Ρεπερτόριο και λειτουργικότητα υποδοχέων έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία
Authors: Ντούφα Σταυρούλα 
Published: September 2021

Ο ρόλος του αντιγόνου στη ΧΛΛ υποδεικνύεται από τη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV για τη δημιουργία των Β κυτταρικών υποδοχέων (B cell Receptors, BcRs) που εκφράζουν τα νεοπλασματικά κύτταρα, την προγνωστική αξία της δομής των BcR καθώς και την ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν πανομοιότυπους, στερεότυπους, BcR. Η δομική ομολογία υποδεικνύει το σημαντικό ρόλο ενός περιορισμένου εύρους παθογόνων ή δομικά σχετιζόμενων επιτόπων, στη λευχαιμογένεση. Η άμυνα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών στηρίζεται στη συνεργική δράση πολλών μηχανισμών, ώστε να επιτευχθεί μία αποτελεσματική άνοση απάντηση. Σε αυτούς τους μηχανισμούς συμπεριλαμβάνεται και η μη ειδική διέγερση των Β λεμφοκυττάρων μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας, κύριοι αντιπρόσωποι των οποίων οι τύπου Toll και NOD (Toll Like Receptors, TLRs, Nod Like Receptors, NLRs). Τα δεδομένα που υπάρχουν σχετικά με την έκφραση των υποδοχέων TLR και NLR στη ΧΛΛ είναι περιορισμένα και προέρχονται από μικρές σειρές ασθενών. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση του προτύπου έκφρασης του σηματοδοτικού μονοπατιού των υποδοχέων TLR καθώς και των υποδοχέων NLR, σε μία μεγάλη σειρά 191 ασθενών με ΧΛΛ. Η ανάλυση περιελάμβανε όλους τους TLR και τους NOD1/2, προσαρμοστές, τελεστές, μόρια που εμπλέκονται σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια που αλληλεπιδρούν με το μονοπάτι των TLR, καθώς και τελικά μόρια-­‐στόχους. Παρατηρήθηκαν διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ υποομάδων ασθενών με ΧΛΛ που ορίστηκαν με βάση τα μοριακά χαρακτηριστικά του BcR, όπως το ρεπερτόριο και το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV και η έκφραση στερεότυπων BcR. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε CD19+ Β λεμφοκύτταρα που επιλέχθηκαν αρνητικά από ολικό αίμα. Το γονιδιακό πρότυπο έκφρασης του σηματοδοτικού μονοπατιού των TLR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RT² Profiler™ PCR Array kit (PAHS-­‐018A array, SABiosciences), ενώ τα επίπεδα των mRNA μεταγράφων των υποδοχέων NOD1/2 μετρήθηκαν με τη χρήση ειδικών εκκινητών. Στο σύνολο των ασθενών, μεταξύ των υποδοχέων υψηλά επίπεδα έκφρασης παρουσίαζαν οι TLR7 και CD180, ενδιάμεσα οι TLR1, TLR6 και TLR10 και χαμηλά οι TLR2 και TLR9. Τα επίπεδα έκφρασης των TLR4 και TLR8 ήταν πολύ χαμηλά και σε πολλές περιπτώσεις μη ανιχνεύσιμα. Η έκφραση των TLR3 και TLR5 ήταν αρνητική στην πλειονότητα των περιπτώσεων. Οι NOD1/2 παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης. Οι περισσότεροι προσαρμοστές (MyD88, TICAM1, TRAF6), οι τελεστές που ρυθμίζουν τη λειτουργία του μονοπατιού (UBE2N) καθώς και τα μόρια που εμπλέκονται στα άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια των NFKB, JNK/p38, NF/IL6 και IRF καθοδικά του μονοπάτιου των TLR εμφάνιζαν υψηλά ή ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης, ενώ οι αναστολείς του μονοπατιού εκφραζόταν σε χαμηλά έως μηδενικά επίπεδα (TOLLIP, SIGIRR/TIR8). Η σύγκριση των περιπτώσεων που φέρουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες IGHV (M-­‐ΧΛΛ) έναντι εκείνων που φέρουν αμετάλλακτες αλληλουχίες IGHV (Α-­‐ΧΛΛ) (124 και 67 περιπτώσεις, αντιστοίχως) αποκάλυψε ότι τα μόρια CD80, CD86, IL6, IFNG και TLR4 υπερεκφράζονταν, ενώ τα μόρια TLR8 και NFKBIL1 υποεκφράζονταν στην M-­‐ΧΛΛ έναντι της Α-­‐ΧΛΛ. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και κατά τη σύγκριση ασθενών που ανήκαν σε διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα (στερεότυπο υποσύνολο #4, IGHV4-­‐34/1GKV2-­‐30 BcR, στερεότυπο υποσύνολο #1, IGHV1/5/7-­‐ IGKV1(D)-­‐39 BcR, στερεότυπο υποσύνολο #8, IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39 BcR): (i) υπερέκφραση των μορίων TLR7 και NFKBIA και υποέκφραση των μορίων CD86 και TLR4 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #1 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #4, (ii) υπερέκφραση ων μορίων TLR4 και MAP4K4 και υποέκφραση των μορίων NFKBIA και RIPK2 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #8 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #1 και (iii) υπερέκφραση του μορίου LY96 και υποέκφραση των μορίων RIPK2 και CD86 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #8 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #4. Συμπερασματικά, το πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR είναι παρόμοιο με το αντίστοιχο των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων, ενισχύοντας την άποψη ότι τα κύτταρα της ΧΛΛ έχουν εμπειρία αντιγόνου. Επιπλέον, υπο-­‐ομάδες ασθενών με ΧΛΛ που ορίζονται με βάση τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά των BcR -­‐ιδίως οι περιπτώσεις που φέρουν στερεότυπους BcR-­‐ εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων TLR, γεγονός που υποδεικνύει ότι διαφορετικά (και ταυτόχρονα) σήματα εκτός από τα σήματα που προέρχονται από τον BcR μπορεί να επηρεάζουν τη συμπεριφορά του νεοπλασματικού κλώνου. Τα ώριμα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα ειδικά μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (B cell Receptor, BcR) αλλά και μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας, όπως οι υποδοχείς τύπου Toll (Toll Like Receptors, TLRs) και υποδοχείς τύπου NOD (NOD Like Receptors, NLRs), οι οποίοι ασκούν συν-­‐διεγερτική δράση στον BcR. Φαίνεται ότι η σηματοδότηση μέσω BcR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και ίσως στην εξέλιξη της Χρόνιας Λεμφοκυτταρικής Λευχαιμίας (ΧΛΛ). Ωστόσο, η ακριβής χρονική στιγμή, η διάρκεια και κυρίως η φύση της αντιγονικής διέγερσης είναι μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστα. Παρόλο που σημαντικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι υποδοχείς έμφυτης ανοσίας σχετίζονται με την παθογένεια της ΧΛΛ, η λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NLR δεν έχει μελετηθεί εκτενώς στη ΧΛΛ. Μελετήσαμε τη λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NLR σε υποομάδες ασθενών με ΧΛΛ οι οποίες διαχωρίστηκαν με βάση το ρεπερτόριο, το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV και την έκφραση στερεότυπων BcR. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε 67 ασθενείς, με σκόπιμη υπερ-­‐αντιπροσώπευση περιπτώσεων που εκφράζουν στερεότυπους υποδοχείς χαρακτηριστικούς των στερεότυπων υποσυνόλων #1 (IGHV1/5/7-­‐IGKV1(D)-­‐39) και #4 (IGHV4-­‐34/IGKV2-­‐30), τα οποία θεωρούνται υποδείγματα κακής και καλής πρόγνωσης, αντίστοιχα. Έγινε διέγερση CD19+ κυττάρων, που είχαν επιλεγεί αρνητικά από ολικό αίμα, με προσδέτες ειδικούς για όλους τους TLR/NLR που εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα. Τα αποτελέσματα της διέγερσης εκτιμήθηκαν μετά από 12 ώρες με μέτρηση της έκφρασης των μορίων CD25 και CD86 (δείκτες ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων), με κυτταρομετρία ροής. Επίσης, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά στιγμιότυπα (Ημέρα 3, 6, 9). Οι TLR1/2, TLR2/6, TLR9 και NOD2 απάντησαν στη διέγερση με τους ειδικούς προσδέτες στις περισσότερες περιπτώσεις που μελετήθηκαν, αν και με μεγάλη ετερογένεια. Η διέγερση του TLR7 με Imiquimod, ένα μικρό συνθετικό αντι-­‐ιικό μόριο, οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης του CD25 και/ή CD86 σε ~50% των περιπτώσεων. Αντίθετα, η loxoribine που είναι ο φυσικός προσδέτης του TLR7 δεν είχε καμία επίδραση στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ. Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην απάντηση μετά από διέγερση επιλεγμένων TLR όταν μεταξύ περιπτώσεων που έφεραν μεταλλαγμένες έναντι αμετάλλακτων αλληλουχιών IGHV (M-­‐ΧΛΛ vs Α-­‐ΧΛΛ). Συγκεκριμένα, το ποσοστό των CD25 θετικών κυττάρων αυξήθηκε περισσότερο στην Α-­‐ΧΛΛ μετά από διέγερση του TLR7 με Im. Αντίθετα, μετά από διέγερση του TLR9 με CpG, το ποσοστό των CD86 θετικών κυττάρων ήταν μεγαλύτερο στην M-­‐ΧΛΛ. Ιδιαίτερα λειτουργικά πρότυπα των TLR και NOD2 παρατηρήθηκαν και στα διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα ασθενών. Συγκεκριμένα, μετά από διέγερση των υποδοχέων TLR9, TLR1/2, TLR2/6, και NOD2 με τους κατάλληλους προσδέτες, η έκφραση του CD86 επαγόταν ισχυρά στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσύνολου #4, ενώ στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσύνολου #1 η επαγωγή της έκφρασης ήταν χαμηλή έως μηδενική. Η διέγερση του TLR7 με Im δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του CD86, αλλά οδηγούσε σε αυξημένη έκφραση του CD25 μόνο στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #1. Η μελέτη μας περιλάμβανε επίσης περιπτώσεις που ανήκαν στα στερεότυπα υποσύνολα #8 (IGHV4-­‐39/IGKV1(D)-­‐39, UM) και #16 (IGHV4-­‐34/IGKV3-­‐20, M). Παρατηρήσαμε ιδιαίτερα λειτουργικά πρότυπα ακόμα και όταν συγκρίναμε περιπτώσεις που ανήκαν σε στερεότυπα υποσύνολα με ίδιο status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV (στερεότυπο υποσύνολο #1 έναντι #8 και στερεότυπο υποσύνολο #4 έναντι #16), γεγονός που υποδεικνύει ότι τα ιδιαίτερα πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων TLR είναι χαρακτηριστικά των στερεότυπων υποσυνόλων, ανεξάρτητα από τη χρήση συγκεκριμένου γονιδίου IGHV ή status μεταλλάξεων. Για να επιβεβαιώσουμε το παραπάνω συμπέρασμα, επικεντρωθήκαμε στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούσαν το γονίδιο IGHV4-­‐34 σε στερεότυπες (#4 και #16) και μη (non #4/16) αναδιατάξεις. Με αυτή την προσέγγιση παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0.05) ανάμεσα στις τρεις ομάδες ασθενών αναφορικά με την έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων μετά από διέγερση των TLR1/2, TLR2/6, NOD2 και TLR9. Σε όλες τις παραπάνω συγκρίσεις παρατηρήθηκαν επίσης διαφορετικά ποσοστά βιωσιμότητας μετά από διέγερση συγκεκριμένων TLR και/ή NLR με τους κατάλληλους προσδέτες. Συμπερασματικά, η ανάπτυξη και εξέλιξη της ΧΛΛ πιθανόν επηρεάζεται και από σήματα που λαμβάνονται μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας. Υποομάδες ασθενών με ΧΛΛ που ορίζονται με βάση τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά των BcR εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα λειτουργικότητας των υποδοχέων TLR και/ή NLR. Με βάση τα παραπάνω, η βιολογική συμπεριφορά του λευχαιμικού κλώνου, που αντικατοπτρίζεται στην κλινική πορεία της νόσου, είναι αποτέλεσμα της συνεργασίας των κλωνοτυπικών BcR με συγκεκριμένους υποδοχείς έμφυτης ανοσίας που διαφέρουν κατά περίπτωση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσε να χρησιμεύσουν για τη διάκριση ομάδων ασθενών που θα ωφελούνταν από τη θεραπεία με συγκεκριμένους προσδέτες.