Standardisierung eines indirekten Enzyme‐linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen Hühner‐Bronchitisvirus
Authors: Herling A. , Monreal G. , von Bülow V. 
Published: August 2010

ZusammenfassungDer indirekte Enzyme‐linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde zum Nachweis von Antikörpern gegen Hühnerbronchitis‐Virus optimiert und standardisiert. Als Antigen eignete sich partiell gereinigtes Virus der infektiösen Bronchitis (IBV) verschiedener Stämme mit einem Proteingehalt von 10–20 μg/ml, das in 0,05 M Carbonat‐Bicarbonatpuffer (pH 9,6) an Mikrotiterplatten 16 Stunden bei 4 °C adsorbiert wurde. Zur Reduzierung unspezifischer Bindungen und daraus resultierender störender Hintergrundfärbungen erwies sich ein Serum‐Inkubationsmedium mit 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20 und einem pH von 7,4 als optimal.Die Unterscheidungsgrenze zwischen negativen und positiven Reaktionen wurde auf Grund der Meßwerte von 45 IB‐negativen Seren ermittelt und lag für Serum‐Verdünnungen ab 1: 40 bei einem Extinktionswert von 0,2. Die Ergebnisse der Titrationen von 45 IB‐positiven Hühnerseren ließen darauf schließen, daß der indirekte ELISA eine wesentlich empfindlichere serologische Methode ist als der Präzipitationstest. Nicht präzipitierende Seren mit IBV‐Antikörpern konnten im ELISA regelmäßig und zuverlässig als positiv erkannt werden; ihre Titer lagen zwischen 1: 40 und 1: 160. Die Titer der stark positiven IB‐Seren erreichten Werte bis zu 1: 2560.SummaryStandardization of an indirect enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting antibodies to avian infectious bronchitis virusThe indirect enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA) was adapted for the detection of antibodies against infectious bronchitis virus (IBV) in chicken sera, and the respective methods were standardized. The antigens used for the ELISA were partially purified IBV of different strains with protein concentrations of 10–20 μg./ml. Microtitre plates were coated with antigen in carbonate‐bicarbonate buffer (pH 9.5) for 16 hours at 4 °C. Background staining could be reduced considerably by using a suitable serum incubation medium containing 0.5 M NaCl, 0.05% Tween 20 at a pH of 7.4.The discrimination level between positive and negative reactions was determined by titration of 45 IB‐negative sera and was found to be at an optical density of 0.2 for serum dilutions of 1: 40 or more. The results of the titration of 45 IB‐positive sera suggested that the indirect ELISA was much more sensitive than the precipitation test. Sera found to be negative for precipitins were regularly found to be positive for antibodies detectable by the ELISA with titres of 1: 40 to 1: 160. Strongly positive IBV‐antisera reached titres of up to 1: 2,560.RésuméStandardisation d'un «Enzyme‐linked Immunosorbent Assay» indirect (ELISA) pour la mise en évidence d'anticorps contre le virus de la bronchite aviaireUn test ELISA indirect de mise en évidence des anticorps anti‐virus de la bronchite aviaire a été optimisé et standardisé. Du virus partiellement purifié de la bronchite infectieuse (IBV) de différentes souches avec un taux de protéine de 10–20 μg/ml a été adsorbé 16 heures à 4 °C dans un tampon carbonate‐bicarbonate 0,05 M (pH 9,6) sur microplaques. Un milieu d'incubation sérique avec 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20 et un pH de 7,4 s'est révélé être optimum pour la réduction des liaisons non spécifiques et des colorations parasites qui en résultent. La limite de différenciation entre des réactions positives et négatives fut obtenue sur la base des valeurs de mesure de 45 sérums IB‐négatifs et s'est située à une valeur d'extinction de 0,2 pour des dilutions du sérum à partir de 1: 40. Les résultats des titrations de 45 sérums IB‐positifs des vollailles ont permis de déduire que l'ELISA indirect est une méthode sérologique nettement plus sensible que le test de précipitation. Des sérums non précipitants avec des anticorps IBV ont pu être reconnus comme positifs régulièrement et fidèlement avec ELISA; les titres se situaient entre 1: 40 et 1: 160. Les titres des sérums fortement IB‐positifs ont atteint des valeurs allant jusqu'à 1: 2560.ResumenEstandarización de un ensayo inmunosorbente indirecto ligado a la enzima (ELISA) para identificar anticuerpos contra los virus de la bronquitis de las gallinasSe optimó y estandarizó la prueba inmunosorbente indirecta ligada a la enzima (ELISA) para la puesta en evidencia de los anticuerpos contra el virus de la bronquitis de las gallinas. Como antígeno resultó apropiado virus puri‐ficado parcialmente de la bronquitis infecciosa (VBI) de diversas estirpes con un contenido proteico de 10–20 μg./ml., el cual fué adsorbido en tampón de carbonato‐bicarbonato 0.05 M (pH 9.6) a placas microtitulares durante 16 horas a 4 °C. Para reducir las uniones inespecíficas y las tinciones inoportunas del fondo se mostró como ótimo un medio de incubación del suero sanguíneo con ClNa 0.5 M, tween 20 al 0.05% y un pH de 7.4.El límite de diferenciación entre las reacciones negativas y las positivas se infirió a la vista de los valores de medición de 45 sueros BI‐negativos y se hallaba para diluciones de suero a partir de 1: 40 en un valor de extinción de 0.2. Los resultados de las titulaciones de 45 sueros BI‐positivos de gallina permitieron sacar en conclusión que la ELISA indirecta es un método serológico bastante más sensible que la prueba de precipitación. Los sueros no precipitantes con los anticuerpos del VBI se pudieron reconocer en la ELISA de forma regular y auténtica como positivos; sus títulos se ubicaban entre 1: 40 y 1: 160. Los títulos de los sueros BI fuertemente positivos alcanzaron valores de hasta 1: 2.560.