Молекулярно-генетическая диагностика инвазивных микозов у детей с онкогематологической патологией на основе этиологического анализа грибковой микрофлоры, циркулирующей в стационаре: технология и результаты исследования
Authors: М.А. Черновецкий , Е.Я. Скоповец , Н.В. Агеев 
Published: December 2024

Введение. В последние годы во всем мире возрастает актуальность грибковых инфекций. Наиболее опасными формами данного вида патологии являются инвазивные микозы с поражением внутренних органов и тканей, характеризующиеся тяжелым течением заболевания и высокой летальностью. Цель. Разработка технологии мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) для диагностики инвазивных микозов в клинически значимых видах биологического материала и формирование на основе комплексного подхода с использованием молекулярно-генетического анализа картины циркуляции микромицет дрожжевой и плесневой этиологии в условиях стационара в течение последнего более чем 20-летнего периода (2002–2023 гг.). Материалы и методы. В исследование были включены все штаммы грибов (микромицеты), выявленные в клинически значимом материале (кровь, моча, содержимое дыхательной системы – бронхоальвеолярный лаваж и трахеобронхиальный дренаж) у 589 детей с сопутствующими инфекциями на фоне основной онкогематологической патологии, находившихся на лечении в Республиканском научно-практическом центре детской онкологии, гематологии и иммунологии (далее – Центр) в период с 2002 по 2023 год включительно. Выделенные штаммы грибов были идентифицированы методами фенотипирования микромицет и оценки биохимических свойств дрожжевых патогенов с последующим подтверждением видовой идентификации отдельных штаммов грибов путем дополнительного исследования методами масс-спектрометрии белкового профиля (в варианте MALDI-TOF MS). На основе анализа этиологического спектра выделенной грибковой микрофлоры выявлены наиболее часто обнаруживаемые микромицеты с последующим подбором родоспецифичных и видоспецифичных праймеров в рамках разработки мультиплексной реал-тайм ПЦР для диагностики инвазивных микозов. Результаты. В общей сложности было выделено 620 штаммов микромицет, среди которых превалировали дрожжевые грибы: 90,05% в крови (201 из 221 гемокультуры); 87,07% в моче (101 из 116 уреакультур) и 69,61% в содержимом дыхательной системы (197 из 283 штаммов). Основными дрожжевыми патогенами явились Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida (Meyerozyma) guillermondii, Candida glabrata и Candida krusei. Среди плесневых микромицет основная этиологическая роль принадлежала Aspergillus spp. (c превалированием Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus и Aspergillus niger) и Fusarium spp. (c преобладанием Fusarium solani). На основе полученных локальных эпидемиологических данных подобраны панели праймеров и разработана технология комплексной реал-тайм ПЦР-диагностики основных возбудителей грибковых инфекций, циркулирующих в Центре. Заключение. Микромицеты рода Candida продолжают оставаться основными возбудителями инвазивных микозов, обнаруживаемыми у детей с онкогематологической патологией. Обращает на себя внимание существенный удельный вес плесневой микрофлоры (30,39%; 86 из 283 культур) среди микромицет, выделенных из содержимого дыхательной системы. Подавляющее большинство выделенных из биологического материала микромицет (71,45%; 443 из 620 выделенных штаммов) относятся к указанным пяти видам Candida spp. (Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida (Meyerozyma) guillermondii, Candida glabrata и Candida krusei) и трем видам Aspergillus spp. (Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus и Aspergillus niger). Показана возможность применения реал-тайм ПЦР-детекции основных возбудителей грибковых инфекций на основе предварительного анализа микрофлоры, циркулирующей в конкретном медицинском стационаре. Внедрение современных диагностических технологий на основе использования комплексного мультиплексного ПЦР-анализа создает возможность повысить эффективность специфической диагностики грибковых инфекций.
Introduction. Recently, fungal infections have become a growing worldwide challenge. The most dangerous forms of this pathology are invasive mycoses with involvement of internal organs and tissues, characterized by severity and high mortality. Purpose. To elaborate a technology of multiplex real-time PCR (real-time PCR) for diag-nosing invasive mycoses in clinically significant types of biological material and to form a pattern of yeast and mold micromycetes circulation in inpatient conditions during a more than 20–year period (2002–2023) on the basis of an integrated approach using molecular genetic analysis. Materials and methods. The study covered all fungal strains (micromycetes) detected in clinically relevant material (blood, urine, and respiratory system contents) obtained from 589 children with concomitant infections against the background of underlying on-cohematological pathology treated at the Republican Scientific and Practical Center for Children’s Oncology, Hematology, and Immunology from 2002 to 2023 inclusive. Isolated fungal strains were identified by micromycetes phenotyping and biochemical properties of yeast pathogens assessing with further confirmation of specific identification of individual fungal strains by extra testing using protein profile mass spectrometry (MALDI–TOF MS). Based on the analysis of the etiological spectrum of the isolated fungal microflora, the most frequently detected micromycetes were identified with subsequent selection of genus-specific and species-specific primers in the framework of elaborating multiplex real-time PCR for invasive mycoses diagnosis. Results. A total of 620 strains of micromycetes were isolated, among which yeasts pre-vailed: 90.05% in blood (201 of 221 hemocultures); 87.07% in urine (101 of 116 ureacultures); and 69.61% in respiratory contents (197 of 283 strains). The main yeast pathogens were Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida (Meyerozyma) guillermondii, Candida glabrata and Candida krusei. Among mold micromycetes, the main etiological role belonged to Aspergillus spp. (with predominance of Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus and Aspergillus niger) and Fusarium spp. (with predominance of Fusarium solani). Based on the obtained local epidemiological data, primers panels were selected and the technology of integrated real-time PCR diagnosis of the main pathogens of fungal infections circulating in the Center was elaborated. Conclusion. Candida micromycetes remain the main causative agents of invasive mycoses in children with oncohematological pathology. A significant proportion of mold microflora (30.39%; 86 of 283 cultures) among micromycetes isolated from the respiratory contents is noteworthy. The overwhelming majority of micromycetes isolated from bio-logical material (71.45%; 443 of 620 strains isolated) belonged to the above five species of Candida spp. (Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida (Meyerozyma) guillermondii, Candida glabrata, and Candida krusei) and three species of Aspergillus spp. (Aspergil-lus fumigatus, Aspergillus flavus, and Aspergillus niger). The feasibility of using real-time PCR-detection of main fungal pathogens on the basis of preliminary analysis of in-patient microflora circulating in a particular hospital was demonstrated. The implementation of modern diagnostic technologies based on the use of integrated multiplex PCR-analysis provides an opportunity for improving the effectiveness of specific fungal infections diagnosis.