Untersuchungen über den Erreger der infektiösen Anämie bei Hühnerküken (CAA) in vitro: Vermehrung, Titration, Serumneutralisationstest und indirekter Immunfluoreszenztest
Authors: v. Bülow V. , Fuchs B. , Bertram M. 
Published: August 2010

ZusammenfassungDie Stämme Gifu‐1 und Cux‐1 des Erregers der Kükenanämie (CAA) wurden in Kulturen der lymphoblastoiden Zellinie MDCC‐MSB 1 vermehrt und titriert. Maximale Infektiositätstiter wurden in den Zellen 2 Tage p. i. und im zellfreien Kulturmedium 3 Tage p. i. erreicht. Zytopathische Effekte waren nur nach Beimpfung der Kulturen mit CAA in einer Multiplizität von mindestens 5ID50 pro Zelle eindeutig zu erkennen. Fast alle MSB‐Zellen erschienen 30 Stunden nach ausreichend starker Infektion der Kulturen stark aufgebläht. Der Zerfall infizierter Zellen begann 34 Stunden p. i. und nahm während der folgenden 24 Stunden erheblich zu. Mit Hilfe des indirekten Immunfluoreszenz(FA)‐Tests ließen sich ab 34 Stunden p. i. bei über 50% der vergrößerten Zellen CAA‐Antigene in Form von kleinen Granula im Zellkern nachweisen.CAA‐Titrationen erforderten eine mindestens 7 malige Subkultivierung der beimpften Zellen in Abständen von 3—4 Tagen und dauerten deshalb jeweils 5—6 Wochen. Die Bestimmung neutralisierender Antikörper‐Titer in Hühnerseren war ebenso langwierig. Qualitative SN‐Tests mit niedrigen Serum‐ oder Dotterverdünnungen und hohen CAA‐Dosen erforderten nur 2—3 Subkultivierungen mit einer Dauer von 10—14 Tagen bis definitive Ergebnisse vorlagen. Der indirekte FA‐Test mit CAA‐infizierten, 34—44 Stunden p. i. in Aceton fixierten MSB‐Zellen als Antigen envies sich für den Nachweis von CAA‐Antikörpern als etwas weniger empfindlich als der SN‐Test. Bei Versuchen zum qualitativen Nachweis von CAA‐Antikörpern in Serum‐ oder Dotterproben ergab sich jedoch eine Übereinstimmung von mehr als 80% zwischen den Ergebnissen von FA‐ und SN‐Tests.SummaryInvestigations on chicken infectious anaemia agent (CAA) in vitro: Propagation, titration, serum neutralization tests, and indirect immunofluorescence assaysStrains Gifu‐1 and Cux‐1 of chicken anaemia agent (CAA) were propagated and titrated in cultures of the MDCC‐MSB 1 lymphoblastoid cell line. Maximum infectivity titres were reached in the cultured cells at 2 days p. i., and in cell‐free culture supernatants at 3 days p. i. Cytopathic effects could only be clearly recognized if cultures were inoculated with CAA at a multiplicity of at least 5ID50 per cell. In sufficiently infected cultures, almost all cells appeared considerably swollen at 30 hours p.i.; cell destruction started by 34 hours p. i. and was increasing during the following 24 hours. Small granules of intranuclear CAA antigens could be demonstrated by indirect immunofluorescence at 34 hours p. i. and thereafter in at least 50% of the swollen MSB 1 cells.Titration of CAA infectivity required 5—6 weeks because inoculated cells had to be subcultured at least 7 times every 3 to 4 days. Determination of neutralizing antibody titres in chicken sera was equally lengthy, but qualitative SN tests employing low serum or yolk dilutions and high concentrations of CAA needed only 2 to 3 subcultures, i. e. 10 to 14 days, to provide definite results. Indirect fluorescent antibody (FA) tests, using CAA‐infected cells, fixed in acetone at 34 to 44 hours p. i., as a source of antigen were less sensitive than SN tests. However, there was a more than 80 % concordance between the results of FA and SN tests if employed as qualitative assays to detect the presence of CAA antibody in egg yolks or in chicken sera.RésuméRecherches sur l'agent de l'anémie infectieuse des poussins (CAA) in vitro: multiplication, titration, test de séroneutralisation et test d'immunofluorescence indirecteLes souches Gifu‐1 et Cux‐1 de l'agent de l'anémie du poussin (CAA) ont été multipliées et titrés dans des cultures de lignée cellulaire lymphoblastoïde MDCC‐MSB 1. Les titres infectieux maximaux ont été atteints 2 jours p. i. dans les cellules et 3 jours p. i. dans le milieu de culture sans cellules. Des effets cytopathiques furent seulement reconnaissables après une inoculation des cultures avec CAA dans une multiplication d'au‐moins 5ID50 par cellule. Presque toutes les cellules MSB sont apparues gonflées 30 heures après une infection suffisamment forte des cultures. La destruction des cellules infectées a commencé 34 heures p. i. et a augmenté fortement durant les 24 heures suivantes. Des antigénes CAA sous la forme de fines granulations dans le noyau cellulaire ont été mis en évidence dès la 34e heure p. i. chez plus du 50% des cellules grossies avec le test d'immunofluorescence (FA) indirecte.Les titrations CAA exigèrent au moins une sous‐culture en 7 fois des cellules inocuées en l'espace de 3—4 jours et durérent 5—6 semaines. La détermination du titre des anticorps neutralisants dans les sérums de volaille furent également de longue durée. Les tests de seroneutralisation avec des dilutions basses de sérum ou de liquide vitellin et des doses Clevies CAA exigèrent seulement 2—3 sous‐cultures avec une durée de 10—14 jours pour obtenir des résultats définitifs. Le test FA indirect avec des cellules MSB CAA‐infectées et fixées à l'acétone 34—44 heures p. i. comme antigène s'est révélé moins sensible pour la mise en évidence des anticorps CAA que le test de neutralisation. Une concordance de plus de 80% entre les résultats de tests FA et SN a été trouvée lors des essais de mise en évidence qualitative des anticorps CAA dans des échantillons sériques et vitellins.ResumenEstudios in vitro sobre el agente etiológico de la anemia infecciosa en pollítos (CAA): multiplicación, titulación, prueba de seroneutralización y prueba indirecta de la inmunofluorescenciaLas estirpes Gifu‐1 y Cux‐1 del agente etiológico de la anemia de los pollitos (CAA) fueron multiplicadas y tituladas en cultivos de la linea celular linfoblastoide MDCC‐MSB 1. Los títulos máximos de infecciosidad se consiguieron en las células 2 días p. i. y en el medio de cultivo libre de cilulas 3 días p. i. Efectos citopáticos solo se pudieron reconocer de forma clara tras la inoculación de los cultivos con CAA en una multiplicidad al menos de 5DI50 por célula. Casi todas las células MSB aparecieron fuertemente insufladas a las 30 horas tras una infección suficientemente intcnsa de los cultivos. La desintegración de las células infectadas comenzó 34 horas p. i. y aumentó considerablemente durante las 24 horas siguientes. Con ayuda de la prueba indirecta de inmunofluorescencia (FA) se pudieron poner en evidencia, a partir de las 34 horas p. i., en más del 50% de las células aumentadas de tamaño, antígenos CAA en forma de gránulos pequeños en el núcleo celular.Las titulaciones CAA precisaron al menos un subcultivo de 7 pases de las células inoculadas en intervalos de 3—4 días y duraba, por tanto, cada vez de 5—6 semanas. La determinación de los títulos de anticuerpos neutralizantes en sueros de gallinas era igual de engorrosa. Las pruebas cualitativas de SN con diluciones bajas de suero o yema y dosis elevadas de CAA solo precisaban 2—3 subcultivos con una duración de 10—14 días hasta que se podia disponer de los resultados definitivos. La prueba FA indirecta con células MSB fijadas 34—44 horas p. i. en acetona, infectadas con CAA, como antígeno resultó ser para la puesta en evidencia de anticuerpos CAA algo menos sensible que la prueba de SN. Sin embargo, en ensayos acerca de la puesta en evidencia cualitativa de anticuerpos CAA en muestras de suero y yema se infirió una concordancia superior al 80% entre los resultados de las pruebas de FA y de SN.