In unseren Versuchen standen Komplement‐bindungs‐ und Immunisierungsfähigkeit in Beziehung zueinander. Weitere Versuche mit anderen Viren sind nötig, bevor dies verallgemeinert werden kann. Außerdem ist es nötig, das Titrationsverfahren des Komplement‐bindungsantigen zu standardisieren, um die Ergebnisse der verschiedenen Laboratorien vergleichen zu können.Zum Schluß werden wir für jedes Virus ein internationales Standard‐Virusantigen zur Verfügung haben, das eine gegebene Anzahl von Komplementbindungsantigen‐Einheiten enthält. In diesem Falle könnte die orientierende Titration der Infektiosität durch die der Komplementbindungsfähigkeit ersetzt werden. Obgleich die Komplementbindungsmethode kein direktes Zeichen für die Immunisierungsfähigkeit des M. K. S.‐Virus ist, ist sie doch am zuverlässigsten, Geld sparend und leicht zu bestimmen.SummaryInvestigations on the “in vitro” culture of the foot‐and‐mouth disease virus according to FrenkelThe authors point out the discrepant results obtained by various workers in the culture incubation time of the foot‐and‐mouth disease virus.Investigations made with different procedures and tissues have revealed interesting facts such as the irregular growth during the first passages i n vitro, the slower virus multiplication at 30° C than at 37° C, the possibility of a change in some virus properties after a certain number of passages, and the multiplication of virus first in the tissue and its later appearance in the liquid.Frenkel (1950) adapted the cultivation of foot‐and‐mouth disease virus to mass virus culture and this method is now used widely for vaccine production. Systematic investigations on the immunising power at various incubation times are lacking, and many workers believe that the virulence peak coincides with the greatest immunising power.According to the recent work of Fogedby and Johnson and of Henderson, there is no relationship between infectivity titre and vaccinating power of the virus cultured “in vitro”. The great practical importance of culture “in vitro” is that a large quantity of foot‐and‐mouth disease virus is obtainable, and the possibility of utilising the bovine tongue epithelium of all the cattle slaughtered in the big abattoirs opens new perspectives for vaccine production. Another advantage is that the processing of the infected material takes place only in the laboratory.Extensive investigations are required especially on the immunising power and to find an easy method of preliminary titration of a virus culture “in vitro” which will estimate with sufficient certainty its antigenic power.The investigations and the results obtained were as follows:Virus O/139The main results are summarized in Table 8 and Graph 5. The infectivity peak of the epithelium occurs at least 6 hours earlier than that of complement fixing activity and immunising power. Infectivity is already present after 6 hours incubation, whereas complement fixing activity and immunising power are not then demonstrable. The growth curve of complement fixing activity is parallel to that of immunising power. In both the peak occurs after 24 hours incubation. After 24 hours there is a fall in the 3 growth curves; this fall is continuous for infectivity and complement fixing power, but for immunising power there is a significant rise at the 60th and 66th hours. Tables 2, 3, 4, 5 and Graphs 1 and 2 show that infectivity and complement fixing power first multiply in the epithelium and then pass into the liquid. Some degree of balance occurs after 42 hours incubation. The infectivity titre is greater in the liquid after 60 hours, and the complement fixing activity is higher after a longer period.Virus A/145The main results are summarized in Table 16 and Graph 10. Infectivity of the epithelium reaches its highest level about 12 hours earlier than complement fixing activity and immunising power. Growth curves of complement fixing and immunising power run parallel until 48 hours incubation and both of them show peaks at 24 hours. After 48 hours, complement fixing and immunising power behave differently.Tables 10, 11 and 12 and Graphs 6 and 7 show the same characteristics for Virus 0/139.Investigations on the development in vitro and in vivo of the infectivity, complement fixing and immunising power of Virus A/165The main results obtained in vitro are summarized in Table 23 and Graph 14, and confirm the results obtained in the previous preliminary trial. The results with virus culture “in vivo” are summarized in Table 24 from which it appears that the infectivity power occurs more rapidly in vivo also. A good infectivity power is present 6 hours after infection, whereas complement fixing activity is not demonstrable and immunising power is poor.It thus appears that virulence titration is not a reliable means of determining the activity of vaccines. In our experiments complement fixing activity was, however, related to immunising power. Further work is needed with other viruses before one can generalise. It is also necessary to standardize the titration procedure of complement fixing antigen in order to compare the results of various laboratories so that there may eventually be available for each virus an international standard virus antigen containing a given number of complement fixing antigen units. Preliminary titration of the infectivity power might then be replaced by that of complement fixing activity. Although the complement fixing property is not the direct expression of the immunising activity of a foot‐and‐mouth disease virus, it is the most reliable and the cheapest, and is easy to determine.ResumenEstudios sobre el cultivo del virus de la glosopeda «in vitro» según Frenkel1a Parte: Desarrollo de las capacidades infectiva, de desviación del complemento e inmunógena durante la incubación de 72 horas.Las investigaciones realizadas con cultivos de virus de fiebre aftosa, según diversas técnicas y en varios tejidos, demostraron que durante el primer pase «in vitro» sobreviene un crecimiento irregular; la multiplicación del virus es más lenta a 30° que a 37°, se alteran algunas características del virus trás un número de pases determinado; la multiplicación del virus sucede primero en el tejido y luego pasa al líquido (caldo).Frenkel (1950) logró cultivar el virus en cultivos masivos. Sin embargo, hasta la fecha no se conocen más que escasas investigaciones sistemáticas sobre la capacidad inmunizante tras los diversos tiempos de incubación. Esto tal vez se halla justificado con la opinión en que abundan muchos investigadores, según la cual la virulencia y la capacidad mayor de inmunización tienen relaciones entre sí. Por esta razón, los ensayos se limitaban al estudio de la virulencia. Sin embargo, según el reciente trabajo de Fogedby, Johnson y Henderson, no existe ninguna relación entre el título de infección y la capacidad vacunante de un cultivo virósico «in vitro».La gran importancia práctica de un cultivo «in vitro» depende de que se pueda disponer de una gran cantidad de virus aftoso en un momento dado. La posibilidad de emplear el epitelio lingual bovino de la totalidad de los bóvidos sacrificados en los mataderos públicos, abre nuevas perspectivas a la vacunación. Otra ventaja más reside en el tratamiento del material infeccioso en el laboratorio exclusivamente.Con el fin de poder predeterminar la capacidad de inmunización antigénica, se hizo patente la necesidad de realizar extensos ensayos sobre la capacidad de inmunización y de elaborar una técnica de titulación orientadora fácil de manejar del cultivo virósico «in vitro».Los ensayos sobre el desarrollo del grado de infección, la capacidad de fijación del complemento y de inmunización del cultivo «in vitro» ofrecieron los resultados siguientes:Virus O/139Como se deriva de la tabla 8 y del gráfico 5, a las 6 horas de incubación ya se halla presente una capacidad infectiva del cultivo, mientras que aún no se pueden demostrar las capacidades de fijación del complemento y de inmunización. La curva ascendente de la capacidad de fijación del complemento vá paralela a la de la capacidad de inmunización. En ambas, el máximo se tiene en la incubación de 24 horas. A partir de las 24 horas, se reconoce un descenso en las tres curvas de crecimiento, al igual que para la infecciosidad y la capacidad de fijación del complemento. A su vez, para la capacidad de inmunización se reconoce un ascenso marcado tras 60 y 66 horas, de manera que esta curva se separa de la de la capacidad de fijación del complemento.Las tablas 2, 3, 4, 5 y las gráficas 1 y 2 demuestran que la infecciosidad y la capacidad de fijación del complemento aumentan primero en el epitelio y luego pasan al líquido. El equilibrio del título de infección aparecen estos dos componentes de cultivo tras la incubación durante 24 horas. Después de 60 horas, en el líquido se puede demostrar un título infectivo mayor. Lo mismo sucede con, la capacidad de fijación del complemento, ahora que con mayor retraso.Virus A/145Como se deriva de la tabla 16 y del gráfico 10, la infecciosidad del epitelio alcanza su grado máximo unas 12 horas antes que las capacidades de fijación del complemento y de inmunización. Las curvas ascendentes de las capacidades de fijación del complemento y de inmunización transcurren paralelas hasta la 48a hora de incubación. Ambas alcanzan el máximo a las 24 horas de incubación. Después de las 48 horas, las capacidades de fijación del complemento y de inmunización muestran un comportamiento diferente. Las mismas propiedades las presentaba el virus O2/139.Los ensayos sobre el desarrollo de la infecciosidad, de la capacidad de fijación del complemento y de inmunización del cultivo «in vitro» e «in vivo» ofrecieron el resultado siguiente:Virus A/165Los ensayos «in vitro», (tabla 23 y gráfica 14) confirman los resultados obtenidos en los grupos experimentales precedentes. Con el cultivo del virus «in vivo» (tabla 24), la virulencia es mucho mayor. A las 6 horas de manifestarse una buena capacidad infectiva, la fijación del complemento todavía no es realizable y sólo posee una capacidad de inmunización muy débil.Por esta razón, la titulación de la virulencia no parece ser un medio muy exacto para medir la actividad de la vacuna. En nuestros ensayos, las capacidades de fijación del complemento e inmunización estaban íntimamente relacionadas. Se precisan realizar ensayos con otros virus antes de que esto pueda generalizarse. Además es preciso standarizar la técnica de titulación del antígeno de fijación del complemento para poder comparar los resultados de los diversos Laboratorios.Finalmente debemos disponer para cada virus de un antígeno virósico standarizado internacional que contenga un número dado de unidades de antígeno fijador del complemento. En este caso, la titulación orientadora de la infecciosidad podría substituirse por la capacidad de fijación del complemento. Aunque la técnica de fijación del complemento no es ningún signo directo de la capacidad inmunizante del virus aftoso, sí que es la más eficaz, barata y fácil de determinar.