Generation and evaluation of chimeric antigen receptor-modified natural killer cells for the treatment of acute myeloid leukemia
Authors:   , Albinger Nawid 
Published: November 2024

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) stellt die häufigste maligne Bluterkrankung im Erwachsenenalter dar, und besitzt eine äußerst schlechte Prognose vor allem bei älteren PatientInnen. Sie ist durch eine klonale Proliferation undifferenzierter myeloider Vorläuferzellen gekennzeichnet, welche mit der physiologischen Hämatopoese interferieren. Unbehandelt führt dies zu einer erheblichen Anfälligkeit für schwere Infektionen und Blutungen mit letalem Ausgang. Die Behandlung der AML wird Patient-spezifisch durchgeführt und ist abhängig vom AML-Subtyp, dem Krankheitsfortschritt, sowie der Effektivität vorangegangener Behandlungen. Der Großteil der AML-PatientInnen wird mit einem intensiven Chemotherapie-Protokoll behandelt, gegebenenfalls ergänzt durch eine Hämatopoetische-Stammzelltransplantation. Letztere ist jedoch mit einem signifikanten Risiko für schwere Nebenwirkungen wie der Graft-versus-host Erkrankung verbunden und für viele ältere und/oder geschwächte PatientInnen nicht durchführbar. Daher werden dringend neue Therapiekonzepte zur Behandlung der AML benötigt. Während immuntherapeutische Ansätze mit chimären Antigenrezeptor (CAR)-modifizierten T-Lymphozyten herausragende klinische Ergebnisse bei der Behandlung von B-Zell Neoplasien und dem Multiplen Myelom zeigen konnten, gibt es bislang keine effektiven Zelltherapeutika zur Behandlung der AML. Im Gegensatz zu T-Zell-basierten Therapiekonzepten ist die Verwendung von Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) deutlich nebenwirkungsärmer und kann allogen erfolgen. Zudem besitzen NK-Zellen eine intrinsische Zytotoxizität gegenüber AML-Zellen, was sie besonders attraktiv für die Behandlung bei der AML macht. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung und Testung einer neuartigen CAR-NK-Zell-Therapie zur Behandlung der AML. Dafür wurden folgende Unterziele definiert: •	Die Generierung AML-spezifischer CAR-NK-Zellen, welche z.B. gegen die auf AML-Zellen exprimierten Oberflächenantigene CD33 oder CD123 gerichtet sind. Dabei sollen virale Transduktionsmethoden verwendet und die erfolgreiche Transduktion mittels CAR-Expressionsanalysen bestätigt werden. •	Die Viabilität, Expansion und der Phänotyp der CAR-NK-Zellen soll analysiert und mit nicht-transduzierten NK (NT-NK)-Zellen verglichen werden. •	Die Zytotoxizität der CAR-NK- im Vergleich zu NT-NK-Zellen soll mittels durchflusszytometrischer Analyse gegenüber AML-Zelllinien mit unterschiedlichen Antigenexpressionsdichten getestet werden. •	Das Zytotoxizitätspotential einzelner CAR-NK-Zellen soll untersucht werden, wobei die darunterliegenden Mechanismen ermittelt werden (z.B. Perforin/Granzym-, tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand (TRAIL)-, oder Fas-induzierter Zelltod). •	Der Einfluss der CAR-Modifikation auf intrazelluläre Signalwege soll mittels Transkriptomanalysen (RNAseq und qPCR) vor und nach Kontakt mit AML-Zellen bestimmt werden. •	Die Funktionalität der CAR-NK Zellen soll durch zusätzliche Modifikationen der Zelle optimiert werden. Dabei sollen mittels CRISPR/Cas9-Technologies Gene ausgeschaltet werden, welche für inhibitorische Moleküle wie zum Beispiel natural killer group 2A (NKG2A) kodieren. •	Die Wirksamkeit der zuvor generiert und charakterisierten CAR-NK-Zellen soll in AML-xenotransplantierten Mausmodellen getestet werden. Zunächst wurde parallel zu ersten Versuchen Literaturrecherche betrieben, wodurch zwei Review-Artikel (Publikation 1 und 2) veröffentlicht werden konnten. In Publikation 1 wurde das Rezeptorprofil und die Tötungsmechanismen der NK-Zellen herausgearbeitet, zusammengefasst und mit T-Zellen, welche bis zum heutigen Tag die einzigen zugelassenen CAR-Immunzellprodukte ausmachen, verglichen. In Publikation 2 wurden u.a. alle in Deutschland durchgeführten klinischen Studien mit CAR-T- und CAR-NK-Zellen identifiziert, zusammengefasst und analysiert. Dabei zeigte sich, dass es in Deutschland kaum klinische Studien mit CAR-Immunzellprodukten zur Behandlung der AML gibt. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung existierte nur eine CAR-NK-Studien, welche jedoch NK-92-Zellen verwendete. Für die Entwicklung einer CAR-NK-Zelltherapie zur Behandlung der AML, wurde CD33 als Antigen ausgewählt, da es sowohl auf AML-Blasten als auch auf Leukämie-Stammzellen (LSC) in den allermeisten PatientInnen hoch exprimiert wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte mittels viraler Transduktion von aus peripherem Blut gewonnenen NK-Zellen erfolgreich gegen CD33-gerichtete (CAR33)-NK-Zellen hergestellt werden. Die so gewonnenen CAR33-NK Zellen zeigten eine hervorragende Wirksamkeit gegen CD33-positive AML-Zellen in vitro sowie in AML-xenotransplantierten Mausmodellen (Publikation 3). In weiteren von uns durchgeführten Studien, wurde die Effektivität von CAR33-NK-Zellen verglichen, welche manuell oder mittels eines CliniMACS Prodigy®-Geräts semi-automatisiert hergestellt wurden. Dabei konnte gezeigt werden, dass manuell und automatisiert hergestellte CAR33-NK-Zellen trotz eines mehrstündigen Transports funktional, und hinsichtlich ihres Phänotyps und ihrer in vitro- und in vivo-Wirksamkeit vergleichbar sind (Publikation 4). Mit dem Ziel eine erhöhte und länger andauernde Wirksamkeit der CAR33-NK Zellen zu erreichen, wurden im Rahmen von in Publikation 5 durchgeführten Arbeiten, die Expression des inhibitorischen Rezeptors NKG2A (KLRC1) mittels CRISPR/Cas9 auf CAR33-NK-Zellen reduziert. Dabei wurde zunächst untersucht, ob sich die Nukleofektion methodisch mit einer viralen Transduktion kombinieren lässt. Nach erfolgreicher Herstellung der so doppelt-modifizierten NK-Zellen, wurden intensive Einzelzellanalysen sowie Zytotoxizitätstest durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die CAR- sowie NKG2A-Expressionen kaum gegenseitig beeinflussen. CAR33-KLRC1ko-NK-Zellen zeigten zudem eine deutlich gesteigerte Zytotoxizität im Vergleich zu einfach-modifizierten oder nicht-modifizierten NK-Zellen gegenüber CD33+, NKG2A-Ligand (HLA-E)+ OCI-AML2 Zellen sowie AML-Patientenmaterial in vitro also auch in OCI-AML2-xenotransplantierten Mausmodellen. Durch die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Arbeiten, konnten wichtige Erkenntnisse zu (CAR-)NK-Zell Funktionalität und Biologie gewonnen, und substanzielle technologische Fortschritte in der Entwicklung von CAR-NK-Zelltherapeutika gemacht werden.