Bovine adenoviruses V. Diagnostic efficiency of dual‐antigen immuno‐diffusion test using two different group‐reactive antigens in parallel
Authors: Messner A. , Hinaidy B. , Bürki F. 
Published: August 2010

SummaryA serodiagnostic screening procedure for adenovirus antibodies in cattle sera should uncover humoral antibodies against all known and possibly as yet undetected bovine adenovirus species; it should also be specific, of adequate sensitivity, simple to perform, rapid to read and inexpensive. Since extensive group‐reactivity in immunodiffusion tests (ID) occurs between bovine adenovirus species 1, 2, 3 and 9 on the one hand and between species 4 to 8 on the other hand, but not between the 2 subgroups, two different antigens are needed, and not only one, as former authors have used. By detecting 59.16% seroreactors among 148 randomly collected fattening calves with the dual‐ID test described, we surpassed by 1 1/2 to 10 times the reactor‐rates determined by investigators using a single antigen. Diagnostic calf sera were examined against bovine adenovirus antigens 1 and 4 in separate rosettes, whereby undiluted sera were put into only every second peripheral well. In a process called the “bilateral flanking technique” a group‐reactive reference serum of rabbit origin was put into each alternate peripheral well, diluted to an extent so as to produce a single precipitin line at exactly mid‐distance to the central antigen well. Only diagnostic calf sera developing bilaterally a continuous line of identity were read as positive, which allows one to omit co‐testing them against a control antigen. Furthermore, the relative position of a diagnostic line as compared to the bilateral reference lines allows one to grade positive diagnostic sera into strong, medium strong and weak reactor categories. Bovine sera make unsuitable references sera; rabbit sera produced with pelleted virion proved excellent. From conventionally prepared rabbit sera disturbing anti‐bovine co‐precipitins were easily preabsorbed with foetal calf serum. The dual‐ID test as described is simple to perform, simple to read and economical. In most cases group‐specific diagnosis satisfies the need of a diagnostic laboratory. The ID allows a great reduction of sera which have to be submitted to the laborious sero‐neutralization test to obtain a type‐specific serodiagnosis.ZusammenfassungBovine Adenoviren V. Diagnostische Leistungsfähigkeit eines Doppelantigen‐Immunodiffusions‐Testes, der 2 gruppenreaktive Antigene im Parallelansatz verwendetEin serodiagnostisches Untersuchungsverfahren auf Adenovirus‐Antikörper in Rinderseren sollte humorale Antikörper gegen alle bekannten — wie allfällige noch unentdeckte — Adeno Virusspecies (früher „Typen”) des Rindes aufdecken, sollte spezifisch ausfallen, angemessene Nachweisempfindlichkeit aufweisen, einfach abzulesen und preisgünstig sein. Da im Immunodiffusionstest (ID) weitreichende Kreuzreaktivität zwischen den bovinen Adenovirusspecies 1, 2, 3 und 9 einerseits, andererseits den Species 4 bis 8, nicht aber zwischen diesen beiden Subgruppen, besteht, sind zur Serodiagnostik 2 verschiedene Antigene erforderlich, und nicht bloß ein einziges, wie bisherige Autoren dies verwendeten. Mittels des beschriebenen Doppelantigen‐Testes waren wir imstande, unter 148 zufällig gesammelten Seren äußerlich normaler Mastkälber 59,16% Seroreagenten aufzudecken. Damit wurden die Reagentensätze früherer Autoren, welche mit lediglich einem Antigen arbeiteten, um das eineinhalb‐ bis 10fache übertroffen. Wir setzten diagnostische Kälberseren grundsätzlich in separaten Rosetten gegen bovines Adenovirus 1 Antigen wie andererseits bovines Adenovirus 4 Antigen an, wobei alternativ in jedes zweite periphere Becken unverdünntes Diagnostikserum eingefüllt wurde. In einem als „bilaterale Flankier‐Technik” bezeichneten Verfahren wurde in jedes alternative Becken Referenzserum eines Kaninchens in einer vorher bestimmten Idealverdünnung eingefüllt, welche zur Ausbildung einer genau in mittlerer Diffusionsdistanz gelegenen einzelnen Präcipitinlinie führte. Einzig diagnostisch geprüfte Kälberseren welche mit beiden bilateralen Referenzlinien eine kontinuierliche Identitätslinie ausbildeten, wurden als positiv abgelesen, was uns ermöglichte, auf ihre zusätzliche Austestung an einem Kontrollantigen zu verzichten. Außerdem gestattete die relative Position diagnostischer Linien bezogen auf die Referenzlinien, eine abgestufte Bewertung von Diagnostikseren als stark, mittelstark bzw. schwach positiv vorzunehmen. Als Referenzseren der beschriebenen Aussagekraft erwiesen sich Rinderseren ungeeignet, Kaninchenseren nach Immunisierung mittels pelletierter Adenovirionen ideal geeignet, dagegen enthielten Seren konventionell immunisierter Kaninchen außer Adenoviruspräcipitinen störende Präcipitine gegen Rindereiweiß, welche sich indessen leicht durch Präabsorption mittels fötalem Kälberserum entfernen ließen. Der beschriebene Doppelantigen‐ID‐Test ist einfach auszuführen, einfach abzulesen und preislich ökonomisch. In den meisten Fällen wird sein positiver gruppenspezifischer Ausfall dem Labor als diagnostische Aussage genügen. Wo dieses an einer speciesspezifischen („typusspezifischen”) Diagnose interessiert ist, vermag der vorher ermittelte ID‐Befund den Aufwand des Seroneutralisationstestes stark einzuschränken, indem nur ID‐reaktive Seren und nur mittels Adenovirusspecies der positiven Subgruppe nachzuprüfen sind.RésuméAdenovirus bovins V. Practicabilité pour le diagnostic d'un antigène double dans le test d'immunodiffusion qui utilise 2 antigènes réactifs de groupe mis en parallèleUn procédé de recherche sérodiagnostique d'anticorps d'Adenovirus dans des sérums de bovins devrait couvrir des anticorps humoraux contre toutes les espèces connues comme encore inconnues d'Adenovirus (autrefois «types») du bovin, devrait être spécifique, présenter une sensibilité mesurable de mise en évidence, être simple à lire et bon marché. Etant donné qu'il existe dans le test d'immunodiffusion (ID) une réaction croisée entre les espèces d'Adenovirus bovins 1, 2, 3 et 9 d'une part et entre les espèces 4 et 8 d'autre part, mais pas entre ces deux sous‐groupes, 2 antigènes différents sont souhaitables pour le sérodiagnostic et pas un seul comme certains auteurs l'ont utilisé jusqu'à maintenant. Il a été possible au moyen du test de double antigène de mettre en évidence 59,16% de réagissants sérologiques sur 148 sérums de veaux d'engrais normaux. Les données de réagissants d'auteurs n'ayant travaillé qu'avec un antigène ont été dépassées d'1,5 à 10 fois. On a disposé les sérums de diagnostic de veaux dans des rosettes séparées contre l'antigène de l'Adenovirus bovin 1 et de l'autre côté contre l'antigène de l'Adenovirus bovin 4 en remplissant alternativement chaque deuxième cupule d'un sérum de diagnostic non dilué. Avec un procédé désigné eomme technique «flanceur», on a rempli alternativement chaque cupule avec un sérum de référence de lapin dans une dilution adéquate présentant une seule ligne de précipitines à une distance de diffusion moyenne exacte. Les sérums de veaux testés qui formaient une ligne d'identité continue avec les deux lignes de référence bilatérales ont été lus comme positifs, ce qui a permis de renoncer à un antigène de contrôle. La position relative des lignes de diagnostic par rapport aux lignes de référence a permis en outre de déterminer le résultat en fortement, moyennement ou faiblement positif. Les sérums de bovins ne se sont pas révélés être de bons sérums de référence dans les condition décrites, alors que des sérums de lapins immunisés par des virions d'Adenovirus en pellets étaient adéquats, mais les sérums conventionnels de lapins immunisés contenaient à côté des précipitines Adenovirus des précipitines gênantes anti‐protéine bovine qui ont pu être éliminées facilement par préabsorption avec un sérum foetal. Ce test est à lire et bon marché. Son résultat positif spécifique de groupe suffit dans la plupart des cas comme résultat de diagnostic pour le laboratoire. Celui qui est intéressé à un diagnostic spécifique d'espèce («spécifique du type») pourra se limiter au test de séruneutralisation dans lequel, seuls les sérums réagissants à L'ID seront testés avec l'espèce d'Adenovirus du sous‐groupe positif.ResumenAdenovirus bovinos V. Eficiencia diagnóstica de la prueba de inmunodifusión con antígeno doble, en la cual se emplean 2 antígenos diferentes reactivos de grupo en evaluación dobleUn procedimiento de análisis serodiagnóstico en cuanto a anticuerpos frente a adenovirus en sueros sanguíneos vacunos debería poder revelar los anticuerpos humorales frente a todas las especies adenovirósicas (antes «tipos») vacunos conocidos — incluyendo en caso dado los que no han sido descubiertos todavía —, acertar específicamente, presentar una sensibilidad de demostración adecuada, tener una lectura fácil y un precio favorable. Puesto que en la prueba de inmunodifusión (ID) existe reactividad cruzada trascendente entre las especies de adenovirus bovinos 1, 2, 3 y 9 por un lado, por otro entre las especies 4 hasta 8, aunque no entre estos dos subgrupos, se precisan para establecer el serodiagnóstico 2 antígenos diferentes, y no uno solo, tal y como le utilizaban todos los autores hasta la fecha. Mediante la prueba descrita con antígeno doble nos hallamos en condiciones de descubrir entre 148 sueros coleccionados al azar entre terneros de engorde, normales en su aspecto exterior, un 59.16% de reaccionantes séricos, es decir sueros que reaccionaron. Con ello se sobrepasaron las tasas de reaccionantes de los autores primitivos, los cuales trabajaban con un antígeno nada más, en una vez y media hasta 10 veces. Nosotros colocábamos por principio sueros diagnósticos de terneros en rosetas separadas por un lado frente al antígeno adenovirósico bovino 1 y por otro lado frente al antígeno adenovirósico bovino 4, echando alternativamente en cada cubeta segunda periférica suero diagnóstico sin diluir. En un procedimiento que denominamos «técnica bilateral flanqueante» se llenó en cada cubeta alternativa suero de referencia de conejo en una dilución ideal determinada de antemano, el cual conducía a la formación de una línea de precipitina individual situada justamente en la distancia media de la difusión. Únicamente se leyeron como positivos los sueros de terneros contrastados diagnósticamente que formaban con ambas líneas bilaterales de referencia una línea continua de identidad, lo cual nos permitió prescindir de su testificación con un antígeno de control o testigo. Además permitió la posición relativa de las líneas diagnósticas relativas a las líneas de referencia el efectuar una valoración gradual de los sueros diagnósticos como intensos, medianos resp. débilmente positivos. Como sueros de referencia de la potencia aseverativa descrita se revelaron como inadecuados los sueros vacunos, mientras que los sueros de conejo eran idóneos tras la inmunización mediante adenoviriones peletados; sin embargo contenían los sueros de conejos inmunizados de forma convencional, además de precipitinas de adenovirus, unas precipitinas importunas frente a la albúmina vacuna, las cuales no obstante se podrían eliminar con facilidad por medio de preabsorción con suero sanguíneo de feto de ternera. La prueba descrita de ID con antígeno doble es de ejecución fácil, de lectura simple y de un precio económico. En la mayoría de los casos le será suficiente su precipitación positiva específica de grupo al laboratorio como declaración positiva. Cuando aquél se halle interesado en un diagnóstico específico de especie («específico de tipo»), el hallazgo ID determinado antes es capaz de limitar considerablemente las impensas del test de seroneutralización, puesto que nada más se tienen que verificar los sueros reactivos en la ID y sólo mediante las especies de adenovirus del subgrupo positivo.